1973L0046 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 1
Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentointitarkoituksiin.Toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä.
►B NELJÄS KOMISSION DIREKTIIVI
annettu 5 päivänä joulukuuta 1972
yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten
(73/46/ETY)
(EYVL L 83, 30.3.1973, s. 21)
Muutettu:
virallinen lehti
N:o sivu päivämäärä
►M1Komission direktiivi 81/680/ETY, annettu 30 päivänä heinäkuuta 1981 L 246 32 29.8.1981
▼B
NELJÄS KOMISSION DIREKTIIVI
annettu 5 päivänä joulukuuta 1972
yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten
(73/46/ETY)
EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka
ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen,
ottaa huomioon yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmistä rehujen
virallista tarkastusta varten 20 päivänä heinäkuuta 1970 annetunneuvoston direktiivin(
1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna 20
päivänä heinäkuuta 1972 annetulla direktiivillä 72/275/ETY(2), ja
erityisesti sen 2 artiklan,
sekä katsoo, että
mainitussa direktiivissä säädetään rehujen virallisen tarkastuksen suorit-
tamisesta yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmiä käyttäen sentarkastamiseksi, että rehujen laatua ja koostumusta koskevat lakien,asetusten ja hallinnollisten määräysten vaatimukset tulevat täytetyksi,
useita yhteisön määritysmenetelmiä on jo vahvistettu 15 kesäkuuta
1971 annetulla direktiivillä 71/250/ETY(
3), 18 päivänä marraskuuta
1971 annetulla direktiivillä 71/393/ETY(4) ja 27 päivänä huhtikuuta
1972 annetulla direktiivillä 72/199/ETY(5); työ on tämän jälkeen edis-
tynyt siinä määrin, että olisi hyväksyttävä neljäs ryhmä menetelmiä, ja
tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän rehukomitean
lausunnon mukaiset,
ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:
1 artikla
Jäsenvaltioiden on vaadittava, että rehujen virallisessa tarkastuksessa
käytettävät eläin- ja kasvirasvojen ja öljyjen kosteus- sekä rehujen
magnesium- ja raakakuitupitoisuusmääritykset suoritetaan tämän direk-
tiivin liitteessä I esitettyjen menetelmien mukaisesti.
2 artikla
Jäsenvaltioiden on vaadittava, että rehujen virallisessa tarkastuksessa
käytettävät retinoli- (A-vitamiini), tiamiini- (aneuriini, B1-vitamiini),
askorbiini- ja dehydroaskorbiinihappo (C-vitamiini) -pitoisuusmääri-tykset suoritetaan tämän direktiivin liitteessä II esitettyjenmenetelmien mukaisesti.
3 artikla
Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edel-
lyttämät lait, asetukset tai hallinnolliset määräykset voimaanviimeistään 1 päivänä tammikuuta 1974. Niiden on ilmoitettava tästäkomissiolle viipymättä.1973L0046 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 2
(1) EYVL N:o L 170, 3.8.1970, s. 2
(2) EYVL N:o L 171, 29.7.1972, s. 39
(3) EYVL N:o L 155, 12.7.1971, s. 13
(4) EYVL N:o L 279, 20.12.1971, s. 7
(5) EYVL N:o L 123, 29.5.1972, s. 6▼M1
▼B
▼M1
▼B
▼B
4 artikla
Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.1973L0046 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 3
▼B
LIITE I
1.ELÄIN- JA KASVIRASVOJEN JA ÖLJYJEN KOSTEUDEN
MÄÄRITYS
1.Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää eläin- ja kasvirasvojen ja öljyjen vesi-
pitoisuus ja haihtuvien aineiden pitoisuus.
2.Periaate
Näyte kuivataan vakiopainoon 103 ºC:ssa. Painohäviö määritetään punnitse-
malla.
3.Välineistö
3.1 Korroosionkestävästä materiaalista valmistettu tasapohjainen astia, jonka
läpimitta on 8-9 cm ja jonka korkeuson noin 3 cm.
3.2 Elohopealämpömittari, jossa on vahvistettu säiliö ja yläpäässä oleva
paisuntaputki ja joka on varustettu asteikolla noin 80 ºC:sta ainakin
110 ºC:seen ja jonka pituus on noin 10 cm.
3.3 Hiekkahaude tai sähkölevy.
3.4 Eksikkaattori, joka sisältää tehokasta kuivausainetta.
3.5 Analyysivaaka.
4.Menettely
Punnitaan mg:n tarkkuudella noin 20 g homogenisoitua näytettä kuivaan
punnittuun astiaan (3.1), jossa on lämpömittari (3.2). Näytettä kuumennetaan
hiekkahauteella tai sähkölevyllä (3.3), sekoittaen jatkuvasti lämpömittarilla
niin, että lämpötila saavuttaa 90 ºC:n noin 7 minuutissa.
Lämpöä vähennetään pitäen silmällä lautasen pohjasta nousevien kuplien
syntymisnopeutta. Lämpötila ei saa nousta yli 105 ºC. Sekoitusta jatketaan
astian pohjaa raaputtaen, kunnes kuplien muodostus lakkaa.
Kosteuden täydellisen poistumisen varmistamiseksi kuumennetaan useita
kertoja 103 ± 2 ºC:seen jäähdyttäen peräkkäisten kuumennusten välillä
93 ºC:seen. Sen jälkeen astian sisältöineen annetaan jäähtyä huoneen lämpöti-
laan eksikkaattorissa (3.4) ja punnitaan. Tämä menettely toistetaan niin
monta kertaa, että kahden peräkkäisen punnituksen välinen ero ei ole yli
2 mg:aa.
Huom. Näytteen painon kasvu toistettujen kuumennusten jälkeen viittaa
rasvan hapettumiseen. Tällaisessa tapauksessa tulos lasketaan siitä
punnituksesta, joka on tehty välittömästi ennen kuin paino on alkanut
lisääntyä.
5.Tulosten laskeminen
Kosteuspitoisuus, joka ilmoitetaan prosenttina näytteestä, saadaan kaavasta:
M1/C0M2 ðÞ /C1100
M0
jossa:
M0= näytteen paino grammoina,
M1= astian paino sisältöineen grammoina ennen kuumennusta,
M2= astian paino sisältöineen grammoina kuumennuksen jälkeen.
Tulokset, jotka ovat pienempiä kuin 0,05 %, on varustettava merkinnällä
”alle 0,05 %”.
ToistettavuusSamasta näytteestä suoritetun kahden samanaikaisen rinnakkaismäärityksen
ero ei saa olla yli 0,05 %.1973L0046 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 4
▼B
2.MAGNESIUMIN MÄÄRITYS
— atomiabsorptiospektrofotometrisesti —
1.Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää magnesiumin määrä rehuissa. Se
soveltuu erityisesti alle 5 %:n magnesiumpitoisuuksien määrittämiseen.
2.Periaate
Näyte poltetaan tuhkaksi, joka liuotetaan laimeaan kloorivetyhappoon. Jos
näyte ei sisällä orgaanisia aineita, se liuotetaan suoraan laimeaan kloorivety-
happoon. Liuos laimennetaan ja magnesiumpitoisuus määritetään
atomiabsorptiospektrofotometrisesti 285,2 nm:n aallonpituudella vertaamalla
standardiliuoksiin.
3.Reagenssit
3.1 Kloorivetyhappo, analyysilaatua, tiheys 1,16.
3.2 Väkevä kloorivetyhappo, analyysilaatua, tiheys 1,19.3.3 Magnesiumnauha tai -lanka tai magnesiumsulfaattiheptahydraatti, joka
on kuivattu huoneen lämpötilassa.
3.4 Strontiumsuolaliuos (kloridi tai nitraatti), jonka pitoisuus on 2,5 % (w/v)
strontiumia (= 76,08 g SrCl
2·6H2O, analyysilaatua, tai 60,38 g
Sr(NO3)2, analyysilaatua).
3.5 Magnesiumin standardiliuos: punnitaan mg:n tarkkuudella 1 g magne-
siumia (3.3), josta on tarkoin poistettu siinä ennen ollut oksidikerros, tai
vastaava määrä (10,143 g) magnesiumsulfaattiheptahydraattia (3.3). Siir-
retään se 1 000 ml:n mittapulloon, lisätään 80 ml kloorivetyhappoa (3.1),
annetaan sen liueta ja täytetään 1 000 ml:ksi vedellä. 1 ml tätä liuosta
sisältää 1 000 mg magnesiumia.
4.Välineistö
4.1 Platina-, kvartsi- tai posliinipolttoupokkaita.
4.2 Termostaattisäädöllä varustettu muhveliuuni.
4.3 Atomiabsorptiospektrofotometri.
5.Menettely
5.1 Näyteliuoksen valmistaminen
5.1.1Yksinomaan mineraalipitoisista aineista koostuvat rehut
Punnitaan mg:n tarkkuudella 5 g näytettä 500 ml:n vetoiseen
mittapulloon ja lisätään 250-300 ml vettä. Lisätään 40 ml kloorive-
tyhappoa (3.1), kuumennetaan kiehuvaksi ja annetaan nesteen
kiehua varovasti 30 minuuttia. Annetaan jäähtyä, täytetään merk-
kiin vedellä, sekoitetaan ja suodatetaan kuivaan dekantterilasiin
kuivan laskostetun suodattimen läpi. Heitetään pois ensimmäiset
30 ml suodoksesta. Piin esiintyessä käsitellään 5 g näytettä
riittävällä määrällä (15-30 ml) kloorivetyhappoa (3.2), haihdute-
taan kuivaksi vesihauteella ja viedään yhdeksi tunniksi
lämpökaappiin, jonka lämpötila on 105 ºC. Suoritusta jatketaan
5.1.2 kohdan kolmannesta virkkeestä.
5.1.2Pääasiassa mineraalipitoisista aineksista koostuvat rehut
Punnitaan milligramman tarkkuudella 5 g näytettä upokkaaseen ja
poltetaan näyte tuhkaksi 550 ºC:ssa muhveliuunissa, kunnes
muodostuu tuhkaa, jossa ei ole hiilipitoisia hiukkasia. Annetaan
jäähtyä. Piin poistamiseksi tuhkaan lisätään riittävä määrä (15-
30 ml) kloorivetyhappoa (3.2), haihdutetaan kuivaksi vesihauteella
ja viedään lämpökaappiin 105 ºC:seen yhden tunnin ajaksi.
Jäännös käsitellään 10 ml:lla kloorivetyhappoa (3.1) ja se siirretään
500 ml:n mittapulloon käyttäen lämmintä vettä. Annetaan tämän
jäähtyä ja täytetään pullo vedellä. Sekoitetaan ja suodatetaan
kuivaan astiaan kuivan laskostetun suodatinpaperin läpi. Ensim-
mäiset 30 ml suodosta heitetään pois.
5.1.3Pääasiassa orgaanisista aineista koostuvat rehut
Upokkaaseen punnitaan mg:n tarkkuudella 5 g näytettä ja poltetaan
550 ºC:ssa muhveliuunissa tuhkaksi, jossa ei ole hiilipitoisia
partikkeleita. Tuhka käsitellään 5 ml:lla kloorivetyhappoa (3.2),1973L0046 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 5
▼B
haihdutetaan kuivaksi vesihauteella ja kuivataan tämän jälkeen
yhden tunnin ajan 105 ºC:ssa lämpökaapissa, jotta pii saataisiin
liukenemattomaan muotoon. Tuhka käsitellään 5 ml:lla kloorivety-
happoa (3.1), siirretään 250 ml:n mittapulloon käyttäen lämmintä
vettä, sen lämpötila kohotetaan kiehumispisteeseen, jätetään
jäähtymään ja mittapullo täytetään merkkiin vedellä. Sekoitetaan
ja suodatetaan kuivaan astiaan kuivan laskostetun suodattimen
läpi. Ensimmäiset 30 ml suodoksesta heitetään pois.
5.2Atomiabsorptiomittaus
Laimentamalla standardiliuos (3.5) vedellä valmistetaan ainakin viiden
referenssiliuoksen sarja, joissa pitoisuudet kasvavat suhteessa spektrofo-
tometrin optimaaliseen mittausalueeseen. Kuhunkin liuokseen lisätään
10 ml strontiumsuolaliuosta (3.4) ja tämän jälkeen täytetään 100 ml:ksi
vedellä. Laimennetaan vedellä 5.1.1, 5.1.2 tai 5.1.3 kohdasta saatua
suodosta siten, että liuoksen magnesiumpitoisuus on referenssiliuosten
konsentraatioiden rajoissa. Tämän liuoksen kloorivetyhappopitoisuus ei
saa ylittää 0,4 N. Lisätään 10 ml strontiumsuolaliuosta (3.4) ja täytetään
pullo 100 ml:ksi vedellä. Määritettävän liuoksen ja referenssiliuosten
absorptio mitataan 285,2 nm:ssa.
6.Tulosten laskeminen
Lasketaan näytteessä olevan magnesiumin määrä suhteessa referenssiliuok-
siin. Tulokset ilmoitetaan prosentteina näytteestä.
Toistettavuus
Kahden samasta näytteestä suoritetun rinnakkaisen määrityksen tulosten ero
ei saa olla yli 5 % magnesiumin määrästä.
3.RAAKAKUIDUN MÄÄRITYS
1.Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää rehuista sen rasvattoman orgaanisen
aineksen määrä, joka ei liukene happo- ja emäsliuoksen kanssa keitettäessä.
Jäännöstä kutsutaan perinteisesti raakakuiduksi.
2.Periaate
Näyte, josta tarvittaessa on poistettu rasva, käsitellään keittäen peräkkäin
tietyn väkevyisillä rikkihappo- ja kaliumhydroksidiliuoksilla. Jäännös erote-
taan suodattamalla näyte asbestin kanssa, se pestään, kuivataan, punnitaan ja
poltetaan tuhkaksi 900 ºC:ssa. Tuhkaksi poltosta aiheutuva painohäviö vastaa
näytteen raakakuitupitoisuutta.
3.Reagenssit
3.1 0,26 N rikkihappo.
3.2 Käsitelty asbesti: asbestin joukkoon, joka on laadultaan Goochin-upok-
kaassa käytettävää laatua, lisätään noin viisi kertaa sen painoa vastaava
määrä laimeaa suolahappoa (1 tilavuusosa suolahappoa, tiheys 1,19 + 3
tilavuusosaa vettä). Seosta keitetään noin 45 minuuttia, sen annetaan
jäähtyä ja se suodatetaan Büchner-suppilon läpi. Jäännöstä pestään ensin
vedellä, kunnes pesuvesi ei enää ole suolahappoinen ja sen jälkeen aseto-
nilla (3.6). Asbesti kuivataan lämpökaapissa ja sitä pidetään uunissa
900 ºC:ssa kahden tunnin ajan. Sen annetaan jäähtyä ja se säilytetään
suljetussa astiassa. Tällä tavalla käsiteltyä asbestia voidaan käyttää useita
kertoja. Sen on sokeakokeen osalta täytettävä 5.1 kohdassa mainitut
vaatimukset.
3.3 Kuohunestoaine (esim. silikoni).
3.4 0,23 N kaliumhydroksidiliuos.
3.5 0,5 N suolahappo.
3.6 Asetoni.
3.7 Dietyylieetteri.
4.Välineistö
4.1 Dekantterilaseja, joiden tilavuus on vähintään 600 ml ja joissa on mitta-
asteikko vähintään 200 ml:n välein.
4.2 Posliinikiekkoja, joiden läpimitta on noin 80 mm ja paksuus noin 4 mm
ja joissa on 32 noin 4 mm:n läpimittaista reikää.1973L0046 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 6
▼B
4.3 Kumitulpalla varustettuja imupulloja, joiden tilavuus on noin 2 l, ja
joissa on mitta-asteikko 800 ml:n kohdalla ja jotka voidaan yhdistää
120 mm:n läpimittaisiin lasisuppiloihin.
4.4 Suodatinlevyjä, joiden läpimitta on noin 40 mm ja paksuus noin 4 mm ja
joiden reunat ovat siten vinot, että ne sopivat suppilon kartioon (4.3).
Levyissä tulee olla 16 noin 4 mm:n läpimittaista reikää ja ne on peitetty
metalliverkolla, jonka silmäkoko on noin 1 mm. Sekä levyjen että verkon
on oltava happoja ja emäksiä kestävää materiaalia.
4.5 Platina- tai kvartsiupokkaita.4.6 Termostaattisäätöinen muhveliuuni.4.7 Eksikkaattori4.8 Asbestisuodatin: 2,0 g asbestia (3.2) suspensoidaan 100 ml:aan vettä,
joka suodatetaan vakuumissa käyttäen metalliverkolla varustettua suoda-
tinlevyä (4.4), joka on yhdistetty imupullon suodatinsuppiloon (4.3).
Suodos otetaan talteen ja se suodatetaan vielä kerran saman suodattimen
läpi. Suodosheitetään pois .
5.Menettely
Dekantterilasiin (4.1) punnitaan mg:n tarkkuudella 3 g näytettä ja 2 g
käsiteltyä asbestia (3.2), lisätään 200 ml rikkihappoa (3.1) ja muutama pisara
kuohunestoainetta (3.3). Seoksen lämpötila kohotetaan nopeasti kiehumapis-
teeseen ja sen annetaan kiehua tarkalleen 30 minuuttia. Tilavuuden
pitämiseksi vakiona dekantterilasin päälle asetetaan jäähdytyslaitteeksi esim.
500 ml:n pyöreäpohjainen keittokolvi, jossa kierrätetään kylmää vettä.
Seoksen kiehuminen lopetetaan lisäämällä noin 50 ml kylmää vettä ja se
suodatetaan välittömästi vakuumia käyttäen asbestisuodattimen läpi, joka on
valmistettu aikaisemmin siten kuin 4.8. kohdassa esitetään.
Jäännös pestään viidellä noin 100 ml:n erällä kiehuvaa vettä siten, että
suodoksen lopulliseksi tilavuudeksi tulee 800 ml. Jäännös siirretään kvantita-
tiivisesti dekantterilasiin (4.1), johon on ensin asetettu posliinikiekko (4.2)
säätelemään kiehumista. Siihen lisätään 200 ml kaliumhydroksidiliuosta
(3.4). Lämpötila nostetaan nopeasti kiehumispisteeseen ja seoksen annetaan
kiehua tarkalleen 30 minuuttia. Siihen lisätään noin 50 ml kylmää, vettä ja
se suodatetaan välittömästi vakuumia käyttäen uuden asbestisuodattimen
läpi, joka on valmistettu aiemmin 4.8 kohdan mukaan. Jäännös pestään
kiehuvalla vedellä, kunnes pesuvesi on neutraalia (todetaan lakmuspaperilla),
sen jälkeen kolme kertaa asetonilla (3.6) (kaikkiaan noin 100 ml asetonia).
Jäännös siirretään kvantitatiivisesti polttoupokkaaseen (4.5), kokkareet hajo-
tetaan tarvittaessa ja sen annetaan kuivua vakiopainoon kuivauskaapissa,
jonka lämpötila on 130 ºC.
Upokkaan sisältöineen annetaan jäähtyä eksikkaattorissa (4.7) ja se punnitaan
nopeasti.
Upokas asetetaan muhveliuuniin (4.6) ja sen sisältö poltetaan tuhkaksi
pitämällä upokasta uunissa 30 minuuttia 900 ºC:ssa. Upokkaan sisältöineen
annetaan jäähtyä eksikkaattorissa (4.7) ja se punnitaan nopeasti.
Sokeakoe tehdään käyttäen samaa menettelyä käsitellylle asbestille (3.2),
mutta ilman näytettä. Painohäviö, joka saadaan poltettaessa 6 g asbestia, ei
saa olla yli 10 mg.
6.Tulosten laskeminen
Raakakuitupitoisuus prosentteina näytteestä saadaan seuraavasti:
a/C0b ðÞ /C1 100
3
jossa:
a = näytteen polttamisesta aiheutuva painohäviö,
b = sokeakokeen polttamisesta aiheutuva painohäviö
ToistettavuusKahden samasta näytteestä tehdyn määrityksen tulosten välinen ero ei saa
olla yli:
0,3 prosenttiyksikköä, kun raakakuitupitoisuus on alle 10 %:n;
3 % raakakuitupitoisuuden määrästä, kun sen määrä on vähintään 10 %.1973L0046 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 7
▼B
7.Huomautuksia
7.1 Rehuista, jotka sisältävät yli 10 % öljyjä ja rasvoja, on rasva poistettava
ennen analyysiä dietyylieetterillä (3.7). Tämän suorittamiseksi näytettä
(3 g, joka on punnittu mg:n tarkkuudella) huuhdellaan kolme kertaa
noin 50 ml:lla dietyylieetteriä (3.7) asbestisuodattimella (4.8) ja eetteri
suodatetaan pois varovasti vakuumia käyttäen. Näyte, josta rasva on
poistettu, sekä asbesti siirretään kvantitatiivisesti dekantterilasiin (4.1) ja
määritystä jatketaan 5 kohdassa esitetyllä tavalla.
7.2 Rehuista, jotka sisältävät öljyjä ja rasvoja ja joita ei voida uuttaa
suoraan, on rasva poistettava siten kuin 7.1 kohdassa esitetään, ja niistä
on poistettava rasva vielä uudelleen happokäsittelyn jälkeen, kun happo
on pesty jäännöksestä.
Tämän suorittamiseksi jäännöstä pestään kolme kertaa asetonilla (3.6)
(yhteensä 100 ml) ja sen jälkeen kolme kertaa 50 ml:lla dietyylieetteriä
(3.7). Tämän jälkeen jäännös siirretään kvantitatiivisesti dekantterilasiin
(4.1) ja analyysiä jatketaan 5 kohdassa esitetyllä tavalla (käsittely
kaliumhydroksidiliuoksella).
7.3 Jos rehuissa on runsaasti kalsiumia (yli 2 % kalsiumia), näyte (3 g, mg:n
tarkkuudella punnittuna) punnitaan dekantterilasiin (4.1), johon lisätään
100 ml 0,5 N suolahappoa (3.5). Seosta pidetään viileässä viiden
minuutin ajan, jonka jälkeen se suodatetaan välittömästi ja pestään
kylmällä vedellä. Suodattamisen helpottamiseksi lisätään 2,0 g asbestia,
joka on tarkoitettu käytettäväksi rikkihappokeitossa. Jos suodatus osoit-
tautuu vaikeaksi, suspensiota laimennetaan asetonilla (3.6). Sen jälkeen
jatketaan 5 kohdassa esitetyllä tavalla.1973L0046 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 8
▼B
LIITE II
1.RETINOLIN (A-VITAMIININ) MÄÄRITYS
1.Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää retinolin (A-vitamiinin) määrä
rehuissa, konsentraateissa ja esiseoksissa. Määrityksen alaraja on 10 000 ky/
kg suuria väriainemääriä sisältävissä rehuissa ja 4 000 ky/kg muissa tapauk-
sissa(1). Tuotteet luokitellaan kahteen ryhmään niiden oletetun
retinolipitoisuuden perusteella:
A-ryhmä: pitoisuus alle 200 000 ky/kg;
B-ryhmä: pitoisuus vähintään 200 000 ky/kg.
2.Periaate
Näyte hydrolysoidaan kuumassa kaliumhydroksidi-etanoli-liuoksessa ja anti-
oksidantin läsnäollessa tai typpiatmosfäärissä. Seos uutetaan 1,2-
dikloorietaanilla. Uute haihdutetaan kuivaksi ja käsitellään petrolieetterillä.
Liuokselle suoritetaan kromatografia aluminiumoksidipylväässä (B-ryhmän
tuotteilletarvitaan kromatografia vain tietyissä tapauksissa). A-ryhmän retino-
lipitoisuus määritetään mittaamalla Carr-Price-reaktion perusteella
muodostunut värillinen kompleksi spektrofotometrisesti 610 nm:ssä; B-
ryhmän retinoli määritetään spektrofotometrisesti UV:ssa 325 nm:ssä.
3.Reagenssit
a)A- ja B-ryhmän tuotteiden analysoimiseksi käytetyt reagenssit
3.1 96 % (v/v) etanoli3.2 10 % (w/v) natriumaskorbaattiliuos, analyysilaatua, tai
3.3 puhdistettu typpi.
3.4 50 % (w/v) kaliumhydroksidiliuos, analyysilaatua.
3.5 1 N kaliumhydroksidiliuos, analyysilaatua.
3.6 0,5 N kaliumhydroksidiliuos, analyysilaatua.3.7 1,2-dikloorietaani, analyysilaatua.
3.8 Petrolieetteri, kiehumisväli 30-50 ºC. Puhdistetaan tarvittaessa seur-
aavasti: sekoitetaan 1 000 ml:aan petrolieetteriä 20 ml eriä väkevää
rikkihappoa, kunnes happo pysyy värittömänä. Poistetaan happo ja
pestään petroolieetteri 500 ml:lla vettä, sitten kaksi kertaa 250 ml:lla
10-%:ista (w/v) natriumhydroksidiliuosta ja lopuksi kolme kertaa
500 ml:lla vettä. Poistetaan vesifaasi, petrolieetteri kuivataan yhden
tunnin ajan aktiivihiilen ja vedettömän natriumsulfaatin päällä,
suodatetaan ja tislataan.
3.9 Aluminiumoksidi, joka on standardoitu Brockmannin mukaan:
hehkutetaan kahdeksan tunnin ajan 750 ºC:ssa, jäähdytetään eksik-
kaattorissa ja säilytetään ruskeassa hioslasipullossa. Ennen
käyttöönottoa punnitaan ruskeaan pulloon 10 g aluminiumoksidia ja
0,7 ml vettä, suljetaan tulpalla, ja pulloa kuumennetaan viiden
minuutin ajan kiehuvalla vesihauteella ravistellen. Annetaan
jäähtyä. Todennetaan näin valmistetun alumiinin aktiivisuus suoritta-
malla tunnetulle retinolimäärälle (3.17) (noin 500 ky) 5.3 ja 5.4
kohdan mukaiset vaiheet.
3.10 Emäksinen aluminiumoksidi, aktiivisuusaste 1 (Woelm, Merck tai
vastaava).
3.11 Puhdas dietyylieetteri. Poistetaan peroksidit ja jäljellä oleva vesi
kromatografisesti emäksisessä aluminiumoksidipylväässä (3.10)
(25 g aluminiumoksidia 250 ml:n dietyylieetterierää kohti).
3.12 Petrolieetteriliuokset (3.8), joissa on 4, 8, 12, 16 ja 20 % (v/v)
dietyylieetteriä (3.11).
3.13 0,5 M natriumsulfidiliuos 70 % (v/v) glyseriinissä, valmistettu
analyysilaatua olevasta natriumsulfidista.1973L0046 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 9
(1) 1 ky = 0,3 µg retinolia.
▼B
b)yksinomaan A-ryhmän tuotteiden määrittämiseen käytetyt reagenssit
3.14 Bentseeniä, analyysilaatua.
3.15 Kloroformi, analyysilaatua. Poistetaan etanoli, fosgeeni ja jäljellä
oleva vesi kromatografisesti emäksisessä aluminiumoksidipylväässä
(3.10) (50 g aluminiumoksidia 200 ml kloroformia kohti; on suosi-
teltavaa kromatografoida eluaatin ensimmäinen 50 ml toisen kerran).
3.16 Carr-Price-reagenssi: sekoitetaan noin 25 g antimonitrikloridia,
analyysilaatua (jota on säilytetty eksikkaattorissa), 100 ml:aan klor-
oformia (3.15) kunnesliuoson kylläis tä. Pieni
antimonitrikloridisakka ei aiheuta vaikeuksia. Lisätään 2 ml etikka-
happoanhydridiä analyysilaatua. Seos säilytetään jääkaapissa
ruskeassa hioslasipullossa. Liuosta voidaan säilyttää useita viikkoja.
3.17 Retinoli - standardoitu spektrofotometrisesti.
c)yksinomaan B-ryhmän tuotteiden määrittämiseen käytetyt reagenssit
3.18 Isopropanoli, kromatografiaa varten.
4.Välineistö
4.1 Vesihaude.
4.2 Tyhjiöhaihdutuslaitteisto varustettuna eri kokoisilla pyöreäpohjaisilla
kolveilla.
4.3 Lasista valmistettuja kromatografiaputkia (pituus 300 mm; sisäläpimitta
noin 13 mm).
4.4 Spektrofotometri, jossa käytetään 10 mm:n kyvettejä. UV-alueella suori-
tettavissa mittauksissa käytetään kvartsikyvettejä.
4.5 UV-lamppuja, jotka soveltuvat käyttöön 365 nm:ssä.
5.Menettely
Huom: Kaikki vaiheet on suoritettava suoralta valolta suojattuna tarvittaessa
ruskeasta lasista valmistetuissa välineissä.
5.1Tutkittava näyte
Punnitaan hienoksi jauhetusta näytteestä otaksutun retinolipitoisuuden
perusteella
0,1-1,0 g konsentraattia (pitoisuus suurempi kuin 20 000 ky/g);
3,0-5,0 g esiseosta (sisältää noin 400-20 000 ky/g);
10-20 g mineraaliseosta;
30 g A-ryhmän tuotteita
Tutkittava näyte laitetaan välittömästi 500 ml:n hiostulpalliseen pulloon.
5.2Hydrolyysi ja uutto (1)
Näytteeseen lisätään ensin 40 ml etanolia (3.1), sitten 2 ml natriumaskor-
baattiliuosta (3.2)(2), 10 ml kaliumhydroksidiliuosta (3.4) ja lopuksi 2 ml
natriumsulfidiliuosta (3.13).
Refluksoidaan 30 minuuttia 70-80 ºC:ssa ja annetaan seoksen jäähtyä
virtaavassa vedessä. Lisätään 50 ml etanolia (3.1) ja 100 ml 1,2-dikloor-
ietaania (3.7) pipetoimalla. Ravistetaan voimakkaasti ja supernatantti
dekantoidaan dekantterilasiin. Lisätään dekantterilasiin 150 ml kaliumhy-
droksidiliuosta (3.5), ravistellaan 10 sekuntia ja annetaan seoksen seistä,
kunneskerroks et ovat erottuneet. Otetaan dikloorietaanikerros(alempi
kerros) dekantointisäiliöön, lisätään 40 ml kaliumhydroksidiliuosta (3.6),
ravistellaan 10 sekunnin ajan ja annetaan tämän seistä, kunnes kerrokset
ovat erottuneet. Otetaan dikloorietaanikerrostalteen dekantointis äiliöön
ja pestään 6-8 kertaa 40 ml:n erillä vettä, kunnes tämä on vapaa alkalista
(fenoliftaleiinitesti). Dikloorietaanikerros otetaan talteen ja loput jäljelle
jääneestä vedestä poistetaan suodatinpaperilla.1973L0046 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 10
(1) Maitotuotteiden ja sellaisten tuotteiden osalta, joilla on taipumusta muodostaa kokkar-
eita tai turvota, kaksinkertaistetaan 5 artiklan 2 kohdan, 1 ja 2 alakohdassa, esitettyjen
reagenssien määrät.
(2) Natriumaskorbaattia ei tarvitse lisätä suoritettaessa hydrolyysi typpiatmosfäärissä.
▼B
Erä liuosta haihdutetaan kuivaksi tyhjiössä käyttäen vesihaudetta, jonka
lämpötila on 40 ºC. Jäännös käsitellään nopeasti 5 ml:lla petrolieetteriä
(3.8).
A-ryhmän tuotteiden osalta kromatografia suoritetaan 5.3.1 kohdan
mukaan.
B-ryhmän tuotteiden osalta liuoss iirretään 50 ml:n mittapulloon,
täytetään merkkiin petrolieetterillä (3.8), sekoitetaan ja mitataan optinen
tiheys5.4.2 kohdan mukaan.
5.3Kromatografia
5.3.1A-ryhmän tuotteet
Kromatografiaputki (4.3) täytetään 200 mm:n korkeuteen 10 g:lla
aluminiumoksidia (3.9), joka on aiemmin lietetty petrolieetteriin
(3.8). Putkeen pipetoidaan 5.2 kohdassa saatu liuos, ja tähän
lisätään välittömästi 20 ml petrolieetteriä (3.8). Eluoidaan
peräkkäin 10 ml:n erilläpetrolieetteriä, joissa on 4, 8, 12, 16 ja
20 % dietyylieetteriä (3.12), joko normaalipaineessa tai alipai-
neessa virtausnopeuden ollessa 2-3 pisaraa sekunnissa.
Karoteeni eluoituu ensin(1). Retinoli eluoituu tavallisesti petrolieet-
teriliuoksella, jossa on 20 % dietyylieetteriä (3.12). Eluoitumista
seurataan UV-valossa (pylvään säteilytys lyhyesti elohopealam-
pulla). Fluoresoiva retinolivyöhyke erottuu selvästi keltaisista
ksantofyllivyöhykkeistä, jotka tulevat tämän jälkeen. Retinolia
sisältävä eluoitunut fraktio otetaan talteen erlenmeyerpulloon.
5.3.2B-ryhmän tuotteet
Kromatografointi on suoritettava vain, jos 5.4.2 kohdassa saadut
optisen tiheyden mittaukset eivät ole 5.4.2 kohdassa esitettyjen
vaatimusten mukaisia.
Jos kromatografointi osoittautuu tarpeelliseksi, kromatografia-
pylvääseen pipetoidaan erä petrolieetteriin valmistettua liuosta,
joka on saatu 5.2 kohdassa ja joka sisältää noin 500 k.y. retinolia,
ja kromatografointi suoritetaan kuten 5.3.1 kohdassa esitetään.
5.4Optisen tiheyden mittaus
5.4.1A-ryhmän tuotteet
Eluaatti, joka sisältää 5.3.1 kohdan mukaisesti saadun retinolin,
haihdutetaan kuivaksi tyhjiössä. Jäännös käsitellään 2 ml:lla bent-
seeniä (3.14). Tästä liuoksesta otetaan 0,3 ml:a ja siihen lisätään
3 ml Carr-Price-reagenssia (3.16). Tästä kehittyy sininen väri.
Optinen tiheys mitataan spektrofotometrillä 610 nm:ssä tarkalleen
30 sekuntia reaktion alkamisesta. Retinolipitoisuus määritetään
standardikäyrän avulla, joka on saatu nousevia retinolistandardipi-
toisuuksia sisältävien bentseeniliuoksien perusteella.
Bentseeniliuokset on käsitelty Carr-Price-reagenssilla (2-16 IU reti-
nolistandardia (3.17), 0,3 ml:ssa bentseeniä (3.14) + 3 ml:ssa Carr-
Price-reagenssia (3.16)). Standardikäyrä on tarkistettava säännölli-
sesti ja usein käyttäen standardia ja juuri valmistettua Carr-Price-
reagenssiliuosta.
5.4.2B-ryhmän tuotteet
Otetaan erä 5.2 kohdan mukaisesti saatua petrolieetteriin valmis-
tettua liuosta, joka sisältää noin 200 ky retinolia. Tämä
haihdutetaan kuivaksi tyhjiössä ja jäännös käsitellään 25 ml:lla
isopropanolia (3.18). Optinen tiheys mitataan spektrofotometrissä
325, 310 ja 334 nm:ssä. Absorptiomaksimi sijaitsee 325 nm:ssä.
Liuoksen retinolipifoisuus lasketaan seuraavasti:
E325· 18,30 = ky retinolia/ml
Kuitenkin on optisten tiheyksien suhteiden
E310:E325ja E334:E325
oltava 6 : 7 = 0,857.
Jos jokin näistä suhteista eroaa huomattavasti tästä arvosta (< 0,830
tai > 0,880), on ennen optisten tiheyksien mittausta suoritettava1973L0046 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 11
(1) Karoteenipitoisuus voidaan määrittää mittaamalla optinen tiheys 450 nm:ssä;
E1%
1c m¼2600 :
▼B
kromatografointi 5.3.2 kohdassa esitetyn menetelmän mukaisesti.
Jos kromatografoinnin jälkeen suoritettava optisten tiheyksien
mittaus osoittaa, että edellä mainitut suhteet vielä eroavat huomat-
tavasti arvosta 0,857 (< 0,830 tai > 0,880), on mittaus suoritettava
A-ryhmän tuotteille annetun menetelmän mukaisesti.
6.Tulosten laskeminen
Näytteen retinolipitoisuus lasketaan huomioiden tutkittavan näytteen paino ja
määrityksen kuluessa suoritetut laimennukset. Tulokset ilmoitetaan ky:nä
retinolia rehukiloa kohti tai konsentraatti- tai esiseoskiloa kohti.
ToistettavuusKahden samasta näytteestä suoritetun rinnakkaismäärityksen tuloksen välinen
ero ei saa olla yli:
— 20 % retinolin määristä, jotka ovat alle 75 000 ky/kg;
— 15 000 ky, kun pitoisuudet ovat välillä 75 000-150 000 ky/kg;— 10 % retinolin määristä, jotka ovat välillä 150 000-250 000 ky/kg;— 25 000 ky, kun pitoisuudet ovat välillä 250 000-500 000 ky/kg;— 5 % retinolin määristä, jotka ovat suurempia kuin 500 000 ky/kg.
2.TIAMIININ (B
1-VITAMIININ, ANEURIININ) MÄÄRITYS
1.Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä määritetään tiamiinin (aneuriinin, B1-vitamiinin) määrä
rehuissa, konsentraateissa ja esiseoksissa. Määrityksen alaraja on 5 mg/kg.
2.Periaate
Liuos käsitellään kuumalla laimealla rikkihapolla ja hydrolysoidaan tämän
jälkeen entsymaattisesti. Saatu liuos hapetetaan emäksisissä olosuhteissa.
Muodostunut tiokromi uutetaan isobutanolilla ja määritetään fluorometrisesti.
3.Reagenssit
3.1 Tiamiinistandardiliuos, 100 µg/ml: liuotetaan 112,3 mg tiamiinihydrok-
loridia, joka on tätä ennen kuivattu tyhjiössä vakiopainoon, 1 000 ml:aan
0,2 N rikkihappoa (3.2). Liuos säilyy viileässä ja pimeässä yhden
kuukauden ajan.
3.2 0,2 N rikkihappo.
3.3 Puhdasta natriumbisulfiittia.3.4 20 % (w/v) kaliumferrisyanidiliuos, analyysilaatua.3.5 25 % (w/v) kaliumhydroksidiliuos, analyysilaatua.
3.6 Hapetusseos: sekoitetaan 2 ml kaliumferrisyanidiliuosta (3.4) 48 ml:aan
kaliumhydroksidiliuosta (3.5). Tämä liuos ei säily neljää tuntia
kauempaa.
3.7 Isobutanoli, analyysilaatua.3.8 2,5 N natriumasetaattiliuos.3.9 Monientsyymipreparaatti, joka sisältää proteaasia, fosfataasia ja
amylaasia (esimerkiksi Clarase).
3.10 96 % (v/v) etanoli.
4.Välineistö
4.1 Vesihaude.
4.2 Sentrifugi (3 500 kierr./min) varustettuna 30-50 ml:n vetoisilla putkilla,
joissa on lasihiostulpat.
4.3 Fluorometri.
5.Menettely
5.1Entsymaattinen hydrolyysi
Kahteen 250 ml:n mittapulloon A ja B punnitaan samat määrät hienoksi
jauhettua näytettä, joka sisältää noin 100 µg tiamiinia, ja lisätään 125 ml
rikkihappoa (3.2). Lisätään 1,0 ml standardiliuosta (3.1) (sisäinen stan-
dardi)ainoastaan pulloon A .1973L0046 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 12
▼B
Pulloja ravistellaan voimakkaasti, ne asetetaan kiehuvaan vesihauteeseen
15 minuutiksi ja ravistellaan silloin tällöin. Annetaan mittapullojen
jäähtyä noin 45 ºC:seen. Kuhunkin pulloon lisätään 20 ml natriumase-
taattiliuosta (3.8) ja 0,5 g entsyymien seosta (3.9) ja seisotetaan 20
minuuttia huoneen lämmössä. Lisätään 20 ml natriumasetaattiliuosta
(3.8), täytetään merkkiin vedellä, homogenoidaan ja suodatetaan.
Suodokset A ja B otetaan talteen sitten, kun ensimmäiset 15 ml on
heitetty pois. Valmistetaan seuraavat liuokset:
5.1.1Referenssiliuos T
Sentrifugiputkeen (4.2) pipetoidaan 5 ml suodosta A ja lisätään
noin 10 g natriumbisulfiittia (3.3). Putki upotetaan kiehuvaan vesi-
hauteeseen 15 minuutin ajaksi ja tämän jälkeen jäähdytetään
huoneen lämpötilaan.
5.1.2Liuokset A (sisäinen standardi) ja B (näyte)
Pipetoidaan 5 ml suodosta A sentrifugiputkeen (4.2) ja 5 ml
suodosta B toiseen sentrifugiputkeen (4.2).
5.2Hapetus
Liuoksiin T, A ja B lisätään 5 ml hapetusseosta (3.6) ja yhden minuutin
kuluttua 10 ml isobutanolia (3.7). Asetetaan putkiin tulpat ja niitä ravis-
tetaan voimakkaasti viiden sekunnin ajan. Annetaan seistä yhden
minuutin ja sentrifugoidaan kerrosten erottamiseksi. Kustakin putkesta
pipetoidaan 5 ml supernatanttina olevaa isobutanolikerrosta 25 ml:n
mittapulloihin, täytetään merkkiin etanolilla (3.10) ja homogenoidaan (=
uutteet T, A ja B).
5.3Fluoresenssimittaus
Mittaukset suoritetaan aallonpituudella, jolla fluorometri antaa optimaa-
lisen vasteen tiokromin fluoresenssiin. Heräteaallonpituus on noin
365 nm.
Laite säädetään nollaan käyttäen uutetta T. Mitataan uutteiden A ja B
fluoresenssin voimakkuus.
6.Tulosten laskeminen
Näytteen tiamiinipitoisuus ilmoitettuna milligrammoissa kiloa kohti saadaan
suhteesta:
a/C1b
a/C0b ðÞ c
jossa:
a = uutteen A (sisäinen standardi) fluoresenssin intensiteetti
b = uutteen B (näyte) fluoresenssin intensiteetti;
c = tutkittavan näytteen paino grammoina;d = tutkittavaan näytteeseen (sisäinen standardi) lisätyn tiamiinin määrä
mikrogrammoina.
Toistettavuus
Kahden samasta näytteestä suoritetun rinnakkaismäärityksen tuloksen välinen
ero ei saa olla yli:
10 % tiamiinin määrästä, joka on alle 500 mg/kg, ja
5 % tiamiinin määrästä, joka on vähintään 500 mg/kg.
3.ASKORBIINIHAPON JA DEHYDROASKORBIINIHAPON (C-VITA-
MIININ) MÄÄRITYS
1.Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää rehuissa, konsentraateissa ja esiseok-
sissa olevan askorbiini- ja dehydroaskorbiinihapon (C-vitamiinin)
kokonaismäärä. Määrityksen alaraja on 5 mg/kg. Tuotteet luokitellaan
kahteen ryhmään niiden oletetun C-vitamiinipitoisuuden perusteella:
A-ryhmä: pitoisuus alle 10 g/kg;
B-ryhmä: pitoisuus vähintään 10 g/kg1973L0046 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 13
▼B
2.Periaate
Näyte suspendoidaan laimeaan metafosforihappoliuokseen ja se uutetaan
kloroformilla. Vesipitoinen faasi käsitellään 2,6-dikloorifenoli-indofenoli-
liuoksella askorbiinihapon muuttamiseksi dehydroaskorbiinihapoksi ja sen
jälkeen 2,4-dinitrofenyylihydratsiiniliuoksella. Muodostunut hydratsoni uute-
taan etyyliasetaatin, jääetikan ja asetonin seoksella. Liuokselle suoritetaan
kromatografia silikageelipylväässä, eluaatti haihdutetaan kuivaksi ja jäännös
liuotetaan laimeaan rikkihappoon. Liuoksen optinen tiheys mitataan spektro-
fotometrillä 509 nm:ssä.
A-ryhmän tuotteiden osalta pylväässä suoritetusta kromatografiasta saadulle
eluaatille tehdään vielä levykromatografia hydratsonin eristämiseksi.
3.Reagenssit
3.1 0,05 % L-askorbiinihapon standardiliuos: liuotetaan 50 mg L-askorbii-
nihappoa, analyysilaatua, noin 20 ml:aan metafosforihappoliuosta (3.2)
ja liuoksen tilavuus säädetään 100 ml:ksi vedellä. Liuos valmistetaan
välittömästi ennen käyttöä.
3.2 10 % (w/v) metafosforihappoliuos: 200 g metafosforihappoa, analyysi-
laatua, jauhetaan huhmaressa, liuotetaan veteen ja täytetään 2 000 ml:ksi
vedellä. Liuos säilytetään 4 ºC:ssa. Tämä liuos säilyy viikon.
3.3 Kloroformi, analyysilaatua.
3.4 0,5 % (w/v) 2,6-dikloorifenoli-indofenoliliuos, analyysilaatua, valmiste-
taan välittömästi ennen käyttöä.
3.5 Suodatusapu (S. ja S. N:o 121tai tätä vastaava)
3.6 2 % (w/v) 2,4-dinitrofenyylihydratsiinin happoliuos: liuotetaan 2 g 2,4-
dinitrofenyylihyratsiinia 100 ml:aan laimeaa rikkihappoa (25 ml rikki-
happoa, analyysilaatua, tiheys 1,84, laimennettu täyttämällä 100 ml:ksi
vedellä). Viileässä säilytettynä tämä liuos säilyy yhden viikon.
3.7 Typpi, tai3.8 Hiilidioksidi.
3.9 Etyyliasetaatin, analyysilaatua, jääetikan ja asetonin, analyysilaatua,
seos: tilavuussuhteet 96/2/2.
3.10 Dikloorimetaanin, analyysilaatua, ja jääetikan seos: tilavuussuhteet 97/
3.
3.11 Silikageeli, raekoko 0,05-0,2 mm.
3.12 Stahl-laatua oleva silikageeli H, levykromatografiaa varten.
3.13 Laimea rikkihappo: 200 ml:n mittapulloon mitataan 105 ml vettä ja
täytetään merkkiin rikkihapolla, analyysilaatua, tiheys 1,84.
3.14 Levykromatografian eluointiliuos: sekoitetaan 75 ml dietyylieetteriä,
analyysilaatua, 25 ml etyyliasetaattia, analyysilaatua, ja 4,0 ml 96 %
(w/v) etikkahappoa, analyysilaatua. Tehdään uudestaan 2-3 kromatogra-
fian suorituksen jälkeen.
4.Välineistö
4.1 Termostaatilla varustettu vesihaude, joka on asetettu 20 ºC:n lämpötilaan.
4.2 Sentrifugi (3 500 kierr./min) varustettuna hiostulpallisilla 40-50 ml:n
vetoisilla putkilla.
4.3 Pyöröhaihdutin, jossa käytetään 250 ml:n pulloja.
4.4 Lasista valmistettuja kromatografiaputkia (pituus: 100 mm, sisäläpimitta:
20 mm), joissa on sintterikiekko (esim. Allihn-putket).
4.5 Spektrofotometri tai kolorimetri, jossa on 10 mm:n kyvetit.
4.6 Levykromatografialaitteisto, jossa käytetään silikageelilevyjä (3.12),
jotka on päällystetty 0,5-0,6 mm:n paksuuteen. (Valmiina hankittavat
levyt ovat tarkoitukseen sopivia). Levyt kuivataan 2,5-3 tunnin ajan
kuivauskaapissa 120-130 ºC:ssa. Niiden annetaan jäähtyä ja pidetään
eksikkaattorissa ainakin 24 tuntia ennen käyttöä.
4.7 Kuivauskaappi, jonka lämpötila on säädetty 120-130 ºC:seen.1973L0046 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 14
▼B
5.Menettely
5.1Uutto
Kahteen 250 ml:n mittapulloon (lasisilla hiostulpilla varustettuja) A ja B
punnitaan erikseen yhtä suuret määrät hienojakoista näytettä, joka
sisältää noin 200 µg C-vitamiinia. Lisätään vain A-pulloon 0,4 ml stan-
dardiliuosta (3.1) ja sekoitetaan varovasti ravistaen (sisäinen standardi).
Kumpaankin pulloon lisätään 30 ml kloroformia (3.3) ja 25 ml metafos-
forihappoliuosta (3.2) 4 ºC:ssa. Pulloja ravistellaan hetken ja seisotetaan
10-15 minuuttia. Lisätään 25 ml vettä, pullot varustetaan tulpilla, ravis-
tellaan voimakkaasti 10 sekunnin ajan ja annetaan seistä 10-15 minuuttia
vesihauteessa (4.1). Suoritetaan sentrifugointi vesipitoisen faasin erotta-
miseksi kloroformifaasista. Toimenpiteet vesipitoisille uutteille A
(sisäinen standardi) ja B suoritetaan samanaikaisesti jäljempänä kuvatulla
tavalla.
5.2Hapetus
Pipetoidaan 40 ml kohdassa 5.1 valmistettua vesipitoista supernatanttia
(hieman samea) reaktioputkeen, joka on varustettu lasisella hiostulpalla,
lisätään 0,5-1 ml 2,6-dikloorifenoli-indofenoliliuosta (3.4) ja sekoitetaan.
Kehittyy punainen väri, jonka tulisi pysyä ainakin 15 minuutin ajan.
Tämän jälkeen lisätään noin 300 mg suodatusapuainetta (3.5), sekoite-
taan ja suodatetaan kuivan laskostetun suodattimen läpi. Suodoksen ei
välttämättä tarvitse olla kirkas.
5.32,4-dinitrofenyylihydratsiinin kanssa tapahtuva reaktio ja hydratsonin
uutto
Pipetoidaan 10 ml 5.2 kohdan suodosta sentrifugiputkeen (4.2), lisätään
2 ml 2,4-dinitrofenyylihydratsiiniliuosta (3.6) ja sekoitetaan. Putkeen
johdetaan typpi- (3.7) tai hiilidioksidi (3.8) -virta nopeasti, putki sulje-
taan tulpalla ja se upotetaan noin 15 tunnin ajaksi (yön yli)
vesihauteeseen (4.1).
Tämän jälkeen lisätään 3 ml vettä, 20 ml etyyliasetaatin, jääetikan ja
asetonin seosta (3.9) ja noin 800 mg suodatusapua (3.5). Putki suljetaan
tulpalla, ravistetaan voimakkaasti 30 sekunnin ajan ja sentrifugoidaan.
15 ml supernatanttifaasista pipetoidaan haihdutuspulloon ja haihdutetaan
alipaineessa pyöröhaihduttajalla (4.3), kunnes saadaan öljymäinen
jäännös. Jäännös liuotetaan 2 ml:aan etyyliasetaatin, jääetikan ja asetonin
seosta (3.9) kuumentamalla se uudestaan 50 ºC:seen, annetaan tämän
jäähtyä, lisätään 10 ml dikloorimetaanin ja jääetikan seosta (3.10) ja
sekoitetaan.
5.4Pylväskromatografia
Kromatografiaputki (4.4) täytetään 30 mm:n tasolle dikloorimetaani/
jääetikka-seoksella (3.10). Suspendoidaan (voimakkaasti sekoittaen) 5 g
silikageeliä (3.11) 30 ml:aan trikloorimetaanin ja jääetikan seosta
(3.10); suspensio kaadetaan putkeen. Annetaan tämän seistä ja haihdute-
taan typpi (3.7) alipaineessa. Putkeen dekantoidaan 5.3 kohdassa saatu
liuos, pullo huuhdotaan pienellä määrällä dikloorimetaanin ja jääetikan
seosta (3.10) ja tämä dekantoidaan putkeen, ja viimeksi mainittu
täytetään seoksella (3.10) ja toimenpidettä jatketaan pesemällä pylväs
samalla seoksella (3-4 kertaa noin 5 ml:n suuruisella erällä), kunnes
saadaan väritön eluaatti. Väriltään keltainen osa eluaatista heitetään pois.
Pylvään yläosassa oleva punertava vyöhyke eluoidaan etyyliasetaatin,
jääetikan ja asetonin seoksella (3.9), eluaatti otetaan talteen ja haihdute-
taan kuivaksi.
5.4.1A-ryhmän tuotteiden osalta (C-vitamiinipitoisuus alle 10 g/kg)
jäännös liuotetaan 2,0 ml:aan etyyliasetaatin, jääetikan ja asetonin
seosta (3.9) ja sille suoritetaan levykromatografia välittömästi 5.5
kohdassa esitetyllä tavalla.
5.4.2B-ryhmän tuotteiden osalta (C-vitamiinisisältö yhtä suuri tai suur-
empi kuin 10 g/kg) öljymäinen jäännöskäs itellään 4.0 ml:lla
laimeaa rikkihappoa (3.13), ravistetaan voimakkaasti jäännöksen
liuottamiseksi täydellisesti ja optinen tiheys mitataan 5.6 kohdassa
esitetyllä tavalla.
5.5Levykromatografia
Seuraavassa selostetut toimenpiteet suoritetaan rinnakkaismäärityksinä.
Levylle (4.6) pipetoidaan ohueksi viivaksi 0,5 ml:n erä 5.4.1 kohdassa
saatua liuosta. Levyä kehitetään ainakin 20 minuuttia säiliössä, joka on
kyllästetty eluointiliuoksella (3.14), kunnes väriltään vaaleanpunainen
hydratsonivyöhyke saadaan selvästi erottumaan. Jätetään kuivumaan1973L0046 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 15
▼B
avoimessa tilassa. Vaaleanpunaisen alueen raja merkitään, vyöhyke
raaputetaan pois spaattelilla ja jauhe siirretään kvantitatiivisesti kromato-
grafiaputkeen (4.4).
Eluoidaan peräkkäin kerran 2 ml:lla ja kaksi kertaa 1,5 ml:lla etyyliase-
taatin, jääetikan ja asetonin seosta (3.9). Eluoitunut liuos kootaan talteen
pieneen pulloon (viimeisen erän on oltava väritön). Haihdutetaan
kuivaksi, öljymäinen jäännös käsitellään 4,0 ml:lla laimeaa rikkihappoa
(3.13), ravistetaan voimakkaasti jäännöksen liuottamiseksi täydellisesti
ja mitataan optinen tiheys.
5.6Optisen tiheyden mittaus
Optinen tiheys mitataan spektrofotometrillä 509 nm:ssä 20-30 minuuttia
jäännöksen liuottamisesta laimeaan rikkihappoon. Mittaus suoritetaan
laimeaan rikkihappoon (3.13) vertaamalla.
5.7Sokeakoe
Sokeakoe suoritetaan käyttäen samaa suoritustapaa ilman näytettä.
6.Tulosten laskeminen
Näytteen C-vitamiinipitoisuus grammoina kilogrammaa kohti saadaan
suhteesta:
c/C0a ðÞ /C1 2
b/C0c ðÞ /C1 10d
jossa:
a = sokeakokeessa havaittu optinen tiheys;
b = sisäisen standardiliuoksen optinen tiheys;
c = näyteliuoksen optinen tiheys;d = tutkittavan näytteen paino grammoina.
ToistettavuusKahden samasta näytteestä suoritetun rinnakkaismäärityksen tuloksen välinen
ero ei saa ylittää:
10 % C-vitamiinin määrästä, joka on alle 10 g/kg;
5 % C-vitamiinin määrästä, joka on 10 g/kg tai suurempi.1973L0046 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 16