02009R0152 — FI — 16.11.2020 — 007.001

Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentoinnin apuväline eikä sillä ole oikeudellista vaikutusta. Unionin toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä. Säädösten todistusvoimaiset versiot on johdanto-osineen julkaistu Euroopan unionin virallisessa lehdessä ja ne ovat saatavana EUR-Lexissä. Näihin virallisiin teksteihin pääsee suoraan tästä asiakirjasta siihen upotettujen linkkien kautta.

►B KOMISSION ASETUS (EY) N:o 152/2009, annettu 27 päivänä tammikuuta 2009, näytteenotto- ja määritysmenetelmistä rehujen virallista valvontaa varten (ETA:n kannalta merkityksellinen teksti) (EUVL L 054 26.2.2009, s. 1)

Muutettu:









▼B

KOMISSION ASETUS (EY) N:o 152/2009,

annettu 27 päivänä tammikuuta 2009,

näytteenotto- ja määritysmenetelmistä rehujen virallista valvontaa varten

(ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)







▼M3

1 artikla

Rehujen virallisessa valvonnassa suoritettava näytteenotto, erityisesti rehun sisältämien ainesosien, mukaan lukien ainekset, jotka sisältävät muuntogeenisiä organismeja (GMO) tai koostuvat tai on valmistettu niistä, Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksessa (EY) N:o 1831/2003 ( 1 ) määriteltyjen rehun lisäaineiden ja Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivissä 2002/32/EY ( 2 ) määriteltyjen haitallisten aineiden määrittämiseksi, on suoritettava liitteessä I vahvistettujen menetelmien mukaisesti.

Liitteessä I vahvistettua näytteenottomenetelmää sovelletaan rehun valvonnassa Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksessa (EY) N:o 396/2005 ( 3 ) määriteltyjen torjunta-ainejäämien määrittämiseksi sekä asetuksen (EU) N:o 619/2011 noudattamisen valvonnassa.

▼B

2 artikla

Näytteet on valmistettava määritystä varten ja tulokset on ilmoitettava liitteessä II esitettyjen menetelmien mukaisesti.

3 artikla

Rehujen virallista tarkastusta varten tehtävissä määrityksissä on noudatettava menetelmiä, jotka on vahvistettu liitteessä III (Rehuaineiden ja rehuseosten koostumuksen valvonnassa käytettävät määritysmenetelmät), liitteessä IV (Rehujen sisältämien sallittujen lisäaineiden valvonnassa käytettävät määritysmenetelmät), liitteessä V (Rehujen sisältämien haitallisten aineiden valvonnassa käytettävät määritysmenetelmät) ja liitteessä VI (Rehujen sisältämien eläinperäisten ainesosien määritysmenetelmät rehujen virallista valvontaa varten).

4 artikla

Siipikarjan rehuseosten energia-arvo on laskettava liitteen VII mukaisesti.

5 artikla

Liitteessä VIII vahvistettuja määritysmenetelmiä sellaisten laittomien lisäaineiden osoittamiseksi, jotka eivät enää ole sallittuja rehuissa, käytetään varmistustarkoituksiin.

6 artikla

Kumotaan direktiivit 71/250/ETY, 71/393/ETY, 72/199/ETY, 73/46/ETY, 76/371/ETY, 76/372/ETY, 78/633/ETY, 81/715/ETY, 84/425/ETY, 86/174/ETY, 93/70/ETY, 93/117/EY, 98/64/EY, 1999/27/EY, 1999/76/EY, 2000/45/EY, 2002/70/EY ja 2003/126/EY.

Viittauksia kumottuihin direktiiveihin pidetään viittauksina tähän asetukseen liitteessä IX olevien vastaavuustaulukoiden mukaisesti.

7 artikla

Tämä asetus tulee voimaan kahdentenakymmenentenä päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan unionin virallisessa lehdessä.

Sitä sovelletaan 26 päivästä elokuuta 2009.

Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa.

▼M3









LIITE I

NÄYTTEENOTTOMENETELMÄT

1. TARKOITUS JA SOVELTAMISALA

Rehujen virallisessa valvonnassa käytettävät näytteet on otettava seuraavassa esitettyjen menetelmien mukaisesti. Näin saatujen näytteiden katsotaan edustavan koko tutkittavaa erää.

Edustavan näytteenoton tarkoituksena on ottaa erästä pieni osaerä siten, että osaerästä määritettävä tekijä edustaa keskimääräisesti koko tutkittavaa rehuerää. Erästä tulee ottaa osanäytteitä kauttaaltaan useista kohdista erää. Nämä osanäytteet yhdistetään sekoittamalla kokoomanäytteeksi, josta muodostetaan edustavan jakomenettelyn avulla erää edustavat lopulliset näytteet.

Jos rehuerän visuaalisessa tarkastuksessa todetaan, että näytteenoton kohteena oleva rehuerän osa eroaa laadultaan muusta rehusta niin se käsitellään erillisenä osaeränä. Jos rehua ei ole mahdollista jakaa erillisiin osaeriin, sitä käsitellään yhtenä eränä. Tällöin asia mainitaan näytteenottoraportissa.

Jos todetaan, että rehu, josta on otettu näytteet tämän asetuksen säännösten mukaisesti, ei täytä EU:n vaatimuksia ja kyseinen rehu on osa samaan luokkaan kuuluvaa tai samaa kuvausta vastaavaa rehuerää, on oletettava, että tämä säädöstenvastaisuus koskee koko rehuerää, ellei yksityiskohtaisesta arvioinnista ilmene, että ei ole mitään näyttöä siitä, että loppuosa erästä ei täyttäisi EU:n vaatimuksia.

2. MÄÄRITELMÄT

— Erä : tunnistettava määrä rehua, jolla on määritetty olevan yhteisiä ominaisuuksia kuten alkuperä, lajike, pakkaustapa, pakkaaja, lähettäjä tai pakkausmerkinnät, jos kyse on tuotantoprosessista, yksittäisessä laitoksessa samoja tuotantoparametreja käyttäen tuotettu tuotantoerä tai useita tällaisia tuotantoeriä, jos ne on tuotettu yhtäjaksoisesti ja varastoidaan yhdessä.

— Tutkittava erä : erä tai tunnistettava osa erästä tai osaerästä.

— Sinetöity näyte : näyte, joka on sinetöity siten, ettei näytteeseen pääse käsiksi rikkomatta tai poistamatta sinettiä.

— Osanäyte : määrä, joka on otettu tutkittavan erän yhdestä kohdasta.

— Kokoomanäyte : tutkittavan erän eri kohdista otetuista osanäytteistä muodostettu yhteisnäyte.

— Supistettu näyte : kokoomanäytteen osa, joka on saatu kokoomanäytteestä edustavasti supistamalla.

— Lopullinen näyte : supistetun näytteen osa tai homogenisoidun kokoomanäytteen osa.

— Laboratorionäyte : laboratoriolle tarkoitettu näyte (laboratorion vastaanottama näyte), joka voi olla lopullinen näyte, supistettu näyte tai kokoomanäyte.

3. YLEISET SÄÄNNÖKSET

— Näytteenottajat: näytteitä ottavat toimivaltaisen viranomaisen tähän tehtävään valtuuttamat henkilöt.

— Näyte on sinetöitävä siten, ettei näytteeseen pääse käsiksi rikkomatta tai poistamatta sinettiä. Sinetin merkin olisi oltava selvästi tunnistettavissa ja selvästi näkyvillä. Vaihtoehtoisesti näyte voidaan panna astiaan, joka voidaan sulkea siten, ettei sitä voi avata ilman, että astia tai säiliö rikkoutuu pysyvästi; näin estetään astian tai säiliön käyttö uudelleen.

— Näytteen tunnistaminen: näyte on merkittävä pysyvästi ja siten, että yhteys näytteenottopöytäkirjaan on selvä.

— Kustakin kokoomanäytteestä otetaan vähintään kaksi lopullista näytettä: vähintään yksi valvontaa (valvontatoimenpiteitä) varten ja yksi rehualan toimijaa (oikeusturvaa) varten. Yksi lopullinen näyte voidaan ottaa myös vertailunäytteeksi. Jos kokoomanäyte homogenisoidaan kokonaisuudessaan, niin lopulliset näytteet otetaan homogenisoidusta kokoomanäytteestä edellyttäen, että tällainen menettely on jäsenvaltiossa noudatettavien rehualan toimijoiden oikeuksia koskevien sääntöjen mukainen.

4. VÄLINEISTÖ

4.1 Näytteenottovälineiden on oltava valmistettu materiaaleista, jotka eivät aiheuta kontaminaatiota tuotteista otettuihin näytteisiin. Laitteistojen, joita käytetään useita kertoja, tulee olla ristiinkontaminaation välttämiseksi helppoja puhdistaa.

4.2 Kiinteiden rehujen näytteenottoon suositellut välineet 4.2.1 Manuaalinen näytteenotto 4.2.1.1 Tasapohjainen kauha, jossa on pystysuorat sivuseinämät. 4.2.1.2 Näytteenottokaira, jossa on pitkä ura tai osastoja. Kairan mittojen on oltava oikeassa suhteessa tutkittavaan erään (esim. säiliön syvyys, säkin mitat) sekä rehun raekokoon. Jos näytteenottokairassa on useita aukkoja, tulee aukkojen olla kairassa osastoittain jaettuna tai aueta eriaikaisesti, jotta voidaan varmistaa, että näytettä saadaan kerättyä koko kairan pituudelta. 4.2.2 Mekaaninen näytteenotto Asianmukaista mekaanista laitetta voidaan käyttää otettaessa näytteitä liikkeessä olevasta rehuerästä. Asianmukaisella tarkoitetaan sitä, että näytettä otetaan ainakin liikkeessä olevan rehun koko kerrostumasta. Rehun ollessa liikkeessä (voimakkaasti virtaavana) rehuerän näytteenotossa voidaan käyttää automaattisia näytteenkerääjiä. 4.2.3 Näytteenjakolaite Supistettujen näytteiden valmistukseen edustavasti olisi käytettävä laitetta, joka on suunniteltu jakamaan näyte suunnilleen yhtä suuriin osiin, jos se on mahdollista ja asianmukaista.

5. OSANÄYTTEIDEN LUKUMÄÄRÄÄ KOSKEVAT MÄÄRÄLLISET VAATIMUKSET

— Osanäytteiden lukumäärää koskevia 5.1 ja 5.2 kohdan määrällisiä vaatimuksia sovelletaan tutkittaviin eriin, joiden koko on enintään 500 tonnia ja joista voidaan ottaa näyte edustavasti. Kuvattu näytteenottomenettely pätee myös rehumäärille, jotka ovat suurempia kuin tutkittavalle erälle määrätty enimmäiskoko edellyttäen, että jäljempänä olevissa taulukoissa esitetty osanäytteiden enimmäismäärä jätetään huomiotta ja osanäytteiden lukumäärä määritetään menettelyn asianomaisessa osassa (katso 5.3 kohta) annetulla neliöjuurikaavalla ja kokoomanäytteen vähimmäiskokoa korotetaan suhteessa tarkastettavaan rehumäärään. Tämä ei estä suuren rehuerän jakamista pienempiin osaeriin, joista kustakin otetaan näytteet 5.1 ja 5.2 kohdassa kuvatun menettelyn mukaisesti.

— Tutkittavan erän on oltava sen kokoinen, että näyte voidaan ottaa kaikista erän kohdista.

— Hyvin suuriin eriin tai osaeriin (> 500 tonnia) sekä eriin, jotka kuljetetaan tai varastoidaan siten, että näytteenottoa ei voida suorittaa tämän luvun 5.1 ja 5.2 kohdassa esitetyn näytteenottomenetelmän mukaisesti, sovelletaan 5.3 kohdan mukaista näytteenottomenetelmää.

— Jos lainsäädännössä edellytetään, että rehualan toimija noudattaa tätä asetusta pakollisen laadunvarmistusmenettelynsä puitteissa, rehualan toimija voi toiminnallisia ominaisuuksia huomioon ottaakseen poiketa tässä luvussa säädetyistä määrällisistä vaatimuksista, jos rehualan toimija on toimivaltaista viranomaista tyydyttävällä tavalla osoittanut näytteenottomenettelyn vastaavuuden edustavuuden osalta ja jos toimivaltainen viranomainen on antanut siihen luvan.

— Jos edellä kuvattua näytteenottomenetelmää ei poikkeustapauksissa ole mahdollista määrällisten vaatimusten osalta soveltaa ilman erälle aiheutuvaa kaupallista vahinkoa (esimerkiksi pakkausmuotojen tai kuljetus- tai varastointitapojen vuoksi), joka ei ole hyväksyttävissä, voidaan soveltaa vaihtoehtoista näytteenottomenetelmää edellyttäen, että se on mahdollisimman edustava sekä tarkkaan kuvattu ja dokumentoitu.

5.1 Osanäytteitä koskevat määrälliset vaatimukset sellaisten ainesosien tai tuotteiden valvonnan osalta, jotka ovat tasaisesti jakautuneina rehussa

5.1.1 Kiinteä irtorehu







Tutkittavan erän koko Pienin vaadittu osanäytteiden lukumäärä: ≤ 2,5 tonnia 7 > 2,5 tonnia √ 20 x tutkittavan erän tonnimäärä (*1), kuitenkin enintään 40 osanäytettä ( *1 ) Jos saatu luku ei ole kokonaisluku, se pyöristetään ylöspäin lähimpään kokonaislukuun.

5.1.2 Nestemäinen irtorehu







Tutkittavan erän koko Pienin vaadittu osanäytteiden lukumäärä: ≤ 2,5 tonnia tai ≤ 2 500 litraa 4 (*1) > 2,5 tonnia tai > 2 500 litraa 7 (*1) ( *1 ) Jos nestettä ei saada homogeeniseksi, osanäytteiden lukumäärää on korotettava.

5.1.3 Pakattu rehu

Rehu (kiinteä ja nestemäinen) voidaan pakata pusseihin, säkkeihin, tölkkeihin, tynnyreihin jne., joihin viitataan taulukossa yksikköinä. Näytteet suurista yksiköistä (≥ 500 kiloa tai litraa) on otettava irtorehua koskevien säännösten mukaisesti (katso 5.1.1 ja 5.1.2. kohta).







Tutkittavan erän koko Pienin vaadittu yksiköiden lukumäärä, joista on otettava (vähintään) yksi osanäyte (*1) 1–20 yksikköä 1 yksikkö (*2) 21–150 yksikköä 3 yksikköä (*2) 151–400 yksikköä 5 yksikköä (*2) > 400 yksikköä ¼ sellaisten yksiköiden √ lukumäärästä, joista tutkittava erä koostuu (*3), kuitenkin enintään 40 yksikköä ( *1 ) Jos yksikön avaaminen saattaa vaikuttaa analyysiin (esim. herkästi pilaantuvat kosteat rehut), osanäyte on avaamaton yksikkö. ( *2 ) Jos yksikön sisällön paino on enintään 1 kilo tai yksi litra, osanäyte on yhden alkuperäisyksikön sisältö. ( *3 ) Jos saatu luku ei ole kokonaisluku, se pyöristetään ylöspäin lähimpään kokonaislukuun.

5.1.4 Rehukakut ja nuolukivet

Näyte on otettava vähintään yhdestä rehukakusta tai yhdestä nuolukivestä tutkittavan erän jokaista 25 yksikköä kohti, kuitenkin enintään 4 rehukakusta tai nuolukivestä.

Jos rehukakun tai nuolukiven paino on enintään yksi kilo, osanäyte on yhden rehukakun tai yhden nuolukiven sisältö.

5.1.5 Karkearehu/nurmirehu







Tutkittavan erän koko Pienin vaadittu osanäytteiden lukumäärä (*1) ≤ 5 tonnia 5 > 5 tonnia √ 5 x tutkittavan erän tonnimäärä (*2), kuitenkin enintään 40 osanäytettä ( *1 ) Jos vaadittuja osanäytteitä ei ole mahdollista ottaa tietyissä tilanteissa (esim. säilörehu) aiheuttamatta sellaista vahinkoa erälle, jota ei voida hyväksyä, niin näissä tapauksissa voidaan soveltaa vaihtoehtoista näytteenottomenetelmää. Ohjeet tällaisten erien näytteenottoa varten laaditaan ennen tämän asetuksen soveltamisen voimaantuloa. ( *2 ) Jos saatu luku ei ole kokonaisluku, se pyöristetään ylöspäin lähimpään kokonaislukuun.

5.2 Osanäytteitä koskevat määrälliset vaatimukset sellaisten ainesosien tai tuotteiden valvonnan osalta, jotka todennäköisesti ovat epätasaisesti jakautuneina rehussa

Näitä osanäytteitä koskevia määrällisiä vaatimuksia käytetään seuraavissa tilanteissa:

— rehuaineiden sisältämien aflatoksiinien, torajyvän, muiden mykotoksiinien ja haitallisten kasviperäisten epäpuhtauksien valvonta

— ainesosan, mukaan lukien muuntogeeninen aines, tai sellaisen aineen, jonka odotetaan olevan epätasaisesti jakautuneena rehussa, ristikontaminaation valvonta.

Jos valvontaviranomaisella on vahva epäilys siitä, että tällaista epätasaista jakautumista tapahtuu myös rehuseoksen sisältämän ainesosan tai aineen ristikontaminaatiotapauksessa, voidaan soveltaa jäljempänä olevassa taulukossa olevia määrällisiä vaatimuksia.







Tutkittavan erän koko Pienin vaadittu osanäytteiden lukumäärä: < 80 tonnia Katso 5.1 kohdan määrälliset vaatimukset. Otettavien osanäytteiden lukumäärä on kerrottava 2,5:llä. ≥ 80 tonnia 100

5.3 Osanäytteitä koskevat määrälliset vaatimukset hyvin suurten erien osalta

Jos kyseessä ovat suuret tutkittavat erät (tutkittavat erät > 500 tonnia), otettavien osanäytteiden lukumäärä = 40 osanäytettä + √ tonnia sellaisten aineiden tai tuotteiden valvonnan osalta, jotka ovat tasaisesti jakautuneina rehussa tai 100 osanäytettä + √ tonnia sellaisten ainesosien tai aineiden valvonnan osalta, jotka ovat todennäköisesti epätasaisesti jakautuneina rehuaineissa.

6. KOKOOMANÄYTETTÄ KOSKEVAT MÄÄRÄLLISET VAATIMUKSET







Tutkittavaa erää kohti riittää yksi kokoomanäyte. Rehujen tyyppi Kokoomanäytteen vähimmäiskoko (*1) (*2) 6.1 Irtorehu 4 kg 6.2 Pakattu rehu 4 kg (*3) 6.3 Nestemäinen tai puolijuokseva rehu 4 litraa 6.4 Rehukakut ja nuolukivet: 6.4.1 yksikköpaino yli 1 kg 4 kg 6.4.2 yksikköpaino enintään 1 kg neljän alkuperäisen rehukakun tai nuolukiven paino 6.5 Karkearehu/nurmirehu 4 kg (*4) ( *1 ) Jos näytteenoton kohteena oleva rehu on arvokasta, kokoomanäytteen määrä voi olla pienempi, jos asia kuvataan ja dokumentoidaan näytteenottopöytäkirjassa. ( *2 ) Rehun virallisessa valvonnassa käytettävistä näytteenotto- ja määritysmenetelmistä tutkittaessa sellaisen muuntogeenisen aineksen esiintymistä, jota koskeva lupamenettely on kesken tai jonka lupa ei ole enää voimassa, 24 päivänä kesäkuuta 2011 annetun komission asetuksen (EU) N:o 619/2011 (EUVL L 166, 25.6.2011, s. 9) säännösten mukaisesti muuntogeenisen aineksen esiintymisen valvomiseksi otetussa kokoomanäytteessä on oltava vähintään 35 000 siementä/jyvää. Näin ollen maissin osalta kokoomanäytteen koon on oltava vähintään 10,5 kg ja soijapavun osalta 7 kg. Muiden siementen ja jyvien, kuten ohran, hirssin, kauran, riisin, rukiin ja vehnän sekä rapsinsiementen osalta 4 kg:n kokoinen kokoomanäyte vastaa yli 35 000 :ta siementä. ( *3 ) Pakatun rehun osalta kokoomanäytteen 4 kg:n kokoa ei ehkä ole mahdollista saavuttaa johtuen yksittäisten yksiköiden koosta. ( *4 ) Jos kyse on karkearehusta tai nurmirehusta, jonka ominaispaino on pieni (esim. heinä, olki), kokoomanäytteen koon on oltava vähintään 1 kg.

7. LOPULLISIA NÄYTTEITÄ KOSKEVAT MÄÄRÄLLISET VAATIMUKSET

Lopulliset näytteet

Analyysi tehdään vähintään yhdestä lopullisesta näytteestä. Analyysia varten valmistetun lopullisen näytteen määrän on oltava vähintään:







Kiinteä rehu 500 g (*1) (*2) (*3) Nestemäinen tai puolijuokseva rehu 500 ml (*1) ( *1 ) Asetuksen (EU) N:o 619/2011 säännösten mukaisesti muuntogeenisen aineksen esiintymisen valvomiseksi otetussa lopullisessa näytteessä on oltava vähintään 10 000 siementä/jyvää. Näin ollen maissin osalta lopullisen näytteen koon on oltava vähintään 3 000 g ja soijapavun osalta 2 000 g. Muiden siementen ja jyvien, kuten ohran, hirssin, kauran, riisin, rukiin ja vehnän sekä rapsinsiementen osalta 500 g:n kokoinen lopullinen näyte vastaa yli 10 000 :ta siementä. ( *2 ) Jos kokoomanäytteen koko on huomattavasti pienempi kuin 4 kiloa tai litraa (ks. alaviitteet, 6 kohta), lopullinen näyte voi olla myös pienempi, jos asia kuvataan ja dokumentoidaan näytteenottopöytäkirjassa. ( *3 ) Jos näytteet otetaan palkokasveista, viljanjyvistä ja pähkinöistä torjunta-ainejäämien määrittelemiseksi, lopullisen näytteen on oltava vähintään 1 kg komission direktiivin 2002/63/EY säännösten mukaisesti (EYVL L 187, 16.7.2002, s. 30).

8. NÄYTTEENOTTOMENETELMÄ ERITTÄIN SUURIA ERIÄ TAI SELLAISIA ERIÄ VARTEN, JOTKA VARASTOIDAAN TAI KULJETETAAN SITEN, ETTÄ NÄYTTEENOTTO KOKO ERÄSTÄ EI OLE TOTEUTETTAVISSA

8.1 Yleiset periaatteet

Jos erän kuljetus- tai varastointitapa on sellainen, ettei osanäytettä voida ottaa koko erästä, suositetaan näytteenotto tehtäväksi silloin kuin rehuerä on liikkeessä.

Jos kyse on suurista rehun varastointiin tarkoitetuista varastoista, toimijoita olisi rohkaistava asentamaan varastoon sellaiset laitteet, joilla on mahdollista ottaa näytteet (koneellinen näytteenottolaite) koko varastoidusta erästä.

Jos sovelletaan tässä 8 luvussa säädettyjä näytteenottomenetelmiä, rehualan toimijalle tai sen edustajalle on ilmoitettava näytteenottomenetelmästä. Jos rehualan toimija tai sen edustaja kyseenalaistaa tämän näytteenottomenetelmän, rehualan toimijan tai sen edustajan on annettava toimivaltaiselle viranomaiselle mahdollisuus ottaa näytteet koko erästä rehualan toimijan tai sen edustajan kustannuksella.

8.2 Laivalla kuljetettavat suuret erät

8.2.1 Dynaaminen näytteenotto laivalla kuljetettavista suurista eristä

Näytteenotto laivalla kuljetettavista suurista eristä suoritetaan mieluiten silloin, kun rehuerä on liikkeessä (dynaaminen näytteenotto).

Näytteenotto suoritetaan lastiruumakohtaisesti (yksikkö, joka voidaan erottaa fyysisesti). Lastiruumat tyhjennetään kuitenkin osittain yksi toisensa jälkeen siten, että alkuperäinen fyysinen erottelu ei enää varastotiloihin siirron jälkeen ole voimassa. Näytteenotto voidaan sen vuoksi suorittaa alkuperäisen fyysisen erottamisen mukaan tai varastotiloihin siirron jälkeisen erottamisen mukaan.

Laivan lastin purku voi kestää useita päiviä. Näytteenotto on yleensä suoritettava säännöllisin väliajoin koko purkamisen keston ajan. Virallisen tarkastajan läsnäolo näytteenotossa koko purkamisen keston ajan ei kuitenkaan välttämättä aina ole toteutettavissa tai tarkoituksenmukaista. Näytteet voidaan sen vuoksi ottaa koko erän (tutkittava erä) osasta. Osanäytteiden lukumäärä määritetään tutkittavan erän koon mukaan.

Jos näyte otetaan osasta samaan luokkaan kuuluvaa tai samaa kuvausta vastaavaa rehuerää ja on todettu, että kyseinen erän osa ei täytä EU:n vaatimuksia, on oletettava, että sama koskee koko rehuerää, ellei yksityiskohtaisesta arvioinnista ilmene, että ei ole mitään näyttöä siitä, että loppuosa erästä ei täyttäisi EU:n vaatimuksia.

Vaikka virallinen näyte otetaan automaattisesti, tarkastajan läsnäolo on tarpeen. Jos automaattisessa näytteenotossa käytetään kuitenkin ennalta asetettuja parametreja, joita ei voida muuttaa näytteenoton aikana ja jos osanäytteet kerätään sinetöityyn astiaan, joka estää mahdolliset väärinkäytökset, tarkastajan läsnäolo vaaditaan ainoastaan näytteenoton alussa, aina kun astia on tarpeen vaihtaa ja näytteenoton lopussa.

8.2.2 Staattinen näytteenotto laivalla kuljetettavista eristä

Jos näytteenotossa käytetään staattista tapaa, on sovellettava samaa menetelmää kuin ylhäältä käsin päästävien varastointitilojen (siilot) ollessa kyseessä (katso 8.4.1 kohta).

Näytteenotto on suoritettava erän/lastiruuman siitä osasta, johon on pääsy (yläpuolelta). Osanäytteiden lukumäärä määritetään tutkittavan erän koon mukaan. Jos näyte otetaan osasta samaan luokkaan kuuluvaa tai samaa kuvausta vastaavaa rehuerää ja on todettu, että kyseinen erän osa ei täytä EU:n vaatimuksia, on oletettava, että sama koskee koko rehuerää, ellei yksityiskohtaisesta arvioinnista ilmene, että ei ole mitään näyttöä siitä, että loppuosa erästä ei täyttäisi EU:n vaatimuksia.

8.3 Näytteenotto varastoihin sijoitetuista suurista eristä

Näytteenotto on suoritettava erän siitä osasta, johon on pääsy. Osanäytteiden lukumäärä määritetään tutkittavan erän koon mukaan. Jos näyte otetaan osasta samaan luokkaan kuuluvaa tai samaa kuvausta vastaavaa rehuerää ja on todettu, että kyseinen erän osa ei täytä EU:n vaatimuksia, on oletettava, että sama koskee koko rehuerää, ellei yksityiskohtaisesta arvioinnista ilmene, että ei ole mitään näyttöä siitä, että loppuosa erästä ei täyttäisi EU:n vaatimuksia.

8.4 Näytteenotto varastotiloista (siilot)

8.4.1 Näytteenotto siiloista, joihin on (helppo) pääsy yläpuolelta

Näytteenotto on suoritettava erän siitä osasta, johon on pääsy. Osanäytteiden lukumäärä määritetään tutkittavan erän koon mukaan. Jos näyte otetaan osasta samaan luokkaan kuuluvaa tai samaa kuvausta vastaavaa rehuerää ja on todettu, että kyseinen erän osa ei täytä EU:n vaatimuksia, on oletettava, että sama koskee koko rehuerää, ellei yksityiskohtaisesta arvioinnista ilmene, että ei ole mitään näyttöä siitä, että loppuosa erästä ei täyttäisi EU:n vaatimuksia.

8.4.2 Näytteenotto siiloista, joihin ei ole pääsyä yläpuolelta (suljetut siilot)

8.4.2.1 Siilot, joihin ei ole pääsyä yläpuolelta (suljetut siilot) ja joiden koko on > 100 tonnia

Tällaisiin siiloihin varastoiduista rehuista ei voida ottaa näytteitä staattisesti. Jos siilossa olevasta rehusta on otettava näyte, eikä lähetystä ole mahdollista siirtää, on sovittava toimijan kanssa siitä, että toimija ilmoittaa tarkastajalle, milloin siilo tyhjennetään, jotta näytteenotto voidaan suorittaa liikkuvasta rehusta.

8.4.2.2 Siilot, joihin ei ole pääsyä yläpuolelta (suljetut siilot) ja joiden koko on < 100 tonnia

Menettelyssä näyte otetaan kaatamalla 50–100 kilon suuruinen määrä astiaan, josta näyte otetaan. Kokoomanäytteen koko vastaa koko erää ja osanäytteiden lukumäärä liittyy siilosta astiaan näytteenottoa varten kaadettuun määrään. Jos näyte otetaan osasta samaan luokkaan kuuluvaa tai samaa kuvausta vastaavaa rehuerää ja on todettu, että kyseinen erän osa ei täytä EU:n vaatimuksia, on oletettava, että sama koskee koko rehuerää, ellei yksityiskohtaisesta arvioinnista ilmene, että ei ole mitään näyttöä siitä, että loppuosa erästä ei täyttäisi EU:n vaatimuksia.

8.5 Näytteenotto suurissa suljetuissa säiliöissä olevasta irtorehusta

Tällaisista eristä voidaan usein ottaa näytteet vain purkamisen yhteydessä. Joissakin tapauksissa, kun rehuerän purkua ei ole mahdollista suorittaa tuonti- ja tarkastuspaikassa, olisi näytteet otettava tällaisten säiliöiden purun yhteydessä.

9. NÄYTTEIDEN OTTAMISTA, VALMISTAMISTA JA PAKKAAMISTA KOSKEVAT OHJEET

9.1 Yleistä

Näytteet on otettava ja valmistettava viipymättä noudattaen varotoimenpiteitä, joilla varmistetaan, ettei tuote muutu tai saastu. Kaikkien näytteiden kanssa kosketuksiin joutuvien välineiden sekä pintojen ja säiliöiden on oltava puhtaita ja kuivia.

9.2 Osanäytteet

Osanäytteet on otettava satunnaisesti koko tutkittavasta erästä, ja niiden on oltava suunnilleen samansuuruisia.

Osanäytteen koon on oltava vähintään 100 grammaa tai karkearehun/nurmirehun tapauksessa vähintään 25 grammaa johtuen tällaisen rehun pienestä ominaispainosta.

Jos 8 kohdassa vahvistetun näytteenottomenetelmän sääntöjen mukaisesti on otettava alle 40 osanäytettä, niin osanäytteiden koon on oltava suhteessa vaadittuun kokoomanäytteen vähimmäiskokoon (katso 6 kohta).

Jos kyse on pakattujen rehujen näytteenotosta pienistä eristä, jolloin määrällisten vaatimusten mukaan on otettava rajallinen määrä osanäytteitä, osanäyte on yhden alkuperäisen yksikön sisältö, joka ei ylitä yhtä kiloa tai yhtä litraa.

Jos kyse on pakattujen rehujen näytteenotosta pienistä yksiköistä (esim. < 250 g), niin osanäytteen koko riippuu yksikön koosta.

9.2.1 Irtorehu

Näytteenotto voidaan tarvittaessa tehdä rehuerää siirrettäessä (lastauksen tai purkamisen yhteydessä).

9.2.2 Pakattu rehu

Kun 5 luvun mukainen lukumäärä yksiköitä on valittu näytteenottoa varten, kunkin yksikön sisällöstä otetaan osa kairaa tai kauhaa käyttäen. Tarvittaessa näytteet otetaan vasta, kun yksiköt on erikseen tyhjennetty.

9.2.3 Homogeeniset ja homogenoituvat nestemäiset tai puolijuoksevat rehut

Kun 5 luvun mukainen lukumäärä yksiköitä on valittu näytteenottoa varten, sisältö on tarvittaessa homogenoitava ja vaadittava määrä näytettä otettava kustakin yksiköstä.

Osanäytteet voidaan ottaa myös sisältöä tyhjennettäessä.

9.2.4 Nestemäiset tai puolijuoksevat rehut, joita ei voi homogenoida

Kun 5 luvun mukainen lukumäärä yksiköitä on valittu näytteenottoa varten, on näytettä otettava rehun eri kerroksista.

Osanäytteet voidaan ottaa myös sisältöä tyhjennettäessä, kuitenkin siten, että ensimmäisiä fraktioita ei oteta talteen.

Kummassakin tapauksessa näytteen kokonaismäärän on oltava vähintään 10 litraa.

9.2.5 Rehukakut ja nuolukivet

Kun 5 luvun mukainen lukumäärä rehukakkuja tai nuolukiviä on valittu näytteenottoa varten, niin jokaisesta kakusta tai kivestä voidaan ottaa pala. Jos epäillään, että rehukakku tai nuolukivi on epähomogeeninen, näytteeksi voidaan ottaa koko rehukakku tai nuolukivi.

Jos rehukakun tai nuolukiven paino on enintään yksi kilo, niin osanäyte on yhden rehukakun tai yhden nuolukiven sisältö.

9.3 Kokoomanäytteen koostaminen

Kokoomanäyte muodostetaan sekoittamalla osanäytteet keskenään.

9.4 Lopullisen näytteen valmistaminen

Kokoomanäytteen sisältämä näytemateriaali on sekoitettava huolellisesti ( 4 ).

— Kukin näyte laitetaan asianmukaiseen säiliöön/astiaan. On toteutettava kaikki tarvittavat varotoimenpiteet, jotta vältetään näytteen koostumuksen muuttuminen, saastuminen tai turmeltuminen kuljetuksen tai varastoinnin aikana.

— Jos kyse on rehuun tasaisesti jakautuneiden ainesosien tai aineiden valvonnasta, kokoomanäyte voidaan edustavasti supistaa vähintään 2,0 kiloon tai 2,0 litraan (supistettu näyte) ( 5 ) ensisijaisesti käyttämällä joko koneellista tai automaattista näytteenjakolaitetta. Jos valvotaan torjunta-ainejäämien esiintymistä palkokasveissa, viljanjyvissä ja pähkinöissä, supistetun näytteen vähimmäiskoko on 3 kiloa. Jos rehutyyppi on sellaista, että näytteenjakolaitetta ei voida käyttää tai laitetta ei ole käytettävissä, näyte voidaan supistaa neljännesmenetelmällä. Supistetuista näytteistä valmistetaan sen jälkeen lähes sama lukumäärä lopullisia näytteitä (valvontatoimenpiteitä, oikeusturvaa ja vertailua varten), jotka täyttävät 7 luvussa vahvistetut määrälliset vaatimukset. Jos kyse on sellaisten ainesosien, muuntogeeninen aines mukaan lukien, tai aineiden valvonnasta, jotka ovat todennäköisesti epätasaisesti jakautuneina rehuaineissa, kokoomanäytteen on oltava: — täydellisesti homogenoitu ja jaettu jälkeenpäin lopullisiksi näytteiksi tai — supistettu vähintään 2 kiloksi tai 2 litraksi ( 6 ) käyttämällä mekaanista tai automaattista näytteenjakolaitetta. Vain siinä tapauksessa, että rehutyyppi on sellainen, ettei näytteenjakolaitetta voida käyttää, näyte voidaan tarvittaessa supistaa neljännesmenetelmällä. Asetuksen (EU) N:o 619/2011 puitteissa suoritettavan muuntogeenisen aineksen esiintymisen valvontaa varten supistetussa näytteessä on oltava vähintään 35 000 siementä/jyvää, jotta olisi mahdollista ottaa vähintään 10 000 siemenen/jyvän lopulliset näytteet valvontatoimenpiteitä, puolustautumista ja vertailua varten (katso 6 luvun alaviite (**) ja 7 luvun alaviite (*).

9.5 Näytteiden pakkaaminen

Säiliöt tai pakkaukset sinetöidään ja varustetaan etiketillä siten, ettei niitä voi avata vahingoittamatta sinettiä. Koko etiketin on oltava suljettu sinetillä.

9.6 Näytteiden toimittaminen laboratorioon

Näyte lähetetään viipymättä nimettyyn viralliseen laboratorioon yhdessä analyysin suorittajan tarvitsemien tietojen kanssa.

10. NÄYTTEENOTTOPÖYTÄKIRJA

Jokaisesta näytteenotosta on laadittava näytteenottopöytäkirja, josta jokainen tutkittava erä ja sen määrä voidaan yksiselitteisesti tunnistaa.

Näytteenottopöytäkirjassa on mainittava myös mahdolliset poikkeamat tässä asetuksessa säädetystä näytteenottomenettelystä.

Sen lisäksi, että näytteenottopöytäkirja toimitetaan virallisen tutkimuslaboratorion saataville, se toimitetaan rehualan toimijan saataville ja/tai rehualan toimijan nimeämän laboratorion saataville.









LIITE II

REHUJEN MÄÄRITYSMENETELMIÄ KOSKEVAT YLEISET SÄÄNNÖKSET

A. NÄYTTEIDEN VALMISTAMINEN MÄÄRITYSTÄ VARTEN

1. Tarkoitus

Seuraavassa esitettävät menetelmät koskevat näytteiden valmistusta määritystä varten; näytteet lähetetään tutkimuslaboratorioihin sen jälkeen, kun ne on otettu liitteessä I vahvistettujen säännösten mukaisesti.

Laboratorionäytteet on valmistettava siten, että määritysmenetelmää varten punnittava määrä näytettä on homogeeninen ja edustaa tutkittavaa lopullista näytettä.

2. Varotoimenpiteet

Näytteen valmistuksessa noudatettava menettely riippuu käytettävistä määritysmenetelmistä ja valvonnan kohteena olevista ainesosista tai aineista. Tästä syystä on olennaisen tärkeää varmistaa, että näytteiden esikäsittely on käytettävien määritysmenetelmien ja valvonnan kohteena olevien ainesosien tai aineiden kannalta asianmukainen.

Kaikki toimenpiteet on suoritettava siten, että vältetään mahdollisimman hyvin näytteen saastuminen ja sen koostumuksen muuttuminen.

Näyte on jauhettava, sekoitettava ja seulottava viipymättä siten, että se altistuu ilmalle ja valolle mahdollisimman vähän. Sellaisia myllyjä ja jauhatuslaitteita, joissa näytteen huomattava lämpeneminen on todennäköistä, ei pidä käyttää.

On suositeltavaa jauhaa erityisen lämmönarat rehut käsin. Lisäksi on huolehdittava siitä, ettei itse välineistö ole kontaminaation lähde.

Jos näytettä ei voida valmistaa ilman, että sen kosteuspitoisuus muuttuu merkittävästi, on kosteuspitoisuus määritettävä ennen valmistusta ja sen jälkeen liitteessä III olevassa A osassa säädetyn menetelmän mukaisesti.

3. Menettely

3.1 Yleinen menettely

Näyte määritysmenetelmää varten otetaan lopullisesta näytteestä. Kartiomurskaimen ja neljännesmenetelmän käyttöä ei suositella, koska ne saattavat aiheuttaa suuren jakovirheriskin.

3.1.1 Sellaisenaan jauhettavat rehut

— Seulottu lopullinen näyte sekoitetaan ja kerätään tarkoituksenmukaiseen puhtaaseen, kuivaan ja ilmatiiviisti suljettavaan säiliöön. Näyte sekoitetaan uudelleen täydellisen homogenoinnin varmistamiseksi välittömästi ennen määritysmenetelmää varten tehtävää näytteen punnitsemista.

3.1.2 Kuivauksen jälkeen jauhettavat rehut

— Jollei määritysmenetelmissä toisin mainita, lopullinen näyte kuivataan kosteuspitoisuuteen 8–12 % käyttäen esikuivatusmenetelmää, joka esitetään liitteessä III olevan A osan 4.3 kohdassa kuvatun kosteudenmääritysmenetelmän yhteydessä. Tämän jälkeen käsittelyä jatketaan edellä 3.1.1 jaksossa esitetyllä tavalla.

3.1.3 Nestemäiset tai puolijuoksevat rehut

— Lopullinen näyte kerätään sopivaan puhtaaseen, kuivaan ja ilmatiiviisti suljettavaan säiliöön. Näyte sekoitetaan perusteellisesti täydellisen homogenoinnin varmistamiseksi välittömästi ennen määritystä varten tehtävää määräosan punnitsemista.

3.1.4 Muut rehut

— Jos lopullista näytettä ei voida valmistaa jollain edellä esitetyllä tavalla, se on valmistettava sellaisella tavalla, jolla varmistetaan, että määritysmenetelmää varten punnitut näytteet ovat homogeenisia ja edustavat lopullisia näytteitä.

3.2 Erityismenettely, jos kyse on visuaalisesta tarkastuksesta tai mikroskooppitutkimuksesta tai jos koko kokoomanäyte homogenoidaan

— Jos kyse on visuaalisesta tarkastuksesta (ilman mikroskooppia), niin tutkitaan laboratorionäyte kokonaisuudessaan.

— Jos kyse on mikroskooppitutkimuksesta, laboratorio saa supistaa kokoomanäytettä tai siitä supistettua näytettä edelleen. Lopulliset näytteet toimijan oikeusturvan takaamiseksi ja vertailumittauksia varten otetaan samalla näytteenjakomenettelyllä kuin otetaan vastaavasti lopullinen näyte valvontatoimenpiteitä varten.

— Jos koko kokoomanäyte homogenisoidaan, lopulliset näytteet otetaan homogenoidusta kokoomanäytteestä.

4. Näytteiden säilytys

Näytteet on säilytettävä lämpötilassa, jossa niiden koostumus ei muutu. Vitamiinien tai valolle erityisen herkkien aineiden määritykseen tarkoitetut näytteet on varastoitava olosuhteissa, joissa valo ei pääse vaikuttamaan niihin haitallisesti.

B. MÄÄRITYSMENETELMISSÄ KÄYTETTÄVIÄ REAGENSSEJA JA VÄLINEITÄ KOSKEVAT SÄÄNNÖKSET

1. Jollei määritysmenetelmissä toisin mainita, kaikkien reagenssien on oltava analyysilaatua (p.a.). Hivenainejäämiä määritettäessä reagenssien puhtaus on tarkistettava nollanäytteellä. Saatujen tuloksien mukaan voi reagenssien lisäpuhdistus olla tarpeen.

2. Määritysmenetelmän työvaiheissa, joihin liittyy liuosten valmistusta, laimennusta, huuhtelua tai pesua ja joissa käytettävän liuottimen tai laimennusliuoksen laatua ei ole mainittu, on käytettävä vettä. Pääsääntöisesti tämän veden on oltava demineralisoitua tai tislattua. Tietyissä erityistapauksissa, jotka on mainittu määritysmenetelmissä, on vesi puhdistettava erityisillä puhdistusmenetelmillä.

3. Tutkimuslaboratorioissa käytettävistä välineistä määritysmenetelmissä mainitaan ainoastaan erikoisinstrumentit ja -välineet tai erityiskäyttöön tarkoitetut instrumentit ja välineet. Niiden on oltava puhtaita etenkin määritettäessä hyvin pieniä ainemääriä.

C. MÄÄRITYSMENETELMIEN KÄYTTÖ JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN

1. Uuttomenettely

Useat menetelmät edellyttävät erityistä uuttomenetelmää. Pääsääntöisesti voidaan soveltaa myös muita uuttomenettelyjä kuin menetelmän kuvauksessa tarkoitettu menettely, jos voidaan osoittaa, että käytetyn menettelyn uuttoteho on analysoitavan materiaalin osalta samantasoinen kuin menetelmässä kuvatun menettelyn uuttoteho.

2. Puhdistusmenettely

Useat menetelmät edellyttävät erityistä puhdistusmenettelyä. Pääsääntöisesti voidaan soveltaa myös muita puhdistusmenettelyjä kuin menetelmän kuvauksessa tarkoitettu menettely, jos voidaan osoittaa, että käytetty puhdistusmenettely johtaa tutkittavaa materiaalia analysoitaessa analyysituloksiin, jotka vastaavat menetelmässä mainittua menettelyä käytettäessä saatuja tuloksia.

3. Määritysten lukumäärä

Jos haitallisten aineiden määrityksessä ensimmäisen määrityksen tulos on merkittävästi (> 50 %) valvottavaa arvoa alempi, lisämääritykset eivät ole tarpeen edellyttäen, että asianmukaisia laatumenettelyjä on sovellettu. Muissa tapauksissa rinnakkaismääritys (toinen määritys) on tarpeen, jotta voidaan sulkea pois mahdollinen sisäinen ristikontaminaatio tai näytteiden sekoittuminen vahingossa. Sääntöjenmukaisuuden varmistamiseen käytetään näiden kahden määrityksen keskiarvoa, mittausepävarmuus huomioon ottaen.

Jos kyse on aineen tai ainesosan ilmoitetun pitoisuuden valvonnasta ja jos ensimmäisen määrityksen tulos vahvistaa ilmoitetun pitoisuuden eli määrityksen tulos on ilmoitetun pitoisuuden hyväksyttävällä vaihteluvälillä, lisämääritykset eivät ole tarpeen edellyttäen, että asianmukaisia laatumenettelyjä on sovellettu. Muissa tapauksissa kaksoismääritys (toinen määritys) on tarpeen, jotta voidaan sulkea pois mahdollinen sisäinen ristikontaminaatio tai näytteiden sekoittuminen vahingossa. Sääntöjenmukaisuuden varmistamiseen käytetään näiden kahden määrityksen keskiarvoa, mittausepävarmuus huomioon ottaen.

Joissain tapauksissa hyväksyttävä vaihteluväli määritellään lainsäädännössä, esimerkiksi rehun markkinoille saattamisesta ja käytöstä, Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 1831/2003 muuttamisesta sekä neuvoston direktiivin 79/373/ETY, komission direktiivin 80/511/ETY, neuvoston direktiivien 82/471/ETY, 83/228/ETY, 93/74/ETY, 93/113/EY ja 96/25/EY ja komission päätöksen 2004/217/EY kumoamisesta 13 päivänä heinäkuuta 2009 annetussa Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksessa (EY) N:o 767/2009 ( 7 ).

4. Käytetyn määritysmenetelmän ilmoittaminen

Tutkimustodistuksessa on mainittava käytetty määritysmenetelmä.

5. Määritystuloksen ilmoittaminen

Analyysitulos on ilmaistava määritysmenetelmässä vahvistetulla tavalla asianmukaisella merkitsevien numeroiden tarkkuudella, ja tulos on tarvittaessa korjattava sen mukaan, mikä lopullisen näytteen kosteuspitoisuus oli ennen näytteen valmistamista.

6. Mittausepävarmuus ja saanto haitallisten aineiden määrityksessä

Direktiivissä 2002/32/EY tarkoitettujen haitallisten aineiden ollessa kyseessä eläinten rehuksi tarkoitettua tuotetta ei pidetä vahvistetun enimmäispitoisuuden mukaisena, kun kyse on kosteuspitoisuudeltaan 12 prosentin rehusta, jos analyysituloksen katsotaan ylittävän enimmäispitoisuuden, kun otetaan huomioon laajennettu mittausepävarmuus ja korjaus saannon suhteen. Vaatimustenmukaisuuden arvioinnissa käytetään määritettyä pitoisuutta, joka on korjattu saannon suhteen ja josta on vähennetty laajennettu mittausepävarmuus. Tätä menettelyä sovelletaan ainoastaan silloin, kun määritysmenetelmässä voidaan arvioida mittausepävarmuus ja korjata tulos saannon suhteen (esimerkiksi mikroskooppitutkimuksessa tämä ei ole mahdollista).

Analyysitulos on esitettävä seuraavalla tavalla (sikäli kuin käytetty määritysmenetelmän mittausepävarmuus voidaan arvioida ja tulos korjata saannon suhteen):

a) saannon suhteen korjattuna, saantoaste ilmoitetaan. Korjaus saannon suhteen ei ole tarpeen, jos saantoaste on 90–110 prosenttia.

b) muodossa x +/– U, jossa x on analyysitulos ja U on mittaukseen liittyvä laajennettu epävarmuus, käyttäen kattavuuskerrointa 2, jolloin luotettavuustaso on noin 95 prosenttia.

Jos analyysitulos on kuitenkin merkittävästi (> 50 %) valvottavaa arvoa alempi ja edellyttäen, että asianmukaisia laatumenettelyjä on sovellettu ja määrityksen ainoana tarkoituksena on todeta säännösten noudattaminen, analyysitulos voidaan ilmoittaa ilman korjausta saannon suhteen, ja saantoaste ja mittausepävarmuus voidaan näissä tapauksissa jättää pois.

▼B









LIITE III

REHUAINEIDEN JA REHUSEOSTEN KOOSTUMUKSEN VALVONNASSA KÄYTETTÄVÄT MÄÄRITYSMENETELMÄT

A. KOSTEUDEN MÄÄRITYS

1. Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehun kosteuspitoisuus. Jos rehu sisältää haihtuvia aineita, kuten orgaanisia happoja, on huolehdittava siitä, että kosteuspitoisuuden kanssa määritetään myös merkittäviä määriä haihtuvia aineita.

Menetelmä ei koske suoraan rehuina käytettäviä maitotuotteita, kivennäisaineita ja pääasiassa kivennäisaineista koostuvia seoksia, eläin- ja kasvirasvoja ja -öljyjä tai öljysiemeniä ja öljypitoisia hedelmiä.

2. Periaate

Näyte kuivataan määrätyissä olosuhteissa, jotka vaihtelevat rehun laadun mukaan. Painohäviö määritetään punnitsemalla. Hyvin kosteat, kiinteät rehunäytteet on syytä esikuivata ennen varsinaista kosteusmääritystä.

3. Välineistö

3.1 Kosteutta imemättömästä materiaalista valmistettu mylly, joka on helppo puhdistaa ja jolla saadaan aikaan nopea, tasainen jauhautuminen mutta jolla vältetään havaittavissa oleva kuumentuminen ja ulkopuolisen ilman vaikutus mahdollisimman hyvin ja joka on 4.1.1 ja 4.1.2 kohdassa säädettyjen vaatimusten mukainen (esimerkiksi vasara- tai vesijäähdytteiset pienoismyllyt, kartiomyllyt, hitaasti liikkuvat tai hammaspyörillä varustetut hienonnuslaitteet).

3.2 Analyysivaaka, jonka tarkkuus on 1 mg.

3.3 Lasisia tai korroosionkestävästä metallista valmistettuja kuivausastioita, jotka voidaan sulkea ilmatiiviisti kannella; astian tilavuuden on oltava sellainen, että näytettä voidaan levittää sille noin 0,3 g/cm2.

3.4 Sähkölämmitteinen, tasalämpöinen ja nopeasti säädettävissä oleva lämpökaappi (± 2 oC), jossa on tuuletusjärjestelmä ( 8 ).

3.5 Säädettävä sähkölämmitteinen vakuumilämpökaappi, jossa on öljypumppu ja johon voidaan johtaa kuumaa, kuivaa ilmaa tai jossa voidaan käyttää kuivausainetta (kuten kalsiumoksidia).

3.6 Eksikkaattori, jossa on paksu rei’itetty metalli- tai posliinilevy ja joka sisältää tehokasta kuivausainetta.

4. Menettely

Huomautus: Tässä jaksossa kuvatut toimenpiteet on suoritettava välittömästi näytelähetyksen avaamisen jälkeen. Määritykset on suoritettava ainakin kahtena rinnakkaismäärityksenä.

4.1 Valmistaminen

4.1.1 Muut kuin 4.1.2 ja 4.1.3 kohdassa tarkoitetut rehut

Punnitaan vähintään 50 g näytettä. Tarvittaessa se jauhetaan tai jaetaan sopivalla tavalla kosteuspitoisuuden muuttumista välttäen (ks. 6 kohta).

4.1.2 Vilja ja suurimot

Punnitaan vähintään 50 g näytettä. Se jauhetaan niin hienoksi, että vähintään 50 % näytteestä läpäisee seulan, jonka reikien koko 0,5 mm, eikä 1 mm:n pyöreäreikäistä seulaa jää läpäisemättä yli 10 % näytteestä.

4.1.3 Nestemäiset ja liisterimäiset rehut sekä pääasiassa öljyistä ja rasvoista koostuvat rehut

Punnitaan noin 25 g näytettä 10 mg:n tarkkuudella, lisätään sopiva määrä 10 mg:n tarkkuudella punnittua vedetöntä hiekkaa ja sekoitetaan kunnes saadaan homogeeninen seos.

4.2 Kuivaus

4.2.1 Muut kuin 4.2.2 ja 4.2.3 kohdassa tarkoitetut rehut

Näyteastia (3.3) punnitaan kansineen 1 mg:n tarkkuudella. Siihen punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g hienonnettua näytettä, joka levitetään tasaisesti. Astia asetetaan ilman kantta 103 oC:ssa olevaan lämpökaappiin. Kaapin lämpötilan tarpeettoman laskun välttämiseksi astia viedään sen sisään mahdollisimman nopeasti. Annetaan kuivua neljän tunnin ajan laskettuna siitä hetkestä, kun lämpökaapin lämpötila on uudelleen saavuttanut 103 oC. Astia suljetaan kannella, otetaan pois lämpökaapista, annetaan jäähtyä 30–45 minuuttia eksikkaattorissa (3.6) ja punnitaan 1 mg:n tarkkuudella.

Pääasiassa öljyistä ja rasvoista koostuvia rehuja kuivataan lämpökaapissa 130 oC:ssa vielä 30 minuutin ajan. Kahden punnituksen välinen ero ei saa olla suurempi kuin 0,1 % kosteudesta.

4.2.2 Vilja, jauhot, suurimot ja rouheet

Näyteastia (3.3) punnitaan kansineen 0,5 mg:n tarkkuudella. Siihen punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g hienonnettua näytettä, joka levitetään tasaisesti. Astia asetetaan ilman kantta 130 oC:ssa olevaan lämpökaappiin. Kaapin lämpötilan tarpeettoman laskun välttämiseksi astia viedään sen sisään mahdollisimman nopeasti. Annetaan kuivua kahden tunnin ajan laskettuna siitä hetkestä, kun lämpökaapin lämpötila on uudelleen saavuttanut 130 oC. Astia suljetaan kannella, otetaan pois lämpökaapista, annetaan jäähtyä 30–45 minuuttia eksikkaattorissa (3.6) ja punnitaan 1 mg:n tarkkuudella.

4.2.3 Rehuseokset, jotka sisältävät yli 4 % sakkaroosia tai laktoosia: rehuaineet, kuten johanneksenleipäpuun palot, hydrolysoidut viljatuotteet, maltaat, kuivatut juurikasleikkeet, kala ja liukoisia sokereita sisältävät rehut; rehuseokset, jotka sisältävät yli 25 % mineraalisuoloja kidevesi mukaan luettuna.

Näyteastia (3.3) punnitaan kansineen 0,5 mg:n tarkkuudella. Siihen punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g hienonnettua näytettä, joka levitetään tasaisesti. Astia asetetaan ilman kantta vakuumilämpökaappiin (3.5), joka on kuumennettu 80–85 oC:seen. Kaapin lämpötilan tarpeettoman laskun välttämiseksi astia viedään sen sisään mahdollisimman nopeasti.

Paine säädetään 100 torriksi ja annetaan kuivua vielä neljän tunnin ajan tässä paineessa joko kuumassa, kuivassa ilmavirrassa tai kuivausainetta käyttäen (noin 300 g 20:tä näytettä kohden). Jälkimmäisessä tapauksessa vakuumipumppu kytketään pois päältä, kun vaadittu paine on saavutettu. Kuivausaika lasketaan siitä hetkestä, kun lämpökaapin lämpötila on uudelleen saavuttanut 80–85 oC. Kuivausajan päätyttyä lämpökaapin paine palautetaan varovasti normaalipaineeseen. Lämpökaappi avataan, näyteastia suljetaan välittömästi kannella, otetaan pois lämpökaapista, annetaan jäähtyä 30–45 minuuttia eksikkaattorissa (3.6) ja punnitaan 1 mg:n tarkkuudella. Näytteen annetaan kuivua vielä 30 minuuttia vakuumilämpökaapissa 80–85 oC:ssa ja se punnitaan uudelleen. Kahden punnituksen välinen ero ei saa ylittää 0,1 %:a kosteudesta.

4.3 Esikuivaus

4.3.1 Muut kuin 4.3.2 kohdassa tarkoitetut rehut

Kiinteille, vaikeasti jauhettaville rehunäytteille, joiden kosteuspitoisuus on suuri, suoritetaan esikuivaus seuraavasti:

Punnitaan 50 g hienontamatonta näytettä (puristetut tai kokkareina olevat rehut voidaan tarvittaessa hienontaa karkeiksi) 10 mg:n tarkkuudella sopivaan astiaan (esim. 0,5 cm:n reunalla varustettu 20 x 12 cm:n alumiiniastia). Annetaan kuivua lämpökaapissa 60–70 oC:ssa, kunnes kosteuspitoisuus on laskenut 8–12 prosenttiin. Näyteastia otetaan pois lämpökaapista, annetaan jäähtyä avoimena laboratoriossa tunnin ajan ja punnitaan 10 mg:n tarkkuudella. Näyte jauhetaan välittömästi 4.1.1 kohdassa esitetyllä tavalla ja kuivataan rehutyypin mukaan 4.2.1 tai 4.2.3 kohdassa esitetyllä tavalla.

4.3.2 Viljat

Jyvät, joiden kosteuspitoisuus on yli 17 %, on esikuivattava seuraavasti:

Punnitaan 50 g jauhamattomia jyviä 10 mg:n tarkkuudella sopivaan astiaan (esim. 0,5 cm:n reunalla varustettu 20 × 12 cm:n alumiiniastia). Annetaan kuivua lämpökaapissa 130 oC:ssa 5–7 minuuttia. Astia poistetaan lämpökaapista, annetaan jäähtyä avoimena laboratoriossa 2 tunnin ajan ja punnitaan 10 mg:n tarkkuudella. Jyvät jauhetaan välittömästi 4.1.2 kohdassa esitetyllä tavalla ja kuivataan 4.2.2 kohdan mukaisesti.

5. Tulosten laskeminen

Kosteuspitoisuus (X), joka ilmoitetaan prosentteina näytteestä, lasketaan käyttäen seuraavia kaavoja:

5.1 Kosteuspitoisuus ilman esikuivausta

jossa:

m = näytteen alkuperäinen paino grammoina,

m0 = näytteen paino grammoina kuivauksen jälkeen.

5.2 Kosteuspitoisuus esikuivausta käyttäen

jossa:

m = näytteen alkuperäinen paino grammoina,

m1 = näytteen paino grammoina esikuivauksen jälkeen,

m2 = näytteen paino grammoina hienontamisen tai jauhamisen jälkeen,

m0 = näytteen paino grammoina kuivauksen jälkeen.

5.3 Toistettavuus

Samasta näytteestä tehdyn kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla suurempi kuin 0,2 % kosteuden absoluuttisesta arvosta.

6. Huomautus

Jos jauhaminen on tarpeen ja sen havaitaan muuttavan tuotteen kosteuspitoisuutta, rehun komponenttien määritystulokset on korjattava alkuperäisen näytteen kosteuspitoisuuden perusteella.

B. ELÄIN- JA KASVIRASVOJEN JA ÖLJYJEN KOSTEUDEN MÄÄRITYS

1. Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää eläin- ja kasvirasvojen ja öljyjen vesipitoisuus ja haihtuvien aineiden pitoisuus.

2. Periaate

Näyte kuivataan vakiopainoon 103 oC:ssa (kahden peräkkäisen punnituksen välisen painoeron on oltava alle 1 mg). Painohäviö määritetään punnitsemalla.

3. Välineistö

3.1 Korroosionkestävästä materiaalista valmistettu tasapohjainen astia, jonka läpimitta on 8–9 cm ja jonka korkeus on noin 3 cm.

3.2 Lämpömittari, jossa on vahvistettu säiliö ja yläpäässä oleva paisuntaputki ja joka on varustettu asteikolla noin 80 oC:sta ainakin 110 oC:seen ja jonka pituus on noin 10 cm.

3.3 Hiekkahaude tai sähkölevy.

3.4 Eksikkaattori, jossa on tehokasta kuivausainetta.

3.5 Analyysivaaka.

4. Menettely

Punnitaan mg:n tarkkuudella noin 20 g homogenisoitua näytettä kuivaan punnittuun astiaan (3.1), jossa on lämpömittari (3.2). Näytettä kuumennetaan hiekkahauteella tai sähkölevyllä (3.3), sekoittaen jatkuvasti lämpömittarilla niin, että lämpötila saavuttaa 90 oC:n noin 7 minuutissa.

Lämpöä vähennetään pitäen silmällä lautasen pohjasta nousevien kuplien syntymisnopeutta. Lämpötila ei saa nousta yli 105 oC:n. Sekoitusta jatketaan astian pohjaa raaputtaen, kunnes kuplien muodostus lakkaa.

Kosteuden täydellisen poistumisen varmistamiseksi kuumennetaan useita kertoja 103 ± 2 oC:seen jäähdyttäen peräkkäisten kuumennusten välillä 93 oC:seen. Sen jälkeen astian sisältöineen annetaan jäähtyä huoneen lämpötilaan eksikkaattorissa (3.4) ja punnitaan. Tämä menettely toistetaan niin monta kertaa, että kahden peräkkäisen punnituksen välinen ero ei ole yli 2 mg:aa.

Huomautus : Näytteen painon kasvu toistettujen kuumennusten jälkeen viittaa rasvan hapettumiseen, ja tällaisessa tapauksessa tulos lasketaan siitä punnituksesta, joka on tehty välittömästi ennen kuin paino on alkanut kasvaa.

5. Tulosten laskeminen

Kosteuspitoisuus (X), joka ilmoitetaan prosentteina näytteestä, saadaan seuraavasta kaavasta:

joissa:

m = näytteen paino grammoina,

m1 = astian paino sisältöineen grammoina ennen kuumennusta,

m2 = astian paino sisältöineen grammoina kuumennuksen jälkeen.

Tulokset, jotka ovat pienempiä kuin 0,05 %, on varustettava merkinnällä ”alle 0,05 %”.

Toistettavuus

Samasta näytteestä suoritetun kahden samanaikaisen rinnakkaismäärityksen ero ei saa absoluuttisena arvona ilmoitettuna olla yli 0,05 %.

C. RAAKAVALKUAISPITOISUUDEN MÄÄRITYS

1. Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan laskea Kjeldahlin menetelmän mukaan saadusta typpipitoisuudesta rehujen raakavalkuaispitoisuus.

2. Periaate

Näyte hajotetaan rikkihapolla katalysaattorin läsnä ollessa. Hapan liuos tehdään emäksiseksi natriumhydroksidiliuoksella. Ammoniakki tislataan ja kerätään mitattuun määrään rikkihappoa, ja ylimääräinen rikkihappo titrataan natriumhydroksidin standardiliuoksella.

Vaihtoehtoisesti vapautunut ammoniakki tislataan ylimäärään boorihappoliuosta, jonka jälkeen se titrataan kloorivetyhappo- tai rikkihappoliuoksella.

3. Reagenssit

3.1 Kaliumsulfaatti.

3.2 Katalysaattori: kupari(II)oksidi CuO tai kupari(II)sulfaattipentahydraatti, CuSO45H2O.

3.3 Sinkki, rakeinen.

3.4 Rikkihappo, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5 Rikkihappo, standardiliuos, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6 Rikkihappo, standardiliuos, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7 Rikkihappo, standardiliuos, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8 Metyylipunaindikaattori: 300 g metyylipunaista liuotetaan 100 ml:aan 95–96 % etanolia (v/v)

3.9 Natriumhydroksidiliuos (teknisen laadun käyttö mahdollista) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10 Natriumhydroksidi, standardiliuos c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11 Natriumhydroksidi, standardiliuos c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12 Kiehumakiviä, suolahapossa pestyjä ja hehkutettuja.

3.13 Asetanilidi (sulamispiste = 114 oC, typpipitoisuus = 10,36 %).

3.14 Typetön sakkaroosi.

3.15 Boorihappo (H3BO3).

3.16 Metyylipunaindikaattoriliuos: liuotetaan 0,1 g metyylipunaa 100 ml:aan etanolia tai metanolia.

3.17 Bromikresolivihreäliuos: liuotetaan 100 mg bromikresolivihreää 100 ml:aan etanolia tai metanolia.

3.18 Boorihappoliuos (10–40 g/l, käytettävien laitteiden mukaan)

Jos loppupisteen toteamiseksi käytetään kolorimetristä menetelmää, boorihappoliuoksiin on lisättävä metyylipuna- ja bromokresoli-indikaattoreita. Kun boorihappoliuosta valmistetaan 1 litra, siihen on ennen tilavuuden säätämistä lisättävä 7 ml metyylipunaindikaattoriliuosta (3.16) ja 10 ml bromikresolivihreäliuosta (3.17).

Käytetystä vedestä johtuen boorihappoliuoksen pH saattaa vaihdella erien välillä. Usein on lisättävä vähän emästä, jotta nollanäyte saadaan positiiviseksi.

Huomautus : Säätäminen onnistuu yleensä lisäämällä noin 3–4 ml NaOH:ta (3.11) 1 litraan boorihappoa, jonka pitoisuus on 10 g/l. Liuos säilytetään huoneen lämpötilassa suojattuna valolta ja ammoniakkihöyryiltä.

3.19 Kloorivetyhapon standardiliuos c(HCl) = 0,10 mol/l.

Huomautus : Myös muita standardiliuosten konsentraatioita (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 ja 3.19) voidaan käyttää, jos konsentraatio korjataan laskelmissa. Konsentraatiot on aina ilmaistava neljän desimaalin tarkkuudella.

4. Välineistö

Välineet näytteen hajottamista, tislausta ja titrausta varten Kjeldahlin menetelmän mukaan.

5. Menettely

5.1 Hajotus

Punnitaan 1 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella Kjeldahl-kolviin hajotuspolttoa varten. Lisätään 15 g kaliumsulfaattia (3.1), sopiva määrä katalysaattoria (3.2) (0,3 –0,4 g kupari(II)oksidia tai 0,9 –1,2 g kupari(II)sulfaattipentahydraattia, 25 ml rikkihappoa (3.4) ja tarvittaessa muutamia kiehumakiviä (3.12) ja sekoitetaan.

Kolvia kuumennetaan varovasti tarvittaessa ajoittain pyörittäen, kunnes massa on hiiltynyt ja kuohu hävinnyt. Tämän jälkeen kuumennetaan voimakkaammin, kunnes neste kiehuu tasaisesti. Kuumennus on sopiva, jos kiehuva happo tiivistyy kolvin seinämiin. Kolvin seinämien ylikuumennusta ja orgaanisen aineksen tarttumista kolvin seinämiin on vältettävä.

Kun liuos on muuttunut kirkkaaksi ja kirkkaanvihreäksi, keittämistä jatketaan vielä kahden tunnin ajan; tämän jälkeen kolvin annetaan jäähtyä.

5.2 Tislaus

Kolviin lisätään varovasti riittävä määrä vettä, jotta sulfaatit liukenisivat täysin. Annetaan jäähtyä ja lisätään tarvittaessa muutama sinkkirae (3.3). Jatketaan 5.2.1 tai 5.2.2 kohdan mukaisesti.

5.2.1 Tislaus rikkihappoon

Tislauslaitteen keräilyastiaan lisätään oletetun typpipitoisuuden mukaan 25 ml rikkihappoa (3.5) tai (3.7) tarkasti mitattuna. Lisätään muutama pisara metyylipunaindikaattoria (3.8).

Kolvi yhdistetään tislauslaitteen jäähdyttimeen ja jäähdyttimen pää upotetaan keräilyastiassa olevaan liuokseen vähintään 1 cm:n syvyyteen (ks. 8.3 huomautus). Kolviin lasketaan hitaasti 100 ml natriumhydroksidiliuosta (3.9) siten, ettei ammoniakkia katoa (ks. 8.1 huomautus). Kolvia kuumennetaan siten, että ammoniakki tislautuu kokonaan.

5.2.2 Tislaus boorihappoon

Kun tisleestä titrataan ammoniakki manuaalisesti, noudatetaan alla olevaa menettelyä. Jos tislauslaite on täysin automaattinen ja suorittaa ammoniakin titraamisen tisleestä, noudatetaan valmistajan käyttöohjeita.

Keräilyastia, joka sisältää 25–30 ml boorihappoliuosta (3.18), asetetaan jäähdyttimen ulostulon alle siten, että poistoputki jää boorihappoliuoksen pinnan alapuolelle. Tislauslaite säädetään annostelemaan 50 ml natriumhydroksidiliuosta (3.9). Tislauslaitetta käytetään valmistajan ohjeiden mukaan ja tislataan pois natriumhydroksidiliuoksen lisäyksen tuloksena vapautunut ammoniakki. Tisle kerätään boorihappoa sisältävään vastaanottoliuokseen. Tisleen määrä (vesihöyrytislauksen aika) riippuu näytteen sisältämän typen määrästä. Valmistajan ohjeita noudatetaan.

Huomautus : Puoliautomaattisessa tislauslaitteessa natriumhydroksidiylimäärän lisäys ja vesihöyrytislaus tapahtuvat automaattisesti.

5.3 Titraus

Jatketaan 5.3.1 tai 5.3.2 kohdan mukaisesti.

5.3.1 Rikkihappo

Keräilyastiassa oleva rikkihappoylimäärä titrataan käytetyn rikkihapon konsentraation mukaan natriumhydroksidiliuoksella (3.10 tai 3.11), kunnes loppupiste saavutetaan.

5.3.2 Boorihappo

Keräilyastian sisältö titrataan kloorivetyhapon standardiliuoksella (3.19) tai rikkihapon standardiliuoksella (3.6) byrettiä käyttäen ja todetaan käytetyn titrausliuoksen määrä.

Jos loppupisteen toteamiseksi käytetään kolorimetristä menetelmää, loppupiste on saavutettu, kun sisältöön alkaa ilmestyä vaaleanpunaista väriä. Byretin lukema arvioidaan 0,05 ml:n tarkkuudella. Loppupisteen havaitseminen saattaa olla helpompaa valaistun magneettisekoittimen tai fotometrisen detektorin avulla.

Tämä voidaan tehdä automaattisesti vesihöyrytislaimella, jossa on automaattinen titraus.

Tislauslaitteen tai tislaus/titrauslaitteen käytössä noudatetaan valmistajan ohjeita.

Huomautus : Kun käytetään automaattista titrausjärjestelmää, titraus alkaa välittömästi tislauksen alettua ja kun 1-prosenttinen boorihappoliuos (3.18) on kulunut. Käytettäessä täysin automaattista tislausyksikköä ammoniakki voidaan titrata automaattisesti ja loppupiste detektoida käyttämällä potentiometristä pH-järjestelmää. Tässä tapauksessa käytetään automaattista titrauslaitetta, jossa on pH-mittari. pH-mittari on kalibroitava asianmukaisesti välille pH 4–7 noudattaen tavanomaisia laboratorioiden pH-kalibrointimenettelyjä. Titrauksen pH-loppupiste saavutetaan, kun pH on 4,6 , mikä on titrauskäyrän jyrkin kohta (käännekohta).

5.4 Nollakoe

Reagenssien typettömyyden varmistamiseksi suoritetaan nollakoe (hajotus, tislaus ja titraus) käyttämällä 1 g sakkaroosia (3.14) näytteen sijasta.

6. Tulosten laskeminen

Tulokset lasketaan 6.1 tai 6.2 kohdan mukaisesti.

6.1 Tuloksen laskeminen 5.3.1 kohdan mukaisessa titrauksessa

Raakavalkuaispitoisuus ilmaistuna painoprosentteina lasketaan seuraavaa kaavaa käyttäen:

jossa:

V0 = nollakokeessa kulunut NaOH:n (3.10 tai 3.11) määrä (ml),

V1 = näytteen titrauksessa kulunut NaOH:n (3.10 tai 3.11) määrä (ml),

c = natriumhydroksidin (3.10 tai 3.11) konsentraatio (mol/l),

m = näytteen paino (g).

6.2 Tuloksen laskeminen 5.3.2 kohdan mukaisessa titrauksessa

6.2.1 Titraus kloorivetyhapolla

Raakavalkuaispitoisuus ilmaistuna painoprosentteina lasketaan seuraavalla kaavalla:

jossa:

m = näytteen paino (g),

c = kloorivetyhapon standardiliuoksen (3.19) konsentraatio (mol/l),

V0 = nollakokeessa kuluneen kloorivetyhapon määrä (ml),

V1 = näytteen titrauksessa kuluneen kloorivetyhapon määrä (ml).

6.2.2 Titraus rikkihapolla

Raakavalkuaispitoisuus ilmaistuna painoprosentteina lasketaan seuraavalla kaavalla:

jossa:

m = näytteen paino (g),

c = rikkihapon standardiliuoksen (3.6) konsentraatio (mol/l),

V0 = nollakokeessa kuluneen rikkihapon (3.6) määrä (ml),

V1 = näytteen titrauksessa kuluneen rikkihapon (3.6) määrä (ml).

7. Menetelmän varmistus

7.1 Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla suurempi kuin:

— 0,2 % absoluuttisena arvona, kun raakavalkuaispitoisuus on alle 20 %,

— 1,0 %, suhteellisena arvona suuremmasta lukuarvosta, kun raakavalkuaispitoisuus on 20–40 %,

— 0,4 % absoluuttisena arvona, kun raakavalkuaispitoisuus on yli 40 %.

7.2 Tarkkuus

Määritys (hajotus, tislaus ja titraus) tehdään 1,5 –2,0 grammalla asetanilidia (3.13) siten, että läsnä on 1 grammaa sakkaroosia (3.14); 1 g asetanilidia kuluttaa 14,80 ml rikkihappoa (3.5). Saannon on oltava vähintään 99 %.

8. Huomautukset

8.1 Välineet voivat olla käsikäyttöisiä, puoliautomaattisia tai automaattisia. Jos liuos joudutaan siirtämään astiasta toiseen hajotuksen ja tislauksen välillä, siirto on suoritettava siten, ettei häviöitä tapahdu. Jos tislauslaitteen kolvissa ei ole tiputussuppiloa, lisätään natriumhydroksidi välittömästi ennen kolvin liittämistä jäähdyttimeen kaataen liuos hitaasti kolvin seinämää myöten.

8.2 Jos hajotettu tuote kiinteytyy, määritys on aloitettava alusta käyttämällä suurempaa määrää rikkihappoa (3.4) kuin edellä on mainittu.

8.3 Kun tuotteiden typpipitoisuus on alhainen, voidaan rikkihapon (3.7) määrä keräilyastiassa tarvittaessa vähentää 10–15 ml:aan ja täyttää 25 ml:ksi vettä lisäämällä.

8.4 Raakavalkuaisen rutiinimäärityksissä voidaan käyttää vaihtoehtoisia menetelmiä, mutta vertailumenetelmänä on käsillä olevassa C osassa kuvailtu Kjeldahlin menetelmä. Vaihtoehtoisilla menetelmillä (kuten Dumas-menetelmällä) saatujen tulosten vastaavuus on osoitettava erikseen kunkin analysoitavan materiaalin osalta. Koska vaihtoehtoisilla menetelmillä saadut tulokset saattavat vastaavuuden varmistamisesta huolimatta hieman poiketa vertailumenetelmällä saaduista tuloksista, määritysselosteessa on mainittava, mitä menetelmää raakavalkuaisen määrityksessä on käytetty.

D. UREAN MÄÄRITYS

1. Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehujen ureapitoisuus.

2. Periaate

Näyte suspendoidaan veteen sellaisen aineen läsnä ollessa, joka saa suspension kirkastumaan. Suspensio suodatetaan. Suodoksen ureamäärä määritetään sen jälkeen kun siihen on lisätty 4-dimetyyliaminobentsaldehydiä (4-DMAB) mittaamalla liuoksen absorbanssi 420 nm:n aallonpituudella.

3. Reagenssit

3.1 4-dimetyyliaminobentsaldehydiliuos: 1,6 g 4-DMAB:ta liuotetaan 100 ml:aan 96-prosenttista etanolia ja siihen lisätään 10 ml kloorivetyhappoa (ρ201,19 g/ml). Tämä reagenssi säilyy korkeintaan kahden viikon ajan.

3.2 Carrez-liuos I: veteen liuotetaan 21,9 g sinkkiasetaattia Zn(CH3COO)2 2H2O ja 3 g jääetikkaa. Tilavuus säädetään 100 ml:ksi vedellä.

3.3 Carrez-liuos II: Liuotetaan veteen 10,6 g kaliumferrosyanidia K4Fe(CN)6 3H2O. Tilavuus säädetään 100 ml:ksi vedellä.

3.4 Aktiivihiili, joka ei absorboi ureaa (tarkastettava).

3.5 Urealiuos 0,1 % (w/v).

4. Välineistö

4.1 Sekoitin: noin 35–40 kierr./min.

4.2 Lasihiostulpallisia koeputkia 160 × 16 mm.

4.3 Spektrofotometri.

5. Menettely

5.1 Näytteen määritys

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella 2 g näytettä sekä 1 g aktiivihiiltä (3.4) 500 ml:n mittapulloon. Lisätään 400 ml vettä ja 5 ml Carrez I -liuosta (3.2), sekoitetaan noin 30 sekunnin ajan ja lisätään 5 ml Carrez II -liuosta (3.3). Pidetään sekoittimessa 30 minuutin ajan. Lisätään vettä merkkiin asti, sekoitetaan ja suodatetaan.

Läpinäkyvästä, värittömästä suodoksesta pipetoidaan 5 ml lasihiostulpallisiin koeputkiin, lisätään 5 ml 4-DMAB -liuosta (3.1) ja sekoitetaan. Putket asetetaan 20 C:ssa (+/– 4 C) olevaan vesihauteeseen. Viidentoista minuutin kuluttua mitataan näyteliuoksen absorbanssi spektrofotometrillä 420 nm:n aallonpituudella. Lukemaa verrataan reagensseista valmistettuun nollakoeliuokseen.

5.2 Kalibrointikäyrä

Pipetoidaan 100 ml:n mittapulloihin 1, 2, 4, 5 ja 10 ml urealiuosta (3.5) ja täytetään merkkiin asti vedellä. Kutakin liuosta pipetoidaan koeputkiin 5 ml, lisätään 5 ml 4-DMAB -liuosta (3.1), homogenoidaan ja niiden absorbanssi mitataan edellä kuvatulla tavalla verrattuna kontrolliliuokseen, joka sisältää 5 ml 4-DMAB:ta ja 5 ml vettä ja jossa ei ole ureaa. Piirretään kalibrointikäyrä.

6. Tulosten laskeminen

Urean määrä näytteessä määritetään kalibrointikäyrää käyttäen.

Tulokset ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

7. Huomautukset

7.1 Kun urean määrä ylittää 3 %, näytteen määrä vähennetään 1 g:ksi tai alkuperäinen liuos laimennetaan siten, ettei siinä ole yli 50 mg ureaa 500 ml:ssa.

7.2 Kun ureapitoisuus on alhainen, näytteen kokoa suurennetaan, kunhan suodos säilyy läpinäkyvänä ja värittömänä.

7.3 Jos näyte sisältää yksinkertaisia typpiyhdisteitä, kuten aminohappoja, optinen tiheys on mitattava 435 nm:ssä.

E. HAIHTUVIEN TYPPIPITOISTEN EMÄSTEN MÄÄRITYS

I MIKRODIFFUUSIO

1. Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehuista haihtuvien typpipitoisten emästen pitoisuus ammoniakkina ilmoitettuna.

2. Periaate

Näyte uutetaan vedellä, liuos kirkastetaan ja suodatetaan. Haihtuvat typpipitoiset emäkset vapautetaan mikrodiffuusiolla käyttäen kaliumkarbonaattiliuosta, sidotaan boorihappoliuokseen ja titrataan rikkihapolla.

3. Reagenssit

3.1 Trikloorietikkahappoliuos, 20 % (w/v).

3.2 Indikaattori: liuotetaan 33 mg bromikresolivihreää ja 65 mg metyylipunaista 100 ml:aan 95–96-prosenttista (v/v) etanolia.

3.3 Boorihappoliuos: liuotetaan 10 g boorihappoa 1 litran mittapullossa 200 ml:aan 95–96-prosenttista (v/v) etanolia ja 700 ml:aan vettä. Lisätään 10 ml indikaattoria (3.2). Sekoitetaan ja liuoksen väri säädetään tarvittaessa vaaleanpunaiseksi lisäämällä natriumhydroksidiliuosta. 1 ml tätä liuosta sitoo enintään 300 μg NH3:a.

3.4 Kyllästetty kaliumkarbonaattiliuos: liuotetaan 100 g kaliumkarbonaattia 100 ml:aan kiehuvaa vettä. Annetaan jäähtyä ja suodatetaan.

3.5 Rikkihappo, 0,01 mol/l.

4. Välineistö

4.1 Sekoitin: noin 35–40 kierr./min.

4.2 Lasisia tai muovisia Conway-maljoja (ks. oheinen kaavio).

4.3 1/100 ml:n asteikolla varustettuja mikrobyrettejä.

5. Menettely

Punnitaan 10 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella 200 ml:n mittapulloon, johon lisätään 100 ml vettä. Pidetään sekoittimessa 30 minuutin ajan. Lisätään 50 ml trikloorietikkahappoliuosta (3.1), täytetään merkkiin asti vedellä, ravistellaan voimakkaasti ja suodatetaan laskostetun suodatinpaperin läpi.

Pipetoidaan Conway-maljan keskiympyrään 1 ml boorihappoliuosta (3.3) ja reunaympyrään 1 ml näytemaljasuodosta. Peitetään osittain rasvatulla kannella. Reunaympyrään lisätään nopeasti 1 ml kyllästettyä kaliumkarbonaattiliuosta (3.4) ja kansi suljetaan ilmatiiviisti. Maljaa pyöritetään varovasti vaakasuorassa tasossa siten, että nämä kaksi reagenssia sekoittuvat. Inkuboidaan vähintään neljä tuntia huoneenlämmössä tai yksi tunti 40 oC:ssa.

Boorihappoliuoksessa olevat haihtuvat emäkset titrataan rikkihapolla (3.5) mikrobyrettiä (4.3) käyttäen.

Nollakoe suoritetaan samalla tavalla, mutta ilman määritettävää näytettä.

6. Tulosten laskeminen

1 ml H2SO4:ää, 0,01 mol/l, vastaa 0,34 mg:aa ammoniakkia.

Tulos ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

Toistettavuus

Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli:

— 10 %:a, suhteellisena arvona ilmoitettuna, kun ammoniakkipitoisuus on alle 1,0 %,

— 0,1 %:a, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, kun ammoniakkipitoisuus on vähintään 1,0 %.

7. Huomautus

Jos näytteen ammoniakkipitoisuus ylittää 0,6 %, on alkuperäinen suodos laimennettava.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II TISLAUSMENETELMÄ

1. Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää haihtuvien typpipitoisten emästen pitoisuus ammoniakkina ilmoitettuna kalajauhosta, joka ei käytännöllisesti katsoen sisällä ureaa. Menetelmä soveltuu ainoastaan näytteisiin, joiden ammoniakkipitoisuus on alle 0,25 %.

2. Periaate

Näyte uutetaan vedellä, liuos kirkastetaan ja suodatetaan. Haihtuvat typpipitoiset emäkset vapautuvat keitettäessä näyteliuosta magnesiumoksidin kanssa ja ne sidotaan tunnettuun määrään rikkihappoa, jonka ylimäärä titrataan takaisin natriumhydroksidiliuoksella.

3. Reagenssit

3.1 Trikloorietikkahappoliuos, 20 % (w/v).

3.2 Magnesiumoksidi.

3.3 Kuohunestoaine (esim. silikoni).

3.4 Rikkihappo, 0,05 mol/l.

3.5 Natriumhydroksidiliuos, 0,1 mol/l.

3.6 Metyylipunaliuos, 0,3 % (w/v), joka on valmistettu 95–96-prosenttiseen (v/v) etanoliin.

4. Välineistö

4.1 Sekoitin: noin 35–40 kierr./min.

4.2 Kjeldahl-tyyppinen tislauslaitteisto.

5. Menettely

Punnitaan 10 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella 200 ml:n mittapulloon, johon lisätään 100 ml vettä. Pidetään sekoittimessa 30 minuutin ajan. Lisätään 50 ml trikloorietikkahappoliuosta (3.1), täytetään merkkiin asti vedellä, ravistellaan voimakkaasti ja suodatetaan laskostetun suodatinpaperin läpi.

Otetaan kirkasta liuosta sopiva määrä haihtuvien typpipitoisten emästen oletetun pitoisuuden kannalta (100 ml on yleensä sopiva määrä). Laimennetaan 200 ml:ksi ja lisätään 2 g magnesiumoksidia (3.2) ja muutama pisara kuohunestoainetta (3.3). Liuoksen on oltava lakmuspaperilla määritettynä emäksinen; muussa tapauksessa siihen lisätään hieman magnesiumoksidia (3.2). Jatketaan raakavalkuaispitoisuuden määrityksessä käytettävän menetelmän 5.2 ja 5.3 kohdan mukaisesti (tämän liitteen C osa).

Nollakoe suoritetaan samalla tavalla, mutta ilman määritettävää näytettä.

6. Tulosten laskeminen

1 ml H2SO4:ää, 0,05 mol/l, vastaa 1,7 mg:aa ammoniakkia.

Tulos ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

Toistettavuus

Kahden samasta näytteestä suoritetun rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla suhteellisena arvona ilmoitettuna suurempi kuin 10 % ammoniakkimäärästä.

F. AMINOHAPPOJEN MÄÄRITYS (TRYPTOFAANIA LUKUUN OTTAMATTA)

1. Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehujen vapaat aminohapot (synteettiset ja luonnon aminohapot) ja kokonaisaminohapot (peptideihin kiinnittyneet ja vapaat) aminohappoanalysaattorilla. Se sopii seuraaviin aminohappoihin: kyst(e)iini, metioniini, lysiini, treoniini, alaniini, arginiini, asparagiinihappo, glutamiinihappo, glysiini, histidiini, isoleusiini, leusiini, fenyylialaniini, proliini, seriini, tyrosiini ja valiini.

Menetelmällä ei eroteta toisistaan aminohappojen suoloja eikä aminohappojen D- ja L-muotoja. Se ei sovellu tryptofaanin eikä aminohappojen hydroksianalogien määritykseen.

2. Periaate

2.1 Vapaat aminohapot

Vapaat aminohapot uutetaan laimealla kloorivetyhapolla. Mukana uuttuneet typpipitoiset makromolekyylit saostetaan sulfosalisyylihapolla ja poistetaan suodattamalla. Suodatetun liuoksen pH säädetään arvoon 2,20 . Aminohapot erotetaan ioninvaihtokromatografialla ja määritetään fotometrillä ninhydriinijohdoksina aallonpituudella 570 nm.

2.2 Kokonaisaminohapot

Menetelmä valitaan tutkittavien aminohappojen mukaan. Kyst(e)iini ja metioniini on hapetettava kysteiinihapoksi ja metioniinisulfoniksi ennen hydrolyysiä. Tyrosiini on määritettävä näytteistä, joita ei hapeteta ennen hydrolyysiä. Kaikki muut 1 kohdassa mainitut aminohapot voidaan määrittää joko hapetetusta tai hapettamattomasta näytteestä.

Hapettaminen tapahtuu 0 oC:ssa permuurahaishapon ja fenolin seoksella. Hapetusreagenssin ylimäärä hajotetaan natriumdisulfiitin avulla. Hapetettu tai hapettamaton näyte hydrolysoidaan kloorivetyhapolla (3.20) avulla 23 tunnin ajan. Hydrolyysituotteen pH säädetään arvoon 2,20 . Aminohapot erotetaan ioninvaihtokromatografialla ja määritetään fotometrillä ninhydriinijohdoksina aallonpituudella 570 nm (proliini 440 nm).

3. Reagenssit

Veden on oltava kaksoistislattua tai vastaavan laatuista (johtokyky < 10 μS).

3.1 Vetyperoksidi, w (w/w) = 30 %.

3.2 Muurahaishappo, w (w/w) = 98–100 %.

3.3 Fenoli.

3.4 Natriumdisulfiitti.

3.5 Natriumhydroksidi.

3.6 5-Sulfosalisyylihappo-dihydraatti.

3.7 Kloorivetyhappo, tiheys noin 1,18 g/ml.

3.8 Trinatriumsitraatti-dihydraatti.

3.9 2,2 '-Tiodietanoli (tiodiglykoli).

3.10 Natriumkloridi.

3.11 Ninhydriini.

3.12 Petrolieetteri, kiehumislämpötila 40–60 oC.

3.13 Norleusiini tai muu yhdiste, jota voidaan käyttää sisäisenä standardina.

3.14 Typpikaasu (<10 ppm happea).

3.15 1-Oktanoli.

3.16 Aminohapot.

3.16.1 Edellä 1 kohdassa luetellut standardina käytettävät yhdisteet. Puhtaat yhdisteet, jotka eivät sisällä kidevettä. Kuivataan tyhjiössä P2O5:n tai H2SO4:n päällä viikon ajan ennen käyttöä.

3.16.2 Kysteiinihappo.

3.16.3 Metioniinisulfoni.

3.17 Natriumhydroksidiliuos, c = 7,5 mol/l:

liuotetaan 300 g NaOH:ta (3.5) veteen ja laimennetaan 1 litraksi.

3.18 Natriumhydroksidiliuos, c = 1 mol/l:

liuotetaan 40 g NaOH:ta (3.5) veteen ja laimennetaan 1 litraksi.

3.19 Muurahaishappo-fenoliliuos:

sekoitetaan 889 g muurahaishappoa (3.2) ja 111 g vettä ja lisätään 4,73 g fenolia (3.3).

3.20 Hydrolyysiseos, c = 6 mol HCl/l ja 1 g fenolia litrassa:

lisätään 1 g fenolia (3.3) 492 ml:aan HCl (3.7) ja laimennetaan vedellä 1 litraksi.

3.21 Uuttoseos, c = 0,1 mol HCl /l ja 2 % tiodiglykolia litrassa: laimennetaan 8,2 ml HCl (3.7) noin 900 ml:aan vettä, lisätään 20 ml tiodiglykolia (3.9) ja täytetään vedellä yhdeksi litraksi (ei sekoiteta suoraan aineita 3.7 ja 3.9).

3.22 5-Sulfosalisyylihappo, ß = 6 %:

Liuotetaan 60 g 5-sulfosalisyylihappoa (3.6) veteen ja laimennetaan vedellä litraksi.

3.23 Hapetusseos (permuurahaishappo-fenoli):

sekoitetaan 0,5 ml vetyperoksidia (3.1) 4,5 ml:aan muurahaishappo-fenoliliuosta (3.19) pienessä dekantterilasissa. Inkuboidaan 20–30 oC:ssa tunnin ajan, jotta saadaan permuurahaishappoa, annetaan sitten jäähtyä jäävesihauteessa (15 min) ennen näytteeseen lisäämistä.

Varoitus: vältettävä ihokosketusta ja käytettävä suojavaatteita.

3.24 Sitraattipuskuriliuos, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20 :

liuotetaan 19,61 g natriumsitraattia (3.8), 5 ml tiodiglykolia (3.9), 1 g fenolia (3.3) ja 16,50 ml HCl (3.7) noin 800 ml:aan vettä. Säädetään pH arvoon 2,20 . Laimennetaan vedellä yhdeksi litraksi.

3.25 Eluointipuskurit, valmistetaan analysaattorin vaatimusten mukaisesti (4.9).

3.26 Ninhydriinireagenssi, valmistetaan analysaattorin vaatimusten mukaisesti (4.9).

3.27 Aminohappojen standardiliuokset. Nämä liuokset säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa.

3.27.1 Aminohappojen standardin kantaliuos (3.16.1).

c = 2,5 μmol/ml kutakin aminohappoa kloorivetyhapossa.

Saatavana kaupallisesti.

3.27.2 Kysteiinihapon ja metioniinisulfonin standardin kantaliuos, c = 1,25 μmol/ml.

Liuotetaan 0,2115 g kysteiinihappoa (3.16.2) ja 0,2265 g metioniinisulfonia (3.16.3) sitraattipuskuriin (3.24) litran mittapullossa ja täytetään merkkiin asti sitraattipuskurilla. Säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa enintään 12 kuukautta. Tätä liuosta ei tarvita, jos standardin kantaliuos (3.27.1) sisältää kysteiinihappoa ja metioniinisulfonia.

3.27.3 Sisäisen standardin kantaliuos, esimerkiksi norleusiini, c = 20 μmol/ml.

Liuotetaan 0,6560 g norleusiinia (3.13) sitraattipuskuriin (3.24) mittapullossa ja täytetään 250,0 ml:ksi sitraattipuskurilla (3.24). Säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa enintään 6 kuukautta.

3.27.4 Aminohappojen kalibrointiliuos hydrolysaateille: kysteiinihappo ja metioniinisulfoni, c = 5 nmol/50 μl, muut aminohapot c = 10 nmol/50 μl. Liuotetaan 2,2 g natriumkloridia (3.10) 30 ml:aan sitraattipuskuria (3.24) 100 ml:n dekantterilasissa. Lisätään 4,00 ml aminohappojen standardin kantaliuosta (3.27.1), 4,00 ml kysteiinihapon ja metioniinisulfonin standardin kantaliuosta (3.27.2) ja tarvittaessa 0,50 ml sisäisen standardin kantaliuosta (3.27.3). Säädetään pH arvoon 2,20 natriumhydroksidilla (3.18).

Siirretään kvantitatiivisesti 50 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti sitraattipuskurilla (3.24) ja sekoitetaan.

Säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa enintään 3 kuukautta.

Katso myös huomautukset 9.1 kohdassa.

3.27.5 Aminohappojen kalibrointiliuos 5.3.3.1 kohdan mukaisesti valmistetuille hydrolysaateille ja uutteille (5.2). Kalibrointiliuos valmistetaan 3.27.4 kohdan mukaisesti kuitenkin jättäen natriumkloridi pois.

Säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa enintään 3 kuukautta.

4. Välineistö

4.1 100 ml:n tai 250 ml:n pyörökolvi, joka on varustettu palautusjäähdyttimellä.

4.2 Borosilikaattilasinen 100 ml:n pullo, jossa on kumi/teflontiivisteinen kierrettävä uuninkestävä korkki (esimerkiksi Duran, Schott).

4.3 Koneellisella ilmanvaihdolla varustettu ja lämpötilaltaan säädettävä kuivausuuni, jonka tarkkuus on parempi kuin ± 2 oC.

4.4 pH-mittari (lukemat kolmen desimaalin tarkkuudella).

4.5 Kalvosuodatin (0,2 μm).

4.6 Sentrifugi.

4.7 Vakuumipyöröhaihdutin.

4.8 Mekaaninen ravistelija tai magneettisekoitin.

4.9 Aminohappoanalysaattori tai HPLC-laitteisto, joissa on ioninvaihtokolonni, välineistö kolonnin jälkeistä ninhydriiniderivointia varten ja fotometri.

Kolonni täytetään sellaisella sulfonoidulla polystyreenihartsilla, jolla voidaan erottaa eri aminohapot toisistaan ja muista ninhydriinin kanssa reagoivista yhdisteistä. Puskuri- ja ninhydriinipumpun virtausnopeuden stabiilisuuden tulee olla ±0,5 % ajanjaksona, jona analysoidaan sekä standardiliuos että näyte.

Tietyissä aminohappoanalysaattoreissa voidaan käyttää hydrolyysimenetelmää, jossa hydrolysaatin natriumpitoisuus on c = 0,8 mol/l ja se sisältää näin kaiken hapetuksessa jäljelle jääneen muurahaishapon. Muut laitteet eivät erota tyydyttävästi tiettyjä aminohappoja, jos hydrolysaatti sisältää liikaa muurahaishappoa ja/tai natriumionipitoisuus on suuri. Tässä tapauksessa hapon määrää vähennetään haihduttamalla hydrolysaatti noin 5 ml:aan ennen pH:n säätämistä. Haihduttamisen on tapahduttava tyhjiössä enintään 40 oC:ssa.

5. Menettely

5.1 Näytteen valmistaminen

Näyte jauhetaan siten, että se läpäisee 0,5 mm:n seulan. Näytteet, joiden kosteuspitoisuus on suuri, on ilmakuivattava korkeintaan 50 oC:n lämpötilassa tai kylmäkuivattava ennen jauhamista. Näytteet, joiden rasvapitoisuus on suuri, on uutettava petrolieetterillä (3.12) ennen jauhamista.

5.2 Vapaiden aminohappojen määrittäminen rehuista ja esiseoksista

Punnitaan 0,2 mg:n tarkkuudella sopiva määrä (1–5 g) valmistettua näytettä (5.1) erlenmeyerkolviin ja lisätään 100,0 ml uuttoseosta (3.21). Ravistellaan seosta 60 minuuttia mekaanisella ravistelijalla tai magneettisekoittimella (4.8). Annetaan sakan laskeutua ja pipetoidaan 10,0 ml supernatanttiliuosta dekantterilasiin.

Lisätään koko ajan sekoittaen 5,0 ml sulfosalisyylihappoliuosta (3.22) ja jatketaan sekoittamista 5 minuutin ajan magneettisekoittimella. Suodatetaan tai sentrifugoidaan liuos mahdollisen sakan erottamiseksi. Pipetoidaan 10,0 ml saatua liuosta 100 ml:n dekantterilasiin, säädetään pH arvoon 2,20 natriumhydroksidiliuoksella (3.18), huuhdotaan sopivan kokoiseen mittapulloon sitraattipuskurilla (3.24) ja täytetään merkkiin asti puskuriliuoksella (3.24).

Jos käytetään sisäistä standardia (3.27.3), sitä lisätään 1,00 ml lopullisen liuoksen kutakin 100 ml:aa kohden ja täytetään merkkiin asti purskuriliuoksella (3.24).

Siirrytään kromatografiavaiheeseen 5.4 kohdan mukaisesti.

Jos kromatografiaa ei tehdä samana päivänä, uutteet säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa.

5.3 Kokonaisaminohappojen määrittäminen

5.3.1 Hapettaminen

Punnitaan 0,2 mg:n tarkkuudella 0,1 –1 g valmistettua näytettä (5.1):

— 100 ml:n pyörökolviin (4.1) avointa hydrolyysiä varten (5.3.2.3), tai

— 250 ml:n pyörökolviin (4.1), jos tarvitaan alhaista natriumpitoisuutta (5.3.3.1), tai

— 100 ml:n kierrekorkilliseen pulloon (4.2) suljettua hydrolyysiä varten (5.3.2.4).

Punnitun näytemäärän typpipitoisuuden on oltava noin 10 mg ja kosteuspitoisuuden enintään 100 mg.

Asetetaan pyörökolvi tai pullo jää-vesihauteeseen ja jäähdytetään 0 oC:seen, lisätään 5 ml hapetusseosta (3.23) ja sekoitetaan kaarevakärkisellä lasilastalla. Suljetaan kolvi/pullo lastoineen ilmatiiviin kalvon avulla, asetetaan jää-vesihaude näin suljettuine astioineen jääkaappiin, jonka lämpötila on 0 oC, ja jätetään sinne 16 tunniksi. Tämän jälkeen se otetaan jääkaapista ja hajotetaan hapetusreagenssin ylimäärä lisäämällä 0,84 g natriumdisulfiittia (3.4).

Siirrytään 5.3.2.1 kohtaan.

5.3.2 Hydrolyysi

5.3.2.1 Hapetettujen näytteiden hydrolyysi

Edellä 5.3.1. kohdan mukaisesti valmistettuun hapetettuun näytteeseen lisätään 25 ml hydrolyysiseosta (3.20) huolehtien siitä, että astian seinämiin ja lastaan jäänyt näyte huuhdellaan pois.

Jatketaan valitun hydrolyysimenetelmän mukaan 5.3.2.3 tai 5.3.2.4 kohdasta.

5.3.2.2 Hapettamattomien näytteiden hydrolyysi

Punnitaan 100 ml:n tai 200 ml:n pyörökolviin (4.1) tai 100 ml:n kierrekorkilliseen pulloon (4.2) 0,1 –1,0 g valmistettua näytettä (5.1) 0,2 mg:n tarkkuudella. Punnitun näytemäärän typpipitoisuuden on oltava noin 10 mg. Lisätään varovasti 25 ml hydrolyysiseosta (3.20) ja sekoitetaan näytteeseen. Jatketaan joko 5.3.2.3 tai 5.3.2.4 kohdasta.

5.3.2.3 Avoin hydrolyysi

Lisätään kolme lasihelmeä kolvissa olevaan seokseen (valmistettu 5.3.2.1 tai 5.3.2.2 kohdan mukaisesti) ja keitetään tasaisesti kuplittaen palautusjäähdyttimen alla 23 tuntia. Hydrolyysin jälkeen huuhdellaan jäähdytin 5 ml:lla sitraattipuskuria (3.24). Kolvi irrotetaan ja jäähdytetään jäähauteessa.

Jatketaan 5.3.3 kohdan mukaisesti.

5.3.2.4 Suljettu hydrolyysi

Asetetaan 5.3.2.1 tai 5.3.2.2 kohdan mukaisesti valmistettua näyteseosta sisältävä pullo uuniin (4.3) 110 oC:seen. Ensimmäisen tunnin aikana pidetään kierrekorkki sulkematta pullon päällä, jottei kaasun muodostuksen vuoksi syntyisi painetta ja jotta vältyttäisiin räjähdyksiltä. Pulloa ei saa sulkea korkilla. Tunnin kuluttua pullo suljetaan kierrekorkilla ja sen annetaan olla uunissa (4.3) 23 tunnin ajan. Hydrolyysin jälkeen pullo otetaan uunista, avataan korkki varovasti ja asetetaan pullo jää-vesihauteeseen. Annetaan jäähtyä.

Riippuen tavasta, jolla pH säädetään (5.3.3), siirretään pullon sisältö kvantitatiivisesti sitraattipuskurin avulla (3.24) 250 ml:n dekantterilasiin tai 250 ml:n pyörökolviin.

Jatketaan 5.3.3 kohdan mukaisesti.

5.3.3 pH:n säätäminen

Aminohappoanalysaattorin (4.9) natriuminsietokyvyn mukaan noudatetaan 5.3.3.1 tai 5.3.3.2 kohtaa pH:n säätämiseksi.

5.3.3.1 Kromatografit (4.9), jotka edellyttävät alhaista natriumpitoisuutta

On suositeltavaa käyttää sisäisen standardin perusliuosta (3.27.3), jos käytetään aminohappoanalysaattoreita, jotka edellyttävät alhaista natriumpitoisuutta (kun hapon määrää on vähennettävä).

Tässä tapauksessa lisätään 2,00 ml sisäisen standardin perusliuosta (3.27.3) hydrolysaattiin ennen haihdutusta tai sen jälkeen.

Lisätään 2 tippaa 1-oktanolia (3.15) 5.3.2.3 tai 5.3.2.4 kohdan mukaisesti saatuun hydrolysaattiin.

Haihdutetaan näyte 5–10 ml:aan pyöröhaihduttimella (4.7), jonka hauteen lämpötila on 40 oC. Jos tilavuus pienenee vahingossa alle viiden millilitran, hydrolysaatti on hylättävä ja analyysi aloitettava uudelleen.

pH säädetään arvoon 2,20 natriumhydroksidiliuoksella (3.18) ja jatketaan kohdasta 5.3.4.

5.3.3.2 Muut aminohappoanalysaattorit (4.9):

Kohdan 5.3.2.3 tai 5.3.2.4 mukaisesti saatu hydrolysaatti neutraloidaan osittain lisäämällä varovasti koko ajan sekoittaen 17 ml natriumhydroksidiliuosta (3.17) ja huolehditaan siitä, että lämpötila on alle 40 oC.

Lopullinen pH:n säätäminen 2,20 :een tapahtuu huoneen lämpötilassa 3.17 kohdan mukaisen natriumhydroksidiliuoksen avulla ja lopuksi 3.18 kohdan mukaisella natriumhydroksidiliuoksella. Siirrytään 5.3.4 kohtaan.

5.3.4 Näyteliuos kromatografiaa varten

Siirretään kvantitatiivisesti hydrolysaatti, jonka pH on säädetty (5.3.3.1 tai 5.3.3.2.), sitraattipuskurilla (3.24) 200 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin asti puskurilla (3.24).

Jos sisäistä standardia ei ole vielä käytetty, lisätään sitä 2,00 ml (3.27.3) ja täytetään merkkiin asti sitraattipuskurilla (3.24). Sekoitetaan huolellisesti.

Siirrytään kromatografiavaiheeseen (5.4).

Jos kromatografiaa ei tehdä samana päivänä, näyteliuokset säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa.

5.4 Kromatografia

Annetaan uutteen (5.2) tai hydrolysaatin (5.3.4) tasoittua huoneenlämpöisiksi ennen kromatografiaa. Ravistellaan seosta ja suodatetaan sopiva määrä 0,2 μm:n kalvosuodattimen läpi (4.5). Saatu kirkas liuos analysoidaan aminohappoanalysaattorilla käyttäen ioninvaihtokromatografiaa (4.9).

Injektio voidaan suorittaa käsin tai automaattisesti. On tärkeää, että kolonniin lisätään aina sama määrä (±0,5 %) vertailu- tai näyteliuosta, paitsi silloin kun käytetään sisäistä standardia, ja että natriumin ja aminohappojen suhde standardi- ja näyteliuoksissa on mahdollisimman lähellä toisiaan.

Kalibrointiajojen tiheys riippuu ninhydriinireagenssin ja analysaattorin toiminnan stabiilisuudesta. Standardi- tai näyteliuosta laimennetaan sitraattipuskurilla (3.24), siten, että standardiliuoksen antama piikin pinta-ala on 30–200 % näytteen aminohapon antaman piikin pinta-alasta.

Aminohappojen kromatografia vaihtelee jonkin verran käytetyn analysaattorin tyypin ja käytetyn hartsin mukaan. Valitun menetelmän on mahdollistettava aminohappojen erottaminen toisistaan ja muista ninhydriinin kanssa reagoivista aineista. Pylvääseen ruiskutettujen yhdisteiden pitoisuuden muutosten on käyttöalueella annettava lineaarinen vaste.

Analysoitaessa aminohappojen ekvimolaarisia liuoksia sovelletaan seuraavassa kappaleessa määriteltyjä laakson ja piikin välisiä suhteita. Ekvimolaarisen liuoksen tulee sisältää vähintään 30 % kunkin aminohapon siitä enimmäismäärästä, joka voidaan määrittää tarkasti käytetyllä aminohappoanalysaattorilla (4.9).

Kromatogrammissa treoniinin ja seriinin osittain päällekkäisten piikkien välisen laakson suhde matalamman piikin korkeuteen ei saa olla suurempi kuin 2:10. (Jos määritetään ainoastaan kyst(e)iiniä, metioniiniä, treoniiniä ja lysiiniä, vierekkäisten piikkien riittämätön erottuminen toisistaan häiritsee määritystä.) Muiden aminohappojen osalta erottumisen on oltava parempi kuin 1:10.

Kromatografiajärjestelmän on pystyttävä erottamaan lysiini lysiiniartefaktoista ja ornitiinistä.

6. Tulosten laskeminen

Näytteen ja vertailuliuoksen piikkien pinta-ala mitataan kunkin yksittäisen aminohapon osalta ja määrä (X) lasketaan seuraavan kaavan mukaisesti; tulos ilmoitetaan grammoina aminohappoa näytekiloa kohden.

Jos sisäistä standardia käytetään, kerrotaan kaava vielä termillä

A = analysoitavan piikin pinta-ala, hydrolysaatti tai uute

B = analysoitavan piikin pinta-ala, standardiliuos

C = sisäisen standardin piikin pinta-ala hydrolysaatissa tai uutteessa

D = sisäisen standardin piikin pinta-ala kalibrointiliuoksessa

M = analysoitavan aminohapon molekyylipaino

c = standardin konsentraatio μmol/ml

m = näytteen paino grammoina (korjataan alkuperäiseen painoon, jos kuivattu tai rasva poistettu)

V = ml kokonaishydrolysaattia (5.3.4) tai ml uutteen laskettua kokonaislaimennosta (6.1).

Sekä kystiini että kysteiini määritetään kysteiinihappona hapetetun näytteen hydrolysaateista, mutta ne lasketaan kystiiniksi (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) käyttäen molekyylipainoa 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metioniini määritetään metioniinisulfonina hapetetun näytteen hydrolysaateista, mutta lasketaan metioniiniksi käyttäen metioniinin molekyylipainoa 149,21 g/mol.

Lisätty vapaa metioniini määritetään uuttamisen jälkeen metioniinina; laskennassa käytetään samaa molekyylipainoa.

6.1 Uutteiden kokonaislaimennoksen tilavuus (F) vapaiden aminohappojen määrittämistä varten (5.2) lasketaan seuraavasti:

V = lopullisen uutteen määrä.

7. Menetelmän arviointi

Menetelmä on testattu vuonna 1990 tehdyssä kansainvälisessä laboratorioiden välisessä vertailussa käyttäen neljää eri rehua (sikojen täysrehu, broilereiden täysrehu, valkuaistiiviste ja esiseos). Tulosten keskiarvo ja standardipoikkeama poikkeavien arvojen poissulkemisen jälkeen on esitetty tämän kohdan taulukoissa.







Keskiarvot g/kg Vertailuaine Aminohappo Treoniini Kyst(e)iini Metioniini Lysiini Sikojen täysrehu 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Broilereiden täysrehu 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Valkuaistiiviste 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Esiseos 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = osallistuneiden laboratorioiden lukumäärä.

7.1 Toistettavuus

Toistettavuus edellä mainitussa laboratorioiden välisessä vertailussa on ilmaistu muodossa ”laboratorion sisäinen standardipoikkeama” alla olevassa taulukossa.







Laboratorion sisäinen standardipoikkeama (Sr) g/kg Vertailuaine Aminohappo Treoniini Kyst(e)iini Metioniini Lysiini Sikojen täysrehu 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Broilereiden täysrehu 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Valkuaistiiviste 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Esiseos 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = osallistuneiden laboratorioiden lukumäärä.







Variaatiokerroin (%) laskettuna laboratorion sisäisestä standardipoikkeamasta (Sr) Vertailuaine Aminohappo Treoniini Kyst(e)iini Metioniini Lysiini Sikojen täysrehu 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Broilereiden täysrehu 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Valkuaistiiviste 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Esiseos 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = osallistuneiden laboratorioiden lukumäärä.

7.2 Uusittavuus

Edellä mainitun vertailun laboratorioiden välisten standardipoikkeamien tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa.







Standardointipoikkeama laboratorioiden välillä (SR) g/kg Vertailuaine Aminohappo Treoniini Kyst(e)iini Metioniini Lysiini Sikojen täysrehu 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Broilereiden täysrehu 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Valkuaistiiviste 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Esiseos 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = osallistuneiden laboratorioiden lukumäärä.







Laboratorioiden välisistä standardipoikkeamista (SR) laskettu variaatiokerroin (%) Vertailuaine Aminohappo Treoniini Kyst(e)iini Metioniini Lysiini Sikojen täysrehu 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Broilereiden täysrehu 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Valkuaistiiviste 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Esiseos 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = osallistuneiden laboratorioiden lukumäärä.

8. Vertailumateriaalin käyttö

Menetelmän oikea soveltaminen tarkistetaan sertifioidulla vertailumateriaalilla, jos sellainen on saatavilla, tehdyllä kaksoismäärityksellä. Kalibrointi sertifioidulla aminohappojen kalibrointiliuoksella on suotavaa.

9. Huomautukset

9.1 Aminohappoanalysaattoreiden välisten erojen vuoksi annettuja aminohappojen kalibrointiliuosten (3.27.4 ja 3.27.5) ja hydrolysaattien (5.3.4) lopullisia konsentraatioita on pidettävä suuntaa antavina.

Laitteiston lineaarisen vasteen alue on tarkistettava kaikkien aminohappojen osalta.

Standardiliuos laimennetaan sitraattipuskurilla siten, että piikit sijoittuvat alueen keskivaiheille.

9.2 Kun hydrolysaattien analysointiin käytetään suuren erotuskyvyn nestekromatografialaitteistoa, koeolosuhteet on optimoitava valmistajan suositusten mukaisesti.

9.3 Jos menetelmää sovelletaan rehuihin, jotka sisältävät enemmän kuin yhden prosentin kloridia (tiiviste, kivennäisaineita sisältävät ravinteet tai lisäravinteet), sillä saatetaan saada metioniinille liian pieniä arvoja, ja erityiskäsittely on tarpeen.

G. TRYPTOFAANIN MÄÄRITYS

1. Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmän avulla voidaan määrittää rehuissa olevan tryptofaanin kokonaismäärä ja vapaan tryptofaanin määrä. Menetelmällä ei voi erottaa D- ja L-muotoja toisistaan.

2. Periaate

Tryptofaanin kokonaismäärän määrittämiseksi näyte hydrolysoidaan emäksisissä olosuhteissa kyllästetyllä bariumhydroksidiliuoksella ja kuumennetaan 110 oC:ssa 20 tuntia. Hydrolyysin jälkeen lisätään sisäinen standardi.

Vapaan tryptofaanin määrittämiseksi näytettä uutetaan lievästi happamissa olosuhteissa yhdessä sisäisen standardin kanssa.

Tryptofaani ja sisäinen standardi hydrolysaatissa tai uutteessa määritetään HPLC:llä käyttäen fluoresenssidetektoria.

3. Reagenssit

3.1 Veden on oltava kaksoistislattua tai vastaavan laatuista (johtokyky < 10 μS/cm).

3.2 Standardi: tryptofaani (puhtaus/pitoisuus ≥ 99 %), kuivattu tyhjiössä fosforipentoksidin päällä.

3.3 Sisäinen standardi: α-metyylitryptofaani (puhtaus/pitoisuus ≥ 99 %), kuivattu tyhjiössä fosforipentoksidin päällä.

3.4 Bariumhydroksidioktahydraatti (on varottava, ettei Ba(OH)2 8 H2O joudu liiaksi kosketuksiin ilman kanssa; tällöin muodostuisi BaCO3:a, joka voi häiritä määritystä) (ks. huomautus 9.3).

3.5 Natriumhydroksidi.

3.6 Ortofosforihappo, w (w/w) = 85 %

3.7 Kloorivetyhappo, ρ201,19 g/ml.

3.8 Metanoli, HPLC-laatua vastaava.

3.9 Petrolieetteri, kiehumislämpötila 40–60 oC.

3.10 Natriumhydroksidiliuos, c = 1 mol/l:

Liuotetaan 40,0 g NaOH:ta (3.5) veteen ja täytetään 1 litraksi vedellä (3.1).

3.11 Kloorivetyhappo, c = 6 mol/l:

Mitataan 492 ml HCl:ää (3.7) ja täytetään 1 litraksi vedellä.

3.12 Kloorivetyhappo, c = 1 mol/l:

Mitataan 82 ml HCl:ää (3.7) ja täytetään 1 litraksi vedellä.

3.13 Kloorivetyhappo, c = 0,1 mol/l:

Mitataan 8,2 ml HCl:ää (3.7) ja täytetään 1 litraksi vedellä.

3.14 Ortofosforihappo, c = 0,5 mol/l:

Mitataan 34 ml ortofosforihappoa (3.6) ja täytetään 1 litraksi vedellä (3.1).

3.15 Väkevä tryptofaaniliuos (3.2), c = 2,50 μmol/ml:

Liuotetaan 500 ml:n mittapullossa 0,2553 g tryptofaania (3.2) kloorivetyhappoon (3.13) ja täytetään merkkiin asti kloorivetyhapolla (3.13). Säilyy –18 oC:ssa enintään 4 viikkoa.

3.16 Konsentroitu sisäisen standardin liuos, c = 2,50 μmol/ml:

Liuotetaan 500 ml:n mittapullossa 0,2728 g α-metyylitryptofaania (3.3) kloorivetyhappoon (3.13) ja täytetään merkkiin asti kloorivetyhapolla (3.13). Säilyy –18 oC:ssa enintään 4 viikkoa.

3.17 Tryptofaanin ja sisäisen standardin kalibrointistandardiliuos:

Mitataan 2,00 ml konsentroitua tryptofaaniliuosta (3.15) ja 2,00 ml konsentroitua sisäisen standardin (α-metyylitryptofaanin) liuosta (3.16). Laimennetaan vedellä (3.1) ja metanolilla (3.8) siten, että liuoksen tilavuus ja metanolipitoisuus on suunnilleen sama kuin valmiin hydrolysaatin (metanolia 10–30 %).

Tämä liuos on valmistettava juuri ennen käyttöä.

Liuos suojataan suoralta auringonvalolta valmistuksen aikana.

3.18 Etikkahappo.

3.19 1,1,1-Trikloori-2-metyyli-2-propanoli.

3.20. Etanoliamiini w (w/w) > 98 %.

3.21 Valmistetaan liuos, jossa on 1 g 1,1,1-trikloori-2-metyyli-2-propanolia (3.19) 100 ml:ssa metanolia (3.8).

3.22 HPLC:ssä käytettävä liikkuva faasi: 3,00 g etikkahappoa (3.18) + 900 ml vettä (3.1) +50,0 ml 1,1 ,1-trikloori-2-metyyli-2-propanolia (3.19) metanolissa (3.21) (1g/100ml). pH säädetään arvoon 5,00 etanoliamiinilla (3.20). Täytetään 1 000 ml:ksi vedellä (3.1).

4. Välineistö

4.1 HPLC-laitteisto, jossa on spektrofluorimetri-detektori.

4.2 Nestekromatografiakolonni, 125 mm × 4 mm, C18, hartsin (pakkausaineen) hiukkaskoko 3 μm, tai vastaava.

4.3 pH-mittari.

4.4 Polypropyleenipullo, tilavuus 125 ml, jossa on leveä kaula ja kierretulppa.

4.5 Kalvosuodatin 0,45 μm.

4.6 Autoklaavi, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1 ) bar.

4.7 Mekaaninen ravistelija tai magneettisekoitin.

4.8 Vortex-sekoitin.

5. Menettely

5.1 Näytteiden valmistaminen

Näyte jauhetaan siten, että se läpäisee 0,5 mm:n seulan. Näytteet, joilla on suuri kosteuspitoisuus, on ilmakuivattava korkeintaan 50 oC:n lämpötilassa tai kylmäkuivattava ennen jauhamista. Näytteet, joilla on suuri rasvapitoisuus, on uutettava petrolieetterillä (3.9) ennen jauhamista.

5.2 Vapaan tryptofaanin määritys (uutteesta)

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella sopiva määrä (1–5 g) valmistettua näytettä (5.1) erlenmeyerkolviin. Lisätään 100,0 ml kloorivetyhappoa (3.13) ja 5,00 ml konsentroitua sisäisen standardin liuosta (3.16). Ravistellaan tai sekoitetaan 60 minuuttia mekaanisella ravistelijalla tai magneettisekoittimella (4.7). Annetaan sakan laskeutua ja pipetoidaan 10,0 ml supernatanttiliuosta dekantterilasiin. Lisätään 5 ml ortofosforihappoa (3.14). Säädetään pH arvoon 3 natriumhydroksidilla (3.10). Lisätään metanolia (3.8) niin että lopputilavuudessa on 10–30 % metanolia. Siirretään liuos sopivankokoiseen mittapulloon ja laimennetaan vedellä sopivaan tilavuuteen kromatografiaa varten (suunnilleen sama tilavuus kuin kalibrointistandardiliuoksella (3.17)).

Suodatetaan muutama ml liuosta 0,45 μm:n kalvosuodattimen (4.5) läpi ennen HPLC-kolonniin injektointia. Siirrytään kromatografiavaiheeseen 5.4 kohdan mukaisesti.

Standardiliuos ja uutteet suojataan suoralta auringonvalolta. Jos näyteliuoksia ei voida analysoida samana päivänä, uutteita voi säilyttää 5 oC:ssa enintään 3 päivää.

5.3 Tryptofaanin kokonaismäärän määritys (hydrolysaatista)

Punnitaan 0,2 mg:n tarkkuudella 0,1 –1 g valmistettua näytettä (5.1) polypropyleenipulloon (4.4). Punnitun näytemäärän typpipitoisuuden on oltava noin 10 mg. Lisätään 8,4 g bariumhydroksidioktahydraattia (3.4) ja 10 ml vettä. Sekoitetaan vortex-sekoittimella (4.8) tai magneettisekoittimella (4.7). Teflon-päällystetty magneetti jätetään seokseen. Huuhdotaan pullon seinämät 4 ml:lla vettä. Pullo suljetaan löyhästi kierrekorkilla. Pullo pannaan autoklaaviin (4.6), jossa on kiehuvaa vettä, ja autoklavoidaan 30–60 minuutin ajan. Suljetaan autoklaavi ja autoklavoidaan 110 (± 2) oC:ssa 20 tuntia.

Lämpötila on laskettava juuri alle 100 oC:seen, ennen kuin autoklaavi avataan. Jotta Ba(OH)2 · 8 H2O ei kiteytyisi, lämpimään seokseen lisätään 30 ml huoneenlämpöistä vettä. Ravistellaan tai sekoitetaan varovasti. Lisätään 2,00 ml konsentroitua sisäisen standardin liuosta (α-metyylitryptofaania, 3.16). Jäähdytetään pulloja vesi/jäähauteessa 15 minuuttia.

Lisätään 5 ml ortofosforihappoa (3.14). Pullo pidetään jäähdytyshauteessa ja liuos neutraloidaan HCl:llä (3.11) sekoittaen samalla, ja pH säädetään arvoon 3,0 HCl:llä (3.12). Lisätään metanolia niin että lopputilavuudessa on 10–30 % metanolia. Siirretään liuos sopivankokoiseen mittapulloon ja laimennetaan vedellä tiettyyn sopivaan tilavuuteen kromatografiaa varten (esim. 100 ml). Metanolin lisääminen ei saa aiheuttaa saostumista.

Suodatetaan muutama ml liuosta 0,45 μm:n kalvosuodattimen (4.5) läpi ennen HPLC-kolonniin injektointia. Siirrytään kromatografiavaiheeseen 5.4 kohdan mukaisesti.

Standardiliuos ja hydrolysaatit suojataan suoralta auringonvalolta. Jos hydrolysaatteja ei voida analysoida samana päivänä, niitä voi säilyttää 5 oC:ssa enintään 3 päivää.

5.4 HPLC-määritys

Seuraavat isokraattisen erotuksen olosuhteet ovat ohjeellisia; ajo voidaan suorittaa muissa olosuhteissa, jos niillä saadaan samanlaiset tulokset (ks. myös huomautukset 9.1 ja 9.2):







Nestekromatografiakolonni (4.2): 125 mm × 4 mm, C18, hiukkaskoko 3 μm, tai vastaava Kolonnin lämpötila: huoneenlämpötila Liikkuva faasi (3.22): 3,00 g etikkahappoa (3.18) + 900 ml vettä (3.1) +50,0 ml liuosta (3.21), jossa on 1,1,1-trikloori-2-metyyli-2-propanolia (3.19) metanolissa (3.8) (1 g/100 ml). Säädetään pH arvoon 5,00 etanoliamiinilla (3.20). Täytetään 1 000 ml:ksi vedellä (3.1). Virtausnopeus: 1 ml/min Kokonaisajoaika: noin 34 min Detektioaallonpituus: eksitaatio: 280 nm, emissio: 356 nm. Injektiotilavuus: 20 μl.

6. Tulosten laskeminen

Lasketaan tryptofaanin määrä (X) grammoina 100 grammassa näytettä.

A = sisäisen standardin piikin pinta-ala, kalibrointistandardiliuos (3.17)

B = tryptofaanin piikin pinta-ala, uute (5.2) tai hydrolysaatti (5.3)

V1 = kalibrointiliuokseen (3.17) lisätyn konsentroidun tryptofaaniliuoksen (3.15) tilavuus ml (2 ml)

c = kalibrointiliuokseen (3.17) lisätyn konsentroidun tryptofaaniliuoksen (3.15) pitoisuus μmol/ml (= 2,50 )

V2 = uuttovaiheessa (5.2) lisätyn (= 5,00 ml) tai hydrolysaattiin (5.3) lisätyn (= 2,00 ml) konsentroidun sisäisen standardiliuoksen (3.16) tilavuus ml

C = sisäisen standardin piikin pinta-ala, uute (5.2) tai hydrolysaatti (5.3)

D = tryptofaanin piikin pinta-ala, kalibrointistandardiliuos (3.17)

V3 = kalibrointiliuokseen (3.17) lisätyn konsentroidun sisäisen standardiliuoksen (3.16) tilavuus ml (= 2,00 ml)

m = näytteen paino grammoina (korjataan alkuperäiseen painoon, jos kuivattu ja/tai rasva poistettu)

M = tryptofaanin molekyylipaino (= 204,23 g/mol).

7. Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla suurempi kuin 10 % suuremmasta tuloksesta.

8. Laboratorioiden välisen vertailun tulokset

Järjestetyssä EY-vertailussa (4. vertailututkimus) 12 laboratoriota analysoi kolme näytettä hydrolyysimenetelmän varmentamiseksi. Kustakin näytteestä tehtiin viisi rinnakkaismääritystä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:







Näyte 1 Sian rehu Näyte 2 Sian rehu, johon on lisätty L-tryptofaania Näyte 3 Sian rehutiiviste L 12 12 12 n 50 55 50 Keskiarvo [g/kg] 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [%] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [%] 6,3 6,0 2,2

L = laboratorioiden lukumäärä

n = keskiarvoon mukaan otettujen yksittäisten tulosten lukumäärä, kun on poistettu poikkeavat arvot (tunnistettu Cochranin ja Dixonin poikkeavien arvojen testillä)

sr = toistettavuuden keskihajonta

SR = uusittavuuden keskihajonta

r = toistettavuus

R = uusittavuus

CVr = toistettavuuden variaatiokerroin, %

CVR = uusittavuuden variaatiokerroin, %.

Toisessa EY-vertailussa (3. vertailututkimus) 13 laboratoriota analysoi kaksi näytettä vapaan tryptofaanin uuttomenetelmän varmentamiseksi. Kustakin näytteestä tehtiin viisi rinnakkaismääritystä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:







Näyte 4 Vehnä-soijaseos Näyte 5 Vehnä-soijaseos (= näyte 4), johon on lisätty tryptofaania (0,457 g/kg) L 12 12 n 55 60 Keskiarvo [g/kg] 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [%] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [%] 4,71 5,11

L = laboratorioiden lukumäärä

n = keskiarvoon mukaan otettujen yksittäisten tulosten lukumäärä, kun on poistettu suuresti poikkeavat arvot (tunnistettu Cochranin ja Dixonin poikkeavien arvojen testillä)

sr = toistettavuuden keskihajonta

SR = uusittavuuden keskihajonta

r = toistettavuus

R = uusittavuus

CVr = toistettavuuden variaatiokerroin, %

CVR = uusittavuuden variaatiokerroin, %.

Vielä järjestettiin EY-vertailututkimus, jossa seitsemän laboratoriota analysoi neljä näytettä, tarkoituksena tryptofaanin varmentaminen hydrolyysissä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa. Kustakin näytteestä tehtiin viisi rinnakkaismääritystä.







Näyte 1 Sikarehuseos (CRM 117) Näyte 2 Vähärasvainen kalajauho (CRM 118) Näyte 3 Soijajauho (CRM 119) Näyte 4 Rasvaton maitojauhe (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Keskiarvo [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236 sr [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CVr [%] 1,04 1,15 1,30 0,76 SR [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CVR [%] 1,48 4,69 4,11 4,22

L = laboratorioiden lukumäärä

n = keskiarvoon mukaan otettujen yksittäisten tul