1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 1
Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentointitarkoituksiin. Toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä.
►B NEUVOSTON DIREKTIIVI 98/57/EY,
annettu 20 päivänä heinäkuuta 1998,
Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.-kasvintuhoojan torjunnasta
(EYVL L 235, 21.8.1998, s. 1)
Oikaistu:
►C1Oikaisu, EYVL L 218, 18.8.1999, s. 30 (98/57)
1998L0057 —FI— 21.08.1998 — 000.001 — 2
▼B
NEUVOSTON DIREKTIIVI 98/57/EY,
annettu 20 päivänä heinäkuuta 1998,
Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.-kasvintuhoojan
torjunnasta
EUROOPAN UNIONIN NEUVOSTO, joka
ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen ja erityisestisen 43 artiklan,
ottaa huomioon komission ehdotuksen(
1),
ottaa huomioon Euroopan parlamentin lausunnon(2),
ottaa huomioon talous- ja sosiaalikomitean lausunnon(3),
sekä katsoo, ettähaitallinen organismi Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.
tunnettiin aikaisemmin nimellä Pseudomonas solanacearum (Smith)
Smith; nimeä Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.käytettä-
neen vastaisuudessa organismin yleisesti hyväksyttynä nimenä; tässädirektiiissä olisi tieteellinen kehitys otettava huomioon,
perunan- ja tomaatintuotannolla on tärkeä asema yhteisön maatalou-
dessa; haitalliset organismit uhkaavat tomaatti- ja perunasatoa jatku-vasti,
perunan- ja tomaatinviljelyä näiltä haitallisilta organismeilta suojaa-
malla olisi tuotostason ylläpitämisen lisäksi myös parannettava maata-louden tuottavuutta,
haitallisten organismien jäsenvaltion alueelle kulkeutumisen estävillä
suojatoimenpiteillä olisi ainoastaan rajallinen vaikutus, ellei näitä orga-nismeja samanaikaisesti ja järjestelmällisesti torjuta koko yhteisössä janiitä estetä leviämästä,
eräs perunan ja tomaatin haitallisista organismeista on Ralstonia solana-
cearum(Smith) Yabuuchi et al., perunan tumman rengasmädän sekä
perunan ja tomaatin bakteerilakastumistaudin aiheuttaja; tämän taudinai-heuttajan aiheuttamia tautipesäkkeitä on tavattu tietyillä yhteisönalueilla, ja joitakin rajoitettuja tartuntalähteitä on vielä olemassa,
perunan- ja tomaatinviljely on koko yhteisössä suuresti uhattuna, ellei
näiden satokasvien osalta toteuteta tehokkaita toimenpiteitä tämän orga-nismin paikallistamiseksi ja levinneisyyden määrittämiseksi, sen esiinty-misen ja leviämisen estämiseksi ja, jos tautia löydetään, sen leviämisenestämiseksi ja torjumiseksi tarkoituksella hävittää se,
tiettyjä toimenpiteitä on toteutettava yhteisössä tämän tavoitteen saavut-
tamiseksi; jäsenvaltioiden on lisäksi voitava toteuttaa lisätoimenpiteitätai tiukempia toimenpiteitä, jos ne ovat tarpeen eivätkä aiheuta esteitäperunoiden ja tomaattien liikkumiselle yhteisössä, jollei kasvien taikasvituotteiden haitallisten organismien yhteisöön kulkeutumisen jayhteisössä leviämisen estämiseen liittyvistä suojatoimenpiteistä 21päivänä joulukuuta 1976 annetussa neuvoston direktiivissä 77/93/ETY(
4) toisin säädetä; nämä toimenpiteet on ilmoitettava muille
jäsenvaltioille ja komissiolle,
toimenpiteissä on otettava huomioon se, että järjestelmälliset viralliset
tutkimukset ovat tarpeen taudinaiheuttajan paikallistamiseksi; näihintutkimuksiin olisi sisällytettävä tarkastusmenettelyt ja koska tietyissäympäristöoloissa tauti voi kasvavissa perunoissa sekä varastoiduissaperunoissa jäädä piileväksi ja havaitsematta, niihin olisi sisällyttävä
(1) EYVL C 124, 21.4.1997, s. 12 ja EYVL C 108, 7.4.1998, s. 85.
(2) EYVL C 14, 19.1.1998, s. 34.
(3) EYVL C 206, 7.7.1997, s. 57.
(4) EYVL L 26, 31.1.1977, s. 20, direktiivi sellaisena kuin se on viimeksi
muutettuna komission direktiivillä 98/2/EY (EYVL L 15, 21.1.1998, s.34).
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 3
▼B
tarvittaessa näytteenotto- sekä testausmenettelyt; taudinaiheuttajan
leviäminen kasvavissa perunoissa ja tomaateissa ei ole tärkein tekijävaan taudinaiheuttaja voi levitä pintaveden sekä tiettyjen viljelmilläesiintyvien luonnonvaraisten koisokasvien välityksellä ja sen vuoksiperuna- ja tomaattisadon kastelu saastuneella vedellä muodostaailmeisen tartunnanvaaran näille sadoille; taudinaiheuttaja voi myöstalvehtia kasveissa, jotka ovat peräisin maahan jääneistä perunoista taitomaateista (”ylivuotiset kasvit”), ja nämä voivat muodostaa saastunta-lähteen kasvukaudesta toiseen; taudinaiheuttaja leviää myös, kunperunat joutuvat kosketuksiin saastuneiden perunoiden sekä istutus-,nosto- ja käsittelyvälineiden tai sellaisten kuljetuksessa ja varastoinnissakäytettyjen säiliöiden kanssa, jotka ovat saastuneet oltuaan aiemminkosketuksissa saastuneiden perunoiden kanssa,
taudinaiheuttajan leviämistä voidaan vähentää tai se voidaan estää
puhdistamalla nämä välineet; tällainen siemenperunoiden saastuntamuodostaa suurimman taudinaiheuttajan leviämisvaaran; vastaavastisiemenperunoiden piilevä tartunta muodostaa pääasiallisen taudinaiheut-tajan leviämisvaaran ja tämä voidaan estää käyttämällä virallisestihyväksytyn suunnitelman mukaisesti tuotettuja siemenperunoita, jolloinsiemenperunat on kokeiden avulla todettu tartunnasta vapaiksi,
nykyinen tietämys Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.
-taudinaiheuttajan biologiasta ja epidemiologiasta Euroopan oloissa onpuutteellista ja on suunniteltu, että ehdotetut toimenpiteet on tarpeentarkistaa usealla kasvukaudella; vastaavasti koemenettelyihin on suunni-teltu parannuksia tulevaisuudessa tehtäviä tutkimuksia ajatellen erityi-sesti menetelmien herkkyyden ja spesifisyyden osalta, jotta voidaanvalita ja standardoida käytettävissä olevista koemenetelmistä parhaat, ja
näitä yleisiä toimenpiteitä koskevia yksityiskohtaisia sääntöjä määritet-
täessä ja jäsenvaltioiden tämän taudinaiheuttajan alueelleen leviämisenestämiseksi toteuttamien tiukempien tai täydentävien toimenpiteidenosalta on suotavaa, että jäsenvaltiot toimivat komission kanssa tiiviissäyhteistyössä pysyvässä kasvinsuojelukomiteassa (jäljempänä”komitea”),
ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:
1 artikla
Tämä direktiivi koskee toimenpiteitä, jotka on toteutettava jäsenval-
tioissaRalstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.-taudinaiheut-
tajan, josta on aikaisemmin käytetty nimeä Pseudomonas solanacearum
(Smith) Smith, (jäljempänä ”organismi”) torjunnassa liitteessä Iolevassa I jaksossa lueteltujen organismin isäntäkasvien (jäljempänä”luettelossa oleva kasviaineisto”) osalta:
a) sen paikallistamiseksi ja sen levinneisyyden määrittämiseksi,
b) sen esiintymisen ja leviämisen estämiseksi, ja
c) jos sitä havaitaan, sen leviämisen estämiseksi ja sen torjumiseksi
tarkoituksella hävittää se.
2 artikla
1. Jäsenvaltioiden on tehtävä vuosittain virallinen ja järjestelmällinen
tutkimus organismin havaitsemiseksi niiden luettelossa olevien kasviai-neistojen osalta, jotka ovat peräisin niiden alueelta. Luettelossa olevankasviaineiston tuotantoa uhkaavien muiden mahdollisten saastuntaläh-teiden tunnistamiseksi jäsenvaltioiden on suoritettava riskien arviointija, jollei arvioinnissa ole todettu organismin leviämisen vaaraa, suoritet-tava luettelossa olevan kasviaineiston tuotantoalueilla kohdennettujavirallisia tutkimuksia, jotka koskevat organismin esiintymistä muissakuin luettelossa olevan kasviaineiston kasveissa, luonnonvaraiset isäntä-kasvina olevat koisokasvit mukaan luettuina, sekä luettelossa olevankasviaineiston kasteluun tai sumutukseen käytettyä pintavettä ja luette-lossa olevaa kasviaineistoa käsittelevien teollisten jalostus- tai pakkaus-laitosten laskemia nestemäisiä jätteitä, joita käytetään luettelossa olevankasviaineiston kasteluun tai sumutukseen. Näiden kohdennettujen tutki-musten laajuus on määritettävä tunnistetun riskin mukaisesti. Jäsenval-
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 4
▼B
tioiden on myös tehtävä virallisia tutkimuksia, jotka koskevat orga-nismin esiintymistä muussa aineistossa, kuten kasvualustassa, maape-rässä tai teollisten jalostus- tai pakkauslaitosten kiinteissä jätteissä.
2. Edellä 1 kohdassa säädetyt viralliset tutkimukset on toteutettava:
a) luettelossa olevan kasviaineiston osalta liitteessä I olevan II jakson 1
kohdassa määrättyjen yksityiskohtien mukaisesti, ja
b) muiden kuin luettelossa olevassa kasviaineistossa esiintyvien isäntä-
kasvien ja veden osalta, nestemäiset jätteet mukaan lukien, asianmu-kaisten menetelmien mukaisesti ja tarvittaessa ottamalla näytteitä,jotka virallisesti tai virallisesti valvottuina tutkitaan laboratoriossa,
c) tarvittaessa muun aineiston osalta asianmukaisten menetelmien
mukaisesti.
Direktiivin 77/93/ETY mukaiset toimivaltaiset viranomaiset vahvistavat
näitä tutkimuksia varten tarkastusmenettelyjä koskevat täydentävät yksi-tyiskohtaiset säännöt sekä näytteiden lukumäärän, alkuperän ja sen,mistä kohdin perunakerroksia näytteet otetaan, sekä näytteenoton ajoi-tuksen perusteltujen tieteellisten ja tilastollisten periaatteiden ja orga-nismin biologian mukaisesti sekä ottaen huomioon kyseisen jäsenvaltionerityisen, luettelossa olevan kasviaineiston ja tarvittaessa muiden orga-nismin isäntäkasvien tuotantojärjestelmät.
3. Edellä 1 kohdassa tarkoitettuja virallisia tutkimuksia koskevat
yksityiskohtaiset säännöt sekä tutkimusten tulokset on ilmoitettavamuille jäsenvaltioille ja komissiolle vuosittain liitteessä I olevan IIjakson 2 kohdan säännösten mukaisesti. Nämä ilmoitukset on jätettävä 1päivään kesäkuuta mennessä lukuun ottamatta siemenperunoina käytet-tyjä perunoita koskevia ilmoituksia, jotka on jätettävä 1 päivään syys-kuuta mennessä. Satoa koskevat tiedot ja tulokset suhteutetaan edellisenvuoden tuotantoon. Näitä ilmoituksia koskevat tiedot voi jättää komi-tean käsiteltäväksi.
4. Seuraava säännös on annettava direktiivin 77/93/ETY 16 a artik-
lassa säädettyä menettelyä noudattaen:
— edellä 2 kohdan ensimmäisen alakohdan b alakohdassa tarkoitettujen
tutkimusten ja laboratoriokokeiden asianmukaiset menetelmät.
5. Seuraavat säännökset voidaan antaa direktiivin 77/93/ETY 16 a
artiklassa säädettyä menettelyä noudattaen:
— edellä 2 kohdan ensimmäisen alakohdan c alakohdassa tarkoitettujen
tutkimusten asianmukaiset menetelmät,
— edellä 2 kohdan toisessa alakohdassa tarkoitettujen tutkimusten
täydentävät yksityiskohtaiset säännöt, jotta kullakin jäsenvaltiollaolisi keskenään vertailukelpoiset takeet.
3 artikla
Jäsenvaltioiden on huolehdittava siitä, että organismin epäilty tai
varmistettu esiintyminen niiden alueella ilmoitetaan jäsenvaltioidenomille toimivaltaisille viranomaisille.
4 artikla
1. Kunkin epäillyn esiintymistapauksen osalta kyseisen jäsenvaltion
toimivaltaisten viranomaisten on varmistettava, että viralliset tai viralli-sesti valvotut laboratoriotutkimukset tehdään käyttämällä luettelossaolevan kasviaineiston osalta liitteessä II esitettyä asianmukaista mene-telmää liitteessä III olevassa 1 kohdassa mainittujen edellytysten mukai-sesti tai kaikissa muissa tapauksissa käyttämällä jotain muuta virallisestihyväksyttyä menetelmää mainitun esiintymisen varmistamiseksi taiepäilyn kumoamiseksi. Jos esiintyminen varmistetaan, on sovellettavaliitteessä III olevassa 2 kohdassa määrättyjä vaatimuksia.
2. Ennen kuin 1 kohdassa tarkoitettu epäilty esiintyminen on varmis-
tunut tai kumottu, kussakin epäillyssä esiintymistapauksessa, jossa ontodettu:
1998L0057 —FI—21.08.1998 —000.001 —5
▼B
i) organismin aiheuttamia taudinoireita sekä saatu positiivinen tulos
liitteessä II olevan I jakson 1 kohdassa ja II jaksossa määritellyssänopeassa seulontakokeessa (-kokeissa) tai
ii) positiivinen tulos liitteessä II olevan I jakson 2 kohdassa ja III
jaksossa määritety(i)ssä seulontakokeessa (-kokeissa),
jäsenvaltioiden toimivaltaisten viranomaisten on niiden oman tuotannonosalta:
a) kiellettävä kaikkien sellaisten satokasvien ja niiden mukuloiden,
erien tai lähetysten liikkuminen, joista on otettu näytteitä, paitsi josne liikkuvat heidän valvontansa alaisina ja jos on todennettu, etteiorganismin tunnistettavaa leviämisvaaraa ole olemassa;
b) toteutettava tarvittavat toimenpiteet epäillyn esiintymisen alkuperän
jäljittämiseksi;
c) otettava käyttöön sopivia arvioidun riskin asteen mukaisia lisävaro-
toimenpiteitä organismin leviämisen estämiseksi, erityisesti luette-lossa olevan kasviaineiston tuotannon sekä muiden kuin a kohdassatarkoitettujen sillä tuotantopaikalla tuotettujen siemenperunaerienliikkumisen osalta, josta a kohdassa tarkoitetut näytteet on otettu.
3. Jos epäiltyjen esiintymistapausten yhteydessä uhkana on luette-
lossa olevan kasviaineiston tai pintaveden saastuminen toisesta jäsenval-tiosta (-valtioista) tai toiseen jäsenvaltioon (-valtioihin), jäsenvaltion,jossa epäillyt esiintymistapaukset on todettu, on ilmoitettava viipymättätunnistetun riskin mukaisesti mainittua epäiltyä esiintymistapaustakoskevat yksityiskohtaiset tiedot kyseiselle toiselle jäsenvaltiolle (-valtioille), ja mainittujen jäsenvaltioiden on oltava asianmukaisessayhteistyössä. Jäsenvaltion (-valtioiden) jo(i)lle asiasta on ilmoitettu, onotettava käyttöön 2 kohdan c alakohdan mukaisia varotoimenpiteitäsekä toteutettava tarvittaessa muita lisätoimenpiteitä 1 ja 2 kohdanmukaisesti.
4. Seuraava säännös voidaan antaa direktiivin 77/93/ETY 16 a artik-
lassa säädettyä menettelyä noudattaen:
— edellä 2 kohdan c alakohdassa tarkoitetut toimenpiteet.
5 artikla
1. Jos virallisten tai virallisesti valvottujen liitteessä II kuvattua
asianmukaista menetelmää käyttäen suoritettujen, luettelossa olevaakasviaineistoa koskevien laboratoriotutkimusten tai kaikissa muissatapauksissa jonkin muun virallisesti hyväksytyn menetelmän perusteellavarmistuu, että organismi esiintyy tämän direktiivin mukaisesti otetussanäytteessä, jäsenvaltion toimivaltaisten viranomaisten on, ottaenhuomioon perustellut tieteelliset periaatteet, organismin biologian jatässä jäsenvaltiossa käytössä olevat organismin isäntäkasvien erityisettuotanto-, kaupanpitämis- ja jalostusjärjestelmät:
a) luettelossa olevan kasviaineiston osalta:
i) suoritettava tutkimukset saastunnan laajuuden ja alkuperäisen
lähteen (lähteiden) määrittämiseksi liitteessä IV olevien sään-nösten mukaisesti ja vähintään kaikkia samasta kloonista polveu-tuvia siemenperunaeriä koskevat 4 artiklan 1 kohdan mukaisettäydentävät kokeet, ja
ii) ilmoitettava saastuneiksi luettelossa oleva kasviaineisto, lähetys
ja/tai erä, josta näyte otettiin, sekä välineet, ajoneuvo, säiliö,varasto tai sen osat ja kaikki muut kohteet, pakkaukset mukaanlukien, jotka ovat olleet kosketuksissa luettelossa olevan kasviai-neiston kanssa, josta näyte on otettu; saastuneiksi on ilmoitettavatarvittaessa myös pelto (pellot), katteen alla kasvatettujen sato-kasvien tuotantoyksikkö (-yksiköt) sekä tuotantopaikka (-paikat),jo(i)sta luettelossa oleva kasviaineisto on korjattu ja josta näyteon otettu; kasvukaudella otettujen näytteiden osalta saastuneiksion ilmoitettava pelto (pellot), tuotantopaikka (-paikat) ja tarvit-taessa katteen alla kasvatettujen satokasvien tuotantoyksikkö (-yksiköt), josta näyte on otettu; ja
iii) määritettävä liitteessä V olevan 1 kohdan säännösten mukaisesti
todennäköinen saastunnan laajuus kosketuksen kautta saastu-neiksi ilmoitettujen kohteiden kanssa ennen tai jälkeen sadon-korjuun tai näiden kohteiden kanssa tuotanto-, kastelu- tai sumu-
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 6
▼B
tusjärjestelmässä olevien yhteyksien tai samasta kloonista
polveutumisen kautta; ja
iv) rajoitettava alue ii kohdassa tarkoitetun saastuntailmoituksen, iii
kohdassa tarkoitetun todennäköisen saastunnan laajuudenmäärittämisen ja organismin mahdollisen leviämisen perusteellaliitteessä V olevan 2 kohdan i alakohdan säännösten mukaisesti.
b) muiden kuin a alakohdassa mainittujen isäntäkasvien sadon osalta,
jossa luettelossa olevan kasviaineiston tuotannossa on tunnistetturiskejä:
i) suoritettava tutkimukset a alakohdan i alakohdan mukaisesti;
ii) ilmoitettava saastuneiksi ne organismin isäntäkasvit, joista näyte
on otettu; ja
iii) määritettävä todennäköinen saastunta ja rajoitettava alue a
alakohdan iii ja iv alakohdan mukaisesti luettelossa olevankasviaineiston tuotannon osalta.
c) pintaveden (mukaan lukien luettelossa olevaa kasviaineistoa käsitte-
levien teollisten jalostus- ja pakkauslaitosten nestemäiset jätepäästöt)sekä viljelmillä esiintyvien luonnonvaraisten isäntäkasvina olevienkoisokasvien osalta, joissa luettelossa olevan kasviaineiston tuotan-nossa on tunnistettu riskejä pintavedellä tapahtuvan kastelun, sumu-tuksen tai pintaveden tulvimisen vuoksi:
i) suoritettava sopivina ajankohtina pintavesinäytteitä ja mahdol-
lisia luonnonvaraisia isäntäkasvina olevia koisokasveja koskevattutkimukset, virallinen tutkimus mukaan luettuna, saastunnanlaajuuden määrittämiseksi;
ii) ilmoitettava saastuneiksi pintavesi, josta näyte (näytteet) on
otettu, soveltuvassa laajuudessa ja i alakohdan mukaisen tutki-muksen perusteella; ja
iii) määritettävä todennäköinen saastunta ja rajoitettava alue ii
alakohdassa tarkoitetun saastuntailmoituksen ja organisminmahdollisen leviämisen perusteella ottaen huomioon liitteessä Volevan 1 kohdan ja 2 kohdan ii alakohdan määräykset.
2. Jäsenvaltioiden on ilmoitettava viipymättä muille jäsenvaltioille ja
komissiolle liitteessä V olevassa 3 kohdassa määrättyä menettelyänoudattaen kaikki 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan ja 1 kohdan calakohdan ii alakohdan mukaisesti ilmoitetut saastunnat sekä 1 kohdan aalakohdan iv alakohdassa ja soveltuvin osin 1 kohdan c alakohdan iiialakohdassa tarkoitetun alueen rajoittamista koskevat yksityiskohtaisettiedot. Tämän kohdan mukaisissa ilmoituksissa olevat yksityiskohtaisettiedot voidaan jättää komitean käsiteltäväksi.
Jäsenvaltioiden on samanaikaisesti toimitettava komissiolle liitteessä V
olevassa 4 kohdassa mainitut lisäilmoitukset. Tämän kohdan mukaisissailmoituksissa olevat yksityiskohtaiset tiedot on jätettävä välittömästikomitean käsiteltäväksi.
3. Edellä 2 kohdassa tarkoitetun ilmoituksen ja siinä mainittujen
seikkojen perusteella muiden ilmoituksessa mainittujen jäsenvaltioidenon tehtävä tutkimus 1 kohdan a alakohdan i alakohdan ja soveltuvinosin 1 kohdan c alakohdan i alakohdan mukaisesti ja toteutettava tarvit-taessa lisätoimia 1 ja 2 kohdan mukaisesti.
6 artikla
1. Jäsenvaltioiden on määrättävä, että 5 artiklan 1 kohdan a
alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitettua luettelossaolevaa kasviaineistoa ei saa istuttaa ja että siihen on toimivaltaistenviranomaisten valvonnassa ja hyväksymänä sovellettava liitteessä VIolevan 1 kohdan säännöksiä siten, että varmistetaan, ettei minkäänlaistatunnistettavaa organismin leviämisvaaraa ole olemassa.
2. Jäsenvaltioiden on määrättävä, että 5 artiklan 1 kohdan a
alakohdan iii alakohdan sekä c alakohdan iii alakohdan mukaisestitodennäköisesti saastuneeksi ilmoitettua luettelossa olevaa vaaralliseksitunnistettua kasviaineistoa mukaan lukien 5 artiklan 1 kohdan aalakohdan iii alakohdan mukaisesti todennäköisesti saastuneeksi määri-tetyillä tuotantopaikoilla tuotettu kasviaineisto, ei saa istuttaa ja että sekäytetään tai hävitetään asianmukaisella tavalla liitteessä VI olevan 2
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 7
▼B
kohdan mukaisesti jäsenvaltioiden toimivaltaisten viranomaisten
valvonnassa varmistaen, ettei tunnistettavaa organismin leviämisvaaraaole.
3. Jäsenvaltioiden on määrättävä, että 5 artiklan 1 kohdan a
alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneiksi ilmoitetut tai 5 artiklan1 kohdan a alakohdan iii alakohdan sekä c alakohdan iii alakohdanmukaisesti todennäköisesti saastuneiksi ilmoitetut välineet, ajoneuvot,säiliöt, varastot tai niiden osat sekä kaikki muut kohteet, pakkauksetmukaan lukien, on tuhottava tai puhdistettava liitteessä VI olevassa 3kohdassa tarkoitettuja asianmukaisia menetelmiä käyttäen. Puhdistuksenjälkeen näitä kohteita ei enää pidetä saastuneina.
4. Jäsenvaltioiden on määrättävä, että liitteessä VI olevassa 4.1 ja 4.2
kohdassa määritellyt eri toimenpiteet on toteutettava 5 artiklan 1 kohdana alakohdan iv alakohdan ja c alakohdan iii alakohdan mukaisestirajoitetulla alueella, sanotun kuitenkaan rajoittamatta 1, 2 ja 3 kohdanmukaisesti toteutettavia toimenpiteitä. Näitä toimenpiteitä koskevatyksityiskohtaiset tiedot on ilmoitettava vuosittain muille jäsenvaltioilleja komissiolle. Tässä ilmoituksessa olevat yksityiskohtaiset tiedotvoidaan jättää komitean käsiteltäviksi.
7 artikla
1. Jäsenvaltioiden on määrättävä, että siemenperunoiden on täytet-
tävä direktiivin 77/93/ETY vaatimukset ja niiden on polveuduttavasuoraan peruna-aineistosta, joka on saatu virallisesti hyväksyttyä suun-nitelmaa noudattaen ja joka on virallisesti tai virallisesti valvotussaliitteessä II esitettyä asianmukaista menetelmää käyttäen suoritetussatutkimuksessa todettu kyseisestä organismista vapaaksi.
Jäsenvaltion on tehtävä edellä mainitut tutkimukset:
a) jos niiden omassa siemenperunan tuotannossa on varmistettuja
havaintoja organismista,
i) tutkimalla aikaisempien sukupolvien siemenperunat, alkuperäinen
kloonivalinta mukaan luettuna, ja testaamalla järjestelmällisestikaikki perussiemenperunat, tai
ii) jos on osoitettu, että kyseessä ei ole samasta kloonista polveutu-
minen, testaamalla kaikki perussiemenperunoiden kloonit taiaikaisempien sukupolvien siemenperunat, alkuperäisen klooniva-linnan testaaminen mukaan luettuna, ja
b) muissa tapauksissa joko jokaiselle alkuperäisestä kloonista valitulle
kasville tai perussiemenperunan tai aikaisempien sukupolviensiemenperunan edustaville näytteille.
2. Seuraavat säännökset voidaan antaa direktiivin 77/93/ETY 16 a
artiklassa säädetyn menettelyn mukaisesti:
— yksityiskohtaiset säännöt 1 kohdan toisen alakohdan a alakohdan
soveltamisesta,
— 1 kohdan toisen alakohdan b alakohdassa tarkoitettuja edustavia
näytteitä koskevat säännöt.
8 artikla
Jäsenvaltioiden on kiellettävä organismin hallussapito ja käsittely.
9 artikla
Jäsenvaltiot voivat myöntää poikkeuksia tämän direktiivin 6 ja 8 artik-
laan direktiivin 95/44/EY säännösten mukaisesti kokeellisia tai tieteel-lisiä tarkoituksia tai lajikevalintatyötä varten(
1), sanotun kuitenkaan
rajoittamatta direktiivin 77/93/ETY säännösten soveltamista.
(1) EYVL L 184, 3.8.1995, s. 34, direktiivi sellaisena kuin se on viimeksi
muutettuna komission direktiivillä 97/46/EY (EYVL L 204, 31.7.1997, s.43).
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 8
▼B
10 artikla
Jäsenvaltiot voivat toteuttaa oman tuotantonsa osalta lisätoimenpiteitä
tai tiukempia toimenpiteitä, jotka ovat tarpeen organismin torjumiseksitai sen leviämisen estämiseksi, jos nämä toimenpiteet ovat direktiivin77/93/ETY säännösten mukaisia.
Näitä toimenpiteitä koskevat yksityiskohtaiset tiedot on ilmoitettava
muille jäsenvaltioille ja komissiolle. Tässä ilmoituksessa olevat yksityis-kohtaiset tiedot voidaan jättää komitean käsiteltäviksi.
11 artikla
Tämän direktiivin liitteisiin tieteellisen tai teknisen tietämyksen lisään-
tymisen vuoksi tehtävät muutokset tehdään direktiivin 77/93/ETY 16 aartiklassa säädettyä menettelyä noudattaen. Tämän direktiivin liitteessäII esitettyjen menetelmien sekä liitteessä VI olevassa 4.1 ja 4.2kohdassa säädettyjen toimenpiteiden osalta komissio laatii kertomuksen,jossa näitä menetelmiä ja toimenpiteitä tarkistetaan saadun kokemuksenperusteella, ja kertomus toimitetaan komitealle ennen 1 päivää tammi-kuuta 2002.
12 artikla
1. Jäsenvaltioiden on saatettava voimaan tämän direktiivin noudatta-
misen edellyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset 21päivästä elokuuta 1999 lukien. Niiden on ilmoitettava tästä komissiolleviipymättä.
Näissä jäsenvaltioiden antamissa säädöksissä on viitattava tähän direk-
tiiviin tai niihin on liitettävä tällainen viittaus, kun ne virallisesti julkais-taan. Jäsenvaltioiden on säädettävä siitä, miten viittaukset tehdään.
2. Jäsenvaltioiden on välittömästi toimitettava tässä direktiivissä
tarkoitetuista kysymyksistä antamansa keskeiset kansalliset säännöksetkomissiolle. Komissio ilmoittaa tästä muille jäsenvaltioille.
13 artikla
Tämä direktiivi tulee voimaan päivänä, jona se julkaistaan Euroopan
yhteisöjen virallisessa lehdessä .
14 artikla
Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 9
▼B
LIITE I
I JAKSO
Luettelo 1 artiklassa tarkoitetuista Ralstonia solanacearum (Smith)
Yabuuchi et al. -kasvintuhoojan isäntäkasveista
Solanum tuberosum L. -lajin kasvit (mukulat mukaan luettuina),
varsinaisia siemeniä lukuun ottamattaPeruna
Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farw. -lajin kasvit
hedelmiä ja siemeniä lukuun ottamattaTomaatti
II JAKSO
Tutkimukset
1. Edellä 2 artiklan 2 kohdan a alakohdassa tarkoitettujen virallisten tutkimusten
on perustuttava organismin biologiaan sekä kyseisen jäsenvaltion erityisiintuotantojärjestelmiin ja niihin on kuuluttava:
i) perunan osalta,
— kasvavien perunoiden silmämääräinen tarkastus sopivina ajankohtina
ja/tai näytteenotto sekä siemenistä että muista perunoista kasvukaudenaikana tai varastossa. Näille näytteille tehdään virallisesti tai viralli-sesti valvottu silmämääräinen tarkastus halkaisemalla mukulat,
ja
— siemenperunoiden ja tarvittaessa muiden perunoiden osalta virallinen
tai virallisesti valvottu laboratoriotutkimus liitteessä II esitettyä mene-telmää käyttäen;
ii) tomaatin osalta,
— ainakin uudelleenistutettavaksi ammattikäyttöön tarkoitettujen kasva-
vien tomaattien silmämääräinen tarkastus sopivina ajankohtina.
2. Edellä 2 artiklan 3 kohdassa tarkoitettuun virallisia tutkimuksia koskevaan
ilmoitukseen on kuuluttava:
i) perunoita koskevien tutkimusten osalta:
— siemenperunoiden ja muiden perunoiden viljelmän arvioitu kokonais-
pinta-ala hehtaareina,
— luokittelu siemenperunaluokkiin ja ruokaperunaan, sekä tarvittaessa
alueisiin,
— tutkimusta varten otettujen näytteiden lukumäärä ja näytteenoton
ajoitus,
— silmämääräisten tarkastusten lukumäärä pellolla,— mukuloiden silmämääräisten tarkastusten lukumäärä (ja näytteen
koko);
ii) ainakin uudelleenistutettavaksi ammattikäyttöön tarkoitettuja kasvavia
tomaatteja koskevien tutkimusten osalta:
— kasvien arvioitu kokonaismäärä,
— silmämääräisten tarkastusten lukumäärä;
iii) muita isäntäkasveja kuin perunoita ja tomaatteja, luonnonvaraiset isäntä-
kasvina olevat koisokasvit mukaan luettuina, koskevien tutkimustenosalta:
— lajit,
— otettujen näytteiden lukumäärä ja näytteenoton ajoitus,— alue/joki, josta näytteet otetaan (tarvittaessa),— analyysimenetelmä;
iv) vesiä ja teollisten jalostus- tai pakkauslaitosten nestemäisiä jätteitä koske-
vien tutkimusten osalta:
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 10
▼B
— otettujen näytteiden lukumäärä ja näytteenoton ajoitus,
— alue/joki/laitokset, joista näytteet otetaan (tarvittaessa),— analyysimenetelmä.
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 11
▼B
LIITE II
TUTKIMUSMENETELMÄ RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH)
YABUUCHI ET AL. -KASVINTUHOOJAN MÄÄRITTÄMISEKSI,
TOTEAMISEKSI JA TUNNISTAMISEKSI
TUTKIMUSMENETELMÄN SOVELTAMISALA
Esitetty menetelmä kuvaa eri menettelyjä, jotka koskevat:
i) tumman rengasmädän määritystä perunan mukuloista ja bakteerilakastumis-
taudin määritystä perunan ja tomaatin kasveista,
ii)Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteamista perunan mukuloista
otetuista näytteistä,
iii)Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan tunnistamista.
Lisäyksissä esitetään yksityiskohtaisesti tutkimusaineistojen, so. kasvualustojen,
puskurien, liuosten, reagenssien valmistelu.
SISÄLTÖ:
I JAKSO: Tutkimusmenetelmän soveltaminen … 9
1. Tumman rengasmädän määritys perunan mukuloista ja bakteerilakastu-
mistaudin määritys perunan ja tomaatin kasveista …9
2.Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteaminen ja tunnistaminen
perunan mukuloista otetuista näytteistä …11
II JAKSO: Tumman rengasmädän määritys perunan mukuloista ja bakteerilakas-
tumistaudin määritys perunan ja tomaatin kasveista …13
1. Oireet … 13
2. Nopea seulontakoe (-kokeet) … 133. Eristämismenettely … 144. Varmistuskoe (-kokeet) … 14
III JAKSO: Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteaminen ja tunnistaminen
perunan mukuloista otetuista näytteista …17
1. Näytteen esikäsittely koetta varten … 17
2. Immunofluoresenssi (IF) -testi … 183. Enzyme linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) -testi … 204. Polymeraasiketjureaktio (PCR ) -testi … 20
5. Laimennussarja valikoivalle alustalle … 226. Biotesti … 237. Rikastustestit … 238. Patogeenisystesti … 23
Lisäys 1: Ravintoalusta Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan eristämistä ja
viljelyä varten …24
Lisäys 2: Aineistot näytteen esikäsittelyä varten … 25
Lisäys 3: Aineistot IF-testiä varten … 26
Lisäys 4: Kontaminaatioasteen määritys IF-testillä … 27
Lisäys 5: Aineistot ELISA-testiä varten … 28
Lisäys 6: Aineistot PCR-testiä varten … 29
Lisäys 7: Aineistot valikoivalle alustalle tehtävää laimennussarjaa ja rikastustestiä
(-testejä) varten …29
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 12
▼B
Viitteet … 30
I JAKSO
TUTKIMUSMENETELMÄN SOVELTAMINEN
1.Tumman rengasmädän määritys perunan mukuloista ja bakteerila-
kastumistaudin määritys perunan ja tomaatin kasveista
Testimenetelmä on tarkoitettu perunan mukuloille, joiden oireet ovat
tyypillisiä tummalle rengasmädälle tai antavat aihetta epäillä tätä tautia,ja perunan ja tomaatin kasveille, joiden oireet ovat tyypillisiä bakteerila-kastumistaudille tai antavat aihetta epäillä tätä tautia. Siihen kuuluunopea seulontatesti, taudinaiheuttajan eristäminen infektoituneesta johto-solukosta määritysalustalle ja, jos tulos on positiivinen, viljelmän tunnis-taminenRalstonia solanacearum -kasvintuhoojaksi.
Etenemiskaavio
Etenemiskaavion viittaukset
(1) Oireiden kuvaus esitetään II jakson 1 kohdassa.
(2) Nopealla seulontakokeella voidaan tehdä alustava taudinmääritys.
Tarkoituksenmukaiset testit ovat:
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 13
▼B
— johtosolukon valutustesti (II jakso, 2 kohta)
— testi poly- β-hydroksibutyraattirakeille (II jakso, 2 kohta)
— IF-testi (III jakso, 2 kohta)— ELISA-testi (III jakso, 3 kohta)— PCR-testi (III jakso, 4 kohta)
(
3) Vaikka taudinaiheuttajan eristäminen tyypillisten oireiden perusteella laimen-
nussarjalla on yksinkertaista, viljely voi epäonnistua, jos tartunta on edennytpitkälle. Taudin saastuttamissa solukoissa elävät saprofyyttiset bakteeritvoivat ohittaa kasvussa taudinaiheuttajan tai estää taudinaiheuttajan kasvuaeristysalustalla. Jos eristyskokeen tulos on negatiivinen, mutta taudin oireettyypilliset, eristäminen on toistettava mieluiten valikoivalla laimennussarjalla.
(
4)Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan puhtaan viljelmän tunnistaminen
luotettavasti on mahdollista vähintään yhden II jakson 4.1 kohdassa luetelluntestin ja patogeenisyystestin avulla (II jakson 4.3 kohta). Biovarin ja rodunmäärittäminen on vapaaehtoista, mutta sitä suositellaan kaikissa uusissatapauksissa.
2.Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteaminen ja tunnista-
minen perunan mukuloista otetuista näytteistä
Menettely on tarkoitettu piilevien tartuntojen toteamiseen perunan muku-
loissa yhden tai mieluummin useamman seulontakokeen avulla. Jos tutki-mustulos on positiivinen, sitä täydennetään eristämällä taudinaiheuttaja.Jos eristyskokeen tuloksena saadaan morfologialtaan tyypillisiä pesäk-keitä, vuorossa on puhtaan viljelmän tunnistaminen Ralstonia solana-
cearum-bakteeriksi.
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 14
▼B
Etenemiskaavio
Etenemiskaavion viittaukset:
(1) Näytekoko
Standardi näytekoko on 200 mukulaa. Menetelmä soveltuu myös käytettä-väksi alle 200 mukulan näytteille.
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 15
▼B
(2) Seulontakoe (-kokeet)
Yksi ainoa testi ei ehkä ole riittävän herkkä tai luotettava Ralstonia solana-
cearum-bakteerin toteamiseksi näytteestä. Sen vuoksi suositellaan useampaa
kuin yhtä testiä. Näiden testien olisi mahdollisuuksien mukaan oltava meto-diikaltaan erilaisia.
(
3) Immunofluoresenssi (IF) -testi
IF-testi (epäsuora menetelmä) on hyvin tunnettu seulontakoe. Tämä on etuverrattuna muihin kokeisiin, joita ei ole vielä täysin kehitetty tai validoitu.Testiä käytetään moniin muihinkin lakisääteisiin bakteeritutkimuksiin, esim.Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus tutkimuksiin. Testin herkkyys
on 10
3—104solua/ml perunauutetta tämän menetelmän mukaisilla paramet-
reillä.Antiseerumin laatu on kriittinen tekijä koetulosten luotettavuuden kannalta.Ainoastaan sellainen antiseerumi, jonka tiitteri on korkea (vähintään 2000käsittelemättömän antiseerumin osalta), on kelvollista, ja kaikki kokeet ontehtävä antiseerumitiitterillä tai tiitteriä pienemmällä yhdellä laimennoksella.Epäsuora menetelmä on parempi. Suoraa menetelmää voidaan soveltaa, joskoe on herkkyysasteeltaan ja spesifisyydeltään epäsuoraa menetelmäävastaava.IF-testin etuna on se, että reaktion spesifisyydestä tietoa antavaa solujenvärjäytymisen morfologiaa ja fluoresenssin voimakkuutta voidaan tulkitasubjektiivisesti. Ristireaktiot solumorfologialtaan Ralstonia solanacearum
-bakteerin kaltaisten maassa tai perunan solukoissa olevien serologisestisaman sukuisten bakteerien kanssa ovat tavallisia. IF-testiä voidaan käyttääainoana seulontakokeena, vaikka tapauksissa, joissa epäillään ristireaktioita,olisi tehtävä toinen sellainen IF-testi, jossa käytetään eri alkuperää olevaaantiseerumia, tai vaihtoehtoinen seulontakoe. Tällaisissa tapauksissa vali-koiva laimennussarja on sopivin koe.
(
4) Valikoiva laimennussarja
Kyseinen koe on herkkä ja valikoiva testi Ralstonia solanacearum -bakteerintoteamiseksi, jos käytetään muunnettua SMSA-alustaa ja tätä menetelmäävarten määriteltyä testausmetodiikkaa. Tulos saadaan 3—6 päivää näytteenvalmistuksen jälkeen. Taudinaiheuttaja saadaan eristettyä suoraan viljelmäksija se on helppo tunnistaa. Jotta testistä saataisiin täysi hyöty, testissä käytet-tävät mukuloiden pienet napapäät on käsiteltävä huolellisesti, jotta voidaaneliminoida toissijaiset bakteerit, jotka ovat alustalla Ralstonia solanacearum
-bakteerin kilpailijoita ja voivat estää taudinaiheuttajan kehittymisen. Jotkutkannat voivat kasvaa heikosti, koska alustan aineosat vaikuttavat myös vali-koivasti kohdeorganismiin. Ralstonia solanacearum -bakteerin erottamiseen
muista alustalla mahdollisesti kehittyvistä bakteereista tarvitaan myös huolel-lisuutta. Valikoivaa laimennussarjaa voidaan käyttää ainoana seulontako-keena, vaikkakin kun saadaan negatiivinen testitulos ja kun epäillään muidenbakteerien estävän Ralstonia solanacearum -bakteerin kasvua alustalla, olisi
tehtävä toinen seulontakoe. Tällaisissa tapauksissa IF-testi on sopivin koe.
(
5) ELISA-testi
ELISA-testi ei yleensä ole yhtä herkkä kuin IF-testi (104—105solua peru-
nauutteen yhtä millilitraa kohden). Tämä testi on halpa ja nopea, mutta antaayleensä herkemmin vääriä positiivisia (ristireaktiot) tuloksia ja vääriä negatii-visia (fenolimolekyylien estävä vaikutus perunauutteessa) tuloksia. Antisee-rumin spesifisyyttä koskevat vaatimukset ovat erittäin korkeat. ELISA-testiäei voida käyttää ainoana seulontakokeena.
(
6) PCR-testi
PCR-testillä on mahdollista suorittaa toteaminen erittäin suurella herkkyy-dellä, vaikka kasvi- tai mukulauutteen aineosat estävät helposti koetta, jolloinsaadaan väärä negatiivinen tulos. Jotkut perunalajikkeet sisältävät toisiaenemmän inhibiittoreita. Sen vuoksi on tarpeen poistaa nämä inhibiittorit.Inhibiittoreita voidaan torjua laimentamalla, mutta Ralstonia solanacearum
-populaatiot laimenevat samalla. On noudatettava suurta huolellisuuttakaikissa näytevaiheissa ja testin valmistelussa sellaisen saastunnan estämi-seksi, joka voisi aiheuttaa vääriä positiivisia tuloksia. Tämän vuoksi suoraaPCR-testiä ei voida käyttää ainoana seulontakokeena.
(
7) Rikastustesti
Perunauutenäytteiden inkubointi puolivalikoivassa liuoksessa, kuten muunne-tussa SMSA-liuoksessa, tekee mahdolliseksi Ralstonia solanacearum
-bakteerin lisääntymisen. Ehkä vielä tärkeämpää on se, että se laimentaamyös ELISA- ja PCR-testille mahdolliset inhibiittorit. Näin Ralstonia solana-
cearum-bakteeri voidaan havaita rikastusliuoksessa IF-, ELISA- ja PCR-
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 16
▼B
testillä. Suoraa laimennussarjaa ei suositella tehtäväksi rikastusliuoksista.
Näitä rikastusmenetelmiä ei ole perusteellisesti kokeiltu ja testattu. Ne onmainittu tässä, koska niihin sisältyy lupaavia mahdollisuuksia. Niitä eikuitenkaan voida käyttää ainoina toteamismenetelminä, koska niistä onsuhteellisen vähän kokemusta.
(
8) Biotesti
Biotestiä käytetään Ralstonia solanacearumin eristämiseen perunauutteesta
käyttäen valikoivaa laimennussarjaa isäntäkasvissa ja se voidaan tehdätomaatilla tai munakoisolla. Testi edellyttää optimaalisia menetelmässätarkennettuja inkubointiolosuhteita. Ralstonia solanacearum -bakteerin inhi-
biittorit SMSA-alustalla eivät todennäköisesti häiritse testiä.
(
9) Varmistuskoe (-kokeet)
Ralstonia solanacearum -bakteerin puhdas viljelmä voidaan tunnistaa luotet-
tavasti vähintään yhden II jakson 4.1. kohdassa luetellun testin ja patogeeni-syystestin (II jakson 4.3. kohta) avulla. Biovarin ja rodun määritys onvapaaehtoista, mutta sitä suositellaan kaikissa uusissa tapauksissa.
II JAKSO
TUMMAN RENGASMÄDÄN MÄÄRITYS PERUNAN MUKULOISTA JA
BAKTEERILAKASTUMISTAUDIN MÄÄRITYS PERUNAN JA
TOMAATIN KASVEISTA
1.Oireet
1.1 Oireet perunassa
Perunan kasvi . Tartunnan varhaisessa vaiheessa lehdet nuutuvat kasvin
tyvestä alkaen päivällä lämpimällä säällä ja toipuvat yöllä. Nuutuminenjää nopeasti pysyväksi ja kasvi kuolee. Nuutuneiden kasvien varsienjohtosolukko voi poikkileikkauksesta tarkasteltuna muuttua ruskeaksi jamaitomaista mätää valuu leikatulta pinnalta tai sitä saadaan helposti ulospusertamalla. Kun leikattu varsi asetetaan veteen, johtosolukkokimpuistavaluu limaa.
Perunan mukula . Perunan mukulat leikataan halki maavarren kiinnitys-
kohdan läheltä. Tartunnan varhainen vaihe ilmenee lasimaisena värityk-senä keltaisesta vaaleanruskeaan johtosolukkorenkaassa, josta muutamanminuutin kuluttua pursuaa joko itsestään tai peukaloilla kevyestikuoresta leikkauspinnan läheltä painettaessa vaaleankeltaista mätää.Myöhemmin johtojänteiden väritys muuttuu selvemmin ruskeaksi janekroosi voi laajeta tylppysolukkoon. Myöhemmässä vaiheessa tartuntaleviää maavarren kiinnityskohdasta ja mukulan silmistä, mistä onseurauksena punaruskeita hieman painuneita kuoren vioittumia, joistavuotaa bakteerimätää, johon maahiukkasia kiinnittyy.
1.2 Oireet tomaatissa
Tomaatin kasvi . Ensimmäinen näkyvä oire on nuorimpien lehtien velt-
tous. Taudinaiheuttajalle suotuisissa ympäristöolosuhteissa (maaperänlämpötila noin 25 °C, kyllästyskosteus) on seurauksena muutaman
päivän kuluessa epinastia ja kasvin yhden puolen tai koko kasvin nuutu-minen, mikä johtaa koko kasvin kollapsiin. Vähemmän suotuisissaolosuhteissa (maaperän lämpötila alle 21 °C) varteen saattaa kehittyä
suuri määrä versojuuria. Varren pinnalla on mahdollista havaitarasvainen nuora, joka on osoitus johtojärjestelmän nekroosista. Leikat-taessa vartta poikittaissuunnassa varren värittyneen ruskeat johtosolukottihkuvat valkoisia pisaroita tai kellertävää bakteerimätää.
2.Nopeat seulontakokeet
Nopeilla seulontakokeilla voidaan tehdä alustava taudinmääritys. Käyte-
tään yhtä tai useampaa seuraavista kokeista:
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 17
▼B
Valutuskoe
Ralstonia solanacearum -bakteerin esiintyminen nuutuneissa perunan tai
tomaatin varsissa voidaan arvioida seuraavalla yksinkertaisella ennakoi-valla kokeella:
Varsi leikataan juuri maanpinnan yläpuolelta. Leikattu pinta asetetaan
dekantterilasiin, jossa on vettä. Pian tämän jälkeen bakteerilimaa alkaaitsestään valua johtosolukkokimpuista. Mikään muu johtosolukkojaperunan tai tomaatin kasveissa tartuttava bakteeri ei aiheuta tällaistailmiötä.
Poly- β-hydroksibutyraattirakeiden (PHB) toteaminen
PHB-rakeet Ralstonia solanacearum -bakteerin soluissa saadaan näky-
viin värjäämällä niilinsinisellä A tai sudaninmustalla B.
Valmistetaan preparaatti joko limasta taikka suspendoidusta solukosta
mikroskooppilevylle tai preparaatti 48 tunnin viljelmästä YPGA- taiSPA-alustalla (lisäys 1). Valmistetaan positiiviset kontrollipreparaatitbiovarin 2 tai rodun 3 kannasta. Annetaan kuivua. Kuljetetaan levynpohja useita kertoja nopeasti liekin läpi kunnes preparaatti on kiinnit-tynyt.
Niilinsinisellä tehtävä testi
1. Peitetään kiinnittynyt preparaatti niilinsinisen A 1-prosenttisella vesi-
liuoksella. Inkuboidaan 10 minuutin ajan 55 °C:ssa.
2. Valutetaan värjäävä liuos pois. Pestään nopeasti vedellä hiljaa
valuvan hanan alla. Poistetaan ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä.
3. Peitetään preparaatti 8-prosenttisella etikkahapon vesiliuoksella.
Inkuboidaan 1 minuutin ajan laboratoriolämpötilassa.
4. Pestään vedellä hiljaa valuvan hanan alla. Pyyhitään kuivaksi paperi-
pyyhkeellä.
5. Kostutetaan uudelleen pisaralla vettä. Asetetaan peitelevy.6. Tutkitaan värjäytynyttä preparaattia mikroskoopilla, joka on varus-
tettu epifluoresoivalla valonlähteellä, aallonpituudella 450nm öljyim-mersio-objektiivilla 1000-kertaisella suurennoksella.
Tarkastellaan PHB-rakeiden kirkkaan oranssia fluoresenssia. Tarkastel-
laan myös tavanomaisessa valaistuksessa sen varmistamiseksi, että rakeetovat solunsisäisiä ja että solujen morfologia on tyypillinen Ralstoniasolanacearum -bakteerille.
Sudaninmustalla tehtävä testi
1) Peitetään kiinnittynyt preparaatti sudaninmustan B 0,3-prosenttisella
70-prosenttisessa etanolissa olevalla liuoksella. Inkuboidaan 10minuutin ajan laboratoriolämpötilassa.
2) Valutetaan värjäävä liuos pois. Pestään nopeasti vedellä hanan alla.
Poistetaan ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä.
3) Upotetaan preparaatti nopeasti ksyloliin. Pyyhitään kuivaksi paperi-
pyyhkeellä. Varoitus! Ksyloli on haitallinen tuote. Työskennelläänvetokaapissa.
4) Peitetään preparaatti 0,5-prosenttisella (w/v) safraniinin vesiliuoksella
ja jätetään 10 sekunniksi laboratoriolämpötilaan. Varoitus! Safraniinion haitallinen tuote. Työskennellään vetokaapissa.
5) Pestään vedellä hiljaa valuvan hanan alla. Pyyhitään kuivaksi paperi-
pyyhkeellä. Asetetaan peitelevy päälle.
6) Tutkitaan värjäytynyttä preparaattia valomikroskoopilla öljyssä
1000-kertaisella suurennoksella.
Ralstonia solanacearum -bakteerin solujen PHB-rakeet värjäytyvät
sinimustiksi. Solunseinämä värjäytyy vaaleanpunaiseksi.
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 18
▼B
Muut testit
Muut soveltuvat seulontatestit ovat IF-testi (jakso III.2), ELISA-testi
(jakso III.3) ja PCR-testi (jakso III.4).
3.Eristämismenettely
3.1 Otetaan bakteerilimaa tai värittyneen solukon pala mukulan johtosoluk-
korenkaasta tai perunan tai tomaatin kasvin varren johtojänteistä.Suspendoidaan pieneen määrään steriiliä tislattua vettä tai 50mM fosfaa-tipuskuriin. Jätetään 5—10 minuutiksi työpöydälle.
3.2 Valmistetaan suspensiosta vähintään kaksi kymmenkertaista laimennosta,
1/10 ja 1/100 tai useampia, jos se on tarpeellista.
3.3 Siirretään vakiomäärä suspensiota ja laimennoksia tavalliselle ravintoa-
lustalle (NA, YPGA ja SPA lisäys 1) ja/tai Kelman’s tetrazolium-alus-talle (lisäys 1) ja/tai valikoivalle SMSA-alustalle (lisäys 7) ja levitetääntarkoituksenmukaisella laimennussarjatekniikalla. Tarvittaessa valmiste-taan sarja erillisiä maljoja, joissa on laimennettua solususpensioviljelmääRalstonia solanacearum -bakteerikannan rodun 3 biovaria 2 positiivisena
kontrollina.
3.4 Inkuboidaan maljoja 3 päivän ajan 28 °C:ssa. Inkubointia voidaan jatkaa
6 päivään jos kasvu on hidasta, mutta SMSA-alustalla olevat pesäkkeetvoivat muuttua ei-tyypillisiksi ja kuolla.
Tavallisella ravintoalustalla elinvoimaiset Ralstonia solanacearum
-bakteerin isolaatit kehittyvät helmenvalkoisiksi, litteiksi, epäsäännöllisenmuotoisiksi ja juokseviksi pesäkkeiksi, jotka ovat usein tyypillisesti kier-teisiä.
Kelman’s Tetrazolium -alustalla Ralstonia solanacearum -lajin virulent-
tien isolaattien tyypilliset pesäkkeet ovat kermamaisia, litteitä, epäsään-nöllisiä ja juoksevia ja niiden keskellä on verenpunaisia kierteitä. Aviru-lenttien Ralstonia solanacearum -isolaattien pesäkkeet ovat tummanpu-naisia.
SMSA-alustalla tyypilliset elinvoimaiset Ralstonia solanacearum
-bakteerin isolaatit kehittyvät maidonvalkoisiksi, litteiksi, epäsäännöl-lisen muotoisiksi ja juokseviksi pesäkkeiksi, joiden keskiosan väri onverenpunainen.
Avirulentit Ralstonia solanacearum -bakteerin muodot kehittävät
vähemmän juoksevia pesäkkeitä, joiden väri SMSA-alustalla vaihteleetäysin vaaleanpunaisesta punaiseen.
3.5 Puhdistetaan pesäkkeet, joiden morfologia on luonteenomainen, jatkovil-
jelmällä tavanomaisella ravintoalustalla. Vältetään säännöllistä jatkovil-jelyä, joka voi johtaa elinvoimaisuuden vähenemiseen.
4.Varmistuskoe (-kokeet)
4.1Ralstonia solanacearum -bakteerin tunnistaminen
Ralstonia solanacearum -bakteerin puhdasviljelmät tunnistetaan vähin-
tään yhdellä seuraavista menetelmistä:
Ravinto- jaentsymaattiset testit
Huom.Mukaan on valikoitu testejä, joilla on ratkaiseva merkitys lajin
ja biovarin määrittelemisessä.
Seuraavat Ralstonia solanacearum -bakteerin fenotyyppiset ominai-
suudet joko esiintyvät tai puuttuvat:
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 19
▼B
fluoresoiva pigmentti −
PHB-inkluusiot +
O/F-testi O+/F−katalaasi +Kovacsin oksidaasi +
nitraatin vähentäminen +
sitraatin käyttö +
kasvu 40 °C:ssa −
kasvu 1-prosenttisessa NaCl:ssa +
kasvu 2-prosenttisessa NaCl:ssa −arginiinidihydrolaasi −gelatiinin sulatus −tärkkelyksen hydrolyysi −eskuliinin hydrolyysi −levaanin tuotanto −
ravintoliuokset ja menetelmät, ks. Lelliott & Stead (1987).
IF-testi
Valmistetaan viljelmästä ja positiivisesta kontrollikannasta suspensio,
jossa on 10
6solua millilitraa kohden. Valmistetaan sarja antiseerumin
kaksinkertaisia laimennoksia. Sovelletaan IF-menettelyä (III jakson 2.kohta). Viljelmän IF-tiitterin on vastattava positiivisen kontrollin tiit-teriä.
ELISA-testi
Valmistetaan viljelmästä ja positiivisesta kontrollikannasta suspensio,
jossa on >10
6solua millilitraa kohden. Sovelletaan ELISA-menettelyä
(III jakson 3. kohta). Viljelmän ELISA-arvon on vastattava positiivisenkontrollin arvoa.
PCR-testi
Valmistetaan viljelmästä ja positiivisesta kontrollikannasta suspensio,
jossa on 10
6solua millilitraa kohden. Sovelletaan PCR-menettelyä (III
jakson 4. kohta). Viljelmän PCR tuotteen on vastattava määrältään jarestriktio entsyymianalyysi (REA) -kuvioltaan positiivista kontrollia.
Fluoresoiva in-situ hybridisaatio (FISH)
Valmistetaan viljelmästä ja positiivisesta kontrollikannasta suspensio,
jossa on 10
6solua millilitraa kohden. Sovelletaan FISH-menettelyä (van
Beuningen et al, 1995) sekä OLI-1 PCR aluketta (Sea et al., 1993).
Viljelmässä on ilmettävä samat reaktiot kuin positiivisessa kontrollissa.
Proteiiniprofilointi
Denaturoidut kokonaiset soluproteiinit erotetaan polyakryyliamidigeelie-
lektroforeesilla (PAGE) (Stead, 1992a).
Rasvahappoprofilointi (FAP)
Kasvatetaan viljelmää ja positiivista kontrollikantaa 48 tunnin ajan
28°C:ssa tryptikaasisoija-agarilla ja sovelletaan FAP-menettelyä (Janse,
1991; Stead, 1992a; Stead 1992b). Viljelmän profiilin on oltava sama
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 20
▼B
Biovar
12345
Biovar 2 Biovar 2-A Biovar 2-T
Rotu(*)
1 2 3kuin positiivisella kontrollilla. Tarkasti määritellyissä olosuhteissa luon-
teenomaiset rasvahapot ovat 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH ja 18:12OH.
4.2 Kantojen määrittäminen
Kannan määrittäminen on vapaaehtoista, mutta suositeltavaa kaikissa
uusissa tapauksissa.
Biovarin määrittäminen
Ralstonia solanacearum -bakteerin biovarit erotetaan kolmen heksoo-
sialkoholin ja kolmen sokerin käyttö- ja hapettamiskyvyn perusteella(Hayward, 1964 ja 1994):
Käyttö:
— maltoosi
−++−+
— laktoosi −++−+
— sellobioosi −++−+
— mannitoli −−+++
— sorbitoli −−++−
— dulcitoli −−++−
Lisäkokeet jakavat biovarin 2 alafenotyyppeihin (Hayward, 1994):
trehaloosin käyttö − + +
inositolin käyttö + − +
D-riboosin käyttö − − +
pektolyyttinen aktiivisuus alhainen alhainen korkea
Rodun määrittäminen
Rotu (Buddenhagen et al., 1962) määritetään patogeenisyystestin perus-
teella tomaatti- tai munakoisokasveista ja tupakkakasveista ja yliherk-kyysreaktiotestillä (HR) tupakan lehdistä (Lozano ja Sequeira, 1970):
Reaktio: — tomaatti/munakoiso-
kasveissa nuutuminen ei reaktiota nuutuminen
— tupakkakasveissa nuutuminen ei reaktiota ei reaktiota
— tupakan lehdissä nekroosi (48 h)
ja nuutuminen
(7—8 pv)HR (12—24
h)Kloroosi
(2—8 pv)
(*) Rotua 4 (patogeeninen inkiväärillä ja muutamilla muilla isäntäkasveilla) ja rotua 5 (patogeeninen vain
mulperipuulla) ei ole sisällytetty.
Rodun määrittäminen tupakan hypersensitiivisyysreaktioon perustuvallapatogeenisyystestillä ei ole täysin luotettavaa, ja rotu voidaan sen sijaanmäärittää biovarin ja eristetyn bakteerin isäntäkasvin perusteella.
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 21
▼B
Viljelmä voidaan lisäksi kuvata seuraavilla menetelmillä:
Genomien sormenjäljet
Ralstonia solanacearum -kompleksin rotujen molekulaarinen erotta-
minen voi tapahtua:
RFLP-analyysillä (Cook et al., 1989)
Toistuvan järjestyksen PCR:llä (REP-, ERIC- & BOX-PCR [Louws et
al., 1995; Smith et al., 1995]).
4.3 Patogeenisyystesti
Tämä testi on tarkoitettu varmistamaan Ralstonia solanacearum -baktee-
riksi tunnistettujen viljelmien virulenssi.
Valmistetaan viljelmästä ja positiivisesta kontrollikannasta inokulaatti,
jossa on 106, solua millilitraa kohden. Inokuloidaan 5—10 kolmelehtias-
teella olevaa tomaatti- tai munakoisokasvia (III jakson 6. kohta). Inku-boidaan kahden viikon ajan 22 °C—28 °C:ssa korkeassa suhteellisessa
kosteudessa kastellen päivittäin. Tarkkaillaan nuutumisoireita, equinas-tiaa, kloroosia ja/tai hidastunutta kasvua.
Eristetään kasveista, joissa näkyy oireita:
— Poistetaan kudosta varresta 2cm inokulointikohdan yläpuolelta.
— Pienennetään ja suspendoidaan pieneen määrään steriiliä tislattua
vettä tai 50mM fosfaattipuskuria. Viljellään maljassa, inkuboidaan jatutkitaan tyypilliset Ralstonia solanacearum -pesäkkeet.
III JAKSO
RALSTONIA SOLANACEARUM -KASVINTUHOOJAN TOTEAMINEN
JA TUNNISTAMINEN PERUNAN MUKULOISTA OTETUISTA NÄYT-
TEISTÄ
Huom.Standardinäytekoko on 200 mukulaa. Menetelmä soveltuu myös käytet-
täväksi alle 200 mukulan näytteille.
1.Näytteen valmistaminen koetta varten
Huom.Kyseisessä menettelyssä saatavaa perunauutetta voidaan käyttää
myös Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus -bakteerintoteamiseen.
Vapaavalintaiset esikäsittelyt, jos ne arvioidaan tarpeellisiksi:
i) Inkuboidaan näytettä 25—30 °C:ssa kahden viikon ajan piilevien
Ralstonia solanacearum -populaatioiden lisääntymisen edistämiseksi.
ii) Pestään mukulat juoksevalla vedellä tarkoituksenmukaisilla desin-
fiointi- ja puhdistusaineilla. Ilmakuivataan mukulat.
1.1. Poistetaan puhtaalla ja desinfioidulla leikkausveitsellä tai vihannesveit-
sellä kuori mukulan napapäästä siten, että johtosolukot tulevat ensinnäkyviin. Leikataan varovasti pieni kartionmuotoinen kappale (halkaisija3—5mm) johtosolukosta kunkin mukulan napapäästä. Yritetään pitäämuun solukon kuin johtosolukon osuus mahdollisimman pienenä. Toiste-taan 1 kohdan mukaiset toimet näytteen jokaisen mukulan kohdalla.Vaihdetaan leikkausveitsen terää tai vihannesveistä näytteiden välillä.
Huom.Mukuloiden silmämääräinen tarkastelu (II jakson 1 kohta)
voidaan tehdä tässä vaiheessa. Laitetaan sivuun jokainen mukula,jossa on oireita, ja testataan yksittäin (II jakso).
1.2. Kerätään solukkokappaleet suljettuun astiaan. Solukkokappaleet olisi
mieluiten käsiteltävä viipymättä. Jos tämä ei ole mahdollista, niitävoidaan varastoida korkeintaan 24 tunnin ajan tai 4 °C:ssa korkeintaan
72 tunnin ajan.
1.3. Käsitellään solukkokappaleet yhtä seuraavista menettelyistä noudattaen:
i) Siirretään solukkokappaleet sopivaan säiliöön.
Lisätään riittävä määrä liotuspuskuria (lisäys 2) peittämään kappa-
leet. Jauhetaan kappaleet hienoksi Waring Blenderissä tai Ultra
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 22
▼B
Thurraxissa kunnes ne ovat juuri homogenoituneet. Vältetään liial-
lista homogenointia. Annetaan massan liota 15—30 minuuttia.
ii) Siirretään solukkokappaleet sopivaan säiliöön.
Lisätään riittävä määrä liotuspuskuria peittämään kappaleet.Asetetaan säiliö tasoravistimeen.Inkuboidaan 50—100 rpm:n kierrosnopeudella neljän tunnin ajan
20—22 °C:ssa tai 16—24 tunnin ajan 4 °C:ssa.
iii) Siirretään solukkokappaleet vahvaan kertakäyttöiseen maseraatiopus-
siin (esim. Stomacher-pussi, jonka mitat ovat 105mm×150mm,säteilysteriili).
Murskataan solukkokappaleet varovasti sopivalla työkalulla, esim.
vasaralla, kunnes ne ovat juuri homogenoituneet.
Lisätään riittävä määrä liotuspuskuria peittämään murskatut kappa-
leet. Annetaan massan seistä 15—30 minuuttia.
1.4. Uutetaan bakteerit käsitellyistä solukkokappaleista jollakin seuraavista
menettelyistä:
i) Dekantoidaan liuos varovasti sentrifugiputkeen jättäen jäännökset
säiliöön tai pussiin.
Vaihtoehto: Jos dekantoitu liuos on sameaa: sentrifugoidaan enintään
180xg 10 minuutin ajan alle 10 °C:n lämpötilassa.
Sentrifugoidaan dekantoitua liuosta tai ensimmäisestä sentrifugoin-
nista saatua supernatanttia 7000xg 15 minuutin ajan tai 10000xg 10minuutin ajan alle 10 °C:n lämpötilassa.
Poistetaan supernatantti sakkaa sekoittamatta.
ii) Suodatetaan liuos sellaisen suodatusjärjestelmän läpi, jonka huokos-
koko on 40—100µm. Tehostetaan suodatusta tyhjiöpumpulla.
Kootaan suodos sentrifugiputkeen.Pestään suodatin liotuspuskurilla.Sentrifugoidaan suodosta 7000 15 minuutin ajan tai 10000xg 10
minuutin ajan alle 10 °C:n lämpötilassa.
Poistetaan supernatantti sakkaa sekoittamatta.
1.5. Suspendoidaan sakka uudelleen 1ml:aan sakkapuskuria (lisäys 2).
Jaetaan kahteen yhtä suureen osaan ja siirretään kumpikin osa pieneen
koeputkeen.
Käytetään toinen koeputkista testaukseen. Säilytetään loput tästä
uutteesta 4 °C:n lämpötilassa testauksen ajan.
Lisätään 10—25% (v/v) steriiliä glyserolia toiseen koeputkeen. Sekoite-
taan (Vortex). Varastoidaan −18 °C:n lämpötilaan (viikoiksi) tai
−70°C:n lämpötilaan (kuukausiksi).
2.Immunofluoresenssitesti (IF)
Käytetään Ralstonia solanacearum -bakteerin, mieluiten rodun 3 biovaria
2, antiseerumia. Määritetään tiitteri suspensiosta, jossa on 10
6solua
millilitraa kohden Ralstonia solanacearum -bakteerin homologisesta
kannasta sopivalla fluoreseiini -isotiosyanaattikonjugaatin (FITC)laimennoksella valmistajan suositusten mukaisesti. Käsittelemättömänantiseerumin IF-tiitterin olisi oltava vähintään 1:2000.
Käytetään mikroskoopin monisyvennyslevyjä, joissa on mieluiten 10
halkaisijaltaan vähintään 6mm:n syvennystä.
Käytetään FITC-konjugaattikontrollia ja fosfaattipuskuroidun suola-
liuoksen (PBS) kontrollia kullakin testilevyllä. Testi olisi toistettavaPBS-kontrollin kanssa, jos FITC-kontrollissa havaitaan yksikin positii-vinen solu. Valmistetaan erilliset positiiviset kontrollilevyt suspensiosta,jossa on 10
6solua millilitraa kohden, Ralstonia solanacearum -bakteeri-
kannan rodun biovarin. Sisällytetään yksi levy kuhunkin testisarjaan.
2.1. Käsitellään testilevyt yhdellä seuraavista menettelyistä:
i) Sakat, jossa on suhteellisen vähän tärkkelystä:
Pipetoidaan mitattu vakiomäärä (15µl on sopiva halkaisijaltaan
6mm:n syvennykseen — lisätään määrää samassa suhteessa suurem-mille syvennyksille) uudelleen suspendoitua sakkaa riville syven-nyksiä. Jäljellä olevaa riviä voidaan käyttää toisintona tai toisellenäytteelle kuten kuvassa 1 on esitetty.
ii) Muut sakat:
Valmistetaan kymmenkertaisia laimennoksia, eli 1/10, 1/100 ja 1/
1000 uudelleen suspendoidusta sakasta sakkapuskuriin. Pipetoidaanmitattu vakiomäärä (15µl on sopiva halkaisijaltaan 6mm:n syven-
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 23
▼B
FITC T/4 T/2 T 2T = >Antiseerumin
kaksinkertaisetlaimennokset
FITC Vakiolaimennos antiseerumista
Laimenta-
matonLaimenta-
maton1/10 1/100 1/1000 = >Uudelleen suspen-
doidun sakankymmenkertainenlaimennosnykseen — lisätään määrää samassa suhteessa suuremmille syven-
nyksille) uudelleen suspendoitua sakkaa ja kutakin laimennosta rivillesyvennyksiä. Jäljellä olevaa riviä voidaan käyttää toisintona taitoiselle näytteelle kuten kuvassa 2 on esitetty.
2.2. Annetaan pisaroiden kuivua. Kiinnitetään bakteerisolut levylle joko
kuumentamalla, liekittämällä tai 95% etanolilla.
2.3. IF-menettely
i) Testilevyn valmistaminen 1 kohdan i alakohdan mukaisesti:
Valmistetaan sarja kaksinkertaisia antiseerumin laimennoksia IF-
puskuriin (lisäys 3): tiitteriä (T/4 ), tiitteriä (T/2 ), tiitteri (T) jatiitteri kaksinkertaisena (2T).
ii) Testilevyn valmistaminen 1 kohdan ii alakohdan mukaisesti:
Valmistetaan työskentelylaimennos (WD) antiseerumista IF-pusku-
riin. Työskentelylaimennos on antiseerumin laimennos, jonka spesifi-syys on optimaalinen, ja se on tavallisesti puolet tiitteristä.
Kuva 1
Testilevyn valmistaminen 1 kohdan i alakohdan ja 3 kohdan i
alakohdan mukaisesti
Vakiolaimennos uudelleen suspendoidusta sakasta
(T = tiitteri)
Näyte 1 • 1 • 2 • 3 • 4 • 5
Näytteen 1 toisinto tai
näyte 2•6 •7 •8 •9 •1 0
Kuva 2
Testilevyn valmistaminen 1 kohdan ii alakohdan ja 3 kohdan ii alakohdan
mukaisesti
Näyte 1 • 1 • 2 • 3 • 4 • 5
Näytteen 1 toisinto tai
näyte 2•6 •7 •8 •9 •1 0
2.3.1. Järjestetään levyt kostean paperipyyhkeen päälle.
Täytetään testisyvennykset antiseerumin laimennokse(i)lla. Pipetoidaan
PBS:ää PBS- ja FITC-syvennyksiin. Syvennyksiin pipetoidun antisee-rumin määrän on vastattava levitetyn uutteen määrää.
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 24
▼B
2.3.2. Inkuboidaan kannen alla 30 minuutin ajan huoneenlämmössä.
2.3.3. Ravistetaan antiseerumipisarat pois levyltä ja huuhdellaan levyt varovasti
IF-puskurilla. Pestään 5 minuutin ajan Tween-IF-puskurissa ja senjälkeen 5 minuutin ajan IF-puskurissa (lisäys 3).
Poistetaan varovasti ylimääräinen kosteus paperipyyhkeellä.
2.3.4. Järjestetään levyt kostean paperipyyhkeen päälle.
Täytetään testisyvennykset ja FITC-syvennys FITC-konjugaatin laimen-
noksella, jota on käytetty tiitterin määrittämiseen. Syvennyksiin pipe-toidun konjugaatin määrän on vastattava pipetoidun antiseeruminmäärää.
2.3.5. Inkuboidaan kannen alla 30 minuutin ajan huoneenlämmössä.2.3.6. Ravistetaan konjugaattipisarat pois levyltä. Huuhdellaan ja pestään kuten
edellä (2.3.3). Poistetaan varovasti ylimääräinen kosteus paperipyyh-keellä.
2.3.7. Pipetoidaan 5—10µl 0,1 M fosfaattipuskuroitua glyserolia (lisäys 3)
kuhunkin syvennykseen ja asetetaan peitelevy.
2.4. IF-testin lukeminen
Tutkitaan testilevyjä mikroskoopilla, joka on varustettu epifluoresoivalla
valonlähteellä, FITC:n eksitaatioon sopivilla suodattimilla öljyimmersio-objektiivin 500—1000-kertaisella suurennoksella. Tutkitaan syvennyksiätarkasti kohtisuoraan kahden halkaisijan suuntaisesti ja pitkin aukonkehää.
Tutkitaan ensin positiiviset kontrollilevyt. Solujen on oltava kirkkaasti
fluoresoivia ja täydellisesti värjäytyneitä. Huom.Testi on uusittava, josvärjäytyminen ei ole täydellistä.
Tutkitaan testilevyt. Tarkastellaan ensin fluoresoivien solujen puuttu-
mista FITC-kontrollisyvennyksissä. Fluoresoivat solut FITC-kontrollissaosoittavat konjugaatin epäspesifistä sitoutumista, autofluorisaatiota taikontaminaatiota. Huom.Toistetaan testi, jos tällaista ilmenee.
Tarkastellaan testisyvennyksissä kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden
morfologia on tyypillinen Ralstonia solanacearum -bakteerille. Fluore-
senssin intensiteetin on vastattava positiivista kontrollikantaa samassaantiseerumilaimennoksessa. Sellaisia soluja, joiden värjäytyminen onkirjavaa tai epätäydellistä tai joiden fluoresenssi on heikko, ei otetahuomioon, paitsi, jos tällaisia soluja on paljon. (Ks. IF-testin tulostentulkinta).
IF-testin tulosten tulkinta:
i) Jos näytteestä ei löydy kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfo-
logia on tyypillinen, IF-testin tulos on negatiivinen.
ii) Jos näytteestä löytyy kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfo-
logia on tyypillinen, solujen keskimääräinen lukumäärä määritetäänmikroskooppikenttää kohden ja lasketaan solujen lukumäärä (N)uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden (lisäys 4).
IF-testin herkkyys on noin 10
3solua/ml uudelleen suspensoitua
sakkaa:
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 25
▼B
— jos näytteissä on N >103solua millilitraa kohden, IF-testin
tulos on positiivinen,
— jos näytteissä on ►C1N<103solua◄millilitraa kohden,
IF-testin tulosta voidaan pitää positiivisena.
iii) Jos näytteessä on paljon ( >105solua millilitraa kohden) epätäydel-
lisesti tai heikosti fluoresoivia soluja antiseerumin tiitterillä, näytetulisi testata uudelleen:
— joko toisella, biologisesti erilaisella testillä
tai
— toisella IF-testillä, jossa käytetään eri antiseerumia tai sakasta
tehtyä kymmenkertaista laimennossarjaa.
3.ELISA-testi
(Robinson-Smith et al., 1995)
Käytetään Ralstonia solanacearum -bakteerin, mieluiten rodun 3 biovaria
2, antiseerumia. Määritetään tiitteri suspensiosta, jossa on 10
6solua
millilitraa kohden, Ralstonia solanacearum -bakteerin homologisesta
kannasta.
NUNC Polysorb -mikrotiitterilevyjen käyttöä suositellaan.
Testiin sisällytetään negatiivinen perunauutekontrolli ja fosfaattipusku-
roidun suolaliuoksen (PBS) kontrolli.
Positiivisena kontrollina käytetään suspensiota, jossa on >106solua
millilitraa kohden, Ralstonia solanacearum -bakteerikannan rodun
biovaria. Testataan kuten näyte (näytteet), mutta pidetään selvästi erilläänmikrotiitterilevyllä olevista näytteistä.
3.1. Pipetoidaan 100—200µl uudelleen suspendoitua sakkaa pieneen
putkeen. Kuumennetaan neljän minuutin ajan 100 °C:n lämpötilassa.
Siirretään putki jäihin.
3.2. Lisätään yhtä suuri määrä väkevyydeltään kaksinkertaista karbonaatti-
kiinnityspuskuria (lisäys 5). Sekoitetaan (Vortex).
3.3. Lisätään 100µl kuhunkin, vähintään kahteen, mikrotiitterilevyn syven-
nykseen. Inkuboidaan yhden tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa tai yön yli
4°C:n lämpötilassa.
3.4. Kaadetaan uutteet syvennyksistä. Pestään syvennykset kolmeen kertaan
PBS-Tweenillä (lisäys 5) niin, että viimeinen pesuliuos jätetään syven-nyksiin vähintään viideksi minuutiksi.
3.5. Valmistetaan sopiva laimennos Ralstonia solanacearum -bakteerin anti-
seerumista estopuskuriin (blocking buffer) (lisäys 5). Lisätään 100µlantiseerumin laimennosta syvennyksiin.
Inkuboidaan yhden tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa.
3.6. Kaadetaan antiseerumi syvennyksistä. Pestään syvennykset kuten edellä
(3.4.).
3.7. Valmistetaan sopiva laimennos emäksistä fosfataasikonjugaattia estopus-
kuriin (blocking buffer). Lisätään 100µl konjugaatin laimennosta syven-nyksiin.
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 26
▼B
Aine OsamääräLopullinen pito-
isuusInkuboidaan yhden tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa.
3.8. Kaadetaan konjugaatti syvennyksistä. Pestään syvennykset kuten edellä
(3.4. ja 3.6.).
3.9. Valmistetaan emäksinen fosfataasisubstraattiliuos (lisäys 5). Lisätään
100µl syvennyksiin. Inkuboidaan 30 minuutista yhteen tuntiin pimeässälaboratoriolämpötilassa.
3.10. Mitataan absorbanssi 409nm:ssä.
ELISA-testin tulkinta
ELISA-testi on negatiivinen, jos näytteen optinen tiheys (O.D.) on
>2×negatiivisen kontrollin optinen tiheys.
ELISA-testi on positiivinen jos näytteen optinen tiheys (O.D.) on
>2×negatiivisen kontrollin optinen tiheys.
4.PCR-testi
(Sealet al., 1993)
Huom.Kaikissa näytteen esikäsittelyvaiheissa ja muissa PCR:ään liitty-
vissä käsittelyissä on käytettävä suodattimella varustetun pipetinkärkiä.Valmistetaan suspensio, jossa on 10
6solua millilitraa
kohden, Ralstonia solanacearum -bakteerikannan rodun 3
biovaria 2, positiiviseksi kontrolliksi. Testataan kuten näyte (näyt-teet).
4.1. Pipetoidaan 100µl uudelleen suspendoitua sakkaa pieneen putkeen.
Vaihtoehtoisesti siirretään 90µl uudelleen suspendoitua sakkaa pieneenputkeen, jossa on 10µl 0,5 M NaOH:ta. Sekoitetaan kääntelemälläputkea useita kertoja.
4.2. Kuumennetaan neljän minuutin ajan 100 °C:n lämpötilassa. Siirretään
putki välittömästi jäihin.
4.3. Valmistetaan kymmenkertaiset laimennokset, esim. 1/10 ja 1/100, sterii-
liin tislattuun tai ultrapuhtaaseen veteen (UPW).
4.4. Valmistetaan PCR-reaktioseos (lisäys 6) steriiliin putkeen lisäämällä
seuraavat aineosat seuraavassa järjestyksessä:
50 µl:n reaktiotilavuuteen:
Steriili tislattu vesi tai
UPW30,8µl — 33,8µl
10×PCR puskuri 5,0µl 1×
d-ATP 1,0µl 0,2mMd-CTP 1,0µl 0,2mMd-GTP 1,0µl 0,2mMd-TTP 1,0µl 0,2mM
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 27
▼B
Aine OsamääräLopullinen pito-
isuus
Primer OLI-1 (20µM) 2,5µl 1µm
Primer Y-2 (20µM) 2,5µl 1µm
Taq-polymeraasi (5U/
µl)0,2µl 1,0U
45µl — 48µl
Lisäreaktioihin:
Lasketaan kunkin aineosan määrä vaaditulle lukumäärälle reaktioita.Sekoitetaan aineosat ja siirretään 45µl — 48µl seosta steriileihin PCR-putkiin.Pidetään putket, joissa on PCR-reaktioseosta, jäissä.
25 µl:n reaktiotilavuuteen:
Pienennetään aineosien määriä vastaavasti.
4.5. PCR:n monistaminen
4.5.1. Vapaaehtoista! Sentrifugoidaan (pulse centrifuge) putket keitetyn näyt-
teen ja positiivisen kontrollin kanssa.
Lisätään täsmennetyssä järjestyksessä 2—5µl näytettä (näytteitä), vesi-
kontrollia ja positiivista kontrollia putkiin, joissa on PCR-reaktioseosta.Asetetaan putket DNA-lämpösyklilaitteen (DNA thermal cycler) lämpöb-lokkiin.
4.5.2. Ajetaan seuraava ohjelma:
1 sykli:i) 2 minuuttia 96 °C:n lämpötilassa:templaatin (DNA-näytteen) denatu-
rointi
50 sykliä:
ii) 20 sekuntia 94 °C:n lämpötilassa:denaturointi
iii) 20 sekuntia 68 °C:n lämpötilassa:alukkeiden (primers) pariutuminen
iv) 30 sekuntia 72 °C:n lämpötilassa:kopioiden lisääminen1 sykli:
v) 10 minuuttia 72 °C:n lämpötilassa:lisääminen edelleen1 sykli:
vi) pidetään 4 °C:n lämpötilassa
Huom.Nämä parametrit koskevat Perkin Elmer 9600:ta. Muut lämpösyklilait-
teet voivat vaatia mineraaliöljykerroksen PCR-reaktioputkiin ja/taivaiheiden ii), iii) ja iv) keston muuttamisen monistamisohjelmassa.
4.5.3. Poistetaan putket lämpösyklilaitteesta. Analysoidaan PCR-tuote. Jos tätä
ei tehdä välittömästi, putket varastoidaan 4 °C:n lämpötilaan samana
päivänä käytettäväksi tai -18 °C:n lämpötilaan pidemmäksi aikaa varas-
toitavaksi.
4.6. PCR-tuotteen määrittäminen
PCR-fragmentit todetaan agaroosigeelielektroforeesilla ja etidiumbromi-
divärjäyksellä.
4.6.1. Valmistetaan tarkoituksenmukainen agaroosigeeli kuumentamalla varo-
vasti kiehumapisteeseen agaroosia trisasetaattielektroforeesipuskurissa(TAE).
1998L0057 —FI—21.08.1998 —000.001 —28
▼B
4.6.2. Jäähdytetään sulanut agaroosi 50—60 °C:seen, kaadetaan elektroforee-
siyksikön muottiin ja lisätään kampa. Annetaan geelin jähmettyä.
4.6.3. Poistetaan kampa. Peitetään geeli TAE:lla niin, että se juuri ja juuri
peittyy (2—3mm) puskurilla.
4.6.4. Pipetoidaan 3µl latauspuskuria (loading buffer) parafilmille. Lisätään
12µl PCR-tuotetta joko näytteistä, positiivisesta kontrollista tai vesikont-rollista ja sekoitetaan imemällä kevyesti pipetinkärjestä ennen täyttä-mistä. Annettuja määriä voidaan muuttaa agaroosigeelisyvennysten tila-vuuden mukaan.
4.6.5. Täytetään geelisyvennykset varovasti. Laitetaan vertailuksi sopiva DNA-
markkeri vähintään yhteen syvennykseen.
4.6.6. Kytketään virtalähde ja virta elektroforeesilaitteeseen. Ajetaan geeliä 5—
8V/cm kunnes seurantaindikaattorin rintama on 1cm:n päässä geelinreunasta.
4.6.7. Kytketään virta pois virtalähteestä. Irrotetaan johdot elektroforeesiyksi-
köstä. Poistetaan geeli varovasti. Liotetaan sitä etidiumbromidiliuoksessa30—45 minuutin ajan.
Huom.Käytetään kertakäyttökäsineitä aina, kun käsitellään etidiumbro-
midia, joka on voimakas mutageeni!
4.6.8. Poistetaan väriä tislatussa vedessä 10—15 minuutin ajan.
4.6.9. Saatetaan moniste(tut)ttu DNA-fragmentti(it) näkyviin UV-läpivalaisulla.
Ralstonia solanacearum -bakteerin PCR-tuote OLI-1- ja Y-2-alukeyhdis-
telmällä tuotettuna on 288bp:n pituinen. Tutkitaan DNA-markkeriin japositiiviseen kontrolliin verrattuna.
Huom.Vesikontrollin on oltava aina negatiivinen; jos se on positiivinen,
testi toistetaan.
4.6.10. Valokuvataan geeli, jos tiedon tallentamista vaaditaan.
4.6.11. Varmistetaan monistetun fragmentin autenttisuus restriktioentsyymiana-
lyysillä (REA).
4.7. Restriktio-entsyymianalyysi (REA)
4.7.1. Siirretään 8,5µl PCR-tuotetta (4.5.3.) uuteen pieneen putkeen. Lisätään
1µl 10×entsyymipuskuria ja 0,5µl rajoittavaa entsyymiä Avall.
4.7.2. Sekoitetaan imemällä kevyesti pipetinkärjellä. Jos pisaroita jää pullon
seinämiin, sentrifugoidaan (pulse spin) mikrosentrifugilla. Inkuboidaanyhden tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa.
4.7.3. Määritetään pilkottu PCR-fragmentti agaroosigeelielektroforeesilla kuten
edellä (4.6.).
PCR-testin tulosten tulkinta
PCR-testi on negatiivinen, jos tyypillistä 288bp -fragmenttia ei todeta ja
fragmentti todetaan Ralstonia solanacearum -kannan positiivisesta kont-
rollista.
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 29
▼B
PCR-testi on positiivinen, jos tyypillinen 288bp -fragmentti todetaan ja
monistetun fragmentin REA-määrityksestä saadaan sama tulos kuin Rals-
tonia solanacearum -kannan positiivisen kontrollin määrityksestä.
5.Laimennussarja valikoivalle alustalle
(Elphinstone et al., 1996)
5.1. Koe tehdään sopivalla laimennussarjatekniikalla, esim.:
i) Koe tehdään sopivalla laimennussarjatekniikalla, esim.: 1/10 ja 1/100,
uudelleen suspendoidusta sakasta sakkapuskuriin. Pipetoidaan mitattuvakiomäärä (50—100µl) uudelleen suspendoitua sakkaa ja kutakinlaimennosta muunnetulle valikoivalle SMSA-alustalle (liite 7) ja levi-tetään lasisauvalla koko alustan pinnalle.
Tehdään myös, mikäli katsotaan tarpeelliseksi, viiden kohdan sively-
viljely 10-µl:n silmukallisella uudelleen suspendoitua sakkaa.Silmukka liekitetään sivelyjen välillä.
ii) Siirretään mitattu vakiomäärä (50—100µl) uudelleen suspendoitua
sakkaa muunnetulle valikoivalle SMSA-alustalle ja levitetään lasisau-valla koko alustan pinnalle. Sivellään sauvaa liekittämättä sitäkahdella tai useammalla muunnetulla SMSA-levyllä.
5.2. Levitetään samalla laimennussarjatekniikalla Ralstonia solanacearum
-bakteerikannan rodun 3 biovaria 2 positiiviseksi kontrolliksi tehtyäsuspensiota, jossa on 10
6solua millilitraa kohden, sarjalle erillisiä muun-
nettuja SMSA-alustoja.
5.3. Inkuboidaan levyjä 28 °C:n lämpötilassa. Tulosten tulkitseminen aloite-
taan kolme päivää myöhemmin. Jos tulos on negatiivinen, inkuboidaanedelleen kuuteen päivään asti. Ralstonia solanacearum -bakteerin elin-
voimaiset isolaatit kehittävät maidonvalkoisia, litteitä, epäsäännöllisenmuotoisia ja juoksevia pesäkkeitä, joiden keskustat ovat selvästi väriltäänpunaisesta purppuraan ja sisältä juovikkaita tai kierteisiä kuten kuvassa 1osoitetaan.
5.4. Puhdistetaan pesäkkeet, joiden morfologia on tyypillinen, jatkoviljelyllä
tavallisella ravintoalustalla (lisäys 1).
5.5. Tunnistetaan puhtaat viljelmät (II jakson 4.1. kohta) ja varmistetaan
positiiviset viljelmät patogeenisyystestillä (II jakson 4.3. kohta).
Laimennussarjatestin tulosten tulkinta
Laimennussarjatesti on negatiivinen, jos yhtään pesäkettä ei ole eristetty
kuuden päivän jälkeen tai jos yhtään Ralstonia solanacearum -bakteerille
tyypillistä pesäkettä ei ole eristetty edellyttäen, että ei epäillä muidenbakteerien pesäkkeiden estävää vaikutusta ja että Ralstonia solana-
cearum-bakteerin tyypillisiä pesäkkeitä löytyy positiivisesta kontrollista.
Laimennussarjatesti on positiivinen, jos Ralstonia solanacearum -baktee-
rille tyypillisiä pesäkkeitä eristetään.
6.Biotesti
(Janse, 1988)
6.1. Käytetään 10 todellisella kolmilehtiasteella olevaa testikasvia kutakin
näytettä kohden. Testikasveja ei kastella 24 tuntiin ennen inokulointia.
6.2. Jaetaan 100µl uudelleen suspendoitua sakkaa testikasvien kesken. Inoku-
loidaan varteen sirkkalehtien väliin ja yhteen tai useampaan muuhunpaikkaan.
6.3. Inokuloidaan samalla tekniikalla 10 siementainta suspensiolla, jossa on
10
6solua/m virulenttia Ralstonia solanacearumin biovar 2/rotu 3-kantaa
(positiivinen kontrolli) ja sakkapuskuri (negatiivinen kontrolli). Kasvit,
1998L0057 —FI—21.08.1998 —000.001 —30
▼B
joita käytetään positiivisena kontrollina, pidetään erillään muista
kasveista ristikontaminaation estämiseksi.
6.4. Kasvatetaan testitaimia edelleen neljä viikkoa 22 °C—2 8 °C:ssa
korkeassa suhteellisessa kosteudessa kastellen päivittäin. Tarkkaillaannuutumisoireita, epinastiaa, kloroosia ja/tai hidastunutta kasvua.
6.5. Eristetään tartunnan saaneista kasveista (II jakso). Tunnistetaan puhtaat
viljelmät, joiden morfologia on tyypillinen (II jakson 4.1. kohta) javarmistetaan positiiviset viljelmät patogeenisyystestillä (II jakson 4.3.kohta).
6.6. Tutkitaan tartunnan puuttumista niissä testikasveissa, jotka eivät osoita
minkäänlaisia tartunnan merkkejä. Poistetaan kustakin testikasvista1cm:n pala vartta 2cm inokulointikohdan yläpuolelta. Homogenoidaansolukot maseraatiopuskurissa. Tehdään laimennussarja valikoivalle alus-talle (III jakson 5. kohta). Jos tulos on positiivinen, tunnistetaan puhtaatviljelmät, joiden morfologia on tyypillinen (II jakson 4.1. kohta) javarmistetaan positiiviset viljelmät patogeenisyystestillä (II jakson 4.3.kohta).
Biotestin tulosten tulkinta
Biotesti on negatiivinen, jos testikasveissa ei ole Ralstonia solanacearum
-bakteerin aiheuttamaa tartuntaa ja että Ralstonia solanacearum -bakteeri
todetaan positiivisesta kontrollista.
Biotesti on positiivinen, jos testikasveissa on Ralstonia solanacearum
-bakteerin aiheuttama tartunta.
7.Rikastustesti
(Elphinstone et al., 1996)
7.1. 100µl des resuspendierten Pellets in 3ml modifizierte SMSA-Bouillon
geben (Anlage 7).
7.2. Inkuboidaan 48 tunnin ajan, ei missään tapauksessa yli 72:ta tuntia,
28°C:n lämpötilassa siten, että putken korkki on löysästi kiinni ilman-
vaihdon turvaamiseksi.
7.3. Kiinnitetään korkki tiiviisti ja sekoitetaan Vortexilla. Jaetaan määräosiin
IF-testiä (tämän jakson 2. kohta), ELISA-testiä (tämän jakson 3. kohta)ja/tai PCR-testiä (tämän jakson 4. kohta) varten.
8.Patogeenisyystesti
II jakson 4.3. kohta.
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 31
▼B
Lisäys 1
Ravintoalusta Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan viljelyä varten
Ravinneagar (NA)
Ravinneagar (Difco) 23g
Tislattu vesi 1litra
Valmistetaan puolen litran tilavuus alustaa yhden litran pulloihin.
Liuotetaan ainesosat.Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.
Jäähdytetään 50 °C:seen. Kaadetaan maljoille.
Hiiva-peptoni-glukoosiagar (YPGA)
Hiivauute (Difco) 5g
Bacto-peptoni (Difco) 5gD(+)-glukoosi (monohydraatti) 10gBacto-agar (Difco) 15gTislattu vesi 1litra
Valmistetaan puolen litran tilavuus alustaa yhden litran pulloihin.
Liuotetaan ainesosat.Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.
Jäähdytetään 50 °C:seen. Kaadetaan maljoille.
Sakkaroosipeptoniagar (SPA)
Sakkaroosi 20g
Peptoni 5gK
2HPO4 0,5g
MgSO4×7H2O 0,25g
Bacto-agar (Difco) 15g
Tislattu vesi 1litra
Valmistetaan puolen litran tilavuus alustaa yhden litran pulloihin.
Liuotetaan ainesosat. Säädetään tarvittaessa pH:ksi 7,2—7,4.Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.
Jäähdytetään 50 °C:seen. Kaadetaan maljoille.
Kelmanin tetrasolium-alusta
Casaminohappoja 1g
Bacto-peptoni 10gDekstroosi 5gBacto-agar 15gTislattu vesi 1litra
Valmistetaan puolen litran tilavuus alustaa yhden litran pulloihin.
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 32
▼B
Liuotetaan ainesosat. Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.
Jäähdytetään 50 °C:seen.
Lisätään suodatinsteriloitua trifenyylitetratsoliumkloridin (Sigma) vesiliuosta,
jotta loppupitoisuudeksi saadaan 50mg/l.
Kaadetaan maljoille.
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 33
▼B
Lisäys 2
Aineistot näytteen käsittelyä varten
Maserointipuskuri: 50 mM fosfaattipuskuri, pH 7,0
Tätä puskuria käytetään solukon pehmentämiseen.
Na2HPO4 4,26g
KH2PO4 2,72g
Tislattu vesi 1litra
Liuotetaan ainesosat ja tarkastetaan pH. Jaetaan sopivaksi katsottaviin osiin.
Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.
Suositellaan lisättäväksi 5% polyvinylpyrolidine-40000 MWT (PVP-40):tä
suoraa PCR-testiä suoritettaessa, jotta uutteessa olevien aromaattisen molekyy-lien monistumista estävä vaikutus vähenisi.
Homogenoitaessa pehmitettäviä perunasolukoita Waring Blenderissä tai Ultra
Thurraxissa suositellaan lisättäväksi dispergointiainetta, vaahdonestoainetta taiantioksidanttia.
Lubrol-hiutaleita 0,5g/l
DC-silikoni-vaahdonesto 1,0ml/lTetranatriumpyrofosfaatti 1,0g/l
Autoklavoidaan erillään. Säädetään haluttuun väkevyyteen.
Sakkapuskuri: 10 mM fosfaattipuskuri, pH 7,2Tätä puskuria käytetään perunan tyvistä saadun uutteen uudelleen suspendointiin
ja laimentamiseen.
Na
2HPO4×12H2O 2,7g
NaH2PO4×2H2O 0,4g
Tislattu vesi 1litra
Liuotetaan ainesosat ja tarkastetaan pH. Jaetaan sopivaksi katsottaviin osiin.
Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.
1998L0057 —FI—21.08.1998 — 000.001 — 34
▼B
Lisäys 3
Aineistot IF-testiä varten
IF-puskuri: 10 mM fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), pH 7,2
Tätä puskuria käytetään antiseerumin laimentamiseen.
Na2HPO4×12H2O 2,7g
NaH2PO4×2H2O 0,4g
NaCl 8,0g
Tislattu vesi 1litra
Liuotetaan ainesosat ja tarkastetaan pH. Otetaan soveltuvaksi katsottu määräosa.
Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.
IF-puskuri-TweenTätä puskuria käytetään levyjen pesuun. Lisätään 0,1% Tween 20:tä IF-pusku-
riin.
0,1 M fosfaattipuskuroitu glyseroli, pH 7,6Tätä puskuria käytetään petausliuoksena IF-levyillä fluoresenssin tehostamiseksi.
Na
2HPO4×12H2O 3,2g
NaH2PO4×2H2O 0,15g
Glyseroli 50ml
Tislattu vesi 100ml
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 35
▼B
Lisäys 4
Kontaminaatioasteen määritys IF-testillä
Moniaukkoisen levyn yhden aukon pinta-ala (S):
=πD2
4
jossa D = aukon halkaisija (1)
Näkökentän pinta-ala (s):
=πd2
4
jossa d = näkökentän halkaisija. (2)
Lasketaan kentän halkaisija (d) suoraan mittaamalla tai soveltaen seuraavia kaavoja:
s=πi2
G2K2×4
jossa i=kentän kerroin (8—24 okulaarin tyypin mukaan),
K=putken kerroin (1 tai 1,25),G=objektiivin suurennos (100-kertainen, 40-kertainen jne.). (3)
(2):sta saadaan:
d=4s
π√(4)
(3):sta saadaan:
d=4×πi2
G2K2×4
π=i
GK√
Lasketaan tyypillisten fluoresoivien solujen määrä kenttää kohden (c).
Lasketaan tyypillisten fluoresoivien solujen määrä aukkoa kohden (C).
C=cS
s
Lasketaan tyypillisten fluoresoivien solujen määrä konsentroidun uutteen millilitraa kohti (N):
N=C×1000
y×F
jossa y = konsentroidun uutteen määrä (tilavuus) aukossa,
F = konsentroidun uutteen laimennuskerroin.
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 36
▼B
Lisäys 5
Aineistot ELISA-testiä varten
Väkevyydeltään kaksinkertainen karbonaattikiinnityspuskuri,
pH 9,6
Na2CO3 6,36g
NaHCO3 11,72g
Tislattu vesi 1litra
Liuotetaan ainesosat ja tarkastetaan pH. Jaetaan sopivaksi katsottaviin osiin.
Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.
Natriumsulfiittia voidaan lisätä antioksidanttina siten, että sen lopulliseksi pitoi-
suudeksi tulee 0,2%, jos uute sisältää paljon aromaattisia molekyylejä.
10 × fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), pH 7,4
NaCl 80g
KH2PO4 2g
Na2HPO4×12H2O2 9 g
KCl 2g
Tislattu vesi 1litra
Liuotetaan ainesosat ja tarkastetaan pH. Jaetaan sopivaksi katsottaviin osiin.
Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.
Fosfaattipuskuroitu suolaliuos — Tween (PBS-T)
10×PBS100ml
10% Tween 20:tä 5mlTislattu vesi 895ml
Estopuskuri (valmistettava juuri ennen käyttöä)
10×PBS10ml
Polyvinylpyrolidine-44000 MWT (PVP-44) 2g10% Tween 20:tä 0,5gMaitojauhe 0,5gTislattu vesi 100ml:aan
Emäksinen fosfataasisubstraattiliuos, pH 9,8
Dietanoliamiini 97ml
Tislattu vesi 800ml
Sekoitetaan ja säädetään pH:ksi9,8 väkevällä HCI:llä.
Täytetään 1 l:ksi tislatulla vedellä.Lisätään 0,2g MgCl
2:ta.
Liuotetaan 2×5mgfosfataasisubstraattitablettia (Sigma) 15ml liuosta kohden.
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 37
▼B
Lisäys 6
Aineistot PCR-testiä varten
Oligonukleotidialukejakso
Alukejakso OLI-1 5 /prime1-GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-3 /prime1
Alukejakso Y-2 5 /prime1CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3 /prime1
Aineistoa varten: katso Seal ym.(1993).
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 38
▼B
Lisäys 7
Aineistot valikoivaa laimennussarjaa varten ja rikastustesti (-testejä)
Valikoiva SMSA-alusta (Engelbrecht 1994, sellaisena kuin se on
Elphinstonen ym. muuttamana 1996)
Kasvualusta
Casaminohappoja (Difco) 1gBacto-peptoni (Difco) 10gGlyseroli 5mlAgar (Difco) 15gTislattu vesi 1litra
Valmistetaan puolen litran tilavuus alustaa yhden litran pulloihin.
Liuotetaan ainesosat ja tarkastetaan pH. Säädetään, tarvittaessa, pH:ksi6,5 ennen
autoklavoimista. Ralstonia solanacearum kasvaa heikosti, jos alustan pH on yli
7,0. Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.
Jäähdytetään 50 °C:seen.
Lisätään seuraavat ainesosat (kaikki Sigmalta), jotta saadaan määrätyt lopulliset
pitoisuudet:
Kristallivioletti 5mg/l
Polymiksiini-B-sulfaatti 100mg/l (noin 600000 yksikköä) Sigma P-1004Basitrasiini(*) 25mg/l (noin 1250 yksikköä) Sigma P-0125Kloramfenikoli 5mg/l Sigma C-3175Penisilliini-G 0,5mg/l (noin 825 yksikköä) Sigma P-3032Tetratsoliumsuoloja 50mg/l
(*) Basitrasiinipitoisuuden voi tarvittaessa korottaa 300ppm:n suuruiseksi vähentämään kontaminoivia soprofyyttisiä
bakteereja vaikuttamatta Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan löytämiseen.
Liuotetaan ainesosat 70-prosenttiseen etanoliin, jotta valmistetun alustan määräti-
lavuudelle saadaan annetut pitoisuudet. Jotkut ainesosat, erityisesti polymiksiini-B ja kloramfenikoli, vaativat hieman lämmitystä ja ravistelua.
SMSA-ravintoliuos (Elphinstone ym., 1996)
Valmistetaan samalla tavoin kuin valikoiva SMSA-alusta, mutta ilman agaria ja
tetrasoliumsuoloja.
Jaetaan 3ml:n määräosiin 30ml:n vetoisiin kertakäyttöisiin Universal-putkiin.
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 39
▼B
Viitteet
Buddenhagen, I.W.; Sequeira, L. and Kelman, A., 1962. Description of races in
Pseudomonas solanacearum. Phytopathology 52, 726.
Cook, D.; ElizabethB. and Sequeira L., 1989. Genetic diversity of Pseudomonas
solanacearum: detection of restriction fragment lengthpolymorph ism withDNAprobes that specify virulence and hypersensitive respons. Molecular Plant-Microbe Interactions 2, 113—121.
Dinesen I.G. and DeBoer, S.H., 1995. Extraction of Clavibacter michiganensis
subsp. sepedonicus from composite samples of potato tubers. American PotatoJournal 72, 133—142.
Elphinstone, J.G.; Hennessy, J.; Wilson, J. and Stead, D.E., 1996. Sensitivity of
different methods for the detection of Pseudomonas solanacearum (Smith)Smithin potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26.
Engelbrecht, M.C., 1994. Modification of a semi-selective medium for the isola-
tion and quantification of Pseudomonas solanacearum. ACIAR Bacterial WiltNewsletter 10, 3—5.
Hayward, A.C., 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of
Applied Bacteriology 27, 265—277.
Hayward, A.C., 1994. Systematic and phylogeny of Pseudomonas solanacearum
and related bacteria. In: Bacterial Wilt: the disease and its causative agent,Pseudomonas solanacearum (eds. A.C. Hayward and G.L. Hartman) CAB Inter-national Oxford, 127—135.
Janse, J.D., 1988. A detection method for Pseudomonas solanacearum in symp-
tomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. EPPOBulletin 18, 343—351.
Janse, J.D., 1991. Infra- and intraspecific classification of Pseudomonas solana-
cearum strains using whole cell fatty acid analysis. Systematic and AppliedMicrobiology 14, 335—345.
Kelman, A., 1954. The relationship of pathogenicity in Pseudomonas solana-
cearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 64,693—695.
Lelliot, R.A. and Stead, D.E., 1987. Methods for the diagnosis of bacterial
diseases of plants. (T.F. Preece ed.) Blackwell Scientific Publications, Oxford.216 ss.
Louws, F.J.; Fulbright, D.W.; Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1995. Diffe-
rentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classifyXanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85, 528—536.
Lozano, J.C. and Sequeira, L., 1970. Differentiation of races of Pseudomonas
solanacearum by a leaf infiltration technique. Phytopathology 60, 838.
Mirza, M.S.; Rademaker, J.W.L.; Janse, J.D. and Akkermans, A.D.L., 1993.
Specific 16S ribosomal RNA targeted oligonucleotide probe against Clavibactermichiganensis subsp. sepedonicus. Canadian Journal of Microbiology 39,1029—1034.
Robinson-Smith, A.; Jones, P.; Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D., 1995.
Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent ofbacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67—79.
Seal, S.E.; Jackson, L.A.; Young, J.P.W. and Daniels, M.J., 1993. Differentiation
of Pseudomonas solanacearum, P. syzygii, P. pickettii and the blood diseasebacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotideprimers for sensitive detection by polymerase chain reaction. Journal of GeneralMicrobiology 139, 1587—1594.
Smith, J.J.; Offord, L.C.; Holderness, M. and Saddler, G.S., 1995. Genetic
diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum)race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61, 4262—4268.
Stead, D.E., 1992a. Techniques for detecting and identifying plant pathogenic
bacteria. In: Techniques for rapid detection of plant pathogens (eds. J.M.Duncan and L. Torrance). Blackwell Scientific Publications, Oxford, 76—111.
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 40
▼B
Stead, D.E., 1992b. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas
spp. using cellular fatty acid profiles. International Journal of Systematic Bacte-riology 42, 281—295.
Van Beuningen, A.; Derks, H. and Janse J.D., 1995. Detection and identification
of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluo-rescent in-situ hybridisation (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotideprobe. Züchtungsforschung 2, 266—269.
1998L0057 —FI—21.08.1998 —000.001 —4 1
▼B
LIITE III
1. Kaikissa epäillyissä esiintymistapauksissa, joiden seulontakokeista on luette-
lossa olevan kasviaineiston osalta saatu positiivinen tulos käyttäen liitteessä IIesitettyä asianmukaista menetelmää tai kaikissa muissa tapauksissa käyttäenjotain muuta virallisesti hyväksyttyä menetelmää ja joille odotetaan vahvis-tusta tai kumoamista kyseisen menetelmän päätyttyä, olisi säilytettävä javarastoitava asianmukaisissa olosuhteissa kyseisen menetelmän loppuun saat-tamiseen asti:
— jos mahdollista, erä tai osa erästä (josta näyte on otettu) alkuperäisessä
pakkauksessaan etiketillä varustettuna,
— jos mahdollista, jäljelle jäävä osa näytteistä,— ylimääräinen uute ja seulontakoetta (-kokeita) varten valmistettu täyden-
tävä aineisto, esimerkiksi immunofluoresenssikokeita varten valmistetutlevyt,
ja
— kaikki aiheeseen liittyvät asiakirjat.
2. Tapauksissa, joissa organismin esiintyminen on varmistunut, olisi säilytettävä
ja varastoitava asianmukaisissa olosuhteissa vähintään kuukauden ajan 5artiklan 2 kohdassa säädetyn ilmoitusmenettelyn jälkeen:
— 1 kohdassa tarkoitettu aineisto,
— tartunnan saanut tomaatti- tai munakoisonäyte, joka on tarvittaessa inoku-
loitu mukula- tai kasviuutteella, ja
— organismin eristetty viljelmä.
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 42
▼B
LIITE IV
Edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan i alakohdassa tarkoitetussa tutkimuksessa
olisi tarvittaessa otettava huomioon seuraavat tekijät:
i) tuotantopaikat,
— joilla viljellään tai on viljelty perunoita, jotka polveutuvat samasta kloo-
nista kuin organismin saastuttamat perunat,
— joilla viljellään tai on viljelty tomaatteja, joiden alkuperä on sama kuin
organismin saastuttamien tomaattien,
— joilla viljellään tai on viljelty perunoita tai tomaatteja, jotka ovat viral-
lisen valvonnan alaisina organismin epäillyn esiintymisen vuoksi,
— joilla viljellään tai on viljelty perunoita, jotka polveutuvat samasta kloo-
nista kuin perunat, joiden on todettu kasvaneen organismin saastuttamissatuotantopaikoissa,
— joilla viljellään perunoita tai tomaatteja, jotka sijaitsevat saastuneiden
tuotantopaikkojen läheisyydessä mukaan lukien tuotantopaikat, jotkajoutuvat tekemisiin samojen välineiden tai tuotantotilojen kanssa välittö-mästi tai yhteisen yrittäjän välityksellä,
— joilla käytetään pintavettä kasteluun tai sumutukseen lähteestä, joka on
vahvistettu tai jota epäillään organismin saastuttamaksi,
— joilla käytetään pintavettä kasteluun tai sumutukseen lähteestä, jota käyte-
tään myös organismin saastuttamiksi vahvistetuilla tai epäillyillä tuotanto-paikoilla,
— joilla organismin saastuttamaksi vahvistettu tai epäilty pintavesi tulvii tai
on tulvinut,
jaii) pintavesi, jota käytetään kasteluun tai sumutukseen tai joka on tulvinut
pellolla (pelloilla) tai tuotantopaikalla (-paikoilla), joiden on vahvistettuolevan organismin saastuttamia.
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 43
▼B
LIITE V
1. Edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iii alakohdassa ja c alakohdan iii
alakohdassa tarkoitetun todennäköisen saastunnan laajuuden määrittämiseenolisi tarpeen mukaan kuuluttava seuraavat tekijät:
— luettelossa oleva kasviaineisto, jota on viljelty 5 artiklan 1 kohdan a
alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitetulla tuotantopai-kalla,
— tuotantopaikka (-paikat), jotka ovat tuotantojärjestelmässä yhteydessä 5
artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoi-tettuun luettelossa olevaan kasviaineistoon, mukaan lukien ne, jotkajoutuvat tekemisiin samojen välineiden tai tuotantotilojen kanssa välittö-mästi tai yhteisen yrittäjän välityksellä,
— luettelossa oleva kasviaineisto, joka on tuotettu edellisessä luetelmakoh-
dassa tarkoitetulla tuotantopaikalla (-paikoilla), tai jotka ovat mainitulla(mainituilla) paikalla (paikoilla) aikana, jolloin 5 artiklan 1 kohdan aalakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitettu luettelossaoleva kasviaineisto oli ensimmäisessä luetelmakohdassa tarkoitetuissatuotantopaikoissa,
— varastot, joissa on käsitelty luettelossa olevaa kasviaineistoa edellä maini-
tuilta tuotantopaikoilta,
— kaikki koneet, ajoneuvot, säiliöt, varastot tai näiden osat sekä kaikki muut
esineet, mukaan lukien pakkaukset, jotka ovat voineet olla kosketuksissa 5artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoi-tetun luettelossa olevan kasviaineiston kanssa,
— luettelossa oleva kasviaineisto, joka on varastoitu johonkin edellisessä
luetelmakohdassa tarkoitettuun rakenteeseen tai esineeseen tai joka onollut kosketuksissa niiden kanssa ennen kyseisten rakenteiden ja esineidenpuhdistamista ja desinfiointia,
— perunan osalta 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan i alakohdassa tarkoitet-
tujen tutkimusten ja testien jälkeen ne mukulat tai kasvit, jotka ovat samaasisarus- tai vanhemmaiskloonialkuperää, ja tomaatin osalta kasvit, jotkaovat samasta lähteestä kuin 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdanmukaisesti saastuneeksi ilmoitettu luettelossa oleva kasviaineisto ja joidensaastunta näyttäisi todennäköiseltä samasta kloonista polveutumisenkautta, vaikka niiden testitulokset ovat negatiiviset organismin osalta,
— edellisessä luetelmakohdassa tarkoitetun luettelossa olevan kasviaineiston
tuotantopaikka (-paikat),
— luettelossa olevan kasviaineiston tuotantopaikka (-paikat), jossa käytetään
5 artiklan 1 kohdan c alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksiilmoitettua pintavettä kasteluun tai sumutukseen,
— pelloilla, joilla on tulvinut organismin saastuttamaksi vahvistettu pinta-
vesi, tuotettu luettelossa oleva kasviaineisto.
2. Edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iv alakohdassa ja 5 artiklan 1 kohdan
c alakohdan iii alakohdassa tarkoitetun mahdollisen leviämisen määrittämi-sessä on otettava huomioon seuraavat tekijät:
i) 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iv alakohdan mukaisissa tapauksissa:
— muiden sellaisten tuotantopaikkojen läheisyys, joilla viljellään luette-
lossa olevaa kasviaineistoa,
— siemenperunavarastojen yhteinen tuotanto ja käyttö,— tuotantopaikat, joilla käytetään pintavettä luettelossa olevan kasviai-
neiston kasteluun tai sumutukseen, jos kyseessä olevissa tapauksissa 5artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksiilmoitetulta tuotantopaikalta (-paikoilta) on tai on ollut vaarana valuapintavettä tai jos siellä on tai on ollut tulvimisvaara.
ii) 5 artiklan 1 kohdan c alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi
ilmoitetun pintaveden osalta:
— tuoantopaikka (-paikat), jo(i)ssa tuotetaan luettelossa olevaa kasviai-
neistoa ja joka sijaitsee saastuneeksi ilmoitetun pintaveden läheisyy-dessä tai jossa esiintyy sen tulvimisen uhka,
— kaikki erilliset kastelualtaat, jotka ovat yhteydessä saastuneeksi ilmoi-
tettuun pintaveteen.
3. Yksityiskohtaisiin, 5 artiklan 2 kohdan ensimmäisessä alakohdassa tarkoitet-
tuihin ilmoittamista koskeviin sääntöihin kuuluu:
— tapauksen mukaan 4 artiklan mukaisen epäillyn esiintymistapauksen
ilmoituspäivä sekä 5 artiklan mukaisen näytteenottopäivämäärät ja 5artiklan mukainen vahvistus organismin esiintymisestä,
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 44
▼B
— tiedot ilmoitetusta saastunnasta ja alueen määrittäminen.
4. Yksityiskohtaisiin, 5 artiklan 2 kohdan ensimmäisessä alakohdassa tarkoitet-
tuihin ilmoittamista koskeviin täydentäviin sääntöihin kuuluu:
— kaikkien saastuneiksi ilmoitettujen perunalähetysten tai -erien osalta direk-
tiivin 77/93/ETY 7 tai 8 artiklassa säädetyt todistukset ja, tapauksenmukaan, passin numero tai perunantuottajien, yhteisvarastojen ja lähetys-keskusten rekisterinumero,
— kaikkien saastuneiksi ilmoitettujen tomaattilähetysten tai -erien osalta
direktiivin 77/93/ETY 7 tai 8 artiklassa säädetyt todistukset ja passinnumero direktiivin 77/93/ETY liitteessä V olevan A osan I jakson 2.2kohdan luettelon mukaisesti,
— lajikenimitys ja luokka siemenperunavarastojen osalta ja jos mahdollista,
myös kaikissa muissa tapauksissa,
— vahvistettua esiintymistä koskevat muut vastaavat tiedot, joita komissio
voi vaatia.
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 45
▼B
LIITE VI
1. Edellä 6 artiklan 1 kohdassa tarkoitettuja toimenpiteitä ovat:
— polttaminen, tai
— käyttö eläinten rehuksi sellaisen lämpökäsittelyn jälkeen, jolla varmiste-
taan ettei organismi jää henkiin, tai
— syvähautaamalla ne jätteiden käsittelypaikkaan, josta ne eivät voi valua
maatalousmaahan tai joutua kosketuksiin sellaisten vedensaantilähteidenkanssa, joita voitaisiin käyttää maatalousmaan kasteluun, tai
— teollinen käsittely toimittamalla suoraan ja välittömästi sellaiselle käsi-
ttelylaitokselle, jolla on käytettävissään tämän direktiivin liitteen VIImääräysten mukaiset virallisesti hyväksytyt jätteidenhävitystilat ja -lait-teet, tai
— muut toimenpiteet, jos on todettu, että ne eivät voi aiheuttaa tunnistet-
tavaa organismin leviämisvaaraa; nämä toimenpiteet on viipymättäilmoitettava komissiolle ja muille jäsenvaltioille.
2. Kyseisen jäsenvaltion (-valtioiden) vastuullisten toimivaltaisten viran-
omaisten valvonnan alaista 6 artiklan 2 kohdassa tarkoitetun luettelossaolevan kasviaineiston asianmukaista käyttöä tai hävittämistä on, edellyttäen,että toimivaltaisten viranomaisten välillä toimii asianmukainen tiedonvaihtojatkuvan valvonnan varmistamiseksi ja että jäsenvaltion vastuullinen toimi-valtainen viranomainen on hyväksynyt ensimmäisessä ja toisessa luetelma-kohdassa tarkoitetut jätteidenhävitystilat ja -laitteet paikoissa, joissa perunaton tarkoitus pakata tai jalostaa, seuraava:
i) perunan mukuloiden osalta:
— niiden käyttö kulutukseen tarkoitettuina ruokaperunoina, jos ne on
pakattu paikoissa, joissa on käytettävissä asianmukaiset jätteidenhä-vitystilat ja -laitteet, ja jos ne ovat valmiita suoraan toimitettavaksi jakäytettäväksi ilman uudelleen pakkaamista ja jos ne on tarkoitettutällä tavoin suoraan toimitettavaksi ja käytettäväksi, tai
— niiden käyttö teolliseen käsittelyyn tarkoitettuina ruokaperunoina, jos
ne toimitetaan suoraan ja välittömästi sellaiselle käsittelylaitokselle,jolla on käytettävissään asianmukaiset jätteidenhävitystilat ja -lait-teet, tai
— mikä tahansa muu käyttö tai hävittäminen, jos on todettu, että se ei
aiheuta tunnistettavaa organismin leviämisvaaraa ja jos se on saanutmainittujen vastuullisten toimivaltaisten viranomaisten hyväksynnän.Nämä toimenpiteet on viipymättä ilmoitettava komissiolle ja muillejäsenvaltioille.
ii) muiden kasvin osien osalta, varsien ja lehtien jätteet mukaan luettuina,
— hävittäminen, tai
— mikä tahansa muu käyttö tai hävittäminen, jos on todettu, että se ei
aiheuta tunnistettavaa organismin leviämisvaaraa; nämä toimenpiteeton ilmoitettava komissiolle ja muille jäsenvaltioille.
3. Asianmukaiset 6 artiklan 3 kohdassa tarkoitettujen esineiden puhdistamis-
menetelmät ovat pesu ja tarvittaessa desinfioiminen siten, että ne eivätaiheuta tunnistettavaa organismin leviämisvaaraa; niitä on käytettävä jäsen-valtioiden vastuullisten viranomaisten valvonnassa.
4. Toimenpiteisiin, jotka jäsenvaltioiden on toteutettava 5 artiklan 1 kohdan a
alakohdan iv alakohdan ja c alakohdan iii alakohdan mukaisesti vahvis-tetu(i)lla ja 6 artiklan 4 kohdassa tarkoitetu(i)lla alueella (alueilla) onkuuluttava seuraavat toimenpiteet:
4.1. Edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneiksi
ilmoitettujen tuotantopaikkojen tapauksissa:
a) edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastu-
neeksi ilmoitetulla pellolla tai katteen alla kasvatettujen satokasvientuotantoyksikössä, joko
i) ilmoitettua saastuntaa seuraavien vähintään neljän kasvuvuoden
aikana:
— toteutetaan toimenpiteitä ylivuotisten peruna- ja tomaattikasvien
ja muiden organismin isäntäkasvien, koisokasvien rikkakasvitmukaan luettuina, hävittämiseksi, ja
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 46
▼B
— ei istuteta eikä kylvetä:
— perunan mukuloita tai kasveja,
— tomaatin kasveja tai siemeniä,— organismin biologia huomioon ottaen,
— muita isäntäkasveja,
—Brassica-sukuisia kaaleja, joiden osalta on olemassa
tunnistettava vaara, että organismi säilyy hengissä,
— satokasveja, joiden osalta on olemassa tunnistettava orga-
nismin leviämisvaara,
— edellisessä luetelmakohdassa tarkoitettua ajanjaksoa seuraavan
ensimmäisen perunoiden tai tomaattien korjuukauden aikana jaedellyttäen, että pelto on todettu vähintään kahden perättäisenkasvuvuoden aikana ennen istuttamista vapaaksi ylivuotisistaperunan tai tomaatin kasveista tai muista isäntäkasveista, koiso-kasvien rikkakasvit mukaan luettuina,
— perunoiden osalta istutetaan virallisesti sertifioituja siemenpe-
runoita ainoastaan ruokaperunoiden tuottamiseksi,
— suoritetaan 2 artiklan 1 kohdan mukaisesti virallinen
tutkimus, johon kuuluu myös testaus,
— edellisessä luetelmakohdassa tarkoitettua korjuukautta seuraavan
perunoiden tai tomaattien korjuukauden aikana ja sopivan viljely-kierron jälkeen perunoiden osalta istutetaan virallisesti serti-fioitua siemenperunaa siemenen tai ruokaperunan tuottamiseksija perunoiden ja tomaattien osalta suoritetaan virallinen tutkimus2 artiklan 1 kohdan mukaisesti,
tai
ii) ilmoitettua saastuntaa seuraavien viiden kasvuvuoden aikana:
— toteutetaan toimenpiteitä ylivuotisten perunan ja tomaatin kasvien
sekä muiden organismin isäntäkasvien, koisokasvien rikkakasvitmukaan luettuina, hävittämiseksi,
— pelto jätetään avokesannoksi ja sitä pidetään ensimmäisten
kolmen vuoden ajan joko avokesantona tai viljalla tunnistetustavaarasta riippuen tai se jätetään pysyvästi laitumeksi, jolloin sitäjoko niitetään usein ja matalaan tai laidunnetaan tehokkaasti, taise pidetään nurmella siementuotantoa varten, minkä jälkeenseuraavien kahden vuoden ajan siinä viljellään muita kuin orga-nismin isäntäkasveja, joista ei aiheudu tunnistettavaa organisminsäilymis- tai leviämisvaaraa,
— edellisessä luetelmakohdassa tarkoitettua korjuukautta seuraavan
ensimmäisen perunoiden tai tomaattien korjuukauden aikana,
— perunoiden osalta istutetaan virallisesti sertifioitua siemenpe-
runaa joko siemenen tai ruokaperunan tuottamiseksi,
ja suoritetaan 2 artiklan 1 kohdan mukaisesti virallinen tutkimus,
johon kuuluu myös testaus,
b) muilla pelloilla:
— todettua saastuntaa seuraavan kasvuvuoden aikana:
— yhtään perunan mukulaa, kasvia tai muuta organismin isäntä-
kasvia ei istuteta tai kylvetä ja tarvittaessa toteutetaan toimenpi-teitä ylivuotisten perunan ja tomaatin kasvien ja muiden isäntä-kasvien, koisokasvien rikkakasvit mukaan luettuina, hävittämi-seksi, tai
— perunan mukuloiden osalta istutetaan virallisesti sertifioitua
siemenperunaa ainoastaan ruokaperunan tuottamiseksi edellyt-täen, että on todettu vastuullisia toimivaltaisia viranomaisiatyydyttävällä tavalla, että ylivuotisista perunan ja tomaatinkasveista ja muista organismin isäntäkasveista, koisokasvienrikkakasvit mukaan luettuina, ei ole vaaraa. Kasvustot tarkaste-taan sopivina ajankohtina ja ylivuotiset perunakasvit testataanorganismin esiintymisen selvittämiseksi; lisäksi perunoidenosalta tarkastetaan korjatut mukulat.
— ensimmäisessä luetelmakohdassa tarkoitettua kasvuvuotta seuraavan
ensimmäisen kasvuvuoden aikana,
— perunoiden osalta istutetaan ainoastaan virallisesti sertifioituja
siemenperunoita joko siemenen tai ruokaperunan tuottamiseksi,
— ainakin toisen ensimmäisssä luetelmakohdassa tarkoitettua kasvu-
vuotta seuraavan kasvuvuoden aikana,
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 47
▼B
— perunoiden osalta istutetaan ainoastaan virallisesti sertifioituja
siemenperunoita tai virallisesti sertifioiduista siemenperunoistavirallisen valvonnan alaisina kasvatettuja siemenperunoita jokosiemenen tai ruokaperunan tuottamiseksi,
— edellisissä alakohdissa tarkoitettujen kasvuvuosien aikana toteutetaan
toimenpiteitä ylivuotisten perunan tai tomaatin kasvien ja muidenorganismin isäntäkasvien, koisokasvien rikkakasvit mukaan luet-tuina, hävittämiseksi ja suoritetaan virallinen tutkimus 2 artiklan 1kohdan mukaisesti, ja siementuotantoa varten istutettujen siemen-perunoiden osalta suoritetaan mukuloiden testaus,
c) välittömästi 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisen
saastunnan toteamisen jälkeen ja kaikkien seuraavien kasvuvuosienaikana ensimmäiseen a kohdassa esitettyjen yksityiskohtaisten sääntöjenmukaisesti hyväksyttyyn perunan tai tomaatin korjuukauteen asti jakyseinen kausi mukaan lukien saastuneiksi ilmoitetu(i)lla pellolla(pelloilla):
— kaikki tuotantopaikan koneet ja varastotilat, joita käytetään perunan
ja tomaatin tuotantoon, puhdistetaan ja tarvittaessa desinfioidaansopivin menetelmin 3 kohdan mukaisesti,
— kastelu- ja sumutusohjelmia sekä niiden kieltoa koskevia virallisia
tarkastuksia on tarvittaessa toteutettava organismin leviämisen estä-miseksi,
d) edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastu-
neeksi ilmoitetussa, katteen alla kasvatettujen satokasvien yksikössä,jossa kasvualustan korvaaminen kokonaan on mahdollista:
— mukuloita tai kasveja tai muita organismin isäntäkasveja, tomaatti-
kasvit ja tomaatin siemenet mukaan luettuina, saa istuttaa tai kylvääainoastaan, jos kyseinen yksikkö on virallisessa valvonnassa olevientoimenpiteiden alainen, joiden tarkoituksena on organismin ja kaik-kien isäntäkasviaineistoon kuuluvien kasvien hävittäminen, mukaanlukien vähintään kasvualustan vaihtaminen kokonaan sekä kyseisenyksikön ja kaikkien välineiden puhdistus ja tarvittaessa desinfiointi,ja jos vastuulliset viranomaiset ovat tämän seurauksena hyväksyneetsen perunan tai tomaatin tuotantoon, ja
— perunantuotannossa perunoita tuotetaan virallisesti sertifioiduista
siemenperunoista tai testatuista lähteistä olevista minimukuloista taimikrokasveista;
— kastelu- ja sumutusohjelmia sekä niiden kieltoa koskevia virallisia
tarkastuksia on toteutettava tarvittaessa organismin leviämisen estä-miseksi.
4.2. Rajoittamatta 4.1. kohdassa lueteltujen toimenpiteiden soveltamista, jäsen-
valtioiden on määritetyn alueen sisällä:
a) välittömästi todetun saastunnan jälkeen ja sen jälkeen vähintään kolmen
kasvuvuoden ajan:
aa) edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iv alakohdan mukaisesti
määritetyn alueen osalta:
— määrättävä vastuulliset viranomaiset valvomaan tiloja, joissa
harjoitetaan perunan mukuloiden tai tomaattien viljelyä varas-tointia tai käsittelyä, sekä niiden yritysten tiloja, jotka käyttävätperunan- tai tomaatintuotannossa koneita sopimuksen perus-teella,
— vaadittava näiden tilojen koneiden ja varastojen puhdistusta ja
tarvittaessa desinfiointia 3 kohdassa tarkoitetuilla asianmukai-silla menetelmillä,
— vaadittava, että kyseisen alueen kaikki perunasadot istutetaan
ainoastaan sertifioitua siementä käyttäen tai virallisen valvonnanalaisena kasvatettua siementä ja että korjuun jälkeen testataan 5artiklan 1 kohdan a alakohdan iii alakohdan mukaisesti mahdol-lisesti saastuneiksi määritellyillä tuotantopaikoilla kasvaneetsiemenperunat,
— vaadittava, että kaikissa alueella sijaitsevissa tiloissa siemenpe-
runa ja ruokaperuna käsitellään erikseen,
— toteutettava viralliset tutkimukset 2 artiklan 1 kohdan mukai-
sesti,
ab) edellä 5 artiklan 1 kohdan c alakohdan ii alakohdan mukaisesti
saastuneeksi ilmoitetun tai liitteessä V olevan 2 kohdan mukaisestiorganismin mahdollisen leviämisen määrittämisessä huomioon otet-taviin tekijöihin kuuluvan pintaveden osalta:
— toteutettava soveltuvina ajankohtina vuosittainen tutkimus, joka
käsittää näytteenoton pintavedestä sekä asiaankuuluvista isäntä-
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 48
▼B
koisokasveista soveltuviin vedensaantilähteisiin liittyen sekä
testauksen
— luettelossa olevan kasviaineiston osalta liitteessä II oleva
asianmukaisen menetelmän mukaisesti,
— muissa tapauksissa muun virallisesti hyväksytyn menetelmän
mukaisesti,
— toteutettava virallisia tarkastuksia, jotka koskevat kastelu- ja
sumutusohjelmia sekä saastuneeksi ilmoitetun veden luettelossaolevan kasviaineiston kasteluun ja sumutukseen tarkoitettuakäyttöä koskevaa kieltoa ja tarvittaessa muita isäntäkasvejaorganismin leviämisen estämiseksi. Kieltoa voidaan tarkistaamainitussa vuosittaisessa tutkimuksessa saatujen tulosten perus-teella,
— saastuneiden nestemäisten jätepäästöjen osalta toteutettava viral-
lisia tarkastuksia, jotka koskevat luettelossa olevaa kasviai-neistoa käsittelevien teollisten jalostus- ja pakkauslaitostenjätteiden hävittämistä.
b) laadittava tarvittaessa ohjelma kaikkien siemenperunavarastojen korvaa-
miseksi sopivan ajanjakson kuluessa.
1998L0057 — FI — 21.08.1998 — 000.001 — 49
▼B
LIITE VII
Liitteessä VI olevan 1 kohdan neljännessä luetelmakohdassa tarkoitettujen viral-
lisesti hyväksyttyjen jätteidenhävitystilojen ja -laitteiden on oltava seuraavienmääräysten mukaisia, siten että organismin leviämisen vaara vältetään:
i) perunoiden ja tomaattien käsittelyjäte (mukaan lukien poisheitetyt perunat,
kuoret ja tomaatit) sekä kaikki muut perunoista ja tomaateista peräisin olevatkiinteät jätteet on hävitettävä, joko
— syvähautaamalla ne jätteiden käsittelypaikkaan, josta ne eivät pääse valu-
maan maatalousmaahan tai joudu kosketuksiin sellaisten vedensaantiläh-teiden kanssa, joita voitaisiin käyttää maatalousmaan kasteluun. Jätteet onkuljetettava suoraan paikkaan sellaisissa säiliöissä, että jätteiden valu-misen uhkaa ei esiinny, tai
— polttamalla.
ii) nestemäinen käsittelyjäte: ennen hävittämistä nestemäinen jäte, joka sisältää
suspendoituneita kiintoaineita, on suodatettava tai laskeutettava kiintoaineenpoistamiseksi. Kiintoaineet on hävitettävä i alakohdassa määrätyllä tavalla.
Tämän jalkeen nestemäinen jäte joko:
— kuumennetaan vähintään 70 °C:seen vähintään 30 minuutin ajaksi ennen
hävittämistä,
tai
— hävitetään muulla virallisesti hyväksytyllä tavalla virallisen valvonnan
alaisena siten, että jäte ei voi joutua kosketuksiin maatalousmaan taisellaisten vedensaantilähteiden kanssa, joita voitaisiin käyttää maatalous-maan kasteluun. Tähän liittyvät yksityiskohdat on ilmoitettava muillejäsenvaltioille ja komissiolle.