1976L0372 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 1
Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentointitarkoituksiin.Toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä.
►B SEITSEMÄS KOMISSION DIREKTIIVI,
annettu 1 päivänä maaliskuuta 1976,
yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten
(76/372/ETY)
(EYVL L 102, 15.4.1976, s. 8)
Muutettu:
virallinen lehti
N:o sivu päivämäärä
►M1Komission direktiivi 81/680/ETY, annettu 30 päivänä heinäkuuta 1981 L 246 32 29.8.1981
▼B
SEITSEMÄS KOMISSION DIREKTIIVI,
annettu 1 päivänä maaliskuuta 1976,
yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten
(76/372/ETY)
EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka
ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen,ottaa huomioon yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmistä rehujen
virallista tarkastusta varten 20 päivänä heinäkuuta 1970 annetunneuvoston direktiivin(
1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna liit-
tymisasiakirjalla (2), ja erityisesti sen 2 artiklan,
sekä katsoo, ettämainitussa direktiivissä säädetään rehujen virallisen tarkastuksen suorit-
tamisesta yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmiä käyttäen sentodentamiseksi, että lakien, asetusten ja hallinnollisten määräystenrehujen laatua ja koostumusta koskevat vaatimukset tulevat täytetyksi,
useita yhteisön määritysmenetelmiä on jo vahvistettu 15 päivänä
kesäkuuta 1971 annetulla komission direktiivillä 71/250/ETY(
3), 18
päivänä marraskuuta 1971 annetulla komission direktiivillä 71/393/
ETY(4), 27 päivänä huhtikuuta 1972 annetulla komission direktiivillä
72/199/ETY(5), 5 päivänä joulukuuta 1972 annetulla komission direk-
tiivillä 73/46/ETY(6), 25 päivänä maaliskuuta 1974 annetulla
komission direktiivillä 74/203/ETY(7) ja 20 päivänä joulukuuta 1974
annetulla komission direktiivillä 75/84/ETY(8); työ on tämän jälkeen
edistynyt siinä määrin, että olisi hyväksyttävä seitsemäs ryhmä mene-
telmiä, ja
tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän rehukomitean
lausunnon mukaiset,
ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:
1 artikla
Jäsenvaltioiden on vaadittava, että rehujen virallisessa tarkastuksessa
aflatoksiini B1-pitoisuuden määritykset suoritetaan tämän direktiivin
liitteessä esitettyjen menetelmien mukaisesti.
2 artikla
Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edel-
lyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset voimaanviimeistään 1 päivänä lokakuuta 1976. Niiden on ilmoitettava tästäkomissiolle viipymättä.
3 artikla
Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.1976L0372 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 2
(1) EYVL N:o L 170, 3.8.1970, s. 2
(2) EYVL N:o L 73, 27.3.1972, s. 14
(3) EYVL N:o L 155, 12.7.1971, s. 13
(4) EYVL N:o L 279, 20.12.1971, s. 7
(5) EYVL N:o L 123, 29.5.1972, s. 6
(6) EYVL N:o L 83, 30.3.1973, s. 21
(7) EYVL N:o L 108, 22.4.1974, s. 7
(8) EYVL N:o L 32, 5.2.1975, s. 26▼M1
▼B
▼B
LIITE
AFLATOKSIINI B1:N MÄÄRITYS
A. YKSISUUNTAINEN OHUTLEVYKROMATOGRAFINEN MENETELMÄ
1 Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää aflatoksiini B1-pitoisuus
seuraavissa rehuissa: maapähkinä, kopra, pellavansiemen, soija,
seesami, biassavapalmun pähkinä ja maissinalkioöljykakut, viljat ja
viljatuotteet, hernejauho, perunapulppa ja tärkkelys. Määrityksen
alaraja on 0,01 mg/kg (10 ppb).
Mikäli häiritsevät aineet haittaavat määritystä, se on aloitettava
alusta käyttäen B-menetelmää (kaksisuuntainen ohutlevykromato-
grafia).
2 Periaate
Näyte uutetaan kloroformilla. Uute suodatetaan, saadusta nesteestä
otetaan erä, joka puhdistetaan silikageelipylväällä. Eluaatti haihdu-
tetaan ja jäännösliuotetaan uudelleen tiettyyn tilavuuteen
kloroformia tai bentseenin ja asetonitriilin seosta. Tästä liuoksesta
otetulle erälle tehdään ohutlevykromatografinen (TLC) ajo. Afla-
toksiini B1:n määrä todetaan kromatogrammista UV-valon avulla
joko visuaalisesti tai fluorodensitometrisesti vertaamalla tunnet-
tuihin määriin aflatoksiini B1-standardia. Rehuista uutetun
aflatoksiini B1:n tunnistus on varmennettava esitetyllä tavalla.
3 Reagenssit
Huom: Ellei toisin mainita, kaikkien reagenssien on oltava laatu-
luokaltaan ”analyysilaatua”.
3.1 Asetoni.
3.2 Kloroformi, stabiloitu 0,5-1,0 % etanolilla (96 % v/v).
3.3 n-Heksaani.
3.4 Metanoli.
3.5 Vedetön dietyylieetteri, peroksidivapaa.
3.6 Bentseeni-asetonitriiliseos: 98/2 (v/v).3.7 Kloroformi (3.2)-metanoli (3.4) -seos: 97/3 (v/v).
3.8 Pylväskromatografiaan tarkoitettu silikageeli, partikkelikoko 0,05-
0,20 mm.
3.9 Absorboivaa puuvillaa, josta rasva on poistettu etukäteen klorofor-
milla, tai lasivillaa.
3.10 Vedetön, rakeinen natriumsulfaatti.
3.11 Inertti kaasu, esim. typpi.
3.12 1 N kloorivetyhappo.
3.13 50 % (v/v) rikkihappo.3.14 Happopestyä piimaata (hyflosupercel).
3.15 Silikageeli G-HR tai tätä vastaava, TLC:tä varten.
3.16 Standardiliuos, jossa on noin 0,1 µg/ml aflatoksiini B
1:tä klorofor-
missa (3.2) tai bentseeni/asetonitriili-seoksessa (3.6). Valmistettu
ja tarkistettu 7 kohdassa esitetyllä tavalla.
3.17 Kvalitatiivisiin määrityksiin tarvittava standardiliuos, jossa on noin
0,1 µg/ml aflatoksiini B1:tä ja B2:ta kloroformissa (3.2) tai bent-
seeni/asetonitriili-seoksessa (3.6). Nämä konsentraatiot ovat
ohjeellisia. Ne on valittava sellaisiksi, että molemmista aflatoksii-
neista saatavan fluoresenssin voimakkuus on samanlainen.
3.18 Ajoliuokset
3.18.1 Kloroformi (3.2)/asetoni (3.1): 9/1 (v/v), kyllästymätön kammio;1976L0372 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 3
▼B
3.18.2 Dietyylieetteri (3.5)/metanoli (3.4)/vesi: 96/3/1 (v/v), kyllästymätön
kammio;
3.18.3 Dietyylieetteri (3.5)/metanoli (3.4)/vesi: 94/4,5/1,5 (v/v/v),
kylläinen kammio;
3.18.4 Kloroformi (3.2)/metanoli (3.4): 94/6 (v/v), kylläinen kammio;
3.18.5 Kloroformi (3.2)/metanoli (3.4): 97/3 (v/v), kylläinen kammio.
4 Välineistö
4.1 Jauhatuslaite.
4.2 Ravistelija tai magneettisekoittaja.
4.3 Laskostettuja suodatinpapereita, Schleicher ja Schüll N:o 588 tai
vastaava, läpimitta 24 cm.
4.4 Lasinen kromatografiaputki (sisäläpimitta: 22 mm, pituus: 300 mm),
jossa on PTFE-hana ja 250 ml:n säiliö.
4.5 Tyhjiöpyöröhaihdutin ja 500 ml:n pyöreäpohjainen pullo.
4.6 500 ml:n hiostulpallisia erlenmayerkolveja.
4.7 TLC-laite.
4.8 Lasisia TLC-levyjä, 200 × 200 mm, jotka on käsitelty seuraavasti
(annetut määrät riittävät viiteen levyyn). Punnitaan 30 g silikageeliG-HR:ää (3.15) erlenmayerkolviin. Lisätään 60 ml vettä, suljetaan
tulpalla ja ravistellaan minuutin ajan. Suspensio levitetään levyille
0,25 mm paksuksi yhtenäiseksi kerrokseksi. Annetaan kuivua
ilmassa ja säilytetään silikageeliä sisältävässä eksikaattorissa. Levyt
aktivoidaan käyttöön otettaessa pitämällä niitä lämpökaapissa
110 ºC:ssa tunnin ajan.
Valmiina hankittavat levyt ovat myöskäyttökelpois ia, mikäli niillä
saadaan samanlaisia tuloksia kuin tässä esitetyllä tavalla tehdyillä
levyillä.
4.9 Pitkäaallonpituuksinen (360 nm) UV-lamppu. Säteilyn voimak-
kuuden tulee olla sellainen, että sillä on mahdollista havaita 1 ng:n
suuruinen aflatoksiini B
1-täplä TLC-levyllä 10 cm:n etäisyydellä
lampusta.
4.10 Polyetyleenitulpallisia asteikolla varustettuja 10 ml:n putkia.
4.11 UV-spektrofotometri.
4.12 Fluorodensitometri (vaihtoehtoinen).
5 Suoritus
5.1 Näytteen esikäsittely (ks. ”huomautukset”, Cosa, 1 kohta).
Näyte jauhetaan niin, että se kokonaisuudessaan läpäisee 1 mm:n
seulan (ISO R 565 suosituksen mukainen).
5.2 Uutto
Punnitaan 50 g jauhettua ja homogenoitua näytettä 500 ml:n erlen-
mayerkolviin (4.6). Lisätään 25 g piimaata (3.14), 25 ml vettä ja
250 ml kloroformia (3.2). Kolvi suljetaan, ravistetaan tai sekoite-
taan 30 minuuttia laitteessa (4.2) ja suodatetaan laskostetun
suodatinpaperin läpi (4.3). Ensimmäiset 10 ml suodoksesta
heitetään pois ja sen jälkeen otetaan talteen 50 ml:n suuruinen erä.
5.3 Puhdistus pylväässä
Kromatografiaputken (4.4) alapäähän asetetaan puuvilla- tai lasivil-
latuppo (3.9), putki täytetään kahdella kolmanneksella
tilavuudestaan kloroformilla (3.2) ja lisätään 5 g natriumsulfaattia
(3.10).
Tarkistetaan, että natriumsulfaattikerroksen yläpinta on tasainen,
jonka jälkeen lisätään pieninä erinä 10 g silikageeliä (3.8). Kunkin
lisäyksen jälkeen sekoitetaan varovasti ilmakuplien poistamiseksi.
Annetaan seistä 15 minuuttia ja tämän jälkeen lisätään varovasti
15 g natriumsulfaattia (3.10). Nesteen annetaan laskea, kunnes se
on juuri natriumsulfaattikerroksen yläpinnan yläpuolella.
Sekoitetaan keskenään 5.2 kohdassa talteen otettua uutetta 50 ml ja
100 ml n-heksaania (3.3) ja seos siirretään kvantitatiivisesti pylvää-
seen. Nesteen annetaan laskea, kunnes se on juuri1976L0372 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 4
▼B
natriumsulfaattikerroksen yläpuolella. Tämä pesuliuos heitetään
pois. Tämän jälkeen lisätään 100 ml dietyylieetteriä (3.5) ja sen
annetaan taas laskeutua natriumsulfaattikerroksen yläpintaan.
Näiden toimenpiteiden aikana on huolehdittava siitä, että virtausno-
peus on 8-12 ml minuutissa ja että pylväs ei pääse kuivumaan.
Ulostullut neste heitetään pois. Tämän jälkeen eluoidaan 150 ml:lla
kloroformi/metanoli-seosta (3.7) ja koko eluaatti kerätään talteen.
Viimeksi mainittu erä haihdutetaan miltei kuivaksi inertin kaasun
(3.11) alla pyöröhaihduttimessa (4.5), jossa lämpötila ei ylitä 50 ºC.
Jäännös siirretään kvantitatiivisesti kloroformilla (3.2) tai bentseeni-
asetonitriili-seoksella (3.6) 10 ml:n asteikolla varustettuun putkeen
(4.10). Liuos väkevöidään johtamalla sen pintaan inerttiä kaasua
(3.11), minkä jälkeen tilavuus säädetään 2 ml:ksi kloroformilla
(3.2) tai bentseeni-asetonitriili-seoksella (3.6).
5.4 Ohutlevykromatografia
TLC-levylle (4.8) pipetoidaan täplinä 2 cm:n etäisyydelle alareu-
nasta ja 2 cm:n välein jäljempänä esitetyt määrät standardiliuosta
ja uutetta:
— 10, 15, 20, 30 ja 40 µl aflatoksiini B1-standardiliuosta (3.16);
— 10 µl 5.3 kohdassa saatua uutetta ja tähän samaan kohtaan 20 µl
standardiliuosta (3.16);
— 10 ja 20 µl 5.3 kohdassa saatua uutetta.
Kromatogrammi kehitetään pimeässä yhdellä ajoliuoksista (3.18).
Ajoliuoksien valinta on tehtävä etukäteen pipetoimalla levylle 25 µl
kvalitatiivista standardiliuosta (3.17) ja tarkistamalla, että aflatok-
siini B1ja B2ovat kromatogrammin kehityksen jälkeen erottuneet
toisistaan täydellisesti.
Liuottimien annetaan haihtua pimeässä ja levyä valaistaan tämän
jälkeen UV-valolla siten, että se on 10 cm:n etäisyydellä lampusta
(4.9). Aflatoksiini B1-täplät fluoresoivat sinisinä.
5.5 Kvantitatiiviset määritykset
Määritetään joko visuaalisesti tai fluorodensitometrisesti jäljempänä
kuvatulla tavalla.
5.5.1 Visuaaliset mittaukset
Uutteessa olevan aflatoksiini B1:n määrä määritetään etsimällä stan-
dardiliuoksen täplistä se täplä, joka vastaa uutteesta saatujen täplien
fluoresenssin voimakkuutta. Tarvittaessa interpoloidaan. Uutteeseen
lisätyn standardiliuoksen täplän fluoresenssin on oltava voimak-
kaampi kuin 10 µl:sta uutetta saatu fluoresenssi eikä tällöin saa
esiintyä useampia kuin yksi havaittava täplä. Mikäli 10 µl:sta
uutetta saatu fluoresenssin voimakkuus on suurempi kuin 40 µl:sta
standardiliuosta saatu voimakkuus, uute laimennetaan 10- tai 100-
kertaisesti kloroformilla (3.2) tai bentseeni/asetonitriili-seoksella
(3.6), jonka jälkeen tälle suoritetaan uusi ohutlevykromatografinen
ajo.
5.5.2 Fluorodensitometriset mittaukset
Aflatoksiini B1-täplien fluoresenssin voimakkuus mitataan fluoro-
densitometrillä (4.12) käyttäen viritysaallonpituutena 365 nm ja
emissioaallonpituutena 443 nm. Aflatoksiini B1:n määrä uutteen
täplissä määritetään vertaamalla niiden fluoresenssin voimak-
kuuksia aflatoksiini B1-standardin täplien voimakkuuksiin.
5.6 Aflatoksiini B1:n tunnistamisen varmistus
Aflatoksiini B1:n tunnistaminen varmistetaan seuraavassa esitetyllä
tavalla.
5.6.1 Rikkihappokäsittely
Ruiskutetaan rikkihappoa (3.13) 5.4 kohdan mukaisesti saadulle
kromatogrammille. Aflatoksiini B1:n täplien fluoresenssin täytyy
muuttua UV-valossa sinisestä keltaiseksi.
5.6.2 Aflatoksiini B1-hemiasetaalin (aflatoksiini B2a)
muodostumisen sisältävä kaksisuuntainen kromatografia
Huom.: Seuraavassa esitetyt toimenpiteet on suoritettava noudat-
taen huolellisesti kuvassa 3 esitettyä kaaviota.
5.6.2.1 Liuosten pipetointi1976L0372 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 5
▼B
Levylle (4.8) tehdään liuotinrintamien liikkumisen rajoittamiseksi
kaksi vierekkäisten sivujen suuntaista suoraa uraa (6 cm sisäänpäin
kummaltakin sivulta). Levylle pipetoidaan kapillaaripipettejä tai
mikroruiskuja käyttäen täpliksi seuraavat liuokset:
—pisteeseen A: erä 5.3 kohdassa saadun näytteen puhdistettua
uutetta, joka sisältää noin 2,5 ng aflatoksiini B1:tä;
—pisteisiin B ja C: 25 µl standardiliuosta (3.16).
5.6.2.2 Kehitys
Kromatogrammi kehitetään suuntaan I pimeässä käyttäen kehityk-
seen ajoliuosta (3.18.1) (1 cm:n kerros kyllästämättömässä
kammiossa), kunnes liuotinrintama saavuttaa liuotinta rajoittavan
uran.
Levy otetaan kammiosta ja annetaan kuivua pimeässä
huoneenlämmössä viiden minuutin ajan. Ruiskutetaan kloorivety-
happoa (3.12) pisteet A ja B peittävää 2,5 cm leveää vyöhykettä
myöten (osoitettu viivoituksella kuvassa 3), kunnes se tummenee,
muu osa levystä suojataan lasilevyllä. Annetaan reagoida 10
minuuttia pimeässä ja kuivataan ilmavirralla huoneenlämmössä.
Kromatogrammi kehitetään seuraavaksi pimeässä suuntaan II,
käyttäen ajoliuosta (3.18.1) (1 cm:n kerros kyllästämättömässä
kammiossa) kunnes liuotinrintama saavuttaa liuotinta rajoittavan
uran. Levy poistetaan kammiosta ja sen annetaan kuivua
huoneenlämmössä.
5.6.2.3 Kromatogrammin tulkinta
Kromatogrammia tarkastellaan UV-valossa (4.9) ja siitä tarkistetaan
seuraavat piirteet:
a) C kohtaan pipetoidusta standardiliuoksesta peräisin oleva afla-
toksiini B1:n sinisen fluoresoivan täplän esiintyminen
(liikkumissuuntaan I).
b) Reagoimattoman (kloorivetyhapon kanssa) aflatoksiini B1:n
sinisen fluoresoivan täplän esiintyminen ja aflatoksiini B1-hemi-
asetaalin voimakkaamman sinisen fluoresoivan täplän
esiintyminen, jotka molemmat ovat peräisin B kohtaan pipetoi-
dusta standardiliuoksesta (liikkumissuuntaan II).
c) b kohdassa kuvattuja täpliä vastaavien täplien esiintyminen,
jotka ovat peräisin A kohtaan pipetoidusta näytteestä. Näiden
täplien asema määritetään ensin aflatoksiini B1:n etäisyydestä A
kohdasta liikkumissuunnassa I (sama kuin C kohtaan pipetoidun
standardin matka), ja tämän jälkeen aflatoksiini B1-hemiase-
taalin liikkumisetäisyydet tästä liikkumissuunnassa II (sama
kuin B kohtaan pipetoidun standardin liikkumamatka). Uutteesta
ja B kohtaan pipetoidusta standardista peräisin olevien hemiase-
taalitäplien fluoresenssivoimakkuuksien tulisi olla toisiaan
vastaavia.
6 Tulosten laskeminen
6.1 Visuaalisista mittauksista
Aflatoksiini B1:n pitoisuus ilmoitettuna µg/kg näytettä (ppb)
saadaan kaavasta:
S/C1Y/C1V
W /C1X
jossa:
Y on aflatoksiini B1:n standardiliuoksen (3.16) ja X on vastaavasti
samanlaisen fluoresenssivoimakkuuden omaavan uutteen tilavuus
mikrolitroina;
S = aflatoksiini B1-pitoisuus standardiliuoksessa (3.16) mikro-
grammoina millilitraa kohti;
V = uutteen lopputilavuusmikrolitroina ottaen huomioon kaikki
tarpeelliset laimennukset;
W = pylväässä puhdistetun uutteen tilavuutta vastaava näytteen
paino grammoina.1976L0372 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 6
▼B
6.2 Fluorodensitometrisistä mittauksista
Aflatoksiini B1:n pitoisuus mikrogrammoina/kg näytettä saadaan
kaavasta:
S/C1V
W /C1Y
jossa:
Y = levylle täpläksi pipetoidun uutteen tilavuus mikrolitroina (10
tai 20 mikrolitraa);
S = uutetäplässä olevan aflatoksiini B1:n määrä nanogrammoina
(suhteessa Y arvoon), joka on saatu mittauksista;
V = uutteen lopputilavuusmikrolitroina, ottaen huomioon kaikki
tarpeelliset laimennukset;
W = pylväässä puhdistetun uutteen tilavuutta vastaava näytteen
paino grammoina.
7 Standardiliuoksen (3.16) valmistus ja testaus
7.1 Aflatoksiini B1-pitoisuuden määritys
Aflatoksiini B1-standardiliuos tehdään pitoisuudeltaan 8-10 µg/ml
ja se valmistetaan kloroformiin (3.2) tai bentseeni/asetonitriili-seok-
seen (3.6). Absorptiospektri välillä 330-370 nm määritetään
spektrofotometrin avulla (4.11).
Absorbanssi (A) mitataan 363 nm:ssa kloroformiliuoksilla tai
348 nm:ssa bentseeni/asetonitriili-seoksilla.
Aflatoksiini B1:n konsentraatio mikrogrammoina millilitrassa
liuosta lasketaan seuraavista kaavoista:
312 /C1A/C11000
20600kloroformiliuoksilla;
312 /C1A/C11000
19800 bentseeni =asetonitriili-seoksilla :
Valmistetaan päivänvalolta suojattuna sopiva laimennus käyttöstan-
dardiliuokseksi, jonka aflatoksiini B1-konsentraatio on noin 0,1 µg/
ml. Jääkaapissa 4 ºC:ssa säilytettynä tämä liuos säilyy kaksi
viikkoa.
7.2 Kromatografisen puhtauden testaus
Levylle (4.8) pipetoidaan täpläksi 5 µl aflatoksiini B1-standardi-
liuosta, jonka pitoisuus on 8-10 µg/ml (ks. 7.1). Kromatogrammi
kehitetään 5.4 kohdassa esitetyllä tavalla. Kromatogrammissa tulisi
UV-valossa näkyä ainoastaan yksi täplä eikä näytteen alkuperäisellä
pipetointivyöhykkeellä saa olla havaittavissa lainkaan fluoresenssia.
8 Toistettavuus
Saman henkilön samasta näytteestä tekemien kahden rinnakkaisen
määrityksen tulosten välinen ero ei saa ylittää:
— 25 %, suurempaan tulokseen verrattuna, suuruudeltaan välillä
10-20 µg/kg olevilla aflatoksiini B1-pitoisuuksilla;
— 5 µg, absoluuttisena arvona annettuna, välillä 20-50 µg/kg
olevilla aflatoksiini B1-pitoisuuksilla;
— 10 %, suurempaan arvoon verrattuna, yli 50 µg/kg olevilla
pitoisuuksilla.
9 Verrattavuus
Ks. kohta ”Huomautukset”, C osa, 2 kohta.
B. KAKSISUUNTAINEN OHUTLEVYKROMATOGRAFINEN MENE-
TELMÄ
1 Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää aflatoksiini B1-pitoisuus
rehuissa, jotka eivät kuulu menetelmän A käyttöalueeseen.1976L0372 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 7
▼B
Määrityksen alaraja on 0,01 mg/kg (10 ppb). Menetelmää ei voida
soveltaa elintarvikkeisiin, jotka sisältävät sitrushedelmämassaa.
2 Periaate
Näyte uutetaan kloroformilla. Uute suodatetaan ja tästä otetaan erä,
joka puhdistetaan silikageelipylväällä. Eluaatti haihdutetaan ja
jäännösliuotetaan uudelleen tiettyyn tilavuuteen kloroformia tai
bentseenin ja asetonitriilin seosta. Osalle liuosta tehdään kaksisuun-
tainen ohutlevykromatografinen (TLC) ajo. Aflatoksiini B1:n määrä
määritetään kromatogrammista UV-valossa arvioimalla joko visuaa-
lisesti tai fluorodensitometriaa käyttäen vertaamalla tunnettuihin
aflatoksiini B1-standardeihin. Rehuista uutetun aflatoksiini B1:n
tunnistus on tehtävä esitetyllä tavalla.
3 Reagenssit
Huom: Jollei toisin mainita, kaikkien reagenssien on oltava laatu-
luokaltaan ”analyysilaatua”.
3.1 Asetoni.
3.2 Kloroformi, stabiloitu 0,5-1 % etanolilla (96 % v/v).3.3 n-heksaani.
3.4 Metanoli.
3.5 Vedetön dietyylieetteri, peroksidivapaa.
3.6 Bentseeni-asetonitriiliseos: 98/2 (v/v).
3.7 Kloroformi (3.2) - metanoli (3.4) -seos: 97/3 (v/v).
3.8 Pylväskromatografiaan tarkoitettu silikageeli, partikkelikoko 0,05-
0,20 mm.
3.9 Absorboivaa puuvillaa, josta on rasva poistettu etukäteen klorofor-
milla, tai lasivillaa.
3.10 Vedetön ja rakeinen natriumsulfaatti.
3.11 Inertti kaasu, esim. typpi.
3.12 1 N kloorivetyhappo.
3.13 Happopestyä piimaata (hyflosupercel).
3.14 Silikageeli G-HR tai tätä vastaava, TLC:tä varten.
3.15 Ajoliuokset:
3.15.1 Dietyylieetteri (3.5)/metanoli (3.4)/vesi: 94/4,5/1,5 (v/v/v),
kylläinen kammio;
3.15.2 Kloroformi (3.2)/asetoni (3.1): 9/1 (v/v), kyllästymätön kammio;
3.16 Standardiliuos, jossa on noin 0,1 µg/ml aflatoksiini B
1:tä, klorofor-
missa (3.2) tai bentseeni/asetonitriiliseoksessa (3.6). Valmistettu ja
tarkistettu A menetelmän 7 kohdassa esitetyllä tavalla.
4 Välineistö
Ks. A menetelmän 4 kohta.
5 Menettely
5.1 Näytteen valmistus
Katso A menetelmän 5.1, 5.2 ja
5.3 kohta/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C1505.2 Uutto
5.3 Puhdistus pylväässä
5.4 Kaksisuuntainen TLC
5.4.1 Liuosten pipetointi levylle (noudatetaan kuvassa 1
olevaa kaaviota)
Levylle (4.8) vedetään kaksi vierekkäisten sivujen suuntaista suoraa
uraa (5 ja 6 cm:n etäisyydelle sivulta) liuotinrintamien kulkeutu-
misen rajoittamiseksi. Levylle pipetoidaan täpliksi
kapillaaripipettejä tai mikroruiskuja käyttäen liuokset seuraavasti:
—pisteeseen A 20 µl näytteestä 5.3 kohdan mukaisesti saatua
puhdistettua uutetta1976L0372 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 8
▼B
—pisteeseen B 20 µl standardiliuosta (3.16)
—pisteeseen C 10 µl standardiliuosta (3.16)
—pisteeseen D 20 µl standardiliuosta (3.16)
—pisteeseen E 40 µl standardiliuosta (3.16).
Kuivataan hitaassa ilmavirrassa tai inertin kaasun (3.11) virrassa.
Saatujen täplien läpimitan on oltava noin 5 mm.
5.4.2 Kehitys( noudatetaan kuvassa 1 esitettyä kaaviota)
Kromatogrammi kehitetään pimeässä suuntaan I käyttäen ajoliuosta
(3.15.1) (1 cm:n syvyinen kerros kylläisessä säiliössä), kunnes liuo-
tinrintama saavuttaa liuottimen kulkua rajoittavan viivan. Levy
otetaan pois säiliöstä ja sen annetaan kuivua pimeässä ja
huoneenlämmössä 15 minuutin ajan.
Kromatogrammi kehitetään tämän jälkeen pimeässä suuntaan II
käyttäen ajoliuosta (3.15.2) (1 cm:n syvyinen kerros
kyllästämättömässä säiliössä), kunnes liuotinrintama saavuttaa
liuottimen kulkua rajoittavan uran. Levy otetaan poiskammios ta
ja sen annetaan kuivua pimeässä ja huoneenlämmössä.
5.4.3 Kromatogrammin tulkinta (noudatetaan kuvassa 2
esitettyä kaaviota)
Kromatogrammi valaistaan UV-valolla asettamalla levy 10 cm:n
etäisyydelle lampusta (4.9). Paikannetaan standardiliuoksesta peräi-
sin olevan aflatoksiini B1:n siniset fluoresoivat täplät B, C, D ja E.
Projisioidaan kaksi näiden pisteiden kautta kulkevaa kuviteltua
viivaa, jotka ovat kohtisuorassa kehityksen liikkumissuuntaa
vastaan. Näiden viivojen leikkauskohta P on paikka, jossa A-
kohtaan (kuva 1) pipetoidusta näytteestä peräisin olevan aflatoksiini
B1:n täplän tulisi löytyä. Aflatoksiini B1:n täplän todellinen paikka
voi olla pisteessä Q, joka on kahden sellaisen kuvitellun viivan
leikkauspiste, jotka muodostavat keskenään noin 100º:n kulman ja
jotka kulkevat pisteiden B ja C kautta. Näytteestä saadussa
uutteessa olevan aflatoksiini B1:n määrä määritetään 5.5 kohdassa
esitetyllä tavalla.
5.4.4 Täydentävä kromatografia
Uuteen levyyn (4.8) tehdään kaksi suoraa uraa, jotka ovat yhden-
suuntaiset kahden vierekkäisen sivun kanssa kuvassa 1 esitetyllä
tavalla, ja pisteeseen A (katso kuva 1) pipetoidaan 20 µl näytteestä
5.3 kohdassa saatua puhdistettua uutetta ja sen päälle 20 µl standar-
diliuosta (3.16). Kehitetään 5.4.2 kohdassa esitetyllä tavalla.
Kromatogrammia valaistaan UV-valolla (4.9) ja todetaan, että:
— uutteesta ja standardiliuoksesta peräisin olevat aflatoksiini B1-
täplät menevät päällekkäin,
— tämän täplän fluoresenssi on voimakkaampaa kuin ensimmäi-
sessä levyssä kohtaan Q kehittynyt fluoresenssi.
5.5 Kvantitatiiviset määritykset
Määritys suoritetaan joko visuaalisesti tai fluorodensitometrisesti
jäljempänä esitetyn mukaisesti.
5.5.1 Visuaaliset mittaukset
Uutteessa olevan aflatoksiini B1:n määrä määritetään etsimällä
uutteen täplää vastaava fluoresenssivoimakkuus standardiliuoksen
täplistä C, D ja E. Tarvittaessa interpoloidaan. Mikäli 20 µl:n
erästä uutetta saatu fluoresenssin voimakkuus on suurempi kuin
40 µl:n erästä standardiliuosta saatu voimakkuus, uute laimennetaan
10- tai 100-kertaisesti kloroformilla(3.2) tai bentseeni/asetonitriili-
seoksella (3.6) ennen sille suoritettavaa uutta levykromatografiaa.
5.5.2 Fluorodensitometriset mittaukset
Aflatoksiini B1-täplien fluoresenssin voimakkuus mitataan fluoro-
densitometrillä (4.12) käyttäen viritysaallonpituutta 365 nm ja
emissioaallonpituutta 443 nm.
Uutetäplässä olevan aflatoksiini B1:n määrä määritetään vertaamalla
sen fluoresenssin voimakkuutta standardiliuoksen täplien C, D ja E
voimakkuuksiin.
5.6 Aflatoksiini B1:n tunnistamisen varmistus
Ks. A menetelmän 5.6 kohta1976L0372 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 9
▼B
6 Tulosten laskeminen
Ks. A menetelmän 6 kohta.
7 Toistettavuus
Ks. A menetelmän 8 kohta.
8 Uusittavuus
Ks. kohta ”Huomautukset”, C osa, 2 kohta.
C. A JA B MENETELMÄÄ KOSKEVAT HUOMAUTUKSET
1Rasvanpoisto
Näytteille, jotka sisältävät yli 5 % rasvaa, on tehtävä rasvanpoisto petrolieet-
terillä (kp. 40-60 ºC) 5.1 kohdassa kuvatun näytteen esikäsittelyn jälkeen.
2Tulosten verrattavuus
Tulosten verrattavuuden, ts. samasta näytteestä kahden tai useamman labora-
torion saamien tulosten vaihtelun on arvioitu olevan:
± 50 % keskiarvosta välillä 10-20 µg/kg olevilla aflatoksiini B1:n keskiar-
voilla;
± 10 µg/kg keskiarvosta välillä 20-50 µg/kg olevilla keskiarvoilla;± 20 % keskiarvosta yli 50 µg/kg olevilla keskiarvoilla.1976L0372 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 10
▼B
LIITE
Kuva 1
Kuva 21976L0372 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 11
▼B
Kuva 31976L0372 — FI — 19.08.1981 — 001.001 — 12