1994R0086 — FI — 03.02.1999 — 001.001 — 1
Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentointitarkoituksiin. Toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä.
►B KOMISSION ASETUS (EY)N:o 86/94,
annettu 19 päivänä tammikuuta 1994,
voin sisältämän sitosterolin ja stigmasterolin määrittämisessä käytettävästä vertailumenetelmästä
(EYVL L 17, 20.1.1994, s. 7)
Muutettu:
virallinen lehti
N:o sivu päivämäärä
►M1Komission asetus (EY) N:o 175/1999, annettu 26 päivänä tammikuuta
1999 L20 22 27.1.1999
1994R0086 — FI — 03.02.1999 — 001.001 — 2
▼B
KOMISSION ASETUS (EY)N:o 86/94,
annettu 19 päivänä tammikuuta 1994,
voin sisältämän sitosterolin ja stigmasterolin määrittämisessä
käytettävästä vertailumenetelmästä
EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka
ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen,
ottaa huomioon maito- ja maitotuotealan yhteisestä markkinajärjeste-
lystä 27 päivänä kesäkuuta 1968 annetun neuvoston asetuksen (ETY)N:o 804/68(
1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella
(ETY) N:o 2071/92(2), ja erityisesti sen 6 artiklan 7 kohdan,
sekä katsoo, ettävoi voidaan merkitä ja merkittyjä tuotteita on valvottava komission
asetuksen(ETY)N:o570/88(
3),sellaisenakuinseonviimeksimuutet-
tuna asetuksella (ETY) N:o 3049/93(4), 3 ja 6 artiklan mukaisesti,
voin merkitsemistä koskevien vaatimusten tiukka noudattaminen on
välttämätöntätukeasaavanvoinmahdollisenlaittomankäytönvälttämi-seksi,
merkitsemisen tärkeys näiden järjestelmien hyvälle toiminnalle
huomioon ottaen on tarpeen määritellä kaikille näissä järjestelmissävaadittaville merkkiaineille yhteiset havaitsemismenetelmät; tämämahdollistaisi erityisesti käsittelyjen tasapuolisuuden takaamisen kaik-kiennäitäjärjestelmiäkäyttävientoimijoidenvälilläjapoistaisikaikenepätasa-arvoisuudenkilpailuolosuhteissa,jokavoiaiheutuaeroavaisuuk-sista kansallisten määritysmenetelmien välillä,
komission asetuksessa (ETY) N:o 3942/92(
5) määritellään voiöljyn
sisältämän sitosterolin ja stigmasterolin määrittämisessä käytettävävertailumenetelmä; tätä menetelmää voidaan soveltaa hiukan muunnel-tuna voin sisältämien steroli-merkkiaineiden määrittämiseksi,
ontarpeenmäärittäämenetelmäntarkkuusjasensallitutpoikkeamat,jatässä asetuksessa säädetyt toimenpiteet ovat maidon ja maitotuotteiden
hallintokomitean lausunnon mukaiset,
ON ANTANUT TÄMÄN ASETUKSEN:
1 artikla
Voin sisältämän stigmasteroli- tai B-sitosterolipitoisuuden määrittämi-
seksi►M1asetuksen (EY) N:o 2571/97 ◄6 artiklan mukaisesti
sovellettava määritysmenetelmä on tämän asetuksen liitteessä.
Voionmerkittyoikein,jossaaduttuloksetvastaavatliitteen8kohdassa
täsmennettyjä vaatimuksia.
2 artikla
Tämäasetustuleevoimaankolmantenapäivänäsenjälkeen,kunseon
julkaistu Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä .
Sitä sovelletaan 1 päivästä huhtikuuta 1994.
Tämäasetusonkaikiltaosiltaanvelvoittava,jasitäsovelletaansellaise-
naan kaikissa jäsenvaltioissa.
(1) EYVL N:o L 148, 28.6.1968, s. 13
(2) EYVL N:o L 215, 30.7.1992, s. 64
(3) EYVL N:o L 55, 1.3.1988, s. 31
(4) EYVL N:o L 273, 5.11.1993, s. 7
(5) EYVL N:o L 399, 31.12.1992, s. 29
1994R0086 — FI — 03.02.1999 — 001.001 — 3
▼B
LIITE
VOIN SISÄLTÄMÄN SITOSTEROLIN TAI STIGMASTEROLIN
MÄÄRITYS KAASUKROMATOGRAFISESTI KAPILLAARIKOLON-
NILLA
1 TARKOITUS JA SOVELTAMISALA
Menetelmässä selostetaan voin sisältämän sitosterolin tai stigmasterolin
kvantitatiivisen määrityksen mahdollistava menettely. Sitosteroli on β-
sitosterolinja22-dihydro- β-sitosterolinsummapidettäessämuitasitoste-
roleitamerkitykseltäänvähäisinä.Tätämenetelmääsovelletaanasetuksen(ETY) N:o 570/88 mukaisesti saatuihin näytteisiin.
2 PERIAATE
Voisaippuoidaankaliumhydroksidinavullaetanoliliuoksessajasaippuoi-
tumattomat osat uutetaan eetterillä.
Sterolitmuutetaantrimetyylisilyylieettereiksijamääritetäänkaasukroma-
tografisesti kapillaarikolonnilla suhteessa sisäiseen standardiin, betulii-niin.
3 VÄLINEISTÖ
3.1 Saippuoimispullo,150ml,varustettunapäistäänhiotullapalautusjäähdyt-
timellä.
3.2 Erotussuppiloita, 500 ml.3.3 Pulloja, 250 ml.3.4 Paineentasauspulloja, 250 ml tai sisällöltään vastaavia, tarkoitettu pois
heitettävän eetterin keräämiseen.
3.5 Lasikolonni, 350 mm × 20 mm, varustettuna sintterilasiliitoksella.3.6 Vesihaude tai tasalämpöinen mantteli.3.7 Reaktiopulloja, 2 ml.3.8 Kaasukromatografialaitteisto, jossa voidaan käyttää kapillaarikolonnia,
varustettuna toimintalaitteistolla, joka koostuu:
3.8.1 termostoidusta kolonniuunista, jossa voidaan ylläpitää haluttu lämpötila
±1 °C tarkkuudella;
3.8.2 lämpötilasäädettävästä injektorista;
3.8.3 liekki-ionisaatiodetektorista ja muuntaja-vahvistimesta;3.8.4 integraattori-piirturista, jota voidaan käyttää muuntaja-vahvistimen
(3.8.3) kanssa.
3.9 Kvartsilasinenkapillaarikolonni,jokaonpäällystettykokonaisuudessaan
BP 1:llä tai vastaavalla aineella tasaisesti 0,25 µmpaksuisella kerrok-sella; kolonnilla on pystyttävä erottamaan lanosterolin ja sitosterolintrimetyylisilyylijohdannaiset.KolonniBP1,pituudeltaan12mjasisähal-kaisijaltaan 0,2 mm, on sopiva.
3.10 Mikroruisku, 1 µl, kärki karkaistua terästä, kaasukromatografiaa varten.
4 REAGENSSIT
Kaikkien reagenssien on oltava hyväksyttyä analyysilaatua. Käytetyn
vedenonoltavatislattuavettätaipuhtaudeltaanvähintäänsitävastaavaa.
4.1 Etanoli, puhtaudeltaan vähintään 95 %.4.2 Kaliumhydroksidi, 60 % liuos, liuotetaan 600 g kaliumhydroksidia
(vähintään 85 %) veteen ja täytetään 1 litraksi vedellä.
4.3 Betuliini, puhtaudeltaan vähintään 99 %.
4.3.1 Betuliiniliuoksia dietyylieetterissä (4.4).
4.3.1.1 Sitosterolin määritykseen käytettävän betuliiniliuoksen pitoisuuden on
oltava 1,0 mg/ml.
1994R0086 — FI — 03.02.1999 — 001.001 — 4
▼B
4.3.1.2 Stigmasterolinmääritykseenkäytettävänbetuliiniliuoksenpitoisuudenon
oltava 0,4 mg/ml.
4.4 Dietyylieetteri, puhtaudeltaan analyysilaatua (ei sisällä peroksideja tai
jäännöksiä).
4.5 Natriumsulfaatti,vedetön,rakeina,kuivattuennalta102 °C:ssa2tunnin
ajan.
4.6 Silylointireagenssi, esimerkiksi TRI-SIL (saatavana yritykseltä Pierce
Chemical Co., Cat N:o 49001) tai vastaava. (VAROITUS: TRI-SIL onsyttyvää,myrkyllistä,syövyttävääjavoiollakarsinogeeninen.Laborato-riohenkilökunnan on tunnettava hyvin TRI-SILiin sovellettavat turvalli-suusohjeet ja heidän on noudatettava välttämättömiä varotoimenpiteitä).
4.7 Lanosteroli.4.8 Sitosteroli, puhtaudeltaan tunnettu, vähintään 90 % (P).
Huomautus 1: Kalibrointiin käytettävien standardiaineiden puhtaus on
määritettävänormalisointimenetelmänavulla.Lähdetäänolettamuksesta,että kaikki näytteessä olevat sterolit esiintyvät kromatogrammissa, ettäpiikkien kokonaispinta-ala edustaa 100 %:sti steroliainesosia ja ettästerolit antavat saman vasteen detektorilla. Järjestelmän lineaarisuus ontarkistettava kyseisillä pitoisuustasoilla.
4.8.1 Sitosterolinstandardiliuos:valmistetaan0,001mg/mltarkkuudellaliuos,
joka sisältää noin 0,5 mg/ml (W
1) sitosterolia (4.8) dietyylieetterissä
(4.4).
4.9 Stigmasteroli, puhtaudeltaan tunnettu, vähintään 90 % (P).4.9.1 Stigmasterolin standardiliuos: valmistetaan 0,001 mg/ml tarkkuudella
liuos,jokasisältäänoin0,2mg/ml(W
1)stigmasterolia(4.9)dietyylieette-
rissä (4.4).
4.10 Seos erotustestiä varten: valmistetaan liuos, joka sisältää 0,05 mg/ml
lanosterolia (4.7) ja 0,5 mg/ml sitosterolia (4.8) dietyylieetterissä (4.4).
5 MENETTELY
5.1 Standardiliuostenvalmistuskromatografiaavarten:lisätäänsisäinenstan-
dardiliuos (4.3.1) sopivaan sterolistandardiliuokseen samanaikaisestisaippuoidun näytteen (5.2.2) kanssa.
5.1.1 Sitosterolin kromatografinen standardiliuos: siirretään 1 ml sitosterolin
standardiliuosta(4.8.1)kahteenreaktiopulloon(3.7)japoistetaaneetterityppivirran avulla. Lisätään 1 ml sisäistä standardiliuosta (4.3.1.1) japoistetaan eetteri typpivirran avulla.
5.1.2 Stigmasterolinkromatografinenstandardiliuos:siirretään1mlstigmaste-
rolin standardiliuosta (4.9.1) kahteen reaktiopulloon (3.7) ja poistetaaneetterityppivirranavulla.Lisätään1mlsisäistästandardiliuosta(4.3.1.2)ja poistetaan eetteri typpivirran avulla.
5.2 Saippuoitumattomien osien valmistus
5.2.1 Sulatetaanvoinäyteenintään35 °Clämpötilassa;sekoitetaansehuolelli-
sesti.
Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noi n 1 g voita (W
2) 150 ml:n pulloon
(3.1). Lisätään 50 ml etanolia (4.1) ja 10 ml kaliumhydroksidiliuosta(4.2).Säädetäänjäähdytinrefluksoivaksijanostetaanlämpötilanoin75°C:seen 30 minuutin ajaksi. Irrotetaan jäähdytin ja annetaan pullon
jäähtyä huoneenlämpötilaan.
5.2.2 Lisätäänpulloon1,0mlsisäistästandardiliuosta(4.3.1.1,josmääritetään
sitosterolia tai 4.3.1.2, jos määritetään stigmasterolia). Sekoitetaanhuolellisesti. Siirretään pullon sisältö kvantitatiivisesti 500 ml:n erotus-suppiloon(3.2).Huuhdellaanpullo50ml:llavettäjatämänjälkeen250ml:lla dietyylieetteriä (4.4). Erotussuppiloa ravistetaan voimakkaasti 2minuutinajanjaannetaanfaasienerottua.Poistetaanalempivesifaasija
1994R0086 — FI — 03.02.1999 — 001.001 — 5
▼B
pestään eetterifaasi ravistellen neljällä peräkkäisellä 100 ml:n määräo-
salla vettä.
Huomautus 2: Emulsionmuodostumisenvälttämiseksionvälttämätöntä,
että kaksi ensimmäistä vedellä tapahtuvaa huuhtelua suoritetaan varoen(10 kertaa käännellen). Kolmannessa huuhtelussa voidaan ravistellavoimakkaasti 30 sekunnin ajan. Jos muodostuu emulsio, se voidaanpoistaa lisäämällä 5-10 ml etanolia. Jos etanolia lisätään, on välttämä-töntä suorittaa kaksi uutta ja voimakasta pesua vedellä.
5.2.3 Kaadetaankirkassaippuatoneetterifaasilasikolonniin(3.5),jokasisältää
30gvedetöntänatriumsulfaattia(4.5).Kerätääneetteri250ml:npulloon(3.3).Lisätäänkiehumakiviäjahaihdutetaanläheskuivaksivesihauteellataitasalämpöisellämanttelillahuolehtienpoistettavienliuottimienkerää-misestä.
Huomautus 3: Jos näytteiden uutteet haihdutetaan kuivaksi liian
korkeassa lämpötilassa, voi tapahtua sterolihäviöitä.
5.3 Trimetyylisilyylieettereiden valmistus
5.3.1 Siirretäänpulloonjäänyteetteriliuos2ml:nreaktiopulloon(3.7)käyttäen
apuna 2 ml:aa eetteriä ja poistetaan eetteri typpivirran avulla. Pestäänpullo kahdella ylimääräisellä 2 ml:n määräosalla eetteriä siirtäen nereaktiopulloon ja poistaen eetteri kummallakin kerralla typen avulla.
5.3.2 Näyte silyloidaan lisäämällä 1 ml TRI-SILiä (4.6). Suljetaan pullo ja
ravistetaan voimakkaasti sen liukenemiseksi. Jos liukeneminen onepätäydellistä, lämmitetään 65-70 °C:seen. Annetaan seistä vähintään 5
minuutinajanenneninjektointiakaasukromatografiin.Standarditsilyloi-daan samalla tavoin kuin näytteet. Erotuskyvyn testaamiseen käytettäväseos (4.10) silyloidaan samalla tavoin kuin näytteet.
Huomautus 4: Silyloinnin on tapahduttava vedettömässä ympäristössä.
Betuliinin epätäydellinen silyloituminen näkyy toisena betuliinipiikinlähellä olevana piikkinä.
Etanolin läsnäolo silyloinnin aikana häiritsee silylointia. Tämä voi olla
seurausta riittämättömästä pesusta uuton aikana. Jos tämä ongelmatoistuu, uuttovaiheeseen voidaan lisätä viides huuhtelu, joka tapahtuuravistellen voimakkaasti 30 sekunnin ajan.
5.4 Analyysi kaasukromatografian avulla.
5.4.1 Toimintaolosuhteiden valinta.
Kaasukromatografi ohjelmoidaan valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Ohjeelliset toimintaolosuhteet ovat seuraavat:
— kolonnin lämpötila: 265 °C
— injektorin lämpötila: 280 °C
— detektorin lämpötila: 300 °C
— kantajakaasun virtausnopeus: 0,6 ml/min— vedyn paine: 84 kPa— ilman paine: 155 kPa— jakosuhde: 10/1-50/1; jakosuhde on optimoitava valmistajan
ohjeidenmukaisestijadetektorinvasteenlineaarisuusonsittenvalidoi-tava kyseiselle pitoisuusalueelle.
Huomautus 5: On erityisen tärkeää, että höyrystymiskammio puhdiste-
taan säännöllisesti.
— injektoitavan aineen määrä: 1 µl TMSE-liuosta.
Järjestelmän annetaan tasapainottua, kunnes saadaan riittävän stabiili
vaste ennen analyysin suorittamista.
Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin
ominaisuuksienmukaisesti,jottasaadaanseuraavatedellytyksettäyttävätkromatogrammit:
1994R0086 — FI — 03.02.1999 — 001.001 — 6
▼B
— sitosterolin piikin on erotuttava riittävästi lanosterolista. Kuvassa 1
esitetääntyypillinenkromatogrammi,jollainenonsaatavaerotustes-tiin käytetystä silyloidusta seoksesta (4.10)
— seuraaviensteroleidensuhteellistenretentioaikojenolisioltavasuun-
nilleen:
kolesteroli 1,0
stigmasteroli 1,3sitosteroli 1,5betuliini 2,5
— betuliinin retentioajan olisi oltava noin 24 minuuttia.
5.4.2 Analyyttinen menettely:
Injektoidaan 1 µl silyloitua standardiliuosta (stigmasterolia tai sitoste-
rolia) ja säädetään integraattorin kalibrointiparametrit.
Injektoidaan uudelleen 1 µl silyloitua standardiliuosta vastekertoimen
määrittämiseksi suhteessa betuliiniin.
Injektoidaan 1 µl silyloitua näyteliuosta ja mitataan piikkien pinta-ala.
Jokaista näytesarjaa on edellettävä ja seurattava standardien injektointi.
Yleisenä sääntönä standardien injektointi voidaan suorittaa näytteen
kuuden injektoinnin sarjan jälkeen.
Huomautus 6: Stigmasterolipiikinintegroinninolisikäsitettäväkuvassa
2b olevassa 1, 2 ja 3 kohdassa osoitettujen pisteiden välinen alue.
Sitosterolipiikinintegroinninolisikatettava22-dihydro- β-sitosterolipiikin
(stigmastanoli),jokaeluoituuvälittömästisitosterolinjälkeen(kuva3b),pinta-ala arvioitaessa sitosterolia kokonaisuudessaan.
6 TULOSTEN LASKEMINEN
6.1 Määritetään sterolipiikkien ja betuliinipiikkien pinta-ala kahdesta stan-
dardista jokaisen sarjan alussa ja lopussa ja lasketaan R
1:
R1=standardin sterolipiikin keskimääräinen pinta-ala
standardin betuliinipiikin keskimääräinen pinta-ala
Määritetäänsterolipiikinpinta-ala(stigmasterolitaisitosteroli)jabetulii-
nipiikin pinta-ala näytteestä ja lasketaan R2:
R2=näytteen sterolipiikin pinta-ala
näytteen betuliinipiikin pinta-ala
W1= standardin sterolipitoisuus (mg) 1 ml:ssa standardiliuosta (4.8.1
tai 4.9.1)
W2= näytteen paino (g) (5.2.1)
P = standardisterolin puhtaus (4.8 tai 4.9)
Näytteen sterolipitoisuus (mg/kg) =R2
R1×W1
W2×P×1 0 .
7 MENETELMÄN TARKKUUS
7.1 Toistettavuus
7.1.1 Stigmasteroli
Kahdenmäärityksen,jotkayksihenkilösuorittaasamaalaitteistoakäyt-
täen mahdollisimman lyhyellä aikavälillä täysin samasta koemateriaa-lista, tulosten välinen ero ei saa olla yli 19,3 mg/kg.
7.1.2 Sitosteroli
Kahdenmäärityksen,jotkayksihenkilösuorittaasamaalaitteistoakäyt-
täen mahdollisimman lyhyellä aikavälillä täysin samasta koemateriaa-lista, tulosten välinen ero ei saa olla yli 23,0 mg/kg.
1994R0086 — FI — 03.02.1999 — 001.001 — 7
▼B
7.2 Uusittavuus
7.2.1 Stigmasteroli
Kahden määrityksen, jotka suoritetaan eri laboratorioissa eri laitteistoja
käyttäentäysinsamastakoemateriaalista,tulostenvälineneroeisaaollayli 31,9 mg/kg.
7.2.2 Sitosteroli
Kahden määrityksen, jotka suoritetaan eri laboratorioissa eri laitteistoja
käyttäentäysinsamastakoemateriaalista,tulostenvälineneroeisaaollayli 8,7 % suhteessa määritysten keskiarvoon.
7.3 Tarkkuustietojen lähde
Tarkkuutta koskevat tiedot on määritetty vuonna 1992 suoritetusta
koejärjestelystä,johonosallistuikahdeksanlaboratoriotajakuusinäytettä(kolme sokeakokeen kaksoisnäytettä) stigmasterolin osalta ja kuusinäytettä (kolme sokeakokeen kaksoisnäytettä) sitosterolin osalta.
8 SALLITUT POIKKEAMAT
▼
M1
8.1 Merkitystätuotteestaonotettavakolmenäytettäsentarkistamiseksi,että
tuote on merkitty oikein.
▼B
8.2 Stigmasteroli
8.2.1 Stigmasterolinosaltalisättävämääräon150gstigmasterolia,puhtaudel-
taan vähintään 95 %, voitonnia kohden eli 142,5 mg/kg; tai 170 gstigmasterolia,puhtaudeltaanvähintään85%,voitonniakohdeneli144,5mg/kg.
▼
M1
8.2.2 Tuoteanalyysinkolmestanäytteestäsaatujentulostenavullatarkistetaan
lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus, ja näiden tulostenpienintä arvoa verrataan seuraaviin raja-arvoihin (kun kriittinen ero95%:n todennäköisyydellä (CrD95) otetaan huomioon):
— 116,0 mg/kg (kun lisätään puhtaudeltaan 95%:sta stigmasterolia
95% pienimmästä lisättävästä määrästä)
— 118,0 mg/kg (kun lisätään puhtaudeltaan 85%:sta stigmasterolia
95% pienimmästä lisättävästä määrästä)
— 81,0mg/kg(kunlisätäänpuhtaudeltaan95%:stastigmasterolia70%
pienimmästä lisättävästä määrästä)
— 82,0mg/kg(kunlisätäänpuhtaudeltaan85%:stastigmasterolia70%
pienimmästä lisättävästä määrästä).
Merkkiaineen pitoisuutta näytteessä, joka antaa pienimmän tuloksen,
käytetääninterpoloinnissaarvojen116,0mg/kgja81,0mg/kgvälillätaiarvojen 118,0 mg/kg ja 82,0 mg/kg välillä.
▼
B
8.3 Sitosteroli
8.3.1 Sitosterolin osalta lisättävä määrä on 600 g sitosterolia, puhtaudeltaan
vähintään 90 %, voitonnia kohden eli 540 mg/kg.
▼M1
8.3.2 Tuoteanalyysinkolmestanäytteestäsaatujentulostenavullatarkistetaan
lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus, ja näiden tulostenpienintä arvoa verrataan seuraaviin raja-arvoihin (kun kriittinen ero95%:n todennäköisyydellä (CrD95) otetaan huomioon):
— 486,0 mg/kg (kun lisätään puhtaudeltaan 90%:sta sitosterolia 95%
pienimmästä lisättävästä määrästä)
1994R0086 — FI — 03.02.1999 — 001.001 — 8
▼M1
— 358,0 mg/kg (kun lisätään puhtaudeltaan 90%:sta sitosterolia 70%
pienimmästä lisättävästä määrästä).
Merkkiaineen pitoisuutta näytteessä, joka antaa pienimmän tuloksen,
käytetään interpoloinnissa arvojen 486,0 mg/kg ja 358,0 mg/kg välillä.
1994R0086 — FI — 03.02.1999 — 001.001 — 9
▼M1

1994R0086 — FI — 03.02.1999 — 001.001 — 10
▼M1

1994R0086 — FI — 03.02.1999 — 001.001 — 11
▼M1