1998L0057 — FI — 30.07.2006 — 001.001

Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentointitarkoituksiin. Toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä.

Muutettu:





Oikaisu









▼B

NEUVOSTON DIREKTIIVI 98/57/EY,

annettu 20 päivänä heinäkuuta 1998,

Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. -kasvintuhoojan torjunnasta







EUROOPAN UNIONIN NEUVOSTO, joka ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen ja erityisesti sen 43 artiklan, ottaa huomioon komission ehdotuksen ( 1 ), ottaa huomioon Euroopan parlamentin lausunnon ( 2 ), ottaa huomioon talous- ja sosiaalikomitean lausunnon ( 3 ), sekä katsoo, että sekä katsoo, että haitallinen organismi Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. tunnettiin aikaisemmin nimellä Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith; nimeä Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. käytettäneen vastaisuudessa organismin yleisesti hyväksyttynä nimenä; tässä direktiiissä olisi tieteellinen kehitys otettava huomioon, perunan- ja tomaatintuotannolla on tärkeä asema yhteisön maataloudessa; haitalliset organismit uhkaavat tomaatti- ja perunasatoa jatkuvasti, perunan- ja tomaatinviljelyä näiltä haitallisilta organismeilta suojaamalla olisi tuotostason ylläpitämisen lisäksi myös parannettava maatalouden tuottavuutta, haitallisten organismien jäsenvaltion alueelle kulkeutumisen estävillä suojatoimenpiteillä olisi ainoastaan rajallinen vaikutus, ellei näitä organismeja samanaikaisesti ja järjestelmällisesti torjuta koko yhteisössä ja niitä estetä leviämästä, eräs perunan ja tomaatin haitallisista organismeista on Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., perunan tumman rengasmädän sekä perunan ja tomaatin bakteerilakastumistaudin aiheuttaja; tämän taudinaiheuttajan aiheuttamia tautipesäkkeitä on tavattu tietyillä yhteisön alueilla, ja joitakin rajoitettuja tartuntalähteitä on vielä olemassa, perunan- ja tomaatinviljely on koko yhteisössä suuresti uhattuna, ellei näiden satokasvien osalta toteuteta tehokkaita toimenpiteitä tämän organismin paikallistamiseksi ja levinneisyyden määrittämiseksi, sen esiintymisen ja leviämisen estämiseksi ja, jos tautia löydetään, sen leviämisen estämiseksi ja torjumiseksi tarkoituksella hävittää se, tiettyjä toimenpiteitä on toteutettava yhteisössä tämän tavoitteen saavuttamiseksi; jäsenvaltioiden on lisäksi voitava toteuttaa lisätoimenpiteitä tai tiukempia toimenpiteitä, jos ne ovat tarpeen eivätkä aiheuta esteitä perunoiden ja tomaattien liikkumiselle yhteisössä, jollei kasvien tai kasvituotteiden haitallisten organismien yhteisöön kulkeutumisen ja yhteisössä leviämisen estämiseen liittyvistä suojatoimenpiteistä 21 päivänä joulukuuta 1976 annetussa neuvoston direktiivissä 77/93/ETY ( 4 ) toisin säädetä; nämä toimenpiteet on ilmoitettava muille jäsenvaltioille ja komissiolle, toimenpiteissä on otettava huomioon se, että järjestelmälliset viralliset tutkimukset ovat tarpeen taudinaiheuttajan paikallistamiseksi; näihin tutkimuksiin olisi sisällytettävä tarkastusmenettelyt ja koska tietyissä ympäristöoloissa tauti voi kasvavissa perunoissa sekä varastoiduissa perunoissa jäädä piileväksi ja havaitsematta, niihin olisi sisällyttävä tarvittaessa näytteenotto- sekä testausmenettelyt; taudinaiheuttajan leviäminen kasvavissa perunoissa ja tomaateissa ei ole tärkein tekijä vaan taudinaiheuttaja voi levitä pintaveden sekä tiettyjen viljelmillä esiintyvien luonnonvaraisten koisokasvien välityksellä ja sen vuoksi peruna- ja tomaattisadon kastelu saastuneella vedellä muodostaa ilmeisen tartunnanvaaran näille sadoille; taudinaiheuttaja voi myös talvehtia kasveissa, jotka ovat peräisin maahan jääneistä perunoista tai tomaateista (”ylivuotiset kasvit”), ja nämä voivat muodostaa saastuntalähteen kasvukaudesta toiseen; taudinaiheuttaja leviää myös, kun perunat joutuvat kosketuksiin saastuneiden perunoiden sekä istutus-, nosto- ja käsittelyvälineiden tai sellaisten kuljetuksessa ja varastoinnissa käytettyjen säiliöiden kanssa, jotka ovat saastuneet oltuaan aiemmin kosketuksissa saastuneiden perunoiden kanssa, taudinaiheuttajan leviämistä voidaan vähentää tai se voidaan estää puhdistamalla nämä välineet; tällainen siemenperunoiden saastunta muodostaa suurimman taudinaiheuttajan leviämisvaaran; vastaavasti siemenperunoiden piilevä tartunta muodostaa pääasiallisen taudinaiheuttajan leviämisvaaran ja tämä voidaan estää käyttämällä virallisesti hyväksytyn suunnitelman mukaisesti tuotettuja siemenperunoita, jolloin siemenperunat on kokeiden avulla todettu tartunnasta vapaiksi, nykyinen tietämys Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. -taudinaiheuttajan biologiasta ja epidemiologiasta Euroopan oloissa on puutteellista ja on suunniteltu, että ehdotetut toimenpiteet on tarpeen tarkistaa usealla kasvukaudella; vastaavasti koemenettelyihin on suunniteltu parannuksia tulevaisuudessa tehtäviä tutkimuksia ajatellen erityisesti menetelmien herkkyyden ja spesifisyyden osalta, jotta voidaan valita ja standardoida käytettävissä olevista koemenetelmistä parhaat, ja näitä yleisiä toimenpiteitä koskevia yksityiskohtaisia sääntöjä määritettäessä ja jäsenvaltioiden tämän taudinaiheuttajan alueelleen leviämisen estämiseksi toteuttamien tiukempien tai täydentävien toimenpiteiden osalta on suotavaa, että jäsenvaltiot toimivat komission kanssa tiiviissä yhteistyössä pysyvässä kasvinsuojelukomiteassa (jäljempänä ”komitea”), ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:







1 artikla

Tämä direktiivi koskee toimenpiteitä, jotka on toteutettava jäsenvaltioissa Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. -taudinaiheuttajan, josta on aikaisemmin käytetty nimeä Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, (jäljempänä ”organismi”) torjunnassa liitteessä I olevassa I jaksossa lueteltujen organismin isäntäkasvien (jäljempänä ”luettelossa oleva kasviaineisto”) osalta:

a) sen paikallistamiseksi ja sen levinneisyyden määrittämiseksi,

b) sen esiintymisen ja leviämisen estämiseksi, ja

c) jos sitä havaitaan, sen leviämisen estämiseksi ja sen torjumiseksi tarkoituksella hävittää se.

2 artikla

1. Jäsenvaltioiden on tehtävä vuosittain virallinen ja järjestelmällinen tutkimus organismin havaitsemiseksi niiden luettelossa olevien kasviaineistojen osalta, jotka ovat peräisin niiden alueelta. Luettelossa olevan kasviaineiston tuotantoa uhkaavien muiden mahdollisten saastuntalähteiden tunnistamiseksi jäsenvaltioiden on suoritettava riskien arviointi ja, jollei arvioinnissa ole todettu organismin leviämisen vaaraa, suoritettava luettelossa olevan kasviaineiston tuotantoalueilla kohdennettuja virallisia tutkimuksia, jotka koskevat organismin esiintymistä muissa kuin luettelossa olevan kasviaineiston kasveissa, luonnonvaraiset isäntäkasvina olevat koisokasvit mukaan luettuina, sekä luettelossa olevan kasviaineiston kasteluun tai sumutukseen käytettyä pintavettä ja luettelossa olevaa kasviaineistoa käsittelevien teollisten jalostus- tai pakkauslaitosten laskemia nestemäisiä jätteitä, joita käytetään luettelossa olevan kasviaineiston kasteluun tai sumutukseen. Näiden kohdennettujen tutkimusten laajuus on määritettävä tunnistetun riskin mukaisesti. Jäsenvaltioiden on myös tehtävä virallisia tutkimuksia, jotka koskevat organismin esiintymistä muussa aineistossa, kuten kasvualustassa, maaperässä tai teollisten jalostus- tai pakkauslaitosten kiinteissä jätteissä.

2. Edellä 1 kohdassa säädetyt viralliset tutkimukset on toteutettava:

a) luettelossa olevan kasviaineiston osalta liitteessä I olevan II jakson 1 kohdassa määrättyjen yksityiskohtien mukaisesti, ja

b) muiden kuin luettelossa olevassa kasviaineistossa esiintyvien isäntäkasvien ja veden osalta, nestemäiset jätteet mukaan lukien, asianmukaisten menetelmien mukaisesti ja tarvittaessa ottamalla näytteitä, jotka virallisesti tai virallisesti valvottuina tutkitaan laboratoriossa,

c) tarvittaessa muun aineiston osalta asianmukaisten menetelmien mukaisesti.

Direktiivin 77/93/ETY mukaiset toimivaltaiset viranomaiset vahvistavat näitä tutkimuksia varten tarkastusmenettelyjä koskevat täydentävät yksityiskohtaiset säännöt sekä näytteiden lukumäärän, alkuperän ja sen, mistä kohdin perunakerroksia näytteet otetaan, sekä näytteenoton ajoituksen perusteltujen tieteellisten ja tilastollisten periaatteiden ja organismin biologian mukaisesti sekä ottaen huomioon kyseisen jäsenvaltion erityisen, luettelossa olevan kasviaineiston ja tarvittaessa muiden organismin isäntäkasvien tuotantojärjestelmät.

3. Edellä 1 kohdassa tarkoitettuja virallisia tutkimuksia koskevat yksityiskohtaiset säännöt sekä tutkimusten tulokset on ilmoitettava muille jäsenvaltioille ja komissiolle vuosittain liitteessä I olevan II jakson 2 kohdan säännösten mukaisesti. Nämä ilmoitukset on jätettävä 1 päivään kesäkuuta mennessä lukuun ottamatta siemenperunoina käytettyjä perunoita koskevia ilmoituksia, jotka on jätettävä 1 päivään syyskuuta mennessä. Satoa koskevat tiedot ja tulokset suhteutetaan edellisen vuoden tuotantoon. Näitä ilmoituksia koskevat tiedot voi jättää komitean käsiteltäväksi.

4. Seuraava säännös on annettava direktiivin 77/93/ETY 16 a artiklassa säädettyä menettelyä noudattaen:

— edellä 2 kohdan ensimmäisen alakohdan b alakohdassa tarkoitettujen tutkimusten ja laboratoriokokeiden asianmukaiset menetelmät.

5. Seuraavat säännökset voidaan antaa direktiivin 77/93/ETY 16 a artiklassa säädettyä menettelyä noudattaen:

— edellä 2 kohdan ensimmäisen alakohdan c alakohdassa tarkoitettujen tutkimusten asianmukaiset menetelmät,

— edellä 2 kohdan toisessa alakohdassa tarkoitettujen tutkimusten täydentävät yksityiskohtaiset säännöt, jotta kullakin jäsenvaltiolla olisi keskenään vertailukelpoiset takeet.

3 artikla

Jäsenvaltioiden on huolehdittava siitä, että organismin epäilty tai varmistettu esiintyminen niiden alueella ilmoitetaan jäsenvaltioiden omille toimivaltaisille viranomaisille.

4 artikla

1. Kunkin epäillyn esiintymistapauksen osalta kyseisen jäsenvaltion toimivaltaisten viranomaisten on varmistettava, että viralliset tai virallisesti valvotut laboratoriotutkimukset tehdään käyttämällä luettelossa olevan kasviaineiston osalta liitteessä II esitettyä asianmukaista menetelmää liitteessä III olevassa 1 kohdassa mainittujen edellytysten mukaisesti tai kaikissa muissa tapauksissa käyttämällä jotain muuta virallisesti hyväksyttyä menetelmää mainitun esiintymisen varmistamiseksi tai epäilyn kumoamiseksi. Jos esiintyminen varmistetaan, on sovellettava liitteessä III olevassa 2 kohdassa määrättyjä vaatimuksia.

2. Ennen kuin 1 kohdassa tarkoitettu epäilty esiintyminen on varmistunut tai kumottu, kussakin epäillyssä esiintymistapauksessa, jossa on todettu:

i) organismin aiheuttamia taudinoireita sekä saatu positiivinen tulos liitteessä II olevan I jakson 1 kohdassa ja II jaksossa määritellyssä nopeassa seulontakokeessa (-kokeissa) tai

ii) positiivinen tulos liitteessä II olevan I jakson 2 kohdassa ja III jaksossa määritety(i)ssä seulontakokeessa (-kokeissa),

jäsenvaltioiden toimivaltaisten viranomaisten on niiden oman tuotannon osalta:

a) kiellettävä kaikkien sellaisten satokasvien ja niiden mukuloiden, erien tai lähetysten liikkuminen, joista on otettu näytteitä, paitsi jos ne liikkuvat heidän valvontansa alaisina ja jos on todennettu, ettei organismin tunnistettavaa leviämisvaaraa ole olemassa;

b) toteutettava tarvittavat toimenpiteet epäillyn esiintymisen alkuperän jäljittämiseksi;

c) otettava käyttöön sopivia arvioidun riskin asteen mukaisia lisävarotoimenpiteitä organismin leviämisen estämiseksi, erityisesti luettelossa olevan kasviaineiston tuotannon sekä muiden kuin a kohdassa tarkoitettujen sillä tuotantopaikalla tuotettujen siemenperunaerien liikkumisen osalta, josta a kohdassa tarkoitetut näytteet on otettu.

3. Jos epäiltyjen esiintymistapausten yhteydessä uhkana on luettelossa olevan kasviaineiston tai pintaveden saastuminen toisesta jäsenvaltiosta (-valtioista) tai toiseen jäsenvaltioon (-valtioihin), jäsenvaltion, jossa epäillyt esiintymistapaukset on todettu, on ilmoitettava viipymättä tunnistetun riskin mukaisesti mainittua epäiltyä esiintymistapausta koskevat yksityiskohtaiset tiedot kyseiselle toiselle jäsenvaltiolle (-valtioille), ja mainittujen jäsenvaltioiden on oltava asianmukaisessa yhteistyössä. Jäsenvaltion (-valtioiden) jo(i)lle asiasta on ilmoitettu, on otettava käyttöön 2 kohdan c alakohdan mukaisia varotoimenpiteitä sekä toteutettava tarvittaessa muita lisätoimenpiteitä 1 ja 2 kohdan mukaisesti.

4. Seuraava säännös voidaan antaa direktiivin 77/93/ETY 16 a artiklassa säädettyä menettelyä noudattaen:

— edellä 2 kohdan c alakohdassa tarkoitetut toimenpiteet.

5 artikla

1. Jos virallisten tai virallisesti valvottujen liitteessä II kuvattua asianmukaista menetelmää käyttäen suoritettujen, luettelossa olevaa kasviaineistoa koskevien laboratoriotutkimusten tai kaikissa muissa tapauksissa jonkin muun virallisesti hyväksytyn menetelmän perusteella varmistuu, että organismi esiintyy tämän direktiivin mukaisesti otetussa näytteessä, jäsenvaltion toimivaltaisten viranomaisten on, ottaen huomioon perustellut tieteelliset periaatteet, organismin biologian ja tässä jäsenvaltiossa käytössä olevat organismin isäntäkasvien erityiset tuotanto-, kaupanpitämis- ja jalostusjärjestelmät:

a) luettelossa olevan kasviaineiston osalta: i) suoritettava tutkimukset saastunnan laajuuden ja alkuperäisen lähteen (lähteiden) määrittämiseksi liitteessä IV olevien säännösten mukaisesti ja vähintään kaikkia samasta kloonista polveutuvia siemenperunaeriä koskevat 4 artiklan 1 kohdan mukaiset täydentävät kokeet, ja ii) ilmoitettava saastuneiksi luettelossa oleva kasviaineisto, lähetys ja/tai erä, josta näyte otettiin, sekä välineet, ajoneuvo, säiliö, varasto tai sen osat ja kaikki muut kohteet, pakkaukset mukaan lukien, jotka ovat olleet kosketuksissa luettelossa olevan kasviaineiston kanssa, josta näyte on otettu; saastuneiksi on ilmoitettava tarvittaessa myös pelto (pellot), katteen alla kasvatettujen satokasvien tuotantoyksikkö (-yksiköt) sekä tuotantopaikka (-paikat), jo(i)sta luettelossa oleva kasviaineisto on korjattu ja josta näyte on otettu; kasvukaudella otettujen näytteiden osalta saastuneiksi on ilmoitettava pelto (pellot), tuotantopaikka (-paikat) ja tarvittaessa katteen alla kasvatettujen satokasvien tuotantoyksikkö (-yksiköt), josta näyte on otettu; ja iii) määritettävä liitteessä V olevan 1 kohdan säännösten mukaisesti todennäköinen saastunnan laajuus kosketuksen kautta saastuneiksi ilmoitettujen kohteiden kanssa ennen tai jälkeen sadonkorjuun tai näiden kohteiden kanssa tuotanto-, kastelu- tai sumutusjärjestelmässä olevien yhteyksien tai samasta kloonista polveutumisen kautta; ja iv) rajoitettava alue ii kohdassa tarkoitetun saastuntailmoituksen, iii kohdassa tarkoitetun todennäköisen saastunnan laajuuden määrittämisen ja organismin mahdollisen leviämisen perusteella liitteessä V olevan 2 kohdan i alakohdan säännösten mukaisesti.

b) muiden kuin a alakohdassa mainittujen isäntäkasvien sadon osalta, jossa luettelossa olevan kasviaineiston tuotannossa on tunnistettu riskejä: i) suoritettava tutkimukset a alakohdan i alakohdan mukaisesti; ii) ilmoitettava saastuneiksi ne organismin isäntäkasvit, joista näyte on otettu; ja iii) määritettävä todennäköinen saastunta ja rajoitettava alue a alakohdan iii ja iv alakohdan mukaisesti luettelossa olevan kasviaineiston tuotannon osalta.

c) pintaveden (mukaan lukien luettelossa olevaa kasviaineistoa käsittelevien teollisten jalostus- ja pakkauslaitosten nestemäiset jätepäästöt) sekä viljelmillä esiintyvien luonnonvaraisten isäntäkasvina olevien koisokasvien osalta, joissa luettelossa olevan kasviaineiston tuotannossa on tunnistettu riskejä pintavedellä tapahtuvan kastelun, sumutuksen tai pintaveden tulvimisen vuoksi: i) suoritettava sopivina ajankohtina pintavesinäytteitä ja mahdollisia luonnonvaraisia isäntäkasvina olevia koisokasveja koskevat tutkimukset, virallinen tutkimus mukaan luettuna, saastunnan laajuuden määrittämiseksi; ii) ilmoitettava saastuneiksi pintavesi, josta näyte (näytteet) on otettu, soveltuvassa laajuudessa ja i alakohdan mukaisen tutkimuksen perusteella; ja iii) määritettävä todennäköinen saastunta ja rajoitettava alue ii alakohdassa tarkoitetun saastuntailmoituksen ja organismin mahdollisen leviämisen perusteella ottaen huomioon liitteessä V olevan 1 kohdan ja 2 kohdan ii alakohdan määräykset.

2. Jäsenvaltioiden on ilmoitettava viipymättä muille jäsenvaltioille ja komissiolle liitteessä V olevassa 3 kohdassa määrättyä menettelyä noudattaen kaikki 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan ja 1 kohdan c alakohdan ii alakohdan mukaisesti ilmoitetut saastunnat sekä 1 kohdan a alakohdan iv alakohdassa ja soveltuvin osin 1 kohdan c alakohdan iii alakohdassa tarkoitetun alueen rajoittamista koskevat yksityiskohtaiset tiedot. Tämän kohdan mukaisissa ilmoituksissa olevat yksityiskohtaiset tiedot voidaan jättää komitean käsiteltäväksi.

Jäsenvaltioiden on samanaikaisesti toimitettava komissiolle liitteessä V olevassa 4 kohdassa mainitut lisäilmoitukset. Tämän kohdan mukaisissa ilmoituksissa olevat yksityiskohtaiset tiedot on jätettävä välittömästi komitean käsiteltäväksi.

3. Edellä 2 kohdassa tarkoitetun ilmoituksen ja siinä mainittujen seikkojen perusteella muiden ilmoituksessa mainittujen jäsenvaltioiden on tehtävä tutkimus 1 kohdan a alakohdan i alakohdan ja soveltuvin osin 1 kohdan c alakohdan i alakohdan mukaisesti ja toteutettava tarvittaessa lisätoimia 1 ja 2 kohdan mukaisesti.

6 artikla

1. Jäsenvaltioiden on määrättävä, että 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitettua luettelossa olevaa kasviaineistoa ei saa istuttaa ja että siihen on toimivaltaisten viranomaisten valvonnassa ja hyväksymänä sovellettava liitteessä VI olevan 1 kohdan säännöksiä siten, että varmistetaan, ettei minkäänlaista tunnistettavaa organismin leviämisvaaraa ole olemassa.

2. Jäsenvaltioiden on määrättävä, että 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iii alakohdan sekä c alakohdan iii alakohdan mukaisesti todennäköisesti saastuneeksi ilmoitettua luettelossa olevaa vaaralliseksi tunnistettua kasviaineistoa mukaan lukien 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iii alakohdan mukaisesti todennäköisesti saastuneeksi määritetyillä tuotantopaikoilla tuotettu kasviaineisto, ei saa istuttaa ja että se käytetään tai hävitetään asianmukaisella tavalla liitteessä VI olevan 2 kohdan mukaisesti jäsenvaltioiden toimivaltaisten viranomaisten valvonnassa varmistaen, ettei tunnistettavaa organismin leviämisvaaraa ole.

3. Jäsenvaltioiden on määrättävä, että 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneiksi ilmoitetut tai 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iii alakohdan sekä c alakohdan iii alakohdan mukaisesti todennäköisesti saastuneiksi ilmoitetut välineet, ajoneuvot, säiliöt, varastot tai niiden osat sekä kaikki muut kohteet, pakkaukset mukaan lukien, on tuhottava tai puhdistettava liitteessä VI olevassa 3 kohdassa tarkoitettuja asianmukaisia menetelmiä käyttäen. Puhdistuksen jälkeen näitä kohteita ei enää pidetä saastuneina.

4. Jäsenvaltioiden on määrättävä, että liitteessä VI olevassa 4.1 ja 4.2 kohdassa määritellyt eri toimenpiteet on toteutettava 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iv alakohdan ja c alakohdan iii alakohdan mukaisesti rajoitetulla alueella, sanotun kuitenkaan rajoittamatta 1, 2 ja 3 kohdan mukaisesti toteutettavia toimenpiteitä. Näitä toimenpiteitä koskevat yksityiskohtaiset tiedot on ilmoitettava vuosittain muille jäsenvaltioille ja komissiolle. Tässä ilmoituksessa olevat yksityiskohtaiset tiedot voidaan jättää komitean käsiteltäviksi.

7 artikla

1. Jäsenvaltioiden on määrättävä, että siemenperunoiden on täytettävä direktiivin 77/93/ETY vaatimukset ja niiden on polveuduttava suoraan peruna-aineistosta, joka on saatu virallisesti hyväksyttyä suunnitelmaa noudattaen ja joka on virallisesti tai virallisesti valvotussa liitteessä II esitettyä asianmukaista menetelmää käyttäen suoritetussa tutkimuksessa todettu kyseisestä organismista vapaaksi.

Jäsenvaltion on tehtävä edellä mainitut tutkimukset:

a) jos niiden omassa siemenperunan tuotannossa on varmistettuja havaintoja organismista, i) tutkimalla aikaisempien sukupolvien siemenperunat, alkuperäinen kloonivalinta mukaan luettuna, ja testaamalla järjestelmällisesti kaikki perussiemenperunat, tai ii) jos on osoitettu, että kyseessä ei ole samasta kloonista polveutuminen, testaamalla kaikki perussiemenperunoiden kloonit tai aikaisempien sukupolvien siemenperunat, alkuperäisen kloonivalinnan testaaminen mukaan luettuna, ja

b) muissa tapauksissa joko jokaiselle alkuperäisestä kloonista valitulle kasville tai perussiemenperunan tai aikaisempien sukupolvien siemenperunan edustaville näytteille.

2. Seuraavat säännökset voidaan antaa direktiivin 77/93/ETY 16 a artiklassa säädetyn menettelyn mukaisesti:

— yksityiskohtaiset säännöt 1 kohdan toisen alakohdan a alakohdan soveltamisesta,

— 1 kohdan toisen alakohdan b alakohdassa tarkoitettuja edustavia näytteitä koskevat säännöt.

8 artikla

Jäsenvaltioiden on kiellettävä organismin hallussapito ja käsittely.

9 artikla

Jäsenvaltiot voivat myöntää poikkeuksia tämän direktiivin 6 ja 8 artiklaan direktiivin 95/44/EY säännösten mukaisesti kokeellisia tai tieteellisiä tarkoituksia tai lajikevalintatyötä varten ( 5 ), sanotun kuitenkaan rajoittamatta direktiivin 77/93/ETY säännösten soveltamista.

10 artikla

Jäsenvaltiot voivat toteuttaa oman tuotantonsa osalta lisätoimenpiteitä tai tiukempia toimenpiteitä, jotka ovat tarpeen organismin torjumiseksi tai sen leviämisen estämiseksi, jos nämä toimenpiteet ovat direktiivin 77/93/ETY säännösten mukaisia.

Näitä toimenpiteitä koskevat yksityiskohtaiset tiedot on ilmoitettava muille jäsenvaltioille ja komissiolle. Tässä ilmoituksessa olevat yksityiskohtaiset tiedot voidaan jättää komitean käsiteltäviksi.

11 artikla

Tämän direktiivin liitteisiin tieteellisen tai teknisen tietämyksen lisääntymisen vuoksi tehtävät muutokset tehdään direktiivin 77/93/ETY 16 a artiklassa säädettyä menettelyä noudattaen. Tämän direktiivin liitteessä II esitettyjen menetelmien sekä liitteessä VI olevassa 4.1 ja 4.2 kohdassa säädettyjen toimenpiteiden osalta komissio laatii kertomuksen, jossa näitä menetelmiä ja toimenpiteitä tarkistetaan saadun kokemuksen perusteella, ja kertomus toimitetaan komitealle ennen 1 päivää tammikuuta 2002.

12 artikla

1. Jäsenvaltioiden on saatettava voimaan tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset 21 päivästä elokuuta 1999 lukien. Niiden on ilmoitettava tästä komissiolle viipymättä.

Näissä jäsenvaltioiden antamissa säädöksissä on viitattava tähän direktiiviin tai niihin on liitettävä tällainen viittaus, kun ne virallisesti julkaistaan. Jäsenvaltioiden on säädettävä siitä, miten viittaukset tehdään.

2. Jäsenvaltioiden on välittömästi toimitettava tässä direktiivissä tarkoitetuista kysymyksistä antamansa keskeiset kansalliset säännökset komissiolle. Komissio ilmoittaa tästä muille jäsenvaltioille.

13 artikla

Tämä direktiivi tulee voimaan päivänä, jona se julkaistaan Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä.

14 artikla

Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.









LIITE I

I JAKSO

Luettelo 1 artiklassa tarkoitetuista Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. -kasvintuhoojan isäntäkasveista







Solanum tuberosum L. -lajin kasvit (mukulat mukaan luettuina), varsinaisia siemeniä lukuun ottamatta Peruna Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farw. -lajin kasvit hedelmiä ja siemeniä lukuun ottamatta Tomaatti

II JAKSO

Tutkimukset

1. Edellä 2 artiklan 2 kohdan a alakohdassa tarkoitettujen virallisten tutkimusten on perustuttava organismin biologiaan sekä kyseisen jäsenvaltion erityisiin tuotantojärjestelmiin ja niihin on kuuluttava: i) perunan osalta, — kasvavien perunoiden silmämääräinen tarkastus sopivina ajankohtina ja/tai näytteenotto sekä siemenistä että muista perunoista kasvukauden aikana tai varastossa. Näille näytteille tehdään virallisesti tai virallisesti valvottu silmämääräinen tarkastus halkaisemalla mukulat, — ja — siemenperunoiden ja tarvittaessa muiden perunoiden osalta virallinen tai virallisesti valvottu laboratoriotutkimus liitteessä II esitettyä menetelmää käyttäen; ii) tomaatin osalta, — ainakin uudelleenistutettavaksi ammattikäyttöön tarkoitettujen kasvavien tomaattien silmämääräinen tarkastus sopivina ajankohtina.

2. Edellä 2 artiklan 3 kohdassa tarkoitettuun virallisia tutkimuksia koskevaan ilmoitukseen on kuuluttava: i) perunoita koskevien tutkimusten osalta: — siemenperunoiden ja muiden perunoiden viljelmän arvioitu kokonaispinta-ala hehtaareina, — luokittelu siemenperunaluokkiin ja ruokaperunaan, sekä tarvittaessa alueisiin, — tutkimusta varten otettujen näytteiden lukumäärä ja näytteenoton ajoitus, — silmämääräisten tarkastusten lukumäärä pellolla, — mukuloiden silmämääräisten tarkastusten lukumäärä (ja näytteen koko); ii) ainakin uudelleenistutettavaksi ammattikäyttöön tarkoitettuja kasvavia tomaatteja koskevien tutkimusten osalta: — kasvien arvioitu kokonaismäärä, — silmämääräisten tarkastusten lukumäärä; iii) muita isäntäkasveja kuin perunoita ja tomaatteja, luonnonvaraiset isäntäkasvina olevat koisokasvit mukaan luettuina, koskevien tutkimusten osalta: — lajit, — otettujen näytteiden lukumäärä ja näytteenoton ajoitus, — alue/joki, josta näytteet otetaan (tarvittaessa), — analyysimenetelmä; iv) vesiä ja teollisten jalostus- tai pakkauslaitosten nestemäisiä jätteitä koskevien tutkimusten osalta: — otettujen näytteiden lukumäärä ja näytteenoton ajoitus, — alue/joki/laitokset, joista näytteet otetaan (tarvittaessa), — analyysimenetelmä.

▼M1









LIITE II

TUTKIMUSMENETELMÄ RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. -KASVINTUHOOJAN MÄÄRITTÄMISEKSI, TOTEAMISEKSI JA TUNNISTAMISEKSI

TUTKIMUSMENETELMÄN SOVELTAMISALA

Esitetty menetelmä kuvaa eri menettelyjä, jotka koskevat

i) tumman rengasmädän määritystä perunan mukuloista ja bakteerilakastumistaudin määritystä perunasta ja tomaatista ja eräistä muista isäntäkasveista;

ii) Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteamista perunan mukuloista, perunoista, tomaateista ja muista isäntäkasveista, vedestä ja maaperästä otetuista näytteistä;

iii) Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) -kasvintuhoojan tunnistamista.

SISÄLTÖ







Yleiset periaatteet I JAKSO: Tutkimusmenetelmän soveltaminen 1. Toteamismenetelmä tumman rengasmädän ja bakteerilakastumistaudin (R. solanacearum) määrittämiseksi perunan mukuloista ja perunasta, tomaatista tai muusta isäntäkasvista, jossa on tumman rengasmädän tai bakteerilakastumistaudin oireita 2. Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista mukulanäytteistä 3. Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista perunoista, tomaateista tai muista isäntäkasveista. II JAKSO: Yksityiskohtaiset menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi perunan mukuloista ja perunasta, tomaatista tai muusta isäntäkasvista, jossa on tumman rengasmädän tai bakteerilakastumistaudin oireita 1. Oireet 2. Pikaseulontatestit 3. Eristämismenettely 4. R. solanacearum -kasvintuhoojan tunnistustestit III JAKSO: 1. Yksityiskohtaiset menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista mukulanäytteistä 1.1 Näytteiden valmistelu 1.2 Testaus 2. Yksityiskohtaiset menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista perunoista, tomaateista tai muista kasveista. 2.1 Näytteiden valmistelu 2.2 Testaus IV JAKSO: 1. Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi vedestä 2. Menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi vedestä 2.1 Näytteiden valmistelu 2.2 Testaus V JAKSO: 1. Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi maaperästä 2. Menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi maaperästä 2.1 Näytteen valmistus 2.2 Testaus VI JAKSO: Optimoidut protokollat R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi A) Määritys- ja toteamistestit 1. Valutuskoe 2. Poly-β-hydroksibutyraattirakeiden (PHB) toteaminen 3. Serologiset agglutinaatiokokeet 4. Eristäminen selektiivisellä alustalla 4.1 Valikoiva maljaus 4.2 Rikastusmenettely 5. Immunofluoresenssitesti (IF-testi) 6. Polymeraasiketjureaktiotesti (PCR-testi) 6.1 DNA:n puhdistusmenetelmät a) Pastrikin menetelmä (2000) b) Muut menetelmät 6.2 PCR-testi 6.3. PCR-tuotteen määrittäminen 7. Fluoresoiva in situ -hybridisaatio (FISH-testi) 8. Entsyymi-immunologinen määritys (ELISA-testi) a) Epäsuora ELISA-testi b) DASI (Double-Antibody Sandwich Indirect) ELISA 9. Biologinen määritys B) Tunnistustestit 1. Ravintokokeet ja entsymaattiset tunnistustestit 2. IF-testi 3. ELISA-testi 4. PCR-testi 5. FISH-testi 6. Rasvahappoprofilointi (FAP) 7. Kantojen määrittämismenetelmät 7.1 Biovarin määrittäminen 7.2 Genomien sormenjäljet 7.3 PCR-menetelmät C) Varmistustesti Lisäys 1 Optimointi- ja validointimenettelyissä mukana olevat laboratoriot Lisäys 2 Ravintoalusta R. solanacearum -kasvintuhoojan eristämistä ja viljelyä varten Lisäys 3 A) Kaupallisesti saatavilla olevat standardoidut kontrollimateriaalit B) Kontrollien valmistaminen Lisäys 4 Puskuriliuokset testimenettelyihin Lisäys 5 Kontaminaatioasteen määritys IF- ja FISH-testeillä Lisäys 6 Validoidut PCR-menettelyt ja reagenssit Lisäys 7 Validoidut reagenssit FISH-testiä varten Lisäys 8 Tomaatin ja munakoison viljelyolosuhteet Viitteet

YLEISET PERIAATTEET

Lisäyksissä esitetään optimaaliset testausprotokollat eri menetelmien ja validoitujen reagenssien osalta sekä testi- ja kontrollimateriaalien valmistusta koskevat tiedot. Lisäyksessä 1 on luettelo niistä laboratorioista, jotka olivat mukana testausprotokollien optimoinnissa ja validoinnissa.

Koska menettelyt liittyvät karanteenin alaisten organismien toteamiseen ja niissä käytetään R. solanacearum -kasvintuhoojan elinkykyisiä viljelmiä kontrollimateriaaleina, menettelyt on ehdottomasti toteutettava sopivissa karanteenioloissa siten, että käytössä on riittävät jätteenhävitysmahdollisuudet ja toiminta tapahtuu kasvikaranteenista vastaavien viranomaisten myöntämän luvan mukaisissa olosuhteissa.

Testausparametreilla on varmistettava R. solanacearum -kasvintuhoojan määrien johdonmukainen ja toistettavissa oleva toteaminen valituilla menetelmillä asetetuilla kynnysarvoilla.

Positiivisten kontrollinäytteiden huolellinen valmistaminen on ehdottoman tärkeää.

Vaadittujen kynnysarvojen mukainen testaus edellyttää myös laitteiden asianmukaisia asetuksia sekä niiden asianmukaista huoltoa ja vakaamista, reagenssien huolellista käsittelyä ja säilyttämistä sekä kaikkien sellaisten toimenpiteiden toteuttamista, joilla ehkäistään näytteiden välinen kontaminaatio, esim. positiivisten kontrollinäytteiden pitämistä erillään testinäytteistä. Laadunvalvontastandardeja on sovellettava hallinnollisten ja muiden virheiden välttämiseksi, erityisesti pakkausmerkintöjen ja dokumentaation osalta.

Direktiivin 98/57/EY 4 artiklan 2 kohdassa tarkoitettu epäilty esiintyminen tarkoittaa positiivista tulosta näytteelle jäljempänä olevissa vuokaavioissa esitetyissä määritys- tai seulontatesteissä. Jos ensimmäisen seulontatestin (IF- tai PCR/FISH-testi, selektiivinen eristäminen) tulos on positiivinen, se on vahvistettava toisella seulontatestillä, joka perustuu muihin biologisiin periaatteisiin.

Jos ensimmäisestä seulontatestistä saadaan positiivinen tulos, näytteen epäillään olevan bakteerin saastuttama ja sille on tehtävä toinen seulontatesti. Jos toisesta seulontatestistä saadaan positiivinen tulos, epäilys varmistuu (epäilty esiintyminen) ja tutkimusmenetelmän mukaista testausta on jatkettava. Jos toisesta seulontatestistä saadaan negatiivinen tulos, näytteen katsotaan olevan puhdas R. solanacearum -bakteerista.

Direktiivin 98/57/EY 5 artiklan 1 kohdassa tarkoitettu varmistettu esiintyminen tarkoittaa puhtaan R. solanacearum -viljelmän eristämistä ja tunnistamista siten, että sen patogeenisyys on varmistettu.

I JAKSO

TUTKIMUSMENETELMÄN SOVELTAMINEN

1. Toteamismenetelmä tumman rengasmädän ja bakteerilakastumistaudin (Ralstonia solanacearum) määrittämiseksi perunan mukuloista ja perunasta, tomaatista tai muusta isäntäkasvista, jossa on tumman rengasmädän tai bakteerilakastumistaudin oireita

Testimenetelmä on tarkoitettu perunan mukuloille, joiden oireet ovat tyypillisiä tummalle rengasmädälle tai johtosolukon lakastumistaudille taikka antavat aihetta epäillä näitä tauteja. Siihen kuuluu pikaseulontatesti, taudinaiheuttajan eristäminen infektoituneesta johtosolukosta (selektiiviselle) alustalle ja, jos tulos on positiivinen, viljelmän tunnistaminen Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojaksi.

2. Menetelmä Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista mukulanäytteistä

Periaate

Menettely on tarkoitettu piilevien tartuntojen toteamiseen perunan mukuloissa. Jos erilaisiin biologisiin periaatteisiin perustuvista vähintään kahdesta seulontakokeesta saadaan positiivinen tutkimustulos, 3 sitä täydennetään eristämällä taudinaiheuttaja. Jos eristyskokeen tuloksena saadaan tyypillisiä pesäkkeitä, vuorossa on puhtaan viljelmän varmistaminen R. solanacearum -kasvintuhoojaksi. Positiivinen tulos ainoastaan yhdestä seulontatestistä ei riitä pitämään näytettä epäilyttävänä.

Seulonta- ja eristystesteillä on saatava toteamisrajaksi 103–104 solua perunauutteen yhtä millilitraa kohden; ne sisältyvät positiivisina kontrollivälineinä kuhunkin testisarjaan.

3. Menetelmä Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista perunoista, tomaateista tai muista isäntäkasveista

II JAKSO

YKSITYISKOHTAISET MENETELMÄT RALSTONIA SOLANACEARUM -KASVINTUHOOJAN TOTEAMISEKSI PERUNAN MUKULOISTA JA PERUNASTA, TOMAATISTA TAI MUUSTA ISÄNTÄKASVISTA, JOSSA ON TUMMAN RENGASMÄDÄN TAI BAKTEERILAKASTUMISTAUDIN OIREITA

1. Oireet (ks. www-sivusto osoitteessa: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1 Oireet perunassa

Perunakasvi. Tartunnan varhaisvaihe pellolla voidaan tunnistaa lehdistä, jotka nuutuvat kasvin tyvestä alkaen päivällä lämpimällä säällä ja toipuvat yöllä. Nuutumisen alkuvaiheessa lehdet pysyvät vihreinä, mutta myöhemmin ne kellastuvat ja niihin kehittyy ruskea nekroosi. Myös epinastiaa esiintyy. Yhden verson tai koko kasvin nuutuminen jää nopeasti pysyväksi ja johtaa kasvin kollapsiin ja kuolemaan. Nuutuneiden kasvien varsien johtosolukko muuttuu poikkileikkauksesta tarkasteltuna tavallisesti ruskeaksi, ja maitomaista bakteerimätää valuu leikatulta pinnalta tai sitä voidaan pusertaa ulos. Kun leikattu varsi asetetaan veteen, johtosolukkokimpuista valuu limaa.

Perunan mukula. Perunan mukulat leikataan halki maavarren kiinnityskohdan läheltä tai poikkisuuntaan kiinnityskohdan yli. Tartunnan varhaisvaihe ilmenee lasimaisena, keltaisesta vaaleanruskeaan vaihtelevana värityksenä johtosolukkorenkaassa, josta muutaman minuutin kuluttua pursuaa itsestään vaaleankeltaista bakteerimätää. Myöhemmin johtojänteiden väritys muuttuu selvemmin ruskeaksi ja nekroosi voi laajeta tylppysolukkoon. Myöhemmässä vaiheessa tartunta leviää maavarren kiinnityskohdasta ja mukulan silmistä, ja näistä vuotaa bakteerimätää, johon kiinnittyy maahiukkasia. Kuoreen voi tulla punaruskeita hieman painuneita vioittumia, kun sisäiset johtosolukot painuvat kasaan. Taudin myöhemmissä vaiheissa esiintyy yleisesti sekundaarista sieni- ja bakteerimätää.

1.2 Oireet tomaatissa

Tomaattikasvi. Ensimmäinen näkyvä oire on nuorimpien lehtien velttous. Taudinaiheuttajalle suotuisissa ympäristöolosuhteissa (maaperän lämpötila noin 25 °C, kyllästyskosteus) on seurauksena muutaman päivän kuluessa epinastia ja kasvin yhden puolen tai koko kasvin nuutuminen, mikä johtaa koko kasvin kollapsiin. Vähemmän suotuisissa olosuhteissa (maaperän lämpötila alle 21 °C) nuutumista esiintyy vähemmän, mutta varteen saattaa kehittyä suuri määrä versojuuria. Varressa voidaan havaita varren alaosasta lähteviä vettyneitä juovia, jotka ovat osoitus johtojärjestelmän nekroosista. Jos varsi leikataan poikittaissuunnassa, varren värittyneistä ruskeista johtosolukoista tihkuu valkoista tai kellertävää bakteerimätää.

1.3 Oireet muissa isäntäkasveissa

Solanum dulcamara- ja S. nigrum -kasvit. Luonnonoloissa nuutumista esiintyy äärimmäisen harvoin näissä isäntinä toimivissa rikkakasveissa, ellei maaperän lämpötila ylitä 25 °C tai elleivät inokulaattitasot ole äärimmäisen korkeita (esim. S. nigrum, joka kasvaa saastuneiden peruna- tai tomaattikasvien vierellä). Jos nuutumista esiintyy, oireet vastaavat tomaatin yhteydessä kuvattuja oireita. Nuutumattomissa S. dulcamara -kasveissa, joiden varret ja juuret kasvavat vedessä, voi ilmetä johtosolukon sisäistä vaaleanruskeaa värinmuutosta varren alaosan tai varren vedenalaisen osan poikkileikkauksessa. Vaikka nuutumisoireita ei olisikaan, bakteereja voi tihkua johtosolukosta tai ne voivat muodostaa limanauhoja, jos leikattu varsi asetetaan pystysuoraan veteen.

2. Pikaseulontatestit

Pikaseulontatestit helpottavat alustavaa taudinmääritystä, mutta ne eivät ole välttämättömiä. Käytetään yhtä tai useampaa seuraavista validoiduista testeistä:

2.1 Valutuskoe

(Ks. VI jakson A kohdan 1 alakohta)

2.2 Poly-β-hydroksibutyraattirakeiden (PHB) toteaminen

Tyypilliset PHB-rakeet R. solanacearum -bakteerin soluissa saadaan näkyviin värjäämällä saastuneesta solukosta otetusta bakteerimädästä lämpökäsittelyllä kiinnitetyt preparaatit niilinsinisellä A tai sudaninmustalla (ks. VI jakson A kohdan 2 alakohta).

2.3 Serologiset agglutinaatiokokeet

(Ks. VI jakson A kohdan 3 alakohta)

2.4 Muut testit

Muita soveltuvia pikaseulontatestejä ovat IF-testi (ks. VI jakson A kohdan 5 alakohta), FISH-testi (ks. VI jakson A kohdan 7 alakohta), ELISA-testit (ks. VI jakson A kohdan 8 alakohta) ja PCR-testit (ks. VI jakson A kohdan 6 alakohta).

3. Eristämismenettely

a) Otetaan bakteerilimaa tai värittyneen solukon pala mukulan johtosolukkorenkaasta tai perunan tai tomaatin tai muun nuutuvan isäntäkasvin varren johtojänteistä. Suspendoidaan pieneen määrään steriiliä tislattua vettä tai 50 mM fosfaattipuskuriin (lisäys 4). Jätetään liuos 5–10 minuutiksi.

b) Valmistetaan suspensiosta kymmenkertaisten laimennosten sarja.

c) Siirretään 50–100 µl suspensiota ja laimennoksia tavalliselle ravintoalustalle (NA, YPGA tai SPA; ks. lisäys 2) ja/tai Kelmanin tetratsoliumalustalle (lisäys 2) ja/tai validoidulle selektiiviselle alustalle (esim. SMSA; ks. lisäys 2). Levitetään tai sivellään maljalle tarkoituksenmukaista laimennussarjatekniikkaa käyttäen. Tarvittaessa valmistetaan erillisiä maljoja, joissa on laimennettua R. solanacearum biovaria 2 -solususpensioviljelmää positiivisena kontrollina.

d) Inkuboidaan maljoja 2–6 päivän ajan 28 °C:ssa. — Tavallisella ravintoalustalla elinvoimaiset R. solanacearum -bakteerin isolaatit kehittyvät kermanvalkoisiksi, litteiksi, epäsäännöllisen muotoisiksi ja juokseviksi pesäkkeiksi, jotka ovat usein keskeltä tyypillisesti kierteisiä. Tautia aiheuttamattomat R. solanacearum -bakteerin muodot kehittävät pieniä, pyöreitä, voimaisia ja kokonaisuudessaan kermanvalkoisia pesäkkeitä, jotka eivät ole juoksevia. — Kelmanin tetratsolium- ja SMSA-alustalla kierteet ovat väriltään verenpunaisia. Tautia aiheuttamattomat Ralstonia solanacearum -bakteerin muodot kehittävät pieniä, pyöreitä, voimaisia ja kokonaisuudessaan syvänpunaisia pesäkkeitä, jotka eivät juoksevia.

4. R. solanacearum -kasvintuhoojan tunnistustestit

Testit, joilla vahvistetaan oletettujen R. solanacearum -isolaattien tunnistus, esitetään VI jakson B kohdassa.

III JAKSO

1. Yksityiskohtaiset menetelmät Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista mukulanäytteistä

1.1 Näytteiden valmistelu

Huomautus:

— Standardinäytekoko on 200 mukulaa testiä kohden. Laajempi näytteenotto edellyttää useampia testejä tämänkokoisille näytteille. Jos näytteessä on enemmän kuin 200 mukulaa, tulokset saattavat jäädä saamatta tai niitä on vaikea tulkita. Menettelyä voidaan kuitenkin hyvin käyttää alle 200 mukulan näytteisiin, jos 200:aa mukulaa ei ole käytettävissä.

— Kaikkien jäljempänä kuvattujen toteamismenetelmien validointi perustuu 200 mukulan suuruisen näytteen testaamiseen.

— Jäljempänä kuvattua perunauutetta voidaan käyttää myös perunan vaaleaa rengasmätää aiheuttavan Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus -bakteerin toteamiseen.

Näytteiden valmistamista edeltävät vapaavalintaiset esikäsittelyt:

a) Inkuboidaan näytteitä 25–30 °C:ssa enintään 2 viikon ajan ennen testausta mahdollisten R. solanacearum -populaatioiden lisääntymisen helpottamiseksi.

b) Pestään mukulat. Kunkin näytteen jälkeen käytetään tarkoituksenmukaisia desinfiointiaineita (tehtäessä PCR-testi on käytettävä klooriyhdisteitä patogeenisen DNA:n poistamiseksi) ja puhdistusaineita. Ilmakuivataan mukulat. Pesumenettelystä on erityistä hyötyä (vaikkakaan sitä ei vaadita), jos näytteissä on paljon ylimääräistä multaa ja jos PCR-testi tai suora eristysmenettely toteutetaan.

1.1.1 Poistetaan puhtaalla ja desinfioidulla leikkausveitsellä tai vihannesveitsellä kuori mukulan napapäästä siten, että johtosolukot tulevat näkyviin. Leikataan varovasti pieni kartionmuotoinen kappale johtosolukosta kunkin mukulan napapäästä ja yritetään pitää muun solukon kuin johtosolukon osuus mahdollisimman pienenä (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Huomautus: Laitetaan sivuun jokainen (pilaantunut) mukula, jossa on tummaksi rengasmädäksi epäiltyjä oireita, ja testataan yksittäin. Jos napapään irrottamisen aikana havaitaan tummaksi rengasmädäksi epäiltyjä oireita, mukula olisi tutkittava silmämääräisesti ja lohkaistava läheltä napapäätä. Lohkaistuja mukuloita, joissa on epäilyttäviä oireita, olisi säilytettävä vähintään 2 vuorokautta huoneenlämmössä korkkiutumisen mahdollistamiseksi, minkä jälkeen mukula säilytetään jäähdytettynä (4–10 °C:ssa) asianmukaisissa karanteenioloissa. Kaikki mukulat (myös ne, joissa on epäilyttäviä oireita) olisi säilytettävä liitteen III mukaisesti.

1.1.2 Kerätään napapääkappaleet käyttämättömiin kertakäyttöisiin säilytysastioihin, jotka voidaan sulkea ja/tai sinetöidä (jos astioita käytetään uudelleen, ne olisi puhdistettava perusteellisesti ja desinfioitava klooriyhdisteillä). Kappaleet olisi mieluiten käsiteltävä viipymättä. Jos tämä ei ole mahdollista, niitä voidaan säilyttää astiassa – lisäämättä puskuriliuosta – jäähdytettyinä enintään 72 tunnin ajan tai huoneenlämmössä enintään 24 tunnin ajan. Käsitellään napapääkappaleet yhtä seuraavista menettelyistä noudattaen: joko a) peitetään kappaleet riittävällä määrällä (noin 40 ml) uuttopuskuria (lisäys 4) ja sekoitetaan tasoravistimella (50–100 rpm:n kierrosnopeudella) neljän tunnin ajan alle 24 °C:ssa tai 16–24 tunnin ajan jäähdytettyinä; tai b) homogenoidaan kappaleet riittävällä määrällä (noin 40 ml) uuttopuskuria (lisäys 4) joko sekoittimella (esim. Waring tai Ultra Turrax) tai murskaamalla suljetussa kertakäyttöisessä liotepussissa (esim. luja Stomacher- tai Bioreba-polyeteenipussi, jonka mitat ovat 150 mm × 250 mm, säteilysteriili) käyttäen kumivasaraa tai sopivaa jauhamisvälinettä (esim. Homex). Huomautus: Näytteiden ristikontaminaation riski on suuri silloin, kun näytteet homogenoidaan sekoittimella. On ryhdyttävä varotoimiin roiskumisen tai läikkymisen välttämiseksi uuttamisprosessin aikana. On varmistettava, että jokaista näytettä varten käytetään vasta steriloituja sekoittimen lapoja ja astioita. Jos aiotaan tehdä PCR-testi, on vältettävä DNA:n siirtyminen astioihin tai jauhamislaitteisiin. Tehtäessä PCR-testi on suositeltavaa suorittaa murskaaminen kertakäyttöisissä pusseissa ja käyttää kertakäyttöisiä putkia.

1.1.3 Dekantoidaan supernatantti. Jos liuos on liian sameaa, sitä kirkastetaan joko hitaasti sentrifugoiden (enintään 180 g kymmenen minuutin ajan 4–10 °C:n lämpötilassa) tai suodatetaan liuos (40–100 µm:n huokoskoon vakuumisuodatusjärjestelmällä) ja pestään suodatin vielä uuttopuskurilla (10 ml).

1.1.4 Konsentroidaan bakteerifraktio sentrifugoimalla 7 000 g 15 minuutin ajan (tai 10 000 g 10 minuutin ajan) 4–10 °C:n lämpötilassa ja poistetaan supernatantti sakkaa sekoittamatta.

1.1.5 Suspendoidaan sakka uudelleen 1,5 ml:aan sakkapuskuria (lisäys 4). Käytetään 500 µl:aa R. solanacearum -bakteerin testaamiseksi, 500 µl:aa Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus -bakteerin testaamiseksi ja 500 µl:aa vertailutarkoituksiin. Lisätään 10–25 % (v/v) steriiliä glyserolia 500 µl:aan vertailuarvona olevaan määräosaan ja jäljellä olevaan testimääräosaan, sekoitetaan ja varastoidaan 16–24 °C:n lämpötilaan (viikoiksi) tai 68–86 °C:n lämpötilaan (kuukausiksi). Säilytetään testimääräosat 4–10 °C:ssa testauksen ajan. Toistuva jäädytys ja sulatus ei ole suositeltavaa. Jos uutetta joudutaan kuljettamaan, toimitus on tehtävä kylmälaukussa 24–48 tunnin kuluessa.

1.1.6 Saastunnan välttämiseksi on ehdottoman tärkeää käsitellä näytteet ja R. solanacearum -positiiviset vertailu-, kontrolli- ja valvontanäytteet toisistaan erillään. Tämä koskee sekä immunofluoresenssitestiä että kaikkia muitakin testejä.

1.2 Testaus

Ks. vuokaavio ja testien kuvaus sekä optimoidut protokollat niitä käsittelevissä lisäyksissä:

Eristäminen selektiivisellä alustalla (ks. VI jakson A kohdan 4 alakohta)

IF-testi (VI jakson A kohdan 5 alakohta)

PCR-testi (VI jakson A kohdan 6 alakohta)

FISH-testi (VI jakson A kohdan 7 alakohta)

ELISA-testi (VI jakson A kohdan 8 alakohta)

Biologinen määritys (VI jakson A kohdan 9 alakohta).

2. Yksityiskohtaiset menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista perunoista, tomaateista tai muista isäntäkasveista

2.1 Näytteiden valmistelu

Huomautus: Piilevien R. solanacearum -kantojen toteamiseksi on suositeltavaa käyttää kokoomanäytteitä. Menettelyä voidaan vaivatta käyttää jopa 200:n varresta otetun osan muodostamiin kokoomanäytteisiin. Jos tehdään tutkimuksia, niiden olisi perustuttava tilastollisesti edustavaan otokseen tutkittavana olevasta kasvipopulaatiosta.

2.1.1 Kerätään 1–2 cm:n kokoiset varren palaset suljettavaan steriiliin astiaan seuraavien näytteenottomenetelmien mukaisesti: Tomaatin taimet taimitarhalla: Poistetaan desinfioiduilla leikkausveitsellä 1 cm:n palanen kunkin varren alaosasta juuri maanpinnan yläpuolelta. Pellolla tai kasvihuoneessa kasvatetut tomaattikasvit: Puhtaalla ja desinfioidulla veitsellä poistetaan kustakin kasvista alin sivuverso leikkaamalla juuri verson ja kasvin päävarren liitoskohdan yläpuolelta. Poistetaan alin 1 cm:n osa kustakin sivuversosta. Muut isäntäkasvit: Poistetaan desinfioiduilla leikkausveitsellä tai oksasaksilla 1 cm:n palanen kunkin varren alaosasta juuri maanpinnan yläpuolelta. Jos kyseessä on S. dulcamara tai muu vedessä kasvava isäntäkasvi, poistetaan 1–2 cm:n osia vedenalaisesta varresta tai rönsystä, jossa on vesijuuria. Kun näytteitä otetaan jostakin tietystä paikasta, on suositeltavaa testata tilastollisesti edustava näyte, jossa on vähintään 10 potentiaalista isäntärikkakasvia kustakin näytteenottopaikasta. Taudinaiheuttaja voidaan luotettavimmin havaita loppukeväästä, kesällä ja syksyllä, vaikka luonnossa voidaankin havaita tartuntoja läpi vuoden vesistöissä kasvavissa monivuotisissa Solanum dulcamara -kasveissa. Tunnettuja isäntäkasveja ovat ylivuotiset perunakasvit, Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium ja muut Solanaceae-heimon jäsenet. Muita isäntäkasveja ovat Pelargonium spp. ja Portulaca oleracea. Muita eurooppalaisia rikkakasvilajikkeita, joiden juurissa ja/tai ritsosfäärissä (juurten ympäristössä) voidaan tietyissä ympäristöoloissa tavata R. solanacearum biovarin 2 rodun 3 populaatioita, ovat Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra ja Urtica dioica. Huomautus: Kasveja voidaan tässä vaiheessa tarkastella silmämääräisesti sisäisten oireiden varalta (johtosolukon värjäytyminen tai bakteerimätä. Laitetaan sivuun kaikki varren osat, joissa on oireita, ja testataan erikseen (ks. II jakso).

2.1.2 Desinfioidaan varren osat pikaisesti 70-prosenttisella etanolilla ja kuivataan välittömästi paperipyyhkeeseen taputtamalla. Käsitellään tämän jälkeen varren palaset yhtä seuraavista menettelyistä noudattaen: joko a) peitetään kappaleet riittävällä määrällä (noin 40 ml) uuttopuskuria (lisäys 4) ja sekoitetaan tasoravistimella (50–100 rpm:n kierrosnopeudella) neljän tunnin ajan alle 24 °C:ssa tai 16–24 tunnin ajan jäähdytettyinä; tai b) käsitellään välittömästi jauhamalla palaset lujassa pussissa (esim. Stomacher tai Bioreba) siten, että siinä on sopiva määrä uuttopuskuria (lisäys 4), käyttäen kumivasaraa tai sopivaa jauhamisvälinettä (esim. Homex). Jos tämä ei ole mahdollista, varastoidaan varren palaset jäähdytettyinä enintään 72 tunnin ajan tai huoneenlämmössä enintään 24 tunnin ajan.

2.1.3 Dekantoidaan supernatantti, kun seos on saanut seistä 15 minuuttia.

2.1.4 Uutteen kirkastaminen lisää tai bakteerifraktion konsentrointi ei yleensä ole tarpeen mutta voidaan tehdä suodattamalla ja/tai sentrifugoimalla, kuten III jakson 1.1.3–1.1.5 kohdassa kuvataan.

2.1.5 Jaetaan laimentamaton tai konsentroitu näyteuute kahteen yhtä suureen osaan. Pidetään toista osaa 4–10 °C:n lämpötilassa testauksen ajan ja varastoidaan toinen puolisko 10–25 %:ssa (v/v) steriilissä glyserolissa 16–24 °C:n lämpötilaan (viikoiksi) tai 68–86 °C:n lämpötilaan (kuukaudeksi), mikäli lisätestaus on tarpeen.

2.2 Testaus

Ks. vuokaavio ja testien kuvaus sekä optimoidut protokollat niitä käsittelevissä lisäyksissä:

Eristäminen selektiivisellä alustalla (ks. VI jakson A kohdan 4 alakohta)

IF-testi (VI jakson A kohdan 5 alakohta)

PCR-testi (VI jakson A kohdan 6 alakohta)

FISH-testi (VI jakson A kohdan 7 alakohta)

ELISA-testi (VI jakson A kohdan 8 alakohta)

Biologinen määritys (VI jakson A kohdan 9 alakohta).

IV JAKSO

1. Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi vedestä

2. Menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi vedestä

Periaate

Tässä jaksossa kuvattavaa validoitua toteamismenettelyä sovelletaan taudinaiheuttajan havaitsemiseksi pintavesinäytteistä, ja sitä voidaan soveltaa myös perunanjalostuksessa syntyvien tai muiden jätevesien näytteiden testaamiseen. On kuitenkin huomattava, että odotettu havaitsemisherkkyys vaihtelee substraatin mukaisesti. Eristystestin herkkyyteen vaikuttavat kilpailevien saprofyyttisten bakteerien populaatiot, jotka ovat yleensä huomattavasti suurempia perunanjalostuksen jätevesissä ja muissa jätevesissä kuin pintavedessä. Vaikka jäljempänä kuvattavalla menettelyllä odotetaan havaittavan niinkin pieniä pitoisuuksia kuin 103 solua litraa kohden, havaitsemisherkkyys on todennäköisesti merkittävästi pienempi, kun kyseessä ovat perunanjalostuksen jätevedet tai muut jätevedet. Tämän vuoksi suositellaan, että jätevedet testataan mahdollisten puhdistuskäsittelyiden (esim. sedimentointi tai suodatus) jälkeen, jolloin saprofyyttisten bakteereiden populaatiot ovat pienempiä. Testimenettelyn herkkyyteen liittyvät rajoitukset on pidettävä mielessä, kun arvioidaan mahdollisesti saatujen negatiivisten tulosten luotettavuutta. Vaikka tätä menettelyä on onnistuneesti käytetty tutkimustyössä, jolla on pyritty määrittämään taudinaiheuttajan esiintyminen pintavedessä, menettelyn rajoitukset on tunnettava, jos sitä käytetään vastaaviin tutkimuksiin, jotka koskevat perunanjalostuksessa syntyviä jätevesiä tai muita jätevesiä.

2.1 Näytteiden valmistelu

Huomautus:

— R. solanacearum havaitaan pintavedestä luotettavimmin loppukeväästä, kesällä tai syksyllä, kun veden lämpötila on yli 15 °C.

— Toistamalla näytteenotto määritetyistä näytteenottopaikoista eri aikoina edellä kuvatun kauden aikana voidaan vähentää ilmastollisten vaihteluiden vaikutuksia ja näin parantaa havaitsemisluotettavuutta.

— Runsaiden sateiden ja vesistön maantieteellisen muodon vaikutus on otettava huomioon, jotta voidaan välttää laajan laimentumisen vaikutukset, jotka voisivat kätkeä taudinaiheuttajan esiintymisen.

— Pintavesinäytteitä otetaan isäntäkasvien läheisyydestä, jos näitä kasveja esiintyy.

2.1.1 Vesinäytteet kerätään valikoiduista näytteenottopaikoista täyttämällä kertakäyttöiset steriilit putket tai pullot yli 30 cm syvyydessä ja enintään 2 m etäisyydellä rannasta, jos mahdollista. Jalostus- ja jätevesinäytteet kerätään jäteveden laskupaikalta. Suositeltava näytekoko on enintään 500 ml näytteenottopaikkaa kohden. Jos halutaan käyttää pienempiä näytteitä, on suositeltavaa ottaa näytteitä vähintään kolmesti kustakin näytteenottopaikasta ja siten, että kukin näyte koostuu kahdesta samanlaisesta vähintään 30 ml:n osanäytteestä. Intensiivistä tutkimustyötä varten valitaan vähintään 3 näytteenottopaikkaa 3 vesistökilometriä kohden ja varmistetaan, että myös vesistöön laskevista sivujoista ja -puroista otetaan näytteet.

2.1.2 Näytteet kuljetetaan pimeässä ja viileässä (4–10 °C) ja testataan 24 tunnin kuluessa.

2.1.3 Bakteerifraktio voidaan tarvittaessa konsentroida jollakin seuraavista menetelmistä: a) Sentrifugoidaan 30–50 ml:n osanäytteitä 10 000 g:ssa 10 minuutin ajan (tai 7 000 g:ssa 15 minuutin ajan) mieluiten 4–10 °C:ssa, poistetaan supernatantti ja suspendoidaan pelletti uudelleen 1 ml:aan pellettipuskuria (lisäys 4). b) Kalvosuodatus (vähimmäishuokoskoko 0,45 µm), minkä jälkeen pestään suodatin 5–10 ml:ssa pellettipuskuria ja säilytetään pesuliuos. Tämä menetelmä soveltuu suurille vesimäärille, jotka sisältävät vähäisiä määriä saprofyyttejä. Konsentrointia ei yleensä suositella perunan jalostuksessa syntyvän jäteveden tai muun jäteveden näytteille, koska kilpailevien saprofyyttisten bakteereiden populaatioiden kasvu estää Ralstonia solanacearum -bakteerien havaitsemisen.

2.2 Testaus

Ks. vuokaavio ja testien kuvaus niitä käsittelevissä lisäyksissä.

V JAKSO

1. Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi maaperästä

2. Menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi maaperästä

Periaatteet

Tässä jaksossa kuvattavaa validoitua toteamismenettelyä sovelletaan taudinaiheuttajan havaitsemiseksi maaperänäytteissä, mutta sitä voidaan soveltaa myös perunan jalostuksessa syntyvän kiinteän jätteen tai viemärilietteen näytteiden testaamiseen. On kuitenkin huomattava, että nämä menetelmät eivät ole riittävän herkkiä sen takaamiseksi, että sillä havaittaisiin pienet ja/tai epätasaisesti jakautuneet Ralstonia solanacearum -populaatiot, joita voi esiintyä näistä substraateista saaduissa luonnollisesti saastuneissa näytteissä.

Tämän testimenettelyn herkkyyden asettamat rajoitukset olisi otettava huomioon, kun arvioidaan mahdollisesti saatujen negatiivisten tulosten luotettavuutta sekä silloin kun menettelyä käytetään tutkimuksissa, joilla pyritään määrittämään taudinaiheuttajan esiintyminen maaperässä tai lietteessä. Luotettavin testi taudinaiheuttajan toteamiseksi maaperästä on se, että istutetaan taudille altis kasvi ja seurataan, saako se tartunnan. Tälläkään menetelmällä ei tosin havaita alhaisia saastumistasoja.

2.1 Näytteiden valmistelu

2.1.1 Näytteenotto peltomaasta tehdään sukkulamatojen varalta tehtävässä näytteenotossa käytettävien yleisten periaatteiden mukaisesti. Kerätään 0,5–1 kg maata näytettä kohden 10–20 cm syvyydeltä siten, että näytteenottopaikkoja on 60 jokaista 0,3 ha kohden (tai ruudukosta, joka on 7 × 7 m). Jos taudinaiheuttajaa epäillään esiintyvän, keruupisteiden määrä nostetaan 120:een 0,3 ha kohden. Näytteet säilytettään 12–15 °C:ssa ennen testausta. Näytteet perunoiden jalostuksen jätelietteestä ja viemärilietteestä otetaan keräämällä yhteensä 1 kg paikoista, jotka edustavat tutkittavan lietteen kokonaismäärää. Näytteet sekoitetaan hyvin ennen testaamista.

2.1.2 Hajotetaan maaperästä tai lietteestä otetut 10–25 g:n osanäytteet tasoravistimella (250 rpm) 60–150 ml:aan uuttopuskuria (lisäys 4) enintään 2 tunnin ajan. Dispersiota voidaan tarvittaessa auttaa lisäämällä 0,02 % steriiliä Tween-20:tä ja 10–20 g steriiliä soraa.

2.1.3 Suspensio pidetään 4 °C:ssa testauksen aikana.

2.2 Testaus

Ks. vuokaavio ja testien kuvaus niitä käsittelevissä lisäyksissä.

VI JAKSO

OPTIMOIDUT PROTOKOLLAT R. SOLANACEARUM -KASVINTUHOOJAN TOTEAMISEKSI JA TUNNISTAMISEKSI

A) Määritys- ja toteamistestit

1. Valutuskoe

R. solanacearum -bakteerin esiintyminen nuutuvissa perunan, tomaatin tai muun isäntäkasvin varsissa voidaan osoittaa seuraavan yksinkertaisen ennakoivan testin avulla: Leikataan varsi aivan maanpinnan yläpuolelta. Suspendoidaan leikkuupinta putkelliseen puhdasta vettä. Seurataan, alkaako leikatuista johtosolukimpuista muutaman minuutin kuluttua spontaanisti valua bakteerilimarihmoja.

2. Poly-β-hydroksibutyraattirakeiden (PHB) toteaminen

1. Valmistetaan mikroskooppilevylle preparaatti saastuneesta solukosta saadusta bakteerimädästä tai 48 tunnin viljelmästä YPGA- tai SPA-alustalla (lisäys 2).

2. Valmistetaan positiiviset kontrollipreparaatit R. solanacearum -bakteerin biovarin 2 kannasta ja negatiivinen kontrollipreparaatti tunnetusti PHB-negatiivisesta lajista, jos tämä katsotaan hyödylliseksi.

3. Annetaan kuivua ja kuljetetaan kunkin levyn pohjaa nopeasti liekin yllä preparaattien kiinnittämiseksi.

4. Värjätään preparaatti joko niilinsinisellä tai sudaninmustalla ja tutkitaan sitä mikroskoopilla seuraavasti:

Niilinsinisellä tehtävä testi

a) Peitetään kukin preparaatti niilinsinisen A 1-prosenttisella vesiliuoksella. Inkuboidaan 10 minuuttia 55 °C:ssa.

b) Valutetaan värjäävä liuos pois. Pestään nopeasti vedellä hiljaa valuvan hanan alla. Poistetaan ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä.

c) Peitetään preparaatti 8-prosenttisella etikkahapon vesiliuoksella ja annetaan inkuboitua 1 minuutin ajan laboratoriolämpötilassa.

d) Pestään nopeasti vedellä hiljaa valuvan hanan alla. Poistetaan ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä.

e) Kostutetaan uudelleen pisaralla vettä. Asetetaan peitelasi.

f) Tutkitaan värjäytynyttä preparaattia mikroskoopilla, joka on varustettu epifluoresoivalla valonlähteellä, aallonpituudella 450 nm öljy- tai vesi-immersio-objektiivin 600–1 000-kertaisella suurennoksella.

g) Seurataan, esiintyykö PHB-rakeiden kirkkaan oranssia fluoresenssia. Tarkastellaan myös tavanomaisessa valaistuksessa sen varmistamiseksi, että rakeet ovat solunsisäisiä ja että solujen morfologia on tyypillinen R. solanacearum -bakteerille.

Sudaninmustalla tehtävä testi

a) Peitetään kukin preparaatti sudaninmustan B 0,3-prosenttisella 70-prosenttisessa etanolissa olevalla liuoksella. Inkuboidaan 10 minuutin ajan laboratoriolämpötilassa.

b) Valutetaan värjäävä liuos pois. Pestään nopeasti vedellä hanan alla. Poistetaan ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä.

c) Kastetaan levyt pikaisesti ksyloliin. Taputellaan kuivaksi paperipyyhkeellä. Varoitus: Ksyloli on haitallinen aine. Tarvittaviin varotoimiin on ryhdyttävä. Työskennellään vetokaapissa.

d) Peitetään levyt 0,5-prosenttisella (w/v) safraniinin vesiliuoksella ja jätetään 10 sekunniksi laboratoriolämpötilaan. Varoitus: Safraniini on haitallinen tuote. Tarvittaviin varotoimiin on ryhdyttävä. Työskennellään vetokaapissa.

e) Pestään vedellä hiljaa valuvan hanan alla. Kuivataan paperipyyhkeellä ja asetetaan peitelasi.

f) Tutkitaan värjäytynyttä preparaattia valomikroskoopilla öljyimmersio-objektiivin 1 000-kertaisella suurennoksella.

g) R. solanacearum -bakteerin solujen PHB-rakeet värjäytyvät sinimustiksi ja soluseinät vaaleanpunaisiksi.

3. Serologiset agglutinaatiokokeet

Bakteerimädässä tai oireilevassa kudoksessa olevien R. solanacearum -solujen agglutinaatio voidaan havaita parhaiten käyttämällä validoituja vasta-aineita (ks. lisäys 3), jotka on leimattu soveltuvilla värimarkkereilla, kuten punaisilla Staphylococcus aureus -soluilla tai värillisillä lateksihiukkasilla. Jos käytetään kaupallista testisarjaa (ks. lisäys 3), on noudatettava valmistajan ohjeita. Muussa tapauksessa toimitaan seuraavan menettelyn mukaisesti:

a) Sekoitetaan leimatun vasta-aineen suspensiota ja bakteerimätää pisaroina (noin 5 µl kumpaakin) monisyvennyslevyjen syvennyksissä.

b) Valmistetaan positiivinen ja negatiivinen kontrolli käyttämällä R. solanacearum biovarin 2 suspensiota ja heterologista kantaa.

c) Positiivissa näytteissä voidaan havaita agglutinaatio, kun niitä on kevyesti sekoitettu 15 sekunnin ajan.

4. Eristäminen selektiivisellä alustalla

4.1 Valikoiva maljaus

Huomautus: Ennen kuin tätä menetelmää käytetään ensimmäisen kerran, on suoritettava alustavia testejä, jolla varmistetaan, että aiemmin negatiivisiksi testattuihin näyteuutteisiin lisätyt R. solanacearum -bakteerin pesäkkeitä muodostavat yksiköt (103–104/ml) voidaan todeta. Testi on voitava toistaa.

Käytetään asiamukaisesti validoitua selektiivistä alustaa, esim. SMSA:ta (sellaisena kuin se muutettuna Elphinstone et al., 1996; ks. lisäys 2).

R. solanacearum -bakteerin erottaminen muista alustalla mahdollisesti kehittyvistä bakteereista edellyttää huolellisuutta. R. solanacearum -pesäkkeet voivat lisäksi olla morfologialtaan epätyypillisiä, jos alustalla on liian suuri populaatio tai jos myös antagonistisia bakteereita esiintyy. Jos epäillään kilpailua tai antagonismia, näyte olisi testattava uudestaan eri testiä käyttäen.

Tämän menetelmän tunnistamisherkkyys on suurin, kun käytetään vasta valmistettuja näyteuutteita. Menetelmää voidaan kuitenkin käyttää myös silloin, kun uutteita on säilytetty glyserolissa 68–86 °C:ssa.

Positiivisiksi kontrolleiksi valmistetaan kymmenkertaiset laimennokset suspensiosta, jossa on 106 PMY/ml R. solanacearum -bakteerin virulenttia biovari 2 -kantaa (esim. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Mahdollisen kontaminaation välttämiseksi positiiviset kontrollit on valmistettava täysin erillään testinäytteistä.

Ennen kuin vasta valmistettua selektiivisen alustan erää käytetään rutiininäytteiden testaamiseen, olisi testattava sen soveltuvuus taudinaiheuttajan kasvattamiseen.

Testataan kontrollimateriaali samalla tavoin kuin näyte (näytteet).

4.1.1 Käytetään tarkoituksenmukaista laimennussarjatekniikkaa, jolla pyritään varmistamaan, että mahdolliset taustalla olevat saprofyyttiset pesäkkeitä muodostavat populaatiot laimentuvat pois. Levitetään levyä kohden 50–100 µl näyteuutetta ja kutakin laimennosta.

4.1.2 Inkuboidaan levyjä 28 °C:n lämpötilassa. Tarkastellaan levyjä 48 tunnin kuluttua ja tämän jälkeen päivittäin kuuden päivän ajan. Tyypilliset R. solanacearum -pesäkkeet SMSA-alustalla ovat maidonvalkoisia, litteitä, epäsäännöllisiä ja juoksevia, ja kolmen päivän inkubaation jälkeen niiden keskustaan kehittyy vaaleanpunaisesta verenpunaiseen vaihtelevaa väritystä, johon liittyy sisäinen raidoitus tai kierteet. (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Huomautus: Tällä alustalla muodostuu joskus epätyypillisiä R. solanacearum -pesäkkeitä. Nämä voivat olla pieniä, pyöreitä, täysin punaisia ja ei-juoksevia tai ainoastaan osittain juoksevia. Tämän vuoksi niitä on vaikeaa erottaa saprofyyttisista pesäkkeitä muodostavista bakteereista.

4.1.3 Puhdistetaan oletetut R. solanacearum -pesäkkeet sen jälkeen, kun ne on sivelty tai laimennettu tavanomaiselle ravintoalustalle eristettyjen pesäkkeiden saamiseksi (ks. lisäys 2).

4.1.4 Viljelmiä säilytetään lyhyen aikaa steriilissä vedessä (pH 6–8, klooriton) huoneenlämmössä ja pimeässä tai pidemmän aikaa soveltuvassa kylmäsuojaavassa alustassa 68–86 °C:ssa tai ne lyofilisoidaan.

4.1.5 Tunnistetaan oletetut viljelmät (ks. VI jakson B kohta) ja tehdään patogeenisyystesti (ks. VI jakson C kohta).

Laimennussarjatesti on negatiivinen, jos yhtään pesäkettä ei ole havaittu kuuden päivän jälkeen tai jos yhtään R. solanacearum -bakteerille tyypillistä pesäkettä ei löydetä edellyttäen, että ei epäillä muiden bakteerien kilpailevaa tai estävää vaikutusta ja että R. solanacearum -bakteerin tyypillisiä pesäkkeitä löytyy positiivisesta kontrollista. Laimennussarjatesti on positiivinen, jos oletettuja R. solanacearum -bakteerin pesäkkeitä eristetään.

4.2 Rikastusmenettely

Käytetään validoitua rikastusalustaa kuten muutettua Wilbrinkin lientä (ks. lisäys 2).

Tällä menettelyllä voidaan valikoivasti kasvattaa R. solanacearum -populaatioita näyteuutteissa ja lisätä toteamisherkkyyttä. Menettely laimentaa myös tehokkaasti PCR-reaktion inhibiittoreita (1:100). On kuitenkin huomattava, että R. solanacearum -bakteerin rikastaminen voi epäonnistua saprofyyttisten organismien kilpailun tai estovaikutuksen vuoksi, sillä nämä rikastuvat usein samanaikaisesti. R. solanacearum -bakteerin eristäminen rikastetuista liemiviljelmistä voi tämän vuoksi olla vaikeaa. Koska serologisesti samankaltaisten saprofyyttien populaatiot voivat kasvaa, suositellaan spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden käyttämistä polyklonaalisten vasta-aineiden sijaan, kun käytetään ELISA-testiä.

4.2.1 Rikastus-PCR:ää varten siirretään 100 µl näyteuutetta 10 ml:aan rikastuslientä (lisäys 2), joka on aiemmin jaettu DNA-vapaisiin putkiin tai pulloihin. Rikastus-ELISAa varten näyteuutteen suhde liemeen voi olla suurempi (esim. 100 µl 1,0 ml:ssa rikastuslientä).

4.2.2 Inkuboidaan 72 tuntia 27–30 °C:ssa ravisteltavassa viljelmässä tai staattisessa viljelmässä siten, että korkit ovat löysällä ilmanvaihdon turvaamiseksi.

4.2.3 Sekoitetaan hyvin ennen ELISA- tai PCR-testeihin käyttämistä.

4.2.4 Rikastuslientä käytetään edellä mainituissa testeissä samoin kuin näytteitäkin. Huomautus: Jos epäillään, että R. solanacearum -bakteerin rikastaminen voi estyä tiettyjen kilpailevien saprofyyttisten bakteerien suurten populaatioiden vuoksi, parempia tuloksia voidaan saada rikastamalla näyteuutteita ennen sentrifugointia tai muuta konsentrointivaihetta.

5. Immunofluoresenssitesti (IF)

Periaate

IF-testin käyttö pääasiallisena seulontatestinä on suositeltavaa, koska se on todistetusti riittävän herkkä vaadittavien kynnysarvojen saavuttamiseksi.

Kun IF-testiä käytetään pääasiallisena seulontatestinä ja IF-testin tulos on positiivinen, toisena seulontatestinä on tehtävä eristämistesti, PCR- tai FISH-testi. Jos IF-testiä käytetään toisena seulontatestinä ja IF-testin tulos on positiivinen, vuokaavion mukainen lisätestaus on tarpeen analyysin suorittamiseksi.

Huomautus: Käytetään validoitua R. solanacearum -vasta-aineiden lähdettä (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). On suositeltavaa määrittää titteri kullekin uudelle vasta-aine-erälle. Titteri määritellään korkeimmaksi laimennokseksi, jolla optimaalinen reaktio tapahtuu, kun testataan suspensiota, joka sisältää R. solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta saatuja soluja, 105–106/ml, sopivalla fluoreseiini-isotiosyanaattikonjugaatilla (FITC) valmistajan suositusten mukaisesti. Validoidun polyklonaalisen antiseerumin IF-titterin olisi oltava vähintään 1:2 000. Testauksen aikana vasta-aineita olisi käytettävä lähellä titteriä olevassa tai titterin suuruisessa työskentelylaimennoksessa (tai -laimennoksissa).

Testi olisi tehtävä vasta valmistetuista näyteuutteista. Testi voidaan tarvittaessa tehdä uutteista, joita on säilytetty 68–86 °C:ssa glyserolissa. Glyseroli voidaan poistaa näytteestä lisäämällä 1 ml sakkapuskuria (lisäys 4), sentrifugoimalla uudelleen 15 minuutin ajan 7 000 g:ssä ja suspendoimalla uudelleen yhtä suureen määrään puskuriliuosta. Tämä ei ole useinkaan välttämätöntä erityisesti, jos näytteet kiinnitetään levyihin liekittämällä.

Valmistetaan erilliset positiiviset kontrollilevyt R. solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta tai mistä tahansa muusta vertailukannasta, jotka on suspendoitu perunauutteeseen, kuten lisäyksen 3 B kohdassa täsmennetään, ja vaihtoehtoisesti puskuriliuokseen.

Luonnollisesti saastunutta solukkoa (joka on säilytetty lyofilisoimalla tai pakastamalla16–24 °C:ssa) olisi mahdollisuuksien mukaan käytettävä vertailua varten samalla levyllä.

Negatiivisina kontrolleina käytetään sellaisia näyteuutteen määräosia, jotka on aiemmin testattu R. solanacearum -bakteerin osalta negatiivisiksi.

Tämän testin yhteydessä käytettäviksi on saatavilla standardoituja positiivisia ja negatiivisia kontrollimateriaaleja, jotka luetellaan lisäyksessä 3.

Käytetään mikroskoopin monisyvennyslevyjä, joissa on mieluiten 10 halkaisijaltaan vähintään 6 mm:n syvennystä.

Testataan kontrollimateriaali samalla tavoin kuin näyte (näytteet).

5.1 Käsitellään testilevyt yhdellä seuraavista menettelyistä:

i) Pelletit, joissa on suhteellisen vähän tärkkelystä: Pipetoidaan mitattu vakiomäärä (15 µl on sopiva halkaisijaltaan 6 mm:n syvennykseen – lisätään määrää samassa suhteessa suuremmille syvennyksille) suhteessa 1:100 laimennettua, uudelleen suspendoitua sakkaa ensimmäiseen syvennykseen. Pipetoidaan samanlainen määrä laimentamatonta sakkaa (1:1) rivin muihin syvennyksiin. Jäljellä olevaa riviä voidaan käyttää toisintona tai toiselle näytteelle kuten kuviossa 1 on esitetty.

ii) Muut pelletit: Valmistetaan kymmenkertaisia laimennoksia (1:10, 1:100) uudelleen suspendoidusta sakasta sakkapuskuriin. Pipetoidaan mitattu vakiomäärä (15 µl on sopiva halkaisijaltaan 6 mm:n syvennykseen – lisätään määrää samassa suhteessa suuremmille syvennyksille) uudelleen suspendoitua sakkaa ja kutakin laimennosta riville syvennyksiä. Jäljellä olevaa riviä voidaan käyttää toisintona tai toiselle näytteelle kuten kuviossa 2 on esitetty.

5.2 Annetaan pisaroiden kuivua huoneenlämmössä tai lämmittämällä 40–45 °C:n lämpötilaan. Kiinnitetään bakteerisolut levylle joko kuumentamalla (15 minuuttia 60 °C:n lämpötilassa), liekittämällä tai 95 % etanolilla tai vasta-aineiden toimittajien nimenomaisten ohjeiden mukaisesti. Kiinnitettyjä levyjä voidaan tarvittaessa säilyttää jäädytettyinä kuivatusainetta sisältävässä laatikossa mahdollisimman lyhyen aikaa (enintään 3 kuukautta) ennen lisätestejä.

5.3 IF-menettely i) Testilevyn valmistaminen 5.1 alakohdan i alakohdan mukaisesti: Valmistetaan kaksinkertaisten laimennosten sarja. Ensimmäisen syvennyksen olisi oltava 1/2 titteriä (T/2), ja muiden 1/4 titteriä (T/4), 1/2 titteriä (T/2), titteri (T) ja titteri kaksinkertaisena (2T). ii) Testilevyn valmistaminen 5.1 alakohdan ii alakohdan mukaisesti: Valmistetaan työskentelylaimennos vasta-aineesta IF-puskuriin. Työskentelylaimennos vaikuttaa spesifisyyteen.



Kaavio 1. Testilevyn valmistaminen 5.1 alakohdan i alakohdan ja 5.3 alakohdan i alakohdan mukaisesti Laimennokset uudelleen suspendoidusta sakasta 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Uudelleen suspendoidun sakan laimennos (T = titteri) T/2 T/4 T/2 T 2T  Antiseerumin/vasta-aineen kaksinkertaiset laimennokset Näyte 1 1 2 3 4 5 Näytteen 1 toisinto tai näyte 2 6 7 8 9 10



Kaavio 2. Testilevyn valmistaminen 5.1 alakohdan ii alakohdan ja 5.3 alakohdan ii alakohdan mukaisesti Työskentelylaimennos antiseerumista/vasta-aineesta 1/1 1/10 1/100 Tyhjä Tyhjä  Uudelleen suspendoidun sakan kymmenkertainen laimennos Näyte 1 1 2 3 4 5 Näytteen 1 toisinto tai näyte 2 6 7 8 9 10 5.3.1 Järjestetään levyt kostean paperipyyhkeen päälle. Täytetään testisyvennykset kokonaisuudessaan vasta-aineen laimennoksella tai laimennoksilla. Syvennyksiin lisättävän vasta-aineen tilavuuden on vastattava vähintään levitetyn uutteen tilavuutta. Seuraava menettely olisi toteutettava, jos vasta-aineiden toimittajilta ei ole saatu nimenomaisia ohjeita: 5.3.2 Inkuboidaan levyjä kannen alla kostealla paperilla 30 minuutin ajan huoneenlämmössä (18–25 °C). 5.3.3 Ravistetaan pisarat pois kaikilta levyiltä ja huuhdellaan levyt varovasti IF-puskurilla. Pestään 5 minuutin ajan IF-puskuri-Tweenillä (lisäys 4) ja sen jälkeen IF-puskurissa. Vältetään roiskeita tai pisaroiden kulkeutumista, joista saattaa olla seurauksena ristikontaminaatio. Poistetaan varovasti ylimääräinen kosteus paperipyyhkeellä. 5.3.4 Järjestetään levyt kostean paperin päälle. Täytetään testisyvennykset FITC-konjugaatin laimennoksella, jota on käytetty titterin määrittämiseen. Syvennyksiin lisätyn konjugaatin määrän on vastattava lisätyn vasta-aineen määrää. 5.3.5 Inkuboidaan levyt kannen alla kostealla paperilla 30 minuutin ajan huoneenlämmössä (18–25 °C). 5.3.6 Ravistetaan konjugaattipisarat pois levyltä. Huuhdellaan ja pestään kuten edellä (5.3.3 alakohta). Poistetaan varovasti ylimääräinen kosteus paperipyyhkeellä. 5.3.7 Pipetoidaan 5–10 µl 0,1 M fosfaattipuskuroitua glyserolia (lisäys 4) tai vastaavaa kaupallisesti saatavilla olevaa haalistumiselta suojaavaa peittausainetta kuhunkin syvennykseen ja asetetaan peitelasi.

5.4 IF-testin lukeminen 5.4.1 Tutkitaan testilevyjä mikroskoopilla, joka on varustettu epifluoresoivalla valonlähteellä, FITC:n eksitaatioon sopivilla suodattimilla öljy- tai vesi-immersio-objektiivin 500–1 000-kertaisella suurennoksella. Tarkastellaan objektikenttää laidasta laitaan pystysuoraan ja vaakasuoraan ja kiertämällä ulkoreunaa pitkin. Näytteistä, joissa ei näy yhtään tai vain hyvin vähän soluja, tarkastellaan vähintään 40 mikroskooppikenttää. Tutkitaan ensin positiiviset kontrollilevyt. Solujen on oltava kirkkaasti fluoresoivia ja täydellisesti värjäytyneitä määritellyllä vasta-ainetitterillä tai työskentelylaimennoksella. IF-testi (VI jakson A kohdan 5 alakohta) on uusittava, jos värjäytyminen ei ole täydellistä. 5.4.2 Tarkastellaan testisyvennyksissä kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen R. solanacearum -bakteerille (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluoresenssin intensiteetin on vastattava positiivista kontrollikantaa samassa vasta-ainelaimennoksessa. Sellaisia soluja, joiden värjäytyminen on epätäydellistä tai joiden fluoresenssi on heikko, ei oteta huomioon. Jos epäillään kontaminaatiota, testi on toistettava. Näin saattaa käydä, jos kaikilla erän levyillä on positiivisia soluja puskurin kontaminaation vuoksi tai jos positiivisia soluja löytyy (levyn syvennysten ulkopuolelta) levyn kalvolta. 5.4.3 Immunofluoresenssitestien spesifisyyteen liittyy useita ongelmia. Perunan napapäiden ja varren palasten sakassa esiintyy todennäköisesti morfologisesti epätyypillisiä fluoresoivien solujen ja R. solanacearum -bakteerin kanssa kooltaan ja morfologialtaan samanlaisten ristiin reagoivien saprofyyttisten bakteerien populaatioita. 5.4.4 Tarkastellaan ainoastaan fluoresoivia soluja, joilla on tyypillinen koko ja morfologia vasta-ainetitterissä tai -työskentelylaimennoksessa, kuten 5.3 alakohdassa kuvattiin. 5.4.5 IF-testin tulosten tulkinta: i) Jos näytteestä löytyy kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen, arvioidaan tyypillisten solujen keskimääräinen lukumäärä mikroskooppikenttää kohden ja lasketaan näiden solujen lukumäärä uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden (lisäys 5). IF-testin tulos on positiivinen, jos näytteissä on vähintään 5 × 103 tyypillistä solua uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden. Näytettä pidetään mahdollisesti saastuneena, ja lisätestaus on tarpeen. ii) IF-testin tulos on negatiivinen, jos näytteissä on vähemmän kuin 5 × 103 solua uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden, ja näytettä pidetään negatiivisena. Lisätestausta ei vaadita.

6. PCR-testi

Periaatteet

Kun PCR-testiä käytetään pääasiallisena seulontatestinä ja siitä saadaan positiivinen tulos, toisena pakollisena seulontatestinä on tehtävä eristys- tai IF-testi. Kun PCR-testiä käytetään toisena seulontatestinä ja siitä saadaan positiivinen tulos, vuokaavion mukainen lisätestaus on tarpeen määrityksen tekemiseksi.

Tätä menetelmää on suositeltavaa käyttää pääasiallisena seulontatestinä ainoastaan, jos käytettävissä on sen tekemiseen vaadittavaa erityisasiantuntemusta.

Huomautus: Alustavan testauksen tällä menetelmällä pitäisi mahdollistaa se, että voidaan todeta aiemmin negatiivisiksi testattuihin näyteuutteisiin lisätyt R. solanacearum -bakteerin solut (103–104/ml). Testi on voitava toistaa. Optimointikokeet saattavat olla tarpeen herkkyyden ja spesifisyyden maksimoimiseksi kaikissa laboratorioissa.

Käytetään validoituja PCR-reagensseja ja -testausprotokollia (ks. lisäys 6). Olisi mielellään valittava menetelmä, johon kuuluu sisäinen kontrolli.

On toteutettava tarkoituksenmukaisia varotoimia, jotta vältetään näytteen kontaminaatio kohde-DNA:lla. PCR-testi olisi annettava kokeneiden teknikoiden tehtäväksi erikoistuneissa molekyylibiologian laboratorioissa, jotta minimoidaan näytteen mahdollinen kontaminaatio kohde-DNA:lla.

Negatiivisia kontrolleja (DNA:n uuttamis- ja PCR-menettelyjen osalta) olisi aina käsiteltävä menettelyn viimeisenä näytteenä, jotta voitaisiin osoittaa selvästi, onko DNA:n siirtymistä tapahtunut.

PCR-testiin olisi sisällytettävä seuraavat negatiiviset kontrollit:

— näyteuute, joka on aiemmin testattu R. solanacearum -bakteerin suhteen negatiiviseksi,

— puskurikontrollit, joita käytetään bakteerin ja DNA:n uuttamiseksi näytteestä,

— PCR-reaktioseos.

Testissä olisi käytettävä seuraavia positiivisia kontrolleja:

— uudelleen suspendoitujen sakkojen määräosat, joihin R. solanacearum -bakteeri on lisätty (valmistus ks. lisäyksen 3 B kohta),

— vesisuspensio R. solanacearum -bakteerin virulentista isolaatista (esim. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ks. lisäyksen 3 B kohta) saaduista soluista, 106 solua/ml,

— jos mahdollista, PCR-testissä käytetään myös positiivisista kontrollinäytteistä saatua DNA:ta.

Mahdollisen kontaminaation välttämiseksi positiiviset kontrollit valmistetaan erillään testinäytteistä.

Näyteuutteiden olisi oltava mahdollisimman puhtaita mullasta. Joissakin tapauksissa saattaisi siksi olla suositeltavaa valmistaa uutteet pestyistä perunoista, mikäli aiotaan käyttää PCR-testausprotokollia.

Tämän testin yhteydessä käytettäviksi on saatavilla standardoituja positiivisia ja negatiivisia kontrollimateriaaleja, jotka luetellaan lisäyksessä 3.

6.1 DNA:n puhdistusmenetelmät

Käytetään edellä kuvattuja negatiivisia ja positiivisia kontrollinäytteitä (ks. lisäys 3).

Testataan kontrollimateriaali samalla tavoin kuin näyte (näytteet).

Kohde-DNA:n eristämiseksi kompleksisista näytealustoista on käytettävissä useita eri menetelmiä, joilla voidaan poistaa PCR:n ja muiden entsyymireaktioiden inhibiittorit ja konsentroida kohde-DNA näyteuutteessa. Seuraava menetelmä on optimoitu käytettäväksi lisäyksessä 6 kuvatuilla validoiduilla PCR-menetelmillä.

a) Pastrikin menetelmä (2000)

1) Pipetoidaan 220 µl lyysipuskuria (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) 1,5 ml:n eppendorfputkeen.

2) Lisätään 100 µl näyteuutetta ja asetetaan kuumentimelle tai vesihauteeseen 95 °C:ssa 10 minuutin ajaksi.

3) Siirretään putki jäihin 5 minuutiksi.

4) Lisätään 80 µl lysotsyymikantaliuosta (50 mg lysotsyymia/ml 10 mM Tris HCl:ssa, pH 8,0) ja inkuboidaan 37 °C:ssa 30 minuutin ajan.

5) Lisätään 220 µl Easy DNA® -liuosta A (Invitrogen), sekoitetaan hyvin vorteksoimalla ja inkuboidaan 65 °C:ssa 30 minuutin ajan.

6) Lisätään 100 µl Easy DNA® -liuosta B (Invitrogen), vorteksoidaan voimakkaasti, kunnes sakka valuu putkessa vapaasti ja näyte on kauttaaltaan yhtäläisen viskoosi.

7) Lisätään 500 µl kloroformia ja vorteksoidaan, kunnes viskositeetti vähenee ja seos on homogeeninen.

8) Sentrifugoidaan 15 000 g 20 minuutin ajan 4 °C:ssa faasien erottamiseksi ja interfaasin muodostamiseksi.

9) Siirretään yläfaasi puhtaaseen eppendorfputkeen.

10) Lisätään 1 ml 100 % etanolia (20 °C), vorteksoidaan pikaisesti ja inkuboidaan jäissä 10 minuutin ajan.

11) Sentrifugoidaan 15 000 g 20 minuutin ajan 4 °C:ssa ja poistetaan etanoli pelletistä.

12) Lisätään 500 µl 80 % etanolia (20 °C) ja sekoitetaan kääntelemällä putkea.

13) Sentrifugoidaan 15 000 g 10 minuutin ajan 4 °C:ssa, säästetään pelletti ja poistetaan etanoli.

14) Annetaan pelletin kuivua ilmassa tai DNA Speed Vac -laitteessa.

15) Suspendoidaan pelletti uudelleen 100 µl:aan steriiliä ultrapuhdasta vettä ja jätetään seisomaan huoneenlämpöön vähintään 20 minuutin ajaksi.

16) Varastoidaan 20 °C:ssa, kunnes näytettä tarvitaan PCR-testissä.

17) Erotetaan mahdollinen valkea sakka sentrifugoimalla, ja PCR-määritykseen käytetään 5 µl DNA:ta sisältävää liuosta.

b) Muut menetelmät

Muita DNA:n uuttamismenetelmiä (esim. Qiagen Dneasy Plant Kit) voidaan käyttää, jos niiden on osoitettu olevan yhtä tehokkaita DNA:n puhdistamisessa kontrollinäytteistä, jotka sisältävät 103–104 taudinaiheuttajasolua/ml.

6.2 PCR-testi

6.2.1 Valmistetaan PCR-testin testi- ja kontrollitemplaatit validoitujen testausprotokollien mukaisesti (VI jakson A kohdan 6 alakohta). Valmistetaan yksi kymmenkertainen laimennos DNA-näyteuutetta (1:10 ultrapuhtaaseen veteen).

6.2.2 Valmistetaan tarkoituksenmukainen PCR-reaktioseos julkaistujen testausprotokollien mukaisesti (lisäys 6) kontaminaatiolta vapaassa ympäristössä. Jos mahdollista, on suositeltavaa käyttää moninkertaisista PCR-protokollaa, johon sisältyy myös sisäinen PCR-kontrolli.

6.2.3 Lisätään 2–5 µl DNA-uutetta 25 µl:aan PCR-reaktioseosta steriileihin PCR-putkiin PCR-protokollien mukaisesti (ks. lisäys 6).

6.2.4 Otetaan ainoastaan PCR-reaktioseosta sisältävä negatiivinen kontrollinäyte ja lisätään näytteen sijasta ultrapuhdasta vettä samasta lähteestä, jota käytettiin PCR-seoksessa.

6.2.5 Asetetaan putket samaan lämpösyklilaitteeseen, jota käytettiin esitestauksessa, ja ajetaan asianmukaisesti optimoitu PCR-ohjelma (lisäys 6).

6.3 PCR-tuotteen määrittäminen

6.3.1 Erotetaan PCR-amplikonit agaroosigeelielektroforeesilla. Lisätään vähintään 12 µl monistettua DNA-reaktioseosta jokaisesta näytteestä ja sekoitetaan se 3 µl:aan latauspuskuria (lisäys 6) 2,0 % (w/v) agaroosigeelissä trisasetaattielektroforeesipuskurissa (TAE) (lisäys 6) ajaen geeliä 5–8 V/cm. Käytetään tarkoituksenmukaista DNA-markkeria, ”esim. 100 emäsparia.”

6.3.2 Saatetaan DNA-fragmentit näkyviin värjäämällä näyte etidiumbromidiliuoksessa (0,5 mg/l) 30–60 minuutin ajan huolehtien asianmukaisista varotoimista tämän mutageenin käsittelyssä.

6.3.3 Tarkastellaan värjäytynyttä geeliä UV-läpivalaisulla (λ = 302 nm) odotetunkokoisten monistettujen PCR-tuotteiden (lisäys 6) löytämiseksi ja dokumentoidaan tiedot.

6.3.4 Kaikkien uusien löydösten/tapausten osalta varmistetaan PCR-amplikonin autenttisuus tekemällä restriktioentsyymianalyysi jäljellä olevan monistetun DNA:n näytteelle inkuboimalla optimilämpötilassa ja -ajassa tarkoituksenmukaisella entsyymillä ja puskurilla (ks. lisäys 6). Määritetään pilkotut fragmentit agaroosigeelielektrofereesillä kuten edellä ja tarkkaillaan tyypillistä restriktiofragmenttikuviota UV-läpivalaisulla etidiumbromidivärjäyksen jälkeen ja verrataan pilkkoutumattomiin ja pilkottuihin positiivisiin kontrolleihin.

PCR-testin tulosten tulkinta

PCR-testin tulos on negatiivinen, jos odotetunkokoista R. solanacearum -spesifistä PCR-amplikonia ei todeta kyseisestä näytteestä, mutta se todetaan kaikista positiivisista kontrollinäytteistä (kun on kyse moninkertaisista PCR-tuotteista, joilla on kasveille spesifiset sisäiset kontrollialukkeet: toinen odotetunkokoinen PCR-tuote on monistettava kyseisellä näytteellä).

PCR-testin tulos on positiivinen, jos odotetunkokoinen R. solanacearum -spesifinen PCR-amplikoni ja odotettu restriktioreaktio (jos sellaista vaaditaan) todetaan edellyttäen, että sitä ei ole monistettu mistään negatiivisesta kontrollinäytteestä. Positiivisen tuloksen luotettava varmistus voidaan saada myös toistamalla testi toisilla PCR-alukkeilla (lisäys 6).

Huomautus: PCR:n inhibitiota voidaan epäillä, jos odotettu amplikoni saadaan positiivisesta kontrollinäytteestä, joka sisältää R. solanacearum -bakteeria vedessä, mutta negatiiviset tulokset saadaan positiivisista kontrolleista, jotka sisältävät R. solanacearum -bakteeria perunauutteessa. Moninkertaisten reaktioiden määritykseen perustuvissa PCR-testausprotokollissa, joissa on mukana sisäinen PCR-kontrolli, reaktion inhibitio näyttää olevan kyseessä silloin, jos ei saada kumpaakaan näistä kahdesta amplikonista.

Saastuntaa voidaan epäillä, jos odotettua amplikonia ei saada yhdestä tai useammasta negatiivisesta kontrollista.

7. FISH-testi

Periaate

Kun FISH-testiä käytetään ensimmäisenä seulontatestinä ja siitä saadaan positiivinen tulos, toisena pakollisena seulontatestinä on tehtävä eristystesti tai IF-testi. Kun FISH-testiä käytetään toisena seulontatestinä ja siitä saadaan positiivinen tulos, vuokaavion mukainen lisätestaus on tarpeen määrityksen tekemiseksi.

Huomautus: Käytetään validoituja R. solanacearum -spesifisiä oligokoettimia (lisäys 7). Alustavan testauksen tällä menetelmällä pitäisi mahdollistaa se, että voidaan toistettavasti todeta aiemmin negatiivisiksi testattuihin näyteuutteisiin lisätyt R. solanacearum -bakteerin solut vähintään pitoisuudella 103–104/ml.

Menettely voidaan tarvittaessa kuitenkin tehdä näyteuutteille, joita on säilytetty glyserolissa 16–24 °C:ssa tai 68–86 °C:ssa.

Negatiivisina kontrolleina käytetään sellaisia näyteuutteen osia, jotka on aiemmin testattu R. solanacearum -bakteerin osalta negatiivisiksi.

Positiivisiksi kontrolleiksi valmistetaan suspensioita, jotka sisältävät 105–106 solua/ml R. solanacearum -bakteerin biovaria 2 (esim. kanta NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ks. lisäys 3) 0,01 M fosfaattipuskurissa (PB) 3–5 vuorokauden viljelmästä. Valmistetaan erilliset positiiviset kontrollilevyt R. solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta tai mistä tahansa muusta vertailukannasta, jotka on suspendoitu perunauutteeseen, kuten lisäyksen 3 B kohdassa täsmennetään.

FITC-leimatun eubakteriaalisen oligokoettimen käyttö toimii kontrollina hybridisaatioprosessissa, sillä se värjää kaikki näytteessä olevat eubakteerit.

Tämän testin yhteydessä käytettäviksi on saatavilla standardoituja positiivisia ja negatiivisia kontrollimateriaaleja, jotka luetellaan lisäyksen 3 A kohdassa.

Testataan kontrollimateriaali samalla tavoin kuin näyte (näytteet).

7.1 Perunauutteen fiksointi

Seuraava testausprotokolla on peräisin lähteestä Wullings et al., (1998):

7.1.1 Valmistetaan kiinniteliuos (ks. lisäys 7).

7.1.2 Pipetoidaan 100 µl kustakin näyteuutteesta eppendorfputkeen ja sentrifugoidaan 7 minuuttia 7 000 g:ssä.

7.1.3 Poistetaan supernatantti ja liuotetaan sakka 200 µl:aan kiinniteliuosta, joka on valmistettu < 24 tuntia aiemmin. Sekoitetaan vorteksilla ja inkuboidaan tunnin ajan jääkaapissa.

7.1.4 Sentrifugoidaan 7 minuutin ajan 7 000 g:ssä, poistetaan supernatantti ja suspensoidaan pelletti uudelleen 75 µl:aan 0,01 M fosfaattipuskuria (ks. lisäys 7).

7.1.5 Tiputetaan 16 µl kiinnitettyjä suspensioita kuvassa 7,1 esitetylle puhtaalle monitestilevylle. Laitetaan kullekin levylle 2 laimentamatonta eri näytettä ja käytetään 10 µl 1/100-laimennoksen (0,01 M:ssa fosfaattipuskuria) tekemiseksi. Jäljellä oleva näyteliuos (49 µl) voidaan varastoida 20 °C:ssa, kun siihen on lisätty 1 tilavuus 96-prosenttista etanolia. Jos FISH-testi on toistettava, poistetaan etanoli sentrifugoimalla ja lisätään sama määrä 0,01 M fosfaattipuskuria (sekoitetaan vorteksilla).



Kuvio 7.1 FISH-levy Näyte 1 Nollakoe Nollakoe Nollakoe Näyte 2 syvennys 1 syvennys 2 syvennys 3 syvennys 4 syvennys 5 Näyte 1 Nollakoe Nollakoe Nollakoe Näyte 2 syvennys 6 syvennys 7 syvennys 8 syvennys 9 syvennys 10 Peitelasi 1 Peitelasi 2

7.1.6 Ilmakuivataan levyt (tai kuivataan ne levynkuivaajalla 37 °C:ssa) ja kiinnitetään ne liekittämällä. Tässä vaiheessa menettely voidaan keskeyttää, ja hydridisaatiota voidaan jatkaa seuraavana päivänä. Levyt olisi säilytettävä pölyltä suojassa ja kuivassa paikassa huoneenlämmössä.

7.2 Hybridisaatio

7.2.1 Poistetaan soluista vesi vaiheittain 50-, 80- ja 96-prosenttisessa etanolissa minuutin ajan kussakin. Ilmakuivataan levyt levynpidikkeessä.

7.2.2 Valmistellaan kostea inkubaatiokammio peittämällä ilmatiiviin laatikon pohja paperi- tai suodatinpaperilla, joka on kastettu 1X hybmixiin (lisäys 7). Esi-inkuboidaan laatikko hybridisaatiouunissa 45 °C:ssa vähintään 10 minuutin ajan.

7.2.3 Asetetaan 10 μl hybridisaatioliuosta (lisäys 7) kunkin levyn 8 syvennykseen (syvennykset 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 ja 10; ks. kuva 7.1) siten, että kaksi keskimmäistä syvennystä (3 ja 8) jäävät tyhjiksi.

7.2.4 Asetetaan peitelasit (24 × 24 mm) ensimmäiseen ja neljään viimeiseen syvennykseen siten, että väliin ei jää ilmaa. Laitetaan levyt esilämmitettyyn kosteaan kammioon ja hybridisoidaan 5 tuntia pimeässä uunissa 45 °C:ssä.

7.2.5 Valmistetaan 3 dekanterilasia, joiden koostumus on seuraava: 1 l Milli Q (molekyylisuodattimilla puhdistettua) -vettä, 1 l 1X hybmix (334 ml 3X hybmix ja 666 ml Milli Q -vettä) ja 1 l 1/8X hybmix (42 ml 3X hybmix ja 958 ml Milli Q -vettä). Esi-inkuboidaan kukin vesihauteessa 45 °C:ssa.

7.2.6 Poistetaan peitelasit levyiltä ja asetetaan levyt levytelineeseen.

7.2.7 Pestään ylimääräinen koetin inkuboimalla 15 minuutin ajan dekanterilasissa, jossa on 1X hybmix, 45 °C:ssa.

7.2.8 Siirretään levyteline 1/8X hybmix -pesuliuokseen ja inkuboidaan vielä 15 minuutin ajan.

7.2.9 Kastetaan levyt pikaisesti Milli Q -veteen ja asetetaan ne suodatinpaperille. Poistetaan liiallinen kosteus peittämällä pinta kevyesti suodatinpaperilla. Pipetoidaan 5–10 μl haalistumiselta suojaavaa peittausainetta (esim. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA, tai vastaavaa) jokaiseen syvennykseen ja asetetaan iso peitelasi (24 × 60 mm) koko levyn päälle.

7.3 FISH-testin lukeminen

7.3.1 Tutkitaan levyt välittömästi mikroskoopilla, joka on varustettu epifluoresoivalla valonlähteellä, öljyimmersio-objektiivin 630–1 000-kertaisella suurennoksella. FITC:iin sopivilla suodattimilla näytteen eubakteerisolut (mukaan luettuina useimmat gramnegatiiviset solut) fluoresoivat vihreinä. Kun käytetään tetrametyylirodamiini-5-isotiosyanaatille tarkoitettua suodatinta, Cy3-värjätyt R. solanacearum -bakteerin solut näkyvät fluoresoivan punaisina. Verrataan solujen morfologiaa positiivisten kontrollien morfologiaan. Solujen on oltava kirkkaasti fluoresoivia ja täydellisesti värjäytyneitä. FISH-testi (VI jakson A kohdan 7 alakohta) on toistettava, jos värjäytyminen on poikkeavaa. Tutkitaan syvennyksiä tarkasti kohtisuoraan kahden halkaisijan suuntaisesti ja pitkin aukon kehää. Näytteistä, joissa ei näy yhtään tai vain hyvin vähän soluja tarkastellaan vähintään 40 mikroskooppikenttää.

7.3.2 Tarkastellaan testisyvennyksissä kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen R. solanacearum -bakteerille (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluoresenssin intensiteetin on vastattava vähintään positiivisen kontrollikannan fluoresenssin intensiteettiä. Sellaisia soluja, joiden värjäytyminen on epätäydellistä tai joiden fluoresenssi on heikko, ei oteta huomioon.

7.3.3 Jos epäillään kontaminaatiota, testi on toistettava. Näin saattaa käydä, jos kaikilla erän levyillä on positiivisia soluja puskurin saastumisen vuoksi tai jos positiivisia soluja löytyy (levyn syvennysten ulkopuolelta) levyn kalvolta.

7.3.4 FISH-testin spesifisyyteen liittyy useita ongelmia. Perunan napapäiden ja varren palasten sakassa saattaa esiintyä morfologisesti epätyypillisiä fluoresoivien solujen ja R. solanacearum -bakteerin kanssa kooltaan ja morfologialtaan samanlaisten ristiin reagoivien saprofyyttisten bakteerien populaatioita, vaikkakin huomattavasti harvemmin kuin IF-testissä.

7.3.5 Ainoastaan ne fluoresoivat solut, jotka ovat kooltaan ja morfologialtaan tyypillisiä, on otettava huomioon.

7.3.6 FISH-testin tulosten tulkinta i) FISH-testistä saadaan validit tulokset, jos FITC-suodatinta käyttäen havaitaan kirkkaan vihreitä fluoresoivia soluja, joiden koko ja morfologia on R. solanacearum -bakteerille tyypillinen, ja jos rodamiinisuodatinta käyttäen havaitaan kirkkaan punaisia fluoresoivia soluja kaikissa positiivissa kontrolleissa muttei yhdessäkään negatiivisessa kontrollissa. Jos näytteestä löytyy kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen, arvioidaan tyypillisten solujen keskimääräinen lukumäärä mikroskooppikenttää kohden ja lasketaan näiden solujen lukumäärä uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden (lisäys 4). Näytteitä, joissa on vähintään 5 × 103 tyypillistä solua uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden, pidetään mahdollisesti saastuneina. Lisätestaus on tarpeen. Näytteitä, joissa on vähemmän kuin 5 × 103 tyypillistä solua uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden, pidetään negatiivisina. ii) FISH-testin tulos on negatiivinen, jos rodamiinisuodatinta käyttäen ei havaita kirkkaan punaisia fluoresoivia soluja, joiden koko ja morfologia on R. solanacearum -bakteerille tyypillinen edellyttäen, että tyypillisiä kirkkaan punaisia fluoresoivia soluja havaitaan positiivisissa kontrollivalmisteissa silloin, kun käytetään rodamiinisuodatinta.

8. ELISA-testi

Periaate

ELISA-testiä voidaan käyttää ainoastaan valinnaisena testin IF-, PCR- tai FISH-testin lisäksi, koska testin herkkyys on verrattain alhainen. Kun käytetään DAS ELISA -testiä, rikastus ja monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö ovat pakollisia (ks. www-sivusto http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Näytteiden rikastus ennen ELISA-testin käyttöä voi olla hyödyllistä testin herkkyyden parantamiseksi, mutta se voi epäonnistua näytteessä olevien muiden organismien kilpailun vuoksi.

Huomautus: Käytetään validoitua R. solanacearum -vasta-aineiden lähdettä (ks. www-sivusto http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). On suositeltavaa määrittää titteri kullekin uudelle vasta-aine-erälle. Titteri määritellään korkeimmaksi laimennokseksi, jolla optimaalinen reaktio tapahtuu, kun testataan suspensiota, joka sisältää millilitraa kohden 105–106 R. solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta saatua solua, ja kun käytetään sopivia sekundaareja vasta-ainekonjugaatteja valmistajan suositusten mukaisesti. Testauksen aikana vasta-aineita olisi käytettävä lähellä kaupallisesti saatavilla olevaa titteriä olevassa tai titterin suuruisessa työskentelylaimennoksessa.

Määritetään vasta-aineiden titteri suspensiossa, jossa on millilitraa kohden 105–106 solua R. solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta.

Negatiiviksi kontrolleiksi otetaan näyteuute, joka on aiemmin testattu negatiiviseksi R. solanacearum -bakteerin osalta, sekä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) oleva bakteeri, joka ei reagoi ristiin.

Positiivisena kontrollina käytetään sellaisia näyteuutteen osia, jotka on aiemmin testattu R. solanacearum -bakteerin osalta negatiivisiksi ja joihin on sekoitettu millilitraa kohden 103–104 R. solanacearum -bakteerin biovarin 2 solua (esim. kanta NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ks. lisäyksen 2 A ja B kohta). Tulosten vertailemiseksi kullakin levyllä käytetään standardiliuosta, jossa on millilitraa kohden 105–106 R. solanacearum -solua fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa. On varmistettava, että positiiviset kontrollit on tarkoin erotettu testattavista näytteistä mikrotitterilevyllä.

Tämän testin yhteydessä käytettäviksi on saatavilla standardoituja positiivisia ja negatiivisia kontrollimateriaaleja, jotka luetellaan lisäyksen 3 A kohdassa.

Testataan kontrollimateriaali samalla tavoin kuin näyte (näytteet).

Kaksi ELISA-protokollaa on validoitu.

a) Epäsuora ELISA (Robinson Smith et al., 1995)

1) Käytetään 100–200 µl näyteuutteen osia. (Kuumentaminen 100 °C:ssa 4 minuutin ajan vesihauteessa tai kuumentimella voi joissakin tapauksissa vähentää ei-spesifisiä tuloksia.)

2) Lisätään sama tilavuusmäärä väkevyydeltään kaksinkertaista kiinnityspuskuria (lisäys 4) ja sekoitetaan vorteksilla.

3) Lisätään 100 µl:aa kuhunkin, vähintään kahteen, mikrotitterilevyn syvennykseen (esim. Nunc-Polysorp tai vastaava). Inkuboidaan tunnin ajan 37 °C:ssa tai yön yli 4 °C:ssa.

4) Kaadetaan uutteet pois syvennyksistä. Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4) siten, että viimeinen pesuliuos jätetään syvennyksiin vähintään 5 minuutiksi.

5) Valmistetaan sopiva laimennos R. solanacearum -bakteerin vasta-aineista estopuskuriin (lisäys 4). Validoiduista kaupallisista vasta-aineista käytetään suositeltuja laimennoksia (yleensä kaksinkertainen konsentraatio titteriin verrattuna).

6) Lisätään 100 µl kuhunkin syvennykseen ja inkuboidaan tunnin ajan 37 °C:ssa.

7) Kaadetaan vasta-aineliuos syvennyksistä ja pestään kuten edellä (kohta 4).

8) Valmistetaan sopiva laimennos sekundaarista vasta-aine-emäsfosfataasikonjugaattia estopuskuriin. Lisätään 100 µl kuhunkin syvennykseen ja inkuboidaan tunnin ajan 37 °C:ssa.

9) Kaadetaan konjugaattivasta-aine syvennyksistä ja pestään kuten edellä (kohta 4).

10) Lisätään 100 µl emäksistä fosfataasisubstraattiliuosta (lisäys 4) kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan pimeässä huoneenlämmössä ja mitataan absorbanssi 405 nm:ssä säännöllisesti 90 minuutin välein.

b) DASI ELISA

1) Valmistetaan sopiva laimennos R. solanacearum -bakteerin polyklonaalisista immunoglobuliinivasta-aineista kiinnityspuskuriin, pH 9,6 (lisäys 4). Lisätään 200 µl kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan 37 °C:ssa 4–5 tunnin ajan tai 4 °C:ssa 16 tunnin ajan.

2) Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4). Lisätään 190 µl näyteuutetta vähintään kahteen syvennykseen. Lisätään myös positiiviset ja negatiiviset kontrollit kahteen syvennykseen kullakin levyllä. Inkuboidaan 16 tunnin ajan 4 °C:ssa.

3) Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4).

4) Valmistetaan sopiva laimennos R. solanacearum -bakteerille spesifisistä monoklonaalisista vasta-aineista fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) (lisäys 4), joka sisältää myös 0,5 % naudan seerumin albumiinia (BSA), ja lisätään 190 µl kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan kahden tunnin ajan 37 °C:ssa.

5) Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4).

6) Valmistetaan sopiva laimennus hiiren vasta-aineimmunoglobuliineja konjugoituna emäksiseen fosfataasiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa. Lisätään 190 µl kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan kahden tunnin ajan 37 °C:ssa.

7) Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4).

8) Valmistetaan emäksinen fosfataasisubstraattiliuos, jossa on 1 mg p-nitrofenyylifosfaattia substraattipuskurin millilitraa kohden (lisäys 4). Lisätään 200 µl kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan pimeässä huoneenlämmössä ja mitataan absorbanssi 405 nm:ssä säännöllisesti 90 minuutin välein.

ELISA-testitulosten tulkinta

ELISA-testi on negatiivinen, jos kahden näytteen keskimääräinen optinen tiheys (OD) on < 2 × negatiivisen kontrollinäytesyvennyksen OD, sillä edellytyksellä, että kaikkien positiivisten kontrollien OD on suurempi kuin 1,0 (kun kontrolleja on inkuboitu 90 minuutin ajan substraatin kanssa) ja enemmän kuin kaksinkertainen negatiivista näyteuutteista saatuun OD:hen verrattuna.

ELISA-testi on positiivinen, jos kahden näytesyvennyksen keskimääräinen OD on > 2 × negatiivisen näyteuutteen syvennyksen OD, sillä edellytyksellä, että kaikkien negatiivisten kontrollisyvennysten OD on < 2 × positiivisten kontrollisyvennysten OD.

Negatiivinen ELISA-tulos positiivisissa kontrollisyvennyksissä osoittaa, että testiä ei ole tehty oikein tai se on inhiboitunut. Positiiviset ELISA-tulokset negatiivisissa kontrollisyvennyksissä ilmaiset, että testissä on tapahtunut ristikontaminaatiota tai epäspesifistä vasta-aineen sitoutumista.

9. Biologinen määritys

Huomautus: Alustavan testauksen tällä menetelmällä pitäisi mahdollistaa se, että voidaan todeta aiemmin negatiivisiksi testattuihin näyteuutteisiin lisätyt R. solanacearum -bakteerin pesäkkeitä muodostavat yksiköt (103–104) (valmistus ks. lisäys 3). Testi on voitava toistaa.

Suurinta todentamisherkkyyttä voidaan odottaa, kun käytetään vasta valmistettua näyteuutetta optimaalisissa kasvuolosuhteissa. Menetelmää voidaan kuitenkin käyttää menestyksekkäästi myös sellaisiin uutteisiin, joita on varastoitu glyserolissa 68–86 °C:ssa.

Seuraava testausprotokolla on peräisin lähteestä Janse (1988):

9.1 Testikasveina käytetään 10 kasvia, jotka ovat taudille altista kolmilehtiasteella olevaa tomaattilajiketta (esim. Moneymaker tai lajike, jonka alttiuden testilaboratorio on määrittän