1994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 1
Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentointitarkoituksiin.Toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä.
►B KOMISSION PÄÄTÖS,
tehty 15 päivänä heinäkuuta 1994,
eläinten terveyttä koskevista vaatimuksista ja eläinlääkärintodistuksista naudan siemennesteen
tuonnissa kolmansista maista
(94/577/EY)
(EYVL L 221, 26.8.1994, s. 26)
Muutettu:
virallinen lehti
N:o sivu päivämäärä
►M1Komission päätös 1999/495/EY, tehty 1 päivänä heinäkuuta 1999 L 192 56 24.7.1999
►M2Komission päätös 2004/52/EY, tehty 9 päivänä tammikuuta 2004 L 10 67 16.1.2004
Muutettu:
►A1Asiakirja Tšekin tasavallan, Viron tasavallan, Kyproksen tasavallan,
Latvian tasavallan, Liettuan tasavallan, Unkarin tasavallan, Maltan tasa-vallan, Puolan tasavallan, Slovenian tasavallan ja Slovakian tasavallan
liittymisehdoista ja niiden sopimusten mukautuksista, joihin Euroopan
unioni perustuuL 236 33 23.9.2003
▼B
KOMISSION PÄÄTÖS,
tehty 15 päivänä heinäkuuta 1994,
eläinten terveyttä koskevista vaatimuksista ja eläinlääkärintodis-
tuksista naudan siemennesteen tuonnissa kolmansista maista
(94/577/EY)
EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka
ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen,
ottaa huomioon eläinten terveyttä koskevista vaatimuksista yhteisön
sisäisessä naudansukuisten kotieläinten pakastetun siemennesteenkaupassa ja tuonnissa 14 päivänä kesäkuuta 1988 annetun neuvoston
direktiivin 88/407/ETY (
1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna
direktiivillä 93/60/ETY (2), ja erityisesti sen 10 ja 11 artiklan,
sekä katsoo, ettäluettelo kolmansista maista, joista peräisin olevan kotieläimenä pidetyn
naudansukuisen eläimen siemennesteen tuonnin jäsenvaltiot sallivat,jäljempänä ’luettelo’, on laadittu komission päätöksellä 90/14/ETY (
3),
sellaisena kuin se on muutettuna päätöksellä 91/276/ETY (4),
Israelin tautitilanne on aiheuttanut tähän maahan kohdistuvan komis-
sion päätöksessä 91/277/ETY (5) määrätyn tuontikiellon,
komission päätöksissä 91/479/ETY (6), 91/549/ETY (7), 91/123/ETY (8),
91/124/ETY (9), 91/125/ETY (10), 91/126/ETY (11), 91/127/ETY (12), 91/
128/ETY (13), 92/386/ETY (14), 92/387/ETY (15) ja 92/455/ETY (16)
määrätään eläinten terveyttä koskevista vaatimuksista ja eläinlääkärito-
distuksista tuotaessa naudan siemennestettä, joka on peräisinvastaavassa järjestyksessä Amerikan yhdysvalloista, Kanadasta,Puolasta, Suomesta, Uudesta-Seelannista, Australiasta, Sveitsistä, Ruot-sista, Unkarista, Norjasta ja Tsekkoslovakiasta,
direktiivillä 93/60/ETY, joka on pantava täytäntöön jäsenvaltioissa
viimeistään 1 päivänä heinäkuuta 1994, muutetaan direktiiviä 88/407/
ETY ja siksi on tarpeen muuttaa edellä mainittuja kolmansia maita
koskevia päätöksiä; yhteisön tätä alaa koskevan lainsäädännön yksin-kertaistamiseksi on aiheellista ryhmitellä edellä mainitut päätökset jakumota kutakin maata koskevat erilliset päätökset,
ottaen huomioon Euroopan talousalueesta annetut määräykset, ei ole
tarpeen säilyttää eläinlääkärintodistuksia tuotaessa Itävallasta,Suomesta, Norjasta ja Ruotsista naudansukuisten eläinten siemennes-
tettä,
eläinlääkintäalan tiedekomitean lausunnon mukaisesti vaaditaan lisäksi
uusi koe epitsoottisen verenvuototaudin toteamiseksi,
Kanada on ainoa maa, jossa tehdään rutiinikokeita mainitun taudin
toteamiseksi kuuden kuukauden välein ennen siemennesteenkeräämistä,1994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 2
(1) EYVL N:o L 194, 22.7.1988, s. 10
(2) EYVL N:o L 186, 28.7.1993, s. 28
(3) EYVL N:o L 8, 11.1.1990, s. 71
(4) EYVL N:o L 135, 30.5.1991, s. 58
(5) EYVL N:o L 135, 30.5.1991, s. 60
(6) EYVL N:o L 258, 16.9.1991, s. 1
(7) EYVL N:o L 298, 29.10.1991, s. 6
(8) EYVL N:o L 48, 22.2.1992, s. 1
(9) EYVL N:o L 48, 22.2.1992, s. 10
(10) EYVL N:o L 48, 22.2.1992, s. 19
(11) EYVL N:o L 48, 22.2.1992, s. 28
(12) EYVL N:o L 48, 22.2.1992, s. 37
(13) EYVL N:o L 48, 22.2.1992, s. 46
(14) EYVL N:o L 204, 21.7.1992, s. 13
(15) EYVL N:o L 204, 21.7.1992, s. 22
(16) EYVL N:o L 247, 27.8.1992, s. 1
▼B
on tarpeen sallia Kanadalle siirtymäaika tämän päätöksen soveltami-
selle, jotta Kanadan eläinlääkintäviranomaisilla on tarpeeksi aikaalisätä uusi koe rutiinitarkastuksiinsa,
ottaen huomioon bluetongue-taudin epidemiologiassa viime aikoina
saavutettu kehitys, on mahdollista sallia naudan siemennesteen tuontiAustraliasta,
luettelossa olevien kolmansien maiden eläinlääkinnällinen tilanne on
hyvä ja sitä valvoo siemennesteen välityksellä tarttuvien tautien osaltarakenteeltaan hyvä ja hyvin järjestetty eläinlääkintätoimi,
luettelossa olevien kolmansien maiden toimivaltaiset eläinlääkintävira-
nomaiset ovat sitoutuneet 24 tunnin kuluessa ilmoittamaan teleksillä
tai telekopiolla Euroopan yhteisön komissiolle ja jäsenvaltioille vahvis-
tuksen jonkin Maailman eläintautijärjestön (OIE) A-luettelossa olevantaudin esiintymisestä tai näihin tauteihin sovellettavien rokotusohjel-mien muutoksesta tai ilmoittamaan kohtuullisessa määräajassa OIE:nB-luettelossa olevan taudin esiintymisestä ja kaikista muutosehdotuk-
sista kotieläinten tai niiden siemennesteen tai alkioiden tuontiin
sovellettavissa säännöissä,
luettelossa olevien kolmansien maiden viranomaiset ovat sitoutuneet
virallisesti valvomaan tämän päätöksen mukaisten todistusten antamistaja valvomaan, että kaikki todistukset, poikkeukset ja laboratorioko-keiden tulokset, joihin tämä todistus pohjautuu, säilytetään vähintään12 kuukautta virallisessa arkistossa kyseisen siemennesteen toimituksen
jälkeen,
luettelossa olevien kolmansien maiden toimivaltaiset eläinlääkintävira-
nomaiset ovat sitoutuneet neuvoston direktiivin 88/407/ETY 9 artiklanmukaisesti virallisesti hyväksymään keinosiemennysasemat, joistaviedään naudan siemennestettä Euroopan talousyhteisöön,
eläinten terveyttä koskevat vaatimukset ja eläinlääkärintodistukset on
mukautettava kyseisen kolmannen maan terveydelliseen tilanteeseen, ja
tässä päätöksessä määrätyt toimenpiteet ovat pysyvän eläinlääkintäko-
mitean lausunnon mukaiset,
ON TEHNYT TÄMÄN PÄÄTÖKSEN:
1 artikla
Jäsenvaltiot sallivat liitteissä A, B, C ja D olevan 1 osan todistusten
ehdot täyttävän ja yksinomaan liitteissä A, B, C ja D olevassa 2 osassa
vastaavasti luetelluista maista peräisin olevan naudan siemennesteentuonnin.
Ne sallivat kuitenkin Kanadasta peräisin olevan, päätöksen 91/549/ETY
mukaisesti kerätyn ja käsitellyn naudan siemennesteen tuonnin 31päivään joulukuuta 1994 asti.
2 artikla
Kumotaan päätökset 91/479/ETY, 92/123/ETY, 92/124/ETY, 92/125/
ETY, 92/126/ETY, 92/127/ETY, 92/128/ETY, 92/386/ETY, 92/387/
ETY ja 92/455/ETY.
Kumotaan päätös91/549/ETY 1 päiväs tä tammikuuta 1995 alkaen.
3 artikla
Edellä 1 artiklan 1 kohdassa tarkoitettuja Kanadaa koskevia määräyksiä
sovelletaan 1 päivästä tammikuuta 1995.
4 artikla
Tämä päätös on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.1994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 3
▼B
LIITE A
1 OSA
TERVEYSTODISTUS
naudan siemennesteen tuontia varten
1994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 4
▼B
1994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 5
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 6
▼A1
2 OSA
Luettelo kolmansista maista, joiden sallitaan käyttää liitteessä A olevan 1
osan mukaista terveystodistusta
UUSI-SEELANTI
ROMANIA
SVEITSI1994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 7
▼B
LIITE B
1 OSA
TERVEYSTODISTUS
Amerikan yhdysvalloista peräisin olevan naudan siemennesteen tuontia varten
1994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 8
▼B
1994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 9
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 10
▼B
2 OSA
Luettelo maista, joiden sallitaan käyttävän liitteessä B olevan 1 osan
mukaista terveystodistusta
AMERIKAN YHDYSVALLAT1994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 11
▼B
LIITE C
1 OSA
TERVEYSTODISTUS
naudan siemennesteen tuontia varten
1994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 12
▼B
1994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 13
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 14
▼B
2 OSA
Luettelo maista, joiden sallitaan käyttävän liitteessä C olevan 1 osan
mukaista terveystodistusta
KANADA: lukuun ottamatta Okanaganin laaksoa Brittiläisessä Kolumbiassa,
alue määritellään vyöhykkeenä linjan sisällä, joka lähtee Kanadanja Amerikan yhdysvaltojen rajalta pisteestä 120º 15 ′pituutta ja 49º
leveyttä, jatkuu pohjoiseen pisteeseen 119º 35 ′pituutta ja 50º 30 ′'
leveyttä, koilliseen pisteeseen 119º pituutta ja 50º 45' leveyttä,
etelään Kanadan ja Amerikan yhdysvaltojen rajalla sijaitsevaan
pisteeseen 118º 15 ′pituutta ja 49º leveyttä1994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 15
▼B
LIITE D
1 OSA
TERVEYSTODISTUS
Australiasta peräisin olevan naudan siemennesteen tuontia varten
1994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 16
▼B
1994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 17
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 18
▼B
2 OSA
Luettelo maista, joiden sallitaan käyttää liitteessä D olevan 1 osan mukaista
terveystodistusta
AUSTRALIA1994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 19
▼B
LIITE E
Toimintaohjeet poissulkevan tai vertailevan entsyymivälitteisen immunosor-
benttimäärityksen tekemiseksi ryhmäspesifisen monokloonisen vasta-aineen
avulla bluetongue-taudin virusvasta-aineiden toteamiseksi
VERTAILEVA ELISA-KOE BLUETONGUE-TAUDIN TOTEAMISEKSI
MONOKLOONISEN 3-17-A3 VASTA-AINEEN AVULLA
Vertailevalla ELISA-kokeella monokloonista 3-17-A3 vasta-ainetta käyttäen
voidaan havaita kaikki bluetongue-tautiviruksen (BTV) tunnetut seerumityypit.
Kokeessa on periaatteena, että BTV:n antigeenin ja lajiryhmän (3-17-A3) mono-
kloonisen vasta-aineen reaktio keskeytetään lisäämällä koeseerumin
laimennoksia. Koeseerumissa olevat BTV:n vasta-aineet estävät monokloonisen
vasta-aineen (MKV) reagoinnin ja entsyymiuutteen lisäys heikentää odotettua
värimuutosta.
TARVIKKEET JA REAGENSSIT
1. Tasapohjaiset mikrotitrauslevyt.
2. Antigeeni: valmistetaan jäljempänä esitetyllä menetelmällä.
3. Estopuskuri: 5 % (w/v) ”Marvel” kuivattua maitojauhetta, 0,1 % (v/v)
Tween-20: tä (polyoksietyleenisorbitonimonolauraatti-siirapin muodossa)
fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS).
4. Monoklooninen vasta-aine (MKV): 3-17-A3 (hybridomin kudosviljelmän
kelluvana nesteenä) varastoidaan −20 ºC:ssa tai kylmäkuivataan, laimennet-
tuna estopuskurilla suhteessa 1/50 ennen käyttöä, kohdistetaan
ryhmäspesifistä p7 polypeptidiä vastaan.
5. Konjugaatti: kanin hiirivasta-aine (absorboituna ja eluoituna), retikkaperoksi-
daasiin konjugoituna ja säilytettynä pimeässä 4 ºC:ssa.
6. Substraatti ja kromogeeni: 0,2 g ortofenyleeniä (OPD) liuotettuna puskuri-
liuokseen, jossa on 2,553 g sitruunahappoa ja 4,574 g
dinatriumvetyortofosfaattia joka on saatettu 500 ml:ksi tislatulla vedellä, jaet-
tuna 25 ml:n annoksiksi ja säilytettynä pimeässä −20 ºC: ssä, välittömästi
ennen käyttöä lisätään 12 µl/25 ml vetyperoksidia (30 % w/v).
OPD:TÄ ON KÄSITELTÄVÄ VAROEN - ON KÄYTETTÄVÄ KUMIKÄ-
SINEITÄ - TUOTETTA EPÄILLÄÄN MUTAGEENISEKSI.
7. Rikkihappoa, 1 M: 26,6 ml happoa lisätään 473,4 ml:aan tislattua vettä.
HUOM.: HAPPO ON AINA LISÄTTÄVÄ VETEEN, EI KOSKAAN
VETTÄ HAPPOON.
8. Orbital-ravistelija9. ELISA-levynlukija (koe voidaan lukea silmämääräisesti).1994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 20
▼B
KOEKAAVAKE
1994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 21
▼B
KOEMENETTELY
Nollausrivi
Rivi 1 A: sta H: hon on nollausrivi, joka sisältää BTV-antigeenin ja konjugaatin.
Kokeella Elisa-lukija voidaan kalibroida.
MKV-koeRivillä 2 A: sta H: hon on monokloonisen vasta-aineen koe ja siihen kuuluvat
BTV: n antigeeni, monoklooninen vasta-aine ja konjugaatti. Kysymyksessä on
negatiivinen tarkastus. Tämän koerivin optisen tiheyden keskiarvo vastaa 0
prosentin inhibitioarvoa.
Positiivinen tarkastusRivillä 3 A:sta H:hon on positiivinen tarkastus. Siihen kuuluvat BTV:n anti-
geeni, BTV-positiiviset antiseerumilaimennokset, monoklooninen vasta-aine ja
konjugaatti. Tällä osoitetaan, että koe sujuu oikein ja että kokeesta toiseen inhi-
bitioarvo on sama.
KoeseerumitEdellä mainitussa koekaavakkeessa 18 seerumia voidaan testata laimennoksilla
1/2, 1/4, 1/8 ja 1/16. Tulokseksi saadaan tietoja koeseerumien vasta-aineiden
pitoisuuksista. Laimennossarjaa voitaisiin vielä laajentaa seerumilaimennosten
loppupitoisuuksien saamiseksi. Suuressa mittakaavassa suoritettavissa serologi-
sissa kokeissa yhden (1/4) tai kahden (1/2 ja 1/4) laimennoksen seerumikoetta
voitaisiin vaihtoehtoisesti käyttää nopeana seulontakokeena.
MENETTELY
1. BTV-antigeeni laimennetaan pitoisuudeltaan esititrattuun puskuroituun suola-
liuokseen (PBS). Käsitellään lyhyesti ultraäänellä yhteen kasautuneiden
virusten hajoittamiseksi (ellei tätä laitetta ole käytettävissä, pipetoidaan
voimakkaasti) ja liuosta annostellaan 50 µl ELISA-levyn jokaiseen syvennyk-
seen. Reunoja naputtamalla antigeeni jaetaan tasaisesti levylle.
2. Inkuboidaan 37 ºC:ssa 60 minuuttia orbital-ravistelijassa. Levyt pestään
kolmeen kertaan huuhtelemalla ja syvennykset tyhjennetään epästeriilillä
puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kuivataan imupaperilla.
3. Estopuskuria annostellaan 50 µl levysyvennystä kohti. Koeseerumit ja yksi
positiivinen seerumi pannaan asianomaisiin syvennyksiin ja levyn sisältö
laimennetaan monikanavaisen pipetin avulla. Seerumia ei saa lisätä
sokeakoe-ja MKV-koekohtiin.
4. Heti koeseerumien lisäämisen jälkeen MTV laimennetaan estopuskurilla
(esititrattuun laimennokseen) ja levyn kaikkiin syvennyksiin sokeakoesyven-
nystä lukuunottamatta lisätään 50 µl.
5. Inkuboidaan 37 ºC:ssa 60 minuuttia orbital-ravistelijassa. Levyt pestään
kolmeen kertaan puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kuivataan imupaper-
illa.
6. Kanin hiirivasta-aineen konsentraatti laimennetaan suhteessa 1/5 000 estopus-
kuriin ja levyn kaikkiin syvennyksiin lisätään 50 µl.
7. Inkuboidaan 37 ºC:ssa 60 minuuttia orbital-ravistelijassa. Levyt pestään
kolmeen kertaan PBS: lla ja kuivataan imupaperilla.
8. OPD sulatetaan ja välittömästi ennen käyttöä lisätään 12 µl 30 %:sta vetyper-
oksidia jokaista OPD:n 25 ml:aa kohti. Levyn jokaiseen syvennykseen
lisätään 50 µl. Värin muuttumista odotetaan noin 10 minuuttia ja reaktio
keskeytetään 1 M:lla rikkihapolla (50 µl/syvennys). Värin pitäisi muuttua
MKV-koesyvennyksissä ja BTV-vastaaineettomissa seerumisyvennyksissä.
9. Levyt tutkitaan joko silmämääräisesti tai spektrofotometrin avulla ja tulokset
kirjataan.
TULOSTEN MÄÄRITYS
MKV-kokeiden avulla lasketaan OD-keskiarvo. Se vastaa 0 %:n inhibitioarvoa.
Koeseerumien optiset tiheysarvot ilmaistaan inhibitioarvoprosentteina seuraavan
kaavan mukaisesti:
inhibitioarvo % ¼100/C0
OD koeseerumin esiintyess¨ a
OD koeseerumin puuttuessa/C2100
Positiivisena pidetään 1/4-seerumilaimennosta, jonka inhibitioarvot ylittävät
40 %. Silmämääräinen tulosten luku on mahdollista, koska 40 %:n inhibitioarvo
on alhaisin paljain silmin luettavissa oleva arvo.1994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 22
▼B
BTV-ELISA-ANTIGEENIN ESIKÄSITTELY
1. Yhtyvien BHK-21:n solujen 10 Roux-pulloa pestään kolme kertaa seerumit-
tomalla Eagle kasvualustalla ja infektoidaan BTV:n serotyypin 1 avulla
seerumittomalla Eagle-kasvualustalla.
2. Inkuboidaan 37 ºC:ssa ja solutuhovaikutus (cpe) tutkitaan päivittäin.
3. Kun cpe tulee esille 80-90 %:sti jokaisen Roux-pullon solulevyllä, virus
kerätään ravistamalla solut irti seinämästä.
4. Solut sentrifugoidaan rakeiksi nopeudella 2 000 tai 3 000 kierrosta minuu-
tissa.
5. Kelluva jae heitetään pois ja solut suspendoidaan uudelleen noin 30 ml:ssa
puskuroitua suolaliuosta (PBS), jossa on 1 % ”Sarkosyliä” ja 2 ml fenyyli-
metyylisulfonyylifluoridia (lysis-puskuri). Tämä voi aiheuttaa solujen
hyytelöitymistä, jolloin on lisättävä enemmän lysispuskuria.
Huom! fenyylimetyylisulfonyylifluoridi on vaarallista, sitä on käsiteltävä
äärimmäisen huolellisesti.
6. Solut irrotetaan 60 sekunniksi 30 mikronin amplitudilla toimivan ultraääni-
sondin avulla.
7. Sentrifugoidaan kymmenen minuutin ajan nopeudella 10 000 kierrosta
minuutissa.
8. Kelluva jae varastoidaan +4 ºC:seen ja jäljellä olevat solurakeet suspendoi-
daan uudelleen 10-20 ml:aan lysispuskuria.
9. Sekoitetaan ultraäänilaitteella ja selkeytetään. Kelluva jae varastoidaan
kussakin vaiheessa, kaikkiaan kolme kertaa.
10. Kelluvat jakeet yhdistetään ja sentrifugoidaan nopeudella 24 000 kierrosta
minuutissa 120 minuutin ajan 4 ºC: een lämpötilassa 5 ml:n tyynyllä
40 %:sta sakkaroosia (w/v PBS:ssa) käyttäen Beckmannin 30 ml:n sentrifu-
giputkia ja SW 28 roottoria.
11. Kelluva jae heitetään pois, putket tyhjennetään hyvin ja rakeet suspendoi-
daan uudelleen puskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) ultraäänen avulla.
Antigeeni varastoidaan määräosissa −70 ºC:ssa.
BTV-ANTIGEENIN ELISA-TITRAUS
Bluetongue-taudin antigeeni ELISA-koetta varten titrataan epäsuoralla ELISA-
tekniikalla. Antigeenin kaksoislaimennokset titrataan monokloonisen vasta-
aineen 3-17-A3 vakiolaimennoksella (1/50). Koetapa on seuraava:
MENETTELY
1. BTV-antigeeni laimennetaan PBS:lla mikrotitrauslevyllä kaksoislaimennosten
(50µl/syvennys) sarjana käyttäen monikanavapipettiä.
2. Inkuboidaan orbital-ravistelijassa tunnin ajan 37 ºC:ssa.3. Levyt pestään kolmeen kertaan puskuroidulla suolaliuoksella (PBS).4. Monokloonista vasta-ainetta 3-17-A3 (laimennos 1/50) lisätään 50 µl mikro-
titrauslevyn jokaiseen syvennykseen.
5. Inkuboidaan orbital-ravistelijassa tunnin ajan 37 ºC:ssa.6. Levyt pestään kolmeen kertaan puskuroidulla suolaliuoksella (PBS).
7. Mikrotitrauslevyn jokaiseen syvennykseen pannaan 50 µl kanin hiirivasta-
aineglobuliinia retikka-peroksidaasiin konjugoituneena, joka on laimennettu
esititrattuun optimaaliseen pitoisuuteen.
8. Inkuboidaan orbital-ravistelijassa tunnin ajan 37 ºC:ssa.9. Lisätään substraatti ja kromogeeni kuten edellä. Reaktio pysäytetään 10
minuutin kuluttua lisäämällä 1 M:sta rikkihappoa (50 µl/syvennys).
Koska vertailukokeessa monokloonista vasta-ainetta on oltava ylimäärin, on
valittava antigeenilaimennos, joka on titrauskäyrällä (eikä tasaisella alueella),
joka antaa suunnilleen 0,8 OD:n kymmenen minuutin jälkeen.1994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 23
▼B
Toimintaohjeet epitsoottisen verenvuototaudin vasta-aineiden toteamiseksi
agargeeli-immunodiffuusiokokeen avulla
Agargeeli-immunodiffuusiokoe tehdään seuraavalla tavalla:
TARVIKKEET JA REAGENSSIT
1. Antigeeni
Saostava antigeeni valmistetaan millä tahansa soluviljelyjärjestelmällä, jossa
solun jakautuminen on yhtä nopeaa kuin Bluetongue-viruksen asianomaisissa
serotyypeissä. Suositellaan BHK-tai Vero-soluja. Antigeeni esiintyy virus-
kasvun lopussa kelluvassa nesteessä, mutta ollakseen tehokas se on
väkevöitävä 50-100-kertaiseksi. Tähän päästään millä tahansa proteiinien
väkevöinnin standardimenetelmällä, antigeenivirus voidaan inaktivoida
lisäämäilä 0,3 % (v/v) beetapropiolaktonia.
2. Tunnettu positiivinen tarkastusseerumi
Kansainvälisestä vertailuseerumista ja antigeenista tehdään kansallinen
seerumi, joka standardoidaan optimaalisen suhteen aikaansaamiseksi
kansainvälisen seerumin kanssa, ja joka kylmäkuivataan ja jota käytetään
kaikkien kokeiden tunnettuna tarkastusseerumina.
3. Koeseerumi
MENETTELY
1. Kaadetaan 1-prosenttista agaroosia boraatti- tai natriumbarbitolipuskurissa,
pH 8,5-9,0, vähintään 3,0 mm:n syvyiseen petrimaljaan.
2. Agariin koverretaan seitsemän kosteudesta vapaata, halkaisijaltaan 5,0 mm:n
kuoppaa. Kuviossa keskelle tulee yksi kuoppa ja sen ympärille 3 mm:n
säteellä 6 kuoppaa.
3. Keskimmäinen kuoppa täytetään standardiantigeenilla. Kehällä olevat kuopat
2, 4 ja 6 täytetään tunnetuilla positiivisilla seerumeilla, kuopat 1, 3 ja 5
koeseerumeilla.
4. Järjestelmää inkuboidaan korkeintaan 72 tuntia huoneenlämmössä kosteassa
hyvin suljetussa tilassa.
TULKINTA
Koeseerumi on positiivinen, jos se muodostaa määrätyn presipitiinilinjan anti-
geenin kanssa sekä täysin samanlaisen linjan tarkastusseerumin kanssa.
Koeseerumi on negatiivinen, ellei se muodosta määrättyä linjaa antigeenin
kanssa eikä taivuta tarkastusseerumin linjaa. Petrimaljoja on tutkittava tummaa
taustaa vasten ja epäsuorassa valossa.1994D0577 — FI — 01.05.2004 — 003.001 — 24