1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 1
Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentointitarkoituksiin.Toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä.
►B KOLMAS KOMISSION DIREKTIIVI,
annettu 27 päivänä huhtikuuta 1972,
yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten
(72/199/ETY)
(EYVL L 123, 29.5.1972, s. 6)
Muutettu:
virallinen lehti
N:o sivu päivämäärä
►M1 Komission direktiivi 81/680/ETY, annettu 30 päivänä heinäkuuta 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2 Komission direktiivi 84/4/ETY, annettu 20 päivänä joulukuuta 1983 L 15 28 18.1.1984
►M3 Komission direktiivi 93/28/ETY, annettu 4 päivänä kesäkuuta 1993 L 179 8 22.7.1993
▼B
KOLMAS KOMISSION DIREKTIIVI,
annettu 27 päivänä huhtikuuta 1972,
yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten
(72/199/ETY)
EUROOPAN YHTEISÖJEN NEUVOSTO, joka
ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen,ottaa huomioon yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmistä rehujen
virallista tarkastusta varten 20 päivänä heinäkuuta 1970 annetunneuvoston direktiivin (
1) ja erityisesti sen 2 artiklan,
sekä katsoo, ettämainitussa direktiivissä säädetään rehujen virallisen tarkastuksen suorit-
tamisesta yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmiä käyttäen sen
tarkastamiseksi, että lakien, asetusten ja hallinnollisten määräystenrehujen laatua ja koostumusta koskevat vaatimukset tulevat täytetyksi,
useita yhteisön määritysmenetelmiä on jo vahvistettu 15 päivänä
kesäkuuta 1971 annetulla komission direktiivillä 71/250/ETY (
2) sekä
18 päivänä marraskuuta 1971 annetulla komission direktiivillä 71/393/ETY (
3); työ on tämän jälkeen edistynyt siinä määrin, että olisi hyväk-
syttävä kolmas ryhmä menetelmiä, ja
tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän rehukomitean
lausunnon mukaiset,
ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:
1 artikla
Jäsenvaltioiden on vaadittava, että rehujen virallisessa tarkastuksessa
niiden tärkkelys-, raakavalkuais- ja pepsiini-suola-happoliukoisenraakavalkuaispitoisuuden sekä vapaan ja kokonaisgossypolipitoisuudensamoin kuin pepsiiniaktiivisuuden määritykset suoritetaan tämän direk-tiivin liitteessä I esitettyjen menetelmien mukaisesti.
2 artikla
Jäsenvaltioiden on vaadittava, että rehujen virallisessa tarkastuksessa
tetrasykliiniryhmän antibioottien toteamis- ja identifiointimäärityksetsekä klooritetrasykliinin, oksitetrasykliinin, tetrasykliinin, oleandomy-siinin, tylosiinin ja virginiamysiinin pitoisuusmääritykset suoritetaan
tämän direktiivin liitteessä II esitettyjen menetelmien mukaisesti.
3 artikla
Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edel-
lyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset voimaanviimeistään 1 päivänä heinäkuuta 1973. Niiden on ilmoitettava tästä
komissiolle viipymättä.
4 artikla
Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 2
(1) EYVL N:o L 170, 3.8.1970, s. 2
(2) EYVL N:o L 155, 12.7.1971, s. 13
(3) EYVL N:o L 279, 20.12.1971, s. 7▼M1
▼B
▼M1
▼B
▼B
LIITE I
1TÄRKKELYKSEN MÄÄRITYS
— Polarimetrinen menetelmä —
1Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää tärkkelyksen ja tärkkelyksen suurimo-
lekyylisten pilkkoutumistuotteiden pitoisuus rehuissa, lukuun ottamatta niitä
rehuja, jotka sisältävät juurikasleikettä, juurikasmassaa, juurikkaan kuivattuja
naatteja tai lehtiä, perunamassaa, kuivahiivaa runsaasti inuliinia (esim.
mukula-artisokkaleike ja -jauho) tai rasvatähteitä.
2Periaate
Menetelmä perustuu kaksoismääritykseen. Ensimmäisessä määrityksessä näyte
käsitellään kuumalla, laimealla suolahapolla. Kun liuos on muuttunut kirk-
kaaksi ja suodatettu, liuoksen optinen kääntökyky mitataan polarimetrisesti.
Toisessa määrityksessä näyte uutetaan 40 % (v/v) etanolilla. Kun suodos on
tehty happamaksi suolahapolla, se on muuttunut kirkkaaksi ja suodatettu,
optinen kääntökyky mitataan kuten ensimmäisessä määrityksessä.
Kun näiden kahden mittauksen erotus kerrotaan tunnetulla kertoimella,
saadaan näytteen tärkkelyspitoisuus.
3Reagenssit
3.1 25 % (w/w) suolahappo, tiheys 1,1263.2 1,128 % (w/v) suolahappo
Konsentraatio on tarkistettava titraamalla 0,1 N natriumhydroksidiliuok-
sella, indikaattorina 0,1 % (w/v) metyylipuna 94 % (v/v) etanolissa.
10 ml vastaa 30,94 ml:aa 0,1 N NaOH:iä.
3.3 Carrez-liuos I: liuotetaan veteen 21,9 g sinkkiasetaattia Zn(CH
3COO)2·
2H2O ja 3 g jääetikkaa. Täytetään 100 ml:ksi vedellä.
3.4 Carrez liuos II: liuotetaan veteen 10,6 g kaliumheksasyanoferraattia
K4(Fe(CN)6)·3 H2O. Täytetään 100 ml:ksi vedellä.
3.5 40 % (v/v) etanoli, tiheys 0,948, 20 ºC.
4Välineistö
4.1 250 ml:n erlenmeyerkolvi, jossa on palautusjäähdytin.
4.2 Polarimetri tai sakkarimetri.
5Menettely
5.1Näytteen esikäsittely
Näyte jauhetaan hienoksi siten, että se läpäisee kokonaan 0,5 mm:n
seulan.
5.2Optisen kokonaiskiertokyvyn (P tai S)määritys (ks. 7.1 Huomautus)
Punnitaan 2,5 g hienoksi jauhettua näytettä 1 mg:n tarkkuudella 100 ml:n
mittapulloon. Lisätään 25 ml suolahappoa (3.2), ravistellaan kunnes
määritettävä näyte on jakaantunut tasaisesti ja lisätään vielä 25 ml suola-
happoa (3.2). Pullo asetetaan kiehuvaan vesihauteeseen ja sitä ravistellaan
voimakkaasti ja yhtäjaksoisesti ensimmäisten kolmen minuutin ajan
kokkaroitumisen estämiseksi. Vesihauteen vesimäärän on oltava riittävän
suuri, jotta haude pysyy kiehuvana kun pullo upotetaan siihen. Pulloa
ravisteltaessa sitä ei saa ottaa pois hauteesta. Tarkalleen 15 minuutin
kuluttua pullo otetaan hauteesta, lisätään 30 ml kylmää vettä ja jäähdy-
tetään välittömästi 20 ºC:een.
Lisätään 5 ml Carrez-liuosta I (3.3) ja ravistellaan yhden minuutin ajan.
Tämän jälkeen lisätään 5 ml Carrez-liuosta II (3.4) ja ravistellaan uudel-
leen yhden minuutin ajan. Täytetään merkkiin vedellä, homogenoidaan ja
suodatetaan. Jos suodos ei ole täysin kirkasta (mikä tapahtuu harvoin),
määritys toistetaan käyttäen suurempaa määrää Carrez-liuoksia I ja II,
esimerkiksi 10 ml.1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 3
▼B
Liuoksen optinen kiertokyky mitataan 200 mm:n putkessa polarimetrillä
tai sakkarimetrillä.
5.340-prosenttiseen etanoliin liukoisten yhdisteiden optisen kiertokyvyn (P ′
tai S ′)määritys
Punnitaan 5 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella 100 ml:n mittapulloon ja
lisätään noin 80 ml etanolia (3.5) (ks. 7.2 Huomautus). Pullon annetaan
seistä 1 tunnin ajan huoneenlämmössä ja tänä aikana sitä ravistellaan
voimakkaasti kuusi kertaa siten, että näyte sekoittuu perusteellisesti
etanoliin. Täytetään merkkiin etanolilla (3.5), homogenoidaan ja suodate-
taan.
Pipetoidaan 50 ml suodosta (= 2,5 g näytettä) 250 ml:n erlenmeyerkol-
viin, lisätään 2,1 ml suolahappoa (3.1) ja ravistellaan voimakkaasti.
Erlenmeyerkolviin kiinnitetään palautusjäähdytin ja kolvi asetetaan kiehu-
vaan vesihauteeseen. Tarkalleen 15 minuutin kuluttua erlenmeyerkolvi
otetaan hauteelta ja sen sisältö siirretään 100 ml:n mittapulloon huuhto-
malla pienellä määrällä kylmää vettä ja jäähdytetään 20 ºC:een.
Tämän jälkeen suoritetaan selkeytys Carrez-liuoksilla I (3.3) ja II (3.4),
täytetään merkkiin vedellä, sekoitetaan, homogenoidaan ja mitataan
optinen kiertokyky 5.2 kohdan toisessa ja kolmannessa alakohdassa esite-
tyllä tavalla.
6Tulosten laskeminen
Tärkkelyspitoisuus prosentteina lasketaan seuraavasti:
6.1Polarimetriset mittaukset
T¨arkkelysprosentti ¼2000 P /C0P0ðÞ
α½/C13820º
D
P = Optinen kokonaiskiertokyky asteina.
P′ = 40 % (v/v) etanoliin liukoisten aineiden optinen
kokonaiskiertokyky asteina.
α½/C13820º
D = puhtaan tärkkelyksen ominaiskiertokyky.
Näinä tekijöinä käytetään seuraavia sovittuja
arvoja:
+ 185,9º: riisitärkkelys,
+ 195,4º: perunatärkkelys,+ 184,6º: maissitärkkelys,+ 182,7º: vehnätärkkelys,+ 181,5º: ohratärkkelys,+ 181,3º: kauratärkkelys,+ 184,0º: muut tärkkelyslajit sekä tärkkelysseokset
rehuseoksissa.
6.2Sakkarimetriset mittaukset
T¨arkkelysprosentti ¼
2000
α½/C13820º
D/C12N/C10;665 ðÞ S/C0S0ðÞ
100¼26;6N S /C0S0ðÞ
α½/C13820º
D
S = Optinen kokonaiskiertokyky sakkarimetrin asteina.
S′ = 40 % (v/v) etanoliin liukoisten aineiden optinen kokonaiskier-
tokyky sakkarimetrin asteina.
N = sellainen sakkaroosin määrä grammoina, joka 100 ml:ssa vettä
ja 200 mm:n kerrospaksuudessa antaa optisen kiertokyvyn,
jonka suuruus on 100 sakkarimetrin astetta. Tämä paino vaih-
telee sakkarimetrityyppien mukaan seuraavasti:
16,29 g ranskalaisella sakkarimetrillä26,00 g saksalaisella sakkarimetrillä20,00 g sekalaisilla sakkarimetrillä,
α½/C138
20º
D= puhtaan tärkkelyksen ominaiskiertokyky (ks. 6.1).1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 4
▼B
6.3.Toistettavuus
Samasta näytteestä tehdyn kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen
ero ei saa ylittää 0,4 % absoluuttisena arvona ilmoitettuna alle 40 %
tärkkelyspitoisuuksien osalta ja 1,1 % suhteellisena arvona ilmoitettuna
40 % tai tätä suurempien tärkkelyspitoisuuksien osalta.
7Huomautuksia
7.1 Kun näyte sisältää yli 6 % karbonaatteja, kalsiumkarbonaatteina lasket-
tuna, on ne ennen optisen kokonaiskiertokyvyn määritystä hajotettava
tarkalleen sopivalla määrällä laimeaa rikkihappoa.
7.2 Paljon laktoosia sisältävien tuotteiden, kuten maitojauheen tai kuoritusta
maidosta valmistetun jauheen, määritystä jatketaan 80 ml:n etanolili-
säyksen (3.5) jälkeen seuraavasti. Palautusjäähdytin kiinnitetään pulloon
ja pullo asetetaan vesihauteelle 50 ºC:een 30 minuutin ajaksi. Annetaan
jäähtyä ja jatketaan määritystä 5.3 kohdassa esitetyllä tavalla.
2RAAKAVALKUAISEN MÄÄRITYS
1Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista laskea Kjeldahlin menetelmän mukaan saadusta
typpipitoisuudesta rehujen raakavalkuaispitoisuus.
2Periaate
Näyte hajotetaan rikkihapolla katalysaattorin läsnä ollessa. Hapan liuos
tehdään emäksiseksi natriumhydroksidiliuoksella. Vapautunut ammoniakki
tislataan ja sidotaan määrättyyn rikkihappomäärään, jonka ylimäärä titrataan
natriumhydroksidiliuoksella.
3Reagenssit
3.1 Kaliumsulfaatti
3.2 Katalysaattori: kupari(II)oksidi CuO, analyysilaatua tai kuparisulfaatti
CuSO4·5H2O, analyysilaatua.
3.3 Sinkki, rakeinen
3.4 Rikkihappo, ρ20= 1,84 g/ml
3.5 Rikkihappo c(½H2SO4) = 0,5 mol/l
3.6 Rikkihappo c(½H2SO4) = 0,1 mol/l
3.7 Metyylipunaindikaattori: 300 g metyylipunaista liuotetaan 100 ml:aan
95 - 96 % etanolia (v/v)
3.8 Natriumhydroksidiliuos (teknisen laadun käyttö mahdollista) = 40 g/
100 ml (m/v: 40 %)
3.9 Natriumhydroksidiliuos c = 0,25 mol/l
3.10 Natriumhydroksidiliuos c = 0,1 mol/l
3.11 Hohkakivijyväsiä, suolahapossa pestyjä ja hehkutettuja
3.12 Asetanilidi (sulamispiste = 114 ºC, N = 10,36 %)
3.13 Typetön sakkaroosi
4Välineistö
Välineet näytteen hajottamista, tislausta ja titrausta varten Kjeldahlin mene-
telmän mukaan.
5Suoritus
5.1Hajotus
Punnitaan 1 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella Kjeldahl-kolviin hajotus-
polttoa varten. Lisätään 15 g kaliumsulfaattia (3.1), sopiva määrä
katalysaattoria (3.2) [0,3 - 0,4 g analyysilaatuista kuparioksidia tai 0,9 -
1,2 g analyysilaatuista kuparisulfaattia], 25 ml rikkihappoa (3.4) ja
muutamia hohkakivijyväsiä (3.11) ja sekoitetaan. Kolvia kuumennetaan
varovasti tarvittaessa ajoittain ravistellen, kunnes massa on hiiltynyt ja
kuohu hävinnyt. Tämän jälkeen kuumennetaan voimakkaammin, kunnes1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 5
▼M3
▼M3
neste kiehuu tasaisesti. Kuumennus on sopiva, jos kiehuva happo tiivistyy
kolvin seinämiin. Kolvin seinämien ylikuumennusta ja orgaanisen
aineksen tarttumista kolvin seinämiin on vältettävä. Kun liuos on muut-
tunut kirkkaaksi ja kirkkaanvihreäksi, keittämistä jatketaan vielä kahden
tunnin ajan. Tämän jälkeen kolvin annetaan jäähtyä.
5.2Tislaus
Kolviin lisätään varovasti riittävä määrä vettä, jotta sulfaatit liukenisivat
täysin. Annetaan jäähtyä ja lisätään muutama sinkkirae (3.3).
Tislauslaitteen keräilyastiaan lisätään oletetun typpipitoisuuden mukaan
tarkalleen 25 ml rikkihappoa (3.5) tai (3.6) ja muutama pisara metyylipu-
naindikaattoria (3.7).
Kolvi yhdistetään tislauslaitteen jäähdyttäjään ja jäähdyttäjän pää upote-
taan keräilyastiassa olevaan liuokseen vähintään 1 cm:n syvyyteen (ks.
8.3 Huomautus). Kolviin lasketaan hitaasti 100 ml natriumhydroksidi-
liuosta (3.8) siten, ettei ammoniakkia katoa (ks. 8.1 huomautus).
Kolvia kuumennetaan siten, että ammoniakki tislautuu kokonaan.
5.3Titraus
Keräilyastiassa oleva rikkihappoylimäärä titrataan käytetyn rikkihapon
normaalisuuden mukaan natriumhydroksidiliuoksella (3.9) tai (3.10),
kunnes loppupiste saavutetaan.
5.4Sokeakoe
Reagenssien typettömyyden varmistamiseksi suoritetaan sokeakoe
(hajotus, tislaus ja titraus) käyttämällä 1 g sakkaroosia (3.13) näytteen
sijasta.
6Tulosten laskeminen
Raakavalkuaispitoisuus lasketaan seuraavalla kaavalla:
V0/C0V1 ðÞ /C2 c/C20;014/C2100/C26;25
m
jossa
V0 = sokeakokeessa kulunut NaOH (3.9 tai 3.10) määrä (ml)
V1 = näytteen titrauksessa kulunut NaOH (3.9 tai 3.10) määrä (ml)
c = natriumhydroksidin (3.9 tai 3.10) normaalisuus (mol/l)m = näytteen massa (g)
7Menetelmän varmistus
7.1Toistettavuus
Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten
välinen ero ei saa ylittää:
— 0,2 %, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, alle 20 % olevien raaka-
valkuaispitoisuuksien osalta,
— 1,0 %, suhteessa korkeimpaan arvoon, välillä 20 - 40 % olevien
raakavalkuaispitoisuuksien osalta,
— 0,4 %, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, yli 40 % olevien pitoisuuk-
sien osalta.
7.2Tarkkuus
Määritys (hajotus, tislaus ja titraus) tehdään 1,5 - 2,0 g:lla asetanilidia
(3.12) ja 1 g:lla sakkaroosia (3.13); 1 g astanilidia kuluttaa 14,80 ml
rikkihappoa (3.5). Saannon on oltava vähintään 99 %.
8Huomautukset
8.1 Voidaan käyttää käsikäyttöistä, puoliautomaattista tai automaattista
välineistöä. Jos liuos joudutaan siirtämään astiasta toiseen hajotuksen ja
tislauksen välillä, siirto on suoritettava siten, ettei häviöitä tapahdu. Jos
tislauslaitteen kolvissa ei ole tiputussuppiloa, lisätään natriumhydroksidi
välittömästi ennen kolvin liittämistä jäähdyttäjään kaataen liuos hitaasti
kolvin seinämää myöten.1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 6
▼M3
8.2 Jos hajotettu tuote kiinteytyy, määritys on aloitettava alusta käyttämällä
suurempaa määrää rikkihappoa (3.4) kuin edellä on mainittu.
8.3 Typpipitoisuudeltaan alhaisille tuotteille keräilykolvissa olevan rikki-
hapon (3.6) määrää voidaan vähentää tarvittaessa 10 tai 15 ml:aan ja
täyttää 25 ml:ksi vettä lisäämällä.
3PEPSIINI-SUOLAHAPPOLIUKOISEN RAAKAVALKUAISEN
MÄÄRITYS
1Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää pepsiini-suolahappoliukoinen raaka-
valkuaismäärä määritellyissä koeolosuhteissa. Se soveltuu kaikkiin rehuihin.
2Periaate
Näytettä pidetään 48 tuntia 40 ºC:ssa pepsiini-suolahappoliuoksessa.
Suspensio suodatetaan ja suodoksen typpipitoisuus määritetään raakavalk-
uaisen määrittämiseksi esitetyn menetelmän mukaan.
3Reagenssit
3.1 Suolahappo, tiheys 1,125
3.2 0,075 N suolahappo3.3 2,0 U/mg pepsiiniä: pepsiiniaktiivisuus määritetään ja tarkastetaan tässä
liitteessä olevan 4 osan mukaisesti.
3.4 Noin 0,02 % pepsiini-suolahappoliuos (w/v) (3.2), vasta valmistettu.
Aktiivisuus: 400 U/l.
3.5 Kuohunestoaine (esim. silikoni).
3.6 Kaikki raakavalkuaismääritysmenetelmää koskevassa 3 kohdassa luetellut
reagenssit.
4Välineistö
4.1 Vesihaude tai lämpökaappi, säädetty 40 ± 1 ºC:een.4.2 Välineistö näytteen hajottamista ja tislausta varten Kjeldahlin menetelmän
mukaan.
5Menettely
5.1Raakavalkuaisen liuottaminen (ks. 7.2 Huomautus)
Punnitaan 2 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella 500 ml:n mittapulloon ja
lisätään 450 ml 40 ºC:een lämmitettyä pepsiini-suolahappoliuosta (3.4).Ravistellaan kokkaroitumisen estämiseksi. Tarkistetaan, että suspension
pH on alle 1,7. Pulloa pidetään vesihauteessa tai lämpökaapissa (4.1) 48
tuntia. Ravistellaan 8, 24 ja 32 tunnin kuluttua. Lisätään 48 tunnin
kuluttua 15 ml suolahappoa (3.1), annetaan jäähtyä 20 ºC:een, täytetään
merkkiin asti vedellä ja suodatetaan.
5.2Hajotus
Otetaan 250 ml suodosta Kjeldahl-kolviin tislausta varten (4.2). Kolviin
lisätään tarvittavat reagenssit kuten raakavalkuaispitoisuutta määritet-
täessä 5.1 kohdan toisessa lauseessa on kuvattu.
Homogenoidaan ja kuumennetaan kiehuvaksi. Jos kuohua muodostuu,
lisätään muutama pisara kuohunestoainetta (3.5). Kiehumisen annetaan
jatkua kunnes vesi on lähes kokonaan haihtunut. Loppuvesi haihdutetaan
kolvia varovaisemmin kuumentamalla. Liuoksen muututtua kirkkaaksi ja
värittömäksi (tai kirkkaanvihreäksi kuparipitoista katalyyttia käytettäessä),
keittämistä jatketaan vielä tunnin ajan. Tämän jälkeen annetaan jäähtyä.
5.3Tislaus ja titraus
Näytteen tislaus ja titraus suoritetaan kuten raakavalkuaispitoisuutta
määritettäessä 5.2 ja 5.3 kohdassa.
5.4Sokeakoe
Sokeakoe suoritetaan samalla tavalla, mutta ilman määritettävää näytettä.1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 7
▼B
▼B
6Tulosten laskeminen
Nollakokeen kuluttama rikkihappomäärä vähennetään näytteen kuluttamasta
rikkihappomäärästä. 1 ml 0,1 N rikkihappoa vastaa 1,4 mg typpeä.
Typen määrä kerrotaan kertoimella 6,25. Tulos ilmoitetaan prosenttina
näytteestä.
Toistettavuus
Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen
ero ei saa ylittää:
— 0,4 %, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, alle 20 % olevien pitoisuuksien
osalta;
— 2,0 %, suhteellisena arvona ilmoitettuna, välillä 20-40 % olevien pitoi-
suuksien osalta;
— 0,8 %, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, yli 40 % olevien pitoisuuksien
osalta.
7Huomautuksia
7.1 Tällä menetelmällä saaduilla arvoilla ei ole suoraa yhteyttä sulavuuteen in
vivo-olosuhteissa.
7.2 Kun rehunäytteiden raakarasvapitoisuus on yli 10 %, on rasva ensin pois-
tettava petroolieetteriuutolla (kp. 40-60 ºC).
4PEPSIINIAKTIIVISUUDEN MÄÄRITYS
1Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää sellaisen pepsiinin aktiivisuus, jota
käytetään pepsiini-suolahappoliukoista raakavalkuaista määritettäessä.
2Periaate
Hemoglobiini käsitellään pepsiinillä ja laimealla suolahappoliuoksella
määritellyissä olosuhteissa. Valkuaisaineen hydrolysoitumaton osa saostetaan
trikloorietikkahapolla. Suodokseen lisätään natriumhydroksidi ja Folin-
Ciocalteu-reagenssi. Tämän liuoksen optinen tiheys mitataan 750 nm:ssa ja
vastaava tyrosiinin määrä luetaan kalibrointikäyrältä.
Määritelmä: Pepsiiniyksikkö määritellään sellaisena entsyymimääränä, joka
koeolosuhteissa vapauttaa minuutissa sellaisen määrän hydroksiaryyliryhmiä,
että niiden värjäys Folin-Ciocalteau-reagenssilla antaa optisen tiheyden, joka
saadaan samoissa olosuhteissa yhdestä mikromoolista tyrosiinia.
3Reagenssit
3.1 0,2 N suolahappo.
3.2 0,06 N suolahappo.3.3 0,025 N suolahappo.
3.4 5 % trikloorietikkahappoliuos (w/v).
3.5 0,5 N natriumhydroksidiliuos.3.6 Folin-Ciocalteau-reagenssi. Punnitaan 100 g natriumwolframaattia
(Na
2WO4·2H2O), 25 g natriummolybdaattia (Na2MoO4·2H2O) ja
700 ml vettä hiokselliseen 2 l:n pyörökolviin. Lisätään 50 ml fosfori-
happoa (tiheys 1,71) ja 100 ml väkevää suolahappoa (tiheys 1,19),
yhdistetään pystyjäähdyttäjään, kuumennetaan kiehuvaksi ja keitetään
varovasti 10 tuntia. Annetaan jäähtyä, irrotetaan pystyjäähdyttäjä, lisätään
175 g litiumsulfaattia (Li2SO4·2H2O), 50 ml vettä ja 1 ml bromia.
Keitetään 15 minuuttia bromiylimäärän poistamiseksi.
Annetaan jäähtyä, siirretään liuos 1 litran mittapulloon, täytetään merk-
kiin vedellä, homogenoidaan ja suodatetaan. Liuokseen ei saa jäädä
vihertävää väriä. Ennen käyttöä yksi tilavuusosa reagenssiliuosta laimen-
netaan kahdella tilavuusosalla vettä.
3.7 Hemoglobiiniliuos: Punnitaan 354 mg:aa typpeä (1) vastaava määrä hemo-
globiinia (noin 2 g), proteaasisubstraatti Ansonin mukaan 200 ml:n1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 8
(1) Typpipitoisuus määritetään Kjeldahl-puolimikromenetelmällä (teoreettinen pitoisuus
17,7 % N).
▼B
hiokselliseen kolviin. Lisätään muutama ml suolahappoa (3.2), yhdis-
tetään kolvi imupumppuun ja ravistellaan kunnes hemoglobiini on täysin
liuennut. Vakuumi päästetään pois ja lisätään samalla ravistellen suola-
happoa (3.2) siten, että liuostilavuudeksi tulee 100 ml. Valmistetaan
juuri ennen käyttöä .
3.8 Tyrosiinistandardiliuos: Punnitaan 181,2 mg tyrosiinia 1 l mittapulloon,
liuotetaan suolahappoon (3.1) ja täytetään 1 merkkiin samalla hapolla
(kantaliuos). Otetaan 20,0 ml liuosta ja laimennetaan 100 ml:ksi suolaha-
polla (3.1). 1 ml tätä liuosta sisältää 0,2 mikromoolia tyrosiinia.
4Välineistö
4.1 Termostaattinen vesihaude, asetettu 25 ºC ± 0,1 ºC.4.2 Spektrofotometri.4.3 Kronometri, tarkkuus: 1 sekunti.4.4 pH-mittari.
5Menettely
5.1Liuoksen valmistus (ks. 7.1 Huomautus)
Liuotetaan 150 mg pepsiiniä 100 ml:aan suolahappoa (3.2). Pipetoidaan
2 ml tätä liuosta 50 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin suolahapolla
(3.3). Liuoksen pH:n tulee olla 1,6 ± 0,1 pH-mittarilla tarkistettuna. Pullo
asetetaan vesihauteeseen (4.1).
5.2Hydrolysointi
Koeputkeen pipetoidaan 5,0 ml hemoglobiiniliuosta (3.7), siirretään
25 ºC:een vesihauteeseen (4.1), lisätään 1,0 ml kohdassa 5.1 saatua
pepsiiniliuosta ja sekoitetaan noin 10 kertaa edestakaisin lasipuikolla.
Koeputki pidetään vesihauteessa 25 ºC:ssa tasan 10 minuutin ajan pepsii-
nilisäyksestä (aikaa ja lämpötilaa on noudatettava tarkalleen). Tämän
jälkeen lisätään 10,0 ml 25 ºC:ssa olevaa trikloorietikkahappoliuosta
(3.4), homogenoidaan ja suodatetaan kuivan suodatinpaperin läpi.
5.3Värin kehitys ja optisen tiheyden mittaus
Pipetoidaan 5,0 ml suodosta 50 ml:n erlenmeyeriin, lisätään 10,0 ml
natriumhydroksidiliuosta (3.5) ja koko ajan ravistellen 3,0 ml laimeaa
Folin-Ciocalteau-reagenssia (3.6). 5-10 minuuttia kuluttua liuoksen
optinen tiheys spektrometrissä 750 nm:ssa vettä vastaan 1 cm kyvetissä.
5.4Sokeakoe
Jokaisen määrityksen yhteydessä on suoritettava sokeakoe seuraavalla
tavalla.
Koeputkeen pipetoidaan 5,0 ml hemoglobiiniliuosta (3.7) ja se asetetaan
vesihauteelle (4.1) 25 ºC:een, lisätään 10,0 ml 25 ºC:ssa olevaa trikloor-
ietikkahappoliuosta (3.4), homogenoidaan ja lisätään edelleen 1,0 ml 5.1
kohdassa saatua pepsiiniliuosta. Sekoitetaan lasipuikolla ja asetetaan
koeputki vesihauteelle (4.1) 25 ºC:een tasan 10 minuutiksi. Homogenoi-
daan ja suodatetaan kuivan suodatinpaperin läpi. Suoritusta jatketaan 5.3
kohdassa esitetyllä tavalla.
5.5Kalibrointikäyrä
Pipetoidaan 50 ml:n erlenmeyerpulloihin 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 ja 5,0 ml tyro-
siinistandardiliuosta (3.8), jotka vastaavat 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 ja 1,0
mikromoolia tyrosiinia. Sarja täydennetään näytteellä, joka ei sisällä
tyroksiinia. Tilavuudet säädetään 5,0 ml:ksi suolahapolla (3.1). Lisätään
10,0 ml natriumhydroksidiliuosta (3.5) ja koko ajan sekoittaen 3,0 ml
laimeaa Folin-Ciocalteaureagenssia (3.6). Mitataan optinen tiheys 5.3
kohdan viimeisessä lauseessa esitetyllä tavalla. Kalibrointikäyrä laaditaan
piirtämällä optisia tiheyksiä ja näitä vastaavia tyrosiinimääriä esittävä
kuvaaja.
6Tulosten laskeminen
Värillisen liuoksen optista tiheyttä vastaava ja sokeakokeella korjattu tyrosii-
nimäärä millimooleina määritetään kalibrointikäyrältä.
Pepsiinin aktiivisuus mikromooleina tyrosiinia milligrammaa ja minuuttia
kohden lasketaan seuraavalla kaavalla:1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 9
▼B
Yksikk¨ oj¨a milligrammassa U =mgðÞ ¼0;32 a
p
jossa:
a = tandardisuoralta saatu tyrosiinimäärä mikromooleina
p = isätyn pepsiinimäärän paino milligrammoina (5.2 kohta)
7Huomautuksia
7.1 Liuotettavan pepsiinin määrän on oltava sellainen, että spektrofotometri-
sessä mittauksessa optiseksi tiheydeksi saadaan 0,35 ± 0,035.
7.2 Menetelmällä saadut kaksi yksikköä milligrammassa vastaavat:
3.64 milliAnsonyksikköä/mg (mikromoolia tyrosiinia/mg min 35,5 ºC:ssa)
tai
36 400 kaupallista yksikköä/g (mikromoolia tyrosiinia/g 10 min
35,5 ºC:ssa).
5VAPAAN GOSSYPOLIN JA KOKONAISGOSSYPOLIN MÄÄRITYS
1Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää vapaan gossypolin, kokonaisgossy-
polin ja niitä kemiallisesti lähellä olevien aineiden määrä
puuvillansiemenistä, puuvillansiemenjauhosta ja puuvillansiemenkakusta sekä
niitä sisältävistä rehuseoksista. Määrityksen alaraja on 20 mg/kg.
2Periaate
Gossypoli uutetaan 3-amino-1-propanolin läsnäollessa joko isopropanolin ja
heksaanin seoksella vapaan gossypolin määrittämiseksi tai dimetyyliformami-
dilla kokonaisgossypolin määrittämiseksi. Gossypoli muutetaan aniliinilla
gossypolidianiliiniksi, jonka optinen tiheys mitataan 440 nm:ssa.
3Reagenssit
3.1 Isopropanoli-heksaaniseos: sekoitetaan 60 tilavuusosaa isopropanolia,
analyysilaatua, ja 40 tilavuusosaa n-heksaania.
3.2 Liuotinseos A: Lisätään noin 500 ml isopropanoli-heksaani-seosta (3.1),
2 ml 3-amino-1-propanolia, 8 ml jääetikkaa ja 50 ml vettä 1 litran mitta-
pulloon. Mittapullo täytetään merkkiin isopropanoli-heksaani-seoksella
(3.1). Säilyy yhden viikon ajan.
3.3 Liuotinseos B: Pipetoidaan 2 ml 3-amino-1-propanolia ja 10 ml
jääetikkaa 100 ml:n mittapulloon. Annetaan jäähtyä huoneenlämpöön ja
täytetään merkkiin N,N-dimetyyliformamidilla. Säilyy yhden viikon ajan.
3.4 Aniliini, analyysilaatua: jos sokeakokeessa saatu optinen tiheys on yli
0,022 , aniliini on tislattava sinkkijauheen päältä siten, että tisleestä
jätetään pois 10 % sekä alku- että loppufraktiota. Suljetussa ruskeassa
lasipullossa kylmässä säilytettynä reagenssiliuos säilyy useiden kuukau-
sien ajan.
3.5 Gossypoli-standardiliuos A: Punnitaan 27,9 mg gossypoliasetaattia
250 ml:n mittapulloon. Liuotetaan liuotinseokseen A, täytetään merkkiin
samalla liuotinseoksella (3.2). Pipetoidaan 50 ml tätä seosta 250 ml:n
mittapulloon, joka täytetään merkkiin liuotinseoksella A. Tämän liuoksen
gossypolikonsentraatio on 0,02 mg/ml. Annetaan seistä yhden tunnin ajan
huoneenlämmössä ennen käyttöä.
3.6 Gossypoli-standardiliuos B: Punnitaan 27,9 mg gossypoliasetaattia 50 ml:n
mittapulloon. Liuotetaan liuotinseokseen B ja täytetään merkkiin samalla
liuotinseoksella (3.3). Tämän liuoksen gossypolikonsentraatio on 0,5 mg/
ml.
Gossypolin standardiliuokset A ja B säilyvät 24 tuntia valolta suojattuina.
4Välineistö
4.1 Mekaaninen sekoittaja: noin 35 kierr./min.
4.2 Spektrofotometri.1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 10
▼B
5Menettely
5.1Näytteen punnitusmäärä
Punnitusmäärä riippuu näytteen oletetusta gossypolipitoisuudesta. On
suositeltavaa käyttää pientä punnitusmäärää ja suhteellisen suurta
suodosmäärää, jotta gossypolin määrä saataisiin riittävän suureksi spek-
trofotometrisen mittauksen suorittamiseen. Näytekoko ei saisi ylittää 1 g
määritettäessä vapaan gossypolin pitoisuutta puuvillansiemenistä, puuvil-
lansiemenjauhosta tai puuvillansiemenkakusta. Jos määritys tapahtuu
rehuseoksesta, näytekoko voi olla jopa 5 g. Useimmissa tapauksissa
riittää 10 ml suodosta. Suodoksen tulisi sisältää 50-100 µg gossypolia.
Kokonaisgossypolin määrittämiseen punnitusmäärän tulisi olla 0,5-5 g
siten, että 2 ml:n määrä suodosta sisältää 40-200 µg gossypolia.
Määritys on suoritettava noin 20ºC:n huoneenlämmössä.
5.2Vapaan gossypolin määritys
Sopiva määrä näytettä punnitaan hiokselliseen, lasitulpalla suljettavaan
250 ml:n keittokolviin, jonka pohjalla on lasimurskaa. Lisätään pipetillä
kolviin 50 ml liuotinseosta A (3.2), suljetaan kolvi tulpalla ja sekoitetaan
yhden tunnin ajan sekoittajassa. Suodatetaan kuivan suodatinpaperin läpi
pieneen, hiokselliseen kolviin. Suodatinsuppilo peitetään kellolasilla
suodatuksen ajaksi. Pipetoidaan kahteen 25 ml:n mittapulloon (A ja B)
sama määrä suodosta, joka sisältää 50-100 µg gossypolia. Tarvittaessa
tilavuus täydennetään 10 ml:ksi liuotinseoksella A (3.2). Tämän jälkeen
mittapullo (A) täytetään merkkiin isopropanoli-heksaaniseoksella (3.1).
Tätä liuosta käytetään referenssiliuoksena näyteliuoksen mittauksessa.
Pipetoidaan 10 ml liuotinseosta A (3.2) kahteen 25 ml:n mittapulloon (C
ja D). Toinen mittapullo (C) täytetään merkkiin isopropanoli-heksaani-
seoksella (3.1). Tätä liuosta käytetään referenssiliuoksena
nollakoeliuoksen mittauksessa.
Pipetoidaan mittapulloihin D ja B 2 ml aniliiniliuosta (3.4). Lämmitetään
30 minuuttia kiehuvalla vesihauteella värin muodostumiseksi. Annetaan
jäähtyä huoneenlämpöön, täytetään merkkiin isopropanoli-heksaani-seok-
sella (3.1), homogenoidaan ja annetaan seistä yhden tunnin ajan.
Mitataan sokeakoeliuoksen (D) optinen tiheys spektrometrillä 440 nm:ssa
1 cm:n lasikyvetissä referenssiliuosta (C) vastaan, ja näyteliuoksen (B)
optinen tiheys vertailuliuosta (A) vastaan.
Sokeakoeliuoksen optinen tiheys vähennetään näyteliuoksen optisesta
tiheydestä (= korjattu optinen tiheys). Tästä arvosta lasketaan vapaan
gossypolin pitoisuus 6 kohdassa kuvatulla tavalla.
5.3Kokonaisgossypolin määritys
Näytemäärä, joka sisältää 1-5 mg gossypolia, punnitaan 50 ml:n mittapul-
loon ja siihen lisätään 10 ml liuotinseosta B (3.3). Samanaikaisesti
valmistetaan sokeakoeliuos pipetoimalla 10 ml liuotinseosta B (3.3)
toiseen 50 ml:n mittapulloon. Molemmat mittapullot asetetaan kiehuvalle
vesihauteelle 30 minuutin ajaksi. Annetaan jäähtyä huoneenlämpöön ja
täytetään merkkiin isopropanoli-heksaani-seoksella (3.1). Homogenoidaan
ja annetaan seistä 10-15 minuuttia, suodatetaan hioksellisiin pulloihin.
Sekä suodatettua näyteliuosta että suodatettua sokeakoeliuosta pipetoi-
daan 2 ml 25 ml:n mittapulloihin. Toinen näyteliuosta ja toinen
sokeakoeliuosta sisältävä mittapullo täytetään merkkiin isopropanoli-
heksaaniseoksella (3.1). Näitä liuoksia käytetään vertailuliuoksina.
Jäljelle jääneeseen kahteen mittapulloon lisätään 2 ml aniliiniliuosta (3.4).
Lämmitetään 30 minuutin ajan kiehuvalla vesihauteella värin kehittymi-
seksi. Annetaan jäähtyä huoneenlämpöön, täytetään merkkiin
isopropanoli-heksaaniseoksella (3.1), homogenoidaan ja annetaan seistä
yhden tunnin ajan.
Optinen tiheys mitataan kuten vapaan gossypolin optinen tiheys 5.2
kohdan mukaan. Tästä arvosta lasketaan kokonaisgossypolipitoisuus 6
kohdassa esitetyllä tavalla.
6Tulosten laskeminen
Tulosten laskeminen voidaan suorittaa ominaista optista tiheyttä (6.1 kohta)
tai kalibrointikäyrää (6.2 kohta) käyttäen.1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 11
▼B
6.1Ominaisesta optisesta tiheydestä
Ominainen optinen tiheys on annetuissa olosuhteissa
Vapaalle gossypolille E1%
1c m¼625
Kokonaisgossypolille E1%
1c m¼600
Vapaan tai kokonaisgossypolin pitoisuus saadaan kaavasta:
% gossypolia ¼E/C11250
E1%
1c m/C1p/C1a
jossa:
E = korjattu optinen tiheys määritettynä 5.2 kohdan mukaan
p = punnittu näytemäärä grammoina
a = suodosmäärä millilitroina.
6.2Kalibrointikäyrän avulla
6.2.1 Vapaa gossypoli
Valmistetaan kaksi viiden 25 ml:n mittapullon sarjaa. Molempiin
sarjoihin pipetoidaan 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 ja 10,0 ml gossypolistandar-diliuosta A (3.5) ja tilavuus täydennetään 10 ml:ksi liuotinseoksella
A (3.2). Molempiin sarjoihin otetaan mukaan 25 ml:n mittapullo,
joka sisältää vain 10 ml liuotinseosta A (3.2) (sokeakoe).
Toinen sarja mittapulloja täytetään merkkiin isopropanoli-heksaani-
seoksella (3.1) (vertailusarja).
Toiseen mittapullosarjaan, sokeakoe mukaan lukien, lisätään 2 ml
aniliiniliuosta (3.4). Lämmitetään 30 minuuttia kiehuvalla vesihau-
teella värin kehittämiseksi. Annetaan jäähtyä huoneenlämpöön,
täytetään merkkiin isopropanoli-heksaani-seoksella (3.1), homoge-
noidaan ja annetaan seistä yhden tunnin ajan (standardisarja).
Mitataan 5.2 kohdassa mainituissa olosuhteissa standardisarjan
liuosten optinen tiheys vertailusarjan vastaavia liuoksia vastaan.
Kalibrointikäyrä laaditaan piirtämällä optisia tiheyksiä ja näitä
vastaavia gossypolimääriä (mikrogrammoina) esittävä kuvaaja.
6.2.2 Kokonaisgossypoli
Valmistetaan kuuden 50 ml:n mittapullon sarja. Ensimmäiseen
pipetoidaan 10 ml liuotinseosta B (3.3) ja muihin 2,0; 4,0; 6,0; 8,0
ja 10,0 ml gossypolistandardiliuosta B (3.6). Pullojen tilavuus
säädetään 10 ml:ksi liuotinseoksella B (3.3). Lämmitetään kiehu-
valla vesihauteella 30 minuuttia. Annetaan jäähtyä
huoneenlämpöön, täytetään merkkiin isopropanoli-heksaani-seok-
sella (3.1) ja homogenoidaan.
Kuhunkin kahden sarjan kuuteen 25 ml:n mittapulloon pipetoidaan
2,0 ml tätä liuosta. Ensimmäisen sarjan pullot täytetään 25 ml:ksi
isopropanoli-heksaani-seoksella (3.1) (vertailusarja).
Kuhunkin toisen sarjan mittapulloon lisätään 2 ml aniliiniliuosta
(3.4). Lämmitetään 30 minuuttia kiehuvalla vesihauteella. Annetaan
jäähtyä huoneenlämpöön, täytetään merkkiin isopropanoli-heksaani-
seoksella (3.1), homogenoidaan ja annetaan seistä yhden tunnin
ajan (standardisarja).
Mitataan 5.2 kohdassa mainituissa olosuhteissa standardisarjan
liuosten optinen tiheys vertailusarjan vastaavia liuoksia vastaan.
Kalibrointikäyrä laaditaan piirtämällä optisia tiheyksiä ja näitä
gossypolimääriä (mikrogrammoina) esittävä kuvaaja.
6.3Toistettavuus
Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten
välinen ero ei saa ylittää:
— 15 %, suhteellisena arvona ilmoitettuna, alle 500 mg/kg olevien
gossypolipitoisuuksien osalta,
— 75 mg/kg, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, välillä 500-750 mg/kg
olevien pitoisuuksien osalta,1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 12
▼B
— 10 %, suhteellisena arvona ilmoitettuna, yli 750 mg/kg olevien pitoi-
suuksien osalta.1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 13
▼B
LIITE II
1TETRASYKLIINIRYHMÄN ANTIBIOOTTIEN OSOITTAMINEN JA
TUNNISTAMINEN
1Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista havaita ja tunnistaa tetrasykliiniryhmän anti-
biootteja rehuissa, jotka sisältävät vähintään 0,1 miljoonasosaa antibiootteja,
konsentraateissa ja esiseoksissa.
2Periaate
Näyte uutetaan metanolin ja suolahapon seoksella. Uutteelle ja vertailuun
käytettäville referenssiliuoksille suoritetaan nouseva paperikromatografia.
Antibiootit havaitaan ja tunnistetaan vertaamalla niiden rf-arvoja standardiai-
neiden arvoihin joko UV-valossa havaittavalla fluoresenssilla (suuret
antibioottipitoisuudet) tai bioautografialla B. cereuksella ympätyllä agarkasva-
tusalustalla.
3Reagenssit ja kasvatusliuos
3.1Puskuriliuos, pH 3,5
Sitruunahappomonohydraatti, analyysilaatua 10,256 g
Dinatriumvetyfosfaatti Na2HPO4·2H2O,
analyysilaatua7,45 g
Asetoni, analyysilaatua 300 ml
Tislattu vesi, täytetään 1 000 ml
3.2Fosfaattipuskuriliuos, pH 5,5
Kaliumdivetyfosfaatti KH2PO4, analyysilaatua 130,86 g
Dinatriumvetyfosfaatti Na2HPO4·2H2O,
analyysilaatua6,947 g
Tislattu vesi, täytetään 1 000 ml:ksi
3.3 Eluointiliuos I: nitrometaani (purum)/kloroformi (purum)/1,3-dikloori-
2-propanoli (-dikloorihydriini) -seos, tilavuussuhteet
20/10/1,5, valmistetaan välittömästi ennen käyttöä.
3.4 Eluointiliuos II: nitrometaani (purum)/kloroformi (purum)/2-pikoliini:
tilavuussuhteet 20/10/3. Valmistetaan välittömästi
ennen käyttöä.
3.5 Metanoli (purum)/suolahappo (tiheys 1,19) -seos: tilavuussuhteet: 98/2.
3.6 0,1 N suolahappo.
3.7 Ammoniakki, tiheys 0,91.3.8 Standardiyhdisteet: klooritetrasykliini, oksitetrasykliini ja tetrasykliini,
joiden aktiivisuus ilmoitetaan hydrokloridina.
3.9Mikro-organismi: B. cereus ATCC N:o 11 778
Lähtökannan kasvatus, itiösuspension valmistus ja kasvatusliuoksen
ymppäys: noudatetaan ohjeita, jotka on annettu tämän liitteen 2 osassa
kuvatun klooritetrasykliini-, oksitetrasykliini- ja tetrasykliinipitoisuuk-
sien agardiffuusiomääritysmenetelmän 3.1 ja 3.2 kohdissa.
3.10Kasvatusalusta (
1)
Glukoosi 1 g
Peptoni 10 g
Lihauute 1,5 g1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 14
(1) Voidaan käyttää mitä tahansa vastaavan koostumuksen omaavaa kaupallisesti saatavilla
olevaa kasvatusalustaa, jolla saadaan vastaavat tulokset.
▼B
Hiivauute 3 g
Agar 20 g
Tislattu vesi, täytetään 1 000 ml:ksi
Säädetään pH arvoon 5,8 välittömästi ennen käyttöä
3.11 liuos, jonka koostumus on 0,1 % (w/v) 2,3,5-trifenyylitetratsoliumklor-
idia ja 5 % (w/v) glukoosia.
4Välineistö
4.1 Laite nousevaa paperikromatografiaa varten (paperin korkeus: 25 cm).
Schleicher & Schüll -paperi (2040 b tai 2043 b) tai tätä vastaava paperi.
4.2 Sentrifugi.4.3 Inkubaattori, joka on asetettu 30 ºC:een.
4.4 UV-lamppu fluoresenssin havaitsemiseen.
4.5 Lasilevyjä, joiden koko on noin 20 × 30 cm, bioautografiaa varten.
5Standardiliuokset
5.1Kantaliuokset
Suolahappoa (3.6) käyttäen valmistetaan standardiyhdisteistä (3.8)
liuokset, joiden konsentraatiot vastaavat 500 µg/ml klooritetrasykliini-
HCl:ää, oksitetrasykliini-HCl:ää ja tetrasykliini-HCl:ää.
5.2Referenssiliuokset UV-valossa tehtävää tarkastusta varten
Laimennetaan liuokset (5.1) fosfaattipuskuriliuoksella (3.2), jotta saadaan
liuokset, joiden konsentraatiot vastaavat 100 µg/ml klooritetrasykliini-
HCl:ää, oksitetrasykliini-HCl:ää ja tetrasykliini-HCl:ää.
5.3Referenssiliuokset bioautografialla tehtävää tarkastusta varten
Laimennetaan liuokset (5.1) fosfaattipuskuriliuoksella (3.2), jotta saadaan
liuokset, joiden konsentraatiot vastaavat 5 µg/ml klooritetrasykliini-
HCl:ää, oksitetrasykliini-HCl:ää ja tetrasykliini-HCl:ää.
6Uutto
Kun otaksuttu antibioottipitoisuus on alle 10 mg/kg, voidaan käyttää joko
sekoitettua näytettä tai seulomalla erotettua hienojakoisinta fraktiota, koska
antibiootteja tavataan pääasiassa tästä fraktiosta.
Näyte suspendoidaan seokseen (3.5) ja sentrifugoidaan. Supernatantti otetaan
talteen ja tätä käytetään suoraan tai se laimennetaan tarvittaessa seoksella
(3.5), jotta saataisiin antibioottikonsentraatiot, jotka ovat noin 100 µg/ml
(6.1) ja 5 µg/ml (6.2).
7Toteaminen ja tunnistus
7.1Kromatografia
Paperi upotetaan puskuriliuokseen, jonka pH on 3,5 (3.1). Ylimääräinen
neste poistetaan puristamalla paperia kuivien suodatinpaperiarkkien
välissä. Tämän jälkeen paperille viedään0,01 ml:n tilavuudet referenssi-
liuoksia (5.2 ja 5.3) ja uutetta (6.1 ja 6.2). Hyvä erottuminen vaatii
paperin oikean kosteuspitoisuuden; tarvittaessa paperin annetaan hieman
kuivahtaa.
Kehitys tapahtuu nousevalla kromatografialla. Käytetään eluointiliuosta I
(3.3) bioautografialla tapahtuvan havaitsemisen ollessa kyseessä ja
eluointiliuosta II (3.4) UV-valossa tapahtuvan havaitsemisen ollessa
kyseessä. Kun liuotinrintama on noussut 15-20 cm (noin 1 tunti 30
minuuttia), kromatografia lopetetaan ja paperi kuivataan.
7.2UV-valossa tehtävä tarkastus
Antibioottitason ollessa yli 1 µg/cm
2voidaan kromatogrammin ammo-
niakkihöyrykäsittelyn (3.7) jälkeen UV-lampulla (4.4) säteilytettäessä
havaita kullankeltaisia fluoresoivia täpliä.1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 15
▼B
7.3Bioautografialla tehtävä tarkastus
Etukäteen B. cereuksella (3.9) ympätyt kasvatusalustat (3.10) kaadetaan
lasilevyille (4.5) ja paperi asetetaan kasvatusalustalle. Sen jälkeen, kun
paperi on ollut kosketuksessa 5 minuuttia, se nostetaan pois ja asetetaan
kasvatusalustan toiseen kohtaan, johon se jätetään inkuboinnin ajaksi.
Inkuboidaan yön yli 30 ºC:ssa. Tetrasykliiniryhmän antibiootin esiin-
tyessä sameaan kasvatusalustaan ilmaantuu kirkkaita
inhibitiovyöhykkeitä.
Kromatogrammin kiinnittämiseksi sumutetaan paperi inkuboinnin jälkeen
liuoksella (3.11).
7.4Tunnistus
Seuraavana on esitetty tetrasykliiniryhmän antibioottien suhteelliset rf-
arvot. Nämä arvot voivat vaihdella hieman paperin laadun ja kosteuspitoi-
suuden mukaan:
Klooritetrasykliini (CTC) 0,60
Tetrasykliini (TC) 0,40
Oksitetrasykliini (OTC) 0,20
4-Epi-CTC 0,154-Epi-TC 0,13
4-Epi-OTC 0,10
”Epi”-yhdisteiden antibioottinen aktiivisuus on pienempi kuin normaalien
yhdisteiden.
2KLOORITETRASYKLIININ, OKSITETRASYKLIININ JA TETRA-
SYKLIININ MÄÄRITYS KASVATUSALUSTALLA
A DIFFUUSIOLLA AGARALUSTASSA
1Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää klooritetrasykliinin (CTC), oksitetra-
sykliinin (OTC) ja tetrasykliinin (TC) pitoisuudet rehuissa, konsentraateissa
ja esiseoksissa. Määrityksen alaraja on 5 mg/kg. Alle 5 mg/kg olevat pitoi-
suudet voidaan arvioida graafisella interpoloinnilla.
2Periaate
Jos pitoisuus on 50 mg/kg tai tätä pienempi, uutetaan näyte laimealla forma-
midilla. Jos pitoisuus on yli 50 mg/kg, uutetaan näyte asetonin, veden ja
suolahapon seoksella CTC:n määrityksen osalta ja metanolin ja suolahapon
seoksella OTC:n ja TC:n osalta.
Tämän jälkeen uutteet laimennetaan ja niiden antibioottinen aktiivisuus
määritetään mittaamalla CTC:n, OTC:n tai TC:n diffuusio agaralustalla, johon
on ympätty B. cereusta . Diffuusio mitataan inhibitiovyöhykkeinä mikro-orga-
nismin läsnäollessa. Näiden vyöhykkeiden läpimitta on suoraan verrannollinen
antibioottikonsentraation logaritmiin.
3Mikro-organismi: B.cereus, ATCC N:o 11 778
3.1Kantaviljelmän kasvatus
B. cereus ympätään putkiin, jotka sisältävät kasvatusalustasta (4.1) ilman
metyleenisinistä ja boorihappoa valmistettuja agarvinopintoja. Inkuboi-
daan yön yli noin 30 ºC:ssa. Säilytetään jääkaapissa ja siirrostetaan
uudelleen joka toinen viikko.
3.2Itiösuspension valmistus
Agarvinopinnasta (3.1) kasvusto huudellaan 2-3 ml:lla fysiologista ruoka-
suolaliuosta (4.5). Suspensio siirrostetaan Roux-pulloon, joka sisältää
300 ml kasvatusliuosta (4.1), ilman metyleenisinistä ja boorihappoa ,ja
jonka agarkonsentraatio on 3-4 %. Inkuboidaan 3-5 päivää 28-30 ºC:ssa
ja suoritetaan itiöiden mikroskooppinen tarkistus. Kasvusto huuhdotaan
15 ml:aan etanolia (4.6) ja homogenoidaan. Suspensiota voidaan säilyttää
jääkaapissa vähintään 5 kuukautta.
Maljoilla, joissa on kasvatusalustaa (4.1), määritetään tarvittavan ympin
määrä, joka eri antibioottikonsentraatiolla antaa mahdollisimman suuret
ja kirkkaina pysyvät inhibitiovyöhykkeet. Tämä määrä on tavallisesti
välillä 0,2-0,3 ml/1000 ml. Kasvatusalusta ympätään 50-60 ºC:ssa.1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 16
▼B
4Kasvatusalustat ja reagenssit
4.1Määritysalusta (1)
Glukoosi 1 g
Peptoni 10 gLihauute 1,5 g
Hiivauute 3 g
Agar, laadun mukaan 10-20 gTween 80 1 ml
Fosfaattipuskuriliuos, pH 5,5 (4.2) 10 ml
5 % (w/v) boorihappoliuos 15 ml0,5 %:nen etanoliin valmistettu metyleenisini-
liuos 4 ml
Tislattu vesi, täytetään 1 000 ml:ksi
pH säädetään arvoon 5,8 ennen käyttöä
4.2Fosfaattipuskuriliuos, pH 5,5
Kaliumdivetyfosfaatti KH
2PO4, analyysilaatua 130,86 g
Dinatriumvetyfosfaatti Na2HPO4·2 H2O,
analyysilaatua, 6,947 g
Tislattu vesi, täytetään 1 000 ml:ksi
4.3 Fosfaattipuskuriliuos, pH 5,5, laimennettu suhteessa 1/10.
4.4Fosfaattipuskuriliuos, pH 8
Kaliumdivetyfosfaatti KH2PO4, analyysilaatua 1,407 g
Dinatriumvetyfosfaatti Na2HPO4·2 H2O,
analyysilaatua, 57,539 g
Tislattu vesi, täytetään 1 000 ml:ksi
4.5 Steriili fysiologinen ruokasuolaliuos
4.6 20 % (v/v) etanoli.4.7 0,1 N suolahappo.
4.8 70 % (v/v) formamidi: valmistetaan juuri ennen käyttöä ja pH säädetään
arvoon 4,5 noin 2 N rikkihapolla.
4.9 Asetoni (purum)/vesi/suolahappo -seos (tiheys 1,19): tilavuussuhteet 65/
33/2.
4.10 Metanoli (purum)/suolahappo -seos (tiheys 1,19): tilavuussuhteet 98/2.4.11 Standardiyhdisteet: CTC, OTC ja TC, joiden aktiivisuus ilmoitetaan
hydroklorideina.
5Standardiliuokset
5.1Klooritetrasykliini
Standardiyhdisteestä (4.11) valmistetaan suolahappoa (4.7) käyttäen
kantaliuos, jonka konsentraatio vastaa 500 µg/ml klooritetrasykliini-
HCl:ää. Tämä liuos säilyy yhden viikon ajan jääkaapissa.
Tästä kantaliuoksesta valmistetaan käyttöstandardiliuos S
8, jonka konsen-
traatio vastaa 0,2 µg/ml klooritetrasykliini-HCl:ää. Laimentaminen
suoritetaan fosfaattipuskuriliuoksella, pH 5,5, joka on laimennettu
suhteessa 1/10 (4.3) ja johon on lisätty 0,01 % amidomustaa (2).
Tämän jälkeen valmistetaan peräkkäin laimentaen (1 + 1) puskuriliuosta
(4.3) käyttäen seuraavat konsentraatiot:1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 17
(1) Voidaan käyttää mitä tahansa vastaavan koostumuksen omaavaa kaupallisesti saatavilla
olevaa kasvatusalustaa, jolla saadaan vastaavat tulokset.
(2) Amidomustaa käytetään standardiliuoksen estovyöhykkeiden (siniset renkaat) tunnista-
miseksi.
▼B
S40,1 µg/ml
S20,05 µg/ml
S10,025 µg/ml
5.2Oksitetrasykliini
Edellä 5.1 kohdassa kuvatun menetelmän mukaan valmistetaan kanta-
liuoksesta, jonka konsentraatio vastaa 400 µg oksitetrasykliini HCl:ää/ml,
käyttöstandardiliuos S8, joka sisältää 1,6 µg oksitetrasykliiniHCl:ää/ml, ja
seuraavat konsentraatiot:
S40,8 µg/ml
S20,4 µg/ml
S10,2 µg/ml
5.3Tetrasykliini
Edellä 5.1 kohdassa kuvatun menetelmän mukaan valmistetaan kanta-
liuoksesta, jonka konsentraatio vastaa 500 µg tetrasykliini HCl:ää/ml,
käyttöstandardiliuos S8, joka sisältää 1,0 µg tetrasykliini-HCl:ää/ml, ja
seuraavat konsentraatiot:
S40,5 µg/ml
S20,25 µg/ml
S10,125 µg/ml
6Uutto
6.1Enintään 50 mg/kg pitoisuudet
Näytteeseen lisätään formamidia (4.8) seuraavassa taulukossa annetut
määrät. Ravistellaan 30 minuuttia ravistelijassa. Laimennetaan
välittömästi fosfaattipuskuriliuoksella (4.3) seuraavassa taulukossa esite-
tyllä tavalla U8-konsentraation aikaansaamiseksi. Tämän liuoksen
formamidikonsentraatio ei saa ylittää 40 %. Sentrifugoidaan tai dekantoi-
daan kirkkaan liuoksen aikaansaamiseksi.
Tämän jälkeen valmistetaan konsentraatiot U4,U2jaU1peräkkäin laimen-
taen (1 + 1) fosfaattipuskuriliuosta (4.3) käyttäen.
Antibiootit CTC OTC TC
Vastaava pitoi-
suus mg/kg 10 50 10 50 10 50
Punnittu määrä
grammoina 10 10 24 9,6 20 10
formamidin (4.8)
ml-määrä 100 100 80 100 80 100
fosfaattipuskurin
(4.3) ml-määrälaim.
1:5
(a)laim.
1:25
(b) 70 200 120laim.
1:5
(a)
U8-konsentraatio
µg/ml 0,2 0,2 1,6 1,6 1,0 1,0
(a) otetaan 20 ml uutetta mittapulloon ja tämä täytetään 100 ml:ksi fosfaattipuskur-
illa
(b) otetaan 4 ml uutetta mittapulloon ja tämä täytetään 100 ml:ksi fosfaattipuskur-
illa
6.2Enemmän kuin 50 mg/kg olevat pitoisuudet
6.2.1 Klooritetrasykliini
Näytteeseen, jonka suuruus on 2-10 g, lisätään näytteen oletetusta
antibioottipitoisuudesta tai valmistajan antamasta takuusta riippuen
20 kertaa sen tilavuutta vastaava määrä seosta (4.9). Ravistellaan
30 minuuttia ravistelijassa. Tarkastetaan, että pH on alle 3 uuton1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 18
▼B
aikana, tarvittaessa pH säädetään arvoon 3 (kivennäisyhdisteiden
tapauksessa 10 % etikkahapolla). Otetaan erä uutetta ja säädetään
sen pH arvoon 5,5 fosfaattipuskuriliuoksella, jonka pH on 8 (4.4)
bromikresolivihreän läsnäollessa (muuttuu keltaisesta siniseksi).
Tehdään laimennus käyttäen fosfaattipuskuriliuosta, jonka pH on
5,5 ja joka on laimennettu suhteessa 1/10 (4.3) U8-konsentraation
(ks. 6.1) aikaansaamiseksi.
Tämän jälkeen valmistetaan konsentraatiot U4,U2jaU1peräkkäin
laimentaen (1 + 1) fosfaattipuskuriliuosta (4.3) käyttäen.
6.2.2 Oksitetrasykliini ja tetrasykliini
Edetään 6.2.1 kohdassa esitetyllä tavalla käyttäen seosta (4.10)
seoksen (4.9) tilalla.
7Menettely
7.1Siirrostus määritysalustaan
Itiösuspensio (3.2) siirrostetaan 50-60 ºC:ssa määritysalustaan (4.1).
7.2Maljojen valmistus
Diffuusio agarissa suoritetaan maljoilla käyttäen 4 standardiliuoskonsen-
traatiota (S8,S4,S2,S1) ja 4 määritysliuoskonsentraatiota (U8,U4,U2,
U1). On välttämätöntä, että kuhunkin maljaan lisätään nämä 4 uute- ja
standardiliuoskonsentraatiota.
Maljojen tulee olla riittävän suuret, jotta agaralustaan voidaan tehdä
ainakin 8 reikää, jotka ovat läpimitaltaan 10-13 mm. Lasketaan sellainen
määrä siirrostettua alustaa (7.1), joka muodostaa noin 2 mm paksuisen
kerroksen. On suositeltavaa käyttää lasilevyjä, joiden päälle asetetaan
täysin litteä alumiini- tai muovisylinteri, jonka läpimitta on 200 mm ja
korkeus 20 mm.
Reikiin pipetoidaan tarkalleen mitatut tilavuudet antibioottiliuosta läpimi-
tasta riippuen 0,10-0,15 ml.
Kunkin näytteen osalta diffuusio toistetaan ainakin neljä kertaa kullakin
konsentraatiolla siten, että kukin määritys käsittää 32 inhibitiovyöhykkeen
arvioinnin.
7.3Inkubointi
Maljoja inkuboidaan noin 18 tuntia 28-30 ºC:ssa.
8Laskeminen
Inhibitiovyöhykkeiden läpimitta mitataan mieluummin projisoimalla. Mittauk-
sista piirretään puolilogaritmipaperille kuvaaja, joka esittää konsentraatioiden
logaritmia inhibitovyöhykkeiden läpimittojen suhteen. Laaditaan sekä standar-
diliuoksen että uutteen osalta suorat. Jos häiritseviä tekijöitä ei esiinny, pitäisi
suorien olla yhdensuuntaiset.
Suhteellisen aktiivisuuden logaritmi lasketaan seuraavalla kaavalla:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Todellinen aktiivisuus = oletettu aktivisuus × suhteellinen aktiivisuus.
9Toistettavuus
Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen
ero ei saa ylittää 10 % suhteellisena arvona ilmoitettuna.
B TURBIDIMETRISESTI
1Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää klooritetrasykliini- (CTC), oksitetra-
sykliini- (OTC) ja tetrasykliini- (TC) pitoisuudet silloin, kun konsentraatiot
ylittävät 1 g/kg edellyttäen, että uutteissa ei esiinny samentavista aineista
aiheutuvia häiriöitä. Tämä menetelmä on nopeampi kuin agardiffuusio.1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 19
▼B
2Periaate
Näyte uutetaan asetonin, veden ja suolahapon seoksella CTC:n määrityksen
osalta ja metanolin ja suolahapon seoksella OTC:n ja TC:n määrityksen
osalta.
Uutteet laimennetaan ja niiden antibioottinen vaikutus määritetään mittaa-
malla sellaisen kasvatusliuoksen valon läpäisy, johon on siirrostettu
Staphylococcus aureusta ja lisätty antibioottia. Valon läpäisy riippuu anti-
biootin konsentraatiosta.
3Mikro-organismi: Staphylococcus aureus K 141 (1)
3.1Kantaviljelmän kasvatusS. aureusta ympätään putkeen, joka sisältää
kasvatusliuosta (4.1), johon on lisätty 1,5-3 % agaria (laadun mukaan).
Inkuboidaan yön yli 37ºC:ssa. Viljelmä säilytetään jääkaapissa ja agarvi-
nopinta siirrostetaan uudelleen kuukausittain. Samanaikaisesti
valmistetaan jatkoviljelmät laboratoriokäyttöön.
3.2Ympin valmistus
Agarvinopinta ympätään uudelleen jatkoviljelmällä 24 tuntia ennen
käyttöä ja inkuboidaan yön yli 37 ºC:ssa. Agarilla oleva viljelmä suspen-
doidaan putkesta kokonaisuudessaan noin 2 ml:aan peruskasvatusliuosta
(4.1) ja tämän jälkeen suspensio siirretään steriileissä olosuhteissa noin100 ml:aan samaa perusravintoliuosta (4.1). Inkuboidaan vesihauteessa
37 ºC:ssa kunnes kannan kasvu saavuttaa logaritmisen vaiheen (1 tunti
30 minuuttia-2 tuntia).
4Kasvatusalustat ja reagenssit
4.1Määritysalusta (
2)
Peptoni 5 g
Hiivauute 1,5 gLihauute 1,5 g
Natriumkloridi 3,5 g
Glukoosi 1,0 gKaliumdivetyfosfaatti KH
2PO4, analyysilaatua 1,32 g
Dikaliumvetyfosfaatti K2HPO4, analyysilaatua 3,68 g
Tislattu vesi, täytetään 1 000 ml:ksi
pH steriloinnin jälkeen 6,8-7,0.
4.2Fosfaattipuskuriliuos, pH 4,5
Kaliumdivetyfosfaatti KH2PO4analyysilaatua 13,6 g
Tislattu vesi, täytetään 1 000 ml:ksi
4.3 0,1 N suolahappo.
4.4 Asetoni (purum)/vesi/suolahappo (tiheys 1,19) -seos: tilavuussuhteet 65/
33/2.
4.5 Metanoli (purum)/suolahappo (tiheys 1,19) -seos: tilavuussuhde 98/2.4.6 Noin 10 % (w/v) formaldehydiliuos.4.7 Standardiyhdisteet: CTC, OTC, TC, joiden aktiivisuus ilmoitetaan hydro-
kloridina.
5Standardiliuos
Standardiyhdisteestä valmistetaan (4.7) suolahappoa (4.3) käyttäen kantaliuos,
jonka konsentraatio vastaa 400-500 µg/ml CTC-HCl:ää, OTC-HCl:ää tai TC-
HCl:ää. Tämä liuos säilyy jääkaapissa yhden viikon ajan.1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 20
(1) Tämä LUFA:n Kielissä eristämä kanta kasvaa voimakkaammin kuin S. aureus ATCC
6538P .
(2) Voidaan käyttää mitä tahansa vastaavan koostumuksen omaavaa kaupallisesti saatavilla
olevia kasvatusalustaa, jolla saadaan vastaavat tulokset.
▼B
6Uutto
6.1Klooritetrasykliini
Punnitaan 1-2 g näytettä 200 tai 250 ml:n mittapulloon. Lisätään noin
100 ml seosta (4.4) ja ravistellaan 30 minuuttia ravistelijassa. Täytetään
merkkiin fosfaattipuskuriliuoksella, jonka pH on 4,5 (4.2). Homogenoi-
daan ja annetaan laskeutua.
6.2Oksitetrasykliini ja tetrasykliini
Punnitaan 1-2 g näytettä 200 tai 250 ml:n mittapulloon. Lisätään noin
100 ml seosta (4.5) ja ravistellaan 30 minuuttia ravistelijassa. Täytetään
merkkiin fosfaattipuskuriliuoksella, jonka pH on 4,5 (4.2). Homogenoi-
daan ja annetaan laskeutua.
7Menettely
7.1Standardisarjan ja uutteen valmistus
Standardiliuos (5) ja uute (6) laimennetaan fosfaattipuskuriliuoksella,
jonka pH on 4,5 (4.2) siten, että saadaan konsentraatiosarja, jonka avulla
kustakin määrityksestä voidaan laatia standardikäyrä ja siitä interpoloi-
malla vähintään kaksi uutteesta mitattua arvoa. Laimennokset on
valittava kannankasvuolosuhteiden mukaan. Olosuhteet voivat vaihdella
eri laboratorioissa. Suoritus tapahtuu yleensä seuraavalla tavalla:
7.1.1 Klooritetrasykliini
Standardiliuos (5) laimennetaan fosfaattipuskuriliuoksella (4.2)
siten, että käyttöstandardiliuoksen konsentraatio vastaa CTC-HCl-
pitoisuutta 0,2 µg/ml. Käyttöstandardiliuoksesta laimennetaan
fosfaattipuskuriliuosta (4.2) käyttäen koeputkiin 6 laimennosta seur-
aavan taulukon mukaan. Jokaisesta laimennoksesta tehdään
rinnakkaislaimennos.
Käyttöstandardi-
liuoksen ml-määräFosfaattipuskurin (4.2)
ml-määräCTC-HCl-konsen-
traatio
(µg/ml)
0,7 0,3 0,14
0,6 0,4 0,12
0,55 0,45 0,11
0,45 0,55 0,09
0,4 0,6 0,08
0,3 0,7 0,06
Uute (6.1) laimennetaan fosfaattipuskuriliuoksella (4.2) siten, että
oletetuksi CTC-HCl-konsentraatioksi saadaan 0,12 µg/ml. Tätä
liuosta pipetoidaan kahteen putkeen 1 ml ja kahteen seuraavaan
putkeen 0,75 ml (= 0,09 µg). Kahteen viimeiseen putkeen lisätään
fosfaattipuskuria (4.2) siten, että tilavuudeksi saadaan 1 ml.
7.1.2 Oksitetrasykliini ja tetrasykliini
Standardiliuos (5) laimennetaan fosfaattipuskuriliuoksella (4.2)
siten, että käyttöstandardiliuoksen konsentraatio vastaa 0,6 µg/ml
OTC-HCl:ää tai TC-HCl:ää. Käyttöstandardiliuoksesta laimenne-
taan fosfaattipuskuriliuosta (4.2) käyttäen koeputkiin seitsemän
laimennosta seuraavan taulukon mukaa. Jokaisesta laimennoksesta
tehdään rinnakkaislaimennos.
Käyttöstandardi-
liuoksen ml-määräFosfaattipuskurin (4.2)
ml-määräOTC-HCl tai TC/HCl
(µg/ml)
0,9 0,1 0,54
0,8 0,2 0,48
0,7 0,3 0,42
0,6 0,4 0,36
0,4 0,6 0,24
0,3 0,7 0,18
0,2 0,8 0,121972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 21
▼B
Uute (6.2) laimennetaan fosfaattipuskuriliuoksella (4.2) siten, että
oletetuksi OTC-HCl- tai TC-HCl-konsentraatioksi saadaan 0,48 µg/
ml. Tätä liuosta pipetoidaan kahteen putkeen 1 ml ja kahteen seur-
aavaan putkeen 0,5 ml (0,24 µg). Kahteen viimeiseen putkeen
lisätään fosfaattipuskuria (4.2) siten, että tilavuudeksi saadaan 1 ml.
7.2Siirrostus määritysalustaan
Siirrostetaan ymppi (3.2) määritysalustaan (4.1) siten, että fotometrillä
saadaan 590 nm:ssä 85-%:nen valon transmissio 5 cm:n kyvetissä tai 92-
%:nen transmissio 2 cm:n kyvetissä. Laite on säädetty 100-%:seen trans-
missioon siirrostamattomalla määritysalustalla (4.1).
7.3Siirrostuksen teko
Pipetoidaan 9 ml siirrostettua määritysalustaa (7.2) kuhunkin putkeen
(7.1.1 tai 7.1.2). Putket on täytettävä puhtaissa, muttei välttämättä sterii-
leissä olosuhteissa.
7.4Inkubointi
Inkubointi on suoritettava ravistelemalla vesihauteessa, jonka lämpötila
on 37 ± 0,1 ºC. Inkubointiaika (yleensä 2 tuntia 30 minuuttia - 3 tuntia)
on valittava siten, että transmissiokäyrien kaltevuudet ovat sopivia tark-
koihin mittauksiin. Tämän jälkeen kasvu ehkäistään ruiskuttamalla
nopeasti kuhunkin putkeen 1 ml formaldehydiliuosta (4.6).
7.5Kasvun mittaus
Mitataan transmissiot fotometrillä 590 nm:ssä. Laite säädetään 100 %:seen
transmissioon kirkkaimmalla standardiliuoksella (vastaa suurinta anti-
bioottipitoisuutta). Koska putkien väliset samennuserot ovat vähäisiä, on
suositeltavaa käyttää vähintään 2 cm:n ja mieluummin 5 cm:n kyvettejä.
8Tulosten laskeminen
Kalibrointikäyrä laaditaan millimetripaperille kuvaajana, jossa fotometriset
transmissioarvot on esitetty vastaavien antibioottikonsentraatioiden suhteen.
Käyrältä interpoloidaan uutteen transmissioarvot. Lasketaan näytteen anti-
bioottipitoisuus.
9Toistettavuus
Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen
ero ei saa ylittää 10 % suhteellisena arvona ilmoitettuna.
3OLEANDOMYSIININ MÄÄRITYS
- diffuusiolla agaralustassa -
1Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää, jopa tetrasykliinien läsnäollessa,
rehujen, konsentraattien ja esiseosten oleandomysiinipitoisuus. Määrityksen
alaraja on 0,5 mg/kg.
2Periaate
Näyte uutetaan laimealla tris(hydroksimetyyliamino)metaanin metanoliliuok-
sella. Sentrifugoinnin jälkeen uute laimennetaan ja sen antibioottinenaktiivisuus määritetään mittaamalla oleandomysiinin diffuusio agaralustalla,
johon on ympätty B. cereusta . Diffuusio mitataan inhibitiovyöhykkeinä
mikroorganismin läsnäollessa. Näiden vyöhykkeiden läpimitta on suoraan
verrannollinen antibioottikonsentraation logaritmiin.
3Mikro-organismi: B.cereus K 250 TR (
1) (tetrasykliineille resistentti)
3.1Kantaviljelmän kasvatus
B. cereusta ympätään putkeen, joka sisältää kasvatusalustasta (4.1)
valmistettuja agarvinopintoja ja johon on lisätty 100 µg oksitetrasyk-
liiniä/5 ml. Inkuboidaan yön yli noin 30 ºC:ssa. Viljelmä säilytetään
jääkaapissa ja agarvinopinta siirrostetaan uudelleen kuukausittain.1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 22
(1) LUFA:n Kielissä eristämä kanta.
▼B
3.2Itiösuspension valmistus
Agarvinopinnasta (3.1) kasvusto huuhdotaan noin 3 ml:lla fysiologista
ruokasuolaliuosta (4.3). Suspensio siirrostetaan Roux-pulloon, joka
sisältää 300 ml kasvatusliuosta (4.1), jonka agarkonsentraatio on 3-4 %.
Inkuboidaan 3-5 päivää 28-30 ºC:ssa, suoritetaan itiöiden mikroskoop-
pinen tarkastus, itiöt huuhdotaan 15 ml:aan etanolia (4.4) ja
homogenoidaan. Suspensiota voidaan säilyttää jääkaapissa vähintään 5
kuukautta.
Maljoilla, joissa on kasvatusalustaa (4.2), määritetään tarvittavan ympin
määrä, joka eri oleandomysiinikonsentraatiolla antaa mahdollisimman
suuret ja kirkkaina pysyvät inhibitiovyöhykkeet. Tämä määrä on tavalli-
sesti välillä 0,1-0,2 ml/1000 ml. Kasvatusalusta ympätään 60 ºC:ssa.
4Kasvatusalustat ja reagenssit
4.1Kasvatusalusta (1)
Glukoosi 1 g
Peptoni 10 gLihauute 1,5 g
Hiivauute 3 g
Agar, laadun mukaan 10-20 gTislattu vesi, täytetään 1 000 ml:ksi
pH säädetään arvoon 6,5 välittömästi ennen käyttöä.
4.2Määritysalusta (
1)
Alusta (4.1), jonka pH on säädetty arvoon 8,8.
4.3 Steriili fysiologinen ruokasuolaliuos4.4 20 % (w/v) etanoli.4.5 Puhdas metanoli.4.6 0,5 % (v/v) liuos tris(hydroksimetyyliamino)metaani analyysilaatua
4.7Uuttoliuos
Metanoli (purum) 50 ml
Tislattu vesi 50 mlTris(hydroksimetyyliamino)-
metaani, analyysilaatua0,5 g
4.8 Standardiyhdiste: tunnetun aktiivisuuden omaava oleandomysiini
5Standardiliuos
Liuotetaan standardiyhdistettä (4.8) 5 ml:aan metanolia (4.5) ja laimennetaan
liuoksella (4.6) siten, että oleandomysiinikonsentraatioksi saadaan 100 µg/ml.
Kantaliuoksesta laimennetaan liuoksella (4.6) käyttöstandardiliuos S
8, joka
sisältää 0,1 µg oleandomysiiniä/ml. Käyttöstandardiliuoksesta valmistetaan
peräkkäin laimentaen (1 + 1) liuosta (4.6) käyttäen seuraavat konsentraatiot:
S40,05 µg/ml
S20,025 µg/ml
S10,0125 µg/ml
6Uutto
Punnitaan näytettä 2-10 g riippuen sen oletetusta oleandomysiinipitoisuudesta,
lisätään 100 ml liuosta (4.7) ja ravistellaan 30 minuuttia ravistelijassa.1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 23
(1) Voidaan käyttää mitä tahansa vastaavan koostumuksen omaavaa kaupallisesti saatavilla
olevaa kasvatusalustaa, jolla saadaan vastaavat tulokset.
▼B
Sentrifugoidaan, otetaan erä uutetta ja laimennetaan liuoksella (4.6) siten, että
oletetuksi oleandomysiinikonsentraatioksi saadaan 0,1 µg/ml (= U8). Tämän
jälkeen valmistetaan konsentraatiot U4,U2jaU1peräkkäin laimentaen (1 + 1)
liuosta (4.6) käyttäen.
7Menettely
7.1Siirrostus määritysalustaan
Itiösuspensio (3.2) siirrostetaan 60 ºC:ssa määritysalustaan (4.2).
7.2Maljojen valmistus
Diffuusio agarissa suoritetaan maljoilla käyttäen neljää standardiliuoskon-
sentraatiota (S8,S4,S2,S1) ja neljää määritysliuoskonsentraatiota (U8,U4,
U2,U1). On välttämätöntä, että kuhunkin maljaan lisätään nämä neljä
uute- ja standardiliuoskonsentraatiota.
Maljojen tulee olla riittävän suuret, jotta agaralustaan voidaan tehdä
ainakin kahdeksan reikää, jotka ovat läpimitaltaan 10-13 mm. Lasketaan
sellainen määrä siirrostettua alustaa (7.1), joka muodostaa noin 2 mm
paksuisen kerroksen. On suositeltavaa käyttää lasilevyjä, joiden päälle
asetetaan täysin litteä alumiini- tai muovisylinteri, jonka läpimitta on
200 mm ja korkeus 20 mm.
Reikiin pipetoidaan tarkalleen mitatut tilavuudet antibioottiliuosta läpimi-
tasta riippuen 0,10-0,15 ml.
Kunkin näytteen osalta diffuusio toistetaan ainakin neljä kertaa kullakin
konsentraatiolla siten, että kukin määritys käsittää 32 inhibitiovyöhykkeen
arvioinnin.
7.3Inkubointi
Maljoja inkuboidaan noin 18 tuntia 28-30 ºC:ssa.
8Laskeminen
Inhibitiovyöhykkeiden läpimitta mitataan mieluummin projisoimalla. Mittauk-
sista piirretään puolilogaritmipaperille kuvaaja, joka esittää konsentraatioiden
logaritmia inhibitovyöhykkeiden läpimittojen suhteen. Laaditaan sekä standar-
diliuoksen että uutteen osalta suorat. Jos häiritseviä tekijöitä ei esiinny, pitäisi
suorien olla yhdensuuntaiset.
Suhteellisen aktiivisuuden logaritmi lasketaan seuraavalla kaavalla:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Todellinen aktiivisuus = oletettu aktiivisuus × suhteellinen aktiivisuus.
9Toistettavuus
Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen
ero ei saa ylittää 10 % suhteellisena arvona ilmoitettuna.
4TYLOSIININ MÄÄRITYS
— diffuusiolla agaralustassa —
1Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää rehujen, konsentraattien ja esiseosten
tylosiinipitoisuus. Määrityksen alaraja on 2 mg/kg.
2Periaate
Näyte käsitellään 80 ºC:lla fosfaattipuskuriliuoksella, jonka pH on 8, ja uute-
taan sitten metanolilla. Uute laimennetaan sentrifugoinnin jälkeen ja sen
antibioottinen aktiivisuus määritetään mittaamalla tylosiinin diffuusio agara-
lustalla, johon on ympätty Sarcina luteaa . Diffuusio mitataan
inhibitiovyöhykkeinä mikro-organismin läsnäollessa. Näiden vyöhykkeiden
läpimitta on suoraan verrannollinen antibioottikonsentraation logaritmiin.1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 24
▼B
3Mikro-organismi: Sarcina lutea ATCC N:o 9341
3.1Kantaviljelmän kasvatus
Sarcina luteaa ympätään putkeen, joka sisältää kasvatusalustasta (4.1)
valmistettuja agarvinopintoja. pH säädetään arvoon 7,0. Inkuboidaan yön
yli noin 35 ºC:ssa. Viljelmä säilytetään jääkaapissa ja agarvinopinta siir-
rostetaan uudelleen kuukausittain.
3.2Bakteerisuspension valmistus
Äskettäin valmistetusta agarvinopinnasta (3.1) kasvusto huuhdotaan 2-
3 ml:lla fysiologista ruokasuolaliuosta (4.4). Suspensio siirrostetaan
Roux-pulloon, joka sisältää 250 ml kasvatusliuosta (4.1), jonka pH on
säädetty arvoon 7,0. Inkuboidaan 24 tuntia 35 ºC:ssa. Kasvusto huuhdo-
taan 25 ml:lla fysiologista ruokasuolaliuosta (4.4). Homogenoidaan ja
suspensio laimennetaan siten, että valon transmissio on noin 75 % mitat-
tuna 650 nm:ssä.
Jääkaapissa säilytettynä tätä suspensiota voidaan käyttää yhden viikon
ajan.
Maljoilla, joissa on kasvatusalustaa (4.1), määritetään tarvittavan ympin
määrä, joka eri tylosiinikonsentraatioilla antaa mahdollisimman suuret ja
kirkkaina pysyvät inhibitiovyöhykkeet. Kasvatusliuos ympätään 48-
50 ºC:ssa.sg307
4Kasvatusalustat ja reagenssit
4.1Määritysalusta (1)
Glukoosi 1 g
Peptoni 10 gLihauute 1,5 g
Hiivauute 3 g
Agar, laadun mukaan 10-20 gTislattu vesi, täytetään 1 000 ml:ksi
Kantaviljelmän kasvatusta ja bakteerisuspension valmistusta varten
säädetään pH välittömästi ennen käyttöä arvoon 7,0 ja määritystä varten
arvoon 2,0.
4.2Fosfaattipuskuriliuos, pH 8
Kaliumdivetyfosfaatti KH
2PO4, analyysilaatua 0,523 g
Dikaliumvetyfosfaatti K2HPO4, analyysilaatua 16,730 g
Tislattu vesi, täytetään 1 000 ml:ksi
4.3Fosfaattipuskuriliuos, pH 7
Kaliumdivetyfosfaatti KH2PO4, analyysilaatua 5,5 g
Dikaliumvetyfosfaatti K2HPO4, analyysilaatua 13,6 g
Tislattu vesi, täytetään 1 000 ml:ksi
4.4 Steriili fysiologinen ruokasuolaliuos
4.5 Puhdas metanoli.4.6 10 % (v/v) metanoli.4.7 Fosfaattipuskuriliuos (4.2)/metanoli (purum) -seos: tilavuussuhteet 60/404.8 Standardiyhdiste: tunnetun aktiivisuuden omaava tylosiini1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 25
(1) Voidaan käyttää mitä tahansa vastaavan koostumuksen omaavaa kaupallisesti saatavilla
olevaa kasvatusalustaa, jolla saadaan vastaavat tulokset.
▼B
5Standardiliuokset
Standardiyhdistettä (4.8) kuivataan kolme tuntia 60 ºC:ssa tyhjiölämpökaa-
pissa (5 mm elohopeaa). Punnitaan mittapulloon 10-50 mg, liuotetaan
5 ml:aan metanolia (4.5) ja laimennetaan liuos fosfaattipuskuriliuoksella,
jonka pH on 7 (4.3) siten, että tylosiiniemäksen konsentraatioksi saadaan
1 000 µg/ml.
Tästä kantaliuoksesta valmistetaan seoksella (4.7) laimentaen käyttöstandardi-
liuos S8, joka sisältää tylosiiniemästä 2 µg/ml.
Käyttöstandardiliuoksesta S8valmistetaan peräkkäin laimentaen (1 + 1) seosta
(4.7) käyttäen seuraavat konsentraatiot:
S41 µg/ml
S20,5 µg/ml
S10,25 µg/ml
6Uutto
Punnitaan 10 konsentraatteja tai 20 g esiseoksia ja rehuja. Lisätään 60 ml
80 ºC fosfaattipuskuriliuosta, jonka pH on 8 (4.2) ja homogenoidaan 2
minuutin ajan (keittiösekoitin, Ultraturrax, jne.).
Annetaan seistä 10 minuuttia, lisätään 40 ml metanolia (4.5) ja homogenoi-
daan 5 minuuttia. Sentrifugoidaan, otetaan erä uutetta ja laimennetaan
seoksella (4.7) siten, että oletetuksi tylosiinikonsentraatioksi saadaan 2 µg/ml
(= U8). Valmistetaan konsentraatiot U4,U2jaU1peräkkäin laimentaen (1 + 1)
seosta (4.7) käyttäen.
Kun pitoisuudet ovat alle 10 mg/kg, uute haihdutetaan kuivaksi pyöröhaihdut-
tajassa 35 ºC:ssa ja jäännös liuotetaan 40-%:seen metanoliin (4.6).
7Menettely
7.1Siirrostus määritysalustaan
Bakteerisuspensio (3.2) siirrostetaan 48-50 ºC:ssa määritysalustaan (4.1),
jonka pH on säädetty arvoon 8,0.
7.2Maljojen valmistus
Diffuusio agarissa suoritetaan maljoilla käyttäen neljä standardiliuoskon-
sentraatiota (S8,S4,S2,S1) ja neljä määritysliuoskonsentraatiota (U8,U4,
U2,U1). On välttämätöntä, että kuhunkin maljaan lisätään nämä neljä
uute- ja standardiliuoskonsentraatiota.
Maljojen tulee olla riittävän suuret, jotta agaralustaan voidaan tehdä
ainakin kahdeksan reikää, jotka ovat läpimitaltaan 10-13 mm. Lasketaan
sellainen määrä siirrostettua alustaa (7.1), joka muodostaa noin 2 mm
paksuisen kerroksen. On suositeltavaa käyttää lasilevyjä, joiden päälle
asetetaan täysin litteä alumiini- tai muovisylinteri, jonka läpimitta on
200 mm ja korkeus 20 mm.
Reikiin pipetoidaan tarkalleen mitatut tilavuudet antibioottiliuosta läpimi-
tasta riippuen 0,10-0,15 ml.
Kunkin näytteen osalta diffuusio toistetaan ainakin neljä kertaa kullakin
konsentraatiolla siten, että kukin määritys käsittää 32 inhibitiovyöhykkeen
arvioinnin.
7.3Inkubointi
Maljoja inkuboidaan yön yli 35-37 ºC:ssa.
8Laskeminen
Inhibitiovyöhykkeiden läpimitta mitataan mieluummin projisoimalla. Mittauk-
sista piirretään puolilogaritmipaperille kuvaaja, joka esittää konsentraatioiden
logaritmia inhibitovyöhykkeiden läpimittojen suhteen. Laaditaan sekä standar-
diliuoksen että uutteen osalta suorat. Jos häiritseviä tekijöitä ei esiinny, pitäisi
suorien olla yhdensuuntaiset.
Suhteellisen aktiivisuuden logaritmi lasketaan seuraavalla kaavalla:1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 26
▼B
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Todellinen aktiivisuus = oletettu aktiivisuus × suhteellinen aktiivisuus.
9Toistettavuus
Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen
ero ei saa ylittää 10 % suhteellisena arvona ilmoitettuna.
5VIRGINIAMYSIININ MÄÄRITYS
- diffuusiolla agar-alustassa -
1Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää virginiamysiini rehuista ja esiseok-
sista. Määrityksen alaraja on 2 mg/kg (2 miljoonasosaa) (1).
2Periaate
Näyte uutetaan Tween-80:n metanolipitoisella liuoksella. Uute dekantoidaan
tai sentrifugoidaan ja laimennetaan. Sen antibioottinen aktiivisuus määritetään
mittaamalla virginiamysiinin diffuusio agar-alustalla, johon on ympätty
Micrococcus luteusta . Diffuusio mitataan inhibitiovyöhykkeinä, joita mikro-
organismi muodostaa. Näiden vyöhykkeiden läpimitta on käytetyissä anti-
bioottikonsentraatioissa suoraan verrannollinen antibioottikonsentraation
logaritmiin.
3Mikro-organismi: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB
8553)
3.1Kantaviljelmän kasvatus
Micrococcus luteus ympätään putkiin, jotka sisältävät kasvatusalustasta
(4.1) valmistettuja agar-vinopintoja. Inkuboidaan 24 tuntia 30 ºC:ssa,
säilytetään jääkaapissa noin 4 ºC:ssa, ja siirrostetaan uudelleen joka
toinen viikko.
3.2Bakteerisuspension valmistus (a)
Äskettäin valmistetusta agar-vinopinnasta (3.1) kasvusto huuhdellaan 2-
3 ml:lla natriumkloridiliuosta (4.3). Suspensio siirrostetaan Roux-pulloon,
joka sisältää 250 ml kasvatusliuosta (4.1) ja inkuboidaan 18-20 tuntia
30 ºC:ssa. Kasvusto otetaan talteen 25 ml:aan natriumkloridiliuosta (4.3)
ja homogenoidaan.
Suspensio laimennetaan suhteessa 1/10 natriumkloridiliuokseen (4.3).
Suspension valon transmission on oltava noin 75 % mitattuna 650 nm:ssa
1 cm:n kyvetissä natriumkloridiliuosta (4.3) vastaan. Suspensiota voidaan
säilyttää yhden viikon ajan noin 4 ºC:ssa.
4Kasvatusalustat ja reagenssit
4.1Kasvatus- ja määritysalusta (b)
Lihapeptoni 6,0 g
Tryptoni 4,0 g
Hiivauute 3,0 g
Lihauute 1,5 g
Glukoosi 1,0 g
Agar 10,0-20,0 g
Vesi 1 000 ml
pH 6,5 (steriloinnin jälkeen)1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 27
(1) 1 mg virginiamysiiniä vastaa 1 000 UK-yksikköä.
(a) Voidaan käyttää muita menetelmiä edellyttäen, että niillä on osoitettu saatavan aikaan
samanlaisia bakteerisuspensioita.
(b) Voidaan käyttää mitä tahansa vastaavan koostumuksen omaavaa kaupallisesti saatavilla
olevaa kasvatusalustaa, jolla saadaan vastaavat tulokset.▼M2
▼M2
4.2Fosfaattipuskuriliuos, pH 6
Kaliumvetyfosfaatti, K2HPO42,0 g
Kaliumdivetyfosfaatti, KH2PO48,0 g
Vesi, täytetään 1 000 ml:ksi
4.3 0,8 % (w/v) natriumkloridiliuos: liuotetaan 8 g natriumkloridia veteen ja
laimennetaan 1 000 ml:ksi ja steriloidaan.
4.4 Metanoli.4.5 Fosfaattipuskuriliuos (4.2)/metanoli (4.4) -seos 80/20 (v/v).
4.6 0,5 % (w/v) metanolipitoinen Tween 80 -liuos: liuotetaan 5 g Tween
80:aa metanoliin (4.4) ja laimennetaan metanolilla 1 000 ml:ksi.
4.7 Standardiyhdiste: tunnetun aktiivisuuden omaava virginiamysiini.
5Standardiliuokset
Liuotetaan tarkkaan punnittu määrä standardiyhdistettä (4.7) metanoliin (4.4)
ja tämä laimennetaan metanolilla (4.4) kantaliuokseksi, joka sisältää 1 000 µg
virginiamysiiniä/ml. Liuos säilyy 4 ºC:ssa tulpalla suljetussa pullossa korkein-
taan viisi päivää.
Kantaliuoksesta valmistetaan peräkkäin laimentaen seosta (4.5) käyttäen seur-
aavat liuokset:
s
81 µg/ml
s40,5 µg/ml
s20,25 µg/ml
s10,125 µg/ml
6Uutteen ja määritysliuosten valmistus
6.1Uutto
6.1.1 Virginiamysiiniä enintään 100 mg/kg sisältävät tuotteet
Punnitaan 50 g näytettä. Lisätään 200 ml liuosta (4.6), ravistellaan
30 minuutin ajan, annetaan laskeutua tai sentrifugoidaan. Superna-
tantista otetaan 20 ml:n erä ja haihdutetaan noin 5 ml:ksi
pyöröhaihduttimessa korkeintaan 40 ºC:n lämpötilassa. Jäännös
laimennetaan seoksella (4.5) siten, että odotetuksi virginiamysiini-
pitoisuudeksi saadaan 1 µg/ml (= u8).
6.1.2 Virginiamysiiniä yli 100 mg/kg sisältävät tuotteet
Punnitaan näytemäärä, joka ei ylitä 10,0 g ja joka sisältää virginia-
mysiiniä 1-50 mg. Lisätään 100 ml liuosta (4.6), ravistellaan 30
minuutin ajan, annetaan laskeutua tai sentrifugoidaan. Supernatantti
laimennetaan seoksella (4.5) siten, että virginiamysiinipitoisuudeksi
saadaan 1 µg/ml (= u8).
6.2Määritysliuokset
U8-liuoksesta valmistetaan liuokset u4(oletettu pitoisuus: 0,5 µg/ml), u2(oletettu pitoisuus: 0,25 µg/ml) ja u1(oletettu pitoisuus: 0,125 µg/ml)
seoksella (4.5) peräkkäin laimentaen (1 + 1).
7Määrittämismenetelmä
7.1Siirrostus määritysalustaan
Bakteerisuspensio (3.2) siirrostetaan noin 50 ºC:ssa määritysalustaan
(4.1). Alustasta (4.1) valmistetuilla maljoilla tehdään esikokeet, joilla
määritetään eri virginiamysiinikonsentraatioilla suurimmat ja kirkkaimmat
inhibitiovyöhykkeet antava bakteerisuspensiomäärä.
7.2Maljojen valmistus
Diffuusio agarissa suoritetaan maljoilla käyttäen neljää standardiliuoskon-
sentraatiota (S8,S4,S2jaS1) ja neljää määritysliuoskonsentraatiota (U8,
U4,U2jaU1). On välttämätöntä, että kuhunkin maljaan lisätään nämä
neljä uute- ja standardikonsentraatiota. Maljojen tulee olla riittävän
suuret, jotta agar-alustaan voidaan tehdä ainakin 8 reikää, jotka ovat
läpimitaltaan 10-13 mm ja joiden keskustat ovat vähintään 30 mm:n
päässä toisistaan. Voidaan käyttää lasilevyjä, joiden päälle asetetaan1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 28
▼M2
alumiini- tai muovisylinteri, jonka läpimitta on 200 mm ja korkeus
20 mm.
Maljoille kaadetaan sellainen määrä 7.1 kohdan mukaisesti siirrostettua
alustaa (4.1), joka muodostaa noin 2,0 mm paksun kerroksen (kun malja
on vetoisuudeltaan 60 ml ja läpimitaltaan 200 mm). Jäähdytetään vaaka-
suoralla alustalla, tehdään reiät ja niihin pipetoidaan tarkalleen mitatut
tilavuudet määritys- ja standardiliuoksia (läpimitasta riippuen 0,10-
0,15 ml/reikä). Kutakin pitoisuutta käytetään ainakin neljä kertaa siten,
että kussakin määrityksessä suoritetaan arviointi 32 inhibitiovyöhyk-
keestä.
7.3Inkubointi
Maljoja inkuboidaan 16-18 tuntia 30 ± 2 ºC:ssa.
8Laskeminen
Inhibitiovyöhykkeiden läpimitta mitataan 0,1 mm:n tarkkuudella. Kutakin
pitoisuutta vastaavien mittausten keskiarvoista piirretään puolilogaritmipaper-
ille kuvaaja, joka esittää konsentraatioiden logaritmia inhibitiovyöhykkeiden
läpimittojen suhteen. Piirretään sekä standardiliuoksen että uutteen osalta
parhainta sovitusta edustavat suorat esimerkiksi seuraavasti:
Parhainta sovitusta edustava piste pienimmän standardipitoisuuden (SL) osalta
määritetään käyttäen kaavaa:
a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Parhainta sovitusta edustava piste suurimman standardipitoisuuden (SH) osalta
määritetään käyttäen kaavaa:
b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
10
Parhaan sovituksen omaavat pisteet lasketaan samoin uutteen pienimmän
pitoisuuden (UL) ja uutteen korkeimman pitoisuuden (UH) osalta korvaamalla
edellä olevissa kaavoissa S1,S2,S4jaS8U1:lla, U2:lla, U4:lla ja U8:lla.
Lasketut SL- ja SH-arvot merkitään samalle kuvaajapaperille ja ne yhdis-
tetään parhaimman sovituksen omaavan suoran muodostamiseksi
standardiliuoksen osalta. Samoin merkitään UL- ja UH-arvot ja ne yhdistetään
parhaimman sovituksen omaavan suoran muodostamiseksi uutteen osalta.
Jos häiritseviä tekijöitä ei esiinny, pitäisi suorien olla yhdensuuntaiset.
Käytännössä suorien voidaan katsoa olevan yhdensuuntaisia, jos arvot (SH-
SL) ja (UH-UL) eivät poikkea keskiarvostaan yli 10 %.
Jos suorat eivät ole yhdensuuntaiset, joko u1jas1tai u8jas8voidaan hylätä ja
SL, SH, UL ja UH laskea käyttäen vaihtoehtoisia kaavoja vaihtoehtoisten
parhaimman sovituksen omaavien suorien muodostamiseksi:
a′)S L=5s1þ2s2/C0s4
6tai5s2þ2s4/C0s8
6
b′)S H=5s4þ2s2/C0s1
6tai5s8þ2s4/C0s2
6
ja käyttäen samoja kaavoja UL:n ja UH:n tapauksissa. Yhdensuuntaisuuden
on oltava samojen periaatteiden mukainen.
Tulosten laskeminen kolmen pitoisuuden perusteella on mainittava määritys-
selosteessa.
Kun suoria pidetään yhdensuuntaisina, suhteellisen aktiivisuuden logaritmi
(log A) lasketaan jollakin seuraavista kaavoista sen mukaan, määritetäänkö
yhdensuuntaisuus kolmella vai neljällä pitoisuudella:
Neljän pitoisuuden osalta
c) log A ¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
u4þu8þs4þs8/C0u1/C0u2/C0s1/C0s2
Kolmen pitoisuuden osalta
d) log A ¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4þs4/C0u1/C0s11972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 29
▼M2
tai
d′) Log A ¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
Näytteestä saadun uutteen aktiivisuus = vastaavan standardin aktiivisuus × A.
(U8=S8×A )
Jos suhteellisen aktiivisuuden havaitaan olevan alueen 0,5-2,0 ulkopuolella,
määritys suoritetaan uudelleen siten, että uutteen konsentraatiot säädetään
sopiviksi tai, jos tämä ei ole mahdollista, standardiliuosten konsentraatiot
säädetään sopiviksi. Kun suhteellista aktiivisuutta ei saada tuotua vaaditulle
alueelle, on mikä tahansa saatu tulos katsottava likimääräiseksi ja tämä on
mainittava määritysselosteessa.
Kun suoria ei katsota yhdensuuntaisiksi, määritys toistetaan. Jos yhdensuun-
taisuutta ei vieläkään saada aikaan, määritystä ei voi pitää hyväksyttävänä.
Tulokset ilmoitetaan milligrammoina virginiamysiiniä rehukiloa kohden.
9Toistettavuus
Samasta näytteestä saman henkilön suorittaman kahden määrityksen tulosten
välinen ero ei saa ylittää:
2 mg/kg, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, korkeintaan 10 mg/kg olevien
virginiamysiinipitoisuuksien osalta;
20 %, suurimpaan arvoon verrattuna, välillä 10-25 mg/kg olevien pitoisuuk-
sien osalta;
5 mg/kg, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, välillä 25-50 mg/kg olevien
pitoisuuksien osalta;
10 %, suurimpaan arvoon verrattuna, yli 50 mg/kg olevien pitoisuuksien
osalta.1972L0199 — FI — 22.07.1993 — 003.001 — 30