1972L0199 — FI — 13.08.1998 — 004.001 — 1
Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentointitarkoituksiin.Toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä.
►B KOLMAS KOMISSION DIREKTIIVI,
annettu 27 päivänä huhtikuuta 1972,
yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten
(72/199/ETY)
(EYVL L 123, 29.5.1972, s. 6)
Muutettu:
virallinen lehti
N:o sivu päivämäärä
►M1Komission direktiivi 81/680/ETY, annettu 30 päivänä heinäkuuta 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Komission direktiivi 84/4/ETY, annettu 20 päivänä joulukuuta 1983 L 15 28 18.1.1984
►M3Komission direktiivi 93/28/ETY, annettu 4 päivänä kesäkuuta 1993 L 179 8 22.7.1993
►M4Komission direktiivi 98/54/EY, annettu 16 päivänä heinäkuuta 1998 L 208 49 24.7.1998
▼B
KOLMAS KOMISSION DIREKTIIVI,
annettu 27 päivänä huhtikuuta 1972,
yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten
(72/199/ETY)
EUROOPAN YHTEISÖJEN NEUVOSTO, joka
ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen,ottaa huomioon yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmistä rehujen
virallista tarkastusta varten 20 päivänä heinäkuuta 1970 annetunneuvoston direktiivin (
1) ja erityisesti sen 2 artiklan,
sekä katsoo, ettämainitussa direktiivissä säädetään rehujen virallisen tarkastuksen suorit-
tamisesta yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmiä käyttäen sen
tarkastamiseksi, että lakien, asetusten ja hallinnollisten määräystenrehujen laatua ja koostumusta koskevat vaatimukset tulevat täytetyksi,
useita yhteisön määritysmenetelmiä on jo vahvistettu 15 päivänä
kesäkuuta 1971 annetulla komission direktiivillä 71/250/ETY (
2) sekä
18 päivänä marraskuuta 1971 annetulla komission direktiivillä 71/393/ETY (
3); työon tämän jälkeen edistynyt siinä määrin, että olisi hyväk-
syttävä kolmas ryhmä menetelmiä, ja
tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän rehukomitean
lausunnon mukaiset,
ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:
1 artikla
Jäsenvaltioiden on vaadittava, että rehujen virallisessa tarkastuksessa
niiden tärkkelys-, raakavalkuais- ja pepsiini-suola-happoliukoisenraakavalkuaispitoisuuden sekä vapaan ja kokonaisgossypolipitoisuudensamoin kuin pepsiiniaktiivisuuden määritykset suoritetaan tämän direk-tiivin liitteessä I esitettyjen menetelmien mukaisesti.
2 artikla
Jäsenvaltioiden on vaadittava, että rehujen virallisessa tarkastuksessa
►M4 ◄tylosiinin ja virginiamysiinin pitoisuusmääri-
tykset suoritetaan tämän direktiivin liitteessä II esitettyjenmenetelmien mukaisesti.
3 artikla
Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edel-
lyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset voimaanviimeistään 1 päivänä heinäkuuta 1973. Niiden on ilmoitettava tästäkomissiolle viipymättä.
4 artikla
Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.1972L0199 — FI — 13.08.1998 — 004.001 — 2
(1) EYVL N:o L 170, 3.8.1970, s. 2
(2) EYVL N:o L 155, 12.7.1971, s. 13
(3) EYVL N:o L 279, 20.12.1971, s. 7▼M1
▼B
▼M1
▼B
▼B
LIITE I
1TÄRKKELYKSEN MÄÄRITYS
— Polarimetrinen menetelmä —
1Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää tärkkelyksen ja tärkkelyksen suurimo-
lekyylisten pilkkoutumistuotteiden pitoisuus rehuissa, lukuun ottamatta niitä
rehuja, jotka sisältävät juurikasleikettä, juurikasmassaa, juurikkaan kuivattuja
naatteja tai lehtiä, perunamassaa, kuivahiivaa runsaasti inuliinia (esim.
mukula-artisokkaleike ja -jauho) tai rasvatähteitä.
2Periaate
Menetelmä perustuu kaksoismääritykseen. Ensimmäisessä määrityksessä näyte
käsitellään kuumalla, laimealla suolahapolla. Kun liuos on muuttunut kirk-
kaaksi ja suodatettu, liuoksen optinen kääntökyky mitataan polarimetrisesti.
Toisessa määrityksessä näyte uutetaan 40 % (v/v) etanolilla. Kun suodos on
tehty happamaksi suolahapolla, se on muuttunut kirkkaaksi ja suodatettu,
optinen kääntökyky mitataan kuten ensimmäisessä määrityksessä.
Kun näiden kahden mittauksen erotus kerrotaan tunnetulla kertoimella,
saadaan näytteen tärkkelyspitoisuus.
3Reagenssit
3.1 25 % (w/w) suolahappo, tiheys 1,1263.2 1,128 % (w/v) suolahappo
Konsentraatio on tarkistettava titraamalla 0,1 N natriumhydroksidiliuok-
sella, indikaattorina 0,1 % (w/v) metyylipuna 94 % (v/v) etanolissa.
10 ml vastaa 30,94 ml:aa 0,1 N NaOH:iä.
3.3 Carrez-liuos I: liuotetaan veteen 21,9 g sinkkiasetaattia Zn(CH
3COO)2·
2H2O ja 3 g jääetikkaa. Täytetään 100 ml:ksi vedellä.
3.4 Carrez liuos II: liuotetaan veteen 10,6 g kaliumheksasyanoferraattia
K4(Fe(CN)6)·3 H2O. Täytetään 100 ml:ksi vedellä.
3.5 40 % (v/v) etanoli, tiheys 0,948, 20 ºC.
4Välineistö
4.1 250 ml:n erlenmeyerkolvi, jossa on palautusjäähdytin.
4.2 Polarimetri tai sakkarimetri.
5Menettely
5.1Näytteen esikäsittely
Näyte jauhetaan hienoksi siten, että se läpäisee kokonaan 0,5 mm:n
seulan.
5.2Optisen kokonaiskiertokyvyn (P tai S)määritys (ks. 7.1 Huomautus)
Punnitaan 2,5 g hienoksi jauhettua näytettä 1 mg:n tarkkuudella 100 ml:n
mittapulloon. Lisätään 25 ml suolahappoa (3.2), ravistellaan kunnes
määritettävä näyte on jakaantunut tasaisesti ja lisätään vielä 25 ml suola-
happoa (3.2). Pullo asetetaan kiehuvaan vesihauteeseen ja sitä ravistellaan
voimakkaasti ja yhtäjaksoisesti ensimmäisten kolmen minuutin ajan
kokkaroitumisen estämiseksi. Vesihauteen vesimäärän on oltava riittävän
suuri, jotta haude pysyy kiehuvana kun pullo upotetaan siihen. Pulloa
ravisteltaessa sitä ei saa ottaa pois hauteesta. Tarkalleen 15 minuutin
kuluttua pullo otetaan hauteesta, lisätään 30 ml kylmää vettä ja jäähdy-
tetään välittömästi 20 ºC:een.
Lisätään 5 ml Carrez-liuosta I (3.3) ja ravistellaan yhden minuutin ajan.
Tämän jälkeen lisätään 5 ml Carrez-liuosta II (3.4) ja ravistellaan uudel-
leen yhden minuutin ajan. Täytetään merkkiin vedellä, homogenoidaan ja
suodatetaan. Jos suodos ei ole täysin kirkasta (mikä tapahtuu harvoin),
määritys toistetaan käyttäen suurempaa määrää Carrez-liuoksia I ja II,
esimerkiksi 10 ml.1972L0199 — FI — 13.08.1998 — 004.001 — 3
▼B
Liuoksen optinen kiertokyky mitataan 200 mm:n putkessa polarimetrillä
tai sakkarimetrillä.
5.340-prosenttiseen etanoliin liukoisten yhdisteiden optisen kiertokyvyn (P ′
tai S ′)määritys
Punnitaan 5 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella 100 ml:n mittapulloon ja
lisätään noin 80 ml etanolia (3.5) (ks. 7.2 Huomautus). Pullon annetaan
seistä 1 tunnin ajan huoneenlämmössä ja tänä aikana sitä ravistellaan
voimakkaasti kuusi kertaa siten, että näyte sekoittuu perusteellisesti
etanoliin. Täytetään merkkiin etanolilla (3.5), homogenoidaan ja suodate-
taan.
Pipetoidaan 50 ml suodosta (= 2,5 g näytettä) 250 ml:n erlenmeyerkol-
viin, lisätään 2,1 ml suolahappoa (3.1) ja ravistellaan voimakkaasti.
Erlenmeyerkolviin kiinnitetään palautusjäähdytin ja kolvi asetetaan kiehu-
vaan vesihauteeseen. Tarkalleen 15 minuutin kuluttua erlenmeyerkolvi
otetaan hauteelta ja sen sisältösiirretään 100 ml:n mittapulloon huuhto-
malla pienellä määrällä kylmää vettä ja jäähdytetään 20 ºC:een.
Tämän jälkeen suoritetaan selkeytys Carrez-liuoksilla I (3.3) ja II (3.4),
täytetään merkkiin vedellä, sekoitetaan, homogenoidaan ja mitataan
optinen kiertokyky 5.2 kohdan toisessa ja kolmannessa alakohdassa esite-
tyllä tavalla.
6Tulosten laskeminen
Tärkkelyspitoisuus prosentteina lasketaan seuraavasti:
6.1Polarimetriset mittaukset
T¨arkkelysprosentti ¼2000 P /C0P0ðÞ
α½/C13820º
D
P = Optinen kokonaiskiertokyky asteina.
P′ = 40 % (v/v) etanoliin liukoisten aineiden optinen
kokonaiskiertokyky asteina.
α½/C13820º
D = puhtaan tärkkelyksen ominaiskiertokyky.
Näinä tekijöinä käytetään seuraavia sovittuja
arvoja:
+ 185,9º: riisitärkkelys,
+ 195,4º: perunatärkkelys,+ 184,6º: maissitärkkelys,+ 182,7º: vehnätärkkelys,+ 181,5º: ohratärkkelys,+ 181,3º: kauratärkkelys,+ 184,0º: muut tärkkelyslajit sekä tärkkelysseokset
rehuseoksissa.
6.2Sakkarimetriset mittaukset
T¨arkkelysprosentti ¼
2000
α½/C13820º
D/C12N/C10;665 ðÞ S/C0S0ðÞ
100¼26;6N S /C0S0ðÞ
α½/C13820º
D
S = Optinen kokonaiskiertokyky sakkarimetrin asteina.
S′= 40 % (v/v) etanoliin liukoisten aineiden optinen kokonaiskier-
tokyky sakkarimetrin asteina.
N = sellainen sakkaroosin määrä grammoina, joka 100 ml:ssa vettä
ja 200 mm:n kerrospaksuudessa antaa optisen kiertokyvyn,
jonka suuruus on 100 sakkarimetrin astetta. Tämä paino vaih-
telee sakkarimetrityyppien mukaan seuraavasti:
16,29 g ranskalaisella sakkarimetrillä26,00 g saksalaisella sakkarimetrillä20,00 g sekalaisilla sakkarimetrillä,
α½/C138
20º
D= puhtaan tärkkelyksen ominaiskiertokyky (ks. 6.1).1972L0199 — FI — 13.08.1998 — 004.001 — 4
▼B
6.3.Toistettavuus
Samasta näytteestä tehdyn kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen
ero ei saa ylittää 0,4 % absoluuttisena arvona ilmoitettuna alle 40 %
tärkkelyspitoisuuksien osalta ja 1,1 % suhteellisena arvona ilmoitettuna
40 % tai tätä suurempien tärkkelyspitoisuuksien osalta.
7Huomautuksia
7.1 Kun näyte sisältää yli 6 % karbonaatteja, kalsiumkarbonaatteina lasket-
tuna, on ne ennen optisen kokonaiskiertokyvyn määritystä hajotettava
tarkalleen sopivalla määrällä laimeaa rikkihappoa.
7.2 Paljon laktoosia sisältävien tuotteiden, kuten maitojauheen tai kuoritusta
maidosta valmistetun jauheen, määritystä jatketaan 80 ml:n etanolili-
säyksen (3.5) jälkeen seuraavasti. Palautusjäähdytin kiinnitetään pulloon
ja pullo asetetaan vesihauteelle 50 ºC:een 30 minuutin ajaksi. Annetaan
jäähtyä ja jatketaan määritystä 5.3 kohdassa esitetyllä tavalla.
2RAAKAVALKUAISEN MÄÄRITYS
1Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista laskea Kjeldahlin menetelmän mukaan saadusta
typpipitoisuudesta rehujen raakavalkuaispitoisuus.
2Periaate
Näyte hajotetaan rikkihapolla katalysaattorin läsnä ollessa. Hapan liuos
tehdään emäksiseksi natriumhydroksidiliuoksella. Vapautunut ammoniakki
tislataan ja sidotaan määrättyyn rikkihappomäärään, jonka ylimäärä titrataan
natriumhydroksidiliuoksella.
3Reagenssit
3.1 Kaliumsulfaatti
3.2 Katalysaattori: kupari(II)oksidi CuO, analyysilaatua tai kuparisulfaatti
CuSO4·5H2O, analyysilaatua.
3.3 Sinkki, rakeinen
3.4 Rikkihappo, ρ20= 1,84 g/ml
3.5 Rikkihappo c(½H2SO4) = 0,5 mol/l
3.6 Rikkihappo c(½H2SO4) = 0,1 mol/l
3.7 Metyylipunaindikaattori: 300 g metyylipunaista liuotetaan 100 ml:aan
95 - 96 % etanolia (v/v)
3.8 Natriumhydroksidiliuos (teknisen laadun käyttömahdollista) = 40 g/
100 ml (m/v: 40 %)
3.9 Natriumhydroksidiliuos c = 0,25 mol/l
3.10 Natriumhydroksidiliuos c = 0,1 mol/l
3.11 Hohkakivijyväsiä, suolahapossa pestyjä ja hehkutettuja
3.12 Asetanilidi (sulamispiste = 114 ºC, N = 10,36 %)
3.13 Typetön sakkaroosi
4Välineistö
Välineet näytteen hajottamista, tislausta ja titrausta varten Kjeldahlin mene-
telmän mukaan.
5Suoritus
5.1Hajotus
Punnitaan 1 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella Kjeldahl-kolviin hajotus-
polttoa varten. Lisätään 15 g kaliumsulfaattia (3.1), sopiva määrä
katalysaattoria (3.2) [0,3 - 0,4 g analyysilaatuista kuparioksidia tai 0,9 -
1,2 g analyysilaatuista kuparisulfaattia], 25 ml rikkihappoa (3.4) ja
muutamia hohkakivijyväsiä (3.11) ja sekoitetaan. Kolvia kuumennetaan
varovasti tarvittaessa ajoittain ravistellen, kunnes massa on hiiltynyt ja
kuohu hävinnyt. Tämän jälkeen kuumennetaan voimakkaammin, kunnes1972L0199 — FI — 13.08.1998 — 004.001 — 5
▼M3
▼M3
neste kiehuu tasaisesti. Kuumennus on sopiva, jos kiehuva happo tiivistyy
kolvin seinämiin. Kolvin seinämien ylikuumennusta ja orgaanisen
aineksen tarttumista kolvin seinämiin on vältettävä. Kun liuos on muut-
tunut kirkkaaksi ja kirkkaanvihreäksi, keittämistä jatketaan vielä kahden
tunnin ajan. Tämän jälkeen kolvin annetaan jäähtyä.
5.2Tislaus
Kolviin lisätään varovasti riittävä määrä vettä, jotta sulfaatit liukenisivat
täysin. Annetaan jäähtyä ja lisätään muutama sinkkirae (3.3).
Tislauslaitteen keräilyastiaan lisätään oletetun typpipitoisuuden mukaan
tarkalleen 25 ml rikkihappoa (3.5) tai (3.6) ja muutama pisara metyylipu-
naindikaattoria (3.7).
Kolvi yhdistetään tislauslaitteen jäähdyttäjään ja jäähdyttäjän pää upote-
taan keräilyastiassa olevaan liuokseen vähintään 1 cm:n syvyyteen (ks.
8.3 Huomautus). Kolviin lasketaan hitaasti 100 ml natriumhydroksidi-
liuosta (3.8) siten, ettei ammoniakkia katoa (ks. 8.1 huomautus).
Kolvia kuumennetaan siten, että ammoniakki tislautuu kokonaan.
5.3Titraus
Keräilyastiassa oleva rikkihappoylimäärä titrataan käytetyn rikkihapon
normaalisuuden mukaan natriumhydroksidiliuoksella (3.9) tai (3.10),
kunnes loppupiste saavutetaan.
5.4Sokeakoe
Reagenssien typettömyyden varmistamiseksi suoritetaan sokeakoe
(hajotus, tislaus ja titraus) käyttämällä 1 g sakkaroosia (3.13) näytteen
sijasta.
6Tulosten laskeminen
Raakavalkuaispitoisuus lasketaan seuraavalla kaavalla:
V0/C0V1 ðÞ /C2 c/C20;014/C2100/C26;25
m
jossa
V0 = sokeakokeessa kulunut NaOH (3.9 tai 3.10) määrä (ml)
V1 = näytteen titrauksessa kulunut NaOH (3.9 tai 3.10) määrä (ml)
c = natriumhydroksidin (3.9 tai 3.10) normaalisuus (mol/l)m = näytteen massa (g)
7Menetelmän varmistus
7.1Toistettavuus
Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten
välinen ero ei saa ylittää:
— 0,2 %, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, alle 20 % olevien raaka-
valkuaispitoisuuksien osalta,
— 1,0 %, suhteessa korkeimpaan arvoon, välillä 20 - 40 % olevien
raakavalkuaispitoisuuksien osalta,
— 0,4 %, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, yli 40 % olevien pitoisuuk-
sien osalta.
7.2Tarkkuus
Määritys (hajotus, tislaus ja titraus) tehdään 1,5 - 2,0 g:lla asetanilidia
(3.12) ja 1 g:lla sakkaroosia (3.13); 1 g astanilidia kuluttaa 14,80 ml
rikkihappoa (3.5). Saannon on oltava vähintään 99 %.
8Huomautukset
8.1 Voidaan käyttää käsikäyttöistä, puoliautomaattista tai automaattista
välineistöä. Jos liuos joudutaan siirtämään astiasta toiseen hajotuksen ja
tislauksen välillä, siirto on suoritettava siten, ettei häviöitä tapahdu. Jos
tislauslaitteen kolvissa ei ole tiputussuppiloa, lisätään natriumhydroksidi
välittömästi ennen kolvin liittämistä jäähdyttäjään kaataen liuos hitaasti
kolvin seinämää myöten.1972L0199 — FI — 13.08.1998 — 004.001 — 6
▼M3
8.2 Jos hajotettu tuote kiinteytyy, määritys on aloitettava alusta käyttämällä
suurempaa määrää rikkihappoa (3.4) kuin edellä on mainittu.
8.3 Typpipitoisuudeltaan alhaisille tuotteille keräilykolvissa olevan rikki-
hapon (3.6) määrää voidaan vähentää tarvittaessa 10 tai 15 ml:aan ja
täyttää 25 ml:ksi vettä lisäämällä.
3PEPSIINI-SUOLAHAPPOLIUKOISEN RAAKAVALKUAISEN
MÄÄRITYS
1Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää pepsiini-suolahappoliukoinen raaka-
valkuaismäärä määritellyissä koeolosuhteissa. Se soveltuu kaikkiin rehuihin.
2Periaate
Näytettä pidetään 48 tuntia 40 ºC:ssa pepsiini-suolahappoliuoksessa.
Suspensio suodatetaan ja suodoksen typpipitoisuus määritetään raakavalk-
uaisen määrittämiseksi esitetyn menetelmän mukaan.
3Reagenssit
3.1 Suolahappo, tiheys 1,125
3.2 0,075 N suolahappo3.3 2,0 U/mg pepsiiniä: pepsiiniaktiivisuus määritetään ja tarkastetaan tässä
liitteessä olevan 4 osan mukaisesti.
3.4 Noin 0,02 % pepsiini-suolahappoliuos (w/v) (3.2), vasta valmistettu.
Aktiivisuus: 400 U/l.
3.5 Kuohunestoaine (esim. silikoni).
3.6 Kaikki raakavalkuaismääritysmenetelmää koskevassa 3 kohdassa luetellut
reagenssit.
4Välineistö
4.1 Vesihaude tai lämpökaappi, säädetty 40 ± 1 ºC:een.4.2 Välineistönäytteen hajottamista ja tislausta varten Kjeldahlin menetelmän
mukaan.
5Menettely
5.1Raakavalkuaisen liuottaminen (ks. 7.2 Huomautus)
Punnitaan 2 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella 500 ml:n mittapulloon ja
lisätään 450 ml 40 ºC:een lämmitettyä pepsiini-suolahappoliuosta (3.4).Ravistellaan kokkaroitumisen estämiseksi. Tarkistetaan, että suspension
pH on alle 1,7. Pulloa pidetään vesihauteessa tai lämpökaapissa (4.1) 48
tuntia. Ravistellaan 8, 24 ja 32 tunnin kuluttua. Lisätään 48 tunnin
kuluttua 15 ml suolahappoa (3.1), annetaan jäähtyä 20 ºC:een, täytetään
merkkiin asti vedellä ja suodatetaan.
5.2Hajotus
Otetaan 250 ml suodosta Kjeldahl-kolviin tislausta varten (4.2). Kolviin
lisätään tarvittavat reagenssit kuten raakavalkuaispitoisuutta määritet-
täessä 5.1 kohdan toisessa lauseessa on kuvattu.
Homogenoidaan ja kuumennetaan kiehuvaksi. Jos kuohua muodostuu,
lisätään muutama pisara kuohunestoainetta (3.5). Kiehumisen annetaan
jatkua kunnes vesi on lähes kokonaan haihtunut. Loppuvesi haihdutetaan
kolvia varovaisemmin kuumentamalla. Liuoksen muututtua kirkkaaksi ja
värittömäksi (tai kirkkaanvihreäksi kuparipitoista katalyyttia käytettäessä),
keittämistä jatketaan vielä tunnin ajan. Tämän jälkeen annetaan jäähtyä.
5.3Tislaus ja titraus
Näytteen tislaus ja titraus suoritetaan kuten raakavalkuaispitoisuutta
määritettäessä 5.2 ja 5.3 kohdassa.
5.4Sokeakoe
Sokeakoe suoritetaan samalla tavalla, mutta ilman määritettävää näytettä.1972L0199 — FI — 13.08.1998 — 004.001 — 7
▼B
▼B
6Tulosten laskeminen
Nollakokeen kuluttama rikkihappomäärä vähennetään näytteen kuluttamasta
rikkihappomäärästä. 1 ml 0,1 N rikkihappoa vastaa 1,4 mg typpeä.
Typen määrä kerrotaan kertoimella 6,25. Tulos ilmoitetaan prosenttina
näytteestä.
Toistettavuus
Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen
ero ei saa ylittää:
— 0,4 %, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, alle 20 % olevien pitoisuuksien
osalta;
— 2,0 %, suhteellisena arvona ilmoitettuna, välillä 20-40 % olevien pitoi-
suuksien osalta;
— 0,8 %, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, yli 40 % olevien pitoisuuksien
osalta.
7Huomautuksia
7.1 Tällä menetelmällä saaduilla arvoilla ei ole suoraa yhteyttä sulavuuteen in
vivo-olosuhteissa.
7.2 Kun rehunäytteiden raakarasvapitoisuus on yli 10 %, on rasva ensin pois-
tettava petroolieetteriuutolla (kp. 40-60 ºC).
4PEPSIINIAKTIIVISUUDEN MÄÄRITYS
1Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää sellaisen pepsiinin aktiivisuus, jota
käytetään pepsiini-suolahappoliukoista raakavalkuaista määritettäessä.
2Periaate
Hemoglobiini käsitellään pepsiinillä ja laimealla suolahappoliuoksella
määritellyissä olosuhteissa. Valkuaisaineen hydrolysoitumaton osa saostetaan
trikloorietikkahapolla. Suodokseen lisätään natriumhydroksidi ja Folin-
Ciocalteu-reagenssi. Tämän liuoksen optinen tiheys mitataan 750 nm:ssa ja
vastaava tyrosiinin määrä luetaan kalibrointikäyrältä.
Määritelmä: Pepsiiniyksikkömääritellään sellaisena entsyymimääränä, joka
koeolosuhteissa vapauttaa minuutissa sellaisen määrän hydroksiaryyliryhmiä,
että niiden värjäys Folin-Ciocalteau-reagenssilla antaa optisen tiheyden, joka
saadaan samoissa olosuhteissa yhdestä mikromoolista tyrosiinia.
3Reagenssit
3.1 0,2 N suolahappo.
3.2 0,06 N suolahappo.3.3 0,025 N suolahappo.
3.4 5 % trikloorietikkahappoliuos (w/v).
3.5 0,5 N natriumhydroksidiliuos.3.6 Folin-Ciocalteau-reagenssi. Punnitaan 100 g natriumwolframaattia
(Na
2WO4·2H2O), 25 g natriummolybdaattia (Na2MoO4·2H2O) ja
700 ml vettä hiokselliseen 2 l:n pyörökolviin. Lisätään 50 ml fosfori-
happoa (tiheys 1,71) ja 100 ml väkevää suolahappoa (tiheys 1,19),
yhdistetään pystyjäähdyttäjään, kuumennetaan kiehuvaksi ja keitetään
varovasti 10 tuntia. Annetaan jäähtyä, irrotetaan pystyjäähdyttäjä, lisätään
175 g litiumsulfaattia (Li2SO4·2H2O), 50 ml vettä ja 1 ml bromia.
Keitetään 15 minuuttia bromiylimäärän poistamiseksi.
Annetaan jäähtyä, siirretään liuos 1 litran mittapulloon, täytetään merk-
kiin vedellä, homogenoidaan ja suodatetaan. Liuokseen ei saa jäädä
vihertävää väriä. Ennen käyttöä yksi tilavuusosa reagenssiliuosta laimen-
netaan kahdella tilavuusosalla vettä.
3.7 Hemoglobiiniliuos: Punnitaan 354 mg:aa typpeä (1) vastaava määrä hemo-
globiinia (noin 2 g), proteaasisubstraatti Ansonin mukaan 200 ml:n1972L0199 — FI — 13.08.1998 — 004.001 — 8
(1) Typpipitoisuus määritetään Kjeldahl-puolimikromenetelmällä (teoreettinen pitoisuus
17,7 % N).
▼B
hiokselliseen kolviin. Lisätään muutama ml suolahappoa (3.2), yhdis-
tetään kolvi imupumppuun ja ravistellaan kunnes hemoglobiini on täysin
liuennut. Vakuumi päästetään pois ja lisätään samalla ravistellen suola-
happoa (3.2) siten, että liuostilavuudeksi tulee 100 ml. Valmistetaan
juuri ennen käyttöä .
3.8 Tyrosiinistandardiliuos: Punnitaan 181,2 mg tyrosiinia 1 l mittapulloon,
liuotetaan suolahappoon (3.1) ja täytetään 1 merkkiin samalla hapolla
(kantaliuos). Otetaan 20,0 ml liuosta ja laimennetaan 100 ml:ksi suolaha-
polla (3.1). 1 ml tätä liuosta sisältää 0,2 mikromoolia tyrosiinia.
4Välineistö
4.1 Termostaattinen vesihaude, asetettu 25 ºC ± 0,1 ºC.4.2 Spektrofotometri.4.3 Kronometri, tarkkuus: 1 sekunti.4.4 pH-mittari.
5Menettely
5.1Liuoksen valmistus (ks. 7.1 Huomautus)
Liuotetaan 150 mg pepsiiniä 100 ml:aan suolahappoa (3.2). Pipetoidaan
2 ml tätä liuosta 50 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin suolahapolla
(3.3). Liuoksen pH:n tulee olla 1,6 ± 0,1 pH-mittarilla tarkistettuna. Pullo
asetetaan vesihauteeseen (4.1).
5.2Hydrolysointi
Koeputkeen pipetoidaan 5,0 ml hemoglobiiniliuosta (3.7), siirretään
25 ºC:een vesihauteeseen (4.1), lisätään 1,0 ml kohdassa 5.1 saatua
pepsiiniliuosta ja sekoitetaan noin 10 kertaa edestakaisin lasipuikolla.
Koeputki pidetään vesihauteessa 25 ºC:ssa tasan 10 minuutin ajan pepsii-
nilisäyksestä (aikaa ja lämpötilaa on noudatettava tarkalleen). Tämän
jälkeen lisätään 10,0 ml 25 ºC:ssa olevaa trikloorietikkahappoliuosta
(3.4), homogenoidaan ja suodatetaan kuivan suodatinpaperin läpi.
5.3Värin kehitys ja optisen tiheyden mittaus
Pipetoidaan 5,0 ml suodosta 50 ml:n erlenmeyeriin, lisätään 10,0 ml
natriumhydroksidiliuosta (3.5) ja koko ajan ravistellen 3,0 ml laimeaa
Folin-Ciocalteau-reagenssia (3.6). 5-10 minuuttia kuluttua liuoksen
optinen tiheys spektrometrissä 750 nm:ssa vettä vastaan 1 cm kyvetissä.
5.4Sokeakoe
Jokaisen määrityksen yhteydessä on suoritettava sokeakoe seuraavalla
tavalla.
Koeputkeen pipetoidaan 5,0 ml hemoglobiiniliuosta (3.7) ja se asetetaan
vesihauteelle (4.1) 25 ºC:een, lisätään 10,0 ml 25 ºC:ssa olevaa trikloor-
ietikkahappoliuosta (3.4), homogenoidaan ja lisätään edelleen 1,0 ml 5.1
kohdassa saatua pepsiiniliuosta. Sekoitetaan lasipuikolla ja asetetaan
koeputki vesihauteelle (4.1) 25 ºC:een tasan 10 minuutiksi. Homogenoi-
daan ja suodatetaan kuivan suodatinpaperin läpi. Suoritusta jatketaan 5.3
kohdassa esitetyllä tavalla.
5.5Kalibrointikäyrä
Pipetoidaan 50 ml:n erlenmeyerpulloihin 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 ja 5,0 ml tyro-
siinistandardiliuosta (3.8), jotka vastaavat 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 ja 1,0
mikromoolia tyrosiinia. Sarja täydennetään näytteellä, joka ei sisällä
tyroksiinia. Tilavuudet säädetään 5,0 ml:ksi suolahapolla (3.1). Lisätään
10,0 ml natriumhydroksidiliuosta (3.5) ja koko ajan sekoittaen 3,0 ml
laimeaa Folin-Ciocalteaureagenssia (3.6). Mitataan optinen tiheys 5.3
kohdan viimeisessä lauseessa esitetyllä tavalla. Kalibrointikäyrä laaditaan
piirtämällä optisia tiheyksiä ja näitä vastaavia tyrosiinimääriä esittävä
kuvaaja.
6Tulosten laskeminen
Värillisen liuoksen optista tiheyttä vastaava ja sokeakokeella korjattu tyrosii-
nimäärä millimooleina määritetään kalibrointikäyrältä.
Pepsiinin aktiivisuus mikromooleina tyrosiinia milligrammaa ja minuuttia
kohden lasketaan seuraavalla kaavalla:1972L0199 — FI — 13.08.1998 — 004.001 — 9
▼B
Yksikk¨oj¨a milligrammassa U =mgðÞ ¼0;32 a
p
jossa:
a = tandardisuoralta saatu tyrosiinimäärä mikromooleina
p = isätyn pepsiinimäärän paino milligrammoina (5.2 kohta)
7Huomautuksia
7.1 Liuotettavan pepsiinin määrän on oltava sellainen, että spektrofotometri-
sessä mittauksessa optiseksi tiheydeksi saadaan 0,35 ± 0,035.
7.2 Menetelmällä saadut kaksi yksikköä milligrammassa vastaavat:
3.64 milliAnsonyksikköä/mg (mikromoolia tyrosiinia/mg min 35,5 ºC:ssa)
tai
36400 kaupallista yksikköä/g (mikromoolia tyrosiinia/g 10 min
35,5 ºC:ssa).
5VAPAAN GOSSYPOLIN JA KOKONAISGOSSYPOLIN MÄÄRITYS
1Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää vapaan gossypolin, kokonaisgossy-
polin ja niitä kemiallisesti lähellä olevien aineiden määrä
puuvillansiemenistä, puuvillansiemenjauhosta ja puuvillansiemenkakusta sekä
niitä sisältävistä rehuseoksista. Määrityksen alaraja on 20 mg/kg.
2Periaate
Gossypoli uutetaan 3-amino-1-propanolin läsnäollessa joko isopropanolin ja
heksaanin seoksella vapaan gossypolin määrittämiseksi tai dimetyyliformami-
dilla kokonaisgossypolin määrittämiseksi. Gossypoli muutetaan aniliinilla
gossypolidianiliiniksi, jonka optinen tiheys mitataan 440 nm:ssa.
3Reagenssit
3.1 Isopropanoli-heksaaniseos: sekoitetaan 60 tilavuusosaa isopropanolia,
analyysilaatua, ja 40 tilavuusosaa n-heksaania.
3.2 Liuotinseos A: Lisätään noin 500 ml isopropanoli-heksaani-seosta (3.1),
2 ml 3-amino-1-propanolia, 8 ml jääetikkaa ja 50 ml vettä 1 litran mitta-
pulloon. Mittapullo täytetään merkkiin isopropanoli-heksaani-seoksella
(3.1). Säilyy yhden viikon ajan.
3.3 Liuotinseos B: Pipetoidaan 2 ml 3-amino-1-propanolia ja 10 ml
jääetikkaa 100 ml:n mittapulloon. Annetaan jäähtyä huoneenlämpöön ja
täytetään merkkiin N,N-dimetyyliformamidilla. Säilyy yhden viikon ajan.
3.4 Aniliini, analyysilaatua: jos sokeakokeessa saatu optinen tiheys on yli
0,022, aniliini on tislattava sinkkijauheen päältä siten, että tisleestä
jätetään pois 10 % sekä alku- että loppufraktiota. Suljetussa ruskeassa
lasipullossa kylmässä säilytettynä reagenssiliuos säilyy useiden kuukau-
sien ajan.
3.5 Gossypoli-standardiliuos A: Punnitaan 27,9 mg gossypoliasetaattia
250 ml:n mittapulloon. Liuotetaan liuotinseokseen A, täytetään merkkiin
samalla liuotinseoksella (3.2). Pipetoidaan 50 ml tätä seosta 250 ml:n
mittapulloon, joka täytetään merkkiin liuotinseoksella A. Tämän liuoksen
gossypolikonsentraatio on 0,02 mg/ml. Annetaan seistä yhden tunnin ajan
huoneenlämmössä ennen käyttöä.
3.6 Gossypoli-standardiliuos B: Punnitaan 27,9 mg gossypoliasetaattia 50 ml:n
mittapulloon. Liuotetaan liuotinseokseen B ja täytetään merkkiin samalla
liuotinseoksella (3.3). Tämän liuoksen gossypolikonsentraatio on 0,5 mg/
ml.
Gossypolin standardiliuokset A ja B säilyvät 24 tuntia valolta suojattuina.
4Välineistö
4.1 Mekaaninen sekoittaja: noin 35 kierr./min.
4.2 Spektrofotometri.1972L0199 — FI — 13.08.1998 — 004.001 — 10
▼B
5Menettely
5.1Näytteen punnitusmäärä
Punnitusmäärä riippuu näytteen oletetusta gossypolipitoisuudesta. On
suositeltavaa käyttää pientä punnitusmäärää ja suhteellisen suurta
suodosmäärää, jotta gossypolin määrä saataisiin riittävän suureksi spek-
trofotometrisen mittauksen suorittamiseen. Näytekoko ei saisi ylittää 1 g
määritettäessä vapaan gossypolin pitoisuutta puuvillansiemenistä, puuvil-
lansiemenjauhosta tai puuvillansiemenkakusta. Jos määritys tapahtuu
rehuseoksesta, näytekoko voi olla jopa 5 g. Useimmissa tapauksissa
riittää 10 ml suodosta. Suodoksen tulisi sisältää 50-100 µg gossypolia.
Kokonaisgossypolin määrittämiseen punnitusmäärän tulisi olla 0,5-5 g
siten, että 2 ml:n määrä suodosta sisältää 40-200 µg gossypolia.
Määritys on suoritettava noin 20ºC:n huoneenlämmössä.
5.2Vapaan gossypolin määritys
Sopiva määrä näytettä punnitaan hiokselliseen, lasitulpalla suljettavaan
250 ml:n keittokolviin, jonka pohjalla on lasimurskaa. Lisätään pipetillä
kolviin 50 ml liuotinseosta A (3.2), suljetaan kolvi tulpalla ja sekoitetaan
yhden tunnin ajan sekoittajassa. Suodatetaan kuivan suodatinpaperin läpi
pieneen, hiokselliseen kolviin. Suodatinsuppilo peitetään kellolasilla
suodatuksen ajaksi. Pipetoidaan kahteen 25 ml:n mittapulloon (A ja B)
sama määrä suodosta, joka sisältää 50-100 µg gossypolia. Tarvittaessa
tilavuus täydennetään 10 ml:ksi liuotinseoksella A (3.2). Tämän jälkeen
mittapullo (A) täytetään merkkiin isopropanoli-heksaaniseoksella (3.1).
Tätä liuosta käytetään referenssiliuoksena näyteliuoksen mittauksessa.
Pipetoidaan 10 ml liuotinseosta A (3.2) kahteen 25 ml:n mittapulloon (C
ja D). Toinen mittapullo (C) täytetään merkkiin isopropanoli-heksaani-
seoksella (3.1). Tätä liuosta käytetään referenssiliuoksena
nollakoeliuoksen mittauksessa.
Pipetoidaan mittapulloihin D ja B 2 ml aniliiniliuosta (3.4). Lämmitetään
30 minuuttia kiehuvalla vesihauteella värin muodostumiseksi. Annetaan
jäähtyä huoneenlämpöön, täytetään merkkiin isopropanoli-heksaani-seok-
sella (3.1), homogenoidaan ja annetaan seistä yhden tunnin ajan.
Mitataan sokeakoeliuoksen (D) optinen tiheys spektrometrillä 440 nm:ssa
1 cm:n lasikyvetissä referenssiliuosta (C) vastaan, ja näyteliuoksen (B)
optinen tiheys vertailuliuosta (A) vastaan.
Sokeakoeliuoksen optinen tiheys vähennetään näyteliuoksen optisesta
tiheydestä (= korjattu optinen tiheys). Tästä arvosta lasketaan vapaan
gossypolin pitoisuus 6 kohdassa kuvatulla tavalla.
5.3Kokonaisgossypolin määritys
Näytemäärä, joka sisältää 1-5 mg gossypolia, punnitaan 50 ml:n mittapul-
loon ja siihen lisätään 10 ml liuotinseosta B (3.3). Samanaikaisesti
valmistetaan sokeakoeliuos pipetoimalla 10 ml liuotinseosta B (3.3)
toiseen 50 ml:n mittapulloon. Molemmat mittapullot asetetaan kiehuvalle
vesihauteelle 30 minuutin ajaksi. Annetaan jäähtyä huoneenlämpöön ja
täytetään merkkiin isopropanoli-heksaani-seoksella (3.1). Homogenoidaan
ja annetaan seistä 10-15 minuuttia, suodatetaan hioksellisiin pulloihin.
Sekä suodatettua näyteliuosta että suodatettua sokeakoeliuosta pipetoi-
daan 2 ml 25 ml:n mittapulloihin. Toinen näyteliuosta ja toinen
sokeakoeliuosta sisältävä mittapullo täytetään merkkiin isopropanoli-
heksaaniseoksella (3.1). Näitä liuoksia käytetään vertailuliuoksina.
Jäljelle jääneeseen kahteen mittapulloon lisätään 2 ml aniliiniliuosta (3.4).
Lämmitetään 30 minuutin ajan kiehuvalla vesihauteella värin kehittymi-
seksi. Annetaan jäähtyä huoneenlämpöön, täytetään merkkiin
isopropanoli-heksaaniseoksella (3.1), homogenoidaan ja annetaan seistä
yhden tunnin ajan.
Optinen tiheys mitataan kuten vapaan gossypolin optinen tiheys 5.2
kohdan mukaan. Tästä arvosta lasketaan kokonaisgossypolipitoisuus 6
kohdassa esitetyllä tavalla.
6Tulosten laskeminen
Tulosten laskeminen voidaan suorittaa ominaista optista tiheyttä (6.1 kohta)
tai kalibrointikäyrää (6.2 kohta) käyttäen.1972L0199 — FI — 13.08.1998 — 004.001 — 11
▼B
6.1Ominaisesta optisesta tiheydestä
Ominainen optinen tiheys on annetuissa olosuhteissa
Vapaalle gossypolille E1%
1c m¼625
Kokonaisgossypolille E1%
1c m¼600
Vapaan tai kokonaisgossypolin pitoisuus saadaan kaavasta:
% gossypolia ¼E/C11250
E1%
1c m/C1p/C1a
jossa:
E = korjattu optinen tiheys määritettynä 5.2 kohdan mukaan
p = punnittu näytemäärä grammoina
a = suodosmäärä millilitroina.
6.2Kalibrointikäyrän avulla
6.2.1 Vapaa gossypoli
Valmistetaan kaksi viiden 25 ml:n mittapullon sarjaa. Molempiin
sarjoihin pipetoidaan 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 ja 10,0 ml gossypolistandar-diliuosta A (3.5) ja tilavuus täydennetään 10 ml:ksi liuotinseoksella
A (3.2). Molempiin sarjoihin otetaan mukaan 25 ml:n mittapullo,
joka sisältää vain 10 ml liuotinseosta A (3.2) (sokeakoe).
Toinen sarja mittapulloja täytetään merkkiin isopropanoli-heksaani-
seoksella (3.1) (vertailusarja).
Toiseen mittapullosarjaan, sokeakoe mukaan lukien, lisätään 2 ml
aniliiniliuosta (3.4). Lämmitetään 30 minuuttia kiehuvalla vesihau-
teella värin kehittämiseksi. Annetaan jäähtyä huoneenlämpöön,
täytetään merkkiin isopropanoli-heksaani-seoksella (3.1), homoge-
noidaan ja annetaan seistä yhden tunnin ajan (standardisarja).
Mitataan 5.2 kohdassa mainituissa olosuhteissa standardisarjan
liuosten optinen tiheys vertailusarjan vastaavia liuoksia vastaan.
Kalibrointikäyrä laaditaan piirtämällä optisia tiheyksiä ja näitä
vastaavia gossypolimääriä (mikrogrammoina) esittävä kuvaaja.
6.2.2 Kokonaisgossypoli
Valmistetaan kuuden 50 ml:n mittapullon sarja. Ensimmäiseen
pipetoidaan 10 ml liuotinseosta B (3.3) ja muihin 2,0; 4,0; 6,0; 8,0
ja 10,0 ml gossypolistandardiliuosta B (3.6). Pullojen tilavuus
säädetään 10 ml:ksi liuotinseoksella B (3.3). Lämmitetään kiehu-
valla vesihauteella 30 minuuttia. Annetaan jäähtyä
huoneenlämpöön, täytetään merkkiin isopropanoli-heksaani-seok-
sella (3.1) ja homogenoidaan.
Kuhunkin kahden sarjan kuuteen 25 ml:n mittapulloon pipetoidaan
2,0 ml tätä liuosta. Ensimmäisen sarjan pullot täytetään 25 ml:ksi
isopropanoli-heksaani-seoksella (3.1) (vertailusarja).
Kuhunkin toisen sarjan mittapulloon lisätään 2 ml aniliiniliuosta
(3.4). Lämmitetään 30 minuuttia kiehuvalla vesihauteella. Annetaan
jäähtyä huoneenlämpöön, täytetään merkkiin isopropanoli-heksaani-
seoksella (3.1), homogenoidaan ja annetaan seistä yhden tunnin
ajan (standardisarja).
Mitataan 5.2 kohdassa mainituissa olosuhteissa standardisarjan
liuosten optinen tiheys vertailusarjan vastaavia liuoksia vastaan.
Kalibrointikäyrä laaditaan piirtämällä optisia tiheyksiä ja näitä
gossypolimääriä (mikrogrammoina) esittävä kuvaaja.
6.3Toistettavuus
Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten
välinen ero ei saa ylittää:
— 15 %, suhteellisena arvona ilmoitettuna, alle 500 mg/kg olevien
gossypolipitoisuuksien osalta,
— 75 mg/kg, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, välillä 500-750 mg/kg
olevien pitoisuuksien osalta,1972L0199 — FI — 13.08.1998 — 004.001 — 12
▼B
— 10 %, suhteellisena arvona ilmoitettuna, yli 750 mg/kg olevien pitoi-
suuksien osalta.1972L0199 — FI — 13.08.1998 — 004.001 — 13
▼B
LIITE II
4TYLOSIININ MÄÄRITYS
— diffuusiolla agaralustassa —
1Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää rehujen, konsentraattien ja esiseosten
tylosiinipitoisuus. Määrityksen alaraja on 2 mg/kg.
2Periaate
Näyte käsitellään 80 ºC:lla fosfaattipuskuriliuoksella, jonka pH on 8, ja uute-
taan sitten metanolilla. Uute laimennetaan sentrifugoinnin jälkeen ja sen
antibioottinen aktiivisuus määritetään mittaamalla tylosiinin diffuusio agara-
lustalla, johon on ympätty Sarcina luteaa . Diffuusio mitataan
inhibitiovyöhykkeinä mikro-organismin läsnäollessa. Näiden vyöhykkeiden
läpimitta on suoraan verrannollinen antibioottikonsentraation logaritmiin.
3Mikro-organismi: Sarcina lutea ATCC N:o 9341
3.1Kantaviljelmän kasvatus
Sarcina luteaa ympätään putkeen, joka sisältää kasvatusalustasta (4.1)
valmistettuja agarvinopintoja. pH säädetään arvoon 7,0. Inkuboidaan yön
yli noin 35 ºC:ssa. Viljelmä säilytetään jääkaapissa ja agarvinopinta siir-
rostetaan uudelleen kuukausittain.
3.2Bakteerisuspension valmistus
Äskettäin valmistetusta agarvinopinnasta (3.1) kasvusto huuhdotaan 2-
3 ml:lla fysiologista ruokasuolaliuosta (4.4). Suspensio siirrostetaan
Roux-pulloon, joka sisältää 250 ml kasvatusliuosta (4.1), jonka pH on
säädetty arvoon 7,0. Inkuboidaan 24 tuntia 35 ºC:ssa. Kasvusto huuhdo-
taan 25 ml:lla fysiologista ruokasuolaliuosta (4.4). Homogenoidaan ja
suspensio laimennetaan siten, että valon transmissio on noin 75 % mitat-
tuna 650 nm:ssä.
Jääkaapissa säilytettynä tätä suspensiota voidaan käyttää yhden viikon
ajan.
Maljoilla, joissa on kasvatusalustaa (4.1), määritetään tarvittavan ympin
määrä, joka eri tylosiinikonsentraatioilla antaa mahdollisimman suuret ja
kirkkaina pysyvät inhibitiovyöhykkeet. Kasvatusliuos ympätään 48-
50 ºC:ssa.sg307
4Kasvatusalustat ja reagenssit
4.1Määritysalusta (1)
Glukoosi 1 g
Peptoni 10 gLihauute 1,5 g
Hiivauute 3 g
Agar, laadun mukaan 10-20 gTislattu vesi, täytetään 1 000 ml:ksi
Kantaviljelmän kasvatusta ja bakteerisuspension valmistusta varten
säädetään pH välittömästi ennen käyttöä arvoon 7,0 ja määritystä varten
arvoon 2,0.
4.2Fosfaattipuskuriliuos, pH 8
Kaliumdivetyfosfaatti KH
2PO4, analyysilaatua 0,523 g1972L0199 — FI — 13.08.1998 — 004.001 — 14
(1) Voidaan käyttää mitä tahansa vastaavan koostumuksen omaavaa kaupallisesti saatavilla
olevaa kasvatusalustaa, jolla saadaan vastaavat tulokset.▼M4
▼B
▼B
Dikaliumvetyfosfaatti K2HPO4, analyysilaatua 16,730 g
Tislattu vesi, täytetään 1 000 ml:ksi
4.3Fosfaattipuskuriliuos, pH 7
Kaliumdivetyfosfaatti KH2PO4, analyysilaatua 5,5 g
Dikaliumvetyfosfaatti K2HPO4, analyysilaatua 13,6 g
Tislattu vesi, täytetään 1 000 ml:ksi
4.4 Steriili fysiologinen ruokasuolaliuos
4.5 Puhdas metanoli.4.6 10 % (v/v) metanoli.4.7 Fosfaattipuskuriliuos (4.2)/metanoli (purum) -seos: tilavuussuhteet 60/404.8 Standardiyhdiste: tunnetun aktiivisuuden omaava tylosiini
5Standardiliuokset
Standardiyhdistettä (4.8) kuivataan kolme tuntia 60 ºC:ssa tyhjiölämpökaa-
pissa (5 mm elohopeaa). Punnitaan mittapulloon 10-50 mg, liuotetaan
5 ml:aan metanolia (4.5) ja laimennetaan liuos fosfaattipuskuriliuoksella,
jonka pH on 7 (4.3) siten, että tylosiiniemäksen konsentraatioksi saadaan
1000 µg/ml.
Tästä kantaliuoksesta valmistetaan seoksella (4.7) laimentaen käyttöstandardi-
liuos S
8, joka sisältää tylosiiniemästä 2 µg/ml.
Käyttöstandardiliuoksesta S8valmistetaan peräkkäin laimentaen (1 + 1) seosta
(4.7) käyttäen seuraavat konsentraatiot:
S41 µg/ml
S20,5 µg/ml
S10,25 µg/ml
6Uutto
Punnitaan 10 konsentraatteja tai 20 g esiseoksia ja rehuja. Lisätään 60 ml
80 ºC fosfaattipuskuriliuosta, jonka pH on 8 (4.2) ja homogenoidaan 2
minuutin ajan (keittiösekoitin, Ultraturrax, jne.).
Annetaan seistä 10 minuuttia, lisätään 40 ml metanolia (4.5) ja homogenoi-
daan 5 minuuttia. Sentrifugoidaan, otetaan erä uutetta ja laimennetaan
seoksella (4.7) siten, että oletetuksi tylosiinikonsentraatioksi saadaan 2 µg/ml
(= U8). Valmistetaan konsentraatiot U4,U2ja U1peräkkäin laimentaen (1 + 1)
seosta (4.7) käyttäen.
Kun pitoisuudet ovat alle 10 mg/kg, uute haihdutetaan kuivaksi pyöröhaihdut-
tajassa 35 ºC:ssa ja jäännös liuotetaan 40-%:seen metanoliin (4.6).
7Menettely
7.1Siirrostus määritysalustaan
Bakteerisuspensio (3.2) siirrostetaan 48-50 ºC:ssa määritysalustaan (4.1),
jonka pH on säädetty arvoon 8,0.
7.2Maljojen valmistus
Diffuusio agarissa suoritetaan maljoilla käyttäen neljä standardiliuoskon-
sentraatiota (S8,S4,S2,S1) ja neljä määritysliuoskonsentraatiota (U8,U4,
U2,U1). On välttämätöntä, että kuhunkin maljaan lisätään nämä neljä
uute- ja standardiliuoskonsentraatiota.
Maljojen tulee olla riittävän suuret, jotta agaralustaan voidaan tehdä
ainakin kahdeksan reikää, jotka ovat läpimitaltaan 10-13 mm. Lasketaan
sellainen määrä siirrostettua alustaa (7.1), joka muodostaa noin 2 mm
paksuisen kerroksen. On suositeltavaa käyttää lasilevyjä, joiden päälle
asetetaan täysin litteä alumiini- tai muovisylinteri, jonka läpimitta on
200 mm ja korkeus 20 mm.1972L0199 — FI — 13.08.1998 — 004.001 — 15
▼B
Reikiin pipetoidaan tarkalleen mitatut tilavuudet antibioottiliuosta läpimi-
tasta riippuen 0,10-0,15 ml.
Kunkin näytteen osalta diffuusio toistetaan ainakin neljä kertaa kullakin
konsentraatiolla siten, että kukin määritys käsittää 32 inhibitiovyöhykkeen
arvioinnin.
7.3Inkubointi
Maljoja inkuboidaan yön yli 35-37 ºC:ssa.
8Laskeminen
Inhibitiovyöhykkeiden läpimitta mitataan mieluummin projisoimalla. Mittauk-
sista piirretään puolilogaritmipaperille kuvaaja, joka esittää konsentraatioiden
logaritmia inhibitovyöhykkeiden läpimittojen suhteen. Laaditaan sekä standar-
diliuoksen että uutteen osalta suorat. Jos häiritseviä tekijöitä ei esiinny, pitäisi
suorien olla yhdensuuntaiset.
Suhteellisen aktiivisuuden logaritmi lasketaan seuraavalla kaavalla:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Todellinen aktiivisuus = oletettu aktiivisuus × suhteellinen aktiivisuus.
9Toistettavuus
Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen
ero ei saa ylittää 10 % suhteellisena arvona ilmoitettuna.
5VIRGINIAMYSIININ MÄÄRITYS
- diffuusiolla agar-alustassa -
1Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää virginiamysiini rehuista ja esiseok-
sista. Määrityksen alaraja on 2 mg/kg (2 miljoonasosaa) (1).
2Periaate
Näyte uutetaan Tween-80:n metanolipitoisella liuoksella. Uute dekantoidaan
tai sentrifugoidaan ja laimennetaan. Sen antibioottinen aktiivisuus määritetään
mittaamalla virginiamysiinin diffuusio agar-alustalla, johon on ympätty
Micrococcus luteusta . Diffuusio mitataan inhibitiovyöhykkeinä, joita mikro-
organismi muodostaa. Näiden vyöhykkeiden läpimitta on käytetyissä anti-
bioottikonsentraatioissa suoraan verrannollinen antibioottikonsentraation
logaritmiin.
3Mikro-organismi: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB
8553)
3.1Kantaviljelmän kasvatus
Micrococcus luteus ympätään putkiin, jotka sisältävät kasvatusalustasta
(4.1) valmistettuja agar-vinopintoja. Inkuboidaan 24 tuntia 30 ºC:ssa,
säilytetään jääkaapissa noin 4 ºC:ssa, ja siirrostetaan uudelleen joka
toinen viikko.
3.2Bakteerisuspension valmistus (a)
Äskettäin valmistetusta agar-vinopinnasta (3.1) kasvusto huuhdellaan 2-
3 ml:lla natriumkloridiliuosta (4.3). Suspensio siirrostetaan Roux-pulloon,
joka sisältää 250 ml kasvatusliuosta (4.1) ja inkuboidaan 18-20 tuntia
30 ºC:ssa. Kasvusto otetaan talteen 25 ml:aan natriumkloridiliuosta (4.3)
ja homogenoidaan.1972L0199 — FI — 13.08.1998 — 004.001 — 16
(1) 1 mg virginiamysiiniä vastaa 1 000 UK-yksikköä.
(a) Voidaan käyttää muita menetelmiä edellyttäen, että niillä on osoitettu saatavan aikaan
samanlaisia bakteerisuspensioita.▼M2
▼M2
Suspensio laimennetaan suhteessa 1/10 natriumkloridiliuokseen (4.3).
Suspension valon transmission on oltava noin 75 % mitattuna 650 nm:ssa
1 cm:n kyvetissä natriumkloridiliuosta (4.3) vastaan. Suspensiota voidaan
säilyttää yhden viikon ajan noin 4 ºC:ssa.
4Kasvatusalustat ja reagenssit
4.1Kasvatus- ja määritysalusta (a)
Lihapeptoni 6,0 g
Tryptoni 4,0 g
Hiivauute 3,0 gLihauute 1,5 g
Glukoosi 1,0 g
Agar 10,0-20,0 g
Vesi 1 000 ml
pH 6,5 (steriloinnin jälkeen)
4.2Fosfaattipuskuriliuos, pH 6
Kaliumvetyfosfaatti, K
2HPO42,0 g
Kaliumdivetyfosfaatti, KH2PO48,0 g
Vesi, täytetään 1000 ml:ksi
4.3 0,8 % (w/v) natriumkloridiliuos: liuotetaan 8 g natriumkloridia veteen ja
laimennetaan 1 000 ml:ksi ja steriloidaan.
4.4 Metanoli.4.5 Fosfaattipuskuriliuos (4.2)/metanoli (4.4) -seos 80/20 (v/v).4.6 0,5 % (w/v) metanolipitoinen Tween 80 -liuos: liuotetaan 5 g Tween
80:aa metanoliin (4.4) ja laimennetaan metanolilla 1 000 ml:ksi.
4.7 Standardiyhdiste: tunnetun aktiivisuuden omaava virginiamysiini.
5Standardiliuokset
Liuotetaan tarkkaan punnittu määrä standardiyhdistettä (4.7) metanoliin (4.4)
ja tämä laimennetaan metanolilla (4.4) kantaliuokseksi, joka sisältää 1 000 µg
virginiamysiiniä/ml. Liuos säilyy 4 ºC:ssa tulpalla suljetussa pullossa korkein-
taan viisi päivää.
Kantaliuoksesta valmistetaan peräkkäin laimentaen seosta (4.5) käyttäen seur-
aavat liuokset:
s
81 µg/ml
s40,5 µg/ml
s20,25 µg/ml
s10,125 µg/ml
6Uutteen ja määritysliuosten valmistus
6.1Uutto
6.1.1 Virginiamysiiniä enintään 100 mg/kg sisältävät tuotteet
Punnitaan 50 g näytettä. Lisätään 200 ml liuosta (4.6), ravistellaan
30 minuutin ajan, annetaan laskeutua tai sentrifugoidaan. Superna-
tantista otetaan 20 ml:n erä ja haihdutetaan noin 5 ml:ksi
pyöröhaihduttimessa korkeintaan 40 ºC:n lämpötilassa. Jäännös
laimennetaan seoksella (4.5) siten, että odotetuksi virginiamysiini-
pitoisuudeksi saadaan 1 µg/ml (= u8).
6.1.2 Virginiamysiiniä yli 100 mg/kg sisältävät tuotteet
Punnitaan näytemäärä, joka ei ylitä 10,0 g ja joka sisältää virginia-
mysiiniä 1-50 mg. Lisätään 100 ml liuosta (4.6), ravistellaan 30
minuutin ajan, annetaan laskeutua tai sentrifugoidaan. Supernatantti
laimennetaan seoksella (4.5) siten, että virginiamysiinipitoisuudeksi
saadaan 1 µg/ml (= u8).1972L0199 — FI — 13.08.1998 — 004.001 — 17
(a) Voidaan käyttää mitä tahansa vastaavan koostumuksen omaavaa kaupallisesti saatavilla
olevaa kasvatusalustaa, jolla saadaan vastaavat tulokset.
▼M2
6.2Määritysliuokset
U8-liuoksesta valmistetaan liuokset u4(oletettu pitoisuus: 0,5 µg/ml), u2(oletettu pitoisuus: 0,25 µg/ml) ja u1(oletettu pitoisuus: 0,125 µg/ml)
seoksella (4.5) peräkkäin laimentaen (1 + 1).
7Määrittämismenetelmä
7.1Siirrostus määritysalustaan
Bakteerisuspensio (3.2) siirrostetaan noin 50 ºC:ssa määritysalustaan
(4.1). Alustasta (4.1) valmistetuilla maljoilla tehdään esikokeet, joilla
määritetään eri virginiamysiinikonsentraatioilla suurimmat ja kirkkaimmat
inhibitiovyöhykkeet antava bakteerisuspensiomäärä.
7.2Maljojen valmistus
Diffuusio agarissa suoritetaan maljoilla käyttäen neljää standardiliuoskon-
sentraatiota (S8,S4,S2ja S1) ja neljää määritysliuoskonsentraatiota (U8,
U4,U2ja U1). On välttämätöntä, että kuhunkin maljaan lisätään nämä
neljä uute- ja standardikonsentraatiota. Maljojen tulee olla riittävän
suuret, jotta agar-alustaan voidaan tehdä ainakin 8 reikää, jotka ovat
läpimitaltaan 10-13 mm ja joiden keskustat ovat vähintään 30 mm:n
päässä toisistaan. Voidaan käyttää lasilevyjä, joiden päälle asetetaan
alumiini- tai muovisylinteri, jonka läpimitta on 200 mm ja korkeus
20 mm.
Maljoille kaadetaan sellainen määrä 7.1 kohdan mukaisesti siirrostettua
alustaa (4.1), joka muodostaa noin 2,0 mm paksun kerroksen (kun malja
on vetoisuudeltaan 60 ml ja läpimitaltaan 200 mm). Jäähdytetään vaaka-
suoralla alustalla, tehdään reiät ja niihin pipetoidaan tarkalleen mitatut
tilavuudet määritys- ja standardiliuoksia (läpimitasta riippuen 0,10-
0,15 ml/reikä). Kutakin pitoisuutta käytetään ainakin neljä kertaa siten,
että kussakin määrityksessä suoritetaan arviointi 32 inhibitiovyöhyk-
keestä.
7.3Inkubointi
Maljoja inkuboidaan 16-18 tuntia 30 ± 2 ºC:ssa.
8Laskeminen
Inhibitiovyöhykkeiden läpimitta mitataan 0,1 mm:n tarkkuudella. Kutakin
pitoisuutta vastaavien mittausten keskiarvoista piirretään puolilogaritmipaper-
ille kuvaaja, joka esittää konsentraatioiden logaritmia inhibitiovyöhykkeiden
läpimittojen suhteen. Piirretään sekä standardiliuoksen että uutteen osalta
parhainta sovitusta edustavat suorat esimerkiksi seuraavasti:
Parhainta sovitusta edustava piste pienimmän standardipitoisuuden (SL) osalta
määritetään käyttäen kaavaa:
a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Parhainta sovitusta edustava piste suurimman standardipitoisuuden (SH) osalta
määritetään käyttäen kaavaa:
b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
10
Parhaan sovituksen omaavat pisteet lasketaan samoin uutteen pienimmän
pitoisuuden (UL) ja uutteen korkeimman pitoisuuden (UH) osalta korvaamalla
edellä olevissa kaavoissa S1,S2,S4ja S8U1:lla, U2:lla, U4:lla ja U8:lla.
Lasketut SL- ja SH-arvot merkitään samalle kuvaajapaperille ja ne yhdis-
tetään parhaimman sovituksen omaavan suoran muodostamiseksi
standardiliuoksen osalta. Samoin merkitään UL- ja UH-arvot ja ne yhdistetään
parhaimman sovituksen omaavan suoran muodostamiseksi uutteen osalta.
Jos häiritseviä tekijöitä ei esiinny, pitäisi suorien olla yhdensuuntaiset.
Käytännössä suorien voidaan katsoa olevan yhdensuuntaisia, jos arvot (SH-
SL) ja (UH-UL) eivät poikkea keskiarvostaan yli 10 %.1972L0199 — FI — 13.08.1998 — 004.001 — 18
▼M2
Jos suorat eivät ole yhdensuuntaiset, joko u1ja s1tai u8ja s8voidaan hylätä ja
SL, SH, UL ja UH laskea käyttäen vaihtoehtoisia kaavoja vaihtoehtoisten
parhaimman sovituksen omaavien suorien muodostamiseksi:
a′)S L=5s1þ2s2/C0s4
6tai5s2þ2s4/C0s8
6
b′)S H=5s4þ2s2/C0s1
6tai5s8þ2s4/C0s2
6
ja käyttäen samoja kaavoja UL:n ja UH:n tapauksissa. Yhdensuuntaisuuden
on oltava samojen periaatteiden mukainen.
Tulosten laskeminen kolmen pitoisuuden perusteella on mainittava määritys-
selosteessa.
Kun suoria pidetään yhdensuuntaisina, suhteellisen aktiivisuuden logaritmi
(log A) lasketaan jollakin seuraavista kaavoista sen mukaan, määritetäänkö
yhdensuuntaisuus kolmella vai neljällä pitoisuudella:
Neljän pitoisuuden osalta
c) log A ¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
u4þu8þs4þs8/C0u1/C0u2/C0s1/C0s2
Kolmen pitoisuuden osalta
d) log A ¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4þs4/C0u1/C0s1
tai
d′) Log A ¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
Näytteestä saadun uutteen aktiivisuus = vastaavan standardin aktiivisuus × A.
(U8=S8×A )
Jos suhteellisen aktiivisuuden havaitaan olevan alueen 0,5-2,0 ulkopuolella,
määritys suoritetaan uudelleen siten, että uutteen konsentraatiot säädetään
sopiviksi tai, jos tämä ei ole mahdollista, standardiliuosten konsentraatiot
säädetään sopiviksi. Kun suhteellista aktiivisuutta ei saada tuotua vaaditulle
alueelle, on mikä tahansa saatu tulos katsottava likimääräiseksi ja tämä on
mainittava määritysselosteessa.
Kun suoria ei katsota yhdensuuntaisiksi, määritys toistetaan. Jos yhdensuun-
taisuutta ei vieläkään saada aikaan, määritystä ei voi pitää hyväksyttävänä.
Tulokset ilmoitetaan milligrammoina virginiamysiiniä rehukiloa kohden.
9Toistettavuus
Samasta näytteestä saman henkilön suorittaman kahden määrityksen tulosten
välinen ero ei saa ylittää:
2 mg/kg, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, korkeintaan 10 mg/kg olevien
virginiamysiinipitoisuuksien osalta;
20 %, suurimpaan arvoon verrattuna, välillä 10-25 mg/kg olevien pitoisuuk-
sien osalta;
5 mg/kg, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, välillä 25-50 mg/kg olevien
pitoisuuksien osalta;
10 %, suurimpaan arvoon verrattuna, yli 50 mg/kg olevien pitoisuuksien
osalta.1972L0199 — FI — 13.08.1998 — 004.001 — 19