Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentointitarkoituksiin. Toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä.  
►B ►C1 KOMISSION ASETUS (EY) N:o 440/2008,  
annettu 30 päivänä toukokuuta 2008,  
testimenetelmien vahvistamisesta kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja 
rajoituksista (REACH) annetun Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) 
N:o 1907/2006 nojalla ◄ 
(ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)  
(EUVL L 142, 31.5.2008, s. 1)  
sellaisena kuin se on muutettuna seuraavilla:  
virallinen lehti  
N:o sivu  päivämäärä  
►M1 Komission asetus (EY) N:o 761/2009, annettu 23 päivänä heinäkuuta 
2009  L 220  1  24.8.2009  
►M2 Komission asetus (EU) N:o 1152/2010, annettu 8 päivänä joulukuuta 
2010  L 324  13  9.12.2010  
►M3 Komission asetus (EU) N:o 640/2012, annettu 6 päivänä heinäkuuta 
2012  L 193  1  20.7.2012  
►M4 Komission asetus (EU) N:o 260/2014, annettu 24 päivänä tammikuuta 
2014  L 81  1  19.3.2014  
►M5 Komission asetus (EU) N:o 900/2014, annettu 15 päivänä heinäkuuta 
2014  L 247  1  21.8.2014  
Oikaistu:  
►C1 Oikaisu, EUVL L 151, 10.6.2011, s. 15 (440/2008)  2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1
►C1 KOMISSION ASETUS (EY) N:o 440/2008,  
annettu 30 päivänä toukokuuta 2008,  
testimenetelmien vahvistamisesta kemikaalien rekisteröinnistä, 
arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH) annetun Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 1907/2006 
nojalla ◄
 
(ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)  
EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka  
ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen,  
ottaa huomioon kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenette ­
lyistä ja rajoituksista (REACH), Euroopan kemikaaliviraston perustami ­
sesta, direktiivin 1999/45/EY muuttamisesta sekä neuvoston asetuksen 
(ETY) N:o 793/93, komission asetuksen (EY) N:o 1488/94, neuvoston direktiivin 76/769/ETY ja komission direktiivien 91/155/ETY, 93/67/ETY, 93/105/EY ja 2000/21/EY kumoamisesta 18 päivänä joulu ­
kuuta 2006 annetun Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 1907/2006 (
 1 ) ja erityisesti sen 13 artiklan 3 kohdan,  
sekä katsoo seuraavaa:  
(1) Aineiden sisäisten ominaisuuksien selvittämiseksi käytettävät tes ­
timenetelmät on asetuksen (EY) N:o 1907/2006 mukaisesti hy ­
väksyttävä yhteisön tasolla.  
(2) Vaarallisten aineiden luokitusta, pakkaamista ja merkintöjä kos ­
kevien lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämi ­
sestä 27 päivänä kesäkuuta 1967 annetun neuvoston direktiivin 67/548/ETY (
 2 ) liitteessä V säädetään aineiden ja valmisteiden 
fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien, myrkyllisyyden ja eko ­
myrkyllisyyden määritysmenetelmistä. Direktiivin 67/548/ETY liite V on kumottu Euroopan parlamentin ja neuvoston direktii ­
villä 2006/121/EY 1 päivästä kesäkuuta 2008 alkaen.
 
(3) Direktiivin 67/548/ETY liitteessä V olevat testimenetelmät olisi 
sisällytettävä tähän asetukseen.  
(4) Tämä asetus ei rajoita muiden testimenetelmien käyttämistä, jos 
niitä käytetään asetuksen (EY) N:o 1907/2006 13 artiklan 3 kohdan mukaisesti.  ▼
B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 2  
( 1 ) EUVL L 396, 30.12.2006, s. 1, oikaisu EUVL L 136, 29.5.2007, s. 3. 
( 2 ) EYVL 196, 16.8.1967, s. 1, direktiivi sellaisena kuin se on viimeksi muu ­
tettuna Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivillä 2006/121/EY (EUVL L 396, 30.12.2006, s. 850, oikaisu EUVL L 136, 29.5.2007, s. 281) —  
täydennetään asianmukaisella viitteellä, kun 30. ATP on julkaistu.
 (5) Testimenetelmien suunnittelussa olisi otettava täysimääräisesti 
huomioon eläinkokeiden korvaamista, vähentämistä sekä niihin liittyvien menetelmien parantamista koskevat periaatteet, erityi ­
sesti jos saataville tulee asianmukaisia validoituja menetelmiä, joilla voidaan korvata eläinkokeita, vähentää niiden käyttöä tai parantaa menetelmiä.
 
(6) Tässä asetuksessa säädetyt toimenpiteet ovat asetuksen (EY) 
N:o 1907/2006 133 artiklalla perustetun komitean lausunnon mukaiset,
 
ON ANTANUT TÄMÄN ASETUKSEN:  
1 artikla  
Asetuksen (EY) N:o 1907/2006/EY soveltamiseksi käytettävät testime ­
netelmät vahvistetaan tämän asetuksen liitteessä.  
2 artikla  
Komissio tarkastelee tarvittaessa uudelleen tässä asetuksessa mainittuja 
testimenetelmiä, jos niitä on tarpeen muuttaa selkärankaisilla eläimillä tehtävien kokeiden korvaamiseksi, vähentämiseksi ja menetelmien par ­
antamiseksi.
 
3 artikla  
Viittauksia direktiivin 67/548/ETY liitteeseen V pidetään viittauksina 
tähän asetukseen.  
4 artikla  
Tämä asetus tulee voimaan seuraavana päivänä sen jälkeen, kun se on 
julkaistu  Euroopan unionin virallisessa lehdessä.  
Sitä sovelletaan 1 päivästä kesäkuuta 2008.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 3
 
LIITE  
OSA A: FYSIKAALIS-KEMIALLISTEN OMINAISUUKSIEN 
MÄÄRITYSMENETELMÄT  
SISÄLLYSLUETTELO 
A.1 SULAMIS-/JÄÄTYMISLÄMPÖTILA 
A.2 KIEHUMISLÄMPÖTILA 
A.3 SUHTEELLINEN TIHEYS A.4 HÖYRYNPAINE A.5 PINTAJÄNNITYS 
A.6 VESILIUKOISUUS 
A.8 JAKAANTUMISKERROIN A.9 LEIMAHDUSPISTE 
A.10 SYTTYVYYS (KIINTEÄT AINEET) 
A.11 SYTTYVYYS (KAASUT) A.12 SYTTYVYYS (KOSKETUS VEDEN KANSSA) 
A.13 KIINTEIDEN AINEIDEN JA NESTEIDEN ITSESYTTYVYYS 
A.14 RÄJÄHTÄVYYS A.15 ITSESYTTYMISLÄMPÖTILA (NESTEET JA KAASUT) A.16 KIINTEIDEN AINEIDEN SUHTEELLINEN ITSESYTTYMIS ­
LÄMPÖTILA 
A.17 HAPETTAVAT OMINAISUUDET (KIINTEÄT AINEET) 
A.18 POLYMEERIEN LUKUKESKIMÄÄRÄINEN MOLEKYY ­
LIPAINO JA MOLEKYYLIPAINOJAKAUMA 
A.19 PIENIMOLEKYYLISTEN AINEIDEN PITOISUUS POLYMEE ­
RISSÄ 
A.20 VESILIUOKSESSA OLEVIEN POLYMEERIEN LIUKENE ­
MIS/UUTTUMISOMINAISUUDET 
A.21 HAPETTAVAT OMINAISUUDET (NESTEET) A.22. KUITUJEN HALKAISIJAN PITUUSPAINOTETTU GEOMET ­
RINEN KESKIARVO
 
▼M4 
A.23. JAKAANTUMISKERROIN (1-OKTANOLI-VESI): HITAAN 
SEKOITUKSEN MENETELMÄ  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 4
 
A.1 SULAMIS-/JÄÄTYMISLÄMPÖTILA  
1. MENETELMÄ  
Tässä kuvattavat menetelmät perustuvat pääosin OECD:n testiohjei ­
siin (1). Perusperiaatteet kuvataan viitteissä (2) ja (3).  
1.1 JOHDANTO  
Kuvattuja menetelmiä ja laitteita voidaan soveltaa aineiden sulamis ­
lämpötilan määritykseen ilman rajoituksia aineiden puhtausasteen 
suhteen.  
Sopiva menetelmä valitaan testattavan aineen luonteen mukaan. Ai ­
neet voivat olla helposti, vaikeasti tai ei lainkaan jauhettavissa.  
Joidenkin aineiden kohdalla on käytännöllisempää määrittää jää ­
tymis- tai jähmettymislämpötila, ja tästä syystä menetelmään on 
myös otettu mukaan tällaisten määritysten standardit.  
Jos aineen ominaisuudet ovat sellaiset, että mikään edellä mainituista 
parametreista ei ole mitattavissa, voidaan joissakin tapauksissa käyt ­
tää jähmettymispistettä.  
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Määritelmän mukaan sulamislämpötila on se lämpötila, jossa tapah ­
tuu faasimuutos kiinteästä olomuodosta nestemäiseen olomuotoon 
ilmakehän paineessa. Ihannetapauksissa sulamislämpötila on sama kuin jäätymislämpötila.
 
Koska faasimuutos kattaa usein määrätyn lämpötila-alueen, voidaan 
käyttää myös käsitettä sulamisalue.  
Yksiköiden muuntaminen (K >  o C) 
t = T - 273,15  
t: Celsius-lämpötila, Celsius-astetta (  o C) 
T: termodynaaminen lämpötila, kelviniä (K)  
1.3 VERTAILUAINEET  
Uutta ainetta tutkittaessa ei aina tarvitse käyttää vertailuaineita. Ver ­
tailuaineita käytetään lähinnä menetelmän toimivuuden ajoittaiseen 
tarkistamiseen ja verrattaessa tuloksia muiden menetelmien avulla 
saatuihin tuloksiin.  
Viitteessä (4) kuvataan joitakin kalibrointiaineita.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 5
 
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATTEET  
Määritetään lämpötila (lämpötila-alue), jossa tapahtuu faasimuutos 
kiinteästä olomuodosta nestemäiseen olomuotoon tai päinvastoin. Käy ­
tännössä määritetään sulamisen tai jäätymisen alku- ja loppulämpötila 
kuumennettaessa tai jäähdytettäessä näytettä ilmakehän paineessa. Jäl ­
jempänä kuvataan viisi menetelmätyyppiä: kapillaarimenetelmä, kuu ­
ma-alustamenetelmät, jäätymislämpötilan määritykset, terminen ana ­
lyysi ja jähmettymispisteen määritys (kehitetty paloöljyjä varten).  
Joissakin tapauksissa voi olla käytännöllisempää määrittää sulamis ­
lämpötilan sijasta jäätymislämpötila.  
1.4.1  Kapillaarimenetelmä  
1.4.1.1  Nestehauteella varustetut sulamislämpötilalaitteet  
Pieni määrä hienoksi jauhettua näytettä pakataan tiiviisti kapillaa ­
riputkeen. Putkea kuumennetaan yhdessä lämpömittarin kanssa siten, 
että lämpötilan nousu on alle 1 K minuutissa varsinaisen sulamisen 
aikana. Määritetään sulamisen alku- ja loppulämpötila.  
1.4.1.2  Metallikappaleeseen perustuvat sulamislämpötilalaitteet  
Periaate on muutoin sama kuin kohdassa 1.4.1.1, mutta kapillaa ­
riputki ja lämpömittari asetetaan kuumennettavaan metallikappalee ­
seen, jossa on reiät niiden tarkastelua varten.  
1.4.1.3  Valokennoilmaisin  
Kapillaariputkessa olevaa näytettä kuumennetaan metallisylinterissä 
automaattisesti. Aineen läpi johdetaan valonsäde sylinterin reiän kautta tarkasti kalibroituun valokennoon. Digitaalisesta osoittimesta nähdään kuumennuskammiossa sijaitsevan platinavastuslämpömitta ­
rin mittaama lämpötila. Useimpien aineiden optiset ominaisuudet 
muuttuvat sulamisen myötä valoaläpäisemättömäksi läpinäkyvään, jolloin valokennoon tulevan valonsäteen intensiteetti kasvaa ja digi ­
taalinen osoitin saa pysäytyssignaalin. Menetelmä ei sovellu voimak ­
kaanväristen aineiden mittauksiin.
 
1.4.2  Kuuma-alustamenetelmät  
1.4.2.1  Koflerin kuumasauva  
Koflerin kuumasauvassa on kaksi metalliosaa, joilla on eri lämmön ­
johtavuus. Sähkölämmitteinen sauva on suunniteltu siten, että läm ­
pötilagradientti on lähes lineaarinen sauvan pituussuunnassa. Sauvan 
mitattava lämpötila-alue on 283–573 K, ja mittaus tehdään sauva ­
tyyppikohtaisella erikoislaitteella, jossa on osoitinkisko. Aineen su ­
lamislämpötilan määritystä varten näytettä levitetään ohuelti suoraan kuuman sauvan pinnalle. Muutamassa sekunnissa muodostuu selvä 
raja nestemäisen ja kiinteän faasin välille. Rajan lämpötila luetaan 
siirtämällä osoitin rajan kohdalle.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 6
 
1.4.2.2  Sulamismikroskooppi  
Sulamismikroskoopin avulla sulamislämpötila voidaan määrittää hy ­
vin pienestä näytemäärästä. Sulamismikroskooppcja on monia eri tyyppejä. Useimmissa malleissa lämpötila mitataan herkän termopa ­
rin avulla, mutta myös elohopeamittaria käytetään. Tyypillisessä su ­
lamismikroskoopissa on kuumennuskammio ja tämän sisällä metalli ­
levy, jolle näytettä sisältävä objektilasi asetetaan. Tarvittava valo saadaan kammioon mikroskoopin valaisupeilistä metallilevyn kes ­
kiön reiän kautta. Kammion sulkeva lasilevy estää ilman pääsyn 
näytealueelle mittauksen aikana.
 
Näytteen kuumentamista säätää reostaatti. Hyvin tarkoissa optisesti ani ­
sotrooppisten aineiden mittauksissa voidaan käyttää polarisoitua valoa.  
1.4.2.3  Meniskimenetelmä  
Tätä menetelmää käytetään erityisesti polyamidien ominaisuuksien 
mittauksissa.  
Määritetään visuaalisesti lämpötila, jossa polyamidinäytteellä lepäävä 
kuumennusalustan ja lasilevyn välinen silikoniöljymeniski liikkuu.  
1.4.3  Jäätymislämpötilan määritysmenetelmä  
Näyte pannaan erityiseen koeputkeen, joka asetetaan jäätymislämpö ­
tilan määrityslaitteeseen. Näytettä hämmennetään kevyesti koko jääh ­
dyttämisen ajan. Mitataan lämpötila sopivin välein. Kun lämpötila on 
pysynyt samana muutaman mittauksen ajan, tämä lämpötila (lämpö ­
mittarin virheellä korjattuna) katsotaan jäätymislämpötilaksi.  
Alijäähtymistä on vältettävä pitämällä yllä kiinteän ja nestemäisen 
faasin välistä tasapainoa.  
1.4.4  Terminen analyysi  
1.4.4.1  Differentiaaliterminen analyysi (DTA)  
Tämän tekniikan avulla voidaan rekisteröidä näytteen ja vertailu ­
aineen lämpötilaero lämpötilan funktiona, kun näytettä ja vertailuai ­
netta käsitellään saman valvotun lämpötilaohjelman mukaan. Kun näytteessä tapahtuu entalpiamuutoksen sisältävä olomuodon muutos, 
muutos näkyy endotermisenä (sulaminen) tai eksotermisenä (jäätymi ­
nen) poikkeamana lämpötilakäyrän perusviivasta.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 7
 
1.4.4.2  Differentiaalinen pyyhkäisykalorimetria (DSC)  
Tämän tekniikan avulla voidaan rekisteröidä näytteen ja vertailu ­
aineen energianottoero lämpötilan funktiona, kun näytettä ja vertai ­
luainetta käsitellään saman valvotun lämpötilaohjelman mukaan. 
Tämä energiaero on energiamäärä, joka tarvitaan pienentämään näyt ­
teen ja vertailuaineen lämpötilaero nollaan. Kun näytteessä tapahtuu entalpiamuutoksen sisältävä muodonmuutos, muutos näkyy endoter ­
misenä (sulaminen) tai eksotermisena (jäätyminen) poikkeamana 
lämpövirran perusviivasta.
 
1.4.5  Jähmettymispiste  
Tätä paloöljyjä varten kehitettyä menetelmää voidaan käyttää alhai ­
sen sulamispisteen omaavien öljymäisten aineiden tutkimiseen.  
Alustavan kuumennuksen jälkeen näytettä jäähdytetään määrätyllä 
nopeudella. Jäähtymisen aikana näytteen virtausominaisuuksia tar ­
kastellaan 3 K:n välein. Alin lämpötila, jossa vielä esiinny liikettä, on aineen jähmettymispiste.
 
1.5 LAATUKRITEERIT  
Sulamislämpötilan tai sulamisalueen määritykseen tarkoitettujen me ­
netelmien soveltuvuus ja tarkkuus kuvataan seuraavassa taulukossa:  
TAULUKKO: MENETELMIEN SOVELTUVUUS  
A. Kapillaarimenetelmät  
Mittausmenetelmä Jauhettavat aineet Vaikeasti 
jauhettavat aineet Lämpötila-alue Arvioitu 
tarkkuus (  1 ) Nykyinen 
standardi  
Nestehauteella va ­
rustetut sulamis ­
lämpötilalaitteet kyllä vain harvat 273–573 K ± 0,3K JIS K 0064 
Metallikappalee ­
seen perustuvat 
sulamislämpötil ­
alaitteet kyllä vain harvat 293... > 573 
K ± 0,5K ISO 1218(E) 
Valokennoilmaisin kyllä useat (erikois ­
laitteiden avul ­
la) 253–573 K ± 0,5 K  
( 1 ) Vaihtelee laitteen tyypin ja aineen puhtausasteen mukaan.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 8
 
B. Kuuma-alusta- ja jäätymismenetelmät  
Mittausmenetelmä Jauhettavat aineet Vaikeasti 
jauhettavat aineet Lämpötila-alue Arvioitu 
tarkkuus (  1 ) Nykyinen 
standardi  
Koflerin kuu ­
masauva kyllä ei 283... > 573 
K ± 1,0 K ANSI/ASTM D 
3451-76 
Sulamismikrosko ­
oppi kyllä vain harvat 273... > 573 
K ± 0,5K DIN 53736 
Meniskimenetelmä ei erityisesti po ­
lyamidit 293... > 573 
K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Jäätymislämpötila ­
menetelmät kyllä kyllä 223–573 K ± 0,5 K esim. BS 4695  
( 1 ) Vaihtelee laitteen tyypin ja aineen puhtausasteen mukaan.  
C. Terminen analyysi  
Mittausmenetelma Jauhettavat aineet Vaikeasti 
jauhettavat aineet Lämpötila-alue Arvioitu 
tarkkuus (  1 ) Nykyinen 
standardi  
Differentiaaliter ­
minen analyysi kyllä kyllä 173–1 273 K enintään 
600 K ± 0,5 K 
enintään 
1 273 K ± 
2,0 K ASTM E 537-76 
Differentiaalinen 
pyyhkäisykalori ­
metria kyllä kyllä 173–1 273 K enintään 
600 K ± 0,5 K 
enintään 
1 273 K ± 
2,0 K ASTM E 537-76  
( 1 ) Vaihtelee laitteen tyypin ja aineen puhtausasteen mukaan.  
D. Jähmettymispiste  
Mittausmenetelmä Jauhettavat aineet Vaikeasti 
jauhettavat aineet Lämpötila-alue Arvioitu 
tarkkuus (  1 ) Nykyinen 
standardi  
Jähmettymispiste paloöljyt ja 
öljymäiset ai ­
neet paloöljyt ja öl ­
jymäiset aineet 223–323 K ± 3,0 K ASTM D 97-66  
( 1 ) Vaihtelee laitteen tyypin ja aineen puhtausasteen mukaan.  
1.6 MENETELMÄKUVAUKSET  
Testimenetelmien työjärjestys on pääosin kuvattu kansainvälisissä ja 
kansallisissa standardeissa (katso liitettä 1)  
1.6.1  Kapillaariputkimenetelmät  
Kun hienoksi jauhettua ainetta kuumennetaan hitaasti, siinä on 
yleensä havaittavissa kuvassa 1 esitettävät sulamisvaiheet.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 9
 
Kuva 1
  
Sulamislämpötila määritetään rekisteröimällä sulamisen alku- ja lop ­
pulämpötila.  
1.6.1.1  Nestehauteella varustetut sulamislämpötilalaitteet  
Kuvassa 2 on lasista valmistettu standardoitu sulamislämpötilalaite 
(JIS K 0064). Kaikki mitat ovat millimetreinä.  
Kuva 2
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 10
 
Haudeneste:  
Haudeneste valitaan määritettävän sulamislämpötilan mukaan. Jos 
esimerkiksi sulamislämpötila on enintään 473 K, käytetään paloöljyä, 
ja jos sulamislämpötila on enintään 573 K, käytetään silikoniöljyä.  
Jos sulamislämpötila on suurempi kuin 523 K, voidaan käyttää se ­
osta, jossa on kolme paino-osaa rikkihappoa ja kaksi paino-osaa kaliumsulfaattia. Tätä seosta käytettäessä on noudatettava tarpeellisia varotoimenpiteitä.
 
Lämpömittari  
Käytettävän lämpömittarin tulee täyttää seuraavat tai niitä vastaavat 
standardit:  
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.  
Työjärjestys:  
Kuiva näyte hienonnetaan huhmareessa ja siirretään kapillaariput ­
keen, jonka toinen pää on suljettu. Näytettä pannaan putkeen sel ­
lainen määrä, että sen korkeus tiiviiksi pakattuna on noin 3 mm. 
Yhtenäisen pakkaustiiviyden saavuttamiseksi kapillaariputki pudote ­
taan noin 700 mm:n korkeudelta kohtisuoraan lasiputken läpi kellon ­
lasille.  
Täytetty kapillaariputki asetetaan hauteeseen siten, että lämpömittarin 
elohopeanuppi koskettaa kapillaariputkea näytteen kohdalta. Kun ka ­
pillaariputki asetetaan hauteeseen, sen lämpötila on yleensä noin 
10 K alle sulamislämpötilan.  
Hauteen nestettä kuumennetaan siten, että lämpötilan nousu on noin 
3 K/min. Nestettä on hämmennettävä. Kun lämpötila on noin 10 K alle sulamislämpötilan, kuumenemista säädetään, niin että läm ­
pötilan nousu on enintään 1 K/min.
 
Tuloksen laskenta:  
Sulamislämpötila lasketaan seuraavan suureyhtälön mukaan:  
T = T  D + 0,00016 (T  D - T E )n 
jossa:  
T = korjattu sulamislämpötila kelvineinä  
T D = D-lämpömittarin lukema kelvineinä  
T E = E-lämpömittarin lukema kelvineinä  
n = D-lämpömittarin nesteen yläpuolella olevan varren elohopea ­
pylvään astejakojen määrä  
1.6.1.2  Metallikappaleeseen perustuvat sulamislämpötilalaitteet  
Laitteisto:  
Laitteiston osat ovat seuraavat:  
— sylinterinmuotoinen metallikappale, jonka yläosa on ontto ja 
muodostaa kammion (katso kuvaa 3),  
— metallitulppa, jossa on vähintään kaksi reikää, joiden kautta me ­
tallikappaleeseen voidaan työntää putkia,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 11
 
— metallikappaleen kuumennusjärjestelmä, esimerkiksi kappaleen 
sisällä oleva sähkövastus,  
— reostaatti tehonsäätöä varten (jos käytössä on sähkölämmitys),  
— kammion sivuseinissä neljä lämmönkestävää lasi-ikkunaa, jotka 
ovat vastakkain ja toisiinsa nähden suorassa kulmassa; yhden 
ikkunan edessä on okulaari kapillaariputken tarkastelua varten, 
muiden ikkunoiden läpi johdetaan lampuista valoa kammion si ­
säosaan,  
— lämmönkestävästä lasista valmistettu kapillaariputki, jonka toinen 
pää on suljettu (katso kohtaa 1.6.1.1).  
Lämpömittari:  
Katso kohdassa 1.6.1.1 mainittavia standardeja. Myös riittävän tark ­
koja lämpösähköisiä mittauslaitteita voidaan käyttää.  
Kuva 3
  
1.6.1.3  Valokennoilmaisin  
Laitteisto ja työjärjestys:  
Laitteisto on automaattisella kuumennusjärjestelmällä varustettu me ­
tallikammio. Kolme kapillaariputkea täytetään kohdan 1.6.1.1 ohjei ­
den mukaan ja asetetaan uuniin.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 12
 
Laitteiston kalibroinnin avulla saadaan useita lineaarisia lämpötilan 
nousukäyriä. Kuumennus säädetään sähköisesti valitun vakion ja li ­
neaarisen nousukäyrän mukaan. Uunin lämpötila ja kapillaariput ­
kessa olevien näytteiden lämpötila ilmenevät rekisteröintilaitteesta.  
1.6.2  Kuuma-alustat  
1.6.2.1  Koflerin kuumasauva  
Katso liitettä.  
1.6.2.2  Sulamismikroskooppi  
Katso liitettä.  
1.6.2.3  Meniskimenetelmä (polyamidit)  
Katso liitettä.  
Sulamislämpötilan alueella lämpötilan nousun on oltava alle 
1 K/min.  
1.6.3  Jäätymislämpötilan määritysmenetelmät  
Katso liitettä.  
1.6.4  Terminen analyysi  
1.6.4.1  Differentiaaliterminen analyysi  
Katso liitettä.  
1.6.4.2  Differentiaalinen pyyhkäisykalorimetria  
Katso liitettä.  
1.6.5  Jähmettymispisteen määritys  
Katso liitettä.  
2. TIEDOT  
Joissakin tapauksissa lämpömittarin korjaus on tarpeen.  
3. RAPORTOINTI  
Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat 
tiedot:  
— käytetty menetelmä,  
— aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot, epäpuhtaudet) ja 
mahdolliset esipuhdistukset,  
— arvio tarkkuudesta.  
Sulamislämpötilana raportoidaan vähintään kahden arvioidulla tark ­
kuusalueella (katso taulukoita) olevan mittauksen keskiarvo.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 13
 
Jos sulamisen alku- ja loppulämpötilan ero on menetelmän tarkkuus ­
rajojen sisällä, sulamislämpötilana raportoidaan sulamisen loppuv ­
aiheen lämpötila. Muussa tapauksessa molemmat lämpötilat raportoi ­
daan.  
Jos aine hajoaa tai höyrystyy ennen sulamislämpötilaa, raportoidaan 
lämpötila, jossa hajoaminen tai höyrystyminen on tapahtunut.  
Raporttiin tulee sisällyttää myös kaikki tiedot ja huomautukset, joilla 
on merkitystä tulosten tulkinnan kannalta, erityisesti epäpuhtauksien 
ja aineen fysikaalisen olomuodon osalta.  
4. VIITTEET  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 Final.  
(2) UIPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, London, 1975, vol. II, 803-834.  
(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.
 
(4) UICPA, Physiochemical measurements: Catalogue of reference 
materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 
1976, vol. 48, 505–515.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 14
 
Liite 
Lisää teknisiä tietoja on seuraavissa standardeissa.  
1. Kapillaarimenetelmät  
1.1 Nestehauteella varustetut sulamislämpötilalaitteet 
ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial 
and final melting points and the mel ­
ting range of organic chemicals 
BS 4634 Method for the determination of mel ­
ting point and/or melting range 
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles 
von Harzen nach Kapillarverfahren 
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of 
chemical products.  
1.2 Metallikappaleeseen perustuvat sulamislämpötilalaitteet 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunststof ­
fen 
ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determina ­
tion of ’melting point’  
2. Kuuma-alustat  
2.1 Koflerin kuumasauva 
ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for 
testing polymeric powder coatings  
2.2 Sulamismikroskooppi 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunststof ­
fen 
2.3 Meniskimenetelmä (polyamidit) 
ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determina ­
tion of ’melting point’  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 15
 
ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin 
injection moulding and extrusion ma ­
terials 
NF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination 
du ’point de fusion’. méthode du mé ­
nisque.  
3. Jäätymislämpötilan määritysmenetelmät  
BS 4633 Method for the determination of crys ­
tallizing point 
BS 4695 Method for Determination of Melting 
Point of petroleum wax (Cooling Cur ­
ve) 
DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von 
Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und 
Motorenbenzolen 
ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la 
température de figeage 
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes 
von Fettsäuren 
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de 
cristallsation (point de congélation) 
ISO 1392 Method for the determination of the 
freezing point
 
4. Terminen analyysi  
4.1 Terminen differentiaalianalyysi 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by met ­
hods of differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 16
 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
4.2 Differentiaalinen pyyhkäisykalorimetria 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by met ­
hods of differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
5. Jähmettymispisteen määritys  
NBN 52014 Echantillonnage et analyse des pro ­
duits du pétrole: point de trouble et point d'ecoulement limite — Monster ­
neming en ontleding van aardoliepro ­
ducten: Troebelingspunt en vloeipunt 
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of 
petroleum oils 
ISO 3016 Petroleum oils — Determination of 
pour point.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 17
 
A.2 KIEHUMISLÄMPÖTILA  
1. MENETELMÄ  
Tässä kuvattavat menetelmät perustuvat pääosin OECD:n testiohjei ­
siin (1). Perusperiaatteet kuvataan viitteissä (2) ja (3).  
1.1 JOHDANTO  
Tässä kuvattuja menetelmiä ja laitteita voidaan soveltaa nesteiden ja 
matalissa lämpötiloissa sulavien aineiden kiehumispisteen määrityk ­
seen, edellyttäen että aineissa ei tapahdu kemiallisia reaktioita ennen 
kiehumista (esimerkiksi itsehapettumista, rakennemuutoksia, hajoa ­
mista tms.). Menetelmät soveltuvat sekä puhtaisiin että epäpuhtaisiin nestemäisiin aineisiin.
 
Päähuomion kohteena ovat valokennoilmaisimiin ja termiseen ana ­
lyysiin perustuvat menetelmät, koska näiden menetelmien avulla voi ­
daan määrittää sekä sulamis- että kiehumislämpötila. Lisäksi mitta ­
ukset voidaan suorittaa automaattisesti.  
Ns. dynaamisen menetelmän etu on se, että menetelmää voidaan 
käyttää höyrynpaineen määritykseen. Tällöin kiehumislämpötilaa ei tarvitse korjata normaaliin paineeseen (101,325 kPa), koska normaa ­
lipainetta voidaan mittauksen aikana säätää painekytkimen avulla.
 
Huomautuksia:  
Epäpuhtauksien vaikutus kiehumislämpötilan määritykseen vaihtelee 
huomattavasti niiden luonteen mukaan. Jos näyte sisältää haihtuvia epäpuhtauksia, jotka voivat vaikuttaa tulokseen, aine voidaan puh ­
distaa.
 
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Määritelmän mukaan normaali kiehumislämpötila on lämpötila, jossa 
nesteen höyrynpaine on 101,325 kPa.  
Jos kiehumislämpötilaa ei mitata normaalissa ilmakehän paineessa, 
lämpötilan riippuvuus höyrynpaineesta voidaan esittää Clausius-Cla ­
peyronin yhtälön avulla:  
log p ¼ Δ H v 
2; 3 RT þ const : 
jossa:  
p = aineen höyrynpaine (Pa)  
Δ H v = höyrystymislämpö (J mol  -1 ) 
R = yleinen molaarinen kaasuvakio (8,314 J mol  -1 K -1 ) 
T = termodynaaminen lämpötila (K)  
Kiehumislämpötilan rekisteröinnissä otetaan huomioon mittauksen 
aikana vallitseva ympäristön paine.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 18
 
Muunnokset:  
Paine (yksikkö: kPa)  
100 kPa = 0,1 bar = 0,1 MPa 
(yksikköä bar (baari) saa edelleen käyttää, mutta sitä ei 
suositella)  
133 Pa = 1 mmHg = 1 Torr 
(yksiköitä mmHg ja Torr ei saa käyttää)  
1 atm = normaali-ilmakehä = 101 325 Pa 
(yksikköä atm ei saa käyttää)  
Lämpötila (yksikkö: K)  
t = T - 273,15  
t: Celsius-lämpötila, Celsius-asteina (  o C) 
T: termodynaaminen lämpötila, kelvineinä (K)  
1.3 VERTAILUAINEET  
Uutta ainetta tutkittaessa ei aina tarvitse käyttää vertailuaineita. Ver ­
tailuaineita käytetään lähinnä menetelmän toimivuuden ajoittaiseen tarkistamiseen ja verrattaessa tuloksia muiden menetelmien avulla saatuihin tuloksiin.
 
Liitteessä kuvattavissa menetelmissä mainitaan joitakin kalibrointi ­
aineita.  
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATTEET  
Kiehumislämpötilan (kiehumisalueen) määritysmenetelmistä viisi pe ­
rustuu kiehumislämpötilan mittaamiseen ja kaksi termiseen analyy ­
siin. 
1.4.1  Ebulliometrimenetelmä  
Ebulliometrit kehitettiin alun perin molekyylipainon määritykseen 
kiehumispisteen kohoamisen avulla, mutta niitä voidaan myös käyt ­
tää tarkan kiehumislämpötilan määritykseen. Standardissa ASTM D 
1120-72 (katso liitettä) kuvataan yksinkertainen laitteisto, jolla neste kuumennetaan tasapaino-olosuhteissa kiehumispisteeseen.
 
1.4.2  Dynaaminen menetelmä  
Mitataan höyryn jälleenlauhtumislämpötila pitämällä tarkoitukseen 
soveltuvaa lämpömittaria höyryn palautusvirrassa nesteen kiehuessa. Tämä menetelmä sallii paineen vaihtelun.
 
1.4.3  Tislausmenetelmä  
Neste tislataan ja höyryn jälleenlauhtumislämpötila sekä tisleen 
määrä mitataan.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 19
 
1.4.4  Siwoloboffin menetelmä  
Näyte kuumennetaan putkiottimessa, joka upotetaan kuumahauteen 
nesteeseen. Putkiottimeen pannaan suljettu kapillaari, jonka alaosassa on ilmakupla.
 
1.4.5  Valokennomenetelmä  
Tehdään automaattisia valosähköisiä mittauksia nousevien ilmak ­
uplien avulla Siwoloboffin menetelmän mukaan.  
1.4.6  Differentiaaliterminen analyysi  
Tämän tekniikan avulla voidaan rekisteröidä näytteen ja vertailu ­
aineen lämpötilaero lämpötilan funktiona, kun näytettä ja vertailuai ­
netta käsitellään saman valvotun lämpötilaohjelman mukaan. Kun näytteessä tapahtuu entalpiamuutoksen sisältävä olomuodon muutos, muutos näkyy endotermisenä (kiehuminen) poikkeamana lämpötila ­
käyrän perusviivasta.
 
1.4.7  Differentiaalinen pyyhkäisykalorimetria  
Tämän tekniikan avulla voidaan rekisteröidä näytteen ja vertailu ­
aineen energianottoero lämpötilan funktiona, kun näytettä ja vertai ­
luainetta käsitellään saman valvotun lämpötilaohjelman mukaan. Tämä energiaero on energiamäärä, joka tarvitaan pienentämään näyt ­
teen ja vertailuaineen lämpötilaero nollaan. Kun näytteessä tapahtuu 
entalpiamuutoksen sisältävä olomuodon muutos, muutos näkyy en ­
dotermisenä (sulaminen) poikkeamana lämpövirran perusviivasta.
 
1.5 LAATUKRITEERIT  
Kiehumislämpötilan ja kiehumisalueen määritykseen tarkoitettujen 
menetelmien soveltuvuus ja tarkkuus kuvataan taulukossa 1.  
Taulukko 1  
Menetelmien vertailu  
Mittausmenetelmä Arvioitu tarkkuus Nykyinen standardi  
Ebullioometri ± 1,4 K (enintään 373 K) (  1 ) ( 2 ) 
± 2,5 K (enintään 600 K) (  1 ) ( 2 ) ASTMD 1120-720 (  1 ) 
Dynaaminen menetelmä ± 0,5 K (enintään 600 K) (  2 ) 
Tislausprosessi (kiehumisalue) ± 0,5 K (enintään 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 
4591/71 
Siwoloboffin menetelmä ± 2 K (enintään 600 K) (  2 ) 
Valokennomenetelmä ± 0,3 K (enintään 373 K) (  2 ) 
Differentiaaliterminen analyysi ± 0,5 K (enintään 600 K) 
± 2,0 K (enintään 1 273 K) ASTM E 537-76 
Differentiaalinen pyyhkäisykalori ­
metria ± 0,5 K (enintään 600 K) 
± 2,0 K (enintään 1 273 K) ASTM E 537-76  
( 1 ) Koskee vain esimerkiksi ASTM D 1120-72:ssa kuvattujen yksinkertaisten laitteiden avulla tehtäviä määrityksiä. 
Tarkkuutta voidaan parantaa käyttämällä kehittyneempiä laitteita. 
( 2 ) Koskee vain puhtaita aineita. Menetelmän käyttö muissa olosuhteissa on perusteltava.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 20
 
1.6 MENETELMÄKUVAUKSET  
Joidenkin testimenetelmien työjärjestys on kuvattu kansainvälisissä 
ja kansallisissa standardeissa (katso liitettä).  
1.6.1  Ebulliometrimenetelmä  
Katso liitettä.  
1.6.2  Dynaaminen menetelmä  
Katso testimenetelmää A4, höyrynpaineen määritys.  
Rekisteröidään havaittu kiehumislämpötila 101,325 kPa:n paineessa.  
1.6.3  Tislausmenetelmä  
Katso liitettä.  
1.6.4  Siwoloboffin menetelmä  
Näyte pannaan putkiottimeen, jonka halkaisija on noin 5 mm (kuva 1). 
Putkiotinta kuumennetaan sulamislaitteella.  
Kuvassa 1 on lasista valmistettu standardisoitu sulamis- ja kiehumis ­
lämpötilalaite (JIS K 0064). Kaikki mitat ovat millimetreinä.  
Kuva 1
  
Kapillaariputki (kiehumiskapillaari), joka on suljettu noin 1 cm ala ­
reunan yläpuolelta, asetetaan putkiottimeen. Näytettä lisätään niin paljon, että kapillaariputken suljettu osa on nestepinnan alapuolella. 
Kiehumiskapillaarin sisältävä putkiotin kiinnitetään lämpömittariin 
kuminauhan avulla tai tuetaan sivulta muulla tavoin (katso kuva 2).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 21
 
Kuva 2  
Siwoloboffin periaate  Kuva 3  
Muunneltu periaate
  
Haudeneste valitaan mitattavan kiehumislämpötilan mukaan. Mitatta ­
essa alle 573 K:n lämpötiloja voidaan käyttää silikoniöljyä. Parafii ­
niöljyä voidaan käyttää vain 473 K:iin asti. Alussa haudenestettä kuumennetaan siten, että lämpötila nousee 3 K/min. Kuumentamisen 
aikana nestettä on hämmennettävä. Kun lämpötila on noin 
10 K odotetun kiehumispisteen alapuolella, kuumennusta hidastetaan, niin että lämpötila nousee alle 1 K/min. Kun lämpötila on saavutta ­
nut kiehumispisteen, kiehumiskapillaarista alkaa nopeasti nousta 
kuplia.
 
Kiehumislämpötila on lämpötila, jossa kuplien nousu lakkaa ja neste 
alkaa nousta nopeasti kapillaariputkessa hetkellisen jäähdyttämisen 
seurauksena. Lämpömittarin lukema osoittaa tällöin näytteen kiehu ­
mislämpötilaa.  
Muunnetun periaatteen mukaan (kuva 3) kiehumispiste määritetään 
sulamislämpötilakapillaarin avulla. Kapillaariputkeen imetään näytet ­
tä, kunnes näytepatsaan korkeus kapillaarissa on noin 2 cm (a). Kapillaariputken kapea pää suljetaan sulattamalla ja pieni ilmakupla jätetään ääripäähän. Kun putkea kuumennetaan sulamislämpötilalait ­
teessa (b), ilmakupla laajenee. Kiehumislämpötila on se lämpötila, 
jossa näytteen muodostama tulppa saavuttaa haudenesteen pinnan (c).
 
1.6.5  Valokennomenetelmä  
Tässä menetelmässä kuumennettava näyte on metallikappaleeseen 
asetetussa kapillaariputkessa.  
Metallikappaleen reikien kautta johdetaan valonsäde näytteen läpi 
tarkasti kalibroituun valokennoon.  
Kun näytteen lämpötila nousee, kiehumiskapillaarista nousee yksit ­
täisiä kuplia. Kun kiehumislämpötila saavutetaan, kuplien määrä li ­
sääntyy huomattavasti. Tämä aiheuttaa muutoksen valokennon rekis ­
teröimässä valon intensiteetissä. Valokennosta lähtee pysäytyssig ­
naali osoitinlaitteeseen, joka lukee metallikappaleessa sijaitsevan pla ­
tinavastuslämpömittarin lukeman.  
Tämä menetelmä on erityisen käytännöllinen, koska sillä voidaan 
tehdä määrityksiä kylmissä lämpötiloissa — jopa 253,15 K:ssa 
(–20  o C:ssa) asti — ilman laitteeseen tehtäviä muutoksia. Riittää, 
kun laite asetetaan jäähdytyshauteeseen.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 22
 
1.6.6  Terminen analyysi  
1.6.6.1  Differentiaaliterminen analyysi  
Katso liitettä.  
1.6.6.2  Differentiaalinen pyyhkäisykalorimetria  
Katso liitettä.  
2. TIEDOT  
Kun poikkeamat normaalipaineesta ovat pieniä (enintään ± 5 kPa), 
kiehumislämpötilat normalisoidaan T  n :ään Sidney Youngin yhtälön 
avulla:  
T n = T + (f  T xΔp) 
jossa:  
Δp = (101,325 - p) [huomaa etumerkki]  
p = paine (kPa)  
f T = kiehumislämpötilan muutos paineen funktiona (K/kPa)  
T = mitattu kiehumislämpötila (K)  
T n = normaalipaineeseen korjattu kiehumislämpötila (K).  
Lämpötilan korjausvakiot (f  T ) ja yhtälöt näiden vakioiden likiarvojen 
laskemista varten sisältyvät monien aineiden kohdalla edellä mainit ­
tuihin kansainvälisiin ja kansallisiin standardeihin.  
Esimerkiksi DIN 53171 -menetelmä mainitsee seuraavat karkeat kor ­
jaukset maaleissa käytettävien liuottimien osalta:  
Taulukko 2  
Lämpötilat ja vastaavat korjauskertoimet f  T 
Lämpötila T (K) Korjauskerroin f  T (K/kPa)  
323,15 0,26 
348,15 0,28 
373,15 0,31 
398,15 0,33 
423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 23
 
3. RAPORTOINTI  
Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat 
tiedot:  
— käytetty menetelmä,  
— aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot, epäpuhtaudet) ja 
mahdolliset esipuhdistukset,  
— arvio tarkkuudesta.  
Kiehumislämpötilana raportoidaan vähintään kahden, arvioidun tark ­
kuusalueen (katso taulukoita) sisällä olevan mittauksen keskiarvo.  
Ilmoitetaan mitatut kiehumislämpötilat ja näiden keskiarvo. Mittaus ­
hetkellä vallinnut paine ilmoitetaan kilopascaleina (kPa). Paineen 
tulisi olla lähellä normaalia ilmakehän painetta.  
Raporttiin tulee sisällyttää myös kaikki tiedot ja huomautukset, joilla 
on merkitystä tulosten tulkinnan kannalta, erityisesti epäpuhtauksien ja aineen fysikaalisen olomuodon osalta.
 
4. VIITTEET  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 Final.  
(2) UICPA, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, London, 1975, vol. II.  
(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 24
 
Liite 
Lisää teknisiä tietoja on seuraavissa standardeissa.  
1. Ebulliometri  
ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of 
engine anti-freezes  
2. Tislausprosessi (kiehumisalue)  
ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation 
Yield and Distillation Range) 
BS 4349/68 Method for determination of distillation of 
petroleum products 
BS 4591/71 Method for the determination of distilla ­
tion characteristics 
DIN 53171 Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestim ­
mung des Siedeverlaufes 
NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement 
et de l'intervalle de distillation  
3. Differentiaaliterminen analyysi ja differentiaalinen pyyhkäisyka ­
lorimetria  
ASTM F 537 76 Standard method for assessing the thermal 
stability of chemicals by methods of dif ­
ferential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definition of terms relating to 
thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoana ­
lytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 25
 
A.3 SUHTEELLINEN TIHEYS  
1. MENETELMÄ  
Tässä kuvattavat menetelmät perustuvat pääosin OECD:n testiohjei ­
siin (1). Perusperiaatteet kuvataan viitteessä (2).  
1.1 JOHDANTO  
Tässä kuvattavia suhteellisen tiheyden määritysmenetelmiä voidaan 
soveltaa kiinteisiin ja nestemäisiin aineisiin, ilman rajoituksia ainei ­
den puhtauden suhteen. Luettelo menetelmistä on taulukossa 1.  
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Kiinteiden ja nestemäisten aineiden suhteellinen tiheys (D  20 4 ) ilmaisee 
tutkittavan aineen (t = 20  o C) tilavuuden massan ja saman vesimää ­
rän (t = 4  o C) massan suhteen. Suhteellisella tiheydellä ei ole yksik ­
köä. 
Aineen tiheys ρ on sen massan (m) ja tilavuuden (v) suhde.  
Tiheys ρ ilmaistaan SI-yksikköinä kg/m  3 . 
1.3 VERTAILUAINEET  
Uutta ainetta tutkittaessa ei aina tarvitse käyttää vertailuaineita. Ver ­
tailuaineita käytetään lähinnä menetelmän toimivuuden ajoittaiseen tarkistamiseen ja verrattaessa tuloksia muiden menetelmien avulla saatuihin tuloksiin.
 
1.4 TESTIMENETELMIEN PERIAATTEET  
Käytössä on neljä menetelmäluokkaa.  
1.4.1  Nesteeseen perustuvat menetelmät  
1.4.1.1  Hydrometri  (nestemäiset aineet)  
Nesteen tiheys voidaan määrittää nopeasti ja tyydyttävän tarkasti 
kelluvan hydrometrin avulla, jonka asteikosta voidaan lukea uppoa ­
missyvyyteen perustuva tiheyslukema.  
1.4.1.2  Hydrostaattinen vaaka  (nestemäiset ja kiinteät aineet)  
Aineen tiheys voidaan määrittää punnitsemalla näyte ensin ilmassa ja 
sen jälkeen sopivassa nesteessä (esimerkiksi vedessä).  
Kiinteiden aineiden kohdalla mitattu tiheys on edustava vain kysei ­
sen näytteen osalta. Nesteiden tiheys määritetään siten, että tunnettu 
tilavuus (v) punnitaan ensin ilmassa ja sen jälkeen nesteessä.  
1.4.1.3  Uppokappalemenetelmä  (nestemäiset aineet) (4)  
Tässä menetelmässä nesteen tiheys määritetään kahden punnitustu ­
loksen eron perusteella. Kun näyte on ensin punnittu, siihen upote ­
taan kappale, jonka tilavuus on tunnettu, ja punnitus toistetaan.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 26
 
1.4.2  Pyknometrimenetelmät  
Erimuotoisia pyknometrejä, joiden tilavuus on tunnettu, voidaan 
käyttää kiinteiden ja nestemäisten aineiden tiheyksien määritykseen. Tiheys lasketaan täyden ja tyhjän pyknometrin painoeron ja sen 
tunnetun tilavuuden perusteella.
 
1.4.3  Kaasuvertailupyknometri  (kiinteät aineet)  
Kaasuvertailupyknometrin avulla voidaan mitata minkä tahansa ai ­
neen tiheys huoneenlämpötilassa, olipa aineen muoto mikä tahansa. 
Aineen tilavuus mitataan ilmassa tai inerttikaasussa sylinterissä, 
jonka tilavuus on muutettavissa ja kalibroitu. Tiheyden laskemista varten mitataan tilavuusmittauksen jälkeen aineen massa.
 
1.4.4  Oskilloiva densitometri  (5) (6) (7)  
Tämän laitteen avulla voidaan mitata nesteen tiheys. U-putken muo ­
toinen mekaaninen oskillaattori asetetaan värähtelemään oskillaatto ­
rin resonanssitaajuudella, joka määräytyy oskillaattorin massan mu ­
kaan. Kun oskillaattoriin pannaan näyte, resonanssitaajuus muuttuu. 
Laitteen kalibroinnissa käytetään kahta nestemäistä ainetta, joiden 
tiheys tunnetaan. Kalibrointiaineet valitaan siten, että niiden tiheydet kattavat mitattavan alueen.
 
1.5 LAATUKRITEERIT  
Jäljempänä olevassa taulukossa esitetään suhteellisen tiheyden mää ­
ritysmenetelmien soveltuvuus eri tarkoituksiin.  
1.6 MENETELMÄKUVAUKSET  
Lisätietoja teknisistä yksityiskohdista on mm. liitteessä mainituissa 
standardeissa.  
Testit tulee suorittaa lämpötilassa 20  o C. Vähintään kaksi mittausta 
vaaditaan.  
2. TIEDOT  
Katso standardeja.  
3. RAPORTOINTI  
Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat 
tiedot:  
— käytetty menetelmä,  
— aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot, epäpuhtaudet) ja 
mahdolliset esipuhdistukset.  
Suhteellinen tiheys ( D 20 
4 ) raportoidaan kohdan 1.2 määrityksen mu ­
kaan. Lisäksi on mainittava mitattavan aineen fysikaalinen olomuoto.  
Raporttiin tulee sisällyttää myös kaikki tiedot ja huomautukset, joilla 
on merkitystä tulosten tulkinnan kannalta, erityisesti epäpuhtauksien 
ja aineen fysikaalisen olomuodon osalta.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 27
 
Taulukko  
menetelmien soveltuvuus  
Mittausmenetelmä Tiheys Suurin mahdollinen 
dynaaminen 
viskositeetti Nykyiset standardit 
kiinteä aine neste  
1.4.1.1 Hydrometri kyllä 5 Pa s ISO 387, 
ISO 649-2, 
NF T 20-050 
1.4.1.2 Hydrostaattinen vaaka (a) kiinteät aineet kyllä ISO 1183 (A) (b) nesteet kyllä 5 Pa s ISO 901 ja 758 
1.4.1.3 Uppokappalemenetelmä kyllä 20 Pa s DIN 53217 
1.4.2 Pyknometri ISO 3507 (a) kiinteät aineet kyllä ISO 1183 (B), 
NF T 20-053 
(b) nesteet kyllä 500 Pa s ISO 758 
1.4.3 Kaasuvertailupyknometri kyllä DIN 55990 Teil 3, 
DIN 53243 
1.4.4 Oskilloiva densitometri kyllä 5 Pa s
 
4. VIITTEET  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 Final.  
(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Chapter IV, Inters ­
cience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1.  
(3) IUPAC, Recommended reference materials for realisation of 
physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, 
vol. 48, 508.  
(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte 
von Fliissigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. 11, 427–430.
 
(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektro ­
nik, 1970, vol. 19, 297–302.  
(6) Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeug ­
nissen — Verfahren zur Dichteb estimmung bei flüssigen Pro ­
dukten und ihre praktische Anwendung — Die Pharmazeuti ­
sche Industrie, 1975, vol. 37, 717–726.  
(7) Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im 
Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253–255.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 28
 
Liite 
Lisää teknisiä tietoja on seuraavissa standardeissa:  
1. Nesteeseen perustuvat menetelmät  
1.1 Hydrometri 
DIN 12790, IS0 387 Hydrormeter; general instructions 
DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, 
adjustment and use 
Part II: Density hydrometers; standardized 
sizes, designation 
Part III: Use and test 
ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrome ­
ters for general purpose 
NF T 20-050 Chemical products for industrial use — 
Determination of density of liquids — Areometric method 
DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydro ­
meters
 
1.2 Hydrostaattinen vaaka  
Kiinteät aineet  
ISO 1183 Method A: Methods for determining the 
density and relative density of plastics excluding cellular plastics 
NF T 20-049 Chemical products for industrial use — 
Determination of density and relative den ­
sity of solids other than powders and cel ­
lular products — Hydrostatic balance method 
ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by 
displacement 
DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; deter ­
mination of density
 
Nestemäiset aineet  
ISO 901 ISO 758  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 29
 
DIN 51757 Testing of mineral oils and related mate ­
rials; determination of density 
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 ja ASTM D 1481-62 
ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum pro ­
ducts by hydrometer method 
BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum pro ­
ducts by hydrometer method  
1.3 Uppokappalemenetelmät 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
coating materials; determination of densi ­
ty; immersed body method  
2. Pyknometriset menetelmät  
2.1 Nestemäiset aineet 
ISO 3507 Pycnometers 
ISO 758 Liquid chemical products; determination 
of density at 20  o C 
DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile 
liquids which are not too viscous) 
DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with 
a kinematic viscosity of less than 100 × 10
 -6 m 2 s -1 at 15  o C) 
DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 
12798) 
DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a 
kinematic viscosity of less than 100 × 
10 -6 m 2 s -1 at 20  o C, applicable in parti ­
cular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher 
vapour pressure, approximately 1 bar at 
90
 o C) ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 30
 
DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids 
of all types which do not have a too high 
vapour pressure, in particular also for 
paints, varnishes and bitumen) 
DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in 
DIN 12801) 
DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for et ­
hanol-water mixture) 
DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer 
and capillary side rube (for liquids which are not too viscous) 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
products; determination of density by pyc ­
nometer 
DIN 51757 Point 7: testing of mineral oils and related 
materials; determination of density 
ASTM D 297 Section 15: Rubber products — chemical 
analysis 
ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compo ­
unds 
BS 4699 Method for determination of specific gra ­
vity and density of petroleum products 
(graduated bicapillary pycnometer met ­
hod) 
BS 5903 Method for determination of relative den ­
sity and density of petroleum products by 
the capillary — stoppered pycnometer 
method 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use — 
Determination of density of solids in powder and liquids — Pycnometric met ­
hod
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 31
 
2.2 Kiinteät aineet 
ISO 1183 Method B: Methods for determining the 
density and relative density of plastics excluding cellular plastics 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use — 
Determination of density of solids in 
powder and liquids — Pycnometric met ­
hod 
DIN 19683 Determination of the density of soils
 
3. Kaasuvertailupyknometri  
DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und 
ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulver ­
lack; Bestimmung der Dichte 
DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; 
Prüfung  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 32
 
A.4. HÖYRYNPAINE  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 104 (2004).  
1.1 JOHDANTO  
Tämä testimenetelmän A.4 (1) tarkistettu versio sisältää yhden uuden 
menetelmän. Kyseessä on effuusiomenetelmä: isoterminen termogra ­
vimetria, joka on kehitetty sellaisia aineita varten, joiden höyryn ­
paine on hyvin alhainen (arvoon 10  –10 saakka). Koska uusia mene ­
telmiä tarvitaan erityisesti sellaisten aineiden höyrynpaineen määrit ­
tämiseksi, joiden höyrynpaine on alhainen, muita tähän testimenetel ­
män kuuluvia menetelmiä arvioidaan uudelleen sen perusteella, voi ­
daanko niitä käyttää muillakin määritysalueilla.  
Termodynaamisen tasapainon vallitessa puhtaan aineen höyrynpaine 
vaihtelee ainoastaan lämpötilan funktiona. Perusperiaatteita käsitel ­
lään kirjallisuuslähteissä (2)(3).  
Mitään yksittäistä mittausmenetelmää ei voida käyttää koko höyryn ­
painealueella arvoa 10  –10 pienemmistä arvoista arvoon 10  5 Pa. Tähän 
testimenetelmään kuuluu kahdeksan höyrynpaineen mittausmenetel ­
mää, joita voidaan käyttää eri höyrynpainealueilla. Eri menetelmiä verrataan niiden soveltuvuuden ja mittausalueen suhteen taulukossa 1. Menetelmiä voidaan käyttää ainoastaan sellaisten yhdisteiden tut ­
kimiseen, jotka eivät hajoa testiolosuhteissa. Jos kokeellisia menetel ­
miä ei voida käyttää teknisistä syistä, höyrynpaine voidaan myös arvioida. Sopivaa arviointimenetelmää kuvataan tämän testimenetel ­
män lisäyksessä.
 
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Määritelmän mukaan aineen höyrynpaine on kiinteään tai nestemäi ­
seen aineeseen ylhäältä kohdistuva kyllästyspaine.  
Paineen SI-yksikkö on pascal (Pa), jota tulee käyttää tässä yhteydes ­
sä. Aiemmin käytetyt yksiköt ja niiden muuntokertoimet ovat seura ­
avat: 
1 Torr = 1 mm Hg = 1,333 × 10  2 Pa 
1 ilmakehä = 1,013 × 10  5 Pa 
1 baari (bar) = 10  5 Pa 
Lämpötilan SI-yksikkö on kelvin (K). Celsius-asteet muunnetaan 
kelvineiksi seuraavan kaavan avulla:  
T = t + 273,15  
jossa T on kelvineinä ilmaistu termodynaaminen lämpötila ja t on 
lämpötila Celsius-asteina.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 33
 
Taulukko 1  
Mittausmenetelmä Aineet Arvioitu 
toistettavuus Arvioitu 
uusittavuus Suositeltu alue 
Kiinteät Nestemäiset  
Dynaaminen mene ­
telmä Alhainen su ­
lamispiste Kyllä Enintään 
25 % 
1–5 % Enintään 
25 % 
1–5 % 10 3 Pa – 2 × 
10 3 Pa 
2 × 10  3 Pa – 
10 5 Pa 
Staattinen mene ­
telmä Kyllä Kyllä 5–10 % 5–10 % 10 Pa – 10  5 Pa 
10 –2 Pa – 10  5 
Pa (  1 ) 
Isoteniskooppime ­
netelmä Kyllä Kyllä 5–10 % 5–10 % 10  2 Pa – 10  5 Pa 
Effuusiomenetelmä: 
höyrynpainevaaka Kyllä Kyllä 5–20 % Enintään 
50 % 10 –3 – 1 Pa 
Effuusiomenetelmä: 
Knudsen-kenno Kyllä Kyllä 10–30 % — 10  –10 – 1 P 
Effuusiomenetelmä: 
isoterminen ter ­
mogravimetria Kyllä Kyllä 5–30 % Enintään 
50 % 10 –10 – 1 Pa 
Kaasunkyllästysme ­
netelmä Kyllä Kyllä 10–30 % Enintään 
50 % 10 –10 – 10  3 Pa 
Pyörivä roottori 
-menetelmä Kyllä Kyllä 10–20 % — 10  –4 –0,5 Pa  
( 1 ) Käytettäessä kapasitanssimanometriä.  
1.3 TESTIN PERIAATE  
Höyrynpaine määritetään yleensä eri lämpötiloissa. Rajoitetulla läm ­
pötila-alueella puhtaan aineen höyrynpaineen logaritmi on Clausiuk ­
sen ja Clapeyronin yksinkertaistetun yhtälön mukaan suoraan verran ­
nollinen lämpötilan käänteisarvoon:  
log p ¼ ΔHv 
2; 3RT þ vakio  
jossa  
p = höyrynpaine (Pa)  
ΔHv = höyrystymislämpö (J mol  –1 ) 
R = yleinen kaasuvakio (8,314 J mol  –1 K –1 ) 
T = lämpötila (K).  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 34
 
1.4 VERTAILUAINEET  
Vertailuaineita ei tarvitse käyttää. Niitä käytetään lähinnä silloin, kun 
menetelmän toimivuutta tarkistetaan ajoittain tai kun eri menetelmillä saatuja tuloksia verrataan toisiinsa.
 
1.5 MENETELMIEN KUVAUS  
1.5.1  Dynaaminen menetelmä (Cottrellin menetelmä)  
1.5.1.1  Periaate  
Höyrynpaine määritetään mittaamalla aineen kiehumispiste useissa 
ennalta määrätyissä paineissa suunnilleen alueella 10  3 –10  5 Pa. Me­
netelmää suositellaan myös kiehumispisteen määritykseen, jossa sitä 
voidaan käyttää lämpötilaan 600 K saakka. Nesteiden kiehumispis ­
teet ovat noin 0,1 °C suurempia 3–4 cm:n syvyydellä kuin pinnassa, mikä johtuu nestepatsaan hydrostaattisesta paineesta. Cottrellin me ­
netelmässä (4) lämpömittari viedään nestepinnan yläpuolella olevaan 
höyryyn ja kiehuvaa nestettä pumpataan jatkuvasti lämpömittarin nupin yli. Nuppia peittää ohut nestekerros, joka on tasapainossa höyryn kanssa ilmakehän paineessa. Lämpömittari osoittaa siis todel ­
lisen kiehumispisteen ilman ylikuumennuksesta tai hydrostaattisesta 
paineesta johtuvia virheitä. Kuva 1 esittää Cottrellin alun perin käyt ­
tämää pumppua. Kiehuva neste on putkessa A. Putken pohjaan kiin ­
nitetty platinalanka B tasoittaa kiehumista. Sivuputki C johtaa lauh ­
duttimeen, ja vaippa D estää kylmää lauhdetta pääsemästä lämpömit ­
tarille E. Kun putkessa A oleva neste kiehuu, suppiloon jääneet kuplat ja neste huuhtovat pumpun F molempien haarojen kautta lämpömittarin nuppia.  
Kuva 1
 Kuva 2
  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 35
 
Cottrellin pumppu (4)  
A: Termopari  
B: Tyhjiön puskuritilavuus  
C: Painemittari  
D: Tyhjiö  
E: Mittauspiste  
F: Lämmitysvastus, noin 150 W  
1.5.1.2  Laite  
Kuva 2 esittää hyvin tarkkaa, Cottrellin periaatteen mukaista laitetta. 
Laitteessa on putki, jonka alaosassa on kiehuntaosa, keskiosassa jäähdytin ja yläosassa ulostulo ja laippa. Cottrellin pumppu sijoite ­
taan kiehuntaosaan, jota kuumennetaan sähköpatruunalla. Lämpötila 
mitataan vaipallisella termoparilla tai vastuslämpömittarilla, joka vie ­
dään laitteen yläosassa olevan laipan kautta sisään. Ulostulo kytke ­
tään paineensäätöjärjestelmään, jossa on tyhjiöpumppu, puskuritila ­
vuus, paineensäädin paineensäätöön tarvittavan typen johtamiseksi 
laitteeseen ja manometri.
 
1.5.1.3  Menettely  
Näyte pannaan putken kiehuntaosaan. Jos näyte ei ole jauheena, 
mahdolliset ongelmat voidaan yrittää ratkaista kuumentamalla jääh ­
dytysvaippaa. Laite suljetaan laipan kohdalta, ja näytteelle tehdään kaasunpoisto. Menetelmä ei sovellu vaahtoavien aineiden mittauk ­
seen.
 
Tämän jälkeen asetetaan alin haluttu paine ja aloitetaan kuumennus. 
Lämpöanturi kytketään samalla rekisteröintilaitteeseen.  
Järjestelmässä vallitsee tasapaino, kun vakiopaineessa mitattu kiehu ­
mislämpötila pysyy vakiona. Kiehumisen aikana on erityisesti vältet ­
tävä näytteen ”poukkoilua”. Lisäksi jäähdyttimellä on tapahduttava 
täydellinen tiivistyminen. Jos höyrynpaineen määritys tehdään kiin ­
teälle aineelle, jonka sulamispiste on alhainen, on varottava lauhdut ­
timen tukkeutumista.  
Tasapainopisteen kirjaamisen jälkeen asetetaan uusi, suurempi paine. 
Mittauksia jatketaan 10  5 Pa:n paineeseen asti (yhteensä 
5–10 mittausta). Tulokset tarkistetaan toistamalla mittaukset laske ­
vassa painejärjestyksessä.  
1.5.2  Staattinen menetelmä  
1.5.2.1  Periaate  
Staattisessa menetelmässä (5) mitataan tiettyä lämpötilaa vastaava 
höyrynpaine termodynaamisen tasapainon vallitessa. Menetelmä so ­
veltuu kiinteiden ja nestemäisten yksi- tai monikomponenttiaineiden 
tutkimiseen alueella 10–10  5 Pa ja huolellisuutta noudattaen myös 
alueella 1–10 Pa.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 36
 
1.5.2.2  Laite  
Laitteessa on vakiolämpöinen haude (tarkkuus ± 0,2 K), näyteastia, 
joka on liitetty tyhjiölinjaan, sekä manometri ja paineensäätöjärjes ­
telmä. Näytekammio (kuva 3 a) on liitetty venttiilin välityksellä 
tyhjiölinjaan ja differentiaalimanometriin (sopivaa painemittarines ­
tettä sisältävään U-putkeen), joka toimii nollaosoittimena. Differen ­
tiaalimanometrissa voidaan painealueen ja näytteen kemiallisen käyt ­
täytymisen perusteella käyttää elohopeaa, silikoneja tai ftalaatteja. 
Elohopean käyttöä on kuitenkin vältettävä ympäristösyistä, jos se 
on mahdollista. Näyte ei saa mainittavassa määrin liueta U-putken nesteeseen tai reagoida sen kanssa. U-putken sijasta voidaan käyttää 
painemittaria (kuva 3 b). Manometrissa voidaan käyttää elohopeaa 
normaalista ilmanpaineesta 10
 2 Pa:iin asti sekä silikoninesteitä ja 
ftalaatteja painealueella 10–10  2 Pa. Käytössä on myös muuntyyppisiä 
painemittareita alle 10  2 Pa:n mittauksia varten, ja kuumakalvomano ­
metreja voidaan käyttää jopa alle 10  –1 Pa:n paineessa. Lämpötila 
mitataan näyteastian ulkopuolelta tai astian sisältä.  
1.5.2.3  Menettely  
Kuvan 3 a laitetta käytettäessä U-putki täytetään valitulla nesteellä, 
jolle on tehtävä kaasunpoisto korkeassa lämpötilassa ennen mittauk ­
sia. Näytettä pannaan laitteeseen ja sille tehdään kaasunpoisto alen ­
netussa lämpötilassa. Jos näyte on monikomponenttinen, lämpötilan on oltava niin alhainen, ettei aineen koostumus muutu. Tasapaino voidaan saavuttaa nopeammin sekoittamalla näytettä. Näyte voidaan 
jäähdyttää nestemäisellä typellä tai hiilihappojäällä, mutta silloin on 
varottava ilmankosteuden tai pumppunesteen lauhtumista. Näyte ­
astian venttiili avataan ja ilma poistetaan ylläpitämällä imua usean minuutin ajan. Ilmanpoisto toistetaan tarvittaessa useita kertoja.  
Kuva 3 a
 Kuva 3 b
  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 37
 
Kun näytettä kuumennetaan venttiilin ollessa suljettu, höyrynpaine 
kasvaa, mikä vaikuttaa U-putken nestepatsaan tasapainoon. Tämä 
kompensoidaan päästämällä typpeä tai ilmaa laitteeseen, kunnes pai ­
ne-eron osoitin palaa nollaan. Tähän vaadittava paine voidaan lukea manometrista tai tarkemmasta mittauslaitteesta. Paine vastaa näytteen 
höyrynpainetta kyseisessä mittauslämpötilassa. Käytettäessä kuvan 3 
b laitetta höyrynpaineen lukema saadaan suoraan.
 
Höyrynpaine määritetään sopivin lämpötilavälein (yhteensä 
5–10 mittausta) haluttuun maksimilämpötilaan asti.  
Alhaisen lämpötilan mittaukset on toistettava tarkistuksen vuoksi. Jos 
toistomittauksista saadut tulokset eivät ole yhteneviä lämpötilan nos ­
ton aikana saatujen tulosten kanssa, syy voi olla jokin seuraavista:  
i) Näyte sisältää vielä ilmaa (esimerkiksi aineet, joiden viskositeetti 
on suuri) tai alhaisessa lämpötilassa kiehuvaa ainetta, joka vapau ­
tuu kuumentamisen aikana.  
ii) Näytteessä tapahtuu kemiallinen reaktio (esimerkiksi hajoaminen 
tai polymerisoituminen) mitattavalla lämpötila-alueella.  
1.5.3  Isoteniskooppimenetelmä  
1.5.3.1  Periaate  
Isoteniskooppimenetelmä (6) rakentuu staattisen menetelmän periaat ­
teelle. Menetelmässä näyte pannaan isoteniskoopin laajennukseen, 
jota pidetään vakiolämpötilassa. Laajennus on liitetty manometriin 
ja tyhjiöpumppuun. Epäpuhtaudet, jotka ovat haihtuvampia kuin näy ­
te, poistetaan tekemällä kaasunpoisto alennetussa paineessa. Näytteen höyrynpaine valituissa lämpötiloissa saatetaan tasapainoon inertin 
kaasun tunnetun paineen kanssa. Isoteniskooppi kehitettiin mittaa ­
maan tiettyjen nestemäisten hiilivetyjen höyrynpainetta, mutta se so ­
veltuu myös kiinteiden aineiden tutkimiseen. Menetelmä ei yleensä sovellu monikomponenttijärjestelmien tutkimiseen. Haihtumattomia 
epäpuhtauksia sisältävistä näytteistä saaduissa tuloksissa on vain pie ­
niä virheitä. Suositeltava mittausalue on 10
 2 –10  5 Pa. 
1.5.3.2  Laite  
Kuvassa 4 on esimerkki mittauslaitteesta. Täydellinen kuvaus esite ­
tään testimenetelmässä ASTM D 2879-86 (6).  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 38
 
1.5.3.3  Menettely  
Nestemäiset näytteet toimivat samalla differentiaalimanometrin nes ­
teenä. Isoteniskooppiin lisätään nestettä niin paljon, että sen laajen ­
nus ja manometrin lyhyempi jalka täyttyvät. Isoteniskooppi liitetään 
tyhjiöjärjestelmään ja siitä poistetaan ilma, minkä jälkeen se täyte ­
tään typellä. Tämä toistetaan kaksi kertaa hapenjäännösten poistami ­
seksi. Täytetty isoteniskooppi asetetaan vaaka-asentoon siten, että näyte leviää ohueksi kerrokseksi laajennuksessa ja manometrissa. 
Järjestelmän paine lasketaan arvoon 133 Pa ja näytettä kuumennetaan 
varovasti, kunnes se alkaa kiehua (näytteeseen liuenneiden kaasujen poisto). Isoteniskoopin asentoa muutetaan niin, että näyte palaa laa ­
jennukseen ja täyttää manometrin lyhyemmän jalan. Paine pidetään 
133 Pa:ssa. Laajennuksen nokkaa kuumennetaan pienen liekin avul ­
la, kunnes näytteestä vapautuu niin paljon höyryä, että näytettä työn ­
tyy laajennuksen yläosasta ja manometrin varresta isoteniskoopin 
manometriosaan, jolloin muodostuu höyrytäytteinen tila, jossa ei 
ole typpeä. Tämän jälkeen isoteniskooppi asetetaan hauteeseen, jonka lämpötila on vakio, ja typen painetta säädetään, kunnes se on sama kuin näytteen paine. Tässä tilanteessa typen ja näytteen höyrynpaine 
on sama.
 
Kuva 4
  
Kiinteiden aineiden tutkimiseen käytetään silikoninesteiden tai fta ­
laattien kaltaisia manometrinesteitä. Manometrinesteen valinta riip ­
puu kulloisestakin paine- ja lämpötila-alueesta. Manometrineste, jolle on tehty kaasunpoisto, lisätään isoteniskoopin pidemmän varren pul ­
listumaan. Näyte pannaan laajennukseen, ja sille tehdään kaasun ­
poisto korkeassa lämpötilassa, minkä jälkeen isoteniskooppia kallis ­
tetaan, kunnes manometrineste virtaa U-putkeen.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 39
 
1.5.4  Effuusiomenetelmä: höyrynpainevaaka  (7) 
1.5.4.1  Periaate  
Tutkittavasta aineesta otetaan näyte, jota kuumennetaan pienessä uu ­
nissa kelloastiassa, josta on poistettu ilma. Uuni on peitetty kannella, 
jossa on pieniä aukkoja, joiden halkaisijat tunnetaan. Höyry, joka va ­
pautuu näytteestä yhden tällaisen aukon kautta, johdetaan samassa kel ­
loastiassa olevan erittäin herkän vaa’an vaakakuppiin. Joissakin koe ­
järjestelyissä vaakakupin ympärillä on jäähdytyslaatikko, joka johtaa lämmön ulkopuolelle. Vaakakuppi jäähdytetään säteilyn avulla, jotta vapautuva höyry tiivistyisi kupin pinnalle. Höyryvirran momentti toi ­
mii vaakaan kohdistuvana voimana. Höyrynpaine voidaan määrittää 
kahdella tavalla: suoraan vaakakuppiin kohdistuvasta voimasta tai haihtumisnopeudesta Hertzin ja Knudsenin yhtälön (2) avulla:
 
p ¼ G ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
2πRT Ü 10  3 
M s 
jossa:  
G = haihtumisnopeus (kg s  –1 m –2 ) 
M = moolimassa (g mol  –1 ) 
T = lämpötila (K)  
R = yleinen kaasuvakio (J mol  –1 K –1 ) 
p = höyrynpaine (Pa)  
Suositeltava mittausalue on 10  –3 –1 Pa.  
1.5.4.2  Laite  
Kuva 5 havainnollistaa laitteen yleistä periaatetta.  
Kuva 5
  
A: Aluslevy F: Jäähdytyslaatikko ja kylmätanko 
B: Kiertokäämimittari G: Haihdutusuuni C: Kelloastia H: Dewar-astia, jossa on nestemäistä typpeä D: Vaaka ja vaakakuppi I: Näytteen lämpötilan mittaus E: Tyhjiömittari J: Näyte
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 40
 
1.5.5  Effuusiomenetelmä: Knudsen-kenno  
1.5.5.1  Periaate  
Menetelmä perustuu Knudsen-kennosta (8) aikayksikköä kohti vir ­
taavan, höyrymäisen näytteen massan mittaamiseen. Virtaus tapahtuu mikroaukon läpi ultratyhjiössä. Ulos virtaavan höyryn massa saadaan 
joko määrittämällä kennon painohäviö tai tiivistämällä höyry alhai ­
sessa lämpötilassa, minkä jälkeen höyrystyneen aineen määrä voi ­
daan määrittää kromatografian avulla. Höyrynpaine lasketaan Hertzin ja Knudsenin yhtälön avulla (ks. kohta 1.5.4.1) käyttämällä korjaus ­
kertoimia, jotka riippuvat laitteen parametreista (9). Suositeltava mit ­
tausalue on 10
 –10 –1 Pa (10)(11)(12)(13)(14).  
1.5.5.2  Laite  
Kuva 6 havainnollistaa laitteen yleistä periaatetta.  
Kuva 6
  
1: Tyhjiöliitäntä 7: Kierrekansi 
2: Suojatasku platinavastuslämpömittaria tai 
lämpötilan mittausta ja säätöä varten 8: Siipimutterit 
3: Tyhjiösäiliön kansi 9: Pultit 
4: O-rengas 10: Effuusiokennot (ruostumatonta terästä) 5: Tyhjiösäiliö (alumiinia) 11: Lämpöpatruuna 
6: Effuusiokennojen asetus- ja poistolaite
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 41
 
1.5.6  Effuusiomenetelmä: isoterminen termogravimetria  
1.5.6.1  Periaate  
Menetelmässä määritetään näytteen kiihdytetyt haihtumisnopeudet 
korkeissa lämpötiloissa ja ympäröivässä paineessa termogravimetrian 
avulla (10)(15)(16)(17)(18)(19)(20). Haihtumisnopeudet v  T saadaan 
käsittelemällä valittua ainetta hitaasti virtaavalla inertillä kaasulla ja rekisteröimällä painohäviö tietyissä isotermisissä lämpötiloissa T (kelvineinä) tiettyjen ajanjaksojen kuluessa. Höyrynpaineet p
 T laske­
taan v  T -arvoista höyrynpaineen logaritmin ja haihtumisnopeuden lo ­
garitmin lineaarisen suhteen perusteella. Tarvittaessa voidaan tehdä ekstrapolointi lämpötiloihin 20 ja 25 °C tekemällä regressioanalyysi 
logaritmista p
 T lämpötilan käänteisarvon 1/T suhteen. Menetelmällä 
voidaan tutkia aineita, joiden höyrynpaine voi olla niinkin alhainen kuin 10
 –10 Pa (10  –12 mbar). Tutkittavien aineiden puhtauden on 
oltava niin lähellä 100:aa prosenttia kuin mahdollista, jotta mitattuja 
painohäviöitä ei tulkittaisi väärin.  
1.5.6.2  Laite  
Kuva 7 havainnollistaa koejärjestelyn yleistä periaatetta.  
Kuva 7
  
Lämpötilaohjatussa kammiossa olevaan mikrovaakaan ripustetun 
näytelevyn yli virtaa kuiva typpikaasu, joka kantaa näytteen höyrys ­
tyneet molekyylit mukanaan. Tultuaan ulos kammiosta kaasuvirta puhdistuu sorptioyksikössä.
 
1.5.6.3  Menettely  
Näyte levitetään karhennetun lasilevyn pintaan tasaiseksi kerrokseksi. 
Jos näyte on kiinteä, se liuotetaan sopivalla liuottimella ja liuosta levitetään tasaisesti näytelevylle, joka kuivataan inertissä ympäristös ­
sä. Näin käsitelty levy ripustetaan mittausta varten termogravimetri ­
seen analysaattoriin, ja sen painohäviötä mitataan jatkuvasti ajan 
funktiona.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 42
 
Haihtumisnopeus v  T tietyssä lämpötilassa lasketaan näytelevyn pai ­
nohäviöstä Δm seuraavalla kaavalla:  
v T ¼ Δm 
F Ö t ðgcm  –2 h –1 Þ 
jossa F on levitetyn näytteen pinta-ala (yleensä näytelevyn pinta-ala) 
ja t on painohäviön Δm vaatima aika.  
Höyrynpaine p  T lasketaan haihtumisnopeuden v  T funktiona seuraa ­
van kaavan mukaan:  
Log p  T = C + D log v  T 
jossa C ja D ovat koejärjestelykohtaisia vakioita, jotka riippuvat 
mittauskammion halkaisijasta ja kaasun virtausnopeudesta. Vakiot on määritettävä kerran mittaamalla sarja yhdisteitä, joiden höyryn ­
paineet tiedetään, ja tekemällä regressio, jossa log v
 T riippuu log 
p T :stä (11)(21)(22).  
Höyrynpaineen p  T ja kelvineinä ilmaistun lämpötilan T välinen 
suhde on seuraava:  
Log p  T = A + B 1/T  
jossa A ja B ovat vakioita, jotka on saatu muuttujien log p  T ja 1/T 
välisestä regressiosta. Yhtälön avulla voidaan laskea mitä tahansa 
lämpötilaa vastaava höyrynpaine käyttämällä ekstrapolointia.  
1.5.7  Kaasunkyllästysmenetelmä  (23)  
1.5.7.1  Periaate  
Inerttiä kaasua johdetaan huoneenlämpötilassa tietyllä virtausnopeu ­
della näytteen läpi tai yli siten, että näytteen höyry ehtii kyllästää kaasun. Kaasufaasin kyllästyminen on ratkaisevan tärkeää. Kaasun 
kuljettama aine kerätään talteen, yleensä sorbentin avulla, ja sen 
määrä mitataan. Höyryn keräämisen ja sitä seuraavan analyysin si ­
jasta kuljetettu ainemäärä voidaan määrittää myös suora-analyysin (esimerkiksi kromatografian) avulla. Höyrynpaine lasketaan olettaen, 
että ideaalikaasulaki on voimassa ja että kaasuseoksen kokonaispaine 
on yhtä kuin seoksessa olevien kaasujen paineiden summa. Näytteen osapaine eli höyrynpaine lasketaan kaasujen tunnetun kokonaistila ­
vuuden ja kuljetetun aineen painon avulla.
 
Kaasunkyllästysmenetelmä soveltuu kiinteiden ja nestemäisten ainei ­
den tutkimiseen. Sillä voidaan mitata höyrynpaineita arvoon 10  –10 Pa 
saakka (10)(11)(12)(13)(14). Menetelmä on kaikkein luotettavin mi ­
tattaessa alle 10  3 Pa:n höyrynpaineita. Tätä suuremmilla arvoilla 
höyrynpaineet arvioidaan yleensä liian suuriksi, todennäköisesti ae ­
rosolien muodostumisen vuoksi. Koska höyrynpaineen mittaukset 
tehdään huoneenlämpötilassa, ei ole tarpeen ekstrapoloida korkeam ­
pia lämpötiloja koskevia tietoja. Tällaista ekstrapolointia vältetään, koska se voi aiheuttaa vakavia virheitä.
 
1.5.7.2  Laite  
Menetelmässä käytetään säiliötä, jonka lämpötila on vakio. Kuvan 8 
piirros esittää säiliötä, joka sisältää kolme kiinteän näytteen ja kolme nestemäisen näytteen pidintä. Niiden avulla kiinteästä tai nestemäi ­
sestä näytteestä voidaan tehdä kolme analyysiä. Lämpötila säädetään 
± 0,5 °C:n tarkkuudella tai tarkemmin.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 43
 
Kuva 8
  
Inerttinä kantokaasuna käytetään yleensä typpeä, mutta joskus voi ­
daan tarvita muutakin kaasua (24). Kantokaasun on oltava kuiva. 
Kaasuvirta jaetaan kuudeksi osavirraksi, joita säädetään neulaventtii ­
leillä (aukot noin 0,79 mm) ja jotka johdetaan säiliöön kupariputkien kautta (sisähalkaisija 3,8 mm). Lämpötilatasoituksen jälkeen kaasu 
virtaa näytteen ja sorbenttiloukun läpi ja sen jälkeen ulos säiliöstä.
 
Kiinteä näyte pannaan lasiputkeen, jonka sisähalkaisija on 5 mm ja 
jossa on näytteen molemmin puolin lasivillatulpat (ks. kuva 9). Kuva 10 esittää nestemäisen näytteen pidintä ja sorbenttijärjestelmää. Nes ­
teiden höyrynpaineiden mittauksissa parhaiten toistettavissa oleva 
menetelmä on valaa nestettä lasihelmien tai inertin sorbentin, kuten 
piidioksidin päälle ja täyttää näytteenpidin näillä helmillä. Vaihtoeh ­
tona on antaa kantokaasun kulkea karkean fritin kautta ja kuplia nestemäistä näytettä sisältävän kolonnin läpi.  
Kuva 9
 Kuva 10
  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 44
 
Sorbenttijärjestelmässä on etummainen ja takimmainen sorptio-osa. 
Hyvin alhaisilla höyrypaineilla sorbentti pidättää vain pieniä aine ­
määriä, jolloin adsorboituminen lasivillaan sekä näytteen ja sorbentin välisen lasiputken seiniin voi olla vakava ongelma.
 
Toinen tehokas tapa kerätä höyrystynyt materiaali talteen on käyttää 
loukkuja, jotka jäähdytetään hiilihappojäällä. Ne eivät aiheuta kylläs ­
tymiskolonniin kohdistuvaa vastapainetta, ja niihin jääneen ainemää ­
rän kerääminen on helppoa.  
1.5.7.3  Menettely  
Ulos virtaavan kantokaasun virtausnopeus mitataan huoneenlämpöti ­
lassa. Virtausnopeus tarkistetaan useita kertoja kokeen aikana, jotta kantokaasun kokonaistilavuudesta saadaan luotettava arvo. Jatkuva mittaus massavirtausmittarin avulla on suositeltavaa. Kaasufaasin 
kyllästyminen voi vaatia huomattavan pitkän kontaktiajan, minkä 
vuoksi kaasun virtausnopeuden on oltava suhteellisen pieni (25).
 
Kokeen lopussa sorbenttijärjestelmän molemmat osat analysoidaan 
erikseen. Niissä olevat aineet desorboidaan lisäämällä liuotinta. 
Näin saadut liuokset analysoidaan kvantitatiivisesti, jotta voidaan 
määrittää kummastakin osasta desorboituneen ainemäärän paino. Analyysimenetelmän (kuten myös sorbentin ja desorboivan liuotti ­
men) valinta riippuu näytteen ominaisuuksista. Desorption tehokkuus 
määritetään ruiskuttamalla tunnettu määrä näytettä sorbenttiin, desor ­
boimalla se ja analysoimalla näin saatu määrä. On tärkeää, että de ­
sorption tehokkuus tarkistetaan käyttämällä pitoisuutta, joka on sama tai lähes sama kuin näytteen pitoisuus koeolosuhteissa.
 
Kantokaasun kyllästyminen tutkittavalla aineella varmistetaan käyttä ­
mällä kolmea eri kaasunvirtausnopeutta. Kaasun oletetaan olevan 
kyllästynyt, jos laskettu höyrynpaine ei muutu eri virtausnopeuksilla.  
Höyrynpaine lasketaan seuraavan kaavan avulla:  
p ¼ W 
V Ü RT 
M 
jossa  
p = höyrynpaine (Pa)  
W = haihdutetun näytteen massa (g)  
V = kyllästetyn kaasun tilavuus (m  3 ) 
R = yleinen kaasuvakio (8,314 J mol  –1 K –1 ) 
T = lämpötila (K)  
M = näytteen moolimassa (g mol  –1 ). 
Mitatut tilavuudet on korjattava virtausmittarin ja kyllästimen välis ­
ten paine- ja lämpötilaerojen suhteen.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 45
 
1.5.8  Pyörivä roottori  
1.5.8.1  Periaate  
Menetelmässä käytetään pyörivään roottoriin perustuvaa viskositeet ­
timittaria, jossa mittauselementtinä on pieni teräspallo, joka leijuu 
magneettikentässä ja pyörii pyörivien kenttien vaikutuksesta (26) ­
(27)(28). Pallon pyörimisnopeus saadaan anturikelojen avulla. Kun pallo on saavuttanut tietyn pyörimisnopeuden (yleensä noin 400 kier ­
rosta sekunnissa), magnetointi lopetetaan, jolloin pyöriminen hidas ­
tuu kaasukitkan vaikutuksesta. Pyörimisnopeuden pienenemiset mi ­
tataan ajan funktiona. Höyrynpaine voidaan päätellä määrittämällä teräspallon nopeuden pieneneminen paineen vaikutuksesta. Suositel ­
tava mittausalue on 10
 –4 –0,5 Pa.  
1.5.8.2  Laite  
Laitteen periaatepiirros on kuvassa 11. Mittapää on suljettu vakio ­
lämpöiseen tilaan (säätötarkkuus 0,1 °C). Näytesäiliö asetetaan eril ­
liseen koteloon (säätötarkkuus jälleen 0,1 °C), ja järjestelmän kaikkia muita osia pidetään lämmitettyinä tiivistymisen estämiseksi. Koko laite on liitetty tyhjiöjärjestelmään.
 
Kuva 11
  
2. TIEDOT JA NIIDEN RAPORTOIMINEN  
2.1 TIEDOT  
Kaikissa edellä kuvatuissa menetelmissä höyrynpaine määritetään 
vähintään kahdessa lämpötilassa. Lämpötila-alueella 0–50 °C suosi ­
tellaan vähintään kolmea mittausta, jotta höyrynpainekäyrän lineaa ­
risuus voitaisiin tarkistaa. Käytettäessä effuusiomenetelmää (Knud ­
sen-kennoa tai isotermistä termogravimetriaa) tai kaasunkyllästysme ­
netelmää mittausten lämpötila-alueeksi suositetaan alueen 0–50 °C sijasta aluetta 120–150 °C.
 
2.2 TESTIRAPORTTI  
Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:  
— käytetty menetelmä,  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 46
 
— aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot ja epäpuhtaudet) ja 
mahdolliset esipuhdistukset,  
— vähintään kaksi höyrynpaine- ja lämpötila-arvoa – ja mieluiten 
kolme tai enemmän – alueelta 0–50 °C (tai 120–150 °C),  
— lämpötila-arvoista ainakin yhden on oltava 25 °C tai vähemmän, 
jos se on valitussa menetelmässä teknisesti mahdollista,  
— kaikki lähtöarvot,  
— käyrä, joka kuvaa log p:n ja lämpötilan käänteisarvon 1/T välistä 
riippuvuutta,  
— arvio höyrynpaineesta 20 tai 25 °C:n lämpötilassa.  
Jos aineessa tapahtuu muutoksia (olomuodon muutos, hajoaminen), 
on lisäksi ilmoitettava:  
— muutoksen luonne,  
— lämpötila, jossa muutos tapahtui ilmakehän paineessa,  
— höyrynpaine 10 °C ja 20 °C muutoslämpötilan alapuolella sekä 
10 °C ja 20 °C tämän lämpötilan yläpuolella (ellei kyseessä ole muutos kiinteästä olomuodosta kaasuksi).
 
Raportissa on esitettävä myös kaikki sellaiset tiedot ja huomautukset, 
joilla on merkitystä tulosten tulkinnan kannalta, erityisesti epäpuhta ­
uksien ja aineen fysikaalisen olomuodon osalta.  
3. KIRJALLISUUS  
(1) Euroopan yhteisöjen virallinen lehti  L 383 A, s. 26–47 (1992).  
(2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, 
Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, Lontoo.  
(3) Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, 
Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. 
Chapter IX, Interscience Publ., New York.  
(4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., 
Van Nostrand Company, New York.  
(5) NF T 20–048 AFNOR (syyskuu 1985). Chemical products for 
industrial use – Determination of vapour pressure of solids and 
liquids within a range from 10  –1 to 10  5 Pa – Static method.  
(6) ASTM D 2879–86, Standard test method for vapour pressure – 
temperature relationship and initial decomposition temperature 
of liquids by isoteniscope.  
(7) NF T 20–047 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use – Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within range from 10  –3 to 1 Pa – Vapour pressure 
balance method.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 47
 
(8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 
593. 
(9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. 
Thermodynamics 7, 1173.  
(10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, 
D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest 
Management Science 56, 521–532.  
(11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, kahdestoista laitos 
(2000).  
(12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determi ­
nation of small vapour pressures determination of the vapour 
pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 
22–28.  
(13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 
269–278.  
(14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and 
enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p- 
dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117–122.  
(15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Pro ­
tection; Pesticide Science  4 (1973) 137–147.  
(16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Pro ­
tection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974), 393–400.
 
(17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A 
Method for Determining the Volatility of Active Ingredients 
Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relations ­
hip between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982) 161–168.
 
(18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for 
Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 
45 (1995) 27–31.
 
(19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., 
Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermog ­
ravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction 
(SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300–310.
 
(20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric 
Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low- Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87 ­
(12) (1998) 1512–20.
 
(21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 
81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range -25 °C to 150 °C.
 
(22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 
88 (2002).  
(23) 40 CFR, 796. (1993). s. 148–153, Office of the Federal Re ­
gister, Washington DC.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 48
 
(24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435.  
(25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375.  
(26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987). J. Vac. 
Sci. Technol. (A), 5(4), 2440.  
(27) Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. 
Sci. Technol. 17(2), 642.  
(28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 49
 
Lisäys  
Arviointimenetelmä  
JOHDANTO  
Höyrynpaineen arvioituja arvoja voidaan käyttää, kun halutaan:  
— päättää, mikä kokeellisista menetelmistä on sopiva,  
— saada arvio tai raja-arvo tapauksissa, joissa kokeellista menetelmää ei voida 
käyttää teknisistä syistä.  
ARVIOINTIMENETELMÄ  
Nesteiden ja kiinteiden aineiden höyrynpaine voidaan arvioida muunnetun Wat ­
son-korrelaation (a) avulla. Ainoa tarvittava kokeellinen tieto on normaali kiehu ­
mispiste. Menetelmää voidaan käyttää painealueella 10  5 –10  –5 Pa. 
Tarkemmat tiedot menetelmästä esitetään kirjassa ”Handbook of Chemical Pro ­
perty Estimation Methods” (b). Ks. myös OECD Environmental Monograph No.67 (c).
 
LASKENTA  
Höyrynpaine lasketaan seuraavasti:  
lnP vp ≈ ΔH vb 
ΔZ b RT b 1 – 3 – 2  T 
T b Í Î  m 
T 
T b – 2m 3 – 2  T 
T b Í Î  m – 1 
ln T 
T b 2 
6 6 4 3 
7 7 5
 
jossa  
T = kyseinen lämpötila  
T b = normaali kiehumispiste  
P vp = höyrynpaine lämpötilassa T  
ΔH vb = höyrystymislämpö  
ΔZ b = puristuvuustekijä (arvioitu arvo 0,97)  
m = empiirinen kerroin, joka vaihtelee fysikaalisen olomuodon mukaan 
kyseisessä lämpötilassa.  
Lisäksi  
ΔH vb 
T b ¼ K F ð8; 75 þ R ln T b Þ 
jossa K  F on empiirinen vakio, jolla otetaan huomioon aineen polaarisuus. Viit ­
teessä (b) on lueteltu K  F -vakiot useille sekoitetyypeille.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 50
 
Usein on saatavana tietoja kiehumispisteestä alennetussa paineessa. Tällöin höy ­
rynpaine voidaan viitteen (b) mukaan laskea seuraavasti:  
lnP vp ≈ ln P 1 þ ΔH v1 
ΔZ b RT 1 1 – 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m T 1 
T – 2m 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m – 1 
ln T 
T 1 " #  
jossa T  1 on kiehumispiste alennetussa paineessa P  1 . 
RAPORTTI  
Arviointimenetelmää käytettäessä raportissa on esitettävä yksityiskohtaiset selvi ­
tykset laskennasta.  
KIRJALLISUUS  
(a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398.  
(b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill.  
(c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity 
Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assess ­
ment (1993).  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 51
 
A.5 PINTAJÄNNITYS  
1. MENETELMÄ  
Tässä kuvatut menetelmät perustuvat OECD:n testiohjeisiin (1). Pe ­
rusperiaatteet kuvataan viitteessä (2).  
1.1 JOHDANTO  
Kuvattuja menetelmiä voidaan soveltaa vesiliuosten pintajännityksen 
mittaamiseen.  
On suositeltavaa selvittää ensin tutkittavan aineen vesiliukoisuus, 
rakenne, hydrolysoitumisominaisuudet ja misellimuodostuksen kriit ­
tinen pitoisuus.  
Kuvattuja menetelmiä voidaan käyttää lähes kaikkiin kemiallisiin 
aineisiin ilman rajoituksia aineiden puhtausasteen suhteen.  
Pintajännityksen mittaaminen rengastensiometrillä on rajoitettu vesi ­
liuoksiin, joiden dynaaminen viskositeetti on alle 200 mPa s.  
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Vapaan pinnan entalpiaa pintayksikköä kohti kutsutaan pintajänni ­
tykseksi.  
Pintajännityksen yksiköt ovat seuraavat:  
N/m (SI-yksikkö) tai  
mN/m (SI-alayksikkö)  
1 N/m = 10  3 dyniä/cm  
1 mN/m = 1 dyni käytöstä poistuneessa cgs-järjestelmässä  
1.3 VERTAILUAINEET  
Uutta ainetta tutkittaessa ei aina tarvitse käyttää vertailuaineita. Ver ­
tailuaineita käytetään lähinnä menetelmän toimivuuden ajoittaiseen tarkistamiseen ja verrattaessa tuloksia muiden menetelmien avulla 
saatuihin tuloksiin.
 
Viitteissä (1) ja (3) esitetään vertailuaineita, jotka kattavat laajan 
pintajännitysalueen.  
1.4 TESTIMENETELMIEN PERIAATTEET  
Menetelmä perustuu sen pystysuoran vetovoiman mittaamiseen, joka 
tarvitaan erottamaan sanka tai rengas mitta-astiassa olevan tutkittavan nesteen pinnasta vetämällä kohtisuoraan ylöspäin. Voidaan myös panna neste lautaselle ja mitata voima, joka tarvitaan kappaleen reu ­
nan ja nestepinnan välisen kalvon irrottamiseen.
 
Aineet, joiden vesiliukoisuus on vähintään 1 mg/l, tutkitaan vesiliu ­
oksessa yhtenä ainoana pitoisuutena.  
1.5 LAATUKRITEERIT  
Menetelmillä on mahdollista saavuttaa tarkkuus, joka on 
todennäköisesti suurempi kuin mitä ympäristöllisiä arviointeja var ­
ten tarvitaan.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 52
 
1.6 MENETELMÄKUVAUKSET  
Ainetta liuotetaan tislattuun veteen. Liuoksen pitoisuuden tulee 
olla 90 % aineen kyllästymispitoisuudesta veteen liuotettaessa. Jos kyllästymispitoisuus ylittää arvon 1 g/l, testiin käytetään 
pitoisuutta 1 g/l. Aineita, joiden vesiliukoisuus on alle 1 mg/l, ei 
tarvitse testata.
 
1.6.1  Lautasmenetelmä  
Katso standardeja ISO 304 ia NF T 73-060 (Surface active agents — 
determination of surface tension by drawing up liquid films)  
1.6.2  Sinkilämenetelmä  
Katso standardeja ISO 304 ja NF T 73-060 {Surface active agents — 
determination of surface tension by drawing up liquid films)  
1.6.3  Rengasmenetelmä  
Katso standardeja ISO 304 ja NF T 73-060 (Surface active agents — 
determination of surface tension by drawing up liquid films)  
1.6.4  OECD-maiden yhtenäistetty rengasmenetelmä  
1.6.4.1  Laite  
Tähän mittaukseen voidaan käyttää kaupallisesti saatavia tensiomet ­
rejä. Tensiometrin osat ovat seuraavat:  
— liikkuva näytepöytä,  
— mittauskappale (rengas),  
— voimanmittausjärjestelmä,  
— mittausastia.  
1.6.4.1.1 L i i k k u v a n ä y t e p ö y t ä  
Liikkuva näytepöytä toimii näytettä paikallaanpitävän, termostaatilla 
varustetun mittausastian tukena. Näytepöytä ja voimanmittausjärjes ­
telmä on kiinnitetty telineeseen.  
1.6.4.1.2 V o i m a n m i t t a u s j ä r j e s t e l m ä  
Voimanmittausjärjestelmä (katso kuvaa) sijaitsee näytepöydän ylä ­
puolella. Voimanmittauksen virhe ei saa ylittää arvoa ± 10  -6 N, 
mikä vastaa virherajaa ± 0,1 mg massamittauksissa. Useimmissa ta ­
pauksissa kaupallisten tensiometrien mitta-asteikko on mN/m-yksik ­
köinä, jolloin pintajännityslukema saadaan suoraan mN/m-yksikköinä 
0,1 mN/m:n tarkkuudella.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 53
 
1.6.4.1.3 M i t t a u s k a p p a l e ( r e n g a s )  
Rengas on yleensä tehty noin 0,4 mm:n paksuisesta platina-iridium ­
langasta. Keskiympärysmitta on 60 mm. Rengas riippuu vaakasuo ­
rassa metallitapista ja lankatelineestä ja on tätä kautta yhteydessä voimanmittausjärjestelmään (katso kuvaa).
 
Kuva  
Mittauskappale  
(Kaikki mitat ovat millimetreinä.)
  
1.6.4.1.4 M i t t a u s a s t i a  
Näyteliuosta sisältävän mittausastian on oltava termostaatilla varus ­
tettu ja lasista valmistettu. Astian tulee olla siten muotoiltu, että näyteliuoksen ja sen yläpuolella olevan kaasufaasin lämpötila pysyy mittauksen aikana vakiona eikä näytettä pääse haihtumaan. Hyväk ­
syttävän sylinterinmuotoisen mittausastian sisähalkaisijan on oltava 
vähintään 45 mm.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 54
 
1.6.4.2  Valmistelutoimet  
1.6.4.2.1 P u h d i s t u s  
Lasiastiat on puhdistettava huolella. Tarvittaessa ne on pestävä kuu ­
malla kromi-rikkihapolla ja sen jälkeen väkevällä fosforihapolla (83–98 painoprosenttia H
 3 PO 4 :ää), ja sen jälkeen huuhdeltava huo ­
lellisesti vesijohtovedellä. Lopuksi astiat on pestävä kaksoistislatulla 
vedellä, niin että saadaan neutraali reaktio, ja kuivattava, tai huuh ­
deltava pienellä määrällä näyteliuosta.  
Rengas huuhdellaan ensin huolellisesti vedellä kaikkien vesiliukois ­
ten aineiden poistamiseksi. Tämän jälkeen se upotetaan hetkeksi kromi-rikkihappoon, ja sitten se pestään kaksoistislatulla vedellä, niin että saadaan neutraali reaktio. Lopuksi rengasta kuumennetaan 
vähän aikaa metanoliliekin yllä.
 
Huomautus:  
Epäpuhtaudet, jotka eivät liukene tai tuhoudu kromi-rikkihapon tai 
fosforihapon vaikutuksesta, poistetaan sopivalla orgaanisella liuotti ­
mella.  
1.6.4.2.2 L a i t t e e n k a l i b r o i n t i  
Laite kalibroidaan vahvistamalla nollapiste ja säätämällä se siten, että 
instrumentin lukema sallii luotettavan mN/m-lukeman määrityksen.  
Asennus:  
Laite tasapainotetaan esimerkiksi tensiometrin jalustalla olevan vesi ­
va'an avulla. Jalustan tasapainotusruuveja säädetään tarpeen mukaan.  
Nollapisteen säätö:  
Kun rengas on kiinnitetty laitteeseen, tensiometrin lukema on ennen 
mittauksia säädettävä nollaan ja renkaan yhdensuuntaisuus nesteen 
pinnan suhteen on tarkistettava. Nesteen pintaa voidaan käyttää pei ­
linä. 
Kalibrointi:  
Varsinainen kalibrointi voidaan tehdä jollakin seuraavista menetel ­
mistä:  
a) Massamenetelmä: Renkaalle asetetaan kappaleita, joiden massa 
on tunnettu (0,1–1,0 g). Kalibrointikerroin ( Ф a) , jolla instrumentin 
kaikki lukemat on kerrottava, määritetään yhtälön (1) mukaisesti:  
Φ a ¼ σ r 
σ a (1) 
jossa  
σ r ¼ mg 
2b (mN/m)  
m = kappaleen massa (g)  
g = putoamiskiihtyvyys (981 cm s  -2 merenpinnan tasolla)  
b = renkaan keskiympärysmitta (cm)  
σ a = tensiometrin lukema, kun renkaalle on asetettu kappaleita 
(mN/m).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 55
 
b) Vesimenetelmä: Käytetään vettä, jonka pintajännitys esimerkiksi 
23 o C:ssa on 72,3 mN/m. Menetelmä on nopeampi kuin paino ­
kalibrointi, mutta siihen liittyy vaara veden pintajännitysarvon vääristymisestä pinta-aktiivisten epäpuhtauksien vaikutuksesta.
 
Kalibrointikerroin ( Ф b ), jolla instrumentin kaikki lukemat on ker ­
rottava, määritetään yhtälön (2) mukaisesti:  
Φ b ¼ σ o 
σ g (2) 
jossa  
σ o = lähdekirjallisuudesta saatu veden pintajännityksen arvo 
(mN/m)  
o g = veden pintajännityksen mitattu arvo (mN/m) molemmat 
samassa lämpötilassa.  
1.6.4.3  Näytteiden valmistelu  
Näytteistä valmistetaan vaadittavan pitoiset vesiliuokset, jotka eivät 
saa sisältää liukenemattomia aineita.  
Liuosten lämpötila on pidettävä vakiona (± 0,5  o C). Koska mittaus ­
astiassa olevan liuoksen pintajännitys muuttuu ajan kuluessa, on teh ­
tävä useita mittauksia eri ajankohtina ja tuloksista on piirrettävä käyrä, joka ilmaisee pintajännityksen muuttumisen ajan funktiona. Kun muutoksia ei enää tapahdu, järjestelmä on saavuttanut tasapai ­
non.
 
Pölyt ja muiden aineiden kaasumaiset epäpuhtaudet häiritsevät mit ­
tauksia. Siksi mittaukset on suoritettava suojan alla.  
1.6.5  Testiolosuhteet  
Mittaukset tehdään noin 20  o C:ssa. Lämpötila on säädettävä 
± 0,5  o C:n tarkkuudella.  
1.6.6  Työjärjestys  
Näyteliuokset kaadetaan huolella puhdistettuun mittausastiaan vält ­
täen tarkoin vaahdon muodostumista. Mittausastia asetetaan laitteen 
pöydälle. Pöytää mittausastioineen nostetaan, kunnes rengas on ko ­
konaan näyteliuoksen pinnan alla. Tämän jälkeen pöytää lasketaan hitaasti ja tasaisesti (noin 0,5 cm minuutissa), niin että saavutetaan maksimivoima renkaan noustessa pintaan irtoamatta siitä ja pintaa 
yhdistävästä vesikerroksesta. Mittauksen jälkeen rengas lasketaan uu ­
delleen pinnan alle ja mittauksia toistetaan, kunnes pintajännitysarvo ei enää muutu. Jokaisen mittauksen yhteydessä rekisteröidään aika, joka on kulunut näyteliuoksen kaatamisesta mittausastiaan. Mittaus ­
tulokseksi valitaan maksimivoima, joka tarvitaan nostamaan rengas 
nesteen pinnan yläpuolelle.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 56
 
2. TIEDOT  
Yksikkönä mN/m saadut mittaustulokset kerrotaan ensin kalibrointi ­
kertoimella Φ a tai Φ b (käytetyn kalibrointimenetelmän mukaan). 
Näin saadaan kuitenkin vain likiarvo, jota on vielä korjattava.  
Harkins ja Jordan (4) ovat määritelleet empiirisesti korjauskertoimia 
rengasmenetelmällä mitatuille arvoille renkaan mittojen, nesteen ti ­
heyden ja pintajännityksen mukaan.  
Koska korjauskertoimen määritys Harkinsin ja Jordanin taulukosta 
jokaista yksittäistä mittausta varten on työlästä, voidaan vesiliuosten 
pintajännityksen laskemista varten käyttää yksinkertaistettua menetel ­
mää, jossa korjatut pintajännitysarvot luetaan suoraan taulukosta. (Väliarvoja varten käytetään interpolointia.)
 
Taulukko  
Mitatun pintajännityksen korjaaminen  
Vain vesiliuoksille, joiden tiheys on noin 1 g/cm  3 
R = 9,55 mm (renkaan säteen keskiarvo) 
r = 0,185 mm (renkaan langan säde)  
Kokeellinen arvo (mN/m) Korjattu arvo (mN/m) 
Painokalibroint (katso 1.6.4.2.2 i (a)) Vesikalibrointi (katso 1.6.4.2.2 (b))  
20 16,9 18,1 
22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 
30 26,2 28,1 
32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 57
 
Kokeellinen arvo (mN/m) Korjattu arvo (mN/m) 
Painokalibroint (katso 1.6.4.2.2 i (a)) Vesikalibrointi (katso 1.6.4.2.2 (b))  
58 53,2 57,0 
60 55,2 59,1 
62 57,2 61,3 
64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 
68 63,2 67,7 
70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 
74 69,2 — 
76 71,2 — 
78 73,2 —
 
Taulukko perustuu Harkinsin-Jordanin korjaukseen. Taulukko vastaa 
vettä ja vesiliuoksia käsittelevän DIN-standardin (DIN 53914) tau ­
lukkoa (tiheys = 1 g/cm  3 ). Se on tarkoitettu mittauksiin, joissa käy ­
tetään kaupallista rengasta, jonka mitat ovat R = 9,55 mm (renkaan 
säteen keskiarvo) ja r = 0,185 mm (renkaan langan säde). Taulukossa 
on pintajännitysmittauksien korjatut arvot, jotka tehdään paino- tai vesikalibroinnin jälkeen.
 
Vaihtoehtoisesti pintajännitys, joka on mitattu ilman ensin tehtyä 
kalibrointia, voidaan laskea seuraavan suureyhtälön mukaan:  
σ ¼ fxF 
4πR 
jossa  
F = dynamometrin mittaama voima kalvon murtuessa  
R = renkaan säde  
f = korjauskerroin (1)  
3. RAPORTOINTI  
3.1 TESTIRAPORTTI  
Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat 
tiedot:  
— käytetty menetelmä,  
— käytetyn veden tai liuoksen tyyppi,  
— aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot, epäpuhtaudet),  
— mittaustulokset: pintajännitys (lukema); ilmoitetaan sekä yksilöl ­
liset lukemat aritmeettisine keskiarvoineen että korjattu keskiarvo 
(laitekerroin ja korjaustaulukko huomioon ottaen),  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 58
 
— liuoksen pitoisuus,  
— testilämpötila,  
— liuoksen ikä; erityisesti aika liuoksen valmistelusta mittaushet ­
keen,  
— selvitys liuoksen pintajännityksen verrannollisuudesta aikaan siitä 
hetkestä lähtien, jolloin liuos on siirretty mittausastiaan,  
— kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan kan ­
nalta, erityisesti epäpuhtauksien ja aineen fysikaalisen olomuo ­
don osalta.  
3.2 TULOSTEN TULKINTA  
Koska tislatun veden pintajännitys on 20  o C:ssa 72,75 mN/m, aineet, 
joiden pintajännitys on alle 60 mN/m kuvatun menetelmän kaltai ­
sissa olosuhteissa, on katsottava pinta-aktiivisiksi aineiksi.  
4. VIITTEET  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final.  
(2) R. Weissberger ed., Technique of organic chemistry, Chapter 
XIV, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Inters ­
cience Publ. New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV.  
(3) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511.  
(4) Harkins, W. D., Jordan, H. E, J. Amer. Chem. Soe, 1930, vol. 
52, 1751.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 59
 
A.6 VESILIUKOISUUS  
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 105 (1995). Tämä 
testimenetelmä on tarkistettu versio alkuperäisestä testiohjeesta nro 105, joka hyväksyttiin vuonna 1981. Nykyisen version ja vuoden 1981 version 
välillä ei ole merkittävää eroa, pääosin vain muotoa on muutettu. Tarkistus 
perustui EU:n testimenetelmään ”Vesiliukoisuus” (
 1 ). 
ALUSTAVAT HUOMIOT  
2. Epäpuhtaudet voivat vaikuttaa aineen vesiliukoisuuteen huomattavasti. Tällä 
testimenetelmällä määritetään sellaisten aineiden vesiliukoisuus, jotka ovat 
huomattavan puhtaita sekä stabiileja vedessä, eivät siis haihtuvia. Ennen 
vesiliukoisuuden määrittämistä on suositeltavaa hankkia testiaineesta joitakin alustavia tietoja, kuten rakennekaava, höyrynpaine, dissosiaatiovakio ja hyd ­
rolyysi pH:n funktiona.
 
3. Tässä testimenetelmässä kuvataan kaksi menetelmää, kolonnieluutiomene ­
telmä ja pullomenetelmä. Näitä menetelmiä voidaan soveltaa aineisiin, joi ­
den liukoisuus on yli ja alle 10  –2 grammaa litraa kohti (g/l). Lisäksi kuva ­
taan yksinkertainen alustava testi. Sen avulla voidaan määrittää lopullisessa testissä käytettävä näytemäärä suurin piirtein sekä kyllästymisen saavuttami ­
seen tarvittava aika.
 
MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
4. Aineen vesiliukoisuus on sen kyllästyspitoisuus vedessä määrätyssä lämpö ­
tilassa.  
5. Vesiliukoisuus ilmoitetaan liuenneen aineen massana liuostilavuutta kohti. 
SI-yksikkö on kg/m  3 , mutta myös yksikköä g/l voidaan käyttää.  
VERTAILUKEMIKAALIT  
6. Testiainetta tutkittaessa ei tarvitse käyttää vertailukemikaaleja.  
MENETELMIEN KUVAUS  
Testiolosuhteet  
7. Testi on mieluiten tehtävä lämpötilassa 20 ± 0,5 °C. Valittua lämpötilaa on 
pidettävä yllä laitteen kaikissa tärkeissä osissa.  
Alustava testi  
8. Noin 0,1 g näytettä (kiinteät aineet on ensin jauhettava) pannaan lasilla 
suljettuun, 10 ml:n asteikolla varustettuun mittasylinteriin, johon lisätään 
asteittain suurenevia määriä huoneenlämpöistä vettä. Jokaisen vedenlisäyk ­
sen jälkeen seosta ravistetaan 10 minuuttia ja tarkistetaan silmämääräisesti, ettei liuokseen ole jäänyt liukenemattomia hiukkasia. Jos näyte tai sen osa 
jää liukenematta 10 ml:n vedenlisäyksen jälkeen, koetta on jatkettava 100 
ml:n mittasylinterissä. Likimääräinen liukoisuus ilmenee jäljempänä olevasta
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 60
 
taulukosta 1 sen vesimäärän alta, jonka lisäyksen jälkeen näyte on täysin 
liuennut. Jos liukoisuus on huono, testiaineen liukeneminen voi kestää kau ­
an, ja sitä varten on odotettava vähintään 24 tuntia. Jos testiaine ei ole liuennut 24 tunnin kuluttua, on odotettava kauemmin (enintään 96 tuntia), tai liuosta on yritettävä laimentaa, jotta voitaisiin päättää, käytetäänkö 
kolonnieluutio- vai pullomenetelmää.
 
Taulukko 1  
0,1 liukenee X ml:aan vettä 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 
Likimääräinen liukoisuus < 1 000 1 000–2 ­
00 200–100 100–50 50–10 10–1 < 1  
Kolonnieluutiomenetelmä  
Periaate  
9. Tämä menetelmä perustuu veden avulla suoritettavaan näytteen eluutioon 
mikrokolonnista, jossa on inerttiä, runsaalla määrällä näytettä päällystettyä kantaja-ainetta, esimerkiksi lasihelmiä tai hiekkaa (2). Vesiliukoisuus ilmoi ­
tetaan eluaatin massapitoisuutena, kun se on saavuttanut tasanteen ajan 
funktiona.
 
Laite  
10. Laite koostuu mikrokolonnista (kuva 1), jonka lämpötila pidetään vakiona. 
Se kytketään joko kiertopumppuun (kuva 2) tai tasausastiaan (kuva 3). Mikrokolonnin sisällä on inerttiä kantaja-ainetta. Sitä pitää paikallaan pieni 
lasivillatulppa, joka myös suodattaa hiukkasia. Mahdollisia kantaja-aineeksi 
sopivia materiaaleja ovat lasihelmet, piimaa tai muut inertit materiaalit.
 
11. Kuvassa 1 oleva mikrokolonni sopii käytettäväksi kiertopumpun kanssa. Sen 
ylätilaan mahtuu viisi tilavuutta vettä (jotka poistetaan kokeen alussa) ja viisi näytettä (joita analysoidaan kokeen aikana). Vaihtoehtoisesti kokoa 
voidaan pienentää, jos järjestelmään voidaan lisätä vettä kokeen aikana en ­
simmäisten viiden epäpuhtauksien poistoon tarkoitetun tilavuuden korvaa ­
miseksi. Kolonni liitetään inertistä materiaalista valmistetulla putkella kier ­
topumppuun, joka pystyy säätämään virtauksia, joiden nopeus on noin 25 
ml/h. Kiertopumppu voi olla esimerkiksi peristaltiikkapumppu tai kalvo ­
pumppu. On huolehdittava siitä, ettei putken materiaali aiheuta saastumista ja/tai adsorptiota.
 
12. Kuvassa 3 on kaaviokuva tasausastian käyttämisestä. Tässä mallissa mikro ­
kolonniin on laitettu yksitiesulkuventtiili. Liitos tasausastiaan toteutetaan 
lasihioksella ja inertistä materiaalista valmistetulla putkella. Virtausnopeuden 
tasausastiasta on oltava noin 25 ml tunnissa.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 61
 
Kuva 1
  
Mitat millimetreinä  
A. Lasihioksen liitäntä  
B. Ylätila  
C. Sisätila 5  
D. Ulkotila 19  
E. Lasivillatulppa  
F. Sulkuventtiili  
Kuva 2
  
A. Paineen tasaus  
B. Virtausmittari  
C. Mikrokolonni  
D. Termostaatilla varustettu kiertopumppu  
E. Kiertopumppu  
F. Kaksitieventtiili näytteenottoa varten  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 62
 
Kuva 3
  
A. Tasausastia (esimerkiksi 2,5 litran pullo)  
B. Kolonni  
C. Fraktionkeräin  
D. Termostaatti  
E. Teflonputki  
F. Lasihios  
G. Vesilinja (termostaatin ja kolonnin välillä, sisähalkaisija noin 8 mm)  
13. Noin 600 mg kantaja-ainetta siirretään 50 ml:n pyörökolviin. Sopiva määrä 
testiainetta liuotetaan haihtuvaan liuottimeen, joka on laadultaan analyyttisen 
puhdasta reagenssia, ja kantaja-aine täytetään sopivalla määrällä tätä liuosta. 
Liuottimen on haihduttava täysin, esimerkiksi pyörivässä haihduttimessa, sillä muutoin kantaja-aine ei kyllästy vedellä eluutiovaiheen aikana kantaja-aineen pinnan jakaantumisen vuoksi. Täytön jälkeen kantaja-ainetta 
pidetään noin 5 ml:ssä vettä noin kahden tunnin ajan, minkä jälkeen sus ­
pensio kaadetaan mikrokolonniin. Vaihtoehtoisesti voidaan kaataa kuivaa, täytettyä kantaja-ainetta vedellä täytettyyn mikrokolonniin ja jättää se tasa ­
painottumaan kahden tunnin ajaksi.
 
14. Kantaja-aineen täyttö saattaa aiheuttaa ongelmia, mikä johtaa virheellisiin 
tuloksiin, esimerkiksi jos testiaine lisätään öljynä. Nämä ongelmat on tutkit ­
tava ja yksityiskohdat on raportoitava.  
Mittauksen tekeminen kiertopumpun avulla  
15. Käynnistetään virtaus kolonnin läpi. Suositeltava virtausnopeus on noin 25 
ml/h, mikä vastaa 10:tä tilavuutta tunnissa kuvatun kolonnin kohdalla. Ve ­
siliukoiset epäpuhtaudet poistetaan hylkäämällä vähintään ensimmäiset viisi tilavuutta. Tämän jälkeen kiertopumppu saa käydä, kunnes tasapaino on 
saavutettu. Se voidaan todeta saavutetuksi, kun viiden peräkkäin otetun 
näytteen pitoisuudet vaihtelevat enintään ± 30 prosenttia satunnaisella taval ­
la. Näytteenottovälin on vastattava vähintään eluentin kymmenen tilavuuden läpivirtausta. Sen mukaan, mitä analyysimenetelmää käytetään, voi olla tar ­
peen määrittää pitoisuus-aikakäyrä sen osoittamiseksi, että tasapaino on saa ­
vutettu.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 63
 
Mittauksen tekeminen tasausastian avulla  
16. Peräkkäiset eluaattifraktiot kerätään ja analysoidaan valitun menetelmän mu ­
kaisesti. Vesiliukoisuuden määritykseen käytetään vähintään viisi peräkkäin otettua fraktiota eluaatin keskialueelta, jossa pitoisuudet pysyvät vakiona (± 
30 %).
 
17. Ensisijainen eluentti on kaksoistislattu vesi. Myös deionisoitua vettä, jonka 
resistiivisyys on yli 10 megaohmia/cm ja jonka orgaaninen kokonaishiilipi ­
toisuus on alle 0,01 prosenttia, voidaan käyttää.  
18. Kummankin menetelmän yhteydessä on tehtävä toinen ajo, jossa virtausno ­
peus on puolet ensimmäisen ajon virtausnopeudesta. Jos molempien ajojen tulokset ovat yhtenevät, testin katsotaan olevan tyydyttävä. Jos mitattu liu ­
koisuus on suurempi alemman virtausnopeuden yhteydessä, virtausnopeuden 
puolittamista on jatkettava, kunnes saadaan kaksi peräkkäistä, saman liukoi ­
suuden antavaa ajoa.
 
19. Kummankin menetelmän yhteydessä fraktioista on etsittävä kolloideja 
Tyndall-ilmiön avulla. Hiukkasten esiintyminen mitätöi testin, ja testi on toistettava sen jälkeen, kun kolonnin suodatustehoa on ensin parannettu.
 
20. Jokaisen näytteen pH on mitattava ensisijaisesti erikoistestiliuskoja käyttä ­
mällä.  
Pullomenetelmä  
Periaate  
21. Testiaine (kiinteät aineet on jauhettava) liuotetaan veteen lämpötilassa, joka 
on hieman testilämpötilan yläpuolella. Kun kyllästyminen saavutetaan, seos jäähdytetään, ja sitä pidetään sen jälkeen testilämpötilassa. Vaihtoehtoisesti 
mittaus voidaan suorittaa suoraan testilämpötilassa edellyttäen, että kyllästy ­
mistasapaino varmistetaan soveltuvalla näytteenotolla. Tämän jälkeen mää ­
ritetään testiaineen massapitoisuus sopivalla analyysimenetelmällä vesiliu ­
oksessa, joka ei saa sisältää liukenemattomia hiukkasia (3).
 
Laite  
22. Pullomenetelmää varten tarvitaan seuraavat osat:  
— tavallisia laboratoriolaseja ja -instrumentteja  
— laite, jolla liuoksia voidaan ravistaa säädetyissä vakiolämpötiloissa  
— sentrifugi (mieluiten termostaatilla varustettu), jos sellainen tarvitaan 
emulsioiden käsittelyyn  
— analyysilaitteet.  
Mittauksen tekeminen  
23. Alustavan testin avulla saadaan tieto halutun vesimäärän kyllästämiseen 
tarvittavasta ainemäärästä. Noin viisinkertainen määrä ainetta punnitaan kol ­
meen eri lasitulpalla varustettuun lasiastiaan (esimerkiksi sentrifugiputkiin 
tai pulloihin). Kuhunkin astiaan laitetaan analyysimenetelmän ja liukoisuus ­
alueen mukaan valittu vesimäärä. Astiat suljetaan tiiviisti, ja niitä ravistetaan 30 °C:ssa. Tarkoitukseen käytetään ravistus- tai sekoitustapaa, jossa voidaan ylläpitää vakiolämpötilaa, esimerkiksi magneettisekoitusta termostaatilla va ­
rustetussa vesihauteessa). Vuorokauden kuluttua yksi astioista tasapainote ­
taan 24 tunnin aikana testilämpötilassa astiaa ajoittain ravistamalla.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 64
 
Astian sisältö lingotaan testilämpötilassa, ja testiaineen pitoisuus määritetään 
kirkkaasta vesifaasista sopivan analyyttisen menetelmän mukaisesti. Toista 
jäljellä olevaa astiaa käsitellään ensimmäisen 30 °C:ssa tapahtuneen tasa ­
painotuksen jälkeen samalla tavoin kaksi vuorokautta ja toista astiaa kolme vuorokautta. Jos vähintään kahdesta viimeksi käsitellystä astiasta mitatut 
pitoisuudet vaihtelevat enintään 15 prosenttia, testi hyväksytään. Jos astioista 
1, 2 ja 3 saadut tulokset osoittavat nousevaa suuntausta, koko testi on toistettava pidempiä tasapainotusaikoja käyttäen.
 
24. Testi voidaan myös toteuttaa ilman 30 °C:ssa tapahtuvaa esi-inkubaatiota. 
Kyllästystasapainon saavuttamisnopeutta voidaan arvioida jatkamalla näyt ­
teidenottoa, kunnes sekoitusaika ei enää vaikuta mitattuihin pitoisuuksiin.  
25. Jokaisen näytteen pH on mitattava ensisijaisesti erikoistestiliuskoja käyttä ­
mällä.  
Analyyttiset määritykset  
26. Näitä määrityksiä varten suositellaan ainekohtaista menetelmää, koska pienet 
määrät liukoisia epäpuhtauksia voivat aiheuttaa suuria virheitä mitatussa 
liukoisuudessa. Esimerkkejä tällaisista menetelmistä ovat kaasu- tai nestek ­
romatografia, titraus, fotometriset menetelmät ja kulometriset menetelmät.  
TIEDOT JA RAPORTOINTI  
Tiedot  
Kolonnieluutiomenetelmä  
27. Jokaista ajoa kohti on laskettava vähintään viiden peräkkäisen kyllästysalu ­
eelta otetun näytteen keskiarvo ja näytteiden keskihajonta. Kahdesta eri 
virtauksilla toteutetusta testistä saatujen keskiarvojen ero saa olla enintään 30 prosenttia.
 
Pullomenetelmä  
28. Kaikkien kolmen pullon yksittäisistä tuloksista, joiden välinen ero saa olla 
enintään 15 prosenttia, lasketaan keskiarvo.  
Testiraportti  
Kolonnieluutiomenetelmä  
29. Testiraportin on sisällettävä seuraavat tiedot:  
— alustavan testin tulokset  
— kemiallinen identiteetti ja epäpuhtaudet (esipuhdistusvaihe, jos tarpeen)  
— jokaisen näytteen pitoisuus, virtausnopeus ja pH  
— jokaisen ajon vähintään viiden kyllästysalueelta otetun näytteen keski ­
arvot ja keskihajonnat  
— kahden peräkkäisen ajon keskiarvo  
— veden lämpötila kyllästysprosessin aikana  
— analyysimenetelmä  
— käytetyn kantaja-aineen luonne  
— kantaja-aineen täyttö  
— käytetty liuotin  
— todisteet aineen mahdollisesta kemiallisesta epästabiliteetista testin ai ­
kana  
— kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulosten tulkinnan 
kannalta, erityisesti epäpuhtauksien ja aineen fysikaalisen olomuodon 
osalta.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 65
 
Pullomenetelmä  
30. Testiraportin on sisällettävä seuraavat tiedot:  
— alustavan testin tulokset  
— kemiallinen identiteetti ja epäpuhtaudet (esipuhdistusvaihe, jos tarpeen)  
— yksittäiset analyyttiset määritykset sekä keskiarvo, jos jokaista pulloa 
kohti on määritetty useampia arvoja  
— jokaisen näytteen pH  
— keskiarvo niistä eri astioista, joiden tulokset olivat yhteneviä  
— testilämpötila  
— analyyttinen menetelmä  
— todisteet aineen mahdollisesta kemiallisesta epästabiliteetista testin ai ­
kana  
— kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulosten tulkinnan 
kannalta, erityisesti epäpuhtauksien ja aineen fysikaalisen olomuodon 
osalta.  
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) Komission direktiivi 92/69/ETY, annettu 31 päivänä heinäkuuta 1992, vaa ­
rallisten aineiden luokitusta, pakkaamista ja merkintöjä koskevien lakien, ase ­
tusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä annetun neuvoston direktii ­
vin 67/548/ETY mukauttamisesta tekniikan kehitykseen seitsemännentoista 
kerran, EYVL L 383, 29.12.1992, s. 113.  
2) NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use -Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method.
 
3) NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solu ­
bility – Flask method.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 66
 
A.8 JAKAANTUMISKERROIN  
1. MENETELMÄ  
Tässä kuvattu ravistuspullomenetelmä perustuu OECD:n testiohjee ­
seen (1).  
1.1 JOHDANTO  
On suositeltavaa selvittää ensin tutkittavan aineen rakennekaava, dis ­
sosiaatiovakio, vesiliukoisuus, hydrolysoituminen, n-oktanoliliukoi ­
suus ja pintajännitys.  
Mitattaessa ionisoituvia aineita on aina käytettävä aineiden ionisoi ­
tumatonta muotoa (vapaata happoa tai vapaata emästä), joka on saatu 
sellaisen sopivan puskurin avulla, jonka pH on vähintään yhden pH- 
yksikön pK-arvoa pienempi (vapaa happo) tai suurempi (vapaa emäs).
 
Testi voidaan tehdä kahdella eri menetelmällä: ravistuspullomenetel ­
mällä tai HPLC-nestekromatografialla. Ensimmäistä menetelmää voi ­
daan soveltaa, kun P  ow -arvo (katso jäljempänä olevaa määritelmää) 
on - 2...4, ja toista menetelmää arvon ollessa 0...6. Alustavan kokeen 
avulla saadaan arvio näytteen jakaantumiskertoimesta, minkä jälkeen valitaan sopiva menetelmä.
 
Ravistuspullomenetelmää voidaan soveltaa vain huomattavan puhtai ­
den, vesi- ja n-oktanoliliukoisten aineiden testaukseen. Menetelmää ei voida soveltaa pinta-aktiivisten aineiden testaukseen (näiden koh ­
dalla on esitettävä laskettu arvo tai arvio, joka perustuu yksittäisiin 
vesi- ja n-oktanoliliukoisuuksiin).
 
HPLC-menetelmää ei voida soveltaa vahvojen happojen ja emästen, 
metallikompleksien, pinta-aktiivisten aineiden tai eluentin kanssa rea ­
goivien aineiden testaukseen. Näiden aineiden kohdalla on esitettävä laskettu arvo tai arvio, joka perustuu yksittäisiin vesi- ja n-oktanoli ­
liukoisuuksiin.
 
HPLC-menetelmä ei ole yhtä herkkä näytteessä oleville epäpuhtauk ­
sille kuin ravistuspullomenetelmä. Kuitenkin epäpuhtaudet voivat joissakin tapauksissa vaikeuttaa tulosten tulkintaa, koska kärkien 
kohdentaminen on tällöin epävarmaa. Jos seoksen testauksessa saa ­
daan määrittämätön kaista, on ilmoitettava log P:n ylä- ja alaraja.
 
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Määritelmän mukaan jakaantumiskerroin (P) on liuotetun aineen ta ­
sapainopitoisuuksien (c  i ) välinen suhde kaksifaasijärjestelmässä, 
jossa on kaksi toisiinsa heikosti sekoittuvaa liuotinta:  
p ow ¼ C nÄoktanoli  
C vesi 
Jakaantumiskerroin (P) on siis kahden pitoisuuden välinen suhde, ja 
se ilmoitetaan normaalisti kymmenkantaisena logaritmina (log P).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 67
 
1.3 VERTAILUAINEET  
Ravistuspullomenetelmä  
Uutta ainetta tutkittaessa ei aina tarvitse käyttää vertailuaineita. Ver ­
tailuaineita käytetään lähinnä menetelmän toimivuuden ajoittaiseen tarkistamiseen ja verrattaessa tuloksia muiden menetelmien avulla 
saatuihin tuloksiin.
 
HPLC-menetelmä  
Aineen HPLC-mittaustulosten ja yhdisteen P-arvon välinen vastaa ­
vuus saadaan kalibrointikäyrästä, jossa log P esitetään kromatogra ­
fisten tietojen funktiona. Kalibrointikäyrän kromatografisten tietojen on katettava vähintään 6 vertailupistettä. Käyttäjä valitsee sopivat 
vertailuaineet. Mahdollisuuksien mukaan on valittava vähintään 
yksi vertailuaine, jonka P
 ow -arvo on pienempi kuin näytteen P  ow - 
arvo, ja yksi vertailuaine, jonka P  ow -arvo on suurempi. Kun log P 
-arvo on pienempi kuin 4, kalibrointi voi perustua ravistuspullome ­
netelmällä saatuihin tuloksiin. Kun log P -arvo on suurempi kuin 4, kalibrointi voi perustua validoituihin, lähdekirjallisuudesta saatuihin arvoihin, jotka ovat yhteneviä laskettujen arvojen kanssa. Tarkkuutta 
voidaan parantaa käyttämällä vertailuaineita, joiden rakenne muistut ­
taa näytteen rakennetta.
 
Lähdekirjallisuudessa on laajat luettelot monen kemikaaliryhmän log 
P ow -arvoista (2), (3). Jos näytteen kanssa samankaltaisen rakenteen 
omaavien yhdisteiden tietoja ei ole käytettävissä, voidaan käyttää yleisempää kalibrointia, joka perustuu muihin vertailuaineisiin.
 
Liitteessä 2 on luettelo suositeltavista vertailuaineista ja niiden P  ow - 
arvoista.  
1.4 MENETELMIEN PERIAATTEET  
1.4.1  Ravistuspullomenetelmä  
Jakaantumiskertoimen määritystä varten järjestelmän kaikkien keski ­
näisessä vuorovaikutuksessa olevien osien on saavutettava tasapaino, 
minkä jälkeen määritetään järjestelmän kahteen faasiin liuotetun ai ­
neen pitoisuudet. Lähdekirjallisuudessa esitetään useita tekniikoita, joiden avulla molemmat faasit voidaan sekoittaa huolella ja joiden 
avulla niistä voidaan määrittää näytteen tasapainopitoisuudet kum ­
massakin faasissa faasien erotuksen jälkeen.
 
1.4.2  HPLC-menetelmä  
HPLC tapahtuu analyyttisessa kolonnissa, joka on täytetty kaupalli ­
sesti saatavana olevalla, pitkiä hiilivetyketjuja (esimerkiksi C  8 , C 18 ) 
sisältävällä kiinteällä faasilla, joka on kemiallisesti sidottu piidioksi ­
diin. Kolonniin ruiskutetut kemikaalit liikkuvat eri nopeuksilla sen mukaan, mikä on niiden jakaantumiskerroin liikkuvan faasin ja kiin ­
teän hiilivetyfaasin välillä. Kemikaaliseokset eluoituvat hydrofobi ­
suuden perusteella siten, että vesiliukoiset kemikaalit eluoituvat ensin ja öljyliukoiset viimeisenä suhteessa niiden hiilivety-vesi-jakaantu ­
miskertoimeen. Näin voidaan määrittää vastafaasikolonnin retention 
ja n-oktanoli-vesi-jakaantumiskertoimen välinen suhde. Jakaantumis ­
kerroin voidaan laskea  käyttökertoimen  k perusteella seuraavasti:
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 68
 
k ¼ t R Ä t o 
t o 
jossa t  R = näytteen retentio ja t  0 = liuotinmolekyylin keskimääräinen 
läpäisyaika (viive).  
Kvantitatiivisia analyyttisia menetelmiä ei tarvita. Eluointiaikojen 
määritys riittää.  
1.5 LAATUKRITEERIT  
1.5.1  Toistettavuus  
Ravistuspullomenetelmä  
Jakaantumiskertoimen tarkkuus varmistetaan tekemällä kolme mää ­
ritystä eri testiolosuhteissa, joissa näytteen määrä ja liuotintilavuuk ­
sien suhde voivat vaihdella. Saadut jakaantumiskertoimen arvot sa ­
avat vaihdella enintään ± 0,3 logaritmiyksikköä kymmenkantaisina 
logaritmeina ilmaistuna.  
HPLC-menetelmä  
Mittaustulokset varmistetaan tekemällä kaksi määritystä. Yksittäisten 
mittausten perusteella saadut log P -arvot saavat vaihdella enintään ± 0,1 logaritmiyksikköä.
 
1.5.2  Herkkyys  
Ravistuspullomenetelmä  
Menetelmän mittausalue määräytyy analyyttisen menetelmän havain ­
torajojen mukaan. Yleensä log P  ow -arvoja voidaan määrittää alueella 
- 2...4 (määrätyissä olosuhteissa jopa arvoon log P  ow = 5 asti), kun 
liuenneen aineen pitoisuus kummassakin faasissa on enintään 0,01 
moolia litrassa.  
HPLC-menetelmä  
HPCL-menetelmällä voidaan laskea jakaantumiskerroin P  ow -alueella 
0–6. 
Yleensä yhdisteen jakaantumiskertoimeksi voidaan arvioida ± 1 loga ­
ritmista yksikköä ravistuspullomenetelmän arvosta. Tyypillisiä korre ­
laatioita löytyy lähdekirjallisuudesta (4), (5), (6), (7), (8). Yleensä on 
mahdollista saada tarkempia tuloksia, kun korrelaatiopisteet on saatu 
rakenteellisesti samankaltaisten vertailuyhdisteiden tiedoista (9).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 69
 
1.5.3  Spesifisyys  
Ravistuspullomenetelmä  
Nernstin jakaantumislakia voidaan laimennettujen liuosten kohdalla 
soveltaa vain vakiolämpötilassa, vakiopaineessa ja vakio-pH:ssa. Suoraan sovellettuna laki koskee vain puhtaita aineita, jotka jakau ­
tuvat kahden puhtaan liuottimen välillä. Jos toisessa tai molemmissa 
faaseissa on samanaikaisesti useita erilaisia liuoksia, tämä saattaa vaikuttaa tuloksiin.
 
Liuotettujen molekyylien assosiaatiosta tai dissosiaatiosta seuraa 
poikkeamia Nernstin jakaantumislaista. Tällaiset poikkeamat voidaan osoittaa sillä, että jakaantumiskerroin vaihtelee liuoksen pitoisuuden 
mukaan.
 
Koska tasapainoja on useita, testimenetelmää ei pidä soveltaa ioni ­
soituviin yhdisteisiin ilman korjausta. Tällaisten yhdisteiden kohdalla 
on harkittava veden korvaamista puskuriliuoksilla, ja puskurin pH:n tulisi poiketa vähintään yhden pH-yksikön verran aineen pKa-arvos ­
ta. Lisäksi on otettava huomioon valitun pH:n sovellettavuus kysei ­
seen ympäristöön.
 
1.6 MENETELMÄKUVAUS  
1.6.1  Jakaantumiskertoimen alustava arviointi  
Alustavaan arviointiin tulisi mieluiten käyttää laskentamenetelmää 
(katso liitettä 1). Määrätyissä tapauksissa arviointiin voidaan käyttää myös näytteen liukoisuutta puhtaisiin liuottimiin (10).
 
1.6.2  Ravistuspullomenetelmä  
1.6.2.1  Valmistelutoimet  
n-oktanoli: Jakaantumiskertoimen määritykseen käytetään analyytti ­
sen puhdasta reagenssia.  
Vesi: Tarkoitukseen käytetään lasi- tai kvartsilaitteessa tislattua tai 
kaksoistislattua vettä. Ionisoituvien aineiden kohdalla on tarpeen mu ­
kaan käytettävä puskuriliuoksia veden sijasta.  
Huomautus:  
Suoraan ioninvaihtimesta otettua vettä ei pidä käyttää.  
1.6.2.1.1 L i u o t t i m i e n e s i k y l l ä s t y s  
Ennen jakaantumiskertoimen määritystä molemmat liuotinjärjestel ­
män faasit kyllästetään ravistamalla testilämpötilassa. Käytännöllinen 
toteutustapa on käyttää kahta suurta, analyyttisen puhtaalla n-oktano ­
lilla tai vedellä täytettyä varastopulloa, joissa on tarpeellinen määrä toista liuotinta, pitää pulloja vuorokauden ajan mekaanisessa ravisti ­
messa ja antaa tämän jälkeen pullojen levätä, kunnes faasit erottuvat 
ja kyllästyspiste saavutetaan.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 70
 
1.6.2.1.2 T e s t i n v a l m i s t e l u t o i m e t  
Kaksifaasijärjestelmän on täytettävä testausastia lähes kokonaan. 
Näin voidaan pienentää haihtumisesta aiheutuvaa ainehukkaa. Ai ­
neen tilavuussuhde ja määrät määräytyvät seuraavien tekijöiden mu ­
kaan:  
— jakaantumiskertoimen alustava määritys (katso edellä),  
— pienin määrä näytettä, joka tarvitaan analyyttistä menetelmää var ­
ten, 
— rajoitus, jonka mukaan pitoisuus ei saa ylittää 0,01 moolia lit ­
rassa kummassakaan faasissa.  
Tehdään kolme testiä. Ensimmäisessä käytetään laskettua n-oktanolin 
ja veden tilavuussuhdetta, toisessa suhde puolitetaan ja kolmannessa 
se kerrotaan kahdella (esimerkiksi 1:1, 1:2, 2:1).  
1.6.2.1.3 N ä y t e  
Valmistetaan varastoliuos esikyllästämällä n-oktanolia vedellä. Va ­
rastoliuoksen pitoisuus määritetään tarkasti juuri ennen liuoksen käyttöä jakaantumiskertoimen määritykseen. Liuosta on pidettävä 
olosuhteissa, joissa sen stabiliteetti voidaan taata.
 
1.6.2.2  Testiolosuhteet  
Lämpötila on pidettävä vakiona (± 1  o C) alueella 20–25  o C. 
1.6.2.3  Mittauksen suorittaminen  
1.6.2.3.1 J a k a a n t u m i s t a s a p a i n o n l u o m i n e n  
Jokaista testiolosuhdetta varten valmistetaan kaksi testausastiaa, 
joissa on tarkasti mitatut määrät kumpaakin liuotinta ja tarpeellinen määrä varastoliuosta.
 
Mitataan n-oktanolifaasit tilavuuden mukaan. Testausastiat pannaan 
sopivaan ravistuslaitteeseen tai niitä ravistetaan käsin. Jos käytössä on sentrifugiputki, suositellaan sen kääntämistä nopeasti poikittaisak ­
selillaan 180 astetta, jolloin mahdollisesti loukkuun jäänyt ilma nou ­
see molempien faasien läpi. Käytäntö on osoittanut, että 50 tällaisella 
käännöllä voidaan saavuttaa jakaantumistasapaino. Varmuuden vuoksi suositellaan kuitenkin 100:aa kääntöä viidessä minuutissa.
 
1.6.2.3.2 F a a s i e r o t u s  
Tarvittaessa faasien erotukseen on käytettävä sentrifugointia. Tämä 
tehdään laboratoriosentrifugissa huoneenlämmössä. Jos sentrifugissa 
ei ole termostaattia, sentrifugiputket on pidettävä testilämpötilassa 
vähintään yhden tunnin ajan ennen analyysia.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 71
 
1.6.2.4  Analyysi  
Jakaantumiskertoimen määritystä varten on määritettävä näytteen pi ­
toisuus kummassakin faasissa. Tämä voidaan toteuttaa ottamalla alik ­
vootti kumpaakin faasia kummastakin putkesta testiolosuhdetta kohti 
ja analysoimalla otokset valitulla menetelmällä. Aineen kokonais ­
määrä kummassakin faasissa lasketaan ja arvoja verrataan alun perin lisättyyn määrään.
 
Näytteenotto vesifaasista on tehtävä menetelmällä, joka minimoi n- 
oktanolin mukaanpääsyn riskin. Poistettavalla neulalla varustettu la ­
siruisku on hyvä vaihtoehto. Näytteenottoa varten ruisku täytetään osittain ilmalla, joka työnnetään varovasti ulos vietäessä ruisku n- oktanolikerroksen läpi. Tämän jälkeen ruiskuun vedetään sopiva 
määrä vesifaasia. Ruisku poistetaan nopeasti liuoksesta ja neula ir ­
rotetaan. Ruiskun sisältöä voidaan tämän jälkeen käyttää vesinäyttee ­
nä. Aineen pitoisuus kummassakin erotetussa faasissa määritetään mieluiten ainekohtaisella menetelmällä. Sopivia analyyttisiä menetel ­
miä ovat esimerkiksi
 
— fotometriset menetelmät,  
— kaasukromatografia,  
— nestekromatografia (HPLC).  
1.6.3  HPLC-menetelmä  
1.6.3.1  Valmistelutoimet  
Laite  
Menetelmää varten tarvitaan sykkimättömällä pumpulla ja sopivalla 
ilmaisulaitteella varustettu nestekromatografi, jossa tulisi olla suihku ­
silmukoilla varustettu suihkuventtiili. Kiinteässä faasissa olevat po ­
laariset ryhmät saattavat vakavasti häiritä HPCL-kolonnin tehokkuut ­
ta, minkä vuoksi polaaristen ryhmien määrä kiinteissä faaseissa (1) on minimoitava. Menetelmässä voidaan käyttää kaupallisesti saa ­
tavana olevia mikrohiukkas-vastafaasipakkauksia tai valmiiksi pakat ­
tuja kolonneja. Ruiskutusjärjestelmän ja analyyttisen kolonnin välissä 
voidaan pitää suojakolonnia.
 
Liikkuva faasi  
Eluutioliuotin valmistetaan HPLC-laatuisesta metanolista ja HPLC- 
laatuisesta vedestä. Liuottimelle tehdään kaasunpoisto ennen käyttöä. 
On käytettävä isokraattista eluutiota. Metanoli-vesiseoksessa on ol ­
tava vähintään 25 % vettä. Yleensä seos, jossa on metanolia ja vettä tilavuussuhteessa 3:1, on tyydyttävä log P 6 -yhdisteiden eluoimi ­
seksi yhdessä tunnissa, kun virtausnopeus on 1 ml/min. Jos yhdis ­
teiden log P -arvo on suuri, saattaa olla tarpeen lyhentää eluointi ­
aikaa (myös vertailuaineiden kohdalla) vähentämällä liikkuvan faasin polaarisuutta tai kolonnin pituutta.
 
Aineilla, jotka liukenevat n-oktanoliin hyvin heikosti, on yleensä 
poikkeavan alhainen HPLC-menetelmällä saatu log P  ow -arvo. Joskus 
tällaisten yhdisteiden tuottamat kärjet eivät ylitä liuottimen tasoa. Syynä on todennäköisesti se, että jakaantumisprosessi on liian hidas, eikä tasapaino ehdi asettua HPLC-erotteluun normaalisti käytetyssä 
ajassa. Tulosten luotettavuutta voidaan yleensä parantaa pienentä ­
mällä virtausnopeutta tai metanolin ja veden välistä suhdetta.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 72
 
Näytteiden ja vertailuaineiden liukoisuuden liikkuvaan faasiin on 
oltava tarpeeksi suuri niiden havaitsemista varten. Vain poikkeusta ­
pauksissa voidaan käyttää lisäaineita metanoli-vesiseoksen yhteydes ­
sä, koska lisäaineet muuttavat kolonnin ominaisuuksia. Jos käytetään lisäaineita kromatogrammin tuottamiseen, on ehdottomasti käytettävä 
erillistä, samantyyppistä kolonnia. Jos metanoli-vesiseos ei sovellu 
tarkoitukseen, voidaan käyttää muita orgaanisen liuottimen ja veden seoksia, esimerkiksi etanoli-vesi- tai asetonitriili-vesiseosta.
 
Ionisoivien yhdisteiden osalta eluentin pH on kriittinen. Sen on ol ­
tava kolonnin pH-alueella, yleensä 2-8. Puskurointia suositellaan. On 
varottava suolan saostumista ja kolonnin huononemista, mitä voi tapahtua eräiden orgaanisten faasi-puskuriseosten yhteydessä. HPLC-mittauksia, joissa piidioksidipohjaisen kiinteän faasin pH on 
yli 8, ei suositella, koska emäksinen liikkuva faasi voi aiheuttaa 
kolonnin suorituskyvyn nopeaa huononemista.
 
Liuokset  
Vertailuaineiden on oltava mahdollisimman puhtaita. Testi- ja kalib ­
rointitarkoituksiin käytettävät yhdisteet liuotetaan liikkuvaan faasiin mahdollisuuksien mukaan.
 
Testiolosuhteet  
Mittausten aikana lämpötila saa vaihdella enintään ± 2 K.  
1.6.3.2  Mittaukset  
Viiveen t  o laskeminen  
Viive t  o voidaan määrittää käyttämällä homologista sarjaa (esimer ­
kiksi n-alkyylimetyyliketoneja) tai kolonnin läpi pidättymättä kulke ­
via orgaanisia yhdisteitä (esimerkiksi tiokarbamidia tai formamidia). 
Ensimmäistä vaihtoehtoa käytettäessä kolonniin ruiskutetaan vähin ­
tään seitsenosainen homologinen sarja ja vastaavat retentiot määrite ­
tään. Suoraan saadut retentiot t  r(nc+1)  piirretään ajan t  r(nc) funktiona, 
ja regressioyhtälön  
t r(nc+1)  = a + b\; t  r(nc) 
poikkeama ja kaltevuus b määritetään (n  c = hiiliatomien määrä). 
Viive t  o saadaan tämän jälkeen seuraavasta yhtälöstä:  
t o = a/(l - b)  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 73
 
Kalibrointikäyrä  
Seuraavaksi laaditaan korrelaatiokäyrä, joka esittää soveltuvien ver ­
tailuaineiden log k -arvot log P -arvojen funktiona. Tätä varten ruis ­
kutetaan samanaikaisesti sarja, jossa on 5–10 vakiovertailuainetta, joiden log P kattaa odotetun alueen. Retentiot on suositeltavaa mää ­
rittää ilmaisinjärjestelmään kytketyllä tallentavalla integraattorilla. 
Käyttökertoimen k vastaavat logaritmit lasketaan ja merkitään käy ­
rään ravistuspullomenetelmällä saatujen log P -arvojen funktiona. Kalibrointi tehdään määrätyin välein, vähintään kerran päivässä, jotta 
kolonnin suorituskyvyn mahdolliset muutokset voidaan havaita.
 
Näytteen käyttökertoimen määritys  
Näytettä ruiskutetaan mahdollisimman pieneen määrään liikkuvaa 
faasia. Retentio määritetään kaksi kertaa. Tuloksen perusteella voi ­
daan laskea käyttökerroin k. Näytteen jakaantumiskerroin voidaan 
interpoloida vertailuaineiden korrelaatiokäyrästä. Jos jakaantumisker ­
roin on hyvin pieni tai hyvin suuri, on käytettävä ekstrapolointia. Tällöin on erityisesti otettava huomioon regressiosuoran luottamus ­
rajat.
 
2. TIEDOT  
Ravistuspullomenetelmä  
Määritettyjen log P -arvojen luotettavuus voidaan tarkistaa vertaa ­
malla kaksoismääritysten keskiarvoa kokonaiskeskiarvoon.  
3. RAPORTOINTI  
Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat 
tiedot:  
— aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot, epäpuhtaudet),  
— jos menetelmiä ei voida soveltaa (esimerkiksi aineen pinta-aktii ­
visuuden vuoksi), laskettu arvo tai arvio, joka perustuu yksittäi ­
siin n-oktanoli- tai vesiliukoisuuksiin,  
— kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan kan ­
nalta, erityisesti epäpuhtauksien ja aineen fysikaalisen olomuo ­
don osalta.  
Ravistuspullomenetelmän osalta:  
— alustavan arvioinnin tulos (jos sellainen on tehty),  
— määrityslämpötila,  
— tiedot pitoisuuden määritykseen käytetyistä analyyttisista mene ­
telmistä,  
— sentrifugointiaika ja -nopeus (jos sentrifugointia on käytetty),  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 74
 
— kummastakin faasista mitatut pitoisuudet (eli raportoidaan yh ­
teensä 12 pitoisuutta) jokaista määritystä kohti,  
— näytteen paino, yksittäisten testausastioiden faasien tilavuudet ja 
näytteen laskettu kokonaismäärä jokaisessa faasissa tasapainon 
saavuttamisen jälkeen,  
— jakaantumiskertoimen (P) lasketut arvot, keskiarvo ja kaikkien 
määritysten keskiarvo jokaista testiolosuhdetta kohti. Jos on ha ­
vaittu merkkejä jakaantumiskertoimen vaihtelusta pitoisuuden mukaan, tästä on oltava maininta raportissa,
 
— yksittäisten P-arvojen keskihajonta keskiarvon suhteen,  
— kaikkien määritysten P-keskiarvo ilmoitetaan kymmenkantaisena 
logaritmilukuna,  
— laskettu teoreettinen P  ow kun tällainen on määritetty tai kun mit ­
tausten perusteella saatu arvo on > 10  4 , 
— käytetyn veden ja vesifaasin pH,  
— jos on käytetty puskureita veden sijasta, on ilmoitettava syy, 
puskureiden kokoonpano, pitoisuus ja pH sekä vesifaasin pH ennen testiä ja sen jälkeen.
 
HPLC-menetelmän osalta:  
— alustavan arvioinnin tulos (jos sellainen on tehty),  
— näytteet ja vertailuaineet sekä niiden puhtausaste,  
— määritysten lämpötila-alue,  
— pH, jossa määritykset on tehty,  
— analyyttisen kolonnin, suojakolonnin, liikkuvan faasin ja ilmaisu ­
menetelmän tiedot,  
— retentiotiedot ja lähdekirjallisuudesta saadut, kalibroinnissa käy ­
tettyjen vertailuaineiden log P -arvot,  
— regressiosuoran tiedot (log k:n riippuvuus log P:stä),  
— retentiotietojen keskiarvo ja näytteen interpoloitu log P -arvo,  
— laitteen ja käyttöolosuhteiden kuvaus,  
— eluointiprofillit,  
— kolonniin pantujen näytteiden ja vertailuaineiden määrät,  
— viiveet ja niiden mittaustavat.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 75
 
4. VIITTEET  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final.  
(2) C. Hansch and A. J. Leo, Substituent Constants for Correlation 
Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.
 
(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative 
prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A. J. Leo, dir.) — Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.
 
(4) L. Renberg, G. Sundström and K. Dundh-Nygärd, Chemosp ­
here, 1980, vol. 80, 683.  
(5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sei., 1981, 
vol. 12, 219 (1981).  
(6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.  
(7) W. E. Hammers et al, J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1.  
(8) J. E. Haky and A. M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 
675. 
(9) S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed Mat. Res., 1981, vol. 
15, 787.  
(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der 
Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratori ­
umpraxis (edited by E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stutt ­
gart, 1958, Band I/1, 223-339.  
(11) R. F. Rekker and H. M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, 
vol. 14, 479.  
(12) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and 
their uses, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.  
(13) R. F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, 
Amsterdam, 1977.  
(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for Industrial 
use — Determination of partition coefficient — Flask shaking method.
 
(15) C. V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 
1459.  
(16) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev, 1971, vol. 71, 
525. 
(17) C. Hansch, A. Leo, S. H. Unger, K. H. Kim, D. Nikaitani and 
E. J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207.  
(18) W. B. Neely, D. R. Branson and G. E. Blau, Environ. Sci. 
Technol., 1974, vol. 8, 1113.  
(19) D. S. Brown and E. W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 
382. 
(20) J. K. Seydel and K. J. Schaper, Chemische Struktur und bio ­
logische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, 
New York, 1979.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 76
 
(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Ams ­
terdam, 1984.  
(22) Y. C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New 
York, Basel, 1978.  
(23) N. S. Nirrlees, S. J. Noulton, C. T. Murphy, P. J. Taylor; J. 
Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 77
 
Liite 1  
Laskenta- ja arviointimenetelmät  
JOHDANTO  
Julkaisussa Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a) on yleinen 
johdatus aiheeseen (laskentamenetelmiä, tietoja ja esimerkkejä).  
Laskettuja P  ow -arvoja voidaan käyttää seuraviin tarkoituksiin:  
— päättäminen soveltuvasta kokeellisesta menetelmästä (ravistuspullomenetel ­
män alue: log P  ow : - 2...4, HPLC-menetelmän alue: log P  ow : 0...6),  
— sopivien testiolosuhteiden (esimerkiksi HPLC-menetelmän vertailuaineiden ja 
ravistuspullomenetelmän n-oktanoli-vesisuhteen) valinta,  
— laboratorion sisäiset tarkistukset menetelmävirheiden löytämiseksi,  
— P  ow -arvion antaminen tapauksissa, joissa kokeellisia menetelmiä ei voida 
soveltaa teknisistä syistä.  
ARVIOINTIMENETELMÄ  
Jakaantumiskertoimen alustava arviointi  
Jakaantumiskertoimen arvo voidaan arvioida näytteen liukoisuudesta puhtaisiin 
liuottimiin, joka voidaan laskea seuraavan suureyhtälön avulla:  
P arvio ¼ kyllästys c  nÄoktanoli  
kyllästys c  vesi 
LASKENTAMENETELMÄT  
Laskentamenetelmien periaate  
Kaikki laskentamenetelmät perustuvat molekyylin muodolliseen fragmentointiin 
sopiviin alarakenteisiin, joille on tiedossa luotettavat log P  ow -differentiaalit. 
Koko molekyylin log P  ow -arvo voidaan tämän jälkeen laskea fragmenttiarvo ­
jensa summana lisättynä korjaustermeillä, jotka perustuvat molekyylin sisäisiin 
vuorovaikutuksiin.  
Luettelot fragmenttivakioista ja korjaustermeistä ovat saatavana lähteistä (b), (c), 
(d) ja (e). Joitakin niistä päivitetään säännöllisesti.  
Laatukriteerit  
Yleisesti ottaen laskentamenetelmien luotettavuus heikkenee tutkittavan yhdisteen 
monimutkaisuuden kasvaessa. Kun tutkitaan yksinkertaisia molekyyleja, joilla on 
alhainen molekyylipaino ja yksi tai kaksi funktionaalista ryhmää, voidaan odot ­
taa, että poikkeama fragmentaatiomenetelmien ja mitatun arvon välillä on 0,1 - 0,3 log P
 ow -yksikköä. Kun käsitellään monimutkaisempia molekyyleja, virhe ­
marginaali voi olla tätä suurempi. Tämä vaihtelee fragmenttivakioiden luotetta ­
vuuden ja saatavuuden mukaan sekä sen mukaan, miten hyvin molekyylin sisäi ­
set vuorovaikutukset (esimerkiksi vetysidokset) ovat tunnistettavissa ja miten hyvin korjaustermejä osataan käyttää (ongelma pienenee käytettäessä tietokone ­
ohjelmaa CLOGP-3) (b). Kun käsitellään ionisoivia yhdisteitä, on tärkeää, että 
lataus tai ionisointiaste otetaan huomioon oikealla tavalla.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 78
 
Laskentamenetelmät  
Hanschin π-menetelmä  
Alkuperäinen hydrofobinen substituenttivakio, π, jonka ovat esittäneet Fujita et 
al. (f), määritetään seuraavasti:  
π x = log P  ow (PhX) - log P  ow (PhH)  
jossa P  ow (PhX) on aromaattisen johdannaisen jakaantumiskerroin ja P  ow (PhH) 
on emoyhdisteen jakaantumiskerroin. Esimerkki:  
(π Cl = log P  ow (C 6 H 5 Cl) - log P  ow (C 6 H 6 ) = 2,84 - 2,13 = 0,71.  
Tämän määritelmän mukaan p-menetelmä soveltuu lähinnä aromaattiseen subs ­
tituutioon, p-arvot suurelle määrälle substituentteja on yhdistetty taulukkomuo ­
toon (b), (c), (d). Arvoja käytetään aromaattisten molekyylien tai alarakenteiden 
log P  ow -arvojen laskentaan.  
Rekker-menetelmä  
Rekkerin mukaan (g) log P  ow -arvo lasketaan seuraavasti:  
log P  ow ¼ ∑ 
i a i f i þ ∑ 
j ðvuorovaikutustermit Þ 
jossa f  1 edustaa eri molekyylifragmenttivakioita ja a  1 niiden esiintymistaajuutta 
tutkittavassa molekyylissa. Korjaustermit voidaan esittää yhden ainoan vakion C  m 
integraalikerrannaisina (niin sanottuna maagisena vakiona). Fragmenttivakiot f  1 ja 
C m on määritetty 1 054 kokeellista P  ow -arvoa (825 yhdistettä) sisältävän luettelon 
perusteella moninkertaista regressioanalyysiä (c), (h) käyttäen. Vuorovaikutuster ­
min määritys tehdään lähdekirjallisuudessa kuvatun säännöstön mukaan (e), (h), (i).  
Hansch-Leon menetelmä  
Hanschin ja Leon mukaan (c) log P  ow lasketaan seuraavan suureyhtälön mukaan:  
log P  ow ¼ ∑ 
i a i f i þ ∑ 
j b j F j 
jossa f  1 edustaa eri molekyylifragmenttivakioita, F  j korjaustermejä ja a  i , b j vastaa­
via esiintymistaajuuksia. Yrityksen ja erehdyksen kautta on koottu kokeellisista 
P ow -arvoista johdettujen atomien ja ryhmien fragmenttiarvojen luettelo sekä kor ­
jaustermien F  j (niin sanottujen kertoimien) luettelo. Korjaustermit on jaettu use ­
aan eri luokkaan (a), (c). Kaikkien näiden sääntöjen ja korjaustermien huomioo ­
nottaminen on melko monimutkaista ja hidasta. Tehtävää helpottavat markki ­
noilla myytävät erikoisohjelmat (b).  
Yhdistetty menetelmä  
Monimutkaisten molekyylien P  ow -laskentaa voidaan helpottaa huomattavasti ja ­
kamalla molekyylit suurehkoihin alarakenteisiin, joille on saatavana luotettavia 
P ow -arvoja joko taulukoista (b), (c) tai omista mittauksista. Tällaiset fragmentit 
(esimerkiksi heterosykliset renkaat, antrakinoni ja atsobentseeni) voidaan sen jälkeen yhdistää Hanschin π-arvoihin tai Rekkerin tai Leon fragmenttivakioihin.
 
Huomautuksia  
i) Laskentamenetelmiä voidaan soveltaa vain osittain tai kokonaan ionisoituihin 
yhdistelmiin, edellyttäen, että tarpeelliset korjauskertoimet voidaan ottaa huo ­
mioon.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 79
 
ii) Jos voidaan olettaa, että molekyylin sisällä on vetysidoksia, on lisättävä 
vastaavat korjaustermit (noin + 0,6...+ 0,1 log P  ow -yksikköä). Indikaatiot 
vetysidosten olemassaolosta saadaan stereomalleista tai molekyylin spektros ­
kooppisista tiedoista.  
iii) Jos useat tautomeeriset muodot ovat mahdollisia, todennäköisintä muotoa 
käytetään laskennan perustana.  
iv) Fragmenttivakioluetteloiden päivityksiä on seurattava huolella.  
Raportti  
Kun käytetään laskenta- tai arviointimenetelmiä, testiraporttiin tulee mahdolli ­
suuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:  
— aineen kuvaus (seos, epäpuhtaudet jne.),  
— indikaatiot mahdollisten vetysidosten olemassaolosta, dissosiaatiosta, latauk ­
sesta tai muista epätavallisista ilmiöistä (esimerkiksi tautomeria),  
— laskentamenetelmän kuvaus,  
— tietokannan nimi tai lähde,  
— fragmenttivalinnan erikoispiirteitä,  
— yksityiskohtainen selvitys laskennasta.  
LÄHDEKIRJALLISUUS  
(a) W. J. Lyman, W. F. Reehl and D. H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Che ­
mical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.  
(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, 
USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).  
(c) C. Hansch, A. J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in 
Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.  
(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.  
(e) R. F. Rekker, H. M. de Kort, Eur. J. Med. Chem.- Chim Ther, 1979, vol. 14, 
479. 
(f) T. Fujita, J. lwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.  
(g) R. F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry 
Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.  
(h) C. V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.  
(i) R. A. Scherrer, ACS — American Chemical Society, Washington, D. C. 
1984, Symposium Series 255, p. 225.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 80
 
Liite 2  
Suositeltavia vertailuaineita HPLC-menetelmää varten  
Nro Vertailuaine log P  ow pKa 
1 2-butanoni 0,3 
2 4-asetyylipyridini 0,5 3 Aniliini 0,9 4 Asetanilidi 1,0 
5 Bentsyylialkoholi 1,1 
6 p-metoksifenoli 1,3 pKa = 10,26 7 Fenoksietikkahappo 1,4 pKa = 3,12 8 Fenoli 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-dinitrofenoli 1,5 pKa = 3,96 
10 Bentsonitriili 1,6 11 Fenyyliasetonitriili 1,6 12 4-metyylibentsyylialkoholi 1,6 13 Asetofenoni 1,7 14 2-nitrofenoli 1,8 pKa = 7,17 
15 3-nitrobentsoehappo 1,8 pKa = 3,47 
16 4-kloorianiliini 1,8 pKa = 4,15 17 Nitrobentseeni 1,9 18 Kanelihappo 1,9 19 Bentsoehappo 1,9 pKa = 4,19 20 p-kresoli 1,9 pKa = 10,17 21 Kanelihappo 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 Anisoli 2,1 23 Metyylibentsoaatti 2,1 24 Bentseeni 2,1 
25 3-metyylibentsoehappo 2,4 pKa = 4,27 
26 4-klorofenoli 2,4 pKa = 9,1 27 Trikloroetyleeni 2,4 28 Atrasiini 2,6 29 Etyylibentsoaatti 2,6 30 2,6-diklorobentsonitriili 2,6 31 3-klorobentsoehappo 2,7 pKa = 3,82 32 Tolueeni 2,7 33 1-naftoli 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-dikloroanilini 2,8 
35 Klorobentseeni 2,8 
36 Allyylifenyylieetteri 2,9 37 Bromobentseeni 3,0
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 81
 
Nro Vertailuaine log P  ow pKa 
38 Etyylibentseeni 3,2 
39 Bentsofenoni 3,2 
40 4-fenyylifenoli 3,2 pKa = 9,54 
41 Tymoli 3,3 
42 1,4-diklorobentseeni 3,4 43 Difenyyliamiini 3,4 pKa = 0,79 44 Naftaleeni 3,6 45 Fenyylibentsoaatti 3,6 46 Isopropyylibentseeni 3,7 47 2,4,6-trikloorifenoli 3,7 pKa = 6 48 Bifenyyli 4,0 49 Bentsyylibentsoaatti 4,0 50 2,4-dinitro-6 sek. butyylifenoli 4,1 
51 1,2,4-triklooribentseeni 4,2 
52 Dodekaanihappo 4,2 53 Difenyylieetteri 4,2 54 n-butyylibentseeni 4,5 55 Fenantreeni 4,5 56 Fluoranteeni 4,7 57 Dibentsyyli 4,8 58 2,6-difenyylipyridiini 4,9 59 Trifenyyliamiini 5,7 60 DDT 6,2 
Muita vertailuaineita, joilla on pieni log P
 ow -arvo 
1 Nikotiinihappo - 0,07  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 82
 
A.9 LEIMAHDUSPISTE  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
On suositeltavaa selvittää tutkittavan aineen syttyvyys ennen testa ­
uksen aloittamista. Testimenetelmää voidaan soveltaa nestemäisiin 
aineisiin, joiden höyryt ovat sytytettävissä sytytyslähteen avulla. Tässä luetellut testimenetelmät ovat luotettavia vain menetelmien yhteydessä mainituilla leimahduspistealueilla.
 
Menetelmän valinnassa on otettava huomioon mahdolliset kemialliset 
reaktiot tutkittavan aineen ja näytteenpitimen välillä.  
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Leimahduspiste on alin lämpötila, korjattuna 101,325 kPa:n painee ­
seen, jossa neste testimenetelmässä kuvatuissa olosuhteissa muodos ­
taa niin paljon höyryä, että testausastiassa muodostuu syttyvä höyryn ja ilman seos.
 
Yksiköt:  o C 
t = T - 273,15  
(t annetaan Celsius-asteina ja T kelvineinä)  
1.3 VERTAILUAINEET  
Uutta ainetta tutkittaessa ei aina tarvitse käyttää vertailuaineita. Ver ­
tailuaineita käytetään lähinnä menetelmän toimivuuden ajoittaiseen 
tarkistamiseen ja verrattaessa tuloksia muiden menetelmien avulla 
saatuihin tuloksiin.  
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Näyte pannaan testausastiaan ja se kuumennetaan tai jäähdytetään 
testilämpötilaan testimenetelmän ohjeiden mukaan. Tämän jälkeen 
selvitetään syttymiskokeiden avulla, leimahtaako näyte testilämpöti ­
lassa vai ei.  
1.5 LAATUKRITEERIT  
1.5.1  Toistettavuus  
Toistettavuus vaihtelee leimahduspistealueen ja testimenetelmän mu ­
kaan. Maksimiarvo on 2  o C. 
1.5.2  Herkkyys  
Herkkyys vaihtelee testimenetelmän mukaan.  
1.5.3  Spesifisyys  
Joidenkin testimenetelmien spesifisyys rajoittuu määrättyyn leimah ­
duspistealueeseen ja vaihtelee aineen ominaisuuksien (esimerkiksi 
viskositeetin) mukaan.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 83
 
1.6 MENETELMÄKUVAUS  
1.6.1  Valmistelutoimet  
Näyte asetetaan laitteeseen kohdan 1.6.3.1 tai 1.6.3.2. mukaan.  
Turvallisuussyistä suositellaan, että voimakkaasti reagoivien tai myr ­
kyllisten aineiden kohdalla valitaan menetelmä, jossa näyte on pieni, 
noin 2 cm  3 . 
1.6.2  Testiolosuhteet  
Turvallisuusmääräysten mukaan laite on pidettävä paikassa, jossa ei 
ole vetoa.  
1.6.3  Työjärjestys  
1.6.3.1  Tasapainomenetelmä  
Katso seuraavia standardeja: ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 
3679.  
1.6.3.2  Tasapainottomuusmenetelmä  
Abelin laite:  
Katso seuraavia standardeja: BS 2000 osa 170, NF M07.011, NF 
T66-009.  
Abel-Penskyn laite:  
Katso seuraavia standardeja: EN 57, DIN 51755 osa 1 (lämpötila- 
alue 5-65  o C), DIN 51755 osa 2 (lämpötilat alle 5  o C), NF M07-036.  
Tagin laite:  
Katso standardia ASTM D 56.  
Pensky- Martensin laite:  
Katso seuraavia standardeja: ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM 
D 93, BS 2000-34, NF M07-019.  
Huomautuksia:  
Jos kohdan 1.6.3.2 mukaisen tasapainottomuusmenetelmän tuloksena 
saadaan leimahduspiste, joka on 0 ± 2  o C, 21 ± 2  o C tai 55 ± 2  o C, 
tulos on vahvistettava tasapainomenetelmän avulla samaa laitetta käyttäen.
 
Ilmoituskelpoisia ovat vain sellaiset menetelmät, joilla saadaan lei ­
mahduspisteen lämpötila.  
Nesteiden, jotka sisältävät liuotinta ja joiden viskositeetti on suuri 
(esimerkiksi maalien ja kumien) leimahduspisteen määritykseen saa 
käyttää ainoastaan laitteita ja testimenetelmiä, jotka soveltuvat suuren 
viskositeetin omaavien nesteiden leimahduspisteen määritykseen.  
Katso seuraavia standardeja: ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 
53213 osa 1.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 84
 
2. TIEDOT  
3. RAPORTOINTI  
Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat 
tiedot:  
— aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot ja epäpuhtaudet),  
— käytetty menetelmä ja mahdolliset poikkeamat,  
— kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan kan ­
nalta.  
4. VIITTEET  
Viitteitä ei ole.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 85
 
A.10  SYTITVYYS (KIINTEÄT AINEET)  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
On suositeltavaa selvittää tutkittavan aineen mahdolliset räjähtävät 
ominaisuudet ennen testiä.  
Testimenetelmää tulee soveltaa vain jauhemaisiin, rakeisiin tai pas ­
tamaisiin aineisiin.  
Koska ei ole käytännöllistä testata kaikkia syttyviä aineita, vaan vain 
sellaisia, jotka palavat nopeasti tai joiden palamisominaisuudet ovat 
joltakin osalta erityisen vaaralliset, herkästi syttyväksi aineeksi luo ­
kitellaan vain sellaiset, joiden palamisnopeus ylittää määrätyn raja- arvon.
 
Hehku, joka etenee metallijauheessa, voi olla erityisen vaarallinen 
palon sammutusvaikeuksien vuoksi. Metallijauheita on pidettävä her ­
kästi syttyvinä, jos hehku etenee niissä massan läpi määrätyssä 
ajassa.  
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Palamisaika sekunteina.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Vertailuaineita ei ole määritetty.  
1.4 MENETELMÄN PERIAATE  
Aine muotoillaan yhteneväksi nauhaksi tai jauhelinjaksi, jonka pituus 
on noin 250 mm. Alustavan seulontatestin avulla määritetään, ete ­
neekö kyteminen tai liekki, kun aine sytytetään kaasuliekillä. Jos liekki tai kyteminen etenee yli 200 mm annetun ajan kuluessa, ai ­
neen palamisnopeus määritetään kattavan testiohjelman avulla.
 
1.5 LAATUKRITEERIT  
Laatukriteerejä ei ole määritetty.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 86
 
1.6 MENETELMÄKUVAUS  
1.6.1  Alustava seulontatesti  
Aine muotoillaan yhteneväksi nauhaksi tai jauhelinjaksi, jonka pituus 
on noin 250 mm, leveys 20 mm ja korkeus 10 mm, palamattomalle, 
ei-huokoiselle ja heikosti lämpöä johtavalle alustalle.  
Kaasupolttimen kuumaa liekkiä (vähimmäishalkaisija 5 mm) pide ­
tään jauhelinjan toisessa päässä, kunnes jauhe syttyy tai enintään 2 minuuttia (5 minuuttia metallien ja metalliseosten kohdalla). Seu ­
rataan, eteneekö palaminen 200 mm linjaa pitkin 4 minuutin testi ­
jakson aikana (40 minuuttia metallijauheiden kohdalla). Jos aine ei syty eikä liekki tai kyteminen etene 200 mm:ä 4 minuutin testijakson 
aikana (40 minuuttia metallijauheiden kohdalla), ainetta ei pidetä 
herkästi syttyvänä, eikä lisätestausta tarvita. Jos aineen palaminen etenee jauhelinjaa pitkin 200 mm alle 4 minuutissa (tai alle 40 minuutissa metallijauheiden kohdalla), testausta on jatkettava jäl ­
jempänä kuvatun menetelmän mukaan (jatka kohdasta 1.6.2).
 
1.6.2  Palamisnopeuden testaus  
1.6.2.1  Valmistelutoimet  
Jauhemaista tai rakeista ainetta pannaan kevyelti 250 mm pitkään 
muottiin, jonka kolmionmuotoisen läpileikkauksen sisäkorkeus on 10 mm ja leveys 20 mm. Muotin pituussuunnassa on molemmille 
sivuille kiinnitetty kaksi metallilevyä siten, että levyjen yläreuna on 
2 mm muotin reunan yläpuolella (katso kuvaa). Muotti pudotetaan kolme kertaa 2 cm:n korkeudelta kiinteälle pinnalle. Tarvittaessa ainetta lisätään muottiin. Tämän jälkeen sivulevyt poistetaan ja yli ­
määräinen aines kaavitaan pois. Muotille asetetaan palamaton, ei- 
huokoisesta ja heikosti lämpöä johtavasta aineesta valmistettu alus ­
levy, laite käännetään ja muotti poistetaan.
 
Pastamaiset aineet levitetään nauhana, jonka pituus on 250 mm ja 
läpileikkaus noin 1 cm  2 , palamattomalle, ei-huokoiselle ja lämpöä 
heikosti johtavalle alustalle.  
1.6.2.2  Testiolosuhteet  
Jos aine on herkkä kosteudelle, testi on tehtävä mahdollisimman pian 
aineen säilöstä ottamisen jälkeen.  
1.6.2.3  Työjärjestys  
Aseta näyte vetokaappiin.  
Veto on säädettävä sellaiseksi, ettei laboratoriotiloihin pääse savua. 
Vedon voimakkuus ei saa vaihdella testin aikana. Laitteen ympärille pystytetään suojaseinä vetoa vastaan.
 
Näytenauha sytytetään toisesta päästä kaasupolttimen kuumalla lie ­
killä, jonka halkaisija on vähintään 5 mm. Kun palaminen on eden ­
nyt 80 mm:n verran, mitataan palamisnopeus seuraavalla  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 87
 
100 mm:n osuudella. Testi tehdään kuusi kertaa käyttäen aina puh ­
dasta ja kylmää alustaa, ellei positiivista tulosta saavuteta aiemmin.  
2. TIEDOT  
Arvioinnissa käytetään alustavasta seulontatestistä saatua palamis ­
aikaa (1.6.1) ja enintään kuudesta testistä saatua lyhyintä palamis ­
aikaa (1.6.2.3).  
3. RAPORTOINTI  
3.1 TESTIRAPORTTI  
Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat 
tiedot:  
— aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot, epäpuhtaudet),  
— testattavan aineen kuvaus, sen fysikaalinen olomuoto ja kosteus ­
pitoisuus,  
— tulokset alustavasta seulonta- ja palamisnopeustestistä, jos tällai ­
set on tehty,  
— kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan kan ­
nalta.  
3.2 TULOSTEN TULKINTA  
Jauhemaisia, rakeisia tai pastamaisia aineita pidetään herkästi sytty ­
vinä, jos niiden palamisaika minkä tahansa kohdassa 1.6.2 kuvatun testin tuloksena on lyhyempi kuin 45 sekuntia. Metalli- tai metalli ­
seosjauheita pidetään herkästi syttyvinä, jos ne voidaan sytyttää ja 
liekin tai reaktioalueen leviäminen koko näytteeseen kestää enintään 
kymmenen minuuttia.
 
4. VIITTEET  
(1) NF T 20-042 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of solids.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 88
 
Liite 
Kuva  
Muotti ja tarvikkeet näytteen valmistelua varten  
(Kaikki mitat ovat millimetreinä)
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 89
 
A.11  SYTTYVYYS (KAASUT)  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Tällä menetelmällä voidaan määrittää pitoisuusalueet, joilla ilma-kaa ­
suseos syttyy huoneenlämpötilassa (noin 20  o C:ssa) ja normaalissa 
ilmanpaineessa. Tutkittavan kaasun ja ilman seoksia altistetaan kaas ­
upitoisuuksia suurentaen sähkökipinälle ja tarkkaillaan, syttyykö seos vai ei.
 
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Syttyvyysalue on alimman ja ylimmän räjähdysrajan välinen pitoi ­
suusalue. Alin ja ylin räjähdysraja ovat ne syttyvän kaasun ja ilman 
seoksen pitoisuudet, joissa ei synny leimahdusta.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Vertailuaineita ei ole määritetty.  
1.4 MENETELMÄN PERIAATE  
Ilman kaasupitoisuutta suurennetaan asteittain ja jokaisen vaiheen 
pitoisuuden seos altistetaan sähkökipinälle.  
1.5 LAATUKRITEERIT  
Laatukriteerejä ei ole määritetty.  
1.6 MENETELMÄKUVAUS  
1.6.1  Laite  
Testausastia on pystysuora lasisylinteri, jonka sisähalkaisija on vä ­
hintään 50 mm ja korkeus vähintään 300 mm. Sytytyselektrodit si ­
jaitsevat 3–5 mm:n etäisyydellä toisistaan ja 60 mm:n korkeudella 
sylinterin pohjasta. Sylinterissä on paineentasausaukko. Laitteen ym ­
pärillä on oltava suoja mahdollisten räjähdysvahinkojen estämiseksi.  
Kipinälähteenä käytetään 0,5 sekunnin induktiokipinää, joka saadaan 
korkeajännitemuuntajasta, jonka lähtöjännite on 10-15 kV (tehon ­
tarve enintään 300 W). Esimerkki soveltuvasta laitteesta on viitteessä (2).
 
1.6.2  Testiolosuhteet  
Testi tehdään huoneenlämpötilassa (noin 20  o C:ssa).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 90
 
1.6.3  Työjärjestys  
Lasisylinteriin pumpataan annostuspumpulla kaasu-ilmaseosta, jonka 
pitoisuus tunnetaan. Seoksen läpi johdetaan kipinä ja liekin mahdol ­
lista irtaantumista kipinälähteestä sekä sen itsenäistä etenemistä tark ­
kaillaan. Kaasupitoisuutta muutetaan yhden tilavuusprosentin askelin, 
kunnes syttyminen tapahtuu edellä kuvatulla tavalla.  
Jos kaasun kemiallisen rakenteen perusteella voidaan olettaa, että 
kaasu ei ole syttyvää, ja kaasun ja ilman seoksen stökiometrimen 
koostumus voidaan testata 1 %:n askelin, tarvitsee testata vain seok ­
set, joiden pitoisuus on enintään 10 % suurempi tai pienempi kuin tämä koostumus.
 
2. TIEDOT  
Määrityksen ainoa merkitsevä tieto on liekin eteneminen.  
3. RAPORTOINTI  
Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat 
tiedot:  
— aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot ja epäpuhtaudet),  
— käytetyn laitteen kuvaus mittatietoineen,  
— testilämpötila,  
— testatut pitoisuudet ja saadut tulokset,  
— testin tulos: syttyvä kaasu tai herkästi syttyvä kaasu,  
— jos kaasu todetaan syttymättömäksi, on ilmoitettava, millä pitoi ­
suusalueella kaasua on testattu 1 %:n askelin,  
— kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan kan ­
nalta.  
4. VIITTEET  
(1) NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases.  
(2) W. Berthold, D. Conrad, T, Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. 
Redeker und H. Schacke. ”Entwicklung einer Standard-Appara ­
tur zur Messung von Explosionsgrenzen”. Chem.-Ing.-Tech., 1984, vol. 56, 2, 126–127.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 91
 
A.12  SYTTYVYYS (KOSKETUS VEDEN KANSSA)  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Tällä testimenetelmällä voidaan määrittää, kehittääkö testattava aine 
veden tai kostean ilman kanssa kosketuksiin joutuessaan vaarallisia 
määriä kaasua tai kaasuja, jotka voivat olla herkästi syttyviä.  
Testimenetelmää voidaan soveltaa sekä kiinteisiin että nestemäisiin 
aineisiin. Menetelmää ei voi soveltaa aineisiin, jotka syttyvät itses ­
tään joutuessaan kosketuksiin ilman kanssa.  
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Herkästi syttyviä ovat aineet, jotka veden tai kostean ilman kanssa 
kosketuksiin joutuessaan muodostavat vaarallisia määriä herkästi syt ­
tyviä kaasuja miniminopeudella 1 l/kg/h.  
1.3 MENETELMÄN PERIAATE  
Ainetta testataan jäljempänä kuvatun vaiheittaisen sarjan mukaan. Jos 
syttymistä esiintyy, sarjaa ei tarvitse jatkaa. Jos tiedetään, että aine ei 
reagoi voimakkaasti veden kanssa, voidaan edetä vaiheeseen 4 (1.3.4).
 
1.3.1  Vaihe 1  
Näyte pannaan kaukaloon, jossa on 20-celsiusasteista tislattua vettä. 
Todetaan, syttyykö muodostunut kaasu vai ei.  
1.3.2  Vaihe 2  
Näyte pannaan suodatinpaperille, joka kelluu 20-celsiusasteisen tis ­
latun veden pinnalla sopivassa astiassa. Todetaan, syttyykö muodos ­
tunut kaasu vai ei. Suodatinpaperia tarvitaan vain pitämään näyte 
koossa mahdollisen syttymisen helpottamiseksi.  
1.3.3  Vaihe 3  
Näyte muotoillaan keoksi, jonka korkeus on noin 2 cm ja läpimitta 
noin 3 cm. Keolle kaadetaan muutama tippa vettä, ja todetaan, syt ­
tyykö muodostunut kaasu vai ei.  
1.3.4  Vaihe 4  
Näytettä sekoitetaan 20-celsiusasteiseen tislattuun veteen ja kaasun 
muodostumisnopeus mitataan tunnin välein seitsemän tunnin ajan. Jos muodostumisnopeus on epäsäännöllinen tai kasvava seitsemän tunnin jälkeen, mittausaika voidaan pidentää enintään viideksi päi ­
väksi. Testi voidaan keskeyttää, jos nopeus missä tahansa vaiheessa 
ylittää arvon 1 l/kg/h.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 92
 
1.4 VERTAILUAINEET  
Vertailuaineita ei ole määritetty.  
1.5 LAATUKRITEERIT  
Laatukriteerejä ei ole määritetty.  
1.6 MENETELMÄKUVAUKSET  
1.6.1  Vaihe 1  
1.6.1.1  Testiolosuhteet  
Testi tehdään huoneenlämmössä (noin 20  o C:ssa).  
1.6.1.2  Työjärjestys  
Pieni määrä näytettä, jonka läpimitta on noin 2 mm, pannaan tislattua 
vettä sisältävään kaukaloon. Todetaan, (i) muodostuuko kaasua ja (ii) 
syttyykö kaasu. Jos kaasu syttyy, testiä ei tarvitse jatkaa, koska aine 
luokitellaan tällöin vaaralliseksi.  
1.6.2  Vaihe 2  
1.6.2.1  Laite  
Sopivassa astiassa, esimerkiksi 100 ml:n haihdutusastiassa, 
pidetään 20-celsiusasteista tislattua vettä. Veden pinnalla kelluu suo ­
datinpaperi.  
1.6.2.2  Testiolosuhteet  
Testi tehdään huoneenlämmössä (noin 20  o C:ssa).  
1.6.2.3  Työjärjestys  
Pieni määrä näytettä (läpimitta noin 2 mm) asetetaan suodatinpaperin 
keskelle. Todetaan, (i) muodostuuko kaasua ja (ii) syttyykö kaasu. 
Jos kaasu syttyy, testausta ei tarvitse jatkaa, koska aine luokitellaan 
tällöin vaaralliseksi.  
1.6.3  Vaihe 3  
1.6.3.1  Testiolosuhteet  
Testi tehdään huoneenlämmössä (noin 20  o C:ssa).  
1.6.3.2  Työjärjestys  
Näyte muotoillaan keoksi, jonka korkeus on noin 2 cm ja läpimitta 
noin 3 cm. Keon huipulle tehdään kuoppa, johon kaadetaan muutama tippa vettä. Todetaan, (i) muodostuuko kaasua ja (ii) syttyykö kaasu. 
Jos kaasu syttyy, testausta ei tarvitse jatkaa, koska aine luokitellaan 
tällöin vaaralliseksi.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 93
 
1.6.4  Vaihe 4  
1.6.4.1  Laite  
Laite rakennetaan kuvan mukaisesti.  
1.6.4.2  Testiolosuhteet  
Katsotaan, onko näytesäiliössä jauhetta (hiukkaskoko < 500 μm). Jos 
tällaisen jauheen paino-osuus ylittää 1 % tai jos näyte on murenevaa, 
koko näyte on jauhettava ennen testausta, jotta hiukkaskoko olisi pienempi varastoinnin ja käsittelyn aikana. Muuten näytettä testataan 
vastaanotetussa muodossa. Testi tehdään huoneenlämmössä (noin 
20
 ° C:ssa) ja yhden ilmakehän paineessa.  
1.6.4.3  Työjärjestys  
Laitteen tiputussuppiloon kaadetaan 10–20 ml vettä ja erlenmeyer ­
pulloon pannaan 10 g näytettä. Muodostuneen kaasun tilavuus voi ­
daan mitata millä tahansa sopivalla menetelmällä. Tiputussuppilon 
hana avataan ja samalla käynnistetään sekuntikello. Kaasunmuodos ­
tus mitataan kerran tunnissa seitsemän tunnin ajan. Jos muodostu ­
misnopeus on epäsäännöllinen tai kasvava seitsemän tunnin jälkeen, 
mittausaikaa voidaan pidentää enintään viideksi päiväksi. Testi voi ­
daan keskeyttää, jos nopeus ylittää arvon 1 l/kg/h missä tahansa vaiheessa. Testi tehdään kolme kertaa.
 
Jos kaasun kemiallista koostumusta ei tunneta, kaasu on analysoita ­
va. Jos kaasu sisältää herkästi syttyviä osia eikä tiedetä, onko koko seos herkästi syttyvä, on valmistettava koostumukseltaan samanlai ­
nen seos, joka testataan menetelmän A. 11 mukaisesti.
 
2. TIEDOT  
Aine katsotaan vaaralliseksi, jos:  
— se syttyy itsestään testin jossakin vaiheessa, tai  
— jos syttyvää kaasua muodostuu nopeudella, joka ylittää arvon 1 
l/kg/h.  
3. RAPORTOINTI  
Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat 
tiedot:  
— aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot, epäpuhtaudet),  
— selvitys mahdollisista aineen valmistelutoimista,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 94
 
— testitulokset (vaiheet 1, 2, 3 ja 4),  
— muodostuneen kaasun kemiallinen koostumus,  
— kaasun muodostumisnopeus, jos vaihe 4 suoritetaan (1.6.4),  
— kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan kan ­
nalta.  
4. VIITTEET  
(1) Recommendations on the transport of dangerous goods, test and 
criteria, 1990, United Nations, New York.  
(2) NF T 20-040 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases formed by the hyd ­
rolysis of solid and liquid products.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 95
 
Liite 
Kuva  
Laite
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 96
 
A.13  KIINTEIDEN AINEIDEN JA NESTEIDEN ITSESYTTYVYYS  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Testimenetelmää voidaan soveltaa kiinteisiin ja nestemäisiin ainei ­
siin, jotka pieninä määrinä syttyvät itsestään nopeasti jouduttuaan 
kosketuksiin huoneenlämpöisen (20  o C) ilman kanssa.  
Testimenetelmä ei kata aineita, jotka syttyvät vain siinä tapauksessa, 
että niitä pidetään huoneenlämpöisessä ilmassa useita tunteja tai päi ­
viä tai jos lämpötilaa korotetaan.  
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Aine luokitellaan itsestään syttyväksi, jos se syttyy tai aiheuttaa hiil ­
tymistä kohdassa 1.6 kuvatuissa olosuhteissa.  
Nesteiden itsesyttyvyyden testauksessa voidaan myös tarvita mene ­
telmää A.15 Itsesyttymislämpötila (nesteet ja kaasut).  
1.3 VERTAILUAINEET  
Vertailuaineita ei ole määritetty.  
1.4 MENETELMÄN PERIAATE  
Näyte (kiinteä tai nestemäinen) pannaan inertille alustalle ja saatetaan 
kosketuksiin huoneenlämpöisen ilman kanssa viideksi minuutiksi. Jos neste ei syty tässä ajassa, se imeytetään suodatinpaperiin ja pan ­
naan huoneenlämpöiseen (20
 o C) ilmaan viideksi minuutiksi. Jos 
kiinteä aine tai neste syttyy tai jos neste sytyttää suodatinpaperin tai aiheuttaa sen hiiltymisen, aine luokitellaan itsestään syttyväksi.
 
1.5 LAATUKRITEERIT  
Toistettavuus: koska itsesyttyvyysominaisuus on tärkeä turvallisuus ­
tekijä, yksi positiivinen tulos riittää aineen luokittelemiseksi itsestään 
syttyväksi.  
1.6 MENETELMÄKUVAUKSET  
1.6.1  Laite  
Posliinikuppiin, jonka läpimitta on noin 10 cm, pannaan noin 
5 mm:n kerros huoneenlämpöistä (noin 20  o C) piimaata.  
Huomautus:  
Piimaa tai muu vastaava inertti, yleisesti saatavilla oleva aine katso ­
taan esimerkiksi aineesta, johon testattavaa ainetta voi kaataa vahin ­
gon sattuessa.  
Kuivaa suodatinpaperia tarvitaan sellaisten nesteiden testaukseen, 
jotka inertillä alustalla pidettyinä eivät syty joutuessaan ilman kanssa 
kosketuksiin.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 97
 
1.6.2  Testin suorittaminen  
a) Jauhemaiset kiinteät aineet  
1–2 cm  3 testattavaa jauhetta kaadetaan noin 1 m:n korkeudelta pa ­
lamattomalle alustalle. Samalla tarkkaillaan, syttyykö aine palamaan 
pudotessaan tai viiden minuutin kuluessa alustalle asettumisesta.  
Ellei syttymistä tapahdu, koe tehdään kuusi kertaa.  
b) Nesteet  
Noin 5 cm  3 testattavaa nestettä kaadetaan preparoituun posliinik ­
uppiin. Samalla tarkkaillaan, syttyykö neste viiden minuutin kuluessa.
 
Ellei neste syty kuuden kokeen aikana, jatketaan seuraavilla kokeilla:  
0,5 ml näytenestettä annostellaan ruiskusta suodatinpaperille. Samalla 
tarkkaillaan, syttyykö suodatinpaperi palamaan tai hiiltyykö se viiden 
minuutin kuluessa nesteen lisäyksen jälkeen. Ellei syttymistä tai hiil ­
tymistä tapahdu, testi tehdään kolme kertaa.  
2. TIEDOT  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Testi voidaan keskeyttää heti kun mistä tahansa testin osasta saadaan 
myönteinen tulos.  
2.2 ARVIOINTI  
Jos aine syttyy viiden minuutin kuluessa siitä, kun sitä on pantu 
inertille alustalle ja saatettu kosketuksiin ilman kanssa, tai jos neste sytyttää suodatinpaperin tai aiheuttaa sen hiiltymisen viiden minuutin kuluessa, aine luokitellaan itsestään syttyväksi.
 
3. RAPORTOINTI  
Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat 
tiedot:  
— aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot ja epäpuhtaudet),  
— testitulokset,  
— kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan kan ­
nalta.  
4. VIITTEET  
(1) NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the spontaneous flammability of solids and 
liquids.  
(2) Recommendations on the Transport of Dangereous Goods, Test 
and Criteria, 1990, United Nations, New York.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 98
 
A.14  RÄJÄHTÄVYYS  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Menetelmä koostuu testiohjelmasta, jonka avulla voidaan määrittää, 
onko kiinteä tai pastamainen aine räjähdysaltis, kun se altistetaan liekille 
(lämpöherkkyys) tai iskulle tai kitkalle (mekaaninen herkkyys) ja onko neste räjähdysaltis, kun se altistetaan liekille tai iskulle.
 
Menetelmä on kolmiosainen:  
a) lämpöherkkyyden testaus (1);  
b) iskuherkkyyden testaus (1);  
c) kitkaherkkyyden testaus (1).  
Menetelmän avulla voidaan selvittää todennäköisyys sille, että aine 
räjähtää, kun se altistetaan määrätyille tavallisille ärsykkeille. Mene ­
telmää ei ole tarkoitettu käytettäväksi sen selvittämiseen, voiko aine 
yleensä räjähtää.  
Menetelmällä voidaan määrittää, liittyykö aineeseen lämpöherkkyy ­
destä ja mekaanisesta herkkyydestä aiheutuvaa räjähdysvaaraa direk ­
tiivin kuvaamissa erikoisolosuhteissa. Menetelmä perustuu joukkoon laitetyyppejä, joita käytetään yleisesti monissa maissa (1) ja joilla yleensä saadaan selkeitä tuloksia. Todettakoon, että menetelmä ei 
ole lopullinen. Myös muita laitteita voidaan käyttää, edellyttäen, 
että ne ovat kansainvälisesti tunnustettuja ja että tulokset ovat riittä ­
vän hyvin korreloitavissa.
 
Testiä ei tarvitse suorittaa, jos käytettävissä olevien termodynaamis ­
ten tietojen (esimerkiksi muodostumis- tai hajoamislämmön) tai mää ­
rättyjen reaktiivisten ryhmien (2) rakennekaavasta puuttumisen pe ­
rusteella avulla voidaan täysin varmasti osoittaa, että aine ei voi 
hajota nopeasti muodostaen kaasuja tai lämpöä, eikä siihen näin 
ollen liity minkäänlaista räjähdysvaaraa. Nesteiden kohdalla ei vaa ­
dita kitkaherkkyyden testausta.  
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Räjähtävä:  
Aineet, jotka voivat räjähtää liekin vaikutuksesta tai jotka ovat herk ­
kiä iskulle tai kitkalle spesifioidussa laitteessa (tai ovat mekaanisesti 
herkempiä kuin 1,3-dinitrobentseeni vaihtoehtoisessa laitteessa).  
1.3 VERTAILUAINEET  
1,3-dinitrobentseeni, tekninen kiteinen tuote, joka on läpäissyt 
0,5 mm:n seulan, käytetään kitka- ja iskumenetelmissä.  
Perhydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triatsiini (RDX, heksogeeni, sykloniini 
— CAS 121-82-4); uudelleenkiteytetty vesipitoisesta sykloheksano ­
nista, märkäseulottu 250 mm:n tarkkuudella ja pidätetty 150 μm:n 
seulaan sekä kuivattu 130 ± 2 °C:ssa (4 tuntia) toista kitka- ja 
iskutestisarjaa varten.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 99
 
1.4 MENETELMÄN PERIAATE  
On tarpeen tehdä alustavat testit, joiden avulla voidaan määrittää 
turvalliset olosuhteet kolmelle herkkyystestille.  
1.4.1  Käsittelyturvallisuustestit (3)  
Ennen varsinaisen testin aloittamista on turvallisuussyistä altistettava 
hyvin pieniä näytemääriä (noin 10 mg) kuumentamiselle avoimessa kaasuliekissä tai vasaran ja alasimen tai sopivan kitkakoneen avulla 
aikaansaatavalle kitkalle. Tarkoituksena on selvittää, onko aineen 
herkkyys ja räjähtävyys sellaista luokkaa, että kuvatut herkkyystestit, etenkin lämpöherkkyyden kohdalla, on henkilövahinkojen välttämi ­
seksi suoritettava erityistä varovaisuutta noudattaen.
 
1.4.2  Lämpöherkkyys  
Näytettä kuumennetaan teräsputkessa, joka on suljettu sopivalla rei ­
ällä varustetulla mittauslaipalla. Testin avulla selvitetään, onko aine 
räjähdysherkkä hyvin kuumissa olosuhteissa ja ahtaassa tilassa.  
1.4.3  Mekaaninen herkkyys (isku)  
Näyte altistetaan iskulle pudottamalla sen päälle määrätty massa 
määrätyltä korkeudelta.  
1.4.4  Mekaaninen herkkyys (kitka)  
Kiinteä tai pastamainen näyte altistetaan kitkalle vakiopintojen välillä 
käyttäen annettua kuormaa ja suhteellista liikettä.  
1.5 LAATUKRITEERIT  
Laatukriteerejä ei ole määritelty.  
1.6 MENETELMÄKUVAUS  
1.6.1  Lämpöherkkyys (liekin vaikutus)  
1.6.1.1  Laite  
Laitteessa on kuumennus- ja suojaosaan asennettu kertakäyttöinen 
teräsputki, jossa on uudelleen käytettävä suljinosa (kuva 1). Syväve ­
detystä teräslevystä (katso liitettä) valmistettujen putkien sisähalkai ­
sija on 24 mm, pituus on 75 mm ja seinän paksuus 0,5 mm. Putken avoimessa päässä on laippaliitos mittauslaippaa varten. Paineenkes ­
tävä mittauslaippa kiinnitetään putkeen kaksiosaisella ruuviliitännällä 
(mutterilla ja kierrelaipalla). Mutteri ja kierrelaippa on valmistettu kromi-mangaaniteräksestä (katso liitettä), joka on kipinöimätöntä 800
 o C:een asti. Lämmönkestävästä teräksestä valmistettujen, useilla 
eri reiänhalkaisijoilla varustettujen mittauslaippojen paksuus on 
6 mm.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 100
 
1.6.1.2  Testiolosuhteet  
Yleensä aine testataan sellaisenaan. Joissakin tapauksissa (esimer ­
kiksi jos aine on puristetussa, valetussa tai muulla tavoin tiivistetyssä muodossa) aine on murskattava ennen testiä.
 
Kiinteiden aineiden kussakin testauksessa käytettävä massa määrite ­
tään kaksivaiheisen kuiva-ajon avulla. Taarattuun putkeen pannaan 9 cm
 3 ainetta, joka sullotaan putkeen tämän koko poikkileikkauspin ­
ta-alaan kohdistuvalla 80 N:n voimalla. Turvallisuussyistä ja tapauk ­
sissa, joissa näytteen fyysinen muoto voi muuttua puristuksen vaiku ­
tuksesta, voidaan käyttää muuntyyppistä täyttömenetelmää (sullo ­
mista ei voi käyttää esimerkiksi hyvin kitkaherkkien aineiden koh ­
dalla). Jos aine kestää puristamista, täyttöä ja sullomista jatketaan, 
kunnes aineen yläpinnan etäisyys putken reunasta on 55 mm. Mää ­
ritetään kokonaismassa, joka on käytetty putken täyttämiseen 55 mm:iin asti, minkä jälkeen tehdään vielä kaksi lisäystä, kumpikin 
80 N:n voimalla sulloen. Tämän jälkeen ainetta joko lisätään sulloen 
tai poistetaan niin paljon, että aineen yläpinta on 15 mm:n etäisyy ­
dellä putken reunasta. Tehdään toinen kuiva-ajo, joka aloitetaan sul ­
lotulla massalla, joka on kolmasosa ensimmäisen ajon kokonaismas ­
sasta. Kaksi tällaista määrää lisätään sulloen 80 N:n voimalla, ja 
aineen yläpinta säädetään ainetta lisäämällä tai poistamalla 15 mm:n tasolle putken yläpinnasta. Kussakin kokeessa käytetään toisessa ajossa määritettyä massaa; täyttö tehdään kolmella yhtä suu ­
rella määrällä, joista jokainen puristetaan 9 cm
 3 :iin tarpeellista voi ­
maa käyttäen (apuna voidaan käyttää välirenkaita).  
Nesteet ja geelit täytetään putkeen 60 mm:n korkeuteen. Täytössä on 
erityisesti varottava tyhjien kohtien muodostumista. Kierrelaippa oh ­
jataan putkeen yläkautta, valittu mittauslaippa asetetaan paikoilleen, hieman molybdeeni-disulfidipohjaista voiteluainetta lisätään ja mut ­
teri kiristetään. On tärkeää tarkistaa, että mitään aineista ei ole jäänyt 
laipan ja levyn väliin tai kierteisiin.
 
Kuumennus tehdään propaanilla, joka otetaan kaasupullosta. Sylinte ­
rissä on oltava paineensäädin (60–70 mbar). Kaasun on kuljettava mittarin ja jakotukin kautta tasaisesti (virtauksen tasaisuus voidaan 
todeta pohtimien liekeistä) neljään polttimeen, Pohtimien sijoitus 
testauskammion ympärille ilmenee kuvasta 1. Polttimet kuluttavat yhteensä noin 3,2 litraa propaania minuutissa. Myös muita polttokaa ­
suja tai muita polttimia voidaan käyttää, mutta kuumennusnopeuden 
on tällöin oltava sama kuin kuvassa 3. Kaikkien laitteiden kuumen ­
nusnopeus on tarkistettava säännöllisesti kuvasta 3 ilmenevällä ta ­
valla dibutyyliftalaatilla täytettyjen putkien avulla.
 
1.6.1.3  Testin suorittaminen  
Jokaista testiä jatketaan, kunnes putki hajoaa tai kunnes sitä on kuu ­
mennettu viiden minuutin ajan. Jos testin tuloksena on putken ha ­
joaminen vähintään kolmeen osaan, jotka joissakin tapauksissa voi ­
vat olla vielä kiinni toisissaan kapeilla metallikaistaleilla (katso ku ­
vaa 2), aineen katsotaan räjähtäneen. Jos hajoamisosien määrä on 
pienempi tai jos hajoamista ei tapahdu, katsotaan, että räjähdystä ei 
ole tapahtunut.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 101
 
Ensin tehdään kolmen testin sarja, jossa mittauslaipan aukon halkaisija 
on 6,0 mm. Ellei räjähdystä tapahdu, tehdään toinen kolmen testin 
sarja, jossa mittauslaipan aukon halkaisija on 2,0 mm. Jos jomman ­
kumman sarjan tuloksena on räjähdys, testejä ei tarvitse jatkaa.  
1.6.1.4  Arviointi  
Testitulos katsotaan positiiviseksi, jos jommankumman edellä kuva ­
tun testisarjan aikana tapahtuu räjähdys.  
1.6.2  Mekaaninen herkkyys (isku)  
1.6.2.1  Laite (kuva 4)  
Tyypillisen vasaralaitteen tärkeimmät osat ovat teräsvalukappale 
alustoineen, alasin, pylväs, ohjaimet, pudotuspainot, irrotuslaite ja näytteenpidin. Teräsalasin (halkaisija 100 mm ja korkeus 70 mm) 
on kiinnitetty ruuveilla teräskappaleeseen (pituus 230 mm, leveys 
250 mm ja korkeus 200 mm). Teräskappale on teräsvalualustalla (pituus 450 mm, leveys 450 mm ja korkeus 60 mm). Pylväs on tehty saumattomasta teräksestä vedetystä putkesta, ja se sijaitsee pitimessä, 
joka on kiinnitetty ruuveilla teräskappaleen taakse. Laite on ankku ­
roitu massiiviseen sementtikappaleeseen (60 x 60 x 60 cm) ruuveilla siten, että ohjainkiskot ovat ehdottomasti pystysuorassa ja pudotus ­
paino pääsee putoamaan vapaasti. Painot (5 kg ja 10 kg) on valmis ­
tettu umpiteräksestä. Kummankin painon pää on karkaistua terästä 
(HRC 60-63), iskuhalkaisijaltaan vähintään 25 mm.
 
Näyte suljetaan iskulaitteeseen, jossa on kaksi päällekkäistä, konsent ­
rista, umpiteräksistä sylinteriä, jotka sijaitsevat ontossa, sylinterin ­
muotoisessa teräsrenkaassa. Umpiterässylintereiden on oltava halkai ­
sijaltaan 10 (- 0,003, - 0,005) mm ja korkeudeltaan 10 mm ja niissä 
on oltava kiillotettu pinta sekä pyöristetyt reunat (kaarevuussäde 
0,5 mm). Sylintereiden kovuusarvon on oltava HRC 58-65. Onton sylinterin ulkohalkaisijan on oltava 16 mm, sisähalkaisijan 10 (+ 0,005, + 0,10) mm (kiillotettu sisäpinta) ja korkeuden 13 mm. Isku ­
laite on asennettu teräksiseen välialasimeen (halkaisija 26 mm ja 
korkeus 26 mm), joka on keskitetty renkaan avulla. Renkaassa on reiät savunpoistoa varten.
 
1.6.2.2  Testiolosuhteet  
Näytettä käytetään 40 mm  3 tai muu, vaihtoehtoiselle laitteelle sopiva 
määrä. Kiinteät aineet testataan kuivina ja valmistellaan seuraavasti;  
a) Jauhetut aineet seulotaan (seulakoko 0,5 mm). Kaikki seulan lä ­
päissyt aines käytetään.  
b) Puristetut tai muulla tavoin tiivistetyt aineet murskataan ja seulo ­
taan. Testissä käytetään seulontafraktiota 0,5–1 mm, jonka on edustettava alkuperäistä ainetta.
 
Aineet, jotka toimitetaan yleensä pastamuodossa, on mahdollisuuk ­
sien mukaan testattava kuivina tai vasta mahdollisimman täydellisen laimennusaineen poiston jälkeen. Nestemäisten aineiden testauksessa 
ylemmän ja alemman teräs sylinterin väliin on jätettävä 1 mm:n 
aukko.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 102
 
1.6.2.3  Testin suorittaminen  
Tehdään kuuden testin sarja pudottamalla 10 kg:n massa 0,40 m:n 
korkeudelta (40 J). Jos näiden testien aikana syntyy räjähdys, teh ­
dään toinen kuuden testin sarja pudottamalla 5 kg:n massa 0,15 m:n 
korkeudelta (7,5 J). Jos käytetään muuntyyppistä laitetta, näytettä 
verrataan valittuun vertailuaineeseen käyttämällä hyväksyttyä mene ­
telmää (esimerkiksi ylös-alas-tekniikkaa).  
1.6.2.4  Arviointi  
Testitulos katsotaan positiiviseksi, jos räjähdys (liekkeihin leimahta ­
minen tai muu raportti katsotaan räjähdykseksi) tapahtuu vähintään kerran määritetyllä iskulaitteella suoritetussa testissä tai jos näyte on vaihtoehtoisessa iskutestissä herkempi kuin 1,3-dinitrobentseeni tai 
RDX.
 
1.6.3  Mekaaninen herkkyys (kitka)  
1.6.3.1  Laite (kuva 5)  
Kitkalaitteen muodostavat valettu teräslaatta ja sille asennettu kitka ­
yksikkö. Kitkayksikkö koostuu kiinteästä posliinitapista ja liikku ­
vasta posliinilaatasta, joka on kiinnitetty kahdessa ohjaimessa liikku ­
vaan vaunuun. Vaunu on kytketty sähkömoottoriin kytkentäsauvan, epäkeskoakselin ja sopivan vaihteiston kautta siten, että posliinilaatta liikkuu kerran edestakaisin 10 mm:n matkan posliinitapin alla. Poslii ­
nitappia voidaan kuormittaa esimerkiksi 120 tai 360 Newtonin voi ­
malla.
 
Litteät posliinilaatat on valmistettu valkoisesta teknisestä posliinista 
(karheus 9–32 μm). Laattojen mitat ovat 25 mm (pituus) x 25 mm 
(leveys) x 5 mm (korkeus). Myös sylinterinmuotoinen posliinitappi on valkoista teknistä posliinia, pituudeltaan 15 mm ja halkaisijaltaan 10 mm. Tapin pää on pyöreä ja karhennettu (kaarevuussäde 10 mm).
 
1.6.3.2  Testiolosuhteet  
Näytettä käytetään 10 mm  3 tai jokin muu vaihtoehtoiseen laitteeseen 
sopiva määrä.  
Kiinteät aineet testataan kuivina ja valmistellaan seuraavasti:  
a) Jauhetut aineet seulotaan (seulakoko 0,5 mm). Kaikki seulan lä ­
päissyt aines käytetään.  
b) Puristetut tai muulla tavalla tiivistetyt aineet murskataan ja seu ­
lotaan, Testissä käytetään alle 0,5 mm:n seulontafraktiota.  
Aineet, jotka yleensä toimitetaan pastamuodossa, on mahdollisuuk ­
sien mukaan testattava kuivina. Jos ainetta ei voi valmistella kuivassa muodossaan, pasta (jolle tehdään ensin mahdollisimman täydellinen 
laimennusaineen poisto) muotoillaan kalvoksi, jonka paksuus on 
0,5 mm, leveys 2 mm ja pituus 10 mm.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 103
 
1.6.3.3  Testin suorittaminen  
Posliinitappi asetetaan testattavan näytteen päälle ja kuormitus akti ­
voidaan. Testin aikana posiinilaatan karhennuksien on oltava poikit ­
tain liikkeen suuntaan nähden. On varmistettava, että tappi lepää 
näytteellä, että tarpeellinen määrä näyteainetta on tapin alla ja että 
laatta liikkuu oikealla tavoin tapin alla. Pastamaista ainetta pannaan laatalle käyttäen 2 × 10 mm:n uralla varustettua mittalevyä, jonka paksuus on 0,5 mm. Posliinilaatan on liikuttava posliinitapin alla 
10 mm:n matka eteen ja taakse 0,44 sekunnissa. Laatan ja tapin 
pinnan osia saa käyttää vain kerran; kummankin tapin molempia päitä voidaan käyttää kahdessa testissä ja laatan kummankin pinnan 
pitää kestää kolme testiä.
 
Tehdään kuuden testin sarja 360 N:n kuormalla. Jos näiden testien 
aikana saadaan positiivinen tulos, tehdään toinen kuuden testin sarja 120 N:n kuormalla. Jos käytetään muuntyyppistä laitetta, näytettä verrataan valittuun vertailuaineeseen hyväksyttyä menetelmää (esi ­
merkiksi ylös-alas-tekniikkaa) käyttäen.
 
1.6.3.4  Arviointi  
Testin tulos katsotaan positiiviseksi, jos räjähdys (kuuluva rätinä, 
muu raportti tai leimahdus katsotaan räjähdykseksi) tapahtuu vähin ­
tään kerran määritetyllä kitkalaitteella suoritetuissa testeissä tai täyt ­
tää tätä vastaavan kriteerin vaihtoehtoisessa kitkatestissä.  
2. TIEDOT  
Periaatteessa aine katsotaan räjähdysvaaralliseksi direktiivin tarkoit ­
tamassa mielessä, jos lämpöherkkyys-, iskuherkkyys- tai kitkaherk ­
kyystestistä saadaan positiivinen tulos.  
3. RAPORTOINTI  
3.1 TESTIRAPORTTI  
Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat 
tiedot;  
— näyteaineen tunnistustiedot, koostumus, puhtaus, kosteuspitoisuus 
jne., 
— aineen fyysinen muoto ja tiedot siitä, onko ainetta murskattu, 
rikottu tai seulottu,  
— havainnot lämpöherkkyystesteistä (esimerkiksi näytteen massa ja 
sirpaleiden määrä),  
— havainnot mekaanisista herkkyystesteistä (esimerkiksi huomatta ­
van savumäärän muodostuminen tai raportoimaton täydellinen hajoaminen, liekit, kipinät, muu raportti ja rätinä),
 
— jokaisen testityypin tulokset,  
— jos vaihtoehtoisia laitteita on käytetty, on esitettävä tieteellinen 
perustelu ja todisteet korrelaatiosta määritetyllä laitteella saatujen 
ja tätä vastaavalla laitteella saatujen tulosten välillä,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 104
 
— kaikki käyttökelpoiset kommentit, kuten tulosten tulkinnan kan ­
nalta varten tärkeät viitteet vastaavien tuotteiden testauksiin,  
— kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan kan ­
nalta.  
3.2 TULOSTEN TULKINTA JA ARVIOINTI  
Testiraportissa on mainittava kaikki tulokset, joita pidetään virheel ­
lisinä, epänormaaleina tai ei-edustavina. Jos jokin tulos hylätään, on annettava selitys ja esitettävä tulos vaihtoehtoisesta tai täydentävästä 
testistä. Ellei epänormaalia tulosta voida selittää, se on hyväksyttävä 
sellaisenaan ja sitä on käytettävä aineen luokitukseen tuloksen mu ­
kaan.
 
4. VIITTEET  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test 
and Criteria, 1990, United Nations, New York.  
(2) Bretherick, L,. Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th 
edition, Buttervorths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990.  
(3) Koenen, H., Ide, K. H. and Swart, K. H., Explosivstoffe, 1961, 
vol. 3, 6-13 and 30-42.  
(4) NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use — 
Determination of explosion risk.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 105
 
Liite 
Esimerkki ainespesifikaatiosta lämpöherkkyystestiä varten (katso standardia 
DIN 1623)  
(1) Putki: ainespesifikaatio nro 1.0336.505 g  
(2) Mittauslaippa: ainespesifikaatio nro 1.4873  
(3) Kierrelaippa ja mutteri: ainespesifikaatio nro 1.3817  
Kuva 1  
Lämpöherkkyyden mittauslaite  
(kaikki mitat ovat millimetreinä)
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 106
 
Kuva 1a Teräsputki varusteineen  
Kuva 2  
Lämpöherkkyystesti Esimerkkejä sirpaleenmuodostuksesta
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 107
 
Kuva 3  
Kuumennusnopeuden kalibrointi lämpöherkkyystestiä varten
  
Lämpötila-aikakäyrä, joka on saatu kuumentamalla dibutyyliftalaattia (27 cm  3 ) suljetussa 
(1,5 mm:n mittauslaipalla varustetussa) putkessa käyttäen propaania ja virtausnopeutta 3,2 litraa 
minuutissa. Lämpötilan mittaukseen käytetään taipuisaa, ruostumattomasta teräksestä valmistet ­
tua kromi/alumiini-termoparia, jonka halkaisija on 1 mm ja joka on asetettu keskelle putkea 43 mmm etäisyydelle sen suusta. Alueella 135–285
 o C kuumennusnopeuden on oltava välillä 
185–215 K/min.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 108
 
Kuva 4  
Iskutestilaite  
(kaikki mitat ovat millimetreinä)
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 109
 
Kuva 4  
(Jatkuu)
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 110
 
Kuva 5  
Kitkaherkkyyslaite
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 111
 
A.15  ITSESYTTYMISLÄMPÖTILA (NESTEET JA KAASUT)  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Tätä testiä ei pidä käyttää räjähdysaineiden ja itsestään ilmassa tai 
huoneenlämmössä syttyvien aineiden kohdalla. Testiä voidaan sovel ­
taa kaasuihin, nesteisiin tai höyryihin, jotka kosketuksissa ilmaan voivat syttyä kuuman pinnan vaikutuksesta.
 
Itsesyttymislämpötila laskee huomattavasti katalyyttisten epäpuhtauk ­
sien, pinta-aineen tai testausastian suuremman tilavuuden vaikutuk ­
sesta.  
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Itsesyttyvyysaste ilmaistaan itsesyttymislämpötilana. Itsesyttymisläm ­
pötila on alhaisin lämpötila, jossa näyte syttyy, kun se sekoitetaan 
ilmaan testimenetelmän määrittelemissä olosuhteissa.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Vertailuaineet mainitaan standardeissa (katso kohtaa 1.6.3). Vertailu ­
aineita käytetään lähinnä menetelmän toimivuuden ajoittaiseen tar ­
kistamiseen ja verrattaessa tuloksia muiden menetelmien avulla saa ­
tuihin tuloksiin.  
1.4 MENETELMÄN PERIAATE  
Menetelmällä määritetään suljetun astian sisäseinän alhaisin lämpö ­
tila, jossa astiaan ruiskutettu kaasu, höyry tai neste syttyy palamaan.  
1.5 LAATUKRITEERIT  
Toistettavuus vaihtelee itsesyttymislämpötila-alueiden ja käytetyn 
testimenetelmän mukaan.  
Herkkyys ja spesifisyys vaihtelevat käytetyn testimenetelmän mu ­
kaan.  
1.6 MENETELMÄKUVAUS  
1.6.1  Laite  
Laite kuvataan kohdassa 1.6.3 mainituissa menetelmäkuvauksissa.  
1.6.2  Testiolosuhteet  
Näyte aineesta testataan kohdassa 1.6.3 mainitun menetelmäkuvauk ­
sen mukaan.  
1.6.3  Testin suorittaminen  
Katso standardeja IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, 
NF T 20-037.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 112
 
2. TIEDOT  
Pidetään kirjaa testilämpötilasta, ilmanpaineesta, käytetystä näyte ­
määrästä ja syttymiseen kuluvasta ajasta.  
3. RAPORTOINTI  
Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat 
tiedot:  
— näyteaineen tarkat tiedot (tunnistustiedot ja epäpuhtaudet),  
— käytetty näytemäärä,  
— ilmanpaine,  
— käytetty laite,  
— testitulokset (testilämpötilat, syttymistulokset ja viiveet),  
— kaikki lisätiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan 
kannalta.  
4. VIITTEET  
Viitteitä ei ole.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 113
 
A.16  KIINTEIDEN AINEIDEN SUHTEELLINEN 
ITSESYTTYMISLÄMPÖTILA  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Tätä testiä ei pidä käyttää räjähtävien aineiden ja itsestään ilmassa tai 
huoneenlämmössä syttyvien aineiden kohdalla. Testin avulla saadaan alustavaa tietoa kiinteiden aineiden itsesyttyvyydestä korkeissa läm ­
pötiloissa.
 
Jos lämmön vapautuminen ympäristöön aineen reagoidessa hapen 
kanssa tai sen hajotessa eksotermisesti ei tapahdu tarpeeksi nopeasti, aineen kuumentaminen johtaa itsesyttymiseen. Näin ollen itsesyttymi ­
nen tapahtuu, kun lämmöntuotanto on nopeampaa kuin lämpöhäviö.
 
Testimenetelmä on käytännöllinen tapa saada alustavaa tietoa kiin ­
teistä aineista. Koska kiinteiden aineiden syttyminen ja palaminen on 
monimutkainen tapahtuma, tällä menetelmällä määritettyjä itsesytty ­
mislämpötiloja tulee käyttää vain vertailutarkoituksiin.  
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Tällä menetelmällä saatu itsesyttymislämpötila on alhaisin ympäris ­
tön lämpötila (  o C), jossa tunnettu tilavuus näyteainetta syttyy tun ­
netuissa olosuhteissa.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Vertailuaineita ei ole.  
1.4 MENETELMÄN PERIAATE  
Tunnettu määrä näyteainetta pannaan huoneenlämpöiseen uuniin. Uu ­
nin lämpötila nostetaan 0,5  o C:n minuuttinopeudella arvoon 400  o C (tai 
sulamispisteeseen, jos tämä on alhaisempi), ja näytteen keskustan läm ­
pötila kirjataan ajan funktiona. Tämän testin itsesyttymislämpötilaksi 
katsotaan se uunin lämpötila, jossa näytteen lämpötila on itsestään 
kuumenemisen seurauksena saavuttanut arvon 400  o C. 
1.5 LAATUKRITEERIT  
Laatukriteerejä ei ole.  
1.6 MENETELMÄKUVAUS  
1.6.1  Laite  
1.6.1.1  Uuni  
Uuni on termostaatilla varustettu laboratoriouuni (tilavuus noin 2 
litraa), jossa on luonnollinen ilmanvaihto ja räjähdysventtiili. Räjäh ­
dysvaaran välttämiseksi hajoamiskaasuja ei saa päästää kosketuksiin 
sähkölämmityselementtien kanssa.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 114
 
1.6.1.2  Lankaverkkokuutio  
Ruostumattomasta teräslangasta valmistetusta verkosta (0,045 mm 
aukko) leikataan kuvan 1 mukainen kuvio. Verkko taivutetaan yl ­
häältä avoimeksi kuutioksi ja kiinnitetään teräslangalla.  
1.6.1.3  Termoparit  
Käytetään sopivia termopareja.  
1.6.1.4  Rekisteröintilaite  
Mikä tahansa kaksikanavainen rekisteröintilaite, joka on kalibroitu 
0–600  o C:lle tai vastaavalle jännitteelle.  
1.6.2  Testiolosuhteet  
Aineet testataan vastaanotetussa muodossa.  
1.6.3  Testin suorittaminen  
Verkkokuutioon pannaan näyteainetta, naputetaan kevyesti, ja lisä ­
tään ainetta, kunnes kuutio täyttyy. Tämän jälkeen kuutio ripustetaan 
huoneenlämpöisen uunin keskelle. Toinen termopari pannaan kuution 
keskustaan ja toinen kuution ja uunin seinän väliin mittaamaan uunin lämpötilaa.
 
Uunin lämpötila nostetaan 400  o C:seen (tai sulamispisteeseen, jos 
tämä on alhaisempi) 0,5  o C:n minuuttinopeudella. Uunin ja näytteen 
lämpötilaa rekisteröidään koko kuumennuksen ajan.  
Kun aine syttyy, näytteessä olevan termoparin lämpötila nousee erit ­
täin jyrkästi yli uunin lämpötilan.  
2. TIEDOT  
Arviointia varten käytetään sitä uunin lämpötilaa, jossa näytteen 
lämpötila on noussut 400  o C:seen itsesyttymisen vaikutuksesta (katso 
kuvaa 2).  
3. RAPORTOINTI  
Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat 
tiedot:  
— näyteaineen tiedot,  
— mittaustulokset lämpötila-aikakäyrineen,  
— kaikki lisätiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan 
kannalta.  
4. VIITTEET  
(1) NF T 20-036 (September 85), Chemical products for industrial 
use. Determination of the relative temperature of the spontane ­
ous flammability of solids.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 115
 
Kuva 1  
20 mm:n näytekuution kaava
  
Kuva 2  
Tyypillinen lämpötila-aikakäyrä
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 116
 
A.17  HAPETTAVAT OMINAISUUDET (KIINTEÄT AINEET)  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Ennen testiä on suositeltavaa hankkia alustavia tietoja aineen mah ­
dollisista räjähdysominaisuuksista.  
Menetelmää ei voi käyttää nesteiden, kaasujen, räjähdysalttiiden tai 
herkästi syttyvien aineiden tai orgaanisten peroksidien testaukseen.  
Testiä ei tarvitse suorittaa, jos aineen rakennekaavasta voidaan täysin 
varmasti päätellä, että aine ei voi reagoida eksotermisesti syttyvien aineiden kanssa.
 
Alustavan testin avulla selvitetään, onko varsinaisessa testissä nou ­
datettava erityistä varovaisuutta.  
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Palamisaika sekunteina on se aika, jossa reaktiovyöhyke kulkee keon 
läpi, kun käytetään kohdassa 1.6 kuvattua menetelmää.  
Palamisnopeus ilmaistaan millimetreinä sekunnissa.  
Suurin palamisnopeus on se palamisnopeuden suurin arvo, joka saa ­
daan kun ainetta sekoitetaan hapettimeen eri pitoisuuksina (10–90 painoprosenttia hapetinta).
 
1.3 VERTAILUAINEET  
Analyyttisen puhdasta bariumnitraattia voidaan käyttää testin ja alus ­
tavan testin vertailuaineena.  
Vertailuseoksena käytetään sitä kohdan 1.6 mukaan valmistettua ba ­
riumnitraatin ja jauhetun selluloosan seosta, jolla on suurin palamis ­
nopeus (yleensä seos. jossa on 60 painoprosettia bariumnitraattia).  
1.4 MENETELMÄN PERIAATE  
Turvallisuussyistä tehdään alustava testi. Jos alustavasta testistä sel ­
västi ilmenee, että aineella on hapettavia ominaisuuksia, testiä ei 
tarvitse jatkaa. Muussa tapauksessa aine testataan kattavan testiohjel ­
man mukaan.  
Kattavassa testissä testattavaa ainetta ja määritettyä syttyvää ainetta 
sekoitetaan eri suhteissa. Jokaisesta seoksesta valmistetaan pitkän ­
omainen keko, joka sytytetään toisesta päästä. Suurinta palamisno ­
peutta verrataan vertailuseoksen suurimpaan palamisnopeuteen.  
1.5 LAATUKRITEERIT  
Tarvittaessa voidaan käyttää mitä tahansa jauhamis- ja sekoitusme ­
netelmää, edellyttäen, että kuudesta erillisestä testistä saadut suurim ­
mat palamisnopeudet poikkeavat aritmeettisesta keskiarvosta enin ­
tään 10 %.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 117
 
1.6 MENETELMÄKUVAUS  
1.6.1  Valmistelutoimet  
1.6.1.1  Näyte  
Näytteen hiukkaskoko pienennetään alle 0,125 mm:iin seuraavasti: 
näyte seulotaan, jäännös jauhetaan ja seulonta toistetaan. Tätä jatke ­
taan, kunnes koko näytemäärä on läpäissyt seulan.  
Jauhamiseen ja seulontaan voidaan käyttää mitä tahansa laatukriteerit 
täyttävää menetelmää.  
Ennen seoksen valmistelua näytettä kuivataan 105  o C:ssa, kunnes 
paino vakiintuu. Jos testattavan aineen hajoamislämpötila on alle 105
 o C, kuivaus on tehtävä sopivassa, alhaisemmassa lämpötilassa.  
1.6.1.2  Syttyvä aine  
Syttyvänä aineena käytetään jauhettua selluloosaa. Selluloosan on 
oltava ohutkerroskromatografiaan tai pylväskromatografiaan tarkoi ­
tettua tyyppiä. Selluloosatyyppi, jossa yli 85 % kuiduista on pituu ­
deltaan 0,020–0,075 mm, on osoittautunut sopivaksi. Selluloosajauhe seulotaan 0,125 mm:n silmäkoon läpi. Testiin on käytettävä saman erän selluloosaa.
 
Jauhettua selluloosaa kuivataan ennen seoksen valmistelua 
105  o C:ssa, kunnes paino vakiintuu.  
Jos alustavaan testiin käytetään puujauhoa, vaimistetaan havupuu ­
jauhe keräämällä talteen 1,6 mm:n seulan läpäissyt osa. Jauhe sekoi ­
tetaan huolellisesti ja sitä kuivataan 105  o C:ssa neljä tuntia enintään 
25 mm:n paksuisena kerroksena. Kuivauksen jälkeen puujauhe jääh ­
dytetään ja pannaan ilmatiiviiseen säiliöön, joka pakataan mahdolli ­
simman täyteen. Jauhe tulisi käyttää 24 tunnin kuluessa kuivauksesta.  
1.6.1.3  Sytytyslähde  
Sytytyslähteenä käytetään kaasupolttimen kuumaa liekkiä (minimi ­
halkaisija 5 mm). Jos käytetään toista sytytyslähdettä (esimerkiksi 
kun testi tapahtuu inertissä ilmakehässä), on annettava tilanteen ku ­
vaus ja perustelu.  
1.6.2  Testin suorittaminen  
Huomaulus:  
Hapettimien ja selluloosan tai puujauheen seoksia on pidettävä rä ­
jähdysvaarallisina ja niitä on käsiteltävä varoen.  
1.6.2.1  Alustava testi  
Kuivattua näytettä ja kuivattua selluloosaa tai puujauhetta sekoitetaan 
huolella suhteessa 2 paino-osaa näytettä ja 1 paino-osa selluloosaa tai puujauhetta. Seos muotoillaan pieneksi kartionmuotoiseksi keoksi, jonka pohjan halkaisija on 3,5 cm ja korkeus 2,5 cm. Keko tehdään 
täyttämällä (ilman tiivistämistä) kartionmuotoinen muotti (esimer ­
kiksi lasisuppilo, jonka varsi on suljettu).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 118
 
Keko asetetaan kylmälle, palamattomalle ja ei-huokoiselle aluslevyl ­
le, jonka lämmönjohtavuus on heikko. Testi on suoritettava vetokaa ­
pissa (katso 1.6.2.2).  
Kartiota kosketetaan sytytystähteellä. Sytytystä seuraavan reaktion 
voimakkuutta ja kestoa tarkkaillaan ja tulos kirjataan.  
Jos reaktio on voimakas, ainetta pidetään hapettavana.  
Jos tuloksen suhteen on epäilyjä, on tarpeen tehdä jäljempänä ku ­
vattu kattava testi.  
1.6.2.2  Sarjatesti  
Valmistetaan hapettimen ja selluloosan seoksia, joissa hapettimen 
painoprosentti on 10–90 ja vaihteluväli 10 %. Rajatapauksissa on valmistettava seoksia, joilla on pienemmät vaihteluvälit, jotta suurin palamisnopeus voitaisiin määrittää mahdollisimman tarkasti.
 
Keko muotoillaan muotin avulla. Metallista valmistetun muotin pi ­
tuus on 250 mm. Muotin kolmionmuotoisen läpileikkauksen sisäkor ­
keus on 10 mm ja leveys 20 mm. Muotin pituussuunnassa on mo ­
lemmille sivuille kiinnitetty kaksi metallilevyä siten, että levyjen yläreuna on 2 mm muotin reunan yläpuolella (katso kuvaa). Lisätään 
seosta kevyelti hiukan muotin reunojen yli. Muotti pudotetaan kerran 
2 cm korkeudelta kiinteälle pinnalle. Ylimääräinen aines kaavitaan pois, sivulevyt poistetaan ja muottiin jäävä aines tasoitetaan rullalla. Muotille asetetaan palamaton, ei-huokoisesta ja lämpöä heikosti joh ­
tavasta aineesta valmistettu aluslevy, laite käännetään ja muotti pois ­
tetaan.
 
Aseta näyte vetokaappiin.  
Veto on säädettävä sellaiseksi, ettei savua pääse laboratoriotiloihin. 
Vedon voimakkuus ei saa vaihdella testin aikana. Laitteen ympärille pystytetään suojaseinä vetoa vastaan.
 
Koska selluloosa ja eräät testattavat aineet ovat hygroskooppisia, 
testi on suoritettava mahdollisimman nopeasti.  
Keon toinen pää sytytetään koskettamalla sitä liekillä.  
Kun reaktiovyöhyke on edennyt 30 mm, mitataan aika, joka kuluu 
seuraavan 200 mm:n etenemiseen.  
Testi tehdään vertailuaineella ja vähintään kerran näyte-selluloosase ­
ossarjan jokaisella osalla.  
Jos todetaan, että näyteseoksen palamisnopeus on huomattavasti suu ­
rempi kuin vertailuseoksen palamisnopeus, testi voidaan keskeyttää. 
Muussa tapauksessa testi toistetaan viisi kertaa kolmelle nopeimmin 
palavalle seokselle.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 119
 
Jos epäillään, että positiivinen tulos on virheellinen, testi toistetaan 
käyttäen selluloosan sijasta inerttiä ainetta, jolla on sama hiukkas ­
koko (esimerkiksi piimaata). Vaihtoehtoisesti nopeimmin palava näy ­
te-selluloosaseos voidaan testata uudelleen inertissä ilmakehässä (< 2 tilavuusprosenttia happea).
 
2. TIEDOT  
Turvallisuussyistä suurinta palamisnopeutta — ei keskiarvoa — pi ­
detään näyteaineen tunnusomaisena hapettavana ominaisuutena.  
Arviointia varten käytetään kuuden kokeen sarjan suurinta palamis ­
nopeutta.  
Laaditaan käyrä, johon jokaista seosta kohden merkitään suurin pa ­
lamisnopeus hapettimen pitoisuuden funktiona. Tältä käyrältä luetaan 
suurin palamisnopeus.  
Testattaessa suurimman palamisnopeuden omaava seos, testisarjan 
kuusi palamisnopeuden arvoa saavat poiketa aritmeettisesta keski ­
arvosta enintään 10 %. Muussa tapauksessa jauhamis- ja sekoitus ­
menetelmiä on parannettava.  
Suurinta saatua palamisnopeutta verrataan vertailuseoksen palamis ­
nopeuteen (katso 1.3).  
Jos testit tehdään inertissä ilmakehässä, suurinta saatua reaktionope ­
utta verrataan inertissä ilmakehässä testatun vertailuaineen tulokseen.  
3. RAPORTOINTI  
3.1 TESTIRAPORTTI  
Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat 
tiedot:  
— näyteaineen tunnistetiedot, koostumus, puhtausaste, kosteuspitoi ­
suus jne.,  
— näyteaineen mahdolliset käsittelyt (esimerkiksi jauhaminen ja 
kuivaus),  
— testeissä käytetty sytytyslähde,  
— mittaustulokset,  
— havaitun reaktion luonne (esimerkiksi liekki näytteen pinnalla, 
palaminen koko massan läpi, tiedot palamistuotteista,...),  
— kaikki lisätiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulkinnan 
kannalta mukaan lukien kuvaus reaktion voimakkuudesta (liekit, kipinät, savunmuodostus, kyteminen, jne.) ja likimääräinen kesto alustavan testin yhteydessä sekä näytteen että vertailuaineen osalta,
 
— tulokset inertin aineen testauksesta, jos tuloksia on käytettävissä,  
— inertissä ilmakehässä tehtyjen testien tulokset, jos tuloksia on 
käytettävissä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 120
 
3.2 TULOSTEN TULKINTA  
Aineen katsotaan olevan hapettava seuraavissa tapauksissa:  
a) jos alustavassa testissä tapahtuu voimakas reaktio;  
b) jos seosten palamisnopeus kattavassa testissä on vähintään yhtä 
suuri kuin selluloosasta ja bariumnitraatista valmistetun vertailu ­
seoksen suurin palamisnopeus.  
Väärän positiivisen tuloksen välttämiseksi tulosten tulkinnassa on 
otettava huomioon myös tulokset, jotka on saatu testattaessa näytteen ja inertin aineen seosta tai suoritettaessa testiä inertissä ilmakehässä.
 
4. VIITTEET  
(1) NF T 20-035 (SEPT 85), Chemical products for industrial use. 
Determination of the oxidizing properties of solids.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 121
 
Liite 
Kuva  
Muotti ja tarvikkeet näytteen valmistelua varten  
(Kaikki mitat ovat millimetreinä)
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 122
 
A.18.  POLYMEERIEN LUKUKESKIMÄÄRÄINEN MOLEKYYLIPAINO 
JA MOLEKYYLIPAINOJAKAUMA  
1. MENETELMÄ  
Tämä geelipermeaatiokromatografiamenetelmä (GPC) on toisinto 
OECD:n testausohjeesta N:o 118 (1996). Menetelmän periaatteet ja 
teknisiä lisätietoja on viitteessä 1.  
1.1 JOHDANTO  
Koska polymeerien ominaisuudet ovat hyvin vaihtelevia, on mahdo ­
tonta antaa yhtä ainoaa menetelmää ja täsmällisiä erotus- ja arviointi ­
ohjeita, jotka sopisivat kaikkiin polymeerien erotuksessa mahdolli ­
sesti esiintyviin tapauksiin. Erityisesti monimutkaisia polymeeriseok ­
sia voi olla mahdoton erottaa geelipermeaatiomenetelmällä. Jos GPO:tä ei voi käyttää, voidaan molekyylipaino määrittää muilla ta ­
voilla (katso liite). Tällaisissa tapauksissa on käytetystä menetelmästä 
annettava yksityiskohtaiset tiedot ja perustelut on esitettävä.
 
Jäljempänä esitettävä menetelmä perustuu DIN-standardiin 55672 
(1). Yksityiskohtaiset ohjeet kokeiden suorittamiseksi ja tulosten ar ­
vioimiseksi annetaan kyseisessä DIN-standardissa. Jos koeolosuhteita täytyy muuttaa, on muutokset perusteltava. Muita standardeja saa 
käyttää, jos niistä annetaan täydelliset viitteet. Tässä menetelmässä 
käytetään kalibrointiin polystyreeninäytteitä, johon sisältyvien poly ­
meerien koot tunnetaan, ja menetelmää voi joutua muuttamaan, jotta sitä voitaisiin käyttää tietyille polymeereille, esim. vesiliukoisille ja 
pitkäketjuisille haaraantuville polymeereille.
 
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Lukukeskimääräinen molekyylipaino M ja painokeskimääräinen mo ­
lekyylipaino M  w määritetään seuraavilla yhtälöillä: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
joissa  
H i on detektorisignaalin korkeus perustasosta retentiotilavuudelle V  i , 
M i on retentiotilavuutta V  i vastaava polymeerifraktion molekyy ­
lipaino ja  
n on mittauspisteiden lukumäärä.  
Molekyylipainojakauman leveys, joka kuvastaa seoksen dispersii ­
visyyttä, saadaan suhteesta  M w /M n . ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 123
 
1.3 VERTAILUAINEET  
Koska GPC on suhteellinen menetelmä, on tehtävä kalibrointi. Tähän 
käytetään tavallisesti kokojakaumaltaan kapeita lineaarisia polysty ­
reenistandardeja, joiden keskimääräiset molekyylipainot M  n ja M  w 
sekä molekyylipainojakauma tunnetaan. Kalibrointikäyrää voidaan 
käyttää tuntemattoman näytteen molekyylipainon määritykseen vain, jos näytteen ja standardin erotusolosuhteet on valittu samalla tavalla.
 
Molekyylipainon ja eluutiotilavuuden suhde on validi ainoastaan tie ­
tyn kokeen tietyissä koeolosuhteissa. Tärkeitä tekijöitä ovat ennen 
kaikkea lämpötila, liuotin (tai liuotinseos), kromatografiajärjestely 
sekä erotuspylväs tai pylväsjärjestelmä.  
Tällä tavoin määritetyt näytteen molekyylipainot ovat suhteellisia 
arvoja ja niistä käytetään nimitystä ”polystyreeniekvivalenttimole ­
kyylipaino”. Tämä tarkoittaa sitä, että riippuen näytteen ja standar ­
dien rakenne-eroista ja kemiallisista eroista molekyylipainot voivat 
poiketa absoluuttisista arvoista enemmän tai vähemmän. Jos käyte ­
tään muita standardeja, esim. polyetyleeniglykolia, polyetyleemoksi ­
dia, polymetyylimetakrylaattia tai polyakryylihappoa, on syy ilmoi ­
tettava.  
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Sekä näytteen molekyylipainojakauma että keskimääräiset molekyy ­
lipainot M  n ja M  w voidaan määrittää GPC:llä. GPC on erityinen 
nestekromatografian laji, jossa näytteen erottaminen perustuu seok ­
sen yksittäisten aineiden hydrodynaamisiin tilavuuksiin (2).  
Erottuminen tapahtuu, kun näyte kulkee huokoisella aineella, tyy ­
pillisesti orgaanisella geelillä täytetyn pylvään läpi. Pienet molekyylit 
tunkeutuvat huokosiin, kun taas suuret molekyylit jäävät huokosten 
ulkopuolelle. Isojen molekyylien kulkema tie on siten lyhyempi, ja ne tulevat ensimmäisenä ulos pylväästä. Keskikokoiset molekyylit 
tunkeutuvat joihinkin huokosiin ja eluoituvat myöhemmin. Pienim ­
mät molekyylit, joiden keskimääräinen hydrodynaaminen säde on pienempi kuin geelin huokoset, voivat tunkeutua kaikkiin huokosiin. Ne eluoituvat viimeisinä.
 
Ihanteellisessa tilanteessa erottumiseen vaikuttaa ainoastaan mole ­
kyylilajin koko, mutta käytännössä on vaikea välttää ainakin jonkin 
verran adsorptiosta aiheutuvaa haittaa. Epätasaisesti pakattu pylväs ja 
kuolleet tilavuudet voivat pahentaa tilannetta (2).  
Detektorina käytetään esim. taitekerroin- tai UV-detektoria, ja tulok ­
sena saadaan yksinkertainen jakaumakäyrä. Jotta käyrästä voidaan lukea oikeita molekyylipainoja, on pylväs kalibroitava molekyylipai ­
noltaan tunnetuilla polymeereillä, joilla on mieluiten suunnilleen sa ­
manlainen rakenne, esim. erilaiset polystyreenistandardit. Tuloksena on tyypillisesti Gaussin käyrä, joka on joskus vääristynyt siten, että pienen molekyylipainon puolella on ”häntä”; pystysuoralla akselilla 
on eluoitujen molekyylilajien määrät painomitoissa ja vaaka-akselilla 
molekyylipainon logaritmi.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 124
 
1.5 LAATUKRITEERIT  
Eluutiotilavuuden toistettavuuden (keskihajonnan keskivirhe: RSD) 
olisi oltava parempi kuin 0,3 %. Määrityksen vaadittu toistettavuus on varmistettava sisäistä standardia käyttämällä, jos kromatogrammin 
arviointi on aikariippuvainen eikä täytä edellä mainittuja kriteerejä 
(1). Polydispersiivisyys riippuu standardien molekyylipainoista. Po ­
lystyreenistandardien osalta tyypillisiä arvoja ovat: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 < M  p < 10  6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p on standardin molekyylipaino piikin maksimissa)  
1.6 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.6.1  Polystyreenistandardiliuosten valmistus  
Polystyreenistandardit liuotetaan sekoittamalla huolellisesti haluttuun 
eluointiliuokseen. Valmistajan ohjeet on otettava huomioon liuosten 
valmistuksessa.  
Valittujen standardien pitoisuudet riippuvat eri tekijöistä, esim. in ­
jektiotilavuudesta, liuoksen viskositeetistä ja detektorin herkkyydestä. 
Suurin injektiotilavuus on sovitettava pylvään pituuden mukaan, ettei 
pylvästä kuormiteta liikaa. Tyypilliset injektiotilavuudet käytettäessä GPC:tä analyyttisiin erotuksiin pylväässä, jonka koko on 30 cm x 7,8 mm, ovat tavallisesti 40–100 μl. Suuremmat tilavuudet ovat 
mahdollisia, mutta eivät saisi olla enemmän kuin 250 μl. Injektioti ­
lavuuden ja aineen pitoisuuden paras suhde on määritettävä ennen pylvään varsinaista kalibrointia.
 
1.6.2  Näyteliuoksen valmistus  
Periaatteessa samat vaatimukset koskevat näyteliuosten valmistamis ­
ta. Näyte liuotetaan sopivaan liuottimeen (esim tetrahydrofuraaniin (THF)) ravistamalla huolellisesti. Sitä ei saa missään tapauksessa liuottaa ultraäänihauteessa. Tarpeen vaatiessa näyte puhdistetaan suo ­
dattamalla kalvolla, jonka huokoskoko on 0,2–2 μm.
 
Jos näytteessä on liukenemattomia hiukkasia, on tämä kirjattava lop ­
puraporttiin, koska se saattaa johtua suurikokoisista molekyyleistä. Liukenemattomien hiukkasten painoprosenttiosuus on määritettävä 
jollakin sopivalla menetelmällä. Liuokset on käytettävä vuorokauden 
sisällä.
 
1.6.3  Laitteisto  
— liuotinsäiliö  
— kaasunpoistolaite (tarvittaessa)  
— pumppu  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 125
 
— pulssinvaimennin (tarvittaessa)  
— injektiojärjestelmä  
— kromatografiapylväät  
— ilmaisin (detektori)  
— virtausmittari (tarvittaessa)  
— tulosten tallennus/prosessointilaite  
— jäteastia  
On varmistettava, että GPC-laitteisto ei reagoi käytettävien liuotti ­
mien kanssa (esim. THF:n kanssa on käytettävä teräskapillaareja).  
1.6.4  Injektiojärjestelmä ja liuottimen annostelujärjestelmä  
Määrätty näytetilavuus syötetään pylvääseen joko automaattisella 
näytteensyöttölaitteella tai käsin tarkasti määriteltyyn vyöhykkeeseen, jos ruiskun mäntää vedetään tai työnnetään liian nopeasti, se voi aiheuttaa muutoksia havaitussa molekyylipainojakaumassa. Liuotinta 
pumppaavien pumppujen olisi oltava mahdollisimman tasaisia ja 
niissä saisi mieluiten olla pulssinvaimennin. Virtausnopeuden pitäisi olla noin 1 ml/min.
 
1.6.5  Pylväs  
Näytteestä riippuen polymeerin ominaisuudet määritetään käyttäen 
joko yhtä pylvästä tai useita peräkkäin kytkettyjä pylväitä. Kaupal ­
lisesti on saatavilla lukuisia pylväsmateriaaleja, joiden ominaisuudet on määritelty (esim. huokoskoko, ekskluusiorajat). Erotusgeelin ja pylvään pituuden valinta riippuu sekä näytteen ominaisuuksista (hyd ­
rodynaamiset tilavuudet, molekyylipainojakauma) että erotuksen eri ­
tyisvaatimuksista kuten liuottimesta, lämpötilasta ja virtausnopeu ­
desta (1) (2) (3).
 
1.6.6  Teoreettiset levyt  
Käytettävästä pylväästä tai pylväsyhdistelmästä on tiedettävä teoreet ­
tisten levyjen lukumäärä. Tätä varten syötetään pituudeltaan tunnet ­
tuun pylvääsen — jos THF on eluutioliuotin — etyylibentseeniIi ­
uosta tai muuta sopivaa ei-polaarista liuotinta. Teoreettisten levyjen lukumäärä saadaan seuraavasta yhtälöstä: 
N ¼ 5; 54
 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
tai N ¼ 16 V e 
W Í Î  2 
jossa  
N on teoreettisten levyjen lukumäärä  
V e on eluutiotilavuus piikin maksimin kohdalla  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 126
 
W on piikin leveys perusviivalla  
W 1/2 on piikin leveys piikin korkeuden puolivälissä.  
1.6.7  Erotusteho  
Teoreettisten levyjen lukumäärän lisäksi, joka on vyöhykkeen levey ­
den määräävä suure, myös erotusteholla on osansa. Erotustehon mää ­
rää kalibraatiokäyrän jyrkkyys. Pylvään erotusteho saadaan seuraa ­
vasta yhtälöstä:  
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
pylvään leikkausen pinta  Ä ala ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
jossa  
V e, Mx = on sellaisen polystyreenin, jonka molekyylipaino on 
M x , eluutiotilavuus  
V e,(10Mx)  = on molekyylipainoltaan kymmenen kertaa suuremman 
polystyreenin eluutiotilavuus.  
Järjestelmän erotuskyky määritellään yleensä seuraavasti:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
jossa  
V el , V e2 = ovat kahden polystyreenistandardin eluutiotilavuudet 
piikin maksimissa  
W 1 , W  2 = ovat piikin leveydet perusviivalla  
M l , M  2 = ovat molekyylipainot piikin maksimissa (niiden ero pi ­
täisi olla vähintään 10-kertainen).  
Pylvään R-arvon olisi oltava suurempi kuin 1,7 (4).  
1.6.8  Liuottimet  
Kaikkien liuottimien on oltava korkeaa puhtauslaatua (THF:n puh ­
taus 99,5 %). Liuotinastian (tarvittaessa inertissä kaasussa) on oltava 
riittävän iso pylvään kalibroimiseen ja useiden näytteiden määrittä ­
miseen. Liuottimesta on poistettava kaasut ennen kuin sitä pumpa ­
taan pylvääseen.  
1.6.9  Lämpötilansäätö  
Tärkeiden laitteiston sisäisten osien (injektiosilmukka, pylväät, detek ­
tori ja letkut/putket) lämpötilan olisi oltava vakaa ja valitulle liuotti ­
melle sopiva.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 127
 
1.6.10  Detektori  
Detektorin tarkoitus on mitata pylväästä tulevan näytteen pitoisuus. 
Jotta piikit eivät leviäisi tarpeettomasti, on detektorin mittauskyvetin tilavuuden oltava mahdollisimman pieni. Se ei saisi olla suurempi 
kuin 10 μl paitsi valon sirontaa tai viskositeettia mittaavilla detekto ­
reilla. Detektorina käytetään tavallisesti differentiaalirefraktometriä. Muitakin detektoreja, esim. UV/VIS-, IR- ja viskositeettidetektoreja voidaan käyttää, mikäli näytteen tai eluutioliuottimen erityiset omi ­
naisuudet edellyttävät sitä.
 
2. MÄÄRITYSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
2.1 MÄÄRITYSTULOKSET  
Yksityiskohtaisten arviointiperusteiden samoin kuin määritystulosten 
keräämisen ja käsittelyn osalta on noudatettava DIN-standardin (1) määrityksiä.
 
Kustakin näytteestä tehdään kaksi erillistä koetta, jotka on analysoi ­
tava erikseen.  
M n , M  w , M  w /M n ja M  p on ilmoitettava jokaisesta mittauksesta. On 
ilmoitettava selvästi, että mitatut arvot ovat suhteellisia arvoja, jotka ovat suhteessa käytettyjen standardien molekyylipainoihin.
 
Kun retentiotilavuudet tai retentioajat (mahdollisesti korjattuina si ­
säisten standardien suhteen) on määritetty, esitetään log M -arvot 
(M on kalibrointistandardin piikin korkein kohta) jonkin edellä mai ­
nitun suureen funktiona. Kutakin molekyylipainon kymmentä potens ­
sia kohti tarvitaan vähintään kaksi kalibrointipistettä ja koko käyrällä on oltava vähintään viisi mittauspistettä, joiden pitäisi kattaa näytteen 
arvioitu molekyylipainoalue. Kalibrointikäyrän loppupiste pienen 
molekyylipainon päässä määritetään n-heksyylibentseenin tai jonkin muun sopivan ei-polaarisen liuottimen avulla M
 n ja M  w määritetään 
tavallisesti tietokoneella osastossa 1.2 esitettyjen kaavojen perusteel ­
la. Jos käytetään manuaalista digitointia, voidaan ohjeeksi katsoa 
menetelmää ASTM D 3536-91 (3).  
Jakaumakäyrä on esitettävä taulukon tai kuvan muodossa (differen ­
tiaalinen taajuus tai summaprosenttiosuudet log M:n funktiona). Graafisessa esityksessä yksi molekyylipainon kymmenen potenssi 
pitäisi olla tavallisesti noin 4 cm leveä ja piikin maksimin pitäisi 
olla noin 8 cm korkea. Koko jakaumakäyrän osalta y-akselin kor ­
keuden 0 ja 100 %:n välillä olisi oltava noin 10 cm.
 
2.2 TESTIRAPORTTI  
Testiraportissa on esitettävä seuraavat asiat:  
2.2.1  Testattava aine  
— saatavissa olevat tiedot testattavasta aineesta (tunnistetiedot, lisä ­
aineet, epäpuhtaudet);  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 128
 
— näytteen käsittelyn kuvaus, mahdolliset huomiot ja ongelmat.  
2.2.2  Laitteisto  
— eluenttisäiliö, inertti kaasu, kaasun poisto eluentista, eluentin 
koostumus, epäpuhtaudet,  
— pumppu, pulssinvaimennin, injektiojärjestelmä,  
— erotuspylväät (valmistaja, kaikki tiedot pylväiden ominaisuuksista 
kuten huokoskoko, erotusmateriaalin tyyppi jne., käytettävien pylväiden lukumäärä, pituus ja järjestys),
 
— pylvään (tai pylväsyhdistelmän) teoreettisten levyjen lukumäärä, 
erotusteho (järjestelmän erotuskyky),  
— piikkien symmetriaa koskevat tiedot,  
— pylvään lämpötila, lämpötilan säätötapa,  
— detektori (mittausperiaate, tyyppi, kyvetin tilavuus),  
— mahdollinen virtausmittari (valmistaja, mittausperiaate),  
— mittaustulosten tallennus- ja käsittelyjärjestelmä (laitteet ja ohjel ­
mat).  
2.2.3  Järjestelmän kalibrointi  
— kalibrointikäyrän määrittämiseksi käytetyn menetelmän tarkka 
kuvaus  
— tiedot menetelmän laatukriteereistä (esim. korrelaatiokerroin, 
jäännösneliösumma jne.)  
— tiedot kaikista kokeen aikana sekä tulosten arvioinnissa ja käsit ­
telyssä suoritetuista ekstrapolaatioista, oletuksista ja aproksimaa ­
tioista,  
— kaikki kalibrointikäyrän määrittämiseksi käytetyt mittaukset on 
esitettävä taulukossa, jossa esitetään myös seuraavat tiedot kus ­
takin kalibrointipisteestä:  
— näytteen nimi,  
— aineen valmistaja,  
— valmistajan ilmoittamat tai mittauksista johdetut standardien 
M p , M  n , M  w ja M  w /M n ominaisarvot sekä tarkat tiedot niiden 
määritysmenetelmästä,  
— injektiotilavuus ja injektoitavan liuoksen pitoisuus,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 129
 
— kalibrointiin käytetty M  p -arvo  
— eluutiotilavuus tai piikin maksimissa mitattu korjattu retentio ­
aika,  
— piikin maksimissa laskettu M  p 
— laskemalla saadun M  p :n ja kalibrointiarvon prosenttivaihe.  
2.2.4  Arviointi  
— aikaperusteinen arviointi: toistettavuuden varmistamiseen käytetyt 
menetelmät (korjausmenetelmä, sisäinen standardi jne.),  
— suoritetaanko arviointi eluutiotilavuuden vai retentioajan perus ­
teella,  
— tiedot arvion rajoituksista, jos piikkiä ei analysoida täydellisesti,  
— mahdollisten tasoitusmenetelmien kuvaus,  
— näytteen valmistus ja esikäsittely,  
— mahdolliset liukenemattomat hiukkaset,  
— injektiotilavuus ( μl) ja injektoitavan näytteen pitoisuus (mg/ml),  
— huomiot seikoista, joista aiheutuu poikkeamista ihanteellisesta 
GPC-käyttäytymisestä,  
— tarkka kuvaus kaikista testausmeneteimien muutoksista,  
— virherajoja koskevat yksityiskohtaiset tiedot,  
— kaikki tulosten tulkintaan vaikuttavat tiedot ja huomiot.  
3. KIRJALLISUUSVIITTEET  
(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid 
Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- 
GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelp ­
hia, Pennsylvania.  
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polys ­
tyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 130
 
Liite 
Esimerkkejä muista menetelmistä polymeerien lukukeskimääräisen 
molekyylipainon (M  n ) määrittämiseksi  
Geelipermeaatiokromatografia (GPC) on paras menetelmä M  n :n määrittämiseksi, 
erityisesti, jos on käytettävissä sarja standardeja, joiden rakenne vastaa polymee ­
rin rakennetta. Jos kuitenkin GPC:n käytössä on käytännön hankaluuksia tai on 
odotettavissa, että aine ei täytä säädettyä M-kriteeriä (joka on varmistettava), voidaan käyttää muita menetelmiä, kuten
 
1. Kolligatiivisten ominaisuuksien käyttö  
1.1 Ebullioskopia/kryoskopia  
Tässä mitataan kiehumispisteen ylenemä (ebullioskopia) tai jäätymis ­
pisteen alenema (kryoskopia), kun liuokseen lisätään tutkittavaa po ­
lymeeriä. Menetelmä perustuu siihen, että liuenneen polymeerin vai ­
kutus nesteen kiehumis/jäätymispisteeseen riippuu polymeerin mole ­
kyylipainosta (1) (2).  
Soveltamisala: M  n < 20 000.  
1.2 Höyrynpaineen aleneminen  
Tässä mitataan valitun vertailuaineen höyrynpaine ennen ja jälkeen, 
kun on lisätty tunnettu määrä polymeeriä (1) (2).  
Soveltamisala: M  ri < 20 000 (teoreettisesti; käytännössä tästä mene ­
telmästä on vähän hyötyä).  
1.3 Kalvo-osmometria  
Tämä menetelmä perustuu osmoosiin, ts. liuotinmolekyylien luonnol ­
liseen taipumukseen diffundoitua puoliläpäisevän kalvon läpi laime ­
asta väkevään liuokseen päin tasapainon saavuttamiseksi. Testin lai ­
meassa liuoksessa ei ole lainkaan polymeeriä, ja väkevä liuos sisältää polymeeriä. Kun liuos menee kalvon läpi, muodostuu paine-ero, joka riippuu polymeerin konsentraatiosta ja molekyylipainosta (1) (3) (4).
 
Solveltamisala: M  n < 20 000–200 000.  
1.4 Höyryfaasiosmometria  
Tässä menetelmässä verrataan puhtaan liuotinaerosolin haihtumisno ­
peutta vähintään kolmeen aerosoliin, joissa polymeerin pitoisuus 
vaihtelee (1) (5) (6).  
Soveltamisala: M  n < 20 000.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 131
 
2. Pääteryhmäanalyysi  
Jotta tätä menetelmää voitaisiin käyttää, on tunnettava sekä polymee ­
rin koko rakenne että ketjujen päissä olevien ryhmien laatu (joka pitää voida olla erotettavissa päärakenteesta esim. NMR:llä tai titraamalla/derivatisoimalla). Kun määritetään polymeerissä olevien 
pääteryhmien molekulaarinen konsentraatio, voidaan johtaa arvo mo ­
lekyylipainolle (7) (8) (9).
 
Soveltamisala: M  n korkeintaan 50 000 (luotettavuus vähenee mole ­
kyylipainon noustessa).  
Kirjallisuusviitteet  
(1) Billmeyer, F.W. Jr, (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd 
Edn, John Wiley, New York.  
(2) Glover, C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. 
Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed, Marcel Dekker, New York.
 
(3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination 
of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Memb ­
rane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
 
(4) Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of 
Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 
25–52.  
(5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for 
Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, Ame ­
rican Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsyl ­
vania.  
(6) Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure osmometry. In: De ­
termination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons.
 
(7) Schröder, E, Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer 
Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.  
(8) Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 
In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, jr. ed. Marcel Dekker, New York.
 
(9) Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 
2139–2146.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 132
 
A.19.  PIENIMOLEKYYLISTEN AINEIDEN PITOISUUS POLYMEE ­
RISSÄ  
1. MENETELMÄ  
Tämä geelipermeaatiokromatografiamenetelmä on toisinto OECD:n 
testausohjeesta N:o 119 (1996). Perusperiaatteet ja teknisiä lisätietoja 
saa kirjallisuusviitteistä.  
1.1 JOHDANTO  
Koska polymeerien ominaisuudet vaihtelevat suuresti, on mahdotonta 
kuvata yhtä ainoaa menetelmää, jossa selitettäisiin täsmällisesti kaikki polymeerien erotuksessa mahdollisesti esiintyvät erityiset sei ­
kat kattavat erotus- ja analysointiedellytykset. Erityisesti kompleksi ­
set polymeerijärjestelmät eivät useinkaan sovi geelipermeaatiokroma ­
tografiaan. Kun GPC:tä ei voida käyttää, molekyylipaino voidaan määrittää muilla menetelmillä (katso Liite). Tällöin on esitettävä käytettyä menetelmää koskevat yksityiskohdat ja perustelut.
 
Seuraavassa kuvattava menetelmä perustuu DIN-standardiin 55672 
(1). Tässä standardissa esitetään yksityiskohtaisesti, miten kokeet suoritetaan ja tulokset arvioidaan. Jos koeolosuhteita täytyy muuttaa, 
on muutokset perusteltava. Muita standardeja voi käyttää, jos niistä 
annetaan täydelliset viitteet. Tässä kuvattavassa menetelmässä käyte ­
tään tunnetun polydispersiivisyyden omaavia polystyreeninäytteitä 
kalibrointiin, ja menetelmää on mahdollisesti muutettava tiettyjä po ­
lymeerejä varten, esim. vesiliukoisia ja pitkäketjuisia haaraisia poly ­
meerejä varten.
 
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Matalaksi molekyylipainoksi määritellään pienempi kuin 1 000 (dal ­
tonia).  
M n (lukukeskimääräinen molekyylipaino) ja M  w (painokeskimääräi ­
nen molekyylipaino) määritellään seuraavilla yhtälöillä: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
joissa  
H 1 = on detektorisignaalin korkeus perustasosta retentiotilavuu ­
delle V  i , 
M j = on polymeerifraktion molekyylipaino retentiotilavuudessa 
V i , ja n on mittauspisteiden lukumäärä.  
Molekyylipainojakauman leveys, joka on suhteessa järjestelmän dis ­
persiivisyyteen, saadaan suhteesta M  w /M n ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 133
 
1.3 VERTAILUAINEET  
Koska GPC on suhteellinen menetelmä, on tehtävä kalibrointi. Tähän 
käytetään tavallisesti kokojakaumaltaan kapeita lineaarisia polysty ­
reenistandardeja, joiden keskimääräiset molekyylipainot M  n ja M  w 
sekä molekyylipainojakauma tunnetaan. Kalibrointikäyrää voidaan 
käyttää tuntemattoman näytteen molekyylipainon määritykseen vain, jos näytteen ja standardin erotusolosuhteet on valittu samalla tavalla.
 
Molekyylipainon ja eluutiotilavuuden suhde on validi ainoastaan tie ­
tyn kokeen tietyissä koeolosuhteissa. Tärkeitä tekijöitä ovat ennen 
kaikkea lämpötila, liuotin (tai liuotinseos), kromatografiajärjestely 
sekä erotus pylväs tai pylväsjärjestelmä.  
Tällä tavoin määritetyt näytteen molekyylipainot ovat suhteellisia 
arvoja ja niistä käytetään nimitystä ”polystyreeniekvivalenttimole ­
kyylipaino”. Tämä tarkoittaa sitä, että riippuen näytteen ja standar ­
dien rakenne-eroista ja kemiallisista eroista molekyylipainot voivat 
poiketa absoluuttisista arvoista enemmän tai vähemmän. Jos käyte ­
tään muita standardeja, esim. polyetyleeniglykolia, polyetyleenioksi ­
dia, poly-metyylimetakrylaattia tai polyakryylihappoa, on syy ilmoi ­
tettava.  
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Sekä näytteen molekyylipainojakauma että keskimääräiset molekyy ­
lipainot M  n ja M  w voidaan määrittää GPC:llä. GPC on erityinen 
nestekromatografian laji, jossa näytteen erottaminen perustuu seok ­
sen yksittäisten aineiden hydrodynaamisiin tilavuuksiin (2).  
Erottuminen tapahtuu, kun näyte kulkee huokoisella aineella, tyy ­
pillisesti orgaanisella geelillä täytetyn pylvään läpi. Pienet molekyylit tunkeutuvat huokosiin, kun taas suuret molekyylit jäävät huokosten ulkopuolelle. Isojen molekyylien kulkema tie on siten lyhyempi, ja 
ne tulevat ensimmäisenä ulos pylväästä. Keskikokoiset molekyylit 
tunkeutuvat joihinkin huokosiin ja eluoituvat myöhemmin. Pienim ­
mät molekyylit, joiden keskimääräinen hydrodynaaminen säde on pienempi kuin geelin huokoset, voivat tunkeutua kaikkiin huokosiin. 
Ne eluoituvat viimeisinä.
 
Ihanteellisessa tilanteessa erottumiseen vaikuttaa ainoastaan mole ­
kyylilajin koko, mutta käytännössä on vaikea välttää ainakin jonkin 
verran adsorptiosta aiheutuvaa haittaa. Epätasaisesti pakattu pylväs ja kuolleet tilavuudet voivat pahentaa tilannetta (2).
 
Detektorina käytetään esim. taitekerroin- tai UV-detektoria, ja tulok ­
sena saadaan yksinkertainen jakaumakäyrä. Jotta käyrästä voidaan lukea oikeita molekyylipainoja, on pylväs kalibroitava molekyylipai ­
noltaan tunnetuilla polymeereillä, joilla on mieluiten suunnilleen sa ­
manlainen rakenne, esim. erilaiset polystyreenistandardit.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 134
 
Tuloksena on tyypillisesti Gaussin käyrä, joka on joskus vääristynyt 
siten, että pienen molekyylipainon puolella on ”häntä”; pystysuoralla 
akselilla on eluoitujen molekyylilajien määrät painomitoissa ja vaa ­
ka-akselilla molekyylipainon logaritmi.  
1.5 LAATUKRITEERIT  
Eluutiotilavuuden toistettavuuden (keskihajonnan keskivirhe: RSD) 
olisi oltava parempi kuin 0,3 %, Määritvksen vaadittu toistettavuus on varmistettava sisäistä standardia käyttämällä, jos kromato-gram ­
min arviointi on aikariippuvainen eikä täytä edellä mainittuja kritee ­
rejä (1). Polydispersiivisyys riippuu standardien molekyylipainoista. Polystyreenistandardien osalta tyypillisiä arvoja ovat: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p on standardin molekyylipaino piikin maksimissa).  
1.6 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.6.1  Polystyreenistandardiliuosten valmistus  
Polystyreenistandardit liuotetaan sekoittamalla huolellisesti haluttuun 
eluointiliuokseen. Valmistajan ohjeet on otettava huomioon liuosten valmistuksessa.
 
Valittujen standardien pitoisuudet riippuvat eri tekijöistä, esim. in ­
jektiotilavuudesta, liuoksen viskositeetistä ja detektorin herkkyydestä, 
Suurin injektiotilavuus on sovitettava pylvään pituuden mukaan, ettei pylvästä kuormiteta liikaa. Tyypilliset injektiotilavuudet käytettäessä GPC:tä analyyttisiin erotuksiin pylväässä, jonka koko on 30 cm x 
7,8 mm, ovat tavallisesti 40–100 μl. Suuremmat tilavuudet ovat 
mahdollisia, mutta eivät saisi olla enemmän kuin 250 μl. Injektioti ­
lavuuden ja aineen pitoisuuden paras suhde on määritettävä ennen pylvään varsinaista kalibrointia.
 
1.6.2  Näyteliuoksen valmistus  
Periaatteessa samat vaatimukset koskevat näyteliuosten valmistamis ­
ta. Näyte liuotetaan sopivaan liuottimeen (esim. tetrahydrofuraaniin 
(THF) ravistamalla huolellisesti. Sitä ei saa missään tapauksessa 
liuottaa ultraäänihauteessa. Tarpeen vaatiessa näyte puhdistetaan suo ­
dattamalla kalvolla, jonka huokoskoko on 0,2–2 μm. 
Jos näytteessä on liukenemattomia hiukkasia, on tämä kirjattava lop ­
puraporttiin, koska se saattaa johtua suurikokoisista molekyyleistä. Liukenemattomien hiukkasten painoprosenttiosuus on määritettävä 
jollakin sopivalla menetelmällä. Liuokset on käytettävä vuorokauden 
sisällä.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 135
 
1.6.3  Epäpuhtauksista ja lisäaineista johtuvat korjaukset  
Molekyylipainoltaan alle 1 000 olevien molekyylien suhteen on 
yleensä tehtävä korjaus, joka aiheutuu ei-polymeerisistä komponen ­
teista (esim. epäpuhtaudet ja/tai lisäaineet), ellei pitoisuus jo ole 
pienempi kuin 1 %. Tämä tehdään analysoimalla suoraan polymee ­
riliuos tai GPC-eluaatti.  
Jos eluaatti on pylväästä tultuaan liian laimea analysoitavaksi edel ­
leen, se on konsentroitava. Voi olla tarpeen haihduttaa se kuiviin ja liuottaa uudelleen. Konsentroiminen on tehtävä siten, ettei eluaatissa 
tapahdu muutoksia. Eluaatin käsittely GPC-vaiheen jälkeen riippuu 
kvantitatiiviseen määritykseen käytettävästä analyyttisestä menetel ­
mästä.
 
1.6.4  Laitteisto  
GPC-laitteistoon kuuluu seuraavat osat:  
— liuotinsäiliö  
— kaasunpoistolaite (tarvittaessa)  
— pumppu  
— pulssinvaimennin (tarvittaessa)  
— injektiojärjestelmä  
— kromatografiapylväät  
— ilmaisin (detektori)  
— virtausmittari (tarvittaessa)  
— tulosten tallennus/prosessointilaite  
— jäteastia.  
On varmistettava, että GPC-laitteisto ei reagoi käytettävien liuotti ­
mien kanssa (esim. THF:n kanssa on käytettävä teräskapillaareja).  
1.6.5  Injektiojärjestelmä ja liuottimen annostelujärjestelmä  
Määrätty näytetilavuus syötetään pylvääseen joko automaattisella 
näytteensyöttölaitteella tai käsin tarkasti määriteltyyn vyöhykkeeseen. Jos ruiskun mäntää vedetään tai työnnetään liian nopeasti, se voi 
aiheuttaa muutoksia havaitussa molekyylipainojakaumassa. Liuotinta 
pumppaavien pumppujen olisi oltava mahdollisimman tasaisia ja niissä saisi mieluiten olla pulssinvaimennin. Virtausnopeuden pitäisi olla noin 1 ml/min.
 
1.6.6  Pylväs  
Näytteestä riippuen polymeerin ominaisuudet määritetään käyttäen 
joko yhtä pylvästä tai useita peräkkäin kytkettyjä pylväitä. Kaupal ­
lisesti on saatavilla lukuisia pylväsmateriaaleja, joiden ominaisuudet 
on määritelty (esim. huokoskoko, ekskluusiorajat). Erotusgeelin ja pylvään pituuden valinta riippuu sekä näytteen ominaisuuksista (hyd ­
rodynaamiset tilavuudet, molekyylipainojakauma) että erotuksen eri ­
tyisvaatimuksista kuten liuottimesta, lämpötilasta ja virtausnopeu ­
desta (1) (2) (3).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 136
 
1.6.7  Teoreettiset levyt  
Käytettävästä pylväästä tai pylväsyhdistelmästä on tiedettävä teoreet ­
tisten levyjen lukumäärä. Tätä varten syötetään pituudeltaan tunnet ­
tuun pylvääseen — jos THF on eluutioliuotin — etyylibentseeniliu ­
osta tai muuta sopivaa ei-polaarista liuotinta. Teoreettisten levyjen 
lukumäärä saadaan seuraavasta yhtälöstä: 
N ¼ 5; 54 Í V e 
W 1=2 Î 2 
tai N ¼ 16 Í V e 
W Î 2 
jossa  
N on teoreettisten levyjen lukumäärä  
V e on eluutiotilavuus piikin maksimin kohdalla  
W on piikin leveys perusviivalla  
W 172 on piikin leveys piikin korkeuden puolivälissä.  
1.6.8  Erotusteho  
Teoreettisten levyjen lukumäärän lisäksi, joka on vyöhykkeen levey ­
den määräävä suure, myös erotusteholla on osansa. Erotustehon mää ­
rää kalibraatiokäyrän jyrkkyys. Pylvään erotusteho saadaan seuraa ­
vasta yhtälöstä:  
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
pylvään leikkausen pinta  Ä ala ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
jossa  
V e, M x on sellaisen polystyreenin, jonka molekyylipaino on M  x , 
eluutiotilavuus  
V e,(10Mx)  on molekyylipainoltaan kymmenen kertaa suuremman po ­
lystyreenin eluutiotilavuus.  
Järjestelmän erotuskyky määritellään yleensä seuraavasti:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
jossa  
V e1 , V e2 ovat kahden polystyreenistandardin eluutiotilavuudet pii ­
kin maksimissa  
W 1 , W  2 ovat piikin leveydet perusviivalla  
M 1 , M  2 , ovat molekyylipainot piikin maksimissa (niiden ero pitäisi 
olla vähintään 10-kertainen)  
Pylvään R-arvon olisi oltava suurempi kuin 1,7 (4).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 137
 
1.6.9  Liuottimet  
Kaikkien liuottimien on oltava korkeaa puhtauslaatua (THF:n puh ­
taus 99,5 %). Liuotinastian (tarvittaessa inertissä kaasussa) on oltava riittävän iso pylvään kalibroimiseen ja useiden näytteiden määrittä ­
miseen. Liuottimesta on poistettava kaasut ennen kuin sitä pumpa ­
taan pylvääseen.
 
1.6.10  Lämpötilansäätö  
Tärkeiden laitteiston sisäisten osien (injektiosilmukka, pylväät, detek ­
tori ja letkut/putket) lämpötilan olisi oltava vakaa ja valitulle liuotti ­
melle sopiva.  
1.6.11  Detektori  
Detektorin tarkoitus on mitata pylväästä tulevan näytteen pitoisuus. 
Jotta piikit eivät leviäisi tarpeettomasti, on detektorin mittauskyvetin 
tilavuuden oltava mahdollisimman pieni. Se ei saisi olla suurempi 
kuin 10 μl paitsi valon sirontaa tai viskositeettia mittaavilla detekto ­
reilla. Detektorina käytetään tavallisesti differentiaalirefraktometriä. Muitakin detektoreja, esim. UV/VIS-, IR- ja viskositeettidetekto- 
reja voidaan käyttää, mikäli näytteen tai eluutioliuottimen erityiset 
ominaisuudet edellyttävät sitä.
 
2. MÄÄRITYSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
2.1 MÄÄRITYSTULOKSET  
Yksityiskohtaisten arviointiperusteiden samoin kuin määritystulosten 
keräämisen ja käsittelyn osalta on noudatettava DIN-standardin (1) määrävksiä.
 
Kustakin näytteestä tehdään kaksi erillistä koetta, jotka on analysoi ­
tava erikseen.  
M n , M  w , M  w /M n ja M on ilmoitettava jokaisesta mittauksesta. On 
ilmoitettava selvästi, että mitatut arvot ovat suhteellisia arvoja, jotka 
ovat suhteessa käytettyjen standardien molekyylipainoihin.  
Kun retentiotilavuudet tai retentioajat (mahdollisesti korjattuina si ­
säisten standardien suhteen} on määritetty, esitetään log M -arvot 
(M p on kalibrointistandardin piikin korkein kohta) jonkin edellä mai ­
nitun suureen funktiona. Kutakin molekyylipainon kymmenen po ­
tenssia kohti tarvitaan vähintään kaksi kalibrointipistettä ja koko käyrällä on oltava vähintään viisi mittauspistettä, joiden pitäisi kattaa 
näytteen arvioitu molekyylipainoalue. Kalibrointikäyrän loppupiste 
pienen molekyylipainon päässä määritetään n-heksyylibentseenin tai jonkin muun sopivan ei-polaarisen liuottimen avulla. M
 n ja M  w mää­
ritetään tavallisesti tietokoneella osastossa 1.2 esitettyjen kaavojen 
perusteella. Jos käytetään manuaalista digitointia, voidaan ohjeeksi 
katsoa menetelmää ASTM D 3536-91 (3).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 138
 
Jakaumakäyrä on esitettävä taulukon tai kuvan muodossa (differen ­
tiaalinen taajuus tai summaprosenttiosuudet log M:n funktiona). 
Graafisessa esityksessä yksi molekyylipainon kymmenen potenssi pitäisi olla tavallisesti noin 4 cm leveä ja piikin maksimin pitäisi olla noin 8 cm korkea. Koko jakaumakäyrän osalta y-akselin kor ­
keuden 0 ja 100 %:n välillä olisi oltava noin 10 cm.
 
2.2 TESTIRAPORTTI  
Testiraportissa on esitettävä seuraavat asiat:  
2.2.1  Testattava aine  
— saatavissa olevat tiedot testattavasta aineesta (tunnistetiedot, lisä ­
aineet, epäpuhtaudet),  
— näytteen käsittelyn kuvaus, mahdolliset huomiot ja ongelmat.  
2.2.2  Laitteisto  
— eluenttisailiö, inertti kaasu, kaasun poisto eluentista, eluentin 
koostumus, epäpuhtaudet  
— pumppu, pulssinvaimennin, injektiojärjestelmä  
— erotuspylväät (valmistaja, kaikki tiedot pylväiden ominaisuuksista 
kuten huokoskoko, erotusmateriaalin tyyppi jne, käytettävien pyl ­
väiden lukumäärä, pituus ja järjestys),  
— pylvään (tai pylväsyhdistelmän) teoreettisten levyjen lukumäärä, 
erotusteho (järjestelmän erotuskyky),  
— piikkien symmetriaa koskevat tiedot,  
— pylvään lämpötila, lämpötilan säätötapa,  
— detektori (mittausperiaate, tyyppi, kyvetin tilavuus),  
— mahdollinen virtausmittari (valmistaja, mittausperiaate),  
— mittaustulosten tallennus- ja käsittelyjärjestelmä (laitteet ja ohjel ­
mat).  
2.2.3  Järjestelmän kalibrointi  
— kalibrointikäyrän määrittämiseksi käytetyn menetelmän tarkka 
kuvaus,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 139
 
— tiedot menetelmän laatukriteereistä (esim. korrelaatiokerroin, 
jäännösneliösumma jne.),  
— tiedot kaikista kokeen aikana sekä tulosten arvioinnissa ja käsit ­
telyssä suoritetuista ekstrapolaatioista, oletuksista ja aproksimaa ­
tioista,  
— kaikki kalibrointikäyrän määrittämiseksi käytetyt mittaukset on 
esitettävä taulukossa, jossa esitetään myös seuraavat tiedot kus ­
takin kalibrointipisteestä:  
— näytteen nimi,  
— aineen valmistaja,  
— valmistajan ilmoittamat tai mittauksista johdetut standardien 
M p , M  n , M  w ja M  w /M n ominaisarvot sekä tarkat tiedot niiden 
määritysmenetelmästä,  
— injektiotilavuus ja injektoitavan liuoksen pitoisuus,  
— kalibrointiin käytetty M  p -arvo,  
— eluutiotilavuus tai piikin maksimissa mitattu korjattu retentio ­
aika,  
— piikin maksimissa laskettu M  p, 
— laskemalla saadun M  p :n ja kalibrointiarvon prosenttivaihe.  
2.2.4  Tiedot pienimolekyylipainoisen polymeerin pitoisuudesta  
— käytettyjen analyysimenetelmien kuvaus ja kokeiden suoritustapa,  
— tiedot pienimolekyylipainoisen aineen pitoisuusprosentista (w/w) 
suhteessa koko näytteeseen,  
— tiedot epäpuhtauksista, lisäaineista ja muista ei-polymeerisistä ai ­
neista painoprosentteina kokonäytteestä.  
2.2.5  Arviointi  
— aikaperusteinen arviointi: toistettavuuden varmistamiseen käytetyt 
menetelmät (korjausmenetelmä, sisäinen standardi jne.),  
— suoritetaanko arviointi eluutiotilavuuden vai retentioajan perus ­
teella,  
— tiedot arvion rajoituksista, jos piikkiä ei analysoida täydellisesti,  
— mahdollisten tasoitusmenetelmien kuvaus,  
— näytteen valmistus ja esikäsittely,  
— mahdolliset liukenemattomat hiukkaset,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 140
 
— injektiotilavuus ( μl) ja injektoitavan näytteen pitoisuus (mg/ml),  
— huomiot seikoista, joista aiheutuu poikkeamista ihanteellisesta 
GPC-käyttäytymisestä,  
— tarkka kuvaus kaikista testausmenetelmien muutoksista,  
— virherajoja koskevat yksityiskohtaiset tiedot,  
— kaikki tulosten tulkintaan vaikuttavat tiedot ja huomiot.  
3. KIRJALLISUUSVIITTEET  
(1) DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J, and Bly, D.D. eds (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J.Wiley and Sons.  
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelp ­
hia, Pennsylvania.
 
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polys ­
tyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 141
 
Liite 
Ohjeet pienimolekyylipainoisten aineiden pitoisuuden korjaamiseksi, jos 
näytteessä on liukenematonta polymeeriä  
Jos näytteessä on liukenematonta polymeeriä, aiheuttaa se massakatoa GPC-ana ­
lyysissä. Liukenematon polymeeri tarttuu pylvääseen tai näytesuodattimeen, kun 
taas näytteen liukoinen osa menee pylvään läpi. Jos polymeerin taitekerroindif ­
ferentiaali (inkrementti) (dn/dc) voidaan arvioida tai mitata, voidaan arvioida pylvääseen hävinnyt näytemassa. Tällöin tehdään korjaus ulkoisella kalibroinnilla käyttäen standardiaineita, joiden konsentraatio ja dn/dc tunnetaan, refraktometrin 
vasteen kalibroimiseksi. Seuraavassa esimerkissä käytetään poly(metyylimetakry ­
laatti) (pMMA) -stardardia.
 
Akryylipolymeerianalyysin ulkoisessa kalibroinnissa analysoidaan tetrahydrofu ­
raanissa oleva, tietyn konsentraatin omaava pMMA-standardi GPC:llä, ja tulok ­
sien avulla määritetään refraktometrivakio seuraavalla yhtälöllä:  
K = R/ (C x V x dn/dc),  
jossa  
K on refraktometrivakio (mikrovolttiasekunti/ml),  
R on pMMA-standardin vaste (mikrovolttiasekunti),  
C on pMMA-standardin konsentraatio (mg/ml),  
V on injektiovolyymi (ml) ja  
dn/dc on tetrahydrofuraanissa olevan pMMA-standardin taitekerroindifferenti ­
aali (ml/mg).  
Seuraavat tiedot ovat tyypillisiä pMMA-standardille:  
R = 2 937 891  
C = 1,07 mg/ml  
V = 0,1 ml  
dn/dc = 9 × 10  -5 ml/mg.  
Tulokseksi saatua K-arvoa (3,05 × 10  11 ) käytetään sitten teoreettisen detektori ­
vasteen laskemiseksi, kun oletetaan, että injisoitu polymeeri eluoituu detektorist 
100-prosenttisesti.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 142
 
A.20.  VESILIUOKSESSA OLEVIEN POLYMEERIEN LIUKENEMIS/ 
UUTTUMISOMINAISUUDET  
1. MENETELMÄ  
Seuraava menetelmä on toisinto OECD:n ohjeen N:o 120 (1997) 
muutetusta versiosta. Teknisiä lisätietoja on viitteessä (1).  
1.1 JOHDANTO  
Tietyille polymeereille, kuten emulsiopolymeerit, on tehtävä esikäsit ­
telyjä ennen kuin seuraavassa selostettua menetelmää voi käyttää. Menetelmä ei sovellu nestemäisiin polymeereihin eikä veden kanssa 
testausolosuhteissa reagoiviin polymeereihin.
 
Jos menetelmä ei ole kohtuullisesti tai lainkaan mahdollinen, 
liukenemis/uuttumisominaisuuksia voi tutkia muilla menetelmillä. Tällöin on esitettävä käytetyn menetelmän yksityiskohdat ja peruste ­
lut.
 
1.2. VERTAILUAINEET  
Ei vertailuaineita.  
1.3. TESTAUSMENETELMÄN PERIAATE  
Vesiliuoksessa olevien polymeerien liukenemis/uuttumisominaisuu ­
det määritetään pullomenetelmällä (katso A.6. Vesiliukoisuus, pullo ­
menetelmä) seuraavin muutoksin.  
1.4 LAATUKRITEERIT  
Ei laatukriteerejä.  
1.5 TESTAUSMENETELMÄN KUVAUS  
1.5.1  Laitteisto  
Menetelmässä tarvitaan seuraavat laitteet:  
— murskauslaite, esim. jauhin, tietyn koon omaavien hiukkasten 
valmistamiseksi,  
— ravistelulaite, jossa on lämpötilansäätö,  
— kalvosuodatusjärjestelmä  
— sopiva analyysilaitteisto  
— standardisoidut seulat.  
1.5.2  Näytteen valmistus  
Edustava näyte on ensin saatettava hiukkaskokoon 0,125–0,25 mm 
sopivilla seuloilla. Näytteen stabiilisuuden varmistamiseksi tai jauha ­
misen aikana voidaan tarvita jäähdytystä. Kumimaisia aineita voi 
murskata neste typpilämpötilassa (1).  
Jos vaadittua hiukkaskokoa ei voida saavuttaa, olisi pyrittävä saa ­
maan hiukkaskoko mahdollisimman pieneksi, ja ilmoitettava tulos. 
Raportissa on selostettava, miten murskattua näytettä säilytettiin en ­
nen testausta.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 143
 
1.5.3  Menetelmä  
Kolme 10 gramman näytettä testattavaa ainetta punnitaan kolmeen 
pulloon, joissa on lasitulpat, ja 1 000 ml vettä lisätään kuhunkin pulloon. Jos on hankala käsitellä 10:tä grammaa polymeeriä, käyte ­
tään suurempaa määrää ja lisätyn veden tilavuutta muutetaan vastaa ­
vasti.
 
Pullot suljetaan tiiviisti ja niitä ravistetaan 20  o C:ssa. Olisi käytettävä 
ravistelu- tai sekoituslaitetta, jonka lämpötila pysyy käytettäessä va ­
kiona. Kunkin pullon sisältö sentrifugoidaan tai suodatetaan 24 tun ­
nin kuluttua ja polymeerin pitoisuus kirkkaassa vesifaasissa määrite ­
tään sopivalla määritysmenetelmällä. Jos vesifaasille ei ole olemassa sopivaa määritysmenetelmää, kokonaisliukoisuus/uuttuvuus voidaan arvioida suodatusjäännöksen tai sentrifugoidun sakan kuivapainosta.
 
Tavallisesti on tehtävä kvantitatiivinen ero epäpuhtauksien ja lisä ­
aineiden ja toisaalta pienimolekyylipainoisten aineiden välillä. Gra ­
vimetrisiä määrityksiä tehtäessä on tärkeää tehdä myös nollakoe il ­
man testattavaa ainetta, jotta voidaan määrittää koemenetelmästä joh ­
tuvat jäämät.  
Polymeerien liukenemis/uuttumisominaisuuksia vedessä 37  o C:ssa 
pH:ssa 2 ja 9 voidaan määrittää samalla tavalla kuin 20  o C:n kokees ­
sa. pH-arvot voidaan säätää lisäämällä joko sopivia puskureita tai 
sopivia happoja tai emäksiä kuten suolahappoa, etikkahappoa, pro analyysi -laatuista natrium- tai kaliumhydroksidia tai NH
 3 :a. 
Määritysmenetelmästä riippuen on tehtävä yksi tai kaksi testiä. Jos 
on olemassa riittävän spesifinen menetelmä polymeerikomponentin määrittämiseksi suoraan vesiliuoksesta, pitäisi yhden edellä kuvatun 
kaltaisen testin riittää. Jos tällaista menetelmää ei kuitenkaan ole 
käytettävissä ja jos polymeerin liukenemis/uuttumisominaisuuksien määritys rajoittuu epäsuoraan analyysiin eli ainoastaan orgaanisen hiilen kokonaismäärän (TOC) määrittämiseen vesiuutteesta, pitäisi 
tehdä lisätesti. Tämä lisätesti pitäisi myös tehdä kolmoismäärityksenä 
käyttäen kymmenen kertaa pienempiä polymeerinäytteitä ja samaa määrää vettä kuin ensimmäisessä testissä.
 
1.5.4  Määritys  
1.5.4.1  Testi, jossa on yksi näytekoko  
Menetelmiä vesifaasissa olevan polymeerikomponentin suoraa mää ­
rittämistä varten voi olla olemassa. Vaihtoehtoisesti voidaan harkita 
myös liuenneiden/uuttuneiden polymeerikomponenttien epäsuoraa 
analyysiä, jolloin määritetään liukoisten osien kokonaispitoisuus ja korjataan ei-polymeerispesifisten komponenttien suhteen.
 
Kokonaispolymeeri voidaan määrittää vesiliuoksesta:  
joko riittävän herkällä menetelmällä, esim.  
— TOC käyttämällä persulfaatti- tai dikromaattidigestiota, jolloin 
muodostuva CO  2 määritetään IR:llä tai kemiallisesti;  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 144
 
— atomiabsorptiospektrometrialla (AAS) tai ICP (inductively co ­
upled plasma) -emissiomenetelmällä, jos polymeeri sisältää piitä 
tai metallia;  
— UV-absorptio- tai spektrofluorometrialla, jos on kyseessä aryy ­
lipolymeeri;  
— LC-MS:llä, jos on kyseessä pienimolekyylipainoiset näytteet;  
tai haihduttamalla vesiuute tyhjiössä kuiviin ja tekemällä jäännök ­
sestä spektroskooppinen (IR, UV jne.) tai AAS/ICP-analyysi.  
Jos vesifaasia ei voida sellaisenaan analysoida, pitäisi vesiuute uuttaa 
veteen sekoittuvalla orgaanisella liuottimella, esim. klooratulla hiilive ­
dyllä. Liuotin haihdutetaan ja jäännöksestä määritetään ilmoitetun po ­
lymeerin pitoisuus kuten edellä on selostettu. Jos tässä jäännöksessä 
tunnistetaan epäpuhtauksia tai lisäaineita, on niiden osuus vähennet ­
tävä itse polymeerin liukenemis/uuttumisasteen määrittämiseksi.  
Jos näytteessä on suhteellisen paljon tällaisia aineita, voi olla tarpeen 
tehdä jäännökselle esim. HPLC-tai GC-analyysi epäpuhtauksien erot ­
tamiseksi monomeeristä ja monomeeristä peräisin olevasta aineesta, jotta monomeerin todellinen pitoisuus voidaan määrittää.
 
Joskus voi riittää, että orgaaninen liuotin haihdutetaan kuiviin ja 
kuiva jäännös punnitaan.  
1.5.4.2  Testi, jossa on kaksi eri näytekokoa  
Kaikista vesiuutteista määritetään TOC.  
Näytteen liukenemattomalle osalle (joka ei uuttunut) tehdään gravi ­
metrinen analyysi. Jos kunkin pullon sisällön sentrifugoinnin tai suo ­
dattamisen jälkeen polymeerijäännöksiä on tarttunut pullon seinä ­
miin, pitäisi pullo huuhtoa suodoksella, kunnes siinä ei enää näy 
mitään jäännöstä. Sen jälkeen suodos sentrifugoidaan tai suodatetaan 
uudelleen. Suodattimeen tai sentrifuugiputkeen jäänyt jäännös kuiva ­
taan 40  o C:ssa tyhjiössä ja punnitaan. Kuivaamista jatketaan, kunnes 
saavutetaan vakiopaino.  
2. MÄÄRITYSTULOKSET  
2.1 TESTI, JOSSA ON YKSI NÄYTEKOKO  
Ilmoitetaan erilliset tulokset kutakin kolmea pulloa kohti ja keski ­
arvot ilmaistuna massayksiköllä liuostilavuutta kohti (tyypillisesti mg/l) tai massayksiköllä polymeerinäytteen massaa kohti (tyypilli ­
sesti mg/g). Lisäksi pitäisi ilmoittaa näytteen painohävikki (liuenneen 
aineen paino jaettuna alkuperäisen näytteen painolla) Suhteelliset keskihajonnat (RSD) pitäisi laskea. Tulokset pitää antaa koko aine ­
määrää kohti (polymeeri + olennaiset lisäaineet jne.) ja pelkkää po ­
lymeeriä kohti (ts. sen jälkeen, kun on vähennetty tällaisten lisäainei ­
den vaikutus).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 145
 
2.2 TESTI, JOSSA ON KAKSI NÄYTEKOKOA  
Ilmoitetaan erilliset TOC-arvot kahden kolmenkertaisilla näytteillä 
tehdyn kokeen vesiliuosuutteille ja kunkin kokeen keskiarvo ilmais ­
tuna massayksiköllä liuostilavuutta kohti (tyypillisesti mgC/l) sekä 
massayksikköinä alkuperäisen näytteen painoa kohti (tyypillisesti 
mgC/g).  
Jos tuloksissa ei ole eroa, kun näytteen suhde vesimäärään on suuri 
tai pieni, tämä voi merkitä sitä, että kaikki uuttuvat komponentit ovat 
todella uuttuneet. Tällöin ei suora määritys ole yleensä tarpeen.  
Kunkin jäännöksen painot olisi ilmoitettava erikseen ja ilmaistava 
prosentteina näytteiden alkuperäispainoista. Keskiarvot lasketaan ko ­
etta kohti. Erotus sadan prosentin ja havaittujen prosenttimäärien välillä on alkuperäisen näytteen liukoisen ja uuttuvan aineksen pro ­
senttimäärä.
 
3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
3.1 TESTIRAPORTTI  
Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:  
3.1.1  Testattava aine:  
— saatavissa olevat tiedot testattavasta aineesta (tunnistetiedot, lisä ­
aineet, epäpuhtaudet, pienimolekyylipainoisen aineen pitoisuus)  
3.1.2  Koeolosuhteet  
— kuvaus käytetyistä menetelmistä ja koeolosuhteista;  
— kuvaus analyyttisistä ja detektiomenetelmistä.  
3.1.3  Tulokset:  
— liukoisuus/uuttuvuustulokset mg/l; yksittäiset arvot ja keskiarvot 
uuttumiskokeista eri liuoksissa, eritellen polymeeripitoisuus ja 
epäpuhtaudet, lisäaineet ym.,  
— liukoisuus/uuttuvuustulokset mg/g polymeeriä,  
— vesiliuosuutteiden TOC-arvot, liuenneen aineen paino ja lasketut 
prosenttiosuudet, jos ne on mitattu,  
— kunkin näytteen pH,  
— tiedot nollanäytteistä,  
— tarvittaessa kirjallisuudesta saatavat tiedot testattavan aineen ke ­
miallisesta epästabiilisuudesta sekä testausprosessin aikana että 
analyysin aikana,  
— muut tiedot, jotka ovat tärkeitä tulosten tulkitsemisen kannalta.  
4. KIRJALLISUUSVIITTEET  
(1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen 
für Prüfzwecke.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 146
 
A.21.  HAPETTAVAT OMINAISUUDET (NESTEET)  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Tämän testimenetelmän tarkoituksena on mitata nestemäisen aineen 
kyky suurentaa palavan aineen palamisnopeutta tai -intensiteettiä tai 
sen kykyä muodostaa palavan aineen kanssa sellainen seos, joka voi syttyä itsestään, kun aineet sekoitetaan täydellisesti. Menetelmä pe ­
rustuu YK:n testiin hapettaville nesteille (1) ja vastaa sitä täysin. 
Koska menetelmä A.21 on kuitenkin tarkoitettu pääasiassa täyttä ­
mään asetuksen 1907/2006 vaatimukset, testattavaa ainetta on tar ­
peen verrata vain yhteen vertailuaineeseen. Testaaminen ja aineen 
vertaaminen muihin vertailuaineisiin voi olla tarpeen, jos on odotet ­
tavissa, että testien tuloksia käytetään muihin tarkoituksiin (
 1 ). 
Tätä testiä ei tarvitse tehdä, jos rakennekaavaa tarkastelemalla voi ­
daan päätellä kohtuullisella varmuudella, että aine ei voi reagoida 
eksotermisesti palavan aineen kanssa.  
On hyvä, jos aineen mahdollisista räjähdysominaisuuksista on saa ­
tavilla alustavaa tietoa ennen testin tekemistä.  
Tätä testi ei sovellu kiinteille aineille, kaasuille, räjähtäville tai erit ­
täin helposti syttyville aineille eikä orgaanisille peroksideille.  
Tätä testiä ei mahdollisesti tarvitse tehdä, jos ainetta koskevia tulok ­
sia on jo olemassa YK:n hapettavia nesteitä koskevasta testistä (1).  
1.2 MÄÄRITELMÄT JA MITTAYKSIKÖT  
Keskimääräinen paineennousuaika on niiden aikojen keskiarvo, jotka 
on mitattu, kun testattavan seoksen paine on nostettu 690 kPa:sta 
2 070 kPa:an ilmanpaineen yläpuolella.  
1.3 VERTAILUAINE  
Vertailuaineeksi tarvitaan 65-painoprosenttista typpihappoa (vesiliu ­
os; analyyttinen laatu) (  2 ). ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 147  
( 1 ) Esimerkiksi YK:n kuljetussäännösten yhteydessä. 
( 2 ) Happo on titrattava ennen testausta sen konsentraation varmistamiseksi.
 Jos kokeen tekijä kuitenkin arvelee, että testin tuloksia saatetaan 
käyttää muihin tarkoituksiin (  1 ), muidenkin vertailuaineiden testaa ­
minen voi olla aiheellista (  2 ). 
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Testattava neste sekoitetaan massasuhteessa 1:1 kuituselluloosan 
kanssa ja siirretään paineastiaan. Jos aineet syttyvät itsestään sekoi ­
tettaessa tai astiaa täytettäessä, ei testiä tarvitse jatkaa.  
Jos testattava seos ei syty itsestään, tehdään koko testi. Seosta kuu ­
mennetaan paineastiassa ja määritetään keskimääräinen aika, joka 
tarvitaan, että paine nousee 690 kPa:sta 2 070 kPa:an ilmanpaineen yläpuolella. Tätä verrataan siihen keskimääräiseen aikaan, joka tar ­
vitaan, että vertailuaine(id)en ja selluloosan 1:1-seos paine nousee 
saman verran.
 
1.5 LAATUKRITEERIT  
Viiden kokeen sarjassa yhdellä aineella mikään tulos ei saa erota 
enempää kuin 30 % aritmeettisesta keskiarvosta. Tulokset, jotka ero ­
avat yli 30 % keskiarvosta, on hylättävä, sekoitus- ja täyttömenetel ­
mää on parannettava ja testi uusittava.  
1.6 MENETELMÄN KUVAUS  
1.6.1  Valmistelu  
1.6.1.1  Palava aine  
Palavana aineena käytetään kuivattua kuituselluloosaa, jonka kuidun 
pituus 50–250 μm ja keskihalkaisuja 25 μm (  3 ). Selluloosa kuivataan 
vakiopainoon kerroksena, joka on enintään 25 mm paksu, 105  o C:ssa 
4 tuntia, ja sitä pidetään eksikkaattorissa kuivatusaineen kanssa, kun ­
nes se on jäähtynyt ja kunnes sitä tarvitaan. Kuivatun selluloosan vesipitoisuuden pitäisi olla alle 0,5 % kuivasta massasta (
 4 ). Tarvit­
taessa kuivatusaikaa on pidennettävä, jotta tähän päästään (  5 ). Koko 
testin aikana on käytettävä samaa selluloosaerää.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 148  
( 1 ) Esimerkiksi YK:n kuljetussäännösten yhteydessä. 
( 2 ) Esimerkiksi 50-painoprosenttista perkloorihappoa ja 40-painoprosenttista natriumkloraat ­
tia on käytetty viitteessä 1. 
( 3 ) Esimerkiksi Whatman Column Chromatographic Cellulose Powder CF 11, luettelon nro 
4021 050. 
( 4 ) Varmistetaan (esim.) Karl-Fisherin titrauksella. 
( 5 ) Vesipitoisuus voidaan määrittää myös (esim.) kuumentamalla 105  o C:ssa tyhjiössä 24 h.
 1.6.1.2  Laitteet  
1.6.1.2.1 P a i n e a s t i a  
Testiin tarvitaan lieriönmuotoinen teräksinen paineastia, jonka pituus 
on 89 mm ja ulkohalkaisija 60 mm (ks. kuva 1). Vastakkaisille sivuille työstetään kaksi tasaista pintaa (jolloin astian poikkileikkaus pienenee 50 mm:iin) kiinnipitämisen helpottamiseksi, kun sytytys ­
tulppaa ja ilmaustulppaa pannaan paikoilleen. Astian sisäläpimitta 
on 20 mm ja kummankin pään sisäpuoli on kyntetty 19 mm:n syvyy ­
deltä ja siinä on kierteet, joihin sopii 1" British Standard Pipe (BSP) tai vastaava metrijärjestelmän mukainen osa. Paineastian pyöreään 
pintaan 35 mm:n päähän astian toisesta päästä ja 90 asteen kulmassa 
työstettyihin pintoihin on ruuvattu sivuhaara, jonka kautta paine voi ­
daan päästää ulos. Sivuhaaraputken istukka porataan 12 mm:n sy ­
vyyteen siten, että siihen sopii 1/2":n BSP (tai metrijärjestelmän 
vastaava) kierre sivuhaaran päässä. Tarvittaessa lisätään inertti tii ­
viste, jotta liitos on kaasutiivis. Sivuhaara ulottuu 55 mm:n päähän paineastian ulkopuolelle, ja sen sisäläpimitta on 6 mm. Sivuhaaran pää on kyntetty ja sen kierteet ovat sellaiset, että niihin sopii kalvo ­
tyyppinen paineenmuunnin. Mitä tahansa paineenmittauslaitetta voi ­
daan käyttää edellyttäen, etteivät kuumat kaasut tai hajoamisessa syntyvät yhdisteet vaikuta siihen ja että se pystyy mittaamaan pai ­
neennousunopeuksia 690–2 070 kPa:n välillä alle 5 ms:ssa.
 
Kauempana sivuhaarasta oleva paineastian pää suljetaan sytytystul ­
palla, jossa on kaksi elektrodia. Toinen niistä on eristetty tulpan pääosasta ja toinen on maadoitettu siihen. Paineastian toisessa päässä 
on varokalvo (murtumispaine noin 2 200 kPa), jota pitää paikallaan 
sisäläpimitaltaan 20 mm:n tulppa. Tarvittaessa sytytystulpan kanssa käytetään inerttiä tiivistettä, jotta liitos on kaasutiivis. Tukiteline (kuva 2) pitää kokoonpanon oikeassa asennossa käytön aikana. Sii ­
hen kuuluu tavallisesti pehmeää terästä oleva pohjalaatta, jonka mitat 
ovat 235 mm x 184 mm x 6 mm, ja 185 mm:n pituinen poikkileik ­
kaukseltaan neliönmuotoinen onttotanko, jonka mitat ovat 70 mm x 70 mm x 4 mm.
 
Neliöonttotangon toisessa päässä siitä leikataan pala vastakkaisilta 
puolilta siten, että saadaan rakenne, jossa on kaksi litteäreunaista jalkaa, joiden yläpuolella on 86 mm koskematonta neliöonttotankoa. Jalat leikataan siten, että ne muodostavat 60
 o :n kulman vaakatason 
kanssa, kun tanko on hitsattu pohjalaattaan. Pohjarakenteen yläosan 
yhdelle laidalle työstetään lovi, jonka leveys on 22 mm ja syvyys 46 mm, siten, että kun paineastiakokoonpano lasketaan onttotankot ­
elineeseen sytytystulppa edellä, sivuhaara sopii loveen. Onttotangon 
alempaan sisäpintaan hitsataan 30 mm leveä ja 6 mm paksu teräs ­
pala, joka toimii välikkeenä. Kaksi vastakkaisilla pinnoilla olevaa 7 mm:n siipiruuvia pitää paineastian tukevasti paikallaan. Kaksi 12 mm leveää 6 mm:n paksuisesta teräksestä tehtyä nauhaa, jotka 
on hitsattu onttotangon pohjaosaan kiinnittyviin sivuosiin, tukee pai ­
neastiaa alhaalta päin.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 149
 
1.6.1.2.2 S y t y t y s j ä r j e s t e l m ä  
Sytytysjärjestelmä koostuu 25 cm pitkästä Ni/Cr-langasta, jonka hal ­
kaisija on 0,6 mm ja vastus 3,85 ohm/m. Lanka on kierretty halkai ­
sijaltaan 5 mm:n tangon avulla kelaksi ja kiinnitetty sytytystulpan elektrodeihin. Kelan muodon pitäisi olla sellainen kuin kuvassa 3 esitetään. Astian pohjan ja sytytyskelan alapään välisen etäisyyden 
pitäisi olla 20 mm. Ellei elektrodeja voi säätää, pitäisi kelan ja astian 
pohjan välillä olevan sytytyslangan päät eristää keraamivaipalla. Lan ­
kaa kuumennetaan tasavirtatehonlähteellä, joka pystyy tuottamaan vähintään 10 A:n voimakkuista virtaa.
 
1.6.2  Testin suoritusarvot  ( 1 ) 
Laitetta, joka on koottu täydellisesti ja jossa on paineenmuunnin ja 
kuumennusjärjestelmä, mutta johon ei ole asennettu varokalvoa, tue ­
taan sytytystulppapuoli alaspäin. 2,5 g testattavaa nestettä ja 2,5 g kuivattua selluloosaa sekoitetaan lasidekanterissa käyttäen lasista sekoitussauvaa (
 2 ). Turvallisuussyistä työntekijän ja seoksen välillä 
on oltava suojalevy sekoituksen aikana. Jos seos syttyy sekoituksen 
tai täytön aikana, ei testiä tarvitse jatkaa. Seos siirretään paineastiaan pieni määrä kerrallaan taputtaen, jotta seos pakkautuisi sytytyskelan 
ympärille ja olisi hyvin kosketuksissa sen kanssa. On tärkeää, ettei 
kela vääristy seoksen pakkaamisen aikana, koska se voisi aiheuttaa vääriä tuloksia (
 3 ). Varokalvo asetetaan paikalleen ja kiinnitystulppa 
kierretään tiukasti paikalleen. Täytetty astia asetetaan tukitelineeseen 
siten, että varokalvo on ylöspäin. Teline olisi sijoitettava sopivaan 
vahvistettuun vetokaappiin tai sytytyskammioon. Tehonlähde yhdis ­
tetään sytytystulpan ulompiin päihin ja annetaan 10 A:n virtaa. Aika, joka kuluu sekoituksen aloittamisesta tehon kytkemiseen, ei saisi olla 
pitempi kuin 10 min.
 
Paineenmuuntimen aikaansaama signaali rekisteröidään sopivalla jär ­
jestelmällä, joka mahdollistaa sekä arvioinnin että saadun aika-paine ­
käyrän pysyvän rekisteröinnin (esim. transienttitallennin, joka on 
kytketty piirturiin). Seosta kuumennetaan, kunnes varokalvo murtuu 
tai ainakin 60 s. Jos varokalvo ei murru, seoksen on annettava jääh ­
tyä ennen kuin laite puretaan varovasti ja varoen erityisesti mahdol ­
lista paineen vapautumista. Testattavalla aineella ja vertailuaineella 
(-aineilla) tehdään viisi koetta. Kirjataan aika, joka kuluu siihen, että 
paine nousee 690 kPa:sta 2 070 kPa:iin ilmanpaineen yläpuolella. Lasketaan paineennousuun kuluvien aikojen keskiarvo.
 
Joissakin tapauksissa aineet saattavat aiheuttaa paineen nousun (liian 
suuren tai liian pienen), joka aiheutuu sellaisista kemiallisista reak ­
tioista, jotka eivät liity aineen hapettaviin ominaisuuksiin. Tällöin voi olla tarpeen toistaa testi inertillä aineella, esim. piimaalla (kiesel ­
guhr), selluloosan sijasta reaktion laadun selvittämiseksi.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 150  
( 1 ) Hapettimien ja selluloosan seoksia on pidettävä mahdollisesti räjähtävinä ja käsiteltävä 
asianmukaisella huolella. 
( 2 ) Käytännössä tämä voidaan tehdä valmistamalla testattavasta nesteestä ja selluloosasta 
1:1-seosta suurempi määrä kuin kokeeseen tarvitaan ja siirtämällä 5 ± 0,1 g seosta 
paineastiaan. Seos on valmistettava tuoreeltaan joka koetta varten. 
( 3 ) Erityisesti on estettävä kelan vierekkäisten kierteiden välinen kosketus.
 2. MITTAUSTULOKSET  
Paineen nousuun kuluneet ajat sekä testiaineelle että vertailuaineelle 
(-aineille). Paineen nousuun kuluneet ajat mahdollisille inertin aineen kanssa tehdyille testeille.
 
2.1 TULOSTEN KÄSITTEY  
Lasketaan paineen nousuun kuluneiden aikojen keskiarvot sekä testi ­
aineelle että vertailuaineelle (-aineille).  
Lasketaan paineen nousuun kuluneiden aikojen keskiarvot mahdolli ­
sille inertin aineen kanssa tehdyille testeille.  
Taulukossa 1 esitetään joitakin esimerkkejä tuloksista.  
Taulukko 1  
Esimerkkejä tuloksista  ( a ) 
Aine (  b ) Keskimääräinen paineen nousuun kulunut aika 
1:1 -selluloosaseokselle (ms)  
Ammoniumdikromaatti, kyllästetty vesiliuos 20 800 
Kalsiumnitraatti, kyllästetty vesiliuos 6 700 
Ferrinitraatti, kyllästetty vesiliuos 4 133 
Litiumperkloraatti, kyllästetty vesiliuos 1 686 Magnesiumperkloraatti, kyllästetty vesiliuos 777 
Nikkelinitraatti, kyllästetty vesiliuos 6 250 
Typpihappo, 65 % 4 767 (
 c ) 
Perkloorihappo, 50 % 121 (  c ) 
Perkloorihappo, 55 % 59 
Kaliumnitraatti, 30 % vesiliuos 26 690 
Hopeanitraatti, kyllästetty vesiliuos — (  d ) 
Natriumkloraatti, 40 % vesiliuos 2 555 (  c ) 
Natriumnitraatti, 45 % vesiliuos 4 133  
Inertti aine  
Vesi: selluloosa — (  d ) 
( a ) Ks. viite (1), YK:n kuljetusjärjestelmän mukainen luokitus. 
( b ) Kyllästetyt liuokset on valmistettava 20  o C:ssa. 
( c ) Laboratorioidenvälisten vertailevien tutkimusten keskiarvo. 
( d ) Maksimipainetta 2 070 kPa ei saavutettu.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 151
 
3. TESTISELOSTE  
3.1 TESTISELOSTE  
Testiselosteessa on ilmoitettava seuraavat tiedot:  
— testattavan aineen tunnistetiedot, koostumus, puhtausaste jne.  
— testiaineen pitoisuus,  
— selluloosan kuivausmenetelmä,  
— käytetyn selluloosan vesipitoisuus,  
— mittaustulokset,  
— inertin aineen kanssa mahdollisesti tehtyjen testien tulokset,  
— paineen nousuun kuluvista ajoista lasketut keskiarvot,  
— mahdolliset poikkeamat tästä menetelmästä ja syyt niihin,  
— kaikki lisätiedot ja huomautukset, jotka voivat vaikuttaa tulosten 
tulkintaan.  
3.2 TULOSTEN TULKINTA (  1 ) 
Testitulosten arvioinnissa  
a) todetaan, syttyykö testiaineen ja selluloosan seos itsestään ja  
b) verrataan paineen nousuun (690 kPa – 2 070 kPa) kuluneiden 
aikojen keskiarvoja vertailuaine(id)en vastaaviin arvioihin.  
Nestemäisen aineen katsotaan olevan hapettava, kun  
a) testattavan aineen ja selluloosan 1:1-seos (massana) syttyy itses ­
tään tai  
b) testattavan aineen ja selluloosan 1:1-seoksella (massana) on pie ­
nempi tai yhtä suuri keskimääräinen paineen nousuun kuuluva aika kuin 65-painoprosenttisen typpihapon ja selluloosan 1:1-se ­
oksella (massana).
 
Väärien positiivisten tulosten välttämiseksi on tuloksia tulkittaessa 
tarkasteltava tarvittaessa myös tuloksia, jotka on saatu testattaessa ainetta inertin materiaalin kanssa.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 152  
( 1 ) Ks. viite 1, tulosten tulkinta YK:n kuljetusmäärysten mukaan käytettäessä useita vertailu ­
aineita.
 4. KIRJALLISUUS  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Ma ­
nual of Tests and Criteria. 3. tarkistettu painos. YK:n julkaisu nro ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, sivu 342. Test O.2: Test for 
oxidizing liquids.
 
Kuva1  
Paineastia
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 153
 
Kuva 2  
Tukiteline
  
Kuva 3  
Sytytysjärjestelmä
  
Huom: kokoonpanosta voidaan käyttää kumpaa hyvänsä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 154
 
A.22.  KUITUJEN HALKAISIJAN PITUUSPAINOTETTU 
GEOMETRINEN KESKIARVO  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Tässä testiohjeessa kuvataan menettely, jolla voidaan mitata bulkki ­
materiaalien tai -tuotteiden sisältämien keinotekoisten mineraalikui ­
tujen halkaisijan pituuspainotettu geometrinen keskiarvo (LWGMD, Length Weighted Geometric Mean Diameter). Koska populaation LWGMD on 95 prosentin todennäköisyydellä 95 prosentin luotta ­
mustasojen välillä (LWGMD ± 2 x keskivirhe), kirjattu arvo (testin 
tulos) on näytteen alempi 95 prosentin luottamustaso (ts. LWGMD miinus kaksi keskivirhettä). Menetelmän perustana on tar ­
kistettu versio (kesäkuu 1994) HSE:n (Health and Safety Executive, 
UK) teknisestä menetelmästä, josta sovittiin ECFIA:n (European Ce ­
ramic Fibres Industry Association) ja HSE:n välisessä kokouksessa Chesterissä 26.9.1993 ja joka kehitettiin toista laboratorioiden välistä koetta varten sekä kyseisen kokeen tulosten perusteella (1, 2). Ky ­
seisellä mittausmenetelmällä voidaan määrittää kuidun halkaisija 
bulkkimateriaaleissa tai -tuotteissa, jotka sisältävät keinotekoisia mi ­
neraalikuituja, esimerkiksi tulenkestäviä keraamisia kuituja, keinote ­
koisia lasikuituja ja yksikide- tai monikidekuituja.
 
Pituuspainotuksella kompensoidaan vaikutusta, jonka pitkien kuitu ­
jen särkymisellä (näytteenoton tai käsittelyn yhteydessä) on halkai ­
sijoiden kokojakaumaan. Keinotekoisten mineraalikuitujen kokoja ­
kaumaa määritettäessä käytetään geometrisia tilastomuuttujia (geo ­
metrista keskiarvoa), koska näiden halkaisijoiden kokojakaumat 
ovat yleensä lähellä logaritmista normaalijakaumaa.  
Kaikkien kuitujen pituuden ja halkaisijan mittaaminen on pitkällistä 
ja aikaavievää, mutta jos vain ne kuidut mitataan, jotka koskettavat äärettömän ohutta viivaa pyyhkäisyelektronimikroskoopin tarkastelu ­
kentässä, määrätyn kuidun valinnan todennäköisyys on suhteessa 
kyseisen kuidun pituuteen. Koska pituus on tätä kautta otettu huo ­
mioon pituuspainotetuissa mittauksissa, ainoa tarvittava mittaus on halkaisijan mittaus, jotta voidaan määrittää LWGMD miinus kaksi 
keskivirhettä.
 
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Hiukkanen : kappale, jonka pituus-leveyssuhde on alle 3:1  
Kuitu : kappale, jonka pituus-leveyssuhde (muotosuhde) on vähin ­
tään 3:1.  
1.3 SOVELTAMISALA JA RAJOITUKSET  
Menetelmä on suunniteltu määrittämään halkaisijoiden kokojakau ­
mat, kun keskihalkaisija on välillä 0,5 μm – 6 μm. Tätä suurempia 
halkaisijoita voidaan mitata käyttämällä pienempiä pyyhkäisyelektro ­
nimikroskoopin suurennuksia, mutta menetelmän tarkkuus vähenee 
siirryttäessä pienempiin halkaisijoihin. Jos keskihalkaisija on alle 
0,5 μm, suositellaan läpäisyelektronimikroskoopin käyttöä.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 155
 
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Kuituhuovasta tai irtonaisesta bulkkikuidusta otetaan useita edustavia 
kairausnäytteitä. Näytteiden pituutta lyhennetään murskaamalla, ja edustava näyte dispergoidaan veteen. Näytteestä otetaan osanäytteet, 
jotka suodatetaan polykarbonaattisuodattimen läpi (huokoskoko 
0,2 μm) ja preparoidaan pyyhkäisyelektronimikroskoopilla tehtävää 
tutkimusta varten. Kuitujen halkaisijat mitataan vähintään suurennuk ­
sella 10 000 x (
 1 ) käyttäen viivan leikkauspistettä käyttävää menetel ­
mää, jotta keskihalkaisija voidaan estimoida harhattomasti. Alempi 
95 prosentin luottamustaso määritetään (yksipuolisen testin perusteel ­
la), jotta saadaan estimaatti materiaalin kuitujen halkaisijan geomet ­
risen keskiarvon alimmasta arvosta.  
1.5 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.5.1  Turvallisuus ja varotoimet  
Fyysinen altistus ilmassa leijuville kuiduille on minimoitava ja kui ­
vien kuitujen käsittelyssä on käytettävä veto- tai hansikaskaappia. Fyysistä altistusta on seurattava määrävälein, jotta voidaan määrittää 
turvamenetelmien tehokkuus. Keinotekoisia mieneraalikuituja käsitel ­
täessä on käytettävä kertakäyttöhansikkaita ihoärsytyksen ehkäisemi ­
seksi ja ristikontaminaation estämiseksi.
 
1.5.2  Laitteet  
— Puristin ja puristusmuotit (paine 10 MPa)  
— polykarbonaattisuodattimet, joiden halkaisija on 25 mm ja joissa 
on kapillaarihuokoset (huokoskoko 0,2 μm) 
— selluloosaesterisuodatin (huokoskoko 5 μm) varasuodattimena  
— lasinen suodatuslaite (tai kertakäyttösuodatinjärjestelmä), joka sovel ­
tuu halkaisijaltaan 25 mm:n kokosille suodattimille (esim. Millipo ­
ren lasinen mikroanalyysijärjestelmä, tyyppi XX10 025 00)  
— vastatislattu vesi, joka on suodatettu (huokoskoko 0,2 μm) mikro- 
organismien poistamiseksi  
— päällystyslaite (kulta tai kulta/palladium)  
— pyyhkäisyelektronimikroskooppi, jonka erotuskyky 10 nm ja suu ­
rennus 10 000 x  
— spaattelit, skalpelli (tyyppi 24), pinsetit, pyyhkäisyelektronimik ­
roskoopin putket, hiililiima tai -teippi, kolloidinen hopea  
— ultraäänisondi tai ultraäänihaude  
— kairauslaite tai korkkipora kairausnäytteiden ottamiseksi kuitu ­
huovasta.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 156  
( 1 ) Suurennus on tarkoitettu 3 μm:n kuiduille; 6 μm:n kuiduille voi soveltua paremmin 
suurennus 5 000 ×.
 1.5.3  Testimenettely  
1.5.3.1  Näytteenotto  
Kuituhuovasta tai -levystä otetaan näytteet 25 mm:n kairalla tai kork ­
kiporalla. Näytteet pitäisi ottaa tasaisin välimatkoin, jos huopa on 
lyhyt, tai sattumanvaraisesti valituilta alueilta, jos huopa on pitkä. 
Samoja välineitä voidaan käyttää sattumanvaraisten näytteiden otta ­
miseksi irrallisesta kuidusta. Näytteitä on mahdollisuuksien mukaan otettava kuusi siten, että otetaan huomioon bulkkimateriaalin spatiaa ­
linen vaihtelu.
 
Kaikki kuusi kairausnäytettä murskataan halkaisijaltaan 50:mm ko ­
koisessa puristusmuotissa paineella 10 Mpa. Materiaali sekoitetaan spaattelilla ja puristetaan uudelleen paineella 10 MPa. Sen jälkeen 
materiaali poistetaan puristusmuotista ja varastoidaan sinetöityyn la ­
sipulloon.
 
1.5.3.2  Näytteiden preparointi  
Orgaaninen sideaine voidaan tarvittaessa poistaa panemalla kuitu uu ­
niin (lämpötila 450 °C) noin tunniksi.  
Näytteestä muodostetaan kartio, joka ositetaan neljään osaan (tämä 
olisi tehtävä vetokaapin sisällä).  
Pieni määrä < 0,5 g) näytettä lisätään spaattelilla 100 ml:aan vasta ­
tislattua vettä, joka on suodatettu kalvosuodattimen läpi (huokoskoko 0,2 μm) (myös muulla tavalla valmistettua ultrapuhdasta vettä voi ­
daan käyttää, jos sen voidaan osoittaa olevan tarkoitukseen sopivaa). 
Näyte dispergoidaan kokonaan ultraäänisondilla, jota käytetään 100 
W:n teholla ja sellaisella säädöllä, että syntyy kavitaatiota. (Jos son ­
dia ei ole käytettävissä, käytetään seuraavaa menetelmää: ravistellaan ja käännellään ylösalaisin 30 sekunnin ajan, pannaan viideksi minuu ­
tiksi ultraäänihauteeseen ja ravistellaan ja käännellään ylösalaisin 
uudelleen 30 sekunnin ajan.)
 
Välittömästi näytteen dispergoinnin jälkeen siitä otetaan osanäytteet 
(esim. kolme näytettä, 3, 6 ja 10 ml) käyttämällä leveäsuista pipettiä 
(kapasiteetti 2–5 ml).  
Kukin osanäyte suodatetaan polykarbonaattivakuumisuodattimella 
(huokoskoko 0,2 μm), jonka yhteydessä on MEC-varmistussuodatin 
(huokoskoko 5 μm), käyttämällä 25 mm:n lasista suodatinsuppiloa, 
jossa on sylinterimäinen säiliö. Suppiloon pannaan noin 5 ml suoda ­
tettua tislattua vettä, ja osanäyte pipetoidaan hitaasti veteen pitäen pipetin päätä meniskuksen alla. Pipetti ja säiliö huuhdellaan perus ­
teellisesti pipetoinnin jälkeen, koska ohuet kuidut jäävät usein pin ­
toihin.
 
Suodatin poistetaan varovasti ja erotetaan varmistussuodattimesta en ­
nen sen asettamista kuivumaan.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 157
 
Suodatinkalvolla olevasta saostumasta leikataan neljäsosa tai puolet 
skalpellilla (tyyppi 24) käyttämällä edestakaista liikettä. Leike kiin ­
nitetään varovasti pyyhkäisyelektronimikroskoopin näytealustalle hii ­
liteipillä tai -liimalla. Kolloidihopeaa aplikoidaan vähintään kolmeen paikkaan, jotta sähkökontakti olisi parempi suodattimen ja näytealus ­
tan reunoilla. Kun liima tai kolloidinen hopea on kuivunut, kerroksen 
pinta päällystetään kullalla tai kulta-palladiumseoksella (paksuus noin 50 nm).
 
1.5.3.3  Pyyhkäisyelektronimikroskoopin kalibrointi ja käyttö  
1.5.3.3.1 K a l i b r o i n t i  
Pyyhkäisyelektronimikroskoopin kalibrointi on tarkistettava vähin ­
tään kerran viikossa (mieluiten kerran päivässä) käyttämällä sertifi ­
oitua kalibraattoria. Kalibrointi on tarkistettava sertifioituihin standar ­
diarvoihin nähden, ja jos mitattu arvo ei ole ± 2 % sertifioidusta 
arvosta, kalibrointia on säädettävä ja se on tarkistettava uudelleen.  
Pyyhkäisyelekronimikroskoopin erotuskyvyn on oltava vähintään sel ­
lainen, että sillä pystytään erottamaan 0,2 μm:n halkaisija (aito näyte ­
matriisi), kun suurennus on 2 000 x.  
1.5.3.3.2 K ä y t t ö  
Pyyhkäisyelektronimikroskooppia pitäisi käyttää suurennuksella 
10 000 x olosuhteissa (  1 ), jotka mahdollistavat hyvän erotuskyvyn 
hitailla pyyhkäisynopeuksilla (esim. 5 sekuntia/pyyhkäisy). Vaikka eri pyyhkäiselektronimikroskooppien käyttövaatimukset voivat vaih ­
della, parhaan näkyvyyden ja erotuskyvyn aikaansaamiseksi atomi ­
painoltaan suhteellisen kevyillä materiaaleilla olisi käytettävä kiihdy ­
tysjännitettä 5–10 keV sekä pientä pyyhkäisypisteen kokoa ja lyhyttä työskentelyetäisyyttä. Suoritettaessa lineaarista pyyhkäisyä pitäisi käyttää 0
 o :n kallistuskulmaa uudelleenfokusoinnin minimoimiseksi, 
tai jos pyyhkäisyelektronimikroskoopissa on eusentrinen objektipöy ­
tä, tulisi käyttää eusentristä työskentelyetäisyyttä. Pienempää suuren ­
nusta voidaan käyttää, jos materiaali sisältää ainostaan suuria kuituja (halkaisija > 5 μm).
 
1.5.3.4  Koon määritys  
1.5.3.4.1 T u t k i m u s p i e n i l l ä s u u r e n n u k s i l l a n ä y t t e e n a r v i ­
o i m i s e k s i  
Näyte arvioidaan aluksi pienillä suurennuksilla. Tällöin tarkistetaan, 
onko näytteessä suurien kuitujen rykelmiä, ja arvioidaan kuitujen 
tiheys. Jos kuidut esiintyvät paljon rykelminä, suositellaan uuden 
näytteen ottamista.  
Tilastotulosten luotettavuuden takaamiseksi on mitattava riittävästi 
kuituja. Suuri kuitujen tiheys voi näyttää tämän vuoksi tarpeelliselta, 
koska tyhjien kenttien tutkimimen on aikaavievää eikä tue analyysiä. 
Jos suodatin on kuitenkin ylikuormattu, on vaikea mitata kaikkia mitattavissa olevia kuituja, ja koska suuret kuidut voivat peittää nä ­
kyvistä pienemmät kuidut, pienemmät kuidut voivat jäädä mittaa ­
matta.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 158  
( 1 ) 3 μm:n kuitujen osalta ks. edellinen alaviite.
 LWGMD-arvon yliarvioiminen voi johtua kuitujen tiheyksistä, jotka 
ovat yli 150 kuitua yhtä lineaarisen pyyhkäisyn millimetriä kohti. 
Toisaalta pienet tiheydet pidentävät analyysiin tarvittavaa aikaa. Siksi on usein kustannustehokkaampaa preparoida näyte, jossa kuitujen tiheys on lähempänä optimia, kuin jatkaa mittauksia tiheyden ollessa 
pieni. Optimitiheys on sellainen, että yhtä näkökenttää kohti on kes ­
kimäärin yksi tai kaksi mitattavissa olevaa kuitua suurennuksella 5 000 x. Optimitiheys riippuu kuitenkin kuitujen koosta (halkaisijas ­
ta), joten tutkijan on harkittava, onko kuitujen tiheys optimaalinen 
vai ei.
 
1.5.3.4.2 K u i t u j e n h a l k a i s i j a n p i t u u s p a i n o t u s  
Vain ne kuidut lasketaan, jotka koskettavat (äärettömän) ohutta vii ­
vaa (tai leikkaavat sen) pyyhkäisyelektronimikroskoopin näkökentäs ­
sä. Tätä varten näkökentän keskustan yli vedetään vaakasuora (tai 
pystysuora) viiva.  
Vaihtoehtoisesti näkökentän keskelle asetetaan yksi piste ja käynnis ­
tetään jatkuva pyyhkäisy yhteen suuntaan suodattimen yli. Jokainen kuitu, jonka muotosuhde on yli 3:1 ja joka koskettaa tätä pistettä tai 
leikkaa sen, mitataan ja kirjataan.
 
1.5.3.4.3 K u i t u j e n k o o n m ä ä r i t y s  
Suositellaan, että vähintään 300 kuitua mitataan. Kukin kuitu mita ­
taan vain kerran kohdassa, jossa se leikkaa kentässä olevan viivan tai 
pisteen (tai leikkauskohtaa lähellä olevassa kohdassa, jos kuidun 
reunat peittyvät näkyvistä). Jos kuidun poikkileikkaukset eivät ole kauttaaltaan samat, on käytettävä mittausta, joka edustaa kuidun kes ­
kiarvoa. Reuna on määriteltävä huolellisesti ja mitattava lyhyin vä ­
limatka kuidun reunojen välillä. Mittaukset voidaan tehdä suoraan 
tai (valo)kuvista. Käytettäväksi suositellaan puoliautomaattisia mitta ­
usjärjestelmiä, jotka lataavat tiedot suoraan laskentataulukkoon, koska ne säästävät aikaa, eliminoivat kopiointivirheiden mahdollisuu ­
den, ja laskenta voidaan automatisoida.
 
On tarkistettava pienellä suurennuksella, että pitkien kuitujen päät 
eivät kierry takaisin mittauskenttään ja että ne mitataan vain kerran.  
2. TULOKSET  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Kuitujen halkaisijat eivät tavallisesti edusta normaalijakaumaa. Lo ­
garitmimuunnoksen avulla on kuitenkin mahdollista saada jakauma, 
joka on lähellä normaalijakaumaa.  
Lasketaan n kuitujen halkaisijan (D) luonnollisten logaritmien (lnD) 
aritmeettinen keskiarvo (keskiarvo lnD) ja keskihajonta (SD  lnD ). 
mean lnD ¼ ∑ lnD 
n (1) ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 159
 
SD lnD ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
∑ðlnD – mean lnDÞ 2 
n – 1 s 
(2) 
Keskihajonta jaetaan mittausten lukumäärän (n) neliöjuurella keski ­
virheen (SE  lnD ) määrittämiseksi. 
SE lnD ¼ SD ﬃﬃﬃ n p (3) 
Vähennetään keskiarvosta 2 x keskivirhe ja määritetään tämän arvon 
(keskiarvo miinus 2 x keskivirhe) eksponenttiarvo, mikä antaa geo ­
metrisen keskiarvon miinus 2 x geometrinen keskivirhe. 
LWGMD – 2SE ¼ e ðmittl : lnD – 2SE  lnd Þ (4) 
3. RAPORTOINTI  
TESTISELOSTE  
Testiselosteessa on annettava ainakin seuraavat tiedot:  
— arvo LWGMD miinus 2 x keskivirhe  
— mahdolliset poikkeamiset testimenettelystä (erityisesti ne, joilla 
voi olla vaikutusta tulosten tarkkuuteen tai luotettavuuteen) pe ­
rusteluineen.  
4. KIRJALLISUUSVIITTEET  
1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 
1999.  
2. G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to 
measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project 
R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory 
Services Division. 1994.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 160
 
A.23  JAKAANTUMISKERROIN (1-OKTANOLI-VESI): HITAAN 
SEKOITUKSEN MENETELMÄ  
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 123 (2006). 1-oktanoli- 
vesi-jakaantumiskertoimen (P  ow ) arvot on määritetty tarkasti log P  ow 8,2 
-arvoon asti hitaan sekoituksen menetelmällä (1). Näin ollen se on sopiva 
kokeellinen lähestymistapa erittäin hydrofobisten aineiden P  ow -arvon suo ­
raan määrittämiseen.  
2. Muita menetelmiä 1-oktanoli-vesi-jakaantumiskertoimen (P  ow ) määrittämistä 
varten ovat ravistuspullomenetelmä (2) sekä P  ow -arvon määrittäminen kään ­
teisfaasi-HPLC:n retentiokäyttäytymisestä (3). Ravistuspullomenetelmä on 
altis virheille, mikä johtuu oktanolin mikropisaroiden siirtymisestä vesifa ­
asiin. Suurenevien P  ow -arvojen yhteydessä näiden pisaroiden esiintyminen 
vesifaasissa johtaa siihen, että testiaineen pitoisuus vedessä arvioidaan liian 
suureksi Sen vuoksi tämän menetelmän käyttö on rajattu aineisiin, joiden 
log P  ow -arvo on pienempi kuin 4. Toinen menetelmä perustuu suoraan 
määritetyistä P  ow -arvoista saatuihin varmoihin tietoihin, jolloin 
HPLC-retentiokäyttäytymisen ja mitattujen P  ow -arvojen välinen suhde voi ­
daan kalibroida. Saatavilla oli OECD:n ohjeluonnos ionisoituvien aineiden 
1-oktanoli-vesi-jakaantumiskertoimen määrittämiseen (4), mutta sitä ei tule enää käyttää.
 
3. Tämä testimenetelmä on kehitetty Alankomaissa. Tässä kuvattujen menetel ­
mien tarkkuus on validoitu ja optimoitu laboratorioiden välisessä validoin ­
titutkimuksessa, johon osallistui 15 laboratoriota (5).  
ALUSTAVAT HUOMIOT  
Merkitys ja käyttö  
4. Inerttien orgaanisten aineiden yhteydessä on löydetty erittäin merkittäviä 
suhteita 1-oktanoli-vesi-jakaantumiskertoimien (P  ow ) ja niiden kaloihin koh ­
distuvan biokertyvyyden väliltä. Lisäksi on osoitettu, että P  ow -arvo korreloi 
kaloihin kohdistuvaan myrkyllisyyteen sekä kemikaalien imeytymiseen kiin ­
teään ainekseen, kuten maaperään ja sedimentteihin. Viitteessä (6) on esi ­
tetty kattava yhteenveto näistä suhteista.  
5. 1-oktanoli-vesi-jakaantumiskertoimen ja aineen muiden, ympäristömyrkylli ­
syyden ja kemian kannalta tärkeiden ominaisuuksien väliltä on määritetty monia erityyppisiä suhteita. Tämän vuoksi 1-oktanoli-vesi-jakaantumisker ­
toimesta on tullut keskeinen parametri kemikaalien ympäristöriskien arvioin ­
nissa sekä kemikaalien ympäristövaikutusten ennustamisessa.
 
Soveltamisala  
6. Hitaan sekoituksen kokeen oletetaan vähentävän mikropisaroiden muodos ­
tumista 1-oktanolipisaroista vesifaasissa. Tämän vuoksi vesipitoisuutta, joka 
johtuu testiaineen tällaisiin pisaroihin liittyvistä molekyyleistä, ei arvioida liian suureksi. Näin ollen hitaan sekoituksen menetelmä sopii erityisesti sellaisten aineiden P
 ow -arvon määrittämiseen, joiden oletetut log P  ow -arvot 
ovat vähintään 5, sillä tällaisten aineiden osalta ravistuspullomenetelmä (2) 
tuottaa helposti virheellisiä tuloksia.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 161
 
MÄÄRITELMÄ JA YKSIKÖT  
7. Aineen jakaantumiskerroin veden ja lipofiilisen liuottimen (1-oktanolin) vä ­
lillä kuvastaa kemikaalin tasapainon jakaantumista kahden faasin välillä. Määritelmän mukaan veden ja 1-oktanolin välinen jakaantumiskerroin (P
 ow ) 
on testiaineen tasapainopitoisuuksien välinen suhde vedellä kyllästetyssä 1- 
oktanolissa (C  O ) ja 1-oktanolilla kyllästetyssä vedessä (C  W ). 
P OW ¼ C O=C W 
Pitoisuuksien suhteena se on paljas luku. Yleensä se ilmoitetaan kymmen ­
kantaisena logaritmina (log P  ow ). P  ow on lämpötilasta riippuvainen, ja rapor ­
toiduissa tiedoissa on oltava myös mittauslämpötila.  
MENETELMÄN PERIAATE  
8. Jakaantumiskertoimen määritystä varten vesi, 1-oktanoli ja testiaine tasapai ­
notetaan toistensa kanssa vakiolämpötilassa. Sen jälkeen määritetään testi ­
aineen pitoisuudet kahdessa faasissa.  
9. Kokeellisia vaikeuksia, jotka liittyvät mikropisaroiden muodostumiseen ra ­
vistuspullokokeen aikana, voidaan vähentää hitaan sekoituksen menetelmäl ­
lä, jota tässä luvussa kuvataan. Hitaan sekoituksen menetelmässä vesi, 1- oktanoli ja testiaine tasapainotetaan termostaatilla varustetussa sekoitusreak ­
torissa. Faasien vaihtumista nopeutetaan sekoittamalla. Sekoittaminen saa 
aikaan rajatun turbulenssin, joka parantaa 1-oktanolin ja veden vaihtumista 
ilman, että mikropisaroita (1) muodostuu.
 
TESTIN SOVELTUVUUS  
10. Koska muiden aineiden kuin testiaineen läsnäolo saattaa vaikuttaa testi ­
aineen aktiivisuuskertoimeen, testiaine on testattava puhtaana aineena. 1- 
oktanoli-vesi-jakaantumiskerroinkoetta varten on käytettävä puhtainta kau ­
pallisesti saatavilla olevaa ainetta.  
11. Tätä menetelmää sovelletaan puhtaisiin aineisiin, jotka eivät dissosioidu tai 
assosioidu ja jotka eivät vaikuta merkittävästi pintojen väliseen toimintaan. Menetelmää voidaan käyttää tällaisten aineiden ja seosten 1-oktanoli-vesi- jakaantumissuhteen määrittämiseen. Kun menetelmää käytetään seosten yh ­
teydessä, määritetyt 1-oktanoli-vesi-jakaantumissuhteet ovat ehdollisia, ja ne 
määräytyvät testatun seoksen kemiallisen koostumuksen ja vesifaasina käy ­
tetyn elektrolyytin koostumuksen mukaisesti. Lisävaiheita käyttämällä me ­
netelmä soveltuu myös yhdisteiden dissosioimiseen tai assosioimiseen (12 
kohta).
 
12. Koska dissosioituvien aineiden, kuten orgaanisten happojen ja fenoleiden, 
orgaanisten emästen ja organometallisten aineiden, 1-oktanoli-vesi-jakaantu ­
miseen osallistuvassa vedessä ja 1-oktanolissa on monia tasapainotiloja, 1- 
oktanoli/vesi-jakaantumissuhde on ehdollinen, ja siihen vaikuttaa vahvasti elektrolyytin koostumus (7) (8). Sen vuoksi 1-oktanoli/vesi-jakaantumissuh ­
teen määrittäminen edellyttää, että pH:ta ja elektrolyytin koostumusta seu ­
rataan kokeen aikana, ja niitä koskevat tiedot on raportoitava. Näiden ja ­
kaantumissuhteiden arvioinnissa on käytettävä asiantuntijoita. Sopivat pH-arvot on valittava dissosiaatiovakion (-vakioiden) arvoa käyttämällä, jotta jakaantumissuhde voidaan määrittää jokaista ionisaatiotilaa varten. Or ­
ganometallisia yhdisteitä (8) käytettäessä on käytettävä ei-kompleksoivia 
puskureita. Kun otetaan huomioon nykyinen tietämys vesikemiasta (muo ­
dostumisvakiot, dissosiaatiovakiot), koeolosuhteet on valittava siten, että testiaineen spesifikaatio vesifaasissa voidaan arvioida. Ionivahvuuden on 
oltava sama kaikissa kokeissa, mikä saadaan aikaan käyttämällä taustaelek ­
trolyyttiä.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 162
 
13. Testattaessa aineita, joiden vesiliukoisuus on huono tai P  ow -arvo suuri, voi 
ilmetä ongelmia, sillä kun pitoisuudet vedessä ovat hyvin pieniä, niiden 
määrittäminen tarkasti on vaikeaa. Tässä testimenetelmäkuvauksessa anne ­
taan myös ohjeita tämän ongelman ratkaisemiseen.  
TESTIAINETTA KOSKEVAT TIEDOT  
14. Kemiallisten reagenssien on oltava analyysilaatua tai sitä puhtaampia. On 
suositeltavaa käyttää merkitsemättömiä, koostumukseltaan tunnettuja ja mie ­
luiten vähintään 99-prosenttisen puhtaita testiaineita tai koostumukseltaan ja radiokemialliselta puhtaudeltaan tunnettuja radioaktiivisesti merkittyjä testi ­
aineita. Jos merkkiaineiden puoliintumisajat ovat lyhyitä, on tehtävä hajoa ­
miskorjauksia. Radioaktiivisesti merkittyjen testiaineiden yhteydessä on käy ­
tettävä kemiallisesti tarkkaa analyysimenetelmää, jotta voidaan varmistaa, että mitattu radioaktiivisuus liittyy suoraan testiaineeseen.
 
15. Arvio log P  ow -arvosta voidaan hankkia käyttämällä kaupallisesti saatavia 
ohjelmia, jotka on tarkoitettu log P  ow -arvon estimointiin, tai käyttämällä 
liukoisuuksien suhdetta kummassakin liuottimessa.  
16. Testiaineesta on oltava seuraavat tiedot saatavilla ennen P  ow -arvon määrit ­
tämiseen tarkoitetun hitaan sekoituksen kokeen toteuttamista:  
a) rakennekaava  
b) sopivat analyysimenetelmät aineen pitoisuuden määrittämiseen vedessä ja 
1-oktanolissa  
c) ionisoituvien aineiden dissosiaatiovakio(t) (OECD:n ohje 112 (9))  
d) vesiliukoisuus (10)  
e) abioottinen hydrolyysi (11)  
f) biologinen hajoavuus (12)  
g) höyrynpaine (13).  
MENETELMÄN KUVAUS  
Välineet ja laitteet  
17. Kokeeseen tarvitaan vakiolaboratoriolaitteisto, erityisesti seuraavat:  
— magneettisekoittimia ja teflonpäällysteisiä magneettisekoitinsauvoja vesi ­
faasin sekoittamista varten  
— analyysivälineet, jotka soveltuvat testiaineen konsentraation määrittämi ­
seen oletettuina pitoisuuksina  
— sekoitusastia, jossa on hana pohjassa. Testiyhdisteen arvioidun log P  ow 
-arvon ja havaitsemisrajan (LOD:n) mukaan on harkittava samanmuotoi ­
sen, tilavuudeltaan yli litran suuruisen reaktioastian käyttämistä, jotta kemiallista erottelua ja analyysia varten saadaan riittävästi vettä. Tällöin 
vesiuutteen pitoisuudet ovat suurempia, jolloin analyyttinen määrittämi ­
nen on luotettavampaa. Lisäyksessä 1 on taulukko, jossa esitetään arviot tarvittavasta vähimmäismäärästä, yhdisteen havaitsemisraja, sen arvioitu log P
 ow sekä sen vesiliukoisuus. Taulukko perustuu log P  ow -arvon ja 
oktanoli- ja vesiliukoisuuksien väliseen suhteeseen Pinsuwanin ja mui ­
den mukaan (14):  
log P  OW ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 163
 
kun 
SR ¼ S oct=S w (yksikkönä molaarisuus);  
sekä Lymanin (15) esittämään suhteeseen, joka liittyy vesiliukoisuuden 
ennustamiseen. Lisäyksessä 1 olevalla yhtälöllä laskettuja vesiliukoi ­
suuksia on pidettävä alustavana arviona. Todettakoon, että käyttäjä voi 
laatia arvion vesiliukoisuudesta käyttämällä mitä tahansa suhdetta, jonka 
käyttäjä katsoo edustavan hydrofobisuuden ja liukoisuuden suhdetta pa ­
remmin. Esimerkiksi kiinteiden yhdisteiden osalta on suositeltavaa, että liukoisuuden ennustamisessa käytetään myös sulamispistettä. Kun käy ­
tetään muunnettua yhtälöä, on varmistettava, että oktanolissa liukoisuu ­
den laskemisessa käytetty yhtälö on edelleen validi. Lisäyksessä 2 on kaaviokuva lasisesta sekoitusastiasta, jonka tilavuus on noin yksi litra. Lisäyksessä 2 olevan astian mittasuhteet ovat osoittautuneet suotuisiksi, 
ja ne on säilytettävä, jos käytetään erikokoista laitetta.
 
— On tärkeää, että lämpötila pidetään vakiona hitaan sekoituksen kokeen 
aikana jollakin tavalla.  
18. Astioiden on oltava valmistettu inertistä materiaalista, jotta imeytyminen 
astian pintoihin on mahdollisimman vähäistä.  
Testiliuosten valmisteleminen  
19. P  ow -arvo on määritettävä puhtaimmalla 1-oktanolilla (vähintään + 99 pro ­
senttia), jota on saatavilla kaupallisesti. 1-oktanolin puhdistaminen happo-, 
emäs- ja vesiuutolla ja sen jälkeinen kuivaaminen on suositeltavaa. 1-okta ­
nolin puhdistamiseen voidaan käyttää myös tislausta. Puhdistettua 1-oktano ­
lia käytetään testiaineiden standardiliuosten valmistamiseen. P  ow -arvon mää ­
rittämisessä käytettävän veden on oltava lasi- tai kvartsilaitteessa tislattua tai 
puhdistusjärjestelmästä hankittua. Myös HPLC-laatuista vettä voi käyttää. 
Tislattu vesi on suodatettava 0,22 mm:n suodattimen läpi, ja sokeanäytteillä on varmistettava, ettei konsentroiduissa uutteissa ole epäpuhtauksia, jotka voivat vaikuttaa testiaineeseen. Jos käytetään lasikuitusuodatinta, se on puh ­
distettava kuumentamalla sitä uunissa vähintään kolme tuntia 400 °C:ssa.
 
20. Molemmat liuottimet kyllästetään ennen koetta tasapainottamalla ne riittävän 
suuressa astiassa. Tämä tehdään sekoittamalla kaksifaasijärjestelmää hitaasti kahden päivän ajan.
 
21. Riittävä pitoisuus testiainetta valitaan ja liuotetaan 1-oktanoliin (joka on 
kyllästetty vedellä). 1-oktanoli-vesi-jakaantumiskerroin täytyy määrittää 1- oktanolin ja veden laimeissa liuoksissa. Sen vuoksi testiaineen pitoisuus 
saa olla kummassakin faasissa enintään 70 prosenttia sen liukoisuudesta, 
kun enimmäiskonsentraatio on 0,1 M (1). Kokeessa käytettävissä 1-oktano ­
liliuoksissa ei saa olla suspendoitunutta kiinteää testiainetta.
 
22. Riittävä pitoisuus testiainetta liuotetaan 1-oktanoliin (joka on kyllästetty 
vedellä). Jos log P  ow -arvon estimaatti on suurempi kuin viisi, on varmis ­
tettava huolella, ettei kokeessa käytetyissä 1-oktanoliliuoksissa ole suspen ­
doitunutta kiinteää testiainetta. Tätä varten sovelletaan jäljempänä kuvattua menetelmää, joka koskee sellaisia kemikaaleja, joiden arvioitu log P
 ow -arvo 
on suurempi kuin 5:  
— Testiaine liuotetaan 1-oktanoliin (joka on kyllästetty vedellä).  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 164
 
— Liuoksen annetaan seistä riittävä aika, jotta suspendoitunut kiinteä aines 
saostuu. Testiaineen pitoisuutta seurataan saostumisen aikana.  
— Kun 1-oktanoliliuoksesta mitattujen pitoisuuksien arvot ovat vakiintu ­
neet, kantaliuos laimennetaan sopivalla määrällä 1-oktanolia.  
— Laimennetun kantaliuoksen pitoisuus mitataan. Jos mitattu pitoisuus on 
yhdenmukainen laimennuksen kanssa, laimennettua kantaliuosta voidaan 
käyttää hitaan sekoituksen menetelmällä tehtävässä kokeessa.  
Näytteiden uutto ja analysointi  
23. Testiaineen määrityksissä on käytettävä validoitua analyysimenetelmää. Tut ­
kijoiden on esitettävä todisteet siitä, että pitoisuudet vedellä kyllästetyssä 1- oktanolissa ja 1-oktanolilla kyllästetyssä vesifaasissa ovat kokeen aikana 
käytettyjen analyysimenetelmien määritysrajaa suuremmat. Testiaineen 
saanto on analysoitava vesifaasista ja 1-oktanolifaasista ennen kokeen suo ­
rittamista niissä tapauksissa, joissa tarvitaan uuttomenetelmiä. Analyyttiset 
signaalit on korjattava nollakokeita varten, ja on syytä varmistaa, ettei yh ­
destä näytteestä peräisin oleva analyytti voi kontaminoida toista analyyttia.
 
24. Vesifaasin uutto orgaanisella liuottimella ja uutteen esikonsentrointi on to ­
dennäköisesti tarpeen ennen analyysia, koska hydrofobisten testiaineiden 
pitoisuudet ovat melko pienet vesifaasissa. Samasta syystä mahdollisten 
nollanäytteiden pitoisuuksia täytyy pienentää. Siinä on käytettävä erittäin puhtaita liuottimia, ensisijaisesti sellaisia, jotka on tarkoitettu jäämien ana ­
lysointiin. Myös työskentely huolellisesti esipuhdistetuilla (esimerkiksi liuo ­
tinpesulla tai korkeassa lämpötilassa kuumentamalla) lasivälineillä voi auttaa 
välttämään ristikontaminaatiota.
 
25. Estimaatti log P  ow -arvosta voidaan hankkia estimointiohjelman tai 
asiantuntija-arvion avulla. Jos arvo on suurempi kuin kuusi, nollakokeen 
korjauksia ja analyyttien siirtymistä on seurattava tiiviisti. Vastaavasti 
myös silloin, kun log P  ow -arvo on suurempi kuin kuusi, standardin (surro ­
gaatin) käyttäminen saannon korjaamisessa on pakollista suurten esikonsent ­
rointikertoimien saavuttamiseksi. Saatavilla on kaupallisia ohjelmia log Pow 
-arvon estimointiin (  1 ), esimerkiksi Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP 
(18) ja ACD log P (19). Erilaisia estimointitapoja on kuvattu viitteissä (20–22).
 
26. Testiaineen pitoisuuden määrittämisessä 1-oktanolissa ja vedessä käytettävät 
määritysrajat (LOQ) selvitetään hyväksytyillä menetelmillä. Pääsääntö on se, että määritysraja voidaan määrittää sellaiseksi pitoisuudeksi vedessä tai 1- oktanolissa, joka tuottaa signaali-kohinasuhteeksi kymmenen. On valittava 
sopiva uutto- ja esikonsentrointimenetelmä, ja myös analyyttiset saannot on 
täsmennettävä. On valittava myös sopiva esikonsentrointikerroin, jotta ana ­
lyyttisen määrityksen perusteella saadaan vaaditun kokoinen signaali.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 165  
( 1 ) Näiden tietojen tarkoituksena on vain helpottaa käyttäjän työtä. Muita vastaavia tietoko ­
neohjelmia voi käyttää, jos voidaan osoittaa, että ne antavat samat tulokset.
 27. Analyysimenetelmän parametrien ja oletettujen pitoisuuksien perusteella 
määritetään likimääräinen näytekoko, jota yhdisteen pitoisuuden tarkka mää ­
rittäminen edellyttää. On vältettävä käyttämästä sellaisia vesinäytteitä, jotka ovat liian pieniä riittävän analyyttisen signaalin tuottamiseksi. Toisaalta myös liian suurten vesinäytteiden käyttämistä on vältettävä, koska muuten 
voi jäädä liian vähän vettä käytettäväksi vaadittujen analyysien vähimmäis ­
määrän toteuttamiseksi (n = 5). Lisäyksessä 1 vähimmäisnäytemäärä on ilmoitettu astian tilavuuden, testiaineen havaitsemisrajan ja testiaineen liu ­
koisuuden funktiona.
 
28. Testiaineiden kvantifiointi tehdään vertailemalla kunkin yhdisteen kalibroin ­
tikäyriä. Analysoitujen näytteiden pitoisuuksien on oltava standardien pitoi ­
suusalueella.  
29. Sellaisten testiaineiden osalta, joiden log P  ow -estimaatti on suurempi kuin 
kuusi, surrogaattistandardi on lisättävä vesinäytteeseen ennen uuttoa, jotta 
voidaan kirjata vesinäytteiden uuton ja esikonsentroinnin aikana tapahtuvat 
hävikit. Jotta saanto voidaan korjata tarkasti, surrogaateilla on oltava hyvin samankaltaiset tai identtiset ominaisuudet kuin testiaineella. Tähän tarkoituk ­
seen on käytettävä ensisijaisesti (vakaita) kyseisten aineiden isotooppimerkit ­
tyjä analogeja (esimerkiksi deuteroituja tai
 13 C-leimattuja). Jos leimattuja vak ­
aita isotooppeja, kuten  13 C:ta tai  2 H:ta ei voida käyttää, on osoitettava luo ­
tettavien kirjallisuustietojen perusteella, että surrogaatin fysikaalis-kemialliset ominaisuudet ovat hyvin samanlaiset kuin testiaineen. Vesifaasin neste-neste- 
uuton aikana voi muodostua emulsioita. Sitä voidaan vähentää lisäämällä 
suolaa ja antamalla emulsion seistä yön yli. Näytteiden uuttoon ja esikonsent ­
rointiin käytetyt menetelmät on ilmoitettava.
 
30. 1-oktanolifaasista otetut näytteet voi tarvittaessa laimentaa sopivalla liuotti ­
mella ennen analyysia. Lisäksi on suositeltavaa käyttää surrogaattistandar ­
deja saannon korjaamiseen sellaisten aineiden yhteydessä, joiden saantoko ­
keet osoittivat, että kokeissa esiintyy suurta vaihtelua (suhteellinen keskih ­
ajonta > 10 %).  
31. Analyysimenetelmä on kuvattava yksityiskohtaisesti. Tähän sisältyvät uutto ­
menetelmä, esikonsentrointi ja laimennuskertoimet, instrumenttiparametrit, 
kalibrointirutiini, kalibrointialue, testiaineen saanto vedestä analysoituna, saannon korjaamiseksi lisätyt surrogaattistandardit, nollanäytteet, havaitse ­
misraja ja määritysrajat.
 
Testin suorittaminen  
Optimaaliset 1-oktanolin ja veden tilavuuden suhteet  
32. Valittaessa veden ja 1-oktanolin tilavuuksia on otettava huomioon määritys ­
raja l-oktanolissa ja vedessä, vesinäytteisiin sovelletut esikonsentrointikertoi ­
met, 1-oktanolista ja vedestä kerättyjen näytteiden määrä sekä odotuksen ­
mukaiset pitoisuudet. Kokeeseen liittyvistä syistä 1-oktanolin tilavuus hitaan sekoituksen menetelmässä on valittava siten, että 1-oktanolikerros on riittä ­
vän paksu (> 0,5 cm), jotta 1-oktanolifaasista voidaan ottaa näyte häiritse ­
mättä sitä.
 
33. Tyypilliset faasien tilavuudet, joita käytetään sellaisten yhdisteiden määrityk ­
sissä, joiden log P  ow -arvot ovat vähintään 4,5, ovat 20–50 ml 1-oktanolia ja 
950–980 ml vettä yhden litran astiassa.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 166
 
Testiolosuhteet  
34. Testin aikana reaktioastiaa säädellään termostaatilla, jotta lämpötilan vaihtelu 
voidaan pitää pienempänä kuin 1 °C. Testi on tehtävä 25 °C:n lämpötilassa.  
35. Koejärjestelmä on suojattava päivänvalolta joko tekemällä koe pimeässä 
huoneessa tai peittämällä reaktioastia alumiinifoliolla.  
36. Koe on tehtävä pölyttömässä ympäristössä (mikäli mahdollista).  
37. 1-oktanoli-vesi-järjestelmää sekoitetaan, kunnes tasapainotila saavutetaan. 
Pilottikokeessa tasapainotilan saavuttamiseen kuluvaa aikaa arvioidaan tote ­
uttamalla hitaan sekoituksen menetelmällä tehtävä koe ja ottamalla säännöl ­
lisesti näytteitä vedestä ja 1-oktanolista. Näytteet on otettava vähintään vii ­
den tunnin mittaisen ajanjakson aikana.  
38. Jokainen P  ow -arvo on määritettävä käyttämällä vähintään kolmea toisistaan 
riippumatonta hitaan sekoituksen menetelmällä tehtävää koetta.  
Tasapainotilan saavuttamisajan määrittäminen  
39. Tasapainotila oletetaan saavutetuksi, kun 1-oktanolin ja veden pitoisuus ­
suhde aikaan nähden neljän aikapisteen pituisella ajanjaksolla tuottaa tulok ­
seksi kulmakertoimen, joka ei eroa merkittävästi nollasta, kun p = 0,05. Tasapainotilan saavuttamisessa vähimmäisaika on yksi päivä, ennen kuin näytteenoton voi aloittaa. Pääsääntö on se, että sellaisista aineista, joiden 
log P
 ow -estimaatti on pienempi kuin viisi, voidaan ottaa näytteitä toisena ja 
kolmantena päivänä (päivät 2 ja 3). Tavallista hydrofobisempien yhdisteiden kohdalla tasapainotilan saavuttaminen saattaa kestää kauemmin. Yhdisteellä, jonka log P
 ow -arvo oli 8,23 (dekaklorobifenyyli), tasapainotilan saavutta ­
minen kesti 144 tuntia. Tasapainotilaa arvioidaan ottamalla jokaisesta asti ­
asta toistuvasti näytteitä.  
Kokeen aloittaminen  
40. Kokeen alussa reaktioastia täytetään 1-oktanolilla kyllästetyllä vedellä. Ter ­
mostaatilla säädetyn lämpötilan saavuttamiseen on varattava riittävästi aikaa.  
41. Haluttu määrä testiainetta (joka on liuotettu tarvittavaan määrään vedellä 
kyllästettyä 1-oktanolia) lisätään reaktioastiaan varovasti. Tämä on tärkeä vaihe kokeessa, koska on vältettävä sekoittamasta näitä kahta faasia siten, että syntyy pyörteisyyttä. Sitä varten 1-oktanolifaasi voidaan pipetoida hi ­
taasti koeastian seinää vasten lähellä veden pintaa. Se valuu hitaasti lasisei ­
nää pitkin ja muodostaa kalvon vesifaasin yläpuolelle. 1-oktanolin dekan ­
tointia suoraan pulloon on aina vältettävä, sillä 1-oktanolipisaroita ei saa tippua suoraan veteen.
 
42. Sekoittamisen aloituksen jälkeen sekoitusnopeutta on lisättävä hitaasti. Jos 
sekoitusmoottoreita ei voida säätää asianmukaisesti, on harkittava muuntajan 
käyttöä. Sekoitusnopeutta on mukautettava siten, että veden ja 1-oktanolin yhtymäkohtaan muodostuu vortex-ilmiö, jonka syvyys on vähintään 0,5 cm ja enintään 2,5 cm. Sekoitusnopeutta on pienennettävä, jos vortex-ilmiön 
syvyys ylittää 2,5 cm. Muutoin 1-oktanolipisaroista saattaa muodostua vesi ­
faasiin mikropisaroita, jolloin testiaineen pitoisuus vedessä arvioidaan liian suureksi. Laboratorioiden välisen validointitutkimuksen (5) löydösten perus ­
teella enimmäissekoitusnopeudeksi suositellaan 2,5 cm:ä. Se on kompromis ­
si, jolla varmistetaan nopea tasapainottuminen ja rajoitetaan 1-oktanolin 
mikropisaroiden muodostumista.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 167
 
Näytteenotto ja näytteiden käsittely  
43. Sekoitin on kytkettävä pois päältä ennen näytteenottoa, ja nesteiden liikkeen 
on annettava pysähtyä. Kun näytteet on otettu, sekoitin käynnistetään uu ­
delleen hitaasti edellä kuvatun mukaisesti, ja sekoitusnopeutta lisätään vähi ­
tellen.  
44. Vesifaasin näyte otetaan reaktioastian pohjassa olevan venttiilin kautta. 
Poista aina hanoissa oleva kuollut tilavuus vettä (lisäyksessä 2 kuvatussa astiassa noin 5 ml). Hanoissa olevaa vettä ei sekoiteta, joten se ei ole tasa ­
painossa bulkin kanssa. Merkitse vesinäytteiden tilavuus ylös ja varmista, 
että poisheitetyssä vedessä olleen testiaineen määrä otetaan huomioon mas ­
satasetta laskettaessa. Haihtumishäviöt on minimoitava antamalla veden vir ­
rata hitaasti erotussuppiloon siten, ettei siitä aiheudu vesi-/1-oktanolikerrok ­
seen kohdistuvaa häiriötä.
 
45. 1-oktanolinäytteet hankitaan ottamalla pieni alikvootti (noin 100 μl) 1-okta­
nolikerroksesta 100 mikrolitran lasikuitu-metalliruiskulla. Näyte on otettava varovasti siten, ettei rajakohta rikkoudu. Näytenesteen tilavuus merkitään muistiin. Pieni alikvootti riittää, koska 1-oktanolinäyte laimennetaan.
 
46. Näytteen käsittelyssä on vältettävä tarpeettomia siirtovaiheita. Sitä varten 
näytteen tilavuus on määritettävä gravimetrisesti. Vesinäytteiden osalta se 
voidaan tehdä keräämällä vesinäyte erotussuppiloon, jossa jo on tarvittava määrä liuotinta.
 
TIEDOT JA RAPORTOINTI  
47. Nykyisen testimenetelmän mukaan P  ow -arvo määritetään tekemällä tutkitta ­
valla yhdisteellä kolme hitaan sekoituksen koetta (kolme kokeellista yksik ­
köä), joissa käytetään identtisiä olosuhteita. Tasapainotilan saavuttamisen 
osoittamisessa käytettävän regression on perustuttava vähintään neljän pe ­
räkkäisistä aikapisteistä tehtyjen Co-/Cw-määrityksen tuloksiin. Näin voi ­
daan laskea varianssi kustakin kokeellisesta yksiköstä saadun keskiarvon 
epävarmuuden mittana.  
48. P  ow -arvoa voidaan luonnehtia kustakin kokeellisesta yksiköstä saatujen tie ­
tojen varianssilla. Tämän tiedon avulla lasketaan P  ow -arvo yksittäisten ko ­
keellisten yksikköjen tulosten painotettuna keskiarvona. Sitä varten painona käytetään kokeellisten yksikköjen tulosten varianssin käänteislukua. Tällä 
tavalla tiedot, joiden variaatio (joka ilmaistaan varianssina) on suuri ja jotka 
ovat siten vähemmän luotettavia, vaikuttavat tulokseen vähemmän kuin tie ­
dot, joiden varianssi on pieni.
 
49. Samalla tavalla lasketaan painotettu keskihajonta. Se kuvaa P  ow -mittauksen 
toistettavuutta. Jos painotetun keskihajonnan arvo on pieni, se tarkoittaa, että 
P ow -arvon määrittämisen toistettavuus oli hyvä yhdessä laboratoriossa. Tie ­
tojen muodollista tilastollista käsittelyä selostetaan jäljempänä.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 168
 
Tulosten käsittely  
Tasapainotilan saavuttamisen osoittaminen  
50. Testiaineen pitoisuuden suhteen logaritmi 1-oktanolissa ja vedessä (log 
(C O /C w )) lasketaan jokaiselta näytteenottokerralta. Kemiallisen tasapainotilan 
saavuttaminen osoitetaan esittämällä tämä suhde aikaan nähden. Tässä esi ­
tystavassa tasanne, joka perustuu vähintään neljään peräkkäiseen aikapistee ­
seen, osoittaa, että tasapainotila on saavutettu ja että yhdiste on liuennut 1- 
oktanoliin. Jos näin ei ole, testiä on jatkettava, kunnes neljä peräkkäistä aikapistettä antavat tulokseksi kulmakertoimen, joka ei eroa nollasta huo ­
mattavasti p-tason ollessa 0,05, mikä tarkoittaa sitä, että log C
 o /C w ei riipu 
ajasta.  
Log P  ow -arvon laskeminen  
51. Kokeellisen yksikön log P  ow -arvo lasketaan log C  o /C w -arvon painotettuna 
keskiarvona log C  o /C w -käyrän osalle siihen aikaan nähden, jonka osalta 
tasapainotila on osoitettu saavutetuksi. Painotettu keskiarvo lasketaan pai ­
nottamalla tietoja varianssin käänteisluvulla, jotta tietojen vaikutus lopputu ­
lokseen on käänteisessä suhteessa tietojen epävarmuuteen.  
Log P  ow -arvon keskiarvo  
52. Eri kokeellisten yksiköiden log P  ow -arvojen keskiarvo lasketaan yksittäisten 
kokeellisten yksikköjen tulosten, joita on painotettu niiden variansseilla, 
keskiarvona.  
Keskiarvo lasketaan seuraavan kaavan mukaan:  
log P  OW ;Av ¼ ðΣw i Ü log P  OW ;i Þ Ü ðΣw i Þ –1 
jossa  
log P  OW,i = yksittäisen kokeellisen yksikön i log P  ow -arvo  
log P  OW,Av  = yksittäisten log P  ow -arvojen painotettu keskiarvo  
w i = kokeellisen yksikön I log P  ow -arvolle osoitettu tilastollinen 
paino.  
Log P  OW,i -arvon varianssin käänteislukua käytetään muodossa w  i 
(w i ¼ varðlog P  OW ;i Þ –1 ). 
53. Log P  ow -arvojen keskiarvon virhe arvioidaan yksittäisten kokeellisten yk ­
siköiden tasapainotilan saavuttamisen vaiheessa määritetyn log C  o /C w -arvon 
toistettavuutena. Se ilmaistaan log P  OW,Av  (σ log Pow,Av  ) -arvon painotettuna 
keskihajontana, joka taas on log P  OW,Av  -arvoon liittyvän virheen mitta. 
Painotettu keskihajonta voidaan laskea painotetusta varianssista (var  log 
Pow,Av  ) seuraavasti:  
var log Pow ;Av ¼ ðΣw i Ü ðlog P  OW ;i Ä log P  OW ;Av Þ 2 Þ Ü ðΣw i Ü ðn Ä 1ÞÞ –1 
σ log Pow ;Av ¼ ðvar log Pow ;Av Þ 0;5 
Symboli n tarkoittaa kokeellisten yksiköiden lukumäärää.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 169
 
Testiraportti  
54. Testiraporttiin on sisällytettävä seuraavat tiedot:  
Testiaine:  
— yleisnimi, kemiallinen nimi, CAS-numero, rakennekaava (josta käy ilmi 
leiman sijainti käytettäessä radioaktiivista merkkiainetta) ja merkityksel ­
liset fysikaalis-kemialliset ominaisuudet (katso 17 kohta)  
— testiaineen puhtaus (epäpuhtaudet)  
— merkkiaineella leimatun kemikaalin leiman puhtaus ja molaarinen aktii ­
visuus (tapauksen mukaan)  
— alustava arvio log P  ow -arvosta sekä arvon johtamisesssa käytetty mene ­
telmä.  
Testiolosuhteet:  
— testien suorituspäivämäärät  
— lämpötila testin aikana  
— 1-oktanolin ja veden tilavuudet testin alussa  
— otettujen 1-oktanoli- ja vesinäytteiden tilavuudet  
— 1-oktanolin ja veden jäljelle jääneet tilavuudet testiastioissa  
— käytettyjen testiastioiden ja sekoitusolosuhteiden kuvaus (sekoitussauvan 
ja testiastian geometria, vortex-ilmiön korkeus millimetreinä ja sekoitus ­
nopeus, jos saatavilla)  
— testiaineen ja määritysrajan määrittämisessä käytetyt analyysimenetelmät  
— näytteenottokertojen määrä  
— vesifaasin ja käytettyjen puskuriliuosten pH, kun pH:ta on muutettu 
ionisoituneita molekyylejä varten  
— rinnakkaisnäytteiden määrä.  
Tulokset:  
— käytettyjen analyysimenetelmien toistettavuus ja herkkyys  
— testiaineen määritetyt pitoisuudet 1-oktanolissa ja vedessä ajan funktiona  
— massataseen osoittaminen  
— lämpötila ja keskihajonta tai lämpötilan vaihteluväli kokeen aikana  
— pitoisuussuhteen regressio ajan suhteen  
— keskiarvo log P  ow,Av  ja sen keskivirhe  
— tulosten pohdinta ja tulkinta  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 170
 
— esimerkkejä edustavan analyysin mittaustuloksista (kaikki mittaustulok ­
set on tallennettava hyvää laboratoriokäytäntöä koskevien periaatteiden 
mukaisesti), mukaan luettuina surrogaattien saannot, sekä kalibroinnissa käytettyjen tasojen määrä (ja kalibrointikäyrän korrelaatiokerrointa kos ­
kevat kriteerit) ja laadunvarmistuksen/laadunvalvonnan tulokset
 
— jos saatavilla: koemenettelyn validointiraportti (merkitään kirjallisuusviit ­
teisiin).  
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of 
octanol/water partition coefficients with the ”slow-stirring” method. Envi ­
ron. Toxicol. Chem. 8: 499–512.  
2) Tämän liitteen luku A.8 Jakaantumiskerroin.  
3) Tämän liitteen luku A.8 Jakaantumiskerroin.  
4) OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 
Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris.
 
5) Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring 
Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM 
contract-Nrs 602730 M/602700/01.  
6) Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation 
methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.  
7) Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental 
Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.  
8) Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwar ­
zenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of 
tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition.  Environ. Sci. 
Technol.  31: 2596–2602.  
9) OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Disso ­
ciation Constants in Water. Paris.  
10) Tämän liitteen luku A.6 Vesiliukoisuus.  
11) Tämän liitteen luku C.7 Hajoaminen – Abioottinen hajoaminen: Hydrolyysi 
pH:n funktiona.  
12) Tämän liitteen luku C.4 Biohajoavuuden määritys – Osat II–VII (menetel ­
mät A–F).  
13) Tämän liitteen luku A.4 Höyrynpaine.  
14) Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water 
solubility ratios and partition coefficients,  J. Chem. Eng. Data.  40: 623–626.  
15) Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property 
Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Ly ­
man WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, 
Washington, DC, 2–1 ja 2–52.  
16) Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemi ­
cal Information Systems, Irvine, CA.  
17) Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.  
18) Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.  
19) ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario 
M5H 3V9, Canada, 2001.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 171
 
20) Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl 
WF, Rosenblatt DH, eds,  Handbook of chemical property estimation , Ame­
rican Chemical Society, Washington, D.C.  
21) Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An 
extension to a 1 000 data point set.  Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther.  14: 
479–488.  
22) Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed,  Methoden der Organischen Che ­
mie: 386–390.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 172
 
Lisäys 1  
Laskentataulukko: sellaisten testiaineiden, joilla on erilaiset log P  OW -arvot 
vesifaasissa, havaitsemisessa tarvittavien vähimmäisvesimäärien laskeminen  
Oletukset:  
— Yksittäisten alikvoottien enimmäistilavuus = 10 prosenttia kokonaistilavuu ­
desta, viisi alikvoottia = 50 prosenttia kokonaistilavuudesta.  
— Testiaineiden pitoisuus= 0,7 × liukoisuus kummassakin faasissa. Jos pitoisuu ­
det ovat alhaisempia, on käytettävä suurempia määriä.  
— Havaitsemisrajan määrityksessä käytetty tilavuus = 100 ml.  
— log P  ow vs. log S  w ja log P  ow vs. SR (S  oct /S w ) edustavat testiaineiden suhteita 
riittävästi.  
Estimaatti S  w 
log P  ow Kaava log S  w S w (mg/l)  
4 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,496 3,133E+00 
4,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,035 1,084E+00 
5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,426 3,750E-01 
5,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,887 1,297E-01 
6 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,348 4,487E-02 
6,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,809 1,552E-02 
7 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,270 5,370E-03 
7,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,731 1,858E-03 
8 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 3,192 6,427E-04  
Estimaatti S  oct 
log P  ow Kaava S  oct (mg/l)  
4 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 3,763E+04 
4,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 42 4,816E+04 
5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 43 6,165E+04 
5,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 44 7,890E+04 
6 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 45 1,010E+05 
6,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 46 1,293E+05 
7 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 47 1,654E+05 
7,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 48 2,117E+05 
8 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 49 2.710E+05  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 173
 
Testiaineen 
kokonaismassa 
(mg) Mass  oct /Mass  water Mass  H2O 
(mg) Conc  H2O 
(mg/l) Mass  oct 
(mg) Conc  oct 
(mg/l)  
1 319 526 2,5017 2,6333 1 317 26 333 
1 686 1 664 1,0127 1,0660 1 685 33 709 2 158 5 263 0,4099 0,4315 2 157 43 149 2 762 16 644 0,1659 0,1747 2 762 55 230 
3 535 52 632 0,0672 0,0707 3 535 70 691 
4 524 1664 36 0,0272 0,0286 4 524 90 480 5 790 5263 16 0,0110 0,0116 5 790 115 807 7 411 1 664 357 0,0045 0,0047 7 411 148 223 9 486 5 263 158 0,0018 0,0019 9 486 189 713
 
Tilavuuksien laskeminen  
H 2 O-faasiin tarvittava vähimmäistilavuus kussakin LOD-pitoisuudessa  
log K  ow LOD 
(mikrogrammaa/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 0,04 0,38 3,80 38 380 
4,5 0,09 0,94 9,38 94 938 
5 0,23 2,32 23,18 232 2 318 
5,5 0,57 5,73 57,26 573 5 726 
6 1,41 14,15 141 1 415 14 146 
6,5 3,50 34,95 350 3 495 34 950 
7 8,64 86,35 864 8 635 86 351 
7,5 21,33 213 2 133 21 335 213 346 
8 52,71 527 5 271 52 711 527 111 
LOD:n yhtey ­
dessä käytetty 
tilavuus (l) 0,1 
Laskentaohjeet  
Edustaa alle 10:tä prosenttia vesifaasin kokonaistilavuudesta, 1 litran tasapaino ­
tusastia.  
Edustaa alle 10:tä prosenttia vesifaasin kokonaistilavuudesta, 2 litran tasapaino ­
tusastia.  
Edustaa alle 10:tä prosenttia vesifaasin kokonaistilavuudesta, 5 litran tasapaino ­
tusastia.  
Edustaa alle 10:tä prosenttia vesifaasin kokonaistilavuudesta, 10 litran tasapaino ­
tusastia.  
Ylittää 10 prosenttia myös 10 litran tasapainotusastian yhteydessä.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 174
 
Yhteenveto tarvittavista tilavuuksista vesiliukoisuuden ja log P  ow -arvon funktiona  
H 2 O-faasiin tarvittava vähimmäistilavuus kussakin LOD-pitoisuudessa (ml)  
log P  ow S w (mg/l) LOD 
(mikrogrammaa/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 10 0,01 0,12 1,19 11,90 118,99 
5 0,02 0,24 2,38 23,80 237,97 3 0,04 0,40 3,97 39,66 396,62 1 0,12 1,19 11,90 118,99 1 189,86 
4,5 5 0,02 0,20 2,03 20,34 203,37 
2 0,05 0,51 5,08 50,84 508,42 1 0,10 1,02 10,17 101,68 1 016,83 
0,5 0,20 2,03 20,34 203,37 2 033,67 
5 1 0,09 0,87 8,69 86,90 869,01 
0,5 0,17 1,74 17,38 173,80 1 738,02 
0,375 0,23 2,32 23,18 231,75 2 317,53 
0,2 0,43 4,35 43,45 434,51 4 345,05 
5,5 0,4 0,19 1,86 18,57 185,68 1 856,79 
0,2 0,37 3,71 37,14 371,36 3 713,59 0,1 0,74 7,43 74,27 742,72 7 427,17 
0,05 1,49 14,85 148,54 1 485,43 14 854,35 
6 0,1 0,63 6,35 63,48 634,80 6 347,95 
0,05 1,27 12,70 126,96 1 269,59 12 695,91 
0,025 2,54 25,39 253,92 2 539,18 25 391,82 
0,0125 5,08 50,78 507,84 5 078,36 50 783,64 
6,5 0,025 2,17 21,70 217,02 2 170,25 21 702,46 
0,0125 4,34 43,40 434,05 4 340,49 43 404,93 
0,006 9,04 90,43 904,27 9 042,69 90 426,93 0,003 18,09 180,85 1 808,54 18 085,39 180 853,86 
7 0,006 7,73 77,29 772,89 7 728,85 77 288,50 
0,003 15,46 154,58 1 545,77 15 457,70 154 577,01 
0,0015 23,19 231,87 2 318,66 23 186,55 231 865,51 
0,001 46,37 463,73 4 637,31 46 373,10 463 731,03 
7,5 0,002 19,82 198,18 1 981,77 19 817,73 198 177,33 
0,001 39,64 396,35 3 963,55 39 635,47 396 354,66 
0,0005 79,27 792,71 7 927,09 79 270,93 792 709,32
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 175
 
log P  ow S w (mg/l) LOD 
(mikrogrammaa/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
0,00025 158,54 1 585,42 15 854,19 158 541,86 1 585 418,63 
8 0,001 33,88 338,77 3 387,68 33 876,77 338 767,72 
0,0005 67,75 677,54 6 775,35 67 753,54 677 535,44 
0,00025 135,51 1 355,07 13 550,71 135 507,09 1 355 070,89 
0,000125 271,01 2 710,14 27 101,42 271 014,18 2 710 141,77 
LOD:n yhteydessä käy ­
tetty tilavuus (l) 0,1 
Lisäys 2  
Esimerkki lasisesta testiastiasta P  OW -arvon määrittämistä varten 
tarkoitettuun hitaan sekoituksen kokeeseen
  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 176
 
OSA B: TOKSISUUDEN JA MUIDEN TERVEYSVAIKUTUSTENMÄÄ ­
RITYS  
SISÄLLYSLUETTELO 
YLEISJOHDANTO 
B.1 a. AKUUTTI ORAALINEN TOKSISUUS — VAKIOANNOSME ­
NETELMÄ 
B.1 b. AKUUTTI ORAALINEN TOKSISUUS — AKUUTIN TOKSI ­
SUUSLUOKAN MENETELMÄ 
B.2. AKUUTTI MYRKYLLISYYS (HENGITETTYNÄ) 
B.3. AKUUTTI MYRKYLLISYYS (IHON KAUTTA) B.4. AKUUTTI TOKSISUUS: IHOÄRSYTTÄVYYS/-SYÖVYTTÄ ­
VYYS 
B.5. AKUUTTI TOKSISUUS: SILMÄN ÄRSYTTÄVYYS/SYÖVYT ­
TÄVYYS 
B.6. IHON HERKISTYMINEN 
B.7. ORAALINEN TOISTUVAN ANNOSTELUN TOKSISUUSTUT ­
KIMUS (28 PV) JYRSIJÖILLÄ 
B.8. SUBAKUUTTI MYRKYLLISYYS HENGITETTYNÄ: 28 PÄI ­
VÄN TUTKIMUS 
B.9. TOISTETUN ANNOKSEN (28 PÄIVÄÄ) MYRKYLLISYYS 
(IHON KAUTTA NAUTITTAVAT AINEET) 
B.10. MUTAGEENISUUS — KROMOSOMIPOIKKEAVUUSTESTI 
NISÄKÄSSOLUILLA  IN VITRO  
B.11. MUTAGEENISUUS — KROMOSOMIPOIKKEAVUUSTESTI 
NISÄKKÄIDEN LUUYTIMESSÄ  IN VIVO  
B.12. MUTAGEENISUUS — MIKROTUMATESTI NISÄKKÄÄN 
PUNASOLUISSA  IN VIVO  
B.13/14. MUTAGEENISUUS — TAKAISINMUTAATIOTESTI BAK ­
TEEREILLA 
B.15. MUTAGEENISUUSTESTAUS JA KARSINOGEENISTEN AI ­
NEIDEN SEULONTA GEENIMUTAATIOT —  SACCHAROMY ­
CES CEREVISIAE  
B.16. MITOOTTINEN REKOMBINAATIO —  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE.  
B.17. MUTAGEENISUUS — GEENIMUTAATIOTESTI NISÄKÄS ­
SOLUILLA  IN VITRO  
B.18. DNA-VAURIO JA SEN KORJAANTUMINEN — UDS-TESTI 
NISÄKÄSSOLUVILJELMÄLLÄ 
B.19. SISARKROMATIDIVAIHDOSTESTI 
B.20. RESESSIIVI LETAALI -TESTI BANAANIKÄRPÄSELLÄ  
(DROSOPHILIA MELANOGASTER)
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 177
 
B.21. SOLUTRANSFORMAATIOTESTIT NISÄKÄSSOLUVILJEL ­
MILLÄ 
B.22. DOMINOIVA LETAALITESTI JYRSIJÖILLÄ 
B.23. NISÄKKÄIDEN SPERMATOGONIOIDEN KROMOSOMI ­
POIKKEAVUUSTESTI 
B.24. HIIREN SPOT-TESTI 
B.25. HIIREN PERIYTYVÄ TRANSLOKAATIO 
B.26. SUBKROONINEN ORAALINEN MYRKYLLISYYSTESTI TOIS ­
TETUILLA ANNOKSILLA TEHTÄVÄ 90 VUOROKAUDEN ORAALINEN MYRKYLLISYYSTUTKIMUS JYRSIJÖILLÄ 
B.27. SUBKROONINEN ORAALINEN MYRKYLLISYYSTESTI TOIS ­
TETUILLA ANNOKSILLA TEHTÄVÄ 90 VUOROKAUDEN ORAALINEN MYRKYLLISYYSTUTKIMUS MUILLA KUIN 
JYRSIJÖILLÄ 
B.28. SUBKROONINEN MYRKYLLISYYSTESTI (IHON KAUTTA) 
TOISTUVA ANNOSTELU IHON KAUTTA, 90 VUO ­
ROKAUTTA, JYRSIJÄT 
B.29. SUBKROONINEN MYRKYLLISYYS HENGITETTYNÄ: 90 
PÄIVÄN TUTKIMUS 
B.30. KROONISET MYRKYLLISYYSTUTKIMUKSET 
B.31. PRENATAALISEN KEHITYKSEN AIKAISTEN MYRKYLLI ­
SYYSVAIKUTUSTEN TUTKIMUS 
B.32. KARSINOGEENISUUSTUTKIMUKSET 
B.33. YHDISTETTY KROONINEN MYRKYLLISYYS-/KARSINO ­
GEENISUUSTUTKIMUS 
B.34. MYRKKYJEN VAIKUTUS LISÄÄNTYMISKYKYYN (YHDEN 
SUKUPOLVEN TESTI) 
B.35. KAKSI SUKUPOLVEA KÄSITTÄVÄ LISÄÄNTYMISKY ­
KYYN KOHDISTUVIEN MYRKYLLISYYSVAIKUTUSTEN 
TUTKIMUS 
B.36. TOKSIKOKINETIIKKA 
B.37. ORGANOFOSFAATTIEN AIHEUTTAMA VIIVÄSTYNYT 
NEUROTOKSISUUS AKUUTIN ALTISTUKSEN JÄLKEEN 
B.38. ORGANOFOSFAATTIEN AIHEUTTAMA VIIVÄSTYNYT 
NEUROTOKSISUUS 28 PÄIVÄN TOISTUVAN ANNOSTE ­
LUN TUTKIMUKSESSA 
B.39. UDS-TESTI NISÄKKÄIDEN MAKSASOLUILLA  IN VIVO  
B.40.  IN VITRO  IHOSYÖVYTTÄVYYS: IHON SÄHKÖVASTUS ­
MÄÄRITYSTESTI (TER) 
B.40 a.  IN VITRO  IHOSYÖVYTTÄVYYS: IHMISIHOMALLITESTI
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 178
 
B.41.  IN VITRO  3T3 NRU — VALOMYRKYLLISYYSTESTI 
B.42. IHOHERKISTYS: PAIKALLINEN IMUSOLMUKEMÄÄRITYS ­
MENETELMÄ 
B.43. NEUROTOKSISUUSTUTKIMUS JYRSIJÖILLÄ 
B.44. IHON KAUTTA IMEYTYMINEN:  IN VIVO  -MENETELMÄ 
B.45. IHON KAUTTA IMEYTYMINEN:  IN VITRO  -MENETELMÄ 
B.46.  IN VITRO  -IHOÄRSYTTÄVYYS: REKONSTRUOIDUN IHMI ­
SORVASKEDEN TESTIMENETELMÄ 
B.47. NAUDAN SARVEISKALVON SAMEUTEEN JA LÄPÄISE ­
VYYTEEN PERUSTUVA TESTIMENETELMÄ SILMÄÄ SYÖ ­
VYTTÄVIEN JA SILMÄÄ VAKAVASTI ÄRSYTTÄVIEN AI ­
NEIDEN TUNNISTAMISEKSI 
B.48. ERISTETTYÄ KANAN SILMÄÄ KÄYTTÄVÄ TESTIMENE ­
TELMÄ SILMÄÄ SYÖVYTTÄVIEN JA SILMÄÄ VA ­
KAVASTI ÄRSYTTÄVIEN AINEIDEN TUNNISTAMISEKSI 
B.49.  IN VITRO  -MIKROTUMATESTI NISÄKÄSSOLUILLA 
B.50. IHOHERKISTYS: PAIKALLINEN IMUSOLMUKEMÄÄRITYS ­
MENETELMÄ: DA 
B.51. IHOHERKISTYS: PAIKALLINEN IMUSOLMUKEMÄÄRITYS ­
MENETELMÄ: BRDU-ELISA  
▼M4 
B.52. AKUUTTI MYRKYLLISYYS HENGITETTYNÄ – AKUUTIN 
TOKSISUUSLUOKAN MENETELMÄ  
▼M5 
B.53. HERMOSTONKEHITYKSEEN KOHDISTUVIA MYRKYLLI ­
SYYSVAIKUTUKSIA KOSKEVA TUTKIMUS 
B.54. KOHTUUN AIHEUTUVIEN VAIKUTUKSIEN BIOTESTI JYR ­
SIJÖILLÄ: LYHYTAIKAINEN SEULONTATESTI ESTROGEE ­
NISISTA OMINAISUUKSISTA 
B.55. ROTILLA TEHTÄVÄ HERSHBERGERIN BIOTESTI: LYHYT ­
AIKAINEN SEULONTATESTI ANDROGEENISISTA (ANTI ­
ANDROGEENISISTA) OMINAISUUKSISTA 
B.56. PIDENNETTY YHDEN SUKUPOLVEN LISÄÄNTYMISTOK ­
SISUUTTA KOSKEVA TUTKIMUS 
B.57. H295R-STEROIDOGENEESIÄ KOSKEVA TESTI 
B.58. SIIRTOGEENISTEN JYRSIJÖIDEN SOMAATTISTEN SOLU ­
JEN JA SUKUSOLUJEN GEENIMUTAATIOTESTIT  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 179
 
YLEISJOHDANTO  
A. TESTIAINEEN KARAKTERISAATIO  
Testiaineen koostumus, mukaan lukien tärkeimmät epäpuhtaudet, ja 
sen olennaiset fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, mukaan lukien sta ­
biliteetti, on oltava tiedossa ennen toksisuustutkimusten aloittamista.  
Testiaineen fysikaalis-kemialliset ominaisuudet antavat tärkeää tietoa 
antotavan, tutkimusasetelman ja testiaineen käsittely- ja säilyttämis ­
tavan valintaa varten.  
Annosteluaineessa ja biologisessa materiaalissa olevan testiaineen (ja 
mahdollisuuksien mukaan myös tärkeimpien epäpuhtauksien) mää ­
rittämiseen käytettävä määrällinen ja laadullinen analyysimenetelmä 
tulee kehittää ennen tutkimuksen aloittamista.  
Kaikki testiaineen tunnistamiseen, fysikaalis-kemiallisiin ominai ­
suuksiin, puhtauteen ja käyttäytymiseen liittyvät tiedot tulee sisällyt ­
tää tutkimusraporttiin.  
B. ELÄINTEN HOITO  
Ympäristöolosuhteiden ja eläinten oikeiden hoitomenetelmien tiukka 
seuranta on oleellista toksisuustutkimuksissa.  
i) Elinolosuhteet  
Koe-eläintilojen ja häkkien ympäristöolosuhteiden on oltava testatta ­
valle lajille tarkoituksenmukaiset. Rotalle, hiirelle ja marsulle sopiva huoneenlämpötila on 22 ± 3
 o C ja suhteellinen ilmankosteus 30- 
70 %. Kaniineille sopiva huoneenlämpötila on 20 ± 3  o C ja suhteel ­
linen ilmankosteus 30–70 %.  
Jotkut tutkimusmenetelmät ovat erityisen herkkiä lämpötilavaikutuk ­
sille. Näissä tapauksissa asianmukaiset olosuhteet on selostettu yksi ­
tyiskohtaisesti tutkimusmenetelmän kuvauksen yhteydessä. Kaikissa toksisuustutkimuksissa on valvottava huoneenlämpötilaa ja ilmankos ­
teutta, rekisteröitävä tiedot ja kirjattava ne tutkimuksen loppuraport ­
tiin.
 
Valaistuksen tulee olla keinovaloa. Eläimen tulee saada olla 12 tuntia 
valossa ja 12 tuntia pimeässä. Valaistusmallin yksityiskohdat on re ­
kisteröitävä ja kirjattava tutkimuksen loppuraporttiin.  
Jollei menetelmässä erikseen muuta mainita, eläimiä voidaan säilyt ­
tää yksin tai pienryhmänä häkeissä, joissa on samaa sukupuolta. Yhdessä ryhmähäkissä saa olla enintään viisi eläintä.
 
Koe-eläintutkimusraporteissa on tärkeää ilmoittaa käytetty häkki ­
tyyppi ja eläinten määrä häkkiä kohti sekä kemiallisen altistuksen 
että sitä seuranneiden havainnointijaksojen aikana.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 180
 
ii) Ruokintaolosuhteet  
Ravinnon tulee tyydyttää testattavan eläinlajin kaikki ravitsemuksel ­
liset tarpeet. Jos testiainetta annetaan eläimille ravinnossa, ravinnon ravintoarvo voi heiketä testiaineen ja ruoka-aineen interaktion vuok ­
si. Tällaisen reaktion mahdollisuus on otettava huomioon tutkimus ­
tuloksia tulkittaessa. Eläimille voidaan antaa tavanomaista koe-eläin ­
ravintoa ja juomavettä on oltava kaiken aikaa tarjolla. Ravinnon valintaan voi vaikuttaa tarve varmistaa testiaineelle sopiva sekoitus, 
kun se annostellaan ravinnon mukana.
 
Ravintoa saastuttavia aineita, joiden tiedetään vaikuttavan toksisuu ­
teen, ei saa olla läsnä häiritsevinä pitoisuuksina.  
C. VAIHTOEHTOISET TUTKIMUKSET  
Euroopan unioni on sitoutunut edistämään sellaisten vaihtoehtome ­
netelmien kehittämistä ja validointia, joista saadaan samantasoista 
tietoa kuin nykyisistä eläinkokeista, mutta joihin tarvitaan vähemmän 
eläimiä ja jotka aiheuttavat vähemmän kärsimystä tai joissa eläimiä ei tarvita lainkaan.
 
Sitä mukaa kuin tällaisia menetelmiä tulee saataville, on niitä mah ­
dollisuuksien mukaan käytettävä vaaran luonnehdinnassa ja siihen 
perustuvassa ominaisvaarojen luokittelussa ja merkitsemisessä.  
D. ARVIONTI JA TULKINTA  
Testien arvioinnissa ja tulkinnassa on otettava huomioon ekstrapolaa ­
tiorajoitukset eläinkokeiden ja  in vitro  -tutkimusten tulosten sovelta ­
misessa suoraan ihmiseen, ja siksi mahdollisesti saatavia todisteita haittavaikutuksista ihmisellä voidaan käyttää tutkimustulosten vah ­
vistamiseen.
 
E. LÄHDELUETTELO  
Useimmat näistä menetelmistä on kehitetty OECD:n ”Testing Guid ­
elines” -ohjelman puitteissa ja niitä tulisi käyttää yhtenevästi GLP (Good Laboratory Practice) -periaatteiden kanssa mahdollisimman laajan ”keskinäisen tietojen hyväksymisen” varmistamiseksi.
 
Lisätietoa löytyy OECD-ohjeiston kirjallisuusluettelossa mainituista 
lähteistä ja muusta asiaankuuluvasta kirjallisuudesta.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 181
 
B.1 a.  AKUUTTI ORAALINEN TOKSISUUS — VAKIOANNOSME ­
NETELMÄ  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro TG 420 (2001)  
1.1 JOHDANTO  
Perinteisissä menetelmissä akuutin toksisuuden arvioimiseksi käyte ­
tään päätepisteenä eläinten kuolemaa. Vuonna 1984 British Toxico ­
logy Society ehdotti akuutin toksisuuden testaamiseksi uutta käytän ­
töä, joka perustuu aineen annosteluun vakioannostasojen sarjana (1). 
Menetelmässä vältettiin käyttämästä eläinten kuolemaa päätepisteenä ja tarkkailtiin sen sijaan selviä toksisuusoireita yhdellä annossarjasta valitulla vakioannostasolla. Menetelmä on hyväksytty tutkimusmene ­
telmäksi vuonna 1992 Yhdistyneen kuningaskunnan (2) ja kansain ­
välisten (3)  in vivo - validointitutkimusten perusteella. Tämän jälkeen 
vakioannosmenetelmän tilastollisia ominaisuuksia on arvioitu mate ­
maattisten mallien avulla useissa tutkimuksissa (4) (5) (6).  In vivo-  ja 
mallintamistutkimukset ovat osoittaneet, että menetelmä on toistetta ­
va, että siinä käytetään vähemmän eläimiä ja että se aiheuttaa vä ­
hemmän kärsimystä kuin perinteiset menetelmät. Menetelmällä voi ­
daan luokitella aineita vaarallisuuden mukaan samalla tavoin kuin 
muilla akuutin toksisuuden tutkimusmenetelmillä.
 
Ohjeita tiettyyn tarkoitukseen sopivimman tutkimusmenetelmän va ­
linnasta on annettu akuutin oraalisen toksisuuden testausta koske ­
vassa ohjeasiakirjassa (Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing (7)). Ohjeasiakirjassa on myös lisätietoa tutkimusmenetelmä B.l a:n käyttämisestä ja tulkinnasta.
 
Menetelmän periaatteena on, että päätutkimuksessa käytetään ainoas ­
taan lievästi toksisia annoksia ja että todennäköisesti tappavien an ­
nosten antamista vältetään. Annoksia, joiden tiedetään aiheuttavan 
voimakasta kipua ja kärsimystä syövyttävien tai vaikea-asteisten är ­
sytysvaikutusten vuoksi, ei myöskään tarvitse annostella. Kuolemai ­
sillaan olevat, selvästi kärsivät tai voimakkaasta ja jatkuvasta kivusta merkkejä osoittavat eläimet on lopetettava humaanilla tavalla, ja 
koetulosten tulkinnassa ne on otettava huomioon samalla tavalla 
kuin kokeessa kuolleet eläimet. Erillisessä ohjeasiakirjassa (8) on esitetty kriteerit, joiden perusteella tehdään päätös kuolemaisillaan olevan tai voimakkaasti kärsivän eläimen lopettamisesta. Lisäksi 
siinä on annettu ohjeita ennustettavan tai uhkaavan kuoleman tunnis ­
tamiseksi.
 
Menetelmällä saadaan tietoa vaarallisista ominaisuuksista ja aineet 
voidaan sen perusteella sijoittaa ja luokitella akuuttia toksisuutta ai ­
heuttavien kemikaalien kansainvälisesti yhdenmukaistetun luokitus ­
järjestelmän mukaisesti (Globally Harmonised System (GHS) for the classification of chemicals which cause acute toxicity (9)).
 
Koelaboratorion on otettava huomioon kaikki testiaineesta saatavilla 
olevat tiedot ennen tutkimuksen suorittamista. Näissä tiedoissa on esitettävä aineen tunnistetiedot ja kemiallinen rakenne, sen fysikaa ­
lis-kemialliset ominaisuudet, kaikkien muiden aineella  in vivo  tai in 
vitro  suoritettujen toksisuuskokeiden tulokset, rakenteellisesti saman ­
laisten aineiden toksikologiset tiedot ja aineen odotettu käyttö. Nämä tiedot ovat välttämättömiä kaikkien asianosaisten vakuuttamiseksi 
siitä, että kokeella on merkitystä ihmisten terveyden suojelun kan ­
nattaja että sen avulla voidaan valita sopiva alkuannos.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 182
 
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Akuutti oraalinen toksisuus:  haittavaikutukset, joita esiintyy, kun 
ainetta on annosteltu suun kautta kerta-annoksena tai useampana annoksena 24 tunnin aikana.
 
Viivästynyt kuolema:  eläin ei kuole tai vaikuta kuolevalta 48 tunnin 
kuluessa, mutta kuolee myöhemmin 14 päivän havainnointijakson aikana.
 
Annos:  annostellun testiaineen määrä. Annos ilmaistaan testiaineen 
painona koe-eläimen painoyksikköä kohti (esimerkiksi mg/kg).  
Ilmeinen toksisuus:  yleistermi, jolla tarkoitetaan testiaineen antami ­
sen jälkeen ilmeneviä selviä toksisuuden oireita (katso esimerkiksi 
(3)). Näiden oireiden perusteella vakioannoksen suurentaminen seu ­
raavaan annokseen aiheuttaisi todennäköisesti voimakasta kipua ja jatkuvia merkkejä kovasta kärsimyksestä tai sen, että eläin on kuo ­
lemaisillaan (perusteet on esitetty eläinkokeen humaaneja lopetta ­
miskriteereitä koskevassa ohjeasiakirjassa Humane Endpoints Gui ­
dance Document (8)) tai todennäköisesti useimpien eläinten kuole ­
man.
 
GHS:  Globally Harmonised Classification System for Chemical 
Substances and Mixtures (Kemiallisten aineiden ja seosten kansain ­
välisesti yhdenmukaistettu luokitusjärjestelmä). Yhteinen toimi, jo ­
hon osallistuvat OECD (ihmisten terveys ja ympäristö), YK:n vaa ­
rallisten aineiden kuljettamista käsittelevä asiantuntijakomitea (fysi ­
kaalis-kemialliset ominaisuudet) ja ILO (vaarojen ilmoittaminen) ja jota koordinoidaan kemikaalien järkevää hallinnointia koskevalla or ­
ganisaatioiden välisellä ohjelmalla (IOMC).
 
Uhkaava kuolema:  eläin on vakavasti sairas tai kuolee todennäköi ­
sesti ennen seuraavaa suunniteltua havainnointiajankohtaa. Jyrsijöillä tällaista tilaa osoittavia merkkejä voivat olla kouristukset, kyljellään 
makaaminen, velttous ja vapina. (Katso tarkempia tietoja eläinkokeen 
humaaneja lopettamiskriteereitä koskevasta ohjeasiakirjasta (8)).
 
LD 50 (median lethal dose, keskimääräinen tappava annos):  on tilas­
tollinen kerta-annos, jonka voidaan suun kautta annosteltuna odottaa 
tappavan puolet annoksen saaneista eläimistä. LD  50 -arvo ilmoitetaan 
testiaineen painona koe-eläimen painoyksikköä kohti (mg/kg).  
Raja-annos:  kokeen yläraja-annos (2 000 tai 5 000 mg/kg).  
Kuolemaisillaan oleva:  eläin, joka on kuolemaisillaan tai ei kykene 
säilymään hengissä hoidosta huolimatta. (Katso tarkempia lisätietoja eläinkokeen humaaneja lopettamiskriteereitä koskevasta ohjeasiakir ­
jasta (8)).
 
Ennustettava kuolema:  sellaisten kliinisten oireiden esiintyminen, 
jotka viittaavat siihen, että eläin tulee kuolemaan tietyn ajan kuluttua ennen kokeen suunniteltua päättymistä. Näitä oireita ovat esimerkiksi kykenemättömyys käyttää vettä tai ruokaa. (Katso tarkempia lisätie ­
toja eläinkokeen humaaneja lopettamiskriteereitä koskevasta ohje ­
asiakirjasta (8)).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 183
 
1.3 KOEMENETELMÄN PERIAATE  
Samaa sukupuolta olevien eläinten ryhmille annostellaan testiainetta 
vaiheittain käyttämällä 5, 50, 300 ja 2 000 mg:n/kg vakioannoksia (poikkeuksellisesti voidaan käyttää 5 000 mg:n/kg lisävakioannosta, 
katso kappale 1.6.2). Alkuannostaso valitaan esikokeen perusteella 
annokseksi, jonka odotetaan aiheuttavan joitakin toksisuusoireita, mutta ei kuitenkaan vakavia toksisia vaikutuksia tai kuolleisuutta. Kipuun, kärsimykseen ja uhkaavaan kuolemaan liittyviä kliinisiä oi ­
reita ja tiloja on kuvailtu yksityiskohtaisesti OECD:n ohjeasiakirjassa 
(8). Muille eläinryhmille voidaan antaa korkeampia tai matalampia vakioannoksia sen mukaan, esiintyykö merkkejä toksisuudesta tai 
kuolleisuudesta. Menettelyä jatketaan, kunnes ilmeistä toksisuutta 
tai korkeintaan yhden kuoleman aiheuttava annos pystytään määrit ­
tämään, tai kun korkeimmasta annoksesta ei ole havaittavissa vaiku ­
tuksia tai alhaisin annos aiheuttaa kuolemia.
 
1.4 KOEMENETELMÄN KUVAUS  
1.4.1  Eläinlajin valinta  
Suositeltavin jyrsijälaji on rotta, tosin muitakin jyrsijöitä voidaan 
käyttää. Yleensä käytetään naaraita (7). Syynä tähän on, että tavan ­
omaisia LD  50 -kokeita koskevien kirjallisuustutkimusten perusteella 
sukupuolten herkkyydessä on yleensä vähän eroja, mutta silloin kun eroja on havaittu, naaraat ovat yleensä hieman herkempiä (10). 
Mikäli rakenteellisesti samanlaisten kemikaalien toksikologisia ja 
toksikokineettisiä ominaisuuksia koskevat tiedot osoittavat urosten olevan herkempiä, on käytettävä uroksia. Kokeen tekeminen urok ­
silla edellyttää riittäviä perusteita.
 
Kokeeseen on käytettävä terveitä, nuoria ja täysikasvuisia yleisesti 
käytettyjä koe-eläinkantoja. Naaraat eivät saa olla synnyttäneitä ei ­
vätkä kantavia. Kunkin eläimen on annostuksensa alussa oltava 8-12 viikon ikäinen, ja sen paino saa poiketa korkeintaan ± 20 % aikai ­
semmin annoksen saaneiden eläinten keskipainosta.
 
1.4.2  Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta  
Koe-eläinhuoneen lämpötilan tulee olla 22  o C (± 3  o C). Vaikka 
riittävät vaatimukset suhteellisen kosteuden suhteen ovat vähintään 
30 % eikä mielellään yli 70 % muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, pitäisi kuitenkin pyrkiä 50–60 %:n suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 
tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää 
normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa ra ­
joittaa. Eläimet voidaan erotella eri häkkeihin annoksen mukaan, mutta eläinten lukumäärä häkkiä kohti ei saa häiritä kunkin eläimen 
selkeää havainnointia.
 
1.4.3  Eläinten valmistelu  
Eläimet valitaan satunnaisesti ja merkitään yksilötunnistusta varten. 
Eläimiä pidetään häkeissään vähintään viiden päivän ajan ennen an ­
nostelun aloittamista, jotta ne tottuvat laboratorio-oloihin.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 184
 
1.4.4  Annosten valmistelu  
Yleensä testiaineen testattavat annokset annostellaan vakiotilavuu ­
dessa niin, että annosteltavan valmisteen pitoisuus vaihtelee. Testat ­
taessa nestemäistä lopputuotetta tai sekoitusta testiaineen käyttö lai ­
mentamattomana eli vakiopitoisena saattaa kuitenkin olla oleellista 
kyseisen aineen myöhemmän riskinarvioinnin kannalta, ja jotkut sääntelyviranomaiset edellyttävätkin tällaista menettelyä. Kummassa ­
kaan tapauksessa annoksen enimmäistilavuutta ei saa ylittää. Kerralla 
annettavan nesteen enimmäismäärä riippuu koe-eläimen koosta. Jyr ­
sijöillä määrä ei yleensä saa olla yli 1 ml sataa painogrammaa kohti. Vesiliuoksia voidaan kuitenkin antaa 2 ml sataa painogrammaa kohti. 
Annostellun valmisteen koostumukseksi suositellaan vesipitoista 
liuosta/suspensiota/emulsiota aina, kun se on mahdollista. Muussa tapauksessa on mieluiten käytettävä öljypohjaista (esimerkiksi mais ­
siöljy) liuosta/suspensiota/emulsiota tässä järjestyksessä ja sen jäl ­
keen muihin kantaja-aineisiin pohjautuvia liuoksia. Jos kantaja-aine 
on muu kuin vesi, sen toksiset ominaisuudet on tunnettava. Annokset on valmistettava vähän ennen annostelua paitsi, jos valmisteen tie ­
detään säilyttävän stabiliteettinsa käytön ajan ja sen on osoitettu 
olevan hyväksyttävä.
 
1.5 TESTIN SUORITUS  
1.5.1  Annostelu  
Testiaine annetaan kerta-annoksena mahaletkun tai sopivan intubaa ­
tiokanyylin kautta. Mikäli kerta-annostelu ei poikkeuksellisesti ole mahdollinen, annos voidaan antaa pienempinä osina enintään 24 
tunnin kuluessa.
 
Eläimiä ei saa ruokkia ennen annostelua (esimerkiksi rottaa on pi ­
dettävä ruoatta yli yön ja hiirtä 3–4 tuntia, mutta vettä tulee olla tarjolla). Paaston jälkeen eläimet punnitaan ja niille annetaan testiai ­
ne. Aineen annostelun jälkeen ruokintaa voidaan siirtää rotilla vielä 
3–4 tuntia ja hiirillä 1–2 tuntia. Mikäli annos annetaan osina tietyn ajan kuluessa, eläimille saatetaan joutua antamaan ruokaa ja vettä 
jakson pituudesta riippuen.
 
1.5.2  Esikoe  
Esikokeen tarkoituksena on sopivan alkuannoksen valinta päätutki ­
musta varten. Testiaine annostellaan yksittäisille eläimille vaiheittain liitteessä 1 esitetyn toimenpidekaavion mukaisesti. Esikoe on valmis, kun päätös päätutkimuksessa käytettävästä alkuannoksesta voidaan 
tehdä (tai jos kuolleisuutta ilmenee alhaisimman vakioannoksen yh ­
teydessä).
 
Esikokeen alkuannos valitaan vakioannostasoista 5, 50, 300 ja 2 000 
mg/kg. Valitun alkuannoksen odotetaan aiheuttavan ilmeistä toksi ­
suutta ja sen on mahdollisuuksien mukaan perustuttava samalla ke ­
mikaalilla tai rakenteellisesti samanlaisilla kemikaaleilla suoritettujen  
in vivo-  tai in vitro - testien tietoihin. Jos tällaisia tietoja ei ole käy ­
tettävissä, alkuannos on 300 mg/kg.  
Annokset annetaan eläimille vähintään 24 tunnin välein. Kaikkia 
eläimiä on havainnoitava vähintään 14 päivää.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 185
 
Korkeinta 5 000 mg:n/kg vakioannostasoa voidaan käyttää poikke ­
uksellisesti ja vain silloin, kun se on perusteltua erityisten sääntelyyn 
liittyvien vaatimusten vuoksi (katso liite 3). Eläinten hyvinvoinnin takia eläinkokeiden tekeminen GHS-luokassa 5 annoksella 2 000–5 000 mg/kg ei ole suositeltavaa, ja sitä tulee käyttää vain, 
kun on erittäin todennäköistä, että tällaisen kokeen tuloksilla on 
välitöntä merkitystä eläinten tai ihmisten terveyden tai ympäristön suojelemiselle.
 
Kun esikokeessa alhaisimmalla vakioannostasolla (5mg/kg) testattu 
eläin kuolee, tavanomainen menettely on päättää tutkimus ja luoki ­
tella aine GHS-luokkaan 1 (kuten liitteessä 1 on esitetty). Mikäli 
luokitus on kuitenkin vielä varmennettava, voidaan suorittaa seuraa ­
vanlainen vaihtoehtoinen lisätoimenpide: Toiselle eläimelle annetaan 5 mg:n/kg annos. Mikäli eläin kuolee, vahvistetaan luokitukseksi GHS-luokka 1 ja tutkimus päätetään välittömästi. Mikäli eläin jää 
henkiin, annetaan korkeintaan kolmelle muulle eläimelle 5 mg:n/kg 
annos. Koska kuolleisuusriski on suuri, annostelun tulee tapahtua vaiheittain eläinten hyvinvoinnin turvaamiseksi. Annokset on annet ­
tava eläimille riittävin aikavälein, jotta voidaan osoittaa edellisen 
eläimen todennäköisesti jäävän henkiin. Mikäli toinen eläin kuolee, 
annostelu keskeytetään välittömästi eikä enempää eläimiä testata. Koska toisen eläimen kuolema (riippumatta testattujen eläinten mää ­
rästä päättymishetkellä) kuuluu tulosluokkaan A (kaksi tai useampia 
eläimiä kuolee), noudatetaan 5 mg:n/kg vakioannokselle liitteessä 2 
esitettyä luokitussääntöä (luokka 1 mikäli kaksi tai useampia eläimiä kuolee tai luokka 2 mikäli vain yksi eläin kuolee). Lisäksi liitteessä 4 annetaan ohjeita EU:n järjestelmän mukaisesta luokituksesta ennen 
uuden GHS-järjestelmän käyttöönottoa.
 
1.5.3  Päätutkimus  
1.5.3.1  Eläinten määrä ja annostasot  
Alkuannostasolla tapahtuneen testauksen jälkeen suoritettavat toimet 
on esitetty toimenpidekaavioissa liitteessä 2. Valittavana on kolme toimintavaihtoehtoa: testauksen keskeyttäminen ja sopivan vaaralli ­
suusluokan määrittäminen, korkeamman vakioannoksen testaaminen 
tai matalamman vakioannoksen testaaminen. Eläinten suojelemiseksi 
päätutkimuksessa ei kuitenkaan käytetä uudestaan esikokeessa kuole ­
maan johtanutta annostasoa (katso liite 2). Kokemusten mukaan to ­
dennäköisin tulos alkuannostasolla on, että aine voidaan luokitella 
eikä uutta testausta tarvita.
 
Yleensä kullakin tutkitulla annostasolla käytetään yhteensä viittä sa ­
maa sukupuolta olevaa eläintä. Näihin viiteen eläimeen kuuluu yksi esikokeessa valitulla annostasolla testattu eläin sekä neljä muuta eläintä (paitsi jos päätutkimuksessa käytetty annostaso ei poikkeuk ­
sellisesti sisältynyt katsaustutkimukseen).
 
Annostelun aikaväli kullakin tasolla määritellään toksisten oireiden 
alkamishetken, keston ja vaikeusasteen mukaan. Seuraavan annoksen 
antamista tulee siirtää, kunnes jo annosteltujen eläinten eloonjää ­
misestä on saatu varmuus. Tarvittaessa annosteluväliksi suositellaan jokaisella annostasolla 3–4 päivää viivästyneen toksisuuden havain ­
noimiseksi. Aikaväliä voidaan muuttaa sopivaksi esimerkiksi, jos 
vasteesta ei vielä ole täyttä varmuutta.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 186
 
Käytettäessä korkeinta 5 000 mg:n/kg vakioannosta on noudatettava 
liitteessä 3 esitettyä menettelytapaa (katso myös kappale 1.6.2).  
1.5.3.2  Raja-annostesti  
Raja-annostestiä käytetään pääasiassa silloin, kun tutkimuksen teki ­
jällä on tietoa, jonka mukaan testiaine on todennäköisesti ei-toksinen, 
toisin sanoen se on toksista ainoastaan ylittäessään säädösten mukai ­
set raja-annokset. Tietoa testiaineen toksisuudesta saadaan samanlai ­
sia testattuja yhdisteitä tai seoksia koskevista tiedoista, kun otetaan huomioon toksikologisesti merkittävien ainesosien tunnistetiedot ja 
prosenttiosuus. Päätutkimus on suoritettava, kun testiaineen toksisuu ­
desta on vain vähän tai ei lainkaan tietoa tai kun se todennäköisesti on toksinen.
 
Näiden ohjeiden mukaisena raja-annostestinä voidaan tavanomaista 
menettelytapaa käytettäessä käyttää katsaustutkimusta, jossa alkuan ­
nos on 2 000 mg/kg (tai poikkeuksellisesti 5 000 mg/kg), ja jossa sen 
jälkeen annetaan neljälle muulle eläimelle sama annos.  
1.6 HAVAINNOINTI  
Eläimiä havainnoidaan yksittäin annostelun jälkeen vähintään yhden 
kerran ensimmäisten 30 minuutin aikana ja säännöllisin väliajoin 
ensimmäisten 24 tunnin aikana. Havainnoinnin on oltava erityisen 
tarkkaa ensimmäisten neljän tunnin aikana. Sen jälkeen havainnointi tapahtuu päivittäin 14 päivän ajan paitsi, jos eläin on poistettava tutkimuksesta ja lopetettava humaanilla tavalla eläinten hyvinvointia 
koskevien periaatteiden vuoksi tai se löydetään kuolleena. Havain ­
noinnin kestoa ei pitäisi kuitenkaan määritellä tiukasti. Se tulee mää ­
rittää toksisten reaktioiden, niiden alkamishetken ja toipumisen kes ­
ton perusteella ja sitä tulisi voida pidentää tarvittaessa. Toksisuus ­
oireiden ilmaantumis- ja häviämisajankohdat ovat tärkeitä etenkin, 
jos toksisilla oireilla on taipumus viivästyä (11). Kaikki havainnot kirjataan järjestelmällisesti eläinkohtaisesti.
 
Lisähavainnointi on tarpeen jos eläinten toksisuusoireet jatkuvat. Ha ­
vaintoihin tulee sisältyä ihon, karvapeitteen, silmien, limakalvojen, hengitys- ja verenkiertojärjestelmän, autonomisen hermoston ja kes ­
kushermoston, somatomotorisen toiminnan ja käyttäytymisen muu ­
tokset. Huomiota tulee kiinnittää vapinaan, kouristuksiin, syljeneri ­
tykseen, ripuliin, letargiaan, uneen ja koomaan. Eläinkokeiden hu ­
maaneja lopettamiskriteereitä koskevassa ohjeasiakirjassa esitetyt pe ­
riaatteet ja perustelut on otettava huomioon (8). Kuolevat eläimet ja 
eläimet, jotka osoittavat merkkejä voimakkaasta kivusta ja jatkuvasta kovasta kärsimyksestä, tulee lopettaa humaanilla tavalla. Humaa ­
neista syistä lopetettujen tai kuolleena löydettyjen eläinten kuolin ­
ajankohta tulee kirjata muistiin mahdollisimman tarkasti.
 
1.6.1  Ruumiinpaino  
Kunkin eläimen paino on määritettävä hieman ennen testiaineen an ­
nostelua ja vähintään viikoittain sen jälkeen. Painon muutokset on 
laskettava ja kirjattava. Kokeen päätyttyä henkiin jääneet eläimet 
punnitaan ja lopetetaan sen jälkeen humaanilla tavalla.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 187
 
1.6.2  Patologia  
Kaikki koe-eläimet (myös kokeen aikana kuolleet tai eläinten hyvin ­
vointia koskevien periaatteiden vuoksi tutkimuksesta poistetut) ava ­
taan. Kunkin eläimen kaikki makroskooppiset muutokset tulee kirja ­
ta. Ensimmäisen annostelun jälkeen vähintään 24 tuntia hengissä 
säilyneiden eläinten makroskooppisia muutoksia sisältävät elimet voidaan myös tutkia mikroskooppisesti siitä mahdollisesti saatavan hyödyllisen tiedon vuoksi.
 
2. TULOKSET  
Tuloksina on esitettävä yksittäisiä eläimiä koskevat tulokset. Kaikki 
tulokset tulee esittää myös yhteenvetona taulukossa, josta käy ilmi 
kussakin koeryhmässä käytettyjen eläinten lukumäärä, toksisuus ­
oireita osoittaneiden eläinten lukumäärä, kokeen aikana kuolleena löydettyjen tai humaaneista syistä lopetettujen eläinten lukumäärä, 
yksittäisten eläinten kuolinajankohta, toksisten vaikutusten ja palau ­
tuvuuden kuvaus ja niiden ajallinen esiintyminen sekä ruumiinava ­
uslöydökset.
 
3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
3.1 LOPPURAPORTTI  
Loppuraportin tulee tarpeen mukaan sisältää seuraavat tiedot:  
Testiaine:  
— fysikaalinen olomuoto, puhtaus ja tarvittaessa fysikaalis-kemial ­
liset ominaisuudet (myös isomeroituminen),  
— tunnistetiedot CAS-numero mukaan lukien.  
Kantaja-aine (tarvittaessa):  
— perustelut kantaja-aineen valinnalle, mikäli se on muu kuin vesi.  
Koe-eläimet:  
— käytetty eläinlaji ja -kanta,  
— eläinten mikrobiologinen status, mikäli se on tiedossa,  
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli (tarvittaessa myös perusteet 
urosten käytölle naaraiden sijasta),  
— lähde, ylläpito-olosuhteet, ravinto jne.  
Koeolosuhteet:  
— yksityiskohtaiset tiedot testiainevalmisteesta, mukaan luettuna an ­
nostellun aineen fysikaalinen muoto,  
— yksityiskohtaiset tiedot testiaineen annostelusta, mukaan luettuina 
annostelutilavuudet ja -ajankohta,  
— yksityiskohtaiset tiedot ravinnon ja veden laadusta (mukaan lu ­
kien eläinrehun tyyppi/lähde, veden lähde),  
— alkuannoksen valintaperusteet.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 188
 
Tulokset:  
— kunkin eläimen vastetulosten ja annostason taulukot (toksisuus ­
oireet, mukaan lukien kuolleisuus, vaikutusten luonne, vaikeu ­
saste ja kesto),  
— ruumiinpainon ja siinä tapahtuneiden muutosten taulukot,  
— kunkin eläimen paino annostelupäivänä, sen jälkeen viikon välein 
sekä kuolin- tai lopettamishetkellä,  
— kuolinpäivä ja -ajankohta, mikäli eläin kuolee ennen suunniteltua 
lopettamista,  
— kunkin eläimen toksisuusoireiden alkamisajankohta ja niiden 
mahdollinen palautuminen,  
— kunkin eläimen ruumiinavauslöydökset ja histopatologiset löy ­
dökset, mikäli saatavilla.  
Tulosten tarkastelu ja tulkinta.  
Johtopäätökset  
4. VIITTEET  
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). 
Special report: a new approach to the classification of subs ­
tances and preparations on the basis of their acute toxicity. 
Human Toxicol., 3, 85–92.  
(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. 
(1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of subs ­
tances and preparations for their acute toxicity. Human Toxi ­
col., 6, 279-291.  
(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, 
P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose pro ­
cedure as an alternative to the classical LD
 50 test. Fd. Chem. 
Toxicol. 28, 469-482.  
(4) Whitehead, A. and Cumow, R.N. (1992). Statistical evaluation 
of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324.  
(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in 
the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315- 323. Human Exptl. Toxicol.
 
(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statisti ­
cal evaluation of the revised fixed dose procedure.-Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196.
 
(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, As ­
sessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmen ­
tal Health and Safety Monograph Series on Testing and As ­
sessment N. 19.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 189
 
(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification 
for Human Health and Environmental Effects of Chemical 
Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Che ­
micals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p.11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/ 
pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no- 
24-no-0,FF.html].
 
(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, 
K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and- 
Down, Conventional LD
 50 , and Fixed-Dose Acute Toxicity 
Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231.  
(11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity 
and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology . 3
 rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, 
USA.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 190
 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 191
 ▼B 
LIITE 1:  
ESIKOKEEN TOIMENPIDEKAAVIO

 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 192
 ▼B

 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 193
 ▼B 
LIITE 2:  
PÄÄTUTKIMUKSEN TOIMENPIDEKAAVIO

 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 194
 ▼B

 
LIITE 3  
PERUSTEET SELLAISTEN TESTIAINEIDEN LUOKITTELULLE, 
JOIDEN ODOTETTAVISSA OLEVA LD  50 -ARVO YLITTÄÄ 2 000 
MG/KG JA JOITA EI TARVITSE TESTATA  
Vaarallisuusluokkaa 5 koskevien kriteereiden avulla on tarkoitus tunnistaa sellai ­
set testiaineet, joiden akuutti toksisuusvaara on suhteellisen alhainen, mutta jotka 
tietyissä olosuhteissa voivat olla vaaraksi heikommille populaatioille. Näiden aineiden LD
 50 -arvon odotetaan vaihtelevan välillä 2 000–5 000 mg/kg ihon tai 
suun kautta annosteltuna tai vastaavina annoksina muuta kautta annettuna. 
Testiaineet voidaan luokitella vaarallisuusluokkaan, jonka rajat ovat 2 000 mg/kg 
< LD  50 < 5 000 mg/kg (luokka 5 GHS-järjestelmässä) seuraavissa tapauksissa:  
a) mikäli aine määritellään missä tahansa liitteessä 2 esitetyistä koejärjestelyistä 
tähän luokkaan kuuluvaksi kuolleisuuden esiintymisen perusteella;  
b) mikäli on jo käytettävissä luotettavia todisteita, joiden mukaan LD  50 on luok­
kaan 5 kuuluvien arvojen vaihteluvälin rajoissa tai mikäli muut eläinkokeet tai toksiset vaikutukset ihmisillä osoittavat, että asialla on välitöntä merkitystä ihmisten terveydelle;
 
c) tietoja ekstrapoloimalla, arvioimalla tai mittaamalla, jos määritteleminen kor ­
keampaan vaarallisuusluokkaan ei ole aiheellista; ja kun  
— käytettävissä on luotettavaa tietoa, joka osoittaa huomattavia toksisuusvai ­
kutuksia ihmisillä, tai  
— kun havaitaan kuolleisuutta testattaessa suun kautta enintään luokkaa 4 
vastaavia arvoja, tai kun  
— asiantuntija-arvio vahvistaa huomattavia kliinisiä toksisuusoireita testatta ­
essa enintään luokkaa 4 vastaavia arvoja, lukuun ottamatta ripulia, piloe ­
rektiota tai puhtauden laiminlyöntiä, tai kun  
— asiantuntija-arvio vahvistaa muista eläinkokeista saadut luotettavat tiedot, 
joiden mukaan huomattavat akuutit vaikutukset ovat mahdollisia.  
TESTAAMINEN 2 000 MG/KG YLITTÄVILLÄ ANNOKSILLA  
Korkeinta 5 000 mg:n/kg vakioannostasoa voidaan käyttää poikkeuksellisesti ja 
vain silloin, kun se on perusteltua erityisten sääntelyyn liittyvien vaatimusten 
vuoksi. Koska eläinten hyvinvointia on suojeltava, kokeiden tekeminen 5 000 
mg:n/kg annoksella ei ole suositeltavaa, ja sitä tulee käyttää vain kun on erittäin todennäköistä, että tällaisen kokeen tuloksilla on välitöntä merkitystä eläinten tai ihmisten terveyden tai ympäristön suojelemiselle (9).
 
Esikoe  
Liitteessä 1 esitettyä vaiheittaista menettelyä koskevia päätöksentekosääntöjä laajen ­
netaan siten, että niihin sisältyy 5 000 mg:n/kg annostaso. Käytettäessä esikokeen alkuannoksena 5 000 mg:aa/kg tulos A (kuolema) edellyttää kokeen tekemistä toisella eläimellä 2 000 mg:n/kg annoksella. Jos saadaan tulos B tai C (ilmeinen toksisuus tai 
ei toksisuutta), voidaan päätutkimuksen alkuannokseksi valita 5 000 mg/kg. 
Vastaavasti käytettäessä muuta alkuannosta kuin 5 000 mg:aa/kg koetta jatketaan 5 000 mg:aan/kg asti siinä tapauksessa, että kokeen tulos on B tai C 2 000 mg:n/kg annoksella. Mikäli 5 000 mg:n/kg annoksella saadaan myöhemmin tulokseksi A, 
on päätutkimuksen alkuannos 2 000 mg/kg. Mikäli tulokseksi saadaan B ja C, 
on päätutkimuksen alkuannos 5 000 mg/kg.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 195
 
Päätutkimus  
Liitteessä 2 esitettyä vaiheittaista menettelyä koskevia päätöksentekosääntöjä laa ­
jennetaan siten, että niihin sisältyy 5 000 mg:n/kg annostaso. Käytettäessä pää ­
tutkimuksen alkuannoksena 5 000 mg:aa/kg tulos A (>2 kuolemaa) edellyttää kokeen tekemistä toisella ryhmällä 2 000 mg:n/kg annoksella. Mikäli tulos on 
B (ilmeinen toksisuus ja/tai < 1 kuolemaa) tai C (ei toksisuutta), ainetta ei GHS- 
järjestelmän mukaan luokitella. Vastaavasti käytettäessä muuta alkuannosta kuin 5 000 mg:aa/kg koetta jatketaan 5 000 mg:aan/kg asti siinä tapauksessa että kokeen tulos on C 2 000 mg:n/kg annoksella. Mikäli myöhemmin saadaan 
5 000 mg:n/kg annoksella tulos A, aine luokitellaan kuuluvaksi GHS-järjestelmän 
luokkaan 5. Mikäli tulos on B tai C, ainetta ei luokitella.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 196
 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 197
 ▼B 
LIITE 4  
KOEMENETELMÄ B. 1 a  
EU:n järjestelmän mukaiset luokitteluohjeet, joita käytetään siirtymäkaudella ennen kansainvälisesti yhdenmukaistetun järjestel män (GHS) (viitteessä (8)) täysimääräistä täytäntöönpanoa

 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 198
 ▼B

 
B.1 b.  AKUUTTI ORAALINEN TOKSISUUS — AKUUTIN 
TOKSISUUSLUOKAN MENETELMÄ  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro TG 423 (2001)  
1.1 JOHDANTO  
Tässä esitetään vaiheittainen akuutin toksisuusluokan menetelmä (1), 
jonka kussakin vaiheessa käytetään kolmea samaa sukupuolta olevaa 
eläintä. Testiaineen akuutin toksisuuden arvioimiseksi saatetaan tar ­
vita keskimäärin kahdesta neljään vaihetta riippuen eläinten kuollei ­
suudesta ja/tai siitä, ovatko ne kuolemaisillaan. Menetelmä on tois ­
tettava ja siinä käytetään erittäin vähän eläimiä. Sillä voidaan luoki ­
tella aineita vaarallisuuden mukaan samalla tavoin kuin muilla akuu ­
tin toksisuuden tutkimusmenetelmillä. Akuutin toksisuusluokan me ­
netelmä perustuu biometrisiin arviointeihin (2) (3) (4) (5) vakio ­
annoksilla, jotka eroavat toisistaan riittävästi aineen luokittelemiseksi 
vaarallisuuden mukaan ja riskin arvioimiseksi. Menetelmä hyväksyt ­
tiin vuonna 1996, ja se on validoitu laajasti sekä kansallisella tasolla (6) että kansainvälisellä tasolla (7)  in vivo  vertaamalla tuloksia kir ­
jallisuudesta saatuihin LD
 50 -arvoja koskeviin tietoihin.  
Ohjeita tiettyyn tarkoitukseen sopivimman tutkimusmenetelmän va ­
linnasta on annettu akuutin oraalisen toksisuuden testausta käsittele ­
vässä ohjeasiakirjassa (Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (S)). Ohjeasiakirjassa on myös lisätietoa tutkimusmenetelmä 
B.1 b:n käyttämisestä ja tulkinnasta.
 
Testiaineita ei tarvitse annostella annoksina, joiden tiedetään aiheut ­
tavan voimakasta kipua ja kärsimystä syövyttävien tai vaikea-asteis ­
ten ärsytysvaikutusten vuoksi. Kuolemaisillaan olevat, selvästi kärsi ­
vät tai voimakkaasta ja jatkuvasta kivusta merkkejä osoittavat eläi ­
met on lopetettava humaanilla tavalla, ja koetulosten tulkinnassa ne 
on otettava huomioon samalla tavalla kuin kokeessa kuolleet eläimet. Erillisessä ohjeasiakirjassa (9) on esitetty kriteerit, joiden perusteella tehdään päätös kuolemaisillaan olevan tai voimakkaasti kärsivän eläi ­
men lopettamisesta. Lisäksi siinä on annettu ohjeita ennustettavan tai 
uhkaavan kuoleman tunnistamiseksi.
 
Menetelmässä käytetään etukäteen määriteltyjä annoksia, ja tulosten 
avulla voidaan määritellä aineen vaarallisuusaste ja luokitella se akuut ­
tia toksisuutta aiheuttavien kemikaalien kansainvälisesti yhdenmukais ­
tetun luokitusjärjestelmän mukaisesti (Globally Harmonised System 
for the classification of chemicals which cause acute toxicity (10)).  
Periaatteessa menetelmän avulla ei ole tarkoitus laskea tarkkaa LD  50 - 
annosta, vaan sillä voidaan määrittää tietty altistusalue, jolla kuollei ­
suutta on odotettavissa, sillä kokeen tärkein päätepiste on edelleenkin se, että osa eläimistä kuolee. Menetelmän avulla voidaan määrittää 
LD
 50 -arvo vain silloin, kun vähintään kaksi annosta aiheuttaa kuol ­
leisuuden, joka on korkeampi kuin 0 % ja alhaisempi kuin 100 %. Menetelmässä käytetään testiaineesta riippumatta tiettyjä etukäteen määriteltyjä annoksia, ja luokitus tehdään selkeästi eri tilassa olevien 
eläinten määrästä tehtyjen havaintojen perusteella. Tämän ansiosta eri 
laboratorioiden raportit ovat yhdenmukaisempia ja toistettavampia.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 199
 
Koelaboratorion on otettava huomioon kaikki testiaineesta saatavilla 
olevat tiedot ennen tutkimuksen suorittamista. Näitä tietoja ovat mm. 
aineen tunnistetiedot ja kemiallinen rakenne, sen fysikaalis-kemialli ­
set ominaisuudet, kaikkien muiden aineella  in vitro  tai in vivo  suo­
ritettujen toksisuuskokeiden tulokset, rakenteellisesti samanlaisten ai ­
neiden toksikologiset tiedot ja aineen odotettu käyttö. Nämä tiedot 
ovat välttämättömiä kaikkien asianosaisten vakuuttamiseksi siitä, että kokeella on merkitystä ihmisten terveyden suojelun kannalta ja että sen avulla voidaan valita sopiva alkuannos.
 
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Akuutti oraalinen toksisuus:  haittavaikutukset, joita esiintyy, kun 
ainetta on annosteltu suun kautta kerta-annoksena tai useina annok ­
sina 24 tunnin aikana.  
Viivästynyt kuolema:  eläin ei kuole tai vaikuta kuolevalta 48 tunnin 
kuluessa, mutta kuolee myöhemmin 14 päivän havainnointijakson 
aikana.  
Annos:  annostellun testiaineen määrä. Annos ilmaistaan testiaineen 
painona koe-eläimen painoyksikköä kohti (esimerkiksi mg/kg).  
GHS:  Globally Harmonised Classification System for Chemical 
Substances and Mixtures (Kemiallisten aineiden ja seosten kansain ­
välisesti yhdenmukaistettu luokitusjärjestelmä). Yhteinen toimi, jo ­
hon osallistuvat OECD (ihmisten terveys ja ympäristö), YK:n vaa ­
rallisten aineiden kuljettamista käsittelevä asiantuntijakomitea (fysi ­
kaalis-kemialliset ominaisuudet) ja ILO (vaarojen ilmoittaminen) ja jota koordinoi kemikaalien järkevää hallinnointia koskeva organisaa ­
tioiden välinen ohjelma (IOMC).
 
Uhkaava kuolema:  eläin on vakavasti sairas tai kuolee todennäköi ­
sesti ennen seuraavaa suunniteltua havainnointiajankohtaa. Jyrsijöillä tällaista tilaa osoittavia merkkejä voivat olla kouristukset, kyljellään makaaminen, velttous ja vapina. (Katso tarkempia tietoja eläinkokeen 
humaaneja lopettamiskriteereitä koskevasta ohjeasiakirjasta (9)).
 
LD 50 (median lethal oral dose, keskimääräinen tappava annos 
suun kautta annettuna):  on tilastollinen kerta-annos, jonka voidaan 
suun kautta annosteltuna odottaa tappavan puolet annoksen saaneista 
eläimistä. LD  50 -arvo ilmoitetaan testiaineen painona koe-eläimen pai ­
noyksikköä kohti (mg/kg).  
Raja-annos:  kokeen yläraja-annos (2 000 tai 5 000 mg/kg).  
Kuolemaisillaan oleva:  eläin, joka on kuolemaisillaan tai ei kykene 
säilymään hengissä hoidosta huolimatta. (Katso tarkempia lisätietoja eläinkokeen humaaneja lopettamiskriteereitä koskevasta ohjeasiakir ­
jasta (9)).
 
Ennustettava kuolema:  sellaisten kliinisten oireiden esiintyminen, 
jotka viittaavat siihen, että eläin tulee kuolemaan tietyn ajan kuluttua ennen kokeen suunniteltua päättymistä. Näitä oireita ovat esimerkiksi kykenemättömyys käyttää vettä tai ruokaa. (Katso tarkempia lisätie ­
toja eläinkokeen humaaneja lopettamiskriteereitä koskevasta ohje ­
asiakirjasta (9)).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 200
 
1.3 TESTIN PERIAATE  
Testin periaate on, että vaiheittaisella menetelmällä ja käyttämällä 
mahdollisimman vähän eläimiä kussakin vaiheessa saadaan riittävästi tietoa testiaineen akuutista toksisuudesta sen luokittelemiseksi. Ai ­
netta annetaan koe-eläinryhmälle suun kautta yhdellä määritellyistä 
annostasoista. Ainetta testataan vaiheittain siten, että kussakin vai ­
heessa käytetään kolmea samaa sukupuolta olevaa eläintä (yleensä naaraita). Kyseisestä yhdisteestä johtuva kuolleisuus kussakin testin 
vaiheessa määrää kokeen seuraavan vaiheen, eli
 
— lisäkokeita ei tarvita,  
— ainetta annetaan kolmelle muulle eläimelle samalla annostasolla,  
— ainetta annetaan kolmelle muulle eläimelle astetta korkeammalla 
tai astetta matalammalla annostasolla.  
Testin suoritus on kuvattu yksityiskohtaisesti liitteessä 1. Menetelmän 
avulla testiaine voidaan luokitella johonkin niistä toksisuusluokista, jotka on määritelty kiinteiden LD
 50 -raja-arvojen perusteella.  
1.4 MENETELMÄN KUVAUS  
1.4.1  Eläinlajin valinta  
Suositeltavin jyrsijälaji on rotta, tosin muitakin jyrsijöitä voidaan 
käyttää. Yleensä käytetään naaraita (9). Syynä tähän on, että tavan ­
omaisia LD  50 -kokeita koskevien kirjallisuustutkimusten perusteella 
sukupuolten herkkyydessä on vähäisiä eroja, mutta silloin kun eroja on havaittu, naaraat ovat yleensä hieman herkempiä (11). Mikäli rakenteellisesti samanlaisten kemikaalien toksikologisia ja toksikoki ­
neettisiä ominaisuuksia koskevat tiedot osoittavat urosten olevan her ­
kempiä, on käytettävä uroksia. Kokeen tekeminen uroksilla edellyttää riittäviä perusteita.
 
Kokeeseen on käytettävä terveitä, nuoria ja täysikasvuisia yleisesti 
käytettyjä koe-eläinkantoja. Naaraat eivät saa olla synnyttäneitä ei ­
vätkä kantavia. Kunkin eläimen on annostuksensa alussa oltava 8–12 
viikon ikäinen, ja sen paino saa poiketa korkeintaan ± 20 % aikai ­
semmin annoksen saaneiden eläinten keskipainosta.  
1.4.2  Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta  
Koe-eläinhuoneen lämpötilan tulee olla 22  o C (± 3  o C). Vaikka 
riittävät vaatimukset suhteellisen kosteuden suhteen ovat vähintään 30 % eikä mielellään yli 70 % muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, pitäisi kuitenkin pyrkiä 50–60 %:n suhteelliseen kosteuteen. 
Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 
tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa ra ­
joittaa. Eläimet voidaan sijoittaa eri häkkeihin ryhmissä annoksen 
mukaan, mutta eläinten lukumäärä häkkiä kohti ei saa häiritä kunkin 
eläimen selkeää havainnointia.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 201
 
1.4.3  Eläinten valmistelu  
Eläimet valitaan satunnaisesti ja merkitään yksilötunnistusta varten. 
Eläimiä pidetään häkeissään vähintään viiden päivän ajan ennen an ­
nostelun aloittamista, jotta ne tottuvat laboratorio-oloihin.  
1.4.4  Annosten valmistelu  
Yleensä testiaineen testattavat annokset annostellaan vakiotilavuu ­
dessa niin, että annosteltavan valmisteen pitoisuus vaihtelee. Testat ­
taessa nestemäistä lopputuotetta tai seosta testiaineen käyttö laimen ­
tamattomana eli vakiopitoisena saattaa kuitenkin olla oleellista kysei ­
sen aineen myöhemmän riskinarvioinnin kannalta, ja jotkut säänte ­
lyviranomaiset edellyttävätkin tällaista menettelyä. Kummassakaan 
tapauksessa annoksen enimmäistilavuutta ei saa ylittää. Kerralla an ­
nettava nesteen enimmäismäärä riippuu koe-eläimen koosta. Jyrsi ­
jöillä määrä ei yleensä saa olla yli 1 ml sataa painogrammaa kohti. 
Vesiliuoksia voidaan kuitenkin antaa 2 ml sataa painogrammaa kohti. 
Annostellun valmisteen koostumukseksi suositellaan vesipohjaista liuosta/suspensiota/emulsiota aina kun se on mahdollista. Muussa tapauksessa on mieluiten käytettävä öljypohjaista (esimerkiksi mais ­
siöljy) liuosta/suspensiota/emulsiota tässä järjestyksessä ja sen jäl ­
keen muihin kantaja-aineisiin pohjautuvia liuoksia. Jos kantaja-aine on muu kuin vesi, sen toksiset ominaisuudet on tunnettava. Annokset on valmistettava vähän ennen annostelua paitsi, jos valmisteen tie ­
detään säilyttävän stabiliteettinsa käytön ajan ja sen on osoitettu 
olevan hyväksyttävä.
 
1.5 TESTIN SUORITUS  
1.5.1  Annostelu  
Testiaine annetaan kerta-annoksena mahaletkun tai sopivan intubaa ­
tiokanyylin kautta. Mikäli kerta-annostelu ei poikkeuksellisesti ole 
mahdollinen, annos voidaan antaa pienempinä osina enintään 24 
tunnin kuluessa.  
Eläimiä ei saa ruokkia ennen annostelua (esimerkiksi rottaa on pi ­
dettävä ruoatta yli yön ja hiirtä 3–4 tuntia, mutta vettä tulee olla tarjolla). Paaston jälkeen eläimet punnitaan ja niille annetaan testiai ­
ne. Aineen annostelun jälkeen ruokintaa voidaan siirtää rotilla vielä 
3–4 tuntia ja hiirillä 1–2 tuntia. Mikäli annos annetaan osina tietyn ajan kuluessa, eläimille saatetaan joutua antamaan ruokaa ja vettä jakson pituudesta riippuen.
 
1.5.2  Eläinten määrä ja annostasot  
Kussakin vaiheessa käytetään kolmea eläintä. Alkuannostasoksi 
valitaan yksi neljästä vakiotasosta, jotka ovat 5, 50, 300 ja 2 000 
mg/kg. Alkuannostason tulee olla sellainen, että se todennäköisesti 
tappaa muutaman annoksen saaneista eläimistä. Liitteessä 1 esite ­
tyissä toimenpidekaavioissa kuvataan kunkin alkuannoksen yhtey ­
dessä noudatettava menettely. Lisäksi liitteessä 4 annetaan ohjeita 
EU:n järjestelmän mukaisesta luokituksesta ennen uuden GHS-järjes ­
telmän käyttöönottoa.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 202
 
Kun saatavissa olevat tiedot viittaavat siihen, ettei korkein alkuan ­
nostaso (2 000 mg/kg) todennäköisesti aiheuta eläinten kuolemaa, on 
tehtävä raja-annostesti. Kun testiaineesta ei ole tietoja, alkuannok ­
seksi suositellaan eläinten hyvinvointia koskevien periaatteiden vuoksi 300 mg/kg.
 
Testiryhmien testaamisen aikavälit määritellään toksisten oireiden 
alkamishetken, keston ja vaikeusasteen mukaan. Seuraavan annoksen 
antamista tulee siirtää, kunnes jo annosteltujen eläinten eloonjää ­
misestä on saatu varmuus.  
Korkeinta 5 000 mg:n/kg annostasoa voidaan käyttää poikkeukselli ­
sesti ja vain silloin, kun se on perusteltua erityisten sääntelyyn liit ­
tyvien vaatimusten vuoksi (katso liite 2). Eläinten hyvinvointia kos ­
kevien periaatteiden vuoksi eläinkokeiden tekeminen GHS-luokan 5 annoksilla (2 000–5 000 mg/kg) ei ole suositeltavaa, ja niitä tulee 
käyttää vain, kun on erittäin todennäköistä, että tällaisen kokeen 
tuloksilla on välitöntä merkitystä ihmisten tai eläinten terveyden tai ympäristön suojelemiselle.
 
1.5.3  Raja-annostesti  
Raja-annostestiä käytetään pääasiassa silloin, kun tutkimuksen teki ­
jällä on tietoa, jonka mukaan testiaine on todennäköisesti ei-toksinen, 
toisin sanoen se on toksista ainoastaan ylittäessään säädösten mukai ­
set raja-annokset. Tietoa testiaineen toksisuudesta saadaan samanlai ­
sia testattuja yhdisteitä tai seoksia koskevista tiedoista, kun otetaan 
huomioon, mitä toksikologisesti merkittävät ainesosat ovat ja mikä 
on niiden prosenttiosuus. Päätutkimus on suoritettava, kun testiaineen toksisuudesta on vain vähän tai ei lainkaan tietoa tai kun se toden ­
näköisesti on toksinen.
 
Raja-annostesti voidaan tehdä yhdellä annostasolla 2 000 mg/kg 
käyttäen kuutta eläintä (kolme eläintä vaihetta kohden). Poikkeuksel ­
lisesti voidaan tehdä raja-annostesti yhdellä annostasolla 5 000 mg/ ­
kg käyttäen kolmea eläintä (katso liite 2). Mikäli testiaineeseen liit ­
tyvää kuolleisuutta esiintyy, voidaan tarvita lisäkokeita seuraavaksi 
alemmalla annostasolla.  
1.6 HAVAINNOINTI  
Eläimiä havainnoidaan yksittäin annostelun jälkeen vähintään yhden 
kerran ensimmäisten 30 minuutin aikana ja säännöllisin väliajoin ensimmäisten 24 tunnin aikana. Havainnoinnin on oltava erityisen 
tarkkaa ensimmäisten neljän tunnin aikana. Sen jälkeen havainnointi 
tapahtuu päivittäin 14 päivän ajan paitsi, jos eläin on poistettava tutkimuksesta ja lopetettava humaanilla tavalla eläinten hyvinvointia koskevien periaatteiden vuoksi tai se löydetään kuolleena. Havain ­
noinnin kestoa ei pitäisi kuitenkaan määritellä tiukasti. Se tulee mää ­
rittää toksisten reaktioiden, niiden alkamishetken ja toipumisen kes ­
ton perusteella ja sitä tulisi voida pidentää tarvittaessa. Toksisuus ­
oireiden ilmaantumis- ja häviämisajankohdat ovat tärkeitä etenkin, 
jos toksisilla oireilla on taipumus viivästyä (12). Kaikki havainnot 
kirjataan järjestelmällisesti eläinkohtaisesti.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 203
 
Lisähavainnointi on tarpeen jos eläinten toksisuusoireet jatkuvat. Ha ­
vaintoihin tulee sisältyä ihon, karvapeitteen, silmien, limakalvojen, 
hengitys- ja verenkiertojärjestelmän, autonomisen hermoston ja kes ­
kushermoston, somatomotorisen toiminnan ja käyttäytymisen muu ­
tokset. Huomiota tulee kiinnittää vapinaan, kouristuksiin, syljeneri ­
tykseen, ripuliin, letargiaan, uneen ja koomaan. Eläinkokeiden hu ­
maaneja lopettamiskriteereitä koskevassa ohjeasiakirjassa (9) esitetyt periaatteet ja perustelut on otettava huomioon. Kuolevat eläimet ja eläimet, jotka osoittavat merkkejä voimakkaasta kivusta ja jatkuvasta 
kovasta kärsimyksestä, tulee lopettaa humaanilla tavalla. Humaa ­
neista syistä lopetettujen tai kuolleena löydettyjen eläinten kuolin ­
ajankohta tulee kirjata mahdollisimman tarkasti.
 
1.6.1  Ruumiinpaino  
Kunkin eläimen paino on määritettävä hieman ennen testiaineen an ­
nostelua ja vähintään viikoittain sen jälkeen. Painon muutokset on 
laskettava ja kirjattava. Kokeen päätyttyä henkiin jääneet eläimet 
punnitaan ja lopetetaan humaanilla tavalla.  
1.6.2  Patologia  
Kaikki koe-eläimet (myös kokeen aikana kuolleet tai eläinten hyvin ­
vointia koskevien periaatteiden vuoksi tutkimuksesta poistetut) on 
avattava. Kunkin eläimen kaikki makroskooppiset muutokset tulee 
kirjata. Vähintään 24 tuntia hengissä säilyneiden eläinten makrosko ­
oppisia muutoksia sisältävät elimet voidaan myös tutkia mikrosko ­
oppisesti siitä mahdollisesti saatavan hyödyllisen tiedon vuoksi.  
2. TULOKSET  
Tuloksina on esitettävä yksittäisiä eläimiä koskevat tulokset. Kaikki 
tulokset tulee esittää myös yhteenvetona taulukossa, josta käy ilmi kussakin koeryhmässä käytettyjen eläinten lukumäärä, toksisuus ­
oireita osoittaneiden eläinten lukumäärä, kokeen aikana kuolleena 
löydettyjen tai humaaneista syistä lopetettujen eläinten lukumäärä, 
yksittäisten eläinten kuolinajankohta, toksisten vaikutusten ja palau ­
tuvuuden kuvaus ja niiden ajallinen esiintyminen sekä ruumiinava ­
uslöydökset.
 
3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
3.1 Loppuraportti  
Loppuraportin tulee tarpeen mukaan sisältää seuraavat tiedot:  
Testiaine:  
— fysikaalinen olomuoto, puhtaus ja tarvittaessa fysikaalis-kemial ­
liset ominaisuudet (myös isomeroituminen),  
— tunnistetiedot, CAS-numero mukaan lukien.  
Kantaja-aine (tarvittaessa):  
— perustelut kantaja-aineen valinnalle, mikäli se on muu kuin vesi.  
Koe-eläimet:  
— käytetty eläinlaji ja -kanta,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 204
 
— eläinten mikrobiologinen status, mikäli se on tiedossa,  
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli (tarvittaessa myös perusteet 
urosten käytölle naaraiden sijasta),  
— lähde, ylläpito-olosuhteet, ravinto jne.  
Koeolosuhteet:  
— yksityiskohtaiset tiedot testiainevalmisteesta, mukaan luettuna an ­
nostellun aineen fysikaalinen muoto,  
— yksityiskohtaiset tiedot testiaineen annostelusta, mukaan luettuina 
annostelutilavuudet ja -ajankohta,  
— yksityiskohtaiset tiedot ravinnon ja veden laadusta (mukaan lu ­
kien eläinrehun tyyppi/lähde, veden lähde),  
— alkuannoksen valintaperusteet.  
Tulokset:  
— kunkin eläimen vastetulosten ja annostason taulukot (toksisuus ­
oireet, mukaan lukien kuolleisuus, vaikutusten luonne, vaikeu ­
saste ja kesto),  
— ruumiinpainon ja siinä tapahtuneiden muutosten taulukot,  
— kunkin eläimen paino annostelupäivänä, sen jälkeen viikon välein 
sekä kuolin- tai lopettamishetkellä,  
— kuolinpäivä ja -ajankohta, mikäli eläin kuolee ennen suunniteltua 
lopettamista,  
— kunkin eläimen toksisuusoireiden alkamisajankohta ja niiden 
mahdollinen palautuminen,  
— kunkin eläimen ruumiinavauslöydökset ja histopatologiset löy ­
dökset, mikäli saatavilla.  
Tulosten tarkastelu ja tulkinta.  
Johtopäätökset.  
4. VIITTEET  
(1) Roll R., Höfer-Bosse Th. and Kayser D. (1986). New Pers ­
pectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. 
Lett., Suppl. 31, 86.  
(2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). 
Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemi ­
kalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336–341.  
(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. 
(1994). The Biometric Evaluation of the Acute- Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559–610.
 
(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The 
Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the 
Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729–734.  
(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Met ­
hods: Alterations to LD/LC  50 Tests. ALTEX 16, 129–134.  
(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National 
Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method — An 
Altemative to the LD  50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455–470.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 205
 
(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The 
International Validation Study of the Acute- Toxic-Class Met ­
hod (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659–670.  
(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
 
(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, As ­
sessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints 
for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.
 
(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System For Human Health And Environmental Effects Of Che ­
mical Substances as endorsed by the 28  th Joint Meeting of the 
Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in 
November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/ 
pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no- 24-no-0,FF.html].
 
(11) Lipnick R. L, Cotruvo, J. A., Hill R. N., Bruce R. D., Stitzel 
K. A., Walker A. P., Chu I.; Goddard M., Segal L., Springer J. 
A. and Myers R. C. (1995) Comparison of the Up-and Down, 
Conventional LD  50 , and Fixed Dose Acute Toxicity Procedu ­
res. Fd. Chem. Toxicol 33, 223–231.  
(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity 
and Eye Irritancy.  Principles and Methods of Toxicology.  Third 
Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 206
 
LIITE 1  
TESTIN SUORITUS ERI ALKUANNOKSILLA  
YLEISIÄ HUOMAUTUKSIA  
Tässä liitteessä selostetaan testin suoritus kullekin alkuannokselle.  
— Liite 1 a: alkuannos 5 mg/kg  
— Liite 1 b: alkuannos 50 mg/kg  
— Liite 1 c: alkuannos 300 mg/kg  
— Liite 1 d: alkuannos 2 000 mg/kg  
Humaanilla tavalla lopetettujen tai kuolleiden eläinten lukumäärästä riippuen koe 
etenee nuolten osoittamalla tavalla.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 207
 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 208
 ▼B 
Liite 1 A  
TESTIN SUORITUS ALKUANNOKSELLA 5 MG/KG

 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 209
 ▼B 
Liite 1 B  
TESTIN SUORITUS ALKUANNOKSELLA 50 MG/KG

 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 210
 ▼B 
Liite 1 C  
TESTIN SUORITUS ALKUANNOKSELLA 300 MG/KG

 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 211
 ▼B 
Liite 1 D  
TESTIN SUORITUS ALKUANNOKSELLA 2 000 MG/KG

 LIITE 2  
PERUSTEET SELLAISTEN TESTIAINEIDEN LUOKITTELULLE, 
JOIDEN ODOTETTAVISSA OLEVA LD  50 -ARVO YLITTÄÄ 2 000 
MG/KG JA JOITA EI TARVITSE TESTATA  
Vaarallisuusluokkaa 5 koskevien kriteereiden avulla on tarkoitus tunnistaa sellai ­
set testiaineet, joiden akuutti toksisuusvaara on suhteellisen alhainen, mutta jotka 
tietyissä olosuhteissa voivat olla vaaraksi herkimmille populaatioille. Näiden ai ­
neiden LD  50 -arvon odotetaan vaihtelevan välillä 2 000–5 000 mg/kg ihon tai 
suun kautta annosteltuna tai vastaavina annoksina muuta kautta annettuna. Testi ­
aineet on luokiteltava vaarallisuusluokkaan, jonka rajat ovat 2 000 mg/kg < LD  50 
< 5 000 mg/kg (luokka 5 GHS-järjestelmässä) seuraavissa tapauksissa:  
a) mikäli aine määritellään missä tahansa liitteissä 1a-1d esitetyistä koejärjeste ­
lyistä tähän luokkaan kuuluvaksi kuolleisuuden esiintymisen perusteella;  
b) mikäli on jo käytettävissä luotettavaa näyttöä, jonka mukaan LD  50 on luok­
kaan 5 kuuluvien arvojen vaihteluvälin rajoissa tai mikäli muut eläinkokeet tai 
toksiset vaikutukset ihmisillä osoittavat, että aineella on välitöntä merkitystä 
ihmisten terveydelle;  
c) tietoja ekstrapoloimalla, arvioimalla tai mittaamalla, jos määritteleminen kor ­
keampaan vaarallisuusluokkaan ei ole aiheellista ja kun  
— käytettävissä on luotettavaa tietoa, joka osoittaa huomattavia toksisuusvai ­
kutuksia ihmisillä, tai  
— kun havaitaan kuolleisuutta testattaessa suun kautta enintään luokkaa 4 
vastaavia arvoja, tai kun  
— asiantuntija-arvio vahvistaa huomattavia kliinisiä toksisuusoireita testatta ­
essa enintään luokkaa 4 vastaavia arvoja lukuun ottamatta ripulia, piloe ­
rektiota tai puhtauden laiminlyöntiä, tai kun  
— asiantuntija-arvio vahvistaa muista eläinkokeista saadut luotettavat tiedot, 
joiden mukaan huomattavat akuutit vaikutukset ovat mahdollisia.  
TESTAAMINEN 2 000 MG/KG YLITTÄVILLÄ ANNOKSILLA  
Koska eläinten hyvinvointia on suojeltava, testaaminen eläimillä luokan 5 (5 000 
mg/kg) rajoissa ei ole suositeltavaa, ja sitä tulee käyttää vain kun on erittäin 
todennäköistä, että tällaisen kokeen tuloksilla on välitöntä merkitystä eläinten tai ihmisten terveyden suojelemiselle (10). Lisäkokeita korkeammilla annosta ­
soilla ei pidä tehdä.
 
Kun kokeen tekeminen 5 000 mg:n/kg annoksella on välttämätöntä, tarvitaan vain 
yksi vaihe (eli kolme eläintä). Jos ensimmäinen annoksen saanut eläin kuolee, annostelua jatketaan 2 000 mg:n/kg annoksella liitteessä 1 esitettyjen toimenpi ­
dekaavioiden mukaisesti. Jos ensimmäinen eläin jää henkiin, kahdelle muulle 
eläimelle annetaan annos testiainetta. Jos vain yksi kolmesta eläimestä kuolee, 
LD
 50 -arvo ylittää todennäköisesti 5 000 mg/kg. Jos molemmat eläimet kuolevat, 
annostelua jatketaan 2 000 mg:lla/kg.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 212
 
LIITE 3  
KOEMENETELMÄ B.1 b: EU:n järjestelmän mukaiset luokitteluohjeet, joita käytetään 
siirtymäkaudella ennen kemikaalien kansainvälisesti yhdenmukaistetun järjestelmän (GHS) 
(viitteessä (8)) täysimääräistä täytäntöönpanoa
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 213
 
LIITE 3 (JATKOA 1)  
KOEMENETELMÄ B.1 b: EU:n järjestelmän mukaiset luokitteluohjeet, joita käytetään siirtymä ­
kaudella ennen kemikaalien kansainvälisesti yhdenmukaistetun järjestelmän (GHS) (viitteessä (8)) täysimääräistä täytäntöönpanoa
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 214
 
LIITE 3 (JATKOA 2)  
KOEMENETELMÄ B.1 b: EU:n järjestelmän mukaiset luokitteluohjeet, joita käytetään siirtymä ­
kaudella ennen kemikaalien kansainvälisesti yhdenmukaistetun järjestelmän (GHS) (viitteessä (8)) 
täysimääräistä täytäntöönpanoa  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 215
 
LIITE 3 (JATKOA 3)  
KOEMENETELMÄ B.1 b: EU:n järjestelmän mukaiset luokitteluohjeet, joita käytetään siirtymä ­
kaudella ennen kemikaalien kansainvälisesti yhdenmukaistetun järjestelmän (GHS) (viitteessä (8)) täysimääräistä täytäntöönpanoa
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 216
 
B.2 AKUUTTI MYRKYLLISYYS (HENGITETTYNÄ)  
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 403 (2009) (1). Alku ­
peräinen akuuttia myrkyllisyyttä hengitettynä koskeva testiohje nro 403 (TG 403) hyväksyttiin 1981. Tämän tarkistetun testimenetelmän B.2 (joka vastaa tarkistettua testiohjetta nro 403) tarkoituksena on lisätä joustavuutta, vähen ­
tää eläinten käyttöä ja täyttää sääntelyvaatimukset. Tarkistetussa testimene ­
telmässä on kaksi erityyppistä tutkimusta: perinteinen LC
 50 -protokolla ja 
pitoisuus × aika (C × t) -protokolla. Eräs tämän testimenetelmän tärkeimpiä ominaisuuksia on se, että sillä voidaan tuottaa pitoisuus-vaste-suhde, joka 
vaihtelee ei-tappavasta tappavaan. Sen perusteella voidaan johtaa mediaani 
tappava pitoisuus (LC
 50 ), ei-tappavan pitoisuuden raja (esimerkiksi LC01) ja 
kulmakerroin. Lisäksi sen avulla voidaan tunnistaa mahdollinen sukupuoleen liittyvä herkkyys. C × t -protokollaa on käytettävä silloin, kun on sellainen 
erityinen sääntelyyn liittyvä tai tieteellinen tarve, jonka vuoksi eläimiä on 
testattava eripituisia aikoja. Tällaisia tarkoituksia ovat esimerkiksi hätäavun suunnittelu [esimerkiksi akuutin altistuksen ohjearvojen (AEGL-arvojen), hätäavun suunnitteluohjeiden (ERPG) tai akuuttien altistumisraja-arvojen 
(AETL-arvojen) johtamiseksi], tai maankäytön suunnittelu.
 
2. Tämän testimenetelmän mukaisten tutkimusten toteuttamista ja tulosten tul ­
kintaa koskevat ohjeet ovat akuuttia myrkyllisyyttä hengitettynä koskevassa 
OECD:n ohjeasiakirjassa GD 39 (2).  
3. Tämän testimenetelmän yhteydessä käytetyt määritelmät ovat tämän luvun 
lopussa ja ohjeasiakirjassa GD 39 (2).  
4. Tämän testimenetelmän avulla voidaan toteuttaa testattavan kemikaalin luon ­
nehdinta ja määrällinen riskinarviointi, ja testikemikaalit voidaan myös laji ­
tella ja luokitella asetuksen (EY) N:o 1272/2008 (3) mukaisesti. Ohjeasia ­
kirja GD 39 (2) sisältää ohjeita akuuttia testausta varten tarvittavan asian ­
mukaisen testimenetelmän valintaan. Kun tarvitaan vain luokitukseen ja 
merkintöihin liittyvää tietoa, on suositeltavaa lukea tämän liitteen (4) luku B.52 [katso GD 39 (2)]. Tätä testimenetelmää B.2 ei ole varsinaisesti tar ­
koitettu erikoismateriaalien, kuten huonosti liukenevien isometristen tai kui ­
tuisten materiaalien taikka teollisesti valmistettujen nanomateriaalien testa ­
ukseen.
 
ALUSTAVAT HUOMIOT  
5. Ennen tämän testimenetelmän mukaista testausta testauslaboratorion on han ­
kittava kaikki saatavilla olevat tiedot testikemikaalista, mukaan luettuina 
olemassa olevat tutkimukset (esimerkiksi tämän liitteen luku B.52 (4)). Niistä saatavat tiedot mahdollisesti tukevat lisätestien tekemättä jättämistä, jotta eläinten käyttö voidaan minimoida. Tietoihin, joista voi olla apua 
sopivimman lajin, kannan, sukupuolen, altistustavan ja asianmukaisten tes ­
tipitoisuuksien valinnassa, sisältyvät testikemikaalin identiteetti, kemiallinen rakenne ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet,  in vitro-  tai in vivo  -toksi­
suustestien tulokset, odotettavissa olevat käytöt ja ihmisten altistumisen 
mahdollisuus sekä saatavilla olevat (Q)SAR-tiedot ja toksikologiset tiedot 
rakenteellisesti samankaltaisista aineista [katso GD 39 (2)].
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 217
 
6. Syövyttävien ja/tai ärsyttävien testikemikaalien testausta sellaisina pitoisuuk ­
sina, joiden oletetaan aiheuttavan kovia tuskia tai stressiä, on vältettävä, 
mikäli mahdollista. Mahdollista syövyttävää/ärsyttävää vaikutusta on arvioi ­
tava asiantuntija-arvioiden avulla, ja arvion on perustuttava ihmisistä ja eläi ­
mistä kertyneeseen kokemukseen (esimerkiksi ei-syövyttävillä/ärsyttävillä pi ­
toisuuksilla tehdyt toistuvan annostelun tutkimukset), olemassa oleviin  in 
vitro  -tietoihin (esimerkiksi tämän liitteen luvut B.40 (5) ja B.40a (6) tai 
OECD:n ohje TG 435 (7)), pH-arvoihin, samankaltaisia aineita koskeviin tietoihin tai muihin asiaankuuluviin tietoihin, jotta voidaan selvittää, voi ­
daanko lisätestit jättää tekemättä. Tiettyjä sääntelyvaatimuksia (esimerkiksi 
hätäavun suunnittelutarkoituksia) varten tätä testimenetelmää voidaan käyttää eläinten altistamiseen tällaisille materiaaleille, koska näin tutkimuksen johta ­
jalla tai päätutkijalla on mahdollisuus valita tavoitepitoisuudet. Tavoiteltujen 
pitoisuuksien ei tule aiheuttaa vakavia ärsyttäviä tai syövyttäviä vaikutuksia, 
mutta niiden on kuitenkin oltava riittävät, jotta saavutetaan sellaisia pitoisuus-vastesuhteita, joilla voidaan täyttää testin sääntelyyn liittyvät ja tieteelliset tavoitteet. Nämä pitoisuudet on valittava tapauskohtaisesti, ja pi ­
toisuuden valinnalle on esitettävä myös perustelut [katso GD 39 (2)].
 
TESTIN PERIAATE  
7. Tämän testimenetelmän B.2 tarkoituksena on tuottaa tarpeeksi tietoa testi ­
kemikaalin akuutista myrkyllisyydestä, jotta se voidaan luokitella, sekä tie ­
toa aineen tappavuudesta (esimerkiksi LC  50, LC 01 ja kulmakerroin) toisen tai 
kummankin sukupuolen kannalta sen mukaan, mikä on tarpeen määrällisissä riskinarvioinneissa. Tämä testimenetelmä koostuu kahdesta menetelmästä. 
Ensimmäinen menetelmä on perinteinen protokolla, jossa eläinryhmät altis ­
tetaan rajapitoisuudelle (rajatesti) tai pitoisuuksien sarjalle vaiheittaisessa menettelyssä, jonka kestoksi on yleensä määritetty neljä tuntia. Myös muun ­
pituisia altistuksia voidaan soveltaa tiettyihin sääntelytarkoituksiin. Toinen 
menetelmä on C × t -protokolla, jossa eläinryhmät altistetaan yhdelle pitoi ­
suudelle (rajapitoisuus) tai sarjalle useita pitoisuuksia eripituisiksi ajoiksi.
 
8. Kuolemaisillaan olevat, selvästi kärsivät tai voimakkaasta ja jatkuvasta ki ­
vusta merkkejä osoittavat eläimet on lopetettava humaanilla tavalla, ja koe ­
tulosten tulkinnassa ne on otettava huomioon samalla tavalla kuin kokeessa 
kuolleet eläimet. Eläinkokeiden humaaneja lopettamiskriteereitä koskevassa OECD:n ohjeasiakirjassa 19 (8) on esitetty kriteerit, joiden perusteella teh ­
dään päätös kuolemaisillaan olevan tai voimakkaasti kärsivän eläimen lopet ­
tamisesta. Lisäksi siinä on annettu ohjeita ennustettavan tai uhkaavan kuo ­
leman tunnistamiseksi.
 
MENETELMÄN KUVAUS  
Eläinlajin valinta  
9. On käytettävä terveitä, nuoria ja täysikasvuisia yleisesti käytettyjä 
koe-eläinkantoja. Suositeltavin laji on rotta, ja jos käytetään muita lajeja, sille on esitettävä perustelut.
 
Eläinten valmistelu  
10. Naaraat eivät saa olla synnyttäneitä eivätkä tiineinä. Altistuspäivänä on 
käytettävä 8–12 viikon ikäisiä nuoria aikuisia eläimiä, joiden ruumiinpainon on oltava ± 20 prosenttia aiemmin altistettujen samanikäisten eläinten kes ­
kimääräisestä painosta kummankin sukupuolen osalta. Eläimet valitaan sa ­
tunnaistetusti ja merkitään niin, että yksilöt voidaan erottaa toisistaan. Eläi ­
met pidetään häkeissä vähintään viiden päivän ajan ennen testin aloittamista, jotta ne tottuvat laboratorio-olosuhteisiin. Eläimet on totutettava myös testi ­
laitteistoon vähän ennen testausta, sillä se vähentää uuteen ympäristöön 
tutustumisesta aiheutuvaa stressiä.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 218
 
Eläinten hoito  
11. Koe-eläintilan lämpötilan on oltava 22 ± 3 °C. Suhteellinen ilmankosteus on 
pidettävä mielellään 30–70 prosentin välillä, mikä ei välttämättä ole mah ­
dollista, jos kantaja-aineena käytetään vettä. Ennen altistuksia ja niiden jäl ­
keen eläimet on eroteltava häkkeihin sukupuolen ja pitoisuuden mukaisiin 
ryhmiin, mutta eläinten lukumäärä häkkiä kohti ei saa häiritä kunkin eläimen selkeää havainnointia, ja määrä on pidettävä sellaisena, että kannibalismista ja tappelusta johtuvat hävikit voidaan minimoida. Jos eläimet altistetaan vain 
nasaalisesti, ne voi olla tarpeen totuttaa immobilisointiputkiin. Immobilisoin ­
tiputket eivät saa aiheuttaa eläimille tarpeetonta fyysistä, lämpöön tai liik ­
kumattomuuteen liittyvää stressiä. Immobilisointi voi vaikuttaa fysiologisiin 
tutkittaviin ominaisuuksiin, kuten ruumiinlämpöön (hypertermia) ja/tai hen ­
gityksen minuuttitilavuuteen. Jos saatavilla on rinnakkaistietoja, jotka osoit ­
tavat, ettei tällaisia muutoksia juuri ilmene, immobilisointiputkiin totuttami ­
nen ei ole tarpeen. Eläimet, jotka altistetaan aerosolille kokonaan, on laitet ­
tava kokeen ajaksi häkkiin yksittäin, jotta testattava aerosoli ei suodatu 
muiden häkissä olevien eläinten karvapeitteen kautta. Tavallista ja sertifioi ­
tua laboratorioruokavaliota voidaan käyttää muulloin paitsi altistuksen aika ­
na, eikä tavallisen juomaveden määrää tule rajoittaa. Huoneessa tulee käyt ­
tää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa / 12 tuntia pimeää).
 
Inhalaatiokammiot  
12. Testikemikaalin luonne ja testin tavoite on otettava huomioon inhalaatio ­
kammiota valittaessa. Ensisijainen altistumistapa on vain nasaalisesti (tähän termiin kuuluvat myös altistustavat vain pään kautta, vain nasaalisesti tai vain nokan kautta). Vain nasaalista altistusta suositellaan yleensä tutkittaessa 
nestemäisiä tai kiinteitä aerosoleja sekä sellaisia höyryjä, jotka saattavat tii ­
vistyä ja muodostaa siten aerosoleja. Tutkimuksen tietyt tavoitteet voidaan saavuttaa paremmin käyttämällä koko kehoon kohdistuvaa altistusta, mutta se on perusteltava tutkimusraportissa. Jotta kammion ilma voidaan pitää 
vakaana koko kehon kammiossa, koe-eläinten viemä tila saa olla korkein ­
taan viisi prosenttia kammion tilavuudesta. Vain nasaalisesti ja koko kehon kautta tapahtuvan altistuksen tekniikoiden periaatteet sekä niiden erityiset hyödyt ja haitat on kuvattu ohjeasiakirjassa GD 39 (2).
 
ALTISTUSOLOSUHTEET  
Pitoisuuksien annostelu  
13. Vain nasaalisesti -altistukset rotilla voivat kestää enintään kuusi tuntia. Jos 
hiiriä altistetaan vain nasaalisesti, altistusten kesto ei tavallisesti saa ylittää 
neljää tuntia. Jos tarvitaan pitempään kestäviä tutkimuksia, on esitettävä perustelut [katso GD 39 (2)]. Eläimille, joita altistetaan aerosoleille koko kehon kammioissa, on järjestettävä oma häkki sen estämiseksi, etteivät muut 
häkissä olevat eläimet niele testikemikaalia, kun ne nuolevat toistensa turk ­
kia. Eläimiä ei saa ruokkia altistusjakson aikana. Vettä saa antaa koko kehoon kohdistuvan altistuksen ajan.
 
14. Eläimet altistetaan testikemikaalille, kun se on kaasuna, höyrynä, aerosolina 
tai niiden sekoituksena. Testattava fyysinen olomuoto määräytyy testikemi ­
kaalin fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien, valitun pitoisuuden ja/tai tes ­
tikemikaalin käsittelyssä ja käytössä todennäköisen fyysisen muodon perus ­
teella. Hygroskooppiset ja kemiallisesti reaktiiviset testikemikaalit on testat ­
tava kuivaa ilmaa käyttäen. Räjähtävien pitoisuuksien tuottamista on vältet ­
tävä huolellisesti.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 219
 
Hiukkaskokojakauma  
15. Hiukkasten koko on mitattava kaikista aerosoleista ja sellaisista höyryistä, 
jotka voivat tiivistyä ja muodostaa siten aerosoleja. Jotta kaikki hengityse ­
limistön oleelliset osat altistuvat aineelle, on suositeltavaa käyttää aerosoleja, 
joiden massan aerodynaamisen halkaisijan mediaani (MMAD) on 1–4 μm ja 
joiden geometrinen keskihajonta ( σ g ) sijoittuu välille 1,5–3,0 (2) (9) (10). 
Tämä vaatimus on pyrittävä täyttämään kaikin keinoin, mutta jos se ei onnistu, on esitettävä asiantuntijan lausunto. Esimerkiksi metallihuurut voi ­
vat olla tätä vaatimusta pienempiä, kun taas varautuneet hiukkaset, kuidut ja 
hygroskooppiset materiaalit (joiden koko kasvaa hengitystie-elimistön kos ­
teassa ympäristössä) voivat olla vaatimusta suurempia.
 
Testikemikaalin valmistelu kantaja-aineessa  
16. Jotta ilmakehään saadaan testikemikaalista sopiva pitoisuus ja hiukkaskoko, 
voidaan käyttää kantaja-ainetta. Pääsääntöisesti on käytettävä vettä. Hiuk ­
kasmateriaaleja voidaan joutua käsittelemään mekaanisesti vaaditun hiukkas ­
kokojakauman saavuttamiseksi, mutta se on tehtävä varovasti, jotta testike ­
mikaali ei hajoa tai muutu. Jos mekaanisen prosessin oletetaan muuttaneen testikemikaalin koostumusta (esimerkiksi kitkan vuoksi liiallisen jauhamisen 
aiheuttamat hyvin korkeat lämpötilat), testikemikaalin koostumus on var ­
mennettava analyyttisesti. Riittäviä varotoimia on noudatettava, jotta testike ­
mikaali ei kontaminoidu. Murenemattomia raemateriaaleja, jotka on tarkoi ­
tuksella valmistettu sellaisiksi, ettei niitä voi hengittää, ei tarvitse testata. 
Hankauskoe on tehtävä sen osoittamiseksi, ettei raemaisen materiaalin kä ­
sittelyssä synny hengitettäviä hiukkasia. Jos hankauskoe tuottaa hengitettäviä aineita, on tehtävä hengityksen kautta aiheutuvaa myrkyllisyyttä koskeva 
testi.
 
Verrokkieläimet  
17. Samanaikaista negatiivista (ilma-) verrokkiryhmää ei tarvita. Jos 
testi-ilmakehän tuottamisessa käytetään apuna muuta kantaja-ainetta kuin 
vettä, kantaja-aineverrokkiryhmää on käytettävä ainoastaan silloin, kun saa ­
tavilla ei ole aiempia tietoja sisäänhengityksen kautta aiheutuvasta myrkylli ­
syydestä. Jos kantaja-aineessa valmistellun testikemikaalin myrkyllisyystutki ­
mus osoittaa, ettei kemikaali ole myrkyllinen, se tarkoittaa, että kantaja-aine on myrkytön testattuna pitoisuutena, joten kantaja-aineverrokkia ei tarvita.
 
ALTISTUSOLOSUHTEIDEN SEURANTA  
Kammion ilmavirtaus  
18. Ilman virtausta kammion läpi on valvottava tarkasti ja seurattava jatkuvasti, 
ja sitä koskevat tiedot on kirjattava vähintään kerran tunnissa jokaisen al ­
tistuksen aikana. Testi-ilmakehän pitoisuuden (tai stabiiliuden) seuranta kuu ­
luu olennaisena osana kaikkien dynaamisten parametrien mittaamiseen, ja se 
on myös epäsuora keino valvoa kaikkia oleellisia dynaamisia parametreja, 
joita tarvitaan ilmakehän tuottamiseen. Erityistä huomiota on kiinnitettävä siihen, että uudelleenhengittäminen vältetään vain nasaalisen altistuksen kammioissa niissä tapauksissa, kun altistusjärjestelmän läpi kulkeva ilmavir ­
taus ei riitä tuottamaan dynaamista testikemikaali-ilmakehän virtaa. On tiet ­
tyjä menetelmiä, joiden avulla voidaan osoittaa, ettei valituissa toimintaolo ­
suhteissa tapahdu uudelleenhengittämistä (2) (11). Happipitoisuuden on ol ­
tava vähintään 19 prosenttia, eikä hiilidioksidipitoisuus saa ylittää yhtä pro ­
senttia. Jos on aihetta olettaa, ettei näitä vaatimuksia voida täyttää, happi- ja 
hiilidioksidipitoisuudet on mitattava.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 220
 
Kammion lämpötila ja suhteellinen kosteus  
19. Kammion lämpötila on pidettävä välillä 22 ± 3 °C. Eläinten hengitysilman 
suhteellista kosteutta on seurattava sekä nasaalisissa että koko kehoon koh ­
distuvissa altistuksissa, ja se on kirjattava vähintään kolmesti enintään neljä 
tuntia kestävien altistusten osalta ja tunneittain lyhyempien altistusten osalta. 
Suhteellisen kosteuden tulisi olla välillä 30–70 prosenttia, mutta tämä ei ole välttämättä mahdollista (esimerkiksi testattaessa vesipohjaisia seoksia) tai mitattavissa, koska testikemikaali häiritsee testimenetelmää.
 
Testikemikaali: nimellispitoisuus  
20. Aina kun mahdollista, altistuskammion nimellispitoisuus on laskettava ja 
kirjattava. Nimellispitoisuus on tuotetun testikemikaalin massa jaettuna kam ­
miojärjestelmän läpi virtaavan ilman kokonaistilavuudella. Nimellispitoisuu ­
della ei luonnehdita eläinten altistumista, vaan nimellispitoisuuden ja varsi ­
naisen pitoisuuden vertailusta saadaan tietoa testijärjestelmän generointite ­
hokkuudesta, ja sitä voidaan siis käyttää generointiongelmien havaitsemi ­
seen.  
Testikemikaali: todellinen pitoisuus  
21. Todellinen pitoisuus on testikemikaalin pitoisuus eläinten hengitysilmassa 
inhalaatiokammiossa. Todelliset pitoisuudet saadaan tietyillä menetelmillä (esimerkiksi suoralla näytteenotolla, adsorptiivisilla tai kemiallisesti reaktii ­
visilla menetelmillä ja tulosten analyyttisella luonnehtimisella) tai muilla 
menetelmillä, kuten suodatukseen perustuvalla gravimetrisella analyysilla. Gravimetrisen analyysin käyttö on hyväksyttävää vain yksikomponenttisten jauhemaisten aerosolien tai heikosti haihtuvista nesteistä koostuvien aeroso ­
lien yhteydessä, ja sitä on tuettava asianmukaisella esitutkimuksella, jossa 
käsitellään testikemikaalia koskevia luonnehdintoja. Monikomponenttisten jauhemaisten aerosolien pitoisuus voidaan myös määrittää gravimetrisen analyysin avulla. Siihen tarvitaan kuitenkin analyysitietoja, jotka osoittavat, 
että ilmassa leijuvan materiaalin koostumus on sama kuin lähtömateriaalin. 
Jos näitä tietoja ei ole saatavilla, testikemikaali voi olla tarpeen analysoida uudelleen (mieluiten ilmassa leijuvassa muodossaan) säännöllisin väliajoin tutkimuksen aikana. Sellaisten aerosolisoituvien aineiden osalta, jotka voivat 
höyrystyä tai sublimoitua, on osoitettava, että valitulla menetelmällä kerättiin 
kaikki faasit. Tutkimusraportissa on ilmoitettava tavoitepitoisuus, nimellinen pitoisuus ja todellinen pitoisuus, mutta tilastollisissa analyyseissa käytetään vain todellisia pitoisuuksia tappavien pitoisuuksien arvoja laskettaessa.
 
22. Jos mahdollista, on käytettävä yksi erä testikemikaalia, ja testinäyte on 
säilytettävä sen puhtauden, homogeenisuuden ja stabiiliuden säilyttävissä olosuhteissa. Ennen tutkimuksen aloittamista testikemikaalista on laadittava luonnehdinta, johon on sisällyttävä sen puhtaus ja – mikäli teknisesti mah ­
dollista – identiteetti sekä tunnistettujen kontaminanttien ja epäpuhtauksien 
määrät. Tämä voidaan osoittaa esimerkiksi seuraavien tietojen avulla: reten ­
tioaika ja piikin suhteellinen pinta-ala sekä molekyylipaino, joka on saatu massaspektroskopialla tai kaasukromatografia-analyyseista, tai muut estimaa ­
tit. Vaikka testinäytteen identiteetti ei kuulu testauslaboratorion vastuulle, 
sen voi olla järkevää vahvistaa rahoittajan laatima luonnehdinta ainakin joiltain osin (esimerkiksi väri, fysikaalinen olomuoto jne.).
 
23. Altistusilmakehä on pidettävä mahdollisimman muuttumattomana, ja sitä on 
tarkkailtava jatkuvasti ja/tai ajoittain analyysimenetelmän mukaisesti. Jos 
näytteitä otetaan ajoittain, kammion ilmakehästä on otettava näytteitä vähin ­
tään kahdesti neljän tunnin tutkimuksen aikana. Jos se ei ole mahdollista vähäisen ilmanvirtauksen tai pienten pitoisuuksien vuoksi, koko altistusjak ­
son ajalta voidaan ottaa yksi näyte. Jos näytteiden välillä ilmenee suurta 
vaihtelua, seuraavia pitoisuuksia testattaessa on otettava neljä näytettä kuta ­
kin altistusta kohti. Yksittäiset kammion pitoisuusnäytteet eivät saa poiketa
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 221
 
keskimääräisestä pitoisuudesta enempää kuin ± 10 prosenttia kaasujen ja 
höyryjen osalta tai ± 20 prosenttia nestemäisten tai kiinteiden aerosolien 
osalta. Kammion tasapainotukseen kulunut aika (t  95 ) on laskettava ja kirjat ­
tava. Altistuksen kesto käsittää ajan, jolloin testikemikaali muodostetaan, mikä otetaan huomioon t
 95 -ajan saavuttamiseen tarvittavissa ajoissa. Ohjeita 
t 95 -ajan arvioimiseksi on ohjeasiakirjassa GD 39 (2).  
24. Hyvin monimutkaisten, kaasuista/höyryistä koostuvien seosten ja aerosolien 
(esimerkiksi polttokammiot ja tietyn tarkoituksen mukaisten lopputuottei ­
den/-laitteiden perusteella kehitetyt testikemikaalit) osalta kukin faasi voi käyttäytyä inhalaatiokammiossa eri tavoin, joten jokaisesta faasista (kaa ­
su/höyry ja aerosoli) on valittava vähintään yksi indikaattoriaine (analyytti), 
yleensä seoksen pääasiallinen vaikuttava aine. Kun testikemikaali on seos, 
on ilmoitettava seoksen analyyttinen pitoisuus, ei siis pelkästään vaikuttavan aineen tai komponentin (analyytin) pitoisuutta. Lisätietoja todellisista pitoi ­
suuksista on ohjeasiakirjassa GD 39 (2).
 
Testikemikaali: hiukkaskokojakauma  
25. Aerosolien hiukkaskokojakauma on määritettävä vähintään kahdesti jokaisen 
neljän tunnin mittaisen altistuksen aikana käyttämällä kaskadierotinta tai jotain toista laitetta, kuten aerodynaamista hiukkaskokoluokittelijaa. Jos kas ­
kadierottimella tai muulla laitteella saatujen tulosten välinen vastaavuus 
voidaan osoittaa, kyseistä muuta laitetta voidaan käyttää koko tutkimuksen ajan. Ensisijaisen laitteen rinnalla on käytettävä toissijaista laitetta, esimer ­
kiksi gravimetrista suodatinta tai törmäytintä/kuplituslaitetta ensisijaisen lait ­
teen keräystehon vahvistamiseksi. Hiukkaskoon analyysista saadun massa ­
pitoisuuden on sijoituttava kohtuullisessa määrin suodatusanalyysilla saadun massapitoisuuden rajoihin [katso GD 39 (2)]. Jos vastaavuus voidaan osoit ­
taa tutkimuksen varhaisessa vaiheessa, myöhemmät vahvistavat mittaukset 
voidaan jättää tekemättä. Eläinten hyvinvointia koskevien periaatteiden 
vuoksi on pyrittävä minimoimaan epävarmat tiedot, jotta altistusta ei tarvitse toistaa. Höyryjen osalta on määritettävä hiukkaskoko, jos on mahdollista, että höyryn tiivistyessä muodostuu aerosolia, tai jos höyrykammiossa, jossa 
faasien sekoittuminen on mahdollista, havaitaan hiukkasia (katso 15 kohta).
 
MENETTELY  
26. Jäljempänä kuvataan kahdentyyppisiä tutkimuksia: perinteistä protokollaa ja C 
× t -protokollaa. Molemmat protokollat voivat sisältää esikokeen, päätutki ­
muksen ja/tai raja-annostestin (perinteinen protokolla) tai testauksen rajapitoi ­
suudella (C × t). Jos yhden sukupuolen tiedetään olevan herkempi, tutkimuk ­
sen johtaja voi päättää suorittaa nämä tutkimukset käyttäen vain herkkää sukupuolta. Jos muita jyrsijöitä kuin rottia altistetaan vain nasaalisesti, altis ­
tuksen enimmäiskestoaikoja voidaan muuttaa lajikohtaisen stressin minimoi ­
miseksi. Ennen tutkimuksen aloittamista on otettava huomioon kaikki saa ­
tavilla olevat tiedot, jotta eläinten käyttö voidaan pitää mahdollisimman vä ­
häisenä. Esimerkiksi tiedot, jotka on saatu hyödyntämällä tämän liitteen lukua 
B.52 (4), saattavat poistaa tarpeen toteuttaa esikoe, ja ne voivat myös osoittaa, 
onko jompikumpi sukupuoli toista herkempi [katso GD 39 (2)].
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 222
 
PERINTEINEN PROTOKOLLA  
Yleisiä huomioita: perinteinen protokolla  
27. Perinteisessä tutkimuksessa ryhmä eläimiä altistetaan testikemikaalille tie ­
tyksi ajaksi (yleensä neljäksi tunniksi) joko nasaalisen altistuksen tai koko kehoon kohdistuvan altistuksen kammiossa. Eläimet altistetaan joko rajapi ­
toisuudelle (rajatesti) tai vähintään kolmelle pitoisuudelle vaiheittaisessa me ­
nettelyssä (päätutkimus). Päätutkimusta voi edeltää esikoe, ellei testikemi ­
kaalista ole jo jonkin verran tietoa saatavilla, esimerkiksi aiemmin tehty luvun B.52 mukainen tutkimus [katso GD 39 (2)].
 
Esikoe: perinteinen protokolla  
28. Esikoetta käytetään testikemikaalin vaikutuskyvyn arvioimisessa, sukupuol ­
ten välisten herkkyyserojen tunnistamisessa ja helpottamaan altistuksen pi ­
toisuustasojen valintaa päätutkimukseen tai rajatestiin. Kun valitaan esiko ­
keen pitoisuustasoja, on käytettävä kaikkea saatavilla olevaa tietoa, myös (Q)SAR-tietoja ja samanlaisia kemikaaleja koskevia tietoja. Kullekin 
pitoisuudelle saa altistaa enintään kolme urosta ja kolme naarasta (kolme 
eläintä / sukupuoli voi olla tarpeen sukupuolten välisen eron määrittämisek ­
si). Esikoe voi koostua yhdestä pitoisuudesta, mutta myös useampia pitoi ­
suuksia voidaan testata, mikäli tarpeen. Esikokeessa ei tule kuitenkaan tes ­
tata niin montaa eläintä ja pitoisuutta, että se alkaa muistuttaa päätutkimusta. Esikokeen sijasta voidaan käyttää aiemmin toteutettua luvun B.52 mukaista tutkimusta (4) [katso GD 39 (2)].
 
Rajatesti: perinteinen protokolla  
29. Rajatestiä käytetään silloin, kun testikemikaalin tiedetään tai oletetaan ole ­
van periaatteessa myrkytön eli aiheuttavan toksisen vasteen vain lakisääteistä rajapitoisuutta suuremmilla pitoisuuksilla. Rajatestissä altistetaan yksi ryh ­
mä, jossa on kolme urosta ja kolme naarasta, rajapitoisuuden vahvuiselle 
testikemikaalille. Tietoa testikemikaalin myrkyllisyydestä voidaan hankkia 
samanlaisia testattuja kemikaaleja koskevista tiedoista, jolloin on otettava huomioon niiden komponenttien identiteetti ja prosenttiosuus, joilla tiede ­
tään olevan toksikologista merkitystä. Tilanteissa, joissa tietoa testikemikaa ­
lin myrkyllisyydestä on vain vähän tai sitä ei ole lainkaan tai jos testikemi ­
kaalin oletetaan olevan myrkyllinen, on toteutettava päätutkimus.
 
30. Rajapitoisuudet valitaan yleensä sääntelyvaatimusten perusteella. Kun käy ­
tetään asetusta (EY) N:o 1272/2008, kaasujen, höyryjen ja aerosolien raja ­
pitoisuudet ovat 20 000 ppm, 20 mg/l ja 5 mg/l (tai suurin mahdollinen pitoisuus) (3). Rajapitoisuuksien määrittäminen tietyille testikemikaaleille, etenkin höyryille ja aerosoleille, voi olla teknisesti haasteellista. Aerosolien 
testauksessa ensisijaisena tavoitteena tulee olla hengitettävän hiukkaskoon 
(MMAD 1–4 μm) saavuttaminen. Useimpien kemikaalien osalta tämä on 
mahdollista, kun niiden pitoisuus on 2 mg/l. Aerosolien testaamista suu ­
rempina pitoisuuksina kuin 2 mg/l on yritettävä vain, jos hengitettävä hiuk ­
kaskoko voidaan saavuttaa [katso GD 39 (2)]. Asetuksen (EY) 
N:o 1272/2008 mukaan rajapitoisuuden ylittävien testien tekeminen ei ole suositeltavaa eläinten hyvinvointia koskevien periaatteiden vuoksi (3). Raja ­
pitoisuutta on harkittava vain, jos on erittäin todennäköistä, että sellaisen 
testin tulokset ovat suoraan merkityksellisiä ihmisten terveyden (3) suojele ­
misessa, ja tutkimusraportissa on esitettävä asiaa koskevat perustelut. Mah ­
dollisesti räjähtäviä testikemikaaleja on käsiteltävä varovasti räjähdykselle suotuisien olosuhteiden välttämiseksi. Jotta vältetään eläinten tarpeeton käyt ­
tö, ennen rajatestiä on tehtävä testiajo ilman eläimiä sen varmistamiseksi, 
että rajatestin edellyttämät kammio-olosuhteet voidaan saavuttaa.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 223
 
31. Jos rajapitoisuudella havaitaan kuolleisuutta tai kuoleman lähestymistä, ra ­
jatestin tuloksia voidaan käyttää muiden, eri pitoisuuksilla tehtävien testien 
esikokeena (katso päätutkimus). Jos rajapitoisuuden tuottaminen ei ole mah ­
dollista testikemikaalin fysikaalisten tai kemiallisten ominaisuuksien vuoksi, on testattava suurin mahdollinen pitoisuus. Jos kuolleisuus on alle 50 pro ­
senttia suurimmalla mahdollisella pitoisuudella, lisätestaus ei ole tarpeen. Jos 
rajapitoisuutta ei voitu tuottaa, tutkimusraportissa on esitettävä sitä koskeva selvitys ja sitä tukevia tietoja. Jos höyryn suurin mahdollinen pitoisuus ei aiheuta myrkyllisyyttä, testikemikaalista voi olla tarpeen tuottaa nestemäinen 
aerosoli.
 
Päätutkimus: perinteinen protokolla  
32. Päätutkimuksessa käytetään yleensä viittä urosta ja viittä naarasta (tai viittä 
herkän sukupuolen yksilöä, jos herkkyys tiedetään) pitoisuustasoa kohti. Pitoisuustasoja on oltava vähintään kolme. On käytettävä riittävän suuria pitoisuuksia, jotta voidaan laatia luotettava tilastollinen analyysi. Altistus ­
ryhmien välinen aika määritellään toksisten oireiden alkamishetken, keston 
ja vaikeusasteen mukaan. Eläinten altistusta seuraavalla pitoisuudella on lykättävä, kunnes on saatu riittävä varmuus jo testattujen eläinten eloonjää ­
misestä. Näin tutkimuksen johtaja voi mukauttaa seuraavan altistusryhmän 
tavoitepitoisuutta. Kehittyneiden tekniikoiden vuoksi tämä ei ole välttämättä 
käytännöllistä inhalaatiotutkimuksissa, joten eläinten altistamisen seuraavalla pitoisuustasolla on perustuttava aiempaan kokemukseen ja tieteelliseen arvi ­
oon. Seosten testaamisesta saa tietoa ohjeasiakirjasta GD 39 (2).
 
PITOISUUS × AIKA (C × T) -PROTOKOLLA  
Yleisiä huomioita: C × t -protokolla  
33. Vaiheittaista C × t -tutkimusta voidaan harkita vaihtoehdoksi perinteiselle 
protokollalle, kun arvioidaan aineen myrkyllisyyttä hengitettynä (12) (13) 
14). Tämän lähestymistavan avulla eläimet voidaan altistaa testikemikaalille useilla pitoisuustasoilla ja eripituisiksi ajoiksi. Kaikki testit tehdään vain na ­
saaliseen altistukseen tarkoitetussa kammiossa (koko kehoon kohdistuvaan 
altistukseen tarkoitetut kammiot eivät ole käytännöllisiä tässä protokollassa). 
Tämä protokolla on kuvattu lisäyksessä 1 olevassa vuokaaviossa. Simulaa ­
tioanalyysi on osoittanut, että sekä perinteisellä protokollalla että C × t -pro ­
tokollalla voidaan tuottaa luotettavia LC
 50 -arvoja, mutta että C × t -protokolla 
on yleisesti parempi luotettavien LC  01 - ja LC  10 -arvojen tuottamisessa (15).  
34. Lisäksi simulaatioanalyysi on osoittanut, että kahden eläimen käyttäminen 
yhtä C × t -aikaväliä kohti (yksi kumpaakin sukupuolta, jos käytetään mo ­
lempia sukupuolia, tai kaksi herkemmän sukupuolen edustajaa) saattaa olla 
riittävä, kun päätutkimuksessa testataan neljä pitoisuutta ja viisi altistuksen 
kestoa. Tietyissä olosuhteissa tutkimuksen johtaja voi päättää käyttää kahta rottaa kummastakin sukupuolesta yhtä C × t -aikaväliä kohti (15). Kahden eläimen käyttäminen kumpaakin sukupuolta kohti voi vähentää vinoumia ja 
estimaattien vaihtelevuutta, lisätä arvioinnin onnistumista ja parantaa luotta ­
musvälin kattavuutta. Jos tiedot eivät kuitenkaan riitä arviointiin (kun käy ­
tetään yhtä eläintä sukupuolta kohti tai kahta herkemmän sukupuolen eläin ­
tä), viides altistuspitoisuus voi olla myös tarpeen. Lisätietoja eläinten mää ­
rästä ja käytettävistä pitoisuuksista C × t -tutkimuksessa on ohjeasiakirjassa 
GD 39 (2).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 224
 
Esikoe: C × t -protokolla  
35. Esikokeella arvioidaan testikemikaalin vaikutuskykyä ja helpotetaan altistuk ­
sen pitoisuustasojen valintaa päätutkimusta varten. Jotta voidaan valita asi ­
anmukainen aloituspitoisuus päätutkimukseen ja minimoida käytettävien 
eläinten määrä, saatetaan tarvita esikoe, jossa käytetään enintään kolmea 
eläintä sukupuolta ja pitoisuutta kohti [katso tarkemmat tiedot ohjeasiakirjan GD 39 lisäyksestä III (2)]. Sukupuolten välisen eron määrittämiseksi voi olla tarpeen käyttää kolmea eläintä sukupuolta kohti. Nämä eläimet on altistet ­
tava yhden kerran, yleensä 240 minuutin ajaksi. Riittävien testi-ilmakehien 
tuottamisen mahdollisuus on arvioitava teknisissä esitesteissä ilman eläimiä. Yleensä esikoetta ei tarvita, jos kuolleisuustiedot ovat saatavilla luvun B.52 
mukaisesta tutkimuksesta (4). Kun B.2-tutkimukseen valitaan alustavaa ta ­
voitepitoisuutta, tutkimuksen johtajan on otettava huomioon saatavilla ole ­
vissa B.52-tutkimuksissa (4) havaitut kuolleisuusmallit kummankin suku ­
puolen ja kaikkien testattujen pitoisuuksien osalta [katso GD 39 (2)].
 
Alkupitoisuus: C × t -protokolla  
36. Alkupitoisuus (altistuskerta I) (lisäys 1) on joko rajapitoisuus tai pitoisuus, 
jonka tutkimuksen johtaja on valinnut esikokeen perusteella. Ryhmät, joissa 
on yksi eläin sukupuolta kohti, altistetaan tälle pitoisuudelle eripituisiksi ajoiksi (esimerkiksi 15, 30, 60, 120 tai 240 minuuttia), jolloin eläinten ko ­
konaismäärä on 10 (tätä ryhmää kutsutaan nimellä altistuskerta I) (lisäys 1).
 
37. Rajapitoisuudet valitaan yleensä sääntelyvaatimusten perusteella. Kun käy ­
tetään asetusta (EY) N:o 1272/2008, kaasujen, höyryjen ja aerosolien raja ­
pitoisuudet ovat 20 000 ppm, 20 mg/l ja 5 mg/l (tai suurin mahdollinen pitoisuus) (3). Rajapitoisuuksien määrittäminen tietyille testikemikaaleille, 
etenkin höyryille ja aerosoleille, voi olla teknisesti haasteellista. Aerosoleja 
testattaessa tavoitteena on oltava kooltaan hengitettävä hiukkanen (esimer ­
kiksi 1–4 μm:n MMAD) rajapitoisuudella 2 mg/l. Tämä on mahdollista 
useimpien kemikaalien osalta. Aerosolien testaamista suuremmalla pitoisuu ­
della kuin 2 mg/l on yritettävä vain, jos on mahdollista saavuttaa kooltaan 
hengitettävä hiukkanen [katso ohjeasiakirja GD 39 (2)]. Asetuksen (EY) N:o 1272/2008 mukaan rajapitoisuuden ylittävien testien tekeminen ei ole suositeltavaa eläinten hyvinvointia koskevien periaatteiden vuoksi (3). Raja ­
pitoisuuden ylittävää testausta on harkittava vain, jos on erittäin todennä ­
köistä, että sellaisen testin tulokset ovat suoraan merkityksellisiä ihmisten terveyden (3) suojelemisessa, ja tutkimusraportissa on esitettävä perustelut. Mahdollisesti räjähtäviä testikemikaaleja on käsiteltävä varovasti räjähdyk ­
selle suotuisien olosuhteiden välttämiseksi. Jotta vältetään eläinten tarpeeton 
käyttö, ennen alkupitoisuudella testausta on tehtävä testiajo ilman eläimiä sen varmistamiseksi, että tämän pitoisuuden edellyttämät kammio-olosuhteet voidaan saavuttaa.
 
38. Jos alkupitoisuuteen havaitaan liittyvän kuolleisuutta tai kuoleman lähesty ­
mistä, tällä pitoisuudella saatuja tuloksia voidaan käyttää muiden, eri pitoi ­
suuksilla tehtävien testien lähtökohtana (katso päätutkimus). Jos rajapitoi ­
suuden tuottaminen ei ole mahdollista testikemikaalin fysikaalisten tai ke ­
miallisten ominaisuuksien vuoksi, on testattava suurin mahdollinen pitoi ­
suus. Jos kuolleisuus on alle 50 prosenttia suurimmalla mahdollisella pitoi ­
suudella, lisätestaus ei ole tarpeen. Jos rajapitoisuutta ei voitu tuottaa, tut ­
kimusraportissa on esitettävä sitä koskeva selvitys ja sitä tukevia tietoja. Jos 
höyryn suurin mahdollinen pitoisuus ei aiheuta myrkyllisyyttä, testikemikaa ­
lista voi olla tarpeen tuottaa nestemäinen aerosoli.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 225
 
Päätutkimus: C × t -protokolla  
39. Päätutkimuksessa testattu alkupitoisuus (altistuskerta I) (lisäys 1) on joko 
rajapitoisuus tai pitoisuus, jonka tutkimuksen johtaja on valinnut esikokeen perusteella. Jos altistuskerran I aikana tai sen jälkeen on havaittu kuollei ­
suutta, vähimmäisaltistus (C × t), josta seuraa kuolema, ohjaa altistuskerran 
II pitoisuuden ja altistusjaksojen määrittämistä. Edellinen altistuskerta vai ­
kuttaa jokaiseen seuraavaan altistuskertaan (katso lisäys 1).
 
40. Monien testikemikaalien osalta alkupitoisuudella saadut tulokset sekä kolme 
muuta altistuskertaa, jotka on toteutettu pienemmällä aikavälillä (esimerkiksi 
altistusjaksojen jaottelu geometrisesti peräkkäisten jaksojen välisen kertoi ­
men mukaisesti, yleensä √2) riittävät C × t -kuolleisuussuhteen (15) mää ­
rittämiseen, mutta viidennen altistuspitoisuuden käyttämisestä voi olla jonkin verran hyötyä [katso lisäys 1 ja GD 39 (2)]. Lisätietoja C × t -protokollalla 
saatujen tulosten matemaattisesta käsittelystä on lisäyksessä 1.
 
HAVAINNOT  
41. Eläimiä on tarkkailtava kliinisesti ja säännöllisesti altistumisjakson aikana. 
Altistuksen jälkeen kliinisiä havaintoja on tehtävä vähintään kahdesti altis ­
tuspäivän aikana tai useammin, jos eläinten vaste käsittelyyn antaa siihen 
aihetta, ja vähintään kerran päivässä sen jälkeen yhteensä 14 päivän ajan. Havaintojakson pituus ei ole kiinteä, vaan se on määritettävä kliinisten merkkien luonteen ja alkamisajankohdan sekä toipumisajan pituuden perus ­
teella. Ne ajankohdat, jolloin myrkyllisyyden merkit ilmaantuvat ja häviävät, 
ovat tärkeitä varsinkin, jos myrkyllisyyden merkit ilmaantuvat viipeellä. Kaikki havainnot kirjataan järjestelmällisesti jokaisesta eläimestä erikseen. Kuolevat eläimet, selvästi kärsivät eläimet ja/tai eläimet, jotka osoittavat 
selviä merkkejä voimakkaasta ja jatkuvasta kärsimyksestä, on lopetettava 
humaanisti eläinten hyvinvointiin liittyvien periaatteiden vuoksi. Kun tutki ­
taan myrkyllisyyden kliinisiä merkkejä, on kiinnitettävä huomiota siihen, ettei altistusmenettelystä johtuvaa huonoa ulkonäköä ja ohimeneviä muu ­
toksia hengityksessä pidetä erehdyksessä merkkeinä kemikaaliin liittyvästä 
myrkyllisyydestä, jolloin eläimet pitäisi lopettaa ennenaikaisesti. Eläinkokei ­
den humaaneja lopettamiskriteereitä koskevassa ohjeasiakirjassa (GD 19) esitetyt periaatteet ja perustelut on otettava huomioon (7). Humaaneista 
syistä lopetettujen tai kuolleena löydettyjen eläinten kuolinajankohta tulee 
kirjata muistiin mahdollisimman tarkasti.
 
42. Häkin vieressä tehtyihin havaintoihin tulee sisältyä ihon, karvapeitteen, sil ­
mien, limakalvojen, hengitys- ja verenkiertojärjestelmän, autonomisen her ­
moston ja keskushermoston, somatomotorisen toiminnan ja käyttäytymisen muutokset. Mikäli mahdollista, paikallisten ja systeemisten vaikutusten vä ­
liset erot on merkittävä muistiin. Huomiota tulee kiinnittää vapinaan, kou ­
ristuksiin, syljeneritykseen, ripuliin, letargiaan, uneen ja koomaan. Lämmön mittaaminen peräsuolesta voi antaa vahvistavaa näyttöä refleksinomaisesta bradypneasta tai käsittelyyn tai ahtaaseen tilaan liittyvästä tai 
hypo-/hypertermiasta.
 
Ruumiinpainot  
43. Kunkin eläimen paino on kirjattava kerran sopeutumisvaiheen aikana, altis ­
tuspäivänä ennen altistusta (päivä 0) ja vähintään päivinä 1, 3 ja 7 (ja 
myöhemmin viikoittain) sekä kuolinhetkellä tai lopettamisen yhteydessä, 
jos se tapahtuu päivän 1 jälkeen. Ruumiinpaino on tunnetusti erittäin tärkeä myrkyllisyyden indikaattori, joten eläimiä, joiden paino on jatkuvasti vähin ­
tään 20 prosenttia pienempi kuin ennen tutkimusta mitatut arvot, on seurat ­
tava tarkasti. Elossa olevat eläimet punnitaan ja lopetetaan humaanisti altis ­
tumisen jälkeisen jakson lopussa.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 226
 
Patologia  
44. Kaikki koe-eläimet, myös kokeen aikana kuolleet tai eläinten hyvinvointia 
koskevien periaatteiden vuoksi lopetetut ja tutkimuksesta poistetut, avataan. Jos ruumiinavausta ei voida tehdä heti kuolleen eläimen löytämisen jälkeen, 
eläintä on säilytettävä riittävän kylmässä lämpötilassa (ei pakastimessa) au ­
tolyysin minimoimiseksi. Ruumiinavaukset on tehtävä mahdollisimman pi ­
an, yleensä yhden tai kahden päivän kuluessa. Kunkin eläimen kaikki mak ­
roskooppiset muutokset tulee kirjata, ja erityistä huomiota on kiinnitettävä 
hengitysteissä oleviin muutoksiin.
 
45. Myös tutkimussuunnitelmaan ennalta sisällytettyjen lisätutkimusten käyttöä 
voidaan harkita tutkimuksen tulkinnallisen arvon lisäämiseksi. Tällaisia tut ­
kimuksia ovat esimerkiksi eloonjääneiden rottien keuhkojen painon punnit ­
seminen ja/tai todisteiden hankkiminen ärsyttävyydestä hengitysteiden mik ­
roskooppitutkimuksella. Tutkittaviin elimiin voi sisältyä myös vähintään 24 tuntia hengissä säilyneiden eläinten makroskooppisia muutoksia sisältävät 
elimet ja elimet, joissa tiedetään tai oletetaan olevan kemikaalin aiheuttamia 
vaikutuksia. Koko hengityselimistön mikroskooppitutkimus voi antaa hyö ­
dyllistä tietoa veden kanssa reagoivista testikemikaaleista, kuten hapoista ja hygroskooppisista testikemikaaleista.
 
TIEDOT JA RAPORTOINTI  
Tiedot  
46. Yksittäisiä eläimiä koskevat tiedot ruumiinpainoista ja ruumiinavaustulok ­
sista on esitettävä. Kliiniset havaintotiedot tulee esittää yhteenvetona taulu ­
kossa, josta käy ilmi kussakin testiryhmässä käytettyjen eläinten lukumäärä, myrkyllisyyden oireita osoittaneiden eläinten lukumäärä, kokeen aikana kuolleena löydettyjen tai humaaneista syistä lopetettujen eläinten lukumäärä, 
yksittäisten eläinten kuolinajankohta, myrkyllisten vaikutusten ja palautu ­
vuuden kuvaus ja niiden ajallinen esiintyminen sekä ruumiinavauslöydökset.
 
Testiraportti  
47. Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:  
Koe-eläimet ja niiden hoito  
— kuvaus häkkiolosuhteista, mukaan luettuina seuraavat tiedot: yhdessä 
häkissä olevien eläinten lukumäärä (tai lukumäärän muutos), alustama ­
teriaali, lämpötila ja suhteellinen kosteus, valoisa aika ja tiedot ravin ­
nosta  
— käytetyt lajit/kanta ja perustelu muun lajin kuin rotan käyttämiselle  
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli  
— satunnaistamismenetelmä  
— tiedot ruoan ja veden laadusta (sekä ravinnon tyyppi/lähde, veden lähde)  
— kuvaus testiä edeltäneestä tilanteesta ja tiedot ravinnosta, karanteenista ja 
sairauden hoidosta.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 227
 
Testikemikaali  
— fysikaalinen olomuoto, puhtaus ja tarvittaessa fysikaalis-kemialliset omi ­
naisuudet (mukaan luettuna isomeria)  
— tunnistetiedot ja CAS-numero, jos se tiedetään.  
Kantaja-aine  
— perustelut kantaja-aineen käyttämiselle ja sen valinnalle (jos se on muu 
kuin vesi)  
— aikaisemmin tai tämän tutkimuksen yhteydessä saadut tiedot, jotka osoit ­
tavat, ettei kantaja-aine vaikuta tutkimuksen tulokseen.  
Inhalaatiokammio  
— kuvaus inhalaatiokammiosta sekä sen mitat ja tilavuus  
— kuvaus eläinten altistukseen ja ilmakehän tuottamiseen käytetystä lait ­
teistosta ja sen alkuperä  
— lämmön, kosteuden, hiukkaskoon ja todellisen pitoisuuden mittauslaitteet  
— ilmanlähde, tulo- ja poistoilman käsittely sekä ilmanvaihtojärjestelmä  
— menetelmät, joilla laitteisto on kalibroitu yhtenäisen testi-ilmakehän var ­
mistamiseksi  
— paine-ero (yli- vai alipaine)  
— kunkin kammion altistusportit (vain nasaalinen altistus); eläinten sijainti 
järjestelmässä (koko kehoon kohdistuva altistus)  
— testi-ilmakehän ajallinen yhtenäisyys/stabiilius  
— lämpötila- ja kosteusantureiden sekä testi-ilmakehän näytteenottopaikan 
sijainti kammiossa  
— ilman virtausnopeudet, ilman virtausnopeus kussakin altistusportissa 
(vain nasaalinen altistus) tai eläinkuorma/kammio (koko kehoon kohdis ­
tuva altistus)  
— tiedot hapen ja hiilidioksidin mittauslaitteistosta, jos tarpeen  
— inhalaatiokammion tasapainotilan saavuttamiseen kulunut aika (t  95 ) 
— tilavuuden muutosten määrä tunneittain  
— annostelulaitteet (tarvittaessa).  
Altistustiedot  
— päätutkimuksen tavoitepitoisuuden valinnan peruste  
— nimellispitoisuudet (altistuskammioon tuotetun testikemikaalin massa ja ­
ettuna kammion läpi virtaavan ilman tilavuudella)  
— eläinten hengitysilmasta kerätyt testikemikaalin todelliset pitoisuudet; 
epäyhtenäisiä fyysisiä muotoja (kaasuja, höyryjä, aerosoleja) tuottavien 
seosten osalta jokainen voidaan analysoida erikseen  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 228
 
— kaikki ilmapitoisuudet on ilmoitettava massayksikköinä (esimerkiksi 
mg/l, mg/m  3 , etc.), tilavuusyksiköt (esimerkiksi ppm, ppb jne.) voidaan 
ilmoittaa sulkeissa  
— hiukkaskokojakauma, massan aerodynaamisen halkaisijan mediaani 
(MMAD) ja geometrinen keskihajonta ( σg) sekä niiden laskentamenetel ­
mät yksittäiset hiukkaskokoanalyysit on myös esitettävä.  
Testiolosuhteet  
— tiedot testikemikaalin valmistelusta, mukaan luettuina tiedot kiinteiden 
materiaalien hiukkaskoon pienentämisessä tai testikemikaaliliuosten val ­
mistamisessa käytetyistä menetelmistä Jos mekaaniset prosessit ovat voi ­
neet muuttaa kemiallista koostumusta, on ilmoitettava analyysien tulok ­
set testikemikaalin koostumuksen vahvistamiseksi.  
— kuvaus (mieluiten kaavio) testi-ilmakehän tuottamiseen ja eläinten altis ­
tamiseen testi-ilmakehälle käytetystä laitteistosta  
— tiedot käytetystä kemiallisesta analyysimenetelmästä ja sen validointime ­
netelmästä (myös tiedot siitä, miten tehokasta testikemikaalin saanto oli 
näytteenottokohdasta)  
— testipitoisuuksien valintaperuste.  
Tulokset  
— kammion lämpötila, kosteus ja ilmanvirtaus (taulukkomuodossa)  
— tiedot nimellisistä ja todellisista pitoisuuksista kammiossa (taulukkomuo ­
dossa)  
— hiukkaskokotiedot sekä analyyttiset tiedot näytteen keräämisestä, hiuk ­
kaskokojakaumasta ja MMAD-arvon ja σ g -arvon laskelmat (taulukko ­
muodossa)  
— vastetiedot ja pitoisuustaso jokaisesta eläimestä (ts. eläimet, jotka osoit ­
tivat merkkejä myrkyllisyydestä, ja tiedot kuolleisuudesta sekä vaikutus ­
ten luonteesta, vaikeusasteesta, alkamisajankohdasta ja kestosta) (tauluk ­
komuodossa)  
— tutkimuksen aikana kerätyt tiedot yksittäisten eläinten ruumiinpainoista, 
kuolinpäivä ja -aika, jos se tapahtui ennen suunniteltua lopetusta, kunkin eläimen toksisuusoireiden alkamisajankohta ja niiden mahdollinen palau ­
tuminen
 
— kunkin eläimen ruumiinavauslöydökset ja histopatologiset löydökset, mi ­
käli saatavilla  
— kuolleisuusestimaatit (esimerkiksi LC  50 , LD  01 ) sekä 95 prosentin luotta ­
musrajat ja kulmakerroin (jos se on voitu laskea arviointimenetelmällä)  
— tilastollinen suhde ja eksponentin n estimaatti (C × t -protokolla) käy ­
tetyn tilasto-ohjelman nimi.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 229
 
Tulosten pohdinta ja tulkinta  
— On kiinnitettävä erityistä huomiota niiden menetelmien kuvaukseen, joita 
tämän testimenetelmän vaatimusten (esimerkiksi rajapitoisuus tai hiuk ­
kaskoko) täyttämisessä käytettiin.  
— Hiukkasten hengitettävyyttä on käsiteltävä kaikkien löydösten kannalta 
etenkin, jos hiukkaskokoon liittyvää kriteeriä ei voitu täyttää.  
— Jos kärsiviä tai voimakkaasta ja jatkuvasta kärsimyksestä merkkejä osoit ­
tavia eläimiä oli lopetettava humaanisti eläinkokeiden humaaneja lopet ­
tamiskriteereitä koskevassa OECD:n ohjeasiakirjassa (8) olevien perus ­
telujen mukaisesti, siitä on esitettävä selvitys.  
— Jos tämän liitteen luvun B.52 (4) mukainen testaus keskeytettiin tämän 
testimenetelmän (B.2) puoltamiseksi, sille on esitettävä perustelut.  
— Tutkimuksen kokonaisarviointiin on sisällytettävä tiedot nimellisten ja 
todellisten pitoisuuksien määrittelemiseen käytettyjen menetelmien yhte ­
näisyydestä sekä todellisen ja nimellisen pitoisuuden suhde.  
— Raportissa on käsiteltävä myös todennäköistä kuolinsyytä ja pääasiallista 
vaikutustapaa (systeeminen vs. paikallinen).  
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Saatavilla internetosoitteessa: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 39, OECD, Paris. Saatavilla internetosoitteessa: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
3) Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1272/2008, annettu 
16 päivänä joulukuuta 2008, aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaamisesta sekä direktiivien 67/548/ETY ja 1999/45/EY muuttami ­
sesta ja kumoamisesta ja asetuksen (EY) N:o 1907/2006 muuttamisesta, 
EUVL L 353, 31.12.2008, s. 1.
 
4) Tämän liitteen luku B.52: Akuutti myrkyllisyys hengitettynä – akuutin tok ­
sisuuden luokittelua koskeva menetelmä (ATC-menetelmä)  
5) Tämän liitteen luku B.40  In vitro  ihosyövyttävyys: Ihon 
sähkövastusmääritystesti (TER).  
6) Tämän liitteen luku B.40 a  In vitro  ihosyövyttävyys: Ihmisihomallitesti.  
7) OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. 
OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Saa ­
tavilla internetosoitteessa: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Saatavilla internetosoit ­
teessa: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
9) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, So ­
ciety of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321–327.
 
10) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 230
 
11) Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 
160–167.  
12) Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative 
Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with 
Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278–290,
 
13) Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Deter ­
mination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105–117.
 
14) Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in 
Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65–71.  
15) OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t 
Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Saatavilla internetosoitteessa: [http://www.oecd.org/env/test ­
guidelines]
 
16) Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, 
London/New York.  
MÄÄRITELMÄ  
Testikemikaali:  Tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 231
 
Lisäys 1  
C × t -protokolla  
1. Vaiheittaista pitoisuus × aika (C × t) -tutkimusta voidaan harkita vaihtoeh ­
doksi perinteiselle protokollalle, kun arvioidaan aineen myrkyllisyyttä hen ­
gitettynä (12) (13) 14). Sitä on käytettävä ensisijaisesti silloin, kun on eri ­
tyinen sääntelyyn liittyvä tai tieteellinen tarve, jonka vuoksi eläimiä on 
testattava eripituisia aikoja, esimerkiksi hätäavun tai maankäytön suunnitte ­
luun liittyviä tarkoituksia varten. Tämä lähestymistapa alkaa yleensä rajapi ­
toisuudella testaamisella (altistuskerta I), jolloin eläimet altistetaan testike ­
mikaalille viideksi eripituiseksi ajaksi (esimerkiksi 15, 30, 60, 120 ja 240 
minuutiksi). Toisin sanoen yhdellä altistuskerralla saadaan tietoa eripituisista 
altistusajoista (katso kuva 1). Kun käytetään asetusta (EY) N:o 1272/2008, kaasujen, höyryjen ja aerosolien rajapitoisuudet ovat 20 000 ppm, 20 mg/l ja 5 mg/l. Nämä rajat saa ylittää vain, jos on sääntelyyn liittyvä tai tieteellinen 
tarve testata näitä suuremmilla pitoisuuksilla (katso 37 kohta luvun B.2 
päätekstissä).
 
2. Jos testikemikaalin myrkyllisyydestä on vain vähän tietoa tai jos sitä ei ole 
lainkaan, on toteutettava esikoe, jossa enintään kolme eläintä sukupuolta kohti altistetaan tutkimuksen johtajan valitsemille tavoitepitoisuuksille 
yleensä 240 minuutin ajaksi.
 
3. Jos altistuskerralla I testataan rajapitoisuutta ja jos siinä yhteydessä havaitaan 
alle 50 prosentin kuolleisuus, lisätestit eivät ole tarpeen. Jos on sääntelyyn liittyvä tai tieteellinen tarve määrittää pitoisuus-/aika-/vastesuhde saatua raja ­
pitoisuutta suuremmilla pitoisuuksilla, seuraava altistus on tehtävä suurem ­
malla pitoisuudella, joka on kaksi kertaa rajapitoisuus (ts. 2L kuvassa 1).
 
4. Jos rajapitoisuuden yhteydessä havaitaan myrkyllisyyttä, lisätestaus (päätut ­
kimus) on tarpeen. Nämä lisäaltistukset toteutetaan joko pienemmillä pitoi ­
suuksilla (kuvassa 1: altistuskerrat II, III tai IV’) tai suuremmilla pitoisuuk ­
silla käyttäen lyhyempiä altistusaikoja (kuvassa 1: altistuskerta IV) siten, että 
aikoja mukautetaan tai että niiden välinen aika on lyhyempi.  
5. Testi (alkupitoisuus ja muut pitoisuudet) toteutetaan käyttämällä yhtä eläintä 
sukupuolta kohti kutakin pitoisuutta/aikapistettä kohti tai kahta herkemmän sukupuolen eläintä kutakin pitoisuutta/aikapistettä kohti. Tietyissä olosuh ­
teissa tutkimuksen johtaja voi valita käyttää kahta rottaa sukupuolta kohti 
kutakin pitoisuutta/aikapistettä kohti (tai neljää herkemmän sukupuolen 
eläintä kutakin pitoisuutta/aikapistettä kohti) (15). Kahden eläimen käyttä ­
minen kumpaakin sukupuolta kohti yleensä vähentää vinoumia ja estimaat ­
tien vaihtelevuutta, lisää arvioinnin onnistumista ja parantaa tässä kuvattuun 
protokollaan liittyvän luottamusvälin kattavuutta. Lisätietoja on ohjeasiakir ­
jassa GD 39 (2).
 
6. Kukin altistuskerta toteutetaan mielellään yhtenä päivänä. Tämän ansiosta 
seuraavaa altistusta voidaan lykätä, kunnes on saatu riittävä varmuus jo testattujen eläinten eloonjäämisestä, ja tutkimuksen johtaja voi myös muut ­
taa seuraavan altistuskerran tavoitepitoisuutta ja altistuksen kestoa. Kukin 
altistuskerta on suositeltavaa aloittaa sillä ryhmällä, joka altistuu pisimpään, eli ensin 240 minuutin altistusryhmä, seuraavaksi 120 minuutin altistus ­
ryhmä ja niin edelleen. Jos esimerkiksi 240 minuutin ryhmän eläimet kuo ­
levat 90 minuutin kuluttua tai osoittavat vakavia merkkejä myrkyllisyydestä 
(esimerkiksi suuria muutoksia hengityksessä, kuten vaivalloista hengittämis ­
tä), ei ole mielekästä altistaa ryhmää 120 minuutin ajaksi, koska kuolleisuus olisi todennäköisesti 100 prosenttia. Tällöin tutkimuksen johtajan on valit ­
tava kyseiselle pitoisuudelle lyhyempikestoiset altistukset (esimerkiksi 90, 
65, 45, 33 ja 25 minuuttia).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 232
 
7. Kammion pitoisuudet on mitattava säännöllisesti, jotta kunkinpituisen altis ­
tuksen aikapainotettu keskimääräinen pitoisuus voidaan määrittää. Aina kun 
mahdollista, tilastollisessa analyysissa on käytettävä kunkin eläimen kuolin ­
aikaa (pikemmin kuin altistuksen kestoa).  
8. Neljän ensimmäisen altistuskerran tulokset on analysoitava, jotta voidaan 
tunnistaa pitoisuus-aikakäyrästä puuttuvat tiedot (katso kuva 1). Jos käyrä 
ei kuvaa tietoja riittävästi, voidaan toteuttaa ylimääräinen altistus (viides pitoisuus). Viidennen altistuksen pitoisuus ja kesto on valittava siten, että puuttuvat tiedot voidaan tuottaa.
 
9. Kaikkia altistuskertoja (myös ensimmäistä altistuskertaa) käytetään lasketta ­
essa pitoisuus-aika-vaste-suhdetta tilastollista analyysia hyödyntäen (16). Mikäli mahdollista, kutakin C × t -väliä kohti on käytettävä aikapainotettua keskimääräistä pitoisuutta ja altistuksen kestoa kuolemaan saakka (jos eläin 
kuolee altistuksen aikana).
 
Kuva 1  
Hypoteettinen kuvaus pitoisuus-aika-kuolleisuussuhteesta rotilla.
  
Vaaleat symbolit = eloonjääneet, mustat symbolit = kuolleet eläimet  
Kolmio = naaras, neliö = uros  
Yhtenäinen viiva = LC  50 -arvot (vaihteluväli 7,5–240 min), urokset, n = 1  
Katkoviiva = LC  50 -arvot (vaihteluväli 7,5–240 min), naaraat, n = 1  
Pisteviivat = hypoteettiset LC  50 -arvot uroksille ja naaraille, jos n olisi ollut 2 
(12).  
Sanasto  
Pitoisuus:  
Altistusaika:  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 233
 
10. Jäljempänä on esimerkki vaiheittaisesta menettelystä:  
Altistuskerta I – Testaus rajapitoisuudella (katso kuva 1)  
— Yksi eläin/sukupuoli pitoisuutta/aikapistettä kohti, yhteensä (  a ) 
— Tavoitepitoisuus (  b ) = rajapitoisuus.  
— Altista viisi eläinryhmää tälle tavoitepitoisuudelle 15, 30, 60, 120 ja 240 
minuutin ajaksi.  
↓ 
Altistuskerta II  ( c ) – Päätutkimus  
— Yksi eläin/sukupuoli pitoisuutta/aikapistettä kohti, yhteensä 10 eläintä.  
— Altista viisi eläinryhmää pienemmälle pitoisuudelle (  d ) (1/2 L) hieman 
pidemmäksi aikaa (kertoimen √2 mukaan porrastettuna, katso kuva 1).  
↓ 
Altistuskerta III – Päätutkimus  
— Yksi eläin/sukupuoli pitoisuutta/aikapistettä kohti, yhteensä 10 eläintä.  
— Altista viisi eläinryhmää pienemmälle pitoisuudelle (  d ) (1/4 L) hieman 
pidemmäksi aikaa (kertoimen √2 mukaan porrastettuna, katso kuva 1).  
↓ 
Altistuskerta IV' – Päätutkimus  
— Yksi eläin/sukupuoli pitoisuutta/aikapistettä kohti, yhteensä 10 eläintä.  
— Altista viisi eläinryhmää pienemmälle pitoisuudelle (  d ) (1/8 L) hieman 
pidemmäksi aikaa (kertoimen √2 mukaan porrastettuna, katso kuva 1).  
tai ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 234  
( a ) Jos tietoja sukupuolikohtaisesta herkkyydestä ei ole, käytetään sekä uros- että naarasrot ­
tia, ts. yksi eläin kumpaakin sukupuolta pitoisuutta kohti. Olemassa olevien tietojen 
perusteella – tai jos tämän altistuskerran aikana käy ilmi, että jompikumpi sukupuoli 
on herkempi – käytetään 10:tä herkemmän sukupuolen eläintä (kaksi eläintä pitoisuut ­
ta/aikapistettä kohti) jokaisella pitoisuustasolla testauksen seuraavissa vaiheissa. 10 eläin ­
tä. 
( b ) Kun käytetään asetusta (EY) N:o 1272/2008, kaasujen, höyryjen ja aerosolien rajapitoi ­
suudet ovat 20 000 ppm, 20 mg/l ja 5 mg/l. Oletetun myrkyllisyyden tai esikokeen 
tulosten perusteella on valittava pienemmät aloituspitoisuudet. Sääntelyyn liittyvien tai 
tieteellisten tarpeiden yhteydessä voidaan käyttää suurempia pitoisuuksia. 
( c ) Eläinten altistusta seuraavalle pitoisuudelle on lykättävä, kunnes on saatu riittävä var ­
muus jo testattujen eläinten eloonjäämisestä. Näin tutkimuksen johtaja voi mukauttaa 
seuraavan altistusryhmän tavoitepitoisuutta ja altistuksen kestoa. 
( d ) Pienintä annosta (pitoisuus x aika), joka aiheutti kuolleisuutta alkupitoisuudella testatta ­
essa (ensimmäinen altistuskerta), käytetään ohjenuorana määritettäessä seuraavaa pitoi ­
suuden ja altistuksen keston yhdistelmää. Yleensä pitoisuutta pienennetään kaksinkertai ­
sesti (1/2 L), ja eläimet altistetaan uudelle aikavälille, jota on tarkennettu siten, että altistusajat on jaettu kertoimella 1,4 ( √2; katso viite 11) ensimmäisen altistuksen yhtey ­
dessä havaittuun pienimpään tappavaan annokseen (aika × pitoisuus) liittyvän ajan mu ­
kaisesti. Tässä kuvassa (kuva 1) altistuskerralla 1 havaittiin kuolleisuutta 15 minuutin 
kohdalla, joten altistuskerran II kestot sijoitetaan tällöin 30 minuutin ympärille, ja ne ovat 
15, 21, 30, 42 ja 60 minuuttia. Kahden ensimmäisen altistuksen jälkeen on erittäin 
suositeltavaa piirtää tiedoista edellä olevan kuvan kaltainen kuva ja tarkistaa, onko pi ­
toisuuden ja ajan välinen kulma 45 astetta (n = 1) vai onko pitoisuus-aika-vastesuhde 
loivempi (esimerkiksi N = 2) vai jyrkempi (esimerkiksi n = 0,8). Jälkimmäisissä tapauk ­
sissa on erittäin suositeltavaa muuttaa seuraavia pitoisuuksia ja kestoja vastaavasti.
 Altistuskerta IV – Päätutkimus  
— Yksi eläin/sukupuoli pitoisuutta/aikapistettä kohti, yhteensä 10 eläintä.  
— Altista viisi eläinryhmää suuremmalle pitoisuudelle (  e ) (2 L) hieman 
lyhyemmäksi aikaa (kertoimen √2 mukaan porrastettuna, katso kuva 1).  
C × t -protokollalla saatujen tulosten matemaattinen käsittely  
11. C × t -menettely, jossa on neljä tai viisi altistuspitoisuutta ja viisi kestoa, 
tuottaa 20 tai 25 datapistettä. Näiden datapisteiden avulla C × t -suhde 
voidaan laskea käyttämällä tilastollista analyysia (16):  
Kaava 1  
ProbittiðPÞ ¼ b 0 þ b 1 ln C þ b 2 ln t 
jossa C = pitoisuus; t = altistuksen kesto, tai  
Kaava 2  
Vaste ¼ ƒðC n tÞ 
jossa  n ¼ b 1=b 2: 
Kaavan 1 avulla LC  50 -arvo voidaan laskea tietylle ajanjaksolle (esimerkiksi 
neljä tuntia, yksi tunti, 30 minuuttia tai mikä tahansa ajanjakso testatuilta 
ajanjaksoilta) käyttäen arvoa P = 5 (50 prosentin vaste). Haberin sääntöä voidaan soveltaa vain, kun n = 1. LC
 01 -arvo voidaan laskea käyttäen arvoa 
P = 2,67.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 235  
( e ) Tietyissä tapauksissa voi olla tarpeen suurentaa pitoisuutta (2 L) uuden, vieläkin tarkem ­
man aikavälin mukaisesti siten, että altistusajat jaetaan geometrisesti kertoimella 1,4 ( √2) 
sen ajan mukaisesti, jolloin ensimmäisessä altistuksessa havaittiin pienin tappava pitoi ­
suus. Altistuksen vähimmäiskeston on mielellään oltava yli viisi minuuttia, kun taas 
enimmäiskesto ei saa ylittää kahdeksaa tuntia.
 B.3. AKUUTTI MYRKYLLISYYS (IHON KAUTTA)  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Katso yleistä johdantoa, osa B (A).  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Katso yleistä johdantoa, osa B (B).  
1.3 VERTAILUAINEET  
Vertailuaineita ei ole.  
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Ainetta levitetään useaan ryhmään jaettujen eläinten iholle porrastet ­
tuina annoksina (yksi annos ryhmää kohti). Tämän jälkeen eläimiä 
tarkkaillaan oireiden ja kuolemien suhteen. Ruumiinavaus tehdään kokeen aikana kuolleille eläimille ja kokeen päätyttyä myös henkiin jääneille eläimille, kun ne on ensin lopetettu.
 
Eläimet, joilla on vakavia ja pitkittyneitä ahdistuneisuuden ja kivun 
oireita, voidaan tarvittaessa lopettaa. Testattavia aineita ei tarvitse 
antaa tavalla, jonka tiedetään aiheuttavan selvää kipua ja ahdistusta 
syövyttävien tai ärsyttävien ominaisuuksien vuoksi.  
1.5 LAATUKRITEERIT  
Laatukriteerejä ei ole.  
1.6 MENETELMÄKUVAUS  
1.6.1  Valmistelut  
Ennen testiä eläinten elinolosuhteet pidetään tietyntyyppisinä vähin ­
tään viiden päivän ajan testin suorittamista silmälläpitäen. Terveiden 
aikuisten eläinten joukosta otetaan satunnaisotos, joka jaetaan käsit ­
telyryhmiin. Noin 24 tuntia ennen testiä turkki leikataan tai ajetaan eläinten selkäalueelta varoen naarmuttamasta ihoa, koska naarmut 
saattaisivat muuttaa ihon läpäisevyyttä. Vähintään 10 % ihoa peittä ­
västä karvasta on ajeltava tai leikattava. Kiinteät aineet voidaan tar ­
vittaessa jauhaa, ja ne on kosteutettava riittävällä vesimäärällä tai tarvittaessa muulla liuottimella hyvän ihokontaktin varmistamiseksi. 
Jos käytetään liuotinta, on otettava huomioon liuottimen vaikutus 
aineen imeytymiseen iholta. Nestemäisiä aineita käytetään yleensä laimentamattomina.
 
1.6.2  Testiolosuhteet  
1.6.2.1  Koe-eläimet  
Koe-eläiminä voidaan käyttää aikuisia rottia tai kaneja. Muiden lajien 
käyttö on perusteltava. Testiin käytetään yleisiä laboratoriokantoja. Testin alussa kumpaakaan sukupuolta edustavien eläinten painon ­
vaihtelut eivät saa olla enempää kuin ± 20 % sukupuolen keski ­
arvosta.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 236
 
1.6.2.2  Lukumäärä ja sukupuoli  
Jokaista annostasoa kohti tarvitaan vähintään viisi eläintä, joiden on 
oltava samaa sukupuolta. Jos käytetään naaraita, ne eivät saa olla synnyttäneitä eivätkä tiineitä. Jos on käytettävissä tietoja, joiden mu ­
kaan jompikumpi sukupuoli on selvästi toista herkempi, kokeessa on 
käytettävä tätä sukupuolta.
 
Huomautus:  Käytettäessä rottaa kehittyneempiä eläimiä akuutin myr ­
kyllisyyden testauksia varten on harkittava pienempää eläinmäärää kuin rottien kohdalla. Annokset valitaan huolella, ja kohtuullisen 
myrkyllisten annosten ylittämistä on vältettävä kaikin keinoin. Täl ­
laisissa kokeissa on vältettävä tappavien annosten antamista.
 
1.6.2.3  Annostasot  
Annostasoja on oltava tarpeellinen määrä, kuitenkin vähintään kol ­
me. Annostasot jaetaan siten, että saadaan jakauma myrkytysoireiden 
ja kuolleisuuden suhteen. Annostasojen valinnassa on otettava huo ­
mioon mahdolliset ärsyttävät tai syövyttävät ominaisuudet. Tietojen perusteella tulisi voida piirtää pitoisuus/kuolleisuus-käyrä, ja LC
 50 - 
arvo tulisi määrittää aina kun se vain on mahdollista.  
1.6.2.4  Rajatesti  
Voidaan tehdä yhden annostason rajatesti (vähintään 2 000 mg/kg) 
viiden koiraan ja viiden naaraan ryhmälle edellä kuvattujen menetel ­
mien mukaisesti. Jos aineeseen liittyvää kuolleisuutta esiintyy, on 
harkittava kattavaa testiä.  
1.6.2.5  Tarkkailujakso  
Tarkkailujakson minimipituus on 14 päivää. Jakson pituus ei ole 
ehdottoman kiinteä, vaan sitä voidaan tarvittaessa säätää myrkytysoi ­
reiden, oireiden alkamisnopeuden ja toipumisjakson mukaan. Myrky ­
tysoireiden ilmestymis- ja häviämisajankohta sekä kuoleman ajan ­
kohta ovat tärkeät, etenkin jos kuolemilla on taipumus ”viivästyä”.  
1.6.3  Testin suorittaminen  
Eläimiä pidetään yksin häkeissä. Testattavaa ainetta levitetään tasai ­
sesti alueelle, joka on noin 10 % kehon kokonaispinta-alasta. Erittäin 
myrkyllisten aineiden kohdalla voidaan käyttää pienempää pinta-alaa, 
mutta ainetta on levitettävä mahdollisimman ohuelti ja tasaisesti niin suurelle alueelle kuin mahdollista.
 
Testattava ihoalue peitetään harsositeellä ja ärsyttämättömällä laasta ­
rilla koko 24 tunnin altistusjakson ajaksi. Tämän lisäksi alue on peitettävä siten, että harsoside ja aine pysyvät paikallaan eikä eläin pääse syömään ainetta. Eläin voidaan sitoa osittain siten, että se ei 
pysty syömään ainetta. Täyttä liikkumattomuutta ei kuitenkaan suo ­
sitella.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 237
 
Altistusjakson jälkeen aineen jäännökset poistetaan vedellä tai 
muulla sopivalla ihonpuhdistusmenetelmällä.  
Havainnot tehdään ja kirjataan systemaattisesti. Jokaisesta eläimestä 
tulee olla oma kirjanpitonsa. Ensimmäisen päivän aikana havaintoja 
on tehtävä usein. Vähintään kerran työpäivässä on tehtävä huolelli ­
nen kliininen tutkimus. Muut havainnot tehdään päivittäin ja eläin ­
hukka minimoidaan soveltuvin toimenpitein (kuolleet eläimet jää ­
dytetään tai niille tehdään ruumiinavaus ja heikot tai kuolevat eläimet eristetään tai lopetetaan).
 
Tarkkaillaan turkin, käsitellyn ihon, silmien, limakalvojen, hengitys ­
teiden, verenkierron, autonomisen hermoston, keskushermoston, so ­
matomotorisen aktiviteetin ja käyttäytymismallin muutoksia. Erityi ­
sesti on tarkkailtava vapinaa, kouristuksia, syljeneritystä, ripulia, le ­
targiaa, unta ja koomaa. Kuoleman ajankohta on kirjattava niin tar ­
koin kuin mahdollista. Ruumiinavaus tehdään kokeen aikana kuol ­
leille eläimille ja kokeen päätyttyä myös henkiin jääneille eläimille, 
kun ne on ensin lopetettu. Kaikki huomattavan suuret patologiset muutokset on kirjattava. Histopatologista tutkimusta varten otetaan kudosnäytteet voimassa olevan ohjeen mukaan.
 
Arviointi myrkyllisyydestä toisen sukupuolen kohdalla  
Kun toiselle sukupuolelle tehty koe on saatu päätökseen, ainetta 
annostellaan vähintään viiden toista sukupuolta olevan eläimen ryh ­
mälle, jotta voitaisiin todeta, ovatko tämän sukupuolen eläimet ai ­
neelle huomattavasti herkempiä. Pienemmänkin eläinmäärän käyttöä 
voidaan perustella yksittäisissä tapauksissa. Jos on käytettävissä tie ­
toja, joiden mukaan testatun sukupuolen eläimet ovat huomattavasti herkempiä, toista sukupuolta ei tarvitse testata.
 
2. TIEDOT  
Yhteenveto tiedoista esitetään taulukkona, jossa jokaisen ryhmän 
kohdalla on eläinten määrä kokeen alussa, yksittäisten eläinten kuo ­
linajankohdat, niiden eläinten määrä, joilla on muita myrkyllisyy ­
destä johtuvia oireita, myrkytysoireiden kuvaus ja ruumiinavauslöy ­
dökset. Yksittäisten eläinten painot on kirjattava välittömästi ennen aineen annostelua, sen jälkeen viikoittain ja lopuksi kuoleman jäl ­
keen. Painonmuutokset on laskettava ja kirjattava, kun eläin pysyy 
hengissä kauemmin kuin yhden vuorokauden. Eläimet, jotka on lo ­
petettu aineen aiheuttaman ahdistuksen ja kipujen takia, luokitellaan aineen vaikutuksesta kuolleiksi. LD
 50 voidaan määrittää yleisesti tun ­
netun menetelmän mukaan.  
Tietojen arviointiin tulee sisältyä mahdolliset yhteydet eläimen ai ­
neelle altistamisen ja kaikkien poikkeavuuksien esiintymisen ja va ­
kavuuden välillä. Tällaisia poikkeavuuksia ovat esimerkiksi käyttäy ­
tymismuutokset, kliiniset muutokset, painonmuutokset, kuolleisuus ja 
muut toksikologiset vaikutukset.  
3. RAPORTOINTI  
3.1 TESTIRAPORTTI  
Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat 
tiedot:  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 238
 
— laji, kanta, toimittaja, ympäristöolosuhteet, ruokavalio jne.,  
— testiolosuhteet (mukaan lukien ihonpuhdistusmenetelmä ja siteen 
tyyppi: okklusiivinen tai ei-okklusiivinen),  
— annostasot (annoksen suuruus apuaine mukaan lukien sekä mah ­
dollinen testattavan aineen pitoisuus),  
— altistettujen eläinten sukupuoli,  
— vastetietojen luokittelu sukupuolen ja annostason mukaan (ko ­
keen aikana kuolleiden tai lopetettujen eläinten määrä, niiden 
eläinten määrä, joilla on myrkyllisyydestä johtuvia oireita, altis ­
tettujen eläinten määrä),  
— annostelun jälkeisten kuolemien ajankohta, syyt ja kriteerit eläin ­
ten lopettamiseen,  
— kaikki havainnot,  
— LD  50 -arvo sukupuolelle, jolle on tehty 14 päivän pituinen kattava 
koe (määritysmenetelmä on ilmoitettava),  
— LD  50 -arvon 95 prosentin luottamusväli (mahdollisuuksien mu ­
kaan),  
— annos-kuolleisuuskäyrä ja sen kaltevuus (määritysmenetelmän 
sallimissa rajoissa),  
— ruumiinavauslöydökset,  
— muut histopatologiset löydökset,  
— toisen sukupuolen testauksen tulokset (jos on tehty),  
— tulosten pohdinta (erityistä huomiota on kiinnitettävä kokeen ai ­
kana tehtyjen koe-eläinten lopettamisien LD  50 -arvoon kohdista ­
maan vaikutukseen),  
— tulosten tulkinta.  
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA  
Katso yleistä johdantoa, osa B (D).  
4. VIITTEET  
Katso yleistä johdantoa, osa B (E).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 239
 
B.4. AKUUTTI TOKSISUUS: IHOÄRSYTTÄVYYS/SYÖVYTTÄVYYS  
1. TESTIMENETELMÄ  
Tämä menetelmä on toisinto OECD:n testiohjeesta nro 404 (2002).  
1.1 JOHDANTO  
Tämän päivitetyn testimenetelmän valmistelun yhteydessä on erityi ­
sesti pyritty ottamaan huomioon eläinten hyvinvointiin liittyvät nä ­
kökohdat sekä kaikkien testiaineesta aiemmin saatujen tietojen arvi ­
ointi, jotta voidaan välttää tarpeettomia eläinkokeita. Tässä menetel ­
mässä esitetään suositus, että ennen tässä kuvatun, aineen 
ärsyttävyyttä/syövyttävyyttä tutkivan  in vivo  -testin toteuttamista on 
arvioitava aiempien relevanttien tutkimustulosten painoarvo. Jos saa ­
tavissa olevat tiedot ovat puutteellisia, niitä voidaan täydentää vai ­
heittaisen menettelyn avulla (1). Suositeltava testausstrategia, joka on 
selostettu tämän menetelmän liitteessä, sisältää validoitujen ja hyväk ­
syttyjen  in vitro  -testien suorittamisen. Lisäksi suositellaan tilanteen 
mukaan, että  in vivo - alkutestissä eläimelle asetetaan kolme testilap ­
pua peräkkäin eikä samanaikaisesti.  
Sekä järkevien tieteellisten menettelytapojen että eläinten hyvinvoin ­
nin vuoksi  in viro  -testiä ei pidä suorittaa ennen kuin kaikkien saa ­
tavissa olevien testiaineen mahdolliseen ihoärsyttävyyteen/-syövyttä ­
vyyteen liittyvien tietojen painoarvo on arvioitu. Tällaisia tietoja ovat 
todisteet aiemmista ihmisille ja/tai koe-eläimille tehdyistä tutkimuk ­
sista, todisteet yhden tai usean rakenteellisesti samankaltaisen aineen tai ainetta sisältävän seoksen ärsyttävyydestä/syövyttävyydestä, ai ­
neen voimakasta happamuutta tai emäksisyyttä osoittavat tulokset 
(2) (3) sekä validoidut ja hyväksytyt  in vitro-  tai ex vivo  -testit (4) 
(5) (5a). Tällainen analyysi vähentää  in vivo  -testien tarvetta sellais ­
ten aineiden kohdalla, joiden ihoärsyttävyydestä/-syövyttävyydestä aiempi tutkimus on jo tuottanut riittävästi todisteita.
 
Suositeltava tapa toteuttaa vaiheittainen menettely, johon sisältyy 
validoituja ja hyväksyttyjä  in vitro-  tai  ex vivo - testejä 
ärsyttävyyden/syövyttävyyden selvittämiseksi, selostetaan tämän me ­
netelmän liitteessä. Tämä menettelytapa kehitettiin OECD:n seminaa ­
rissa (6), jonka osanottajat suosittelevat sitä yksimielisesti, ja se hy ­
väksyttiin suositeltavaksi testimenettelyksi Globally Harmonised Sys ­
tem for the Classification of Chemical Substances (GHS) -kokouk ­
sessa (7). Vaikka tämä menettely ei olekaan olennainen osa testime ­
netelmää B.4, sen käyttöä suositellaan ennen  in vivo  -testin suoritta ­
mista. Uusia aineita testattaessa se on suositeltava vaiheittainen me ­
nettelytapa tieteellisesti pätevien tulosten tuottamiseksi aineen ärsyttävyydestä/syövyttävyydestä. Sellaisten aineiden kohdalla, joi ­
den ihoärsyttävyydestä/-syövyttävyydestä ei ole riittävästi tietoja, me ­
nettelytapaa voidaan käyttää puuttuvien tietojen hankkimiseen. Jos päätetään käyttää jotain muuta menettelytapaa tai olla käyttämättä vaiheittaista menettelytapaa, päätös on perusteltava.
 
Jos aineen ärsyttävyyttä tai syövyttävyyttä ei voida määrittää vaiheit ­
taisen menettelyn mukaisesti aiempien tulosten painoarvoanalyysin 
avulla, on syytä harkita  in vivo  -testiä (katso liite).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 240
 
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Ihoärsytys:  korjautuvan ihovaurion syntyminen enintään neljä tuntia 
kestäneen testiaineen annostelun jälkeen.  
Ihon syöpyminen:  korjautumattoman ihovaurion eli näkyvän orvas ­
keteen ja verinahkaan ulottuvan kuolion ilmaantuminen enintään 
neljä tuntia kestäneen aineen annostelun jälkeen. Tyypillisiä syöpy ­
misreaktioita ovat haavaumat, verenvuoto, veriset ruvet, 14 päivän tarkkailujakson lopussa ihon vaalenemisen aiheuttama värinmuutos, kokonaan kaljuuntuneet alueet ja arvet. Epäselvien vaurioiden ta ­
pauksessa olisi harkittava histopatologista tutkimusta.
 
1.3 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Testiaine annostellaan yhtenä annoksena koe-eläimen iholle; eläimen 
ihon käsittelemättömät alueet toimivat kontrollina. Ärsytyksen/ ­
syöpymisen aste todetaan ja pisteytetään määrävälein, ja vauriota kuvaillaan vaikutusten arvioinnin täydentämiseksi. Testin on kestet ­
tävä niin pitkään, että havaittujen vaikutusten korjautuvuus tai kor ­
jautumattomuus voidaan arvioida.
 
Eläimet, joissa havaitaan merkkejä jatkuvasta vakavasta stressistä 
ja/tai tuskista missä tahansa testin vaiheessa, on lopetettava inhimil ­
lisellä tavalla, ja tämä on otettava huomioon testiaineen arvioinnissa. 
Kuolevien ja kärsivien eläinten lopettamiskriteerit ovat lähteessä (8).  
1.4 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.4.1  In vivo  -testin valmistelu  
1.4.1.1  Eläinlajin valinta  
Suositeltava koe-eläinlaji on albiinokaniini. Kokeessa käytetään nuo ­
ria ja terveitä täysikasvuisia yksilöitä. Muiden lajien käyttö on pe ­
rusteltava.  
1.4.1.2  Eläinten valmistelu  
Noin 24 tuntia ennen testiä eläinten selkäpuolen karva ajetaan lyhy ­
eksi. Ihoa on varottava hankaamasta. Testissä voidaan käyttää vain 
eläimiä, joiden iho on terve ja vahingoittumaton.  
Joillakin kaniinikannoilla esiintyy tiheitä karvalaikkuja, jotka ovat 
tavallista voimakkaampia tiettyinä vuodenaikoina. Tällaisia tiheäkar ­
vaisia alueita ei pidä käyttää testikohtina.  
1.4.1.3  Eläinten häkit ja ruokinta  
Jokaisella eläimellä on oltava oma häkki. Koe-eläinhuoneen lämpö ­
tilan on oltava kaniineilla 20  o C (± 3  o C). Vaikka riittää, että suh ­
teellinen kosteus on vähintään 30 % eikä mielellään ylitä 70 %:a 
muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, pitäisi kuitenkin pyrkiä 50–60 %:n suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa täytyy käyttää kei ­
novalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). 
Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokava ­
liota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 241
 
1.4.2  Testin suoritus  
1.4.2.1  Testiaineen annostelu  
Testiaine annostellaan pienelle ihoalueelle (noin 6 cm  2 ) ja peitetään 
sideharsolapulla, joka kiinnitetään ihoa ärsyttämättömällä teipillä. Jos 
suora annostelu ei ole mahdollinen (esimerkiksi nesteiden tai joiden ­
kin tahnojen tapauksessa), testiaine annostellaan ensin sideharsolapu ­
lle, joka sitten asetetaan iholle. Lappu on pidettävä kevyessä koske ­
tuksessa ihoon sopivan, puolitiiviin siteen avulla koko altistusjakson 
ajan. Jos testiaine annostellaan lappuun, se on kiinnitettävä ihoon 
siten, että aine on hyvässä kosketuksessa ihoon ja leviää tasaisesti. Eläimen yltäminen lappuun ja testiaineen nieleminen tai sisäänhen ­
gittäminen on estettävä.
 
Nestemäisiä testiaineita käytetään yleensä laimentamattomina. Testat ­
taessa kiinteitä aineita (jotka voidaan tarvittaessa jauhaa) testiaine on 
kostutettava mahdollisimman pienellä määrällä vettä (tai tarvittaessa jollain muulla sopivalla kantaja-aineella), jotta saadaan hyvä ihokos ­
ketus. Jos käytetään muuta kantaja-ainetta kuin vettä, kantaja-aineen 
mahdollisen vaikutuksen testiaineen aiheuttamaan ihoärsytykseen pi ­
täisi olla olematon tai mahdollisimman vähäinen.
 
Tavallisesti neljän tunnin mittaisen altistusjakson lopussa ylimääräi ­
nen testiaine on poistettava, jos se on käytännössä mahdollista, ve ­
dellä tai sopivalla liuottimella muuttamatta orvaskeden senhetkistä 
vastetta tai eheyttä.  
1.4.2.2  Annostaso  
Testikohtaan annostellaan 0,5 ml nestettä tai 0,5 g kiinteää ainetta tai 
tahnaa.  
1.4.2.3  Alkutesti (ihoärsyttävyyden/-syövyttävyyden in vivo -testi yhdelle eläi ­
melle)  
On erittäin suositeltavaa suorittaa  in vivo  -testi aluksi yhdelle eläi ­
melle, erityisesti jos testiaineella arvellaan mahdollisesti olevan syö ­
vyttävä vaikutus. Tämä on vaiheittaisen menettelyn mukaista (katso 
liite 1).  
Kun aine on todettu syövyttäväksi aiempien tietojen painoarvoana ­
lyysin perusteella, eläinkokeita ei enää tarvita. Useimmille syövyttä ­
viksi epäillyille aineille  in vivo  -jatkotesti ei yleensä ole tarpeen. 
Tapauksissa, joissa lisätietoja katsotaan tarvittavan puutteellisten to ­
disteiden takia, rajoitettuja eläinkokeita voidaan kuitenkin tehdä seu ­
raavasti: Enintään kolme testilappua asetetaan yksi toisensa jälkeen eläimen iholle. Ensimmäinen niistä poistetaan kolmen minuutin ku ­
luttua. Jos vakavaa ihoreaktiota ei havaita, toinen lappu asetetaan 
iholle ja poistetaan tunnin kuluttua. Jos havainnot tässä vaiheessa 
osoittavat, että altistusta voidaan inhimillisesti jatkaa neljään tuntiin asti, kolmas lappu asetetaan paikoilleen ja poistetaan neljän tunnin kuluttua. Vaste pisteytetään.
 
Jos syövyttävä vaikutus havaitaan minkä tahansa kolmen peräkkäisen 
altistuksen aikana, testi lopetetaan heti. Jos syövyttävää vaikutusta ei 
havaita viimeisen lapun poistamisen jälkeen, eläintä tarkkaillaan 14 
päivän ajan, mikäli syöpymistä ei kehity sitä ennen.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 242
 
Jos testiaineen ei odoteta aiheuttavan syöpymistä vaan ärsytystä, 
eläimelle asetetaan yksi lappu neljän tunnin ajaksi.  
1.4.2.4  Vahvistustesti (ihoärsyttävyyden in vivo -testi useille eläimille)  
Jos alkutestissä ei havaita syövyttävää vaikutusta, ärsyttävyys tai 
negatiivinen vaste on vahvistettava testaamalla vielä kaksi eläintä. Kummallekin asetetaan lappu neljän tunnin altistusjakson ajaksi. 
Jos ärsyttävä vaikutus havaitaan alkutestissä, vahvistustesti voidaan 
tehdä peräkkäistestinä tai altistamalla kaksi lisäeläintä yhtäaikaisesti. Siinä poikkeustapauksessa, että alkutestiä ei tehdä, kahdelle tai kol ­
melle eläimelle voidaan asettaa yksi lappu, joka poistetaan neljän 
tunnin kuluttua. Kun käytetään kahta eläintä, lisätestiä ei tarvita, 
jos molemmilla esiintyy sama vaste. Muussa tapauksessa testataan myös kolmas eläin. Epäselvät vasteet täytyy mahdollisesti arvioida testaamalla lisää eläimiä.
 
1.4.2.5  Tarkkailujakso  
Tarkkailujakson on oltava riittävän pitkä havaittujen vaikutusten kor ­
jautuvuuden arvioimiseksi täydellisesti. Testi on kuitenkin lopetet ­
tava heti, jos eläin osoittaa jatkuvia kovien tuskien tai stressin merk ­
kejä. Vaikutusten korjautuvuuden määrittämiseksi eläimiä on tarkka ­
iltava enintään 14 päivän ajan lappujen poistamisen jälkeen. Jos 
korjautuvuus todetaan ennen kuin 14 päivää on kulunut, testi on lopetettava silloin.
 
1.4.2.6  Kliiniset havainnot ja ihoreaktioiden pisteytys  
Kaikista eläimistä tutkitaan eryteeman ja ödeeman merkit ja vasteet 
pisteytetään ensiksi 60 minuutin jälkeen ja sitten 24, 48 ja 72 tunnin kuluttua lapun poistamisesta. Yhdelle eläimelle tehtävän alkutestin jälkeen testikohta tutkitaan myös heti lapun poistamisen jälkeen. 
Ihoreaktiot pisteytetään ja kirjataan jäljempänä esitetyn taulukon as ­
teikon mukaan. Jos iholla esiintyy vaurioita, joita ei voida tunnistaa ärsytykseksi tai syöpymiseksi 72 tunnin kuluttua, voi olla tarpeen jatkaa havainnointia päivään 14 asti, jotta vaikutusten korjautuvuus 
voidaan todeta. Ärsytyksen lisäksi kaikki paikalliset toksiset vaiku ­
tukset, kuten ihon rasvan liukeneminen ja mitkä tahansa koko eli ­
mistöön kohdistuvat vaikutukset (esimerkiksi vaikutukset kliinisiin toksisuuden merkkeihin ja ruumiinpainoon), on kuvattava ja kirjat ­
tava täydellisesti. Epäselvien vaurioiden tapauksessa olisi harkittava 
histopatologista tutkimusta.
 
Ihovasteiden pisteytys on väistämättä subjektiivista. Ihovasteiden pis ­
teytyksen yhdenmukaistamiseksi sekä testilaboratorion ja havaintoja 
tekevien ja tulkitsevien henkilöiden työn helpottamiseksi havaintoja tekevän henkilöstön on oltava riittävän perehtynyttä pisteytysjärjes ­
telmään (katso jäljempänä olevaa taulukkoa). Kuvitettu opas ihoär ­
sytyksen ja muiden vaurioiden asteista voi olla hyödyllinen (9). Iho ­
vasteiden pisteytys on arvioitava sokkona.
 
2. MÄÄRITYSTULOKSET  
2.1 TULOSTEN ESITYSTAPA  
Tutkimuksen tulokset on esitettävä taulukkomuodossa lopullisessa 
testiselosteessa, ja niiden on sisällettävä kaikki kohdassa 3.1 luetellut 
asiat. ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 243
 
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI  
Ihoärsytyspisteet on arvioitava yhdessä vaurioiden luonteen ja vaka ­
vuuden sekä niiden korjautuvuuden tai korjautumattomuuden kanssa. Yksittäiset pisteet eivät edusta aineen ärsyttävyysominaisuuksien ab ­
soluuttista tasoa, koska testiaineen muutkin vaikutukset ovat arvioin ­
nissa mukana. Sen sijaan yksittäisiä pisteitä voidaan tarkastella vii ­
tearvoina, jotka on arvioitava kaikkien muiden tutkimuksessa tehty ­
jen havaintojen yhteydessä.
 
Ihovaurioiden korjautuvuus on otettava huomioon ärsytysvastetta ar ­
vioitaessa. Jos vasteet kuten kaljuuntuminen (suppealla alueella), lii ­
kasarveistuminen, liikakasvu ja hilseily jatkuvat 14 päivän tarkkailu ­
jakson loppuun asti, testiainetta voidaan pitää ihoa ärsyttävänä.  
3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
3.1 LOPPURAPORTTI  
Loppuraportissa on oltava seuraavat tiedot:  
Perustelut  in vivo  -testin tekemiselle: aiemmista tutkimuksista saa ­
tujen testitulosten painoarvoanalyysi, mukaan luettuina vaiheittaisen menettelyn tulokset:
 
— aiemmista testeistä saatujen relevanttien tulosten kuvaus,  
— testissä käytetyn menettelytavan kustakin vaiheesta saadut tulok ­
set, 
— kuvaus tehdyistä  in vitro  -testeistä, mukaan luettuina suoritusta 
koskevat yksityiskohtaiset tiedot ja testi-/vertailuaineesta saadut tulokset,
 
— painoarvoanalyysi  in vivo  -testiä varten.  
Testiaine:  
— tunnistetiedot (esimerkiksi CAS-numero, alkuperä, puhtaus, tun ­
netut epäpuhtaudet, eränumero)  
— fysikaalinen olomuoto ja fysikokemialliset ominaisuudet (esimer ­
kiksi pH, haihtuvuus, liukoisuus, stabiilius),  
— jos kyseessä on seos, sen koostumus ja ainesosien suhteellinen 
osuus.  
Kantaja-aine:  
— tunnistetiedot, konsentraatio (tilanteen mukaan), käytetty tilavuus,  
— perustelut kantaja-aineen valinnalle.  
Koe-eläin:  
— käytetty laji ja kanta, perustelut muiden eläinten kuin albiinoka ­
niinien käytölle,  
— uros- ja naaraseläinten määrä,  
— eläinyksilöiden paino testin alussa ja lopussa,  
— eläinten ikä testin alussa,  
— eläinten alkuperä, häkkijärjestelyt, ruokavalio ja niin edelleen.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 244
 
Testiolosuhteet:  
— lapun asetuskohdan valmistelu,  
— tiedot lapun materiaalista ja asetustekniikasta,  
— tiedot testiaineen valmistelusta, annostelusta ja iholta poistami ­
sesta.  
Tulokset:  
— kunkin eläimen ärsytys-/syöpymisvasteen pisteytys jokaiselta mit ­
tauskerralta taulukkomuodossa,  
— havaittujen vaurioiden kuvaus,  
— sanallinen kuvaus havaitun ärsytyksen/syöpymisen luonteesta ja 
asteesta sekä mahdolliset histopatologiset löydökset,  
— kuvaus muista paikallisista haittavaikutuksista (esimerkiksi ihon 
rasvan liukeneminen) ja ihoärsytyksen/-syöpymisen lisäksi koko elimistöön kohdistuvat vaikutukset,
 
tulosten pohdinta.  
4. LÄHDELUETTELO  
(1) Barratt, M. D., Castell, J. V., Chamberlain, M., Combes, R. D., 
Dearden, J. C, Fentem, J. H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T. J. B., Livingston, D. J., Provan, W. M., Rutten, F. A. J. J. L., Verhaar, H. J. M., Zbinden, P. (1995). The Integrated Use of 
Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM 
Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429.
 
(2) Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth W. M. H. 
(1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Prepa ­
rations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Tes ­
ting on Animals. Toxicol. I n Vitro,  2, 19–26.  
(3) Worth, A. P., Fentem, J. H., Balls, M., Botham, P. A., Curren, 
R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Liebsch, M. (1998). Evalua ­
tion of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709–720.
 
(4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, ”Skin Irritation”, Euro ­
pean Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brys ­
sel. 
(5) Fentem, J.H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., 
Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhutter, H. G. 
and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation 
study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, 483–524.
 
(5a) Testimenetelmä B.40 Skin Corrosion.  
(6) OECD (1996). OECD Test Guidelines Programme: Final Re ­
port of the OECD Workshop on Harmonization of Validation 
and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test 
Methods. Pidetty Solnassa, Ruotsissa 22.–.24. tammikuuta 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm).
 
(7) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Che ­
mical Substances, as endorsed by the 28  th Joint Meeting of the 
Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, 
marraskuu 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 245
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, As ­
sessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for 
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD En ­
vironmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/ ­
monos.htm).
 
(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions,  (20T-2004).  United Sta ­
tes Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, elokuu 1990.
 
(Saatavana OECD:n sihteeristöltä pyydettäessä.)  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 246
 
Taulukko I  
IHOREAKTIOIDEN PISTEYTYS  
Eryteeman ja karstan muodostus  
Ei eryteemaa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Hyvin lievä eryteema (tuskin havaittava) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Selkeästi erottuva eryteema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Keskivakava — vakava eryteema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Vakava eryteema (voimakas punoitus) — karsta, joka estää eryteeman 
pisteytyksen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
 
Suurin mahdollinen pistemäärä: 4  
Ödeeman (turvotuksen) muodostus  
Ei ödeemaa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Hyvin lievä ödeema (tuskin havaittava) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Lievä ödeema (selvärajainen alue, jonka reunat ovat koholla) . . . . . . . . 2 Keskivakava ödeema (noin 1 mm koholla) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Vakava ödeema (enemmän kuin 1 mm koholla ja levinnyt altistuskohtaa 
laajemmalle) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
 
Suurin mahdollinen pistemäärä: 4  
Epäselvien vaurioiden tapauksessa voidaan tehdä histopatologinen tutkimus.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 247
 
LIITE  
Ihoärsyttävyyden ja -syövyttävyyden vaiheittainen testaus  
YLEISIÄ NÄKÖKOHTIA  
Sekä järkevien tieteellisten menettelytapojen että eläinten hyvinvoinnin vuoksi on 
tärkeää välttää tarpeettomia eläinkokeita ja tehdä mahdollisimman vähän sellaisia 
testejä, jotka todennäköisesti aiheuttavat eläimissä vakavia vasteita. Ennen  in vivo  
-testin suunnittelemista on arvioitava kaikki tiedot testiaineen mahdollisesta ihoärsyttävyydestä/-syövyttävyydestä. Riittävät todisteet testiaineen ihoärsyttävyyden/-syövyttävyyden luokittelemiseksi voivat jo olla olemassa, jol ­
loin koe-eläintestejä ei tarvita. Painoarvoanalyysin ja vaiheittaisen menettelyn 
käyttö vähentää  in vivo  -testien tarvetta, erityisesti jos on todennäköistä, että 
testiaine aiheuttaa vakavia reaktioita.
 
On suositeltavaa arvioida aineiden ihoärsyttävyydestä ja -syövyttävyydestä saa ­
tavissa olevien tietojen painoarvo, jotta voidaan päättää, tarvitaanko aineen iho ­
ärsytyspotentiaalin määrittämiseksi muita testejä kuin  in vivo  -ihotesti. Jos muita 
testejä tarvitaan, on suositeltavaa käyttää vaiheittaista menettelyä relevanttien koetulosten hankkimiseksi. Jos ainetta ei ole aikaisemmin testattu, vaiheittaisen 
menettelyn avulla voidaan hankkia ihoärsyttävyyden/-syövyttävyyden arviointiin 
tarvittavat tulokset. Tässä liitteessä kuvattu testimenettely on kehitetty OECD:n seminaarissa (1), ja se on vahvistettu ja laajennettu myöhemmin järjestelmässä  
Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and 
Environmental Effects of Chemical Substances,  sellaisena kuin se vahvistettiin 
kemikaalikomitean ja kemikaalityöryhmän 28. yhteisessä kokouksessa marras ­
kuussa 1998 (2).
 
Vaikka tämä vaiheittainen testausstrategia ei ole olennainen osa testimenetelmää 
B.4, siinä kuvataan suositeltavaa lähestymistapaa aineen ihoärsyttävyys-/ ­
-syövyttävyysominaisuuksien määrittämiseen. Tämä lähestymistapa edustaa sekä parhaita käytäntöjä että eettistä vertailukohdetta ihoärsyttävyyden/-syövyttävyy ­
den in vivo  -testauksessa. Siinä annetaan ohjeita  in vivo  -testin suorittamiseen ja 
esitetään yhteenveto tekijöistä, jotka on käsiteltävä ennen testin aloittamista. 
Strategia tarjoaa lähestymistavan aiemmin saatujen tulosten arviointiin testiaineen ihoärsyttävyys-/-syövyttävyysominaisuuksien selvittämiseksi, ja sen avulla voi ­
daan vaihe vaiheelta tuottaa merkitseviä tuloksia aineista, joista tarvitaan lisätie ­
toja tai joita ei ole aikaisemmin tutkittu. Strategiassa suositellaan myös tietyissä 
tapauksissa käyttämään validoituja ja hyväksyttyjä  in vitro- tai ex vivo  -testejä 
ihoärsyttävyyden/-syövyttävyyden toteamiseksi.
 
ARVIOINTI- JA TESTAUSSTRATEGIAN KUVAUS  
Ennen vaiheittaiseen menettelyyn sisältyvien testien suorittamista (kaavio) on 
analysoitava kaikki saatavissa olevat tiedot, jotta  in vivo  -ihotestauksen tarve 
voidaan määrittää. Vaikka yksittäisistä parametreista (esimerkiksi äärimmäiset pH-arvot) voidaan saada merkitseviä tietoja, on syytä ottaa huomioon tulokset 
kokonaisuudessaan. Kaikkien kyseessä olevan aineen tai sen kaltaisten aineiden 
vaikutusta koskevien tietojen painoarvo on arvioitava testauspäätöksen yhteydes ­
sä, ja päätökselle on esitettävä perustelut. Ensisijaisesti on painotettava sekä ihmisillä että eläimillä aiemmin saatuja tuloksia ja seuraavaksi  in vitro-  tai ex 
vivo -testien tuloksia. Syövyttävien aineiden in  vivo  -testejä on vältettävä aina 
kun se on mahdollista. Testimenettelyssä on otettava huomioon seuraavat asiat:
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 248
 
Ihmisillä ja eläimillä aiemmin saatujen tulosten arviointi (vaihe 1).  Aiemmat 
ihmisillä saadut tulokset, esimerkiksi kliiniset tai työperäiseen altistukseen liitty ­
vät tutkimustulokset ja tapausselostukset ja/tai eläinkokeiden tulokset, esimerkiksi yksittäisten tai toistettujen ihoaltistustestien tulokset, on otettava ensiksi huomi ­
oon, koska niistä saadaan suoraan aineen ihovaikutuksiin liittyviä tietoja.  In vivo  
-testejä ei tarvitse tehdä aineille, joiden ärsyttävyys tai syövyttävyys tiedetään, 
eikä aineille, joista on selvästi todistettu, että ne eivät ole ärsyttäviä tai syövyt ­
täviä.
 
Rakenne —aktiivisuusanalyysi (SAR) (vaihe 2).  Jos saatavilla on rakenteellisesti 
samankaltaisten aineiden testituloksia, ne on otettava huomioon. Kun rakenteel ­
lisesti samankaltaisista aineista tai niitä sisältävistä seoksista on saatavilla riittä ­
västi ihmisillä tehtyjen testien ja eläinkokeiden tuloksia, jotka osoittavat niiden ihoärsyttävyys-/-syövyttävyyspotentiaalin, voidaan olettaa, että arvioitava testi ­
aine tuottaa samanlaiset vasteet. Tällaisessa tapauksessa ainetta ei kenties tarvitse 
testata. Negatiiviset tulokset rakenteellisesti samankaltaisten aineiden tai sellai ­
sista aineista koostuvien seosten tutkimuksista eivät vaiheittaisessa menettelyssä ole riittävä todiste siitä, että aine ei ole ihoa ärsyttävä tai syövyttävä. Ihoärsyttä ­
vyys ja -syövyttävyys on selvitettävä validoitujen ja hyväksyttyjen SAR-mene ­
telmien avulla.
 
Fysikokemialliset ominaisuudet ja kemiallinen reaktiivisuus (vaihe 3).  Aineella, 
jolla esiintyy äärimmäisiä pH-arvoja, kuten ≤ 2,0 ja ≥ 11,5, voi olla voimakkaita 
paikallisvaikutuksia. Jos aine määritetään ihoa syövyttäväksi äärimmäisen pH- 
arvon perusteella, sen happo-/emäsreservi (eli puskurointikyky) voidaan myös 
ottaa huomioon (3) (4). Jos puskurointikyky viittaa siihen, että aine  ei ole ihoa 
syövyttävä, tämän vahvistamiseksi on tehtävä jatkotesti, jonka on ensisijaisesti 
oltava validoitu ja hyväksytty  in vitro-  tai ex vivo  -testi (katso vaiheet 5 ja 6).  
Toksisuus iholla (vaihe 4).  Jos aine on todettu erittäin toksiseksi ihon kautta 
annosteltuna, ihoärsyttävyyden/-syövyttävyyden testaaminen  in vivo  -testillä ei 
kenties ole järkevää, koska tavallisesti käytetty testiainemäärä voi ylittää erittäin toksisen annoksen ja siten johtaa eläinten kuolemaan tai vakaviin kärsimyksiin. 
Jos lisäksi toksisuuden ihotestejä albiinokaniineilla on jo tehty raja-annosarvoon 
2 000 mg/ruumiinpainokilo tai sitä suurempaan arvoon eikä ihoärsytystä tai -syö ­
pymistä ole havaittu, ihoärsyttävyyden/-syövyttävyyden lisätestaus ei kenties ole tarpeen. Joitakin seikkoja on syytä pitää mielessä arvioitaessa aiempien tutkimus ­
ten tuloksia akuutista toksisuudesta iholla. Esimerkiksi ihovaurioista raportoidut 
tiedot voivat olla puutteellisia. Testeissä ja havainnoinnissa on saatettu käyttää muuta eläinlajia kuin kaniinia, ja eri eläinlajien vasteherkkyys poikkeaa toisistaan 
suuresti. Niin ikään eläimille annosteltu testiaine ei välttämättä ole ollut sopivassa 
muodossa ihoärsyttävyyden/-syöpymisen arvioimiseksi (esimerkiksi aineiden lai ­
mentaminen toksisuuden testaamiseksi iholla (5)). Tapauksissa, joissa hyvin suunnitellut ja toteutetut ihotoksisuutta tutkivat testit on tehty kaniineille, negatii ­
viset löydökset voidaan kuitenkin katsoa riittäviksi todisteiksi siitä, että aine ei 
ole syövyttävä eikä ärsyttävä.
 
In vitro- tai ex vivo -testien tulokset (vaiheet 5 ja 6).  Aineita, joilla on todettu 
olevan syövyttäviä tai vakavasti ärsyttäviä ominaisuuksia validoiduissa ja hyväk ­
sytyissä, nimenomaan näiden ominaisuuksien mittaamista varten kehitetyissä  in 
vitro-  tai ex vivo  -testeissä (6) (7), ei tarvitse testata eläimillä. Voidaan olettaa, 
että tällaiset aineet aiheuttavat samoja vaikutuksia  in vivo - testeissä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 249
 
In vivo -testi kaniineilla (vaiheet 7 ja 8).  Jos painoarvoanalyysin jälkeen pää ­
tetään toteuttaa  in vivo  -testi, se on aloitettava testaamalla ensin yksi eläin. Jos 
tämän testin tulokset osoittavat, että aine on ihoa syövyttävä, jatkotestiä ei pidä tehdä. Jos alkutestissä ei todeta syövyttävää vaikutusta, ärsyttävyys tai negatii ­
vinen vaste on vahvistettava testaamalla vielä enintään kaksi eläintä neljän tunnin 
altistusjakson ajan. Jos alkutestissä todetaan ihoa ärsyttävä vaikutus, vahvistus ­
testi voidaan toteuttaa peräkkäistestinä tai altistamalla mainitut kaksi eläintä sa ­
manaikaisesti.
 
LÄHDELUETTELO  
1) OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD 
Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Al ­
ternative Toxicological Test Methods. Pidetty Solnassa, Ruotsissa, 22.–24. tammikuuta 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm).
 
2) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Hu ­
man Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed 
by the 28  th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working 
Party on Chemicals, marraskuu 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/ HCL6.htm).
 
3) Worth, A. P., Fentem J. H., Balls M., Botham P. A., Curren R. D., Earl L. 
K., Esdaile D. J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709–720.
 
4) Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth, W. M. H. (1988). Clas ­
sification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic 
or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2 (1) 
s. 1926.  
5) Patil, S. M., Patrick, E., Maibach, H. I. (1996). Animal, Human, and In 
Vitro Test Methods for Predicting Skin Irritation teoksessa Francis N. Mar ­
zulli and Howard I. Maibach (toim.): Dermatotoxicology. Viides painos. 
ISBN 1-56032-356-6, luku 31, 411–436.  
6) Testimenetelmä B.40.  
7) Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., 
Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 
2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, 
s. 483–524.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 250
 
Kaavio  
IHOÄRSYTTÄVYYDEN/SYÖVYTTÄVYYDEN TESTAUS- JA ARVIOINTIMENETTELY
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 251
 
B.5. AKUUTTI TOKSISUUS: SILMÄN ÄRSYTTÄVYYS/SYÖVYTTÄ ­
VYYS  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä on toisinto OECD:n testiohjeesta nro 405 (2002).  
1.1 JOHDANTO  
Tämän päivitetyn testimenetelmän valmistelun yhteydessä on erityi ­
sesti pyritty ottamaan huomioon kaikkien testiaineesta aiemmin saa ­
tujen tietojen arviointi ja eläinten hyvinvointiin liittyvät näkökohdat, jotta voidaan välttää tarpeettomia eläinkokeita. Tässä menetelmässä esitetään suositus, että ennen tässä kuvatun, akuuttia silmä- 
ärsyttävyyttä/syövyttävyyttä tutkivan  in vivo  -testin toteuttamista on 
arvioitava aiempien relevanttien tutkimustulosten painoarvo (1). Jos saatavissa olevat tiedot ovat puutteellisia, niitä voidaan täydentää vaiheittaisen menettelyn avulla (2) (3). Suositeltava testausstrategia, 
joka on selostettu tämän menetelmän liitteessä, sisältää validoitujen 
ja hyväksyttyjen  in vitro  -testien suorittamisen. Lisäksi suositellaan, 
että ennen  in vivo  -silmätestin tekemistä tehdään  in vivo  -ihoärsyttä ­
vyys-/-syövyttävyystesti silmäsyövytyksen ennustamiseksi.
 
Sekä järkevien tieteellisten menettelytapojen että eläinten hyvinvoin ­
nin vuoksi  in vivo  -testiä ei pidä suorittaa ennen kuin kaikkien saa ­
tavissa olevien testiaineen mahdolliseen silmä-ärsyttävyyteen/ ­
syövyttävyyteen liittyvien tietojen painoarvo on arvioitu. Tällaisia tietoja ovat todisteet aiemmista ihmisille ja/tai koe-eläimille tehdyistä 
tutkimuksista, todisteet yhden tai usean rakenteellisesti samankaltai ­
sen aineen tai ainetta sisältävän seoksen ärsyttävyydestä/ ­
syövyttävyydestä, aineen voimakasta happamuutta tai emäksisyyttä osoittavat tulokset (4) (5) sekä validoidut ja hyväksytyt  in vitro-  
tai ex vivo - ihoärsyttävyys-/-syövyttävyystestit (6) (6a). Tutkimukset 
voivat olla painoarvoanalyysia aiemmin tehtyjä tai sen tuloksena syntyneitä.
 
Joidenkin aineiden kohdalla painoarvoanalyysi voi osoittaa, että  in 
vivo -testi on tarpeen aineen mahdollisen silmä-ärsyttävyyden/-syö ­
vyttävyyden selvittämiseksi. Kaikissa sellaisissa tapauksissa on en ­
nen in vivo  -silmätestin harkitsemista suositeltavaa tehdä ensin  in 
vivo -ihotesti ihovaikutusten selvittämiseksi ja arvioida se testimene ­
telmän B.4 mukaan (7). Painoarvoanalyysi ja vaiheittainen menettely 
vähentävät tarvetta  in vivo  -testeihin silmä-ärsyttävyyden/-syövyttä ­
vyyden selvittämiseksi aineilla, joiden ominaisuuksista muut tutki ­
mukset ovat jo tuottaneet riittävästi todisteita. Jos aineen silmä- ärsyttävyyttä/-syövyttävyyttä ei voida määrittää vaiheittaisen menet ­
telyn avulla eikä edes  in vivo  -ihotestin jälkeen,  in vivo  -silmätesti 
voidaan tehdä.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 252
 
Suositeltava tapa toteuttaa vaiheittainen menettely, johon sisältyy 
validoituja ja hyväksyttyjä  in vitro-  tai  ex vivo  -testejä 
ärsyttävyyden/syövyttävyyden selvittämiseksi, selostetaan tämän me ­
netelmän liitteessä. Tämä menettelytapa kehitettiin OECD:n seminaa ­
rissa (8), jonka osanottajat suosittelevat sitä yksimielisesti, ja hyväk ­
syttiin suositeltavaksi testimenettelyksi Globally Harmonised System 
for the Classification of Chemical Substances (GHS) -kokouksessa (9). Vaikka tämä menettely ei olekaan olennainen osa testimenetel ­
mää B.4, sen käyttöä suositellaan ennen  in vivo  -testin suorittamista. 
Uusia aineita testattaessa se on suositeltava vaiheittainen menettely ­
tapa, jonka avulla voidaan kehittää tieteellisesti päteviä tuloksia ai ­
neen ärsyttävyydestä/syövyttävyydestä. Sellaisten aineiden kohdalla, joiden iho- ja silmä-ärsyttävyydestä/-syövyttävyydestä ei ole riittä ­
västi tietoja, menettelytapaa voidaan käyttää puuttuvien tietojen 
hankkimiseen. Jos päätetään käyttää jotain muuta menettelytapaa tai olla käyttämättä vaiheittaista menettelytapaa, päätös on perustel ­
tava.
 
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Silmä-ärsytys:  silmän muutokset, jotka syntyvät, kun testiainetta on 
annosteltu silmän etupinnalle, ja korjautuvat täysin 21 päivän kulu ­
essa annostelusta.  
Silmän syöpyminen:  silmän kudosvauriot tai vakava fyysinen näön 
rappeutuminen, joka syntyy, kun testiainetta on annosteltu silmän etupinnalle, eikä se korjaudu täysin 21 päivän kuluessa annostelusta.
 
1.3 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Testiaine annostellaan yhtenä annoksena koe-eläimen toiseen 
silmään. Käsittelemätön silmä toimii kontrollina. Silmän ärtymisen/ syöpymisen aste arvioidaan pisteyttämällä sidekalvon, sarveiskalvon ja värikalvon vammat tietyin väliajoin. Muut silmään kohdistuvat 
vaikutukset ja koko elimistöön kohdistuvat haittavaikutukset kuva ­
taan myös, jotta vaikutuksia voidaan arvioida kokonaisuudessaan. Testin on kestettävä niin pitkään, että havaittujen vaikutusten korjau ­
tuvuus tai korjautumattomuus voidaan arvioida.
 
Eläimet, joissa havaitaan merkkejä jatkuvasta vakavasta stressistä ja/tai 
tuskista missä tahansa testin vaiheessa, on lopetettava inhimillisellä tavalla, ja tämä on otettava huomioon testiaineen arvioinnissa. Kuole ­
vien ja kärsivien eläinten lopettamiskriteerit ovat lähteessä (10).
 
1.4 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.4.1  In vivo  -testin valmistelu  
1.4.1.1  Eläinlajin valinta  
Suositeltava koe-eläinlaji on albiinokaniini. Kokeessa käytetään nuo ­
ria ja terveitä täysikasvuisia yksilöitä. Muiden lajien käyttö on pe ­
rusteltava.  
1.4.1.2  Koe-eläinten valmistelu  
Kunkin alustavasti testiin valitun koe-eläimen molemmat silmät tut ­
kitaan testin alkua edeltävän 24 tunnin aikana. Eläimiä, joilla esiin ­
tyy silmien ärtyneisyyttä, silmävikoja tai aiempia sarveiskalvon vau ­
rioita, ei voi käyttää testissä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 253
 
1.4.1.3  Eläinten häkit ja ruokinta  
Jokaisella eläimellä on oltava oma häkki. Koe-eläinhuoneen lämpö ­
tilan on oltava kaniineilla 20  o C (± 3  o C). Vaikka riittää, että suh ­
teellinen kosteus on vähintään 30 % eikä mielellään ylitä 70 %:a 
muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, pitäisi kuitenkin pyrkiä 
50–60 %:n suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa tulee käyttää keinov ­
alaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokava ­
liota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa.
 
1.4.2  Testimenettely  
1.4.2.1  Testiaineen annostelu  
Eläimen alaluomea vedetään varovasti silmämunasta poispäin ja tes ­
tiaine annostellaan eläimen toisen silmän sidekalvopussiin. Sen jäl ­
keen luomia pidetään varovasti yhdessä sekunnin ajan, jotta aine ei 
valuisi ulos silmästä. Toinen silmä, jota ei käsitellä, toimii kontrol ­
lina. 
1.4.2.2  Huuhtelu  
Koe-eläinten silmiä ei saa pestä vähintään 24 tuntiin testiaineen an ­
nostelun jälkeen, paitsi jos kyseessä on kiinteä aine (katso kohta 1.4.2.3.2) tai välitön ärsyttävä tai syövyttävä vaikutus. Silmät voi ­
daan pestä 24 tunnin kuluttua, jos se katsotaan tarpeelliseksi.
 
Pesemisen vaikutuksen selvittämiseksi ei suositella kontrolliryhmää, 
paitsi jos sille on tieteellisiä perusteita. Jos kontrolliryhmä tarvitaan, käytetään kahta kaniinia. Pesuolosuhteet on dokumentoitava tarkasti, 
esimerkiksi pesuaika, pesuliuoksen koostumus ja lämpötila, pesun 
kesto, nesteen tilavuus ja virtausnopeus.
 
1.4.2.3  Annostaso  
1.4.2.3.1  Nesteiden testaus  
Testattaessa nesteitä testiannos on 0,1 ml. Ainetta ei saa annostella 
suoraan suihkepumpusta silmään. Nestesuihke on ensin kerättävä 
astiaan ennen 0,1 ml:n annostelua silmään.  
1.4.2.3.2  Kiinteiden aineiden testaus  
Testattaessa kiinteitä aineita, tahnoja ja hiukkasmaisia aineita annok ­
sen tilavuuden on oltava 0,1 ml tai painon enintään 100 mg. Testi ­
aine jauhetaan hienoksi pölyksi. Kiinteän aineen tilavuus mitataan, 
kun aine on ensin kevyesti tiivistetty esimerkiksi naputtamalla mitta- astiaa. Jos kiinteä aine ei ole poistunut koe-eläimen silmästä fysio ­
logisten mekanismien seurauksena ensimmäiseen havainnointiaikaan 
mennessä eli tunnin kuluttua käsittelystä, silmä voidaan huuhdella 
fysiologisella suolaliuoksella tai tislatulla vedellä.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 254
 
1.4.2.3.3  Aerosolien testaus  
On suositeltavaa kerätä kaikki pumpattavat suihkeet ja aerosolit en ­
nen niiden annostelua silmään. Ainoa poikkeus ovat paineistetuissa 
aerosolisäiliöissä olevat aineet, joita ei voida kerätä höyrystymisen takia. Sellaisessa tapauksessa silmää pidellään auki ja testiaine an ­
nostellaan silmään yhtenä sekunnin kestävänä purskauksena 10 cm:n 
etäisyydeltä suoraan silmän edestä. Välimatka voi vaihdella suihke ­
säiliön paineen ja sisällön mukaan. On varottava, ettei suihkesäiliön paine vahingoita silmää. Joissakin tapauksissa voi olla syytä arvioida suihkeen voimakkuuden silmälle mahdollisesti aiheuttamat ”mekaa ­
niset” vauriot.
 
Aerosoliannoksen suuruus voidaan arvioida simuloimalla testiä seu ­
raavalla tavalla. Testiaine suihkutetaan punnituspaperille suoraan pa ­
perin edessä olevasta kaniinin silmän kokoisesta aukosta. Paperin 
painon lisäyksen avulla arvioidaan silmään suihkutettu määrä. Haih ­
tuvien aineiden tapauksessa annoksen suuruus voidaan arvioida pun ­
nitsemalla keräysastia ennen ja jälkeen testiaineen poistamisen.  
1.4.2.4  Alkutesti (in vivo -silmä-ärsyttävyys/syövyttävyystesti yhdelle eläimelle)  
Vaiheittaisen menettelyn mukaan (katso liite 1) on erittäin 
suositeltavaa suorittaa  in vivo  -testi aluksi vain yhdelle eläimelle.  
Jos testitulos osoittaa, että aine on silmää syövyttävä tai vakavasti 
ärsyttävä kuvattua menettelyä käytettäessä, silmän ärtymistä ei pidä enää testata.
 
1.4.2.5  Paikallispuudutusaineet  
Paikallispuudutusainetta voidaan käyttää tapauskohtaisesti. Jos paino ­
arvoanalyysi tai vaiheittainen menettely osoittaa, että aine saattaa aiheuttaa tuskia, tai jos alkutestissä on todettu kipureaktio, paikallis ­
puudutusainetta voidaan antaa ennen testiaineen annostelua. Paikal ­
lispuudutusaineen laji, konsentraatio ja annos on valittava huolelli ­
sesti, jotta varmistetaan, että erot testiaineen aiheuttamissa reaktioissa eivät johdu puudutusaineesta. Testiaineella käsittelemätön silmä on puudutettava samalla tavoin.
 
1.4.2.6  Vahvistustesti (in vivo -silmä-ärsyttävyystesti useille eläimille)  
Jos alkutestissä ei havaita syövyttävää vaikutusta, ärsyttävyys tai 
negatiivinen vaste on vahvistettava testaamalla vielä enintään kaksi eläintä. Jos alkutestissä todetaan voimakas ärsyttävä vaikutus, joka viittaa mahdolliseen voimakkaaseen (korjautumattomaan) vaikutuk ­
seen vahvistustestissä, on suositeltavampaa tehdä vahvistustesti vai ­
heittaisen menettelyn mukaan yhdelle eläimelle kerrallaan kuin altis ­
taa uudet kaksi eläintä samalla kertaa. Jos toisella eläimellä esiintyy syöpymisoireita tai vakavia ärsytysoireita, testiä ei jatketa. Heikon tai 
keskinkertaisen ärsyttävän vaikutuksen vahvistamiseksi saattaa olla 
tarpeen testata useampia eläimiä.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 255
 
1.4.2.7  Tarkkailujakso  
Tarkkailujakson on oltava riittävän pitkä havaittujen vaikutusten voi ­
makkuuden ja korjautuvuuden arvioimiseksi täydellisesti. Testi on kuitenkin lopetettava heti, jos eläin osoittaa jatkuvia kovien tuskien 
tai stressin merkkejä (9). Vaikutusten korjautuvuuden määrittämi ­
seksi eläimiä on tarkkailtava tavallisesti 21 päivän ajan testiaineen antamisen jälkeen. Jos korjautuvuus todetaan ennen kuin 21 päivää on kulunut, testi on lopetettava silloin.
 
1.4.2.7.1  Kliiniset havainnot ja silmäreaktioiden pisteytys  
Silmät tutkitaan 1, 24, 48 ja 72 tuntia testiaineen annostelun jälkeen. 
Eläintä ei saa pitää testattavana sen jälkeen kun lopulliset tiedot on saatu. Eläimet, jotka osoittavat jatkuvia stressin tai vakavien tuskien 
merkkejä, on viipymättä lopetettava inhimillisellä tavalla, ja tämä on 
otettava huomioon testiaineen vaikutusten arvioinnissa. Inhimillisellä tavalla on lopetettava eläimet, joilla esiintyy testiaineen annostelun jälkeen seuraavia silmävammoja: sarveiskalvon puhkeaminen tai 
huomattava sarveiskalvon haavauma mukaan luettuna pullistuma, 
verta silmän etukammiossa, asteen 4 sarveiskalvosamentuma, joka jatkuu 48 tuntia, valorefleksin puuttuminen (värikalvon vaste 2), joka jatkuu 72 tuntia, sidekalvon haavauma, sidekalvon tai vilkku ­
kalvon kuolio tai arpeutuminen. Näin menetellään siksi, että kyseiset 
vauriot ovat yleensä korjautumattomia.
 
Eläimet, joille ei kehity silmävammoja, voidaan lopettaa aikaisintaan 
kolme päivää testiaineen annostelun jälkeen. Eläimiä, joilla esiintyy lieviä tai keskinkertaisia vaurioita, on tarkkailtava, kunnes vauriot 
häviävät, tai 21 päivää, jolloin testi lopetetaan. Havainnot on tehtävä 
päivinä 7, 14 ja 21, jotta voidaan määrittää vaurioiden tila ja niiden korjautuvuus tai korjautumattomuus.
 
Silmäreaktioiden (sidekalvon, sarveiskalvon ja värikalvon) asteet on 
kirjattava joka kerta, kun eläintä tutkitaan (taulukko I). Kaikki muut 
silmävauriot (esimerkiksi sarveiskalvoverho, värjäytyminen) tai koko 
elimistöön kohdistuvat haittavaikutukset on myös raportoitava.  
Reaktioiden tutkimista helpottaa luuppilasien, lampun, biomikrosko ­
opin tai muiden sopivien laitteiden käyttö. Kun havainnot on kirjattu 24 tunnin jälkeen, silmiä voidaan edelleen tutkia fluoreskeiinin avulla.
 
Silmävasteiden pisteytys on väistämättä subjektiivista. Silmävastei ­
den pisteytyksen yhdenmukaistamiseksi sekä testilaboratorion ja ha ­
vaintoja tekevien ja tulkitsevien henkilöiden työn helpottamiseksi havaintoja tekevän henkilöstön on oltava riittävän perehtynyttä pis ­
teytysjärjestelmään. Silmävasteiden pisteytys on arvioitava sokkona.
 
2. MÄÄRITYSTULOKSET  
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI  
Silmä-ärsytyspisteet on arvioitava yhdessä vammojen luonteen ja 
vakavuuden sekä niiden korjautuvuuden tai korjautumattomuuden 
kanssa. Yksittäiset pisteet eivät edusta aineen ärsyttävyysominaisuuk ­
sien absoluuttista tasoa, koska testiaineen muutkin vaikutukset ovat arvioinnissa mukana. Sen sijaan yksittäisiä pisteitä pitäisi tarkastella 
viitearvoina, jotka ovat merkitseviä vain, kun kaikki muut havainnot 
ja niiden arviointi tukevat pisteiden antamaa tietoa.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 256
 
3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
3.1 LOPPURAPORTTI  
Loppuraportissa on annettava seuraavat tiedot:  
Perustelut  in vivo  -testin tekemiselle: aiemmista tutkimuksista saa ­
tujen testitulosten painoarvon analyysi, mukaan luettuna vaiheittaisen 
menettelyn tulokset:  
— aiemmista testeistä saatujen relevanttien tulosten kuvaus,  
— testimenettelyn kustakin vaiheesta saadut tulokset,  
— kuvaus tehdyistä  in vitro  -testeistä, mukaan luettuna niiden suo ­
rittamistapa ja testi-/viiteaineesta saadut tulokset,  
— kuvaus tehdyistä  in vivo  -ihoärsyttävyys/-syövyttävyystesteistä 
sekä niiden tulokset,  
— painoarvoanalyysi  in vivo  -testiä varten.  
Testiaine:  
— tunnistetiedot (esimerkiksi CAS-numero, alkuperä, puhtaus, tun ­
netut epäpuhtaudet, eränumero),  
— fysikaalinen olomuoto ja fysikokemialliset ominaisuudet (esimer ­
kiksi pH, haihtuvuus, liukoisuus, stabiilius, reaktiivisuus veden 
kanssa),  
— jos kyseessä on seos, sen koostumus ja ainesosien suhteellinen 
osuus,  
— jos on käytetty paikallispuudutusainetta, sen tunnistetiedot, puh ­
taus, laji, annos ja mahdollinen vuorovaikutus testiaineen kanssa.  
Kantaja-aine:  
— tunnistetiedot, konsentraatio (tilanteen mukaan), käytetty tilavuus,  
— perustelut kantaja-aineen valinnalle.  
Koe-eläimet:  
— käytetty laji ja kanta, perustelut muiden eläinten kuin albiinoka ­
niinien käytölle,  
— eläinten ikä testin alussa,  
— uros- ja naaraseläinten määrä testi- ja kontrolliryhmissä (jos tar ­
peen),  
— eläinyksilöiden paino testin alussa ja lopussa,  
— eläinten alkuperä, häkkijärjestelyt, ruokavalio ja niin edelleen.  
Tulokset:  
— kuvaus ärsytyksen pisteytyksessä käytetystä välineestä kullakin 
havaintokerralla (esimerkiksi lamppu, biomikroskooppi, fluores ­
keiini),  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 257
 
— taulukkomuotoiset tiedot kunkin eläimen ärsytys-/ 
syöpymisvasteesta kullakin havaintokerralla siihen asti, kun eläin 
on poistettu testistä,  
— sanallinen kuvaus havaitun ärsytyksen/syöpymisen luonteesta ja 
asteesta,  
— kuvaus kaikista silmässä havaituista vaurioista (esimerkiksi veri ­
suonittuminen, sarveiskalvoverhon muodostus, umpeen muurau ­
tuminen, värjäytyminen),  
— kuvaus muualle kuin silmään kohdistuvista vaurioista sekä koko 
elimistöön kohdistuvista haittavaikutuksista ja mahdolliset histo ­
patologiset löydökset.  
Tulosten pohdinta.  
3.2 TULOSTEN TULKINTA  
Koe-eläimille tehtyjen silmä-ärsytystestien tulosten ekstrapolointi ih ­
misiä koskeviksi on vain rajoitetusti pätevää. Monissa tapauksissa albiinokaniini on ihmistä herkempi silmää ärsyttäville tai syövyttä ­
ville aineille.
 
Tulosten tulkinnassa on huolellisesti erotettava sekundäärisestä tuleh ­
duksesta johtuva ärsytys.  
4. LÄHDELUETTELO  
(1) Barratt, M. D., Castell, J. V., Chamberlain, M., Combes, R. D., 
Dearden, J. C, Fentem, J. H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T. 
J. B., Livingston, D. J., Provan, W. M., Rutten, F. A. J. J. L., 
Verhaar, H. J. M., Zbinden, P. (1995). The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM 
Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429.
 
(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., 
Toufic, A., Sicard, C, Dossou, K. G., Gerner, I., Schlede, E., 
Spielmann, H., Gupta, K. C, Hill, R. N. (1997). Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159–164.
 
(3) Worth A. P. and Fentem J. H. (1999). A general approach for 
evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161–177.  
(4) Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth W. M. H. 
(1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Pre ­
parations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro,  2, 19–26.
 
(5) Neun, D. J. (1993). Effects of Alkalinity on the Eye Irritation 
Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. 
Ocular Toxicol. 12, 227–231.  
(6) Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., 
Curren, R. D., Earl, L. K., Edsaile, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and 
evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 
12, s. 483–524.
 
(6a) Testimenetelmä B.40. Ihosyövyttävyys.  
(7) Testimenetelmä B.4. Akuutti toksisuus: ihoärsyttävyys/-syövyt ­
tävyys.  
(8) OECD (1996). OECD Test Guidelines Programme: Final Re ­
port of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test 
Methods. Pidetty Solnassa, Ruotsissa, 22.–24. tammikuuta 
1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 258
 
(9) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Che ­
mical Substances, as endorsed by the 28  th Joint Meeting of the 
Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, marraskuu 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
 
(10) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, As ­
sessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for 
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD En ­
vironmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/ 
monos.htm).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 259
 
Taulukko I  
SILMÄVAURIOIDEN PISTEYTYS  
Sarveiskalvo  
Samentuma: tiheysaste (mittausarvot otettava tiheimmästä kohdasta) (*) 
Ei haavaumia tai samentumaa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Yksittäisiä tai hajanaisia samentuma-alueita (muu kuin lievä normaa ­
lin kiillon himmentyminen); värikalvon yksityiskohdat selvästi näh ­
tävissä . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . 1 
Selvästi erottuva läpinäkyvä alue; värikalvon yksityiskohdat hiukan 
peittyneet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Helmiäishohtoinen alue; värikalvon yksityiskohtia ei erotu lainkaan; 
pupilli tuskin erottuva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Samea sarveiskalvo; värikalvo ei erotu samentuman läpi . . . . . . . . . . . . . 4  
Suurin mahdollinen pistemäärä: 4  
HUOMAUTUKSET  
(*) Sarveiskalvosamentuman alue on mainittava.  
Värikalvo  
Normaali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Selvästi syventyneet poimut, verentungosta, turvotusta, keskinkertaista 
verekkyyttä sarveiskalvon ympärillä; värikalvon reagoiminen valoon 
(viivästynyt reaktio katsotaan testiaineen vaikutukseksi) . . . . . . . . . . . . . . 1 
Verenvuotoa, vakavasti tuhoutunut värikalvo tai ei reaktiota valoon . . 2  
Suurin mahdollinen pistemäärä: 2  
Sidekalvo  
Normaali punaisuus (viittaa luomen ja silmämunan sidekalvoon; pois 
lukien sarveiskalvo ja värikalvo) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Joitakin hypereemisiä verisuonia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Laajalle levinnyt helakka punaisuus; yksittäiset suonet eivät erotu sel ­
västi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . 2 
Laajalle levinnyt voimakas punaisuus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3  
Suurin mahdollinen pistemäärä: 3  
Sidekalvopöhö  
Turvotus (viittaa luomiin ja/tai vilkkukalvoon) 
Normaali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Hiukan normaalia enemmän turvotusta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Selvää turvotusta, luomet osittain kääntyneet ympäri . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Turvotusta, luomet puoliksi muurautuneet umpeen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Turvotusta, luomet enemmän kuin puoliksi muurautuneet umpeen . . . 4
 
Suurin mahdollinen pistemäärä: 4  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 260
 
LIITE  
Silmä-ärsyttävyyden ja -syövyttävyyden vaiheittainen testaus  
YLEISIÄ NÄKÖKOHTIA  
Sekä järkevien tieteellisten menettelytapojen että eläinten hyvinvoinnin vuoksi on 
tärkeää välttää tarpeettomia eläinkokeita ja tehdä mahdollisimman vähän sellaisia 
testejä, jotka todennäköisesti aiheuttavat elämissä vakavia vasteita. Ennen  in vivo  
-testin suunnittelemista on arvioitava kaikki tiedot testiaineen mahdollisesta sil ­
mä-ärsyttävyydestä/-syövyttävyydestä. Riittävät todisteet testiaineen silmä- ärsyttävyyden/-syövyttävyyden luokittelemiseksi voivat jo olla olemassa, jolloin 
koe-eläintestejä ei tarvita. Painoarvoanalyysin ja vaiheittaisen menettelyn käyttö 
vähentää  in vivo  -testien tarvetta, erityisesti jos on todennäköistä, että testiaine 
aiheuttaa vakavia reaktioita.
 
On suositeltavaa arvioida aineiden silmä-ärsyttävyydestä/-syövyttävyydestä saa ­
tavissa olevien tietojen painoarvo, jotta voidaan päättää, tarvitaanko aineen silmä- ärsyttävyyspotentiaalin määrittämiseksi muita testejä kuin  in vivo  -silmätesti. Jos 
muita testejä tarvitaan, on suositeltavaa käyttää vaiheittaista menettelyä relevant ­
tien koetulosten hankkimiseksi. Jos ainetta ei ole testattu aikaisemmin, vaiheit ­
taisen menettelyn avulla voidaan hankkia silmä-ärsyttävyyden/-syövyttävyyden arviointiin tarvittavat tulokset. Tässä liitteessä kuvattu testimenettely on kehitetty OECD:n seminaarissa (1), ja se on vahvistettu ja laajennettu myöhemmin järjes ­
telmässä  Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health 
and Environmental Effects of Chemical Substances,  sellaisena kuin se vahvistet ­
tiin kemikaalikomitean ja kemikaalityöryhmän 28. yhteisessä kokouksessa mar ­
raskuussa 1998 (2).
 
Vaikka tämä vaiheittainen testausstrategia ei ole olennainen osa testimenetelmää 
B.4, siinä kuvataan suositeltavaa lähestymistapaa aineen silmä-ärsyttävyys-/ ­
-syövyttävyysominaisuuksien määrittämiseen. Tämä lähestymistapa edustaa sekä 
parhaita käytäntöjä että eettistä vertailukohdetta silmä-ärsyttävyyden/-syövyttä ­
vyyden  in vivo  -testauksessa. Siinä annetaan ohjeita  in vivo  -testin suorittamiseen 
ja esitetään yhteenveto tekijöistä, jotka on käsiteltävä ennen testin aloittamista. Strategia tarjoaa lähestymistavan aiemmin saatujen tulosten arviointiin testiaineen 
silmä-ärsyttävyys-/-syövyttävyysominaisuuksien selvittämiseksi, ja sen avulla 
voidaan vaihe vaiheelta tuottaa merkitseviä tuloksia aineista, joista tarvitaan li ­
sätietoja tai joita ei ole aikaisemmin tutkittu. Strategiassa suositellaan myös tie ­
tyissä tapauksissa käyttämään validoituja ja hyväksyttyjä  in vitro-  tai ex vivo  
-testejä silmä-ärsyttävyyden/-syövyttävyyden toteamiseksi (3) (4).
 
VAIHEITTAISEN TESTAUSSTRATEGIAN KUVAUS  
Ennen vaiheittaiseen menettelyyn sisältyvien testien suorittamista (kaavio) on 
analysoitava kaikki saatavissa olevat tiedot, jotta  in vivo  -silmätestauksen tarve 
voidaan määrittää. Vaikka yksittäisistä parametreista (esimerkiksi äärimmäiset pH-arvot) voidaan saada merkitseviä tietoja, on syytä ottaa huomioon tulokset kokonaisuudessaan. Kaikkien kyseessä olevan aineen tai sitä rakenteeltaan vas ­
taavan aineen vaikutustietojen painoarvo on arvioitava testauspäätöksen yhtey ­
dessä, ja päätökselle on esitettävä perustelut. Ensisijaisesti on painotettava sekä ihmis- että eläintesteillä aineesta aiemmin saatuja tuloksia ja seuraavaksi  in vitro-  
tai ex vivo  -testien tuloksia. Syövyttävien aineiden in  vivo  -testejä on vältettävä 
aina kun se on mahdollista. Testimenettelyssä on otettava huomioon seuraavat 
asiat:
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 261
 
Ihmisillä ja eläimillä aiemmin saatujen tulosten arviointi (vaihe 1).  Aiemmat 
ihmisillä saadut tulokset, esimerkiksi kliiniset tai työperäiseen altistukseen liitty ­
vät tutkimustulokset ja tapausselostukset ja/tai eläinkokeiden tulokset silmätes ­
teistä, on otettava ensiksi huomioon, koska niistä saadaan suoraan aineen silmä ­
vaikutuksiin liittyviä tietoja. Sen jälkeen on arvioitava saatavissa olevat tiedot 
ihmisillä ja/tai eläimillä tehdyistä ihoärsyttävyys/-syövyttävyystesteistä. Eläinten 
silmiin ei saa annostella aineita, joiden tiedetään olevan syövyttäviä tai voimak ­
kaasti ärsyttäviä, eikä aineita, joilla on ihoa ärsyttävä/syövyttävä vaikutus; sel ­
laisten aineiden voidaan katsoa vaikuttavan samoin myös silmiin.  In vivo - testejä 
ei tarvitse tehdä aineille, joiden silmä-ärsyttävyys tai -syövyttävyys tiedetään, 
eikä aineille, joista on selvästi todistettu, että ne eivät ole ärsyttäviä tai syövyt ­
täviä.  
Rakenne-aktiivisuusanalyysi (SAR) (vaihe 2).  Jos saatavilla on rakenteellisesti 
samankaltaisten aineiden testituloksia, ne on otettava huomioon. Kun rakenteel ­
lisesti samankaltaisista aineista tai niitä sisältävistä seoksista on saatavilla riittä ­
västi ihmisille tehtyjen testien ja eläinkokeiden tuloksia, jotka osoittavat niiden 
silmä-ärsyttävyys/-syövyttävyyspotentiaalin, voidaan olettaa, että arvioitava testi ­
aine tuottaa samanlaiset vasteet. Tällaisessa tapauksessa ainetta ei kenties tarvitse testata. Negatiiviset tulokset rakenteellisesti samankaltaisten aineiden tai sellai ­
sista aineista koostuvien seosten tutkimuksista eivät vaiheittaisessa menettelyssä 
ole riittävä todiste siitä, että aine ei ole ärsyttävä tai syövyttävä. Sekä silmä- että 
ihoärsyttävyys ja -syövyttävyys on selvitettävä validoitujen ja hyväksyttyjen SAR-menettelytapojen avulla.
 
Fysikokemialliset ominaisuudet ja kemiallinen reaktiivisuus (vaihe 3).  Aineella, 
jolla esiintyy äärimmäisiä pH-arvoja, kuten ≤ 2,0 ja ≥ 11,5, voi olla voimakkaita 
paikallisvaikutuksia. Jos aine määritetään silmää syövyttäväksi äärimmäisen pH- 
arvon perusteella, sen happo-/emäsreservi (eli puskurointikyky) voidaan myös 
ottaa huomioon (5) (6). Jos puskurointikyky viittaa siihen, että aine ei ole silmää syövyttävä, tämän vahvistamiseksi on tehtävä jatkotesti, jonka on ensisijaisesti oltava validoitu ja hyväksytty  in vitro-  tai ex vivo  -testi (katso vaiheet 5 ja 6).
 
Muiden aiempien tietojen ottaminen huomioon (vaihe 4).  Kaikki saatavissa olevat 
tiedot koko elimistöön ihon kautta kohdistuvasta toksisuudesta on arvioitava tässä vaiheessa. Testiaineen akuutti toksisuus ihon kautta saatuna on myös otettava 
huomioon. Jos testiaine on osoitettu erittäin toksiseksi ihon kautta saatuna, sitä 
ei kenties tarvitse testata silmille. Vaikkakaan akuutin ihotoksisuuden ja silmä- ärsyttävyyden/-syövyttävyyden välillä ei välttämättä ole suhdetta, voidaan olettaa, että jos aine on erittäin toksinen ihon kautta saatuna, se on erittäin toksinen myös 
silmään annosteltuna. Tällaiset tiedot voidaan ottaa huomioon myös vaiheiden 2 
ja 3 välissä.
 
In vitro- tai ex vivo -testien tulokset (vaiheet 5 ja 6).  Aineita, joilla on todettu 
olevan syövyttäviä tai vakavasti ärsyttäviä ominaisuuksia validoiduissa ja hyväk ­
sytyissä, nimenomaan silmä- ja ihoärsyttävyyden/-syövyttävyyden mittaamista varten kehitetyissä  in vitro-  tai ex vivo  -testeissä (7)(8), ei tarvitse testata eläi ­
millä. Voidaan olettaa, että tällaiset aineet aiheuttavat samoja vaikutuksia  in vivo  
-testeissä. Jos validoituja ja hyväksyttyjä  in vitro- / ex vivo  -testejä ei ole saa ­
tavissa, vaiheet 5 ja 6 ohitetaan ja siirrytään suoraan vaiheeseen 7.
 
Testiaineen in vivo -ihoärsyttävyyden/-syövyttävyyden arviointi (vaihe 7).  Kun 
testiaineesta ei ole saatavilla riittäviä todisteita painoarvoanalyysin ja lopullisen johtopäätöksen tekemiseksi testiaineen ihoärsyttävyys/-syövyttävyyspotentiaalista edellä lueteltujen tutkimusten tietojen perusteella,  in vivo  -ihoärsyttävyys/-syövyt ­
tävyyspotentiaali on arvioitava ensiksi testimenetelmän B.4 (4) ja sen liitteen 
mukaisesti (9). Jos aineen on osoitettu aiheuttavan ihon syöpymistä tai vakavaa ärsytystä, sitä on syytä pitää syövyttävänä ja silmä-ärsytystä aiheuttavana, mikäli muut tiedot eivät tue toisenlaista johtopäätöstä. Tällöin  in vivo  -silmätestiä ei 
tarvita. Jos aine ei ole ihoa syövyttävä tai vakavasti ärsyttävä,  in vivo  -silmätesti 
on tehtävä.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 262
 
In vivo -testi kaniineilla (vaiheet 8 ja 9). In vivo  -silmätesti on aloitettava testaa ­
malla ensin yksi eläin. Jos tämän testin tulokset osoittavat, että aine on silmiä 
vakavasti ärsyttävä tai syövyttävä, jatkotestiä ei pidä tehdä. Jos alkutestissä ei todeta vakavasti ärsyttävää tai syövyttävää vaikutusta, ärsyttävyys tai negatiivinen vaste on vahvistettava testaamalla vielä enintään kaksi eläintä.
 
LÄHDELUETTELO  
1) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the 
OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Pidetty Solnassa, Ruotsissa 
22.–24. tammikuuta 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
 
2) OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human 
Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28
 th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on 
Chemicals, marraskuu 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).  
3) Worth, A. P. and Fentem J. H. (1999). A General Approach for Evaluating 
Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161–177.  
4) Testimenetelmä B.4. Akuutti toksisuus: ihoärsyttävyys/-syövyttävyys.  
5) Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth, W. M. H. (1988). Clas ­
sification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro,  2, 
19–26.
 
6) Neun, D. J. (1993). Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of 
Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227–231.
 
7) Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., 
Earl, L. K., Edsail, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998). The 
ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, s. 483–524.
 
8) Testimenetelmä B.40. Ihosyövyttävyys.  
9) Testimenetelmän B.4 liite: Ihoärsyttävyyden ja -syövyttävyyden vaiheittai ­
nen tutkimusmenettely.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 263
 
Kaavio  
SILMÄ-ÄRSYTTÄVYYDEN/-SYÖVYTTÄVYYDEN TESTAUS- JA ARVIOINTIMENET ­
TELY
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 264
 
▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 265
 
B.6. IHON HERKISTYMINEN  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Huomautukset:  
Testien herkkyys ja kyky havaita ihmisen ihoa mahdollisesti herkis ­
täviä aineita on tärkeä kansanterveyteen liittyvän toksisuuden luoki ­
tusjärjestelmän kannalta.  
Kaikkia ihmisen ihoa mahdollisesti herkistäviä aineita ei voida adek ­
vaatisti tunnistaa millään yksittäisellä testimenetelmällä, joka myös sopisi kaikille aineille.
 
Sellaiset tekijät kuten aineen fysikaaliset ominaisuudet, mukaan lu ­
kien sen ihon läpäisykyky, on otettava huomioon testin valinnassa.  
On kehitetty kahdentyyppisiä marsutestejä: adjuvanttityyppiset testit, 
joissa allergista tilaa voimistetaan liuottamalla tai suspensoimalla 
testiaine Freundin täydelliseen adjuvanttiin (FCA, Freunds Complete Adjuvant), ja muut kuin adjuvanttitestit.
 
Adjuvanttityyppiset testit todennäköisesti ennustavat aineen ihmisen 
ihoa mahdollisesti herkistävää vaikutusta tarkemmin kuin menetel ­
mät, joissa ei käytetä FCA:ta, minkä vuoksi adjuvantti-tyyppisiä tes ­
tejä suositaan.  
Marsun maksimaatiotesti (Guinea-Pig Maximisation test, GPMT) on 
laajalti käytetty adjuvantti-tyyppinen testi. Vaikka aineen ihon her ­
kistämisriski voidaan todeta useilla muillakin menetelmillä, marsun maksimaatiotesti on suositeltavin adjuvanttimenetelmistä.
 
Monien kemikaalien kohdalla muita kuin adjuvanttitestejä (joista 
suositeltavin on Buehlerin testi) pidetään vähemmän herkkinä.  
Tietyissä tapauksissa voi olla perusteltua valita Buehlerin testi, jossa 
aine annostellaan paikallisesti eikä ihonsisäisesti kuten marsun mak ­
simaatiotestissä. Buehlerin testin käytölle on esitettävä tieteelliset perusteet.
 
Marsun maksimaatiotesti ja Buehlerin testi kuvataan tässä menetel ­
mässä. Myös muita menetelmiä voidaan käyttää edellyttäen, että ne on validoitu hyvin ja niiden käyttö on tieteellisesti perusteltua.
 
Jos tunnustetussa seulontatutkimuksessa saadaan positiivinen tulos, 
testiaine voidaan määrittää mahdollisesti herkistäväksi aineeksi eikä ole tarpeen enää tehdä marsutestiä. Jos tunnustetussa seulontatutki ­
muksessa saadaan negatiivinen tulos, marsutesti on tehtävä tämän 
testimenetelmän yhteydessä kuvattua menetelmää käyttäen.
 
Ks. myös yleisjohdanto, osa B.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 266
 
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Ihon herkistyminen:  (allerginen kosketusihottuma) Aineen aiheuttama 
immunologisesti välittyvä ihoreaktio. Ihmisellä vastereaktio voi olla kutina, punoitus, turvotus, näppylät, vesirakkulat, vesikellot tai jokin 
näiden yhdistelmä. Muilla eläinlajeilla reaktiot voivat olla erilaisia ja 
vain punoitusta ja turvotusta voi esiintyä.
 
lnduktioaltistus:  Koehenkilön kokeellinen altistaminen testiaineelle 
tarkoituksena aikaansaada yliherkistymistila.  
Induktiojakso:  Induktioaltistusta seuraava vähintään viikon kestävä 
jakso, jonka aikana yliherkistymistila voi kehittyä.  
Haastealtistus:  Aiemmin käsitellyn koehenkilön kokeellinen altista ­
minen testiaineelle induktiojakson jälkeen koehenkilön mahdollisen yliherkistymisreaktion määrittämiseksi.
 
1.3. VERTAILUAINEET  
Käytetyn koemenetelmän herkkyys ja luotettavuus tulee tutkia puo ­
len vuoden välein aineilla, joiden tiedetään herkistävän ihoa lievästi tai kohtalaisesti.
 
Oikein suoritetussa adjuvanttitestissä vasteen voidaan odottaa olevan 
vähintään 30 % ja muussa kuin adjuvanttitestissä vähintään 15 % 
lievillä/kohtalaisilla herkistäjillä.  
Seuraavia aineita suositellaan:  
CAS-numerot EINECS-numerot EINECS-nimet Geneeriset nimet  
101-86-0 202-983-3 α-heksyylisinnaamialdehydi α-heksyylisinnaamialdehydi 
149-30-4 205-736-8 bentsotiatsoli-2-tioli (merkap ­
tobentsotiatsoli) kaptaksi 
94-09-7 202-303-5 bentsokaiini norkaiini  
Joissakin olosuhteissa voidaan riittävin perustein käyttää muita ver ­
tailuaineita, jotka täyttävät edellä mainitut perusteet.  
1.4 KOEMENETELMÄN PERIAATE  
Koe-eläimet altistetaan testiaineelle aluksi ruiskuttamalla ainetta 
ihonsisäisesti ja/tai levittämällä sitä iholle (induktioaltistus). Lepojak ­
son (10–14 vrk:n induktiojakso) aikana voi kehittyä immuunivaste. 
Lepojakson jälkeen eläimet altistetaan haasteannokselle. Haastealtis ­
tuksen testiryhmässä aiheuttamaa ihoreaktion laajuutta ja voimak ­
kuutta verrataan verrokkieläimiin, joille annetaan induktion aikana 
lumekäsittely, mutta jotka saavat kuitenkin haastealtistuksen.  
1.5 KOEMENETELMIEN KUVAUS  
Jos testiaine on välttämättä poistettava, se tulee tehdä vedellä ja 
sopivalla liuottimella niin ettei saavutettu vaste muutu eikä ihon pinta 
rikkoonnu.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 267
 
1.5.1  Marsun maksimaatiotesti  
1.5.1.1 V a l m i s t e l u t  
Terveet nuoret täysikasvuiset albiinomarsut totutetaan laboratorio- 
olosuhteisiin vähintään viiden päivän ajan ennen testiä. Ennen testiä 
eläimet jaetaan satunnaisotannalla testi- ja verrokkiryhmiin. Karvat 
poistetaan leikkaamalla, ajelemalla tai mahdollisesti kemiallisella de ­
pilaatiolla käytetystä testimenetelmästä riippuen. Varovaisuutta on noudatettava, ettei iho naarmuunnu rikki. Eläimet punnitaan ennen 
testiä ja sen jälkeen.
 
1.5.1.2 K o e o l o s u h t e e t  
1.5.1.2.1 Koe-eläimet  
Koe-eläiminä käytetään yleisesti käytettyjä albiinomarsun laborato ­
riokantoja.  
1.5.1.2.2 Lukumäärä ja sukupuoli  
Testissä voidaan käyttää sekä uroksia että naaraita. Naaraat eivät saa 
olla synnyttäneitä eivätkä tiineinä.  
Testiryhmässä on oltava vähintään kymmenen eläintä ja verrokkiryh ­
mässä vähintään viisi. Testeissä, joissa on käytetty alle 20 testimar ­
sua ja alle 10 verrokkimarsua, eikä testiaineen herkistävyydestä voida tehdä johtopäätöksiä, suositellaan voimakkaasti lisätestejä si ­
ten, että testieläimiä on yhteensä vähintään 20 ja verrokkieläimiä 
kymmenen.
 
1.5.1.2.3 Annostasot  
Testiaineen pitoisuus kutakin induktioaltistusta kohti tulee olla hyvin 
siedetty systeemisesti ja korkein mahdollinen lievän tai kohtalaisen 
ihoärsytyksen aiheuttamiseksi. Haastealtistuspitoisuuden tulee olla suurin ärsyttämätön annos. Mikäli on tarpeen, sopivat pitoisuudet 
voidaan määrittää esitutkimuksessa kahdella tai kolmella eläimellä. 
Tähän tarkoitukseen tulisi käyttää FCA:lla käsiteltyjä eläimiä.
 
1.5.1.3 K o k e e n s u o r i t t a m i n e n  
1.5.1.3.1 Induktio  
Päivä 0 — testiryhmä  
Lapojen alueelle, jolta on poistettu karvat, pistetään kuusi ihonsi ­
säistä 0,1 ml:n ruisketta pareittain siten, että puolet (3) on keskivii ­
van vasemmalla ja puolet (3) oikealla puolella.  
1. ruiske: 1:1 sekoitus (v/v) FCA:ta ja vettä tai fysiologista keitto ­
suolaliuosta  
2. ruiske: testiaine sopivassa vehikkelissä valitulla pitoisuudella  
3. ruiske: testiaine valitulla pitoisuudella 1:1 seoksessa (v/v) FCA:ta 
ja vettä tai fysiologista keittosuolaliuosta.  
Kolmannen ruiskeen vesiliukoiset aineet liuotetaan vesifaasiin ennen 
FCA:han sekoittamista. Rasvaliukoiset tai liukenemattomat aineet 
suspensoidaan FCA:han ennen vesifaasiin yhdistämistä. Testiaineen 
lopullisen pitoisuuden on oltava sama kuin toisessa ruiskeessa.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 268
 
Ensimmäinen ja toinen ruiske pistetään lähekkäin lähimmäksi päätä. 
Kolmas ruiske pistetään testialueen hännänpuoleiseen osaan.  
Päivä 0 — verrokkiryhmä  
Kuusi ihonsisäistä 0,1 ml:n ruisketta pistetään samoihin kohtiin kuin 
testiryhmään kuuluville eläimille.  
1. ruiske: 1:1 seos (v/v) FCA:ta ja vettä tai fysiologista keittosuola ­
liuosta  
2. ruiske: laimentamatonta vehikkeliä  
3. ruiske: 50-prosenttinen v/v -sekoitus vehikkeliä FCA:n ja veden 
tai fysiologisen keittosuolaliuoksen seoksessa suhteessa 1:1 (v/v).  
Päivät 5. – 7. — testi- ja verrokkiryhmät  
Jos aine on ihoa ärsyttämätön, testialuetta käsitellään noin 24 tuntia 
ennen paikallista induktiota karvojen huolellisen poisleikkaamisen 
ja/tai ajelemisen jälkeen 0,5 ml:lla 10-prosenttista natrium-lauryy ­
lisulfaatti-vaseliinia paikallisärsytyksen aiheuttamiseksi.  
Päivät 6. – 8. — testiryhmä  
Testialueelta poistetaan jälleen karvat. Sopivassa vehikkelissä ole ­
valla testiaineella läpikotaisin kyllästetty suodatinpaperi (2 x 4 cm) 
asetetaan testialueelle ihoa vasten ja peitetään okkluusiositeellä 48 
tunniksi. Vehikkelin valinta tulee perustella. Kiinteät aineet hienon ­
netaan ja yhdistetään sopivaan vehikkeliin. Nesteitä voidaan käyttää laimentamattomina, jos se on tarkoituksenmukaista.
 
Päivät 6. – 8. — verrokkiryhmä  
Testialueelta poistetaan jälleen karvat. Pelkkä vehikkeli asetetaan 
testiaineen tavoin testialueelle ja peitetään okkluusiositeellä 48 tun ­
niksi.  
1.5.1.3.2 Haastealtistus  
Päivät 20. – 22. — testi- ja verrokkiryhmät  
Testi- ja verrokkieläinten kyljistä poistetaan karvapeite. Testiaineella 
kyllästetty lappu tai kupu asetetaan eläinten toiseen kylkeen ja tar ­
vittaessa pelkällä vehikkelillä kyllästetty lappu tai kupu toiseen kyl ­
keen. Lappujen annetaan olla ihoa vasten okkluusiositeen alla 24 
tuntia.  
1.5.1.3.3 Havainnointi ja pisteytys: testi- ja verrokkiryhmät  
— noin 21 tuntia lapun poistamisen jälkeen haastealue puhdistetaan 
ja tarvittaessa karvat leikataan huolellisesti pois ja/tai ajellaan tai 
poistetaan depilaatiolla,  
— noin kolme tuntia myöhemmin (noin 48 tunnin kuluttua haaste ­
altistuksen aloittamisesta) havainnoidaan ihoreaktiota ja kirjataan 
se liitteen pisteytysasteikon mukaisesti,  
— noin 24 tunnin kuluttua ensimmäisestä havainnoinnista ihoreak ­
tiota havainnoidaan uudestaan (72 h) ja tulokset kirjataan jälleen.  
Testi- ja verrokkieläinten sokkoarviointia suositellaan.  
Jos ensimmäisen haastealtistuksen tulokset vaativat selventämistä, on 
harkittava haastealtistuksen uusimista mahdollisesti uudella verrokki ­
ryhmällä, jos se on tarkoituksenmukaista, noin viikon kuluttua en ­
simmäisestä haastealtistuksesta. Haastealtistus voidaan uusia myös 
alkuperäisellä verrokkiryhmällä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 269
 
Kaikki induktiosta ja haastetoimenpiteistä johtuvat ihoreaktiot ja epä ­
tavalliset löydökset, mukaan lukien systeemiset reaktiot, tulee ha ­
vainnoida ja kirjata Magnusson/Kligman -pisteytysasteikon mukaan (ks. liite). Muita toimenpiteitä, esimerkiksi histopatologinen tutkimus ja ihopoimumittaus, voidaan suorittaa epäilyttävien reaktioiden sel ­
ventämiseksi.
 
1.5.2  Buehlerin testi  
1.5.2.1 V a l m i s t e l u t  
Terveet nuoret täysikasvuiset albiinomarsut totutetaan laboratorio- 
olosuhteisiin vähintään viiden päivän ajan ennen testiä. Ennen testiä eläimet jaetaan satunnaisotannalla testi- ja verrokkiryhmiin. Karvat 
poistetaan leikkaamalla, ajelemalla tai mahdollisesti kemiallisella de ­
pilaatiolla käytetystä testimenetelmästä riippuen. Varovaisuutta on noudatettava, ettei ihon pinta naarmuunnu rikki. Eläimet punnitaan ennen testiä ja sen jälkeen.
 
1.5.2.2 K o e o l o s u h t e e t  
1.5.2.2.1 Koe-eläimet  
Koe-eläiminä käytetään yleisesti käytettyjä albiinomarsun laborato ­
riokantoja.  
1.5.2.2.2 Lukumäärä ja sukupuoli  
Testissä voidaan käyttää sekä uroksia että naaraita. Naaraat eivät saa 
olla synnyttäneitä eivätkä tiineinä.  
Testiryhmässä on oltava vähintään 20 eläintä ja verrokkiryhmässä 
vähintään kymmenen.  
1.5.2.2.3 Annostasot  
Testiaineen pitoisuuden kutakin induktioaltistusta kohti tulee olla 
korkein mahdollinen lievän, mutta ei liiallisen ärsytyksen tuottami ­
seksi. Haastealtistuspitoisuuden tulee olla suurin ärsyttämätön annos. Mikäli on tarpeen, sopivat pitoisuudet voidaan määrittää esitutkimuk ­
sessa kahdella tai kolmella eläimellä.
 
Vesiliukoisten testiaineiden vehikkeliksi sopii vesi tai laimennettu 
ärsyttämätön pinta-aktiivinen liuos. Muiden testiaineiden vehikkeliksi suositellaan 80-prosenttista etanoli-vesiliuosta induktioon ja asetonia haastealtistukseen.
 
1.5.2.3 K o k e e n s u o r i t t a m i n e n  
1.5.2.3.1 Induktio  
Päivä 0 — testiryhmä  
Eläimen toisesta kyljestä leikataan huolellisesti karvat pois. Testil ­
apun tulee olla läpikotaisin kyllästetty sopivaan vehikkeliin (vehik ­
kelin valinta tulee perustella; nestemäisiä testiaineita voidaan käyttää laimentamattomina, jos se on tarkoituksenmukaista) sekoitetulla testi ­
aineella.
 
Testilappu asetetaan testialueelle ihoa vasten ja peitetään tiiviillä 
lapulla tai kuvulla ja sopivalla siteellä kuudeksi tunniksi.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 270
 
Testilappujärjestelmän on oltava okklusiivinen. Tarkoitukseen sopii 
pyöreä tai neliskulmainen vanulappu, jonka pinta-ala on 4–6 cm  2 . 
Tiiviyden varmistamiseen suositellaan sopivaa kiinnitysmekanismia. Kääreitä käytettäessä voidaan tarvita lisäaltistuskertoja.
 
Päivä 0 — verrokkiryhmä  
Eläimen toisesta kyljestä leikataan huolellisesti karvat pois. Pelkkä 
vehikkeli asetetaan samoin kuin testiryhmässä. Testilapun annetaan 
olla ihoa vasten tiiviin lapun tai kuvun ja sopivan siteen alla kuusi 
tuntia. Jos voidaan osoittaa, ettei lumeverrokkiryhmää tarvita, voi ­
daan käyttää käsittelemätöntä verrokkiryhmää.  
Päivät 6.–8. ja 13.–15. — testi- ja verrokkiryhmät  
Päivän 0 toimenpiteet tehdään samalle testialueelle (jolta poistetaan 
tarvittaessa karvat) eläimen samaan kylkeen päivinä 6.–8. ja uudel ­
leen päivinä 13.–15.  
1.5.2.3.2 Haastealtistus  
Päivä 27.–29. — testi- ja verrokkiryhmät  
Testi- ja verrokkiryhmien eläinten käsittelemättömästä kyljestä pois ­
tetaan karvat (huolellisesti leikkaamalla). Tiivis lappu tai kupu, joka 
sisältää sopivan määrän testiainetta korkeimpana mahdollisena ärsyt ­
tämättömänä pitoisuutena, asetetaan molempien ryhmien eläinten kä ­
sittelemättömän kyljen takaosaan.  
Tarvittaessa asetetaan myös pelkkää vehikkeliä sisältävä tiivis lappu 
tai kupu molempien ryhmien eläinten käsittelemättömän kyljen etuo ­
saan. Lappujen tai kupujen annetaan olla ihoa vasten sopivalla si ­
teellä peitettyinä kuusi tuntia.  
1.5.2.3.3 Havainnointi ja pisteytys  
— noin 21 tuntia lapun poistamisen jälkeen haastealueelta poistetaan 
karvat,  
— noin kolme tuntia myöhemmin (noin 30 tunnin kuluttua haastel ­
apun asettamisesta) havainnoidaan ihoreaktioita ja kirjataan ne liitteen pisteytysasteikon mukaisesti,
 
— noin 24 tunnin kuluttua 30 ensimmäisen tunnin jälkeen suorite ­
tusta havainnointikerrasta (noin 54 tuntia haastelapun asettami ­
sesta) havainnoidaan ihoreaktioita uudelleen ja tulokset kirjataan.  
Testi- ja verrokkieläinten sokkoarviointia suositellaan.  
Jos ensimmäisen haastealtistuksen tulokset vaativat selventämistä, on 
harkittava haastealtistuksen uusimista mahdollisesti uudella verrokki ­
ryhmällä, jos se on tarkoituksenmukaista, noin viikon kuluttua en ­
simmäisestä haastealtistuksesta. Haastealtistus voidaan uusia myös 
alkuperäisellä verrokkiryhmällä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 271
 
Kaikki induktiosta ja haastetoimenpiteistä johtuvat ihoreaktiot ja epä ­
tavalliset löydökset, mukaan lukien systeemiset reaktiot, tulee ha ­
vainnoida ja kirjata Magnusson/Kligman -pisteytysasteikon mukaan (ks. liite). Muita toimenpiteitä, esimerkiksi histopatologinen tutkimus ja ihopoimumittaus, voidaan suorittaa epäilyttävien reaktioiden sel ­
ventämiseksi.
 
2. TULOKSET (GPMT JA BUEHLERIN TESTI)  
Yhteenveto tuloksista tulee esittää taulukossa, josta ilmenee kunkin 
eläimen ihoreaktiot kullakin havainnointikerralla.  
3. RAPORTOINTI (GPMT JA BUEHLERIN TESTI)  
Jos seulontatesti tehdään ennen marsutestiä, testin (esim. paikallinen 
imusolmuketesti, LLNA; hiiren korvan turpoamistesti, MEST) ku ­
vaus tai viite, mukaan lukien toimenpiteen yksityiskohdat, on ilmoi ­
tettava testi- ja vertailuaineella saatujen tulosten yhteydessä.  
Testiraportti (GPMT ja Buehlerin testi)  
Testiraportin tulee mahdollisuuksien mukaan sisältää seuraavat tie ­
dot: 
Koe-eläimet:  
— käytetty marsukanta,  
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli,  
— lähde, elinolosuhteet, ravinto jne., ja  
— kunkin eläimen paino testin alussa.  
Koeolosuhteet:  
— lapun asettamiskohdan valmistelumenetelmä,  
— käytettyjen lappumateriaalien ja lappujen asettamismenetelmän 
yksityiskohdat,  
— esitutkimustulokset ja niiden pohjalta tehty johtopäätös testissä 
käytettävistä induktio- ja haastepitoisuuksista,  
— testiaineen valmistamisen, asettamisen ja poistamisen yksityis ­
kohdat,  
— vehikkelin valintaperusteet, ja  
— induktio- ja haastealtistuksissa käytetyt vehikkeli- ja testiainepi ­
toisuudet sekä induktiossa ja haastealtistuksessa käytetyn aineen kokonaismäärä.
 
Tulokset:  
— yhteenveto tuoreimman herkkyys- ja luotettavuustarkistuksen tu ­
loksista (ks. 1.3) mukaan lukien tiedot käytetystä aineesta, pitoi ­
suudesta ja vehikkelistä,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 272
 
— kunkin eläimen kohdalta mukaan lukien pisteytysjärjestelmä,  
— selostuskuvaus havaittujen vaikutusten luonteesta ja voimakkuu ­
desta, ja  
— mahdolliset histopatologiset löydökset.  
Tulosten pohdinta  
Johtopäätökset  
4. LÄHDELUETTELO  
Tämä menetelmä on analoginen OECD TG 406:n kanssa.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 273
 
Lisäys  
TAULUKKO  
Magnusson/Kligman -pisteytysasteikko haastelapputestireaktioiden 
arvioimiseksi  
0 = ei silmin havaittavia muutoksia  
1 = lievä tai laikukas punoitus  
2 = kohtalainen ja yhtenäinen punoitus  
3 = voimakas punoitus ja turvotus  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 274
 
B.7 ORAALINEN TOISTUVAN ANNOSTELUN TOKSISUUSTUTKIMUS 
(28 PV) JYRSIJÖILLÄ  
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 407 (2008). Alkupe ­
räinen testiohje nro 407 hyväksyttiin vuonna 1981. Vuonna 1995 hyväksyt ­
tiin tarkistettu versio, jonka tavoitteena oli saada lisätietoja tutkimuksessa 
käytetystä eläimestä eritoten neurotoksisuuden ja immunotoksisuuden osalta.  
2. Vuonna 1998 OECD aloitti tärkeän toimenpiteen, olemassa olevien testi ­
ohjeiden uudistuksen ja uusien testiohjeiden laatimisen mahdollisten hormo ­
naalisten haitta-aineiden seulontaa ja testausta varten (8). Osa tätä toimen ­
pidettä oli ajantasaistaa OECD:n olemassa olevaa ohjetta ”Oraalinen toistu ­
van annostelun toksisuustutkimus (28 pv) jyrsijöillä” (TG 407) parametreil ­
la, joilla voidaan havaita testikemikaalien hormonitoimintaan kohdistuva vaikutus. Tämä menettely kävi läpi laajan kansainvälisen ohjelman, jossa 
testattiin uusien parametrien merkityksellisyys ja käytännöllisyys, näiden 
parametrien suorituskyky (anti)estrogeenisia, (anti)androgeenisia ja kilpira ­
uhasen toimintaa estäviä vaikutuksia omaaviin kemikaaleihin nähden, labo ­
ratorion sisäinen ja laboratorioiden välinen toistettavuus sekä se, häiritse ­
vätkö uudet parametrit ohjeen TG 407 vanhemmassa versiossa vaadittuja 
parametreja. Näin saatu valtava määrä tietoa on koottu yhteen ja arvioitu yksityiskohtaisesti OECD:n kattavassa raportissa (9). Tämä ajantasaistettu testimenetelmä B.7 (joka vastaa ohjetta TG 407) perustuu kansainvälisen 
testiohjelman aikana saatuihin kokemuksiin ja tuloksiin. Tämän testimene ­
telmän avulla hormonivälitteisiä vaikutuksia voidaan tarkastella muiden tok ­
sikologisten vaikutusten yhteydessä.
 
ALUSTAVAT HUOMIOT JA RAJOITUKSET  
3. Kun määritetään ja arvioidaan kemikaalin myrkyllisyysominaisuuksia, tois ­
tettujen annosten aiheuttama oraalinen myrkyllisyys voidaan määrittää sen 
jälkeen, kun akuutin myrkyllisyyden testistä on saatu alustavia tietoja myr ­
kyllisyydestä. Tällä testimenetelmällä voidaan tutkia hyvin monenlaisia mahdollisia kohteita, joihin myrkylliset vaikutukset voivat kohdistua. Se antaa tietoa mahdollisista terveyshaitoista, joita todennäköisesti seuraa tois ­
tuvasta altistuksesta suhteellisen lyhyen ajan kuluessa, mukaan luettuina 
hermostoon sekä immuuni- ja hormonijärjestelmiin kohdistuvat vaikutukset. Näiden erityisten tutkittavien ominaisuuksien osalta menetelmän avulla on voitava tunnistaa kemikaalit, jotka saattavat olla neurotoksisia, jolloin tar ­
kemmat asiaa koskevat tutkimukset saattavat olla tarpeen, sekä kemikaalit, 
jotka häiritsevät kilpirauhasen fysiologiaa. Menetelmä voi myös tuottaa tie ­
toa kemikaaleista, jotka vaikuttavat uroksen ja/tai naaraan lisääntymiselimiin nuorilla eläimillä, ja sen avulla voidaan saada myös viitteitä immunologisista 
vaikutuksista.
 
4. Tällä B.7-testimenetelmällä saatavia tuloksia on käytettävä vaarojen tunnis ­
tamisessa ja riskinarvioinnissa. Hormonitoimintaan liittyvien parametrien avulla saatuja tuloksia on tarkasteltava OECD:n asiakirjaan ”Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals” 
(11) (hormonaalisten haitta-aineiden testausta ja arviointia koskeva toimin ­
tamalli) liittyvässä kontekstissa. Menetelmä koostuu tavanomaisesta toistu ­
van annoksen myrkyllisyystutkimuksesta, jota voidaan käyttää sellaisten ke ­
mikaalien testaamisessa, joiden osalta 90 päivän tutkimus ei ole perusteltu 
(kun esimerkiksi tuotantomäärä ei ylitä tiettyjä rajoja), tai pitkäaikaisen 
tutkimuksen esitutkimuksena. Altistuksen on kestettävä 28 päivää.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 275
 
5. Kansainvälinen ohjelma, joka koski sellaisten parametrien validointia, joiden 
avulla voidaan mahdollisesti havaita testikemikaalin hormonitoimintaan koh ­
distuva vaikutus, osoitti, että testauslaboratorion kokemus vaikuttaa suuresti testimenetelmällä B.7 saatujen tietojen laatuun. Tämä liittyy varsinkin naa ­
raiden lisääntymiselimissä tapahtuvien syklisten muutosten histopatologiseen 
määrittämiseen sekä pienten hormoneista riippuvaisten elinten painon mää ­
rittämiseen, koska näitä elimiä on vaikea dissekoida. Histopatologiaa koske ­
via ohjeita on laadittu (19). Ne ovat saatavilla OECD:n julkisella verkkosi ­
vustolla kemikaalien testausta käsittelevässä kohdassa. Ohjeet on tarkoitettu 
patologeille avuksi tutkimuksiin ja määritysmenetelmän herkkyyden paranta ­
miseen. Useiden parametrien havaittiin antavan viitteitä hormonitoimintaan liittyvästä myrkyllisyydestä, ja ne on sisällytetty testimenetelmään. Paramet ­
reja, joista oli saatavilla käyttökelpoisuuden vahvistamisen kannalta liian 
vähän tietoa, tai joiden kyvystä auttaa havaitsemaan hormonaalisia 
haitta-aineita saatiin validointiohjelmassa vain heikkoa näyttöä, ehdotetaan käytettäväksi valinnaisina päätepisteinä (katso lisäys 2).
 
6. Validointiprosessissa saatujen tietojen perusteella on korostettava, että tämän 
menetelmän herkkyys ei riitä kaikkien sellaisten aineiden tunnistamiseen, 
joilla on (anti)androgeenisia tai (anti)estrogeenisia vaikutustapoja (9). Testi ­
menetelmää ei käytetä siinä elämänvaiheessa, joka on herkin hormonaalisille häiriöille. Validointiprosessin aikana testimenetelmällä tunnistettiin kuitenkin 
aineita, jotka vaikuttavat kilpirauhasen toimintaan heikosti ja voimakkaasti, 
sekä hormonitoimintaan estrogeeni- tai androgeenireseptoreiden kautta voi ­
makkaasti tai kohtalaisesti vaikuttavia aineita, mutta useimmissa tapauksissa menetelmällä ei pystytty tunnistamaan sellaisia hormonitoimintaan vaikutta ­
via aineita, jotka vaikuttavat estrogeeni- tai androgeenireseptoreihin heikosti. 
Sitä ei siis voida pitää hormonitoimintaan kohdistuvan vaikutuksen seulon ­
tamenetelmänä.
 
7. Vastaavasti näihin vaikutustapoihin liittyvien vaikutusten puuttumista ei 
voida pitää osoituksena hormonijärjestelmään kohdistuvien vaikutusten 
puuttumisesta. Hormonivälitteisten vaikutusten osalta aineen luonnehdinnan ei tule sen vuoksi perustua pelkästään tällä testimenetelmällä saatuihin tu ­
loksiin, vaan niitä tulee käyttää näyttöön perustuvan toimintatavan yhtey ­
dessä, ja siihen on sisällytettävä kaikki kemikaalista olemassa olevat tiedot, 
jotta mahdollista hormonitoimintaan vaikutusta voidaan luonnehtia. Tästä syystä sääntelyyn liittyvässä päätöksenteossa, joka koskee hormonitoimin ­
taan kohdistuvia vaikutuksia (aineen luonnehdinta), on sovellettava 
laaja-alaista lähestymistapaa, eikä siinä tule tukeutua pelkästään tätä testi ­
menetelmää soveltaen saatuihin tuloksiin.
 
8. Kaikissa eläimiin liittyvissä menettelyissä on noudatettava paikallisia eläin ­
tenhoitovaatimuksia. Jäljempänä olevat kuvaukset eläinten hoidosta ja käsit ­
telystä ovat vähimmäisvaatimuksia, ja paikalliset määräykset ovat niihin 
nähden ensisijaisia, jos ne ovat tiukempia. OECD on antanut lisäohjeita eläinten humaanista käsittelystä (14).
 
9. Käytetyt määritelmät on esitetty lisäyksessä 1.  
TESTIN PERIAATE  
10. Testikemikaali annostellaan useille koe-eläinryhmille suun kautta päivittäin 
asteittain suurenevina annoksina siten, että yksi ryhmä saa aina yhtä annos ­
tasoa 28 päivän ajan. Annostelujakson aikana eläimiä havainnoidaan tarkoin 
päivittäin toksisuusoireiden varalta. Kokeen aikana kuolleille tai lopetetuille eläimille tehdään ruumiinavaus. Kokeen lopussa vielä elossa olevat eläimet lopetetaan ja niille tehdään ruumiinavaus. Kahdenkymmenenkahdeksan 
päivän mittainen tutkimus antaa tietoa toistuvan oraalisen altistuksen vaiku ­
tuksesta, ja siitä voidaan myös saada viitteitä pitempiaikaisten tutkimusten
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 276
 
tarpeesta. Lisäksi tutkimus voi antaa tietoa pitoisuuksien valinnasta pitkä ­
aikaisia tutkimuksia varten. Testimenetelmän avulla saatujen tietojen perus ­
teella tulisi voida luonnehtia testikemikaalin myrkyllisyyttä, jotta annos-vastesuhde ja taso, joka ei aiheuta havaittavaa haittavaikutusta (NOAEL), voidaan määrittää.
 
MENETELMÄN KUVAUS  
Eläinlajin valinta  
11. Suositeltavin jyrsijälaji on rotta, mutta muitakin jyrsijöitä voidaan käyttää. 
Jos tässä testimenetelmässä B.7 määritettyjä parametreja tutkitaan muilla 
jyrsijöillä, on esitettävä yksityiskohtainen perustelu. Vaikka on biologisesti 
todennäköistä, että muut lajit reagoivat myrkkyihin samalla tavoin kuin rotta, pienempien lajien käyttö voi kuitenkin lisätä vaihtelua pienempien elinten dissekoimiseen liittyvien teknisten haasteiden vuoksi. Kansainväli ­
sessä validointiohjelmassa, jossa tutkittiin hormonaalisten haitta-aineiden ha ­
vaitsemista, rotta oli ainoa käytetty laji. Testissä tulee käyttää yleisesti käy ­
tettyjä nuoria ja terveitä täysikasvuisia koe-eläinkantoja. Naaraat eivät saa olla synnyttäneitä eivätkä tiineinä. Annostelun tulee alkaa mahdollisimman 
pian vieroituksen jälkeen ja ainakin ennen yhdeksättä elinviikkoa. Käytettä ­
vien eläinten paino ei saisi juurikaan vaihdella eikä ylittää ± 20:tä prosenttia kummankaan sukupuolen keskipainosta kokeen alussa. Mikäli toistuvan oraalisen annostelun tutkimusta käytetään pitkäaikaistutkimuksen esitestinä, 
molemmissa tutkimuksissa tulee mieluiten käyttää samasta kannasta ja läh ­
teestä olevia eläimiä.
 
Koe-eläintilat ja ruokinta  
12. Kaikissa menettelyissä on noudatettava laboratorioeläinten hoitoa koskevia 
paikallisia vaatimuksia. Koe-eläinhuoneen lämpötilan tulee olla 22 °C (± 
3 °C). Vaikka riittää, että suhteellinen kosteus on vähintään 30 prosenttia 
eikä mielellään ylitä 70:tä prosenttia muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, pitäisi kuitenkin pyrkiä 50–60 prosentin suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa 
/ 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia labora ­
torioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. Ruokavalion valin ­
nassa on varmistettava, että testiaineen ja ravinnon suhde on sopiva, mikäli testiaine annetaan ravintoon sekoitettuna. Eläimet voidaan pitää häkeissä 
muutaman samaa sukupuolta olevan eläimen ryhmissä tai yksittäin, jos se 
on tieteellisesti perusteltua. Yhdessä ryhmähäkissä saa olla enintään viisi eläintä.
 
13. Eläinten ravinto on analysoitava säännöllisesti kontaminanttien varalta. 
Näyte ruokavaliosta on säilytettävä siihen saakka, kunnes tutkimusraportti 
on valmis.  
Eläinten valmistelu  
14. Terveet nuoret täysikasvuiset eläimet jaetaan satunnaisesti testi- ja verrokki ­
ryhmiin. Häkit on sijoitettava siten, että häkin sijainnista johtuvat vaikutuk ­
set ovat mahdollisimman vähäisiä. Eläimet tunnistetaan yksilöllisesti, ja ne 
pidetään häkeissä vähintään viiden päivän ajan ennen testin aloittamista, jotta ne tottuvat laboratorio-olosuhteisiin.
 
Annosten valmistelu  
15. Testikemikaali annetaan ruokintaletkulla tai ruoan tai juomaveden kautta. 
Oraalisen annostelun menetelmä määräytyy tutkimuksen tarkoituksen sekä 
testikemikaalin fysikaalis-kemiallisten ja toksikokineettisten ominaisuuksien 
mukaan.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 277
 
16. Tarvittaessa testikemikaali liuotetaan tai suspendoidaan sopivaan 
kantaja-aineeseen. On suositeltavaa, että ensin harkitaan vesiliuosta tai sus ­
pensiota aina, kun se on mahdollista, ja sen jälkeen öljyyn (esimerkiksi maissiöljyyn) tehtävää liuosta/suspensiota ja sitten mahdollisesti muita liuot ­
timia. Jos kantaja-aine on muu kuin vesi, sen myrkkyominaisuudet on tun ­
nettava. Testiaineen stabiliteetti kantaja-aineessa on määritettävä.
 
MENETTELY  
Eläinten lukumäärä ja sukupuoli  
17. Kutakin annostasoa tulee testata vähintään kymmenellä eläimellä (viisi naa ­
rasta ja viisi urosta). Jos osa eläimistä aiotaan lopettaa kesken kokeen, 
eläinten määrää tulee lisätä saman verran kuin niitä aiotaan lopettaa ennen kokeen päättymistä. Myös ylimääräisen, kymmenestä eläimestä (viisi kum ­
paakin sukupuolta) koostuvan satelliittiryhmän käyttöä voidaan harkita ver ­
rokkiryhmässä ja suurimman annoksen ryhmässä, jotta toksisten vaikutusten 
korjaantuvuutta, jatkuvuutta ja ilmenemisen viivästymistä voidaan havain ­
noida vähintään 14 päivän ajan käsittelyn jälkeen.
 
Annostelu  
18. Yleensä tulee käyttää vähintään kolmea testiryhmää ja yhtä verrokkiryhmää, 
mutta jos vaikutuksia ei muiden tietojen arvioinnin perusteella ole odotetta ­
vissa toistetulla vuorokausiannoksella 1 000 mg/kg, voidaan tehdä raja-annostesti. Jos sopivia tietoja ei ole saatavilla, voidaan tehdä annos ­
alueen haarukointitesti (samaa sukupuolta ja samasta lähteestä olevia eläimiä 
käyttäen) käytettävien annosten määrittämisen helpottamiseksi. Testiaineen 
annostelua lukuun ottamatta verrokkiryhmän eläimiä on käsiteltävä täsmäl ­
leen samoin kuin testiryhmän eläimiä. Jos testiaineen annostelussa käytetään kantaja-ainetta, sitä tulee antaa verrokkiryhmälle suurin käytetty määrä.
 
19. Annostasojen valinnassa tulee ottaa huomioon kaikki testikemikaaleista tai 
samankaltaisista kemikaaleista saatavilla olevat aiemmin saadut toksisuus- ja kinetiikkatiedot. Korkein annostaso tulee valita siten, että sen tarkoituksena 
on aiheuttaa toksisia vaikutuksia mutta ei kuolemaa tai vakavia kärsimyksiä. 
Annostasojen on oltava laskevia, jotta voitaisiin osoittaa kaikki annokseen liittyvät vasteet ja haitaton taso alhaisimmalla annostasolla (NOAEL). Kaksin-nelinkertaiset erot annostasojen välillä ovat usein parhaimmat alene ­
vassa annossarjassa, ja usein on hyödyllisempää lisätä neljäs testiryhmä kuin 
käyttää hyvin suuria annosvälejä (ts. suurempia kuin 10-kertaisia).
 
20. Jos havaitaan yleisiä myrkyllisyysvaikutuksia (kuten ruumiinpainon piene ­
nemistä, maksaan, sydämeen, keuhkoihin tai munuaisiin kohdistuvia vaiku ­
tuksia jne.) tai muita muutoksia, jotka eivät ole välttämättä toksisia (esimer ­
kiksi ravinnonoton vähentymistä, maksan suurenemista), immuunijärjestel ­
män, hermoston tai hormonitoiminnan kannalta herkkiin tutkittaviin ominai ­
suuksiin kohdistuvia vaikutuksia on tulkittava varovaisesti.  
Rajatesti  
21. Ellei yhdellä annostasolla, joka on vähintään 1 000 mg painokiloa kohti / 
vrk tai jota annetaan ravintoon tai juomaveteen sekoitettuna vastaava pro ­
senttiosuus (painomääritysten perusteella), tehdyssä testissä, joka on tehty 
tälle tutkimukselle annettujen ohjeiden mukaan, havaita myrkyllisiä vaiku ­
tuksia ja jos myrkyllisyyttä ei ole odotettavissa kemialliselta rakenteeltaan samanlaisilla kemikaaleilla saatujen tutkimustulosten perusteella, täydellinen tutkimus kolmella eri annostasolla ei ehkä ole välttämätön. Rajatestisääntöä 
sovelletaan, paitsi jos ihmisten altistumisesta voidaan päätellä, että on käy ­
tettävä korkeampaa annostasoa.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 278
 
Antotapa  
22. Eläimille annetaan testikemikaalia päivittäin seitsemänä päivänä viikossa 28 
vuorokauden ajan. Jos testikemikaali annetaan ruokintaletkun kautta, se on annettava eläimille yhtenä annoksena mahaletkun tai sopivan intubaatioka ­
nyylin kautta. Suurin yhdellä kerralla annettava nestetilavuus määräytyy 
koe-eläimen koon mukaan. Määrä ei saa ylittää 1 ml/100 g painoa. Poikke ­
uksen muodostavat vesiliuokset, joita käytettäessä tilavuus voi olla 2 ml/100 g painoa. Poikkeuksena tästä ovat ärsyttävät tai syövyttävät aineet, joiden 
kohdalla voidaan yleensä todeta vaikutusten voimistuminen suurempia pi ­
toisuuksia käytettäessä. Muutoin testitilavuuden vaihtelu tulee minimoida pitoisuutta muuttamalla, jotta kaikilla annostasoilla voidaan käyttää tilavuu ­
deltaan samaa nestemäärää.
 
23. Jos kemikaaleja annetaan ravintoon tai juomaveteen sekoitettuna, on tärkeää 
varmistaa, että testikemikaalimäärät eivät häiritse normaalia ravinto- tai nes ­
tetasapainoa. Jos testikemikaali annetaan ravintoon sekoitettuna, voidaan 
ilmoittaa joko testikemikaalin pitoisuus ravinnossa (ppm) tai eläimen pai ­
noon suhteutettu annostaso; käytetty tapa on mainittava. Jos kemikaali an ­
netaan letkulla, annos tulee antaa päivittäin samaan aikaan ja sitä on mu ­
kautettava tarvittaessa siten, että annostaso pysyy samana eläimen ruumiin ­
painoon nähden. Mikäli toistuvan annostelun tutkimusta käytetään pitkä ­
aikaistutkimuksen esitestinä, kummassakin tutkimuksessa on käytettävä sa ­
manlaista ruokavaliota.  
Havainnot  
24. Havainnointijakson on kestettävä 28 päivää. Seurantahavainnointiin tarkoi ­
tettuja satelliittiryhmän eläimiä tulisi pitää vähintään 14 päivää ilman annos ­
telua, jotta viivästyneet toksiset vaikutukset, niiden jatkuminen tai niistä 
toipuminen voidaan todeta.  
25. Eläimestä on tehtävä kliinisiä yleishavaintoja vähintään kerran päivässä mie ­
luiten suurin piirtein samaan aikaan / samoihin aikoihin joka päivä ja ottaen 
huomioon, että odotettuja vaikutuksia esiintyy eniten annostelun jälkeen. Eläinten vointi on kirjattava. Eläinten sairastavuus ja kuolleisuus tarkistetaan vähintään kahdesti päivässä.
 
26. Kutakin eläintä on havainnoitava kliinisesti seikkaperäisesti kerran ennen 
ensimmäistä altistuskertaa (samaa koe-eläintä koskevia vertailuja varten) ja sen jälkeen vähintään kerran viikossa. Havainnot tulee tehdä eläimen oman 
häkin ulkopuolella vakioalueella mieluiten samaan kellonaikaan joka kerta. 
Havainnot on kirjattava tarkoin muistiin, mieluiten koelaboratorion erikseen määrittelemiä pisteytysjärjestelmiä käyttäen. Vaihtelut koeolosuhteissa on 
pyrittävä minimoimaan ja havainnoijien on mieluiten oltava annostelusta 
tietämättömiä henkilöitä. Huomiota tulee kiinnittää mm. ihon, karvapeitteen, silmien, limakalvojen, mahdollisten sisäeritteiden ja kuonaeritteiden ja auto ­
nomisen toiminnan (esim. kyynelvuoto, piloerektio, mustuaisen koko, hen ­
gitys) muutoksiin. Käynnin, asennon ja käsittelyvasteen muutokset, mahdol ­
liset klooniset tai tooniset liikkeet, stereotypiat (esim. ylenmääräinen turkin hoito, jatkuva kehän kiertäminen) tai omituinen käytös (esim. itsensä silpo ­
minen, takaperin käveleminen) tulee myös kirjata muistiin (2).
 
27. Neljännellä altistusviikolla arvioidaan aistien reaktiivisuutta erityyppisille 
ärsykkeille (2) (esim. kuulo, näkö ja asentotunto) (3) (4) (5), tarttumaotteen voimakkuutta (6) ja motorista toimintaa (7). Mahdollisten toimenpiteiden 
tarkemmat yksityiskohdat löytyvät mainituista kirjallisuusviitteistä. Myös 
muita kuin viittausten mukaisia toimenpiteitä voidaan käyttää.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 279
 
28. Toiminnallisia havaintoja ei tarvitse tehdä neljännellä altistusviikolla, jos 
kyseessä on subkroonisen (90 päivän) tutkimuksen esitutkimus. Tällöin toi ­
minnalliset havainnot tehdään seurantatutkimuksessa. Toisaalta toistuvan an ­
nostelun tutkimuksesta saatavat toiminnallisia havaintoja koskevat tiedot voivat helpottaa annostasojen valintaa subkroonista tutkimusta varten.
 
29. Poikkeuksellisesti toiminnallisia havaintoja ei myöskään tarvitse tehdä ryh ­
millä, joissa muutoin ilmenee merkkejä myrkyllisyydestä laajuudessa, joka häiritsisi merkitsevästi toiminnallisten kokeiden suorittamista.
 
30. Ruumiinavauksen yhteydessä kaikkien naaraiden kiimasykli voidaan mää ­
rittää (valinnaisesti) ottamalla niiltä irtosolunäytteet. Näistä havainnoista saa ­
daan tietoa kiimasyklin vaiheesta eläimen lopettamisen ajankohtana, ja niistä 
on myös apua estrogeeniherkkien kudosten histologisessa arvioinnissa [katso histopatologiaa koskevat ohjeet (19)].
 
Ruumiinpaino ja ravinnon/veden kulutus  
31. Kukin eläin on punnittava vähintään kerran viikossa. Ravinnon kulutus on 
mitattava vähintään viikoittain. Jos testikemikaali annostellaan juomavedes ­
sä, myös veden kulutus on mitattava vähintään viikoittain.  
Hematologia  
32. Seuraavat verikokeet on tehtävä koejakson päätyttyä: hematokriitti, hemog ­
lobiini, erytrosyyttien määrä, retikulosyytit, leukosyyttien kokonaismäärä ja 
erittelylaskenta, trombosyyttien määrä ja veren hyytymisajan/-potentiaalin 
mittaus. Muita määrityksiä, jotka on tehtävä, jos testikemikaalilla tai sen oletetuilla metaboliiteilla on tai epäillään olevan hapettavia ominaisuuksia, ovat methemoglobiinipitoisuus ja Heinzin kappaleet.
 
33. Verinäytteet tulee ottaa nimetystä kohdasta juuri ennen eläinten lopettamista 
tai sen yhteydessä. Näytteet tulee säilyttää asianmukaisissa olosuhteissa. 
Eläinten ruokintaa on siirrettävä lopettamista edeltävän yön yli (  1 ). 
Kliininen biokemia  
34. Kliiniset biokemialliset määritykset tärkeimpien toksisten kudosvaikutusten 
ja erityisesti munuais- ja maksavaikutusten tutkimiseksi tulee tehdä verinä ­
ytteistä, jotka otetaan kustakin eläimestä juuri ennen lopettamista tai sen 
yhteydessä (lukuun ottamatta eläimiä, jotka on löydetty kuolemaisillaan 
ja/tai lopetettu kesken kokeen). Plasma- ja seerumikokeiden tulee kattaa natrium, kalium, glukoosi, kokonaiskolesteroli, urea, kreatiniini, kokonaisp ­
roteiini ja albumiini, vähintään kaksi hepatosellulaarisia vaikutuksia osoitta ­
vaa entsyymiä (kuten alaniiniaminotransferaasi, aspartaattiaminotransferaasi, 
alkalinen fosfataasi, gammaglutamyylitranspeptidaasi ja glutamaattidehydro ­
tenaasi) ja sappihapot. Muiden entsyymien (maksasta tai muualta peräisin olevien) ja bilirubiinin mittauksista voidaan saada hyödyllistä tietoa tietyissä 
olosuhteissa.
 
35. Vaihtoehtoisesti voidaan tehdä seuraavat virtsa-analyysit viimeisellä tutki ­
musviikolla ajastetun virtsankeräyksen avulla: ulkonäkö, määrä, osmolali ­
teetti tai ominaistiheys, pH-arvo, proteiini, glukoosi ja veri/verisolut.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 280  
( 1 ) Ruokinnan siirtämistä yön yli suositellaan monissa seerumi- ja plasmamittauksissa, eten ­
kin glukoosimittauksissa. Tärkein syy tälle suositukselle on se, että syöminen väistämättä 
lisää vaihtelua, mikä voi estää lievien vaikutusten havaitsemisen ja vaikeuttaa tulosten 
tulkintaa. Toisaalta ruokinnan siirtäminen yön yli voi häiritä eläinten yleistä metaboliaa ja 
etenkin ruokintatutkimuksissa päivittäistä altistusta testikemikaalille. Jos eläimen ruokinta 
siirretään yli yön, kliiniset biokemialliset mittaukset tulee tehdä neljännellä tutkimusvii ­
kolla suoritettavien toiminnallisten havaintojen jälkeen.
 36. Lisäksi tulee tutkia, esiintyykö seerumissa yleisiä kudosvaurioita osoittavia 
merkkiaineita. Muita määrityksiä, jotka on tehtävä, jos testikemikaalin tun ­
netut ominaisuudet voivat vaikuttaa tai niiden epäillään vaikuttavan siihen liittyviin metaboliaprofiileihin, ovat kalsium, fosfaatti, triglyseridit, tietyt hormonit, methemoglobiini ja koliiniesteraasi. Nämä on selvitettävä tiettyjen 
luokkien aineista tai tapauskohtaisesti.
 
37. Vaikka hormonitoimintaan liittyvien tutkittavien ominaisuuksien kansainvä ­
lisessä arvioinnissa ei voitu osoittaa, että kilpirauhashormonien (T3, T4) ja 
TSH:n määrittämisestä olisi selvää hyötyä, plasma- ja seeruminäytteet kan ­
nattaa kuitenkin säilyttää T3- ja T4-arvojen sekä TSH-arvon (valinnainen) mittaamista varten, jos näyttää siltä, että kemikaali vaikuttaa aivolisäke-kil ­
pirauhasakseliin. Nämä näytteet voidaan pakastaa –20 °C:ssa säilytystä var ­
ten. Seuraavat seikat saattavat vaikuttaa hormonimääritysten vaihteluun ja absoluuttisiin pitoisuuksiin:
 
— lopettamisaika hormonipitoisuuksien vuorokausivaihtelun takia  
— lopettamistapa, jotta vältetään aiheuttamasta eläimille turhaa stressiä, 
joka voi vaikuttaa hormonipitoisuuksiin  
— hormonimääritysten testipaketit, joiden standardikäyrät voivat vaihdella.  
Kilpirauhaseen vaikuttavat kemikaalit tunnistetaan varmemmin ja luotetta ­
vammin käyttämällä hormonipitoisuuksien sijasta mieluummin histopatolo ­
gista analyysia.  
38. Plasmanäytteet, jotka on nimenomaisesti tarkoitettu hormonimäärityksiin, on 
otettava samaan aikaan päivästä. On suositeltavaa harkita T3-, T4- ja THS-määrityksiä, jos kilpirauhasen histopatologiset muutokset antavat siihen aihetta. Hormonipitoisuuksien analysoimisesta saadaan toisenlaisia numee ­
risia arvoja kuin erilaisten kaupallisten testipakettien avulla. Näin ollen yh ­
tenäisiin aiempiin tietoihin perustuvia vaatimuksia ei voida välttämättä laa ­
tia. Vaihtoehtoisesti laboratorioiden on pyrittävä pitämään variaatiokertoimet T3:n ja T4:n osalta pienempinä kuin 25 ja TSH:n osalta pienempänä kuin 
35. Kaikki pitoisuudet on kirjattava käyttäen yksikköä ng/ml.
 
39. Jos aiemmat lähtötason tiedot ovat riittämättömiä, hematologiset ja kliiniset 
biokemialliset muuttujat on määritettävä ennen annostelun aloittamista tai 
mieluiten ryhmässä eläimiä, jotka eivät kuulu koeryhmiin.  
PATOLOGIA  
Ruumiinavaustutkimukset  
40. Kaikille tutkimukseen sisältyville eläimille on tehtävä täydellinen ja yksityis ­
kohtainen ruumiinavaus, jossa tutkitaan huolellisesti eläimen ruumis päältä 
päin, kaikki ruumiin aukot sekä kallo-, rinta- ja vatsaontelot ja niiden sisältö. 
Kaikkien eläinten (lukuun ottamatta kuolleina löydettyjä ja/tai kesken koetta lopetettuja)
 maksa, munuaiset, lisämunuaiset, kivekset, lisäkivekset, eturau ­ 
hanen + rakkularauhanen ja niiden etuosat kokonaisuudessaan, kateenkorva,  
perna, aivot ja sydän on puhdistettava muusta kudoksesta tapauksen mu ­
kaan, ja ne on punnittava mahdollisimman nopeasti avauksen jälkeen kui ­
vumisen estämiseksi. Eturauhaskokonaisuuden puhdistamisessa on oltava huolellinen, jotta nestettä sisältävät rakkularauhaset eivät puhkea. Rakkula ­
rauhaset ja eturauhanen voidaan puhdistaa ja punnita myös kiinnittämisen 
jälkeen.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 281
 
41. Lisäksi voidaan valinnaisesti punnita kaksi muuta kudosta mahdollisimman 
pian dissektion jälkeen kuivumisen estämiseksi: munasarjat (märkäpaino), 
kohtu ja kohdunkaula (ohjeita kohtukudosten irrottamisesta ja valmistelusta punnitusta varten on OECD:n ohjeessa TG 440 (18)).
 
42. Kilpirauhasen paino (valinnainen) voidaan määrittää kiinnittämisen jälkeen. 
Puhdistus on tehtävä hyvin varovasti ja vasta kiinnittämisen jälkeen kudos ­
vaurioiden välttämiseksi. Kudosvauriot voivat haitata histopatologista ana ­
lyysia.  
43. Seuraavat kudokset säilytetään sekä kudostyypin että aiotun histopatologisen 
tutkimuksen kannalta sopivimmassa kiinnitysaineessa (katso 47 kohta): kaikki
 silmin havaittavat vauriot, aivot (edustavat alueet, mukaan lukien 
iso- ja pikkuaivot ja aivosilta),  selkäydin, mahalaukku, ohutsuoli, paksusuoli 
(mukaan lukien Peyerin levyt),  maksa, munuaiset, lisämunuaiset, perna, sy ­ 
dän, kateenkorva, kilpirauhanen, henkitorvi ja keuhkot (säilytetään puhalta ­
malla keuhkot täyteen kiinnitysainetta ja upottamalla ne sitten kiinnitys ­
aineeseen),  sukurauhaset (kivekset ja munasarjat), avustavat sukuelimet 
(kohtu ja kohdunkaula, lisäkivekset, eturauhanen ja rakkularauhanen sekä niiden etuosat),
 vagina, virtsarakko, imusolmukkeet [proksimaalisimman 
imusolmukkeen lisäksi on otettava vielä toinen imusolmuke laboratorion 
kokemuksen perusteella (15)],  ääreishermo (lonkka- tai säärihermo) mielui ­
ten läheltä lihasta,  luurankolihas ja luu sekä osa  luuydintä (tai vaihtoehtoi ­
sesti tuore luuydinaspiraatti). Kivekset suositellaan kiinnitettävän upotta ­
malla ne Bouinin tai muunneltuun Davidsonin kiinnitysaineeseen (16) (17). 
Tunica albugineaan on tehtävä varovasti pieni reikä neulalla elimen molem ­
piin päihin, jotta kiinnitysaine pääsee tunkeutumaan sisään nopeasti. Klii ­
nisten ja muiden löydösten perusteella on vielä ehkä tutkittava muita ku ­
doksia. Myös testikemikaalin tunnettujen ominaisuuksien perusteella toden ­
näköiset kohde-elimet on säilytettävä.  
44. Seuraavista kudoksista voi löytyä tärkeitä merkkejä hormonitoimintaan liit ­
tyvistä vaikutuksista: sukurauhaset (munasarjat ja kivekset), avustavat su ­
kuelimet (kohtu ja kohdunkaula, lisäkivekset, rakkularauhanen ja sen etuosa, dorsolateraalinen ja ventraalinen eturauhanen), vagina, aivolisäke, uroksen rintarauhanen sekä kilpirauhanen ja lisämunuainen. Uroksen rintarauhasten 
muutoksia ei ole dokumentoitu riittävästi, mutta tämä parametri voi olla 
hyvin herkkä aineille, joilla on estrogeenisia vaikutuksia. Niiden elinten/ku ­
dosten, joita ei ole lueteltu 43 kohdassa, havainnointi ei ole pakollista (katso lisäys 2).
 
45. Histopatologiaa koskevissa ohjeissa (19) on tarkempia tietoja endokriinisten 
kudosten dissektiosta, kiinnittämisestä, mikrotomiasta ja histopatologiasta.  
46. Kansainvälisestä testiohjelmasta saatiin jonkin verran näyttöä siitä, että sel ­
laisten kemikaalien, jotka vaikuttavat sukupuolihormonien tasapainoon vain vähän, lievät hormonitoimintaan kohdistuvat vaikutukset voidaan tunnistaa kiimasyklin synkronoinnin häiriintymisestä eri kudoksissa eikä niinkään suo ­
raan naaraan sukupuolielinten histopatologisista muutoksista. Vaikkei tällai ­
sista vaikutuksista saatu varmoja todisteita, on suositeltavaa ottaa huomioon todisteet kiimasyklin epäsynkroniasta, kun tulkitaan munasarjojen (follikkeli- , teeka- ja granuloosasolut), kohdun, kohdunkaulan ja vaginan histopatolo ­
giaa. Jos syklin vaihe on arvioitu vaginan irtosolunäytteestä, myös tämä tieto 
voidaan sisällyttää tähän vertailuun.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 282
 
Histopatologia  
47. Kaikkien verrokkien ja suuriannoksiseen ryhmään kuuluneiden eläinten säi ­
lytetyt elimet ja kudokset tutkitaan perusteellisesti histopatologisesti. Histo ­
patologiset tutkimukset tulee tehdä myös kaikille muiden annostusryhmien 
eläimille, jos käsittelyyn liittyviä muutoksia havaitaan suuren annoksen ryh ­
mässä.  
48. Kaikki silmin havaittavat vauriot on tutkittava.  
49. Mahdolliseen satelliittiryhmään kuuluvilta eläimiltä tulee tutkia histopatolo ­
gisesti sellaiset kudokset ja elimet, joissa ilmenee samoja vaikutuksia kuin 
käsitellyillä ryhmillä.  
TIEDOT JA RAPORTOINTI  
Tiedot  
50. Koetulokset tulee esittää yksilöidysti. Yhteenveto tuloksista on esitettävä 
myös taulukossa, josta ilmenee kussakin koeryhmässä tutkimuksen alussa 
käytettyjen eläinten lukumäärä, kokeen aikana kuolleena löydettyjen tai hu ­
maaneista syistä lopetettujen eläinten lukumäärä ja niiden kuolinaika, merk ­
kejä myrkyllisyydestä osoittaneiden eläinten lukumäärä, havaittujen toksisten vaikutusten kuvaus, mukaan lukien niiden alkamisajankohta, kesto ja vai ­
keusaste, vaurioita saaneiden eläinten lukumäärä, vauriotyypit ja eläinten 
prosentuaaliset osuudet vauriotyypeittäin.
 
51. Numeeriset tulokset on mahdollisuuksien mukaan arvioitava asianmukaisella 
ja yleisesti hyväksytyllä tilastollisella menetelmällä. Verrattaessa vaikutusta pitoisuusalueen mukaan on vältettävä monien t-testien käyttöä. Tilastolliset 
menetelmät tulee valita tutkimusasetelman suunnitteluvaiheessa.
 
52. Laadunvalvontaa varten on suositeltavaa kerätä vertailutietoja aiemmista 
tutkimuksista ja laskea vaihtelukertoimista numeeriset tiedot varsinkin sel ­
laisista parametreista, jotka liittyvät hormonaalisten haitta-aineiden havaitse ­
miseen. Näitä tietoja voidaan käyttää vertailutarkoituksiin, kun varsinaisia 
tutkimuksia arvioidaan.  
Testiraportti  
53. Testiraportin on sisällettävä seuraavat tiedot:  
Testikemikaali:  
— fysikaalinen olomuoto, puhtaus ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet  
— tunnistetiedot.  
Kantaja-aine (tarvittaessa):  
— kantaja-aineen valinnan perustelut, jos se on muu kuin vesi.  
Koe-eläimet:  
— käytetty laji/kanta  
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli  
— lähde, elinolosuhteet, ravinto jne.  
— kunkin eläimen paino testin alkaessa  
— lajin valinnan perustelut, jos se on muu kuin rotta.  
Testiolosuhteet:  
— annostason valintaperustelut  
— yksityiskohdat testikemikaalin koostumuksesta/ravintovalmisteesta, val ­
misteessa saavutetusta pitoisuudesta, sen stabiliteetista ja homogeenisuu ­
desta ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 283
 
— testikemikaalin annostelun yksityiskohdat  
— ravinnossa/juomavedessä olevan testikemikaalin määrän (ppm) muunta ­
minen varsinaiseksi annokseksi (mg/kg/vrk) tarvittaessa  
— yksityiskohdat ravinnon ja veden laadusta.  
Valinnaiset tutkitut ominaisuudet  
— luettelo valinnaisista ominaisuuksista, jotka on tutkittu.  
Tulokset:  
— ruumiinpaino / ruumiinpainon muutokset  
— ravinnon ja tarvittaessa veden kulutus  
— toksiset vastetiedot sukupuolen ja annostason mukaan, mukaan lukien 
toksisuusoireet  
— kliinisten havaintojen luonne, vaikeusaste ja kesto (korjaantuvuudesta 
riippumatta)  
— arvioinnit aistitoiminnoista, tarttumaotteen voimakkuudesta ja motori ­
sesta toiminnasta  
— verikokeet ja niihin liittyvät lähtötasoarvot  
— kliiniset biokemialliset kokeet ja niihin liittyvät lähtötasoarvot  
— ruumiinpaino eläimen lopettamisen yhteydessä ja eri elinten painotiedot  
— ruumiinavauslöydökset  
— kaikkien histopatologisten löydösten seikkaperäinen kuvaus  
— tiedot imeytymisestä, mikäli saatavilla  
— tulosten tilastollinen käsittely tarvittaessa.  
Tulosten pohdinta  
Johtopäätökset  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 284
 
Lisäys 1  
MÄÄRITELMÄT  
Androgeenisuus  on kemikaalin kyky vaikuttaa nisäkkäiden organismissa luon ­
nollisen androgeenihormonin (esimerkiksi testosteronin) tavoin.  
Annos  on annetun testikemikaalin määrä. Annos ilmaistaan testikemikaalin pai ­
nona koe-eläimen painoyksikköä kohti (esim. mg/kg päivässä) tai vakioina pi ­
dettävinä ruokavalion pitoisuuksina (ppm).  
Annostelu  on yleinen termi, joka kattaa annoksen, annostelutaajuuden ja annos ­
telun keston.  
Antiandrogeenisuus  on kemikaalin kyky estää luonnollisen androgeenihormonin 
(esimerkiksi testosteronin) vaikutus nisäkkäiden organismissa.  
Antiestrogeenisuus  on kemikaalin kyky estää luonnollisen estrogeenihormonin 
(esimerkiksi 17ß-estradiolin) vaikutus nisäkkäiden organismissa.  
Estrogeenisuus  on kemikaalin kyky vaikuttaa nisäkkäiden organismissa luonnol ­
lisen estrogeenihormonin (esimerkiksi 17ß-estradiolin) tavoin.  
Ilmeinen toksisuus  on yleistermi, jolla tarkoitetaan testikemikaalin antamisen 
jälkeen ilmeneviä selviä toksisuuden oireita. Niitä on oltava riittävästi vaaran 
arviointia varten, ja niiden on oltava sellaisia, että annetun annoksen suurenta ­
misen voidaan odottaa aiheuttavan vakavia merkkejä myrkyllisyydestä ja toden ­
näköisesti kuolleisuutta.  
Kilpirauhasen kaltainen vaikutus  on kemikaalin kyky vaikuttaa nisäkkäiden 
organismissa luonnollisen kilpirauhashormonin (esimerkiksi T  3 :n) tavoin.  
Kilpirauhasen toimintaa estävä vaikutus  on kemikaalin kyky estää luonnolli ­
sen kilpirauhashormonin (esimerkiksi T  3 :n) vaikutus nisäkkäiden organismissa.  
NOAEL  on lyhennys englanninkielisistä sanoista no-observed-adverse-effect le ­
vel (taso, joka ei aiheuta havaittavaa haittavaikutusta). Se on siis suurin annos, jolla ei havaita mitään haitallisia käsittelyyn liittyviä vaikutuksia.
 
Testikemikaali:  Tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos.  
Validointi  on tieteellinen menettely, jonka tarkoituksena on luonnehtia testime ­
netelmän toiminnallisia vaatimuksia ja rajoituksia sekä osoittaa sen luotettavuus 
ja merkityksellisyys tiettyyn tarkoitukseen nähden.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 285
 
Lisäys 2  
Testimenetelmässä B.7 tutkittavat ominaisuudet hormonaalisten 
haitta-aineiden havaitsemiseksi  
Pakolliset tutkittavat kohteet Valinnaiset tutkittavat kohteet 
Paino  
— Kivekset 
— Lisäkivekset 
— Lisämunuaiset 
— Eturauhanen + rakkularauhanen ja 
niiden etuosat — Munasarja 
— Kohtu ja kohdunkaula 
— Kilpirauhanen  
Histopatologia  
— Sukupuolirauhaset: 
— Kivekset — Munasarjat 
— Lisäsukupuolirauhaset: 
— Lisäkivekset — Eturauhanen + rakkularauhanen 
ja niiden etuosat 
— Kohtu ja kohdunkaula 
— Lisämunuaiset — Kilpirauhanen 
— Vagina — Vaginan irtosolunäytteet 
— Urosten maitorauhaset — Aivolisäke
 
Hormonimääritys  
— T3- ja T4-hormonien pitoisuus ve ­
renkierrossa 
— TSH-hormonin pitoisuus verenki ­
errossa  
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the  ad hoc  
Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neuro ­
toxicity.  
2) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Do ­
cument No. 60,  
3) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003.  
4) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol Environ. Health 9: 691–704.  
5) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Com ­
parisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and 
Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.  
6) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. 
Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 286
 
7) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experi ­
ments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Tera ­
tol. 13: 599–609.  
8) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Dis ­
rupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, 
ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
9) OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: 
Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.
 
10) OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for 
Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment 
No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.  
11) OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of En ­
docrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/docu ­
ment/58/0,3343,fr_2649_37407_23487 94_1_1_1_37407,00.html  
12) OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation 
Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.  
13) OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endoc ­
rine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.  
14) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MO ­
NO(2000)7.  
15) Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, 
Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice 
Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. 
Toxicol Pathol 33: 404–407.  
16) Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the 
Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, s. 52–85.
 
17) Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation of 
testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524–533.
 
18) OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 440: Uterot ­
rophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic 
properties.  
19) OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endoc ­
rine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 287
 
B.8 SUBAKUUTTI MYRKYLLISYYS HENGITETTYNÄ: 28 PÄIVÄN 
TUTKIMUS  
TIIVISTELMÄ  
Tämän tarkistetun testimenetelmän B.8 tarkoituksena on luonnehtia kokonaisval ­
taisesti testikemikaalin myrkyllisyyttä hengitettynä toistuvan altistuksen jälkeen 
tietyllä ajanjaksolla (28 päivää) ja tuottaa tietoa määrällistä riskinarviointia varten. Jyrsijäryhmät, joissa on vähintään viisi urosta ja viisi naarasta, altistetaan kuuden tunnin ajan päivittäin 28 päivän ajan a) testikemikaalille kolmella tai useammalla 
pitoisuudella, b) suodatetulle ilmalle (negatiivinen kontrolli) ja/tai kantaja-aineelle 
(kantaja-ainekontrolli). Eläimiä altistetaan yleensä viitenä päivänä viikossa, mutta myös seitsemän päivän altistus viikossa on mahdollista. Sekä uroksia että naaraita testataan aina, mutta ne voidaan altistaa eri pitoisuuksille, jos jommankumman 
tiedetään olevan herkempi tietylle testikemikaalille. Tässä menetelmässä tutkimuk ­
sen johtajalla on mahdollisuus sisällyttää tutkimukseen satelliittiryhmiä (vaikutus ­
ten korjaantuvuus), bronkoalveolaarinen huuhtelu (BAL), neurologisia testejä sekä muita kliiniskemiallisia ja histopatologisia arviointeja, jotta testikemikaalin myr ­
kyllisyyttä voidaan luonnehtia paremmin.
 
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 412 (2009). Alkupe ­
räinen subakuuttia inhalaatiotestiä koskeva testiohje nro 412 (TG 412) hy ­
väksyttiin vuonna 1981. Tätä testimenetelmää B.8 (joka vastaa tarkistettua ohjetta TG 412) on ajantasaistettu, jotta tieteellinen kehitys voidaan ottaa huomioon ja jotta nykyiset ja tulevat sääntelyvaatimukset voidaan täyttää.
 
2. Tämän menetelmän avulla voidaan luonnehtia haittavaikutuksia, joita seuraa 
toistuvasta altistumisesta testikemikaalille päivittäin hengityksen kautta 28 
päivän ajan. Tietoja, jotka saadaan 28 päivän mittaisista, subakuuttia myr ­
kyllisyyttä hengitettynä koskevista tutkimuksista, voidaan käyttää määrälli ­
sissä riskinarvioinneissa [jos niiden jälkeen ei tehdä 90 päivän tutkimusta 
subkroonisesta myrkyllisyydestä hengitettynä (tämän liitteen luku B.29)]. 
Tiedoista voi olla apua myös valittaessa pitoisuuksia pitkäkestoisempiin tutkimuksiin, kuten 90 päivän tutkimukseen, jossa tarkastellaan subkroonista myrkyllisyyttä hengitettynä. Tätä testimenetelmää ei ole varsinaisesti tarkoi ­
tettu nanomateriaalien testaamiseen. Tämän testimenetelmän yhteydessä käy ­
tetyt määritelmät ovat tämän luvun lopussa ja ohjeasiakirjassa GD 39 (2).
 
ALUSTAVAT HUOMIOT  
3. Testauslaboratorion on otettava huomioon kaikki testikemikaalista saatavilla 
olevat tiedot ennen tutkimuksen toteuttamista tutkimuksen laadun paranta ­
miseksi ja eläinten käytön minimoimiseksi. Tietoihin, joista voi olla apua asianmukaisten testipitoisuuksien valinnassa, sisältyvät testattavan kemikaa ­
lin identiteetti, kemiallinen rakenne ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet,  in 
vitro-  tai in vivo  -toksisuustestien tulokset, odotettavissa olevat käytöt ja 
ihmisten altistumisen mahdollisuus, saatavilla olevat (Q)SAR-tiedot ja tok ­
sikologiset tiedot rakenteellisesti samankaltaisista aineista sekä akuuttia myr ­
kyllisyyttä hengitettynä koskevista testeistä saadut tulokset. Jos oletetaan tai 
havaitaan, että tutkimuksen aikana ilmenee neurotoksisuutta, tutkimuksen 
johtaja voi sisällyttää tutkimukseen asianmukaisia arviointeja, kuten toimin ­
nallisen havaintosarjan (FOB:n) ja motorisen aktiivisuuden mittauksen. Vaikka altistuksen ajoitus voi olla kriittinen tietyissä tutkimuksissa, näiden 
ylimääräisten toimien toteuttaminen ei saa häiritä perustutkimuksen raken ­
netta.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 288
 
4. Syövyttävien tai ärsyttävien testikemikaalien laimennoksia voidaan testata 
sellaisina pitoisuuksina, joilla saadaan aikaan haluttu myrkyllisyyden aste 
[katso GD 39 (2)]. Kun eläimiä altistetaan näille materiaaleille, tavoitepitoi ­
suuksien on oltava riittävän pienet, jotta eläimille ei aiheudu suurta kipua ja stressiä, mutta kuitenkin tarpeeksi suuret, jotta pitoisuus-vastekäyrä on riit ­
tävä sääntelyyn liittyvien ja tieteellisten testaustavoitteiden saavuttamiseksi. 
Nämä pitoisuudet on valittava tapauskohtaisesti, ja niiden tulee ensisijaisesti perustua asianmukaisesti suunniteltuun annosalueen määritystestiin, josta saadaan tietoa kriittisestä tutkittavasta ominaisuudesta, ärsytysrajasta ja oi ­
reiden alkamisajankohdasta (katso 11–13 kohta). Pitoisuuden valinnalle on 
esitettävä perusteet.
 
5. Kuolemaisillaan olevat eläimet, selvästi kärsivät eläimet tai eläimet, jotka 
osoittavat selviä merkkejä voimakkaasta ja jatkuvasta kärsimyksestä, on 
lopetettava humaanisti. Kuolemaisillaan olevia eläimiä käsitellään samalla tavalla kuin eläimiä, jotka kuolevat testissä. Eläinkokeiden humaaneja lopet ­
tamiskriteereitä koskevassa OECD:n ohjeasiakirjassa (3) on esitetty kriteerit, 
joiden perusteella tehdään päätös kuolemaisillaan olevan tai voimakkaasti 
kärsivän eläimen lopettamisesta. Lisäksi siinä on annettu ohjeita ennustetta ­
van tai uhkaavan kuoleman tunnistamiseksi.
 
MENETELMÄN KUVAUS  
Eläinlajin valinta  
6. Kokeessa tulee käyttää terveitä nuoria täysikasvuisia jyrsijöitä, jotka kuu ­
luvat yleisesti käytettyihin koe-eläinkantoihin. Suositeltavin laji on rotta. Jos 
käytetään muita lajeja, sille on esitettävä perustelut.  
Eläinten valmistelu  
7. Naaraat eivät saa olla synnyttäneitä eivätkä tiineinä. Satunnaistamispäivänä 
eläinten on oltava nuoria ja täysikasvuisia, ja niiden iän on oltava 7–9 viikkoa. Ruumiinpainon on oltava ± 20 prosenttia keskimääräisestä painosta 
kummankin sukupuolen osalta. Eläimet valitaan satunnaistetusti ja merkitään 
niin, että yksilöt voidaan erottaa toisistaan. Eläimet pidetään häkeissä vähin ­
tään viiden päivän ajan ennen testin aloittamista, jotta ne tottuvat laboratorio-olosuhteisiin.
 
Eläinten hoito  
8. Eläimet on voitava erottaa toisistaan esimerkiksi ihon alle asennettavien 
lähettimien avulla havainnoinnin helpottamiseksi ja sekaannuksien välttämi ­
seksi. Koe-eläintilan lämpötilan on oltava 22 ± 3 °C. Suhteellinen ilman ­
kosteus on pidettävä mielellään 30–70 prosentin välillä, mikä ei välttämättä 
ole mahdollista, jos kantaja-aineena käytetään vettä. Ennen altistuksia ja 
niiden jälkeen eläimet on eroteltava häkkeihin sukupuolen ja pitoisuuden mukaisiin ryhmiin, mutta eläinten lukumäärä häkkiä kohti ei saa häiritä kunkin eläimen selkeää havainnointia, ja määrä on pidettävä sellaisena, 
että kannibalismista ja tappelusta johtuvat hävikit voidaan minimoida. Jos 
eläimet altistetaan vain nasaalisesti, ne voi olla tarpeen totuttaa immobili ­
sointiputkiin. Immobilisointiputket eivät saa aiheuttaa eläimille tarpeetonta fyysistä, lämpöön tai liikkumattomuuteen liittyvää stressiä. Immobilisointi 
voi vaikuttaa fysiologisiin tutkittaviin ominaisuuksiin, kuten ruumiinläm ­
pöön (hypertermia) ja/tai hengityksen minuuttitilavuuteen. Jos saatavilla on rinnakkaistietoja, jotka osoittavat, ettei tällaisia muutoksia juuri ilmene, im ­
mobilisointiputkiin totuttaminen ei ole tarpeen. Eläimet, jotka altistetaan 
aerosolille kokonaan, on laitettava kokeen ajaksi häkkiin yksittäin, jotta 
testattava aerosoli ei suodatu muiden häkissä olevien eläinten karvapeitteen kautta. Tavallista ja sertifioitua laboratorioruokavaliota voidaan käyttää muulloin paitsi altistuksen aikana, eikä tavallisen juomaveden määrää tule 
rajoittaa. Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 
tuntia valoa / 12 tuntia pimeää).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 289
 
Inhalaatiokammiot  
9. Testikemikaalin luonne ja testin tavoite on otettava huomioon inhalaatio ­
kammiota valittaessa. Ensisijainen altistustapa on vain nasaalisesti (nose- only; tähän termiin kuuluvat altistustavat vain pään kautta, vain nasaalisesti 
tai vain nokan kautta). Vain nasaalista altistusta suositellaan yleensä tutkit ­
taessa nestemäisiä tai kiinteitä aerosoleja sekä sellaisia höyryjä, jotka saat ­
tavat tiivistyä ja muodostaa siten aerosoleja. Tutkimuksen tietyt tavoitteet voidaan saavuttaa paremmin käyttämällä koko kehoon kohdistuvaa altistus ­
ta, mutta se on perusteltava tutkimusraportissa. Jotta kammion ilma voidaan 
pitää vakaana koko kehon kammiossa, koe-eläinten viemä tila saa olla kor ­
keintaan viisi prosenttia kammion tilavuudesta. Vain nasaalisesti -altistuksen 
ja koko kehoon kohdistuvan altistuksen tekniikoiden periaatteet sekä niiden 
erityiset hyödyt ja haitat on kuvattu ohjeasiakirjassa GD 39 (2).
 
MYRKYLLISYYSTUTKIMUKSET  
Rajapitoisuudet  
10. Toisin kuin akuuteissa tutkimuksissa, 28 päivän subakuuteissa tutkimuksis ­
sa, joissa tarkastellaan myrkyllisyyttä hengitettynä, ei ole määritettyjä raja ­
pitoisuuksia. Testatun enimmäispitoisuuden osalta on otettava huomioon seuraavat seikat: 1) suurin mahdollinen pitoisuus, 2) ihmisen altistustaso pahimmassa tapauksessa, 3) tarve ylläpitää riittävä hapensyöttö ja/tai 4) 
eläinten hyvinvointiin liittyvät seikat. Koska tietoon perustuvia rajoja ei 
siis ole, voidaan käyttää asetuksen (EY) N:o 1272/2008 (13) mukaisia akuutteja rajoja (ts. enimmäispitoisuus aerosolien osalta on 5 mg/l, höyryjen osalta 20 mg/l ja kaasujen osalta 20 000 ppm), ks. GD 39 (2). Jos nämä rajat 
täytyy ylittää esimerkiksi testattaessa kaasuja tai erittäin haihtuvia testikemi ­
kaaleja (esimerkiksi jäähdytysaineita), sille on esitettävä perustelut. Rajapi ­
toisuudella on saatava aikaan selvä myrkyllisyys, joka ei saa aiheuttaa eläi ­
mille tarpeetonta stressiä tai vaikuttaa niiden pitkäikäisyyteen (3).
 
Annosalueen määritystutkimus  
11. Ennen päätutkimuksen aloittamista voi olla tarpeen tehdä annosalueen mää ­
ritystutkimus. Annosalueen määritystutkimus on esikoetta kattavampi, koska 
sitä ei ole rajattu pitoisuuden valintaan. Annosalueen määritystutkimuksesta 
karttunut tieto voi edistää päätutkimuksen onnistumista. Annosalueen mää ­
ritystutkimuksesta voidaan saada esimerkiksi teknistä tietoa analyysimene ­
telmistä, hiukkasten koosta, toksisten mekanismien löytämisestä, kliinisestä 
patologiasta ja histopatologiasta, ja sen avulla voidaan arvioida, mitkä ovat päätutkimuksen NOAEL- ja MTC-pitoisuudet. Tutkimuksen johtaja voi päättää toteuttaa annosalueen määritystutkimuksen, jotta tiedetään, mikä on 
hengityselimistöä ärsyttävä pitoisuus (esimerkiksi hengityselimistön histopa ­
tologia, keuhkojen toiminnan testaus tai bronkoalveolaarinen huuhtelu), mikä on siedettävän pitoisuuden yläraja, joka ei aiheuta eläimille tarpeetonta stressiä, ja millä parametreilla testikemikaalin myrkyllisyyttä voidaan luon ­
nehtia parhaiten.
 
12. Annosalueen määritystutkimuksessa voi olla yksi tai useampi pitoisuustaso. 
Kullekin pitoisuustasolle saa altistaa enintään kolme urosta ja kolme naa ­
rasta. Annosalueen määritystutkimuksen on kestettävä vähintään viisi päi ­
vää, yleensä ei enempää kuin 14 päivää. Tutkimusraportissa on esitettävä 
perustelut päätutkimuksen pitoisuuksien valinnalle. Päätutkimuksen tavoite 
on osoittaa sellainen pitoisuus-vastesuhde, joka perustuu herkimmäksi ole ­
tettuun tutkittavaan ominaisuuteen. Pienen pitoisuuden on mielellään oltava sellainen, joka ei aiheuta havaittavia haittavaikutuksia, kun taas suuren pi ­
toisuuden on aiheutettava selvä myrkyllisyys, joka ei kuitenkaan saa aihe ­
uttaa eläimille tarpeetonta stressiä tai vaikuttaa niiden pitkäikäisyyteen (3).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 290
 
13. Kun valitaan annosalueen määritystutkimuksen pitoisuustasoja, on käytet ­
tävä kaikkea saatavilla olevaa tietoa, myös rakenne-aktiivisuussuhdetta kos ­
kevia tietoja ja samanlaisia kemikaaleja koskevia tietoja (katso 3 kohta). Annosalueen määritystutkimuksessa voidaan vahvistaa tai kumota se, mitä pidetään herkimpänä mekanistisesti perusteltuna tutkittavana ominaisuutena, 
esimerkiksi koliiniesteraasin esto organofosfaateilla, methemoglobiinin muo ­
dostus erytrosytotoksisilla aineilla, kilpirauhashormonit (T
 3 , T 4 ) kilpirauh ­
aselle myrkyllisillä aineilla sekä proteiini, LDH tai neutrofiilit bronkoalveo ­
laarisessa huuhtelussa vaarattomilla huonosti liukenevilla hiukkasilla tai 
keuhkoja ärsyttävillä aerosoleilla.  
Päätutkimus  
14. Subakuuttia myrkyllisyyttä koskeva päätutkimus sisältää yleensä kolme pi ­
toisuustasoa ja tarvittaessa myös samanaikaiset negatiivisen (ilma)verrokki ­
ryhmän ja/tai kantaja-aineverrokkiryhmän (katso 17 kohta). Asianmukaisten 
altistustasojen valinnassa on käytettävä apuna kaikkia saatavilla olevia tie ­
toja, mukaan luettuina tulokset systeemisistä myrkyllisyystutkimuksista sekä metabolia ja kinetiikka (erityisesti on pyrittävä välttämään suuria pitoisuuk ­
sia, joiden vuoksi kineettiset prosessit saturoituvat). Jokainen testiryhmä 
sisältää vähintään 10 jyrsijää (viisi urosta ja viisi naarasta), jotka altistetaan 
testikemikaalille kuuden tunnin ajaksi päivittäin viitenä päivänä viikossa neljän viikon ajanjaksolla (tutkimuksen kokonaiskesto on 28 päivää). Eläi ­
met voidaan altistaa myös seitsemänä päivänä viikossa (esimerkiksi testat ­
taessa inhaloitavia lääkkeitä). Jos jommankumman sukupuolen tiedetään 
olevan herkempi tietylle testikemikaalille, sukupuolet voidaan altistaa eri pitoisuuksille pitoisuus-vasteen optimoimiseksi 15 kohdassa kuvatun mukai ­
sesti. Jos muita jyrsijöitä kuin rottia altistetaan vain nasaalisesti, altistuksen 
enimmäiskestoja voidaan mukauttaa lajikohtaisen stressin minimoimiseksi. 
Perustelut on esitettävä, jos altistuksen kesto on alle kuusi tuntia päivässä tai jos on toteutettava pitkäkestoinen (esimerkiksi 22 tuntia/päivä) koko kehoon kohdistuvan altistuksen tutkimus [katso GD 39 (2)]. Eläimiä ei saa ruokkia 
altistusjakson aikana, paitsi jos altistus kestää yli kuusi tuntia. Vettä saa 
antaa koko kehoon kohdistuvan altistuksen ajan.
 
15. Valituilla tavoitepitoisuuksilla tulee voida tunnistaa kohde-elin (-elimet) ja 
osoittaa selvä pitoisuus-vaste:  
— Suurimman pitoisuuden tulee aiheuttaa myrkyllisiä vaikutuksia, mutta ne 
eivät saa lievittyä tai aiheuttaa kuolleisuutta, koska se estää mielekkään 
arvioinnin.  
— Keskisuuri pitoisuus (keskisuuret pitoisuudet) on valittava siten, että 
myrkylliset vaikutukset porrastuvat pienimmän ja suurimman pitoisuu ­
den välille.  
— Pienimmän pitoisuuden tulee aiheuttaa vain vähän tai ei lainkaan oireita 
myrkyllisyydestä.  
Satelliittitutkimus (vaikutusten korjaantuvuus)  
16. Satelliittitutkimuksen (korjaantuvuustutkimuksen) avulla voidaan tarkkailla 
myrkytysoireiden korjaantuvuutta, pysyvyyttä sekä sitä, esiintyykö viivästy ­
neitä myrkytysoireita käsittelyn jälkeisellä jaksolla, jonka on oltava riittävän 
pitkä, vähintään kuitenkin 14 päivää. Satelliittiryhmissä (korjaantuvuusryh ­
missä) on viisi urosta ja viisi naarasta, jotka altistetaan samaan aikaan kuin päätutkimuksen koe-eläimet. Satelliittitutkimuksen (korjaantuvuustutkimuk ­
sen) ryhmät on altistettava testikemikaalille suurimmalla pitoisuudella, ja 
tarvittaessa tutkimuksissa on oltava rinnakkaiset ilma- ja/tai 
kantaja-aineverrokit (katso 17 kohta).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 291
 
Verrokkieläimet  
17. Rinnakkaisryhmien negatiivisia (ilma)verrokkieläimiä on käsiteltävä samalla 
tavalla kuin testiryhmän eläimiä muutoin paitsi että ne altistetaan suodate ­
tulle ilmalle testikemikaalin sijasta. Jos testi-ilmakehän tuottamisessa käyte ­
tään apuna vettä tai muuta ainetta, tutkimukseen on sisällytettävä 
kantaja-aineverrokkiryhmä negatiivisen (ilma)verrokkiryhmän sijasta. Kantaja-aineena on käytettävä vettä, mikäli mahdollista. Jos kantaja-aineena käytetään vettä, verrokkieläimet on altistettava ilmalle, jonka 
suhteellinen kosteus on sama kuin altistusryhmissä. Sopiva kantaja-aine on 
valittava asianmukaisesti toteutetun esitutkimuksen tai aiempien tietojen pohjalta. Jos kantaja-aineen myrkyllisyyttä ei tiedetä, tutkimuksen johtaja 
voi päättää käyttää sekä negatiivista (ilma)verrokkiryhmää ja 
kantaja-aineverrokkiryhmää, joskaan se ei ole suositeltavaa. Jos aiemmat tiedot osoittavat, että kantaja-aine on myrkytön, negatiivista (ilma)verrokki ­
ryhmää ei tarvita, ja tällöin tulee käyttää vain kantaja-aineverrokkia. Jos 
esitutkimus osoittaa, ettei kantaja-aineessa oleva testikemikaali ole myrkyl ­
linen, se tarkoittaa sitä, että kantaja-aine on myrkytön testatulla pitoisuu ­
della, ja tällöin on käytettävä tätä kantaja-aineverrokkia.
 
ALTISTUSOLOSUHTEET  
Pitoisuuksien annostelu  
18. Eläimet altistetaan testikemikaalille, kun se on kaasuna, höyrynä, aerosolina 
tai niiden sekoituksena. Testattava fyysinen olomuoto määräytyy testikemi ­
kaalin fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien, valitun pitoisuuden ja/tai tes ­
tikemikaalin käsittelyssä ja käytössä todennäköisen fyysisen muodon perus ­
teella. Hygroskooppiset ja kemiallisesti reaktiiviset testikemikaalit on testat ­
tava kuivaa ilmaa käyttäen. Räjähtävien pitoisuuksien tuottamista on vältet ­
tävä huolellisesti. Hiukkasmateriaaleja voidaan joutua käsittelemään mekaa ­
nisesti hiukkaskoon pienentämisen vuoksi. Lisätietoja on ohjeasiakirjassa 
GD 39 (2).  
Hiukkaskokojakauma  
19. Hiukkasten koko on mitattava kaikista aerosoleista ja sellaisista höyryistä, 
jotka voivat tiivistyä ja muodostaa siten aerosoleja. Jotta kaikki hengityse ­
limistön oleelliset osat altistuvat aineelle, on suositeltavaa käyttää aerosoleja, joiden massan aerodynaamisen halkaisijan mediaani (MMAD) on 1–3 μm ja 
joiden geometrinen keskihajonta ( σ
 g ) sijoittuu välille 1,5–3,0 (4). Tämä vaa ­
timus on pyrittävä täyttämään kaikin keinoin, mutta jos se ei onnistu, on 
esitettävä asiantuntijan lausunto. Esimerkiksi metallihuurut voivat olla tätä vaatimusta pienempiä, kun taas varautuneet hiukkaset ja kuidut voivat olla vaatimusta suurempia.
 
Testikemikaalin valmistelu kantaja-aineessa  
20. Testikemikaali on testattava mielellään ilman kantaja-ainetta. Jos 
kantaja-aineen käyttö on tarpeellista asianmukaisen testikemikaalipitoisuu ­
den ja hiukkaskoon tuottamiseksi, on käytettävä ensisijaisesti vettä. Aina 
kun testikemikaali liuotetaan kantaja-aineeseen, sen stabiilius on osoitettava.  
ALTISTUSOLOSUHTEIDEN SEURANTA  
Kammion ilmavirtaus  
21. Ilman virtausta altistuskammion läpi on valvottava tarkasti ja seurattava 
jatkuvasti, ja sitä koskevat tiedot on kirjattava vähintään kerran tunnissa 
jokaisen altistuksen aikana. Testi-ilmakehän pitoisuuden (tai ajallisen stabii ­
liuden) reaaliaikainen seuranta kuuluu olennaisena osana kaikkien dynaa ­
misten parametrien mittaamiseen, ja se on myös epäsuora keino valvoa kaikkia oleellisia dynaamisia inhalaatioparametreja. Jos pitoisuutta seurataan 
reaaliajassa, ilmavirtausten mittaustaajuutta voidaan vähentää yhteen mitta ­
ukseen altistusta kohti päivässä. Erityistä huomiota on kiinnitettävä siihen,
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 292
 
että uudelleenhengittäminen vältetään vain nasaalisesti -altistuksen kammi ­
oissa. Happipitoisuuden on oltava vähintään 19 prosenttia, eikä hiilidioksi ­
dipitoisuus saa ylittää yhtä prosenttia. Jos on aihetta olettaa, ettei näitä vaa ­
timuksia voida täyttää, happi- ja hiilidioksidipitoisuudet on mitattava. Jos ensimmäisenä altistuspäivänä tehdyt mittaukset osoittavat, että näiden kaa ­
sujen pitoisuus on asianmukainen, myöhemmät mittaukset eivät välttämättä 
ole tarpeen.
 
Kammion lämpötila ja suhteellinen kosteus  
22. Kammion lämpötila on pidettävä välillä 22 ± 3 °C. Eläinten hengitysilman 
suhteellista kosteutta on seurattava sekä nasaalisissa että koko kehoon koh ­
distuvissa altistuksissa, ja se on kirjattava kerran tunnissa kunkin altistuksen aikana, mikäli mahdollista. Suhteellisen kosteuden tulisi olla välillä 30–70 prosenttia, mutta tämä ei ole välttämättä mahdollista (esimerkiksi testattaessa 
vesipohjaisia seoksia) tai mitattavissa, koska testikemikaali häiritsee testime ­
netelmää.
 
Testikemikaali: nimellispitoisuus  
23. Aina kun mahdollista, altistuskammion nimellispitoisuus on laskettava ja 
kirjattava. Nimellispitoisuus on tuotetun testikemikaalin massa jaettuna kam ­
miojärjestelmän läpi virtaavan ilman kokonaistilavuudella. Nimellispitoisuu ­
della ei luonnehdita eläinten altistumista, vaan nimellispitoisuuden ja varsi ­
naisen pitoisuuden vertailusta saadaan tietoa testijärjestelmän generointite ­
hokkuudesta, ja sitä voidaan siis käyttää generointiongelmien havaitsemi ­
seen.  
Testikemikaali: todellinen pitoisuus  
24. Todellinen pitoisuus on testikemikaalin pitoisuus eläinten hengitysilmassa 
inhalaatiokammiossa. Todelliset pitoisuudet saadaan tietyillä menetelmillä 
(esimerkiksi suoralla näytteenotolla, adsorptiivisilla tai kemiallisesti reaktii ­
visilla menetelmillä ja tulosten analyyttisella luonnehtimisella) tai muilla menetelmillä, kuten suodatukseen perustuvalla gravimetrisella analyysilla. 
Gravimetrisen analyysin käyttö on hyväksyttävää vain yksikomponenttisten 
jauhemaisten aerosolien tai heikosti haihtuvista nesteistä koostuvien aeroso ­
lien yhteydessä, ja sitä on tuettava asianmukaisella esitutkimuksella, jossa käsitellään testikemikaalia koskevia luonnehdintoja. Monikomponenttisten 
jauhemaisten aerosolien pitoisuus voidaan myös määrittää gravimetrisen 
analyysin avulla. Siihen tarvitaan kuitenkin analyysitietoja, jotka osoittavat, että ilmassa leijuvan materiaalin koostumus on sama kuin lähtömateriaalin. Jos näitä tietoja ei ole saatavilla, testikemikaali voi olla tarpeen analysoida 
uudelleen (mieluiten ilmassa leijuvassa muodossaan) säännöllisin väliajoin 
tutkimuksen aikana. Sellaisten aerosolisoituvien aineiden osalta, jotka voivat höyrystyä tai sublimoitua, on osoitettava, että valitulla menetelmällä kerättiin kaikki faasit.
 
25. Jos mahdollista, koko tutkimuksen keston ajan on käytettävä yhdestä erästä 
peräisin olevaa testikemikaalia, ja testinäyte on säilytettävä sen puhtauden, 
homogeenisuuden ja stabiiliuden säilyttävissä olosuhteissa. Ennen tutkimuk ­
sen aloittamista testikemikaalista on laadittava luonnehdinta, johon on sisäl ­
lyttävä sen puhtaus ja – mikäli teknisesti mahdollista – identiteetti sekä tunnistettujen kontaminanttien ja epäpuhtauksien määrät. Tämä voidaan 
osoittaa esimerkiksi seuraavien tietojen avulla: retentioaika ja piikin suhteel ­
linen pinta-ala sekä molekyylipaino, joka on saatu massaspektroskopialla tai kaasukromatografia-analyyseista, tai muut estimaatit. Vaikka testinäytteen identiteetti ei kuulu testauslaboratorion vastuulle, sen voi olla järkevää vah ­
vistaa rahoittajan laatima luonnehdinta ainakin joiltain osin (esimerkiksi 
väri, fysikaalinen olomuoto jne.).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 293
 
26. Altistusilmakehä on pidettävä mahdollisimman muuttumattomana. Altistuso ­
losuhteiden stabiiliuden osoittamiseen voidaan käyttää reaaliaikaista seur ­
antalaitetta, kuten aerosolifotometria aerosoleille tai hiilivetyanalysaattoria höyryille. Kammion todellinen pitoisuus on mitattava vähintään kolme ker ­
taa jokaisena altistuspäivänä ja jokaiselta altistustasolta. Jos se ei ole mah ­
dollista pienen ilmavirtauksen tai pienten pitoisuuksien vuoksi, yksi näyte 
altistuskertaa kohti hyväksytään. Tällöin tämä näyte on mielellään kerättävä koko altistuskerran ajalta. Yksittäiset kammion pitoisuusnäytteet eivät saa poiketa keskimääräisestä pitoisuudesta enempää kuin enintään ± 10 prosent ­
tia kaasujen ja höyryjen osalta tai enintään ± 20 prosenttia nestemäisten tai 
kiinteiden aerosolien osalta. Kammion tasapainotukseen kulunut aika (t
 95 ) 
on laskettava ja kirjattava. Altistuksen kesto käsittää ajan, jolloin testikemi ­
kaali muodostetaan. Tässä otetaan huomioon hajoamiseen ja kammion tasa ­
painotilan saavuttamiseen kulunut aika (t  95 ). Ohjeita t  95 -ajan arvioimiseksi 
on ohjeasiakirjassa GD 39 (2).  
27. Hyvin monimutkaisten, kaasuista/höyryistä koostuvien seosten ja aerosolien 
(esimerkiksi polttokammiot ja tietyn tarkoituksen mukaisten lopputuottei ­
den/-laitteiden perusteella kehitetyt testikemikaalit) osalta kukin faasi voi käyttäytyä inhalaatiokammiossa eri tavoin. Sen vuoksi jokaisesta faasista 
(kaasu/höyry ja aerosoli) on valittava vähintään yksi indikaattoriaine (ana ­
lyytti), yleensä seoksen pääasiallinen vaikuttava aine. Kun testikemikaali on seos, on ilmoitettava koko seoksen analyyttinen pitoisuus, ei siis pelkästään vaikuttavan aineen tai indikaattoriaineen (analyytin) pitoisuutta. Lisätietoja 
todellisista pitoisuuksista on ohjeasiakirjassa GD 39 (2).
 
Testikemikaali: hiukkaskokojakauma  
28. Aerosolien hiukkaskokojakauma on määritettävä vähintään kerran viikossa 
jokaisesta pitoisuudesta käyttämällä kaskadierotinta tai jotain vaihtoehtoista laitetta, kuten aerodynaamista hiukkaskokoluokittelijaa. Jos kaskadierotti ­
mella tai muulla laitteella saatujen tulosten välinen vastaavuus voidaan 
osoittaa, vaihtoehtoista laitetta voidaan käyttää koko tutkimuksen ajan.
 
29. Ensisijaisen laitteen rinnalla on käytettävä toissijaista laitetta, esimerkiksi 
gravimetrista suodatinta tai törmäytintä/kuplituslaitetta ensisijaisen laitteen keräystehon vahvistamiseksi. Hiukkaskoon analyysista saadun massapitoi ­
suuden on sijoituttava kohtuullisessa määrin suodatusanalyysilla saadun 
massapitoisuuden rajoihin [katso GD 39 (2)]. Jos vastaavuus voidaan osoit ­
taa kaikkien pitoisuuksien osalta tutkimuksen varhaisessa vaiheessa, myö ­
hemmät vahvistavat mittaukset voidaan jättää tekemättä. Eläinten hyvinvoin ­
tia koskevien periaatteiden vuoksi on pyrittävä minimoimaan epävarmat 
tiedot, jotta altistusta ei tarvitse toistaa.
 
30. Höyryjen osalta hiukkaskoko on määritettävä, jos on mahdollista, että höy ­
ryn tiivistyessä muodostuu aerosolia, tai jos höyryatmosfäärissä, jossa fa ­
asien sekoittuminen on mahdollista, havaitaan hiukkasia.  
HAVAINNOT  
31. Eläimiä on tarkkailtava kliinisesti ja säännöllisesti ennen altistusjaksoa, sen 
aikana ja sen jälkeen. Tiiviimpi tarkkailu voi olla aiheenmukaista sen pe ­
rusteella, millainen vaste eläimille muodostuu altistuksen aikana. Kun eläin ­
ten tarkkailu ei ole mahdollista immobilisointiputkien, huonosti valaistujen koko kehon altistuskammioiden tai läpinäkymättömien ilmakehien vuoksi, eläimiä on tarkkailtava huolellisesti altistuksen jälkeen. Myrkyllisten vaiku ­
tusten korjaantuvuutta tai pahenemista voidaan arvioida ennen seuraavan 
päivän altistusta tehtävillä havainnoilla.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 294
 
32. Kaikki havainnot kirjataan jokaisesta eläimestä erikseen. Humaaneista syistä 
lopetettujen tai kuolleena löydettyjen eläinten kuolinajankohta tulee kirjata 
muistiin mahdollisimman tarkasti.  
33. Häkin vieressä tehtyihin havaintoihin tulee sisältyä ihon, karvapeitteen, sil ­
mien, limakalvojen, hengitys- ja verenkiertojärjestelmän, hermoston, soma ­
tomotorisen toiminnan ja käyttäytymisen muutokset. Huomiota tulee kiinnit ­
tää vapinaan, kouristuksiin, syljeneritykseen, ripuliin, letargiaan, uneen ja koomaan. Lämmön mittaaminen peräsuolesta voi antaa tukevaa näyttöä ref ­
leksinomaisesta bradypneasta tai käsittelyyn tai ahtaaseen tilaan liittyvästä 
tai hypo-/hypertermiasta. Tutkimussuunnitelmaan voidaan sisällyttää muita arviointeja, kuten kinetiikka, biomonitorointi, keuhkojen toiminta, huonosti liukenevien, keuhkokudokseen kertyvien materiaalien retentio sekä käyttäy ­
tymisen muutokset.
 
RUUMIINPAINOT  
34. Eläinyksilöiden painot on kirjattava vähän ennen ensimmäistä altistusta 
(päivä 0) ja sen jälkeen kahdesti viikossa (esimerkiksi perjantaisin ja maa ­
nantaisin, jotta voidaan osoittaa toipuminen altistuksettoman viikonlopun tai 
tietyn ajan jälkeen systeemisen toksisuuden arvioimiseksi) sekä kuolinhet ­
kellä tai lopettamisen yhteydessä. Jos eläimessä ei ilmene vaikutuksia kah ­
den ensimmäisen viikon aikana, ruumiinpainot voidaan punnita kerran vii ­
kossa tutkimuksen loppuun saakka. Satelliittiryhmän (korjaantuvuusryhmän) 
eläinten (jos käytössä) punnitsemista viikoittain on jatkettava koko toipu ­
misjakson ajan. Tutkimuksen päättyessä kaikki eläimet on punnittava vähän ennen niiden lopettamista, jotta elinten ja ruumiinpainon väliset suhteet 
voidaan laskea ilman vääristymiä.
 
RAVINNON JA VEDEN KULUTUS  
35. Ravinnon kulutus on mitattava viikoittain. Myös veden kulutus voidaan 
mitata.  
KLIININEN KEMIA  
36. Kaikista eläimistä, myös verrokki- ja satelliittiryhmän (korjaantuvuusryh ­
män) eläimistä, on tehtävä kliinis-kemialliset arvioinnit, kun ne lopetetaan. Altistuksen päättymisen ja verinäytteen ottamisen välinen aika on merkittävä 
muistiin varsinkin, jos kyseinen tutkittava ominaisuus rekonstituoituu nope ­
asti. Niistä parametreista, joiden puoliintumisaika plasmassa on lyhyt (esi ­
merkiksi COHb, CHE ja MetHb), on syytä ottaa näyte heti altistuksen pää ­
tyttyä.
 
37. Taulukossa 1 luetellaan ne kliinis-kemialliset parametrit, jotka yleensä vaa ­
ditaan kaikissa toksikologisissa tutkimuksissa. Virtsa-analyysia ei yleensä tarvita. Se tehdään silloin, kun oletettu tai todettu myrkyllisyys antaa siihen 
aihetta. Jotta testikemikaalin myrkyllisyyttä voitaisiin luonnehtia tarkemmin, 
tutkimuksen johtaja voi päättää arvioida myös muita parametreja (esimer ­
kiksi koliiniesteraasi, lipidit, hormonit, happo-emästasapaino, methemoglo ­
biini tai Heinzin kappaleet, kreatiinikinaasi, myelosyyttien ja punasolujen 
suhde, troponiinit, valtimoverikaasut, laktaattidehydrogenaasi, sorbitolide ­
hydrogenaasi, glumaattidehydrogenaasi ja gammaglutamyylitranspeptidaasi).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 295
 
Taulukko 1  
Kliinis-kemialliset vakioparametrit  
Hematologia  
Punasolujen määrä 
Hematokriitti 
Hemoglobiinipitoisuus 
Keskihemoglobiini (MCH) Punasolujen keskimääräinen 
tilavuus (MCV) 
Keskihemoglobiinikonsentraatio (MC ­
HC) 
Retikulosyytit Valkosolujen kokonaismäärä 
Valkosolujen erittely 
Verihiutaleiden määrä 
Hyytymisominaisuudet (valittava 
yksi): 
— Protrombiiniaika 
— Hyytymisaika 
— Partiaalinen tromboplastii ­
niaika
 
Kliininen kemia  
Glukoosi (*) 
Kokonaiskolesteroli 
Triglyseridit 
Veren ureatyppi Kokonaisbilirubiini Kreatiniini 
Kokonaisproteiini 
Albumiini Globuliini Alaniiniaminotransferaasi 
Aspartaattiaminotransferaasi 
Alkaalifosfataasi 
Kalium Natrium Kalsium 
Fosfori 
Kloridi
 
Virtsa-analyysi (valinnainen)  
Ulkonäkö (väri ja sameus) 
Määrä Ominaistiheys tai osmolaliteetti 
pH Kokonaisproteiini 
Glukoosi Veri/verisolut
 
(*) Koska pitkähkö paastojakso voi vääristää glukoosinmittauksen tuloksia (käsitellyt 
eläimet vs. verrokkieläimet), tutkimuksen johtajan on päätettävä, onko eläinten 
pitäminen ravinnotta tarpeen. Jos paastojaksoa käytetään, sen on oltava käytetyille 
lajeille sopiva, esimerkiksi rotalle paastoajan pituus voi olla 16 h (ravinnotta 
yli yön). Paastoverensokeri voidaan määrittää yli yön toteutetun paaston jälkeen 
viimeisellä altistusviikolla tai yli yön paastoamisen jälkeen ennen ruumiinavausta (jälkimmäisessä tapauksessa on määritettävä myös kaikki muut kliinis-kemialliset 
parametrit).
 
38. Jos on todisteita siitä, että alemmat hengitystiet (esimerkiksi keuhkorakkulat) 
ovat ensisijainen kertymä- ja retentiopaikka, bronkoalveolaarinen huuhtelu 
voi olla sopiva tekniikka analysoida määrällisesti hypoteesiperusteiset annos-vaikutus-parametrit, jotka kohdistuvat keuhkorakkulatulehdukseen, keuhkotulehdukseen ja fosfolipidoosiin. Tämän avulla voidaan testata annos ­
vaste ja keuhkorakkuloiden vaurioiden ajalliset muutokset. Huuhtelunes ­
teestä voidaan analysoida valkosolujen kokonaismäärä ja niiden erottelu, kokonaisproteiini ja laktaattidehydrogenaasi. Lisäksi voidaan analysoida pa ­
rametreja, jotka viittaavat lysosomien vaurioihin, fosfolipidoosiin, fibroosiin 
sekä ärsytyksen aiheuttamaan tai allergiseen tulehdukseen, johon voi sisältyä 
esitulehduksellisten sytokiinien/kemokiinien määritys. Bronkoalveolaariseen huuhteluun perustuvat mittaukset yleensä täydentävät histopatologisten tut ­
kimusten tuloksia mutta eivät korvaa niitä. Ohjeita keuhkohuuhtelun teke ­
misestä on ohjeasiakirjassa GD 39 (2).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 296
 
MAKROSKOOPPISET MUUTOKSET JA ELINTEN PAINOT  
39. Kaikille koe-eläimille, myös kokeen aikana kuolleille tai eläinten hyvinvoin ­
tia koskevien periaatteiden vuoksi lopetetuille ja tutkimuksesta poistetuille, on tehtävä täydellinen verenlasku ja ruumiinavaus. Jokaisen eläimen viimei ­
sen altistuksen ja lopetuksen välinen aika on merkittävä muistiin. Jos ruu ­
miinavausta ei voida tehdä heti kun eläimen on havaittu kuolleen, eläintä on säilytettävä riittävän kylmässä lämpötilassa (ei pakastimessa) autolyysin mi ­
nimoimiseksi. Ruumiinavaukset on tehtävä mahdollisimman pian, yleensä 
yhden tai kahden päivän kuluessa. Kunkin eläimen kaikki makroskooppiset 
muutokset tulee kirjata, ja erityistä huomiota on kiinnitettävä hengitysteissä oleviin muutoksiin.
 
40. Taulukossa 2 on lueteltu kaikki elimet ja kudokset, jotka on säilytettävä 
sopivassa aineessa histopatologista tutkimusta varten. [Hakasulkeisiin] mer ­
kittyjen elinten ja kudosten säilyttämisestä päättää tutkimuksen johtaja.  Li­
havoidut  elimet ja kudokset on puhdistettava ja punnittava mahdollisimman 
pian dissektion jälkeen kuivumisen välttämiseksi. Kilpirauhanen ja lisäki ­
vekset on punnittava vain tarvittaessa, koska puhdistuksen aiheuttamat va ­
hingot voivat estää histopatologisen arvioinnin. Kudokset ja elimet on kiin ­
nitettävä 10-prosenttisella puskuroidulla formaliinilla tai muulla sopivalla 
kiinnitysaineella heti ruumiinavauksen jälkeen, vähintään 24–48 tuntia en ­
nen puhdistusta sen mukaan, mitä kiinnitysainetta käytetään.  
Taulukko 2  
Ruumiinavauksen aikana säilöttävät elimet ja kudokset  
Lisämunuaiset  
Luuydin (ja/tai tuore aspiraatti)  
Aivot  (mukaan luettuina osia iso- ja pikkuai ­
voista sekä aivosillasta)  
[Silmät (verkkokalvo, silmähermo) ja silmä ­
luomet]  
Sydän  
Munuaiset  
Kurkunpää (kolmesta kohdasta, joista yhden 
on oltava kurkunkansi)  
Maksa  
Keuhkot  (kaikki lohkot yhdestä kohdasta, 
mukaan luettuina pääkeuhkoputket)  
Imusolmukkeet keuhkoportin alueelta etenkin 
huonosti liukenevien hiukkasmaisten testike ­
mikaalien yhteydessä. Tarkempia kokeita 
ja/tai tutkimuksia, joissa keskitytään immuno ­
logiaan, voidaan käyttää myös muita imusol ­
mukkeita esimerkiksi välikarsinan, servikaa ­
liselta/submandibulaariselta ja/tai aurikulaa ­
riselta alueelta.  
Nenänielun kudokset (vähintään neljästä koh ­
dasta, yhden kohdan on oltava nenänieluka ­
nava ja NALT-imukudos (Nasal Associated Lymphoid Tissue)
 
Ruokatorvi  
[Hajurauhanen]  
Munasarjat  Rakkularauhaset  
Selkäydin (kaularanka, rintarangan keskiosa 
ja lanneranka)  
Perna  
Maha  
Kivekset  
Kateenkorva  
Kilpirauhanen  
Henkitorvi (vähintään kahdesta kohdasta si ­
ten, että mukana on yksi pitkittäinen leik ­
kaus harjun läpi ja yksi poikittainen leik ­
kaus)  
[Virtsarakko]  
Kohtu  
Kaikki suuret leesiot  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 297
 
41. Keuhkot on poistettava kokonaisina, punnittava ja täytettävä sopivalla kiin ­
nitysaineella 20–30 cm:n syvyisen veden paineessa, jotta niiden rakenne 
säilyy (5). Leikkeet on kerättävä kaikista lohkoista yhdestä kohdasta pää ­
keuhkoputket mukaan luettuina, mutta jos tehdään keuhkohuuhtelu, huuhte ­
lemattomasta lohkosta on otettava leikkeet kolmesta kohdasta (ei sarjaleik ­
keitä).  
42. Nenänielun kudoksista on tutkittava vähintään neljästä kohdasta otetut näyt ­
teet, joista yhden on oltava nenänielukanava (5, 6, 7, 8, 9), jotta levyepiteeli, välimuotoinen epiteeli (värekarvaton hengitysepiteeli), hengitysepiteeli (vä ­
rekarvallinen), hajuepiteeli sekä imukudos (NALT; 10, 11) voidaan tutkia. 
Kurkunpäästä on tutkittava kolmesta kohdasta otetut leikkeet, ja yhden niistä on oltava kurkunpään kansi (12). Henkitorvesta on tutkittava vähintään kahdesta kohdasta otetut leikkeet, joista toisen on oltava pitkittäinen leike 
ekstrapulmonaalisten keuhkoputkien ja henkitorven harjun haarautuman läpi 
ja toisen poikittaisleike.
 
HISTOPATOLOGIA  
43. Histopatologinen arviointi on tehtävä kaikkien taulukossa 2 lueteltujen elin ­
ten ja kudosten osalta niin verrokkiryhmästä kuin suuren pitoisuuden ryh ­
mästä sekä kaikista eläimistä, jotka kuolevat tai jotka lopetetaan tutkimuksen aikana. Erityistä huomiota on kiinnitettävä hengitysteihin, kohde-elimiin ja 
näkyviin vammoihin. Ne elimet ja kudokset, joissa suuren pitoisuuden ryh ­
män eläimillä on leesioita, on tutkittava kaikista ryhmistä. Tutkimuksen johtaja voi päättää toteuttaa histopatologiset arvioinnit myös muista ryhmistä 
selvän pitoisuus-vasteen osoittamiseksi. Kun tutkimukseen sisältyy satelliit ­
tiryhmä (korjaantuvuus), sellaiset kudokset ja elimet, joissa ilmenee samoja vaikutuksia kuin käsitellyillä ryhmillä, on tutkittava histopatologisesti. Jos suuren pitoisuuden ryhmässä on hyvin paljon varhaisia kuolemantapauksia 
tai muita ongelmia, jotka vaarantavat tietojen merkityksellisyyden, seuraava 
pienemmän pitoisuuden ryhmä on tutkittava histopatologisesti. Silmämää ­
räisten havaintojen ja mikroskooppisten löydösten välille on pyrittävä löy ­
tämään korrelaatio.
 
TIEDOT JA RAPORTOINTI  
Tiedot  
44. Jokaisesta eläimestä on ilmoitettava seuraavat tiedot: ruumiinpaino, ravin ­
nonkulutus, kliinis-kemialliset tiedot, makroskooppiset muutokset sekä his ­
topatologiset löydökset. Kliiniset havaintotiedot tulee esittää yhteenvetona 
taulukossa, josta käy ilmi kussakin koeryhmässä käytettyjen eläinten luku ­
määrä, toksisuusoireita osoittaneiden eläinten lukumäärä, kokeen aikana kuolleena löydettyjen tai humaaneista syistä lopetettujen eläinten lukumäärä, yksittäisten eläinten kuolinajankohta, toksisten vaikutusten ja palautuvuuden 
kuvaus ja niiden ajallinen esiintyminen sekä ruumiinavauslöydökset. Kaikki 
tulokset, niin määrälliset kuin satunnaiset, on arvioitava sopivalla tilastome ­
netelmällä. Kaikkia yleisesti hyväksyttyjä tilastomenetelmiä voi käyttää, ja ne on valittava tutkimuksen suunnitteluvaiheessa.
 
Testiraportti  
45. Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:  
Koe-eläimet ja niiden hoito  
— kuvaus häkkiolosuhteista, mukaan luettuina seuraavat tiedot: yhdessä 
häkissä olevien eläinten lukumäärä (tai lukumäärän muutos), alustama ­
teriaali, lämpötila ja suhteellinen kosteus, valoisa aika ja tiedot ravin ­
nosta  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 298
 
— käytetyt lajit/kanta ja perustelu muun lajin kuin rotan käyttämiselle tie ­
toja lähteestä ja aiemmin saatuja tietoja voi ilmoittaa, jos ne koskevat 
eläimiä, jotka on altistettu samankaltaisessa altistuksessa ja joiden asumis- ja paasto-olosuhteet ovat olleet samat
 
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli  
— satunnaistamismenetelmä  
— kuvaus testiä edeltäneestä tilanteesta ja tiedot ravinnosta, karanteenista ja 
sairauden hoidosta.  
Testikemikaali  
— fysikaalinen olomuoto, puhtaus ja tarvittaessa fysikaalis-kemialliset omi ­
naisuudet (mukaan luettuna isomeria)  
— tunnistetiedot ja CAS-numero, jos se tiedetään.  
Kantaja-aine  
— perustelut kantaja-aineen käyttämiselle ja sen valinnalle (jos se on muu 
kuin vesi)  
— aikaisemmin tai tämän tutkimuksen yhteydessä saadut tiedot, jotka osoit ­
tavat, ettei kantaja-aine vaikuta tutkimuksen tulokseen.  
Inhalaatiokammio  
— yksityiskohtainen kuvaus inhalaatiokammiosta, mukaan luettuina tila ­
vuus ja kaavakuva  
— kuvaus eläinten altistukseen ja ilmakehän tuottamiseen käytetystä lait ­
teistosta ja sen alkuperä  
— lämmön, kosteuden, hiukkaskoon ja todellisen pitoisuuden mittauslaitteet  
— ilman lähde ja ilmanvaihtojärjestelmä  
— menetelmät, joilla laitteisto on kalibroitu yhtenäisen testi-ilmakehän var ­
mistamiseksi  
— paine-ero (yli- vai alipaine)  
— kunkin kammion altistusportit (vain nasaalinen altistus); eläinten sijainti 
kammiossa (koko kehoon kohdistuva altistus)  
— testi-ilmakehän stabiilius  
— lämpötila- ja kosteusantureiden sekä testi-ilmakehän näytteenottopaikan 
sijainti kammiossa  
— tulo- ja poistoilman käsittely  
— ilman virtausnopeudet, ilman virtausnopeus kussakin altistusportissa 
(vain nasaalinen altistus) tai eläinkuorma/kammio (koko kehoon kohdis ­
tuva altistus)  
— inhalaatiokammion tasapainotilan saavuttamiseen kulunut aika (t  95 ) 
— tilavuusmuutosten määrä tunneittain  
— annostelulaitteet (tarvittaessa).  
Altistustiedot  
— päätutkimuksen tavoitepitoisuuden valinnan peruste  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 299
 
— nimellispitoisuudet (altistuskammioon tuotetun testikemikaalin kokonais ­
massa jaettuna kammion läpi virtaavan ilman tilavuudella)  
— eläinten hengitysilmasta kerätyt testikemikaalin todelliset pitoisuudet; 
epäyhtenäisiä fyysisiä muotoja (kaasuja, höyryjä, aerosoleja) tuottavien seosten osalta jokainen voidaan analysoida erikseen
 
— kaikki ilmapitoisuudet on ilmoitettava mieluummin massayksikköinä 
(esimerkiksi mg/l, mg/m  3 , jne.) kuin tilavuusyksikköinä (ppm, ppb jne.)  
— hiukkaskokojakauma, massan aerodynaamisen halkaisijan 
mediaani (MMAD) ja geometrinen keskihajonta ( σg) sekä niiden lasken ­
tamenetelmät yksittäiset hiukkaskokoanalyysit on myös esitettävä.  
Testiolosuhteet  
— yksityiskohtaiset tiedot testikemikaalin valmistelusta, mukaan luettuina 
tiedot kiinteiden materiaalien hiukkaskoon pienentämisessä tai testikemi ­
kaaliliuosten valmistamisessa käytetyistä menetelmistä  
— (mieluiten kaavion sisältävä) kuvaus testi-ilmakehän tuottamiseen ja 
eläinten altistamiseen testi-ilmakehälle käytetystä laitteistosta  
— yksityiskohdat kammion lämpötilan, kosteuden ja ilmanvirtauksen seu ­
raamiseen käytetystä laitteistosta (esimerkiksi kalibrointikäyrän laatimi ­
nen) 
— yksityiskohdat kammion pitoisuuden ja hiukkaskokojakauman määrittä ­
misessä tarvittavien näytteiden keräämiseen tarkoitetusta laitteistosta  
— tiedot käytetystä kemiallisesta analyysimenetelmästä ja sen validointime ­
netelmästä (myös tiedot siitä, miten tehokasta testikemikaalin saanto oli 
näytteenottokohdasta)  
— satunnaistamismenetelmä, jolla eläimet jaettiin testi- ja verrokkiryhmiin  
— tiedot ravinnon ja veden laadusta (sekä ravinnon tyyppi/lähde, veden 
lähde)  
— testipitoisuuksien valintaperuste.  
Tulokset  
— kammion lämpötila, kosteus ja ilmanvirtaus (taulukkomuodossa)  
— tiedot nimellisistä ja todellisista pitoisuuksista kammiossa (taulukkomuo ­
dossa)  
— hiukkaskokotiedot sekä analyyttiset tiedot näytteen keräämisestä, hiuk ­
kaskokojakaumasta ja MMAD-arvon ja σ g -arvon laskelmat (taulukko ­
muodossa)  
— kunkin eläimen vastetulosten ja pitoisuustason taulukot (ts. eläimet, joilla 
ilmeni toksisuusoireita, mukaan lukien kuolleisuus, vaikutusten luonne, 
vaikeusaste, alkamisajankohta ja kesto)  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 300
 
— taulukko kunkin eläimen painoista  
— taulukko ravinnonkulutuksesta  
— taulukko kliinis-kemiallisista tiedoista  
— kunkin eläimen ruumiinavauslöydökset ja histopatologiset löydökset, mi ­
käli saatavilla  
— taulukko muista mitatuista parametreista.  
Tulosten pohdinta ja tulkinta  
— On kiinnitettävä erityistä huomiota niiden menetelmien kuvaukseen, joita 
tämän testimenetelmän vaatimusten (rajapitoisuus tai hiukkaskoko) täyt ­
tämisessä käytettiin.  
— Hiukkasten hengitettävyyttä on käsiteltävä kaikkien löydösten kannalta 
etenkin, jos hiukkaskokoon liittyvää kriteeriä ei voitu täyttää.  
— Tutkimuksen kokonaisarviointiin on sisällytettävä tiedot nimellisten ja 
todellisten pitoisuuksien määrittämiseen käytettyjen menetelmien yhte ­
näisyydestä sekä todellisen ja nimellisen pitoisuuden suhde.  
— Raportissa on käsiteltävä myös todennäköistä kuolinsyytä ja pääasiallista 
vaikutustapaa (systeeminen vs. paikallinen).  
— Jos kärsiviä tai voimakkaasta ja jatkuvasta kivusta merkkejä osoittavia 
eläimiä oli lopetettava humaanisti eläinkokeiden humaaneja lopettamisk ­
riteereitä koskevassa OECD:n ohjeasiakirjassa (3) olevien perustelujen mukaisesti, siitä on esitettävä selvitys.
 
— Kohde-elin (-elimet) on määritettävä.  
— NOAEL- ja LOAEL-arvot on määritettävä.  
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guid ­
eline No 412, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.  
3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
4) Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and 
Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesti ­
cide Programs, United States Environmental Protection Agency.  
5) Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, s. 229–258.
 
6) Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309–312.  
7) Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231–238.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 301
 
8) Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in hu ­
mans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215–263.
 
9) Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diag ­
rams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353–372.
 
10) Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn 
AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyn ­
geal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219–224.  
11) Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymp ­
hoid tissue. Toxicol. Lett. 140–141: 281–285.  
12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419–428.  
13) Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1272/2008, annettu 
16 päivänä joulukuuta 2008, aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä 
ja pakkaamisesta sekä direktiivien 67/548/ETY ja 1999/45/EY muuttami ­
sesta ja kumoamisesta ja asetuksen (EY) N:o 1907/2006 muuttamisesta, EUVL L 353, 31.12.2008, s. 1.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 302
 
Lisäys 1  
MÄÄRITELMÄ  
Testikemikaali:  Tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 303
 
B.9. TOISTETUN ANNOKSEN (28 PÄIVÄÄ) MYRKYLLISYYS 
(IHON KAUTTA NAUTITTAVAT AINEET)  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Katso yleistä johdantoa, osa B (A).  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Katso yleistä johdantoa, osa B (B).  
1.3 VERTAILUAINEET  
Vertailuaineita ei ole.  
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Testattavaa ainetta levitetään useisiin ryhmiin jaettujen eläinten iholle 
porrastettuina annoksina (yksi annos ryhmää kohti) säännöllisesti 28 
päivän koejakson aikana. Jakson aikana eläimiä tarkkaillaan myrky ­
tysoireiden suhteen. Ruumiinavaus tehdään kokeen aikana kuolleille eläimille ja kokeen päätyttyä myös henkiin jääneille eläimille, kun ne on ensin lopetettu.
 
1.5 LAATUKRITEERIT  
Laatukriteerejä ei ole.  
1.6 MENETELMÄKUVAUS  
1.6.1  Valmistelut  
Ennen testiä eläinten elinolosuhteet pidetään tietyntyyppisinä vähin ­
tään viiden päivän ajan testin suorittamista silmälläpitäen. Terveiden 
aikuisten eläinten joukosta otetaan satunnaisotos, joka jaetaan käsit ­
tely- ja vertailuyryhmiin. Noin 24 tuntia ennen testiä turkki leikataan tai ajetaan eläinten selkäalueelta varoen naarmuttamasta ihoa, koska naarmut saattavat muuttaa ihon läpäisevyyttä. Turkinpoisto on 
yleensä uusittava noin viikon välein. Vähintään 10 % kehon pinta- 
alaa peittävästä karvasta on ajeltava tai leikattava. Koe-eläimen paino on otettava huomioon suunniteltaessa paljastettavan alueen ja siteen suuruutta. Kiinteät aineet voidaan tarvittaessa jauhaa, ja ne on kos ­
teutettava riittävällä vesimäärällä tai tarvittaessa muulla liuottimella 
hyvän ihokontaktin varmistamiseksi. Nestemäisiä aineita käytetään yleensä laimentamattomina. Käsittely toistetaan päivittäin 5–7 päi ­
vänä viikossa.
 
1.6.2  Testiolosuhteet  
1.6.2.1  Koe-eläimet  
Koe-eläiminä voidaan käyttää aikuisia rottia, kaneja tai marsuja. 
Muiden lajien käyttö on perusteltava.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 304
 
Testin alussa kumpaakaan sukupuolta edustavien eläinten painon ­
vaihtelut eivät saa olla enempää kuin ± 20 % sukupuolen keski ­
arvosta.  
1.6.2.2  Lukumäärä ja sukupuoli  
Jokaista annostasoa kohti tarvitaan vähintään kymmenen eläintä 
(viisi naarasta ja viisi urosta). Naaraat eivät saa olla synnyttäneitä 
eivätkä tiineitä. Jos suunnitellaan testin kuluessa tapahtuvia lopetta ­
misia, eläinten määrää on lisättävä vastaavasti. Tarvittaessa testiin voidaan ottaa kymmenen eläimen apuryhmä (viisi naarasta ja viisi urosta), jota altistetaan suurille annoksille 28 päivän ajan tarkkaillen 
myrkytysoireiden palautumista ja pysyvyyttä sekä sitä, esiintyykö 
käsittelyä seuraavan 14 päivän jakson aikana viivästyneitä myrkyty ­
soireita. Tarvitaan myös kymmenen vertailueläimen (viiden naaran ja viiden uroksen) apuryhmä.
 
1.6.2.3  Altistuspitoisuudet  
Tarvitaan vähintään kolme pitoisuustasoa ja yksi kontrolliryhmä. Jos 
testattava aine liuotetaan apuaineeseen, tätä varten tarvitaan erillinen kontrolliryhmä. Päivittäisen altistuksen on kestettävä vähintään kuusi 
tuntia. Ainetta levitetään samaan aikaan joka päivä, ja annosta sää ­
detään 1-2 viikon välein siten, että pitoisuustasot pysyvät vakiona eläimen painoon nähden. Aineella käsittelyä lukuun ottamatta kont ­
rolliryhmän ja käsittelyryhmien eläimiä on käsiteltävä samalla taval ­
la. Jos annostelun yhteydessä käytetään liuotinta apuaineena, liuo ­
tinta annostellaan kontrolliryhmän eläimille samalla menetelmällä kuin käsittelyryhmän eläimille määränä, joka vastaa suurinta käsitte ­
lyannosta. Suurimman annostason on aiheutettava myrkytysoireita, 
mutta vain vähän tai ei lainkaan kuolleisuutta. Pienimmän annosta ­
son ei pidä aiheuttaa lainkaan myrkytysoireita. Jos käytettävissä on soveltuva arvio ihmisaltistumisesta, pienimmän annostason on ylitet ­
tävä tämä taso. Keskimmäisen annostason tulee aiheuttaa mahdolli ­
simman vähän myrkytysoireita. Jos käytetään useita välitasoja, ne on 
valittava siten, että myrkytysoireet porrastuvat. Alimman annostason ja välitason ryhmissä sekä kontrolliryhmissä kuolleisuuden on oltava pieni, jotta tuloksia voidaan arvioida merkityksellisellä tavalla.
 
Jos aine aiheuttaa vakavaa ihoärsytystä iholle levitettynä, pitoisuuk ­
sia on pienennettävä, mikä voi aiheuttaa suurannosryhmän eläimille muiden myrkytysoireiden vähenemistä tai oireiden häviämisen. Jos 
eläimen iho on pahoin vaurioitunut, voi olla tarpeen keskeyttää koe 
ja uusia se pienempiä pitoisuuksia käyttäen.
 
1.6.2.4  Rajatesti  
Jos suoritetaan alustava koe käyttäen annostasoa 1 000 mg/kg tai tätä 
korkeampaa tasoa, joka perustuu tunnettuun ihmisaltistukseen, eikä 
tällainen testi aiheuta myrkytysoireita, lisätestit voidaan katsoa tar ­
peettomiksi.  
1.6.2.5  Tarkkailujakso  
Kaikkia eläimiä on tarkkailtava päivittäin myrkytysoireiden suhteen. 
Kuolinajankohta ja myrkytysoireiden llmestymis- sekä häviämisajan ­
kohta kirjataan.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 305
 
1.6.3  Testin suorittaminen  
Eläimiä pidetään yksin häkeissä. Eläimiä käsitellään testattavalla ai ­
neella mieluiten seitsemänä päivänä viikossa 28 päivän ajan. Seur ­
antaa varten koottuja apuryhmiä tarkkaillaan altistusjakson jälkeen 
vielä 14 päivän ajan ilman käsittelyä, jotta voidaan todeta, ovatko 
myrkytysoireet häviäviä vai pysyviä. Päivittäisen altistuksen on kes ­
tettävä vähintään kuusi tuntia.  
Testattavaa ainetta levitetään tasaisesti alueelle, joka vastaa noin 
10 %:a kehon kokonaispinta-alasta. Erittäin myrkyllisten aineiden kohdalla voidaan käyttää pienempää pinta-alaa, mutta ainetta on le ­
vitettävä mahdollisimman ohuelti ja tasaisesti niin suurelle alueelle 
kuin mahdollista.
 
Altistuksen aikana ihoalue peitetään harsositeellä ja ärsyttämättö ­
mällä laastarilla. Tämän lisäksi alue on peitettävä, niin että harsoside 
ja aine pysyvät paikallaan eikä eläin pääse syömään ainetta. Eläin voidaan sitoa osittain siten, ettei se pysty syömään ainetta. Täydel ­
listä liikkumattomuutta ei kuitenkaan suositella. Vaihtoehtoisesti voi ­
daan käyttää suojakaulusta.
 
Altistusjakson jälkeen aineen jäännökset poistetaan vedellä tai 
muulla sopivalla ihonpuhdistusmenetelmällä.  
Eläimiä on tarkkailtava säännöllisesti, jotta voidaan varmistaa, että 
mahdollisimman vähän eläimiä menetetään kannibalismin, kudosten autolyysin tai sijoitusvirheiden takia. Testijakson jälkeen kaikki ai ­
neelle altistuneet eläimet lopetetaan. Kuolemaisillaan olevat eläimet 
tai eläimet, joilla on vakavia ahdistuneisuuden tai kivun oireita, on poistettava ryhmästä ja lopetettava, minkä jälkeen niille tehdään ruu ­
miinavaus.
 
Testijakson päätyttyä kaikki eläimet, kontrolliryhmien eläimet mu ­
kaan lukien, tutkitaan seuraavilta osin:  
1) hematologia — vähintään hematokriitti, hemoglobiinipitoisuus, 
punasolujen lukumäärä, valkosolujen kokonaismäärä ja erittely ­
laskenta sekä hyytymistekijät;  
2) kliininen veribiokemia — vähintään yksi parametri seuraavista 
maksan ja munuaisten toimintakokeista, alaniiniaminotransferaasi (ALAT), seeruminaspartaattiaminotransferaasi (ASAT), virtsa-ai ­
neen typpi, albumiini, veren kreatiniini, kokonaisbilirubiini ja see ­
rumin kokonaisproteiini.
 
Muita, riittävän toksikologisen arvion kannalta tärkeitä määrityksiä 
ovat kalsium, fosfori, kloridi, natrium, kalium, paastoverensokeri, 
lipidit, hormonit, happo-emästasapaino, methemoglobiini ja kolines ­
teraasiaktiivisuus.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 306
 
Havaittujen oireiden tutkimista voidaan tarvittaessa laajentaa muita 
kliinisiä biokemianmäärityksiä käyttämällä.  
1.6.4  Kattava ruumiinavaus  
Kaikille kokeeseen osallistuneille eläimille on tehtävä kattava ruu ­
miinavaus. Vähintään maksa, munuaiset, lisämunuaiset ja kivekset 
on punnittava märkinä mahdollisimman pian dissektion jälkeen. Eli ­
met ja kudokset (maksa, munuaiset, perna, kivekset, lisämunuaiset, sydän ja muut elimet, joissa on oleellisia vaurioita tai kokomuutok ­
sia) on säilytettävä sopivassa aineessa mahdollisia myöhemmin teh ­
täviä histopatologisia tutkimuksia varten.
 
1.6.5  Histopatologinen tutkimus  
Suurannosryhmän ja kontrolliryhmän eläinten säilötyille elimille ja 
kudoksille on tehtävä histologinen tutkimus. Jos suurimman annok ­
sen saaneen ryhmän eläinten elimissä ja kudoksissa on testattavasta aineesta johtuvia vaurioita, myös pienempien annoskokojen ryhmien 
eläinten vastaavat elimet on tutkittava. Kaikkien apuryhmien eläimet 
on tutkittava histologisesti kiinnittäen erityistä huomiota niihin eli ­
miin ja kudoksiin, joissa on havaittu muutoksia käsiteltyjen ryhmien kohdalla.
 
2. TIEDOT  
Yhteenveto tiedoista esitetään taulukkona, jossa esitetään eläinten 
määrä kokeen alussa ja eläinten määrä kutakin vauriota kohti ryh ­
mittäin.  
Kaikki havaintotulokset on arvioitava soveltuvan tilastollisen mene ­
telmän avulla. Tarkoitukseen voidaan käyttää kaikkia yleisiä mene ­
telmiä.  
3. RAPORTOINTI  
3.1 TESTIRAPORTTI  
Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat 
tiedot:  
— laji, kanta, toimittaja, ympäristöolosuhteet, ruokavalio jne.,  
— testiolosuhteet (mukaan lukien siteen tyyppi, okklusiivinen tai ei- 
okklusiivinen),  
— annostasot (annoksen suuruus apuaine mukaan lukien ja mahdol ­
linen testattavan aineen pitoisuus),  
— oireita tuottamaton annostaso, mikäli mahdollista,  
— vastetietojen luokittelu sukupuolen ja annostason mukaan,  
— kuolinajankohdat kokeen aikana tai eläinten hengissäpysyminen 
kokeen loppuun,  
— myrkytysoireet ja muut vaikutukset,  
— ajankohdat, jolloin on havaittu poikkeavuuksia, ja poikkeavuuk ­
sien kehittyminen jatkossa,  
— tiedot ruoasta ja kehonpainosta,  
— käytetyt hematologiset testit tuloksineen,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 307
 
— käytetyt kliinis-biokemialliset testit tuloksineen,  
— ruumiinavauslöydökset,  
— histopatologisten löydösten yksityiskohtaiset kuvaukset,  
— tulosten tilastollinen käsittely soveltuvin osin,  
— tulosten pohdinta,  
— tulosten tulkinta.  
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA  
Katso yleistä johdantoa, osa B (D).  
4. VIITTEET  
Katso yleistä johdantoa, osa B (E).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 308
 
B.10.  MUTAGEENISUUS — KROMOSOMIPOIKKEAVUUSTESTI 
NISÄKÄSSOLUILLA  IN VITRO  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä on sama kuin OECD TG 473,  In Vitro  Mammalian 
Chromosome Aberration Test (1997).  
1.1 JOHDANTO  
In vitro -kromosomipoikkeavuustestin tarkoituksena on tunnistaa ai ­
neet, jotka aiheuttavat rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia vil ­
jellyissä nisäkässoluissa (1) (2) (3). Rakenteelliset poikkeavuudet 
jakautuvat kahteen tyyppiin, kromosomi- ja kromatidipoikkeavuuk ­
siin. Kemiallisten mutageenien aiheuttamat poikkeavuudet ovat useimmiten kromatidityyppisiä, mutta myös kromosomityyppisiä 
poikkeavuuksia esiintyy. Polyploidian lisääntyminen saattaa osoittaa, 
että kemiallinen aine voi aiheuttaa numeerisia poikkeavuuksia. Tätä menetelmää ei ole kuitenkaan suunniteltu numeeristen poikkeavuuk ­
sien mittaamiseen, eikä sitä käytetä rutiininomaisesti tähän tarkoituk ­
seen. Kromosomimutaatiot ja niihin liittyvät tapahtumat ovat syynä 
moniin ihmisen geneettisiin sairauksiin, ja on saatu vakuuttavia to ­
disteita siitä, että kromosomimutaatiot ja niihin liittyvät tapahtumat, 
jotka aiheuttavat muutoksia somaattisten solujen onkogeeneissä ja 
kasvunrajoitegeeneissä, ovat osallisina syövän synnyssä ihmisillä ja koe-eläimillä.
 
In vitro  -kromosomipoikkeavuustestissä voidaan käyttää pysyvien 
solulinjojen viljelmiä, solukantoja tai primaarisia soluviljelmiä. Käy ­
tettävien solujen valintakriteerejä ovat solujen kasvukyky viljelmäs ­
sä, karyotyypin pysyvyys, kromosomiluku, kromosomien diversi ­
teetti ja kromosomipoikkeavuuksien spontaanifrekvenssi.  
In vitro -testit vaativat yleensä eksogeenista metabolista aktivaatiota. 
Tällainen metabolinen aktivaatiojärjestelmä ei pysty täysin jäljittele ­
mään in vivo -olosuhteita nisäkkäissä. On pyrittävä välttämään erityi ­
sesti sellaisia olosuhteita, joissa saatavat positiiviset tulokset eivät hei ­
jasta aineen luontaista mutageenisuutta ja saattavat johtua pH:n muu ­
toksista, osmolaliteetista tai voimakkaasta sytotoksisuudesta (4) (5).  
Tätä testiä käytetään nisäkkäiden mahdollisten mutageenien ja karsi ­
nogeenien seulontaan. Monet yhdisteet, joilla saadaan positiivinen tu ­
los tässä testissä, ovat nisäkkäiden karsinogeeneja. Tämän testin ja 
karsinogeenisuuden välillä ei ole kuitenkaan täydellistä korrelaatiota. 
Korrelaatio riippuu kemiallisista ominaisuuksista, ja yhä useammat tutkimustulokset viittaavat siihen, että on olemassa karsinogeeneja, joita ei voida havaita tällä testillä, koska ne näyttävät vaikuttavan mui ­
den mekanismien kuin suoran DNA-vaurion välityksellä.
 
Ks. myös Yleisjohdanto, osa B.  
1.2. MÄÄRITELMÄT  
Kromatidipoikkeavuus:  rakenteellinen kromosomivaurio, joka ilme ­
nee yksittäisten kromatidien katkeamisena tai kromatidien katkeami ­
sena ja uudelleen yhtymisenä.  
Kromosomipoikkeavuus:  rakenteellinen kromosomivaurio, joka il ­
menee molempien kromatidien katkeamisena tai katkeamisena ja uu ­
delleen yhtymisenä samassa kohdassa.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 309
 
Endoreduplikaatio:  tapahtumasarja, jossa DNA:n kahdentumisen S- 
vaiheen tuma ei etene mitoosiin vaan aloittaa uuden S-vaiheen. Tä ­
män seurauksena syntyy kromosomeja, joissa on 4, 8, 16, ... kroma ­
tidia.  
Aukko:  gap, akromaattinen leesio, joka on pienempi kuin yhden 
kromatidin leveys ja johon liittyy minimaalinen kromatidin (kroma ­
tidien) siirtymä.  
Mitoosi-indeksi:  suhdeluku, joka saadaan jakamalla metafaasissa 
olevien solujen määrä solupopulaatiossa todettujen solujen kokonais ­
määrällä; ilmoittaa solujen proliferaatioasteen kyseisessä solupopu ­
laatiossa.  
Numeerinen poikkeavuus:  käytetyille soluille tyypillisestä normaa ­
lista kromosomimäärästä poikkeava kromosomien lukumäärä.  
Polyploidia:  haploidisen kromosomimäärän ( n) esiintyminen monin ­
kertaisena, muu kuin diploidinen kromosomimäärä ( 3n, 4n  jne.).  
Rakenteellinen poikkeavuus:  kromosomirakenteen muutos, joka 
voidaan havaita solunjakautumisen meta-faasivaiheen mikroskooppi ­
tutkimuksella ja joka ilmenee deleetioina ja fragmentteina, kromoso ­
mien sisäisinä tai kromosomien välisinä tekijänvaihdoksina.  
1.3 TESTIN PERIAATE  
Soluviljelmät altistetaan tutkittavalle aineelle sekä ilman metabolista 
aktivaatiota että metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa. Kun soluviljelmät on altistettu tutkittavalle aineelle, ne käsitellään etukä ­
teen määrätyin välein metafaasin pysäyttävällä aineella (esim. Colce ­
mid® tai kolkisiini), solut kerätään ja värjätään, ja metafaasissa ole ­
vat solut analysoidaan mikroskooppisesti kromosomipoikkeavuuk ­
sien havaitsemiseksi.
 
1.4 TESTIN KUVAUS  
1.4.1  Testin valmistelu  
1.4.1.1  Solut  
Testissä voidaan käyttää eri solulinjoja, solukantoja tai primaarisia 
soluviljelmiä, myös ihmisen soluja (esim. kiinanhamsterin fibroblas ­
teja, ihmisen tai muun nisäkkään perifeerisen veren lymfosyyttejä).  
1.4.1.2  Kasvatusväliaineet ja viljelyolosuhteet  
Soluviljelmien ylläpidossa on käytettävä soveltuvia kasvatusalustoja 
ja inkubaatio-olosuhteita (kasvatusastiat, CO  2 -pitoisuus, lämpötila ja 
kosteus). Pysyvistä solulinjoista ja kannoista on tarkistettava ajoittain modaalisen kromosomimäärän pysyvyys ja mahdollinen mykoplas ­
makontaminaatio. Kontaminoituneita viljelmiä ei pidä käyttää. Solu ­
jen normaali solusyklin kesto ja käytetyt viljelyolosuhteet on tunnet ­
tava.
 
1.4.1.3  Soluviljelmien valmistelu  
Pysyvät solulinjat ja solukannat: solut kasvatetaan kantaviljelmistä, 
kylvetään kasvatusvälineeseen sellaiseen tiheyteen, että soluviljelmät 
eivät saavuta konfluenttisuutta ennen solujen keräämisajankohtaa, ja 
inkuboidaan 37  o C:ssa.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 310
 
Lymfosyytit: antikoagulanteilla (esim. hepariinilla) käsiteltyä koko ­
verta tai terveiltä luovuttajilta saatuja erotettuja lymfosyyttejä lisätään 
mitogeenia (esim. fytohemagglutiniinia) sisältävään kasvatusväli ­
aineeseen ja inkuboidaan 37  o C:ssa.  
1.4.1.4  Metabolinen aktivaatio  
Solut on altistettava tutkittavalle aineelle sekä sopivan metabolisen 
aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa että ilman sitä. Yleisimmin käy ­
tetty aktivaatiojärjestelmä on entsyymejä indusoivilla aineilla, kuten 
Aroclor 1254:11ä (6) (7) (8) (9) tai fenobarbitonin ja ß-naftoflavonin 
(10) (11) (12) yhdistelmällä käsiteltyjen jyrsijöiden maksasta eristetty postmitokondriaalinen jae (S9), johon on lisätty kofaktoria.
 
Postmitokondriaalisen jakeen yleisesti käytetty pitoisuusalue lopulli ­
sessa testiväliaineessa on 1-10 % v/v. Metabolinen aktivaatiojärjes ­
telmä voi vaihdella sen mukaan, mihin kemiallisten aineiden ryh ­
mään tutkittava aine kuuluu. Joissakin tapauksissa saattaa olla perus ­
teltua käyttää useampaa kuin yhtä postmitokondriaalisen jakeen pi ­
toisuutta.  
Monilla kehitetyillä menetelmillä, kuten yhdistelmä-DNA-tekniikalla 
tuotetuilla solulinjoilla, joissa ilmentyy spesifisiä aktivaatioentysyy ­
mejä, saattaa olla endogeenista aktivaatiovaikutusta. Käytettyjen so ­
lulinjojen valinnan on oltava tieteellisesti perusteltua (esim. sytok ­
romi P450 -isoentsyymin merkitys tutkittavan aineen metabolialle).  
1.4.1.5  Tutkittava aine / valmistelu  
Kiinteät tutkittavat aineet liuotetaan tai sekoitetaan sopiviin liuotti ­
miin tai kantaja-aineisiin ja laimennetaan tarvittaessa ennen solujen 
käsittelyä. Nestemäiset tutkittavat aineet voidaan lisätä suoraan koe ­
järjestelmiin ja/tai laimentaa ennen solujen käsittelyä. Tutkittava aine on valmisteltava juuri ennen altistusta, paitsi jos säilyvyys on osoi ­
tettu stabiliteettitutkimuksilla.
 
1.4.2  Koeolosuhteet  
1.4.2.1  Liuotin/kantaja-aine  
Liuotin/kantaja-aine ei saa olla sellainen, että sen voidaan epäillä 
reagoivan kemiallisesti tutkittavan aineen kanssa, eikä se saa vaikut ­
taa solujen elinkykyyn eikä S9-aktiivisuuteen. Jos käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita, niiden käyttö on pe ­
rusteltava yhteensopivuuden osoittavilla tutkimustuloksilla. Vesipitoi ­
sen liuottimen/kantaja-aineen käyttöä on harkittava ensisijaisesti aina, kun se on mahdollista. Testattaessa aineita, jotka ovat epästabiileja 
vedessä, orgaanisten liuottimien tulisi olla vedettömiä. Vesi voidaan 
poistaa lisäämällä molekyylisiivilä.
 
1.4.2.2  Altistuspitoisuudet  
Huomioonotettavia kriteerejä suurinta pitoisuutta määritettäessä ovat 
sytotoksisuus, liukoisuus testijärjestelmään ja pH:n tai osmolaliteetin muutokset.
 
Sytotoksisuus on määritettävä pääasiallisessa kokeessa sekä metabo ­
lisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa että ilman sitä käyttäen asi ­
anmukaisia solujen eheyden ja solukasvun indikaattoreita, kuten konfluenttisuuden astetta, elinkykyisten solujen määrää tai mitoosi- 
indeksiä. Sytotoksisuus ja liukoisuus saattaa olla hyödyllistä mää ­
rittää alustavassa kokeessa.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 311
 
Vähintään kolmea analysoitavissa olevaa pitoisuutta on käytettävä. 
Mikäli sytotoksisuutta esiintyy, näiden pitoisuuksien on katettava 
alue, jossa suurimmalla pitoisuudella on maksimaalinen myrkkyvai ­
kutus ja pienimmällä vähäinen tai ei lainkaan myrkkyvaikutusta, mikä tarkoittaa yleensä sitä, että pitoisuudet voivat poiketa toisistaan 
enintään kertoimella 2–10. Solujen keräämisajankohtana suurimpaan 
pitoisuuteen tulisi liittyä merkittävä konfluenttisuuden asteen, solu ­
määrän tai mitoosi-indeksin pieneneminen (kaikkien osalta yli 50 %). Mitoosi-indeksi on vain epäsuora sytotoksisten/sytostaattisten vaiku ­
tusten mitta, ja se riippuu altistuksesta kuluneesta ajasta. Mitoosi- 
indeksi hyväksytään kuitenkin suspensioviljelmissä, joissa muiden myrkkyvaikutusta mittaavien menetelmien käyttö saattaa olla hanka ­
laa ja epäkäytännöllistä. Tietoja solusyklin kinetiikasta, kuten keski ­
määräistä generaatioaikaa (average generation time, AGT), voidaan 
käyttää täydentävinä tietoina. AGT on kuitenkin yleinen keskiarvo, joka ei aina paljasta hidastuneiden alapopulaatioiden olemassaoloa, ja vähäinenkin generaatioajan piteneminen voi siirtää poikkeavuuksien 
optimaalista toteamisaikaa hyvinkin paljon myöhemmäksi.
 
Soluille suhteellisen myrkyttömiä aineita tutkittaessa suurimman tes ­
tattavan pitoisuuden on oltava 5 μl/ml, 5 mg/ml tai 0,01 M, sen 
mukaan, mikä näistä pitoisuuksista on pienin.  
Testattaessa huonosti veteen liukenevia aineita, jotka ovat myrkyttö ­
miä liukenemattoman pitoisuuden alittavina pitoisuuksina, suurim ­
man käytetyn annoksen aikaansaaman pitoisuuden on ylitettävä liu ­
koisuusraja lopullisessa kasvatusväliaineessa altistusjakson lopussa. 
Joissakin tapauksissa (esim. kun myrkkyvaikutus todetaan ainoastaan pienimmän liukenemattoman pitoisuuden ylittävillä pitoisuuksilla) on suositeltavaa testata useampia kuin yksi pitoisuus, jossa havaitaan 
näkyvää saostumista. Liukoisuus kannattaa arvioida sekä käsittelyn 
alussa että lopussa, sillä se voi muuttua koejärjestelmässä altistuksen aikana esimerkiksi solujen, S9:n, seerumin ym. vaikutuksesta. Liu ­
kenemattomuus voidaan havaita paljaalla silmällä. Sakan ei pitäisi 
vaikuttaa laskentaan.
 
1.4.2.3  Negatiiviset ja positiiviset kontrollit  
Jokaisessa kokeessa on käytettävä rinnakkaisia positiivisia ja negatii ­
visia (liuotin tai kantaja-aine} kontrolleja, sekä metabolisen aktivaa ­
tion läsnäollessa että ilman sitä. Metabolista aktivaatiota käytettäessä positiivisena kontrollina on käytettävä sellaista kemiallista ainetta, 
joka vaatii aktivaatiota mutageenisen vasteen aikaansaamiseksi.
 
Positiivisina kontrollialueina on käytettävä tunnettua klastogeenia al ­
tistustasoina, joiden voidaan odottaa aiheuttavan toistettavissa ja ha ­
vaittavissa olevan lisääntymisen taustaan verrattuna, mikä osoittaa koejärjestelmän herkkyyden.
 
Positiivisen kontrollialueen pitoisuudet on valittava siten, että vaiku ­
tukset ovat selvät mutta eivät paljasta heti lukijalle koodattujen ob ­
jektilasien identiteettiä. Esimerkkejä positiivisista kontrolliaineista:  
Metabolinen aktivaatio Aine CAS nro EINECS nro  
Ei eksogeenista metabolista ak ­
tivaatiota metyylimetaanisulfonaatti 66-27-3 200-625-0 
etyylimetaanisulfonaatti 62-50-0 200-536-7  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 312
 
Metabolinen aktivaatio Aine CAS nro EINECS nro  
etyylinitrosourea 759-73-9 212-072-2 
mitomysiini C 50-07-7 212-072-2 
4-nitrokinoliini-N-oksidi 56-57-5 200-281-1 
Eksogeeninen metabolinen akti ­
vaatio Bentso[a]pyreeni 50-32-8 200-028-5 
syklofosfamidi 
syklofosfamidimonohydraatti 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4  
Muita sopivia positiivisia kontrolliaineita voidaan käyttää. Samaan 
kemiallisten aineiden ryhmään kuuluvan positiivisen kemiallisen 
kontrolliaineen käyttöä on harkittava, mikäli tällainen aine on käy ­
tettävissä.  
Jokaisena solujen keräämisajankohtana on otettava näytteet myös 
negatiivisista kontrolleista, jotka koostuvat tutkittavaa ainetta sisältä ­
vässä kasvatusväliaineessa olevasta liuottimesta tai pelkästä kantaja- aineesta ja joita on käsitelty samalla tavoin kuin altistettuja viljelmiä. Lisäksi on käytettävä myös käsittelemättömiä kontrolleja, paitsi jos 
aikaisemmat tiedot kontrollista osoittavat, ettei valitulla liuottimella 
ole haitallisia eikä mutageenisia vaikutuksia.
 
1.4.3  Testin suorittaminen  
1.4.3.1  Altistaminen tutkittavalle aineelle  
Lisääntyvät solut altistetaan tutkittavalle aineelle metabolisen akti ­
vaatiojärjestelmän läsnäollessa ja ilman sitä. Lymfosyyttien altistus on aloitettava noin 48 tunnin kuluttua mitogeenisesta stimulaatiosta.
 
1.4.3.2 Normaalisti jokaisesta pitoisuudesta tulisi tehdä kaksi rinnakkaista 
viljelmää, ja niiden käyttöä suositellaan erityisesti negatiivisissa/ ­
liuotinkontrolliviljelmissä. Mikäli aikaisemmat tutkimustulokset osoittavat, että rinnakkaisviljelmien välillä on vain hyvin vähäisiä 
eroja (13) (14), yhden viljelyn käyttö kustakin pitoisuudesta saattaa 
olla hyväksyttävää.
 
Kaasumaisia tai haihtuvia aineita on testattava asianmukaisilla me ­
netelmillä, kuten suljetuissa kasvatusastioissa (15) (16).  
1.4.3.3  Näytteiden keräämisajankohdat  
Ensimmäisessä kokeessa soluja on altistettava tutkittavalle aineelle 
sekä metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa että ilman sitä 3–6 tunnin ajan, ja näytteet kerätään suunnilleen 1,5 normaalin so ­
lusyklin kuluttua altistuksesta (12). Jos tässä menettelyssä saadaan 
negatiiviset tulokset sekä metabolisen aktivaation läsnäollessa että ilman sitä, on tehtävä uusi testi ilman aktivaatiota, ja altistusta on jatkettava yhtäjaksoisesti siihen asti, kun näytteet kerätään suunnil ­
leen 1,5 normaalia solusykliä vastaavan ajan kuluttua. Tietyt kemi ­
alliset aineet saatetaan havaita helpommin, kun altistus/ ­
näytteenottoaika on pitempi kuin 1,5 solusykliä. Metabolisen akti ­
vaation läsnäollessa saadut negatiiviset tulokset on vahvistettava ta ­
pauskohtaisesti. Ellei negatiivisten tulosten vahvistamista pidetä tar ­
peellisena, perustelut on esitettävä.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 313
 
1.4.3.4  Kromosomipreparaatti  
Soluviljelmiä käsitellään Colcemid®illa tai kolkisiinilla yleensä 1–3 
tunnin ajan ennen näytteiden keräämistä. Jokaisen viljelmän näytteet kerätään ja käsitellään erikseen kromosomipreparaattien valmistusta 
varten. Kromosomipreparaattien valmistukseen kuuluu solujen hypo ­
toninen käsittely, fiksointi ja värjäys.
 
1.4.3.5  Analyysi  
Kaikki objektilasit, myös positiiviset ja negatiiviset kontrollit, on 
koodattava toisistaan riippumattomasti ennen mikroskooppitutkimus ­
ta. Koska fiksaatio johtaa usein joidenkin metafaasissa olevien solu ­
jen rikkoutumiseen ja kromosomien menettämiseen, lasketuissa so ­
luissa tulisi olla sentromeerejä modaalista lukumäärää vastaava määrä ± 2 kaikissa solutyypeissä. Kustakin pitoisuudesta ja kontrol ­
lista olisi laskettava vähintään 200 hyvin levinnyttä metafaasia, jotka 
jakautuvat tasaisesti rinnakkaisviljelmien kesken, mikäli niitä käyte ­
tään. Lukumäärää voidaan pienentää, mikäli aberraatioita todetaan runsaasti.
 
Vaikka testillä pyritään ensisijaisesti toteamaan rakenteelliset kromo ­
somipoikkeavuudet, on tärkeää rekisteröidä myös polyploidia ja en ­
doreduplikaatio, mikäli näitä esiintyy.  
2. TULOKSET  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Kokeellinen yksikkö on solu, joten on arvioitava niiden solujen pro ­
sentuaalinen määrä, joissa on rakenteellinen kromosomipoikkeavuus 
(poikkeavuuksia). Erityyppiset rakenteelliset kromosomipoikkeavuu ­
det on lueteltava ja niiden lukumäärät ja esiintymistaajuudet altiste ­
tuissa viljelmissä ja kontrolliviljelmissä on mainittava. Aukot (gaps) 
rekisteröidään erikseen ja raportoidaan mutta niitä ei yleensä lasketa mukaan poikkeavuuksien kokonaistaajuuteen.
 
Lisäksi on rekisteröitävä kaikissa testiviljelmissä ja negatiivisissa 
kontrolliviljelmissä tehdyt samanaikaiset sytotoksisuusmittaukset pääasiallisissa kromosomipoikkeavuustesteissä.
 
Tulokset on ilmoitettava kutakin viljelmää kohti. Lisäksi on esitet ­
tävä yhteenveto kaikista tiedoista taulukkomuodossa.  
Selvää positiivista vastetta ei tarvitse vahvistaa. Epäselvät tulokset on 
selvitettävä jatkotestauksella mieluiten muunnetuissa koeolosuhteissa. 
Negatiivisten tulosten vahvistamisen tarvetta on käsitelty kohdassa 
1.4.3.3. Jatkokokeissa on harkittava tutkimusparametrien modifiointia arvioitavien olosuhteiden laajentamiseksi. Mahdollisia modifioitavia tutkimusparametreja ovat pitoisuusvälit ja metaboliset aktivaatiojär ­
jestelmät.
 
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI JA TULKINTA  
Positiivisten tulosten määrittämiseen on useita kriteerejä, kuten kro ­
mosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen lukumäärän lisääntymi ­
nen, joka on riippuvainen tutkittavan aineen pitoisuudesta tai on toistettavissa. Tulosten biologinen merkitys on otettava ensisijaisesti huomioon. Tilastollisia menetelmiä voidaan käyttää apuna testitulos ­
ten arvioinnissa (3) (13). Tilastollinen merkitsevyys ei saa olla ainoa 
määräävä tekijä positiivisen vasteen arvioinnissa.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 314
 
Polyploidisten solujen määrän suureneminen saattaa osoittaa, että 
tutkittava aine pystyy estämään mitoottisia prosesseja ja aiheutta ­
maan numeerisia kromosomipoikkeavuuksia. Endoreduplikoituneita kromosomeja sisältävien solujen määrän suureneminen saattaa osoit ­
taa, että tutkittava aine kykenee pysäyttämään solusyklin etenemisen 
(17) (18).
 
Tutkittava aine, jolla saadut tulokset eivät täytä edellä kuvattuja 
kriteerejä, katsotaan ei-mutageeniseksi tässä koejärjestelmässä.  
Useimmissa testeissä saadaan selvästi positiivisia tai negatiivisia tu ­
loksia, mutta joissakin harvinaisissa tapauksissa saatujen tietojen 
pohjalta ei voida tehdä varmoja päätelmiä tutkittavan aineen vaiku ­
tuksesta. Tulokset saattavat jäädä epäselviksi tai kyseenalaisiksi ko ­
keen toistokertojen määrästä riippumatta.  
In vitro  -kromosomipoikkeavuustestissä saadut positiiviset tulokset 
osoittavat, että tutkittava aine aiheuttaa rakenteellisia kromosomi ­
poikkeavuuksia viljellyissä nisäkkäiden somaattisissa soluissa. Nega ­
tiiviset tulokset osoittavat, ettei tutkittava aine aiheuta koeolosuh ­
teissa kromosomipoikkeavuuksia viljellyissä nisäkkäiden somaatti ­
sissa soluissa.  
3. RAPORTOINTI  
TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on sisällettävä seuraavat tiedot:  
Liuotin/kantaja-aine:  
— kantaja-aineen valintaperusteet,  
— tutkittavan aineen liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja- 
aineessa, jos tiedossa.  
Solut:  
— solutyyppi ja solujen lähde,  
— karyotyypin ominaisuudet ja käytetyn solutyypin soveltuvuus,  
— mykoplasman puuttuminen, tarvittaessa,  
— tiedot solusyklin pituudesta,  
— verenluovuttajien sukupuoli, kokoveri vai eristetyt lymfosyytit, 
käytetty mitogeeni,  
— siirtojen lukumäärä, tarvittaessa,  
— soluviljelmän ylläpitomenetelmät, tarvittaessa,  
— kromosomien modaalinen lukumäärä.  
Koeolosuhteet:  
— metafaasin estämiseen käytetty aine, sen pitoisuus ja solujen al ­
tistuksen kesto,  
— pitoisuuksien ja soluviljelmien lukumäärän valintaperusteet, joi ­
hin sisältyvät esim. sytotoksisuustiedot ja liukoisuusrajoitukset, mikäli tiedot ovat käytettävissä,
 
— kasvatusväliaineen koostumus, CO  2 -pitoisuus, tarvittaessa,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 315
 
— tutkittavan aineen pitoisuus,  
— lisätyn kantaja-aineen ja tutkittavan aineen määrä,  
— inkubaatiolämpötila,  
— inkubaatioaika,  
— altistuksen kesto,  
— solutiheys kylvämisen aikana, tarvittaessa,  
— metabolisen aktivaatiojärjestelmän tyyppi ja koostumus, myös 
sen hyväksyttävyyskriteerit,  
— positiiviset ja negatiiviset kontrollit,  
— objektilasien valmistelumenetelmät,  
— kromosomipoikkeavuuksien laskentakriteerit,  
— analysoitujen metafaasien lukumäärä,  
— myrkkyvaikutuksen mittausmenetelmät,  
— positiivisten, negatiivisten tai epäselvien tulosten kriteerit.  
Tulokset:  
— myrkkyvaikutuksen merkit, esim. konfluenttisuuden aste, solu ­
sykliä koskevat tiedot, solumäärät, mitoosi-indeksi,  
— saostumisen merkit,  
— tiedot tutkittavaa ainetta sisältävän kasvatusväliaineen pH:sta ja 
osmolaliteetista, jos määritetty,  
— kromosomipoikkeavuuksien, myös aukkojen, määrittely (gaps),  
— kromosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen lukumäärä ja kro ­
mosomipoikkeavuuksien tyyppi ilmoitetaan kunkin altistetun vil ­
jelmän ja kontrolliviljelmän osalta erikseen,  
— ploidian muutokset, jos niitä esiintyy,  
— annos-vastesuhde, mikäli mahdollista,  
— mahdolliset tilastolliset analyysit,  
— rinnakkaisten negatiivisten (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisten 
kontrollien tulokset,  
— aikaisemmat tutkimustulokset negatiivisista (liuotin/kantaja-aine) 
ja positiivisista kontrolleista, myös vaihteluvälit, keskiarvot ja keskihajonnat.
 
Tulosten pohdinta.  
Johtopäätökset.  
4. KIRJALLISUUTTA  
(1) Evans, H.J. (1976). Cytological Methods for Detecting Chemi ­
cal Mutagens, in:  Chemical mutagens, Principles and Methods 
for their Detection,  Vol. 4, Hollaender, A., (ed) Plenum Press, 
New York and London, s. 1–29.  
(2) Ishidate, M.Jr. and Sofumi, T. (1985), The  In Vitro  Chromo­
somal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in:  Progress in Mutation 
Research,  Vol. 5, Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Pub ­
lishers, Amsterdam-New York-Oxford, s. 427–432.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 316
 
(3) Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C. Colman, S., 
Brown, B., Cannon, C., Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, 
M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, MA, Ander ­
son, G. and Zeiger, E. (1978). Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: 
Evaluation of 108 chemicals,  Environs, Molec. Mutagen  10 
(suppl.10), s. 1–175.
 
(4) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M.Jr., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991).Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, s. 147–204.
 
(5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992). 
Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian 
Cells, Mutation Res., 268, s. 297–305.  
(6) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ Mammalian Microsome Mutagenicity Test.  Mutation  Res., 31, 
s. 347–364.
 
(7) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the 
Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, s. 173–215.  
(8) Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. 
and de Vogel, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagen/ ­
Carcinogens after Activation in a Microsomal System in Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosa ­
mine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Mic ­
rosomes,  Mutation  Res., 37, s. 83–90.
 
(9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979). Chro ­
mosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro, Mutation  Res., 66, s. 277–290.
 
(10) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., 
Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Report of 
UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alterna ­
tives to Aroclor 1254-induced S9 in  In Vitro  Genotoxicity 
Assays,  Mutagenesis,  7, s. 175–177.  
(11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A. Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, 
F.J. Fouts, J.R. Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), In Vitro  
Metabolic Activation in Mutagenesis Testing,  Elsevier, North- 
Holland, s. 85–88.
 
(12) Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, M.Jr.. Ivett, J.L., 
Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994). 
Report from Working Group on in  In Vitro  Tests for Chromo ­
somal Aberrations, Mutation  Res.,  312, s. 241–261.  
(13) Richardson, C, Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., 
Chanter, D.O. and Phillips, B. (1989). Analysis of Data from  
In Vitro  Cytogenetic Assays, in:  Statistical Evaluation of Mu ­
tagenicity Test Data,  Kirkland, D.J., (ed) Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, s. 141–154.  
(14) Soper, K.A. and Galloway, S.M. (1994), replicate Flasks are 
not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells,  Mutation Res,,  312, s. 139–149.
 
(15) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/ ­
HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds),  Ge­
notoxic Effects of Airborne Agents,  New York, Plenum, 
s. 91–103.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 317
 
(16) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). 
Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on 
Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, E nvironmental Mutagenesis,  5, 
s. 795–801.
 
(17) Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation induced G2 arrest,  Mutation Res.,  
119, s. 403–413.  
(18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983), Aphidicolin 
— induced endoreduplication in Chinese hamster cells,  Cancer 
Res.,  43, s. 1362–1364.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 318
 
B.11.  MUTAGEENISUUS — KROMOSOMIPOIKKEAVUUSTESTI 
NISÄKKÄIDEN LUUYTIMESSÄ  IN VIVO  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä on sama kuin OECD TG 475, Mammalian Bone 
Marrow Chromosome Aberration Test (1997).  
1.1 JOHDANTO  
Nisäkkäillä  in vivo  tehtävää kromosomipoikkeavuustestiä käytetään 
tutkittavan aineen aiheuttamien rakenteellisten kromosomipoikkea ­
vuuksien osoittamiseen nisäkkäiden, yleensä jyrsijöiden, luuydinso ­
luissa (1) (2) (3) (4). Rakenteelliset kromosomipoikkeavuudet jakau ­
tuvat kahteen tyyppiin, kromosomi- ja kromatidipoikkeavuuksiin. Polyploidian lisääntyminen saattaa osoittaa, että kemiallinen aine 
voi aiheuttaa numeerisia poikkeavuuksia. Kemiallisten mutageenien 
aiheuttamat poikkeavuudet ovat useimmiten kromatidityyppisiä, mutta myös kromosomityyppisiä mutaatioita esiintyy. Kromosomi ­
mutaatiot ja niihin liittyvät tapahtumat ovat syynä moniin ihmisen 
geneettisiin sairauksiin, ja on saatu vakuuttavia todisteita siitä, että 
kromosomimutaatiot ja niihin liittyvä tapahtumat, jotka aiheuttavat muutoksia somaattisten solujen onkogeeneissä ja kasvunrajoitegee ­
neissä, ovat osallisina syövän synnyssä ihmisillä ja kokeellisissa jär ­
jestelmissä.
 
Tässä testissä käytetään rutiinimaisesti jyrsijöitä. Luuydin on tämän 
testin kohdekudos, sillä sen verisuonitus on hyvin runsasta ja se sisältää solupopulaation, jonka solusykli on nopea ja joka on helppo 
eristää ja prosessoida. Tätä menetelmää ei käytetä muilla lajeilla eikä 
muissa kohdekudoksissa.
 
Tämä kromosomipoikkeavuustesti soveltuu erityisesti mutageenisuu ­
den vaaran arvioimiseen, sillä siinä voidaan ottaa huomioon tekijöitä, 
jotka liittyvät  in vivo  -metaboliaan, farmakokinetiikkaan ja DNA:n 
korjautumisprosesseihin, joskin näissä saattaa esiintyä eroja lajien ja kudosten välillä.  In vivo  -testiä voidaan käyttää myös  in vitro  -tes­
tissä havaitun mutageenisen vaikutuksen jatkotutkimuksena.
 
Jos on saatu viitteitä siitä, ettei tutkittava aine tai sen reaktiivinen 
metaboliitti pääse kohdekudokseen, tätä testiä ei pidä käyttää.  
Ks. myös Yleisjohdanto, osa B.  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Kromatidipoikkeavuus:  rakenteellinen kromosomivaurio, joka ilme ­
nee yksittäisten kromatidien katkeamisena tai kromatidien katkeami ­
sena ja uudelleenyhtymisenä.  
Kromosomipoikkeavuus:  rakenteellinen kromosomivaurio, joka il ­
menee molempien kromatidien katkeamisena tai katkeamisena ja uu ­
delleenyhtymisenä samassa kohdassa.  
Endoreduplikaatio:  tapahtumasarja, jossa DNA:n kahdentumisen S- 
vaiheen jälkeen tuma ei etene mitoosiin vaan aloittaa uuden S-vai ­
heen. Tämän seurauksena syntyy kromosomeja, joissa on 4, 8, 16, ... 
kromatidia.  
Aukko:  gap, akromaattinen leesio, joka on pienempi kuin yhden 
kromatidin leveys, ja johon liittyy minimaalinen kromatidin (kroma ­
tidien) siirtymä.  
Numeerinen poikkeavuus:  käytetyille soluille tyypillisestä normaa ­
lista kromosomimäärästä poikkeava kromosomien lukumäärä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 319
 
Polyploidia:  haploidisen kromosomimäärän ( n) esiintyminen monin ­
kertaisena, muu kuin diploidinen kromosomimäärä ( 3n, 4n  jne.).  
Rakenteellinen poikkeavuus:  kromosomirakenteen muutos, joka 
voidaan havaita solunjakautumisen metafaasivaiheen mikroskooppi ­
tutkimuksella ja joka ilmenee deleetioina ja fragmentteina, kromoso ­
mien sisäisinä tai kromosomien välisinä tekijänvaihdoksina.  
1.3 TESTIN PERIAATE  
Eläimet altistetaan tutkittavalle aineelle soveltuvaa altistusreittiä käyt ­
täen ja lopetetaan sopivan ajan kuluttua altistuksesta. Ennen lopetta ­
mista eläimille annetaan ainetta, joka pysäyttää solunjakautumisen metafaasiin (esim. kolkisiinia tai Colcemid®ia). Tämän jälkeen luuy ­
dinsoluista tehdään kromosomipreparaatit ja ne värjätään, ja metafaa ­
sissa olevien solujen kromosomipoikkeavuudet analysoidaan.
 
1.4 TESTIN KUVAUS  
1.4.1  Testin valmistelu  
1.4.1.1  Eläinlajien valinta  
Yleisesti käytettyjä eläinlajeja ovat rotta, hiiri ja kiinanhamsteri, 
mutta myös muita soveltuvia nisäkäslajeja voidaan käyttää. Koe- 
eläinten on oltava yleisesti käytettyä laboratoriokantaa olevia nuoria 
terveitä aikuisia eläimiä. Testin alkaessa eläinten painon vaihtelun on oltava minimaalista, enintään ± 20 % kummankin sukupuolen keski ­
painosta.
 
1.4.1.2  Asuinolot ja ruokinta  
Yleiset olosuhteet ovat samat kuin osan B Yleisjohdannossa, mutta 
kosteustavoitteen on oltava 50–60 %.  
1.4.1.3  Eläinten valmistelu  
Terveet nuoret aikuiset eläimet jaetaan satunnaistetusti koe- ja kont ­
rolliryhmiin. Häkit on sijoitettava siten, että häkin sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Eläimet tunnistetaan yk ­
silöllisesti. Eläimiä sopeutetaan laboratorio-olosuhteisiin vähintään 
viiden päivän ajan.
 
1.4.1.4  Annosten valmistelu  
Kiinteät tutkittavat aineet liuotetaan tai sekoitetaan sopiviin liuotti ­
miin tai kantaja-aineisiin ja laimennetaan tarvittaessa ennen kuin niitä annetaan koe-eläimille. Nestemäiset tutkittavat aineet voidaan antaa 
suoraan tai laimentaa ennen antamista. Tutkittava aine on valmistet ­
tava juuri ennen annostelua, paitsi jos sen säilyvyys on osoitettu stabiliteettitesteillä.
 
1.4.2  Koeolosuhteet  
1.4.2.1  Liuotin/kantaja-aine  
Liuottimella/kantaja-aineella ei saa olla myrkkyvaikutuksia käyte ­
tyillä annostasoilla, eikä sen käyttöön saa liittyä epäilyjä mahdolli ­
sista kemiallisista reaktioista tutkittavan aineen kanssa. Jos käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita, niiden käyttö on perusteltava niiden yhteensopivuuden osoittavilla tutkimustulok ­
silla. Ensisijaisesti on harkittava vesipitoisen liuottimen/kantaja-ai ­
neen käyttöä, mikäli mahdollista.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 320
 
1.4.2.2  Kontrollit  
Jokaiseen testiin on otettava mukaan kumpaakin sukupuolta olevat 
rinnakkaiset positiiviset ja negatiiviset (liuotin/kantaja-aine) kontrol ­
lit. Kontrolliryhmän eläimiä on käsiteltävä samalla tavoin kuin koe ­
ryhmän eläimiä, mutta niille ei anneta tutkittavaa ainetta.  
Positiivisten kontrollien tulisi aiheuttaa rakenteellisia poikkeavuuksia  
in vivo - altistustasoilla, joiden odotetaan aiheuttavan poikkeavuuk ­
sien havaittavaa lisääntymistä taustaan verrattuna. Positiivisten kont ­
rollien annokset on valittava siten, että vaikutukset ovat selvät mutta 
eivät paljasta heti lukijalle koodattujen objektilasien identiteettiä. Po ­
sitiivinen kontrolli voidaan antaa eri reittiä kuin tutkittava aine ja näytteet voidaan ottaa vain kerran. Positiivisina kontrolleina tulisi käyttää samaan kemiallisten aineiden ryhmään kuuluvia aineita, mi ­
käli mahdollista. Esimerkkejä positiivisista kontrolleista:
 
Aine CAS-nro EINECS-nro  
Etyylimetaanisulfonaatti 62-50-0 200-536-7 
Etyylinitrosourea 759-73-9 212-072-2 
Mitomysiini C 50-07-7 200-008-6 Syklofosfamidi 
Syklofosfamidimonohydraatti 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Trietyleenimelamiini 51-18-3 200-083-5
 
Pelkkää liuotinta tai kantaja-ainetta saaneista negatiivisista kontrol ­
leista, joita muuten on käsitelty samalla tavoin kuin koeryhmiä, on 
otettava näytteet jokaisella näytteenottokerralla, paitsi jos aikaisem ­
mat tutkimustulokset osoittavat, että eläinten väliset erot ja vaihtelut kromosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen esiintymistaajuudessa ovat hyväksyttävällä tasolla. Jos negatiivisista kontrolleista otetaan 
vain yksi näyte, se tulisi ottaa ensimmäisellä näytteenottokerralla. 
Lisäksi on käytettävä myös käsittelemättömiä kontrolleja, paitsi jos kontrolleilla aikaisemmin tehdyt tutkimukset tai julkaistut tulokset osoittavat, että valittu liuotin/kantaja-aine ei aiheuta haitallisia eikä 
mutageenisia vaikutuksia.
 
1.5 TESTIN SUORITTAMINEN  
1.5.1  Eläinten lukumäärä ja sukupuoli  
Jokaisessa koe- ja kontrolliryhmässä on oltava vähintään 5 analysoi ­
tavissa olevaa eläintä kumpaakin sukupuolta. Vain toista sukupuolta voidaan käyttää, mikäli tutkimusajankohtana on käytettävissä samalla 
eläinlajilla samaa altistusreittiä käyttäen tehtyjä tutkimuksia, joiden 
tulokset osoittavat, ettei myrkkyvaikutuksessa ole huomattavia eroja sukupuolten välillä. Jos ihmisen altistuminen tutkittavalle kemialli ­
selle aineelle voi olla sukupuolesta riippuvaa, kuten joidenkin lää ­
keaineiden kohdalla, testi on tehtävä asianomaista sukupuolta olevilla 
eläimillä.
 
1.5.2  Altistusohjelma  
Tutkittavat aineet tulisi antaa mieluiten kerta-annoksena. Ne voidaan 
kuitenkin antaa myös jaettuina annoksina, eli kahtena altistuksena saman päivän aikana vain muutaman tunnin välein, mikä helpottaa 
suurten ainemäärien antamista. Muut annosteluohjelmat on perustel ­
tava tieteellisesti.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 321
 
Näytteet on otettava kahtena ajankohtana saman päivän aikana altis ­
tuksen jälkeen. Jyrsijöillä ensimmäisen näytteenottovälin pituus on 
1,5 normaalia solusykliä (solusyklin pituus on normaalisti 12–18 tuntia) altistuksen jälkeen. Koska tutkittavan aineen soluunottoon ja metaboloitumiseen kuluva aika ja sen vaikutus solusyklin kinetiik ­
kaan voi muuttaa kromosomipoikkeavuuksien optimaalista havaitse ­
misajankohtaa, myöhempi näyte tulisi kerätä 24 tunnin kuluttua en ­
simmäisestä näytteestä. Jos tutkittavaa ainetta annetaan pitempään kuin yhden päivän ajan. yksi näyte on otettava 1,5 normaalin solu ­
syklin kuluttua viimeisestä altistusajankohdasta.
 
Ennen lopettamista eläimille annetaan injektiona vatsaonteloon so ­
piva annos ainetta, joka pysäyttää solut metafaasivaiheeseen (esim. Colcemid®ia tai kolkisiinia). Eläimistä otetaan näytteet sopivan ajan kuluttua tämän jälkeen. Hiirillä tämä väli on noin 3–5 tuntia; kii ­
nanhamstereilla se on noin 4–5 tuntia. Solut kerätään luuytimestä ja 
analysoidaan kromosomipoikkeavuuksien toteamiseksi.
 
1.5.3  Annostasot  
Jos tehdään annoksenmääritystutkimus, koska soveltuvia tietoja ei 
ole käytettävissä, se on tehtävä samassa laboratoriossa käyttäen sa ­
maa lajia, samaa kantaa, samaa sukupuolta olevia eläimiä ja samaa 
altistusohjelmaa kuin päätutkimuksessa on tarkoitus käyttää (5). Mi ­
käli myrkkyvaikutuksia esiintyy, ensimmäiseen näytteenottoajankoh ­
taan asti käytetään kolmea annostasoa. Näistä suurimmalla annok ­
sella on oltava maksimaalinen myrkkyvaikutus ja pienimmällä vähäi ­
nen tai ei lainkaan myrkkyvaikutusta. Myöhemmän näytteenottoajan ­
kohdan edellä voidaan käyttää vain suurinta annosta. Suurin annos määritellään annokseksi, joka aiheuttaa sen kaltaisia myrkyllisyysoi ­
reita, että samaa annosteluohjelmaa käytettäessä suurempien annosten 
voitaisiin odottaa johtavan kuolemaan. Aineet, joilla on spesifisiä biologisia vaikutuksia pieninä, myrkyttöminä annoksina (kuten hor ­
monit ja mitogeenit), saattavat edellyttää toisenlaisia annoksenmää ­
rityskriteerejä, ja niitä pitäisi arvioida tapauskohtaisesti. Suurin annos 
voidaan määritellä myös annokseksi, joka aiheuttaa joitakin myrkyl ­
lisyyteen viittaavia muutoksia luuytimessä (esim. mitoosi-indeksi 
pienenee yli 50 %).
 
1.5.4  Raja-annostesti  
Ellei havaittavia myrkkyvaikutuksia esiinny testattaessa yhtä annos ­
tasoa, joka on vähintään 2 000 mg/kg (eläimen painokiloa kohti) ja joka annetaan kerta-annoksena tai kahtena annoksena saman päivän aikana, ja ellei genotoksisuutta ole odotettavissa kemialliselta raken ­
teeltaan samanlaisilla aineilla saatujen tutkimustulosten perusteella, 
täydellinen tutkimus kolmella eri annostasolla ei ehkä ole välttämä ­
tön. Pitempään kestävissä tutkimuksissa raja-annos on 2 000 mg painokiloa kohti vuorokaudessa, jos altistusta jatketaan enintään 14 
vuorokautta, ja 1 000 mg/kg/vrk, jos altistus kestää yli 14 vuoro ­
kautta. Ihmisten odotettu altistus saattaa edellyttää suurempien an ­
nostasojen käyttöä raja-annostestissä.
 
1.5.5  Antotapa  
Tutkittava aine annetaan yleensä ruokintaletkulla tai sopivalla intu ­
baatiokanyylillä tai injektiona vatsaonteloon. Myös muut antotavat 
ovat mahdollisia, mikäli ne voidaan perustella. Koe-eläimen koosta riippuu, kuinka paljon nestettä voidaan antaa kerralla ruokintaletkun kautta tai injektiona. Määrä ei kuitenkaan saa olla yli 2 ml/100 g 
eläimen painon mukaan mitattuna. Mikäli käytetään suurempia nes ­
temääriä, ne on perusteltava. Lukuun ottamatta ärsyttäviä tai syövyt ­
täviä aineita, joiden vaikutukset yleensä pahenevat suurempia pitoi ­
suuksia käytettäessä, nestemäärien vaihtelu olisi pidettävä mahdolli ­
simman pienenä säätämällä tutkittavan aineen pitoisuuksia siten, että 
kokonaisnestemäärä pysyy samana kaikilla annostasoilla.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 322
 
1.5.6  Kromosomipreparaatin valmistus  
Luuydintä kerätään heti eläinten lopettamisen jälkeen, käsitellään 
hypotonisella liuoksella ja fiksoidaan. Tämän jälkeen solut levitetään objektilaseille ja värjätään.
 
1.5.7  Analyysi  
Mitoosi-indeksi on määritettävä sytotoksisuuden mittana vähintään 
1 000 solusta eläintä kohti kaikista tutkittavalle aineelle altistetuista eläimistä (myös positiivisista kontrolleista) ja altistamattomista nega ­
tiivisista kontrollieläimistä.
 
Jokaisesta eläimestä on analysoitava vähintään 100 solua. Määrä voi 
olla pienempi, mikäli havaitaan runsaasti poikkeavuuksia. Kaikki 
objektilasit, myös ne, joilla on positiiviset ja negatiiviset kontrollit, 
on koodattava toisistaan riippumattomasti ennen mikroskooppitutki ­
musta. Koska objektilasien valmistelu johtaa usein joidenkin meta ­
faasissa olevien solujen rikkoutumiseen ja kromosomien menettämi ­
seen, sentromeerien lukumäärän lasketuissa soluissa on vastattava 
lukua 2n ± 2.  
2. TULOKSET  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Yksittäisten eläinten tulokset on esitettävä taulukkomuodossa. Ko ­
keellinen yksikkö on eläin. Jokaisesta eläimestä on arvioitava lasket ­
tujen solujen lukumäärä, poikkeavuuksien lukumäärä solua kohti ja niiden solujen prosentuaalinen osuus, joissa on yksi tai useampia 
rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia. Erityyppiset rakenteelliset 
kromosomipoikkeavuudet on lueteltava ja niiden lukumäärä ja esiin ­
tymistaajuus on ilmoitettava koe- ja kontrolliryhmien osalta. Aukot (gaps) rekisteröidään erikseen ja raportoidaan, mutta niitä ei yleensä 
lasketa mukaan kromosomipoikkeavuuksien kokonaistaajuuteen. El ­
lei viitteitä sukupuolten välisistä vaste-eroista ole havaittavissa, mo ­
lempien sukupuolten tiedot voidaan yhdistää tilastollista analyysiä tehtäessä.
 
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI JA TULKINTA  
Positiivisille tuloksille on useita kriteerejä, kuten kromosomipoikkea ­
vuuksia sisältävien solujen suhteellisen lukumäärän annoksesta riip ­
puva suureneminen tai kromosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen 
lukumäärän selvä suureneminen yksittäisessä annosryhmässä yhdellä 
näytteenottokerralla. Tulosten biologinen merkitys on otettava ensi ­
sijaisesti huomioon. Tilastollisia menetelmiä voidaan käyttää apuna testitulosten arvioinnissa (6). Tilastollinen merkitsevyys ei saa olla 
ainoa määräävä tekijä positiivisen vasteen arvioinnissa. Epäselviä 
tuloksia on selkeytettävä jatkotestauksella mieluiten muunnetuissa koeolosuhteissa.
 
Polyploidian lisääntyminen saattaa osoittaa, että tutkittava aine pys ­
tyy aiheuttamaan numeerisia kromosomipoikkeavuuksia. Endored ­
uplikaation lisääntyminen saattaa osoittaa, että tutkittava aine kyke ­
nee pysäyttämään solusyklin etenemisen (7) (8).  
Tutkittava aine, jolla saadut tulokset eivät täytä edellä kuvattuja 
kriteerejä, katsotaan ei-mutageeniseksi tässä testissä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 323
 
Useimmissa testeissä saadaan selvästi positiivisia tai negatiivisia tu ­
loksia, mutta joissakin harvinaisissa tapauksissa saatujen tulosten 
pohjalta ei voida tehdä varmoja päätelmiä tutkittavan aineen vaiku ­
tuksesta. Tulokset saattavat jäädä epäselviksi tai kyseenalaisiksi teh ­
tyjen kokeiden lukumäärästä riippumatta.  
In vivo  -kromosomipoikkeavuustestissä saadut positiiviset tulokset 
osoittavat, että tutkittava aine aiheuttaa kromosomipoikkeavuuksia 
testatun lajin luuytimessä. Negatiiviset tulokset osoittavat, ettei tut ­
kittava aine aiheuta koeolosuhteissa kromosomipoikkeavuuksia testa ­
tun lajin luuytimessä.  
Tutkittavan aineen tai sen metaboliittien todennäköistä pääsyä ylei ­
seen verenkiertoon tai erityisesti kohdekudokseen (esim. systeeminen toksisuus) on pohdittava.
 
3. RAPORTOINTI  
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on sisällettävä seuraavat tiedot:  
Liuotin/kantaja-aine:  
— kantaja-aineen valintaperusteet,  
— tutkittavan aineen liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja- 
aineessa, jos tiedossa.  
Koe-eläimet:  
— käytetty eläinlaji/kanta,  
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli,  
— hankintapaikka, asuinolosuhteet, ruokavalio jne.,  
— eläinten yksilöllinen paino testiä aloitettaessa, myös painon vaih ­
teluväli, keskiarvo ja keskihajonta kussakin ryhmässä.  
Koeolosuhteet:  
— positiiviset ja negatiiviset (kantaja-aine/liuotin) kontrollit,  
— mahdolliset raja-annostutkimuksen tulokset,  
— annostasojen valintaperusteet,  
— tutkittavan aineen valmistelun yksityiskohdat,  
— tutkittavan aineen antotavan yksityiskohdat,  
— antotavan valintaperusteet,  
— menetelmät, joilla on vahvistettu tutkittavan aineen pääsy ylei ­
seen verenkiertoon tai kohdekudokseen, tarvittaessa,  
— ravintoon/juomaveteen sekoitetun tutkittavan aineen pitoisuuden 
(ppm) muuntaminen todelliseksi annokseksi (mg painokiloa kohti vuorokaudessa, mg/kg/vrk), tarvittaessa,
 
— yksityiskohtaiset tiedot ravinnon ja veden laadusta,  
— yksityiskohtainen kuvaus altistus- ja näytteidenkeräysohjelmasta,  
— myrkkyvaikutuksen mittausmenetelmät,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 324
 
— metafaasin pysäyttämisessä käytetty aine, sen pitoisuus ja käsit ­
telyn kesto,  
— objektilasien valmistusmenetelmät,  
— kromosomipoikkeavuuksien laskentakriteerit,  
— analysoitujen solujen lukumäärä eläintä kohti,  
— kriteerit, joiden perustella tutkimukset luokiteltiin positiivisiksi, 
negatiivisiksi tai epäselviksi.  
Tulokset:  
— myrkkyvaikutuksen merkit,  
— mitoosi-indeksi,  
— kromosomipoikkeavuuksien tyyppi ja lukumäärä, ilmoitettava jo ­
kaisen eläimen osalta erikseen,  
— kromosomipoikkeavuuksien kokonaismäärä ryhmää kohti sekä 
keskiarvot ja keskihajonnat,  
— kromosomipoikkeavuuksia sisältäneiden solujen lukumäärä ryh ­
mää kohti sekä keskiarvot ja keskihajonnat,  
— ploidian muutokset, jos niitä esiintyy,  
— annos-vastesuhde, mikäli mahdollista.  
— mahdolliset tilastolliset analyysit,  
— rinnakkaisen negatiivisen kontrollin tulokset,  
— aikaisemmat negatiivisesta kontrollista saadut tutkimustulokset 
sekä vaihteluvälit, keskiarvot ja keskihajonnat,  
— rinnakkaisen positiivisen kontrollin tulokset.  
Tulosten pohdinta.  
Johtopäätökset.  
4. KIRJALLISUUTTA  
(1) Adler, I.D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals, in:  Muta­
genicity Testing: a Practical Approach , S. Venitt and J.M. 
Party (eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., s. 275–306.  
(2) Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H., McFee, 
A.F. and Shelby, M. (1987). Mammalian  In Vivo  Cytogenetic 
Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow 
Cells,  Mutation Res.,  189, s. 57–165.  
(3) Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D.G., Boot ­
man, J. and Henderson, L. (1990).  In Vivo  Cytogenetic Assays, 
in: D.J. Kirkland (Ed.),  Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Re ­
commended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised,  Cambridge 
University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbo ­
urne, Sydney, s. 115–141.
 
(4) Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Bla ­
key, D.H., Holden, H.E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F.B., 
Pacchierotti, K, Preston, R.J., Romagna, F., Shimada, H., Su ­
tou, S. and Vannier, B. (1994). Report from the Working Group on the  In Vivo  Mammalian Bone Marrow Chromosomal 
Aberration Test.  Mutation Res.,  s. 312, 305–312.
 
(5) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Wor ­
king Group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays,  Mu­
tagenesis,  7, s. 313–319.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 325
 
(6) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Cla ­
re, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, 
J.R.K. (1989). Statistical Analysis of  In Vivo  Cytogenetic As ­
says, in:  UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutageni ­
city Testing . Report Part III. Statistical Evaluation of Mutage ­
nicity Test Data,  D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge University 
Press, Cambridge, s. 184–232.  
(7) Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation-induced G2 arrest.  Mutation Res.,  
11 9, s. 403–413.  
(8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin — 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells,  Cancer 
Res.,  43, s. 1362–1364.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 326
 
B.12.  MUTAGEENISUUS — MIKROTUMATESTI NISÄKKÄÄN 
PUNASOLUISSA  IN VIVO  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä on sama kuin OECD TG 474, Mammalian Eryth ­
rocyte Micronucleus Test (1997).  
1.1 JOHDANTO  
Nisäkkäiden  in vivo  -mikrotumatestiä käytetään tutkittavan aineen 
aiheuttamien kromosomivaurioiden tai mitoosilaitteen vaurioiden to ­
teamiseen erytroblasteissa analysoimalla eläinten, yleensä jyrsijöiden, 
luuytimestä kerättyjä punasoluja ja/tai perifeerisiä verisoluja.  
Mikrotumatestin tarkoituksena on tunnistaa sellaisia sytogeneettisiä 
vaurioita aiheuttavat aineet, jotka johtavat hitaasti liikkuvia (lagging) kromosomifragmentteja tai kokonaisia kromosomeja sisältävien mik ­
rotumien muodostumiseen.
 
Kun luuytimen erytroblasti kehittyy polykromaattiseksi punasoluksi, 
päätuma irtoaa solusta, ja mahdollinen muodostunut mikrotuma saat ­
taa jäädä muutoin tumattomaan solulimaan. Päätuman puuttuminen helpottaa mikrotumien havaitsemista näissä soluissa. Mikrotumaisten 
polykromaattisten punasolujen suurentunut esiintymistaajuus altiste ­
tuilla eläimillä on osoitus tutkittavan aineen aiheuttamasta kromoso ­
mivauriosta.
 
Tässä testissä käytetään rutiinimaisesti jyrsijöiden luuydintä, sillä 
polykromaattiset punasolut muodostuvat luuytimessä. Mikrotumaiset 
epäkypsät (polykromaattiset) punasolut voidaan mitata yhtä hyvin perifeerisestä verestä miltä tahansa eläinlajilta, jonka perna ei kykene poistamaan mikrotumaisia punasoluja tai jonka on todettu olevan 
riittävän herkkä rakenteellisia tai numeerisia kromosomipoikkea ­
vuuksia aiheuttavien aineiden osoittamiseen. Mikrotumien erottami ­
sessa voidaan käyttää useita kriteerejä. Näitä ovat kinetokorin tai sentromeerisen DNA:n osoittaminen mikrotumissa tai puuttuminen 
niistä. Mikrotumaisten epäkypsien (polykromaattisten) punasolujen 
esiintymistaajuus on pääasiallinen tulos. Perifeerisen veren kypsien (normokromaattisten) punasolujen lukumäärää, jossa esiintyy mikro ­
tumia tietyssä määrässä kypsiä punasoluja, voidaan myös käyttää 
analyysin tuloksena, kun eläimet saavat tutkittavaa ainetta jatkuvasti 
vähintään 4 viikon ajan.
 
Tämä nisäkkäiden  in vivo  -mikrotumatesti soveltuu erityisesti muta ­
geenisuuden vaaran arvioimiseen, sillä siinä voidaan ottaa huomioon tekijöitä, jotka liittyvät  in vivo  -metaboliaan, farmakokinetiikkaan ja 
DNA:n korjautumisprosesseihin, joskin näissä saattaa esiintyä eroja 
eri lajeilla, eri kudoksissa ja geneettisissä tuloksissa.  In vivo  -analyysi 
on hyödyllinen myös  in vitro  -koejärjestelmässä havaitun mutagee ­
nisen vaikutuksen jatkotutkimuksena.
 
Jos on saatu viitteitä siitä, että testattava aine, tai sen reaktiivinen 
metaboliitti, ei pääse kohdekudokseen, tätä testiä ei pidä käyttää.  
Ks. myös Yleisjohdanto, osa B.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 327
 
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Sentromeeri (kinetokori):  Kromosomin alue (alueita), joihin sukku ­
larihmat ovat kiinnittyneet solunjakautumisen aikana. Tähän perustuu tytärkromosomien järjestäytynyt siirtyminen tytärsolujen napoihin.
 
Mikrotumat:  Pieniä solun päätumasta erillisiä ja niiden rinnalla 
esiintyviä tumia, jotka muodostuvat mitoosin (meioosin) telofaasin aikana hitaasti liikkuvista (lagging) kromosomikappaleista tai koko ­
naisista kromosomeista.
 
Normokromaattinen punasolu:  Kypsä punasolu, josta puuttuvat 
ribosomit ja joka voidaan erottaa polykromaattisista punasolujen esi ­
asteista ribosomiselektiivisillä väriaineilla.  
Polykromaattinen punasolu:  Punasolun esiaste, kehityksen väliv ­
aiheessa oleva (epäkypsä) punasolu, jossa on edelleen ribosomeja 
ja joka voidaan tämän perusteella erottaa kypsistä, normokromaatti ­
sista punasoluista ribosomiselektiivisillä väriaineilla.  
1.3 TESTIN PERIAATE  
Eläimet altistetaan tutkittavalle aineelle sopivaa antotapaa käyttäen. 
Jos käytetään luuydintä, eläimet lopetetaan sopivan ajan kuluttua 
altistuksesta, luuydin poistetaan ja preparaatit valmistetaan ja värjä ­
tään (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Käytettäessä perifeeristä verta veri ­
näytteet otetaan sopivina ajankohtina altistuksen jälkeen, tehdään 
sivelyvalmisteet ja värjätään (4) (8) (9) (10). Perifeeristä verta käyt ­
tävissä tutkimuksissa viimeisen altistuksen ja solujen keräämisen vä ­
lisen ajan tulisi olla mahdollisimman lyhyt. Preparaatit analysoidaan mikrotumien toteamiseksi.
 
1.4 TESTIN KUVAUS  
1.4.1  Testin valmistelu  
1.4.1.1  Eläinlajin valinta  
Luuydintä käytettäessä hiiret tai rotat ovat suositeltavia koe-eläimiä, 
mutta myös muita soveltuvia nisäkäslajeja voidaan käyttää. Perifee ­
risestä verestä tehtävissä tutkimuksissa koe-eläimiksi suositellaan hii ­
riä. Koe-eläimenä voidaan kuitenkin käyttää mitä tahansa sopivaa nisäkäslajia, jonka perna ei poista mikrotumaisia punasoluja tai jonka on osoitettu olevan riittävän herkkä rakenteellisia tai numeerisia 
poikkeavuuksia aiheuttavien aineiden toteamiseen. Koe-eläinten on 
oltava yleisesti käytettyä laboratoriokantaa olevia nuoria terveitä eläi ­
miä. Tutkimuksen alkaessa eläinten painon vaihtelun on oltava mini ­
maalista, enintään ± 20 % kummankin sukupuolen keskipainosta.
 
1.4.1.2  Asuinolot ja ruokinta  
Yleiset olosuhteet ovat samat kuin osan B Yleisjohdannossa maini ­
tut, mutta kosteustavoitteen on oltava 50–60 %.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 328
 
1.4.1.3  Eläimen valmistelu  
Terveet nuoret aikuiset eläimet jaetaan satunnaistetusti koe- ja kont ­
rolliryhmiin. Eläimet tunnistetaan yksilöllisesti. Eläimiä sopeutetaan laboratorio-olosuhteisiin vähintään viiden päivän ajan. Häkit on si ­
joitettava siten, että häkin sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mah ­
dollisimman vähäisiä.
 
1.4.1.4  Annosten valmistelu  
Kiinteät tutkittavat aineet liuotetaan tai sekoitetaan sopiviin liuotti ­
miin tai kantaja-aineisiin ja laimennetaan tarvittaessa ennen kuin niitä 
annetaan koe-eläimille. Nestemäiset tutkittavat aineet voidaan antaa 
suoraan tai laimentaa ennen antamista. Tutkittava aine on valmistel ­
tava juuri ennen annostelua, paitsi jos sen säilyvyys on osoitettu stabiliteettitesteillä.
 
1.4.2  Koeolosuhteet  
1.4.2.1  Liuotin/kantaja-aine  
Liuottimella/kantaja-aineella ei saa olla myrkkyvaikutuksia käyte ­
tyillä annostasoilla, eikä sen käyttöön saa liittyä epäilyjä mahdolli ­
sista kemiallisista reaktioista tutkittavan aineen kanssa. Jos käytetään 
muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita, niiden käyttö 
on perusteltava niiden yhteensopivuuden osoittavilla tutkimustulok ­
silla. Ensisijaisesti on harkittava vesipitoisen liuottimen/kantaja-ai ­
neen käyttöä, mikäli mahdollista.  
1.4.2.2  Kontrollit  
Jokaiseen testiin on otettava mukaan kumpaakin sukupuolta olevat 
rinnakkaiset positiiviset ja negatiiviset (liuotin/kantaja-aine) kontrol ­
lit. Kontrolliryhmän eläimiä on käsiteltävä samalla tavoin kuin koe ­
ryhmän eläimiä, mutta niille ei anneta tutkittavaa ainetta.  
Positiivisten kontrollien tulisi aiheuttaa mikrotumia  in vivo - altistus­
tasoilla, joiden odotetaan aiheuttavan havaittavaa lisääntymistä taus ­
taan verrattuna. Positiivisten kontrolliaineiden annokset on valittava siten, että vaikutukset ovat selvät mutta eivät paljasta heti lukijalle koodattujen objektilasien identiteettiä. Positiivinen kontrolliaine voi ­
daan antaa eri reittiä pitkin kuin tutkittava aine ja näytteet voidaan 
ottaa vain kerran. Lisäksi positiivisina kontrolleina tulisi käyttää sa ­
maan kemiallisten aineiden ryhmän kuuluvia aineita, mikäli mahdol ­
lista. Esimerkkejä positiivisista kontrolliaineista:
 
Aine CAS-nro EINECS-nro  
Etyylimetaanisulfonaatti 62-50-0 200-536-7 
N-etyyli-N-nitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomysiini C 50-07-7 200-008-6 Syklofosfamidi 
Syklofosfamidimonohydraatti 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Trietyleenimelamiini 51-18-3 200-083-5
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 329
 
Negatiivisista kontrolleista, jotka ovat saaneet pelkkää liuotinta tai 
kantaja-ainetta ja joita muuten on käsitelty samalla tavoin kuin koe ­
ryhmiä, on otettava näytteet jokaisella näytteenottokerralla, paitsi jos aikaisemmat tutkimustulokset osoittavat, että eläinten väliset erot ja vaihtelut mikrotumia sisältävien solujen esiintymistaajuudessa ovat 
hyväksyttävällä tasolla. Jos negatiivisista kontrolleista otetaan vain 
yksi näyte, se tulisi ottaa ensimmäisellä näytteenottokerralla. Lisäksi on käytettävä käsittelemättömiä kontrolleja, paitsi jos aikaisemmat kontrolleista tehdyt tutkimukset ja julkaistut tulokset osoittavat, ettei 
valittu liuotin/kantaja-aine aiheuta haitallisia eikä mutageenisia vai ­
kutuksia.
 
Jos käytetään perifeeristä verta, rinnakkaiseksi negatiiviseksi kontrol ­
liksi voidaan hyväksyä myös ennen altistusta otettu näyte, mutta vain lyhytaikaisissa perifeerisestä verestä tehtävissä testeissä (esim. 1-3 
altistusta), mikäli saadut tulokset ovat aikaisempiin kontrollista saa ­
tuihin tutkimustuloksiin perustuvalla odotetulla alueella.
 
1.5 TESTIN SUORITTAMINEN  
1.5.1  Eläinten lukumäärä ja sukupuoli  
Jokaisessa koe- ja kontrolliryhmässä on oltava vähintään 5 analysoi ­
tavissa olevaa eläintä kumpaakin sukupuolta (11). Vain toista suku ­
puolta voidaan käyttää, mikäli tutkimusajankohtana on käytettävissä samalla eläinlajilla ja samaa antoreittiä käyttämällä tehtyjä tutkimuk ­
sia, joiden tulokset osoittavat, ettei myrkkyvaikutuksessa ole huomat ­
tavia eroja sukupuolten välillä. Jos ihmisen altistuminen tutkittavalle kemialliselle aineelle voi olla sukupuolesta riippuvaa, kuten joiden ­
kin lääkeaineiden kohdalla, testi on tehtävä asianomaista sukupuolta 
olevilla eläimillä.
 
1.5.2  Altistusohjelma  
Mitään standardia altistusohjelmaa (kuten 1, 2 tai useampia altistuk ­
sia 24 tunnin välein) ei voida suositella. Pitempien altistusohjelmien aikana kerätyt näytteet ovat hyväksyttäviä, mikäli positiivinen vaiku ­
tus on osoitettu tässä tutkimuksessa tai negatiivisessa tutkimuksessa 
on osoitettu myrkkyvaikutusta tai raja-annosta on käytetty ja annos ­
telua on jatkettu näytteenoton ajankohtaan asti. Tutkittavat aineet voidaan antaa myös jaettuina annoksina, eli kaksi altistuskertaa sa ­
mana päivänä muutaman tunnin välein, mikä helpottaa suurten aine ­
määrien antamista.
 
Testi voidaan tehdä kahdella tavalla:  
a) Eläimet altistetaan tutkittavalle aineelle yhden kerran. Luuydinnä ­
ytteitä otetaan vähintään kaksi kertaa siten, että ensimmäinen 
näyte otetaan aikaisintaan 24 tunnin kuluttua altistuksesta ja vii ­
meinen viimeistään 48 tunnin kuluttua altistuksesta ja näytteen ­
ottokertojen välillä on sopiva väli. Mikäli näytteitä otetaan aikai ­
semmin kuin 24 tunnin kuluttua, perustelut on esitettävä. Perifee ­
risestä verestä otetaan näytteitä vähintään kaksi kertaa siten, että 
ensimmäinen näyte otetaan aikaisintaan 36 tunnin kuluttua altis ­
tuksesta ja seuraavat sopivan ajan kuluttua siitä, kuitenkin vii ­
meistään 72 tunnin kuluttua altistuksesta. Mikäli positiivinen 
vaste havaitaan yhden näytteenottokerran jälkeen, lisänäytteitä ei 
tarvita.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 330
 
b) Jos päivittäisiä altistuskertoja on 2 tai enemmän (esim. kaksi tai 
useampia altistuksia 24 tunnin välein), näytteet on kerättävä luuy ­
timestä kerran 18-24 tunnin kuluttua viimeisestä altistuksesta ja perifeerisestä verestä kerran 36–48 tunnin kuluttua viimeisestä altistuksesta (12).
 
Tarvittaessa voidaan näytteitä ottaa muinakin ajankohtina.  
1.5.3  Annostasot  
Jos tehdään annoksenmääritystutkimus, koska soveltuvia tietoja ci 
ole käytettävissä, se on tehtävä samassa laboratoriossa käyttäen sa ­
maa lajia, samaa kantaa, samaa sukupuolta olevia eläimiä ja samaa altistusohjelmaa kuin päätutkimuksessa on tarkoitus käyttää (13). Mikäli myrkkyvaikutuksia esiintyy, ensimmäiseen näytteenottoajan ­
kohtaan asti käytetään kolmea annostasoa. Näistä suurimmalla an ­
noksella on oltava maksimaalinen myrkkyvaikutus ja pienimmällä vähäinen tai ei lainkaan myrkkyvaikutusta. Myöhemmän näytteen ­
ottoajankohdan edellä voidaan käyttää vain suurinta annosta. Suurin 
annos määritellään annokseksi, joka aiheuttaa sen kaltaisia myrkylli ­
syysoireita, että samaa annosteluohjelmaa käytettäessä suurempien annosten voitaisiin odottaa johtavan kuolemaan. Aineet, joilla on spesifisiä biologisia vaikutuksia pieninä, myrkyttöminä annoksina 
(kuten hormonit ja mitogeenit) saattavat edellyttää toisenlaisia annok ­
senmäärityskriteerejä, ja niitä pitäisi arvioida tapauskohtaisesti. Suu ­
rin annos voidaan määritellä myös annokseksi, joka aiheuttaa joitakin myrkyllisyyteen viittaavia muutoksia luuytimessä (esim. punasolujen 
esiasteiden osuuden pieneneminen punasolujen kokonaismäärästä 
luuytimessä tai perifeerisessä veressä).
 
1.5.4  Raja-annostesti  
Ellei havaittavia myrkkyvaikutuksia esiinny testattaessa yhtä annos ­
tasoa, joka on vähintään 2 000 mg/kg (eläimen painokiloa kohti) ja joka annetaan kerta-annoksena tai kahtena annoksena saman päivän 
aikana, ja ellei genotoksisuutta ole odotettavissa kemialliselta raken ­
teeltaan samanlaisilla aineilla saatujen tutkimustulosten perusteella, täydellinen tutkimus kolmella eri annostasolla ei ehkä ole välttämä ­
tön. Pitempään kestävissä tutkimuksissa raja-annos on 2 000 mg 
painokiloa kohti vuorokaudessa, jos altistusta jatketaan enintään 14 
vuorokautta, ja 1 000 mg/kg/vrk, jos altistus kestää yli 14 vuoro ­
kautta. Ihmisten odotettu altistus saattaa edellyttää suurempien an ­
nostasojen käyttöä raja-annostestissä.
 
1.5.5  Antotapa  
Tutkittava aine annetaan yleensä ruokintaletkulla tai sopivalla intu ­
baatiokanyylillä tai injektiona vatsaonteloon. Myös muut antotavat 
ovat mahdollisia, mikäli ne voidaan perustella. Koe-eläimen koosta riippuu, kuinka paljon nestettä voidaan antaa kerralla ruokintaletkun kautta tai injektiona. Määrä ei kuitenkaan saa olla yli 2 ml/100 g 
eläimen painon mukaan mitattuna. Mikäli käytetään suurempia nes ­
temääriä, ne on perusteltava. Lukuun ottamatta ärsyttäviä tai syövyt ­
täviä aineita, joiden vaikutukset yleensä pahenevat suurempia pitoi ­
suuksia käytettäessä, nestemäärien vaihtelu olisi pidettävä mahdolli ­
simman pienenä säätämällä tutkittavan aineen pitoisuuksia siten, että 
kokonaisnestemäärä pysyy samana kaikilla annostasoilla.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 331
 
1.5.6  Luuydin-/veripreparaatit  
Luuydinsolut kerätään yleensä reisiluista tai sääriluista heti koe-eläin ­
ten lopettamisen jälkeen. Solut otetaan reisi- tai sääriluista, niistä tehdään preparaatit ja ne värjätään vakiintuneilla värjäysmenetelmil ­
lä. Perifeerinen veri kerätään häntälaskimosta tai muusta sopivasta 
verisuonesta. Verisolut värjätään heti supravitaaliväreillä (8) (9) (10) tai niistä tehdään ensin sivelyvalmisteet ja värjätään sen jälkeen. DNA-spesifisten väriaineiden käyttö [esim. akridiinioranssi (14) tai 
Hoechst 33258 plus pyroniini-Y (15)] voi eliminoida joitakin ei- 
DNA-spesifisen väriaineen käyttöön liittyviä artefakteja. Tämä etu ei sulje pois tavanomaisten väriaineiden (esim. Giemsa) käyttöä. 
Myös muita järjestelmiä [esim. selluloosapylväitä tumallisten solujen 
poistamiseksi (16)] voidaan käyttää, mikäli nämä menetelmät on laboratoriossa osoitettu riittävän toimiviksi mikrotumapreparaattien valmistamisessa.
 
1.5.7  Analyysi  
Punasolujen esiasteiden osuus koko punasolumäärästä 
(esiasteet + kypsät punasolut) määritetään jokaisen eläimen osalta 
erikseen laskemalla yhteensä vähintään 200 punasolua luuytimestä 
ja 1 000 punasolua perifeerisestä verestä (17). Kaikki objektilasit, myös ne, joilla on positiiviset ja negatiiviset kontrollit, on koodattava toisistaan riippumattomasti ennen mikroskooppitutkimusta. Vähin ­
tään 2 000 punasolun esiastetta lasketaan eläintä kohti mikrotumais ­
ten punasolujen esiasteiden esiintymistiheyden määrittämistä varten. Lisätietoja voidaan saada laskemalla mikrotumat kypsistä punasoluis ­
ta. Objektilaseja analysoitaessa punasolujen esiasteiden osuuden pu ­
nasolujen kokonaismäärästä tulisi olla vähintään 20 % kontrolliarvos ­
ta. Kun koe-eläimille annetaan tutkittavaa ainetta jatkuvasti 4 viikon ajan tai pitempään, voidaan laskea myös vähintään 2 000 kypsää punasolua eläintä kohti mikrotumien esiintymistiheyden toteamiseksi. 
Automaattiset analyysijärjestelmät (kuva-analyysi ja solususpensioi ­
den virtaussytometria) ovat hyväksyttäviä vaihtoehtoja manuaaliselle arvioinnille, mikäli ne perustellaan ja validoidaan asianmukaisesti.
 
2. TULOKSET  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Yksittäisten eläinten tulokset on esitettävä taulukkomuodossa. Ko ­
keellinen yksikkö on eläin. Punasolujen esiasteiden laskettu määrä, 
mikrotumaisten punasolujen esiasteiden lukumäärä ja punasolujen 
esiasteiden osuus koko punasolumäärästä on lueteltava kunkin ana ­
lysoidun eläimen osalta erikseen. Mikäli eläimille annetaan tutkitta ­
vaa ainetta jatkuvasti 4 viikon ajan tai pitempään, myös kypsien 
punasolujen tiedot on ilmoitettava, mikäli niitä on kerätty. Punaso ­
lujen esiasteiden osuus koko punasolumäärästä ja, jos katsotaan ai ­
heelliseksi, mikrotumaisten punasolujen prosentuaalinen määrä ilmoi ­
tetaan jokaisen eläimen osalta. Ellei viitteitä sukupuolten välisistä 
vaste-eroista ole havaittavissa, molempien sukupuolten tiedot voi ­
daan yhdistää tilastollista analyysiä tehtäessä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 332
 
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI JA TULKINTA  
Positiivisille tuloksille on useita kriteerejä, kuten mikrotumaisten so ­
lujen lukumäärän annoksesta riippuva suureneminen tai mikrotumais ­
ten solujen lukumäärän selvä suureneminen yksittäisessä annosryh ­
mässä yhdellä näytteenottokerralla. Tulosten biologinen merkitys on 
otettava ensisijaisesti huomioon. Tilastollisia menetelmiä voidaan käyttää apuna testitulosten arvioinnissa (18) (19). Tilastollinen mer ­
kitsevyys ei saa olla ainoa määräävä tekijä positiivisen vasteen arvi ­
oinnissa. Epäselviä tuloksia on selkeytettävä jatkotestauksella, mie ­
luiten muunnetuissa koeolosuhteissa.
 
Testattava aine, jolla saadut tulokset eivät täytä edellä kuvattuja 
kriteerejä, katsotaan ei-mutageeniseksi tässä testissä.  
Useimmissa testeissä saadaan selvästi positiivisia tai negatiivisia tu ­
loksia, mutta joissakin harvinaisissa tapauksissa saatujen tietojen pohjalta ei voida tehdä varmoja päätelmiä tutkittavan aineen vaiku ­
tuksesta. Tulokset saattavat jäädä epäselviksi tai kyseenalaisiksi ko ­
keen toistokertojen määrästä riippumatta.
 
Mikrotumatestissä saadut positiiviset tulokset osoittavat, että tutkit ­
tava aine aiheuttaa mikrotumia, jotka ovat seurausta kromosomivau ­
riosta tai mitoosilaitteen vauriosta testatun lajin punasoluissa. Nega ­
tiiviset tulokset osoittavat, ettei tutkittava aine aiheuta koeolosuh ­
teissa mikrotumia testattujen lajien punasolujen esiasteissa.  
Tutkittavan aineen tai sen metaboliittien todennäköistä pääsyä ylei ­
seen verenkiertoon tai erityisesti kohdekudokseen (esim. systeeminen toksisuus) on pohdittava.
 
3. RAPORTOINTI  
TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on sisällettävä seuraavat tiedot:  
Liuotin/kantaja-aine:  
— kantaja-aineen valintaperusteet,  
— tutkittavan aineen liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja- 
aineessa, jos tiedossa.  
Koe-eläimet:  
— käytetty eläinlaji/kanta,  
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli,  
— hankintapaikka, asuinolosuhteet, ruokavalio jne.,  
— eläinten yksilöllinen paino testiä aloitettaessa, myös painon vaih ­
teluväli, keskiarvo ja keskihajonta kussakin ryhmässä.  
Koeolosuhteet:  
— positiivisia ja negatiivisia (kantaja-aine/liuotin) kontrolleja koske ­
vat tiedot,  
— raja-annostutkimuksen tulokset, jos tehty,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 333
 
— annostasojen valintaperusteet,  
— tutkittavan aineen valmistelujen yksityiskohdat,  
— tutkittavan aineen antotavan yksityiskohdat,  
— antotavan valintaperusteet,  
— menetelmät, joilla on vahvistettu tutkittavan aineen pääsy ylei ­
seen verenkiertoon tai kohdekudokseen, tarvittaessa,  
— ravintoon/juomaveteen sekoitetun tutkittavan aineen pitoisuuden 
(ppm) muuntaminen todelliseksi annokseksi (mg painokiloa kohti 
vuorokaudessa, mg/kg/vrk), tarvittaessa,  
— yksityiskohtaiset tiedot ravinnon ja veden laadusta,  
— yksityiskohtainen kuvaus altistus- ja näytteenotto-ohjelmasta,  
— objektilasien valmistusmenetelmät,  
— myrkkyvaikutuksen mittausmenetelmät,  
— mikrotumaisten punasolujen esiasteiden laskentakriteerit,  
— analysoitujen solujen lukumäärä eläintä kohti,  
— kriteerit, joiden perustella tutkimukset luokiteltiin positiivisiksi, 
negatiivisiksi tai epäselviksi.  
Tulokset:  
— myrkkyvaikutuksen merkit,  
— punasolujen esiasteiden osuus punasolujen kokonaismäärästä,  
— mikrotumaisten punasolujen esiasteiden lukumäärä, ilmoitetaan 
erikseen jokaisesta eläimestä,  
— mikrotumaisten punasolujen esiasteiden keskiarvo ± keskihajonta 
ryhmää kohti,  
— annos-vastesuhde, mikäli mahdollista,  
— käytetyt tilastolliset analyysit ja menetelmät,  
— samanaikaiset ja aikaisemmat negatiivisilla kontrolleilla saadut 
tulokset,  
— rinnakkaisen positiivisen kontrollin tiedot.  
Tulosten pohdinta.  
Johtopäätökset.  
4. KIRJALLISUUTTA  
(1) Heddle, J.A. (1973), A Rapid  In Vivo  Test for Chromosomal 
Damage,  Mutation Res.,  18, s. 187–190.  
(2) Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test,  Mutation Res.,  31, 
s. 9–15.  
(3) Heddle, J.A., Salamonc, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavo ­
urnin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983), The 
Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity,  Muta­
tion Res.  123, s. 61–118.  
(4) Mavournin, K. H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, 
M.F. and Heddle, J.A. (1990), The  In Vivo  Micronucleus As ­
say in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A 
report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene- 
Tox Program,  Mutation Res.,  239, s. 29–80.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 334
 
(5) MacGregor, J.T., Schlegel, R., Choy, W.N. and Wehr, C.M. 
(1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid 
Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in:  Developments in Science and Practice 
of Toxicology,  ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, 
Elsevier, Amsterdam, s. 555–558.
 
(6) MacGregor, J.T., Heddle, J.A., Hite, M., Margolin, G.H., Ra ­
mel, C., Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D. (1987), 
Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mam ­
malian Bone Marrow Erythrocytes,  Mutation Res.,  189, 
s. 103–112.  
(7) MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R. and Shelby, M.E. 
(1990), The  in vivo  Erythrocyte Micronucleus Test: Measure ­
ment at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies,  Fund. Appl. Toxicol.  14, 
s. 513–522.
 
(8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, 
M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral 
Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides,  
Mutation Res.,  245, s. 245–249.  
(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(1992), Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Eryth ­
rocytes by Acridime Orange Supravital Staining: The Summary 
Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS,  Mutation Res.,  278, s. 83–98.
 
(10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study 
Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) 
(1995), Protocol recommended for the short-term mouse perip ­
heral blood micronucleus test,  Mutagenesis,  10, s. 53–159.  
(11) Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blac ­
key, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr.F.B., Pacchicrotti, 
F., Romagna, F., Shimada, H. Sutou, S. and Vannier, B. 
(1994),  In Vivo  Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay,  Mu­
tation Res.,  312, s. 293–304.  
(12) Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995). An optimal, generalized 
sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse 
peripheral micronucleus test,  Mutagenesis,  10, s. 313–319.  
(13) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Wor ­
king Group: Dose Setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays,  
Mutagenesis, 7,  s. 313–319.
 
(14) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An App ­
lication of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micro ­
nucleus Test,  Mutation Res.,  120, s. 241–247.  
(15) MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G. (1983), A 
Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and 
RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y,  
Mutation Res.,  120, s. 269–275.  
(16) Romagna, F. and Staniforth, C.D. (1989), The automated bone 
marrow micronucleus test,  Mutation Res.,  213, s. 91–104.  
(17) Gollapudi, B. and McFadden, L.G. (1995), Sample size for the 
estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ra ­
tio in the bone marrow micronucleus test,  Mutation Res.,  347, 
s. 97–99.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 335
 
(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, 
D.G. and Henderson, L. (1990),  In Vivo  Cytogenetics Assay, 
in: D.J. Kirkland (ed.),  Basic Mutagenicity tests, UKEMS Re ­
commended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guid ­
elines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised,  Camb­
ridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, 
Melbourne, Sydney, s. 115–141.  
(19) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., 
Clare, G., Ferguson R., Richold, M., Papworth, D.G. and Sa ­
vage, J.R.K. (1989), Statistical Analysis of  In Vivo  Cytogenetic 
Assays, in: D.J. Kirkland (ed.),  Statistical Evaluation of Muta ­
genicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for 
Mutagenicity Testing. Report, Part III,  Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Syd ­
ney, s. 184–232.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 336
 
B.13/14.  MUTAGEENISUUS — TAKAISINMUTAATIOTESTI 
BAKTEEREILLA  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä on sama kuin OECD TG 471 Bacterial Reverse 
Mutation Test (1997).  
1.1 JOHDANTO  
Bakteereilla tehtävässä takaisinmutaatiotestissä käytetään  Salmonella 
typhimurium-  ja Escherichia coli  -bakteereiden aminohappoja vaa ­
tivia kantoja sellaisten pistemutaatioiden havaitsemiseksi, joihin liit ­
tyy DNA:n yhden tai useamman emäsparin korvautuminen, ylimäärä tai deleetio (1) (2) (3). Tämän bakteereilla tehtävän takaisinmutaa ­
tiotestin periaate on, että se paljastaa mutaatiot, jotka korjaavat tes ­
tikannassa olevat mutaatiot ja palauttavat bakteerien toiminnallisen 
kyvyn syntetisoida essentiaalista aminohappoa. Revertantit bakteerit tunnistetaan siitä, että ne pystyvät kasvamaan, vaikka testibaktee ­
rikannan ennen takaisinmutaatiota tarvitsema aminohappo puuttuu.
 
Pistemutaatiot aiheuttavat monia ihmisen geneettisiä sairauksia, ja on 
saatu vakuuttavia todisteita siitä, että somaattisten solujen onkogee ­
neissä ja kasvunrajoitegeeneissä olevat pistemutaatiot ovat osallisina 
ihmisten ja koe-eläinten kasvainten muodostumisessa. Bakteereilla 
tehtävä takaisinmutaatiotesti on nopea, edullinen ja suhteellisen hel ­
posti toteutettava testi. Monilla testikannoilla on useita ominaisuuk ­
sia, joiden ansiosta ne osoittavat herkästi mutaatiot. Näitä ovat esi ­
merkiksi herkästi reagoivat DNA-jaksot takaisinmutaatiokohdissa, 
solujen lisääntynyt läpäisevyys suurille molekyyleille ja DNA:n kor ­
jausjärjestelmien eliminoituminen tai virheille alttiiden DNA:n kor ­
jausprosessien lisääntyminen. Testikantojen spesifisyys voi tuottaa 
hyödyllistä tietoa genotoksisten aineiden aiheuttamien mutaatioiden 
tyypistä. Käytettävissä on hyvin laaja tietokanta bakteerien takaisin ­
mutaatiotestien tuloksista erittäin monissa rakenteissa, ja vakiintu ­
neita menetelmiä on kehitetty fysikaalis-kemiallisilta ominaisuuksil ­
taan erilaisten kemiallisten aineiden, myös haihtuvien yhdisteiden, 
testaamista varten.  
Ks. myös yleisjohdanto, osa B.  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Takaisinmutaatiotesti  joko  Salmonella typhimurium-  tai Escheri­
chia coli  -bakteereilla osoittaa aminohappoa vaativassa kannassa 
(edellisessä histidiini ja jälkimmäisessä tryptofaani) mutaation, jonka 
seurauksena syntyy ulkopuolisesta aminohapon saannista riippuma ­
ton kanta.  
Emäsparin korvautumista aiheuttavat mutageenit  ovat aineita, 
jotka aiheuttavat emäksen vaihtumisen DNA:ssa. Takaisinmutaatio ­
testissä tämä vaihtuminen saattaa tapahtua alkuperäisen mutaation kohdassa tai jossakin muussa bakteerigenomin kohdassa.
 
Lukukehyksensiirtomutageenit  ovat aineita, jotka aiheuttavat yh ­
den tai useamman emäsparin ylimäärän tai vajauksen DNA:ssa, 
mikä muuttaa lukukehystä (reading frame) RNA:ssa.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 337
 
1.3 ALUSTAVAT VALMISTELUT  
Bakteereilla tehtävässä takaisinmutaatiotestissä käytetään prokaryoot ­
tisoluja, jotka poikkeavat nisäkässoluista soluunoton, metabolian, kromosomirakenteen ja DNA:n korjautumisprosessien suhteen.  In 
vitro  -testit vaativat yleensä eksogeenista metabolista aktivaatiojärjes ­
telmää.  In vitro  -metaboliset aktivaatiojärjestelmät eivät pysty täysin 
jäljittelemään nisäkässolujen  in vivo  -olosuhteita. Testistä ei sen 
vuoksi voida suoraan päätellä aineen mutageenisuutta ja karsinogee ­
nisuutta nisäkkäillä.
 
Bakteereilla tehtävää takaisinmutaatiotestiä käytetään yleisesti geno ­
toksisuuden, ja varsinkin pistemutaatioita aiheuttavan vaikutuksen, 
alustavana seulontamenetelmänä. Laaja tietokanta on osoittanut, että monilla kemiallisilla aineilla, joilla saadaan positiivinen tulos tässä tutkimuksessa, todetaan mutageenista vaikutusta myös muissa 
tutkimuksissa. On myös esimerkkejä mutageenisista aineista, joita ei 
voida todeta tällä testillä. Nämä epäonnistumiset voivat johtua tode ­
tun tulostapahtuman spesifisestä luonteesta, metabolisen aktivaation eroista tai aineen erilaisesta biologisesta hyödynnettävyydestä. Toi ­
saalta takaisinmutaatiotestin herkkyyttä lisäävät tekijät voivat johtaa 
mutageenisen aktiivisuuden liialliseen stimulaatioon.
 
Bakteereilla tehtävä takaisinmutaatiotesti ei välttämättä sovellu tiet ­
tyjen kemiallisten aineryhmien testaamiseen. Tällaisia ovat esimer ­
kiksi voimakkaasti bakterisidiset yhdisteet (esim. tietyt antibiootit) ja aineet, joiden arvellaan (tai tiedetään) vaikuttavan erityisesti nisäkäs ­
solun kahdentumisjärjestelmään (esim. jotkut topoisomeraasin estäjät 
ja jotkut nukleosidianalogit). Nisäkkäillä tehtävät mutaatiotestit saat ­
tavat soveltua paremmin näihin tapauksiin.
 
Vaikka monet tässä testissä positiivisen tuloksen antavat kemialliset 
aineet ovat karsinogeenisia nisäkkäillä, korrelaatio ei ole ehdoton. Se riippuu aineryhmän kemiallisista ominaisuuksista, eikä kaikkia kar ­
sinogeeneja voida todeta tällä testillä, koska ne vaikuttavat muiden, 
ei-genotoksisten mekanismien tai bakteerisoluista puuttuvien meka ­
nismien välityksellä.
 
1.4 TESTIN PERIAATE  
Bakteerisolususpensiot altistetaan tutkittavalle aineelle eksogeenisen 
metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa tai ilman sitä. Mal ­
jainkorporoitumismenetelmässä nämä suspensiot sekoitetaan over ­
lay-agariin ja levitetään heti minimaalisen kasvualustan pinnalle. 
Preinkubaatiomenetelmässä tutkittavaa ainetta sisältävää seosta inku ­
boidaan, minkä jälkeen se sekoitetaan overlay-agariin ennen kuin se 
levitetään minimaalisen kasvualustan pinnalle. Molemmissa menetel ­
missä revertantit pesäkkeet lasketaan 2–3 päivän inkubaatioajan jäl ­
keen ja niiden määrää verrataan spontaanien revertanttien pesäkkei ­
den määrään pelkkää liuotinta sisältävissä kontrollimaljoissa.  
Takaisinmutaatiotesti bakteereilla voidaan tehdä useilla eri menetel ­
millä. Yleisesti käytettyjä ovat maljainkorpo-roitumismenetelmä (1) (2) (3) (4), preinkubaatiomenetelmä (2) (3) (5) (6) (7) (8), fluktuaa ­
tiomenetelmä (9) (10) ja suspensiomenetelmä (11). Kaasujen ja höy ­
ryjen testaamiseen käytettäviä muunnelmia on myös kuvattu (12).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 338
 
Tässä menetelmässä kuvataan pääasiassa maljainkorporoitumis- ja 
preinkubaatiomenetelmiä. Niillä molemmilla voidaan tehdä kokeita 
sekä metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa että ilman sitä. Jotkut aineet voidaan havaita tehokkaammin preinkubaatiomenetel ­
mällä. Nämä kuuluvat sellaisiin kemiallisten aineiden ryhmiin, joihin 
kuuluu lyhytketjuisia alifaattisia nitrosoamiineja, kaksiarvoisia metal ­
leja, aldehydejä, atsovärejä ja diatsoyhdisteitä, pyrollitsidiinialkaloi ­
deja, allyyliyhdisteitä ja nitroyhdisteitä (3). On todettu myös, että tiettyjä mutageeniryhmiä ei pystytä aina toteamaan standardeilla me ­
netelmillä, kuten maljainkorporoitumis- tai preinkubaatiomenetelmäl ­
lä. Näitä on pidettävä erikoistapauksina, ja niiden toteamiseen tulisi ehdottomasti käyttää vaihtoehtoisia menetelmiä. Seuraavat erikoista ­
paukset on voitu tunnistaa (sekä esimerkkejä toimenpiteistä, joita 
voidaan käyttää niiden toteamisessa): atsovärit ja diatsoyhdisteet 
(3) (5) (6) (13), kaasut ja haihtuvat kemialliset aineet (12) (14) (15) (16) ja glykosidit (17) (18). Poikkeaminen standardista mene ­
telmästä on perusteltava tieteellisesti.
 
1.5 TESTIN KUVAUS  
1.5.1  Testin valmistelu  
1.5.1.1  Bakteerit  
Tuoreita bakteeriviljelmiä on kasvatettava myöhäiseen eksponentiaa ­
liseen tai varhaiseen stationääriseen kasvuaiheeseen (noin 10  9 solua/­
ml). Myöhäisessä stationäärivaiheessa olevia viljelmiä ei pidä käyt ­
tää. Oleellista on, että kokeessa käytettävät viljelmät sisältävät elin ­
kykyisiä soluja suurina tittereinä. Titteri voidaan osoittaa joko aikai ­
semmissa kontrollitutkimuksissa saatujen kasvukäyrien perusteella tai 
määrittämällä jokaisessa analyysissä elinkykyisten solujen lukumää ­
rät maljakokeella.  
Suositeltu inkubaatiolämpötila on 37  o C. 
On käytettävä vähintään viittä bakteerikantaa. Näihin tulee sisältyä 
neljä  S. typhimurium  -kantaa (TA 1535; TA 1537 tai TA97a tai 
TA97; TA98; ja TA100), joiden on osoitettu olevan luotettavia ja 
joilla on saatu toistettavissa oleva vaste eri laboratorioissa. Näissä 
neljässä  S. typhimurium  -kannassa on GC-emäsparit primaarisessa 
takaisinmutaatiokohdassa, ja tiedetään, että ne eivät ehkä paljasta tiettyjä hapettavia mutageeneja, ristisidoksia muodostavia aineita ei ­
vätkä hydratsiineja. Tällaiset aineet voidaan todeta  E. coli  WP2 -kan ­
noilla tai  S. typhimurium  TA 102 -kannalla (19), joissa on AT-emäs ­
pari primaarisessa takaisinmutaatiokohdassa. Suositeltava kantojen yhdistelmä on tämän vuoksi:
 
— S. typhimurium  TA 1535, ja  
— S. typhimurium  TA 1537 tai TA97 tai TA97a, ja  
— S. typhimurium  TA98, ja  
— S.  typhimurium  TA100, ja  
— E. coli  WP2 uvrA tai  E. coli  WP2 uvrA (pKM101) tai  S. typhi­
murium  TA102.  
Ristisidoksia muodostavien mutageenien toteamiseksi mukaan tulisi 
ehkä käyttää TA102-kantaa tai käyttää lisäksi DNA:n korjautumiseen 
kykenevää  E. coli  -kantaa (esim.  E. coli  WP2 tai  E. coli  WP2 
(pKM101)).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 339
 
Varastoviljelmien valmistuksessa, markkerien vahvistamisessa ja säi ­
lytyksessä on käytettävä vakiintuneita menetelmiä. Kasvuun vaadit ­
tavien aminohappojen tarve on osoitettava kunkin jäädytetyn varas ­
toviljelmäpreparaatin osalta erikseen  (S. typhimurium  -kannoilla his ­
tidiini ja  E. coli  -kannoilla tryptofaani). Muut fenotyyppiset ominai ­
suudet on tarkistettava vastaavasti. Niitä ovat: R-tekijäplasmidien 
esiintyminen tai puuttuminen, mikäli sillä on merkitystä (ampisillii ­
niresistenssi kannoissa TA98, TA100 ja TA97a tai TA97, WP2 uvrA ja WP2 uvrA (pKM101) ja ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenssi 
kannassa TA102); tyypillisten mutaatioiden esiintyminen (kristalli ­
violettiherkkyyden aiheuttama rfa-mutaatio  S. typhimurium  -baktee­
rissa ja ultraviolettivaloherkkyyden aiheuttama uvrA-mutaatio  E. coli  
-bakteerissa tai uvrB-mutaatio  S. typhimurium  -bakteerissa) (2) (3). 
Kantojen tuottamien spontaanien revertanttien pesäkkeiden määrän 
tulisi myös olla laboratoriokohtaisten vertailuarvojen esiintymistihe ­
ysalueella ja mieluiten kirjallisuudessa raportoidulla alueella.
 
1.5.1.2  Kasvatusväliaine  
Käytetään sopivaa minimaalista agaria (sisältää esim. Vogel-Bonner 
minimal medium E:tä ja glukoosia) ja ”overlay”-agaria. joka sisältää histidiiniä ja biotiinia tai tryptofaania, jotta muutama solunjakautu ­
minen voi tapahtua (1) (2) (9).
 
1.5.1.3  Metabolinen aktivaatio  
Bakteerit on altistettava tutkittavalle aineelle sekä sopivan metaboli ­
sen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa että ilman sitä. Yleisimmin 
käytetty aktivaatiojärjestelmä on entsyymejä indusoivilla aineilla, ku ­
ten Aroclor 1254:11ä (1) (2) tai fenobarbitonin ja ß-naftoflavonin (18) (20) (21) yhdistelmällä, käsiteltyjen jyrsijöiden maksasta eris ­
tetty postmitokondriaalinen jae (S9), johon on lisätty kofaktoria. 
Käytetty postmitokondriaalisen jakeen pitoisuus S9-seoksessa on yleensä 5–30 % v/v. Metabolisen aktivaatiojärjestelmän valinta tai sen pois jättäminen saattaa riippua siitä, millaiseen kemiallisten ai ­
neiden ryhmään tutkittava aine kuuluu. joissakin tapauksissa saattaa 
olla perusteltua käyttää useampia kuin yhtä postmitokondriaalisen jakeen pitoisuutta. Pelkistävä metabolinen aktivaatiojärjestelmä saattaa soveltua paremmin atsovärien ja diatsoyhdisteiden tutkimi ­
seen (6) (13).
 
1.5.1.4  Tutkittava aine/valmistelu  
Kiinteät tutkittavat aineet liuotetaan tai sekoitetaan sopiviin liuotti ­
miin tai kantaja-aineisiin ja laimennetaan tarvittaessa ennen baktee ­
rien altistamista. Nestemäiset tutkittavat aineet voidaan lisätä suoraan koejärjestelmään ja/tai laimentaa ennen käsittelyä. Tutkittava aine on valmisteltava juuri ennen altistusta, paitsi jos säilyvyys on osoitettu 
stabiliteettitutkimuksilla.
 
Liuotin/kantaja-aine ei saa olla sellainen, että sen voidaan epäillä 
reagoivan kemiallisesti tutkittavan aineen kanssa, eikä se saa vaikutta 
solujen elinkykyyn eikä S9-aktiivisuuteen (22). Jos käytetään muita 
kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita, niiden yhteensopi ­
vuuden osoittavat tutkimustulokset on esitettävä. Vesipitoisen liuottimen/kantaja-aineen käyttöä tulisi harkita ensisijaisesti aina, 
kun se on mahdollista. Testattaessa aineita, jotka ovat epästabiileja 
vedessä, orgaanisten liuottimien tulisi olla vedettömiä.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 340
 
1.5.2  Koeolosuhteet  
1.5.2.1  Testikannat (ks. 1.5.1.1)  
1.5.2.2  Altistuspitoisuus  
Tutkittavan aineen suurinta testattavaa pitoisuutta määritettäessä on 
otettava huomioon aineen sytotoksisuus ja liukoisuus altistuksessa 
käytettävään lopulliseen seokseen.  
Myrkkyvaikutus ja liukenemattomuus saattaa olla hyödyllistä mää ­
rittää alustavalla kokeella. Sytotoksisuus voidaan havaita revertant ­
tien pesäkkeiden lukumäärän pienenemisestä, taustakasvuston kirkas ­
tumisesta tai vähenemisestä tai solujen eloonjäämisasteesta käsitel ­
lyissä viljelmissä. Aineen sytotoksisuus saattaa muuttua metabolisten 
aktivaatiojärjestelmien läsnäollessa. Liukenemattomuus on arvioitava lopullisen seoksen paljaalla silmällä havaittavan sakkautumisen pe ­
rusteella todellisissa koeolosuhteissa.
 
Liukoisten, ei-sytotoksisten aineiden suositeltu testattava maksimipi ­
toisuus on 5 mg/malja tai 5 ul/malia. Testattaessa ei-sytotoksisia 
aineita, jotka eivät ole liukoisia pitoisuuksissa 5 mg/malja tai 5 μl/­
malja. yhden tai useamman testattavan pitoisuuden on oltava liuke ­
nemattomia lopullisessa altistusseoksessa. Jos tutkittava aine on sy ­
totoksinen jo pienempinä pitoisuuksina kuin 5 mg/malja tai 5 μl/­
malja, se olisi testattava sytotoksiseen pitoisuuteen asti. Sakka ei 
saisi vaikuttaa laskentaan.  
Alustavassa kokeessa on käytettävä ainakin viittä erisuuruista tutkit ­
tavan aineen analysoitavissa olevaa pitoisuutta siten, että testauspis ­
teiden välillä on noin puolen log:n ( √10) väli. Pitoisuus-vastesuhdetta 
tutkittaessa voi olla syytä käyttää pienempiä välejä. Arvioitaessa 
aineita, jotka sisältävät huomattavia määriä mahdollisia mutageenisia 
epäpuhtauksia, voidaan harkita testaamista myös suuremmilla pitoi ­
suuksilla kuin 5 mg/malja tai 5 μl/malja.  
1.5.2.3  Negatiiviset ja positiiviset kontrollit  
Jokaisessa testissä on käytettävä myös kannan suhteen spesifisiä rin ­
nakkaisia positiivisia ja negatiivisia (liuotin tai kantaja-aine) kontrol ­
leja sekä metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa että ilman 
sitä. Positiivisen kontrolliaineen pitoisuudet on valittava siten, että ne 
tuovat esiin kunkin testin tehokkuuden.  
Testeissä, joissa käytetään metabolista aktivaatiojärjestelmää, positii ­
vinen (positiiviset) kontrolliaine(et) on valittava käytettävien baktee ­
rikantojen tyypin perusteella.  
Seuraavassa on esimerkkejä sopivista positiivisista kontrolliaineista 
testeissä, joissa käytetään metabolista aktivaatiota:  
Aine CAS-nro EINECS-nro  
9,10-dimetyyliantraseeni 781-43-1 212-308-4 
7,12-dimetyylibents[a]antraseeni 57-97-6 200-359-5 
bentso[a]pyreeni 50-32-8 200-028-5 
2-aminoantraseeni 613-13-8 210-330-9  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 341
 
Aine CAS-nro EINECS-nro  
syklofosfamidi 50-18-0 
syklofosfamidimonohydraatti 6055-19-2 200-015-4  
Seuraava aine sopii positiiviseksi kontrollialueeksi pelkistävää meta ­
bolista aktivaatiota käytettäessä:  
Aine CAS-nro EINECS-nro  
Congo Red 573-58-0 209-358-4  
2-aminoantraseenia ei pidä käyttää ainoana S9-seoksen tehon indik ­
aattorina. Jos 2-aminoantraseenia käytetään, jokainen S9-erä on ka ­
rakterisoitava myös mutageenilla, joka vaatii mikrosomaalisiin ent ­
syymeihin perustuvaa metabolista aktivaatiota, esim. bentso[a]pyree ­
nilla, dimetyylibentsantraseenilla.  
Seuraavat aineet ovat esimerkkejä kannan suhteen spesifisistä positii ­
visista kontrolleista, joita voidaan käyttää ilman eksogeenista meta ­
bolista aktivaatiojärjestelmää tehtävissä testeissä:  
Aine CAS-nro EINECS-nro Kanta  
natriumatsidi 26628-22-8 247-852-1 TA 1535 ja TA 100 
2-nitrofluoreeni 607-57-8 210-138-5 TA 98 
9-aminoakridiini 90-45-9 201-995-6 TA 1537, TA 97 ja TA 97a 
ICR 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 ja TA 97a 
kumeenihydrope ­
roksidi 80-15-9 201-254-7 TA 102 
mitomysiini C 50-07-7 200-008-6 WP2uvrA ja TA 102 
N-etyyli-N-nitro- 
N-nitrosoguani ­
diini 70-25-7 200-730-1 WP2, WP2uvrA ja WP2uv ­
rA(pKM101) 
4-nitrokinoliini-l- 
oksidi 56-57-5 200-281-1 WP2, WP2uvrA ja WP2uv ­
rA(pKM101) 
furyylifuramidi 
(AF2) 3688-53-7 plasmidin sisältävät kannat  
Myös muita soveltuvia positiivisia kontrolleja voidaan käyttää. Sa ­
maan kemiallisten aineiden ryhmään kuuluvien positiivisten kontrol ­
lien käyttöä on harkittava, mikäli niitä on käytettävissä.  
Lisäksi on käytettävä pelkkää liuotinta tai kantaja-ainetta negatii ­
visina kontrolleina, jotka eivät sisällä tutkittavaa ainetta mutta joita muutoin käsitellään samalla tavoin. Lisäksi on käytettävä käsittele ­
mättömiä kontrolleja, paitsi jos kontrolleista saadut aikaisemmat tut ­
kimustulokset osoittavat, ettei valittu liuotin aiheuta haitallisia eikä 
mutageenisia vaikutuksia.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 342
 
1.5.3  Testin suorittaminen  
Maljainkorporoitumismenetelmässä (1) (2) (3) (4), jossa ei käytetä 
metabolista aktivaatiota, 0,05 ml tai 0,1 ml tutkittavia liuoksia, 0,1 ml tuoretta bakteeriviljelmää (noin 10
 8 elinkykyistä solua) ja 0,5 ml 
steriiliä puskuria sekoitetaan 2 ml:aan ”overlay”-agaria. Metabolista 
aktivaatiojärjestelmää käytettäessä 0,5 ml metabolista aktivaatioseos ­
ta. jossa on riittävä määrä postmitokondriaalista jaetta (pitoisuus 5–30 % v/v metabolisessa aktivaatioseoksessa), sekoitetaan ”overla ­
y”-agariin (2,0 ml) yhdessä bakteerien ja tutkittavan aineen/ ­
tutkittavan liuoksen kanssa. Jokaisen koeputken sisältö sekoitetaan ja kaadetaan minimaalisen agarmaljan pinnalle. ”Overlay”-agarin an ­
netaan jähmettyä ennen inkubaatiota.
 
Preinkubaatiomenetelmässä (2) (3) (5) (6) tutkittavaa ainetta/ ­
tutkittavaa liuosta esi-inkuboidaan testikannan (noin 10  8 elinkykyistä 
solua) ja steriilin puskurin tai metabolisen aktivaatiojärjestelmän (0,5 ml) kanssa yleensä vähintään 20 minuuttia 30–37
 o C:ssa, ennen kuin 
se sekoitetaan ”overlay”-agariin ja kaadetaan minimaalisen agarmal ­
jan pinnalle. Yleensä 0,05 tai 0,1 ml tutkittavaa ainetta/tutkittavaa liuosta, 0,1 ml bakteereja ja 0,5 ml S9-seosta tai steriiliä puskuria sekoitetaan 2,0 ml:aan ”overlay”-agaria. Koeputket tulisi ilmata 
preinkubaation aikana sekoittajaa käyttäen.
 
Riittävän arvion tekemiseksi hajonnasta on käytettävä kolmea rinnak ­
kaista maljaa kullakin annostasolla. Kaksoismaljauksen käyttö on mahdollista, mikäli se voidaan perustella tieteellisesti. Satunnainen maljan menetys ei välttämättä mitätöi analyysiä.
 
Kaasumaisia tai haihtuvia aineita tulisi testata asianmukaisin mene ­
telmin, esimerkiksi suljetuissa astioissa (12) (14) (15) (16).  
1.5.4  Inkubaatio  
Kaikkia tiettyyn testiin kuuluvia maljoja on inkuboitava 37  o C:ssa 
48–72 tunnin ajan. Inkubaatioajan jälkeen lasketaan revertanttien pesäkkeiden lukumäärä maljaa kohti.
 
2. TULOKSET  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Tulokset on ilmoitettava revertanttien pesäkkeiden lukumääränä mal ­
jaa kohti. Revertanttien pesäkkeiden määrä sekä negatiivisissa (liuo ­
tinainekontrolli ja käsittelemätön kontrolli, jos käytetty) että positii ­
visissa kontrollimaljoissa on myös ilmoitettava. Maljakohtaiset luku ­
määrät, revertanttien pesäkkeiden maljakohtaisten määrien keskiarvo 
ja keskihajonta on ilmoitettava tutkittavan aineen ja positiivisten ja 
negatiivisten (käsittelemättömät ja/tai liuotinaine) kontrollien osalta.  
Selvää positiivista vastetta ei tarvitse vahvistaa. Epäselvät tulokset on 
selvitettävä jatkotestauksella mieluiten muunnelluissa koeolosuhteis ­
sa. Negatiiviset tulokset on vahvistettava tapauskohtaisesti. Ellei ne ­
gatiivisten tulosten vahvistamista jossakin tapauksessa pidetä tarpeel ­
lisena, tämä päätös on perusteltava. Tutkimusparametrien muutta ­
mista koeolosuhteiden monipuolistamiseksi on harkittava seurantatut ­
kimuksia tehtäessä. Mahdollisia muutettavia tutkimusparametreja 
ovat pitoisuusvälit, altistusmenetelmä (maljainkorporoitumiskoe tai 
nesteen preinkubointi) ja metaboliset aktivaatiojärjestelmät.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 343
 
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI JA TULKINTA  
Positiivisille tuloksille on useita kriteerejä, kuten pitoisuudesta riip ­
puva revertanttien pesäkkeiden maljakohtaisen lukumäärän suurene ­
minen koko testatulla annosalueella ja/tai toistettavissa oleva lisään ­
tyminen yhdellä tai useammalla pitoisuustasolla vähintään yhdessä 
kannassa joko metabolista aktivaatiojärjestelmää käytettäessä tai il ­
man sitä (23). Tulosten biologinen merkitys on otettava ensisijaisesti huomioon. Tilastollisia menetelmiä voidaan käyttää apuna testitulos ­
ten arvioinnissa (24). Tilastollinen merkitsevyys ei saa kuitenkaan 
olla ainoa määräävä tekijä positiivisen vasteen arvioinnissa.
 
Tutkittava aine, jolla saadut tulokset eivät täytä edellä kuvattuja 
kriteerejä, katsotaan ei-mutageeniseksi tässä testissä.  
Useimmissa testeissä saadaan selvästi positiivisia tai negatiivisia tu ­
loksia, mutta joissakin harvinaisissa tapauksissa saatujen tietojen pohjalta ei voida tehdä varmoja päätelmiä tutkittavan aineen vaiku ­
tuksesta. Tulokset saattavat jäädä epäselviksi tai kyseenalaisiksi ko ­
keen toistokertojen määrästä riippumatta.
 
Bakteereilla tehtävässä takaisinmutaatiotestissä saadut positiiviset tu ­
lokset osoittavat, että tutkittava aine aiheuttaa pistemutaatioita emäs ­
substituutioiden tai lukukehyksensiirtojen kautta joko  Salmonella 
typhimurium-  ja/tai  Escherichia coli  -bakteerien genomissa. Negatii ­
viset tulokset osoittavat, ettei testattava aine ole koeolosuhteissa mu ­
tageeninen testatulla lajilla.  
3. RAPORTOINTI  
TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on sisällettävä seuraavat tiedot:  
Liuotin/kantaja-aine:  
— kantaja-aineen valintaperusteet,  
— tutkittavan aineen liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja- 
aineessa, jos tiedossa.  
Kannat:  
— käytetyt kannat,  
— solujen määrä viljelmää kohti,  
— kannan ominaisuudet.  
Koeolosuhteet:  
— tutkittavan aineen määrä maljaa kohti (mg/malja tai μl/malja) 
sekä annoksen valinnan ja kutakin pitoisuutta kohti valittujen 
maljojen lukumäärän perustelut,  
— käytetty kasvatusväliaine,  
— metabolisen aktivaatiojärjestelmän tyyppi ja koostumus sekä hy ­
väksymiskriteerit,  
— altistusmenettely.  
Tulokset:  
— myrkkyvaikutuksen merkit,  
— sakkautumisen merkit,  
— maljakohtaiset määrät,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 344
 
— revertanttien pesäkkeiden määrä maljaa kohti ja keskihajonta,  
— annos-vastesuhde, mikäli mahdollista,  
— mahdolliset tilastolliset analyysit,  
— rinnakkaisista negatiivisista (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisista 
kontrolleista saadut tulokset, myös vaihteluvälit, keskiarvot ja 
keskihajonnat,  
— aikaisemmat negatiivisista (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisista 
kontrolleista saadut tutkimustulokset, myös vaihteluväli, keski ­
arvot ja keskihajonnat,  
Tulosten pohdinta.  
Johtopäätökset.  
4. KIRJALLISUUTTA  
(1) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods of 
Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ Mammalian-Microsome Mutagenicity Test,  Mutation Res.,  
31, s. 347–364.
 
(2) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test,  Mutation Res.,  113, 
s. 173–215.  
(3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., 
Matsushima, T., Melcion, C, Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, 
E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial 
Mutation Assays,  Mutation Res.,  312, s. 217–233.  
(4) Kier, L. D., Brusick D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., 
Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., Mor ­
telmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), The  
Salmonella  typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A 
Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene- Tox Program,  Mutation Res.,  168, s. 69–240.
 
(5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, 
M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of 
Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives,  Cancer Letters  1, 
s. 91-96.  
(6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, 
A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutageni ­
city Microbial Tests, in:  Short-term Test Systems for Delecting 
Carcinogens,  ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C, Springer, 
Berlin-Heidelberg-New York, s. 273–285.  
(7) Gatehouse, D. G., Rowland. I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. 
and Foster, R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in:  Basic 
Mutagenicity Tests : UKEMS Part I Revised,  ed. D. J. Kirkland, 
Cambridge University Press, s. 13–61.  
(8) Aeschacher, H. U., Wolleb. U. and Porchet, E. (1987), Liquid 
Preincubation Mutagenicity Test for Foods.  J. Food Safety,  8, 
s. 167–77.  
(9) Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use 
of a simplified fluctuation test to detect low levels of muta ­
gens,  Mutation Res.,  38, s. 33–42.  
(10) Hubbard, S. A., Green, M. H. L, Gatehouse, D. and Bridges, J. 
W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in:  Handbook of 
Mutagenicity Test Procedures,  2nd Edition, ed. Kilbey, B. J., 
Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C, Elsevier, Amsterdam- 
New York-Oxford, s. 141–161.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 345
 
(11) Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination 
of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis With 
Strains of  Salmonella typhimurium, Environmental Mutagene ­
sis, 3, s. 45–465.  
(12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), 
Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Com ­
pounds by Using a Gas Sampling Bag,  Mutation Res.,  307, 
s. 335–344.  
(13) Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and 
Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Ben ­
zidinc-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Mo ­
dified Salmonella Assay,  Mutation Res.,  136, s. 33–47.  
(14) Zeiger, E., Anderson. B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and 
Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals,  Environ. Mol. 
Mutagen.,  19, s. 2–141.
 
(15) Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R. G. (1977), Muta ­
genic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in  
Progress in Genetic Toxicology,  D. Scott, B. Bridges and F., 
Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, s. 249–258.  
(16) Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, 
L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmo ­
nella Assay,  Environmental Mutagenesis,  9, s. 421–441.
 
(17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., 
and Sugimura, T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Oc ­
curring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Met ­
hane Conjugates in  Salmonella typhimurium, Cancer Res.,  39, 
s. 3780–3782.  
(18) Tamura, G., Gold, C, Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. (1980), 
Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to 
Mutagens by Intestinal Flora,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA,  
77, s. 4961–4965.  
(19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. 
(1990), Comparison of . Salmonella typhimurium  TA 102 with  
Escherichia coli  WP2 Tester strains,  Mutagenesis,  5, 
s. 285–291.  
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in:  In vitro Me ­
tabolic Activation in Mutagenesis Testing, e ds. F. J. de Serres 
et al. Elsevier, North Holland, s. 85–88.
 
(21) Elliot. B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), 
Alternativcs to Aroclor 1254-induccd 89 in  in vitro  Genotoxi ­
city Assays,  Mutagenesis, 7,  s. 175–177.  
(22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), 
Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/ 
Microsome Test,  Mutation Res.,  88, s. 343–350.  
(23) Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nest ­
mann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the  Salmonella 
typhimurium /Mammalian Microsome Tests for Bacterial Muta ­
genicity,  Mutation Res.,  189, s. 83–91.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 346
 
(24) Mahon, G. A. T., Green, M. H. L, Middleton, B., Mitchel, I., 
Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data 
from Microbial Colony Assays, in:  UKEMS Sub-Committee on 
Guidelines for Mutagenicity Testing, Part II. Statistical Eva ­
luation of Mutagenicity Test Data,  ed. Kirkland, D. J., Camb ­
ridge University Press, s. 28–65.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 347
 
B.15.  MUTAGEENISUUSTESTAUS JA KARSINOGEENISTEN 
AINEIDEN SEULONTA GEENIMUTAATIOT —  
SACCHAROMYCES CEREVISIAE  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Ei ole.  
1.4 TESTIN PERIAATE  
Saccharomyces cerevisiae  -hiivalla on joukko haploidisia ja diploi ­
disia kantoja, joiden avulla voidaan mitata kemiallisten aineitten ky ­
kyä aiheuttaa geenimutaatioita ilman metabolista aktivaatiota tai me ­
tabolisen aktivaation jälkeen.  
Testeissä on käytetty haploidisten kantojen mutaatioita, esim. punai ­
sen, adeniinia vaativan kannan  (ade-1 ade-2)  mutaatiota kaksinker ­
taisen määrän adeniinia vaativaksi valkoiseksi kannaksi, ja selektii ­
visiä koejärjestelyitä, kuten kanavnaiini- ja sykloheksimidiresistens ­
sin induktiota.  
Laajimmin tutkitussa takaisinmutaatiojärjestelmässä käytetään haploi ­
dista XV 185-14C -kantaa, jolla on ”ochre”-nonsense- mutaatiot  ade 
2-1, arg 4-17,  lys 1-1 ja  trp 5-48, joiden takaisinmutaatiota saavat 
aikaan sellaiset emäsvaihdoksia aiheuttavat mutageenit, jotka aiheut ­
tavat paikkaspesifisiä mutaatioita tai ”ochre”-suppressorimutaatioita. 
XV 185-14C -kannalla on myös  his 1-7 -markkeri, missensemutaa ­
tio, jonka takaisinmutaatiota saavat aikaan lähinnä muissa kohdissa tapahtuvat mutaatiot, ja  hom  3-10 -markkeri, jonka takaisinmutaa ­
tiota saavat aikaan lukuraamiinsiirtomutageenit.
 
Diploidisista  S. cerevisiae  -kannoista ainoa laajassa käytössä oleva 
on D  7 , joka on homotsygoottinen geenin  ilv 1-92 suhteen.  
1.5 LAATUKRITEERIT  
Ei ole.  
1.6 TESTIN KUVAUS  
Testin valmistelu  
Tutkittavat aineet ja kontrolliaineet tulee sekoittaa soveltuvaan kan ­
taja-aineeseen juuri ennen testiä. Veteen liukenemattomia orgaanisia yhdisteitä tutkittaessa saa orgaanisen liuottimen, kuten etanolin, ase ­
tonin tai dimetyylisulfoksidin (UMSO) loppupitoisuus olla korkein ­
taan 2 tilavuus- %. Kantaja-aineen loppupitoisuus ei saa merkitse ­
västi vaikuttaa solujen elinkykyyn ja kasvuominaisuuksiin.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 348
 
M e t a b o 1 i n e n a k t i v a a t i o  
Solut on altistettava tutkittaville aineille sekä ilman eksogeenista 
metabolista aktivaatiojärjestelmää että soveltuvan eksogeenisen akti ­
vaatiojärjestelmän läsnäollessa.  
Yleisimmin käytetty aktivaatiojärjestelmä on entsyymejä indusoivilla 
aineilla käsiteltyjen jyrsijöiden maksoista eristetty postmitokondriaa ­
linen jae, johon on lisätty kofaktoreita. Myös muista lajeista, muista kudoksista tai muista postmitokondriaalisista jakeista peräisin olevat valmisteet tai muut menetelmät saattavat soveltua metaboliseen akti ­
vaatioon.
 
Koeolosuhteet  
T e s t i k a n n a t  
Geenimutaatiotutkimuksissa yleisimmin käytetyt kannat ovat haploi ­
dinen XV 185-14C -kanta ja diploidinen D  7 -kanta. Myös muut kan ­
nat saattavat soveltua tarkoitukseen.  
K a s v a t u s a l u s t a t  
Hiivojen kuolleisuuden määrittämiseen ja mutanttien määrien laske ­
miseen käytetään soveltuvia kasvatusalustoja.  
N e g a t i i v i s e t j a p o s i t i i v i s e t k o n t r o l l i t  
Testissä on käytettävä rinnakkaisia altistamattomia, testattavan aineen 
liuottimelle altistettuja ja positiivisia kontrolliviljelmiä. Kunkin tut ­
kittavan mutaation kohdalla on käytettävä soveltuvia positiivisia kontrolliaineita.
 
A l t i s t u s p i t o i s u u d e t  
Tutkittava aine on testattava vähintään viitenä eri pitoisuutena, joiden 
keskinäiset erot ovat sopivat. Myrkyllisillä aineilla korkein testattu 
pitoisuus ei saa aiheuttaa yli 5-10 %.m kuolleisuutta. Huonosti ve ­
teen liukenevilla aineilla liukoisuus määrää korkeimman tutkittavan pitoisuuden. Vesiliukoisten myrkyttömien aineiden korkein tutkittava 
pitoisuus on päätettävä tapauskohtaisesti.
 
I n k u b a a t i o - o l o s u h t e e t  
Maljoja inkuboidaan pimeässä 28–30  o C:n lämpötilassa 4–7 vrk:n 
ajan.  
S p o n t a a n i m u t a a t i o i d e n f r e k v e n s s i  
Testissä on käytettävä jatkoviljelmiä, joiden spontaanimutaatioiden 
frekvenssi on normaalina pidettävällä tasolla.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 349
 
T o i s t o j e n l u k u m ä ä r ä  
Kussakin pitoisuudessa maljat tehdään ainakin kolmena kappaleena 
geenimutaation tuottamien prototrofien määrän laskemista ja solujen kuolleisuuden määrittämistä varten. Kokeissa, joissa käytetään alhai ­
sen mutaatiofrekvenssin omaavia markkereita, kuten  hom  3–10, rin ­
nakkaisten maljojen määrää on lisättävä tilastollisesti käyttökelpois ­
ten tulosten saamiseksi.
 
Testin suorittaminen  
S. cerevisiae  -solujen altistus suoritetaan tavallisesti nesteessä statio ­
näärivaiheessa olevilla tai kasvavilla soluilla. Ensimmäinen koe on 
tehtävä kasvavilla soluilla, siten että 1-5 x 10  7 solua/ml altistetaan 
tutkittavalle aineelle ja seosta ravistellaan 18 tunnin ajan 28–37
 o C:ssa; altistuksen aikana seokseen lisätään sopiva määrä me ­
tabolista aktivaatioseosta, tarpeen mukaan. Altistuksen jälkeen solut 
sentrifugoidaan, huuhdotaan ja kylvetään sopivalle kasvatusalustalle. 
Inkubaation jälkeen maljoilta lasketaan solujen kuolleisuus ja tapah ­
tuneet geenimutaatiot. Jos ensimmäisen kokeen tulos on negatiivinen, tehdään toinen koe stationäärivaiheessa olevilla soluilla. Jos ensim ­
mäisen kokeen tulos on positiivinen, tulos varmistetaan soveltuvalla 
erillisellä kokeella.
 
2. TULOKSET  
Tulokset on esitettävä taulukkoina siten, että niistä käyvät ilmi pe ­
säkkeiden lukumäärä, mutanttien lukumäärä, kuolleisuus ja mutaa ­
tiofrekvenssi. Kaikki tulokset on varmistettava erillisellä kokeella. 
Tulosten merkitsevyys on arvioitava soveltuvin tilastollisin menetel ­
min. 
3. RAPORTOINTI  
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat 
tiedot:  
— käytetty kanta,  
— koeolosuhteet: stationäärivaiheessa olevien tai kasvavien solujen 
käyttö, kasvatusalustojen koostumus, inkubaatiolämpötila ja inku ­
baatioaika, metabolinen aktivaatiojärjestelmä,  
— altistusolosuhteet: altistuspitoisuudet, altistusmenetelmä ja 
altistuksen kesto, altistuslämpötila, positiiviset ja negatiiviset kontrollit,
 
— pesäkkeiden lukumäärä, mutanttien lukumäärä, kuolleisuus, mu ­
taatiofrekvenssi, annos/vastesuhde mikäli mahdollista, tulosten 
tilastollinen käsittely,  
— tulosten pohdinta,  
— tulosten tulkinta.  
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
4. LÄHDELUETTELO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 350
 
B.16.  MITOOTTINEN REKOMBINAATIO —  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Ei ole.  
1.4 TESTIN PERIAATE  
Saccharomyces cerevisiae  -hiivalla esiintyy mitoottista rekombinaa ­
tiota sekä geenien välillä (tai yleisemmin ottaen geenin ja sentromee ­
rin välillä) että geenien sisällä. Ensin mainittu ilmiö on nimeltään mitoottinen tekijäinvaihto ja siinä kaksi sisarkromatidia vaihtaa kes ­
kenään osia. Jälkimmäinen ilmiö on yleensä yksisuuntainen ja nimel ­
tään geenikonversio. Tekijäinvaihtotutkimukset perustuvat yleensä 
heterotsygoottiseen kantaan ilmaantuvien resessiivisten homotsygoot ­
tisten pesäkkeiden tai maljasektoreiden laskentaan, kun taas gee ­
nikonversioiden tutkiminen perustuu prototrofisten revertanttien las ­
kentaan auksotrofisilla heteroalleelisilla kannoilla, joilla on kaksi eri ­
laista viallista alleelia samasta geenistä. Yleisimmin mitoottisen gee ­
nikonversion tutkimiseen käytettyjä kantoja ovat D
 4 (heteroalleelinen  
ade 2 ja  trp 5 -lokusten suhteen), D  7 (heteroalleelinen  trp 5 -lokuk ­
sen suhteen), BZ  34 (heteroalleelinen  arg 4 -lokuksen suhteen) ja JD1 
(heteroalleelinen  his 4 ja  trp 5 -lokusten suhteen). Mitoottista teki ­
jäinvaihtoa voidaan testata kannoilla D  5 ja D  7 (jälkimmäisellä voi ­
daan havainnoida myös mitoottista geenikonversiota ja takaisinmu ­
taatiota il v 1-92 -lokuksessa), jotka kummatkin ovat heteroalleelisia  
ade 2  -lokuksen komplementtigeenien suhteen ja joissa mitoottinen 
tekijäinvaihdos ilmenee maljoilla punaisina tai vaaleanpunaisina ho ­
motsygoottisina sektoreina.  
1.5 LAATUKRITEERIT  
Ei ole.  
1.6 TESTIN KUVAUS  
Testin valmistelu  
Tutkittavat aineet sekä kontrolli- tai vertailuyhdisteet on sekoitettava 
soveltuvaan kantaja-aineeseen juuri ennen testiä. Veteen liukenemat ­
tomia orgaanisia yhdisteitä tutkittaessa saa orgaanisen liuottimen, 
kuten etanolin, asetonin tai dimetyylisulfoksidin (DMSO) loppupitoi ­
suus olla korkeintaan 2 tilavuus- %. Kantaja-aineen loppupitoisuus ei saa merkitsevästi vaikuttaa solujen elinkykyyn ja kasvuominaisuuk ­
siin.
 
M e t a b o l i n e n a k t i v a a t i o  
Solut on altistettava tutkittaville aineille sekä ilman eksogeenista 
metabolista aktivaatiojärjestelmää että soveltuvan eksogeenisen akti ­
vaatiojärjestelmän läsnäollessa. Yleisimmin käytetty aktivaatiojärjes ­
telmä on entsyymejä indusoivilla aineilla käsiteltyjen jyrsijöiden maksoista eristetty postmitokondriaalinen jae, johon on lisätty kofak ­
toreita. Myös muista lajeista, muista kudoksista tai muista postmito ­
kondriallisista jakeista peräisin olevat valmisteet tai muut menetelmät 
saattavat soveltua metaboliseen aktivaatioon.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 351
 
Koeolosuhteet  
T e s t i k a n n a t  
Yleisimmin käytettyjä ovat diploidiset kannat D  4 , D  5 , D  7 ja 
JD1. Myös muut kannat saattavat soveltua tarkoitukseen.  
K a s v a t u s a l u s t a t  
Hiivojen kuolleisuuden ja mitoottisen rekombinaatiofrekvenssin mää ­
rittämiseen käytetään soveltuvia kasvatusalustoja.  
N e g a t i i v i s e t j a p o s i t i i v i s e t k o n t r o l l i t  
Testissä on käytettävä rinnakkaisia altistamattomia, testattavan aineen 
liuottimelle altistettuja ja positiivisia kontrolliviljelmiä. Kunkin tut ­
kittavan rekombinaation kohdalla on käytettävä soveltuvia positii ­
visia kontrolliaineita.  
A l t i s t u s p i t o i s u u d e t  
Tutkittava aine on testattava vähintään viitenä eri pitoisuutena, joiden 
keskinäiset erot ovat sopivat. Huomioon otettavia seikkoja ovat mm. 
aineen sytomyrkyllisyys ja liukoisuus. Alin pitoisuus ei saa lainkaan 
lisätä solujen kuolleisuutta. Myrkyllisillä aineilla korkein testattu pi ­
toisuus ei saa aiheuttaa yli 5–10 %:n kuolleisuutta. Huonosti veteen liukenevilla aineilla liukoisuus määrää korkeimman tutkittavan pitoi ­
suuden. Vesiliukoisten myrkyttömien aineiden korkein tutkittava pi ­
toisuus on päätettävä tapauskohtaisesti.
 
Solut voidaan altistaa tutkittavalle aineelle joko stationäärivaiheessa 
tai kasvuvaiheessa, ja pisin altistusaika voi olla 18 tuntia. Pitkässä altistuksessa viljelmiä on kuitenkin seurattava mikroskoopilla mah ­
dollisen itiönmuodostuksen varalta, sillä itiönmuodostus pilaa testin.
 
I n k u b a a t i o - o l o s u h t e e t  
Maljoja inkuboidaan pimeässä 28–30  o C:n lämpötilassa 4–7 vrk:n 
ajan. Maljoja, joilta tutkitaan mitoottisen tekijäinvaihdoksen aikaan ­
saamat punaiset ja vaaleanpunaiset homotsygoottiset sektorit, on in ­
kuboinnin jälkeen säilytettävä jääkaapissa (noin 4  o C:ssa) yhdestä 
kahteen vuorokautta ennen laskemista, jotta pesäkkeiden väri ehtii kehittyä.
 
S p o n t a a n i n e n m i t o o t t i n e n r e k o m b i n a a t i o f r e k ­
v e n s s i  
Testissä on käytettävä jatkoviljelmiä, joiden spontaaninen mitootti ­
nen rekombinaatiofrekvenssi on normaalina pidettävällä tasolla.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 352
 
T o i s t o j e n l u k u m ä ä r ä  
Kussakin pitoisuudessa maljat tehdään ainakin kolmena kappaleena 
mitoottisen geenikonversion tuottamien prototrofien määrän laske ­
mista ja solujen kuolleisuuden määrittämistä varten. Kokeissa, joissa lasketaan mitoottisen tekijäinvaihdon aikaansaamia resessiivisiä ho ­
motsygootteja, rinnakkaisten maljojen määrää on lisättävä riittävän 
pesäkemäärän saamiseksi.
 
Testin suorittaminen  
S. cerevisiae  -solujen altistus suoritetaan tavallisesti nesteessä statio ­
näärivaiheessa olevilla tai kasvavilla soluilla. Ensimmäinen koe on tehtävä kasvavilla soluilla, siten että 1-5 x 10
 7 solua/ml altistetaan 
tutkittavalle aineelle ja seosta ravistellaan 18 tunnin ajan 
28–37  o C:ssa; altistuksen aikana seokseen lisätään sopiva määrä me ­
tabolista aktivaatioseosta, mikäli tarpeellista.  
Altistuksen jälkeen solut sentrifugoidaan, huuhdotaan ja kylvetään 
sopivalle kasvatusalustalle. Inkubaation jälkeen maljoilta lasketaan 
solujen kuolleisuus ja tapahtuneet mitoottiset rekombinaatiot.  
Jos ensimmäisen kokeen tulos on negatiivinen, tehdään toinen koe 
stationäärivaiheessa olevilla soluilla. Jos ensimmäisen kokeen tulos 
on positiivinen, tulos varmistetaan erillisellä kokeella.  
2. TULOKSET  
Tulokset on esitettävä taulukkoina siten, että niistä käyvät ilmi pe ­
säkkeiden lukumäärä, rekombinanttien lukumäärä, kuolleisuus ja re ­
kombinaatiofrekvenssi.  
Tulokset on varmistettava erillisellä kokeella.  
Tulosten merkitsevyys on arvioitava soveltuvin tilastollisin menetel ­
min. 
3. RAPORTOINTI  
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat 
tiedot:  
— käytetty kanta,  
— koeolosuhteet: stationäärivaiheessa olevien tai kasvavien solujen 
käyttö, kasvatusalustojen koostumus, inkubaatiolämpötila ja inku ­
baatioaika, aineenvaihdunnallinen aktivaatiojärjestelmä,  
— altistusolosuhteet: altistuspitoisuudet, altistusmenetelmä ja 
altistuksen kesto, altistuslämpötila, positiiviset ja negatiiviset kontrollit,
 
— pesäkkeiden lukumäärä, rekombinanttien lukumäärä, kuolleisuus, 
rekombinaatiofrekvenssi, annos/vastesuhde mikäli mahdollista, tulosten tilastollinen käsittely,
 
— tulosten pohdinta,  
— tulosten tulkinta,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 353
 
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
4. LÄHDELUETTELO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 354
 
B.17.  MUTAGEENISUUS — GEENIMUTAATIOTESTI NISÄK ­
ÄSSOLUILLA  IN VITRO  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä on sama kuin OECD TG 476,  In Vitro  Mammalian 
Cell Gene Mutation Test (1997).  
1.1 JOHDANTO  
Nisäkässoluviljelmissä tehtävää  in vitro  -geenimutaatiotestiä voidaan 
käyttää kemiallisten aineiden aiheuttamien geenimutaatioiden totea ­
miseen. Sopivia solulinjoja ovat hiiren lymfoomasolulinja L5178Y, 
kiinanhamsterin solulinjat CHO, CHO-AS52 ja V79 ja ihmisen lym ­
foblastoidisolulinja TK6 (1). Näissä solulinjoissa yleisimmin käytetyt geneettiset tulostapahtumat mittaavat tymidiinikinaasi- (TK) ja hy ­
poksantiini-guaniinifosforibosyyli-transferaasilokusten (HPRT) mu ­
taatioita ja ksantiiniguaniinifosforibosyylitransferaasin (XPRT) trans ­
geeniä. TK-, HPRT- ja XPRT-mutaatiotesteillä voidaan havaita eri ­
laisia geneettisiä tapahtumia. Koska TK ja XPRT sijaitsevat autoso ­
missa, niiden avulla voidaan ehkä havaita sellaisia geneettisiä tapah ­
tumia (esim. suuria deleetioita), joita ei voida havaita X-kromoso ­
micn HPRT-lokuksessa (2) (3) (4) (5) (6).
 
Nisäkässoluilla tehtävissä  in vitro  -geenimutaatiotesteissä voidaan 
käyttää pysyvien solulinjojen tai solukantojen viljelmiä. Solujen va ­
lintakriteereinä käytetään niiden kykyä kasvaa viljelmässä ja niiden spontaanimutaatiotaajuuden stabiliteettia.
 
In vitro  tehtävät testit vaativat yleensä eksogeenista metabolista ak ­
tivaatiota. Tällainen metabolinen aktivaatiojärjestelmä ei pysty täysin jäljittelemään  in vivo  -olosuhteita nisäkkäissä. On pyrittävä välttä ­
mään erityisesti sellaisia olosuhteita, joissa saatavat positiiviset tulok ­
set eivät heijasta aineen luontaista mutageenisuutta ja saattavat johtua pH:n muutoksista, osmolaliteetista tai voimakkaasta sytotoksisuu ­
desta (7).
 
Tätä testiä käytetään nisäkkäiden mahdollisten mutageenien ja karsi ­
nogeenien seulontaan. Monet yhdisteet, joilla saadaan positiivinen tulos tässä testissä, ovat nisäkkäiden karsinogeeneja. Tämän testin ja karsinogeenisuuden välillä ei kuitenkaan ole täydellistä korrelaa ­
tiota. Korrelaatio riippuu aineryhmän kemiallisista ominaisuuksista, 
ja yhä useammat tutkimustulokset viittaavat siihen, että on olemassa karsinogeeneja, joita ei voida havaita tällä testillä, koska ne näyttävät vaikuttavan muiden, ei-genotoksisten mekanismien tai bakteeriso ­
luista puuttuvien mekanismien välityksellä (6).
 
Ks. myös Yleinen johdanto Osa B.  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Forward-mutaatio:  geenin mutaatio parentaalisesta tyypistä mutant ­
timuotoon, minkä seurauksena geenin koodittama valkuaisaine me ­
nettää entsymaattisen aktiivisuutensa tai sen entsyymiaktiivisuus 
muuttuu.  
Emäsparien korvautumista aiheuttavat mutageenit:  aineita, jotka 
aiheuttavat yhden tai useamman emäsparin substituution DNA:ssa.  
Lukukehyksensiirtomutageenit:  aineita, jotka aiheuttavat yhden tai 
useamman emäsparin ylimäärän tai vajauksen DNA-molekyylissä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 355
 
Fenotyypin ilmentymisaika:  ajanjakso, jonka aikana muuttumatto ­
mat geenituotteet poistuvat hiljattain mutatoituneista soluista.  
Mutaatiotaajuus:  todettu mutanttien solujen lukumäärä jaettuna 
elinkykyisten solujen määrällä.  
Suhteellinen kokonaiskasvu:  solumäärän suureneminen tietyssä 
ajassa verrattuna kontrollina käytettävään solupopulaatioon; lasketaan tulona, joka saadaan kertomalla keskenään suspensiokasvu suhteessa negatiiviseen kontrolliin ja kloonaustehokkuus suhteessa negatii ­
viseen kontrolliin.
 
Suhteellinen suspensiokasvu:  solujen lukumäärän suureneminen il ­
mentymisajan kuluessa verrattuna negatiiviseen kontrolliin.  
Elinkykyisyys:  tutkittavalle aineelle altistettujen solujen kloonauste ­
hokkuus maljausajankohtana selektiivisissä olosuhteissa ilmentymisa ­
jan jälkeen.  
Eloonjääneisyys:  tutkittavalle aineelle altistettujen solujen kloonaus ­
tehokkuus maljattaessa altistusjakson lopussa; eloonjääneisyys ilmoi ­
tetaan yleensä suhteessa kontrollina käytetyn solupopulaation eloon ­
jääneisyyteen.  
1.3 TESTIN PERIAATE  
Solut, joista TK  +/- → TK-/- -mutaation seurauksena puuttuu tymidii ­
nikinaasi (TK), ovat resistenttejä pyrimidiinianalogitrifluorotymidii ­
nin (TFT) sytotoksisille vaikutuksille. Tymidiinikinaasin läsnä ol ­
lessa solut ovat herkkiä TFT:lle, joka estää solun aineenvaihduntaa 
ja pysäyttää solunjakautumisen. Mutantit solut kykenevät siis lisään ­
tymään TFT:n läsnä ollessa, kun taas normaalit, tymidiinikinaasia sisältävät, solut eivät kykene. Vastaavasti solut, joista puuttuu HPRT- tai XPRT-entsyymi, ovat resistenttejä 6-tioguaniinille (TG) 
tai 8-atsaguaniinille (AG). Tutkittavan aineen ominaisuuksiin on 
kiinnitettävä erityistä huomiota, jos selektiivisen aineen emäsanalogia tai sille kemiallisesti sukua olevaa ainetta testataan millä tahansa nisäkässoluissa tehtävällä geenimutaatiotestillä. Esimerkiksi tutkitta ­
van aineen mahdollinen epäilty selektiivinen myrkkyvaikutus mu ­
tantteihin ja ei-mutantteihin soluihin on selvitettävä. Selektiivisen järjestelmän/aineen toimintakyky on sen vuoksi vahvistettava testat ­
taessa kemiallisia aineita, jotka ovat rakenteeltaan selektiivisen ai ­
neen kaltaisia (8).
 
Suspensiossa tai yksikerrosviljelmässä olevat solut altistetaan sopi ­
vaksi ajaksi testattavalle aineelle sekä metabolisen aktivaatiojärjestel ­
män läsnä ollessa että ilman sitä ja jatkoviljellään sytotoksisuuden toteamiseksi ja fenotyypin ilmentymisen aikaansaamiseksi ennen mu ­
tanttien selektiota (9) (10) (11) (12) (13). Sytotoksisuus määritetään 
yleensä mittaamalla viljelmien suhteellinen kloonaustehokkuus (eloonjääneisyys) tai suhteellinen kokonaiskasvu altistusjakson jäl ­
keen. Altistettuja viljelmiä pidetään kasvatusväliaineessa riittävän 
pitkä aika, joka on jokaiselle valitulle lokukselle ja solutyypille omi ­
nainen, jotta aikaansaatujen mutanttien fenotyypin ilmentyminen olisi lähellä optimaalista. Mutaatiotaajuus lasketaan siten, että tunnettu lukumäärä soluja kylvetään toisaalta mutanttien toteamiseksi selektii ­
vistä ainetta sisältävälle alustalle, toisaalta kloonaustehokkuuden 
(elinkykyisyyden) määrittämiseksi alustalle, joka ei sisällä selektii ­
vistä ainetta. Sopivan inkubaatioajan kuluttua lasketaan pesäkkeet. Mutaatiotaajuus lasketaan selektiivisellä alustalla todettujen mutant ­
tipesäkkeiden lukumäärän ja ei-selektiivisellä alustalla todettujen pe ­
säkkeiden lukumäärän perusteella.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 356
 
1.4 MENETELMÄN KUVAUS  
1.4.1  Testin valmistelu  
1.4.1.1  Solut  
Tässä testissä voidaan käyttää useita eri solutyyppejä, kuten 
L5178Y-, CHO-, CHO-AS52-, V79- tai TK6-solulinjojen subkloo ­
neja. Tässä testissä on käytettävä solutyyppejä, joiden on osoitettu olevan herkkiä kemiallisille mutageeneille ja joilla on hyvä kloo ­
naustehokkuus ja stabiili spontaanimutaatiotaajuus. Solujen mahdol ­
linen mykoplasmakontaminaatio on tutkittava. Kontaminoituneita so ­
luja ei saa käyttää.
 
Testi on suunniteltava siten, että sillä on tietty herkkyys ja teho. 
Solujen lukumäärän, viljelmien ja käytettyjen tutkittavan aineen pi ­
toisuuksien tulee olla näiden määriteltyjen parametrien mukaisia 
(14). Altistuksen jälkeen elossa olevien ja kussakin testivaiheessa 
käytettävien elinkykyisten solujen vähimmäismäärän tulee perustua spontaanimutaatiotaajuuteen. Yleisohje on. että solujen lukumäärän on oltava vähintään kymmenen kertaa spontaanimutaatiotaajuuden 
käänteisluvun suuruinen, vähimmäismääräksi suositellaan kuitenkin 
10
 6 solua. Käytetystä solujärjestelmästä on oltava riittävästi aikai ­
sempaa tutkimustietoa, joka osoittaa, että testillä saadaan pysyvästi päteviä tuloksia.
 
1.4.1.2  Kasvatusväliaineet ja viljelyolosuhteet  
Testissä on käytettävä soveltuvia kasvatusväliaineita ja inkubaatio- 
olosuhteita (kasvatusastiat, lämpötila, CO  2 -pitoisuus ja kosteus). Kas ­
vatusväliaineet on valittava käytettävän selektiojärjestelmän ja solu ­
tyypin mukaan. On erityisen tärkeää valita viljelyolosuhteet, jotka takaavat optimaalisen solukasvun ilmentymisaikana ja sekä mutant ­
tien että ei-mutanttien solujen optimaalisen pesäkkeenmuodostusky ­
vyn.
 
1.4.1.3  Viljelmien valmistelu  
Solut kasvatetaan varastoviljelmistä, kylvetään kasvatusväliaineeseen 
ja inkuboidaan 37  o C:ssa. Viljelmät on ehkä puhdistettava aikaisem ­
mista mutanteista soluista, ennen kuin niitä käytetään tässä testissä.  
1.4.1.4  Metabolinen aktivaatio  
Solut on altistettava tutkittavalle aineelle sekä sopivan metabolisen 
aktivaatiojärjestelmän läsnä ollessa että ilman sitä. Yleisimmin käy ­
tetty aktivaatiojärjestelmä on entsyymejä indusoivilla aineilla, kuten Aroclor 1254:llä (15) (16) (17) (18) tai fenobarbitonin ja ß-naftofla ­
vonin (19) (20) yhdistelmällä, käsiteltyjen jyrsijöiden maksasta eris ­
tetty postmitokondriaalinen jae (S9), johon on lisätty kofaktoria.
 
Postmitokondriaalisen jakeen yleisesti käytetty pitoisuusalue lopulli ­
sessa kasvatusväliaineessa on 1–10 % v/v. Metabolisen aktivaatiojär ­
jestelmän valinta tai sen pois jättäminen saattaa riippua siitä, mihin kemiallisten aineiden ryhmään tutkittava aine kuuluu. Joissakin ta ­
pauksissa saattaa olla perusteltua käyttää useampaa kuin yhtä post ­
mitokondriaalisen jakeen pitoisuutta.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 357
 
Monilla uusilla menetelmillä, kuten yhdistelmä-DNA-tekniikalla tu ­
otetuilla solulinjoilla, jotka ilmentävät spesifisiä aktivaatioentsyy ­
mejä, saattaa olla endogeenista aktivaatiovaikutusta. Käytettyjen so ­
lulinjojen valinnan on oltava tieteellisesti perusteltua (esim. sytok ­
romi P450 -isoentsyymin merkitys tutkittavan aineen metabolialle).  
1.4.1.5  Tulkittava aine/valmistelu  
Kiinteät tutkittavat aineet liuotetaan tai sekoitetaan sopiviin liuotti ­
miin tai kantaja-aineisiin ja laimennetaan tarvittaessa ennen solujen käsittelyä. Nestemäiset tutkittavat aineet voidaan lisätä suoraan koe ­
järjestelmiin ja/tai laimentaa ennen solujen käsittelyä. Tutkittava aine 
on valmisteltava juuri ennen altistusta, paitsi jos säilyvyys on osoi ­
tettu stabiliteettitutkimuksilla.
 
1.4.2  Koeolosuhteet  
1.4.2.1  Liuotin/kantaja-aine  
Liuotin/kantaja-aine ei saa olla sellainen, että sen voidaan epäillä 
reagoivan kemiallisesti tutkittavan aineen kanssa, eikä se saa vaikut ­
taa solujen elinkykyyn eikä S9-aktiivisuuteen. Jos käytetään muita 
kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita, niiden käyttö on pe ­
rusteltava yhteensopivuuden osoittavilla tutkimustuloksilla. Vesipitoi ­
sen liuottimen/kantaja-aineen käyttöä on harkittava ensisijaisesti aina, 
kun se on mahdollista. Testattaessa aineita, jotka ovat epästabiileja 
vedessä, orgaanisten liuottimien tulisi olla vedettömiä. Vesi voidaan poistaa lisäämällä molekyylisiivilä.
 
1.4.2.2  Altistuspitoisuudet  
Huomioon otettavia kriteerejä suurinta pitoisuutta määritettäessä ovat 
sytotoksisuus, liukoisuus testijärjestelmään ja pH:n tai osmolaliteetin muutokset.
 
Sytotoksisuus on määritettävä pääasiallisessa kokeessa sekä metabo ­
lisen aktivaatiojärjestelmän läsnä ollessa että ilman sitä käyttäen asi ­
anmukaisia solujen eheyden ja solukasvun indikaattoreita, kuten suh ­
teellista kloonaustehokkuutta (eloonjääneisyyttä) tai suhteellista ko ­
konaiskasvua. Sytotoksisuus ja liukoisuus saattaa olla hyödyllistä 
määrittää alustavassa kokeessa.  
Vähintään neljää analysoitavissa olevaa pitoisuutta on käytettävä. 
Mikäli sytotoksisuutta esiintyy, näiden pitoisuuksien on katettava 
alue, jossa suurimmalla pitoisuudella on maksimaalinen myrkkyvai ­
kutus ja pienimmällä vähäinen tai ei lainkaan myrkkyvaikutusta, mikä tarkoittaa yleensä sitä, että pitoisuudet voivat poiketa toisistaan 
enintään kertoimella 2– √10. Mikäli suurin pitoisuus perustuu syto ­
toksisuuteen, siihen liittyvän suhteellisen eloonjääneisyyden (suhteel ­
lisen kloonaustehokkuuden) tai suhteellisen kokonaiskasvun tulisi olla noin 10–20 % (mutta ei alle 10 %). Suhteellisen ei-sytotoksisia 
aineita testattaessa suurimman testattavan pitoisuuden tulisi olla 
5 mg/ml, 5 μl/ml tai 0,01 M sen mukaan, mikä näistä on pienin.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 358
 
Huonosti liukenevia aineita on testattava viljelyolosuhteissa liukoi ­
suusrajaan asti tai sen yli. Liukenemattomuuteen viittaavat muutokset 
on määritettävä lopullisessa kasvatusväliaineessa, jolle solut altiste ­
taan. Liukoisuus kannattaa arvioida sekä käsittelyn alussa että lopussa, sillä se voi muuttua koejärjestelmässä altistuksen aikana esimerkiksi 
solujen, S9:n, seerumin ym. vaikutuksesta. Liukenemattomuus voidaan 
havaita paljaalla silmällä. Sakan ei pitäisi vaikuttaa laskentaan.
 
1.4.2.3  Kontrollit  
Jokaisessa kokeessa on käytettävä rinnakkaisia positiivisia ja negatii ­
visia (liuotin tai kantaja-aine) kontrolleja, sekä metabolisen aktivaa ­
tiojärjestelmän läsnä ollessa että ilman sitä. Metabolista aktivaatiota käytettäessä positiivisena kontrollina on käytettävä sellaista kemial ­
lista ainetta, joka vaatii aktivaatiota mutageenisen vasteen aikaansaa ­
miseksi.
 
Esimerkkejä positiivisista kontrolliaineista:  
Metabolinen aktivaa ­
tio Lokus Aine CAS-nro EINECS-nro  
Ei eksogeenista 
metabolista akti ­
vaatiota HPRT etyylimetaanisulfonaatti 62-50-0 200-536-7 
etyylinitrosourea 759-73-9 212-072-2 
TK (pienet ja 
suuret pesäk ­
keet) metyylimetaanisulfonaatti 66-27-3 200-625-0 
XPRT etyylimetaanisulfonaatti 62-50-0 200-536-7 
etyylinitrosourea 759-73-9 212-072-2 
Eksogeeninen me ­
tabolinen aktivaa ­
tio HPRT 3-metyylikolantreeni 56-49-5 200-276-4 
N-nitrosodimetyyliamiini 62-75-9 200-549-8 7,12-dimetyylibentsantraseeni 57-97-6 200-359-5 
TK (pienet ja 
suuret pesäk ­
keet) syklofosfamidi 50-18-0 200-015-4 
syklofosfamidimonohydraatti 6055-19-2 bentso[a]pyreeni 50-32-8 200-028-5 3-metyylikolantreeni 56-49-5 200-276-5 
XPRT N-nitrosodimetvyliamiini (suurilla 
S-9-pitoisuuksilla) 62-75-9 200-549-S 
bentso[a]pyreeni 50-32-8 200-028-5
 
Muita sopivia positiivisia kontrolliaineita voidaan käyttää, esim. jos 
käytettävissä on laboratoriokohtainen tietokanta 5-bromo-2'-deoksiu ­
ridiinista (CAS-nro 59-14-3, Einecs-nro 200-415-9), myös tätä ver ­
tailuainetta voidaan käyttää. Samaan kemiallisten aineiden ryhmään 
kuuluvien positiivisten kontrolliaineiden käyttöä tulisi harkita, mikäli 
niitä on käytettävissä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 359
 
Mukana on oltava myös negatiivisia kontrolleja, jotka koostuvat 
liuottimesta tai pelkästä kantaja-aineesta kasvatusväliaineessa ja joita 
on käsitelty samalla tavoin kuin altistettuja ryhmiä. Lisäksi on käy ­
tettävä käsittelemättömiä kontrolleja, paitsi jos aikaisemmat tiedot kontrollista osoittavat, ettei valitulla liuottimella ole haitallisia eikä 
mutageenisia vaikutuksia.
 
1.4.3  Testin suorittaminen  
1.4.3.1  Altistuminen tutkittavalle aineelle  
Lisääntyvät solut on altistettava testattavalle aineelle sekä metaboli ­
sen aktivaatiojärjestelmän läsnä ollessa että ilman sitä. Altistusajan 
on oltava sopiva (tehokas aika on yleensä 3–6 tuntia). Altistusta 
voidaan jatkaa yhden tai useamman solusyklin ajan.  
Kullekin testattavalle pitoisuudelle voidaan altistaa kaksi rinnakkaista 
viljelmää tai vain yksi viljelmä. Yksittäisiä viljelmiä käytettäessä 
pitoisuuksien määrää on suurennettava, jotta saadaan riittävä määrä viljelmiä analyysiä varten (esim. vähintään 8 analysoitavissa olevaa pitoisuutta). Rinnakkaisia negatiivisia (liuotin) kontrolliviljelmiä on 
käytettävä.
 
Kaasumaisia tai haihtuvia aineita on testattava asianmukaisin mene ­
telmin, esimerkiksi suljetuissa kasvatusastioissa (21) (22).  
1.4.3.2  Eloonjääneisyyden, elinkykyisyyden ja mutaatiotaajuuden mittaa ­
minen  
Altistusajan päätyttyä solut pestään ja viljellään eloonjääneisyyden 
määrittämiseksi ja mutanttifenotyypin ilmentymisen aikaansaamisek ­
si. Sytotoksisuuden mittaus aloitetaan yleensä altistusajan jälkeen 
määrittämällä viljelmien suhteellinen kloonaustehokkuus (eloonjää ­
neisyys) tai suhteellinen kokonaiskasvu.  
Jokainen lokus vaatii määrätyn minimiajan, jotta hiljattain aiheutet ­
tujen mutanttien fenotyypin ilmentyminen olisi lähellä optimaalista 
(HPRT ja XPRT vaativat vähintään 6–8 vuorokautta ja TK vähintään 
2 vuorokautta). Soluja kasvatetaan selektiivistä ainetta (aineita) sisäl ­
tävillä alustoilla mutanttien lukumäärän määrittämiseksi ja ilman se ­
lektiivisiä aineita kloonaustehokkuuden määrittämiseksi. Elinkykyi ­
syyden mittaaminen (käytetään mutaatiotaajuuden laskemiseen) aloi ­
tetaan altistusajan päätyttyä maljaamalla soluja ei-selektiivisessä kas ­
vatusväliaineessa.  
Jos tutkittavalla aineella saadaan positiivinen tulos L5178Y TK  +/- 
-testissä, pesäkkeiden koko on määritettävä ainakin yhdessä koevil ­
jelmässä (suurin positiivinen pitoisuus) ja negatiivisissa ja positii ­
visissa kontrolleissa. Jos tutkittavalla aineella saadaan negatiivinen tulos L5178Y TK
 +/- -testissä, pesäkkeiden koko on määritettävä ne ­
gatiivisissa ja positiivisissa kontrolleissa. Pesäkkeiden koon määritys 
voidaan tehdä myös tutkimuksissa, joissa käytetään TK6TK  +/- -testiä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 360
 
2. TULOKSET  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Tulosten tulee sisältää tiedot sytotoksisuuden ja elinkykyisyyden 
määrityksistä, pesäkkeiden lukumäärästä ja mutaatiotaajuudesta altis ­
tetuissa viljelmissä ja kontrolliviljelmissä. Mikäli vaste on positii ­
vinen L5178Y TK  +/- -testissä, pesäkkeet lasketaan pienten ja suurten 
pesäkkeiden kriteeriä käyttäen vähintään yhdestä testattavan aineen pitoisuudesta (suurin positiivinen pitoisuus) ja negatiivisista ja posi ­
tiivisista kontrolleista. Sekä suurten että pienten mutaatiopesäkkeiden 
molekulaarinen ja sytogeneettinen luonne on selvitetty yksityiskoh ­
taisesti (23) (24). TK
 +/- -testissä pesäkkeet lasketaan käyttäen kritee ­
reinä normaalin kasvun (suuri) ja hitaan kasvun (pieni) pesäkkeitä 
(25). Mutanteilla soluilla, joissa geneettinen vaurio on kaikkein suu ­
rin, on pitkittynyt kahdentumisaika, joten ne muodostavat pieniä pesäkkeitä. Tällaiset vauriot ulottuvat tyypillisesti kokonaisen geenin 
puuttumisesta karyotyypissä näkyviin kromosomipoikkeavuuksiin. 
Pienten mutaatiopesäkkeiden muodostuminen on yhdistetty suuria kromosomipoikkeavuuksia aiheuttaviin kemiallisiin aineisiin (26). Lievemmin vaurioituneet mutantit solut kasvavat yhtä nopeasti 
kuin parentaalisetkin solut ja muodostavat suuria pesäkkeitä.
 
Eloonjääneisyys (suhteelliset kloonaustehokkuudet) tai suhteellinen 
kokonaiskasvu on ilmoitettava. Mutaatiotaajuus on ilmoitettava mu ­
tanttien solujen lukumäärän suhteena eloonjääneiden solujen luku ­
määrään.  
Viljelmäkohtaiset tulokset on ilmoitettava. Lisäksi yhteenveto kai ­
kista tiedoista on ilmoitettava taulukkomuodossa.  
Selvää positiivista vastetta ei tarvitse vahvistaa. Epäselvät tulokset on 
selvitettävä jatkotestauksella mieluiten muunnetuissa koeolosuhteissa. 
Negatiiviset tulokset on vahvistettava tapauskohtaisesti. Ellei negatii ­
visten tulosten vahvistamista jossakin tapauksessa pidetä tarpeellise ­
na, tämä päätös on perusteltava. Tutkimusparametrien muuttamista 
on harkittava epäselvien tai negatiivisten tulosten seurantakokeissa 
arvioitavien koeolosuhteiden monipuolistamiseksi. Mahdollisia muu ­
tettavia tutkimusparametreja ovat pitoisuusvälit ja metaboliset akti ­
vaatiojärjestelmät.  
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI JA TULKINTA  
Positiivisille tuloksille on useita kriteerejä, kuten pitoisuuteen liittyvä 
tai toistettavissa oleva mutaatiotaajuuden suureneminen. Tulosten biologinen merkitys on otettava ensisijaisesti huomioon. Tilastollisia menetelmiä voidaan käyttää apuna testitulosten arvioinnissa. Tilastol ­
linen merkitsevyys ei saa olla ainoa määräävä tekijä positiivisen 
vasteen arvioinnissa.
 
Tutkittava aine. jolla saadut tulokset eivät täytä edellä kuvattuja 
kriteerejä, katsotaan ei-mutageeniseksi tässä koejärjestelmässä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 361
 
Useimmissa testeissä saadaan selvästi positiivisia tai negatiivisia tu ­
loksia, mutta joissakin harvinaisissa tapauksissa saatujen tietojen 
pohjalta ei voida tehdä varmoja päätelmiä tutkittavan aineen vaiku ­
tuksesta. Tulokset saattavat jäädä epäselviksi tai kyseenalaisiksi ko ­
keen toistokertojen määrästä riippumatta.  
Nisäkässoluilla tehtävässä  in vitro  -geenimutaatiotestissä saadut po ­
sitiiviset tulokset osoittavat, että tutkittava aine aiheuttaa geenimutaa ­
tioita käytetyissä viljellyissä nisäkässoluissa. Toistettavissa oleva po ­
sitiivinen pitoisuus-vastesuhde on kaikkein merkityksellisin. Negatii ­
viset tulokset osoittavat, ettei tutkittava aine aiheuta koeolosuhteissa 
geenimutaatioita testatuissa viljellyissä nisäkässoluissa.  
3. RAPORTOINTI  
TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on sisällettävä seuraavat tiedot:  
Liuotin/kantaja-aine:  
— kantaja-aineen valintaperusteet,  
— tutkittavan aineen liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja- 
aineessa, jos tiedossa.  
Solut:  
— tyyppi ja solujen lähde,  
— soluviljelmien lukumäärä,  
— siirrostusten lukumäärä tarvittaessa,  
— soluviljelmien ylläpitomenetelmät tarvittaessa,  
— mykoplasman puuttuminen.  
Koeolosuhteet:  
— pitoisuuksien ja viljelmien lukumäärän valintaperusteet, joihin 
sisältyvät esim. sytotoksisuustiedot ja liukoisuusrajoitukset, mi ­
käli tiedot ovat käytettävissä,  
— kasvatusväliaineen koostumus, CO  2 -pitoisuus,  
— tutkittavan aineen pitoisuus,  
— lisätyn kantaja-aineen ja tutkittavan aineen määrä,  
— inkubaatiolämpötila,  
— inkubaatioaika,  
— altistuksen kesto.  
— solutiheys altistuksen aikana,  
— metabolisen aktivaatiojärjestelmän tyyppi ja koostumus, myös 
hyväksymiskriteerit,  
— positiiviset ja negatiiviset kontrollit,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 362
 
— ilmentymisajan pituus (myös kylvettyjen solujen lukumäärä ja 
jatkoviljelmät ja kasvatusväliaineen vaihtoajat tarvittaessa),  
— selektiiviset aineet,  
— kriteerit, joiden perusteella testit määritellään positiivisiksi, nega ­
tiivisiksi tai epäselviksi,  
— elinkykyisten ja mutanttien solujen laskentamenetelmät,  
— pesäkkeiden määritelmät, kun pesäkkeen koko ja tyyppi on otettu 
huomioon (myös ”pienten” ja ”suurten” pesäkkeiden kriteerit 
tarvittaessa).  
Tulokset:  
— myrkkyvaikutuksen merkit,  
— sakkautumisen merkit,  
— tutkittavalle aineelle altistetun viljelmän pH ja osmolaliteetti, jos 
määritetty,  
— pesäkkeen koko, jos määritetty, ainakin negatiivisista ja positii ­
visista kontrolleista,  
— laboratorion valmiudet todeta pienet mutanttipesäkkeet L5178Y 
TK +/- -järjestelmässä, mikäli merkitystä,  
— annos-vastesuhde, mikäli mahdollista,  
— mahdolliset tilastolliset analyysit,  
— rinnakkaisista negatiivisista (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisista 
kontrolleista saadut tulokset,  
— aikaisemmat negatiivisista (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisista 
kontrolleista saadut tutkimustulokset, myös vaihteluvälit, keski ­
arvot ja keskihajonnat,  
— mutaatiofrekvenssi.  
Tulosten pohdinta.  
Johtopäätökset.  
4. KIRJALLISUUTTA  
(1) Moore, M. M, DeMarini, D. M., DeSerres, F. J. and Tindall, 
K. R. (Eds.) (1987),  Banbury Report 28: Mammalian Cell 
Mutagenesis,  Cold Spring Harbor Laboratory, New York.  
(2) Chu, E. H. Y. and Mailing, H. V. (1968), Mammalian Cell 
Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells  In Vitro, Proc. Natl Acad. Sci.,  USA, 
61, s. 1306–1312.
 
(3) Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the 
Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts,  
Mutation Res ., 94, s. 467–485.  
(4) Moore, M. M., Harington-Brock, K., Doerr, C. L. and Dearfi ­
eld, K. L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the 
Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Lori,  Mutagenesis , 
4, s. 394–403.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 363
 
(5) Aaron, C. S. and Stankowski. Jr. L. F. (1989). Comparison of 
the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of 
Six Drug Candidates,  Mutation Res.,  223, s. 121–128.  
(6) Aaron, G S., Bolcsfoldi, G.. Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, 
Y., Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Re ­
port. Report of the International Workshop on Standardisation 
of Genotoxicitv Test Procedures,  Mutation Res.,  312, 
s. 235–239.
 
(7) Scott, D, Galloway, S. M., Marshall, R. K., Ishidate, M., Bru ­
sick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicitv 
Under Extremc Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation  Res.,  257, s. 147–204.
 
(8) Clive. D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavo ­
urnin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells 
in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program,  Mutation Res.,  115, s. 225–251.
 
(9) Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. 
(1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster 
Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase Sys ­
tem to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection 
Agcncy Gene-Tox Program,  Mutation Res.,  196, s. 17–36.
 
(10) Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. 
S., Loveday, K. S., O'Neill, J. P., Riddle, J. C., Standkowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance 
of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine 
Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay,  Mutation 
Res.,  189, s. 135–141.
 
(11) Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Com ­
parison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in 
Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are 
Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus,  Mutation Res.,  216, s. 9–17.
 
(12) Stankowski, L. F. Jr., Tindall, K. R. and Hsie, A. W. (1986), 
Quantitative and Molecular Anaylses of Ethyl Methanosulpho ­
nate — and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate — and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells,  Mutation Res.,  160, s. 133–147.
 
(13) Turner, N. T., Batson, A. G. and Clive, D. (1984), Procedures 
for the L5178Y/TK  +/- — TK  +/- Mouse Lymphoma Cell Muta ­
genicity Assay, in: Kilbey, B. J. et al. (eds.)  Handbook of 
Mutagenicity Test Procedures,  Elsevier Science Publishers, 
New York, s. 239–268.  
(14) Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., 
Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith, J. C. (1989), Mamma ­
lian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formati ­
on, in:  Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data,  Kirk­
land, D. J., Ed., Cambridge University Press, s. 66–101.  
(15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, 
N. and Mazzaccaro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine- 
Rcsistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse- 
Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine,  Mutation 
Res.,  46, s. 365–373.  
(16) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test,  Mutation Res.,  31, 
s. 347–364.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 364
 
(17) Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. E. S., Batson, A. G. and 
Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of 
the L5178/TK  +/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System,  
Mutat. Res.,  59, s. 61–108.  
(18) Maron, D. M. and Ames, B. N. (198 3), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test,  Mutation Res.,  113, 
s. 173–215.  
(19) Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Catehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), 
Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genoto ­
xicity Assays,  Mutagenesis,  7, s. 175–177.  
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as 
an Inducer of Metabolic Activation System, in:  In Vitro Meta ­
bolic Activation in Mutagenesis Testing,,  de Serres, F. J., 
Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), Elsevier, North-Holland, s. 85–88.
 
(21) Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooney, K. T. (1982), 
CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Vola ­
tile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds),  
Genotoxic Effects of Airborne Agents,  New York, Plenum, 
s. 91–103.  
(22) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. 
(1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Crown 
on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in 
the CHO/HGPRT Mutation Assay,  Environmental Mutagene ­
sis, 5, s. 795–801.  
(23) Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. 
and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at 
the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymp ­
homa Cells,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA,  87, s. 51–55.  
(24) Moore, M. M., Clive, D., Hozier, J. C, Howard, B. E., Batson, 
A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trif ­
luorothymidine-Resistant TFT  r Mutants of L5178Y/TK  +/- 
Mouse Lymphoma Cells,  Mutation Res.,  151, s. 161–174.  
(25) Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular 
Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous 
Autosomal Locus in Human Cells,  Mutation Res.,  229, 
s. 89–102.  
(26) Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chro ­
mosome Aberration Frequency and Small-Colony TK-Defici ­
ent Mutant Frequency in L5178Y/TK  +/- — 3.7.2C Mouse 
Lymphoma Cells,  Mutagenesis,  5, s. 609–614.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 365
 
B.18.  DNA-VAURIO JA SEN KORJAANTUMINEN — UDS-TESTI 
NISÄKÄSSOLUVILJELMÄLLÄ  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.2 MÄÄRITELMÄ  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Ei ole.  
1.4 TESTIN PERIAATE  
UDS-testissä (Unscheduled DNA Synthesis test) nisäkässolu altiste ­
taan kemiallisille tai fysikaalisille tekijöille, minkä jälkeen näiden mahdollisesti vaurioittama DNA-segmentti leikkautuu irti ja poistuu kromosomista. Testi perustuu tritiumilla leimatun tymidiinin (
 3 H- 
TdR) sitoutumiseen nisäkässolun DNA:han solunjakautumissyklin 
S-vaiheen ulkopuolella.  3 H-TdR:n sitoutuminen voidaan todeta altis ­
tettujen solujen DNA:sta autoradiografisesti tai nestetuikelaskennalla. Testissä altistetaan primaarisia rotan maksasoluja tai nisäkässoluvil ­
jelmä tutkittavalle aineelle sekä ilman metabolista aktivaatiota että 
eksogeenisen metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa. UDS- testi voidaan myös suorittaa  in vivo.
 
1.5 LAATUKRITEERIT  
Ei ole.  
1.6 TESTIN KUVAUS  
Testin valmistelu  
Tutkittava aine ja kontrolli- tai vertailuaineet on sekoitettava kasva ­
tusalustaan tai liuotettava tai sekoitettava soveltuvaan kantaja-ainee ­
seen ja sen jälkeen edelleen kasvatusalustaan testiä varten. Kantaja- 
aineen loppupitoisuus ei saa vaikuttaa solujen elinkykyyn.  
Testissä voidaan käyttää primaarisia rotan maksasoluviljelmiä, pri ­
maarisia ihmisen lymfosyyttiviljelmiä tai pysyviä solulinjoja (esim. ihmisen diploidisia fibroblasteja).
 
Solut on altistettava tutkittavalle aineelle sekä ilman metabolista ak ­
tivaatiota että soveltuvan metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäol ­
lessa.  
Koeolosuhteet  
S o l u v i l j e l m i e n l u k u m ä ä r ä  
Autoradiografiaa käytettäessä tarvitaan ainakin kaksi ja nestetuikelas ­
kentaa käytettäessä kuusi (tai vähemmän, mikäli tämä on tieteellisesti 
perusteltua) soluviljelmää kutakin parametriyhdistelmää kohti.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 366
 
N e g a t i i v i s e t j a p o s i t i i v i s e t k o n t r o l l i t  
Kuhunkin kokeeseen on sisällyttävä samanaikaisia positiivisia ja ne ­
gatiivisia (altistamattomia ja/tai kantaja-aineelle altistettuja) kontrol ­
leja sekä ilman metabolista aktivaatiota että metabolisen aktivaatio ­
järjestelmän läsnäollessa.  
Rotan maksasoluilla suoritettavan testin positiivisia kontrolleja voivat 
olla esimerkiksi 7,12-dimetyylibentsantraseeni (7,12-DMBA) tai 2- 
asetyyliaminofluoreeni (2-AAF). Pysyvien solulinjojen osalta 4-nitro ­
kinoliini-N-oksidi (4-NQO) on esimerkki positiivisesta kontrollista, jota voidaan käyttää ilman metabolista aktivaatiota autoradiografisesti tai nestetuikelaskennalla suoritettavissa testeissä; N-dimentyylinitrosa ­
miini puolestaan on esimerkki positiivisesta kontrolliyhdisteestä, jota 
käytetään metabolisten aktivaatiojärjestelmien läsnäollessa.
 
A l t i s t u s p i t o i s u u d e t  
Tutkittava aine on testattava useana eri pitoisuutena, siten että käy ­
tetty pitoisuusalue mahdollistaa annos/vastesuhteen selvittämisen. 
Korkeimmalla pitoisuudella on oltava jonkinasteinen sytomyrkkyvai ­
kutus. Huonosti veteen liukenevilla aineilla pitoisuus määräytyy liu ­
koisuuden mukaan. Vesiliukoisten myrkyttömien aineiden korkein 
tutkittava pitoisuus on päätettävä tapauskohtaisesti.  
S o l u t  
Soluviljelmien kasvatuksessa on käytettävä soveltuvia kasvatusalus ­
toja, CO  2 -pitoisuuksia, lämpötiloja ja kosteusarvoja. Pysyvät solulin ­
jat on tarkastettava ajoittain  Mycoplasma -kontaminaation varalta.  
M e t a b o l i n e n a k t i v a a t i o  
Primaarisissa maksasoluviljelmissä ei käytetä metabolista aktivaatio ­
järjestelmää. Pysyvät solulinjat ja lymfosyytit altistetaan tutkittavalle aineelle sekä ilman metabolista aktivaatiota että soveltuvan metabo ­
lisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa.
 
Testin suorittaminen  
S o l u v i l j e l m i e n p e r u s t a m i n e n  
Testissä käytettävät pysyvät solulinjat erotetaan kantaviljelmistä 
esim. trypsiinin avulla tai ravistelemalla, kylvetään kasvatusastioihin 
sopivaan tiheyteen ja inkuboidaan 37  o C:ssa.  
Rotan maksasoluista tehdään lyhytaikaisviljelmät antamalla vastaero ­
teltujen maksasolujen kiinnittyä kasvupinnalle soveltuvassa kasvu ­
alustassa.  
Ihmisen lymfosyyttiviljelmät perustetaan soveltuvin menetelmin.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 367
 
S o l u v i l j e l m i e n a l t i s t a m i n e n t u t k i t t a v a l l e a i ­
n e e l l e  
Primaariset rotan maksasolut:  
Vastaeristettyjä rotan maksasoluja altistetaan sopivan pituiseksi 
ajaksi tutkittavalle aineelle alustassa, joka sisältää  3 H-TdR:ä. Altis ­
tuksen jälkeen kasvatusalusta poistetaan kasvatusastiasta, ja solut 
huuhdellaan, fiksoidaan ja kuivataan. Objektilasit kastetaan auto ­
radiografiaemulsioon (vaihtoehtoisesti voidaan käyttää valmista ”st ­
ripping”-filmiä) ja valottumisajan jälkeen lasit kehitetään, värjätään 
ja lasketaan.  
Pysyvät solulinjat ja lymfosyytit:  
Autoradiografiset menetelmät:  Soluviljelmiä altistetaan sopivaksi 
ajaksi tutkittavalle aineelle, minkä jälkeen ne käsitellään  3 H-TdR:llä. 
Altistus- ja käsittelyajat määräytyvät tutkittavan aineen luonteen, me ­
taboliajärjestelmien aktiivisuuden ja solutyypin mukaan. Maksimaa ­
lisen S-vaiheen ulkopuolisen DNA-synteesin (unscheduled DNA- 
synthesis) havaitsemiseksi tulee  3 H-TdR lisätä kasvatusalustaan 
yhtä aikaa kuin tutkittava aine tai muutama minuutti tutkittavalle aineelle altistuksen jälkeen. Tutkittavan aineen ja
 3 H-TdR:n väliset 
mahdolliset vuorovaikutukset vaikuttavat valintaan näiden kahden 
menetelmän välillä. S-vaiheen ulkopuolisen DNA-synteesin ja semi ­
konservatiivisen DNA-replikaation erottamiseksi toisistaan jälkim ­
mäinen voidaan estää esimerkiksi käyttämällä kasvatusalustaa, josta 
puuttuu arginiini tai jonka seerumipitoisuus on alhainen tai joka 
sisältää hydroksiureaa.  
S-vaiheen ulkopuolisen DNA-synteesin mittaaminen nestetuikelasken ­
nan avulla:  Ennen solujen altistamista tutkittavalle aineelle solunja ­
kautumisen S-vaiheen alkaminen estetään edellä kuvatulla tavalla, minkä jälkeen altistaminen suoritetaan samoin kuin autoradiografiaa 
käytettäessä. Inkubaation jälkeen DNA eristetään soluista, ja DNA:n 
kokonaismäärä sekä sitoutuneen
 3 H-TdR:n määrä mitataan.  
On huomattava, että semikonservatiivisen DNA-replikaation estämi ­
nen ei ole tarpeen stimuloimattomissa ihmisen lymfosyyttiviljelmissä.  
Analyysi  
A u t o r a d i o g r a f i n e n m ä ä r i t y s  
S-vaiheessa olevat tumat jätetään laskennan ulkopuolelle määritettä ­
essä viljeltyjen solujen S-vaiheen ulkopuolista DNA-synteesiä. Ku ­
takin tutkittavan aineen pitoisuutta kohti on laskettava vähintään 50 
solua. Objektilasit on kooditettava ennen laskemista. Kultakin lasilta 
lasketaan useita sattumanvaraisesti valittuja, selvästi toisistaan eril ­
lään olevia näkökenttiä. Sytoplasmaan sitoutunut  3 H-TdR määrite ­
tään laskemalla kolme tuman suuruista sytoplasma-aluetta kustakin 
laskettavasta solusta.  
N e s t e t u i k e l a s k e n t a a n p e r u s t u v a m ä ä r i t y s  
Nestetuikelaskentaa käytettäessä on kutakin pitoisuutta ja kontrollia 
kohti oltava riittävä määrä rinnakkaisia soluviljelmiä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 368
 
Kaikki tulokset on varmistettava erillisellä kokeella.  
2. TULOKSET  
Tulokset on esitettävä taulukkomuodossa.  
2.1 AUTORADIOGRAFINEN MÄÄRITYS  
3 H-TdR:n sitoutuminen sytoplasmaan ja tuman kohdalla olevien va ­
lottuneiden pisteiden lukumäärä on esitettävä erikseen.  
3 H-TdR:n sytoplasmaattisen sitoutumisen ja tumassa olevien valottu ­
neiden pisteiden lukumäärän jakautumia voidaan kuvata keskiarvolla, 
mediaanilla ja moodilla.  
2.2 NESTETUIKELASKENTAAN PERUSTUVA MÄÄRITYS  
Ilmoitettaessa sitoutuneen  3 H-TdR:n määrää nestetuikelaskentaan pe ­
rustuvassa määrityksessä tulee yksikkönä olla dpm/ μg DNA. Sitou ­
tuneen  3 H-TdR:n määrän jakautumaa kuvaamaan voidaan käyttää 
saatujen dpm/| μg DNA -lukemien keskiarvoa ja keskihajontaa.  
Tulosten merkitsevyys on arvioitava soveltuvin tilastollisin menetel ­
min. 
3. RAPORTOINTI  
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tie ­
dot: 
— käytetyt solut, solutiheys ja altistettujen jatkoviljelmien järjestys ­
luku, soluviljelmien lukumäärä,  
— soluviljelmien ylläpitomenetelmät, kuten kasvatusalusta, lämpö ­
tila ja CO  2 -pitoisuus,  
— tutkittu aine, kantaja-aine, testissä käytetyt pitoisuudet ja pitoi ­
suuksien valinnassa käytetyt perusteet,  
— metabolisten aktivaatiojärjestelmien yksityiskohtainen kuvaus,  
— altistusohjelma,  
— positiiviset ja negatiiviset kontrollit,  
— käytetty autoradiografiamenetelmä,  
— solunjakautumisen S-vaiheen estämisessä käytetyt menetelmät,  
— DNA:n eristämisessä ja kokonais-DNA:n määrittämisessä käyte ­
tyt menetelmät nestetuikelaskentaan perustuvassa testissä,  
— annos/vastesuhde mikäli mahdollista,  
— tulosten tilastollinen käsittely,  
— tulosten pohdinta,  
— tulosten tulkinta.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 369
 
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
4. LÄHDELUETTELO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 370
 
B.19.  SISARKROMATIDIVAIHDOSTESTI  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Ei ole.  
1.4 TESTIN PERIAATE  
Sisarkromatidivaihdostesti (Sister Chromatid Exchange, SCE) on ly ­
hytaikainen testi kahdentuvan kromosomin sisarkromatidien kesken tapahtuvan DNA:n vaihtumisen toteamiseksi. Sisarkromatidivaihdok ­
sessa tapahtuu DNA:n replikaatiotuotteiden vaihtumista kahden, il ­
meisesti homologisen lokuksen välillä. Vaihtumistapahtumassa olete ­
taan DNA-ketjun katkeavan ja liittyvän uudelleen yhteen, vaikka ilmiön molekyylitason tapahtumia ei juuri tunneta. Sisarkromatidi ­
vaihdosten toteaminen edellyttää sisarkromatidien differentiaalileima ­
usta, joka suoritetaan antamalla bromodeoksiuridiinin sitoutua kro ­
mosomaaliseen DNA:han kahden solusyklin ajan.
 
Nisäkässoluviljelmä altistetaan tutkittavalle aineelle tarpeen mukaan 
sekä ilman metabolista aktivaatiota että nisäkäsperäisen eksogeenisen 
metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa. Soluviljelmää kasva ­
tetaan kahden DNA:n replikaatiosyklin ajan alustassa, joka sisältää bromodeoksiuridiinia. Soluja käsitellään tämän jälkeen tumasukkulan muodostumisen inhibiittorilla (esim. kolkisiinilla) solujen pysäyttämi ­
seksi mitoosin metafaasivaiheeseen (c-metafaasiin), minkä jälkeen 
solut kerätään ja niistä tehdään kromosomipreparaatit.
 
1.5 LAATUKRITEERIT  
Ei ole.  
1.6 TESTIN KUVAUS  
Testin valmistelu  
— Testissä voidaan käyttää primaarisia soluviljelmiä, (ihmisen lym ­
fosyyttejä) tai pysyviä solulinjoja (esim. kiinanhamsterin ovario ­
soluja). Solulinjat on tarkastettava  Mycoplasma -kontaminaation 
varalta.  
— Testissä on käytettävä soveltuvia kasvatusalustoja ja inkubaatio- 
olosuhteita (esim. lämpötila, kasvatusastiat, CO  2 - pitoisuus ja 
kosteus).  
— Tutkittavat aineet voidaan sekoittaa kasvatusalustaan tai liuotet ­
tava tai sekoitettava soveltuviin kantaja-aineisiin ennen solujen 
altistamista. Kantaja-aineen loppupitoisuus kasvatusastiassa ei saa merkitsevästi vaikuttaa solujen elinkykyyn tai kasvunopeu ­
teen, ja sen vaikutusta sisarkromatidivaihdosfrekvenssiin on seu ­
rattava kontrollikokeella, jossa altisteena on tutkittavan aineen 
kantaja-aine.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 371
 
— Solut on altistettava tutkittavalle aineelle sekä ilman metabolista 
aktivaatiota että nisäkäsperäisen eksogeenisen metabolisen akti ­
vaatiojärjestelmän läsnäollessa. Jos käytetään solutyyppejä, joilla on itsessään kyky metaboloida vierasaineita, tämän metabolisen aktiivisuuden on oltava nopeudeltaan ja luonteeltaan tutkittavalle 
aineryhmälle soveltuva.
 
Koeolosuhteet  
S o l u v i l j e l m i e n l u k u m ä ä r ä  
Kutakin parametriyhdistelmää kohti on oltava ainakin kaksi rinnak ­
kaista soluviljelmää.  
N e g a t i i v i s e t j a p o s i t i i v i s e t k o n t r o l l i t  
Kuhunkin kokeeseen on sisällyttävä sekä suoraan vaikuttavia että 
metabolista aktivaatiota vaativia positiivisia kontrolleja; myös kanta ­
ja-ainekontrollia on käytettävä.  
Seuraavat ovat esimerkkejä aineista, joita voidaan käyttää positii ­
visina kontrolleina:  
— suoraan vaikuttava aine:  
— etyylimetaanisulfonaatti,  
— epäsuorasti vaikuttava aine:  
— syklofosfamidi  
Tarvittaessa kokeessa voidaan lisäksi käyttää ylimääräistä positiivista 
kontrollia, joka kuuluu samaan kemiallisten aineitten ryhmään kuin 
tutkittava aine.  
A l t i s t u s p i t o i s u u d e t  
Tutkittava aine on testattava vähintään kolmena eri pitoisuutena, 
joiden keskinäiset erot ovat sopivat. Korkeimmalla pitoisuudella on 
oltava merkitsevä myrkkyvaikutus, mutta se ei saa silti estää riittävää 
solunjakautumista. Huonosti veteen liukenevilla aineilla pitoisuus määräytyy liukoisuuden mukaan. Vesiliukoisten myrkyttömien ainei ­
den korkein tutkittava pitoisuus on päätettävä tapauskohtaisesti.
 
Testin suorittaminen  
S o l u v i l j e l m i e n p e r u s t a m i n e n  
Testissä käytettävät pysyvät solulinjat erotetaan kantaviljelmistä 
esim. trypsiinin avulla tai ravistelemalla, kylvetään kasvatusastioihin 
sopivaan tiheyteen ja inkuboidaan 37  o C:ssa. Yksikerrosviljelmissä 
solujen lukumäärä kasvatusastiaa kohti on säädettävä siten, että vil ­
jelmien konfluenttisuus ei juuri ylitä 50 prosenttia solujen keräyshet ­
kellä. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää suspensioviljelmiä. Ihmisen 
lymfosyyttiviljelmät perustetaan heparinisoidusta verestä soveltuvin 
menetelmin, ja viljelmiä inkuboidaan 37  o C:ssa.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 372
 
A l t i s t u s  
Eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa olevat solut altistetaan sopivaksi 
ajaksi tutkittavalle aineelle; useimmissa tapauksissa 1–2 tuntia voi olla riittävä, mutta tietyissä tapauksissa altistusaikaa voidaan pidentää aina kahteen täyteen solunjakautumissykliin saakka. Solut, joilla ei 
itsessään ole riittävää kykyä metaboloida vierasaineita, on altistettava 
tutkittavalle aineelle sekä ilman metabolista aktivaatiota että soveltu ­
van metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa. Altistuksen jäl ­
keen solut huuhdellaan puhtaiksi tutkittavasta aineesta ja niitä viljel ­
lään kahden solunjakautumissyklin ajan bromodeoksiuridiinin läsnä ­
ollessa. Vaihtoehtoisesti solut voidaan altistaa samanaikaisesti tutkit ­
tavalle aineelle ja bromodeoksiuridiinille siten, että kokonaisviljely ­
aika on kaksi solunjakautumissykliä.
 
Ihmisen lymfosyytit altistetaan niiden ollessa semisynkronisessa kas ­
vuvaiheessa.  
Solut analysoidaan niiden ollessa toisessa altistuksen alkamisen jäl ­
keisessä jakautumisvaiheessa, kun on varmistettu, että solunjakautu ­
missyklin herkimmät vaiheet ovat altistuneet tutkittavalle aineelle. 
Bromodeoksiuridiinia sisältävän DNA:n fotolysoitumisen minimoi ­
miseksi kaikkia bromodeoksiuridiinia sisältäviä soluviljelmiä on kä ­
siteltävä pimeässä tai heikossa hehkulampun valossa solujen kerää ­
miseen saakka.  
S o l u j e n k e r ä ä m i n e n  
Soluja käsitellään tumasukkulan muodostumisen inhibiittorilla (esim. 
kolkisiinilla) 1–4 tuntia ennen solujen keräämistä. Jokaisen viljelmän solut kerätään ja käsitellään erikseen kromosomipreparaattien valmis ­
tamiseksi.
 
K r o m o s o m i p r e p a r a a t t i e n v a l m i s t u s j a v ä r j ä y s  
Kromosomipreparaatit valmistetaan normaalein sytogeneettisin mene ­
telmin. Objektilasien värjäys sisarkromatidivaihdosten osoittamiseksi voidaan tehdä useilla eri menetelmillä (esim. fluoresenssi + Giemsa- 
värjäys).
 
A n a l y y s i  
Analysoitavien solujen lukumäärä perustuu kontrolliviljelmien spon ­
taaniin sisarkromatidivaihdosfrekvenssiin. Yleensä kustakin viljel ­
mästä lasketaan ainakin 25 hyvin levinneen metafaasin sisarkromati ­
divaihdokset. Objektilasit koodataan ennen analyysiä. Ihmisen lym ­
fosyyteistä analysoidaan ainoastaan 46 sentromeeriä sisältävät meta ­
faasit. Pysyvistä solulinjoista analysoidaan ainoastaan metafaasit, joi ­
den sentromeerien lukumäärä on moodi ± 2. Tuloksissa on ilmaista ­
va, onko sentromeerin kohdalla havaittu leiman vaihtuminen tulkittu 
sisarkromatidivaihdokseksi vai ei. Tulokset on varmistettava erilli ­
sellä kokeella.  
2. TULOKSET  
Tulokset on esitettävä taulukkomuodossa. Sisarkromatidivaihdosten 
lukumäärä kussakin metafaasissa ja sisarkromatidivaihdosten keski ­
määräinen lukumäärä kromosomia kohti kussakin metafaasissa on 
kirjattava erikseen kunkin altistetun viljelmän ja kontrolliviljelmän osalta.
 
Tulosten merkitsevyys on arvioitava soveltuvin tilastollisin menetel ­
min. ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 373
 
3. RAPORTOINTI  
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tie ­
dot: 
— käytetyt solut, soluviljelmien ylläpitomenetelmät,  
— koeolosuhteet: kasvatusalustojen koostumus, CO  2 -pitoisuus, tut ­
kitun aineen pitoisuus, käytetty kantaja-aine, inkubaatiolämpötila, 
altistusaika, käytetty tumasukkulan muodostumisen inhibiittori ja sen pitoisuus sekä käsittelyaika, käytetty nisäkäsperäinen aktivaa ­
tiojärjestelmä, positiiviset ja negatiiviset kontrollit,
 
— viljelmien lukumäärä parametriyhdistelmää kohti,  
— kromosomipreparaattien valmistusmenetelmän yksityiskohtainen 
kuvaus,  
— analysoitujen metafaasien lukumäärä (erikseen kustakin soluvil ­
jelmästä),  
— sisarkromatidivaihdosten keskimääräinen lukumäärä solua kohti 
ja kromosomia kohti (erikseen kustakin soluviljelmästä),  
— sisarkromatidivaihdosten laskentaperusteet,  
— annostusten valintaperusteet,  
— annos/vastesuhde mikäli mahdollista,  
— tulosten tilastollinen käsittely,  
— tulosten pohdinta,  
— tulosten tulkinta.  
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
4. LÄHDELUETTELO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 374
 
B.20.  RESESSIIVI LETAALI -TESTI BANAANIKARPÄSELLÄ  
(DROSOPHILA MELANOGASTER)  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.2 MÄÄRITELMÄ  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Ei ole.  
1.4 TESTIN PERIAATE  
Resessiivi letaali -testillä voidaan todeta pistemutaatiot ja pienet de ­
leetiot banaanikärpäsen ituradan soluissa. Testillä havaitaan mutaatiot noin 800:ssa X-kromosomin lokuksessa, jotka muodostavat noin 80 % kaikista X-kromosomin lokuksista. X-kromosomi puolestaan 
edustaa noin yhtä viidesosaa banaanikärpäsen koko haploidisesta 
perintöaineksesta.
 
Banaanikärpäsen X-kromosomissa tapahtuvat mutaatiot ilmenevät 
mutanttigeeniä kantavien koiraiden fenotyypissä. Jos mutaatio on 
hemitsygoottisena letaali, mutaation tapahtuminen voidaan päätellä 
siitä, että jälkeläissukupolvesta puuttuu toinen niistä kahdesta koiras ­
tyypistä, jotka normaalisti esiintyvät heterotsygoottisen naaraan jäl ­
keläisten joukossa. Resessiivi letaali -testissä näitä ilmiöitä hyödyn ­
netään spesifisiä markkereita ja uudelleen järjestynyttä geenimateri ­
aalia sisältävien kromosomien avulla.  
1.5 LAATUKRITEERIT  
Ei ole.  
1.6 TESTIN KUVAUS  
Testin valmistelu  
K a n n a t  
Testissä voidaan käyttää hyvin kuvaillun villikannan koiraita ja Mul ­
ler-5-kannan naaraita. Myös muita sopivalla tavalla merkittyjä naa ­
raskantoja, joilla on multippeleita inversioita X-kromosomeissa, voi ­
daan käyttää.  
T u t k i t t a v a a i n e  
Tutkittava aine on liuotettava veteen. Veteen liukenemattomat aineet 
voidaan liuottaa tai sekoittaa soveltuviin kantaja-aineisiin (esim. eta ­
nolin ja Tween-60:n tai Tween-80:n seokseen) ja sen jälkeen laimen ­
taa vedellä tai suolaliuoksella ennen kärpäsille antamista. Dimetyy ­
lisulfoksidin (DMSO:n) käyttöä kantaja-aineena tulee välttää.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 375
 
K ä r p ä s t e n l u k u m ä ä r ä  
Testi on suunniteltava etukäteen määriteltyjen tilastollisten herkkyys- 
ja tehokkuusvaatimusten mukaisesti. Sopivalla kontrollikokeella to ­
dettu spontaanimutaatiofrekvenssi vaikuttaa suuresti analysoitavien altistettujen kromosomien lukumäärään.
 
A n t o t a p a  
Altistus voidaan toteuttaa antamalla altiste suun kautta, ruiskeena tai 
kaasu- tai höyryaltistuksena. Tutkittava aine voidaan syöttää sokeri ­
liuoksessa. Tarpeen mukaan aineet voidaan liuottaa 0,7 % NaCl- 
liuokseen ja injektoida rintakehään tai vatsaan.  
N e g a t i i v i s e t j a p o s i t i i v i s e t k o n t r o l l i t  
Testiin on sisällytettävä negatiivisia (kantaja-ainekontrolleja) ja posi ­
tiivisia kontrolleja. Jos kuitenkin on käytettävissä laboratoriokohtai ­
set oletusarvot (laboratory historical Control data), samanaikaisia negatiivisia kontrolleja ei tarvita.
 
A l t i s t u s t a s o t  
Testissä on käytettävä kolmea eri altistustasoa. Alustavassa tutkimuk ­
sessa voidaan tutkittavasta aineesta käyttää yhtä altistustasoa, jonka on oltava suurin siedetty pitoisuus tai pitoisuus, jolla on joitakin myrkkyvaikutuksia. Myrkyttömien aineitten kohdalla on käytettävä 
suurinta pitoisuutta, joka on käytännössä mahdollinen.
 
T e s t i n s u o r i t t a m i n e n  
Villikoiraat (ikä 3–5 vrk) altistetaan tutkittavalle aineelle, minkä jäl ­
keen niiden kunkin annetaan pariutua useiden Muller-5-kannan tai 
jonkin muun asianmukaisesti (multippeleilla X-kromosomi-inversioil ­
la) merkityn kannan nuorten naaraiden kanssa. Naaraat vaihdetaan uusiin joka toinen tai kolmas vuorokausi koko sukusolusyklin katta ­
miseksi. Naaraiden jälkeläisten laskennalla havaittavat letaalivaiku ­
tukset voidaan luokitella valmiisiin siittiöihin, keski- tai myöhäisas ­
teen spermatideihin, varhaisasteen spermatideihin, spermatosyytteihin ja spermatogonioihin kohdistuneista altistusvaikutuksista johtuviksi.
 
Edellä kuvatusta risteytyksestä saatujen heterotsygoottisten F  1 -polven 
naaraiden annetaan kunkin pariutua (so. yksi naaras kussakin kasva ­
tuspullossa) saman jälkeläisparven koiraiden kanssa. F  2 -polvessa ku ­
kin kärpäsviljelmä tarkastetaan villikoiraiden puuttumisen toteami ­
seksi. Jos jokin viljelmä näyttää saaneen alkunsa sellaisesta F  1 -naa­
raasta, joka on edellisestä polvesta saanut letaalimutaation sisältävän 
X-kromosomin (eli viljelmässä ei havaita lainkaan koiraita, joilla olisi altistettu X-kromosomi), tällaisen naaraan naaraspuoliset, saman genotyypin omaavat jälkeläiset on testattava, jotta nähdään, toistuuko 
letaalivaikutus seuraavassa sukupolvessa.
 
2. TULOKSET  
Tulokset on taulukoitava siten, että niistä ilmenee testattujen X-kro ­
mosomien lukumäärä, steriilien koiraiden lukumäärä sekä kullakin altistuspitoisuudella ja pariutumisjaksolla havaittujen letaalikromoso ­
mien lukumäärä kullakin altistetulla koiraalla. Tuloksissa on ilmais ­
tava myös letaalimutaatioiden lukumäärien jakautuma koirasta kohti. 
Nämä tulokset on varmistettava erillisellä kokeella.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 376
 
Resessiivinen letaali -testien tulosten merkitsevyys on arvioitava so ­
veltuvin tilastollisin menetelmin. Resessiivisten letaalimutaatioiden 
kasaantuminen yhden koiraan kohdalle on otettava huomioon ja kä ­
siteltävä soveltuvin tilastollisin menetelmin.  
3. RAPORTOINTI  
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tie ­
dot: 
— kanta: käytetyt banaanikärpäskannat, hyönteisten ikä, altistettujen 
koiraiden lukumäärä, steriilien koiraiden lukumäärä, perustettujen 
F 2 -viljelmien lukumäärä, jälkeläisiä tuottamattomien F  2 -viljel­
mien lukumäärä, kussakin sukusolusyklin vaiheessa letaalimutaa ­
tion saaneiden kromosomien lukumäärä,  
— altistettavien ryhmien koon määrittelyssä käytetyt perusteet,  
— koeolosuhteet: altistus- ja näytteenotto-ohjelman yksityiskohtai ­
nen kuvaus, altistustasot, tiedot myrkyllisyydestä, negatiiviset 
(liuotinkontrollit) ja mahdolliset positiiviset kontrollit,  
— käytetyt letaalimutaation kriteerit,  
— altistus/vastesuhde, jos mahdollista,  
— tulosten tilastollinen käsittely,  
— tulosten pohdinta,  
— tulosten tulkinta.  
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
4. LÄHDELUETTELO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 377
 
B.21.  SOLUTRANSFORMAATIOTESTIT NISÄKÄSSOLUVILJELMILLÄ  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.2 MÄÄRITELMÄ  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Ei ole.  
1.4 TESTIN PERIAATE  
Nisäkässoluviljelmillä voidaan tutkia  in vitro  sellaisten aineitten ai ­
kaansaamia fenotyyppisiä muutoksia, jotka  in vivo  aiheuttavat pahan ­
laatuista transformaatiota. Laajassa käytössä olevia soluja ovat mm. 
C3H10T  1/2 , 3T3, SHE ja Fischer rotan solut. Testit perustuvat solu ­
jen morfologian muutoksiin, fokusten muodostukseen tai muutoksiin kasvukyvyn pehmytagarissa. On olemassa myös vähäisemmässä käy ­
tössä olevia testejä, joilla voidaan tutkia muita, karsinogeenisille ai ­
neille altistumisen aiheuttamia fysiologisia tai morfologisia muutok ­
sia soluissa. Millään  in vitro  -testeissä havainnoidulla tulostapahtu ­
malla ei ole osoitettu olevan suoraa mekaanista yhteyttä syövän syn ­
tyyn. Joillakin testeillä voidaan havaita tuumoripromoottoreiden 
muodostuminen. Sytomyrkyllisyys voidaan todeta havainnoimalla tutkittavan aineen vaikutusta soluviljelmien pesäkkeenmuodostusky ­
kyyn (kloonaustehokkuuteen) tai kasvunopeuteen. Sytotoksisuuden 
mittauksen tarkoituksena on varmistaa, että altistustaso on toksiko ­
logisesti mielekäs, mutta kaikissa testeissä tätä mittausta ei voida käyttää transformaatiofrekvenssin laskemiseen, sillä eräät testit edel ­
lyttävät pitkää inkubaatiota ja/tai jatkomaljausta.
 
1.5 LAATUKRITEERIT  
Ei ole.  
1.6 TESTIN KUVAUS  
Testin valmistelu  
S o l u t  
Testeissä voidaan käyttää useita erilaisia solulinjoja tai primaarisoluja 
transformaatiotestistä riippuen. Tutkijan on varmistettava, että testissä käytettävissä soluissa ilmenee haluttu fenotyyppinen muutos tunne ­
tuille karsinogeeneille altistamisen jälkeen ja että testin kelpoisuus ja 
luotettavuus on osoitettu ja kirjattu tutkijan omassa laboratoriossa.
 
K a s v a t u s a l u s t a  
Kasvatusalustojen ja koeolosuhteiden on sovelluttava käytettävälle 
transformaatiotestille.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 378
 
T u t k i t t a v a a i n e  
Tutkittavat aineet voidaan sekoittaa kasvatusalustaan tai liuottaa tai 
sekoittaa soveltuvaan kantaja-aineeseen ennen solujen altistamista. Kantaja-aineen loppupitoisuus kasvatusalustassa ei saa vaikuttaa so ­
lujen elinkykyyn, kasvunopeuteen tai transformaatiofrekvenssiin.
 
M e t a b o l i n e n a k t i v a a t i o  
Solut on altistettava tutkittavalle aineelle sekä ilman metabolista ak ­
tivaatiota että soveltuvan metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäol ­
lessa. Jos käytetään solutyyppejä, joilla on itsessään kyky metabo ­
loida vierasaineita, tämän metabolisen aktiivisuuden on oltava luon ­
teeltaan tunnetusti soveltuva tutkittavalle aineryhmälle.  
Koeolosuhteet  
N e g a t i i v i s e t j a p o s i t i i v i s e t k o n t r o l l i t  
Kuhunkin kokeeseen on sisällyttävä sekä suoraan vaikuttavia että 
metabolista aktivaatiota vaativia positiivisia kontrolleja; myös nega ­
tiivista kontrollia (kantaja-ainekontrollia) on käytettävä.  
Seuraavassa esimerkkejä aineista, joita voidaan käyttää positiivisina 
kontrolleina:  
— suoraan vaikuttavat aineet:  
— etyylimetaanisulfonaatti,  
— μ-propiolaktoni,  
— metabolista aktivaatiota vaativat aineet:  
— 2-asetyyliaminofluoreeni,  
— 4-dimetyyliaminoatsobentseeni,  
— 7,12-dimetyylibentsantraseeni.  
Tarvittaessa kokeessa voidaan lisäksi käyttää ylimääräistä positiivista 
kontrollia, joka kuuluu samaan kemiallisten aineitten ryhmään kuin tutkittava yhdiste.
 
A l t i s t u s p i t o i s u u d e t  
Tutkittava aine on testattava useana eri pitoisuutena, joiden on saa ­
tava aikaan pitoisuudesta riippuva myrkkyvaikutus siten, että korkein 
pitoisuus aiheuttaa suuren solujen kuolleisuuden ja että alhaisimman 
pitoisuuden aiheuttama kuolleisuus on likimäärin sama kuin negatii ­
visen kontrollin aikaansaama. Huonosti veteen liukenevilla aineilla pitoisuus määräytyy liukoisuuden mukaan. Vesiliukoisten myrkyttö ­
mien aineiden korkein tutkittava pitoisuus on päätettävä tapauskoh ­
taisesti.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 379
 
Testin suorittaminen  
Solujen altistusajan on oltava käytettävään testiin sopiva; jos altistus ­
aika on pitkä, saattaa olla välttämätöntä sen kuluessa vaihtaa soluille tuore kasvatusalusta (ja mahdollisesti tuore metabolinen aktivaatiose ­
os) sekä annostella tutkittava aine uudelleen. Solut, joilla ei itsessään 
ole riittävää kykyä metaboloida vierasaineita, on altistettava tutkitta ­
valle aineelle sekä ilman metabolista aktivaatiota että soveltuvan metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa. Altistuksen jälkeen solut huuhdellaan puhtaiksi tutkittavasta aineesta ja niitä viljellään 
olosuhteissa, jotka mahdollistavat tarkasteltavana olevan transformoi ­
tuneen fenotyypin ilmaantumisen ja transformaatiofrekvenssin mää ­
rittämisen. Kaikki tulokset varmistetaan erillisellä kokeella.
 
2. TULOKSET  
Tulokset on esitettävä taulukkomuodossa. Tarkka esitysmuoto riip ­
puu käytetystä testistä, ja se voi sisältää esim. maljakohtaiset tulok ­
set, positiivisten maljojen lukumäärät tai transformoituneiden solujen 
lukumäärät. Kuolleisuus mahdollisuuksien mukaan on ilmaistava prosenttiosuutena kontrolliviljelmien solujen lukumäärästä ja trans ­
formaatiofrekvenssi transformoituneiden solujen osuutena eloonjää ­
neistä soluista. Tulosten merkitsevyys on arvioitava soveltuvin tilas ­
tollisin menetelmin.
 
3. RAPORTOINTI  
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tie ­
dot: 
— käytetty solutyyppi, soluviljelmien lukumäärä, soluviljelmien 
edelläpitomenetelmät,  
— koeolosuhteet: tutkittavan aineen pitoisuus, käytetty kantaja-aine, 
inkubaatioaika, altistuksen kesto ja toistokerrat, solutiheys altis ­
tuksen aikana, käytetty eksogeeninen metabolinen aktivaatiojär ­
jestelmä, positiiviset ja negatiiviset kontrollit, tarkasteltavana ol ­
leen fenotyypin kuvaus, mahdollisesti käytetty valikointimenetel ­
mä, annostuksen valinnassa käytetyt perusteet,  
— eloonjääneiden ja transformoituneiden solujen laskentamenetel ­
mä, 
— tulosten tilastollinen käsittely,  
— tulosten pohdinta,  
— tulosten tulkinta.  
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
4. LÄHDELUETTELO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 380
 
B.22.  DOMINOIVA LETAALITESTI JYRSIJÖILLÄ  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Ei ole.  
1.4 TESTIN PERIAATE  
Dominoivat letaalivaikutukset aiheuttavat alkio- tai sikiökuolemia. 
Kun kemialliselle aineelle altistus aiheuttaa dominoivia letaalivaiku ­
tuksia, on syytä olettaa, että aineella on testattavan lajin sukusoluihin 
kohdistuvia vaikutuksia. Dominoivia letaalivaikutuksia pidetään ylei ­
sesti kromosomivaurioista (rakenteellisista ja numeerisista poikkea ­
mista) johtuvina. Sikiökuolemat voivat myös johtua toksisista vaiku ­
tuksista, mikäli naaraat on altistettu.  
Tässä testissä altistetaan tavallisesti urokset testattavalle yhdisteelle ja 
pariutetaan altistamattomien ennen pariutumattomien naaraiden kans ­
sa. Sukusolujen eri asteita voidaan tutkia erikseen jaksottamalla pa ­
riuttamisvälit. Kuolleiden munasolujen lisääntyminen testiryhmän naarasta kohden verrattuna kontrolliryhmän naaraisiin osoittaa muna ­
solun kohdun seinämään kiinnittymisen jälkeen tapahtuneet menetyk ­
set. Ennen sitä tapahtuneet menetykset voidaan arvioida laskemalla munasarjojen keltarauhaset tai vertaamalla kiinnittyneiden munasolu ­
jen kokonaismäärää naarasta kohden testiryhmässä ja kontrolliryh ­
mässä. Dominoiva kokonaisletaalivaikutus on ennen ja jälkeen kiin ­
nittymisen kuolleitten munasolujen yhteismäärä. Se lasketaan vertaa ­
malla elävien kohdun seinämään kiinnittyneiden munasolujen määrää testiryhmän naarasta kohden vastaavasti kontrolliryhmän naarasta 
kohden. Tietyin väliajoin tapahtuva määrän väheneminen voi johtua 
solujen (spermatosyyttien ja spermatogonioiden) kuolemasta.
 
1.5 LAATUKRITEERIT  
Ei ole.  
1.6 TESTIN KUVAUS  
Testin valmistelu  
Jos mahdollista, testattavat aineet olisi liuotettava tai seostettava iso ­
toniseen suolaliuokseen. Veteen liukenemattomat kemikaalit liuote ­
taan sopivia liuottimia käyttäen. Liuottimella ei saa olla testattavaan 
kemikaaliin kohdistuvia vaikutuksia eikä myrkkyvaikutuksia. Käyt ­
töliuoksen on oltava vastavalmistettua.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 381
 
Koe-olosuhteet  
A n t o t a p a  
Testattava yhdiste annetaan tavallisesti yhtenä annoksena. Toistuvaa 
annostelua voidaan käyttää, jos aineen tiedossa olevat myrkkyvaiku ­
tukset edellyttävät sitä. Tavanomaiset antotavat ovat suun kautta 
ruokintaletkulla ja vatsaontelonsisäinen ruiske. Muitakin antotapoja 
voidaan käyttää.  
K o e - e l ä i m e t  
Rotta tai hiiri on suositeltavin eläinlaji. Terveet, täysin sukukypsät 
eläimet jaetaan satunnaisesti tutkimus- ja kontrolliryhmiin.  
L u k u m ä ä r ä j a s u k u p u o l i  
Altistettujen urosten lukumäärästä päätettäessä on otettava huomioon 
määritettävänä olevan biologisen ominaisuuden spontaani vaihtelu. 
Lukumäärän on perustuttava ennalta määritettyyn toteamisherkkyy ­
teen ja merkitsevyyteen. Tyypillisessä testissä on uroksia kussakin annosryhmässä oltava niin monta, että 30-50 naarasta tulee kanta ­
vaksi kunkin pariutumisajan kuluessa.
 
N e g a t i i v i s t e n j a p o s i t i i v i s t e n k o n t r o l l i e n k ä y t t ö  
Kuhunkin testiin on yleensä liitettävä positiivinen ja negatiivinen 
(liuotin) kontrolli. Jos kokeen suorittavassa laboratoriossa on käytet ­
tävissä äskettäin tehtyjen kokeiden positiivisia kontrollituloksia, näitä voidaan käyttää meneillään olevan testin positiivisen kontrollin ase ­
mesta. Positiivia kontrolliaineita on käytettävä alhaisina annoksina 
(esimerkiksi MMS:ää vatsaontelon sisäisesti 10 mg/kg) osoittamaan testiherkkyyttä.
 
A n n o s t a s o t  
Tavallisesti käytetään kolmea annostasoa. Korkeimman annoksen 
olisi aiheutettava altistetuissa koe-eläimissä myrkkyoireita tai lisään ­
tymiskyvyn alenemista. Eräissä tapauksissa pelkästään korkein kerta- 
annos saattaa olla riittävä.  
R a j a - a n n o s t e s t i  
Myrkyttömiä aineita käytetään 5 g/kg, kun annoskertoja on yksi, tai 
1 g/kg/päivä, kun annostelu on toistuvaa.  
Testin suorittaminen  
Altistustapoja on useita. Testattavan aineen antaminen kerta-annok ­
sena on yleisimmin käytetty tapa. Muitakin tapoja voidaan käyttää.  
Yksittäiset urokset pariutetaan peräkkäin yhden tai kahden altistamat ­
toman ja astuttamattoman naaraan kanssa määräajoin altistuksen jäl ­
keen. Naaraita on pidettävä uroksen luona vähintään yhden estrus ­
syklin ajan tai kunnes pariutumisen on todettu tapahtuneen emätti ­
messä esiintyvän sperman tai emätintulpan perusteella.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 382
 
Altistustapa määrää altistamisen jälkeen tapahtuvien pariutumisten 
määrän. Pariutumisia olisi oltava niin monta, että kaikista sukusolu ­
asteista saadaan näytteet altistuksen jälkeen.  
Naaraat lopetetaan tiineyden puolenvälin jälkeen ja kohdusta laske ­
taan kuolleet ja elävät sikiöt. Munasarjoista voidaan laskea keltarau ­
hasten määrä.  
2. TULOKSET  
Tulokset esitetään taulukkomuodossa, josta ilmenee urosten ja kan ­
tavien naaraiden sekä hedelmöittymättömien naaraiden lukumäärä. Jokaisen pariutumisen tulos esitetään kunkin yksittäisen uroksen ja naaraan osalta. Naaraiden osalta kirjataan pariutumisviikko, uroksen 
saama annostaso, elävien ja kuolleiden alkioiden luku.
 
Dominoivaa kokonaisletaalivaikutusta määritettäessä testiryhmän ja 
kontrolliryhmän kunkin naaraan elävien alkioiden määrää vertaillaan keskenään. Testiryhmän kuolleiden alkioiden suhde eläviin verrat ­
tuna kontrolliryhmän vastaavaan suhteeseen analysoidaan munasolun 
kohdun seinämään kiinnittymisen jälkeen tapahtuneiden menetysten määrittämiseksi.
 
Jos aineisto on käsitelty siten, että tuloksina ilmoitetaan varhaiset ja 
myöhäiset kuolemat, tämä on ilmoitettava taulukoissa selvästi. Jos 
menetykset ennen kohdun seinämään kiinnittymistä on arvioitu, tämä on ilmoitettava. Ennen kiinnittymistä tapahtuneet menetykset voidaan määrittää keltarauhasten ja munasolujen määrän välisenä erona tai 
kiinnittymisten määränä kohtua kohden kontrolliryhmän pariutumis ­
tuloksiin verrattuna.
 
Tulosten merkitsevyys arvioidaan soveltuvin tilastollisin menetelmin.  
3. RAPORTOINTI  
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tie ­
dot: 
— koe-eläinten laji, kanta, ikä ja paino, eläinten lukumäärä suku ­
puolta kohden koe- ja kontrolliryhmissä,  
— testattava aine, liuotin, käytetyt annostasot ja annostasojen valin ­
taperusteet, negatiiviset ja positiiviset kontrollit, tiedot myrkylli ­
syydestä,  
— altistustie ja annostelutapa,  
— pariutumisaikataulu,  
— pariutumisen toteamistapa,  
— eläinten lopettamisaika,  
— dominoivien letaalitekijöiden määritysperusteet,  
— annos/vastesuhde, jos sovellettavissa,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 383
 
— tilastollinen arviointi,  
— tulosten pohdinta,  
— tulosten tulkinta.  
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
4. LÄHDELUETTELO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 384
 
B.23.  NISÄKKÄIDEN SPERMATOGONIOIDEN KROMOSOMIPOIK ­
KEAVUUSTESTI  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä on sama kuin OECD TG 48 3, Mammalian Sper ­
matogonial Chromosome Aberration Test (1997).  
1.1 JOHDANTO  
Tämän nisäkkäiden spermatogonioilla tehtävän  in vivo  -kromosomi ­
poikkeavuustestin tarkoituksena on tunnistaa aineet, jotka aiheuttavat rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia nisäkkäiden spermatogoni ­
oissa (1) (2) (3) (4) (5). Rakenteelliset poikkeavuudet jakautuvat 
kahteen tyyppiin, kromosomi- ja kromatidipoikkeavuuksiin. Kemial ­
listen mutageenien aiheuttamat poikkeavuudet ovat useimmiten kro ­
matidityyppisiä, mutta myös kromosomityyppisiä poikkeavuuksia esiintyy. Tätä menetelmää ei ole suunniteltu numeeristen poikkea ­
vuuksien mittaamiseen, eikä sitä käytetä rutiinimaisesti tähän tarkoi ­
tukseen. Kromosomimutaatiot ja niihin liittyvät tapahtumat ovat syynä moniin ihmisen geneettisiin sairauksiin.
 
Tämä testi niittaa kromosomipoikkeavuuksia spermatogoniaalisissa 
itusoluissa, joten sen odotetaan voivan ennustaa itusolujen periytyviä mutaatioita.
 
Testissä käytetään yleensä jyrsijöitä. Tämä  in vivo  -sytogeneettinen 
testi paljastaa kromosomipoikkeavuudet spermatogonioiden mitoo ­
seissa. Tällä menetelmällä ei tutkita muita kohdesoluja.  
Spermatogonioiden kromatidityyppisten poikkeavuuksien havaitsemi ­
seksi on tutkittava ensimmäistä mitoottista solunjakautumista altis ­
tuksen jälkeen, ennen kuin nämä leesiot häviävät myöhemmissä so ­
lunjakautumisissa. Altistetuista spermatogoniaalisista kantasoluista voidaan saada lisätietoja tekemällä meioottisia kromosomianalyysejä 
kromosomityyppisten poikkeavuuksien toteamiseksi diakineesi-meta ­
faasi I:ssä altistettujen solujen muuttuessa spermatosyyteiksi.
 
Tällä  in vivo  -testillä pyritään selvittämään, vaikuttavatko somaattis ­
ten solujen mutageenit myös itusoluihin. Spermatogonioilla tehtävä testi soveltuu myös mutageenisuuden vaaran arvioimiseen, sillä siinä voidaan ottaa huomioon tekijöitä, jotka liittyvät  in vivo  metaboliaan, 
farmakokinetiikkaan ja DNA:n korjautumisprosesseihin.
 
Kiveksissä on yhtaikaa monia spermatogonioiden sukupolvia, joiden 
herkkyys kemiallisten aineiden vaikutuksille vaihtelee. Havaitut 
poikkeavuudet edustavat siten käsiteltyjen spermatogoniopopulaatioi ­
den kokonaisvastetta, jossa hallitsevassa asemassa ovat muita suu ­
rempina määrinä esiintyvät erilaistuneet spermatogoniot. Eri suku ­
polviin kuuluvien spermatogonioiden yhteys yleiseen verenkiertoon 
riippuu niiden sijainnista kiveksissä. Kaikki spermatogoniot eivät ole yhteydessä verenkiertoon Sertolin solujen muodostaman fysikaalisen ja fysiologisen esteen ja veri-kivesesteen vuoksi.
 
Jos on saatu viitteitä siitä, että tutkittava aine tai sen reaktiivinen 
metaboliitti ei pääse kohdekudokseen, tätä testiä ei pidä käyttää.  
Ks. myös Yleisjohdanto, osa B.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 385
 
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Kromatidipoikkeavuus:  rakenteellinen kromosomivaurio, joka ilme ­
nee yksittäisten kromatidien katkeamisena tai kromatidien katkeami ­
sena ja uudelleenyhtymisenä.  
Kromosomipoikkeavuus:  rakenteellinen kromosomivaurio, joka il ­
menee molempien kromatidien katkeamisena tai katkeamisena ja uu ­
delleenyhtymisenä samassa kohdassa.  
Aukko:  gap, akromaattinen leesio, joka on pienempi kuin yhden 
kromatidin leveys, ja johon liittyy minimaalinen kromatidien siirtymä.  
Numeerinen poikkeavuus:  testissä käytetyille eläimille tyypillisestä 
normaalista kromosomimäärästä poikkeava kromosomien lukumäärä.  
Polyploidia:  haploidisen kromosomimäärän (n) esiintyminen monin ­
kertaisena, muu kuin diploidinen kromosomimäärä (3n, 4n jne.).  
Rakenteellinen poikkeama:  kromosomirakenteen muutos, joka voi ­
daan havaita solunjakautumisen metafaasivaiheen mikroskooppitutki ­
muksella ja joka ilmenee deleetioina, kromosomien sisäisinä tai kro ­
mosomien välisinä tekijänvaihdoksina.  
1.3 TESTIN PERIAATE  
Eläimet altistetaan tutkittavalle aineelle soveltuvaa altistusreittiä käyt ­
täen ja lopetetaan sopivan ajan kuluttua altistuksesta. Ennen lopetta ­
mista eläimille annetaan ainetta, joka pysäyttää solunjakautumisen metafaasiin (esim. kolkisiini tai Colcemid
 ® ). Tämän jälkeen ituso ­
luista valmistetaan kromosomipreparaatit ja ne värjätään, ja metafaa ­
sissa olevista soluista analysoidaan kromosomipoikkeavuudet.  
1.4 TESTIN KUVAUS  
1.4.1  Testin valmistelu  
1.4.1.1  Eläinlajin valinta  
Yleisesti käytettyjä eläinlajeja ovat kiinanhamsteri- ja hiiriurokset. 
Myös muiden soveltuvien nisäkäslajien uroksia voidaan käyttää. Koe-eläinten on oltava yleisesti käytettyä laboratoriokantaa olevia 
nuoria terveitä täysikasvuisia eläimiä. Testin alkaessa eläinten painon 
vaihtelun on oltava minimaalista, enintään ± 20 % keskipainosta.
 
1.4.1.2  Asuinolot ja ruokinta  
Yleiset olosuhteet ovat samat kuin osan B Yleisjohdannossa maini ­
tut, mutta kosteustavoitteen on oltava 50–60 %.  
1.4.1.3  Eläinten valmistelu  
Terveet nuoret täysikasvuiset urokset jaetaan satunnaistetusti koe- ja 
kontrolliryhmiin. Häkit on sijoitettava siten, että häkin sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Eläimet tunnis ­
tetaan yksilöllisesti. Eläimiä sopeutetaan laboratorio-olosuhteisiin vä ­
hintään viiden päivän ajan ennen tutkimuksen aloittamista.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 386
 
1.4.1.4  Annosten valmistelu  
Kiinteät tutkittavat aineet liuotetaan tai sekoitetaan sopiviin liuotti ­
miin tai kantaja-aineisiin ja laimennetaan tarvittaessa ennen kuin niitä annetaan koe-eläimille. Nestemäiset tutkittavat aineet voidaan antaa 
suoraan tai laimentaa ennen antamista. Tutkittava aine on valmistel ­
tava juuri ennen annostelua, paitsi jos sen säilyvyys on osoitettu stabiliteettitesteillä.
 
1.4.2  Koeolosuhteet  
1.4.2.1  Liuotin /kantaja-aine  
Liuottimella/kantaja-aineella ei saa olla myrkkyvaikutuksia käyte ­
tyillä annostasoilla, eikä sen käyttöön saa liittyä epäilyjä mahdolli ­
sista kemiallisista reaktioista tutkittavan aineen kanssa. Jos käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita, niiden käyttö 
on perusteltava niiden yhteensopivuuden osoittavilla tutkimustulok ­
silla. Ensisijaisesti on harkittava vesipitoisen liuottimen/kantaja-ai ­
neen käyttöä, mikäli mahdollista.
 
1.4.2.2  Kontrollit  
Jokaiseen testiin on otettava mukaan rinnakkaiset positiiviset ja ne ­
gatiiviset (liuotin/kantaja-aine) kontrollit. Kontrolliryhmän eläimiä on 
käsiteltävä samalla tavoin kuin koeryhmän eläimiä, mutta niille ei 
anneta tutkittavaa ainetta.  
Positiivisten kontrollien tulisi aiheuttaa spermatogonioissa rakenteel ­
lisia kromosomipoikkeavuuksia  in vivo  altistustasoilla, joiden odote ­
taan aiheuttavan havaittavaa lisääntymistä taustaan verrattuna.  
Positiivisten kontrolliaineiden annokset on valittava siten, että vaiku ­
tukset ovat selvät mutta eivät paljasta heti lukijalle koodattujen ob ­
jektilasien identiteettiä. Positiivinen kontrolliaine voidaan antaa eri 
reittiä pitkin kuin testattava aine ja näytteet voidaan ottaa vain ker ­
ran. Lisäksi positiivisina kontrolleina tulisi käyttää samaan kemial ­
listen aineiden ryhmään kuuluvia aineita, mikäli mahdollista. Esi ­
merkkejä positiivisista kontrolliaineista:  
Aine CAS-nro EINECS-nro  
syklofosfamidi 
syklofosfamidimonohydraatti 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
sykloheksyyliamiini 108-91-8 203-629-0 
mitomysiini C 50-07-7 200-008-6 
monomeerinen akryyliamidi 79-06-1 201-173-7 trietyleenimelamiini 51-18-3 200-083-5
 
Pelkkää liuotinta tai kantaja-ainetta saaneista negatiivisista kontrol ­
leista, joita muuten on käsitelty samalla tavoin kuin koeryhmiä, on otettava näytteet jokaisella näytteenottokerralla, paitsi jos aikaisem ­
mat tutkimustulokset osoittavat, että eläinten väliset erot ja vaihtelut 
kromosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen esiintymistaajuudcssa ovat hyväksyttävällä tasolla. Lisäksi on käytettävä käsittelemättömiä kontrolleja, paitsi jos kontrolleilla aikaisemmin tehdyt tutkimukset tai 
julkaistut tulokset osoittavat, että valittu liuotin/kantaja-aine ei ai ­
heuta haitallisia eikä mutageenisia vaikutuksia.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 387
 
1.5 TESTIN SUORITTAMINEN  
1.5.1  Eläinten lukumäärä  
Jokaisessa koe- ja kontrolliryhmässä on oltava vähintään 5 analysoi ­
tavissa olevaa urosta.  
1.5.2  Altistusohjelma  
Tutkittavia aineita tulisi antaa mieluiten kerran tai kaksi kertaa (ker ­
ta-annoksena tai kahtena altistuksena). Ne voidaan antaa myös jaet ­
tuina annoksina eli kahtena altistuksena saman päivän aikana vain muutaman tunnin välein, mikä helpottaa suurten ainemäärien anta ­
mista. Muunlaiset annosteluohjelmat on perusteltava tieteellisesti.
 
Suurinta annosta saavassa ryhmässä käytetään kahta näytteenottoker ­
taa altistuksen jälkeen. Koska tutkittava aine voi vaikuttaa solusyklin 
kinetiikkaan, näytteet kerätään yhtenä aikaisempana ja yhtenä myö ­
hempänä ajankohtana noin 24–48 tunnin kuluttua altistuksesta. Muissa kuin suurimmassa annosryhmässä näytteet kerätään kerran 24 tunnin tai 1,5 solusyklin kuluttua altistuksesta, paitsi jos jonkin 
muun näytteenottoajankohdan tiedetään soveltuvan paremmin vaiku ­
tusten toteamiseen (6).
 
Näytteitä voidaan ottaa lisäksi myös muina ajankohtina. Varhaisem ­
mat näytteenottoajat saattavat olla perusteltuja esimerkiksi testatta ­
essa kemiallisia aineita, jotka voivat aiheuttaa kromosomien hidastu ­
mista (lagging) tai joilla saattaa olla S-vaiheesta riippumattomia vai ­
kutuksia (1).  
Toistuvien altistusten soveltuvuus on osoitettava tapauskohtaisesti. 
Toistuvan altistuksen jälkeen eläimet on lopetettava 24 tunnin (1,5 solusyklin) kuluttua viimeisestä altistuksesta. Tarvittaessa voidaan käyttää ylimääräisiä näytteenottokertoja.
 
Ennen lopettamista eläimille annetaan injektiona vatsaonteloon so ­
piva annos ainetta, joka pysäyttää solut metafaasivaiheeseen (esim. 
Colcemid®ia tai kolkisiinia). Elämistä otetaan näytteet sopivan ajan kuluttua tämän jälkeen. Hiirillä tämä väli on noin 3–5 tuntia: kii ­
nanhamstereilla se on noin 4–5 tuntia.
 
1.5.3  Annostasot  
Jos tehdään annoksenmääritystutkimus, koska soveltuvia tietoja ei 
ole käytettävissä, se on tehtävä samassa laboratoriossa käyttäen sa ­
maa lajia, samaa kantaa ja samaa altistusohjelmaa kuin päätutkimuk ­
sessa on tarkoitus käyttää (7). Mikäli myrkkyvaikutuksia esiintyy, ensimmäiseen näytteenottoajankohtaan asti käytetään kolmea annos ­
tasoa. Näistä suurimmalla annoksella on oltava maksimaalinen myrk ­
kyvaikutus ja pienimmällä vähäinen tai ei lainkaan myrkkyvaikutus ­
ta. Myöhemmän näytteenottoajankohdan edellä voidaan käyttää vain suurinta annosta. Suurin annos määritellään annokseksi, joka aiheut ­
taa sen kaltaisia myrkyllisyysoireita, että samaan annosteluohjelmaan 
perustuvien suurempien annosten voitaisiin odottaa johtavan kuole ­
maan.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 388
 
Aineet, joilla on spesifisiä biologisia vaikutuksia pieninä, myrkyttö ­
minä annoksina (kuten hormonit ja mitogeenit), saattavat edellyttää 
muita annoksenmäärityskriteerejä, ja ne pitäisi arvioida tapauskohtai ­
sesti. Suurin annos voidaan määritellä myös annokseksi, joka aihe ­
uttaa joitakin myrkkyvaikutukseen viittaavia muutoksia spermatogo ­
nioissa (esim. spermatogonioiden mitoosien suhde ensimmäiseen ja 
toiseen meioottiseen metafaa-siin on pienentynyt; tämä pieneneminen ei saa olla yli 50 %).
 
1.5.4  Raja-annostesti  
Ellei havaittavia myrkkyvaikutuksia esiinny testattaessa yhtä annos ­
tasoa, joka on vähintään 2 000 mg eläimen painokiloa kohti vuoro ­
kaudessa (mg/kg/vrk) ja joka annetaan kerta-annoksena tai kahtena annoksena saman päivän aikana, ja ellei genotoksisuutta ole odotet ­
tavissa kemialliselta rakenteeltaan samanlaisilla aineilla saatujen tut ­
kimustulosten perusteella, täydellinen tutkimus kolmella eri annosta ­
solla ei ehkä ole välttämätön. Ihmisten odotettu altistus saattaa edel ­
lyttää suurempien annostasojen käyttöä raja-annostestissä.
 
1.5.5  Antotapa  
Tutkittava aine annetaan yleensä ruokintaletkulla tai sopivalla intu ­
baatiokanyylillä tai injektiona vatsaonteloon. Myös muut antotavat ovat mahdollisia, mikäli ne voidaan perustella. Koe-eläimen koosta 
riippuu, kuinka paljon nestettä voidaan antaa kerralla ruokintaletkun 
kautta tai injektiona. Määrä ei kuitenkaan saa olla yli 2 ml/100 g eläimen painon mukaan mitattuna. Mikäli käytetään suurempia nes ­
temääriä, ne on perusteltava. Lukuun ottamatta ärsyttäviä tai syövyt ­
täviä aineita, joiden vaikutukset yleensä pahenevat suurempia pitoi ­
suuksia käytettäessä, nestemäärien vaihtelu olisi pidettävä mahdolli ­
simman pienenä säätämällä tutkittavan aineen pitoisuuksia siten, että kokonaisnestemäärä pysyy samana kaikilla annostasoilla.
 
1.5.6  Kromosomipreparaattien valmistus  
Heti eläinten lopettamisen jälkeen toisesta kiveksestä tai molemmista 
kiveksistä otetaan solususpensioita, jotka pannaan hypotoniseen 
liuokseen ja fiksoidaan. Tämän jälkeen solut levitetään objektilaseille 
ja värjätään.  
1.5.7  Analyysi  
Jokaista eläintä kohti tulisi analysoida vähintään 100 hyvin levin ­
nyttä metafaasia (vähintään 500 metafaasia/ ryhmä). Tätä määrää 
voidaan pienentää, jos havaitaan runsaasti poikkeavuuksia. Kaikki objektilasit, myös positiiviset ja negatiiviset kontrollit, on koodattava toisistaan riippumattomasti ennen mikroskooppitutkimusta. Koska 
fiksaatiotoimenpiteet johtavat usein joidenkin metafaasien rikkoutu ­
miseen ja kromosomien menetykseen, sentromeerien lukumäärän las ­
ketuissa soluissa on vastattava lukua 2n ± 2.
 
2. TULOKSET  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Eläinkohtaiset tiedot on esitettävä taulukkomuodossa. Kokeellinen 
yksikkö on eläin. Jokaisesta yksittäisestä eläimestä on arvioitava rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen luku ­
määrä ja kromosomipoikkeavuuksien lukumäärä solua kohti. Eri 
tyyppiset rakenteelliset kromosomipoikkeavuudet on lueteltava, ja niiden lukumäärä ja esiintymistaajuus koe- ja kontrolliryhmien osalta on ilmoitettava. Aukot (gaps) rekisteröidään erikseen ja raportoidaan, 
mutta niitä ei yleensä lasketa mukaan kromosomipoikkeavuuksien 
kokonaistaajuuteen.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 389
 
Jos havaitaan sekä mitoosia että meioosia, spermatogonioiden mitoo ­
sien suhde ensimmäiseen ja toiseen meioottiseen metafaasiin on mää ­
ritettävä sytotoksisuuden mittana kaikista tutkittavalle aineelle altis ­
tetuista eläimistä ja negatiivisista kontrolleista yhteensä 100 jakautu ­
van solun näytteestä eläintä kohti mahdollisen sytotoksisen vaikutuk ­
sen osoittamiseksi. Jos tarkastellaan ainoastaan mitoosia, mitoosi-in ­
deksi on määritettävä vähintään 1 000 solusta jokaista eläintä kohti.  
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI JA TULKINTA  
Positiivisille tuloksille on useita kriteerejä, kuten annoksesta riippuva 
kromosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen suhteellisen lukumää ­
rän suureneminen tai kromosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen 
lukumäärän selvä suureneminen yksittäisen annoksen osalta yhdellä 
näytteenottokerralla. Tulosten biologinen merkitys on otettava ensi ­
sijaisesti huomioon. Tilastollisia menetelmiä voidaan käyttää apuna testitulosten arvioinnissa (8). Tilastollinen merkitsevyys ei saa olla 
ainoa määräävä tekijä positiivisen vasteen arvioinnissa. Epäselviä 
tuloksia on selkeytettävä jatkotestauksella mieluiten muunnetuissa koeolosuhteissa.
 
Tutkittava aine, jolla saadut tulokset eivät täytä edellä kuvattuja 
kriteerejä, katsotaan ei-mutageeniseksi tässä testissä.  
Useimmissa testeissä saadaan selvästi positiivisia tai negatiivisia tu ­
loksia, mutta joissakin harvinaisissa tapauksissa saatujen tietojen pohjalta ei voida tehdä varmoja päätelmiä testattavan aineen vaiku ­
tuksesta. Tulokset saattavat jäädä epäselviksi tai kyseenalaisiksi ko ­
keen toistokertojen määrästä riippumatta.
 
Spermatogonioiden  in vivo  -kromosomipoikkeavuustestissä saadut 
positiiviset tulokset osoittavat, että tutkittava aine aiheuttaa rakenteel ­
lisia kromosomipoikkeavuuksia testatun lajin itusoluissa. Negatiiviset tulokset osoittavat, ettei tutkittava aine aiheuta koeolosuhteissa kro ­
mosomipoikkeavuuksia testatun lajin itusoluissa.
 
Tutkittavan aineen tai sen metaboliittien todennäköistä pääsyä koh ­
dekudokseen on pohdittava.  
3. RAPORTOINTI  
TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on sisällettävä seuraavat tiedot:  
Liuotin/kantaja-aine:  
— kantaja-aineen valintaperusteet,  
— tutkittavan aineen liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja- 
aineessa, jos tiedossa.  
Koe-eläimet:  
— käytetty eläinlaji/kanta,  
— eläinten lukumäärä ja ikä,  
— hankintapaikka, asuinolosuhteet, ruokavalio jne.,  
— eläinten yksilöllinen paino testiä aloitettaessa, myös painon vaih ­
teluväli, keskiarvo ja keskihajonta kussakin ryhmässä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 390
 
Koeolosuhteet:  
— mahdolliset raja-annostutkimuksen tulokset,  
— annostasojen valintaperusteet,  
— antotavan valintaperusteet,  
— tutkittavan aineen valmistelun yksityiskohdat,  
— tutkittavan aineen antotavan yksityiskohdat,  
— eläinten lopettamisajankohtien perustelut,  
— ravintoon/juomaveteen sekoitetun tutkittavan aineen pitoisuuden 
(ppm) muuntaminen todelliseksi annokseksi (mg painokiloa kohti 
vuorokaudessa, mg/kg/vrk} tarvittaessa,  
— yksityiskohtaiset tiedot ravinnon ja veden laadusta,  
— yksityiskohtainen kuvaus altistus- ja näytteidenkeräysohjelmasta,  
— myrkkyvaikutuksen mittausmenetelmät,  
— metafaasin pysäyttämisessä käytetty aine, sen pitoisuus ja käsit ­
telyn kesto,  
— objektilasien valmistusmenetelmät,  
— kromosomipoikkeavuuksien laskentakriteerit,  
— analysoitujen solujen lukumäärä eläintä kohti,  
— kriteerit, joiden perusteella tutkimukset luokiteltiin positiivisiksi, 
negatiivisiksi tai epäselviksi.  
Tulokset:  
— myrkkyvaikutuksen merkit,  
— mitoosi-indeksi,  
— spermatogonioiden mitoosien suhde ensimmäisiin ja toisiin mei ­
oottisiin metafaaseihin,  
— kromosomipoikkeavuuksien tyyppi ja lukumäärä, ilmoitettava jo ­
kaisen eläimen osalta erikseen,  
— kromosomipoikkeavuuksien kokonaismäärä ryhmää kohti,  
— kromosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen lukumäärä ryhmää 
kohti,  
— annos-vastesuhde, mikäli mahdollista,  
— mahdolliset tilastolliset analyysit,  
— rinnakkaisten negatiivisten kontrollien tulokset,  
— aikaisemmat negatiivisesta kontrollista saadut tutkimustulokset 
sekä vaihteluvälit, keskiarvot ja keskihajonnat,  
— rinnakkaisten positiivisten kontrollien tulokset,  
— ploidian muutokset, jos niitä esiintyy.  
Tulosten pohdinta.  
Johtopäätökset.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 391
 
4. KIRJALLISUUTTA  
(1) Adler, I. D. (1986), Clastogenic Potential in Mouse Spermato ­
gonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Speci ­
fications, in:  Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, 
Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis,  Ramel, C, 
Lambert, B. and Magnusson, J. (eds.) Liss, New York, s. 477–484.
 
(2) Adler. I. D., (1984). Cytogenetic tests in Mammals, in: Muta ­
genicity Testing: a Practical Approach, ed. S. Venitt and J. M. 
Parry, IR.L Press, Oxford, Washington DC, s. 275–306.  
(3) Evans, E. P., Breckon, G. and Ford, C. E., (1964), An Air- 
drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Tes ­
tes, Cytogenetics and Cell Genetics,  3, s. 289–294.  
(4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and 
Henderson, L. (1990),  In Vivo  Cytogenetic Assays, in: D. J. 
Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommen ­
ded Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mu ­
tagenicity Testing. Report. Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 115–141.
 
(5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978), A New Method for 
Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes, Mu ­
tation Res., 52, s. 207–209.  
(6) Adler, I. D., Shelby, M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, 
W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994), Inter ­
national Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Pro ­
cedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian 
Germ Cell Tests, Mutation Res., 312, s. 313–318.  
(7) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Mor ­
ton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society 
Working Group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays, 
Mutagenesis, 7, s. 313–319.
 
(8) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of  In Vivo  Cytoge­
netic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. report. Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 
s. 184–232.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 392
 
B.24.  HIIREN SPOT-TESTI  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.2 MÄÄRITELMÄ  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Ei ole.  
1.4 TESTIN PERIAATE  
Tässä hiirellä tehdyssä  in vivo  -testissä kehittyvät sikiöt altistetaan 
kemikaaleille. Kehittyvien sikiöiden kohdesolut ovat melanoblasteja ja kohdegeenit niitä, jotka säätelevät karvapeitteen karvojen pigmen ­
taatiota. Kehittyvät sikiöt ovat heterotsygootteja useiden karvapeit ­
teen värigeenien osalta. Melanoblastin tällaisen geenin dominoivan alleelin mutaatio tai (jonkin geneettisen tapahtuman aiheuttama) po ­
istuma aiheuttaa resessiivisen fenotyypin ilmenemisen siitä synty ­
vissä soluissa, ja se näkyy värimuutostäplänä kehityksen lopputulok ­
sena olevan hiiren turkissa. Täplikkäiden poikasten määrä ja mutaa ­
tioiden yleisyys kirjataan ja sitä verrataan ainoastaan liuottimelle sikiöasteella altistettuihin poikasiin. Hiiren spot-testillä voidaan mää ­
rittää sikiösolujen oletetut somaattiset mutaatiot.
 
1.5 LAATUKRITEERIT  
Ei ole.  
1.6 TESTIN KUVAUS  
Testin valmistelu  
Jos mahdollista, testattavat kemikaalit liuotetaan isotoniseen suolaliu ­
okseen. Veteen liukenemattomat kemikaalit liuotetaan tai sekoitetaan 
sopiviin liuottimiin. Liuottimella ei saa olla testattavaan yhdisteeseen 
kohdistuvia vaikutuksia eikä myrkkyvaikutuksia. Testattavia yhdis ­
teitä on käytettävä vastavalmistettuina liuoksina.  
K o e - e l ä i m e t  
T-kantaa olevat hiiret (nonagouti, a/a; chinchilla, pink eye, c  ch p/c ch p; 
brown, b/b; dilute, short ear, d se/d se; piebald spotting, s/s) pariu ­
tetaan joko HT-kantaa (pallid, nonagouti, brachypody, pa a bp/pa a 
bp; leaden fuzzy, ln fz/ln fz; pearl pe/pe) tai C57 BL-kantaa (nona ­
gouti, a/a) olevien hiirten kanssa. Muitakin sopivia risteytyksiä, esi ­
merkiksi NMRI-kantaa (nonagouti, a/a; albino, c/c) ja DBA-kantaa 
(nonagouti, a/a; brown, b/b; dilute d/d), voidaan käyttää edellyttäen, 
että ne tuottavat nonagoutijälkeläisiä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 393
 
L u k u m ä ä r ä j a s u k u p u o l i  
Riittävä määrä tiineitä naaraita altistetaan siten, että kutakin annos ­
tasoa kohden saadaan tarpeellinen määrä elossa olevia poikasia. Määrä riippuu altistetuissa hiirissä havaittujen täplien lukumäärästä ja kontrollitulosten kattavuudesta. Negatiivinen tulos voidaan hyväk ­
syä ainoastaan, kun korkeimmalla annoksella käsiteltyjen naaraiden 
poikasia on tutkittu vähintään 300.
 
N e g a t i i v i s t e n j a p o s i t i i v i s t e n k o n t r o l l i e n k ä y t t ö  
Tulokset kontrollitesteistä, joissa hiirille on annettu ainoastaan liuo ­
tinta (negatiivinen kontrolli) on oltava käytettävissä. Samasta labora ­
toriosta peräisin olevat aikaisempien kontrollitutkimusten tulokset 
voidaan yhdistää testin herkkyyden lisäämiseksi edellyttäen, että ne ovat yhtenäiset. Kokeensuorittavassa laboratoriossa olisi oltava käy ­
tettävissä positiivisia kontrollituloksia sellaisella kemikaalilla teh ­
dyistä kokeista, jonka tiedetään tässä testissä osoittavan mutagee ­
nisuutta, ellei nyt testattavana oleva kemikaali osoittaudu mutagee ­
niseksi.
 
A n t o t a p a  
Ainetta annetaan tiineille naaraille tavallisesti suun kautta ruokinta ­
letkulla tai vatsaontelonsisäisenä ruiskeena. Altistus voidaan tarvitta ­
essa tehdä hengitysteiden kautta ja muitakin antotapoja voidaan käyt ­
tää. 
A n n o s t a s o t  
Testissä käytetään vähintään kahta annostasoa, joista toinen aiheuttaa 
myrkkyoireita tai pienentää poikueen kokoa. Myrkyttömiä kemikaa ­
leja testattaessa on käytettävä mahdollisimman suurta annosta.  
Testin suorittaminen  
Kerta-annos annetaan yleensä raskauden 8., 9. tai 10. päivänä. Ras ­
kauden 1. päivä on emätintulpan havaitsemispäivä. Nämä päivät vastaavat 7,25, 8,25 ja 9,25 päivää hedelmöityksestä. Näiden päivien aikana voidaan antaa toistuvia annoksia.
 
A n a l y y s i  
Poikaset koodataan ja niiden täplikkyys tutkitaan 3–4 viikon ikäisinä. 
Täplät eritellään kolmeen ryhmään:  
a) valkeat täplät 5 mm:n alueella vatsan keskiviivasta, joiden olete ­
taan aiheutuvan solukuolemista (WMVS);  
b) keltaiset, agouti-tyyppiset täplät nisien ja sukupuolielinten yhtey ­
dessä, kaulassa, kainaloiden ja nivusten alueella ja otsan keskio ­
sassa, joiden oletetaan aiheutuvan erilaistumisvirheistä (misdiffe ­
rentiation, MDS); sekä  
c) pigmentoidut ja valkeat sattumanvaraisesti karvapeitteessä esiin ­
tyvät täplät, joiden oletetaan aiheutuvan somaattisista mutaatioista 
(RS).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 394
 
Kaikki kolme ryhmää kirjataan, mutta ainoastaan viimeinen, RS, on 
geneettisesti merkitsevä. MDS- ja RS-täplät voidaan erottaa toisistaan 
tutkimalla näytekarvat fluoresoivalla mikroskoopilla.  
Poikasten selvästi näkyvät morfologiset poikkeamat on kirjattava.  
2. TULOKSET  
Tuloksina ilmoitetaan tutkittujen poikasten kokonaismäärä sekä nii ­
den poikasten määrä, joissa esiintyy yksi tai useampia oletetusta somaattisesta mutaatiosta johtuvia täpliä. Altistus- ja kontrollitulosten vertailu suoritetaan jollakin soveltuvalla menetelmällä. Tulokset esi ­
tetään myös poikuekohtaisesti.
 
3. RAPORTOINTI  
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tie ­
dot: 
— risteytyksessä käytetyt kannat,  
— tiineiden naaraiden lukumäärä koe- ja kontrolliryhmissä,  
— poikueiden keskikoko koe- ja kontrolliryhmissä syntymähetkellä 
ja vieroituksen tapahtuessa,  
— testattavan kemikaalin annostaso(t),  
— käytetty liuotin,  
— tiineyspäivä, jolloin annos annettiin,  
— annostelutapa,  
— poikasten kokonaismäärä sekä koe- ja kontrolliryhmissä esiinty ­
neiden WMVS-, MDS- ja RS-ryhmän täplikkäiden poikasten lu ­
kumäärä,  
— näkyvät morfologiset poikkeamat,  
— RS-ryhmän osalta annos/vastesuhde, jos mahdollista,  
— tulosten tilastollinen käsittely,  
— tulosten pohdinta,  
— tulosten tulkinta.  
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
4. LÄHDELUETTELO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 395
 
B.25.  HIIREN PERIYTYVÄ TRANSLOKAATIO  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.2 MÄÄRITELMÄ  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Ei ole.  
1.4 TESTIN PERIAATE  
Hiiren periytyvä translokaatiotesti tutkii nisäkkäiden sukusolujen ra ­
kenteellisia ja lukumääräisiä kromosomimuutoksia ensimmäisen pol ­
ven jälkeläisistä. Havaittuja kromosomimuutoksia ovat vastavuoroi ­
set translokaatiot sekä X-kromosomin häviämät naaraspuolisissa jäl ­
keläisissä. Translokaatiokantajat ja XO-naaraat osoittavat hedelmälli ­
syyden alenemista, jonka perusteella F  1 -jälkeläiset valitaan sytoge ­
neenisuustutkimuksiin. Eräät translokaatiotyypit aiheuttavat täydelli ­
sen steriliteetin (X-autosomi ja c-t-tyyppi). Translokaatioita tutkitaan 
sytogeneettisesti joko F  1 -urosten tai F  1 -naaraiden urospuolisten poi ­
kasten meioottisista diakineesi-metafaasi I -vaiheessa olevista soluis ­
ta. XO-naaraat tunnistetaan sytogeneettisesti siitä, että niillä on ai ­
noastaan 39 kromosomia luuydinmitoosissa.  
1.5 LAATUKRITEERIT  
Ei ole.  
1.6 TESTIN KUVAUS  
Testin valmistelu  
Testattavat kemikaalit liuotetaan isotoniseen suolaliuokseen. Veteen 
liukenemattomat kemikaalit liuotetaan tai sekoitetaan sopiviin liuot ­
timiin. Jos käytetään liuotinta annostelun helpottamiseksi, sillä ei saa olla testattavaan yhdisteeseen kohdistuvia vaikutuksia eikä myrkky ­
vaikutuksia.
 
A n t o t a p a  
Altistus suoritetaan tavallisesti suun kautta ruokintaletkulla tai vatsa ­
ontelonsisäisenä ruiskeena. Muitakin antotapoja voidaan käyttää.  
K o e - e l ä i m e t  
Testit suoritetaan hiirillä, koska niiden kasvatus ja solututkimukset 
eivät aiheuta ongelmia. Kantaa ei ole määrätty. Kannan keskimää ­
räisen poikuekoon on kuitenkin oltava yli kahdeksan ja pysyä suh ­
teellisen vakiona.  
Koe-eläiminä käytetään terveitä sukukypsiä hiiriä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 396
 
E l ä i n t e n l u k u m ä ä r ä  
Tarvittavien eläinten määrä riippuu spontaanin translokaation esiin ­
tymistiheydestä ja minimiannoksesta, joka tarvitaan positiivisen tu ­
loksen aikaansaamiseksi.  
Testi suoritetaan yleensä analysoimalla F  1 -urospuolisia jälkeläisiä. 
Vähintään 500 F  1 -sukupolven urospuolista jälkeläistä on tutkittava 
kutakin annosryhmää kohden. Mikäli myös F  1 -sukupolven naaras ­
puoliset jälkeläiset kuuluvat tutkimuksen piiriin, tarvitaan 300 naa ­
rasta ja 300 urosta.  
N e g a t i i v i s t e n j a p o s i t i i v i s t e n k o n t r o l l i e n k ä y t t ö  
Käytettävissä on oltava riittävästi sekä meneillään olevista että aikai ­
semmista tutkimuksista saatuja kontrollituloksia. Mikäli testin suorit ­
tavassa laboratoriossa on käytettävissä äskettäin tehtyjen kokeiden 
positiivisia kontrollituloksia, näitä voidaan käyttää meneillään olevan kokeen positiivisen kontrollin asemesta.
 
A n n o s t a s o t  
Tutkimuksessa käytetään yhtä annostasoa. Se on yleensä korkein 
annos, joka aiheuttaa pienimmät havaittavissa olevat myrkkyvaiku ­
tukset, mutta ei vaikuta lisääntymiskäyttäytymiseen eikä eloonjää ­
miseen. Annos/vastesuhteen määrittämiseksi tarvitaan lisäksi kaksi alempaa annostasoa. Myrkyttömiä kemikaaleja testattaessa on käytet ­
tävä mahdollisimman suurta annosta.
 
Testin suorittaminen  
A n n o s t e l u j a p a r i u t t a m i n e n  
Käytettävissä on kaksi annostustapaa. Testattava aine annetaan 
yleensä kerta-annoksena. Testattavaa ainetta voidaan myös antaa vii ­
kon jokaisena päivänä 35 päivän aikana. Annostelutapa määrää al ­
tistusta seuraavien pariuttamisten määrän. On tärkeää, että kaikista sukusoluasteista saadaan näyte. Pariuttamisajan lopussa naaraat siir ­
retään yksittäishäkkeihin. Kun naaraat synnyttävät, synnytyspäivä, 
poikueen koko ja jälkeläisten sukupuoli kirjataan. Kaikki urospuoli ­
set jälkeläiset vieroitetaan ja naaraspuoliset lopetetaan, elleivät ne kuulu tutkimuksen piiriin.
 
T r a n s l o k a a t i o n h e t e r o t s y g o o t t i s u u s t e s t i  
Jompaakumpaa jäljempänä esitetyistä menetelmistä voidaan käyttää:  
— F  1 -jälkeläisten hedelmällisyystutkimus ja sen jälkeen translokaa ­
tiokantajien varmistus sytogeneettisen analyysin avulla.  
— Kaikkien F  1 -urospuolisten jälkeläisten sytogeneettinen analyysi 
ilman edeltävää hedelmällisyystutkimusta.  
a) Hedelmällisyystutkimus:  
F 1 -eläimen alentunut hedelmällisyys voidaan määrittää tutkimalla 
poikueiden kokoa ja/tai analysoimalla naaraiden kohdun sisältö.  
Käytetyn hiirikannan normaalin ja alentuneen hedelmällisyyden 
arviointikriteerit on määritettävä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 397
 
Poikueen koon tutkiminen: testattavat F  1 -urokset pannaan yksit ­
täishäkkeihin samasta testistä tai samasta yhdyskunnasta peräisin 
olevien naaraiden kanssa. Häkit tutkitaan päivittäin 18 päivän kuluttua pariutumisesta alkaen. Synnytyksen tapahduttua poiku ­
een koko ja F
 2 -jälkeläisten sukupuoli kirjataan ja poikueet hävi ­
tetään. Kun tutkitaan naaraspuolisia F  1 -jälkeläisiä, pienten poiku ­
eiden F  2 -jälkeläiset säilytetään jatkotutkimuksia varten. Naaras ­
puoliset translokaatiokantajat varmistetaan tekemällä sytogeneet ­
tinen translokaatioanalyysi jostakin niiden urospuolisesta jälkeläi ­
sestä. XO-naaraat tunnistetaan siitä, että niiden jälkeläisten suku ­
puolijakautuma 1:1 muuttuu suhteeksi 1:2 uroksia/naaraita. Sar ­
jatutkimuksissa normaalien F  1 -eläimien lisätutkimuksia ei suori ­
teta, jos ensimmäinen F  2 -poikue on ennalta määritetyn normaa ­
lipoikueen kokoinen tai sitä suurempi. Muussa tapauksessa tut ­
kitaan toinen tai kolmas F  2 -poikue.  
Niille F  1 -eläimille, joita ei voida pitää normaaleina kolmen F  2 - 
poikueen tutkimisen perusteella, suoritetaan lisätutkimuksia joko 
analysoimalla emojen kohdun sisältö tai tekemällä niistä suoraan 
sytogeneettinen analyysi.  
Kohdun sisällön tutkiminen: translokaatiokantajien poikueiden 
pieneminen johtuu sikiökuolemista, joten kohdun seinämään kiin ­
nittyneiden kuolleiden munasolujen suuri määrä viittaa tutkitta ­
vana olevassa eläimessä tapahtuneeseen translokaatioon. Kukin testattava F
 1 -uros pariutetaan kahden tai kolmen naaraan kanssa. 
Hedelmöitys varmistetaan joka aamu tutkimalla, onko naaraille 
kehittynyt emätintulppa. Naaraat lopetetaan 14–16 päivän kulut ­
tua ja kohdussa olevien elävien ja kuolleiden alkioiden määrä kirjataan.
 
b) Sytogeneettinen analyysi:  
Kivekset preparoidaan ilmakuivatusmenetelmää käyttäen. Trans ­
lokaatiokantajat tunnistetaan primaarispermatogyyttien ensimmäi ­
sen diakineesimetafaasin multivalenttien rakennemuotojen perus ­
teella. Vähintään kahdessa solussa esiintyvä multivalentti yhdis ­
tyminen on riittävä osoitus siitä, että tutkittava eläin on trans ­
lokaatiokantaja.  
Ellei siitosvalintaa ole tehty, kaikki F  1 -urokset tutkitaan sytoge ­
neettisesti. Vähintään 25 ensimmäisen diakineesimetafaasin solua 
on mikroskopoitava urosta kohden. Mitoosin metafaasit sperma ­
togonioista tai luuytimestä on tutkittava F  1 -uroksilta, joilla on 
pienet kivekset ja diakineesia edeltävä meioosin jakautumisvaihe F
 1 -naarailta, joiden epäillään olevan XO-naaraita. Epätavallisen 
pitkän ja/tai lyhyen kromosomin esiintyminen 10 solussa osoittaa 
steriiliä translokaatiota yksittäisessä uroksessa (c-tyyppi). Eräät urosten steriliteettiä aiheuttavat X-autosomi-translokaatiot voi ­
daan todeta ainoastaan mitoottisten kromosomien raita-analyysin 
perusteella. Kun kaikissa 10 mitoosissa esiintyy 39 kromosomia, 
tämä osoittaa, että kysymyksessä on XO-naaras.
 
2. TULOKSET  
Tulokset esitetään taulukkomuodossa.  
Parentaalisukupolven poikueiden keskikoko ja sukupuolijakautuma 
syntymis- ja vieroitusajankohtana ilmoitetaan jokaista pariutumisjak ­
soa kohden.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 398
 
F 1 -eläinten hedelmällisyystutkimusten osalta ilmoitetaan kaikkien 
normaalien pariutumisten tuottamien poikueiden keskikoko ja F  1 - 
translokaatiokantajien kunkin poikueen koko. Kohdun sisällön ana ­
lyyseistä ilmoitetaan normaalien pariutumisten tuottamat elävät ja kuolleet kohdun seinämään kiinnittyneet munasolut ja F
 1 -translokaa ­
tiokantajien jokaisen pariutumisen tuottamat elävät ja kuolleet koh ­
dun seinämään kiinnittyneet munasolut.  
Ensimmäisen diakineesimetafaasin sytogeneettisistä analyyseistä il ­
moitetaan multivalenttien raken-nemuutostyyppien määrät ja koko ­
naissolumäärä kutakin translokaatiokantajaa kohden.  
Steriilien F  1 -yksilöiden osalta ilmoitetaan pariutumisien kokonais ­
määrä ja pariuttamisajan kesto. Ilmoitetaan kivesten paino ja sytoge ­
neettisen analyysin tulokset.  
XO-naaraiden osalta ilmoitetaan poikueiden keskikoko, F  2 -jälkeläis­
ten sukupuolijakautuma sekä sytogeneettisen analyysin tulokset.  
Jos mahdolliset F  1 -translokaatiokantajat valittiin ennakolta hedelmäl ­
lisyystutkimusten perusteella, taulukosta on ilmettävä, kuinka moni näistä varmistui translokaatioheterotsygootiksi.
 
Negatiiviset kontrollitulokset ja positiivisten kontrollitestien tulokset 
ilmoitetaan.  
3. RAPORTOINTI  
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tie ­
dot: 
— hiirikanta, eläinten ikä, altistettujen eläinten paino,  
— parentaalieläinten lukumäärä sukupuolta kohden koe- ja kontrol ­
liryhmissä,  
— koeolosuhteet, tarkka kuvaus altistuksesta, annostasot, liuottimet, 
pariutumisaikataulu,  
— poikasten lukumäärä ja sukupuoli naarasta kohden, translokaa ­
tioanalyysiä varten kasvatettujen poikasten lukumäärä ja suku ­
puoli,  
— translokaatioanalyysin ajankohta ja perusteet,  
— translokaatiokantajien lukumäärä ja tarkka selostus translokaatio ­
kantajista, risteyttämisestä ja kohdun sisällöstä soveltuvin osin,  
— sytogeneettiset menettelytavat sekä selostus mikroskooppisesta 
analyysistä mieluimmin kuvien kera,  
— tilastollinen arviointi,  
— tulosten pohdinta,  
— tulosten tulkinta.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 399
 
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
4. LÄHDELUETTELO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 400
 
B.26.  SUBKROONINEN ORAALINEN MYRKYLLISYYSTESTI 
TOISTETUILLA ANNOKSILLA TEHTÄVÄ 
90 VUOROKAUDEN ORAALINEN 
MYRKYLLISYYSTUTKIMUS JYRSIJÖILLÄ  
1. MENETELMÄ  
Tämä subkrooninen oraalinen myrkyllisyystesti on toisinto OECD:n 
testiohjeesta nro 408 (1998).  
1.1 JOHDANTO  
Määritettäessä ja arvioitaessa kemikaalin myrkyllisyysominaisuuksia 
voidaan subkrooninen toistetuilla annoksilla aiheutettu suun kautta 
vaikuttava myrkyllisyys määrittää sen jälkeen, kun alustavia myrkyl ­
lisyyttä koskevia tietoja on saatu välittömän myrkyllisyyden testistä tai toistetuilla annoksilla suoritetusta 28 vuorokauden myrkvllisyys ­
testistä. 90 vuorokauden tutkimuksesta saadaan tietoja terveyshaitois ­
ta, joita todennäköisesti seuraa toistuvasta altistuksesta pitkähkön ajanjakson aikana, myös vieroittamisen jälkeen eläimen kehittyessä ja kasvaessa täysikasvuiseksi. Tutkimuksessa saadaan tietoa tärkeim ­
mistä myrkyllisyysvaikutuksista, siinä käyvät ilmi kohde-elimet ja 
aineen mahdollinen kertyminen ja siinä voidaan saada arvio haitat ­
tomista altistustasoista (NO-AEL), joita voidaan käyttää valittaessa annoksia pitkäaikaisten vaikutusten tutkimiseen sekä turvallisuuskri ­
teerien asettamiseen ihmisten altistukselle.
 
Menetelmässä korostetaan neurologisia loppupisteitä, ja siinä saadaan 
tietoa immunologisista ja lisääntymisfysiologisista vaikutuksista. Me ­
netelmässä korostetaan myös sitä, että eläimistä on tehtävä huolelli ­
sesti kliinisiä havaintoja, jotta saadaan mahdollisimman paljon tietoa. 
Tämän tutkimuksen avulla pitäisi olla mahdollista tunnistaa kemikaa ­
leja, joilla voi olla perusteellisempia tutkimuksia vaativia myrkyllisiä vaikutuksia hermostoon, immuunijärjestelmään ja lisääntymiselimiin.
 
Ks. myös Yleisjohdanto, osa B.  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Annos:  annetun testiaineen määrä. Annos ilmaistaan painoyksik ­
köinä (g, mg) tai testiaineen painona koe-eläi-men painoyksikköä 
kohti (esim. mg/kg) tai vakioina pidettävinä ruokavalion pitoisuuk ­
sina (ppm).  
Annostelu:  yleinen termi, joka kattaa annoksen, annostelutaajuuden 
ja annostelun keston.  
NOAEL:  lyhennys määritelmälle ”no observed adverse effect level” 
eli korkein annostaso, jolla ei havaita mitään haitallisia käsittelyyn liittyviä vaikutuksia.
 
1.3 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Testiainetta annetaan suun kautta päivittäin asteittain suurenevina 
annoksina useille koe-eläinryhmil!e niin, että yhtä annostasoa anne ­
taan ryhmää kohti 90 vuorokauden ajan. Tänä aikana eläimiä havain ­
noidaan tarkasti myrkkyvaikutusten havaitsemiseksi. Testin kuluessa kuolleille tai tapetuille eläimille tehdään ruumiinavaus, ja testin päät ­
tyessä myös vielä elossa olevat eläimet tapetaan ja niille tehdään 
ruumiinavaus.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 401
 
1.4 TESTIN KUVAUS  
1.4.1  Eläinten valmistelu  
Testissä olisi käytettävä terveitä eläimiä, jotka on totutettu laborato ­
rio-olosuhteisiin vähintään viiden vuorokauden ajan ja joita ei ole 
käytetty kokeisiin aiemmin. Koe-eläinten laji, kanta, alkuperä, suku ­
puoli, paino ja/tai ikä on tunnettava. Eläimet jaetaan satunnaistetusti kontrolli- ja käsittelyryhmiin. Häkit on sijoitettava siten, että häkin sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Kul ­
lekin eläimelle annetaan oma tunnistenumero.
 
1.4.2  Annosten valmistelu  
Testiainetta annetaan letkuruokinnalla tai ravinnon tai juomaveden 
mukana. Menetelmä riippuu tutkimuksen tarkoituksesta ja testiaineen fysikaalisista ja kemiallisista ominaisuuksista.
 
Tarvittaessa testiaine liuotetaan tai suspendoidaan sopivaan kantaja- 
aineeseen. On suositeltavaa, että ensin harkitaan vesiliuosta tai sus ­
pensiota aina, kun se on mahdollista, ja sen jälkeen öljyyn (esim. 
maissiöljyyn) tehtävää liuosta tai emulsiota ja sitten mahdollisesti muita liuottimia. Jos liuotin on muu kuin vesi, sen myrkkyominai ­
suudet on tunnettava. Testiaineen stabiilisuus annosteluolosuhteissa 
olisi määritettävä.
 
1.4.3  Testiolosuhteet  
1.4.3.1  Koe-eläimet  
Rotta on suositeltava koe-cläin, vaikka muita jyrsijöitä, kuten hiirtä, 
voidaan myös käyttää. Koe-eläinten on oltava yleisesti käytettyä laboratoriokantaa ja nuoria terveitä täysikasvuisia eläimiä. Naaraat 
eivät saa olla synnyttäneitä eivätkä tiineinä. Annostelu on aloitettava 
mahdollisimman pian vieroittamisen jälkeen ja joka tapauksessa en ­
nen kuin eläimet ovat yhdeksän viikon ikäisiä. Tutkimuksen alkaessa eläinten painot saavat erota toisistaan mahdollisimman vähän, enin ­
tään ± 20 % kummankin sukupuolen keskipainosta. Jos tutkimuksen 
on tarkoitus olla alustava tutkimus pitkäaikaiselle myrkyilisyystutki ­
mukselle, molemmissa tutkimuksissa olisi käytettävä samaa kantaa ja samalta toimittajalta hankittuja eläimiä.
 
1.4.3.2  Määrä ja sukupuoli  
Kullakin annostasolla olisi käytettävä vähintään 20:tä eläintä (10 
naarasta ja 10 koirasta). Jos eläimiä tapetaan kokeen aikana, määrän 
on oltava saman verran suurempi kuin ennen tutkimuksen päätty ­
mistä tapettavien eläinten määrä. Kemikaalista tai sitä läheisesti muistuttavasta aineesta saatavilla olevien aiempien tietojen perus ­
teella olisi harkittava kymmenen eläimen (viisi kumpaakin sukupuol ­
ta) lisäryhmän sisällyttämistä kontrolliryhmään ja suurimman annok ­
sen ryhmään sitä varten, että niitä havainnoitaisiin käsittelyjakson jälkeen mahdollisten myrkkyvaikutusten palautumisen tai jatkumisen 
havaitsemiseksi. Tämä käsittelyn jälkeinen aika olisi asetettava ha ­
vaittujen vaikutusten mukaan.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 402
 
1.4.3.3  Annostasot  
Tutkimuksessa on käytettävä vähintään kolmea annostasoa ja testin 
kanssa samaan aikaan on tehtävä kontrolli paitsi jos tehdään raja- arvotesti (ks. 1.4.3.4). Annostasot voidaan asettaa toistetuilla annok ­
silla tehdyn testin tai raja-arvotestin tulosten perusteella, ja kaikki 
mahdolliset testiaineesta tai samanlaisista aineista saatavilla olevat toksikologiset ja toksikokineettiset tiedot on otettava huomioon. Mi ­
käli testiaineen fysikokemialliset ominaisuudet tai biologiset vaiku ­
tukset eivät rajoita korkeimman annostason valintaa, annostaso olisi 
valittava siten, että se on myrkyllinen, mutta ei johda kuolemaan eikä aiheuta suurta kärsimystä. Annostasojen on oltava laskevia, jotta 
voitaisiin osoittaa kaikki annokseen liittyvät vasteet ja haitaton taso 
alhaisimmalla annostasolla. Kaksinkertaiset-nelinkertaiset erot annos ­
tasojen välillä ovat usein parhaimmat alenevassa annossarjassa, ja usein on hyödyllisempää lisätä neljäs testiryhmä kuin käyttää hyvin 
suuria annosvälejä (ts. suurempia kuin n. 6–10-ker-taisia).
 
Kontrolliryhmän on oltava käsittelemätön ryhmä tai kantaja-ainetta 
saava ryhmä, jos testiaineen antamiseen käytetään kantaja-ainetta. Kontrolliryhmän eläimiä on käsiteltävä samalla tavoin kuin koeryh ­
män eläimiä, mutta niille ei anneta testiainetta. Jos käytetään kantaja- 
ainetta, kontrolliryhmälle on annettava testiainetta suurimmassa käy ­
tetyssä kantaja-aineen tilavuudessa. Jos testiaine annetaan ravinnon mukana ja siitä aiheutuu ravinnonoton vähenemistä, voi normaalira ­
vintoa saava kontrolliryhmä olla hyödyllinen, jotta erotettaisiin mait ­
tavuudesta aiheutunut ravinnonoton väheneminen sellaisesta, joka 
aiheutuu testimallin toksikologisista muutoksista.
 
Seuraavat mahdollisen kantaja-aineen ja muiden lisäaineiden ominai ­
suudet on otettava huomioon: vaikutukset imeytymiseen, elimistöön 
jakautumiseen, aineenvaihduntaan tai testiaineen pidättymiseen (re ­
tentioon) elimistössä; sellaiset vaikutukset testiaineen kemiallisiin ominaisuuksiin, jotka voivat muuttaa sen myrkkyominaisuuksia; vai ­
kutukset ravinnon tai veden nauttimiseen tai eläinten ravitsemustilan ­
teeseen.
 
1.4.3.4  Raja-annostesti  
Ellei yhdellä annostasolla, joka on vähintään 1 000 mg/kg (eläimen 
painokiloa kohti) / vrk ja joka annetaan tälle tutkimukselle annettujen ohjeiden mukaan, havaita haittavaikutuksia ja jos myrkyllisyyttä ei 
ole odotettavissa kemialliselta rakenteeltaan samanlaisilla aineilla 
saatujen tutkimustulosten perusteella, täydellinen tutkimus kolmella eri annostasolla ei ehkä ole välttämätön. Rajatestisääntöä sovelletaan, paitsi jos ihmisten altistumisesta voidaan päätellä, että on käytettävä 
korkeampaa annostasoa.
 
1.5 TESTIN SUORITUS  
1.5.1  Antotapa  
Eläimille annetaan testiainetta päivittäin seitsemänä päivänä viikossa 
90 vuorokauden ajan. Jos käytetään muunlaista koejärjestelyä, esim. 
testiainetta annetaan viitenä päivänä viikossa, se on perusteltava. Jos 
testiaine annetaan letkuruokinnalla, se on annettava yhtenä annok ­
sena mahaletkulla tai sopivalla intubaatiokanyylillä. Suurin yhdellä kerralla annettava nestetilavuus riippuu koe-eläimen koosta. Tilavuus 
ei saisi olla suurempi kuin 1 ml/100 g painoa. Lukuun ottamatta 
ärsyttäviä tai syövyttäviä aineita, joiden vaikutukset yleensä pahene ­
vat suurempia pitoisuuksia käytettäessä, nestemäärien vaihtelu olisi pidettävä mahdollisimman pienenä säätämällä tutkittavan aineen pi ­
toisuuksia siten, että kokonaisnestemäärä pysyy samana kaikilla an ­
nostasoilla.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 403
 
Kun aine annetaan ravinnon tai juomaveden kanssa, on tärkeää var ­
mistaa, ettei testiainemäärä häiritse normaalia ravitsemusta tai vesit ­
asetta. Kun testiaine annetaan ravinnon kanssa, voidaan käyttää joko vakiopitoisuutta (ppm) ravinnossa tai eläimen painoon suhteutettua annoksen vakiotasoa. Valittu vaihtoehto on mainittava. Kun aine 
annetaan letkulla, annos olisi annettava joka päivä suunnilleen sa ­
maan aikaan, ja sitä olisi säädettävä tarvittaessa, jotta annostaso voi ­
taisiin pitää vakiona suhteutettuna eläimen painoon. Kun 90 vuoro ­
kauden testin on tarkoitus olla alustava testi ennen pitkäaikaisen 
myrkyllisyystestin suorittamista, olisi molemmissa testeissä käytet ­
tävä samanlaista ruokavaliota.
 
1.5.2  Havainnot  
Havainnointiajan olisi oltava vähintään 90 vuorokautta. Pitkäaikai ­
seen havainnointiin tarkoitetun ryhmän eläimiä olisi pidettävä sopiva aika ilman käsittelyä, jotta voitaisiin osoittaa myrkkyvaikutusten py ­
syvyys tai eläinten toipuminen niistä.
 
Yleiset kliiniset havainnot olisi tehtävä vähintään kerran päivässä, 
mieluiten samaan kellonaikaan (samoihin kellonaikoihin). Tässä olisi 
otettava huomioon se, milloin annoksen antamisen jälkeen odotetut 
vaikutukset ovat suurimmillaan. Eläinten kliininen tila on kirjattava. Kaikki eläimet tarkastetaan sairastavuuden ja kuolleisuuden havaitse ­
miseksi vähintään kahdesti päivässä, tavallisesti aamulla ja illalla.
 
Kaikista eläimistä olisi tehtävä yksityiskohtaiset kliiniset havainnot 
vähintään kerran ennen ensimmäistä altistusta (jotta eläimessä havait ­
tavia muutoksia voidaan verrata alkutilaan) ja kerran viikossa sen 
jälkeen. Havainnointi olisi tehtävä niin, että eläin on häkin ulkopuo ­
lella, mieluiten vakioalueella ja suunnilleen samaan vuorokauden ­
aikaan. Havainnot olisi kirjattava huolellisesti, ja mieluiten olisi käy ­
tettävä testilaboratorion nimenomaisesti määrittelemää pisteytys ­
menctelmää. Olisi pyrittävä siihen, että havainnointiolosuhteissa olisi mahdollisimman vähän vaihtelua. Kirjattavia havaintoja olisivat mm. muutokset nahassa, turkissa, silmissä ja limakalvoissa, eritykset ja 
eritteet, autonominen aktiviteetti (esim. kyynelet, karvojen jäykisty ­
minen, silmäterän koko, epätavallinen hengitys). Muutokset käynnis ­
sä, asennossa ja reagoimisessa käsittelyyn sekä kouristusliikkeet ja jäykkyys, kaavamaiset liikkeet (esim. liioiteltu siistiminen, toistuva 
ympyrää kulkeminen) tai omituinen käyttäytyminen (esim. itseään 
vahingoittaminen, takaperin kävely) olisi myös kirjattava (1).
 
Silmät olisi tutkittava oftalmoskoopilla tai muulla sopivalla laitteella 
ennen testiaineen antamista ja testin lopussa mieluiten kaikilta koe- eläimiltä ja ainakin suuren annoksen ryhmään ja kontrolliryhmään kuuluvilta. Jos silmissä havaitaan muutoksia, olisi tutkittava kaikki 
eläimet.
 
Altistusajanjakson loppua kohti, mutta ei aikaisemmin kuin viikolla 
11 olisi tutkittava aistien reagointi erilaisiin ärsykkeisiin (1) (esim. 
kuulo-, näkö- ja proprioseptiiviset ärsykkeet) (2), (3), (4), tarttumi ­
sotteen voimakkuus (5) ja motorinen aktiivisuus (6). Lisätietoja käy ­
tettävistä menetelmistä annetaan vastaavissa viitteissä. Myös muita 
menetelmiä saa käyttää.  
Tutkimuksen loppupuolella tehtäviä toiminnallisia havaintoja ei tar ­
vitse suorittaa, jos muista tutkimuksista on saatavilla toiminnallisia 
havaintoja koskevia tietoja ja päivittäisissä kliinisissä havainnoissa ei 
ole tullut ilmi toiminnallisia vajavaisuuksia.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 404
 
Poikkeuksellisesti toiminnallisia havaintoja ei tarvitse myöskään 
tehdä ryhmille, joissa havaitaan muita myrkkyvaikutuksia siinä mää ­
rin, että ne haittaisivat merkittävästi toiminnallista testiä.  
1.5.2.1  Eläimen paino ja ravinnon ja/tai veden nauttiminen  
Kaikki eläimet olisi punnittava vähintään kerran viikossa. Ravinnon ­
otto olisi mitattava vähintään viikoittain. Jos testiaine annetaan juo ­
maveden mukana, veden nauttiminen olisi myös mitattava vähintään 
viikoittain. Veden nauttimisen mittaamista voidaan harkita myös sel ­
laisissa ruoka- tai letkuruokintatutkimuksissa, joiden aikana juomi ­
sessa voi esiintyä muutoksia.  
1.5.2.2  Hematologia ja kliininen biokemia  
Verinäytteet olisi otettava nimetystä paikasta ja säilytettävä tarvitta ­
essa asianmukaisissa olosuhteissa. Testiajanjakson lopussa näytteet 
otetaan juuri ennen tappamista tai sen yhteydessä.  
Verestä olisi tehtävä testiajanjakson lopussa ja aina, kun on otettu 
verinäytteitä, seuraavat määritykset: hematokriitti, hemoglobiinikon ­
sentraatio, punasolujen määrä, valkosolujen kokonaismäärä ja niiden erittelylaskenta, verihiutaleiden määrä ja veren hyytymisaika tai hyy ­
tymiskyky.
 
Kliinisen biokemian määritykset, joilla tutkitaan tärkeimpiä myrkky ­
vaikutuksia kudoksissa ja erityisesti munuaisissa ja maksassa, olisi tehtävä verinäytteistä, jotka on otettu kustakin eläimestä juuri ennen tappamista tai sen yhteydessä (lukuun ottamatta kuolleina löydettyjä 
ja/tai kesken koetta tapettuja). Samoin kuin hematologisia tutkimuk ­
sia varten myös kliinisen biokemian testejä varten voidaan näytteitä ottaa kokeen kestäessäkin. Suositellaan, että eläimet paastoaisivat yli yön ennen verinäytteiden ottoa (
 1 ). Plasmasta tai seerumista olisi 
määritettävä natrium, kalium, glukoosi, kokonaiskolesteroli, urea, ve ­
ren ureatyppi, kreatiniini, kokonaisvalkuainen ja albumiini sekä enemmän kuin kaksi entsyymiä, jotka osoittavat maksasoluvaikutuk ­
sia {kuten alaniini-aminotransferaasi, asparagiinihappoaminotrans ­
feraasi, alkalinen fosfataasi, gamma-glutamiinihappotranspeptidaasi 
ja sorbitolidehydrogenaasi). Muitakin (maksan tai muiden elimien) entsyymejä ja sappihapot, jotka voivat antaa hyödyllistä tietoa tie ­
tyissä olosuhteissa, voidaan määrittää.
 
Seuraavat virtsamääritykset voidaan tehdä valinnaisesti tutkimuksen 
viimeisen viikon aikana (tällöin on mitattava virtsan keruuaika): ul ­
konäkö, tilavuus, osmolaalisuus tai ominaistiheys, pH, valkuainen, glukoosi ja veri ja/ tai verisolut.
 
Lisäksi olisi harkittava yleistä kudosvauriota osoittavien seerumissa 
esiintyvien merkkiaineiden määritystä. Muita määrityksiä, jotka olisi 
tehtävä, jos testiaineen tunnetut ominaisuudet saattavat vaikuttaa tai 
niiden epäillään vaikuttavan kyseisiin määrityksiin liittyvään aineen ­
vaihduntaan, ovat kalsium, fosfori, paasto-triglyseridit, tietyt hormo ­
nit, methemoglobiini ja koliinicsteraasi. Tarvittavat määritykset olisi 
yksilöitävä tiettyihin luokkiin kuuluville kemikaaleille tai tapauskoh ­
taisesti.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 405  
( 1 ) Monia seerumista ja plasmasta tehtäviä määrityksiä, esimerkiksi glukoosia varten olisi 
paasto yön yli suositeltava. Tärkeimmät syyt tähän ovat se, että ilman paastoa näytteissä 
olisi luonnollisesti paljon enemmän vaihtelua, mikä saattaisi peittää vähäisempiä vaiku ­
tuksia ja vaikeuttaa tulkintaa. Toisaalta paastoaminen yli yön saattaa häiritä eläinten 
yleistä aineenvaihduntaa ja myös päivittäistä altistamista testiaineelle erityisesti ruokin ­
tatutkimuksissa. Jos eläimet paastoavat yli yön, kliinisen biokemian määritykset olisi 
tehtävä sen jälkeen, kun on tehty toiminnalliset havainnot.
 Kaiken kaikkiaan lähestymistavan on oltava joustava. Se riippuu 
eläinlajista ja aineen havaituista ja/tai odotetuista vaikutuksista.  
Jos aiemmat tiedot ovat puutteelliset, olisi harkittava, täytyykö he ­
matologisia ja kliinisen biokemian määrityksiä tehdä ennen annosten antamisen aloittamista. Yleensä ei suositella, että tällaisia tietoja tu ­
otettaisiin ennen käsittelyä (7).
 
1.5.2.3  Ruumiinavaustutkimukset  
Kaikille tutkimukseen sisältyville eläimille on tehtävä täydellinen ja 
yksityiskohtainen ruumiinavaus, jossa tutkitaan huolellisesti eläimen ruumis päältä päin, kaikki ruumiin aukot sekä kallo-, rinta- ja vatsa ­
ontelot ja niiden sisältö. Kaikkien eläinten (lukuun ottamatta kuol ­
leina löydettyjä ja/tai kesken koetta tapettuja) maksa, munuaiset, 
lisämunuaiset, kivekset, lisäkivekset, kohtu, munasarjat, kateenkorva, perna, aivot ja sydän olisi puhdistettava muusta kudoksesta tapauk ­
sen mukaan, ja ne olisi punnittava mahdollisimman nopeasti avauk ­
sen jälkeen kuivumisen estämiseksi.
 
Seuraavat kudokset olisi säilöttävä sellaiseen kiinnitysväliaineeseen, 
joka sopii parhaiten kyseiselle kudostyypille ja aiottuun histopatolo ­
giseen tutkimukseen: kaikki suuret leesiot, aivot (edustavat alueet, 
mukaan luettuina iso-aivot, pikkuaivot ja ydin/aivosilta), selkäydin 
(kolmesta kohdasta: kaularanka, rintarangan keskiosa ja lanneranka), aivolisäke, kilpirauhanen, lisäkilpirauhanen, kateenkorva, ruokatorvi, sylkirauhaset, maha, ohut- ja paksusuoli (mukaan lukien Peyerin 
imukerässikermät), maksa, haima, munuaiset, lisämunuaiset, perna, 
sydän, rintakehä ja keuhkot (säilötään puhaltamalla täyteen kiinnitys ­
ainetta ja upottamalla sitten siihen), aortta, sukurauhaset, kohtu, lisä ­
sukupuolirauhaset, naaraan rintarauhanen, eturauhanen, virtsarakko, 
sappirakko (hiiri), imusolmukkeet (mieluiten yksi imusolmuke, joka 
kattaa antotien ja toinen, joka on kaukana antotiestä ja kattaa systee ­
miset vaikutukset), ääreishermo (lonkkahermo tai säärihermo), mie ­
luiten lähellä kyseessä olevaa lihasta, näyte luuytimestä (ja/tai tuore 
luuydinnestenäyte}, nahkaa, silmät (jos oftalmologisessa tutkimuk ­
sessa havaittiin muutoksia). Kliiniset ja muut löydökset voivat antaa aihetta muiden kudosten tutkimiseen. Myös muut elimet, joihin testi ­
aineen oletetaan vaikuttavan ennestään tunnettujen ominaisuuksien 
perusteella, olisi säilöttävä.
 
1.5.2.4  Histopatologia  
Täydellinen histopatologinen tutkimus olisi tehtävä kontrolliryhmän 
ja suuren annoksen ryhmän kaikkien eläinten säilötyistä elimistä ja kudoksista. Nämä tutkimukset on tehtävä myös muiden annosryh ­
mien eläimille, jos suuren annoksen ryhmässä havaitaan käsittelyyn 
liittyviä muutoksia.
 
Kaikki suuret leesiot olisi tutkittava.  
Jos tutkimuksessa on mukana testiryhmä, jolle testiä on jatkettu 
pitempään sen jälkeen, kun testiaineen antaminen lopetettiin, histo ­
patologiset tutkimukset on tehtävä niille kudoksille ja elimille, joissa 
on näkynyt muutoksia käsitellyissä ryhmissä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 406
 
2. MÄÄRITYSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
2.1 MÄÄRITYSTULOKSET  
Tutkimuksessa on ilmoitettava yksilökohtaiset tulokset. Tulokset on 
lisäksi esitettävä taulukoituina, ja niistä on käytävä ilmi seuraavat 
tiedot: kuhunkin ryhmään kuuluvien eläinten lukumäärä testin alussa: 
testin aikana kuolleena löydettyjen tai inhimillisistä syistä tapettujen eläinten lukumäärä ja kuoleman tai tappamisen ajankohta: niiden eläinten lukumäärä, joissa näkyy myrkkyvaikutuksia; havaittujen 
myrkkyvaikutusten kuvaus, mukaan luettuna myrkytysoireiden alku, 
kesto ja vakavuus; niiden eläinten lukumäärä, joissa havaitaan lee ­
sioita: leesioiden tyyppi ja kunkin tyypin leesioista kärsivien eläinten 
prosenttiosuus.
 
Kun on numeerisia tuloksia, ne on arvioitava asianmukaisella ja 
yleisesti hyväksytyllä tilastomenetelmällä. Tilastomenetelmät ja ana ­
lysoitavat määritystulokset on valittava tutkimusta suunniteltaessa.  
2.2 TESTISELOSTE  
Testiselosteessa on annettava seuraavat tiedot:  
2.2.1  Testiaine:  
— fysikaalinen olomuoto, puhtaus ja fysikokemialliset ominaisuu ­
det, 
— tunnistetiedot,  
— kantaja-aine (tarvittaessa): jos kantaja-aine on muu kuin vesi, sen 
valinta on perusteltava.  
2.2.2  Koe-eläinlajit:  
— käytetty eläinlaji ja kanta,  
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli,  
— toimittaja, häkit, ravinto jne.  
— kunkin eläimen paino testin alkaessa.  
2.2.3  Koeolosuhteet:  
— annostasojen valintaperusteet,  
— yksityiskohtaiset tiedot testiainevalmisteesta/ravintovalmisteesta, 
pitoisuus, stabiilisuus ja tasalaatuisuus valmisteessa.  
— yksityiskohtaiset tiedot testiaineen antotavasta,  
— todellinen annos (mg/painokilo/vrk) ja muuntokerroin ravintoon/ ­
juomaveteen sekoitetun testiaineen pitoisuudelle (ppm) tarvittaessa,  
— yksityiskohtaiset tiedot ravinnon ja veden laadusta.  
2.2.4  Tulokset:  
— eläimen paino ja painon muutokset,  
— ravinnon nauttiminen ja veden nauttiminen tarvittaessa,  
— myrkyllisyysvaste sukupuolittain ja annostasoittain, mukaan lu ­
kien myrkyllisyysvaikutuksen merkit,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 407
 
— kliinisten havaintojen laatu, vakavuus ja kesto (sekä palautuvat 
vaikutukset että muut),  
— silmätutkimuksen tulokset,  
— aistitoiminta, tarttumisvoimakkuus ja motorisen aktiivisuuden ar ­
viointi (jos saatavilla),  
— hematologiset testit ja kyseisiä testejä koskevat perustasot,  
— kliinisen biokemian testit ja kyseisiä testejä koskevat perustasot,  
— eläimen paino testin lopussa, elinten painot sekä elinten ja eläin ­
ten painosuhteet,  
— ruumiinavauslöydökset,  
— yksityiskohtainen kuvaus kaikista histopatologisista löydöksistä,  
— imeytymistiedot, jos saatavilla,  
— tulosten tilastollinen käsittely tarvittaessa.  
Tulosten pohdinta.  
Johtopäätökset.  
3. LÄHDELUETTELO  
(1) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of 
Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environ ­
mental Health Criteria Document No 60.  
(2) Tupper. D. E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologie 
Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, pp. 999–1003.  
(3) Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Indust ­
rial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, pp. 691–704.  
(4) Moser, V. C, Mc Daniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, pp. 267–283.
 
(5) Meyer O. A., Tilson H. A., Byrd W. C, Riley M. T. (1979). A 
Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb 
grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol, 1, pp. 233–236.
 
(6) Crofton K. M., Howard J. L, Moser V. C, Gill M. W., 
Reiter L. W., Tilson H. A., MacPhail R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for 
Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 
pp. 599–609.
 
(7) Weingand K., Brown G., Hall R. et al. (1996). ”Harmonisation 
of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Stu ­
dies”, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, pp. 198–201.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 408
 
B.27.  SUBKROONINEN ORAALINEN MYRKYLLISYYSTESTI 
TOISTETUILLA ANNOKSILLA TEHTÄVÄ 90 VUOROKAUDEN 
ORAALINEN MYRKYLLISYYSTUTKIMUS MUILLA KUIN 
JYRSIJÖILLÄ  
1. MENETELMÄ  
Tämä subkrooninen oraalinen myrkyllisyystesti on toisinto OECD:n 
testiohjeesta N:o 409 (1998).  
1.1 JOHDANTO  
Määritettäessä ja arvioitaessa kemikaalin myrkyllisyysominaisuuksia 
voidaan subkrooninen toistetuilla annoksilla aiheutettu suun kautta 
vaikuttava myrkyllisyys määrittää sen jälkeen, kun alustavia myrkyl ­
lisyyttä koskevia tietoja on saatu välittömän myrkyllisyyden testistä tai toistetuilla annoksilla suoritetusta vuorokauden myrkyllisyystes ­
tistä. 90 vuorokauden tutkimuksesta saadaan tietoja mahdollisista 
terveyshaitoista, joita todennäköisesti seuraa toistuvasta altistuksesta aikana, jolloin eläin kasvaa nopeasti nuoreksi aikuiseksi. Tutkimuk ­
sessa saadaan tietoa tärkeimmistä myrkyllisyysvaikutuksista, siinä 
käyvät ilmi kohde-elimet ja aineen mahdollinen kertyminen ja siinä 
voidaan saada arvio haitattomista altistustasoista (NOAEL), joita voi ­
daan käyttää valittaessa annoksia pitkäaikaisten vaikutusten tutkimi ­
seen sekä turvallisuuskriteerien asettamiseen ihmisten altistukselle.
 
Tällä testimenetelmällä voidaan tunnistaa kemikaalialtistuksen haitta ­
vaikutukset muissa kuin jyrsijöissä, ja sitä olisi käytettävä ainoastaan silloin, kun
 
— muissa tutkimuksissa havaitut vaikutukset edellyttävät selven ­
nystä tai tarkempaa ominaisuuksien määrittämistä jossain muussa 
lajissa, joka ei ole jyrsijä,  
— oksikokineettisten tutkimusten perusteella muu kuin jyrsijä on 
paras koe-eläinlaji, tai  
— muun kuin jyrsijän käyttö on perusteltua muista erityisistä syistä.  
Ks. myös Yleisjohdanto, osa B.  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Annos:  annetun testiaineen määrä. Annos ilmaistaan painoyksik ­
köinä (g, mg) tai testiaineen painona koe-eläimen painoyksikköä kohti (esim. mg/kg) tai vakiopitoisuuksina ravinnossa (ppm).
 
Annostelu:  yleinen termi, joka kattaa annoksen, annostelutaajuuden 
ja annostelun keston.  
NOAEL:  lyhennys määritelmälle ”no observed adverse effect level” 
eli korkein annostaso, jolla ei havaita mitään haitallisia käsittelyyn liittyviä vaikutuksia.
 
1.3 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Testiainetta annetaan suun kautta päivittäin asteittain vaihtelevina 
annoksina useille koe-eläinryhmille niin, että yhtä annostasoa anne ­
taan ryhmää kohti 90 vuorokauden ajan. Tänä aikana eläimiä havain ­
noidaan tarkasti myrkyllisyysvaikutusten havaitsemiseksi. Testin ku ­
luessa kuolleille tai tapetuille eläimille tehdään ruumiinavaus, ja tes ­
tin päättyessä myös vielä elossa olevat eläimet tapetaan ja niille 
tehdään ruumiinavaus.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 409
 
1.4 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.4.1  Eläinlajin valinta  
Jos käytetään muuta eläinlajia kuin jyrsijää, yleisesti käytetty koe- 
eläinlaji on koira. Koirarodun pitäisi olla tarkasti määritelty; usein 
käytetään beaglea. Muitakin lajeja, esim. sikaa tai minisikaa, voi 
käyttää. Kädellisiä ei suositella, ja niiden käytön olisi oltava perus ­
teltua. Eläinten olisi oltava nuoria ja terveitä. Jos on kyseessä koira, annostelu olisi aloitettava mieluiten 4–6 kuukauden iässä ja viimeis ­
tään 9 kuukauden iässä. Jos tutkimuksen on tarkoitus olla alustava 
tutkimus pitkäaikaiselle myrkyllisyystutkimukselle, molemmissa tut ­
kimuksissa olisi käytettävä samaa lajia/rotua.
 
1.4.2  Eläinten valmistelu  
Testissä olisi käytettävä terveitä eläimiä, jotka on totutettu laborato ­
rio-olosuhteisiin ja joita ei ole käytetty kokeisiin aiemmin. Totutta ­
misajan pituus riippuu valitusta koe-eläinlajista ja sen alkuperästä. 
Suositellaan vähintään viittä päivää koirille tai kyseistä tarkoitusta 
varten omassa siittolassa kasvatetuille sioille ja vähintään kahta viik ­
koa, jos eläimet ovat peräisin ulkopuoliselta toimittajalta. Koe-eläin ­
ten laji, kanta, alkuperä, sukupuoli, paino ja/tai ikä on tunnettava. 
Eläimet jaetaan satunnaistetusti kontrolli- ja käsittelyryhmiin. Häkit on sijoitettava siten, että häkin sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Kullekin eläimelle annetaan oma tunniste ­
numero.
 
1.4.3  Annosten valmistelu  
Testiaine voidaan antaa ruokavaliossa tai juomavedessä, letkuruokin ­
nalla tai kapseleina. Menetelmä riippuu tutkimuksen tarkoituksesta ja 
testiaineen fysikaalisista ja kemiallisista ominaisuuksista.  
Tarvittaessa testiaine liuotetaan tai suspendoidaan sopivaan kantaja- 
aineeseen. On suositeltavaa, että ensin harkitaan vesiliuosta tai sus ­
pensiota aina, kun se on mahdollista, ja sen jälkeen öljyyn (esim. maissiöljyyn) tehtävää liuosta tai emulsiota ja sitten mahdollisesti muita liuottimia. Jos liuotin on muu kuin vesi, sen myr-kyllisyy ­
sominaisuudet on tunnettava. Testiaineen stabiilisuus annosteluolo ­
suhteissa olisi määritettävä.
 
1.5 TESTIN SUORITUS  
1.5.1  Eläinten lukumäärä ja sukupuoli  
Kullakin annostasolla olisi käytettävä vähintään kahdeksaa eläintä 
(neljä naarasta ja neljä koirasta). Jos eläimiä tapetaan kokeen aikana, testiin on otettava alussa sen verran enemmän eläimiä kuin niitä 
tapetaan ennen tutkimuksen päättymistä. Eläinten lukumäärän testin 
päättyessä on oltava riittävä myrkyllisyysvaikutusten järkevään arvi ­
ointiin. Kemikaalista tai sitä läheisesti muistuttavasta aineesta saa ­
tavilla olevien aiempien tietojen perusteella olisi harkittava kahdek ­
san eläimen (neljä kumpaakin sukupuolta) lisäryhmän sisällyttämistä 
kontrolliryhmään ja suurimman annoksen ryhmään sitä varten, että niitä havainnoitaisiin käsittelyjakson jälkeen mahdollisten myrkylli ­
syysvaikutusten palautumisen tai jatkumisen havaitsemiseksi. Tämä 
käsittelyn jälkeinen aika olisi asetettava havaittujen vaikutusten mu ­
kaan.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 410
 
1.5.2  Annokset  
Tutkimuksessa on käytettävä vähintään kolmea annostasoa, ja testin 
kanssa samaan aikaan on tehtävä kontrolli, paitsi jos tehdään raja- arvotesti (ks. 1.5.3). Annostasot voidaan asettaa toistetuilla annok ­
silla tehdyn testin tai raja-arvotestin tulosten perusteella, ja kaikki 
mahdolliset testiaineesta tai samanlaisista aineista saatavilla olevat toksikologiset ja toksikokineettiset tiedot on otettava huomioon. Mi ­
käli testiaineen fysikokemialliset ominaisuudet tai biologiset vaiku ­
tukset eivät rajoita korkeimman annostason valintaa, annostaso olisi 
valittava siten, että se on myrkyllinen, mutta ei johda kuolemaan eikä aiheuta suurta kärsimystä. Annostasojen on oltava laskevia, jotta 
voitaisiin osoittaa kaikki annokseen liittyvät vasteet ja haitaton taso 
alhaisimmalla annostasolla. Kaksin-nelinkertaiset erot annostasojen välillä ovat usein parhaimmat alenevassa annossarjassa, ja usein on hyödyllisempää lisätä neljäs testiryhmä kuin käyttää hyvin suuria 
annosvälejä (ts. suurempia kuin n. 6–10-kertaisia).
 
Kontrolliryhmän on oltava käsittelemätön ryhmä tai kantaja-ainetta 
saava ryhmä, jos testiaineen antamiseen käytetään kantaja-ainetta. 
Kontrolliryhmän eläimiä on käsiteltävä samalla tavoin kuin testiryh ­
män cläimiä, mutta niille ei anneta testiainetta. Jos käytetään kantaja- ainetta, kontrolliryhmän on saatava kantaja-aine suurimmassa käyte ­
tyssä tilavuudessa. Jos testiaine annetaan ravinnon mukana ja siitä 
aiheutuu ravinnonoton vähenemistä, voi normaaliravintoa saava 
kontrolliryhmä olla hyödyllinen, jotta erotettaisiin maittavuudesta ai ­
heutunut ravinnonoton väheneminen sellaisesta, joka aiheutuu testi ­
mallin toksikologisista muutoksista.
 
Seuraavat mahdollisen kantaja-aineen ja muiden lisäaineiden ominai ­
suudet on otettava huomioon: vaikutukset imeytymiseen, elimistöön 
jakautumiseen, aineenvaihduntaan tai testiaineen retentioon elimistös ­
sä; sellaiset vaikutukset testiaineen kemiallisiin ominaisuuksiin, jotka voivat muuttaa sen myrkyllisyysominaisuuksia; sekä vaikutukset ra ­
vinnon tai veden nauttimiseen tai eläinten ravitsemustilanteeseen.
 
1.5.3  Raja-annostesti  
Ellei yhdellä annostasolla, joka on vähintään 1 000 mg/kg (eläimen 
painokiloa kohti) / vrk ja joka annetaan tälle tutkimukselle annettujen 
ohjeiden mukaan, havaita haittavaikutuksia ja jos myrkyllisyyttä ei 
ole odotettavissa kemialliselta rakenteeltaan samanlaisilla aineilla saatujen tutkimustulosten perusteella, täydellinen tutkimus kolmella eri annostasolla ei ehkä ole välttämätön. Rajatestisääntöä sovelletaan, 
paitsi jos ihmisten altistumisesta voidaan päätellä, että on käytettävä 
korkeampaa annostasoa.
 
1.5.4  Antotapa  
Eläimille annetaan testiainetta päivittäin seitsemänä päivänä viikossa 
90 vuorokauden ajan. Jos käytetään muunlaista koejärjestelyä, esim. 
testiainetta annetaan viitenä päivänä viikossa, se on perusteltava. Jos testiaine annetaan letkuruokinnalla, se on annettava yhtenä annoksena mahaletkulla tai sopivalla intubaatiokanyylillä. Suurin yhdellä kerralla 
annettava nestetilavuus riippuu koe-eläimen koosta. Tilavuuden pitäisi 
yleensä olla mahdollisimman pieni. Testitilavuuksien tilavuuden vaih ­
telun pitäisi olla mahdollisimman pientä (testiannos-ten pitoisuutta olisi säädeltävä niin, että tilavuus olisi sama kaikilla annostasoilla), 
paitsi jos käytetään ärsyttäviä tai syövyttäviä aineita, joiden vaikutus 
suuremmissa pitoisuuksissa on yleensä voimakkaampi.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 411
 
Kun testiaine annetaan ravinnon tai juomaveden kanssa, on tärkeää 
varmistaa, ettei testiainemäärä häiritse normaalia ravitsemusta tai ve ­
sitasetta. Kun testiaine annetaan ravinnon kanssa, voidaan käyttää joko vakiopitoisuutta (ppm) ravinnossa tai eläimen painoon suhteu ­
tettua annoksen vakiotasoa. Mahdolliset muut antotavat on mainitta ­
va. Kun aine annetaan letkulla tai kapseleina, annos olisi annettava 
joka päivä suunnilleen samaan aikaan, ja sitä olisi mukautettava tarvittaessa, jotta annostaso voitaisiin pitää vakiona suhteutettuna eläimen painoon. Kun 90 vuorokauden testin on tarkoitus olla alus ­
tava testi ennen pitkäaikaisen myrkyllisyystestin suorittamista, olisi 
molemmissa testeissä käytettävä samanlaista ruokavaliota.
 
1.5.5  Havainnot  
Havainnointiajan olisi oltava vähintään 90 vuorokautta. Pitkäaikai ­
seen havainnointiin tarkoitetun ryhmän eläimiä olisi pidettävä sopiva aika ilman käsittelyä, jotta voitaisiin osoittaa myrkyllisyysvaikutusten 
pysyvyys tai eläinten toipuminen niistä.
 
Yleiset kliiniset havainnot olisi tehtävä vähintään kerran päivässä, 
mieluiten samaan kellonaikaan (samoihin kellonaikoihin). Tässä olisi otettava huomioon se, milloin annoksen antamisen jälkeen odotetut vaikutukset ovat suurimmillaan. Eläinten kliininen tila on kirjattava. 
Kaikki eläimet tarkastetaan sairastavuuden ja kuolleisuuden havaitse ­
miseksi vähintään kahdesti päivässä, tavallisesti aamulla ja illalla.
 
Kaikista eläimistä olisi tehtävä yksityiskohtaiset kliiniset havainnot 
vähintään kerran ennen ensimmäistä altistusta (jotta eläimessä havait ­
tavia muutoksia voidaan verrata lähtötilaan) ja kerran viikossa sen 
jälkeen. Havainnointi olisi tehtävä niin, että eläin on häkin ulkopuo ­
lella, mieluiten vakioalueella ja suunnilleen samaan vuorokauden ­
aikaan. Olisi pyrittävä siihen, että havainnointiolosuhteissa olisi mah ­
dollisimman vähän vaihtelua. Myrkyllisyyden merkit olisi kirjattava 
huolellisesti, mukaan luettuna niiden alkamisajankohta, aste ja kesto. Kirjattavia havaintoja olisivat mm. muutokset nahassa, turkissa, sil ­
missä ja limakalvoissa, eritykset ja eritteet, autonominen aktiviteetti 
(esim. kyynelet, karvojen jäykistyminen, silmäterän koko, epätaval ­
linen hengitys). Muutokset käynnissä, asennossa ja reagoimisessa käsittelyyn sekä kouristusliikkeet ja jäykkyys, kaavamaiset liikkeet (esim. liioiteltu siistiminen, toistuva ympyrää kulkeminen) tai omi ­
tuinen käyttäytyminen olisi myös kirjattava (1).
 
Silmät olisi tutkittava oftalmoskoopilla tai muulla sopivalla laitteella 
ennen testiaineen antamista ja testin lopussa mieluiten kaikilta koe- eläimiltä ja ainakin suuren annoksen ryhmään ja kontrolliryhmään kuuluvilta. Jos silmissä havaitaan käsittelyyn liittyviä muutoksia, 
olisi tutkittava kaikki eläimet.
 
1.5.5.1  Eläimen paino ja ravinnon ja/lai veden nauttiminen  
Kaikki eläimet olisi punnittava vähintään kerran viikossa. Ravinnon ­
otto olisi mitattava vähintään viikoittain. Jos testiaine annetaan juo ­
maveden mukana, veden nauttiminen olisi myös mitattava vähintään viikoittain. Veden nauttimisen mittaamista voidaan harkita myös sel ­
laisissa ruoka- tai letkuruokintatutkimuksissa, joiden aikana juomi ­
sessa voi esiintyä muutoksia.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 412
 
1.5.5.2  Hematologia ja kliininen biokemia  
Verinäytteet olisi otettava nimetystä paikasta ja säilytettävä tarvitta ­
essa asianmukaisissa olosuhteissa. Testiajanjakson lopussa näytteet otetaan juuri ennen tappamista tai sen yhteydessä.
 
Verestä olisi tehtävä tutkimuksen alussa ja sitten joko kuukauden 
välein tai testiajanjakson puolivälissä ja lopuksi testiajanjakson päät ­
tyessä seuraavat määritykset: hematokriitti, hemoglobiinikonsentraa ­
tio, punasolujen määrä, valkosolujen kokonaismäärä ja niiden eritte ­
lylaskenta, verihiutaleiden määrä ja veren hyytymiskykyä kuvaavia 
määrityksiä, kuten hyytymisaika, protrombiiniaika tai tromboplastii ­
niaika.  
Kliinisen biokemian määritykset, joilla tutkitaan tärkeimpiä myrkyl ­
lisyysvaikutuksia kudoksissa ja erityisesti munuaisissa ja maksassa, 
olisi tehtävä verinäytteistä, jotka on otettu kaikista eläimistä tutki ­
muksen alussa ja sitten joko kuukauden välein tai testiajanjakson puolivälissä ja lopuksi testiajanjakson päättyessä. Testattavaksi har ­
kittavia kohteita ovat elektrolyyttitasapaino, hiilihydraattiaineenvaih ­
dunta sekä maksan ja munuaisten toiminta. Erityistestien valinta riip ­
puu testiaineen vaikutustavasta tehdyistä havainnoista. Eläimiä olisi pidettävä paastossa sopiva aika ennen verinäytteiden ottamista. Suo ­
siteltavia määrityksiä ovat mm. kalsium, fosfori, kloridi, natrium, 
kalium, paastoglukoosi, alaniiniaminotransferaasi, asparagiinihappoa ­
minotransferaasi, omitiinidekarboksylaasi, gamma-glutamiinihappot ­
ranspeptidaasi, urcatyppi, albumiini, veren kreatiniini, kokonaisbili ­
rubiini ja seerumin kokonaisproteiinipitoisuus.
 
Virtsamäärityksiä olisi tehtävä ainakin tutkimuksen alussa, sitten tut ­
kimuksen puolivälissä ja lopuksi sen päättyessä (virtsan keruuaika on 
mitattava). Virtsasta on määritettävä ulkonäkö, tilavuus, osmolaa ­
lisuus tai ominaistiheys, pH, valkuainen, glukoosi ja veri ja/tai veri ­
solut. Muita muuttujia voidaan mitata tarvittaessa.  
Lisäksi olisi harkittava yleistä kudosvauriota osoittavien merkkiainei ­
den määritystä. Muita myrkyllisyyden arviointiin mahdollisesti tar ­
vittavia määrityksiä ovat esim. lipidi-, hormoni-, happo/emäs-, met ­
hemoglobiini- ja koliiniesteraasi-inhibiittorimääritykset. Muita klii ­
nisen biokemian määrityksiä voidaan tehdä tarvittaessa havaittujen 
vaikutusten tutkimisen laajentamiseksi. Tarvittavat määritykset olisi yksilöitävä tiettyihin luokkiin kuuluville kemikaaleille tai tapauskoh ­
taisesti.
 
Kaiken kaikkiaan lähestymistavan on oltava joustava. Se riippuu 
eläinlajista ja aineen havaitusta ja/tai odotetusta vaikutuksesta.  
1.5.5.3  Ruumiinavaustutkimukset  
Kaikille tutkimukseen sisältyville eläimille on tehtävä täydellinen ja 
yksityiskohtainen ruumiinavaus, jossa tutkitaan huolellisesti eläimen ruumis päältä päin, kaikki ruumiin aukot sekä kallo-, rinta- ja vatsa ­
ontelot ja niiden sisältö. Kaikkien eläinten (lukuun ottamatta kuol ­
leina löydettyjä ja/tai kesken koetta tapettuja) maksa ja sappirakko, 
munuaiset, lisämunuaiset, kivekset, lisäkivekset, munasarjat, kohtu, kilpirauhanen (ja lisäkilpirauhaset), kateenkorva. perna, aivot ja sy ­
dän olisi puhdistettava muusta kudoksesta tapauksen mukaan, ja ne 
olisi punnittava mahdollisimman nopeasti avauksen jälkeen kuivumi ­
sen estämiseksi.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 413
 
Seuraavat kudokset olisi säilöttävä sellaiseen kiinnitysväliaineeseen, 
joka sopii parhaiten kyseiselle kudostyypille ja aiottuun histopatolo ­
giseen tutkimukseen: kaikki suuret leesiot, aivot (edustavat alueet, mukaan luettuina isoaivot, pikkuaivot ja ydin/aivosilta), selkäydin (kolmesta kohdasta: kaularanka, rintarangan keskiosa ja lanneranka), 
aivolisäke, kilpirauhanen, lisäkilpirauhanen, kateenkorva, ruokatorvi, 
sylkirauhaset, maha, ohut- ja paksusuoli (mukaan luettuna Peyerin imukerässikermät), maksa, sappirakko, haima, munuaiset, lisämunu ­
aiset, perna, sydän, rintakehä ja keuhkot, aortta, sukurauhaset, kohtu, 
lisäsukupuolirauhaset, naaraan rintarauhanen, eturauhanen, virtsarak ­
ko, imusolmukkeet (mieluiten yksi imusolmuke, joka kattaa antotien ja toinen, joka on kaukana autotiestä ja kattaa systeemiset vaikutuk ­
set), ääreishermo (lonkkahermo tai säärihermo), mieluiten lähellä 
kyseessä olevaa lihasta, näyte luuytimestä (ja/tai tuore luuydinneste ­
näyte) ja nahkaa. Kliiniset ja muut löydökset voivat antaa aihetta muiden kudosten tutkimiseen. Myös muut elimet, joihin testiaineen oletetaan vaikuttavan ennestään tunnettujen ominaisuuksien perus ­
teella, olisi säilöttävä.
 
1.5.5.4  Histopatologia  
Täydellinen histopatologinen tutkimus olisi tehtävä kontrolliryhmän 
ja suuren annoksen ryhmän kaikkien eläinten säilötyistä elimistä ja kudoksista. Nämä tutkimukset on tehtävä myös muiden annosryh ­
mien eläimille, jos suuren annoksen tyhmässä havaitaan käsittelyyn 
liittyviä muutoksia.
 
Kaikki suuret leesiot olisi tutkittava.  
Jos tutkimuksessa on mukana testiryhmä, jolle testiä on jatkettu 
pitempään sen jälkeen, kun testiaineen antaminen lopetettiin, histo ­
patologiset tutkimukset on tehtävä niille kudoksille ja elimille, joissa on näkynyt muutoksia käsitellyissä ryhmissä.
 
2. MÄÄRITYSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
2.1 MÄÄRITYSTULOKSET  
Tutkimuksessa on ilmoitettava yksilökohtaiset tulokset. Tulokset on 
lisäksi esitettävä taulukoituina, ja niistä on käytävä ilmi seuraavat 
tiedot: kuhunkin ryhmään kuuluvien eläinten lukumäärä testin alussa; testin aikana kuolleena löydettyjen tai inhimillisistä syistä tapettujen eläinten lukumäärä ja kuoleman tai tappamisen ajankohta; niiden 
eläinten lukumäärä, joissa näkyy myrkkyvaikutuksia; havaittujen 
myrkkyvaikutusten kuvaus, mukaan luettuina myrkytysoireiden alku, kesto ja vakavuus; niiden eläinten lukumäärä, joissa havaitaan lee ­
sioita; leesioiden tyyppi ja kunkin tyypin leesioista kärsivien eläinten 
prosenttiosuus.
 
Kun on numeerisia tuloksia, ne on arvioitava asianmukaisella ja 
yleisesti hyväksytyllä tilastomenetelmällä. Tilastomenetelmät ja ana ­
lysoitavat määritystulokset on valittava tutkimusta suunniteltaessa.  
2.2 TESTISELOSTE  
Testiselosteessa on annettava seuraavat tiedot:  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 414
 
2.2.1  Testiaine:  
— fysikaalinen olomuoto, puhtaus ja fysikokemialliset ominaisuu ­
det, 
— tunnistetiedot,  
— kantaja-aine (tarvittaessa): jos kantaja-aine on muu kuin vesi, sen 
valinta on perusteltava.  
2.2.2  Koe-eläinlajit:  
— käytetty eläinlaji ja kanta,  
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli,  
— toimittaja, häkit, ravinto jne.,  
— kunkin eläimen paino testin alkaessa.  
2.2.3  Koeolosuhteet:  
— annostasojen valintaperusteet,  
— yksityiskohtaiset tiedot testiainevalmisteesta/ravintovalmisteesta, 
pitoisuus, stabiilisuus ja tasalaatuisuus valmisteessa,  
— yksityiskohtaiset tiedot testiaineen antotavasta,  
— todellinen annos (mg/painokilo/vrk) ja muuntokerroin ravintoon/ 
juomaveteen sekoitetun testiaineen pitoisuudelle (ppm) tarvittaessa,  
— yksityiskohtaiset tiedot ravinnon ja veden laadusta.  
2.2.4  Tulokset:  
— eläimen paino ja painon muutokset,  
— ravinnon nauttiminen ja veden nauttiminen tarvittaessa,  
— myrkkyvaste sukupuolittain ja annostasoittain, mukaan luettuina 
myrkkyvaikutuksen merkit,  
— kliinisten havaintojen laatu, vakavuus ja kesto (sekä palautuvat 
vaikutukset että muut),  
— silmätutkimukset,  
— hematologiset testit ja kyseisiä testejä koskevat perustasot,  
— kliinisen biokemian testit ja kyseisiä testejä koskevat perustasot,  
— eläimen paino testin lopussa, elinten painot sekä elinten ja eläin ­
ten painosuhteet,  
— ruumiinavauslöydökset,  
— yksityiskohtainen kuvaus kaikista histopatologisista löydöksistä,  
— imeytymistiedot, jos saatavilla,  
— tulosten tilastollinen käsittely tarvittaessa.  
Tulosten pohdinta.  
Johtopäätökset.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 415
 
B.28.  SUBKROONINEN MYRKYLLISYYSTESTI (IHON KAUTTA) 
TOISTUVA ANNOSTELU IHON KAUTTA, 
90 VUOROKAUTTA, JYRSIJÄT  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Ei ole.  
1.4 TESTIN PERIAATE  
Testattavaa ainetta annostellaan päivittäin 90 vuorokauden ajan usei ­
siin ryhmiin jaettujen koe-eläinten iholle eri pitoisuuksina, yksi pitoi ­
suus kullekin ryhmälle. Tutkimuksen kuluessa eläimiä tarkkaillaan 
päivittäin myrkkyoireiden toteamiseksi. Kokeen aikana kuolleille 
eläimille ja sen loputtua elossa oleville eläimille suoritetaan ruumii ­
navaus.  
1.5 LAATUKRITEERIT  
Ei ole.  
1.6 TESTIN KUVAUS  
Testin valmistelu  
Eläimet siirretään koetiloihin ja testin aikana annettava ruokinta aloi ­
tetaan vähintään viisi päivää ennen testin alkua. Nuoret, terveet eläi ­
met jaetaan satunnaisesti koe- ja kontrolliryhmiin. Juuri ennen ko ­
keen alkua eläinten selästä poistetaan karvapeite leikkaamalla. Kar ­
vapeite voidaan myös ajella, mutta se tulee tehdä noin vuorokautta 
ennen testin alkua. Karvanpoisto on yleensä toistettava noin viikon välein. Karvapeitettä poistettaessa on varottava vahingoittamasta ihoa. Vähintään 10 % ruumiin pinnasta on oltava ajeltuna, jotta 
siihen voidaan annostellaan testattavaa ainetta. Koealueen suuruus 
ja peitesiteen mitat riippuvat eläimen painosta. Kun testataan kiinteitä aineita, jotka voidaan tarvittaessa jauhaa, aine kostutetaan vedellä tai sopivalla liuottimella, jotta ihoon saadaan hyvä kosketus. Testattavia 
nesteitä ei yleensä laimenneta. Päivittäinen altistus tehdään 5–7 ker ­
taa viikossa.
 
Koeolosuhteet  
K o e - e l ä i m e t  
Voidaan käyttää täysikasvuisia rottia, kaneja tai marsuja. Muitakin 
lajeja voidaan käyttää, mutta niiden käyttö on perusteltava. Tutki ­
muksen alkaessa koe-eläinten paino saa vaihdella korkeintaan ± 20 % keskiarvosta. Mikäli pitkäaikaistutkimuksen esitestinä on tehty 
subkrooninen ihon kautta tapahtuva altistustesti, kummassakin ko ­
keessa on käytettävä samaa lajia ja kantaa.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 416
 
L u k u m ä ä r ä j a s u k u p u o l i  
Kutakin annostasoa varten tarvitaan vähintään 20 terveihoista eläintä 
(10 naarasta ja 10 urosta). Naaraiden on oltava synnyttämättömiä, eivätkä ne saa olla tiineenä. Mikäli tutkimussuunnitelma edellyttää eläinten lopettamista tutkimuksen kuluessa, eläinmäärään on lisättävä 
lopettaviksi aiottujen eläinten määrä. Lisäksi voidaan muodostaa 20 
eläimen satelliittiryhmä (10 eläintä kumpaakin sukupuolta), jolle an ­
netaan suurin annos 90 vuorokauden aikana ja jota tarkkaillaan 28 päivän ajan kokeen loputtua myrkytysoireiden ohimenevyyden, py ­
syvyyden tai viivästyneen esiintymisen toteamiseksi.
 
A n n o s t a s o t  
Testissä käytetään vähintään kolmea annostasoa ja kontrolliryhmää 
tai liuotinkontrolliryhmää, jos liuotinta käytetään. Päivittäinen altis ­
tusaika on vähintään kuusi tuntia. Eläimet altistetaan testattavalle 
aineelle samaan aikaan joka päivä ja annosta säädetään määräajoin 
(viikoittain tai joka toinen viikko), jotta annostaso pysyy muuttumat ­
tomana suhteessa eläimen painoon. Kontrolliryhmän eläimille ei an ­
neta testattavaa ainetta, mutta muuten niitä käsitellään aivan samoin 
kuin testiryhmän eläimiä. Mikäli liuotinta käytetään annostelun hel ­
pottamiseksi, kontrolleille annostellaan liuotinta samalla tavoin kuin testiryhmille ja liuottimen määrä on yhtä suuri kuin suurimman an ­
nostason saavan testiryhmän liuotinmäärä. Suurimman annoksen tu ­
lisi aiheuttaa myrkytysoireita, mutta ei lainkaan tai hyvin vähän 
kuolemantapauksia. Pienimmällä annoksella ei saisi olla myrkkyvai ­
kutusta. Mikäli ihmisten altistustasosta on tietoja, pienimmän testi ­
annoksen on oltava tätä suurempi. Keskimmäisen annostason olisi 
aiheutettava pienimmät havaittavissa olevat myrkytysoireet. Käytet ­
täessä useampia väliannostasoja ne on porrastettava niin, että myr ­
kytysoireet lisääntyvät asteittain. Pienimmän ja keskisuuren annoksen saavissa ryhmissä sekä kontrolliryhmässä kuolemantapausten luvun 
on oltava pieni, jotta tuloksista voidaan tehdä luotettava arviointi.
 
Mikäli testattava aine aiheuttaa voimakasta ihon ärsytystä, aineen 
pitoisuutta pienennetään ja tämä voi aiheuttaa muiden myrkytysoi ­
reiden poisjäämisen tai vähenemisen korkeimmalla annostasolla. Jos iho on pahoin vaurioitunut, voi olla tarpeen lopettaa tutkimus ja aloittaa uusi pienemmillä pitoisuuksilla.
 
Raja-annostesti  
Jos esitutkimuksessa ei esiinny testattavaan aineeseen liittyviä myrk ­
kyvaikututuksia 1 000 mg/kg:n tai sitä suuremmalla, ihmisten altis ­
tumisen perusteella määritetyllä annostasolla, jatkotestejä ei yleensä tarvitse tehdä.
 
Tarkkailuaika  
Eläimiä tarkkaillaan päivittäin myrkytysoireiden toteamiseksi. Kuo ­
linaika sekä myrkytysoireiden alkamis- ja loppumisaika kirjataan.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 417
 
Testin suorittaminen  
Eläimet säilytetään yksittäishäkeissä. Niitä käsitellään testattavalla 
aineella mieluimmin viikon jokaisena päivänä 90 vuorokauden ajan.  
Mikäli tutkimukseen sisältyy satelliittiryhmä, sitä tarkkaillaan vielä 
28 päivän ajan altistamisen loputtua myrkkyvaikutusten ohimenevyy ­
den tai pysyvyyden toteamiseksi. Altistamisajan on oltava kuusi tun ­
tia päivässä.  
Testattavaa ainetta annostellaan tasaisesti alueelle, joka on n. 10 % 
ruumiin koko pinta-alasta. Testattaessa erittäin myrkyllisiä aineita altistusalue voi olla pienempi, mutta aine tulisi levittää alueelle mah ­
dollisimman ohuena ja tasaisena kalvona.
 
Testattava aine pidetään kosketuksessa ihoon huokoisen sideharson 
ja ärsyttämättömän teipin avulla. Testialueelle on asetettava jokin sopiva peite pitämään harsosidos ja testattava aine paikoillaan ja estämään eläintä syömästä sitä. Eläimen liikkumista voidaan rajoit ­
taa, mutta täydellisesti liikkumattomaksi saattaminen ei ole suositel ­
tava menettelytapa.
 
Altistusajan päätyttyä jäljellä oleva aine poistetaan vedellä tai puh ­
distamalla iho jollakin muulla sopivalla tavalla.  
Eläimiä tarkkaillaan päivittäin ja myrkytysoireet, niiden alkamis- ja 
kestoaika sekä voimakkuus kirjataan. Eläimiä tarkkailtaessa kiinnite ­
tään huomiota muutoksiin, joita tapahtuu karvapeitteessä ja ihossa, silmissä ja limakalvoissa sekä hengitys- ja verenkiertoelimissä, auto ­
nomisessa ja keskushermostossa, somatomotorisissa toiminnoissa ja 
käyttäytymistavassa. Ruoan kulutus mitataan ja eläimet punnitaan 
viikoittain. Tarkkailua on suoritettava säännöllisesti, jotta koe-eläimiä ei menetettäisi kannibalismin, kudosten autolyysin tai virheellisen 
sijoituksen vuoksi. Tutkimuksen päätyttyä eloonjääneille eläimille 
satelliittiryhmää lukuun ottamatta suoritetaan ruumiinavaus. Kuole ­
maisillaan olevat eläimet poistetaan viipymättä ja niille suoritetaan ruumiinavaus.
 
Seuraavat tutkimukset tehdään testin päätyttyä kaikille eläimille, mu ­
kaan lukien kontrolliryhmän eläimet:  
a) Silmätutkimus on suoritettava oftalmoskoopilla tai vastaavalla 
laitteella ennen aineen antamista ja testin päätyttyä mieluimmin kaikille eläimille, mutta vähintään suurimman annoksen saaneille 
sekä kontrolliryhmälle. Mikäli silmissä havaitaan muutoksia, 
kaikki eläimet tutkitaan.
 
b) Veritutkimus, jossa määritetään hematokriitti, hemoglobiini, eryt ­
rosyyttien määrä, leukosyyttien määrä ja erittely sekä joitakin hyytymisominaisuuksia kuten hyytymisaika, protrombiiniaika, 
tromboplastiiniaika tai trombosyyttien määrä, tehdään tutkimus ­
ajanjakson päätyttyä.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 418
 
c) Veren kliininen biokemiallinen tutkimus on suoritettava tutkimus ­
ajanjakson päätyttyä. Kaikkiin tutkimuksiin soveltuvia määrityskoh ­
teita ovat elektrolyyttitasapaino, hiilihydraattien metabolia sekä, maksan ja munuaisten toiminta. Testien valintaperusteena on aineen todettu vaikutustapa. Suositeltavia määrityskohteita ovat: kalsium, 
fosfori, kloridi, natrium, kalium, glukoosin paastoarvo (lajille sovel ­
tuva paaston pituus), seerumin glutamiinipyruviinitransaminaasi (
 1 ), 
seerumin glutamiinioksaloasetaattitransaminaasi (  2 ), ornitiinidekar ­
boksylaasi, gammaglutamyylitranspeptidaasi, virtsan typpi, albumii ­
ni, veren kreatiniinin kokonaisbilirubiini ja seerumin proteiinit. Myr ­
kyllisyyden arvioinnissa auttavat tarvittaessa lisävalaistusta esimerkiksi lipidi-, hormoni-, happo/emästasapaino-, methemoglobii ­
ni- ja kolinesteraasiaktiivisuuden analyysit. Muitakin kliinisiä 
biokemiallisia testejä voidaan tehdä, jos todettujen vaikutusten 
laajempi tutkimus on tarpeen.
 
d) Virtsa-analyysia ei yleensä tarvita. Se tehdään silloin, kun oletettu 
tai todettu myrkyllisyys antaa siihen aihetta.  
Mikäli käytettävissä olevat taustatiedot ovat riittämättömät, hemato ­
logisten ja biokemiallisten parametrien määritystä tulisi harkita ennen altistuksen aloittamista.
 
R u u m i i n a v a u s  
Kaikille koe-eläimille suoritetaan ruumiinavaus, jossa tutkitaan ruu ­
mis ulkopuolelta, kaikki aukot, kallo-, rinta- ja vatsaontelo sekä nii ­
den sisältö. Maksa, munuaiset, lisämunuaiset ja kivekset punnitaan märkinä mahdollisimman pian irrottamisen jälkeen, jotta ne eivät 
pääse kuivumaan. Seuraavat elimet ja kudokset säilytetään sopivassa 
aineessa mahdollista myöhempää histopatologista tutkimusta varten: kaikki näkyvät vammat, aivot — ytimen/aivosillan osat mukaan lu ­
kien, pikkuaivokuori ja aivokuori, aivolisäke, kilpirauhanen/ ­
lisäkilpirauhanen, kateenkorvakudosta, (henkitorvi), keuhkot, sydän, 
aortta, sylkirauhaset, maksa, perna, munuaiset, lisämunuaiset, haima, sukupuolirauhaset, kohtu, muut sukupuolielimet, sappirakko (jos on), ruokatorvi, mahalaukku, pohjukaissuoli, ohutsuoli, umpisuoli, paksu ­
suoli, peräsuoli, virtsarakko, tyypillinen imusolmuke (naarailta rinta ­
rauhanen), (reisilihaksistoa), ääreishermo, (silmät), (rintalasta luuyti ­
mineen), (reisiluu ja nivelen pintaa) (selkärankaa kolmesta kohdasta — kaulasta, henkitorven keskiosasta ja lantiosta) sekä (kyynelrauh ­
aset). Suluissa olevat kudokset tutkitaan vain, jos ne tai kohde-elimet 
osoittavat merkkejä myrkyllisyydestä.
 
H i s t o p a t o l o g i n e n t u t k i m u s  
a) Suurimman annoksen saaneen ryhmän sekä kontrolliryhmän 
eläinten normaalista ja altistetusta ihosta otetuille näytteille sekä elin- ja kudosnäytteille tehdään täydellinen histopatologinen tut ­
kimus.
 
b) Kaikki näkyvät vammat tutkitaan.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 419  
( 1 ) Nykyisin seerumin alaniiniaminotransferaasi. 
( 2 ) Nykyisin seerumin aspartaattiaminotransferaasi.
 c) Muiden annosryhmien eläinten tärkeät elimet tutkitaan.  
d) Rotan ollessa koe-eläimenä tutkitaan alhaisen ja keskitason an ­
nosryhmien eläinten keuhkot infektioiden löytämiseksi, koska nii ­
den perusteella pystytään vaivattomasti arvioimaan eläinten ter ­
veydentila. Yleensä ei näiden ryhmien eläimille tarvitse suorittaa muita histopatologisia tutkimuksia, mutta elimet, jotka suurimman annoksen saaneessa ryhmässä olivat vaurioituneet, on aina tutkit ­
tava myös näiden ryhmien osalta.
 
e) Kun tutkimukseen sisältyy satelliittiryhmä, histopatologinen tutki ­
mus suoritetaan niille elimille ja kudoksille, joissa muiden ryh ­
mien eläimillä oli vaurioita.  
2. TULOKSET  
Tulokset esitetään taulukkomuodossa, josta näkyy kuhunkin testiryh ­
mään kuuluvien eläinten lukumäärä kokeen alussa, vammautuneiden eläinten määrä ja eläinten prosentuaalinen osuus kutakin erityyppistä 
vammaa kohden. Tulosten merkitsevyys arvioidaan jotakin tilastol ­
lista menetelmää käyttäen. Kaikkia tunnettuja tilastointimenetelmiä voidaan käyttää.
 
3. RAPORTOINTI  
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tie ­
dot: 
— eläinlaji, kanta, hankintapaikka, ympäristöolosuhteet, ruokavalio,  
— koeolosuhteet,  
— annostasot (käytetty liuotin) ja pitoisuudet,  
— myrkyllisyysoireet sukupuolen ja annostason perusteella,  
— oireeton taso, mikäli mahdollista,  
— eläinten kuolinaika tutkimuksen kuluessa ja eloonjääneet sen pää ­
tyttyä,  
— selostus myrkyllisyysoireista ja muista vaikutuksista,  
— kunkin oireen toteamisaika ja kehittyminen,  
— ruokintaa ja painoa koskevat tiedot,  
— silmälöydökset,  
— veritestit ja kaikki tulokset,  
— kliiniset biokemialliset testit ja kaikki tulokset (myös virtsa-ana ­
lyysitulokset),  
— ruumiinavauslöydökset,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 420
 
— tarkka selostus kaikista histopatologisista löydöksistä,  
— tulosten tilastointitapa, mikäli mahdollista,  
— tulosten pohdinta,  
— tulosten tulkinta.  
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
4. LÄHDELUETTELO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 421
 
B.29  SUBKROONINEN MYRKYLLISYYS HENGITETTYNÄ: 90 
PÄIVÄN TUTKIMUS  
TIIVISTELMÄ  
Tämän tarkistetun testimenetelmän B.29 tarkoituksena on luonnehtia kokonais ­
valtaisesti testikemikaalin myrkyllisyyttä hengitettynä toistuvan altistuksen jäl ­
keen tietyllä ajanjaksolla (90 päivää) ja tuottaa yksityiskohtaista tietoa määrällistä 
riskinarviointia varten. Jyrsijäryhmät, joissa on vähintään kymmenen urosta ja kymmenen naarasta, altistetaan kuuden tunnin ajan päivittäin 90 päivän (13 vii ­
kon) ajan a) testikemikaalille kolmella tai useammalla pitoisuudella, b) suodate ­
tulle ilmalle (negatiivinen kontrolli) ja/tai kantaja-aineelle (kantaja-ainekontrolli). 
Eläimiä altistetaan yleensä viitenä päivänä viikossa, mutta myös seitsemän päivän altistus viikossa on mahdollista. Sekä uroksia että naaraita testataan aina, mutta ne voidaan altistaa eri pitoisuuksille, jos jommankumman tiedetään olevan her ­
kempi tietylle testikemikaalille. Tässä menetelmässä tutkimuksen johtajalla on 
mahdollisuus sisällyttää tutkimukseen satelliittiryhmiä (vaikutusten korjaantu ­
vuus), eläinten lopettamista tutkimuksen aikana, bronkoalveolaarinen huuhtelu (BAL), neurologisia testejä sekä muita kliinis-kemiallisia ja histopato ­
logisia arviointeja, jotta testikemikaalin myrkyllisyyttä voidaan luonnehtia parem ­
min.
 
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta TG 413 (2009). Alkupe ­
räinen subkroonista inhalaatiotestiä koskeva testiohje nro 413 (TG 413) 
hyväksyttiin vuonna 1981. Tätä testimenetelmää B.29 (joka vastaa tarkistet ­
tua ohjetta TG 413 (2009)) on ajantasaistettu, jotta tieteellinen kehitys voi ­
daan ottaa huomioon ja jotta nykyiset ja tulevat sääntelyvaatimukset voidaan 
täyttää.  
2. Subkroonisia tutkimuksia, joissa tarkastellaan aineen myrkyllisyyttä hengi ­
tettynä, käytetään pääasiassa lakisääteisten pitoisuuksien johtamiseen, jotta 
on mahdollista arvioida työntekijälle työssä aiheutuva riski. Tutkimuksia 
käytetään myös ihmisten asumiseen, kuljetukseen ja ympäristöön liittyvän riskin arvioinnissa. Tämän menetelmän avulla voidaan luonnehtia haittavai ­
kutuksia, joita seuraa toistuvasta altistumisesta testikemikaalille päivittäin 
hengityksen kautta 90 päivän ajan (noin 10 prosenttia rotan elinajasta). 
Subkroonisia hengitysmyrkyllisyyttä tarkastelevia tutkimuksia voidaan käyt ­
tää myös määrällisissä riskinarvioinneissa ja kroonisten tutkimusten pitoi ­
suuksien valinnassa. Tätä testimenetelmää ei ole varsinaisesti tarkoitettu 
nanomateriaalien testaamiseen. Tämän testimenetelmän yhteydessä käytetyt määritelmät ovat tämän luvun lopussa ja ohjeasiakirjassa GD 39 (2).
 
ALUSTAVAT HUOMIOT  
3. Testauslaboratorion on otettava huomioon kaikki testikemikaalista saatavilla 
olevat tiedot ennen tutkimuksen toteuttamista tutkimuksen laadun paranta ­
miseksi ja eläinten käytön minimoimiseksi. Tietoihin, joista voi olla apua asianmukaisten testipitoisuuksien valinnassa, sisältyvät testattavan kemikaa ­
lin identiteetti, kemiallinen rakenne ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet,  in 
vitro-  tai in vivo  -toksisuustestien tulokset, odotettavissa oleva käyttö (od ­
otettavissa olevat käytöt) ja ihmisten altistumisen mahdollisuus, saatavilla olevat (Q)SAR-tiedot ja toksikologiset tiedot rakenteellisesti samankaltaisista aineista sekä muista toistuvaa altistusta käsitelleistä tutkimuksista saadut 
tiedot. Jos oletetaan tai havaitaan, että tutkimuksen aikana ilmenee neuro ­
toksisuutta, tutkimuksen johtaja voi sisällyttää tutkimukseen asianmukaisia arviointeja, kuten toiminnallisen havaintosarjan (FOB:n) ja motorisen aktii ­
visuuden mittauksen. Vaikka altistuksen ajoitus voi olla kriittinen tietyissä 
tutkimuksissa, näiden ylimääräisten toimien toteuttaminen ei saa häiritä pe ­
rustutkimuksen rakennetta.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 422
 
4. Syövyttävien tai ärsyttävien testikemikaalien laimennoksia voidaan testata 
sellaisina pitoisuuksina, joilla saadaan aikaan haluttu myrkyllisyyden aste. 
Katso lisätietoja ohjeasiakirjasta GD 39 (2). Kun eläimiä altistetaan näille materiaaleille, tavoitepitoisuuksien on oltava riittävän pienet, jotta eläimille ei aiheudu suurta kipua ja stressiä, mutta kuitenkin tarpeeksi suuret, jotta 
pitoisuus-vastekäyrä on riittävä sääntelyyn liittyvien ja tieteellisten testaus ­
tavoitteiden saavuttamiseksi. Nämä pitoisuudet on valittava tapauskohtaises ­
ti, ja niiden tulee ensisijaisesti perustua asianmukaisesti suunniteltuun annos ­
alueen määritystestiin, josta saadaan tietoa kriittisestä tutkittavasta ominai ­
suudesta, ärsytysrajasta ja oireiden alkamisajankohdasta (katso 11–13 koh ­
ta). Pitoisuuden valinnalle on esitettävä perusteet.
 
5. Kuolemaisillaan olevat eläimet, selvästi kärsivät eläimet tai eläimet, jotka 
osoittavat selviä merkkejä voimakkaasta ja jatkuvasta kärsimyksestä, on 
lopetettava humaanisti. Kuolemaisillaan olevia eläimiä käsitellään samalla tavalla kuin eläimiä, jotka kuolevat testissä. Eläinkokeiden humaaneja lopet ­
tamiskriteereitä koskevassa OECD:n ohjeasiakirjassa (3) on esitetty kriteerit, 
joiden perusteella tehdään päätös kuolemaisillaan olevan tai voimakkaasti 
kärsivän eläimen lopettamisesta. Lisäksi siinä on annettu ohjeita ennustetta ­
van tai uhkaavan kuoleman tunnistamiseksi.
 
MENETELMÄN KUVAUS  
Eläinlajin valinta  
6. Kokeessa tulee käyttää terveitä nuoria täysikasvuisia jyrsijöitä, jotka kuu ­
luvat yleisesti käytettyihin koe-eläinkantoihin. Suositeltavin laji on rotta. Jos 
käytetään muita lajeja, sille on esitettävä perustelut.  
Eläinten valmistelu  
7. Naaraat eivät saa olla synnyttäneitä eivätkä tiineinä. Satunnaistamispäivänä 
eläinten on oltava nuoria ja täysikasvuisia, ja niiden iän on oltava 7–9 viikkoa. Ruumiinpainon on oltava ± 20 prosenttia keskimääräisestä painosta 
kummankin sukupuolen osalta. Eläimet valitaan satunnaistetusti ja merkitään 
niin, että yksilöt voidaan erottaa toisistaan. Eläimet pidetään häkeissä vähin ­
tään viiden päivän ajan ennen testin aloittamista, jotta ne tottuvat laboratorio-olosuhteisiin.
 
Eläinten hoito  
8. Eläimet on voitava erottaa toisistaan esimerkiksi ihon alle asennettavien 
lähettimien avulla havainnoinnin helpottamiseksi ja sekaannuksien välttämi ­
seksi. Koe-eläintilan lämpötilan on oltava 22 ± 3 °C. Suhteellinen ilman ­
kosteus on pidettävä mielellään 30–70 prosentin välillä, mikä ei välttämättä 
ole mahdollista, jos kantaja-aineena käytetään vettä. Ennen altistuksia ja 
niiden jälkeen eläimet on eroteltava häkkeihin sukupuolen ja pitoisuuden mukaisiin ryhmiin, mutta eläinten lukumäärä häkkiä kohti ei saa häiritä kunkin eläimen selkeää havainnointia, ja määrä on pidettävä sellaisena, 
että kannibalismista ja tappelusta johtuvat hävikit voidaan minimoida. Jos 
eläimet altistetaan vain nasaalisesti, ne voi olla tarpeen totuttaa immobili ­
sointiputkiin. Immobilisointiputket eivät saa aiheuttaa eläimille tarpeetonta fyysistä, lämpöön tai liikkumattomuuteen liittyvää stressiä. Immobilisointi 
voi vaikuttaa fysiologisiin tutkittaviin ominaisuuksiin, kuten ruumiinläm ­
pöön (hypertermia) ja/tai hengityksen minuuttitilavuuteen. Jos saatavilla on rinnakkaistietoja, jotka osoittavat, ettei tällaisia muutoksia juuri ilmene, im ­
mobilisointiputkiin totuttaminen ei ole tarpeen. Eläimet, jotka altistetaan 
aerosolille kokonaan, on laitettava kokeen ajaksi häkkiin yksittäin, jotta 
testattava aerosoli ei suodatu muiden häkissä olevien eläinten karvapeitteen kautta. Tavallista ja sertifioitua laboratorioruokavaliota voidaan käyttää muulloin paitsi altistuksen aikana, eikä tavallisen juomaveden määrää tule 
rajoittaa. Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 
tuntia valoa / 12 tuntia pimeää).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 423
 
Inhalaatiokammiot  
9. Testikemikaalin luonne ja testin tavoite on otettava huomioon inhalaatio ­
kammiota valittaessa. Ensisijainen altistustapa on vain nasaalisesti (nose- only; tähän termiin kuuluvat altistustavat vain pään kautta, vain nasaalisesti 
tai vain nokan kautta). Vain nasaalista altistusta suositellaan yleensä tutkit ­
taessa nestemäisiä tai kiinteitä aerosoleja sekä sellaisia höyryjä, jotka saat ­
tavat tiivistyä ja muodostaa siten aerosoleja. Tutkimuksen tietyt tavoitteet voidaan saavuttaa paremmin käyttämällä koko kehoon kohdistuvaa altistus ­
ta, mutta se on perusteltava tutkimusraportissa. Jotta kammion ilma voidaan 
pitää vakaana koko kehon kammiossa, koe-eläinten viemä tila saa olla kor ­
keintaan viisi prosenttia kammion tilavuudesta. Vain nasaalisesti -altistuksen 
ja koko kehoon kohdistuvan altistuksen tekniikoiden periaatteet sekä niiden 
erityiset hyödyt ja haitat on kuvattu ohjeasiakirjassa GD 39 (2).
 
MYRKYLLISYYSTUTKIMUKSET  
Rajapitoisuudet  
10. Toisin kuin akuuteissa tutkimuksissa, subkroonisissa tutkimuksissa, joissa 
tarkastellaan myrkyllisyyttä hengitettynä, ei ole määritettyjä rajapitoisuuksia. Testatun enimmäispitoisuuden osalta on otettava huomioon seuraavat seikat: 
1) suurin mahdollinen pitoisuus, 2) ihmisen altistustaso pahimmassa tapauk ­
sessa, 3) tarve ylläpitää riittävä hapensyöttö ja/tai 4) eläinten hyvinvointiin liittyvät seikat. Koska tietoon perustuvia rajoja ei siis ole, voidaan käyttää asetuksen (EY) N:o 1272/2008 (13) mukaisia akuutteja rajoja (ts. enimmäis ­
pitoisuus aerosolien osalta on 5 mg/l, höyryjen osalta 20 mg/l ja kaasujen 
osalta 20 000 ppm), ks. GD 39 (2). Jos nämä rajat täytyy ylittää esimerkiksi testattaessa kaasuja tai erittäin haihtuvia testikemikaaleja (esimerkiksi jääh ­
dytysaineita), sille on esitettävä perustelut. Rajapitoisuudella on saatava ai ­
kaan selvä myrkyllisyys, joka ei saa aiheuttaa eläimille tarpeetonta stressiä 
tai vaikuttaa niiden pitkäikäisyyteen (3).
 
Annosalueen määritystutkimus  
11. Ennen päätutkimuksen aloittamista on yleensä tarpeen tehdä annosalueen 
määritystutkimus. Annosalueen määritystutkimus on esikoetta kattavampi, 
koska sitä ei ole rajattu pitoisuuden valintaan. Annosalueen määritystutki ­
muksesta karttunut tieto voi edistää päätutkimuksen onnistumista. Annos ­
alueen määritystutkimuksesta voidaan saada esimerkiksi teknistä tietoa ana ­
lyysimenetelmistä, hiukkasten koosta, toksisten mekanismien löytämisestä, 
kliinisestä patologiasta ja histopatologiasta, ja sen avulla voidaan arvioida, mitkä ovat päätutkimuksen NOAEL- ja MTC-pitoisuudet. Tutkimuksen joh ­
taja voi päättää toteuttaa annosalueen määritystutkimuksen, jotta tiedetään, 
mikä on hengityselimistöä ärsyttävä pitoisuus (esimerkiksi hengityselimistön 
histopatologia, keuhkojen toiminnan testaus tai bronkoalveolaarinen huuhte ­
lu), mikä on siedettävän pitoisuuden yläraja, joka ei aiheuta eläimille tarpee ­
tonta stressiä, ja millä parametreilla testikemikaalin myrkyllisyyttä voidaan 
luonnehtia parhaiten.
 
12. Annosalueen määritystutkimuksessa voi olla yksi tai useampi pitoisuustaso. 
Valittujen tutkittavien ominaisuuksien mukaan kullekin pitoisuustasolle on 
altistettava 3–6 urosta ja 3–6 naarasta. Annosalueen määritystutkimuksen on kestettävä vähintään viisi päivää, yleensä ei enempää kuin 28 päivää. Tut ­
kimusraportissa on esitettävä perustelut päätutkimuksen pitoisuuksien valin ­
nalle. Päätutkimuksen tavoite on osoittaa sellainen pitoisuus-vastesuhde, 
joka perustuu herkimmäksi oletettuun tutkittavaan ominaisuuteen. Pienen pitoisuuden on mielellään oltava sellainen, joka ei aiheuta havaittavia hait ­
tavaikutuksia, kun taas suuren pitoisuuden on aiheutettava selvä myrkylli ­
syys, joka ei kuitenkaan saa aiheuttaa eläimille tarpeetonta stressiä tai vai ­
kuttaa niiden pitkäikäisyyteen (3).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 424
 
13. Kun valitaan annosalueen määritystutkimuksen pitoisuustasoja, on käytet ­
tävä kaikkea saatavilla olevaa tietoa, myös rakenne-aktiivisuussuhdetta kos ­
kevia tietoja ja samanlaisia kemikaaleja koskevia tietoja (katso 3 kohta). Annosalueen määritystutkimuksessa voidaan vahvistaa tai kumota se, mitä pidetään herkimpänä mekanistisesti perusteltuna päätepisteenä, esimerkiksi 
koliiniesteraasin esto organofosfaateilla, methemoglobiinin muodostus eryt ­
rosytotoksisilla aineilla, kilpirauhashormonit (T
 3 , T 4 ) kilpirauhaselle myrkyl ­
lisillä aineilla sekä proteiini, LDH tai neutrofiilit bronkoalveolaarisessa huuhtelussa vaarattomilla huonosti liukenevilla hiukkasilla tai keuhkoja är ­
syttävillä aerosoleilla.
 
Päätutkimus  
14. Subkroonista myrkyllisyyttä koskeva päätutkimus sisältää yleensä kolme 
pitoisuustasoa ja tarvittaessa myös samanaikaiset negatiivisen (ilma)verrokin ja/tai kantaja-aineverrokin (katso 18 kohta). Asianmukaisten altistustasojen valinnassa on käytettävä apuna kaikkia saatavilla olevia tietoja, mukaan 
luettuina tulokset systeemisistä myrkyllisyystutkimuksista sekä metabolia 
ja kinetiikka (erityisesti on pyrittävä välttämään suuria pitoisuuksia, joiden vuoksi kineettiset prosessit saturoituvat). Jokainen testiryhmä sisältää 10 urosjyrsijää ja 10 naarasjyrsijää, jotka altistetaan testikemikaalille kuuden 
tunnin ajaksi päivittäin viitenä päivänä viikossa 13 viikon ajanjaksolla (tut ­
kimuksen kokonaiskesto on vähintään 90 päivää). Eläimet voidaan altistaa myös seitsemänä päivänä viikossa (esimerkiksi testattaessa inhaloitavia lääk ­
keitä). Jos jommankumman sukupuolen tiedetään olevan herkempi tietylle 
testikemikaalille, sukupuolet voidaan altistaa eri pitoisuuksille 
pitoisuus-vasteen optimoimiseksi 15 kohdassa kuvatun mukaisesti. Jos muita jyrsijöitä kuin rottia altistetaan vain nasaalisesti, altistuksen enimmäiskestoja voidaan mukauttaa lajikohtaisen stressin minimoimiseksi. Perustelut on esi ­
tettävä, jos altistuksen kesto on alle kuusi tuntia päivässä tai jos on toteu ­
tettava pitkäkestoinen (esimerkiksi 22 tuntia/päivä) koko kehoon kohdistu ­
van altistuksen tutkimus (katso GD 39) (2). Eläimiä ei saa ruokkia altistus ­
jakson aikana, paitsi jos altistus kestää yli kuusi tuntia. Vettä saa antaa koko 
kehoon kohdistuvan altistuksen ajan.
 
15. Valituilla tavoitepitoisuuksilla tulee voida tunnistaa kohde-elin (-elimet) ja 
osoittaa selvä pitoisuus-vaste:  
— Suurimman pitoisuuden tulee aiheuttaa myrkyllisiä vaikutuksia, mutta ne 
eivät saa lievittyä tai aiheuttaa kuolleisuutta, koska se estää mielekkään arvioinnin.
 
— Keskisuuri pitoisuus (keskisuuret pitoisuudet) on valittava siten, että 
myrkylliset vaikutukset porrastuvat pienimmän ja suurimman pitoisuu ­
den välille.  
— Pienimmän pitoisuuden tulee aiheuttaa vain vähän tai ei lainkaan oireita 
myrkyllisyydestä.  
Eläinten lopettaminen tutkimuksen aikana  
16. Jos eläimiä suunnitellaan lopetettavaksi tutkimuksen aikana, eläinten luku ­
määrää kullakin altistustasolla on lisättävä lopetettujen eläinten lukumäärää vastaavasti ennen tutkimuksen päättämistä. Tutkimuksen aikana tapahtuville 
lopetuksille on esitettävä perustelut, ja niistä on laadittava myös asianmu ­
kaiset tilastolliset analyysit.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 425
 
Satelliittitutkimus (vaikutusten korjaantuvuus)  
17. Satelliittitutkimuksen (korjaantuvuustutkimuksen) avulla voidaan tarkkailla 
myrkytysoireiden korjaantuvuutta, pysyvyyttä sekä sitä, esiintyykö viivästy ­
neitä myrkytysoireita käsittelyn jälkeisellä jaksolla, jonka on oltava riittävän 
pitkä, vähintään kuitenkin 14 päivää. Satelliittiryhmissä (korjaantuvuusryh ­
missä) on 10 urosta ja 10 naarasta, jotka altistetaan samaan aikaan kuin päätutkimuksen koe-eläimet. Satelliittitutkimuksen (korjaantuvuustutkimuk ­
sen) ryhmät on altistettava testikemikaalille suurimmalla pitoisuudella, ja 
tarvittaessa tutkimuksissa on oltava rinnakkaiset ilma- ja/tai 
kantaja-aineverrokit (katso 18 kohta).
 
Verrokkieläimet  
18. Rinnakkaisryhmien negatiivisia (ilma)verrokkieläimiä on käsiteltävä samalla 
tavalla kuin testiryhmän eläimiä muutoin paitsi että ne altistetaan suodate ­
tulle ilmalle testikemikaalin sijasta. Jos testi-ilmakehän tuottamisessa käyte ­
tään apuna vettä tai muuta ainetta, tutkimukseen on sisällytettävä kantaja-aineverrokkiryhmä negatiivisen (ilma)verrokkiryhmän sijasta. 
Kantaja-aineena on käytettävä vettä, mikäli mahdollista. Jos 
kantaja-aineena käytetään vettä, verrokkieläimet on altistettava ilmalle, jonka suhteellinen kosteus on sama kuin altistusryhmissä. Sopiva kantaja-aine on valittava asianmukaisesti toteutetun esitutkimuksen tai aiempien tietojen 
pohjalta. Jos kantaja-aineen myrkyllisyyttä ei tiedetä, tutkimuksen johtaja 
voi päättää käyttää sekä negatiivista (ilma)verrokkiryhmää ja kantaja-aineverrokkiryhmää, joskaan se ei ole suositeltavaa. Jos aiemmat tiedot osoittavat, että kantaja-aine on myrkytön, negatiivista (ilma)verrokki ­
ryhmää ei tarvita, ja tällöin tulee käyttää vain kantaja-aineverrokkia. Jos 
esitutkimus osoittaa, ettei kantaja-aineessa oleva testikemikaali ole myrkyl ­
linen, se tarkoittaa sitä, että kantaja-aine on myrkytön testatulla pitoisuu ­
della, ja tällöin on käytettävä tätä kantaja-aineverrokkia.
 
ALTISTUSOLOSUHTEET  
Pitoisuuksien annostelu  
19. Eläimet altistetaan testikemikaalille, kun se on kaasuna, höyrynä, aerosolina 
tai niiden sekoituksena. Testattava fyysinen olomuoto määräytyy testikemi ­
kaalin fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien, valitun pitoisuuden ja/tai tes ­
tikemikaalin käsittelyssä ja käytössä todennäköisen fyysisen muodon perus ­
teella. Hygroskooppiset ja kemiallisesti reaktiiviset testikemikaalit on testat ­
tava kuivaa ilmaa käyttäen. Räjähtävien pitoisuuksien tuottamista on vältet ­
tävä huolellisesti. Hiukkasmateriaaleja voidaan joutua käsittelemään mekaa ­
nisesti, jotta hiukkaskokoa voidaan pienentää. Lisätietoja on ohjeasiakirjassa 
GD 39 (2).  
Hiukkaskokojakauma  
20. Hiukkasten koko on mitattava kaikista aerosoleista ja sellaisista höyryistä, 
jotka voivat tiivistyä ja muodostaa siten aerosoleja. Jotta kaikki hengityse ­
limistön oleelliset osat altistuvat aineelle, on suositeltavaa käyttää aerosoleja, 
joiden massan aerodynaamisen halkaisijan mediaani (MMAD) on 1–3 μm ja 
joiden geometrinen keskihajonta ( σ g ) sijoittuu välille 1,5–3,0 (4). Tämä vaa ­
timus on pyrittävä täyttämään kaikin keinoin, mutta jos se ei onnistu, on esitettävä asiantuntijan lausunto. Esimerkiksi metallihuurut voivat olla tätä 
vaatimusta pienempiä, kun taas varautuneet hiukkaset ja kuidut voivat olla 
vaatimusta suurempia.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 426
 
Testikemikaalin valmistelu kantaja-aineessa  
21. Testikemikaali on testattava mielellään ilman kantaja-ainetta. Jos 
kantaja-aineen käyttö on tarpeellista asianmukaisen testikemikaalipitoisuu ­
den ja hiukkaskoon tuottamiseksi, on käytettävä ensisijaisesti vettä. Aina 
kun testikemikaali liuotetaan kantaja-aineeseen, sen stabiilius on osoitettava.  
ALTISTUSOLOSUHTEIDEN SEURANTA  
Kammion ilmavirtaus  
22. Ilman virtausta altistuskammion läpi on valvottava tarkasti ja seurattava 
jatkuvasti, ja sitä koskevat tiedot on kirjattava vähintään kerran tunnissa 
jokaisen altistuksen aikana. Testi-ilmakehän pitoisuuden (tai ajallisen stabii ­
liuden) reaaliaikainen seuranta kuuluu olennaisena osana kaikkien dynaa ­
misten parametrien mittaamiseen, ja se on myös epäsuora keino valvoa 
kaikkia oleellisia dynaamisia inhalaatioparametreja. Jos pitoisuutta seurataan 
reaaliajassa, ilmavirtausten mittaustaajuutta voidaan vähentää yhteen mitta ­
ukseen altistusta kohti päivässä. Erityistä huomiota on kiinnitettävä siihen, että uudelleenhengittäminen vältetään vain nasaalisesti -altistuksen kammi ­
oissa. Happipitoisuuden on oltava vähintään 19 prosenttia, eikä hiilidioksi ­
dipitoisuus saa ylittää yhtä prosenttia. Jos on aihetta olettaa, ettei näitä vaa ­
timuksia voida täyttää, happi- ja hiilidioksidipitoisuudet on mitattava. Jos ensimmäisenä altistuspäivänä tehdyt mittaukset osoittavat, että näiden kaa ­
sujen pitoisuus on asianmukainen, myöhemmät mittaukset eivät välttämättä 
ole tarpeen.
 
Kammion lämpötila ja suhteellinen kosteus  
23. Kammion lämpötila on pidettävä välillä 22 ± 3 °C. Eläinten hengitysilman 
suhteellista kosteutta on seurattava sekä nasaalisissa että koko kehoon koh ­
distuvissa altistuksissa, ja se on kirjattava kerran tunnissa kunkin altistuksen 
aikana, mikäli mahdollista. Suhteellisen kosteuden tulisi olla välillä 30–70 
prosenttia, mutta tämä ei ole välttämättä mahdollista (esimerkiksi testattaessa vesipohjaisia seoksia) tai mitattavissa, koska testikemikaali häiritsee testime ­
netelmää.
 
Testikemikaali: nimellispitoisuus  
24. Aina kun mahdollista, altistuskammion nimellispitoisuus on laskettava ja 
kirjattava. Nimellispitoisuus on tuotetun testikemikaalin massa jaettuna kam ­
miojärjestelmän läpi virtaavan ilman kokonaistilavuudella. Nimellispitoisuu ­
della ei luonnehdita eläinten altistumista, vaan nimellispitoisuuden ja varsi ­
naisen pitoisuuden vertailusta saadaan tietoa testijärjestelmän generointite ­
hokkuudesta, ja sitä voidaan siis käyttää generointiongelmien havaitsemi ­
seen.  
Testikemikaali: todellinen pitoisuus  
25. Todellinen pitoisuus on testikemikaalin pitoisuus eläinten hengitysilmassa 
inhalaatiokammiossa. Todelliset pitoisuudet saadaan tietyillä menetelmillä (esimerkiksi suoralla näytteenotolla, adsorptiivisilla tai kemiallisesti reaktii ­
visilla menetelmillä ja tulosten analyyttisella luonnehtimisella) tai muilla 
menetelmillä, kuten suodatukseen perustuvalla gravimetrisella analyysilla. 
Gravimetrisen analyysin käyttö on hyväksyttävää vain yksikomponenttisten jauhemaisten aerosolien tai heikosti haihtuvista nesteistä koostuvien aeroso ­
lien yhteydessä, ja sitä on tuettava asianmukaisella esitutkimuksella, jossa 
käsitellään testikemikaalia koskevia luonnehdintoja. Monikomponenttisten 
jauhemaisten aerosolien pitoisuus voidaan myös määrittää gravimetrisen
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 427
 
analyysin avulla. Siihen tarvitaan kuitenkin analyysitietoja, jotka osoittavat, 
että ilmassa leijuvan materiaalin koostumus on sama kuin lähtömateriaalin. 
Jos näitä tietoja ei ole saatavilla, testikemikaali voi olla tarpeen analysoida uudelleen (mieluiten ilmassa leijuvassa muodossaan) säännöllisin väliajoin tutkimuksen aikana. Sellaisten aerosolisoituvien aineiden osalta, jotka voivat 
höyrystyä tai sublimoitua, on osoitettava, että valitulla menetelmällä kerättiin 
kaikki faasit.
 
26. Jos mahdollista, koko tutkimuksen keston ajan on käytettävä yhdestä erästä 
peräisin olevaa testikemikaalia, ja testinäyte on säilytettävä sen puhtauden, 
homogeenisuuden ja stabiiliuden säilyttävissä olosuhteissa. Ennen tutkimuk ­
sen aloittamista testikemikaalista on laadittava luonnehdinta, johon on sisäl ­
lyttävä sen puhtaus ja – mikäli teknisesti mahdollista – identiteetti sekä tunnistettujen kontaminanttien ja epäpuhtauksien määrät. Tämä voidaan 
osoittaa esimerkiksi seuraavien tietojen avulla: retentioaika ja piikin suhteel ­
linen pinta-ala sekä molekyylipaino, joka on saatu massaspektroskopialla tai kaasukromatografia-analyyseista, tai muut estimaatit. Vaikka testinäytteen identiteetti ei kuulu testauslaboratorion vastuulle, sen voi olla järkevää vah ­
vistaa rahoittajan laatima luonnehdinta ainakin joiltain osin (esimerkiksi 
väri, fysikaalinen olomuoto jne.).
 
27. Altistusilmakehä on pidettävä mahdollisimman muuttumattomana. Altistuso ­
losuhteiden stabiiliuden osoittamiseen voidaan käyttää reaaliaikaista seur ­
antalaitetta, kuten aerosolifotometria aerosoleille tai hiilivetyanalysaattoria 
höyryille. Kammion todellinen pitoisuus on mitattava vähintään kolme ker ­
taa jokaisena altistuspäivänä ja jokaiselta altistustasolta. Jos se ei ole mah ­
dollista pienen ilmavirtauksen tai pienten pitoisuuksien vuoksi, yksi näyte 
altistuskertaa kohti hyväksytään. Tällöin tämä näyte on mielellään kerättävä 
koko altistuskerran ajalta. Yksittäiset kammion pitoisuusnäytteet eivät saa poiketa keskimääräisestä pitoisuudesta enempää kuin enintään ± 10 prosent ­
tia kaasujen ja höyryjen osalta tai enintään ± 20 prosenttia nestemäisten tai 
kiinteiden aerosolien osalta. Kammion tasapainotukseen kulunut aika (t
 95 ) 
on laskettava ja kirjattava. Altistuksen kesto käsittää ajan, jolloin testikemi ­
kaali muodostetaan. Tässä otetaan huomioon hajoamiseen ja kammion tasa ­
painotilan saavuttamiseen kulunut aika (t  95 ). Ohjeita t  95 -ajan arvioimiseksi 
on ohjeasiakirjassa GD 39 (2).  
28. Hyvin monimutkaisten, kaasuista/höyryistä koostuvien seosten ja aerosolien 
(esimerkiksi polttokammiot ja tietyn tarkoituksen mukaisten lopputuottei ­
den/-laitteiden perusteella kehitetyt testikemikaalit) osalta kukin faasi voi 
käyttäytyä inhalaatiokammiossa eri tavoin. Sen vuoksi jokaisesta faasista 
(kaasu/höyry ja aerosoli) on valittava vähintään yksi indikaattoriaine (ana ­
lyytti), yleensä seoksen pääasiallinen vaikuttava aine. Kun testikemikaali on seos, on ilmoitettava koko seoksen analyyttinen pitoisuus, ei siis pelkästään 
vaikuttavan aineen tai indikaattoriaineen (analyytin) pitoisuutta. Lisätietoja 
todellisista pitoisuuksista on ohjeasiakirjassa GD 39 (2).
 
Testikemikaali: hiukkaskokojakauma  
29. Aerosolien hiukkaskokojakauma on määritettävä vähintään kerran viikossa 
jokaisesta pitoisuudesta käyttämällä kaskadierotinta tai jotain vaihtoehtoista laitetta, kuten aerodynaamista hiukkaskokoluokittelijaa. Jos kaskadierotti ­
mella tai muulla laitteella saatujen tulosten välinen vastaavuus voidaan 
osoittaa, vaihtoehtoista laitetta voidaan käyttää koko tutkimuksen ajan.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 428
 
30. Ensisijaisen laitteen rinnalla on käytettävä toissijaista laitetta, esimerkiksi 
gravimetrista suodatinta tai törmäytintä/kuplituslaitetta ensisijaisen laitteen 
keräystehon vahvistamiseksi. Hiukkaskoon analyysista saadun massapitoi ­
suuden on sijoituttava kohtuullisessa määrin suodatusanalyysilla saadun massapitoisuuden rajoihin [katso GD 39 (2)]. Jos vastaavuus voidaan osoit ­
taa kaikkien pitoisuuksien osalta tutkimuksen varhaisessa vaiheessa, myö ­
hemmät vahvistavat mittaukset voidaan jättää tekemättä. Eläinten hyvinvoin ­
tia koskevien periaatteiden vuoksi on pyrittävä minimoimaan epävarmat tiedot, jotta altistusta ei tarvitse toistaa.
 
31. Höyryjen osalta hiukkaskoko on määritettävä, jos on mahdollista, että höy ­
ryn tiivistyessä muodostuu aerosolia, tai jos höyryatmosfäärissä, jossa fa ­
asien sekoittuminen on mahdollista, havaitaan hiukkasia.  
HAVAINNOT  
32. Eläimiä on tarkkailtava kliinisesti ja säännöllisesti ennen altistusjaksoa, sen 
aikana ja sen jälkeen. Tiiviimpi tarkkailu voi olla aiheenmukaista sen pe ­
rusteella, millainen vaste eläimille muodostuu altistuksen aikana. Kun eläin ­
ten tarkkailu ei ole mahdollista immobilisointiputkien, huonosti valaistujen 
koko kehon altistuskammioiden tai läpinäkymättömien ilmakehien vuoksi, 
eläimiä on tarkkailtava huolellisesti altistuksen jälkeen. Myrkyllisten vaiku ­
tusten korjaantuvuutta tai pahenemista voidaan arvioida ennen seuraavan 
päivän altistusta tehtävillä havainnoilla.  
33. Kaikki havainnot kirjataan jokaisesta eläimestä erikseen. Humaaneista syistä 
lopetettujen tai kuolleena löydettyjen eläinten kuolinajankohta tulee kirjata muistiin mahdollisimman tarkasti.
 
34. Häkin vieressä tehtyihin havaintoihin tulee sisältyä ihon, karvapeitteen, sil ­
mien, limakalvojen, hengitys- ja verenkiertojärjestelmän, hermoston, soma ­
tomotorisen toiminnan ja käyttäytymisen muutokset. Huomiota tulee kiinnit ­
tää vapinaan, kouristuksiin, syljeneritykseen, ripuliin, letargiaan, uneen ja koomaan. Lämmön mittaaminen peräsuolesta voi antaa tukevaa näyttöä ref ­
leksinomaisesta bradypneasta tai käsittelyyn tai ahtaaseen tilaan liittyvästä 
tai hypo-/hypertermiasta. Tutkimussuunnitelmaan voidaan sisällyttää muita arviointeja, kuten kinetiikka, biomonitorointi, keuhkojen toiminta, huonosti liukenevien, keuhkokudokseen kertyvien materiaalien retentio sekä käyttäy ­
tymisen muutokset.
 
RUUMIINPAINOT  
35. Eläinyksilöiden painot on kirjattava vähän ennen ensimmäistä altistusta 
(päivä 0) ja sen jälkeen kahdesti viikossa (esimerkiksi perjantaisin ja maa ­
nantaisin, jotta voidaan osoittaa toipuminen altistuksettoman viikonlopun tai tietyn ajan jälkeen systeemisen toksisuuden arvioimiseksi) sekä kuolinhet ­
kellä tai lopettamisen yhteydessä. Jos eläimessä ei ilmene vaikutuksia neljän 
ensimmäisen viikon aikana, ruumiinpainot voidaan punnita kerran viikossa 
tutkimuksen loppuun saakka. Satelliittiryhmän (korjaantuvuusryhmän) eläin ­
ten (jos käytössä) punnitsemista viikoittain on jatkettava koko toipumisjak ­
son ajan. Tutkimuksen päättyessä kaikki eläimet on punnittava vähän ennen 
niiden lopettamista, jotta elinten ja ruumiinpainon väliset suhteet voidaan 
laskea ilman vääristymiä.
 
RAVINNON JA VEDEN KULUTUS  
36. Ravinnon kulutus on mitattava viikoittain. Myös veden kulutus voidaan 
mitata.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 429
 
KLIININEN KEMIA  
37. Kaikista eläimistä, myös verrokki- ja satelliittiryhmän (korjaantuvuusryh ­
män) eläimistä, on tehtävä kliinis-kemialliset arvioinnit, kun ne lopetetaan. Altistuksen päättymisen ja verinäytteen ottamisen välinen aika on merkittävä 
muistiin varsinkin, jos kyseinen tutkittava ominaisuus rekonstituoituu nope ­
asti. Niistä parametreista, joiden puoliintumisaika plasmassa on lyhyt (esi ­
merkiksi COHb, CHE ja MetHb), on syytä ottaa näyte heti altistuksen pää ­
tyttyä.
 
38. Taulukossa 1 luetellaan ne kliinis-kemialliset parametrit, jotka yleensä vaa ­
ditaan kaikissa toksikologisissa tutkimuksissa. Virtsa-analyysia ei yleensä 
tarvita. Se tehdään silloin, kun oletettu tai todettu myrkyllisyys antaa siihen aihetta. Jotta testikemikaalin myrkyllisyyttä voitaisiin luonnehtia tarkemmin, tutkimuksen johtaja voi päättää arvioida myös muita parametreja (esimer ­
kiksi koliiniesteraasi, lipidit, hormonit, happo-emästasapaino, methemoglo ­
biini tai Heinzin kappaleet, kreatiinikinaasi, myelosyyttien ja punasolujen suhde, troponiinit, valtimoverikaasut, laktaattidehydrogenaasi, sorbitolide ­
hydrogenaasi, glumaattidehydrogenaasi ja gammaglutamyylitranspeptidaasi).
 
Taulukko 1  
Kliinis-kemialliset vakioparametrit  
Hematologia  
Punasolujen määrä 
Hematokriitti 
Hemoglobiinipitoisuus Keskihemoglobiini (MCH) 
Punasolujen keskimääräinen 
tilavuus (MCV) 
Keskihemoglobiinikonsentraatio (MC ­
HC) 
Retikulosyytit Valkosolujen kokonaismäärä 
Valkosolujen erittely 
Verihiutaleiden määrä Hyytymisominaisuudet (valittava 
yksi): 
— Protrombiiniaika — Hyytymisaika — Partiaalinen tromboplastii ­
niaika
 
Kliininen kemia  
Glukoosi (*) 
Kokonaiskolesteroli 
Triglyseridit Veren ureatyppi Kokonaisbilirubiini 
Kreatiniini 
Kokonaisproteiini Albumiini 
Globuliini Alaniiniaminotransferaasi 
Aspartaattiaminotransferaa–si 
Alkaalifosfataasi Kalium Natrium 
Kalsium 
Fosfori Kloridi
 
Virtsa-analyysi (valinnainen)  
Ulkonäkö (väri ja sameus) 
Määrä 
Ominaistiheys tai osmolaliteetti 
pH Kokonaisproteiini 
Glukoosi 
Veri/verisolut  
(*) Koska pitkähkö paastojakso voi vääristää glukoosinmittauksen tuloksia (käsitellyt 
eläimet vs. verrokkieläimet), tutkimuksen johtajan on päätettävä, onko eläinten 
pitäminen ravinnotta tarpeen. Jos paastojaksoa käytetään, sen on oltava käytetyille 
lajeille sopiva, esimerkiksi rotalle paastoajan pituus voi olla 16 h (ravinnotta yli 
yön). Paastoverensokeri voidaan määrittää yli yön toteutetun paaston jälkeen 
viimeisellä altistusviikolla tai yli yön paastoamisen jälkeen ennen ruumiinavausta 
(jälkimmäisessä tapauksessa on määritettävä myös kaikki muut kliinis-kemialliset 
parametrit).  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 430
 
39. Jos on todisteita siitä, että alemmat hengitystiet (esimerkiksi keuhkorakkulat) 
ovat ensisijainen kertymä- ja retentiopaikka, bronkoalveolaarinen huuhtelu 
voi olla sopiva tekniikka analysoida määrällisesti hypoteesiperusteiset annos-vaikutus-parametrit, jotka kohdistuvat keuhkorakkulatulehdukseen, keuhkotulehdukseen ja fosfolipidoosiin. Tämän avulla voidaan testata annos ­
vaste ja keuhkorakkuloiden vaurioiden ajalliset muutokset. Huuhtelunes ­
teestä voidaan analysoida valkosolujen kokonaismäärä ja niiden erottelu, kokonaisproteiini ja laktaattidehydrogenaasi. Lisäksi voidaan analysoida pa ­
rametreja, jotka viittaavat lysosomien vaurioihin, fosfolipidoosiin, fibroosiin 
sekä ärsytyksen aiheuttamaan tai allergiseen tulehdukseen, johon voi sisältyä 
esitulehduksellisten sytokiinien/kemokiinien määritys. Bronkoalveolaariseen huuhteluun perustuvat mittaukset yleensä täydentävät histopatologisten tut ­
kimusten tuloksia mutta eivät korvaa niitä. Ohjeita keuhkohuuhtelun teke ­
misestä on ohjeasiakirjassa GD 39 (2).
 
OFTALMOLOGINEN TUTKIMUS  
40. Kaikilta eläimiltä on tutkittava silmänpohjat, taittavat väliaineet, värikalvot 
ja sidekalvot oftalmoskoopilla tai muulla sopivalla laitteella ennen testike ­
mikaalin antamista ja testin lopussa kaikilta suuren annoksen ryhmään ja verrokkiryhmään kuuluvilta eläimiltä. Jos silmissä havaitaan muutoksia, kaikki muiden ryhmien eläimet on tutkittava, myös satelliittiryhmä (korjaan ­
tuvuusryhmä).
 
MAKROSKOOPPISET MUUTOKSET JA ELINTEN PAINOT  
41. Kaikille koe-eläimille, myös kokeen aikana kuolleille tai eläinten hyvinvoin ­
tia koskevien periaatteiden vuoksi lopetetuille ja tutkimuksesta poistetuille, 
on tehtävä täydellinen verenlasku ja ruumiinavaus. Jokaisen eläimen viimei ­
sen altistuksen ja lopetuksen välinen aika on merkittävä muistiin. Jos ruu ­
miinavausta ei voida tehdä heti kuolleen eläimen löytämisen jälkeen, eläintä 
on säilytettävä riittävän kylmässä lämpötilassa (ei pakastimessa) autolyysin 
minimoimiseksi. Ruumiinavaukset on tehtävä mahdollisimman pian, yleensä yhden tai kahden päivän kuluessa. Kunkin eläimen kaikki makroskooppiset muutokset tulee kirjata, ja erityistä huomiota on kiinnitettävä hengitysteissä 
oleviin muutoksiin.
 
42. Taulukossa 2 on lueteltu kaikki elimet ja kudokset, jotka on säilytettävä 
sopivassa aineessa histopatologista tutkimusta varten. [Hakasulkeisiin] mer ­
kittyjen elinten ja kudosten säilyttämisestä päättää tutkimuksen johtaja.  Li­
havoidut  elimet ja kudokset on puhdistettava ja punnittava mahdollisimman 
pian dissektion jälkeen kuivumisen välttämiseksi. Kilpirauhanen ja lisäki ­
vekset on punnittava vain tarvittaessa, koska puhdistuksen aiheuttamat va ­
hingot voivat estää histopatologisen arvioinnin. Kudokset ja elimet on kiin ­
nitettävä 10-prosenttisella puskuroidulla formaliinilla tai muulla sopivalla 
kiinnitysaineella heti ruumiinavauksen jälkeen, vähintään 24–48 tuntia en ­
nen puhdistusta sen mukaan, mitä kiinnitysainetta käytetään.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 431
Taulukko 2  
Ruumiinavauksen aikana säilöttävät elimet ja kudokset  
Lisämunuaiset  
Aortta  
Luuydin (ja/tai tuore aspiraatti)  
Aivot  (mukaan luettuina osia iso- ja pikkuai ­
voista sekä aivosillasta)  
Umpisuoli  
Paksusuoli  
Pohjukaissuoli  
[Lisäkivekset ] 
[Silmät (verkkokalvo, silmähermo) ja silmä ­
luomet]  
Reisiluu ja polvinivel  
Sappirakko (jos olemassa)  
[Harderin rauhaset]  
Sydän  
Sykkyräsuoli  
Tyhjäsuoli  
Munuaiset  
[Kyynelrauhaset (ekstraorbitaalisesti)]  
Kurkunpää (kolmesta kohdasta, joista yhden 
oltava kurkunkansi)  
Maksa  
Keuhkot  (kaikki lohkot yhdestä kohdasta, 
mukaan luettuina pääkeuhkoputket)  
Imusolmukkeet keuhkoportin alueelta etenkin 
huonosti liukenevien hiukkasmaisten testike ­
mikaalien yhteydessä. Tarkempia kokeita ja/tai tutkimuksia, joissa keskitytään immuno ­
logiaan, voidaan käyttää myös muita imusol ­
mukkeita esimerkiksi välikarsinan, servikaa ­
liselta/submandibulaariselta ja/tai aurikulaa ­
riselta alueelta.
 
Imusolmukkeet (distaalisesti aineen antokoh ­
dasta)  
Rintarauhanen (naaras)  
Lihas (reisi)  
Nenänielun kudokset (vähintään neljästä koh ­
dasta, yhden kohdan on oltava nenänieluka ­
nava ja NALT-imukudos (Nasal Associated 
Lymphoid Tissue)  Ruokatorvi  
[Hajurauhanen]  
Munasarjat  
Haima  
Lisäkilpirauhanen  
Ääreishermo (lonkka- tai säärihermo, mielui ­
ten lihaksen läheltä)  
Aivolisäke  
Eturauhanen  
Peräsuoli  
Sylkirauhaset  
Rakkularauhaset  
Iho 
Selkäydin (kaularanka, rintarangan keskiosa 
ja lanneranka)  
Perna  
Rintalasta  
Maha  
Hampaat  
Kivekset  
Kateenkorva  
Kilpirauhanen  
[Kieli]  
Henkitorvi (vähintään kahdesta kohdasta si ­
ten, että mukana on yksi pitkittäinen leike harjun läpi ja yksi poikittainen leike)
 
[Virtsanjohdin]  
[Virtsaputki]  
Virtsarakko  
Kohtu  
Kohde-elimet  
Kaikki silmin havaittavat vauriot ja mitat  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 432
 
43. Keuhkot on poistettava kokonaisina, punnittava ja täytettävä sopivalla kiin ­
nitysaineella 20–30 cm:n syvyisen veden paineessa, jotta niiden rakenne 
säilyy (5). Leikkeet on kerättävä kaikista lohkoista yhdestä kohdasta pää ­
keuhkoputket mukaan luettuina, mutta jos tehdään keuhkohuuhtelu, huuhte ­
lemattomasta lohkosta on otettava leikkeet kolmesta kohdasta (ei sarjaleik ­
keitä).  
44. Nenänielun kudoksista on tutkittava vähintään neljästä kohdasta otetut näyt ­
teet, joista yhden on oltava nenänielukanava (5) (6) (7) (8) (9), jotta levye ­
piteeli, välimuotoinen epiteeli (värekarvaton hengitysepiteeli), hengitysepi ­
teeli (värekarvallinen), hajuepiteeli sekä imukudos (NALT) (10) (11) voi ­
daan tutkia. Kurkunpäästä on tutkittava kolmesta kohdasta otetut leikkeet, ja yhden niistä on oltava kurkunpään kansi (12). Henkitorvesta on tutkittava vähintään kahdesta kohdasta otetut leikkeet, joista toisen on oltava pitkittäi ­
nen leike ekstrapulmonaalisten keuhkoputkien ja henkitorven harjun haarau ­
tuman läpi ja toisen poikittaisleike.
 
HISTOPATOLOGIA  
45. Histopatologinen arviointi on tehtävä kaikkien taulukossa 2 lueteltujen elin ­
ten ja kudosten osalta niin verrokkiryhmästä kuin suuren pitoisuuden ryh ­
mästä sekä kaikista eläimistä, jotka kuolevat tai jotka lopetetaan tutkimuksen aikana. Erityistä huomiota on kiinnitettävä hengitysteihin, kohde-elimiin ja 
näkyviin vammoihin. Ne elimet ja kudokset, joissa suuren pitoisuuden ryh ­
män eläimillä on leesioita, on tutkittava kaikista ryhmistä. Tutkimuksen johtaja voi päättää toteuttaa histopatologiset arvioinnit myös muista ryhmistä 
selvän pitoisuus-vasteen osoittamiseksi. Kun tutkimukseen sisältyy satelliit ­
tiryhmä (korjaantuvuus), sellaiset kudokset ja elimet, joissa ilmenee samoja vaikutuksia kuin käsitellyillä ryhmillä, on tutkittava histopatologisesti. Jos suuren pitoisuuden ryhmässä on hyvin paljon varhaisia kuolemantapauksia 
tai muita ongelmia, jotka vaarantavat tietojen merkityksellisyyden, seuraava 
pienemmän pitoisuuden ryhmä on tutkittava histopatologisesti. Silmämää ­
räisten havaintojen ja mikroskooppisten löydösten välille on pyrittävä löy ­
tämään korrelaatio.
 
TIEDOT JA RAPORTOINTI  
Tiedot  
46. Jokaisesta eläimestä on ilmoitettava seuraavat tiedot: ruumiinpaino, ravin ­
nonkulutus, kliinispatologiset tiedot, makroskooppiset muutokset sekä histo ­
patologiset löydökset. Kliiniset havaintotiedot tulee esittää yhteenvetona tau ­
lukossa, josta käy ilmi kussakin koeryhmässä käytettyjen eläinten lukumää ­
rä, toksisuusoireita osoittaneiden eläinten lukumäärä, kokeen aikana kuol ­
leena löydettyjen tai humaaneista syistä lopetettujen eläinten lukumäärä, yksittäisten eläinten kuolinajankohta, toksisten vaikutusten ja palautuvuuden 
kuvaus ja niiden ajallinen esiintyminen sekä ruumiinavauslöydökset. Kaikki 
tulokset, niin määrälliset kuin satunnaiset, on arvioitava sopivalla tilastome ­
netelmällä. Kaikkia yleisesti hyväksyttyjä tilastomenetelmiä voi käyttää, ja ne on valittava tutkimuksen suunnitteluvaiheessa.
 
Testiraportti  
47. Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:  
Koe-eläimet ja niiden hoito  
— kuvaus häkkiolosuhteista, mukaan luettuina seuraavat tiedot: yhdessä 
häkissä olevien eläinten lukumäärä (tai lukumäärän muutos), alustama ­
teriaali, lämpötila ja suhteellinen kosteus, valoisa aika ja tiedot ravin ­
nosta  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 433
 
— käytetyt lajit/kanta ja perustelu muun lajin kuin rotan käyttämiselle tie ­
toja lähteestä ja aiemmin saatuja tietoja voi ilmoittaa, jos ne koskevat 
eläimiä, jotka on altistettu samankaltaisessa altistuksessa ja joiden asumis- ja paasto-olosuhteet ovat olleet samat
 
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli  
— satunnaistamismenetelmä  
— kuvaus testiä edeltäneestä tilanteesta ja tiedot ravinnosta, karanteenista ja 
sairauden hoidosta.  
Testikemikaali  
— fysikaalinen olomuoto, puhtaus ja tarvittaessa fysikaalis-kemialliset omi ­
naisuudet (mukaan luettuna isomeria)  
— tunnistetiedot ja CAS-numero, jos se tiedetään.  
Kantaja-aine  
— perustelut kantaja-aineen käyttämiselle ja sen valinnalle (jos se on muu 
kuin vesi)  
— aikaisemmin tai tämän tutkimuksen yhteydessä saadut tiedot, jotka osoit ­
tavat, ettei kantaja-aine vaikuta tutkimuksen tulokseen.  
Inhalaatiokammio  
— yksityiskohtainen kuvaus inhalaatiokammiosta, mukaan luettuina tila ­
vuus ja kaavakuva  
— kuvaus eläinten altistukseen ja ilmakehän tuottamiseen käytetystä lait ­
teistosta ja sen alkuperä  
— lämmön, kosteuden, hiukkaskoon ja todellisen pitoisuuden mittauslaitteet  
— ilman lähde ja ilmanvaihtojärjestelmä  
— menetelmät, joilla laitteisto on kalibroitu yhtenäisen testi-ilmakehän var ­
mistamiseksi  
— paine-ero (yli- vai alipaine)  
— kunkin kammion altistusportit (vain nasaalinen altistus); eläinten sijainti 
kammiossa (koko kehoon kohdistuva altistus)  
— testi-ilmakehän stabiilius  
— lämpötila- ja kosteusantureiden sekä testi-ilmakehän näytteenottopaikan 
sijainti kammiossa  
— tulo- ja poistoilman käsittely  
— ilman virtausnopeudet, ilman virtausnopeus kussakin altistusportissa 
(vain nasaalinen altistus) tai eläinkuorma/kammio (koko kehoon kohdis ­
tuva altistus)  
— inhalaatiokammion tasapainotilan saavuttamiseen kulunut aika (t  95 ) 
— tilavuuden muutosten määrä tunneittain  
— annostelulaitteet (tarvittaessa).  
Altistustiedot  
— päätutkimuksen tavoitepitoisuuden valinnan peruste  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 434
 
— nimellispitoisuudet (altistuskammioon tuotetun testikemikaalin kokonais ­
massa jaettuna kammion läpi virtaavan ilman tilavuudella)  
— eläinten hengitysilmasta kerätyt testikemikaalin todelliset pitoisuudet; 
epäyhtenäisiä fyysisiä muotoja (kaasuja, höyryjä, aerosoleja) tuottavien seosten osalta jokainen voidaan analysoida erikseen
 
— kaikki ilmapitoisuudet on ilmoitettava mieluummin massayksikköinä 
(esimerkiksi mg/l, mg/m  3 , jne.) kuin tilavuusyksikköinä (ppm, ppb jne.)  
— hiukkaskokojakauma, massan aerodynaamisen halkaisijan 
mediaani (MMAD) ja geometrinen keskihajonta ( σg) sekä niiden lasken ­
tamenetelmät; yksittäiset hiukkaskokoanalyysit on myös esitettävä.  
Testiolosuhteet  
— tiedot testikemikaalin valmistelusta, mukaan luettuina tiedot kiinteiden 
materiaalien hiukkaskoon pienentämisessä tai testikemikaaliliuosten val ­
mistamisessa käytetyistä menetelmistä  
— (mieluiten kaavion sisältävä) kuvaus testi-ilmakehän tuottamiseen ja 
eläinten altistamiseen testi-ilmakehälle käytetystä laitteistosta  
— yksityiskohdat kammion lämpötilan, kosteuden ja ilmanvirtauksen seu ­
raamiseen käytetystä laitteistosta (esimerkiksi kalibrointikäyrän laatimi ­
nen) 
— yksityiskohdat kammion pitoisuuden ja hiukkaskokojakauman määrittä ­
misessä tarvittavien näytteiden keräämiseen tarkoitetusta laitteistosta  
— tiedot käytetystä kemiallisesta analyysimenetelmästä ja sen validointime ­
netelmästä (myös tiedot siitä, miten tehokasta testikemikaalin saanto oli 
näytteenottokohdasta)  
— satunnaistamismenetelmä, jolla eläimet jaettiin testi- ja verrokkiryhmiin  
— tiedot ravinnon ja veden laadusta (sekä ravinnon tyyppi/lähde, veden 
lähde)  
— testipitoisuuksien valintaperuste.  
Tulokset  
— kammion lämpötila, kosteus ja ilmanvirtaus (taulukkomuodossa)  
— tiedot nimellisistä ja todellisista pitoisuuksista kammiossa (taulukkomuo ­
dossa)  
— hiukkaskokotiedot sekä analyyttiset tiedot näytteen keräämisestä, hiuk ­
kaskokojakaumasta ja MMAD-arvon ja σ g -arvon laskelmat (taulukko ­
muodossa)  
— kunkin eläimen vastetulosten ja pitoisuustason taulukot (ts. eläimet, joilla 
ilmeni toksisuusoireita, mukaan lukien kuolleisuus, vaikutusten luonne, 
vaikeusaste, alkamisajankohta ja kesto)  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 435
 
— taulukko kunkin eläimen painoista  
— taulukko ravinnonkulutuksesta  
— taulukko kliinis-kemiallisista tiedoista  
— kunkin eläimen ruumiinavauslöydökset ja histopatologiset löydökset, mi ­
käli saatavilla.  
Tulosten pohdinta ja tulkinta  
— On kiinnitettävä erityistä huomiota niiden menetelmien kuvaukseen, joita 
tämän testimenetelmän vaatimusten (rajapitoisuus tai hiukkaskoko) täyt ­
tämisessä käytettiin.  
— Hiukkasten hengitettävyyttä on käsiteltävä kaikkien löydösten kannalta 
etenkin, jos hiukkaskokoon liittyvää kriteeriä ei voitu täyttää.  
— Tutkimuksen kokonaisarviointiin on sisällytettävä tiedot nimellisten ja 
todellisten pitoisuuksien määrittämiseen käytettyjen menetelmien yhte ­
näisyydestä sekä todellisen ja nimellisen pitoisuuden suhde.  
— Raportissa on käsiteltävä myös todennäköistä kuolinsyytä ja pääasiallista 
vaikutustapaa (systeeminen vs. paikallinen).  
— Jos kärsiviä tai voimakkaasta ja jatkuvasta kivusta merkkejä osoittavia 
eläimiä oli lopetettava humaanisti eläinkokeiden humaaneja lopettamisk ­
riteereitä koskevassa OECD:n ohjeasiakirjassa (3) olevien perustelujen mukaisesti, siitä on esitettävä selvitys.
 
— Kohde-elin (-elimet) on määritettävä.  
— NOAEL- ja LOAEL-arvot on määritettävä.  
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) OECD (1981).  Subchronic Inhalation Toxicity Testing , Original Test Guid ­
eline No 413, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2) OECD (2009).  Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing,  
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.  
3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
4) Whalan.E and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit 
Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide 
Programs, United States Environmental Protection Agency.  
5) Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in  Toxicology of Inhaled 
Material,  Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, 
s. 229–258.  
6) Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309–312.  
7) Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231–238.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 436
 
8) Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in hu ­
mans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215–263.
 
9) Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diag ­
rams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353–372.
 
10) Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn 
AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyn ­
geal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219–224.  
11) Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymp ­
hoid tissue. Toxicol. Lett. 140–141: 281–285.  
12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419–428.  
13) Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1272/2008, annettu 
16 päivänä joulukuuta 2008, aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä 
ja pakkaamisesta sekä direktiivien 67/548/ETY ja 1999/45/EY muuttami ­
sesta ja kumoamisesta ja asetuksen (EY) N:o 1907/2006 muuttamisesta, EUVL L 353, 31.12.2008, s. 1.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 437
 
Lisäys 1  
MÄÄRITELMÄ  
Testikemikaali:  Tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 438
 
B.30  KROONISET MYRKYLLISYYSTUTKIMUKSET  
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 452 (2009). Alkupe ­
räinen testiohje nro 452 hyväksyttiin vuonna 1981. Tämän tarkistetun testi ­
menetelmän B.30 kehittäminen katsottiin tarpeelliseksi, jotta siinä voidaan 
ottaa huomioon eläinten hyvinvointiin ja sääntelyvaatimuksiin liittyvä vii ­
meaikainen kehitys (1) (2) (3) (4). Tämän testimenetelmän B.30 ajantasais ­
tus on toteutettu yhdessä tässä liitteessä olevan luvun B.32 (Karsinogee ­
nisuustesti) ja luvun B.33 (Yhdistetty krooninen myrkyllisyys/karsinogee ­
nisuustesti) tarkistusten kanssa. Tavoitteena on saada lisää tietoa tutkimuk ­
sessa käytetyistä eläimistä ja yksityiskohtaisempaa tietoa annoksen valinnas ­
ta. Tämä testimenetelmä on tarkoitettu käytettäväksi monien erilaisten ke ­
mikaalien, torjunta-aineiden ja teollisuuskemikaalien testauksessa.  
2. Koska valtaosa kroonisista myrkyllisyystutkimuksista tehdään jyrsijälajeilla, 
tämä testimenetelmä on tarkoitettu käytettäväksi ensisijaisesti tutkimuksissa, jotka tehdään näillä lajeilla. Jos näitä tutkimuksia on tehtävä muilla lajeilla kuin jyrsijöillä, tässä testimenetelmässä kuvattujen periaatteiden ja menetel ­
mien lisäksi voidaan soveltaa myös tässä liitteessä olevassa luvussa B.27 
(Subkrooninen oraalinen myrkyllisyystesti – toistetuilla annoksilla tehtävä 90 vuorokauden oraalinen myrkyllisyystutkimus muilla kuin jyrsijöillä) (5) kuvattuja periaatteita ja menetelmiä asianmukaisin muutoksin, kuten 
OECD:n ohjeasiakirjassa GD 116 (Kroonisten myrkyllisyys- ja karsinogee ­
nisuustutkimusten suunnittelu ja toteutus) (6) on määritelty.
 
3. Kroonisissa myrkyllisyystutkimuksissa käytettävät kolme pääasiallista anto ­
reittiä ovat suun kautta, ihon kautta ja hengitysteiden kautta. Antoreitti valitaan testattavan kemikaalin fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuksien sekä ihmisten todennäköisen altistumisreitin mukaan. Lisätietoja altistumis ­
reitin valinnasta on OECD:n ohjeasiakirjassa GD 116 (6).
 
4. Tässä testimenetelmässä keskitytään suun kautta altistukseen, koska se on 
yleisimmin käytetty altistusreitti kroonisissa myrkyllisyystutkimuksissa. Vaikka pitkäaikaiset myrkyllisyystutkimukset, joissa altistus tapahtuu ihon tai hengitysteiden kautta, voivat olla tarpeen ihmisten terveysriskien arvioin ­
nissa ja/tai vaikka niitä voidaan tarvita tiettyjen sääntelyohjelmien nojalla, 
molemmat altistusreitit ovat teknisesti erittäin monimutkaisia. Tällaiset tut ­
kimukset on suunniteltava tapauskohtaisesti, joskin tässä kuvattu testimene ­
telmä, joka on tarkoitettu suun kautta -antoreitistä aiheutuvan kroonisen 
myrkyllisyyden määrittämiseen ja arviointiin, on pohjana hengitysteiden 
ja/tai ihon kautta tapahtuvaa altistusta koskeville tutkimuksille käsittelyai ­
koja sekä kliinisiä ja patologisia parametreja koskevien suositusten osalta. Saatavilla on OECD:n ohje testikemikaalien annostelusta hengitysteiden (6) 
(7) ja ihon kautta (6). Kun suunnitellaan pitempiaikaisia tutkimuksia, joihin 
liittyy altistus hengitysteiden kautta, on suositeltavaa käyttää apuna tämän liitteen lukua B.8 (8) ja lukua B.29 (9) sekä OECD:n ohjeasiakirjaa, joka koskee akuuttia testausta hengitysteiden kautta (7). Kun altistustestaus to ­
teutetaan ihon kautta, on suositeltavaa käyttää apuna tämän liitteen lukua 
B.9 (10).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 439
 
5. Kroonisesta myrkyllisyystutkimuksesta saadaan tietoa terveyshaitoista, joita 
käytetylle lajille todennäköisesti aiheutuu toistuvasta altistuksesta niiden 
elinkaaren suurimman osan aikana. Tutkimuksesta saadaan tietoa myös tes ­
tikemikaalin myrkyllisistä vaikutuksista, kohde-elimistä ja kemikaalin mah ­
dollisesta kertymisestä. Lisäksi tutkimuksesta voidaan saada arvio tasosta, 
joka ei aiheuta havaittavaa haittavaikutusta (NOAEL). Sitä voidaan käyttää 
määritettäessä turvallisuuskriteerejä ihmisten altistumiselle. Korostettakoon, että eläinten huolellinen kliininen tarkkailu on hyvin tärkeää, jotta tutkimuk ­
sesta saadaan mahdollisimman paljon tietoa.
 
6. Tämän testimenetelmän kattamien tutkimusten tavoitteita ovat seuraavat:  
— Testikemikaalin kroonisen myrkyllisyyden määrittäminen  
— Kohde-elinten tunnistaminen  
— Annos-vaste-suhteen luonnehtiminen  
— NOAEL-arvon (tason, joka ei aiheuta havaittavaa haittavaikutusta) mää ­
rittäminen tai viiteannoksen (BMD:n) määrittämisen lähtökohta.  
— Kroonisten myrkyllisyysvaikutusten ennustaminen ihmisten altistumista ­
soilla  
— Tiedon tuottaminen vaikutustapaa koskevia testihypoteeseja varten (6).  
ALUSTAVAT HUOMIOT  
7. Kun määritetään ja arvioidaan testikemikaalin myrkyllisiä ominaisuuksia, 
testauslaboratorion on otettava huomioon kaikki testikemikaalista saatavilla olevat tiedot ennen tutkimuksen toteuttamista, jotta tutkimus voidaan suun ­
nitella siten, että mahdollista kroonista myrkyllisyyttä voidaan testata tehok ­
kaasti ja jotta eläinten käyttö voidaan pitää mahdollisimman vähäisenä. Tietoihin, joista on apua tutkimuksen suunnittelussa, sisältyvät testattavan kemikaalin identiteetti, kemiallinen rakenne ja fysikaalis-kemialliset ominai ­
suudet, tiedot vaikutustavasta,  in vitro-  tai in vivo  -myrkyllisyystestien tu ­
lokset, odotettavissa oleva käyttö (odotettavissa olevat käytöt) ja ihmisten altistumisen mahdollisuus, saatavilla olevat (Q)SAR-tiedot ja toksikologiset tiedot rakenteellisesti samankaltaisista aineista, saatavilla olevat toksikoki ­
neettiset tiedot (kerta-annoksen ja myös toistuvan annoksen kinetiikka, jos 
saatavilla) sekä muista toistuvaa altistusta käsittelevistä tutkimuksista saadut tiedot. Krooninen myrkyllisyys on määritettävä vasta sitten, kun myrkylli ­
syydestä on saatu alustavia tietoja 28 päivän ja/tai 90 päivän myrkyllisyys ­
testeistä, joissa on käytetty toistuvia annoksia. Kroonisen myrkyllisyystesta ­
uksen osalta on harkittava vaiheittaista testaustapaa osana tietyn testikemi ­
kaalin mahdollisten terveyteen kohdistuvien haitallisten vaikutusten kokonai ­
sarviointia (11) (12) (13) (14).
 
8. Ennen tutkimuksen aloittamista on määritettävä tulosten analysointiin sopi ­
vimmat tilastomenetelmät koejärjestelyt ja tavoitteet huomioon ottaen. Tässä yhteydessä on pohdittava, onko tilastoihin sisällytettävä eloonjäämistä kos ­
keva korjaus ja analyysi, jos testi päättyy yhden tai useamman ryhmän 
osalta ennenaikaisesti. Asianmukaisia tilastollisia analyyseja koskevia ohjeita sekä keskeiset viitetiedot kansainvälisesti hyväksytyistä tilastomenetelmistä on ohjeasiakirjassa GD 116 (6) sekä ohjeasiakirjassa GD 35, joka koskee 
kroonisten myrkyllisyys- ja karsinogeenisuustutkimusten analyysia ja arvi ­
ointia.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 440
 
9. Kroonisia myrkyllisyystutkimuksia tehtäessä on noudatettava aina periaat ­
teita ja näkökohtia, jotka on määritelty OECD:n ohjeasiakirjassa GD 19 
(turvallisuuden arvioinneissa käytetyillä koe-eläimillä ilmenevien kliinisten merkkien tunnistaminen, arvioiminen ja käyttäminen humaaneina lopetta ­
miskriteereinä) ja eritoten sen 62 kohdassa. Kyseisessä kohdassa todetaan 
näin: ”Kun tutkimuksissa, joihin sisältyy toistuvaa annostelua, eläin osoittaa 
sellaisia kliinisiä merkkejä, jotka ovat progressiivisia ja jotka johtavat eläi ­
men tilan huonontumiseen, on tehtävä tietoon perustuva päätös siitä, tuleeko eläin lopettaa humaaneista syistä. Päätöstä tehtäessä on otettava huomioon, 
mitä tutkimuksellista arvoa eläimen hengissä pitämisen jatkamisesta saa ­
tavalla tiedolla on suhteessa sen yleistilaan. Jos eläin päätetään pitää testissä edelleen, havaintoja on tehtävä tiheämmin, mikäli tarpeen. On myös mah ­
dollista keskeyttää annostus tai pienentää testiannosta väliaikaisesti, mikäli 
se lievittää tuskia tai kärsimyksiä, ilman että se haittaa testin tarkoitusta.”
 
10. Tarkempia ohjeita ja kroonisten myrkyllisyys- ja karsinogeenisuustutkimus ­
ten annoksen valintaa ohjaavia periaatteita on ohjeasiakirjassa GD 116 (6) sekä kahdessa International Life Sciences Instituten julkaisussa (17) (18). Keskeinen annoksen valintastrategia määräytyy tutkimuksen ensisijaisen ta ­
voitteen tai ensisijaisten tavoitteiden mukaisesti (6 kohta). Asianmukaisia 
annostasoja valittaessa on pyrittävä saavuttamaan tasapaino yhtäältä vaarojen seulonnan ja toisaalta pieniin annoksiin liittyvien vasteiden ja niiden merki ­
tyksen välillä. Tämä on oleellista varsinkin tilanteessa, kun on määrä tote ­
uttaa yhdistetty kroonista myrkyllisyyttä ja karsinogeenisuutta koskeva tut ­
kimus (tämän liitteen luku B.33) (11 kohta).
 
11. Erillisen kroonisen myrkyllisyystutkimuksen (tämä testimenetelmä B.30) ja 
karsinogeenisuustutkimuksen (tämän liitteen luku B.32) sijasta on harkittava yhdistetyn kroonisen myrkyllisyys- ja karsinogeenisuustutkimuksen (tämän 
liitteen luku B.33) toteuttamista. Kahteen erilliseen tutkimukseen verrattuna 
yhdistetty tutkimus on ajan ja kustannusten kannalta tehokkaampi, mutta tietojen laatu ei vaarannu kroonisessa vaiheessa tai karsinogeenisuutta käsit ­
televässä vaiheessa. Kun tehdään yhdistetty krooninen myrkyllisyys- ja kar ­
sinogeenisuustutkimus (tämän liitteen luku B.33), on kiinnitettävä erityistä 
huomiota annoksen valinnan periaatteisiin (9 ja 20–25 kohta). Todettakoon, että tiettyjen sääntelypuitteiden nojalla voidaan edellyttää erillisiä tutkimuksia.
 
12. Tämän testimenetelmän yhteydessä käytetyt määritelmät on esitetty tämän 
kohdan lopussa ja ohjeasiakirjassa GD 116 (6).  
TESTIN PERIAATE  
13. Testikemikaalia annetaan useille koe-eläinryhmille erisuuruisina annoksina 
joka päivä yleensä 12 kuukauden ajan, joskin on mahdollista valita tätä 
pidempi tai lyhyempi aika sääntelyvaatimusten mukaisesti (katso 33 kohta). 
Tämän pituisen ajan katsotaan olevan riittävän pitkä, jotta mahdolliset ku ­
mulatiivisen myrkyllisyyden vaikutukset tulevat esiin ilman geriatristen muutosten häiritseviä vaikutuksia. Poikkeukset 12 kuukauden mittaisesta 
altistuksesta on perusteltava varsinkin, jos altistus on sitä lyhyempi. Testi ­
kemikaali annetaan yleensä suun kautta, mutta myös hengitysteiden tai ihon kautta testaus voi olla asianmukaista. Tutkimussuunnitelmaan voi myös si ­
sältyä yksi tai useampi eläinten lopettamiskerta kesken kokeen esimerkiksi 
kolmen ja kuuden kuukauden kohdalla, ja tutkimukseen voidaan ottaa lisää 
eläinryhmiä tämän kompensoimiseksi (katso 19 kohta). Annostelujakson aikana eläimiä havainnoidaan tarkoin myrkyllisyyteen viittaavien oireiden varalta. Kokeen aikana kuolleille tai lopetetuille eläimille tehdään ruumii ­
navaus. Kokeen lopussa vielä elossa olevat eläimet lopetetaan ja niille teh ­
dään ruumiinavaus.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 441
 
MENETELMÄN KUVAUS  
Eläinlajin valinta  
14. Tämä testimenetelmä koskee ensisijaisesti jyrsijöillä ilmenevän kroonisen 
myrkyllisyyden määrittämistä ja arviointia (katso 2 kohta), joskin samanlai ­
set tutkimukset muilla kuin jyrsijöillä saattavat olla tarpeen tietyn lainsää ­
dännön nojalla. Lajin valinta on perusteltava. Tarvittaessa muilla lajeilla 
kuin jyrsijöillä tehtävät krooniset myrkyllisyystutkimukset on suunniteltava 
ja toteutettava tässä testimenetelmässä kuvattujen sekä tämän liitteen luvussa B.27 (Oraalinen myrkyllisyystesti – toistetuilla annoksilla tehtävä 90 vuoro ­
kauden oraalinen myrkyllisyystutkimus muilla kuin jyrsijöillä) kuvattujen 
periaatteiden mukaisesti Lisätietoja lajin ja kannan valinnasta on ohjeasia ­
kirjassa GD 116 (6).
 
15. Tässä testimenetelmässä suositeltavin jyrsijälaji on rotta, mutta muitakin 
jyrsijöitä, esimerkiksi hiirtä, voidaan käyttää. Rottia ja hiiriä on käytetty 
ensisijaisina koe-eläiminä seuraavista syistä: niiden elinaika on suhteellisen lyhyt, niitä käytetään laajalti farmakologisissa ja toksikologisissa tutkimuk ­
sissa, niille muodostuu herkästi kasvaimia, ja saatavilla on kantoja, joita on 
luonnehdittu riittävästi. Tämän vuoksi niiden fysiologiasta ja patologiasta on 
saatavana paljon tietoa. Testissä tulee käyttää yleisesti käytettyjä nuoria ja terveitä täysikasvuisia koe-eläinkantoja. Kroonisessa myrkyllisyystutkimuk ­
sessa on käytettävä eläimiä, jotka ovat samaa kantaa ja samasta lähteestä 
kuin eläimet, joita käytettiin kestoltaan lyhyemmässä alustavassa myrkylli ­
syystutkimuksessa (alustavissa myrkyllisyystutkimuksissa). Naaraat eivät saa olla synnyttäneitä eivätkä tiineinä.
 
Koe-eläintilat ja ruokinta  
16. Eläimet voidaan pitää häkeissä yksittäin tai muutaman samaa sukupuolta 
olevan eläimen ryhmissä. Yksittäin pitämistä on harkittava vain, jos se on 
tieteellisesti perusteltua (19) (20) (21). Häkit on sijoitettava siten, että häkin sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Koe-eläinhuoneen lämpötilan tulee olla 22 °C (± 3 °C). Vaikka riittää, 
että suhteellinen kosteus on vähintään 30 prosenttia eikä mielellään ylitä 
70:tä prosenttia muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, tulee kuitenkin pyrkiä 50–60 prosentin suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa / 12 tuntia pimeää). 
Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä 
juomaveden määrää saa rajoittaa. Ruokavalion on vastattava kaikkia testat ­
tujen lajien ravintovaatimuksia. Ruokavalion sisältämien kontaminanttien määrän on oltava mahdollisimman pieni. Tällaisia kontaminantteja, jotka 
saattavat vaikuttaa testin tuloksiin, ovat esimerkiksi torjunta-ainejäämät, py ­
syvät orgaaniset yhdisteet, fytoestrogeenit, raskasmetallit ja mykotoksiinit. Ravintoaine- ja kontaminanttipitoisuudesta on tuotettava analyyttista tietoa 
säännöllisesti, vähintään tutkimuksen alussa ja silloin, kun käytettävä erä 
muuttuu, ja nämä tiedot on sisällytettävä loppuraporttiin. Yhtä lailla on ilmoitettava analyyttiset tiedot tutkimuksessa käytetystä juomavedestä. Ruo ­
kavalion valintaan voi vaikuttaa tarve varmistaa testikemikaalin ja eläinten 
ravintovaatimusten välinen tasapaino silloin, kun testikemikaalia annetaan 
ravintoon sekoitettuna.
 
Eläinten valmistelu  
17. Testissä on käytettävä terveitä eläimiä, joita on totutettu laboratorio-olosuhteisiin 
vähintään seitsemän vuorokauden ajan ja joita ei ole käytetty kokeisiin aiemmin. Jyrsijöiden osalta testikemikaalin antaminen eläimille tulee aloittaa mahdollisim ­
man pian vieroituksen ja totutuksen jälkeen, mielellään ennen kuin eläimet ovat 
kahdeksanviikkoisia. Koe-eläinten laji, kanta, alkuperä, sukupuoli, paino ja ikä on tunnettava. Testin alkaessa eläinten painon vaihtelun tulee olla mahdollisim ­
man vähäistä, ja se saa vaihdella kummankin käytetyn sukupuolen osalta 
korkeintaan ± 20 prosenttia kaikkien tutkimuksessa käytettyjen eläinten keski ­
määräisestä painosta, joka on määritettävä kummallekin sukupuolelle erikseen.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 442
 
Eläimet tulee jakaa verrokki- ja testiryhmään satunnaistetusti. Satunnaistamisen 
jälkeen kummankaan sukupuolen ryhmissä ei saa olla suuria eroja keskimää ­
räisessä painossa. Jos tilastollisesti merkitseviä eroja on, satunnaistamisvaihe on toistettava, mikäli mahdollista. Kullekin eläimelle tulee antaa oma tunnistenu ­
mero, joka on merkittävä eläimeen pysyvästi tatuoimalla, mikrosiruimplantilla tai 
muulla sopivalla tavalla.
 
MENETTELY  
Eläinten lukumäärä ja sukupuoli  
18. Testissä on käytettävä molempia sukupuolia. Testissä on käytettävä riittävää 
määrää eläimiä, jotta jokaisessa ryhmässä on tarpeeksi eläimiä tutkimuksen lopussa perusteellista biologista ja tilastollista arviointia varten. Kun tutki ­
muksessa käytetään jyrsijöitä, jokaisella annostasolla on käytettävä yleensä 
vähintään 20:tä eläintä kumpaakin sukupuolta. Kun tutkimuksessa käytetään muita eläimiä kuin jyrsijöitä, suositeltava määrä on vähintään neljä eläintä kumpaakin sukupuolta. Tutkimuksissa, joissa käytetään hiiriä, kuhunkin an ­
nosryhmään saatetaan tarvita enemmän eläimiä, jotta kaikki vaadittavat he ­
matologiset määritykset saadaan tehtyä.
 
Eläinten lopettamista kesken tutkimuksen sekä satelliittiryhmiä ja eri ­
tyisvalvonnassa olevia eläimiä koskeva säännös  
19. Tutkimuksessa voidaan hyödyntää mahdollisuutta lopettaa eläimiä kesken 
tutkimuksen (vähintään 10 eläintä/sukupuoli/ryhmä) esimerkiksi kuuden kuu ­
kauden kohdalla, jotta saadaan tietoa toksikologisten muutosten etenemisestä 
ja mekanistista tietoa, mikäli se on tieteellisesti perusteltua. Jos tällaisia tietoja 
on jo saatavana aiemmista samaa testikemikaalia koskevista toistetun annok ­
sen myrkyllisyystutkimuksista, eläinten lopettaminen kesken tutkimuksen ei ole välttämättä tieteellisesti perusteltua. Tutkimukseen voidaan sisällyttää 
myös satelliittiryhmiä, jotta tutkittavana olevan testikemikaalin aiheuttamien 
toksikologisten muutosten korjaantuvuutta voidaan seurata. Nämä ryhmät ra ­
jataan yleensä tutkimuksen suurimman annoksen ryhmään ja verrokkiryh ­
mään. Lisäksi tutkimukseen voidaan sisällyttää ryhmä erityisvalvonnassa ole ­
via eläimiä (yleensä viisi eläintä kumpaakin sukupuolta) sairauden tilan seu ­
raamiseksi tutkimuksen aikana, mikäli tarpeen (22). Jos osa eläimistä aiotaan lopettaa kesken tutkimuksen tai jos tutkimukseen aiotaan sisällyttää satelliit ­
tiryhmiä tai erityisvalvonnassa olevien eläinten ryhmiä, tutkimussuunnitelman 
mukaista eläinten määrää on lisättävä niiden eläinten määrällä, jotka on määrä 
lopettaa ennen tutkimuksen päättymistä. Näitä eläimiä on yleensä tarkkailtava samalla tavalla kuin päätutkimuksen kroonisen myrkyllisyyden vaiheessa käy ­
tettäviä eläimiä: niiden ruumiinpainoa ja ravinnon-/vedenkulutusta on tarkka ­
iltava ja hematologiset ja kliinis-biokemialliset mittaukset sekä patologiset tutkimukset on tehtävä. Mittaukset voidaan rajata (kesken tutkimuksen lope ­
tettavien eläinten ryhmissä) tiettyihin keskeisiin seikkoihin, kuten neurotoksi ­
suuteen tai immunotoksisuuteen.
 
Annosryhmät ja annostus  
20. Ohjeita kaikista annoksen valintaan ja annosten porrastamiseen liittyvistä 
näkökohdista on ohjeasiakirjassa GD 116 (6). Tutkimuksessa on käytettävä 
vähintään kolmea annostasoa ja samanaikaista verrokkiryhmää, paitsi jos 
tehdään rajatesti (katso 27 kohta). Annostasot perustuvat yleensä lyhyempi ­
en, toistetuilla annoksilla tehdyn testien tai annosalueen määritystestien tu ­
loksiin, ja kaikki mahdolliset testikemikaalista tai samanlaisista kemikaa ­
leista saatavilla olevat toksikologiset ja toksikokineettiset tiedot on otettava 
huomioon.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 443
 
21. Mikäli testikemikaalin fysikaalis-kemialliset ominaisuudet tai biologiset vai ­
kutukset eivät rajoita korkeimman annostason valintaa, annostaso on yleensä 
valittava siten, että sen avulla voidaan tunnistaa ensisijaiset kohde-elimet ja myrkylliset vaikutukset ilman, että annos aiheuttaa kärsimyksiä, vakavaa myrkyllisyyttä, sairastuvuutta tai kuolemaa. Kun otetaan huomioon jäljem ­
pänä 22 kohdassa esitetyt tekijät, suurin annos on valittava siten, että se 
aiheuttaa merkkejä myrkyllisyydestä, mikä näkyy esimerkiksi painon nousun hidastumisena (noin 10 prosentilla).
 
22. Tutkimuksen tavoitteiden mukaan (katso 6 kohta) suurimmaksi annokseksi 
voidaan valita myös pienempi annos kuin se, joka aiheuttaa merkkejä myr ­
kyllisyydestä , jos jokin annos aiheuttaa esimerkiksi huolestuttavan haittavai ­
kutuksen, joka vaikuttaa kuitenkin vain vähän elinaikaan tai ruumiinpai ­
noon. Suurin annos saa olla enintään 1 000 mg painokiloa kohti päivässä 
(raja-annos, katso 27 kohta).  
23. Annostasot ja niiden porrastus voidaan valita annosvasteen ja NOAEL-arvon 
määrittämisen tai tutkimuksen muun tavoitteen (esimerkiksi viiteannos pie ­
nimmällä annostasolla (katso 25 kohta)) perusteella. Pienempien annosten määrittämisessä huomioon otettavia tekijöitä ovat annos-vastekäyrän odotuk ­
senmukainen kulmakerroin, annokset, joiden yhteydessä saattaa ilmetä tär ­
keitä muutoksia metaboliassa tai myrkyllisen vaikutuksen tavassa, odotuk ­
senmukainen raja-arvo tai arvo, jota pidetään lähtökohtana pienen annoksen ekstrapolaatiolle.
 
24. Valittu annostason porrastus määräytyy testikemikaalin ominaisuuksien pe ­
rusteella, eikä sitä voida määrätä tässä testimenetelmässä. Kaksinkertaiset–n ­
elinkertaiset erot annostasojen välillä ovat usein parhaimmat alenevissa an ­
nossarjoissa, ja usein on parempi lisätä neljäs testiryhmä kuin käyttää hyvin 
suuria annosvälejä (esimerkiksi 6–10-kertaisia annosvälejä). Yleisesti ottaen 
on pyrittävä välttämään käyttämästä kertoimia, jotka ovat suurempia kuin 10, ja niiden mahdollinen käyttö on perusteltava.
 
25. Kuten ohjeasiakirjassa GD 116 (6) on täsmennetty, annoksen valinnassa on 
otettava huomioon seuraavat seikat:  
— Tunnetut tai oletetut epälineaarisuudet tai käännepisteet annosvasteessa  
— Toksikokinetiikka ja pitoisuusalueet, joilla ilmenee tai ei ilmene meta ­
bolian induktiota, saturaatiota tai epälineaarisuutta ulkoisten ja sisäisten 
annosten välillä  
— Leesioiden esiasteet, vaikutusten merkkiaineet tai keskeisten biologisten 
prosessien toimintaa osoittavat indikaattorit  
— Vaikutustapaan liittyvät keskeiset (tai oletetut) näkökohdat, kuten annok ­
set, joilla alkaa ilmetä sytotoksisuutta, hormonipitoisuuksien ja homeos ­
taattisten mekanismien häiriintymistä jne.  
— Annos-vastekäyrän alueet, joilla tarvitaan erittäin yksityiskohtainen esti ­
mointi, esimerkiksi ennakoidun viitearvon tai oletetun raja-arvon koh ­
dalla  
— Ihmisten ennakoituja altistumistasoja koskeva pohdinta.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 444
 
26. Verrokkiryhmän tulee olla joko ryhmä, joka ei saa käsittelyä, tai 
kantaja-ainetta saava ryhmä, mikäli testikemikaalin antamisen yhteydessä 
käytetään kantaja-ainetta. Testikemikaalin annostelua lukuun ottamatta ver ­
rokkiryhmän eläimiä on käsiteltävä täsmälleen samoin kuin testiryhmien eläimiä. Jos käytetään kantaja-ainetta, verrokkiryhmälle tulee antaa tilavuu ­
deltaan suurin annosryhmissä käytetty kantaja-aineannos. Jos testikemikaali 
annetaan ravintoon sekoitettuna ja jos se vähentää ravinnonottoa sen vuoksi, ettei ravinto maita eläimelle entiseen tapaan, normaaliravintoa saava verrok ­
kiryhmä voi olla sopivampi.
 
27. Jos esitutkimuksista saatujen tietojen perusteella voidaan olettaa, ettei yksi 
annostaso, joka on vähintään 1 000 mg painokiloa kohti päivässä ja joka 
annetaan tälle tutkimukselle annettujen ohjeiden mukaan, todennäköisesti aiheuta haittavaikutuksia ja jos myrkyllisyyttä ei ole odotettavissa kemialli ­
selta rakenteeltaan samanlaisilla kemikaaleilla saatujen tutkimustulosten pe ­
rusteella, täydellinen tutkimus kolmella eri annostasolla ei ehkä ole välttä ­
mätön. Tätä rajaa (1 000 mg painokiloa kohti päivässä) sovelletaan, paitsi jos ihmisten altistumisesta voidaan päätellä, että on käytettävä korkeampaa annostasoa.
 
Annosten valmistelu ja testikemikaalin antaminen  
28. Testikemikaali annetaan yleensä suun kautta ruoan tai juomaveden seassa tai 
ruokintaletkulla. Lisätietoja antoreiteistä ja -tavoista on ohjeasiakirjassa GD 
116 (6). Antoreitti ja antotapa määräytyvät tutkimuksen tarkoituksen, testi ­
kemikaalin fysikaalis- kemiallisten ominaisuuksien ja sen biologisen hyötyo ­
suuden sekä ihmisten yleisimmän altistumisreitin ja -tavan perusteella. Va ­
litulle antoreitille ja -tavalle on esitettävä perustelut. Eläinten hyvinvoinnin 
vuoksi suun kautta käytettävä ruokintaletku on valittava yleensä vain sellai ­
sille aineille, joiden osalta tämä antoreitti ja -tapa ovat todennäköisesti mah ­
dollisia ihmisten altistumisen yhteydessä (esimerkiksi lääkkeet). Torjunta-aineita sisältävät ravinto- tai ympäristökemikaalit annetaan yleensä 
ravintoon tai juomaveteen sekoitettuna. Joidenkin skenaarioiden, kuten työ ­
peräisen altistuksen, yhteydessä kemikaalin antaminen muita antoreittejä pitkin voi kuitenkin olla tarkoituksenmukaisempaa.
 
29. Tarvittaessa testikemikaali liuotetaan tai suspendoidaan sopivaan 
kantaja-aineeseen. Seuraavat mahdolliset kantaja-aineen ja muiden lisäainei ­
den ominaisuudet on otettava huomioon: vaikutukset imeytymiseen, elimis ­
töön jakautumiseen, metaboliaan tai testikemikaalin pidättymiseen (retenti ­
oon) elimistössä; sellaiset vaikutukset testikemikaalin kemiallisiin ominai ­
suuksiin, jotka voivat muuttaa sen myrkyllisiä ominaisuuksia; vaikutukset 
ravinnon ja veden kulutukseen tai eläinten ravitsemustilanteeseen. On suo ­
siteltavaa, että ensin harkitaan vesiliuosta tai suspensiota aina, kun se on mahdollista, ja sen jälkeen öljyyn (esimerkiksi maissiöljyyn) tehtävää liuos ­
ta/suspensiota ja sitten mahdollisesti muita kantaja-aineita. Jos kantaja-aine 
on muu kuin vesi, sen myrkylliset ominaisuudet on tunnettava. Testikemi ­
kaalin stabiiliudesta ja annosteluliuosten homogeenisuudesta tai ruokavali ­
oista (tarvittaessa) annosteluolosuhteissa (esimerkiksi ravinto) on oltava saa ­
tavilla tietoa.
 
30. Jos kemikaaleja annetaan ravintoon tai juomaveteen sekoitettuna, on tärkeää 
varmistaa, että testikemikaalimäärät eivät häiritse normaalia ravinto- tai nes ­
tetasapainoa. Pitkäaikaisissa myrkyllisyystutkimuksissa, joissa testikemikaa ­
lia annetaan ravinnon seassa, testikemikaalin pitoisuus eläinten ruoassa saa 
yleensä olla enintään viisi prosenttia kokonaisruokavaliosta, jotta vältetään 
ravitsemuksellinen epätasapaino. Kun testikemikaali annetaan ravinnon kanssa, voidaan käyttää joko vakiopitoisuutta (mg/kg-ruokavalio tai ppm) ravinnossa tai eläimen painoon suhteutettua annoksen vakiotasoa (mg pai ­
nokiloa kohti). Molemmat lasketaan viikoittain. Valittu vaihtoehto on mai ­
nittava.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 445
 
31. Suun kautta annostelun yhteydessä eläimille annetaan testikemikaalia päivit ­
täin (seitsemänä päivänä joka viikko) yleensä 12 kuukauden ajan (katso 
myös 33 kohta), joskin tätä pidempi aika voi olla tarpeen sääntelyvaatimus ­
ten perusteella. Jos käytetään muunlaista koejärjestelyä (jos testikemikaalia annetaan esimerkiksi viitenä päivänä viikossa), se on perusteltava. Ihon 
kautta annostelun yhteydessä eläimille annetaan testikemikaalia vähintään 
kuuden tunnin ajan päivässä seitsemänä päivänä viikossa, kuten tämän liit ­
teen B.9 luvussa (10) on täsmennetty, vähintään 12 kuukauden ajan. Hen ­
gitysteiden kautta altistuksessa testikemikaalia annetaan kuuden tunnin ajan 
päivässä seitsemänä päivänä viikossa, mutta myös altistusta viitenä päivänä 
viikossa voidaan käyttää, jos se on perusteltua. Altistusjakso on yleensä 12 kuukautta. Jos muita jyrsijöitä kuin rottia altistetaan vain nasaalisesti, altis ­
tuksen enimmäiskestoaikoja voidaan muuttaa lajikohtaisen stressin minimoi ­
miseksi. Jos altistuksen kesto on alle kuusi tuntia päivässä, se on perustel ­
tava. Katso myös tämän liitteen luku B.8 (8).
 
32. Kun testikemikaali annetaan eläimille ruokintaletkulla, on käytettävä maha ­
letkua tai sopivaa intubaatiokanyylia, ja kemikaali on annettava joka päivä 
samoihin aikoihin. Yleensä kerta-annos annetaan kerran päivässä, mutta jos kemikaali on esimerkiksi paikallisesti ärsyttävä aine, päivittäinen annos voi ­
daan antaa myös jaettuna (kaksi kertaa päivässä). Suurin yhdellä kerralla 
annettava nestetilavuus määräytyy koe-eläimen koon mukaan. Tilavuus tulee 
pitää mahdollisimman pienenä, ja jyrsijöillä se saa olla yleensä enintään 1 ml 100 g:n painoa kohti (22). Testitilavuuden vaihtelu on minimoitava muuttamalla pitoisuutta sen varmistamiseksi, että tilavuus on sama kaikilla 
annostasoilla. Poikkeuksena ovat mahdollisesti syövyttävät tai ärsyttävät ke ­
mikaalit, jotka on laimennettava vakavien paikallisten vaikutusten välttämi ­
seksi. On vältettävä testausta sellaisilla pitoisuuksilla, jotka todennäköisesti syövyttävät tai ärsyttävät maha-suolikanavaa.
 
Tutkimuksen kesto  
33. Vaikka tämä testimenetelmä on tarkoitettu ensisijaisesti 12 kuukauden mit ­
taiseen krooniseen myrkyllisyystutkimukseen, tutkimussuunnitelman mu ­
kaan testimenetelmää on mahdollista soveltaa joko lyhyempiin (esimerkiksi kuusi tai yhdeksän kuukautta) tai pitempiin (esimerkiksi 18 tai 24 kuukautta) 
tutkimuksiin tietyn lainsäädännön nojalla tai tiettyjen mekanististen tarkoi ­
tusten perusteella. Poikkeukset 12 kuukauden mittaisesta altistuksesta on perusteltava varsinkin, jos altistus on tätä lyhyempi. Tutkimukseen sisälty ­
ville satelliittiryhmille, joiden avulla seurataan tutkittavan testikemikaalin 
aiheuttamien toksikologisten muutosten korjaantuvuutta, ei saa antaa testi ­
kemikaalia vähintään neljään viikkoon eikä pidempään kuin kolmanneksen tutkimuksen kokonaiskestosta altistuksen päätyttyä. Lisää ohjeita ja tietoa eloonjäämisen käsittelystä tutkimuksessa on ohjeasiakirjassa GD 116 (6).
 
HAVAINNOT  
34. Kaikki eläimet on tutkittava sairastuvuuden tai kuolleisuuden havaitsemi ­
seksi yleensä aamuin illoin joka päivä myös viikonloppuisin ja lomien ai ­
kana. Kliinisiä yleishavaintoja on tehtävä vähintään kerran päivässä mielui ­
ten suurin piirtein samaan aikaan / samoihin aikoihin joka päivä. On otettava 
huomioon, että kun testikemikaalia annetaan ruokintaletkun kautta, odotet ­
tuja vaikutuksia esiintyy eniten annostelun jälkeen.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 446
 
35. Kaikista eläimistä on tehtävä yksityiskohtaisia kliinisiä havaintoja vähintään 
kerran ennen ensimmäistä altistusta (jotta eläimessä havaittavia muutoksia 
voidaan verrata alkutilanteeseen), tutkimuksen ensimmäisen viikon päät ­
teeksi ja kerran kuukaudessa sen jälkeen. Havainnointi on toteutettava siten, että yksittäisten havainnoijien välinen vaihtelu on mahdollisimman pientä ja 
testiryhmästä riippumatonta. Havainnot tulee tehdä eläimen oman häkin 
ulkopuolella mieluiten vakioalueella samaan kellonaikaan joka kerta. Ha ­
vainnot on kirjattava tarkoin muistiin, mieluiten koelaboratorion erikseen määrittelemiä pisteytysjärjestelmiä käyttäen. On pyrittävä varmistamaan, 
että havainnointiolosuhteissa on mahdollisimman vähän vaihtelua. Kirjatta ­
via havaintoja ovat mm. ihon, karvapeitteen, silmien ja limakalvojen muu ­
tokset sekä sisäeritteiden, kuonaeritteiden ja autonomisen toiminnan (esimer ­
kiksi kyynelvuoto, piloerektio, mustuaisen koko ja epätavallinen hengitys) 
esiintyminen. Käynnin, asennon ja käsittelyvasteen muutokset, mahdolliset 
klooniset tai tooniset liikkeet, stereotypiat (esimerkiksi ylenmääräinen turkin hoito, jatkuva kehän kiertäminen) tai omituinen käytös (esimerkiksi itsensä silpominen, takaperin käveleminen) tulee myös kirjata muistiin (24).
 
36. Kaikille eläimille on tehtävä silmätutkimus oftalmoskoopilla tai muulla so ­
pivalla laitteella ennen testikemikaalin ensimmäistä antokertaa. Tutkimuksen päätteeksi tämä tutkimus on tehtävä mieluiten kaikille eläimille, mutta vä ­
hintään suuren annoksen ryhmässä ja verrokkiryhmässä. Jos silmissä hav ­
aitaan käsittelyyn liittyviä muutoksia, kaikki eläimet on tutkittava. Jos ra ­
kenteellinen analyysi tai muut tiedot viittaavat silmiin kohdistuvaan myrkyl ­
lisyyteen, silmätutkimuksia on tehtävä useammin.
 
37. Sellaisten kemikaalien yhteydessä, joiden osalta aikaisemmat toistetulla an ­
noksella tehdyt 28 päivän ja/tai 90 päivän myrkyllisyystestit osoittivat niiden 
mahdollisesti aiheuttavan neurotoksisia vaikutuksia, voidaan lisäksi arvioida aistien reaktiivisuus erityyppisille ärsykkeille (24) (esimerkiksi kuulon, näön tai asentotunnon kautta välittyville ärsykkeille) (25), (26), (27), tarttumaot ­
teen voimakkuus (28) ja motorinen toiminta (29) ennen tutkimuksen aloit ­
tamista ja kolmen kuukauden välein sen jälkeen, kunnes tutkimus on kes ­
tänyt 12 kuukautta, sekä tutkimuksen päättyessä (jos se kestää yli 12 kuu ­
kautta). Mahdollisten toimenpiteiden tarkemmat yksityiskohdat löytyvät mai ­
nituista kirjallisuusviitteistä. Myös muita kuin viittauksissa mainittuja toi ­
menpiteitä voidaan käyttää.
 
38. Sellaisten kemikaalien yhteydessä, joiden osalta aikaisemmat toistetulla an ­
noksella tehdyt 28 päivän ja/tai 90 päivän myrkyllisyystestit osoittivat niiden 
mahdollisesti aiheuttavan immunotoksisia vaikutuksia, tätä tutkittavaa omi ­
naisuutta koskevat tarkemmat tutkimukset voidaan tehdä tutkimuksen päät ­
tyessä.  
Ruumiinpaino, ravinnon/veden kulutus ja ruumiinpainon lisäys  
39. Kaikki eläimet on punnittava käsittelyn alussa, vähintään kerran viikossa 
ensimmäisten 13 viikon ajan ja sen jälkeen vähintään kerran kuukaudessa. 
Ravinnon kulutus ja painon lisäys on mitattava vähintään kerran viikossa 
ensimmäisten 13 viikon ajan ja sen jälkeen vähintään kerran kuukaudessa. Veden kulutus on mitattava vähintään kerran viikossa ensimmäisten 13 vii ­
kon ajan ja sen jälkeen vähintään kerran kuussa, kun kemikaali annetaan 
juomaveteen sekoitettuna. Veden kulutuksen mittaamista on harkittava myös 
sellaisissa tutkimuksissa, joissa eläimen juomistottumukset muuttuvat.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 447
 
Hematologia ja kliininen biokemia  
40. Tutkimuksissa, joissa käytetään jyrsijöitä, hematologiset tutkimukset on teh ­
tävä vähintään kymmenelle urokselle ja kymmenelle naaraalle kutakin ryh ­
mää kohti, kun tutkimus on kestänyt kolme, kuusi ja kaksitoista kuukautta, 
sekä tutkimuksen päättyessä (jos se kestää yli 12 kuukautta). Kaikissa veri ­
kokeissa on käytettävä samoja eläimiä. Hiirten osalta saatetaan tarvita satel ­
liittiryhmän eläimiä, jotta kaikki vaaditut hematologiset määritykset saadaan tehtyä (katso 18 kohta). Tutkimuksissa, joissa käytetään muita eläimiä kuin 
jyrsijöitä, näytteet otetaan pienemmästä määrästä eläimiä (esimerkiksi koi ­
ratutkimuksissa neljältä eläimeltä sukupuolta ja ryhmää kohti) saman näyt ­
teenottoaikataulun mukaisesti kuin jyrsijöilläkin sekä tutkimuksen päättyes ­
sä. Kolmannen kuukauden jälkeisiä mittauksia ei tarvitse tehdä jyrsijöillä 
eikä muilla eläimillä, jos hematologisissa parametreissa ei havaittu vaikutuk ­
sia aiemmin tehdyssä 90 päivän tutkimuksessa, jossa käytettiin vertailukel ­
poisia annostasoja. Verinäytteet on otettava nimetystä paikasta esimerkiksi 
sydänpunktiolla tai silmäntakaisesta laskimopunoksesta anestesiassa.
 
41. Seuraavassa on luettelo parametreista, jotka on tutkittava (30): valkosolujen 
kokonaismäärä ja niiden erittelylaskenta, punasolujen määrä, verihiutaleiden määrä, hemoglobiinipitoisuus, hematokriitti (punasolujen tilavuusosuus), pu ­
nasolujen keskimääräinen tilavuus (MCV), keskihemoglobiini (MCH), 
keskihemoglobiinikonsentraatio (MCHC), protrombiiniaika ja aktivoitu par ­
tiaalinen tromboplastiiniaika. Muita hematologisia parametreja (kuten Hein ­
zin kappaleet, epätyypillinen punasolujen morfologia tai methemoglobiini) voidaan tarvittaessa mitata testikemikaalin myrkyllisyyden mukaan. Kaiken 
kaikkiaan on toimittava joustavasti tietystä kemikaalista havaitun ja/tai od ­
otetun vaikutuksen mukaisesti. Jos testikemikaali vaikuttaa verta muodosta ­
vaan järjestelmään, retikulosyyttien määrän ja luuytimen sytologinen tutki ­
mus voi olla aiheenmukaista, joskaan sitä ei tarvitse tehdä rutiininomaisesti.
 
42. Kliinis-biokemialliset määritykset tärkeimpien myrkyllisten kudosvaikutus ­
ten ja erityisesti munuais- ja maksavaikutusten tutkimiseksi tulee tehdä ve ­
rinäytteistä, jotka otetaan vähintään kymmeneltä urokselta ja kymmeneltä naaraalta jokaisesta ryhmästä hematologisia tutkimuksia varten määritetyin 
aikavälein käyttäen aina samoja eläimiä. Hiirten osalta saatetaan tarvita 
satelliittiryhmän eläimiä, jotta kaikki vaaditut kliinis- biokemialliset mää ­
ritykset saadaan tehtyä. Tutkimuksissa, joissa käytetään muita eläimiä kuin jyrsijöitä, näytteet otetaan pienemmästä määrästä eläimiä (esimerkiksi koi ­
ratutkimuksissa neljältä eläimeltä sukupuolta ja ryhmää kohti) saman näyt ­
teenottoaikataulun mukaisesti kuin jyrsijöilläkin sekä tutkimuksen päättyes ­
sä. Kolmannen kuukauden jälkeisiä mittauksia ei tarvitse tehdä jyrsijöillä eikä muilla eläimillä, jos kliinisen biokemian parametreissa ei havaittu vai ­
kutuksia aiemmin tehdyssä 90 päivän tutkimuksessa, jossa käytettiin vertai ­
lukelpoisia annostasoja. Eläinten ruokinnan siirtämistä yön yli (hiiriä lukuun ottamatta) ennen verinäytteen ottoa suositellaan. Seuraavassa on luettelo parametreista, jotka on tutkittava (30): glukoosi, virtsa (virtsan typpi), krea ­
tiniini, kokonaisproteiini, albumiini, kalsium, natrium, kalium, kokonaisko ­
lesteroli, vähintään kaksi hepatosellulaariseen arviointiin sopivaa testiä (ala ­
niiniaminotransferaasi, aspartaattiaminotransferaasi, glutamaattidehydroge ­
naasi, kokonaissappihapot) (31), ja vähintään kaksi hepatobiliaariseen arvi ­
ointiin sopivaa testiä (alkalinen fosfataasi, gammaglutamyylitransferaasi, 5’- 
nukleotidaasi, kokonaisbilirubiini, kokonaissappihapot) (31). Muita kliinis-kemiallisia parametreja, kuten paastotriglyseridit, tietyt hormonit ja koliiniesteraasi, voidaan mitata tarvittaessa testikemikaalin myrkyllisyyden 
mukaan. Kaiken kaikkiaan on toimittava joustavasti tietystä kemikaalista 
havaitun ja/tai odotetun vaikutuksen mukaisesti.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 448
 
43. Virtsa-analyysit on tehtävä vähintään kymmeneltä urokselta ja kymmeneltä 
naaraalta ryhmää kohti näytteistä, jotka otetaan samoina aikoina kuin hema ­
tologiset ja kliinis-kemialliset näytteet. Kolmannen kuukauden jälkeisiä mit ­
tauksia ei tarvitse tehdä, jos virtsa-analyysissa ei havaittu vaikutuksia aiem ­
min tehdyssä 90 päivän tutkimuksessa, jossa käytettiin vertailukelpoisia an ­
nostasoja. Seuraava parametriluettelo on kliinis-patologisia tutkimuksia kos ­
kevan asiantuntijasuosituksen mukainen (30): ulkonäkö, tilavuus, osmolali ­
teetti tai ominaistiheys, pH, kokonaisproteiini ja glukoosi. Muita määrityksiä ovat ketoaineet, urobilinogeeni, bilirubiini ja piilevä veri. Myös muita para ­
metreja voidaan tarvittaessa käyttää, jos havaitun vaikutuksen (havaittujen 
vaikutusten) tutkimusta on laajennettava.
 
44. Koiratutkimuksissa lähtötilanteen hematologiset ja kliinis-biokemialliset 
muuttujat on yleensä määritettävä ennen käsittelyn aloittamista, mutta jyrsi ­
jätutkimuksissa niitä ei tarvitse määrittää (30). Jos aiemmat lähtötason tiedot 
ovat riittämättömät (katso 50 kohta), näiden tietojen hankkimista on harkit ­
tava.  
Patologia  
Ruumiinavaustutkimukset  
45. Kaikille tutkimukseen sisältyville eläimille on tehtävä täydellinen ja yksityis ­
kohtainen ruumiinavaus, jossa tutkitaan huolellisesti eläimen ruumis päältä päin, kaikki ruumiin aukot sekä kallo-, rinta- ja vatsaontelot ja niiden sisältö. 
Mittaukset voidaan kuitenkin määrätä rajattavaksi (kesken tutkimuksen lo ­
petettavien eläinten ryhmässä tai satelliittiryhmässä) tiettyihin keskeisiin seikkoihin, kuten neurotoksisuuteen tai immunotoksisuuteen (katso 19 koh ­
ta). Näille eläimille ei tarvitse tehdä ruumiinavausta eikä jäljempänä olevissa 
kohdissa kuvattuja toimenpiteitä. Erityisvalvonnassa olevien eläinten ruumii ­
navauksen tarve määräytyy tapauskohtaisesti tutkimuksen johtajan harkinnan perusteella.
 
46. Elinten painotiedot on kerättävä kaikilta eläimiltä lukuun ottamatta 45 koh ­
dan jälkimmäisessä osassa lueteltuja eläimiä. Lisämunuaiset, aivot, lisäki ­
vekset, sydän, munuaiset, maksa, munasarjat, perna, kivekset ja kilpirauha ­
nen (punnittava kiinnityksen jälkeen lisäkilpirauhasten kanssa) on puhdistet ­
tava niihin kiinnittyvistä kudoksista tarkoituksenmukaisella tavalla, ja elinten 
märkäpaino on punnittava mahdollisimman pian dissektion jälkeen kuivu ­
misen estämiseksi. Tutkimuksessa, jossa käytetään hiiriä, lisämunuaisten punnitseminen ei ole pakollista.
 
47. Seuraavat kudokset säilytetään sekä kudostyypin että aiotun histopatologisen 
tutkimuksen kannalta sopivimmassa kiinnitysaineessa (32) (hakasulkeissa olevat kudokset ovat valinnaisia): 
Kaikki suuret leesiot Sydän Haima Maha (etumaha, rauhasmaha) 
Lisämunuainen Sykkyräsuoli Lisäkilpirauhanen [Hampaat] Aortta Tyhjäsuoli Ääreishermo Kivekset 
Aivot (mukaan luettuina 
osia iso- ja pikkuaivoista sekä aivosillasta) Munuaiset Aivolisäke Kateenkorva 
Umpisuoli Kyynelrauhanen (silmän 
ulkopuolelta) Eturauhanen Kilpirauhanen 
Kohdunkaula Maksa Peräsuoli [Kieli]
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 449
 
Eturauhasen etuosa Keuhkot Sylkirauhanen Henkitorvi 
Paksusuoli Imusolmukkeet (pinnalli ­
set ja syvät) Rakkularauhanen Virtsarakko 
Pohjukaissuoli Rintarauhanen (pakolli ­
nen naarailta; mikäli sel ­
västi dissekoitavissa, myös uroksilta) Luurankolihas Kohtu (mukaan luettuna koh ­
dunkaula) 
Lisäkivekset [Ylähengitystiet, mukaan 
luettuina nenä, kuorikot 
ja sivuontelot] Iho [Virtsanjohdin] 
Silmä (mukaan luettuna 
verkkokalvo) Ruokatorvi Selkäydin (kolmesta 
kohdasta: kaularanka, 
rintarangan keskiosa ja 
lanneranka) [Virtsaputki] 
[Reisiluu ja nivel] [Hajurauhanen] Perna Vagina 
Sappirakko (muut lajit kuin 
rotta) Munasarjat [Rintalasta] Osa luuydintä ja/tai tuore 
luuydinaspiraatti 
Harderin rauhaset
 
Parillisten elinten (esimerkiksi munuaisten, lisämunuaisten jne.) osalta mo ­
lemmat elimet on säilytettävä. Kliinisten ja muiden löydösten perusteella on vielä ehkä tutkittava muita kudoksia. Myös testikemikaalin tunnettujen omi ­
naisuuksien perusteella todennäköiset kohde-elimet on säilytettävä. Tutki ­
muksissa, joissa altistus tapahtuu ihon kautta, on säilytettävä ne elimet, jotka on lueteltu suun kautta altistuksen yhteydessä. On oleellista, että näyte otetaan nimenomaan siitä kohdasta ihoa, johon testikemikaalia on annostel ­
tu, ja että kyseinen ihokohta säilytetään. Hengityksen kautta altistuksen 
yhteydessä hengityselimistön säilytettyjen ja tutkittujen kudosten luettelon osalta on noudatettava tämän liitteen lukua B.8 (8) ja lukua B.29 (9). Mui ­
den elinten/kudosten osalta (ja hengityselimistöstä otettujen kudosten lisäksi) 
on tutkittava ne elimet, jotka on mainittu suun kautta altistuksen yhteydessä 
esitetyssä luettelossa.
 
Histopatologia  
48. Toksikologis-patologisten tutkimusten toteuttamisen parhaista käytännöistä 
on saatavana ohjeistusta (32). Vähintään seuraavat histopatologiset tutki ­
mukset on tehtävä:  
— kaikki kudokset suuren annoksen ryhmästä ja verrokkiryhmästä  
— kaikki kudokset tutkimuksen aikana kuolleilta tai lopetetuilta eläimiltä  
— kaikki kudokset, joissa on makroskooppisia poikkeavuuksia  
— kohdekudokset tai kudokset, joissa oli käsittelyyn liittyviä muutoksia 
suuren annoksen ryhmässä; kaikilta eläimiltä kaikissa muissa annosryh ­
missä  
— parillisten elinten (esimerkiksi munuaisten, lisämunuaisten jne.) osalta 
molemmat elimet on tutkittava.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 450
 
TIEDOT JA RAPORTOINTI  
Tiedot  
49. Jokaisesta eläimestä on ilmoitettava tiedot kaikista arvioiduista parametreis ­
ta. Yhteenveto tuloksista on esitettävä myös taulukossa, josta ilmenee kus ­
sakin testiryhmässä tutkimuksen alussa käytettyjen eläinten lukumäärä, testin aikana kuolleena löydettyjen tai humaaneista syistä lopetettujen eläinten 
lukumäärä ja niiden kuolinaika, merkkejä myrkyllisyydestä osoittaneiden 
eläinten lukumäärä, havaittujen myrkyllisten vaikutusten kuvaus, mukaan lukien niiden alkamisajankohta, kesto ja vaikeusaste, vaurioita saaneiden eläinten lukumäärä, vauriotyypit ja eläinten prosentuaaliset osuudet vaurio ­
tyypeittäin. Yhteenvetotaulukoissa on ilmoitettava keskiarvot ja keskihajo ­
nnat (jatkuvan testin tietojen osalta) niistä eläimistä, joilla ilmeni toksisia vaikutuksia tai vaurioita. Myös vaurioiden vaikeusaste on ilmoitettava.
 
50. Aiemmista vertailutiedoista voi olla apua tutkimuksen tulosten tulkinnassa 
esimerkiksi silloin, kun näyttää siltä, että samanaikaisista verrokeista saadut 
tiedot ovat merkittävästi erilaisia verrattuna saman testilaitoksen/kolonian verrokkieläimiltä saatuihin uudempiin tietoihin. Jos aiempia tietoja arvioi ­
daan, niiden on oltava peräisin samasta laboratoriosta ja liityttävä eläimiin, 
jotka ovat samanikäisiä ja sellaisesta kannasta, joka on tuotettu kyseistä 
tutkimusta edeltäneen viiden vuoden aikana.
 
51. Numeeriset tulokset on mahdollisuuksien mukaan arvioitava asianmukaisella 
ja yleisesti hyväksytyllä tilastollisella menetelmällä. Tilastolliset menetelmät 
ja analysoitavat tiedot on valittava tutkimuksen suunnitteluvaiheessa (8 koh ­
ta). Valinnassa on otettava huomioon myös eloonjäämistä koskevat korja ­
ukset, mikäli tarpeen.  
Testiraportti  
52. Testiraporttiin on sisällytettävä seuraavat tiedot:  
Testikemikaali:  
— fysikaalinen olomuoto, puhtaus ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet  
— tunnistetiedot  
— kemikaalin lähde  
— eränumero  
— todistus kemiallisesta analyysista.  
Kantaja-aine (tarvittaessa):  
— kantaja-aineen valinnan perustelut, jos se on muu kuin vesi.  
Koe-eläimet:  
— käytetty laji/kanta ja perustelut niiden valinnalle  
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli testin alussa  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 451
 
— lähde, elinolosuhteet, ravinto jne.  
— kunkin eläimen paino testin alkaessa.  
Testiolosuhteet:  
— antoreitin ja annoksen valinnan perustelut  
— tietojen analysointiin käytetyt tilastolliset menetelmät tarvittaessa  
— yksityiskohtaiset tiedot testikemikaalin koostumuksesta / ravintovalmis ­
teesta  
— analyysitiedot valmisteessa saavutetusta pitoisuudesta sekä sen stabilitee ­
tista ja homogeenisuudesta  
— antoreitti ja yksityiskohdat testikemikaalin annostelusta  
— inhalaatiotutkimuksissa tieto siitä, käytettiinkö vain nasaalista altistusta 
vai koko kehoon kohdistuvaa altistusta  
— todelliset annokset (mg painokiloa kohti päivässä) ja muuntokerroin, 
jolla ravintovalmisteen/juomaveden testikemikaalipitoisuus (mg/kg tai 
ppm) muunnetaan todelliseksi annokseksi, mikäli tarpeen  
— yksityiskohdat ravinnon ja veden laadusta.  
Tulokset (tiedot on esitettävä yhteenvetotaulukossa ja jokaisesta eläimestä 
erikseen):  
— eloonjäämistä koskevat tiedot  
— ruumiinpaino / ruumiinpainon muutokset  
— ravinnon kulutus, ruumiinpainon lisäystä koskeva laskelmat sekä veden 
kulutus tarvittaessa  
— toksiset vastetiedot sukupuolen ja annostason mukaan, mukaan lukien 
toksisuusoireet  
— kliinisten havaintojen luonne, ilmaantuvuus (ja vaikeusaste, jos se on 
pisteytetty) ja kesto (väliaikaisuus/pysyvyys)  
— silmätutkimus  
— hematologiset testit  
— kliinisen biokemian testit  
— virtsa-analyyttiset testit  
— neurotoksisuutta tai immunotoksisuutta koskevien tutkimusten tulokset  
— eläimen paino testin lopussa  
— elinten painot (ja niiden suhteet tarvittaessa)  
— ruumiinavauslöydökset  
— kaikkien käsittelyyn liittyvien histopatologisten löydösten seikkaperäinen 
kuvaus  
— tiedot imeytymisestä, mikäli saatavilla.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 452
 
Tulosten tilastollinen käsittely tarvittaessa  
Tulosten pohdinta, mukaan luettuina seuraavat seikat:  
— annos-vastesuhteet  
— vaikutustapaa koskeviin tietoihin liittyvä pohdinta  
— mallintamistapoja koskeva pohdinta  
— BMD-, NOAEL- tai LOAEL-arvojen määritykset  
— aiemmat vertailutiedot  
— merkitys ihmisten kannalta.  
Päätelmät  
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
 
2) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208.
 
3) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW  et al.  (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145–191.  
4) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteriza ­
tion of environmental chemicals by the US National Toxicology Program ­
me: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445.  
5) Tämän liitteen luku B.27 (Subkrooninen oraalinen myrkyllisyystesti – tois ­
tetuilla annoksilla tehtävä 90 vuorokauden oraalinen myrkyllisyystutkimus 
muilla kuin jyrsijöillä)  
6) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 
and 453 – Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, 
available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines.
 
7) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment N°39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
8) Tämän liitteen luku B.8 (Subakuutti myrkyllisyys hengitettynä: 28 päivän 
tutkimus)  
9) Tämän liitteen luku B.29 (Subkrooninen myrkyllisyys hengitettynä: 90 päi ­
vän tutkimus)  
10) Tämän liitteen luku B.9 (Toistetun annoksen (28 päivää) myrkyllisyys (ihon 
kautta nautittavat aineet))  
11) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural Chemi ­
cal Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of 
Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1–7.  
12) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Cri ­
tical Reviews in Toxicology 36: 9–35.  
13) Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al.  (2006). A Tiered Approach to Sys ­
temic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Criti ­
cal Reviews in Toxicology 36: 37–68.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 453
 
14) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al . (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Revi ­
ews in Toxicology 36: 69–98.  
15) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
16) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.  
17) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpre ­
tation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: App ­
roaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837.
 
18) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
19) Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivi 2010/63/EU, annettu 
22 päivänä syyskuuta 2010, tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten 
suojelusta, EUVL L 276, 20.10.2010, s. 33.  
20) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86–23. Washington D.C., US. Dept. of Health 
and Human Services.  
21) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versu ­
chstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2.
 
22) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in 
various housing systems.  
23) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15–23.
 
24) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Do ­
cument No. 60,  
25) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003.  
26) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691–704.  
27) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Com ­
parisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.
 
28) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.
 
29) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experi ­
ments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Tera ­
tol. 13: 599–609.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 454
 
30) Weingand K, Brown G, Hall R  et al.  (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam.&Appl. 
Toxicol. 29: 198–201.  
31) EMEA (draft) document ”Non-clinical guideline on drug-induced hepatoto ­
xicity” (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
32) Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 455
 
Lisäys 1  
MÄÄRITELMÄ  
Testikemikaali:  Tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 456
 
B.31.  PRENATAALISEN KEHITYKSEN AIKAISTEN MYRKYLLISYYS ­
VAIKUTUSTEN TUTKIMUS  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä on toisinto OECD:n testiohjeesta nro 414 (2001).  
1.1 JOHDANTO  
Tämän sikiönkehityksen aikaisten myrkyllisyysvaikutusten testime ­
netelmän tarkoitus on hankkia yleistä tietoa syntymää edeltävän al ­
tistuksen vaikutuksista tiineeseen koe-eläimeen ja sen kohdussa ke ­
hittyvään organismiin. Testiin voi sisältyä emoon kohdistuvien vai ­
kutusten arviointi sekä sikiön kuoleman, rakenteellisten epämuodos ­
tumien tai poikkeavan kehityksen arviointi. Sikiön toiminnallisia häi ­
riöitä, jotka ovat tärkeä osa kehitystä, ei tutkita tässä menetelmässä. 
Niitä voidaan tutkia erillisellä testillä tai tämän testin ohessa käyttä ­
mällä hermostonkehitykseen kohdistuvia myrkyllisyysvaikutuksia selvittävää menetelmää. Toiminnallisten häiriöiden ja muiden synty ­
män jälkeisten vaikutusten testauksesta saa tietoa kahden sukupolven 
reproduktiivisten myrkyllisyysvaikutusten tutkimusmenetelmästä 
sekä hermostonkehitykseen kohdistuvien myrkyllisyysvaikutusten menetelmästä soveltuvin osin.
 
Tätä testimenetelmää voidaan joutua mukauttamaan yksittäistapauk ­
sissa testiaineen fysikokemiallisten tai toksikologisten ominaisuuk ­
sien mukaan. Mukauttaminen on hyväksyttävää, jos on olemassa vakuuttavaa tieteellistä viitettä, että testi olisi siten informatiivisempi. 
Jos testiä mukautetaan, on mainittu tieteellinen näyttö dokumentoi ­
tava huolellisesti tutkimusraportissa.
 
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Kehitystoksikologia:  tieteenala, joka tutkii kehittyvässä organis ­
missa esiintyviä haittavaikutuksia, jotka voivat aiheutua altistuksesta 
ennen hedelmöitymistä, syntymää edeltävän kehityksen aikana tai syntymän jälkeisenä aikana sukukypsyysikään asti. Sikiönkehityksen aikaisten myrkyllisyysvaikutusten tärkeimmät ilmenemismuodot ovat 
1) organismin kuolema 2) rakenteelliset epämuodostumat 3) poik ­
keava kasvu sekä 4) toiminnalliset häiriöt. Aikaisemmin kehitystok ­
sikologiaa kutsuttiin usein teratologiaksi.
 
Haittavaikutus:  sellainen käsittelyyn liittyvä poikkeama perustasos ­
ta, joka vähentää organismin kykyä pysyä hengissä, lisääntyä tai 
sopeutua ympäristöön. Kehitystoksikologian kannalta haittavaikutus on laajimmassa merkityksessään mikä tahansa vaikutus, joka haittaa conceptuksen normaalia kehitystä sekä ennen syntymää että synty ­
män jälkeen.
 
Poikkeava kehitys:  poikkeama poikasen elinten tai ruumiin painossa 
tai koossa.  
Poikkeamat (epämuodostumat):  kehityksessä ilmenevät rakenteel ­
liset poikkeamat, joihin sisältyvät sekä epämuodostumat että vaihtelu (28).
 
Epämuodostuma / merkittävä epänormaalius:  rakenteellinen muu ­
tos, joka katsotaan eläimelle haitalliseksi (voi olla myös letaali) ja 
jota esiintyy harvoin.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 457
 
Vaihtelu / vähäinen epänormaalius:  rakenteellinen muutos, joka 
katsotaan eläimelle vähän tai ei lainkaan haitalliseksi. Muutos voi 
olla ohimenevä ja esiintyä suhteellisen usein vertailupopulaatiossa.  
Hedelmöitymisen tulos (conceptus):  kaikki hedelmöityneestä mu ­
nasolusta kehittyneet kudokset kaikissa kehitysvaiheissa hedelmöity ­
misestä syntymään asti. Sisältää alkion tai sikiön sekä sikiökalvot ja istukan.
 
Implantaatio:  blastokystan kiinnittyminen kohdun epiteeliin, mu ­
kaan lukien tunkeutuminen epiteelin läpi ja kiinnittyminen endomet ­
riumiin.  
Alkio:  organismin varhais- tai kehitysvaihe, erityisesti munasolun 
hedelmöitymisen tuote pituusakselin ilmaantumisen jälkeen siihen saakka, kunnes keskeiset rakenteet ovat kehittyneet.
 
Alkioon kohdistuva myrkyllisyysvaikutus:  alkion normaalia raken ­
netta, kehitystä, kasvua ja/tai elinkelpoisuutta haittaava vaikutus.  
Sikiö:  syntymätön organismi alkiokehityksen jälkeen.  
Sikiöön kohdistuva myrkyllisyysvaikutus:  sikiön normaalia raken ­
netta, kehitystä, kasvua ja/tai elinkelpoisuutta haittaava vaikutus.  
Tiineyden keskeytyminen (abortoituminen):  hedelmöitymisen tu ­
losten (alkion tai elinkelvottoman sikiön) ennenaikainen poistuminen kohdusta.
 
Resorptio:  implantaation jälkeen kuollut conceptus, joka resorboituu 
parhaillaan tai on jo resorboitunut.  
Varhainen resorptio:  todistettavasti tapahtunut implantaatio ilman 
tunnistettavaa alkiota tai sikiötä.  
Myöhäinen resorptio:  kuollut alkio tai sikiö, jossa näkyy 
ulkoisia degeneratiivisia muutoksia.  
NOAEL:  lyhennys määritelmälle ”no-observed-adverse-effect level” 
(haitaton vaikutustaso). Korkein annos- tai altistustaso, jolla ei hav ­
aita mitään haitallisia käsittelyyn liittyviä vaikutuksia.  
1.3 VERTAILUAINE  
Ei käytössä.  
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Testiainetta annetaan tiineille eläimille ainakin implantaation ja eläi ­
men suunnitellun lopettamisen välisenä aikana. Lopettaminen on teh ­
tävä mahdollisimman lähellä normaalia synnytyspäivää välttäen kui ­
tenkin sitä, että menetettäisiin tutkimustietoja ennenaikaisen synny ­
tyksen johdosta. Testimenetelmän tarkoitus ei ole tutkia yksinomaan organogeneesin eli elinten muodostumisen jaksoa (jyrsijöillä päivät 
5–15, kaniinilla päivät 6–18), vaan myös soveltuvissa tapauksissa 
koko tiineyden aikaisia vaikutuksia alkaen ennen implantaatiota ja päättyen sektiota edeltävään päivään. Hiukan ennen sektiota naaraat lopetetaan, niiden kohdunsisältö tutkitaan ja sikiöistä tutkitaan ulkoi ­
set näkyvät epämuodostumat sekä pehmytkudosten ja luuston muu ­
tokset.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 458
 
1.5 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.5.1  Eläinlajin valinta  
Testissä suositellaan käytettäväksi parhaiten soveltuvaa eläinlajia 
sekä sellaisia laboratorioeläinlajeja ja -kantoja, joita käytetään ylei ­
sesti syntymää edeltävien myrkyllisyysvaikutusten tutkimuksessa. 
Jyrsijöistä suositeltava koe-eläin on rotta ja muista eläimistä kaniini. Muiden lajien käyttö on erikseen perusteltava.
 
1.5.2  Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta  
Koe-eläinhuoneen lämpötilan tulee olla jyrsijöillä 22  o C (+ 3  o ) ja 
kaniineilla 18  o C (+ 3  o ). Vaikka riittää, että suhteellinen kosteus 
on vähintään 30 % eikä mielellään ylitä 70 %:a muulloin kuin huo ­
neen puhdistuksen aikana, pitäisi kuitenkin pyrkiä 50–60 %:n suh ­
teelliseen kosteuteen. Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokin ­
nassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juoma ­
veden määrää saa rajoittaa.
 
Pariutumisen tulee tapahtua tarkoitukseen sopivissa häkeissä. Pariu ­
tumisen jälkeen on suositeltavaa pitää kukin eläin omassa häkissään, 
mutta myös muutaman eläimen pitäminen samassa häkissä on hy ­
väksyttävää.  
1.5.3  Eläinten valmistelu  
Testissä tulee käyttää terveitä eläimiä, jotka on totutettu laboratorio- 
olosuhteisiin vähintään viiden vuorokauden ajan ja joita ei ole aiem ­
min käytetty testeihin. Koe-eläinten laji, kanta, alkuperä, sukupuoli, paino ja/tai ikä on tunnettava. Eläinten tulee kaikissa testiryhmissä 
olla samanpainoisia ja -ikäisiä niin tarkasti kuin on käytännössä 
mahdollista. Kullakin annostasolla tulee käyttää nuoria täysikasvuisia naaraita, jotka eivät ole synnyttäneet. Naaraat tulee parittaa saman 
lajin ja kannan urosten kanssa, ja sisarusten pariutumista tulee vält ­
tää. Jyrsijöillä tiineyden alkupäivä (päivä 0) on se, jolloin vaginan tulpitus ja/tai sperma havaitaan; kaniineilla se on yleensä pariutumi ­
sen tai keinosiemennyksen päivä, mikäli keinosiemennystä käytetään. 
Häkit on sijoitettava siten, että häkin sijainnista johtuvat vaikutukset 
ovat mahdollisimman vähäisiä. Kullekin eläimelle annetaan oma tun ­
nistenumero. Paritetut naaraat jaetaan satunnaisesti kontrolli- ja tes ­
tiryhmään, ja jos naaraat on paritettu erissä, kunkin erän eläimet tulee 
jakaa tasaisesti molempiin ryhmiin. Samoin on meneteltävä saman 
uroksen hedelmöittämien naaraiden kohdalla.
 
1.6 TESTIN SUORITUS  
1.6.1  Eläinten määrä ja sukupuoli  
Kussakin testi- ja kontrolliryhmässä tulee olla niin paljon naaraita, 
että ruumiinavaukseen saadaan noin 20 eläintä, joilla implantaatio voidaan havaita. Ryhmät, joissa tällaisia eläimiä on vähemmän kuin 16, eivät mahdollisesti ole asianmukaisia. Emojen kuolleisuus 
ei välttämättä heikennä tutkimuksen validiteettia, mikäli kuolleisuus 
ei ylitä keskimäärin 10 %:a.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 459
 
1.6.2  Annosten valmistelu  
Jos annostelun helpottamiseksi käytetään kantaja-ainetta tai muuta 
lisäainetta, on syytä selvittää sen vaikutus testiaineen absorboitumi ­
seen ja jakautumiseen, testiaineen metaboloitumiseen, elimistössä 
säilymiseen ja eritykseen. Lisäksi on selvitettävä sellaiset vaikutukset 
testiaineen kemiallisiin ominaisuuksiin, jotka saattavat muuttaa testi ­
aineen myrkyllisyyttä, sekä vaikutukset koe-eläinten ravinnon ja juo ­
man nauttimiseen tai ravitsemustilaan. Kantaja-aineella ei saa olla 
sikiönkehitykseen tai lisääntymiseen kohdistuvia myrkyllisyysvaiku ­
tuksia.  
1.6.3  Annostasot  
Normaalisti testiainetta annetaan päivittäin alkaen implantaatiosta 
(esim. päivä 5 pariutumisen jälkeen) suunniteltua sektiota edeltävään 
päivään asti. Jos aikaisemmat tutkimukset, mikäli sellaisia on tehty, eivät osoita merkittävää ennen implantaatiota tapahtuvan alkionme ­
netyksen mahdollisuutta, ainetta voidaan antaa koko tiineyden ajan 
parittelusta eläimen suunniteltua lopettamista edeltävään päivään. 
Eläimen virheellinen käsittely tai tiineyden aikainen stressi voivat johtaa sikiön menetykseen. Jotta sikiön menetys muista kuin testiin liittyvistä syistä estettäisiin, tiineiden eläinten tarpeetonta käsittelyä 
sekä ulkoisten tekijöiden kuten melun aiheuttamaa stressiä tulee vält ­
tää.
 
Testissä tulee käyttää vähintään kolmea annostasoa ja testin kanssa 
samaan aikaan tehtäviä kontrolleja. Terveet eläimet jaetaan satunnai ­
sesti kontrolli- ja testiryhmään. Annostasojen välit määritetään siten, 
että toksiset vaikutukset saadaan porrastettua. Jos testiaineen 
fysikaalinen/kemiallinen olomuoto tai biologiset ominaisuudet eivät aseta rajoituksia, suurin annos määritetään sellaiseksi, että se on 
jonkin verran myrkyllinen kehittyvälle sikiölle ja/tai emolle (kliinisiä 
löydöksiä tai ruumiinpainon väheneminen), mutta ei aiheuta kuole ­
maa tai kovia tuskia. Ainakin yksi suurimman ja pienimmän välillä oleva annostaso asetetaan sellaiseksi, että se aiheuttaa erittäin pienen 
havaittavan myrkyllisyysvaikutuksen. Pienin annos asetetaan sellai ­
seksi, että sillä ei ole mitään myrkyllisyysvaikutuksia kehittyvään sikiöön tai emoon. Annostasot on porrastettava siten, että tutkimuk ­
sessa saadaan esiin mahdolliset annostasoihin liittyvät reaktiot sekä 
haitaton altistustaso (NOAEL). Kaksinkertaiset–nelinkertaiset erot 
annostasojen välillä ovat usein parhaimmat alenevissa annossarjoissa, ja usein on parempi lisätä neljäs testiryhmä kuin käyttää hyvin suuria annosvälejä (esimerkiksi yli 10-kertaisia annosvälejä). Vaikka tavoit ­
teena onkin määrittää emon haitaton altistustaso, hyväksyttäviä voi ­
vat olla myös tutkimukset, joissa tällaista tasoa ei määritetä (1).
 
Annostasojen valinnassa tulee ottaa huomioon aikaisemmat myrkyl ­
lisyystiedot sekä tiedot testiaineen tai muiden sen kanssa samantyyp ­
pisten materiaalien metaboloitumisesta elimistössä samoin kuin nii ­
den toksikokineettisistä ominaisuuksista. Nämä tiedot auttavat myös osoittamaan, että annostasot on valittu oikein.
 
Testissä on käytettävä samanaikaista kontrolliryhmää. Sen tulee olla 
joko plaseboa saava kontrolliryhmä tai kantaja-ainetta saava kontrol ­
liryhmä, mikäli testiaineen antamisen yhteydessä käytetään kantaja- 
ainetta. Kaikille ryhmille annetaan tilavuudeltaan sama määrä joko testi- tai kantaja-ainetta. Kontrolliryhmän tai -ryhmien eläimiä tulee käsitellä samalla tavoin kuin testiryhmän eläimiä. Kantaja-aineen 
kontrolliryhmille tulee antaa suurin käytetty määrä kantaja-ainetta 
(kuten alimmassa testiryhmässä).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 460
 
1.6.4  Raja-annostesti  
Jos jokin testin annostaso, joka on vähintään 1 000 mg/kg (eläimen 
painokilo)/vrk ja joka annetaan suun kautta tässä testimenetelmässä kuvattujen menettelyjen mukaisesti, ei aiheuta lainkaan havaittavaa 
myrkyllisyysvaikututusta tiineissä eläimissä tai niiden jälkeläisissä ja 
jos myrkyllisyysvaikutusta ei aikaisempien tutkimustulosten perus ­
teella ole odotettavissa (esimerkiksi rakenteellisesti ja/tai metaboli ­
sesti samantyyppiset yhdisteet), täydellinen kolmea annostasoa käyt ­
tävä testi ei välttämättä ole tarpeen. Jos odotettavissa on ihmisten 
altistuminen aineelle, voi olla tarpeen käyttää raja-annostestissä suu ­
rempaa annostasoa, kun aine annetaan suun kautta. Muita antotapoja 
kuten inhalaatiota tai ihoapplikaatiota käytettäessä testiaineen fysiko ­
kemialliset ominaisuudet saattavat usein osoittaa altistuksen enim ­
mäistason (esimerkiksi ihoapplikaatio ei saa aiheuttaa vakavaa pai ­
kallista myrkyllisyysvaikutusta).
 
1.6.5  Antotapa  
Testiaine tai kantaja-aine annetaan yleensä suun kautta letkulla. Jos 
käytetään muuta antotapaa, testin tekijän on perusteltava sen käyttö 
ja muutettava muita kohtia vastaavasti (2) (3) (4). Testiaine annetaan 
päivittäin suunnilleen samaan aikaan.  
Kunkin eläinyksilön annoksen tulee yleensä perustua viimeiseen eläi ­
men ruumiin painon määritykseen. Annoskoon määrittämisessä on kuitenkin oltava erityisen huolellinen viimeisen tiineyskolmanneksen aikana. Aikaisempien tutkimustietojen perusteella on valittava sellai ­
nen annoskoko, joka ei aiheuta liikaa myrkyllisyysvaikutuksia emol ­
le. Jos kuitenkin havaitaan liian suuria myrkyllisyysvaikutuksia tes ­
tiainetta saaneissa emoissa, nämä eläimet on lopetettava inhimillisellä tavalla. Jos useissa tiineissä eläimissä havaitaan liian suuren myrkyl ­
lisyysvaikutuksen merkkejä, on syytä harkita koko kyseisen annos ­
tasoryhmän lopettamista. Letkuruokinnassa aine on annettava eläi ­
melle yhtenä annoksena mahaletkun tai sopivan intubaatiokanyylin kautta. Suurin kerralla annettava nestemäärä määräytyy koe-eläimen 
koon mukaan. Nestemäärän tilavuus ei saa ylittää 1 ml/100 g painoa. 
Poikkeuksen muodostavat vesiliuokset, joita käytettäessä tilavuus voi olla 2 ml/100 g painoa. Kun kantaja-aineena on maissiöljy, tilavuus ei saa olla suurempi kuin 0,4 ml/100 g painoa. Testiaineen nestemää ­
rän tilavuusvaihtelu tulee minimoida pitoisuutta muuttamalla, jotta 
kaikilla annostasoilla voidaan käyttää tilavuudeltaan samaa nestemää ­
rää.
 
1.6.6  Emojen havainnointi  
Kliinisiä havaintoja tulee tehdä ja kirjata ainakin kerran päivässä, 
mieluiten samaan aikaan joka päivä ottaen huomioon se, milloin annoksen antamisen jälkeen odotetut vaikutukset ovat suurimmillaan. 
Eläinten kliinisestä tilasta kirjataan kuolleisuus, kuoleman lähestymi ­
nen, testiin liittyvät käytösmuutokset ja kaikki ilmeisten myrkylli ­
syysvaikutusten merkit.
 
1.6.7  Eläimen paino ja ravinnon nauttiminen  
Eläimet punnitaan tiineyden päivänä 0 (tai viimeistään päivänä 3, jos 
käytetään ulkopuolisen kasvattajan toimittamia aikaparitettuja eläi ­
miä), ensimmäisen annoksen antopäivänä, vähintään joka kolmas 
päivä annosten antamisjaksolla sekä eläinten suunniteltuna lopetta ­
mispäivänä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 461
 
Ravinnonotto kirjataan kolmen päivän välein ruumiinpainon mää ­
rityspäivinä.  
1.6.8  Post mortem -tutkimus  
Naaraat lopetetaan päivää ennen odotettua synnytyspäivää. Naaraat, 
joissa havaitaan tiineyden keskeytymisen tai ennenaikaisen synnytyk ­
sen merkkejä ennen suunniteltua lopetuspäivää, on lopetettava, ja 
niille on tehtävä perusteellinen makroskooppinen tutkimus.  
Kun naaras lopetetaan tai kun se kuolee testin aikana, siitä on mak ­
roskooppisesti tutkittava mahdolliset rakenteelliset epämuodostumat tai patologiset muutokset. Systemaattisen virheen minimoimiseksi naaraiden arviointi sektion aikana ja sitä seuraavat sikiöanalyysit 
tulisi tehdä tietämättä, mihin ryhmään kyseinen naaras kuuluu.
 
1.6.9  Kohdunsisällön tutkiminen  
Välittömästi eläimen lopettamisen jälkeen tai mahdollisimman pian 
kuoleman jälkeen kohtu poistetaan ja tiineys varmistetaan. Kohdut, 
joissa ei ole näkyviä tiineyden merkkejä, on tutkittava tarkemmin 
(jyrsijät esimerkiksi ammoniumsulfidivärjäyksellä ja kaniinit Salews ­
ki-värjäyksellä tai vastaavalla menetelmällä) asian varmistamiseksi (5).  
Tiineiden eläinten kohdut punnitaan, mukaan lukien kohdunkaula. 
Jos eläimet ovat kuolleet testin aikana, kohtuja ei punnita.  
Tiineiden eläinten keltarauhasten määrä määritetään.  
Kuolleiden alkioiden tai sikiöiden määrä sekä elinkelpoisten sikiöi ­
den määrä määritetään kohdunsisältöä tutkimalla. Resorptioaste ku ­
vataan, jotta voidaan arvioida conceptuksen suhteellinen kuolinaika 
(katso kohta 1.2).  
1.6.10  Sikiöiden tutkiminen  
Kunkin sikiön sukupuoli ja ruumiinpaino määritetään.  
Kustakin sikiöstä tutkitaan ulkoiset muutokset (6).  
Sikiöistä tutkitaan luuston ja pehmytkudosten muutokset (esimerkiksi 
vaihtelut ja epämuodostumat) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24). Sikiömuutosten luokit ­
telu on suositeltavaa, mutta ei pakollista. Jos luokitus tehdään, on 
kunkin luokan määrityskriteerit esitettävä selvästi. Erityistä huomiota on kiinnitettävä lisääntymiselimiin, joista tutkitaan poikkeavan kehi ­
tyksen merkit.
 
Kustakin jyrsijäpoikueesta noin puolet preparoidaan luustomuutosten 
tutkimista varten ja tutkitaan. Toinen puoli preparoidaan pehmytku ­
dosmuutosten tutkimista varten ja tutkitaan käyttäen hyväksyttyjä tai 
soveltuvia mikrotomiamenetelmiä tai huolellista dissektiomenetel ­
mää. ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 462
 
Muiden eläinten kuin jyrsijöiden, esimerkiksi kaniinien, poikueista 
tutkitaan kaikilta sikiöiltä sekä pehmytkudos- että luustomuutokset. 
Näiden sikiöiden ruumiista tutkitaan pehmytkudosmuutokset huolel ­
lisen dissektion avulla. Tähän voi liittyä jatkotoimia sydämen sisäis ­
ten rakenteiden (25) arvioimiseksi. Puolelta näin tutkituista sikiöistä 
irrotetaan päät, joiden pehmytkudosmuutokset (muun muassa silmät, 
aivot, nenäontelot ja kieli) tutkitaan käyttäen tavanomaisia sarjalei ­
kemenetelmiä (26) tai muita yhtä herkkiä menetelmiä. Näiden siki ­
öiden vartalo-osat sekä muut sikiöt, joita ei ole tutkittu, preparoidaan 
luustomuutosten tutkimista varten ja tutkitaan samoilla menetelmillä 
kuin jyrsijät.  
2. MÄÄRITYSTULOKSET  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Tiedot raportoidaan erikseen kustakin emosta ja sen jälkeläisistä ja 
esitetään taulukossa, jossa on eritelty testiryhmittäin eläinten määrä testin alussa, testin aikana kuolleiden tai inhimillisistä syistä lopetet ­
tujen eläinten määrä, kuoleman tai lopettamisen aika, tiineiden naa ­
raiden määrä, niiden eläinten määrä, joissa myrkyllisyysvaikutuksia on havaittavissa, kuvaus havaituista myrkyllisyysvaikutuksista mu ­
kaan lukien myrkytysoireiden alkamisaika, kesto ja vakavuus, alki ­
osta tai sikiöstä tehtyjen havaintojen laji sekä kaikki asiaankuuluvat 
tiedot poikueesta.
 
Numeeriset tulokset arvioidaan sopivalla tilastollisella menetelmällä 
käyttäen poikuetta analyysin yksikkönä. Tilastollisen menetelmän on oltava yleisesti hyväksytty, se on valittava tutkimusta suunniteltaessa ja sen valinta on perusteltava. Myös sellaisten eläinten tiedot, jotka 
kuolevat ennen niiden suunniteltua lopettamista, on raportoitava. 
Nämä tiedot voidaan sisällyttää ryhmäkeskiarvoihin, mikäli se on perusteltua. Tällaisista eläimistä saatujen tietojen relevanssi ja niin muodoin näiden tietojen sisällyttäminen ryhmäkeskiarvoihin tai jät ­
täminen niistä pois tulee perustella ja arvioida tapauskohtaisesti.
 
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI  
Syntymää edeltävien kehitysmyrkyllisyysvaikutusten testin löydökset 
arvioidaan tarkastelemalla havaittuja vaikutuksia. Arviointiin tulee 
sisältyä seuraavat tiedot:  
— emon ja alkion/sikiön testitulokset sekä eläinten testiainealtistuk ­
sen ja toisaalta kaikkien löydösten esiintyvyyden ja vakavuuden välisen mahdollisen suhteen arvioiminen
 
— sikiön ulkoisten muutosten sekä pehmytkudos- ja luustomuutos ­
ten luokittelussa käytetyt kriteerit, jos luokittelua on käytetty  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 463
 
— soveltuvissa tapauksissa historiallinen kontrolliaineisto, joka te ­
hostaa tutkimustulosten tulkintaa  
— kaikkien prosenttiosuuksien tai indeksien laskennassa käytetyt 
luvut  
— soveltuvissa tapauksissa tutkimustulosten asianmukainen tilastol ­
linen analyysi, joka sisältää analyysimenetelmästä sellaiset tiedot, 
että riippumaton arvioija/tilastoasiantuntija voi niiden avulla ar ­
vioida ja rekonstruoida analyysin.  
Jos kehitykseen kohdistuvia myrkyllisyysvaikutuksia ei voida osoit ­
taa, on syytä harkita jatkoselvitystä, jossa määritetään absorptio ja testiaineen hyötyosuus.
 
2.3 TULOSTEN TULKINTA  
Syntymää edeltävien myrkyllisyysvaikutusten tutkimuksen tulee an ­
taa tietoja toistuvan tiineydenaikaisen testiainealtistuksen vaikutuk ­
sista emoihin sekä niiden jälkeläisten kohdunsisäiseen kehitykseen. 
Tutkimuksen tulokset on tulkittava yhdessä subkroonisten, lisäänty ­
misfysiologisten, toksikokineettisten ja muiden tutkimusten kanssa. Koska tutkimuksessa painotetaan sekä yleisiä myrkyllisyysvaikutuk ­
sia (emoon kohdistuvat vaikutukset) että sikiön kehitykseen vaikut ­
tavien myrkyllisyysvaikutusten loppupisteitä, tutkimustulosten perus ­
teella voidaan jossain määrin erotella toisaalta ne sikiön kehitykseen kohdistuvat vaikutukset, jotka esiintyvät yleisten myrkyllisyysvaiku ­
tusten puuttuessa, sekä toisaalta ne vaikutukset, jotka esiintyvät vain 
sellaisilla annostasoilla, jotka ovat myrkyllisiä myös emolle (27).
 
3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
3.1 TESTISELOSTE  
Testiselosteessa on annettava seuraavat tiedot:  
Testiaine:  
— fysikaalinen olomuoto ja tarvittaessa fysikokemialliset ominai ­
suudet  
— tunnistetiedot mukaan lukien CAS-numero, jos tiedossa/käytössä  
— puhtaus.  
Kantaja-aine (tarvittaessa)  
— jos kantaja-aine on muu kuin vesi, sen valinta on perusteltava.  
Koe-eläinlajit  
— käytetty eläinlaji ja kanta  
— eläinten lukumäärä ja ikä  
— toimittaja, häkit, ravinto ja niin edelleen  
— kunkin eläimen paino testin alussa.  
Testiolosuhteet:  
— annostasojen valintaperusteet  
— yksityiskohtaiset tiedot testiainevalmisteesta/ravintovalmisteesta, 
testiaineen saavutettu pitoisuus, stabiilisuus ja tasalaatuisuus val ­
misteessa  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 464
 
— yksityiskohtaiset tiedot testiaineen antotavasta  
— todellinen annos (mg/painokilo/vrk) ja muuntokerroin ravintoon/ ­
juomaveteen sekoitetun testiaineen pitoisuudelle (ppm) tarvitta ­
essa 
— ympäristöolosuhteet  
— yksityiskohtaiset tiedot ravinnon ja veden laadusta.  
Tulokset:  
Ainakin seuraavat tiedot emon vasteesta myrkylliseen aineeseen:  
— eläinten määrä testin alussa, testin lopussa elossa olevien eläinten 
määrä, tiineiden eläinten määrä, niiden eläinten määrä, joiden tiineys keskeytyi, sekä ennenaikaisesti synnyttäneiden eläinten 
määrä
 
— kuolinpäivä testin aikana tai tieto eläimen selviämisestä suunni ­
teltuun lopettamiseen asti  
— ennen suunniteltua lopettamista kuolleiden eläinten tiedot kirja ­
taan, mutta niitä ei oteta mukaan ryhmien väliseen tilastolliseen vertailuun
 
— jokaisen poikkeavan kliinisen löydöksen havaintopäivä ja sen 
jatkokehitys  
— ruumiinpaino, painon muutos ja tiineen eläimen kohdun paino; 
haluttaessa myös ruumiinpainon muutos korjattuna kohdun pai ­
nolla  
— ravinnonotto sekä nautitun veden määrä, mikäli se on mitattu  
— ruumiinavauslöydökset, mukaan lukien kohdun paino  
— haitattoman annostason arvot emolle ja kehittyvälle sikiölle.  
Kehitykseen liittyvät loppupisteet annostasoittain poikueille, joissa 
on implantaatioita, mukaan lukien seuraavat tiedot:  
— keltarauhasten määrä  
— implantaatioiden määrä, elävien ja kuolleiden sikiöiden sekä re ­
sorptiotapausten määrä ja prosenttiosuus  
— ennen ja jälkeen implantaation tapahtuneiden tiineyden keskey ­
tymisten määrä ja prosenttiosuus.  
Kehitykseen liittyvät loppupisteet annostasoittain poikueille, joissa 
on eläviä sikiöitä, mukaan lukien seuraavat tiedot:  
— elävien poikasten määrä ja prosenttiosuus  
— sukupuolten välinen suhde  
— sikiön ruumiinpaino, mielellään sekä sukupuolen mukaan että 
molemmille sukupuolille  
— ulkoiset epämuodostumat, pehmytkudosten ja luuston epämuo ­
dostumat ja muut merkittävät muutokset  
— luokittelukriteerit tarvittaessa  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 465
 
— niiden sikiöiden ja poikueiden kokonais- ja prosenttimäärä, joilla 
on ulkoisia muutoksia tai pehmytkudosten tai luuston muutoksia, 
sekä yksittäisten epämuodostumien ja muutosten laji ja esiinty ­
vyys.  
Tulosten pohdinta.  
Johtopäätökset.  
4. LÄHDELUETTELO  
(1) Kavlock R.J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence 
of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for 
Developmental Toxicity.  Risk Analysis  16; 399–410.  
(2) Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990) Proceedings of the 
Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal 
Developmental Toxicity Studies.  Fundamental and Applied 
Toxicologv  14; 386–398.  
(3) Wong, B.A., et al. (1997) Developing Specialized Inhalation 
Exposure Systems to Address Toxicological Problems.  CIIT 
Activities  17; 1–8.  
(4) US Environmental Protection Agency (1985) Subpart E-Speci ­
fic Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation De ­
velopmental Toxicity Study.  
(5) Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen 
Nachweis von Implantations Stellen am Uterus der Ratte.  Nau­
nyn-Schmeidebergs Archiv für Pharmakologie und Experimen ­
telle Pathologie  247:367.  
(6) Edwards, J.A. (1968) The external Development of the Rabbit 
and Rat Embryo. In  Advances in Teratology.  D.H.M. Woolam 
(ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.  
(7) Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone 
in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S.  
Congenital Anomalies  16; 171–173.  
(8) Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial 
Skeletal Variations Detected by the Double Staining Techni ­
quefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses.  
Congenital Anomalies  32; :381–391.  
(9) Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following 
Heat Exposure in the Rat.  Teratology  47:229–242.  
(10) Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double 
Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats.  Teratology  37; 476.
 
(11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for 
Detecting Malformations in Rat Foetuses.  Journal of Morpho ­
logy 127:291–306.  
(12) Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative 
of Foetal Maturity.  Teratology  11; 313–320.  
(13) Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity 
Studies.  Toxicology and Applied Pharmacology  9; :398–408.  
(14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in 
Rats: Malformations or Variations?  Teratology  8; 309–316.  
(15) Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD 
(Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to 
Ethylene Glycol.  Teratology  46; 169–181.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 466
 
(16) Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat Foe ­
tuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and Histo ­
logical Study of Viscera.  Supplement to Teratology Workshop 
Manual,  pp. 163–173.  
(17) Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of 
appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the Pos ­
sible Influence of the Sex Factor.  American Journal of Ana ­
tomy  41; 411–445.
 
(18) Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid 
Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for Fetal Bone.  Stain Technology  39; 61–63.
 
(19) Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification 
of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) 
Skeleton.  American Journal of Anatomy  36; 313–355.  
(20) Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Exa ­
mination of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity Testing.  Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis  4; 
181–188.
 
(21) Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957)  The Genesis of the 
Rat Skeleton.  Thomas, Springfield, IL.  
(22) Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Terato ­
logy. In  Teratology: Principles and Techniques,  Wilson J.G. 
and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, pp 251–277.
 
(23) Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977)  Handbook of 
Teratology,  Vol. 4. Plenum, NY.  
(24) Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Techni ­
ques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity.  Acta Vet. 
Acad. Sci. Hung.  28; 233–239.  
(25) Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in Mam ­
malian Foetuses.  Teratology  9; 37–38.  
(26) Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting 
Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In:  Methods in Prenatal Toxicology  Neubert, D., Mer ­
ker, H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of Chicago, 
Chicago, IL, pp. 126–144.
 
(27) US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for 
Developmental Toxicity Risk Assessment.  Federal Register  
56; 63798–63826.  
(28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental Ab ­
normalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) Te ­
ratology 55; 249–292.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 467
 
B.32  KARSINOGEENISUUSTUTKIMUKSET  
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 451 (2009). Alkupe ­
räinen karsinogeenisuustestejä koskeva testiohje nro 451 hyväksyttiin vuonna 1981. Tämän tarkistetun testimenetelmän B.32 kehittäminen katsot ­
tiin tarpeelliseksi, jotta siinä voidaan ottaa huomioon eläinten hyvinvointiin 
ja sääntelyvaatimuksiin liittyvä viimeaikainen kehitys (2) (3) (4) (5) (6). Tämän testimenetelmän B.32 ajantasaistus on toteutettu yhdessä tässä liit ­
teessä olevan luvun B.30 (Krooninen myrkyllisyystesti) ja luvun B.33 (Yh ­
distetty krooninen myrkyllisyys/karsinogeenisuustesti) tarkistusten kanssa. 
Tavoitteena on saada lisää tietoa tutkimuksessa käytetyistä eläimistä ja yk ­
sityiskohtaisempaa tietoa annoksen valinnasta. Tämä testimenetelmä B.32 on tarkoitettu käytettäväksi monien erilaisten kemikaalien, torjunta-aineiden ja 
teollisuuskemikaalien testauksessa. Todettakoon kuitenkin, että jotkin yksi ­
tyiskohdat ja vaatimukset saattavat erota lääkkeitä koskevista vaatimuksista (katso kansainvälisen harmonisointikonferenssin (ICH:n) ohje S1B lääkkei ­
den karsinogeenisuuden testauksesta).
 
2. Koska valtaosa karsinogeenisuustesteistä tehdään jyrsijälajeilla, tämä testi ­
menetelmä on tarkoitettu käytettäväksi ensisijaisesti tutkimuksissa, jotka teh ­
dään näillä lajeilla. Jos tällaisia tutkimuksia on tehtävä muilla kuin jyrsijöil ­
lä, on noudatettava tässä testimenetelmässä esitettyjä sekä tässä liitteessä 
olevan luvun B.27 (Toistetuilla annoksilla tehtävä 90 vuorokauden oraalinen myrkyllisyystutkimus muilla kuin jyrsijöillä) (6) mukaisia periaatteita ja menettelyjä asianmukaisin muutoksin. Lisää ohjeita on OECD:n ohjeasiakir ­
jassa GD 116, joka koskee kroonisten myrkyllisyys- ja karsinogeenisuustut ­
kimusten suunnittelua ja toteuttamista (7).
 
3. Karsinogeenisuustutkimuksissa käytettävät kolme pääasiallista antoreittiä 
ovat suun kautta, ihon kautta ja hengitysteiden kautta. Antoreitti valitaan 
testattavan kemikaalin fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuksien sekä ih ­
misten todennäköisen altistumisreitin mukaan. Lisätietoja altistusreitin valin ­
nasta on OECD:n ohjeasiakirjassa GD 116 (7).  
4. Tässä testimenetelmässä keskitytään suun kautta altistukseen, koska se on 
yleisimmin käytetty altistustapa karsinogeenisuustutkimuksissa. Vaikka kar ­
sinogeenisuustutkimukset, joihin sisältyy ihon tai hengitysteiden kautta al ­
tistus, voivat olla tarpeen ihmisten terveysriskien arvioinnissa ja/tai vaikka 
niitä voidaan tarvita tiettyjen sääntelyohjelmien nojalla, molemmat altistus ­
reitit ovat teknisesti erittäin monimutkaisia. Tällaiset tutkimukset on suun ­
niteltava tapauskohtaisesti, joskin tässä kuvattu testimenetelmä, joka on tar ­
koitettu suun kautta altistuksesta aiheutuvan karsinogeenisuuden määrittämi ­
seen ja arviointiin, voi olla pohjana hengitysteiden ja/tai ihon kautta tapah ­
tuvaa altistusta koskeville tutkimuksille käsittelyaikoja sekä kliinisiä ja pa ­
tologisia parametreja jne. koskevien suositusten osalta. Saatavilla on 
OECD:n ohje testikemikaalien annostelusta ihon (7) ja hengitysteiden (7) 
(8) kautta. Kun suunnitellaan pitempiaikaisia tutkimuksia, joihin liittyy al ­
tistus hengitysteiden kautta, on suositeltavaa käyttää apuna tämän liitteen lukua B.8 (8) ja lukua B.29 (9) sekä OECD:n ohjeasiakirjaa (8), joka koskee 
altistusta hengitysteiden kautta. Kun altistustestaus toteutetaan ihon kautta, 
on suositeltavaa käyttää apuna tämän liitteen lukua B.9 (11).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 468
 
5. Karsinogeenisuustutkimuksesta saadaan tietoja mahdollisista terveyshaitois ­
ta, joita toistuvasta altistuksesta todennäköisesti seuraa ja jotka kestävät jopa 
käytettyjen lajien koko eliniän ajan. Tutkimuksesta saadaan tietoa testikemi ­
kaalin myrkyllisistä vaikutuksista ja mahdollisesta karsinogeenisuudesta, ja sen avulla saatetaan tunnistaa kohde-elimet ja kemikaalin mahdollinen ker ­
tyminen. Lisäksi tutkimuksesta voidaan saada arvio tasosta, joka ei aiheuta 
havaittavaa haittavaikutusta (NOAEL). Ei-genotoksisten karsinogeenien osalta voidaan määrittää kasvainvasteet, joita voidaan käyttää laadittaessa turvallisuuskriteereitä ihmisten altistumiselle. Korostettakoon, että eläinten 
huolellinen kliininen tarkkailu on hyvin tärkeää, jotta tutkimuksesta saadaan 
mahdollisimman paljon tietoa.
 
6. Tämän testimenetelmän kattamien karsinogeenisuustutkimusten tavoitteet 
ovat seuraavat:  
— Testikemikaalin sellaisten karsinogeenisten ominaisuuksien tunnistami ­
nen, jotka lisäävät kasvainten ilmaantuvuutta tai pahanlaatuisten kasvain ­
ten määrää tai vähentävät kasvainten syntymiseen kuluvaa aikaa verrat ­
tuna samanaikaisiin vertailuryhmiin.  
— Karsinogeenisuuden kohde-elimen (-elinten) tunnistaminen.  
— Kasvainten ilmaantumiseen kuluvan ajan määrittäminen  
— Kasvaimen annos-vastesuhteen luonnehtiminen.  
— NOAEL-arvon (tason, joka ei aiheuta havaittavaa haittavaikutusta) mää ­
rittäminen tai viiteannoksen (BMD:n) määrittämisen lähtökohta.  
— Karsinogeenisten vaikutusten ekstrapolointi ihmisten altistumistasoihin 
pienillä annoksilla.  
— Tiedon tuottaminen vaikutustapaa koskevia testihypoteeseja varten (2) 
(7) (12) (13) (14) (15).  
ALUSTAVAT HUOMIOT  
7. Kun määritetään ja arvioidaan testikemikaalin karsinogeenisia ominaisuuk ­
sia, testauslaboratorion on otettava huomioon kaikki testikemikaalista saa ­
tavilla olevat tiedot ennen tutkimuksen toteuttamista, jotta tutkimus voidaan suunnitella siten, että mahdollista karsinogeenisuutta voidaan testata tehok ­
kaasti ja jotta eläinten käyttö voidaan pitää mahdollisimman vähäisenä. 
Epäillyn karsinogeenin vaikutustapaa koskevat tiedot ja niiden ottaminen huomioon (2) (7) (12) (13) (14) (15) on erittäin tärkeää, koska paras tutki ­
musmenetelmä voi vaihdella sen mukaan, tiedetäänkö vai epäilläänkö testi ­
kemikaalin olevan genotoksinen karsinogeeni. Lisätietoa vaikutustapaa kos ­
kevista huomioista on ohjeasiakirjassa GD 116 (7).
 
8. Tietoihin, joista on apua tutkimuksen suunnittelussa, sisältyvät testattavan 
kemikaalin identiteetti, kemiallinen rakenne ja fysikaalis-kemialliset ominai ­
suudet,  in vitro-  tai in vivo  -myrkyllisyystestien ja genotoksisuustestien tu ­
lokset, odotettavissa oleva käyttö (odotettavissa olevat käytöt) ja ihmisten 
altistumisen mahdollisuus, saatavilla olevat (Q)SAR-tiedot, mutagee ­
nisuus/genotoksisuustiedot, karsinogeenisuustiedot ja toksikologiset tiedot rakenteellisesti samankaltaisista aineista, saatavilla olevat toksikokineettiset tiedot (kerta-annoksen ja myös toistuvan annoksen kinetiikka, jos saatavilla) 
sekä muista toistuvaa altistusta käsitelleistä tutkimuksista saadut tiedot. Kar ­
sinogeenisuus on määritettävä vasta sitten, kun myrkyllisyydestä on saatu
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 469
 
alustavia tietoja toistetuilla annoksilla suoritetuista 28 päivän ja/tai 90 päivän 
myrkyllisyystesteistä. Lyhytaikaiset testit, joissa tutkitaan syövän puhkea ­
mista ja etenemistä, voivat antaa myös hyödyllistä tietoa. Karsinogeenisuus ­
testauksen osalta on harkittava vaiheittaista testaustapaa osana tietyn testi ­
kemikaalin mahdollisten terveyteen kohdistuvien haitallisten vaikutusten ko ­
konaisarviointia (16) (17) (18) (19).  
9. Ennen tutkimuksen aloittamista on määritettävä tulosten analysointiin sopi ­
vimmat tilastomenetelmät koejärjestelyt ja tavoitteet huomioon ottaen. On pohdittava sitä, onko tilastoihin sisällytettävä eloonjäämistä koskeva korjaus, 
kumulatiivisten kasvainriskien analyysi suhteessa eloonjäämisen pituuteen, 
kasvaimen ilmaantumiseen kuluvaa aikaa koskeva analyysi sekä analyysi, joka on tehtävä, jos testi keskeytyy yhdessä tai useammassa ryhmässä en ­
nenaikaisesti. Asianmukaisia tilastollisia analyyseja koskevia ohjeita sekä 
keskeiset viitetiedot kansainvälisesti hyväksytyistä tilastomenetelmistä on 
ohjeasiakirjassa GD 116 (7) sekä ohjeasiakirjassa GD 35, joka koskee kroo ­
nisten myrkyllisyys- ja karsinogeenisuustutkimusten analyysia ja arviointia (20).
 
10. Karsinogeenisuustutkimuksia tehtäessä on noudatettava aina periaatteita ja 
näkökohtia, jotka on määritelty OECD:n ohjeasiakirjassa nro 19 (turvalli ­
suuden arvioinneissa käytetyillä koe-eläimillä ilmenevien kliinisten merkkien tunnistaminen, arvioiminen ja käyttäminen humaaneina lopettamiskriteerei ­
nä) (21) ja eritoten sen 62 kohdassa. Kyseisessä kohdassa todetaan näin: 
”Kun tutkimuksissa, joihin sisältyy toistuvaa annostelua, eläin osoittaa sel ­
laisia kliinisiä merkkejä, jotka ovat progressiivisia ja jotka johtavat eläimen tilan huonontumiseen, on tehtävä tietoon perustuva päätös siitä, tuleeko eläin 
lopettaa humaaneista syistä. Päätöstä tehtäessä on otettava huomioon, mitä 
tutkimuksellista arvoa eläimen hengissä pitämisen jatkamisesta saatavalla tiedolla on suhteessa sen yleistilaan. Jos eläin päätetään pitää testissä edel ­
leen, havaintoja on tehtävä tiheämmin, mikäli tarpeen. On myös mahdollista 
keskeyttää annostus tai pienentää testiannosta väliaikaisesti, mikäli se lievit ­
tää tuskia tai kärsimyksiä, ilman että se haittaa testin tarkoitusta.”
 
11. Tarkempia ohjeita ja kroonisten myrkyllisyys- ja karsinogeenisuustutkimus ­
ten annoksen valintaa ohjaavia periaatteita on ohjeasiakirjassa GD 116 (7) 
sekä kahdessa International Life Sciences Instituten julkaisussa (22) (23). 
Keskeinen annoksen valintastrategia määräytyy tutkimuksen ensisijaisen ta ­
voitteen tai ensisijaisten tavoitteiden mukaisesti (6 kohta). Asianmukaisia annostasoja valittaessa on pyrittävä saavuttamaan tasapaino yhtäältä vaarojen 
seulonnan ja toisaalta pieniin annoksiin liittyvien vasteiden ja niiden merki ­
tyksen välillä. Tämä on oleellista varsinkin tilanteessa, kun on määrä tote ­
uttaa yhdistetty kroonista myrkyllisyyttä ja karsinogeenisuutta koskeva tut ­
kimus (tämän liitteen luku B.33) (12 kohta).
 
12. Erillisen kroonisen myrkyllisyystutkimuksen (tämän liitteen luku B.30) ja 
karsinogeenisuustutkimuksen (tämän liitteen luku B.32) sijasta on harkittava yhdistetyn kroonisen myrkyllisyys- ja karsinogeenisuustutkimuksen (tämän liitteen luku B.33) toteuttamista. Kahteen erilliseen tutkimukseen verrattuna 
yhdistetty tutkimus on ajan ja kustannusten kannalta tehokkaampi, mutta 
tietojen laatu ei vaarannu kroonisessa vaiheessa tai karsinogeenisuutta käsit ­
televässä vaiheessa. Kun tehdään yhdistetty krooninen myrkyllisyys- ja karsi ­
nogeenisuustutkimus (tämän liitteen luku B.33), on kiinnitettävä erityistä huo ­
miota annoksen valinnan periaatteisiin (11 ja 22–25 kohta). Todettakoon, että 
tiettyjen sääntelypuitteiden nojalla voidaan edellyttää erillisiä tutkimuksia.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 470
 
13. Tämän testimenetelmän yhteydessä käytetyt määritelmät on esitetty tämän 
kohdan lopussa ja ohjeasiakirjassa GD 116 (7).  
TESTIN PERIAATE  
14. Testikemikaalia annostellaan päivittäin erisuuruisina annoksina useille 
koe-eläinryhmille suurimman osan niiden elinajasta yleensä suun kautta. 
Testaus voi olla tarkoituksenmukaista myös hengitysteiden tai ihon kautta. Eläimiä havainnoidaan tarkasti myrkyllisyyden merkkien ja neoplastisten leesioiden kehittymisen havaitsemiseksi. Kokeen aikana kuolleille tai lope ­
tetuille eläimille tehdään ruumiinavaus. Kokeen lopussa vielä elossa olevat 
eläimet lopetetaan ja niille tehdään ruumiinavaus.
 
MENETELMÄN KUVAUS  
Eläinlajin valinta  
15. Tämä testimenetelmä koskee ensisijaisesti jyrsijöillä ilmenevän karsinogee ­
nisuuden määrittämistä ja arviointia (katso 2 kohta). Muiden lajien kuin 
jyrsijöiden käyttöä voidaan harkita, kun saatavilla olevat tiedot viittaavat siihen, että muut lajit ovat oleellisempia ihmisten terveyteen kohdistuvien vaikutusten ennustamisessa. Lajin valinta on perusteltava. Suositeltavin jyr ­
sijälaji on rotta, mutta muitakin jyrsijöitä, esimerkiksi hiiriä, voidaan käyttää. 
Vaikka hiiren käyttämisestä karsinogeenisuustestauksessa koituva hyöty voi olla rajallinen (24) (25) (26), jotkin sääntelyohjelmat edellyttävät karsinogee ­
nisuustestien tekemistä hiirellä, ellei päätetä, että tällainen tutkimus on tie ­
teellisesti tarpeeton. Rottia ja hiiriä on käytetty ensisijaisina koe-eläiminä 
seuraavista syistä: niiden elinaika on suhteellisen lyhyt, niitä käytetään laa ­
jalti farmakologisissa ja toksikologisissa tutkimuksissa, niille muodostuu herkästi kasvaimia, ja saatavilla on kantoja, joita on luonnehdittu riittävästi. 
Tämän vuoksi niiden fysiologiasta ja patologiasta on saatavana paljon tietoa. 
Lisätietoja lajin ja kannan valinnasta on ohjeasiakirjassa nro 116 (7).
 
16. Testissä tulee käyttää yleisesti käytettyjä nuoria ja terveitä täysikasvuisia 
koe-eläinkantoja. Karsinogeenisuustutkimus on tehtävä mieluiten eläimillä, 
jotka ovat samaa kantaa ja samasta lähteestä kuin eläimet, joita käytettiin 
lyhyemmissä alustavissa myrkyllisyystutkimuksissa. Jos kyseisestä kannasta ja lähteestä peräisin olevien eläinten kuitenkin tiedetään aiheuttavan ongel ­
mia pitkäaikaisissa tutkimuksissa yleensä käytettävien hyväksyttyjen eloon ­
jäämiskriteerien täyttämisessä [katso ohjeasiakirja GD 116 (7)], on harkit ­
tava sellaisen eläinkannan käyttämistä, jonka eloonjäämisaste pitkäaikaisessa tutkimuksessa on hyväksyttävä. Naaraat eivät saa olla synnyttäneitä eivätkä tiineinä.
 
Koe-eläintilat ja ruokinta  
17. Eläimet voidaan pitää häkeissä yksittäin tai muutaman samaa sukupuolta 
olevan eläimen ryhmissä. Yksittäin pitämistä on harkittava vain, jos se on 
tieteellisesti perusteltua (27) (28) (29). Häkit on sijoitettava siten, että häkin 
sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Koe-eläinhuoneen lämpötilan tulee olla 22 °C (± 3 °C). Vaikka riittää, että suhteellinen kosteus on vähintään 30 prosenttia eikä mielellään ylitä 
70:tä prosenttia muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, tulee kuitenkin 
pyrkiä 50–60 prosentin suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa / 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä 
juomaveden määrää saa rajoittaa. Ruokavalion on vastattava kaikkia testat ­
tujen lajien ravintovaatimuksia. Ruokavalion sisältämien kontaminanttien
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 471
 
määrän on oltava mahdollisimman pieni. Kontaminantteja, jotka saattavat 
vaikuttaa testin tuloksiin, ovat esimerkiksi torjunta-ainejäämät, pysyvät or ­
gaaniset yhdisteet, fytoestrogeenit, raskasmetallit ja mykotoksiinit. Ravintoaine- ja kontaminanttipitoisuudesta on tuotettava analyyttista tietoa säännöllisesti, vähintään tutkimuksen alussa ja silloin, kun käytettävä erä 
muuttuu, ja nämä tiedot on sisällytettävä loppuraporttiin. Yhtä lailla on 
annettava analyyttista tietoa tutkimuksessa käytetystä juomavedestä. Ruo ­
kavalion valintaan voi vaikuttaa tarve varmistaa testikemikaalin ja eläinten ravintovaatimusten välinen tasapaino silloin, kun testikemikaalia annetaan 
ravintoon sekoitettuna.
 
Eläinten valmistelu  
18. Testissä on käytettävä terveitä eläimiä, joita on totutettu 
laboratorio-olosuhteisiin vähintään seitsemän vuorokauden ajan ja joita ei ole käytetty kokeisiin aiemmin. Jyrsijöiden osalta testikemikaalin antaminen 
eläimille tulee aloittaa mahdollisimman pian vieroituksen ja totutuksen jäl ­
keen, mielellään ennen kuin eläimet ovat kahdeksanviikkoisia. Koe-eläinten laji, kanta, alkuperä, sukupuoli, paino ja ikä on tunnettava. Testin alkaessa eläinten painon vaihtelun tulee olla mahdollisimman vähäistä, ja se saa 
vaihdella kummankin käytetyn sukupuolen osalta korkeintaan ± 20 prosent ­
tia kaikkien tutkimuksessa käytettyjen eläinten keskimääräisestä painosta, joka on määritettävä kummallekin sukupuolelle erikseen. Eläimet tulee jakaa verrokki- ja testiryhmään satunnaistetusti. Satunnaistamisen jälkeen kum ­
mankaan sukupuolen ryhmissä ei saa olla suuria eroja keskimääräisessä 
painossa. Jos tilastollisesti merkitseviä eroja on, satunnaistamisvaihe on tois ­
tettava, mikäli mahdollista. Kullekin eläimelle tulee antaa oma tunnistenu ­
mero, joka on merkittävä eläimeen pysyvästi tatuoimalla, mikrosiruimplan ­
tilla tai muulla sopivalla tavalla.
 
MENETTELY  
Eläinten lukumäärä ja sukupuoli  
19. Testissä on käytettävä molempia sukupuolia. Testissä on käytettävä riittävää 
määrää eläimiä, jotta jokaisessa ryhmässä on tarpeeksi eläimiä tutkimuksen lopussa perusteellista biologista ja tilastollista arviointia varten. Sen vuoksi 
jokaisessa annosryhmässä ja samanaikaisessa verrokkiryhmässä on oltava 
vähintään 50 eläintä kumpaakin sukupuolta. Sen mukaan, mikä on tutkimuk ­
sen tavoite, keskeisten estimaattien tilastollista voimaa on mahdollista lisätä jakamalla eläimet eri annosryhmiin eri tavoin epätasaisesti siten, että pienen 
annoksen ryhmissä on yli 50 eläintä esimerkiksi sen vuoksi, että voidaan 
arvioida kemikaalin mahdollista karsinogeenisuutta pienillä annoksilla. On kuitenkin muistettava, että jos ryhmäkokoa kasvatetaan vain jonkin verran, tutkimuksen tilastollinen voima lisääntyy suhteellisen vähän. Lisätietoa tut ­
kimuksen tilastollisesta suunnittelusta ja annostasojen valinnasta tilastollisen 
voiman maksimoimiseksi on ohjeasiakirjassa GD 116 (7).
 
Eläinten lopettamista kesken tutkimuksen, satelliittiryhmiä ja erityisval ­
vonnassa olevia eläimiä koskeva säännös  
20. Tutkimuksessa voidaan hyödyntää mahdollisuutta lopettaa eläimiä kesken 
tutkimuksen esimerkiksi 12 kuukauden kohdalla, jotta saadaan tietoa neop ­
lastisten muutosten etenemisestä ja mekanistista tietoa, mikäli se on tieteel ­
lisesti perusteltua. Jos tällaisia tietoja on jo saatavana aiemmista samaa testikemikaalia koskevista toistetun annoksen myrkyllisyystutkimuksista, 
eläinten lopettaminen kesken tutkimuksen ei ole välttämättä tieteellisesti 
perusteltua. Jos tutkimussuunnitelmaan sisältyy kesken tutkimuksen tapah ­
tuvia lopettamisia, kesken tutkimuksen lopetettavien eläinten määrä jokai ­
sessa annosryhmässä on yleensä 10 eläintä kumpaakin sukupuolta. Tutki ­
mussuunnitelman mukaista eläinten kokonaismäärää on lisättävä ennen tut ­
kimuksen päättymistä lopetettavaksi aiottujen eläinten määrällä. Lisäksi tut ­
kimukseen voidaan sisällyttää ryhmä erityisvalvonnassa olevia eläimiä (yleensä viisi eläintä kumpaakin sukupuolta) sairauden tilan seuraamiseksi 
tutkimuksen aikana, mikäli tarpeen (30). Lisätietoja on ohjeasiakirjassa GD 
116 (7).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 472
 
Annosryhmät ja annostus  
21. Ohjeita kaikista annoksen valintaan ja annosten porrastamiseen liittyvistä 
näkökohdista on ohjeasiakirjassa GD 116 (7). Tutkimuksessa on käytettävä vähintään kolmea annostasoa ja yhtä samanaikaista verrokkiryhmää. Annos ­
tasot perustuvat yleensä lyhyempien, toistetuilla annoksilla tehdyn testien tai 
annosalueen määritystestien tuloksiin, ja kaikki mahdolliset testikemikaalista tai samanlaisista kemikaaleista saatavilla olevat toksikologiset ja toksikoki ­
neettiset tiedot on otettava huomioon.
 
22. Mikäli testikemikaalin fysikaalis-kemialliset ominaisuudet tai biologiset vai ­
kutukset eivät rajoita korkeimman annostason valintaa, annostaso on yleensä 
valittava siten, että sen avulla voidaan tunnistaa ensisijaiset kohde-elimet ja 
myrkylliset vaikutukset ilman, että annos aiheuttaa kärsimystä, vakavaa myr ­
kyllisyyttä, sairastuvuutta tai kuolemaa. Kun otetaan huomioon jäljempänä 23 kohdassa esitetyt tekijät, suurin annos on yleensä valittava siten, että se 
aiheuttaa merkkejä myrkyllisyydestä, mikä näkyy esimerkiksi painon nousun 
hidastumisena (noin 10 prosentilla). Tutkimuksen tavoitteiden mukaan (katso 6 kohta) suurimmaksi annokseksi voidaan valita myös pienempi an ­
nos kuin se, joka aiheuttaa merkkejä myrkyllisyydestä, jos jokin annos 
aiheuttaa esimerkiksi huolestuttavan haittavaikutuksen, joka vaikuttaa kui ­
tenkin vain vähän elinaikaan tai ruumiinpainoon.
 
23. Annostasot ja niiden porrastus voidaan valita annosvasteen ja – testikemi ­
kaalin vaikutustavan mukaan – NOAEL-arvon määrittämisen tai tutkimuk ­
sen muun tavoitteen (esimerkiksi BMD-arvo (katso 25 kohta) pienimmän annoksen tasolla) saavuttamisen perusteella. Pienempien annosten määrittä ­
misessä huomioon otettavia tekijöitä ovat annos-vastekäyrän odotuksenmu ­
kainen kulmakerroin, annokset, joiden yhteydessä saattaa ilmetä tärkeitä 
muutoksia metaboliassa tai myrkyllisen vaikutuksen tavassa, odotuksenmu ­
kainen raja-arvo tai arvo, jota pidetään lähtökohtana pienen annoksen ekst ­
rapolaatiolle.
 
24. Valittu annostason porrastus määräytyy testikemikaalin ominaisuuksien pe ­
rusteella, eikä sitä voida määrätä tässä testimenetelmässä. 
Kaksinkertaiset-nelinkertaiset erot annostasojen välillä ovat usein parhaim ­
mat alenevissa annossarjoissa, ja usein on parempi lisätä neljäs testiryhmä kuin käyttää hyvin suuria annosvälejä (esimerkiksi 6–10-kertaisia annosvä ­
lejä). Yleisesti ottaen on pyrittävä välttämään käyttämästä kertoimia, jotka 
ovat suurempia kuin 10, ja niiden mahdollinen käyttö on perusteltava.
 
25. Kuten ohjeasiakirjassa GD 116 (7) on täsmennetty, annoksen valinnassa on 
otettava huomioon seuraavat seikat:  
— Tunnetut tai oletetut epälineaarisuudet tai käännepisteet annosvasteessa  
— Toksikokinetiikka ja pitoisuusalueet, joilla ilmenee tai ei ilmene meta ­
bolian induktiota, saturaatiota tai epälineaarisuutta ulkoisten ja sisäisten annosten välillä
 
— Leesioiden esiasteet, vaikutusten merkkiaineet tai keskeisten biologisten 
prosessien toimintaa osoittavat indikaattorit  
— Vaikutustapaan liittyvät keskeiset (tai oletetut) näkökohdat, kuten annok ­
set, joilla alkaa ilmetä sytotoksisuutta, hormonipitoisuuksien ja homeos ­
taattisten mekanismien häiriintymistä jne.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 473
 
— Annos-vastekäyrän alueet, joilla tarvitaan erittäin yksityiskohtainen esti ­
mointi, esimerkiksi ennakoidun viitearvon tai oletetun raja-arvon koh ­
dalla  
— Ihmisten ennakoituja altistumistasoja koskeva pohdinta.  
26. Verrokkiryhmän tulee olla joko ryhmä, joka ei saa käsittelyä, tai 
kantaja-ainetta saava ryhmä, mikäli testikemikaalin antamisen yhteydessä 
käytetään kantaja-ainetta. Testikemikaalin annostelua lukuun ottamatta ver ­
rokkiryhmän eläimiä on käsiteltävä täsmälleen samoin kuin testiryhmien eläimiä. Jos käytetään kantaja-ainetta, verrokkiryhmälle tulee antaa tilavuu ­
deltaan suurin annosryhmissä käytetty kantaja-aineannos. Jos testikemikaali 
annetaan ravintoon sekoitettuna ja jos se vähentää ravinnonottoa sen vuoksi, ettei ravinto maita eläimelle entiseen tapaan, normaaliravintoa saava verrok ­
kiryhmä voi olla sopivampi.
 
Annosten valmistelu ja testikemikaalin antaminen  
27. Testikemikaali annetaan yleensä suun kautta ruoan tai juomaveden seassa tai 
ruokintaletkulla. Lisätietoja antoreiteistä ja -tavoista on ohjeasiakirjassa GD 116 (7). Antoreitti ja antotapa määräytyvät tutkimuksen tarkoituksen, testi ­
kemikaalin fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien ja sen biologisen hyötyo ­
suuden sekä ihmisten yleisimmän altistumisreitin ja -tavan perusteella. Va ­
litulle antoreitille ja -tavalle on esitettävä perustelut. Eläinten hyvinvoinnin vuoksi suun kautta käytettävä ruokintaletku on valittava yleensä vain sellai ­
sille aineille, joiden osalta tämä antoreitti ja -tapa ovat todennäköisesti mah ­
dollisia ihmisten altistumisen yhteydessä (esimerkiksi lääkkeet). Torjunta-aineita sisältävät ravinto- tai ympäristökemikaalit annetaan yleensä ravintoon tai juomaveteen sekoitettuna. Joidenkin skenaarioiden, kuten työ ­
peräisen altistuksen, yhteydessä kemikaalin antaminen muita antoreittejä 
pitkin voi kuitenkin olla tarkoituksenmukaisempaa.
 
28. Tarvittaessa testikemikaali liuotetaan tai suspendoidaan sopivaan 
kantaja-aineeseen. Seuraavat mahdolliset kantaja-aineen ja muiden lisäainei ­
den ominaisuudet on otettava huomioon: vaikutukset imeytymiseen, elimis ­
töön jakautumiseen, metaboliaan tai testikemikaalin pidättymiseen (retenti ­
oon) elimistössä; sellaiset vaikutukset testikemikaalin kemiallisiin ominai ­
suuksiin, jotka voivat muuttaa sen myrkyllisiä ominaisuuksia; vaikutukset ravinnon ja veden kulutukseen tai eläinten ravitsemustilanteeseen. On suo ­
siteltavaa, että ensin harkitaan vesiliuosta tai suspensiota aina, kun se on 
mahdollista, ja sen jälkeen öljyyn (esimerkiksi maissiöljyyn) tehtävää liuos ­
ta/suspensiota ja sitten mahdollisesti muita kantaja-aineita. Jos kantaja-aine on muu kuin vesi, sen myrkylliset ominaisuudet on tunnettava. Testikemi ­
kaalin stabiiliudesta ja annosteluliuosten homogeenisuudesta tai ruokavali ­
oista (tarvittaessa) annosteluolosuhteissa (esimerkiksi ravinto) on oltava saa ­
tavilla tietoa.
 
29. Jos kemikaaleja annetaan ravintoon tai juomaveteen sekoitettuna, on tärkeää 
varmistaa, että testikemikaalimäärät eivät häiritse normaalia ravinto- tai nes ­
tetasapainoa. Pitkäaikaisissa myrkyllisyystutkimuksissa, joissa testikemikaa ­
lia annetaan ravinnon seassa, testikemikaalin pitoisuus eläinten ruoassa saa 
yleensä olla enintään viisi prosenttia kokonaisruokavaliosta, jotta vältetään 
ravitsemuksellinen epätasapaino. Kun testikemikaali annetaan ravinnon kanssa, voidaan käyttää joko vakiopitoisuutta (mg/kg-ruokavalio tai ppm) ravinnossa tai eläimen painoon suhteutettua annoksen vakiotasoa (mg pai ­
nokiloa kohti). Molemmat lasketaan viikoittain. Valittu vaihtoehto on mai ­
nittava.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 474
 
30. Suun kautta annostelun yhteydessä eläimille annetaan testikemikaalia päivit ­
täin (seitsemänä päivänä viikossa), jyrsijöillä yleensä 24 kuukauden ajan 
(katso myös 32 kohta). Jos käytetään muunlaista koejärjestelyä (jos testike ­
mikaalia annetaan esimerkiksi viitenä päivänä viikossa), se on perusteltava. Ihon kautta annostelun yhteydessä eläimille annetaan testikemikaalia vähin ­
tään kuuden tunnin ajan päivässä seitsemänä päivänä viikossa, kuten tämän 
liitteen B.9 luvussa (11) on täsmennetty, vähintään 24 kuukauden ajan. Hengitysteiden kautta altistuksessa testikemikaalia annetaan kuuden tunnin ajan päivässä seitsemänä päivänä viikossa, mutta myös altistusta viitenä 
päivänä viikossa voidaan käyttää, jos se on perusteltua. Altistusjakso on 
yleensä 24 kuukautta. Jos muita jyrsijöitä kuin rottia altistetaan vain nasaa ­
lisesti, altistuksen enimmäiskestoaikoja voidaan muuttaa lajikohtaisen stres ­
sin minimoimiseksi. Jos altistuksen kesto on alle kuusi tuntia päivässä, se on 
perusteltava. Katso myös tämän liitteen luku B.8 (9).
 
31. Kun testikemikaali annetaan eläimille ruokintaletkulla, on käytettävä maha ­
letkua tai sopivaa intubaatiokanyylia, ja kemikaali on annettava joka päivä 
samoihin aikoihin. Yleensä kerta-annos annetaan kerran päivässä, mutta jos kemikaali on esimerkiksi paikallisesti ärsyttävä aine, päivittäinen annos voi ­
daan antaa myös jaettuna (kaksi kertaa päivässä). Suurin yhdellä kerralla 
annettava nestetilavuus määräytyy koe-eläimen koon mukaan. Tilavuus tulee 
pitää mahdollisimman pienenä, ja jyrsijöillä se saa olla yleensä enintään 1 ml 100 g:n painoa kohti (31). Testitilavuuden vaihtelu on minimoitava muuttamalla pitoisuutta sen varmistamiseksi, että tilavuus on sama kaikilla 
annostasoilla. Poikkeuksena ovat mahdollisesti syövyttävät tai ärsyttävät ke ­
mikaalit, jotka on laimennettava vakavien paikallisten vaikutusten välttämi ­
seksi. On vältettävä testausta sellaisilla pitoisuuksilla, jotka todennäköisesti syövyttävät tai ärsyttävät maha-suolikanavaa.
 
Tutkimuksen kesto  
32. Jyrsijöiden osalta tutkimus kestää yleensä 24 kuukautta, mikä on valtaosa 
käytettävien eläinten normaalista elinajasta. Tutkimus voi olla tätä pidempi tai lyhyempi sen mukaan, mikä on tutkimuksessa käytettävän eläinlajin kannan elinaika, mutta tämä on kuitenkin perusteltava. Tietyille hiirikannoil ­
le, joita ovat esimerkiksi AKR/J, C3H/J tai C57BL/6J, 18 kuukauden mit ­
tainen tutkimus voi olla sopivampi. Ohjeita tutkimuksen kestosta, päättymi ­
sestä ja tutkimuksessa havaitun eloonjäämisen käsittelemisestä sekä lisä ­
ohjeita negatiivisen karsinogeenisuuden hyväksyttävyydestä suhteessa tutki ­
muksessa ilmenneeseen eloonjäämiseen on OECD:n ohjeasiakirjassa GD 
116, joka koskee kroonisten myrkyllisyys- ja karsinogeenisuustutkimusten suunnittelua ja toteuttamista (7).
 
— Tutkimuksen lopettamista on harkittava, kun eloonjääneiden eläinten 
määrä pienemmän annoksen ryhmissä tai verrokkiryhmässä on pienempi kuin 25 prosenttia.
 
— Jos vain suuren annoksen ryhmä kuolee ennenaikaisesti myrkyllisyyden 
vuoksi, tutkimusta ei tule lopettaa.  
— Eloonjäämistä on käsiteltävä kummankin sukupuolen osalta erikseen.  
— Tutkimusta ei tule jatkaa sen jälkeen, kun tutkimuksesta saatavat tiedot 
eivät enää riitä tilastollisesti validin arvioinnin tekemiseen.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 475
 
HAVAINNOT  
33. Kaikki eläimet on tutkittava sairastuvuuden tai kuolleisuuden havaitsemi ­
seksi yleensä jokaisen päivän aamulla ja illalla myös viikonloppuisin ja lomien aikana. Lisäksi eläimet on tutkittava kerran päivässä toksikologisesti 
merkityksellisten erityisten merkkien havaitsemiseksi. On otettava huomi ­
oon, että kun testikemikaalia annetaan ruokintaletkun kautta, odotettuja vai ­
kutuksia esiintyy eniten annostelun jälkeen. Erityistä huomiota on kiinnitet ­
tävä kasvainten kehittymiseen. Jokaisen paljain silmin tai käsin tunnustele ­
malla havaittavissa olevan kasvaimen toteamisaika, paikka, koko, ulkonäkö 
ja kehitys on kirjattava.
 
Ruumiinpaino, ravinnon/veden kulutus ja ruumiinpainon lisäys  
34. Kaikki eläimet on punnittava käsittelyn alussa, vähintään kerran viikossa 
ensimmäisten 13 viikon ajan ja sen jälkeen vähintään kerran kuukaudessa. Ravinnon kulutus ja painon lisäys on mitattava vähintään kerran viikossa ensimmäisten 13 viikon ajan ja sen jälkeen vähintään kerran kuukaudessa. 
Veden kulutus on mitattava vähintään kerran viikossa ensimmäisten 13 vii ­
kon ajan ja sen jälkeen vähintään kerran kuussa, kun testikemikaali annetaan juomaveteen sekoitettuna. Veden kulutuksen mittaamista on harkittava myös sellaisissa tutkimuksissa, joissa eläimen juomistottumukset muuttuvat.
 
Hematologia, kliininen biokemia ja muut mittaukset  
35. Jotta tutkimuksesta saadaan mahdollisimman paljon tietoa erityisesti vaiku ­
tustapaa koskevia pohdintoja varten, eläimiltä voidaan ottaa tutkimuksen johtajan harkinnan perusteella verinäytteet hematologisia ja 
kliinis-biokemiallisia määrityksiä varten. Myös virtsa-analyysi voi olla tar ­
peen. Lisätietoa tällaisten näytteiden ottamisen hyödyllisyydestä osana kar ­
sinogeenisuustutkimusta on ohjeasiakirjassa GD 116 (7). Tarvittaessa veri ­
näytteet hematologisia ja kliinis-biokemiallisia määrityksiä ja 
virtsa-analyysia varten voidaan ottaa kesken tutkimuksen tapahtuvien lope ­
tusten yhteydessä (20 kohta) ja tutkimuksen päättyessä vähintään 10 eläi ­
meltä sukupuolta ja ryhmää kohti. Verinäytteet on otettava nimetystä pai ­
kasta esimerkiksi sydänpunktiolla tai silmäntakaisesta laskimopunoksesta 
anestesiassa, ja niitä on tarvittaessa säilytettävä asianmukaisissa olosuhteissa. 
Verinäytteet voidaan valmistella myös tutkimusta varten etenkin, jos kohde-elin vaikuttaa olevan luuydin, joskin tällaisen tutkimuksen arvoa mahdollisen karsinogeenisuuden/onkogeenisuuden arvioinnissa on pidetty 
kyseenalaisena (32).
 
PATOLOGIA  
Ruumiinavaustutkimukset  
36. Kaikille tutkimukseen sisältyville eläimille paitsi erityisvalvonnassa oleville 
eläimille (katso 20 kohta) on tehtävä täydellinen ja yksityiskohtainen ruu ­
miinavaus, jossa tutkitaan huolellisesti eläimen ruumis päältä päin, kaikki 
ruumiin aukot sekä kallo-, rinta- ja vatsaontelot ja niiden sisältö. Erityisval ­
vonnassa olevien eläinten ruumiinavauksen tarve määräytyy tapauskohtai ­
sesti tutkimuksen johtajan harkinnan perusteella. Yleensä elinten painot eivät kuulu karsinogeenisuutta käsittelevään tutkimukseen, koska geriatriset muu ­
tokset ja myöhemmissä vaiheissa kasvainten kehittyminen mitätöivät elinten 
painoa koskevien tietojen käyttökelpoisuuden. Nämä tiedot voivat kuitenkin olla erittäin tärkeitä näyttöön perustuvan arvioinnin toteuttamisessa ja eten ­
kin vaikutustapaa koskevissa pohdinnoissa. Jos ne ovat osa satelliittitutki ­
musta, ne on kerättävä viimeistään vuoden kuluttua tutkimuksen aloittami ­
sesta.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 476
 
37. Seuraavat kudokset säilytetään sekä kudostyypin että aiotun histopatologisen 
tutkimuksen kannalta sopivimmassa kiinnitysaineessa (33) (hakasulkeissa 
olevat kudokset ovat valinnaisia): 
Kaikki suuret leesiot Sydän Haima Maha (etumaha, rauhasmaha) 
Lisämunuainen Sykkyräsuoli Lisäkilpirauhanen [Hampaat] Aortta Tyhjäsuoli Ääreishermo Kivekset Aivot (mukaan luettuina 
osia iso- ja pikkuaivoista 
sekä aivosillasta) Munuaiset Aivolisäke Kateenkorva 
Umpisuoli Kyynelrauhanen (silmän 
ulkopuolelta) Eturauhanen Kilpirauhanen 
Kohdunkaula Maksa Peräsuoli [Kieli] 
Eturauhasen etuosa Keuhkot Sylkirauhanen Henkitorvi 
Paksusuoli Imusolmukkeet (pinnalli ­
set ja syvät) Rakkularauhanen Virtsarakko 
Pohjukaissuoli Rintarauhanen (pakolli ­
nen naarailla; mikäli sel ­
västi dissekoitavissa, myös uroksilla) Luurankolihas Kohtu (mukaan luettuna koh ­
dunkaula) 
Lisäkivekset [Ylähengitystiet, mukaan 
luettuina nenä, kuorikot 
ja sivuontelot] Iho [Virtsanjohdin] 
Silmä (mukaan luettuna 
verkkokalvo) Ruokatorvi Selkäydin (kolmesta 
kohdasta: kaularanka, 
rintarangan keskiosa ja lanneranka) [Virtsaputki] 
[Reisiluu ja nivel] [Hajurauhanen] Perna Vagina 
Sappirakko (muut lajit kuin 
rotta) Munasarjat [Rintalasta] Osa luuydintä ja/tai tuore 
luuydinaspiraatti 
Harderin rauhaset
 
Parillisten elinten (esimerkiksi munuaisten, lisämunuaisten jne.) osalta mo ­
lemmat elimet on säilytettävä. Kliinisten ja muiden löydösten perusteella on vielä ehkä tutkittava muita kudoksia. Myös elimet, joita pidetään testikemi ­
kaalin tunnettujen ominaisuuksien perusteella todennäköisinä kohde-eliminä, 
on säilytettävä. Tutkimuksissa, joissa altistus tapahtuu ihon kautta, on säi ­
lytettävä ne elimet, jotka on lueteltu suun kautta altistuksen yhteydessä. On oleellista, että näyte otetaan nimenomaan siitä kohdasta ihoa, johon testike ­
mikaalia on annosteltu, ja että kyseinen ihokohta säilytetään. Hengitysteiden 
kautta altistumista koskevien tutkimusten yhteydessä hengityselimistön säi ­
lytettävien ja tutkittavien kudosten luettelon osalta on noudatettava tämän liitteen luvussa B.8 (8) ja luvussa B.29 (9) annettuja suosituksia. Muiden elinten/kudosten osalta (ja hengityselimistöstä otettujen kudosten lisäksi) on 
tutkittava ne elimet, jotka on mainittu suun kautta altistuksen yhteydessä 
esitetyssä luettelossa.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 477
 
Histopatologia  
38. Toksikologis-patologisten tutkimusten toteuttamisen parhaista käytännöistä 
on saatavana ohjeistusta (33). Vähintään seuraavat kudokset on tutkittava:  
— kaikki kudokset suuren annoksen ryhmästä ja verrokkiryhmästä  
— kaikki kudokset tutkimuksen aikana kuolleilta tai lopetetuilta eläimiltä  
— kaikki kudokset, joissa on makroskooppisia poikkeavuuksia  
— Jos suuren annoksen ryhmässä havaitaan käsittelyyn liittyviä histopato ­
logisia muutoksia, samat kudokset on tutkittava kaikilta eläimiltä kai ­
kissa muissa annosryhmissä.  
— Parillisten elinten (esimerkiksi munuaisten, lisämunuaisten jne.) osalta 
molemmat elimet on tutkittava.  
TIEDOT JA RAPORTOINTI  
Tiedot  
39. Jokaisesta eläimestä on ilmoitettava tiedot kaikista arvioiduista parametreis ­
ta. Yhteenveto tuloksista on esitettävä myös taulukossa, josta ilmenee kus ­
sakin testiryhmässä tutkimuksen alussa käytettyjen eläinten lukumäärä, testin 
aikana kuolleena löydettyjen tai humaaneista syistä lopetettujen eläinten lukumäärä ja niiden kuolinaika, merkkejä myrkyllisyydestä osoittaneiden eläinten lukumäärä, havaittujen myrkyllisten vaikutusten kuvaus, mukaan 
lukien niiden alkamisajankohta, kesto ja vaikeusaste, vaurioita saaneiden 
eläinten lukumäärä, vauriotyypit ja eläinten prosentuaaliset osuudet vaurio ­
tyypeittäin. Yhteenvetotaulukoissa on ilmoitettava keskiarvot ja keskihajo ­
nnat (jatkuvan testin tietojen osalta) niistä eläimistä, joilla ilmeni toksisia 
vaikutuksia tai vaurioita. Myös vaurioiden vaikeusaste on ilmoitettava.
 
40. Aiemmista vertailutiedoista voi olla apua tutkimuksen tulosten tulkinnassa 
esimerkiksi silloin, kun näyttää siltä, että samanaikaisista verrokeista saadut 
tiedot ovat merkittävästi erilaisia verrattuna saman testilaitoksen/kolonian verrokkieläimiltä saatuihin uudempiin tietoihin. Jos aiempia tietoja arvioi ­
daan, niiden on oltava peräisin samasta laboratoriosta ja liityttävä eläimiin, 
jotka ovat samanikäisiä ja sellaisesta kannasta, joka on tuotettu kyseistä 
tutkimusta edeltäneen viiden vuoden aikana.
 
41. Numeeriset tulokset on mahdollisuuksien mukaan arvioitava asianmukaisella 
ja yleisesti hyväksytyllä tilastollisella menetelmällä. Tilastolliset menetelmät ja analysoitavat tiedot on valittava tutkimuksen suunnitteluvaiheessa (9 koh ­
ta). Valinnassa on otettava huomioon myös eloonjäämistä koskevat korja ­
ukset, mikäli tarpeen.
 
Testiraportti  
42. Testiraporttiin on sisällytettävä seuraavat tiedot:  
Testikemikaali:  
— fysikaalinen olomuoto, puhtaus ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet  
— tunnistetiedot  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 478
 
— kemikaalin lähde  
— eränumero  
— todistus kemiallisesta analyysista.  
Kantaja-aine (tarvittaessa):  
— kantaja-aineen valinnan perustelut, jos se on muu kuin vesi.  
Koe-eläimet:  
— käytetty laji/kanta ja perustelut niiden valinnalle  
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli testin alussa  
— lähde, elinolosuhteet, ravinto jne.  
— kunkin eläimen paino testin alkaessa.  
Testiolosuhteet:  
— antoreitin ja annoksen valinnan perustelut  
— tietojen analysointiin käytetyt tilastolliset menetelmät tarvittaessa  
— yksityiskohtaiset tiedot testikemikaalin koostumuksesta / ravintovalmis ­
teesta  
— analyysitiedot valmisteessa saavutetusta pitoisuudesta sekä sen stabilitee ­
tista ja homogeenisuudesta  
— antoreitti ja yksityiskohdat testikemikaalin annostelusta  
— inhalaatiotutkimuksissa tieto siitä, käytettiinkö vain nasaalista altistusta 
vai koko kehoon kohdistuvaa altistusta  
— todelliset annokset (mg painokiloa kohti päivässä) ja muuntokerroin, 
jolla ravintovalmisteen/juomaveden testikemikaalipitoisuus (mg/kg tai ppm) muunnetaan todelliseksi annokseksi, mikäli tarpeen
 
— yksityiskohdat ravinnon ja veden laadusta.  
Tulokset (tiedot on esitettävä yhteenvetotaulukossa ja jokaisesta eläimestä 
erikseen)  
Yleiset tiedot  
— eloonjäämistä koskevat tiedot  
— ruumiinpaino / ruumiinpainon muutokset  
— ravinnon kulutus, ruumiinpainon lisäystä koskeva laskelmat, jos ne on 
tehty, sekä veden kulutus tarvittaessa  
— toksikokineettiset tiedot (jos saatavilla)  
— silmätutkimuksen tiedot (jos saatavilla)  
— hematologiset tiedot (jos saatavilla)  
— kliinis-biokemialliset tiedot (jos saatavilla).  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 479
 
Kliiniset löydökset  
— myrkyllisyyden merkit  
— kaikkien poikkeavuuksien ilmaantuvuus (ja vaikeusaste, jos pisteytetty)  
— kliinisten havaintojen luonne, vaikeusaste ja kesto (korjaantuvuudesta 
riippumatta).  
Ruumiinavaustiedot  
— eläimen paino testin lopussa  
— elinten painot (ja niiden suhteet tarvittaessa)  
— ruumiinavauslöydökset, poikkeavuuksien ilmaantuvuus ja vaikeusaste.  
Histopatologia  
— muut kuin neoplastiset histopatologiset löydökset  
— neoplastiset histopatologiset löydökset  
— makroskooppisten ja mikroskooppisten löydösten välinen korrelaatio  
— yksityiskohtainen kuvaus kaikista käsittelyyn liittyvistä histopatologisista 
löydöksistä sekä niiden vaikeusaste  
— raportti objektilasien vertaisarvioinnista.  
Tulosten tilastollinen käsittely tarvittaessa  
Tulosten pohdinta, mukaan luettuina seuraavat seikat:  
— mallintamistapoja koskeva pohdinta  
— annos-vastesuhteet  
— aiemmat vertailutiedot  
— vaikutustapaa koskeviin tietoihin liittyvä pohdinta  
— BMD-, NOAEL- tai LOAEL-arvojen määritykset  
— merkitys ihmisten kannalta.  
Päätelmät  
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.  
3) Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208.
 
4) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145–191.  
5) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteriza ­
tion of environmental chemicals by the US National Toxicology Program ­
me: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 480
 
6) Tämän liitteen luku B.27 (Subkrooninen oraalinen myrkyllisyystesti – tois ­
tetuilla annoksilla tehtävä 90 vuorokauden oraalinen myrkyllisyystutkimus 
muilla kuin jyrsijöillä)  
7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at 
www.oecd.org/env/testguidelines.
 
8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, 
OECD, Paris.  
9) Tämän liitteen luku B.8 (Subkrooninen myrkyllisyys hengitettynä: 28 päi ­
vän tutkimus).  
10) Tämän liitteen luku B.29 Subkrooninen myrkyllisyys hengitettynä: 90 päi ­
vän tutkimus.  
11) Tämän liitteen luku B.9 (Toistetun annoksen (28 päivää) myrkyllisyys (ihon 
kautta nautittavat aineet)).  
12) Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 
36:793–801.  
13) Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, and Fenner-Crisp PA 
(2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581–589.
 
14) Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent 
Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51–56.  
15) Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE 
(2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591–653.
 
16) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemical 
Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1–7.
 
17) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and App ­
lication of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) 
Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35.
 
18) Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to Syste ­
mic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37–68.
 
19) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Revi ­
ews in Toxicology 36: 69–98.  
20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Paris.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 481
 
22) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West, W, Olin S(2007). Issues in the Design and Interpre ­
tation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: App ­
roaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837.
 
23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, 
Washington, DC.  
24) Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
maceuticals. The Toxicologist 14(1):214.  
25) Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for 
the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy 
POF&Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Confe ­
rence on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. S. 279–284.  
26) Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance 
of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Re ­
sults and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the 
Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196–1203.  
27) Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivi 2010/63/EU, annettu 
22 päivänä syyskuuta 2010, tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten suojelusta, EUVL L 276, 20.10.2010, s. 33.
 
28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86–23. Washington, D.C., US Dept. of Health 
and Human Services.  
29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal 
Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04- 2.
 
30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in 
various housing systems.  
31) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15–23.
 
32) Weingand K,  et al.  (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology 
Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198–201.  
33) Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P,  et al.  (2004). Best Practices Guid ­
eline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 482
 
Lisäys 1  
MÄÄRITELMÄ  
Testikemikaali:  Tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 483
 
B. 33  YHDISTETTY KROONINEN MYRKYLLISYYS-/KARSINOGEE ­
NISUUSTUTKIMUS  
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 453 (2009). Alkupe ­
räinen testiohje nro 453 hyväksyttiin vuonna 1981. Tämän tarkistetun testi ­
menetelmän B.33 kehittäminen katsottiin tarpeelliseksi, jotta siinä voidaan ottaa huomioon eläinten hyvinvointiin ja sääntelyvaatimuksiin liittyvä vii ­
meaikainen kehitys (1) (2) (3) (4) (5). Tämän testimenetelmän B.33 ajanta ­
saistus on toteutettu yhdessä tässä liitteessä olevan luvun B.32 (Karsinogee ­
nisuustesti) ja luvun B.30 (Krooninen myrkyllisyystesti) tarkistusten kanssa. Tavoitteena on saada lisää tietoa tutkimuksessa käytetyistä eläimistä ja yk ­
sityiskohtaisempaa tietoa annoksen valinnasta. Tämä testimenetelmä on tar ­
koitettu käytettäväksi monien erilaisten kemikaalien, torjunta-aineiden ja 
teollisuuskemikaalien testauksessa. Todettakoon kuitenkin, että jotkin yksi ­
tyiskohdat ja vaatimukset saattavat erota lääkkeitä koskevista vaatimuksista [katso kansainvälisen harmonisointikonferenssin (ICH:n) ohje S1B lääkkei ­
den karsinogeenisuuden testauksesta].
 
2. Koska valtaosa kroonisista myrkyllisyys- ja karsinogeenisuustutkimuksista 
tehdään jyrsijälajeilla, tämä testimenetelmä on tarkoitettu käytettäväksi en ­
sisijaisesti tutkimuksissa, jotka tehdään näillä lajeilla. Jos näitä tutkimuksia on tehtävä muilla lajeilla kuin jyrsijöillä, tässä testimenetelmässä kuvattujen periaatteiden ja menetelmien lisäksi voidaan soveltaa myös tässä liitteessä 
olevassa luvussa B.27 (Subkrooninen oraalinen myrkyllisyystesti – toiste ­
tuilla annoksilla tehtävä 90 vuorokauden oraalinen myrkyllisyystutkimus muilla kuin jyrsijöillä) (6) kuvattuja periaatteita ja menetelmiä asianmukaisin muutoksin, kuten OECD:n ohjeasiakirjassa GD 116 (Kroonisten 
myrkyllisyys- ja karsinogeenisuustutkimusten suunnittelu ja toteutus) (7) 
on määritelty.
 
3. Kroonisissa myrkyllisyys-/karsinogeenisuustutkimuksissa käytettävät kolme 
pääasiallista antoreittiä ovat suun kautta, ihon kautta ja hengitysteiden kaut ­
ta. Antoreitti valitaan testattavan kemikaalin fysikaalisten ja kemiallisten 
ominaisuuksien sekä ihmisten todennäköisen altistumisreitin mukaan. Lisä ­
tietoja altistusreitin valinnasta on OECD:n ohjeasiakirjassa GD 116 (7).  
4. Tässä testimenetelmässä keskitytään suun kautta altistukseen, koska se on 
yleisimmin käytetty altistusreitti kroonisissa myrkyllisyys- ja karsinogee ­
nisuustutkimuksissa. Vaikka pitkäaikaiset tutkimukset, joihin sisältyy ihon tai hengitysteiden kautta altistus, voivat olla tarpeen ihmisten terveysriskien 
arvioinnissa ja/tai vaikka niitä voidaan tarvita tiettyjen sääntelyohjelmien 
nojalla, molemmat altistusreitit ovat teknisesti erittäin monimutkaisia. Täl ­
laiset tutkimukset on suunniteltava tapauskohtaisesti, joskin tässä kuvattu testimenetelmä, joka on tarkoitettu suun kautta altistuksesta aiheutuvan kroo ­
nisen myrkyllisyyden tai karsinogeenisuuden määrittämiseen ja arviointiin, 
voi olla pohjana hengitysteiden ja/tai ihon kautta tapahtuvaa altistusta kos ­
keville tutkimuksille käsittelyaikoja sekä kliinisiä ja patologisia parametreja jne. koskevien suositusten osalta. Saatavilla on OECD:n ohje testikemikaa ­
lien annostelusta hengitysteiden (7) (8) ja ihon (7) kautta. Kun suunnitellaan 
pitempiaikaisia tutkimuksia, joihin liittyy altistus hengitysteiden kautta, on suositeltavaa käyttää apuna tämän liitteen lukua B.8 (8) ja lukua B.29 (9) sekä OECD:n ohjeasiakirjaa, joka koskee akuuttia testausta hengitysteiden 
kautta (7). Kun altistustestaus toteutetaan ihon kautta, on suositeltavaa käyt ­
tää apuna tämän liitteen lukua B.9 (11).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 484
 
5. Yhdistetystä myrkyllisyys-/karsinogeenisuustutkimuksesta saadaan tietoja 
mahdollisista terveyshaitoista, joita toistuvasta altistuksesta todennäköisesti 
seuraa ja jotka kestävät jopa käytettyjen lajien koko eliniän ajan. Tutkimuk ­
sesta saadaan tietoa testikemikaalin myrkyllisistä vaikutuksista ja mahdolli ­
sesta karsinogeenisuudesta, ja sen avulla voidaan tunnistaa kohde-elimet ja 
kemikaalin mahdollinen kertyminen. Lisäksi tutkimuksesta voidaan saada 
arvio tasosta, joka ei aiheuta havaittavaa haittavaikutusta (NOAEL). Ei-genotoksisten karsinogeenien osalta voidaan määrittää kasvainvasteet, joita voidaan käyttää laadittaessa turvallisuuskriteereitä ihmisten altistumisel ­
le. Korostettakoon, että eläinten huolellinen kliininen tarkkailu on hyvin 
tärkeää, jotta tutkimuksesta saadaan mahdollisimman paljon tietoa.
 
6. Tämän testimenetelmän kattamien kroonisten myrkyllisyys-/ 
karsinogeenisuustutkimusten tavoitteet ovat seuraavat:  
— Testikemikaalin sellaisten karsinogeenisten ominaisuuksien tunnistami ­
nen, jotka lisäävät kasvainten ilmaantuvuutta tai pahanlaatuisten kasvain ­
ten määrää tai vähentävät kasvainten syntymiseen kuluvaa aikaa verrat ­
tuna samanaikaisiin verrokkiryhmiin.  
— Kasvainten ilmaantumiseen kuluvan ajan määrittäminen  
— Testikemikaalin kroonisen myrkyllisyyden määrittäminen  
— Kroonisen myrkyllisyyden ja karsinogeenisuuden kohde-elimen (-elin ­
ten) tunnistaminen  
— Annos-vastesuhteen luonnehdinta  
— NOAEL-arvon (tason, joka ei aiheuta havaittavaa haittavaikutusta) mää ­
rittäminen tai viiteannoksen (BMD:n) määrittämisen lähtökohta  
— Karsinogeenisten vaikutusten ekstrapolointi ihmisten altistumistasoihin 
pienillä annoksilla  
— Kroonisten myrkyllisyysvaikutusten ennustaminen ihmisten altistumista ­
soilla  
— Tiedon tuottaminen vaikutustapaa koskevia testihypoteeseja varten (2) 
(7) (12) (13) (14) (15).  
ALUSTAVAT HUOMIOT  
7. Kun määritetään ja arvioidaan testikemikaalin mahdollista karsinogee ­
nisuutta ja kroonista myrkyllisyyttä, testauslaboratorion on otettava huomi ­
oon kaikki testikemikaalista saatavilla olevat tiedot ennen tutkimuksen tote ­
uttamista, jotta tutkimus voidaan suunnitella siten, että kemikaalin toksiko ­
logisia ominaisuuksia voidaan testata tehokkaasti ja jotta eläinten käyttö voidaan pitää mahdollisimman vähäisenä. Epäillyn karsinogeenin vaikutus ­
tapaa koskevat tiedot ja niiden ottaminen huomioon (2) (7) (12) (13) (14) 
(15) on erittäin tärkeää, koska paras tutkimusmenetelmä voi vaihdella sen mukaan, tiedetäänkö vai epäilläänkö testikemikaalin olevan genotoksinen karsinogeeni. Lisätietoa vaikutustapaa koskevista huomioista on ohjeasiakir ­
jassa GD 116 (7).
 
8. Tietoihin, joista on apua tutkimuksen suunnittelussa, sisältyvät testattavan 
kemikaalin identiteetti, kemiallinen rakenne ja fysikaalis-kemialliset ominai ­
suudet, tiedot vaikutustavasta,  in vitro-  tai in vivo  -myrkyllisyystestien ja 
genotoksisuustestien tulokset, odotettavissa oleva käyttö (odotettavissa ole ­
vat käytöt) ja ihmisten altistumisen mahdollisuus, saatavilla olevat (Q)SAR- 
tiedot, mutageenisuus/genotoksisuustiedot, karsinogeenisuustiedot ja toksi ­
kologiset tiedot rakenteellisesti samankaltaisista aineista, saatavilla olevat toksikokineettiset tiedot (kerta-annoksen ja myös toistuvan annoksen 
kinetiikka, jos saatavilla) sekä muista toistuvaa altistusta käsitelleistä 
tutkimuksista saadut tiedot. Krooninen myrkyllisyys/karsinogeenisuus on
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 485
 
määritettävä vasta sitten, kun myrkyllisyydestä on saatu alustavia tietoja 
toistetuilla annoksilla suoritetuista 28 päivän ja/tai 90 päivän myrkyllisyys ­
testeistä. Lyhytaikaiset testit, joissa tutkitaan syövän puhkeamista ja etene ­
mistä, voivat antaa myös hyödyllistä tietoa. Karsinogeenisuustestauksen osalta on harkittava vaiheittaista testaustapaa osana tietyn testikemikaalin 
mahdollisten terveyteen kohdistuvien haitallisten vaikutusten kokonaisarvi ­
ointia (16) (17) (18) (19).
 
9. Ennen tutkimuksen aloittamista on määritettävä tulosten analysointiin sopi ­
vimmat tilastomenetelmät koejärjestelyt ja tavoitteet huomioon ottaen. On pohdittava sitä, onko tilastoihin sisällytettävä eloonjäämistä koskeva korjaus, 
kumulatiivisten kasvainriskien analyysi suhteessa eloonjäämisen pituuteen, 
kasvaimen ilmaantumiseen kuluvaa aikaa koskeva analyysi sekä analyysi, joka on tehtävä, jos testi keskeytyy yhdessä tai useammassa ryhmässä en ­
nenaikaisesti. Asianmukaisia tilastollisia analyyseja koskevia ohjeita sekä 
keskeiset viitetiedot kansainvälisesti hyväksytyistä tilastomenetelmistä on 
ohjeasiakirjassa GD 116 (7) sekä ohjeasiakirjassa GD 35, joka koskee kroo ­
nisten myrkyllisyys- ja karsinogeenisuustutkimusten analyysia ja arviointia (20).
 
10. Karsinogeenisuustutkimuksia tehtäessä on noudatettava aina periaatteita ja 
näkökohtia, jotka on määritelty OECD:n ohjeasiakirjassa (Turvallisuuden 
arvioinneissa käytetyillä koe-eläimillä ilmenevien kliinisten merkkien tunnis ­
taminen, arvioiminen ja käyttäminen humaaneina lopettamiskriteereinä) (21) ja eritoten sen 62 kohdassa. Kyseisessä kohdassa todetaan näin: ”Kun tut ­
kimuksissa, joihin sisältyy toistuvaa annostelua, eläin osoittaa sellaisia klii ­
nisiä merkkejä, jotka ovat progressiivisia ja jotka johtavat eläimen tilan huonontumiseen, on tehtävä tietoon perustuva päätös siitä, tuleeko eläin lopettaa humaaneista syistä. Päätöstä tehtäessä on otettava huomioon, mitä 
tutkimuksellista arvoa eläimen hengissä pitämisen jatkamisesta saatavalla 
tiedolla on suhteessa sen yleistilaan. Jos eläin päätetään pitää testissä edel ­
leen, havaintoja on tehtävä tiheämmin, mikäli tarpeen. On myös mahdollista keskeyttää annostus tai pienentää testiannosta väliaikaisesti, mikäli se lievit ­
tää tuskia tai kärsimyksiä, ilman että se haittaa testin tarkoitusta.”
 
11. Tarkempia ohjeita ja kroonisten myrkyllisyys- ja karsinogeenisuustutkimus ­
ten annoksen valintaa ohjaavia periaatteita on ohjeasiakirjassa GD 116 (7) sekä kahdessa International Life Sciences Instituten julkaisussa (22) (23). Keskeinen annoksen valintastrategia määräytyy tutkimuksen ensisijaisen ta ­
voitteen tai ensisijaisten tavoitteiden mukaisesti (6 kohta). Asianmukaisia 
annostasoja valittaessa on pyrittävä saavuttamaan tasapaino yhtäältä vaarojen seulonnan ja toisaalta pieniin annoksiin liittyvien vasteiden ja niiden merki ­
tyksen välillä. Tämä on erityisen tärkeää yhdistetyssä kroonisessa 
myrkyllisyys- ja karsinogeenisuustutkimuksessa.
 
12. Tällaisen yhdistetyn kroonisen myrkyllisyys- ja karsinogeenisuustutkimuk ­
sen toteuttamista on harkittava erillisen kroonisen myrkyllisyystutkimuksen (tämän liitteen luku B.30) ja karsinogeenisuustutkimuksen (tämän liitteen luku B.32) sijasta. Kahteen erilliseen tutkimukseen verrattuna yhdistetty 
tutkimus on ajan ja kustannusten kannalta tehokkaampi, mutta tietojen laatu 
ei vaarannu kroonisessa vaiheessa tai karsinogeenisuutta käsittelevässä vai ­
heessa. Kun tehdään yhdistetty krooninen myrkyllisyys- ja karsinogee ­
nisuustutkimus, on kiinnitettävä erityistä huomiota annoksen valinnan peri ­
aatteisiin (11 ja 22–26 kohta). Todettakoon, että tiettyjen sääntelypuitteiden 
nojalla voidaan edellyttää erillisiä tutkimuksia. Lisäohjeita yhdistetyn kroo ­
nisen myrkyllisyys- ja karsinogeenisuustutkimuksen suunnittelusta tutkimuk ­
sen tehokkuuden maksimoimiseksi siltä kannalta, että eläinten määrää voi ­
daan mahdollisesti vähentää ja että erilaisia koemenetelmiä voidaan yhte ­
näistää, on ohjeasiakirjassa GD 116 (7).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 486
 
13. Tämän testimenetelmän yhteydessä käytetyt määritelmät on esitetty tämän 
kohdan lopussa ja ohjeasiakirjassa GD 116 (7).  
TESTIN PERIAATE  
14. Tutkimusmenetelmä koostuu kahdesta rinnakkaisesta vaiheesta, jotka ovat 
krooninen vaihe ja karsinogeenisuusvaihe (vaiheiden kesto: katso 34 ja 35 kohta). Testikemikaali annetaan yleensä suun kautta, mutta myös hengitys ­
teiden tai ihon kautta testaus voi olla asianmukaista. Kroonisessa vaiheessa 
testikemikaalia annetaan päivittäin erisuuruisina annoksina useille 
koe-eläinryhmille yleensä 12 kuukauden ajan, joskin on mahdollista valita tätä pidempi tai lyhyempi aika sääntelyvaatimusten mukaisesti (katso 34 kohta). Tämän pituisen ajan katsotaan olevan riittävän pitkä, jotta mahdol ­
liset kumulatiivisen myrkyllisyyden vaikutukset tulevat esiin ilman geriatris ­
ten muutosten häiritseviä vaikutuksia. Tutkimussuunnitelmaan voi myös si ­
sältyä yksi tai useampi eläinten lopettamiskerta kesken kokeen esimerkiksi kolmen ja kuuden kuukauden kohdalla, ja tutkimukseen voidaan ottaa lisää 
eläinryhmiä tämän kompensoimiseksi (katso 20 kohta). Karsinogeenisuus ­
vaiheessa testikemikaalia annetaan päivittäin useille koe-eläinryhmille suu ­
rimman osan niiden elinajasta. Kummankin ryhmän eläimiä havainnoidaan 
tarkasti myrkyllisyyden merkkien ja neoplastisten leesioiden kehittymisen 
havaitsemiseksi. Kokeen aikana kuolleille tai lopetetuille eläimille tehdään ruumiinavaus. Kokeen lopussa vielä elossa olevat eläimet lopetetaan ja niille tehdään ruumiinavaus.
 
MENETELMÄN KUVAUS  
Eläinlajin valinta  
15. Tämä testimenetelmä koskee ensisijaisesti jyrsijöillä ilmenevän kroonisen 
myrkyllisyyden ja karsinogeenisuuden määrittämistä ja arviointia (2 kohta). 
Muiden lajien kuin jyrsijöiden käyttöä voidaan harkita, kun saatavilla olevat 
tiedot viittaavat siihen, että muut lajit ovat oleellisempia ihmisten terveyteen kohdistuvien vaikutusten ennustamisessa. Lajin valinta on perusteltava. Suo ­
siteltavin jyrsijälaji on rotta, mutta muitakin jyrsijöitä, esimerkiksi hiiriä, 
voidaan käyttää. Vaikka hiiren käyttämisestä karsinogeenisuustestauksessa 
koituva hyöty voi olla rajallinen (24) (25) (26), jotkin sääntelyohjelmat edellyttävät karsinogeenisuustestien tekemistä hiirellä, ellei päätetä, että täl ­
lainen tutkimus on tieteellisesti tarpeeton. Rottia ja hiiriä on käytetty ensi ­
sijaisina koe-eläiminä seuraavista syistä: niiden elinaika on suhteellisen ly ­
hyt, niitä käytetään laajalti farmakologisissa ja toksikologisissa tutkimuksis ­
sa, niille muodostuu herkästi kasvaimia, ja saatavilla on kantoja, joita on luonnehdittu riittävästi. Tämän vuoksi niiden fysiologiasta ja patologiasta on 
saatavana paljon tietoa. Tarvittaessa muilla lajeilla kuin jyrsijöillä tehtävät 
krooniset myrkyllisyys-/karsinogeenisuustutkimukset on suunniteltava ja to ­
teutettava tässä testimenetelmässä kuvattujen sekä tämän liitteen luvussa B.27 (Oraalinen myrkyllisyystesti – toistetuilla annoksilla tehtävä 90 vuoro ­
kauden oraalinen myrkyllisyystutkimus muilla kuin jyrsijöillä) (6) kuvattujen 
periaatteiden mukaisesti. Lisätietoja lajin ja kannan valinnasta on ohjeasia ­
kirjassa GD 116 (7).
 
16. Testissä tulee käyttää yleisesti käytettyjä nuoria ja terveitä täysikasvuisia 
koe-eläinkantoja. Yhdistetty myrkyllisyys-/karsinogeenisuustutkimus on teh ­
tävä mieluiten eläimillä, jotka ovat samaa kantaa ja samasta lähteestä kuin eläimet, joita käytettiin lyhyemmissä alustavissa myrkyllisyystutkimuksissa. 
Jos kyseisestä kannasta ja lähteestä peräisin olevien eläinten kuitenkin tie ­
detään aiheuttavan ongelmia pitkäaikaisissa tutkimuksissa yleensä käytettä ­
vien hyväksyttyjen eloonjäämiskriteerien täyttämisessä [katso ohjeasiakirja GD 116 (7)], on harkittava sellaisen eläinkannan käyttämistä, jonka eloon ­
jäämisaste pitkäaikaisessa tutkimuksessa on hyväksyttävä. Naaraat eivät saa 
olla synnyttäneitä eivätkä tiineinä.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 487
 
Koe-eläintilat ja ruokinta  
17. Eläimet voidaan pitää häkeissä yksittäin tai muutaman samaa sukupuolta 
olevan eläimen ryhmissä. Yksittäin pitämistä on harkittava vain, jos se on tieteellisesti perusteltua (27) (28) (29). Häkit on sijoitettava siten, että häkin 
sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. 
Koe-eläinhuoneen lämpötilan tulee olla 22 °C (± 3 °C). Vaikka riittää, että suhteellinen kosteus on vähintään 30 prosenttia eikä mielellään ylitä 70:tä prosenttia muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, tulee kuitenkin 
pyrkiä 50–60 prosentin suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa tulee käyttää 
keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa / 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä 
juomaveden määrää saa rajoittaa. Ruokavalion on vastattava kaikkia testat ­
tujen lajien ravintovaatimuksia. Ruokavalion sisältämien kontaminanttien määrän on oltava mahdollisimman pieni. Kontaminantteja, jotka saattavat vaikuttaa testin tuloksiin, ovat esimerkiksi torjunta-ainejäämät, pysyvät or ­
gaaniset yhdisteet, fytoestrogeenit, raskasmetallit ja mykotoksiinit. 
Ravintoaine- ja kontaminanttipitoisuudesta on tuotettava analyyttista tietoa säännöllisesti, vähintään tutkimuksen alussa ja silloin, kun käytettävä erä muuttuu, ja nämä tiedot on sisällytettävä loppuraporttiin. Yhtä lailla on 
annettava analyyttista tietoa tutkimuksessa käytetystä juomavedestä. Ruo ­
kavalion valintaan voi vaikuttaa tarve varmistaa testikemikaalin ja eläinten ravintovaatimusten välinen tasapaino silloin, kun testikemikaalia annetaan ravintoon sekoitettuna.
 
Eläinten valmistelu  
18. Testissä on käytettävä terveitä eläimiä, joita on totutettu 
laboratorio-olosuhteisiin vähintään seitsemän vuorokauden ajan ja joita ei 
ole käytetty kokeisiin aiemmin. Jyrsijöiden osalta testikemikaalin antaminen 
eläimille tulee aloittaa mahdollisimman pian vieroituksen ja totutuksen jäl ­
keen, mielellään ennen kuin eläimet ovat kahdeksanviikkoisia. Koe-eläinten 
laji, kanta, alkuperä, sukupuoli, paino ja ikä on tunnettava. Testin alkaessa 
eläinten painon vaihtelun tulee olla mahdollisimman vähäistä, ja se saa vaihdella kummankin käytetyn sukupuolen osalta korkeintaan ± 20 prosent ­
tia kaikkien tutkimuksessa käytettyjen eläinten keskimääräisestä painosta, 
joka on määritettävä kummallekin sukupuolelle erikseen. Eläimet tulee jakaa 
verrokki- ja testiryhmään satunnaistetusti. Satunnaistamisen jälkeen kum ­
mankaan sukupuolen ryhmissä ei saa olla suuria eroja keskimääräisessä painossa. Jos tilastollisesti merkitseviä eroja on, satunnaistamisvaihe on tois ­
tettava, mikäli mahdollista. Kullekin eläimelle tulee antaa oma tunnistenu ­
mero, joka on merkittävä eläimeen pysyvästi tatuoimalla, mikrosiruimplan ­
tilla tai muulla sopivalla tavalla.
 
MENETTELY  
Eläinten lukumäärä ja sukupuoli  
19. Testissä on käytettävä molempia sukupuolia. Testissä on käytettävä riittävää 
määrää eläimiä, jotta jokaisessa ryhmässä on tarpeeksi eläimiä tutkimuksen lopussa perusteellista biologista ja tilastollista arviointia varten. Jyrsijöiden osalta jokaisessa annosryhmässä (22 kohdassa määritetyn mukaisesti) ja 
samanaikaisessa verrokkiryhmässä, jotka on tarkoitettu tutkimuksen karsino ­
geenisuusvaiheeseen, on oltava vähintään 50 eläintä kumpaakin sukupuolta. Sen mukaan, mikä on tutkimuksen tavoite, keskeisten estimaattien tilastol ­
lista voimaa on mahdollista lisätä jakamalla eläimet eri annosryhmiin eri 
tavoin epätasaisesti siten, että pienen annoksen ryhmissä on yli 50 eläintä, 
jolloin voidaan esimerkiksi arvioida kemikaalin mahdollista karsinogee ­
nisuutta pienillä annoksilla. On kuitenkin muistettava, että jos ryhmäkokoa kasvatetaan vain jonkin verran, tutkimuksen tilastollinen voima lisääntyy 
suhteellisen vähän. Jyrsijöiden osalta jokaisessa annosryhmässä (22 koh ­
dassa määritetyn mukaisesti) ja samanaikaisessa verrokkiryhmässä, jotka
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 488
 
on tarkoitettu tutkimuksen kroonisen myrkyllisyyden vaiheeseen, on oltava 
vähintään 10 eläintä kumpaakin sukupuolta. On huomattava, että tämä 
määrä on pienempi kuin kroonisessa myrkyllisyystutkimuksessa (tämän liit ­
teen luku B.30). Vaikka tämän yhdistetyn tutkimuksen kroonisen myrkylli ­
syyden vaiheessa on vähemmän eläimiä jokaisessa ryhmässä, niistä saatujen 
tietojen tulkintaa tukevat kuitenkin tutkimuksen karsinogeenisuusvaiheesta 
saadut tiedot, jotka on saatu käyttämällä enemmän eläimiä. Tutkimuksissa, joissa käytetään hiiriä, saatetaan tarvita lisää eläimiä kroonisen myrkyllisyy ­
den vaiheessa kussakin annosryhmässä, jotta kaikki vaadittavat hematologi ­
set määritykset saadaan tehtyä. Lisätietoa tutkimuksen tilastollisesta suunnit ­
telusta ja annostasojen valinnasta tilastollisen voiman maksimoimiseksi on ohjeasiakirjassa GD 116 (7).
 
Eläinten lopettamista kesken tutkimuksen, satelliittiryhmiä ja erityisval ­
vonnassa olevia eläimiä koskeva säännös  
20. Tutkimuksessa voidaan hyödyntää mahdollisuutta lopettaa eläimiä kesken 
tutkimuksen esimerkiksi kuuden kuukauden kohdalla, jotta saadaan tietoa 
neoplastisten muutosten etenemisestä ja mekanistista tietoa, mikäli se on 
tieteellisesti perusteltua. Jos tällaisia tietoja on jo saatavana aiemmista samaa testikemikaalia koskevista toistetun annoksen myrkyllisyystutkimuksista, eläinten lopettaminen kesken tutkimuksen ei ole välttämättä tieteellisesti 
perusteltua. Tutkimuksen kroonisen myrkyllisyyden vaiheessa, joka kestää 
yleensä 12 kuukautta, käytetyistä eläimistä saadaan tutkimuksen karsinogee ­
nisuusvaiheeseen tietoa kesken tutkimuksen lopetetuista eläimistä, jolloin käytettyjen eläinten kokonaismäärä siis pienenee. Tutkimuksen kroonisen 
myrkyllisyyden vaiheeseen voidaan sisällyttää myös satelliittiryhmiä, jotta 
tutkittavana olevan testikemikaalin aiheuttamien toksikologisten muutosten korjaantuvuutta voidaan seurata. Nämä ryhmät voidaan rajata tutkimuksen suurimpaan annoksen ryhmään ja verrokkiryhmään. Lisäksi tutkimukseen 
voidaan sisällyttää ryhmä erityisvalvonnassa olevia eläimiä (yleensä viisi 
eläintä kumpaakin sukupuolta) sairauden tilan seuraamiseksi tutkimuksen aikana, mikäli tarpeen (30). Lisätietoja siitä, miten tutkimussuunnitelmaan sisällytetään tutkimuksen aikana tapahtuvia lopettamisia, satelliittiryhmiä ja 
erityisvalvonnassa olevia eläimiä samalla, kun käytettävien eläinten koko ­
naismäärää pienennetään, on ohjeasiakirjassa GD 116 (7).
 
21. Jos tutkimussuunnitelmaan sisältyy kesken tutkimuksen tapahtuvia lopetta ­
misia, kesken tutkimuksen lopetettavien eläinten määrä jokaisessa annosryh ­
mässä on yleensä 10 eläintä kumpaakin sukupuolta. Tutkimussuunnitelman 
mukaista eläinten kokonaismäärää on lisättävä ennen tutkimuksen päätty ­
mistä lopetettavaksi aiottujen eläinten määrällä. Näitä eläimiä on yleensä tarkkailtava samalla tavalla kuin päätutkimuksen kroonisen myrkyllisyyden vaiheessa käytettäviä eläimiä: niiden ruumiinpainoa ja 
ravinnon-/vedenkulutusta on seurattava, ja hematologiset ja kliinisen bioke ­
mian mittaukset sekä patologiset tutkimukset on tehtävä, joskin mittaukset voidaan rajata (kesken tutkimuksen lopetettavien eläinten ryhmissä) tiettyi ­
hin keskeisiin seikkoihin, kuten neurotoksisuuteen tai immunotoksisuuteen.
 
Annosryhmät ja annostus  
22. Ohjeita kaikista annoksen valintaan ja annosten porrastamiseen liittyvistä 
näkökohdista on ohjeasiakirjassa GD 116 (7). Vähintään kolmea annostasoa 
ja samanaikaista verrokkiryhmää on käytettävä sekä kroonista myrkyllisyyttä 
että karsinogeenisuutta tarkastelevissa vaiheissa. Annostasot perustuvat yleensä lyhyempien, toistetuilla annoksilla tehdyn testien tai annosalueen määritystestien tuloksiin, ja kaikki mahdolliset testikemikaalista tai saman ­
laisista kemikaaleista saatavilla olevat toksikologiset ja toksikokineettiset 
tiedot on otettava huomioon.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 489
 
23. Tutkimuksen kroonisen myrkyllisyyden vaiheessa täydellinen kolmea annos ­
tasoa soveltava tutkimus ei välttämättä ole tarpeen, jos voidaan ennustaa, 
että yksi annostaso, joka vastaa vähintään 1 000 mg:n annosta painokiloa kohti päivässä, ei todennäköisesti aiheuta haitallisia vaikutuksia. Tämän tu ­
lee perustua alustavista tutkimuksista saatuihin tietoihin ja siihen huomioon, 
ettei myrkyllisyyttä ole odotettavissa rakenteellisesti samanlaisia kemikaaleja 
koskevien tietojen perusteella. Tätä rajaa (1 000 mg painokiloa kohti päi ­
vässä) sovelletaan, paitsi jos ihmisten altistumisesta voidaan päätellä, että on käytettävä korkeampaa annostasoa.
 
24. Mikäli testikemikaalin fysikaalis-kemialliset ominaisuudet tai biologiset vai ­
kutukset eivät rajoita korkeimman annostason valintaa, annostaso on yleensä valittava siten, että sen avulla voidaan tunnistaa ensisijaiset kohde-elimet ja myrkylliset vaikutukset ilman, että annos aiheuttaa kärsimystä, vakavaa myr ­
kyllisyyttä, sairastuvuutta tai kuolemaa. Suurin annos on valittava yleensä 
siten, että se aiheuttaa merkkejä myrkyllisyydestä, mikä näkyy esimerkiksi painon nousun hidastumisena (noin 10 prosentilla). Tutkimuksen tavoittei ­
den mukaan (katso 6 kohta) suurimmaksi annokseksi voidaan valita myös 
pienempi annos kuin se, joka aiheuttaa merkkejä myrkyllisyydestä , jos jokin 
annos aiheuttaa esimerkiksi huolestuttavan haittavaikutuksen, joka vaikuttaa kuitenkin vain vähän elinaikaan tai ruumiinpainoon.
 
25. Annostasot ja niiden porrastus voidaan valita annosvasteen ja – testikemi ­
kaalin vaikutustavan mukaan – NOAEL-arvon määrittämisen tai tutkimuk ­
sen muun tavoitteen (esimerkiksi BMD-arvo (katso 25 kohta) pienimmän annoksen tasolla) saavuttamisen perusteella. Pienempien annosten määrittä ­
misessä huomioon otettavia tekijöitä ovat annos-vastekäyrän odotuksenmu ­
kainen kulmakerroin, annokset, joiden yhteydessä saattaa ilmetä tärkeitä muutoksia metaboliassa tai myrkyllisen vaikutuksen tavassa, odotuksenmu ­
kainen raja-arvo tai arvo, jota pidetään lähtökohtana pienen annoksen ekst ­
rapolaatiolle. Kun toteutetaan yhdistetty karsinogeenisuutta / kroonista myr ­
kyllisyyttä käsittelevä tutkimus, ensisijainen tavoite on hankkia tietoa karsi ­
nogeenisuudesta riskinarviointitarkoituksiin. Kroonista myrkyllisyyttä koske ­
vien tietojen hankinta on useimmiten toissijainen tavoite. Tämä on syytä 
muistaa, kun valitaan tutkimuksen annostasoja ja niiden porrastusta.
 
26. Valittu annostason porrastus määräytyy tutkimuksen tavoitteiden ja testike ­
mikaalin ominaisuuksien perusteella, eikä sitä voida määrätä tässä testime ­
netelmässä. Kaksinkertaiset-nelinkertaiset erot annostasojen välillä ovat 
usein parhaimmat alenevissa annossarjoissa, ja usein on parempi lisätä neljäs 
testiryhmä kuin käyttää hyvin suuria annosvälejä (esimerkiksi 6–10-kertaisia annosvälejä). Yleisesti ottaen on pyrittävä välttämään käyttämästä kertoimia, 
jotka ovat suurempia kuin 10, ja niiden mahdollinen käyttö on perusteltava.
 
27. Kuten ohjeasiakirjassa GD 116 (7) on täsmennetty, annoksen valinnassa on 
otettava huomioon seuraavat seikat:  
— Tunnetut tai oletetut epälineaarisuudet tai käännepisteet annosvasteessa  
— Toksikokinetiikka ja pitoisuusalueet, joilla ilmenee tai ei ilmene meta ­
bolian induktiota, saturaatiota tai epälineaarisuutta ulkoisten ja sisäisten annosten välillä
 
— Leesioiden esiasteet, vaikutusten merkkiaineet tai keskeisten biologisten 
prosessien toimintaa osoittavat indikaattorit  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 490
 
— Vaikutustapaan liittyvät keskeiset (tai oletetut) näkökohdat, kuten annok ­
set, joilla alkaa ilmetä sytotoksisuutta, hormonipitoisuuksien ja homeos ­
taattisten mekanismien häiriintymistä jne.  
— Annos-vastekäyrän alueet, joilla tarvitaan erittäin yksityiskohtainen esti ­
mointi, esimerkiksi ennakoidun viitearvon tai oletetun raja-arvon koh ­
dalla  
— Ennakoidut ihmisten altistumistasot etenkin keskisuuria ja pieniä annok ­
sia valittaessa  
28. Verrokkiryhmän tulee olla joko ryhmä, joka ei saa käsittelyä, tai 
kantaja-ainetta saava ryhmä, mikäli testikemikaalin antamisen yhteydessä käytetään kantaja-ainetta. Testikemikaalin annostelua lukuun ottamatta ver ­
rokkiryhmän eläimiä on käsiteltävä täsmälleen samoin kuin testiryhmien 
eläimiä. Jos käytetään kantaja-ainetta, verrokkiryhmälle tulee antaa tilavuu ­
deltaan suurin annosryhmissä käytetty kantaja-aineannos. Jos testikemikaali annetaan ravintoon sekoitettuna ja jos se vähentää ravinnonottoa sen vuoksi, ettei ravinto maita eläimelle entiseen tapaan, normaaliravintoa saava verrok ­
kiryhmä voi olla sopivampi.
 
Annosten valmistelu ja testikemikaalin antaminen  
29. Testikemikaali annetaan yleensä suun kautta ruoan tai juomaveden seassa tai 
ruokintaletkulla. Lisätietoja antoreiteistä ja -tavoista on ohjeasiakirjassa GD 
116 (7). Antoreitti ja antotapa määräytyvät tutkimuksen tarkoituksen, testi ­
kemikaalin fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien ja sen biologisen hyötyo ­
suuden sekä ihmisten yleisimmän altistumisreitin ja -tavan perusteella. Va ­
litulle antoreitille ja -tavalle on esitettävä perustelut. Eläinten hyvinvoinnin 
vuoksi suun kautta käytettävä ruokintaletku on valittava yleensä vain sellai ­
sille aineille, joiden osalta tämä antoreitti ja -tapa ovat todennäköisesti mah ­
dollisia ihmisten altistumisen yhteydessä (esimerkiksi lääkkeet). 
Torjunta-aineita sisältävät ravinto- tai ympäristökemikaalit annetaan yleensä 
ravintoon tai juomaveteen sekoitettuna. Joidenkin skenaarioiden, kuten työ ­
peräisen altistuksen, yhteydessä kemikaalin antaminen muita antoreittejä pitkin voi kuitenkin olla tarkoituksenmukaisempaa.
 
30. Tarvittaessa testikemikaali liuotetaan tai suspendoidaan sopivaan 
kantaja-aineeseen. Seuraavat mahdolliset kantaja-aineen ja muiden lisäainei ­
den ominaisuudet on otettava huomioon: vaikutukset imeytymiseen, elimis ­
töön jakautumiseen, metaboliaan tai testikemikaalin pidättymiseen (retenti ­
oon) elimistössä; sellaiset vaikutukset testikemikaalin kemiallisiin ominai ­
suuksiin, jotka voivat muuttaa sen myrkyllisiä ominaisuuksia; vaikutukset 
ravinnon ja veden kulutukseen tai eläinten ravitsemustilanteeseen. On suo ­
siteltavaa, että ensin harkitaan vesiliuosta tai suspensiota aina, kun se on mahdollista, ja sen jälkeen öljyyn (esimerkiksi maissiöljyyn) tehtävää liuos ­
ta/suspensiota ja sitten mahdollisesti muita kantaja-aineita. Jos kantaja-aine 
on muu kuin vesi, sen myrkylliset ominaisuudet on tunnettava. Testikemi ­
kaalin stabiiliudesta ja annosteluliuosten homogeenisuudesta tai ruokavali ­
oista (tarvittaessa) annosteluolosuhteissa (esimerkiksi ravinto) on oltava saa ­
tavilla tietoa.
 
31. Jos kemikaaleja annetaan ravintoon tai juomaveteen sekoitettuna, on tärkeää 
varmistaa, että testikemikaalimäärät eivät häiritse normaalia ravinto- tai nes ­
tetasapainoa. Pitkäaikaisissa myrkyllisyystutkimuksissa, joissa testikemikaa ­
lia annetaan ravinnon seassa, testikemikaalin pitoisuus eläinten ruoassa saa 
yleensä olla enintään viisi prosenttia kokonaisruokavaliosta, jotta vältetään 
ravitsemuksellinen epätasapaino. Kun testikemikaali annetaan ravinnon kanssa, voidaan käyttää joko vakiopitoisuutta (mg/kg-ruokavalio tai ppm) ravinnossa tai eläimen painoon suhteutettua annoksen vakiotasoa (mg pai ­
nokiloa kohti). Molemmat lasketaan viikoittain. Valittu vaihtoehto on mai ­
nittava.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 491
 
32. Suun kautta annostelun yhteydessä eläimille annetaan testikemikaalia päivit ­
täin (seitsemänä päivänä joka viikko) 12 kuukauden ajan (krooninen vaihe) 
tai 24 kuukauden ajan (karsinogeenisuusvaihe), katso myös 33 ja 34 kohta. Jos käytetään muunlaista koejärjestelyä (jos testikemikaalia annetaan esimer ­
kiksi viitenä päivänä viikossa), se on perusteltava. Ihon kautta annostelun 
yhteydessä eläimille annetaan testikemikaalia vähintään kuuden tunnin ajan 
päivässä seitsemänä päivänä viikossa, kuten tämän liitteen luvussa B.9 (11) on täsmennetty, 12 kuukauden ajan (krooninen vaihe) tai 24 kuukauden ajan (karsinogeenisuusvaihe). Hengitysteiden kautta altistuksessa testikemikaalia 
annetaan kuuden tunnin ajan päivässä seitsemänä päivänä viikossa, mutta 
myös altistusta viitenä päivänä viikossa voidaan käyttää, jos se on perustel ­
tua. Altistusjakson pituus on yleensä 12 kuukautta (krooninen vaihe) tai 24 kuukautta (karsinogeenisuusvaihe). Jos muita jyrsijöitä kuin rottia altistetaan 
vain nasaalisesti, altistuksen enimmäiskestoaikoja voidaan muuttaa lajikoh ­
taisen stressin minimoimiseksi. Jos altistuksen kesto on alle kuusi tuntia päivässä, se on perusteltava. Katso myös tämän liitteen luku B.8 (9).
 
33. Kun testikemikaali annetaan eläimille ruokintaletkulla, on käytettävä maha ­
letkua tai sopivaa intubaatiokanyylia, ja kemikaali on annettava joka päivä 
samoihin aikoihin. Yleensä kerta-annos annetaan kerran päivässä, mutta jos kemikaali on esimerkiksi paikallisesti ärsyttävä aine, päivittäinen annos voi ­
daan antaa myös jaettuna (kaksi kertaa päivässä). Suurin yhdellä kerralla 
annettava nestetilavuus määräytyy koe-eläimen koon mukaan. Tilavuus tulee 
pitää mahdollisimman pienenä, ja jyrsijöillä se saa olla yleensä enintään 1 ml 100 g:n painoa kohti (31). Testitilavuuden vaihtelu on minimoitava muuttamalla pitoisuutta sen varmistamiseksi, että tilavuus on sama kaikilla 
annostasoilla. Poikkeuksena ovat mahdollisesti syövyttävät tai ärsyttävät ke ­
mikaalit, jotka on laimennettava vakavien paikallisten vaikutusten välttämi ­
seksi. On vältettävä testausta sellaisilla pitoisuuksilla, jotka todennäköisesti syövyttävät tai ärsyttävät maha-suolikanavaa.
 
Tutkimuksen kesto  
34. Tämän tutkimuksen annostelujakso ja krooninen vaihe kestävät yleensä 12 
kuukautta, mutta tutkimussuunnitelman mukaan testimenetelmää on mahdol ­
lista soveltaa joko lyhyempiin (esimerkiksi kuusi tai yhdeksän kuukautta) tai 
pitempiin (esimerkiksi 18 tai 24 kuukautta) tutkimuksiin tietyn lainsäädän ­
nön nojalla tai tiettyjen mekanististen tarkoitusten perusteella. Poikkeukset 12 kuukauden mittaisesta altistuksesta on perusteltava varsinkin, jos altistus 
on tätä lyhyempi. Kaikki tähän vaiheeseen kohdennetut annosryhmät lope ­
tetaan määrättynä ajankohtana kroonisen myrkyllisyyden ja ei-neoplastisten muutosten arvioimiseksi. Tutkimukseen sisältyville satelliittiryhmille, joiden 
avulla seurataan tutkittavan testikemikaalin aiheuttamien toksikologisten 
muutosten korjaantuvuutta, ei saa antaa testikemikaalia vähintään neljään viikkoon eikä pidempään kuin kolmanneksen tutkimuksen kokonaiskestosta altistuksen päätyttyä.
 
35. Jyrsijöiden osalta tämän tutkimuksen karsinogeenisuusvaihe kestää yleensä 
24 kuukautta, mikä on valtaosa käytettävien eläinten normaalista elinajasta. 
Tutkimus voi olla tätä pidempi tai lyhyempi sen mukaan, mikä on tutki ­
muksessa käytettävän eläinlajin kannan elinaika, mutta tämä on kuitenkin perusteltava. Tietyille hiirikannoille, joita ovat esimerkiksi AKR/J, C3H/J tai 
C57BL/6J, 18 kuukauden mittainen tutkimus voi olla sopivampi. Ohjeita 
tutkimuksen kestosta, päättymisestä ja tutkimuksessa havaitun eloonjäämisen käsittelemisestä sekä lisäohjeita negatiivisen karsinogeenisuuden hyväksyttä ­
vyydestä suhteessa tutkimuksessa ilmenneeseen eloonjäämiseen on OECD:n 
ohjeasiakirjassa GD 116, joka koskee kroonisten myrkyllisyys- ja karsino ­
geenisuustutkimusten suunnittelua ja toteuttamista (7).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 492
 
— Tutkimuksen lopettamista on harkittava, kun eloonjääneiden eläinten 
määrä pienemmän annoksen ryhmissä tai verrokkiryhmässä on pienempi 
kuin 25 prosenttia.  
— Jos vain suuren annoksen ryhmä kuolee ennenaikaisesti myrkyllisyyden 
vuoksi, tutkimusta ei tule lopettaa.  
— Eloonjäämistä on käsiteltävä kummankin sukupuolen osalta erikseen.  
— Tutkimusta ei tule jatkaa sen jälkeen, kun tutkimuksesta saatavat tiedot 
eivät enää riitä tilastollisesti validin arvioinnin tekemiseen.  
HAVAINNOT (KROONISEN MYRKYLLISYYDEN VAIHE)  
36. Kaikki eläimet on tutkittava sairastuvuuden tai kuolleisuuden havaitsemi ­
seksi yleensä aamuin illoin joka päivä myös viikonloppuisin ja lomien ai ­
kana. Kliinisiä yleishavaintoja on tehtävä vähintään kerran päivässä mielui ­
ten suurin piirtein samaan aikaan / samoihin aikoihin joka päivä. On otettava huomioon, että kun testikemikaalia annetaan ruokintaletkun kautta, odotet ­
tuja vaikutuksia esiintyy eniten annostelun jälkeen.
 
37. Kaikista eläimistä on tehtävä yksityiskohtaisia kliinisiä havaintoja vähintään 
kerran ennen ensimmäistä altistusta (jotta eläimessä havaittavia muutoksia voidaan verrata alkutilanteeseen), tutkimuksen ensimmäisen viikon päät ­
teeksi ja kerran kuukaudessa sen jälkeen. Havainnointi on toteutettava siten, 
että yksittäisten havainnoijien välinen vaihtelu on mahdollisimman pientä ja testiryhmästä riippumatonta. Havainnot tulee tehdä eläimen oman häkin ulkopuolella mieluiten vakioalueella samaan kellonaikaan joka kerta. Ha ­
vainnot on kirjattava tarkoin muistiin, mieluiten koelaboratorion erikseen 
määrittelemiä pisteytysjärjestelmiä käyttäen. On pyrittävä varmistamaan, että havainnointiolosuhteissa on mahdollisimman vähän vaihtelua. Kirjatta ­
via havaintoja ovat mm. ihon, karvapeitteen, silmien ja limakalvojen muu ­
tokset sekä sisäeritteiden, kuonaeritteiden ja autonomisen toiminnan (esimer ­
kiksi kyynelvuoto, piloerektio, mustuaisen koko ja epätavallinen hengitys) esiintyminen. Käynnin, asennon ja käsittelyvasteen muutokset, mahdolliset klooniset tai tooniset liikkeet, stereotypiat (esimerkiksi ylenmääräinen turkin 
hoito, jatkuva kehän kiertäminen) tai omituinen käytös (esimerkiksi itsensä 
silpominen, takaperin käveleminen) tulee myös kirjata muistiin (32).
 
38. Kaikille eläimille on tehtävä silmätutkimus oftalmoskoopilla tai muulla so ­
pivalla laitteella ennen testikemikaalin ensimmäistä antokertaa. Tutkimuksen 
päätteeksi tämä tutkimus on tehtävä mieluiten kaikille eläimille, mutta vä ­
hintään suuren annoksen ryhmässä ja verrokkiryhmässä. Jos silmissä hav ­
aitaan käsittelyyn liittyviä muutoksia, kaikki eläimet on tutkittava. Jos ra ­
kenteellinen analyysi tai muut tiedot viittaavat silmiin kohdistuvaan myrkyl ­
lisyyteen, silmätutkimuksia on tehtävä useammin.  
39. Sellaisten kemikaalien yhteydessä, joiden osalta aikaisemmat toistetulla an ­
noksella tehdyt 28 päivän ja/tai 90 päivän myrkyllisyystestit osoittivat niiden 
mahdollisesti aiheuttavan neurotoksisia vaikutuksia, voidaan lisäksi arvioida aistien reaktiivisuus erityyppisille ärsykkeille (32) (esimerkiksi kuulon, näön tai asentotunnon kautta välittyville ärsykkeille) (33) (34) (35), tarttumaotteen 
voimakkuus (36) ja motorinen toiminta (37) ennen tutkimuksen aloittamista 
ja kolmen kuukauden välein sen jälkeen, kunnes tutkimus on kestänyt 12 kuukautta, sekä tutkimuksen päättyessä (jos se kestää yli 12 kuukautta). Mahdollisten toimenpiteiden tarkemmat yksityiskohdat löytyvät mainituista 
kirjallisuusviitteistä. Myös muita kuin viittauksissa mainittuja toimenpiteitä 
voidaan käyttää.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 493
 
40. Sellaisten kemikaalien yhteydessä, joiden osalta aikaisemmat toistetulla an ­
noksella tehdyt 28 päivän ja/tai 90 päivän myrkyllisyystestit osoittivat niiden 
mahdollisesti aiheuttavan immunotoksisia vaikutuksia, tätä tutkittavaa omi ­
naisuutta koskevat tarkemmat tutkimukset voidaan tehdä tutkimuksen päät ­
tyessä.  
Ruumiinpaino, ravinnon/veden kulutus ja ruumiinpainon lisäys  
41. Kaikki eläimet on punnittava käsittelyn alussa, vähintään kerran viikossa 
ensimmäisen 13 viikon ajan ja sen jälkeen vähintään kerran kuukaudessa. 
Ravinnon kulutus ja painon lisäys on mitattava vähintään kerran viikossa 
ensimmäisten 13 viikon ajan ja sen jälkeen vähintään kerran kuukaudessa. Veden kulutus on mitattava vähintään kerran viikossa ensimmäisten 13 vii ­
kon ajan ja sen jälkeen vähintään kerran kuussa, kun testikemikaali annetaan 
juomaveteen sekoitettuna. Veden kulutuksen mittaamista on harkittava myös 
sellaisissa tutkimuksissa, joissa eläimen juomistottumukset muuttuvat.
 
Hematologia ja kliininen biokemia  
42. Tutkimuksissa, joissa käytetään jyrsijöitä, hematologiset tutkimukset on teh ­
tävä kaikille tutkimuseläimille (10 urosta ja 10 naarasta ryhmää kohti) kol ­
men, kuuden ja kahdentoista kuukauden jälkeen sekä tutkimuksen päättyessä (jos se kestää yli 12 kuukautta). Hiirten osalta saatetaan tarvita satelliittiryh ­
män eläimiä, jotta kaikki vaaditut hematologiset määritykset saadaan tehtyä 
(katso 19 kohta). Tutkimuksissa, joissa käytetään muita eläimiä kuin jyrsi ­
jöitä, näytteet otetaan pienemmästä määrästä eläimiä (esimerkiksi koiratut ­
kimuksissa neljältä eläimeltä sukupuolta ja ryhmää kohti) saman näytteen ­
ottoaikataulun mukaisesti kuin jyrsijöilläkin sekä tutkimuksen päättyessä. 
Kolmannen kuukauden jälkeisiä mittauksia ei tarvitse tehdä jyrsijöillä eikä muilla eläimillä, jos hematologisissa parametreissa ei havaittu vaikutuksia aiemmin tehdyssä 90 päivän tutkimuksessa, jossa käytettiin vertailukelpoisia 
annostasoja. Verinäytteet on otettava nimetystä paikasta, esimerkiksi sydän ­
punktiolla tai silmäntakaisesta laskimopunoksesta anestesiassa.
 
43. Seuraavassa on luettelo parametreista, jotka on tutkittava (38): valkosolujen 
kokonaismäärä ja niiden erittelylaskenta, punasolujen määrä, verihiutaleiden 
määrä, hemoglobiinipitoisuus, hematokriitti (punasolujen tilavuusosuus), pu ­
nasolujen keskimääräinen tilavuus (MCV), keskihemoglobiini (MCH), keskihemoglobiinikonsentraatio (MCHC), protrombiiniaika ja aktivoitu par ­
tiaalinen tromboplastiiniaika. Muita hematologisia parametreja (kuten Hein ­
zin kappaleet, epätyypillinen punasolujen morfologia tai methemoglobiini) 
voidaan tarvittaessa mitata testikemikaalin myrkyllisyyden mukaan. Kaiken kaikkiaan on toimittava joustavasti tietystä kemikaalista havaitun ja/tai od ­
otetun vaikutuksen mukaisesti. Jos testikemikaali vaikuttaa verta muodosta ­
vaan järjestelmään, retikulosyyttien määrän ja luuytimen sytologinen tutki ­
mus voi olla aiheenmukaista, joskaan sitä ei tarvitse tehdä rutiininomaisesti.
 
44. Kliinisen biokemian määritykset tärkeimpien myrkyllisten kudosvaikutusten 
ja erityisesti munuais- ja maksavaikutusten tutkimiseksi tulee tehdä verinä ­
ytteistä, jotka otetaan kaikilta tutkimuseläimiltä (kymmenen urosta ja kym ­
menen naarasta jokaisesta ryhmästä) hematologisia tutkimuksia varten mää ­
ritetyin aikavälein. Hiirten osalta saatetaan tarvita satelliittiryhmän eläimiä, jotta kaikki vaaditut kliinis- biokemialliset määritykset saadaan tehtyä. Tut ­
kimuksissa, joissa käytetään muita eläimiä kuin jyrsijöitä, näytteet otetaan 
pienemmästä määrästä eläimiä (esimerkiksi koiratutkimuksissa neljältä eläi ­
meltä sukupuolta ja ryhmää kohti) saman näytteenottoaikataulun mukaisesti kuin jyrsijöilläkin sekä tutkimuksen päättyessä. Kolmannen kuukauden jäl ­
keisiä mittauksia ei tarvitse tehdä jyrsijöillä eikä muilla eläimillä, jos klii ­
nisen biokemian parametreissa ei havaittu vaikutuksia aiemmin tehdyssä 90 
päivän tutkimuksessa, jossa käytettiin vertailukelpoisia annostasoja. Eläinten
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 494
 
ruokinnan siirtämistä yön yli (hiiriä lukuun ottamatta) ennen verinäytteen 
ottoa suositellaan (  1 ). Seuraavassa on luettelo parametreista, jotka on tutkit ­
tava (38): glukoosi, virtsa (virtsan typpi), kreatiniini, kokonaisproteiini, al ­
bumiini, kalsium, natrium, kalium, kokonaiskolesteroli, vähintään kaksi he ­
patosellulaariseen arviointiin sopivaa testiä (alaniiniaminotransferaasi, aspar ­
taattiaminotransferaasi, glutamaattidehydrogenaasi, kokonaissappihapot) 
(39), ja vähintään kaksi hepatobiliaariseen arviointiin sopivaa testiä (alkali ­
nen fosfataasi, gammaglutamyylitransferaasi, 5’-nukleotidaasi, kokonaisbili ­
rubiini, kokonaissappihapot) (39). Muita kliinis-kemiallisia parametreja, ku ­
ten paastotriglyseridit, tietyt hormonit ja koliiniesteraasi, voidaan mitata tar ­
vittaessa testikemikaalin myrkyllisyyden mukaan. Kaiken kaikkiaan on toi ­
mittava joustavasti tietystä kemikaalista havaitun ja/tai odotetun vaikutuksen mukaisesti.
 
45. Virtsa-analyysit on tehtävä kaikilta tutkimuseläimiltä (10 urosta ja 10 naa ­
rasta jokaisesta ryhmästä) näytteistä, jotka otetaan samoina aikoina kuin 
hematologiset ja kliinis-kemialliset näytteet. Kolmannen kuukauden jälkeisiä mittauksia ei tarvitse tehdä, jos virtsa-analyysissa ei havaittu vaikutuksia aiemmin tehdyssä 90 päivän tutkimuksessa, jossa käytettiin vertailukelpoisia 
annostasoja. Seuraava parametriluettelo on kliinis-kemiallisia tutkimuksia 
koskevan asiantuntijasuosituksen mukainen (38): ulkonäkö, tilavuus, osmo ­
laliteetti tai ominaistiheys, pH, kokonaisproteiini ja glukoosi. Muita mää ­
rityksiä ovat ketoaineet, urobilinogeeni, bilirubiini ja piilevä veri. Myös 
muita parametreja voidaan tarvittaessa käyttää, jos havaitun vaikutuksen 
(havaittujen vaikutusten) tutkimusta on laajennettava.
 
46. Koiratutkimuksissa lähtötilanteen hematologiset ja kliinis-biokemialliset 
muuttujat on yleensä määritettävä ennen käsittelyn aloittamista, mutta jyrsi ­
jätutkimuksissa niitä ei tarvitse määrittää (38). Jos aiemmat lähtötason tiedot 
ovat riittämättömät (katso 58 kohta), näiden tietojen hankkimista on harkit ­
tava.  
PATOLOGIA  
Ruumiinavaustutkimukset  
47. Kaikille tutkimukseen sisältyville eläimille on tehtävä täydellinen ja yksityis ­
kohtainen ruumiinavaus, jossa tutkitaan huolellisesti eläimen ruumis päältä päin, kaikki ruumiin aukot sekä kallo-, rinta- ja vatsaontelot ja niiden sisältö. Mittaukset voidaan kuitenkin määrätä rajattavaksi (kesken tutkimuksen lo ­
petettavien eläinten ryhmässä tai satelliittiryhmässä) tiettyihin keskeisiin 
seikkoihin, kuten neurotoksisuuteen tai immunotoksisuuteen (katso 21 koh ­
ta). Näille eläimille ei tarvitse tehdä ruumiinavausta eikä jäljempänä olevissa kohdissa kuvattuja toimenpiteitä. Erityisvalvonnassa olevien eläinten ruumii ­
navauksen tarve määräytyy tapauskohtaisesti tutkimuksen johtajan harkinnan 
perusteella.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 495  
( 1 ) Ruokinnan siirtämistä yön yli suositellaan monissa seerumi- ja plasmamittauksissa, eten ­
kin glukoosimittauksissa. Tärkein syy tälle suositukselle on se, että syöminen väistämättä 
lisää vaihtelua, mikä voi estää lievien vaikutusten havaitsemisen ja vaikeuttaa tulosten 
tulkintaa. Toisaalta ruokinnan siirtäminen yön yli voi häiritä eläinten yleistä metaboliaa ja 
etenkin ruokintatutkimuksissa häiritä päivittäistä altistusta testikemikaalille. Kaikki eläi ­
met on arvioitava samassa fysiologisessa tilassa, ja yksityiskohtaiset tai neurologiset 
arvioinnit on mieluiten tehtävä eri päivänä kuin näytteenotto kliinistä biokemiaa varten.
 48. Elinten painotiedot on kerättävä kaikilta eläimiltä lukuun ottamatta 47 koh ­
dan jälkimmäisessä osassa lueteltuja eläimiä. Lisämunuaiset, aivot, lisäki ­
vekset, sydän, munuaiset, maksa, munasarjat, perna, kivekset ja kilpirauha ­
nen (punnittava kiinnityksen jälkeen lisäkilpirauhasten kanssa) on puhdistet ­
tava niihin kiinnittyvistä kudoksista tarkoituksenmukaisella tavalla, ja elinten 
märkäpaino on punnittava mahdollisimman pian dissektion jälkeen kuivu ­
misen estämiseksi.  
49. Seuraavat kudokset säilytetään sekä kudostyypin että aiotun histopatologisen 
tutkimuksen kannalta sopivimmassa kiinnitysaineessa (40) (hakasulkeissa olevat kudokset ovat valinnaisia): 
Kaikki suuret leesiot Sydän Haima Maha (etumaha, rauhasmaha) 
Lisämunuainen Sykkyräsuoli Lisäkilpirauhanen [Hampaat] Aortta Tyhjäsuoli Ääreishermo Kivekset 
Aivot (mukaan luettuina 
osia iso- ja pikkuaivoista sekä aivosillasta) Munuaiset Aivolisäke Kateenkorva 
Umpisuoli Kyynelrauhanen (silmän 
ulkopuolelta) Eturauhanen Kilpirauhanen 
Kohdunkaula Maksa Peräsuoli [Kieli] 
Eturauhasen etuosa Keuhkot Sylkirauhanen Henkitorvi 
Paksusuoli Imusolmukkeet (pinnalli ­
set ja syvät) Rakkularauhanen Virtsarakko 
Pohjukaissuoli Rintarauhanen (pakolli ­
nen naarailla; mikäli sel ­
västi dissekoitavissa, 
myös uroksilla) Luurankolihas Kohtu (mukaan luettuna koh ­
dunkaula) 
Lisäkivekset [Ylähengitystiet, mukaan 
luettuina nenä, kuorikot 
ja sivuontelot] Iho [Virtsanjohdin] 
Silmä (mukaan luettuna 
verkkokalvo) Ruokatorvi Selkäydin (kolmesta 
kohdasta: kaularanka, rintarangan keskiosa ja 
lanneranka) [Virtsaputki] 
[Reisiluu ja nivel] [Hajurauhanen] Perna Vagina 
Sappirakko (muut lajit kuin 
rotta) Munasarjat [Rintalasta] Osa luuydintä ja/tai tuore 
luuydinaspiraatti 
Harderin rauhaset
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 496
 
Parillisten elinten (esimerkiksi munuaisten, lisämunuaisten jne.) osalta mo ­
lemmat elimet on säilytettävä. Kliinisten ja muiden löydösten perusteella on 
vielä ehkä tutkittava muita kudoksia. Myös testikemikaalin tunnettujen omi ­
naisuuksien perusteella todennäköiset kohde-elimet on säilytettävä. Tutki ­
muksissa, joissa altistus tapahtuu ihon kautta, on säilytettävä ne elimet, jotka 
on lueteltu suun kautta altistuksen yhteydessä. On oleellista, että näyte 
otetaan nimenomaan siitä kohdasta ihoa, johon testikemikaalia on annostel ­
tu, ja että kyseinen ihokohta säilytetään. Hengitysteiden kautta altistusta koskevien tutkimusten yhteydessä hengityselimistön säilytettävien ja tutkit ­
tavien kudosten luettelon osalta on noudatettava tämän liitteen luvussa B.8 
(9) ja luvussa B.29 (10) annettuja suosituksia. Muiden elinten/kudosten osalta (ja hengityselimistöstä otettujen kudosten lisäksi) on tutkittava ne elimet, jotka on mainittu suun kautta altistuksen yhteydessä esitetyssä luet ­
telossa.
 
Histopatologia  
50. Toksikologis-patologisten tutkimusten toteuttamisen parhaista käytännöistä 
on saatavana ohjeistusta (40). Vähintään seuraavat histopatologiset tutki ­
mukset on tehtävä:  
— kaikki kudokset suuren annoksen ryhmästä ja verrokkiryhmästä  
— kaikki kudokset tutkimuksen aikana kuolleilta tai lopetetuilta eläimiltä  
— kaikki kudokset, joissa on makroskooppisia poikkeavuuksia  
— kohdekudokset tai kudokset, joissa oli käsittelyyn liittyviä muutoksia 
suuren annoksen ryhmässä; kaikilta eläimiltä kaikissa muissa annosryh ­
missä  
— parillisten elinten (esimerkiksi munuaisten, lisämunuaisten jne.) osalta 
molemmat elimet on tutkittava.  
HAVAINNOT (KARSINOGEENISUUSVAIHE)  
51. Kaikki eläimet on tutkittava sairastuvuuden tai kuolleisuuden havaitsemi ­
seksi yleensä jokaisen päivän aamulla ja illalla myös viikonloppuisin ja 
lomien aikana. Lisäksi eläimet on tutkittava kerran päivässä tiettyjen, toksi ­
kologisesti oleellisten merkkien havaitsemiseksi. Tutkimuksissa, joissa käy ­
tetään ruokintaletkua, eläimet on tutkittava heti annostelun jälkeen. Erityistä huomiota on kiinnitettävä kasvainten kehittymiseen. Jokaisen paljain silmin 
tai käsin tunnustelemalla havaittavissa olevan kasvaimen toteamisaika, paik ­
ka, koko, ulkonäkö ja kehitys on kirjattava.
 
52. Kaikki eläimet on punnittava käsittelyn alussa, vähintään kerran viikossa 
ensimmäisen 13 viikon ajan ja sen jälkeen vähintään kerran kuukaudessa. 
Ravinnon kulutus ja painon lisäys on mitattava vähintään kerran viikossa 
ensimmäisten 13 viikon ajan ja sen jälkeen vähintään kerran kuukaudessa. Veden kulutus on mitattava vähintään kerran viikossa ensimmäisten 13 vii ­
kon ajan ja sen jälkeen vähintään kerran kuussa, kun testikemikaali annetaan 
juomaveteen sekoitettuna. Veden kulutuksen mittaamista on harkittava myös 
sellaisissa tutkimuksissa, joissa eläimen juomistottumukset muuttuvat.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 497
 
Hematologia, kliininen biokemia ja muut mittaukset  
53. Jotta tutkimuksesta saadaan mahdollisimman paljon tietoa erityisesti vaiku ­
tustapaa koskevia pohdintoja varten, eläimiltä voidaan ottaa tutkimuksen johtajan harkinnan perusteella verinäytteet hematologisia ja 
kliinis-biokemiallisia määrityksiä varten. Myös virtsa-analyysi voi olla tar ­
peen. Näistä parametreista saadaan tietoa tutkimuksen kroonisen myrkylli ­
syyden vaiheessa, joka kestää yleensä 12 kuukautta (34 kohta), käytettyjä eläimiä koskevien tietojen perusteella. Lisätietoa tällaisten näytteiden otta ­
misen hyödyllisyydestä osana karsinogeenisuustutkimusta on ohjeasiakir ­
jassa GD 116 (7). Jos verinäytteitä otetaan, ne on kerättävä testijakson lopussa vähän ennen eläinten lopettamista tai sen yhteydessä. Verinäytteet 
on otettava nimetystä paikasta, esimerkiksi sydänpunktiolla tai silmäntakai ­
sesta laskimopunoksesta anestesiassa. Verinäytteet voidaan valmistella myös tutkimusta varten etenkin, jos kohde-elin vaikuttaa olevan luuydin, joskin verinäytteiden tutkimisen arvoa mahdollisen karsinogeenisuuden/onkogee ­
nisuuden arvioinnissa karsinogeenisuusvaiheen yhteydessä on pidetty ky ­
seenalaisena (38).
 
PATOLOGIA  
Ruumiinavaustutkimukset  
54. Kaikille tutkimukseen sisältyville eläimille paitsi erityisvalvonnassa oleville 
eläimille (katso 20 kohta) on tehtävä täydellinen ja yksityiskohtainen ruu ­
miinavaus, jossa tutkitaan huolellisesti eläimen ruumis päältä päin, kaikki 
ruumiin aukot sekä kallo-, rinta- ja vatsaontelot ja niiden sisältö. Erityisval ­
vonnassa olevien eläinten ruumiinavauksen tarve määräytyy tapauskohtai ­
sesti tutkimuksen johtajan harkinnan perusteella. Yleensä elinten painot eivät kuulu karsinogeenisuutta käsittelevään tutkimukseen, koska geriatriset muu ­
tokset ja myöhemmissä vaiheissa kasvainten kehittyminen mitätöi elinten 
painoa koskevien tietojen käyttökelpoisuuden. Nämä tiedot voivat kuitenkin olla erittäin tärkeitä näyttöön perustuvan arvioinnin toteuttamisessa ja eten ­
kin vaikutustapaa koskevissa pohdinnoissa. Jos ne ovat osa satelliittitutki ­
musta, ne on kerättävä viimeistään vuoden kuluttua tutkimuksen aloittami ­
sesta.
 
55. Seuraavat kudokset säilytetään sekä kudostyypin että aiotun histopatologisen 
tutkimuksen kannalta sopivimmassa kiinnitysaineessa (40) (hakasulkeissa olevat kudokset ovat valinnaisia): 
Kaikki suuret leesiot Sydän Haima Maha (etumaha, rauhasmaha) 
Lisämunuainen Sykkyräsuoli Lisäkilpirauhanen [Hampaat] Aortta Tyhjäsuoli Ääreishermo Kivekset Aivot (mukaan luettuina 
osia iso- ja pikkuaivoista sekä aivosillasta) Munuaiset Aivolisäke Kateenkorva 
Umpisuoli Kyynelrauha-nen (silmän 
ulkopuolelta) Eturauhanen Kilpirauhanen 
Kohdunkaula Maksa Peräsuoli [Kieli] 
Eturauhasen etuosa Keuhkot Sylkirauhanen Henkitorvi Paksusuoli Imusolmukkeet (pinnalli ­
set ja syvät) Rakkularauhanen Virtsarakko
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 498
 
Pohjukaissuoli Rintarauhanen (pakolli ­
nen naarailla; mikäli sel ­
västi dissekoitavissa, myös uroksilla) Luurankolihas Kohtu (mukaan luettuna koh ­
dunkaula) 
Lisäkivekset [Ylähengitystiet, mukaan 
luettuina nenä, kuorikot 
ja sivuontelot] Iho [Virtsanjohdin] 
Silmä (mukaan luettuna 
verkkokalvo) Ruokatorvi Selkäydin (kolmesta 
kohdasta: kaularanka, 
rintarangan keskiosa ja lanneranka) [Virtsaputki] 
[Reisiluu ja nivel] [Hajurauhanen] Perna Vagina 
Sappirakko (muut lajit kuin 
rotta) Munasarjat [Rintalasta] Osa luuydintä ja/tai tuore 
luuydinaspiraatti 
Harderin rauhaset
 
Parillisten elinten (esimerkiksi munuaisten, lisämunuaisten jne.) osalta mo ­
lemmat elimet on säilytettävä. Kliinisten ja muiden löydösten perusteella on vielä ehkä tutkittava muita kudoksia. Myös elimet, joita pidetään testikemi ­
kaalin tunnettujen ominaisuuksien perusteella todennäköisinä kohde-eliminä, 
on säilytettävä. Tutkimuksissa, joissa altistus tapahtuu ihon kautta, on säi ­
lytettävä ne elimet, jotka on lueteltu suun kautta altistuksen yhteydessä. On oleellista, että näyte otetaan nimenomaan siitä kohdasta ihoa, johon testike ­
mikaalia on annosteltu, ja että kyseinen ihokohta säilytetään. Hengityksen 
kautta altistuksen yhteydessä hengityselimistön säilytettyjen ja tutkittujen kudosten luettelon osalta on noudatettava tämän liitteen lukua B.8 (8) ja lukua B.29 (9). Muiden elinten/kudosten osalta (ja hengityselimistöstä otet ­
tujen kudosten lisäksi) on tutkittava ne elimet, jotka on mainittu suun kautta 
altistuksen yhteydessä esitetyssä luettelossa.
 
Histopatologia  
56. Toksikologis-patologisten tutkimusten toteuttamisen parhaista käytännöistä 
on saatavana ohjeistusta (40). Vähintään seuraavat kudokset on tutkittava:  
— Kaikki kudokset suuren annoksen ryhmästä ja verrokkiryhmästä  
— Kaikki kudokset tutkimuksen aikana kuolleilta tai lopetetuilta eläimiltä  
— Kaikki kudokset, joissa on makroskooppisia poikkeavuuksia  
— Jos suuren annoksen ryhmässä havaitaan käsittelyyn liittyviä histopato ­
logisia muutoksia, samat kudokset on tutkittava kaikilta eläimiltä kai ­
kissa muissa annosryhmissä.  
— Parillisten elinten (esimerkiksi munuaisten, lisämunuaisten jne.) osalta 
molemmat elimet on tutkittava.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 499
 
TIEDOT JA RAPORTOINTI (KARSINOGEENISUUS JA KROONINEN 
MYRKYLLISYYS)  
Tiedot  
57. Jokaisesta eläimestä on ilmoitettava tiedot kaikista arvioiduista parametreis ­
ta. Yhteenveto tuloksista on esitettävä myös taulukossa, josta ilmenee kus ­
sakin testiryhmässä tutkimuksen alussa käytettyjen eläinten lukumäärä, testin 
aikana kuolleena löydettyjen tai humaaneista syistä lopetettujen eläinten 
lukumäärä ja niiden kuolinaika, merkkejä myrkyllisyydestä osoittaneiden eläinten lukumäärä, havaittujen myrkyllisten vaikutusten kuvaus, mukaan lukien niiden alkamisajankohta, kesto ja vaikeusaste, vaurioita saaneiden 
eläinten lukumäärä, vauriotyypit ja eläinten prosentuaaliset osuudet vaurio ­
tyypeittäin. Yhteenvetotaulukoissa on ilmoitettava keskiarvot ja keskihajo ­
nnat (jatkuvan testin tietojen osalta) niistä eläimistä, joilla ilmeni myrkyllisiä vaikutuksia tai vaurioita. Myös vaurioiden vaikeusaste on ilmoitettava.
 
58. Aiemmista vertailutiedoista voi olla apua tutkimuksen tulosten tulkinnassa 
esimerkiksi silloin, kun näyttää siltä, että samanaikaisista verrokeista saadut 
tiedot ovat merkittävästi erilaisia verrattuna saman testilaitoksen/kolonian verrokkieläimiltä saatuihin uudempiin tietoihin. Jos aiempia tietoja arvioi ­
daan, niiden on oltava peräisin samasta laboratoriosta ja liityttävä eläimiin, 
jotka ovat samanikäisiä ja sellaisesta kannasta, joka on tuotettu kyseistä 
tutkimusta edeltäneen viiden vuoden aikana.
 
59. Numeeriset tulokset on mahdollisuuksien mukaan arvioitava asianmukaisella 
ja yleisesti hyväksytyllä tilastollisella menetelmällä. Tilastolliset menetelmät ja analysoitavat tiedot on valittava tutkimuksen suunnitteluvaiheessa (9 koh ­
ta). Valinnassa on otettava huomioon myös eloonjäämistä koskevat korja ­
ukset, mikäli tarpeen.
 
60. Testiraporttiin on sisällytettävä seuraavat tiedot:  
Testikemikaali:  
— fysikaalinen olomuoto, puhtaus ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet  
— tunnistetiedot  
— kemikaalin lähde  
— eränumero  
— todistus kemiallisesta analyysista.  
Kantaja-aine (tarvittaessa):  
— kantaja-aineen valinnan perustelut, jos se on muu kuin vesi.  
Koe-eläimet:  
— käytetty laji/kanta ja perustelut niiden valinnalle  
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli testin alussa  
— lähde, elinolosuhteet, ravinto jne.  
— kunkin eläimen paino testin alkaessa.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 500
 
Testiolosuhteet:  
— antoreitin ja annoksen valinnan perustelut  
— tietojen analysointiin käytetyt tilastolliset menetelmät tarvittaessa  
— yksityiskohtaiset tiedot testikemikaalin koostumuksesta / ravintovalmis ­
teesta  
— analyysitiedot valmisteessa saavutetusta pitoisuudesta sekä sen stabilitee ­
tista ja homogeenisuudesta  
— antoreitti ja yksityiskohdat testikemikaalin annostelusta  
— inhalaatiotutkimuksissa tieto siitä, käytettiinkö vain nasaalista altistusta 
vai koko kehoon kohdistuvaa altistusta  
— todelliset annokset (mg painokiloa kohti päivässä) ja muuntokerroin, 
jolla ravintovalmisteen/juomaveden testikemikaalipitoisuus (mg/kg tai 
ppm) muunnetaan todelliseksi annokseksi, mikäli tarpeen  
— yksityiskohdat ravinnon ja veden laadusta.  
Tulokset (tiedot on esitettävä yhteenvetotaulukossa ja jokaisesta eläimestä 
erikseen):  
Yleiset tiedot  
— eloonjäämistä koskevat tiedot  
— ruumiinpaino / ruumiinpainon muutokset  
— ravinnon kulutus, ruumiinpainon lisäystä koskeva laskelmat sekä veden 
kulutus tarvittaessa  
— toksikokineettiset tiedot, jos saatavilla  
— silmätutkimuksen tiedot (jos saatavilla)  
— hematologiset tiedot (jos saatavilla)  
— kliinis-biokemialliset tiedot (jos saatavilla).  
Kliiniset löydökset  
— myrkyllisyyden merkit  
— kaikkien poikkeavuuksien ilmaantuvuus (ja vaikeusaste, jos pisteytetty)  
— kliinisten havaintojen luonne, vaikeusaste ja kesto (korjaantuvuudesta 
riippumatta).  
Ruumiinavaustiedot  
— eläimen paino testin lopussa  
— elinten painot (ja niiden suhteet tarvittaessa)  
— ruumiinavauslöydökset, poikkeavuuksien ilmaantuvuus ja vaikeusaste.  
Histopatologia  
— muut kuin neoplastiset histopatologiset löydökset  
— neoplastiset histopatologiset löydökset  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 501
 
— makroskooppisten ja mikroskooppisten löydösten välinen korrelaatio  
— yksityiskohtainen kuvaus kaikista käsittelyyn liittyvistä histopatologisista 
löydöksistä sekä niiden vaikeusaste  
— raportti objektilasien vertaisarvioinnista.  
Tulosten tilastollinen käsittely tarvittaessa  
Tulosten pohdinta, mukaan luettuina seuraavat seikat:  
— mallintamistapoja koskeva pohdinta  
— annos-vastesuhteet  
— aiemmat vertailutiedot  
— vaikutustapaa koskeviin tietoihin liittyvä pohdinta  
— BMD-, NOAEL- tai LOAEL-arvojen määritykset  
— merkitys ihmisten kannalta.  
Päätelmät  
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
 
2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.  
3) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208
 
4) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145–191.  
5) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteriza ­
tion of environmental chemicals by the US National Toxicology Program ­
me: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445.  
6) Tämän liitteen luku B.27 (Subkrooninen oraalinen myrkyllisyystesti – tois ­
tetuilla annoksilla tehtävä 90 vuorokauden oraalinen myrkyllisyystutkimus 
muilla kuin jyrsijöillä).  
7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 
and 453 – Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, 
available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines.
 
8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, 
OECD, Paris.  
9) Tämän liitteen luku B.8. (Subakuutti myrkyllisyys hengitettynä: 28 päivän 
tutkimus)  
10) Tämän liitteen luku B.29 (Subkrooninen myrkyllisyys hengitettynä: 90 päi ­
vän tutkimus)  
11) Tämän liitteen luku B.9 (Toistetun annoksen (28 päivää) myrkyllisyys (ihon 
kautta nautittavat aineet)).  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 502
 
12) Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793–801.
 
13) Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, Fenner-Crisp PA (2003). 
The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An 
Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581–589.  
14) Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51–56.
 
15) Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591–653.
 
16) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural Chemi ­
cal Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1–7.
 
17) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Crit. 
Rev. Toxicol. 36: 9–35.  
18) Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al . (2006). A Tiered Approach to Sys ­
temic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. 
Rev. Toxicol. 36: 37–68.  
19) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al.  (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69–98.
 
20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Paris.  
22) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpre ­
tation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: App ­
roaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837.
 
23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
24) Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
maceuticals. The Toxicologist 14(1):214.  
25) Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for 
the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy 
POF&Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Confe ­
rence on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. S. 279–284.  
26) Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance 
of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Re ­
sults and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the 
Agrochemical Industry. Environ Health Perspect 105:1196–1203.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 503
 
27) Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivi 2010/63/EU, annettu 
22 päivänä syyskuuta 2010, tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten 
suojelusta, EUVL L 276, 20.10.2010, s. 33.  
28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86–23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
 
29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and Structure 
of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3- 
906255-06–9.  
30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
 
31) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology, 21:15–23.  
32) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Do ­
cument No. 60,  
33) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003.  
34) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691–704.  
35) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Com ­
parisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.
 
36) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.
 
37) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experi ­
ments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Tera ­
tol. 13: 599–609.  
38) Weingand K, Brown G, Hall R  et al . (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam.&Appl. 
Toxicol. 29: 198–201.  
39) EMEA (draft) document ”Non-clinical guideline on drug-induced hepatoto ­
xicity” (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
40) Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK  et al.  (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 504
 
Lisäys 1  
MÄÄRITELMÄ  
Testikemikaali:  Tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 505
 
B.34.  MYRKKYJEN VAIKUTUS LISÄÄNTYMISKYKYYN (YHDEN 
SUKUPOLVEN TESTI)  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Ei ole.  
1.4 TESTIN PERIAATE  
Testattavaa ainetta annetaan erisuuruisina annoksina useille uros- ja 
naarasryhmille. Urokset altistetaan kasvuaikana ja ainakin yhden täy ­
dellisen spermatogeneesisyklin ajan (noin 56 päivää hiirellä ja 70 
päivää rotalla), jotta voidaan todeta testattavan aineen mahdolliset haittavaikutukset siemennesteen tuottoon.
 
Parentaalipolven (P) naaraat on altistettava vähintään kahden estrus ­
syklin ajan, jotta voidaan todeta testattavan aineen mahdolliset hait ­
tavaikutukset estrukseen. Sen jälkeen eläimet pariutetaan. Pariutta ­
misaikana testattavaa ainetta annetaan kummallekin sukupuolelle ja sen jälkeen tiineyden ja imetyksen aikana ainoastaan naaraille. Tes ­
tausmenetelmää on muunneltava, jos altistus tapahtuu hengitysteiden 
kautta.
 
1.5 LAATUKRITEERIT  
Ei ole.  
1.6 TESTIN KUVAUS  
Testin valmistelu  
Ennen tutkimuksen aloittamista nuoret, terveet eläimet jaetaan satun ­
naisesti koe- ja kontrolliryhmiin. Eläimet siirretään koetiloihin ja kokeen aikana annettava ruokinta aloitetaan vähintään viisi päivää 
ennen kokeen alkua. Testattavaa ainetta suositellaan annettavaksi 
ravintoon tai juomaveteen sekoitettuna. Myös muita antotapoja voi ­
daan käyttää. Samaa antotapaa on käytettävä kaikille koe-eläimille koko koeajan. Jos liuotinta tai muita lisäaineita käytetään annostelun 
helpottamiseksi, niiden myrkyttömyys on oltava tiedossa. Eläimet on 
altistettava viikon jokaisena päivänä.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 506
 
K o e - e l ä i m e t  
Eläinlajin valinta  
Suositeltavimmat lajit ovat rotta tai hiiri. Koe-eläiminä on käytettävä 
terveitä eläimiä, joilla ei ole tehty aikaisempia kokeita. Kantoja, joiden hedelmällisyys on alhainen, ei saa käyttää. Koe-eläinten laji, 
kanta, sukupuoli, paino ja/tai ikä on oltava tiedossa.
 
Hedelmällisyysmäärityksiä tehtäessä tutkitaan sekä urokset että naa ­
raat. Kaikki koe- ja kontrollieläimet on vieroitettava ennen altistuk ­
sen alkamista.  
Lukumäärä ja sukupuoli  
Kussakin koe- ja kontrolliryhmässä on oltava niin monta eläintä, että 
tutkimukseen saadaan noin 20 kantavaa naarasta, joiden tiineys on päättymässä.
 
Tarkoituksena on tuottaa niin monta tiineyttä ja poikuetta, että tes ­
tattavan aineen mahdollisista vaikutuksista P-sukupolven eläinten he ­
delmällisyyteen, tiineyteen ja emon käyttäytymiseen sekä F  1 -suku­
polven imeväisvaiheeseen, kasvuun ja kehitykseen syntymästä vie ­
roitukseen voidaan tehdä luotettava arviointi.  
K o e - o l o s u h t e e t  
Ravintoa ja vettä on oltava vapaasti saatavilla. Synnytyksen lähesty ­
essä kantavat naaraat tulee sijoittaa yksitellen synnytyshäkkeihin, joihin voidaan laittaa pesäntekotarvikkeita.
 
A n n o s t a s o t  
Testissä käytetään vähintään kolmea annostasoa ja kontrolliryhmää. 
Jos aineen annostelussa käytetään liuotinta, kontrolleille annostellaan liuotinta suurimman annoksen saavalle ryhmälle annettu määrä. Jos 
testattava aine vähentää ravinnon tarvetta tai hyväksikäyttöä, tutki ­
mukseen voidaan liittää ravintokontrolliryhmä. Elleivät testattavasta aineesta johtuvat fysikaalis-kemialliset tai biologiset vaikutukset ai ­
heuta rajoituksia, suurimman annoksen on aiheutettava parentaalisu ­
kupolvessa myrkkyvaikutuksia mutta ei kuolleisuutta. Keskimmäisen 
annostason(tasojen) on aiheutettava testattavan aineen pienimmät ha ­
vaittavissa olevat myrkkyvaikutukset eikä pienimmällä annoksella saa olla havaittavia haittavaikutuksia kumpaankaan sukupolveen. 
Kun annos annetaan kapseleina tai ruokintaletkulla, se tulee määrittää 
kunkin eläimen painon perusteella ja säätää viikoittain painon muu ­
tosten mukaan. Kantavien naaraiden annos voidaan myös määrittää naaraan painon perusteella tiineyden 0-päivänä ja 6. päivänä.
 
R a j a - a n n o s t e s t i  
Jos lievästi myrkyllisiä aineita tutkittaessa 1 000 mg/kg ei vaikuta 
lisääntymiskykyyn, muita annostasoja ei tarvitse tutkia. Mikäli suu ­
rimmalla annoksella tehty esitesti aiheuttaa emossa selviä myrkky ­
vaikutuksia, mutta ei vaikuta hedelmällisyyteen, muita annostasoja ei 
ole tarpeen tutkia.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 507
 
Testin suorittaminen  
T e s t i n a i k a t a u l u  
Parentaalipolven (P) urosten päivittäinen altistus on aloitettava vie ­
roituksen jälkeen 5–9 viikon iässä ja vähintään viiden vuorokauden koeolosuhteisiin sopeuttamisen jälkeen. Rottia altistetaan 10 viikkoa 
ennen pariuttamisaikaa (hiiriä kahdeksan viikkoa). Urokset lopete ­
taan ja tutkitaan pariuttamisajan kuluttua. Vaihtoehtoisesti ne voidaan pitää testin ruokavaliolla mahdollisen toisen poikueen tuottamista varten. Tällöin ne lopetetaan ja tutkitaan jossakin vaiheessa ennen 
tutkimuksen päättymistä. Parentaalipolven (P) naaraiden altistuksen 
on alettava vähintään viiden vuorokauden sopeutumisajan kuluttua ja jatkuttava ainakin kahden viikon ajan ennen pariutumista. P-naarai ­
den päivittäisen altistuksen on jatkuttava koko kolmen viikon pari ­
uttamisajan ja tiineysajan aina F
 1 -poikasten vieroitukseen asti. Altis ­
tusaikataulun muutoksia voidaan harkita testattavasta aineesta saa ­
tavilla olevien tietojen, kuten metabolisten vaikutusten tai biokerty ­
vyyden perusteella.  
P a r i u t t a m i s m e n e t t e l y  
Tutkittaessa myrkkyjen vaikutusta hedelmällisyyteen voidaan eläimet 
pariuttaa joko 1:1 (yksi uros yhtä naarasta kohden) tai 1:2 (yksi uros kahta naarasta kohden).
 
Kun pariutetaan 1:1, yhtä naarasta pidetään saman uroksen luona 
kunnes tiineys alkaa tai kolme viikkoa on kulunut. Naaraat on tut ­
kittava joka aamu sperman tai emätintulpan havaitsemiseksi. Sper ­
man tai emätintulpan toteamispäivä on tiineyden 0-päivä.  
Pariutumattomat parit tutkitaan näennäisen lisääntymiskyvyttömyy ­
den selvittämiseksi.  
Näihin tutkimuksiin voi kuulua uuden pariutumismahdollisuuden jär ­
jestäminen toisen hedelmällisen naaraan tai uroksen kanssa, suku ­
puolielinten mikroskooppinen tutkimus ja estrussyklin sekä siemen ­
nestetuotannon tutkiminen.  
P o i k u e i d e n k o k o  
Lisääntymiskykytutkimuksen kuluessa altistettujen eläinten annetaan 
synnyttää normaalisti ja hoitaa poikueensa vieroitukseen asti ilman, että poikueita yhtenäistetään.
 
Jos poikueet yhtenäistetään, seuraavaa menetelmää suositellaan käy ­
tettäväksi. Syntymän jälkeen 1-4 päivän välisenä aikana poikuetta voidaan mukauttaa poistamalla liiat poikaset niin, että poikueeseen 
jää, jos mahdollista, neljä urosta ja neljä naarasta.
 
Silloin kun uros- tai naaraspuolisten poikasten määrä on sellainen, 
että poikueeseen ei jää neljää poikasta kumpaakin sukupuolta, voi ­
daan tehdä osittaismukautus (esimerkiksi viisi urosta ja kolme naa ­
rasta). Alle kahdeksan poikasen poikueita ei mukauteta.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 508
 
E l ä i n t e n t a r k k a i l u  
Kaikkien eläinten tarkkailu suoritetaan vähintään kerran päivässä 
koko tutkimuksen ajan. Käyttäytymistavan muutokset, vaikeat tai pitkittyneet synnytysoireet ja kaikki myrkkyoireet sekä kuolleisuus on kirjattava. Ennen pariutumista ja pariutumisajan kuluessa ravin ­
non kulutus voidaan mitata päivittäin. Synnytyksen jälkeinen ja ime ­
tyksen aikainen ravinnon kulutus (ja veden kulutus kun testattava aine annetaan juomavedessä) mitataan samana päivänä kun poikue punnitaan. P-urokset ja P-naaraat on punnittava ensimmäisenä altis ­
tuspäivänä ja sen jälkeen viikoittain. Nämä huomiot on kirjattava 
jokaisesta täysikasvuisesta koe-eläimestä erikseen.
 
Tiineysajan pituus on laskettava tiineyden 0-päivästä. Kukin poikue 
on tutkittava mahdollisimman pian synnytyksen jälkeen sekä kirjat ­
tava poikasten lukumäärä ja sukupuoli, kuolleena syntyneet, elävänä 
syntyneet ja paljain silmin havaittavat poikkeavuudet.  
Kuolleet ja neljäntenä päivänä lopetetut poikaset säilytetään ja tutki ­
taan poikkeavuuksien havaitsemiseksi. Elävät poikaset lasketaan ja poikue punnitaan synnytystä seuraavana aamuna sekä neljäntenä ja seitsemäntenä päivänä ja sen jälkeen viikoittain tutkimuksen päätty ­
miseen saakka, jolloin eläimet punnitaan yksitellen.
 
Emojen ja poikasten fyysiset poikkeavuudet ja käyttäytymishäiriöt 
kirjataan.  
Patologia  
R u u m i i n a v a u s  
Tutkimuksen kuluessa kuolleet tai lopetetut P-sukupolven eläimet 
tutkitaan mikroskooppisesti rakenteellisten poikkeavuuksien tai pato ­
logisten muutosten toteamiseksi. Huomiota kiinnitetään erityisesti sukupuolielimiin. Kuolleet tai huonokuntoiset poikaset tutkitaan 
poikkeavuuksien toteamiseksi.
 
H i s t o p a t o l o g i a  
Kaikkien P-eläinten munasarjat, kohtu, kohdunkaula, emätin, kivek ­
set, lisäkivekset, rakkularauhaset, eturauhanen, koagulaatiorauhanen, 
aivolisäke ja kohde-elimet on säilytettävä mikroskooppista tutkimusta 
varten. Ellei niitä ole tutkittu muissa moniannostutkimuksissa, ne on tutkittava mikroskooppisesti kaikkien suurimman annoksen saanei ­
den ja kontrollieläinten osalta sekä, mikäli mahdollista, tutkimuksen 
aikana kuolleiden eläinten osalta.
 
Elimet, joissa näillä eläimillä esiintyy poikkeavuuksia, on myös tut ­
kittava kaikkien muiden P-eläinten osalta. Näissä tapauksissa on kaikki näkyviä patologisia muutoksia osoittavat kudokset tutkittava mikroskooppisesti. Kuten pariuttamismenettelyä selostavassa koh ­
dassa esitetään, lisääntymiskyvyttömiksi epäiltyjen eläinten sukupuo ­
lielimet voidaan tutkia mikroskooppisesti.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 509
 
2. TULOKSET  
Tulokset voidaan esittää taulukkomuodossa, josta ilmenevät kuhun ­
kin koeryhmään kuuluvien eläinten lukumäärä testin alussa, hedel ­
mällisten urosten määrä, kantavien naaraiden määrä, muutosten laatu 
ja eläinten prosentuaalinen osuus kutakin muutosta kohden.  
Jos mahdollista, tulosten merkitsevyys on arvioitava jotakin tilastol ­
lista menetelmää käyttäen. Kaikki tunnetut tilastointimenetelmät ovat sallittuja.
 
3. RAPORTOINTI  
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tie ­
dot: 
— koe-eläinlaji/kanta,  
— myrkkyvaikutukset sukupuolen ja annostason perusteella sekä 
hedelmällisyys, tiineys ja elinkelpoisuus,  
— eläinten kuolinaika tutkimuksen kuluessa ja elossa olevat ennen 
lopetusajankohtaa tai tutkimuksen päättyessä,  
— taulukko, josta ilmenee kunkin poikueen paino, poikasten keski ­
paino ja kunkin poikasen paino tutkimuksen päättyessä,  
— lisääntymistä, poikasia ja syntymän jälkeistä kasvua koskevat 
myrkky- ja muut vaikutukset,  
— kunkin oireen toteamispäivä ja kehittyminen,  
— P-eläinten painoa koskevat tiedot,  
— ruumiinavauslöydökset,  
— tarkka selostus kaikista mikroskooppilöydöksistä,  
— tulosten tilastollinen käsittely,  
— tulosten pohdinta,  
— tulosten tulkinta.  
3.2 ARVIOINTI JA TULKINTA  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  
4. LÄHDELUETTELO  
Ks. Yleisjohdanto, osa B.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 510
 
B.35.  KAKSI SUKUPOLVEA KÄSITTÄVÄ LISÄÄNTYMISKYKYYN 
KOHDISTUVIEN MYRKYLLISYYSVAIKUTUSTEN 
TUTKIMUS  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä on toisinto OECD: n testiohjeesta nro 416 (2001).  
1.1 JOHDANTO  
Tällä kaksi sukupolvea käsittävällä reproduktiotestillä on tarkoitus 
tuottaa yleistä tietoa testiaineen vaikutuksista urosten ja naaraiden 
lisääntymiselinten vahingoittumattomuuteen ja toimintaan. Siihen si ­
sältyy sukupuolirauhasten toiminta, kiimasykli, pariutumiskäyttäyty ­
minen, hedelmöityminen, tiineys, synnytys, imetys ja vieroitus sekä 
testiaineen vaikutukset jälkeläisten kasvuun ja kehitykseen. Tutkimus 
voi myös tuottaa tietoja testiaineen vaikutuksista vastasyntyneiden sairastuvuuteen ja kuolleisuuteen sekä alustavia tietoja pre- ja post ­
nataalisen kehityksen aikaisista myrkyllisyysvaikutuksista. Tutkimus 
voi lisäksi ohjata seuraavien tutkimusten suorittamista. F1-sukupol ­
ven kasvun ja kehityksen lisäksi tämän testimenetelmän tarkoitus on arvioida F2-sukupolven urosten ja naaraiden lisääntymiselinten va ­
hingoittumattomuutta ja toimintaa sekä kasvua ja kehitystä. Lisätie ­
toja kehityksen aikaisista myrkyllisyysvaikutuksista ja toiminnalli ­
sista häiriöistä voidaan hankkia lisäämällä tässä kuvattuun tutkimus ­
ohjelmaan muita osatutkimuksia, joissa sovelletaan yleiseen ja/tai hermojen kehitykseen kohdistuvien myrkyllisyysvaikutusten tutki ­
musmenetelmiä, tai tutkimalla näitä loppupisteitä erillisillä testeillä 
soveltuvia testimenetelmiä käyttäen.
 
1.2 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Testiainetta annetaan porrastettuina annoksina useille uros- ja naa ­
rasryhmille. P-sukupolven uroksille tulee antaa testiainetta niiden 
kasvun aikana ja ainakin yhden kokonaisen spermatogeneesisyklin ajan (hiirellä noin 56 päivää ja rotalla 70 päivää), jotta spermatoge ­
neesiin kohdistuvat haittavaikutukset voidaan todeta. Spermaan koh ­
distuvat vaikutukset määritetään useiden spermaparametrien (esimer ­
kiksi siittiöiden morfologia ja liikkuvuus), kudospreparaattien ja yk ­
sityiskohtaisen histopatologisen tutkimuksen avulla. Jos käytettävissä on spermatogeneesiä koskevia tietoja aikaisemmasta toistuvaa annos ­
telua käyttäneestä tutkimuksesta, jonka kesto on riittävä, esimerkiksi 
90 päivää, P-sukupolven uroksia ei tarvitse sisällyttää arviointiin. On kuitenkin suositeltavaa säilyttää P-sukupolven spermanäytteet tai di ­
gitaaliset tallenteet myöhempää arviointia varten. P-sukupolven naa ­
raille tulee antaa testiainetta niiden kasvun aikana ja useiden koko ­
naisten kiimasyklien ajan, jotta testiaineen mahdolliset normaalia kii ­
masykliä häiritsevät haittavaikutukset voidaan todeta. Testiainetta annetaan poikasten vanhemmille (P-sukupolvi) pariutumisen aikana, 
tiineyden aikana ja niiden F1-poikasten vieroitukseen asti. Vieroituk ­
sesta lähtien ainetta annetaan F1-poikasille aikana, jolloin ne kehit ­
tyvät sukukypsiksi, pariutumisen aikana sekä F2-sukupolven synty ­
män jälkeen vieroitukseen asti.
 
Kaikista eläimistä tutkitaan myrkyllisyysvaikutusten merkit kliinisesti 
havainnoiden ja patologisten tutkimusten avulla kiinnittäen erityistä huomiota urosten ja naaraiden lisääntymiselinten vahingoittumatto ­
muuteen ja toimintaan sekä jälkeläisten kasvuun ja kehitykseen koh ­
distuviin vaikutuksiin.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 511
 
1.3 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.3.1  Eläinlajin valinta  
Suositeltava eläinlaji on rotta. Jos käytetään muita lajeja, niiden 
käyttö on erikseen perusteltava ja testimenetelmää on tarvittaessa 
mukautettava. Kantoja, joiden hedelmällisyys on alhainen tai joilla 
tiedetään esiintyvän kehityshäiriöitä, ei tule käyttää. Tutkimuksen alussa eläinten painon variaation tulisi olla mahdollisimman pieni, eikä se saa olla suurempi kuin 20 % kummankin sukupuolen paino ­
keskiarvosta.
 
1.3.2  Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta  
Koe-eläinhuoneen lämpötilan olisi oltava 22  o C (± 3  o ). Vaikka riit ­
tää, että suhteellinen kosteus on vähintään 30 % eikä mielellään ylitä 70 %:a muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, pitäisi kuitenkin 
pyrkiä 50-60 %:n suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa tulee käyttää 
keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pi ­
meää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorio ­
ruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. Ruokavalion 
valinnassa on varmistettava, että testiaineen ja ravinnon suhde on 
sopiva, mikäli testiaine annetaan ravintoon sekoitettuna.
 
Eläimet voidaan pitää häkeissä yksittäin tai muutaman samaa suku ­
puolta olevan eläimen ryhmissä. Parituksen tulee tapahtua tarkoituk ­
seen sopivissa häkeissä. Kun parituksen voidaan todeta tapahtuneen, 
kukin pariutunut naaras siirretään omaan synnytys- tai poikimishäk ­
kiinsä. Paritetut rotat voidaan myös pitää häkeissä pienissä ryhmissä ja erottaa toisistaan yksi tai kaksi päivää ennen synnytystä. Parite ­
tuille eläimille on annettava synnytyksen lähestyessä asianmukaiset 
ja etukäteen määritellyt pesäntekoaineet.
 
1.3.3  Eläinten valmistelu  
Testissä tulee käyttää terveitä, nuoria eläimiä, jotka on totutettu la ­
boratorio-olosuhteisiin vähintään viiden vuorokauden ajan ja joita ei ole aiemmin käytetty testeihin. Koe-eläinten laji, kanta, alkuperä, sukupuoli, paino ja/tai ikä on tunnettava. Mahdollisista sisarussuh ­
teista eläinten välillä on oltava selvillä, jotta sisarusten parittaminen 
voidaan välttää. Eläimet jaetaan satunnaisesti kontrolli- ja testiryh ­
mään (jaottelu ruumiinpainon mukaan on suositeltavaa). Häkit on sijoitettava siten, että häkin sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mah ­
dollisimman vähäisiä. Kullekin eläimelle annetaan oma tunnistenu ­
mero. P-sukupolvelle on annettava tunnistenumerot ennen annostelun aloittamista. F1-sukupolvelle tunnistenumerot annetaan paritukseen valittujen eläinten vieroituksen yhteydessä. F1-sukupolven kaikkien 
valittujen eläinten alkuperäispoikue on merkittävä muistiin. Lisäksi 
suositellaan, että poikasille annetaan yksilöllinen tunniste mahdolli ­
simman pian syntymän jälkeen, mikäli yksilöt aiotaan punnita tai mikäli niille aiotaan tehdä toiminnallisia testejä.
 
P-sukupolven eläinten tulee olla käsittelyn alkaessa noin 5-9 viikon 
ikäisiä. Eläinten tulee kaikissa testiryhmissä olla samanpainoisia ja 
-ikäisiä niin tarkasti kuin on käytännössä mahdollista.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 512
 
1.4 TESTIN SUORITUS  
1.4.1  Eläinten lukumäärä ja sukupuoli  
Kussakin testi- ja kontrolliryhmässä on oltava riittävä määrä eläimiä, 
jotta testiin saadaan mielellään vähintään 20 tiinettä naarasta, jotka 
synnyttävät tai joiden synnytysaika on lähellä. Tämä ei ehkä ole 
mahdollista testattaessa aineita, jotka aiheuttavat käsittelyyn liittyviä ei-toivottuja vaikutuksia (esimerkiksi steriiliys tai liian suuri myrkyl ­
lisyys ylimmällä annostasolla). Tavoitteena on tuottaa tarpeeksi tii ­
neystapauksia, jotta voidaan tehdä merkitsevä arvio testiaineen vai ­
kutuksesta hedelmällisyyteen, tiineyteen, emon käytökseen ja ime ­
tykseen, F1-sukupolven poikasten kasvuun ja kehitykseen hedelmöi ­
tyksestä sukukypsyyteen, sekä F1-sukupolven poikasten (F2) kehi ­
tykseen vieroitukseen asti. Jos tutkimuksessa ei päästä tavoiteltuun tiineiden eläinten määrään (20), tutkimus ei silti välttämättä ole epä ­
validi. Tutkimuksen validiteetti tulee arvioida kussakin tapauksessa 
erikseen.
 
1.4.2  Annosten valmistelu  
Testiaineen antaminen suun kautta (ravintoon tai juomaveteen sekoi ­
tettuna tai letkulla) on suositeltavaa, paitsi jos jokin muu antotapa 
(esimerkiksi ihoapplikaatio tai inhalaatio) todetaan sopivammaksi.  
Tarvittaessa testiaine liuotetaan tai siitä tehdään suspensio sopivaan 
kantaja-aineeseen. Ensiksi tulisi aina harkita vesiliuoksen/suspension käyttämistä, milloin se on mahdollista, seuraavaksi öljyliuoksen/ ­
emulsion (esimerkiksi maissiöljy) käyttämistä ja vasta sitten muiden 
kantaja-aineiden käyttämistä. Jos kantaja-aineena käytetään muuta 
kuin vettä, kantaja-aineen toksiset ominaisuudet on tunnettava. Testi ­
aineen stabiilius kantaja-aineessa on määritettävä.
 
1.4.3  Annostasot  
Testissä tulee käyttää vähintään kolmea annostasoa ja testin kanssa 
samaan aikaan tehtävää kontrollia. Jos testiaineen fysikaalinen/ ­
kemiallinen olomuoto tai biologiset ominaisuudet eivät aseta rajoi ­
tuksia, suurin annos valitaan sellaiseksi, että se aiheuttaa myrkylli ­
syysvaikutuksen mutta ei aiheuta kuolemaa tai kovia tuskia. Mikäli odottamatonta kuolleisuutta esiintyy, hyväksyttävä on yleensä sellai ­
nen tutkimus, jossa P-sukupolven kuolleisuus on alle 10 %. Annos ­
tasot on porrastettava laskevasti siten, että tutkimuksessa saadaan 
esiin mahdolliset annostasoihin liittyvät vaikutukset sekä haitaton altistustaso (NOAEL). Kaksinkertaiset-nelinkertaiset erot annostaso ­
jen välillä ovat usein parhaimmat alenevissa annossarjoissa, ja usein 
on parempi lisätä neljäs testiryhmä kuin käyttää hyvin suuria annos ­
välejä (esimerkiksi yli kymmenkertaisia annosvälejä). Tutkimuksissa, joissa testiaine annetaan ravintoon sekoitettuna, annostasojen väliset erot saavat olla enintään kolminkertaisia. Annostasojen valinnassa 
tulee ottaa huomioon aikaisemmat myrkyllisyystiedot ja erityisesti 
toistettujen annostelututkimusten tulokset. Tutkimuksessa on otettava huomioon myös tiedot testiaineen tai muiden sen kanssa samantyyp ­
pisten materiaalien metaboloitumisesta elimistössä samoin kuin nii ­
den toksikokineettisistä ominaisuuksista. Nämä tiedot auttavat myös 
osoittamaan, että annostasot on valittu oikein.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 513
 
Kontrolliryhmän tulee olla joko ryhmä, joka ei saa käsittelyä, tai 
kantaja-ainetta saava ryhmä, mikäli testiaineen antamisen yhteydessä 
käytetään kantaja-ainetta. Kontrolliryhmän eläimiä tulee käsitellä sa ­
malla tavoin kuin testiryhmän eläimiä (testiainekäsittelyä lukuun ot ­
tamatta). Jos käytetään kantaja-ainetta, kontrolliryhmälle tulee antaa 
tilavuudeltaan suurin käytetty kantaja-aineannos. Jos testiaine anne ­
taan ravintoon sekoitettuna ja se vähentää ravinnonottoa tai ravinnon hyväksikäyttöä elimistössä, voi olla tarpeen käyttää parikontrolliryh ­
mää. Samanaikaisen parikontrolliryhmän sijasta voidaan käyttää tie ­
toja, jotka on saatu sellaisista tutkimuksista, joilla on selvitetty vä ­
hentyneen ravinnonoton vaikutusta lisääntymisfysiologisiin paramet ­
reihin.
 
Kantaja-ainetta tai muuta lisäainetta käytettäessä aineesta on syytä 
selvittää seuraavat ominaisuudet: vaikutus testiaineen absorboitumi ­
seen, jakautumiseen, metaboloitumiseen ja elimistössä säilymiseen, sellaiset vaikutukset testiaineen kemiallisiin ominaisuuksiin, jotka saattavat muuttaa testiaineen myrkyllisyyttä, sekä vaikutukset koe- 
eläinten ravinnon- ja juomanottoon tai ravitsemustilaan.
 
1.4.4  Raja-annostesti  
Jos jokin testin annostaso, joka on vähintään 1 000 mg/kg (eläimen 
painokilo)/vrk tai vastaava suhteellinen määrä ravinnossa tai juomav ­
edessä, milloin testiaine annetaan ravinnon tai juomaveden seassa, ja 
joka annetaan tässä testimenetelmässä kuvattujen menettelyjen mu ­
kaisesti, ei aiheuta lainkaan havaittavaa myrkyllisyysvaikutusta poi ­
kasten vanhemmissa tai poikasissa ja jos myrkyllisyysvaikutusta ei 
aikaisempien tutkimustulosten perusteella ole odotettavissa (esimer ­
kiksi rakenteellisesti ja/tai metabolisesti samantyyppiset yhdisteet), täydellinen useita annostasoja käyttävä testi ei välttämättä ole tar ­
peen. Raja-annostestiä voidaan soveltaa, paitsi silloin, kun ihmisten 
altistuminen viittaa siihen, että on käytettävä suurempaa suun kautta 
annettavaa annosta. Muita antotapoja, kuten inhalaatiota tai ihoapp ­
likaatiota käytettäessä, testiaineen fysikokemialliset ominaisuudet, esimerkiksi liukoisuus, saattavat usein osoittaa altistuksen enimmäis ­
tason ja rajoittaa sitä.
 
1.4.5  Antotapa  
Testiainetta annetaan eläimille seitsemänä päivänä viikossa. Suun 
kautta tapahtuva antotapa (ravintoon tai juomaveteen sekoitettuna tai letkulla) on suositeltava. Jos käytetään muuta antotapaa, testin 
tekijän on perusteltava muun antotavan käyttö ja muutettava muita 
kohtia vastaavasti. Kaikille eläimille tulee antaa testiaineannokset samalla tavalla asianmukaisena koeaikana. Jos testiaine annetaan let ­
kulla, on syytä käyttää mahaletkua. Kerralla annettavan nesteen tila ­
vuus ei saa ylittää 1 ml/100 g eläimen painoa (maissiöljyä käytettä ­
essä tilavuus saa olla enintään 0,4 ml/100 g eläimen painoa), paitsi käytettäessä vesiliuosta, jolloin enimmäistilavuus voi olla 2 ml/100 g eläimen painoa. Testiaineen tilavuuden vaihtelu tulee minimoida pi ­
toisuutta muuttamalla, jotta kaikilla annostasoilla voidaan käyttää 
tilavuudeltaan samaa nestemäärää. Poikkeuksena tästä ovat ärsyttävät tai syövyttävät aineet, joiden kohdalla voidaan yleensä todeta vaiku ­
tusten voimistuminen suurempia pitoisuuksia käytettäessä. Letkuan ­
nostelua käyttävissä tutkimuksissa poikaset saavat yleensä testiainetta 
vain epäsuorasti emon maidosta vieroitukseen asti, jolloin annosten antaminen poikasille aloitetaan. Tutkimuksissa, joissa testiaine anne ­
taan ravintoon tai juomaveteen sekoitettuna, poikaset saavat lisäksi 
testiainetta suoraan, kun ne alkavat itse syödä imetysajan viimeisellä 
viikolla.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 514
 
Jos aineita annetaan eläimille ravintoon tai juomaveteen sekoitettuna, 
on tärkeää varmistaa, että testiainemäärät eivät häiritse normaalia 
ravinto- tai nestetasapainoa. Jos testiaine annetaan ravintoon sekoi ­
tettuna, voidaan ilmoittaa joko testiaineen pitoisuus ravinnossa (ppm) tai eläimen painoon suhteutettu annos; käytetty tapa on mainittava. 
Jos testiaine annetaan letkulla, annos tulee antaa päivittäin samaan 
aikaan ja sitä on mukautettava vähintään viikoittain siten, että annos ­
taso pysyy samana eläimen ruumiinpainoon nähden. Näin menetel ­
täessä on otettava huomioon tiedot testiaineen leviämisestä istukan 
kautta.
 
1.4.6  Testiaikataulu  
P-sukupolven urosten ja naaraiden päivittäinen käsittely aloitetaan, 
kun eläimet ovat 5–9 viikon ikäisiä. F1-sukupolven urosten ja naa ­
raiden päivittäinen käsittely aloitetaan vieroituksen yhteydessä pitäen kuitenkin mielessä, että jos testiaine annetaan ravintoon tai juoma ­
veteen sekoitettuna, F1-sukupolven poikaset saattavat altistua testi ­
aineelle jo imetysaikana. Molempien sukupuolten käsittelyä jatketaan 
sekä P- että F1-ryhmissä ainakin kymmenen viikon ajan ennen pa ­
rittamisvaihetta. Molempien sukupuolten käsittelyä jatketaan myös kahden viikon parittamisjakson aikana. Urokset lopetetaan inhimilli ­
sellä tavalla ja tutkitaan, kun niitä ei enää tarvita lisääntymisfysiolo ­
gisten vaikutusten arviointiin. P-sukupolven naaraiden käsittelyä jat ­
ketaan koko tiineysajan ja F1-sukupolven poikasten vieroitukseen asti. Annosteluaikataulun mukauttamista harkittaessa tulee ottaa huo ­
mioon käytettävissä olevat tiedot testiaineesta, mukaan lukien aikai ­
semmat myrkyllisyystiedot sekä metaboloituminen tai biologinen kertyminen. Kunkin eläimen annos on yleensä määriteltävä eläimen viimeksi määritetyn ruumiinpainon mukaan. Annoksen mukauttami ­
sessa viimeisen tiineyskolmanneksen aikana on kuitenkin oltava va ­
rovainen.
 
P- ja F1-sukupolvien urosten ja naaraiden käsittelyä jatketaan eläin ­
ten lopettamiseen asti. P- ja F1-sukupolvien kaikki aikuiset urokset ja naaraat tulee lopettaa inhimillisellä tavalla, kun eläimiä ei enää tar ­
vita lisääntymisfysiologisten vaikutusten arviointiin. F1-sukupolven 
poikaset, joita ei valita paritukseen, ja kaikki F2-sukupolven poikaset 
lopetetaan inhimillisellä tavalla vieroituksen jälkeen.
 
1.4.7  Paritus  
1.4.7.1  P-sukupolven paritus  
Kussakin parituksessa jokainen naaras on samassa häkissä yhden, 
samalla annostasolla olevan uroksen kanssa (1:1-paritus) siihen saak ­
ka, kunnes eläimet parittelevat tai kunnes kaksi viikkoa on kulunut. 
Naaraat tutkitaan päivittäin sperman tai vaginan tulpituksen toteami ­
seksi. Tiineyden päivä 0 katsotaan päiväksi, jolloin jompikumpi to ­
detaan. Jos parittelua ei tapahdu, voidaan harkita naaraan uutta pa ­
ritusta saman ryhmän hedelmällisiksi todettujen urosten kanssa. Pa ­
riutuneet eläinparit on merkittävä muistiin. Sisarusten parittamista on 
vältettävä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 515
 
1.4.7.2  F1 -sukupolven paritus  
F1-sukupolven eläinten paritus tapahtuu siten, että kustakin poiku ­
eesta valitaan vieroituksen yhteydessä vähintään yksi uros ja yksi naaras, jotka paritetaan samalla annostasolla olevien eri poikueeseen 
kuuluvien poikasten kanssa. Näin syntyvä sukupolvi on F2-sukupol ­
vi. Poikaset valitaan kustakin poikueesta satunnaisesti, jos poikasten ruumiinpainossa tai ulkomuodossa ei ole merkittäviä eroja. Jos täl ­
laisia eroja havaitaan, kustakin poikueesta on valittava sitä parhaiten 
edustavat yksilöt. Käytännössä valinta on paras tehdä ruumiinpainon 
perusteella, mutta se voidaan tehdä myös ulkomuodon perusteella. F1-sukupolven poikasia ei saa parittaa ennen kuin ne ovat saavutta ­
neet täyden sukukypsyyden.
 
Poikimattomien parien hedelmättömyyden todennäköinen syy on ar ­
vioitava. Menetelminä voidaan käyttää toista paritusta muiden hedel ­
mällisiksi todettujen urosten tai naaraiden kanssa, lisääntymiselinten mikroskooppitutkimusta sekä kiimasyklien ja spermatogeneesin tut ­
kimista.
 
1.4.7.3  Toinen paritus  
Joissakin tapauksissa, esimerkiksi kun havaitaan käsittelyyn liittyviä 
muutoksia poikueen koossa tai epäselviä vaikutuksia ensimmäisessä parituksessa, on suositeltavaa parittaa P- tai F1-sukupolven aikuiset eläimet uudelleen toisen poikueen tuottamiseksi. Suositeltava tapa on 
parittaa uudelleen naaraat tai urokset, jotka eivät ole tuottaneet poi ­
kuetta vastakkaisen sukupuolen hedelmälliseksi todetun eläimen kanssa. Jos toisen poikueen tuottamista pidetään tarpeellisena jom ­
massakummassa sukupolvessa, eläimet on paritettava uudelleen noin 
viikon kuluttua viimeisen poikueen vieroituksesta.
 
1.4.7.4  Poikueen koko  
Eläinten on annettava poikia normaalisti ja kasvattaa poikaset vieroi ­
tukseen asti. Poikueen koon vakioiminen ei ole välttämätöntä. Jos vakiointia käytetään, vakiointimenetelmä on kuvattava yksityiskoh ­
taisesti.
 
1.5 HAVAINNOT  
1.5.1  Kliiniset havainnot  
Yleinen kliininen havainnointi on tehtävä päivittäin, ja letkuruokin ­
nassa havainnoinnin ajoitusta suunniteltaessa on syytä ottaa huomi ­
oon se, milloin annoksen antamisen jälkeen odotetut myrkyllisyys ­
vaikutukset ovat suurimmillaan. Käytösmuutokset, vaikean tai pitkit ­
tyneen synnytyksen merkit ja kaikki myrkyllisyysvaikutusten merkit on kirjattava. Kukin eläin on lisäksi tutkittava yksityiskohtaisesti esimerkiksi punnituksen yhteydessä ainakin viikoittain. Kaikkia eläi ­
miä havainnoidaan kaksi kertaa päivässä ja tarvittaessa viikonloppui ­
sin kerran päivässä sairastuvuuden ja kuolleisuuden toteamiseksi.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 516
 
1.5.2  Poikasia saaneiden eläinten paino sekä ravinnon- ja nesteenotto  
Poikasia saaneet eläimet (P ja F1) punnitaan annostelun aloituspäi ­
vänä ja sen jälkeen ainakin kerran viikossa. Poikasia saaneet naaraat (P ja F1) punnitaan ainakin tiineyspäivinä 0, 7, 14 ja 20 tai 21 sekä 
imetyksen aikana poikueiden punnituspäivinä sekä eläinten lopetus ­
päivänä. Havainnot raportoidaan erikseen kustakin täysikasvuisesta eläimestä. Paritusta edeltävänä aikana ja tiineysjaksojen aikana ravin ­
nonotto tulee mitata vähintään viikoittain. Juomanotto mitataan vä ­
hintään viikoittain, jos testiaine annetaan juomaveteen sekoitettuna.
 
1.5.3  Kiimasykli  
Kiimasyklin pituus ja normaalius arvioidaan P- ja F1-sukupolven 
naaraista ottamalla vaginasta irtosolunäyte ennen pariutumista sekä haluttaessa myös pariutumisjakson aikana, kunnes pariutumisen voi ­
daan todeta tapahtuneen. Otettaessa irtosolunäytettä vaginasta tai 
kohdunkaulasta on varottava limakalvojen vahingoittamista ja siitä 
seuraavaa valeraskautta (1).
 
1.5.4  Siemennesteen muuttujat  
Lopettamisen yhteydessä kaikilta P- ja F1-uroksilta kirjataan kivesten 
ja lisäkivesten paino ja yksi kappale kumpaakin elintä säilötään his ­
topatologista tutkimusta varten (katso kohdat 1.5.7 ja 1.5.8.1). Sekä 
P- että F1-sukupolven kustakin ryhmästä erotetaan vähintään kym ­
menen uroksen osajoukko, jonka lopuista kiveksistä ja lisäkiveksistä lasketaan homogenisoinnille resistentit spermatidit ja lisäkiveksen häntään varastoituneen siemennesteen määrä. Samalta osajoukolta 
kerätään siemenneste lisäkiveksen hännästä tai siemenjohtimesta siit ­
tiöiden liikkuvuuden ja morfologian arviointia varten. Jos havaitaan käsittelyyn liittyviä vaikutuksia tai jos muissa tutkimuksissa on osoi ­
tettu mahdollisia vaikutuksia spermatogeneesiin, jokaisen ryhmän 
kaikkien urosten siemenneste tulee arvioida. Muussa tapauksessa riittää, että laskenta tehdään kontrolliryhmän ja korkean annostaso ­
ryhmän P- ja F1-eläimille.
 
Homogenisoinnille resistenttien kiveksissä olevien spermatidien ja 
lisäkiveksen häntään varastoituneiden siittiöiden määrä on laskettava 
(2)(3). Lisäkiveksen häntään varastoituneiden siittiöiden määrä voi ­
daan johtaa kvalitatiiviseen arviointiin käytetyn suspension sisältä ­
mien siittiöiden pitoisuudesta ja tilavuudesta sekä jäljelle jääneen lisäkiveksen hännän kudoksen jauhamisen ja/tai homogenoinnin jäl ­
keen saadusta siittiöiden lukumäärästä. Laskenta tulee tehdä valitulle 
urosten osajoukolle kaikissa annosryhmissä heti eläinten lopettami ­
sen jälkeen, paitsi jos käytetään video- tai digitaalista tallennusta tai jos näytteet jäädytetään myöhempää analyysia varten. Näissä tapauk ­
sissa kontrolliryhmät ja ylin annosryhmä voidaan analysoida ensin. 
Jos mitään käsittelyyn liittyviä vaikutuksia (esimerkiksi vaikutukset siittiöiden määrään, liikkuvuuteen tai morfologiaan) ei havaita, muita annosryhmiä ei tarvitse analysoida. Jos taas ylimmässä annosryh ­
mässä havaitaan käsittelyyn liittyviä vaikutuksia, myös alemmat an ­
nosryhmät on arvioitava.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 517
 
Lisäkiveksessä (tai siemenjohtimessa) olevien siittiöiden liikkuvuus 
tulee arvioida tai videoida heti eläimen lopettamisen jälkeen. Siittiöt 
kerätään niitä mahdollisimman vähän vaurioittaen ja sperma laimen ­
netaan liikkuvuusanalyysia varten hyväksyttyjä menetelmiä käyttäen (4). Progressiivisesti liikkuvien siittiöiden prosenttiosuus tulee mää ­
rittää joko subjektiivisesti tai objektiivisesti. Kun tehdään tietokonea ­
vusteinen liikkuvuusanalyysi (5) (6) (7) (8) (9) (10), progressiivinen liikkuvuus johdetaan käyttäjän määrittelemien keskimääräisten no ­
peuden ja suoruuden kynnysarvojen eli lineaarisen indeksin mukaan. 
Jos näytteet on videoitu (11) tai kuvat on muulla tavoin tallennettu 
ruumiinavauksen yhteydessä, jatkoanalyysi tarvitsee tehdä vain kont ­
rolliryhmän ja ylimmän annosryhmän P- ja F1-sukupolvien uroksille. Jos kuitenkin havaitaan käsittelyyn liittyviä vaikutuksia, myös alem ­
mat annosryhmät on arvioitava. Jos video- tai digitaalitallenteita ei 
ole tehty, kaikkien testiryhmien kaikki näytteet tulee analysoida ruu ­
miinavauksen yhteydessä.
 
Lisäkiveksen (tai siemenjohtimen) siemennestenäytteestä tehdään 
morfologinen arvio. Siemenneste (vähintään 200 siittiötä/näyte) tut ­
kitaan fiksatiivikäsiteltynä märkäpreparaattina (12) ja luokitetaan joko normaaliksi tai epänormaaliksi. Morfologisiin siemennesteen epänormaaliuksiin kuuluvat siittiöiden fuusio, eristyneet päät sekä 
päiden tai häntien epämuodostumat. Arviointi on tehtävä kaikista 
annosryhmistä valitulle urosten osajoukolle joko heti eläinten lopet ­
tamisen jälkeen tai myöhemmin video- tai digitaalitallenteiden poh ­
jalta. Kun preparaatit on käsitelty fiksatiivilla, ne voidaan tutkia 
myöhemminkin. Näissä tapauksissa kontrolliryhmä ja ylin annos ­
ryhmä voidaan tutkia ensin. Jos mitään käsittelyyn liittyviä vaikutuk ­
sia (esimerkiksi vaikutuksia sperman morfologiaan) ei havaita, alem ­
pia annosryhmiä ei tarvitse analysoida. Jos käsittelyyn liittyviä vai ­
kutuksia esiintyy ylimmässä annosryhmässä, myös alemmat annosta ­
soryhmät on arvioitava.
 
Jos jokin edellä kuvatuista siemennesteen muuttujista on jo tutkittu 
vähintään 90 päivää kestäneissä systeemisen myrkyllisyyden tutki ­
muksissa, tutkimusta ei tarvitse toistaa tässä yhteydessä. On kuiten ­
kin suositeltavaa tallentaa P-sukupolven näytteet tai siemennesteen digitaalinen tallenne mahdollista myöhempää tutkimusta varten.
 
1.5.5  Poikaset  
Kukin poikue tutkitaan mahdollisimman pian synnytyksen jälkeen 
(imetyspäivä 0) ja poikueista määritetään poikasten lukumäärä ja 
sukupuoli, kuolleena ja elävänä syntyneiden poikasten määrä sekä merkittävien poikkeavuuksien esiintyminen. Poikasista, jotka löyde ­
tään kuolleina päivänä 0, on mielellään tutkittava mahdolliset kehi ­
tyshäiriöt ja kuolinsyy, mikäli mahdollista, ja ruumiit säilötään. Elä ­
vät poikaset lasketaan ja punnitaan kukin erikseen synnytyksen yh ­
teydessä (imetyspäivä 0) tai päivänä 1 sekä säännöllisesti punnitus ­
päivinä, esimerkiksi imetyspäivinä 4, 7, 14 ja 21. Emoissa tai poi ­
kasissa havaitut ruumiilliset epämuodostumat tai epänormaali käyt ­
täytyminen on merkittävä muistiin.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 518
 
Poikasten ruumiillisesta kehityksestä kirjataan lähinnä painonlisäys. 
Muista fyysisistä muuttujista (esimerkiksi korvien ja silmien avautu ­
minen, hampaiden puhkeaminen, karvankasvu) voidaan saada täy ­
dentäviä tietoja, mutta tällaiset tiedot tulee mielellään arvioida suku ­
kypsyystietojen pohjalta (esimerkiksi ikä ja ruumiinpaino emättimen 
avautuessa tai terskan ja esinahan erotessa) (13). Toiminnalliset tut ­
kimukset (esimerkiksi motoriset toiminnot, aistitoiminnot, refleksien kehitys), jotka liittyvät erityisesti sukukypsyyden saavuttamiseen, suositellaan tehtäväksi F1-sukupolven poikasille ennen vieroitusta 
ja/tai sen jälkeen, mikäli edellä mainittuja tutkimuksia ei ole tehty 
erillisten tutkimusten yhteydessä. F1-sukupolven vieroitetuista, pari ­
tukseen valituista poikasista tulee määrittää ikä emättimen avautuessa ja esinahan irtautuessa. Peräaukon ja sukupuolielinten välinen etäi ­
syys on mitattava F1-sukupolven poikasilta syntymän jälkeisenä päi ­
vänä 0, mikäli F1-sukupolven sukupuolijakauman muutokset tai su ­
kukypsyyden saavuttamisen ajoitus antavat siihen aihetta.
 
Toimintoja koskevia havaintoja ei tarvitse tehdä ryhmistä, jotka muu ­
toin osoittavat selviä haittavaikutusten merkkejä (esimerkiksi merkit ­
tävä painonnousun väheneminen). Jos toiminnallisia tutkimuksia teh ­
dään, niitä ei tule tehdä paritettaviksi valituille poikasille.  
1.5.6  Ruumiinavaus  
Rakenne-epämuodostumat tai patologiset muutokset tutkitaan mak ­
roskooppisesti lopettamisen tai tutkimuksen kuluessa sattuneen kuo ­
leman yhteydessä kaikista poikasia saaneista eläimistä (P ja F1), 
kaikista poikasista, joissa on näkyviä epämuodostumia tai kliinisiä merkkejä, sekä yhdestä satunnaisesti F1- ja F2-sukupolvesta valitusta poikasesta kummastakin sukupuolesta ja kustakin poikueesta. Eri ­
tyistä huomiota tulee kiinnittää lisääntymiselimiin. Kuolemaisillaan 
olevista poikasista, jotka lopetetaan inhimillisellä tavalla, sekä kuol ­
leista poikasista (niiden ruumiin kunnon salliessa) tulee tutkia mah ­
dolliset häiriöt ja/tai kuolinsyy, ja ruumiit tulee säilöä.
 
Kaikkien ensi kertaa poikineiden naaraiden kohduista tutkitaan imp ­
lantaatiokohtien olemassaolo ja niiden määrä tavalla, joka ei haittaa histopatologista tutkimusta.
 
1.5.7  Elinten paino  
Lopettamisen aikaan P- ja F1-sukupolven vanhemmilta määritetään 
ruumiinpaino sekä seuraavien elinten paino (parilliset elimet punni ­
taan erikseen):  
— kohtu ja munasarjat,  
— kivekset ja lisäkivekset (kokonaispaino ja häntäosan paino),  
— eturauhanen,  
— rakkularauhaset ja eturauhasen etuosa sekä niiden nesteet ja etu ­
rauhanen (yhtenä kokonaisuutena),  
— aivot, maksa, munuaiset, perna, aivolisäke, kilpirauhanen ja lisä ­
munuaiset sekä määritetyt kohde-elimet.  
F1- ja F2-sukupolvien ruumiinavaukseen valittujen poikasten paino 
määritetään lopetuksen yhteydessä. Kummastakin sukupuolesta ja 
kustakin poikueesta satunnaisesti valitulta poikaselta (katso kohta 
1.5.6) punnitaan aivot, perna ja kateenkorva.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 519
 
Ruumiinavaustulosten ja elinten punnitustulosten arvioinnissa tulee 
ottaa huomioon muissa toistuvaa annostelua käyttävissä tutkimuk ­
sissa tehdyt havainnot, milloin niitä on saatavissa.  
1.5.8  Histopatologinen tutkimus  
1.5.8.1 Poikasia saaneet eläimet  
Poikasia saaneilta eläimiltä (P ja F1) irrotetaan seuraavat elimet ja 
kudokset tai niiden edustavat näytteet. Kudokset tai näytteet käsitel ­
lään fiksatiivilla ja säilötään sopivalla tavalla histopatologista tutki ­
musta varten.  
— emätin, kohtu ja kohdunkaula sekä munasarjat (säilötään sovel ­
tuvassa fiksatiivissa),  
— yksi kives (säilötään Bouinin fiksatiivissa tai vastaavassa), yksi 
lisäkives, rakkularauhaset, eturauhanen ja sen etuosa,  
— etukäteen määritetyt kohde-elimet kaikilta paritukseen valituilta 
P- ja F1-eläimiltä.  
Kaikille paritukseen valituille ylimpiin annosryhmiin ja kontrolliryh ­
miin kuuluville P- ja F1-sukupolven eläimille tulee tehdä edellä 
mainittujen elinten ja kudosten täydellinen histopatologinen tutkimus. 
P-sukupolven eläinten munasarjojen tutkimus ei ole pakollinen. Eli ­
met, joissa todetaan käsittelyyn liittyviä muutoksia, on tutkittava myös alemmissa ja keskikokoisissa annosryhmissä NOAEL-tason 
määrityksen helpottamiseksi. Lisäksi on tutkittava histopatologisin 
menetelmin lisääntymiselimet sellaisilta alempiin ja keskikokoisiin annosryhmiin kuuluvilta eläimiltä, joiden kohdalla epäillään vähen ­
tynyttä hedelmällisyyttä, toisin sanoen niiltä, jotka eivät pariutuneet, 
hedelmöityneet, siittäneet tai synnyttäneet terveitä poikasia, tai niiltä, 
joiden kiimasykliin tai sperman määrään, liikkuvuuteen tai morfolo ­
giaan testiaine vaikutti. Kaikki vakavat vauriot, kuten surkastumat tai kasvaimet on tutkittava.
 
Kivesten yksityiskohtaisella histopatologisella tutkimuksella (esimer ­
kiksi Bouinin fiksatiivi, parafiinivalu ja 4–5 μm paksut poikittaisleik ­
keet) tulee määrittää käsittelyn aiheuttamat vaikutukset, kuten rauh ­
aseen jääneet spermatidit, puuttuvat itusolukerrokset tai -tyypit, mo ­
nitumaiset jättisolut tai spermatogeenisten solujen irtoaminen lume ­
niin (14). Koskemattomasta lisäkiveksestä tulee tutkia pää-, runko- ja 
häntäosa pitkittäisleikkeen avulla. Lisäkiveksestä tulee arvioida leu ­
kosyytti-infiltraatio, solutyyppien esiintyvyyden muutokset, aberrantit solutyypit sekä siemennesteen fagosytoosi. PAS- ja hematoksylii ­
nivärjäystä voidaan käyttää urosten lisääntymiselinten tutkimukseen.
 
Imetyksen jälkeisen vaiheen munasarjojen pitäisi sisältää varhaismu ­
narakkuloita ja kasvavia munarakkuloita sekä imetysvaiheen suuria 
keltarauhasia. Histopatologisessa tutkimuksessa olisi pystyttävä osoit ­
tamaan varhaismunarakkuloiden väheneminen kvalitatiivisesti. Var ­
haismunarakkuloiden kvantitatiivinen arvio tulee tehdä F1-sukupol ­
ven naaraille. Eläinten määrän, munasarjaleikkeen valinnan sekä leik ­
keen näytekoon tulee sopia käytettävään tilastolliseen arviointimenet ­
telyyn. Tutkimuksessa on laskettava varhaismunarakkuloiden määrä, johon voidaan yhdistää pienten kasvavien munarakkuloiden määrä, 
jotta käsiteltyjä munasarjoja ja kontrolliryhmään kuuluvia munasar ­
joja voidaan verrata. (15) (16) (17) (18) (19).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 520
 
1.5.8.2 Vieroitetut poikaset  
Vakavasti epämuodostuneet kudokset ja kohde-elimet kaikilta poika ­
silta, joilla on ulkoisia epämuodostumia tai kliinisiä merkkejä, sekä yhdeltä sellaiselta F1- ja F2-sukupolvesta satunnaisesti valitulta poik ­
aselta kummastakin sukupuolesta ja kustakin poikueesta, jota ei ole 
valittu paritukseen, käsitellään fiksatiivilla ja säilötään sopivalla ta ­
valla histopatologista tutkimusta varten. Säilötyille kudoksille teh ­
dään täydellinen histopatologinen määritys, jossa pääpaino on lisään ­
tymiselinten tutkimisessa.
 
2. MÄÄRITYSTULOKSET  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Tiedot raportoidaan yksilöittäin ja esitetään taulukossa, jossa on eri ­
telty testiryhmittäin ja sukupolvittain eläinten määrä testin alussa, 
testin aikana kuolleiden tai inhimillisistä syistä lopetettujen eläinten määrä, milloin eläimet ovat kuolleet tai lopetettu, fertiilien eläinten määrä, tiineiden naaraiden määrä, niiden eläinten määrä, joissa myr ­
kyllisyysvaikutuksia on havaittavissa, kuvaus havaituista myrkylli ­
syysvaikutuksista mukaan lukien myrkytysoireiden alkamisaika, kesto ja vakavuus, millaisia havaintoja vanhemmista ja poikasista on tehty, millaisia histopatologisia muutoksia on havaittu sekä kaikki 
asiaankuuluvat tiedot poikueesta.
 
Numeeriset tulokset arvioidaan sopivalla, yleisesti hyväksytyllä tilas ­
tollisella menetelmällä, joka on valittava tutkimusta suunniteltaessa ja jonka valinta on perusteltava. Annostasovasteiden tilastolliset mallit 
voivat olla avuksi tietojen analyysissa. Tutkimusselosteessa on oltava 
analyysimenetelmästä ja käytetystä tietokoneohjelmasta riittävät tie ­
dot, jotta riippumaton arvioija/tilastoasiantuntija voi niiden avulla arvioida ja rekonstruoida analyysin.
 
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI  
Kaksi sukupolvea käsittävän lisääntymiskykyyn kohdistuvien myr ­
kyllisyysvaikutusten tutkimuksen löydökset — mukaan lukien ruu ­
miinavauslöydökset ja mikroskooppiset löydökset — on arvioitava 
havaittujen vaikutusten pohjalta. Arvioinnissa tulee todeta testiaineen 
annostason ja epämuodostumien tai häiriöiden — mukaan lukien vakavat vauriot, tietyt kohde-elimet, vaikutukset hedelmällisyyteen, kliiniset häiriöt, vaikutukset lisääntymiskykyyn ja poikueen kokoon/ ­
laatuun, ruumiinpainon muutokset, vaikutukset kuolleisuuteen sekä 
muut myrkyllisyysvaikutukset — esiintyvyyden ja vaikutusten vaka ­
vuuden välinen mahdollinen suhde. Testitulosten arvioinnissa on otettava huomioon testiaineen fysikokemialliset ominaisuudet ja tok ­
sikokineettiset tiedot, milloin jälkimmäisiä on saatavissa.
 
Asianmukaisesti toteutetussa lisääntymiskykyyn kohdistuvien myr ­
kyllisyysvaikutusten tutkimuksessa pitäisi saada tyydyttävä arvio hai ­
tattomasta annostasosta sekä tietoa haittavaikutuksista lisääntymisky ­
kyyn, synnytykseen, imetykseen sekä syntymän jälkeiseen kehityk ­
seen mukaan lukien kasvu ja sukupuolinen kehitys.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 521
 
2.3 TULOSTEN TULKINTA  
Kaksi sukupolvea käsittävä lisääntymiskykyyn kohdistuvien myrkyl ­
lisyysvaikutusten tutkimus tuottaa tietoja toistuvan testiainealtistuk ­
sen vaikutuksista kaikissa lisääntymiskierron vaiheissa. Erityisesti 
tutkimus tuottaa tietoja lisääntymisfysiologisista muuttujista sekä poi ­
kasten kehityksestä, kasvusta, sukukypsyyden saavuttamisesta ja eloonjäämisestä. Tutkimuksen tulokset on tulkittava yhdessä subk ­
roonisten, prenataalisen kehityksen aikaisten ja toksikokineettisten 
sekä muiden käytettävissä olevien tutkimustulosten kanssa. Tämän 
tutkimuksen tulosten pohjalta voidaan arvioida tietyn kemikaalin jat ­
kotutkimustarve. Tulosten ekstrapolointi koskemaan ihmistä on vali ­
dia rajoitetussa määrin. Tuloksia voidaan parhaiten käyttää haitatto ­
man annostason ja ihmisille sallitun altistuksen määrittämiseen (20) (21) (22) (23).
 
3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
3.1. TESTISELOSTE  
Testiselosteessa on annettava seuraavat tiedot:  
Testiaine:  
— fysikaalinen olomuoto ja tarvittaessa fysikokemialliset ominai ­
suudet,  
— tunnistetiedot,  
— puhtaus.  
Kantaja-aine (tarvittaessa):  
— jos kantaja-aine on muu kuin vesi, sen valinta on perusteltava.  
Koe-eläinlajit:  
— käytetty eläinlaji ja kanta,  
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli,  
— toimittaja, häkit, ravinto, pesäntekoaineet ja niin edelleen,  
— kunkin eläimen paino testin alussa.  
Testiolosuhteet:  
— annostasojen valintaperusteet,  
— yksityiskohtaiset tiedot testiainevalmisteesta/ravintovalmisteesta, 
testiaineen saavutettu pitoisuus,  
— valmisteen stabiilisuus ja tasalaatuisuus,  
— yksityiskohtaiset tiedot testiaineen antotavasta,  
— todellinen annos (mg/painokilo/vrk) ja muuntokerroin ravintoon/ ­
juomaveteen sekoitetun testiaineen pitoisuudelle (ppm) tarvittaessa,  
— yksityiskohtaiset tiedot ravinnon ja veden laadusta.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 522
 
Tulokset:  
— ravinnonotto sekä nautitun veden määrä, mikäli se on mitattu, 
ruumiinpainon lisäys nautittua ravintogrammaa kohti sekä saadun 
testiaineen määrä P- ja F1-eläimillä, lukuun ottamatta sitä aikaa, 
kun eläimet pidetään yhdessä, ja vähintään imetysajan viimeisen kolmanneksen aikana,
 
— absorptiotiedot (jos mitattu),  
— paritukseen valittujen P- ja F1-eläinten painotiedot,  
— poikueiden ja poikasten painotiedot,  
— P-eläinten paino lopettamishetkellä sekä elinten absoluuttinen ja 
suhteellinen paino,  
— kliinisten havaintojen laatu, vakavuus ja kesto (riippumatta siitä, 
korjaantuvatko vauriot myöhemmin),  
— kuolinaika testin kuluessa tai elikö koe-eläin lopettamiseen asti,  
— myrkkyvastetiedot sukupuolen ja annoksen mukaan sekä parituk ­
sen, hedelmällisyyden, tiineyden, syntymän, elinkelpoisuuden ja 
imetyksen indeksit; selosteessa tulee esittää luvut, joista nämä 
indeksit on laskettu,  
— toksiset tai muut vaikutukset lisääntymisfysiologiaan, poikasiin, 
syntymänjälkeiseen kasvuun ja niin edelleen,  
— ruumiinavauslöydökset,  
— yksityiskohtaiset tiedot kaikista histopatologisista löydöksistä,  
— P- ja F1 -sukupolvien niiden naaraiden lukumäärä, joilla on nor ­
maali kiimasykli, sekä syklin pituus,  
— lisäkiveksen hännän siittiöiden kokonaismäärä, progressiivisesti 
liikkuvien siittiöiden prosenttiosuus, morfologisesti normaalien 
siittiöiden prosenttiosuus ja poikkeavien siittiöiden prosenttiosuus 
kunkin tietyn poikkeavuuden mukaan,  
— aika pariutumiseen asti, mukaan lukien pariutumista edeltävien 
päivien määrä,  
— tiineyden kesto,  
— implantaatioiden ja keltarauhasten määrä sekä poikueiden koko,  
— elävänä syntyneiden poikasten määrä ja implantaation jälkeen 
tapahtuneet abortoitumiset,  
— selvästi näkyvistä epämuodostumista kärsivien poikasten luku ­
määrä; erityisen pienikasvuisten poikasten lukumäärä, jos se on määritetty,
 
— tiedot poikasten fyysisistä kehitysvaiheista ja muut syntymän jäl ­
keisen kehityksen tiedot; arvioitujen kehitysvaiheiden valinta on 
perusteltava,  
— poikasten ja aikuisten toiminnallisesta havainnoinnista saadut tie ­
dot soveltuvin osin,  
— tulosten tilastollinen käsittely tapauksen mukaan.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 523
 
Tulosten pohdinta.  
Johtopäätökset, mukaan lukien haitattoman altistustason (NOAEL) 
arvot emojen ja poikasten osalta.  
4. LÄHDELUETTELO  
(1) Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons. Teoksessa:  Rep­
roduction in Mammals:  I. Germ Cells and Fertilization, C.R. 
Auston and R.V. Short (toim.), Cambridge, New York.  
(2) Gray, L.E. et al., (1989). A Dose-Response Analysis of Met ­
hoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development 
and Function in the Rat.  Fundamental and Applied Toxicology  
12: 92–108.  
(3) Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epi ­
didymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats.  Journal 
of Reproduction and Fertility  54: 103–107.  
(4) Klinefelter, G.R. et al., (1991). The Method of Sperm Collec ­
tion Significantly Influences Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat.  
Reproductive Toxicology  5: 39–44.  
(5) Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, 
Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Con ­
sensus Report.  Reproductive Toxicology  10(3): 237–244.  
(6) Chapin, R.E. et al., (1992).Methods for Assessing Rat Sperm 
Motility.  Reproductive Toxicology  6: 267–273  
(7) Klinefelter, G.R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Di ­
methanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  
In Vitro  Demonstration.  Journal of Andrology  13: 409–421.  
(8) Slott, V.L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Met ­
hodologic Considerations.  Reproductive Toxicology  5: 
449–458.  
(9) Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993). Computer-Assisted 
Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using 
the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. Teoksessa:  Methods in 
Toxicology,  Part A., Academic, Orlando, Florida, s. 319–333.  
(10) Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat 
Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Admi ­
nistration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andrology 10: 401–415.
 
(11) Working, P.K. and M. Hurtt, (1987). Computerized Videomic ­
rographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andro ­
logy 8: 330–337.  
(12) Linder, R.E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the 
Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6: 491–505.
 
(13) Korenbrot, C.C. et al., (1977). Preputial Separation as an Ex ­
ternal Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biolo ­
gical Reproduction 17: 298–303.  
(14) Russell, L.D. et al., (1990). Histological and Histopathological 
Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Flo ­
rida. 
(15) Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (toim.) (1993). Part B. Female 
Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Or ­
lando, Florida.  
(16) Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian 
Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. Teoksessa: Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield 
(toim.), Plenum, New York, pp. 421–426.
 
(17) Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989). Test Methods for Asses ­
sing Female Reproductive and Developmental Toxicology. Te ­
oksessa: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes 
(toim.), Raven, New York.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 524
 
(18) Smith, B.J. et al,. (1991). Comparison of Random and Serial 
Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive To ­
xicology 5: 379–383.  
(19) Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histo ­
logy. Teoksessa: An Evaluation and Interpretation of Repro ­
ductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. 
Daston, and C.A. Kimmel, (toim.), ILSI Press, Washington, 
DC. 
(20) Thomas, J. A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive 
System. Teoksessa: Casarett and Doull's Toxicology, M.O. Amdur, J. Doull, and C.D. Klaassen (toim.), Pergamon, New 
York.
 
(21) Zenick, H. and E.D. Clegg, (1989). Assessment of Male Rep ­
roductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. Teoksessa: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (toim.), 
Raven Press, New York.
 
(22) Palmer, A.K. (1981). Teoksessa: Developmental Toxicology, 
Kimmel, C.A. and J. Buelke-Sam (toim.), Raven Press, New York.
 
(23) Palmer, A.K. (1978). Teoksessa: Handbook of Teratology, Vol. 4, 
J.G. Wilson and F.C. Fraser (toim.), Plenum Press, New York.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 525
 
B.36  TOKSIKOKINETIIKKA  
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 417 (2010). Testike ­
mikaalin toksikokinetiikkaa tarkastelevien tutkimusten tavoitteena on tuottaa tietoa kemikaalin imeytymisestä, jakautumisesta, biotransformaatiosta (esi ­
merkiksi metaboliasta) ja erittymisestä, jotta pitoisuus tai annos voidaan 
suhteuttaa havaittuun myrkyllisyyteen ja jotta kemikaalin myrkyllisyyden mekanismia opitaan ymmärtämään paremmin. Toksikokinetiikka voi auttaa ymmärtämään toksikologisia tutkimuksia, sillä sen avulla voidaan osoittaa, 
että koe-eläimet altistuvat testikemikaalille systemaattisesti. Lisäksi sen 
avulla voidaan määrittää, mitkä ovat kiertäviä osia (alkuperäinen kemikaali / metaboliitit). Näiden tutkimusten perusteella määritetyt toksikokineettiset perusparametrit tuottavat tietoa myös testikemikaalin mahdollisesta kerty ­
vyydestä kudoksiin ja/tai elimiin sekä testikemikaalille altistumisen aiheut ­
tamasta mahdollisesta biotransformaatiosta.
 
2. Toksikokineettiset tiedot voivat vaikuttaa myös eläinmyrkyllisyystietojen 
asianmukaisuuden ja oleellisuuden arviointiin, kun tietoja ekstrapoloidaan ihmisiin kohdistuvien vaarojen ja/tai riskien arviointia varten. Lisäksi toksi ­
kokineettisistä tutkimuksista voidaan saada hyödyllistä tietoa annostasojen 
määrittämisestä myrkyllisyystutkimuksia varten (lineaarinen vs. 
ei-lineaarinen kinetiikka), antoreittiin liittyvistä vaikutuksista, biologisesta hyötyosuudesta sekä tutkimussuunnitelmaan liittyvistä seikoista. Tietyntyyp ­
pisiä toksikokineettisiä tietoja voidaan käyttää fysiologiaan perustuvan tok ­
sikokineettisen mallin kehittämisessä.
 
3. Metaboliitteihin liittyville ja toksikokineettisille tiedoille on tärkeitä käyttö ­
tarkoituksia: niiden avulla voidaan esimerkiksi ennustaa mahdollisia myrkyl ­
lisyyksiä ja vaikutustapoja sekä niiden suhdetta annostasoon ja altistumis ­
reittiin. Metaboliatiedoista voidaan lisäksi saada hyödyllistä tietoa, jota voi ­
daan käyttää arvioitaessa testikemikaalin eksogeenisesti tuottamille metabo ­
liiteille altistumisen toksikologista merkitystä.  
4. Asianmukaisten toksikokineettisten tietojen avulla voidaan vahvistaa kvan ­
titatiivisten rakenne-aktiivisuussuhteiden sekä interpolointiin tai ryhmittelyyn perustuvien toimintatapojen hyväksyttävyyttä ja sovellettavuutta kemikaalien turvallisuuden arvioinnissa. Kinetiikkatietoja voidaan käyttää myös muiden 
tutkimusten toksikologisen merkityksen arvioinnissa (esimerkiksi  in vivo / in 
vitro ).
 
5. Tätä testimenetelmää voidaan soveltaa, kun testikemikaalia annetaan suun 
kautta, ellei muuta antoreittiä ole mainittu (katso etenkin 74–78 kohta).  
ALUSTAVAT HUOMIOT  
6. Eri luokkiin kuuluvien kemikaalien (esimerkiksi torjunta-aineet, biosidit, 
teollisuuskemikaalit) toksikokinetiikkaan liittyvien tutkittavien ominaisuuk ­
sien ja parametrien mittauksen osalta sääntelyjärjestelmissä on erilaisia vaa ­
timuksia ja tarpeita. Toisin kuin useimmissa testimenetelmissä, tässä testi ­
menetelmässä kuvataan toksikokineettistä testausta, johon sisältyy monia 
mittauksia ja tutkittavia ominaisuuksia. Tulevaisuudessa saatetaan kehittää lukuisia uusia testimenetelmiä ja/tai ohjeasiakirjoja, joissa kutakin tutkittavaa ominaisuutta kuvataan erikseen ja tarkemmin. Tämän testimenetelmän osalta 
se, mitä testejä tai arviointeja tehdään, määräytyy kunkin sääntelyjärjestel ­
män vaatimusten ja/tai tarpeiden mukaisesti.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 526
 
7. Kun testikemikaalia arvioidaan sääntelytarkoituksia varten, sen toksikoki ­
neettisen käyttäytymisen määrittämiseksi voidaan joutua tekemään useita 
tutkimuksia. Tiettyjen sääntelytarpeiden tai tilanteiden mukaan kaikki mah ­
dolliset tutkimukset eivät kuitenkaan ole välttämättä tarpeen testikemikaalin arvioinnissa. Toksikokineettisten tutkimusten suunnittelussa tarvitaan siis 
joustavuutta, kun otetaan huomioon tutkittavan testikemikaalin ominaisuu ­
det. Joissakin tapauksissa on selvitettävä vain tietyt kysymykset testikemi ­
kaaliin liittyviä vaaroja ja riskejä koskevien huolenaiheiden hälventämiseksi. Joissakin tilanteissa toksikokineettisiä tietoja voidaan kerätä muissa tutki ­
muksissa tehtävän arvioinnin yhteydessä. Toisissa tilanteissa ylimääräiset 
ja/tai kattavammat toksikokineettiset tutkimukset voivat olla tarpeen sen mukaan, mitkä ovat sääntelytarpeet ja/tai herääkö testikemikaalin arvioinnin aikana uusia kysymyksiä.
 
8. Testauslaboratorion on otettava huomioon kaikki testikemikaalista ja sen 
oleellisista metaboliiteista ja niiden analogeista saatavilla olevat tiedot ennen 
tutkimuksen toteuttamista tutkimuksen laadun parantamiseksi ja eläinten käytön minimoimiseksi. Tähän voi sisältyä muiden oleellisten testimenetel ­
mien avulla saatuja tietoja ( in vivo  -tutkimukset,  in vitro  -tutkimukset ja/tai  
in silico  -arvioinnit). Seuraavista tiedoista voi olla hyötyä tutkimuksen suun ­
nittelussa ja tulosten tulkinnassa: kemikaalin fysikaalis-kemialliset ominai ­
suudet, kuten oktanoli-vesi-jakaantumiskerroin (ilmaistuna log P
 OW -arvo­
na), pKa, vesiliukoisuus, höyrynpaine ja molekyylipaino. Ne voidaan mää ­
rittää asianmukaisin menetelmin, jotka on kuvattu kulloisissakin testimene ­
telmissä.  
RAJOITUKSET  
9. Tätä testimenetelmää ei ole tarkoitettu käytettäväksi erityisolosuhteissa, ku ­
ten tiineiden tai imettävien eläinten ja niiden jälkeläisten yhteydessä tai 
arvioitaessa elintarvikkeita tuottavissa altistuneissa eläimissä olevia mahdol ­
lisia jäämiä. Testimenetelmän B.36 mukaisen tutkimuksen tuottamista tie ­
doista voidaan kuitenkin saada taustatietoa, joka ohjaa nimenomaan näihin 
seikkoihin liittyvien tutkimusten suunnittelua. Tätä testimenetelmää ei ole tarkoitettu nanomateriaalien testaamiseen. OECD:n testiohjeiden sovelletta ­
vuutta nanomateriaaleihin koskevasta alustavasta arvioinnista laadittu ra ­
portti viittaa siihen, että testiohje nro 417 (joka vastaa tätä testimenetelmää 
B.36) ei välttämättä sovellu nanomateriaaleihin (1).
 
MÄÄRITELMÄT  
10. Tässä testimenetelmässä käytetyt määritelmät on esitetty lisäyksessä.  
ELÄINTEN HYVINVOINTIA KOSKEVAT HUOMAUTUKSET  
11. Ohjeita eläinten humaanista käsittelystä on OECD:n ohjeasiakirjassa GD 19 
(2). OECD:n ohjeasiakirjaan GD 19 on suositeltavaa tutustua kaikkien tässä 
testimenetelmässä kuvattujen  in vitro - ja in vivo  -tutkimusten yhteydessä.  
MENETELMIEN KUVAUS  
Esitutkimukset  
12. Esitutkimusten käyttö on erittäin suositeltavaa, kun valitaan toksikokineet ­
tisten tutkimusten kokeellisia parametreja (kuten metabolia, massatase, ana ­
lyysimenetelmät, annoksen määritys, uloshengitysilman CO  2 -pitoisuus jne.). 
Kemikaalia ei välttämättä tarvitse leimata radioaktiivisesti luonnehdittaessa 
joitakin näistä parametreista.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 527
 
Eläinten valinta  
Laji 
13. Toksikokinetiikan testauksessa käytettävän eläinlajin (ja kannan) on oltava 
mieluiten sama kuin muissa kyseisen testikemikaalin yhteydessä toteute ­
tuissa toksikologisissa tutkimuksissa. Yleensä on käytettävä rottaa, koska sitä on käytetty laajalti toksikologisissa tutkimuksissa. Toisten tai ylimää ­
räisten lajien käyttö voi olla perusteltua, jos kriittisistä toksikologisista tut ­
kimuksista on saatu näyttöä merkittävästä myrkyllisyydestä näissä lajeissa tai jos niihin liittyvä myrkyllisyys/toksikokinetiikka osoittautuu olevan ih ­
misen kannalta merkityksellisempää. Eläinlajin ja kannan valinta on perus ­
teltava.
 
14. Ellei muuta ole mainittu, tässä testimenetelmässä testilajilla tarkoitetaan rot ­
taa. Tiettyjä menetelmän näkökohtia voi olla tarpeen muokata, jos käytetään muita testilajeja.
 
Ikä ja kanta  
15. Tutkimuksessa tulee käyttää nuoria terveitä täysikasvuisia eläimiä (ikä an ­
nostelun aikana yleensä 6–12 viikkoa) (katso myös 13 ja 14 kohta). Jos 
tutkimuksessa käytetään muita kuin nuoria täysikasvuisia eläimiä, se on 
perusteltava. Kaikkien eläinten on oltava samanikäisiä tutkimuksen alussa. Yksittäisten eläinten paino saa vaihdella enintään ± 20 prosenttia testiryh ­
män keskipainosta. Käytettävän kannan on oltava mieluiten sama kuin se, 
jota on käytetty testikemikaalia koskevan toksikologisen tietokannan laa ­
timisessa.
 
Eläinten lukumäärä ja sukupuoli  
16. Jokaista testattavaa annosta kohti on käytettävä vähintään neljää eläintä, 
joiden sukupuoli on sama. Käytettävien eläinten sukupuolen valinta on pe ­
rusteltava. Kummankin sukupuolen (neljän uroksen ja neljän naaraan) käyt ­
töä on harkittava, jos on näyttöä siitä, että myrkyllisyydessä on huomattavia 
sukupuoleen liittyviä eroja.  
Koe-eläintilat ja ruokinta  
17. Yleensä eläimet on pidettävä häkeissä yksittäin testijakson ajan. Ryhmähä ­
keissä pitäminen voi olla perusteltua tietyissä olosuhteissa. Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa / 12 tuntia pimeää). Koe-eläinhuoneen lämpötilan tulee olla 22 °C (± 3 °C) ja suhteel ­
lisen ilmankosteuden 30–70 prosenttia. Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää 
normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa.
 
Testikemikaali  
18. Tutkimuksen kaikissa massataseen ja metaboliittien määrityksissä on käytet ­
tävä  14 C-leimattua radioaktiivista testikemikaalia. Jos voidaan osoittaa, että  
— massatase ja metaboliitit voidaan määrittää asianmukaisesti käyttämällä 
muuta kuin radioaktiivisesti leimattua testikemikaalia  
— ei-radioaktiivisen testikemikaalin kanssa käytetyn menetelmän analyytti ­
nen tarkkuus ja herkkyys on sama tai parempi kuin se, joka olisi voitu 
saada radioaktiivisesti leimattua testikemikaalia käyttäen  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 528
 
radioaktiivisesti leimattua testikemikaalia ei tarvitse käyttää. Myös muita 
radioaktiivisia ja vakaita isotooppeja voidaan käyttää varsinkin, jos kyseinen 
osa aiheuttaa testikemikaalin myrkyllisyyden tai on osa sitä. Jos mahdollista, radioleima on sijoitettava metabolisesti vakaan molekyylin (joka ei ole vaih ­
dettavissa, ei poistu metabolisesti CO
 2 :na eikä tule osaksi organismin hii ­
lipoolia eli biomassaa) ydinosaan. Molekyyli voi olla tarpeen leimata useista 
paikoista tai tietyiltä alueilta, jotta testikemikaalin metabolista kulkeutumista voidaan seurata.
 
19. Radioaktiivisesti leimatut ja leimaamattomat testikemikaalit on analysoitava 
asianmukaisilla menetelmillä puhtauden ja identiteetin määrittämiseksi. Ra ­
dioaktiivisen testikemikaalin on oltava radioaktiivisesti niin puhdas kuin 
tietylle testikemikaalille on mahdollista (puhtausasteen on oltava mieluiten yli 95 prosenttia). Epäpuhtaudet, joiden pitoisuus on vähintään kaksi pro ­
senttia, on pyrittävä tunnistamaan. Puhtaus sekä määritettyjen epäpuhtauk ­
sien identiteetti ja pitoisuus on ilmoitettava. Yksittäisissä sääntelyohjelmissa 
voidaan antaa lisäohjeita seoksista koostuvien testikemikaalien määrittämistä ja spesifikaatioita sekä puhtauden määrittämiseen tarkoitettujen menetelmien valintaa varten.
 
Annoksen valinta  
Esitutkimus  
20. Tavallisesti esitutkimukseen riittää kerta-annos suun kautta. Annoksen on 
oltava myrkytön mutta riittävän suuri, jotta eritteistä (ja tarvittaessa plasmas ­
ta) voidaan määrittää metaboliitit ja jotta voidaan täyttää esitutkimuksen 
ilmoitettu tarkoitus tämän testimenetelmän 12 kohdassa todetun mukaisesti.  
Päätutkimukset  
21. Päätutkimuksissa on suotavaa käyttää vähintään kahta annosta, sillä vähin ­
tään kahdesta annosryhmästä saatavista tiedoista voi olla apua määritettäessä annoksia muihin myrkyllisyystutkimuksiin ja arvioitaessa jo saatavilla ole ­
vien myrkyllisyystestien annosvastetta.
 
22. Kahta annosta käytettäessä molempien on oltava riittävän suuria, jotta erit ­
teistä (ja tarvittaessa plasmasta) voidaan määrittää metaboliitit. Myrkylli ­
syystiedot on otettava huomioon annoksen valinnassa. Jos tietoja ei ole saatavilla (esimerkiksi akuuteista suun kautta aiheutuvaa myrkyllisyyttä kä ­
sittelevistä tutkimuksista, joihin on kirjattu myrkyllisyyden kliiniset merkit, 
tai toistuvan annoksen myrkyllisyyttä käsittelevistä tutkimuksista), suurem ­
maksi annokseksi voidaan harkita arvoa, joka on pienempi kuin LD
 50 -esti­
maatti (suun ja ihon kautta) tai LC  50 -estimaatti (hengitysteiden kautta) tai 
akuutin myrkyllisyystason estimaatin pienempi arvo. Pienemmän annoksen 
tulee olla jokin osuus suuremmasta annoksesta.  
23. Jos tutkitaan vain yhtä annostasoa, annoksen on oltava riittävän suuri, jotta 
eritteistä (ja tarvittaessa plasmasta) voidaan määrittää metaboliitit, mutta annoksen ei tule aiheuttaa ilmeistä myrkyllisyyttä. Lisäksi on perusteltava, 
miksi tutkimukseen ei sisällytetty toista annostasoa.
 
24. Jos on määritettävä annoksen vaikutus kineettisiin prosesseihin, kaksi an ­
nosta ei välttämättä riitä, ja vähintään yhden annoksen on oltava riittävän suuri näiden prosessien saturoimiseksi. Jos plasman pitoisuus-aikakäyrän alle jäävä pinta-ala (AUC-arvo) ei ole lineaarinen kahden päätutkimuksessa 
käytetyn annostason välillä, se on vahva osoitus siitä, että yksi tai useampi 
kineettinen prosessi saturoituu jossain kohdassa kahden annostason välillä.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 529
 
25. Sellaisten testikemikaalien yhteydessä, joiden myrkyllisyys on vähäistä, on 
käytettävä enimmäisannosta 1 000 mg painokiloa kohti (suun ja ihon kautta 
-antoreitit) (jos annostelu tapahtuu hengitysteiden kautta, katso ohjeet tämän liitteen luvusta B.2; yleensä tämä annos on enintään 2 mg/l). Kemikaalikoh ­
taisten pohdintojen perusteella suurempi annos voi olla tarpeen sen mukaan, 
mitkä ovat sääntelytarpeet. Annoksen valinta on aina perusteltava.
 
26. Tiedot kerta-annoksen toksikokinetiikasta ja kudoksiin jakaantumisesta saat ­
tavat riittää mahdollisen kertyvyyden ja/tai pysyvyyden määrittämiseksi. 
Tietyissä olosuhteissa saatetaan kuitenkin tarvita toistuvan annoksen annos ­
telu, jotta i) mahdollista kertyvyyttä ja/tai pysyvyyttä tai toksikokineettisiä 
muutoksia (esimerkiksi entsyymi-induktiota ja -estoa) voidaan käsitellä tar ­
kemmin, tai ii) jos sovellettava sääntelyjärjestelmä edellyttää sitä. Vaikka tutkimuksissa, joissa käytetään toistuvaa annostelua, pienen annoksen tois ­
tuva annostelu yleensä riittää, suuren annoksen toistuva annostelu voi kui ­
tenkin olla tarpeen tietyissä olosuhteissa (katso myös 57 kohta).
 
Testikemikaalin annostelu  
27. Testikemikaali on liuotettava tai suspendoitava tasaisesti samaan 
kantaja-aineeseen, jota on käytetty muissa testikemikaalilla tehdyissä tutki ­
muksissa, joissa tarkasteltiin suun kautta aiheutuvaa myrkyllisyyttä ja joissa 
käytettiin ruokintaletkua, mikäli kantaja-aineesta on saatavilla tällaisia tieto ­
ja. Kantaja-aineen valinta on perusteltava. Kantaja-aineen valinta ja annos ­
telutilavuus on otettava huomioon tutkimuksen suunnittelussa. Tavanomai ­
nen antotapa on ruokintaletkun kautta, mutta tietyissä tilanteissa kemikaali 
voi olla parempi antaa gelatiinikapselissa tai ravinnon seassa (kummassakin tapauksessa on esitettävä perustelut). Jokaiselle eläimelle annettu todellinen annos on vahvistettava.
 
28. Ruokintaletkun kautta kerrallaan annosteltavan nesteen enimmäistilavuus 
määräytyy koe-eläinten koon, annoksen kantaja-aineen tyypin ja sen mu ­
kaan, onko eläin pidetty ravinnotta ennen testikemikaalin antamista. Ravin ­
non antaminen tai ravinnotta pitäminen ennen annostelua on perusteltava. Yleensä tilavuus on pidettävä niin pienenä kuin vesipitoisten tai muiden 
kuin vesipitoisten kantaja-aineiden osalta on käytännöllistä. Jyrsijöillä an ­
noksen tilavuus saa yleensä olla enintään 10 ml painokiloa kohti. Lipofii ­
lisempien testikemikaalien kanssa käytettävien kantaja-aineiden aloitustila ­
vuus voi olla 4 ml painokiloa kohti. Toistuvassa annostelussa on harkittava 
pienempiä annostilavuuksia (esimerkiksi 2–4 ml painokiloa kohti), kun 
eläinten pitäminen ravinnotta päivittäin on vasta-aiheista. Mikäli mahdollis ­
ta, on harkittava sen annostilavuuden käyttämistä, joka annettiin suun kautta ruokintaletkulla muissa testikemikaalin tutkimuksissa.
 
29. Testikemikaali voidaan annostella suonensisäisesti, ja testikemikaalin pitoi ­
suus veressä ja/tai eritteissä voidaan mitata biologisen hyötyosuuden tai 
suhteellisen oraalisen absorption määrittämiseksi. Suonensisäistä annostelua koskevassa tutkimuksessa testikemikaalia annetaan kerta-annos (joka on yleensä enintään pienemmän suun kautta annettavan annoksen suuruinen, 
katso annoksen valinta -kohta) käyttäen asianmukaista kantaja-ainetta. Tätä 
ainetta on annettava sopiva tilavuus (esimerkiksi 1 ml painokiloa kohti) valittuun antopaikkaan vähintään neljälle sopivaa sukupuolta edustavalle eläimelle (molempia sukupuolia voidaan käyttää, mikäli tarpeen, katso 16 
kohta). Kun testikemikaalia annetaan suonensisäisesti, annos on 
valmisteltava siten, että kemikaali on täysin liuennut tai suspendoitunut.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 530
 
Suonensisäisessä annostelussa käytettävä kantaja-aine ei saa rikkoa verisuo ­
nia tai häiritä verenvirtausta. Jos testikemikaali annetaan infuusiona, infuu ­
sionopeus on ilmoitettava ja se on pidettävä vakiona eläinten välillä, jos käytetään infuusiopumppua. Jos eläimelle asetetaan kanyyli kaulalaskimoon (testikemikaalin antamista ja/tai verinäytteiden ottamista varten) tai jos an ­
nosteluun käytetään reisilaskimoa, on käytettävä anestesiaa. Anestesian 
tyyppi on valittava huolellisen harkinnan perustella, sillä se voi vaikuttaa toksikokinetiikkaan. Eläinten on annettava toipua riittävästi ennen testikemi ­
kaalin ja kantaja-aineen annostelua.
 
30. Muita antoreittejä, kuten suun ja hengitysteiden kautta, (katso 74–78 kohta), 
voidaan käyttää tiettyjen testikemikaalien yhteydessä, kun otetaan huomioon 
niiden fysikaalis-kemialliset ominaisuudet ja ihmisten odotuksenmukainen 
käyttö tai altistuminen.  
Mittaukset  
Massatase  
31. Massatase määritetään laskemalla yhteen annetun (radioaktiivisen) annoksen 
prosenttiosuus, joka on erittynyt virtsaan, ulosteeseen ja uloshengitysilmaan, sekä prosenttiosuus, joka on kudoksissa, eläimen ruumiin jäännöksissä ja 
koe-eläinhäkin pesuvedessä (katso 46 kohta). Yleensä annostellun (radio ­
aktiivisesti leimatun) testikemikaalin kokonaissaantoja pidetään riittävinä, kun ne ovat vähintään 90 prosenttia.
 
Imeytyminen  
32. Alustava arvio imeytymisestä saadaan vähentämällä maha-suolikanavassa 
ja/tai ulosteessa olevan annoksen prosenttiosuus määritetystä massataseesta. Katso lisätietoja imeytymisen prosenttiosuuden laskemisesta 33 kohdasta. Lisätietoja eritteiden tutkimisesta on 44–49 kohdassa. Jos suun kautta an ­
nostelun jälkeisen imeytymisen määrää ei voida määrittää tarkasti massat ­
asetutkimusten perusteella (esimerkiksi kun ulosteessa on yli 20 prosenttia annetusta annoksesta), lisätutkimukset voivat olla tarpeen. Nämä tutkimukset voivat koostua joko 1) testikemikaalin annostelusta suun kautta ja testike ­
mikaalipitoisuuden mittaamisesta sapessa tai 2) testikemikaalin annostelusta 
suun kautta ja suonensisäisesti sekä testikemikaalin nettopitoisuuden mittaa ­
misesta virtsassa, uloshengitysilmassa ja eläimen ruumiissa kummankin an ­
toreitin osalta. Kummassakin tutkimusmenetelmässä radioaktiivisuuden mit ­
taus toteutetaan testikemikaalin ja metaboliittien kemikaalikohtaisen analyy ­
sin korvaavana menetelmänä.
 
33. Jos tehdään sappeen erittymistä koskeva tutkimus, käytetään yleensä suun 
kautta -antoreittiä. Tässä tutkimuksessa kanyloidaan vähintään neljän sopi ­
vaa sukupuolta edustavan eläimen (tai tarvittaessa kumpaakin sukupuolta edustavien eläinten) sappitiehyet, ja eläimille annetaan kerta-annos testike ­
mikaalia. Testikemikaalin annostelun jälkeen radioaktiivisuuden/testikemi ­
kaalin erittymistä sappeen on seurattava niin pitkään kuin on tarpeen, jotta annetusta annoksesta voidaan arvioida se prosenttiosuus, joka erittyy tätä 
reittiä. Sen avulla voidaan laskea suoraan suun kautta tapahtuvan imeytymi ­
sen määrä seuraavasti:
 
Imeytymisen prosenttiosuus  ¼ ðmäärä sapessa þ virtsassa þ uloshengitysilmassa  
þ ruumiissa ilman maha  Ä suolikanavan sisältöä Þ
=annettu annos Ü 100 
34. Tiettyihin luokkiin kuuluvien testikemikaalien osalta imeytynyt annos voi 
erittyä suolen limakalvojen kautta. Näissä tapauksissa katsotaan, että ulos ­
teessa olevan annoksen prosenttiosuuden mittaus rotilta, joiden sappitiehyt on kanyloitu ja joille annos on annettu suun kautta, ei edusta imeytymätöntä annosta. Kun suoleen erittymistä oletetaan tapahtuvan, on suositeltavaa, että 
imeytyneen annoksen prosenttiosuus perustuu imeytymiseen, joka lasketaan 
vertaamalla suun kautta -reitin ja suonensisäisen reitin erittymistä (kanyloi ­
maton tai sappitiehyeen kanyloitu rotta) (katso 35 kohta). Lisäksi suositel ­
laan, että jos suoleen erittymisen kvantifiointia pidetään tarpeellisena, erit ­
tyminen mitataan myös rotalta, jonka sappitiehyt on kanyloitu, annoksen 
suonensisäisen annostelun jälkeen.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 531
 
Biologinen hyötyosuus  
35. Biologinen hyötyosuus voidaan määrittää suun kautta ja suonensisäisen an ­
nostelun ryhmien plasman/veren kinetiikasta 50–52 kohdassa kuvatun mu ­
kaisesti testikemikaalin ja/tai tärkeimpien metaboliittien spesifisellä kemial ­
lisella analyysilla, jolloin radioaktiivisesti leimattua testikemikaalia ei tarvita. 
Testikemikaalin tai tärkeimmän metaboliitin (tärkeimpien metaboliittien) biologinen hyötyosuus (F) voidaan laskea seuraavasti:
 
F ¼ ðAUC  exp=AUC  IV Þ Ü ðDose  IV=Dose  exp Þ 
Tässä yhtälössä AUC on plasman pitoisuus-aikakäyrän alle jäävä pinta-ala 
ja exp tarkoittaa testattua antoreittiä (suun, ihon tai hengitysteiden kautta).  
36. Systeemisten vaikutusten riskinarvioinnissa myrkyllisen komponentin biolo ­
gista hyötyosuutta pidetään yleensä ensisijaisena imeytymisen prosenttiosuu ­
teen nähden, kun eläinkokeiden systeemisiä pitoisuuksia verrataan vastaaviin biomonitorointitietoihin, jotka on saatu työntekijöiden altistumistutkimuksis ­
ta. Tilanne voi muuttua monimutkaisemmaksi, jos annokset ovat 
ei-lineaarisella alueella, joten on tärkeää, että toksikokineettisessä seulon ­
nassa määritetään lineaarisen alueen annokset.
 
Kudoksiin jakautuminen  
37. Tieto testikemikaalin ja/tai sen metaboliittien jakautumisesta kudoksiin on 
tärkeää kohdekudosten tunnistamiseksi, myrkyllisyyden taustalla olevien mekanismien ymmärtämiseksi sekä tiedon saamiseksi testikemikaalin ja 
sen metaboliittien mahdollisesta kertyvyydestä ja pysyvyydestä. Kudoksissa 
ja eläimen ruumiissa olevan (radioaktiivisen) kokonaisannoksen prosentti ­
osuus on mitattava vähintään erityskokeen päättyessä (yleensä viimeistään seitsemän päivän kuluttua annoksen antamisesta tai aikaisemmin testikemi ­
kaalille tyypillisen käyttäytymisen mukaan). Jos kudoksissa ei havaita testi ­
kemikaalia tutkimuksen päättyessä (esimerkiksi sen takia, että testikemikaali on voinut eliminoitua ennen tutkimuksen päättymistä lyhyen puoliintumisa ­
jan vuoksi), tulosten tulkinnassa on oltava huolellinen virhetulkintojen vält ­
tämiseksi. Tällaisissa tilanteissa kudoksiin jakautumista on tutkittava samalla 
kun tutkitaan testikemikaalin (ja/tai metaboliitin) huippupitoisuutta plasmas ­
sa/veressä (T
 max ) tai virtsaan erittymisen huippunopeutta, mikäli tarpeen 
(katso 38 kohta). Lisäksi tietyissä aikapisteissä on mahdollisesti otettava 
kudosnäytteitä, jotta voidaan arvioida testikemikaalin ja/tai sen metaboliit ­
tien jakautumista kudoksiin sekä aikariippuvuutta (mikäli tarpeen). Siitä on apua myös massataseen määrittämisessä ja/tai muissa seikoissa sen mukaan, mitä toimivaltainen viranomainen edellyttää. Kudosnäytteet on otettava seu ­
raavista kudoksista: maksa, rasva, maha-suolikanava, munuaiset, perna, ko ­
koveri, eläimen ruumis, kohde-elimen kudokset ja muut sellaiset kudokset, joilla voi olla merkitystä testikemikaalin toksikologisessa arvioinnissa (esi ­
merkiksi kilpirauhanen, punasolut, lisääntymiselimet, iho, silmät (etenkin 
värillisillä eläimillä)). Ylimääräisten kudosten analyysia samoissa aikapis ­
teissä on harkittava, jotta eläimiä voidaan käyttää mahdollisimman tehok ­
kaasti, ja erityisesti silloin, kun kohde-elimeen kohdistuvaa myrkyllisyyttä havaitaan subkroonisissa tai kroonisissa myrkyllisyystutkimuksissa. (Radio ­
aktiivinen) jäämäpitoisuus ja kudos/plasma-pitoisuussuhde on myös ilmoi ­
tettava.
 
38. Lisäksi kudokseen jakautumisen arviointia voidaan tarvita muissa aikapis ­
teissä, kuten plasman/veren huippupitoisuuden (esimerkiksi T  max ) tai virt­
saan erittymisen huippunopeuden aikana (ne on selvitetty plasman/veren 
kinetiikkaa tai erittymistä käsittelevissä kokeissa). Myös toimivaltainen vi ­
ranomainen voi edellyttää näitä arviointeja. Nämä tiedot voivat olla hyödyl ­
lisiä, kun pyritään ymmärtämään myrkyllisyyttä sekä testikemikaalin ja me ­
taboliittien kertyvyyttä ja pysyvyyttä. Näytteiden valinta on perusteltava; 
yleensä analysoitavien näytteiden on oltava samoja kuin edellä mainitut 
(katso 37 kohta).  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 532
 
39. Radioaktiivisuuden kvantifiointi kudoksiin jakautumista käsittelevissä tutki ­
muksissa voidaan toteuttaa seuraavilla menetelmillä: elinten dissekointi, ho ­
mogenisointi, polttaminen ja/tai liuottaminen sekä talteen otettujen jäämien nestetuikelaskenta (LSC). Tietyt tekniikat, esimerkiksi määrällinen koko ke ­
hon autoradiografia ja reseptoreiden mikroskooppinen autoradiografia, voi ­
vat osoittautua hyödyllisiksi, kun määritetään testikemikaalin jakautumista 
elimiin ja/tai kudoksiin (3) (4), vaikka näiden tekniikoiden kehitys on eri vaiheessa.
 
40. Muiden altistumisreittien kuin suun kautta -reitin osalta näytteet on kerättävä 
ja analysoitava tietyistä kudoksista, esimerkiksi inhalaatiotutkimuksissa keuhkoista ja ihotutkimuksissa ihosta. Katso 74–78 kohta.
 
Metabolia  
41. Eritteistä (ja plasmasta, jos tarpeen) on otettava näytteet, jotta muuttumaton 
testikemikaali ja metaboliitit voidaan määrittää ja kvantifioida 44–49 koh ­
dassa kuvatun mukaisesti. Näytteiden yhdistäminen metaboliittien määrittä ­
miseksi tietyssä annosryhmässä on hyväksyttävää. Metaboliittien profilointi 
kultakin ajanjaksolta on suositeltavaa. Jos tämä ei ole mahdollista näytteiden 
puuttumisen ja/tai radioaktiivisuuden vuoksi, virtsa- ja ulostenäytteiden yh ­
distäminen eri aikapisteistä on hyväksyttävää. Sen sijaan eri sukupuolilta peräisin olevien tai eri annoksiin liittyvien näytteiden yhdistäminen ei ole 
hyväksyttävää. Käsiteltyjen eläinten virtsan, ulosteen ja uloshengitysilman 
(ja tarvittaessa sapen) radioaktiivisuus on arvioitava käyttäen asianmukaisia laadullisia ja määrällisiä menetelmiä.
 
42. Kaikki metaboliitit, joiden määrä on vähintään viisi prosenttia annetusta an ­
noksesta, on pyrittävä määrittämään, jotta testikemikaalista voidaan laatia me ­
taboliamalli. Testikemikaalit, joiden määrän eritteissä on havaittu olevan vä ­
hintään viisi prosenttia annetusta annoksesta, on määritettävä. Määrittäminen 
tarkoittaa komponenttien tarkkaa rakenteellista määrittelemistä. Tavallisesti määritys tehdään joko metaboliitin rinnakkaiskromatografialla tunnettujen stan ­
dardien mukaisesti käyttäen kahta erilaista järjestelmää tai tekniikoita, joilla 
positiivinen rakennemääritys on mahdollista. Tällaisia menetelmiä ovat esimer ­
kiksi massaspektrometria, ydinmagneettiresonanssispektroskopia (NMR) jne. Rinnakkaiskromatografian osalta kromatografiatekniikoita, joissa hyödynne ­
tään samaa paikallaan pysyvää faasia kahden erilaisen liuotinjärjestelmän kans ­
sa, ei pidetä riittävänä kahden menetelmän varmistuksena metaboliitin identi ­
teetille, koska menetelmät eivät ole toisistaan riippumattomia. Rinnakkaiskro ­
matografialla määrittäminen on tehtävä käyttämällä kahta erilaista, analyytti ­
sesti riippumatonta järjestelmää, kuten ohutlevykromatografiaa (käänteisfaasi- 
ja suorafaasi-TLC:tä) ja korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa 
(HPLC:tä). Jos kromatografinen erottelu on laadultaan hyväksyttävä, spektros ­
kopian keinoin tehtävä lisävahvistus ei ole tarpeen. Selvä määritys voidaan tuottaa vaihtoehtoisesti menetelmillä, joista saadaan rakenteellista tietoa. 
Tällaisia menetelmiä ovat esimerkiksi nestekromatografia/massaspektrometria 
(LC-MS) tai nestekromatografia / kaksivaiheinen massaspektrometria (LC-MS/MS), kaasukromatografia/massaspektrometria (GC-MS) ja NMR- 
spektrometria.
 
43. Jos ei ole mahdollista määrittää metaboliitteja, joiden pitoisuus on vähintään 
viisi prosenttia annetusta annoksesta, loppuraportissa on esitettävä sille pe ­
rustelut tai selitys. Voi olla tarkoituksenmukaista määrittää myös metaboliit ­
teja, joiden pitoisuus on alle viisi prosenttia annetusta annoksesta. Tämä auttaa ymmärtämään metaboliareittiä testikemikaaliin liittyvien vaarojen ja/tai riskin arvioimisen kannalta paremmin. Rakenne on vahvistettava 
aina kun mahdollista. Tähän voi sisältyä myös profilointi plasmassa tai 
veressä tai muissa kudoksissa.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 533
 
Erittyminen  
44. Annetun annoksen erittymisnopeus ja -määrä on määritettävä mittaamalla 
virtsasta, ulosteesta ja uloshengitysilmasta talteen otetun (radioaktiivisen) annoksen prosenttiosuus. Näistä tiedoista on apua myös massataseen mää ­
rittämisessä. Virtsan, ulosteen ja uloshengitysilman kautta erittyneen testike ­
mikaalin määrät on määritettävä sopivin väliajoin (katso 47–49 kohta). Tois ­
tuvan annoksen kokeet on suunniteltava asianmukaisesti siten, että erittymis ­
tietojen kerääminen on mahdollista 26 kohdassa kuvattujen tavoitteiden saa ­
vuttamiseksi. Tämän avulla vertailu kerta-annoskokeisiin on mahdollista.
 
45. Jos esitutkimus on osoittanut, ettei testikemikaalia (radioaktiivisuutta) erity 
uloshengitysilmaan suuria määriä (49 kohdan mukaisesti), varsinaisessa tut ­
kimuksessa ei tarvitse kerätä uloshengitysilmaa.  
46. Jokainen eläin on sijoitettava erilliseen metaboliahäkkiin eritteiden (virtsan, 
ulosteen ja uloshengitysilman) keräämistä varten. Kunkin keräysvaiheen lo ­
puksi (katso 47–49 kohta) metaboliahäkit on huuhdeltava sopivalla liuotti ­
mella (tätä kutsutaan ”häkin pesuvedeksi”), jotta varmistetaan, että testike ­
mikaalia saadaan talteen mahdollisimman paljon (radioaktiivisuus). Erittei ­
den kerääminen on lopetettava seitsemäntenä päivänä tai sen jälkeen, kun vähintään 90 prosenttia annetusta annoksesta on saatu talteen sen mukaan, 
kumpi vaatimus täyttyy ensin.
 
47. Testikemikaalin (radioaktiivisuuden) kokonaismäärät virtsassa on määritet ­
tävä vähintään kahdessa aikapisteessä ensimmäisenä keruupäivänä. Toisen 
niistä on oltava 24 tuntia annostelun jälkeen. Sen jälkeen tämä on tehtävä 
päivittäin tutkimuksen päättymiseen saakka. Useamman kuin kahden näyt ­
teenottoajankohdan käyttäminen ensimmäisenä päivänä (esimerkiksi 6, 12 ja 24 tunnin kuluttua) on suositeltavaa. Esitutkimusten tulokset tulee analy ­
soida tietojen saamiseksi vaihtoehtoisista tai ylimääräisistä näytteidenkeruun 
aikapisteistä. Näytteidenkeruuaikataulut on perusteltava.
 
48. Testikemikaalin (radioaktiivisuuden) kokonaismäärät ulosteessa on määritet ­
tävä päivittäin tutkimuksen päättymiseen saakka siten, että ensimmäinen 
määritys tehdään 24 tunnin kuluttua annoksen antamisesta, elleivät vaihto ­
ehtoiset tai ylimääräiset aikapisteet ole esitutkimusten mukaan tarkoituksen ­
mukaisempia. Vaihtoehtoiset näytteidenkeruuaikataulut on perusteltava.  
49. Uloshengitysilman CO  2 :n ja muiden haihtuvien aineiden kerääminen voi ­
daan lopettaa tietyssä kokeessa, jos uloshengitysilmassa havaitaan alle yksi prosentti annetusta annoksesta 24 tunnin pituisen keräysjakson aikana.
 
Aikaan perustuvat tutkimukset  
Plasman/veren kinetiikka  
50. Näiden tutkimusten tarkoituksena on tuottaa estimaatit testikemikaalin tok ­
sikokineettisistä perusparametreista [esimerkiksi C  max , T max -puoliintumisaika 
(t 1/2 ), AUC]. Nämä tutkimukset voidaan tehdä yhdellä annoksella, mieluum ­
min kuitenkin kahdella tai useammalla annoksella. Annos on määritettävä 
kokeen luonteen ja/tai käsiteltävän ongelman mukaan. Kinetiikkatietoja voi ­
daan tarvita tiettyjen ongelmien, kuten testikemikaalin biologisen hyötyosuu ­
den, ratkaisemiseksi tai sen selvittämiseksi, miten annos vaikuttaa puhdistu ­
maan (ts. saturoituuko puhdistuma annoksesta riippuvalla tavalla).  
51. Näissä tutkimuksissa tulee käyttää vähintään neljää eläintä sukupuolta ja 
annosryhmää kohti. Käytettävien eläinten sukupuolen valinta on perustelta ­
va. Kummankin sukupuolen (neljän uroksen ja neljän naaraan) käyttöä on 
harkittava, jos on näyttöä siitä, että myrkyllisyydessä on huomattavia suku ­
puoleen liittyviä eroja.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 534
 
52. (Radioaktiivisesti leimatun) testikemikaalin antamisen jälkeen jokaiselta eläi ­
meltä on otettava verinäyte sopivissa aikapisteissä käyttäen asianmukaista 
näytteenottomenetelmää. Eläintä kohti otettavien verinäytteiden tilavuutta ja lukumäärää voidaan joutua rajoittamaan siksi, että toistuva näytteenotto saat ­
taa vaikuttaa eläimen terveyteen/fysiologiaan ja/tai analyysimenetelmän 
herkkyyteen. Jokaisen eläimen näytteet on analysoitava erikseen. Tietyissä 
olosuhteissa (esimerkiksi metaboliittien luonnehdinta) voi olla tarpeen yh ­
distää useamman kuin yhden eläimen näytteitä. Yhdistetyt näytteet on mer ­
kittävä selvästi, ja yhdistämiselle on esitettävä perustelut. Jos käytetään 
radioaktiivisesti leimattua testikemikaalia, kokonaisradioaktiivisuuden ana ­
lyysi voi olla tarkoituksenmukaista. Jos näin on, kokonaisradioaktiivisuus on analysoitava kokoverestä ja plasmasta tai plasmasta ja punasoluista veri-plasmasuhteen laskemiseksi. Muissa tapauksissa tarkemmat tutkimukset, 
jotka edellyttävät perusyhdisteen ja/tai metaboliittien määrittämistä tai pro ­
teiineihin sitoutumisen arviointia, voivat olla tarpeen.
 
Muu kudoskinetiikka  
53. Näiden tutkimusten tarkoituksena on tuottaa aikaan liittyvää tietoa, jotta 
myrkyllistä vaikutustapaa, biokertyvyyttä ja biopysyvyyttä koskeviin kysy ­
myksiin voidaan vastata määrittämällä testikemikaalin pitoisuudet eri kudok ­
sissa. Kudosten valinta ja arvioitavien aikapisteiden määrä määräytyvät kä ­
siteltävän kudoksen ja testikemikaalia koskevan toksikologisen tietokannan mukaan. Tällaisten ylimääräisten kudoskinetiikkaa käsittelevien tutkimusten 
suunnittelussa on otettava huomioon kerätyt tiedot 37–40 kohdissa kuvatun 
mukaisesti. Näissä tutkimuksissa voidaan käyttää kerta-annosta tai toistuvaa annostelua. Käytettävä lähestymistapa on perusteltava yksityiskohtaisesti.
 
54. Muiden kudoskinetiikkaa käsittelevien tutkimusten toteuttamisen syitä voivat 
olla esimerkiksi seuraavat:  
— Näyttö pidentyneestä puoliintumisajasta veressä, mikä viittaa siihen, että 
testikemikaali mahdollisesti kertyy eri kudoksiin.  
— Tarve selvittää, onko vakaa tila saavutettu tietyissä kudoksissa (esimer ­
kiksi toistuvan annostelun tutkimuksissa, sillä vaikka testikemikaalin näennäinen vakaa tila veressä on saavutettu, voi olla tarpeen varmistaa, 
että vakaa tila on saavutettu myös kohdekudoksissa).
 
55. Tämäntyyppisissä aikaan perustuvissa tutkimuksissa vähintään neljälle eläi ­
melle annosta ja aikapistettä kohti on annettava sopiva annos testikemikaalia 
suun kautta, ja jakautumista valittuihin kudoksiin on seurattava ajan suhteen. 
Vain yhtä sukupuolta voidaan käyttää, ellei myrkyllisyyden ole havaittu olevan sukupuolikohtaista. Se, analysoidaanko kokonaisradioaktiivisuutta tai alkuperäistä kemikaalia ja/tai metaboliitteja, määräytyy myös käsiteltävän 
ongelman perusteella. Kudoksiin jakautuminen on arvioitava asianmukaisia 
tekniikoita käyttäen.
 
Entsyymi-induktio/-esto  
56. Yhdessä tai useammassa jäljempänä luetellussa tapauksessa saatetaan tarvita 
tutkimuksia, joissa tarkastellaan entsyymi-induktion/-eston mahdollisia vai ­
kutuksia tai tutkittavana olevan testikemikaalin biotransformaatiota.  
1) Saatavilla oleva näyttö osoittaa, että testikemikaalin biotransformaation ja 
lisääntyneen myrkyllisyyden välillä on suhde.  
2) Saatavilla olevat myrkyllisyystiedot osoittavat, että annoksen ja metabo ­
lian välinen suhde on ei-lineaarinen.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 535
 
3) Metaboliittien määritystutkimusten tulosten mukaan on määritetty mah ­
dollisesti myrkyllinen metaboliitti, joka on voinut syntyä testikemikaalin 
indusoimaa entsyymireittiä pitkin.  
4) Kun tavoitteena on selittää vaikutuksia, joiden oletetaan liittyvän 
entsyymi-induktion ilmiöihin.  
5) Jos testikemikaalin metabolisessa profiilissa havaitaan toksikologisesti 
merkittäviä muutoksia joko  in vitro - tai in vivo  -kokeissa, jotka on tehty 
eri lajeilla tai eri olosuhteissa, kyseisen entsyymin (kyseisten entsyymien) luonnehdinta voi olla tarpeen (esimerkiksi I vaiheen entsyymit, kuten 
sytokromi P450 -riippuvaisen mono-oksigenaasijärjestelmän isoentsyy ­
mit, vaiheen II entsyymit, kuten sulfotransferaasin tai uridiinidifosfaattig ­
lukuronosyylitransferaasin isoentsyymit tai muut oleelliset entsyymit). Näitä tietoja voidaan käyttää lajienvälisten ekstrapolointien asianmukai ­
suuden arvioinnissa.
 
57. Kun arvioidaan testikemikaaliin liittyviä muutoksia toksikokinetiikassa, on 
käytettävä sopivia tutkimusprotokollia, jotka on validoitu ja perusteltu asian ­
mukaisesti. Esimerkinomaisiin tutkimussuunnitelmiin sisältyy leimaamatto ­
man testikemikaalin toistuva annostelu, jonka jälkeen annetaan radioaktii ­
visesti leimattu kerta-annos päivänä 14, tai radioaktiivisesti leimatun kemi ­
kaalin toistuva annostelu ja näytteenotot päivinä 1, 7 ja 14 metaboliittien profiilien määrittelemiseksi. Radioaktiivisesti leimatun testikemikaalin tois ­
tuva annostelu voi tuottaa tietoa myös biokertyvyydestä (katso 26 kohta).
 
TÄYDENTÄVÄT TUTKIMUKSET  
58. Tässä testimenetelmässä kuvattujen  in vivo  -kokeiden lisäksi tehtävistä täy ­
dentävistä tutkimuksista voidaan saada hyödyllistä tietoa testikemikaalin imeytymisestä, jakautumisesta, metaboliasta ja eliminoitumisesta tietyissä 
lajeissa.
 
In vitro  -tietojen käyttö  
59. In vitro  -tutkimuksissa, joissa käytetään asianmukaisia testijärjestelmiä, voi ­
daan käsitellä useita testikemikaalin metaboliaan liittyviä kysymyksiä. Mah ­
dollisten metaboliittien tutkimiseen voidaan käyttää maksasta eristettyjä tai 
kasvatettuja hepatosyyttejä ja subsellulaarisia fraktioita (esimerkiksi mikro ­
someja ja sytosolia tai S9-fraktiota). Kohde-elimen, kuten keuhkojen, pai ­
kallinen metabolia voi olla tutkimisen arvoinen riskinarvioinnin kannalta. 
Näihin tarkoituksiin kannattaa hyödyntää kohdekudosten mikrosomaalisia 
fraktioita. Mikrosomeilla tehtävät tutkimukset voivat olla hyödyllisiä mah ­
dollisten sukupuoleen ja elinkaaren vaiheeseen liittyvien erojen selvittämi ­
seksi ja entsyymiparametrien (K  m ja V  max ) luonnehtimiseksi, sillä niistä voi 
olla apua metabolian annosriippuvuuden ja altistustasojen välisen suhteen 
arvioimisessa. Lisäksi mikrosomit voivat olla hyödyllisiä, kun määritetään tiettyjä testikemikaalin metaboliaan osallistuvia mikrosomaalisia entsyymejä, joilla voi olla merkitystä lajienvälisessä ekstrapoloinnissa (katso myös 56 
kohta). Biotransformaation mahdollista indusoitumista voidaan myös tutkia 
käyttämällä kyseisellä testikemikaalilla esikäsiteltyjen eläinten maksan sub ­
sellulaarisia fraktioita (esimerkiksi mikrosomeja ja sytosolia). Sitä voidaan tutkia myös  in vitro  hepatosyyttien induktiotutkimusten tai tiettyjen, oleelli ­
sia entsyymejä ilmentävien solulinjojen avulla. Tietyissä tilanteissa ja asian ­
mukaisissa olosuhteissa voidaan harkita myös ihmisten kudoksista peräisin olevien subsellulaaristen fraktioiden käyttöä, kun määritetään biotransfor ­
maation mahdollisia lajien välisiä eroja.  In vitro  -tutkimusten tulokset voivat 
olla käyttökelpoisia myös fysiologiaan perustuvien toksikokineettisten mal ­
lien (5) kehittämisessä.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 536
 
60. Ihon kautta imeytymistä käsittelevistä  in vitro  -tutkimuksista saatetaan saada 
täydentäviä tietoja imeytymisen luonnehtimiseksi (6).  
61. Kun käsitellään samanlaisia kysymyksiä kuin maksan mikrosomien yhtey ­
dessä, voidaan käyttää maksasoluista peräisin olevia primaarisia soluviljel ­
miä ja tuoreita kudosleikkeitä. Joissakin tapauksissa voi olla mahdollista 
ratkaista tiettyjä kysymyksiä käyttämällä solulinjoja, joiden on määritetty 
ilmentävän oleellista entsyymiä, tai yhdistelmä-DNA-tekniikalla tuotettuja solulinjoja. Tietyissä tapauksissa kannattaa tutkia tiettyjen sytokromi P450 -isotsyymien (esimerkiksi CYP1A1:n, 2E1:n, 1A2:n ja muiden) ja/tai II 
vaiheen entsyymien estoa ja induktiota perusyhdisteellä käyttäen  in vitro  
-tutkimuksia. Näin hankituista tiedoista saattaa olla hyötyä rakenteeltaan samanlaisten yhdisteiden tutkimuksissa.
 
Myrkyllisyystutkimuksista peräisin olevien toksikokineettisten tietojen 
käyttö täydentävinä tietoina  
62. Muissa myrkyllisyystutkimuksissa otettujen veri-, kudos- ja/tai eritenäyttei ­
den analyysi voi tuottaa tietoa biologisesta hyötyosuudesta, plasmapitoisuu ­
den muutoksista aikaan nähden (AUC, C  max ), biokertyvyyspotentiaalista, 
puhdistumasta sekä sukupuoleen tai elinkaaren vaiheeseen liittyvistä muu ­
toksista metaboliassa ja kinetiikassa.  
63. Tutkimussuunnitelmassa voidaan tarkastella esimerkiksi seuraaviin seikkoi ­
hin liittyviä kysymyksiä: imeytymisen saturaatio, biotransformaatio- tai erit ­
tymisreitit suuremmilla annoksilla, uusien metaboliareittien toiminta suurem ­
milla annoksilla ja myrkyllisten metaboliittien rajoittuminen suurempiin an ­
noksiin.  
64. Muita vaaran arvioinnissa huomioon otettavia seikkoja voivat olla esimer ­
kiksi seuraavat:  
— Ikään liittyvä herkkyys, joka johtuu veri-aivoesteen ja munuaisten tilan 
eroista sekä detoksifikaatiokapasiteeteista  
— Alapopulaation herkkyys, joka johtuu biotransformaatiokapasiteettien 
eroista tai muista toksikokineettisistä eroista  
— Sikiön tai poikasen altistumisen laajuus (istukan läpi tai imetyksen 
kautta kulkeutuvat kemikaalit).  
Toksikokineettisen mallintamisen käyttö  
65. Toksikokineettiset mallit voivat olla hyödyllisiä vaaran ja riskinarvioinnin 
eri näkökohtien kannalta, esimerkiksi systeemisen altistuksen ja sisäisen kudosannoksen ennustamisessa. Mallien avulla voidaan käsitellä myös vai ­
kutustapaan liittyviä erityiskysymyksiä. Mallit voivat olla myös perusteena 
lajienvälisen, altistusreittien ja annostusmallien ekstrapoloinnille sekä ihmi ­
siin kohdistuvan riskin arvioinnille. Fysiologiaan perustuvien toksikokineet ­
tisten mallien, jotka koskevat tiettyä testikemikaalia ja tiettyä lajia, kehittä ­
misessä hyödyllisiä tietoja ovat 1) jakaantumiskertoimet, 2) biokemialliset 
vakiot ja fysiologiset parametrit, 3) reittikohtaiset imeytymisparametrit ja 4)  
in vivo  -kinetiikkatiedot mallin arviointia varten (esimerkiksi oleellisten 
(> 10 prosenttia) erittymisreittien puhdistumaparametrit, metabolian K
 m - ja 
V max -arvot). Mallin kehittämisessä käytetyt kokeelliset tiedot on tuotettava 
tieteellisesti pätevillä menetelmillä, ja mallin avulla saadut tulokset on vali ­
doitava. Testikemikaali- ja lajikohtaiset parametrit, kuten imeytymisasteet, verenkiertoon ja kudoksiin jakaantuminen ja metaboliset nopeusvakiot, mää ­
ritetään usein siksi, että tilavapaiden (non-compartmental) tai fysiologiaan 
perustuvien mallien kehittäminen on helpompaa.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 537
 
TIEDOT JA RAPORTOINTI  
66. On suositeltavaa, että tutkimusraportissa on sisällysluettelo.  
Raportin rakenne  
67. Raportin tulee sisältää tämän testimenetelmän kattamat tiedot, ja ne on 
järjestettävä eri osiin ja kohtiin seuraavasti:  
Yhteenveto  
68. Tässä tutkimusraportin osassa on oltava yhteenveto tutkimussuunnitelmasta 
ja kuvaus käytetyistä menetelmistä. Siinä on myös esitettävä keskeiset löy ­
dökset, jotka koskevat massatasetta, metaboliittien luonnetta ja määrää, ku ­
dosjäämiä, puhdistumanopeutta, biokertyvyyspotentiaalia, sukupuolten väli ­
siä eroja jne. Yhteenveto on laadittava riittävän yksityiskohtaisesti, jotta 
löydöksiä voidaan arvioida.  
Johdanto  
69. Raportin tämän osan tulee sisältää tutkimuksen tavoitteet, perustelut ja tut ­
kimussuunnitelma sekä asianmukaiset viitteet ja taustatiedot.  
Aineet ja menetelmät  
70. Raportin tässä osassa on esitettävä yksityiskohtainen kuvaus kaikista asian ­
mukaisista tiedoista seuraavasti:  
a) Testikemikaali  
Tässä alakohdassa on esitettävä testikemikaalista seuraavat tunnistetiedot: 
kemiallinen nimi, molekyylirakenne, sen kemiallisen koostumuksen laa ­
dullinen ja määrällinen määritys, kemiallinen puhtaus ja epäpuhtauksien 
tyyppi ja määrät, mikäli mahdollista. Myös seuraavat tiedot on esitettävä: 
fysikaalis-kemialliset ominaisuudet sekä fysikaalinen olomuoto, väri, ko ­
konaisliukoisuus ja/tai jakaantumiskerroin, stabiliteetti ja tarvittaessa syö ­
vyttävyys. Mikäli tarpeen, myös isomeerejä koskevat tiedot on esitettävä. 
Jos testikemikaali on leimattu radioaktiivisella aineella, tähän alakohtaan 
on sisällyttävä myös seuraavat tiedot: radionuklidin tyyppi, leiman sijain ­
ti, spesifinen aktiivisuus ja radiokemiallinen puhtaus.  
Kantaja-aineen, laimenteiden, suspendoivien aineiden ja emulgointiainei ­
den tai muiden testikemikaalin annostelussa käytettyjen aineiden tyyppi 
tai kuvaus niistä on ilmoitettava.  
b) Koe-eläimet  
Tässä alakohdassa on esitettävä tiedot koe-eläimistä, mukaan luettuina 
seuraavat seikat: lajin ja kannan valinta sekä perustelut, eläinten ikä 
tutkimuksen alkaessa, sukupuoli ja paino, terveydentila ja eläinten hoito.  
c) Menetelmät  
Tässä alakohdassa on esitettävä yksityiskohdat tutkimussuunnitelmasta ja 
käytetystä menetelmästä. Alakohdassa on esitettävä myös seuraavat tie ­
dot: 
1) Perustelut altistumisreitin ja altistusolosuhteiden muuttamiselle, mi ­
käli tarpeen  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 538
 
2) Perustelut annostasojen valinnalle  
3) Kuvaus seurantatutkimusten kokeellisissa osioissa käytetyistä esitut ­
kimuksista, mikäli tarpeen. Tiedot vahvistava esitutkimus on toimi ­
tettava.  
4) Tiedot siitä, miten annosteluliuos valmistettiin, sekä mahdollisesti 
käytetyn liuottimen tai kantaja-aineen tyyppi  
5) Testiryhmien lukumäärä ja kussakin ryhmässä olleiden eläinten lu ­
kumäärä  
6) Annostelutasot ja tilavuus (ja annoksen spesifinen aktiivisuus, jos 
käytettiin radioaktiivista ainetta)  
7) Antoreitti (-reitit) ja -menetelmät  
8) Annostelutiheys  
9) Paastojakso (jos käytetty)  
10) Eläinkohtainen kokonaisradioaktiivisuus  
11) Eläinten käsittely  
12) Näytteiden kerääminen ja käsittely  
13) Metaboliittien erottelussa, kvantifioinnissa ja määrittämisessä käyte ­
tyt analyysimenetelmät  
14) Käytettyjen menetelmien havaitsemisrajat  
15) Muut käytetyt kokeelliset mittaukset ja menettelyt (sekä metaboliit ­
tien analysoinnissa käytettyjen menetelmien validointi)  
d) Tilastollinen analyysi  
Jos tutkimustulosten analysoinnissa käytetään tilastollista analyysia, ana ­
lyysimenetelmästä ja käytetystä tilasto-ohjelmasta on esitettävä tarpeeksi 
tietoa, jotta puolueeton arvioija/tilastotieteilijä voi arvioida ja rekonst ­
ruoida analyysin uudestaan.  
Järjestelmien mallintamistutkimusten (kuten fysiologiaan perustuvat tok ­
sikokineettiset mallit) osalta on esitettävä täydellinen kuvaus mallista, jotta malli voidaan rekonstruoida ja validoida riippumattomasti (katso 65 kohta ja lisäys: Määritelmät).
 
Tulokset  
71. Yhteenveto kaikista tiedoista on esitettävä taulukossa asianmukaisen tilas ­
tollisen arvioinnin kanssa, ja tiedot on kuvattava tämän osan tekstissä. Yh ­
teenveto radioaktiivisuuden laskentatiedoista on esitettävä tutkimuksen kan ­
nalta tarkoituksenmukaisella tavalla, yleensä mikrogramman tai milligram ­
man ekvivalentteina näytteen massaa kohti, joskin myös muita yksiköitä 
voidaan käyttää. Tämän osan on sisällettävä kaavioita, jotka kuvaavat löy ­
döksiä, jäljennöksiä edustavista kromatografia- ja spektrometriatiedoista, me ­
taboliittien määrittämistä/kvantifiointia sekä ehdotettuja metaboliareittejä 
metaboliittien molekyylirakenne mukaan luettuna. Lisäksi tämän osan on 
sisällettävä seuraavat tiedot, mikäli tarpeen:  
1) Radioaktiivisuuden määrä ja saanto virtsassa, ulosteessa, uloshengitys ­
ilmassa sekä häkin pesuvedessä olevassa virtsassa ja ulosteessa.  
— Ihotutkimusten osalta on sisällytettävä myös tiedot käsitellyltä iholta 
talteenotetusta testikemikaalista, ihohuuhteluista ja ihon jäännösradio ­
aktiivisuudesta, mukaan luettuina laitteet ja metaboliayksikkö sekä 
ihonpesututkimuksen tulokset. Katso lisätietoja 74–77 kohdasta.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 539
 
— Inhalaatiotutkimusten osalta on sisällytettävä myös tiedot testikemi ­
kaalin saannosta keuhkoista ja nenän kudoksista (8). Katso lisätietoja 
78 kohdasta.  
2) Kudoksiin jakautuminen (ilmoitettava prosenttiosuutena annetusta annok ­
sesta ja pitoisuudesta (mikrogramman ekvivalentteina kudosgrammaa kohti)) ja kudoksista verenkiertoon tai kudoksista plasmaan -suhteet.
 
3) Jokaisen tutkimuksen perusteella laadittu ainetase sekä kudosten ja erit ­
teiden analyysi.  
4) Plasmapitoisuudet ja toksikokineettiset parametrit (biologinen hyöty ­
osuus, AUC, Cmax, Tmax, puhdistuma, puoliintumisaika) sen jälkeen, kun kemikaalia on annettu oleellista altistumisreittiä (oleellisia altistumis ­
reittejä) pitkin.
 
5) Testikemikaalin imeytymisnopeus ja -laajuus sen jälkeen, kun sitä on 
annettu oleellista altistumisreittiä (oleellisia altistumisreittejä) pitkin.  
6) Eritteistä talteenotettujen testikemikaalin ja metaboliittien määrät (ilmoi ­
tetaan prosenttiosuutena annetusta annoksesta).  
7) Viittaus liitteessä esitettäviin tietoihin, jotka sisältävät jokaisen eläimen 
tiedot kaikista mittaustuloksista (esimerkiksi annoksen annostelu, saan ­
non prosenttiosuus, pitoisuudet, toksikokineettiset parametrit jne.)  
8) Kuva ehdotetuista metaboliareiteistä ja metaboliittien molekyylirakenteista.  
Pohdinta ja päätelmät  
72. Tässä osassa kirjoittajan (kirjoittajien) on  
1) esitettävä ehdotettu metaboliareitti, joka perustuu metaboliaa koskeviin 
tuloksiin ja testikemikaalin jakautumiseen eri komponentteihin  
2) pohdittava mahdollisia lajien ja sukupuolten välisiä eroja testikemikaalin 
jakautumisessa ja/tai biotransformaatiossa  
3) taulukoitava seuraavat tiedot ja pohdittava niitä: metaboliittien määrittä ­
minen ja niiden lukumäärä, puhdistumanopeudet, biokertyvyyspotentiaali 
sekä perusaineen ja/tai metaboliitin (metaboliittien) kudosjäämäpitoisuus 
ja toksikokineettisten parametrien mahdolliset annosriippuvaiset muutok ­
set, mikäli tarpeen  
4) sisällytettävä tähän osaan kaikki oleelliset myrkyllisyystutkimusten ai ­
kana saadut toksikokineettiset tiedot  
5) esitettävä ytimekkäät päätelmät, joita tutkimuksen tulokset tukevat  
6) lisättävä osia (jos tarpeen).  
73. Muita osia tulee käyttää tutkimusta tukevien kirjallisuustietojen, taulukoiden, 
kuvien, liitteiden jne. lisäämiseksi raporttiin.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 540
 
VAIHTOEHTOISET ALTISTUMISREITIT  
Ihon kautta altistus  
Ihon kautta käsittely  
74. Tässä osassa esitetään spesifistä tietoa ihon kautta annetun testikemikaalin 
toksikokinetiikan tutkimisesta. Ihon kautta imeytymisen osalta on luettava 
tämän liitteen luku B.44 [Ihon kautta imeytyminen:  in vivo  -menetelmä (9)]. 
Muiden tutkittavien ominaisuuksien, kuten jakautumisen ja metabolian, osalta voidaan käyttää tätä testimenetelmää B.36. Ihon kautta käsittelyssä 
testikemikaalista tulee käyttää yhtä tai useampaa annostasoa. Testikemikaa ­
lin (testikemikaalia sisältävä laimentamaton tai laimennettu materiaali tai formulaatio, joka applikoidaan iholle) on oltava sama kuin se, jolle ihmiset tai muut kohdelajit voivat altistua, tai kyseisen kemikaalin realistinen kor ­
vike. Annostaso(t) on valittava tämän testimenetelmän 20–26 kohdan mu ­
kaisesti. Ihon kautta annettavan annoksen valinnassa voidaan ottaa huomi ­
oon seuraavat seikat: oletettu ihmisten altistuminen ja/tai annokset, joissa on havaittu myrkyllisyyttä muissa ihon kautta välittyvää myrkyllisyyttä koske ­
vissa tutkimuksissa. Ihon kautta annettava annos (annettavat annokset) on 
tarvittaessa liuotettava sopivaan kantaja-aineeseen, ja annosteltavan määrän on oltava halutun annoksen kannalta riittävä. Juuri ennen kokeen alkua eläinten selästä poistetaan karvapeite leikkaamalla. Karvapeite voidaan 
myös ajella, mutta se tulee tehdä noin vuorokautta ennen testin alkua. Kar ­
vapeitettä poistettaessa on varottava vahingoittamasta ihoa, sillä se voi muut ­
taa ihon läpäisykykyä. Noin 10 prosenttia ruumiin pinnasta on oltava ajel ­
tuna, jotta siihen voidaan annostella testikemikaalia. Erittäin myrkyllisten 
kemikaalien yhteydessä tämä alue voi olla pienempi kuin 10 prosenttia, 
mutta mahdollisimman suuri osa alueesta on peitettävä ohuella ja yhtenäi ­
sellä kerroksella testikemikaalia. Samaa käsittelyaluetta on käytettävä kai ­
kissa testiryhmissä, joissa tutkitaan ihon kautta altistusta. Käsitellyt alueet on 
suojattava sopivalla paikalleen kiinnitettävällä suojuksella. Eläimet on pidet ­
tävä omissa häkeissään.
 
75. Ihonpesututkimus on tehtävä, jotta voidaan arvioida, mikä määrä testikemi ­
kaalin annetusta annoksesta voi poistua iholta, kun käsitelty ihoalue pestään miedolla saippualla ja vedellä. Tästä tutkimuksesta voi myös olla apua mää ­
ritettäessä massatasetta, kun testikemikaali annostellaan ihon kautta. Tässä 
ihonpesututkimuksessa on annettava kerta-annos testikemikaalia kahdelle eläimelle. Annostaso valitaan tämän testimenetelmän 23 kohdan mukaisesti 
(katso lisätietoja ihokontaktiajasta myös 76 kohdasta). Pesuvesistä talteen ­
otetut testikemikaalimäärät on määritettävä, jotta voidaan arvioida sitä, miten tehokkaasti pesutoimenpide poistaa testikemikaalia.
 
76. Ellei syövyttävyys estä sitä, testikemikaalia on pidettävä iholla vähintään 
kuusi tuntia. Kun suojus poistetaan, käsitelty alue on pestävä ihonpesutut ­
kimuksessa kuvatun menettelyn mukaisesti (katso 75 kohta). Sekä suojuk ­
sesta että pesuvesistä on analysoitava testikemikaalin jäämät. Tutkimuksen 
päättyessä jokainen eläin on lopetettava humaanisti viitteen (2) mukaisesti, ja käsitelty ihoalue on irrotettava. Käsitellystä ihosta on analysoitava tarkoi ­
tuksenmukainen osa testikemikaalijäämien (radioaktiivisuuden) määrittämi ­
seksi.
 
77. Lääkkeiden toksikokineettisessä arvioinnissa saatetaan tarvita muita toimen ­
piteitä asianmukaisen sääntelyjärjestelmän mukaisesti.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 541
 
Inhalaatio  
78. Testikemikaalista on käytettävä yhtä pitoisuutta (tai useampaa, mikäli tar ­
peen). Pitoisuus (pitoisuudet) on valittava tämän testimenetelmän 20–26 kohdan mukaisesti. Inhalaatiokäsittelyt on tehtävä käyttäen nenäkartiota tai 
vain pää -laitetta muita altistumisreittejä pitkin tapahtuvan imeytymisen es ­
tämiseksi (8). Jos käytetään muita inhalaatioaltistusolosuhteita, niiden perus ­
telut on dokumentoitava. Inhalaatioaltistuksen kesto on määriteltävä; yleensä altistus kestää 4–6 tuntia.
 
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their App ­
licability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manufac ­
tured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris.  
2) OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of 
Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series 
on Testing and Assessment N°19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris.
 
3) Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in the 
pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and re ­
gulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73–81.  
4) Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor microsco ­
pic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 
25–40,  
5) Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, 
Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically 
based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. 
Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400–411.
 
6) Tämän liitteen luku B.45 (Ihon kautta imeytyminen:  in vitro  -menetelmä)  
7) IPCS (2010). Characterization and application of 
Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS 
Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organization, 
International Programme on Chemical Safety.  
8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, 
OECD, Paris.  
9) Tämän liitteen luku B.44 (Ihon kautta imeytyminen:  in vivo  -menetelmä)  
10) Barton HA,  et al.  (2006). The Acquisition and Application of Absorption, 
Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Che ­
mical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35.  
11) Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel 
Dekker, Inc., New York.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 542
 
Lisäys  
MÄÄRITELMÄT  
ADME : Lyhennesana englanninkielisistä sanoista ”Absorption, Distribution, Me ­
tabolism, and Excretion” (imeytyminen, jakautuminen, metabolia ja erittyminen).  
Ainetase : Katso ”Massatase”.  
Antoreitti : (suun kautta, suonensisäisesti, ihon kautta, hengitysteiden kautta jne.): 
Tarkoittaa sitä tapaa, jolla kemikaalit annostellaan elimistöön (esimerkiksi suun 
kautta ruokintaletkulla, suun kautta ravinnon seassa, hengitysteiden kautta, suo ­
nensisäisesti jne.).  
AUC : (Area under the plasma concentration-time curve eli plasman 
pitoisuus-aikakäyrän alle jäävä pinta-ala): Testikemikaalin pitoisuutta plasmassa 
ajan suhteen kuvaavan käyrän alapuolinen pinta-ala. Se edustaa elimistöön imey ­
tyneen testikemikaalin kokonaismäärää ennalta määritetyn ajanjakson aikana. Li ­
neaarisissa olosuhteissa AUC (ajasta nolla äärettömyyteen saakka) on verrannol ­
linen elimistöön imeytyneen testikemikaalin kokonaismäärään imeytymisnopeu ­
desta riippumatta.  
Autoradiografia : (koko kehon autoradiografia): Käytetään radioaktiivisen testi ­
kemikaalin sijainnin määrittämiseen kudoksessa (laadullisesti ja/tai määrällisesti). Tässä tekniikassa käytetään röntgenkuvausfilmiä tai nykyään ennemminkin digi ­
taalista kuvantamista fosforilevylle radioaktiivisesti leimattujen molekyylien tai 
niiden fragmenttien saamiseksi näkyviin tallentamalla tutkittavan kohteen lähet ­
tämää säteilyä. Elinten dissekointiin verrattuna määrällisestä koko kehon auto ­
radiografiasta voi olla joitakin etuja arvioitaessa testikemikaalin jakautumista ja määritettäessä radioaktiivisen materiaalin kokonaissaantoa ja hajoamista kudok ­
sissa. Eräs merkittävä etu on esimerkiksi se, että sitä voidaan käyttää värillisiä 
eläimiä koskevassa mallissa, jolloin voidaan arvioida testikemikaalin ja melanii ­
nin välistä mahdollista suhdetta, sillä melaniini voi sitoa tiettyjä molekyylejä. Vaikka tämä tekniikka voi olla hyödyllinen koko kehoon kohdistuvissa arvioin ­
neissa sellaisten sitoutumispaikkojen osalta, joiden kapasiteetti on suuri mutta 
affiniteetti pieni, se voi olla rajallinen tunnistettaessa tiettyjä kohdepaikkoja, esi ­
merkiksi reseptoreihin sitoutumisen paikkoja, jolloin havaitseminen edellyttää suhteellisen suurta resoluutiota ja herkkyyttä. Autoradiografiaa käytettäessä ko ­
keet, joiden tavoitteena on määrittää annostellun yhdisteen massatase, on tehtävä 
kudoksiin jakautumiskokeesta erillisessä ryhmässä tai erillisenä tutkimuksena, jossa kaikki eritteet (joihin voi sisältyä myös uloshengitysilma) ja kokonaiset ruumiit homogenisoidaan ja analysoidaan nestetuikelaskennalla.
 
Biokertyvyys : Katso ”Kertyvyys”.  
Biologinen hyötyosuus : Annetun annoksen se fraktio, joka pääsee systeemiseen 
verenkiertoon tai fysiologiseen vaikutuspaikkaan. Testikemikaalin biologisella 
hyötyosuudella tarkoitetaan yleensä perusyhdistettä, mutta sillä voidaan tarkoittaa 
myös sen metaboliitteja. Se koskee ainoastaan yhtä kemiallista muotoa.  Huomio:  
biologinen hyötyosuus ja imeytyminen eivät ole sama asia. Esimerkiksi suun kautta imeytymisen (jolloin ainetta on suolen seinämässä ja porttiverenkierrossa) 
ja biologisen hyötyosuuden (jolloin ainetta on systeemisessä verenkierrossa ja 
kudoksissa) välinen ero voi syntyä esimerkiksi kemiallisesta hajoamisesta, joka johtuu aineen metabolisoitumisesta suolen seinämässä, ulosvirtauskuljetuksesta takaisin suoliston onteloon tai presysteemisestä metaboliasta maksassa (10). Myr ­
kyllisen komponentin (perusyhdisteen tai metaboliitin) biologinen hyötyosuus on 
kriittinen parametri ihmisiin kohdistuvan riskin arvioinnissa (ekstrapolointi suu ­
resta pieneen annokseen tai reitistä toiseen), jotta ulkoisista NOAEL- tai 
BMD-arvoista (sovellettu annos) voidaan johtaa sisäinen arvo. Suun kautta an ­
nostelun yhteydessä aiheutuvien maksavaikutusten osalta riittää suun kautta imeytyminen. Kaikkien muiden vaikutusten, jotka ilmenevät muualla kuin aineen antokohdassa, biologinen hyötyosuus on kuitenkin imeytymistä luotettavampi 
parametri käytettäväksi riskinarvioinnissa.
 
Biopysyvyys : Katso ”Pysyvyys”.  
Biotransformaatio : Tutkittavan testikemikaalin (yleensä entsymaattinen) kemial ­
linen muuntuminen eri kemikaaliksi elimistössä. ”Metabolian” synonyymi.  
C max : Joko enimmäis- tai huippupitoisuus veressä (plasmassa/seerumissa) annos ­
telun jälkeen tai enimmäis- tai huippuerittyminen (virtsaan tai ulosteeseen) an ­
nostelun jälkeen.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 543
 
Detoksifikaatioreitit : Vaihesarja, joka johtaa myrkyllisten kemikaalien eliminoi ­
tumiseen kehosta joko metabolisen muuntumisen tai erittymisen kautta.  
Eksogeeninen : Organismin tai järjestelmän ulkopuolella aiheutettu tai tuotettu 
(asia).  
Ekstrapolointi : Yhden tai useamman arvon päättely sen perusteella, mitä tiede ­
tään tai mitä on havaittu.  
Entsymaattiset parametrit : K  m : Michaelisin vakio ja V  max : enimmäisnopeus.  
Entsyymit/isotsyymit : Kemiallisia reaktioita katalysoivia (nopeuttavia) proteii ­
neja. Isotsyymit ovat entsyymejä, jotka katalysoivat samanlaisia kemiallisia reak ­
tioita mutta joiden aminohapposekvenssi on erilainen.  
Erittyminen : Prosessi(t), jonka (joiden) kautta annosteltu testikemikaali ja/tai sen 
metaboliitit poistuvat kehosta.  
Herkkyys : Menetelmän tai välineen kyky erotella mittausvasteita siten, että ne 
edustavat kyseisen muuttujan eri tasoja.  
Huippupitoisuus veressä (plasmassa/seerumissa) : Veren (plasman/seerumin) 
enimmäis- tai huippupitoisuus annostelun jälkeen (katso myös ”C  max ”). 
Imeytyminen : Kemikaalien siirtyminen kudoksiin tai niiden läpi. Imeytymisellä 
tarkoitetaan perusyhdistettä ja kaikkia sen metaboliitteja. Sitä ei tule sekoittaa 
biologinen hyötyosuus -käsitteeseen.  
Induktio/entsyymi-induktio : Ympäristön ärsykkeen tai induktorimolekyylin ai ­
heuttama entsyymisynteesi.  
Interpolointi : Kohdekemikaaliin liittyvän ominaisuuden ennustamisessa käyte ­
tään tietoja yhden tai useamman kemikaalin ominaisuuksista.  
Jakaantumiskerroin : Tunnetaan myös nimellä jakautumiskerroin; se on kah ­
dessa liuottimessa olevan kemikaalin erilaisen liukoisuuden mittari.  
Jakautuminen : Testikemikaalin ja sen johdannaisten leviäminen koko organis ­
miin.  
Järjestelmien mallintaminen  (fysiologiaan perustuva toksikokinetiikka, farma ­
kokinetiikkaan, fysiologiaan perustuva farmakokinetiikka, biologiaan perustuva 
jne.): Abstrakti malli, jossa käytetään matemaattista kieltä kuvaamaan järjestel ­
män käyttäytymistä.  
Kertyvyys  (biokertyvyys): Testikemikaalin määrän lisääntyminen kudoksissa 
ajan myötä (yleensä rasvakudoksissa toistuvan altistuksen jälkeen). Jos testike ­
mikaalia syötetään elimistöön enemmän kuin sitä eliminoituu, organismiin kertyy 
testikemikaalia, jolloin saatetaan saavuttaa myrkyllisiä testikemikaalipitoisuuksia.  
Kohdekudos : Kudos, jossa myrkyllisen aineen pääasiallinen haittavaikutus ilme ­
nee. 
Kudoksiin jakautuminen : Testikemikaalin palautuva liike elimistön yhdestä 
paikasta toiseen. Kudoksiin jakautumista voidaan tutkia elinten dissektion, homo ­
genisoinnin, polttamisen tai nestetuikelaskennan avulla tai koko kehon laadulli ­
sella ja/tai määrällisellä autoradiografialla. Edellinen on hyödyllinen määritettä ­
essä pitoisuutta ja saantoa kudoksista sekä jäljellä olevasta ruumiista samoilla eläimillä, mutta sen tarkkuus voi olla riittämätön kaikkien kudosten osalta ja 
sen kokonaissaanto voi olla tarkoituksenmukaista pienempi (< 90 prosenttia). 
Katso jälkimmäisen määritelmä edeltä.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 544
 
Lineaarisuus / lineaarinen kinetiikka : Kinetiikan kannalta prosessi on lineaa ­
rinen silloin, kun kaikki eri osien väliset siirtymisnopeudet ovat verrannollisia 
määriin tai pitoisuuksiin nähden (eli ensimmäisen kertaluvun reaktio). Tällöin puhdistuma- ja jakautumistilavuudet ovat vakioita, kuten myös puoliintumisajat. Saavutetut pitoisuudet ovat verrannollisia annostelumäärään (altistukseen), ja ker ­
tymisen ennustaminen on helpompaa. Lineaarisuutta/ei-lineaarisuutta voidaan ar ­
vioida vertailemalla oleellisia parametreja (kuten AUC-arvoa) eri annosten tai kerrallisen ja toistuvan altistuksen jälkeen. Annosriippuvuuden puute saattaa vii ­
tata siihen, että yhdisteen metaboliaan osallistuvat entsyymit ovat saturoituneet. 
AUC-arvon suureneminen toistuvan altistuksen jälkeen (verrattuna 
kerta-altistukseen) saattaa viitata metabolian estymiseen, ja AUC-arvon pienene ­
minen saattaa puolestaan viitata metabolian indusoitumiseen [katso myös (11)].
 
Mallien validointi : Prosessi, jossa arvioidaan, kuvaako jokin malli käytettävissä 
olevia toksikokineettisiä tietoja yhdenmukaisesti. Malleja voidaan arvioida ver ­
tailemalla mallin avulla saatuja ennusteita ja kokeellisia arvoja yhteiseen riippu ­
mattomaan muuttujaan (esimerkiksi aikaan). Arvioinnin laajuus on perusteltava 
suhteessa mallin käyttötarkoitukseen.  
Massatase : Järjestelmään tulevan ja siitä poistuvan testikemikaalin määrä.  
Metabolia : ”Biotransformaation” synonyymi.  
Metaboliitit : Metabolian tai metabolisten prosessien tuotteet.  
Myrkyllisyyden mekanismi / myrkyllisyyden vaikutustapa : Vaikutusmeka ­
nismi tarkoittaa tiettyjä biokemiallisia interaktioita, joiden kautta testikemikaalin vaikutus syntyy. Vaikutustapa tarkoittaa yleisempiä reittejä, joiden kautta testike ­
mikaalin myrkyllisyys aiheutuu.
 
Osa: Kehon, kudoksen tai solun rakenteellinen tai biokemiallinen osio (tai yk ­
sikkö), joka on muista osista erillinen.  
Puhdistumanopeus : Määrällinen mittari, jolla mitataan sitä nopeutta, jolla testi ­
kemikaali poistuu verestä, plasmasta tai tietystä kudoksesta aikayksikköä kohti.  
Puoliintumisaika (t  1/2 ): Aika, jossa testikemikaalin pitoisuus pienenee puoleen 
tietyssä osassa. Yleensä sillä tarkoitetaan plasmapitoisuutta tai testikemikaalin määrää koko kehossa.
 
Pysyvyys (biopysyvyys) : Kemikaalin pitkäaikainen läsnäolo (biologisessa järjes ­
telmässä) sen vuoksi, että se hajoaa/eliminoituu hitaasti.  
Reseptorien mikroskooppinen autoradiografia  (tai reseptorien mikroautoradio ­
grafia): Tätä tekniikkaa voidaan käyttää tutkittaessa tiettyjen kudospaikkojen tai 
solupopulaatioiden välistä ksenobioottista vuorovaikutusta, esimerkiksi resepto ­
reihin sitoutumista tai tiettyä vaikutustapaa koskevissa tutkimuksissa, joissa voi ­
daan tarvita suurta resoluutiota ja suurta tarkkuutta, mikä taas ei ole mahdollista 
koko kehon autoradiografiassa.  
Sappieritys : Erittyminen sappiteiden kautta.  
Saturaatio : Tila, jolloin yksi tai useammin kineettinen prosessi (esimerkiksi 
imeytyminen, metabolia tai puhdistuma) on suurimmillaan (eli saturoitunut).  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 545
 
Suun kautta imeytyminen : Prosenttiosuus antopaikasta (esimerkiksi 
maha-suolikanavasta) imeytyneestä testikemikaaliannoksesta. Tätä kriittistä para ­
metria voidaan käyttää, jotta saadaan selville, mikä fraktio annostellusta testike ­
mikaalista pääsee porttilaskimoon ja sen jälkeen maksaan.  
Testikemikaali : Tätä testimenetelmää käyttäen testattu kemikaali tai seos.  
T max : C max -arvon saavuttamiseen tarvittava aika.  
Toksikokinetiikka  (farmakokinetiikka): Kemikaalien imeytymistä, jakautumista, 
metaboliaa ja erittymistä aikaan nähden käsittelevä tutkimus.  
Vakaan tilan pitoisuus veressä (plasmassa) : Avoimen järjestelmän tasapainoti ­
la, jossa kaikki järjestelmään vaikuttavat tekijät ja vastakkaiset tekijät ovat tasa ­
painossa siten, että sen kaikkien komponenttien pitoisuus on vakaa, vaikka aine virtaa järjestelmän läpi.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 546
 
B.37.  ORGANOFOSFAATTIEN AIHEUTTAMA VIIVÄSTYNYT 
NEUROTOKSISUUS AKUUTIN ALTISTUKSEN JÄLKEEN  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Aineiden toksisten vaikutusten arvioinnissa on tärkeää ottaa huomi ­
oon mahdollisuus, että tietyt aineluokat voivat aiheuttaa erityistä neurotoksisuutta, jota ei ehkä todeta muissa toksisuuskokeissa. Tiet ­
tyjen organofosfaattien on havaittu aiheuttavan viivästynyttä neuro ­
toksisuutta, ja niitä tulisi pitää mahdollisina tutkimuskohteina.
 
Viivästynyttä polyneuropatiaa aiheuttavat aineet voidaan tunnistaa  in 
vitro  -seulontatesteillä. Negatiiviset tulokset näistä tutkimuksista ei ­
vät kuitenkaan todista, ettei testiaine ole neurotoksinen.  
Ks. myös Yleisjohdanto, osa 8.  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Organofosfaatteja  ovat varauksettomat organofosfaattiesterit, tioeste ­
rit tai organofosfori-, organofosfoni- tai organofosforamidihappoan ­
hydridit tai samantyyppisten fosforotioidi-, fosfonotioidi- tai fosforo ­
tioamidihappoanhydridit tai muut tässä aineluokassa joskus tavattavat aineet, jotka voivat aiheuttaa viivästynyttä neurotoksisuutta.
 
Viivästynyt neurotoksisuus  on oireryhmä, johon liittyy ataksian, sel ­
käytimen ja ääreishermon distaalisten aksonopatioiden pitkittynyt vii ­
västynyt ilmeneminen ja neuropatian kohde-esteraasin (NTE) esto ja 
vanheneminen hermokudoksessa.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Vertailuainetta voidaan testata positiivisella verrokkiryhmällä sen 
osoittamiseksi, ettei testatun lajin vaste muutu laboratoriokoeolosuh ­
teissa merkitsevästi.  
Yksi esimerkki laajalti käytetystä neurotoksisesta aineesta on tri-o- 
tolyylifosfaatti (CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5, CAS-nimistö: 
fosforihappo, tris(2-metyylifenyyli)esteri), tunnettu myös nimellä tris-o-kresyylifosfaatti.
 
1.4 KOEMENETELMÄN PERIAATE  
Testiaine annostellaan kerta-annoksena suun kautta kanoille, joita on 
suojeltu akuuteilta kolinergisiltä vaikutuksilta silloin kun se on ollut tarkoituksenmukaista. Eläimiä havainnoidaan 21 päivän ajan käyttäy ­
tymispoikkeavuuksien, ataksian ja paralyysin suhteen. Kustakin ryh ­
mästä satunnaisesti valituille kanoille tehdään biokemialliset mää ­
ritykset, erityisesti neuropatian kohde-esteraasin (NTE) esto, yleensä 24 ja 48 tunnin kuluttua annostelusta. Kahdenkymmenenyhden päi ­
vän kuluttua altistuksesta loput kanat lopetetaan ja valitut hermoku ­
dokset tutkitaan histopatologisesti.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 547
 
1.5 KOEMENETELMÄN KUVAUS  
1.5.1  Valmistelut  
Terveet nuoret täysikasvuiset kanat, joilla ei ole häiritseviä virussai ­
rauksia, lääkitystä eikä käynnin poikkeavuuksia, jaetaan satunnaiso ­
tannalla koe- ja verrokkiryhmiin ja niitä totutetaan laboratorio-olo ­
suhteisiin vähintään viiden päivän ajan ennen tutkimuksen alkua.  
Kokeessa käytettävien testihäkkien on oltava tarpeeksi tilavia, jotta 
kanat voivat liikkua vapaasti ja käynnin havainnointi käy helposti.  
Testiainetta pitäisi yleensä annostella suun kautta mahaletkun avulla, 
liivatekapseleina tai vastaavalla menetelmällä. Nesteet voidaan antaa 
laimentamattomina tai liuotettuna sopivaan vehikkeliin, kuten mais ­
siöljyyn. Kiinteät aineet tulee mahdollisuuksien mukaan liuottaa, koska suuret määrät kiinteää ainetta liivatekapseleissa eivät välttä ­
mättä imeydy tehokkaasti. Muiden kuin vesipitoisten vehikkelien 
toksiset ominaisuudet on oltava tiedossa ja jos ne eivät ole, on ne 
määritettävä ennen koetta.
 
1.5.2  Koeolosuhteet  
1.5.2.1  Koe-eläimet  
Kokeessa suositellaan käytettäväksi nuoria täysikasvuisia kanoja  
(Gallus gallus domesticus),  jotka ovat iältään 8–12 kuukautta. Ka ­
nojen tulee olla normaalikokoisia, -lajisia ja -kantaisia ja mieluiten 
kasvatettu oloissa, joissa ne ovat voineet liikkua vapaasti.  
1.5.2.2  Lukumäärä ja sukupuoli  
Kokeessa tulee käyttää koeryhmän lisäksi yhtä vehikkeliä saavaa 
verrokkiryhmää ja yhtä positiivista verrokkiryhmää. Vehikkeliä saa ­
vaa verrokkiryhmää tulee käsitellä täsmälleen samoin kuin koeryh ­
mää testiaineen annostelua lukuun ottamatta.  
Kussakin ryhmässä tulee olla riittävä määrä lintuja, jotta vähintään 
kuusi lintua voidaan lopettaa biokemiallisia määrityksiä varten 
(kolme kanaa kahtena eri ajankohtana) ja kuusi lintua säilyy hengissä 21 päivän havaintojakson ajan patologisia tutkimuksia varten.
 
Positiivista verrokkiryhmää voidaan tutkia samanaikaisesti tai se voi 
olla tuore historiallinen verrokkiryhmä. Siinä on oltava vähintään kuusi kanaa, joita on käsitelty tunnetulla viivästynyttä neurotoksi ­
suutta aiheuttavalla aineella. Näistä kuudesta kanasta kolmelle teh ­
dään biokemialliset määritykset ja kolmelle patologiset tutkimukset. Historiallisten tietojen ajoittaista päivitystä suositellaan. Uusia posi ­
tiivisia kontrollitietoja pitäisi kehittää, kun kokeen suorittava labora ­
torio muuttaa joitakin olennaisia seikkoja koekäytännössä (esim. kan ­
ta, ravinto, elinolosuhteet).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 548
 
1.5.2.3  Annostasot  
Päätutkimuksessa käytettävä annostaso on määritettävä alustavassa 
tutkimuksessa, johon sisältyy tarkoituksenmukainen määrä kanoja ja annostasoryhmiä. Jonkinasteinen letaliteetti alustavassa tutkimuk ­
sessa on tyypillisesti välttämätöntä riittävän annoksen määrittämi ­
seksi päätutkimusta varten. Akuuttien kolinergisten vaikutusten aihe ­
uttaman kuoleman estämiseksi voidaan kanoille antaa atropiinia tai muuta suoja-ainetta, joka ei tiettävästi vaikuta viivästyneisiin neuro ­
toksisiin vasteisiin. Testiaineiden ei-letaali enimmäisannos voidaan 
määrittää erilaisilla koemenetelmillä (ks. menetelmä B.1 bis). Kanoja koskevat historialliset tiedot tai muut toksikologiset tiedot voivat 
helpottaa annosten valintaa.
 
Päätutkimuksen testiaineen annostason tulee olla mahdollisimman 
korkea ottaen huomioon alustavan annosvalintatutkimuksen tulokset ja 2 000 mg/kg:n yläraja-annos. Mahdollisesti ilmenevä kuolleisuus 
ei saisi olla niin laajaa, etteikö riittävä määrä eläimiä säilyisi hengissä 
21. päivänä tehtäviä biokemiallisia (kuusi eläintä) ja histologisia (kuusi eläintä) tutkimuksia varten. Atropiinia tai muuta suoja-ainetta, jotka eivät tiettävästi vaikuta viivästyneisiin neurotoksisiin vasteisiin, 
tulisi käyttää akuuteista kolinergisistä vaikutuksista johtuvien kuole ­
mien estämiseksi.
 
1.5.2.4  Raja-annoskoe  
Jos kokeessa ei vähintään 2 000 mg/kg/vrk:n annostasolla tässä tut ­
kimuksessa kuvatuilla toimenpiteillä todeta havaittavia toksisia vai ­
kutuksia ja jos toksisuutta ei ole odotettavissa rakenteellisesti saman ­
tyyppisistä aineista olevien tietojen perusteella, tutkimusta suurem ­
malla annoksella ei pidetä tarpeellisena. Raja-annoskoe voidaan tehdä paitsi silloin kun odotettavissa oleva altistus ihmisellä viittaa 
tarpeeseen käyttää korkeampaa annostasoa.
 
1.5.2.5  Havainnointijakso  
Havainnointijakso kestää 21 päivää.  
1.5.3  Kokeen suorittaminen  
Kun eläimille on annettu suoja-ainetta akuutista kolinergisestä vai ­
kutuksesta johtuvan kuoleman estämiseksi, annostellaan testiaine ker ­
ta-annoksena.  
1.5.3.1 Yleishavainnot  
Havainnoinnin tulee alkaa heti käsittelyn alettua. Kaikkia kanoja 
tulee havainnoida tarkoin useita kertoja kahden ensimmäisen päivän aikana ja sen jälkeen vähintään kerran päivässä 21 päivän ajan tai 
siihen asti kunnes eläin aiotaan lopettaa. Kaikki toksisuusoireet tulee 
kirjata muistiin, mukaan lukien niiden alkamisajankohta, tyyppi, voi ­
makkuus ja kesto. Ataksia tulee mitata vähintään neliportaisella or ­
dinaaliasteikolla, ja paralyysi tulee kirjata muistiin. Patologisia tutki ­
muksia varten valitut kanat on päästettävä häkistä vähintään kahdesti 
viikossa ja pakotettava joksikin aikaa liikkumaan, kuten kiipeämään tikkaita, vähäisten toksisten vaikutusten havainnoinnin helpottami ­
seksi. Kuolemaisillaan olevat ja voimakasta kärsimystä tai kipua 
osoittavat eläimet tulee poistaa heti kun niiden tila huomataan ja 
lopettaa humaanilla tavalla ja niille tulee tehdä ruumiinavaus.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 549
 
1.5.3.2 Ruumiinpaino  
Kaikki kanat on punnittava juuri ennen testiaineen annostelua ja 
vähintään kerran viikossa sen jälkeen.  
1.5.3.3 Biokemia  
Kuusi satunnaisesti kustakin käsittelyä saavasta koeryhmästä ja ve ­
hikkeliä saavasta verrokkiryhmästä valittua kanaa sekä kolme kanaa 
positiivisesta verrokkiryhmästä (silloin kun tätä ryhmää tutkitaan sa ­
manaikaisesti) lopetetaan muutaman päivän kuluttua annostelusta ja niiden aivoista ja lannerangasta tehtyjä preparaatteja arvioidaan neu ­
ropatian kohde-esteraasin (NTE) estovaikutuksen osalta. Lisäksi voi 
olla hyödyllistä tehdä preparaatti lonkkahermokudoksesta neuropa ­
tian kohde-esteraasin (NTE) estovaikutuksen arvioimiseksi. Yleensä kolme lintua sekä verrokki- että kustakin koeryhmästä lopetetaan 24 tunnin kuluttua ja toiset kolme 48 tunnin kuluttua annostelusta. Po ­
sitiivisesta kontrolliryhmästä sen sijaan lopetetaan kolme kanaa 24 
tunnin kuluttua annostelusta. Jos havainnot myrkytyksen kliinisistä oireista (tämä voidaan usein arvioida havainnoimalla kolinergisten 
merkkien alkamisajankohtaa) viittaavat toksisen aineen erittäin hita ­
aseen eliminaatioon, voi olla suositeltavaa ottaa kudosnäyte kolmesta linnusta kahtena eri ajankohtana 24–72 tunnin sisällä annostelusta.
 
Näille näytteille voidaan tehdä myös asetyylikoliiniesteraasi (AChE)- 
analyysit, jos se katsotaan tarkoituksenmukaiseksi. AChE voi kuiten ­
kin reaktivoitua spontaanisti  in vivo  ja johtaa aineen voimakkuuden 
aliarviointiin AChE:n estäjänä.  
1.5.3.4 Silmämääräinen ruumiinavaus  
Jokaisen eläimen (sekä lopetettavaksi suunniteltujen ja kuolemaisil ­
laan olevien) silmämääräiseen ruumiinavaukseen tulee sisältyä aivo ­
jen ja selkäytimen ulkonäön havainnointi.  
1.5.3.5 Histopatologinen tutkimus  
Havainnointijaksosta hengissä säilyneiden ja biokemiallisissa tutki ­
muksessa käyttämättömien eläinten hermokudos tutkitaan mikrosko ­
oppisesti Kudokset on kiinnitettävä perusfuusiotekniikoilla  in situ.  
Sektiot tulee ottaa pikkuaivoista (keskellä kulkeva pitkittäistaso), ydinjatkeesta, selkäytimestä ja ääreishermoista. Selkäydinsektiot tulee 
ottaa kaularangan yläosasta, rintarangan keskiosasta ja lannerstiran ­
gan alueelta. Säärihermon distaalialueelta ja sen kaksoiskantalihasta (m. gastrocnemicus) huoltavista haaroista ja lonkkahermosta otetaan näyte. Sektiot värjätään sopivalla myeliini- ja aksonispesifisillä ai ­
neilla.
 
2. TULOKSET  
Negatiiviset tulokset tässä menetelmässä valituilla kohdevaikutuksilla 
(biokemia, histopatologia ja käyttäytymisen havainnointi) eivät nor ­
maalisti vaadi viivästyneen neurotoksisuuden lisätestausta. Kohdevai ­
kutuksia koskevat epävarmat tai keskeneräiset tulokset voivat vaatia 
lisätutkimuksia.  
Yksilötiedot on esitettävä. Ne on myös esitettävä yhteenvetona tau ­
lukossa, josta käy ilmi eläinten lukumäärä koeryhmittäin testin alus ­
sa, leesioita, käyttäytymis- tai biokemiallisia vaikutuksia osoittanei ­
den eläinten lukumäärä, leesio- tai vaikutustyypit ja niiden vaikeu ­
saste sekä eläinten prosentuaaliset määrät kutakin erityyppistä ja vai ­
keusasteeltaan erilaisia leesioita tai vaikutusta kohti.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 550
 
Tämän tutkimuksen tuloksia tulee arvioida käyttäytymis-, biokemial ­
listen ja histopatologisten vaikutusten esiintyvyyden, vaikeusasteen ja 
korrelaation perusteella ja kussakin koe- ja verrokkiryhmässä havait ­
tujen muiden vaikutusten suhteen.  
Numeerisia tuloksia tulee arvioida tarkoituksenmukaisin ja yleisesti 
hyväksytyin tilastollisin menetelmin. Tilastolliset menetelmät tulee 
valita tutkimuksen suunnitteluvaiheessa.  
3. RAPORTOINTI  
TESTIRAPORTTI  
Testiraportin tulee mahdollisuuksien mukaan sisältää seuraavat tie ­
dot: 
Koe-eläimet:  
— käytetty kanta,  
— eläinten lukumäärä ja ikä,  
— lähde, elinolosuhteet jne., ja  
— kunkin eläimen paino testin alussa.  
Koeolosuhteet:  
— selostus testiaineen valmistamisesta, säilyvyydestä ja homogee ­
nisuudesta, silloin kun se on tarkoituksenmukaista,  
— vehikkelin valintaperusteet,  
— selonteko testiaineen annostelusta,  
— selonteko ravinnon ja veden laadusta,  
— annosvalintojen perustelu,  
— annosteltujen annosten erittely, mukaan lukien selonteko vehik ­
kelistä ja annostellun aineen määrästä ja fyysisestä muodosta, ja  
— mahdollisen suoja-aineen identifiointi ja selonteko sen annoste ­
lusta.  
Tulokset:  
— ruumiinpaino,  
— toksinen vaste annostasoittain, mukaan lukien kuolleisuus,  
— kliinisten havaintojen luonne, voimakkuus ja kesto (korjaantu ­
vuudesta riippumatta),  
— biokemiallisten menetelmien ja löydösten yksityiskohtainen ku ­
vaus,  
— ruumiinavauslöydökset,  
— kaikkien histopatologisten löydösten yksityiskohtainen kuvaus, ja  
— tulosten tilastollinen käsittely silloin kun se on tarkoituksenmu ­
kaista.  
Tulosten pohdinta  
Johtopäätökset  
4. LÄHDELUETTELO  
Tämä menetelmä on analoginen OECD TG 418:n kanssa.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 551
 
B.38.  ORGANOFOSFAATTIEN AIHEUTTAMA VIIVÄSTYNYT 
NEUROTOKSISUUS 28 PÄIVÄN TOISTUVAN ANNOSTELUN 
TUTKIMUKSESSA  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Aineiden toksisten vaikutusten arvioinnissa on tärkeää ottaa huomi ­
oon mahdollisuus, että tietyt aineluokat voivat aiheuttaa erityistä neurotoksisuutta, jota ei ehkä todeta muissa toksisuuskokeissa. Tiet ­
tyjen organofosfaattien on havaittu aiheuttavan viivästynyttä neuro ­
toksisuutta, ja niitä tulisi pitää mahdollisina tutkimuskohteina.
 
Viivästynyttä polyneuropatiaa aiheuttavat aineet voidaan tunnistaa  in 
vitro  -seulontatesteillä. Negatiiviset tulokset näistä tutkimuksista ei ­
vät kuitenkaan todista, ettei testiaine ole neurotoksinen.  
Tästä 28 päivää kestävästä viivästynyttä neurotoksisuutta koskevasta 
kokeesta saadaan tietoa mahdollisista terveyshaitoista, joita toistuvat 
altistukset rajoitetun aikajakson sisällä todennäköisesti aiheuttavat. Kokeesta saadaan tietoa annosvasteesta ja sen avulla voidaan arvi ­
oida haitatonta vaikutustasoa (NOAEL), mistä voi olla hyötyä altis ­
tuksen turvallisuusperusteiden määrittelyssä.
 
Ks. myös yleisjohdanto, osa B.  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Organofosfaatteja  ovat varauksettomat organofosfaattiesterit, tioeste ­
rit tai organofosfori-, organofosfoni- tai organofosforamidihappoan ­
hydridit tai samantyyppisten fosforotioidi-, fosfonotioidi- tai fosforo ­
tioamidihappoanhydridit tai muut tässä aineluokassa joskus tavattavat aineet, jotka voivat aiheuttaa viivästynyttä neurotoksisuutta.
 
Viivästynyt neurotoksisuus  on oireyhtymä, johon liittyy ataksian, sel ­
käytimen ja ääreishermon distaalisten aksonopatioiden pitkittynyt vii ­
västynyt ilmeneminen ja neuropatian kohde-esteraasin (NTE) esto ja 
vanheneminen hermokudoksessa.  
1.3 KOEMENETELMÄN PERIAATE  
Testiainetta annostellaan kanoille päivittäin suun kautta 28 päivän 
ajan. Eläimiä havainnoidaan vähintään kerran päivässä käyttäytymis ­
poikkeavuuksien, ataksian ja paralyysin suhteen 14 päivän ajan vii ­
meisestä annoksesta laskettuna. Kustakin ryhmästä satunnaisesti va ­
lituille kanoille tehdään biokemialliset määritykset, erityisesti neuro ­
patian kohde-esteraasin (NTE) esto, yleensä 24 ja 48 tunnin kuluttua viimeisestä annoksesta. Kaksi viikkoa viimeisen annoksen jälkeen 
loput kanat lopetetaan ja valitut hermokudokset tutkitaan histopato ­
logisesti.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 552
 
1.4 KOEMENETELMÄN KUVAUS  
1.4.1  Valmistelut  
Terveet nuoret täysikasvuiset kanat, joilla ei ole häiritseviä virussai ­
rauksia, lääkitystä eikä käynnin poikkeavuuksia, jaetaan satunnaiso ­
tannalla koe- ja verrokkiryhmiin ja niitä totutetaan laboratorio-olo ­
suhteisiin vähintään viiden päivän ajan ennen tutkimuksen alkua.  
Kokeessa käytettävien testihäkkien on oltava tarpeeksi tilavia, jotta 
kanat voivat liikkua vapaasti ja käynnin havainnointi käy helposti.  
Testiainetta annostellaan päivittäin seitsemänä päivänä viikossa mie ­
luiten mahaletkun kautta tai liivatekapseleina. Nesteet voidaan antaa 
laimentamattomina tai liuotettuna sopivaan vehikkeliin, kuten mais ­
siöljyyn. Kiinteät aineet tulee mahdollisuuksien mukaan liuottaa, koska suuret määrät kiinteää ainetta liivatekapseleissa eivät välttä ­
mättä imeydy tehokkaasti. Muiden kuin vesipitoisten vehikkelien 
toksiset ominaisuudet on oltava tiedossa ja jos ne eivät ole, on ne määritettävä ennen koetta.
 
1.4.2  Koeolosuhteet  
1.4.2.1  Koe-eläimet  
Kokeessa suositellaan käytettäväksi nuoria täysikasvuisia kanoja  
(Gallus gallus domesticus),  jotka ovat iältään 8–12 kuukautta. Ka ­
nojen tulee olla normaalikokoisia, -lajisia ja -kantaisia ja mieluiten 
kasvatettu oloissa, joissa ne ovat voineet liikkua vapaasti.  
1.4.2.2  Lukumäärä ja sukupuoli  
Kokeessa tulee yleensä käyttää vähintään kolmea koeryhmää ja yhtä 
vehikkeliä saavaa verrokkiryhmää. Vehikkeliä saavaa verrokkiryh ­
mää tulee käsitellä täsmälleen samoin kuin koeryhmää lukuun otta ­
matta testiaineen annostelua.  
Kussakin ryhmässä tulee olla riittävä määrä lintuja, jotta vähintään 
kuusi lintua voidaan lopettaa biokemiallisia määrityksiä varten (kolme kanaa kahtena eri ajankohtana) ja kuusi lintua säilyy hengissä 14 päivän havaintojakson ajan patologiaa varten.
 
1.4.2.3  Annostasot  
Annostasojen valinnassa tulee ottaa huomioon viivästynyttä neuro ­
toksisuutta koskevan akuutin testin tulokset ja kaikki muut testiyh ­
disteestä saatavilla olevat toksisuus- tai kinetiikkatiedot. Korkein an ­
nostaso tulee valita siten, että se aiheuttaa toksisia vaikutuksia, mie ­
luiten viivästynyttä neurotoksisuutta, mutta ei kuolemaa eikä ilmeistä kärsimystä. Tämän jälkeen annostasot valitaan asteittain alenevasti 
mahdollisen annosvasteen ja haitattoman vaikutustason (NOAEL) 
osoittamiseksi alhaisimmalla annostasolla.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 553
 
1.4.2.4  Raja-annoskoe  
Jos kokeessa ei vähintään 1 000 mg/kg/vrk:n annostasolla tässä tut ­
kimuksessa kuvatuilla toimenpiteillä todeta havaittavia toksisia vai ­
kutuksia ja jos toksisuutta ei ole odotettavissa rakenteellisesti saman ­
tyyppisistä aineista olevien tietojen perusteella, tutkimusta suurem ­
malla annoksella ei pidetä tarpeellisena. Raja-annoskoe voidaan tehdä paitsi silloin kun odotettavissa oleva altistus ihmisellä viittaa tarpeeseen käyttää korkeampaa annostasoa.
 
1.4.2.5  Havainnointijakso  
Kaikkia eläimiä tulee havainnoida vähintään kerran päivässä altistus ­
aikana ja 14 päivän ajan sen jälkeen, lukuun ottamatta eläimiä, joille aiotaan tehdä ruumiinavaus.
 
1.4.3  Kokeen suorittaminen  
Eläimille annetaan testiainetta seitsemänä päivänä viikossa 28 päivän 
ajan.  
1.4.3.1  Yleishavainnot  
Havainnoinnin tulee alkaa heti käsittelyn alettua. Kaikkia kanoja 
tulee havainnoida tarkoin vähintään kerran päivässä kunakin 28 kä ­
sittelypäivänä ja 14 päivän ajan annostelun päätyttyä tai siihen asti kunnes eläin aiotaan lopettaa. Kaikki toksisuusoireet tulee kirjata muistiin, mukaan lukien niiden alkamisajankohta, tyyppi, voimak ­
kuus ja kesto. Havaintoihin tulee sisältyä muun muassa käyttäyty ­
mispoikkeavuudet. Ataksia tulee mitata vähintään neliportaisella or ­
dinaaliasteikolla ja paralyysi tulee kirjata muistiin. Kanat on päästet ­
tävä häkistä vähintään kahdesti viikossa ja pakotettava joksikin aikaa 
liikkumaan, kuten kiipeämään tikkaita, vähäisten toksisten vaikutus ­
ten havainnoinnin helpottamiseksi. Kuolemaisillaan olevat ja voima ­
kasta kärsimystä tai kipua osoittavat eläimet tulee poistaa heti kun niiden tila huomataan ja lopettaa humaanilla tavalla ja niille tulee 
tehdä ruumiinavaus.
 
1.4.3.2  Ruumiinpaino  
Kaikki kanat on punnittava juuri ennen testiaineen ensimmäistä an ­
nostelua ja vähintään kerran viikossa sen jälkeen.  
1.4.3.3  Biokemia  
Kuusi satunnaisesti kustakin käsittelyä saavasta koeryhmästä ja ve ­
hikkeliä saavasta verrokkiryhmästä valittua kanaa lopetetaan muu ­
taman päivän kuluttua viimeisen annoksen antamisesta ja niiden ai ­
voista ja lannerangasta tehtyjä preparaatteja arvioidaan neuropatian kohde-esteraasin (NTE) estovaikutuksen osalta. Lisäksi voi olla hyö ­
dyllistä tehdä preparaatti lonkkahermokudoksesta neuropatian kohde- 
esteraasin (NTE) estovaikutuksen arvioimiseksi. Tavallisesti kolme 
lintua sekä verrokki- että kustakin koeryhmästä lopetetaan 24 tunnin kuluttua ja toiset kolme 48 tunnin kuluttua viimeisestä annoksesta laskettuna. Jos tiedot akuutista tutkimuksesta tai muista tutkimuksista 
(esim. toksikokinetiikka) viittaavat siihen, että eläimet tulisi mielui ­
ten lopettaa joinakin muina ajankohtina viimeisen annostelun jäl ­
keen, tulisi näitä aikoja noudattaa ja perustelut dokumentoida.
 
Näille näytteille voidaan tehdä myös asetyylikoliiniesteraasi (AChE)- 
analyysit, jos se katsotaan tarkoituksenmukaiseksi. AChE voi kuiten ­
kin reaktivoitua spontaanisti  in vivo  ja johtaa aineen voimakkuuden 
aliarviointiin AChE:n estäjänä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 554
 
1.4.3.4  Silmämääräinen ruumiinavaus  
Jokaisen eläimen (sekä lopetettavaksi suunniteltujen ja kuolemaisil ­
laan olevien) silmämääräiseen ruumiinavaukseen tulee sisältyä aivo ­
jen ja selkäytimen ulkonäön havainnointi.  
1.4.3.5  Histopatologinen tutkimus  
Havainnointijaksosta hengissä säilyneiden ja biokemiallisissa tutki ­
muksessa käyttämättömien eläinten hermokudos tutkitaan mikrosko ­
oppisesti. Kudokset on kiinnitettävä perfuusiotekniikoilla  in situ.  
Sektiot tulee ottaa pikkuaivoista (keskellä kulkeva pitkittäistaso), ydinjatkeesta, selkäytimestä ja ääreishermoista. Selkäydinsektiot tulee ottaa kaularangan yläosasta, rintarangan keskiosasta ja lanneristiran ­
gan alueelta. Säärihermon distaalialueelta ja sen kaksoiskantalihasta 
(m. gastrocnemicus) huoltavista haaroista ja lonkkahermosta otetaan näyte. Sektiot värjätään sopivilla myeliini- ja aksonispesifisillä aineil ­
la. Ensin tehdään mikroskooppitutkimukset verrokki- ja suuriannok ­
sisen ryhmän eläinten säilytetyille kudoksille. Kun vaikutuksista suu ­
riannoksisessa ryhmässä on näyttöä, tehdään mikroskooppitutkimuk ­
set myös keskisuurten ja pienen annoksen ryhmissä.
 
2. TULOKSET  
Negatiiviset tulokset tässä menetelmässä valituilla kohdevaikutuksilla 
(biokemia, histopatologia ja käyttäytymisen havainnointi) eivät nor ­
maalisti vaadi viivästyneen neurotoksisuuden lisätestausta. Kohdevai ­
kutuksia koskevat epävarmat tai keskeneräiset tulokset voivat vaatia 
lisätutkimuksia.  
Yksilötiedot on esitettävä. Ne on myös esitettävä yhteenvetona tau ­
lukossa, josta käy ilmi eläinten lukumäärä koeryhmittäin testin alus ­
sa, leesioita, käyttäytymis- tai biokemiallisia vaikutuksia osoittanei ­
den eläinten lukumäärä, leesio- tai vaikutustyypit ja niiden vaikeu ­
saste sekä eläinten prosentuaaliset määrät kutakin erityyppistä ja vai ­
keusasteeltaan erilaista leesiota tai vaikutusta kohti.  
Tämän tutkimuksen tuloksia tulee arvioida käyttäytymis-, biokemial ­
listen ja histopatologisten vaikutusten esiintyvyyden, vaikeusasteen ja korrelaation perusteella ja kussakin koe- ja verrokkiryhmässä havait ­
tujen muiden vaikutusten suhteen.
 
Numeerisia tuloksia tulee arvioida tarkoituksenmukaisin ja yleisesti 
hyväksytyin tilastollisin menetelmin. Tilastolliset menetelmät tulee 
valita tutkimuksen suunnitteluvaiheessa.  
3. RAPORTOINTI  
TESTIRAPORTTI  
Testiraportin tulee mahdollisuuksien mukaan sisältää seuraavat tie ­
dot: 
Koe-eläimet:  
— käytetty kanta,  
— eläinten lukumäärä ja ikä,  
— lähde, elinolosuhteet jne., ja  
— kunkin eläimen paino testin alussa.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 555
 
Koeolosuhteet:  
— selostus testiaineen valmistamisesta, säilyvyydestä ja homogee ­
nisuudesta, silloin kuin se on tarkoituksenmukaista,  
— vehikkelin valintaperusteet,  
— selonteko testiaineen annostelusta,  
— selonteko ravinnon ja veden laadusta,  
— annosvalintojen perustelut,  
— annosteltujen annosten erittely, mukaan lukien selonteko vehik ­
kelistä ja annostellun aineen määrästä ja fyysisestä muodosta, ja  
— perustelut biokemiallisten määritysten ajankohtien muuttamisesta 
muuksi kuin 24 ja 48 tuntia viimeisestä annostelusta.  
Tulokset:  
— ruumiinpaino,  
— toksinen vaste annostasoittain, mukaan lukien kuolleisuus,  
— haitaton vaikutustaso (NOAEL),  
— kliinisten havaintojen luonne, voimakkuus ja kesto (korjaantu ­
vuudesta riippumatta),  
— biokemiallisten menetelmien ja löydösten yksityiskohtainen ku ­
vaus,  
— ruumiinavauslöydökset,  
— kaikkien histopatologisten löydösten yksityiskohtainen kuvaus, ja  
— tulosten tilastollinen käsittely silloin kun se on tarkoituksenmu ­
kaista.  
Tulosten pohdinta  
Johtopäätökset  
4. LÄHDELUETTELO  
Tämä menetelmä on analoginen OECD RG 419:n kanssa.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 556
 
B.39.  UDS-TESTI NISÄKKÄIDEN MAKSASOLUILLA  IN VIVO  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä on sama kuin OECD TG 486, Unscheduled DNA 
Synthesis (UDS) Test with Mammalian Liver Cells  In Vivo  (1997).  
1.1 JOHDANTO  
Nisäkkäiden maksasoluilla  in vivo  tehtävän UDS-testin (unscheduled 
DNA Synthesis (UDS) test) tarkoituksena on tunnistaa tutkittavat aineet, jotka aiheuttavat DNA:n korjautumista altistettujen eläinten 
maksasoluissa (1) (2) (3) (4).
 
Tällä in  vivo  -testillä voidaan tutkia kemiallisten aineiden genotoksi ­
sia vaikutuksia maksassa. Mitattava tulostapahtuma ilmaisee DNA- 
vaurion ja sen myöhemmän korjautumisen maksasoluissa. Elimistöön imeytyvät kemialliset aineet metaboloituvat yleensä pääasiassa mak ­
sassa. Se soveltuu siten hyvin DNA-vaurioiden mittaamiseen  in vivo.
 
Jos on saatu viitteitä siitä, että tutkittava aine ei pääse kohdekudok ­
seen, tätä testiä ei pidä käyttää.  
Lopputapahtuma, S-vaiheen ulkopuolinen DNA-synteesi (unschedu ­
led DNA-synthesis), mitataan määrittämällä radioaktiivisesti merkit ­
tyjen nukleosidien inkorporoitumista DNA:han solunjakautumissyk ­
lin S-vaiheen ulkopuolella. Yleisimmin käytetty menetelmä on tritiu ­
milla merkityn tymidiinin (  3 H-TdR) inkorporoitumisen määrittämi ­
nen autoradiografisesti.  In vivo  UDS-testeissä käytetään pääasiassa 
rotan maksaa. Myös muita kudoksia kuin maksaa voidaan käyttää, 
mutta niitä ei kuvata tämän menetelmän yhteydessä.  
UDS-vasteen toteaminen riippuu irtileikkautuneiden ja korvautunei ­
den DNA-segmenttien lukumäärästä vauriokohdassa. UDS-testi on 
sen vuoksi erityisen arvokas kemiallisten aineiden aiheuttamien ”pit ­
kien DNA-pätkien korjautumisten” (”longpatch repair”) (20–30 emästä) toteamisessa. Testin herkkyys on sen sijaan huomattavasti 
heikompi ”lyhyiden pätkien korjautumisen” (”shortpatch repair”) 
(1–3 emästä) toteamisessa. Mutageenisia muutoksia saattaa lisäksi syntyä DNA-vaurioiden korjautumattomuuden, korjautumisvirheiden tai kahdentumisvirheiden seurauksena. UDS-vasteen laajuus ei anna 
viitteitä korjausprosessien luotettavuudesta. On myös mahdollista, 
että mutageeni reagoi DNA:n kanssa mutta DNA-vaurio ei korjaudu leikkautumiskorjautumisprosessin kautta. Koska tämä lopputapah ­
tuma mitataan koko genomista, sen potentiaalinen herkkyys kompen ­
soi sitä, ettei UDS-testi tuota spesifistä tietoa tutkittavan aineen mu ­
tageenisesta aktiivisuudesta.
 
Ks. myös Yleisjohdanto, osa B.  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Korjautuvat solut:  jyvästen nettomäärä tumissa eli NNG-arvo on 
suurempi kuin etukäteen asetettu arvo, joka on määriteltävä testin 
suorittavassa laboratoriossa.  
NNG-arvo (net nuclear grains):  solujen UDS-aktiivisuuden kvan ­
titatiivinen mitta autoradiografialla tehdyissä UDS-testeissä lasket ­
tuna siten, että sytoplasmisten jyvästen keskimääräinen lukumäärä 
tumaa vastaavilla sytoplasma-alueilla (CG) vähennetään tumissa ha ­
vaittavien jyvästen (NG) lukumäärästä (NG): NNG = NG — CG. NNG-määrät lasketaan yksittäisistä soluista, minkä jälkeen luvut yh ­
distetään saman viljelmän solujen osalta, rinnakkaisviljelmien solujen 
osalta jne.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 557
 
UDS (Unscheduled DNA Synthesis):  DNA:n korjautumissynteesi 
sen jälkeen, kun kemiallisten aineiden tai fysikaalisten tekijöiden 
aiheuttaman vaurion alueen sisältävä DNA-jakso on leikkautunut irti ja poistunut kromosomista.
 
1.3 TESTIN PERIAATE  
UDS-testi nisäkkään maksasoluilla  in vivo  osoittaa DNA korjautu ­
missynteesin sen jälkeen, kun kemiallisten aineiden tai fysikaalisten tekijöiden aiheuttaman vaurion alueen sisältävä DNA-jakso on leik ­
kautunut irti ja poistunut kromosomista. Testi perustuu yleensä
 3 H- 
TdR:n inkorporoitumiseen solujen DNA:han maksassa, jossa on yleensä vain vähän solusyklin S-vaiheessa olevia soluja.
 3 H-TdR:n 
inkorporoituminen määritetään yleensä autoradiografisesti, sillä tämä 
tekniikka ei ole herkkä S-vaiheessa oleville soluille kuten esimerkiksi 
nestetuikelaskenta.  
1.4 TESTIN KUVAUS  
1.4.1  Testin valmistelut  
1.4.1.1  Eläinlajin valinta  
Yleisesti käytetty eläinlaji on rotta, mutta myös muita soveltuvia 
nisäkäslajeja voidaan käyttää. Koe-eläinten on oltava yleisesti käy ­
tettyä laboratoriokantaa olevia nuoria terveitä täysikasvuisia eläimiä. 
Testin alkaessa eläinten painon vaihtelun on oltava minimaalista, enintään ± 20 % kummankin sukupuolen keskipainosta.
 
1.4.1.2  Asuinolot ja ruokinta  
Yleiset olosuhteet ovat samat kuin osan B yleisjohdannossa mainitut, 
mutta kosteustavoitteen on oltava 50–60 %.  
1.4.1.3  Eläinten valmistelu  
Terveet nuoret täysikasvuiset eläimet jaetaan satunnaistetusti koe- ja 
kontrolliryhmiin. Häkit on sijoitettava siten, että häkin sijainnista 
johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Eläimet tunnis ­
tetaan yksilöllisesti ja pidetään häkeissään vähintään viisi päivää ennen tutkimuksen aloittamista, jotta ne ehtivät sopeutua laborato ­
rio-olosuhteisiin.
 
1.4.1.4  Tutkittava aine / valmistelu  
Kiinteät tutkittavat aineet liuotetaan tai sekoitetaan sopiviin liuotti ­
miin tai kantaja-aineisiin ja laimennetaan tarvittaessa ennen kuin ne 
annetaan koe-eläimille. Nestemäiset tutkittavat aineet voidaan antaa 
suoraan tai laimentaa ennen antamista. Tutkittava aine on valmistel ­
tava juuri ennen annostelua, paitsi jos sen säilyvyys on osoitettu stabiliteettitesteillä.
 
1.4.2  Koeolosuhteet  
1.4.2.1  Liuotin/kantaja-aine  
Liuottimella/kantaja-aineella ei saa olla myrkkyvaikutuksia käyte ­
tyillä annostasoilla, eikä sen käyttöön saa liittyä epäilyjä mahdolli ­
sista kemiallisista reaktioista tutkittavan aineen kanssa. Jos käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita, niiden käyttö on perusteltava niiden yhteensopivuuden osoittavilla tutkimustulok ­
silla. Ensisijaisesti on harkittava vesipitoisen liuottimen/kantaja-ai ­
neen käyttöä, mikäli se on mahdollista.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 558
 
1.4.2.2  Kontrollit  
Jokaiseen itsenäisesti suoritettavaan testin osaan on otettava mukaan 
rinnakkaiset positiiviset ja negatiiviset (liuotin/kantaja-aine) kontrol ­
lit. Kontrolliryhmän eläimiä on käsiteltävä samalla tavoin kuin koe ­
ryhmän eläimiä, mutta niille ei anneta tutkittavaa ainetta.  
Positiivisten kontrolliaineiden on oltava aineita, joiden tiedetään ai ­
heuttavan UDS-reaktion, kun niitä annetaan pitoisuuksina, joiden 
odotetaan aiheuttavan havaittavaa lisääntymistä taustaan verrattuna. 
Metabolista aktivaatiota vaativia positiivisia kontrolliaineita on käy ­
tettävä annoksina, jotka aiheuttavat kohtalaisen vasteen (4). Annokset on valittava siten, että vaikutukset ovat selvät mutta eivät heti pal ­
jasta lukijalle koodattujen objektilasien identiteettiä. Esimerkkejä po ­
sitiivisista kontrolliaineista:
 
Näytteidenottoajat Aine CAS-nro EINECS-nro  
Varhaiset näytteidenottoajat (2–4 
tuntia) N-nitrosodimetyyliamiini 62-75-9 200-249-8 
Myöhäiset näytteidenottoajat 
(12–16 tuntia) N-2-fluorenyyliasetamidi (2-AAF) 53-96-3 200-188-6  
Myös muita sopivia positiivisia kontrolliaineita voidaan käyttää. Po ­
sitiiviset kontrolliaineet voidaan antaa myös muuta reittiä pitkin kuin 
testattava aine.  
1.5 TESTIN SUORITTAMINEN  
1.5.1  Eläinten lukumäärä ja sukupuoli  
Koe-eläinten määrän on oltava riittävä testivasteen luonnollinen bio ­
loginen vaihtelu huomioon ottaen. Analysoitavissa olevia eläimiä on 
oltava vähintään kolme ryhmää kohti. Mikäli merkittävä tietokanta on kerätty jo aikaisemmin, rinnakkaisiin negatiivisiin ja positiivisiin kontrolliryhmiin tarvitaan vain yksi tai kaksi eläintä.
 
Vain toista sukupuolta, mieluiten uroksia, voidaan käyttää, mikäli 
tutkimusajankohtana on käytettävissä samalla eläinlajilla ja samalla altistustavalla tehtyjä tutkimuksia, joiden tulokset osoittavat, ettei 
myrkkyvaikutuksessa ole huomattavia eroja sukupuolten välillä. Jos 
ihmisen altistuminen tutkittavalle kemialliselle aineelle voi olla suku ­
puolesta riippuvaa, kuten joidenkin lääkeaineiden kohdalla, testi on tehtävä asianomaista sukupuolta olevilla eläimillä.
 
1.5.2  Altistusohjelma  
Tutkittavia aineita annetaan yleensä yhtenä altistuksena.  
1.5.3  Annostasot  
Normaalisti käytetään vähintään kahta annostasoa. Suurin annos 
määritellään annokseksi, joka aiheuttaa sen kaltaisia myrkyllisyysoi ­
reita, että samalla annosteluohjelmalla suurempien annosten voitaisiin 
odottaa johtavan kuolemaan. Pienemmän annoksen pitäisi yleensä 
olla 50–25 % suuresta annoksesta.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 559
 
Aineet, joilla on spesifisiä biologisia vaikutuksia pieninä, myrkyttö ­
minä annoksina (kuten hormonit ja mitogeenit), saattavat edellyttää 
muita annoksenmäärityskriteerejä, ja ne pitäisi arvioida tapauskohtai ­
sesti. Jos tehdään annoksenmääritystutkimus, koska soveltuvia tietoja ei ole käytettävissä, se on tehtävä samassa laboratoriossa käyttäen 
samaa lajia, samaa kantaa, samaa sukupuolta olevia eläimiä ja samaa 
annosteluohjelmaa kuin päätutkimuksessa on tarkoitus käyttää.
 
Suurin annos voidaan määritellä myös annokseksi, joka aiheuttaa 
joitakin myrkyllisyyteen viittaavia muutoksia maksassa (esim. pyk ­
noottisia tumia).  
1.5.4  Raja-annostesti  
Ellei havaittavia myrkkyvaikutuksia esiinny testattaessa yhtä annos ­
tasoa, joka on vähintään 2 000 mg/kg (eläimen painokiloa kohti) ja 
joka annetaan kerta-annoksena tai kahtena annoksena saman päivän 
aikana, ja ellei genotoksisuutta ole odotettavissa kemialliselta raken ­
teeltaan samanlaisilla aineilla saatujen tutkimustulosten perusteella, täydellinen tutkimus ei ehkä ole välttämätön. Ihmisten odotettu altis ­
tus saattaa edellyttää suurempien annostasojen käyttöä raja-annostes ­
tissä.
 
1.5.5  Antotapa  
Tutkittava aine annetaan yleensä ruokintaletkulla tai sopivalla intu ­
baatiokanyylillä. Myös muut antotavat ovat mahdollisia, mikäli ne 
voidaan perustella. Vatsaontelonsisäistä annostelua ei kuitenkaan suositella, koska maksa saattaisi tällöin altistua tutkittavalle aineelle suoraan eikä verenkierron kautta. Koc-eläimen koosta riippuu, 
kuinka paljon nestettä voidaan antaa kerralla ruokintaletkun kautta 
tai injektiona. Määrä ei kuitenkaan saa olla yli 2 ml/100 g eläimen painon mukaan mitattuna. Mikäli käytetään suurempia nestemääriä, ne on perusteltava. Lukuun ottamatta ärsyttäviä tai syövyttäviä ainei ­
ta, joiden vaikutukset yleensä pahenevat suurempia pitoisuuksia käy ­
tettäessä, nestemäärien vaihtelu olisi pidettävä mahdollisimman pie ­
nenä säätämällä tutkittavan aineen pitoisuuksia siten, että kokonais ­
nestemäärä pysyy samana kaikilla annostasoilla.
 
1.5.6  Maksasolujen preparointi  
Maksasolut preparoidaan tutkittavalle aineelle altistetuista eläimistä 
yleensä 12–16 tunnin kuluttua annostelusta. Ylimääräinen varhai ­
sempi näytteenottoajankohta (yleensä 2–4 tunnin kuluttua altistukses ­
ta) on yleensä tarpeen, ellei selvää positiivista vastetta havaita 12–16 
tunnin kuluttua. Myös muut näytteidenottoajankohdat ovat kuitenkin mahdollisia, mikäli ne voidaan perustella toksikokineettisten tutki ­
mustulosten perusteella.
 
Lyhytaikaisviljelmät nisäkkäiden maksasoluista perustetaan yleensä 
siten, että maksaa perfusoidaan kollagenaasilla  in situ  ja tuoreiden 
irronneiden maksasolujen annetaan kiinnittyä sopivaan pintaan. Ne ­
gatiivisista kontrollieläimistä kerättyjen maksasolujen elinkykyisyy ­
den (5) pitäisi olla vähintään 50 prosenttia.  
1.5.7  UDS:n määrittäminen  
Hiljattain eristettyjä nisäkkäiden maksasoluja inkuboidaan yleensä  
3 H-TdR:ää sisältävässä kasvatusväliaineessa sopivan pituinen aika, 
esim. 3–8 tuntia. Inkubaatioajan päätyttyä kasvatusväliaine erotetaan 
soluista, minkä jälkeen soluja voidaan inkuboida kasvatusväliainees ­
sa, joka sisältää ylimääräistä merkitsemätöntä tymidiiniä inkorporoi ­
tumattoman radioaktiivisuuden vähentämiseksi. Tämän jälkeen solut 
huuhdellaan, fiksoidaan ja kuivataan. Pitempiä inkubaatioaikoja käy ­
tettäessä käsittely merkitsemättömällä tymidiinillä ei ehkä ole tar ­
peen. Objektilasit kastetaan autoradiografiemulsioon, valotetaan pi ­
meässä (esim. säilytetään jääkaapissa 7–14 päivää), kehitetään, vär ­
jätään ja lasketaan valottuneet hopeajyväset. Jokaisesta eläimestä 
valmistetaan 2–3 objektilasia.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 560
 
1.5.8  Analyysi  
Objektilasipreparaattien tulisi sisältää riittävästi soluja, joiden morfo ­
logia on normaali, jotta luotettava UDS-analyysi voidaan tehdä. Pre ­
paraateista tehdään mikroskooppitutkimus selvän sytotoksisuuden 
merkkien havaitsemiseksi (esim. pyknoosi, radioaktiivisuuden vähe ­
neminen).  
Objektilasit on koodattava ennen jyvästen laskemista. Normaalisti 
jokaisesta eläimestä lasketaan 100 solua vähintään kahdesta objekti ­
lasista; jos lasketaan alle 100 solua/eläin, tämä on perusteltava. Jy ­
västen määrää ei lasketa S-vaiheessa olevista tumista, mutta S-vai ­
heessa olevien solujen suhteellinen osuus voidaan rekisteröidä.  
Morfologisesti normaalien solujen tumaan ja sytoplasmaan inkorpo ­
roituneen  3 H-TdR:n määrä, joka näkyy hopeajyvästen kertymänä, on 
määritettävä soveltuvilla menetelmillä.  
Hopeajyvästen määrä määritetään tumien kohdalta (tumassa esiinty ­
vät jyväset, NG) ja tumaa vastaavilta alueilta sytoplasman kohdalta (sytoplasmiset jyväset, CG). CG-määrät mitataan joko valitsemalla 
sytoplasmasta kaikkein eniten radioaktiivisesti merkittyä ainetta sisäl ­
tävä alue tai valitsemalla keskimäärin kaksi tai kolme satunnaisesti valittua tuman vierestä laskettua sytoplasmisten jyvästen määrää. Myös muita laskentamenetelmiä (esim. kokosolulaskentaa) voidaan 
käyttää, jos ne voidaan perustella (6).
 
2. TULOKSET  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Jokaisen objektilasin ja jokaisen eläimen tiedot on esitettävä erik ­
seen. Lisäksi kaikkien tietojen yhteenveto on esitettävä taulukkomuo ­
dossa. Tumassa esiintyvien jyvästen nettomäärät (NNG) on lasket ­
tava jokaisesta solusta, jokaisesta eläimestä ja jokaisesta annoksesta 
ja ajankohdasta erikseen vähentämällä CG-lukemat NG-lukemista. 
Jos ”korjautuvat solut” lasketaan, käsitteen ”korjautuvat solut” kritee ­
rit on perusteltava ja niiden on perustuttava negatiivisista kontrol ­
leista aikaisemmin tai tämän tutkimuksen yhteydessä saatuihin tietoi ­
hin. Numeeriset tulokset voidaan arvioida tilastollisin menetelmin. 
Jos tilastollisia testejä käytetään, ne on valittava ja perusteltava ennen tutkimusta.
 
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI JA TULKINTA  
Esimerkkejä positiivisten/negatiivisten vasteiden kriteereistä: 
positiivinen i) NNG-arvot ovat aikaisemmin asetettujen, la ­
boratoriokohtaisiin vertailuarvoihin perustu ­
vien kynnysarvojen yläpuolella; tai 
ii) NNG-arvot ovat merkitsevästi suurempia kuin 
rinnakkaisessa kontrollissa; 
negatiivinen i) NNG-arvot ovat laboratoriokohtaisiin vertailu ­
arvoihin perustuvan kynnysarvon tasalla tai sen alapuolella; tai 
ii) NNG-arvot eivät ole merkitsevästi suuremmat 
kuin rinnakkaisessa kontrollissa.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 561
 
Tulosten biologista merkitystä on pohdittava: huomioitavia paramet ­
reja ovat eläinten väliset erot, annos-vastesuhde ja sytotoksisuus. 
Tilastollisia menetelmiä voidaan käyttää apuna testitulosten arvioin ­
nissa. Tilastollinen merkitsevyys ei saa kuitenkaan olla ainoa mää ­
räävä tekijä positiivisen vasteen arvioinnissa.  
Useimmissa testeissä saadaan selvästi positiivisia tai negatiivisia tu ­
loksia, mutta joissakin harvinaisissa tapauksissa saatujen tulosten pohjalta ei voida tehdä varmoja päätelmiä tutkittavan aineen vaiku ­
tuksesta. Tulokset saattavat jäädä epäselviksi tai kyseenalaisiksi ko ­
keen määrästä riippumatta.
 
Nisäkkäiden maksasoluissa  in vivo  tehdyssä UDS-testissä saadut po ­
sitiiviset tulokset osoittavat, että tutkittava aine aiheuttaa nisäkkäiden maksasoluissa  in vivo  DNA-vaurioita, jotka S-vaiheen ulkopuolinen 
DNA-synteesi (unscheduled DNA synthesis) voi korjata  in vitro.  
Negatiivinen tulos osoittaa, ettei tutkittava aine aiheuta koeolosuh ­
teissa sellaisia DNA-vaurioita, jotka voidaan todeta tällä testillä.
 
Tutkittavan aineen tai sen metaboliittien todennäköistä pääsyä ylei ­
seen verenkiertoon tai erityisesti kohdekudokseen on pohdittava.  
3. RAPORTOINTI  
TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on sisällettävä seuraavat tiedot:  
Liuotin/kantaja-aine:  
— kantaja-aineen valintaperusteet,  
— tutkittavan aineen liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja- 
aineessa, jos tiedossa.  
Koe-eläimet:  
— käytetty eläinlaji/kanta,  
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli,  
— hankintapaikka, asuinolosuhteet, ruokavalio jne.,  
— eläinten yksilöllinen paino testiä aloitettaessa, myös painon vaih ­
teluväli, keskiarvo ja keskihajonta kussakin ryhmässä.  
Koeolosuhteet:  
— positiiviset ja negatiiviset (kantaja-aine/liuotin) kontrollit,  
— mahdolliset raja-annostutkimuksen tulokset,  
— annostasojen valintaperusteet,  
— tutkittavan aineen valmistelun yksityiskohdat,  
— tutkittavan aineen antotavan yksityiskohdat,  
— antotavan valintaperusteet,  
— menetelmät, joilla on vahvistettu tutkittavan aineen pääsy ylei ­
seen verenkiertoon tai kohdekudokseen tarvittaessa,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 562
 
— ravintoon/juomaveteen sekoitetun testattavan aineen pitoisuuden 
(ppm) muuntaminen todelliseksi annokseksi (mg painokiloa kohti 
vuorokaudessa, mg/kg/vrk) tarvittaessa,  
— yksityiskohtaiset tiedot ravinnon ja veden laadusta,  
— yksityiskohtainen kuvaus altistus- ja näytteidenotto-ohjelmasta,  
— myrkkyvaikutuksen mittausmenetelmät,  
— maksasolujen preparointi- ja viljelymenetelmä,  
— käytetty autoradiografinen tekniikka,  
— preparoitujen objektilasien lukumäärä ja laskettujen solujen luku ­
määrät,  
— arviointikriteerit,  
— kriteerit, joiden perusteella tutkimukset luokiteltiin positiivisiksi, 
negatiivisiksi tai epäselviksi.  
Tulokset:  
— tumassa esiintyvien jyvästen määrien, sytoplasmisten jyvästen 
määrien ja tumassa esiintyvien jyvästen nettomäärien keskiarvot 
yksittäistä objektilasia, eläintä ja ryhmää kohti,  
— mahdollinen annos-vastesuhde,  
— mahdolliset tilastolliset analyysit,  
— myrkkyvaikutuksen merkit,  
— rinnakkaisten negatiivisten (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisten 
kontrollien tulokset,  
— aikaisemmat negatiivisilla (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisilla 
kontrolleilla saadut tutkimustulokset sekä vaihteluvälit, keski ­
arvot ja keskihajonnat,  
— ”korjautuvien solujen” lukumäärä, jos määritetty,  
— S-vaiheessa olevien solujen lukumäärä, jos määritetty,  
— solujen elinkykyisyys.  
Tulosten pohdinta.  
Johtopäätökset.  
4. KIRJALLISUUTTA  
(1) Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson, B. and Penman, M. G. 
(1985), An Assessment of the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA 
Repair Assay,  Mutation Res.,  156, s. 1–18.  
(2) Butterworth, B. E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., 
Mirsalis, J., Probst, G. and Williams, G. (1987), A Protocol and Guide for the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay,  
Mutation Res.,  189, s. 123–133.
 
(3) Kennelly, J. C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlin ­
son, B., Benford, D. J., Dean, S. W. and Mitchell, I. de G. 
(1993),  In Vivo  Rat Liver UDS Assay, in: Kirkland, D. J. and 
Fox, M., (eds)  Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Re ­
commended Procedures. UKEMS Subcommitte on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part II revised,  Cambridge 
University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbo ­
urne, Sydney, s. 52–77.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 563
 
(4) Madle, S., Dean, S. W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlinson, 
B., Doolittle, D. J., Furihata, C, Hertner, T., McQueen, C. A. 
and Mori, H. (1993), Recommendations for the Performance of UDS Tests  In Vitro  and  In Vivo. Mutation Res.,  312, 
s. 263–285.
 
(5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl, 
C. (1993), Assessment of the Relation Between the Initial Via ­
bility and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes Used for the  In Vivo/In Vitro  DNA Repair Assay (UDS),  Mu­
tation Res.,  291, s. 21–27.
 
(6) Mirsalis, J. C., Tyson, C. K. and Butterworth, B. E. (1982), 
Detection of Genotoxic Carcinogens in the  In Vivo/In Vitro  
Hepatocyte DNA Repair Assay, Environ. Mutagen, 4, s. 553–562.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 564
 
B.40.  IN VITRO  IHOSYÖVYTTÄVYYS: IHON SÄHKÖVASTUSMÄÄ ­
RITYSTESTI (TER)  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro TG 430 (2004)  
1.1. JOHDANTO  
Ihosyövyttävyydellä tarkoitetaan palautumattoman kudosvaurion il ­
menemistä ihossa testiaineen aplikaation jälkeen [määritelmä sisältyy GHS-järjestelmään (Globally Harmonised System for the Classifica ­
tion and Labelling of Chemical Substances and Mixtures)] (1). Seu ­
raavassa kuvatulla testimenetelmällä voidaan arvioida syövyttävyys tarvitsematta käyttää eläviä koe-eläimiä.
 
Ihosyövyttävyyden arviointi on tyypillisesti edellyttänyt koe-eläinten 
käyttöä (2). Huoli testissä käytettäville eläimille aiheutuvasta kärsi ­
myksestä on otettu huomioon testimenetelmän B.4 tarkistetussa ver ­
siossa, jossa ihosyövyttävyys voidaan määrittää käyttämällä vaihto ­
ehtoisia  in vitro  -menetelmiä, joissa eläimille ei aiheuteta kipua tai 
kärsimystä.  
Sääntelytarkoituksiin käytettävien vaihtoehtoisten ihosyövyttävyys ­
testien kehittäminen aloitettiin validointia edeltävillä tutkimuksilla 
(3). Tämän jälkeen tehtiin ihosyövyttävyyden arviointiin  käytettävien 
in vitro  -menetelmien (4) (5) virallinen validointitutkimus (6) (7) (8). 
Näiden tutkimusten tulokset ja muu julkaistu kirjallisuus johtivat 
siihen suositukseen, että ihosyövyttävyyden arviointiin  in vivo  voi­
taisiin käyttää seuraavia testejä (9) (10) (11): ihmisihomallitesti (tes ­
timenetelmä B.40 a) ja sähkövastusmääritystesti (tässä kuvattu me ­
netelmä).  
Validointitutkimus ja muut julkaistut tutkimukset osoittivat, että ro ­
tan ihon sähkövastusmäärityksellä (TER) (12) (13) voidaan luotetta ­
vasti erottaa tunnetut ihoa syövyttävät kemikaalit sellaisista kemikaa ­
leista, jotka eivät syövytä ihoa (5) (9).  
Tässä kuvatulla testimenetelmällä voidaan tunnistaa syövyttävät ke ­
mialliset aineet ja seokset. Sillä voidaan tunnistaa myös sellaiset 
aineet ja seokset, jotka eivät syövytä ihoa, kunhan tukena on muista 
käytettävissä olevista tiedoista saatua näyttöä (esim. pH, rakenne- aktiivisuussuhteet, koehenkilöillä ja/tai -eläimillä tehdyistä kokeista saadut tiedot) (1) (2) (11) (14). Se ei tarjoa tietoa ihoärsytyksestä, 
eikä sen perusteella ole mahdollista luokitella syövyttäviä aineita 
GHS-järjestelmän (Globally Harmonised Classification System) mu ­
kaisiin alaluokkiin (1).
 
Haluttaessa arvioida kattavasti ihoaltistuksen jälkeiset paikalliset iho ­
vaikutukset suositellaan käytettäväksi testimenetelmän B.4 liitteessä esitettyä monivaiheista testausta (2), joka on esitetty GHS-järjestel ­
mässä (1). Kyseiseen testaukseen kuuluu ihosyövyttävyystestien 
(tässä kuvattu testimenetelmä) ja ihoärsytystestien suorittaminen  in 
vitro  ennen testauksen harkitsemista elävillä eläimillä.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 565
 
1.2. MÄÄRITELMÄT  
Ihosyövyttävyys  in vivo:  korjautumattoman ihovaurion eli orvaske ­
den läpi verinahkaan ulottuvan näkyvän kuolion ilmaantuminen enin ­
tään neljä tuntia kestäneen testiaineen annostelun jälkeen. Tyypillisiä 
syöpymisreaktioita ovat haavaumat, verenvuoto, veriset ruvet sekä 14 
päivän tarkkailujakson lopussa ihon vaalenemisen aiheuttama värin ­
muutos, kokonaan kaljuuntuneet alueet ja arvet. Epäselvien vaurioi ­
den tapauksessa olisi harkittava histopatologista tutkimusta.  
Ihon sähkövastus  (TER) on ihon sähköisen impedanssin mittayk ­
sikkö (kilo-ohmeina). Kyseessä on ihon suojaavan vaikutuksen arvi ­
ointiin käytettävä yksinkertainen ja luotettava menetelmä, jossa re ­
kisteröidään ihon läpi kulkevat ionit Wheatstone-siltamittauksella.  
1.3. VERTAILUAINEET  
Taulukko 1  
Vertailukemikaalit  
Nimi EINECS-numero CAS-numero  
1,2-Diaminopropaani 201-155-9 78-90-0 Erittäin syövyttävä 
Akryylihappo 201-177-9 79-10-7 Erittäin syövyttävä 2-tert-Butyylifenoli 201-807-2 88-18-6 Syövyttävä 
Kaliumhydroksidi (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Syövyttävä 
Rikkihappo (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Syövyttävä Oktaanihappo (kapryylihappo) 204-677-5 124-07-02 Syövyttävä 4-Amino-1,2,4-triatsoli 209-533-5 584-13-4 Ei syövyttävä Eugenoli 202-589-1 97-53-0 Ei syövyttävä Fenetyylibromidi 203-130-8 103-63-9 Ei syövyttävä 
Tetrakloorietyleeni 204-825-9 27-18-4 Ei syövyttävä 
Isosteariinihappo 250-178-0 30399-84-9 Ei syövyttävä 4-(Metyylitio)-bentsaldehydi 222-365-7 3446-89-7 Ei syövyttävä
 
Useimmat taulukossa mainituista kemikaaleista on valittu ECVAM:in 
kansainvälisessä validointitutkimuksessa käytettyjen kemikaalien 
joukosta (4). Ne valittiin seuraavilla perusteilla:  
i) Syövyttäviä ja ei-syövyttäviä aineita on oltava yhtä paljon.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 566
 
ii) Niiden on oltava kaupallisesti saatavilla olevia aineita, jotka kat ­
tavat useimmat relevantit kemikaaliluokat.  
iii) Mukana on oltava sekä erittäin syövyttäviä että vähemmän syö ­
vyttäviä aineita, jotta mahdollistettaisiin syövyttävyysvoimakkuu ­
den mukainen luokittelu.  
iv) Kemikaaleja on voitava käsitellä laboratoriossa aiheuttamatta va ­
kavia riskejä (syövyttävyyttä lukuun ottamatta).  
1.4. TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Testiainetta aplikoidaan enintään 24 tunnin ajan ihonäytteiden orvas ­
kesipinnalle kaksikammioisessa testijärjestelmässä, jossa ihonäytele ­
vyt toimivat kammioiden välisenä erotusseinänä. Ihonäytteet otetaan 
inhimillisellä tavalla lopetetuista 28–30 päivän ikäisistä rotista. Ai ­
neen katsotaan olevan syövyttävä, jos marraskesi tulee läpäiseväksi, mikä mitataan ihon sähkövastuksen pienenemisenä tietyn raja-arvon alapuolelle (12). Rotan ihon sähkövastuksen raja-arvoksi valittiin 5 
kΏ. Valinta perustui laajoihin tietoihin useista kemikaaleista, joiden 
osalta arvot olivat (valtaenemmistössä) selvästi yli kyseisen arvon (usein > 10 k Ω) tai ali sen (usein < 3 k Ω). Yleensä materiaalit, jotka 
eivät ole syövyttäviä eläimissä (mutta voivat olla joko ärsyttäviä tai 
ei-ärsyttäviä), eivät laske ihon sähkövastusta alle kyseisen erottavan 
arvon. Lisäksi muiden ihonäytteiden tai muiden laitteiden käyttö voi muuttaa raja-arvoa, mikä edellyttää lisävalidointia.
 
Testimenetelmään lisätään väriaineensitomisvaihe, jotta voidaan vah ­
vistaa positiiviset tulokset tapauksissa, joissa arvo on lähellä 5 k Ω:ia. 
Väriaineensitomisvaiheessa voidaan määrittää, johtuuko ionien läpäi ­
sykyvyn lisääntyminen marraskeden rakenteen tuhoutumisesta. Rotan 
ihoa käyttävän menetelmän on osoitettu kykenevän ennustamaan syövyttävyyttä  in vivo  kanissa, jota käytettiin koe-eläimenä testime ­
netelmän B.4 mukaisessa testissä (2). On huomattava, että  in vivo  
-kanitesti on karkea ihosyövyttävyyden ja -ärsytyksen suhteen ver ­
rattuna ihmisiholla suoritettavaan lapputestiin (15).
 
1.5. TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.5.1.  Eläimet  
Testiä varten valittu laji on rotta, koska rottien ihon herkkyys testat ­
taville kemikaaleille on osoitettu aikaisemmissa tutkimuksissa (10). Rotan iällä (jossa ihonäyte otetaan) ja kannalla on erityinen merkitys, 
sillä testi edellyttää, että rottien karvatupet ovat vielä uinuvassa ti ­
lassa ennen aikuisen yksilön karvankasvun alkua.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 567
 
Nuorten (noin 22 päivän ikäisten) uros- tai naarasrottien (Wistar tai 
vastaava kanta) selästä ja kyljistä ajetaan karvat tarkasti pienillä kar ­
valeikkureilla. Eläimet pestään pyyhkimällä huolellisesti, ja aluetta, jolta on poistettu karvat, käsitellään runsaalla määrällä antibioottiliu ­
osta (jossa on bakteerikasvua tehokkaasti estävät pitoisuudet esim. 
streptomysiiniä, penisilliiniä, kloramfenikolia ja amfoterisiiniä). Eläi ­
met pestään jälleen antibioottiliuoksella kolmantena tai neljäntenä päivänä ensimmäisen pesun jälkeen ja käytetään kokeisiin kolmen päivän sisällä toisesta pesusta, kun marraskesi on toipunut karvojen 
poistosta.
 
1.5.2.  Ihonäytteiden valmistus  
Eläimet lopetetaan inhimillisesti 28–30 päivän ikäisinä; ikävaatimus 
on ehdoton. Kunkin eläimen selkä- ja kylkinahka poistetaan ja na ­
hasta kuoritaan tarkasti ylimääräinen ihonalainen rasva. Ihosta ote ­
taan läpimitaltaan noin 20 mm:n suuruiset näytteet. Ihonäytteet voi ­
daan varastoida ennen niiden käyttöä, jos voidaan osoittaa, että po ­
sitiivisilla ja negatiivisilla kontrolleilla saatavat tiedot vastaavat tuo ­
reilla näytteillä saatuja.  
Kukin ihonäyte asetetaan polytetrafluoroetyleeniputken (PTFE-put ­
ken) toisen pään yli siten, että orvaskesipinta on kosketuksissa put ­
ken kanssa. Ihonäyte kiristetään paikalleen kumisella O-renkaalla, ja 
liika nahka leikataan pois. Kuvassa 2 esitetään putken ja O-renkaan mitat. O-rengas tiivistetään huolellisesti PTFE-putken päähän vaselii ­
nilla. Putki kiinnitetään jousipidikkeellä koeastian sisälle, jossa on 
MgSO
 4 -liuosta (154 mM) (kuva 1). Ihonäyte on kokonaan upotettava 
MgSO  4 -liuokseen. Yhdestä rotan nahasta on mahdollista saada 
10–15 ihonäytettä.  
Ennen testauksen alkua mitataan kahden ihonäytteen sähkövastus 
kunkin eläimen nahan laadunvarmistusmenettelynä. Kummankin 
näytteen vastusarvon on oltava yli 10 k Ω, jotta muita nahasta saatuja 
ihonäytteitä voidaan käyttää testissä. Jos vastusarvo on alle 10 k Ω, 
kaikki samasta nahasta saadut näytteet on hylättävä.  
1.5.3.  Testi-ja kontrolliaineen aplikoiminen  
Kussakin testissä on käytettävä samaan aikaan tehtyjä positiivisia ja 
negatiivisia kontrollimäärityksiä, jotta voidaan varmistaa testimallin 
riittävä suorituskyky. Testissä käytetään vain yhdestä eläimestä otet ­
tuja ihonäytteitä. Suositellut kontrolliaineet ovat 10 M suolahappo (positiivinen kontrolli) ja tislattu vesi (negatiivinen kontrolli).
 
Nestemäiset testiaineet (150 μl) aplikoidaan tasaisesti putken sisä ­
puolella olevalle orvaskesipinnalle. Kun testataan kiinteitä aineita, 
ainetta on pantava tasaisesti näytepalan päälle riittävä määrä, että 
se peittää koko orvaskesipinnan. Kiinteän aineen päälle lisätään sit ­
ten deionisoitua vettä (150 μl) ja putkea ravistellaan varovasti. Jotta 
kiinteä testiaine olisi mahdollisimman hyvin kosketuksissa ihon 
kanssa, ainetta voidaan sulattaa tai pehmentää lämmittämällä se 
30 o C:een tai se voidaan jauhaa rakeiseksi tai pulverimaiseksi.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 568
 
Kutakin testi-ja kontrolliainetta varten käytetään kolme ihonäytettä. 
Testiaineita aplikoidaan 24 tunnin ajaksi lämpötilassa 20–23  o C. Tes­
tiaine poistetaan pesemällä vesihanan alla enintään 30  o C:n lämpöti ­
lassa, kunnes ainetta ei enää irtoa.  
1.5.4.  Ihon sähkövastuksen mittaukset  
Ihon impedanssi mitataan ihon sähkövastuksena matalajännitevaihto ­
virtasillalla (Wheatstone-silta) (13). Sillan yleiset eritelmät ovat: 
käyttöjännite 1–3 volttia, vaihtovirta 50–1 000 Hz (sini- tai suorakai ­
deaalto) ja mittausalue vähintään 0,1-30 k Ω. Validointitutkimuksessa 
käytetty silta mittasi induktanssin aina arvoon 2 000 H, kapasitanssin arvoon 2 000 μF ja vastuksen arvoon 2 M Ω taajuuksilla 100 Hz tai 
1 kHz sarja-arvoina tai rinnakkaisina arvoina. Ihon sähkövastusmää ­
ritystä varten mittaukset kirjataan vastuksena taajuudella 100 Hz ja sarja-arvoina. Ennen sähkövastuksen mittausta ihon pintajännitystä pienennetään lisäämällä putkeen 70-prosenttista etanolia riittävästi 
orvaskeden peittämiseksi. Etanoli poistetaan putkesta muutaman se ­
kunnin kuluttua, ja kudos hydratoidaan lisäämällä 3 ml MgSO
 4 - 
liuosta (154 mM). Mittaussillan elektrodit asetetaan ihonäytteen mo ­
lemmille puolille vastuksen mittaamiseksi kilo-ohmeina ihonäytettä 
kohti (kuva 1). Elektrodien mitat ja hauenleukapidikkeen alapuolella 
olevan elektrodin pituus esitetään kuvassa 2. Sisemmän elektrodin pidike pidetään mittauksen aikana PTFE-putken päällä sen varmista ­
miseksi, että sama pituusmäärä elektrodia on upotettuna MgSO
 4 - 
liuokseen. Ulompi elektrodi asetetaan koeastian sisälle siten, että se 
lepää astian pohjalla. Jousipidikkeen ja PTFE-putken pohjan välinen etäisyys pidetään vakiona (kuva 2), koska tämä etäisyys vaikuttaa mitattavaan vastuksen arvoon. Samoin sisemmän elektrodin ja iho ­
näytteen välisen etäisyyden on oltava vakio ja mahdollisimman pieni 
(1–2 mm).
 
Jos mitattu vastuksen arvo on yli 20 k Ω, se voi johtua siitä, että 
jäljellä oleva testiaine peittää ihonäytteen orvaskesipinnan. Tätä ker ­
rosta voidaan yrittää poistaa esim. sulkemalla PTFE-putki peukalolla 
(hansikas kädessä) ja ravistelemalla putkea noin 10 sekuntia; MgSO
 4 -liuos heitetään pois ja vastusmittaus toistetaan tuoreen 
MgSO  4 -liuoksen kanssa.  
Testauslaitteiden ominaisuudet ja mitat sekä koemenetelmä voivat 
vaikuttaa saatuihin ihon sähkövastusarvoihin. Viiden k Ω:n syövyttä ­
vyysraja perustuu tässä ohjeessa selostetuilla erityislaitteilla ja -me ­
netelmällä saatuihin mittaustuloksiin. Jos testiolosuhteita muutetaan 
tai jos käytetään erilaisia laitteita, voi olla tarpeen käyttää eri raja- ja 
kontrolliarvoja. Siksi on tarpeen kalibroida menetelmä ja vastuksen raja-arvot testaamalla vertailukemikaaleja, jotka on valittu validoin ­
titutkimuksessa käytettyjen kemikaalien joukosta (4) (5) tai vastaa ­
vista kemikaaliluokista kuin testattavat kemikaalit. Taulukossa 1 on 
luettelo sopivista vertailukemikaaleista.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 569
 
1.5.5.  Väriaineen sitomista mittaavat menetelmät  
Altistus tietyille ei-syövyttäville materiaaleille voi vähentää vastusta 
alle raja-arvon 5 k Ω ja mahdollistaa ionien pääsyn marraskeden läpi 
ja sitä kautta vähentää sähkövastusta (5). Esimerkiksi neutraalit or ­
gaaniset aineet ja pinta-aktiiviset kemikaalit (mm. puhdistusaineet, 
emulgointiaineet ja muut pinta-aktiiviset aineet) voivat poistaa ihon lipidejä ja lisätä ihon läpäisevyyttä ioneille. Niinpä jos testiaineilla saadut ihon sähkövastusarvot ovat alle tai noin 5 k Ω, mutta näkyvää 
vauriota ei ole, on määritettävä väriaineen tunkeutuminen kontrolli ­
näytteiden ja käsiteltyjen näytteiden kudokseen sen määrittämiseksi, ovatko ihon sähkövastusarvot tulosta ihon läpäisevyyden kasvusta 
vai ihon syöpymästä (3) (5). Kun on kyse syöpymästä, jossa mar ­
raskesi on vaurioitunut, ihon pinnalle aplikoitu sulforodamiini B -väriaine tunkeutuu nopeasti ihoon ja värjää pinnanalaisen kudoksen. Kyseinen väriaine on stabiili useiden eri kemikaalien kanssa, eikä 
alla kuvattu uuttomenettely vaikuta siihen.
 
1.5.5.1.  Sulforodamiini B -väriaineen aplikaatio ja poistaminen  
Ihon sähkövastusmäärityksen jälkeen magnesiumsulfaattiliuos poiste ­
taan putkesta. Tämän jälkeen tutkitaan tarkasti, onko ihossa vaurioi ­
ta. Jos ilmeisiä vaurioita ei ole, kunkin ihonäytteen orvaskesipinnalle 
aplikoidaan 2 tunniksi 150 μl 10-prosenttista (paino/tilavuus) sulfo ­
rodamiini B -liuosta (Acid Red 52; C.I. 45100; EINECS-numero 222-529-8; CAS-numero 3520-42-1) tislatussa vedessä. Ihonäytteitä 
pestään sen jälkeen vesihanan alla huoneenlämpötilassa noin 10 se ­
kuntia liian tai sitoutumattoman väriaineen poistamiseksi. Ihonäytteet poistetaan varovasti PTFE-putkista ja pannaan pulloon (esim. 20 ml:n lasinen tuikelaskentapullo), jossa on deionisoitua vettä 
(8 ml). Pulloja ravistellaan varovasti 5 minuuttia mahdollisen jäljellä 
olevan sitoutumattoman väriaineen poistamiseksi. Huuhtelu toiste ­
taan. Ihonäytteet otetaan pulloista, pannaan toisiin pulloihin, joissa on 5 ml 30-prosenttista (paino/tilavuus) natriumdodekyylisulfaattia 
(SDS) tislatussa vedessä, ja inkuboidaan yli yön 60
 o C:ssa.  
Inkubaation jälkeen ihonäytteet otetaan pulloista ja heitetään pois. 
Jäljellä olevaa liuosta sentrifugoidaan 8 minuuttia 21  o C:ssa (suhteel ­
linen keskipakoisvoima ~175 x g). Supernatantista otetaan 1 ml:n 
näyte, joka laimennetaan 1:5:een (tilavuus/tilavuus) [ts. 1 ml + 4 ml] 30-prosenttisella (paino/tilavuus) SDS:llä tislatussa vedessä. Liuoksen optinen tiheys (OD) mitataan aallonpituudella 
565 nm.
 
1.5.5.2.  Väriaineen pitoisuuden laskeminen  
Sulforodamiini B -väriaineen pitoisuus ihonäytteessä lasketaan OD- 
arvoista (5) (sulforodamiini B:n molaarinen ekstinktiokerroin aallon ­
pituudella 565 nm = 8,7 × 10  4 ; molekyylipaino = 580). Väriaineen 
pitoisuus ihonäytteessä määritellään käyttämällä sopivaa kalibrointi ­
käyrää, ja väriaineen keskiarvopitoisuus lasketaan sitten rinnakkais ­
näytteistä.  
2. TULOKSET  
Testiaineiden ja positiivisten ja negatiivisten kontrollien vastusarvot 
(kΩ) ja väriainepitoisuuden keskiarvot ( μg/näyte) on esitettävä tau ­
lukkomuodossa (yksittäiset koetulokset ja keskiarvot ± keskihajonta). 
Samoin esitetään rinnakkaiskokeista tai toistetuista kokeista saadut 
tulokset, keskiarvot ja yksittäiset arvot.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 570
 
2.1. TULOSTEN TULKINTA  
Ihon sähkövastusmittausten keskiarvot hyväksytään, jos samaan ai ­
kaan mitatut positiivisten ja negatiivisten kontrollinäytteiden mää ­
ritysten tulokset ovat tälle menetelmälle määritellyissä hyväksyttä ­
vissä rajoissa (testilaboratoriossa). Hyväksyttävät vastusalueet käytet ­
täessä tätä menetelmää ja näitä laitteita esitetään seuraavassa taulu ­
kossa:  
Kontrolli Aine Vastusalue 
(kΩ) 
Positiivinen 10 M kloorivetyhappo 0,5–1,0 
Negatiivinen Tislattu vesi 10–25  
Väriaineen sitoutumiskokeen keskiarvotulokset hyväksytään, jos sa ­
maan aikaan tehtyjen kontrolliaineiden määritysten tulokset ovat tälle menetelmälle määritellyissä hyväksyttävissä rajoissa. Suositellut 
kontrolliaineiden hyväksyttävät väriainepitoisuusalueet käytettäessä 
tätä menetelmää ja näitä laitteita ovat:
 
Kontrolli Aine Väriaineen pi ­
toisuusalue 
(μg/näyte)  
Positiivinen 10 M kloorivetyhappo 40–100 
Negatiivinen Tislattu vesi 15–35  
Testiainetta ei katsota ihosyövyttäväksi  
i) jos testiaineelle saatu ihon sähkövastusarvo (keskiarvo) on yli 5 
kΩ, tai 
ii) ihon sähkövastusarvo (keskiarvo) on enintään 5 k Ω, ja 
— ihonäytteessä ei ole ilmeisiä vaurioita, ja  
— ihonäytteen sisältämän väriaineen keskipitoisuus on selvästi 
vähemmän kuin samanaikaisesti määritetyn positiivisen kont ­
rollin (10M HCl) aiheuttama ihonäytteen sisältämän väri ­
aineen keskipitoisuus.  
Testiaine katsotaan ihosyövyttäväksi  
i) jos ihon sähkövastusarvo (keskiarvo) on enintään 5 k Ω ja iho­
näyte on selvästi vaurioitunut tai  
ii) ihon sähkövastusarvo (keskiarvo) on enintään 5 k Ω ja 
— ihonäytteessä ei ole ilmeisiä vaurioita, mutta  
— ihonäytteen sisältämän väriaineen keskipitoisuus on sama tai 
suurempi kuin samanaikaisesti määritetyn positiivisen kontrol ­
lin (10M HC1) aiheuttama ihonäytteen sisältämän väriaineen 
keskipitoisuus.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 571
 
3. RAPORTOINTI  
3.1 TESTISELOSTE  
Testiselosteessa on annettava seuraavat tiedot:  
Testi- ja kontrolliaineet:  
— kemiallinen nimi, kuten IUPAC- tai CAS-nimi sekä CAS-nume ­
ro, jos se tiedetään,  
— aineen tai valmisteen puhtaus ja koostumus (painoprosentteina), 
fysikaaliset tila ja puhtaus,  
— testin suorittamisen kannalta merkitykselliset fysikokemialliset 
ominaisuudet, kuten fysikaalinen tila, pH, stabiilius ja vesiliukoi ­
suus,  
— tarvittaessa testi- tai kontrolliaineiden käsittely ennen testiä (esim. 
lämmittäminen tai jauhaminen),  
— stabiilius, jos se tiedetään.  
Koe-eläimet:  
— käytetty kanta ja sukupuoli,  
— eläinten ikä, kun niitä käytetään luovuttajaeläiminä,  
— toimittaja, häkit, ravinto jne.,  
— tiedot ihonäytteestä.  
Testiolosuhteet:  
— kalibrointikäyrät testilaitteille,  
— kalibrointikäyrät väriaineensitomistestille,  
— tiedot ihon sähkövastuksen mittauksiin käytetystä testimenettelystä,  
— tiedot väriaineensitomistestissä käytetystä testimenettelystä (tar ­
vittaessa),  
— kuvaus testimenettelyjen mahdollisista muutoksista,  
— käytetyt arviointikriteerit.  
Tulokset:  
— taulukkomuodossa tulokset, jotka on saatu ihon sähkövastuksen 
ja tarvittaessa värinsitoutumisen määrityksestä yksittäisistä eläi ­
mistä ja yksittäisistä ihonäytteistä,  
— kuvaus mahdollisista havaituista vaikutuksista.  
Tulosten pohdinta.  
Päätelmät.  
4. KIRJALLISUUSVIITTEET  
1. OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 
33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/ 
2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 572
 
2. Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/ ­
Corrosion.  
3. Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Le ­
wis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. (1995). 
A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity testing. The 
report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, 219–255.
 
4. Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international vali ­
dation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic. in Vitro 12, 471–482.
 
5. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhütter, H.-G., and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. in Vitro 12, 483–524.
 
6. OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on Har ­
monization of Validation and Acceptance Criteria for Alterna ­
tive Toxicological Test Methods, 62pp.  
7. Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. The report and recommen ­
dations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129–147.
 
8. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory 
Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication 
No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/ docs/guidelines/validate.pdf
 
9. ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275–280.  
10. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of Epi ­
DermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin Transcutane ­
ous Electrical Resistance (TER) assay:  In Vitro  test methods for 
assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publica ­
tion No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, 
National Institute of Environmental Health Sciences, Research 
Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ epiddocs/epis_brd.pdf.
 
11. OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The  In 
Vitro  Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st - 2nd 
November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27  th 
March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from 
the Secretariat  
12. Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C. (1986). An  in 
vitro skin corrosivity test –modifications and validation. Fd. Chem. 
Toxicol. 24, 507–512.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 573
 
13. Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, 
D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, J. 
(1992). The skin corrosivity test  in vitro : results of an interla ­
boratory trial. Toxic.  in Vitro  6, 191–194.  
14. Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Pro ­
posed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 
709–720.  
15. Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, M., 
Whittle, E., York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, 845–852.
 
16. Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C. (1988). An  In 
Vitro  model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial 
Validation. Toxic. in Vitro. 2, 7–17.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 574
 
Kuva 1  
Rotan ihon sähkövastuksen määrityslaite
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 575
 
Kuva 2:  
Polytetrafluoroetyleeniputken (PFTE-putken), koeastioiden ja elektrodien mitat
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 576
 
Yllä kuvattujen laitteiden kriittiset tekijät:  
— PTFE-putken sisähalkaisija  
— elektrodien pituus suhteessa PTFE-putkeen ja koeastiaan siten, 
että ihonäyte ei ole kosketuksissa elektrodeihin ja että vakiomitta 
elektrodia on kosketuksissa MgSO4-liuoksen kanssa  
— MgSO4-liuosta on oltava koeastiassa sellainen määrä, että nes ­
teellä on tietty syvyys suhteessa nesteen tasoon PFTE-putkessa 
(kuvassa 1 esitetyllä tavalla)  
— ihonäyte on kiinnitettävä tarpeeksi hyvin PFTE-putkeen, jotta 
sähkövastus ilmentäisi ihon ominaisuuksia oikein.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 577
 
B.40 a.  IN VITRO  IHOSYÖVYTTÄVYYS: IHMISIHOMALLITESTI  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro TG 431 (2004)  
1.1 JOHDANTO  
Ihosyövyttävyydellä tarkoitetaan palautumattoman kudosvaurion il ­
menemistä ihossa testiaineen aplikaation jälkeen [määritelmä sisältyy GHS-järjestelmään (Globally Harmonised System for the Classifica ­
tion and Labelling of Chemical Substances and Mixtures)] (1). Tes ­
timenetelmä ei edellytä elävien eläinten tai eläinkudoksen käyttöä ihosyövyttävyyden määrittämiseksi.
 
Ihosyövyttävyyden arviointi on tyypillisesti edellyttänyt koe-eläinten 
käyttöä (2). Huoli testissä käytettäville eläimille aiheutuvasta kärsi ­
myksestä on otettu huomioon testimenetelmän B.4 tarkistetussa ver ­
siossa, jossa ihosyövyttävyys voidaan määrittää käyttämällä vaihto ­
ehtoisia  in vitro  -menetelmiä, joissa eläimille ei aiheuteta kipua tai 
kärsimystä.  
Sääntelytarkoituksiin käytettävien vaihtoehtoisten ihosyövyttävyys ­
testien kehittäminen aloitettiin validointia edeltävillä tutkimuksilla (3). Tämän jälkeen tehtiin ihosyövyttävyyden arviointiin käytettävien  
in vitro  -menetelmien (4) (5) virallinen validointitutkimus (6) (7) (8). 
Näiden tutkimusten tulokset ja muu julkaistu kirjallisuus (9) johtivat siihen suositukseen, että ihosyövyttävyyden arviointiin  in vivo  voi­
taisiin käyttää seuraavia testejä (10) (11) (12) (13): ihmisihomallitesti 
(tässä kuvattu menetelmä) ja sähkövastusmääritystesti (testimene ­
telmä B.40).
 
Validointitutkimukset ovat osoittaneet, että ihmisihomalleja käyttä ­
villä testeillä (3) (4) (5) (9) voidaan luotettavasti erottaa tunnetut 
ihoa syövyttävät kemikaalit sellaisista kemikaaleista, jotka eivät syö ­
vytä ihoa. Lisäksi on mahdollista, että testillä voidaan erotella erittäin 
syövyttäviä kemikaaleja vähemmän syövyttävistä.  
Tässä kuvatulla testimenetelmällä voidaan tunnistaa syövyttävät ke ­
mialliset aineet ja seokset. Sillä voidaan tunnistaa myös sellaiset 
aineet ja seokset, jotka eivät syövytä ihoa, kunhan tukena on muista 
käytettävissä olevista tiedoista saatua näyttöä (esim. pH, rakenne- aktiivisuussuhteet, koehenkilöillä ja/tai -eläimillä tehdyistä kokeista saadut tiedot) (1) (2) (13) (14). Se ei yleensä tarjoa riittävää tietoa 
ihoärsytyksestä, eikä sen perusteella ole mahdollista luokitella syö ­
vyttäviä aineita GHS-järjestelmän mukaisiin alaluokkiin (1).
 
Haluttaessa arvioida kattavasti ihoaltistuksen jälkeiset paikalliset iho ­
vaikutukset suositellaan käytettäväksi testimenetelmän B.4 liitteessä esitettyä monivaiheista testausta (2), joka on esitetty GHS-järjestel ­
mässä (1). Kyseiseen testaukseen kuuluu ihosyövyttävyystestien 
(tässä kuvattu testimenetelmä) ja ihoärsytystestien suorittaminen  in 
vitro  ennen testauksen harkitsemista elävillä eläimillä.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 578
 
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Ihosyövyttävyys  in vivo:  korjautumattoman ihovaurion eli orvaske ­
den läpi verinahkaan ulottuvan näkyvän kuolion ilmaantuminen enin ­
tään neljä tuntia kestäneen testiaineen annostelun jälkeen. Tyypillisiä 
syöpymisreaktioita ovat haavaumat, verenvuoto, veriset ruvet sekä 14 
päivän tarkkailujakson lopussa ihon vaalenemisen aiheuttama värin ­
muutos, kokonaan kaljuuntuneet alueet ja arvet. Epäselvien vaurioi ­
den tapauksessa olisi harkittava histopalogista tutkimusta.  
Solujen elävyys:  muuttuja, jolla mitataan solupopulaation kokonai ­
saktiivisuutta (esim. solujen mitokondrioiden dehydrogenaasien kyky 
pelkistää väriaine MTT), joka mittaussuureesta ja testimenetelmästä 
riippuen korreloi solujen kokonaismäärään ja/tai elinkykyyn.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Taulukko 1  
Vertailukemikaalit  
Nimi EINECS-numero CAS-numero  
1,2-Diaminopropaani 201-155-9 78-90-0 Erittäin syövyttävä 
Akryylihappo 201-177-9 79-10-7 Erittäin syövyttävä 2-tert-Butyylifenoli 201-807-2 88-18-6 Syövyttävä Kaliumhydroksidi (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Syövyttävä Rikkihappo (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Syövyttävä Oktaanihappo (kapryylihappo) 204-677-5 124-07-02 Syövyttävä 
4-Amino-1,2,4-triatsoli 209-533-5 584-13-4 Ei syövyttävä 
Eugenoli 202-589-1 97-53-0 Ei syövyttävä Fenetyylibromidi 203-130-8 103-63-9 Ei syövyttävä Tetrakloorietyleeni 204-825-9 27-18-4 Ei syövyttävä Isosteariinihappo 250-178-0 30399-84-9 Ei syövyttävä 4-(Metyylitio)-bentsaldehydi 222-365-7 3446-89-7 Ei syövyttävä
 
Useimmat taulukossa mainituista kemikaaleista on valittu ECVAM:in 
kansainvälisessä validointitutkimuksessa käytettyjen kemikaalien joukosta (4). Ne valittiin seuraavilla perusteilla:
 
(i) Syövyttäviä ja ei-syövyttäviä aineita on oltava yhtä paljon.  
(ii) Niiden on oltava kaupallisesti saatavilla olevia aineita, jotka 
kattavat useimmat relevantit kemikaaliluokat.  
(iii) Mukana on oltava sekä erittäin syövyttäviä että vähemmän syövyt ­
täviä aineita, jotta mahdollistettaisiin syövyttävyysvoimakkuuden 
mukainen luokittelu.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 579
 
(iv) Kemikaaleja on voitava käsitellä laboratoriossa aiheuttamatta va ­
kavia riskejä (syövyttävyyttä lukuun ottamatta).  
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Testiainetta aplikoidaan kolmiulotteiseen ihmisihomalliin, jossa on 
ainakin rekonstruoitu orvaskesi ja toimiva marraskesi. Syövyttävät materiaalit tunnistetaan niiden kyvystä vähentää solujen elävyyttä 
[joka arvioidaan esim. MTT:n pelkistyskokeella (15)] määriteltyjen 
raja-arvojen alapuolelle spesifioitujen altistusaikojen jälkeen. Ihmisi ­
homallimäärityksen periaate perustuu oletukseen, jonka mukaan syö ­
vyttäviä kemikaaleja ovat ne, jotka pystyvät tunkeutumaan marras ­
keteen (diffundoitumalla tai eroosion seurauksena) ja ovat myrkylli ­
siä soluille allaolevissa solukerroksissa.
 
1.4.1  Menettely  
1.4.1.1  Ihmisihomallit  
Ihmisihomallit voidaan valmistaa tai hankkia kaupallisesti (esim. the 
EpiDerm  TM - ja EPISKIN  TM -mallit) (16) (17) (18) (19) tai ne voidaan 
kehittää testilaboratoriossa (20) (21). Ihmisihon käyttöön on sovel ­
lettava kansallisia ja kansainvälisiä eettisiä käytäntöjä ja ehtoja. 
Kaikki uudet mallit on validoitava (vähintään kohdassa 
1.4.1.1.2 mainituilta osin). Tässä testissä käytettävien ihmisihomal ­
lien on täytettävä seuraavassa mainitut ehdot:  
1.4.1.1.1 M a l l i n y l e i s e t e h d o t :  
Epiteelin valmistamiseen on käytettävä ihmisen keratinosyyttejä. Toi ­
mivan marraskeden alla on oltava useita kerroksia eläviä epiteeliso ­
luja. Ihomallissa voi olla myös stroomakerros. Marraskedessa on 
oltava useita kerroksia ja sopiva lipidiprofiili, jotta se voi tarjota toimivan esteen ja kykenee torjumaan solumyrkyllisten merkkinainei ­
den nopean tunkeutumisen. Mallin on oltava sellainen, että marras ­
keden ympärillä olevan materiaalin pääsy elävään kudokseen estyy. 
Marraskeden ympärillä olevien testikemikaalien pääsy kudokseen heikentää mallin kykyä mallintaa ihoaltistusta. Ihomallissa ei saa olla bakteerikontaminaatiota (esim. mykoplasmat) tai sieni-itiöitä.
 
1.4.1.1.2 M a l l i n t o i m i n t a a k o s k e v a t e h d o t :  
Elävyyden aste kvantifioidaan yleensä käyttämällä MTT-väriainetta 
tai muita metabolisesti muuntuvia väriaineita. Näissä tapauksissa ne ­
gatiivisesta kontrollikudoksesta uutetun (liuotetun) väriaineen optisen 
tiheyden (OD) on oltava ainakin 20 kertaa suurempi kuin uuttamis ­
liuottimen OD-arvon [yleiset tiedot: katso (22)]. Negatiivisen kont ­
rollikudoksen on oltava stabiili viljelyssä (solujen elävyyttä koske ­
vien mittaustulosten on oltava samanlaisia) testin koko altistusajan. 
Marraskeden on oltava riittävän vahva, jotta se estää tiettyjen solu ­
myrkyllisten merkkikemikaalien (esim. 1 % Triton X-100) nopean tunkeutumisen. Kyseinen ominaisuus voidaan arvioida sen altistusa ­
jan perusteella, joka tarvitaan, jotta solujen elävyys vähenee 50 % 
(ET
 50 ) (esim. EpiDerm  TM - ja EPISKIN  TM -malleilla > 2 tuntia). On 
osoitettava, että kudosta voidaan käyttää toistuvasti ajan myötä ja mielellään laboratorioiden välillä. Lisäksi sen avulla on voitava en ­
nustaa vertailukemikaalien (taulukko 1) syövyttävyyspotentiaali, kun 
sitä käytetään valitussa testimenettelyssä.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 580
 
1.4.1.2.  Testi- ja kontrolliaineen aplikoiminen  
Kutakin käsittelyä (altistusaikaa) kohti käytetään kahta rinnakkaista 
kudosnäytettä (myös kontrolleista). Nestemäistä testiainetta aplikoi ­
daan riittävä määrä (vähintään 25 μL/cm  2 ), että se peittää ihopinnan 
tasaisesti. Kiinteää testiainetta aplikoidaan riittävä määrä, että se peit ­
tää tasaisesti ihon, ja ainetta pitäisi kostuttaa deionisoidulla tai tisla ­
tulla vedellä, jotta se olisi hyvin kosketuksissa ihoon. Tarvittaessa kiinteät aineet on jauhettava aplikointia varten. Aplikaatiomenetel ­
män on sovelluttava testiaineelle (katso esim. kirjallisuusviite 5). 
Altistuksen jälkeen testiaine pestään huolellisesti ihon pinnalta sopi ­
valla puskuriliuoksella tai 0,9 % NaCl:lla.
 
Kussakin testissä on tehtävä samaan aikaan positiiviset ja negatiiviset 
kontrollimääritykset, jotta voidaan varmistaa testimallin riittävä suo ­
rituskyky. Suositeltavat positiiviset kontrolliaineet ovat jääetikka tai 8N KOH. Suositellut negatiiviset kontrollit ovat 0,9 % NaC1 tai vesi.
 
1.4.1.3  Solujen elävyysmittaukset  
Solujen elävyyden määrittämiseksi voidaan käyttää vain kvantitatii ­
visia ja validoituja menetelmiä. Lisäksi elävyyden määrityksen on sovelluttava kolmiulotteiseen kudosrakenteeseen. Ei-spesifinen väri ­
aineen sitominen ei saa vaikuttaa solujen elävyyden määritykseen. 
Proteiineja sitovat väriaineet ja väriaineet, jotka eivät muunnu meta ­
bolisesti (esim. neutraalipuna), eivät sen vuoksi ole sopivia. Tavalli ­
sin määritysmenetelmä on MTT:n 3-(4,5-dimetyylitiatsol-2yyli)-2,5- 
difenyylitetratsoliumbromidi, tiatsolyylisininen: EINECS-numero 
206-069-5, CAS-numero 298-93-1)] pelkistys. MTT:n on osoitettu antavan tarkkoja ja toistettavia tuloksia (5), mutta myös muita voi ­
daan käyttää. Ihonäyte pannaan MTT-liuokseen, jonka pitoisuus on 
sopiva (esim. 0,3–1 mg/ml), sopivassa inkubointilämpötilassa 3 tun ­
niksi. Saostunut sininen formatsaani uutetaan liuottimella (isopropa ­
noli), ja formatsaanipitoisuus määritetään mittaamalla OD-arvo aal ­
lonpituudella 540–595 nm.
 
Testiaineen kemiallinen reaktio vitaaliväriaineen kanssa voi jäljitellä 
solujen aineenvaihduntaa, mikä voi johtaa väärään arvioon solujen elävyydestä. Tämän on osoitettu tapahtuvan, jos testiainetta ei ole kokonaan poistettu iholta huuhtelemalla (9). Jos testiaine reagoi suo ­
raan vitaaliväriaineen kanssa, on käytettävä lisäkontrolleja, jotta voi ­
daan havaita ja korjata testiaineen vaikutus solujen elävyyden mitta ­
ukseen (9) (23).
 
2. MITTAUSTULOKSET  
Testiaineiden sekä positiivisten ja negatiivisten kontrollien OD-arvot 
ja lasketut prosentuaaliset solujen elävyysarvot olisi esitettävä kunkin kudosnäytteen osalta taulukkomuodossa, sekä myös tulokset rinnak ­
kaiskokeista tai toistetuista kokeista (tarvittaessa), keskiarvot ja yk ­
sittäiset arvot.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 581
 
2.1 TULOSTEN TULKINTA  
Negatiivisen kontrollin OD-arvon katsotaan testissä edustavan 100- 
prosenttista solujen elävyyttä. Siksi kullekin testinäytteelle saaduista OD-arvoista voidaan laskea solujen elävyys prosentteina negatii ­
visesta kontrollista. Prosentuaalinen solujen elävyyden raja-arvo, 
jolla erotetaan syövyttävät testiaineet ei-syövyttävistä (tai eri syövyt ­
tävyysluokat), taikka tulosten arviointiin ja syövyttävien aineiden tunnistamiseen käytettävät tilastomenetelmät, on määriteltävä selvästi 
ja dokumentoitava ja niiden on osoitettava olevan soveltuvia. 
Yleensä nämä erottelevat arvot määritetään testin optimoinnin aika ­
na, testataan validointia edeltävässä vaiheessa ja vahvistetaan vali ­
dointitutkimuksessa. Esimerkiksi EpiDerm
 TM -mallilla syövyttävyys 
ennustetaan seuraavasti (9):  
Testiaine on syövyttävä iholle:  
i) jos solujen elävyys kolmen minuutin altistuksen jälkeen on alle 
50 % tai  
ii) jos solujen elävyys kolmen minuutin altistuksen jälkeen on 50 % 
tai suurempi ja yhden tunnin altistuksen jälkeen alle 15 %.  
Testiaine ei ole syövyttävä iholle:  
i) jos solujen elävyys kolmen minuutin altistuksen jälkeen on 50 % 
tai suurempi ja yhden tunnin altistuksen jälkeen 15 % tai suu ­
rempi.  
3. RAPORTOINTI  
3.1 TESTISELOSTE  
Testiselosteessa on annettava seuraavat tiedot:  
Testi- ja kontrolliaine:  
— kemiallinen nimi, kuten IUPAC- tai CAS-nimi sekä CAS-nume ­
ro, jos se tiedetään,  
— aineen tai valmisteen puhtaus ja koostumus (painoprosentteina),  
— testin suorittamisen kannalta merkitykselliset fysikokemialliset 
ominaisuudet, kuten fysikaalinen tila, pH, stabiilius ja vesiliukoi ­
suus,  
— tarvittaessa testi- tai kontrolliaineiden käsittely ennen testiä (esim. 
lämmittäminen tai jauhaminen),  
— stabiilius, jos se tiedetään.  
Käytetyn ihomallin ja testisuunnitelman perustelut.  
Testiolosuhteet:  
— käytetty solujärjestelmä,  
— solujen elävyysmäärityksessä käytetyn mittauslaitteen (esim. 
spektrofotometri) kalibrointiedot,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 582
 
— täydelliset tiedot käytetyn spesifisen ihomallin tueksi (mm. mallin 
validointiaste),  
— tiedot käytetystä testimenettelystä,  
— käytetyt testiannokset,  
— kuvaus testimenettelyjen mahdollisista muutoksista,  
— viittaukset mallia koskeviin aiempiin tietoihin,  
— käytetyt arviointikriteerit.  
Tulokset:  
— yksittäisistä testinäytteistä saadut tulokset taulukkomuodossa,  
— kuvaus muista havaituista vaikutuksista.  
Tulosten tarkastelu.  
Päätelmät.  
4. KIRJALLISUUSVIITTEET  
1. OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical Subs ­
tances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment 
Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis. 
oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.  
2. Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/ 
Corrosion.  
3. Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Le ­
wis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. (1995). 
A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity testing. The 
report recommendations of ECVAM Workshop 6 ATLA 23,219–255.
 
4. Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international vali ­
dation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection 
and distribution of the test chemicals. Toxic.  In Vitro  12, 
471–482.  
5. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic.  In Vitro  12, 483–524.
 
6. OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on Har ­
monization of Validation and Acceptance Criteria for Alterna ­
tive Toxicological Test Methods, 62pp.  
7. Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. Test report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129–147.
 
8. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, 
Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/ 
docs/guidelines/validate.pdf.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 583
 
9. Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C., Spielmann, H., Uphill, P., 
Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C., Kaufmann, T., 
Remmele, M. and Holzhutter, H.G. (2000). The ECVAM pre ­
validation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, pp.371–401.
 
10. ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275–280.  
11. ECVAM (2000). ECVAM News & Views. ATLA 28, 365–67.  
12. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of 
EpiDerm  TM , EPISKIN  TM (EPI-200), and the Rat Skin Transcuta ­
neous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publica ­
tion No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency 
Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ 
epiddocs/epis_brd.pdf.
 
13. OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In 
Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st–2nd 
November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27  th 
March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from 
the Secretariat  
14. Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Pro ­
posed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 709–720.
 
15. Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular 
growth and survival: application to proliferation and cytotoxi ­
city asssays. J.Immunol. Meth. 65, 55–63.  
16. Cannon, C.L., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J., and Klaus ­
ner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancy tes ­
ting. Toxic. In Vitro 8, 889–891.  
17. Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, 
J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructural characte ­
rization of reconstructed skin models. International Journal of Pharmaceutics. 203, 211–225.
 
18. Tinois E, Gaetani Q, Gayraud B, Dupont D, Rougier A, Pou ­
radier DX (1994). The Episkin model: Successful reconstruction of human epidermis in vitro. In In vitro Skin Toxicology. Edi ­
ted by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach: 133–140
 
19. Tinois E, Tiollier J, Gaucherand M, Dumas H, Tardy M, Thi ­
volet J (1991). In vitro and post -transplantation differentiation of human keratinocytes grown on the human type IV collagen film of a bilayered dermal substitute. Experimental Cell Rese ­
arch 193: 310–319
 
20. Parentau, N.L., Bilbo, P., Molte, C.J., Mason, V.S., and Rosen ­
berg, H. (1992). The organotypic culture of human skin kerati ­
nocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytote ­
chnology 9, 163–171.  
21. Wilkins, L.M., Watson, S.R., Prosky, S.J., Meunier, S.F., Pa ­
rentau, N.L. (1994). Development of a bilayered living skin 
construct for clinical applications. Biotechnology and Bioengi ­
neering 43/8, 747–756.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 584
 
22. Marshall, N.J., Goodwin, C.J., Holt, S.J. (1995). A critical as ­
sessment of the use of microculture tetrazolium assays to mea ­
sure cell growth and function. Growth Regulation 5, 69–84.  
23. Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne, C., Elliot, G.R., Harbell, 
J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Rouget, R., and van de Sandt, J.J.M., and Botham, P.A. (2001). A prevalidation study on  in 
vitro  tests for acute skin irritation: results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. InVItro 15, 57–93.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 585
 
B.41.  IN VITRO  3T3 NRU -VALOMYRKYLLISYYSTESTI  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 432 (2004).  
1.1 JOHDANTO  
Valomyrkyllisyys on kehon toksinen vaste, joka ilmenee tai kasvaa 
(todettavissa pienemmillä annoksilla), kun keholle on aplikoitu ky ­
seistä ainetta ja iho on altistettu valolle, tai jonka aiheuttaa ihon säteilytys sen jälkeen, kun ainetta on annettu elimistöön.
 
In vitro  3T3 NRU -valomyrkyllisyystestiä käytetään tunnistamaan 
testiaineen valomyrkyllisyyspotentiaali sen jälkeen, kun valo on ek ­
sitoinut sen valolle altistuksen jälkeen. Testillä arvioidaan fotosyto ­
toksisuus kemikaalille altistuneiden solujen elävyyden vähenemisenä valoaltistuksessa verrattuna tilanteeseen, jossa ei ole valoaltistusta. 
Tällä testillä tunnistetut aineet ovat todennäköisesti valomyrkyllisiä  
in vivo  elimistöön annettuna ja ihoon jakautuneina tai aplikoituina 
iholle paikallisesti.
 
Useantyyppisten kemikaalien on ilmoitettu olevan valomyrkyllisiä 
(1) (2) (3) (4). Niiden yhteinen ominaisuus on kyky absorboida energiaa auringonvalon spektrialueella. Valokemian ensimmäisen lain (Grotthaus-Draperin lain) mukaan valoreaktio edellyttää riittävää 
valokvanttien absorptiota. Tämä merkitsee sitä, että ennen kuin har ­
kitaan biologista testausta, testikemikaalin absorptiospektri UV-valon ja näkyvän valon alueella on määritettävä OECD:n testiohjeen 101 mukaisesti. On esitetty, että jos kemikaalin mooliekstinktio- tai 
absorptiokerroin on pienempi kuin 10 litraa × mol-1 × cm-1, kemi ­
kaalilla ei todennäköisesti ole valoreaktiokykyä eikä sitä todennäköi ­
sesti tarvitse testata  in vitro  3T3 NRU -valomyrkyllisyystestillä tai 
millään muulla haitallisia valokemiallisia vaikutuksia määrittävällä 
biologisella testillä (1) (5). Katso myös liite 1.
 
In vitro  3T3 NRU -valomyrkyllisyystestin luotettavuus ja relevanssi 
on arvioitu hiljattain (6) (7) (8) (9).  In vitro  3T3 NRU -valomyrkyl ­
lisyystestin osoitettiin kykenevän ennustamaan akuutteja valomyrkyl ­
lisyysvaikutuksia eläimissä ja ihmisissä  in vivo . Testin tarkoituksena 
ei ole ennustaa muita kemikaalien ja valon yhteisvaikutuksesta ai ­
heutuvia haitallisia vaikutuksia, esim. fotogenotoksisuutta, valoaller ­
giaa ja fotokarsinogeenisuutta. Testi ei pysty myöskään arvioimaan aineen valomyrkyllisyyspotenssia kvantitatiivisesti. Sen tarkoituksena 
ei myöskään ole arvioida valomyrkyllisyyden epäsuoria mekamisme ­
ja, testiaineen metaboliittien vaikutuksia tai sekoitusten vaikutuksia.
 
Vaikka metaboloivia järjestelmiä yleensä tarvitaan kaikissa  in vitro  
-testeissä, joilla ennustetaan genotoksisuutta ja karsinogeenisuutta, 
tunnetaan toistaiseksi vain harvoja kemikaaleja, jotka edellyttäisivät metabolista aktivaatiota, jotta ne voisivat olla valomyrkyllisiä  in vivo  
tai in vitro . Siten ei katsota olevan tarpeellista eikä tieteellisesti 
perusteltua suorittaa tätä testiä metabolisen aktivaatiojärjestelmän 
kanssa.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 586
 
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Säteilyvoimakkuus:  pintaan kohdistuvan ultraviolettivalon (UV) tai 
näkyvän valon (VIS) intensiteetti mitattuna watteina neliömetriä kohti tai watteina neliösenttimetriä kohti (W/m
 2 tai mW/cm  2 ). 
Valoannos:  pintaan kohdistuvan ultraviolettisäteilyn (UV) tai näky ­
vän valon säteilyn määrä (= intensiteetti × aika) ilmaistuna jouleina (= W × s) pinta-alayksikköä kohti, esim. J/m
 2 tai J/cm  2 . 
UV-valon aallonpituusalueet:  Kansainvälisen valaistustoimikunnan 
(ICI) suosittelemat määritelmät ovat: UVA (315–400 nm), UVB (280–315 nm) ja UVC (100–280 nm). Muitakin määritelmiä käyte ­
tään: UVB- ja UVA-alueen raja asetetaan usein 320 nanometriin ja 
UVA-alue voidaan jakaa alueisiin UV-A1 ja UV-A2, jolloin raja on 
noin 340 nanometrissä.
 
Solujen elävyys:  muuttuja, jolla mitataan solupopulaation kokonai ­
saktiivisuutta (esim. neutraalipunan ottoa solujen lysosomeihin), joka 
mittaussuureesta ja testimenetelmästä riippuen korreloi solujen koko ­
naismäärään ja/tai elinkykyyn.  
Suhteellinen solujen elävyys:  solujen elävyys ilmaistuna suhteessa 
liuotinkontrolleihin (negatiivisiin kontrolleihin), jotka käyvät läpi tes ­
tin muuten (joko +Irr tai -Irr), mutta joita ei ole käsitelty testikemi ­
kaalilla.  
PIF (valoärsyttävyystekijä):  tekijä, joka muodostetaan vertaamalla 
testikemikaalin kahta yhtä tehokasta solumyrkyllisyyspitoisuutta (IC50) sen jälkeen, kun soluja säteilytetään UVA-/näkyvällä valolla (+Irr), joka ei ole solumyrkyllistä, ja kun soluja ei säteilytetä (-Irr).
 
IC 50 : testikemikaalin pitoisuus, jossa solujen elävyys on vähentynyt 
50 %  
MPE (keskimääräinen valovaikutus):  suure, joka saadaan analy ­
soimalla matemaattisesti pitoisuus-vastekuvaajat, jotka on saatu, kun 
soluja säteilytetään UVA-/näkyvällä valolla (+Irr), joka ei ole solu ­
myrkyllistä, ja kun soluja ei säteilytetä (-Irr).  
Valomyrkyllisyys:  akuutti toksinen vaste, joka ilmenee sen jälkeen, 
kun iho on ensimmäisen kerran altistettu tietyille kemikaaleille ja sen 
jälkeen valolle, tai jonka ihon säteilytys aiheuttaa samalla tavalla sen jälkeen, kun kemikaalia on annettu elimistöön.
 
1.3 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
In vitro  3T3 NRU -valomyrkyllisyystesti perustuu kemikaalin solu ­
myrkyllisyyden vertaamiseen, kun kemikaalia testataan altistettaessa 
kohdetta sellaiselle simuloidulle auringonvalolle, joka ei ole solumyr ­
kyllinen, ja ilman tällaista valoaltistusta. Solumyrkyllisyys ilmaistaan tässä testissä pitoisuudesta riippuvana neutraalipunan (vitaaliväri) so ­
luunoton vähenemisenä 24 tuntia kemikaalikäsittelyn ja säteilytyksen 
jälkeen (10). Neutraalipuna on heikosti kationinen väriaine, joka läpäisee solukalvot muulla tavalla kuin diffundoitumalla ja keräytyy solunsisäisiin lysosomeihin. Lysosomien herkän kalvon pinnan muu ­
tokset johtavat lysosomien haurastumiseen ja muihin muutoksiin, 
joista tulee vähitellen peruuttamattomia. Tällaiset vierasaineiden toi ­
minnan aikaansaamat muutokset johtavat neutraalipunan oton ja si ­
toutumisen vähenemiseen. Tämän perusteella on mahdollista erotella 
elinkykyiset, vaurioituneet ja kuolleet solut, mikä on perustana tälle 
testille.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 587
 
Balb/c 3T3 -soluja viljellään 24 tuntia yhden solun vahvuisen ker ­
roksen aikaansaamiseksi. Kutakin testikemikaalia kohti inkuboidaan 
aluksi yhden tunnin ajan kahta 96 kuopan levyä, joissa on kahdeksaa eri pitoisuutta testattavaa kemikaalia Sen jälkeen toinen levyistä al ­
tistetaan suurimmalle ei-solumyrkylliselle säteilytysannokselle ja toi ­
nen levy pidetään pimeässä. Sitten kummankin levyn käsittelyneste 
korvataan viljelynesteellä, inkuboidaan toiset 24 tuntia, ja määrite ­
tään solujen elävyys neutraalipunan ottona. Solujen elävyys, joka ilmaistaan prosenttiosuutena käsittelemättömistä liuotinkontrolleista, 
lasketaan kullekin testipitoisuudelle. Valomyrkyllisyyskyvyn ennus ­
tamiseksi verrataan pitoisuusvasteita, jotka on saatu säteilytyksen kanssa ja ilman sitä, yleensä IC
 50 -tasolla, ts. siinä pitoisuudessa, 
joka vähentää solujen elävyyttä 50 prosentilla verrattuna käsittele ­
mättömiin kontrolleihin.  
1.4 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.4.1  Testin valmistelut  
1.4.1.1  Solut  
Validointitutkimuksessa käytettiin joko ATCC:stä (American Type 
Culture Collection, Manassas, VA, USA) tai ECACC:stä (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, UK) hankittua py ­
syvää hiiren fibroblastisolulinjaa Balb/c 3T3, kloonia 31, ja siksi sen 
hankkimista suositellaan (laadukkaasta solupankista). Muita soluja tai solulinjoja voidaan käyttää, kun testimenettely on sama, jos viljelyo ­
losuhteet mukautetaan solujen erityistarpeisiin. Samanlaisuus on täl ­
löin osoitettava.
 
Mykoplasmakontaminaatio on tutkittava säännöllisesti, ja soluja saa 
käyttää vain jos mykoplasmakontaminaatiota ei todeta (11).  
On tärkeää, että solujen UV-herkkyys tarkistetaan säännöllisesti tässä 
menetelmässä selostetun laadunvalvontamenettelyn mukaisesti. Koska solujen UVA-herkkyys voi lisääntyä siirrostamisten myötä, 
pitäisi käyttää sellaisia Balb/c 3T3 -soluja, joita on siirrostettu mah ­
dollisimman harvoja kertoja, mieluiten alle 100 kertaa. (Katso kohta 1.4.2.2.2 ja liite 2).
 
1.4.1.2  Kasvatusväliaineet ja viljelyolosuhteet  
Sopivaa viljelynestettä ja inkubaatio-olosuhteita olisi käytettävä so ­
lujen tavanomaiseen siirrostamiseen ja testin aikana. Esimerkiksi 
Balb/c 3T3 -soluille käytetään DMEM:iä (Dulbecco's Modified Eag ­
le's Medium), jossa on 10 % vastasyntyneen vasikan seerumia, 4 mM glutamiinia, penisilliiniä (100 IU) ja streptomysiiniä (100 μg/­
mL), ja soluja inkuboidaan kaapissa, jonka lämpötila on 37
 o C ja 
CO2-pitoisuus 5–7,5 % riippuen puskurista (katso kohdan 1.4.1.4 
toinen alakohta). On erityisen tärkeää, että viljelyolosuhteet ovat sellaiset, että solusykli pysyy samanlaisena kuin se käytetyillä so ­
luilla tai solulinjalla on aiemminkin ollut.
 
1.4.1.3  Viljelmien valmistelu  
Pakastetuista varastoviljelmistä otettuja soluja inokuloidaan viljely ­
nesteeseen sopivassa tiheydessä, ja niitä siirrostetaan vähintään ker ­
ran ennen kuin ne käytetään  in vitro  3T3 NRU -valomyrkyllisyys ­
testissä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 588
 
Valomyrkyllisyystestiä varten soluja inokuloidaan viljelynesteeseen 
sellaisessa tiheydessä, että viljelmät eivät ole konfluentteja testin 
päättyessä 48 tunnin kuluttua solujen inokuloinnista, kun solujen elävyys määritetään. Balb/c 3T3 -soluille, joita viljellään 96-kuoppa ­
levyillä, suositellaan solutiheyttä 1 × 10
 4 solua kuoppaa kohti.  
Kutakin testikemikaalia varten soluja inokuloidaan täysin samalla 
tavalla kahdelle erilliselle 96-kuoppalevylle, jotka käyvät läpi saman ­
aikaisesti koko testiohjelman täysin samanlaisissa olosuhteissa, lu ­
kuun ottamatta aikaa, jolloin yhtä kuoppalevyä säteilytetään (+Irr) ja toinen pidetään pimeässä (-Irr).
 
1.4.1.4  Testiaineen valmistaminen  
Testikemikaalit on valmistettava välittömästi ennen käyttöä, ellei tie ­
doista ilmene, että ne pysyvät stabiileina varastoitaessa. Kaikki ke ­
mikaalien käsittely ja valmistelu suositellaan tehtäväksi sellaisissa valo-olosuhteissa, että vältetään testettavan aineen valoaktivaatio tai hajoaminen ennen säteilytystä.
 
Testikemikaali pitäisi liuottaa puskuroituun suolaliuokseen, esim. 
Earlin tasapainotettuun suolaliuokseen (EBSS) tai muihin fysiologi ­
sesti tasapainoisiin puskuriliuoksiin, joissa ei saa olla proteiineja tai valoa absorboivia aineita (esim. pH-indikaattorivärejä ja vitamiineja), etteivät ne häiritsisi reaktioita säteilytyksen aikana. Koska soluja 
pidetään säteilytyksen aikana noin 50 minuuttia CO
 2 -inkubaattorin 
ulkopuolella, on vältettävä huolellisesti alkalisaatio. Käytettäessä lai ­
meita puskureita, kuten EBSS:ää, tähän päästään inkuboimalla soluja siten, että CO
 2 -pitoisuus on 7,5 %. Jos solut inkuboidaan ainoastaan 
5 prosentin CO  2 -pitoisuudella, olisi valittava voimakkaampi puskuri.  
Huonosti vesiliukoiset testikemikaalit pitäisi liuottaa sopivaan liuot ­
timeen. Jos käytetään liuotinta, sitä on oltava vakiotilavuudessa kai ­
kissa viljelmissä, ts. negatiivisissa kontrolleissa (liuotinkontrolleissa) 
ja kaikissa testikemikaalipitoisuuksissa, ja se ei saa olla solumyrkyl ­
listä käytetyssä pitoisuudessa. Testikemikaalipitoisuudet olisi valit ­
tava siten, että vältetään liuoksen saostuminen tai sameus.  
Dimetyylisulfoksidi (DMSO) ja etanoli (ETOH) ovat suositeltavia 
liuottimia. Myös muut liuottimet, jotka eivät ole kovin solumyrkyl ­
lisiä, voivat olla sopivia. Kaikkien liuottimien erityisominaisuudet 
(esim. reaktiivisuus testikemikaalin kanssa, valomyrkyllisyysvaiku ­
tuksen vaimeneminen, radikaalien sitomisominaisuus ja/tai kemialli ­
nen stabiilius) on arvioitava ennen käyttöä.  
Vortex-sekoitusta ja/tai ultraäänihajoitusta ja/tai lämmittämistä sopi ­
viin lämpötiloihin voidaan käyttää liukenemisen helpottamiseksi, 
kunhan tämä ei vaikutatestikemikaalin stabiiliuteen.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 589
 
1.4.1.5  Säteilytysolosuhteet  
1.4.1.5.1 V a l o l ä h d e  
Sopivan valolähteen ja sopivien suodattimien valitseminen on kes ­
keinen asia valomyrkyllisyyden testauksessa. UVA ja näkyvä valo liittyvät yleensä valomyrkyllisiin reaktioihin  in vivo  (3) (12), kun 
taas UVB on vähemmän tärkeä, mutta soluille erittäin myrkyllinen. 
Sen solumyrkyllisyys lisääntyy 1 000-kertaiseksi aallonpituudelta 
313 nm aallonpituudelle 280 nm (13). Perusteena sopivan valoläh ­
teen valitsemiseen pitäisi olla mm. vaatimus, että valolähde emittoi aallonpituuksia, joita testikemikaali absorboi (absorptiospektri), ja 
että valoannoksen (joka pitää saavuttaa järkevässä ajassa) pitäisi 
olla riittävä tunnettujen fotosytotoksisten kemikaalien osoittamiseksi. Lisäksi käytetyt aallonpituudet ja annokset eivät saisi olla liian tu ­
hoisia testijärjestelmälle; tällainen vaikutus olisi mm. lämpö (infra ­
puna-alue).
 
Simuloitua auringonvaloa pidetään parhaimpana keinotekoisena va ­
lolähteenä. Suodatetun auringonvalosimulaattorin valon säteilytehoja ­
kauman olisi oltava lähellä auringonvalon säteilytehojakaumaa (14). Sekä ksenonkaarilamppuja että (seostettuja) elohopeahalidikaarilamp ­
puja käytetään auringonvalosimulaattoreina (15). Jälkimmäisillä on 
se etu, että ne muodostavat vähemmän lämpöä ja ovat halvempia, mutta niiden spektri ei vastaa auringonvalon spektriä yhtä hyvin kuin ksenonkaarilampuissa. Koska kaikki auringonvalosimulaattorit lähet ­
tävät huomattavia määriä UVB-valoa, niiden valo pitäisi suodattaa 
sopivasti erittäin solumyrkyllisten UVB-aallonpituuksien vaimenta ­
miseksi. Koska soluviljelmissä käytettävät muovimateriaalit sisältävät 
UV-stabilisaattoreja, spektri pitäisi mitata samantyyppisen 96-kuop ­
palevyn kannen läpi, jollaista käytetään määrityksessä. Huolimatta laitteiston väistämättömistä suodatinvaikutuksista tai toimenpiteistä, joilla spektrin osia vaimennetaan suodattamalla, näin suodatetun va ­
lon spektri ei saisi poiketa standardiauringonvalosta (14). Viitteissä 
(8) ja (16) annetaan esimerkki  in vitro  3T3 NRU -valomyrkyllisyys ­
testin validointitutkimuksessa käytetyn auringonvalosimulaattorin suodatetun valon spektrijakaumasta. Katso myös liitteen 2 kuva 1.
 
1.4.1.5.2 D o s i m e t r i a  
Valon voimakkuus (säteilyvoimakkuus, radianssi) olisi tarkistettava 
säännöllisesti ennen jokaista valomyrkyllisyystestiä käyttämällä sopi ­
vaa leveäkaistaista UV-mittaria. Voimakkuus olisi mitattava käyttäen samantyyppistä 96-kuoppalevyn kantta kuin itse testissä. UV-mittarin 
on oltava kalibroitu valolähteen suhteen. Sen suorituskyky pitäisi 
tarkistaa, mitä varten suositetaan toisen, samantyyppisen ja täysin samalla tavalla kalibroidun vertailu-UV-mittarin käyttöä. On toivot ­
tavaa, että tasaisin välein käytettäisiin spektrometriä suodatetun va ­
lolähteen säteilyvoimakkuusspektrin mittaamiseen ja leveäkaista-UV- 
mittarin kalibroinnin tarkistamiseen.
 
On todettu, että annos 5 J/cm  2 (UVA-alueella mitattuna) ei ollut 
myrkyllinen Balb/c 3T3 -soluille ja että se pystyi eksitoimaan kemi ­
kaaleja siten, että ilmeni valomyrkyllisiä vaikutuksia (6) (17). Esi ­
merkiksi arvo 5 J/cm  2 saavutettiin 50 minuutin aikana säätämällä 
säteilyvoimakkuus arvoon 1,7 mW/cm  2 (ks. liitteen 2 kuva 2). Jos 
käytetään muuta solulinjaa tai eri valolähdettä, säteilytysannos voi olla tarpeen kalibroida, jotta voidaan valita annos, joka ei vahingoita 
soluja, mutta riittää valomyrkyllisten standardiaineiden eksitoimisek ­
si. Valoaltistusaika lasketaan seuraavasti:
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 590
 
tðminÞ ¼ irradiation dose ðJ= cm  2 Þ Ü 1000 
irradiance ðmW = cm  2 Þ Ü 60 (1 J = 1 Wsec)  
1.4.2  Koeolosuhteet  
1.4.2.1  Testiaineiden pitoisuudet  
Valon kanssa (+ Irr) ja ilman sitä (- Irr) testattavan kemikaalin pitoi ­
suusalue on määritettävä riittävän laajasti pitoisuusalueenmäärittely ­
kokeissa. Voi olla tarpeen määritellä liukoisuus alussa ja 60 minuutin kuluttua (riippuen käsittelyajasta), koska liukoisuus voi muuttua ajan 
myötä tai altistuksen aikana. Jotta vältettäisiin epäasianmukaisten 
viljelyolosuhteiden tai hyvin happamien tai alkalisten kemikaalien aiheuttama myrkyllisyys, soluviljelmien, joihin on lisätty testikemi ­
kaali, pH:n pitäisi olla välillä 6,5–7,8.
 
Testiaineen suurimman pitoisuuden pitäisi olla fysiologisten testiolo ­
suhteiden rajoissa eli pitäisi välttää osmoottista ja pH-stressiä. Tes ­
tikemikaalista riippuen voi olla tarpeen ottaa huomioon myös muita 
fysikokemiallisia ominaisuuksia, jotka voivat asettaa rajoituksia suu ­
rimmalle testipitoisuudelle. Kun on kyse suhteellisen huonoliukoi ­
sista aineista, jotka eivät ole myrkyllisiä kyllästymispisteessä tai sitä alemmilla pitoisuuksilla, suurin saavutettavissa oleva pitoisuus 
olisi testattava. Testikemikaalin saostumista olisi yleisesti vältettävä 
kaikilla testipitoisuuksilla. Testiaineen suurin pitoisuus ei saisi olla yli 1 000 μg/mL; osmolaarisuus ei saisi olla yli 10mMol. Olisi käy ­
tettävä geometrista laimennussarjaa, jossa on kahdeksan testiaineen 
pitoisuutta ja laimennuskerroin vakio (katso kohta 2.1, toinen ala ­
kohta).
 
Jos (pitoisuusalueenmäärittelykokeiden perusteella) tiedetään, että 
testikemikaali ei ole myrkyllinen soluille edes suurimmassa pitoisuu ­
dessa pimeäkokeessa (-Irr), mutta on erittäin myrkyllinen soluille säteilytettäessä (+ Irr), voi olla tarpeen valita (+ Irr)-kokeeseen eri 
pitoisuusalue kuin (- Irr)-kokeeseen, jotta mittaustulosten riittävää 
laatua koskevat vaatimukset täyttyvät.
 
1.4.2.2  Kontrollit  
1.4.2.2.1 S o l u j e n s ä t e i l y h e r k k y y s j a s e n m u u t t u m i s e n t a r ­
k i s t a m i n e n :  
Solujen herkkyys valolähteelle pitäisi tarkistaa säännöllisesti (noin 
joka viidennen siirrostamisen jälkeen) arvioimalla niiden elävyys 
sen jälkeen, kun niitä on altistettu suuremmille säteilytysannoksille. 
Tässä arvioinnissa pitäisi käyttää useita säteilytysannoksia, myös huomattavasti suurempia kuin 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestissä käytetyt. Annokset voidaan kvantifioida helpoimmin mittaamalla va ­
lolähteen UV-valon määrä. Solut inokuloidaan tiheydessä, jota käy ­
tetään  in vitro  3T3 NRU -valomyrkyllisyystestissä, ja säteilytetään 
seuraavana päivänä. Solujen elävyys määritellään yhtä päivää myö ­
hemmin neutraalipunan ottona. On osoitettava, että suurin ei-solu ­
myrkyllinen annos (esim. validointitutkimuksessa 5 J/cm
 2 [UVA]) 
oli riittävä vertailukemikaalien luokittelemiseksi (taulukko) oikein.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 591
 
1.4.2.2.2 S ä t e i l y h e r k k y y s , t e s t i n t a r k i s t a m i n e n :  
Testi täyttää laatuvaatimukset, jos säteilytettyjen negatiivisten kont ­
rollien (liuotinkontrollien) elävyys on yli 80 % verrattuna säteilyttä ­
mättömiin negatiivisiin kontrolleihin (liuotinkontrolleihin).  
1.4.2.2.3 L i u o t i n k o n t r o l l i e n e l ä v y y s :  
Liuotinkontrollien neutraalipunauutteesta mitattu absoluuttinen opti ­
nen tiheys (OD540 NRU) osoittaa, ovatko kuoppaa kohti inokuloidut 
1 × 10  4 solua lisääntyneet normaalilla nopeudella määritykseen kuu ­
luvien kahden päivän aikana. Testi täyttää hyväksymisvaatimukset, jos käsittelemättömien kontrollien keskimääräinen OD540
 NRU on ≥ 
0,4 (noin 20 kertaa liuottimen tausta-absorbanssi).  
1.4.2.2.4 P o s i t i i v i n e n k o n t r o l l i :  
Kussakin  in vitro  3T3 NRU -valomyrkyllisyystestissä on testattava 
samanaikaisesti jokin tunnetusti valomyrkyllinen kemikaali. Käytet ­
täväksi suositellaan klooripromatsiinia (CPZ). CPZ:n testaukselle  in 
vitro  3T3 NRU -valomyrkyllisyyden standardiprotokollassa määritel ­
tiin seuraavat hyväksyntävaatimukset: CPZ, säteilytetty (+ Irr): IC  50 
= 0,1-2,0 g/ml; CPZ, ei säteilytetty (- Irr): IC50 = 7,0 -90,0 μg/ml. 
Valoärsyttävyystekijän (PIF) pi täisi olla > 6. Positiivisen kontrollin 
suorituskykyä olisi seurattava pitkän ajan kuluessa.  
Klooripromatsiinin sijasta voidaan samanaikaisesti testattavina posi ­
tiivisina kontrolleina käyttää muita valomyrkyllisiä kemikaaleja, jotka sopivat kyseessä olevalle kemikaaliluokalle tai arvioitavana 
olevan kemikaalin liukoisuusominaisuuksiin.
 
1.4.3  Testimenetelmä (6) (7) (8) (16) (17):  
1.4.3.1  1. päivä:  
Pipetoidaan 100 μlviljelynestettä 96-mikrotitterikuoppalevyn laitim ­
maisiin kuoppiin (= nollakokeet). Muihin kuoppiin pipetoidaan 100 μlsolususpensiota, jossa on 1 × 10
 5 solua/ml viljelynesteessä (= 1 × 
10 4 solua/kuoppa). Kullekin yksittäisen testiaineen pitoisuuksien sar ­
jalle sekä liuotin- ja positiivisille kontrolleille on valmistettava kaksi levyä.
 
Soluja inkuboidaan 24 h (katso kohta 1.4.1.2), kunnes ne muodos ­
tavat puoliksi konfluentin yhden solun vahvuisen kerroksen. Tässä 
ajassa solut toipuvat, tarttuvat levyn pohjaan ja alkavat kasvaa eks ­
ponentiaalisesti.  
1.4.3.2  2. päivä:  
Inkubaation jälkeen viljelyneste kaadetaan kuopista pois ja solut 
pestään huolellisesti 150 μl:lla puskuriliuosta, jota käytettiin inkubaa ­
tiossa. Lisätään 100 μL puskuria, jossa on testikemikaalia tai liuo ­
tinta (liuotinkontrolli). Kuoppiin lisätään kahdeksaa eri pitoisuutta 
testikemikaalia. Soluja inkuboidaan testikemikaalin kanssa pimeässä 60 minuuttia (katso kohta 1.4.1.2 ja kohta 1.4.1.4, toinen alakohta).
 
Kullekin yksittäisen testiaineen pitoisuuksien sarjalle sekä kontrol ­
leille valmistetuista kahdesta levystä valitaan yksi (yleensä sattuman ­
varaisesti) sytotoksisuuden määritystä varten (- Irr) (kontrollilevy) ja 
toinen (testilevy) fotosytotoksisuuden määritystä varten (+ Irr).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 592
 
Testin (+ Irr)-osaa varten soluja säteilytetään huoneenlämpötilassa 
50 minuuttia 96-kuoppalevyn kannen läpi suurimmalla ei-solumyr ­
kyllisellä säteilyannoksella (katso myös liite 2). Säteilyttämättömät levyt (- Irr) pidetään huoneenlämpötilassa pimeässä laatikossa 50 min (= valoaltistusaika).
 
Testiliuos kaadetaan pois ja solut pestään huolellisesti kahdesti 150 
μl:lla puskuriliuosta, jota käytettiin inkubaatiossa, mutta jossa ei ole 
testiainetta. Puskuri korvataan viljelynesteellä, ja soluja inkuboidaan 
(katso kohta 1.4.1.2) yli yön (18–22 h).  
1.4.3.3  3. päivä:  
1.4.3.3.1 M i k r o s k o o p p i t u t k i m u s  
Solujen lisääntyminen, morfologia ja yhden solun vahvuisen kerroksen 
eheys on tutkittava käyttäen faasikontrastimikroskooppia. Solujen 
muodonmuutokset ja vaikutukset solujen lisääntymiseen on kirjattava.  
1.4.3.3.2 N e u t r a a l i p u n a t e s t i  
Solut pestään 150 μl:lla esilämmitettyä puskuriliuosta. Pesuliuos kaa ­
detaan pois ravistamalla levyä varovasti. Kuoppiin lisätään 100 € 
neutra alipunaa (NR) (3-amino-7-dimetyyliamino-2-metyylifenatsii ­
nihydrokloridi, EINECS-numero 209-035-8; CAS-numero 553-24-2; C.I. 50040) viljelynesteessä ilman seerumia (16) ja soluja inkuboi ­
daan 3 tunnin ajan kohdassa 1.4.1.2 kuvatulla tavalla. Inkubaation 
jälkeen NR-viljelyneste poistetaan ja solut pestään 150 μl:lla pusku ­
riliuosta. Puskuriliuos kaadetaan pois ja kuopat kuivataan täysin ime ­
yttäen neste paperiin tai sentrifugoimalla.
 
Lisätään tarkasti 150 μl NR-desorbointiliuosta (juuri valmistettu, 49 
osaa vettä + 50 osaa etanolia + 1 osa etikkahappoa).  
Mikrotitterilevyä heilutetaan varovasti ravistajassa 10 minuutin ajan, 
kunnes NR on uuttunut soluista ja muodostanut tasaisen liuoksen.  
NR-uutteen optinen tiheys luetaan aallonpituudella 540 nm spektro ­
fotometrissä käyttäen vertailuliuoksena nollanäytteitä. Mittaustulokset 
tallennetaan sopivassa sähköisessä muodossa myöhempää analysoin ­
tia varten.  
2. MITTAUSTULOKSET  
2.1 MITTAUSTULOSTEN LAATU JA MÄÄRÄ  
Mittaustulosten avulla pitäisi voida analysoida järkevästi säteilytyk ­
sellä ja ilman sitä saadut pitoisuusvasteet sekä mahdollisuuksien 
mukaan se testikemikaalin pitoisuus, jossa solujen elävyys on vähen ­
tynyt 50 prosenttiin (IC50). Jos havaitaan sytotoksisuutta, sekä pitoi ­
suusalue että yksittäiset pitoisuudet on valittava siten, että koetulok ­
siin voidaan sovittaa kuvaaja.  
Selvästi positiivisia tai selvästi negatiivisia tuloksia ei tarvitse tarkis ­
taa toistamalla koetta (katso kohta 2.3, ensimmäinen alakohta). Täl ­
laisissa tapauksissa riittää yksi koe, jota tukee yksi tai useampia 
annoksen pitoisuusaluetta määrittäviä alustavia kokeita.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 593
 
Moniselitteiset tai epäselvät tulokset tai rajatapaukset olisi selvennet ­
tävä uudella testillä (katso kohdan 2.4 toinen alakohta). Tällaisissa 
tapauksissa olisi harkittava koeolosuhteiden muuttamista. Voidaan muuttaa pitoisuusalue tai pitoisuuksien välit, esi-inkubaatioaika ja altistusaika säteilytykselle. Vedessä hajoaville kemikaaleille voi lyhyt 
altistusaika olla tarkoituksenmukainen.
 
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI  
Tulosten arvioimiseksi voidaan laskea valoärsyttävyystekijä (PIF) tai 
keskimääräinen valovaikutus (MPE).  
Valomyrkyllisyyden arvojen laskemiseksi (ks. jäljempänä) on yksit ­
täisiä konsentraatio-vastearvoja aproksimoitava jatkuvalla konsent ­
raatio-vastekuvaajalla (malli). Kuvaaja sovitetaan tuloksiin tavalli ­
sesti soveltamalla ei-lineaarista regressiomenetelmää (18). Jotta voi ­
daan arvioida tietojen vaihtelevuuden vaikutus kuvaajaan, suositel ­
laan bootstrap-menetelmää.  
Valoärsyttävyystekijä (PIF) lasketaan seuraavasta kaavasta:  
PIF ¼ IC 50 ðÄIrrÞ 
IC 50 ðþIrrÞ 
Jos IC  50 :tä (joko valon kanssa tai ilman valoa) ei voida laskea, PIF:iä 
ei voida määrittää testiaineelle. Keskimääräinen valovaikutus (MPE) 
perustuu täydellisten pitoisuus-vastekuvaajien vertailuun (19). Se mää ­
ritellään edustavien valovaikutusarvojen painotetuksi keskiarvoksi.  
MPE ¼ Σ 
i ¼ 1 n 
w i PE c i 
Σ 
i ¼ 1 n 
w i 
Valovaikutus PE  c missä tahansa pitoisuudessa C määritellään vaste ­
vaikutuksen RE  c ja annosvaikutuksen DE  c tulona PE  c = RE  c x DE  c . 
Vastevaikutus RE  c on ilman valoa ja valon kanssa havaittujen vas ­
teiden erotus RE  c = R  c (- Irr) - R  c (+ Irr). Annosvaikutus lasketaan 
kaavasta  
DE  c ¼ C=C ä Ä 1 
C=C ä þ 1 Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ 
jossa C* on ekvivalenssipitoisuus eli pitoisuus, jossa + Irr-vaste 
vastaa - Irr-vastetta pitoisuudessa C. Jos C*:tä ei voida määrittää, koska + Irr-kuvaajan vastearvot ovat järjestelmällisesti suurempia tai pienempiä kuin R
 C (- Irr), annosvaikutuksen arvo on 
1. Painotuskertoimet (WI) saadaan suurimmasta vastearvosta: w  i = 
MAX {Ri (+ Irr), Ri (- Irr)}. Pitoisuusvälit Ci valitaan siten, että kuhunkin pitoisuusväliin kuuluu sama määrä pisteitä. MPE:n laske ­
minen rajoittuu siihen suurimpaan pitoisuusarvoon, jossa ainakin 
toinen kuvaajista edelleen antaa vähintään 10 prosentin vastearvon. 
Jos tämä suurin pitoisuus on suurempi kuin + Irr-kokeessa käytetty suurin pitoisuus, + Irr-kuvaajan jäljelle jäävässä osassa vastearvo on 0. Riippuen siitä, onko MPE:n arvo suurempi kuin asianmukaisesti 
valittu erotteleva raja-arvo (MPE
 c =0,15) vai ei, kemikaali luokitel ­
laan valomyrkylliseksi.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 594
 
PIF:n ja MPE:n laskemista varten on saatavissa ohjelmistopaketti 
(20).  
2.3 TULOSTEN TULKINTA  
Validointitutkimuksen perusteella (8) testiaineen, jonka PIF < 2 tai 
MPE < 0,1 ennuste on: ”ei valomyrkyllinen”. Kun PIF > 2 ja < 5, tai kun MPE > 0,1 ja < 0,15, ennuste on: ”todennäköisesti valomyrkyl ­
linen”; kun PIF > 5, tai kun MPE > 0,15, ennuste on: ”valomyrkyl ­
linen”.
 
Laboratorion, joka ottaa käyttöön tämän määrityksen, olisi testattava 
ensin taulukossa 1 mainitut vertailumateriaalit ennen kuin aloitetaan testinaineiden testaaminen valomyrkyllisyyden arvioimiseksi. PIF- ja MPE-arvojen tulisi olla lähellä taulukossa 1 mainittuja arvoja.
 
Taulukko 1  
Kemiallinen nimi EINECS nro CAS nro PIF MPE Absorptio- 
huippu Liuotin (  1 ) 
Amiodaroni- 
HCL 243-293-2 [19774-82-4] > 3,25 0,27-0,54 242 nm 
300 nm 
(olkapää) ethanoli 
Klooripromatsii ­
ni-HCL 200-701-3 [69-09-0] > 14,4 0,33-0,63 309 nm ethanoli 
Norfloksasiini 274-614-4 [70458-96-7] > 71,6 0,34-0,90 316 nm asetonitriili 
Antraseeni 204-371-1 [120-12-7] > 18,5 0,19-0,81 356 nm asetonitriili Protoporfyriini 
IX, dinatrium 256-815-9 [50865-01-5] > 45,3 0,54-0,74 402 nm ethanoli 
L-histidiini [7006-35-1] ei PIF-ar ­
voa 0,05-0,10 211 nm vesi 
Heksaklorofeeni 200-733-8 [70-30-4] 1,1-1,7 0,00-0,05 299 nm 
317nm 
(olkapää) ethanoli 
Natriumlauryy ­
lisulfaatti 205-788-1 [151-21-3] 1,0-1,9 0,00-0,05 Ei absorp ­
tiota vesi
 
( 1 ) Absorption määritykseen käytetty liuotin.  
2.4 TULOSTEN TULKINTA  
Jos valomyrkyllisyysvaikutuksia havaitaan vain suurimmilla testipi ­
toisuuksilla (erityisesti vesiliukoisilla testikemikaaleilla), vaaran arvi ­
oimiseksi voidaan tarvita lisätestaamista muilla pitoisuuksilla. Lisä ­
tietoja voidaan tarvita esimerkiksi kemikaalin imeytymisestä ja ker ­
tymisestä ihoon, ja/tai kemikaali on testattava muulla testillä, esimer ­
kiksi ihmisen tai eläimen ihoa käyttävällä  in vitro  -testillä tai iho ­
mallien avulla.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 595
 
Jos myrkyllisyyttä ei voida osoittaa (+ Irr ja - Irr) ja jos aineen 
huonoliukoisuus rajoittaa testattavia pitoisuuksia, voidaan asettaa ky ­
seenalaiseksi, sopiiko testiaine kyseiseen määritykseen, ja on harkit ­
tava vahvistavaa määritystä (esim. käyttämällä muuta mallia).  
3. RAPORTOINTI  
TESTIRAPORTTI  
Testiraportissa on esitettävä vähintään seuraavat tiedot:  
Testiaine:  
— tunnistetiedot, yleisnimet ja IUPAC- ja CAS-numero, jos se tie ­
detään,  
— fysikaalinen olomuoto ja puhtaus,  
— fysikokemialliset ominaisuudet, jotka vaikuttavat tutkimuksen te ­
kemiseen,  
— UV-valon ja näkyvän valon absorptiospektri,  
— stabiilius ja valostabiilius, jos tunnetaan.  
Liuotin:  
— perustelut liuottimen valinnalle,  
— testikemikaalin liukoisuus liuottimeen,  
— liuottimen pitoisuus prosentteina käsittelynesteessä.  
Solut:  
— solujen tyyppi ja lähde,  
— onko soluissa mykoplasmaa,  
— solujen siirrostusjärjestysluku, jos se tiedetään,  
— solujen säteilyherkkyys määritettynä sillä säteilytyslaitteella, jota 
käytetään  in vitro  3T3 NRU -valomyrkyllisyystestissä.  
Testiolosuhteet (1) —  inkubointi ennen käsittelyä ja sen jälkeen:  
— viljelynesteen tyyppi ja koostumus,  
— inkubaatio-olosuhteet (CO  2 -pitoisuus, lämpötila, kosteus),  
— inkubaatioaika (esikäsittely, jälkikäsittely).  
Testiolosuhteet (2) —  käsittely kemikaalilla:  
— perustelut testikemikaalin pitoisuuksien valintaan (sekä säteily ­
tyksen kanssa että ilman sitä),  
— jos testikemikaali on huonoliukoinen eikä osoita solumyrkylli ­
syyttä, perustelut suurimmalle testatulle pitoisuudelle,  
— käsittelynesteen tyyppi ja koostumus (puskuroitu suolaliuos),  
— kemikaalikäsittelyn kesto.  
Testiolosuhteet (3) —  säteilytys:  
— perustelut käytetyn valolähteen valinnalle,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 596
 
— valolähteen ja säteilymittarin valmistaja ja tyyppi,  
— valolähteen spektrin säteilyominaisuudet,  
— käytetyn suodattimen (käytettyjen suodattimien) transmissio- ja 
absorptio-ominaisuudet,  
— säteilymittarin ominaisuudet ja sen kalibrointi yksityiskohtaisesti,  
— valolähteen etäisyys testijärjestelmästä,  
— UVA-säteilyn voimakkuus kyseisellä etäisyydellä, mW/cm  2 , 
— UV-altistuksen tai näkyvälle valolle altistuksen kesto,  
— UVA-annos (säteilyvoimakkuus × aika), ilmaistuna laatuna J/ ­
cm 2 , 
— soluviljelmien lämpötila säteilytyksen aikana ja samanaikaisesti 
pimeässä pidettyjen soluviljelmien lämpötila.  
Testiolosuhteet (4) —  neutraalipunatesti:  
— neutraalipunaliuoksen koostumus,  
— neutraalipunainkubaation kesto,  
— inkubaatio-olosuhteet (CO2-pitoisuus, lämpötila, kosteus),  
— neutraalipunan uutto-olosuhteet (uuttoaine, kesto),  
— aallonpituus, jolla neutraalipunan optinen tiheys luettiin spektro ­
fotometrillä,  
— toinen (vertailu-) aallonpituus, jos sellaista käytettiin,  
— spektrofotometrin mahdollisen nollaliuoksen sisältö.  
Tulokset:  
— solujen elävyys kullakin testikemikaalin pitoisuudella ilmaistuna 
prosentteina rinnakkaisten liuotinkontrollien keskimääräisestä elä ­
vyydestä,  
— pitoisuus-vastekuvaajat (testikemikaalin pitoisuus vs. suhteellinen 
solujen elävyys), joka on saatu samanaikaisesti tehdyissä (+ Irr)- ja (- Irr)-kokeissa,
 
— pitoisuus-vastekuvaajien analyysi; jos mahdollista, lasketaan IC  50 
(+ Irr) ja IC  50 (- Irr),  
— niiden kahden konsentraatio-vastekuvaajan vertailu, jotka on 
saatu säteilytyksen kanssa ja ilman sitä, joko laskemalla valoär ­
syttävyystekijä (PIF) tai laskemalla keskimääräinen valovaikutus (MPE),
 
— testin hyväksyttävyyskriteerit; samanaikainen liuotinkontrolli:  
— säteilytettyjen ja säteilyttämättömien solujen absoluuttinen elä ­
vyys (neutraalipunauutteen optinen tiheys),  
— negatiivista ja liuotinkontrollia koskevat aiemmat tiedot; keski ­
arvot ja vakiopoikkeamat,  
— –testin hyväksyttävyyskriteerit; samanaikainen positiivinen kont ­
rolli: ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 597
 
— positiivisen kontrollikemikaalin IC  50 (+ Irr) ja IC  50 (- Irr) ja PIF/ ­
MPE;  
— positiivista kontrollia koskevat aiemmat kemialliset tiedot: IC  50 (+ 
Irr) ja IC  50 (- Irr) ja PIF/MPE; keskiarvot ja vakiopoikkeamat.  
Tulosten tarkastelu.  
Päätelmät.  
4. KIRJALLISUUSVIITTEET  
1. Lovell W.W. (1993). A scheme for  in vitro  screening of subs ­
tances for photoallergenic potential. Toxic. In Vitro 7: 95–102.  
2. Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photodynamic 
substances. In ”Research Progress in Organic, Biological and Medicinal Chemistry” Vol. 3 part 1. North Holland Publishing 
Co. Amsterdam. p XI–XXXV.
 
3. Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., Mau ­
rer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O., and Sladows ­
ki, D. (1994).  In vitro  phototoxicity testing: The report and 
recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA, 22, 
314–348.  
4. Spikes, J.D. (1989). Photosensitization. In ”The science of Pho ­
tobiology” Edited by K.C. Smith. Plenum Press, New York. 
2nd edition, p 79–110.  
5. OECD (1997) Environmental Health and Safety Publications, 
Series on Testing and Assessment No.7 ”Guidance Document On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water” Envi ­
ronment Directorate, OECD, Paris.
 
6. Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H.G., Kal ­
weit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, 
W.W., Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and Willshaw, A. (1994). EEC/COLIPA project on  in vitro  photo­
toxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell 
phototoxicity assay. Toxic. In Vitro 8, 793–796.
 
7. Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 
NRU PT test (an  in vitro  test for phototoxicity), European 
Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA, 26, 7–8.
 
8. Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pechovitch, 
G. De Silva, O., Holzhütter, H.G., Clothier, R., Desolle, P., Ger ­
berick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Pfannenbecker, 
U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W., and Brantom, P. (1998). The international EU/COLIPA  In vitro  pho­
totoxicity validation study: results of phase II (blind trial), part 1: 
the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxic. In Vitro 12, 305–327.
 
9. OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In 
Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, Berlin, 30
 th -31 th October 2001, Secretariat's Final Summary Report, 
15 th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request 
from the Secretariat.  
10. Borenfreund, E., and Puerner, J.A. (1985). Toxicity determina ­
tion in vitro by morphological alterations and neutral red ab ­
sorption. Toxicology Lett., 24, 119–124.  
11. Hay, R.J. (1988) The seed stock concept and quality control for 
cell lines. Analytical Biochemistry 171, 225–237.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 598
 
12. Lambert L.A, Warner W.G., and Kornhauser A. (1996) Animal 
models for phototoxicity testing. In ”Dermatotoxicology”, edi ­
ted by F.N. Marzulli and H.I. Maibach. Taylor & Francis, Washington DC. 5th Edition, p 515–530.
 
13. Tyrrell R.M., Pidoux M (1987) Action spectra for human skin 
cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultra ­
violet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epider ­
mal keratinocytes. Cancer Res., 47, 1825–1829.  
14. ISO 10977. (1993). Photography — Processed photographic colour 
films and paper prints — Methods for measuring image stability.  
15. Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, Inter ­
national Commission on Illumnation, Publication No. 90, Vien ­
na, 1993, ISBN 3 900 734 275  
16. ZEBET/ECVAM/COLIPA — Standard Operating Procedure: In 
Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 September, 1998. 18 pgs.
 
17. Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, 
O., Holzhütter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter chemicals from Annex VII of the European Union Directive 76/768/EEC, 
in the in vitro 3T3 NRU phototoxicity test. ATLA 26, 679–708.
 
18. Holzhütter, H.G., and Quedenau, J. (1995) Mathematical mod ­
eling of cellular responses to external signals. J. Biol. Systems 3, 127–138.
 
19. Holzhütter, H.G. (1997). A general measure of in vitro photo ­
toxicity derived from pairs of dose-response curves and its use 
for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals. ATLA, 
25, 445–462.  
20. http://www.oecd.org/document/55/0, 2340,en_2649_34377_ 
2349687_1_1_1_1, 00.html  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 599
 
LIITE 1  
3T3 NRU -valomyrkyllisyystestin asema kemikaalien valomyrkyllisyyden vaiheittaisessa 
määrittämisessä
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 600
 
LIITE 2  
Kuva 1  
Suodatetun auringonvalosimulaattorin valon spektritehojakauma
  
(katso kohdan 1.4.1.5 toinen alakohta)  
Kuvassa 1 oleva kaavio on esimerkki hyväksyttävästä suodatetun auringonvalosimulaattorin spekt ­
rin säteilyvoimakkuusjakaumasta. Kyseessä on (seostettu) metallihalidikaarilamppu, jota käytettiin 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestin validointikokeessa (6) (8) (17). Kaaviosta käy ilmi kahden eri suodattimen suodatinvaikutus sekä soluviljelmien 96-kuoppalevyn kannen lisäsuodatinvaikutus. H2- 
suodatinta käytettiin vain testijärjestelmissä, jota sietävät suurempia määriä UVB-säteilyä (ihomal ­
litesti ja punaisten verisolujen fotohemolyysitesti). 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestissä käytettiin H1-suodatinta. Kaaviosta käy ilmi, että kuoppalevyn kannen lisäsuodatinvaikutus todetaan pääasi ­
allisesti UVB-alueella. Suodatinvaikutus jättää säteilyspektriin tarpeeksi UVB-säteilyä, jotta voidaan 
eksitoida kemikaaleja, jotka absorboivat säteilyä tyypillisesti UVB-alueella (esim. amiodaroni) 
(katso taulukko 1).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 601
 
Kuva 2  
Balb/c 3T3 -solujen säteilyherkkyys (mitattuna UVA-alueella)  
Solujen elävyys (neutraalipunan otto prosentteina pimeässä pidettyjen kontrollien neutraalipunan 
otosta)
  
(katso kohdan 1.4.1.5.2 toinen alakohta sekä kohdat 1.4.2.2.1 ja 1.4.2.2.2)  
Kaavio kuvaa Balb/c 3T3 -solujen herkkyyttä 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestin validointikokeessa 
käytetyn auringonvalosimulaattorin valolle (mitattuna UVA-alueella). Kuvaajasta näkyvät validoin ­
tia edeltäneessä tutkimuksessa (seitsemässä eri laboratoriossa) saadut tulokset (1). Valkoisilla sym ­
boleilla merkityt kaksi kuvaajaa saatiin vanhoilla soluilla (paljon siirrostamisia), jotka oli korvattava uusilla soluilla. Mustilla symboleilla merkityt kuvaajat saatiin soluilla, joiden säteilyherkkyys oli 
hyväksyttävä.
 
Näistä tiedoista johdettiin suurimmaksi ei-solumyrkylliseksi säteilytysannokseksi 5 J/cm  2 (pysty­
suora katkoviiva). Vaakasuora katkoviiva osoittaa lisäksi suurimman hyväksyttävän säteilyvaikutuk ­
sen (katso kohta 1.4.2.2.).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 602
 
B.42.  IHOHERKISTYS: PAIKALLINEN IMUSOLMUKEMÄÄRITYSME ­
NETELMÄ  
JOHDANTO  
1. Kemikaalien testausta koskevia OECD:n ohjeita ja niihin perustuvia EU:n 
testimenetelmiä tarkistetaan säännöllisesti tieteellisen kehityksen, muuttu ­
vien sääntelytarpeiden ja eläinten hyvinvointiin liittyvien kysymysten perus ­
teella. Hiirten ihoherkistyksen määrittämisessä käytettävä alkuperäinen tes ­
timenetelmä, paikallinen imusolmukemääritysmenetelmä (Local Lymph 
Node Assay, LLNA; OECD:n testiohje 429; tämän liitteen B.42 luku), on 
hyväksytty aiemmin (1). LLNA-menetelmän validointia koskevat yksityis ­
kohtaiset tiedot ja siihen liittyvien tehtävien arviointi on julkaistu (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). Ajan tasalle saatettu LLNA perustuu kokemus ­
ten ja tieteellisten tietojen arviointiin (12). Tämä on toinen menetelmä ke ­
mikaalien (aineiden ja seosten) ihoherkistyspotentiaalin arvioimiseksi eläi ­
millä. Toisessa testimenetelmässä (OECD:n testiohje 406; tämän liitteen B.6 luku) käytetään marsutestejä, erityisesti marsuilla tehtävää maksimointitestiä 
ja Bühlerin testiä (13). LLNA-menetelmä on B.6 menetelmään ja OECD:n 
testiohjeeseen 406 (13) verrattuna edistyneempi eläinten hyvinvoinnin kan ­
nalta. Tässä ajan tasalle saatetussa LLNA-testimenetelmässä esitetään suo ­
ritusvaatimuksia (lisäys 1), joiden avulla LLNA-menetelmää toiminnallisesti 
ja mekaanisesti vastaavien uusien ja/tai mukautettujen testimenetelmien va ­
lidoinnin tila voidaan arvioida OECD:n ohjeasiakirjan nro 34 (14) periaat ­
teiden mukaisesti.
 
2. LLNA-menetelmällä tutkitaan ihoherkistyksen induktiovaihetta ja tuotetaan 
annosvasteen arviointiin sopivia kvantitatiivisia tuloksia. On syytä huomata, 
että lievää tai keskimääräistä herkistystä aiheuttavia aineita, joita suositel ­
laan positiivisiksi kontrollikemikaaleiksi marsutestimenetelmissä (B.6; OECD:n testiohje 406) (13), voidaan käyttää myös LLNA-menetelmässä 
(6) (8) (15). Myös koe-eläinten vähäisempään käyttöön perustuva 
LLNA-menetelmän muunnos (rLLNA-menetelmä), jossa eläimiä käytetään jopa 40 prosenttia vähemmän, kuvataan vaihtoehtona tässä testimenetel ­
mässä (16) (17) (18). rLLNA-menetelmää voidaan käyttää, jos ihoherkis ­
tyspotentiaalin ennakoitu negatiivinen löydös on sääntelysyistä vahvistetta ­
va, edellyttäen että kaikkia muita tässä testimenetelmässä kuvattuja LLNA-menettelyn vaatimuksia noudatetaan. Negatiivisen löydöksen oletuk ­
sen on perustuttava kaikkiin 4 kohdassa tarkoitettuihin saatavilla oleviin 
tietoihin. Ennen rLLNA-menetelmän käyttöä on sille esitettävä selvät pe ­
rustelut ja tieteelliset perusteet. Jos rLLNA-menetelmällä saadaan odotusten vastaisesti positiivinen tai epäselvä tulos, löydöksen tulkitsemiseksi tai sel ­
ventämiseksi voidaan tarvita täydentäviä testejä. Tätä rLLNA-menetelmää ei 
saa käyttää ihoherkistystesteissä käytettävien aineiden vaarallisuuden mää ­
rittämiseksi siinä tapauksessa, että vaaditaan annos-vastetietoja, kuten ainei ­
den ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaamisesta annetussa asetuksessa (EY) N:o 1272/2008 ja Yhdistyneiden kansakuntien (YK) 
GHS-järjestelmässä (Globally Harmonized System of Classification and 
Labelling of Chemicals) määritettyä alaluokitusta.
 
MÄÄRITELMÄT  
3. Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 2.  
JOHDANTO JA RAJOITUKSET  
4. LLNA on vaihtoehtoinen menetelmä ihoa herkistävien kemikaalien tunnis ­
tamiseksi. Tämä ei välttämättä merkitse sitä, että LLNA-menetelmää pitäisi 
käyttää kaikissa tapauksissa marsutestin asemesta (B.6; OECD:n testiohje 
406) (13), vaan pikemminkin sitä, että menetelmä on yhtä hyvä ja sitä voidaan käyttää vaihtoehtona, jossa positiivisia ja negatiivisia tuloksia ei yleensä enää tarvitse varmistaa uudelleen. Testilaboratorion on otettava 
huomioon kaikki testiaineesta saatavilla olevat tiedot ennen tutkimuksen 
tekemistä. Tällaisia tietoja ovat muun muassa testiaineen tunnistetiedot ja
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 603
 
kemiallinen rakenne, sen fysikaaliskemialliset ominaisuudet, muiden testi ­
aineella tehtyjen  in vitro - tai  in vivo  -myrkyllisyystestien tulokset sekä 
rakenteellisesti samankaltaisten kemikaalien toksikologiset tiedot. Tietojen perusteella on määritettävä, voidaanko LLNA-menetelmää käyttää kyseisen aineen testaamiseen (ottaen huomioon, että LLNA-menetelmä ei sovellu 
tiettyjen kemikaalityyppien testaamiseen – katso 1 kohta) ja mitä annosta 
on käytettävä.
 
5. LLNA on  in vivo  -menetelmä, joten sitä käytettäessä ei lopeteta koe-eläinten 
käyttöä kosketusherkistyksen arvioinnissa. Sitä käytettäessä voidaan kuiten ­
kin vähentää tähän tarkoitukseen tarvittavien eläinten määrää. 
LLNA-menetelmässä käytetty tapa testata kosketusherkistystä eläimillä on 
myös huomattavasti aikaisempia edistyneempi (vähemmän kipua ja kärsi ­
mystä). LLNA-menetelmän perustana on kemikaalien aiheuttamien immu ­
nologisten tapahtumien tarkastelu ihoherkistyksen induktiovaiheen aikana. 
Marsutesteistä (B.6; OECD:n testiohje 406) (13) poiketen 
LLNA-menetelmässä ei edellytetä tarkoituksellista ihon yliherkkyysreaktioi ­
den tuottamista. LLNA-menetelmä ei myöskään edellytä adjuvantin käyttöä, toisin kuin marsuilla tehtävä maksimointitesti (13). Lena-menetelmään siis 
liittyy vähemmän eläinten kipua ja kärsimystä. Vaikka LLNA-menetelmä 
onkin B.6 menetelmään ja OECD:n testiohjeeseen 406 verrattuna edisty ­
neempi, on syytä huomata, että siihen liittyy tiettyjä rajoituksia, joiden vuoksi voi olla tarpeen käyttää B.6 menetelmää tai OECD:n testiohjetta 
406 (13) (väärät negatiiviset löydökset LLNA-menetelmällä joidenkin me ­
tallien osalta, väärät positiiviset löydökset joidenkin ihoa ärsyttävien ainei ­
den, esimerkiksi pinta-aktiivisten kemikaalien, osalta (19) (20) tai testi ­
aineen liukoisuus). Määritystä häiritseviä (21) funktionaalisia ryhmiä sisäl ­
tävien kemikaaliluokkien tai aineiden yhteydessä voi olla tarpeen käyttää 
marsutestejä (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) (13). Pääasiassa torjunta-aineformulaatioita sisältävän suppean validointitietokannan perus ­
teella LLNA-menetelmällä saadaan tämäntyyppisistä testiaineista (22) mar ­
sutestiä todennäköisemmin positiivinen tulos. Formulaatioita testattaessa on 
kuitenkin tarvittaessa otettava vertailuaineeksi tunnettuja tuloksia antavia aineita sen osoittamiseksi, että LLNA-menetelmä toimii asianmukaisesti (katso 16 kohta). Tällaisia tunnettuja rajoituksia lukuun ottamatta 
LLNA-menetelmällä olisi pystyttävä testaamaan mitä tahansa ainetta, ellei ­
vät kyseisten aineiden ominaisuudet vaikuta LLNA-menetelmän tarkkuu ­
teen.
 
TESTIN PERIAATE  
6. LLNA-menetelmän perusperiaate on, että ihoa herkistävät aineet aiheuttavat 
lymfosyyttien proliferaatiota imusolmukkeissa, jotka dreneeraavat alueen, 
jonne testiaine on annosteltu. Tämä proliferaatio on suhteessa allergeenin 
annokseen ja potenssiin ja tarjoaa yksinkertaisen keinon ihoherkistyksen mittaamiseksi kvantitatiivisella tavalla. Proliferaatio mitataan vertaamalla kussakin testiryhmässä tapahtuvaa keskimääräistä proliferaatiota 
kantaja-aineella käsitellyssä kontrolliryhmässä tapahtuvaan keskimääräiseen 
proliferaatioon. Kunkin käsitellyn ryhmän keskimääräisen proliferaation ja sitä vastaavan kantaja-aineella käsitellyn ryhmän keskimääräisen proliferaa ­
tion suhde (stimulaatioindeksi, SI) määritetään, ja sen on oltava vähintään 3, 
ennen kuin testiaine voidaan arvioida mahdollisesti ihoherkistystä aiheutta ­
vaksi. Tässä kuvatut menetelmät perustuvat korvalehden dreneeraavien imu ­
solmukkeiden solujen proliferaation mittaamiseen radioaktiivisen  in vivo  
-merkkiaineen avulla. Solujen proliferaation arvioimiseksi voidaan kuitenkin 
käyttää myös muita päätepisteitä edellyttäen, että suoritusvaatimukset täyte ­
tään (lisäys 1).
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 604
 
MÄÄRITYSMENETELMÄN KUVAUS  
Eläinlajin valinta  
7. Paras eläinlaji tähän testiin on hiiri. Testissä käytetään nuoria täysikasvuisia 
CBA/Ca- tai CBA/J-kannan naarashiiriä, jotka eivät ole synnyttäneet eivätkä 
ole raskaana. Testin alussa eläinten on oltava 8–12 viikon ikäisiä, ja eläinten painoerojen on oltava vähäisiä eli enintään 20 prosenttia keskipainosta. Muita kantoja tai uroseläimiä voidaan käyttää, jos tietoja tuotetaan riittävästi 
sen osoittamiseksi, että LLNA-vasteessa ei esiinny merkitseviä 
koe-eläinkantaan tai sukupuoleen liittyviä eroja.
 
Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta  
8. Hiiret on pidettävä samoissa häkeissä (23), ellei hiirien pitämiselle erillisissä 
häkeissä esitetä riittäviä tieteellisiä perusteluja. Koe-eläintilan lämpötilan on oltava 22 ± 3 celsiusastetta. Vaikka riittää, että suhteellinen kosteus on vähintään 30 prosenttia eikä mielellään ylitä 70 prosenttia muulloin kuin 
huoneen puhdistuksen aikana, on kuitenkin pyrittävä 50–60 prosentin suh ­
teelliseen kosteuteen. Huoneessa on käytettävä keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa ra ­
joittaa.
 
Eläinten valmistelu  
9. Eläimet valitaan satunnaistetusti, merkitään niin, että yksilöt voidaan erottaa 
toisistaan (ei kuitenkaan korvamerkeillä), ja pidetään häkeissä vähintään 
viiden päivän ajan ennen testiaineen annostelun aloittamista, jotta ne tottu ­
vat laboratorio-olosuhteisiin. Ennen käsittelyn alkua kaikki eläimet on tut ­
kittava sen varmistamiseksi, ettei niillä ole havaittavia ihovaurioita.  
Annosteluliuosten valmistelu  
10. Kiinteät kemikaalit on liuotettava tai sekoitettava liuottimiin tai 
kantaja-aineisiin ja tarvittaessa laimennettava ennen niiden annostelua hiiren 
korvaan. Nestemäiset kemikaalit voidaan annostella laimentamattomana tai 
ennen annostelua laimennettuina. Vaikealiukoisia kemikaaleja, kuten sellai ­
sia, joita käytetään yleisesti lääkinnällisissä laitteissa, olisi uutettava erityi ­
sen voimakkaasti asianmukaisessa liuottimessa, jotta saataisiin testausta var ­
ten esiin kaikki uuttuvat ainesosat ennen annostelua hiirten korviin. Testi ­
aineet on valmistettava päivittäin, paitsi jos säilyvyys on osoitettu stabili ­
teettitutkimuksilla.  
Testin luotettavuuden tarkistus  
11. Määritysmenetelmän toimivuus osoitetaan positiivisten kontrollikemikaalien 
avulla. Niillä on testissä saatava aikaan riittävä ja toistettavissa oleva her ­
kistyminen, ja vasteen voimakkuuden on oltava aineelle tyypillinen. Positii ­
visen kontrollikemikaalin käyttöä samanaikaisesti suositellaan, koska sillä 
osoitetaan, että laboratoriolla on riittävä pätevyys kunkin määritysmenetel ­
män toteuttamiseksi, ja sen avulla voidaan arvioida laboratorioiden sisäistä ja laboratorioiden välistä uusittavuutta ja vertailtavuutta. Myös tietyt sään ­
telyviranomaiset vaativat positiivisen kontrollikemikaalin käyttöä jokaisessa 
määrityksessä, ja käyttäjiä kehotetaankin ottamaan yhteyttä asiasta vastaa ­
viin viranomaisiin ennen LLNA-menetelmän toteuttamista. Tämän takia suositellaan, että positiivista kontrollikemikaalia käytetään säännönmukai ­
sesti kaikissa määrityksissä, jotta positiivisen kontrollikemikaalin satunnai ­
sesta käytöstä mahdollisesti johtuvien vaatimusten täyttämiseksi ei tarvitsisi
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 605
 
tehdä uusia eläinkokeita (katso 9 kohta). Positiivisen kontrollikemikaalin on 
tuotettava positiivinen LLNA-vaste altistustasolla, jonka odotetaan antavan 
stimulaatioindeksin (SI), joka on suurempi kuin 3, negatiiviseen kontrolli ­
ryhmään verrattuna. Positiivisen kontrollikemikaalin annostaso on valittava siten, että se ei aiheuta liian voimakasta ihoärsytystä tai koko elimistöön 
kohdistuvaa toksisuutta ja että induktio on toistettavissa mutta ei liian suuri 
(esimerkiksi SI > 20 on liian suuri). Suositeltavia positiivisia kontrollike ­
mikaaleja ovat 25-prosenttinen heksyylikanelialdehydi (CAS-numero 101- 86-0) asetonin ja oliiviöljyn seoksessa (4:1 v/v) ja 5-prosenttinen merkap ­
tobentsotiatsoli (CAS-numero 149-30-4)  N,N -dimetyyliformamidissä (katso 
lisäyksen 1 taulukko 1). Joissakin olosuhteissa voidaan riittävin perustein käyttää muita positiivisia kontrollikemikaaleja, jotka täyttävät edellä maini ­
tut kriteerit.
 
12. Vaikka positiivisen kontrolliryhmän käyttöä suositellaan aina, joissakin ta ­
pauksissa positiivisen kontrollikemikaalin testaus vain ajoittain (enintään 
kuuden kuukauden välein) voi riittää LLNA-menetelmää säännöllisesti käyt ­
tävissä laboratorioissa (eli sellaisissa, jotka tekevät LLNA-määritystä vähin ­
tään kerran kuukaudessa) ja joilla on aiempia positiivisen kontrollikemikaa ­
lin määritystietoja, jotka osoittavat laboratorion valmiuden saada aikaan 
uusittavissa olevia ja täsmällisiä tuloksia positiivisilla kontrollikemikaaleilla. 
Riittävä LLNA-menetelmää koskeva pätevyys voidaan osoittaa tuottamalla positiivisella kontrollikemikaalilla toistuvasti samantasoisia positiivisia tu ­
loksia vähintään kymmenessä riippumattomassa testissä kohtuullisen ajan 
kuluessa (alle yhden vuoden aikana).
 
13. Samaan aikaan tehtyä positiivista kontrollikemikaalia on käytettävä aina, 
kun LLNA-menetelmää muutetaan (esimerkiksi kun koulutettu henkilökunta 
vaihtuu, testimenetelmän materiaalit ja/tai reagenssit vaihtuvat, testimenetel ­
mässä käytettävät laitteet vaihtuvat tai koe-eläinten alkuperä vaihtuu), ja tällaiset muutokset on kirjattava laboratorioraportteihin. Muutosten vaiku ­
tusta aiempien määritystietojen asianmukaisuuteen on tarkasteltava päätettä ­
essä, onko uusien määritystietojen kerääminen tarpeen positiivisen kontrol ­
likemikaalin tulosten yhdenmukaisuuden osoittamiseksi.
 
14. Tutkijoiden on otettava huomioon, että jos positiivista kontrollikemikaalia ei 
määritetä joka kerralla vaan vain silloin tällöin, saattaa negatiivisten tutki ­
mustulosten asianmukaisuus ja hyväksyttävyys vaarantua, kun ajoittain teh ­
tyjen positiivisen kontrollikemikaalin määritysten välillä ei tehdä positii ­
visen kontrollikemikaalin määritystä samanaikaisesti. Jos esimerkiksi ajoit ­
taisesta positiivisen kontrollikemikaalin määrityksestä saadaan väärä negatii ­
vinen tulos, positiivisen kontrollikemikaalin viimeisen hyväksytyn ajoittai ­
sen määrityksen ja positiivisen kontrollikemikaalin hylätyn ajoittaisen mää ­
rityksen tuloksen välisenä aikana saadut testiaineen negatiiviset tulokset voivat olla kyseenalaisia. Näiden tulosten seurauksia on tarkasteltava huo ­
lellisesti päätettäessä positiivisten kontrollikemikaalien käyttämisestä testi ­
aineen rinnalla tai vain ajoittain. Lisäksi olisi harkittava, että testiaineen 
rinnalla käytettävää positiivista kontrolliryhmää varten käytettäisiin vähem ­
män eläimiä, jos se on tieteellisesti perusteltua ja jos laboratorio osoittaa laboratoriokohtaisten aiempien tietojen perusteella, että käytettävien hiirten 
määrää voidaan vähentää (12).
 
15. Vaikka positiiviset kontrollikemikaalit on testattava kantaja-aineessa, jonka 
tiedetään antavan aina samanlaisen vasteen (esimerkiksi asetoni:oliiviöljy, 
4:1 v/v), joissakin tapauksissa testaus saattaa sääntelysyistä olla tarpeen myös muussa kuin standardikantaja-aineessa (kliinisesti/kemiallisesti rele ­
vantissa aineessa) (24). Jos samanaikaisesti määritettävää positiivista kont ­
rollikemikaalia testataan eri kantaja-aineessa kuin testiainetta, on sitä varten 
käytettävä erillistä kantaja-aineella käsiteltyä positiivista kontrollia.
 
16. Arvioitaessa tiettyyn kemikaaliluokkaan kuuluvia tai tietyn vastetason ai ­
kaansaavia testiaineita voidaan myös käyttää vertailuaineita sen osoittami ­
seksi, että testimenetelmällä voidaan asianmukaisesti havaita tämäntyyppis ­
ten testiaineiden ihoherkistyspotentiaali. Vertailuaineilla olisi oltava seura ­
avat ominaisuudet:  
— rakenteellinen ja funktionaalinen vastaavuus testattavana olevaan testiai ­
neluokkaan verrattuna  
— tunnetut fyysiset/kemialliset ominaisuudet  
— sopivuutta tukevia LLNA-menetelmästä saatuja tietoja  
— sopivuutta tukevia muista eläinmalleista ja/tai ihmisistä saatuja tietoja.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 606
 
TESTIMENETTELY  
Koe-eläinten määrä ja annostasot  
17. Kussakin annostasoryhmässä on oltava vähintään neljä eläintä, ja testi ­
aineesta on käytettävä vähintään kolmea konsentraatiota; lisäksi käytetään 
aina negatiivista kontrolliryhmää, joka käsitellään vain testiaineen kantaja-aineella, sekä positiivista kontrolliryhmää (jota käytetään aina tai jota on käytetty hiljattain, laboratorion toimintatavan mukaisesti, ottaen 
huomioon 11–14 kohdat). Positiivisesta kontrolliryhmästä on tarvittaessa 
testattava useita annoksia, etenkin jos positiivista kontrollikemikaalia testa ­
taan epäsäännöllisesti. Kontrolliryhmän eläimiä on kohdeltava samalla ta ­
voin kuin testiryhmän eläimiä, paitsi että niitä ei käsitellä testiaineella.
 
18. Annostason ja kantaja-aineen valinnan on perustuttava lähteissä (3) ja (5) 
esitettyihin suosituksiin. Yleensä valitaan sopivasta konsentraatiosarjasta, esimerkiksi sarjasta 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % jne. peräkkäisiä konsentraatioita. Käytettävälle konsentraatiosarjalle on esi ­
tettävä asianmukaiset tieteelliset perustelut. Kaikki käytettävissä olevat tok ­
sikologiset tiedot (esimerkiksi akuutti toksisuus ja ihoärsytys) ja rakenteel ­
liset ja fysikaaliskemialliset tiedot kyseisestä testiaineesta (ja/tai rakenteelli ­
sesti vastaavista aineista) on tarvittaessa otettava huomioon kolmen peräk ­
käisen konsentraation valinnassa siten, että suurin konsentraatio edustaa 
maksimialtistusta, mutta kuitenkin niin, että vältetään koko elimistöön koh ­
distuva toksisuus ja/tai liian voimakas paikallinen ihoärsytys (3) (25). Jos tällaisia tietoja ei ole käytettävissä, voi olla tarpeen tehdä alustava kartoi ­
tustesti (katso 21–24 kohta).
 
19. Kantaja-aine ei saa vaikuttaa testituloksiin tai vääristää niitä, ja se on valit ­
tava siten, että testiaineen annosteluun sopivan liuoksen/suspension aikaan saannissa varmistetaan suurin mahdollinen liukoisuus ja konsentraatio. Suo ­
siteltavia kantaja-aineita ovat asetoni:oliiviöljy (4:1 v/v),  N,N -dimetyylifor ­
mamidi, metyylietyyliketoni, propyleeniglykoli ja dimetyylisulfoksidi (19), 
mutta muitakin kantaja-aineita voidaan käyttää riittävin tieteellisin perustein. Joissakin tilanteissa voi olla tarpeen käyttää lisäkontrolliaineena kliinisesti perusteltua liuotinta tai sitä kaupallista valmistetta, jona testiainetta markki ­
noidaan. Erityisesti on varmistettava, että hydrofiiliset testiaineet sisällyte ­
tään sellaiseen kantaja-ainejärjestelmään, joka vettää ihon eikä valu heti pois, lisäämällä asianmukaisia liukenemista edistäviä aineita (esimerkiksi 1-prosenttinen Pluronic® L92). On siis syytä välttää kantaja-aineina pelkkiä 
vesiliuoksia.
 
20. Yksittäisten hiirten imusolmukkeita prosessoimalla voidaan arvioida eläin ­
tenvälistä vaihtelua ja vertailla tilastollisesti testiaineella ja kantaja-aineella käsiteltyjen ryhmien tuloksia (katso 35 kohta). Myös positiivisen kontrolli ­
ryhmän hiirten määrän vähentämisen arviointi on mahdollista, kun tietoja 
kerätään yksittäisistä eläimistä (12). Tietyt sääntelyviranomaiset vaativat, että tietoja on kerättävä yksittäisistä eläimistä. Jotkut sääntelyviranomaiset kuitenkin hyväksyvät useista eläimistä yhdistettyjä tietoja, ja tällaisissa ti ­
lanteissa käyttäjät voivat kerätä tietoja joko yksittäisistä eläimistä tai eläin ­
ryhmistä.
 
Varsinaista testiä edeltävä kartoitustesti  
21. Jos suurimman testattavan annoksen määrittämiseksi ei ole saatavilla tietoja 
(katso 18 kohta), on kartoitettava esitestillä, mikä olisi LLNA-menetelmän testeissä käytettävä asianmukainen annostaso. Kartoitustesti helpottaa enim ­
mäisannoksen tason valinnassa varsinaista LLNA-tutkimusta varten, kun 
tietoja koko elimistöön kohdistuvan toksisuuden (katso 24 kohta) ja/tai liian voimakkaan paikallisen ihoärsytyksen (katso 23 kohta) aiheuttavasta kon ­
sentraatiosta ei ole saatavilla. Testattavan enimmäisannoksen tason on vas ­
tattava sataa prosenttia nestemäisen testiaineen osalta tai suurinta mahdol ­
lista konsentraatiota kiinteiden tai suspendoitujen aineiden osalta.
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 607
 
22. Kartoitustesti suoritetaan varsinaista LLNA-tutkimusta vastaavissa olosuh ­
teissa, kuitenkin niin, että imusolmukkeiden proliferaatiota ei arvioida ja 
kussakin annosryhmässä voidaan käyttää vähemmän eläimiä. Kussakin an ­
nosryhmässä olisi hyvä käyttää yhtä tai kahta eläintä. Kaikkia hiiriä tark ­
kaillaan päivittäin koko elimistöön kohdistuvan toksisuuden tai applikaa ­
tiokohdassa esiintyvän paikallisen ärsytyksen kliinisten merkkien havaitse ­
miseksi. Eläinten paino kirjataan ennen testaamista ja ennen eläinten lopet ­
tamista (päivä 6). Kunkin hiiren molemmista korvista tutkitaan eryteeman merkit, ja ne pisteytetään taulukon 1 mukaisesti (25). Korvan paksuus mi ­
tataan paksuusmittarilla (esimerkiksi digitaalisella mikrometrillä tai Peacock 
Dial -paksuusmittarilla) päivänä 1 (ennen annosta), päivänä 3 (noin 48 tunnin kuluttua ensimmäisestä annoksesta) ja päivänä 6. Päivänä 6 korvan paksuus voidaan myös määrittää mittaamalla korvan lävistämiseen tarvittava 
massa sen jälkeen, kun eläimet on lopetettu humaanisti. Jos eryteema on 
erittäin voimakas ja/tai korvan paksuus on kasvanut vähintään 25 prosenttia minä tahansa mittauspäivänä, paikallinen ihoärsytys pisteytetään arvolla ≥ 3 
(26) (27). Suurin varsinaiseen LLNA-tutkimukseen valittava annos on testiä 
edeltävän konsentraatiosarjan (katso 18 kohta) suurin annos, joka ei enää 
aiheuta koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja/tai liian voimakasta pai ­
kallista ihoärsytystä.
 
Taulukko 1  
Eryteemapisteytys  
Havainto Pisteet  
Ei eryteemaa 0 
Hyvin lievä eryteema (tuskin havaittava) 1 Selkeästi erottuva eryteema 2 
Keskivakava–vakava eryteema 3 
Vakava eryteema (voimakas punoitus)–karsta, joka estää ery ­
teeman pisteytyksen 4
 
23. Käsiteltyjen hiirten korvien paksuuden tilastollisesti merkittävää yli 25 
prosentin kasvua (26) (27) kontrollihiiriin verrattuna on käytetty myös 
LLNA-menetelmän ärsyttävien aineiden määrittämisessä (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Vaikka tilastollisesti merkittävää paksuuden kasvua voi esiintyä silloinkin, kun korvan paksuus on alle 25 prosenttia, sen 
ei katsota liittyvän erityisesti erittäin voimakkaaseen ärsytykseen (30) 
(32) (33) (34).
 
24. Seuraavat kliiniset havainnot voivat yhdennetyn arvioinnin osana olla osoi ­
tuksena koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta (35) (36) ja voivat 
näin ollen olla osoituksena suurimmasta annostasosta, jota varsinaisessa LLNA-menetelmässä voidaan käyttää: muutokset hermoston toiminnassa (esimerkiksi karvojen jäykistyminen, ataksia, vapina ja kouristukset); muu ­
tokset käyttäytymisessä (esimerkiksi aggressiivisuus, muutokset turkin hoi ­
dossa, aktiivisuustason huomattava muuttuminen); muutokset hengityksessä (hengityksen säännöllisyyden ja syvyyden muutokset, kuten hengenahdistus, hengen haukkominen ja rahina) sekä muutokset ravinnon ja veden kulutuk ­
sessa. Arvioinnissa on huomioitava myös letargian ja/tai passiivisuuden 
merkit, vähäistä tai hetkittäistä kipua suuremman kivun ja kärsimyksen mahdolliset kliiniset merkit tai eläimen painon yli viiden prosentin laske ­
minen päivästä 1 päivään 6 sekä kuolleisuus. Kuolevat eläimet, selvästi 
kärsivät eläimet tai eläimet, jotka osoittavat selviä merkkejä voimakkaasta 
ja jatkuvasta kärsimyksestä, on lopetettava humaanisti (37).
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 608
 
Varsinaisen tutkimuksen aikataulu  
25. Määrityksen aikataulu on seuraava:  
— Päivä 1:  Määritetään ja kirjataan kunkin koe-eläimen paino ja tehdään 
ja kirjataan mahdolliset kliiniset havainnot. Kunkin korvan takaosaan applikoidaan 25 μl testiaineen, kantaja-aineen tai positiivisen kontrolli ­
kemikaalin (jota käytetään aina tai jota on käytetty hiljattain, laborato ­
rion toimintatavan mukaisesti, ottaen huomioon 11–15 kohdat) sopivaa laimennosta.
 
— Päivät 2 ja 3:  Toistetaan päivänä 1 toteutettu applikointimenettely.  
— Päivät 4 ja 5:  Ei käsittelyä.  
— Päivä 6:  Kirjataan kunkin eläimen paino. Ruiskutetaan 250 μl steriiliä 
fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), joka sisältää 20 μCi (7,4 × 10  5 
Bq) tritiumilla merkittyä (  3 H)-metyylitymidiiniä, kaikkiin testi- ja kont ­
rolliryhmän hiiriin häntävaltimon kautta. Vaihtoehtoisesti ruiskutetaan 250 μl steriiliä PBS:ää, joka sisältää 2 μCi (7,4 × 10
 4 Bq)  125 I-jodide­
oksiuridiinia ja 10  -5 -molaarista fluorideoksiuridiinia, kaikkiin hiiriin 
häntävaltimon kautta. Viiden tunnin (5 h) kuluttua eläimet lopetetaan 
humaanisti. Kummastakin korvasta leikataan irti dreneeraavat korvaleh ­
den imusolmukkeet, ja kunkin eläimen imusolmukkeet upotetaan PBS:ään (vain yhden yksilön näytteet); vaihtoehtoisesti kummankin 
korvan imusolmukkeet voidaan leikata ja koko koeryhmän imusolmuk ­
keet voidaan upottaa PBS:ään (käsittelyryhmän näytteet yhdistetään). Imusolmukkeiden tunnistukseen ja leikkaamiseen liittyvät yksityiskoh ­
dat ja kaaviot esitetään lähteessä (12). Paikallista ihovastetta voidaan 
seurata varsinaisessa tutkimuksessa tarkemmin niin, että tutkimussuun ­
nitelmaan sisällytetään täydentäviä parametreja, kuten korvan eryteeman pisteytys tai korvan paksuutta koskevat mittaustulokset (saadaan joko paksuusmittarilla tai ruumiinavauksen yhteydessä tehtävillä korvan lä ­
vistämiseen tarvittavan massan mittauksilla).
 
Solususpensioiden valmistus  
26. Yksittäisten eläinten imusolmukeparien soluista tai testiryhmien yhdiste ­
tyistä imusolmukesoluista valmistetaan suspensio, jossa kaikki solut ovat 
irrallaan muista (yksisolususpensio), mekaanisesti hajottamalla solukertymät painamalla ne varovaisesti ruostumattoman terässeulan läpi (silmäkoko 200 μm) tai käyttämällä muuta yksisolususpension valmistamiseksi hyväksyttyä 
tekniikkaa. Imusolmukesolut pestään kahdesti runsaalla PBS:llä, ja DNA 
saostetaan 5-prosenttisessa trikloorietikkahapossa 4 °C:n lämpötilassa 18 tunnin ajan (3). Pelletit voidaan joko suspendoida uudelleen 1 ml:aan trik ­
loorietikkahappoa ja siirtää tuikeputkiin, joissa on 10 ml tuikenestettä
 3 H- 
laskentaa varten, tai siirtää suoraan gammalaskentaputkiin  125 I-laskentaa 
varten.  
Solujen proliferaation (inkorporoituneen radioaktiivisuuden) määritys  
27. 3 H-metyylitymidiinin inkorporoituminen mitataan β-tuikelaskennalla hajoa ­
misina minuutissa (DPM).  125 I-jodideoksiuridiinin inkorporoituminen mita ­
taan  125 I-laskennalla ja ilmoitetaan niin ikään DPM-arvona. Inkorporoitumi ­
nen ilmoitetaan DPM:nä joko eläintä kohti tai testiryhmää kohti.  
Vähemmän koe-eläimiä käyttävä LLNA-menetelmä  
28. Vaihtoehtoista, vähemmän koe-eläimiä käyttävää rLLNA-menetelmää (16) 
(17) (18) voidaan soveltaa tietyissä tapauksissa, joissa ihoherkistyspotentiaa ­
lin negatiivinen oletus on sääntelysyistä vahvistettava, edellyttäen että kaik ­
kia muita tässä testimenetelmässä kuvattuja LLNA-menettelyn vaatimuksia noudatetaan. rLLNA-menettelyn käyttö on perusteltava selvästi ja tieteelli ­
sesti ennen menetelmän käyttöä. Jos tulos on positiivinen tai epäselvä, 
löydöksen tulkitsemiseksi tai selventämiseksi voidaan tarvita täydentäviä 
testejä.
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 609
 
29. LLNA- ja rLLNA-testimenetelmien ainoana erona on erilainen annosryh ­
mien määrä, minkä vuoksi rLLNA-menetelmä ei anna tietoja annosvastees ­
ta. Näin ollen rLLNA-menettelyä ei pidä käyttää, jos annosvastetta koskevia tietoja tarvitaan. Kuten useisiin annoksiin perustuvassa LLNA-menettelyssä, myös rLLNA-menettelyssä arvioitavan testiaineen konsentraationa on käy ­
tettävä suurinta konsentraatiota, joka ei vielä aiheuta hiiressä koko elimis ­
töön kohdistuvaa toksisuutta ja/tai liian voimakasta ihoärsytystä (katso 18 kohta).
 
HAVAINNOT  
Kliiniset havainnot  
30. Kustakin hiirestä on päivittäin havainnoitava huolellisesti mahdolliset klii ­
niset merkit joko annostelualueen paikallisesta ärsytyksestä tai koko elimis ­
töön kohdistuvasta toksisuudesta. Kaikki havainnot kirjataan järjestelmälli ­
sesti erikseen kustakin hiirestä. Seurantasuunnitelmissa on esitettävä myös perusteet, joiden avulla voidaan nopeasti tunnistaa hiiret, joissa havaitaan merkkejä koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta, erittäin voimak ­
kaasta paikallisesta ihoärsytyksestä tai ihosyövyttävyydestä, jotta ne voitai ­
siin lopettaa (37).
 
Ruumiinpainot  
31. Kuten 25 kohdassa todetaan, kukin eläin on punnittava erikseen testin 
alussa ja aikataulun mukaisesti humaanin lopettamisen yhteydessä.  
TULOSTEN LASKEMINEN  
32. Kunkin käsittelyryhmän tulokset ilmoitetaan stimulaatioindeksinä (SI). Yk ­
silönäytteistä SI-arvo saadaan jakamalla kunkin testiaineryhmän ja positii ­
visen kontrolliryhmän hiirikohtaisista DPM-arvoista laskettu keskiarvo liuo ­
tin/kantaja-aineryhmän vastaavalla tuloksella. Kantaja-aineella käsiteltyjen kontrolliryhmien SI:n keskiarvo on 1. Ryhmänäytteistä SI-arvo saadaan jakamalla kunkin testiryhmän yhdistetty radioaktiivinen inkorporoituminen 
kantaja-aineryhmän yhdistetyllä inkorporoitumisella, jolloin saadaan SI:n 
keskiarvo.
 
33. Tulos katsotaan positiiviseksi, kun SI ≥ 3. Päätettäessä, katsotaanko rajatu ­
los positiiviseksi, voidaan myös käyttää annosvasteen voimakkuutta, tilas ­
tollista merkitsevyyttä sekä liuottimen/kantaja-aineen ja positiivisen kontrol ­
likemikaalin vasteiden yhdenmukaisuutta (4) (5) (6).  
34. Jos saatuja tuloksia pitää selventää, huomioon on otettava testiaineen eri ­
laiset ominaisuudet, mukaan luettuina mahdolliset rakenteelliset yhtäläisyy ­
det tunnettuihin ihoherkistystä aiheuttaviin aineisiin, sen hiirelle mahdolli ­
sesti aiheuttama erittäin voimakas paikallinen ihoärsytys ja havaitun annos ­
vasteen luonne. Näitä ja muita huomionarvoisia seikkoja käsitellään yksi ­
tyiskohtaisesti lähteessä (7).  
35. Kun radioaktiivisuuden mittaustuloksia kerätään erikseen kustakin hiirestä, 
voidaan niiden perusteella analysoida tilastollisesti mahdollista annosvastetta 
ja sen tasoa. Tilastollisessa arvioinnissa voidaan myös arvioida annosvas ­
teen voimakkuutta ja tehdä asianmukaisesti mukautettuja vertailuja testiryh ­
millä (esimerkiksi pareittain annoksen saaneen ryhmän vertailu 
kantaja-ainekontrolliryhmään, kun kontrolli on tehnyt samanaikaisesti). Ti ­
lastoanalyyseissä voidaan käyttää esimerkiksi lineaarista regressiota tai Wil ­
liamin testiä, joilla arvioidaan annos-vastesuuntauksia, sekä Dunnettin testiä, jolla vertaillaan pareja. Tutkijan on otettava asianmukaisen tilastollisen ana ­
lyysimenetelmän valinnassa huomioon varianssien mahdolliset erot ja muut 
vastaavat ongelmat, jotka saattavat edellyttää määritystulosten muuntamista tai non-parametrista tilastollista analyysia. Joka tapauksessa tutkija voi jou ­
tua tekemään SI-laskelmia ja tilastoanalyyseja siten, että mukana on tai ei 
ole tiettyjä määrityskohtia koskevia tietoja (ns. käyrän ulkopuolella olevat 
tulokset).
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 610
 
MITTAUSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
Mittaustulokset  
36. Mittaustulokset on esitettävä taulukkona. Yksilönäytteiden osalta esitetään 
eläinkohtaiset DPM-arvot, ryhmän eläinkohtaisen DPM-arvon keskiarvo, 
siihen liittyvä virhe (esimerkiksi keskihajonta tai keskiarvon keskivirhe) sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen SI vastaavaan kantaja-ainekontrolliryhmään verrattuna. Ryhmänäytteiden osalta esitetään 
keskimääräinen DPM / DPM:n mediaani sekä kunkin annosryhmän keski ­
määräinen SI samanaikaisesti käsiteltyyn kantaja-ainekontrolliryhmään ver ­
rattuna.
 
Testiraportti  
37. Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:  
Testi- ja kontrolliaineet  
— tunnistetiedot (esimerkiksi CAS- ja EC-numerot, jos tiedossa; alkuperä, 
puhtaus, tunnetut epäpuhtaudet, eränumero),  
— fysikaalinen olomuoto ja fysikaaliskemialliset ominaisuudet (esimerkiksi 
haihtuvuus, stabiilisuus, liukoisuus),  
— jos kyseessä on seos, sen koostumus ja ainesosien suhteelliset osuudet.  
Liuotin/kantaja-aine  
— tunnistetiedot (puhtaus, tarvittaessa konsentraatio, käytetty tilavuus),  
— perustelut kantaja-aineen valinnalle.  
Koe-eläimet  
— CBA-hiirten alkuperä,  
— eläinten mikrobiologinen tila, jos se on tiedossa,  
— eläinten määrä ja ikä,  
— eläinten alkuperä, koe-eläintilat, ruokavalio ja niin edelleen.  
Testiolosuhteet  
— tiedot testiaineen valmistelusta ja annostelusta,  
— perustelut annostasojen valinnalle (mukaan luettuina kartoitustestin tu ­
lokset, jos sellainen on tehty),  
— käytetyt kantaja- ja testiaineiden konsentraatiot ja annostellun testiaineen 
kokonaismäärä,  
— tiedot ravinnon ja veden laadusta (mukaan luettuina ruokavalion tyyp ­
pi/alkuperä, veden alkuperä),  
— tiedot käsittely- ja näytteenottoaikatauluista,  
— toksisuuden mittausmenetelmät,  
— tutkimusten positiivisuuden tai negatiivisuuden arviointiperusteet,  
— tiedot menettelystä poikkeamisesta ja selvitys siitä, miten poikkeaminen 
vaikuttaa tutkimussuunnitelmaan ja tuloksiin.  
Luotettavuuden tarkistus  
— yhteenveto viimeisimmän luotettavuustarkistuksen tuloksista, mukaan 
luettuina tiedot käytetystä testiaineesta, konsentraatiosta ja kantaja-aineesta,
 
— testauslaboratorion samanaikaisesti tehtyjen ja/tai aiemmin tehtyjen po ­
sitiivisten ja samanaikaisesti tehtyjen negatiivisten kontrollien tulokset,  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 611
 
— jos määrityksessä ei ollut samanaikaisesti tehtyä positiivista kontrollia, 
on annettava viimeisimmän positiivisen kontrollin päivämäärä ja labo ­
ratorioraportti sekä yksityiskohtainen selvitys laboratorion aiemmista positiivisista kontrollitiedoista, joiden perusteella positiivista kontrollia ei tehty.
 
Tulokset  
— kunkin hiiren paino annostelun alussa ja aikataulun mukaisen lopetta ­
misen yhteydessä sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen virhetermi ja siihen liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta tai keskiarvon keskivirhe),
 
— toksisuuden ilmeneminen ajan funktiona ja toksisuuden merkit, mukaan 
luettuna annostelualueen ihoärsytys, jos sellaista esiintyy, erikseen kul ­
lekin eläinyksilölle,  
— taulukko kunkin hiiren (yksilönäytteet) tai kunkin käsittelyryhmän (ryh ­
mänäytteet) keskimääräisistä DPM- ja SI-arvoista / DPM:n ja SI:n me ­
diaaneista,  
— kunkin käsittelyryhmän hiirikohtaisen DPM-arvon keskimääräinen vir ­
hetermi ja siihen liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta ja keski ­
arvon keskivirhe) sekä käyrän ulkopuolella olevien vasteiden analyysin 
tulokset kullekin käsittelyryhmälle käytettäessä yksittäisiä eläimiä,  
— testiaineella ja kontrolliaineella käsitellyille ryhmille yksilönäytteiden 
yhteydessä laskettu SI ja asianmukaisesti määritetty vaihteluväli, jossa otetaan huomioon eläinten välinen vaihtelu,
 
— annos-vastesuhde,  
— tarvittaessa tilastolliset analyysit.  
Tulosten pohdinta  
— tulosten lyhyt kommentointi, annos-vasteanalyysi ja tarvittaessa tilastol ­
linen analyysi sekä johtopäätös siitä, onko testiainetta pidettävä ihoher ­
kistystä aiheuttavana.  
LÄHDELUETTELO  
(1) OECD (2002). Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Guid ­
eline for the Testing of Chemicals No 429. Pariisi. Saatavilla osoitteessa 
http://www.oecd.org/env/testguidelines  
(2) Kimber, I. ja Basketter, D. A. (1992). The murine local lymph node assay; 
collaborative studies and new directions: A commentary.  Food Chem. To ­
xicol . 30, s. 165–169.  
(3) Kimber, I., Dearman, R. J., Scholes, E. W. ja Basketter, D. A. (1994). The 
local lymph node assay: developments and applications.  Toxicol . 93, s. 
13–31.  
(4) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R. J., Gerberick, G. F., Ryan, C. A., 
Basketter, D. A., Lea, L., House, R. V., Ladies, G. S., Loveless, S. E. ja 
Hastings, K. L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of 
topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise.  J. Toxicol. Environ. Health  53, s. 563–79.
 
(5) Chamberlain, M. ja Basketter, D. A. (1996). The local lymph node assay: 
status of validation.  Food Chem. Toxicol . 34, s. 999–1002.  
(6) Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Kimber, I. ja Loveless, S. E. (1996). The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests.  Food Chem. Toxicol . 34, s. 985–997.
 
(7) Basketter, D. A., Gerberick, G. F. ja Kimber, I. (1998). Strategies for 
identifying false positive responses in predictive sensitisation tests.  Food 
Chem. Toxicol . 36, s. 327–33.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 612
 
(8) Van Och, F. M. M., Slob, W., De Jong, W. H., Vandebriel, R. J. ja Van 
Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncer ­
tainty margins.  Toxicol . 146, s. 49–59.
 
(9) Dean, J. H., Twerdok, L. E., Tice, R. R., Sailstad, D. M., Hattan, D. G. ja 
Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node 
assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific 
peer review panel.  Reg. Toxicol. Pharmacol  34, s. 258–273.  
(10) Haneke, K. E., Tice, R. R., Carson, B. L., Margolin, B. H. ja Stokes, W. S. 
(2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol  34, s. 274–286.
 
(11) Sailstad, D. M., Hattan, D., Hill, R. N. ja Stokes, W. S. (2001). ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process.  Reg. Toxicol. Pharmacol  34, s. 249–257.  
(12) ICCVAM (2009). Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay. NIH-julkaisunumero 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoit ­
teessa http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNA ­
PerfStds.pdf
 
(13) OECD (1992).  Skin Sensitisation . OECD Guideline for Testing 
of Chemicals No 406. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines
 
(14) OECD (2005).  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , En­
vironment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assess ­
ment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14. OECD, Pariisi. Saatavilla osoit ­
teessa http://www.oecd.org/env/testguidelines  
(15) Dearman, R. J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D. A. ja 
Kimber, I. (1998). Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde.  J. Appl. Toxicol . 18, s. 281–284.
 
(16) Kimber, I., Dearman, R. J., Betts, C. J., Gerberick, G. F., Ryan, C. A., 
Kern, P. S., Patlewicz, G. Y. ja Basketter, D. A. (2006). The local lymph 
node assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal 
requirements?  Contact Dermatitis  54, s. 181–185.  
(17) ESAC (2007). Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay 
(rLLNA). Euroopan komission pääosasto – yhteinen tutkimuskeskus, kulut ­
tajien terveyden ja kuluttajansuojan laitos, Euroopan vaihtoehtoisten mene ­
telmien validointikeskus, huhtikuu 2007. Saatavilla osoitteessa http://ec ­
vam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf  
(18) ICCVAM (2009). The Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. 
The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Met ­
hod Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Poten ­
tial of Chemicals and Products. NIH-julkaisunumero 09-6439. Research 
Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. 
Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/  
(19) ICCVAM (1999). The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method 
for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Com ­
pounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordina ­
ted by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alter ­
native Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Intera ­
gency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH-julkaisunumero 99-4494. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla 
osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llna ­
rep.pdf
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 613
 
(20) Kreiling, R., Hollnagel, H. M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M. S., Griem, 
P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. ja Wendel, A. (2008). 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT).  Food Chem. Toxicol.  46, s. 1896–1904.
 
(21) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J. C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. ja Mehling, A. 
(2009). Application of a weight of evidence approach to assessing discor ­
dant sensitisation datasets: implications for REACH.  Reg. Toxicol. Pharma ­
col 55, s. 90–96.  
(22) ICCVAM (2009). ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of 
the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other 
Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions. 
NIH-julkaisunumero 10-7512. Research Triangle Park, NC: National Ins ­
titute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/  
(23) ILAR (1996). Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7. painos. Washington, DC: 
National Academies Press.  
(24) McGarry, H. F. (2007). The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH.  Toxicol.  238, s. 71–89.  
(25) OECD (2002). Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 404. Pariisi, Ranska. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/docu ­
ment/40/0,3343,en_2649_34377_3 7051368_1_1_1_1,00.html
 
(26) Reeder, M. K., Broomhead, Y. L., DiDonato, L. ja DeGeorge, G. L. (2007). 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances.  Toxicologist  96, s. 235.  
(27) ICCVAM (2009). Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Backg ­
round Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf
 
(28) Hayes, B. B., Gerber, P. C., Griffey, S. S. ja Meade, B. J. (1998). Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice. Drug. Chem.  Toxicol.  21, s. 195–206.  
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H. C., Ruzicka, T., Ahr, 
H. J., Lehmann, P. ja Vohr, V. W. (1998). An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions.  To­
xicol. Appl. Pharmacol . 153, s. 83–94.
 
(30) Woolhiser, M. R., Hayes, B. B. ja Meade, B. J. (1998). A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals.  Toxicol. Meth.  8, s. 245–256.  
(31) Hayes, B. B. ja Meade, B. J. (1999). Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods.  Drug. Chem. Toxicol . 22, s. 491–506.  
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A. O., van Love ­
ren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. ja 
Vohr, H. W. (2005). A European inter-laboratory validation of alternative 
endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol . 212, s. 
60–68.  
(33) Vohr, H. W. ja Ahr, H. J. (2005). The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol.  79, s. 721–728.  
(34) Patterson, R. M., Noga, E. ja Germolec, D. (2007). Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract.  Environ. Health Perspect . 115, s. 
1023–1028.  
(35) OECD (1987).  Acute Dermal Toxicity , OECD Guideline for Testing of 
Chemicals No 402. Pariisi, Ranska. Saatavilla osoitteessa 
http://www.oecd.org/env/testguidelines  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 614
 
(36) ICCVAM (2009). Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro 
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acute ­
tox/Tox_workshop.htm
 
(37) OECD (2000).  Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph, 
Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7. OECD, 
Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 615
 
Lisäys 1  
Suoritusvaatimukset ehdotettujen samanlaisten tai mukautettujen 
ihoherkistyksen LLNA-testimenetelmien arviointia varten  
JOHDANTO  
1. Suoritusvaatimusten tarkoituksena on antaa arviointiperusteet, joiden avulla 
voidaan määrittää, ovatko uudet testimenetelmät – niin yksinoikeudelliset 
(eli tekijänoikeudelliset, tavaramerkityt tai rekisteröidyt) kuin muut kuin yksinoikeudelliset – riittävän tarkkoja ja luotettavia tiettyjä testaustarkoituk ­
sia varten. Näitä validoituihin ja hyväksyttyihin testimenetelmiin perustuvia 
suoritusvaatimuksia voidaan käyttää muiden samanlaisten menetelmien (niin 
sanottujen me-too-testien) luotettavuuden ja täsmällisyyden arviointiin, kun kyseiset menetelmät perustuvat samanlaisiin tieteellisiin periaatteisiin ja niillä mitataan tai ennakoidaan samaa biologista tai toksista vaikutusta (14).
 
2. Ennen menetelmien muuttamisen (eli hyväksytyn testimenetelmän ehdotetun 
mahdollisen parantamisen) hyväksymistä on arvioitava ehdotettujen muu ­
tosten vaikutus testin suorituskykyyn ja se, missä määrin kyseiset muutokset vaikuttavat validointimenettelyn muita osia varten saatavilla oleviin tietoi ­
hin. Ehdotettujen muutosten määrästä ja luonteesta, saaduista mittaustulok ­
sista ja kyseisiä muutoksia tukevasta asiakirja-aineistosta riippuen menetel ­
män muutoksille on tehtävä uudelle testille kuvatun kaltainen validointime ­
nettely tai tarvittaessa luotettavuuden ja merkityksellisyyden rajattu arviointi 
käyttämällä vakiintuneita suoritusvaatimuksia (14).
 
3. Tähän testaustarkoitukseen käytettäväksi ehdotettujen samanlaisten tai mu ­
kautettujen menetelmien luotettavuus ja tarkkuus olisi määritettävä käyttä ­
mällä kemikaaleja, jotka edustavat kattavasti kaikkia LLNA:n pisteytysarvo ­
ja. Eläinten tarpeettoman käytön välttämiseksi suositellaan painokkaasti, että 
mallien kehittäjät kuulevat asiasta vastaavia viranomaisia ennen validointi ­
tutkimusten käynnistämistä suoritusvaatimusten ja tässä testimenetelmässä esitettyjen ohjeiden mukaisesti.
 
4. Nämä suoritusvaatimukset perustuvat Yhdysvaltain US-ICCVAM:in, EU:n 
EC-ECVAM:in ja Japanin JaCVAM:in yhdenmukaistettuihin suoritusvaa ­
timuksiin (12), joilla arvioidaan LLNA:n samanlaisten tai mukautettujen versioiden pätevyyttä. Suoritusvaatimukset koskevat testimenetelmän olen ­
naisia osia, suositeltuja vertailukemikaaleja ja tarkkuus- ja luotettavuusvaa ­
timuksia, jotka ehdotetun menetelmän olisi saavutettava tai ylitettävä.
 
I. Olennaiset testimenetelmän osat  
5. Jotta samanlainen tai mukautettu LLNA-menetelmä vastaisi toiminnallisesti 
ja mekaanisesti LLNA:ta jotta varmistettaisiin, että sillä mitataan samaa 
biologista vaikutusta, testausprotokollassa on oltava seuraavat osat:  
— Testiainetta on applikoitava paikallisesti hiiren molempiin korviin.  
— Lymfosyyttien proliferaatio on mitattava niissä imusolmukkeissa, jotka 
dreneeraavat alueelta, johon testiaine on annosteltu.  
— Lymfosyyttien proliferaatio on mitattava ihoherkistyksen induktiov ­
aiheessa.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 616
 
— Testiaineiden suurimpana valittuna annoksena on käytettävä suurinta 
konsentraatiota, joka ei vielä aiheuta hiiressä koko elimistöön kohdistu ­
vaa toksisuutta ja/tai liian voimakasta paikallista ihoärsytystä. Positii ­
visten vertailukemikaalien suurimpana annoksena on käytettävä annosta, joka vastaa vähintään vastaavien vertailukemikaalien LLNA EC3 -ar ­
voja (katso taulukko 1) ilman, että se aiheuttaa hiiressä koko elimistöön 
kohdistuvaa toksisuutta ja/tai liian voimakasta paikallista ihoärsytystä.
 
— Jokaiseen tutkimukseen on sisällytettävä samaan aikaan määritetty 
kantaja-ainekontrolliryhmä ja tarvittaessa myös samaan aikaan mää ­
ritetty positiivinen kontrollikemikaali.  
— Kussakin annosryhmässä on oltava vähintään neljä eläintä.  
— Tietoja voidaan kerätä joko eläinkohtaisesti tai ryhmäkohtaisesti.  
Jos kaikkia vaatimuksia ei täytetä, suoritusvaatimuksilla ei voida validoida 
samanlaista tai mukautettua menetelmää.  
II. Vertailukemikaalien vähimmäisluettelo  
6. Yhdysvaltain US-ICCVAM:in, EU:n EC-ECVAM:in ja Japanin JaC ­
VAM:in yhdenmukaistetuissa suoritusvaatimuksissa (12) on määritetty 18 
pakollista vähimmäisvertailukemikaalia ja neljä valinnaista vertailukemikaa ­
lia (aineita, joilla saadaan LLNA-menetelmässä aikaan vääriä positiivisia tai vääriä negatiivisia tuloksia ihmis- ja marsutestien tuloksiin verrattuna (B.6 tai OECD:n testiohje 406) (13) ja joiden avulla voidaan näin ollen osoittaa 
LLNA-menetelmää vastaava tai parempi suorituskyky), jotka on sisällytetty 
LLNA-menetelmän suoritusvaatimuksiin. Näiden kemikaalien valinnassa on sovellettu seuraavia perusteita:
 
— Vertailukemikaalien luettelo edustaa niitä ainetyyppejä, joiden ihoärsy ­
tyspotentiaalia yleensä testataan, ja kaikkia niitä vasteita, joita 
LLNA-menetelmällä voidaan mitata tai ennustaa.  
— Aineiden kemiallinen rakenne on määritetty täsmällisesti.  
— LLNA-menetelmän tiedot marsutesteistä (B.6; OECD:n testiohje 406) 
(13) ja mahdolliset tiedot ihmiskokeista ovat saatavilla kunkin aineen osalta.
 
— Aineet ovat helposti saatavilla kaupallisista lähteistä.  
Suositellut vertailukemikaalit luetellaan taulukossa 1. Ehdotetuilla vertailu ­
kemikaaleilla tehtävät tutkimukset on arvioitava siinä kantaja-aineessa, joi ­
den kanssa ne luetellaan taulukossa 1. Jos luettelossa mainittua ainetta ei ole saatavilla, muita edellä mainitut valintaperusteet täyttäviä aineita voidaan 
käyttää asianmukaisin perusteluin.
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 617
 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 618
 ▼M3 
Taulukko 1  
Suositellut vertailukemikaalit LLNA-menetelmän suoritusvaatimuksia varten  
Numero Kemikaalit (  1 ) CAS-nro Olomuoto K-aine (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x EC3 Todellinen 
EC3-vaihte ­
luväli LLNA vs. M LLNA vs. 
ihminen  
1 5-Kloori-2-metyyli-4-isotiatsolin-3-oni (CMI) / 
2-metyyli-4-isotiatsolin-3-oni (MI) (  5 ) 26172-55-4/ 
2682-20-4 Nest. DMF 0,009 1 0,0045–0,018 EL +/+ +/+ 
2 DNCB 97-00-7 Kiint. AOO 0,049 15 0,025–0,099 0,02–0,09 ­
4 +/+ +/+ 
3 4-Fenyleenidiamiini 106-50-3 Kiint. AOO 0,11 6 0,055–0,22 0,07–0,16 +/+ +/+ 
4 Kobolttikloridi 7646-79-9 Kiint. DMSO 0,6 2 0,3–1,2 0,4–0,8 +/+ +/+ 5 Isoeugenoli 97-54-1 Nest. AOO 1,5 47 0,77–3,1 0,5–3,3 +/+ +/+ 6 2-Merkaptobentsotiatsoli 149-30-4 Kiint. DMF 1,7 1 0,85–3,4 EL +/+ +/+ 7 Sitraali 5392-40-5 Nest. AOO 9,2 6 4,6–18,3 5,1–13 +/+ +/+ 
8 HCA 101-86-0 Nest. AOO 9,7 21 4,8–19,5 4,4–14,7 +/+ +/+ 
9 Eugenoli 97-53-0 Nest. AOO 10,1 11 5,05–20,2 4,9–15 +/+ +/+ 
10 Fenyylibentsoaatti 93-99-2 Kiint. AOO 13,6 3 6,8–27,2 1,2–20 +/+ +/+ 11 Kanelialkoholi 104-54-1 Kiint. AOO 21 1 10,5–42 EL +/+ +/+ 12 Imidatsolidinyyliurea 39236-46-9 Kiint. DMF 24 1 12–48 EL +/+ +/+ 13 Metyylimetakrylaatti 80-62-6 Nest. AOO 90 1 45–100 – +/+ +/+ 
14 Klooribentseeni 108-90-7 Nest. AOO 25 1 ES ES –/– –/ (*) 
15 Isopropanoli 67-63-0 Nest. AOO 50 1 ES ES –/– –/+
 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 619
 ▼M3 
Numero Kemikaalit (  1 ) CAS-nro Olomuoto K-aine (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x EC3 Todellinen 
EC3-vaihte ­
luväli LLNA vs. M LLNA vs. 
ihminen  
16 Maitohappo 50-21-5 Nest. DMSO 25 1 ES ES –/– –/ (*) 
17 Metyylisalisylaatti 119-36-8 Nest. AOO 20 9 ES ES –/– –/– 18 Salisyylihappo 69-72-7 Kiint. AOO 25 1 ES ES –/– –/– 
Valinnaiset aineet, joilla osoitetaan suorituskyvyn paraneminen LLNA-menetelmään verrattuna 
19 Natriumlauryylisulfaatti 151-21-3 Kiint. DMF 8,1 5 4,05–16,2 1,5–17,1 +/– +/– 20 Etyleeniglykolidimetakrylaatti 97-90-5 Nest. MEK 28 1 14–56 EL +/– +/+ 
21 Ksyleeni 1330-20-7 Nest. AOO 95,8 1 47,9–100 EL +/ (**) +/– 
22 Nikkelikloridi 7718-54-9 Kiint. DMSO 5 2 ES ES –/+ –/+
 
Lyhenteet: AOO = asetoni:oliiviöljy (4:1 v/v); CAS-nro = Chemical Abstracts Service Number; DMF =  N,N -dimetyyliformamidi; DMSO = dimetyylisulfoksidi; DNCB = 2,4-dinitroklooribentseeni; EC3 = arvioitu konsentraatio, 
jolla saadaan aikaan stimulaatioindeksi 3; M = marsutestin tulos (B.6 tai OECD:n testiohje 406) (12); HCA = heksyylikanelialdeh ydi; Nest. = neste; LLNA = hiirelle tehtävän paikallisen imusolmukemääritysmenetelmän tulos 
(B.42 tai OECD:n testiohje 429) (1); MEK = metyylietyyliketoni; ES = ei sovelleta, koska stimulaatioindeksi < 3; EL = ei lasket tu, koska tiedot on saatu yhdestä tutkimuksesta; Kiint. = kiinteä; K-aine = testissä käytettävä 
kantaja-aine. 
(*) Oletetaan, että ei aiheuta ihoherkistystä ihmisillä, koska kliinisten lapputestien tuloksia ei ole saatavilla, sitä ei ole sisällytetty lapputestipaketin allergeeniksi eikä ihmisten herkistymisestä ole saatavilla tapausselvityksiä. 
(**) Marsutestien tietoja ei ole saatavilla. 
( 1 ) Kemikaalit on valmistettava päivittäin, paitsi jos säilyvyys on osoitettu stabiliteettitutkimuksilla. 
( 2 ) Koska erilaiset kantaja-aineet voivat vaikuttaa LLNA-menetelmän suorituskykyyn, kullekin vertailukemikaalille suositeltua kan taja-ainetta on käytettävä (24) (32). 
( 3 ) Keskiarvo, jos saatavilla on useampi kuin yksi EC3-arvo. Negatiivisten aineiden (stimulaatioindeksi < 3) osalta esitetään suu rin testattu konsentraatio. 
( 4 ) Niiden LLNA-tutkimusten määrä, joista tiedot on saatu. 
( 5 ) Kaupallisesti saatavilla Kathon CG:nä (CAS-nro 55965-84-9), joka on CMI:n ja MI:n seos (3:1). Kunkin osan suhteelliset konsen traatiot vaihtelevat välillä 1,1–1,25 % (CMI) ja 0,3–0,45 % (MI). Inaktiivisina osina ovat 
magnesiumsuolat (21,5–24 %) ja kuparinitraatti (0,15–0,17 %), ja muu osa valmisteesta (74–77 %) on vettä. Kathon CG on helposti  saatavilla Sigma-Aldrich-yrityksen ja Rohm and Haas -yrityksen (nykyisin Dow Chemical 
Corporation) välityksellä.
 III. Määritellyt luotettavuus- ja tarkkuusvaatimukset  
7. Samanlaisen tai mukautetun LLNA-menetelmän tarkkuuden on oltava yhtä 
suuri tai suurempi kuin LLNA-suoritusvaatimuksissa määritelty tarkkuus, 
kun sitä arvioidaan käyttämällä 18:aa säädettyä vähimmäisvertailukemikaa ­
lia. Uudella tai mukautetulla menetelmällä on voitava suorittaa oikea luo ­
kittelu, joka perustuu kyllä/ei-päätökseen. Uudella tai mukautetulla mene ­
telmällä ei kuitenkaan välttämättä voida luokitella asianmukaisesti kaikkia 
säädettyjä vähimmäisvertailukemikaaleja. Jos esimerkiksi yksi heikkoa her ­
kistystä aiheuttavista aiheista luokitellaan väärin, vastaava suorituskyky voi ­
daan osoittaa esittämällä virheellisen luokittelun perustelut ja muut tarvitta ­
vat tiedot (esimerkiksi testitulokset, joilla saadaan oikea sellaisten muiden 
aineiden luokittelu, joiden fyysiset, kemialliset ja herkistävät ominaisuudet vastaavat väärin luokitellun vertailukemikaalin ominaisuuksia). Tällaisessa tilanteessa uuden tai mukautetun LLNA-testimenetelmän validoinnin tila 
arvioidaan tapauskohtaisesti.
 
Laboratorionsisäinen uusittavuus  
8. Laboratorionsisäisen uusittavuuden määrittämiseksi uutta tai mukautettua 
LLNA-menetelmää on arvioitava käyttämällä herkistävää ainetta, jonka omi ­
naisuudet on LLNA-menetelmässä määritetty hyvin. Sen vuoksi LLNA-me ­
netelmän suoritusvaatimukset perustuvat heksyylikanelialdehydillä (HCA) 
toistuvasti tehtyjen testien tulosten vaihteluun. Laboratorionsisäisen luotet ­
tavuuden arvioimiseksi HCA:n kynnyskonsentraatioarviot (ECt) on mää ­
ritettävä neljässä eri testissä niin, että testit tehdään vähintään viikon välein. 
Laboratorionsisäinen uusittavuus hyväksytään, jos laboratorion kussakin 
HCA-testissä ECt:ksi saadaan 5–20 %, mikä vastaa LLNA-menetelmässä 0,5–2,0 kertaa HCA:lle määritettyä keskimääräistä EC3:a (10 %) (katso taulukko 1).
 
Laboratorioidenvälinen uusittavuus  
9. Uuden tai mukautetun LLNA-menetelmän laboratorioidenvälistä uusitta ­
vuutta on arvioitava käyttämällä kahta herkistävää ainetta, joiden ominai ­
suudet on LLNA-menetelmässä määritetty hyvin. LLNA-menetelmän suori ­
tusvaatimukset perustuvat HCA:lla ja 2,4-dinitroklooribentseenillä (DNCB) 
eri laboratorioissa tehtyjen testien tulosten vaihteluun. ECt on määritettävä 
riippumattomasti yhden sellaisen tutkimuksen perusteella, joka tehdään vä ­
hintään kolmessa eri laboratoriossa. Laboratorioidenvälinen uusittavuus hy ­
väksytään, jos kussakin laboratoriossa ECt:ksi saadaan HCA-testissä 5–20 
% ja DNCB-testissä 0,025–0,1 %, mikä vastaa LLNA-menetelmässä 
0,5–2,0 kertaa HCA:lle määritettyä keskimääräistä EC3:a (10 %) ja DNCB:lle määritettyä EC3:a (0,05 %) (katso taulukko 1).
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 620
 
Lisäys 2  
Määritelmät  
Tarkkuus:  Testimenetelmän tulosten ja hyväksyttyjen vertailuarvojen välinen ero. 
Tarkkuus mittaa testimenetelmän suorituskykyä, ja se on yksi merkityksellisyy ­
den osatekijöistä. Tarkkuutta ja vastaavuutta (konkordanssi) käytetään usein toi ­
siaan korvaavasti tarkoittamaan testimenetelmällä saatujen oikeiden tulosten 
osuutta (14).  
Vertailuaine:  Herkistävä tai muu kuin herkistävä aine, jota käytetään testiaineen 
vertailustandardina. Vertailuaineella olisi oltava seuraavat ominaisuudet: i) luo ­
tettava alkuperä, joka pysyy samana; ii) samanlainen rakenne ja toiminta kuin 
testattavana olevalla ainetyypillä; iii) tunnetut fysikaaliskemialliset ominaisuudet, iv) sopivuutta tukevia tietoja tunnetuista vaikutuksista ja v) tunnettu voimakkuus tavoitellun vasteen vaihteluvälillä.
 
Kynnyskonsentraatioarvio (ECt):  Testiaineen arvioitu konsentraatio, jolla saadaan 
aikaan stimulaatioindeksi, joka osoittaa positiivisen vasteen.  
Kynnyskonsentraatio-3 (EC3):  Testiaineen arvioitu konsentraatio, jolla saadaan 
aikaan stimulaatioindeksi 3.  
Väärä negatiivinen:  Testiaine on testimenetelmässä määritetty väärin perustein 
negatiiviseksi tai inaktiiviseksi, vaikka se itse asiassa on positiivinen tai aktii ­
vinen.  
Väärä positiivinen:  Testiaine on testimenetelmässä määritetty väärin perustein 
positiiviseksi tai aktiiviseksi, vaikka se itse asiassa on negatiivinen tai inaktii ­
vinen.  
Vaarallisuus:  Mahdollisuus kielteiseen terveys- tai ympäristövaikutukseen. Kiel ­
teinen vaikutus edellyttää altistumista vähintään tietyllä tasolla.  
Laboratorioidenvälinen uusittavuus:  Se, missä määrin erilaiset valtuutetut labo ­
ratoriot voivat saada aikaan laadullisesti ja määrällisesti samanlaisia tuloksia käyttämällä samoja tutkimussuunnitelmia ja testaamalla samoja testiaineita. La ­
boratorioidenvälinen uusittavuus määritetään esivalidointi- ja validointimenette ­
lyssä, ja sillä osoitetaan, missä määrin testi voidaan onnistuneesti toteuttaa eri laboratorioissa (14).
 
Laboratorionsisäinen uusittavuus:  Se, missä määrin tietyn laboratorion pätevä 
henkilöstö voi saada onnistuneesti aikaan samat tulokset käyttämällä tiettyä tut ­
kimussuunnitelmaa eri ajankohtina (14).  
Me-too-testi:  Puhekielinen nimitys testimenetelmälle, joka on rakenteellisesti ja 
funktionaalisesti samanlainen kuin validoitu ja hyväksytty vertailutestimenetel ­
mää. Tällainen menetelmä voitaisiin myös validoida. Tarkoittaa samaa kuin ’sa ­
manlainen” testimenetelmä (14).  
Käyrän ulkopuolella oleva vaste:  Käyrän ulkopuolella olevalla vasteella tarkoi ­
tetaan havaintoa, joka poikkeaa merkittävästi muista populaation satunnaistetuista arvoista.
 
Suoritusvaatimukset:  Validoituun testimenetelmään perustuvat vaatimukset, joi ­
den avulla arvioidaan ehdotetun toiminnallisesti ja mekanistisesti samanlaisen testimenetelmän vertailtavuutta. Suoritusvaatimuksiin sisältyvät i) testimenetel ­
män oleelliset osat; ii) vähimmäisluettelo vertailukemikaaleista, jotka on valittu 
niiden kemikaalien joukosta, joita on käytetty osoittamaan validoidun vertailu ­
menetelmän hyväksyttävää suorituskykyä; ja iii) samanlaiset validoidusta testi ­
menetelmästä saatuihin tuloksiin perustuvat tarkkuuden ja luotettavuuden tasot, jotka ehdotetun testimenetelmän olisi osoitettava, kun sitä arvioidaan vertailu ­
aineiden vähimmäisluettelon avulla (14).
 
Yksinoikeudellinen testimenetelmä:  Testimenetelmä, jonka valmistamista ja jake ­
lua rajoitetaan patenteilla, tekijänoikeuksilla, tavaramerkeillä ynnä muilla.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 621
 
Laadunvarmistus:  Hallintomenettely, jossa testausta suorittavista henkilöistä riip ­
pumattomat henkilöt arvioivat laboratorion testausstandardien, vaatimusten ja 
kirjanpitomenettelyjen noudattamista ja tiedonsiirron tarkkuutta.  
Vertailukemikaalit:  Validointimenettelyyn valitut kemikaalit, joiden vasteet  in 
vitro  -vertailutestijärjestelmässä tai  in vivo  kyseisessä lajissa ovat tiedossa. Näi ­
den kemikaalien on vastattava niitä kemikaaliluokkia, joiden yhteydessä kyseistä 
testimenetelmää todennäköisesti käytetään, ja niiden on edustettava kaikkia niitä 
vasteita, joita testimenetelmän kohteena olevilta kemikaaleilta voidaan odottaa (voimakkaista lieviin ja negatiivisiin). Validointimenettelyn eri vaiheita sekä eri testimenetelmiä ja testitarkoituksia varten voidaan vaatia erilaisia vertailukemi ­
kaaleja (14).
 
Merkityksellisyys:  Kuvaus testin ja aineen vaikutuksen välisestä suhteesta ja siitä, 
onko testi tarkoituksenmukainen ja hyödyllinen tiettyä tarkoitusta varten. Merki ­
tyksellisyydellä tarkoitetaan sitä, missä määrin testillä voidaan tarkasti mitata tai ennustaa kyseisen aineen biologista vaikutusta. Merkityksellisyyden yhteydessä 
on huomioitava myös testimenetelmän tarkkuus (konkordanssi) (14).
 
Luotettavuus:  Testimenetelmän uusittavuus samassa laboratoriossa tai eri labora ­
torioissa pitkällä aikavälillä käytettäessä samaa menettelyä. Se arvioidaan laske ­
malla laboratorionsisäinen ja laboratorioidenvälinen uusittavuus (14).  
Ihoherkistys:  Immunologinen prosessi, joka aiheutuu herkän yksilön paikallisesta 
altistamisesta kemialliselle allergeenille, joka aiheuttaa iholla immuunivasteen, 
joka voi johtaa kosketusherkistykseen.  
Stimulaatioindeksi (SI):  Testiaineen ihoärsytyspotentiaalin arvioimiseksi laskettu 
arvo, jolla esitetään käsiteltyjen ryhmien soluproliferaation ja samaan aikaan 
kantaja-aineella käsitellyn kontrolliryhmän soluproliferaation välinen suhde.  
Testiaine (testikemikaali):  Aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä.  
Validoitu testimenetelmä:  Testimenetelmä, jolle on tehty validointitutkimukset 
sen merkityksellisyyden (myös tarkkuuden) ja luotettavuuden määrittämiseksi tiettyä tarkoitusta varten. On syytä pitää mielessä, että validoidun testimenetel ­
män suorituskyky tarkkuuden ja luotettavuuden osalta ei välttämättä ole riittävä, 
jotta se voitaisiin hyväksyä ehdotettuun tarkoitukseen (14).
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 622
 
B.43.  NEUROTOKSISUUSTUTKIMUS JYRSIJÖILLÄ  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 424 (1997).  
Tämän testimenetelmän tarkoituksena on tuottaa tiedot, joilla voidaan 
varmistaa kemikaalien mahdollinen neurotoksisuus täysikasvuisilla eläimillä tai kuvata se tarkemmin. Testi voidaan joko yhdistää tois ­
tuvan annostelun toksisuustutkimusten nykyisiin testimenetelmiin tai 
suorittaa erillisenä tutkimuksena. Tällä testimenetelmällä tehtävien 
tutkimusten suunnittelussa on suositeltavaa käyttää apuna OECD:n ohjeasiakirjaa neurotoksisuuden testistrategioista ja -menetelmistä (Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Met ­
hods (1)). Tämä on erityisen tärkeää suunniteltaessa muutoksia me ­
netelmän rutiinikäyttöön suositeltuihin havaintoihin ja testin suorituk ­
seen. Ohjeasiakirjan tarkoituksena on helpottaa muiden testien valin ­
taa tiettyissä oloissa.
 
Tällä menetelmällä ei arvioida sikiönkehitykseen liittyvää neurotok ­
sisuutta.  
1.1 JOHDANTO  
Arvioitaessa kemikaalien toksisia ominaisuuksia on tärkeää ottaa 
huomioon mahdolliset neurotoksiset vaikutukset. Toistuvan annoste ­
lun systeemisen toksisuuden testimenetelmään sisältyy jo havaintojen 
tekoa mahdollisen neurotoksisuuden seulomiseksi. Tämän testimene ­
telmän avulla voidaan suunnitella tutkimus, jolla saadaan lisätietoja toistuvan annostelun systeemisen toksisuuden tutkimuksissa havai ­
tuista neurotoksisista vaikutuksista tai varmistetaan nämä vaikutuk ­
set. Tiettyjen kemikaaliluokkien mahdollinen neurotoksisuus voi kui ­
tenkin antaa viitteitä siitä, että niiden arviointi on tarkoituksenmukai ­
sempaa tällä menetelmällä, kun mahdollista neurotoksisuutta ei ole 
aiemmin osoitettu toistuvan annostelun systeemisen toksisuuden tut ­
kimuksissa. Huomioon otettavia seikkoja ovat esimerkiksi
 
— havainnot hermostollisista oireista tai neuropatologisista vauri ­
oista muissa toksisuustutkimuksissa kuin toistuvan annostelun 
systeemisen toksisuuden tutkimuksissa tai  
— rakenteellinen sukulaisuus tai muut tiedot, jotka yhdistävät kysei ­
set kemikaalit tunnettuihin neurotoksisiin aineisiin.  
Tämän testimenetelmän käyttäminen voi olla tarkoituksenmukaista 
muissakin tapauksissa. Yksityiskohtaisempia tietoja viitteessä (1).  
Menetelmä on kehitetty sellaiseksi, että se voidaan räätälöidä erityis ­
tarpeisiin, jotta voidaan varmistaa kemikaalin spesifinen histopatolo ­
ginen ja käyttäytymiseen vaikuttava neurotoksisuus sekä kuvata neu ­
rotoksiset vasteet ja kvantifioida ne.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 623
 
Aiemmin neurotoksisuus rinnastettiin neuropatiaan, johon liittyi neu ­
ropatologisia vaurioita tai hermoston toimintahäiriöitä kuten kohta ­
uksia, halvaus tai vapinaa. Vaikka neuropatia onkin tärkeä neurotok ­
sisuuden ilmenemismuoto, nykyään on selvää, että hermostoon koh ­
distuvaan toksisuuteen liittyy monia muitakin oireita (esimerkiksi 
motorisen koordinaation puute, aistitoiminnan vajaukset, oppimis- 
ja muistihäiriöt), jotka eivät ilmene neuropatiaan liittyvissä tai muun tyyppisissä tutkimuksissa.
 
Tämän neurotoksisuuden testimenetelmän tarkoituksena on saada sel ­
ville tärkeimmät hermostoperäiset käyttäytymiseen kohdistuvat ja 
neuropatologiset vaikutukset täysikasvuisilla jyrsijöillä. Vaikka mor ­
fologisia muutoksia ei esiintyisi, vaikutukset käyttäytymiseen voivat ilmentää elimistöön kohdistuvaa haitallista vaikutusta. Kaikki käyt ­
täytymismuutokset eivät kuitenkaan ole nimenomaan hermostoperäi ­
siä. Siksi kaikkia havaittuja muutoksia on arvioitava vastaavien his ­
topatologisten, hematologisten tai biokemiallisten sekä muun tyyppi ­
seen systeemiseen toksisuuteen liittyvien tietojen perusteella. Tässä menetelmässä neurotoksisten vasteiden kuvaamiseksi ja kvantifioimi ­
seksi tehtäviin testeihin kuuluu erityisiä histopatologisia ja käyttäy ­
tymiseen liittyviä testejä. Niiden lisätukena voidaan käyttää sähköfy ­
siologisia ja/tai biokemiallisia tutkimuksia (1)(2)(3)(4).
 
Neurotoksiset aineet voivat vaikuttaa monin tavoin useisiin kohteisiin 
hermostossa. Koska yhdelläkään koesarjalla ei voida täysin arvioida 
kaikkien aineiden mahdollista neurotoksisuutta, saatetaan tarvita 
muita  in vivo  tai in vitro  -testejä, jotka on erityisesti tarkoitettu 
havaitun tai ennakoidun neurotoksisuustyypin tutkimiseen.  
Soveltamalla yhdessä neurotoksisuuden testistrategioita ja -menetel ­
miä koskevan OECD:n ohjeasiakirjan (1) ohjeita ja tätä testimenetel ­
mää voidaan myös suunnitella tutkimuksia, joiden tarkoituksena on 
kuvata tarkemmin annosvasteen kvantifiointia ja lisätä sen herkkyyt ­
tä. Näin voidaan paremmin arvioida haitaton vaikutustaso (no-obser ­
ved-adverse effect level, NOAEL) tai osoittaa kemikaalin tiedetyt tai 
epäillyt haittavaikutukset. Voidaan esimerkiksi suunnitella tutkimuk ­
sia, joilla tunnistetaan ja arvioidaan neurotoksisuusmekanismeja tai täydennetään tietoja, joita on jo saatu käyttämällä tavanomaisia her ­
mostoperäisiin käyttäytymisoireisiin kohdistuvia ja neuropatologisia 
havainnointimenetelmiä. Tällaisissa tutkimuksissa ei tarvitse yrittää 
hankkia tietoja, jotka saataisiin jo tässä menetelmässä suositelluilla tavanomaisilla kokeilla, mikäli nämä tiedot ovat jo saatavilla eikä niitä pidetä välttämättöminä tutkimustulosten tulkinnan kannalta.
 
Käytettäessä tätä neurotoksisuustutkimusta yksin tai yhdessä jonkin 
muun tutkimuksen kanssa saadaan tietoja, joiden avulla voidaan  
— todeta, onko testattu kemikaali vahingoittanut hermostoa pysy ­
västi, vai ovatko vauriot palautuvia  
— kuvata kemikaalialtistumiseen liittyviä hermostonmuutoksia ja 
ymmärtää niiden taustalla olevia mekanismeja  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 624
 
— määritellä annos-vaste- ja aika-vaste-suhteet haitattoman vaiku ­
tustason arvioimiseksi (jota voidaan käyttää kemikaalin turvalli ­
suuskriteerien määrittelemisessä).  
Tässä testimenetelmässä testiaine annostellaan suun kautta. Muut 
antotiet (esimerkiksi ihon kautta tai inhalaationa) voivat olla sopi ­
vampia ja edellyttää suorituksen yksityiskohtien muuttamista. Anto ­
tavan valintaan vaikuttavat ihmisen altistusominaisuudet ja saatavilla olevat toksikologiset tai kineettiset tiedot.
 
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Haittavaikutus:  sellainen käsittelyyn liittyvä poikkeama perustasos ­
ta, joka vähentää organismin kykyä pysyä hengissä, lisääntyä tai 
sopeutua ympäristöön.  
Annos:  annettavan testiaineen määrä. Annos ilmaistaan painoyksik ­
köinä (g, mg) tai testiaineen painona koe-eläimen painoyksikköä 
kohti (esimerkiksi mg/kg) tai vakiopitoisuuksina ravinnossa (ppm).  
Annostus:  yleistermi, joka käsittää annoksen, annostusvälit ja annos ­
telun keston.  
Neurotoksisuus:  kemikaalille tai biologiselle tai fysikaaliselle ai ­
neelle altistumisesta aiheutuva haitallinen muutos hermoston raken ­
teessa tai toiminnassa.  
Neurotoksinen aine:  kemikaali tai biologinen tai fysikaalinen aine, 
joka voi aiheuttaa neurotoksisuutta.  
NOAEL:  (lyhenne sanoista no-observed-adverse effect level). Kor ­
kein annostaso, jolla ei havaita käsittelyyn liittyviä haitallisia löydök ­
siä. 
1.3 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Testattavaa kemikaalia annostellaan suun kautta erilaisina annoksina 
useille koe-eläinryhmille, jotka ovat laboratoriokokeissa käytettäviä jyrsijöitä. Tavallisesti käytetään toistuvaa annostusta. Annosteluoh ­
jelma voi kestää 28 päivää, 90 päivää (subkrooninen) tai yhden 
vuoden tai pidempään (krooninen). Tässä testimenetelmässä esitettyjä 
menettelyjä voidaan käyttää myös akuutin neurotoksisuuden tutki ­
muksessa. Eläimiä testataan käyttäytymiseen ja/tai hermostoon liitty ­
vien poikkeavuuksien selvittämiseksi tai niiden kuvaamiseksi. Jokai ­
sen havainnointijakson aikana arvioidaan monentyyppisiä käyttäyty ­
misilmiöitä, johon neurotoksiset aineet voivat vaikuttaa. Testin lo ­
pussa osalle eläimistä (kaikista ryhmistä, kummastakin sukupuolesta) tehdään perfuusio  in situ,  ja aivoista, selkäytimestä ja ääreishermos ­
tosta preparoidaan leikkeitä, jotka tutkitaan.
 
Kun tutkimus suoritetaan erillisenä tutkimuksena neurotoksisuuden 
seulomiseksi tai neurotoksisten vaikutusten kuvaamiseksi, voidaan kustakin ryhmästä ne eläimet, joita ei käytetä perfuusioon tai myö ­
hempiin histopatologisiin tutkimuksiin (katso taulukko 1), käyttää 
erityisiin hermostoperäisiin käyttäytymisoireisiin liittyviin, neuropa ­
tologisiin, neurokemiallisiin tai sähköfysiologisiin tutkimuksiin. Näillä tutkimuksilla täydennetään tämän menetelmän perustutki ­
muksa (1). Täydentävät tutkimukset voivat olla erityisen hyödyllisiä, 
kun empiiriset havainnot tai ennakoidut vaikutukset osoittavat kemi ­
kaalin neurotoksisuuden olevan tietyn tyyppistä, tai että sillä on erityinen kohde. Vaihtoehtoisesti jäljelle jääneet eläimet voidaan 
käyttää arviointeihin, joita edellytetään jyrsijöillä tehtävien toistuvan 
annostelun toksisuustutkimusten tutkimusmenetelmissä.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 625
 
Kun tämän testimenetelmän menettelyt yhdistetään muiden testime ­
netelmien menettelyihin, on käytettävä riittävää määrää eläimiä, jotta 
molempien tutkimusten havainnointiin liittyvät vaatimukset voidaan täyttää.
 
1.4 MENETELMÄN KUVAUS  
1.4.1  Eläinlajin valinta  
Suositeltavin jyrsijälaji on rotta, tosin muitakin jyrsijöitä voidaan 
käyttää, mikäli se on perusteltua. Testiin on käytettävä nuoria, täy ­
sikasvuisia ja terveitä eläimiä, jotka edustavat yleisesti käytettyjä koe-eläinkantoja. Naaraat eivät saa olla synnyttäneitä eivätkä kanta ­
via. Annostelu aloitetaan yleensä mahdollisimman pian vieroituksen 
jälkeen, mieluiten eläinten ollessa kuuden viikon ikäisiä, ja joka tapauksessa ennen kuin ne ovat yhdeksän viikon ikäisiä. Kun tämä tutkimus yhdistetään muihin tutkimuksiin, ikävaatimusta saatetaan 
joutua mukauttamaan. Käytettyjen eläinten paino saa tutkimuksen 
alussa vaihdella korkeintaan + 20 % kummankin sukupuolen keski ­
painosta. Kun lyhytaikaista toistuvan annostelun tutkimusta seuraa pitkäaikaistutkimus, on molemmissa tutkimuksissa käytettävä sa ­
masta kannasta ja samasta lähteestä olevia eläimiä.
 
1.4.2  Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta  
Koe-eläinhuoneen lämpötilan tulee olla 22  o C (+ 3  o C). Vaikka 
riittävät vaatimukset suhteellisen kosteuden suhteen ovat vähintään 30 % eikä mielellään yli 70 % muulloin kuin huoneen puhdistuksen 
aikana, pitäisi kuitenkin pyrkiä 50–60 %:n suhteelliseen kosteuteen. 
Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Pitäisi välttää äkkinäisiä kovia ääniä. Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratoriorehua, 
eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. Rehun valintaan voi vaikuttaa 
se, miten testiaine voidaan sekoittaa rehuun tällä menetelmällä an ­
nosteltaessa. Eläimet voidaan pitää häkeissä yksittäin tai muutaman samaa sukupuolta olevan eläimen ryhmissä.
 
1.4.3  Eläinten valmistelu  
Nuoret, terveet eläimet jaetaan satunnaisotannalla testi- ja verrokki ­
ryhmiin. Häkit tulee järjestää siten, että niiden sijoittamisesta mah ­
dollisesti aiheutuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Eläi ­
met merkitään yksilöllisesti ja pidetään häkeissään vähintään viiden 
päivän ajan ennen tutkimuksen aloittamista, jotta ne tottuvat labora ­
torio-oloihin.  
1.4.4  Antotie ja annosten valmistelu  
Tutkimusmenetelmässä edellytetään nimenomaan testiaineen annos ­
telua suun kautta. Suun kautta annostelu voi tapahtua letkuruokin ­
nalla, rehun tai juomaveden mukana tai kapseleina. Muita antotapoja 
(esimerkiksi ihon kautta tai inhalaationa) voidaan käyttää, mutta suo ­
ritustapaa saatetaan joutua muuttamaan. Antotavan valintaan vaikut ­
tavat ihmisen altistusominaisuudet sekä saatavilla olevat toksikologi ­
set ja kineettiset tiedot. Antotien valintaperusteet sekä siitä tämän 
testimenetelmän suoritukseen aiheutuvat muutokset on ilmoitettava.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 626
 
Testiaine liuotetaan tai suspensoidaan tarvittaessa sopivaan kantaja- 
aineeseen. Suositusten mukaan ensin tulee käyttää vesipohjaista 
liuosta/suspensiota, sitten öljypohjaista (esimerkiksi maissiöljy) liuosta/suspensiota ja vasta sitten mahdollisesti muuhun kantaja-ai ­
neeseen pohjautuvaa liuosta/suspensiota. Kantaja-aineen toksiset 
ominaisuudet on tunnettava. Lisäksi on kiinnitettävä huomiota seu ­
raaviin kantaja-aineen ominaisuuksiin: kantaja-aineen vaikutukset testiaineen imeytymiseen, jakautumiseen, metaboloitumiseen ja eli ­
mistössä säilymiseen. Edellä mainitut tekijät voivat vaikuttaa testi ­
aineen toksisiin ominaisuuksiin. Lisäksi on otettava huomioon kan ­
taja-aineen vaikutus eläinten ravinnon ja veden kulutukseen sekä niiden ravitsemustilaan.
 
1.5 TESTIN SUORITUS  
1.5.1  Eläinten määrä ja sukupuoli  
Kun tutkimus suoritetaan erillisenä tutkimuksena, on kunkin annok ­
sen testaamiseen sekä verrokkiryhmään, jolla arvioidaan yksityiskoh ­
taisia kliinisiä ja toiminnallisia havaintoja, käytettävä vähintään 20 
eläintä (10 naarasta ja 10 urosta). Ainakin viidelle urokselle ja vii ­
delle naaraalle näistä kymmenestä uroksesta ja kymmenestä naaraasta on tehtävä perfuusio  in situ,  ja niitä on käytettävä yksityiskohtaisiin 
neurohistopatologisiin tutkimuksiin tutkimuksen lopussa. Silloin, kun 
tietystä annosryhmästä havainnoidaan vain muutamia eläimiä neuro ­
toksisten vaikutusten osoittamiseksi, nämä eläimet olisi mahdollisesti otettava perfuusioon valittujen eläinten joukkoon. Kun tutkimus suo ­
ritetaan yhdessä toistuvan annostelun toksisuustutkimuksen kanssa, 
on käytettävä riittävästi eläimiä molempien tutkimusten tavoitteiden 
saavuttamiseksi. Taulukossa 1 on esitetty eläinten vähimmäismäärät ryhmää kohti useissa tutkimusyhdistelmissä. Jos osa eläimistä aiotaan lopettaa kesken tutkimuksen tai suunnitellaan toipuvista eläimistä 
koostuvia ryhmiä toksisten vaikutusten palautuvuuden, jatkuvuuden 
ja ilmenemisen viivästymisen havainnoimiseksi testin jälkeen tai har ­
kitaan täydentävien havaintojen tekemistä, eläinten määrää on lisät ­
tävä. Näin varmistetaan, että saatavilla on tarvittava määrä eläimiä 
havainnointia ja histopatologisia tutkimuksia varten.
 
1.5.2  Testiryhmä ja verrokkiryhmä  
Yleensä käytetään vähintään kolmea annosryhmää ja yhtä verrokki ­
ryhmää. Jos vaikutuksia ei muiden tietojen arvioinnin perusteella ole 
odotettavissa toistetulla vuorokausiannoksella 1 000 mg/kg, voidaan tehdä raja-annostesti. Jos sopivia tietoja ei ole saatavilla, voidaan tehdä annosalueen haarukointitesti käytettävien annosten määrittämi ­
sen helpottamiseksi. Testiaineen annostelua lukuun ottamatta verrok ­
kiryhmän eläimiä on käsiteltävä täsmälleen samoin kuin testiryhmän eläimiä. Jos testiaineen annostelussa käytetään kantaja-ainetta, sitä tulee antaa verrokkiryhmälle suurin käytetty määrä.
 
1.5.3  Luotettavuuden tarkistus  
Tutkimuksen suorittavan laboratorion on esitettävä tiedot, joista il ­
menevät sen kyky suorittaa tutkimus sekä käytettyjen menetelmien herkkyys. Näistä tiedoista tulisi ilmetä kyky osoittaa ja kvantifioida 
muutokset päätepisteissä, joiden havainnointia suositellaan. Näitä 
ovat autonomiset oireet, aistien reaktiivisuus, tarttumaotteen voimak ­
kuus ja motorinen aktiivisuus. Viitteissä 2–9 on tietoja eri tyyppisiä neurotoksisia vasteita aiheuttavista kemikaaleista, joita voidaan käyt ­
tää positiivisina kontrolliaineina. Aiemmin saatuja tietoja voidaan 
käyttää, jos koemenetelmien oleelliset osatekijät pysyvät ennallaan. Aiempien tietojen ajoittaista päivitystä suositellaan. Menetelmien herkkyyden säilymistä osoittavia uusia tietoja on tuotettava, kun tes ­
tin suorittava laboratorio muuttaa jonkin testin toimenpiteiden suorit ­
tamisen kannalta olennaisen tekijän.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 627
 
1.5.4  Annoksen valinta  
Annostasojen valinnassa tulee ottaa huomioon kaikki testattavasta 
yhdisteestä tai sen sukulaisaineista saatavilla olevat aiemmin saadut toksisuus- ja kinetiikkatiedot. Korkein annostaso tulee valita siten, 
että sen tarkoituksena on aiheuttaa neurotoksisia vaikutuksia tai sel ­
viä systeemisen toksisuuden vaikutuksia. Tämän jälkeen annostasot valitaan asteittain alenevasti mahdollisen annosvasteen osoittamiseksi ja haitattoman vaikutustason (NOAEL) osoittamiseksi alhaisimmalla 
annostasolla. Periaatteessa annostasot tulee määrätä siten, että ensi ­
sijaiset hermostoon kohdistuvat toksiset vaikutukset voidaan erottaa systeemiseen toksisuuteen liittyvistä vaikutuksista. Kaksi tai kolme 
eri suuruista annosta on yleensä ihanteellisin määrä, ja usein on 
suositeltavaa käyttää neljättä testiryhmää erittäin pitkien annosvälien sijaan (esimerkiksi kerroin yli 10). Jos ihmisen altistumisesta on olemassa järkevä arvio, se on otettava huomioon.
 
1.5.5  Raja-annostesti  
Jos tutkimus yhdellä annostasolla (vähintään 1 000 mg/kg/vrk) ei 
tässä kuvatulla suoritustavalla aiheuta havaittavia neurotoksisia vai ­
kutuksia ja jos toksisuus ei ole todennäköistä rakenteellisesti saman ­
laisista yhdisteistä saatujen tietojen perusteella, täydellinen tutkimus kolmella annostasolla ei välttämättä ole tarpeen. Odotettavissa olevan 
ihmisen altistuksen perusteella raja-annostestissä on mahdollisesti 
käytettävä korkeampaa annostasoa suun kautta annettuna. Muiden antotapojen kuten inhalaation tai ihoapplikaation osalta korkein saa ­
vutettavissa oleva altistumistaso määräytyy yleensä testiaineen fysi ­
kaalis-kemiallisten ominaisuuksien perusteella. Akuutin oraalisen tut ­
kimuksen tekemiseksi raja-annostestin annoksen tulee olla vähintään 2 000 mg/kg.
 
1.5.6  Annostelu  
Eläimille annetaan testiainetta päivittäin seitsemänä päivänä viikossa 
vähintään 28 päivän ajan. Viisipäiväisen annosteluohjelman käyttö 
tai lyhyempi altistusaika on perusteltava. Letkuruokinnassa testiaine on annettava yhtenä annoksena mahaletkun tai sopivan intubaatioka ­
nyylin kautta. Kerralla annettavan nesteen enimmäismäärä riippuu 
koe-eläinten koosta. Määrä ei saa olla yli 1 ml sataa painogrammaa 
kohti. Vesiliuoksia voidaan kuitenkin antaa 2 ml:aan asti sataa pai ­
nogrammaa kohti. Lukuun ottamatta ärsyttäviä tai syövyttäviä ainei ­
ta, joiden vaikutukset yleensä pahenevat korkeammilla pitoisuuksilla, 
testiainemäärän vaihtelu olisi minimoitava säätämällä pitoisuuksia 
vakiotilavuuden takaamiseksi kaikilla annostasoilla.
 
Jos aineita annetaan eläimille rehuun tai juomaveteen sekoitettuna, 
on tärkeää varmistaa, etteivät testiainemäärät häiritse normaalia ra ­
vinto- tai nestetasapainoa. Kun testiaine annetaan ravintoon sekoitet ­
tuna, sen määrä mitataan joko vakiopitoisuutena rehussa (ppm) tai eläimen painoon suhteutettuna vakioannostasona. Käytetty tapa pitää mainita. Jos testiaine annetaan letkulla, annos tulee antaa joka päivä 
samaan aikaan, ja annosta on mukautettava tarvittaessa siten, että 
annostaso pysyy samana eläimen painoon nähden. Kun toistuvan annostelun tutkimuksen jälkeen tehdään pitkäaikaistutkimus, eläi ­
mille on annettava samanlaista ravintoa molemmissa tutkimuksissa. 
Jos kerta-annos ei akuutissa tutkimuksessa ole mahdollinen, annos 
voidaan antaa pienemmissä osissa vuorokauden kuluessa.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 628
 
1.6 HAVAINNOINTI  
1.6.1  Havainnoinnin ja testien määrä  
Toistuvan annostelun tutkimuksissa havainnointijakson tulee kattaa 
annostelujakso. Akuuteissa tutkimuksissa havaintoja on tehtävä kä ­
sittelyn jälkeen 14 päivän aikana. Satelliittiryhmien eläimiä, joita ei 
altisteta käsittelyn jälkeisen jakson aikana, on myös havainnoitava tällä jaksolla.
 
Havaintoja on tehtävä riittävän usein, jotta kaikki käyttäytymiseen 
liittyvät ja/tai hermostolliset poikkeavuudet voitaisiin havaita. Ha ­
vainnot on mieluiten tehtävä samoihin aikoihin joka päivä ja ottaen 
huomioon, milloin odotettuja vaikutuksia esiintyy eniten. Kliinisten havaintojen ja toiminnallisten kokeiden aikataulu (taajuus) on esitetty yhteenvetona taulukossa 2. Jos aikaisemmista tutkimuksista saadut 
kineettiset tai muut tiedot osoittavat, että havainnoinnin, testien tai 
havainnoinnin jälkeisten jaksojen ajankohtaa on muutettava, on laa ­
dittava uusi aikataulu tiedonsaannin maksimoimiseksi. Aikatauluun tehtävät muutokset on perusteltava.
 
1.6.1.1  Havainnot yleisestä terveydentilasta ja kuolleisuudesta/ ­
sairastavuudesta  
Kaikkien eläinten terveydentilaa on havainnoitava tarkoin vähintään 
kerran päivässä, ja niiden sairastavuutta tai kuolleisuutta vähintään kahdesti päivässä.
 
1.6.1.2  Yksityiskohtaiset kliiniset havainnot  
Kaikista tätä tarkoitusta varten valituista eläimistä on tehtävä yksi ­
tyiskohtaisia kliinisiä havaintoja (katso taulukko 1) kerran ennen ensimmäistä altistuskertaa (samaa koe-eläintä koskevia vertailuja var ­
ten) ja eri väliajoin sen jälkeen tutkimuksen kestosta riippuen (katso 
taulukko 2). Yksityiskohtaiset kliiniset havainnot toipuvien eläinten satelliittiryhmistä on tehtävä toipumisjakson lopussa. Yksityiskohtai ­
set kliiniset havainnot on tehtävä eläimen oman häkin ulkopuolella 
vakioalueella. Havainnot on kirjattava tarkasti käyttämällä pisteytys ­
järjestelmiä, joihin sisältyvät kriteerit tai pisteytysasteikot jokaista havainnointiin kuuluvaa mittausta varten. Testilaboratorion on mää ­
riteltävä käytetyt kriteerit ja asteikot tarkasti. On pyrittävä varmista ­
maan, että testiolosuhteet (jotka eivät liity järjestelmällisesti käsitte ­
lyyn) vaihtelevat mahdollisimman vähän, ja että havainnoinnin suo ­
rittavat eläinten käsittelystä tietämättömät koulutetut havainnoijat.
 
On suositeltavaa, että havainnointi toteutetaan suunnitelmallisesti si ­
ten, että tarkoin määriteltyjä kriteereitä (mukaan lukien normaalit 
”vaihtelun rajat”) sovelletaan järjestelmällisesti kuhunkin eläimeen 
jokaisen havainnointiajankohdan aikana. ”Normaalit vaihtelun rajat” on dokumentoitava tarkoituksenmukaisesti. Kaikki havaitut oireet on kirjattava. Myös havaittujen oireiden voimakkuus on kirjattava mah ­
dollisuuksien mukaan. Kliinisiä havaintoja on tehtävä muun muassa 
ihon, karvapeitteen, silmien, limakalvojen, mahdollisten eritteiden erityksen sekä autonomisen hermoston toiminnan (esimerkiksi kyy ­
nelvuoto, piloerektio, mustuaisen koko, poikkeavuudet hengityksessä 
ja/tai ilman haukkominen, kaikki virtsaamiseen tai ulostamiseen liit ­
tyvät epätavalliset oireet sekä virtsan värjäytyminen) muutoksista.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 629
 
Myös kaikki kehon asentoon, aktiivisuustasoon (esimerkiksi vakio ­
alueen vähentynyt tai lisääntynyt tutkiminen) ja liikekoordinaatioon 
liittyvät epätavalliset vasteet on kirjattava. Muutokset käynnissä (esi ­
merkiksi vaappuminen ja ataksia), asennossa (esimerkiksi selän köy ­
ristäminen) ja käsittelyyn, paikkaan tai muihin ympäristön ärsykkei ­
siin liittyvässä reaktiivisuudessa sekä klooniset tai tooniset liikkeet, 
kouristukset tai vapina, stereotypiat (esimerkiksi ylenmääräinen tur ­
kin hoito, epätavalliset pään liikkeet, jatkuva kehän kiertäminen) tai omituinen käytös (esimerkiksi pureminen tai ylenmääräinen nuolemi ­
nen, itsensä silpominen, takaperin käveleminen, ääntely) tai aggres ­
siivisuus on kirjattava.
 
1.6.1.3  Toiminnalliset kokeet  
Yksityiskohtaisten kliinisten havaintojen tavoin myös toiminnallisia 
kokeita on tehtävä kerran ennen altistusta ja useasti sen jälkeen kaikilla tätä tarkoitusta varten valituilla eläimillä (katso taulukko 1). Myös toiminnallisten kokeiden lukumäärä riippuu tutkimuksen 
kestosta (katso taulukko 2). Taulukossa 2 esitettyjen havainnointijak ­
sojen lisäksi toipuvien eläinten muodostamista satelliittiryhmistä on tehtävä toiminnallisia havaintoja mahdollisimman lähellä eläinten lo ­
pettamisajankohtaa. Toiminnallisissa kokeissa testataan aistien reak ­
tiivisuutta erilaisille ärsykkeille (esimerkiksi kuulo, näkö ja asento ­
tunto (5)(6)(7)), arvioidaan tarttumaotteen voimakkuutta (S) ja mo ­
torista toimintaa (9). Motorista toimintaa on mitattava automaattilait ­
teella, jolla voidaan selvittää sekä toiminnan väheneminen että li ­
sääntyminen. Jos käytetään jotakin muuta määriteltyä järjestelmää, 
sen on oltava kvantitatiivinen, ja sen herkkyys ja luotettavuus on osoitettava. Kaikki laitteet on testattava sen varmistamiseksi, että laitteet ovat luotettavia koko tutkimuksen ajan ja ja antavat toistet ­
tavia tuloksia. Lisätietoja sopivista suoritustavoista on esitetty viit ­
teissä. Jos ei ole saatavissa tietoja, jotka viittaisivat mahdollisiin neurotoksisiin vaikutuksiin (esimerkiksi rakenne-aktiivisuus-tiedot, epidemiologiset tiedot, muut toksikologiset tutkimukset), on harkit ­
tava aistitoiminnan ja motorisen toiminnan sekä oppimisen ja muistin 
testaamiseen erityistestien tekemistä mahdollisten vaikutusten tutki ­
miseksi tarkemmin. Lisätietoja erityistesteistä ja niiden käytöstä on esitetty viitteessä (1).
 
Eläimet, joissa ilmenee toksisuuden oireita siinä määrin, että se häi ­
ritsisi merkittävästi toiminnallisten kokeiden suorittamista, voidaan 
poistaa kyseisestä kokeesta. Eläinten poistaminen toiminnallisesta 
kokeesta on perusteltava.  
1.6.2  Ruumiinpaino ja ravinnon/veden kulutus  
Korkeintaan 90 päivää kestävissä tutkimuksissa eläimet on punnit ­
tava vähintään kerran viikossa, ja ravinnon kulutus (veden kulutus, jos testiaine annetaan veteen sekoitettuna) on mitattava vähintään viikoittain. Pitkäaikaistutkimuksissa kaikki eläimet on punnittava vä ­
hintään kerran viikossa ensimmäisten 13 viikon ajan ja sen jälkeen 
vähintään kerran neljässä viikossa. Ravinnon kulutus (veden kulutus, jos testiaine annetaan veteen sekoitettuna) on mitattava vähintään kerran viikossa ensimmäisten 13 viikon ajan ja sen jälkeen noin 
kolmen kuukauden välein, elleivät muutokset terveydentilassa tai 
ruumiinpainossa muuta edellytä.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 630
 
1.6.3  Silmätutkimukset  
Yli 28 päivää kestävissä tutkimuksissa on tehtävä silmätutkimus of ­
talmoskoopilla tai vastaavalla sopivalla välineellä ennen testiaineen annostelua ja tutkimuksen päättyessä mieluiten kaikille eläimille, 
mutta ainakin korkean annostason ryhmän ja verrokkiryhmän eläi ­
mille. Jos silmistä löydetään muutoksia tai jos se on kliinisten oirei ­
den vuoksi tarpeen, kaikki eläimet on tutkittava. Pitkäaikaistutkimuk ­
sissa silmätutkimus on tehtävä myös 13. viikolla. Silmätutkimuksia 
ei tarvitse tehdä, jos tiedot ovat jo saatavissa muista saman pituisista 
ja samalla annostasolla tehdyistä tutkimuksista.
 
1.6.4  Hematologia ja kliininen biokemia  
Kun neurotoksisuustutkimus tehdään toistuvan annostelun systee ­
misen toksisuuden tutkimuksen yhteydessä, verikokeet ja kliiniset biokemialliset määritykset on tehtävä systeemisen toksisuuden tutki ­
musmenetelmässä esitetyllä tavalla. Näytteiden kerääminen on teh ­
tävä siten, että mahdolliset vaikutukset hermostoperäiseen käyttäyty ­
miseen minimoidaan.
 
1.6.5  Histopatologia  
Neuropatologinen tutkimus on suunniteltava täydentämään ja laajen ­
tamaan tutkimuksen  in vivo  -vaiheen aikana tehtyjä havaintoja. Näyt ­
teet vähintään viiden eläimen kudoksista sukupuolta ja ryhmää kohti (katso taulukko 1 ja seuraava kappale) on kiinnitettävä  in situ  käyt­
tämällä yleisesti hyväksyttyjä perfuusio- ja kiinnitystekniikoita (katso 
viite 3, luku 5 ja viite 4, luku 50). Kaikki havaittavat suuret muu ­
tokset on kirjattava. Kun tutkimus suoritetaan yksittäisenä neurotok ­
sisuuden seulontatutkimuksena tai neurotoksisten vaikutusten kuvaa ­
miseksi, jäljelle jääneet eläimet voidaan käyttää joko erityisiin her ­
mostoperäiseen käyttäytymiseen liittyviin (10) (11), neuropatologisiin (10) (11) (12) (13), neurokemiallisiin (10) (11) (14) (15) tai sähkö ­
fysiologisiin (10) (11) (16) (17) tutkimuksiin, jotka voivat täydentää 
tässä kuvattuja toimenpiteitä ja tutkimuksia. Nämä eläimet voidaan 
myös käyttää histopatologisiin tutkimuksiin. Täydentävät toimenpi ­
teet ovat erityisen hyödyllisiä, kun empiiriset havainnot tai odotetut vaikutukset viittaavat tietyn tyyppiseen tai tiettyyn kohteeseen vai ­
kuttavaan neurotoksisuuteen (2) (3). Vaihtoehtoisesti jäljelle jääneet 
eläimet voidaan käyttää toistuvan annostelun testimenetelmässä ku ­
vattuihin tavanomaisiin patologisiin arviointeihin.
 
Kaikki parafiiniin valetut kudosnäytteet on värjättävä yleisellä värjä ­
ysmenetelmällä kuten hematoksyliini-eosiini-menetelmällä (H&E), ja ne on tutkittava mikroskooppisesti. Jos havaitaan tai epäillään merk ­
kejä ääreishermoston neuropatiasta, on tutkittava muoviin valettuja 
ääreishermoston kudosnäytteitä. Myös kliiniset oireet voivat antaa aihetta uusien kohteiden tutkimiseen tai erityisten värjäysmenetel ­
mien käyttämiseen. Viitteissä (3) ja (4) on annettu ohjeita lisätutki ­
muksen kohteista. Myös sopivat erikoisvärit voivat olla hyödyllisiä 
tietyn tyyppisten patologisten muutosten osoittamiseksi (18).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 631
 
Keskus- ja ääreishermostosta otettuja edustavia leikkeitä on tutkittava 
histologisesti (katso viite 3, luku 5 ja viite 4, luku 50). Yleensä on 
tutkittava seuraavat alueet: etuaivot, isojen aivojen keskiosa mukaan luettuna aivoturson läpi menevä leike, keskiaivot, pikkuaivot, aivo ­
silta, ydinjatke, silmä näköhermo ja verkkokalvo mukaan luettuna, 
selkäydin kaularangan ja lannerangan kohdalta, takajuuren hermosol ­
mu, taka- ja etujuuren hermosäikeet, proksimaalinen lonkkahermo, proksimaalinen säärihermo (polven kohdalta) ja säärihermon puolei ­
set pohjelihaksen haarat. Selkäytimestä ja ääreishermostosta on teh ­
tävä sekä poikittais- että pitkittäisleikkeet. Hermoston verisuonistoon 
on kiinnitettävä huomiota. Lisäksi on tutkittava luurankolihaksesta, erityisesti pohjelihaksesta otettu näyte. Erityistä huomiota on kiinni ­
tettävä keskus- ja ääreishermoston alueisiin, joiden solu- ja säiera ­
kenteeseen sekä -tyyppiin neurotoksisen aineen tiedetään vaikuttavan 
erityisen haitallisesti.
 
Viitteissä (3) ja (4) on annettu ohjeita neuropatologisista muutoksis ­
ta, joita toksisille aineille altistuminen yleisesti aiheuttaa. Kudosnä ­
ytteet on suositeltavaa tutkia vaiheittain siten, että korkean annosta ­
son ryhmästä otettuja leikkeitä verrataan aluksi verrokkiryhmästä otettuihin leikkeisiin. Jos näiden ryhmien näytteissä ei havaita neu ­
ropatologisia muutoksia, myöhempää analyysia ei tarvita. Jos kor ­
kean annoksen ryhmässä havaitaan neuropatologisia muutoksia, on keskisuuren ja pienen annoksen ryhmän kustakin mahdollisesti va ­
hingoittuneesta kudoksesta otettava näytteet, jotka on koodattava ja 
tutkittava järjestyksessä.
 
Jos kvalitatiivisessa tutkimuksessa löydetään näyttöä neuropatologi ­
sista muutoksista, on tehtävä lisätutkimus niille hermoston alueille, 
joissa näitä muutoksia esiintyy. Kaikkien annosryhmien mahdollisesti 
vahingoittuneista alueista on otettava leikkeitä, jotka on koodattava ja tutkittava satunnaisotannalla niiden koodia tietämättä. Kaikkien vaurioiden määrä ja vaikeusaste on kirjattava. Kun kaikki alueet 
kaikista annosryhmistä on arvioitu, voidaan koodi paljastaa ja tehdä 
tilastollinen analyysi annosvasteiden suhteen arvioimiseksi. Kunkin vaurion eri vaikeusasteista on kuvailtava esimerkkejä.
 
Neuropatologiset löydökset on arvioitava yhdessä käyttäytymiseen 
liittyvien havaintojen ja mittausten sekä muista testiaineella tehdyistä edeltävistä ja samanaikaisista systeemisen toksisuuden tutkimuksista saatujen tietojen kanssa.
 
2. TULOKSET  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Tuloksina on esitettävä yksittäisiä eläimiä koskevat tulokset. Kaikki 
tulokset tulee esittää myös yhteenvetona taulukossa, josta käy ilmi kussakin testi- ja verrokkiryhmässä käytettyjen eläinten lukumäärä 
kokeen alussa, kokeen aikana kuolleena löydettyjen tai humaaneista 
syistä lopetettujen eläinten lukumäärä sekä niiden kuolinajankohta, toksisuusoireita osoittaneiden eläinten lukumäärä, havaittujen toksis ­
ten vaikutusten kuvaus mukaan lukien niiden alkamisajankohta, kes ­
to, tyyppi ja vaikeusaste, vaurioita saaneiden eläinten määrä mukaan 
lukien vaurioiden tyyppi ja vaikeusaste.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 632
 
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI JA TULKINTA  
Tutkimuksessa on arvioitava hermostoperäiseen käyttäytymiseen 
kohdistuvien ja neuropatologisten vaikutusten esiintyvyys, vaikeu ­
saste ja korrelaatio (myös neurokemialliset tai sähköfysiologiset vai ­
kutukset, jos on tehty täydentäviä tutkimuksia) sekä muut havaitut 
haittavaikutukset. Numeeriset tulokset on mahdollisuuksien mukaan arvioitava asianmukaisella ja yleisesti hyväksytyllä tilastollisella me ­
netelmällä. Tilastolliset menetelmät on valittava tutkimuksen suun ­
nitteluvaiheessa.
 
3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
3.1 LOPPURAPORTTI  
Loppuraportissa on annettava seuraavat tiedot:  
Testiaine:  
— fysikaalinen olomuoto (isomeria, puhtausaste ja fysikaalis-kemi ­
alliset ominaisuudet mukaan luettuina)  
— tunnistetiedot.  
Kantaja-aine (tarvittaessa):  
— perustelut kantaja-aineen valinnalle.  
Koe-eläimet:  
— käytetty eläinlaji- ja kanta,  
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli,  
— lähde, yllöpito-olosuhteet, totuttamisvaihe, ravinto jne.,  
— kunkin eläimen paino kokeen alussa.  
Koeolosuhteet:  
— yksityiskohtaiset tiedot testiainevalmisteesta/rehuvalmisteesta, 
valmisteessa olleesta pitoisuudesta, valmisteen stabiliteetista ja homogeenisuudesta
 
— annosteltujen annosten erittely, mukaan luettuna yksityiskohtaiset 
tiedot kantaja-aineesta ja annostellun aineen määrästä ja fysikaa ­
lisesta muodosta  
— yksityiskohtaiset tiedot testiaineen annostelusta  
— annostasojen valintaperusteet  
— altistustavan ja altistuksen keston valintaperusteet  
— rehussa/juomavedessä olevan testiaineen määrän (ppm) muunta ­
minen varsinaiseksi annokseksi (mg/kg/vrk) tarvittaessa  
— yksityiskohtaiset tiedot ravinnon ja veden laadusta.  
Havainnointi ja testausmenetelmät:  
— yksityiskohtaiset tiedot kunkin ryhmän eläinten jakamisesta ala ­
ryhmiin perfuusiota varten  
— yksityiskohtaiset tiedot pisteytysjärjestelmistä, mukaan luettuna 
valintaperusteet ja kunkin mittauksen pisteytysasteikot yksityis ­
kohtaisten kliinisten havaintojen yhteydessä  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 633
 
— yksityiskohtaiset tiedot toiminnallisista kokeista, joissa testataan 
aistien reaktiivisuutta erilaisille ärsykkeille (esimerkiksi kuulo, 
näkö ja asentotunto), arvioidaan tarttumaotteen voimakkuutta ja motorista aktiivisuutta (mukaan luettuna yksityiskohtaiset tiedot aktiivisuuden tutkimiseksi käytettävistä automaattilaitteista) sekä 
muista käytetyistä menetelmistä
 
— yksityiskohtaiset tiedot silmätutkimuksista sekä tarvittaessa veri ­
kokeista ja kliinisistä biokemiallisista kokeista ja niihin liittyvistä lähtötasoarvoista
 
— yksityiskohtaiset tiedot erityisistä hermostoperäiseen käyttäytymi ­
seen liittyvistä, neuropatologisista, neurokemiallisista ja sähköfy ­
siologisista menetelmistä.  
Tulokset:  
— ruumiinpaino/ruumiinpainon muutokset mukaan lukien ruumiin ­
paino lopetettaessa  
— ravinnon ja veden kulutus tarvittaessa  
— toksiset vastetiedot sukupuolen ja annostason mukaan, toksisuus ­
oireet tai kuolleisuus mukaan lukien  
— yksityiskohtaisten kliinisten havaintojen luonne, vaikeusaste ja 
kesto (alkamishetki ja jatkokehitys) palautuvuudesta riippumatta  
— yksityiskohtainen kuvaus kaikkien toiminnallisten kokeiden tu ­
loksista  
— ruumiinavauslöydökset  
— yksityiskohtainen kuvaus kaikista hermostoperäiseen käyttäyty ­
miseen liittyvistä, neuropatologisista ja neurokemiallisista tai säh ­
köfysiologisista löydöksistä, mikäli saatavissa  
— tiedot imeytymisestä ja metaboliasta, mikäli saatavissa  
— tulosten tilastollinen käsittely tarvittaessa.  
Tulosten tarkastelu:  
— annos-vaste-tulokset  
— muiden toksisten vaikutusten yhteys testatun kemikaalin mahdol ­
lisesta neurotoksisuudesta tehtyihin johtopäätöksiin  
— haitaton vaikutustaso (NOAEL).  
Johtopäätökset:  
— erityistä lausuntoa testatun kemikaalin yleisestä neurotoksisuu ­
desta suositellaan.  
4. KIRJALLISUUSVIITTEET  
1. OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing Strategies 
and Test Methods. OECD, Paris, valmisteilla.  
2. Test Guidline for a Developmental Neurotoxicitu Study, OECD 
Guidelines for the Testing of Chemicals. Valmisteilla.  
3. World Health Organization (WHO) (1986). Environmental He ­
alth Criteria document 60: Principles and Methods for the As ­
sessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemi ­
cals. 
4. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and 
Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, 
H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 634
 
5. Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurolo ­
gical Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999–1003.  
6. Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial 
Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691–704.  
7. Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl. 
Pharmacol., 108, 267–283.
 
8. Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. (1979). 
A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 
233–236.
 
9. Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, 
L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for NeurotoxicologicalAssessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 
599–609.
 
10. Tilson, H.A., and Mitchell, CL. eds. (1992). Neurotoxicology 
Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.  
11. Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. Marcel 
Dekker, New York.  
12. Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxicity 
Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689–695.  
13. Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. 
(1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydroxy ­
ethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 
18, 343–352.  
14. O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as 
Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445–452.
 
15. O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of 
the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in 
Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368–378.
 
16. Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Elect ­
rophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous 
System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, 
pp 299–335.  
17. Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neuroto ­
xicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxicology. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wil ­
kins Co.,. Baltimore/London, pp. 726–742.
 
18. Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of 
Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Techni ­
ques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livings ­
tone. ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 635
 
Taulukko 1  
Eläinten vähimmäismäärä ryhmää kohti kun neurotoksisuustutkimus tehdään erikseen tai muiden tutkimusten 
yhteydessä  
NEUROTOKSISUUSTUTKIMUKSEN TYYPPI: 
Erillinen tutkimus 28-päiväisen tutkimuk ­
sen yhteydessä 90-päiväisen tutkimuk ­
sen yhteydessä Kroonisen toksisuustut ­
kimuksen yhteydessä  
Eläinten kokonaismäärä 
ryhmää kohti 10 urosta ja 10 
naarasta 10 urosta ja 10 
naarasta 15 urosta ja 15 
naarasta 25 urosta ja 25 naa ­
rasta 
Toiminnallisiin kokeisiin ja 
yksityiskohtaiseen kliiniseen 
havainnointiin valittujen 
eläinten lukumäärä 10 urosta ja 10 
naarasta 10 urosta ja 10 
naarasta 10 urosta ja 10 
naarasta 10 urosta ja 10 naa ­
rasta  
In situ  -perfuusioon ja neu ­
rohistopatologisiin tutki ­
muksiin valittujen eläinten 
lukumäärä 5 urosta ja 5 naa ­
rasta 5 urosta ja 5 naa ­
rasta 5 urosta ja 5 naa ­
rasta 5 urosta ja 5 naarasta 
Toistuvan annostelun/subk ­
roonisen/kroo-nisen toksi ­
suuden havainnointiin, he ­
matologian, kliinisen bioke ­
mian ja histopatologian ko ­
keisiin jne. valittujen eläin ­
ten lukumäärä vastaavien  
ohjeasiakirjojen  mukaisesti 5 urosta ja 5 naa ­
rasta 10 urosta † ja 10 
naarasta † 20 urosta † ja 20 
naarasta † 
Täydentävät havainnot tar ­
vittaessa 5 urosta ja 5 naa ­
rasta  
† Tähän ryhmään kuuluu viisi eläintä, jotka on valittu toiminnallisiin kokeisiin ja yksityiskohtaiseen kliiniseen havainnointii n osana 
neurotoksisuustutkimusta  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 636
 
Taulukko 2  
Kliinisten havaintojen ja toiminnallisten kokeiden taajuus  
Havaintotyyppi Tutkimuksen kesto 
Akuutti 28-päiväinen 90-päiväinen Krooninen  
Kaikille eläimille Yleinen tervey ­
dentila päivittäin päivittäin päivittäin päivittäin 
Kuolleisuus/sai ­
ras- tavuus kahdesti päi ­
vässä kahdesti päi ­
vässä kahdesti päi ­
vässä kahdesti päivässä 
Toiminnallisiin ha ­
vaintoihin valituille eläimille Yksityiskohtaiset 
kliiniset havain ­
not — ennen en ­
simmäistä altistuskertaa 
— 8 tunnin ku ­
luessa an ­
nostelusta ajankohtana, jolloin vai ­
kutuksia on 
arvioitu esiintyvän eniten 
— 7. ja 14. 
päivänä an ­
nostelun jäl ­
keen — ennen en ­
simmäistä altistuskertaa 
— sen jälkeen 
viikoittain — ennen en ­
simmäistä altistuskertaa 
— kerran en ­
simmäisen 
tai toisen al ­
tistusviikon aikana 
— sen jälkeen 
kuukausit ­
tain r — ennen ensim ­
mäistä altis ­
tuskertaa 
— kerran ensim ­
mäisen altis ­
tuskuukauden lopussa 
— sen jälkeen 
joka kolmas 
kuukausi 
Toiminnalliset 
kokeet — ennen en ­
simmäistä 
altistuskertaa 
— 8 tunnin ku ­
luessa an ­
nostelusta 
ajankohtana, jolloin vai ­
kutuksia on 
arvioitu 
esiintyvän eniten 
— 7. ja 14. 
päivänä an ­
nostelun jäl ­
keen — ennen en ­
simmäistä 
altistuskertaa 
— kokeen nel ­
jännen vii ­
kon aikana 
mahdollisim ­
man lähellä altistamisen 
päättymistä — ennen en ­
simmäistä 
altistuskertaa 
— kerran en ­
simmäisen 
tai toisen al ­
tistusviikon aikana 
— sen jälkeen 
kuukausit ­
tain — ennen ensim ­
mäistä altis ­
tuskertaa 
— kerran ensim ­
mäisen altis ­
tuskuukauden 
— sen jälkeen 
joka kolmas kuukausi
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 637
 
B.44.  IHON KAUTTA IMEYTYMINEN:  IN VIVO  -MENETELMÄ  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro TG 427 (2004)  
1.1 JOHDANTO  
Altistuminen tapahtuu monille kemikaaleille  ihon kautta.  Suurim­
massa osassa laboratorioelämillä tehtävistä toksikologista kokeista 
käytetään kuitenkin suun kautta annostelua. Tässä testiohjeessa esi ­
telty in vivo  -ihoabsorptiotesti mahdollistaa ekstrapoloinnin suu ­
annostelua käyttävien kokeiden tulosaineiston perusteella, kun arvi ­
oidaan kemikaalien turvallisuutta ihoaltistuksen jälkeen.  
Aineen on läpäistävä runsaasti ihon solukerroksia ennen kuin se 
päätyy verenkiertoon. Nopeuden kannalta ratkaiseva kerros on 
useimpien aineiden osalta marraskesi, joka koostuu kuolleista soluis ­
ta. Aineen pääsy ihon läpi riippuu sen rasvaliukoisuudesta ja orvas ­
keden ulomman kerroksen paksuudesta sekä myös esimerkiksi mo ­
lekyylipainosta ja aineen pitoisuudesta. Rottien ja kanien iho on yleensä läpäisevämpi kuin ihmisten, kun taas marsujen ja apinoiden ihon läpäisevyys vastaa enemmän ihmisen ihon läpäisevyyttä.
 
Menetelmät, joilla mitataan ihon kautta imeytymistä, voidaan jakaa 
kahteen luokkaan:  in vivo  -menetelmiin ja  in vitro  -menetelmiin.  In 
vivo -menetelmällä voidaan saada luotettavaa tietoa useilla koe-eläin ­
lajeilla. Sittemmin on kehitetty  in vitro  -menetelmiä. Niissä tutkitaan 
testiaineen kulkeutumista ihmisestä tai eläimestä otetun ohennetun 
ihonäytteen tai kokoihonäytteen läpi nesteisiin.  In vitro  -menetelmä 
kuvataan erillisessä testiohjeessa (1). OECD:n asiakirjasta ”Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies” (2) on apua valittaessa sopivinta menetelmää kulloiseenkin erityistilanteeseen. 
Teos tarjoaa lisätietoa sekä  in vivo  -menetelmien että  in vitro  -me­
netelmien soveltuvuudesta.
 
Tässä testiohjeessa kuvatulla  in vivo  -menetelmällä määritetään testi ­
aineen penetraatio ihon läpi verenkiertoon. Menetelmä on ollut laa ­
jassa käytössä useiden vuosien ajan (3) (4) (5) (6) (7). Vaikka  in 
vitro  -ihoabsorptiotestit voivat monissa tapauksissa olla sopivia, on 
tilanteita, joissa vain  in vivo  -kokeella saadaan tarvittavat tiedot.  
In vivo  -menetelmän etuna on, että siinä käytetään fysiologisesti ja 
metabolisesti ehyttä järjestelmää sekä useille myrkyllisyystesteille 
yhteistä lajia. Lisäksi  in vivo  -menetelmää voidaan mukauttaa siten, 
että siinä voidaan käyttää myös muita lajeja. Haittana on, että siinä käytetään eläviä eläimiä ja radioaktiivia merkkiaineita, jotta taattai ­
siin tulosten luotettavuus.  In vivo  -testissä on myös vaikea määrittää 
varhainen imeytymisvaihe. Lisäksi testiä varten suositeltavan koe- 
eläimen (rotan) ja ihmisen ihon läpäisevyysominaisuudet poikkeavat toisistaan. Eläimen iho on yleensä läpäisevämpi, minkä vuoksi eläi ­
millä tehdyissä kokeissa voidaan yliarvioida ihmisen ihoabsorptio (6) 
(8) (9). Syövyttäviä emäksiä tai muita syövyttäviä aineita ei pitäisi 
testata elävillä elämillä.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 638
 
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Imeytymätön annos:  se testiaineen määrä, joka pestään iholta altis ­
tuksen jälkeen ja joka on jäänyt ei-okklusiivisen suojan pinnalle, mukaan lukien se testiaineen määrä, jonka voidaan osoittaa haihtu ­
neen iholta altistuksen aikana
 
Imeytynyt annos  (in vivo)  se testiaineen määrä, joka on virtsassa, 
koe-eläinhäkin pesuvedessä, ulosteessa, uloshengitysilmassa (jos mi ­
tattu), veressä, kudoksissa (jos kerätty) sekä eläimen ruumiissa sen 
jälkeen, kun aplikointialueen iho on poistettu.  
Mahdollisesti imeytyvä annos:  se testiaineen määrä, joka on iholla 
tai ihossa sen jälkeen, kun iho on pesty.  
1.3 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Testiaine, joka suositellaan leimattavaksi radioaktiivisella merkki ­
aineella, aplikoidaan eläinten iholle, jolta on leikattu karvat. Testiaine 
annostellaan yleisesti käytössä olevan valmisteen muodossa, ja an ­
nostelussa käytetään yhtä tai useampaa sopivaa annostasoa. Testi ­
aineen annetaan olla kosketuksissa ihon kanssa tietyn ajan sopivan 
suojan alla (ei-okklusiivinen, puoliokklusiivinen tai okklusiivinen), 
jotta eläin ei voi niellä testiainetta. Altistusajan lopussa suoja pois ­
tetaan ja iho puhdistetaan sopivalla puhdistusaineella. Suoja ja puh ­
distuksessa käytetyt materiaalit kerätään talteen analyysiä varten, ja 
ihon päälle pannaan uusi suoja. Eläimet ovat ennen altistusta, altis ­
tuksen aikana ja altistuksen jälkeen kukin erillisessä aineenvaihdun ­
tahäkissä, jossa eritteet ja uloshengitysilma kerätään koko ajalta tal ­
teen analyysiä varten. Uloshengitysilman kerääminen ei ole välttä ­
mätöntä, jos on riittävää näyttöä siitä, että haihtuvia radioaktiivisia 
metaboliitteja muodostuu vain vähän tai ei lainkaan. Kussakin tutki ­
muksessa käytetään normaalisti useita eläinryhmiä, jotka altistetaan testiaineelle. Yksi ryhmä lopetetaan altistusajan lopussa. Muut ryh ­
mät lopetetaan määräaikavälein sen jälkeen (2). Näytteenottoajan 
lopussa lopetetaan jäljellä olevat eläimet, veri kerätään talteen ana ­
lyysiä varten, altistusalueen iho poistetaan analyysiä varten ja tutki ­
taan, onko eläimen kehossa erittymätöntä materiaalia. Näytteistä teh ­
dään määritykset sopivin menetelmin ja ihoabsorption aste arvioi ­
daan (6) (8) (9).
 
1.4 MENETELMÄN KUVAUS  
1.4.1  Koe-eläinten valinta  
Yleisimmin käytetty laji on rotta, mutta voidaan käyttää myös muita 
karvattomia kantoja ja lajeja, joiden ihoabsorption nopeus vastaa 
enemmän ihmisen ihon abosorptionopeutta (3) (6) (7) (8) (9). Tes ­
tissä pitäisi käyttää nuoria täysikasvuisia elämiä, jotka ovat samaa sukupuolta (oletusarvoisesti uroksia) ja peräisin yleisesti käytetyistä laboratoriokannoista. Testin alussa koe-eläinten paino saa vaihdella 
enintään ± 20 % keskipainosta. Esimerkiksi 200–250 g painavat 
urosrotat ovat sopivia (erityisesti painoasteikon yläosassa).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 639
 
1.4.2  Eläinten lukumäärä ja sukupuoli  
Kunkin testiaineen ja kunkin lopetusajankohdan osalta on käytettävä 
vähintään neljä samaa sukupuolta edustavan eläimen ryhmää. Kukin eläinryhmä lopetetaan eri ajankohtina, esimerkiksi altistusajan lo ­
pussa (tyypillisesti 6 tai 24 tuntia) ja sen jälkeen määräajankohtina 
(esim. 48 ja 72 tunnin kuluttua). Jos on näyttöä merkittävistä eroista uros- ja naarasyksilöiden ihomyrkyllisyydessä, on valittava herkempi sukupuoli. Jos tällaista näyttöä ei ole, voidaan valita kumpi tahansa 
sukupuoli.
 
1.4.3  Häkit ja ruokinta  
Koe-eläinhuoneen lämpötilan on oltava 22  o C (± 3  o C). Suhteellisen 
kosteuden on oltava vähintään 30 % eikä mielellään yli 70 % muul ­
loin kuin huoneen siivouksen aikana. Suhteellinen kosteus pitäisi 
kuitenkin pyrkiä pitämään välillä 50–60 %. Valolähteenä on keino ­
valo, jaksoittaisuus 12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeyttä. Ravintona voidaan käyttää tavanomaista laboratoriorehua, jota pitäisi olla jatku ­
vasti eläinten saatavilla samoin kuin juomavettä. Testin ja mielellään 
myös laboratorio-olosuhteisiin totutuksen aikana eläimet ovat aineen ­
vaihduntahäkeissä (yksi kussakin). Koska ruoan ja veden läikkymi ­
nen vaikuttaisi tuloksiin, sen todennäköisyys on minimoitava.
 
1.4.4  Eläinten preparointi  
Eläimet merkitään, jotta ne voidaan tunnistaa yksilökohtaisesti, ja 
pidetään häkeissä vähintään viisi päivää ennen testin alkua, jotta ne voidaan totuttaa laboratorio-olosuhteisiin.
 
Totutusajan lopussa ja noin 24 tuntia ennen testiaineen annostelua 
kultakin eläimeltä leikataan karvat osalta hartioiden ja selän alueen 
ihoa. Vahingoittuneen ihon läpäisevyysominaisuudet poikkeavat ehyen ihon läpäisevyysominaisuuksista, minkä vuoksi on vältettävä ihon raapiintuminen tai hiertyminen. Karvojen leikkaamisen jälkeen 
ja noin 24 tuntia ennen testiaineen aplikointia (ks. kohta 1.4.7) iho ­
näytteen pinta pyyhitään asetonilla talin poistamiseksi. Muuta pesua saippualla ja vedellä ei suositella, koska saippuajäämät voivat edistää testiaineen imeytymistä. Pinta-alan on oltava tarpeeksi suuri (mielel ­
lään aikakin 10 cm
 2 ), jotta voidaan luotettavasti määrittää testikemi ­
kaalin imeytynyt määrä ihoneliösenttimetriä kohti. Kymmenen neliö ­
sentimetrin näyte saadaan rotista, joiden paino on 200–250 g. Prepa ­
roinnin jälkeen eläimet pannaan takaisin aineenvaihduntahäkkeihin.  
1.4.5  Testiaine  
Testiaine on aine, jonka penetraatio-ominaisuuksia testissä tutkitaan. 
Testiaine suositellaan leimattavaksi radioaktiivisella merkkiaineella.  
1.4.6  Testin valmistelu  
Testiainevalmisteen (esim. testiaineen sisältävä laimentamaton tai lai ­
mennettu materiaali tai formulaatio, joka aplikoidaan iholle) on ol ­
tava sama kuin valmiste, jolle ihmiset tai muut kohdelajit voivat 
altistua, tai kyseisen valmisteen realistinen korvike. Käytössä ole ­
vasta valmisteesta poikkeaminen on perusteltava. Tarvittaessa testi ­
aine on liuotettava tai suspendoitava sopivaan kantaja-aineeseen. Jos 
kantaja-aineena käytetään muuta kuin vettä, sen imeytymisominai ­
suudet ja mahdollinen reagointi testiaineen kanssa on tunnettava.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 640
 
1.4.7  Aplikointi iholle  
Ihon pinnalle määritetään aplikointialue (tietty pinta-ala). Tunnettu 
määrä testiainetta aplikoidaan tasaisesti tälle alueelle. Määrän olisi jäljiteltävä altistumista ihmisissä, minkä vuoksi se on tyypillisesti 
1–5 mg/cm
 2 , kun testiaine on kiinteä, ja enintään 10 μl/cm  2 , kun 
testiaine on nestemäinen. Jos käytetään muuta määrää, tämä pitäisi perustella ennakoiduilla käyttöolosuhteilla, tutkimuksen tavoitteilla ja testiaineen fysikaalisilla ominaisuuksilla. Aplikoinnin jälkeen on es ­
tettävä se, että eläin puhdistaa alueen. Kuvassa 1 on esimerkki tyy ­
pillisestä laitteesta. Tavallisesti aplikointialue peitetään ei-okklusii ­
visella suojalla (esim. läpäisevällä nailonharsolla). Jos on kyse rajoit ­
tamattomasta annoksesta, aplikointialue on peitettävä okklusiivisella 
suojalla. Jos puolihaihtuvien testiaineiden haihtuminen vähentää tes ­
tiaineen saantonopeutta liikaa (ks. myös kohta 1.4.10, ensimmäinen alakohta), haihtunut aine on kerättävä laitteen peittävään hiilisuodat ­
timeen (ks. kuva 1). On tärkeää huolehtia siitä, että mikään väline ei 
vahingoita ihoa eikä absorboi testiainetta tai reagoi sen kanssa. Eläi ­
met palautetaan aineenvaihduntahäkkeihin eritteiden keräämiseksi.
 
1.4.8  Altistus- ja näytteenottoaika  
Altistusaika on aika, joka kuluu testiaineen aplikoinnista sen poista ­
miseen (ihon pesemiseen). Altistusaika (tyypillisesti 6 tai 24 tuntia) valitaan sen mukaan, mikä on ennakoitu altistusaika ihmisissä. Al ­
tistusajan jälkeen eläimiä pidetään aineenvaihduntahäkeissä niiden 
lopettamisajankohtaan asti. Koko testin ajan on tarkistettava mää ­
rävälein, onko eläimissä merkkejä toksisuudesta tai esiintyykö epä ­
normaaleja reaktioita. Altistusajan lopussa on tarkistettava, onko kä ­
sitellyssä ihossa näkyviä merkkejä ärsytyksestä.
 
Aineenvaihduntahäkkien on oltava sellaisia, että virtsa ja ulosteet 
voidaan kerätä kumpikin erikseen koko testin ajan. Lisäksi  14 C-hii­
lidioksidi ja haihtuvat  14 C-hiiliyhdisteet on voitava kerätä. Nämä on 
analysoitava, jos niiden määrä on > 5 %. Virtsa, ulosteet ja haihtu ­
vien aineiden keräämiseen tarkoitettu neste (esim.  14 C-hiilidioksidi ja 
haihtuvat  14 C-yhdisteet) on kerättävä kukin erikseen kustakin ryh ­
mästä kunakin näytteenottoajankohtana. Jos on riittävää näyttöä, 
että haihtuvia radioaktiivisia metaboliitteja muodostuu vain vähän tai ei lainkaan, voidaan käyttää avoimia häkkejä.
 
Eritteet kerätään altistuaikana 24 tunnin ajalta ensimmäisen ihokon ­
taktin jälkeen ja tämän jälkeen päivittäin testin loppuun asti. Yleensä riittää, että eritteet kerätään kolme kertaa, mutta testiaineen ennakoi ­
dun käyttötarkoituksen tai käytettävissä olevien kineettisten tietojen 
perusteella ajankohtia voidaan lisätä tai niitä voidaan muuttaa.
 
Altistusajan lopussa suoja poistetaan kustakin eläimestä ja pannaan 
talteen erillistä analyysiä varten. Kaikkien eläinten käsitelty iho pes ­
tään vähintään kolme kertaa puhdistusaineella käyttäen sopivia tup ­
poja. Muiden ruumiinosien kontaminoituminen on huolellisesti väl ­
tettävä. Puhdistusaineen pitäisi olla normaalien hygieniakäytäntöjen 
mukainen (esim. vesi-saippualiuos). Lopuksi iho kuivataan. Kaikki tupot ja pesuvedet pannaan talteen analyysiä varten. Ennen eläinten siirtämistä häkkeihin asetetaan paikalleen uusi suoja suojaamaan kä ­
siteltyä aluetta niissä eläimissä, joiden ryhmät lopetetaan vasta myö ­
hemmin.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 641
 
1.4.9  Lopetus  
Kunkin ryhmän eläimet lopetetaan määräajankohtana ja veri kerätään 
talteen analyysiä varten. Suoja tai peite poistetaan analyysiä varten. Aplikointialueen iho ja vastaava alue ihoa, jolta on leikattu karvat 
mutta jota ei ole altistettu testiaineelle, poistetaan kustakin eläimestä 
erillistä analyysiä varten. Aplikointialueen iho voidaan jaottaa erot ­
tamalla marraskesi sen alla olevasta orvaskedestä, jotta saataisiin tarkemmat tiedot testikemikaalin jakautumisesta. Tämän jakautumi ­
sen määrittäminen tietyltä ajalta altistusajan jälkeen tarjoaa tietoa 
siitä, miten testikemikaali läpäisee marraskeden. Ihon jaotuksen hel ­
pottamiseksi (ihon viimeisen pesun ja eläimen lopettamisen jälkeen) 
kukin suoja poistetaan. Aplikointialue (ja rengasmainen alue ympä ­
röivää ihoa) leikataan rotasta ja kiinnitetään levylle. Pala teippiä painetaan varovasti ihon pinnalle ja irrotetaan sitten niin että osa marraskettä tulee mukaan. Menettely toistetaan uusilla teipinpaloilla, 
kunnes teippi ei enää kiinnity ihon pintaan (kun koko marraskesi on 
poistettu). Kunkin eläimen kaikki teipinpalat pannaan samaan asti ­
aan, johon lisätään liuotinta, joka pystyy liuottamaan marraskeden täydellisesti. Mahdolliset kohdekudokset voidaan poistaa erillistä 
analyysiä varten ennen kuin jäljellä olevan eläimen ruumis analysoi ­
daan (ruumiiseen imeytynyt annos). Yksittäiset eläinten ruumiit pan ­
naan talteen analyysiä varten. Yleensä riittää kokonaissisällön ana ­
lyysi. Kohde-elimet voidaan kuitenkin ottaa erilleen erillistä analyy ­
siä varten (jos muut tutkimukset antavat tähän aihetta). Virtsarakossa 
eläinten lopettamishetkellä oleva virtsa lisätään aikaisemmin kerät ­
tyyn virtsamäärään. Kun aineenvaihduntahäkeistä on kerätty eritteet eläinten lopettamisen yhteydessä, häkit ja niiden keräyslaitteet pes ­
tään sopivalla liuottimella. Myös muut mahdollisesti kontaminoitu ­
neet välineet on analysoitava.
 
1.4.10  Analyysi  
Kaikissa kokeissa on päästävä riittävään saantoon (keskiarvon on 
oltava 100 ± 10 % radioaktiivisuudesta). Poikkeamat tästä on perus ­
teltava. Kussakin näytteessä oleva määrä analysoidaan asianmukai ­
sesti validoiduilla menetelmillä.  
Kunkin aplikoinnin osalta on määritettävä rinnakkaisnäytteiden ha ­
jonta.  
2. TULOKSET  
Kunkin eläimen osalta on tehtävä testikemikaalista ja/tai metabolii ­
teista kunakin näytteenottoajankohtana seuraavat mittaukset. Yksit ­
täisten tulosten lisäksi on ilmoitettava kootut tulokset näytteenotto ­
ajankohdittain keskiarvoina.  
— suojan pinnalle jäänyt määrä,  
— määrä, joka voidaan irrottaa iholta,  
— ihossa tai iholla oleva määrä, jota ei voida pestä siitä,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 642
 
— näytteenä otetussa veressä oleva määrä,  
— eritteissä ja uloshengitysilmassa oleva määrä (jos määritetty),  
— kuolleen eläimen ruumiissa ja erillistä analyysiä varten poiste ­
tuissa elimissä oleva määrä.  
Eritteissä, uloshengitysilmassa, veressä ja kuolleen eläimen kehossa 
olevan testiaineen ja/tai metaboliittien määrän perusteella voidaan määrittää kunakin ajankohtana imeytynyt kokonaismäärä. Lisäksi voidaan laskea altistusaikana imeytynyt testikemikaalin määrä iho ­
neliösenttimetriä kohti.
 
3. RAPORTOINTI  
3.1 TESTISELOSTE  
Testiselosteessa on esitettävä, miten testiohjeessa asetetut vaatimuk ­
set on täytetty (mm. käytetyn testijärjestelmän perustelut). Siinä on 
oltava seuraavat tiedot:  
Testiaine:  
— tunnistetiedot (esim. CAS-numero, jos se tiedetään; toimitusläh ­
de; puhtaus (radiokemiallinen puhtaus); tunnetut epäpuhtaudet; 
erän numero),  
— fysikaalinen muoto ja fysikokemialliset ominaisuudet (esim. pH, 
haihtuvuus, liukoisuus, stabiilius, molekyylipaino ja log P  ow ). 
Testiainevalmiste:  
— formulaatio ja käytön perustelut,  
— valmiste, aplikoitu annos, aineen pitoisuus valmisteessa, kantaja- 
aine, stabiilius ja homogeenisyys.  
Koe-eläin:  
— käytetty laji/kanta,  
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli,  
— eläinten hankintapaikka, häkit, rehut jne.,  
— yksittäisten eläinten paino testin alussa.  
Koeolosuhteet:  
— testiaineen annostelu (aplikointialue, määritysmenetelmät, okk ­
luusio vai ei, volyymi, uutto, osoitusmenetelmä),  
— ravinnon ja veden laatu.  
Tulokset:  
— mahdolliset merkit toksisuudesta,  
— absorptiotulokset taulukkomuodossa (imeytymisnopeutena sekä 
määränä tai prosenttiosuutena).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 643
 
— testin kokonaissaannot,  
— tulosten tulkinta, vertailu mahdollisiin käytettävissä oleviin tietoi ­
hin, jotka koskevat testiyhdisteen imeytymistä ihon läpi.  
Tulosten pohdinta.  
Johtopäätökset.  
4. KIRJALLISUUSVIITTEET  
1. Testing Method B.45. Skin Absorption:  In vitro  Method.  
2. OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
3. ECETOC (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for 
Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph No. 20.  
4. Zendzian RP (1989) Skin Penetration Method suggested for En ­
vironmental Protection Agency Requirements.  J. Am. Coll. Toxi ­
col. 8(5), 829–835.  
5. Kemppainen BW, Reifenrath WG (1990) Methods for skin ab ­
sorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.  
6. EPA (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and App ­
lications. Exposure Assessment Group, Office of Health and En ­
vironmental Assessment.  
7. EPA (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, 
Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic 
Substances.  
8. Bronaugh RL, Wester RC, Bucks D, Maibach HI and Sarason R 
(1990)  In vivo  percutaneous absorption of fragrance ingredients 
in reshus monkeys and humans.  Fd. Chem. Toxic.  28, 369–373.  
9. Feldman RJ and Maibach HI (1970) Absorption of some organic 
compounds through the skin in man. J.  Invest Dermatol.  54, 
399–404.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 644
 
Kuva 1  
Esimerkki tyypillisestä laitteesta, jota käytetään suojaamaan aplikointialue  in vivo  
-ihoabsorptiotestissä
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 645
 
B.45.  IHON KAUTTA IMEYTYMINEN:  IN VITRO  -MENETELMÄ  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro TG 428 (2004)  
1.1. JOHDANTO  
Tämän testimenetelmän tarkoituksena on tarjota tietoa poisleikatulle 
ihonäytteelle aplikoidun testiaineen imeytymisestä. Se voidaan suo ­
rittaa yhdessä testimenetelmän ”Ihon kautta imeytyminen:  In vivo  
-menetelmä” (1) kanssa tai erikseen. Tähän testimenetelmään perus ­
tuvien kokeiden suunnittelussa suositellaan käytettäväksi apuna OECD:n asiakirjaa ”Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies” (2). OECD:n asiakirjasta on apua valittaessa 
sopivaa  in vitro -menetelmää erityisolosuhteisiin, jotta voidaan var ­
mistaa testimenetelmällä saatavien tulosten luotettavuus.
 
Menetelmät, joilla määritetään aineen imeytymistä ja vapautumista 
elimistöön ihon kautta, voidaan jakaa kahteen luokkaan:  in vivo  
-menetelmiin ja  in vitro  -menetelmiin. Ihoabsorption  in vivo  -mää­
ritysmenetelmät ovat vakiintuneita ja tarjoavat farmakokineettistä tie ­
toa useiden eri eläinlajien osalta.  In vivo  -menetelmä kuvataan eril ­
lisessä testiohjeessa (1). Myös  in vitro  -menetelmiä on käytetty usei ­
den vuosien ajan ihoabsorption määrittämiseen. Vaikka tämän testi ­
ohjeen kattamista  in vitro  -menetelmistä ei ole tehty virallisia vali ­
dointitutkimuksia, OECD:n asiantuntijat katsoivat vuonna 1999, että  
in vitro  -menetelmän tueksi oli riittävä määrä eveluoituja tutkimus ­
tuloksia (3). OECD:n asiakirjassa annetaan tämän tueksi lisätietoja (mm. runsaasti  in vitro  -menetelmien ja  in vivo  -menetelmien suoraa 
vertailutietoa) (2). Aiheesta on tehty useita erityisteoksia, jotka tarjo ­
avat yksityiskohtaista taustatietoja  in vitro  -menetelmän käytön tueksi 
(4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12).  In vitro  -menetelmillä mitataan 
kemikaalien diffundoitumista ihoon ja ihon läpi nesteisiin. Niissä voidaan käyttää ei-elävää ihoa, kun määritetään vain diffundoitumi ­
nen, tai tuoretta aineenvaihdunnallisesti aktiivia ihoa, jos määritetään 
samalla sekä diffundoituminen että ihon aineenvaihdunta. Näille me ­
netelmille on erityistä käyttöä luokiteltaessa erityyppisiä kemikaaleja sen mukaan, miten ne voidaan vapauttaa erilaisista formulaatioista 
ihoon tai ihon läpi. Ne ovat myös hyödyllisiä malleja arvioitaessa 
ihon läpi imeytymistä ihmisissä.
 
In vitro  -menetelmää ei voida soveltaa kaikissa tilanteissa eikä kaik ­
kiin kemikaaleihin.  In vitro  -testimenetelmää voi olla mahdollista 
soveltaa ihopenetraation alustavaan laadulliseen arviointiin. Joissain tapauksissa tämä voi vaatia tuekseen  in vivo  -testejä. OECD:n asia ­
kirja (2) antaa lisätietoja tilanteista, joihin  in vitro  -menetelmä sovel ­
tuu. Muuta lisätietoa päätöksen tueksi: kirjallisuusviite (3).
 
Tässä testiohjeessa esitetään yleiset periaatteet testiaineen ihoabsorp ­
tion määrittämiseksi käyttämällä ihopalaa näytteenä. Siinä voidaan käyttää useiden nisäkäslajien (myös ihmisen) ihoa. Ihon läpäisevyy ­
sominaisuudet säilyvät sen jälkeen, kun iho on leikattu kehosta, 
koska diffundoitumisen pääasiallinen este on ihon kuollut pintakerros 
eli marraskesi; kemikaalien aktiivista kuljetusta ihon läpi ei ole voitu todeta. Ihon on todettu kykenevän metabolisoimaan joitakin kemi ­
kaaleja imeytymisen aikana (6), mutta tämä ei rajoita varsinaisen 
annoksen imeytymisnopeutta. Se voi kuitenkin vaikuttaa verenkier ­
toon pääsevän aineen luonteeseen.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 646
 
1.2. MÄÄRITELMÄT  
Imeytymätön annos:  se testiaineen määrä, joka pestään iholta altis ­
tuksen jälkeen ja joka on jäänyt ei-okklusiivisen suojan pinnalle, mukaan lukien se testiaineen määrä, jonka voidaan osoittaa haihtu ­
neen iholta altistuksen aikana
 
Imeytynyt annos  (in vitro):  se testiaineen määrä, joka päätyy vas ­
taanottonesteeseen tai verenkiertoon tietyn ajan kuluessa  
Mahdollisesti imeytyvä annos  (in vitro):  se testiaineen määrä, joka 
on iholla tai ihossa sen jälkeen, kun iho on pesty.  
1.3. TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Testiaine, joka voi olla radioaktiivisella merkkiaineella leimattu, ap ­
likoidaan diffuusiokammion eri osastojen väliin asetetun ihonäytteen pinnalle. Kemikaalia pidetään iholla tietyn ajan tietyissä olosuhteissa, 
minkä jälkeen se poistetaan sopivalla puhdistusmenetelmällä. Vas ­
taanottonesteestä otetaan koko testin ajan määräajankohdin näytteet sen tarkistamiseksi, onko vastaanottonesteessä testikemikaalia ja/tai sen metaboliitteja.
 
Käytettäessä aineenvaihdunnallisesti aktiiveja järjestelmiä testikemi ­
kaalin metaboliitit voidaan analysoida sopivin menetelmin. Testin 
lopussa testikemikaalin ja (tapauksesta riippuen) sen metaboliittien jakautuminen kvantifioidaan.
 
Testiaineen imeytyminen tietyn ajan kuluessa määritetään analysoi ­
malla vastaanottoneste ja käsitelty iho. Vaadittavat olosuhteet kuva ­
taan tässä testiohjeessa ja OECD:n asiakirjassa (2). Ihossa edelleen 
oleva testiaine on katsottava imeytyneeksi, ellei voida osoittaa, että 
imeytyminen voidaan määrittää vain vastaanottonestettä analysoimal ­
la. Analysoimalla muut testijärjestelmän komponentit (iholta pesty materiaali ja ihokerroksissa edelleen oleva materiaali) voidaan saada 
lisätietoja, joiden perusteella voidaan määrittää muun muassa testi ­
aineen eri komponentteihin jakautuminen ja saantoprosentti (koko ­
naismäärät).
 
Jotta voidaan osoittaa testijärjestelmän suorituskyky ja luotettavuus 
laboratoriossa, käytettävissä on oltava sopivilla vertailukemikaaleilla 
hankitut tulokset, joiden on oltava sopusoinnussa käytettyä menetel ­
mää koskevan julkaistun kirjallisuuden kanssa. Tämä vaatimus voi ­
daan täyttää testaamalla sopiva vertailuaine (mielellään testiainetta muistuttava rasvaliukoinen aine) samanaikaisesti testiaineen kanssa 
tai tarjoamalla riittävät aiemmat tiedot useista vertailuaineista, joiden 
rasvaliukoisuus poikkeaa toisistaan (esim. kafeiini, bentsoehappo ja testosteroni).
 
1.4. TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.4.1  Diffuusiokammio  
Diffuusiokammio muodostuu lähettäjä- ja vastaanotto-osastosta, joi ­
den väliin ihonäyte asetetaan (tyypillinen diffuusiokammio esitetään 
kuvassa 1). Ihopalan reunat on kiinnitettävä tiiviisti kammioon, ja 
kammion pitäisi mahdollistaa helppo näytteidenotto. Ihonäytteen ala ­
pinnan kanssa kosketuksissa olevan vastaanottoliuoksen pitäisi voida sekoittua hyvin. Diffuusiokammion ja sen sisällön lämpötilan on 
oltava säädettävissä. Sekä staattista että läpivirtausjärjestelmää käyt ­
täviä diffuusiokammioita voidaan käyttää. Tavallisesti lähettäjäosas ­
tossa ei käytetä okkluusiota, kun ihonäytettä altistetaan rajalliselle määrälle testiainetta. Lähettäjäosastossa voidaan kuitenkin käyttää 
okkluusiota, jos altistusannosta ei ole rajoitettu, sekä myös tietyissä 
rajallisilla annoksilla tehtävissä kokeissa.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 647
 
1.4.2.  Vastaanottoneste  
Fysiologisesti yhteensopivan vastaanottoliuoksen käyttö on suositel ­
tavaa, mutta myös muunlaisia vastaanottoliuksia voidaan käyttää, kunhan tämä perustellaan. Vastaanottonesteen tarkka koostumus on 
ilmoitettava. On osoitettava, että testikemikaalilla on riittävä liukene ­
vuus vastaanottonesteessä, jotta tämä ei toimi esteenä imeytymiselle. Lisäksi vastaanottoneste ei saa vaikuttaa ihonäytteen funktionaaliseen eheyteen. Läpivirtausjärjestelmässä virtausnopeus ei saa haitata testi ­
aineen diffundoitumista vastaanottonesteeseen. Staattisessa kammio ­
järjestelmässä nestettä on jatkuvasti sekoitettava ja siitä on otettava näytteitä säännöllisesti. Jos tutkitaan metaboliaa, ihonäytteen on py ­
syttävä elävänä koko testin ajan.
 
1.4.3  Ihonäytteet  
Testissä käytetään ihmisestä tai eläimestä otettua ihoa. Ihmisihon 
käyttöön on sovellettava kansallisia ja kansainvälisiä eettisiä käytän ­
töjä ja ehtoja. On suositeltavaa käyttää elävää ihoa, mutta myös kuollutta ihoa voidaan käyttää, kunhan osoitetaan ihon funktionaa ­
linen eheys. Hyväksyttäviä ovat joko (entsyymi, lämpö- tai kemial ­
lisilla menetelmillä erotetut) orvaskesikalvot tai ihohöylällä (derma ­
tomilla) irrotetut ohennetut ihonäytteet (split thickness skin) (paksuus tyypillisesti 200–400 μm). Myös kokoihonäytteitä (full thickness 
skin) voidaan käyttää, mutta liiallista ihonäytteen paksuutta (n. > 
1 mm) pitäisi välttää, ellei sitä erityisesti edellytetä testikemikaalin määrittämiseksi ihokerroksissa. Laji, anatominen näytteenottopaikka ja käytetty menetelmä on perusteltava. Hyväksyttävät testitulokset 
tarvitaan vähintään neljästä rinnakkaisesta näytteestä testiä kohti.
 
1.4.4  Ihonäytteen eheys  
On tärkeää, että ihonäyte valmistetaan oikein. Epäasianmukainen 
käsittely voi vahingoittaa marraskettä, minkä vuoksi ihonäytteen eheys on varmistettava. Jos tutkimuskohteena on ihon metabolia, 
vastaleikattu ihonäyte pitäisi käyttää testissä mahdollisimman pian 
ja olosuhteissa, joiden tiedetään tukevan metabolista toimintaa. Yleissääntönä on, että vastaleikattu iho käytetään 24 tunnin kuluessa, mutta hyväksyttävä varastointiaika voi vaihdella riippuen aineenvaih ­
duntaan osallistuvasta entsyymijärjestelmästä ja varastointilämpöti ­
lasta (13). Jos ihonäytteet on varastoitu ennen käyttöä, on osoitetta ­
va, että ihon läpäisyä estävät ominaisuudet ovat testiajankohtana ennallaan.
 
1.4.5  Testiaine  
Testiaine on aine, jonka penetraatio-ominaisuuksia testissä tutkitaan. 
Testiaine suositellaan leimattavaksi radioaktiivisella merkkiaineella.  
1.4.6  Testin valmistelu  
Testiainevalmisteen (esim. testiaineen sisältävä laimentamaton tai lai ­
mennettu materiaali tai formulaatio, joka aplikoidaan iholle) olisi mielellään oltava sama kuin valmiste, jolle ihmiset tai muut kohde ­
lajit voivat altistua, tai kyseisen valmisteen realistinen korvike. Käy ­
tössä olevasta valmisteesta poikkeaminen on perusteltava.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 648
 
1.4.7  Testiaineen pitoisuudet ja formulaatiot  
Normaalisti käytetään useampaa kuin yhtä testiaineen pitoisuutta si ­
ten, että pitoisuudet kattavat potentiaalisen altistuksen yläpään arvot (ihmisissä). Samoin on harkittava useiden tyypillisten formulaatioi ­
den testaamista.
 
1.4.8  Aplikointi iholle  
Ihmisen altistuessa kemikaaleille annokset ovat normaalioloissa ra ­
jallisia. Siksi altistumista jäljittelevässä annostelussa testiainetta apli ­
koidaan iholle tavallisesti 1-5 mg/cm  2 , kun testiaine on kiinteä, ja 
enintään 10 μl/cm  2 , kun testiaine on nestemäinen. Aplikoitavan mää ­
rän perusteluina ovat ennakoidut käyttöolosuhteet, tutkimuksen ta ­
voitteet ja testivalmisteen fysikaaliset ominaisuudet. Esimerkiksi tes ­
tiaineen aplikointi voi olla rajoittamatonta tapauksissa, joissa valmis ­
tetta aplikoidaan suuria määriä pinta-alayksikköä kohti.  
1.4.9  Lämpötila  
Lämpötila vaikuttaa kemikaalien passiiviseen diffuusioon (ja näin 
ollen niiden imeytymiseen ihon läpi). Diffuusiokammion ja ihonäyt ­
teen lämpötila on pidettävä vakiona lähellä ihon normaalilämpötilaa 32 ± 1
 o C. Erilaiset diffuusiokammiot edellyttävät erilaisia vesihau ­
teen ja blokkikuumentimen lämpötiloja, jotta varmistetaan, että vas ­
taanottofaasi tai ihonäyte on fysiologisessa vakiotilassaan. Suhteelli ­
sen kosteuden arvoksi suositellaan 30–70 %.  
1.4.10  Altistusaika ja näytteenotto  
Ihoa voidaan altistaa testiaineelle koko testin ajan tai lyhyempiä 
aikoja (esim. jonkin tietyntyyppisen altistuksen jäljittelemiseksi). Iholta pestään ylimääräinen testiaine sopivalla puhdistusaineella, ja 
huuhteluvesi kerätään talteen analyysiä varten. Menetelmä, jolla tes ­
tiaine poistetaan, riippuu ennakoiduista käyttöolosuhteista, ja se on perusteltava. Näytteenottoaika on tavallisesti 24 tuntia, jotta absorp ­
tioprofiili voitaisiin karakterisoida riittävästi. Koska ihon eheys voi 
alkaa heikentyä 24 tunnin kuluttua, näytteenottoaika ei tavallisesti 
saisi ylittää 24 tuntia. Jotkin aineet edellyttävät pitempää näytteen ­
ottoaikaa (24 tuntia), mutta nopeasti imeytyville se ei ehkä ole tar ­
peen. Vastaanottonesteestä on otettava näytteitä tarpeeksi tiheästi, 
jotta testiaineen absorptioprofiili voidaan esittää graafisesti.
 
1.4.11  Loppumenettelyt  
Kaikki testijärjestelmän komponentit on analysoitava ja saanto mää ­
ritettävä. Komponetteihin kuuluvat lähettäjäosasto, ihonäytteen pin ­
nan huuhteluvesi, ihonäyte ja vastaanottoneste/osasto. Joissain ta ­
pauksissa iho voidaan erillistä analyysiä varten jaottaa ihon altistu ­
neeseen osaan, kammion reunan alla olevaan osaan, marrasketeen, orvasketeen ja verinahkaan.
 
1.4.11  Analyysi  
Kaikissa kokeissa on saavutettava riittävä saanto (keskiarvon on ol ­
tava 100 ± 10 % radioaktiivisuudesta; poikkeaminen tästä on perus ­
teltava). Vastaanottonesteessä, ihonäytteessä sekä ihon pinnan ja lait ­
teiden huuhteluvedessä oleva testiaine on analysoita sopivalla mene ­
telmällä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 649
 
2. TULOKSET  
Tuloksina esitetään vastaanottonesteen analyysi, testiaineen jakauma 
testijärjestelmässä ja absorptioprofiili ajan funktiona. Kun aplikoitu annos on rajallinen, iholta pesty määrä, ihossa (ihon eri kerroksissa, 
jos analysoitu erikseen) ja vastaanottonesteessä oleva määrä (imey ­
tymisnopeus sekä määrä tai prosenttiosuus aplikoidusta annoksesta) on määritettävä. Ihon läpi imeytyminen voidaan joskus ilmaista käyt ­
tämällä pelkästään vastaanottonesteen analyysistä saatuja tuloksia. 
Jos testiainetta on kuitenkin edelleen ihossa testin lopussa, se saattaa 
olla tarpeen sisällyttää imeytyneeseen kokonaismäärään (ks. kirjalli ­
suusviite [3], kohta 66). Jos on käytetty rajoittamatonta annosta, 
testitulosten perusteella voi olla mahdollista määrittää läpäisyvakio 
(K
 p ). Viimeksi mainitussa tapauksessa imeytymisprosentti ei ole 
merkityksellinen.  
3. RAPORTOINTI  
3.1. TESTISELOSTE  
Testiselosteessa on esitettävä, miten testiohjeessa asetetut vaatimuk ­
set on täytetty (mm. käytetyn testijärjestelmän perustelut). Siinä on oltava seuraavat tiedot:
 
Testiaine:  
— fysikaalinen olomuoto ja fysikokemialliset ominaisuudet (ainakin 
molekyylipaino ja log P  ow ), puhtaus (radiokemiallinen puhtaus)  
— tunnistetiedot (esim. erän numero)  
— liukoisuus vastaanottonesteeseen.  
Testiainevalmiste:  
— formulaatio ja käytön perustelut  
— homogeenisyys.  
Koeolosuhteet:  
— ihonäytteen lähde ja anatominen näytteenottopaikka, käytetty val ­
mistusmenetelmä, varastointiolosuhteet ennen käyttöä, mahdolli ­
nen esikäsittely (puhdistus, antibioottikäsittely jne.), ihon funk ­
tionaalisen eheyden määritys, metabolinen tila, käytön perustelut  
— diffuusiokammion tyyppi, vastaanottonesteen koostumus, vas ­
taanottonesteen virtausnopeus tai näytteenottoajat ja -menettelyt  
— testiaineen aplikointimenetelmä ja aplikoidun annoksen määrän 
määrittäminen  
— altistusaika  
— miten testiaine poistetaan iholta (esim. ihon huuhtelu)  
— ihonäytteen analyysimenetelmä ja mahdolliset jaotustekniikat, 
joita käytettiin jakautumisen määrittämiseksi ihossa  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 650
 
— diffuusiokammion ja muiden laitteiden pesumenetelmät  
— määritysmenetelmät, uuttomenetelmät, detektiorajat ja analyy ­
simenetelmän validointi.  
Tulokset:  
— kokonaissaanto (aplikoitu annos = ihon 
huuhteluvesi + ihonäyte + vastaanottoneste + diffuusiokammion huuhteluvesi)
 
— yksittäisten diffuusiokammioiden saannot kunkin osaston osalta 
(taulukkomuodossa)  
— absorptioprofiili  
— absorptiotiedot taulukkomuodossa (imeytymisnopeutena sekä 
määränä tai prosenttiosuutena).  
Tulosten pohdinta.  
Päätelmät.  
4. KIRJALLISUUSVIITTEET  
1. Testing Method B.44. Skin Absorption:  In vivo  Method.  
2. OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
3. OECD (2000). Report of the Meeting of the OECD Extended 
Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, An ­
nex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris.  
4. Kemppainen BW and Reifenrath WG. (1990). Methods for skin 
absorption. CRC Press, Boca Raton.  
5. Bronaugh RL and Collier, SW. (1991). Protocol for  In vitro  Per­
cutaneous Absorption Studies, in  In vitro Percutaneous Absorpti ­
on: Principles, Fundamentals and Applications,  RL Bronaugh and 
HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, pp. 237–241.  
6. Bronaugh RL and Maibach HI. (1991).  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications.  CRC 
Press, Boca Raton.  
7. European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemi ­
cals (1993). Monograph No. 20, Percutaneous Absorption, 
ECETOC, Brussels.  
8. Diembeck W, Beck H, Benech-Kieffer F, Courtellemont P, Du ­
puis J, Lovell W, Paye M, Spengler J, Steiling W (1999). Test 
Guidelines for  In Vitro  Assessment of Dermal Absorption and 
Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd Chem Tox, 37, 191–205.
 
9. Recommended Protocol for  In vitro  Percutaneous Absorption 
Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No. 65.  
10. Howes D, Guy R, Hadgraft J, Heylings JR  et al. (1996). Met ­
hods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM Workshop 
Report ATLA 24, 81 R10.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 651
 
11. Schaefer H and Redelmeier TE. (1996). Skin barrier: principles 
of percutaneous absorption. Karger, Basel.  
12. Roberts MS and Walters KA. (1998). Dermal absorption and 
toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.  
13. Jewell, C., Heylings, JR., Clowes, HM. And Williams, FM. 
(2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitrochlo ­
robenzene in vitro. Arch Toxicol 74: 356–365.  
Kuva 1  
Esimerkki tyypillisestä in vitro -ihoabsorptiotestissä käytettävästä staattisesta 
diffuusiokammiosta
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 652
 
B.46.  IN VITRO  -IHOÄRSYTTÄVYYS: REKONSTRUOIDUN 
IHMISORVASKEDEN TESTIMENETELMÄ  
JOHDANTO  
1. Ihoärsytyksellä tarkoitetaan korjautuvan ihovaurion syntymistä enintään 
neljä tuntia kestäneen testiaineen annostelun jälkeen (kuten on määritelty 
Yhdistyneiden kansakuntien (YK) GHS-järjestelmässä (Globally Harmoni ­
sed System for the Classification and Labelling of Chemical Substances and Mixtures) ja aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaa ­
misesta 16 päivänä joulukuuta 2008 annetussa Euroopan parlamentin ja 
neuvoston asetuksessa (EY) N:o 1272/2008 (CLP-asetus) (1) (3)). Tässä testimenetelmässä selostetaan  in vitro  -menettely, jolla voidaan määrittää 
ärsyttävien kemikaalien (aineiden ja seosten) vaarallisuus YK:n 
GHS-järjestelmän ja EU:n CLP-asetuksen luokan 2 mukaisesti (1) (2) (3). 
EU:ssa ja muilla alueilla, joilla ei ole hyväksytty YK:n GHS-järjestelmän valinnaista luokkaa 3 (lievästi ärsyttävät aineet), tätä testimenetelmää voi ­
daan käyttää myös luokittelemattomien kemikaalien (YK:n 
GHS-järjestelmän ja EU:n CLP-asetuksen ”ei luokitusta”) määrittämiseen (1) (3). Tämän testimenetelmän avulla voidaan määrittää kemikaalien iho ­
ärsytys yksittäisenä korvaavana testinä vaiheittaisen testausstrategian  in vivo  
-ihoärsytystestauksen asemesta (4 ja tämän liitteen B.4 luku).
 
2. Ihoärsyttävyyden arviointi on tyypillisesti edellyttänyt koe-eläinten käyttöä 
(OECD:n testiohje 404; tämän liitteen B.4 luku) (4). Eläinten hyvinvointiin liittyvien näkökohtien osalta menetelmää B.4 tarkistettiin vuonna 2004 niin, että ihosyövyttävyys ja ihoärsyttävyys voidaan määrittää soveltamalla vai ­
heittaista testausstrategiaa käyttäen  in vitro - tai ex vivo  -testimenetelmiä, 
joiden avulla vältetään eläimille aiheutuva kipu ja kärsimys. Kolme validoi ­
tua in vitro  -testimenetelmää on hyväksytty OECD:n testiohjeina 430, 431 
ja 435 (5) (6) (7) ja kaksi tämän liitteen B.40 ja B.40a lukuna, ja niitä 
voidaan käyttää menetelmän B.4 ja OECD:n testiohjeen 404 vaiheittaisen 
testausstrategian syövyttävyysosiossa (4).
 
3. Tässä testimenetelmässä tarkastellaan ihoärsytystä ihmisten terveyteen liit ­
tyvänä määrityskohteena. Tämä testimenetelmä perustuu ihmisen rekonst ­
ruoituun orvasketeen (Reconstructed human Epidermis, RhE), joka jäljitte ­
lee läheisesti ihmisihon ylemmän kerroksen eli epidermiksen biokemiallisia ja fysiologisia ominaisuuksia (solut ovat peräisin ihmisen orvaskeden kera ­
tinosyyteistä, ja testissä käytetään edustavaa kudos- ja soluarkkitehtuuria). 
Tähän testimenetelmään sisältyy myös sarja suoritusvaatimuksia (lisäys 2), 
joilla voidaan arvioida samanlaisia ja muunnettuja rekonstruoituun ihmisor ­
vasketeen perustuvia menetelmiä. Suoritusvaatimukset on kehittänyt EC-ECVAM (8) OECD:n ohjeasiakirjan nro 34 (9) periaatteiden mukaisesti.
 
4. On olemassa kolme validoitua menetelmää, joissa noudatetaan tätä testi ­
menetelmää. Validointia edeltävää vaihetta, optimointia ja validointia kos ­
kevat tutkimukset on saatettu päätökseen sen  in vitro  -menetelmän (10) 
(11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) osalta, jossa käytetään rekonstruoitua ihmisorvaskesimallia ja joka on kaupallisesti saatavilla ni ­
mellä EpiSkin
 TM (”validoitu vertailumenetelmä”, VVM). Kahdesta muusta 
kaupallisesti saatavilla olevasta ihoärsytyksen  in vitro  -menetelmästä, 
joissa käytetään RhE-menetelmää, on saatu samankaltaisia tuloksia kuin VVM:stä suoritusvaatimuksiin perustuvan validoinnin (21) perusteella. 
Nämä menetelmät ovat EpiDerm
 TM -ihoärsytystesti (EPI-200) ja SkinEt ­
hic TM -RhE-menetelmät (22).  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 653
 
5. Ennen kuin ehdotettua samanlaista tai mukautettua  in vitro  -RhE-menetel ­
mää, joka ei ole VVM, EpiDerm  TM -ihoärsytystesti (EPI-200) tai SkinEt ­
hic TM -RhE-menetelmä, voidaan käyttää lainsäädännössä määriteltyihin tar ­
koituksiin, sen luotettavuus, merkittävyys (tarkkuus) ja ehdotetun käytön rajoitukset on määritettävä, jotta voidaan varmistaa, että sitä voidaan verrata 
VVM:ään tässä testimenetelmässä (lisäys 2) vahvistetuissa suoritusvaa ­
timuksissa asetettujen vaatimusten mukaisesti. Lisäksi suositellaan, että en ­
nen samanlaisen tai mukautetun  in vitro  -RhE-menetelmän validointia ja 
toimittamista sääntelyviranomaisten hyväksyttäväksi on syytä tarkastella  in 
vitro  -ihoärsytystestausta koskevaa OECD:n perusteluasiakirjaa (23).
 
MÄÄRITELMÄT  
6. Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 1.  
ALUSTAVIA POHDINTOJA JA RAJOITUKSET  
7. Validointitutkimuksen (16) mukaisesti tämän testimenetelmän rajoituksena 
on, että kemikaalien luokittelu YK:n GHS-luokkaan 3 (lievästi ärsyttävät 
aineet) (1) ei ole mahdollista. Myöhemmin tehtävä  in vivo  -testaus voi olla 
tarpeen osittain korvaavana testinä ihoärsytyspotentiaalin ominaisuuksien täydellistä määrittämistä varten (4 ja tämän liitteen B.4 luku). On syytä muistaa, että ihmisihon käyttöön liittyy kansallisia ja kansainvälisiä eettisiä 
näkökohtia ja ehtoja.
 
8. Tässä testimenetelmässä tarkastellaan ihoärsyttävyyttä/-syövyttävyyttä kos ­
kevan B.4 menetelmän vaiheittaisen testausstrategian  in vitro  -ihoärsyttä ­
vyysosiota (OECD:n testiohje 404) (4). Vaikka tällä testimenetelmällä ei 
saada riittävästi tietoja ihosyövyttävyydestä, on syytä panna merkille, että 
ihosyövyttävyyttä koskeva B.40a menetelmä (OECD:n testiohje 431) perus ­
tuu samaan RhE-testijärjestelmään, mutta siinä käytetään muuta tutkimus ­
suunnitelmaa (B.40a luku). Tässä selostettu menetelmä perustuu 
RhE-malleihin, joissa käytetään ihmisistä peräisin olevia keratinosyyttejä, 
jotka näin ollen edustavat tarkasteltavana olevan lajin kohde-elintä  in vitro . 
Menetelmä kattaa suoraan myös aluksi esiintyvän tulehdusreaktion ja/tai reaktiomekanismin (soluvauriot ja paikalliseen vammaan johtavat kudosvau ­
riot), joka tapahtuu  in vivo  -ärsytyksen aikana. Tämän testimenetelmän 
validoinnin yhteydessä on testattu useita erilaisia kemikaaleja, ja validoin ­
titutkimuksessa kerättyyn tietopankkiin käsittää yhteensä 58 kemikaalia (16) (18) (23). Menetelmää voidaan käyttää kiinteisiin aineisiin, nesteisiin, puo ­
likiinteisiin aineisiin ja vahamaisiin aineisiin. Nesteet voivat olla vesiliu ­
oksia tai orgaanisia liuoksia; kiinteät aineet voivat olla joko veteen liuke ­
nevia tai veteen liukenemattomia. Kiinteät aineet on mahdollisuuksien mu ­
kaan jauhettava hienoksi jauhoksi ennen applikointia; näytteen muuta esi ­
käsittelyä ei vaadita. Kaasuja ja aerosoleja ei ole vielä arvioitu validointi ­
tutkimuksessa (24). Vaikka voidaan ajatella, että niitä voidaan testata RhE-tekniikalla, tällä testimenetelmällä kaasuja ja aerosoleja ei voida testa ­
ta. On myös pantava merkille, että voimakkaanväriset kemikaalit voivat 
häiritä solujen elinkyvyn mittausta, joten on käytettävä mukautettuja kont ­
rolleja (katso 24–26 kohta).
 
9. Kun testikemikaalin luokittelu on yksiselitteinen, se voidaan testata yhdessä 
kolme kudosnäytettä käsittävässä testiajossa. Jos luokittelu on vaikeaa, esi ­
merkiksi jos rinnakkaisnäytteille saadut tulokset ovat erilaiset ja/tai jos kes ­
kimääräinen elinkyky on 50 ± 5 %, on harkittava toista testiajoa ja myös 
kolmatta, jos kahden ensimmäisen testin tulokset poikkeavat toisistaan.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 654
 
TESTIN PERIAATE  
10. Testikemikaalia applikoidaan paikallisesti kolmiulotteiseen rekonstruoituun 
ihmisorvaskesimalliin, joka koostuu ihmisestä saaduista muuntamattomista 
orvaskeden keratinosyyteistä, jotka on viljelty ihmisen orvaskeden moniker ­
roksiseksi, täysin erilaistuneitten solujen malliksi. Se koostuu järjestyneistä ja selkeistä tyvisolu-, okasolu- ja jyväiskerroksista ja monikerroksisesta 
marraskedestä, joka sisältää solujenvälisiä lamellaarisia lipidikerroksia, jotka 
edustavat lipidiluokkia, joita havaitaan myös  in vivo  -kokeissa.
 
11. Kemikaalien aiheuttama ihoärsytys, joka esiintyy eryteemana ja ödeemana, 
on seurauksena tapahtumasarjasta, joka käynnistyy, kun kemikaali läpäisee marraskeden, ja alla olevat keratinosyyttikerrokset vaurioituvat. Kuolevat keratinosyytit vapauttavat välittäjäaineita, jotka käynnistävät tulehdusreakti ­
on, joka vaikuttaa verinahan soluihin, etenkin strooman ja endoteelin solui ­
hin. Havaitut eryteema ja ödeema johtuvat endoteelin solujen laajentumi ­
sesta ja tavallista suuremmasta läpäisevyydestä (24). RhE-malliin perustu ­
villa menetelmillä mitataan tämän tapahtumasarjan käynnistäviä tapahtumia.
 
12. Solujen elinkyvyn mittaus perustuu siihen, että entsyymit muuntavat väri ­
aine MTT:n (3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromi ­
di, tiatsolyylisininen; CAS-numero 298-93-1) siniseksi formatsaanisuolaksi, 
joka mitataan kvantitatiivisesti, kun se on uutettu kudoksista (25). Ärsytystä 
aiheuttavat aineet tunnistetaan niiden kyvystä alentaa solun elinkykyä mää ­
ritettyjen kynnysarvojen alle (ts. ≤ 50 % YK:n GHS-järjestelmän / EU:n 
CLP-asetuksen luokan 2 osalta). Riippuen siitä sääntely-yhteydestä, jossa 
tämän testimenetelmän tuloksia käytetään, voidaan katsoa, että kemikaalit, jotka aiheuttavat määriteltyä kynnysarvoa korkeamman solujen elinkyvyn, eivät ole ärsyttäviä (ts. > 50 %, ei luokitusta).
 
PÄTEVYYDEN OSOITUS  
13. Ennen kuin laboratoriot ryhtyvät käyttämään rutiininomaisesti jotakin tämän 
testimenetelmän mukaisista kolmesta validoidusta menetelmästä, laboratori ­
oiden on osoitettava tekninen pätevyytensä taulukossa 1 lueteltujen kym ­
menen vertailukemikaalin avulla. Tämän testimenetelmän mukaisesti kehi ­
tettyjen samanlaisten menetelmien tai kolmen validoidun menetelmän mu ­
kautusten osalta tämän testimenetelmän lisäyksessä 2 vahvistetut suoritus ­
vaatimukset on täytettävä, ennen kuin niitä käytetään lainsäädännössä edel ­
lytettyihin testeihin.  
14. Osana pätevyyden osoittamista käyttäjän on kudosten vastaanoton jälkeen 
tarkastettava kudosten läpäisevyysominaisuudet RhE-mallin laatijan vaa ­
timusten mukaisesti. Tämä on erityisen tärkeää, jos kudoksia kuljetetaan pitkiä välimatkoja tai pitkiä aikoja. Kun menetelmä on otettu onnistuneesti 
käyttöön ja laboratorion pätevyys on osoitettu, tällaista tarkastusta ei tarvitse 
tehdä säännöllisesti. Jos menetelmää käytetään säännöllisesti, on läpäisevyy ­
sominaisuudet kuitenkin jatkossakin syytä arvioida säännöllisin väliajoin.
 
Taulukko 1  
Vertailukemikaalit  ( 1 ) 
Kemikaali CAS-nro  In vivo -tulos (  2 ) Fysikaalinen olo ­
muoto YK:n GHS-luokka / 
EU:n CLP-luokka  
naftaleenietikkahappo 86-87-3 0 kiinteä ei luokitusta 
isopropanoli 67-63-0 0,3 neste ei luokitusta  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 655
 
Kemikaali CAS-nro  In vivo -tulos (  2 ) Fysikaalinen olo ­
muoto YK:n GHS-luokka / 
EU:n CLP-luokka  
metyylistearaatti 112-61-8 1 kiinteä ei luokitusta 
heptyylibutyraatti 5870-93-9 1,7 neste ei luokitusta 
(valinnainen 
luokka 3 ) ( 3 ) ( 4 ) 
heksyylisalisylaatti 6259-76-3 2 neste ei luokitusta 
(valinnainen 
luokka 3 ) ( 3 ) ( 4 ) 
syklameenialdehydi 103-95-7 2,3 neste luokka 2 1-bromiheksaani 111-25-1 2,7 neste luokka 2 kaliumhydroksidi (5 % liuos vedessä) 1310-58-3 3 neste luokka 2 
1-metyyli-3-fenyyli-1-piperatsiini 5271-27-2 3,3 kiinteä luokka 2 
heptanaali 111-71-7 3,4 neste luokka 2
 
( 1 ) Nämä vertailukemikaalit muodostavat osan validointitutkimuksessa käytettävistä vertailukemikaaleista. 
( 2 ) In vivo  -pisteytystulos B.4-menetelmän ja OECD:n testiohjeen 404 (4) mukaisesti. 
( 3 ) Tässä testimenetelmässä katsotaan, että YK:n GHS-järjestelmän valinnainen luokka 3 (lievästi ärsyttävät aineet) (1) vastaa lu okitusta 
”ei luokitusta”. 
( 4 ) YK:n GHS-järjestelmän valinnaista luokkaa 3 ei sovelleta EU:n CLP-asetuksessa.  
MENETTELY  
15. Seuraavassa esitellään RhE-menetelmää käyttävän ihoärsyttävyysarvioinnin 
osat ja menettelyt. RhE-malli on valmistettava, ja se voidaan valmistaa itse laboratoriossa tai hankkia kaupallisesti. EpiSkin
 TM -menetelmän, Epi ­
Derm  TM -ihoärsytystestin (EPI-200) ja SkinEthic  TM -RhE-menetelmän stan ­
dardimenettelyt ovat saatavilla lähteissä (26) (27) (28). Testaus on toteutet ­
tava seuraavasti:  
RhE-TESTIMENETELMÄN osat  
Yleiset olosuhteet  
16. Epiteelin valmistamiseen on käytettävä muuntamattomia ihmisen keratinosyyt ­
tejä. Toimivan marraskeden alla on oltava useita kerroksia eläviä epiteelisoluja (tyvisolukerros, okasolukerros ja jyväiskerros). Marraskedessä on oltava useita kerroksia ja olennainen lipidikoostumus, jotta se voi toimia esteenä solumyr ­
kyllisten merkkiaineiden, kuten natriumdodekyylisulfaatin (SDS) tai Triton 
X-100:n, nopealle kulkeutumiselle ihokerrosten läpi. Läpäisynestokyky on osoi ­
tettava, ja se voidaan arvioida joko määrittämällä pitoisuus, jossa merkkiaine vähentää kudosten elinkykyä 50 prosentilla (IC
 50 ) tietyn altistusajan jälkeen, tai 
määrittämällä altistusaika, joka tarvitaan solun elinkyvyn vähenemiseen 50 pro ­
sentilla (ET  50 ) applikoitaessa merkkiainetta tietyssä, tunnetussa pitoisuudessa. 
Mallin on oltava sellainen, ettei materiaali pääse marraskeden ympäri elävään kudokseen, koska se heikentäisi mallin kykyä mallintaa ihoaltistusta. 
RhE-mallissa ei saa olla kontaminaatiota (bakteerit, virukset, mykoplasmat tai 
sieni-itiöt).
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 656
 
Toimintaolosuhteet  
Solujen elinkyky  
17. Solujen elinkyky määritetään MTT-määritysmenetelmällä (25). RhE-mallien 
käyttäjien on varmistettava, että kukin RhE-mallin erä täyttää negatiiviselle 
kontrollille asetetut vaatimukset. Pelkän uuttoliuottimen optisen tiheyden (OD) on oltava riittävän pieni, ts. OD < 0,1. RhE-mallin kehittä ­
jän/tuottajan on määritettävä negatiivisen kontrollin OD-arvojen hyväksyt ­
tävyyden vaihteluväli (ylempi ja alempi raja-arvo) (ihoärsytystestimenetel ­
män olosuhteissa). Kolmen validoidun menetelmän hyväksyttävyyden vaih ­
teluvälit esitetään taulukossa 2. Negatiivisella kontrollikemikaalilla käsitel ­
tyjen kudosten vakaus viljelmässä (niiden on annettava samanlaiset elinky ­
kytulokset) testin altistusjakson ajan on dokumentoitava.
 
Taulukko 2  
Negatiivisen kontrollin OD-arvojen hyväksyttävyyden vaihteluväli  
Alempi hyväksyttävyysraja Ylempi hyväksyttävyysraja  
EpiSkin  TM (ihomalli) ≥ 0,6 ≤ 1,5 
EpiDerm  TM -ihoärsytystesti (EPI- 
200) ≥ 1,0 ≤ 2,5 
SkinEthic  TM -RhE-menetelmä ≥ 1,2 ≤ 2,5 
Läpäisyn esto  
18. Marraskeden ja sen lipidikoostumuksen on oltava riittävä estämään solu ­
myrkyllisten merkkiaineiden, esimerkiksi SDS:n tai Triton X-100:n, nopea läpäisy arvioituna IC
 50 :llä tai ET  50 :llä (taulukko 3).  
Morfologia  
19. RhE-malli on tutkittava histologisesti, ja on osoitettava, että rekonstrukti ­
olla on ihmisen orvaskeden kaltainen rakenne (myös monikerroksinen marraskesi).
 
Uusittavuus  
20. Testimenetelmän positiivisella kontrollikemikaalilla ja negatiivisilla kontrol ­
leilla saatujen tulosten olisi osoitettava tulosten uusittavuus pidemmällä aikavälillä.
 
Laadunvalvonta  
21. RhE-mallin kehittäjän/tuottajan on varmistettava ja osoitettava, että kukin 
RhE-mallin erä täyttää määritellyt tuotantokriteerit, joiden joukosta  elinky­
kyisyyttä  (17 kohta),  läpäisyn estoa  (18 kohta) ja  morfologiaa  (19 kohta) 
koskevat perusteet ovat merkityksellisimmät. Tätä koskevat tiedot on annet ­
tava menetelmän käyttäjille, jotta he voivat ilmoittaa tiedot testiraportissa. 
RhE-mallin kehittäjän/tuottajan (tai laitoksen omaa mallia käytettäessä tut ­
kijan) on annettava IC  50 :n tai ET  50 :n hyväksyttävyyden vaihteluväli (ylempi 
ja alempi raja-arvo). Ainoastaan hyväksytyillä kudoksilla saadut tulokset voidaan hyväksyä luotettavaksi ennusteeksi ärsytyksen luokittelua varten. 
Edellä käsiteltyjen kolmen validoidun menetelmän hyväksyttävyyden vaih ­
teluvälit esitetään esimerkkeinä taulukossa 3.
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 657
 
Taulukko 3  
Esimerkkejä laadunvalvonnan perusteista erän vapauttamiseksi tehtaalta myyntiin  
Alempi hyväksyttävyysraja Ylempi hyväksyttävyysraja  
EpiSkin  TM (ihomalli) 
(18 tunnin käsittely SDS:llä) (26) IC 50 = 1,0 mg/ml IC  50 = 3,0 mg/ml 
EpiDerm  TM -ihoärsytystesti (EPI- 
200) 
(1 % Triton X-100) (27) ET 50 = 4,8 tuntia ET  50 = 8,7 tuntia 
SkinEthic  TM -RhE-menetelmä 
(1 % Triton X-100) (28) ET 50 = 4,0 tuntia ET  50 = 9,0 tuntia  
Testi- ja kontrollikemikaalien annostelu  
22. Kutakin testikemikaalia ja kunkin käsittelyn kontrollia kohti on käytettävä 
vähintään kolmea näytettä. Sekä nestemäisiä että kiinteitä aineita käytet ­
täessä orvaskeden pinnalle on annosteltava testikemikaalia tasaisesti riit ­
tävä määrä kuitenkin niin, ettei käytetä hyvin suurta annosta. Kemikaalia 
olisi käytettävä vähintään 25 μl/cm  2 tai 25 mg/cm  2 . Kiinteitä aineita 
käytettäessä orvaskeden pinta on kostutettava deionisoidulla tai tislatulla vedellä ennen aineen annostelua, jotta testikemikaalin ja orvaskeden pin ­
nan välistä kosketus olisi parempi. Kiinteät aineet on mahdollisuuksien 
mukaan testattava hienona jauheena. Altistuksen jälkeen testikemikaali on huuhdeltava huolellisesti orvaskeden pinnalta sopivalla vesipitoisella pus ­
kuriliuoksella tai 0,9-prosenttisella NaCl:lla. Kolmesta validoidusta 
RhE-menetelmästä valitusta menetelmästä riippuen altistusaika voi olla 
15–60 minuuttia ja inkubaatiolämpötila 20–37 °C. Nämä altistusajat ja lämpötilat on optimoitu erikseen kullekin RhE-menetelmälle, ja ne vasta ­
avat menetelmien erilaisia ominaispiirteitä; lisätietoja on saatavilla mene ­
telmien standardimenettelyistä (26) (27) (28).
 
23. Kussakin käsittelyssä on käytettävä samanaikaisesti negatiivisia ja positii ­
visia kontrolleja osoittamaan, että solujen elinkyky (negatiivisella kontrol ­
lilla), läpäisyn esto ja altistuksesta seuraava kudoksen herkistyminen (posi ­
tiivisella kontrollilla) ovat pidemmän ajan kuluessa määritetyllä hyväksyttä ­
vyyden vaihteluvälillä. Positiivisena kontrolliaineena suositellaan käytettä ­
väksi 5-prosenttista SDS:n vesiliuosta. Suositeltavat negatiiviset kontrollike ­
mikaalit ovat vesi tai fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS).  
Solujen elinkykymittaukset  
24. Tärkeintä testimenettelyssä on se, että elinkykymittauksia ei suoriteta heti 
testikemikaaleille altistumisen jälkeen, vaan vasta, kun kudokset on käsit ­
telyn jälkeen huuhdeltu ja ne ovat olleet riittävän pitkän inkubaatioajan 
tuoreessa elatusaineessa. Inkubaatioaika mahdollistaa sekä palautumisen heikoista sytotoksisista vaikutuksista että selkeiden sytotoksisten vaikutus ­
ten esilletulon. Testin optimointivaiheessa (11) (12) (13) (14) (15) on 
käynyt ilmi, että 42 tuntia kestävä inkubaatioaika käsittelyn jälkeen on optimaalinen.
 
25. MTT-määritysmenetelmä on validoitu kvantitatiivinen menetelmä, jota olisi 
käytettävä solujen elinkyvyn mittaamiseen tässä testimenetelmässä. 
MTT-menetelmä sopii käytettäväksi kolmiulotteisen kudosrakenteen kanssa. Kudosnäyte pannaan kolmeksi tunniksi sopivan vahvuiseen MTT-liuokseen (esimerkiksi 0,3–1 mg/ml). Saostunut sininen formatsaani uutetaan kudok ­
sesta liuottimella (esimerkiksi isopropanoli tai hapan isopropanoli), ja for ­
matsaanipitoisuus määritetään mittaamalla OD-arvo 570 ± 30 nm:ssä.
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 658
 
26. Testikemikaalin optiset ominaisuudet tai sen kemiallinen reaktio MTT:n 
kanssa voivat aiheuttaa sen, että määritysmenetelmällä saadaan väärä arvio 
elinkyvystä (koska testikemikaali voi estää värin muodostumisen tai vaih ­
toehtoisesti aiheuttaa sen). Näin voi tapahtua, jos tietty testikemikaali ei kokonaan poistu kudoksesta huuhtelemalla tai jos se imeytyy orvasketeen. 
Jos testikemikaali reagoi suoraan MTT:n kanssa (MTT-pelkistin), on luon ­
nostaan värillinen tai värjäytyy kudoksen käsittelyn aikana, on käytettävä lisäkontrolleja, jotta testikemikaalin vaikutus solujen elinkyvyn mittaukseen voidaan osoittaa ja korjata. MTT:n suoran pelkistyksen ja väriaineiden ai ­
heuttamien häiriöiden korjaamismenettelyt selostetaan yksityiskohtaisesti 
kyseisiä kolmea validoitua menetelmää koskevissa standardimenettelyissä (26) (27) (28).
 
Hyväksyttävyysperusteet  
27. Jokaisessa menetelmässä, jossa käytetään validoidun RhE-mallin eriä 
(katso 21 kohta), negatiivisella kontrollikemikaalilla käsiteltyjen kudosten 
OD:n vastattava sellaisten kudosten OD:tä, joille on suoritettu kaikki 
kuljetus- ja vastaanottovaiheet sekä kaikki tutkimussuunnitelman menette ­
lyt. Kontrollien OD-arvot eivät saa olla alhaisemmat kuin pitkähkön aiemman ajanjakson alemmat rajat. Vastaavasti positiivisella kontrollilla 
eli 5-prosenttisella SDS:n vesiliuoksella käsiteltyjen kudosten on ilmen ­
nettävä kudosten kykyä reagoida ärsytystä aiheuttavaan kemikaaliin tässä testimenetelmässä (26) (27) (28). Rinnakkaisten kudosnäytteiden välisen vaihtelun asianmukaiset määrät on määriteltävä (esimerkiksi jos käytetään 
vakiopoikkeamia, niiden on oltava aiempien tietojen perusteella lasketun 
1-puolisen 95 prosentin vaihteluvälin sisällä; validoiduille vertailumenetel ­
mille vakiopoikkeama < 18 %).
 
Tulosten tulkinta ja ennustettavuusmalli  
28. Negatiivisen kontrollin OD-arvon katsotaan testissä edustavan 100-prosent ­
tista solujen elinkykyä. Kullakin testikemikaalilla saaduista OD-arvoista 
voidaan laskea solujen elinkyky prosentteina negatiivisesta kontrollista. Pro ­
sentuaalinen solujen elinkyvyn raja-arvo, jolla ärsyttävät testikemikaalit ero ­
tetaan luokittelemattomista testikemikaaleista, ja tulosten arviointiin ja är ­
syttävien kemikaalien tunnistamiseen käytettävät tilastomenetelmät on mää ­
riteltävä selvästi ja dokumentoitava ja niiden sopivuus on osoitettava. Är ­
sytyksen ennusteen raja-arvot esitetään seuraavassa:  
— Testikemikaalin katsotaan aiheuttavan ärsytystä iholla YK:n 
GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen luokan 2 mukaisesti, jos ku ­
doksen elinkyky altistuksen ja käsittelyn jälkeisen inkubaation jälkeen 
on alhaisempi tai yhtä suuri kuin ( ≤) 50 prosenttia.  
— Riippuen siitä, minkä säädöksen noudattaminen tulee kysymykseen tä ­
män testimenetelmän yhteydessä, voidaan katsoa, että testikemikaali ei aiheuta ärsytystä iholla YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen 
luokituksen ”ei luokitusta” mukaisesti, jos kudoksen elinkyky altistuk ­
sen ja käsittelyn jälkeisen inkubaation jälkeen on suurempi kuin (>) 50 prosenttia.
 
MITTAUSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
Mittaustulokset  
29. Kunkin testin osalta on esitettävä taulukkomuodossa yksittäisiä rinnakkaisia 
testinäytteitä koskevat mittaustulokset (esimerkiksi kunkin testikemikaalin 
OD-arvot ja solujen elinkyvyn prosentuaalista osuutta koskevat tiedot, mu ­
kaan luettuna luokittelu) ja tarvittaessa myös mittaustulokset toistetuista kokeista. Lisäksi on esitettävä kunkin käsittelyn keskiarvo ± keskihajonta. 
Kunkin testikemikaalin osalta on esitettävä havaittu vuorovaikutus 
MTT-reagenssin ja värillisten testikemikaalien kanssa.
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 659
 
Testiraportti  
30. Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:  
Testi- ja kontrollikemikaalit  
— kemiallinen nimi/kemialliset nimet, kuten CAS-nimi ja -numero sekä 
EC-nimi ja -numero, jos ne tiedetään,  
— kemikaalin puhtaus ja koostumus (painoprosentteina),  
— tutkimuksen suorittamisen kannalta merkitykselliset fysikaaliskemialliset 
ominaisuudet (kuten fysikaalinen olomuoto, stabiilius ja haihtuvuus, pH 
ja vesiliukoisuus, jos se tiedetään),  
— tarvittaessa testi- tai kontrollikemikaalien käsittely ennen testiä (esimer ­
kiksi lämmittäminen tai jauhaminen),  
— varastointiolosuhteet.  
Käytetyn RhE-mallin ja testisuunnitelman perustelut  
Testiolosuhteet  
— käytetty solujärjestelmä,  
— täydelliset RhE-mallin käyttöä tukevat tiedot (mukaan luettuna mallin 
suoritusarvot). Näitä voivat olla, luettelon olematta tyhjentävä,  
i) solujen elinkyky  
ii) läpäisyn esto  
iii) morfologia  
iv) uusittavuus ja ennustettavuus  
v) mallin laatukontrollit,  
— tiedot käytetystä testimenettelystä,  
— testissä käytetyt annokset, altistuksen kesto ja käsittelyn jälkeinen inku ­
baatioaika,  
— kuvaus testimenettelyjen mahdollisista muutoksista,  
— viittaukset mallia koskeviin aiempiin tietoihin. Näitä voivat olla, luette ­
lon olematta tyhjentävä,  
i) laatukontrollitietojen hyväksyttävyys; viitattava aikaisempia eriä kos ­
keviin tietoihin  
ii) positiivisten ja negatiivisten kontrollien hyväksyttävyys; viitattava 
positiivisten ja negatiivisten kontrollien keskiarvoihin ja vaihteluvä ­
leihin,  
— käytettyjen arviointiperusteiden kuvaus, mukaan luettuina ennustetta ­
vuusmallin raja-arvojen valinnan perusteet,  
— viittaukset aiempiin kontrollitietoihin.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 660
 
Tulokset  
— yksittäisistä testikemikaaleista saadut tulokset kussakin testiajossa ja 
rinnakkaisista mittauksista taulukkomuodossa,  
— tiedot kontrolleista, joita on käytetty suorille MTT:n pelkistimille ja/tai 
värjääville testikemikaaleille,  
— kuvaus muista havaituista vaikutuksista.  
Tulosten tarkastelu  
Päätelmät  
LÄHDELUETTELO  
(1) YK (2009). United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS). 3. tarkistettu painos. YK, New York ja Geneve. Saatavilla osoitteessa http://www.unece.org/trans/danger/pub ­
li/ghs/ghs_rev03/03files_e.html
 
(2) EC-ECVAM (2009). Statement on the ”Performance under UN GHS of 
three  in vitro  assays for skin irritation testing and the adaptation of the 
Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin 
irritation Performance Standards”. ECVAM:in tieteellinen neuvoa-antava komitea (ESAC30), 9. huhtikuuta 2009. Saatavilla osoitteessa http://ec ­
vam.jrc.ec.europa.eu
 
(3) Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1272/2008, annettu 
16 päivänä joulukuuta 2008, aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä 
ja pakkaamisesta sekä direktiivien 67/548/ETY ja 1999/45/EY muuttami ­
sesta ja kumoamisesta ja asetuksen (EY) N:o 1907/2006 muuttamisesta. EUVL L 353, 31.12.2008, s. 1.
 
(4) OECD (2004). Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the 
Testing of Chemicals No. 404. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa 
http://www.oecd.org/env/testguidelines  
(5) OECD (2004).  In Vitro  Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical 
Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 
430. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguid ­
elines  
(6) OECD (2004).  In Vitro  Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No. 431. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines
 
(7) OECD (2006).  In Vitro  Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, 
OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435. OECD, Pariisi. 
Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines  
(8) EC-ECVAM (2009). Performance Standards for  in vitro  skin irritation test 
methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? Saatavilla osoit ­
teessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu  
(9) OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34. OECD, Pariisi. Saatavilla 
osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines
 
(10) Fentem, J. H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G. R., Harbell, J. W., Hey ­
lings, J. R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J. J. M. ja Botham, P. 
(2001). A prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, 
Results and evaluation by the Management Team. Toxicol. in Vitro 15, s. 57–93.
 
(11) Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. ja Roguet, R. (2002). Refinement 
of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of 
chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study. Toxicol. in Vitro 
16, s. 765–770.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 661
 
(12) Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, 
B. ja Spielmann, H. (2004). Optimisation of the EpiDerm test protocol for 
the upcoming ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests. 
ALTEX 21, s. 107–114.  
(13) Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, 
D. ja Spielmann, H. (2005). The EpiDerm test protocol for the upcoming 
ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests – An assessment of 
the performance of the optimised test. ATLA 33, s. 351–367.  
(14) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. ja Rubinsteen, G. 
(2005). The  in vitro  acute skin irritation of chemicals: optimisation of the 
EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation 
process. ATLA 33, s. 329–349.  
(15) Zuang, V., Balls, M., Botham, P. A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R. 
D., Elliot, G. R., Fentem, J. H., Heylings, J. R., Liebsch, M., Medina, J., 
Roguet, R., van De Sandt, J. J. M., Wiemann, C. ja Worth, A. (2002). 
Follow-up to the ECVAM prevalidation study on  in vitro  tests for acute 
skin irritation, The European Centre for the Validation of Alternative Met ­
hods Skin Irritation Task Force report 2. ATLA 30, s. 109–129.  
(16) Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., 
Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, 
P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. ja Zuang, V. (2007). The ECVAM 
international validation study on  in vitro  tests for acute skin irritation: 
Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test. ATLA 35, s. 559–601.
 
(17) Hoffmann, S. (2006). ECVAM skin irritation validation study phase II: 
Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1- α. 
Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu  
(18) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. ja 
Zuang, V. (2007). The ECVAM international validation study on  in vitro  
tests for acute skin irritation: selection of test chemicals. ATLA 35, s. 
603–619.  
(19) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., 
Tinois-Tessonneaud, E. ja Leclaire, J. (2007).  In vitro  acute skin irritancy 
of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy – 
Results and performances with 184 cosmetic ingredients. AATEX 14, s. 
351–358.  
(20) EC-ECVAM (2007). Statement on the validity of  in vitro  tests for skin 
irritation. ECVAM:in tieteellinen neuvoa-antava komitea (ESAC26), 27. huhtikuuta 2007. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu
 
(21) EC-ECVAM (2007). Performance Standards for applying human skin mo ­
dels to  in vitro  skin irritation testing. Saatavilla osoitteessa http://ec ­
vam.jrc.ec.europa.eu  
(22) EC-ECVAM (2008). Statement on the scientific validity of  in vitro  tests for 
skin irritation testing. ECVAM:in tieteellinen neuvoa-antava komitea 
(ESAC29), 5. marraskuuta 2008. Saatavilla osoitteessa http://ec ­
vam.jrc.ec.europa.eu  
(23) OECD (2010). Explanatory background document to the OECD draft Test 
Guideline on  in vitro  skin irritation testing. OECD Series on Testing and 
Assessment, No. 137. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/docu ­
ment/24/0,3746,en_2649_34377_4 7858904_1_1_1_1,00.html
 
(24) Welss, T., Basketter, D. A. ja Schröder, K. R. (2004).  In vitro  skin irrita ­
tion: fact and future. State of the art review of mechanisms and models. 
Toxicol. in Vitro 18, s. 231–243.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 662
 
(25) Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and 
survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. 
Methods 65, s. 55–63.  
(26) EpiSkin  TM SOP, Version 1.8 (helmikuu 2009). ECVAM Skin Irritation 
Validation Study: Validation of the EpiSkin  TM test method 15 min – 42 
hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. Saatavilla 
osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu  
(27) EpiDerm  TM SOP, Version 7.0 (tarkistettu versio, maaliskuu 2009). Protocol 
for: In vitro  EpiDerm  TM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with 
MatTek Corporation's reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu
 
(28) SkinEthic  TM RHE SOP, Version 2.0 (helmikuu 2009). SkinEthic skin irri ­
tation test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu
 
(29) Harvell, J. D., Lamminstausta, K. ja Maibach, H. I. (1995). Irritant contact 
dermatitis. Practical Contact Dermatitis, s. 7–18 (Toim. Guin J. D.). Mc 
Graw-Hill, New York.  
(30) Komission direktiivi 2001/59/EY, annettu 6 päivänä elokuuta 2001, vaa ­
rallisten aineiden luokitusta, pakkaamista ja merkintöjä koskevien lakien, 
asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä annetun neuvoston 
direktiivin 67/548/ETY mukauttamisesta tekniikan kehitykseen kahdennen ­
kymmenennenkahdeksannen kerran. EYVL L 225, 21.8.2001, s. 1.  
(31) Basketter, D. A., York, M., McFadden, J. P. ja Robinson, M. K. (2004). 
Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. Con ­
tact Dermatitis 51, s. 1–4.  
(32) Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., 
Marriott, M. ja Kandarova, H. (2007). Comparison of human skin irritation and photo-irritation patch test data with cellular  in vitro  assays and animal  
in vivo  data. ALTEX 14, s. 359–365.
 
(33) Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, 
M. ja Kandárová, H. (2010). Comparison of human skin irritation patch test data with  in vitro  skin irritation assays and animal data. Contact Dermatitis 
62, s. 109–116.
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 663
 
Lisäys 1  
Määritelmät  
Tarkkuus:  Testimenetelmän tulosten ja hyväksyttyjen vertailuarvojen välinen 
ero. Tarkkuus on testimenetelmän suorituskyvyn mitta ja yksi merkityksellisyy ­
den osatekijöistä. Tarkkuutta ja vastaavuutta (konkordanssia) käytetään usein 
toisiaan korvaavasti tarkoittamaan testimenetelmällä saatujen oikeiden tulosten 
osuutta (9).  
Solujen elinkyky:  Muuttuja, jolla mitataan solupopulaation kokonaisaktiivisuutta, 
esimerkiksi solujen mitokondrioiden dehydrogenaasien kykyä pelkistää väriaine MTT (3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi eli tiatso ­
lyylisininen), joka mitatusta päätepisteestä ja testimenetelmästä riippuen korreloi 
solujen kokonaismäärään ja/tai elinkykyyn.
 
Vastaavuus:  Testimenetelmän suorituskyvyn mitta sellaisille testimenetelmille, 
joiden tulokset ovat luokittelevia, ja yksi merkityksellisyyden osatekijöistä. Vas ­
taavuutta ja tarkkuutta käytetään usein toisiaan korvaavasti, ja vastaavuus on 
määritelty kaikkien niiden testikemikaalien osuudeksi, jotka on luokiteltu oikein positiivisiksi tai negatiivisiksi (9).
 
ET 50 : Voidaan arvioida määrittämällä altistusaika, joka tarvitaan, jotta solujen 
elinkyky vähenee 50 prosenttia annosteltaessa merkkikemikaalia tietyssä, mää ­
rätyssä pitoisuudessa; katso myös IC  50 . 
EU:n CLP-asetus (aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaa ­
misesta 16 päivänä joulukuuta 2008 annettu Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1272/2008):  Kemikaalien (aineiden ja seosten) luokittelua ja 
merkintöjä koskeva YK:n GHS-järjestelmä saatetaan tällä asetuksella osaksi Eu ­
roopan unionin (EU) lainsäädäntöä (3).
 
GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals; 
Yhdistyneiden kansakuntien (YK) kemikaalien maailmanlaajuisesti yhdenmukais ­
tettu luokitus- ja merkintäjärjestelmä):  Tässä järjestelmässä kemikaalit (aineet ja 
seokset) luokitellaan vakioitujen fysikaalisten sekä terveys- ja ympäristövaarojen 
tyyppien ja -tasojen mukaisesti, ja niille osoitetaan vaaraviestinnän tunnukset, 
kuten kuvamerkit, huomiosanat, vaaralausekkeet, turvalausekkeet ja turvatiedot ­
teet, jotta voidaan välittää tietoa kemikaalien haittavaikutuksista ihmisten ja ym ­
päristön suojelemiseksi (esimerkiksi työnantajille, työntekijöille, kuljetushenkilö ­
kunnalle, kuluttajille ja pelastushenkilöstölle) (1).  
IC 50 : Voidaan arvioida määrittämällä pitoisuus, jossa merkkikemikaali alentaa 
solujen elinkykyä 50 prosentilla (IC  50 ) sovitun altistusajan jälkeen; katso 
myös ET  50 . 
Rajoittamaton annos:  Orvasketeen applikoidun testikemikaalin määrä, joka ylit ­
tää määrän, joka tarvitaan orvaskeden pinnan peittämiseksi kokonaisuudessaan ja 
tasaisesti.  
Me-too-testi:  Puhekielinen nimitys testimenetelmälle, joka on rakenteellisesti ja 
funktionaalisesti samanlainen kuin validoitu ja hyväksytty vertailutestimenetelmä. Tällainen menetelmä voitaisiin myös validoida. Tarkoittaa samaa kuin saman ­
lainen testimenetelmä (9).
 
Suoritusvaatimukset:  Validoituihin vertailumenetelmiin perustuvat standardit, 
jotka toimivat perustana arvioitaessa ehdotetun mekaanisesti ja toiminnallisesti samanlaisen testimenetelmän vertailtavuutta. Siihen sisältyvät i) testimenetelmän 
oleelliset osat; ii) vähimmäisluettelo vertailukemikaaleista, jotka on valittu niiden 
kemikaalien joukosta, joita on käytetty osoittamaan validoidun vertailumenetel ­
män hyväksyttävää suorituskykyä; ja iii) vertailukelpoiset validoidusta testimene ­
telmästä saatuihin tuloksiin perustuvat tarkkuuden ja luotettavuuden tasot, jotka 
ehdotetun testimenetelmän olisi osoitettava, kun sitä arvioidaan vertailukemikaa ­
lien vähimmäisluettelon avulla (9).
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 664
 
Vertailukemikaalit:  Validointimenettelyyn valitut kemikaalit, joiden vasteet  in 
vitro - tai in vivo  -vertailutestijärjestelmässä tai kyseisessä lajissa ovat tiedossa. 
Näiden kemikaalien olisi edustettava niitä kemikaaliluokkia, joita testattaessa kyseistä testimenetelmää todennäköisesti käytetään, ja niiden on edustettava kaik ­
kia niitä vasteita, joita tällä testimenetelmällä testattavilta kemikaaleilta voidaan 
odottaa (voimakkaista lieviin ja negatiivisiin). Validointimenettelyn eri vaiheita 
sekä eri testimenetelmiä ja testitarkoituksia varten voidaan vaatia erilaisia vertai ­
lukemikaaleja (9).
 
Merkityksellisyys:  Kuvaus testin ja toivotun vaikutuksen välisestä suhteesta ja 
siitä, onko testi tarkoituksenmukainen ja hyödyllinen tiettyä tarkoitusta varten. 
Merkityksellisyydellä tarkoitetaan sitä, missä määrin testillä voidaan tarkasti mi ­
tata tai ennustaa haluttua biologista vaikutusta. Merkityksellisyyden yhteydessä on huomioitava myös testimenetelmän tarkkuus (vastaavuus) (9).
 
Luotettavuus:  Laajuus, jolla testimenetelmä on uusittavissa samassa laboratori ­
ossa tai eri laboratorioissa ajan myötä käytettäessä samaa menettelyä. Se arvioi ­
daan laskemalla laboratorionsisäinen ja laboratorioidenvälinen uusittavuus (9).  
Korvaava testi:  Testi, jolla voidaan korvata testi, joka on säännöllisesti käytössä 
ja joka on hyväksytty vaarallisuuden määrittämiseen ja/tai riskien arviointiin, ja jonka on osoitettu antavan ihmisten tai eläinten terveyden tai tarvittaessa ympä ­
ristön kannalta vastaavan tai korkeamman suojelutason hyväksyttyyn testiin ver ­
rattuna kaikissa mahdollisissa testaustilanteissa ja kaikkien kemikaalien yhtey ­
dessä (9).
 
Herkkyys:  Niiden positiivisten/aktiivisten testikemikaalien osuus, jotka on luoki ­
teltu testissä oikein. Sillä mitataan luokittavia tuloksia tuottavan testimenetelmän 
tarkkuutta. Herkkyys on tärkeää ottaa huomioon arvioitaessa testimenetelmän 
merkityksellisyyttä (9).  
Ihoärsyttävyys:  Palautuvan ihovaurion ilmaantuminen enintään neljä tuntia kes ­
täneen testikemikaalin annostelun jälkeen. Ihoärsytys on paikallisesti esiintyvä, 
ei-immunogeeninen reaktio, joka kehittyy pian stimulaation jälkeen (29). Sen 
tärkeimmät ominaispiirteet ovat sen palautuvuus, johon liittyy tulehdusreaktioita, ja useimmat tulehdusreaktioon liittyvät ärsyttävyyden kliiniset ominaispiirteet (eryteema, ödeema, kutina ja kipu).
 
Spesifisyys:  Niiden negatiivisten/inaktiivisten testikemikaalien osuus, jotka on 
luokiteltu testissä oikein. Sillä mitataan luokittavia tuloksia tuottavan testimene ­
telmän tarkkuutta. On tärkeää ottaa spesifisyys huomioon arvioitaessa testimene ­
telmän merkityksellisyyttä (9).  
Vaiheittainen testausstrategia:  Testaus, jossa testimenetelmiä käytetään peräk ­
käin; testimenetelmät valitaan kullekin peräkkäiselle tasolle edellisen testaustason 
tulosten perusteella (9).  
Testikemikaali (testiaine):  Aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 665
 
Lisäys 2  
Suoritusvaatimukset ehdotettujen samanlaisten tai mukautettujen 
rekonstruoituun ihmisorvasketeen (RhE) perustuvien ihoärsytyksen  in vitro  
-menetelmien arviointia varten  
JOHDANTO  
1. Suoritusvaatimuksien tarkoituksena on antaa perusta, jolla voidaan määrit ­
tää, ovatko yksinoikeudelliset (eli tekijänoikeudelliset, tavaramerkityt tai 
rekisteröidyt) ja muut kuin yksinoikeudelliset uudet menetelmät riittävän täsmällisiä ja luotettavia tiettyjä testaustarkoituksia varten. Näitä validoitui ­
hin ja hyväksyttyihin testimenetelmiin perustuvia suoritusvaatimuksia voi ­
daan käyttää muiden samanlaisten menetelmien (niin sanottujen me-too-tes ­
tien) luotettavuuden ja täsmällisyyden arviointiin, kun kyseiset menetelmät perustuvat vastaaviin tieteellisiin periaatteisiin ja niillä mitataan tai ennakoi ­
daan samanlaista biologista tai toksista vaikutusta (9).
 
2. Ennen mukautettujen menetelmien (eli hyväksytyn menetelmän mahdollis ­
ten parannusehdotusten) hyväksymistä on arvioitava ehdotettujen muutosten vaikutus testin suorittamiseen ja se, missä määrin kyseiset muutokset vai ­
kuttavat validointimenettelyn muita osia varten saatavilla oleviin tietoihin. 
Ehdotettujen muutosten määrän ja luonteen, saatujen tietojen ja kyseisiä muutoksia tukevan aineiston mukaisesti ne on joko validoitava samalla tavalla kuin uusi testi tai, mikäli se on asianmukaista, niiden luotettavuus 
ja merkityksellisyys on arvioitava suppeammin käyttämällä vakiintuneita 
suoritusvaatimuksia (9).
 
3. Tätä testiä varten käytettäväksi ehdotettujen kolmen validoidun menetelmän 
(EpiSkin  TM (validoitu vertailumenetelmä – VVM), EpiDerm  TM -ihoärsytys ­
testi (EPI-200) ja SkinEthic  TM -RhE-menetelmä) samanlaisten (me-too-me ­
netelmät) tai mukautettujen menetelmien luotettavuus ja täsmällisyys on määritettävä käyttämällä kemikaaleja, jotka edustavat koko Draizen ihoär ­
sytyksen pisteytysasteikkoa. Kun ehdotettu menetelmä arvioidaan käyttä ­
mällä suoritusvaatimuksissa suositeltuja 20:tä vertailukemikaalia (taulukko 1), ehdotettujen samanlaisten tai mukautettujen menetelmien luotettavuus- ja tarkkuusarvojen on vastattava VVM:stä saatuja arvoja tai oltava niitä pa ­
rempia (taulukko 2) (2) (16). Luotettavuus- ja tarkkuusarvot, jotka on saa ­
vutettava, esitetään tässä lisäyksessä olevissa 8–12 kohdassa. Vertailukemi ­
kaaleissa on mukana luokittelemattomia (YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen ”ei luokitusta”) ja luokiteltuja (YK:n GHS-järjestelmän / 
EU:n CLP-asetuksen luokka 2) (1), erilaisia kemikaaliluokkia edustavia 
kemikaaleja, joten ehdotetun menetelmän luotettavuutta ja tarkkuutta (herk ­
kyyttä, spesifisyyttä ja yleistä tarkkuutta) VVM:n luotettavuuteen ja tark ­
kuuteen voidaan verrata. Menetelmän luotettavuus sekä sen kyky tunnistaa 
oikein YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen luokkaan 2 kuuluvat 
ärsytystä aiheuttavat kemikaalit sekä – riippuen siitä säännöstöstä, jota var ­
ten tietoja tuotetaan – myös sen kyky tunnistaa oikein YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen luokkaan ”ei luokitusta” kuuluvat 
kemikaalit olisi määritettävä, ennen kuin menetelmää käytetään uusien tes ­
tikemikaalien testaamiseen.
 
4. Nämä suoritusvaatimukset perustuvat EC-ECVAM:in suoritusvaatimuksiin 
(8), jotka on saatettu ajan tasalle luokitusta ja merkintöjä koskevien YK:n 
GHS-järjestelmän ja EU:n CLP-asetuksen mukaisesti (1) (3). Alkuperäiset suoritusvaatimukset määriteltiin validointitutkimuksen (21) suorittamisen jälkeen, ja ne perustuivat EU:n luokittelujärjestelmään, josta säädetään vaa ­
rallisten aineiden luokitusta, pakkaamista ja merkintöjä koskevien lakien, 
asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä annetun neuvoston direktiivin 67/548/ETY mukauttamisesta tekniikan kehitykseen kahdennen ­
kymmenennenkahdeksannen kerran 6 päivänä elokuuta 2001 annetulla ko ­
mission direktiivillä 2001/59/EY (
 1 ). Koska YK:n GHS-järjestelmä  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 666  
( 1 ) EYVL L 225, 21.8.2001, s. 1.
 hyväksyttiin EU:n luokitus- ja merkintäjärjestelmäksi (EU:n CLP-asetus) (3) 
validointitutkimuksen päätökseen saattamisen ja tämän testimenetelmän lo ­
pullisen version laatimisen välisenä aikana, suoritusvaatimuksia on saatettu ajan tasalle (8). Nämä ajan tasalle saattamiseksi tehtävät tarkistukset koske ­
vat pääasiassa muutoksia i) suoritusvaatimuksissa mainituissa vertailukemi ­
kaaleissa ja ii) määriteltyjä luotettavuus- ja tarkkuusarvoja (2) (23).
 
SUORITUSVAATIMUKSET REKONSTRUOITUUN IHMISORVASKETEEN 
(RhE) PERUSTUVIA IHOÄRSYTYKSEN  IN VITRO  -TESTIMENETELMIÄ 
VARTEN  
5. Suoritusvaatimukset koostuvat seuraavista kolmesta osasta (9):  
I) testimenetelmän oleelliset osat  
II) vertailukemikaalien vähimmäisluettelo  
III) määritellyt luotettavuus- ja tarkkuusarvot  
I) Testimenetelmän oleelliset osat  
6. Nämä koostuvat validoidun menetelmän oleellisista rakenteellisista, toimin ­
nallisista ja menettelyihin liittyvistä osista, jotka on sisällytettävä ehdotetun 
mekaanisesti tai toiminnallisesti samanlaisen tai mukautetun menetelmän 
testisuunnitelmaan. Näitä osia ovat vain kyseisellä menetelmällä olevat omi ­
naisuudet, menettelyihin liittyvät ratkaisevan tärkeät yksityiskohdat sekä laadunvalvontamenettelyt. Testimenetelmän oleellisia osia koskevia vaa ­
timuksia noudattamalla varmistetaan, että ehdotettu samanlainen tai mukau ­
tettu menetelmä perustuu samoihin tekijöihin kuin vastaava VVM (9). Tes ­
timenetelmän oleelliset osat kuvataan yksityiskohtaisesti testimenetelmän 
16–21 kohdassa, ja testaus olisi tehtävä seuraavien kohtien mukaisesti:
 
— yleiset ehdot (16 kohta)  
— funktionaaliset ehdot, joihin kuuluvat  
— solujen elinkyky (17 kohta),  
— läpäisyn esto (18 kohta),  
— morfologia (19 kohta),  
— uusittavuus (20 kohta) ja  
— laadunvalvonta (21 kohta).  
II) Vertailukemikaalien vähimmäisluettelo  
7. Vertailukemikaalien avulla määritetään, onko ehdotettu samanlainen tai mu ­
kautettu menetelmä, joka on osoitettu rakenteellisesti ja toiminnallisesti riit ­
tävän samanlaiseksi VVM:ään verrattuna, tai joka on jonkin edellä maini ­
tuista kolmesta validoidusta menetelmästä vähäinen mukautus, yhtä luotet ­
tava ja tarkka tai luotettavampi tai tarkempi kuin VVM (2) (8) (16) (23). 
Taulukossa 1 lueteltuihin 20 suositeltuun vertailukemikaaliin on sisällytetty kemikaaleja erilaisista kemiallisista luokista (eli funktionaalisiin ryhmiin perustuvista kemikaaliluokista), ja ne edustavat koko Draizen ihoärsytyksen 
pisteytysasteikkoa (ärsyttämättömästä erittäin ärsyttävään). Luetteloon on 
sisällytetty kymmenen YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen luo ­
kan 2 kemikaalia ja kymmenen luokittelematonta kemikaalia, joista kolme on YK:n GHS-järjestelmän valinnaisen luokan 3 kemikaaleja. Tässä testi ­
menetelmässä valinnainen luokka 3 katsotaan luokaksi ”ei luokitusta”. 
Taulukossa 1 luetellut kemikaalit on valittu esivalidointia seuraavassa opti ­
mointivaiheessa ja VVM:n validointitutkimuksessa käytetyistä kemikaaleista niin, että huomioon on otettu kemiallinen funktionaalisuus ja 
fysikaalinen olomuoto (14) (18). Nämä vertailukemikaalit edustavat 
niiden kemikaalien vähimmäismäärää, joita on käytettävä ehdotetun
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 667
 
samanlaisen tai mukautetun menetelmän tarkkuuden ja luotettavuuden arvi ­
oimiseksi. Niitä ei kuitenkaan pidä käyttää uusien menetelmien kehittämi ­
seksi. Jos lueteltu kemikaali ei ole saatavilla, myös muita kemikaaleja voi ­
daan käyttää, jos niistä on saatavilla asianmukaiset  in vivo  -vertailutiedot. 
Tällaiset kemikaalit on valittava ensisijaisesti niistä kemikaaleista, joita on 
käytetty esivalidointia seuraavassa optimointivaiheessa tai VVM:n validoin ­
titutkimuksessa. Vertailukemikaalien vähimmäisluetteloon voidaan tarvitta ­
essa lisätä muita kemikaaliluokkia edustavia kemikaaleja, joista on saa ­
tavilla asianmukaiset  in vivo  -vertailutiedot, jotta ehdotetun menetelmän 
tarkkuutta voidaan arvioida yksityiskohtaisemmin.  
Taulukko 1  
Samanlaisten tai mukautettujen RhE-ihoärsytysmenetelmien tarkkuus- ja luotettavuusarvojen määrittämisessä 
käytettävien vertailukemikaalien vähimmäisluettelo  ( 1 ) 
Kemikaali CAS-nro Fysikaalinen 
olomuoto  In vivo -tulos VRM  in 
vitro -luokka YK GHS / EU CLP  
in vivo -luokka  
1-bromi-4-klooributaani 6940-78-9 neste 0 luokka 2 ei luokitusta 
dietyyliftalaatti 84-66-2 neste 0 ei luokitusta ei luokitusta naftaleenietikkahappo 86-87-3 kiinteä 0 ei luokitusta ei luokitusta 
allyylifenoksiasetaatti 7493-74-5 neste 0,3 ei luokitusta ei luokitusta 
isopropanoli 67-63-0 neste 0,3 ei luokitusta ei luokitusta 
4-(metyylitio)-bentsaldedydi 3446-89-7 neste 1 luokka 2 ei luokitusta 
metyylistearaatti 112-61-8 kiinteä 1 ei luokitusta ei luokitusta heptyylibutyraatti 5870-93-9 neste 1,7 ei luokitusta ei luokitusta 
heksyylisalisylaatti 6259-76-3 neste 2 ei luokitusta ei luokitusta 
kanelialdehydi 104-55-2 neste 2 luokka 2 ei luokitusta 
(valinnainen 
luokka 3 ) (
 3 ) 
1-dekanoli  ( 2 ) 112-30-1 neste 2,3 luokka 2 luokka 2  
syklameenialdehydi 103-95-7 neste 2,3 luokka 2 luokka 2 
1-bromiheksaani 111-25-1 neste 2,7 luokka 2 luokka 2 
2-kloorimetyyli-3,5-dimetyy ­
li-4-metoksipyridiinihydrok ­
loridi 86604-75-3 kiinteä 2,7 luokka 2 luokka 2  
di-n-propyylidisulfidi  ( 2 ) 629-19-6 neste 3 ei luokitusta luokka 2  
kaliumhydroksidi (5 % liuos 
vedessä) 1310-58-3 neste 3 luokka 2 luokka 2 
bentseenitioli, 5-(1,1-dime ­
tyylietyyli)-2-metyyli- 7340-90-1 neste 3,3 luokka 2 luokka 2 
1-metyyli-3-fenyyli-1-piperat ­
siini 5271-27-2 kiinteä 3,3 luokka 2 luokka 2  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 668
 
Kemikaali CAS-nro Fysikaalinen 
olomuoto  In vivo -tulos VRM  in 
vitro -luokka YK GHS / EU CLP  
in vivo -luokka  
heptanaali 111-71-7 neste 3,4 luokka 2 luokka 2 
tetrakloorietyleeni 127-18-4 neste 4 luokka 2 luokka 2  
( 1 ) Kemikaalit valitaan seuraavin perustein: i) kemikaalit ovat kaupallisesti saatavilla; ii) ne edustavat koko Draizen ärsyttävy yspistey­
tysasteikkoa (ärsyttämättömästä erittäin ärsyttävään); iii) niiden kemiallinen rakenne on tarkkaan määritetty; iv) niiden kemia llinen 
funktio on sama kuin validointiprosessissa käytettyjen kemikaalien; ja v) niillä ei ole erittäin toksisia ominaisuuksia (esimer kiksi 
karsinogeenisia tai lisääntymisjärjestelmälle myrkyllisiä ominaisuuksia), eivätkä niiden loppusijoituskustannukset saa olla nii n 
suuret, että ne estäisivät menetelmän käytön. 
( 2 ) Kemikaalit, jotka aiheuttavat ärsytystä kanille mutta jotka luotettavien todisteiden mukaan eivät aiheuta ärsytystä ihmisille  (31) (32) (33). 
( 3 ) YK:n GHS-järjestelmässä, ei EU:n CLP-asetuksessa  
III) Määritellyt luotettavuus- ja tarkkuusarvot  
8. Kun ehdotettuja samanlaisia tai mukautettuja menetelmiä on tarkoitus käyt ­
tää monissa laboratorioissa, on luotettavuuden ja merkityksellisyyden mää ­
rittämiseksi kaikki taulukossa 1 esitetyt 20 vertailukemikaalia testattava 
vähintään kolmessa laboratoriossa. Jos ehdotettua menetelmää aiotaan käyt ­
tää vain yhdessä laboratoriossa, ei validointiin vaadita useissa laboratori ­
oissa tehtävää testausta. On kuitenkin tärkeää, että kansainvälisesti tunnus ­
tetut validointielimet arvioivat kyseisiä validointitutkimuksia riippumatto ­
masti kansainvälisten ohjeiden mukaisesti (9). Kaikki 20 vertailukemikaalia on testattava kussakin laboratoriossa kolmella erillisellä testiajolla, jotka suoritetaan eri kudosnäytteillä ja riittävän pitkän ajan kuluttua toisistaan. 
Kussakin testiajossa on testattava samanaikaisesti vähintään kolme rinnak ­
kaista kudosnäytettä jokaista testattavaa testikemikaalia sekä negatiivista kontrollikemikaalia ja positiivista kontrollikemikaalia kohti.
 
9. Ehdotetun menetelmän luotettavuus- ja tarkkuusarvot on laskettava niin, että 
huomioon otetaan seuraavat neljä perustetta, ja on varmistettava, että 
luotettavuus- ja tarkkuusarvot lasketaan ennalta määritetyllä ja johdonmu ­
kaisella tavalla:  
1. Vain täydellisistä testeistä saatuja tietoja voidaan käyttää menetelmän 
laboratorionsisäisen ja laboratorioidenvälisen vaihtelun ja ennustettavuu ­
den (tarkkuuden) laskemiseksi.  
2. Kunkin osallistuvan laboratorion kunkin vertailukemikaalin lopullinen 
luokittelu on tehtävä käyttämällä täydellisen testin eri testikerroilla saa ­
tujen solujen elinkyvyn arvojen keskiarvoa.  
3. Vain sellaisista kemikaaleista saadut tiedot, joille on tehty täydelliset 
testit kaikissa osallistuvissa laboratorioissa, voidaan ottaa huomioon las ­
kettaessa menetelmän laboratorioidenvälistä vaihtelua.  
4. Tarkkuusarvot on laskettava osallistuvissa laboratorioissa 20 vertailuke ­
mikaalille tuotettujen yksittäisten laboratorioennusteiden perusteella.  
Tässä yhteydessä  testikerta  (testiajo) koostuu tietyn laboratorion tietylle 
testikemikaalille tekemästä kolmesta riippumattomasta testauksesta.  Täydel­
lisellä testiajolla  tarkoitetaan tietyssä laboratoriossa tietylle testikemikaalille 
tehtyä testiä, jonka kaikki kolme ajoa ovat valideja. Tämä tarkoittaa, että 
yksikin hylätty ajo/testikerta johtaa koko kolmesta testiajosta koostuvan 
täydellisen testiajon hylkäämiseen.  
Laboratorionsisäinen uusittavuus  
10. Laboratorion sisäisen uusittavuuden arvioinnilla on osoitettava, että tietyssä 
laboratoriossa 20 vertailukemikaalilla suoritetut yksittäisillä, erillisillä testi ­
kerroilla saadut luokittelut vastaavat vähintään 90-prosenttisesti YK:n 
GHS-järjestelmän tai EU:n CLP-asetuksen luokitusta (luokka 2 tai ei luo ­
kitusta).  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 669
 
Laboratorioidenvälinen uusittavuus  
11. Laboratorioidenvälisen uusittavuuden arviointi ei ole tarpeen, jos ehdotettua 
menetelmää aiotaan käyttää vain yhdessä laboratoriossa. Jotta menetelmiä 
voitaisiin käyttää useissa laboratorioissa, mieluiten kolmessa eri laboratori ­
ossa 20 vertailukemikaalilla suoritetuilla yksittäisillä, erillisillä testikerroilla saatujen luokitusten olisi vastattava vähintään 80-prosenttisesti YK:n 
GHS-järjestelmän tai EU:n CLP-asetuksen luokitusta (luokka 2 tai ei luo ­
kitusta).
 
Ennustettavuusi (tarkkuus)  
12. Ehdotetun samanlaisen tai mukautetun menetelmän tarkkuuden (herkkyy ­
den, spesifisyyden ja yleisen tarkkuuden) on oltava yhtä suuri tai suurempi 
kuin VVM:n, kun kohdelajin osalta otetaan huomioon täydentävät merki ­
tyksellisyyttä koskevat tiedot (taulukko 2). Herkkyyden on oltava yhtä suuri tai suurempi kuin ( ≥) 80 prosenttia (2) (8) (23). Ehdotetun  in vitro  -mene­
telmän herkkyyteen sovelletaan kuitenkin erityistä rajoitusta: vain kaksi 
luokkaan 2 kuuluvaa  in vivo  -kemikaalia,  1-dekanoli  ja di-n-propyylidisul ­
fidi, saadaan luokitella väärin useammassa kuin yhdessä osallistuvassa la ­
boratoriossa. Spesifisyyden on oltava yhtä suuri tai suurempi kuin ( ≥) 70 
prosenttia (2) (8) (23). Ehdotetun  in vitro  -menetelmän spesifisyyteen ei 
sovelleta muita rajoituksia. Toisin sanoen mikä tahansa osallistuva labora ­
torio saa luokitella ei luokitusta -luokkaan kuuluvan  in vivo  -kemikaalin 
väärin edellyttäen, että testimenetelmän lopullinen spesifisyys on hyväksyt ­
tävällä vaihteluvälillä. Yleisen tarkkuuden on oltava yhtä suuri tai suurempi 
kuin (≥) 75 prosenttia (2) (8) (23). Vaikka taulukossa 1 lueteltujen vertai ­
lukemikaalien perusteella lasketun VVM:n herkkyys on yhtä suuri kuin 90 prosenttia, samanlaisen tai mukautetun menetelmän hyväksymiseen vaadittu 
herkkyyden vähimmäisarvo on määritetty 80 prosentiksi, koska tiedetään, 
että 1-dekanoli  (kemikaalina rajatapaus) ja  di-n-propyylidisulfidi  (VVM:n 
väärä negatiivinen) eivät aiheuta ärsytystä ihmisille (31) (32) (33), vaikka niiden on määritetty aiheuttavan ärsytystä kanitestissä. Koska RhE-mallit 
perustuvat ihmisestä saatuihin soluihin, niissä voidaan ennustaa, että kysei ­
set kemikaalit eivät ärsytä (YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen ”ei luokitusta”).
 
Taulukko 2  
Samanlaisen tai mukautetun menetelmän validoimiseksi vaaditut herkkyyden, spesifisyyden ja 
yleisen tarkkuuden ennustearvot  
Herkkyys Spesifisyys Yleinen tarkkuus  
≥ 80 % ≥ 70 % ≥ 75 %  
Tutkimuksen hyväksymisperusteet  
13. On mahdollista, että yhteen tai useampaan testikemikaaliin liittyvässä yh ­
dessä tai useammassa testissä ei täytetä testi- ja vertailukemikaaleihin so ­
vellettavia testien hyväksymisperusteita tai että sitä/niitä ei voida hyväksyä muista syistä. Kullekin testikemikaalille voidaan puuttuvien tietojen täyden ­
tämiseksi tehdä enintään kaksi täydentävää testiä (”uudelleentestaus”). Tar ­
kemmin sanottuna kullakin testikemikaalilla voidaan tehdä enintään kaksi 
täydentävää testiajoa, koska uudelleentestauksen yhteydessä myös positii ­
viset ja negatiiviset vertailukemikaalit on testattava samanaikaisesti.
 
14. Mahdollisesti vielä uudelleentestauksen jälkeenkin kaikilla vertailukemikaa ­
leilla ei saada aikaan kunkin testattavan kemikaalin osalta vaadittuja vähin ­
tään kolmea hyväksyttyä ajoa kaikissa osallistuvissa laboratorioissa. Näin ollen tietomatriisi ei ole täydellinen. Tällaisessa tapauksessa kaikki seura ­
avat kolme vaatimusta olisi täytettävä, jotta tiedot katsotaan hyväksyttäviksi:
 
1. Kaikille 20 vertailukemikaalille on tehty vähintään yksi täydellinen tes ­
tiajo. ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 670
 
2. Kussakin (vähintään kolme) osallistuvassa laboratoriossa vähintään 85 
prosenttia testiajoista ovat täydellisiä (20 kemikaalia; yhdessä laborato ­
riossa sallitaan kolme hylättyä testiä).  
3. Vähintään 90 prosenttia kaikista mahdollisista vähintään kolmen labora ­
torion testiajoista ovat täydellisiä (20 kemikaalia, testattu kolmessa labo ­
ratoriossa; yhteensä kuusi hylättyä testiajoa sallitaan).  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 671
 
B. 47.  NAUDAN SARVEISKALVON SAMEUTEEN JA LÄPÄISEVYY ­
TEEN PERUSTUVA TESTIMENETELMÄ SILMÄÄ SYÖVYTTÄ ­
VIEN JA SILMÄÄ VAKAVASTI ÄRSYTTÄVIEN AINEIDEN 
TUNNISTAMISEKSI  
JOHDANTO  
1. Naudan sarveiskalvon sameuteen ja läpäisevyyteen perustuva testimene ­
telmä (Bovine Corneal Opacity and Permeability, BCOP) on  in vitro  -tes­
timenetelmä, jota voidaan tietyissä olosuhteissa ja tietyin rajoituksin käyttää 
aineiden ja seosten luokittelemiseksi silmää syövyttäviksi ja silmää va ­
kavasti ärsyttäviksi (1) (2) (3). Tätä testimenetelmää sovellettaessa määritel ­
lään vakavasti ärsyttävät aineet sellaisiksi, jotka aiheuttavat silmävaurioita, jotka kestävät kanissa vähintään 21 vuorokautta annostelun jälkeen. Vaikka 
BCOP-testin ei katsota täysin korvaavan  in vivo  -kaninsilmätestiä, sen käyt ­
töä suositellaan vaiheittaisessa testauksessa sääntömääräistä luokitusta ja merkintöjen määräämistä varten tietyllä sovellusalalla (4) (5). Testiaineet ja seokset (6) voidaan luokitella silmää syövyttäviksi tai silmää vakavasti 
ärsyttäviksi ilman kaneilla tehtävää lisätestausta. Aine, jolle saadaan testissä 
negatiivinen tulos, olisi testattava kaneissa käyttäen vaiheittaista testausst ­
rategiaa, kuten OECD:n ohjeessa Test Guideline 405 (7) (tämän liitteen B. 5 luku) esitetään.
 
2. Tässä testimenetelmässä kuvataan menettelyt, joilla arvioidaan testiaineen 
mahdollinen kyky syövyttää tai ärsyttää vakavasti silmää mittaamalla kykyä aiheuttaa sameutta ja läpäisevyyden lisääntymistä eristetyssä naudan sarveis ­
kalvossa. Myrkylliset vaikutukset sarveiskalvoon mitataan seuraavilla me ­
netelmillä: i) valon läpikulun (transmission) vähentyminen (sameus) ja ii) natriumfluoreseiini-väriaineen lisääntynyt siirtyminen silmään (läpäisevyys). Testiaineelle altistuksen jälkeen tehhtyjä sarveiskalvon sameus- ja läpäise ­
vyysarviointeja tarkastellaan yhdessä siten, että voidaan johtaa  in vitro  -är­
syttävyysarvo ( In Vitro  Irritancy Score, IVIS), jonka avulla luokitellaan 
testiaineen ärsyttävyystaso.
 
3. BCOP-menetelmällä on testattu myös silmää ärsyttäviä aineita, jotka aihe ­
uttavat alle 21 päivässä palautuvia vaurioita ja aineita, jotka eivät ärsytä silmää. BCOP-menetelmän tarkkuutta ja luotettavuutta näihin kategorioihin kuuluvien aineiden testauksessa ei ole kuitenkaan validoitu virallisesti.
 
4. Määritelmät esitetään lisäyksessä 1.  
ALUSTAVIA HUOMIOITA JA RAJOITUKSIA  
5. Tämä testimenetelmä perustuu ICCVAMin (Interagency Coordinating Com ­
mittee on the Validation of Alternative Methods, vaihtoehtoisten menetel ­
mien validoinnin virastojenvälinen koordinointikomitea) BCOP-testimene ­
telmäprotokollaan (8), joka kehitettiin kansainvälisen validointitutkimuksen perusteella (4)(5)(9). Siihen ovat osallistuneet vaihtoehtoisten menetelmien eurooppalainen validointikeskus ECVAM ja Japanin vastaava keskus (JaC ­
VAM). Protokolla perustuu tietoihin, jotka on saatu In vitro -tieteiden 
instituutista (IIVS) ja INVITTOX-protokollasta 124 (10), joka edustaa pro ­
tokollaa, jota käytettiin Euroopan yhteisön tukemassa vuosina 1997–1998 tehdyssä BCOP-testin esivalidointitutkimuksessa. Molemmat protokollat pe ­
rustuvat BCOP-määritysmenetelmään, jonka raportoivat ensimmäisenä 
Gautheron  et al.  (11).
 ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 672
 
6. Tämän testimenetelmän haittoja ovat validointitietokannassa havaitut alko ­
holeille ja ketoneille saatujen väärien positiivisten tulosten suuri määrä ja 
kiinteille aineille saatujen väärien negatiivisten tulosten suuri määrä (ks. kohta 44) (5). Kun tietokannasta poistetaan näihin kemiallisiin ja fysikaa ­
lisiin luokkiin kuuluvat aineet, parantuu BCOP-menetelmän tarkkuus EU:n, 
EPAn ja GHS:n luokitusjärjestelmissä huomattavasti (5). Koska tämän testin 
tarkoituksena on ainoastaan tunnistaa silmiä syövyttävät ja/tai silmiä va ­
kavasti ärsyttävät aineet, väärät negatiiviset tulokset eivät haittaa, koska tällaiset aineet testattaisiin myöhemmin kaneilla tai muilla asianmukaisesti 
validoiduilla  in vitro  -testeillä sääntömääräisistä vaatimuksista riippuen käyt ­
täen vaiheittaista testausstrategiaa ja todistusnäytön arviointia. Nykyisen validointitietokannan avulla ei myöskään voida arvioida asianmukaisesti tiettyjä kemikaali- tai tuoteluokkia (esimerkiksi seoksia). Tutkijat voisivat 
kuitenkin harkita tätä testimenetelmää kaikentyyppisille testimateriaaleille, 
myös seoksille, jolloin positiivisen tuloksen voitaisiin katsoa viittaavan sil ­
män syövytykseen tai vakavaan ärsytykseen. Alkoholeilla ja ketoneilla saa ­
tuihin positiivisiin tuloksiin olisi kuitenkin suhtauduttava varovaisesti.
 
7. Kaikissa naudan silmiä ja sarveiskalvoja käyttävissä menettelyissä olisi nou ­
datettava testauslaitoksen määräämiä eläinperäisten materiaalien (muun mu ­
assa muttei ainoastaan kudosten ja kudosnesteiden) käsittelyä koskevia 
sääntöjä. Suositellaan yleismaailmallisia laboratorioissa noudatettavia ennal ­
tavarautumiskäytänteitä (12).  
8. Eräs tämän testimenetelmän rajoitus on se, että vaikka siinä otetaan huomi ­
oon joitakin kanin silmä-ärsytystestissä arvioituja silmävaikutuksia ja jos ­
sain määrin niiden vakavuus, siinä ei tarkastella sidekalvon ja värikalvon 
vaurioita. Kaninsilmätutkimusten perusteella on myös ehdotettu, että vaikka BCOP-testissä ei sinänsä voida arvioida sarveiskalvovaurioiden palautuvuut ­
ta, voidaan kuitenkin arvioida sarveiskalvovaurion alkusyvyys ja sen avulla 
erottaa palautuvat ja palautumattomat vaikutukset (13). BCOP-menetelmällä ei voida myöskään arvioida sitä, missä määrin silmäaltistukseen voi liittyä systeemistä myrkyllisyyttä.
 
9. Tutkimuksissa pyritään selvittämään lisää BCOP-määrityksen käyttökelpoi ­
suutta ja rajoituksia ei-vakavien ärsyttävien aineiden ja ei-ärsyttävien ainei ­
den tunnistamiseksi (ks. myös kohta 45). Käyttäjiä rohkaistaan antamaan näytteitä ja/tai tuloksia validointijärjestöille, jotta BCOP-testimenetelmän 
mahdollisia tulevia käyttötapoja, kuten ei-vakavien ärsyttävien aineiden ja 
ei-ärsyttävien aineiden tunnistusta, voidaan arvioida virallisesti.
 
10. Kun laboratorio alkaa käyttää tätä määritysmenetelmää, sen olisi käytettävä 
lisäyksessä 2 mainittuja pätevyyden osoittamiseen tarkoitettuja kemikaaleja. 
Laboratorio voi käyttää näitä kemikaaleja osoittaakseen teknisen pätevyy ­
tensä BCOP-testin suorituksessa ennen kuin se toimittaa BCOP-määritystuloksia sääntömääräistä vaaraluokitusta varten.
 
TESTIN PERIAATE  
11. BCOP-testimenetelmä on elinmalli, joka mahdollistaa naudan sarveiskalvon 
tavanomaisten fysiologisten ja biokemiallisten toimintojen lyhytaikaisen yl ­
läpitämisen  in vitro  -oloissa. Testiaineen aiheuttamaa vauriota arvioidaan 
tässä menetelmässä mittaamalla muutokset sarveiskalvon sameudessa ns. 
opasitometrillä ja muutokset läpäisevyydessä näkyvää valoa mittaavalla spektrofotometrillä. Molempia mittauksia käytetään IVIS-arvon laskemi ­
seen. IVIS-arvon avulla osoitetaan aineelle  in vitro  -ärsyttävyyteen perus ­
tuva vaaraluokituskategoria, jotta voidaan ennustaa testiaineen  in vivo  -sil­
mä-ärsytyskyky (ks. päätöskriteerit).
 ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 673
 
12. BCOP-testimenetelmässä käytetään vasta teurastetuista naudoista saaduista 
silmistä eristettyjä sarveiskalvoja. Sarveiskalvon sameus mitataan sinä valo ­
määränä, joka kulkee sarveiskalvon läpi. Läpäisevyys mitataan sinä määränä natriumfluoreseiini-väriainetta, joka imeytyy koko sarveiskalvon läpi ja joka mitataan takakammiossa olevassa mediumissa (väliaineessa). Testiaineet an ­
nostellaan sarveiskalvon epiteelipinnalle lisäämällä sitä sarveiskalvotelineen 
etukammioon. Lisäyksessä 3 on kuvaus ja kaavio BCOP-testissä käytetystä sarveiskalvotelineestä. Sarveiskalvotelineitä saa kaupallisesti eri lähteistä, tai ne voi rakentaa itse.
 
Naudan silmien lähde ja eläinten ikä sekä eläinlajin valinta  
13. Teurastamoihin tuodut nautaeläimet teurastetaan useimmiten käytettäväksi 
ihmisravinnoksi tai muihin kaupallisiin tarkoituksiin. BCOP-testiin voidaan 
käyttää vain sarveiskalvoja, jotka on saatu terveistä, ihmisravinnoksi kelpaa ­
vista eläimistä. Koska nautaeläinten paino vaihtelee paljon riippuen rodusta, iästä ja sukupuolesta, ei anneta mitään suositusta siitä, minkä painoisia eläinten olisi oltava teurastushetkellä.
 
14. Sarveiskalvojen mitat voivat vaihdella käytettäessä eri ikäisistä eläimistä 
saatuja silmiä. Yli kahdeksan vuoden ikäisistä eläimistä saatujen sarveiskal ­
vojen halkaisija vaakasuunnassa on yleensä > 30,5 mm ja sarveiskalvon 
keskiosan paksuus (CCT) ≥ 1 100 μm, kun taas alle viiden vuoden ikäisten 
sarveiskalvon halkaisija on < 28,5 mm ja CCT < 900 μm. Tästä syystä ei 
yleensä käytetä silmiä, jotka on saatu yli 60 kuukauden ikäisistä eläimistä. 
Perinteisesti ei ole käytetty alle 12 kuukauden ikäisten nautojen silmiä, 
koska silmien kehitys on vielä kesken ja sarveiskalvo on huomattavasti ohuempi ja sen halkaisija pienempi kuin täysikasvuisten eläinten sarveiskal ­
von. Nuorista eläimistä (eli 6–12 kuukautta vanhoista) saatuja sarveiskalvoja 
voidaan käyttää, koska siihen liittyy joitakin etuja. Niitä saa helpommin, ikävaihtelu on pienempi, ja vaara työntekijöiden altistumisesta naudan spon ­
giformiselle enkefalopatialle on pienempi (15). Koska olisi hyödyllistä ar ­
vioida lisää sarveiskalvon koon tai paksuuden vaikutusta sarveiskalvon rea ­
goimiseen syövyttäviin ja ärsyttäviin aineisiin, käyttäjiä kehotetaan raportoi ­
maan niiden eläinten arvioitu ikä ja/tai paino, joista tutkimuksessa käytetyt sarveiskalvot on saatu.
 
Silmien kerääminen ja niiden kuljetus laboratorioon  
15. Teurastamon henkilökunta kerää silmät. Jotta silmille aiheutuisi mahdolli ­
simman vähän mekaanista tai muuta vahinkoa, olisi silmämuna poistettava 
mahdollisimman pian kuoleman jälkeen. Jotta silmät eivät altistuisi mahdol ­
lisesti ärsyttäville aineille, teurastamon työntekijät eivät saisi käyttää deter ­
genttejä huuhtoessaan eläimen päätä.  
16. Silmät olisi upotettava kokonaan Hanksin suolaliuokseen (Hanks’ Balanced 
Salt Solution, HBSS) sopivankokoisessa astiassa ja kuljetettava laboratori ­
oon sellaisella tavalla, että bakteerikontaminaatio tai muut vauriot ovat 
mahdollisimman pieniä. Koska silmät kerätään teurastuksen yhteydessä, nii ­
hin saattaa roiskua verta ja muita biologisia aineita, kuten bakteereja ja muita pieneliöitä. Siksi on tärkeää varmistaa, että kontaminaatioriski on mahdollisimman pieni. Esimerkiksi astia, jossa silmät ovat, on pidettävä 
jäähauteessa, ja kuljetusta varten käytettävään HBSS:ään on lisättävä anti ­
biootteja (esim. penisilliiniä 100 IU/ml ja streptomysiiniä 100 μg/mL]).
 ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 674
 
17. Silmien keräämisen ja BCOP-testin tekemisen välisen ajan pitäisi olla mah ­
dollisimman lyhyt (keräys ja käyttö mieluiten samana päivänä), ja pitäisi 
osoittaa, etteivät määritystulokset ole sen takia epäluotettavia. Nämä tulok ­
set perustuvat silmien valintaperusteisiin sekä positiivisten ja negatiivisten kontrollinäytteiden vasteisiin. Kaikkien määrityksessä käytettyjen silmien 
olisi oltava peräisin samasta tiettynä päivänä kerätystä silmäryhmästä.
 
BCOP-testissä käytettävien silmien valintaperusteet  
18. Heti kun silmät saapuvat laboratorioon, tutkitaan huolellisesti, onko niissä 
vikoja, kuten lisääntynyttä sameutta, naarmuja ja verisuonittumista. Testissä 
saa käyttää vain sellaisista silmistä saatuja sarveiskalvoja, joissa ei ole tällaisia vikoja.
 
19. Kaikkien sarveiskalvojen laatua arvioidaan myös määrityksen myöhemmissä 
vaiheissa. Sarveiskalvot, joiden sameusaste yhden tunnin tasapainottumisa ­
jan jälkeen on suurempi kuin seitsemän sameusyksikköä (HUOM. opasito ­
metri pitäisi kalibroida sameusyksikköjen vahvistamiseen käytetyillä same ­
usstandardeilla, ks. lisäys 3), hylätään.  
20. Kussakin käsittelyryhmässä (testiaine, samaan aikaan tehtävät negatiiviset ja 
positiiviset kontrollit) on oltava vähintään kolme silmää. BCOP-määrityksessä pitäisi negatiiviseen kontrolliin käyttää kolme sarveis ­
kalvoa. Koska kaikki sarveiskalvot leikataan kokonaisesta silmämunasta ja 
asetetaan sarveiskalvokammioihin, voi käsittelystä aiheutua vahinkoa, joka vaikuttaa yksittäisen sarveiskalvon sameuteen ja läpäisevyyteen (myös ne ­
gatiivisessa kontrollissa). Negatiivisista kontrollisarveiskalvoista saatuja sa ­
meus- ja läpäisevyysarvoja käytetään lisäksi IVIS-laskelmissa korjaamaan testituotteella ja positiivisella kontrollilla käsiteltyjen sarveiskalvojen same ­
us- ja läpäisevyysarvoja.
 
MENETTELY  
Silmien valmistelu  
21. Virheettömät sarveiskalvot leikataan siten, että niihin jää 2–3 mm:n reuna 
kovakalvoa, mikä helpottaa myöhempää käsittelyä. Varotaan vahingoitta ­
masta sarveiskalvon epiteeliä ja endoteeliä. Eristetyt sarveiskalvot asetetaan erikoistelineisiin, joissa on etu- ja takaosasto. Nämä ovat kosketuksissa sarveiskalvon epiteelipuoleen (etukammio) ja endoteelipuoleen (takakam ­
mio). Molemmat kammiot täytetään ylimäärin esilämmitetyllä Eaglen Mini ­
mum Essential Medium (EMEM) -viljelynesteellä (mediumilla) (takakam ­
mio ensin) ja varmistetaan, ettei muodostu kuplia. Laitteen annetaan tasa ­
painottua 32 ± 1 celsiusasteessa vähintään tunnin, jotta sarveiskalvot tasa ­
painottuvat mediumin kanssa ja niiden metabolinen toiminta palautuu nor ­
maaliksi (mikäli mahdollista). Sarveiskalvon pinnan lämpötila  in vivo  on 
noin 32°C.
 
22. Tasapainottumisjakson jälkeen molempiin kammioihin lisätään tuoretta esi ­
lämmitettyä EMEM:iä, ja kustakin sarveiskalvosta otetaan sameuden perus ­
tasolukema. Kaikki sarveiskalvot, joissa esiintyy makroskooppisia kudos ­
vaurioita (esimerkiksi naarmuja, värihäiriöitä, verisuonittumista) tai joiden 
sameus ylittää 7 sameusyksikköä, hylätään. Kaikille tasapainotetuille sar ­
veiskalvoille lasketaan sameuden keskiarvo. Negatiivisiksi kontrollisarveis ­
kalvoiksi (liuotinkontrolli) valitaan vähintään kolme sarveiskalvoa, joiden 
sameusarvot ovat lähellä kaikkien sarveiskalvojen mediaania. Muut sarveis ­
kalvot jaetaan käsittelyryhmään ja positiivisen kontrollin ryhmään.  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 675
 
23. Koska veden lämpökapasiteetti on suurempi kuin ilman, vedellä saadaan 
tasaisempi inkubaatiolämpötila. Siksi suositellaan vesihauteen käyttöä sar ­
veiskalvotelineen ja sen sisällön pitämiseksi 32 ± 1 celsiusasteessa. Kuiten ­
kin myös ilmainkubaattoreita voidaan käyttää, kunhan huolehditaan siihen, että lämpötila pysyy vakaana (esimerkiksi esilämmittämällä telineet ja me ­
diumit).
 
Testiaineen annostelu  
24. Käsittelyä varten on kaksi eri protokollaa, toinen nesteille ja 
pinta-aktiivisille aineille (kiinteät tai nestemäiset) ja toinen kiinteille aineille, 
jotka eivät ole pinta-aktiivisia.  
25. Nesteet testataan laimentamattomina. Pinta-aktiiviset aineet testataan 10-pro ­
senttisen liuoksena (w/v) 0,9-prosenttisessa natriumkloridiliuoksessa, tisla ­
tussa vedessä tai muussa liuottimessa, josta on osoitettu, ettei se häiritse 
testijärjestelmää. Puoliksi kiinteät aineet, voiteet ja vahat testataan tavalli ­
sesti kuten nesteet. Jos laimennuksia muutetaan, on ne perusteltava. Sar ­
veiskalvot altistetaan nesteille ja pinta-aktiivisille aineille 10 minuutin ajan. 
Jos altistusaikaa muutetaan, olisi se perusteltava tieteellisesti.  
26. Kiinteät aineet, jotka eivät ole pinta-aktiivisia, testataan tavallisesti 20-pro ­
senttisena liuoksena tai suspensiona 0,9-prosenttisessa natriumkloridiliu ­
oksessa, tislatussa vedessä tai muussa liuottimessa, josta on osoitettu, ettei 
se häiritse testijärjestelmää. Joissakin olosuhteissa ja asianmukaisesti tieteel ­
lisesti perusteltuna kiinteitä aineita voidaan testata myös sellaisenaan annos ­
telemalla niitä suoraan sarveiskalvon pinnalle avoimen kammion menetel ­
mässä (ks. kohta 29). Sarveiskalvot altistetaan kiinteille aineille neljän tun ­
nin ajan. Kuten nesteiden ja pinta-aktiivisten aineiden tapauksessa, altistu ­
sajan muuttaminen on perusteltava tieteellisesti.  
27. Käsittely voi olla erilaista riippuen testattavan aineen fysikaalisista ja kemi ­
allisista ominaisuuksista, esimerkiksi siitä, onko kyseessä kiinteä aine, neste, viskoosi tai ei-viskoosi neste. Tärkeintä on varmistaa, että testiaine peittää riittävästi epiteelin pinnan ja että se voidaan huuhtelemalla poistaa riittäväs ­
ti. Suljetun kammion menetelmää käytetään tavallisesti testattaville nesteille, 
jotka vaihtelevat ei-viskoosista lievästi viskoosiin, kun taas avoimen kam ­
mion menetelmää käytetään tavallisesti puoliksi viskooseille ja viskooseille nesteille ja kiinteille aineille.
 
28. Suljetun kammion menetelmässä annostellaan etukammioon niin paljon tes ­
tiainetta (750 μl), että se peittää sarveiskalvon epiteelipuolen. Annostelu 
tapahtuu kammion yläosassa olevien aukkojen kautta. Aukot suljetaan sitten 
tulpilla altistuksen ajaksi. On tärkeää varmistaa, että kukin sarveiskalvo 
altistetaan testiaineelle niin pitkäksi aikaa kuin on asianmukaista.  
29. Avoimen kammion menetelmässä ikkunan lukitusrengas ja etukammion 
lasi-ikkuna poistetaan ennen käsittelyä. Kontrollia tai testiainetta (750 μl 
tai niin paljon, että testiaine peittää sarveiskalvon kokonaan) annostellaan suoraan sarveiskalvon epiteelipinnalle mikropipetillä. Jos testiainetta on vai ­
kea pipetoida, se voidaan siirtää paineen avulla ns. positive displacement 
-pipetointilaitteeseen annostelun helpottamiseksi. Positive displacement -pi ­
petin kärki työnnetään ruiskun annostelukärkeen niin, että aine voidaan siirtää displacement-pipetin kärkeen paineen avulla. Ruiskun mäntää paine ­
taan samalla kun pipetin mäntää vedetään ylöspäin. Jos pipetin kärkeen 
ilmestyy ilmakuplia, testiaine puhalletaan ulos ja prosessi toistetaan, kunnes 
kärki saadaan täytettyä ilman ilmakuplia. Jos on tarpeen, voidaan käyttää tavallista ruiskua (ilman neulaa), koska sillä voidaan mitata tarkka tilavuus testiainetta, ja annostelu sarveiskalvon epiteelipinnalle on helpompaa. An ­
nostelun jälkeen lasi-ikkuna pannaan paikalleen etukammion päälle, jotta 
järjestelmä on jälleen suljettu.
 ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 676
 
Inkubointi altistuksen jälkeen  
30. Altistusajan jälkeen testiaine, negatiivinen kontrolliaine tai positiivinen 
kontrolliaine poistetaan etukammiosta ja epiteeli pestään vähintään kolmesti 
(tai kunnes testiainetta ei näy) EMEM:illä (jossa on fenolipunaa). Huuhte ­
luun käytetään fenolipunaa sisältävää mediumia, koska fenolipunan värin vaihtumista voidaan seurata, kun halutaan määrittää happamien tai emäk ­
sisten aineiden huuhtelun tehokkuus. Sarveiskalvoja pestään enemmän kuin 
kolme kertaa, jos fenolipuna on edelleen vääränvärinen (keltainen tai purp ­
puranvärinen) tai jos testiainetta on vielä näkyvillä. Kun mediumissa ei ole enää testiainetta, sarveiskalvot pestään vielä kerran EMEM:illä (jossa ei ole 
fenolipunaa). EMEM-huuhtelua (ilman fenolipunaa) käytetään viimeiseksi 
sen varmistamiseksi, että fenolipuna on poistunut etukammiosta ennen sa ­
meusmittausta. Etukammio täytetään sitten uudelleen tuoreella EMEM:illä (ilman fenolipunaa).
 
31. Kun testiaine on neste tai pinta-aktiivinen aine, sarveiskalvoja inkuboidaan 
huuhtelun jälkeen vielä kaksi tuntia 32 ± 1 celsiusasteessa. Tietyissä olo ­
suhteissa voi pitempi aika altistuksen jälkeen olla hyödyksi. Sitä voidaan harkita tapauskohtaisesti. Kiinteillä aineilla käsitellyt sarveiskalvot huuhdel ­
laan perusteellisesti neljän tunnin altistuksen päätteeksi, mutta niitä ei tar ­
vitse enää inkuboida enempää.
 
32. Kunkin sarveiskalvon sameus ja läpäisevyys kirjataan nesteille ja 
pinta-aktiivisille aineille altistuksen jälkeisen inkubaation jälkeen ja kiin ­
teille aineille, jotka eivät ole pinta-aktiivisia aineita, neljän tunnin altistuk ­
sen jälkeen. Kutakin sarveiskalvoa tarkastellaan myös silmämääräisesti ja kirjataan merkitykselliset havainnot (esimerkiksi kudoksen kuoriutuminen, testiaineen jäämät, epätasainen sameusjakauma). Tällaiset havainnot voivat 
olla tärkeitä, sillä ne voivat näkyä opasitometrin lukemien vaihteluna.
 
Kontrolliaineet  
33. Kussakin kokeessa on mukana samanaikaisesti määritettävät negatiiviset eli 
liuotin/vehikkelikontrollit ja positiiviset kontrollit.  
34. Kun testataan 100-prosenttista nestemäistä ainetta, otetaan 
BCOP-määritykseen samanaikaisesti määritettävä negatiivinen kontrolli (esi ­
merkiksi 0,9-prosenttinen natriumkloridiliuos tai tislattu vesi) sitä varten, että epäspesifiset muutokset testijärjestelmässä voidaan havaita ja määrityk ­
sen päätepisteille saadaan perustaso. Näin varmistetaan myös, etteivät mää ­
ritysolosuhteet aiheuta ärsytysvastetta tahattomasti.
 
35. Kun testataan laimennettua nestettä, pinta-aktiivista ainetta tai kiinteää ai ­
netta, otetaan BCOP-määritykseen samanaikaisesti määritettävä liuotin/ ­
vehikkelikontrolliryhmä sitä varten, että epäspesifiset muutokset testijärjes ­
telmässä voidaan havaita ja määrityksen päätepisteille saadaan perustaso. 
Liuotinta/vehikkeliä saa käyttää vain, jos on osoitettu, ettei se häiritse tes ­
tijärjestelmää.  
36. Kuhunkin kokeeseen otetaan mukaan tunnettu silmiä ärsyttävä aine positii ­
visena kontrollina, jotta voidaan varmistaa, että saadaan asianmukainen 
vaste. Koska BCOP-määritystä käytetään tässä testimenetelmässä syövyttä ­
vien tai vakavasti ärsyttävien aineiden tunnistamiseksi, positiivisen kontrol ­
lin olisi mielellään oltava aine, joka aiheuttaa vakavan vasteen tässä testi ­
menetelmässä. Ärsytysvaste ei kuitenkaan saisi olla liian voimakas, jotta 
positiivisen kontrollivasteen vaihtelu ajan funktiona voidaan määrittää.  
37. Nestemäisille testiaineille voidaan positiivisena kontrollina käyttää esimer ­
kiksi dimetyyliformamidia tai 1-prosenttista natriumhydroksidia. Kiinteiden 
testiaineiden positiivisena kontrollina voidaan käyttää esimerkiksi 20-pro ­
senttista (w/v) imidatsolia 0,9-prosenttisessa natriumkloridiliuoksessa.  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 677
 
38. Vertailuaineet ovat hyödyllisiä, kun arvioidaan tiettyyn kemikaali- tai tuo ­
teryhmään kuuluvien tuntemattomien kemikaalien silmä-ärsytyskykyä tai 
silmää ärsyttävän aineen suhteellista ärsytyskykyä tietyllä ärsytysvastealu ­
eella.  
Mitatut päätepisteet  
39. Sarveiskalvon sameus mitataan sinä valomääränä, joka kulkee sarveiskalvon 
läpi. Sarveiskalvon sameus mitataan kvantitatiivisesti opasitometrillä, jolla saadaan jatkuvalla asteikolla mitattuja sameusarvoja.
 
40. Läpäisevyys mitataan sinä määränä natriumfluoreseiini-väriainetta, joka 
imeytyy kaikkien sarveiskalvon solukerrosten (ts. sarveiskalvon ulkopinnan epiteelin ja sisäpinnan endoteelin) läpi. 1 ml natriumfluoreseiiniliuosta (4 mg/ml testattaessa nesteitä tai pinta-aktiivisia aineita tai 5 mg/ml testat ­
taessa kiinteitä aineita, jotka eivät ole pinta-aktiivisia) lisätään sarveiskalvot ­
elineen etukammioon, joka on kosketuksissa sarveiskalvon epiteelipuolen kanssa. Takakammiossa, joka on kosketuksissa sarveiskalvon endoteelipuo ­
len kanssa, on tuoretta EMEM:iä. Telinettä inkuboidaan vaakasuorassa 90 ± 
5 min 32 ± 1 celsiusasteessa. Takakammioon siirtyvän natriumfluoreseiinin 
määrä mitataan UV/VIS-spektrofotometrillä. 490 nanometrin aallonpituu ­
della mitatut spektrofotometrin lukemat kirjataan optisena tiheytenä (OD
 490 ) 
tai absorbanssiarvoina, jotka mitataan jatkuvalla asteikolla. Fluoreseiinilä ­
päisevyysarvot määritetään käyttäen OD  490 -arvoja, jotka on mitattu spekt ­
rofotometrillä tavanomaisella 1 senttimetrin valotiellä.  
41. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää 96 kuopan kuoppalevyjen lukulaitetta, jos 
i) laitteen fluoreseiinin OD  490 -arvojen mittausalue on lineaarinen; ja ii) 96 
kuopan levyissä käytetään sellaista fluoreseiininäytteiden tilavuutta, jolla saadaan 1 cm:n valotiellä saatuja arvoja vastaavat OD
 490 -arvot (tämä saat ­
taa edellyttää, että kuoppa täytetään kokonaan [tavallisesti 360ml]).  
MITTAUSTULOKSET JA TESTISELOSTEET  
Mittaustulosten arviointi  
42. Kun sameusarvot ja keskimääräiset läpäisevyysarvot (OD  490 ) on korjattu 
taustan sameuden ja negatiivisen kontrollin läpäisevyyden OD  490 -arvojen 
suhteen, yhdistetään kunkin käsittelyryhmän sameuden keskiarvot ja läpäi ­
sevyyden keskimääräiset OD  490 -arvot kokemusperäiseen kaavaan, josta 
lasketaan kullekin käsittelyryhmälle  in vitro  -ärsytysaste (IVIS) seuraavasti:  
IVIS = sameuden keskiarvo + (15 × keskimääräinen läpäisevyyden OD  490 
-arvo)  
Sina et al . (16) ovat raportoineet, että tämä kaava on johdettu heidän 
laboratoriossaan ja laboratorioidenvälisissä tutkimuksissa. Monilaboratorio ­
tutkimuksessa 36 yhdisteen sarjalle saaduille tuloksille tehtiin monimuuttuja-analyysi, jossa määritettiin paras yhtälö  in vivo  ja in vitro  
saatujen tuloksien välille. Kahden yhtiön tutkijat tekivät tämän analyysin. 
He johtivat lähes identtiset yhtälöt.
 
43. Sameus- ja läpäisevyysarvoja olisi arvioitava myös erikseen, jotta nähdään, 
aiheuttaako testiaine syövytystä tai vakavaa ärsytystä vain yhden päätepis ­
teen määrityksessä (ks. päätöskriteerit).  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 678
 
Päätöskriteerit  
44. Aine, jonka aiheuttama IVIS on vähintään 55.1, määritellään syövyttäväksi 
tai vakavaa ärsytystä aiheuttavaksi aineeksi. Kuten 1 kohdassa mainittiin, 
jos testiainetta ei tunnisteta silmiä syövyttäväksi tai niitä vakavasti ärsyttä ­
väksi, on testausta jatkettava luokitusta ja merkintöjen määräämistä varten. BCOP-testimenetelmän yleinen tarkkuus on välillä 79 % (113/143) – 81 % 
(119/147), siinä saatujen väärien positiivisten tulosten määrä on välillä 19 % 
(20/103) – 21 % (22/103) ja väärien negatiivisten tulosten määrä välillä 16 % (7/43) – 25 % (10/40) verrattuna kanin silmää  in vivo  käyttävällä 
testimenetelmällä saatuihin tuloksiin luokiteltuna EPAn (1), EU:n (2) tai 
GHS:n (3) luokitusjärjestelmien mukaan. Kun tietokannasta jätetään pois 
tiettyihin kemiallisiin (alkoholit, ketonit) tai fysikaalisiin (kiinteät aineet) luokkiin kuuluvat aineet, BCOP-menetelmän tarkkuus EPAn, EU:n ja GHS:n luokitusjärjestelmissä vaihtelee väillä 87 % (72/83) – 92 % (78/85), 
väärien positiivisten tulosten määrä on välillä 12 % (7/58) – 16 % (9/56) ja 
väärien negatiivisten tulosten määrä välillä 0 % (0/27) – 12 % (3/26).
 
45. Vaikka testiaineelle ei saataisi luokitusta silmiä syövyttäväksi tai niitä va ­
kavasti ärsyttäväksi aineeksi, BCOP-menetelmässä saaduista tuloksista voi 
olla hyötyä käytettynä yhdessä  in vivo  -kaninsilmätestissä tai asianmukai ­
sesti validoidussa  in vitro  -testissä saatujen testitulosten kanssa, kun arvioi ­
daan BCOP-menetelmän käyttökelpoisuutta ja rajoituksia muiden kuin va ­
kavasti ärsyttävien ja ei-ärsyttävien aineiden tunnistamisessa (valmisteilla on 
ohjeet  in vitro  -silmämyrkyllisyystestimenetelmien käytöstä).  
Tutkimuksen hyväksymiskriteerit  
46. Testiä pidetään hyväksyttävänä, jos positiivisella kontrollilla saadaan 
IVIS-arvo, joka on kahden standardipoikkeaman sisällä senhetkisestä pitkän aikavälin keskiarvosta, joka on päivitettävä vähintään kolmen kuukauden välein tai joka kerta kun sellaisissa laboratorioissa, joissa testejä tehdään 
vain harvoin (vähemmän kuin kerran kuussa) saadaan hyväksytty testi. 
Negatiivisista tai liuotin/vehikkelivasteista saatujen sameus- ja läpäisevyys ­
arvojen pitäisi olla pienemmät kuin vahvistetut sameuden ja läpäisevyyden taustaraja-arvot naudan sarveiskalvolle, jota on käsitelty negatiivisilla tai 
liuotin/vehikkelikontrolleilla.
 
Testiseloste  
47. Testiselosteessa olisi annettava seuraavat tiedot, jos ne ovat merkityksellisiä 
tutkimuksen suorittamiselle:  
Testi- ja kontrolliaineet  
Kemiallinen nimi (nimet), kuten CAS:n (Chemical Abstracts Service) käyt ­
tämä rakennetta kuvaava nimi, jonka jälkeen annetaan muut nimet, jos ne 
tunnetaan;  
CAS-numero, jos se tunnetaan;  
Aineen tai seoksen puhtausaste tai koostumus (painoprosentteina), jos tieto 
on saatavilla;  
Testin suorittamisen kannalta merkitykselliset fysikokemialliset ominaisuu ­
det, kuten olomuoto, haihtuvuus, pH, stabiilius, kemiallinen luokka ja ve ­
siliukoisuus;  
Tarvittaessa testi- ja/tai kontrolliaineiden käsittely ennen testiä (esim. läm ­
mittäminen tai jauhaminen);  
Stabiilius, jos se tiedetään.  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 679
 
Sponsoria ja testauslaitosta koskevat tiedot:  
Sponsorin nimi ja osoite, testilaitos ja tutkimusjohtaja;  
Silmien lähde (laitos, josta ne on kerätty);  
Silmien säilytys- ja kuljetusolosuhteet (kuten silmien keräyspäivä ja kellon ­
aika, aika siihen asti kun testi aloitettiin, kuljetuksessa käytetty medium ja 
lämpötilaolot, mahdollisesti käytetyt antibiootit);  
Erityistietoja eläimistä, joista silmät on kerätty (kuten ikä, sukupuoli, paino), 
jos tiedot ovat saatavilla.  
Käytetyn testimenetelmän ja protokollan perustelu  
Testimenetelmän integriteetti  
Menettely, jolla testimenetelmän integriteetti (ts. tarkkuus ja luotettavuus) 
ajan suhteen varmistetaan (esimerkiksi pätevöittämiseen käytettyjen aineiden 
säännöllinen testaus, aiempien negatiivisten ja positiivisten kontrollitulosten käyttö).
 
Hyväksyttävän testin kriteerit  
Hyväksyttävät aiempiin tuloksiin perustuvat samaan aikaan tehtyjen positii ­
visten ja negatiivisten kontrollien vaihteluvälit;  
Tapauksen mukaan hyväksyttävät aiempiin tuloksiin perustuvat samaan ai ­
kaan tehtyjen vertailukontrollien vaihteluvälit.  
Testausolosuhteet  
Kuvaus käytetystä testijärjestelmästä;  
Käytetyn sarveiskalvotelineen tyyppi;  
Kalibrointitiedot laitteista, joita käytettiin sameuden ja läpäisevyyden mitta ­
ukseen (esimerkiksi opasitometri ja spektrofotometri);  
Käytettyjä naudan silmiä koskevat tiedot, myös niiden laatua koskeva lau ­
suma:  
Käytetty testimenettely yksityiskohtaisesti;  
Käytetyt testiainekonsentraatiot;  
Kuvaus testimenettelyjen mahdollisista muutoksista;  
Viittaus mallia koskeviin aiempiin tuloksiin (esimerkiksi negatiiviset ja po ­
sitiiviset kontrollit, pätevöittämiseen käytetyt aineet, vertailuaineet);  
Kuvaus käytetyistä arviointikriteereistä.  
Tulokset  
Esitetään taulukossa tulokset, jotka on saatu yksittäisistä testinäytteistä (esi ­
merkiksi sameus ja OD  490 -arvot ja lasketut IVIS-arvot testiaineelle sekä 
positiivisille, negatiivisille ja vertailukontrolleille [jos mukana] taulukko ­
muodossa, myös tulokset toistetuista kaksoismäärityksistä tapauksen mu ­
kaan, sekä keskiarvot ± standardipoikkeamat kullekin kokeelle;  
Kuvaus muista havaituista vaikutuksista.  
Tulosten tarkastelu  
Päätelmä  
LÄHDEKIRJALLISUUS  
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 680
 
(2) Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1272/2008, an ­
nettu 16 päivänä joulukuuta 2008, aineiden ja seosten luokituksesta, 
merkinnöistä ja pakkaamisesta sekä direktiivien 67/548/ETY ja 1999/ ­
45/EY muuttamisesta ja kumoamisesta ja asetuksen (EY) N:o 1907/ ­
2006 muuttamisesta. EUVL L 353, 31.12.2008, s. 1.  
(3) YK (2007). Globally Harmonized System of Classification and Label ­
ling of Chemicals (GHS). Second revised edition, New York & Ge ­
neve: United Nations Publications, 2007. Saatavilla seuraavassa osoit ­
teessa:  
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]  
(4) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retros ­
pective study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:
 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]  
(5) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Saatavilla seuraavassa osoitteessa:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(6) Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1907/2006, an ­
nettu 18 päivänä joulukuuta 2006, kemikaalien rekisteröinnistä, arvi ­
oinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH), Euroopan kemi ­
kaaliviraston perustamisesta, direktiivin 1999/45/EY muuttamisesta 
sekä neuvoston asetuksen (ETY) N:o 793/93, komission asetuksen (EY) N:o 1488/94, neuvoston direktiivin 76/769/ETY ja komission direktiivien 91/155/ETY, 93/67/ETY, 93/105/EY ja 2000/ ­
21/EY kumoamisesta. EUVL L 396, 30.12.2006, s. 1.
 
(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Saatavilla seuraavassa osoit ­
teessa:  
[http://www.oecd.org/document/40/0,2340, 
en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]  
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Pro ­
tocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Saatavilla seuraavassa osoitteessa:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opa ­
city and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. 
Research Triangle Park: National Toxicology Program. Saatavilla seu ­
raavassa osoitteessa:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ ­
ocu_brd_ice.htm]  
(10) INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Per ­
meability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, 
Italia: European Centre for the Validation of Alternative 
Methods (ECVAM).  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 681
 
(11) Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine 
corneal opacity and permeability test: An  in vitro  assay of ocular 
irritancy.  Fundam. Appl. Toxicol.  18:442-449.  
(12) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Health ­
care Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guid ­
eline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious 
Agents in Healthcare Settings. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:  
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].  
(13) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106-117.
 
(14) Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and 
morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse.  Can. 
J. Zool.  73:2159-2165.  
(15) Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The 
Lancet 349: 636-641.  
(16) Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, 
E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates.  Fundam Appl Toxi ­
col 26:20-31.
 
(17) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Met ­
hod. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]  
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Saatavilla seuraa ­
vassa osoitteessa:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 682
 
Lisäys 1  
MÄÄRITELMÄT  
Tarkkuus:  Testimenetelmän tulosten ja hyväksyttyjen vertailuarvojen välinen 
ero. Tarkkuudella mitataan testimenetelmän suoritusta, ja se on eräs ”relevanssin” 
näkökohta. Termiä käytetään usein ”konkordanssin” kanssa vaihtoehtoisena, jol ­
loin sillä tarkoitetaan testimenetelmällä saatujen oikeiden tulosten osuutta.  
Vertailuaine:  Aine, johon testiainetta verrataan. Vertailuaineella olisi oltava seu ­
raavat ominaisuudet: i) se saadaan vakaana pysyvästä ja luotettavasta lähteestä; 
ii) sen rakenne ja toiminta ovat samankaltaisia testattavan aineryhmän kanssa; iii) 
sen fysikaalis-kemialliset ominaisuudet tunnetaan; iv) se tukee tunnetuista vaiku ­
tuksista saatuja tietoja, ja v) sen vaikutuskyky halutun vasteen vaihtelualueella tunnetaan.
 
Sarveiskalvo:  Silmämunan etuosan läpinäkyvä osa, joka peittää värikalvon ja 
silmäterän ja päästää valoa sisäosiin.  
Sarveiskalvon sameus:  Sarveiskalvon sameuden mitta, kun sarveiskalvo on al ­
tistettu testiaineelle. Sarveiskalvon sameuden lisääntyminen merkitsee sarveiskal ­
von vauriota. Sameus voidaan arvioida subjektiivisesti Draizen kaninsilmätestillä 
tai objektiivisesti jollain laitteella, kuten ”opasitometrillä”.  
Sarveiskalvon läpäisevyys:  Sarveiskalvon epiteelin vaurion mitta, jota varten 
määritetään kaikkien sarveiskalvon solukerrosten läpi menneen fluoreseiini-väriaineen määrä.
 
EPA-kategoria 1:  Syövyttävä (palautumaton silmäkudoksen tuhoutuminen) tai 
yli 21 vuorokautta kestävä sarveiskalvoon kohdistuva vaikutus tai ärsytys (1).  
EU:n R41-luokka:  Silmän kudosvauriot tai vakava fyysinen näön rappeutumi ­
nen, joka syntyy, kun testiainetta on annosteltu silmän etupinnalle, eikä se kor ­
jaudu täysin 21 päivän kuluessa annostelusta (2).  
Väärien negatiivisten tulosten osuus:  Niiden positiivisten aineiden osuus, jotka 
testimenetelmä yksilöi virheellisesti negatiivisiksi. Väärien positiivisten tulosten osuus on eräs testimenetelmän suorituskyvyn indikaattori.
 
Väärien positiivisten tulosten osuus:  Kaikkien negatiivisten aineiden osuus, 
jotka testimenetelmä yksilöi virheellisesti positiivisiksi. Väärien positiivisten tu ­
losten osuus on eräs testimenetelmän suorituskyvyn indikaattori.  
GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Che ­
micals, kemikaalien maailmanlaajuisesti yhdenmukaistettu luokitus- ja mer ­
kintäjärjestelmä):  Järjestelmä, jossa ehdotetaan kemikaalien (aineet ja seokset) 
luokitusta fysikaalisten, terveyteen ja ympäristöön liittyvien vaarojen standardi ­
tyyppien ja -tasojen mukaisesti ja osoitetaan niille vaaraviestinnän tunnukset, kuten kuvamerkit, huomiosanat, vaaralausekkeet, turvalausekkeet ja turvatiedot ­
teet, jotta voidaan välittää tietoa kemikaalien kielteisistä vaikutuksista ihmisten 
(mukaan luettuina työnantajat, työntekijät, kuljettajat, kuluttajat ja pelastushenki ­
löstö) ja ympäristön suojelemiseksi (3).
 ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 683
 
GHS-kategoria 1:  Silmän kudosvauriot tai vakava fyysinen näön rappeutuminen, 
joka syntyy, kun testiainetta on annosteltu silmän etupinnalle, eikä se korjaudu 
täysin 21 päivän kuluessa annostelusta (3).  
Vaara:  Vaikuttavan tekijän (”agentin”) tai tilanteen sisäinen ominaisuus, jolla on 
kyky aiheuttaa haitallisia vaikutuksia, kun organismi, järjestelmä tai (ala)populaa ­
tio altistuu kyseiselle aineelle.  
In vitro  ärsytysarvo ( In Vitro  Irritancy Score, IVIS):  BCOP-testissä käytetty 
empiirisesti johdettu kaava, jossa kunkin käsittelyryhmän sameuden keskiarvot ja läpäisevyyden keskiarvot yhdistetään yhteen  in vitro  -arvoon. IVIS = sameuden 
keskiarvo + (15 x keskimääräinen läpäisevyysarvo)
 
Negatiivinen kontrolli:  Käsittelemätön näyte, jossa on kaikki testijärjestelmän 
osat. Negatiivinen kontrolli prosessoidaan testiaineella käsiteltyjen näytteiden ja muiden kontrollinäytteiden kanssa, jotta voidaan määrittää, reagoiko liuotin tes ­
tijärjestelmän kanssa.
 
Ei-ärsyttävä:  Aineet, joita ei ole luokiteltu EPA-järjestelmän kategoriaan I, II tai 
III; EU:n kategoriaan R41 tai R36; tai GHS:n kategoriaan 1, 2A tai 2B silmää ärsyttäväksi aineeksi.
 
Silmää syövyttävä aine:  a) Aine, joka aiheuttaa silmään palautumatonta kudos ­
vauriota; b) aineet, jotka on luokiteltu GHS:n kategoriaan 1, EPAn kategoriaan I tai EU:n kategoriaan R41 silmää ärsyttäviksi aineiksi (1) (2) (3).
 
Silmää ärsyttävä aine:  a) Aine, joka aiheuttaa silmään palautuvan muutoksen, 
kun sitä on annosteltu silmän etupinnalle; b) aineet, jotka on luokiteltu EPAn kategoriaan II tai III, EU:n kategoriaan R36 tai GHS:n kategoriaan 2A tai 2B silmää ärsyttäviksi aineiksi (1) (2) (3).
 
Silmää vakavasti ärsyttävä aine:  a) Aine, joka aiheuttaa silmän etupinnalle 
annosteltuna kudosvauriota, joka ei korjaudu 21 päivän kuluessa annostelusta tai joka aiheuttaa näkökyvyn vakavaa fyysistä rappiota; b) aineet, jotka on luo ­
kiteltu GHS:n kategoriaan 1, EPAn kategoriaan I tai EU:n kategoriaan R41 
silmää ärsyttäviksi aineiksi (1) (2) (3).
 
Opasitometri:  Laite, jolla mitataan sarveiskalvon sameutta arvioimalla kvantita ­
tiivisesti valon kulkeminen sarveiskalvon läpi. Opasitometrissä on tyypillisesti kaksi osastoa, joista kussakin on oma valonlähde ja valokenno. Toista osastoa 
käytetään käsitellylle sarveiskalvolle ja toista laitteen kalibrointiin ja nollaa ­
miseen. Halogeenilampun valoa lähetetään kontrolliosaston läpi (tyhjä kammio, jossa ei ole ikkunaa eikä nestettä) valokennoon ja verrataan valoon, joka on lähetetty näytteelle käytetyn osaston (jossa on sarveiskalvon sisältävä kammio) 
läpi valokennoon. Valokennoista saadun valon transmissioita verrataan, ja nume ­
ronäytöllä näytetään numeerinen sameuden arvo.
 
Positiivinen kontrolli:  Näyte, jossa on kaikki testijärjestelmän osat ja joka on 
käsitelty aineella, jonka tiedetään aiheuttavan positiivisen vasteen. Vakava vaste 
ei kuitenkaan saisi olla liian voimakas, jotta positiivisen kontrollivasteen vaihtelu 
ajan funktiona voidaan arvioida.  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 684
 
Luotettavuus:  Arvo, joka osoittaa, missä määrin testimenetelmä pystytään suo ­
rittamaan uusittavalla tavalla samassa laboratoriossa tai eri laboratorioissa ajan 
myötä käytettäessä samaa protokollaa. Arvo määritetään laskemalla laboratorion ­
sisäinen ja laboratorioidenvälinen uusittavuus ja laboratorionsisäinen toistetta ­
vuus.  
Liuotin/vehikkelikontrolli:  Käsittelemätön näyte, jossa on kaikki testijärjestel ­
män osat, mukaan luettuina liuotin tai vehikkeli, ja joka prosessoidaan testi ­
aineella käsiteltyjen ja muiden kontrollinäytteiden kanssa perusvastetason mää ­
rittämiseksi näytteille, joissa testiaine on liuotettu samaan liuottimeen tai vehik ­
keliin. Kun tällainen näyte testataan samanaikaisesti negatiivisen kontrollin kans ­
sa, se osoittaa myös, reagoiko liuotin tai vehikkeli testijärjestelmän kanssa.  
Vaiheittainen testaus:  Vaiheittainen testausstrategia, jossa kaikkia testiainetta 
koskevia olemassa olevia tietoja tarkastellaan tietyssä järjestyksessä käyttäen to ­
distusnäyttöprosessia kussakin vaiheessa sen määrittämiseksi, onko käytettävissä riittävästi tietoja vaaraluokituspäätöstä varten, ennen kuin siirrytään seuraavaan 
vaiheeseen. Jos testiaineen ärsytyskyky voidaan määrittää olemassa olevien tie ­
tojen perusteella, ei lisätestausta tarvita. Jos testiaineen ärsytyskykyä ei voida määrittää olemassa olevien tietojen perusteella, toteutetaan vaiheittainen testaus 
eläimillä, kunnes luokitus voidaan määritellä aukottomasti.
 
Validoitu testimenetelmä:  Testimenetelmä, jonka validointitutkimukset on saa ­
tettu päätökseen ja relevanssi (tarkkuus mukaan luettuna) ja luotettavuus tiettyä tarkoitusta varten on määritetty. On tärkeää huomata, että validoitu testi ei ehkä ole riittävän tarkka ja luotettava, jotta se voitaisiin hyväksyä ehdotettuun tarkoi ­
tukseen.
 
Todistusnäyttö:  Prosessi, jossa tarkastellaan erilaisten tietojen vahvuuksia ja 
heikkouksia, kun niiden avulla on tarkoitus päättää aineen vaarallisuutta koske ­
vasta päätelmästä tai kun tietojen on määrä tukea kyseistä päätelmää.  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 685
 
Lisäys 2  
Pätevöittämiseen käytettävät aineet BCOP-testimenetelmälle  
Ennen kuin laboratorio alkaa käyttää tähän testimenetelmään perustuvaa mene ­
telmää rutiininomaisesti, se voi osoittaa teknisen pätevyytensä määrittämällä oi ­
kein taulukossa 1 suositeltujen 10 aineen syövyttävyysluokituksen. Aineet on valittu siten, että ne edustavat sellaisia paikallisen silmä-ärsytyksen ja/tai syövy ­
tyksen vasteita, jotka perustuvat  in vivo  kaninsilmätestissä (TG 405) saatuihin 
tuloksiin (ts. YK:n GHS-järjestelmän kategoriat 1, 2A, 2B tai ”Ei luokiteltu ja 
merkitty”) (3) (7). Kun otetaan huomioon näiden määritysten validoitu hyödylli ­
syys (ts. ainoastaan silmää syövyttävien ja/tai silmää vakavasti ärsyttävien ainei ­
den tunnistamista varten), vain kahta luokitustarkoituksiin käytettävää testitulosta 
(syövyttävät ja/tai silmää vakavasti ärsyttävät aineet tai ei-syövyttävät ja/tai ei 
vakavasti ärsyttävät aineet) käytetään pätevyyden osoittamiseksi. Muita valintak ­
riteerejä ovat se, että aineet ovat kaupallisesti saatavilla, että saatavilla on laa ­
dukkaita  in vivo  -vertailutietoja ja että on laadukkaita tietoja niistä kahdesta  in 
vitro  -menetelmästä, joille parhaillaan kehitetään testiohjeita. Tästä syystä ärsyt ­
tävät aineet silmätoksisuuden  in vitro  -testimenetelmien validointiin valittiin ICC ­
VAM:n 122 suositellun vertailuaineen luettelosta (ks. lisäys H): ICCVAM: suo ­
sitellut vertailuaineet (5). Vertailutiedot ovat saatavilla BCOP-menetelmälle ja 
eristetyllä kanan silmällä tehtävälle testimenetelmälle (ICE) laadituista tausta-asiakirjoista (17) (18).
 
Taulukko 1  
Suositellut aineet BCOP-menetelmän teknisen pätevyyden osoittamiseksi  
Aine CAS-nro Kemiallinen 
luokka (  1 ) Fysikaalinen 
olomuoto:  In vivo  
-luokitus (  2 ) In vitro  -luokitus (  3 ) 
Bentsalkoniumklo ­
ridi (5 %) 8001-54-5 Oniumyhdiste Neste Kategoria 1 Syövyttävä /vakavasti ärsyt ­
tävä 
Klooriheksidiini 55-56-1 Amiini, amidiini Kiinteä Kategoria 1 Syövyttävä /vakavasti ärsyt ­
tävä 
Dibentsoyyli-L- 
viinihappo 2743-38-6 Karboksyylihap ­
po, esteri Kiinteä Kategoria 1 Syövyttävä /vakavasti ärsyt ­
tävä 
Imidatsoli 288-32-4 Heterosyklinen Kiinteä Kategoria 1 Syövyttävä /vakavasti ärsyt ­
tävä 
Trikloorietikka ­
happo (30 %) 76-03-9 Karboksyyliha ­
pot Neste Kategoria 1 Syövyttävä /vakavasti ärsyt ­
tävä 
2,6-Diklooribent ­
soyylikloridi 4659-45-4 Asyylihalidi Neste Kategoria 
2A Ei syövyttävä /ei vakavasti 
ärsyttävä 
Etyyli-2-metyy ­
liasetoasetaatti 609-14-3 Ketoni, esteri Neste Kategoria 
2B Ei syövyttävä /ei vakavasti 
ärsyttävä 
Ammoniumnit ­
raatti 6484-52-2 Epäorgaaninen 
suola Kiinteä Kategoria 
2A Ei syövyttävä /ei vakavasti 
ärsyttävä  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 686
 
Aine CAS-nro Kemiallinen 
luokka (  1 ) Fysikaalinen 
olomuoto:  In vivo  
-luokitus (  2 ) In vitro  -luokitus (  3 ) 
Glyseroli 56-81-5 Alkoholi Neste Ei merkintää Ei syövyttävä /ei vakavasti 
ärsyttävä 
n-Heksaani 110-54-3 Hiilivety 
(asyklinen) Neste Ei merkintää Ei syövyttävä /ei vakavasti 
ärsyttävä  
Lyhenteet: CAS-nro = Chemical Abstracts Service -rekisterinumero. 
( 1 ) Kunkin testiaineen kemiallinen luokka määritettiin National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH) -luokitusjär ­
jestelmään (saatavilla osoitteessa http//www.nlm.nih.gov/mesh) perustuvan tavanomaisen luokitusjärjestelmän perusteella. 
( 2 ) Perustuu tuloksiin, jotka on saatu kanin silmällä tehdyllä  in vivo  -testillä (OECD TG 405) käyttäen YK:n GHS-järjestelmää (3)(7). 
( 3 ) Perustuu BCOP- ja ICE-testien tuloksiin.  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 687
 
Lisäys 3  
BCOP-TESTISSÄ KÄYTETTY SARVEISKALVOTELINE  
1. BCOP-testissä käytetyt sarveiskalvotelineet valmistetaan reagoimattomasta 
aineesta (esimerkiksi polypropyleenistä). Telineissä on kaksi puolta (etu- 
ja takakammio) ja kaksi samanlaista lieriönmuotoista sisäkammiota. Kuhun ­
kin kammioon mahtuu 5 ml:aa, ja niiden päässä on lasi-ikkuna, jonka läpi 
sameusmittaukset tehdään. Kunkin sisäkammion halkaisija on 1,7 cm ja 
syvyys 2,2 cm (  1 ) Takakammiossa on tiivisterengas vuotojen estämiseksi. 
Sarveiskalvo asetetaan endoteelipuoli alaspäin takakammion tiivisterenkaan päälle, ja etukammio asetetaan sarveiskalvon epiteelipuolen päälle. Kammiot 
kiinnitetään paikoilleen kolmella ruostumattomasta teräksestä valmistetulla 
ruuvilla, jotka sijaitsevat kammion ulkoreunoilla. Kunkin kammion päässä on lasi-ikkuna, joka voidaan poistaa, että sarveiskalvoon päästään helposti käsiksi. Lasi-ikkunan ja kammion välissä on tiivisterengas vuotojen estämi ­
seksi. Medium ja testiyhdisteet lisätään kammioon (ja poistetaan siitä) niiden 
yläosassa olevien kahden aukon kautta. Aukot suljetaan kumitulpilla käsit ­
telyn ja inkubaation ajaksi.
 
Sanasto  
Glass disc: Lasikiekko  
PTFE-O-ring: PTFE-tiivisterengas  
Refill: Täyttö  
Hanger: Ripustinlaite  
Cap: Tulppa  
Nut: Mutteri  
O-ring: Tiivisterengas  
Posterior compartment: Takaosasto  
Anterior compartment: Etuosasto  
Fixing screws: Kiinnitysruuvit  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 688  
( 1 ) Mitat ovat sarveiskalvotelineelle, jota käytetään 12–60 kuukauden ikäisille lehmille. Jos 
käytetään 6–12 kuukauden ikäisiä eläimiä, olisi teline suunniteltava niin, että kunkin 
kammion tilavuus on 4 ml ja kunkin sisäkammion halkaisija 1,5 cm ja syvyys 2,2 cm. 
Jos tehdään uusi, erilainen sarveiskalvoteline, on tärkeää huolehtia siitä, että altistetun 
sarveiskalvon pinta-alan suhde takakammion tilavuuteen on sama kuin käytettäessä ta ­
vanomaista sarveiskalvotelinettä. Tämä on välttämätöntä, jotta läpäisevyysarvot voidaan 
määrittää oikein IVIS-arvon laskemiseksi ehdotetulla kaavalla.
 OPASITOMETRI  
2. Opasitometri on laite, jolla mitataan valon transmissiota. Halogeenilampun 
valoa lähetetään kontrolliosaston läpi (tyhjä kammio, jossa ei ole ikkunaa 
eikä nestettä) valokennoon ja verrataan valoon, joka on lähetetty näytteelle käytetyn osaston (jossa on sarveiskalvon sisältävä kammio) läpi valoken ­
noon. Valokennoista saadun valon transmissioita verrataan, ja numeronäy ­
töllä näytetään numeerinen sameuden arvo. Sameusyksiköt määritetään.
 
3. Opasitometrillä pitäisi saada lineaarinen vaste sellaisella 
sameuslukema-alueella, joka kattaa ennustemallissa kuvatuille eri luokituk ­
sille käytetyt raja-arvot (ts. siihen arvoon saakka, joka määrittää syövyttä ­
vyyden ja/tai vakavan ärsyttävyyden). Jotta voidaan varmistaa, että lukemat 
ovat lineaarisia ja tarkkoja 75–80 sameusyksikköön saakka, on opasitometri 
kalibroitava sarjalla kalibraattoreita. Kalibraattorit (opaakit polyesterilevyt) asetetaan kalibrointikammioon (sarveiskalvokammio, joka on suunniteltu kalibraattoreiden käyttöä varten), ja opasitometristä otetaan lukemat. Kalib ­
rointikammio on suunniteltu sellaiseksi, että kalibraattorit ovat siinä suun ­
nilleen samalla etäisyydellä valosta ja valokennosta kuin mihin sarveiskalvot asetettaisiin sameusmittausten ajaksi. Opasitometri kalibroidaan ensin 0 sa ­
meusyksikköön käyttäen kalibrointikammiota, jossa ei ole kalibraattoria. 
Kalibrointikammioon asetetaan sitten peräkkäin kolme erilaista kalibraattoria ja mitataan sameudet. Kalibraattoreilla 1, 2 ja 3 pitäisi saada 5 prosentin tarkkuudella samat sameuslukemat kuin asetetut arvot 75, 150 ja 225 sa ­
meusyksikköä.
 ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 689
 
B. 48.  ERISTETTYÄ KANAN SILMÄÄ KÄYTTÄVÄ TESTIMENE ­
TELMÄ SILMÄÄ SYÖVYTTÄVIEN JA SILMÄÄ VAKAVASTI 
ÄRSYTTÄVIEN AINEIDEN TUNNISTAMISEKSI  
JOHDANTO  
1. Eristetyn kanan silmän käyttöön perustuva testimenetelmä (Isolated Chic ­
ken Eye, ICE) on  in vitro  -testimenetelmä, jota voidaan tietyissä olosuh ­
teissa ja tietyin rajoituksin käyttää aineiden ja seosten luokittelemiseksi 
silmää syövyttäviksi ja silmää vakavasti ärsyttäviksi (1) (2) (3). Tätä tes ­
timenetelmää sovellettaessa määritellään vakavasti ärsyttävät aineet sellai ­
siksi, jotka aiheuttavat silmävaurioita, jotka kestävät kanissa vähintään 21 vuorokautta annostelun jälkeen. Vaikka ICE-testin ei katsota täysin kor ­
vaavan  in vivo  -kaninsilmätestiä, sen käyttöä suositellaan vaiheittaisessa 
testauksessa sääntömääräistä luokitusta ja merkintöjen määräämistä varten tietyllä sovellusalalla (4) (5). Testiaineita ja seoksia (6), jotka ovat tässä määrityksessä positiivisia, voidaan luokitella silmää syövyttäviksi tai sil ­
mää vakavasti ärsyttäviksi ilman kaneilla tehtävää lisätestausta. Aine, jolle 
saadaan testissä negatiivinen tulos, olisi testattava kaneissa käyttäen vai ­
heittaista testausstrategiaa, kuten OECD:n ohjeessa Test Guideline 405 (7) 
(tämän liitteen B. 5 luku) esitetään.
 
2. Tässä testimenetelmässä kuvataan menettelyt, joilla arvioidaan testiaineen 
mahdollinen kyky syövyttää tai ärsyttää vakavasti silmää mittaamalla ky ­
kyä aiheuttaa myrkyllisyyttä eristetyssä kanan silmässä, josta silmämuna on poistettu. Sarveiskalvoon kohdistuneet myrkyllisyysvaikutukset mita ­
taan i) määrittämällä sameus kvalitatiivisesti, ii) määrittämällä epiteelivau ­
rio kvalitatiivisesti, kun silmään lisätään fluoreseiiniä (fluoreseiinin reten ­
tio), iii) mittaamalla kvantitatiivisesti paksuuntuminen (turpoaminen) ja iv) arvioimalla kvalitatiivisesti pinnan makroskooppiset morfologiset vauriot. 
Sarveiskalvon sameus, turpoaminen ja vaurio arvioidaan testiaineelle altis ­
tuksen jälkeen erikseen ja yhdistetään sen jälkeen, jotta voidaan johtaa silmä-ärsytysluokitus.
 
3. ICE-menetelmällä on testattu myös silmää ärsyttäviä aineita, jotka aiheut ­
tavat alle 21 päivässä palautuvia vaurioita ja aineita, jotka eivät ärsytä 
silmää. ICE-menetelmän tarkkuutta ja luotettavuutta näihin kategorioihin kuuluvien aineiden testauksessa ei ole kuitenkaan validoitu virallisesti.
 
4. Määritelmät esitetään lisäyksessä 1.  
ALUSTAVIA HUOMIOITA JA RAJOITUKSIA  
5. Tämä testimenetelmä perustuu ICCVAMin (Interagency Coordinating 
Committee on the Validation of Alternative Methods, vaihtoehtoisten me ­
netelmien validoinnin virastojenvälinen koordinointikomitea) ICE-testimenetelmäprotokollaan (8), joka kehitettiin kansainvälisen vali ­
dointitutkimuksen perusteella (4)(5)(9). Tutkimukseen ovat osallistuneet 
vaihtoehtoisten menetelmien eurooppalainen validointikeskus, Japanin vas ­
taava keskus ja Alankomaiden sovelletun luonnontieteen tutkimuslaitoksen TNO toksikologian ja sovelletun farmakologian elämän laatu -osasto. Pro ­
tokolla perustuu julkaistuista protokollista ja TNO:n nykyisin käyttämästä 
protokollasta saatuihin tietoihin (10) (11) (12) (13) (14).
 ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 690
 
6. Tämän menetelmän tunnistettuja rajoituksia ovat alkoholeille saatujen vää ­
rien positiivisten tulosten määrä ja kiinteille aineille ja pinta-aktiivisille 
aineille saatujen väärien negatiivisten tulosten määrä (ks. kohta 47) (4). Kun tietokannasta poistetaan näihin kemiallisiin ja fysikaalisiin luokkiin kuuluvat aineet, parantuu ICE-menetelmän tarkkuus EU:n, EPAn ja GHS:n 
luokitusjärjestelmissä huomattavasti (4). Koska tämän testin tarkoituksena 
on ainoastaan tunnistaa silmiä syövyttävät ja/tai silmiä vakavasti ärsyttävät aineet, väärät negatiiviset tulokset eivät haittaa, koska tällaiset aineet tes ­
tattaisiin myöhemmin kaneilla tai muilla asianmukaisesti validoiduilla  in 
vitro  –testeillä sääntömääräisistä vaatimuksista riippuen käyttäen vaiheit ­
taista testausstrategiaa ja todistusnäytön arviointia. Nykyisen validointitie ­
tokannan avulla ei myöskään voida arvioida asianmukaisesti tiettyjä kemi ­
kaali- tai tuoteluokkia (esimerkiksi seoksia). Tutkijat voisivat kuitenkin 
harkita tätä testimenetelmää kaikentyyppisille testimateriaaleille, myös se ­
oksille, jolloin positiivisen tuloksen voitaisiin katsoa viittaavan silmän syövytykseen tai vakavaan ärsytykseen. Alkoholeilla saatuihin positiivisiin tuloksiin olisi kuitenkin suhtauduttava varovaisesti yliennustuksen vaaran 
takia.
 
7. Kaikissa kanan silmiä käyttävissä menettelyissä olisi noudatettava testaus ­
laitoksen määräämiä ihmis- tai eläinperäisten materiaalien (muun muassa 
muttei ainoastaan kudosten ja kudosnesteiden) käsittelyä koskevia sääntöjä ja menettelyjä. Suositellaan yleismaailmallisia laboratorioissa noudatettavia ennaltavarautumiskäytänteitä (15).
 
8. Eräs tämän testimenetelmän rajoitus on se, että vaikka siinä otetaan huo ­
mioon joitakin kanin silmä-ärsytystestissä arvioituja silmävaikutuksia ja 
jossain määrin niiden vakavuus, siinä ei tarkastella sidekalvon ja värikal ­
von vaurioita. On myös ehdotettu kaninsilmätutkimusten perusteella, että vaikka ICE-testissä ei sinänsä voida arvioida sarveiskalvovaurioiden palau ­
tuvuutta, voidaan kuitenkin arvioida sarveiskalvovaurion alkusyvyys ja sen 
avulla erottaa palautuvat ja palautumattomat vaikutukset (16). ICE-menetelmällä ei voida myöskään arvioida sitä, missä määrin silmäal ­
tistukseen voi liittyä systeemistä myrkyllisyyttä.
 
9. ICE-testimenetelmän käyttökelpoisuutta ja rajoituksia ei-vakavien ärsyttä ­
vien aineiden ja ei-ärsyttävien aineiden tunnistamiseksi pyritään selvittä ­
mään lisää (ks. myös kohta 48). Käyttäjiä rohkaistaan myös antamaan näytteitä ja/tai tuloksia validointijärjestöille, jotta ICE-testimenetelmän mahdollisia tulevia käyttötapoja, kuten ei-vakavien silmää ärsyttävien ai ­
neiden ja ei-ärsyttävien aineiden tunnistusta, voidaan arvioida virallisesti.
 
10. Kun laboratorio alkaa käyttää tätä määritysmenetelmää, sen olisi käytettävä 
lisäyksessä 2 mainittuja pätevyyden osoittamiseen tarkoitettuja kemikaa ­
leja. Laboratorio voi käyttää näitä kemikaaleja osoittaakseen teknisen pä ­
tevyytensä ICE-testin suorituksessa ennen kuin se toimittaa ICE-määritystuloksia sääntömääräistä vaaraluokitusta varten.
 
TESTIN PERIAATE  
11. ICE-testimenetelmä on elinmalli, joka mahdollistaa kanan silmän lyhyt ­
aikaisen ylläpitämisen  in vitro . Tässä testimenetelmässä testiaineen aiheut ­
tama vaurio arvioidaan määrittämällä sarveiskalvon turpoaminen, sameus ja fluoreseiinin retentio. Kaksi jälkimmäistä muuttujaa arvioidaan kvalita ­
tiivisesti, kun taas sarveiskalvon turpoaminen voidaan määrittää kvantitatii ­
visesti. Kukin mittaus joko muunnetaan kvantitatiiviseksi arvoksi yleisen 
ärsyttävyysindeksin laskemiseksi tai sille osoitetaan kvalitatiivinen katego ­
ria, jonka avulla vahvistetaan sitten luokitus  in vitro  silmää syövyttäväksi 
ja vakavasti silmää ärsyttäväksi. Kummankin tuloksen avulla voidaan sit ­
ten ennustaa testiaineen  in vivo  -silmäsyövyttävyyttä ja kykyä aiheuttaa 
vakavaa ärsytystä (ks. päätöskriteerit).
 ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 691
 
Kanansilmien lähde ja kanojen ikä  
12. Tässä määrityksessä on tavanomaisesti käytetty teurastamosta saaduista 
kanoista (jotka on teurastettu elintarviketuotantoa varten) kerättyjä silmiä, 
jolloin ei ole tarvittu laboratorioeläimiä. Testiin voidaan käyttää vain sil ­
miä, jotka on saatu terveistä, ihmisravinnoksi kelpaavista eläimistä.  
13. Parasta kanan ikää ei ole arvioitu kontrolloidussa tutkimuksessa. Testime ­
netelmässä on tavanomaisesti käytetty sen ikäisiä ja painoisia kanoja kuin 
ovat siipikarjateurastamossa tavanomaisesti teurastetut kevätkananpojat (ts. noin 7 viikon ikäisiä, paino 1,5–2,5 kg).
 
Silmien kerääminen ja niiden kuljetus laboratorioon  
14. Päät pitäisi irrottaa heti kanojen tainnutuksen jälkeen, mikä tehdään taval ­
lisesti sähkösokilla, ja sen jälkeen, kun kaula on katkaistu verenlaskua varten. Olisi hyvä löytää laboratorion lähellä sijaitseva paikallinen kanojen 
teurastamo, jotta kanojen päät voidaan kuljettaa teurastamosta laboratori ­
oon riittävän nopeasti, että pilaantuminen ja/tai bakteerikontaminaatio ovat mahdollisimman vähäisiä. Kananpäiden keräämisen ja silmien käytön (ICE-testissä) välisen ajan pitäisi olla mahdollisimman lyhyt (mieluiten 
alle kaksi tuntia), ja pitäisi osoittaa, etteivät määritystulokset ole sen takia 
epäluotettavia. Nämä tulokset perustuvat silmien valintaperusteisiin sekä positiivisten ja negatiivisten kontrollinäytteiden vasteisiin. Kaikkien mää ­
rityksessä käytettyjen silmien olisi oltava peräisin samasta tiettynä päivänä 
kerätystä silmäryhmästä.
 
15. Koska silmät dissekoidaan laboratoriossa, koskemattomat päät kuljetetaan 
teurastamosta ympäristön lämpötilassa muovilaatikoissa kosteutettuina iso ­
tonisella fysiologisella keittosuolaliuoksella kostutetuilla pyyheliinoilla.  
ICE-testissä käytettävien silmien valintaperusteet  
16. Silmät, jotka värjäytyvät voimakkaasti fluoreseiinillä (> 0,5) tai joiden 
sarveiskalvon sameus on korkea (> 0,5) silmämunan poistamisen jälkeen, hylätään.
 
17. Kussakin käsitellyssä ryhmässä ja samanaikaisesti määritettävässä positii ­
visessa kontrollissa on oltava vähintään kolme silmää. Negatiivisessa kont ­
rolliryhmässä tai liuotinkontrollissa (jos käytetään muuta liuotinta kuin 
fysiologista keittosuolaliuosta) on oltava vähintään yksi silmä.  
MENETTELY  
Silmien valmistelu  
18. Silmäluomet leikataan huolellisesti pois varoen vahingoittamasta sarveis ­
kalvoa. Sarveiskalvon eheys arvioidaan nopeasti lisäämällä tippa 2-pro ­
senttista (w/v) natriumfluoreseiiniä sarveiskalvon pinnalle muutamaksi se ­
kunniksi, minkä jälkeen huuhdotaan isotonisella fysiologisella keittosuola ­
liuoksella. Fluoreseiinillä käsiteltyjä silmiä tarkastellaan rakovalomikros ­
koopilla, jotta voidaan varmistaa, ettei sarveiskalvo ole vahingoittunut 
(ts. fluoreseiinin retentio ja sarveiskalvon sameusarvo on enintään 0,5).  
19. Jos silmä on vahingoittumaton, se dissekoidaan kallosta varoen vahingoit ­
tamasta sarveiskalvoa. Silmämuna vedetään irti silmäkuopasta pitäen tiu ­
kasti vilkkukalvosta kiinni kirurgisilla pihdeillä, ja silmän lihakset leika ­
taan käyrillä, tylppäkärkisillä saksilla. On tärkeää, ettei sarveiskalvoa va ­
hingoiteta liialla paineella (kompressioartefakta).  
20. Kun silmää poistetaan silmäkuopasta, pitäisi osa näköhermoa jättää kiinni 
ja näkyville. Kun silmä on poistettu silmäkuopasta, se asetetaan imupaperi ­
alustalle, ja vilkkukalvo ja muu sidekudos leikataan pois.  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 692
 
21. Silmämunasta poistettu silmä kiinnitetään ruostumattomasta teräksestä val ­
mistettuun pitimeen siten, että sarveiskalvo on pystysuorassa. Pidin siirre ­
tään tiputuslaitteen (superfuusiolaite) kammioon (16). Pitimet asetetaan tiputuslaitteeseen siten, että koko sarveiskalvoon voidaan kohdistaa isoto ­
nisesta fysiologisesta keittosuolaliuoksesta koostuva tiputus. Tiputuslait ­
teen kammioiden lämpötila on pidettävä arvossa 32 ± 1,5°C. Lisäyksessä 
3 esitetään kaavio tyypillisestä tiputuslaitteesta ja silmänpitimistä. Niitä saa kaupallisesti tai ne voi rakentaa itse. Laite voidaan mukauttaa yksittäisen laboratorion tarpeisiin (esimerkiksi useille silmille).
 
22. Kun silmät on asetettu tiputuslaitteeseen, niitä tarkastellaan jälleen rakova ­
lomikroskoopilla, jotta voidaan varmistaa, etteivät ne ole vahingoittuneet dissektiossa. Sarveiskalvon paksuus sen kärjessä olisi myös mitattava ra ­
kovalomikroskooppiin kuuluvalla syvyydenmittauslaitteella. Jos silmien i) 
fluoreseiinin retentioarvo on yli 0.5; ii) sarveiskalvon sameus on yli 0.5; tai iii) silmissä on muita vahingoittumisen merkkejä, ne on vaihdettava toisiin. Niistä silmistä, joita ei ole hylätty edellä mainittujen kriteerien 
perusteella, hylätään sellaiset, joiden sarveiskalvon paksuus poikkeaa yli 
10 prosentilla kaikkien silmien keskiarvosta. Käyttäjien pitäisi olla tietoisia siitä, että rakovalomikroskoopeilla voi saada erilaisia arvoja sarveiskalvon paksuudelle, jos raon leveyden asetus on erilainen. Raon leveys olisi ase ­
tettava arvoon 0,095 mm.
 
23. Kun kaikki silmät on tutkittu ja hyväksytty, silmiä inkuboidaan noin 
45–60 min, jotta ne tasapainottuvat testijärjestelmässä ennen annostelua. 
Tasapainottumisjakson jälkeen otetaan sarveiskalvon paksuudelle ja sa ­
meudelle lukema perusarvoa varten (nolla-arvo ajanhetkellä 0). Dissektion yhteydessä määritettyä fluoreseiiniarvoa käytetään fluoreseiiniretention pe ­
rusarvona.
 
Testiaineen annostelu  
24. Välittömästi nolla-arvojen mittausten jälkeen silmä (telineineen) poistetaan 
tiputuslaitteesta, asetetaan vaakasuoraan, ja testiaine annostellaan sarveis ­
kalvolle.  
25. Nestemäiset testiaineet testataan tavallisesti laimentamattomina, mutta ne 
voidaan laimentaa tarvittaessa (esimerkiksi jos se kuuluu tutkimussuunni ­
telmaan). Aineet laimennetaan mieluiten fysiologisella keittosuolaliuoksel ­
la. Muitakin liuottimia voidaan käyttää valvotuissa olosuhteissa, mutta muiden liuottimien kuin fysiologisen keittosuolaliuoksen käyttökelpoisuus olisi osoitettava.
 
26. Nestemäiset testiaineet annostellaan sarveiskalvolle siten, että testiaine 
peittää kokonaan ja tasaisesti sarveiskalvon pinnan; tavallinen tilavuus on 0,03 ml.
 
27. Kiinteät aineet olisi mahdollisuuksien mukaan jauhettava mahdollisimman 
hienoksi morttelissa huhmareella tai vastaavalla jauhamislaitteella. Jauhe 
annostellaan sarveiskalvolle siten, että testiaine peittää pinnan tasaisesti; 
tavallinen määrä on 0,03 g.  
28. Testiaineen (nesteen tai kiinteän aineen) annetaan vaikuttaa 10 sekunnin 
ajan, ja se huuhdellaan silmästä isotonisella fysiologisella keittosuolaliu ­
oksella (noin 20 ml) huoneenlämpötilassa. Telineessä oleva silmä asetetaan uudelleen tiputuslaitteeseen pystysuoraan.
 
Kontrolliaineet  
29. Kussakin kokeessa on oltava mukana negatiiviset eli liuotin/ ­
vehikkelikontrollit ja positiiviset kontrollit.  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 693
 
30. Testattaessa 100-prosenttisia nesteitä tai kiinteitä aineita käytetään 
ICE-testissä negatiivisena kontrollina fysiologista keittosuolaliuosta, jotta 
voidaan havaita epäspesifiset muutokset testijärjestelmässä ja varmistaa, etteivät määritysolosuhteet aiheuta tahattomasti ärsytysvastetta.
 
31. Testattaessa laimennettuja nesteitä käytetään testissä samanaikaisesti 
liuotin/vehikkelikontrolliryhmää, jotta voidaan havaita epäspesifiset muu ­
tokset testijärjestelmässä ja varmistaa, etteivät määritysolosuhteet aiheuta 
tahattomasti ärsytysvastetta. Kuten kohdassa 25 mainitaan, liuotinta/ ­
vehikkeliä saa käyttää vain, jos on osoitettu, ettei se häiritse testijärjestel ­
mää.  
32. Kuhunkin kokeeseen otetaan mukaan tunnettu silmiä ärsyttävä aine positii ­
visena kontrollina, jotta voidaan varmistaa, että saadaan asianmukainen vaste. Koska ICE-määritystä käytetään tässä testimenetelmässä syövyttä ­
vien tai vakavasti ärsyttävien aineiden tunnistamiseksi, positiivisen kont ­
rollin olisi mielellään oltava vertailuaine, joka aiheuttaa tässä testimenetel ­
mässä vakavan vasteen. Vakava ärsytysvaste ei kuitenkaan saisi olla liian voimakas, jotta positiivisen kontrollivasteen vaihtelu ajan funktiona voi ­
daan arvioida. Positiivisesta kontrollista olisi hankittava riittävästi  in vitro  
-tuloksia, jotta positiiviselle kontrollille voidaan laskea tilastollisesti mää ­
ritelty hyväksyttävä alue. Jos tietylle positiiviselle kontrollille ei ole saa ­
tavilla riittävästi aiempia ICE-testimenetelmällä saatuja tuloksia, on tietojen saamiseksi mahdollisesti tehtävä lisätutkimuksia.
 
33. Nestemäisten testiaineiden positiivisina kontrolleina voidaan käyttää esi ­
merkiksi 10-prosenttista etikkahappoa tai 5-prosenttista bentsalkoniumklo ­
ridia, ja kiinteiden aineiden positiivisina kontrolleina voidaan käyttää esi ­
merkiksi natriumhydroksidia tai imidatsolia.  
34. Vertailuaineet ovat hyödyllisiä, kun arvioidaan tiettyyn kemikaali- tai tuo ­
teryhmään kuuluvien tuntemattomien kemikaalien silmä-ärsytyskykyä tai 
silmää ärsyttävän aineen suhteellista ärsytyskykyä tietyllä ärsytysvastealu ­
eella.  
Mitatut päätepisteet  
35. Käsitellyt sarveiskalvot arvioidaan ennen käsittelyä ja alkaen 30, 75, 120, 
180 ja 240 minuuttia (± 5 minuuttia) käsittelyn jälkeen tehdyn huuhtelun 
jälkeen. Näillä ajankohdilla saadaan riittävä määrä mittauksia neljän tunnin käsittelyn aikana, ja mittauksien välillä on riittävästi aikaa tehdä kaikista silmistä tarvittavat havainnot.
 
36. Arvioidut päätepisteet ovat sarveiskalvon sameus, turpoaminen, fluoreseii ­
nin retentio ja morfologiset vaikutukset (esimerkiksi epiteelin pistemäinen 
syöpyminen tai irtoaminen). Kaikki määritykset (lukuun ottamatta fluore ­
seiinin retentiota, joka määritetään vain ennen käsittelyä ja 30 minuutin kuluttua testiaineen annostelusta) tehdään kullakin mainitulla ajanhetkellä.
 
37. On suositeltavaa ottaa valokuvia osoitukseksi sarveiskalvon sameudesta, 
fluoreseiinin retentiosta, morfologisista muutoksista ja histopatologiasta (jos sellaisia tutkimuksia on tehty).
 
38. Kun viimeinen tutkimus on tehty neljän tunnin kohdalla, suositellaan, että 
silmät säilytetään sopivassa kiinnitysaineessa (esimerkiksi neutraalissa pus ­
kuroidussa formaliinissa), jotta voidaan mahdollisesti tehdä histopatologi ­
sia tutkimuksia.  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 694
 
39. Sarveiskalvon turpoaminen arvioidaan sarveiskalvon paksuuden mittauk ­
sista, jotka tehdään rakovalomikroskooppiin kuuluvalla optisella paksuu ­
denmittauslaitteella. Turpoaminen ilmoitetaan prosenttilukuna, ja se laske ­
taan sarveiskalvon paksuuden mittauksista seuraavalla kaavalla:  
" 
sarveiskalvon paksuus hetkellat  Ä sarveiskalvon paksuus hetkellat  ¼ 0 
sarveiskalvon paksuus hetkellat  ¼ 0 # 
Ü 100  
40. Kaikkien testattujen silmien sarveiskalvon turpoamisen prosenttikeskiarvo 
lasketaan kaikille havaintojankohdille. Kullekin testiaineelle annetaan ylei ­
nen kategoriaa koskeva arvo sarveiskalvon turpoamiselle saadun korkeim ­
man (minä tahansa ajankohtana havaitun) keskiarvon perusteella.  
41. Sarveiskalvon sameus lasketaan käyttäen sitä sarveiskalvon alaa, joka an ­
taa suurimman sameusarvon. Kaikkien testattujen silmien sarveiskalvon keskimääräinen sameusarvo lasketaan kaikille havaintoajankohdille. Kulle ­
kin testiaineelle annetaan yleinen kategoriaa koskeva arvo sarveiskalvon 
sameudelle saadun korkeimman (minä tahansa ajankohtana havaitun) kes ­
kimääräisen arvon perusteella (Taulukko 1).
 
Taulukko 1  
Sarveiskalvon sameusarvot  
Arvo Havainto  
0 Ei sameutta 
0,5 Hyvin heikkoa sameutta 
1 Hajanaisia sameita alueita; värikalvon yksityiskohdat selvästi nähtävissä 
2 Selvästi erottuva läpikuultava alue; värikalvon yksityiskohdat hiukan hämäriä 3 Vakavaa sarveiskalvon sameutta; värikalvosta ei ole näkyvillä erityisiä yksityis ­
kohtia; silmäterän kokoa voi tuskin erottaa 
4 Täysin samea sarveiskalvo; silmäterää ei näy
 
42. Kaikkien testattujen silmien fluoreseiinin retention keskiarvo lasketaan ai ­
noastaan 30 minuutin ajanhetkelle. Sitä käytetään kullekin testiaineelle 
annettavaan yleiseen kategoria-arvoon (taulukko 2).  
Taulukko 2  
Fluoreseiinin retention arvot  
Arvo Havainto  
0 Ei fluoreseiinin retentiota 
0,5 Hyvin vähäistä yksittäisten solujen värjääntymistä 1 Yksittäisiä värjääntyneitä soluja on hajaantuneena sarveiskalvon käsitellylle alu ­
eelle 
2 Tiiviitä ja tiheitä yksittäisten värjääntyneiden solujen rykelmiä 3 Laajoja sarveiskalvon alueita, joilla esiintyy tiheää fluoreseiinivärjääntymistä
 ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 695
 
43. Morfologisia vaikutuksia ovat esimerkiksi sarveiskalvon epiteelisolujen 
”pistemäinen syöpyminen”, epiteelin ”irtoaminen”, sarveiskalvon pinnan 
”karhentuminen” ja testiaineen ”takertuminen” sarveiskalvoon. Näiden löy ­
dösten vakavuus voi vaihdella, ja ne voivat esiintyä samanaikaisesti. Näi ­
den löydösten luokittelu riippuu tutkijan tulkinnasta.  
MITTAUSTULOKSET JA TESTISELOSTEET  
Mittaustulosten arviointi  
44. Sarveiskalvon sameutta, turpoamista ja fluoreseiinin retentiota koskevat 
tulokset olisi arvioitava erikseen, jotta kullekin päätepisteelle voidaan muo ­
dostaa ICE-luokka. Kutakin päätepistettä koskevat ICE-luokat yhdistetään sitten ärsytysluokituksen muodostamiseksi kullekin testiaineelle.
 
Päätöskriteerit  
45. Kun kukin päätepiste on arvioitu, voidaan ICE-luokat osoittaa ennalta 
määrätyn vaihteluvälin perusteella. Sarveiskalvon paksuus (taulukko 3), 
sameus (taulukko 4) ja fluoreseiinin retentio (taulukko 5) ICE-luokkia 
käyttäen tulkitaan seuraavien asteikkojen mukaisesti:  
Taulukko 3  
ICE-luokituskriteerit sarveiskalvon paksuudelle  
Keskimääräinen sarveiskalvon turpoaminen (%) (*) ICE-luokka  
0–5 I 
> 5–12 II 
> 12–18 (> 75 min käsittelyn jälkeen) II 
> 12–18 ( ≤ 75 min käsittelyn jälkeen) III 
> 18–26 III > 26–32 (> 75 min käsittelyn jälkeen) III > 26–32 ( ≤ 75 min käsittelyn jälkeen) IV 
> 32 IV
 
(*) Sarveiskalvon turpoamisarvoja voi soveltaa vain, jos paksuus on mitattu Haag-Streit BP900 -rakovalo ­
mikroskoopilla, joka on varustettu syvyydenmittauslaitteella nro I, raon leveys asetettuna arvoon 9½, mikä vastaa 0,095 mm:iä. Käyttäjien pitäisi olla tietoisia siitä, että rakovalomikroskoopeilla voi saada erilaisia 
arvoja sarveiskalvon paksuudelle, jos raon leveyden asetus on erilainen.
 
Taulukko 4  
ICE-luokituskriteerit sameudelle  
Keskimääräinen suurin sameusarvo (*) ICE-luokka  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 1,6-2,5 III 2,6-4,0 IV
 
(*) Ks. taulukko 1.  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 696
 
Taulukko 5  
ICE-luokituskriteerit keskimääräiselle fluoreseiinin retentiolle  
Keskimääräinen fluoreseiinin retentioarvo 30 mi ­
nuuttia käsittelyn jälkeen (*) ICE-luokka  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 1,6-2,5 III 2,6-3,0 IV
 
(*) Ks. taulukko 2.  
46. Testiaineen yhdistetty  in vitro  -ärsyttävyysluokitus arvioidaan lukemalla 
ärsyttävyysluokitus, joka vastaa sarveiskalvon turpoamiselle, sarveiskalvon 
sameudelle ja fluoreseiinin retentiolle saatujen kategorioiden yhdistelmää, soveltamalla taulukossa 6 esitettyä järjestelmää.
 
Taulukko 6  
Yhdistetyt  in vitro  -ärsyttävyysluokitukset  
Luokittelu Kolmen päätepisteen yhdistelmät  
Syövyttävä / vakavasti ärsyttävä 3 × IV 
2 × IV, 1 × III 2 × IV, 1 × II (*) 2 × IV, 1 × I (*) 
Sarveiskalvon sameus ≥ 3, 30 minuutin kohdalla 
(vähintään kahdessa silmässä) Sarveiskalvon sameus = 4 millä tahansa mittaus ­
ajankohdalla (vähintään kahdessa silmässä) 
Vakava epiteelin irtoaminen (vähintään yhdessä 
silmässä)
 
(*) Harvinaisemmat yhdistelmät.  
47. Kuten 1 kohdassa mainittiin, jos testiainetta ei tunnisteta silmiä syövyttä ­
väksi tai niitä vakavasti ärsyttäväksi, on testausta jatkettava luokitusta ja 
merkintöjen määräämistä varten. ICE-testimenetelmän yleinen tarkkuus on välillä 83 % (120/144) – 87 % (134/154), siinä saatujen väärien positii ­
visten tulosten määrä on välillä 6 % (7/122) – 8 % (9/116) ja väärien 
negatiivisten tulosten määrä välillä 41 % (13/32) – 50 % (15/30), kun 
menetelmää käytetään tunnistettaessa aineita silmää syövyttäviksi ja silmää vakavasti ärsyttäviksi, verrattuna kanin silmää  in vivo  käyttävällä testime ­
netelmällä saatuihin tuloksiin luokiteltuna EPAn (1), EU:n (2) tai GHS:n 
(3) luokitusjärjestelmien mukaan. Kun tietokannasta jätetään pois tiettyihin 
kemiallisiin (alkoholit, pinta-aktiiviset aineet) ja fysikaalisiin (kiinteät ai ­
neet) luokkiin kuuluvat aineet, ICE-menetelmän tarkkuus EPAn, EU:n ja GHS:n luokitusjärjestelmissä vaihtelee väillä 91 % (75/82) – 92 % (69/75), 
väärien positiivisten tulosten määrä on välillä 5 % (4/73) – 6 % (4/70) ja 
väärien negatiivisten tulosten määrä välillä 29 % (2/7) – 33 % (3/9) (4).
 
48. Vaikka testiaineelle ei saataisi luokitusta silmiä syövyttäväksi tai niitä 
vakavasti ärsyttäväksi aineeksi, ICE-menetelmässä saaduista tuloksista 
voi olla hyötyä käytettynä yhdessä  in vivo  -kaninsilmätestissä tai asian ­
mukaisesti validoidussa  in vitro  -testissä saatujen testitulosten kanssa, kun 
arvioidaan ICE-menetelmän käyttökelpoisuutta ja rajoituksia muiden kuin 
vakavasti ärsyttävien ja ei-ärsyttävien aineiden tunnistamisessa (valmis ­
teilla on ohjeet  in vitro  -silmämyrkyllisyystestimenetelmien käytöstä).  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 697
 
Tutkimuksen hyväksymiskriteerit  
49. Testiä pidetään hyväksyttävänä, jos samanaikaisesti tehtyjen negatiivisten 
tai liuotin/vehikkelikontrollien antama ärsyttävyysluokitus on ”ei ärsyttä ­
vä” ja samanaikaisesti tehtyjen positiivisten kontrollien antama ärsyttä ­
vyysluokitus on ”vakavasti ärsyttävä / syövyttävä”.  
Testiseloste  
50. Testiselosteessa olisi annettava seuraavat tiedot, jos ne ovat merkitykselli ­
siä tutkimuksen suorittamiselle:  
Testi- ja kontrolliaineet  
Kemiallinen nimi (nimet), kuten CAS:n (Chemical Abstracts Service) käyt ­
tämä rakennetta kuvaava nimi, jonka jälkeen annetaan muut nimet, jos ne 
tunnetaan;  
CAS-numero, jos se tunnetaan;  
Aineen tai seoksen puhtausaste tai koostumus (painoprosentteina), jos tieto 
on saatavilla;  
Testin suorittamisen kannalta merkitykselliset fysikokemialliset ominaisuu ­
det, kuten olomuoto, haihtuvuus, pH, stabiilius, kemiallinen luokka ja vesiliukoisuus;
 
Tarvittaessa testi- ja/tai kontrolliaineiden käsittely ennen testiä (esim. läm ­
mittäminen tai jauhaminen);  
Stabiilius, jos se tiedetään.  
Sponsoria ja testauslaitosta koskevat tiedot:  
Sponsorin nimi ja osoite, testilaitos ja tutkimusjohtaja;  
Silmien lähde (esimerkiksi laitos, josta ne on kerätty);  
Silmien säilytys- ja kuljetusolosuhteet (kuten silmien keräyspäivä ja kel ­
lonaika, aika, joka on kulunut keräyksestä siihen asti, kun testi aloitettiin);  
Erityistietoja eläimistä, joista silmät on kerätty (kuten ikä, sukupuoli, pai ­
no), jos tiedot ovat saatavilla.  
Käytetyn testimenetelmän ja protokollan perustelu  
Testimenetelmän integriteetti  
Menettely, jolla testimenetelmän integriteetti (ts. tarkkuus ja luotettavuus) 
ajan suhteen varmistetaan (esimerkiksi pätevöittämiseen käytettyjen ainei ­
den säännöllinen testaus, aiempien negatiivisten ja positiivisten kontrolli ­
tulosten käyttö).  
Hyväksyttävän testin kriteerit  
Tapauksen mukaan hyväksyttävät aiempiin tuloksiin perustuvat samaan 
aikaan tehtyjen vertailukontrollien vaihteluvälit.  
Testausolosuhteet  
Kuvaus käytetystä testijärjestelmästä;  
Käytetty rakovalomikroskooppi (esimerkiksi sen malli);  
Käytetyn rakovalomikroskoopin laiteasetukset;  
Käytettyjä kanan silmiä koskevat tiedot, myös niiden laatua koskeva lau ­
suma;  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 698
 
Käytetty testimenettely yksityiskohtaisesti;  
Käytetyt testiainekonsentraatiot;  
Kuvaus testimenettelyjen mahdollisista muutoksista;  
Viittaus mallia koskeviin aiempiin tuloksiin (esimerkiksi negatiiviset ja 
positiiviset kontrollit, pätevöittämiseen käytetyt aineet, vertailuaineet);  
Kuvaus käytetyistä arviointikriteereistä.  
Tulokset  
Kuvaus muista havaituista vaikutuksista.  
Tarvittaessa valokuvat silmistä.  
Tulosten tarkastelu  
Päätelmä  
LÄHDEKIRJALLISUUS  
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B- 
96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  
(2) Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1272/2008, an ­
nettu 16 päivänä joulukuuta 2008, aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaamisesta sekä direktiivien 67/548/ETY ja 1999/45/EY muuttamisesta ja kumoamisesta ja asetuksen (EY) 
N:o 1907/2006 muuttamisesta. EUVL L 353, 31.12.2008, s. 1.
 
(3) Yhdistyneet Kansakunnat (YK) (2007). Globally Harmonized Sys ­
tem of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN New York ja Geneve, 2007. Saatavilla seuraa ­
vassa osoitteessa:
 
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]  
(4) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro Ocular 
Toxicity  Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Saatavilla seuraavassa osoitteessa:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(5) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retros ­
pective study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Saatavilla 
seuraavassa osoitteessa:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
(6) Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1907/2006, an ­
nettu 18 päivänä joulukuuta 2006, kemikaalien rekisteröinnistä, ar ­
vioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH), Euroopan ke ­
mikaaliviraston perustamisesta, direktiivin 1999/45/EY muuttami ­
sesta sekä neuvoston asetuksen (ETY) N:o 793/93, komission asetuksen (EY) N:o 1488/94, neuvoston direktiivin 76/769/ETY ja 
komission direktiivien 91/155/ETY, 93/67/ETY, 93/105/EY ja 
2000/21/EY kumoamisesta. EUVL L 396, 30.12.2006, s. 1.
 
(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Saatavilla seuraavassa 
osoitteessa:  
[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_ 
37051368_1_1_1_1,00.html]  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 699
 
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended ICE Test Method Pro ­
tocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: 
National Toxicology Program. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]  
(10) Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enuc ­
leated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits.  Fd. Chem. Toxicol.  
31:69-76.
 
(11) INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye 
test (CEET). Saatavilla seuraavassa osoitteessa:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
(12) Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The 
EC/HO international validation study on alternatives to the Draize 
eye irritation test.  Toxicol. In Vitro  9:871-929.  
(13) Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A 
practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials.  Food Chem. Toxicol . 34:291-296.
 
(14) Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. 
(1997). IRAG Working Group I: Organotypic models for the 
assessment/prediction of ocular irritation.  Food Chem. Toxicol.  
35:23-37.  
(15) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the He ­
althcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). 
Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of In ­
fectious Agents in Healthcare Settings. Saatavilla seuraavassa osoit ­
teessa:  
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].  
(16) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and 
recommendations for the development of alternative assays.  Reg. 
Tox. Pharmacol.  36:106-117.  
(17) Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The  in vitro  
assessment of severe irritants.  Fd. Cosmet.- Toxicol. - 19, 471-480.  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 700
 
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  
In Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]  
(19) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  
In Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
IrritantsIsolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Saatavilla seuraa ­
vassa osoitteessa:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 701
 
Lisäys 1  
MÄÄRITELMÄT  
Tarkkuus:  Testimenetelmän tulosten ja hyväksyttyjen vertailuarvojen välinen 
ero. Tarkkuudella mitataan testimenetelmän suoritusta, ja se on eräs ”relevanssin” 
näkökohta. Termiä käytetään usein ”konkordanssin” kanssa vaihtoehtoisena, jol ­
loin sillä tarkoitetaan testimenetelmällä saatujen oikeiden tulosten osuutta.  
Vertailuaine:  Aine, johon testiainetta verrataan. Vertailuaineella olisi oltava seu ­
raavat ominaisuudet: i) se saadaan vakaana pysyvästä ja luotettavasta lähteestä; 
ii) sen rakenne ja toiminta ovat samankaltaisia testattavan aineluokan kanssa; iii) sen fysikaalis-kemialliset ominaisuudet tunnetaan; iv) se tukee tunnetuista vaiku ­
tuksista saatuja tietoja; ja v) sen vaikutuskyky halutun vasteen vaihtelualueella 
tunnetaan.
 
Sarveiskalvo:  Silmämunan etuosan läpinäkyvä osa, joka peittää värikalvon ja 
silmäterän ja päästää valoa sisäosiin.  
Sarveiskalvon sameus:  Sarveiskalvon sameuden mitta, kun sarveiskalvo on al ­
tistettu testiaineelle. Sarveiskalvon sameuden lisääntyminen merkitsee sarveiskal ­
von vauriota.  
Sarveiskalvon turpoaminen:  ICE-testissä objektiivisesti mitattu sarveiskalvon 
pullistumisen määrä, kun sarveiskalvo on altistettu testiaineelle. Turpoaminen ilmaistaan prosenttilukuna ja lasketaan sarveiskalvon paksuuden perustasomitta ­
uksista (ennen annostelua) ja paksuuksista, jotka on mitattu säännöllisin väliajoin 
sen jälkeen, kun sarveiskalvo on altistettu testiaineelle ICE-testissä. Sarveiskalvon turpoamisaste osoittaa sarveiskalvon vauriota.
 
EPA-kategoria 1:  Syövyttävä (palautumaton silmäkudoksen tuhoutuminen) tai 
yli 21 vuorokautta kestävä sarveiskalvoon kohdistuva vaikutus tai ärsytys (1).  
EU:n R41-luokka:  Silmän kudosvauriot tai vakava fyysinen näön rappeutumi ­
nen, joka syntyy, kun testiainetta on annosteltu silmän etupinnalle, eikä se kor ­
jaudu täysin 21 päivän kuluessa annostelusta (2).  
Väärien negatiivisten tulosten osuus:  Niiden positiivisten aineiden osuus, jotka 
testimenetelmä yksilöi virheellisesti negatiivisiksi. Väärien positiivisten tulosten osuus on eräs testimenetelmän suorituskyvyn indikaattori.
 
Väärien positiivisten tulosten osuus:  Kaikkien negatiivisten aineiden osuus, 
jotka testimenetelmä yksilöi virheellisesti positiivisiksi. Väärien positiivisten tu ­
losten osuus on eräs testimenetelmän suorituskyvyn indikaattori.  
Fluoreseiinin retentio:  ICE-testissä tehty subjektiivinen mittaus fluoreseiininat ­
riumin määrästä, jonka epiteelisolut pidättävät sarveiskalvossa, kun se on altis ­
tettu testiaineelle. Sarveiskalvon turpoamisaste osoittaa sarveiskalvon epiteelin 
vauriota.  
GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Che ­
micals, kemikaalien maailmanlaajuisesti yhdenmukaistettu luokitus- ja mer ­
kintäjärjestelmä):  Järjestelmä, jossa ehdotetaan kemikaalien (aineet ja seokset) 
luokitusta fysikaalisten, terveyteen ja ympäristöön liittyvien vaarojen standardi ­
tyyppien ja -tasojen mukaisesti ja osoitetaan niille vaaraviestinnän tunnukset, kuten kuvamerkit, huomiosanat, vaaralausekkeet, turvalausekkeet ja turvatiedot ­
teet, jotta voidaan välittää tietoa kemikaalien kielteisistä vaikutuksista ihmisten 
(mukaan luettuina työnantajat, työntekijät, kuljettajat, kuluttajat ja pelastushenki ­
löstö) ja ympäristön suojelemiseksi (3).
 ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 702
 
GHS-kategoria 1:  Silmän kudosvauriot tai vakava fyysinen näön rappeutuminen, 
joka syntyy, kun testiainetta on annosteltu silmän etupinnalle, eikä se korjaudu 
täysin 21 päivän kuluessa annostelusta (3).  
Vaara:  Vaikuttavan tekijän (”agentin”) tai tilanteen sisäinen ominaisuus, jolla on 
kyky aiheuttaa haitallisia vaikutuksia, kun organismi, järjestelmä tai (ala)populaa ­
tio altistuu kyseiselle aineelle.  
Negatiivinen kontrolli:  Käsittelemätön näyte, jossa on kaikki testijärjestelmän 
osat. Negatiivinen kontrolli prosessoidaan testiaineella käsiteltyjen näytteiden ja 
muiden kontrollinäytteiden kanssa, jotta voidaan määrittää, reagoiko liuotin tes ­
tijärjestelmän kanssa.  
Ei-ärsyttävä:  Aineet, joita ei ole luokiteltu EPA-järjestelmän kategoriaan I, II tai 
III; EU:n kategoriaan R41 tai R36; tai GHS:n kategoriaan 1, 2A tai 2B silmää ärsyttäväksi aineeksi (1)(2)(3).
 
Silmää syövyttävä aine:  a) Aine, joka aiheuttaa silmään palautumatonta kudos ­
vauriota; b) aineet, jotka on luokiteltu GHS:n kategoriaan 1, EPAn kategoriaan I tai EU:n kategoriaan R41 silmää ärsyttäviksi aineiksi (1) (2) (3).
 
Silmää ärsyttävä aine:  a) Aine, joka aiheuttaa silmään palautuvan muutoksen, 
kun sitä on annosteltu silmän etupinnalle; b) aineet, jotka on luokiteltu 
EPA-järjestelmän kategoriaan II tai III; EU:n kategoriaan R36; tai GHS:n kate ­
goriaan 1, 2A tai 2B silmää ärsyttäväksi aineeksi (1)(2)(3).  
Silmää vakavasti ärsyttävä aine:  a) Aine, joka aiheuttaa silmän etupinnalle 
annosteltuna kudosvauriota, joka ei korjaudu 21 päivän kuluessa annostelusta 
tai joka aiheuttaa näkökyvyn vakavaa fyysistä rappiota; b) aineet, jotka on luo ­
kiteltu GHS:n kategoriaan 1, EPAn kategoriaan I tai EU:n kategoriaan R41 silmää ärsyttäviksi aineiksi (1) (2) (3).
 
Positiivinen kontrolli:  Näyte, jossa on kaikki testijärjestelmän osat ja joka on 
käsitelty aineella, jonka tiedetään aiheuttavan positiivisen vasteen. Vakava vaste 
ei kuitenkaan saisi olla liian voimakas, jotta positiivisen kontrollivasteen vaihtelu 
ajan funktiona voidaan arvioida.  
Luotettavuus:  Arvo, joka osoittaa, missä määrin testimenetelmä pystytään suo ­
rittamaan uusittavalla tavalla samassa laboratoriossa tai eri laboratorioissa ajan 
myötä käytettäessä samaa protokollaa. Arvo määritetään laskemalla laboratorion ­
sisäinen ja laboratorioidenvälinen uusittavuus ja laboratorionsisäinen toistetta ­
vuus.  
Rakovalomikroskooppi:  Laite, jolla tarkastellaan silmää suoraan kaksiokulaa ­
risen mikroskoopin suurennoksella luomalla stereoskooppinen, pysty kuva. Lai ­
tetta käytetään ICE-testissä kanan silmän etukammion tarkasteluun ja sarveiskal ­
von paksuuden objektiiviseen mittaukseen mikroskooppiin liitetyn syvyyttä mit ­
taavan laitteen avulla.  
Liuotin/vehikkelikontrolli:  Käsittelemätön näyte, jossa on kaikki testijärjestel ­
män osat, mukaan luettuina liuotin tai vehikkeli, ja joka prosessoidaan testi ­
aineella käsiteltyjen ja muiden kontrollinäytteiden kanssa perusvastetason mää ­
rittämiseksi näytteille, joissa testiaine on liuotettu samaan liuottimeen tai vehik ­
keliin. Kun tällainen näyte testataan samanaikaisesti negatiivisen kontrollin kans ­
sa, se osoittaa myös, reagoiko liuotin tai vehikkeli testijärjestelmän kanssa.  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 703
 
Vaiheittainen testaus:  Vaiheittainen testausstrategia, jossa kaikkia testiainetta 
koskevia olemassa olevia tietoja tarkastellaan tietyssä järjestyksessä käyttäen to ­
distusnäyttöprosessia kussakin vaiheessa sen määrittämiseksi, onko käytettävissä riittävästi tietoja vaaraluokituspäätöstä varten, ennen kuin siirrytään seuraavaan vaiheeseen. Jos testiaineen ärsytyskyky voidaan määrittää olemassa olevien tie ­
tojen perusteella, ei lisätestausta tarvita. Jos testiaineen ärsytyskykyä ei voida 
määrittää olemassa olevien tietojen perusteella, toteutetaan vaiheittainen testaus eläimillä, kunnes luokitus voidaan määritellä aukottomasti.
 
Validoitu testimenetelmä:  Testimenetelmä, jonka validointitutkimukset on saa ­
tettu päätökseen ja relevanssi (tarkkuus mukaan luettuna) ja luotettavuus tiettyä 
tarkoitusta varten on määritetty. On tärkeää huomata, että validoitu testi ei ehkä 
ole riittävän tarkka ja luotettava, jotta se voitaisiin hyväksyä ehdotettuun tarkoi ­
tukseen.  
Todistusnäyttö:  Prosessi, jossa tarkastellaan erilaisten tietojen vahvuuksia ja 
heikkouksia, kun niiden avulla on tarkoitus päättää aineen vaarallisuutta koske ­
vasta päätelmästä tai kun tietojen on määrä tukea kyseistä päätelmää.  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 704
 
Lisäys 2  
PÄTEVYYDEN OSOITTAMISEEN TARKOITETUT KEMIKAALIT 
ICE-TESTIMENETELMÄLLE  
Ennen kuin laboratorio alkaa käyttää tähän testimenetelmään perustuvaa mene ­
telmää rutiininomaisesti, se voi osoittaa teknisen pätevyytensä määrittämällä oi ­
kein taulukossa 1 suositeltujen 10 aineen silmäsyövyttävyysluokituksen. Aineet on valittu siten, että ne edustavat sellaisia paikallisen silmä-ärsytyksen ja/tai- 
syövytyksen vasteita, jotka perustuvat  in vivo  kaninsilmätestissä (TG 405) saa ­
tuihin tuloksiin (ts. YK:n GHS-järjestelmän kategoriat 1, 2A, 2B tai ”Ei luoki ­
teltu ja merkitty”) (3) (7). Kun otetaan huomioon näiden määritysten validoitu hyödyllisyys (ts. ainoastaan silmää syövyttävien ja/tai silmää vakavasti ärsyttä ­
vien aineiden tunnistamista varten), vain kahta luokitustarkoituksiin käytettävää 
testitulosta (syövyttävät ja/tai silmää vakavasti ärsyttävät aineet tai ei-syövyttävät ja/tai ei vakavasti ärsyttävät aineet) käytetään pätevyyden osoittamiseksi. Muita valintakriteerejä ovat se, että aineet ovat kaupallisesti saatavilla, että saatavilla on 
laadukkaita  in vivo  -vertailutietoja ja että on laadukkaita tietoja niistä kahdesta  in 
vitro  -menetelmästä, joille parhaillaan kehitetään testiohjeita. Tästä syystä ärsyt ­
tävät aineet silmätoksisuuden  in vitro  -testimenetelmien validointiin valittiin ICC ­
VAM:n 122 suositellun vertailuaineen luettelosta (ks. lisäys H, ICCVAM:n suo ­
siteltujen vertailuaineiden luettelo) (4). Vertailutiedot ovat saatavilla naudan sar ­
veiskalvon sameus- ja läpäisevyysmenetelmälle (BCOP) ja ICE-menetelmälle laa ­
dituista tausta-asiakirjoista (18) (19).
 
Taulukko 1  
Suositellut aineet ICE-menetelmän teknisen pätevyyden osoittamiseksi  
Kemikaali CAS-nro Kemiallinen 
luokka (  1 ) Fysikaalinen 
olomuoto:  In vivo  -luokitus (  2 ) In vitro  -luokitus (  3 ) 
Bentsalkoniumkloridi 
(5 %) 8001-54-5 Oniumyhdiste Neste Kategoria 1 Syövyttävä/vakavasti 
ärsyttävä 
Klooriheksidiini 55-56-1 Amiini, ami ­
diini Kiinteä Kategoria 1 Syövyttävä/vakavasti 
ärsyttävä 
Dibentsoyyli-L-vii ­
nihappo 2743-38-6 Karboksyyli ­
happo, esteri Kiinteä Kategoria 1 Syövyttävä/vakavasti 
ärsyttävä 
Imidatsoli 288-32-4 Heterosyklinen Kiinteä Kategoria 1 Syövyttävä/vakavasti 
ärsyttävä 
Trikloorietikkahappo 
(30 %) 76-03-9 Karboksyyliha ­
pot Neste Kategoria 1 Syövyttävä/vakavasti 
ärsyttävä 
2,6-Diklooribentso ­
yylikloridi 4659-45-4 Asyylihalidi Neste Kategoria 2A Ei syövyttävä/ei-va ­
kavasti ärsyttävä 
Etyyli-2-metyyliase ­
toasetaatti 609-14-3 Ketoni, esteri Neste Kategoria 2B Ei syövyttävä/ei-va ­
kavasti ärsyttävä 
Ammoniumnitraatti 6484-52-2 Epäorgaaninen 
suola Kiinteä Kategoria 2A Ei syövyttävä/ei-va ­
kavasti ärsyttävä  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 705
 
Kemikaali CAS-nro Kemiallinen 
luokka (  1 ) Fysikaalinen 
olomuoto:  In vivo  -luokitus (  2 ) In vitro  -luokitus (  3 ) 
Glyseroli 56-81-5 Alkoholi Neste Ei merkintää Ei syövyttävä/ei-va ­
kavasti ärsyttävä 
n-Heksaani 110-54-3 Hiilivety 
(asyklinen) Neste Ei merkintää Ei syövyttävä/ei-va ­
kavasti ärsyttävä  
Lyhenteet: CAS-nro = Chemical Abstracts Service -rekisterinumero. 
( 1 ) Kunkin testiaineen kemiallinen luokka määritettiin National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH) -luokitusjär ­
jestelmään (saatavilla osoitteessa http//www.nlm.nih.gov/mesh) perustuvan tavanomaisen luokitusjärjestelmän perusteella. 
( 2 ) Perustuu tuloksiin, jotka on saatu kanin silmällä tehdyllä  in vivo  -testillä (OECD TG 405) käyttäen YK:n GHS-järjestelmää (3)(7). 
( 3 ) Perustuu BCOP- ja ICE-testien tuloksiin.  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 706
 
Lisäys 3  
ICE-testissä käytetyn tiputuslaitteen ja silmänpitimien kaaviot  
(ks. Burton et al. (17), jossa esitetään yleinen kuvaus tiputuslaitteesta 
ja silmänpitimestä)
  ▼M2 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 707
 
B.49.  IN VITRO  -MIKROTUMATESTI NISÄKÄSSOLUILLA  
JOHDANTO  
1. In vitro  -mikrotumamääritysmenetelmä (MNvit) on genotoksisuustesti, jolla 
määritetään interfaasisolujen sytoplasman mikrotumat. Mikrotumat voivat 
olla peräisin asentrisista kromosomin osista (joista puuttuu sentromeeri) 
tai kokonaisista kromosomeista, jotka eivät pysty vetäytymään kohti napoja solunjakautumisen anafaasivaiheessa. Määritysmenetelmässä osoitetaan klastogeenisten ja aneugeenisten kemikaalien (aineiden ja seosten) (1) (2) 
aktiivisuus soluissa, joissa on tapahtunut solun jakautuminen testiaineelle 
altistumisen aikana tai sen jälkeen. Testi voidaan suorittaa niin, että aktiinin polymerisaation inhibiittoria sytokalasiini B:tä (sytoB) käytetään tai ei käy ­
tetä. Kun sytoB:tä lisätään ennen tavoiteltua mitoosia, mikrotumafrekvenssi 
voidaan määrittää ja analysoida valikoivasti soluissa, joissa on tapahtunut 
yksi mitoosi, koska tällaiset solut ovat kaksitumaisia (3) (4). Tässä testime ­
netelmässä testisuunnitelmia voidaan soveltaa myös ilman sytokineesin in ­
hibitointia edellyttäen, että analysoitavassa solupopulaatiossa on todistetusti 
tapahtunut mitoosi.
 
2. Mikrotumien muodostumista aiheuttavien kemikaalien (aineiden ja seosten) 
tunnistamiseksi toteutettavan MNvit-määritysmenetelmän lisäksi kromoso ­
mivaurioiden ja mikrotuman muodostumisen mekanismeista voidaan saada 
tietoa myös käyttämällä sytokineesin inhibiittoria, kinetokorien immunoke ­
miallista merkkausta tai sentromeeri-/telomeerikoettimilla suoritettavaa hyb ­
ridisaatiota (fluoresenssi-  in situ  -hybridisaatio (FISH)) (5) (6) (7) (8) (9) 
(10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Merkkaus- ja hybridisaatiomenetelmiä 
voidaan käyttää, kun mikrotumien muodostuminen on kiihtynyt ja tutkija haluaa määrittää, johtuuko kiihtyminen klastogeenisista ja/tai aneugeenisista tapahtumista.
 
3. Mikrotumat edustavat vauriota, jotka ovat välittyneet tytärsoluihin. Sen si ­
jaan metafaasivaiheen soluissa esiintyvät kromosomipoikkeavuudet eivät ehkä välity seuraaviin vaiheisiin. Koska interfaasisolujen mikrotumat voi ­
daan havaita suhteellisen objektiivisesti, laboratorion henkilökunnan on vain 
määritettävä, ovatko solut jakautuneet ja kuinka monessa solussa on mik ­
rotuma. Näin ollen preparaatit voidaan laskea suhteellisen nopeasti ja ana ­
lysointi voidaan automatisoida. Tämän takia kussakin käsittelyssä voidaan 
laskea satojen solujen sijaan tuhansia soluja, mikä lisää määritysmenetelmän 
tehokkuutta. Koska mikrotumia voi syntyä hitaasti liikkuvista (”lagging”) kromosomeista, menetelmällä voidaan havaita aneuploidisia tekijöitä, joita on vaikea tutkia perinteisillä kromosomipoikkeavuustesteillä, kuten OECD:n 
testiohjeella 473 (tämän liitteen B.10 luku) (17). MNvit-määritysmenetel ­
mällä ei kuitenkaan voida eritellä polyploidisia kemikaaleja ja klastogeenisia kemikaaleja ilman erityistekniikoita, kuten 2 kohdassa tarkoitettua FISH-tekniikkaa.
 
4. MNvit-määritysmenetelmä on  in vitro  -menetelmä, jossa tavallisesti käyte ­
tään viljeltyjä ihmis- tai jyrsijäsoluja. Sillä voidaan kattavasti tutkia  in vitro  
kromosomivaurioiden mahdollisuutta, koska sillä voidaan havaita sekä 
aneugeenit että klastogeenit.  
5. MNvit-määritysmenetelmässä voidaan käyttää luotettavasti ja tehokkaasti 
useita eri solutyyppejä joko sytoB:n kanssa tai ilman sitä. Erilaisten jyrsi ­
jäsolulinjojen (CHO, V79, CHL/IU ja L5178Y) ja ihmisestä saatujen lym ­
fosyyttien käytön soveltuvuudesta MNvit-määritysmenetelmään on saatu 
kattavia todisteita (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Näitä ovat etenkin Société Française de Toxicologie Géné ­
tique -järjestön (SFTG) koordinoimat kansainväliset validointitutkimukset 
(18) (19) (20) (21) (22) sekä genotoksisuuden testausta käsittelevän kan ­
sainvälisen työryhmän (International Workshop on Genotoxicity Testing)
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 708
 
selvitykset (4) (16). Saatavilla olevat tiedot on myös arvioitu uudelleen 
Euroopan komission alaisen Euroopan vaihtoehtoisten menetelmien 
validointikeskuksen (ECVAM) tekemässä todistusnäytön jälkivalidointitut ­
kimuksessa, ja ECVAM:in tieteellinen neuvoa-antava komitea (ESAC) on vahvistanut testimenetelmän tieteellisesti päteväksi (32) (33) (34). Menetel ­
mässä kuvataan ihmisen lymfoblasti-TK6-solulinjan (35), HepG2-solujen 
(36) (37) ja syyrianhamsterialkion primaarisolujen (38) käyttöä, vaikka niitä ei ole käytetty validointitutkimuksissa.
 
MÄÄRITELMÄT  
6. Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 1.  
JOHDANTO  
7. In vitro  -testit edellyttävät yleensä eksogeenista metabolista aktivaatiojärjes ­
telmää, ellei solujen metabolia sovellu kyseisten aineiden testaamiseen. Ek ­
sogeeninen metabolinen aktivaatiojärjestelmä ei täysin jäljittele  in vivo  -olo­
suhteita. On myös vältettävä olosuhteita, joissa väärät positiiviset tulokset 
eivät heijasta luontaista mutageenisuutta, vaan voivat johtua esimerkiksi 
pH-arvon tai osmolaliteetin huomattavasta muutoksesta tai sytotoksisuuden korkeasta tasosta (39) (40) (41). Jos testikemikaali aiheuttaa viljelyaineen pH-arvon muuttumisen lisäämishetkellä, pH-arvoa on mukautettava mielel ­
lään siten, että kantaliuosta puskuroidaan niin, että kaikkien testinäytteiden, 
myös kaikkien kontrollinäytteiden, tilavuus pysyy muuttumattomana.
 
8. Mikrotumien muodostumisen analysoimiseksi on tärkeää, että sekä käsitel ­
lyissä että käsittelemättömissä viljelmissä on tapahtunut mitoosi. Eniten 
tietoja mikrotumien laskemiseksi saadaan soluista, joissa on tapahtunut yksi mitoosi testiaineella käsittelyn aikana tai sen jälkeen.
 
TESTIN PERIAATE  
9. Ihmis- tai nisäkäsperäiset soluviljelmät altistetaan testiaineelle sekä eksogee ­
nisen metabolisen aktivaatiojärjestelmän kanssa että ilman sitä, paitsi jos testissä käytetään soluja, joiden metabolointikyky on riittävä. Kaikissa tes ­
teissä käytetään samanaikaisesti myös liuotinta/kantaja-ainekontrollia ja po ­
sitiivisia kontrollikemikaaleja.
 
10. Testiaineelle altistamisen aikana tai sen jälkeen soluja kasvatetaan riittävän 
kauan, jotta kromosomi- tai sukkulavauriot voivat johtaa mikrotuman muo ­
dostumiseen inferfaasisoluissa. Jotta aneuploidia muodostuisi, testiaineen olisi yleensä oltava läsnä mitoosin aikana. Kerätyt ja värjätyt interfaasisolut analysoidaan mikrotumien havaitsemiseksi. Mikrotumat on laskettava pää ­
asiassa vain niissä soluissa, joissa mitoosi on päättynyt testiaineelle altista ­
misen aikana tai altistamisen jälkeisessä vaiheessa, jos testissä käytetään sitä. Sytokineesin inhibiittorilla käsitellyistä viljelmistä lasketaan vain kak ­
situmaiset solut. Jos sytokineesin inhibiittoria ei ole käytetty, on tärkeä 
osoittaa, että analysoiduissa soluissa on todennäköisesti tapahtunut solunja ­
kautuminen testiaineelle altistumisen aikana tai sen jälkeen. Kaikkien me ­
netelmissä on tärkeä osoittaa, että solut ovat lisääntyneet sekä kontrollivil ­
jelmässä että käsitellyissä viljelmissä, ja testiaineen aiheuttamaa sytotoksi ­
suutta tai sytostaasia on arvioitava niissä viljelmissä (tai rinnakkaisviljelmis ­
sä), joiden mikrotumat lasketaan.
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 709
 
MÄÄRITYSMENETELMÄN KUVAUS  
Testin valmistelu  
11. Testeissä voidaan käyttää viljeltyjä ihmisen perifeerisen veren primaarisia 
lymfosyyttejä (5) (19) (42) (43) ja erilaisten jyrsijäsolulinjojen (esimerkiksi 
CHO, V79, CHL/IU ja L5178Y) soluja (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Muiden solulinjojen ja -tyyppien käyttö on perusteltava esittäen tiedot niiden todistetusta suorituskyvystä määritysmenetelmässä Hy ­
väksyttävyysperusteet -kohdan mukaisesti. Koska mikrotumien esiintymis ­
taajuus vaikuttaa taustana määritysmenetelmän herkkyyteen, menetelmässä olisi käytettävä solutyyppejä, joissa mikrotumien muodostumisen taustataa ­
juus on alhainen ja tasainen.
 
12. Ihmisen perifeerisen veren lymfosyytit on kerättävä nuorilta (noin 18–35- 
vuotiaat), terveiltä, tupakoimattomilta henkilöiltä, joiden ei tiedetä altistu ­
neen äskettäin genotoksisille kemikaaleille tai säteilylle. Jos soluja kerätään 
useammalta kuin yhdeltä luovuttajalta, luovuttajien määrä on ilmoitettava. 
Mikrotumataajuus kasvaa iän myötä, ja ilmiö on yleisempi naisilla kuin miehillä (44). Tämä on otettava huomioon valittaessa luovuttajien soluja, jos ne on tarkoitus yhdistää.
 
Elatusaineet ja viljelyolosuhteet  
13. Soluviljelmiä on viljeltävä sopivissa elatusaineissa ja inkubaatio-olosuhteissa 
(kasvatusastiat, CO  2 -pitoisuus, lämpötila ja kosteus). Pysyvistä solulinjoista 
ja kannoista on tarkistettava ajoittain modaalisen kromosomimäärän pysy ­
vyys ja varmistettava, ettei ole mykoplasmakontaminaatiota. Viljelmiä ei 
pidä käyttää, jos ne ovat kontaminoituneet tai jos modaalinen kromosomi ­
määrä on muuttunut. Normaali solusyklin kesto testauslaboratoriossa käyte ­
tyissä viljelyolosuhteissa on tunnettava. Jos menetelmänä käytetään sytoki ­
neesin estämistä, sytokineesin inhibiittorin pitoisuus on optimoitava tiettyä 
solutyyppiä varten, ja on osoitettava, että sillä saadaan aikaan riittävä määrä kaksitumaisia soluja pisteytystä varten.
 
Soluviljelmien valmistelu  
14. Pysyvät solulinjat ja solukannat: solut kasvatetaan kantaviljelmistä, kylve ­
tään elatusaineeseen sellaiseen tiheyteen, että soluviljelmät eivät saavuta 
konfluenttisuutta yhden solun vahvuisessa kerroksessa eivätkä kasvatusvil ­
jelmät ole liian tiheitä ennen solujen keräämisajankohtaa, ja inkuboidaan 37 °C:ssa.
 
15. Lymfosyytit: antikoagulantilla (esimerkiksi hepariinilla) käsiteltyä kokoverta 
tai erotettuja lymfosyyttejä viljellään mitogeenin (esimerkiksi fytohemagg ­
lutiniini, PHA) kanssa ennen testiaineelle ja sytoB:lle altistamista.  
Metabolinen aktivaatio  
16. Jos solujen endogeeninen metabolointikyky ei ole riittävä, on käytettävä 
eksogeenisia metabolisia järjestelmiä. Yleisimmin käytetty aktivaatiojärjes ­
telmä on entsyymejä indusoivilla aineilla, kuten Aroclor 1254:llä (45) (46) tai fenobarbitonin ja β-naftoflavonin yhdistelmällä (46) (47) (48) (49) käsi ­
teltyjen jyrsijöiden maksasta eristetty postmitokondriaalinen jae (S9), johon 
on lisätty kofaktoria. Jälkimmäisenä mainittu yhdistelmä ei ole ristiriidassa pysyviä orgaanisia yhdisteitä koskevan Tukholman yleissopimuksen (50) ja pysyvistä orgaanisista yhdisteistä annetun asetuksen (EY) N:o 850/2004 
(66) säännösten kanssa, ja sen on osoitettu indusoivan sekaoksidaasia 
yhtä tehokkaasti kuin Aroclor 1254:n (46) (47) (48) (49). S9-jakeen ylei ­
sesti käytetty pitoisuusalue lopullisessa testiväliaineessa on 1–10 % (v/v). Metabolisen aktivaatiojärjestelmän kunto voi riippua testattavan kemikaalin 
luokasta, ja joissakin tapauksissa saattaa olla perusteltua käyttää useampaa 
kuin yhtä S9-jakeen pitoisuutta.
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 710
 
17. Jos käytössä on spesifisiä ihmisen tai jyrsijöiden aktivoivia entsyymejä 
ilmentäviä geenitekniikalla tuotettuja solulinjoja, ei eksogeenista metabolista 
aktivaatiojärjestelmää välttämättä tarvita, ja näitä soluja voidaan myös käyt ­
tää testisoluina. Tällaisissa tapauksissa käytettyjen solulinjojen valinta on perusteltava tieteellisesti, esimerkiksi ilmoittamalla sekaoksidaasin merkitys 
testiaineen (51) metabolialle ja niiden reagoivuus tunnettuihin klastogeenei ­
hin ja aneugeeneihin (katso erillinen Hyväksyttävyysperusteet-kohta). On mahdollista, että ilmentyvä(t) sekaoksidaasi(t) ei(vät) pysty metaboloimaan testiainetta; tässä tapauksessa negatiiviset tulokset eivät osoita, että testi ­
aineella ei voida indusoida mikrotumia.
 
Testiaineen valmistelu  
18. Kiinteät kemikaalit on liuotettava tai sekoitettava sopiviin liuottimiin tai 
kantaja-aineisiin ja tarvittaessa laimennettava ennen solujen käsittelyä. Nes ­
temäiset kemikaalit voidaan lisätä suoraan koejärjestelmiin ja/tai laimentaa 
ennen solujen käsittelyä. Kaasujen tai haituvien kemikaalien testauksessa standardimenettelyihin on tehtävä asianmukaisia mukautuksia. Kyseiset kaa ­
sut tai kemikaalit on esimerkiksi käsiteltävä suljetuissa astioissa (52) (53). 
Testiaine on valmisteltava juuri ennen altistusta, paitsi jos säilyvyys on 
osoitettu stabiliteettitutkimuksilla.
 
Testiolosuhteet  
Liuottimet/kantaja-aineet  
19. Liuotin/kantaja-aine ei saisi reagoida testiaineen kanssa tai vaikuttaa solujen 
elinkykyyn tai S9:n aktiivisuuteen käytetyssä pitoisuudessa. Jos testissä 
käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita (esimerkiksi vettä, soluviljelmän elatusainetta tai dimetyylisulfoksidia), niiden käyttö on perusteltava tiedoilla, joilla osoitetaan, että ne ja testiaine sopivat yhteen ja 
että ne eivät ole genotoksisia. Vesipitoisen liuottimen/kantaja-aineen käyttöä 
on harkittava ensisijaisesti aina, kun se on mahdollista.
 
SytoB:n käyttö sytokineesin inhibiittorina  
20. Yhtenä MNvit-määritysmenetelmän tärkeimpänä näkökohtana on varmis ­
taa, että lasketuissa soluissa on tapahtunut mitoosi käsittelyn aikana tai 
käsittelyä seuraavalla inkubaatiojaksolla, jos sitä on käytetty. Sytokineesin inhibiittorina käytetään yleisimmin sytoB:tä, koska se estää aktiinin muo ­
dostumisen ja näin ollen estää tytärsolujen erkaantumisen mitoosin jäl ­
keen, mikä johtaa kaksitumaisten solujen muodostumiseen (5) (54) (55). 
Tämän ansiosta mikrotumien laskeminen voidaan rajoittaa soluihin, joissa on tapahtunut mitoosi käsittelyn aikana tai sen jälkeen. Testiaineen vai ­
kutus solujen proliferaation kinetiikkaan voidaan mitata samanaikaisesti. 
Ihmisen lymfosyyttejä käytettäessä sytokineesin inhibiittorina on käytet ­
tävä sytoB:tä, koska solusyklin kesto vaihtelee eri viljelmien ja luovutta ­
jien välillä ja koska kaikki lymfosyytit eivät reagoi PHA:han. Solulinjojen testauksessa on käytetty myös muita menetelmiä sen määrittämiseksi, 
ovatko laskettavat solut jakautuneet; näitä menetelmiä tarkastellaan jäljem ­
pänä (katso 26 kohta).
 
21. Laboratorion on määritettävä sopiva sytoB:n pitoisuus erikseen kullekin 
solutyypille, jotta liuottimella/kantaja-aineella käsiteltyjen kontrolliviljel ­
mien kaksitumaisten solujen määrä voidaan optimoida. Yleensä sytoB:n 
sopiva pitoisuus on 3–6 μg/ml. ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 711
 
Solujen proliferaation ja sytotoksisuuden mittaaminen ja altistuspitoisuuk ­
sien valitseminen  
22. Päätettäessä suurimmasta testattavasta pitoisuudesta on vältettävä pitoisuuk ­
sia, jotka voivat aiheuttaa vääriä positiivisia vasteita, kuten liian voimakasta sytotoksisuutta, saostumista väliaineeseen tai pH-arvon tai osmolaliteetin merkittävää muuttumista (39) (40) (41).
 
23. Solujen proliferaation mittauksella varmistetaan, että käsitellyissä soluissa 
on tapahtunut mitoosi määritysmenettelyn aikana ja että käsittelyissä on 
käytetty asianmukaisia sytotoksisuustasoja (katso 29 kohta). Sytotoksisuus on määritettävä metabolisen aktivaation avulla ja ilman sitä soluissa, joissa metabolinen aktivaatio on tarpeen, tarkastelemalla solumäärän suhteellista 
lisääntymistä tai populaation suhteellista kaksinkertaistumista (katso kaavat 
lisäyksessä 2), paitsi jos käytetään sytoB:tä. Jos sytoB:tä käytetään, syto ­
toksisuus voidaan määrittää käyttämällä replikaatioindeksiä (RI) (katso kaava lisäyksessä 2).
 
24. Kun viljelmät käsitellään sytoB:llä ja viljelmän yksitumaisten, kaksitumais ­
ten ja monitumaisten solujen suhteellinen osuus määritetään, käsittelyn täs ­
mällinen vaikutus solujen proliferaatioon ja solun sytotoksiseen tai sytos ­
taattiseen toimintaan voidaan määrittää kvantitatiivisesti (5). Lisäksi varmis ­
tetaan, että laskennassa huomioon otetaan vain solut, jotka ovat jakautuneet 
käsittelyn aikana tai sen jälkeen.  
25. SytoB:llä tehtävissä tutkimuksissa sytostaasi/sytotoksisuus voidaan kvantifi ­
oida sytokineesin eston jälkeisestä proliferaatioindeksistä (5) (26) (56) tai se voidaan johtaa RI:stä, joka on määritetty vähintään 500 solulle viljelmää 
kohti (katso kaavat lisäyksessä 2). Kun solujen proliferaatiota arvioidaan 
sytoB:n avulla, sytokineesin eston proliferaatioindeksi tai RI on määritettävä tarkastelemalla vähintään 500:aa solua viljelmää kohti. Sytotoksisuus voi ­
daan arvioida muun muassa näiden tulosten avulla vertailemalla käsiteltyjen 
viljelmien ja kontrolliviljelmien arvoja. Myös muiden sytotoksisuuden 
merkkien (esimerkiksi konfluenttisuuden, solujen määrän, apoptoosin, nek ­
roosin ja metafaasien määrän) arvioinnilla voidaan saada hyödyllistä tietoa.
 
26. Ilman sytoB:tä tehtävissä tutkimuksissa on osoitettava, että viljelmässä las ­
ketut solut ovat jakautuneet testiaineella käsittelyn aikana tai sen jälkeen. 
Muussa tapauksessa tutkimuksesta voidaan saada vääriä negatiivisia tulok ­
sia. Menetelmiä, joilla varmistetaan, että jakautuneet solut tulevat lasketuik ­
si, ovat muun muassa bromodeoksiuridiinin (BrdU) inkorporoituminen ja 
sen osoittaminen myöhemmin jakautuneiden solujen tunnistamiseksi (57), 
kloonien muodostuminen, kun pysyvien solulinjojen soluja käsitellään ja lasketaan  in situ  mikroskooppilevyllä (proliferaatioindeksi (PI)) (25) (26) 
(27) (28), tai populaation suhteellisen kaksinkertaistumisen tai solumäärän 
suhteellisen lisääntymisen määrittäminen tai muu soveltuvaksi osoitettu me ­
netelmä (16) (56) (58) (59) (katso kaavat lisäyksessä 2). Myös muiden sytotoksisuuden tai sytostaasin merkkien (esimerkiksi konfluenttisuuden, solujen määrän, apoptoosin, nekroosin ja metafaasien määrän) arvioinnilla 
voidaan saada hyödyllistä tietoa.
 
27. Vähintään kolmea analysoitavissa olevaa testipitoisuutta on arvioitava. Jotta 
tämä olisi mahdollista, kokeessa voidaan käyttää useampia, toisistaan vain hieman poikkeavia pitoisuuksia. Mikrotumien muodostuminen voidaan ar ­
vioida niissä pitoisuuksissa, joiden sytotoksisuus on asianmukaisella vaih ­
teluvälillä. Vaihtoehtoisesti voidaan suorittaa alustava sytotoksisuustesti, 
jolla rajataan lopullisen testin vaihteluväliä.
 
28. Suurimmassa pitoisuudessa sytotoksisuuden on oltava 55 ± 5 %. Sitä kor ­
keammilla tasoilla kromosomit voivat vaurioitua sytotoksisuuden sekundaa ­
rivaikutuksena (60). Jos sytotoksisuutta esiintyy, valittujen testipitoisuuksien 
on katettava vaihteluväli 55 ± 5 prosentin sytotoksisuudesta vähäiseen sy ­
totoksisuuteen tai tasoon, jolla sytotoksisuutta ei esiinny lainkaan.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 712
 
29. Jos sytotoksisuutta tai saostumista ei esiinny, suurimman testipitoisuuden on 
vastattava tasoa 0,01 M, 5 mg/ml tai 5 μl/ml sen mukaan, mikä pitoisuuk ­
sista on pienin. Analysoitavaksi valittujen pitoisuuksien on pääsääntöisesti erottava toisistaan enintään 10-kertaisesti. Jos testiaineen pitoisuus-vastekäyrä on jyrkkä, testiaineiden pitoisuudet voivat tarvittaessa 
olla lähempänä toisiaan, jotta myös keskitason ja vähäisen toksisuustason 
viljelmät pisteytetään.
 
30. Jos liukoisuus on rajoittava tekijä, suurimman pitoisuuden – jos sitä ei ole 
rajoitettu sytotoksisuuden takia – on oltava se pienin pitoisuus, jossa viljel ­
missä esiintyy mahdollisimman vähäistä saostumista; saostuminen ei kui ­
tenkaan saa vaikuttaa laskemiseen. Saostumisen arvioinnissa on käytettävä 
esimerkiksi valomikroskooppia, jotta voidaan havaita viljelyn aikana esiin ­
tyvä tai (käsittelyn loppuun mennessä) muodostuva saostuma.  
Kontrollit  
31. Jokaisessa kokeessa on käytettävä samanaikaisia positiivisia kontrolleja ja 
liuotin-/kantaja-ainekontrolleja metabolisen aktivaation läsnä ollessa ja il ­
man sitä.  
32. Positiivisia kontrolliaineita tarvitaan, jotta voidaan osoittaa käytettyjen so ­
lujen – ja testisuunnitelman – kyky tunnistaa klastogeenejä ja aneugeenejä 
sekä vahvistaa S9-preparaatin metabolointikyky. Positiivisina kontrollikemi ­
kaaleina on käytettävä tunnettuja mikrotumien indusoijia pitoisuuksina, joi ­
den voidaan odottaa aiheuttavan vähäisen mutta toistettavissa olevan lisään ­
tymisen taustaan verrattuna ja osoittaa koejärjestelmän herkkyyden. Positii ­
visen kontrollikemikaalin pitoisuudet on valittava siten, että vaikutukset 
ovat selvät mutta eivät paljasta heti lukijalle koodattujen objektilasien iden ­
titeettiä.  
33. Soluviljelmän metabolointikyky ja klastogeenien osoituskyky on osoitettava 
käyttämällä metabolista aktivaatiota edellyttävää klastogeenia (esimerkiksi 
syklofosfamidi tai bentso[a]pyreeni). Muita positiivisia kontrollikemikaaleja 
voidaan käyttää, jos käyttö perustellaan. Koska tietyt metabolista aktivaa ­
tiota edellyttävät positiiviset kontrollikemikaalit voivat tietyissä käsittelyo ­
losuhteissa tai tietyissä solulinjoissa aktivoitua ilman eksogeenista metabo ­
lista aktivaatiota, metabolisen aktivaation tarve ja S9-preparaatin toiminta on 
testattava valitussa solulinjassa ja valituissa pitoisuuksissa.  
34. Tähän mennessä ei ole havaittu, että yhdenkään aneugeenin genotoksinen 
toiminta edellyttäisi metabolista aktivaatiota (16). Nykyisin aneugeenisen 
toiminnan hyväksyttyjä positiivisia kontrollikemikaaleja ovat esimerkiksi 
kolkisiini ja vinblastiini. Myös muiden kemikaalien käyttö on sallittu, jos ne indusoivat mikrotumia yksinomaan tai pääasiassa aneugeenisen toimin ­
nan välityksellä. Jotta ei tarvittaisi kahta positiivista kontrollikemikaalia 
erikseen klastogeenisuutta ja aneugeenisuutta varten (ilman metabolista ak ­
tivaatiota), aneugeenisuuden kontrollikemikaalia voidaan käyttää positii ­
visena kontrollikemikaalina ilman S9-jaetta ja käytetyn metabolisen aktivaa ­
tiojärjestelmän riittävyys voidaan testata klastogeenisuuden kontrollikemi ­
kaalilla. Sekä klastogeenisuuden että aneugeenisuuden positiivista kontrol ­
likemikaalia on käytettävä soluissa, joissa ei tarvita S9-jaetta. Ehdotetut positiiviset kontrollikemikaalit esitetään lisäyksessä 3.
 
35. Samaan kemiallisten aineiden ryhmään kuuluvan positiivisen kontrollikemi ­
kaalin käyttöä voidaan harkita, mikäli sopivia kemikaaleja on saatavilla. 
Positiivisia kontrollikemikaaleja on käytettävä vain, jos ne soveltuvat kysei ­
selle solutyypille ja kyseisiin aktivaatio-olosuhteisiin.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 713
 
36. Solujen jokaisena keräämisajankohtana on otettava näytteet myös liuottimel ­
la/kantaja-aineella käsitellyistä kontrolleista. Lisäksi on käytettävä myös 
käsittelemättömiä negatiivisia kontrolleja (ei liuotinta/kantaja-ainetta), paitsi jos julkaistut tai laboratorion aikaisemmat tiedot kontrollista osoittavat, ettei valitulla liuottimella ole käytetyissä pitoisuuksissa genotoksisia tai muita 
haitallisia vaikutuksia.
 
TESTIMENETTELY  
Käsittelyaikataulu  
37. Jotta aneugeenin tai klastogeenin toiminta tietyssä solusyklin vaiheessa voi ­
daan mahdollisimman todennäköisesti osoittaa, on tärkeää, että testiaineella 
käsitellään riittävä määrä soluja niiden kaikissa solusyklin vaiheissa. Solu ­
linjojen ja primääristen soluviljelmien käsittelyaikataulu voi näin ollen poi ­
keta jonkin verran lymfosyyttien käsittelyaikataulusta, sillä niiden solusyklin käynnistyminen edellyttää mitogeenista stimulaatiota. Niitä tarkastellaan 
41–43 kohdassa (16).
 
38. Teorian ja julkaistujen tietojen perusteella (18) useimmat aneugeenit ja 
klastogeenit voidaan osoittaa S9-jakeen kanssa ja ilman S9-jaetta toteutet ­
tavalla 3–6 tuntia kestävällä lyhyellä käsittelyjaksolla, jonka jälkeen testi ­
aine poistetaan ja viljelmän annetaan kasvaa 1,5–2,0 solusyklin ajan (6). 
Solut kerätään noin 1,5–2,0 normaalin (eli käsittelemättömän) solusyklin kuluttua joko käsittelyn aloittamisen jälkeen tai sen lopussa (katso taulukko 1). Näytteenotto- tai palautumisaikoja voidaan pidentää, jos tiedetään tai 
oletetaan, että testiaine vaikuttaa solusyklin kestoon (esimerkiksi kun testa ­
taan nukleosidianalogeja).
 
39. Koska S9-preparaatiot voivat olla toksisia viljellyille nisäkässoluille, piden ­
nettyä 1,5–2,0 normaalin solusyklin altistusta käytetään vain ilman S9-jaet ­
ta. Pidennetyssä käsittelyssä soluja voidaan käsitellä testikemikaalilla joko sytoB:n kanssa tai ilman sitä. Näin voidaan ottaa huomioon testiaineen ja sytoB:n mahdollinen vuorovaikutus.
 
40. Solujen ehdotetut käsittelyaikataulut esitetään taulukossa 1. Näitä yleisiä 
käsittelyaikatauluja voidaan mukauttaa testiaineen stabiiliuden tai reaktii ­
visuuden tai käytettävien solujen erityisten kasvuominaisuuksien mukaisesti. Kaikki käsittelyt on käynnistettävä ja saatava päätökseen, kun solut kasva ­
vat eksponentiaalisesti. Aikataulut esitellään yksityiskohtaisemmin jäljem ­
pänä olevissa 41–47 kohdassa.
 
Taulukko 1  
Solujen käsittely- ja keräämisajankohdat MNvit-määritysmenetelmässä  
Lymfosyytit, primaarisolut ja solulinjat, jotka 
on käsitelty sytoB:llä + S9 Käsitellään 3–6 tuntia S9:n kanssa; 
poistetaan S9 ja käsittelyväliaine; lisätään uusi väliaine ja sytoB; 
kerätään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myö ­
hemmin. 
– S9 
Lyhyt altistus Käsitellään 3–6 tuntia; 
poistetaan käsittelyväliaine; 
lisätään uusi väliaine ja sytoB; 
kerätään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myö ­
hemmin.
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 714
 
– S9 
Pidennetty altistus  Vaihtoehto A:  Käsitellään 1,5–2 normaalin so ­
lusyklin ajan sytoB:n kanssa; 
kerätään altistusjakson päättyessä.  
Vaihtoehto B:  Käsitellään 1,5–2,0 normaalin 
solusyklin ajan; 
poistetaan testiaine; 
lisätään uusi väliaine ja sytoB; kerätään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myö ­
hemmin. 
Solulinjat, joita ei ole käsitelty sytoB:n kanssa 
(Samat käsittelyaikataulut, mutta sytoB:tä ei lisätä)
 
Lymfosyytit, primaarisolut ja solulinjat sytoB:n kanssa  
41. Tehokkain menetelmä lymfosyyteille on aloittaa testiaineelle altistaminen 
44–48 tunnin kuluttua PHA-stimulaatiosta, kun syklin synkronoitumista ei 
enää havaita (5). Solut käsitellään ensin testiaineella 3–6 tunnin ajan sekä 
S9:n läsnä ollessa että ilman sitä. Käsittelyväliaine poistetaan ja lisätään uutta väliainetta, joka sisältää sytoB:tä, ja solut kerätään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myöhemmin.
 
42. Jos näistä lyhyistä (3–6 tunnin) käsittelyistä saadaan negatiiviset tai epäsel ­
vät tulokset, soluja altistetaan uudelleen kauemmin kestävälle käsittelylle 
ilman S9:ää. On olemassa kaksi yhtä hyvää käsittelyvaihtoehtoa. Stimuloi ­
duille lymfosyyteille voi kuitenkin olla parempi käyttää vaihtoehtoa A, joilla eksponentiaalinen kasvu voi hidastua 96 tunnin kuluttua stimulaatios ­
ta. Soluviljelmät eivät myöskään saa olla konfluentteja vaihtoehdon B vii ­
meiseen näytteenottoajankohtaan mennessä.
 
— Vaihtoehto A: Soluja käsitellään testiaineella 1,5–2,0 normaalin solusyk ­
lin ajan, ja ne kerätään käsittelyjakson päättyessä.  
— Vaihtoehto B: Soluja käsitellään testiaineella 1,5–2,0 normaalin solusyk ­
lin ajan. Käsittelyväliaine poistetaan ja korvataan uudella väliaineella, ja solut kerätään seuraavan 1,5–2,0 normaalin solusyklin jälkeen.
 
43. Primaarisoluja ja solulinjoja on käsiteltävä samalla tavalla kuin lymfosyyt ­
tejä, mutta niitä ei tarvitse stimuloida PHA:lla 44–48 tunnin ajan. Kun 
kyseessä ovat muut solut kuin lymfosyytit, niitä on altistettava niin, että tutkimuksen päättymisajankohtana solut ovat edelleen kasvun logaritmisessa vaiheessa.
 
Solulinjat ilman sytoB:tä  
44. Soluja on käsiteltävä 3–6 tunnin ajan S9:n läsnä ollessa ja ilman sitä. 
Käsittelyväliaine poistetaan ja korvataan uudella väliaineella, ja solut kerä ­
tään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myöhemmin.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 715
 
45. Jos molemmista lyhyistä (3–6 tunnin) käsittelyistä saadaan negatiiviset tai 
epäselvät tulokset, soluja altistetaan uudelleen pidennetylle käsittelylle (il ­
man S9:ää). Käytettävissä on kaksi yhtä hyvää käsittelyvaihtoehtoa:  
— Vaihtoehto A: Soluja käsitellään testiaineella 1,5–2,0 normaalin solusyk ­
lin ajan, ja ne kerätään käsittelyjakson päättyessä.  
— Vaihtoehto B: Soluja käsitellään testiaineella 1,5–2,0 normaalin solusyk ­
lin ajan. Käsittelyväliaine poistetaan ja korvataan uudella väliaineella, ja solut kerätään seuraavan 1,5–2,0 normaalin solusyklin jälkeen.
 
46. Yhden solun vahvuisissa kerroksissa voi esiintyä mitoosissa olevia soluja 
(pyöreitä, irtoavat pinnasta) 3–6 tuntia kestävän käsittelyn päättyessä. Koska mitoosissa olevat solut irtoavat helposti, ne voivat hävitä väliaineen muka ­
na, kun se kaadetaan pois. Nämä solut on kerättävä huolellisesti viljelmien 
huuhtelun yhteydessä ja palautettava viljelmiin, jotta mitoosivaiheessa ole ­
via soluja, joissa mikrotumia voi muodostua, ei menetetä keruuvaiheessa.
 
Viljelmien määrä  
47. Testiaineen jokaista pitoisuutta sekä kantaja-aine-/liuotinkontrollia ja nega ­
tiivista kontrollia varten on käytettävä kaksi rinnakkaisviljelmää. Mikäli 
laboratorion aikaisemmat tutkimustulokset osoittavat, että rinnakkaisviljel ­
mien välillä on vain hyvin vähäisiä eroja, yhden viljelmän käyttö voi olla hyväksyttävää. Yhtä viljelmää käytettäessä suositellaan, että pitoisuuksia analysoidaan tavallista suurempi määrä.
 
Solujen kerääminen ja objektilasien preparointi  
48. Jokainen viljelmä kerätään ja käsitellään erikseen. Solujen preparointiin 
voidaan käyttää hypotonista käsittelyä, mutta tämä vaihe ei ole tarpeen, 
jos solut levittäytyvät lasille riittävästi. Objektilasien preparoinnissa voidaan 
käyttää erilaisia tekniikoita edellyttäen, että pisteytystä varten saadaan kor ­
kealaatuisia solupreparaatteja. Solulima on säilytettävä mikrotumien osoitta ­
mista ja (sytokineesin estämiseen perustuvassa menetelmässä) kaksitumais ­
ten solujen luotettavaa tunnistamista varten.  
49. Objektilasit voidaan värjätä erilaisilla menetelmillä, kuten 
Giemsa-menetelmällä tai fluorisoivilla DNA-spesifisillä väriaineilla (59). DNA-spesifisen väriaineen (esimerkiksi akridiinioranssin (61) tai Hoechst 33258:n plus pyroniini-Y:n (62)) käytöllä voidaan eliminoida joitakin 
ei-DNA-spesifisen väriaineen käyttöön liittyviä artefakteja. Mikrotumien si ­
sällön (kromosomin/kromosomifragmentin) selvittämisessä voidaan käyttää anti-kinetokorivasta-aineita, FISH-tekniikkaa yhdessä pansentromeeri-DNA- koettimien kanssa tai  in situ  -merkkausta pansentromeerispesifisillä aluk ­
keilla yhdessä sopivan DNA:n vastavärjäyksen kanssa, jos mikrotumien 
muodostumisesta halutaan saada mekanistista tietoa (15) (16). Muita klas ­
togeenien ja aneugeenien erottelumenetelmiä voidaan käyttää, jos menetel ­
mät on osoitettu tehokkaiksi.
 
Analyysi  
50. Kaikki objektilasit, myös positiivisia ja negatiivisia kontrolleja sisältävät, on 
koodattava ennen mikroskooppitutkimusta. Koodattuja näytteitä voidaan 
analysoida myös validoidulla, automaattisella virtaussytometria- tai 
kuva-analyysijärjestelmällä.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 716
 
51. SytoB-käsiteltyjen viljelmien mikrotumien määrä on analysoitava vähintään 
2 000 kaksitumaisessa solussa kutakin pitoisuutta kohti (vähintään 1 000 
kaksitumaista solua viljelmää kohti; kaksi viljelmää pitoisuutta kohti). Jos käytetään yhtä erillistä viljelmää, viljelmästä on laskettava vähintään 2 000 kaksitumaista solua pitoisuutta kohti. Jos kussakin pitoisuudessa lasketta ­
vissa on huomattavasti vähemmän kuin 1 000 kaksitumaista solua viljelmää 
kohti (tai 2 000 solua, jos käytetään yhtä viljelmää) ja jos mikrotumien määrä ei havaintojen mukaan ole kasvanut merkittävästi, testi on toistettava useammilla soluilla tai vähätoksisemmilla pitoisuuksilla sen mukaisesti, 
kumpi vaihtoehto soveltuu tarkoitukseen paremmin. On varmistettava, että 
muodoltaan epäsäännöllisiä kaksitumaisia soluja tai soluja, joiden kaksi tumaa poikkeaa kooltaan huomattavasti toisistaan, ei lasketa; kaksitumaisia soluja ei myöskään saa sekoittaa huonosti levittyneisiin monitumaisiin so ­
luihin. Useampia kuin kaksi päätumaa sisältävistä soluista ei pitäisi analy ­
soida mikrotumia, koska mikrotumien määrä voi olla tällaisissa soluissa suurempi (63) (64). Yksitumaisten solujen laskeminen hyväksytään, jos testiaineen on osoitettu häiritsevän sytoB:n aktiivisuutta.
 
52. Solulinjoissa, joilla tehdään määritys ilman sytoB-käsittelyä, mikrotumat 
olisi pisteytettävä vähintään 2 000 solussa pitoisuutta kohti (vähintään 1 000 solua viljelmää kohti; kaksi viljelmää pitoisuutta kohti). Jos yhtä pitoisuutta kohti käytetään vain yhtä viljelmää, kyseisestä viljelmästä on 
laskettava vähintään 2 000 solua.
 
53. Kun sytoB:tä käytetään, sytokineesin eston proliferaatioindeksi tai RI on 
määritettävä solujen proliferaation arvioimiseksi (katso lisäys 2) käyttämällä vähintään 500:aa solua viljelmää kohti. Kun käsittely tehdään ilman sy ­
toB:tä, on tärkeää esittää todisteet siitä, että laskettavat solut ovat prolife ­
roituneet (ks. 24–27 kohta).
 
Hyväksyttävyysperusteet  
54. Tässä kuvatun MNvit-määritysmenetelmän käyttöä ehdottavan laboratorion 
on osoitettava valmiutensa osoittaa luotettavasti ja täsmällisesti kemikaalit, 
jotka tunnetusti toimivat aneugeenisesti ja klastogeenisesti metabolisen ak ­
tivaation läsnä ollessa ja ilman sitä, sekä tunnetut negatiiviset kemikaalit. Tässä on käytettävä lisäyksessä 3 lueteltuja vertailukemikaaleja. Laboratorio 
voi osoittaa valmiutensa käyttää tätä testimenetelmää asianmukaisesti esit ­
tämällä todisteet siitä, että mikrotumien muodostumisen pisteytykseen käy ­
tetyissä soluissa on tapahtunut yksi tuman jakautuminen, jos testi tehdään ilman sytoB:tä.
 
55. Vertailukemikaaleina käytettäväksi suositellaan lisäyksessä 3 lueteltuja 
kemikaaleja. Korvaavia tai täydentäviä kemikaaleja voidaan käyttää, jos niiden vaikutus tunnetaan, jos ne indusoivat mikrotumia samoilla toimintamekanismeilla ja jos ne on osoitettu merkityksellisiksi 
MNvit-menetelmällä testattavien kemikaalien suhteen. Perusteluna voi ­
daan esittää muun muassa validointitutkimusta, jossa testiaineen kemi ­
kaaliluokan tai tutkittavan vauriomekanismin perusteella on käytetty useita eri aineita tai vähäisempää ainemäärää.
 
56. Liuotin-/kantaja-ainekontrollien ja käsittelemättömien viljelmien olisi annet ­
tava tulokseksi toistettavasti vähäinen ja yhdenmukainen mikrotumien määrä (yleensä 5–25 mikrotumaa tuhatta solua kohti 11 kohdassa mainittu ­
jen solutyyppien osalta). Muiden solutyyppien tuotosten vaihteluvälit voivat 
olla erilaisia, ja ne on määritettävä, kun solutyyppejä validoidaan 
MNvit-määritysmenetelmässä käyttämistä varten. Kontrollien vaihteluvälit on määritettävä pitkältä ajalta negatiivisista kontrolleista, liuotinkontrolleista ja positiivisista kontrolleista saatujen tietojen perusteella. Näitä arvoja olisi 
käytettävä arvioitaessa, ovatko samanaikaiset negatiiviset tai positiiviset 
kontrollit asianmukaisia.
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 717
 
57. Jos määritysmenetelmän tutkimussuunnitelmaan ehdotetaan pieniä muutok ­
sia (esimerkiksi automaattisten pisteytystekniikoiden käyttämistä manuaalis ­
ten laskentatekniikoiden asemesta tai uuden solutyypin käyttämistä), muu ­
toksen vaikutus on osoitettava, ennen kuin tutkimussuunnitelman muutos voidaan hyväksyä. Vaikutuksen osoittamisella tarkoitetaan, että on muun 
muassa osoitettava, että kromosomin katkeamisen, liittymän tai häviämän 
tärkeimmät mekanismit voidaan osoittaa ja että testattavan yksittäisen ai ­
neen luokalle tai monille erilaisille aineille voidaan saada asianmukaiset positiiviset ja negatiiviset tulokset.
 
MITTAUSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
Tulosten käsittely  
58. Jos käytetään sytokineesin inhibiittoritekniikkaa, mikrotumien indusoitumi ­
sen arvioinnissa käytetään vain sellaisia kaksitumaisia soluja, joissa esiintyy 
mikrotumia (riippumatta mikrotumien määrästä solua kohti). Yksi, kaksi tai 
monta mikrotumaa omaavien solujen määrän laskemisella voidaan saada hyödyllistä tietoa, mutta se ei ole pakollista.
 
59. Kaikille käsitellyille viljelmille ja liuotin-/kantajakontrolleille olisi tehtävä 
samanaikaisesti sytotoksisuus- ja/tai sytostaasimääritykset (58). Sytokineesin eston proliferaatioindeksi tai RI on laskettava kaikille käsitellyille viljelmille ja kontrolliviljelmille määrittämällä solusyklin viivästyminen, kun käytetään 
sytokineesin estomenetelmää. Jos sytoB:tä ei käytetä, on määritettävä po ­
pulaation suhteellinen kaksinkertaistuminen, solumäärän suhteellisen lisään ­
tyminen tai PI (katso lisäys 2).
 
60. Kustakin viljelmästä on esitettävä tiedot erikseen. Kaikista tiedoista on li ­
säksi esitettävä yhteenveto taulukkomuodossa.  
61. MNvit-määritysmenetelmässä kemikaalit voivat aiheuttaa mikrotumien muo ­
dostumista indusoimalla kromosomien katkeamista, niiden häviämistä tai molempia. Antikinetokorivasta-aineilla, sentromeerispesifisillä  in situ  -koet­
timilla tai muilla menetelmillä voidaan yrittää määrittää, johtuuko mikrotu ­
mien indusoitumismekanismi klastogeenisesta ja/tai aneugeenisesta vaiku ­
tuksesta.
 
Tulosten arviointi ja tulkinta  
62. Selviä positiivisia tai negatiivisia tuloksia ei tarvitse vahvistaa täydentävillä 
testeillä. Epäselviä tuloksia voidaan selventää analysoimalla vielä tuhat so ­
lua kaikista viljelmistä, jotta vältetään satunnaisuuden vääristyminen. Jos tulosta ei saada selville tällä tavalla, viljelmille on tehtävä uusia testejä. 
Niissä olisi harkittava tutkimusparametrien muuttamista tapauksesta riippuen 
laajemmin tai suppeammin. Tutkimusparametreja, joita voitaisiin muuttaa, ovat muun muassa testipitoisuuksien erot, viljelmien käsittelyajankohta ja solujen keräämisajankohta ja/tai metabolisen aktivaation olosuhteet.
 
63. Positiivinen tulos voidaan päätellä useiden perusteiden avulla. Näitä ovat 
esimerkiksi mikrotumallisten solujen määrän pitoisuuteen sidottu kasvu tai tilastollisesti merkittävä kasvu. Aluksi on tarkasteltava tulosten biologista 
merkityksellisyyttä. Sen arvioimiseksi voidaan tarkastella sitä, ovatko havai ­
tut arvot aiemman kontrollivaihteluvälin sisällä vai sen ulkopuolella. Testi ­
tulosten arvioinnissa voidaan käyttää asianmukaisia tilastollisia menetelmiä (65). Tilastollisen testauksen tuloksia on kuitenkin arvioitava suhteessa 
annos-vastesuhteeseen. Myös uusittavuus ja aiemmat tulokset on otettava 
huomioon.
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 718
 
64. Useimmissa testeissä saadaan selvästi positiivisia tai negatiivisia tuloksia, 
mutta joissakin tapauksissa mittaustulosten pohjalta ei voida tehdä varmoja 
päätelmiä testiaineen aktiivisuudesta. Tulokset saattavat jäädä epäselviksi tai kyseenalaisiksi kokeen toistokertojen määrästä riippumatta.
 
65. MNvit-määritysmenetelmässä saadut positiiviset tulokset osoittavat, että tes ­
tiaine indusoi kromosomien katkeamista tai häviämää viljellyissä nisäkässo ­
luissa. Negatiiviset tulokset osoittavat, että testiaine ei käytetyissä testiolo ­
suhteissa indusoi kromosomien katkeamista ja/tai liittymää tai häviämää viljellyissä nisäkässoluissa.
 
Testiraportti  
66. Testiraportissa on annettava vähintään seuraavat tiedot, jos ne ovat merki ­
tyksellisiä tutkimuksen suorituksen kannalta:  
Testikemikaali  
— tunnistetiedot sekä CAS-numero ja EC-numero  
— fysikaalinen olomuoto ja puhtaus  
— tutkimuksen tekemisen kannalta merkitykselliset fysikaaliskemialliset 
ominaisuudet  
— testikemikaalin reagointi liuottimen/kantaja-aineen tai solujen kasvatus ­
väliaineen kanssa  
Liuotin/kantaja-aine  
— liuottimen/kantaja-aineen valintaperusteet  
— testiaineen liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja-aineessa  
Solut  
— käytettyjen solujen tyyppi ja alkuperä  
— käytetyn solutyypin soveltuvuus  
— mahdollinen mykoplasmakontaminaatio  
— tiedot solusyklin kestosta, jakautumisaika tai proliferaatioindeksi  
— lymfosyyttien osalta verenluovuttajien sukupuoli, ikä ja tarvittaessa 
määrä  
— lymfosyyttien osalta tieto siitä, onko testissä altistettu kokoverta vai 
eristettyjä lymfosyyttejä  
— tarvittaessa siirrostusten lukumäärä  
— tarvittaessa soluviljelymenetelmät  
— kromosomien modaalinen lukumäärä  
— tavallinen (negatiivisen kontrollin) solusyklin kesto  
Testiolosuhteet  
— mahdollinen sytokineesin inhibiittori (esimerkiksi sytoB), sen pitoisuus 
ja solujen altistuksen kesto  
— pitoisuuksien ja soluviljelmien lukumäärän valintaperusteet, joihin sisäl ­
tyvät esimerkiksi sytotoksisuustiedot ja liukoisuusrajoitukset, mikäli tie ­
dot ovat käytettävissä  
— väliaineen koostumus ja tarvittaessa CO  2 -pitoisuus  
— testiaineen pitoisuudet  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 719
 
— lisätyn kantaja-aineen ja testiaineen pitoisuus (ja/tai tilavuus)  
— inkubaatiolämpötila ja -aika  
— käsittelyn kesto  
— käsittelyn jälkeinen keräämisajankohta  
— tarvittaessa solutiheys inokuloitaessa  
— metabolisen aktivaatiojärjestelmän tyyppi ja koostumus, myös sen hy ­
väksyttävyysperusteet  
— positiiviset kontrollikemikaalit ja negatiiviset kontrollit  
— objektilasien preparointimenetelmät ja käytetyt värjäystekniikat  
— mikrotumien tunnistusperusteet  
— analysoitujen solujen määrät  
— sytotoksisuuden mittausmenetelmät  
— muut sytotoksisuuteen liittyvät tiedot  
— tutkimusten positiivisuuden, negatiivisuuden tai epäselvyyden arviointi ­
perusteet  
— käytetyt tilastoanalyysimenetelmät  
— tarvittaessa menetelmät sen määrittämiseksi, sisältävätkö mikrotumat ko ­
konaisia kromosomeja vai kromosomifragmentteja, esimerkiksi 
kinetokorivasta-aineen käyttö  
Tulokset  
— käytetyt sytotoksisuuden määritysmenetelmät, esimerkiksi sytokineesin 
eston proliferaatioindeksi tai RI (sytokineesin estoon perustuva menetel ­
mä); solumäärän suhteellinen lisääntyminen, populaation suhteellinen kaksinkertaistuminen tai PI (muu kuin sytokineesin estoon perustuva 
menetelmä); tarvittaessa muut havainnot, esimerkiksi solujen konfluens ­
si, apoptoosi, nekroosi, metafaasien määrä ja kaksitumaisten solujen määrä
 
— saostumisen merkit  
— tiedot käsittelyväliaineen pH:sta ja osmolaliteetista, jos määritetty  
— analysoitavaksi hyväksyttävien solujen määritelmä  
— yksi-, kaksi- ja monitumaisten solujen osuudet, jos sytokineesin estoon 
perustuvaa menetelmää on käytetty  
— mikrotumallisten solujen määrä kussakin käsitellyssä viljelmässä ja 
kontrolliviljelmässä ja tiedot solujen mahdollisesta kaksitumaisuudesta 
tai monitumaisuudesta  
— pitoisuus-vastesuhde, jos mahdollista  
— samanaikaisten negatiivisten (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisten kont ­
rollikemikaalien tiedot (pitoisuudet ja liuottimet)  
— aikaisemmat tiedot negatiivisista (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisista 
kontrollikemikaaleista, myös vaihteluvälit, keskiarvot ja keskihajonnat 
sekä luottamusväli (esimerkiksi 95 prosenttia)  
— tilastoanalyysi; mahdolliset p-arvot  
Tulosten tarkastelu  
Päätelmät  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 720
 
LÄHDELUETTELO  
(1) Kirsch-Volders, M. (1997). Towards a validation of the micronucleus test.  
Mutation Res.  392, s. 1–4.  
(2) Parry, J. M. ja Sors, A. (1993). The detection and assessment of the aneu ­
genic potential of environmental chemicals: the European Community ane ­
uploidy project.  Mutation Res.  287, s. 3–15.  
(3) Fenech, M. ja Morley, A. A. (1985). Solutions to the kinetic problem in the 
micronucleus assay.  Cytobios.  43, s. 233–246.  
(4) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. ja Wakata, A. (2000). Report from the  In Vitro  Micronucleus 
Assay Working Group.  Environ. Mol. Mutagen . 35, s. 167–172.
 
(5) Fenech, M. (2007). Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.  Nature 
Protocols 2  (5), s. 1084–1104.  
(6) Fenech, M. ja Morley, A. A. (1986). Cytokinesis-block micronucleus met ­
hod in human lymphocytes: effect of  in-vivo  ageing and low dose 
X-irradiation.  Mutation Res.  161, s. 193–198.  
(7) Eastmond, D. A. ja Tucker, J. D. (1989). Identification of 
aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody.  Environ. Mol. Mutagen.  13, s. 34–43.
 
(8) Eastmond, D. A. ja Pinkel, D. (1990). Detection of aneuploidy and 
aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence  in- 
situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes.  Mutation Res.  
234, s. 9–20.  
(9) Miller, B. M., Zitzelsberger, H. F., Weier, H. U. ja Adler, I. D. (1991). 
Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to  in situ  hybridization with 
biotinylated gamma satellite DNA.  Mutagenesis  6, s. 297–302.
 
(10) Farooqi, Z., Darroudi, F. ja Natarajan, A. T. (1993). The use of fluorescence  
in-situ  hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked 
mouse splenocytes.  Mutagenesis  8, s. 329–334.  
(11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. ja Lo Jacono, F. (1993). Cytogenetic 
damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and 
micronucleus analysis by fluorescence  in situ  hybridization with a centro ­
meric probe.  Mutation Res.  319, s. 205–213.  
(12) Norppa, H., Renzi, L. ja Lindholm, C. (1993). Detection of whole chromo ­
somes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by anti ­
kinetochore staining and  in situ  hybridization.  Mutagenesis  8, s. 519–525.  
(13) Eastmond, D. A, Rupa, D. S. ja Hasegawa, L. S. (1994). Detection of 
hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes 
following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multico ­
lor fluorescence  in situ  hybridization with DNA probes.  Mutation Res.  322, 
s. 9–20.  
(14) Marshall, R. R., Murphy, M., Kirkland, D. J. ja Bentley, K. S. (1996). 
Fluorescence  in situ  hybridisation (FISH) with chromosome-specific centro ­
meric probes: a sensitive method to detect aneuploidy.  Mutation Res.  372, s. 
233–245.  
(15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. ja Crebelli, R. (1996). Analysis of 
chromosome segregation by means of fluorescence  in situ  hybridization: 
application to cytokinesis-blocked human lymphocytes.  Mutation Res.  
372, s. 211–219.  
(16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der 
Hude, W. ja Wakata, A. (2003). Report from the  in vitro  micronucleus 
assay working group.  Mutation Res.  540, s. 153–163.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 721
 
(17) OECD (1997).  In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test , Test 
Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals. OECD, 
Pariisi. Saatavilla osoitteessa www.oecd.org/env/testguidelines  
(18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M. J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon 
G. ja Marzin, D. (2006). SFTG International collaborative Study on  in vitro  
micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study.  Mutation Res.  607, s. 13–36.
 
(19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L. C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, 
R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. ja Lorge, E. (2006). SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test. II. 
Using human lymphocytes.  Mutation Res.  607, s. 37–60.
 
(20) Aardema, M. J., Snyder, R. D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R. 
J., Gibson, D. P., Soelter, S., Curry, P. T., Thybaud, V., Lorenzon, G., 
Marzin, D. ja Lorge, E. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro  micronucleus test, III. Using CHO cells.  Mutation Res.  607, s. 
61–87.
 
(21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobay ­
ashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. ja 
Lorge, E. (2006). SFTG International collaborative study on the  in vitro  
micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells.  Mutation Res.  607, s. 88–124.
 
(22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., 
Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. ja Lorge, E. (2006). SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test, V. 
Using L5178Y cells.  Mutation Res.  607, s. 125–152.
 
(23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A. A. ja Locher, F. (1997). Detailed data 
on in vitro  MNT and  in vitro  CA: industrial experience.  Mutation Res.  392, 
s. 187–208.  
(24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. ja Lorge, E. (1997). 
Comparative evaluation of the  in vitro  micronucleus test and the  in vitro  
chromosome aberration test: industrial experience.  Mutation Res.  392, s. 
45–59.  
(25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. ja Mad ­
le, S. (1998). Evaluation of the  in vitro  micronucleus test as an alternative 
to the  in vitro  chromosomal aberration assay: position of the GUM Working 
Group on the  in vitro  micronucleus test. Gesellschaft fur 
Umwelt-Mutations-forschung.  Mutation Res.  410, s. 81–116.  
(26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. ja Madle, S. (1999). Chemically 
induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three diffe ­
rent test approaches.  Mutation Res.  439, s. 183–190.  
(27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S. Y., Kasper, P. ja Müller, L. 
(1999). The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 
cells to detect drug-induced photogenotoxicity.  Mutation Res.  445, s. 55–71.  
(28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., 
Slacik-Erben, R., Miltenburger, H. G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. ja Madle, S. (2000).  In vitro  micronucleus assay with Chinese hamster V79 
cells – results of a collaborative study with  in situ  exposure to 26 chemical 
substances.  Mutation Res . 468, s. 137–163.
 
(29) Garriott, M. L., Phelps, J. B. ja Hoffman, W. P. (2002). A protocol for the  
in vitro  micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity.  Muta­
tion Res.  517, s. 123–134.
 
(30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., 
Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. ja 
Sofuni, T. (1999). Validation study of the  in vitro  micronucleus test in a 
Chinese hamster lung cell line (CHL/IU).  Mutagenesis  14, s. 569–580.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 722
 
(31) Elhajouji, A. ja Lorge, E. (2006). Special Issue: SFTG International colla ­
borative study on  in vitro  micronucleus test.  Mutation Res.  607, s. 1–152.  
(32) ECVAM (2006). Statement by the European Centre for the Validation of 
Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on 
the scientific validity of the  in vitro  micronucleus test as an alternative to 
the in vitro  chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC:in 
25. kokous, 16.–17. marraskuuta 2006. Saatavilla osoitteessa http://ec ­
vam.jrc.it/index.htm  
(33) ESAC (2006). ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Revi ­
ew, Retrospective Validation of the  In Vitro  Micronucleus Test, Summary 
and Conclusions of the Peer Review Panel. Saatavilla osoitteessa http://ec ­
vam.jrc.it/index.htm  
(34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, 
van Benthem, J. ja Vanparys P. (2008). ECVAM Retrospective Validation of in vitro  Micronucleus Test (MNT).  Mutagenesis  23, s. 271–283.
 
(35) Zhang, L. S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. ja Sofuni, 
T. (1995). A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the  in vitro  micronucleus test.  Mutation Res.  
347, s. 105–115.
 
(36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. ja Knas ­
meuller, S. (2002). Fumonisin B  1 is genotoxic in human derived hepatoma 
(HepG2) cells.  Mutagenesis  17, s. 257–260.  
(37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., 
Huber, W. W., Hoelzl, C., Bichler, J. ja Majer, B. J. (2004). Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge.  Toxicol.  198, s. 315–328.
 
(38) Gibson, D. P., Brauninger, R., Shaffi, H. S., Kerckaert, G. A., LeBoeuf, R. 
A., Isfort, R. J. ja Aardema, M. J. (1997). Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell trans ­
formation assay for National Toxicology Program test chemicals.  Mutation 
Res. 392, s. 61–70.
 
(39) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., 
Ashby, J. ja Myhr, B. C. (1991). International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under ext ­
reme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9.  Mutation 
Res. 257, s. 147–205.
 
(40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. ja Okumura, K. (1992). Clastogenicity of 
low pH to various cultured mammalian cells.  Mutation Res.  268, s. 
297–305.  
(41) Brusick, D. (1986). Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced 
by low pH treatment conditions and increased ion concentrations.  Environ. 
Mutagen . 8, s. 789–886.  
(42) Fenech, M. ja Morley, A. A. (1985). Measurement of micronuclei in lymp ­
hocytes.  Mutation Res.  147, s. 29–36.  
(43) Fenech, M. (1997). The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood 
micronucleus method.  Mutation Res.  392, s. 11–18.  
(44) Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y. P., Ceppi, M., Chang, W. P., 
Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M. P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L. R., Fucic, A., Lima, O. G., Hrelia, P., Krishnaja, A. P., Lee, T. K., Migliore, L., Mikhalevich, 
L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W. U., Odagiri, Y., Scarffi, M. R., 
Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. ja Zijno, A. (2001). HUman Micro ­
Nucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of 
laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of 
micronuclei.  Environ. Mol. Mutagen.  37, s. 31–45.
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 723
 
(45) Maron, D. M. ja Ames, B. N. (1983). Revised methods for the Salmonella 
mutagenicity test.  Mutation Res.  113, s. 173–215.  
(46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C. R. ja Zeiger, E. (1980). Differential 
effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver.  J. Environ. Pathol. Toxicol.  4, 
s. 55–65.
 
(47) Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, 
G. G., Mackay, J. M. ja Wolf, R. C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254- induced S9 in  in-vitro  genotoxicity assays.  Mutagenesis  7, s. 175–177.
 
(48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. ja Sugimura, T. (1976). A safe 
substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Acti ­
vation Systems,  teoksessa:  de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. ja 
Philpot, R. M. (ed.),  In Vitro  Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, 
Elsevier, North-Holland, s. 85–88.  
(49) Johnson, T. E., Umbenhauer, D. R. ja Galloway, S. M. (1996). Human liver 
S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison 
with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9.  
Environ. Mol. Mutagen.  28, s. 51–59.  
(50) UNEP (2001). Pysyviä orgaanisia yhdisteitä koskeva Tukholman yleissopi ­
mus. Yhdistyneiden kansakuntien ympäristöohjelma (UNEP). Saatavilla 
osoitteessa http://www.pops.int/  
(51) Doherty, A. T., Ellard, S., Parry, E. M. ja Parry, J. M. (1996). An inves ­
tigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells.  Mutagenesis  11, s. 
247–274.
 
(52) Krahn, D. F., Barsky, F. C. ja McCooey, K. T. (1982). CHO/HGPRT 
Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids,  teoksessa:  Tice, 
R. R., Costa, D. L. ja Schaich, K. M. (ed.), Genotoxic Effects of Airborne 
Agents. New York, Plenum, s. 91–103.  
(53) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. ja Brooks, A. L. (1983). Evaluation 
of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay.  Environ. 
Mutagenesis  5, s. 795–801.
 
(54) Fenech, M. (1993). The cytokinesis-block micronucleus technique: a detai ­
led description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations.  Mutation Res.  285, s. 35–44.
 
(55) Phelps, J. B., Garriott, M. L. ja Hoffman, W. P. (2002). A protocol for the  
in vitro  micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals 
with different mechanisms of action and different levels of activity.  Muta­
tion Res.  521, s. 103–112.  
(56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., 
Surralles, J., Vanhauwaert, A. ja Wakata, A. (2004). Corrigendum to ”Re ­
port from the  in vitro  micronucleus assay working group”.  Mutation Res.  
564, s. 97–100.  
(57) Pincu, M., Bass, D. ja Norman, A. (1984). An improved micronuclear assay 
in lymphocytes.  Mutation Res.  139, s. 61–65.  
(58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. ja Kirkland, D. (2008). Comparison of 
different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the  in vitro  
micronucleus test. I. Theoretical aspects.  Mutation Res.  655, s. 1–3.  
(59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. ja Marcos, R. 
(1995). Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures.  Mutation Res.  341, 
s. 169–184.
 
(60) Galloway, S. (2000). Cytotoxicity and chromosome aberrations  in vitro : 
Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the 
aberration assay. Environ. Molec.  Mutagenesis  35, s. 191–201.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 724
 
(61) Hayashi, M., Sofuni, T. ja Ishidate, M. Jr. (1983). An Application of 
Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test.  Mutation 
Res. 120, s. 241–247.  
(62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M. ja Langlois, R. G. (1983). A Simple Fluo ­
rescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y.  Mutation Res.  120, s. 269–275.
 
(63) Hayashi, M., Sofuni, T. ja Ishidate, M. Jr. (1983). An application of acri ­
dine orange fluorescent staining to the micronucleus test.  Mutation Res.  
120, s. 241–247.  
(64) Fenech, M., Chang, W. P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. ja 
Zeiger, E. (2003). HUMN project: detailed description of the scoring criteria 
for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lympho ­
cyte cultures.  Mutation Res.  534, s. 65–75.  
(65) Hoffman, W. P., Garriott, M. L. ja Lee, C. (2003).  In vitro  micronucleus 
test, teoksessa:  Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, 2. painos. S. 
Chow (toim.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, s. 463–467.  
(66) Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 850/2004, annettu 
29 päivänä huhtikuuta 2004, pysyvistä orgaanisista yhdisteistä sekä direktii ­
vin 79/117/ETY muuttamisesta. EUVL L 229, 30.4.2004, s. 5.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 725
 
Lisäys 1  
Määritelmät  
Aneugeeni:  aine tai prosessi, joka vuorovaikutuksessa solun mitoottisen ja mei ­
oottisen jakautumissyklin vaiheiden kanssa johtaa solujen tai organismien ane ­
uploidiaan.  
Aneuploidia:  yksittäisen tai useamman kuin yhden kromosomin mutta ei kuiten ­
kaan koko kromosomiston (polyploidia) poikkeaminen kromosomien tavallisesta diploidisesta (tai haploidisesta) määrästä.
 
Apoptoosi:  ohjelmoitunut solukuolema, jossa tietyt vaiheet johtavat solujen ha ­
joamiseen solukalvon ympäröimiksi rakkuloiksi, jotka myöhemmin häviävät fa ­
gosytoosin tai puhkeamisen seurauksena.  
Solujen proliferaatio:  solujen määrän kasvaminen solujen mitoottisen jakautumi ­
sen seurauksena.  
Sentromeeri:  kromosomin DNA:n alue, jossa kromatidit liittyvät yhteen ja johon 
molemmat kinetokorit kiinnittyvät rinnakkain.  
Klastogeeni:  aine tai prosessi, joka aiheuttaa rakenteellisia kromosomipoikkea ­
vuuksia solu- tai organismipopulaatioissa.  
Sytokineesi:  solun jakautuminen välittömästi mitoosin jälkeen, jolloin muodostuu 
kaksi yksitumaista tytärsolua.  
Sytokineesin eston proliferaatioindeksi:  toisen jakautumisvaiheen solujen osuus 
käsitellyssä populaatiossa käsittelemättömään kontrollipopulaatioon verrattuna 
(katso kaava lisäyksessä 2).  
Sytostaasi:  solujen kasvun estäminen (katso kaava lisäyksessä 2).  
Sytotoksisuus:  solurakenteeseen kohdistuvat haitalliset vaikutukset tai toiminta, 
joka johtaa solukuolemaan.  
Genotoksinen:  yleinen nimitys kaikentyyppisille DNA- tai kromosomivaurioille, 
muun muassa katkeamiselle, adduktien uudelleenjärjestäytymiselle, mutaatioille, kromosomipoikkeavuuksille ja aneuploidialle. Kaikki genotoksiset vaikutukset eivät johda mutaatioihin tai pysyviin kromosomivaurioihin.
 
Interfaasisolut:  solut, jotka eivät ole mitoosivaiheessa.  
Kinetokori:  proteiinia sisältävä rakenne, joka rakentuu kromosomin sentromeerin 
kohdalle, johon tumasukkulat kiinnittyvät solun jakautumisen aikana ja jonka ansiosta tytärkromosomit voivat liikkua kohti tytärsolujen napoja.
 
Mikrotumat:  pienet tumat, jotka eivät ole solujen varsinaisia tumia vaan esiinty ­
vät niiden lisäksi ja jotka muodostuvat hitaasti liikkuvista kromosomifragmen ­
teista tai kokonaisista kromosomeista mitoosin tai meioosin telofaasin aikana.  
Mitoosi:  solutuman jakautuminen, joka jaotellaan yleensä profaasiin, prometafa ­
asiin, metafaasiin, anafaasiin ja telofaasiin.  
Mitoosi-indeksi:  suhdeluku, joka saadaan jakamalla metafaasissa olevien solujen 
määrä solupopulaatiossa todettujen solujen kokonaismäärällä; ilmoittaa solujen 
proliferaatioasteen kyseisessä solupopulaatiossa.  
Mutageeninen:  aiheuttaa periytyvän muutoksen geenien DNA:n emäspariraken ­
teessa tai kromosomirakenteessa (kromosomipoikkeavuudet).  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 726
 
Nondisjunktio:  häiriö, jossa kromatidiparit eivät erkaannu toisistaan ja jakaudu 
oikein kehittyviin tytärsoluihin, minkä takia tytärsolujen kromosomimäärä poik ­
keaa tavallisesta.  
Polyploidia:  solujen tai organismien kromosomien lukumäärää koskeva poikkea ­
vuus, joka koskee yksittäisen kromosomin tai kromosomien (aneuploidia) sijaan koko kromosomistoa.
 
Proliferaatioindeksi (PI):  sytotoksisuuden mittausmenetelmä, kun sytoB:tä ei 
käytetä (katso kaava lisäyksessä 2).  
Solumäärän suhteellinen lisääntyminen:  sytotoksisuuden mittausmenetelmä, kun 
sytoB:tä ei käytetä (katso kaava lisäyksessä 2).  
Populaation suhteellinen kaksinkertaistuminen:  sytotoksisuuden mittausmenetel ­
mä, kun sytoB:tä ei käytetä (katso kaava lisäyksessä 2).  
Replikaatioindeksi (RI):  altistus- ja palautumisjakson aikana päättyneiden solunja ­
kautumissyklien osuus käsitellyssä viljelmässä verrattuna käsittelemättömään 
kontrolliviljelmään (katso kaava lisäyksessä 2).  
Testikemikaali (testiaine):  aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 727
 
Lisäys 2  
Kaavat sytotoksisuuden määritystä varten  
1. Kun sytoB:tä käytetään , sytotoksisuuden arvioinnin on perustuttava sytoki ­
neesin eston proliferaatioindeksiin (SEPI) tai replikaatioindeksiin (RI) (16) (58). 
Sytokineesin eston proliferaatioindeksi ilmaisee solusyklien keskimääräistä mää ­
rää solua kohti sytoB:lle altistamisen aikana, ja sitä voidaan käyttää solujen proliferaation laskemiseen. RI ilmaisee tumien suhteellista määrää käsitellyissä viljelmissä verrattuna kontrolliviljelmiin, ja sitä voidaan käyttää sytostaasiasteen 
(sytostaasi-%) laskemiseen seuraavasti:
 
sytostaasi-% = 100 – 100{(SEPI  T – 1) ÷ (SEPI  C – 1)}  
ja: 
T = testikemikaalilla käsitelty viljelmä  
C = kantaja-ainekontrolliviljelmä  
jossa:  
SEPI ¼ ððyksitumaisten solujen määrä Þ þ ð2 Ü kaksitumaisten solujen määrä Þ þ ð3 Ü monitumaisten solujen määrä ÞÞ 
ðsolujen yhteenlaskettu määrä Þ 
Näin ollen, jos SEPI = 1 (kaikki solut ovat yksitumaisia), sytostaasi on 100 %.  
Sytostaasi = 100 – RI  
RI ¼ ððkaksitumaisten solujen määrä Þ þ ð2 Ü monitumaisten solujen määrä ÞÞ ö ðsolujen yhteenlaskettu määrä Þ T 
ððkaksitumaisten solujen määrä Þ þ ð2 Ü monitumaisten solujen määrä ÞÞ ö 
ðsolujen yhteenlaskettu määrä Þ C Ü 100  
T = käsitellyt viljelmät  
C = kontrolliviljelmät  
2. Näin ollen, jos RI = 53 %, kontrolliviljelmässä kaksitumaisiksi ja monitu ­
maisiksi soluiksi jakaantuneiden solujen määrään verrattuna vain 53 % soluista 
jakaantui käsitellyssä viljelmässä, eli sytostaasi on 47 %.  
3. Kun sytoB:tä ei käytetä , sytotoksisuus on arvioitava solumäärän suhteellisen 
lisääntymisen (SMSL) tai populaation suhteellisen kaksinkertaistumisen (PSK) perus ­
teella (58), koska molemmissa otetaan huomioon jakaantuneen solupopulaation osuus.  
SMSL ¼ ðsolumäärän lisääntyminen käsitellyissä viljelmissä  ðlopussa – alussaÞÞ 
ðsolumäärän lisääntyminen kontrolliviljelmissä  ðlopussa – alussaÞÞ Ü 100  
PSK ¼ ðpopulaatioiden kaksinkertaistumisten lukumäärä käsitellyissä viljelmissä Þ 
ðpopulaatioiden kaksinkertaistumisten lukumäärä kontrolliviljelmissä Þ Ü 100 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 728
 
jossa:  
populaation kaksinkertaistuminen = [log (solumäärä käsittelyn jälkeen ÷ alkupe ­
räinen solumäärä)] ÷ log 2  
4. Näin ollen, jos SMSL tai PSK = 53 %, sytotoksisuus/sytostaasi = 47 %.  
5. Sytotoksisuutta voidaan arvioida proliferaatioindeksin (PI) avulla laskemalla 
1 solusta (kl1), 2 solusta (kl2), 3 tai 4 solusta (kl4) ja 5–8 solusta (kl8) muo ­
dostuneiden kloonien määrä seuraavasti  
PI ¼ ðð1 Ü kl1Þ þ ð2 Ü kl2Þ þ ð3 Ü kl4Þ þ ð4 Ü kl8ÞÞ 
ðkl1 þ kl2 þ kl4 þ kl8Þ 
6. Proliferaatioindeksiä on käytetty sytotoksisuuden tärkeänä ja 
luotettavana parametrina myös ilman sytoB:tä  in situ  viljellyille solulinjoille 
(25) (26) (27) (28).  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 729
 
Lisäys 3  
Suorituskyvyn arviointiin suositeltavat vertailukemikaalit  ( 1 ) 
Luokka Kemikaali CAS-numero EC-numero  
1. Klastogeenit, jotka ovat aktiivisia ilman metabolista aktivaatiota 
Sytosiiniarabinosidi 147-94-4 205-705-9 Mitomysiini C 50-07-7 200-008-6 
2. Klastogeenit, jotka edellyttävät metabolista aktivaatiota 
Bentso(a)pyreeni 50-32-8 200-028-5 
Syklofosfamidi 50-18-0 200-015-4 
3. Aneugeenit 
Kolkisiini 64-86-8 200-598-5 Vinblastiini 143-67-9 205-606-0 
4. Negatiiviset aineet 
Di(2-etyyliheksyyli)ftalaatti 117-81-7 204-211-0 
Nalidiksiinihappo 389-08-2 206-864-7 Pyreeni 129-00-0 204-927-3 Natriumkloridi 7647-14-5 231-598-3
 
( 1 ) Vertailukemikaalien käyttöä suositellaan. Korvaavia tai täydentäviä kemikaaleja voidaan lisätä vertailukemikaalien luetteloon , jos 
niiden vaikutus on tiedossa ja ne indusoivat mikrotumia samoilla toimintamekanismeilla ja jos niiden osoitetaan olevan merkityk ­
sellisiä MNvit-menetelmällä testattavien kemikaalien osalta. Käyttötarkoituksesta riippuen perusteluna voidaan esittää myös muu n 
muassa validointitutkimus, jossa on käytetty useita eri aineita tai jossa keskitytään kapeampaan kirjoon testiaineen kemikaalil uokan 
tai tutkittavan vauriomekanismin perusteella.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 730
 
B.50.  IHOHERKISTYS: PAIKALLINEN IMUSOLMUKEMÄÄRITYSME ­
NETELMÄ: DA  
JOHDANTO  
1. Kemikaalien testausta koskevia OECD:n suuntaviivoja ja EU:n testimenetel ­
miä tarkistetaan säännöllisesti tieteellisen kehityksen, muuttuvien sääntelytar ­
peiden ja eläinten hyvinvointiin liittyvien kysymysten perusteella. Ensimmäi ­
nen, hiiren ihoherkistyksen määrittämisessä käytettävä testimenetelmä (B.42) 
eli paikallinen imusolmukemääritysmenetelmä (Local Lymph Node Assay, LLNA; OECD:n testiohje 429) on tarkistettu (1). LLNA-menetelmän vali ­
dointia koskevat yksityiskohtaiset tiedot ja siihen liittyvän työn arviointi on 
julkaistu (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) LLNA-menetelmässä lymfosyyttien 
proliferaatio määritetään radioisotoopilla leimatun tymidiinin tai jodin avulla. Siksi määritysmenetelmän käyttö on rajattua paikoissa, joissa radioaktiivisten aineiden hankkiminen, käyttö tai hävittäminen on ongelmallista. LLNA: DA 
-menetelmä (jonka on kehittänyt Daicel Chemical Industries, Ltd) on 
LLNA-menetelmän mukautus, jossa ei käytetä radioaktiivisia merkkiaineita, vaan jossa lymfosyyttien proliferaatio määritetään bioluminesenssin avulla määritettävän adenosiinitrifosfaattipitoisuuden (ATP-pitoisuuden) avulla. 
Kansainvälinen vertaisarviointityöryhmä on arvioinut LLNA: DA -testimene ­
telmän, validoinut sen ja katsonut, että sillä voidaan määrittää ihoa herkistä ­
viä ja muunlaisia kemikaaleja tietyin rajoituksin (10) (11) (12) (13). Tässä selostettu testimenetelmä on suunniteltu kemikaalien (aineiden ja seosten) 
ihoherkistyspotentiaalin arvioimiseen eläimillä. Tämän liitteen B.6 luvussa 
ja OECD:n testiohjeessa 406 käytetään marsutestejä, erityisesti marsuilla tehtävää maksimointitestiä ja Bühlerin testiä (14). Käytettäessä LLNA-menetelmää (tämän liitteen B.42 luku; OECD:n testiohje 429) ja 
sen kahta muuhun kuin radioaktiivisuuteen perustuvaa muunnosta eli LLNA: 
DA -menetelmää (tämän liitteen B.50 luku; OECD:n testiohje 442 A) ja LLNA: BrdU-ELISA -menetelmää (tämän liitteen B.51 luku; OECD:n testi ­
ohje 442 B) voidaan testeihin käytettävien eläinten määrää vähentää. Näin 
ollen ne ovat eläinten käytön osalta edistyneempiä B.6 luvussa ja OECD:n 
testiohjeessa 406 (14) tarkoitettuihin marsutesteihin verrattuna.
 
2. Kuten LLNA-menetelmässä, myös LLNA: DA -menetelmässä tutkitaan iho ­
herkistyksen induktiovaihetta ja tuotetaan annosvasteen arviointiin sopivia kvantitatiivisia tuloksia. Koska ihoa herkistäviä aineita voidaan tunnistaa 
ilman radioaktiivista DNA-merkkiainetta, työssä ei altistuta radioaktiivisuu ­
delle, eikä jätteiden hävittäminen aiheuta ongelmia. Tämä voi johtaa hiirten entistä yleisempään käyttöön ihoa herkistävien aineiden tunnistamisessa, 
millä puolestaan vähennetään entisestään marsujen käyttämistä ihoherkistys ­
potentiaalin testauksessa (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) 0.
 
MÄÄRITELMÄT  
3. Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 1.  
JOHDANTO JA RAJOITUKSET  
4. LLNA: DA -menetelmä on LLNA-menetelmän muunnos, jolla voidaan tun ­
nistaa mahdollisia ihoa herkistäviä kemikaaleja tietyin rajoituksin. Tämä ei 
välttämättä merkitse sitä, että LLNA: DA -menetelmää pitäisi käyttää kai ­
kissa tapauksissa LLNA-menetelmän tai marsutestin asemesta (B.6 menetel ­
mä; OECD:n testiohje 406) (14), vaan pikemminkin sitä, että määritysmene ­
telmä on yhtä hyvä ja sitä voidaan käyttää vaihtoehtona, jossa positiivisia ja 
negatiivisia tuloksia ei yleensä enää tarvitse varmistaa uudelleen (10) (11). 
Testilaboratorion on otettava huomioon kaikki testiaineesta saatavilla olevat  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 731
 
tiedot ennen tutkimuksen tekemistä. Tällaisia tietoja ovat muun muassa testi ­
aineen tunnistetiedot ja kemiallinen rakenne, sen fysikaaliskemialliset omi ­
naisuudet, muiden testiaineella tehtyjen  in vitro - tai in vivo  -myrkyllisyystes ­
tien tulokset sekä rakenteellisesti samankaltaisia kemikaaleja koskevat toksikologiset tiedot. Tietojen perusteella on määritettävä, voidaanko 
LLNA: DA -menetelmää käyttää kyseisen aineen testaamiseen (ottaen 
huomioon, että LLNA: DA -menetelmä ei sovellu tiettyjen kemikaa ­
lityyppien testaamiseen (katso 5 kohta)) ja mitä annosta on käytettävä.
 
5. LLNA: DA on  in vivo  -menetelmä, joten sillä ei lopeteta koe-eläinten 
käyttöä kosketusherkistyksen arvioinnissa. Sillä voidaan kuitenkin vähen ­
tää tähän tarkoitukseen käytettävien eläinten määrää marsutesteihin ver ­
rattuna (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) (14). LLNA: DA -me ­
netelmässä käytetty tapa testata kosketusherkistystä eläimillä on myös huomattavasti edistyneempi (vähemmän kipua ja kärsimystä), koska toisin 
kuin B.6 menetelmässä ja OECD:n testiohjeessa 406, LLNA: DA -me ­
netelmässä ei edellytetä tarkoituksellista ihon yliherkkyysreaktioiden tuot ­
tamista. Vaikka LLNA: DA -menetelmä onkin tietyllä tasolla edisty ­
neempi kuin B.6 menetelmä tai OECD:n testiohje 406 (14), siihen 
liittyy tiettyjä rajoituksia, joiden vuoksi voi olla tarpeen käyttää B.6 menetelmää tai OECD:n testiohjetta 406 (esimerkiksi tiettyjen metallien testaus, väärät positiiviset löydökset joidenkin ihoa ärsyttävien aineiden, 
esimerkiksi pinta-aktiivisten aineiden osalta (6) (1 ja tämän liitteen B.42 
luku) tai testiaineen liukoisuus). Määritystä häiritseviä (16) funktionaalisia ryhmiä sisältävien kemikaaliluokkien tai aineiden yhteydessä voi olla tarpeen käyttää marsutestejä (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406 
(14)). Suositellaan, että LLNA-menetelmälle asetettuja rajoituksia (1 ja 
tämän liitteen B.42 luku) sovelletaan myös LLNA: DA -menetelmään (10). LLNA: DA -menetelmä ei välttämättä sovellu ATP-pitoisuuksiin vaikuttavien, esimerkiksi ATP-inhibiittoreina toimivien aineiden tai sel ­
laisten aineiden testaukseen, jotka vaikuttavat solun sisäisen ATP:n täs ­
mälliseen määrittämiseen (esimerkiksi ATP:tä hajottavat entsyymit, solun ulkopuolinen ATP imusolmukkeessa). Tällaisia tunnettuja rajoituksia lu ­
kuun ottamatta aineet on testattava LLNA: DA -menetelmällä, elleivät 
kyseisten aineiden ominaisuudet vaikuta LLNA: DA -menetelmän tark ­
kuuteen. Myös positiivisten rajatulosten mahdollisuus on otettava huomi ­
oon, kun saadaan stimulaatioindeksiksi (SI) välillä 1,8–2,5 (katso 31–32 kohta). Tämä perustuu 44 aineen validointitietokantaan, jossa aineiden SI 
≥ 1,8 (katso 6 kohta) ja jossa LLNA: DA -menetelmällä on tunnistettu 
oikein kaikki 32 herkistystä aiheuttavaa LLNA-ainetta mutta tunnistettu väärin kolme niistä 12 muusta kuin herkistystä aiheuttavasta LLNA-aineesta, joiden SI-arvo on 1,8–2,5 (positiivinen rajatulos) (10). 
Koska samaa tulosjoukkoa on käytetty SI-arvojen määrittämiseen ja tes ­
tin ennakoivien ominaisuuksien laskemiseen, esitetyissä tuloksissa voi ­
daan yliarvioida todellisia ennakoivia ominaisuuksia.
 
TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
6. LLNA: DA -menetelmän perusperiaate on, että ihoa herkistävät aineet aihe ­
uttavat lymfosyyttien proliferaatiota imusolmukkeissa, jotka dreneeraavat tes ­
tiaineen annostelualueen. Tämä proliferaatio on suhteessa käytettyyn annok ­
seen ja allergeenin voimakkuuteen ja tarjoaa yksinkertaisen keinon ihoher ­
kistyksen mittaamiseksi kvantitatiivisella tavalla. Proliferaatio mitataan 
vertaamalla kussakin testiryhmässä tapahtuvaa keskimääräistä proliferaatiota 
pelkästään kantaja-aineella käsitellyssä kontrolliryhmässä tapahtuvaan  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 732
 
keskimääräiseen proliferaatioon. Kunkin testiryhmän keskimääräisen prolife ­
raation ja sitä vastaavan kontrolliryhmän keskimääräisen proliferaation suhde (SI) 
määritetään, ja sen on oltava yhtä suuri ta i suurempi kuin 1,8, jotta testiaine olisi 
syytä arvioida tarkemmin mahdollisesti ihoherkistystä aiheuttavaksi. Tässä mää ­
ritysmenetelmässä kuvatut menettelyt perustuvat ATP-pitoisuuden mittaamiseen 
bioluminesenssin avulla (sen tiedetään ko rreloivan elävien solujen määrää) (17), 
millä määritetään solujen proliferaation lis ääntyminen dreneeraavissa korvalehden 
imusolmukkeissa (18) (19). Bioluminesenssimenetelmässä lusiferaasientsyymi ka ­
talysoi valon muodostusta (luminesenssia) ATP:sta ja lusiferiinista. Reaktio tapah ­
tuu seuraavan kaavan mukaisesti:  
ATP + Lusiferiini  + O 2
 Oksilusiferiini  + AMP  + PP  i + CO  2 + Valo  
ATP ATP 
Luciferin lusiferiini 
O 2 O 2 
Luciferase lusiferaasi 
Oxyluciferin oksilusiferiini AMP AMP 
PP
 i PP i 
CO 2 CO 2 
Light valo  
Emittoituneen valon valovoima on suoraan verrannollinen ATP-pitoisuuteen, ja 
se mitataan luminometrillä. Lusiferiini-lusiferaasi-määritysmenetelmä on herkkä 
ATP-pitoisuuden määritysmenetelmä, jota käytetään erilaisissa käyttökohteissa 
(20).  
MÄÄRITYSMENETELMÄN KUVAUS  
Eläinlajin valinta  
7. Tähän testiin paras eläinlaji on hiiri. LLNA: DA -määritysmenetelmän vali ­
dointitutkimukset on tehty yksinomaan CBA/J-kannalla, joten sen käyttöä 
suositellaan (12) (13). Määritysmenetelmässä käytetään nuoria täysikasvuisia naarashiiriä, jotka eivät ole poikineet eivätkä ole tiineenä. Testin alussa eläinten on oltava 8–12 viikon ikäisiä, ja eläinten painoerojen on oltava 
vähäisiä eli enintään 20 prosenttia keskipainosta. Muita kantoja tai uroseläi ­
miä voidaan käyttää, jos tietoja tuotetaan riittävästi sen osoittamiseksi, että LLNA: DA -vasteessa ei esiinny merkitseviä koe-eläinkantaan tai sukupuo ­
leen liittyviä eroja.
 
Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta  
8. Hiiret on pidettävä yhteishäkeissä (21), ellei hiirien pitämiselle erillisissä häkeissä 
esitetä riittäviä tieteellisiä perusteluja. Koe-eläintilan lämpötilan on oltava 22 ± 3 celsiusastetta. Vaikka riittää, että suhteellinen kosteus on vähintään 30 prosenttia 
eikä mielellään ylitä 70:tä prosenttia muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, 
pitäisi kuitenkin pyrkiä 50–60 prosentin suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa on käytettävä keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pime ­
ää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä 
juomaveden määrää saa rajoittaa.
 
Eläinten valmistelu  
9. Eläimet valitaan satunnaistetusti, merkitään niin, että yksilöt voidaan erottaa 
toisistaan (ei kuitenkaan korvamerkeillä), ja pidetään häkeissä vähintään vii ­
den päivän ajan ennen testiaineen annostelun aloittamista, jotta ne tottuvat 
laboratorio-olosuhteisiin. Ennen käsittelyn alkua kaikki eläimet on tutkittava 
sen varmistamiseksi, ettei niillä ole havaittavia ihovaurioita.  
Annosteluliuosten valmistelu  
10. Kiinteät kemikaalit on liuotettava tai sekoitettava liuottimiin tai kantaja-aineisiin 
ja tarvittaessa laimennettava ennen niiden annostelua hiiren korvaan. Nestemäiset 
kemikaalit voidaan annostella laimentamattomana, tai ne voidaan laimentaa en ­
nen annostelua. Liukenemattomat kemikaalit, kuten lääkinnällisissä laitteissa yleisesti käytetyt kemikaalit, on uutettava erittäin voimakkaasti asianmukaiseen liuottimeen, jotta saataisiin testausta varten esiin kaikki uuttuvat ainesosat ennen 
annostelua hiirten korviin. Testiaineet on valmistettava päivittäin, paitsi jos säi ­
lyvyys on osoitettu stabiliteettitutkimuksilla.
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 733
 
Luotettavuuden tarkistus  
11. Määritysmenetelmän toimivuus osoitetaan positiivisten kontrollikemikaalien 
avulla. Herkistystesteissä käytettävän aineen vasteena on saatava aikaan riit ­
tävä ja toistettavissa oleva herkistyminen. Vasteen on oltava aineelle tyy ­
pillinen. Samanaikaisesti on käytettävä positiivista kontrollikemikaalia, koska sillä osoitetaan, että laboratoriolla on riittävä pätevyys kunkin määritysme ­
netelmän käyttöön. Sen avulla voidaan myös arvioida laboratorioidenvälistä 
ja laboratorionsisäistä uusittavuutta ja vertailtavuutta. Jotkut sääntelyviran ­
omaiset vaativat positiivisten kontrollikemikaalien käyttämistä kaikissa tutki ­
muksissa. Käyttäjien olisikin otettava yhteyttä asiasta vastaaviin viranomai ­
siin ennen LLNA: DA -määritysmenetelmän käyttöönottoa. Tämän takia 
suositellaan, että positiivista kontrollikemikaalia käytetään aina näytteiden kanssa samanaikaisesti, jotta ei tarvitsisi tehdä uusia eläinkokeita sellaisten vaatimusten täyttämiseksi, jotka aiheutuvat positiivisten kontrollikemikaalien 
käyttämisestä vain silloin tällöin (katso 12 kohta). Positiivisen kontrollike ­
mikaalin on tuotettava positiivinen LLNA: DA -vaste altistustasolla, jonka odotetaan antavan negatiiviseen kontrolliryhmään verrattuna stimulaatioin ­
deksin, joka on yhtä suuri tai suurempi kuin 1,8. Positiivisen kontrollikemi ­
kaalin annospitoisuus on valittava siten, että se ei aiheuta liian voimakasta 
ihoärsytystä tai koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja että induktio on toistettavissa mutta ei liian suuri (esimerkiksi SI > 10 on liian suuri). Suo ­
siteltavia positiivisia kontrollikemikaaleja ovat 25-prosenttinen heksyylikane ­
lialdehydi (CAS-numero 101-86-0) ja 25-prosenttinen eugenoli (CAS-numero 
97-53-0) asetonin ja oliiviöljyn seoksessa (4:1 v/v). Joissakin olosuhteissa voidaan riittävin perustein käyttää muita positiivisia kontrollikemikaaleja, jotka täyttävät edellä mainitut kriteerit.
 
12. Vaikka positiivisen kontrolliryhmän samanaikaista käyttöä suositellaan, jois ­
sakin tapauksissa positiivisen kontrollikemikaalin testaus ajoittain (enintään 
kuuden kuukauden välein) voi riittää LLNA: DA -menetelmää säännöllisesti käyttävissä laboratorioissa (eli sellaisissa, jotka käyttävät LLNA: DA -mene ­
telmää vähintään kerran kuukaudessa), joilla on aiempia positiivisen kontrol ­
likemikaalin määritystietoja, jotka osoittavat laboratorion valmiuden saada 
aikaan uusittavissa olevia ja täsmällisiä tuloksia positiivisilla kontrollikemi ­
kaaleilla. Riittävä LLNA DA -menetelmää koskeva pätevyys voidaan osoittaa tuottamalla positiivisella kontrollikemikaalilla toistuvasti samantasoisia posi ­
tiivisia tuloksia vähintään kymmenessä riippumattomassa testissä, jotka suo ­
ritetaan kohtuullisen ajanjakson (alle yhden vuoden) aikana.
 
13. Samanaikaista positiivista kontrolliryhmää olisi käytettävä aina, kun LLNA: 
DA -menettelyjä muutetaan (esimerkiksi kun koulutettu henkilökunta vaih ­
tuu, testimenetelmän materiaalit ja/tai reagenssit vaihtuvat, testimenetelmässä käytettävät laitteet vaihtuvat tai koe-eläinten alkuperä vaihtuu). Tällaiset 
muutokset on kirjattava laboratorioraportteihin. Muutosten vaikutusta aiem ­
pien määritystietojen asianmukaisuuteen on tarkasteltava, jotta voidaan päät ­
tää, onko kerättävä uusi määritystietoja positiivisen kontrollikemikaalin tu ­
losten yhdenmukaisuuden osoittamiseksi.
 
14. Tutkijoiden on otettava huomioon, että jos positiivisen kontrollikemikaalin 
tutkimusta ei suoriteta samanaikaisesti vaan vain ajoittain, negatiivisten tut ­
kimustulosten asianmukaisuus ja hyväksyttävyys voivat vaarantua, jos sa ­
manaikaista positiivista kontrollia ei testata ajoittain tehtyjen positiivisten kontrollitestien välillä. Jos esimerkiksi saadaan väärä negatiivinen tulos, kun positiivinen kontrolli ei ole ollut aina samanaikaisesti mukana, positii ­
visen kontrollikemikaalin viimeisen hyväksytyn yksittäisen tutkimuksen ja 
positiivisen kontrollikemikaalin hylätyn yksittäisen tutkimuksen tuloksen vä ­
lisenä aikana saadut testiaineen negatiiviset tulokset voivat olla kyseenalaisia. Näiden tulosten seurauksia on tarkasteltava huolellisesti päätettäessä positii ­
visten kontrollikemikaalien käyttämisestä testiaineen kanssa samanaikaisesti 
tai vain ajoittain. Olisi myös harkittava pienemmän eläinmäärän käyttämistä testiaineen kanssa samanaikaisesti tehtävää positiivista kontrolliryhmää var ­
ten, jos se on tieteellisesti perusteltua ja jos laboratorio osoittaa laboratorio ­
kohtaisten aiempien tietojen perusteella, että hiiriä voidaan käyttää vähem ­
män (22).
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 734
 
15. Vaikka positiiviset kontrollikemikaalit olisi mieluiten testattava 
kantaja-aineessa, jonka tiedetään antavan aina samanlaisen vasteen (esimer ­
kiksi asetoni:oliiviöljy, 4:1 v/v), voi joidenkin säännösten mukaan olla tar ­
peen testata aine myös muussa kuin vakiokantaja-aineessa (kliinisesti/kemi ­
allisesti relevantissa aineessa (23)). Jos positiivista kontrollikemikaalia testa ­
taan samanaikaisesti eri kantaja-aineessa kuin testiainetta, on samanaikaista 
positiivista kontrollikemikaalia varten käytettävä erillistä kantaja-ainekontrollia.
 
16. Arvioitaessa tiettyyn kemikaaliluokkaan kuuluvia tai tietyn vastetason ai ­
kaansaavia aineita voidaan myös vertailuaineita käyttää osoittamaan, että testimenetelmällä voidaan osoittaa asianmukaisesti tämäntyyppisten aineiden 
ihoherkistyspotentiaali. Vertailuaineilla olisi oltava seuraavat ominaisuudet:
 
— samanlainen rakenne ja toiminta kuin testattavalla aineryhmällä  
— tunnetut fysikaalis-kemialliset ominaisuudet  
— sopivuutta tukevia tietoja LLNA: DA -menetelmästä  
— sopivuutta tukevia tietoja muista eläinmalleista ja/tai ihmisistä.  
TESTIMENETTELY  
Koe-eläinten määrä ja annostasot  
17. Kussakin annostasoryhmässä on oltava vähintään neljä eläintä, ja testi ­
aineesta on käytettävä vähintään kolmea konsentraatiota; lisäksi käytetään 
samanaikaisesti määritettävää negatiivista kontrolliryhmää, joka käsitellään vain testiaineen kantaja-aineella, sekä positiivista kontrolliryhmää (joka mää ­
ritetään samanaikaisesti tai joka on määritetty hiljattain, laboratorion toimin ­
tatavan mukaisesti, ottaen huomioon 11–15 kohdat). Positiivisesta kontrolli ­
ryhmästä on tarvittaessa testattava useita annoksia, etenkin jos positiivista kontrollikemikaalia testataan epäsäännöllisesti. Kontrolliryhmän eläimiä on kohdeltava samalla tavoin kuin testiryhmän eläimiä, paitsi että niitä ei käsi ­
tellä testiaineella.
 
18. Annostaso ja kantaja-aine on valittava lähteissä (2) ja (24) esitettyjen suosi ­
tusten perusteella. Annostasot valitaan yleensä sopivasta konsentraatiosarjas ­
ta, esimerkiksi sarjasta 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % ja niin edelleen. Käytettävälle konsentraatiosarjalle on esitettävä asianmukai ­
set tieteelliset perustelut. Kaikki käytettävissä olevat toksikologiset tiedot 
(esimerkiksi akuutti toksisuus ja ihoärsytys) sekä rakennetta ja fysikaaliske ­
miallisia ominaisuuksia koskevat tiedot kyseisestä testiaineesta (ja/tai raken ­
teellisesti vastaavista aineista) on tarvittaessa otettava huomioon kolmen pe ­
räkkäisen konsentraation valinnassa niin, että suurin konsentraatio edustaa 
maksimialtistusta, mutta koko elimistöön kohdistuva toksisuus ja/tai liian voimakas paikallinen ihoärsytys kuitenkin vältetään (24) (25). Jos tällaisia tietoja ei ole käytettävissä, voi olla tarpeen tehdä esitesti (katso 21–24 kohta).
 
19. Kantaja-aine ei saa vaikuttaa testituloksiin tai vääristää niitä. Se on valittava 
siten, että testiaine liukenee siihen mahdollisimman helposti ja aineen kon ­
sentraatio annosteluun sopivassa liuoksessa tai suspensiossa on mahdollisim ­
man suuri. Suositeltavat kantaja-aineet ovat asetoni:oliiviöljy (4:1 v/v), N,N- dimetyyliformamidi, metyylietyyliketoni, propyleeniglykoli ja dimetyylisul ­
foksidi (6), mutta muitakin kantaja-aineita voidaan käyttää riittävin tieteelli ­
sin perustein. Joissakin tilanteissa voi olla tarpeen käyttää lisäkontrolliaineena 
kliinisesti perusteltua liuotinta tai kaupallista valmistetta, jona testiainetta markkinoidaan. Erityisesti on varmistettava, että hydrofiiliset testiaineet si ­
sällytetään sellaiseen kantaja-ainejärjestelmään, joka vettää ihon eikä valu 
heti pois, lisäämällä asianmukaisia liukenemista edistäviä aineita (esimerkiksi 
1-prosenttinen Pluronic® L92). Pelkkiä vesiliuoksia on siis syytä välttää.
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 735
 
20. Yksittäisiä hiirten imusolmukkeita prosessoimalla voidaan arvioida eläinten ­
välistä vaihtelua ja verrata tilastollisesti testiaineella ja kantaja-aineella käsi ­
teltyjen ryhmien tuloksia (katso 33 kohta). Positiivisen kontrolliryhmän hiir ­
ten määrän vähentäminen voi olla mahdollista, mutta vain siinä tapauksessa, että tietoja kerätään yksittäisistä eläimistä (22). Tietyt sääntelyviranomaiset 
vaativat, että tietoja on kerättävä yksittäisistä eläimistä. Yksittäisiä eläimiä 
koskevien tietojen säännöllisellä keräämisellä edistetään eläinten hyvinvoin ­
tia, koska siten vältetään päällekkäiset testaukset, jotka ovat tarpeen, jos sääntelyviranomaisten on tarkasteltava tietyllä tavalla (esimerkiksi eläimistä 
saatuja mittaustietoja yhdistämällä) saatuja testiainetuloksia myöhemmin 
muiden vaatimusten (esimerkiksi yksittäisiä eläimiä koskevat tiedot) perus ­
teella.
 
Testiä edeltävä kartoitus  
21. Jos ei ole tietoja, joiden perusteella päätetään suurin testattava annos (katso 
18 kohta), on LLNA: DA -menetelmän testeissä käytettävä asianmukainen 
annostaso selvitettävä ennen päätestiä. Siten saadaan apua enimmäisannoksen valintaan varsinaista LLNA: DA -tutkimusta varten, kun tietoja koko elimis ­
töön kohdistuvan toksisuuden (katso 24 kohta) ja/tai liian voimakkaan pai ­
kallisen ihoärsytyksen (katso 23 kohta) aiheuttavasta konsentraatiosta ei ole 
saatavilla. Testattavan enimmäisannoksen on vastattava sataa prosenttia nes ­
temäisen testiaineen osalta tai suurinta mahdollista konsentraatiota kiinteiden tai suspendoitujen aineiden osalta.
 
22. Kartoitustesti suoritetaan varsinaista LLNA: DA -tutkimusta vastaavissa olo ­
suhteissa, kuitenkin niin, että imusolmukkeiden proliferaatiota ei arvioida ja kussakin annosryhmässä voidaan käyttää vähemmän eläimiä. Kussakin an ­
nosryhmässä olisi hyvä käyttää yhtä tai kahta eläintä. Kaikkia hiiriä tarkkail ­
laan päivittäin koko elimistöön kohdistuvan toksisuuden tai annostelukoh ­
dassa esiintyvän paikallisen ärsytyksen kliinisten merkkien havaitsemiseksi. Eläinten paino kirjataan ennen testaamista ja ennen eläinten lopettamista (päivä 8). Kunkin hiiren molemmista korvista tutkitaan eryteeman merkit, 
ja ne pisteytetään taulukon 1 mukaisesti (25). Korvan paksuus mitataan pak ­
suusmittarilla (esimerkiksi digitaalisella mikrometrillä tai Peacock Dial -pak ­
suusmittarilla) päivänä 1 (ennen annosta), päivänä 3 (noin 48 tunnin kuluttua ensimmäisestä annoksesta), päivänä 7 (24 tuntia ennen lopettamista) ja päi ­
vänä 8. Päivänä 8 korvan paksuus voidaan määrittää myös mittaamalla kor ­
van lävistämiseen tarvittava massa sen jälkeen, kun eläimet on lopetettu humaanisti. Paikallinen ärsytys on erittäin voimakas, jos eryteemapisteytyk ­
sen arvo ≥ 3 ja/tai korvan paksuuntuminen ≥ 25 prosenttia minä tahansa 
mittauspäivänä (26) (27). Suurin varsinaiseen LLNA: DA -tutkimukseen valittava annos on kartoitusta varten määritetyn konsentraatiosarjan (katso 18 kohta) suurin annos, joka ei enää aiheuta koko elimistöön kohdistuvaa 
toksisuutta ja/tai liian voimakasta paikallista ihoärsytystä.
 
Taulukko 1  
Eryteemapisteytys  
Havainto Pisteet  
Ei eryteemaa 0 
Hyvin lievä eryteema (tuskin havaittava) 1 Selkeästi erottuva eryteema 2
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 736
 
Havainto Pisteet  
Keskivakava–vakava eryteema 3 
Vakava eryteema (voimakas punoitus)–karsta, joka estää eryteeman pistey ­
tyksen 4 
23. Paitsi korvien paksuuden tilastollisesti merkittävää yli 25 prosentin kasvua 
(26) (27), myös tilastollisesti merkittävää käsiteltyjen hiirten korvien paksuu ­
den lisääntymistä kontrollihiiriin verrattuna on käytetty ärsyttävien aineiden tunnistamiseksi LLNA-menetelmässä (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Ti ­
lastollisesti merkittävää paksuuntumista voi esiintyä silloinkin, kun korvan 
paksuuntuminen on alle 25 prosenttia, mutta sen ei katsota liittyvän spesifi ­
sesti erittäin voimakkaaseen ärsytykseen (30) (31) (32) (33) (34).
 
24. Seuraavat kliiniset havainnot voivat kokonaisvaltaisessa arvioinnissa olla 
osoituksena koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta (35) ja voivat 
näin ollen olla osoituksena suurimmasta annostasosta, jota varsinaisessa 
LLNA. DA -menetelmässä voidaan käyttää: muutokset hermoston toimin ­
nassa (esimerkiksi karvojen jäykistyminen, ataksia, vapina ja kouristukset); muutokset käyttäytymisessä (esimerkiksi aggressiivisuus, muutokset turkin 
hoidossa, aktiivisuustason huomattava muuttuminen); muutokset hengityk ­
sessä (hengityksen säännöllisyyden ja syvyyden muutokset, kuten hengen ­
ahdistus, hengen haukkominen ja rahina) sekä muutokset ravinnon ja veden kulutuksessa. Arvioinnissa on huomioitava myös letargian ja/tai passiivisuu ­
den merkit, vähäistä tai hetkittäistä kipua suuremman kivun ja kärsimyksen 
mahdolliset kliiniset merkit tai eläimen painon yli viiden prosentin laskemi ­
nen päivästä 1 päivään 8 sekä kuolleisuus. Kuolevat eläimet tai eläimet, jotka osoittavat selviä merkkejä voimakkaasta kivusta ja kärsimyksestä, on lope ­
tettava humaanisti (36).
 
Varsinaisen tutkimuksen aikataulu  
25. Määritysmenetelmän aikataulu on seuraava:  
— Päivä 1:  Määritetään ja kirjataan kunkin koe-eläimen paino ja tehdään 
mahdollisia kliinisiä havaintoja. Kunkin korvan takaosaan annostellaan 1-prosenttista natriumlauryylisulfaattivesiliuosta (NLS) NLS-liuokseen 
upotetulla siveltimellä niin että kunkin korvan takaosa peittyy neljällä 
tai viidellä sivellyksellä. Yhden tunnin kuluttua NLS-käsittelystä kunkin korvan takaosaan annostellaan 25 μl testiaineen, kantaja-aineen tai posi ­
tiivisen kontrollikemikaalin (samanaikaisen tai hiljattain tehdyn, labora ­
torion toimintatavan mukaisesti, ottaen huomioon 11–15 kohdat) sopivaa 
laimennosta.
 
— Päivät 2, 3 ja 7:  Toistetaan päivänä 1 suoritettu 1-prosenttisella 
NLS-vesiliuoksella tehty alustava käsittely ja testiaineen annostelu.  
— Päivät 4, 5 ja 6:  Ei käsittelyä.  
— Päivä 8:  Kirjataan kunkin koe-eläimen paino ja tehdään mahdollisia 
kliinisiä havaintoja. Noin 24–30 tunnin kuluttua päivänä 7 tehdyn an ­
nostelun aloittamisesta eläimet lopetetaan humaanisti. Hiiren kummasta ­
kin korvasta leikataan irti dreneeraavat korvalehden imusolmukkeet, ja kunkin eläimen imusolmukkeet upotetaan fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS). Imusolmukkeiden tunnistukseen ja poistamiseen 
liittyvät tiedot ja kaaviot esitetään lähteessä (22). Paikallista ihovastetta 
voidaan seurata varsinaisessa tutkimuksessa edelleen sisällyttämällä tut ­
kimussuunnitelmaan täydentäviä parametreja, kuten korvan eryteeman pisteytys tai korvan paksuutta koskevat mittaustulokset (saadaan joko 
paksuusmittarilla tai ruumiinavauksen yhteydessä tehtävillä korvan lävis ­
tämiseen tarvittavan massan mittauksilla).
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 737
 
Solususpensioiden valmistus  
26. Kunkin hiiren imusolmukeparien soluista valmistetaan yksisolususpensio 
asettamalla imusolmukkeet kahden objektilasin väliin ja painamalla niitä 
kevyesti imusolmukkeiden murskaamiseksi. Tämän jälkeen varmistetaan, että kudos on levinnyt objektilaseille ohuesti, ja objektilasit irrotetaan toisis ­
taan varovasti. Molemmilla objektilaseilla oleva kudos suspendoidaan 
PBS-liuokseen niin, että kumpaakin objektilasia pidetään kallistettuna petri ­
maljan yläpuolella ja huuhdellaan PBS-liuoksella samalla, kun kudosta ra ­
aputetaan objektilasista soluraaputtimella. Negatiivisen kontrolliryhmän eläin ­
ten imusolmukkeet ovat pieniä, joten vaihe on suoritettava huolellisesti 
SI-arvoihin mahdollisesti vaikuttavien artefaktojen välttämiseksi. Molemmat 
objektilasit on huuhdeltava yhteensä 1 ml:lla PBS-liuosta. Imusolmukeparien soluista petrimaljaan valmistettu suspensio homogenoidaan kevyesti solura ­
aputtimella. Tämän jälkeen imusolmukeparien soluista valmistetusta suspen ­
siosta otetaan 20 μl:n mittausnäyte mikropipetillä niin, ettei näytteeseen tule 
mukaan silmämääräisesti havaittavaa kalvoa. Suspensio sekoitetaan 1,98 ml:aan PBS-liuosta, jolloin saadaan 2 ml:n näyte. Tämän jälkeen valmiste ­
taan toinen 2 ml:n näyte samalla menettelyllä niin, että kustakin eläimestä 
saadaan kaksi näytettä.
 
Solujen proliferaation määritys (lymfosyyttien ATP-pitoisuuden mittaa ­
minen)  
27. Imusolmukkeiden ATP-pitoisuuden kasvua mitataan lusiferiini/lusiferaasi- 
menetelmällä käyttämällä ATP-määrityskittiä, jolla mitataan bioluminesenssia suhteellisina valoyksikköinä (Relative Luminescence Unit, RLU). Määritys tehdään aikana, joka ulottuu imusolmukkeiden eläimestä irrottamisesta 
ATP-pitoisuuden mittaamiseen. Sen on oltava kunkin eläimen osalta sama 
noin 30 minuutin tarkkuudella, sillä ATP-pitoisuuden katsotaan laskevan vähitellen sen jälkeen, kun eläin on kuollut (12). Näin ollen menettely, joka käynnistyy korvalehden imusolmukkeiden irrottamisesta ja päättyy 
ATP-mittaukseen, olisi saatava päätökseen 20 minuutin sisällä etukäteen 
määritettyyn määräaikaan mennessä, joka on sama kaikille eläimille. ATP:n luminesenssi on mitattava kustakin 2 ml:n näytteestä. Kullakin eläimellä tehdään siis yhteensä kaksi ATP-mittausta. Tämän jälkeen määritetään ATP:n 
keskimääräinen luminesenssi, jota käytetään myöhemmin tehtävissä laskel ­
missa (katso 30 kohta).
 
HAVAINNOT  
Kliiniset havainnot  
28. Kustakin hiirestä on päivittäin havainnoitava huolellisesti mahdolliset kliiniset 
merkit joko annostelualueen paikallisesta ärsytyksestä tai koko elimistöön koh ­
distuvasta toksisuudesta. Kaikki havainnot kirjataan järjestelmällisesti erikseen 
kustakin hiirestä. Seurantasuunnitelmissa on esitettävä myös perusteet, joiden 
avulla voidaan nopeasti tunnistaa hiiret, joissa havaitaan merkkejä koko elimis ­
töön kohdistuvasta toksisuudesta, liian voimakkaasta paikallisesta ihoärsytyk ­
sestä tai ihosyövyttävyydestä ja jotka on lopetettava (36).  
Ruumiinpainot  
29. Kuten 25 kohdassa todetaan, kukin eläin on punnittava erikseen testin alussa 
ja aikataulun mukaisesti humaanin lopettamisen yhteydessä.  
TULOSTEN LASKEMINEN  
30. Kunkin käsittelyryhmän tulokset ilmoitetaan keskimääräisenä SI:nä. Sl-arvo 
saadaan jakamalla testiaineryhmän ja positiivisen kontrolliryhmän hiirikoh ­
taisista RLU-arvoista laskettu keskiarvo liuotin/kantaja-ainekontrollin vastaa ­
valla tuloksella. Kantaja-ainekontrolliryhmien SI:n keskiarvo on 1.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 738
 
31. Tulos katsotaan positiiviseksi, kun SI ≥ 1,8 (10). Rajatuloksen (SI-arvo 
1,8–2,5) positiivisuuden määrittämiseksi voidaan kuitenkin tarkastella myös 
annos-vastesuhteen voimakkuutta, tilastollista merkitsevyyttä sekä liuotti ­
men/kantaja-aineen ja positiivisen kontrollikemikaalin vasteiden yhdenmukai ­
suutta (2) (3) (37).  
32. Jos positiivisen rajavasteen SI on 1,8–2,5, käyttäjät voivat tulosten positii ­
visuuden vahvistamiseksi tarkastella SI-arvojen lisäksi myös muita tietoja, kuten annos-vastesuhdetta, merkkejä koko elimistöön kohdistuvasta toksisuu ­
desta tai liian voimakkaasta ärsytyksestä ja tarvittaessa tilastollista merkittä ­
vyyttä (10). Lisäksi on syytä ottaa huomioon testiaineen ominaisuudet, mu ­
kaan luettuina mahdolliset rakenteelliset yhtäläisyydet tunnettuihin ihoherkis ­
tystä aiheuttaviin aineisiin, sen hiirelle mahdollisesti aiheuttama erittäin voi ­
makas ihoärsytys ja havaitun annosvasteen luonne. Näitä ja muita huomion ­
arvoisia seikkoja käsitellään yksityiskohtaisesti lähteessä (4).
 
33. Kun tietoja kerätään erikseen kustakin hiirestä, tietojen perusteella voidaan 
analysoida tilastollisesti mahdollista annosvasteen olemassaoloa ja sen voi ­
makkuutta. Tilastoanalyysissä voidaan muun muassa arvioida annos-vastesuhdetta ja tehdä asianmukaisesti mukautettuja vertailuja testiryh ­
millä (esimerkiksi pareittain annoksen saaneen ryhmän vertailu samaan ai ­
kaan tehtyyn liuotin-/kantaja-ainekontrolliryhmään). Tilastollisina analyy ­
seina voidaan käyttää esimerkiksi lineaarista regressiota tai Williamsin testiä, joilla arvioidaan annos-vasteen suuntauksia, sekä Dunnettin testiä, jolla pa ­
reja vertaillaan toisiinsa. Tutkijan on otettava asianmukaisen tilastoanalyy ­
simenetelmän valinnassa huomioon varianssien mahdolliset erot ja muut 
vastaavat ongelmat, jotka saattavat edellyttää määritystulosten muuntamista tai non-parametrista tilastoanalyysia. Joka tapauksessa tutkijan on mahdolli ­
sesti tehtävä SI-laskelmia ja tilastoanalyyseja sekä käyttäen tiettyjä määritys ­
pisteitä koskevia tietoja (niin sanotut käyrän ulkopuolella olevat vasteet) että 
ilman niitä.
 
MITTAUSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
Mittaustulokset  
34. Mittaustulokset on esitettävä taulukkona, josta käyvät ilmi eläinkohtaiset 
RLU-arvot, ryhmän eläinkohtaisten RLU-arvojen keskiarvo, siihen liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta tai keskiarvon keskivirhe) sekä kunkin 
annosryhmän keskimääräinen SI samanaikaiseen liuotin-/kantaja-ainekontrol ­
liryhmään verrattuna.
 
Testiraportti  
35. Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:  
Testi- ja kontrollikemikaalit  
— tunnistetiedot (esimerkiksi CAS- ja EC-numerot, jos tiedossa; alkuperä, 
puhtaus, tunnetut epäpuhtaudet, eränumero),  
— fysikaalinen olomuoto ja fysikaaliskemialliset ominaisuudet (esimerkiksi 
haihtuvuus, stabiilisuus, liukoisuus),  
— jos kyseessä on seos, sen koostumus ja ainesosien suhteelliset osuudet.  
Liuotin/kantaja-aine  
— tunnistetiedot (puhtaus, tarvittaessa konsentraatio, käytetty tilavuus),  
— perustelut kantaja-aineen valinnalle.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 739
 
Koe-eläimet  
— CBA-hiirten alkuperä,  
— eläinten mikrobiologinen tila, jos se on tiedossa,  
— eläinten määrä ja ikä,  
— eläinten alkuperä, koe-eläintilat, ruokavalio ja niin edelleen.  
Testiolosuhteet  
— ATP-määrityskitin alkuperä, eränumero ja valmistajan 
laadunvarmistus-/laadunvalvontatiedot,  
— tiedot testiaineen valmistelusta ja annostelusta,  
— perustelut annostasojen valinnalle (mukaan luettuina kartoitustestin tulok ­
set, jos sellainen on tehty),  
— käytetyt kantaja- ja testiaineiden konsentraatiot ja annostellun testiaineen 
kokonaismäärä,  
— tiedot ravinnon ja veden laadusta (mukaan luettuina ruokavalion tyyp ­
pi/alkuperä, veden alkuperä),  
— tiedot käsittely- ja näytteenottoaikatauluista,  
— toksisuuden määritysmenetelmät,  
— tulosten positiivisuuden tai negatiivisuuden arviointiperusteet,  
— tiedot tutkimussuunnitelmasta poikkeamisesta ja selvitys siitä, miten 
poikkeaminen vaikuttaa tutkimuksen suunnitteluun ja tuloksiin.  
Luotettavuuden tarkistus  
— yhteenveto viimeisimmän luotettavuustarkistuksen tuloksista, mukaan lu ­
ettuina tiedot käytetystä testiaineesta, konsentraatiosta ja kantaja-aineesta,  
— testauslaboratorion samanaikaisesti ja/tai aiemmin tehtyjen positiivisten ja 
samanaikaisesti tehtyjen negatiivisten (liuotin/kantaja-aine) kontrollien tu ­
lokset,  
— jos mukana ei ollut samanaikaista positiivista kontrollia, viimeisimmän 
yksittäisen positiivisen kontrollin päivämäärä ja laboratorioraportti sekä yksityiskohtainen selvitys laboratorion aiemmista positiivista kontrollia koskevista tiedoista, joiden perusteella positiivista kontrollia ei tarvitse 
tehdä joka kerta.
 
Tulokset  
— kunkin hiiren paino annostelun alussa ja aikataulun mukaisen lopettami ­
sen yhteydessä sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen ja asiaan liit ­
tyviin muuttujiin liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta tai keski ­
arvon keskivirhe),  
— toksisuuden ilmeneminen ajan funktiona ja toksisuuden merkit, mukaan 
luettuna annostelualueen ihoärsytys, jos sellaista esiintyy, erikseen kulle ­
kin eläinyksilölle,  
— eläinten lopettamisen ja ATP-mittauksen ajankohta kunkin eläimen 
osalta,  
— taulukko yksittäisten hiirten RLU-arvoista ja SI-arvoista kunkin käsitellyn 
annosryhmän osalta,  
— kunkin käsittelyryhmän hiirikohtaisen RLU-arvon keskimääräinen virhe ­
termi ja asiaan liittyviin muuttujiin liittyvä virhetermi (esimerkiksi kes ­
kihajonta ja keskiarvon keskivirhe) sekä käyrän ulkopuolella olevien 
vasteiden analyysin tulokset kullekin käsittelyryhmälle,  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 740
 
— laskettu SI ja asianmukaisesti määritetty vaihteluväli, jossa otetaan huo ­
mioon eläintenvälinen vaihtelu sekä testiaineella että kontrolliaineella 
käsitellyissä ryhmissä,  
— annos-vastesuhde,  
— tarvittaessa tilastoanalyysit.  
Tulosten pohdinta  
— tulosten lyhyt kommentointi, annos-vasteanalyysi ja tarvittaessa tilastoa ­
nalyysit sekä johtopäätös siitä, voidaanko testiainetta pitää ihoherkistystä 
aiheuttavana.  
LÄHDELUETTELO  
(1) OECD (2010).  Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay , Test Guideline 
No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines
 
(2) Chamberlain, M. ja Basketter, D. A. (1996). The local lymph node assay: 
status of validation.  Food Chem. Toxicol . 34, s. 999–1002.  
(3) Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Kimber, I. ja Loveless, S. E. (1996). The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin 
sensitisation tests.  Food Chem. Toxicol . 34, s. 985–997.  
(4) Basketter, D. A., Gerberick, G. F. ja Kimber, I. (1998). Strategies for 
identifying false positive responses in predictive sensitisation tests.  Food 
Chem. Toxicol.  36, s. 327–333.  
(5) Van Och, F. M. M., Slob, W., De Jong, W. H., Vandebriel, R. J. ja Van 
Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: 
employment of a regression method that includes determination of uncer ­
tainty margins.  Toxicol . 146, s. 49–59.  
(6) ICCVAM (1999). The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH-julkaisunumero 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Saatavilla 
osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llna ­
rep.pdf
 
(7) Dean, J. H., Twerdok, L. E., Tice, R. R., Sailstad, D. M., Hattan, D. G., 
Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific 
peer review panel.  Reg. Toxicol. Pharmacol  34, s. 258–273.
 
(8) Haneke, K. E., Tice, R. R., Carson, B. L., Margolin, B. H. ja Stokes, W. S. 
(2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol  34, a. 274–286.
 
(9) Sailstad, D. M., Hattan, D., Hill, R. N. ja Stokes, W. S. (2001). ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process.  Reg. Toxicol. Pharmacol  34, s. 249–257.  
(10) ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradio ­
active local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd, based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH-julkaisunumero 10-7551A/B. Research Triangle Park, NC: National 
Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 741
 
(11) ICCVAM (2009). Independent Scientific Peer Review Panel Report: Upda ­
ted validation status of new versions and applications of the murine local 
lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf.
 
(12) Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. ja Ito, M. (2008). Characteriza ­
tion and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint.  J. Pharmacol. Toxicol. Meth.  
58, s. 1–10.
 
(13) Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, 
T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, 
T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. ja Yuasa, A. (2008). Interlaboratory validation of the modified murine local lymph node assay 
based on adenosine triphosphate measurement.  J. Pharmacol. Toxicol. 
Meth.  58, s. 11–26.
 
(14) OECD (1992).  Skin Sensitisation , Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoittessa http://www.oecd.org/env/testguidelines
 
(15) Kreiling, R., Hollnagel, H. M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M. S., Griem, 
P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. ja Wendel, A. (2008). 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT).  Food Chem. Toxicol . 46, s. 1896–1904.
 
(16) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J. C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. ja Mehling, A. 
(2009). Application of a weight of evidence approach to assessing discor ­
dant sensitisation datasets: implications for REACH.  Reg. Toxicol. Pharma ­
col 55, s. 90–96.  
(17) Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J. ja Fletcher J. (1993). The use of 
ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.  J. 
Immunol. Meth . 160, s. 81–88.  
(18) Ishizaka, A., Tono-oka, T. ja Matsumoto, S. (1984). Evaluation of the 
proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP.  J. Immunol. Meth . 72, s. 127–132.
 
(19) Dexter, S. J., Cámara, M., Davies, M. ja Shakesheff, K. M. (2003). Deve ­
lopment of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacte ­
rial cell number from a mixed population.  Biomat.  24, s. 27–34.  
(20) Lundin A. (2000). Use of firefly luciferase in ATP-related assays of bio ­
mass, enzymes, and metabolites.  Meth. Enzymol . 305, s. 346–370.  
(21) ILAR (1996). Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7. painos. Washington, DC: 
National Academies Press.  
(22) ICCVAM (2009). Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay. NIH-julkaisunumero 09-7357. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Saatavilla osoit ­
teessa http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNA ­
PerfStds.pdf
 
(23) McGarry, H. F. (2007). The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH.  Toxicol . 238, s. 71–89.  
(24) Kimber, I., Dearman, R. J., Scholes, E. W. ja Basketter, D. A. (1994). The 
local lymph node assay: developments and applications.  Toxicol . 93, s. 
13–31.  
(25) OECD (2002).  Acute Dermal Irritation/Corrosion , Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa 
http://www.oecd.org/env/testguidelines  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 742
 
(26) Reeder, M. K., Broomhead, Y. L., DiDonato, L. ja DeGeorge, G. L. (2007). 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances.  Toxicologist  96, s. 235.  
(27) ICCVAM (2009). Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Backg ­
round Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of 
Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf.  
(28) Hayes, B. B., Gerber, P. C., Griffey, S. S. ja Meade, B. J. (1998). Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice.  Drug. Chem. Toxicol.  21, s. 195–206.
 
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H. C., Ruzicka, T., Ahr, 
H. J., Lehmann, P. ja Vohr, V. W. (1998). An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions.  To­
xicol. Appl. Pharmacol . 153, s. 83–94.
 
(30) Woolhiser, M. R., Hayes, B. B. ja Meade, B. J. (1998). A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals.  Toxicol. Meth.  8, s. 245–256.  
(31) Hayes, B. B. ja Meade, B. J. (1999). Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods.  Drug. Chem. Toxicol . 22, s. 491–506.  
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A. O., van Love ­
ren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. ja Vohr, H. W. (2005). A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol . 212, s. 
60–68.
 
(33) Vohr, H. W. ja Ahr, H. J. (2005). The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol.  79, s. 721–728.  
(34) Patterson, R. M., Noga, E. ja Germolec, D. (2007). Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract.  Environ. Health Perspect . 115, s. 
1023–1028.  
(35) ICCVAM (2009). Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acute ­
tox/Tox_workshop.htm
 
(36) OECD (2000).  Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines
 
(37) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R. J., Gerberick, G. F., Ryan, C. A., 
Basketter, D. A., Lea, L., House, R. V., Ladies, G. S., Loveless, S. E. ja 
Hastings, K. L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of 
topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise.  J. Toxicol. Environ. Health  53, s. 563–79.
 
(38) OECD (2005).  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , En­
vironment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 743
 
Lisäys 1  
MÄÄRITELMÄT  
Tarkkuus:  Testimenetelmän tulosten ja hyväksyttyjen vertailuarvojen välinen 
ero. Tarkkuus on testimenetelmän suorituskyvyn mitta ja yksi merkityksellisyy ­
den osatekijöistä. Tarkkuutta ja vastaavuutta (konkordanssia) käytetään usein 
toisiaan korvaavasti tarkoittamaan testimenetelmällä saatujen oikeiden tulosten osuutta (38).
 
Vertailuaine:  Herkistävä tai muu kuin herkistävä aine, jota käytetään testiaineen 
vertailustandardina. Vertailuaineella on oltava seuraavat ominaisuudet: i) luotet ­
tava alkuperä, joka pysyy samana, ii) samanlainen rakenne ja toiminta kuin 
testiaineryhmällä, iii) tunnetut fysikaaliskemialliset ominaisuudet, iv) todisteet 
tunnetuista vaikutuksista ja v) tunnettu voimakkuus tavoitellulla vasteen vaihte ­
luvälillä.  
Väärä negatiivinen:  Aine on testimenetelmässä määritetty väärin perustein nega ­
tiiviseksi tai inaktiiviseksi, vaikka se itse asiassa on positiivinen tai aktiivinen.  
Väärä positiivinen:  Aine on testimenetelmässä määritetty väärin perustein positii ­
viseksi tai aktiiviseksi, vaikka se itse asiassa on negatiivinen tai inaktiivinen.  
Vaarallisuus:  Mahdollisuus kielteiseen terveys- tai ympäristövaikutukseen. Kiel ­
teinen vaikutus edellyttää altistumista vähintään tietyllä tasolla.  
Laboratorioidenvälinen uusittavuus:  Se, missä määrin eri (pätevät) laboratoriot voi ­
vat saada aikaan laadullisesti ja määrällisesti samanlaisia tuloksia käyttämällä samoja tutkimussuunnitelmia ja testaamalla samoja testiaineita. Laboratorioidenvälinen uu ­
sittavuus määritetään esivalidointi- ja validointimenettelyissä, ja se osoittaa, missä 
määrin testi voidaan onnistuneesti toteuttaa eri laboratorioissa (38).
 
Laboratorionsisäinen uusittavuus:  Se, missä määrin pätevä laboratoriohenkilöstö 
voi (kyseisessä laboratoriossa) saada onnistuneesti aikaan samat tulokset käyttä ­
mällä tiettyä tutkimussuunnitelmaa eri ajankohtina (38).  
Käyrän ulkopuolella oleva vaste:  Käyrän ulkopuolella olevalla vasteella tarkoi ­
tetaan havaintoa, joka poikkeaa merkittävästi muista populaation sattumanvarais ­
ten näytteiden arvoista.  
Laadunvarmistus:  Hallintomenettely, jossa testausta suorittavista henkilöistä riip ­
pumattomat henkilöt arvioivat laboratorion testausstandardien, vaatimusten ja kirjanpitomenettelyjen noudattamista ja tiedonsiirron tarkkuutta.
 
Luotettavuus:  Laajuus, jolla testimenetelmä on uusittavissa samassa laboratori ­
ossa tai eri laboratorioissa pidemmällä aikavälillä käytettäessä samaa tutkimus ­
suunnitelmaa. Luotettavuus arvioidaan laskemalla laboratorionsisäinen ja labora ­
torioidenvälinen uusittavuus (38).  
Ihoherkistys:  Immunologinen prosessi, joka aiheutuu herkän yksilön paikallisesta 
altistamisesta tietylle kemialliselle allergeenille, joka aiheuttaa iholla immuu ­
nivasteen, joka voi johtaa kosketusherkistykseen.  
Stimulaatioindeksi (SI):  Testiaineen ihoärsytyspotentiaalin arvioimiseksi laskettu 
arvo, jolla esitetään käsiteltyjen ryhmien soluproliferaation ja samanaikaisesti kantaja-aineella käsitellyn kontrolliryhmän soluproliferaation välinen suhde.
 
Testiaine (testikemikaali):  Aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 744
 
B.51.  IHOHERKISTYS: PAIKALLINEN IMUSOLMUKEMÄÄRITYSME ­
NETELMÄ: BRDU-ELISA  
JOHDANTO  
1. Kemikaalien testausta koskevia OECD:n suuntaviivoja ja EU:n testimenetelmiä 
tarkistetaan säännöllisesti tieteellisen kehityksen, muuttuvien sääntelytarpeiden ja eläinten hyvinvointiin liittyvien kysymysten perusteella. Ensimmäinen, hiir ­
ten ihoherkistyksen määrittämisessä käytettävä testimenetelmä (B.42) eli pai ­
kallinen imusolmukemääritysmenetelmä (Local Lymph Node Assay, LLNA; OECD:n testiohje 429) on tarkistettu (1 ja tämän liitteen B.42 luku). LLNA-menetelmän validointia koskevat yksityiskohtaiset tiedot ja yleiskatsaus 
siihen liittyneestä työstä on julkaistu (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). 
LLNA-menetelmässä lymfosyyttien proliferaatio määritetään radioisotoopilla leimatun tymidiinin tai jodin avulla. Siksi määritysmenetelmän käyttö on rajat ­
tua paikoissa, joissa radioaktiivisten aineiden hankkiminen, käyttö tai hävittä ­
minen on ongelmallista. LLNA: BrdU-ELISA (entsyymivälitteinen immunosor ­
benttimääritysmenetelmä) on LLNA-testimenetelmän muunnos, jossa ei käytetä radioisotooppeja ja jossa lymfosyyttien proliferaatio määritetään ELISA-testijärjestelmässä käyttämällä ei-radioaktiivisesti merkattua 5-bromi- 
2-deoksiuridiinia (BrdU) (CAS-numero 59-14-3). Kansainvälinen riippumaton 
tieteellinen vertaisarviointityöryhmä on arvioinut LLNA: BrdU-ELISA -testi ­
menetelmä, validoinut sen ja katsonut, että sillä voidaan määrittää ihoa herkis ­
täviä ja muita kuin herkistäviä kemikaaleja tietyin rajoituksin (10) (11) (12). 
Tämä testimenetelmä on suunniteltu kemikaalien (aineiden ja seosten) ihoher ­
kistyspotentiaalin arvioimiseen eläimillä. Tämän liitteen B.6 luvussa ja OECD:n testiohjeessa 406 käytetään marsutestejä, erityisesti marsuilla tehtävää maksi ­
mointitestiä ja Bühlerin testiä (13). LLNA-menetelmällä (tämän liitteen B.42 
luku; OECD:n testiohje 429) ja sen kahdella muuhun kuin radioaktiivisuuteen 
perustuvalla mukautuksella eli LLNA: BrdU-ELISA -menetelmällä (tämän liit ­
teen B.51 luku; OECD:n testiohje 442 B) ja LLNA: DA -menetelmällä (tämän liitteen B.50 luku; OECD:n testiohje 442 A) voidaan kaikilla vähentää 
testeihin käytettävien eläinten määrää. Näin ollen ne ovat eläinten käytön 
osalta edistyneempiä kuin B.6 luvussa ja OECD:n testiohjeessa 406 (13) tarkoitetut marsutestit.
 
2. Kuten LLNA-menetelmässä, myös LLNA: BrdU-ELISA -menetelmässä tut ­
kitaan ihoherkistyksen induktiovaihetta ja tuotetaan annosvasteen arviointiin sopivia kvantitatiivisia tuloksia. Koska ihoa herkistäviä aineita voidaan tun ­
nistaa ilman radioaktiivista DNA-merkkiainetta, työssä ei altistuta radio ­
aktiivisuudelle, eikä jätteiden hävittäminen aiheuta ongelmia. Tämä voi johtaa hiirten entistä yleisempään käyttöön ihoa herkistävien aineiden tun ­
nistamisessa, millä puolestaan vähennetään entisestään marsujen käyttämistä 
ihoherkistyspotentiaalin testauksessa (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) (13).
 
MÄÄRITELMÄT  
3. Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 1.  
JOHDANTO JA RAJOITUKSET  
4. LLNA: BrdU-ELISA -menetelmä on mukautettu LLNA-menetelmä mahdol ­
listen ihoa herkistävien kemikaalien tunnistamiseksi tietyin rajoituksin. Tämä ei välttämättä merkitse sitä, että LLNA: BrdU-ELISA -menetelmää 
pitäisi käyttää kaikissa tapauksissa LLNA-menetelmän tai marsutestin ase ­
mesta (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) (13), vaan pikemminkin sitä, että määritysmenetelmä on yhtä hyvä ja sitä voidaan käyttää vaihtoehtona, jossa positiivisia ja negatiivisia tuloksia ei yleensä enää tarvitse varmistaa 
uudelleen (10) (11). Testilaboratorion on otettava huomioon kaikki testi ­
aineesta saatavilla olevat tiedot ennen tutkimuksen tekemistä. Tällaisia
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 745
 
tietoja ovat muun muassa testiaineen tunnistetiedot ja kemiallinen rakenne, 
sen fysikaaliskemialliset ominaisuudet, muiden aineella tehtyjen  in vitro - tai 
in vivo  -myrkyllisyystestien tulokset sekä rakenteellisesti samankaltaisten 
kemikaalien toksikologiset tiedot. Tietojen perusteella on määritettävä, voi ­
daanko LLNA: BrdU-ELISA -menetelmää käyttää kyseisen aineen testaa ­
miseen (ottaen huomioon, että LLNA: BrdU-ELISA -menetelmä ei sovellu 
tiettyjen kemikaalityyppien testaamiseen (katso 5 kohta)) ja mitä annosta on käytettävä.
 
5. LLNA: BrdU-ELISA on  in vivo  -menetelmä, joten sen käyttö ei merkitse 
koe-eläinten käytön loppumista kosketusherkistyksen arvioinnissa. Sillä voi ­
daan kuitenkin vähentää tähän tarkoitukseen käytettävien eläinten määrää marsutesteihin verrattuna (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) (13). LLNA: BrdU-ELISA -menetelmässä käytetty tapa testata kosketusherkis ­
tystä eläimillä on myös huomattavasti edistyneempi, koska toisin kuin B.6 
menetelmässä ja OECD:n testiohjeessa 406, LLNA: BrdU-ELISA -menetel ­
mässä ei edellytetä tarkoituksellista ihon yliherkkyysreaktioiden tuottamista. LLNA: BrdU-ELISA -menetelmä ei myöskään edellytä adjuvantin käyttöä, 
toisin kuin marsuilla tehtävä maksimointitesti (tämän liitteen B.6 luku, 13). 
Näin ollen LLNA: BrdU-ELISA -menetelmällä vähennetään eläinten kärsi ­
mystä. Vaikka LLNA: BrdU-ELISA -menetelmä onkin tietyllä tasolla edis ­
tyneempi kuin B.6 menetelmä tai OECD:n testiohje 406 (13), siihen liittyy 
tiettyjä rajoituksia, joiden vuoksi voi olla tarpeen käyttää B.6 menetelmää 
tai OECD:n testiohjetta 406 (esimerkiksi tiettyjen metallien testaus, väärät positiiviset löydökset joidenkin ihoa ärsyttävien aineiden, esimerkiksi pinta-aktiivisten aineiden osalta (6) (1 ja tämän liitteen B.42 luku) tai testi ­
aineen liukoisuus). Häiritseviä (15) funktionaalisia ryhmiä sisältävien kemi ­
kaaliluokkien tai aineiden yhteydessä voi olla tarpeen käyttää marsutestejä (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406 (13)). LLNA-menetelmälle asetet ­
tuja rajoituksia (1 ja tämän liitteen B.42 luku) on sovellettava myös LLNA: 
BrdU-ELISA -menetelmään (10). Tällaisia tunnistettuja rajoituksia lukuun 
ottamatta mitä tahansa kemikaaleja pitäisi voida testata LLNA: BrdU-ELISA -menetelmällä, elleivät kyseisten kemikaalien ominaisuudet vaikuta LLNA: BrdU-ELISA -menetelmän tarkkuuteen. Myös positiivisten 
rajatulosten mahdollisuus on otettava huomioon, kun saadaan 
stimulaatioindeksiksi (SI) 1,6–1,9 (katso 31–32 kohta). Tämä perustuu 43 aineen validointitietokantaan, jossa aineiden SI ≥ 1,6 (katso 6 kohta) ja 
jossa LLNA: BrdU-ELISA -menetelmällä on tunnistettu oikein kaikki 32 
herkistystä aiheuttavaa LLNA-ainetta mutta tunnistettu väärin kaksi niistä 
11 muusta kuin herkistystä aiheuttavasta LLNA-aineesta, joiden SI-arvo on 1,6–1,9 (positiivinen rajatulos) (10). Koska samaa tulosjoukkoa on käytetty SI-arvojen määrittämiseen ja testin ennakoivien ominaisuuksien 
laskemiseen, esitetyissä tuloksissa voidaan yliarvioida todellisia ennakoivia 
ominaisuuksia.
 
TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
6. LLNA: BrdU-ELISA -menetelmän perusperiaate on, että ihoa herkistävät 
aineet aiheuttavat lymfosyyttien proliferaatiota imusolmukkeissa, jotka dre ­
neeraavat testiaineen annostelualueen. Tämä proliferaatio on suhteessa käy ­
tettyyn annokseen ja allergeenin voimakkuuteen ja tarjoaa yksinkertaisen keinon ihoherkistyksen mittaamiseksi kvantitatiivisella tavalla. Proliferaatio 
mitataan vertaamalla kussakin testiryhmässä tapahtuvaa keskimääräistä sol ­
uproliferaatiota kantaja-aineella käsitellyssä kontrolliryhmässä tapahtuvaan keskimääräiseen soluproliferaatioon. Kunkin testiryhmän keskimääräisen soluproliferaation ja sitä vastaavan kontrolliryhmän keskimääräisen solupro ­
liferaation suhde (SI) määritetään, ja sen on oltava yhtä suuri tai suurempi 
kuin 1,6, jotta testiaineen mahdollista ihoherkistyspotentiaalia olisi syytä
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 746
 
arvioida tarkemmin. Tässä kuvatut menetelmät perustuvat korvalehden dre ­
neeraavien imusolmukkeiden solujen lisääntymisen määrittämiseen 
BrdU-pitoisuuden mittaamisen avulla. BrdU on tymidiinin analogi ja inkor ­
poroituu lisääntyvien solujen DNA:han samalla tavalla. BrdU:n inkorporoi ­
tumista mitataan ELISA-menetelmällä, jossa käytetään BrdU-spesifistä 
vasta-ainetta, joka leimataan myös peroksidaasilla. Kun lisätään 
peroksidaasi-entsyymin substraatti, peroksidaasi reagoi substraatin kanssa ja muodostaa värillisen tuotteen, jonka määrä määritetään mittaamalla ab ­
sorbanssi tietyllä aallonpituudella käyttämällä kuoppalevyjen lukulaitetta.
 
MÄÄRITYSMENETELMÄN KUVAUS  
Eläinlajin valinta  
7. Tähän testiin paras eläinlaji on hiiri. LLNA: BrdU-ELISA -määritysmene ­
telmän validointitutkimukset on tehty yksinomaan CBA/JN-kannalla, joten 
sen käyttöä suositellaan (10) (12). Määritysmenetelmässä käytetään nuoria täysikasvuisia naarashiiriä, jotka eivät ole poikineet eivätkä ole tiineenä. Testin alussa eläinten on oltava 8–12 viikon ikäisiä, ja eläinten painoerojen 
on oltava vähäisiä eli enintään 20 prosenttia keskipainosta. Muita kantoja tai 
uroseläimiä voidaan käyttää, jos tietoja tuotetaan riittävästi sen osoittami ­
seksi, että LLNA: BrdU-ELISA -vasteessa ei esiinny merkitseviä koe-eläinkantaan tai sukupuoleen liittyviä eroja.
 
Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta  
8. Hiiret on pidettävä yhteishäkeissä (16), ellei hiirien pitämiselle erillisissä 
häkeissä esitetä riittäviä tieteellisiä perusteluja. Koe-eläintilan lämpötilan 
on oltava 22 ± 3 celsiusastetta. Vaikka riittää, että suhteellinen kosteus 
on vähintään 30 prosenttia eikä mielellään ylitä 70 prosenttia muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, on kuitenkin pyrittävä 50–60 prosentin suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa on käytettävä keinovalaistusta 12 tun ­
nin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa 
voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa.
 
Eläinten valmistelu  
9. Eläimet valitaan satunnaistetusti, merkitään niin, että yksilöt voidaan erottaa 
toisistaan (ei kuitenkaan korvamerkeillä), ja pidetään häkeissä vähintään viiden päivän ajan ennen testiaineen annostelun aloittamista, jotta ne tottu ­
vat laboratorio-olosuhteisiin. Ennen käsittelyn alkua kaikki eläimet on tut ­
kittava sen varmistamiseksi, ettei niillä ole havaittavia ihovaurioita.
 
Annosteluliuosten valmistelu  
10. Kiinteät kemikaalit on liuotettava tai sekoitettava liuottimiin tai 
kantaja-aineisiin ja tarvittaessa laimennettava ennen niiden annostelua hiiren korvaan. Nestemäiset kemikaalit voidaan annostella laimentamattomana tai 
ennen annostelua laimennettuina. Liukenemattomia kemikaaleja, kuten lää ­
kinnällisissä laitteissa yleisesti käytettyjä kemikaaleja, on pyrittävä uutta ­
maan erittäin voimakkaasti asianmukaiseen liuottimeen, jotta kaikki uuttuvat ainesosat tulisivat esiin ennen annostelua hiirten korviin. Testiaineet on 
valmistettava päivittäin, paitsi jos säilyvyys on osoitettu stabiliteettitutki ­
muksilla.
 
Luotettavuuden tarkistus  
11. Positiivisia kontrollikemikaaleja käytetään, jotta voidaan osoittaa määritys ­
menetelmän toimivuus. Herkistystesteissä käytettävän aineen vasteena on menetelmässä saatava aikaan riittävä ja toistettavissa oleva herkistyminen, jonka vastetaso on aineelle tyypillinen. Positiivisen kontrollikemikaalin 
käyttöä testissä samanaikaisesti testikemikaalin kanssa suositellaan, koska 
sillä osoitetaan, että laboratoriolla on riittävä pätevyys kuhunkin määritys ­
menetelmään, ja sen avulla voidaan arvioida laboratorionsisäistä ja labora ­
torioidenvälistä uusittavuutta ja vertailtavuutta. Myös tietyt sääntelyviran ­
omaiset vaativat positiivisten kontrollikemikaalien käyttämistä kaikissa tut ­
kimuksissa. Käyttäjien olisikin otettava yhteyttä asiasta vastaaviin
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 747
 
viranomaisiin ennen LLNA: BrdU-ELISA -määritysmenetelmän käyttöön ­
ottoa. Tämän takia suositellaan positiivisen kontrollikemikaalin käyttöä sa ­
manaikaisesti rutiininomaisesti, jotta ei tarvitsisi uusia eläinkokeita sellaisten vaatimusten täyttämiseksi, jotka johtuvat siitä, että positiivista kontrollike ­
mikaalia käytetään vain ajoittain (katso 12 kohta). Positiivisen kontrollike ­
mikaalin on tuotettava positiivinen LLNA: BrdU-ELISA -vaste altistusta ­
solla, jonka odotetaan antavan stimulaatioindeksin, joka on yhtä suuri tai suurempi kuin 1,6 verrattuna negatiiviseen kontrolliryhmään. Positiivisen kontrollikemikaalin annostaso on valittava siten, että se ei aiheuta liian 
voimakasta ihoärsytystä tai koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja 
että induktio on toistettavissa mutta ei liian suuri (esimerkiksi SI > 14 on liian suuri). Suositeltavia positiivisia kontrollikemikaaleja ovat 25-prosent ­
tinen heksyylikanelialdehydi (CAS-numero 101-86-0) ja 25-prosenttinen 
eugenoli (CAS-numero 97-53-0) asetonin ja oliiviöljyn seoksessa (4:1 v/v). 
Joissakin olosuhteissa voidaan riittävin perustein käyttää muita positiivisia kontrollikemikaaleja, jotka täyttävät edellä mainitut kriteerit.
 
12. Vaikka samanaikaisen positiivisen kontrolliryhmän käyttöä suositellaan, 
joissakin tapauksissa positiivisen kontrollikemikaalin ajoittainen testaus (enintään kuuden kuukauden välein) voi riittää LLNA: BrdU-ELISA -me ­
netelmää säännöllisesti käyttävissä laboratorioissa (eli sellaisissa, jotka käyt ­
tävät LLNA: BrdU-ELISA -menetelmää vähintään kerran kuukaudessa) ja 
joilla on aiempia positiivisen kontrollikemikaalin määritystietoja, jotka osoittavat laboratorion valmiuden saada aikaan uusittavissa olevia ja täsmäl ­
lisiä tuloksia positiivisilla kontrollikemikaaleilla. Riittävä LLNA: 
BrdU-ELISA -menetelmää koskeva pätevyys voidaan osoittaa tuottamalla 
positiivisella kontrollikemikaalilla toistuvasti samantasoisia positiivisia tu ­
loksia vähintään kymmenessä riippumattomassa testissä, jotka suoritetaan kohtuullisen ajanjakson kuluessa (alle yhden vuoden aikana).
 
13. Samanaikaista positiivista kontrollikemikaalia on käytettävä aina, kun 
LLNA: BrdU-ELISA -menettelyä muutetaan (esimerkiksi kun koulutettu henkilökunta vaihtuu, testimenetelmän materiaalit ja/tai reagenssit vaihtuvat, 
testimenetelmässä käytettävät laitteet vaihtuvat tai koe-eläinten alkuperä 
vaihtuu), ja tällaiset muutokset on kirjattava laboratorioraportteihin. Muu ­
tosten vaikutusta aiemmin saatujen aiempien määritystietojen asianmukai ­
suuteen on tarkasteltava, jotta voidaan päättää, onko kerättävä uusi mää ­
ritystietokanta positiivisen kontrollikemikaalin tulosten yhdenmukaisuuden 
osoittamiseksi.
 
14. Tutkijoiden on otettava huomioon, että jos positiivisen kontrollikemikaalin 
tutkimusta ei suoriteta samanaikaisesti vaan vain ajoittain, positiivisen kont ­
rollikemikaalin kunkin säännöllisen tutkimuksen välillä ilman vastaavaa 
positiivista kontrollikemikaalia aikaan saatujen negatiivisten tutkimustulos ­
ten asianmukaisuus ja hyväksyttävyys voivat vaarantua. Jos esimerkiksi saadaan väärä negatiivinen tulos, kun positiivinen kontrolli ei ole ollut 
aina samanaikaisesti mukana, positiivisen kontrollikemikaalin viimeisen hy ­
väksytyn yksittäisen tutkimuksen ja positiivisen kontrollikemikaalin hylätyn yksittäisen tutkimuksen tuloksen välisenä aikana saadut testiaineen negatii ­
viset tulokset voivat olla kyseenalaisia. Näiden tulosten seurauksia on tar ­
kasteltava huolellisesti päätettäessä positiivisten kontrollikemikaalien käyt ­
tämisestä aina testiaineen rinnalla tai vain ajoittain Lisäksi on huomioitava, että testiaineen rinnalla käytettävää positiivista kontrolliryhmää varten olisi 
käytettävä vähemmän eläimiä, jos se on tieteellisesti perusteltua ja jos la ­
boratorio osoittaa laboratoriokohtaisten aiempien tietojen perusteella, että hiiriä voidaan käyttää vähemmän (17).
 
15. Vaikka positiiviset kontrollikemikaalit on testattava kantaja-aineessa, jonka 
tiedetään antavan aina samanlaisen vasteen (esimerkiksi asetoni:oliiviöljy, 
4:1 v/v), joidenkin säännösten mukaan testaus muussa kuin standardikantaja-aineessa (kliinisesti/kemiallisesti relevantissa aineessa) saat ­
taa myös olla tarpeen (18). Jos samanaikaista positiivista kontrollikemikaa ­
lia testataan eri kantaja-aineessa kuin testiainetta, sitä varten on käytettävä 
erillistä kantaja-aineella käsiteltyä kontrollia.
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 748
 
16. Arvioitaessa tiettyyn kemikaaliluokkaan kuuluvia tai tietyn vastetason ai ­
kaansaavia testiaineita vertailuaineilla voidaan myös osoittaa, että testime ­
netelmä toimii asianmukaisesti, kun halutaan osoittaa tämäntyyppisten testi ­
aineiden ihoherkistyspotentiaali. Vertailuaineilla olisi silloin oltava seuraavat ominaisuudet:
 
— samanlainen rakenne ja toiminta kuin testattavalla aineryhmällä  
— tunnetut fysikaalis-kemialliset ominaisuudet  
— sopivuutta tukevia tietoja LLNA: DA -menetelmästä  
— sopivuutta tukevia tietoja muista eläinmalleista ja/tai ihmisistä.  
TESTIMENETTELY  
Koe-eläinten määrä ja annostasot  
17. Kussakin annostasoryhmässä on oltava vähintään neljä eläintä, ja testi ­
aineesta on käytettävä vähintään kolmea konsentraatiota. Lisäksi käytetään negatiivista kontrolliryhmää, joka käsitellään vain testiaineen kantaja-aineella, sekä positiivista kontrolliryhmää (joka määritetään saman ­
aikaisesti tai joka on määritetty hiljattain, laboratorion toimintatavan mukai ­
sesti, ottaen huomioon 11–15 kohdat). Positiivisesta kontrolliryhmästä on tarvittaessa testattava useita annoksia, etenkin jos positiivista kontrollikemi ­
kaalia testataan epäsäännöllisesti. Kontrolliryhmän eläimiä on kohdeltava 
samalla tavoin kuin testiryhmän eläimiä, paitsi että niitä ei käsitellä testi ­
aineella.
 
18. Annostason ja kantaja-aineen valinnan on perustuttava lähteissä 2 ja 19 
esitettyihin suosituksiin. Peräkkäiset annostasot valitaan yleensä sopivasta 
konsentraatiosarjasta, esimerkiksi sarjasta 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % ja niin edelleen. Käytettävälle konsentraatiosarjalle on esitettävä asianmukaiset tieteelliset perustelut. Kaikki käytettävissä olevat 
toksikologiset tiedot (esimerkiksi akuutti toksisuus ja ihoärsytys) ja raken ­
teelliset ja fysikaaliskemialliset tiedot kyseisestä testiaineesta (ja/tai raken ­
teellisesti vastaavista aineista) on tarvittaessa otettava huomioon kolmen peräkkäisen konsentraation valinnassa niin, että suurin konsentraatio edustaa 
maksimialtistusta, mutta koko elimistöön kohdistuva toksisuus ja/tai liian 
voimakas paikallinen ihoärsytys kuitenkin vältetään (19) (20 ja tämän liit ­
teen B.4 luku). Jos tällaisia tietoja ei ole käytettävissä, testiä edeltävä kar ­
toitus voi olla tarpeen (katso 21–24 kohta).
 
19. Kantaja-aine ei saa vaikuttaa testituloksiin tai vääristää niitä. Se on valittava 
siten, että testiaine liukenee siihen mahdollisimman helposti ja aineen kon ­
sentraatio annosteluun sopivassa liuoksessa tai suspensiossa on mahdolli ­
simman suuri. Suositeltavat kantaja-aineet ovat asetoni:oliiviöljy (4:1 v/v),  
N,N-dimetyyliformamidi, metyylietyyliketoni, propyleeniglykoli ja dimetyy ­
lisulfoksidi (6), mutta muitakin kantaja-aineita voidaan käyttää riittävin tie ­
teellisin perustein. Joissakin tilanteissa voi olla tarpeen käyttää lisäkontrolli ­
aineena kliinisesti perusteltua liuotinta taikka kaupallista valmistetta, jona 
testiainetta markkinoidaan. Erityisesti on varmistettava, että hydrofiiliset testiaineet sisällytetään sellaiseen kantaja-ainejärjestelmään, joka vettää ihon eikä valu heti pois, lisäämällä asianmukaisia liukenemista edistäviä 
aineita (esimerkiksi 1-prosenttinen Pluronic® L92). Pelkkiä vesiliuoksia 
on siis syytä välttää.
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 749
 
20. Prosessoimalla yksittäisten hiirten imusolmukkeita voidaan arvioida eläin ­
tenvälistä vaihtelua ja vertailla tilastollisesti testiaineen ja kantaja-aineella 
käsitellyn ryhmän tuloksia (katso 33 kohta). Positiivisen kontrolliryhmän hiirten määrän vähentäminen voi olla mahdollista, mutta vain siinä tapauk ­
sessa, että tietoja kerätään yksittäisistä eläimistä (17). Tietyt sääntelyviran ­
omaiset vaativat, että tietoja on kerättävä yksittäisistä eläimistä. Yksittäisiä 
eläimiä koskevien tietojen keräämisellä edistetään eläinten hyvinvointia, koska siten vältetään päällekkäiset testaukset, jotka ovat tarpeen, jos sään ­
telyviranomaisten on tarkasteltava tietyllä tavalla (esimerkiksi eläimistä saa ­
tuja mittaustietoja yhdistämällä) saatuja testiainetuloksia myöhemmin mui ­
den vaatimusten (esimerkiksi yksittäisiä eläimiä koskevat tiedot) perusteella.
 
Testiä edeltävä kartoitus  
21. Jos suurimman testattavan annoksen määrittämiseksi ei ole saatavilla tietoja 
(katso 18 kohta), on testiä ennen kartoitettava LLNA: BrdU-ELISA -mene ­
telmän testeissä käytettävä asianmukainen annostaso. Siten autetaan enim ­
mäisannoksen valinnassa varsinaista LLNA: BrdU-ELISA -tutkimusta var ­
ten, kun tietoja koko elimistöön kohdistuvan toksisuuden (katso 24 kohta) 
ja/tai liian voimakkaan paikallisen ihoärsytyksen (katso 23 kohta) aiheutta ­
vasta konsentraatiosta ei ole saatavilla. Testattavan enimmäisannoksen tason 
on vastattava sadan prosentin pitoisuutta nestemäisen testiaineen osalta tai 
suurinta mahdollista konsentraatiota kiinteiden tai suspendoitujen aineiden osalta.
 
22. Testiä edeltävä kartoitus suoritetaan varsinaista LLNA: BrdU-ELISA -tut ­
kimusta vastaavissa olosuhteissa, kuitenkin niin, että imusolmukkeiden sol ­
uproliferaatiota ei arvioida, ja kussakin annosryhmässä voidaan käyttää vä ­
hemmän eläimiä. Kussakin annosryhmässä olisi hyvä käyttää yhtä tai kahta 
eläintä. Kaikkia hiiriä tarkkaillaan päivittäin koko elimistöön kohdistuvan toksisuuden tai annostelukohdassa esiintyvän paikallisen ärsytyksen kliinis ­
ten merkkien havaitsemiseksi. Eläinten paino kirjataan ennen testaamista ja 
ennen eläinten lopettamista (päivä 6). Kunkin hiiren molemmista korvista 
tutkitaan eryteeman merkit, ja ne pisteytetään taulukon 1 mukaisesti (20 ja tämän liitteen B.4 luku). Korvan paksuus mitataan paksuusmittarilla (esi ­
merkiksi digitaalisella mikrometrillä tai Peacock Dial -paksuusmittarilla) 
päivänä 1 (ennen annosta), päivänä 3 (noin 48 tunnin kuluttua ensimmäi ­
sestä annoksesta) ja päivänä 6. Päivänä 6 korvan paksuus voidaan myös määrittää mittaamalla korvan lävistämiseen tarvittava massa sen jälkeen, kun eläimet on lopetettu humaanisti. Paikallinen ärsytys on erittäin voima ­
kas, jos eryteemapisteytyksen arvo ≥ 3 ja/tai korvan paksuuntuminen ≥ 25 
prosenttia minä tahansa mittauspäivänä (21) (22). Suurin varsinaiseen LLNA: BrdU-ELISA -tutkimukseen valittava annos on kartoitusta varten määritetyn konsentraatiosarjan (katso 18 kohta) suurin annos, joka ei enää 
aiheuta koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja/tai liian voimakasta pai ­
kallista ihoärsytystä.
 
Taulukko 1  
Eryteemapisteytys  
Havainto Pisteet  
Ei eryteemaa 0 
Hyvin lievä eryteema (tuskin havaittava) 1 Selkeästi erottuva eryteema 2
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 750
 
Havainto Pisteet  
Keskivakava–vakava eryteema 3 
Vakava eryteema (voimakas punoitus)–karsta, joka estää ery ­
teeman pisteytyksen 4 
23. Sen lisäksi, että käytetään korvien paksuuden lisääntymistä yli 25 prosenttia 
(21) (22), myös tilastollisesti merkittävää käsiteltyjen hiirten korvan pak ­
suuden kasvua kontrollihiiriin verrattuna on käytetty ärsyttävien aineiden määrittämiseksi LLNA-menetelmässä (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). 
Vaikka tilastollisesti merkittävää kasvua voi esiintyä silloinkin, kun korva 
paksuuntuu alle 25 prosenttia, sen ei katsota liittyvän erityisesti hyvin voi ­
makkaaseen ärsytykseen (25) (26) (27) (28) (29).
 
24. Seuraavat kliiniset havainnot voivat yhdennetyn arvioinnin osana olla osoi ­
tuksena koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta (30) ja voivat näin ollen olla osoituksena suurimmasta annostasosta, jota varsinaisessa LLNA: BrdU-ELISA -menetelmässä voidaan käyttää: muutokset hermoston toimin ­
nassa (esimerkiksi karvojen jäykistyminen, ataksia, vapina ja kouristukset); 
muutokset käyttäytymisessä (esimerkiksi aggressiivisuus, muutokset turkin hoidossa, aktiivisuustason huomattava muuttuminen); muutokset hengityk ­
sessä (hengityksen säännöllisyyden ja syvyyden muutokset, kuten hengen ­
ahdistus, hengen haukkominen ja rahina) sekä muutokset ravinnon ja veden 
kulutuksessa. Arvioinnissa on huomioitava myös letargian ja/tai passiivisuu ­
den merkit, vähäistä tai hetkittäistä kipua suuremman kivun ja kärsimyksen mahdolliset kliiniset merkit tai eläimen painon yli viiden prosentin laske ­
minen päivästä 1 päivään 6 sekä kuolleisuus. Kuolevat eläimet tai eläimet, 
jotka osoittavat selviä merkkejä voimakkaasta kivusta ja kärsimyksestä, on lopetettava humaanisti (31).
 
Varsinaisen tutkimuksen testiaikataulu  
25. Määritysmenetelmän aikataulu on seuraava:  
— Päivä 1:  Määritetään ja kirjataan kunkin koe-eläimen paino ja tehdään 
mahdollisia kliinisiä havaintoja. Kunkin korvan takaosaan annostellaan 25 μl testiaineen, kantaja-aineen tai positiivisen kontrollikemikaalin (rin ­
nakkaisen tai hiljattain tehdyn, laboratorion toimintatavan mukaisesti, 
ottaen huomioon 11–15 kohdat) sopivaa laimennosta.
 
— Päivät 2 ja 3:  Toistetaan päivänä 1 toteutettu annostelu.  
— Päivä 4:  Ei käsittelyä.  
— Päivä 5:  Ruiskutetaan 0,5 ml (5 mg/hiiri) BrdU-liuosta (10 mg/ml) 
intraperitoneaalisesti.  
— Päivä 6:  Kirjataan kunkin koe-eläimen paino ja tehdään mahdollisia klii ­
nisiä havaintoja. Noin 24 tunnin (24 h) kuluttua BrdU-injektiosta eläimet 
lopetetaan humaanisti. Hiiren kummastakin korvasta leikataan irti drenee ­
raavat korvalehden imusolmukkeet, ja kunkin eläimen imusolmukkeet prosessoidaan erikseen fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS). Imu ­
solmukkeiden tunnistukseen ja irrotukseen liittyvät tiedot ja kaaviot esi ­
tetään lähteessä (17). Paikallista ihovastetta voidaan seurata varsinaisessa 
tutkimuksessa tarkemmin niin, että tutkimussuunnitelmaan sisällytetään täydentäviä parametreja, kuten korvan eryteeman pisteytys tai korvan paksuutta koskevat mittaustulokset (saadaan joko paksuusmittarilla tai 
ruumiinavauksen yhteydessä tehtävillä korvan lävistämiseen tarvittavan 
massan mittauksilla).
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 751
 
Solususpensioiden valmistus  
26. Kunkin hiiren imusolmukeparien soluista valmistetaan suspensio, jossa 
kaikki solut ovat irrallaan muista (yksisolususpensio), hajottamalla kudos 
mekaanisesti painamalla se varovaisesti ruostumattoman terässeulan läpi (silmäkoko 200 μm) tai käyttämällä muuta yksisolususpension valmistami ­
seksi hyväksyttyä tekniikkaa (esimerkiksi käyttämällä kertakäyttöistä muo ­
vista survinta imusolmukkeiden murskaamiseen ja painamalla ne sitten ny ­
lonseulan läpi (silmäkoko 70)). Yksisolususpension valmistustapa on tässä määritysmenetelmässä erittäin tärkeä, ja menettely on opeteltava etukäteen. Negatiivisen kontrolliryhmän eläinten imusolmukkeet ovat pieniä, joten 
vaihe on suoritettava huolellisesti SI-arvoihin mahdollisesti vaikuttavien 
artefaktojen välttämiseksi. Kussakin menettelyssä yksisolususpension tila ­
vuus on saatettava määritetyn optimoidun tilavuuden mukaiseksi (noin 15 ml). Optimoitu tilavuus perustuu negatiivisen kontrolliryhmän keskimääräi ­
seen absorbanssiin välillä 0,1–0,2.
 
Solujen proliferaation määritys (lymfosyyttien DNA:n BrdU-pitoisuuden 
mittaaminen)  
27. BrdU mitataan ELISA-menetelmällä käyttämällä kaupallisesti saatavilla ole ­
vaa välineistöä (esimerkiksi Roche Applied Science, Mannheim, Saksa, kataloginumero 11 647 229 001). Tasapohjaisen kuoppalevyn kuoppiin 
lisätään 100 μl imusolmukesolususpensiota kolmoismäärityksinä. Solusus ­
pension fiksaation ja denaturaation jälkeen jokaiseen kuoppaan lisätään anti-BrdU-vasta-aine ja sen annetaan reagoida. Tämän jälkeen anti-BrdU- vasta-aine poistetaan huuhtelemalla ja lisätään reaktion substraatti. Vapau ­
tuvan kromogeenin absorbanssi mitataan 370 nm:ssä ja 492 nm:n vertailu ­
aallonpituudella. Määritysmenetelmän testiolosuhteet on kaikissa yhteyk ­
sissä optimoitava (katso 26 kohta).
 
HAVAINNOT  
Kliiniset havainnot  
28. Kustakin hiirestä on päivittäin havainnoitava huolellisesti mahdolliset klii ­
niset merkit joko annostelualueen paikallisesta ärsytyksestä tai koko eli ­
mistöön kohdistuvasta toksisuudesta. Kaikki havainnot kirjataan järjestel ­
mällisesti erikseen kustakin hiirestä. Seurantasuunnitelmissa on esitettävä myös perusteet, joiden avulla voidaan nopeasti tunnistaa hiiret, joissa havaitaan merkkejä koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta, liian 
voimakkaasta paikallisesta ihoärsytyksestä tai ihosyövyttävyydestä ja jotka 
on lopetettava (31).
 
Ruumiinpainot  
29. Kuten 25 kohdassa todetaan, kukin eläin on punnittava erikseen testin 
alussa ja aikataulun mukaisesti humaanin lopettamisen yhteydessä.  
TULOSTEN LASKEMINEN  
30. Kunkin käsittelyryhmän tulokset ilmoitetaan keskimääräisenä SI:nä. Sl-arvo 
saadaan jakamalla testiaineryhmän ja positiivisen kontrolliryhmän hiirikoh ­
taisista BrdU-merkki-indekseistä laskettu keskiarvo liuottimen/kantaja-ai ­
neen kontrolliryhmän vastaavalla tuloksella. Kantaja-ainekontrollien SI:n 
keskiarvo on 1.  
BrdU-merkki-indeksi määritellään seuraavasti:  
BrdU-merkki-indeksi = (ABS  em – ABS blank  em ) – (ABS  ref – ABS blank  ref ) 
jossa: em = emissioaallonpituus; ja ref = referenssiaallonpituus.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 752
 
31. Tulos katsotaan positiiviseksi, kun SI ≥ 1,6 (10). Rajatuloksen (SI-arvo 
1,6–1,9) positiivisuuden määrittämiseksi voidaan kuitenkin tarkastella 
myös annosvasteen voimakkuutta, tilastollista merkitsevyyttä sekä liuotti ­
men/kantaja-aineen ja positiivisen kontrollikemikaalin vasteiden yhdenmu ­
kaisuutta (3) (6) (32).  
32. Jos positiivisen rajavasteen SI on 1,6–1,9, käyttäjät voivat tulosten positii ­
visuuden vahvistamiseksi tarkastella SI-arvojen lisäksi myös muita tietoja, 
kuten annosvasteen voimakkuutta, merkkejä koko elimistöön kohdistuvasta 
toksisuudesta tai erittäin voimakkaasta ärsytyksestä ja tarvittaessa tilastol ­
lista merkittävyyttä (10). Lisäksi on syytä ottaa huomioon testiaineen eri ­
laiset ominaisuudet, mukaan luettuina mahdolliset rakenteelliset yhtäläisyy ­
det tunnettuihin ihoherkistystä aiheuttaviin aineisiin, sen hiirelle mahdolli ­
sesti aiheuttama erittäin voimakas ihoärsytys ja havaitun annosvasteen luon ­
ne. Näitä ja muita näkökohtia käsitellään yksityiskohtaisesti lähteessä (4).  
33. Kun tiedot kerätään erikseen kustakin hiirestä, voidaan niiden perusteella 
analysoida tilastollisesti mahdollista annosvasteen voimakkuutta ja sen ta ­
soa. Tilastoarvioinnissa voidaan myös arvioida annosvasteen voimakkuutta 
ja tehdä asianmukaisesti mukautettuja vertailuja testiryhmillä (esimerkiksi pareittain annoksen saaneen ryhmän vertailu samanaikaisesti tehtyyn liuotin-/kantaja-ainekontrolliryhmään). Tilastollisina analyyseina voidaan 
käyttää esimerkiksi lineaarista regressiota tai Williamin testiä, joilla arvioi ­
daan annos-vastekehitystä, sekä Dunnettin testiä, jolla pareja vertaillaan toisiinsa. Tutkijan on otettava asianmukaisen tilastoanalyysimenetelmän va ­
linnassa huomioon varianssien mahdolliset erot ja muut vastaavat ongelmat, 
jotka saattavat edellyttää määritystulosten muuntamista tai non-parametrista 
tilastoanalyysia. Tutkijan on kuitenkin mahdollisesti tehtävä SI-laskelmia ja tilastoanalyyseja sekä käyttäen tiettyjä määrityspisteitä koskevia tietoja (niin 
sanotut käyrän ulkopuolella olevat vasteet) että ilman niitä.
 
MITTAUSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
Mittaustulokset  
34. Tulokset on esitettävä taulukkona, josta käyvät ilmi eläinkohtaiset 
BrdU-merkki-indeksin arvot, ryhmän eläinkohtaisten BrdU-merkki-indek ­
sien keskiarvo, siihen liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta tai keski ­
arvon keskivirhe) sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen SI samanaikai ­
seen liuotin-/kantaja-ainekontrolliryhmään verrattuna.  
Loppuraportti  
35. Loppuraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:  
Testi- ja kontrollikemikaalit  
— tunnistetiedot (esimerkiksi CAS- ja EC-numerot, jos tiedossa; alkuperä, 
puhtaus, tunnetut epäpuhtaudet, eränumero),  
— fysikaalinen olomuoto ja fysikaaliskemialliset ominaisuudet (esimerkiksi 
haihtuvuus, stabiilisuus, liukoisuus),  
— jos kyseessä on seos, sen koostumus ja ainesosien suhteelliset osuudet.  
Liuotin/kantaja-aine  
— tunnistetiedot (puhtaus, tarvittaessa konsentraatio, käytetty tilavuus),  
— perustelut kantaja-aineen valinnalle.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 753
 
Koe-eläimet  
— CBA-hiirten alkuperä,  
— eläinten mikrobiologinen tila, jos se on tiedossa,  
— eläinten määrä ja ikä,  
— eläinten alkuperä, koe-eläintilat, ruokavalio ja niin edelleen.  
Testiolosuhteet  
— ELISA-välineistön alkuperä, erän numero ja valmistajan 
laadunvarmistus-/laadunvalvontatiedot (vasta-aineen herkkyys ja spesifi ­
syys sekä osoitusraja),  
— tiedot testiaineen valmistelusta ja annostelusta,  
— perustelut annostasojen valinnalle (mukaan luettuina ennen testiä mah ­
dollisesti suoritetun kartoituksen tulokset),  
— käytetyt kantaja- ja testiaineiden konsentraatiot ja annostellun testiaineen 
kokonaismäärä,  
— tiedot ravinnon ja veden laadusta (mukaan luettuina ruokavalion tyyp ­
pi/alkuperä, veden alkuperä),  
— tiedot käsittely- ja näytteenottoaikatauluista,  
— toksisuuden mittausmenetelmät,  
— tutkimusten positiivisuuden tai negatiivisuuden arviointiperusteet,  
— tiedot menettelystä poikkeamisesta ja selvitys siitä, miten poikkeaminen 
vaikuttaa tutkimussuunnitelmaan ja tuloksiin.  
Luotettavuuden tarkistus  
— yhteenveto viimeisimmän luotettavuustarkistuksen tuloksista, mukaan 
luettuina tiedot käytetystä testiaineesta, konsentraatiosta ja 
kantaja-aineesta,  
— testauslaboratorion samaan aikaan ja/tai aiemmin tehtyjen positiivisten ja 
samanaikaisten negatiivisten (liuotin/kantaja-aine) kontrollien tulokset,  
— jos testissä ei ollut samanaikaista positiivista kontrollia, viimeisimmän 
positiivisen kontrollin päivämäärä ja laboratorioraportti sekä yksityis ­
kohtainen selvitys laboratorion aiemmista positiivista kontrollia koske ­
vista tiedoista, joiden perusteella samanaikaista positiivista kontrollia ei 
tarvitsisi käyttää.  
Tulokset  
— kunkin hiiren paino annostelun alussa ja aikataulun mukaisen humaanin 
lopettamisen yhteydessä sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen vir ­
hetermi ja asiaan liittyviin muuttujiin liittyvä virhetermi (esimerkiksi 
keskihajonta tai keskiarvon keskivirhe),  
— toksisuuden ilmeneminen ajan funktiona ja toksisuuden merkit, mukaan 
luettuna mahdollinen annostelualueen ihoärsytys, erikseen kullekin eläi ­
nyksilölle,  
— taulukko yksittäisten hiirten BrdU-merkki-indekseistä ja kunkin käsitte ­
lyryhmän SI-arvoista,  
— kunkin käsittelyryhmän hiirikohtaisten BrdU-merkki-indeksien keski ­
määräinen virhetermi ja siihen liittyviin muuttujiin liittyvä virhetermi 
(esimerkiksi keskihajonta ja keskiarvon keskivirhe) sekä käyrän ulko ­
puolella olevien vasteiden analyysin tulokset kullekin käsittelyryhmälle,  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 754
 
— laskettu SI ja asianmukaisesti määritetty vaihteluväli, jossa otetaan huo ­
mioon eläintenvälinen vaihtelu, testiaineella ja kontrolliaineella käsitel ­
lyissä ryhmissä,  
— annosvasteen voimakkuus,  
— tarvittaessa tilastoanalyysit.  
Tulosten pohdinta  
— tulosten lyhyt kommentointi, annos-vasteanalyysi ja tarvittaessa tilastoa ­
nalyysi sekä johtopäätös siitä, onko testiainetta pidettävä ihoherkistystä aiheuttavana.
 
LÄHDELUETTELO  
(1) OECD (2010). Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guid ­
eline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines
 
(2) Chamberlain, M. ja Basketter, D. A. (1996). The local lymph node assay: 
status of validation.  Food Chem. Toxicol.  34, s. 999–1002.  
(3) Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Kimber, I. ja Loveless, S. E. (1996). The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests.  Food Chem. Toxicol.  34, s. 985–997.
 
(4) Basketter, D. A., Gerberick, G. F. ja Kimber, I. (1998). Strategies for 
identifying false positive responses in predictive sensitisation tests.  Food 
Chem. Toxicol.  36, s. 327–33.  
(5) Van Och, F. M. M., Slob, W., De Jong, W. H., Vandebriel, R. J. ja Van 
Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncer ­
tainty margins.  Toxicol.  146, s. 49–59.
 
(6) ICCVAM (1999). The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Inte ­
ragency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the 
Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH-julkaisunumero 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Saatavilla osoit ­
teessa http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf
 
(7) Dean, J. H., Twerdok, L. E., Tice, R. R., Sailstad, D. M., Hattan, D. G., 
Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel.  Reg. Toxicol. Pharmacol  34(3), s. 258–273.
 
(8) Haneke, K. E., Tice, R. R., Carson, B. L., Margolin, B. H., Stokes, W. S. 
(2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol  34(3), s. 274–286.
 
(9) Sailstad, D. M., Hattan, D., Hill, R. N., Stokes, W. S. (2001). ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process.  Reg. Toxicol. Pharmacol  34(3), s. 249–257.  
(10) ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive 
local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH-julkaisunumero 10-7552A/B. Research Triangle Park, 
NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm
 ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 755
 
(11) ICCVAM (2009). Independent Scientific Peer Review Panel Report: Upda ­
ted validation status of new versions and applications of the murine local 
lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf
 
(12) Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. ja Hoshuyama, S. (2005). Novel 
approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay.  J. Appl. 
Toxicol.  25, s. 129–134.
 
(13) OECD (1992). Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines
 
(14) Kreiling, R., Hollnagel, H. M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M. S., Griem, 
P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. ja Wendel, A. (2008). 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as 
assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT).  Food Chem. Toxicol.  46, s. 1896–1904.
 
(15) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J. C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. ja Mehling, A. 
(2009). Application of a weight of evidence approach to assessing discor ­
dant sensitisation datasets: implications for REACH.  Reg. Toxicol. Pharma ­
col 55, s. 90–96.  
(16) ILAR (1996). Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7. painos. Washington, DC: National Academies Press.
 
(17) ICCVAM (2009). Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay. NIH-julkaisunumero 09-7357. Research Triangle Park, 
NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoit ­
teessa  
http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNA ­
PerfStds.pdf  
(18) McGarry, H. F. (2007). The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH.  Toxicol.  238, s. 71–89.  
(19) Kimber, I., Dearman, R. J., Scholes E. W. ja Basketter, D. A. (1994). The 
local lymph node assay: developments and applications.  Toxicol.  93, s. 
13–31.  
(20) OECD (2002). Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa 
http://www.oecd.org/env/testguidelines  
(21) Reeder, M. K., Broomhead, Y. L., DiDonato, L. ja DeGeorge, G. L. (2007). 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances.  Toxicologist  96, s. 235.  
(22) ICCVAM (2009). Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Backg ­
round Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of 
Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf.  
(23) Hayes, B. B., Gerber, P. C., Griffey, S. S. ja Meade, B. J. (1998). Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice.  Drug Chem. Toxicol.  21, s. 195–206.
 
(24) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H. C., Ruzicka, T., Ahr, 
H. J., Lehmann, P. ja Vohr, V. W. (1998). An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions.  To­
xicol. Appl. Pharmacol.  153, s. 83–94.
 
(25) Woolhiser, M. R., Hayes, B. B. ja Meade, B. J. (1998). A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals.  Toxicol. Meth.  8, s. 245–256.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 756
 
(26) Hayes, B. B. ja Meade, B. J. (1999). Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods.  Drug. Chem. Toxicol.  22, s. 491–506.  
(27) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A. O., van Love ­
ren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. ja Vohr, H. W. (2005). A European inter-laboratory validation of alternative 
endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol.  212, s. 
60–68.
 
(28) Vohr, H. W. ja Ahr, H. J. (2005). The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol.  79, s. 721–728.  
(29) Patterson, R. M., Noga, E. ja Germolec D. (2007). Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect. 115, s. 
1023–1028.  
(30) ICCVAM (2009). Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acute ­
tox/Tox_workshop.htm.  
(31) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7. OECD, Pa ­
riisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines
 
(32) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R. J., Gerberick, G. F., Ryan, C. A., 
Basketter, D. A., Lea, L., House, R. V., Ladies, G. S., Loveless, S. E. ja 
Hastings, K. L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise.  J. Toxicol. Environ.l Health  53, s. 563–79.
 
(33) OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, 
Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14. OECD, Pariisi. Saatavilla osoit ­
teessa http://www.oecd.org/env/testguidelines  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 757
 
Lisäys 1  
MÄÄRITELMÄT  
Tarkkuus:  Testimenetelmän tulosten ja hyväksyttyjen vertailuarvojen välinen 
ero. Tarkkuus on testimenetelmän suorituskyvyn mitta ja yksi merkitykselli ­
syyden osa-tekijöistä. Tarkkuutta ja vastaavuutta (konkordanssia) käytetään 
usein toisiaan korvaavasti tarkoittamaan testimenetelmällä saatujen oikeiden tulosten osuutta (33).
 
Vertailuaine:  Herkistävä tai muu kuin herkistävä aine, jota käytetään testiaineen 
vertailustandardina. Vertailuaineella on oltava seuraavat ominaisuudet: i) luotet ­
tava alkuperä, joka pysyy samana, ii) samanlainen rakenne ja toiminta kuin 
testiaineryhmällä, iii) tunnetut fysikaaliskemialliset ominaisuudet, iv) todisteet tunnetuista vaikutuksista ja v) tunnettu voimakkuus tavoitellulla vasteen vaihte ­
luvälillä.
 
Väärä negatiivinen:  Testiaine on testimenetelmässä määritetty väärin perustein 
negatiiviseksi tai inaktiiviseksi, vaikka se itse asiassa on positiivinen tai aktii ­
vinen (33).  
Väärä positiivinen:  Testiaine on testimenetelmässä määritetty väärin perustein 
positiiviseksi tai aktiiviseksi, vaikka se itse asiassa on negatiivinen tai inaktii ­
vinen (33).  
Vaarallisuus:  Mahdollisuus kielteiseen terveys- tai ympäristövaikutukseen. Kiel ­
teinen vaikutus edellyttää altistumista vähintään tietyllä tasolla.  
Laboratorioidenvälinen uusittavuus:  Se, missä määrin eri (pätevät) laboratoriot 
voivat saada aikaan laadullisesti ja määrällisesti samanlaisia tuloksia käyttä ­
mällä samoja tutkimussuunnitelmia ja testaamalla samaa testiainetta. Laborato ­
rioidenvälinen uusittavuus määritetään esivalidointi- ja validointimenettelyissä, ja sillä osoitetaan, missä määrin testi voidaan onnistuneesti toteuttaa eri labo ­
ratorioissa (33).
 
Laboratorionsisäinen uusittavuus:  Se, missä määrin tietyn laboratorion pätevä 
henkilöstö voi saada onnistuneesti aikaan samat tulokset käyttämällä tiettyä tut ­
kimussuunnitelmaa eri ajankohtina (33).  
Käyrän ulkopuolella oleva vaste:  Käyrän ulkopuolella olevalla vasteella tarkoi ­
tetaan havaintoa, joka poikkeaa merkittävästi muista populaation sattumanvarais ­
ten näytteiden arvoista.  
Laadunvarmistus:  Hallintomenettely, jossa testausta suorittavista henkilöistä riip ­
pumattomat henkilöt arvioivat laboratorion testausstandardien, vaatimusten ja 
kirjanpitomenettelyjen noudattamista ja tiedonsiirron tarkkuutta.  
Luotettavuus:  Laajuus, jolla testimenetelmä on toistettavissa samassa laborato ­
riossa tai eri laboratorioissa pidemmällä aikavälillä käytettäessä samaa menet ­
telyä. Se arvioidaan laskemalla uusittavuus samassa laboratoriossa ja eri labo ­
ratorioissa (33).  
Ihoherkistys:  Immunologinen prosessi, joka aiheutuu herkän yksilön paikallisesta 
altistamisesta tietylle kemialliselle allergeenille, joka aiheuttaa iholla immuu ­
nivasteen, joka voi johtaa kosketusherkistykseen.  
Stimulaatioindeksi (SI):  Testiaineen ihoärsytyspotentiaalin arvioimiseksi laskettu 
arvo, jolla esitetään käsiteltyjen ryhmien soluproliferaation ja samanaikaisen kantaja-aineella käsitellyn kontrolliryhmän soluproliferaation välinen suhde.
 
Testiaine (testikemikaali):  Aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä.  ▼M3 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 758
 
B.52  AKUUTTI MYRKYLLISYYS HENGITETTYNÄ – AKUUTIN 
TOKSISUUSLUOKAN MENETELMÄ  
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 436 (2009). Ensim ­
mäinen akuuttia myrkyllisyyttä hengitettynä koskeva testiohje nro 403 hy ­
väksyttiin vuonna 1981, ja sitä on sen jälkeen tarkistettu (katso tämän liit ­
teen luku B.2 (1)). Myrkyllinen hengitettynä -altistusta koskevan akuutin toksisuusluokan (ATC) menetelmän kehittäminen (2) (3) (4) katsottiin tar ­
peelliseksi sen jälkeen, kun tarkistettu akuutin toksisuusluokan menetelmä 
oli hyväksytty myrkyllinen suun kautta -altistusta varten (tämän liitteen luku 
B.1 b) (5). Akuuttia myrkyllisyyttä hengitettynä koskevan akuutin toksisuus ­
luokan testimenetelmän takautuva arviointi osoitti, että menetelmä sopii käytettäväksi luokitukseen ja merkintöihin liittyviin tarkoituksiin (6). Myr ­
kyllisyyttä hengitettynä koskevan akuutin toksisuusluokan testimenetelmän 
avulla kiinteitä kohdepitoisuuksia voidaan käyttää vaiheittain testikemikaalin myrkyllisyyden luokittelemiseksi. Keskeinen tutkittava ominaisuus on kuol ­
leisuus, mutta vakavasta kivusta tai tuskasta kärsivät tai kuolemaisillaan 
olevat eläimet on lopetettava humaanilla tavalla kärsimyksen minimoimisek ­
si. Ohjeita eläinkokeiden humaaneista lopettamiskriteereistä on OECD:n oh ­
jeasiakirjassa GD 19 (7).
 
2. Tämän testimenetelmän mukaisten tutkimusten toteuttamista ja tulosten tul ­
kintaa koskevat ohjeet ovat OECD:n ohjeasiakirjassa GD 39, jossa käsitel ­
lään akuuttia myrkyllisyyttä hengitettynä koskevaa testausta (8).  
3. Tämän testimenetelmän yhteydessä käytetyt määritelmät ovat lisäyksessä 1 
ja ohjeasiakirjassa GD 39 (8).  
4. Testimenetelmä antaa tietoa vaarallisista ominaisuuksista, ja sen avulla tes ­
tikemikaali voidaan määrittää ja luokitella akuuttia myrkyllisyyttä aiheutta ­
vien kemikaalien luokittelua koskevan asetuksen (EY) N:o 1272/2008 mu ­
kaisesti (9). Jos tarvitaan LC  50 -arvojen piste-estimaatteja tai 
pitoisuus-vasteanalyyseja, on käytettävä tämän liitteen luvun B.2 (1) mu ­
kaista testimenetelmää. Lisätietoja testimenetelmän valinnasta on ohjeasia ­
kirjassa GD 39 (8). Tätä testimenetelmää ei ole varsinaisesti tarkoitettu 
erikoismateriaalien, kuten huonosti liukenevien isometristen tai kuituisten 
materiaalien tai teollisesti valmistettujen nanomateriaalien testaukseen.  
ALUSTAVAT HUOMIOT  
5. Ennen tämän testimenetelmän mukaista testausta testauslaboratorion on han ­
kittava kaikki saatavilla olevat tiedot testattavasta kemikaalista, mukaan lu ­
ettuina olemassa olevat tutkimukset, joissa olevien tietojen ansiosta lisätestit 
voidaan jättää mahdollisesti tekemättä, jotta eläinten käyttö voidaan mini ­
moida. Tietoihin, joista voi olla apua sopivimman lajin, kannan, sukupuolen, altistustavan ja asianmukaisten testipitoisuuksien valinnassa, sisältyvät tes ­
tattavan kemikaalin identiteetti, kemiallinen rakenne ja fysikaalis-kemialliset 
ominaisuudet,  in vitro-  tai in vivo  -toksisuustestien tulokset, odotettavissa 
oleva käyttö (olevat käytöt) ja ihmisten altistumisen mahdollisuus sekä saa ­
tavilla olevat (Q)SAR-tiedot ja toksikologiset tiedot rakenteellisesti saman ­
kaltaisista aineista. Tällä testimenetelmällä ei tule testata pitoisuuksia, joiden 
odotetaan aiheuttavan vakavaa kipua ja kärsimystä syövyttävien (
 1 ) tai vai­
keasti ärsyttävien vaikutusten vuoksi [katso ohjeasiakirja GD 39 (8)].  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 759  
( 1 ) Syövyttävyyden arviointi voi perustua asiantuntijan lausuntoon, ja näyttönä voidaan 
käyttää esimerkiksi ihmisistä ja eläimistä saatuja tietoja, olemassa olevia ( in vitro  -) 
tietoja, kuten tämän liitteen lukua B.40 (10) ja B.40a tai OECD:n testiohjetta nro 435 
(12), pH-arvoja, tietoja samanlaisista kemikaaleista tai muita asiaankuuluvia tietoja.
 TESTIN PERIAATE  
6. Testin periaatteena on, että testikemikaalin akuutista myrkyllisyydestä hen ­
gitettynä kerätään riittävästi tietoa vaiheittaisen menettelyn avulla neljän tunnin pituisen altistusjakson aikana, jotta kemikaali voidaan luokitella. 
Myös muunpituisia altistuksia voidaan soveltaa tiettyihin sääntelytarkoituk ­
siin. Jokaisessa määritetyn pitoisuuden vaiheessa testataan kolme eläintä kumpaakin sukupuolta. Sen mukaan, montako eläintä on kuollut ja/tai kuo ­
lemaisillaan, kaksi vaihetta voi riittää testikemikaalin akuutin myrkyllisyy ­
den arvioimiseksi. Jos on näyttöä siitä, että toinen sukupuoli on toista her ­
kempi, testiä voidaan jatkaa vain herkemmällä sukupuolella. Aiemman vai ­
heen tuloksen perusteella määritellään seuraava vaihe, joka on jokin seuraa ­
vista:
 
a) Lisätestausta ei tarvita.  
b) On testattava kolme eläintä kumpaakin sukupuolta.  
c) On testattava vain kuusi eläintä herkemmästä sukupuolesta, eli toksisuus ­
luokan alarajan estimaattien on perustuttava kuuteen eläimeen testipitoi ­
suusryhmää kohti sukupuolesta riippumatta.  
7. Kuolemaisillaan olevat, selvästi kärsivät tai voimakkaasta ja jatkuvasta ki ­
vusta merkkejä osoittavat eläimet on lopetettava humaanilla tavalla, ja koe ­
tulosten tulkinnassa ne on otettava huomioon samalla tavalla kuin kokeessa kuolleet eläimet. Eläinkokeiden humaaneja lopettamiskriteereitä koskevassa OECD:n ohjeasiakirjassa GD 19 (7) on esitetty kriteerit, joiden perusteella 
tehdään päätös kuolemaisillaan olevan tai voimakkaasti kärsivän eläimen 
lopettamisesta. Lisäksi siinä on annettu ohjeita ennustettavan tai uhkaavan kuoleman tunnistamiseksi.
 
MENETELMÄN KUVAUS  
Eläinlajin valinta  
8. On käytettävä terveitä, nuoria ja täysikasvuisia yleisesti käytettyjä 
koe-eläinkantoja. Suositeltavin laji on rotta, ja jos käytetään muita lajeja, 
sille on esitettävä perustelut.  
Eläinten valmistelu  
9. Naaraat eivät saa olla synnyttäneitä eivätkä tiineinä. Altistuspäivänä on 
käytettävä 8–12 viikon ikäisiä nuoria aikuisia eläimiä, joiden ruumiinpainon on oltava ± 20 prosenttia aiemmin altistettujen samanikäisten eläinten kes ­
kimääräisestä painosta kummankin sukupuolen osalta. Eläimet valitaan sa ­
tunnaistetusti ja merkitään niin, että yksilöt voidaan erottaa toisistaan. Eläi ­
met pidetään häkeissä vähintään viiden päivän ajan ennen testin aloittamista, jotta ne tottuvat laboratorio-olosuhteisiin. Eläimet on totutettava myös testi ­
laitteistoon vähän ennen testausta, sillä se vähentää uuteen ympäristöön 
tutustumisesta aiheutuvaa stressiä.
 
Eläinten hoito  
10. Koe-eläintilan lämpötilan on oltava 22 ± 3 °C. Suhteellinen ilmankosteus on 
pidettävä mielellään 30–70 prosentin välillä, mikä ei välttämättä ole mah ­
dollista, jos kantaja-aineena käytetään vettä. Ennen altistuksia ja niiden jäl ­
keen eläimet on eroteltava häkkeihin sukupuolen ja pitoisuuden mukaisiin 
ryhmiin, mutta eläinten lukumäärä häkkiä kohti ei saa häiritä kunkin eläimen 
selkeää havainnointia, ja määrä on pidettävä sellaisena, että kannibalismista ja tappelusta johtuvat hävikit voidaan minimoida. Jos eläimet altistetaan vain nasaalisesti, ne voi olla tarpeen totuttaa immobilisointiputkiin. Immobilisoin ­
tiputket eivät saa aiheuttaa eläimille tarpeetonta fyysistä, lämpöön tai liik ­
kumattomuuteen liittyvää stressiä. Immobilisointi voi vaikuttaa fysiologisiin
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 760
 
tutkittaviin ominaisuuksiin, kuten ruumiinlämpöön (hypertermia) ja/tai hen ­
gityksen minuuttitilavuuteen. Jos saatavilla on rinnakkaistietoja, jotka osoit ­
tavat, ettei tällaisia muutoksia juuri ilmene, immobilisointiputkiin totuttami ­
nen ei ole tarpeen. Eläimet, jotka altistetaan aerosolille kokonaan, on laitet ­
tava kokeen ajaksi häkkiin yksittäin, jotta testattava aerosoli ei suodatu 
muiden häkissä olevien eläinten karvapeitteen kautta. Tavallista ja sertifioi ­
tua laboratorioruokavaliota voidaan käyttää muulloin paitsi altistuksen aika ­
na, eikä tavallisen juomaveden määrää tule rajoittaa. Huoneessa tulee käyt ­
tää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa / 12 tuntia pimeää).  
Inhalaatiokammiot  
11. Testikemikaalin luonne ja testin tavoite on otettava huomioon inhalaatio ­
kammiota valittaessa. Ensisijainen altistumistapa on vain nasaalisesti (tähän 
termiin kuuluvat myös altistustavat vain pään kautta, vain nasaalisesti tai 
vain nokan kautta). Vain nasaalista altistusta suositellaan yleensä tutkittaessa nestemäisiä tai kiinteitä aerosoleja sekä sellaisia höyryjä, jotka saattavat tii ­
vistyä ja muodostaa siten aerosoleja. Tutkimuksen tietyt tavoitteet voidaan 
saavuttaa paremmin käyttämällä koko kehoon kohdistuvaa altistusta, mutta 
se on perusteltava tutkimusraportissa. Jotta kammion ilma voidaan pitää vakaana koko kehon kammiossa, koe-eläinten viemä tila saa olla korkein ­
taan viisi prosenttia kammion tilavuudesta. Vain nasaalisesti ja koko kehon 
kautta tapahtuvan altistuksen tekniikoiden periaatteet sekä niiden erityiset 
hyödyt ja haitat on kuvattu ohjeasiakirjassa GD 39 (8).
 
ALTISTUSOLOSUHTEET  
Pitoisuuksien annostelu  
12. Altistuksen kestoksi suositellaan kiinteää aikaa, joka on neljä tuntia, pois 
luettuna tasapainotilan saavuttamiseen kuluva aika. Muunpituiset altistukset 
voivat olla tarpeen tiettyjen vaatimusten täyttämiseksi, mutta tämä on perus ­
teltava tutkimusraportissa [katso ohjeasiakirja GD 39 (8)]. Eläimille, joita altistetaan aerosoleille koko kehon kammioissa, on järjestettävä oma häkki 
sen estämiseksi, etteivät muut häkissä olevat eläimet niele testikemikaalia, 
kun ne hoitavat toistensa turkkia. Eläimiä ei saa ruokkia altistusjakson ai ­
kana. Vettä saa antaa koko kehoon kohdistuvan altistuksen ajan.
 
13. Eläimet altistetaan testikemikaalille, kun se on kaasuna, höyrynä, aerosolina 
tai niiden sekoituksena. Testattava fyysinen olomuoto määräytyy testikemi ­
kaalin fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien, valitun pitoisuuden ja/tai tes ­
tikemikaalin käsittelyssä ja käytössä todennäköisen fyysisen muodon perus ­
teella. Hygroskooppiset ja kemiallisesti reaktiiviset testikemikaalit on testat ­
tava kuivaa ilmaa käyttäen. Räjähtävien pitoisuuksien tuottamista on vältet ­
tävä huolellisesti.  
Hiukkaskokojakauma  
14. Hiukkasten koko on mitattava kaikista aerosoleista ja sellaisista höyryistä, 
jotka voivat tiivistyä ja muodostaa siten aerosoleja. Jotta kaikki hengityse ­
limistön oleelliset osat altistuvat aineelle, on suositeltavaa käyttää aerosoleja, joiden massan aerodynaamisen halkaisijan mediaani (MMAD) on 1–4 μm ja 
joiden geometrinen keskihajonta ( σ
 g ) sijoittuu välille 1,5–3,0 (8) (13) (14). 
Tämä vaatimus on pyrittävä täyttämään kaikin keinoin, mutta jos se ei onnistu, on esitettävä asiantuntijan lausunto. Esimerkiksi metallihuurut voi ­
vat olla tätä vaatimusta pienempiä, kun taas varautuneet hiukkaset, kuidut ja 
hygroskooppiset materiaalit (joiden koko kasvaa hengitystie-elimistön kos ­
teassa ympäristössä) voivat olla vaatimusta suurempia.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 761
 
Testikemikaalin valmistelu kantaja-aineessa  
15. Jotta ilmakehään saadaan testikemikaalista sopiva pitoisuus ja hiukkaskoko, 
voidaan käyttää kantaja-ainetta. Pääsääntöisesti on käytettävä vettä. Hiuk ­
kasmateriaaleja voidaan joutua käsittelemään mekaanisesti vaaditun hiukkas ­
kokojakauman saavuttamiseksi, mutta se on tehtävä varovasti, jotta testike ­
mikaali ei hajoa tai muutu. Jos mekaanisen prosessin oletetaan muuttaneen testikemikaalin koostumusta (esimerkiksi kitkan vuoksi liiallisen jauhamisen aiheuttamat hyvin korkeat lämpötilat), testikemikaalin koostumus on var ­
mennettava analyyttisesti. Riittäviä varotoimia on noudatettava, jotta testike ­
mikaali ei kontaminoidu. Murenemattomia raemateriaaleja, jotka on tarkoi ­
tuksella valmistettu sellaisiksi, ettei niitä voi hengittää, ei tarvitse testata. 
Hankauskoe on tehtävä sen osoittamiseksi, ettei raemaisen materiaalin kä ­
sittelyssä synny hengitettäviä hiukkasia. Jos hankauskoe tuottaa hengitettäviä hiukkasia, on tehtävä sisäänhengityksen kautta aiheutuvaa myrkyllisyyttä koskeva testi.
 
Verrokkieläimet  
16. Samanaikaista negatiivista (ilma-) verrokkiryhmää ei tarvita. Jos 
testi-ilmakehän tuottamisessa käytetään apuna muuta kantaja-ainetta kuin 
vettä, kantaja-aineverrokkiryhmää on käytettävä ainoastaan silloin, kun saa ­
tavilla ei ole aiempia tietoja sisäänhengityksen kautta aiheutuvasta myrkyl ­
lisyydestä. Jos kantaja-aineessa valmistellun testikemikaalin myrkyllisyystut ­
kimus osoittaa, ettei kemikaali ole myrkyllinen, se tarkoittaa, että 
kantaja-aine on myrkytön testattuna pitoisuutena, joten 
kantaja-aineverrokkia ei tarvita.  
ALTISTUSOLOSUHTEIDEN SEURANTA  
Kammion ilmavirtaus  
17. Ilman virtausta kammion läpi on valvottava tarkasti ja seurattava jatkuvasti, 
ja sitä koskevat tiedot on kirjattava vähintään kerran tunnissa jokaisen al ­
tistuksen aikana. Testi-ilmakehän pitoisuuden (tai stabiiliuden) seuranta kuu ­
luu olennaisena osana kaikkien dynaamisten parametrien mittaamiseen, ja se on myös epäsuora keino valvoa kaikkia oleellisia dynaamisia parametreja, 
joita tarvitaan ilmakehän tuottamiseen. Erityistä huomiota on kiinnitettävä 
siihen, että uudelleenhengittäminen vältetään vain nasaalisen altistuksen kammioissa niissä tapauksissa, kun altistusjärjestelmän läpi kulkeva ilmavir ­
taus ei riitä tuottamaan dynaamista testikemikaali-ilmakehän virtaa. On tiet ­
tyjä menetelmiä, joita voidaan käyttää osoittamaan, ettei valituissa toimin ­
taolosuhteissa tapahdu uudelleenhengittämistä (8) (15). Happipitoisuuden on oltava vähintään 19 prosenttia, eikä hiilidioksidipitoisuus saa ylittää yhtä prosenttia. Jos on aihetta olettaa, ettei näitä vaatimuksia voida täyttää, 
happi- ja hiilidioksidipitoisuudet on mitattava.
 
Kammion lämpötila ja suhteellinen kosteus  
18. Kammion lämpötila on pidettävä välillä 22 ± 3 °C. Eläinten hengitysilman 
suhteellista kosteutta on seurattava sekä nasaalisissa että koko kehoon koh ­
distuvissa altistuksissa, ja se on kirjattava vähintään kolmesti enintään neljä tuntia kestävien altistusten osalta ja tunneittain lyhyempien altistusten osalta. Suhteellisen kosteuden tulisi olla välillä 30–70 prosenttia, mutta tämä ei ole 
välttämättä mahdollista (esimerkiksi testattaessa vesipohjaisia seoksia) tai 
mitattavissa, koska testikemikaali häiritsee testimenetelmää.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 762
 
Testikemikaali: nimellispitoisuus  
19. Aina kun mahdollista, altistuskammion nimellispitoisuus on laskettava ja 
kirjattava. Nimellispitoisuus on tuotetun testikemikaalin massa jaettuna kam ­
miojärjestelmän läpi virtaavan ilman kokonaistilavuudella. Nimellispitoisuu ­
della ei luonnehdita eläinten altistumista, vaan nimellispitoisuuden ja varsi ­
naisen pitoisuuden vertailusta saadaan tietoa testijärjestelmän generointite ­
hokkuudesta, ja sitä voidaan siis käyttää generointiongelmien havaitsemi ­
seen.  
Testikemikaali: varsinainen pitoisuus  
20. Todellinen pitoisuus on testikemikaalin pitoisuus eläinten hengitysilmassa 
inhalaatiokammiossa. Todelliset pitoisuudet saadaan tietyillä menetelmillä (esimerkiksi suoralla näytteenotolla, adsorptiivisilla tai kemiallisesti reaktii ­
visilla menetelmillä ja tulosten analyyttisella luonnehtimisella) tai muilla 
menetelmillä, kuten suodatukseen perustuvalla gravimetrisella analyysilla. 
Gravimetrisen analyysin käyttö on hyväksyttävää vain yksikomponenttisten jauhemaisten aerosolien tai heikosti haihtuvista nesteistä koostuvien aeroso ­
lien yhteydessä, ja sitä on tuettava asianmukaisella esitutkimuksella, jossa 
käsitellään testikemikaalia koskevia luonnehdintoja. Monikomponenttisten 
jauhemaisten aerosolien pitoisuus voidaan myös määrittää gravimetrisen analyysin avulla. Siihen tarvitaan kuitenkin analyysitietoja, jotka osoittavat, että ilmassa leijuvan materiaalin koostumus on sama kuin lähtömateriaalin. 
Jos näitä tietoja ei ole saatavilla, testikemikaali voi olla tarpeen analysoida 
uudelleen (mieluiten ilmassa leijuvassa muodossaan) säännöllisin väliajoin tutkimuksen aikana. Sellaisten aerosolisoituvien aineiden osalta, jotka voivat höyrystyä tai sublimoitua, on osoitettava, että valitulla menetelmällä kerättiin 
kaikki faasit. Tutkimusraportissa on ilmoitettava tavoitepitoisuus, nimellinen 
pitoisuus ja todellinen pitoisuus, mutta tilastollisissa analyyseissa käytetään vain todellisia pitoisuuksia tappavien pitoisuuksien arvoja laskettaessa.
 
21. Jos mahdollista, on käytettävä yksi erä testikemikaalia, ja testinäyte on 
säilytettävä sen puhtauden, homogeenisuuden ja stabiiliuden säilyttävissä olosuhteissa. Ennen tutkimuksen aloittamista testikemikaalista on laadittava luonnehdinta, johon on sisällyttävä sen puhtaus ja – mikäli teknisesti mah ­
dollista – identiteetti sekä tunnistettujen kontaminanttien ja epäpuhtauksien 
määrät. Tämä voidaan osoittaa esimerkiksi seuraavien tietojen avulla: reten ­
tioaika ja piikin suhteellinen pinta-ala sekä molekyylipaino, joka on saatu massaspektroskopialla tai kaasukromatografia-analyyseista, tai muut estimaa ­
tit. Vaikka testinäytteen identiteetti ei kuulu testauslaboratorion vastuulle, 
sen voi olla järkevää vahvistaa rahoittajan laatima luonnehdinta ainakin tietyssä määrin (esimerkiksi väri, fysikaalinen olomuoto jne.).
 
22. Altistusilmakehä on pidettävä mahdollisimman muuttumattomana, ja sitä on 
tarkkailtava jatkuvasti ja/tai ajoittain analyysimenetelmän mukaisesti. Jos näytteitä otetaan ajoittain, kammion ilmakehästä on otettava näytteitä vähin ­
tään kahdesti neljän tunnin tutkimuksen aikana. Jos se ei ole mahdollista 
vähäisen ilmanvirtauksen tai pienten pitoisuuksien vuoksi, koko altistusjak ­
son ajalta voidaan ottaa yksi näyte. Jos näytteiden välillä ilmenee suurta vaihtelua, seuraavia pitoisuuksia testattaessa on otettava neljä näytettä kuta ­
kin altistusta kohti. Yksittäiset kammion pitoisuusnäytteet eivät saa poiketa 
keskimääräisestä pitoisuudesta enempää kuin enintään ± 10 prosenttia kaa ­
sujen ja höyryjen osalta tai enintään ± 20 prosenttia nestemäisten tai kiin ­
teiden aerosolien osalta. Kammion tasapainotukseen kulunut aika (t
 95 ) on 
laskettava ja kirjattava. Altistuksen kesto käsittää ajan, jolloin testikemikaali 
muodostetaan, mikä otetaan huomioon t  95 -ajan saavuttamiseen tarvittavissa 
ajoissa. Ohjeita t  95 -ajan arvioimiseksi on ohjeasiakirjassa GD 39 (8).  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 763
 
23. Hyvin monimutkaisten, kaasuista/höyryistä koostuvien seosten ja aerosolien 
(esimerkiksi polttokammiot ja tietyn tarkoituksen mukaisten lopputuottei ­
den/-laitteiden perusteella kehitetyt testikemikaalit) osalta kukin faasi voi käyttäytyä inhalaatiokammiossa eri tavoin, joten jokaisesta faasista (kaa ­
su/höyry ja aerosoli) on valittava vähintään yksi indikaattoriaine (analyytti), 
yleensä seoksen pääasiallinen vaikuttava aine. Kun testikemikaali on seos, 
on ilmoitettava seoksen analyyttinen pitoisuus, ei siis pelkästään vaikuttavan aineen tai komponentin (analyytin) pitoisuutta. Lisätietoja todellisista pitoi ­
suuksista on ohjeasiakirjassa GD 39 (8).
 
Testikemikaali: hiukkaskokojakauma  
24. Aerosolien hiukkaskokojakauma on määritettävä vähintään kahdesti jokaisen 
neljän tunnin mittaisen altistuksen aikana käyttämällä kaskadierotinta tai 
jotain toista laitetta, kuten aerodynaamista hiukkaskokoluokittelijaa. Jos kas ­
kadierottimella tai muulla laitteella saatujen tulosten välinen vastaavuus voidaan osoittaa, kyseistä muuta laitetta voidaan käyttää koko tutkimuksen ajan. Ensisijaisen laitteen rinnalla on käytettävä toissijaista laitetta, esimer ­
kiksi gravimetrista suodatinta tai törmäytintä/kuplituslaitetta ensisijaisen lait ­
teen keräystehon vahvistamiseksi. Hiukkaskoon analyysista saadun massa ­
pitoisuuden on sijoituttava kohtuullisessa määrin suodatusanalyysilla saadun massapitoisuuden rajoihin [katso GD 39 (8)]. Jos vastaavuus voidaan osoit ­
taa tutkimuksen varhaisessa vaiheessa, myöhemmät vahvistavat mittaukset 
voidaan jättää tekemättä. Eläinten hyvinvointiin liittyvistä syistä tietojen epävarmuus on pyrittävä minimoimaan, jotta altistusta ei tarvitse toistaa. Höyryjen osalta on määritettävä hiukkaskoko, jos on mahdollista, että höy ­
ryn tiivistyessä muodostuu aerosolia, tai jos höyrykammiossa, jossa faasien 
sekoittuminen on mahdollista, havaitaan hiukkasia (katso 14 kohta).
 
MENETTELY  
Päätutkimus  
25. Jokaisessa vaiheessa käytetään kolmea eläintä kumpaakin sukupuolta tai 
kuutta eläintä herkemmästä sukupuolesta. Jos muita jyrsijöitä kuin rottia altistetaan vain nasaalisesti, altistuksen enimmäiskestoaikoja voidaan muut ­
taa lajikohtaisen stressin minimoimiseksi. Aloitusannoksena käytettävä pitoi ­
suus valitaan 1–4 kiinteästä pitoisuustasosta. Aloituspitoisuuden on oltava 
sellainen, että se todennäköisimmin aiheuttaa myrkyllisiä vaikutuksia joille ­
kin eläimistä, joille testikemikaalia on annettu. Kaasujen, höyryjen ja aero ­
solien testausmalleissa testataan CLP-luokkien 1–4 raja-arvoilla, jotka ovat 
kaasujen osalta 100, 500, 2 500 ja 20 000 ppm/4h (lisäys 2), höyryjen osalta 
0,5, 2, 10 ja 20 mg/l/4h (lisäys 3) ja aerosolien osalta 0,05, 0,5, ja 1,5 mg/l/4h (lisäys 4). Luokka 5, jota ei käytetä asetuksessa (EY) N:o 1272/2008 (9), koskee pitoisuuksia, jotka ovat suurempia kuin kyseiset 
rajapitoisuudet. Jokaisen aloituspitoisuuden osalta sovelletaan vastaavaa tes ­
tausmallia. Humaaneista syistä lopetettujen tai kuolleiden eläinten lukumää ­
rän mukaan testimenettelyssä edetään merkittyjen nuolten mukaisesti, kun ­
nes luokitus voidaan tehdä.
 
26. Altistusryhmien välinen aika määritellään toksisten oireiden alkamishetken, 
keston ja vaikeusasteen mukaan. Eläinten altistusta seuraavalla pitoisuudella 
on lykättävä, kunnes on saatu riittävä varmuus jo testattujen eläinten eloon ­
jäämisestä. Kunkin pitoisuustason välissä on suositeltavaa pitää kolmen tai neljän päivän mittainen tauko, jotta voidaan tarkkailla, ilmenevätkö myrkyl ­
lisyyden merkit viipeellä. Aikaväliä voidaan tarvittaessa mukauttaa esimer ­
kiksi epävarmojen vasteiden yhteydessä.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 764
 
Rajatesti  
27. Rajatestiä käytetään silloin, kun testikemikaalin tiedetään tai oletetaan ole ­
van periaatteessa myrkytön eli aiheuttavan toksisen vasteen vain lakisääteistä rajapitoisuutta suuremmilla pitoisuuksilla. Tietoa testikemikaalin myrkylli ­
syydestä voidaan hankkia samanlaisia testattuja kemikaaleja koskevista tie ­
doista, jolloin on otettava huomioon niiden komponenttien identiteetti ja prosenttiosuus, joilla tiedetään olevan toksikologista merkitystä. Tilanteissa, joissa tietoa testikemikaalin myrkyllisyydestä on vain vähän tai sitä ei ole 
lainkaan tai jos testikemikaalin oletetaan olevan myrkyllinen, on toteutettava 
päätutkimus [lisäohjeita on ohjeasiakirjassa GD 39 (8)].
 
28. Normaalissa menettelyssä kolme eläintä kumpaakin sukupuolta tai kuusi 
eläintä herkemmästä sukupuolesta altistetaan pitoisuuksille, jotka ovat kaa ­
sujen osalta 20 000 ppm, höyryjen osalta 20 mg/l ja pölyjen/sumutteiden 
osalta 5 mg/l (mikäli saavutettavissa), mikä katsotaan tässä testimenetel ­
mässä rajatestiksi. Aerosolien testauksessa ensisijaisena tavoitteena tulee olla hengitettävän hiukkaskoon (MMAD 1–4 μm) saavuttaminen. Useimpien 
kemikaalien osalta tämä on mahdollista, kun niiden pitoisuus on 2 mg/l. 
Aerosolien testaamista suurempina pitoisuuksina kuin 2 mg/l on yritettävä vain, jos hengitettävä hiukkaskoko voidaan saavuttaa [katso GD 39 (8)]. GHS-järjestelmän (16) mukaan rajapitoisuuden ylittävien testien tekeminen 
ei ole suositeltavaa eläinten hyvinvointiin liittyvistä syistä GHS-järjestelmän 
luokan 5 (16), jota ei käytetä asetuksessa (EY) N:o 1272/2008 (9), mukaista testausta tulee harkita vain, jos on erittäin todennäköistä, että tällaisen testin tulokset ovat suoraan merkityksellisiä ihmisten terveyden suojelemisessa, ja 
se on perusteltava tutkimusraportissa. Mahdollisesti räjähtäviä testikemikaa ­
leja on käsiteltävä varovasti räjähdykselle suotuisien olosuhteiden välttämi ­
seksi. Jotta vältetään eläinten tarpeeton käyttö, ennen rajatestiä on tehtävä testiajo ilman eläimiä sen varmistamiseksi, että rajatestin edellyttämät 
kammio-olosuhteet voidaan saavuttaa.
 
HAVAINNOT  
29. Eläimiä on tarkkailtava kliinisesti ja säännöllisesti altistumisjakson aikana. 
Altistuksen jälkeen kliinisiä havaintoja on tehtävä vähintään kahdesti altis ­
tuspäivän aikana tai useammin, jos eläinten vaste käsittelyyn antaa siihen aihetta, ja vähintään kerran päivässä sen jälkeen yhteensä 14 päivän ajan. Havaintojakson pituus ei ole kiinteä, vaan se on määritettävä kliinisten 
merkkien luonteen ja alkamisajankohdan sekä toipumisajan pituuden perus ­
teella. Ne ajankohdat, jolloin myrkyllisyyden merkit ilmaantuvat ja häviävät, ovat tärkeitä varsinkin, jos myrkyllisyyden merkit ilmaantuvat viipeellä. Kaikki havainnot kirjataan järjestelmällisesti jokaisesta eläimestä erikseen. 
Kuolevat eläimet, selvästi kärsivät eläimet ja/tai eläimet, jotka osoittavat 
selviä merkkejä voimakkaasta ja jatkuvasta kärsimyksestä, on lopetettava humaanisti eläinten hyvinvointiin liittyvien periaatteiden vuoksi. Kun tutki ­
taan myrkyllisyyden kliinisiä merkkejä, on kiinnitettävä huomiota siihen, 
ettei altistusmenettelystä johtuvaa huonoa ulkonäköä ja ohimeneviä muu ­
toksia hengityksessä pidetä erehdyksessä merkkeinä kemikaaliin liittyvästä myrkyllisyydestä. Eläinkokeiden humaaneja lopettamiskriteereitä koskevassa ohjeasiakirjassa esitetyt periaatteet ja perustelut on otettava huomioon (7). 
Humaaneista syistä lopetettujen tai kuolleena löydettyjen eläinten kuolin ­
ajankohta tulee kirjata muistiin mahdollisimman tarkasti.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 765
 
30. Häkin vieressä tehtyihin havaintoihin tulee sisältyä ihon, karvapeitteen, sil ­
mien, limakalvojen, hengitys- ja verenkiertojärjestelmän, autonomisen her ­
moston ja keskushermoston, somatomotorisen toiminnan ja käyttäytymisen muutokset. Mikäli mahdollista, paikallisten ja systeemisten vaikutusten vä ­
liset erot on merkittävä muistiin. Huomiota tulee kiinnittää vapinaan, kou ­
ristuksiin, syljeneritykseen, ripuliin, letargiaan, uneen ja koomaan. Lämmön 
mittaaminen peräsuolesta voi antaa tukevaa näyttöä refleksinomaisesta bra ­
dypneasta tai käsittelyyn tai ahtaaseen tilaan liittyvästä tai hypo-/hypertermiasta.
 
Eläinten painot  
31. Kunkin eläimen paino on kirjattava kerran sopeutumisvaiheen aikana, altis ­
tuspäivänä ennen altistusta (päivä 0) ja vähintään päivinä 1, 3 ja 7 (ja 
myöhemmin viikoittain) sekä kuolinhetkellä tai lopettamisen yhteydessä, jos se tapahtuu päivän 1 jälkeen. Ruumiinpaino on tunnetusti erittäin tärkeä myrkyllisyyden indikaattori, joten eläimiä, joiden paino on jatkuvasti vähin ­
tään 20 prosenttia pienempi ennen tutkimusta mitattuihin arvoihin verrattu ­
na, on seurattava tarkasti. Elossa olevat eläimet punnitaan ja lopetetaan humaanisti altistumisen jälkeisen jakson lopussa.
 
Patologia  
32. Kaikki koe-eläimet, myös kokeen aikana kuolleet tai eläinten hyvinvointia 
koskevien periaatteiden vuoksi lopetetut ja tutkimuksesta poistetut, avataan. 
Jos avausta ei voida tehdä heti kuolleen eläimen löytämisen jälkeen, eläintä 
on säilytettävä riittävän kylmässä lämpötilassa (ei pakastimessa) autolyysin minimoimiseksi. Ruumiinavaukset on tehtävä mahdollisimman pian, yleensä 
yhden tai kahden päivän kuluessa. Kunkin eläimen kaikki makroskooppiset 
muutokset tulee kirjata, ja erityistä huomiota on kiinnitettävä hengitysteissä oleviin muutoksiin.
 
33. Myös tutkimussuunnitelmaan ennalta sisällytettyjen lisätutkimusten käyttöä 
voidaan harkita tutkimuksen tulkinnallisen arvon lisäämiseksi. Tällaisia tut ­
kimuksia ovat esimerkiksi eloonjääneiden rottien keuhkojen painon punnitus ja/tai todisteiden hankkiminen ärsyttävyydestä hengitysteiden mikroskooppi ­
tutkimuksella. Tutkittaviin elimiin voi sisältyä myös vähintään 24 tuntia 
hengissä säilyneiden eläinten makroskooppisia muutoksia sisältävät elimet 
ja elimet, joissa tiedetään tai oletetaan olevan kemikaalin aiheuttamia vai ­
kutuksia. Koko hengityselimistön mikroskooppitutkimus voi antaa hyödyl ­
listä tietoa veden kanssa reagoivista testikemikaaleista, kuten hapoista ja 
hygroskooppisista testikemikaaleista.
 
TIEDOT JA RAPORTOINTI  
Tiedot  
34. Yksittäisiä eläimiä koskevat tiedot ruumiinpainoista ja ruumiinavaustulok ­
sista on esitettävä. Kliiniset havaintotiedot tulee esittää yhteenvetona taulu ­
kossa, josta käy ilmi kussakin testiryhmässä käytettyjen eläinten lukumäärä, myrkyllisyyden oireita osoittaneiden eläinten lukumäärä, kokeen aikana kuolleena löydettyjen tai humaaneista syistä lopetettujen eläinten lukumäärä, 
yksittäisten eläinten kuolinajankohta, myrkyllisten vaikutusten ja palautu ­
vuuden kuvaus ja niiden ajallinen esiintyminen sekä ruumiinavauslöydökset.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 766
 
Testiraportti  
35. Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat tiedot:  
Koe-eläimet ja niiden hoito  
— kuvaus häkkiolosuhteista, mukaan luettuina seuraavat tiedot: yhdessä 
häkissä olevien eläinten lukumäärä (tai lukumäärän muutos), alustama ­
teriaali, lämpötila ja suhteellinen kosteus, valoisa aika ja tiedot ravin ­
nosta  
— käytetyt lajit/kanta ja perustelu muun lajin kuin rotan käyttämiselle  
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli  
— satunnaistamismenetelmä  
— tiedot ruoan ja veden laadusta (sekä ravinnon tyyppi/lähde, veden lähde)  
— kuvaus testiä edeltäneestä tilanteesta ja tiedot ravinnosta, karanteenista ja 
sairauden hoidosta.  
Testikemikaali  
— fysikaalinen olomuoto, puhtaus ja tarvittaessa fysikaalis-kemialliset omi ­
naisuudet (mukaan luettuna isomeria)  
— tunnistetiedot ja CAS-numero, jos se tiedetään.  
Kantaja-aine  
— perustelut kantaja-aineen käyttämiselle ja sen valinnalle (jos se on muu 
kuin vesi)  
— aikaisemmin tai tämän tutkimuksen yhteydessä saadut tiedot, jotka osoit ­
tavat, ettei kantaja-aine vaikuta tutkimuksen tulokseen.  
Inhalaatiokammio  
— kuvaus inhalaatiokammiosta sekä sen mitat ja tilavuus  
— kuvaus eläinten altistukseen ja ilmakehän tuottamiseen käytetystä lait ­
teistosta ja sen alkuperä  
— lämmön, kosteuden, hiukkaskoon ja todellisen pitoisuuden mittauslaitteet  
— ilmanlähde, tulo- ja poistoilman käsittely sekä ilmanvaihtojärjestelmä  
— menetelmät, joilla laitteisto on kalibroitu yhtenäisen testi-ilmakehän var ­
mistamiseksi  
— paine-ero (yli- vai alipaine)  
— kunkin kammion altistusportit (vain nasaalinen altistus); eläinten sijainti 
järjestelmässä (koko kehoon kohdistuva altistus)  
— testi-ilmakehän ajallinen yhtenäisyys/stabiilius  
— lämpötila- ja kosteusantureiden sekä testi-ilmakehän näytteenottopaikan 
sijainti kammiossa  
— ilman virtausnopeudet, ilman virtausnopeus kussakin altistusportissa 
(vain nasaalinen altistus) tai eläinkuorma/kammio (koko kehoon kohdis ­
tuva altistus)  
— tiedot hapen ja hiilidioksidin mittauslaitteistosta, jos tarpeen  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 767
 
— inhalaatiokammion tasapainotilan saavuttamiseen kulunut aika (t  95 ) 
— tilavuusmuutosten määrä tunneittain  
— annostelulaitteet (tarvittaessa).  
Altistustiedot  
— päätutkimuksen tavoitepitoisuuden valinnan peruste  
— nimellispitoisuudet (altistuskammioon tuotetun testikemikaalin massa ja ­
ettuna kammion läpi virtaavan ilman tilavuudella)  
— eläinten hengitysilmasta kerätyt testikemikaalin todelliset pitoisuudet; 
epäyhtenäisiä fyysisiä muotoja (kaasuja, höyryjä, aerosoleja) tuottavien 
seosten osalta jokainen voidaan analysoida erikseen  
— kaikki ilmapitoisuudet on ilmoitettava massayksikköinä (esimerkiksi 
mg/l, mg/m  3 , jne.), tilavuusyksiköt (esimerkiksi ppm, ppb jne.) voidaan 
ilmoittaa sulkeissa  
— hiukkaskokojakauma, massan aerodynaamisen halkaisijan 
mediaani (MMAD) ja geometrinen keskihajonta ( σg) sekä niiden lasken ­
tamenetelmät. Yksittäiset hiukkaskokoanalyysit on myös esitettävä.  
Testiolosuhteet  
— tiedot testikemikaalin valmistelusta, mukaan luettuina tiedot kiinteiden 
materiaalien hiukkaskoon pienentämisessä tai testikemikaaliliuosten val ­
mistamisessa käytetyistä menetelmistä. Jos mekaaniset prosessit ovat 
voineet muuttaa kemiallista koostumusta, on ilmoitettava analyysien tu ­
lokset testikemikaalin koostumuksen vahvistamiseksi.  
— kuvaus (mieluiten kaavio) testi-ilmakehän tuottamiseen ja eläinten altis ­
tamiseen testi-ilmakehälle käytetystä laitteistosta  
— tiedot käytetystä kemiallisesta analyysimenetelmästä ja sen validointime ­
netelmästä (myös tiedot siitä, miten tehokasta testikemikaalin saanto oli 
näytteenottokohdasta)  
— testipitoisuuksien valintaperuste.  
Tulokset  
— kammion lämpötila, kosteus ja ilmanvirtaus (taulukkomuodossa)  
— tiedot nimellisistä ja todellisista pitoisuuksista kammiossa (taulukkomuo ­
dossa)  
— hiukkaskokotiedot sekä analyyttiset tiedot näytteen keräämisestä, hiuk ­
kaskokojakaumasta ja MMAD-arvon ja σ g -arvon laskelmat (taulukko ­
muodossa)  
— vastetiedot ja pitoisuustaso jokaisesta eläimestä (ts. eläimet, joissa oli 
merkkejä myrkyllisistä vaikutuksista, ja tiedot kuolleisuudesta sekä vai ­
kutusten luonteesta, vaikeusasteesta, alkamisajankohdasta ja kestosta) (taulukkomuodossa)
 
— tutkimuksen aikana kerätyt tiedot yksittäisten eläinten ruumiinpainoista, 
kuolinpäivä ja -aika, jos se tapahtui ennen suunniteltua lopetusta, kunkin 
eläimen myrkyllisyysoireiden alkamisajankohta ja niiden mahdollinen 
palautuminen  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 768
 
— kunkin eläimen ruumiinavauslöydökset ja histopatologiset löydökset, mi ­
käli saatavilla  
— CLP-luokitus ja LC  50 -raja-arvo.  
Tulosten pohdinta ja tulkinta  
— On kiinnitettävä erityistä huomiota niiden menetelmien kuvaukseen, joita 
tämän testimenetelmän vaatimusten (esimerkiksi rajapitoisuus tai hiuk ­
kaskoko) täyttämisessä käytettiin.  
— Hiukkasten hengitettävyyttä on käsiteltävä kaikkien löydösten kannalta 
etenkin, jos hiukkaskokoon liittyvää kriteeriä ei voitu täyttää.  
— Tutkimuksen kokonaisarviointiin on sisällytettävä tiedot nimellisten ja 
todellisten pitoisuuksien määrittelemiseen käytettyjen menetelmien yhte ­
näisyydestä sekä todellisen ja nimellisen pitoisuuden suhde.  
— Raportissa on käsiteltävä myös todennäköistä kuolinsyytä ja pääasialli ­
sesta vaikutustavasta (systeeminen vs. paikallinen).  
— Jos kärsiviä tai voimakkaasta ja jatkuvasta kivusta merkkejä osoittavia 
eläimiä oli lopetettava humaanisti eläinkokeiden humaaneja lopettamisk ­
riteereitä koskevassa OECD:n ohjeasiakirjassa (7) olevien perustelujen mukaisesti, siitä on esitettävä selvitys.
 
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) Tämän liitteen luku B.2 – Akuutti myrkyllisyys hengitettynä.  
2) Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal and 
Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric 
Evaluations for the Globally Harmonized Classification System.  Arch. To ­
xicol.  77: 243–254.  
3) Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic- 
Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations.  Arch. Toxicol.  
71: 537–549.  
4) Diener W and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives 
to LD/LC  50 Tests.  ALTEX  1: 129–134.  
5) Tämän liitteen luku B.1 b: Akuutti myrkyllisyys hengitettynä – akuutin 
toksisuuden luokittelua koskeva menetelmä  
6) OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the 
Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 105, OECD, Paris. Saatavilla internetosoitteessa: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19. Saatavilla internetosoitteessa: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 39, OECD, Paris. Saatavilla internetosoitteessa: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
9) Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1272/2008, annettu 
16 päivänä joulukuuta 2008, aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaamisesta sekä direktiivien 67/548/ETY ja 1999/45/EY muuttami ­
sesta ja kumoamisesta ja asetuksen (EY) N:o 1907/2006 muuttamisesta, 
EUVL L 353, 31.12.2008, s. 1.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 769
 
10) Tämän liitteen luku B.40  In vitro  ihosyövyttävyys: Ihon 
sähkövastusmääritystesti (TER).  
11) Tämän liitteen luku B.40  In vitro  ihosyövyttävyys: Ihmisihomallitesti.  
12) OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. 
OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Saatavilla internetosoitteessa: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
13) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  
14) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, So ­
ciety of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests.  Fund. Appl. Toxicol.  18: 321–327.
 
15) Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 
160–167.  
16) UN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and Geneva. Available: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_welco ­
me_e.html]
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 770
 
Lisäys 1  
MÄÄRITELMÄ  
Testikemikaali:  Tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 771
 
Lisäys 2  
Kaasut: jokaisen aloituspitoisuuden (PPM/4 H) yhteydessä noudatettava 
menettely  
Yleisiä huomioita (  1 ) 
Jokaisen aloituspitoisuuden yhteydessä on noudatettava tässä lisäyksessä olevan 
testimallin mukaista menettelyä.  
Lisäys 2 a: Aloituspitoisuus on 100 ppm.  
Lisäys 2 b: Aloituspitoisuus on 500 ppm.  
Lisäys 2 c: Aloituspitoisuus on 2 500 ppm.  
Lisäys 2 d: Aloituspitoisuus on 20 000 ppm.  
Testimenetelmässä edetään merkittyjen nuolten mukaisesti sen mukaan, kuinka 
monta eläintä on lopetettu humaaneista syistä tai kuinka monta eläintä on kuollut.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 772  
( 1 ) Seuraavissa taulukoissa tarkoitetaan yhdenmukaistettua kemikaalien luokitus- ja 
merkintäjärjestelmää (GHS). EU:ssa sitä vastaa asetus (EY) N:o 1272/2008. Akuuttia 
myrkyllisyyttä hengitettynä tutkittaessa asetuksessa (EY) N:o 1272/2008 ei käytetä 
luokkaa 5.
 Lisäys 2 a  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test Procedure with a starting concentration of 100 ppm/4 h for gases
  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 773
 
Lisäys 2 b  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test Procedure with a starting concentration of 500 ppm/4h for gases
  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 774
 
Lisäys 2 c  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test Procedure with a starting concentration of 2 500 ppm/4h for gases
  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 775
 
Lisäys 2 d  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test Procedure with a starting concentration of 20 000 ppm/4h for gases
  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 776
 
Lisäys 3  
Höyryt: jokaisen aloituspitoisuuden yhteydessä noudatettava menettely 
(mg/l/4h)  
Yleisiä huomioita (  1 ) 
Jokaisen aloituspitoisuuden yhteydessä on noudatettava tässä lisäyksessä olevan 
testimallin mukaista menettelyä.  
Lisäys 3 a: Aloituspitoisuus on 0,5 mg/l.  
Lisäys 3 b: Aloituspitoisuus on 2,0 mg/l.  
Lisäys 3 c: Aloituspitoisuus on 10 mg/l.  
Lisäys 3 d: Aloituspitoisuus on 20 mg/l.  
Testimenetelmässä edetään merkittyjen nuolten mukaisesti sen mukaan, kuinka 
monta eläintä on lopetettu humaaneista syistä tai kuinka monta eläintä on kuollut.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 777  
( 1 ) Seuraavissa taulukoissa tarkoitetaan yhdenmukaistettua kemikaalien luokitus- ja 
merkintäjärjestelmää (GHS). EU:ssa sitä vastaa asetus (EY) N:o 1272/2008. Akuuttia 
myrkyllisyyttä hengitettynä tutkittaessa asetuksessa (EY) N:o 1272/2008 ei käytetä 
luokkaa 5.
 Lisäys 3 a  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 0.5 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 778
 
Lisäys 3 b  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 2 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 779
 
Lisäys 3 c  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 10 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 780
 
Lisäys 3 d  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 20 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 781
 
Lisäys 4  
Aerosolit: jokaisen aloituspitoisuuden yhteydessä noudatettava menettely 
(mg/l/4h)  
Yleisiä huomioita (  1 ) 
Jokaisen aloituspitoisuuden yhteydessä on noudatettava tässä lisäyksessä olevan 
testimallin mukaista menettelyä.  
Lisäys 4 a: Aloituspitoisuus on 0,05 mg/l.  
Lisäys 4 b: Aloituspitoisuus on 0,5 mg/l.  
Lisäys 4 c: Aloituspitoisuus on 1 mg/l.  
Lisäys 4 d: Aloituspitoisuus on 5 mg/l.  
Testimenetelmässä edetään merkittyjen nuolten mukaisesti sen mukaan, kuinka 
monta eläintä on lopetettu humaaneista syistä tai kuinka monta eläintä on kuollut.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 782  
( 1 ) Seuraavissa taulukoissa tarkoitetaan yhdenmukaistettua kemikaalien luokitus- ja 
merkintäjärjestelmää (GHS). EU:ssa sitä vastaa asetus (EY) N:o 1272/2008. Akuuttia 
myrkyllisyyttä hengitettynä tutkittaessa asetuksessa (EY) N:o 1272/2008 ei käytetä 
luokkaa 5.
 Lisäys 4 a  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 0,05 mg/L/4h for aerosols
  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 783
 
Lisäys 4 b  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 0,5 mg/L/4h for aerosols
  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 784
 
Lisäys 4 c  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 1 mg/L/4h for aerosols
  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 785
 
Lisäys 4 d  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 5 mg/L/4h for aerosols
  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 786
 
B.53.  HERMOSTONKEHITYKSEEN KOHDISTUVIA MYRKYLLISYYS ­
VAIKUTUKSIA KOSKEVA TUTKIMUS  
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 426 (2007); OECD:n li ­
sääntymis- ja kehitystoksisuutta käsittelevä työryhmä käsitteli Kööpenhami ­
nassa kesäkuussa 1995 tarvetta päivittää voimassa olevia OECD:n lisäänty ­
mis- ja kehitystoksisuutta koskevia testiohjeita ja laatia uusia ohjeita pää ­
tetapahtumille, joita ei vielä ole käsitelty (1). Työryhmä suositteli, että testi ­
ohje hermostonkehitykseen kohdistuvasta neurotoksisuudesta laaditaan Yh ­
dysvaltojen ympäristönsuojeluviraston ohjeiden perusteella. Näitä ohjeita on sittemmin tarkistettu (2). Kööpenhaminassa pidettiin kesäkuussa 1996 toi ­
nen kuulemiskokous, jossa sihteeristölle annettiin ohjeita hermostonkehityk ­
seen kohdistuvaa neurotoksisuutta koskevien uusien testiohjeiden laadinnas ­
ta, mukaan lukien keskeiset näkökohdat, kuten eläinlajin valinta, annoste ­
lujakso, testausajankohta, arvioitavat päätetapahtumat ja tuloksien arviointia koskevat kriteerit. Yhdysvaltojen ohjeet neurotoksisuutta koskevasta riski ­
arvioinnista julkaistiin vuonna 1998 (3). OECD:n asiantuntijakomitean ko ­
kous ja International Life Science Institute -organisaation Risk Science Ins ­
titute -tiedeinstituutin työryhmä kokoontui lokakuussa 2000, ja asiantunti ­
joiden kuulemiskokous pidettiin Tokiossa vuonna 2005. Näissä kokouksissa 
käsiteltiin nykyisen testiohjeen tieteellisiä ja teknisiä kysymyksiä, ja koko ­
uksien suositukset (4)(5)(6)(7) otettiin huomioon tämän testimenetelmän kehittämisessä. Lisätiedot tämän testimenetelmän toteutuksesta, tulkinnasta ja terminologiasta sisältyvät lisääntymistoksisuuden testaamista ja arviointia 
koskevaan OECD:n ohjeasiakirjaan 43 (8) ja neurotoksisuuden testaamista 
koskevaan ohjeasiakirjaan 20 (9).
 
ALUSTAVAT NÄKÖKOHDAT  
2. Useiden kemikaalien tiedetään aiheuttavan ihmisten ja muiden lajien her ­
mostonkehitykselle myrkyllisyysvaikutuksia (10)(11)(12)(13). Hermoston ­
kehitykselle mahdollisesti aiheutuvien myrkyllisyysvaikutusten määrittelyä voidaan tarvita kemikaalin myrkyllisen vaikutusten arviointiin. Tutkimukset 
hermostonkehitykseen kohdistuvista myrkyllisyysvaikutuksia on suunniteltu 
siten, että niillä tarjotaan tietoja, myös annos-vastesuhteen kuvauksia, sel ­
laisista mahdollisista toiminnallisista ja morfologisista vaikutuksista poikas ­
ten kehittyvään hermostojärjestelmään, jotka voivat aiheutua kemikaalille 
altistumisesta kohdussa ja varhaisessa kehitysvaiheessa.
 
3. Tutkimus hermostonkehitykseen kohdistuvista myrkyllisyysvaikutuksista 
voidaan suorittaa erillisenä tutkimuksena, joka sisällytetään tutkimukseen 
lisääntymiselle ja/tai täysikasvuisille eläimille aiheutuvista myrkyllisyysvai ­
kutuksista (kuten testimenetelmät B.34 (14), B.35 (15) ja B.43 (16)), tai se voidaan lisätä tutkimukseen syntymää edeltävistä myrkyllisyysvaikutuksista (esim. testimenetelmä B.31 (17)). Jos tutkimus hermostonkehitykseen koh ­
distuvista myrkyllisyysvaikutuksista sisällytetään toiseen tutkimukseen, on 
tärkeää säilyttää kummankin tutkimustyypin yhtenäisyys. Kaikissa testeissä olisi noudatettava voimassa olevaa lainsäädäntöä taikka viranomaisten tai instituutioiden antamia ohjeita koe-eläinten käytöstä tutkimuksissa (kuten 
18).
 
4. Koelaboratorion on otettava huomioon kaikki testikemikaalista saatavilla 
olevat tiedot ennen tutkimuksen suorittamista. Näihin sisältyvät kemikaalin 
tunnistetiedot ja rakenne, sen fysikokemialliset ominaisuudet, kaikkien mui ­
den kemikaalilla  in vivo  tai in vitro  suoritettujen toksisuuskokeiden tulokset, 
rakenteellisesti samanlaisten aineiden toksikologiset tiedot ja kemikaalin odotettu käyttötapa. Nämä tiedot ovat välttämättömiä kaikkien asianosaisten 
vakuuttamiseksi siitä, että kokeella on merkitystä ihmisten terveyden suo ­
jelulle ja että sen avulla voidaan valita sopiva aloitusannos.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 787
 
TESTIN PERIAATE  
5. Testikemikaali annostellaan eläimille tiineys- ja imetysaikana. Emoja testa ­
taan tiineisiin ja imettäviin naaraisiin aiheutuvien vaikutusten arvioimiseksi 
ja mahdollisesti vertailutietojen tarjoamiseksi (emot poikasiin verrattuna). Poikaset valitaan poikueista sattumanvaraisesti neurotoksisuuden arviointia varten. Arviointiin sisältyy näkyvien neurologisten ja käytösmuutosten ha ­
vainnointi, mukaan lukien arviointi fyysisestä kehityksestä, käytöksen kehi ­
tyksestä, motorisesta aktiviteetista, motorisesta ja aistien toiminnasta sekä oppimisesta ja muistista; myös aivojen painoa ja neuropatologiaa syntymän jälkeisen kehityksen ja kypsän iän aikana arvioidaan.
 
6. Jos testimenetelmä toteutetaan erillisenä tutkimuksena, myös muita kussakin 
ryhmässä käytettävissä olevia eläimiä voidaan käyttää tiettyihin hermosto ­
peräisiin käyttäytymisoireisiin liittyviin, neuropatologisiin, neurokemiallisiin tai sähköfysiologisiin tutkimuksiin. Näin voidaan täydentää tässä testimene ­
telmässä suositelluista tutkimuksista saatuja tietoja (16)(19)(20)(21). Täy ­
dentävät tutkimukset voivat olla erityisen hyödyllisiä, kun empiiriset havain ­
not tai ennakoidut vaikutukset taikka menettely/vaikutustapa osoittavat ke ­
mikaalin neurotoksisuuden olevan tietyn tyyppistä. Näitä täydentäviä toi ­
menpiteitä voidaan soveltaa emoihin ja poikasiin. Lisäksi voidaan käyttää  
ex vivo - tai in vitro  -menettelyjä, kunhan ne eivät vaikuta  in vivo  -menet­
telyjen yhtenäisyyteen.
 
TESTIN VALMISTELU  
Eläinlajin valinta  
7. Suositeltavin testieläinlaji on rotta, mutta muita lajeja voidaan käyttää tar ­
vittaessa. On kuitenkin pantava merkille, että tässä testimenetelmässä mää ­
ritetyt tiineysajan ja synnytyksen jälkeiset päivät ovat ominaisia yleisesti käytetyille rottakannoille, joten eri lajeja tai epätavallisia kantoja käytettä ­
essä olisi valittava vertailukelpoiset päivät. Toisen lajin käyttöä olisi perus ­
teltava toksikologisilla, farmakokineettisillä ja/tai muilla tiedoilla. Peruste ­
luun olisi sisällyttävä lajispesifisten syntymän jälkeisiin hermostoperäisiin käytösoireisiin liittyvien ja neuropatologisten arviointien saatavuus. Jos aiemmassa testissä ilmeni ongelmia, siinä käytettyä lajia/kantaa olisi harkit ­
tava tarkemmin. Eri rottakantojen käyttöön liittyvien tehokkuuskriteerien 
vuoksi on todistettava, että valitun kannan hedelmällisyys ja vaste on riit ­
tävä. Muiden lajien käytön luotettavuutta ja herkkyyttä hermostonkehityk ­
seen kohdistuvien myrkyllisyysvaikutuksien havaitsemiseksi tulee 
dokumentoida.
 
Koe-eläinten häkit ja eläinten ruokinta  
8. Koe-eläinhuoneen lämpötilan pitäisi olla 22 ± 3 °C. Vaikka suhteellisen 
kosteuden pitäisi olla vähintään 30 % eikä mielellään yli 70 % muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, pitäisi kuitenkin pyrkiä 50–60 %:n suh ­
teelliseen kosteuteen. Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin 
jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Valaistussyklin suuntaa on myös mahdollista muuttaa ennen parittelua ja tutkimuksen keston ajaksi, jotta toimintaa ja käytöstä koskevia päätetapahtumia voidaan arvioida pi ­
meän aikana (punaisessa valossa), eli silloin kuin eläimet ovat tavanomai ­
sesti aktiivisia (22). Kaikkiin valaistussykliin tehtäviin muutoksiin olisi si ­
sällyttävä riittävä sopeutumisaika, jotta eläimet voivat mukautua uuteen sykliin. Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokava ­
liota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. Ravinnon ja veden tyyppi olisi 
ilmoitettava ja kummankin epäpuhtaudet olisi analysoitava.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 788
 
9. Eläimet voidaan pitää häkeissä yksittäin tai muutaman samaa sukupuolta 
olevan eläimen ryhmissä. Parituksen tulee tapahtua tarkoitukseen sopivissa 
häkeissä. Kun parituksen voidaan todeta tapahtuneen tai viimeistään tiiney ­
den 15. päivänä kukin pariutunut naaras siirretään omaan synnytys- tai poikimishäkkiinsä. Häkit on sijoitettava siten, että niiden sijainnista johtuvat 
vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Paritetuille eläimille on annet ­
tava synnytyksen lähestyessä asianmukaiset ja etukäteen määritellyt pesän ­
tekoaineet. On tiedossa, että epäasianmukainen käsittely tai tiineyden aikai ­
nen stressi voivat johtaa haitallisiin vaikutuksiin, kuten sikiön menetykseen 
sekä sikiön ja vastasyntyneen kehityksen muutoksiin. Jotta sikiön menettä ­
minen muista kuin altistukseen liittyvistä syistä estettäisiin, tiineiden eläin ­
ten tarpeetonta käsittelyä sekä ulkoisten tekijöiden, kuten melun, aiheutta ­
maa stressiä pitäisi välttää.
 
Eläinten valmistelu  
10. Olisi käytettävä terveitä eläimiä, jotka on totutettu laboratorio-olosuhteisiin 
ja joita ei ole aiemmin käytetty testeihin, ellei tutkimusta sisällytetä toiseen tutkimukseen (ks. 3 kohta). Koe-eläinten laji, kanta, alkuperä, sukupuoli, 
paino ja/tai ikä on tunnettava. Kullekin eläimelle olisi annettava oma tun ­
nistenumero ja se olisi merkittävä sillä. Eläinten tulee olla kaikissa testiryh ­
missä samanpainoisia ja -ikäisiä niin tarkasti kuin on käytännössä mahdol ­
lista ja olla tutkittavan lajin ja kannan normaaleissa rajoissa. Kullakin an ­
nostasolla tulee käyttää nuoria täysikasvuisia naaraita, jotka eivät ole syn ­
nyttäneet. Sisarusten pariutumista tulee välttää, ja tämän varmistamisesta olisi huolehdittava. Tiineyspäivä 0 on se päivä, jolloin vaginan tulpitus ja/tai sperma havaitaan. Riittävä sopeutumisaika (esim. kahdesta kolmeen päi ­
vään) pitäisi varmistaa, kun toimittajalta ostetaan eläimiä, joiden tiineyttä 
valvotaan. Paritetut naaraat olisi jaettava satunnaisesti kontrolli- ja testiryh ­
mään, ja eläimet olisi jaettava mahdollisuuksien mukaan tasaisesti molem ­
piin ryhmiin (jotta kaikki ryhmät jaetaan tasaisesti, suositellaan satunnaista 
ositettua menettelyä, kuten sellaista, joka perustuu ruumiinpainoon). Samoin 
on meneteltävä saman uroksen hedelmöittämien naaraiden kohdalla.
 
TESTIN SUORITTAMINEN  
Eläinten lukumäärä ja sukupuoli  
11. Kussakin testi- ja kontrolliryhmässä pitäisi olla tarpeeksi monta testikemi ­
kaalille altistettua tiineenä olevaa naarasta, jotta varmistetaan, että neurotok ­
sisuuden arviointia varten saadaan tuotettua riittävä määrä poikasia. Kutakin annostasoa varten suositellaan 20 poikuetta. Rinnakkaisia ja porrastettuja ryhmiä koskevat annostussuunnitelmat sallitaan, jos kunkin ryhmän poiku ­
eiden kokonaismäärät saavutetaan ja rinnakkaiskokeita varten käytetään asi ­
anmukaisia tilastollisia malleja.
 
12. Syntymän jälkeisenä päivänä, jäljempänä ‘SJP’, 4 tai sitä ennen (synnytys ­
päivä on syntymän jälkeinen päivä 0) kunkin poikueen kokoa olisi mukau ­
tettava poistamalla ylimääräiset poikaset satunnaisella valinnalla, jotta kaik ­
kien poikueiden koko on sama (23). Poikueen koko ei saisi ylittää käytetyn jyrsijäkannan keskimääräistä poikuekokoa (8–12). Poikueessa olisi oltava — mahdollisimman suuressa määrin — yhtä monta koiras- ja naaraspuolista 
poikasta. Poikasten valikoiva poistaminen esimerkiksi ruumiinpainon perus ­
teella ei ole tarkoituksenmukaista. Poikueiden yhdenmukaistamisen jälkeen (karsinta) ja ennen toiminnallisten päätetapahtumien testaamista kukin vie ­
roitusta edeltävään tai sitä seuraavaan testiin tarkoitettu poikanen olisi tun ­
nistettava yksilöllisesti käyttäen mitä tahansa inhimillistä keinoa poikasen 
tunnistamiseksi (esim. 24).
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 789
 
Eläinten jakaminen toiminnallisiin ja käyttäytymistä mittaaviin testei ­
hin, aivojen paino ja neuropatologiset arvioinnit  
13. Testimenetelmässä käytetään erilaisia tapoja jakaa kohdussa ja imettämisen 
aikana altistetut eläimet toiminnallisia ja käyttäytymistä mittaavia testejä, sukukypsyyttä ja aivojen painon määrittelyä sekä neuropatologista arviointia varten (25). Muita hermostoperäisiin käytösoireisiin (kuten sosiaalinen käyt ­
täytyminen), neurokemiaan tai neuropatologiaan liittyviä testejä voidaan 
lisätä tapauskohtaisesti sillä edellytyksellä, että alkuperäisten vaadittujen testien luotettavuutta ei vaaranneta.
 
14. Poikaset valitaan kustakin annosryhmästä ja niistä tehdään tutkittavien omi ­
naisuuksien arviointi syntymän jälkeisenä päivänä 4. Poikaset valitaan siten, 
että kustakin poikueesta valitaan mahdollisuuksien mukaan kumpaakin su ­
kupuolta jokaiseen annosryhmään niin, että ne ovat tasapuolisesti edustet ­
tuina kaikissa testeissä. Motorista aktiviteettia koskevassa testissä olisi tes ­
tattava samaa uros- ja naarasparia kaikissa vieroitusta edeltävissä ikäryh ­
missä (ks. 35 kohta). Kaikkien muiden testien osalta voidaan valita samoja tai erillisiä uros- ja naaraspareja erilaisiin käyttäytymistä mittaaviin testeihin. Kognitiivisia toimintoja mittaaviin vastavieroitettuja ja täysikasvuisia vertai ­
leviin testeihin voidaan joutua valitsemaan eri poikaset. Näin vältetään se, 
että ikä ja aikaisempi opetus häiritsevät näitä mittauksia (26)(27). Vieroitus ­
ajankohdalla (syntymän jälkeinen päivä 21) poikaset, joita ei ole valittu testeihin, voidaan lopettaa inhimillisellä tavalla. Kaikki poikasten valintaan 
liittyvät muutokset olisi raportoitava. Tilastollisen mittayksikön pitäisi olla 
poikue (tai emo), ei poikanen.
 
15. On erilaisia tapoja valita poikaset vieroitusta edeltäviin ja sitä seuraaviin 
tutkimuksiin, kognitiivisiin testeihin, patologisiin tutkimuksiin jne. (ks. kuva 
1 yleisestä suunnittelusta ja liite 1 valintatapoja koskevista esimerkeistä). Suositellut eläinten vähimmäismäärät kussakin annosryhmässä vieroitusta edeltäviä ja sitä seuraavia tutkimuksia varten ovat seuraavat: 
Kliiniset havainnot ja ruumiinpaino Kaikki eläimet 
Yksityiskohtaiset kliiniset havainnot 20/sukupuoli (1/sukupuoli/ 
poikue) 
Aivojen paino (fiksaation jälkeen) SJP 
11–22 10/sukupuoli (1/poikue) 
Aivojen paino (ilman fiksaatiota) ~ SJP 70 10/sukupuoli (1/poikue) 
Neuropatologia (immersio- tai perfuusiofik ­
saatio) SJP 11–22 10/sukupuoli (1/poikue) 
Neuropatologia (perfuusiofiksaatio) SJP 
~ 70 10/sukupuoli (1/poikue) 
Sukukypsyys 20/sukupuoli (1/sukupuoli/ 
poikue) 
Muut kehitykseen liittyvät tuntomerkit (va ­
paaehtoinen) Kaikki eläimet 
Käytöksen kehitys 20/sukupuoli (1/sukupuoli/ 
poikue) 
Motorinen aktiviteetti 20/sukupuoli (1/sukupuoli/ 
poikue) 
Motorinen ja aistien toiminta 20/sukupuoli (1/sukupuoli/ 
poikue) 
Oppiminen ja muisti 10/sukupuoli (
 a ) (1/poikue)  
( a ) Kognitiivista toimintaa koskevien testien herkkyydestä riippuen suuremman eläin ­
määrän tutkimista olisi harkittava, esimerkiksi enintään 1 koiras- ja 1 naaraspuo ­
linen eläin poikuetta kohti (eläinten valinta, ks. liite 1) (lisäohjeistus otoskoosta 
annetaan OECD:n ohjeasiakirjassa 43 (8)).  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 790
 
Annostasot  
16. On käytettävä vähintään kolmea annostasoa ja rinnakkaista kontrolliryhmää. 
Annostasojen välit määritetään siten, että toksiset vaikutukset saadaan por ­
rastettua. Mikäli testiaineen fysikokemialliset ominaisuudet tai biologiset vaikutukset eivät rajoita korkeimman annostason valintaa, se olisi valittava siten, että emoille aiheutetaan joitain myrkytysoireita (esim. kliinisiä löy ­
döksiä, ruumiinpainon väheneminen (ei yli 10 prosenttia) ja/tai todisteet 
annostusta rajoittavasta toksisuudesta kohde-elimessä). Korkeinta annosta ­
soa voidaan rajoittaa niin, että se on 1 000 mg/painokilo/vrk. On myös joitain poikkeustapauksia. Esimerkiksi odotettavissa oleva ihmisten altistu ­
minen voi merkitä, että tarvitaan korkeampaa annostasoa. Vaihtoehtoisesti 
olisi tehtävä esitutkimuksia tai alustavia raja-annostutkimuksia sellaisen suu ­
rimman käytettävän annoksen määrittämiseksi, jonka pitäisi aiheuttaa emoille vähiten myrkyllisyysvaikutuksia. Jos testikemikaalin on todettu ai ­
heuttavan sikiönkehitykseen kohdistuvia myrkyllisyysvaikutuksia tavan ­
omaisessa kehitystoksisuutta koskevassa tutkimuksessa tai esitutkimuksessa, suurimman annostason pitäisi olla suurin annos, joka ei aiheuta liikaa myr ­
kyllisiä vaikutuksia poikasissa tai kohdussa taikka vastasyntyneiden kuole ­
maa tai epämuodostumia, jotka riittäisivät estämään neurotoksisuuden asi ­
anmukaisen arvioinnin. Pienimmän annostason tavoitteena pitäisi olla se, että sillä ei aiheuteta mitään emoihin tai kehitykseen kohdistuvia myrkylli ­
syysvaikutuksia, mukaan lukien neurotoksisuus. Annostasot valitaan asteit ­
tain alenevasti. Näin osoitetaan mahdollinen annosvaste ja haitaton 
vaikutustaso (NOAEL) tai lähellä havaitsemisrajaa olevat annokset, joiden perustella voidaan määrittää vertailukohtana oleva annos. Vähintään kaksin ­
kertaiset ja enintään nelinkertaiset annostasojen välit ovat usein optimaa ­
liset, kun asetetaan alenevat annostasot. Usein on parempi lisätä neljäs 
annosryhmä kuin käyttää hyvin suuria annosvälejä (esimerkiksi yli kym ­
menkertaisia annosvälejä).
 
17. Annostasojen valinnassa olisi otettava huomioon kaikki aikaisemmat toksi ­
suustiedot sekä tiedot testikemikaalin tai sen kanssa samantyyppisten materi ­
aalien metaboloitumisesta ja toksikokineettisistä ominaisuuksista. Näillä tie ­
doilla voidaan myös tukea sen osoittamista, että annostus on valittu oikein. 
Annosten antamista suoraan poikasille olisi harkittava altistus- ja farmakoki ­
neettisten tietojen perusteella (28)(29). Ennen kuin tehdään tutkimuksia suo ­
rasta annostuksesta, olisi harkittava huolellisesti etuja ja haittoja (30).  
18. Rinnakkaisen kontrolliryhmän pitäisi olla joko plaseboa saava kontrolli ­
ryhmä tai kantaja-ainetta saava kontrolliryhmä, mikäli testikemikaalin anta ­
misen yhteydessä käytetään kantaja-ainetta. Kaikille ryhmille annetaan ta ­
vanomaisesti tilavuudeltaan sama määrä joko testikemikaalia tai 
kantaja-ainetta eläimen painon perusteella. Jos annostelun helpottamiseksi käytetään kantaja-ainetta tai muuta lisäainetta, on syytä selvittää: sen vai ­
kutus imeytymiseen, jakautumiseen, metaboloitumiseen tai elimistössä säi ­
lymiseen; vaikutukset testikemikaalin kemiallisiin ominaisuuksiin, jotka 
saattavat muuttaa sen toksisia ominaisuuksia; sekä vaikutukset koe-eläinten ravinnon ja juoman kulutukseen tai ravitsemustilaan. Kantaja-aine ei saisi aiheuttaa vaikutuksia, jotka voivat olla esteenä tutki ­
muksen tulkinnalle, eikä sillä saisi olla toksisia hermostoperäisiä käyttäyty ­
miseen kohdistuvia vaikutuksia tai vaikutuksia lisääntymiseen tai kehityk ­
seen. Jos käytetään uutta kantaja-ainetta, kantaja-ainetta saavan kontrolliryh ­
män lisäksi tutkimukseen sisällytetään plaseboa saava kontrolliryhmä. Kont ­
rolliryhmän tai -ryhmien eläimiä tulee käsitellä samalla tavoin kuin koeryh ­
män eläimiä.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 791
 
Antotapa  
19. Testikemikaalia tai kantaja-ainetta olisi annettava ihmisten altistumiselle 
asianmukaisinta reittiä. Tämä perustuu koe-eläinten metaboloitumisesta ja 
jakautumisesta saatavilla olevaan tietoon. Ainetta annetaan tavallisesti suun kautta (esim. letkulla, ravinnon tai juomaveden välityksellä), mutta myös muuta reittiä voidaan käyttää (esim. ihon tai inhalaation kautta). 
Tämä riippuu ominaisuuksista taikka odotettavissa olevista tai tunnetuista 
ihmisen altistusreiteistä (lisäohjeita annetaan ohjeasiakirjassa 43 (8)). Vali ­
tusta antoreitistä olisi esitettävä perustelu. Testiaine annetaan päivittäin suunnilleen samaan aikaan.
 
20. Kunkin eläinyksilön annoksen pitäisi yleensä perustua viimeisimpään eläi ­
men ruumiin painon määritykseen. Annoskoon määrittämisessä on kuitenkin toimittava erityisen huolellisesti viimeisen tiineyskolmanneksen aikana. Jos 
testikemikaalia saaneissa emoissa havaitaan kuitenkin liian suuria myrkylli ­
syysvaikutuksia, nämä eläimet on lopetettava inhimillisellä tavalla.
 
21. Testikemikaalia tai kantaja-ainetta olisi annosteltava vähintään päivittäin 
paritelluille naaraille munasolun kohdun seinämään kiinnittymisestä lähtien 
(tiineyspäivä 6) koko imetyksen ajan (SJP 21), jotta poikaset altistetaan 
testikemikaalille syntymää edeltävän ja sen jälkeisen neurologisen kehityk ­
sen aikana. Ikää, jolloin annostus aloitetaan sekä annostuksen kestoa ja tiheyttä voidaan mukauttaa, jos on näyttöä, jolla tuetaan ihmisten altistumi ­
sen suhteen asianmukaisempaa koejärjestelyä. Annostuksen kestoa olisi mu ­
kautettava toisiin lajeihin nähden, jotta altistuminen aivojen kehityksen var ­
haisessa vaiheessa (joka vastaa ihmisen aivojen syntymää edeltävää ja var ­
haista syntymän jälkeistä kasvuvaihetta) varmistetaan. Annostelu voidaan 
aloittaa tiineyden alkamisajankohdasta (tiineyspäivä 0). On kuitenkin kiin ­
nitettävä huomiota siihen mahdollisuuteen, että testikemikaali voi päättää tiineyden, ennen kuin munasolu kiinnittyy kohdun seinämään. Tiineyspäi ­
vänä 6 aloitetulla annostuksella vältettäisiin tämä riski, mutta kehitysvai ­
heita tiineyspäivän 0 ja 6 välillä ei katettaisi. Jos laboratorio hankkii aika ­
paritettuja eläimiä, ei ole käytännöllistä aloittaa annostusta tiineyspäivänä 0, vaan asianmukainen aloituspäivä on tiineyspäivä 6. Koelaboratorion olisi mukautettava annostusta testiaineen vaikutuksia koskevien asianmukaisten 
tietojen, aikaisempien kokemusten ja logististen näkökohtien perusteella. 
Tähän voi sisältyä annostuksen jatkaminen vieroituksen jälkeen. Annostelua ei suoriteta synnytyspäivänä niille eläimille, joiden synnytys on kesken. 
Yleisesti oletetaan, että poikaset altistuvat äidinmaidon kautta, mutta poika ­
sille suoraan annettavia annoksia olisi harkittava tapauksissa, joissa poikas ­
ten jatkuvasta altistuksesta puuttuu näyttöä. Näyttö jatkuvasta altistuksesta voidaan saada esimerkiksi farmakokineettisistä tiedoista, poikasiin kohdis ­
tuvasta toksisuudesta tai biomarkkereiden muutoksista (28).
 
TARKKAILU  
Emojen tarkkailu  
22. Kaikkien emojen terveydentilaa, sairastuneisuutta ja kuolleisuutta olisi seu ­
rattava ainakin kerran päivässä.  
23. Käsittelytoimenpide- ja havaintojaksojen aikana olisi tehtävä säännöllisesti 
yksityiskohtaisempia kliinisiä havaintoja (ainakin kahdesti tiineysajan an ­
nosten antamisjaksolla ja kahdesti imetysajan annosten antamisjaksolla) käyttäen ainakin kymmentä emoa annostasoa kohti. Koulutettujen teknikoi ­
den, jotka eivät ole tietoisia eläinten käsittelytiedoista, olisi tarkkailtava 
eläimiä niiden häkin ulkopuolella. Heidän pitäisi soveltaa standardoituja menettelyitä, joita käytetään eläinten stressin ja tarkkailijan ennakkokäsitys ­
ten vähimmäistämiseksi ja tarkkailijoiden välisen luotettavuuden maksimoi ­
miseksi. On suositeltavaa, että havainnot tietyssä tutkimuksessa tekee sama 
teknikko, kun tämä on mahdollista.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 792
 
24. Havaitut oireet on kirjattava. Myös havaittujen oireiden voimakkuus on 
kirjattava mahdollisuuksien mukaan. Kliinisiä havaintoja on tehtävä muun 
muassa ihon, karvapeitteen, silmien, limakalvojen, mahdollisten eritteiden erityksen sekä autonomisen hermoston toiminnan muutoksista (esimerkiksi kyynelvuoto, piloerektio, mustuaisen koko, poikkeavuudet hengityksessä 
ja/tai ilman haukkominen, kaikki virtsaamiseen tai ulostamiseen liittyvät 
epätavalliset oireet).
 
25. Myös kaikki kehon asentoon, aktiivisuustasoon (esimerkiksi vakioalueen 
vähentynyt tai lisääntynyt tutkiminen) ja liikekoordinaatioon liittyvät epäta ­
valliset vasteet on kirjattava. Muutokset käynnissä (esimerkiksi vaappumi ­
nen ja ataksia), asennossa (esimerkiksi selän köyristäminen) ja käsittelyyn, 
paikkaan tai muihin ympäristön ärsykkeisiin liittyvässä reaktiivisuudessa 
sekä klooniset tai tooniset liikkeet, kouristukset tai vapina, stereotypiat (esi ­
merkiksi ylenmääräinen turkin hoito, epätavalliset pään liikkeet, jatkuva kehän kiertäminen) tai omituinen käytös (esimerkiksi pureminen tai ylen ­
määräinen nuoleminen, itsensä silpominen, takaperin käveleminen, ääntely) 
tai aggressiivisuus on kirjattava.
 
26. Myrkytysoireet olisi kirjattava, mukaan lukien oireiden alkamispäivä, vuoro ­
kaudenaika, voimakkuus ja kesto.  
27. Eläimet punnitaan tutkimuksen aikana annosteluajankohdalla ainakin vii ­
koittain, synnytyspäivänä tai sen lähellä ja syntymän jälkeisenä päivänä 21 (vieroitus). Emot olisi punnittava letkuruokintatutkimuksia varten ainakin kahdesti viikossa. Annoksia olisi mukautettava kunkin painonmäärityksen 
ajankohdalla tarpeen mukaan. Ravinnonkulutusta olisi mitattava viikoittain 
vähintään tiineyden ja imetyksen aikana. Vedenkulutusta olisi mitattava ainakin viikoittain, jos eläin altistuu veden välityksellä.
 
Poikasten tarkkailu  
28. Kaikkien poikasten myrkytysoireita, sairastuneisuutta ja kuolleisuutta seura ­
taan ainakin kerran päivässä.  
29. Käsittelytoimenpide- ja havaintojaksojen aikana olisi tehtävä yksityiskohtai ­
sempia kliinisiä havaintoja poikasista. Koulutettujen teknikoiden, jotka eivät 
ole tietoisia eläinten käsittelytiedoista, olisi tarkkailtava poikasia (ainakin 
yksi poikanen/sukupuoli/poikue). Heidän pitäisi käyttää standardoituja me ­
nettelyitä tarkkailijan ennakkokäsitysten vähimmäistämiseksi ja tarkkailijoi ­
den välisen luotettavuuden enimmäistämiseksi. On suositeltavaa, että ha ­
vainnot tekee sama teknikko, kun tämä on mahdollista. Vähintään 24 ja 
25 kohdassa kuvattuja päätetapahtumia olisi tarkkailtava, kun se on asian ­
mukaista tarkkailtavassa kehitysvaiheessa.  
30. Kaikki poikasten myrkytysoireet olisi kirjattava mukaan lukien oireiden 
alkamispäivä, vuorokaudenaika, voimakkuus ja kesto.  
Fyysiset ja kehitystä koskevat tuntomerkit  
31. Muutokset vieroitusta edeltävissä kehitystä koskevissa tuntomerkeissä (esim. 
korvalehden avautuminen, silmien avautuminen, etuhampaan puhkeaminen) korreloivat merkittävästi ruumiinpainon kanssa (30)(31). Ruumiinpaino voi 
olla fyysisen kehityksen paras indikaattori. Kehitystä koskevien tuntomerk ­
kien määrittäminen on tämän vuoksi suositeltavaa ainoastaan, kun on en ­
nalta näyttöä, että näillä tuloksilla tarjotaan lisätietoja. Näiden parametrien arvioinnin ajoitus esitetään taulukossa 1. Oletetuista vaikutuksista ja ensim ­
mäisten määritysten tuloksista riippuen voi olla suositeltavaa lisätä muita 
ajankohtia tai tehdä määrityksiä muissa kehitysvaiheissa.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 793
 
32. Fyysisen kehityksen arvioinnissa on suositeltavaa käyttää syntymän jälkei ­
sen iän sijasta yhdynnän jälkeistä ikää (33). Jos poikasia testataan vieroi ­
tuspäivänä, on suositeltavaa, että testi tehdään ennen varsinaista vieroitusta, jotta vältetään vieroitukseen liittyvän stressin aiheuttama häiritsevä vaikutus. Lisäksi mitään vieroituksen jälkeistä poikasten testiä ei pitäisi suorittaa 
vieroituksen jälkeisen kahden päivän aikana.
 
Taulukko 1  
Fyysisten ja kehitystä koskevien tuntomerkkien sekä toiminnallisten ja käyttäytymistä 
mittaavien tulostapahtumien arvioinnin ajoittaminen  ( a ) 
Ikäväli 
Päätetapahtumat Ennen vieroitusta (  b ) Kasvuiässä (  b ) Nuoret täysikasvuiset (  b ) 
Fyysiset ja kehitystä koskevat tuntomerkit  
Ruumiinpaino ja klii ­
niset havainnot viikoittain (  c ) vähintään kahden 
viikon välein vähintään kahden 
viikon välein 
Aivojen paino SJP 22 (  d ) lopettamisen yhtey ­
dessä 
Neuropatologia SJP 22 (  d ) lopettamisen yhtey ­
dessä 
Sukukypsyys — tarvittaessa — Muut kehitystä koske ­
vat tunnusmerkit (
 e ) tarvittaessa — —  
Toiminnalliset ja käyttäytymistä mittaavat tulostapahtumat  
Käytöksen kehitys ainakin kaksi mää ­
ritystä 
Motorinen aktiviteetti 
(mukaan lukien tottu ­
minen) 1–3 kertaa (  f ) — kerran 
Motorinen ja aistien 
toiminta — kerran kerran 
Oppiminen ja muisti — kerran kerran  
( a ) Tähän taulukkoon sisältyvät vähimmäismäärät niistä kerroista, kun määritys olisi suoritettava. Oletetuista 
vaikutuksista ja ensimmäisten määritysten tuloksista riippuen voi olla suositeltavaa lisätä muita ajan ­
kohtia (esim. ikääntyneet eläimet) tai tehdä määrityksiä muissa kehitysvaiheissa. 
( b ) On suositeltavaa, ettei poikasia testata vieroituksen jälkeisen kahden päivän aikana (ks. 32 kohta). 
Kasvuiässä olevien eläinten testien ikäsuositukset ovat: oppiminen ja muisti = SJP 25 ± 2; motorinen 
ja aistien toiminta = SJP 25 ± 2. Nuorten täysikasvuisten eläinten suositusikä on SJP 60–70. 
( c ) Ruumiinpaino olisi mitattava ainakin kahdesti viikossa, kun poikaset saavat annokset suoraan, ja annok ­
sia mukautetaan ajankohdalla, jolloin painonnousu on nopeaa. 
( d ) Aivojen painoa ja neuropatologiaa voidaan arvioida tarvittaessa aiemmin (esim. SJP 11) (ks. 39 kohta). 
( e ) Ruumiinpainon lisäksi muut kehitystä koskevat tunnusmerkit (esim. silmien avautuminen) olisi tarvitta ­
essa kirjattava (ks. 31 kohta). 
( f ) Ks. 35 kohta.  
33. Elävät poikaset lasketaan ja niiden sukupuoli määritetään esim. silmämää ­
räisesti tai mittaamalla peräaukon ja sukupuolielinten välinen etäisyys 
(34)(35). Poikueen kukin poikanen olisi punnittava erikseen syntymähet ­
kellä tai pian sen jälkeen ainakin viikoittain koko imetyksen ajan vähintään kerran kahdessa viikossa sen jälkeen. Kun sukukypsyyttä arvioidaan, eläi ­
men ikä ja ruumiinpaino olisi määriteltävä emättimen avautuessa (36) tai 
esinahan erotessa terskasta (37) ainakin yhdestä uros- ja naarapuolisesta 
eläimestä poikuetta kohti.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 794
 
Käytöksen kehitys  
34. Valikoitujen käyttäytymistapojen kehittyminen määritellään ainakin yhden 
poikasen/sukupuolen/poikueen osalta asianmukaisen ikävälin aikana, ja sa ­
moja poikasia käytetään kaikkina testipäivinä kustakin arvioinnin kohteena olevasta käyttäytymistavasta. Mittauspäivät jaetaan tasaisesti kyseiselle ajan ­
jaksolle. Tällä tavoin määritellään kyseisen käyttäytymistavan kehityksen 
normaalit tai käsittelyyn liittyvät muutokset (38). Seuraavat ovat esimerk ­
kejä käytöstavoista, joiden kehittymistä voitaisiin arvioida: oikaisurefleksi, ylöspäin suuntautuva liike ja motorinen aktiviteetti (38)(39)(40).
 
Motorinen aktiviteetti  
35. Motorista aktiviteettia olisi seurattava (41)(42)(43)(44)(45) vieroitusta edel ­
tävällä ajanjaksolla ja täysikasvuisen iässä. Kun testi suoritetaan vieroituk ­
sen aikana, ks. 32 kohta. Testin olisi kestettävä riittävän pitkään, jotta voidaan osoittaa testijakson sisäinen sopeutuminen, kun kyseessä ovat altis ­
tamattomat kontrollit. Motorisen aktiviteetin käyttö käytöksen kehityksen 
arviointia varten on erittäin suositeltavaa. Jos sitä käytetään käytöksen ke ­
hityksen testaamiseen, testissä käytetään samoja eläimiä kaikkien vierotusta edeltävien testijaksojen osalta. Testejä pitäisi suorittaa tarpeeksi usein testi ­
jakson sisäisen sopeutumiskehityksen arviointia varten (44). Tämä saattaa 
edellyttää kolmea tai useampaa ajankohtaa vieroituspäivään mennessä ja se mukaan lukien (esim. SJP 13, 17, 21). Samojen eläinten tai saman poikueen eläinten testi olisi suoritettava myös täysikasvuisilla lähellä tutkimuksen 
päättymisajankohtaa (esim. SJP 60–70). Tutkimuksia lisäpäivinä voidaan 
suorittaa tarpeen mukaan. Motorista toimintaa olisi valvottava toimintaa mitattavalla automaattilaitteella, jolla voidaan selvittää toiminnan vähenty ­
minen ja lisääntyminen (eli laitteen mittaaman lähtötilanteen ei pitäisi olla 
niin alhainen, että toiminnan vähentymisen havaitseminen estetään, eikä niin 
suuri, että estetään toiminnan lisääntymisen havaitseminen). Kutakin laitetta olisi testattava vakiomuotoisilla menettelyillä, jotta toiminnan luotettavuus varmistetaan mahdollisuuksien mukaan laitteiden ja tutkimuspäivien osalta. 
Testiryhmiä olisi tasapainotettava mahdollisuuksien mukaan laitteisiin näh ­
den. Kukin eläin olisi testattava erikseen. Testiryhmiä olisi tasapainotettava testiajankohtiin nähden, jotta vältetään häiritsemästä toiminnan vuorokausi ­
rytmiä. Olisi pyrittävä varmistamaan, että testiolosuhteiden muutokset ovat 
mahdollisimman vähäiset ja että ne eivät liity järjestelmällisesti käsittelyyn. 
Muuttujat, jotka voivat vaikuttaa moniin käyttäytymistä, myös motorista aktiviteettia, koskeviin määrityksiin, ovat äänitaso, testihäkin koko ja muo ­
to, lämpötila, suhteellinen kosteus, valaistusolosuhteet, hajut, kotihäkin tai 
uuden testihäkin käyttö ja ympäristön häiriötekijät.
 
Motorinen ja aistien toiminta  
36. Motorista ja aistien toimintaa olisi tarkasteltava yksityiskohtaisesti ainakin 
kerran, kun eläin on kasvuiässä ja kerran, kun se on nuori täysikasvuinen eläin (esim. SJP 60–70). Jos testi suoritetaan vieroitusaikana, ks. 32 kohta. 
Olisi suoritettava riittävä testi, jotta sensorisesta toiminnasta (esim. somato ­
sensorinen, vestibulaarinen) ja motorisesta toiminnasta (esim. voimakkuus, koordinaatio) varmistetaan riittävä määrällinen näytteenotto. Muutamia esi ­
merkkejä motorisesta ja aistien toiminnasta ovat ojentajalihaksen työntövoi ­
marefleksi (46), suoristusrefleksi (47)(48), akustinen säpsähdysvaste 
(40)(49)(50)(51)(52)(53)(54) ja herätepotentiaalit (55).
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 795
 
Oppimisen ja muistin testaaminen  
37. Assosiatiivista oppimista ja muistia koskeva testi olisi suoritettava vieroi ­
tuksen jälkeen (esim. 25 ± 2 päivää) ja nuorilla täysikasvuisilla eläimillä 
(SJP 60 ja vanhempi). Kun testi suoritetaan vieroituksen aikana, ks. 32 kohta. Samaa tai eri testiä (testejä) voidaan käyttää näissä kahdessa kehi ­
tysvaiheessa. Vastavieroitettujen ja täysikasvuisten rottien oppimista ja 
muistia koskevien testien valinnan osalta sallitaan jonkin verran joustavuut ­
ta. Testit olisi kuitenkin suunniteltava siten, että täytetään kaksi kriteeriä. Ensinnäkin oppimista olisi arvioitava joko usean toistetun oppimista mittaa ­
vaan kokeen tai jakson kuluessa tapahtuneena muutoksena tai yhdestä ko ­
keesta muodostuvissa testeissä, kun kyseessä on olosuhde, joka ohjaa op ­
pimisen ei-assosiatiivisia vaikutuksia. Toiseksi testiin (testeihin) pitäisi si ­
sältyä jonkinlainen (lyhytaikaisen tai pitkäaikaisen) muistin mittaaminen alkuperäisen oppimisen (oppimistuloksen) lisäksi, mutta muistin mittaamista 
ei voida raportoida, jos samasta testistä saadut oppimistuloksen mittaamis ­
toimet puuttuvat. Jos oppimista ja muistia koskeva yksi tai useampi testi osoittaa testikemikaalin vaikutuksen, voidaan harkita täydentäviä testejä, joilla suljetaan pois sensoristen, motivationaalisten ja/tai motoristen valmi ­
uksien muutoksiin perustuvat vaihtoehtoiset tulkinnat. Edellisen kahden kri ­
teerin lisäksi suositellaan, että oppimista ja muistia mittaava testi valitaan sen perusteella, miten sen herkkyys osoitetaan tarkasteltavan kemikaalin luokan perusteella, jos tällaisia tietoja on saatavilla lähteissä. Jos tietoja ei 
ole, seuraavassa on esimerkkejä testeistä, joita voidaan tehdä edellä mainit ­
tujen kriteerien täyttämiseksi: passiivinen välttäminen (43)(56)(57), viiväs ­
tynyt asettuminen asentoon (delayed-matching-to-position), kun kyseessä ovat täysikasvuiset rotat (58) ja kun kyseessä on imeväisikäinen rotta (59), 
hajuihin totuttaminen (43)(60), Morrisin vesisokkelo (61)(62)(63), Bielin tai 
Cincinnatin sokkelo (64)(65), säteittäinen sokkelo (66), T-sokkelo (43) ja aikataululla valvotun käytöksen omaksuminen ja säilyttäminen (26)(67)(68). Täydentäviä testejä kuvataan vastavieroitettuja (26)(27) ja täysikasvuisia 
rottia (19)(20) koskevissa lähteissä.
 
Post mortem -tutkimus  
38. Emot voidaan lopettaa poikasten vieroituksen jälkeen.  
39. Poikasten neuropatologinen arviointi suoritetaan käyttäen kudoksia, jotka 
ovat peräisin eläimiltä, jotka lopetetaan inhimillisesti syntymän jälkeisenä päivänä 22 tai aikaisemmin syntymän jälkeisenä päivänä 11–22 taikka tut ­
kimuksen loppuvaiheessa. SJP 22:een mennessä lopetettujen poikasten ai ­
vokudoksia olisi arvioitava; testin loppuvaiheessa lopetettujen eläinten kes ­
kushermoston kudoksia ja ääreishermoston kudoksia olisi arvioitava. SJP 22:een mennessä lopetettujen eläinten näytteet voidaan fiksoida upottamis- 
tai perfuusiotekniikalla. Tutkimuksen loppuvaiheessa lopetettujen eläinten 
näytteet olisi fiksoitava perfuusion avulla. Kaikissa kudosnäytteiden fiksoin ­
tia koskevissa toimenpiteissä eläinten perfuusiosta kudosnäytteiden dissek ­
tioon, kudosten käsittelyyn ja objektilasien värjäykseen olisi käytettävä sel ­
laista tasapainottavaa mallia, että jokaiseen erään sisältyy edustavia näytteitä 
kustakin annosryhmästä. Lisäohjeita neuropatologiasta sisältyy OECD:n oh ­
jeasiakirjaan 20 (9), ks. myös (103).
 
Kudosnäytteiden käsittely  
40. Kaikki ruumiinavauksessa paljain silmin havaittavat poikkeavuudet on kir ­
jattava. Otettujen kudosnäytteiden on katettava kaikki keskeiset hermoston alueet. Kudosnäytteet olisi säilytettävä sopivassa kiinnitysaineessa ja niitä olisi käsiteltävä julkaistujen standardimuotoisten histologisten menettelyjen 
mukaisesti (69)(70)(71)(103). Parafiinivalun käyttö on hyväksyttävää 
keskushermoston kudoksien ja ääreishermoston kudoksien osalta, mutta
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 796
 
osmiumin käyttö fiksoinnin jälkeen yhdessä epoksivalun kanssa voi olla 
asianmukaista, kun tarvitaan suurempaa resoluutiota (esim. ääreishermoja 
varten, kun epäillään perifeeristä neuropatiaa, ja/tai ääreishermojen morfo ­
metrista analyysia varten). Morfometrista analyysia varten kerätty aivokudos olisi valettava sopivaan aineeseen kaikilla annostasoilla samaan aikaan. 
Näin vältetään kutistuneet artefaktit, jotka voivat liittyä pitkäaikaiseen säi ­
lytykseen fiksatiivissa (6).
 
Neuropatologinen tutkimus  
41. Kvalitatiivisen tutkimuksen tavoitteena on:  
täsmentää hermoston alueet, joilla esiintyy todisteita neuropatologisista 
muutoksista,  
täsmentää testiaineelle altistumisesta johtuvien neuropatologisten muu ­
tosten tyypit, ja  
määrittää neuropatologisten muutosten vakavuus.  
Asianmukaisesti koulutettu patologi tutkii kudosnäytteistä otettuja edustavia 
histologisia leikkeitä mikroskoopilla neuropatologisia muutoksia koskevista 
todisteista. Kaikille neuropatologisille muutoksille olisi annettava yksilölli ­
nen luokka, joka osoittaa muutoksen vakavuuden. Hekatoksyliini ja eosii ­
niväri voi olla riittävä inhimillisesti lopetettujen eläinten aivojen leikkeiden 
arviointia varten syntymän jälkeisenä päivänä 22 tai sitä ennen. Tutkimuk ­
sen loppuvaiheessa lopetettujen eläinten keskushermoston ja ääreishermos ­
ton kudosten leikkeille suositellaan kuitenkin myeliinivärjäystä (esim. luxol fast blue/cresyl violet) ja hopeavärjäystä (kuten Bielschowskyn tai Bodianin 
värjäys). Patologin ammatillisen harkinnan ja havaittujen muutosten tyypin 
perusteella muunlaisia värjäystekniikoita voidaan pitää asianmukaisena tie ­
tyntyyppisten muutosten tunnistamiseksi ja kuvaamiseksi (kuten GFAP-värjäys (gliaalinen fibrillaarinen hapan proteiini) tai lektiinihistoke ­
mia gliaalisten ja mikrogliaalisten muutosten arvioimiseksi (72), fluoro-jade 
-liuoksella värjääminen nekroosin havaitsemiseksi (73)(74), tai hermosolu ­
jen rappeutumiselle spesifiset hopeavärjäykset (75)).
 
42. Morfometrinen (kvantitatiivinen) arviointi olisi suoritettava, koska näillä 
tiedoilla voidaan auttaa havaitsemaan testeihin liittyvä vaikutus ja koska 
ne ovat hyödyllisiä tulkittaessa testeihin liittyviä aivojen painoa koskevia 
tai morfologisia muutoksia (76)(77). Hermokudoksesta olisi otettava näyte ja se olisi preparoitava morfometrista arviointia varten. Morfometrisiin ar ­
viointeihin voi sisältyä esim. aivojen tiettyjen alueiden lineaarinen tai areaa ­
linen mittaaminen (78). Lineaarisiin tai areaalisiin mittauksiin on käytettävä 
homologisia leikkeitä, jotka on valittu tarkasti luotettavien mikroskooppisten tuntomerkkien perusteella (6). Stereologiaa voidaan käyttää täsmentämään käsittelyyn liittyvät vaikutukset, jotka kohdistuvat parametreihin, kuten eri ­
tyisten neuroanatomisten alueiden volyymi tai solumäärä 
(79)(80)(81)(82)(83)(84).
 
43. Aivot olisi tutkittava, jotta todisteet käsittelyyn liittyvistä neuropatologista 
muutoksista havaitaan, ja kaikista aivojen tärkeimmistä alueista (kuten ha ­
jukäämit, aivokuori, hippokampus, tyvitumakkeet, talamus, hypotalamus, keskiaivot (keskiaivojen katto, keskiaivojen peite ja pikkuaivovarret), aivo ­
silta, ydinjatke, pikkuaivot) olisi otettava riittävät näytteet. Näin varmiste ­
taan perusteellinen tutkimus. On tärkeää, että kaikkien eläinten leikkeet otetaan samasta tasosta. Tutkimuksen lopussa inhimillisesti lopetetuilta täy ­
sikasvuisilta eläimiltä olisi otettava näytteeksi selkäytimen ja ääreishermos ­
ton edustavat leikkeet. Tarkasteltaviin alueisiin olisi kuuluttava silmä, nä ­
köhermo ja verkkokalvo mukaan lukien, selkäydin kaularangan ja lanneran ­
gan kohdalta, taka- ja etujuuren hermosäikeet, proksimaalinen lonkkahermo, proksimaalinen säärihermo (polven kohdalta) ja säärihermon puoleiset poh ­
jelihaksen haarat. Selkäytimestä ja ääreishermostosta on tehtävä poikittais- 
ja pitkittäisleikkeet.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 797
 
44. Neuropatologisessa arvioinnissa tarkastellaan, onko hermostolle aiheutu ­
neista kehityshäiriöistä viitteitä (6)(85)(86)(87)(88)(89) solumuutoksien 
(esim. hermosolujen vakuolisaatio, rappeuma, kuolio) ja kudosmuutoksien (esim. glioosi, leukosyyttien infiltraatio, kystien muodostuminen) lisäksi. Tältä osin on tärkeää, että käsittelyyn liittyvät vaikutukset erotetaan nor ­
maalista kehityksestä, jonka tiedetään tapahtuvan lopetusajankohtaa vastaa ­
vassa kehitysvaiheessa (90). Esimerkkeihin merkittävistä muutoksista, jotka viittaavat kehitysvaurioihin, sisältyvät mutta eivät pelkästään:
 
— hajukäämien, aivojen tai pikkuaivojen kokonaiskoon tai muodon muu ­
tokset  
— aivojen eri alueiden suhteellisen koon muutokset, mukaan lukien aluei ­
den koon pienentyminen tai suurentuminen, joka aiheutuu normaalisti 
tilapäisten solupopulaatioiden menettämisestä tai pysyvyydestä taikka 
aksonaalisesta kuljetuksesta (esim. pikkuaivojen ulompi jyvässolukerros, aivokurkiainen)
 
— muutokset solun jakaantumisessa, liikkumisessa ja erilaistumisessa, mitä 
osoittavat liiallinen apoptoosi tai kuolio, klusterit tai hajallaan olevat 
populaatiot ektooppisia, disorientoituneita tai epämuodostuneita neuro ­
neja, taikka muutokset aivokuoren rakenteiden eri kerrosten suhteelli ­
sessa koossa  
— hermosolujen myeliinin kehittymisen muutokset mukaan lukien yleinen 
koon pienentyminen tai myelinoitujen rakenteiden muuttunut värjäys  
— todisteet vesipäästä, erityisesti aivokammion laajentuminen, aivoneste ­
viemärin ahtauma ja aivopuoliskojen ohentuminen.  
Neuropatologisten muutosten annosvasteiden suhteen analyysi  
45. Seuraavaa asteittaista menetelmää suositellaan kvalitatiivisia ja kvantitatii ­
visia neuropatologisia analyysejä varten. Ensinnäkin korkean annostason ryhmästä otettuja leikkeitä verrataan kontrolliryhmän leikkeisiin. Jos kor ­
kean annostason eläinten ryhmässä ei havaita neuropatologisia muutoksia, 
myöhempää analyysiä ei tarvita. Jos korkean annoksen ryhmässä havaitaan 
neuropatologisia muutoksia, keskisuuren ja pienen annoksen ryhmän eläi ­
met tutkitaan. Jos korkean annoksen ryhmä tulee päätekohtaan kuoleman tai muun häiritsevän toksisuuden vuoksi, korkean annoksen ja keskisuuren 
annoksen ryhmiä olisi analysoitava neuropatologisista muutoksista. Jos pie ­
nemmän annoksen ryhmissä havaitaan neurotoksisuutta, niissä olisi tehtävä neuropatologinen analyysi. Jos käsittelyyn liittyviä neuropatologisia muu ­
toksia havaitaan kvalitatiivisessa tai kvantitatiivisessa tutkimuksessa, esiin ­
tyvyyden annosriippuvuus, vaurioiden tai morfometristen muutosten esiin ­
tyvyys ja vakavuus määritellään kaikista annosryhmistä peräisin olevien eläinten arvioinnin perusteella. Kaikki alueet aivoissa, joissa havaitaan to ­
disteita neuropatologisista muutoksista, olisi sisällytettävä tähän arviointiin. 
Jokaisen vauriotyypin osalta kunkin vakavuusasteen määrittelyyn käytetyt 
ominaispiirteet olisi määriteltävä, ja niissä olisi ilmoitettava yksityiskohdat, joita käytetään kunkin luokan erottamiseen. Kunkin vauriotyypin osalta sen yleisyys ja vakavuusaste olisi kirjattava ja olisi tehtävä tilastollinen analyysi 
annos-vastesuhteen luonteen arvioimiseksi. Koodattujen objektilasien käyt ­
töä suositellaan (91).
 
TIEDOT JA RAPORTOINTI  
Tiedot  
46. Tiedot olisi ilmoitettava erikseen ja esitettävä taulukkomuodossa, josta il ­
menevät kunkin testiryhmän osalta muutostyypit, emojen ja poikasten määrä sukupuolittain sekä poikueiden määrä kutakin muutosta kohti. Jos poikasten 
syntymän jälkeinen suora altistaminen on suoritettu, olisi ilmoitettava altis ­
tusreitti, kesto ja altistusajankohta.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 798
 
Tulosten arviointi ja tulkinta  
47. Tutkimuksessa hermostonkehitykseen kohdistuvista myrkyllisyysvaikutuk ­
sista tarjotaan tietoja toistuvasta altistumisesta kemikaalille kohdussa ja 
vastasyntyneen kehitysvaiheessa. Koska tutkimuksessa painotetaan yleisten ja hermostonkehitykseen vaikuttavien myrkyllisyysvaikutusten päätetapahtu ­
mia, tutkimustulosten perusteella voidaan jossain määrin erotella toisaalta ne 
hermoston kehitykseen kohdistuvat vaikutukset, joiden osalta emoilla ei 
ilmene myrkyllisyysvaikutuksia, sekä toisaalta ne vaikutukset, jotka ilmene ­
vät ainoastaan tasoilla, jotka ovat myrkyllisiä myös emoille. Tutkimussuun ­
nitelman, tilastoanalyysin ja tietojen biologisen merkitsevyyden välisten 
monimutkaisten yhteyksien vuoksi asiantuntijan on tulkittava asianmukai ­
sesti tietoja hermostonkehitykseen kohdistuvista myrkyllisyysvaikutuksista (107)(109). Testitulosten tulkintaan olisi käytettävä painoarvoanalyysiä (20)(92)(93)(94). Käytöstä koskevia tai morfologisia löydöksiä, jos niitä 
on, sekä annosvasteita koskevaa näyttöä olisi käsiteltävä. Tähän olisi sisäl ­
lyttävä tiedot kaikista tutkimuksista, jotka koskevat hermostonkehitykseen vaikuttavia myrkyllisyysvaikutuksia, mukaan lukien ihmisen epidemiologi ­
set tutkimukset tai tapausselostukset ja eläimillä tehdyt kokeet (esim. tok ­
sikokineettiset tiedot, rakenne-aktiivisuustiedot, tiedot muista toksisuustutki ­
muksista). Tähän sisältyy testikemikaalin annosten välinen suhde ja kaik ­
kien neurotoksisten vaikutusten olemassaolo tai puuttuminen, esiintyvyys ja laajuus kummankin sukupuolen osalta (20)(95).
 
48. Tietojen arviointiin pitäisi sisältyä pohdinta biologisesta ja tilastollisesta 
merkittävyydestä. Tilastoanalyysiä olisi pidettävä välineenä, joka ohjaa tie ­
tojen tulkintaa sen sijaan, että se määrittää sitä. Tilastollisen merkittävyyden puute ei saisi olla ainoa peruste päätelmälle siitä, että altistusvaikutus puut ­
tuu, ja tilastollinen merkittävyys ei saisi olla ainoa peruste tehdä päätelmä 
altistusvaikutuksesta. Jotta mahdollisia vääriä negatiivisia havaintoja ei esi ­
tettäisi ja negatiivisilla kontrolleilla saatujen tulosten todistamiseen liittyvät hankaluudet vältettäisiin, olisi käsiteltävä käytettävissä olevia positiivisia ja 
aikaisempia kontrollitutkimuksien tietoja erityisesti, jos mitään altistukseen 
liittyviä vaikutuksia ei esiinny (102)(106). Väärien positiivisten löydöksien mahdollisuutta olisi pohdittava tietojen kaikkien tilastollisten arvioiden poh ­
jalta (96). Arviointiin pitäisi sisältyä havaittujen neuropatologisten ja käyt ­
täytymiseen liittyvien muutosten välinen mahdollinen suhde.
 
49. Kaikkia tuloksia olisi analysoitava käyttämällä koesuunnittelun kannalta 
asianmukaisimpia tilastollisia malleja (108). Parametrisen tai ei-parametrisen analyysin valintaa olisi perusteltava ottaen huomioon esi ­
merkiksi tietojen laatu (onko niitä muunneltu) ja niiden jakelu sekä valitun 
tilastoanalyysin suhteellinen luotettavuus. Tutkimuksen tarkoituksen ja 
suunnittelun pitäisi ohjata tilastoanalyysien valintaa tyypin I (väärä positii ­
vinen) ja tyypin II (väärä negatiivinen) virheiden vähimmäistämiseksi (96)(97)(104)(105). Hermostonkehitystä koskevissa tutkimuksissa, joissa 
käytetään useita poikasia kerrallaan synnyttäviä lajeja, joiden poikueesta 
testataan useita poikasia, poikue olisi sisällytettävä tilastolliseen malliin. Tarkoitus on välttää lisäämästä tyypin I virheiden määrää (98)(99)(100)(101). Tilastollisen mittayksikön pitäisi olla poikue, ei poika ­
nen. Kokeet olisi suunniteltava siten, että samaan poikueeseen kuuluvia 
poikasia ei käsitellä erillisten havaintojen tavoin. Kaikkia päätetapahtumia, joita mitataan toistuvasti samalla kohteella, olisi analysoitava käyttämällä tilastollisia malleja, joissa otetaan huomioon, että kyseiset toimenpiteet eivät 
ole toisistaan riippuvaisia.
 
Tutkimusseloste  
50. Tutkimusselosteessa on annettava seuraavat tiedot:  
Testikemikaali:  
— fysikaalinen olomuoto ja tarvittaessa fysikokemialliset ominaisuudet  
— tunnistetiedot, mukaan lukien lähde  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 799
 
— valmisteen puhtaus ja tunnetut ja/tai oletetut epäpuhtaudet.  
Kantaja-aine (tarvittaessa):  
— perusteet kantaja-aineen valinnalle, jos se on muu kuin vesi tai fysiolo ­
ginen keittosuolaliuos.  
Koe-eläinlajit:  
— käytetty eläinlaji ja kanta sekä perustelu, jos se on muu kuin rotta  
— koe-eläinten toimittaja  
— eläinten lukumäärä, ikä testin alussa ja sukupuoli  
— toimittaja, häkit, ravinto, vesi ja niin edelleen  
— kunkin eläimen paino testin alussa.  
Testiolosuhteet:  
— annostasojen valintaperusteet  
— annostelureittiä ja ajankohtaa koskevat valintaperusteet  
— selvitys annetuista annoksista, mukaan lukien selonteko kantaja-aineesta 
sekä annostellun aineen määrästä ja fysikaalisesta olomuodosta  
— yksityiskohtaiset tiedot testikemikaalin koostumuksesta/ravintovalmis ­
teesta, saavutetusta pitoisuudesta, stabiiliudesta ja tasalaatuisuudesta  
— emojen ja poikasten yksilölliseen tunnistamiseen käytetty menetelmä  
— yksityiskohtainen kuvaus satunnaisottoa koskevasta menettelystä (me ­
nettelyistä), jota sovelletaan, kun emoja valitaan koeryhmiin, poikasia karsitaan ja ne jaetaan testiryhmiin
 
— yksityiskohtaiset tiedot testikemikaalin antotavasta  
— ravintoon/juomaveteen sekoitetun hengitysteiden altistukseen liittyvän 
testin testikemikaalin pitoisuuden (ppm) muuntaminen todelliseksi an ­
nokseksi (mg/painokilo/vrk) tarvittaessa  
— ympäristöolosuhteet  
— yksityiskohtaiset tiedot ravinnon ja veden (esim. hanavesi, tislattu vesi) 
laadusta  
— testin alku- ja päättymispäivä.  
Havainnointi ja testausmenetelmät:  
— yksityiskohtainen kuvaus menettelyistä, joita käytetään standardoimaan 
havainnot ja menettelyt sekä operatiiviset määritelmät pisteytykseen liit ­
tyville havainnoille  
— luettelo kaikista käytetyistä testimenettelyistä ja perustelut niiden käy ­
tölle 
— yksityiskohtaiset tiedot sovelletuista käyttäytymiseen/toimintaan liitty ­
vistä, patologisista, neurokemiallisista ja sähköfysiologisista menette ­
lyistä mukaan lukien yksityiskohtaiset tiedot automaattilaitteista  
— laitteiden kalibrointia ja niiden vastaavuuden varmistamista koskevat 
menetelmät sekä koeryhmien tasapainottaminen testausmenettelyissä  
— lyhyt perustelu, jossa selvitetään päätöksiä, joihin liittyy 
asiantuntija-arvio.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 800
 
Tulokset (yksittäiset ja yhteenveto, mukaan lukien tarvittaessa keskiarvo ja 
varianssi):  
— eläinten lukumäärä tutkimuksen alussa ja tutkimuksen lopussa  
— kutakin testimenetelmää varten käytettyjen eläinten ja poikueiden määrä  
— kunkin eläimen tunnistenumero ja poikue, josta se on peräisin  
— poikueen koko ja keskimääräinen syntymäpaino sukupuolittain erotel ­
tuna 
— ruumiinpainoa ja sen muutoksia koskevat tiedot, mukaan lukien emon ja 
poikasten ruumiinpaino lopetettaessa  
— ravinnon ja tarvittaessa veden kulutus (esim. jos testikemikaalia annos ­
tellaan veden kautta)  
— toksiset vastetiedot sukupuolen ja annostason perusteella, mukaan lukien 
toksisuusoireet tai kuolleisuus, ja tarvittaessa kuolinaika ja -syy  
— yksityiskohtaisten kliinisten havaintojen luonne, vaikeusaste, kesto, oi ­
reiden alku, ajankohta ja myöhempi kehitys  
— kunkin kehitystä koskevan päätetapahtuman tilanne (paino, sukukypsyys 
ja käytöksen kehitys) kunakin havainnointiaikana  
— yksityiskohtainen kuvaus kaikista hermostoperäisiin käyttäytymisoirei ­
siin liittyvistä, toiminnallisista, neuropatologisista, neurokemiallista tai sähköfysiologisista löydöksistä sukupuolen perusteella, mukaan lukien niiden lisääntyminen ja vähentyminen kontrollitietojen perusteella
 
— ruumiinavauslöydökset  
— aivojen paino  
— havainnot hermostollisista oireista tai vaurioista mukaan lukien luonnol ­
lisesti esiintyvät sairaudet tai tilat  
— kuvat esimerkkilöydöksistä  
— morfometriassa käytettyjen leikkeiden homologian arviointiin käytetyt 
vähän tehoa kuluttavat kuvat  
— tiedot absorboitumisesta ja metaboloitumisesta, mukaan lukien täyden ­
tävät tiedot erillisestä toksikokineettisestä tutkimuksesta, mikäli saa ­
tavissa  
— tulosten tilastollinen käsittely, mukaan lukien tietojen analysointiin käy ­
tetyt tilastolliset mallit ja tulokset riippumatta siitä, olivatko ne merkit ­
tävät  
— luettelo tutkimushenkilöstöstä, mukaan lukien ammatillinen koulutus.  
Tulosten tarkastelu:  
— annos-vaste-tulokset sukupuolen ja ryhmän mukaan  
— kaikkien muiden myrkyllisyysvaikutusten suhde testikemikaalin mahdol ­
lisesta neurotoksisuudesta tehtyihin johtopäätöksiin sukupuolen ja ryh ­
män perusteella  
— toksikokineettisten tietojen vaikutus päätelmiin  
— vaikutukset, jotka ovat samankaltaisia tunnettujen neurotoksisten ainei ­
den kanssa  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 801
 
— testimenettelyn luotettavuutta ja herkkyyttä tukevat tiedot (kuten positii ­
viset ja aikaisemmat kontrollitiedot)  
— mahdolliset suhteet neuropatologisten ja toiminnallisten vaikutusten vä ­
lillä 
— haitaton tai vertailukohtana oleva annos emoille ja poikasille sukupuolen 
ja ryhmän perusteella.  
Päätelmät:  
— pohdinta tietojen yleisestä tulkinnasta tulosten perusteella, mukaan lu ­
kien johtopäätös siitä, aiheuttiko testikemikaali hermostonkehitykseen vaikuttavia myrkyllisyysvaikutuksia, ja haitattomasta vaikutustasosta.
 
KIRJALLISUUSVIITTEET  
(1) OECD (1995). Draft Report of the OECD  Ad Hoc  Working Group on 
Reproduction and Developmental Toxicity. Copenhagen, Denmark, 
13–14 June 1995.  
(2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects 
Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Available: [http://www.epa.gov/opptsfrs/ 
OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].
 
(3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 
630/R-95/001F. Available: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisp ­
lay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].  
(4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., 
Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize de ­
velopmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79–91.
 
(5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., 
Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., 
Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101–111.
 
(6) Garman, R.H., Fix, A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Clau ­
dio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize develop ­
mental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropatholo ­
gy. Environ. Health Perspect., 109:93–100.  
(7) OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on 
Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23–25 October 2000.
 
(8) OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian 
Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, 
OECD, Paris. July 2008. Saatavilla sivustolla: [http://search.oecd.org/offi ­
cialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mo ­
no(2008)16&doclanguage=en].  
(9) OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, September 2003. Saa ­
tavilla sivustolla: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_ 
34377_ 1916054_1_1_1_1,00.html].
 
(10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantita ­
tive comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173–292.
 
(11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000)  Experimental and 
Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition,  ISBN 0195084772, Oxford Univer ­
sity Press, New York.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 802
 
(12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental 
factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. 
Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188–197.  
(13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998)  Handbook of Developmental Neuroto ­
xicology , 1 st Edition , ISBN 0126488606, Academic Press, New York.  
(14) Tämän liitteen B.34 luku ”Myrkkyjen vaikutus lisääntymiskykyyn (yhden 
sukupolven testi)”.  
(15) Tämän liitteen B.35 luku ”Kaksi sukupolvea käsittävä lisääntymiskykyyn 
kohdistuvien myrkyllisyysvaikutusten tutkimus”.  
(16) Tämän liitteen B.43 luku ”Neurotoksisuustutkimus jyrsijöillä”.  
(17) Tämän liitteen B.31 luku ”Prenataalisen kehityksen aikaisten myrkyllisyys ­
vaikutusten tutkimus”.  
(18) Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivi 2010/63/EU, annettu 
22 päivänä syyskuuta 2010, tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten suojelusta (EUVL L 276, 20.10.2010, s. 33).
 
(19) WHO (1986)  Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals , (Environmental Health Criteria 
60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, 
USA. Available: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].  
(20) WHO (2001)  Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles 
and Approaches,  (Environmental Health Criteria 223), World Health Or ­
ganization Publications, Geneva. Saatavilla: [http://www.intox.org/data ­
bank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].  
(21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995)  Neurotoxicology: Approaches and Met ­
hods , 1 st Edition , ISBN 012168055X, Academic Press, New York.  
(22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on 
neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxi ­
col. Teratol., 19:499–509.  
(23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent 
litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2–6.  
(24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. 
Animal Sci., 27:110–112.  
(25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a pri ­
mary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118–136.
 
(26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979)  Ontogeny of Learning and Memory . 
ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.  
(27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987)  Pe­
rinatal Development: A Psychobiological Perspective.  Academic Press, 
Orlando.  
(28) Zoetis, T., Walls, I. (2003)  Principles and Practices for Direct Dosing of 
Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research . ILSI Press, 
Washington, DC.  
(29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning ro ­
dents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert 
working group. Int. J. Toxicol., 24:87–94.  
(30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to 
improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1–4.  
(31) ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to 
Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceu ­
ticals for Human Use.
 
(32) Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in 
existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical consi ­
derations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433–439.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 803
 
(33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal 
age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter 
gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449–457.
 
(34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. 
(1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital 
distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Rep ­
rod. Toxicol., 13:383–390.  
(35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, 
L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but 
not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350–365.
 
(36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., 
Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. To ­
xicol. Teratol., 7:579–586.
 
(37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separa ­
tion as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298–303.
 
(38) Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal 
period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489–95.  
(39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in 
the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896–920.  
(40) Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In:  Handbook of 
Behavioral Teratology.  Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, 
New York, s. 67–100.  
(41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods 
with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53–66.  
(42) Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measu ­
rement of spontaneous motor activity,  Handbook of Psychopharmacology , 
Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, 
New York, s. 37–82.  
(43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neuroto ­
xicity following neonatal exposure to 3,3 ′-iminodipropionitrile in the rat. 
Neurotoxicol. Teratol., 15:117–129.  
(44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor 
activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247–260.  
(45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., 
Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of motor 
activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599–609.
 
(46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) 
Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neuroto ­
xicol. Teratol., 19:1997. 405–411.  
(47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for 
measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Phy ­
siol. Behav., 64:661–669.  
(48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective 
method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 40:589–591.  
(49) Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In:  Neural Mechanisms 
of Startle Behavior , Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, s. 
287–351  
(50) Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 
59:107–128.  
(51) Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory 
dysfunction. In  TARGET Organ Toxicology Series: Neurotoxicology , Til­
son, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, s. 181–211.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 804
 
(52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function 
using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 
8:199–211.  
(53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxi ­
city in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25–30.
 
(54) Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory 
processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 
6:437–445.  
(55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked po ­
tentials into neurotoxicity test schemes. In:  TARGET Organ Toxicology 
Series: Neurotoxicity , Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New 
York. s. 125–145.  
(56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory 
deficits in rats following exposure to 3,3 ′-iminopropionitrile. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 105:321–332.  
(57) Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter 
involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247–296.
 
(58) Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior 
and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 
10:237–244.  
(59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working me ­
mory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98–105.  
(60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor 
paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 
17:465–479.  
(61) Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying 
spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47–60.  
(62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water 
maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29–69.  
(63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze 
in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60–90.  
(64) Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance 
in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235–241.
 
(65) Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction 
after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387–399.  
(66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and 
Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced micro ­
cephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327–332.  
(67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity 
of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 
71:342–352.  
(68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term me ­
mory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338–341.  
(69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A 
technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 
28: 122–131.  
(70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994)  Laboratory 
Methods in Histotechnology , American Registry of Pathology, Washing ­
ton, DC, s. 84–107.  
(71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002)  Theory and Practice of Histological 
Techniques , 5 th edition, Churchill Livingstone, London.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 805
 
(72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evalua ­
tion of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and 
microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291–304.
 
(73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer 
for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123–130.  
(74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) 
Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 
53:365–372.  
(75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) 
Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and 
semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545–561.
 
(76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, 
J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing 
on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Envi ­
ron. Toxicol. Pharmacol., 19:745–755.
 
(77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, 
M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., 
O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gunder ­
sen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmen ­
tal neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417–432.
 
(78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference 
with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 
1:129–135.  
(79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998)  Unbiased Stereology: 
Three-Dimensional Measurement in Microscopy , Springer-Verlag, New 
York.  
(80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A practi ­
cal primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305–310.  
(81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total num ­
bers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbi ­
ased stereological method. Brain Res., 609: 262–268.  
(82) Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in 
disector stereology. J. Neurocytol., 26:707–710.  
(83) West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of 
neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51–61.
 
(84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. 
Neuroscience, 130: 813–831.  
(85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of 
growth deficiency in rats exposed  in utero  to undernutrition, ethanol, or 
the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 
49:113–121.  
(86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypo ­
xic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain 
Res., 84:294–298.  
(87) Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental 
neurotoxicology. In:  Handbook of Developmental Neurotoxicology , Slik­
ker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, s. 3–41.  
(88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, 
K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade 
of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing 
brain. Science, 283:70–74.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 806
 
(89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., 
Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, 
K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056–1060.
 
(90) Friede, R. L. (1989)  Developmental Neuropathology . Second edition. 
Springer-Verlag, Berlin.  
(91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison 
of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127–133.
 
(92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure 
standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401–405.  
(93) US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA 
NCEA-F-0644A.  
(94) US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, 
Federal Register 61(212): 56274–56322.  
(95) Danish Environmental Protection Agency (1995)  Neurotoxicology.  Review 
of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefo ­
ged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.  
(96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for 
appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicolo ­
gy, 5:113–126.  
(97) Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special emp ­
hasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8:21–27.  
(98) Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental stu ­
dies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329–335.  
(99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in 
teratology studies. Teratology, 12:165–172.  
(100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of 
prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 
14: 221–228.  
(101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. 
(1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587–90.
 
(102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. 
(2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in de ­
velopmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345–352.  
(103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an  ad hoc  
working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. 
(2006) A ‘best practices’ approach to neuropathological assessment in 
developmental neurotoxicity testing — for today. Toxicol. Pathol. 34:296–313.
 
(104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures ana ­
lysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205–210.
 
(105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical 
certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 
41:295–301.  
(106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, 
S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental 
neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk 
Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):266–287.  
(107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. 
(2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute ex ­
pert working group on neurodevelopmental endpoints.  Neurotoxicology 
and Teratology,  30(4):288–325.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 807
 
(108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, 
W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental 
neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):326–348.
 
(109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and 
Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental 
neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):349–381.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 808
 
Kuva 1  
Toimintaan/käyttäytymisoireisiin liittyviä testejä, neuropatologista arviointia ja aivojen painoa 
koskeva yleinen testausjärjestelmä. Tämä kaavio perustuu 13–15 kohdan kuvaukseen (SJP = 
syntymän jälkeinen päivä). Eläinten valintaa koskevia esimerkkejä annetaan liitteessä 1
  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 809
 
Lisäys 1  
1. Esimerkkejä eläinten mahdollisista jakamistavoista kuvataan ja esitetään 
taulukossa jäljempänä. Näillä esimerkeillä kuvataan sitä, että koe-eläinten 
valinta eri testimalleihin voidaan toteuttaa eri tavoin.  
Esimerkki 1  
2. Yhtä ryhmää — 20 poikasta/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros ja 1 naaras 
poikuetta kohti) — käytetään käytöksen kehitystä koskevaan vieroitusta 
edeltävään testiin. Näistä eläimistä 10 poikasta/sukupuoli/annostaso (eli 1 
uros ja 1 naaras poikuetta kohti) lopetetaan inhimillisesti syntymän jälkei ­
senä päivänä 22. Aivot poistetaan, punnitaan ja käsitellään histopatologi ­
sessa tutkimuksessa. Lisäksi aivojen painoja koskevat tiedot kerätään käyt ­
tämällä jäljelle jääneiden 10 uroksen ja 10 naaraan irrotettuja aivoja annos ­
tasoa kohti.  
3. Toista ryhmää — 20 eläintä/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros ja 1 naaras 
poikuetta kohti) — käytetään toimintaa/käyttäytymistä koskevaan vieroituk ­
sen jälkeiseen testiin (yksityiskohtaisten kliinisten havaintojen, motorisen aktiviteetin, akustisen säpsähdysvasteen ja kognitiivisen toiminnan testaa ­
minen kasvuikäisten eläinten osalta) ja sukukypsyysiän arviointiin. Näistä 
10 eläintä/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros ja 1 naaras poikuetta kohti) nu ­
kutetaan ja fiksoidaan perfuusiotekniikalla tutkimuksen päätösvaiheessa (ar ­
violta syntymän jälkeinen päivä 70). Uuden fiksaation  in situ  jälkeen aivot 
poistetaan ja käsitellään neuropatologisessa tutkimuksessa.
 
4. Nuorten täysikasvuisten eläinten (esim. syntymän jälkeinen päivä 60–70) 
kognitiivisen toiminnan testaukseen käytetään kolmatta ryhmää, jossa on 20 poikasta/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros ja 1 naaras poikuetta kohti). Näistä 10 eläintä/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros ja 1 naaras poikuetta kohti) 
lopetetaan tutkimuksen päättyessä ja aivot poistetaan ja punnitaan.
 
5. Jäljelle jääneet 20 eläintä/sukupuoli/ryhmä varataan mahdollisia täydentäviä 
kokeita varten.  
Taulukko 1  
Poikasten 
määrä (  a ) Kokeisiin valittujen 
poikasten määrä Tutkimus/Testi 
uros naaras  
1 5 20 urosta + 20 naarasta Käytöksen kehitys 
10 urosta + 10 naarasta SJP 22 aivojen paino/neuropa ­
tologia/morfometria 
10 urosta + 10 naarasta SJP 22 aivojen paino 
2 6 20 urosta + 20 naarasta Yksityiskohtaiset kliiniset ha ­
vainnot 
20 urosta + 20 naarasta Motorinen aktiviteetti 20 urosta + 20 naarasta Sukukypsyys 
20 urosta + 20 naarasta Motorinen ja aistien toiminta 
20 urosta + 20 naarasta Oppiminen ja muisti (SJP 25) 10 urosta + 10 naarasta Nuoren täysikasvuisen yksilön 
aivojen paino/neuropatologia/ 
morfometria ~ SJP 70
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 810
 
Poikasten 
määrä (  a ) Kokeisiin valittujen 
poikasten määrä Tutkimus/Testi 
uros naaras  
3 7 20 urosta + 20 naarasta Oppiminen ja muisti (nuoret 
täysikasvuiset eläimet) 
10 urosta + 10 naarasta Nuorten täysikasvuisten eläin ­
ten aivojen paino ~ SJP 70 
4 8 — Varalla olevat eläimet poikasten 
korvaamista tai täydentäviä ko ­
keita varten  
( a ) Tässä esimerkissä poikueet karsitaan 4 urokseen + 4 naaraaseen; urospuoliset poik ­
aset numeroidaan yhdestä neljään ja naaraspuoliset poikaset viidestä kahdeksaan.  
Esimerkki 2  
6. Yhtä ryhmää — 20 poikasta/sukupuoli/annostasoa (eli 1 uros ja 1 naaras 
poikuetta kohti) — käytetään käytöksen kehitystä koskevaan vieroitusta 
edeltävään testiin. Näistä eläimistä 10 pentua/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros tai yksi naaras poikuetta kohti) lopetetaan inhimillisesti syntymän jäl ­
keisenä päivänä 11. Aivot poistetaan, punnitaan ja käsitellään histopatolo ­
gisessa tutkimuksessa.
 
7. Toista ryhmää — 20 eläintä/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros ja 1 naaras 
poikuetta kohti) — käytetään vieroituksen jälkeisiin testeihin (yksityiskoh ­
taisten kliinisten havaintojen, motorisen aktiviteetin ja sukukypsyysiän sekä 
motorisen ja aistien toiminnan arviointi). Näistä 10 eläintä/sukupuoli/annos ­
taso (eli 1 uros tai yksi naaras poikuetta kohti) nukutetaan ja fiksoidaan perfuusiotekniikalla tutkimuksen päätösvaiheessa (arviolta syntymän jälkei ­
nen päivä 70). Uuden fiksaation  in situ  jälkeen aivot poistetaan, punnitaan 
ja käsitellään neuropatologisessa tutkimuksessa.
 
8. Kasvuikäisten ja nuorten täysikasvuisten kognitiivisen toiminnan testauk ­
seen käytetään 10 poikasta/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros tai 1 naaras poikuetta kohti). Eri eläimiä käytetään, kun kognitiivista toimintaa testataan 
syntymisen jälkeisenä päivänä 23 ja nuorilla täysikasvuisilla eläimillä. Täy ­
sikasvuisena testatut 10 eläintä/sukupuoli/annostaso lopetetaan tutkimuksen päätösvaiheessa, niiden aivot poistetaan ja punnitaan.
 
9. Jäljelle jääneet 20 eläintä/sukupuoli/ryhmä, joita ei valittu kokeisiin, lope ­
tetaan ja poistetaan vieroituksen yhteydessä.  
Taulukko 2  
Poikasten 
määrä (  a ) Kokeisiin valittujen 
poikasten määrä Tutkimus/Testi 
uros naaras  
1 5 20 urosta + 20 naarasta Käytöksen kehitys 
10 urosta + 10 naarasta SJP 11 aivojen paino/neuropa ­
tologia/morfometria 
2 6 20 urosta + 20 naarasta Yksityiskohtaiset kliiniset ha ­
vainnot 
20 urosta + 20 naarasta Motorinen aktiviteetti 20 urosta + 20 naarasta Sukukypsyys 20 urosta + 20 naarasta Motorinen ja aistien toiminta 10 urosta + 10 naarasta Nuoren täysikasvuisen yksilön 
aivojen paino/neuropatologia/ 
morfometria ~ SJP 70
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 811
 
Poikasten 
määrä (  a ) Kokeisiin valittujen 
poikasten määrä Tutkimus/Testi 
uros naaras  
3 7 10 urosta + 10 
naarasta (  a ) Oppiminen ja muisti (SJP 23) 
3 7 10 urosta + 10 
naarasta (  b ) Oppiminen ja muisti (nuoret 
täysikasvuiset eläimet) 
Nuorten täysikasvuisten eläin ­
ten aivojen paino 
4 8 — Eläimet, jotka lopetetaan ja 
poistetaan syntymän jälkeisenä päivänä 21.
 
( a ) Tässä esimerkissä poikueet karsitaan 4 urokseen + 4 naaraaseen; urospuoliset poik ­
aset numeroidaan yhdestä neljään ja naaraspuoliset poikaset viidestä kahdeksaan. 
( b ) Eri poikasia käytetään kognitiiviseen testiin syntymän jälkeisenä päivänä 23 ja 
nuorten täysikasvuisten keskuudessa (esim. parilliset/parittomat poikueet yhteensä 
20:sta).  
Esimerkki 3  
10. Yhtä ryhmää — 20 poikasta/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros ja 1 naaras 
poikuetta kohti) — käytetään aivojen painon arviointiin ja neuropatologi ­
seen arviointiin syntymän jälkeisenä päivänä 11. Näistä eläimistä 10 poi ­
kasta/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros tai 1 naaras poikuetta kohti) lopetetaan inhimillisellä tavalla syntymän jälkeisenä päivänä 11 ja niiden aivot poiste ­
taan, punnitaan ja käsitellään histopatologisessa tutkimuksessa. Lisäksi ai ­
vojen painoja koskevat tiedot kerätään käyttämällä jäljelle jääneiden 10 
uroksen ja 10 naaraan irrotettuja aivoja annostasoa kohden.
 
11. Toista ryhmää — 20 eläintä/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros ja 1 naaras 
poikuetta kohti) — käytetään käytöksen kehitystä (motorista aktiviteettia) 
koskeviin vieroituksen jälkeisiin kokeisiin (motorinen aktiviteetti ja suku ­
kypsyysiän arviointi) sekä kasvuikäisten eläinten kognitiivisen toiminnan testaukseen.
 
12. Lisäksi toista ryhmää — 20 pentua/sukupuoli/annostasoa (eli 1 uros ja 1 naaras 
poikuetta kohti) — käytetään motorista ja aistien toimintaa koskeviin kokeisiin 
(akustinen säpsähdysvaste) sekä yksityiskohtaisia kliinisiä havaintoja varten. 
Näistä 10 eläintä/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros tai yksi naaras poikuetta kohti) nukutetaan ja fiksoidaan perfuusiotekniikalla tutkimuksen päätösvaiheessa (ar ­
violta syntymän jälkeinen päivä 70). Uuden fiksaation  in situ  jälkeen aivot 
poistetaan, punnitaan ja käsitellään neuropatologisessa tutkimuksessa.
 
13. Kasvuikäisten ja nuorten täysikasvuisten kognitiivisen toiminnan testauk ­
seen käytetään 20 poikasta/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros ja 1 naaras poi ­
kuetta kohti). Näistä 10 eläintä/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros tai yksi 
naaras poikuetta kohti) lopetetaan tutkimuksen päättyessä ja niiden aivot poistetaan ja punnitaan.
 
Taulukko 3  
Poikasten 
määrä (  a ) Kokeisiin valittujen 
poikasten määrä Tutkimus/Testi 
uros naaras  
1 5 10 urosta + 10 naarasta SJP 11 aivojen paino/neuropa ­
tologia/morfometria 
10 urosta + 10 naarasta SJP 11 aivojen paino 
2 6 20 urosta + 20 naarasta Käytöksen kehitys (motorinen 
aktiviteetti) 
20 urosta + 20 naarasta Motorinen aktiviteetti 
20 urosta + 20 naarasta Sukukypsyys 
20 urosta + 20 naarasta Oppiminen ja muisti (SJP 27)  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 812
 
Poikasten 
määrä (  a ) Kokeisiin valittujen 
poikasten määrä Tutkimus/Testi 
uros naaras  
3 7 20 urosta + 20 naarasta Akustinen säpsähdysvaste (kas ­
vuikäiset ja nuoret täysikasvui ­
set eläimet) 
20 urosta + 20 naarasta Yksityiskohtaiset kliiniset ha ­
vainnot 
10 urosta + 10 naarasta Nuorten täysikasvuisten eläin ­
ten aivojen paino/neuropatolo ­
gia morfometria ~ SJP 70 
4 8 20 urosta + 20 naarasta Oppiminen ja muisti (nuoret 
täysikasvuiset eläimet) 
10 urosta + 10 naarasta Nuorten täysikasvuisten eläin ­
ten aivojen paino  
( a ) Tässä esimerkissä poikueet karsitaan 4 urokseen + 4 naaraaseen; urospuoliset poik ­
aset numeroidaan yhdestä neljään ja naaraspuoliset poikaset viidestä kahdeksaan.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 813
 
Lisäys 2  
Määritelmät  
Kemikaali: aine tai seos  
Testattava kemikaali: mikä tahansa aine tai seos, jota testataan käyttämällä tätä 
testimenetelmää  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 814
 
B.54.  KOHTUUN AIHEUTUVIEN VAIKUTUKSIEN BIOTESTI JYRSI ­
JÖILLÄ: LYHYTAIKAINEN SEULONTATESTI ESTROGEE ­
NISISTA OMINAISUUKSISTA  
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 440 (2007). OECD aloitti 
vuonna 1998 korkean prioriteetin toimenpiteet, jotta voimassa olevia ohjeita tarkistetaan ja kehitetään uusia, joilla mahdollisia hormonaalisia 
haitta-aiheita seulotaan ja testataan (1). Yksi toimenpide oli kehittää testi ­
ohje jyrsijöiden kohtuun aiheutuvia vaikutuksia koskevalle biotestille. Jyr ­
sijöiden kohtuun aiheutuvia vaikutuksia koskevan biotestin osalta toteutet ­
tiin kattava validointiohjelma, johon sisältyi yksityiskohtaisten 
tausta-asiakirjojen kerääminen (2)(3) ja sellaisten laajojen laboratorioiden 
sisäisten ja niiden välisten tutkimusten teettäminen, joilla osoitettiin biotes ­
tin merkitys ja toistettavuus, kun kyseessä on tehokas referenssiestrogeeni, heikot estrogeenireseptorin agonistit, voimakas estrogeenireseptorin antago ­
nisti ja negatiivinen vertailukemikaali (4)(5)(6)(7)(8)(9). Tämä testimene ­
telmä B.54 on tulos validointiohjelmassa saadusta kokemuksesta ja tulok ­
sista, joita sen perusteella saatiin agonisteista, joilla on estrogeenisia 
ominaisuuksia.
 
2. Kohtuun aiheutuvia vaikutuksia koskeva biotesti on lyhytaikainen seulonta ­
testi, joka kehitettiin 1930-luvulla (27)(28) ja jonka asiantuntijaryhmä stan ­
dardoi ensimmäisen kerran seulontaa varten vuonna 1962 (32)(35). Se pe ­
rustuu kohdun painon lisääntymiseen tai uterotrofiseen reaktioon (ks. yksi ­
tyiskohtia varten (29)). Testissä arvioidaan kemikaalin kykyä käynnistää 
biologista toimintaa, joka on yhdenmukainen luonnollisten estrogeenien 
(esim. 17ß-estradioli) ominaisuuksia omaavien agonistien tai antagonistien kanssa. Sitä käytetään kuitenkin antagonistin havaitsemiseen paljon harvem ­
min kuin agonistin havaitsemiseen. Kohtu reagoi estrogeeneihin kahdella 
tavalla. Ensimmäinen vaste on painonnousu veden imeytymisen vuoksi. 
Tätä vastetta seuraa kudosten kasvusta aiheutuva painonnousu (30). Kohdun vasteet rotilla ja hiirillä ovat laadullisesti vertailukelpoiset.
 
3. Tämä biotesti on  in vivo  -seulontatesti ja sen soveltamista olisi tarkasteltava 
osana hormonaalisten haitta-aineiden testausta ja arviointia koskevaa OECD:n 
käsitekehystä (OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment 
of Endocrine Disrupting Chemicals) (liite 2). Tässä käsitekehyksessä kohtuun aiheutuvia vaikutuksia mittaava biotesti sisältyy tasolle 3  in vivo  -testinä, jolla 
tarjotaan tietoja yhdestä endokriinisesta mekanismista, estrogeenisesta 
toiminnasta.
 
4. Kohtuun aiheutuvia vaikutuksia koskevaan biotestiin on tarkoitus sisällyttää  
in vitro-  ja in vivo  -testiryhmä, joilla tunnistetaan sisäeritysjärjestelmään 
mahdollisesti vaikutuksia aiheuttavat kemikaalit. Viime kädessä tehdään ihmisten terveyttä tai ympäristöä koskevat riskinarvioinnit. OECD:n vali ­
dointiohjelmassa käytetään vahvoja ja heikkoja estrogeenivaikutuksia omaa ­
via agonisteja arvioimaan estrogeenisten kemikaalien tunnistamista koske ­
van testin tehokkuutta (4)(5)(6)(7)(8). Näin ollen testimenettelyn herkkyys estrogeenivaikutuksia omaaville agonisteille osoitettiin asianmukaisesti sa ­
moin kuin laboratorion sisäinen ja niiden välinen toistettavuus.
 
5. Negatiivisten kemikaalien osalta ainoastaan yksi ”negatiivinen” vertailuke ­
mikaali — joka jo todettiin negatiiviseksi kohtuun kohdistuvia vaikutuksia 
koskevassa testissä sekä  in vitro  reseptorin sitoutumista koskevassa testissä 
ja reseptoritestissä — sisällytettiin validointiohjelmaan. Lisäksi on arvioitu muita testituloksia, jotka eivät liity OECD:n validointiohjelmaan, ja niillä 
tuetaan kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskevan biotestin spesifiyttä est ­
rogeenivaikutuksia omaavien agonistien seulonnan suhteen (16).
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 815
 
ALUSTAVAT NÄKÖKOHDAT JA RAJOITUKSET  
6. Estrogeenivaikutuksia omaavat agonistit ja antagonistit toimivat ligandeina 
estrogeenireseptoreille a ja b, ja ne voivat aktivoida tai estää reseptoreiden 
ohjaaman geenitranskription. Tämä voi mahdollisesti aiheuttaa terveydelle vaaroja, kuten lisääntymis- ja kehitysvaikutuksia. Tästä syystä on arvioitava ja analysoitava nopeasti, voiko kemikaali toimia mahdollisesti estrogee ­
nivaikutuksia omaavana agonistina tai antagonistina. Ligandin sitoutuminen 
estrogeenireseptoriin tai reportterigeenien transkription aktivointi  in vitro  
tarjoaa tietoja, mutta kyseessä on ainoastaan yksi monista tekijöistä, jotka voivat osoittaa mahdollisen vaaran. Muihin voivat sisältyä metaboloinnin 
aktivointi ja deaktivointi kehoon siirtymisen yhteydessä, kohdekudoksiin 
jakautuminen ja poistuminen kehosta riippuen ainakin osittain altistusreitistä ja testattavasta kemikaalista. Tämän vuoksi on seulottava kemikaalin mah ­
dollinen vaikutus  in vivo  tiettyjen olosuhteiden perusteella, ellei kemikaalin 
absorptiota, jakautumista, aineenvaihduntaa ja erittymistä koskevilla ominai ­
suuksilla jo tarjoa asianmukaista tietoa. Kohdun kudokset reagoivat estro ­
geenistimulaatioon nopealla ja voimakkaalla kasvulla erityisesti niiden la ­
boratoriojyrsijöiden osalta, joiden kiimakierto kestää noin neljä päivää. Jyr ­
sijälajeja, erityisesti rottia, käytetään myös laajasti myrkyllisyystutkimuk ­
sissa vaaratekijöiden kuvaamista varten. Tästä syystä jyrsijän kohtu on tar ­
koituksenmukainen kohde-elin estrogeenivaikutuksia omaavien agonistien ja antagonistien  in vivo  -seulontaa varten.
 
7. Tämä testimenetelmä perustuu sellaisiin OECD:n validointitutkimuksessa 
käytettyihin menettelyihin, joiden on osoitettu olevan luotettavia ja toistet ­
tavia laboratorioiden sisäisissä ja niiden välisissä tutkimuksissa (5)(7). Tällä 
hetkellä on käytössä kaksi menettelyä: täysikasvuista naarasta, jolta on poistettu munasarjat (ovarektomia), koskeva menetelmä, jäljempänä ”ovx- täysikasvuista koskeva menetelmä”, ja keskenkasvuista naarasta, jolta ei ole 
poistettu munasarjoja, koskeva menetelmä, jäljempänä ”keskenkasvuista 
eläintä koskeva menetelmä”. OECD:n testin validointiohjelmassa osoitettiin, että molemman menetelmän herkkyys ja toistettavuus vastasivat toisiaan. Kuitenkin keskenkasvuista eläintä, koska sillä on koskematon HPG-akseli 
(eli hypotalamusta, aivolisäkettä ja sukupuolirauhasia koskeva akseli), kos ­
keva menetelmä on vähemmän spesifinen. Se kattaa kuitenkin laajemman tutkimusalan kuin ovx-eläintä koskevassa tapauksessa, koska se voi rea ­
goida HPG-akseliin vaikuttavien kemikaalien, eikä vain estrogeenireseptorin 
kanssa. Rotan HPG-akseli on toimintakykyinen noin 15 päivän iässä. Sitä 
ennen puberteettia ei voida nopeuttaa GnRH:n (gonadoliberiini) kaltaisilla käsittelyillä. Kun naaras tulee puberteetti-ikäiseksi ennen emättimen avau ­
tumista, sillä on useita kuukautiskiertoja, jotka eivät johda emättimen avau ­
tumiseen tai ovulaatioon, mutta jonkinlaisia hormonaalisia vaihteluita esiin ­
tyy. Jos kemikaali stimuloi HPG-akselia suoraan tai epäsuorasti, tästä ai ­
heutuu ennenaikainen puberteetti, varhainen ovulaatio ja nopeutunut emät ­
timen avautuminen. Tätä eivät aiheuta pelkästään HPG-akselilla toimivat 
kemikaalit. Tietyt ruokavaliot, joilla on muita korkeampi muuntokelpoinen 
energiataso, edistävät kasvua ja nopeuttavat emättimen avautumista ilman, että niillä on estrogeenivaikutuksia. Tällaisilla kemikaaleilla ei aiheutettaisi uterotrofista reaktiota ovx-täysikasvuisissa eläimissä, sillä niiden HPG-akseli 
ei toimi.
 
8. Eläinten hyvinvointiin liittyvistä syistä etusija olisi annettava menetelmälle, 
jossa käytetään keskenkasvuisia rottia, jossa vältetään eläinten kirurgista 
esikäsittelyä ja jossa vältetään myös käyttämästä eläimiä, joissa havaitaan 
näyttöä kiimakiertoon siirtymisestä (ks. 30 kohta).  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 816
 
9. Uterotrofinen vaste ei aiheudu pelkästään estrogeeneistä, eli kemikaalit, 
jotka ovat muita kuin estrogeenivaikutuksia omaavia agonisteja tai antago ­
nisteja, voivat myös aiheuttaa vasteen. Esimerkiksi suhteellisen suuret an ­
nokset progesteronia, testosteronia, tai useita synteettisiä progetiinejä voivat kaikki aiheuttaa vasteen (30). Kaikkia reaktioita voidaan myös analysoida 
histologisesti emättimen keratinisaation ja sarveistuman osalta (30). Vasteen 
mahdollisesta alkuperästä riippumatta kohtuun kohdistuvia vaikutuksia kos ­
kevan biotestin positiivisen tuloksen vuoksi olisi normaalisti suoritettava lisäselvityksiä. Estrogeenivaikutusta koskeva täydentävä näyttö voidaan 
saada  in vitro  -testeistä, kuten estrogeenireseptorin sitoutumistesteistä ja 
transkription aktivointia koskevista testeistä tai muista  in vivo  -testeistä, 
kuten naaraan puberteettia koskevasta testistä.
 
10. Kun otetaan huomioon, että kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskevaa bio ­
testiä voidaan käyttää  in vivo  -seulontatestinä, sovellettua validointimenetel ­
mää voidaan hyödyntää eläinten hyvinvointiin liittyviä näkökohtia ja vai ­
heittaista testaamista koskevaa strategiaa varten. Tämän vuoksi pyrittiin validoimaan tarkasti estrogeenivaikutuksen osalta toistettavuus ja herkkyys 
— moniin kemikaaleihin liittyvä pääasiallinen huolenaihe –, mutta toimia 
toteutettiin vain vähän testin antiestrogeenivaikutusta koskevan komponen ­
tin osalta. Ainoastaan yhtä erittäin aktiivista antiestrogeenia testattiin, koska kemikaalien, joilla on selkeästi antiestrogeeninen profiili (joita ei häiritse 
vähäinen estrogeenin aktiivisuus), määrä on hyvin rajallinen. Näin ollen 
tämä testimenetelmä omistettiin estrogeenia koskevalle menettelylle, ja me ­
nettely, jossa kuvataan testin antagonista muotoa, sisällytettiin ohjeasiakir ­
jaan (37). Pelkästään antiestrogeenisia kemikaaleja koskevan testin toistet ­
tavuus ja herkkyys määritellään selkeämmin myöhemmin sen jälkeen, kun 
tämä testimenettely on ollut rutiinikäytössä jonkin aikaa ja tällä toimintata ­
valla on tunnistettu enemmän kemikaaleja.
 
11. On pantava merkille, että kaikkien eläimiin perustuvien menettelyiden on 
täytettävä paikalliset eläinten hoitoa koskevat vaatimukset; jäljempänä esi ­
tetyt kuvaukset hoidosta ja käsittelystä ovat toimintaa koskevia vähimmäis ­
vaatimuksia, ja ne korvataan paikallisilla säännöksillä, kuten tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten suojelusta 22 päivänä syyskuuta 2010 
annetulla Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivillä 2010/63/EU (38). 
OECD antaa lisäohjeita eläinten inhimillisestä kohtelusta (25).
 
12. Kuten kaikissa testeissä, joissa käytetään eläviä eläimiä, ennen testin aloit ­
tamista on tärkeää varmistaa, että tiedot ovat todella tarpeen. Esimerkkinä mainitaan kaksi edellytystä, jolloin tietoja voidaan tarvita:
 
— korkea altistuspotentiaali (käsitekehyksen taso 1, liite 2) tai osoitukset 
estrogeenivaikutuksesta (taso 2), jolloin tutkitaan, voivatko tällaiset vai ­
kutukset esiintyä  in vivo  
— estrogeenivaikutuksia osoittavat vaikutukset tason 4 tai 5  in vivo  -tes­
teissä sen perustelemiseksi, että vaikutukset liittyivät estrogeenin meka ­
nismiin, jota ei voida selvittää  in vitro  -testiä käyttämällä.  
13. Tässä testimenetelmässä käytetyt määritelmät esitetään liitteessä 1.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 817
 
TESTIN PERIAATE  
14. Kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskevan biotestin herkkyys perustuu 
eläinkoejärjestelmään, jossa hypotalamusta, aivolisäkettä ja munasarjoja 
koskeva akseli ei toimi, mikä johtaa estrogeenin alhaiseen endogeeniseen tasoon. Tällä varmistetaan lähtötilanteen alhainen kohdun paino ja maksi ­
mimäärä annettavista estrogeeneista aiheutuvia vasteita. Jyrsijöillä tämän 
edellytyksen täyttävät kaksi estrogeenien kannalta herkkää vaihetta:
 
i) keskenkasvuiset naaraat vieroituksen jälkeen ja ennen puberteettia, ja  
ii) nuoret täysikasvuiset naaraat, joille on suoritettu ovariektomia ja joiden 
kohdun kudoksille on annettu riittävästi aikaa toipua.  
15. Testikemikaali annostellaan päivittäin suun kautta letkulla tai ihonalaisella 
injektiolla. Testikemikaalin porrastetut annokset annetaan vähintään kah ­
delle koeryhmälle (ks. ohjeistusta varten 33 kohta). Ryhmää kohden käyte ­
tään yksi annostaso. Keskenkasvuista eläintä koskevassa menetelmässä al ­
tistusaika on kolme peräkkäistä päivää ja ovx-täysikasvuista koskevassa 
menetelmässä lyhyin mahdollinen altistusaika on kolme peräkkäistä päivää. 
Koe-eläimille suoritetaan ruumiinavaus noin 24 tunnin kuluttua viimeisestä annoksesta. Estrogeenivaikutuksia omaavien agonistien osalta altistettujen eläinryhmien kohdun keskimääräistä painoa verrataan kantaja-ainetta saa ­
neeseen ryhmään tilastollisesti merkittävän lisäyksen arvioimiseksi. Tilastol ­
lisesti merkittävä kohdun keskimääräinen painonlisäys testiryhmässä osoit ­
taa positiivisen reaktion tähän biotestiin.
 
MENETELMÄN KUVAUS  
Eläinlajin valinta  
16. Testiin voidaan käyttää laboratoriossa yleisesti käytettyjä jyrsijäkantoja. Esi ­
merkiksi validoinnissa käytettiin rottakantoja Sprague-Dawley ja Wistar. Niissä ei pitäisi käyttää kantoja, joiden kohdun tiedetään tai epäillään olevan vähemmän reaktiivinen. Laboratorion tulee osoittaa käytetyn kannan herk ­
kyys siten, kuin tämä määritellään 26 ja 27 kohdassa.
 
17. Rottia ja hiiriä on käytetty tavallisesti kohtuun kohdistuvia vaikutuksia 
koskevassa biotestissä 1930-luvulta lähtien. OECD:n validointitutkimukset 
suoritettiin ainoastaan rotilla, koska tulkittiin, että kummankin lajin odote ­
taan olevan vastaavia ja sen vuoksi yhden lajin pitäisi riittää kansainvälistä validointia varten. Näin säästetään resursseja ja eläimiä. Rotta on laji, joka on valittu useimpiin lisääntymistä ja kehitystä koskeviin toksisuustutkimuk ­
siin. On otettava huomioon, että hiiristä on olemassa aikaisempia tietoja 
koskeva laaja tietokanta, ja jyrsijöiden kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskevan biotestin testimenetelmän alaa laajennettiin siten, että hiiriä käy ­
tettiin testilajina, ja hiiristä suoritettiin validointia varten rajoitettu seuranta ­
tutkimus (16). Tällainen vertailuun liittyvä lähestymistapa, jossa käytetään 
rajallinen määrä testikemikaaleja, johon osallistuu rajallinen määrä labora ­
torioita ja johon ei sisälly koodattuja testinäytteitä, valittiin, koska alkupe ­
räinen tarkoitus oli resurssien ja eläimien säästäminen. Tämä vertailuun 
liittyvä validointitutkimus osoittaa nuorten täysikasvuisten hiiren, jolta on 
poistettu munasolut, kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskevan biotestin osalta, että rotista ja hiiristä saadut tiedot korreloivat laadullisesti ja mää ­
rällisesti keskenään. Mikäli kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskeva bio ­
testi tehdään ennen pitkäaikaista tutkimusta, kummassakin kokeessa on 
käytettävä samaa eläinlajia ja -kantaa. Vertailuun perustuva lähestymistapa rajoittui ovx-täysikasvuisiin hiiriin, ja raportissa ei tarjota tarpeeksi kattavia tietoja keskenkasvuista eläintä koskevan mallin validoimiseksi, joten kes ­
kenkasvuisia hiiriä koskevan mallin ei katsota kuuluvan tämän testimene ­
telmän piiriin.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 818
 
18. Näin ollen joissain tapauksissa rottien sijasta voidaan käyttää hiiriä. Tämän 
lajin käyttöä olisi perusteltava toksikologisilla, farmakokineettisillä ja/tai 
muilla kriteereillä. Hiirten osalta menettelyyn voidaan tarvita muutoksia. Esimerkiksi hiiret kuluttavat ruumiinpainon perusteella enemmän ravintoa kuin rotat, joten ravintoon sisältyvän fytoestrogeenin pitoisuuden olisi ol ­
tava hiirillä alhaisempi kuin rotilla (9)(20)(22).
 
Koe-eläinten häkit ja ruokinta  
19. Kaikkien toimenpiteiden olisi oltava eläinten hoitoa koskevien paikallisten 
vaatimusten mukaisia. Nämä kuvaukset hoidosta ja käsittelystä ovat vähim ­
mäisvaatimuksia, ja ne korvataan paikallisilla säännöksillä, kuten tieteelli ­
siin tarkoituksiin käytettävien eläinten suojelusta 22 päivänä syyskuuta 2010 
annetulla Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivillä 2010/63/EU (38). 
Koe-eläinhuoneen lämpötilan pitäisi olla 22 °C (se voi vaihdella noin ± 3 °C). Suhteellinen kosteus on vähintään 30 % eikä mielellään ylitä 70:tä % muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana. Tavoitteena on 50–60 
%:n suhteellinen kosteus. Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta. Valais ­
tusta olisi käytettävä jaksossa 12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää.
 
20. Laboratorioruokintaa ja juomaveden määrää ei saa rajoittaa. Nuoret täysi ­
kasvuiset eläimet voidaan pitää häkeissä yksittäin tai korkeintaan kolmen 
eläimen ryhmissä. Keskenkasvuisten eläinten nuoren iän vuoksi suositellaan 
muutaman eläimen pitämistä häkissä.  
21. Laboratorioruokavalion fytoestrogeenin korkean tason tiedetään lisäävän 
jyrsijöiden kohdun painoa siinä määrin, että se vaikuttaa kohtuun kohdis ­
tuvia vaikutuksia koskevaan biotestiin (13)(14)(15). Fytoestrogeenin ja 
muuntokelpoisen energian korkea taso laboratorioruokavaliossa voi myös 
johtaa varhaiseen puberteettiin, jos käytetään keskenkasvuisia eläimiä. Fy ­
toestrogeenien esiintyminen johtuu pääasiassa soijan ja sinimailasen sisäl ­
lyttämisestä laboratorioravintoon, ja fytoestrogeenien pitoisuuden on osoi ­
tettu vaihtelevan tavanomaisessa laboratorioravinnossa eläinryhmien välillä 
(23). Ruumiinpaino on tärkeä muuttuja, ja kulutetun ravinnon määrä on verrannollinen ruumiinpainoon. Tästä syystä samasta ruokavaliosta saatu todellinen fytoestrogeeniannos voi vaihdella lajien ja iän mukaan (9). Kes ­
kenkasvuisten naarasrottien ravinnonkulutus ruumiinpainoon nähden voi 
olla noin kaksi kertaa suurempi kuin nuorten täysikasvuisten naaraiden, joilta on poistettu munasarjat. Nuorten täysikasvuisten hiirten ravinnonku ­
lutus ruumiinpainoon nähden voi olla noin neljä kertaa suurempi kuin 
nuorten täysikasvuisten naarasrottien, joilta on poistettu munasarjat.
 
22. Kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskevan biotestin tulokset 
(9)(17)(18)(19) osoittavat kuitenkin, että rajallinen määrä ravintoon sisälty ­
vää fytoestrogeenia voidaan hyväksyä ja tämä ei vähennä biotestin herk ­
kyyttä. Ohjeena on se, että ravintoon sisältyvän fytoestrogeenin taso ei saa 
ylittää Sprague Dawley- ja Wistar-lajien keskenkasvuisten naaraspuolisten 
rottien osalta 350:tä μg vastaavaa genisteiinin määrää/gramma (6)(9). Täl ­
laisten ruokavalioiden olisi oltava myös tarkoituksenmukaisia, kun testataan nuoria täysikasvuisia rottia, joilta on poistettu munasarjat, koska nuorten 
täysikasvuisten eläinten ravinnonkulutus ruumiinpainoon nähden on alhai ­
sempi keskenkasvuisiin verrattuna. Jos käytetään täysikasvuisia hiiriä, joilta on poistettu munasarjat, tai fytoestrogeenille herkempiä rottia, on harkittava, että ravintoon sisältyvän fytoestrogeenin tasoa vähennetään vastaavasti (20). 
Lisäksi erilaisista ruokavalioista johtuvat muuntokelpoiseen energiaan liitty ­
vät erot voivat johtaa puberteetin alun siirtymiseen (21)(22).
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 819
 
23. Ennen tutkimusta edellytetään ruokavalion huolellista valintaa, ja sen fyto ­
estrogeenien tai muuntokelpoisen energian taso ei saa olla korkea (ohjeis ­
tusta varten ks. (6)(9)), koska tämä vaikuttaisi tuloksiin häiritsevästi (15)(17)(19)(22)(36). Laboratorion käyttämän testijärjestelmän, siten kuin se määritellään 26 ja 27 kohdassa, moitteettoman suorittamisen varmistami ­
nen on molemman tekijän osalta tärkeää. Hyvän laboratoriokäytännön pe ­
rusteella on varmistettava, että kunkin tutkimuksen aikana annetun ravin ­
toerän edustava näytteenotto suoritetaan fytoestrogeenisen sisällön mahdol ­
lista analyysiä varten (esim. siinä tapauksessa, että kohdun kontrollipaino on 
korkea suhteessa aiempiin kontrolleihin tai jos vaste referenssiestrogeeniin, 
17-alfa-etinyyliestradioliin, ei ole riittävä). Osanäytteitä olisi analysoitava osana tutkimusta tai pakastettuna – 20 °C:een taikka siten, että näytteen hajoaminen ennen analyysiä estetään.
 
24. Joihinkin koehäkin alustan materiaaleihin voi sisältyä luonnossa esiintyviä 
estrogeenisia tai antiestrogeenisia kemikaaleja (esim. maissintähkän tiede ­
tään vaikuttavan rottien sykliin ja sillä vaikuttaa olevan antiestrogeenivai ­
kutuksia). Valittuun alusmateriaaliin pitäisi sisältyä mahdollisimman vähän fytoestrogeeneja.
 
Eläinten valmistelu  
25. Koe-eläimet, joilla ei näy merkkejä taudista tai fyysisistä poikkeavuuksista, 
jaetaan satunnaisotannalla kontrolli- ja koeryhmiin. Häkit on sijoitettava siten, että niiden sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vä ­
häisiä. Jokainen eläinyksilö tunnistetaan. Keskenkasvuisia eläimiä olisi mie ­
luiten pidettävä häkissä emojen tai sijaisemojen kanssa, ennen kuin ne 
vieroitetaan totutusvaiheen aikana. Tutkimusta edeltävän nuorten täysikas ­
vuisten eläinten ja keskenkasvuisten eläinten, jotka toimitetaan emojen tai sijaisemojen kanssa, totutusvaiheen pituuden pitäisi olla noin viisi päivää. 
Jos keskenkasvuiset eläimet saadaan vastavieroitettuina ja ilman emoja, 
lyhyempi totutusvaihe voi olla tarpeen, koska annostelun pitäisi alkaa vä ­
littömästi vieroituksen jälkeen (ks. 29 kohta).
 
TESTIN SUORITTAMINEN  
Laboratorioiden pätevyyden varmistaminen  
26. Laboratorioiden pätevyyden varmistamiseen voidaan käyttää kahta eri 
vaihtoehtoa:  
— Säännöllinen tarkastus, joka perustuu alkuperäiseen lähtötilanteen posi ­
tiiviseen kontrollitutkimukseen (ks. 27 kohta). Vähintään kuuden kuu ­
kauden välein ja aina silloin, kun esiintyy muutos, joka voi vaikuttaa 
testin suoritukseen (esim. ruokavalion uusi koostumus, dissektiot suorit ­
tavaan henkilöstöön liittyvät muutokset, eläinkannan tai toimittajan muuttuminen), testijärjestelmän (eläinmalli) reaktio olisi varmistettava niin, että käytetään (edellä 27 kohdassa kuvatun lähtötilanteen positii ­
visen kontrollitutkimuksen perusteella) asianmukainen annos referens ­
siestrogeenia: 17-alfa-etinyyliestradiolia (CAS-nro 57-63-6) (EE).
 
— Käytetään rinnakkaisia kontrolleja ottamalla mukaan ryhmä, jolle anne ­
taan asianmukainen annos referenssiestrogeenia kussakin testissä.  
Jos järjestelmä ei reagoi odotetulla tavalla, koeolosuhteita olisi arvioitava ja 
muutettava arvion mukaisesti. On suositeltavaa, että kummassakin lähesty ­
mistavassa käytetyn referenssiestrogeenin annos on suunnilleen ED70–80.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 820
 
27. Lähtötilanteen positiivinen kontrollitutkimus  — ennen kuin laboratorio 
tekee tällaisen testimenetelmän mukaisen tutkimuksen ensimmäisen kerran, 
laboratorion pätevyys olisi osoitettava testaamalla eläinmallin reagointiky ­
kyä ja vahvistamalla referenssiestrogeenin annosvaste: 17-alfa-etinyyliest ­
radioli (CAS-nro 57-63-6) (EE), vähintään neljällä annoksella. Kohdun pai ­
non reaktiota verrataan vakiintuneeseen aiempaan tietoon (ks. lähdettä (5)). 
Jos lähtötilanteen positiivinen kontrollitutkimus ei tuota odotettuja tuloksia, koeolosuhteita olisi tarkasteltava ja muutettava.
 
Eläinten lukumäärä ja kunto  
28. Jokaiseen koe- ja kontrolliryhmään pitäisi sisältyä ainakin kuusi eläintä 
(sekä keskenkasvuisia että ovx-täysikasvuisia eläimiä koskevien menettelyi ­
den osalta).  
Keskenkasvuisten eläinten ikä  
29. Keskenkasvuisiin eläimiin liittyvässä kohtuun kohdistuvia vaikutuksia kos ­
kevassa biotestissä on esitettävä syntymäaika. Annostelu on aloitettava riit ­
tävän aikaisin, jotta varmistetaan, että testikemikaalin annostuksen loppuv ­
aiheessa puberteettiin liittyvää endogeenisten estrogeenien fysiologista li ­
sääntymistä ei ole vielä tapahtunut. Toisaalta on näyttöä siitä, että hyvin nuoret eläimet voivat olla vähemmän herkkiä. Kunkin laboratorion olisi 
otettava ihanteellisen iän määrittelyn osalta huomioon omat eläimen kasvuv ­
aihetta koskevat taustatietonsa.
 
Yleinen ohje on, että annostelu rotille voidaan aloittaa välittömästi aikaisen 
vieroituksen jälkeen syntymän jälkeisenä päivänä 18 (syntymäaika on syn ­
tymän jälkeinen päivä 0). Annostelu rotille pitäisi mieluiten päättää synty ­
män jälkeisenä päivänä 21, mutta kaikissa tapauksissa ennen päivää 25, 
koska tämän jälkeen hypotalamusta, aivolisäkettä ja munasarjoja koskeva akseli on toiminnassa ja endogeenisen estrogeenin tasot voivat alkaa nousta. Samanaikaisesti nouseva lähtötason kohdun paino merkitsee, että ryhmän 
standardipoikkeamat lisääntyvät (2)(3)(10)(11)(12).
 
Munasarjojen poistamista koskeva menettely  
30. Kun kyseessä ovat naarasrotat ja -hiiret, joilta poistetaan munasarjat (koe- ja 
kontrolliryhmät), ne olisi poistettava 6–8 viikon iässä. Rottien osalta muna ­
sarjojen poiston ja ensimmäisen annostelupäivän välillä olisi kuluttava vä ­
hintään 14 päivää, jotta kohtu voi palata vakaaseen minimitasoon. Hiirten osalta munasarjojen poiston ja ensimmäisen annostelupäivän välillä olisi 
kuluttava vähintään 7 päivää. Koska pieni määrä munasarjakudosta riittää 
tuottamaan merkittävän määrän estrogeenia (3), eläimet olisi testattava en ­
nen käyttöä tarkkailemalla emättimestä tupolla otettuja epiteelisoluja ainakin viiden peräkkäisen päivän aikana (eli rottien munasarjojen poiston jälkeisinä 
päivinä 10–14). Jos eläimissä esiintyy jonkinlaista näyttöä kiimakierrosta, 
tällaisia eläimiä ei pitäisi käyttää. Lopuksi ruumiinavauksessa olisi tarkas ­
teltava munasarjojen tynkiä näytön saamiseksi siitä, onko niissä munasarja ­
kudosta. Jos on, eläintä ei pitäisi käyttää arvioinneissa (3).
 
31. Munasarjan poisto aloitetaan sen jälkeen, kun asianmukaisesti nukutettu 
eläin makaa vatsallaan. Viillon, jolla avataan selkä- ja kylkilihaksen puo ­
leinen vatsanseinämä, pitäisi olla noin 1 cm:n pituinen pituussuunnassa 
kylkiluun alarajan ja suoliluun harjanteen välisessä keskipisteessä ja muu ­
tama millimetri sivussa lannelihaksen lateraalisesta reunasta. Munasarja olisi sen jälkeen poistettava vatsaontelosta aseptiselle alustalle. Munasarja olisi 
irrotettava munajohtimen ja kohdun runko-osan välisestä yhtymäkohdasta. 
Kun on varmistettu, että runsasta verenvuotoa ei esiinny, vatsanseinämä olisi suljettava ompeleella ja nahka olisi suljettava hakasella tai asianmu ­
kaisella ompeleella. Ligaatiokohdat esitetään kaavamaisesti kuvassa 1. Asi ­
anmukaista leikkauksen jälkeistä kivunlievitystä olisi käytettävä jyrsijöiden 
hoitoon erikoistuneen eläinlääkärin suosituksen mukaisesti.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 821
 
Ruumiinpaino  
32. Ovx-täysikasvuisia eläimiä koskevassa menettelyssä ruumiinpaino ja koh ­
dun paino eivät korreloi, koska kohdun painoon vaikuttavat estrogeenin 
kaltaiset hormonit, mutta eivät ruumiin kokoa säätelevät kasvutekijät. Kes ­
kenkasvuisia eläimiä koskevan mallin osalta ruumiinpaino on kuitenkin yhteydessä kohdun painoon eläimen kasvukauden ajan (34). Tutkimuksen 
alkaessa keskenkasvuisten eläinten painonvaihtelun olisi oltava vähäistä, ja 
paino saa vaihdella korkeintaan ± 20 % keskipainosta. Tämä merkitsee, että kasvattajan olisi yhdenmukaistettava poikueiden koko. Näin varmistetaan, että eri emojen poikaset ruokitaan suunnilleen samaan aikaan. Eläimet pi ­
täisi jakaa ryhmiin (kontrolli- ja koeryhmiin) satunnaisen painojakauman 
mukaisesti, jotta minkään ryhmän keskimääräinen ruumiinpaino ei poikkea tilastollisesti muista ryhmistä. Samaan poikueeseen kuuluvia poikasia olisi vältettävä jakamasta samaan koeryhmään, kun tämä on käytännössä mah ­
dollista, ilman että kokeeseen käytettävien poikueiden määrää lisätään.
 
Annostasot  
33. Sen määrittämiseksi, voiko testattavalla kemikaalilla olla estrogeenistä vai ­
kutusta  in vivo , yleensä riittää kaksi annosryhmää ja yksi kontrolliryhmä. 
Tätä mallia pidetään siten parempana eläinten hyvinvointiin liittyvistä syis ­
tä. Jos tarkoituksena on annosvastekäyrän saaminen tai ekstrapolointi alem ­
piin annoksiin, tarvitaan ainakin kolme annosryhmää. Jos tarvitaan estrogee ­
niaktiivisuuden tunnistamista laajempia tietoja (kuten arviota kemikaalin voimakkuudesta), olisi harkittava erilaista annostusta. Kontrolliryhmän eläi ­
miä käsitellään aivan samoin kuin koeryhmän eläimiä, paitsi että niille ei 
anneta testikemikaalia. Jos kantaja-ainetta käytetään testikemikaalin annon 
yhteydessä, kontrolliryhmän pitäisi saada sama määrä koeryhmien käyttä ­
mää kantaja-ainetta (tai koeryhmien saama suurin määrä, jos ryhmien välillä 
esiintyy eroja).
 
34. Kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskevassa biotestissä on tavoitteena va ­
lita annokset niin, että eläimen selviytyminen varmistetaan ja että niihin ei 
sisälly merkittävää toksisuutta tai ne eivät aiheuta eläimille kärsimystä ke ­
mikaalin antoa seuraavana kolmena peräkkäisenä päivänä, jolloin suurin annos on 1 000 mg/kg/päivä. Kaikki annostasot olisi ehdotettava ja valittava 
siten, että otetaan huomioon kaikki olemassa olevat toksisuus- ja kineettiset 
(toksikokineettiset) tiedot, jotka ovat saatavilla testikemikaalista tai siihen liittyvistä materiaaleista. Suurimman annostason osalta olisi ensin otettava huomioon LD50 (puolet tappava annos) ja/tai välitöntä myrkyllisyyttä kos ­
kevat tiedot, jotta eläinten kuolema, merkittävä kärsiminen tai tuska välte ­
tään (24)(25)(26). Suurimman annoksen tulisi merkitä suurinta siedettävää annosta; annostasolla tehty tutkimus, joka aiheutti positiivisen uterotrofisen 
vasteen, on myös hyväksyttävä. Suojelutoimenpiteenä pitkät välit (esim. 
yksi 0,5 logaritmiyksikkö, joka vastaa annoslisäystä kertoimella 3,2, tai jopa yhden logaritmiyksikön verran) annosten välillä ovat yleensä hyväk ­
syttäviä. Jos soveltuvia tietoja ei ole käytettävissä, voidaan tehdä annoksen ­
määritystutkimus, jonka perusteella käytettävät annokset voidaan määrittää.
 
35. Vaihtoehtoisesti, jos agonistin estrogeeninen vaikutus voidaan arvioida  in 
vitro  (tai in silico ) -tiedoilla, ne voidaan ottaa annoksen valinnassa huomi ­
oon. Esimerkiksi testattavan kemikaalin määrä, joka aiheuttaa kohtuun vai ­
kutuksia yhtä paljon kuin vertailukohteena oleva agonisti (etinyyliestradoli), arvioidaan sen etinyyliestradoliin kohdistuvien suhteellisten  in vitro  -vaiku­
tusten perusteella. Korkein testiannos annettaisiin kertomalla tämä vertailu ­
kohteena oleva annos asianmukaisella kertoimella, kuten 10 tai 100.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 822
 
Annoksenmääritystä koskevat näkökohdat  
36. Tarvittaessa muutamalla eläimellä voidaan tehdä alustava annoksenmääritys ­
tutkimus. OECD:n ohjeasiakirjaa nro 19 (25) voidaan käyttää tältä osin 
määrittelemään sellaisten kliinisten oireiden esiintyminen, jotka viittaavat toksisuuteen tai eläimelle aiheutuvaan kärsimykseen. Tässä annoksenmää ­
ritystutkimuksessa voidaan, jos se on asianmukaista, leikata kohdut kolmen 
päivän jälkeen annoksen antamisesta ja punnita ne noin 24 tuntia viimeisen 
annoksen antamisen jälkeen. Näitä tietoja voidaan sen jälkeen käyttää var ­
sinaisen tutkimuksen annostuksen suunnitteluun (voidaan valita suurin ja alin hyväksyttävä annos ja antaa suositus annosryhmien määrästä).
 
Antotapa  
37. Testikemikaali annostellaan suun kautta letkulla tai ihonalaisella injektiolla. 
Antotavan valinnassa on otettava huomioon eläinten hyvinvointiin liittyvät 
näkökohdat sekä toksikologiset näkökohdat, kuten se, mikä merkitys on 
reitillä, jonka kautta ihminen altistuu kemikaalille (esim. suuletkua käyte ­
tään mallina aineen nautinnan suhteen, ihonalaista injektiota hengitysteiden tai ihoadsorption suhteen), testiaineen fyysiset/kemialliset ominaisuudet ja 
erityisesti olemassa olevat toksikologiset tiedot metaboloitumisesta ja kine ­
tiikasta (esim. tarve välttää ensikierron metabolia, parempi tehokkuus tietyn reitin välityksellä).
 
38. Vesipitoisen liuoksen/suspension käyttöä on harkittava ensisijaisesti aina, 
kun se on mahdollista. Koska useimmat estrogeenien ligandit tai niiden metaboliset prekursorit ovat yleensä hydrofobisia, yleisin menettelytapa on öljypohjaisen liuoksen/suspension käyttö (esimerkiksi maissi-, pähkinä-, 
seesami- tai oliiviöljy). Näillä öljyillä on kuitenkin erilainen kalori- ja ras ­
vapitoisuus, joten kantaja-aine voi vaikuttaa koko muuntokelpoisen energian saantiin. Se voi siten muuttaa mitattavia ominaisuuksia, kuten kohdun pai ­
noa erityisesti, kun kyseessä on keskenkasvuisia eläimiä koskeva menetelmä 
(33). Näin ollen kaikkia käytettäviä kantaja-aineita olisi testattava ennen 
tutkimusta kaikkiin kontrolleihin, joissa ei käytetä kantaja-aineita, nähden. Testikemikaalit voidaan liuottaa pieneen määrään 95-prosenttista etanolia tai 
muihin soveltuviin liuottimiin, ja niitä voidaan laimentaa lopulliseen pitoi ­
suuteen kantaja-aineessa. Liuottimen myrkyllisyysominaisuudet on oltava tiedossa, ja niitä olisi testattava erillisen ainoastaan liuotinta saavan kont ­
rolliryhmän avulla. Jos testikemikaalia pidetään stabiilina, sen liuottamisen 
edistämiseksi voidaan käyttää varovaista lämmitystä ja voimakkaita mekaa ­
nisia toimenpiteitä. Testattavan kemikaalin stabiliteetti kantaja-aineessa tulee määrittää. Jos testikemikaali on stabiili koko tutkimuksen ajan, voidaan valmistaa yksi alkuerä testikemikaalia. Määritelty annos laimennoksia val ­
mistetaan päivittäin.
 
39. Annostuksen ajoitus riippuu käytettävästä mallista (ks. keskenkasvuisia eläi ­
miä koskevan mallin osalta 29 kohta ja ovx-täysikasvuisia eläimiä koskevan 
mallin osalta 30 kohta). Keskenkasvuisille naarasrotille annetaan testikemi ­
kaalia päivittäin kolmena peräkkäisenä päivänä. Naaraspuolisille rotille, joi ­
den munasarja on poistettu, suositellaan myös kolmen päivän käsittelyä, mutta pidempi altistus on hyväksyttävä, ja sillä voidaan parantaa heikkote ­
hoisten kemikaalien havaitsemista. Kun kyseessä ovat naaraspuoliset hiiret, 
joilta on poistettu munasarjat, 3 päivän käsittely on riittävä, ja merkittävää etua ei saada siitä, että koetta jatketaan seitsemän päivän ajan vahvojen estrogeenivaikutusia omaavien agonistien osalta. Tätä suhdetta ei ole kui ­
tenkaan osoitettu validointitutkimuksessa heikkojen estrogeenien osalta (16), 
joten annostelua jatketaan korkeintaan 7 peräkkäiseen päivään ovx-täysikasvuisten hiirten osalta. Annokset annetaan samaan aikaan joka päivä. Niitä olisi mukautettava tarpeen vaatiessa, jotta eläimelle annetaan 
ruumiinpainoon jatkuvasti suhteutettu annos (esim. milligramma testikemi ­
kaalia painokiloa kohti vuorokaudessa). Testiaineen nestemäärän tilavuuden osalta sen vaihtelua ruumiinpainon perusteella olisi minimoitava mukautta ­
malla annosteluliuoksen pitoisuutta. Tarkoituksena on taata kaikilla annos ­
tasoilla ja kaikkien annostelureittien osalta jatkuva määrä ruumiinpainon 
perusteella.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 823
 
40. Kun testikemikaalia annetaan letkuruokinnassa, aine on annettava eläimille 
yhtenä annoksena mahaletkun tai sopivan intubaatiokanyylin kautta. Suurin 
kerralla annettava nestemäärä määräytyy koe-eläimen koon mukaan. Olisi noudatettava paikallisia eläinten hoitoa koskevia vaatimuksia, mutta neste ­
määrän tilavuus ei saa ylittää 5 ml/painokilo. Poikkeuksen muodostavat 
vesiliuokset, joita käytettäessä tilavuus voi olla 10 ml/painokilo.
 
41. Kun testikemikaali annostellaan ihonalaisella injektiolla, se olisi annettava 
yhtenä päivittäisenä annoksena. Annokset olisi annettava lapaluun taakse tai lantion alueelle steriilillä neulalla (esim. 23 tai 25 gaugen neula) ja tuber ­
kuliiniruiskulla. Pistokohdan ajeleminen on vapaaehtoista. Kaikki annosva ­
jaukset ja vuodot pistoskohdassa tai puutteellinen annostus olisi kirjattava. 
Nestemäärän kokonaistilavuus, joka injektoidaan rottaan päivittäin, ei saa ylittää 5:tä ml/painokilo, ja määrä on jaettava kahteen pistoskohtaan. Poik ­
keuksen muodostavat vesiliuokset, joita käytettäessä tilavuus voi olla 10 
ml/painokilo.
 
Tarkkailu  
Yleiset ja kliiniset havainnot  
42. Yleiset kliiniset havainnot olisi tehtävä vähintään kerran päivässä ja useam ­
min, jos havaitaan oireita toksisuudesta. Havaintoja olisi tehtävä mieluiten 
samaan aikaan joka päivä ottaen huomioon se, milloin annoksen antamisen jälkeen odotetut vaikutukset ovat suurimmillaan. Kaikkia eläimiä tarkkail ­
laan niin, että huomiota kiinnitetään kuolleisuuteen, sairastuvuuteen ja ylei ­
siin kliinisiin oireisiin, kuten muutoksiin käyttäytymisessä, ihon, turkin, 
silmien, limakalvojen eritteiden eritykseen sekä autonomisen hermoston toimintaan (esim. kyynelvuoto, piloerektio, mustuaisen koko, poikkeava hengitys).
 
Eläimen paino ja ravinnon kulutus  
43. Kaikki eläimet olisi punnittava lähimpään 0,1 grammaan. Punnitus aloite ­
taan juuri ennen kokeen aloittamista, eli kun eläimet jaetaan ryhmiin. Va ­
linnaisena mittana voidaan käyttää altistusjakson aikana kulutetun ravinnon 
määrää, joka voidaan mitata häkkiä kohti punnitsemalla annostelulaitteet. Ravinnon kulutuksesta saadut tulokset olisi ilmoitettava grammoina rottaa kohti päivässä.
 
Dissektio ja kohdun painon mittaaminen  
44. Kaksikymmentäneljä tuntia viimeisen käsittelyn jälkeen rotat lopetetaan in ­
himillisesti. Ihannetapauksessa ruumiinavausjärjestys satunnaistetaan ryh ­
mien välillä, jotta vältetään etenemistä suoraan ylös tai alaspäin annosryh ­
miä, mikä voi vaikuttaa jonkin verran tietoihin. Biotestin tavoitteena on mitata kohdun märkä- ja kuivattu paino. Märkäpainoon sisältyy kohtu ja luminaalinesteen sisältö. Kuivattu paino mitataan sen jälkeen, kun kohdun 
luminaalineste on puristettu ulos ja poistettu.
 
45. Ennen dissektiota keskenkasvuisten eläinten emättimen avautuminen tutki ­
taan. Dissektiomenettely aloitetaan avaamalla vatsanseinämä häpyliitoksesta alkaen. Sen jälkeen kohdunsarvi ja munasarjat, jos niitä on, poistetaan selänpuoleisesta vatsanseinämästä. Virtsarakko ja virtsajohtimet poistetaan 
kohdusta ja emättimestä vatsan puolelta ja lateraaliselta puolelta. Peräsuolen 
ja emättimen välissä oleva sidekudoksesta muodostuva liitos irrotetaan, kunnes emättimen aukkoa ja välilihan nahkaa voidaan havainnoida. Kohtu ja emätin irrotetaan ruumiista leikkaamalla emättimen seinämää aivan väli ­
lihan välisen yhdyskohdan nahan yläpuolelta, kuten esitetään kuvassa 2. 
Kohtu irrotetaan rungon seinämästä leikkaamalla varovaisesti kohdun
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 824
 
mesenteria kohdassa, jossa se kiinnittyy kunkin kohdunsarven dorsolateraa ­
lisen sivun koko pituudelta. Sen jälkeen kun kohtu poistetaan ruumiista, sen 
käsittelyn olisi oltava tarpeeksi nopeaa, jotta kudoksien kuivuminen välte ­
tään. Kuivumisesta aiheutuva painonlasku on suurempi pienten kudoksien, kuten kohdun tapauksessa (23). Jos munasarjoja ei ole poistettu, ne poiste ­
taan munajohtimesta välttäen, että luminaalineste ei valu pois kohdunsar ­
vesta. Jos eläimeltä on poistettu munasarjat, olisi tutkittava, onko tyngissä munasarjakudosta. Ylimääräinen rasva ja sidekudos olisi puhdistettava pois. Emätin irrotetaan kohdusta aivan kohdunkaulan alapuolelta niin, että koh ­
dunkaula pysyy kohdun runko-osassa, kuten esitetään kuvassa 2.
 
46. Kukin kohtu olisi siirrettävä yksilöllisesti merkittyyn ja punnittuun astiaan 
(esim. petriastia tai muovikulho). Kuivumista olisi pyrittävä jatkuvasti vält ­
tämään ennen punnitsemista (esim. sijoittamalla astiaan suodatinpaperi, jota 
on kostutettu hieman suolaliuoksella). Kohtu, joka sisältää luminaalinesteen, punnitaan lähimpään 0,1 milligrammaan (kohdun märkäpaino).
 
47. Jokainen kohtu käsitellään sen jälkeen erikseen luminaalinesteen poistami ­
seksi. Kummatkin kohdunsarvet lävistetään tai leikataan pituussuuntaan. Kohtu asetetaan hieman kostutetulle suodatinpaperille (esim. Whatman nro 3), ja sitä painetaan varovasti toisella kostutetulla suodatinpaperilla, 
jotta luminaalineste poistuu kokonaan. Kohtu, josta luminaalineste on pois ­
tettu, punnitaan lähimpään 0,1 milligrammaan (kohdun kuivapaino).
 
48. Tutkimuksen päättämisen yhteydessä kohdun painoa voidaan käyttää var ­
mistamaan, että keskenkasvuisen leikkaamattoman rotan asianmukainen ikä 
ei ylittynyt, mutta laboratorion käyttämät rottakantaa koskevat aikaisemmat tiedot ovat tässä asiassa ratkaisevia (ks. tulosten tulkinnan osalta 56 kohta).
 
Vapaaehtoiset tutkimukset  
49. Punnitsemisen jälkeen kohtu voidaan fiksoida 10-prosenttiseen neutraalipus ­
kuroituun formaliiniin, jotta sitä voidaan tutkia histopatologisesti 
hematosykliini- ja eosiinivärjäyksen jälkeen. Emätintä voidaan tutkia vastaa ­
vasti (ks. 9 kohta). Lisäksi kohdun limakalvon pinnasta voidaan tehdä morfometrinen mittaus kvantitatiivista vertailua varten.
 
TIEDOT JA RAPORTOINTI  
Tiedot  
50. Tutkimustietoihin olisi sisällyttävä:  
— eläinten lukumäärä testin alussa  
— testin aikana kuolleiden tai inhimillisistä syistä lopetettujen eläinten 
määrä ja tunnistetiedot sekä kuoleman tai lopettamisen päivä ja aika  
— niiden eläinten lukumäärä ja tunnistetiedot, joissa myrkyllisyysvaikutuk ­
sia on havaittavissa, ja kuvaus havaituista myrkyllisyysvaikutuksista mukaan lukien myrkytysoireiden alkamisaika, kesto ja vaikeusaste
 
— niiden eläinten lukumäärä ja tunnistetiedot, joissa on havaittavissa vam ­
moja ja vammojen tyyppi.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 825
 
51. Yksittäisiä eläimiä koskevat ruumiinpainoon, kohdun märkäpainoon ja kui ­
vattuun painoon liittyvät tiedot olisi kirjattava. Agonisteja koskevaa yksita ­
hoista tilastoanalyysia olisi käytettävä sen määrittämiseksi, johtiko testike ­
mikaalin antaminen tilastollisesti merkittävään kohdun painon nousuun (p- arvo < 0,05). Olisi suoritettava asianmukaiset tilastoanalyysit, joilla testa ­
taan käsittelyyn liittyviä muutoksia kohdun märkäpainon ja kuivatun koh ­
dun painon osalta. Esimerkiksi tietoja voidaan arvioida kovarianssianalyysiä koskevalla lähestymistavalla, jossa ruumiinpaino on ruumiinavauksessa ko ­
variantti. Varianssin stabiloimisiin käytettävä logaritminen muunnos voidaan 
toteuttaa kohtua koskeviin tietoihin ennen tietojen analysointia. Dunnetin ja 
Hsun testi soveltuu kunkin annosryhmän vertailevaan arviointiin kantaja-ainekontrolliin nähden ja luottamusvälien laskemiseksi. Standardoi ­
tua residuaalia voidaan käyttää kuvauksena mahdollisten poikkeamien ha ­
vaitsemiseksi ja varianssien homogeenisuuden arvioimiseksi. Näitä menet ­
telyjä sovellettiin OECD:n validointiohjelmassa käyttämällä tilastoanalyy ­
sijärjestelmässä tilasto-ohjelman PROC CLM (SAS Institute, Cary, Pohjois-Carolina, Yhdysvallat) versiota 8 (6)(7).
 
52. Loppuraporttiin sisältyy:  
Testauslaitos:  
— vastuuhenkilöstö ja heidän tutkimusta koskevat vastuualueensa  
— lähtötilanteen positiivinen kontrollitesti ja määräajoin saatavat positii ­
viset kontrollitiedot (ks. 26 ja 27 kohta).  
Testikemikaali:  
— testikemikaalien kuvaus  
— fysikaalinen olomuoto ja tarvittaessa fysikokemialliset ominaisuudet  
— laimennoksien valmistelun menetelmä ja valmistustiheys  
— stabiliteetista tuotetut kaikki tiedot  
— annosteluliuoksiin liittyvät kaikki analyysit.  
Kantaja-aine:  
— kantaja-aineen kuvaus (laatu, toimittaja ja erä)  
— perustelu kantaja-aineen valinnalle (jos se on muu kuin vesi).  
Koe-eläinlajit:  
— käytetty eläinlaji ja kanta ja perustelu niiden valinnalle  
— toimittaja ja toimittajan tilat  
— toimitusikä ja syntymäaika  
— jos eläimet ovat keskenkasvuisia, tiedot siitä, toimitettiinko ne emon tai 
sijaisemon kanssa, ja vieroitusajankohta  
— tiedot eläimen totutukseen käytetystä menettelystä  
— eläinten lukumäärä häkkiä kohti  
— kunkin eläimen ja ryhmän tunnistamista koskevat yksityiskohdat ja 
menettely.  
Testiolosuhteet:  
— satunnaisotosta (eli sovellettua menettelyä) koskevat yksityiskohdat  
— annoksen valintaperusteet  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 826
 
— yksityiskohtaiset tiedot testikemikaalin koostumuksesta, sen saavutetusta 
pitoisuudesta, stabiiliudesta ja tasalaatuisuudesta  
— tiedot testikemikaalin annostuksesta ja altistusreitin valintaa koskevat 
valintaperusteet  
— ravinto (nimi, tyyppi, toimittaja, sisältö ja, jos tiedossa, fytoestrogeenin 
tasot)  
— vesilähde (esim. vesijohtovesi tai suodatettu vesi) ja jakelu (esim. put ­
kistolla suuresta säiliöstä tai pulloista)  
— alustan materiaali (nimi, tyyppi, toimittaja, sisällys)  
— tiedot häkkiolosuhteista, valaistusjaksoista, huoneen lämpötilasta ja kos ­
teudesta sekä huoneen siivouksesta  
— yksityiskohtainen kuvaus ruumiinavausta ja kohdun punnitsemista kos ­
kevista menetelmistä  
— kuvaus tilastollisista menettelytavoista  
Tulokset  
Yksittäisten eläinten osalta:  
— kunkin eläimen päivittäinen ruumiinpaino (ryhmiin jakamisesta ruumii ­
navaukseen saakka) (lähimpään 0,1 grammaan)  
— kunkin eläimen ikä (päivissä pitäen syntymäajankohtaa päivänä 0) tes ­
tikemikaalin antamisen alkamisesta lähtien  
— kunkin annoksen antamispäivä ja -aika  
— laskettu annettu määrä ja annostus sekä havainnot annosvajauksista an ­
nosten antamisen yhteydessä tai sen jälkeen  
— päivittäiset merkinnät eläimen tilasta mukaan lukien asiaankuuluvat oi ­
reet ja havainnot  
— epäilty kuolinsyy (jos eläin havaitaan tutkimuksen aikana kuolemaisil ­
laan olevaksi tai kuolleeksi)  
— inhimillisen lopettamisen päivämäärä ja aika sekä aikaväli viimeisen 
annoksen antamiseen  
— kohdun märkäpaino (lähimpään 0,1 milligrammaan) ja kaikki havainnot 
luminaalinesteen vuotamisesta dissektion ja punnituksen valmistelun ai ­
kana  
— kuivatun kohdun paino (lähimpään 0,1 milligrammaan).  
Kunkin eläinryhmän osalta:  
— kunkin eläimen päivittäinen ruumiinpaino (lähimpään 0,1 grammaan) ja 
standardipoikkeama (ryhmiin jakamisesta ruumiinavaukseen saakka)  
— keskimääräinen kohdun märkäpaino ja keskimääräinen kohdun kuiva ­
paino (lähimpään 0,1 milligrammaan) ja standardipoikkeamat  
— päivittäinen ravinnonkulutus, mikäli se mitataan (lasketaan grammoina 
kulutettua ravintoa eläintä kohti)  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 827
 
— tulokset tilastoanalyyseistä, joissa verrataan kohderyhmien kohdun mär ­
käpainoja ja kuivatun kohdun painoja kantaja-ainetta saaneen kontrolli ­
ryhmän vastaaviin mittaustuloksiin  
— tulokset tilastoanalyysistä, jossa verrataan kohderyhmien ruumiin koko ­
naispainoa ja painonnousua kantaja-ainetta saaneen kontrolliryhmän vas ­
taaviin mittaustuloksiin  
53. Tiivistelmä testimenetelmän tärkeistä ohjeista  
Rotta Hiiri  
Eläimet  
Kanta Laboratorioissa yleisesti käytetyn jyrsijän kanta Eläinten lukumäärä Vähintään kuusi eläintä annosryhmää kohti 
Ryhmien lukumäärä Vähintään kaksi testiryhmää (ks. ohjeita varten 33 kohta) ja 
negatiivinen kontrolliryhmä 
Katso positiivisia kontrolliryhmiä koskevia ohjeita varten 26 ja 
27 kohta  
Koe-eläinen häkit ja ruokinta  
Eläinhuoneen lämpötila 22 °C ± 3 °C Suhteellinen kosteus 50–60 % ja ei alle 30 % tai yli 70 % Päivittäiset valaistusjaksot 12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää 
Ravinto ja juomavesi Rajoittamattomasti 
Häkki Yksittäin tai korkeintaan kolmen eläimen ryhmissä (keskenkasvui ­
sille eläimille suositellaan muutaman eläimen pitämistä häkissä) 
Ravinto ja alusmateriaali Ravinnon ja alusmateriaalin sisältämä fytoestrogeenin määrä 
olisi oltava vähäinen  
Tutkimusmenettely  
Menettely Keskenkasvuista eläintä, jolta 
ei ole poistettu munasarjoja, 
koskeva menettely (suositelta ­
va) 
Täysikasvuista naaraspuolista 
eläintä, jolta on poistettu mu ­
nasarjat, koskeva menettely Täysikasvuista naaraspuolista 
eläintä, jolta on poistettu muna ­
sarjat, koskeva menettely 
Keskenkasvuisten eläinten 
annoksen antoikä Aikaisintaan syntymän jälkei ­
nen päivä 18. Annostus pitäisi päättää ennen syntymän jäl ­
keistä päivää 25 Ei merkitystä tämän testimene ­
telmän soveltamisalalle 
Ikä, jolloin tehdään ovari ­
ektomia 6–8 viikon iässä 
Eläinten, joilta on pois ­
tettu munasarjat, annoksen 
antoikä Munasarjojen poiston ja ensim ­
mäisen annostelupäivän välillä 
olisi kuluttava vähintään 14 päivää. Munasarjojen poiston ja ensim ­
mäisen annostelupäivän välillä 
olisi kuluttava vähintään 7 päi ­
vää. 
Ruumiinpaino Ruumiinpainon vaihtelun olisi oltava mahdollisimman vähäinen, 
enintään ± 20 % keskipainosta
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 828
 
Rotta Hiiri  
Annostelu  
Annostelureitti Suun kautta letkulla tai ihon alle annettavalla injektiolla 
Annostelutiheys Yksi vuorokausiannos Letkun ja injektion kautta 
annettavan määrän tila ­
vuus ≤ 5ml/painokilo (tai korkeintaan 10 ml/painokilo, jos käytetään 
vesiliuosta) (ihonalaista reittiä kahteen pistoskohtaan) 
Annostelun kesto 3 peräkkäistä päivää kesken ­
kasvuisia eläimiä koskevan 
mallin osalta 
Vähintään 3 peräkkäistä päivää 
täysikasvuisia eläimiä, joilta on 
poistettu munasarjat, koskevan 
mallin osalta Seitsemän peräkkäistä päivää 
täysikasvuisia eläimiä, joilta on 
poistettu munasarjat, koskevan mallin osalta 
Ruumiinavauksen ajan ­
kohta Noin 24 tuntia viimeisen annoksen jälkeen  
Tulokset  
Positiivinen reaktio Tilastollisesti merkittävä kohdun keskipainon (märkä- ja/tai kui ­
vapaino) lisääntyminen 
Referenssiestrogeeni 17-alfa-etinyyliestradioli
 
TULOKSIEN TULKINTAA JA HYVÄKSYMISTÄ KOSKEVAT OHJEET  
54. Estrogeenivaikutuksia koskevaa testiä olisi pidettävä positiivisena, jos koh ­
dun paino lisääntyy tilastollisesti merkittävällä tavalla (p-arvo < 0,05) aina ­
kin suurimman annostason osalta liuotinta saavaan kontrolliryhmään verrat ­
tuna. Positiivista tulosta tukee myös annoksen ja vasteen suuruusluokan 
välisen biologisesti vakuuttavan suhteen osoittaminen. On pidettävä mieles ­
sä, että testikemikaalin päällekkäinen estrogeeni- ja antiestrogeenivaikutus voi vaikuttaa annosvastekäyrän muotoon.
 
55. Tietojen asianmukaisen arvioinnin varmistamiseksi on pidettävä huolta, että 
suurinta siedettävää annosta ei ylitetä. Tältä osin olisi perusteellisesti arvi ­
oitava ruumiinpainon laskua, kliinisiä oireita ja muita havaintoja.  
56. Kantaja-ainetta saavan kontrolliryhmän kohdun painoja pidetään kohtuun 
kohdistuvia vaikutuksia koskevan biotestin tietojen hyväksynnän kannalta tärkeänä näkökohtana. Korkeat kontrolliarvot voivat vaarantaa biotestistä 
saatavan vasteen ja kyvyn havaita erittäin heikot estrogeenivaikutuksia oma ­
avat agonistit. Ammattikirjallisuudessa ja tiedoissa, joita saatiin kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskevan biotestin validoinnin aikana, todetaan, että kontrolleissa esiintyy spontaanisti korkeita keskiarvoja erityisesti kas ­
vuvaiheessa olevilla eläimillä (2)(3)(6)(9). Koska keskenkasvuisten rottien 
kohdun paino on riippuvainen monista muuttujista, kuten kannasta tai ruu ­
miinpainosta, kohdun painolle ei voida antaa mitään lopullista ylärajaa. Ohjeena on, että jos keskenkasvuisten kontrollirottien kuivatun kohdun 
paino on 40 ja 45 milligramman välillä, tuloksia on pidettävä kyseenalaisi ­
na. Jos kohtu painaa yli 45 milligrammaa, testin suorittaminen uudelleen voi olla tarpeen. Tätä on kuitenkin harkittava tapauskohtaisesti (3)(6)(8). Kun testi tehdään täysikasvuisilla rotilla, epätäydellisesti suoritetusta ovariekto ­
miasta jää munasarjakudosta, joka voi tuottaa endogeenistä estrogeeniä ja 
hidastaa kohdun painon regressiota.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 829
 
57. Kantaja-ainetta saavan kontrolli-ryhmän kuivattujen kohtujen painot, jotka 
ovat alle 0,09 % keskenkasvuisten naarasrottien ruumiinpainosta ja alle 
0,04 % nuorten täysikasvuisten naaraiden ruumiinpainosta, vaikuttavat tuot ­
tavan hyväksyttäviä tuloksia (ks. taulukko 31 (2)). Jos kontrolliryhmän kohtujen paino on näitä suurempi, olisi tarkasteltava eri tekijöitä, kuten 
eläinten ikää, asianmukaisesti suoritettua munasarjojen poistoa, ravinnon 
fytoestrogeeneja, ja negatiivista testitulosta (jossa ei havaita estrogeenivai ­
kutusta) olisi käytettävä harkitsevasti.
 
58. Kantaja-ainetta saaneen kontrolliryhmän aikaisemmat tiedot olisi säilytettävä 
laboratoriossa. Positiivisten referenssiestrogeenien, kuten 17-alfa-etinyyliest ­
radolin, vasteita koskevat aikaisemmat tiedot olisi myös säilytettävä labora ­
toriossa. Laboratoriot voivat myös testata vastetta tunnettuihin heikon est ­
rogeenivaikutuksen omaaviin agonisteihin. Kaikkia näitä tietoja voidaan 
verrata saatavilla oleviin tietoihin (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8). Näin varmistetaan 
laboratorion menetelmien riittävä herkkyys.  
59. Kuivatun kohdun painot vaihtelivat OECD:n validointitutkimuksessa vä ­
hemmän kuin kohdun märkäpainot (6)(7). Merkittävä vaste kummassakin 
toimessa osoittaa kuitenkin, että testikemikaali on estrogeenivaikutuksen osalta positiivinen.
 
60. Kohtuun vaste ei aiheudu pelkästään estrogeeneista. Kohtuun kohdistuvia 
vaikutuksia koskevan biotestin positiivista tulosta olisi kuitenkin yleensä 
tulkittava todisteena mahdollisista estrogeenivaikutuksista  in vivo , ja sen 
vuoksi olisi tavallisesti käynnistettävä täydentäviä selvitystoimia (ks. hor ­
monaalisten haitta-aineiden testausta ja arviointia koskevat OECD:n käsit ­
teelliset puitteet (OECD Conceptual Framework for the Testing and Assess ­
ment of Endocrine Disrupting Chemicals), liite 2).  
Kuva 1  
Kaavio, jossa esitetään munasarjojen kirurginen poisto
  
Toimenpide aloitetaan avaamalla selkä- ja kylkilihaksen puoleinen vatsan ­
seinämä pituussuunnassa kylkiluun alarajan ja suoliluun harjanteen välisestä 
keskipisteestä ja muutama millimetri sivuun lannelihaksen lateraalisesta reu ­
nasta. Munasarjat olisi paikannettava vatsaontelon sisällä. Munasarjat olisi sen jälkeen poistettava vatsaontelosta aseptiselle alustalle, munasarjan ja 
kohdun välille olisi sijoitettava sidos verenvuodon hillitsemiseksi, ja muna ­
sarja poistetaan sidoksen päälle tehtävällä leikkauksella munajohtimen ja kunkin kohdunsarven yhtymäkohdasta. Kun on varmistettu, että runsasta verenvuotoa ei esiinny, vatsanseinämä olisi suljettava ompeleella ja nahka 
olisi suljettava hakasella tai ompeleella. Eläinten olisi annettava toipua ja 
kohdun painon palautua vähintään 14 päivän ajan ennen käyttöä.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 830
 
Kuva 2  
Kohdun kudosten irrottaminen ja valmisteleminen painonmittausta varten
  
Tämä menettely aloitetaan avaamalla vatsanseinämä häpyliitoksesta alkaen. Sen 
jälkeen kohdunsarvi ja munasarjat, jos niitä on, poistetaan selänpuoleisesta vat ­
sanseinämästä. Virtsarakko ja virtsajohtimet poistetaan kohdusta ja emättimestä 
vatsan puolelta ja sivupuolelta. Peräsuolen ja emättimen välissä oleva sidekudok ­
sesta muodostuva liitos irrotetaan, kunnes emättimen aukkoa ja välilihan nahkaa voidaan havainnoida. Kohtu ja emätin irrotetaan ruumiista leikkaamalla emätti ­
men seinämää aivan välilihan välisen yhdyskohdan nahan yläpuolelta, kuten 
kuvassa esitetään. Kohtu irrotetaan rungon seinämästä leikkaamalla varovaisesti 
kohdun mesenteria kohdassa, jossa se kiinnittyy kunkin kohdunsarven dorsolate ­
raalisen sivun koko pituudelta. Sen jälkeen kun se irrotetaan ruumiista, ylimää ­
räinen rasva ja sidekudos puhdistetaan pois. Jos munasarjoja ei ole poistettu, ne 
poistetaan munajohtimesta välttäen, että luminaalineste ei valu pois kohdunsar ­
vesta. Jos eläimeltä on poistettu munasarjat, olisi tutkittava, onko tyngissä mu ­
nasarjakudosta. Emätin irrotetaan kohdusta aivan kohdunkaulan alapuolelta niin, 
että kohdunkaula pysyy kohdun runko-osassa, kuten kuvassa esitetään. Kohtu 
voidaan sen jälkeen punnita.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 831
 
Lisäys 1  
MÄÄRITELMÄT:  
Antiestrogeenivaikutus  on kemikaalin kyky estää 17-beeta-estradiolin vaikutus 
nisäkkään elimistössä.  
Kemikaalilla  tarkoitetaan ainetta tai aineiden seosta.  
Syntymäaika  on syntymän jälkeinen päivä 0.  
Annostus  on yleinen käsite, johon sisältyy annos, annostiheys ja annostuksen 
kesto.  
Annos  on annostellun testikemikaalin määrä. Kohtuun kohdistuvia vaikutuksia 
koskevassa biotestissä annos ilmaistaan testikemikaalin painona koe-eläimen ruu ­
miinpainon yksikköä kohden vuorokaudessa (esim. milligramma testikemikaalia painokiloa kohti vuorokaudessa).
 
Suurin siedettävä annos  on korkein määrä kemikaalia, joka ei tapa koe-eläimiä 
siirtyessään niiden ruumiiseen (LD  0 ) (IUPAC, 1993).  
Estrogeenivaikutus  on kemikaalin kyky toimia 17-beeta-estradiolin tavoin ni ­
säkkään elimistössä.  
Syntymän jälkeinen päivä X  on eläimen syntymästä lähtien laskettava elinpäivä X.  
Herkkyys  on testissä oikein luokiteltujen kaikkien positiivisten/aktiivisten kemi ­
kaalien osuus. Se on täsmällisyyden mitta testimenetelmässä, jolla tuotetaan ka ­
tegorisia tuloksia, ja se on tärkeä ottaa huomioon testimenetelmän asianmukai ­
suuden arvioinnissa.  
Spesifiys  on testissä oikein luokiteltujen kaikkien negatiivisten/ei-aktiivisten ke ­
mikaalien osuus. Se on täsmällisyyden mitta testimenetelmässä, jolla tuotetaan kategorisia tuloksia, ja se on tärkeä ottaa huomioon testimenetelmän asianmukai ­
suuden arvioinnissa.
 
Testikemikaali  on mitä tahansa aine tai seos, jota testataan käyttämällä tätä 
testimenetelmää.  
Kohtuun kohdistuva vaikutus  on käsite, jolla kuvataan positiivista vaikutusta 
kohdun kudosten kasvuun.  
Validointi  on tieteellinen prosessi, joka on suunniteltu kuvaamaan toiminnallisia 
vaatimuksia ja testimenetelmän rajoja sekä osoittamaan sen luotettavuus ja asi ­
aankuuluvuus tiettyä tarkoitusta varten.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 832
 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 833
 ▼M5 
Lisäys 2
  
VMG mamm: Validation Management Group on Mammalian Testing and Assessment
 KÄSITEKEHYKSEEN LIITTYVÄT HUOMAUTUKSET:  
Huomautus 1:  Siirtyminen ja poistuminen on mahdollista kaikilla tasoilla ja 
riippuu olemassa olevan tietotarpeen luonteesta vaaran ja riskin 
arvioinnin suhteen.  
Huomautus 2:  Tasolla 5 ekotoksilogiaan olisi sisällyttävä päätetapahtumat, jotka 
osoittavat haittavaikutuksia koskevat mekanismit ja populaatiolle mahdollisesti aiheutuvat vahingot.
 
Huomautus 3:  Jos multimodaalimallilla katetaan useita yksittäisiä päätetapahtu ­
mia koskevia testejä, tämä malli korvaa tällaiset yksittäisiä pää ­
tetapahtumia koskevat testit.  
Huomautus 4:  Kunkin kemikaalin arvioinnin olisi oltava tapauskohtainen, ja 
siinä otetaan huomioon kaikki saatavilla oleva tieto kehyksen 
tasojen tarkoituksen huomioon ottaen.  
Huomautus 5:  Kehystä ei olisi pidettävä sellaisena, että se kattaa tällä hetkellä 
kaiken. Siihen sisältyy tasoilla 3, 4 ja 5 testejä, jotka ovat käy ­
tössä tai joiden validointi on kesken. Testit, joiden validointi on 
kesken, sisällytetään kehykseen väliaikaisesti. Kun ne on kehi ­
tetty ja validoitu, ne lisätään muodollisesti kehykseen.  
Huomautus 6:  Tasoa 5 ei olisi pidettävä sellaisena, että siihen sisältyy pelkäs ­
tään lopullisia testejä. Kyseiseen tasoon sisältyvien testien katso ­
taan edistävän yleistä vaarojen ja riskien arviointia.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 834
 
KIRJALLISUUSVIITTEET  
(1) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Dis ­
rupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10  th -11 th March 1998, 
ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
(2) OECD (2003). Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioassay: 
Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and 
Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic Bio ­
assay. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Tes ­
ting and Assessment No. 38. ENV/JM/MONO(2003)1.
 
(3) Owens JW, Ashby J. (2002). Critical Review and Evaluation of the Ut ­
erotrophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists 
and Antagonists: In Support of the Validation of the OECD Uterotrophic Protocols for the Laboratory Rodent. Crit. Rev. Toxicol. 32:445–520.
 
(4) OECD (2006). OECD Report of the Initial Work Towards the Validation 
of the Rodent Uterotrophic Assay — Phase 1. OECD Environmental 
Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 65. ENV/JM/MONO(2006)33.
 
(5) Kanno, J, Onyon L, Haseman J, Fenner-Crisp P, Ashby J, Owens W. 
(2001). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to 
screen compounds for  in vivo  estrogenic responses: Phase 1. Environ 
Health Perspect. 109:785–94.  
(6) OECD (2006). OECD Report of the Validation of the Rodent Uterotrophic 
Bioassay: Phase 2 — Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by 
Multiple Laboratories. OECD Environmental Health and Safety Publica ­
tion Series on Testing and Assessment No. 66. ENV/JM/MONO(2006)34.  
(7) Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dose Response Studies. Environ. Health Persp.111:1530–1549
 
(8) Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Coded Single Dose Studies. Environ. Health Persp.111:1550–1558.
 
(9) Owens W, Ashby J, Odum J, Onyon L. (2003). The OECD program to 
validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dietary phytoestrogen 
analyses. Environ. Health Persp. 111:1559–1567.  
(10) Ogasawara Y, Okamoto S, Kitamura Y, Matsumoto K. (1983). Prolifera ­
tive pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of 
[
 125 ]iododeoxyuridine. Endocrinology 113:582–587.  
(11) Branham WS, Sheehan DM, Zehr DR, Ridlon E, Nelson CJ. (1985). The 
postnatal ontogeny of rat uterine glands and age-related effects of 17b- estradiol. Endocrinology 117:2229–2237.
 
(12) Schlumpf M, Berger L, Cotton B, Conscience-Egli M, Durrer S, Flei ­
schmann I, Haller V, Maerkel K, Lichtensteiger W. (2001). Estrogen 
active UV screens. SÖFW-J. 127:10–15.  
(13) Zarrow MX, Lazo-Wasem EA, Shoger RL. (1953). Estrogenic activity in a 
commercial animal ration. Science 118:650–651.  
(14) Drane HM, Patterson DSP, Roberts BA, Saba N. (1975). The chance 
discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake. Fd. Cosmet. To ­
xicol. 13:425–427.  
(15) Boettger-Tong H, Murphy L, Chiappetta C, Kirkland JL, Goodwin B, 
Adlercreutz H, Stancel GM, Makela S. (1998). A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on  in vivo  res­
ponses to exogenously administered estrogens. Environ. Health Pers ­
pec.106:369–373.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 835
 
(16) OECD (2007). Additional data supporting the Test Guideline on the Ut ­
erotrophic Bioassay in rodents. OECD Environmental Health and Safety 
Publication Series on Testing and Assessment No. 67.  
(17) Degen GH, Janning P, Diel P, Bolt HM. (2002). Estrogenic isoflavones in 
rodent diets. Toxicol. Lett. 128:145–157.  
(18) Wade MG, Lee A, McMahon A, Cooke G, Curran I. (2003). The influence 
of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats. Food Chem. Toxicol. 41:1517–1525.
 
(19) Yamasaki K, Sawaki M, Noda S, Wada T, Hara T, Takatsuki M. (2002). 
Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats given diffe ­
rent phytoestrogen content diets and the ovarian changes in the immature 
rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide. Arch. Toxicol. 76:613–620.
 
(20) Thigpen JE, Haseman JK, Saunders HE, Setchell KDR, Grant MF, For ­
sythe D. (2003). Dietary phytoestrogens accelerate the time of vaginal 
opening in immature CD-1 mice. Comp. Med. 53:477–485.  
(21) Ashby J, Tinwell H, Odum J, Kimber I, Brooks AN, Pate I, Boyle CC. 
(2000). Diet and the aetiology of temporal advances in human and rodent 
sexual development. J. Appl. Toxicol.20:343–347.  
(22) Thigpen JE, Lockear J, Haseman J, Saunders HE, Caviness G, Grant MF, 
Forsythe DB. (2002). Dietary factors affecting uterine weights of immature CD-1 mice used in uterotrophic bioassays. Cancer Detect. Prev. 
26:381–393.
 
(23) Thigpen JE, Li L-A, Richter CB, Lebetkin EH, Jameson CW. (1987). The 
mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: I. A 
standardized method for conducting the mouse bioassay. Lab. Anim. Sci.37:596–601.
 
(24) OECD (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425.  
(25) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.  
(26) OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4.
 
(27) Bulbring, E., and Burn, J.H. (1935). The estimation of oestrin and of male 
hormone in oily solution. J. Physiol. 85: 320–333.  
(28) Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. and Koch, F.C (1936). The nature of the 
estrogenic substance in human male urine and bull testis. Endocrinology 
19: 33–41.  
(29) Reel, J.R., Lamb IV, J.C. and Neal, B.H. (1996). Survey and assessment 
of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fun ­
dam. Appl. Toxicol. 34: 288–305.  
(30) Jones, R.C. and Edgren, R.A. (1973). The effects of various steroid on the 
vaginal histology in the rat. Fertil. Steril. 24: 284–291.  
(31) OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
— Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Paris.  
(32) Dorfman R.I. (1962). Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: 
Standard Methods Adopted by Official Organization. New York, Acade ­
mic Press.  
(33) Thigpen J. E. et al. (2004). Selecting the appropriate rodent diet for en ­
docrine disruptor research and testing studies. ILAR J 45(4): 401–416.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 836
 
(34) Gray L.E. and Ostby J. (1998). Effects of pesticides and toxic substances 
on behavioral and morphological reproductive development: endocrine 
versus non-endocrine mechanism. Toxicol Ind Health. 14 (1–2): 159–184.  
(35) Booth AN, Bickoff EM and Kohler GO. (1960). Estrogen-like activity in 
vegetable oils and mill by-products. Science 131:1807–1808.  
(36) Kato H, Iwata T, Katsu Y, Watanabe H, Ohta Y, Iguchi T (2004). Eva ­
luation of estrogenic activity in diets for experimental animals using  in 
vitro  assay. J. Agric Food Chem. 52, 1410–1414.  
(37) OECD (2007). Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay Proce ­
dure to Test for Antioestrogenicity. Series on Testing and Assessment. No. 71.
 
(38) Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivi 2010/63/EU, annettu 
22 päivänä syyskuuta 2010, tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten 
suojelusta (EUVL L 276, 20.10.2010, s. 33).  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 837
 
B.55.  ROTILLA TEHTÄVÄ HERSHBERGERIN BIOTESTI: LYHYT ­
AIKAINEN SEULONTATESTI ANDROGEENISISTA (ANTIAND ­
ROGEENISISTA) OMINAISUUKSISTA  
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 441 (2009). OECD aloitti 
vuonna 1998 korkean prioriteetin toimenpiteet, jotta voimassa olevia ohjeita tarkistetaan ja kehitetään uusia, joilla mahdollisia hormonaalisia 
haitta-aiheita seulotaan ja testataan (1). Yksi toimiin kuuluva osa oli rotilla 
tehtävän Hershbergerin biotestiä koskevan testiohjeen kehittäminen. Tätä testiä on käytetty vuosikymmeniä lääketeollisuudessa, ja sen jälkeen viral ­
linen asiantuntijaryhmä standardoi sen ensimmäisen kerran vuonna 1962 
androgeenisia kemikaaleja koskevaksi seulontavälineeksi (2). Rotilla tehtä ­
västä Hershbergerin biotestistä on tehty vuosina 2001–2007 kattava vali ­
dointiohjelma, johon sisältyi tausta-asiakirjan tekeminen (23), yksityiskoh ­
taisia työmenetelmiä koskevan asiakirjan kerääminen (3), dissektiota koske ­
van oppaan laatiminen (21) ja sellaisten laajojen laboratorioiden sisäisten ja 
niiden välisten tutkimusten suorittaminen, joilla osoitettiin biotestin luotet ­
tavuus ja toistettavuus. Nämä validointitutkimukset suoritettiin voimakkaalla 
referenssiandrogeenilla (testosteroni-propionaatti, jäljempänä ’TP’), kahdella 
voimakkaalla synteettisellä androgeenilla (trenboloniasetaatti ja metyylites ­
tosteroni), voimakkaalla antiandrogeenisella lääkkeellä (flutamidi), luonnol ­
lisen androgeenin (dihydrotestosteroni) voimakkaalla synteesin estäjällä (fi ­
nasteridi), usealla heikolla antiandrogeenisellä torjunta-aineella (linuroni, 
vinklotsoliini, prokymidoni, p,p ′ DDE), voimakkaalla 5-alfa-reduktaasin es ­
täjällä (finasteridi) ja kahdella tunnetulla negatiivisella kemikaalilla (dinit ­
rofenoli ja nonyylifenoli) (4)(5)(6)(7)(8). Tämä testimenetelmä on tulos 
biotestistä saadusta pitkästä kokemuksesta sekä validointitestiä koskevan 
ohjelman kokemuksista ja siitä saaduista tuloksista.
 
2. Hershbergerin biotesti on lyhytaikainen  in vivo  -seulontatesti, jossa käyte ­
tään urosten lisääntymiselimiin liittyviä kudoksia. Testi on peräisin 1930- 
luvulta, ja sitä mukautettiin 1940-luvulla niin, että siihen sisällytettiin uros ­
ten lisääntymiselinten androgeenille herkästi reagoivat lihakset (2)(9–15). Yli 700 mahdollista androgeenia arvioitiin 1960-luvulla käyttäen testiproto ­
kollan standardisoitua versiota (2)(14). Androgeeneja ja antiandrogeenejä 
koskevien testien käyttöä pidettiin vakiomenetelmänä 1960-luvulla (2)(15). Tämä biotesti perustuu puberteetin alkuvaiheessa olevien kastroitujen uros ­
rottien viiden androgeeniriippuvaisen kudoksen painonmuutoksiin. Siinä ar ­
vioidaan kemikaalin kykyä käynnistää biologista toimintaa, joka on yhden ­
mukaista androgeenivaikutuksen omaavien agonistien, antagonistien tai 5-alfa-reduktaasin estäjien kanssa. Tähän testimenetelmään sisältyvät viisi 
androgeeniriippuvaista kohdekudosta ovat ventraalinen eturauhanen, rakku ­
larauhanen (sekä nesteitä ja eturauhasen etuosa), peräaukon kohottajalihas ja värvelihas, Cowperin rauhaset ja terska. Puberteetin alkuvaiheessa olevilla kastroiduilla urosrotilla kaikki nämä viisi kudosta reagoivat androgeeneihin 
niin, että niiden absoluuttinen paino lisääntyy. Kun näitä kudoksia stimu ­
loidaan lisäämään painoa voimakasta referenssiandrogeenia antamalla, kaikki nämä viisi kudosta reagoivat antiandrogeeneihin niin, että niiden absoluuttinen paino vähenee. Hershbergergin biotestin päämalli on pubertee ­
tin alkuvaiheessa oleva kirurgisesti kastroitu uros, ja tämä validoitiin Hersh ­
bergerin validointiohjelman vaiheessa 1, 2 ja 3.
 
3. Hershbergerin biotesti on mekaaninen  in vivo  -seulontatesti androgeenivai ­
kutuksen omaaville agonisteille, antagonisteille tai 5-alfa-reduktaasin estä ­
jille. Sen soveltamista olisi tarkasteltava osana hormonaalisten haitta-aineiden testausta ja arviointia koskevia OECD:n käsitteellisiä puit ­
teita (OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of 
Endocrine Disrupting Chemicals) (liite 2). Tässä käsitekehyksessä Hersh ­
bergedin biotesti sisältyy tasolle 3  in vivo  -testinä, jolla tarjotaan tietoja
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 838
 
yhdestä endokriinisesta mekanismista, androgeenisesta toiminnasta (antiad ­
rogeenisesta toiminnasta). Se on tarkoitus sisällyttää  in vitro-  ja in vivo  
-testiryhmään, jolla tunnistetaan sisäeritysjärjestelmään mahdollisesti vaiku ­
tuksia aiheuttavat kemikaalit. Viime kädessä tehdään arviot ihmisten tervey ­
delle tai ympäristölle aiheutuvista vaaroista ja riskeistä.  
4. Kastraatiomenettelyyn liittyvien eläinten hyvinvointia koskevien huolen ­
aiheiden vuoksi Hershbergerin biotestin vaihtoehtoiseksi malliksi, jolla väl ­
tettiin kastraatio, luotiin leikkaamatonta (kastroimatonta) stimuloitua vasta ­
vieroitettua urosta koskeva malli. Stimuloitua vastavieroitettua koskeva tes ­
timenettely validoitiin (24); validointitutkimuksissa Hershbergerin biotestin 
vastavieroitettua urosta koskevalla versiolla ei kuitenkaan pystytty havaitse ­
maan johdonmukaisesti heikkojen antiandrogeenien vaikutusta androgee ­
niriippuvaisten elinten painoon testatuilla annostasoillla. Sitä ei sen vuoksi sisällytetä tähän testimenetelmään. Se on kuitenkin sisällytetty OECD:n 
ohjeasiakirjaan 115 (25), koska se on hyödyllinen eläinten hyvinvoinnin 
kannalta ja sillä voidaan myös tarjota tietoja muista toimintatavoista.
 
ALUSTAVAT NÄKÖKOHDAT JA RAJOITUKSET  
5. Androgeenivaikutuksen omaavat agonistit ja antagonistit toimivat ligandeina 
androgeenireseptorille, jäljempänä ’AR’, ja ne voivat aktivoida tai estää 
reseptorin ohjaaman geenitranskription. Lisäksi jotkut kemikaalit estävät 
testosteronin muuttumisen voimakkaammaksi luonnolliseksi androgeeniksi dihydrotestosteroniksi joissakin androgeenien kohdekudoksissa (5-alfa-re ­
duktaasin estäjät). Tällaiset kemikaalit voivat mahdollisesti aiheuttaa tervey ­
delle vaaraa, myös lisääntymis- ja kehitysvaikutuksia. Siten sääntelyyn liit ­
tyvien vaatimusten vuoksi on arvioitava ja analysoitava nopeasti, voiko kemikaali toimia mahdollisesti androgeenivaikutuksen omaavana agonistina 
tai antagonistina taikka 5-alfa-reduktaasin estäjänä. Ligandin affiniteetti and ­
rogeenireseptoriin, mitattuna reseptoriin sitoutumisena, tai reportterigeenien transkription aktivointi  in vitro,  ei ole ainoa mahdollista vaaraa osoittava 
tekijä, mutta sillä tarjotaan tietoja. Muihin tekijöihin sisältyvät metaboloin ­
nin aktivointi tai deaktivointi kehoon siirtymisen yhteydessä, kemiallinen 
jakautuminen kohdekudoksiin ja poistuminen kehosta. Tämän vuoksi on seulottava kemikaalin mahdollinen vaikutus  in vivo  asianmukaisten olosuh ­
teiden ja altistumisen perusteella.  In vivo  -arviointi ei ole niin ratkaiseva, jos 
kemikaalin absorptiota, jakautumista, metaboloitumista ja erittymistä koske ­
vat ominaisuudet ovat tiedossa. Androgeeniriippuvaiset kudokset reagoivat androgeenistimulointiin nopealla ja voimakkaalla kasvulla erityisesti, kun kyseessä ovat puberteetin alkuvaiheessa kastroidut urosrotat. Jyrsijälajeja, 
erityisesti rottia, käytetään myös laajasti myrkyllisyystutkimuksissa vaarate ­
kijöiden kuvaamista varten. Tästä syystä testiversio, jossa käytetään puber ­
teetin alkuvaiheessa kastroituja rottia ja viittä kohdekudosta, on asianmu ­
kainen androgeenivaikutuksen omaavien agonistien ja antagonistien sekä 5- 
alfa-reduktaasin estäjien  in vivo  -seulonnalle.
 
6. Tämä testimenetelmä perustuu sellaisiin OECD:n validointitutkimuksessa 
käytettyihin protokolliin, joiden on osoitettu olevan luotettavia ja toistettavia laboratorioiden sisäisissä ja niiden välisissä tutkimuksissa (4)(5)(6)(7)(8). 
Tässä testimenetelmässä esitetään androgeeneihin ja antiandrogeeneihin liit ­
tyvät menettelyt.
 
7. Vaikka eri laboratorioiden soveltamassa OECD:n Hershbergerin biotestiä 
koskevassa validointiohjelmassa käytetyssä TP-annoksessa oli jonkin verran vaihtelua (0,2 verrattuna 0,4 milligrammaan/painokilo/vuorokausi, ihonalai ­
nen injektio), näiden kahden testiprotokollan vaihteluvälissä ei ollut juu ­
rikaan eroa, kun kyseessä on kyky havaita heikko tai voimakas antiandro ­
geeninen aktiviteetti. On kuitenkin selvää, että TP-annoksen ei pitäisi olla liian suuri, jolloin heikkojen andogeenireseptorin antagonistien vaikutus es ­
tetään, tai niin pieni, että androgeeniriippuvaisissa kudoksissa esiintyy vain 
vähän kasvuvastetta, vaikka samaan aikaan ei annettaisi antiandrogeenia.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 839
 
8. Yksittäisten androgeeniriippuvaisten kudosten kasvu ei aiheudu pelkästään 
androgeeneistä, eli kemikaalit, jotka ovat muita kuin androgeenivaikutuksen 
omaavia agonisteja, voivat muuttaa tiettyjen kudosten painoa. Kuitenkin useiden kudoksien samanaikainen kasvuvaste osoittaa androgeenispesifisem ­
män mekanismin. Esimerkiksi suuret annokset voimakkaita estrogeeneja 
voivat lisätä rakkularauhasten painoa; muissa testiin sisältyvissä androgee ­
niriippuvaisissa kudoksissa vaste ei ole samanlainen. Antiandrogeeniset ke ­
mikaalit voivat toimia joko androgeenireseptorin antagonisteina tai 5-alfa- reduktaasin estäjinä, ja 5-alfa-reduktaasin estäjillä on vaihteleva vaikutus, 
koska muuttuminen vahvempaan dihydrotestosteroniin vaihtelee kudoksen 
perusteella. Antiandrogeeneilla, jotka estävät 5-alfa-reduktaasin, kuten finas ­
teridi, on voimakkaampi vaikutus ventraaliseen eturauhaseen kuin muihin kudoksiin verrattuna voimakkaaseen AR:n antagonistiin, kuten flutamidiin. 
Tätä kudosvastetta koskevaa eroa voidaan käyttää havaitsemaan ero 
AR-välitteisen ja 5-alfa-reduktaasi-välitteisen toiminnan välillä. Lisäksi and ­
rogeenireseptori liittyy kehityksellisesti muihin steroidihormoneihin, ja tietyt muut hormonit, kun niitä annetaan korkealla, suprafysiologisella annostasol ­
la, voivat sitoa ja toimia vastaan TP:n kasvua edistäviä vaikutuksia (13). On 
myös mahdollista, että tehostunut steroidiaineenvaihdunta ja siitä johtuva seerumin testosteronin alentuminen voi vähentää androgeeniriippuvaisten kudosten kasvua. Tästä syystä kaikkia Hershbergerin biotestin positiivisia 
tuloksia olisi normaalisti arvioitava soveltamalla todistusnäyttöä koskevaa 
lähestymistapaa, myös  in vitro  -testejä, kuten AR:n ja estrogeenireseptorin 
sitoutumistestejä ja vastaavia transkription aktivointia koskevia testejä tai muita  in vivo  -testejä, joissa tarkastellaan samoja androgeenin kohdekudok ­
sia. Näihin sisältyvät urosten puberteettia koskeva testi, 15 vuorokauden 
täyskasvuisia uroksia koskeva testi, taikka toistetuilla annoksilla tehdyt 28 tai 90 vuorokauden testit.
 
9. Kokemus osoittaa, että ksenobioottiset androgeenit ovat harvinaisempia kuin 
ksenobioottiset antiandrogeenit. Siten oletetaan, että Hershbergerin biotestiä käytetään useimmiten antiandrogeenien seulontaan. Androgeenien testaa ­
mista koskevaa menettelyä voitaisiin kuitenkin suositella steroideille tai 
steroidien kaltaisille kemikaaleille, taikka kemikaaleille, joiden indikaatio 
mahdollisista androgeenisista vaikutuksista on peräisin käsitekehyksen ta ­
soon 1 tai 2 sisältyvistä menettelyistä (liite 2). Samoin androgeenisiin (an ­
tiandrogeenisiin) ominaisuuksiin liittyviä haittavaikutuksia voidaan havain ­
noida tason 5 testeissä, mikä johtaa tarpeeseen arvioida, toimiiko kemikaali 
endokriinisella vaikutustavalla.
 
10. On todettava, että kaikkien eläimiin perustuvien menettelyiden on täytettävä 
paikalliset eläinten hoitoa koskevat vaatimukset; jäljempänä esitetyt kuva ­
ukset hoidosta ja käsittelystä ovat toimintaa koskevia vähimmäisvaatimuk ­
sia, ja ne korvataan paikallisilla säännöksillä, kuten tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten suojelusta 22 päivänä syyskuuta 2010 annetulla Euroo ­
pan parlamentin ja neuvoston direktiivillä 2010/63/EU (26). OECD antaa 
lisäohjeita eläinten inhimillisestä kohtelusta (17).
 
11. Kuten kaikissa biotesteissä, joissa käytetään koe-eläimiä, olisi harkittava 
huolellisesti, onko tutkimuksen suorittaminen tarpeen. Tällaiseen päätökseen 
voi olla kaksi syytä:  
— korkea altistuspotentiaali (käsitekehyksen taso 1) tai osoitukset andro ­
geenisestä vaikutuksesta (antiandrogeenisyydesta) (taso 2), jolla tuetaan 
tutkimusta siitä, voivatko vaikutukset esiintyä  in vivo  
— androgeenivaikutusten (antiandrogeenivaikutusten) kanssa yhdenmukai ­
set vaikutukset tason 4 ja 5  in vivo  -testeissä tukevat tutkimuksia tietystä 
vaikutustavasta, esim. määritystä siitä, johtuvatko vaikutukset androgee ­
nisesta (antiandrogeenisesta) mekanismista.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 840
 
12. Tässä testimenetelmässä käytetyt määritelmät esitetään liitteessä 1.  
TESTIN PERIAATE  
13. Hershbergerin biotestin herkkyys saavutetaan käyttämällä uroksia, jotka 
tuottavat mahdollisimman vähän endogeenista androgeenia. Tämä voidaan toteuttaa käyttämällä kastroituja uroksia. Kastraation jälkeen kohdekudok ­
silla on ollut riittävästi aikaa kutistua minimiin, ja samantasoinen lähtöpaino 
on otettu huomioon. Seulottaessa mahdollista androgeenista toimintaa eläi ­
men endogeenisen androgeenin taso on alhainen ja hypotalamusta, aivoli ­
säkettä ja sukupuolirauhasia koskevaa akselia on estetty kompensoimasta 
tätä palautemekanismeilla, kudosten vastekykyä on maksimoitu ja kudosten 
painonvaihtelua kokeen alussa on vähimmäistetty. Seulottaessa mahdollista antiandrogeenista toimintaa, johdonmukaisempi kudosten painonnousu voi ­
daan saada aikaan, kun kudoksia stimuloidaan referenssiandrogeenilla. Siten 
Hershbergerin biotestiin tarvitaan vain kuusi eläintä annosryhmää kohti, kun 
muissa testeissä, joissa käytetään leikkaamattomia puberteettivaiheessa ole ­
via tai täysikasvuisia uroksia, suositellaan käyttämään 15 urosta annosryh ­
mää kohti.
 
14. Puberteetin alkuvaiheessa olevien urosrottien kastraatio olisi toteuttava 
asianmukaisesti käyttämällä hyväksyttyä anestesiamenetelmää ja aseptista tekniikkaa. Kipulääke annetaan ensimmäisinä päivinä leikkauksen jälkeen 
leikkauksen jälkeisten vaivojen poistamiseksi. Kastraatio tehostaa testin 
tarkkuutta havaita heikot androgeenit ja antiandrogeenit, koska leikkaamat ­
toman eläimen kompensoiva endokriininen palautemekanismi, joka voi lie ­
vittää annettujen androgeenien ja antiandrogeenien vaikutusta, poistetaan ja 
koska merkittävä yksilöiden välinen seerumin testosteronin tason vaihtelu 
poistetaan. Kastraatiolla vähennetään siten tällaisen endokriinisen toiminnan seulontaan tarvittavien eläinten määrää.
 
15. Kun seulotaan mahdollista androgeenista toimintaa, testikemikaalia annos ­
tellaan päivittäin suun kautta letkulla tai ihonalaisella injektiolla 10 peräk ­
käisen päivän ajan. Testikemikaali annetaan vähintään kahdelle koe-eläinten koeryhmälle käyttäen yhtä annostasoa ryhmää kohti. Koe-eläimille suorite ­
taan ruumiinavaus noin 24 tunnin kuluttua viimeisestä annoksesta. Kaikki 
tilastollisesti merkittävät kahden tai useamman kohde-elimen painonnousut 
testikemikaalia saavassa ryhmässä verrattuna kantaja-ainetta saavaan kont ­
rolliryhmään, merkitsevät, että testikemikaali on mahdollisen androgeenisen toiminnan osalta positiivinen (ks. 60 kohta). Trenbolonin kaltaisilla andro ­
geeneilla, jotka eivät voi olla 5-alfa-reduktaasin estäjiä, on vahvempia vai ­
kutuksia peräaukon kohottajalihakseen ja värvelihakseen sekä terskaan TP:hen verrattuna, mutta kaikkien kudosten kasvun pitäisi lisääntyä.
 
16. Seulottaessa mahdollista androgeenista toimintaa testikemikaali annostellaan 
päivittäin suun kautta letkulla tai ihonalaisella injektiolla 10 peräkkäisen päivän ajan yhdessä TP-annosten kanssa (0,2 tai 0,4 mg/kg/vuorokausi) ihonalaisella injektiolla. Validointiohjelmassa määriteltiin, että TP:tä voi ­
daan käyttää joko 0,2 tai 0,4 mg/kg/vuorokausi, koska kummatkin annokset 
olivat tehokkaita antiandrogeenien havaitsemisessa ja sen vuoksi testiin olisi valittava ainoastaan yksi annos. Testikemikaalin porrastetut annokset anne ­
taan vähintään kolmelle koe-eläinten koeryhmille käyttäen yhtä annostasoa 
ryhmää kohti. Koe-eläimille suoritetaan ruumiinavaus noin 24 tunnin kulut ­
tua viimeisestä annoksesta. Kaikki tilastollisesti merkittävät kahden tai use ­
amman kohde-elimen painonnousut testattavaa kemikaalia ja TP:tä saavassa ryhmässä verrattuna pelkästään TP:tä saavaan kontrolliryhmään, merkitse ­
vät, että testikemikaali on mahdollisen androgeenisen toiminnan osalta po ­
sitiivinen (ks. 61 kohta).
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 841
 
MENETELMÄN KUVAUS  
Eläinlajin ja kannan valinta  
17. Rottia on käytetty tavallisesti Hershbergerin biotestissä 1930-luvulta lähtien. 
Vaikka on biologisesti mahdollista, että rottien ja hiirten käytöstä saataisiin 
samanlaisia vastauksia, rottamallista saadun 70 vuoden kokemuksen perus ­
teella Hershbergerin biotestin lajiksi on valittu rotta. Lisäksi, koska Hersh ­
bergerin biotesti voidaan tehdä ennen pitkäaikaista monen sukupolven tut ­
kimusta, kummassakin tutkimuksessa on käytettävä samaa eläinlajia, kantaa 
ja toimituslähdettä.  
18. Laboratoriot voivat valita tämän protokollan perusteella testissä käytettävän 
rottakannan. Sen pitäisi yleensä olla kanta, jota on käytetty aikaisemmin testin suorittavassa laboratoriossa. Testiin voidaan käyttää laboratoriossa yleisesti käytettyjä rottakantoja; kuitenkin, kantoja, jotka kehittyvät huomat ­
tavasti 42 päivän ikää myöhemmin, ei pitäisi käyttää, koska näiden urosten 
kastrointi 42 päivän iässä voi estää terskan painon mittaamisen. Tämä voi ­
daan tehdä ainoastaan sen jälkeen, kun esinahka eroaa peniksestä. Tästä syystä Fisher 344 -rotista johdettuja kantoja ei pitäisi käyttää harvinaisia 
tapauksia lukuun ottamatta. Fisher 344 -rotalla on erilainen seksuaalisen 
kehityksen ajoitus muihin yleisemmin käytettyihin kantoihin, kuten Sprague Dawley ja Wistar, nähden (16). Jos tällaista kantaa käytetään, laboratorion pitäisi kastroida ne jonkin verran myöhäisemmässä iässä, ja sen olisi voitava 
osoittaa käytetyn kannan testiherkkyys. Laboratorion olisi esitettävä selke ­
ästi perustelut rottakannan valinnalle. Mikäli seulontatesti suoritetaan ennen oraalista toistuvan annostelun tutkimusta, lisääntymis- ja kehitystutkimusta tai pitkäaikaista tutkimusta, kaikissa kokeissa on käytettävä mieluiten sa ­
masta kannasta ja lähteestä olevaa eläintä.
 
Koe-eläinten häkit ja ruokinta  
19. Kaikkien toimenpiteiden olisi oltava eläinten hoitoa koskevien paikallisten 
vaatimusten mukaisia. Nämä kuvaukset hoidosta ja käsittelystä ovat vähim ­
mäisvaatimuksia, ja ne korvataan tiukemmilla paikallisilla säännöksillä, ku ­
ten tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten suojelusta 22 päivänä syyskuuta 2010 annetulla Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivillä 
2010/63/EU (26). Koe-eläinhuoneen lämpötilan pitäisi olla 22 °C (se voi 
vaihdella noin ± 3 °C). Suhteellinen kosteus on vähintään 30 % eikä mie ­
lellään ylitä 70:tä % muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana. Tavoit ­
teena on 50–60 %:n suhteellinen kosteus. Huoneessa tulee käyttää keinov ­
alaistusta. Valaistusta olisi käytettävä jaksossa 12 tuntia valoa, 12 tuntia 
pimeää.
 
20. Usean eläimen ryhmä on parempi kuin yksin pitäminen, koska eläimet ovat 
nuoria ja rotat ovat sosiaalisia eläimiä. Kahden tai kolmen eläimen pitämi ­
sellä häkissä vältetään tilanahtaus ja siihen liittyvä stressi, joka voi häiritä lisäsukupuolirauhasten kudoksien kehityksen hormonaalista kontrollia. Hä ­
kit puhdistetaan kauttaaltaan ja mahdolliset epäpuhtaudet poistetaan. Häkit 
sijoitetaan siten, että niiden sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdolli ­
simman vähäisiä. Sopivan kokoinen häkki (~ 2 000 neliösenttimetriä) estää tilanahtauden.
 
21. Kukin eläin olisi tunnistettava yksilöllisesti (esim. korvamerkillä tai muulla 
merkinnällä) käyttäen inhimillistä menetelmää. Tunnistustapa on kirjattava.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 842
 
22. Laboratorioruokintaa ja juomaveden määrää ei saa rajoittaa. Hersbergerin 
biotestiä suorittavien laboratorioiden olisi käytettävä laboratorioruokavaliota, 
jota käytetään tavallisesti, kun ne testaavat kemikaaleja. Biotestiä koskevissa validointitesteissä ei havaittu, että ruokavaliolla olisi ollut vaikutuksia tai se olisi aiheuttanut vaihtelua. Käytetty ravinto kirjataan ja näyte laboratoriora ­
vinnosta olisi säilytettävä mahdollista myöhempää analyysia varten.
 
Androgeeniriippuvaisten elinten painoa koskevat suorituskriteerit  
23. Validointitutkimuksen aikana ei esiintynyt näyttöä siitä, että ruumiinpainon 
laskeminen lisäsi tai vähensi kohdekudosten (eli niiden, joita tässä tutki ­
muksessa punnitaan) kudospainon lisääntymistä.  
24. Validointiohjelmassa menestyksekkäästi käytettyjen eri rottakantojen andro ­
geeniriippuvaisten elinten paino on painavammilla rottakannoilla suurempi 
kuin kevyemmillä. Tästä syystä Hershbergerin biotestin suorituskriteereihin 
eivät sisälly absoluuttiset odotettavissa olevat elinten painot positiivista ja negatiivista kontrollia varten.
 
25. Koska kudoksen variaatiokertoimella on vastakkainen suhde tilastollisen 
voiman kanssa, Hershbergerin biotestin suorituskriteerit perustuvat kunkin 
kudoksen variaatiokertoimen maksimiarvoihin (taulukko 1). Variaatiokertoi ­
met ovat peräisin OECD:n validointitutkimuksista. Laboratorioiden olisi tarkasteltava negatiivisten vaikutusten osalta kontrolliryhmän ja korkean 
annoksen koeryhmän variaatiokertoimia sen määrittelemiseksi, onko variaa ­
tiokertoimen maksimiarvoja koskevat suorituskriteerit ylitetty.
 
26. Tutkimus olisi toistettava, jos: 1) kolme tai useampi kymmenestä mahdol ­
lisesta yksittäisestä variaatiokertoimesta kontrolliryhmässä ja korkean an ­
noksen koeryhmässä ylittää agonisteja ja antagonisteja koskeville tutkimuk ­
sille taulukossa 1 osoitetun enimmäisarvon, tai 2) ainakin kaksi kohdeku ­
dosta on vähämerkityksistä, eli niiden r-arvo on 0,05–0,10.  
Taulukko 1  
Suurimpien sallittujen variaatiokertoimien määritteleminen 
lisäsukupuolirauhasten kohdekudoksille kastroitua eläintä koskevassa 
mallissa OECD:n validointitutkimuksissa  ( 1 ) 
Kudos Antiandrogeeniset vai ­
kutukset Androgeeniset vaiku ­
tukset  
Rakkularauhaset 40 % 40 % 
Ventraalinen eturauhanen 40 % 45 % 
Peräaukon kohottajalihas ja 
värvelihas 20 % 30 % 
Cowperin rauhaset 35 % 55 % 
Terska 17 % 22 %  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 843  
( 1 ) Tietyn kudoksen variaatiokertoimen kynnysarvo tunnistettiin variaatiokertoimen arvoja 
koskevasta kaaviokuvasta — joka on järjestetty pienimmästä peräkkäin suurimpaan — 
kaikkien validointiohjelman kokeiden kaikille keskiarvoille käyttäen tiettyä mallia (ago ­
nisti tai antagonisti). Variaatiokertoimen kynnysarvo luetaan siitä pisteestä, kun lisäykset 
seuraavaan suurempaan variaatiokertoimeen sarjassa ovat huomattavasti suurempia kuin 
muutamat edeltävät variaatiokertoimet — raja-arvo. Olisi pantava merkille, että vaikka 
tässä analyysissa todettiin melko luotettavia raja-arvoja testin antagonisteja koskevalle 
mallille, variaatiokertoimen agonisteja koskevan testin käyrät osoittivat tasaisemman li ­
säyksen, jolloin tällä menettelyllä tunnistettava kynnysarvio on jokseenkin 
sattumanvarainen.
 TESTIN SUORITTAMINEN  
Sääntelyn noudattaminen ja laboratorioiden pätevyyden varmistaminen  
27. Toisin kuin kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskevassa testissä (tässä liit ­
teessä oleva B.54 luku), Hershbergerin testissä laboratorioiden pätevyyttä ei 
tarvitse osoittaa ennen tutkimuksen aloittamista, koska rinnakkaisten positii ­
visten (testosteroni-propionaatti ja flutamidi) ja negatiivisten kontrollien suorittaminen on olennainen osa testiä.
 
Eläinten lukumäärä ja kunto  
28. Kuhunkin koe- ja kontrolliryhmään pitäisi sisältyä ainakin kuusi eläintä. 
Tämä koskee androgeeni- ja antiandrogeenivaikutusta koskevia protokollia.  
Kastrointi  
29. Eläinten totutusvaiheen olisi kestettävä usean päivän ajan eläinten vastaan ­
ottamisesta, jotta varmistetaan, että ne ovat terveitä ja menestyvät. Koska 42 päivän ikää tai syntymän jälkeistä päivää 42 ennen kastroitujen eläinten esinahka ei ole mahdollisesti eronnut terskasta, eläimet olisi kastroitava 
syntymän jälkeisenä päivänä 42 tai sen jälkeen, ei aiemmin. Eläimet kast ­
roidaan nukutettuina siten, että niiden kivespussiin tehdään viilto, kummat ­
kin kivekset ja lisäkivekset poistetaan, ja verisuonet sekä siemenjohtimet sidotaan. Kivespussi suljetaan ompeleella tai hakasilla sen jälkeen, kun on 
varmistettu, ettei verenvuotoa esiinny. Eläimille olisi annettava kipulääkettä 
ensimmäisinä päivinä leikkauksen jälkeen mahdollisten vaivojen lievittämi ­
seksi. Jos kastroidut eläimet hankitaan toimittajalta, sen on taattava eläinten ikä ja sukukypsyyden vaihe.
 
Totutus kastraation jälkeen  
30. Eläinten pitäisi voida jatkaa tottumista laboratorio-olosuhteisiin vähintään 
seitsemän päivän ajan kastraatiosta, jotta kohdekudosten paino voisi palau ­
tua. Eläimiä on tarkkailtava päivittäin, ja kaikki eläimet, joilla on merkkejä taudista tai fyysisistä poikkeavuuksista, on poistettava. Käsittely voidaan siten aloittaa (tutkittavan aineen) annostelun aloittamisella jo syntymän jäl ­
keisenä päivänä 49, mutta viimeistään päivänä 60. Eläimen ikä ei saisi olla 
ruumiinavauksessa myöhempi kuin syntymän jälkeinen päivä 70. Laborato ­
rio voi tämän joustavuuden ansiosta ajoittaa kokeet tehokkaasti.
 
Ruumiinpaino ja satunnaisotos ryhmässä  
31. Eri eläinten ruumiinpainon erot aiheuttavat vaihtelua kudospainossa eläin ­
ryhmien sisällä ja niiden välillä. Kudospainon vaihtelun lisääminen johtaa 
korkeampaan variaatiokertoimeen ja vähentää testin tilastollista voimaa (eli 
testiherkkyyttä). Sen vuoksi ruumiinpainon vaihtelua olisi hallittava kokeel ­
lisesti ja tilastollisesti.  
32. Kokeellinen hallinta merkitsee, että tutkimusryhmien sisällä ja niiden välillä 
aiheutetaan pientä ruumiinpainon vaihtelua. Ensinnäkin epätavallisen pieniä tai suuria eläimiä olisi vältettävä ja niitä ei pitäisi sijoittaa tutkimusryhmiin. 
Tutkimuksen alkaessa eläinten paino saa vaihdella korkeintaan ± 20 % ta ­
vanomaisesta keskiarvosta (esim. 175 g ± 35 g puberteetin alkuvaiheessa kastroitujen rottien osalta). Toiseksi eläimet pitäisi jakaa ryhmiin (kontrolli- ja koeryhmiin) satunnaisen painojakauman mukaisesti, jotta minkään ryh ­
män keskimääräinen ruumiinpaino ei poikkea tilastollisesti muista ryhmistä. 
Sovellettu ryhmän satunnaisotosta koskeva menettely on kirjattava.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 844
 
33. Koska toksisuus saattaa vähentää koeryhmien ruumiinpainoa kontrolliryh ­
miin verrattuna, tilastollisena kovarianttina voidaan käyttää testikemikaalin 
ensimmäistä annospäivää, ei ruumiinpainoa ruumiinavauksessa.  
Annostasot  
34. Sen määrittämiseksi, voiko testikemikaalilla olla androgeenivaikutusta  in 
vivo, yleensä riittää kaksi testikemikaalia saavaa annosryhmää sekä positii ­
vinen ja kantaja-aineakontrolli (negatiivinen kontrolli) (ks. 43 kohta). Tätä 
mallia pidetään parempana eläinten hyvinvointiin liittyvistä syistä. Jos tar ­
koituksena on annosvastekäyrän saaminen tai ekstrapolointi alempiin annok ­
siin, tarvitaan ainakin kolme annosryhmää. Jos tarvitaan androgeeniaktii ­
visuuden tunnistamista laajempia tietoja (kuten arviota kemikaalin voimak ­
kuudesta), olisi harkittava erilaista annostusta. Antiandrogeeneja koskevan testin osalta testikemikaali annostellaan yhdessä referenssiandrogeenin vai ­
kutuksen omaavan agonistin kanssa. Olisi käytettävä vähintään kolmea koe ­
ryhmää, joille annetaan erilaiset annokset testikemikaalia, ja positiivista ja negatiivista kontrollia (ks. 44 kohta). Kontrolliryhmän eläimiä käsitellään aivan samoin kuin koeryhmän eläimiä, paitsi että niille ei anneta testikemi ­
kaalia. Jos kantaja-ainetta käytetään testikemikaalin annon yhteydessä, kont ­
rolliryhmän pitäisi saada korkein määrä koeryhmissä käytettyä kantaja-ainetta.
 
35. Kaikki annostasot olisi ehdotettava ja valittava niin, että otetaan huomioon 
testikemikaalista tai siihen liittyvistä materiaaleista mahdollisesti saatavilla 
olevat toksisuustiedot ja kineettiset (toksikokineettiset) tiedot. Suurimman annostason osalta olisi ensiksi otettava huomioon LD
 50 (puolet tappava 
annos) ja/tai välitöntä myrkyllisyyttä koskevat tiedot, jotta eläinten kuolema, 
merkittävä kärsiminen tai tuska vältetään (17)(18)(19)(20), ja toiseksi olisi 
otettava huomioon saatavilla olevat subkroonisissa ja kroonisissa tutkimuk ­
sissa käytetyt annostiedot. Yleensä suurimman annoksen ei pitäisi aiheuttaa sitä, että eläinten lopullinen ruumiinpaino laskee yli 10 % kontrollipainosta. 
Suurimman annoksen pitäisi olla joko 1) suurin annos, jolla varmistetaan 
eläimen selviytyminen ja se, että se ei aiheuta merkittäviä toksisuusvaiku ­
tuksia tai kärsimystä eläimille kemikaalin antoa seuraavana 10 peräkkäisenä päivänä, jolloin suurin annos on 1 000 mg/kg/päivä (ks. 36 kohta); tai 2) 
annos, joka aiheuttaa androgeenisia (antiandrogeenisia) vaikutuksia, riip ­
puen siitä, kumpi annos on pienempi. Suojelutoimenpiteenä pitkät välit, esim. puoli logaritmiyksikköä (joka vastaa annoslisäystä, jonka kerroin on 
3,2) tai jopa yhden logaritmiyksikön verran annosten välillä, ovat hyväk ­
syttäviä. Jos soveltuvia tietoja ei ole käytettävissä, voidaan tehdä annoksen ­
määritystutkimus, (ks. 37 kohta), jonka perusteella käytettävät annokset voidaan määrittää.
 
Raja-annostaso  
36. Jos testissä, jonka raja-annos on 1 000 mg/painokilo/vuorokausi ja jonka 
alhaisempaan annokseen sovelletaan tässä tutkimuksessa kuvattuja menette ­
lyjä, ei voida tuottaa lisääntymiselinten painolle tilastollisesti merkittävää muutosta, täydentäviä annostasoja voidaan pitää tarpeettomina. 
Raja-annosta sovelletaan paitsi silloin, kun ihmisten altistumista koskevat 
tiedot osoittavat, että korkeampi annostaso on tarpeellinen.
 
Annoksenmääritystä koskevat näkökohdat  
37. Alustava annoksenmääritystä koskeva tutkimus voidaan suorittaa tarvitta ­
essa muutamalla eläimellä asianmukaisten annosryhmien valitsemiseksi 
(tässä käytetään välitöntä myrkyllisyyttä koskevien testien menettelyitä (tä ­
män liitteen B.1 a ja B.1 b luku (27), OECD:n testiohje 425 (19))). Hersh ­
bergerin biotestin tavoitteena on valita annokset niin, että eläimen selviyty ­
minen varmistetaan ja että niihin ei sisälly merkittävää toksisuutta tai ne 
eivät aiheuta eläimille kärsimystä kemikaalin antoa seuraavana kymmenenä  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 845
 
peräkkäisenä päivänä, jolloin suurin annos on 1 000 mg/kg/päivä, kuten 
todetaan 35 ja 36 kohdassa. Tältä osin OECD:n ohjeasiakirjaa (17) voidaan 
käyttää määrittelemään sellaisten kliinisten oireiden esiintyminen, jotka viit ­
taavat toksisuuteen tai eläimelle aiheutuvaan kärsimykseen. Mahdollisuuk ­
sien mukaan tässä annoksenmääritystutkimuksessa voidaan kolmen päivän 
jälkeen annoksen antamisesta leikata kohdekudokset ja punnita ne noin 24 
tuntia viimeisen annoksen antamisen jälkeen. Näitä tietoja voidaan sen jäl ­
keen käyttää varsinaisen tutkimuksen annostuksen suunnitteluun.  
Vertailukemikaalit ja kantaja-aine  
38. Vertailuun käytetyn androgeenivaikutuksia aiheuttavan agonistin olisi oltava 
testosteroni-propionaatti (TP) CAS-nro 57-82-5. Vertailuun käytetty TP-annos voi olla joko 0,2 tai 0,4 mg/painokilo/vuorokausi. Vertailuun käytetyn androgeenivaikutuksia aiheuttavan antagonistin olisi oltava 
flutamidi (FT), CAS-nro No 1311-84-7. Vertailuun käytetyn flutamidian ­
noksen olisi oltava 3 mg/painokilo/vuorokausi, ja flutamidi olisi annettava samaan aikaan vertailuun käytetyn TP-annoksen kanssa.
 
39. Vesipitoisen liuoksen/suspension käyttöä on harkittava ensisijaisesti aina, 
kun se on mahdollista. Koska useimmat androgeenien ligandit tai niiden metaboliset prekursorit ovat yleensä hydrofobisia, yleisin menettelytapa on 
öljypohjaisen liuoksen/suspension käyttö (esimerkiksi maissi-, pähkinä-, 
seesami- tai oliiviöljy). Testikemikaalit voidaan liuottaa pieneen määrään 95-prosenttista etanolia tai muihin soveltuviin liuottimiin, ja niitä voidaan laimentaa lopulliseen pitoisuuteen kantaja-aineessa. Liuottimen myrkyllisyy ­
sominaisuudet on oltava tiedossa, ja niitä olisi testattava erillisen ainoastaan 
liuotinta sisältävän kontrolliryhmän avulla. Jos testikemikaalia pidetään sta ­
biilina, sen liuottamisen edistämiseksi voidaan käyttää varovaista lämmitystä ja voimakkaita mekaanisia toimenpiteitä. Testattavan kemikaalin stabiliteetti 
kantaja-aineessa määritetään. Jos testikemikaali on stabiili koko tutkimuksen 
ajan, voidaan valmistaa yksi alkuerä testikemikaalia, ja määritelty annos laimennoksia valmistetaan päivittäin. On huolehdittava, että näytteisiin ei pääse epäpuhtauksia ja että ne eivät pilaannu.
 
Antotapa  
40. TP:tä annostellaan ihonalaisella injektiolla ja FT:tä suun kautta letkulla.  
41. Testikemikaali annostellaan suun kautta letkulla tai ihonalaisella injektiolla. 
Antotavan valinnassa on otettava huomioon eläinten hyvinvointiin liittyvät näkökohdat ja testikemikaalin fyysiset/kemialliset ominaisuudet. Ennen kuin aloitetaan laaja pitkäaikainen testaus — jos injektiolla on saatu jo positii ­
visia tuloksia –, on otettava huomioon toksikologiset näkökohdat, kuten se, 
mikä merkitys on reitillä, jota kautta ihminen altistuu kemikaalille (esim. suuletkua käytetään mallina aineen nautinnan suhteen, ihonalaista injektiota hengitysteiden tai ihoadsorption suhteen), ja olemassa olevat toksikologiset 
tiedot metaboloitumisesta ja kinetiikasta (esim. tarve välttää ensikierron 
metabolia, parempi tehokkuus tietyn reitin välityksellä).
 
42. Eläinten olisi saatava annos samalla tavoin ja samassa aikajärjestyksessä 
kymmenen peräkkäisen päivän aikana noin 24 tunnin välein. Annostasoa 
olisi mukautettava joka päivä samanaikaisesti suoritettavan päivittäisen ruu ­
miinpainon mittauksen perusteella. Annoksen tilavuus ja antoajankohta olisi kirjattava jokaisena altistuspäivänä. Tietojen asianmukaisen arvioinnin var ­
mistamiseksi on pidettävä huolta, että 35 kohdassa tarkoitettua suurinta 
annosta ei ylitetä. Tältä osin olisi perusteellisesti arvioitava ruumiinpainon
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 846
 
alentumista, kliinisiä oireita ja muita havaintoja. Letkuruokinnassa olisi 
käytettävä mahaletkua tai sopivaa intubaatiokanyylia. Suurin kerralla annet ­
tava nestemäärä määräytyy koe-eläimen koon mukaan. Olisi noudatettava paikallisia eläinten hoitoa koskevia vaatimuksia, mutta nestemäärän tilavuus ei saa ylittää 5 ml/painokilo. Poikkeuksen muodostavat vesiliuokset, joita 
käytettäessä tilavuus voi olla 10 ml/painokilo. Ihonalaisten injektioiden 
osalta annokset olisi annettava lapaluun taakse tai lantion alueelle steriilillä neulalla (esim. 23 tai 25 gaugen neula) ja tuberkuliiniruiskulla. Pistokohdan ajeleminen on vapaaehtoista. Kaikki annosvajaukset ja vuodot pistoskoh ­
dassa tai puutteellinen annostus olisi kirjattava. Päivittäin rottaan injektoi ­
tavan nestemäärän kokonaistilavuus ei saa ylittää 0,5:tä ml/painokilo.
 
Androgeenovaikutuksia omaavia agonisteja koskevat erityiset menette ­
lyt 
43. Androgeenivaikutuksia omaavia agonisteja koskevan testi osalta 
kantaja-ainetta saanut ryhmä muodostaa negatiivisen kontrollin ja TP:tä saa ­
nut ryhmä positiivisen kontrollin. Androgeenivaikutuksia omaavien agonis ­
tien kanssa yhdenmukaista biologista toimintaa testataan antamalla koeryh ­
mille testikemikaalia valittu annos kymmenen peräkkäisen päivän ajan. Tes ­
tikemikaalia saaneiden ryhmien viiden lisäsukupuolirauhasen kudoksen pai ­
noa verrataan kantaja-ainetta saaneeseen ryhmään tilastollisesti merkittävän 
painonlisäyksen arvioimiseksi.  
Androgeenivaikutuksen omaavia antagonisteja ja 5-alfa-reduktaasin es ­
täjiä koskevat erityiset menettelyt  
44. Androgeenivaikutuksen omaavia antagonisteja ja 5-alfa-reduktaasin estäjiä 
koskevan testin osalta TP:tä saanut ryhmä muodostaa negatiivisen kontrol ­
lin, ja TP:n ja FT:n vertailuannoksia samanaikaisesti saanut ryhmä muodos ­
taa positiivisen kontrollin. Androgeenivaikutuksen omaavien antagonistien 
ja 5-alfa-reduktaasin estäjien kanssa yhdenmukaista biologista toimintaa testataan antamalla TP:ta vertailuannos ja antamalla testikemikaalia kymme ­
nen peräkkäisen päivän ajan. TP:tä ja testikemikaalia saaneiden ryhmien 
viiden lisäsukupuolirauhasen kudoksen painoa verrataan pelkästään TP:tä 
saaneeseen ryhmään tilastollisesti merkittävän painon vähentymisen arvioimiseksi.
 
Tarkkailu  
Kliiniset havainnot  
45. Yleiset kliiniset havainnot olisi tehtävä vähintään kerran päivässä ja useam ­
min, jos havaitaan toksisuusoireita. Havaintoja olisi tehtävä mieluiten sa ­
maan aikaan joka päivä ottaen huomioon se, milloin annoksen antamisen 
jälkeen odotetut vaikutukset ovat suurimmillaan. Kaikkia eläimiä tarkkail ­
laan niin, että huomiota kiinnitetään kuolleisuuteen, sairastuvuuteen ja ylei ­
siin kliinisiin oireisiin, kuten muutoksiin käyttäytymisessä, ihon, turkin, silmien, limakalvojen eritteiden eritykseen sekä autonomisen hermoston 
toimintaan (esim. kyynelvuoto, piloerektio, mustuaisen koko, poikkeava 
hengitys).
 
46. Kaikki kuolleena löytyneet eläimet olisi poistettava ja hävitettävä, ja tietoja 
ei tarvitse analysoida. Kaikki ennen ruumiinavausta kuolleet eläimet olisi sisällytettävä tutkimustietoihin mukaan lukien ilmeiset kuolinsyyt. Kaikki kuolemaisillaan olevat eläimet olisi lopetettava inhimillisellä tavalla. Kaikki 
kuolemaisillaan olleet ja myöhemmin lopetetut eläimet olisi sisällytettävä 
tutkimustietoihin mukaan lukien ilmeiset kuolinsyyt.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 847
 
Eläimen paino ja ravinnon kulutus  
47. Kaikki eläimet olisi punnittava lähimpään 0,1 grammaan. Punnitus aloite ­
taan juuri ennen kokeen aloittamista, eli kun eläimet jaetaan ryhmiin. Va ­
linnaisena mittana voidaan käyttää altistusjakson aikana kulutetun ravinnon määrää, joka voidaan mitata häkkiä kohti punnitsemalla annostelulaitteet. Ravinnon kulutuksesta saadut tulokset olisi ilmoitettava grammoina rottaa 
kohti päivässä.
 
Dissektio sekä kudosten ja elinten painon mittaaminen  
48. Noin 24 tunnin kuluttua testikemikaalin viimeisestä annoksesta rotat lope ­
tetaan ja veri poistetaan testin suorittavan laboratorion tavanomaisten me ­
nettelyjen mukaisesti, ja ruumiinavaus suoritetaan. Laboratorioraporttiin on merkittävä eläimen inhimilliseen lopettamiseen käytetty menetelmä.
 
49. Ihannetapauksessa ruumiinavausjärjestys satunnaistetaan ryhmien välillä. 
Näin vältetään eteneminen suoraan ylös tai alaspäin annosryhmiä, mikä voi vaikuttaa tietoihin. Kaikki ruumiinavauksen löydökset, eli patologiset muutokset ja näkyvät vauriot, kirjataan ja raportoidaan.
 
50. Viisi androgeeniriippuvaista kudosta (ventraalinen eturauhanen, rakkularau ­
hanen, peräaukon kohottajalihas ja värvelihas, Cowperin rauhaset ja terska) olisi punnittava. Nämä kudokset irrotetaan, niihin tarttunut ylimääräinen 
kudos ja rasva poistetaan, ja niiden käsittelemätön paino (ilman fiksointia) 
määritetään. Kaikkia kudoksia käsitellään varovaisesti, jotta vältetään nes ­
teen valuminen pois ja kuivuminen, mikä saattaa aiheuttaa merkittäviä vir ­
heitä ja vaihtelua, koska tämä vähentää kirjattavaa painoa. Useat kudokset 
voivat olla erittäin pieniä tai niitä on vaikea leikata. Tämä lisää vaihtelua. 
Tästä syystä on tärkeää, että lisäsukupuolirauhasten kudoksen leikkaamisen suorittavat henkilöt ovat tietoisia näiden kudosten dissektiota koskevista 
vakioiduista toimintamenettelyistä. OECD on asettanut saataville oppaan 
kudosten dissektiota koskevista vakioiduista toimintaohjeista (21). Näiden ohjeiden mukaisella perusteellisella koulutuksella vähimmäistetään tutki ­
muksen mahdolliset vaihtelun syyt. Ihannetapauksessa saman näytteiden 
leikkaajan olisi oltava vastuussa tietyn kudoksen irrottamisesta. Näin pois ­
tetaan kudosten käsittelyyn liittyvät näytteiden leikkaajista johtuvat erot. Jos tämä ei ole mahdollista, ruumiinavaus olisi suunniteltava siten, että kukin kudoksen leikkaaja irrottaa tietyn kudoksen kaikista koeryhmistä sen sijaan, 
että yksi henkilö irrottaa kaikki kudokset kontrolliryhmästä ja toinen kemi ­
kaalia saaneista ryhmistä. Kaikki lisäsukupuolirauhasten kudokset olisi pun ­
nittava kuivaamatta lähimpään 0,1 milligrammaan, ja kunkin eläimen ku ­
doksien painot olisi kirjattava.
 
51. Useat kudokset voivat olla erittäin pieniä tai niitä on vaikea leikata. Tämä 
lisää vaihtelua. Aikaisemmissa tutkimuksissa on käynyt ilmi monia variaa ­
tiokertoimia, jotka vaikuttavat eroavan laboratorioiden pätevyyden perus ­
teella. Joissain tapauksissa on havaittu suuria eroja tiettyjen kudosten, kuten 
ventraalisen eturauhasen ja Cowperin rauhasten absoluuttisissa painoissa tietyssä laboratoriossa.
 
52. Maksan, munuaisten ja lisämunuaisten paino ovat vapaaehtoisia mittauksia. 
Ylimääräinen rasva ja sidekudos olisi puhdistettava pois kudoksista. Maksa olisi punnittava lähimpään 0,1 grammaan. Munuaiset ja lisämunuaiset olisi punnittava ja kirjattava lähimpään 0,1 grammaan. Maksaan, munuaisiin ja 
lisämunuaisiin eivät vaikuta pelkästään androgeenit; niillä tarjotaan hyödyl ­
lisiä tietoja systeemisestä toksisuudesta.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 848
 
53. Seerumin luteinisoivan hormonin, jäljempänä ’LH-hormoni’, follikkelia sti ­
muloivan hormonin, jäljempänä ’FSH-hormoni’, ja testosteronin, jäljempänä 
’T’, mittaaminen on vapaaehtoista. Seerumin T-tasot ovat hyödyllisiä sen määrittämiseksi, kiihdyttääkö testikemikaali testosteronin maksametaboliaa alentamalla seerumitasoa. Ilman T-tietoja, tällainen vaikutus näyttää aiheu ­
tuvan antiandrogeenisen mekanismin välityksellä. LH-hormonin tasoilla tar ­
jotaan tietoa siitä, voiko tietty antiandrogeeni vähentää elimen painoa ja sen lisäksi vaikuttaa hypotalamuksen ja aivolisäkkeen toimintaan, mikä voi pit ­
kän aikavälin tutkimuksissa aiheuttaa kasvaimia kiveksissä. FSH-hormoni 
on tärkeä siittiöiden muodostumisen kannalta. Seerumit T4 ja T3 ovat myös 
vapaaehtoisia kokeita, joilla tarjotaan hyödyllistä lisätietoa kyvystä häiritä kilpirauhashormonin homeostaasia. Jos hormonimittauksia tehdään, rotat olisi nukutettava ennen ruumiinavausta ja veri olisi otettava sydänpunktiol ­
la. Nukutusmenetelmä olisi valittava huolella, jotta se ei vaikuta hormoni ­
mittaukseen. Seerumin valmistusmenetelmä, radioimmunoanalyysin tai mui ­
den mittausmenetelmien lähde, analyyttiset menetelmät ja tulokset olisi kir ­
jattava. LH-hormonin tasot olisi ilmoitettava nanogrammoina millilitraa 
kohti seerumissa, ja myös T olisi ilmoitettava nanogrammoina millilitraa 
kohti seerumissa.
 
54. Kudosten irrottamista kuvataan seuraavassa, ja tähän liittyy yksityiskohtai ­
nen kudosten dissektiota koskeva opas ja valokuvat, jotka julkaistaan vali ­
dointiohjelmassa täydentävänä aineistona (21). Kudosten irrottamista kos ­
keva video on saatavilla myös Korean elintarvike- ja lääkehallinnon (Food 
and Drug Administration) verkkosivulla (22).  
— Kun eläin on vatsanpuoleinen puoli ylöspäin, määritä, onko peniksen 
esinahka eronnut terskasta. Jos on, esinahka vedetään taaksepäin ja terska poistetaan ja punnitaan (lähimpään 0,1 milligrammaan), ja paino 
kirjataan.
 
— Vatsanahka ja -seinämä avataan, jolloin sisälmykset ovat näkyvissä. Jos 
valinnaiset elimet punnitaan, maksa poistetaan ja punnitaan lähimpään 0,1 grammaan, vatsalaukku ja suolisto poistetaan, munuaiset ja lisämu ­
nuaiset poistetaan ja punnitaan lähimpään 0,1 grammaan. Dissektiolla 
saadaan näkyviin virtsarakko, ja kohteena olevien uroksen lisäsukupuo ­
lirauhasten kudoksien leikkaaminen aloitetaan.
 
— Ventraalisen eturauhasen dissektiota varten virtsarakko erotetaan vatsa ­
lihaksesta leikkaamalla sidekudosta keskiviivaa pitkin. Siirrä virtsarakko paikaltaan kohti rakkularauhasia, jolloin esiin saadaan ventraalisen etu ­
rauhasen vasen ja oikea lohko (jonka päällä on rasvakerros). Puhdista 
varovaisesti ventraalisen eturauhasen oikean ja vasemman lohkon rasva ­
kerros. Siirrä varovaisesti ventraalisen eturauhasen oikea lohko virtaput ­
kesta ja leikkaa se irti virtsaputkesta. Pidä edelleen kiinni ventraalisen 
eturauhasen oikeasta lohkosta ja siirrä varovaisesti ventraalisen eturauh ­
asen vasen lohko erilleen virtsaputkesta ja leikkaa se irti; punnitse lä ­
himpään 0,1 milligrammaan ja kirjaa paino.
 
— Rakkularauhasten ja eturauhasen etuosan dissektiota varten siirrä virtsa ­
rakkoa kaudaaliseen suuntaan, jolloin saadaan esille siemenjohdin ja 
rakkularauhasten oikea ja vasen lohko sekä eturauhasen etuosa. Estä 
nesteen vuotaminen puristamalla hemostaattia rakkularauhasten ja etura ­
uhasen etuosan tyvessä, jossa siemenjohdin liittyy virtsaputkeen. Leik ­
kaa huolellisesti rakkularauhaset ja eturauhasen etuosa, jossa hemostaatti 
on paikallaan, poista rasva ja sivuelimet, sijoita taaratulle mittausastialle, 
poista hemostaatti, mittaa lähimpään 0,1 milligrammaan ja kirjaa paino.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 849
 
— Peräaukon kohottajalihaksen ja värvelihaksen dissektiota varten penik ­
sen lihakset ja tyvi ovat näkyvissä. Peräaukon kohottajalihakset ovat 
paksusuolen ympärillä ja etummainen peräaukon kohottajalihas ja vär ­
velihas ovat kiinni peniksen paisuvaisissa. Perianaalisen alueen nahka ja sivuelimet poistetaan peniksen tyvestä peräaukon etummaiseen päähän 
saakka. Peräaukon kohottajalihakset irrotetaan vähitellen peniksen pai ­
suvaisesta ja kudoksista. Paksusuoli leikataan kahtia ja peräaukon ko ­
hottajalihas ja värvelihas voidaan irrottaa leikkaamalla ja poistaa. Perä ­
aukon kohottajalihas ja värvelihas puhdistetaan rasvasta ja sivuelimistä 
ja punnitaan lähimpään 0,1 milligrammaan, ja paino kirjataan.
 
— Kun peräaukon kohottajalihas ja värvelihas on poistettu, pyöreät Cow ­
perin tai bulbouretaaliset rauhaset ovat näkyvissä peniksen paisuvaisen juuressa ja hieman sen dorsaalisella puolella. Tarvitaan huolellista dis ­
sektiota, jotta vältetään tekemästä viiltoa ohueen kalvoon, jolloin välte ­
tään nesteen vuotaminen ulos. Punnitse Cowperin tai bulbouretaaliset rauhaset lähimpään 0,1 milligrammaan ja kirjaa paino.
 
— Lisäksi, jos jostain rauhasesta valuu nestettä ruumiinavauksen ja dissek ­
tion aikana, tämä olisi kirjattava.  
55. Jos kunkin kemikaalin arviointiin tarvitaan niin monen eläimen ruumiinava ­
usta, että se ei ole yhdelle päivälle kohtuullista, aloituspäivä voidaan por ­
rastaa kahteen peräkkäiseen päivään, jolloin ruumiinavaus ja siihen liittyvä työ porrastetaan kahdelle päivälle. Jos työ porrastetaan tällä tavoin, kustakin koeryhmästä olisi käytettävä päivässä puolet eläimistä.
 
56. Ruhot olisi hävitettävä asianmukaisella tavalla ruumiinavauksen jälkeen.  
TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
Tiedot  
57. Tiedot olisi ilmoitettava erikseen (eli ruumiinpaino, lisäsukupuolirauhasten 
kudokset, vapaaehtoiset mittaukset ja muut reaktiot ja havainnot) ja kustakin 
eläinryhmästä (keskiarvot ja keskihajonnat kaikista tehdyistä mittauksista). 
Tiedoista olisi esitettävä yhteenveto taulukkomuodossa. Tiedoista olisi käy ­
tävä ilmi eläinten lukumäärä testin alussa, testin aikana kuolleena löytynei ­
den tai sellaisten eläinten lukumäärä, joilla ilmenee myrkyllisyysvaikutuk ­
sia, kuvaus havaituista myrkyllisyysvaikutuksista, mukaan lukien niiden alkamisajankohta, kesto ja vaikeusaste.
 
58. Loppuraporttiin sisältyy:  
Testauslaitos  
— laitoksen nimi, sijainti  
— tutkimusjohtaja ja muu henkilöstö ja heidän tutkimusta koskevat vastuu ­
alueensa  
— päivämäärät, milloin tutkimus alkoi ja päättyi, eli ensimmäinen päivä, 
kun testikemikaalia annettiin, ja viimeinen päivä, kun tehtiin ruumiinavaus.
 
Testikemikaali  
— lähde, erän/annoksen numero, tunnistetiedot, puhtaus, toimittajan täydel ­
linen osoite ja testikemikaalin (testikemikaalien) kuvaus  
— fysikaalinen olomuoto ja tarvittaessa fysikokemialliset ominaisuudet  
— varastointiolosuhteet ja laimennoksien valmistuksen menettely ja valmis ­
tustiheys  
— stabiliteetista tuotetut kaikki tiedot  
— annosteluliuoksiin/suspensioihin liittyvät kaikki analyysit.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 850
 
Kantaja-aine  
— kantaja-aineen kuvaus (laatu, toimittaja ja eränumero)  
— perustelu kantaja-aineen valinnalle (jos muu kuin vesi).  
Koe-eläimet ja eläinten hoitoa koskevat menetelmät  
— käytetty eläinlaji/kanta ja perustelu sen valinnalle  
— eläinten alkuperä tai toimittaja mukaan lukien täydellinen osoite  
— toimitettujen eläinten lukumäärä ja ikä  
— häkkiolosuhteet (esim. lämpötila ja valaistus)  
— ravinto (nimi, tyyppi, toimittaja, eränumero, sisältö ja, jos tiedossa, 
fytoestrogeenin tasot)  
— alustan materiaali (nimi, tyyppi, toimittaja, sisällys)  
— häkkiolosuhteet ja eläinten lukumäärä häkkiä kohti.  
Testiolosuhteet  
— ikä kastrointihetkellä ja kastraation jälkeinen totutusvaihe  
— kunkin eläimen paino testin alussa (lähimpään 0,1 milligrammaan)  
— satunnaisotos ja tiedot kantaja-ainetta, vertailu-annosta ja testikemikaalia 
saaviin ryhmiin sekä häkkeihin jakamisesta  
— kunkin ryhmän ruumiinpainon keskiarvo ja keskihajonta kunakin pun ­
nituspäivänä koko tutkimuksen ajan  
— annoksen valintaperusteet  
— tiedot testikemikaalin annostuksesta ja altistusreitin valintaa koskevat 
valintaperusteet  
— jos tehdään antiadrogeenisuusvaikutuksia koskeva testi, TP-käsittely (an ­
nos ja tilavuus)  
— altistus testikemikaalilla (annos ja tilavuus)  
— annosteluajankohta  
— ruumiinavausmenetelmät, mukaan lukien veren valuttaminen pois ja 
mahdollisesti käytetty anestesia  
— jos seerumianalyyseja tehdään, toimitetaan menetelmää koskevat tiedot. 
Esimerkiksi, jos käytetään radioimmunoanalyysia, olisi kirjattava radio ­
immunoanalyysia koskeva menettely, sen välineistön alkuperä ja voi ­
massaoloajat, menetelmä tuikelaskennalle ja vakiointi.  
Tulokset  
— päivittäiset havainnot kustakin eläimestä annosteluaikana, mukaan 
lukien:  
— ruumiinpaino (lähimpään 0,1 milligrammaan)  
— kliiniset oireet (jos niitä esiintyy)  
— ravinnonkulutusta koskevat kaikki mittaukset tai muistiinpanot  
— ruumiinavauksen havainnot kustakin eläimestä, mukaan lukien:  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 851
 
— ruumiinavauksen ajankohta  
— eläimen koeryhmä  
— eläimen tunniste  
— kudoksen leikkaaja  
— ajankohta, jolloin ruumiinavaus ja dissektio suoritetaan  
— eläimen ikä  
— lopullinen ruumiinpaino ruumiinavauksessa ja sen tilastollisesti merkit ­
tävät laskut ja nousut  
— järjestys, jossa eläimeltä valutetaan veri pois ja dissektio suoritetaan 
ruumiinavauksessa  
— viiden androgeeniriippuvaisen kohdekudoksen painot:  
— ventraalinen eturauhanen (lähimpään 0,1 milligrammaan)  
— rakkularauhaset ja eturauhasen etuosa sekä niiden nesteet (pareittain, 
lähimpään 0,1 milligrammaan)  
— peräaukon kohottajalihaksen ja värvelihaksen yhdistelmä (lähimpään 0,1 
milligrammaan)  
— Cowperin rauhaset (käsittelemätön paino, pareittain, lähimpään 0,1 mil ­
ligrammaan)  
— terska (käsittelemätön paino, lähimpään 0,1 milligrammaan)  
— Vaihtoehtoisten kudosten painot, jos otetaan:  
— maksa (lähimpään 0,1 milligrammaan)  
— munuaiset (pareittain, lähimpään 0,1 milligrammaan)  
— lisämunuaiset (pareittain, lähimpään 0,1 milligrammaan)  
— yleiset huomautukset ja kommentit  
— seerumin hormonien analyysi, jos suoritetaan  
— seerumin LH-hormoni (vaihtoehtoinen — ng millilitrassa seerumia), 
ja 
— seerumin T-hormoni (vaihtoehtoinen — ng millilitrassa seerumia)  
— yleiset huomautukset ja kommentit.  
Tietojen tiivistäminen  
Tulokset esitetään taulukkomuodossa, josta ilmenevät kunkin ryhmän otos ­
koko, keskiarvo arvosta, ja keskiarvon keskivirhe tai keskihajonta. Tauluk ­
koihin pitäisi sisältyä ruumiinavauksen ruumiinpainot, ruumiinpainon muu ­
tokset annostuksen alusta ruumiinavaukseen, lisäsukupuolirauhasten kohde ­
kudosten paino ja valinnaisten elinten painot.  
Tulosten pohdinta  
Tulosten analysointi  
59. Ruumiinavauksen ruumiinpaino ja elinten painot olisi analysoitava tilastol ­
lisesti varianssien homogeenisuuden kaltaisten ominaisuuksien osalta tarvit ­
taessa asianmukaisten tietojen muunnoksien avulla. Testiryhmiä olisi verrat ­
tava kontrolliryhmiin käyttäen varianssianalyysin kaltaista tekniikkaa, jonka 
jälkeen suoritetaan vertailevia arvioita (esim. Dunnettin yksitahoinen testi) ja tilastollisista eroa koskevaa kriteeriä, esim. p ≤ 0,05. Ne ryhmät, joilla on 
tilastollista merkittävyyttä, olisi täsmennettävä. Kuitenkin ”elinten suhteelli ­
sia” painoja pitäisi välttää, koska näiden tietojen käsittelyn taustalla on 
virheellisiä tilastollisia oletuksia.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 852
 
60. Androgeenivaikutuksia omaavien agonistien osalta kontrolliryhmänä pitäisi 
olla pelkästään kantaja-ainetta saanut testiryhmä. Testikemikaalin vaikutus ­
tavan ominaispiirteet voivat johtaa erilaisiin suhteellisiin vasteisiin kudok ­
sissa. Esimerkiksi trenbolonilla, jolla on 5-alfa-reduktaasin suhteen resis ­
tenssi, on vahvempia vaikutuksia peräaukon kohottajalihakseen ja värveli ­
hakseen sekä terskaan kuin TP:llä. Tilastollisesti merkittävää lisäystä (p ≤ 
0,05) kahden tai useamman androgeeniriippuvaisen kohdekudoksen pai ­
noissa (ventraalinen eturauhanen, rakkularauhanen, peräaukon kohottajalihas ja värvelihas, Cowperin rauhaset ja terska) olisi pidettävä androgeenivaiku ­
tuksen omaavan agonistin osalta positiivisena tuloksena, ja kaikissa kohde ­
kudoksissa pitäisi voida havaita, että kasvu on lisääntynyt jonkin verran. Yhdistetty arviointi kaikista lisäsukupuolirauhasten kudosten reaktioista voi ­
daan toteuttaa käyttäen asianmukaista monimuuttuja-analyysia. Tällä voi ­
daan parantaa analyysia erityisesti tapauksissa, missä ainoastaan yksi kudos 
tuottaa tilastollisesti merkittävän vasteen.
 
61. Androgeenivaikutuksia omaavien agonistien osalta kontrolliryhmänä pitäisi 
olla koeryhmä, joka sai vertailuun käytettyä androgeenia (ainoastaan testosteroni-propionaattia). Testikemikaalin vaikutustavan ominaispiirteet 
voivat johtaa erilaisiin suhteellisiin reaktioihin kudoksissa. Esimerkiksi 5- 
alfa-reduktaasin estäjillä, kuten finasterdillä on tuntuvampia vaikutuksia ventraaliseen eturauhaseen kuin muihin kudoksiin, verrattuna voimakkaisiin AR-antagonisteihin, kuten flutamidiin. Tilastollisesti merkittävää vähennystä 
(p ≤ 0,05) kahden tai useamman androgeeniriippuvaisen kohdekudoksen 
painossa (ventraalinen eturauhanen, rakkularauhanen, peräaukon kohottaja ­
lihas ja värvelihas, Cowperin rauhaset ja terska) verrattuna käsittelyyn pel ­
kästään TP:llä olisi pidettävä androgeenivaikutuksen omaavan agonistin 
osalta positiivisena tuloksena, ja kaikissa kohdekudoksissa pitäisi voida hav ­
aita, että kasvu on vähentynyt jonkin verran. Yhdistetty arviointi kaikista lisäsukupuolirauhasten kudosten reaktioista voidaan toteuttaa käyttäen asi ­
anmukaista monimuuttuja-analyysia. Tällä voidaan parantaa analyysia eri ­
tyisesti tapauksissa, missä ainoastaan yksi kudos tuottaa tilastollisesti mer ­
kittävän vasteen.
 
62. Tiedot esitetään taulukkomuodossa, johon sisältyvät kunkin ryhmän keski ­
arvo ja keskiarvon keskivirhe (keskihajonta on myös hyväksyttävä) sekä otoskoko. Lisäksi olisi esitettävä yksittäisiä taulukkotietoja. Kontrollitietojen 
yksittäisiä arvoja, keskiarvoa, keskivirhettä (keskihajonta) ja variaatiokertoi ­
men arvoja olisi tarkasteltava, jotta määritetään, täyttävätkö ne hyväksyttä ­
vät johdonmukaisuutta koskevat kriteerit todennäköisten aikaisempien arvo ­
jen kanssa. Variaatiokertoimilla, jotka ylittävät taulukossa 1 luetellut variaa ­
tiokertoimen arvot (ks. 25 ja 26 kohta) kunkin elimen painon osalta, pitäisi 
määritellä, sisältyykö tietojen tallentamiseen tai kirjaamiseen virheitä tai sitä, eikö laboratorio vielä hallitse androgeeniriippuvaisten kudosten tarkkaa dissektiota, jolloin jatkokoulutus/harjoittelu on perusteltua. Yleensä variaa ­
tiokertoimet (keskihajonta jaettuna keskimääräisellä elimen painolla) ovat 
toistettavissa laboratoriosta toiseen ja tutkimuksesta toiseen. Esitettyihin tie ­
toihin pitäisi sisältyä ainakin ventraalinen eturauhanen, peräaukon kohotta ­
jalihas ja värvelihaksen rakkularauhanen, Cowperin rauhaset, terska, maksa 
ja ruumiinpainot sekä ruumiinpainon muutokset annostuksen alkamisesta 
ruumiinavaukseen. Tiedot voidaan esittää myös sen jälkeen, kun ruumiin ­
painoa on mukautettu kovarianssin perusteella, mutta tämän ei pitäisi kor ­
vata alkuperäisten tietojen esittämistä. Lisäksi, jos esinahkan eroamista ei 
ole tapahtunut missään ryhmässä, tämä olisi kirjattava ja sitä olisi vertailtava 
tilastollisesti kontrolliryhmään Fisherin tarkkaa testiä käyttämällä.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 853
 
63. Kun tietokoneelle syötettyjä tietoja tarkistetaan alkuperäisten tietolomakkei ­
den perusteella tietojen täsmällisyyden osalta, niiden elinten painon arvot, 
jotka eivät ole biologisesti vakuuttavia tai jotka vaihtelevat kyseisestä koe ­
ryhmästä enemmän kuin kolmen keskihajonnan osalta, merkitsee, että niitä on tutkittava huolellisesti ja ne on ehkä hylättävä, koska ne ovat todennä ­
köisesti merkintävirheitä.
 
64. Tutkimustulosten vertailu OECD:n variaatiokertoimen arvojen (taulukko 1) 
kanssa on usein tärkeä vaihe, kun tutkimustulosten pätevyyttä tulkitaan. Kantaja-ainetta saaneen kontrolliryhmän aikaisemmat tiedot olisi säilytettävä laboratoriossa. Positiivisten referenssikemikaalien, kuten TP:n ja FT:n reak ­
tioita koskevat aikaisemmat tiedot olisi myös säilytettävä laboratoriossa. 
Laboratoriot voivat myös ajoittain testata tunnettujen heikkojen androgee ­
nivaikutuksen omaavien agonistien ja antagonistien vastetta ja säilyttää nämä tiedot. Näitä tietoja voidaan verrata saatavilla oleviin OECD:n tietoi ­
hin. Näin varmistetaan, että laboratorion menetelmät tuottavat riittävää ti ­
lastollista tarkkuutta ja voimaa.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 854
 
Lisäys 1  
MÄÄRITELMÄT:  
Androgeenivaikutus  on käsite, jolla kuvataan positiivista vaikutusta androgee ­
niriippuvaisten kudosten kasvuun.  
Antiandrogeenivaikutus  on kemikaalin kyky estää TP:n vaikutus nisäkkään 
elimistössä.  
Kemikaalilla  tarkoitetaan ainetta tai aineiden seosta.  
Syntymäaika  on syntymän jälkeinen päivä 0.  
Annos  on annostellun testikemikaalin määrä. Hershbergerin biotestissä annos ilmais ­
taan testikemikaalin painona koe-eläimen ruumiinpainon yksikköä kohden vuoro ­
kaudessa (esim. milligramma testikemikaalia painokiloa kohti vuorokaudessa).  
Annostus  on yleinen käsite, johon sisältyy annos, annostiheys ja annostuksen 
kesto.  
Kuolemaisillaan oleva  on käsite, jolla kuvataan kuolevaa eläintä eli kuoleman 
partaalla olevaa eläintä.  
Syntymän jälkeinen päivä X  on eläimen syntymästä saakka laskettava elinpäivä X.  
Herkkyys  tarkoittaa testimenetelmän kykyä tunnistaa oikein kemikaalit, joilla on 
ominaisuudet, mitä kokeilla testataan.  
Spesifiys  tarkoittaa testimenetelmän kykyä tunnistaa oikein kemikaalit, joilla ei 
ole ominaisuutta, mitä kokeilla testataan.  
Testikemikaali  on mitä tahansa aine tai seos, jota testataan käyttämällä tätä 
testimenetelmää.  
Validointi  on tieteellinen prosessi, joka on suunniteltu kuvaamaan toiminnallisia 
vaatimuksia ja testimenetelmän rajoja sekä osoittamaan sen luotettavuus ja asi ­
aankuuluvuus tiettyä tarkoitusta varten.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 855
 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 856
 ▼M5 
Lisäys 2
  
VMG mamm: Validation Management Group on Mammalian Testing and Assessment
 KÄSITEKEHYKSEEN LIITTYVÄT HUOMAUTUKSET:  
Huomautus 1:  Siirtyminen ja poistuminen on mahdollista kaikilla tasoilla ja 
riippuu olemassa olevan tietotarpeen luonteesta vaaran ja riskin 
arvioinnin suhteen.  
Huomautus 2:  Tasolla 5 ekotoksilogiaan olisi sisällyttävä päätetapahtumat, jotka 
osoittavat haittavaikutuksia koskevat mekanismit ja populaatiolle mahdollisesti aiheutuvat vahingot.
 
Huomautus 3:  Jos multimodaalimallilla katetaan useita yksittäisiä päätetapahtu ­
mia koskevia testejä, tämä malli korvaa tällaiset yksittäisiä pää ­
tetapahtumia koskevat testit.  
Huomautus 4:  Kunkin kemikaalin arvioinnin olisi oltava tapauskohtainen, ja 
siinä otetaan huomioon kaikki saatavilla oleva tieto käsitekehyk ­
sen tasojen tarkoituksen huomioon ottaen.  
Huomautus 5:  Kehystä ei olisi pidettävä sellaisena, että se kattaa tällä hetkellä 
kaiken. Siihen sisältyy tasoilla 3, 4 ja 5 testejä, jotka ovat käy ­
tössä tai joiden validointi on meneillään. Testit, joiden validointi on kesken, sisällytetään väliaikaisesti. Kun ne on kehitetty ja 
validoitu, ne lisätään muodollisesti kehykseen.
 
Huomautus 6:  Tasoa 5 ei olisi pidettävä sellaisena, että siihen sisältyy pelkäs ­
tään lopullisia testejä. Kyseiseen tasoon sisältyvien testien katso ­
taan edistävän yleistä vaarojen ja riskien arviointia.  
KIRJALLISUUSVIITTEET  
(1) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Dis ­
rupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.
 
(2) Dorfman RI (1962). Standard methods adopted by official organization. 
Academic Press, NY.  
(3) Gray LE Jr, Furr J and Ostby JS (2005). Hershberger assay to investigate 
the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and anti ­
androgenic activity in castrate-immature male rats. In:  Current Protocols 
in Toxicology  16.9.1–16.9.15. J Wiley and Sons Inc.  
(4) OECD (2006). Final OECD report of the initial work towards the valida ­
tion of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to testos ­
terone propionate and anti-androgenic effects of flutamide. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 62. 
ENV/JM/MONO(2006)30.  
(5) OECD (2008). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger 
Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists 
and a 5a-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple La ­
boratories. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 86. ENV/JM/MONO(2008)3.  
(6) OECD (2007). Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: 
Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and 
Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate 
Model Protocol. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 73. ENV/JM/MONO(2007)20.  
(7) Owens, W, Zeiger E, Walker M, Ashby J, Onyon L, Gray, Jr, LE (2006). 
The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use 
of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized proto ­
col. Env. Health Persp. 114:1265–1269.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 857
 
(8) Owens W, Gray LE, Zeiger E, Walker M, Yamasaki K, Ashby J, Jacob E 
(2007). The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to 
screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies. Environ Health Perspect. 115(5):671–8.
 
(9) Korenchevsky V (1932). The assay of testicular hormone preparations. 
Biochem J26:413–422.  
(10) Korenchevsky V, Dennison M, Schalit R (1932). The response of castrated 
male rats to the injection of the testicular hormone. Biochem 
J26:1306–1314.  
(11) Eisenberg E, Gordan GS (1950). The levator ani muscle of the rat as an 
index of myotrophic activity of steroidal hormones. J Pharmacol Exp 
Therap 99:38–44.  
(12) Eisenberg E, Gordan GS, Elliott HW (1949). Testosterone and tissue 
respiration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic activity. Endocrinology 45:113–119.
 
(13) Hershberger L, Shipley E, Meyer R (1953). Myotrophic activity of 19- 
nortestosterone and other steroids determined by modified levator ani 
muscle method. Proc Soc Exp Biol Med 83:175–180.  
(14) Hilgar AG, Vollmer EP (1964). Endocrine bioassay data: Androgenic and 
myogenic. Washington DC: United States Public Health Service.  
(15) Dorfman RI (1969). Androgens and anabolic agents. In: Methods in Hor ­
mone Research, volume IIA. (Dorfman RI, ed.) New York:Academic Press, 151–220.
 
(16) Massaro EJ (2002). Handbook of Neurotoxicology, volume I. New York: 
Humana Press, s 38.  
(17) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.  
(18) OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
— Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Paris.  
(19) OECD (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425.  
(20) OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. 
ENV/JM/MONO(2001)4.  
(21) Supplemental materials for Owens et al. (2006). The OECD programme to 
validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo 
androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265–1269. See, section II, The dissection guidance provided 
to the laboratories: http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/suppl.pdf
 
(22) Korea Food and Drug Administration. Visual reference guide on Hersh ­
berger assay procedure, including a dissection video. http://rndmoa. kfda.go.kr/endocrine/reference/education_fr.html
 
(23) OECD (2008). Background Review Document on the Rodent Hershberger 
Bioassay. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 90. ENV/JM/MONO(2008)17.
 
(24) OECD (2008). Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling 
Male Rat Version of the Hershberger Bioassay.  
(25) OECD (2009). Guidance Document on the Weanling Hershberger Bio ­
assay in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic properties. 
Series on Testing and Assessment, Number 115.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 858
 
(26) Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivi 2010/63/EU, annettu 
22 päivänä syyskuuta 2010, tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten 
suojelusta (EUVL L 276, 20.10.2010, s. 33).  
(27) Tämän liitteen seuraavat luvut:  
B.1 a, Akuutti oraalinen toksisuus — vakioannosmenetelmä  
B.1 b, Akuutti oraalinen toksisuus — akuutin toksisuusluokan menetelmä  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 859
 
B.56.  PIDENNETTY YHDEN SUKUPOLVEN LISÄÄNTYMISTOKSI ­
SUUTTA KOSKEVA TUTKIMUS  
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 443 (2012). Se perustuu 
International Life Science Institute -organisaation (ILSI) ja Health and En ­
vironmental Sciences Institute -organisaation (HESI) maatalouden kemikaaliturvallisuudenarvioinnista (ACSA) vastaavan teknisen komitean 
ehdotukseen F
 1 -kehitysvaihetta koskevasta pidennetystä yhden sukupolven 
lisääntymistutkimuksesta, siten kuin se julkaistiin lähteessä Cooper et al., 2006 (1). Tutkimuksen suunnittelua varten on tehty useita parannuksia ja selvennyksiä. Niillä tarjotaan joustavuutta ja korostetaan, että tutkimus on 
tärkeää aloittaa eläviä eläimiä koskevista tiedoista ja että samalla käytetään 
koehavaintoja testauksen ohjaamiseksi ja suunnittelemiseksi. Tässä testime ­
netelmässä annetaan yksityiskohtainen kuvaus pidennetyn yhden sukupolven lisääntymistoksisuutta koskevan tutkimuksen suorittamisesta. Tässä testime ­
netelmässä kuvataan F
 1 -sukupolven eläinten kolmea kohorttia:  
Kohortti 1: arvioidaan lisääntymiseen/kehitykseen liittyviä päätetapahtumia; 
tätä kohorttia voidaan laajentaa sisällyttämällä siihen F  2 -sukupolvi.  
Kohortti 2: arvioidaan kemikaalille altistumisen mahdollista vaikutusta ke ­
hittyvään hermostoon.  
Kohortti 3: arvioidaan kemikaalille altistumisen mahdollista vaikutusta ke ­
hittyvään immuunijärjestelmään.  
2. Päätöksissä siitä, arvioidaanko toista sukupolvea ja jätetäänkö hermostonke ­
hityksen myrkyllisyysvaikutuksia koskeva kohortti ja/tai immuunijärjestel ­
män kehityksen myrkyllisyysvaikutuksia koskeva kohortti arvioinnin ulko ­
puolelle, olisi otettava huomioon arvioitavasta kemikaalista olemassa olevat tiedot sekä eri sääntelyviranomaisten tarpeet. Testimenettelyn tarkoituksena on antaa tietoja siitä, miten tutkimus voidaan suorittaa ja käsitellä sitä, miten 
kutakin kohorttia olisi arvioitava.
 
3. OECD:n ohjeasiakirjassa 117 (39) kuvataan menettelyä päätökselle sisäisistä 
ominaisuuksien mittaamiseen liittyvistä tekijöistä toisen sukupolven tuotta ­
miseksi niitä sääntelyviranomaisia varten, jotka käyttävät sisäisiä käynnistä ­
viä tekijöitä (internal triggers).  
ALUSTAVAT NÄKÖKOHDAT JA TAVOITTEET  
4. Pidennetyn yhden sukupolven lisääntymistoksisuutta koskevan tutkimuksen 
päätavoite on arvioida tiettyjä kehitysvaiheita, jotka eivät kuulu muiden 
toksisuustutkimusten piiriin ja testata vaikutuksia, joita voi esiintyä synty ­
mää edeltävän ja sen jälkeisen kemikaalille altistumisen seurauksena. Kun kyseessä ovat lisääntymistä koskevat päätetapahtumat, tarkoituksena on käyttää ensimmäisenä toimenpiteenä tietoja toistuvan annostelun tutkimuk ­
sista (mukaan lukien lisääntymistoksisuutta koskevat seulontatutkimukset, 
kuten OECD:n testiohje 422 (32)), tai hormonaalisia haitta-aineita koske ­
vista lyhyen aikavälin seulontatesteistä (esim. kohtuun kohdistuvia vaikutuk ­
sia koskeva testi, testimenetelmä B.54 (36) taikka Hershbergerin testi, testi ­
menetelmä B.55 (37)), jos niitä on saatavilla, havaitsemaan urosten ja naa ­
rasten lisääntymiselimiin aiheutuvia vaikutuksia. Tähän voi sisältyä urosten osalta spermatogeneesi (kivesten histopatologia) ja naaraiden osalta kii ­
masykli, munarakkuloiden laskeminen/oosyyttien kypsyminen ja munasarjo ­
jen eheys (histopatologia). Laajennettu yhden sukupolven lisääntymistoksi ­
suutta koskeva tutkimus on testi lisääntymistä koskeville päätetapahtumille, ja siihen tarvitaan urosten ja naarasten välistä vuorovaikutusta, kantavia naaraita, naaraita, joilla on poikaset ja F
 1 -sukupolvea sukukypsyysiän jäl ­
keen saakka (ks. OECD:n ohjeasiakirja 151, joka tukee tätä testimenetelmää 
(40)).  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 860
 
5. Tämä testimenetelmä on suunniteltu niin, että sillä tarjotaan arviointi synty ­
mää edeltävän ja sen jälkeisen kemikaalille altistumisen vaikutuksesta kehi ­
tykseen sekä perusteellinen arviointi tiineenä olevien ja imettävien naaraiden sekä nuorten ja täysikasvuisten poikasten systeemisestä toksisuudesta. Kes ­
keisten kehitykseen liittyvien päätetapahtumien — kuten poikasten elinkyky, 
vastasyntyneen terveys, kehityksen tila syntymähetkellä sekä fyysinen ja 
toiminnallinen kehitys täysikasvuiseksi saakka — yksityiskohtaisen tutki ­
muksen tarkoituksena on määrittää poikasten erityiset kohde-elimet. Lisäksi tutkimus tarjoaa ja/tai vahvistaa tietoja testikemikaalin vaikutuksesta täysi ­
kasvuisen uroksen ja naaraan lisääntymiselimien eheyteen ja toimintaan. 
Erityisesti, mutta ei yksinomaan, tarkastellaan seuraavia parametreja: suku ­
puolirauhasten toiminta, kiimasykli, lisäkivesten siemennesteen siittiöiden kypsyminen, pariutumiskäyttäytyminen, hedelmöityminen, tiineys, synnytys 
ja imetys. Lisäksi hermostonkehityksen myrkyllisyysvaikutuksia ja immuu ­
nijärjestelmän kehityksen myrkyllisyysvaikutuksia koskevista arvioinneista saadut tiedot kuvaavat mahdollisia vaikutuksia kyseisissä elimissä ja järjes ­
telmissä. Näistä testeistä saatujen tietojen avulla pitäisi voida olla mahdol ­
lista määritellä taso, joka ei aiheuta havaittavaa haittavaikutusta (NOAEL), 
taikka alhaisin havaittavan haittavaikutuksen aiheuttava taso (LOAEL), ja/tai vertailukohtana olevat annokset useita päätetapahtumia varten ja/tai joita käytetään kuvaamaan vaikutuksia, jotka on havaittu aikaisemmissa toistu ­
villa annoksilla tehdyissä tutkimuksissa, ja/tai jotka ovat ohjeena myöhem ­
min suoritettaville testeille.
 
6. Menettelystä esitetään kaavio kuvassa 1. Testattavaa kemikaalia annetaan 
jatkuvasti porrastettuina annoksina usealle sukukypsistä uroksista ja naa ­
raista koostuvalle ryhmälle. Tälle poikasia saaneelle sukupolvelle (P-suku ­
polvi) annetaan annos määritetylle pariutumista edeltävälle ajanjaksolle (joka 
valitaan testikemikaalista saatavilla olevan tiedon perusteella, mutta joka on vähintään kaksi viikkoa) ja kahden viikon pariutumisjaksolle. P-urokset sa ­
avat kemikaalia ainakin F
 1 -sukupolven vieroitukseen saakka. Niiden pitäisi 
saada kemikaalia vähintään 10 viikon ajan. Ne voivat saada sitä pidempään, 
jos lisääntymiseen aiheutuvia vaikutuksia ei tarvitse selvittää. P-naaraiden käsittelyä jatketaan tiineyden ja imetyksen ajan, kunnes poikueiden vieroit ­
taminen päättyy (eli käsittely kestää 8–10 viikkoa). F
 1 -poikaset käsitellään 
edelleen testikemikaalilla vieroitusiästä täysikasvuiseksi saakka.Jos toista 
sukupolvea arvioidaan (ks. OECD:n ohjeasiakirja 117 (39)), F  1 -poikasten 
käsittelyä jatketaan F  2 -sukupolven vieroitukseen saakka tai tutkimuksen 
päättämiseen asti.  
7. Kaikista eläimistä tehdään kliiniset havainnot ja patologiset tutkimukset, 
joissa tarkastellaan myrkytysoireita. Erityistä huomiota kiinnitetään urosten 
ja naaraiden lisääntymiselinten eheyteen ja toimintaan sekä poikasten ter ­
veyteen, kasvuun, kehitykseen ja toimintaan. Valitut poikaset osoitetaan vieroituksen yhteydessä erityisiin alaryhmiin (kohortit 1–3, ks. 33 ja 34 
kohta sekä kuva 1) lisätutkimuksia varten. Näihin sisältyvät sukukypsyys, 
lisääntymiselinten eheys ja toiminta, neurologiset ja käyttäytymistä mittaavat päätetapahtumat sekä immuunijärjestelmän toiminta.
 
8. Tutkimuksen toteuttamisessa olisi noudatettava periaatteita ja näkökohtia, 
jotka esitetään pääpiirteittään OECD:n ohjeasiakirjassa 19 kliinisten oireiden 
tunnustamisesta, arvioimisesta ja soveltamisesta inhimillisinä toimenpiteinä 
turvallisuusarvioinneissa käytettäviin eläimiin (34).  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 861
 
9. Kun käytössä on riittävä määrä tutkimuksia tämän uuden tutkimussuunnitel ­
man vaikutuksen arvioimiseksi, testimenetelmää tarkastellaan uudelleen ja 
tarvittaessa tarkistetaan saadun kokemuksen perusteella.  
Kuva 1  
Järjestelmä pidennetylle yhden sukupolven lisääntymistoksisuutta koskevalle tutkimukselle
  
MENETELMÄN KUVAUS/TESTIN VALMISTELU  
Eläimet  
Eläinlajin ja kannan valinta  
10. Lajien valintaa lisääntymistoksisuutta koskevaan tutkimukseen olisi harkit ­
tava tarkasti kaiken saatavilla olevan tiedon perusteella. Rotta on yleensä 
suositeltavin laji, koska taustatietoja on paljon ja niitä voidaan vertailla yleisiin toksisuustesteihin. Tässä testimenetelmässä annetuissa kriteereissä ja suosituksissa viitataan rottaan. Jos toista lajia käytetään, tämä on perus ­
teltava, ja protokollaan on tehtävä asianmukaiset muutokset. Kantoja, joiden 
hedelmällisyys on alhainen tai joilla tiedetään esiintyvän korkea määrä spon ­
taaneja kehityshäiriöitä, ei pitäisi käyttää.
 
Ikää, ruumiinpainoa ja ryhmiin sisällyttämistä koskevat kriteerit  
11. Olisi käytettävä terveitä poikasia saaneen sukupolven eläimiä, joita ei ole 
käytetty aiempiin kokeisiin. Sekä uroksia että naaraita tutkitaan, ja naaraiden on oltava synnyttämättömiä, eivätkä ne saa olla tiineenä. P-eläinten olisi 
oltava sukukypsiä ja samanpainoisia (sukupuolen mukaan) annostuksen al ­
kuvaiheessa, samanikäisiä (noin 90 päivää) pariutumisvaiheessa, ja niiden on kuuluttava tutkittavaan lajiin ja kantaan. Eläimiä olisi totutettava olosuhtei ­
siin ainakin viiden päivän ajan vastaanottamisen jälkeen. Eläimet jaetaan 
satunnaisesti kontrolli- ja testiryhmiin niin, että ryhmien välinen ruumiin ­
painon keskiarvo on vertailukelpoinen (eli se on ± 20 % keskiarvosta).
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 862
 
Koe-eläinten häkit ja ruokinta  
12. Koe-eläinhuoneen lämpötilan pitäisi olla 22 °C (± 3 °C). Suhteellisen kos ­
teuden pitäisi olla 30–70 %, ja ihanteellinen väli on 50–60 %. Keinovaloa olisi käytettävä jaksossa 12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää. Normaalia labo ­
ratorioruokavaliota voidaan käyttää, ja juomaveden määrää ei saa rajoittaa. 
Olisi kiinnitettävä erityistä huolta siihen, kuinka paljon ravintoon sisältyy fytoestrogeenia, koska korkea määrä fytoestrogeenia ravinnossa voi vaikut ­
taa tiettyihin kehitykseen liittyviin päätetapahtumiin. Vakiomuotoista ruo ­
kavaliota, jonka sisältö kirjataan ja jossa estrogeenisia kemikaaleja on vä ­
hennetty, suositellaan (2)(30). Ravinnon valintaan voi vaikuttaa tarve var ­
mistaa sopiva sekoitus testikemikaalia, kun sitä annetaan tämän menettelyn 
mukaisesti. Testikemikaalin sisältö, homogeenisuus ja stabiliteetti ruokava ­
liossa olisi varmistettava. Rehuun ja juomaveteen mahdollisesti sisältyviä epäpuhtauksia olisi säännöllisesti analysoitava. Kunkin tutkimuksen aikana annetun ravintoerän edustavaa näytettä olisi säilytettävä asianmukaisissa 
oloissa (eli pakastettuna – 20 °C lämpötilassa) raportin valmistumiseen saak ­
ka, jos tulokset edellyttävät ruokavalion ainesosien tarkempaa analyysia.
 
13. Eläimet voidaan pitää häkeissä pienissä samaa sukupuolta ja samassa koe ­
ryhmässä olevien eläinten ryhmissä. Niitä voidaan joutua pitämään häkeissä 
yksittäin mahdollisten vaurioiden välttämiseksi (esim. urokset pariutumisjak ­
solla). Parituksen tulee tapahtua tarkoitukseen sopivissa häkeissä. Kun pari ­
tuksen todetaan tapahtuneen, naaraat, joiden oletetaan olevan tiineinä, sijoi ­
tetaan erikseen synnytys- tai poikimishäkkiin, jossa niille annetaan asianmu ­
kaisia ja määriteltyjä pesäntekoaineita. Poikueet pidetään emojen kanssa vieroitukseen saakka. F
 1 -eläimet voidaan pitää häkeissä pienissä samaa su ­
kupuolta ja samassa koeryhmässä olevien eläinten ryhmissä vieroituksesta 
lopettamiseen saakka. Eläimet voivat olla häkissä yksittäin, jos tämä on tieteellisesti perusteltua. Valittuun alusmateriaalin pitäisi sisältyä mahdolli ­
simman vähän fytoestrogeeneja.
 
Eläinten lukumäärä ja tunnistaminen  
14. Yleensä kussakin koe- ja kontrolliryhmässä pitäisi olla niin paljon pariutu ­
neita eläinpareja, että jokaiseen annosryhmään saadaan ainakin 20 tiinettä naarasta. Tavoitteena on tarpeeksi tiineystapauksia, jotta voidaan tehdä mer ­
kitsevä arvio kemikaalin vaikutuksesta P-sukupolven hedelmällisyyteen, tii ­
neyteen ja emon käytökseen sekä F
 1 -sukupolven kasvuun ja kehitykseen 
hedelmöityksestä sukukypsyyteen saakka. Jos tutkimuksessa ei päästä tavoi ­
teltuun tiineiden eläinten määrään, tämä ei välttämättä mitätöi tutkimusta, ja tätä on arvioitava tapauskohtaisesti ottaen huomioon testikemikaaliin liitty ­
vän mahdollisen syy-yhteyden.
 
15. Kullekin P-eläimelle annetaan oma tunnistenumero ennen annostelun aloit ­
tamista. Jos aikaisempien laboratoriotietojen perusteella vaikuttaa siltä, että 
huomattavalla määrällä naaraista ei ole säännöllinen (neljän tai viiden päi ­
vän) kiimakierto, niin ennen käsittelyn aloittamista suositellaan kiimakierron arviointia. Vaihtoehtoisesti ryhmän kokoa voidaan lisätä, jotta varmistetaan, 
että ainakin 20 naaralla kussakin ryhmässä on säännöllinen (neljän tai viiden 
päivän) kiimakierto käsittelyn alussa. Kaikki F
 1 -poikaset tunnistetaan yksi ­
löllisesti, kun vastasyntyneet tutkitaan ensimmäisen kerran syntymän jälkei ­
senä päivänä 0 tai 1. Kaikkien F  1 -eläinten, ja tarvittaessa F  2 -eläinten, alku ­
peräispoikue on merkittävä muistiin, ja tiedot olisi säilytettävä koko tutki ­
muksen ajan.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 863
 
Testikemikaali  
Testikemikaalista saatavilla olevat tiedot  
16. Olemassa olevien tietojen tarkastelu on tärkeää, kun tehdään päätöksiä al ­
tistusreiteistä, kantaja-aineen valinnasta, eläinlajin valinnasta, annosten va ­
linnasta ja mahdollisista muutoksista altisaikataulussa. Tästä syystä kaikki 
saatavilla olevat asianmukaiset tiedot testikemikaalista, eli fysikokemialliset, toksikokineettiset (mukaan lukien lajispesifinen metabolia) ja toksikodynaa ­
miset ominaisuudet, rakenne-aktiivisuussuhteet, metaboliset prosessit  in vit­
ro, tulokset aikaisemmista toksisuustutkimuksista ja asiaankuuluvat tiedot 
rakenteeltaan vastaavista aineista olisi otettava huomioon pidennetyn yhden sukupolven lisääntymistoksisuutta koskevan tutkimuksen suunnittelussa. Alustavat tiedot absorptiosta, jakautumisesta, metaboloinnista ja erittymi ­
sestä sekä biokertyvyydestä voidaan saada kemiallisesta rakenteesta, fysiko ­
kemiallisista tiedoista, plasmaproteiinin sitoutumisen laajuudesta tai toksiko ­
kineettisistä tutkimuksista, ja toksisuustutkimuksista saadaan lisätietoja eri ­
tyisesti haitattomasta vaikutustasosta, metaboliasta tai metabolian 
induktiosta.
 
Toksikokineettisten tietojen tarkastelu  
17. Aikaisemmin suoritetuista raja-annostutkimuksista tai muista tutkimuksista 
saadut toksikokineettiset tiedot eivät ole välttämättömiä, mutta ne ovat erit ­
täin hyödyllisiä tutkimuksen suunnittelun, annostasojen valinnan ja tuloksien tulkinnan suhteen. Erityisen hyödyllisiä ovat tiedot, joilla: 1) varmistetaan 
kehittyvien sikiöiden ja poikasten altistuminen testikemikaalille (tai asiaan ­
kuuluville metaboliiteille); 2) annetaan arvio sisäisestä dosimetriasta; ja 3) arvioidaan kineettisten prosessien annoksesta riippuvan saturaation mahdol ­
lisuutta. Täydentäviä toksikokineettisiä tietoja, kuten metaboliittiprofiilit, pi ­
toisuuteen liittyvät ajan funktiot, on myös tarkasteltava, jos niitä on saa ­
tavilla. Täydentävät toksikokineettiset tiedot voidaan kerätä myös varsinai ­
sen tutkimuksen aikana, jos se ei häiritse varsinaisen tutkimuksen pääteta ­
pahtumien keräämistä ja tulkintaa.
 
Yleinen ohje on, että seuraava toksikokineettisten tietojen kokonaisuus olisi 
hyödyllinen pidennetyn yhden sukupolven lisääntymistoksisuutta koskevan 
tutkimuksen suunnittelulle:  
— myöhäinen tiineysaika (esim. tiineyspäivä 20): emon veri ja sikiöveri  
— imetyksen puolessa välissä (syntymän jälkeinen päivä 10): emon veri, 
poikasen veri ja/tai maito  
— varhaisessa vaiheessa vieroituksen jälkeen (esim. syntymän jälkeinen 
päivä 28): vastavieroitetun verinäytteet.  
Tiettyjen analyyttien (esim. alkuperäinen kemikaali ja/tai metaboliitit) mää ­
rittelyssä ja näytteenotto-ohjelmassa olisi sovellettava joustavuutta. Esimer ­
kiksi kerättävien näytteiden määrä ja keräämisen ajoitus tiettynä näytteen ­
ottopäivänä riippuu muiden kuin tiineinä olevien eläinten altistusreitistä ja siitä, onko niiden toksikokineettisistä ominaisuuksista aiempia tietoja. Tut ­
kimuksissa, joissa testiaine annetaan ravintoon sekoitettuna, riittää näytteen ­
otto yhtenä johdonmukaisena ajankohtana kunakin näinä päivinä. Annostelu 
letkuruokinnalla voi vaatia täydentäviä näytteenottoaikoja, jotta saadaan pa ­
rempi arvio erilaisista sisäisistä annoksista. Minään näytteenottopäivänä ei ole kuitenkaan tarpeen tehdä täydellistä tutkimusta pitoisuuteen liittyvästä 
aktiviteetista. Veri voidaan tarvittaessa eritellä sukupuolittain poikueiden 
sisällä sikiön ja vastasyntyneen analyyseja varten.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 864
 
Annostelureitti  
18. Reitin valinnassa olisi otettava huomioon ihmisen altistumiselle tarkoituk ­
senmukaisin reitti (reitit). Vaikka testiprotokolla on suunniteltu testikemikaa ­
lin antamiseen ravinnon välityksellä, sitä voidaan muokata niin, että voidaan 
käyttää muuta antotapaa (juomaveden välityksellä, letkulla, inhalaatiolla, 
ihon kautta) kemikaalin ominaisuuksista sekä tarvittavista tiedoista riippuen.  
Kantaja-aineen valinta  
19. Testikemikaali liuotetaan tai suspensoidaan tarvittaessa sopivaan 
kantaja-aineeseen. Suositusten mukaan ensin on harkittava vesipohjaisen liuoksen/suspension käyttöä, sitten öljypohjaista (esimerkiksi maissiöljy) liuosta/suspensiota, kun tämä on mahdollista. Jos kantaja-aine ei ole vesi, 
sen toksiset ominaisuudet on tunnettava. On vältettävä käyttämästä 
kantaja-aineita, jotka ovat mahdollisesti luontaisesti myrkyllisiä (esim. ase ­
toni, DMSO). Testikemikaalin stabiliteetti kantaja-aineessa määritetään. Jos 
annostelun helpottamiseksi käytetään kantaja-ainetta tai muuta lisäainetta, on 
syytä selvittää: sen vaikutus testiaineen absorboitumiseen ja jakautumiseen, testiaineen metaboloitumiseen ja elimistössä säilymiseen. Lisäksi on selvi ­
tettävä sellaiset vaikutukset testiaineen kemiallisiin ominaisuuksiin, jotka 
saattavat muuttaa testiaineen myrkyllisyyttä, sekä vaikutukset koe-eläinten 
ravinnon ja juoman nauttimiseen tai ravitsemustilaan.
 
Annoksen valitseminen  
20. Tutkimukseen olisi tavanomaisesti sisällyttävä vähintään kolmea annostasoa 
ja rinnakkainen kontrolli. Kun valitaan asianmukaiset annostasot, tutkijan olisi otettava huomioon kaikki saatavilla olevat tiedot, kuten annostiedot aikaisemmista tutkimuksista, toksikokineettiset tiedot tiineinä olevista ja 
muista eläimistä ja se, kuinka laajasti ainetta siirtyy maidon kautta, sekä 
ihmisen altistumista koskevat arviot. Jos on saatavilla toksikokineettisiä tie ­
toja, joista käy ilmi toksikokineettisten prosessien annosriippuvainen satu ­
raatio, olisi pyrittävä välttämään korkeita annostasoja, jotka osoittavat sel ­
västi saturaation, jos ihmisen altistumistason oletetaan olevan hyvin paljon 
matalampi kuin kyllästymispiste. Tällaisissa tapauksissa suurimman annos ­
tason olisi oltava hieman suurempi kuin käännekohta, jolloin siirrytään epä ­
lineaariseen toksikokineettiseen käyttäytymiseen.
 
21. Jos asianmukaisia toksikokineettisiä tietoja ei ole käytettävissä, annostasojen 
olisi perustuttava toksisuusvaikutuksiin, ellei tätä rajoiteta testikemikaalin 
fysikaalisen/kemiallisen luonteen vuoksi. Jos annostasot perustuvat myrkyl ­
lisyysvaikutuksiin, suurimman annoksen valinnan tavoitteena on aiheuttaa jonkin verran systeemistä myrkyllisyyttä, mutta ei kuolemaa eikä voimakasta 
kärsimystä.
 
22. Annostasot valitaan asteittain alenevasti, jotta kaikki annostukseen liittyvät 
vaikutukset osoitetaan ja jotta vahvistetaan haitattomat vaikutustasot (NOA ­
EL) tai annokset, jotka ovat lähellä havaitsemisrajaa, joiden perusteella her ­
kimmille päätetapahtumille voidaan johtaa vertailukohtana oleva annos. Hai ­
tattomien vaikutustasojen ja alhaisimman havaittavan haittavaikutuksen ai ­
heuttavan tason välisten suurten annosvälien välttämiseksi kaksinkertaiset tai nelinkertaiset erot annostasojen välillä ovat usein parhaimmat. Usein on parempi lisätä neljäs testiryhmä kuin käyttää hyvin suuria annosvälejä (esi ­
merkiksi yli 10-kertaisia annosvälejä).
 
23. Kontrolliryhmän eläimiä käsitellään aivan samoin kuin koeryhmän eläimiä, 
paitsi että niille ei anneta testikemikaalia. Tämä ryhmä pitäisi jättää altista ­
matta tai sille annetaan plaseboa taikka se saa kantaja-ainetta, mikäli testi ­
kemikaalin antamisen yhteydessä käytetään kantaja-ainetta. Jos 
kantaja-ainetta käytetään, kontrolliryhmän pitäisi saada korkein määrä 
kantaja-ainetta.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 865
 
Raja-annostesti  
24. Tutkimus usealla annostasolla ei ole ehkä välttämätön, jos myrkyllisyyttä ei 
havaita annostasolla, joka on ainakin 1 000 mg/painokilo/vrk toistuvan an ­
nostelun tutkimuksissa tai jos myrkyllisyyttä ei ole odotettavissa rakenteel ­
taan ja/tai metaboliavaikutuksiltaan samankaltaisista kemikaaleista, jotka 
ovat metabolisten ominaisuuksien  in vivo/in vitro  osalta samanlaisia, saa ­
tujen tietojen perusteella. Tällaisissa tapauksissa pidennetty yhden sukupol ­
ven lisääntymistoksisuutta koskeva tutkimus voitaisiin toteuttaa käyttämällä 
kontrolliryhmää ja yhtä annosta, joka on ainakin 1 000 mg/painokilo/vrk. 
Jos kuitenkin tämän raja-annoksen käytön vuoksi löytyy todisteita lisäänty ­
miseen tai kehitykseen liittyvästä toksisuudesta, lisätutkimuksia alemmilla 
annostasoilla tarvitaan haitattoman vaikutustason määrittämiseksi. 
Raja-annostestiä koskevia näkökohtia sovelletaan ainoastaan, jos ihmisten altistumista koskevat tiedot eivät osoita, että korkeampi annostaso on tarpeellinen.
 
MENETELMÄT  
Poikasten altistaminen  
25. Suositeltu annostelutapa on altistaminen ravinnon välityksellä. Jos letkuruo ­
kintatutkimuksia tehdään, on otettava huomioon, että poikaset saavat testi ­
kemikaalia normaalisti ainoastaan epäsuorasti maidon kautta, ennen kuin 
suora annostus aloitetaan vieroituksen yhteydessä. Tutkimuksissa, joissa tes ­
tikemikaali annetaan ravintoon tai juomaveteen sekoitettuna, poikaset saavat 
lisäksi testikemikaalia suoraan, kun ne alkavat itse syödä imetysajan vii ­
meisellä viikolla. Muutoksia tutkimuksen suunnitteluun olisi harkittava, jos testikemikaalia erittyy huonosti maitoon ja jos poikasten jatkuvasta altistu ­
misesta ei ole todisteita. Näissä tapauksissa annosten antamista suoraan 
poikasille imetysaikana olisi harkittava olemassa olevien toksikokineettisten 
tietojen, poikasten toksisuuden tai biomarkkereiden muutoksien perustella (3)(4). Ennen kuin tehdään tutkimuksia poikasille imetysaikana suoraan an ­
nettavista annoksista, olisi harkittava huolellisesti etuja ja haittoja (5).
 
Annosteluaikataulu ja annosten antaminen  
26. Jotain tietoja kiimasykleistä, urosten ja naaraiden lisääntymiselinten histopa ­
tologiasta ja kivesten/lisäkivesten siemennesteen analyysista voi olla saa ­
tavilla aikaisemmista toistuvan annostelun tutkimuksista, joiden kesto oli 
riittävä. Ennen sukukypsyysikää annettavan käsittelyn kestolla pidennetyssä yhden sukupolven lisääntymistoksisuutta koskevassa tutkimuksessa pyritään siten havaitsemaan toiminnallisia muutoksia koskevat vaikutukset, jotka voi ­
vat häiritä parittelukäyttäytymistä ja hedelmöitystä. Annoksia pitäisi antaa 
ennen sukukypsyysikää tarpeeksi kauan, jotta saadaan aikaan tasapainoiset P-uroksien ja naaraiden altistusolosuhteet. Kummankin sukupuolen kaksi ­
viikkoinen ennen sukukypsyysikää toteutettava käsittely katsotaan useim ­
missa tapauksessa riittäväksi. Naaraiden osalta tämä kattaa 3–4 kokonaista 
kiimasykliä, ja tämän pitäisi riittää havaitsemaan syklille aiheutuvat mahdol ­
liset haittavaikutukset. Urosten osalta tämä vastaa ajanjaksoa, jota tarvitaan kehittyvien siittiöiden kypsymiseen lisäkiveksessä, ja tällä pitäisi voida ha ­
vainnoida vaikutuksia siemennesteeseen sen jälkeen, kun se kulkeutuu pois 
kiveksestä (spermiaation loppuvaiheessa ja kypsyessään lisäkiveksessä) pa ­
riutumisen yhteydessä. Lopetusvaiheessa, kun suunnitellaan kivesten ja lisä ­
kivesten histopatologista tutkimusta ja analyysia spermaparametreista, P- ja 
F
 1 -urokset on altistettu ainakin yhden täydellisen spermatogeneesisyklin ajan 
((6)(7)(8)(9) ja OECD:n ohjeasiakirja 151 (40)).  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 866
 
27. Kokeita, joissa uroksia altistetaan ennen sukukypsyysikää, voidaan mukaut ­
taa, jos aikaisemmissa tutkimuksissa on selvästi määritelty kiveksille aiheu ­
tuvat myrkyllisyysvaikutukset (spermatogeneesin heikentyminen) tai siemen ­
nesteen eheydelle ja toiminnalle aiheutuvat vaikutukset. Samoin naaraiden osalta, testikemikaalin tunnetuilla vaikutuksilla kiimasykliin ja siten seksuaa ­
liseen reseptiivisyyteen voidaan perustella erilaisia ennen sukukypsyysikää 
suoritettavia altistuskokeita. Erityistapauksissa voi olla hyväksyttävää, että P-naaraiden käsittely aloitetaan vasta sen jälkeen, kun saadaan siemennes ­
teen osoittava näyte (ks. OECD:n ohjeasiakirja 151 (40)).
 
28. Kun pariutumista edeltävä annostelujakso on otettu käyttöön, eläinten pitäisi 
saada testikemikaalia jatkuvasti seitsemänä päivänä viikossa ruumiinavauk ­
seen saakka. Samaa antotapaa on käytettävä kaikille eläimille. Annosta an ­
netaan edelleen kahden viikon pariutumisjakson aikana ja P-naaraille koko 
tiineyden ja imetyksen ajan vieroituksen jälkeiseen lopettamispäivään saak ­
ka. Uroksille annetaan annos samalla tavalla F  1 -eläinten vieroitukseen saak ­
ka, jolloin ne lopetetaan. Ruumiinavauksessa etusijalla pitäisi olla naaraat, 
joille suoritetaan ruumiinavaus samana/samantapaisena imetyspäivänä. Uros ­
ten ruumiinavaus voidaan jakaa pidemmälle aikavälille laboratoriotiloista riippuen. Valituille F
 1 -uroksille ja -naaraille suoraan annettava annos pitäisi 
aloittaa vieroituksen yhteydessä, ellei sitä jo aloitettu imetyksen aikana, ja 
sen pitäisi jatkua ruumiinavausajankohtaan kohortin tehtävästä riippuen.  
29. Kun testikemikaalit annetaan ravintoon tai juomaveteen sekoitettuna, on 
tärkeää varmistaa, että testikemikaalin määrät eivät häiritse normaalia 
ravinto- tai nestetasapainoa. Jos testikemikaali annetaan ravintoon sekoitet ­
tuna, voidaan ilmoittaa joko testikemikaalin pitoisuus ravinnossa (ppm) tai eläimen painoon suhteutettu annos; käytetty tapa on mainittava.
 
30. Jos testikemikaali annetaan mahaletkulla, kerralla annettavan nesteen tila ­
vuus ei saa ylittää 1:tä ml/100 g eläimen painoa (öljyä, kuten maissiöljyä, 
käytettäessä tilavuus saa olla enintään 0,4 ml/100 g eläimen painoa). Poik ­
keuksena tästä ovat ärsyttävät tai syövyttävät aineet, joiden kohdalla voidaan yleensä todeta vaikutusten voimistuminen suurempia pitoisuuksia käytettä ­
essä. Testiaineen nestemäärän tilavuusvaihtelua olisi minimoitava pitoisuutta 
muuttamalla, jotta kaikilla annostasoilla varmistetaan tilavuudeltaan sama 
nestemäärä. Annokset annetaan samaan aikaan joka päivä. Kunkin eläinyk ­
silön annoksen tulee yleensä perustua viimeiseen eläimen ruumiin painon määritykseen, ja sitä on mukautettava vähintään viikoittain, kun kyseessä 
ovat täysikasvuiset urokset ja täysikasvuiset naarat, jotka eivät ole tiineinä, 
ja kahden päivän välein, kun kyseessä ovat tiineenä olevat naaraat ja F
 1 - 
eläimet, jolloin annos annetaan ennen vieroitusta ja kahden viikon ajan vieroituksen jälkeen. Jos toksikokineettiset tiedot osoittavat, että testikemi ­
kaali leviää heikosti istukan kautta, letkun kautta annettavaa annosta voidaan 
joutua mukauttamaan tiineyden viimeisen viikon aikana, jotta emolle ei annostella liian myrkyllistä annosta. Naaraille ei anneta annosta ruokintalet ­
kun tai minkään muun reitin kautta, jos eläintä on käsiteltävä synnytyspäi ­
vänä; testikemikaalin antamatta jättäminen kyseisenä päivänä on suositelta ­
vaa, jotta synnytystä ei häiritä.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 867
 
Pariutuminen  
31. Kukin P-naaras olisi sijoitettava yhden samasta annosryhmästä satunnaisesti 
valitun uroksen, joka ei ole samaa alkuperää (1:1 paritus), pariksi siihen 
saakka, että parituksen voidaan todeta tapahtuneen taikka on kulunut kaksi viikkoa. Jos uroksia ei ole riittävä määrä esimerkiksi uroksen kuoltua ennen paritusta, uros (tai urokset), joka on jo paritellut, voidaan parittaa (1:1) 
toisen naaraan (toisten naaraiden) kanssa niin, että kaikki naaraat ovat pari ­
telleet. Tiineyspäivä 0 määritellään päiväksi, jolloin todisteet pariutumisesta vahvistetaan (vaginan tulpitus tai sperma havaitaan). Eläimet olisi eroteltava mahdollisimman pian, kun todisteet pariutumisesta vahvistetaan. Jos paritte ­
lua ei ole tapahtunut kahden viikon jälkeen, eläimet olisi eroteltava, ja niitä 
ei enää käytetä paritteluun. Pariutuneet parit olisi selvästi täsmennettävä tiedoissa.
 
Poikueiden koko  
32. Kunkin poikueen kokoa olisi mukautettava syntymän jälkeisenä päivänä 4 
poistamalla ylimääräiset poikaset niin, että poikueeseen jää mahdollisimman tarkasti viisi urosta ja neljä naarasta. Poikasten valikoiva poistaminen esi ­
merkiksi ruumiinpainon perusteella ei ole tarkoituksenmukaista. Jos uros- tai 
naaraspuolisten poikasten määrä on sellainen, että poikueeseen ei jää viittä poikasta kumpaakin sukupuolta, voidaan tehdä osittaismukautus (esimerkiksi kuusi urosta ja neljä naarasta).
 
Poikasten valitseminen vieroituksen jälkeisiä tutkimuksia varten (ks. 
kuva 1)  
33. Vieroitushetkellä (noin syntymän jälkeinen päivä 21) kaikista saatavilla ole ­
vista poikueista valitaan korkeintaan 20 poikasta annos- ja kontrolliryhmää 
kohti jatkotutkimuksiin ja niitä pidetään siinä sukukypsyysikään saakka (el ­
lei vaadita aiempaa testausta). Poikaset valitaan satunnaisesti, mutta ilmeisen kitukasvuisia eläimiä (eläimiä, joiden ruumiinpaino on enemmän kuin kah ­
den keskihajonnan osalta kunkin poikueen keskimääräistä poikasen painoa 
alempi) ei pitäisi sisällyttää niihin, koska ne eivät ole todennäköisesti koe ­
ryhmän osalta edustavia.
 
Syntymän jälkeisenä päivänä 21 valitut F  1 -poikaset jaetaan kolmeen kohort ­
tiin seuraavasti:  
Kohortti 1 (1A ja 1B) = lisääntymiseen ja kehitykseen liittyvän toksisuuden 
testaaminen  
Kohortti 2 (2A ja 2B) = hermostonkehitykseen kohdistuvan toksisuuden 
testaaminen  
Kohortti 3 = immuunijärjestelmän kehitykseen kohdistuvan toksisuuden tes ­
taaminen  
Kohortti 1A: yksi uros ja yksi naaras/poikue/ryhmä (20/sukupuoli/ryhmä): 
etusijainen valinta lisääntymiselimille aiheutuvien vaikutusten ja yleisten 
toksisten vaikutusten ensisijaista arviointia varten.  
Kohortti 1B: yksi uros ja yksi naaras/poikue/ryhmä (20/sukupuoli/ryhmä): 
etusijainen valinta F  1 -eläinten lisääntymiselinten toimintaa koskevaa seur ­
antatutkimusta varten, kun tätä tutkitaan (ks. OECD:n ohjeasiakirja 117 (39)); lisäksi pyritään saamaan histopatologisia tietoja tapauksista, joissa 
epäillään lisääntymis- tai hormonijärjestelmään vaikuttavia toksisia aineita, 
tai kun kohortin 1A tulokset ovat epävarmoja.
 
Kohortti 2A: yhteensä 20 poikasta ryhmää kohti (10 urosta ja 10 naarasta 
ryhmää kohti; yksi uros ja yksi naaras poikuetta kohti), jotka osoitetaan hermostoperäisiä käyttäytymisoireita koskeviin testeihin, ja sen jälkeen täy ­
sikasvuisina neurohistopatologisiin arviointeihin.
 
Kohortti 2B: yhteensä 20 poikasta ryhmää kohti (10 urosta ja 10 naarasta 
ryhmää kohti; yksi uros ja yksi naaras poikuetta kohti), jotka osoitetaan neurohistopatologisiin arviointeihin vieroitusajankohdalla (syntymän jälkei ­
nen päivä 21 tai 22). Jos eläimiä ei ole riittävästi, etusijalle on asetettava 
eläinten osoittaminen kohorttiin 2A.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 868
 
Kohortti 3: yhteensä 20 poikasta ryhmää kohti (10 urosta ja 10 naarasta 
ryhmää kohti; yksi uros ja yksi naaras poikuetta kohti, jos se on mahdol ­
lista). Kontrolliryhmästä voidaan tarvita muita poikasia positiivisen kontrol ­
lin eläimiksi T-soluriippuvaista vasta-ainevastetta koskevaa testiä varten syn ­
tymän jälkeisenä päivänä 56 ± 3.  
34. Jos poikueessa ei ole tarpeeksi poikasia kaikkia kohortteja varten, kohortti 1 
on etusijalla, koska sitä voidaan laajentaa F  2 -sukupolven tuottamiseen. 
Muita poikasia voidaan osoittaa kaikkiin kohortteihin erityisten syiden vuok ­
si, esimerkiksi jos kemikaalia epäillään hermostolle, immuunijärjestelmälle tai lisääntymiselle vaaralliseksi aineeksi. Näitä poikasia voidaan käyttää tut ­
kimuksissa eri ajankohtina tai arvioitaessa täydentäviä päätetapahtumia. 
Poikaset, joita ei ole osoitettu kohortteihin, toimitetaan kliiniseen biokemi ­
alliseen määritykseen (55 kohta) ja ruumiinavausta (68 kohta) varten.
 
P-eläinten toinen parittelu  
35. Toista parittelua ei yleensä suositella P-eläimille, koska sen vuoksi menete ­
tään tärkeitä tietoja ensimmäisen poikueen implantaatiopaikkojen määrästä (ja siten implantoinnin jälkeen tapahtuneen tiineyden keskeytymistä ja peri ­
nataalikuolemaa koskevista tiedoista, jotka osoittavat mahdollisen teratogee ­
nisuuden). Testikemikaalia saaneille naaraille aiheutuneen vaikutuksen var ­
mentamista tai selventämistä varten olisi parempi, jos tutkimukseen sisälly ­
tetään F
 1 -sukupolven pariutuminen. P-urosten toista parittelua naaraiden, 
jotka eivät ole saaneet testikemikaalia, kanssa voidaan kuitenkin aina käyttää 
vaihtoehtona epäselvien havaintojen selventämiseksi tai ensimmäisen parit ­
telun aikana havaittujen hedelmällisyysvaikutusten määrittämiseksi laajemmin.
 
ELÄVIÄ ElÄIMIÄ KOSKEVAT HAVAINNOT  
Kliiniset havainnot  
36. P-eläinten ja valittujen F  1 -eläinten osalta tehdään yleiset kliiniset havainnot 
kerran päivässä. Jos käytetään letkuruokintaa, kliiniset havainnot olisi teh ­
tävä annostelua ennen ja sen jälkeen (mahdollisten plasman huippupitoisuu ­
teen liittyvien toksisuusoireiden vuoksi). Testiin liittyvät käyttäytymistavan 
muutokset, vaikeat tai pitkittyneet synnytysoireet ja kaikki toksisuusoireet 
kirjataan. Kahdesti päivässä ja viikonloppuna kerran päivässä havainnoidaan kaikkien eläinten myrkytysvaikutuksia, sairastuvuutta ja kuolleisuutta.
 
37. Lisäksi kaikkien P- ja F  1 -eläinten yksityiskohtaisempi tarkastelu (vieroituk ­
sen jälkeen) suoritetaan viikoittain, ja se voidaan tehdä helposti eläintä punnittaessa, millä minimoidaan käsittelyyn liittyvä rasitus. Havainnot on 
suoritettava tarkkaan ja kirjattava käyttämällä koelaboratorion määrittelemiä 
pisteytysjärjestelmiä. Olisi pyrittävä varmistamaan, että testiolosuhteiden muutokset ovat mahdollisimman vähäiset. Kirjattaviin oireisiin sisältyvät, mutta eivät pelkästään, ihon, turkin, silmien, limakalvojen eritteiden erityk ­
seen sekä autonomisen hermoston toimintaan (esim. kyynelvuoto, piloerek ­
tio, mustuaisen koko, poikkeava hengitys) liittyvät muutokset. Muutokset käynnissä ja käsittelyyn liittyvässä reaktiivisuudessa sekä klooniset tai too ­
niset liikkeet, kaavamaiset liikkeet (esimerkiksi ylenmääräinen turkin hoito, 
jatkuva kehän kiertäminen) tai omituinen käytös (esimerkiksi itsensä silpo ­
minen, takaperin käveleminen) on kirjattava.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 869
 
Eläimen paino ja ravinnon/veden kulutus  
38. P-eläimet punnitaan ensimmäisenä altistuspäivänä ja sen jälkeen ainakin 
viikoittain. Lisäksi P-naaraat punnitaan imetyksen aikana samoina päivinä 
kuin poikueen poikaset (ks. 44 kohta). Kaikki F  1 -eläimet punnitaan yksitel ­
len vieroituksen yhteydessä (syntymän jälkeinen päivä 21) ja sen jälkeen ainakin viikoittain. Ruumiinpaino kirjataan myös päivänä, jolloin poikaset 
tulevat puberteetti-ikään (esinahka on eronnut tai emätin avautuu). Kaikki 
eläimet punnitaan lopetettaessa.
 
39. Tutkimuksen aikana ravinnon ja veden kulutus (jos testikemikaalia annos ­
tellaan juomaveden välityksellä) kirjataan ainakin kerran viikossa samoina 
päivinä kuin eläimen ruumiinpaino (paitsi silloin, kun eläimiä pidetään yh ­
dessä). F  1 -eläinten kunkin häkin ravinnon kulutus kirjataan viikoittain aloit ­
taen siitä, kun eläin valitaan kuhunkin kohorttiin.  
Kiimasyklit  
40. Ennakkotietoja testikemikaalin kiimakierrolle aiheuttamista vaikutuksista voi 
olla jo saatavilla aikaisemmista toistuvan annostelun tutkimuksista, ja niitä 
voidaan käyttää, kun kemikaalikohtaista protokollaa suunnitellaan pidenne ­
tyssä yhden sukupolven lisääntymistoksisuutta koskevassa tutkimuksessa. Tavanomaisesti kiimakierron arviointi (emättimen solututkimuksilla) aloite ­
taan käsittelyjakson alussa ja jatketaan, kunnes pariutuminen vahvistetaan tai 
kahden viikon pituinen pariutumisjakso päättyy. Jos naaraiden normaalia 
kiimakiertoa on seulottu ennen käsittelyä, niin näytteenottoa on hyödyllistä jatkaa, kun altistus aloitetaan. Jos kuitenkin altistuksen alussa esiintyy huolta epäspesifisistä vaikutuksista (kuten aluksi havaittavasta ravinnon kulutuksen 
vähentymisestä), eläinten voidaan antaa tottua altistukseen korkeintaan kah ­
den viikon ajan ennen kuin aloitetaan kahden viikon näytteenottoaika, joka johtaa pariutumiseen. Jos naaraan käsittelyjaksoa jatketaan tällä tavoin (eli neljän viikon käsittely ennen parittelua), tämä olisi otettava huomioon siten, 
että hankitaan nuorempia eläimiä ja jatketaan urosten käsittelyjaksoa ennen 
parittelua. Emättimen/kohdunkaulan solujen näytteenotossa on varottava li ­
makalvojen vahingoittamista ja siitä seuraavaa valetiineyttä (10)(11).
 
41. Kohortin 1A F  1 -naaraiden emättimen solunäytteitä on tarkasteltava päivittäin 
emättimen avautumisesta siihen saakka, että ensimmäinen sarveistumisen osoittava näyte kirjataan, jotta näiden kahden tapahtuman aikaväli määrite ­
tään. Kaikkien kohortin 1A F
 1 -naaraiden kiimasykliä olisi myös seurattava 
kahden viikon ajan syntymän jälkeisestä päivästä 75 alkaen. Lisäksi, jos F  1 - 
sukupolven parittaminen on tarpeen, kohortin 1B emättimen solututkimuksia seurataan paritteluhetkestä siihen saakka, että pariutumisesta saadaan 
todisteita.
 
Paritus ja tiineys  
42. Vakiomuotoisten päätetapahtumien (kuten ruumiinpaino, ravinnon kulutus, 
kliiniset havainnot mukaan lukien kuolleisuuden ja sairastuvuuden tarkista ­
minen) lisäksi kirjataan paritusajankohdat, siemennysajankohta ja synnytys ­
ajankohta sekä lasketaan yhdyntää edeltävä väli (parituksesta siemennys ­
ajankohtaan) ja tiineyden kesto (siemennysajankohdasta synnytysajankoh ­
taan). P-naaraiden oletetulla synnytysajankohdalla olisi tutkittava huolelli ­
sesti kaikki synnytyshäiriöihin viittaavat oireet. Kaikki pesäkäyttäytymiseen 
tai imetyskykyyn liittyvät poikkeavuudet olisi kirjattava.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 870
 
43. Synnytysajankohta on emolle imetyspäivä 0 ja poikasille syntymän jälkeinen 
päivä 0. Vaihtoehtoisesti kaikki vertailut voivat myös perustua yhdynnän 
jälkeiseen ajankohtaan, jotta vältetään sekaannus syntymän jälkeisten kehi ­
tystietojen kanssa tiineyden kestoon liittyvien erojen vuoksi; synnytyksen ajoitus olisi myös kirjattava. Tämä on erityisen tärkeää silloin, kuin testike ­
mikaali vaikuttaa tiineyden kestoon.
 
Poikasia koskevat parametrit  
44. Kukin poikue tutkitaan mahdollisimman pian synnytyksen jälkeen (synty ­
män jälkeinen päivä 0 tai 1), jolloin määritetään poikasten lukumäärä ja sukupuoli, kuolleena ja elävänä syntyneiden poikasten määrä sekä merkittä ­
vien poikkeavuuksien esiintyminen (ulkoisesti havaittavat poikkeamat, kuten 
suulakihalkio; ihonalainen verenvuoto, epänormaali ihon väri tai pinta; na ­
panuoraa koskevat havainnot, maidon puuttuminen vatsassa; kuivat eritteet). Lisäksi vastasyntyneiden ensimmäiseen kliiniseen tarkasteluun olisi sisällyt ­
tävä ruumiin lämpötilan, aktiivisuuden ja käsittelyyn liittyvän reaktiivisuu ­
den kvalitatiivinen arviointi. Poikasista, jotka löydetään kuolleina päivänä 0, on tutkittava mahdolliset kehityshäiriöt ja kuolinsyy. Elävät poikaset laske ­
taan ja punnitaan kukin erikseen syntymän jälkeisenä päivänä 0 tai 1 sekä 
säännöllisesti sen jälkeen, ainakin syntymän jälkeisinä päivinä 4, 7, 14 ja 21. 
Eläimen iän perusteella sovellettavia kliinisiä tutkimuksia olisi toistettava, kun jälkeläisiä punnitaan tai useammin, jos syntymähetkellä on tehty tapa ­
uskohtaisia havaintoja. Kirjattaviin oireisiin voivat sisältyä, mutta eivät pel ­
kästään, ulkoiset poikkeavuudet, ihon, turkin, silmien, limakalvojen erittei ­
den eritykseen sekä autonomisen hermoston toimintaan liittyvät muutokset. Muutokset käynnissä ja käsittelyyn liittyvässä reaktiivisuudessa sekä kloo ­
niset tai tooniset liikkeet, kaavamaiset liikkeet tai omituinen käytös on 
kirjattava.
 
45. Peräaukon ja sukupuolielinten välinen etäisyys on mitattava kultakin poik ­
aselta ainakin kerran syntymän jälkeisen päivän 0 ja 4 välillä. Poikasen ruumiinpaino olisi punnittava samana päivänä, kun peräaukon ja sukupuoli ­
elinten välinen etäisyys mitataan, ja tämä mittaus olisi normalisoitava poik ­
asen koon mittauksen perusteella, mieluiten kuutiojuureen ruumiinpainosta (12). Urosten nännien/nänninpihojen esiintyvyys olisi tarkastettava syntymän jälkeisenä päivänä 12 tai 13.
 
46. Kaikkien valittujen F  1 -eläimentä osalta tarkastellaan päivittäin urosten ters ­
kan ja esinahan eroamista tai naaraiden emättimen avautumista. Tämä aloi ­
tetaan ennen päivää, jolloin oletetaan, että päätetapahtuma tapahtuu. Näin havainnoidaan, saavutetaanko sukukypsyys varhaisessa vaiheessa. Kaikki 
sukuelimiin liittyvät poikkeavuudet, kuten pitkittyneet emättimessä olevat 
haavaumat, hypospadia tai peniksen halkeama, olisi kirjattava. F
 1 -eläinten 
sukukypsyyttä verrataan fyysiseen kehitykseen määrittelemällä ikä ja ruu ­
miinpaino ajankohdalla, jolloin urosten terska ja esinahka eroavat toisistaan 
tai naaraiden emätin avautuu (13).  
Hermostonkehitykseen liittyvien myrkyllisyysvaikutusten arviointi (ko ­
hortti 2A ja 2B)  
47. Kymmenen urosta ja 10 naarasta kohortin 2A eläimistä ja 10 urosta ja 10 
naarasta kohortin 2B eläimistä, kummastakin annosryhmästä (kutakin ko ­
horttia kohti yksi uros ja yksi naaras; kaikissa poikueissa on ainakin yksi 
poikanen; satunnaisesti valittu) olisi käytettävä hermostonkehitykseen liitty ­
vien myrkyllisyysvaikutusten arvioimiseen. Kohortin 2A eläinten osalta olisi tehtävä arvio akustisesta säpsähdysvasteesta, toimintaa ja havainnointia kos ­
keva testisarja sekä motorista aktiviteettia koskevat (ks. 48–50 kohta) ja 
neuropatologiset arvioinnit (ks. 74–75 kohta). Olisi pyrittävä varmistamaan,
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 871
 
että testiolosuhteiden muutokset ovat mahdollisimman vähäiset ja että ne 
eivät liity järjestelmällisesti käsittelyyn. Muuttujat, jotka voivat vaikuttaa 
käyttäytymiseen, ovat äänitaso (kuten äkkinäiset kovat äänet), lämpötila, kosteus, valaistusolosuhteet, hajut, ajankohta ja ympäristön häiriötekijät. Hermostonkehitykseen liittyvien myrkyllisyysvaikutusten testien tuloksia 
olisi tulkittava suhteessa asianmukaisen aikaisemman kontrollin vertailuvä ­
leihin. Kohortin 2B eläimiä olisi käytettävä hermostonkehitykseen liittyvien myrkytysvaikutusten arvioinnissa syntymän jälkeisenä päivänä 21 tai 22 (ks. 74–75 kohta).
 
48. Akustista säpsähdysvastetta koskeva testi olisi suoritettava syntymän jälkei ­
senä päivänä 24 (± 1 päivä) käyttäen kohorttia 2A. Testauspäivää olisi tasapainotettava annosta saaneiden ryhmien ja kontrolliryhmien välillä. Jo ­
kaiseen testikokonaisuuteen sisältyy 50 testiä. Akustista säpsähdysvastetta 
koskevan testin suorituksessa olisi määriteltävä keskimääräinen vasteampli ­
tudi kussakin 10 testin ryhmässä (viisi 10 testin ryhmää), ja testausolosuh ­
teita olisi optimoitava testijakson sisäisen sopeutumisen aikaansaamiseksi. Näiden menettelyiden olisi oltava yhdenmukaisia testimenetelmän B.53 
kanssa (35).
 
49. Syntymän jälkeisen päivän 63 ja 75 välisellä asianmukaisella ajankohdalla 
kohortin 2A eläimille suoritetaan toimintaa ja havainnointia koskeva testi ­
sarja ja motorista aktiviteettia koskeva automaattinen testi. Näiden menette ­
lyiden olisi oltava yhdenmukaisia testimenetelmän B.43 (33) ja B.53 kanssa (35). Toimintaa ja havainnointia koskevaan testisarjaan sisältyy eläimen ulkonäköä, käyttäytymistä ja toiminnallista eheyttä koskeva yksityiskohtai ­
nen kuvaus. Tätä arvioidaan tekemällä havaintoja kotihäkissä, sen jälkeen 
kun eläin on siirretty havainnointia varten avoimelle kentälle, jossa se liik ­
kuu vapaasti, ja eläinten käsittelyyn liittyvillä testeillä. Testauksen on edet ­
tävä vähiten interaktiivisesta eniten interaktiiviseen testiin. Luettelo toimen ­
piteistä esitetään liitteessä 1. Koulutettujen teknikoiden, jotka eivät ole tie ­
toisia eläinten käsittelytiedoista, olisi havainnoitava tarkasti kaikkia eläimiä, käyttäen standardoituja menettelyitä, joilla vähimmäistetään tarkkailijan en ­
nakkokäsitykset. On suositeltavaa, että eläimiin liittyvät havainnoinnit tie ­
tyssä tutkimuksessa tekee sama teknikko, kun tämä on mahdollista. Jos tämä 
ei ole mahdollista, tarvitaan jotain näyttöä tarkkailijoiden keskinäisen toi ­
minnan luotettavuudesta. Käytöstä mittaavan testisarjan kunkin parametrin osalta käytetään nimenomaisia toiminnallisesti määriteltyjä asteikkoja ja pis ­
teytyskriteerejä. Jos mahdollista, havaintoja koskevia päätetapahtumia, joissa 
on kyse subjektiivisista sijalukutesteistä, varten olisi kehitettävä objektiivisia määrällisiä toimenpiteitä. Kutakin eläintä testataan erikseen motorisen akti ­
viteetin osalta. Testikokonaisuuden olisi kestettävä riittävän kauan, jotta 
kontrolleja varten voidaan osoittaa, että eläin on sopeutunut testeihin. Mo ­
torista toimintaa olisi valvottava toimintaa mittaavalla automaattilaitteella, jolla voidaan selvittää toiminnan vähentyminen ja lisääntyminen (eli laitteen 
mittaaman lähtötilanteen ei pitäisi olla niin alhainen, että toiminnan vähen ­
tymisen havaitseminen estetään, eikä niin suuri, että estetään toiminnan lisääntymisen havaitseminen). Kutakin laitetta olisi testattava vakiomuotoi ­
silla menettelyillä, jotta toiminnan luotettavuus varmistetaan mahdollisuuk ­
sien mukaan laitteiden ja tutkimuspäivien osalta. Testiryhmiä olisi mahdol ­
lisuuksien mukaan tasapainotettava laitteisiin nähden. Testiryhmiä olisi tasa ­
painotettava testiajankohtiin nähden, jotta vältetään häiritsemästä toiminnan vuorokausirytmiä.
 
50. Jos olemassa olevat tiedot osoittavat, että tarvitaan muuta toimintaa koske ­
vaa testausta (esim. aistien, sosiaalinen tai kognitiivinen testaus), nämä si ­
sällytetään toimiin ilman, että tutkimuksessa käytettyjen muiden arviointien eheyttä häiritään. Jos tällaiset testit suoritetaan samoilla eläimillä, joita on 
käytetty vakiomuotoisiin akustista säpsähdysvastetta, toimintaa ja havain ­
nointia sekä motorista aktiviteettia koskeviin testeihin, olisi suunniteltava erilaisia testejä, joilla vähimmäistetään riski näiden testien eheyden vaar ­
antamisesta. Täydentävät tutkimukset voivat olla erityisen hyödyllisiä, kun 
empiiriset havainnot tai ennakoidut vaikutukset taikka menettely/vaikutus ­
tapa osoittavat tietyntyyppisen neurotoksisen vaikutuksen.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 872
 
Immuunijärjestelmän kehitykseen kohdistuvien myrkyllisyysvaikutus ­
ten arviointi (kohortti 3)  
51. Syntymän jälkeisenä päivänä 56 (± 3 päivää) kymmenen urosta ja 10 naa ­
rasta kohortin 3 eläimistä kummastakin koeryhmästä (kutakin kohorttia kohti yksi uros ja yksi naaras; kaikissa poikueissa on ainakin yksi poikanen; satunnaisesti valittu poikanen) olisi käytettävä T-soluriippuvaista 
vasta-ainevastetta koskevaa testiä varten — eli primaarista IgM-vasta-aine ­
vastetta T-soluriippuvaiseen antigeeniin, kuten lampaan punasoluihin (SRBC) tai maljakotilon hemosyaniiniin (keyhole limpet he ­
mocyanin, KLH) –, joka on yhdenmukainen tämänhetkisten immuunijärjes ­
telmään kohdistuvien myrkyllisyysvaikutusten testausmenetelmien kanssa 
(14)(15). Vastetta voidaan arvioida laskemalla erityiset plakkia muodostavat solut (PFC) pernassa tai määrittämällä ELISA-testissä SRBC- tai KLH-spesifisen IgM-vasta-aineen titteri vastehuipun aikana. Vasteen huippu 
on tavanomaisesti neljän (PFC-vaste) tai viiden (ELISA-testi) vuorokauden 
kuluttua laskimonsisäisestä immunisaatiosta. Jos primaarista vasta-ainevastetta testaan laskemalla plakkia muodostavat solut, eläinten ala ­
ryhmiä voidaan arvioida eri päivinä edellyttäen, että: alaryhmien immunisaa ­
tio ja lopettaminen ajoitetaan siten, että PFC:t lasketaan reaktiohuipun aika ­
na; alaryhmiin sisältyy yhtä monta uros- ja naaraspuolista poikasta kaikista koeryhmistä, mukaan lukien kontrolliryhmät; ja että alaryhmiä arvioidaan suunnilleen samalla syntymän jälkeisellä iällä.Testikemikaalille altistaminen 
jatkuu ajankohtaan, jolloin perna kerätään PFC-vastetta tai seerumi kerätään 
ELISA-testiä varten.
 
Lisääntymiseen mahdollisesti kohdistuvien myrkyllisyysvaikutusten ar ­
vioinnin seuranta (kohortti 1B)  
52. Kohortin 1B eläinten altistusta voidaan jatkaa syntymän jälkeisen päivän 90 
jälkeen ja ne voivat tarvittaessa saada F  2 -sukupolven poikasia. Saman an ­
nosryhmän urosten ja naaraiden olisi oltava samassa häkissä (välttäen sisa ­
rusten parittamista) enintään kahden viikon ajan syntymän jälkeisestä päi ­
västä 90 alkaen tai sen jälkeen, mutta ei kauempaa kuin syntymän jälkeinen 
päivä 120. Menettelyiden pitäisi olla samankaltaisia kuin mitä sovelletaan P-eläimiin. Näytön perusteella voi kuitenkin riittää, että poikueet lopetetaan syntymän jälkeisenä päivänä 4 sen sijaan, että niitä seurataan vieroitukseen 
saakka tai sen jälkeen.
 
LOPETTAMISTA KOSKEVAT NÄKÖKOHDAT  
Kliininen biokemia/hematologia  
53. P-eläimille aiheutuvia systeemisiä vaikutuksia olisi seurattava. Paaston jäl ­
keisiä verinäytteitä otetaan määritellyistä paikoista kymmeneltä satunnaisesti 
valitulta P-urokselta ja naaraalta annosryhmää kohti lopetettaessa. Ne säily ­
tetään asianmukaisissa olosuhteissa, ja niille tehdään osittainen tai täysimit ­
tainen veritutkimus, kliininen biokemiallinen tutkimus, T4:ää tai TSH:tä mittaava testi tai muita testejä testikemikaalin tunnettuja vaikutuksia koske ­
van profiilin perusteella (ks. OECD:n ohjeasiakirja 151 (40)). Seuraavia 
verenkuvan parametreja olisi tarkasteltava: hematokriitti, hemoglobiinipitoi ­
suus, punasolujen määrä, valkosolujen määrä yhteensä ja erittelylaskenta, verihiutaleiden määrä ja veren hyytymisaika ja/tai -potentiaali. Plasman tai 
seerumin tarkasteluun olisi sisällyttävä: glukoosi, kokonaiskolesteroli, urea, 
kreatiniini, valkuaisaine yhteensä, albumiini ja ainakin kaksi entsyymiä, jotka osoittavat maksasoluvaikutuksia (kuten alaniiniaminotranferaasi, aspar ­
taattiaminotransferaasi, alkalinen fosfataasi, gammaglutamyylitranspeptidaasi 
ja sorbitolidehydrogenaasi). Muiden entsyymien ja sappihappojen mittaus 
voi tarjota joissain tapauksissa hyödyllistä tietoa. Lisäksi kaikista eläimistä
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 873
 
voidaan ottaa verta ja säilyttää sitä mahdolliseen myöhemmin toteutettavaan 
analyysiin, jolla autetaan selventämään epäselviä vaikutuksia tai tuottamaan 
sisäistä altistumista koskevia tietoja. Jos P-eläimiä ei aiota parittaa toisen kerran, verinäytteet kerätään juuri ennen tai osana menetelmää suunnitellun lopettamisen yhteydessä. Jos eläimiä ei lopeteta, verinäytteet olisi kerättävä 
muutama päivä ennen kuin eläimet paritetaan toisen kerran. Elleivät ole ­
massa olevat tiedot toistuvan annostelun tutkimuksista osoita, että testike ­
mikaali ei vaikuta parametreihin, ennen lopettamista olisi tehtävä virtsa-analyysi, ja seuraavia parametreja olisi arvioitava: ulkonäkö, tilavuus, 
osmolaalisuus tai ominaistiheys, pH-arvo, valkuaisaine, glukoosi, veri ja 
verisolut, solujäte. Virtsaa voidaan myös kerätä testikemikaalin ja/tai meta ­
boliittien erittymisen seurantaa varten.
 
54. F  1 -eläimille aiheutuvia systeemisiä vaikutuksia olisi myös seurattava. Paas ­
ton jälkeisiä verinäytteitä otetaan määritellyistä paikoista kymmeneltä satun ­
naisesti valitulta kohortin 1A urokselta ja naaraalta annosryhmää kohti lo ­
petettaessa. Ne säilytetään asianmukaisissa olosuhteissa, ja niille tehdään 
vakiomuotoinen kliininen biokemiallinen tutkimus, mukaan lukien kilpirau ­
hashormonien (T4 ja TSH) seerumitason arviointi, veritutkimus (punasolujen ja valkosolujen määrä yhteensä ja erittelylaskenta) ja virtsa-analyysi.
 
55. Lopuille poikasille tehdään syntymän jälkeisenä päivänä 4 ruumiinavaus. 
Samalla harkitaan seerumin kilpirauhashormonin (tetrajodityroniini, T4) pi ­
toisuuksien mittaamista. Tarvittaessa vastasyntyneiden (syntymän jälkeinen päivä 4) veri voidaan eritellä poikueittain biokemiallisia/kilpirauhashormonin 
analyyseja varten. Verta kerätään T4- ja TSH-analyysiin vastavieroitetuilta 
eläimiltä, joille tehdään ruumiinavaus syntymän jälkeisenä päivänä 22 (F
 1 - 
poikasia, joita ei ole valittu kohortteihin).  
Siemennestettä koskevat parametrit  
56. Kaikkien P-sukupolven urosten siemennestettä koskevia parametreja olisi 
mitattava, ellei ole tietoja, jotka osoittavat, että näihin parametreihin ei kohdistu vaikutuksia 90 vuorokauden tutkimuksessa. Kaikille kohortin 1A uroksille olisi tehtävä siemennestettä koskevien parametrien tarkastelu.
 
57. Lopettamisen yhteydessä kaikkien P- ja F  1 - (kohortti 1A) urosten kivesten ja 
lisäkivesten paino kirjataan. Ainakin yksi kives ja yksi lisäkives varataan histopatologista tutkimusta varten. Jäljelle jäänyttä lisäkivestä käytetään li ­
säkiveksen hännän siemennesteen varastojen määrittelyyn (16)(17). Lisäksi 
lisäkiveksen hännän (tai siemenjohtimen) siemenneste kerätään käyttämällä menettelyitä, joilla vähimmäistetään siittiöiden liikkuvuuden ja morfologian arvioinnille aiheutuvat vahingot (18).
 
58. Siittiöiden liikkuvuutta voidaan arvioida välittömästi lopettamisen jälkeen tai 
tämä voidaan merkitä muistiin myöhempää analyysiä varten. Progressii ­
visesti liikkuvien siittiöiden prosenttiosuus voidaan määritellä subjektiivisesti 
tai objektiivisesti tietokoneavusteisella liikkuvuusanalyysilla 
(19)(20)(21)(22)(23)(24). Siittiöiden morfologista arviota varten lisäkiveksen tai siemenjohtimen siemenneste tutkitaan fiksatiivikäsiteltynä tai märkäpre ­
paraattina (25) ja vähintään 200 siittiötä/näyte luokitetaan joko normaaliksi 
(pää ja keskiosa/häntä vaikuttavat normaalilta) tai epänormaaliksi. Morfolo ­
gisiin siemennesteen epänormaaliuksiin kuuluvat siittiöiden fuusio, eristy ­
neet päät sekä päiden tai häntien epämuodostuma (26). Siittiöiden epämuo ­
dostuneet tai suuret päät voivat osoittaa kehityshäiriön spermiaatiossa.
 
59. Jos siittiönäytteet pakastetaan, näytteet fiksoidaan ja siittiöiden liikkuvuuden 
arviointia koskevat kuvat otetaan talteen ruumiinavaushetkellä (27), myö ­
hempää analyysiä voidaan rajoittaa kontrolliryhmän ja korkean annosryhmän 
uroksiin. Jos kuitenkin käsittelyyn liittyviä vaikutuksia havaitaan, alempia 
annosryhmiä olisi myös arvioitava.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 874
 
Ruumiinavaus  
60. Kun eläimet lopetetaan tai ne kuolevat testin aikana, kaikille P- ja F  1 -eläi­
mille tehdään ruumiinavaus ja ne tutkitaan silmämääräisesti mahdollisten 
rakenteellisten epämuodostumien tai patologisten muutosten vuoksi. Eri ­
tyistä huomiota olisi kiinnitettävä lisääntymiselimiin. Kuolemaisillaan olevat inhimillisellä tavalla lopetettavat poikaset ja kuolleet poikaset olisi kirjattava, 
ja mikäli niiden ruumiin kunto sallii, olisi tutkittava niiden mahdolliset 
kehityshäiriöt ja/tai kuolinsyy, ja ruumiit säilötään.
 
61. Täysikasvuisten P- ja F  1 -naaraiden osalta emättimen solunäytettä tarkastel ­
laan ruumiinavauspäivänä, jotta kiimasyklin vaihe määritellään ja jotta voi ­
daan mahdollistaa korrelaatio lisääntymiselinten histopatologisen tutkimuk ­
sen kanssa. Kaikkien P-sukupolven naaraiden (ja soveltuvin osin F  1 -naa­
raiden) kohdut tutkitaan implantaation esiintyvyyden ja määrän osalta niin, 
että histopatologista arviointia ei haitata.  
Elinten paino ja kudosten säilyttäminen — täysikasvuiset P- ja F  1 -eläi­
met 
62. Kun eläin lopetetaan, asiaankuuluvien kohorttien kaikkien P-eläinten ja 
kaikkien F  1 -eläinten ruumiinpaino ja (jäljempänä lueteltujen) elinten märkä ­
painot määritetään mahdollisimman nopeasti dissektion jälkeen, jotta ne eivät pääse kuivumaan. Näitä elimiä olisi säilytettävä sen jälkeen asianmu ­
kaisissa olosuhteissa. Ellei toisin mainita, parilliset elimet voidaan punnita 
erikseen tai yhdessä, testin suorittavan laboratorion tavanomaisen käytännön 
mukaisesti.
 
— kohtu (ja munajohtimet sekä kohdunkaula), munasarjat  
— kivekset, lisäkivekset (kokonaispaino ja häntä siittiöiden määrän laske ­
miseen käytetyissä näytteissä)  
— eturauhanen (dorsolateraalinen ja ventraalinen osa yhdessä). Eturauhasen 
yhdistelmää puhdistettaessa olisi pidettävä huolta, että nestettä sisältäviä 
rakkularauhaisia ei puhkaista. Jos eturauhasen kokonaispainolle aiheutuu 
vaikutuksia käsittelystä, dorsolateraalinen ja ventraalinen osa olisi leikat ­
tava huolellisesti erilleen fiksaation jälkeen ja punnittava erikseen  
— rakkularauhaset ja eturauhasen etuosa sekä niiden nesteet (yhtenä koko ­
naisuutena)  
— aivot, maksa, munuaiset, sydän, perna, kateenkorva, aivolisäke, kilpirau ­
hanen (fiksaation jälkeen) ja lisämunuaiset sekä määritetyt kohde-elimet 
ja -kudokset.  
63. Edellä mainittujen elinten lisäksi asianmukaisissa olosuhteissa olisi säilytet ­
tävä näytteitä seuraavista: ääreishermosto, lihakset, selkäydin, silmät ja nä ­
köhermo, maha-suolikanava, virtsarakko, keuhkot, henkitorvi (ja siihen liit ­
tyvä kilpirauhanen ja lisäkilpirauhanen), luuydin, siemenjohdin (urokset), rintarauhasen rauhanen (urokset ja naaraat) ja emätin.
 
64. Kohortin 1A eläinten kaikki elimet punnitaan ja säilytetään histopatologista 
tutkimusta varten.  
65. Ennen syntymää ja sen jälkeen aiheutettujen immunotoksisten vaikutusten 
tutkintaa varten kymmenelle urokselle ja 10 naaraalle kohortin 1A eläimistä 
kummastakin annosryhmästä (yksi uros ja yksi naaras poikuetta kohti; kai ­
kissa poikueissa on ainakin yksi poikanen; satunnaisesti valittu poikanen) olisi toteutettava seuraavat toimenpiteet niiden lopettamisen jälkeen:
 
— punnitaan imusolmukkeet, jotka liittyvät altistumisreittiin ja jotka sijait ­
sevat siitä etäämmällä (kaikille kohortin 1A eläimille jo tehdyn lisämu ­
nuaisten, kateenkorvan ja pernan punnituksen lisäksi)  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 875
 
— analysoidaan pernan lymfosyyttien alapopulaatioita (CD4+- ja CD8+- 
lymfosyytit, T-lymfosyytit, B-lymfosyytit ja luonnolliset tappajasolut) 
käyttäen pernan yhtä puoliskoa, ja toinen puolisko säilytetään histopato ­
logista arviointia varten.  
Pernan lymfosyyttien alaluokkien analyysilla eläimillä, joita ei ole immuni ­
soitu (kohortti 1 A), määritetään, liittyykö altistus muutoksiin ”auttajasolun” 
(CD4+) tai sytotoksisten (CD8+) kateenkorvasta peräisin olevien lymfosyyt ­
tien taikka luonnollisten tappajasolujen immunologisesti vakaassa jakau ­
massa (nopea reagointi neoplastisiin soluihin ja patogeeneihin).  
66. Kohortin 1 B eläinten seuraavat elimet punnitaan ja vastaavat kudokset 
käsitellään ryhmätasoa varten:  
— emätin (ei punnita)  
— kohtu ja kohdunkaula  
— munasarjat  
— kivekset (ainakin yksi)  
— lisäkivekset  
— rakkularauhaset ja eturauhasen etuosa  
— eturauhanen  
— aivolisäke  
— määritetyt kohde-elimet.  
Kohortin 1B histologinen tutkimus suoritetaan, jos kohortin 1A tulokset ovat 
epävarmoja tai jos epäillään lisääntymis- tai hormonijärjestelmään vaikutta ­
via toksisuutta aiheuttavia aineita.  
67. Kohortit 2A ja 2B: hermostonkehitykseen kohdistuvan myrkyllisyysvaiku ­
tuksen testaaminen (syntymän jälkeinen päivä 21 tai 22 ja täysikasvuiset 
poikaset). Kohortin 2A eläimet lopetetaan käyttäytymistä mittaavan testin jälkeen, aivojen painot kirjataan ja täydellinen neurohistologinen tutkimus tehdään neurotoksisuutta koskevaa arviota varten. Kohortin 2B eläimet lo ­
petetaan syntymän jälkeisenä päivänä 21 tai 22, aivojen painot kirjataan ja 
aivoista tehdään mikroskooppitutkimus neurotoksisuutta koskevaa arviota varten. Kohortin 2A eläimille on käytettävä perfuusiofiksaatiota, mikä on vapaaehtoista kohortin 2B eläimille testimenetelmän B.53 mukaisesti (35).
 
Elinten paino ja kudosten säilyttäminen — vastavieroitetut F  1 -eläimet  
68. Poikaset, joita ei ole valittu kohortteihin, mukaan lukien kitukasvuiset eläi ­
met, lopetetaan vieroituksen jälkeen syntymän jälkeisenä päivänä 22, elleivät tulokset osoita tarvetta täydentäville elävillä eläimillä tehtäville tutkimuksil ­
le. Lopetetuille poikasille tehdään ruumiinavaus mukaan lukien lisääntymi ­
selimiä koskeva arviointi, kuten kuvataan 62 ja 63 kohdassa. Enintään 10 
poikaselta sukupuolta ja ryhmää kohti (mahdollisimman monesta poikuees ­
ta) punnitaan aivot, perna ja kateenkorva, ja ne säilytetään asianmukaisissa olosuhteissa. Lisäksi näiden uros- ja naaraspuolisten poikasten rintarauhas ­
kudosta voidaan säilyttää täydentävää mikroskooppianalyysia varten (
 1 ) (ks. 
OECD:n ohjeasiakirja 151 (40)). Paljain silmin havaittavat poikkeavuudet ja kohdekudokset on säilytettävä mahdollista histologista tutkimusta varten.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 876  
( 1 ) Tutkimuksissa on käynyt ilmi, että rintarauhanen ja erityisesti rintarauhasen kehittyminen 
varhaisessa kehitysvaiheessa on estrogeenisen toiminnan osalta herkkä päätetapahtuma. 
On suositeltavaa, että päätetapahtumat, joihin käytetään kumpaakin sukupuolta olevien 
poikasten rintarauhasia, sisällytetään tähän testimenetelmään, kun se validoidaan.
 Histopatologia — P-eläimet  
69. Edellä 62 ja 63 kohdassa lueteltujen elinten täydellinen histopatologia suo ­
ritetaan kaikista suuren annoksen ja kontrolliryhmän P-eläimistä. Ne elimet, 
joissa todetaan käsittelyyn liittyviä muutoksia, olisi tutkittava myös kaikilta pienempiä annoksia saavilta eläimiltä, jotta haitaton vaikutustaso voidaan määritellä. Histopatologinen arviointi olisi tehtävä lisäksi kaikista suurista 
vaurioista sekä kaikista sellaisten eläinten lisääntymiselimistä, joiden hedel ­
mällisyyden epäillään vähentyneen, eli niiden, jotka eivät paritelleet, tulleet tiineiksi, siittäneet tai synnyttäneet terveitä poikasia tai joiden kiimakiertoon tai siittiöiden määrään, liikkuvuuteen tai morfologiaan vaikutettiin.
 
Histopatologia — F  1 -eläimet  
Kohortin 1 eläimet  
70. Edellä 62 ja 63 kohdassa lueteltujen elinten täydellinen histopatologia suo ­
ritetaan kaikista suuren annoksen ryhmän ja täysikasvuisten kontrolliryhmän 1A-eläimistä. Kaikissa poikueissa olisi oltava ainakin 1 poikanen sukupuolta kohti. Elimet ja kudokset, joissa todetaan käsittelyyn liittyviä muutoksia, ja 
kaikki suuret vauriot olisi tutkittava myös kaikilta eläimiltä, jotka saavat 
pienempiä annoksia, jotta voidaan määritellä haitaton vaikutustaso. Synty ­
mää ennen ja sen jälkeen imukudoselimille aiheutettujen vaikutusten arvi ­
ointia varten myös kerättyjen imusolmukkeiden ja luuytimen histopatologia 
olisi arvioitava kohorttiin 1A kuuluvalta 10 urokselta ja 10 naaralta kaikkien 1A eläinten keskuudessa tehdyn kateenkorvan, pernan ja lisämunuaisten arvioinnin lisäksi.
 
71. Kaikkien kohortin 1 B eläinten lisääntymiselinten kudoksia ja endokriinisia 
kudoksia, jotka on käsitelty 66 kohdassa tarkoitetulle ryhmätasolle, olisi tutkittava histopatologisesti, jos epäillään lisääntymis- tai hormonijärjestel ­
mään vaikuttavia toksisia aineita. Kohortista 1B olisi tehtävä myös histolo ­
ginen tutkimus, jos kohortin 1A tulokset ovat epäselvät.
 
72. Täysikasvuisten naaraiden munasarjoihin pitäisi sisältyä varhaismunarakku ­
loita ja kasvavia munarakkuloita sekä suuria keltarauhasia; tästä syystä his ­
topatologisessa tutkimuksessa on pyrittävä osoittamaan F  1 -naaraiden var ­
haismunarakkuloiden ja pienten kasvavien munarakkuloiden sekä suurten keltarauhasten määrällinen arvio; eläinten määrän, munasarjaleikkeen valin ­
nan sekä leikkeen näytekoon olisi oltava tilastollisesti asiamukainen käytet ­
tyyn arviointimenettelyyn nähden. Munarakkuloiden määrä lasketaan ensin kontrolli- ja korkean annoksen ryhmän eläimillä, ja jos jälkimmäisessä ryh ­
mässä esiintyy haitallisia vaikutuksia, olisi tarkasteltava alemman annoksen 
ryhmiä. Tutkimukseen sisältyy varhaismunarakkuloiden määrän laskenta. 
Tämä voidaan yhdistää pienten kasvavien munarakkuloiden määrän lasken ­
taan, jotta käsiteltyjä munasarjoja ja kontrolliryhmän munasarjoja voidaan verrata (ks. OECD:n ohjeasiakirja 151 (40)). Keltarauhasen arviointi olisi 
suoritettava samanaikaisesti kiimakiertoa koskevan testin kanssa, jotta kii ­
makierron vaihe voidaan ottaa huomioon arvioinnissa. Munajohtimet, kohtu ja emätin tutkitaan asianmukaisen elimelle tyypillisen kehityksen suhteen.
 
73. F  1 -uroksille tehdään yksityiskohtaiset kivesten histopatologiset tutkimukset, 
jotta käsittelyyn liittyvät vaikutukset kivesten erilaistumiselle ja kehitykselle sekä spermatogeneesille tunnistetaan (38). Jos mahdollista, tutkitaan kivek ­
sen verkon (rete testis) osia. Lisäkiveksen pää, runko ja häntä sekä siemen ­
johdin tutkitaan elimelle tyypillisen kehityksen suhteen samoin kuin 
P-uroksilta edellytetyt parametrit.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 877
 
Kohortin 2 eläimet  
74. Neurohistopatologinen tutkimus suoritetaan kaikille korkean annoksen ja 
kontrolliryhmän kohortin 2A eläimille sukupuolta kohden hermostoperäisiä käyttäytymisoireita koskevan testin loppuunsaattamisen jälkeen (syntymän 
jälkeisen päivän 75 jälkeen, mutta ennen päivää 90). Aivojen histopatologi ­
nen tutkimus suoritetaan kaikille korkean annoksen ja kontrolliryhmän ko ­
hortin 2A eläimille sukupuolta kohden syntymän jälkeisenä päivänä 21 tai 22. Elimet ja kudokset, joissa todetaan käsittelyyn liittyviä muutoksia, olisi 
tutkittava myös kaikilta eläimiltä, jotka ovat pienempiä annoksia saavissa 
ryhmissä, jotta haitaton vaikutustaso voidaan määritellä. Kohortin 2A ja 2B eläinten osalta olisi tutkittava useita aivojen osia, jotta voidaan tarkastella 
hajukäämejä, aivokuorta, hippokampusta, tyvitumakkeita, talamusta, hypot ­
alamusta, keskiaivoja (keskiaivojen kattoa, keskiaivojen peitettä ja pikkuai ­
vovarsia), aivorunkoa ja pikkuaivoja. Pelkästään kohortin 2A osalta tarkas ­
tellaan silmiä (verkkokalvo ja silmähermo) ja näytteitä ääreishermostosta, 
lihaksista ja selkäytimestä. Kaikkien neurohistologisten menettelyiden olisi 
oltava yhdenmukaisia testimenetelmän B.53 kanssa (35).
 
75. Aivojen edustavista alueista olisi tehtävä morfometriset (kvantitatiiviset) ar ­
vioinnit (homologiset kohdat, jotka on valittu huolellisesti luotettavien mik ­
roskooppisten tuntomerkkien perusteella), ja niihin voi sisältyä lineaarinen 
ja/tai pinta-alaa koskeva mittaus tietyistä aivojen alueista. Kunkin tunnus ­
merkin (taso) osalta olisi otettava ainakin kolme yhdensuuntaista leikettä, jotta valitaan homologisin ja edustavin osa arvioitavasta tietystä aivon alu ­
eesta. Neuropatologin olisi ratkaistava asianmukaisesti, ovatko mittausta var ­
ten valmistellut leikkeet homologisia muiden näytteiden kanssa ja voidaanko 
ne sisällyttää tutkimukseen, koska erityisesti lineaariset mittaustulokset voi ­
vat muuttua suhteellisen lyhyellä etäisyydellä (28). Ei-homologisia leikkeitä ei saa käyttää. Tarkoitus on ottaa näytteitä kaikilta tähän tarkoitukseen va ­
ratuilta eläimiltä (10/sukupuoli/annosryhmä), mutta pienempi määrä voi silti 
riittää. Alle kuudelta eläimeltä/sukupuoli/annosryhmä otettavia näytteitä ei pidetä kuitenkaan yleensä riittävänä tätä testimenetelmää varten. Stereolo ­
giaa voidaan käyttää täsmentämään testeihin liittyvät vaikutukset, jotka koh ­
distuvat parametreihin, kuten tiettyjen neuroanatomisten alueiden volyymi 
tai solumäärä. Kaikissa kudosnäytteiden valmistelua koskevissa toimissa kudosten fiksoinnista kudosnäytteiden dissektioon, kudosten käsittelyyn ja objektilasien värjäykseen saakka olisi käytettävä tasapainottavaa mallia, jotta 
jokaiseen erään sisältyy edustavia näytteitä kustakin annosryhmästä. Morfo ­
metristä tai stereologista analyysia varten aivokudos olisi valettava sopivaan aineeseen kaikilla annostasoilla samaan aikaan, jotta vältetään kutistuneet 
artefaktit, jotka voivat liittyä pitkäaikaiseen säilytykseen fiksatiivissa.
 
TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
Tiedot  
76. Tiedot olisi esitettävä erikseen ja yhteenvetona taulukossa. Kustakin testi ­
ryhmästä ja sukupolvesta ilmoitetaan soveltuvissa tapauksissa seuraavaa: eläinten määrä testin alussa, testin aikana kuolleiden tai inhimillisistä syistä 
lopetettujen eläinten määrä, kuoleman tai lopettamisen aika, lisääntymisky ­
kyisten eläinten määrä, tiineiden naaraiden määrä, niiden naaraiden määrä, jotka synnyttävät poikueen ja niiden eläinten määrä, joissa myrkyllisyysvai ­
kutuksia on havaittavissa. Myrkytysoireet olisi kirjattava mukaan lukien 
oireiden alkamispäivä, kesto ja voimakkuus.
 
77. Numeeriset tulokset arvioidaan tarkoituksenmukaista ja hyväksyttyä tilastol ­
lista menetelmää käyttäen. Tilastolliset menetelmät tulee valita tutkimuksen suunnitteluvaiheessa, ja niissä olisi otettava asianmukaisesti huomioon fak ­
tuaaliset tiedot (esim. laskutiedot), tiettyjen arvojen määrää mittaavat tiedot 
(esim. rajoitettu havainnointiaika) ei-riippumattomat tiedot (esim. vaikutuk ­
set poikueisiin ja toistetut toimenpiteet) ja erisuuret varianssit. Yleistetyt
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 878
 
lineaariset sekamallit ja annosvastemallit kattavat laajan luokan analyyttisiä 
välineitä, jotka voivat soveltua tästä testimenetelmästä saaduille tiedoille. 
Raporttiin pitäisi sisältyä riittävästi tietoa analyysimenetelmästä ja käytetystä tietokoneohjelmasta, jotta riippumaton arvioija/tilastoasiantuntija voi niiden avulla arvioida/arvioida uudelleen analyysin.
 
Tulosten arviointi  
78. Löydökset — mukaan lukien ruumiinavauslöydökset ja mikroskooppiset 
löydökset — on arvioitava havaittujen vaikutusten pohjalta. Arviointiin si ­
sältyy annoksen ja epämuodostumien tai häiriöiden, mukaan lukien vakavat vauriot, esiintyvyyden ja vaikutusten vakavuuden välinen mahdollinen suh ­
de. Kohde-elimiä, vaikutuksia hedelmällisyyteen, kliinisiä häiriöitä, vaiku ­
tuksia lisääntymiskykyyn ja poikueen kokoon/laatuun, ruumiinpainon muu ­
toksia, vaikutuksia kuolleisuuteen sekä muita myrkyllisyysvaikutuksia ja kehitysvaikutuksia olisi myös arvioitava. Sukupuolikohtaisiin muutoksiin 
olisi kiinnitettävä erityistä huomiota. Testikemikaalin fysikokemialliset omi ­
naisuudet ja toksikokineettiset tiedot, kun ne ovat saatavilla, mukaan lukien kemikaalin leviäminen istukan kautta ja maidon erittyminen, olisi otettava huomioon testitulosten arvioinnissa.
 
Tutkimusseloste  
79. Tutkimusselosteen on sisällettävä seuraavat tiedot, jotka on saatu tässä tut ­
kimuksessa P-, F  1 - ja F  2 -eläimiltä (soveltuvin osin):  
Testikemikaali:  
— kaikki asianmukaiset saatavilla olevat tiedot testikemikaalin kemiallisis ­
ta, toksikokineettisista ja toksikodynaamisista ominaisuuksista  
— tunnistetiedot  
— puhtaus.  
Kantaja-aine (tarvittaessa):  
— jos kantaja-aine on muu kuin vesi, sen valinta on perusteltava.  
Koe-eläinlajit:  
— käytetty eläinlaji ja kanta  
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli  
— toimittaja, häkit, ravinto, pesäntekoaineet ja niin edelleen  
— kunkin eläimen paino testin alussa  
— P-naaraiden emättimen solunäytetiedot ennen käsittelyn alkua (jos tiedot 
kerätään tuolloin)  
— P-sukupolven paritusta koskevat tiedot, joissa mainitaan uros- ja naa ­
raspuolinen parittelukumppani ja parittelun onnistuminen  
— alkuperäispoikuetta koskevat tiedot täysikasvuisista F  1 -sukupolven eläi ­
mistä  
Testiolosuhteet:  
— annostasojen valintaperusteet  
— yksityiskohdat testikemikaalin koostumuksesta/ravintovalmisteesta, val ­
misteessa saavutetusta pitoisuudesta  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 879
 
— valmisteen stabiliteetti ja homogeenisuus kantaja-aineessa tai välittäjässä 
(esim. ravinto, juomavesi), veressä ja/tai maidossa käyttöä ja varastointia 
koskevien edellytysten mukaisesti käyttökertojen välillä  
— yksityiskohtaiset tiedot testikemikaalin antotavasta  
— muuntokerroin ravintoon/juomaveteen sekoitetun testikemikaalin pitoi ­
suudelle (ppm) todelliseen annokseen (mg/painokilo/vrk) nähden (tarvit ­
taessa)  
— yksityiskohtaiset tiedot ravinnon ja veden laadusta (mukaan lukien ra ­
vinnon koostumus, mikäli saatavissa)  
— yksityiskohtainen kuvaus satunnaisotosta koskevista menettelyistä, joita 
käytetään poikasten karsitaan ja kun niitä valitaan koeryhmiin  
— ympäristöolosuhteet  
— luettelo tutkimushenkilöstöstä mukaan lukien ammatillinen koulutus.  
Tulokset (yhteenveto ja yksilökohtaiset tiedot sukupuolittain ja annostason 
perusteella):  
— ravinnonotto sekä nautitun veden määrä, mikäli se on mitattu, ravinnon 
tehokkuus (ruumiinpainon lisäys nautittua ravintogrammaa kohti lukuun ottamatta sitä aikaa, kun eläimet pidetään yhdessä, ja imetysaikaa) ja 
saadun testiaineen määrä P- ja F1-eläimillä (ravintoon/juomaveteen se ­
koitettuna)
 
— absorptiotiedot (jos mitattu)  
— P-eläinten painotiedot  
— valittujen F  1 -eläinten painotiedot vieroituksen jälkeen  
— eläinten kuolinaika tutkimusaikana tai eloonjääneet sen päätyttyä  
— kliinisten havaintojen luonne, vaikeusaste ja kesto (ovatko kumottavissa 
vai eivät)  
— hematologia, virtsa-analyysi ja kliinisen kemian tiedot, mukaan lukien 
TSH ja T4  
— pernan solujen fenotyypin analyysi (T-, B-, tappajasolut)  
— luuytimen solujen määrä  
— toksista vastetta koskevat tiedot  
— niiden P- ja F  1 -naaraiden määrä, joilla on normaali tai epänormaali kii ­
masykli, ja syklin pituus  
— pariutumiseen tarvittava aika (yhdyntää edeltävä väli, parituksen ja pa ­
riutumisen välisten päivien määrä)  
— toksiset ja muut vaikutukset lisääntymiseen, mukaan lukien lukumäärä ja 
prosenttiosuus eläimistä jotka parittelevat, tulevat tiineiksi, synnyttävät ja 
imettävät, uroksista, jotka saavat naaraan tiineeksi, ja naaraista, joilla 
esiintyy merkkejä synnytyshäiriöstä, pitkittyneestä tai vaikeasta synny ­
tyksestä  
— tiineyden kesto ja, jos on tietoja, synnytyksen kesto  
— implantaatioiden lukumäärä, poikueiden koko ja urospuolisten pentujen 
prosenttiosuus  
— implantaation jälkeen tapahtuneiden tiineyden keskeytymisten, elävänä 
syntyneiden ja kuolleena syntyneiden lukumäärä ja prosenttiosuus  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 880
 
— poikueen paino ja poikasen painotiedot (urokset ja naaraat erikseen sekä 
kummatkin yhdessä), kitukasvuisten eläinten määrä, jos tämä määritel ­
lään 
— selvästi näkyvistä epämuodostumista kärsivien poikasten lukumäärä  
— toksiset tai muut vaikutukset poikasiin, syntymän jälkeiseen kasvuun, 
elinkykyyn jne.  
— tiedot poikasten fyysisistä kehitysvaiheista ja muut syntymän jälkeiseen 
kehitykseen liittyvät tiedot  
— F  1 -eläinten sukukypsyyttä koskevat tiedot  
— poikasten ja täysikasvuisten toimintoja koskevat havainnot tarvittaessa  
— P-eläinten ja täysikasvuisten F  1 -eläinten ruumiinpaino lopettamishetkellä 
sekä elinten absoluuttinen ja suhteellinen paino  
— ruumiinavauslöydökset  
— tarkka selostus kaikista histopatologisista löydöksistä  
— P- ja F  1 -sukupolvien urosten lisäkiveksen hännän siittiöiden kokonais ­
määrä, progressiivisesti liikkuvien siittiöiden prosenttiosuus, morfologi ­
sesti normaalien siittiöiden prosenttiosuus ja poikkeavien siittiöiden pro ­
senttiosuus kunkin havaitun poikkeavuuden mukaan  
— P- ja F  1 -naaraiden munasarjoihin sisältyvien munarakkuloiden määrä ja 
kypsyysaste tarvittaessa  
— F  1 -naaraiden munasarjojen keltarauhasten laskenta  
— tulosten tilastollinen käsittely tarvittaessa  
Kohortin 2 parametrit:  
— yksityiskohtainen kuvaus menettelyistä, joita käytetään standardoimaan 
havainnot ja menettelyt sekä operatiiviset määritelmät pisteytykseen liit ­
tyville havainnoille  
— luettelo kaikista käytetyistä testimenettelyistä ja perustelut niiden käy ­
tölle 
— yksityiskohtaiset tiedot käytetyistä käyttäytymisoireisiin/toimintaan liitty ­
vistä, neuropatologisista ja morfometrisistä menettelyistä mukaan lukien yksityiskohtaiset tiedot automaattilaitteista
 
— laitteiden kalibrointia ja vastaavuuden varmistamista koskevat menettelyt 
ja koeryhmien tasapainottaminen testimenettelyissä  
— lyhyt perustelu, jossa selvitetään mahdollisia päätöksiä, joihin liittyy 
asiantuntija-arvio  
— yksityiskohtainen kuvaus kaikista käyttäytymisoireisiin/toimintaan liitty ­
vistä, neuropatologisista ja morfometrisistä löydöksistä sukupuolen ja 
annosryhmän perusteella, mukaan lukien kontrolliryhmiä koskevat lisä ­
ykset ja vähennykset  
— aivojen paino  
— havainnot hermostollisista oireista tai vaurioista mukaan lukien luonnol ­
lisesti esiintyvät sairaudet tai tilat  
— kuvat esimerkkilöydöksistä  
— morfometriassa käytettyjen leikkeiden homologian arviointiin käytetyt 
vähän tehoa kuluttavat kuvat  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 881
 
— tulosten tilastollinen käsittely, mukaan lukien tietojen analysointiin käy ­
tetyt tilastolliset mallit ja tulokset riippumatta siitä, olivatko ne merkit ­
tävät  
— muiden toksisten vaikutusten yhteys testikemikaalin mahdollisesta neu ­
rotoksisuudesta tehtyihin johtopäätöksiin sukupuolen ja annosryhmän perusteella
 
— toksikokineettisten tietojen vaikutus päätelmiin  
— testimenetelmän luotettavuutta ja herkkyyttä tukevat tiedot (kuten positii ­
viset ja aikaisemmat kontrollitiedot)  
— mahdolliset suhteet neuropatologisten ja toiminnallisten vaikutusten vä ­
lillä 
— haitaton tai vertailukohtana oleva annos emoille ja poikasille sukupuolen 
ja annosryhmän perusteella.  
— pohdinta tietojen yleisestä tulkinnasta tulosten perusteella, mukaan lu ­
kien johtopäätös siitä, aiheuttiko kemikaali hermostonkehitykseen vai ­
kuttavia myrkyllisyysvaikutuksia, ja haitattomasta vaikutustasosta.  
Kohortin 3 parametrit:  
— seerumin IgM-vasta-aineiden titteri (herkistys SRBC:lle tai KLH:lle) tai 
pernan IgM:n PFC-yksiköt (herkistys SRBC:lle)  
— T-solujen antigeenin reaktiota (TDAR) koskeva menettely pitäisi vahvis ­
taa osaksi optimointiprosessia laboratoriossa, joka suorittaa testin ensim ­
mäisen kerran, ja se olisi toteutettava säännöllisesti (esimerkiksi vuosit ­
tain) kaikissa laboratorioissa  
— pohdinta tietojen yleisestä tulkinnasta tulosten perusteella, mukaan lu ­
kien johtopäätös siitä, aiheuttiko kemikaali immuunijärjestelmän kehi ­
tykseen vaikuttavia myrkyllisyysvaikutuksia, ja haitattomasta vaikutustasosta.
 
Tulosten pohdinta  
Päätelmät, mukaan lukien haitatonta vaikutustasoa koskevat arvot poikasia 
saaneille täysi-ikäisille ja poikasille aiheutuvista vaikutuksista  
Kaikki tiedot, joita ei saatu tutkimuksen aikana mutta jotka ovat hyödyllisiä 
tulosten tulkintaa varten (kuten vaikutusten yhtäläisyydet joihinkin tunnet ­
tuihin neurotoksisiin aineisiin), pitäisi myös esittää.  
Tulosten tulkinta  
80. Pidennetyssä yhden sukupolven lisääntymistoksisuutta koskevassa tutkimuk ­
sessa tarjotaan tarvittaessa tietoja toistuvasta altistumisesta kemikaalille li ­
sääntymissyklin kaikissa vaiheissa. Tutkimuksella tarjotaan erityisesti tietoa 
poikasten lisääntymiselimistä ja kehityksestä, kasvusta, selviytymisestä sekä toiminnallisista päätetapahtumista syntymän jälkeiseen päivään 90 saakka.
 
81. Tutkimustulosten tulkinnassa olisi otettava huomioon kaikki saatavilla olevat 
tiedot kemikaalista, kuten fysikaalis-kemialliset, toksikokineettiset ja toksi ­
kodynaamiset ominaisuudet, saatavilla olevat asiaankuuluvat tiedot raken ­
teeltaan vastaavista aineista ja tulokset aikaisemmin tehdyistä myrkyllisyys ­
tutkimuksista, joissa on käytetty testikemikaalia (esim. välitön myrkyllisyys, myrkyllisyys toistuvan käsittelyn jälkeen, mekaaniset tutkimukset tai tutki ­
mukset, joissa arvioidaan, liittyykö metabolisiin ominaisuuksiin  in vivo/in 
vitro  huomattavia laadullisia ja määrällisiä lajikohtaisia eroja). Ruumiinava ­
usta ja elinten painoja koskevia tuloksia olisi arvioitava muiden toistuvilla annoksilla tehtyjen tutkimusten yhteydessä, kun tämä on mahdollista Poi ­
kasten kasvun hidastumista voidaan tarkastella suhteessa testikemikaalin 
maidon koostumukselle aiheuttamaan vaikutukseen (29).
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 882
 
Kohortti 2 (hermostonkehitykseen kohdistuva toksisuus)  
82. Hermostoperäisiä käyttäytymisoireita koskevia tuloksia olisi tulkittava kaik ­
kien löydösten yhteydessä käyttäen painoarvoanalyysiä ja 
asiantuntija-arviota. Käytöstä koskevia tai morfologisia löydöksiä, jos niitä on, sekä annosvasteita koskevaa näyttöä olisi käsiteltävä. Tähän olisi sisäl ­
lyttävä hermostonkehitykseen vaikuttavien myrkyllisyysvaikutuksien arvi ­
ointi, mukaan lukien ihmisen epidemiologiset tutkimukset tai tapausselos ­
tukset ja koe-eläimillä tehdyt tutkimukset (esim. toksikokineettiset tiedot, rakenne-aktiivisuustiedot, tiedot muista toksisuustutkimuksista). Tietojen ar ­
viointiin olisi sisällyttävä pohdinta biologisista ja tilastollisesta merkitykses ­
tä. Arviointiin pitäisi sisältyä havaittujen neuropatologisten ja käyttäytymi ­
seen liittyvien muutosten välinen mahdollinen suhde. Ohjeita hermostonke ­
hitykseen kohdistuvaa myrkyllisyysvaikutusta koskevien tulosten tulkinnasta esitetään testimenetelmässä B.53 (35) ja lähteessä Tyl et al., 2008 (31).
 
Kohortti 3 (Immuunijärjestelmän kehitykseen kohdistuva toksisuus)  
83. T-soluriippuvaisella vasta-ainevasteella (TDAR) arvioitavaa immuunitoimin ­
nan suppressiota tai tehostumista olisi arvioitava kaikkien tehtyjen havain ­
tojen yhteydessä. TDAR:in tulosten merkitsevyyttä voivat tukea muut vai ­
kutukset immunologisesti samankaltaisiin indikaattoreihin (kuten luuytimen 
solut, imukudosten paino ja histopatologia, lymforsyyttien alaryhmien jakau ­
tuminen). TDAR:in osoittamat vaikutukset voivat olla vähemmän merkitse ­
viä, jos alemmilla altistuspitoisuuksilla todetaan muita haittavaikutuksia.  
84. OECD:n ohjeasiakirjaa 43 olisi käytettävä lisääntymiseen ja hermostonkehi ­
tykseen kohdistuviin myrkyllisyysvaikutuksiin liittyvien tulosten tulkinnan apuna (26).
 
KIRJALLISUUSVIITTEET  
(1) Cooper, R.L., J.C. Lamb, S.M. Barlow, K. Bentley, A.M. Brady, N. Doerr, 
D.L. Eisenbrandt, P.A. Fenner-Crisp, R.N. Hines, L.F.H. Irvine, C.A. Kimmel, H. Koeter, A.A. Li, S.L. Makris, L.P. Sheets, G.J.A. Speijers 
and K.E. Whitby (2006), ‘A Tiered Approach to Life Stages Testing for 
Agricultural Chemical Safety Assessment’,  Critical Reviews in Toxicology , 
36, 69–98.
 
(2) Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, K.B. Ahlmark, J. Locklear, T. Spahr, G.F. 
Leviness, M.F. Goelz, J.K. Haseman, R.R. Newbold, and D.B. Forsythe (1999), ‘Phytoestrogen Content of Purified Open and Closed Formula Laboratory Animal Diets’,  Lab. Anim. Sci. , 49, 530–536.
 
(3) Zoetis, T. and I. Walls (2003), Principles and Practices for Direct Dosing 
of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, Washington, DC.
 
(4) Moser, V.C., I. Walls and T. Zoetis (2005), ‘Direct Dosing of Preweaning 
Rodents in Toxicity Testing and Research: Deliberations of an ILSI RSI Expert Working Group’, International Journal of Toxicology, 24, 87–94.
 
(5) Conolly, R.B., B.D. Beck, and J.I. Goodman (1999), ‘Stimulating Rese ­
arch to Improve the Scientific Basis of Risk Assessment’,  Toxicological 
Sciences , 49, 1–4.  
(6) Ulbrich, B. and A.K. Palmer (1995), ‘Detection of Effects on Male Rep ­
roduction — a Literature Survey’,  Journal of the American College of 
Toxicologists , 14, 293–327.  
(7) Mangelsdorf, I., J. Buschmann and B. Orthen (2003), ‘Some Aspects 
Relating to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility’,  
Regulatory Toxicology and Pharmacology , 37, 356–369.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 883
 
(8) Sakai, T., M. Takahashi, K. Mitsumori, K. Yasuhara, K. Kawashima, H. 
Mayahara and Y. Ohno (2000). ‘Collaborative work to evaluate toxicity on 
male reproductive organs by repeated dose studies in rats — overview of the studies’,  Journal of Toxicological Sciences , 25, 1–21.
 
(9) Creasy, D.M. (2003), ‘Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis 
and Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of To ­
xicologic Pathology’,  Birth Defects Research , Part B, 68, 408–415.  
(10) Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell and R.L. Cooper 
(2007), ‘The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology 
and its Utility in Toxicological Studies’,  Birth Defects Research , Part B, 
80 (2), 84–97.  
(11) Sadleir, R.M.F.S. (1979), ‘Cycles and Seasons’, in C.R. Auston and R.V. 
Short (eds.),  Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization , 
Cambridge, New York.  
(12) Gallavan, R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. Rey ­
nolds (1999), ‘Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in 
Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights’,  Reproductive Toxicology,  13: 383–390.
 
(13) Korenbrot, C.C., I.T. Huhtaniemi and R.I. Weiner (1977), ‘Preputial Se ­
paration as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat’,  
Biological Reproduction , 17, 298–303.  
(14) Ladics, G.S. (2007), ‘Use of SRBC Antibody Responses for Immunotoxi ­
city Testing’,  Methods , 41, 9–19.  
(15) Gore, E.R., J. Gower, E. Kurali, J.L. Sui, J. Bynum, D. Ennulat and D.J. 
Herzyk (2004), ‘Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemo ­
cyanin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation’,  Toxicology , 
197, 23–35.  
(16) Gray, L.E., J. Ostby, J. Ferrell, G. Rehnberg, R. Linder, R. Cooper, J. 
Goldman, V. Slott and J. Laskey (1989), ‘A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and 
Function in the Rat’,  Fundamental and Applied Toxicology , 12, 92–108.
 
(17) Robb, G.W., R.P. Amann and G.J. Killian (1978), ‘Daily Sperm Produc ­
tion and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats’,  Journal 
of Reproduction and Fertility ,54, 103–107.  
(18) Klinefelter, G.R., L.E. Jr Gray and J.D. Suarez (1991), ‘The Method of 
Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Fol ­
lowing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat’.  Reproduc ­
tive Toxicology ,5, 39–44.  
(19) Seed, J., R.E. Chapin, E.D. Clegg., L.A. Dostal, R.H. Foote, M.E. Hurtt, 
G.R. Klinefelter, S.L. Makris, S.D. Perreault, S. Schrader, D. Seyler, R. 
Sprando, K.A. Treinen, D.N. Veeramachaneni and L.D. Wise (1996), 
‘Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report’,  Reproductive Toxicology , 10, 
237–244.
 
(20) Chapin, R.E., R.S. Filler, D. Gulati, J.J. Heindel, D.F. Katz, C.A. Mebus, 
F. Obasaju, S.D. Perreault, S.R. Russell and S. Schrader (1992), ‘Methods for Assessing Rat Sperm Motility’,  Reproductive Toxicology , 6, 267–273.
 
(21) Klinefelter, G.R., N.L. Roberts and J.D. Suarez (1992), ‘Direct Effects of 
Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration’,  Journal of Andrology , 13, 409–421.  
(22) Slott, V.L., J.D. Suarez and S.D. Perreault (1991), ‘Rat Sperm Motility 
Analysis: Methodologic Considerations’,  Reproductive Toxicology , 5, 
449–458.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 884
 
(23) Slott, V.L., and S.D. Perreault (1993), ‘Computer-Assisted Sperm Analysis 
of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility 
Analyzer’,  Methods in Toxicology, Part A , Academic, Orlando, Florida. s. 
319–333.  
(24) Toth, G.P., J.A. Stober, E.J. Read, H. Zenick and M.K. Smith (1989), ‘The 
Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epi ­
chlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations’,  
Journal of Andrology , 10, 401–415.  
(25) Linder, R.E., L.F. Strader, V.L. Slott and J.D. Suarez (1992), ‘Endpoints 
of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants’,  Reproductive Toxicology , 6, 491–505.
 
(26) OECD (2008),  Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity 
Testing and Assessment , Series on Testing and Assessment, No. 43, 
ENV/JM/MONO(2008)16, OECD, Paris.  
(27) Working, P.K., M. Hurtt (1987), ‘Computerized Videomicrographic Ana ­
lysis of Rat Sperm Motility’,  Journal of Andrology , 8, 330–337.  
(28) Bolin, B., R. Garman, K. Jensen, G. Krinke, B. Stuart, and an ad Hoc 
Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee (2006), ‘A “Best Practices” Approach to Neuropathologic Assessment in 
Developmental Neurotoxicity Testing — for Today”,  Toxicological Patho ­
logy, 34, 296–313.
 
(29) Stütz, N., B. Bongiovanni, M. Rassetto, A. Ferri, A.M. Evangelista de 
Duffard, and R. Duffard (2006), ‘Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic 
Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of their Major Components’,  Food Chemicals Toxicology , 44, 8–16.
 
(30) Thigpen, JE, K.D.R. Setchell, J.K. Haseman, H.E. Saunders, G.F. Cavi ­
ness, G.E. Kissling, M.G. Grant and D.B. Forsythe (2007), ‘Variations in Phytoestrogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet Produces Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in 
CD-1 Mice and F344 Rats but not in CD Sprague Dawley Rats’,  Envi­
ronmental health perspectives,  115(12), 1717–1726.
 
(31) Tyl, R.W., K. Crofton, A. Moretto, V. Moser, L.P. Sheets and T.J. So ­
botka (2008), ‘Identification and Interpretation of Developmental Neuro ­
toxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute Expert Working Group on Neurodevelopmental Endpoints’,  Neu­
rotoxicology and Teratology , 30: 349–381.
 
(32) OECD (1996),  Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Repro ­
duction/Developmental Toxicity Screening Test , OECD Guideline for Tes ­
ting of Chemicals, No. 422, OECD, Paris.  
(33) Tämän liitteen B.43 luku, ”Neurotoksisuustutkimus jyrsijöillä”.  
(34) OECD (2000),  Guidance Document on the recognition, assessment, and 
use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations , Series on Testing and Assessment, No. 19, 
ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
(35) Tämän liitteen B.53 luku, ”Hermostonkehitykseen kohdistuvia myrkylli ­
syysvaikutuksia koskeva tutkimus”.  
(36) Tämän liitteen B.54 luku, ”Kohtuun aiheutuvien vaikutuksien biologinen 
määritysmenetelmä jyrsijöillä: lyhytaikainen seulontatesti estrogeenisista ominaisuuksista”
 
(37) Tämän liitteen B.55 luku, ”Rotilla tehtävä Hershbergerin biotesti: lyhytaikai ­
nen seulontatesti androgeenisista (antiandrogeenisista) ominaisuuksista”  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 885
 
(38) OECD (2009), Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine 
and Reproductive Test in Rodents, Series on Testing and Assessment, No. 
106, OECD, Paris.  
(39) OECD (2011), Guidance Document on the Current Implementation of 
Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Canada, Series on Testing and Assessment, No. 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OECD, Paris.
 
(40) OECD (2013), Guidance Document supporting TG 443: Extended One 
Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Assess ­
ment, No. 151, OECD, Paris.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 886
 
Lisäys 1  
Toimenpiteet ja havainnot, jotka sisältyvät toimintaa ja havainnointia koskevaan testiin 
(Kohortti 2A)  
Kotihäkissä ja avoimella kentällä Käsittely Fysiologia  
Asento Vaivaton siirtäminen Lämpötila 
Tahattomat kouristusliikkeet ja 
jäykkyys Vaivaton käsittely Ruumiinpaino 
Luomen sulkeutuminen Lihaskunto Pupillien vaste 
Karvojen jäykistyminen Lähestymiseen liittyvä vaste Pupillien koko Syljeneritys Kosketusvaste 
Kyyneleet Kuulovaste 
Ääntely Hännänpuristusvaste Tukeminen pystyyn Suoristusvaste Epätavallinen käynti Käpälän leviäminen pudo ­
tessa 
Herätysreaktio Eturaajan puristusvoima Kaavamainen liike Takaraajan puristusvoima Omituinen käyttäytyminen 
Laikut 
Epätavallinen hengitys
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 887
 
Lisäys 2  
MÄÄRITELMÄT:  
Kemikaali : aine tai aineiden seos.  
Testikemikaali : mikä tahansa aine tai seos, jota testataan käyttämällä tätä testi ­
menetelmää.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 888
 
B.57.  H295R-STEROIDOGENEESIÄ KOSKEVA TESTI  
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 456 (2011). OECD aloitti 
vuonna 1998 korkean prioriteetin toimenpiteet, jotta voimassa olevia testi ­
ohjeita tarkistetaan ja jotta kehitetään uusia ohjeita, joilla mahdollisia hor ­
monaalisia haitta-aiheita seulotaan ja testataan. Vuonna 2002 annettuihin hormonaalisten haitta-aineiden testausta ja arviointia koskeviin OECD:n 
käsitteellisiin puitteisiin (OECD Conceptual Framework for the Testing 
and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals) sisältyy viisi tasoa, joista kukin vastaa biologisen monimuotoisuuden eri tasoa (1). Tässä testi ­
menettelyssä kuvatussa H295R-steroidogeneesiä koskevassa testissä  in vitro , 
jäljempänä ’H295R-testi’, käytetään ihmisen adreno-karsinooma-solulinjaa 
(NCI-H295R-soluja). Kyseessä on tason 2  in vitro  -testi, jolla tarjotaan 
mekanistisia tietoja, joita käytetään seulontaa ja etusijajärjestystä varten. Testin kehittäminen ja standardointi steroidogeneesin kemiallisten vaikutus ­
ten seurantaan, erityisesti 17-beeta-estradiolin, jäljempänä ’E2’, ja testoste ­
ronin, jäljempänä ’T’, tuotannon osalta, toteutettiin monivaiheisessa proses ­
sissa. H295R-testiä on optimoitu ja se on validoitu (2)(3)(4)(5).
 
2. H295R-testin tavoitteena on havaita kemikaalit, jotka vaikuttavat E2:n ja 
T:n tuotantoon. H295R-testillä on tarkoitus tunnistaa vierasaineet, joiden 
kohteena ovat ne endogeeniset komponentit, jotka muodostavat solunsisäi ­
sen biokemiallisen reitin, joka alkaa reaktiosarjalla kolesterolista E2:n ja/tai T:n tuottamiseen. H295R-testillä ei ole tarkoitus tunnistaa kemikaaleja, jotka vaikuttavat steroidogeneesiin hypotalamusta, aivolisäkettä ja sukupuolirauh ­
asia koskevan akselin (HPG-akseli) vaikutusten vuoksi. Testin tavoitteena 
on antaa vastaukseksi KYLLÄ tai EI siihen, voiko kemikaali aiheuttaa tai estää T:n ja E2:n tuotannon. Joissain tapauksissa voidaan kuitenkin saada kvantitatiivisia tuloksia (ks. 53 ja 54 kohta) Testin tulokset ilmaistaan suh ­
teellisina muutoksina hormonituotantoon liuotinkontrolleihin verrattuna. 
Testillä ei pyritä tarjoamaan erityistä mekanistista tietoa testikemikaalin vuorovaikutuksesta umpieritysjärjestelmän kanssa. On tehty tutkimuksia, joissa solulinjoja käytetään havaitsemaan vaikutuksia tiettyihin entsyymei ­
hin ja reaktion välituotteina oleviin hormoneihin, kuten progesteroniin (2).
 
3. Tässä testimenetelmässä käytetyt määritelmät ja lyhenteet määritellään liit ­
teessä. Yksityiskohtainen testiprotokolla, johon sisältyvät tiedot siitä, miten 
valmistetaan liuoksia, viljellään soluja ja toteutetaan testin eri aspekteja, on saatavilla OECD:n asiakirjassa ‘Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol 
Production’ olevassa liitteessä I–III (4).
 
ALUSTAVAT NÄKÖKOHDAT JA RAJOITUKSET  
4. Sukupuolisteroidihormonien biosynteesiin liittyy viisi erilaista entsyymiä, 
jotka katalysoivat kuusi erilaista reaktiota. Kolesterolin entsymaattinen 
muuntaminen pregnonoloniksi sytokromin P450 (CYP) kolesterolin sivuket ­
jun pilkkovalla entsyymillä (CYP11A) muodostaa ensimmäisen vaiheen sarjassa biokemiallisia reaktioita, jotka johtavat steroidien lopputuotteiden 
synteesiin. Seuraavan kahden reaktion järjestyksestä riippuen steroidogee ­
ninen reitti jakaantuu kahteen reittiin, Δ
 5 -hydroksisteroidi-reittiin ja Δ 4 -ke­
tosteroidi-reittiin, jotka lähenevät toisiaan androsteenidionin tuottamiseksi (kuva 1).
 
5. Androstenedioni muunnetaan testosteroniksi 17 β-hydroksisteroididehydro ­
genaasin välityksellä (17 β-HSD). Testosteroni on reaktion välituotteena 
oleva hormoni ja lopputuote. Urosten osalta T voidaan muuntaa dihydro ­
testosteroniksi, jäljempänä ’DHT’, 5-alfareduktaasilla. Sitä on solukalvoissa, tumakotelossa ja androgeenien kohdekudosten, kuten eturauhasen ja rakku ­
larauhasten endoplasmakalvostoissa. DHT on huomattavasti vahvempi and ­
rogeeni kuin T ja sitä pidetään lopputuotteena olevana hormonina. H295R- 
testissä ei mitata DHT:tä (ks. 10 kohta).
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 889
 
6. Steroidogeenisen reitin entsyymi on aromataasi, jäljempänä ’CYP19’. Se 
muuntaa kemikaalit, joilla on androgeenivaikutus, kemikaaleiksi, joilla on 
estrogeenivaikutus. CYP19 muuntaa T:n 17 β-estradioliksi (E2) ja androste ­
nedionin estroniksi. E2:ta ja T:tä pidetään steroidogeneesin lopputuotteina.  
7. CYP17:n lyaasiaktiivisuuden spesifiys eroaa substraattina toimivien välitu ­
otteiden osalta lajien välillä. Ihmisellä entsyymi suosii Δ 5 -hydroksisteroidi- 
reitin substraatteja, kuten pregnenoloni, ja rotilla Δ 4 -ketosteroidi-reitin subst ­
raatteja, kuten progesteroni (19). Tällaiset erot CYP17:n lyaasiaktiivisuu ­
dessa voivat selittää eräät lajiriippuvaiset erot reaktiossa kemikaaleihin, jotka muuttavat steroidogeneesiä  in vivo  -olosuhteissa (6). H295-solujen 
on osoitettu vastaavan parhaiten aikuisen ihmisen lisämunaisen entsyymin 
ilmentymistä ja steroidituotannon kaavaa (20), mutta niiden tiedetään ilmen ­
tävän entsyymejä sekä Δ
 5 -hydroksisteroidi-reitillä että Δ 4 -ketosteroidi-reitillä 
androgeenisynteesiä varten (7)(11)(13)(15).  
Kuva 1  
Streoidogeeninen reitti H295R-soluissa
  
Huom.  
Entsyymit on kirjoitettu kursiivilla, hormonit on lihavoitu ja nuolet osoitta ­
vat synteesin suunnan. Harmaa tausta osoittaa kortikosteroidin reitit/tuotteet. 
Sukupuolisteroidireitit/tuotteet on ympyröity. CYP = sytokromi P450; HSD 
= hydroksisteroididehydrogenaasi; DHEA = dehydroepiandrosteroni.  
8. Ihmisen adreno-karsinooma-solulinja on hyödyllinen  in vitro  -malli, jolla 
selvitetään steroidihormonien synteesin vaikutuksia (2)(7)(8)(9)(10). H295R-solulinja ilmentää geenejä, jotka koodaavat kaikkia steroidogeneesin pääasiallisia entsyymejä, jotka on esitetty edellä (11)(15) (kuva 1). Tämä on 
ainutlaatuista, koska näiden geenien  in vivo  ilmiasu on kudos, ja se on 
kehitysvaihespesifinen, ja tavallisesti yhdessäkään kudoksessa tai kehitys ­
vaiheessa ei ilmene kaikkia steroidogeneesiin osallistuvia geenejä (2). H295R-soluilla on ihmisen sikiön erilaistumattomien lisämunuaissolujen fy ­
siologiset ominaisuudet (11). Nämä solut ovat ainutlaatuinen  in vitro  -jär­
jestelmä, koska niillä on mahdollista tuottaa kaikkia aikuisen lisämunuaisten kuoressa ja sukurauhasissa olevia steroidihormoneja. Niillä voidaan siten testata vaikutuksia kumpaankin kortikosteroidin synteesiin ja sukupuoliste ­
roidihormonien, kuten androgeenien ja estrogeenien tuotantoon, vaikka testi 
validoitiin ainoastaan T:n ja E2:n havainnointia varten. Testijärjestelmässä kirjatut muutokset, jotka liittyvät T:n ja E2:n tuotannon muutoksiin, voivat olla tulos testikemikaalien hyvin erilaisista vuorovaikutuksista steroidogee ­
nisten toimintojen kanssa, joita ilmentävät H295-solut. Näihin sisältyvät 
steroidihormonien tuotantoon, muuntamiseen tai poistamiseen osallistuvien
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 890
 
entsyymien ilmentymisen, synteesin tai toiminnan modulointi (12)(13)(14). 
Hormonituotannon inhibitio voi johtua suorasta kompetitiivisesta sitoutumi ­
sesta entsyymiin reitillä, kofaktoreiden, kuten NADPH:n (nikotiiniamidiade ­
niinidinukleotidifosfaatti) ja cAMP:in (syklinen adenosiinimonofosfaatti) vaikutuksesta ja/tai steroidiaineenvaihdunnan lisääntymisestä taikka tiettyjen 
entsyymien geenien ilmentymisen vaimenemisesta steroidogeneesiä koske ­
valla reitillä. Vaikka inhibitio voi olla hormonituotannon suoraan ja epä ­
suoraan prosesseihin liittyvä toiminta, induktio liittyy siihen tyypillisesti epäsuorasti, eli se vaikuttaa kofaktoreiden, kuten NADPH:n ja cAMP:n 
välityksellä (kuten forskoliinin tapauksessa), steroidiaineenvaihduntaa alen ­
tamalla (13) ja/tai se voi johtaa steroidogeenisen geenin ilmentymän ylös ­
säätymiseen.
 
9. H295R-testillä on useita etuja:  
— sillä voidaan havaita T:n ja E2:n tuotannon lisääntyminen ja vähenty ­
minen  
— sen perusteella voidaan arvioida suoraan kemikaalin mahdollista vaiku ­
tusta solujen elinkykyyn/sytotoksisuuteen. Tämä on tärkeä seikka, koska 
tällä voidaan todeta ero sytotokisuudesta johtuvien vaikutusten ja niiden vaikutusten välillä, jotka johtuvat suorasta vuorovaikutuksesta kemikaa ­
leihin, joilla on steroidogeeninen reitti. Tämä ei ole mahdollista kudos ­
ten eksplanttien järjestelmissä, jotka koostuvat useista solutyypeistä, 
joiden herkkyys ja toiminta vaihtelevat
 
— se ei edellytä eläinten käyttöä  
— H295R-solulinja on saatavissa kaupallisesti.  
10. Testin pääasialliset rajoitukset ovat seuraavat:  
— sen metabolointikyky on tuntematon, mutta se on luultavasti melko 
rajallinen; tästä syystä kemikaalit, jotka edellyttävät metabolista akti ­
vointia, jätetään todennäköisesti pois tästä testistä  
— koska H295R on peräisin lisämunuaisen kudoksesta, siinä on entsyy ­
mejä, jotka voivat tuottaa gluko- ja mineraalikortikoideja sekä sukupuo ­
lihormoneja; tästä syystä gluko- ja mineraalikortikoiden tuotannon vai ­
kutus voi vaikuttaa testissä havaittavaan T:n ja E2:n tasoon  
— sillä ei mitata DHT:tä ja tästä syystä ei oleteta, että sillä havaitaan 
kemikaaleja, jotka estävät 5-alfa-reduktaasin, missä tapauksessa voidaan 
käyttää Hershbergerin testiä (16)  
— H295R-testillä ei tunnisteta kemikaaleja, jotka häiritsevät steroidogenee ­
siä vaikuttamalla hypotalamusta, aivolisäkettä ja sukupuolirauhasia kos ­
kevaan akseliin (HPG-akseli), koska tätä voidaan tutkia ainoastaan leik ­
kaamattomilla eläimillä.  
TESTIN PERIAATE  
11. Testin tarkoituksena on havaita kemikaalit, jotka vaikuttavat T:n ja E2:n 
tuotantoon. Testosteroni on myös reaktion välituote E2:n tuotantoreitillä. 
Tällä testillä voidaan havaita kemikaalit, jotka yleensä inhiboivat tai indu ­
soivat stereidogeneesin reitin entsyymejä.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 891
 
12. Testi tehdään yleensä vakiomuotoisissa soluviljelyolosuhteissa käyttämällä 
24-kuoppalevyjä. Testin suorittamiseen voidaan käyttää vaihtoehtoisesti 
muita levykokoja; istutusta ja koeolosuhteita olisi kuitenkin vastaavasti mu ­
kautettava, jotta suorituskriteereitä noudatetaan.  
13. Soluja sopeutetaan monikuoppalevyillä 24 tunnin ajan, jonka jälkeen ne 
altistetaan 48 tunnin ajan testikemikaalin seitsemälle pitoisuudelle ainakin 
kolmena näytekappaleena. Liuotinta sekä hormonituotannon tunnettua inhi ­
biittoria ja indusoijaa käytetään vakiokonsentraatiossa negatiivisena ja posi ­
tiivisena kontrollina. Altistusjakson jälkeen kasvatusliuos poistetaan kusta ­
kin kuopasta. Kunkin kuopan solujen elinkykyä analysoidaan välittömästi 
kasvatusliuoksen poistamisen jälkeen. Hormonipitoisuus kasvatusliuoksessa voidaan mitata käyttäen erilaisia menetelmiä, kuten kaupallisesti saatavilla olevia hormonimittaussarjoja ja/tai instrumenttitekniikoita, kuten 
nestekromatografiaa-massaspektrometriaa (LC-MS). Tiedot ilmaistaan ker ­
rannaismuutoksena suhteessa liuotinkontrolliin ja alhaisimman havaittavan vaikutuksen aiheuttavaan pitoisuuteen (LOEC). Jos testi on negatiivinen, korkein testattu pitoisuus ilmoitetaan pitoisuutena, joka ei aiheuta havaitta ­
vaa vaikutusta (NOEC). Päätelmän siitä, vaikuttaako kemikaali steroidoge ­
neesiin, olisi perustuttava vähintään kahteen toisistaan riippumattomaan tes ­
tiin. Ensimmäinen testi voi olla haarukointitesti, jonka jälkeen pitoisuuksia mukautetaan tarvittaessa toista ja kolmatta testiajoa varten, jos havaitaan 
liukoisuutta tai sytotoksisuutta koskevia ongelmia tai jos kemikaalin aktii ­
visuus vaikuttaa olevan testattavien pitoisuuksien sarjan loppupäässä.
 
VILJELMÄÄ KOSKEVA MENETTELY  
Solulinja  
14. NCI-H295R-solut ovat kaupallisesti saatavilla American Type Culture Col ­
lections -organisaatiolta (ATCC) materiaalin siirtosopimuksen allekirjoitta ­
misen jälkeen (  1 ). 
Johdanto  
15. Koska E2:n kapasiteetti tuottaa soluja muuttuu iän/pasaasien myötä (2), 
solut olisi viljeltävä erityisen menetelmän perusteella, ennen kuin niitä käy ­
tetään. Samalla olisi kirjattava pasaasinumero (jakamiskertojen määrä), sen 
jälkeen kun solut sulatetaan, sekä pasaasinumero, jolloin solut pakastettiin ja säilöttiin nestemäiseen typpeen. Ensimmäinen numero osoittaa todellisen solun pasaasin numeron ja toinen numero sen pasaasin numeron, jolloin 
solut pakastettiin ja säilöttiin. Esimerkiksi solut, jotka pakastettiin pasaasin 
viisi jälkeen ja sulatettiin ja jaettiin sen jälkeen kolme kertaa (4 jakamis ­
kertaa, jolloin juuri sulatetut solut lasketaan jakamiskerraksi 1), ennen kuin ne viljeltiin uudelleen, merkittäisiin pasaasinumerolla 4.5. Numerointijärjes ­
telmää koskeva esimerkki sisältyy validointiraportin liitteeseen I (4).
 
16. Kasvatusliuoksen kantaliuosta käytetään pohjana lopulliselle kasvatusliu ­
okselle ja pakastusliuokselle. Lopullinen kasvatusliuos on tarpeellinen kom ­
ponentti solujen viljelyssä. Pakastusliuos on suunniteltu niin, että solut voi ­
daan pakastaa ilman, että niille aiheutuu vaikutuksia pitkän aikavälin varas ­
toinnista. Seeruminkorviketta (Nu-serum) (tai vastaavaa seerumia, jolla on samanlaiset ominaisuudet ja jonka on osoitettu tuottavan tietoa, joka on testin suoritusta ja laadunvalvontaa koskevien edellytysten mukainen), 
joka on lopullisen kasvatusliuoksen ainesosa, olisi analysoitava ennen käyt ­
töä T:n ja E2:n taustapitoisuuksien osalta. Näiden liuosten valmistusta ku ­
vataan validointiraportin liitteessä II (4).
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 892  
( 1 ) ATCC CRL-2128; ATCC, Manassas, VA, Yhdysvallat [http://www.lgcstandards- 
atcc.org/].
 17. Sen jälkeen, kun alkuperäisen ATCC-sarjan H295R-soluviljelmä otetaan 
käyttöön, soluja olisi kasvatettava viiden pasaasin ajan (eli solut jaetaan 
neljä kertaa). Pasaasin viisi solut pakastetaan nestemäiseen typpeen varas ­
tointia varten. Ennen kuin solut pakastetaan, näyte edellisen pasaasin 4 soluista tehdään laadunvalvontalevyllä (ks. 36 ja 37 kohta), jotta varmiste ­
taan, täyttävätkö hormonien perustuotanto ja positiivisen kontrollin kemi ­
kaalien vaste taulukossa 5 määritellyt testin laadunvalvontakriteerit.
 
18. H295R-solut on viljeltävä, pakastettava ja säilytettävä nestemäisessä types ­
sä, jotta varmistetaan, että viljelyä ja käyttöä varten on aina pasaasiltaan ja iältään asianmukaisia soluja. Pasaasien enimmäismäärä sen jälkeen, kun viljelyyn on otettua uusien (
 1 ) tai pakastettujen (  2 ) solujen erä, jonka käyttö 
H295R-testissä on hyväksyttävää, ei saisi ylittää 10 kertaa. Esimerkiksi 
hyväksyttävä jakamiskerta pakastetusta erästä peräisin olevien solujen vil ­
jelmälle jakamiskerralla 5 olisi 4.5 aina jakamiskertaan 10.5 saakka. Näistä pakastetuista eristä kasvatettavien solujen osalta olisi noudatettava 19 koh ­
dassa kuvattua menetelmää. Nämä solut olisi viljeltävä vielä ainakin neljän 
(4) pasaasin ajan (pasaasinumero 4.5), ennen kuin niitä käytetään testaukseen.
 
Pakastetusta varastosta peräisin olevat kasvatettavat solut  
19. Pakastetusta erästä kasvatettavia soluja koskevaa menettelyä käytetään, kun 
uusi erä soluja poistetaan nestemäisen typen varastosta viljelyä ja testausta 
varten. Tämän menettelyn yksityiskohtia kuvataan validointiraportin liit ­
teessä III (4). Solut siirretään nestemäisen typen varastosta, ne sulatetaan nopeasti, sijoitetaan sentrifugiputkeen lopulliseen kasvatusliuokseen, sentri ­
fugoidaan huoneenlämmössä, suspensoidaan jälleen lopulliseen kasvatusliu ­
okseen ja siirretään soluviljelypulloon. Kasvatusliuos pitäisi vaihtaa seuraa ­
vana päivänä. H295R-soluja kasvatetaan inkubaattorissa 37 °C:ssa ja ilman seoksessa johon sisältyy 5 % CO
 2 :ta normaali-ilmanpaineessa. Kasvatusli ­
uos vaihdetaan 2–3 kertaa viikossa. Kun solujen konfluenssi on noin 85–90 
%, niiden pitäisi jakautua. Solujen jakaminen on tarpeen, jotta solujen ter ­
veys ja kasvu varmistetaan ja jotta niitä ylläpidetään biotestien suorittamista varten. Solut huuhdellaan kolme kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliu ­
oksella (PBS, ilman Ca
 2+ Mg 2+ ) ja irrotetaan soluviljelypullosta lisäämällä 
asianmukaista irrottamiseen tarkoitettua entsyymiä, esimerkiksi trypsiiniä, PBS:ään (ilman Ca
 2+ Mg 2+ ). Välittömästi sen jälkeen kun solut irtoavat 
soluviljelypullosta, entsyymien toiminta olisi päätettävä lisäämällä lopullista 
kasvatusliuosta suhteessa 3 × entsyymikäsittelyyn käytetty tilavuus. Solut 
sijoitetaan sentrifugiputkeen, sentrifugoidaan huoneenlämmössä, superna ­
tantti poistetaan ja solupelletti resuspensoidaan lopulliseen kasvatusliu ­
okseen. Asianmukainen määrä soluliuosta sijoitetaan uuteen soluviljelypul ­
loon. Soluliuoksen määrää olisi mukautettava, jotta solut ovat konfluentteja 
5–7 päivän kuluessa. Suositeltu jatkoviljelmien suhde on 1:3–1:4. Levy olisi merkittävä huolellisesti. Soluja voidaan sen jälkeen käyttää testissä ja yli ­
määräiset solut voidaan pakastaa nestemäiseen typpeen 20 kohdassa tarkoi ­
tetulla tavalla.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 893  
( 1 ) Uudella erällä tarkoitetaan ATCC:lta vastaanotettua uutta soluerää. 
( 2 ) Pakastetulla erällä tarkoitetaan soluja, joita on viljelty aikaisemmin ja joita on sen jälkeen 
pakastettu laboratoriossa, joka ei ole ATCC.
 H295R-solujen pakastaminen (solujen valmistelu nestemäiseen typpeen 
varastointia varten)  
20. H295R-solujen pakastamisen valmistelemiseksi olisi noudatettava edellä esi ­
tettyä solujen jakamista koskevaa menettelyä siihen vaiheeseen saakka, että solupelletti resuspendoidaan sentrifugiputken pohjaan. Tämän jälkeen sol ­
upelletti resuspendoidaan pakastusliuokseen. Liuos siirretään kryogeeniseen 
pulloon, se merkitään asianmukaisesti ja jäädytetään – 80 °C:een 24 tun ­
niksi, jonka jälkeen kryogeeninen pullo siirretään nestemäiseen typpiin va ­
rastointia varten. Tämän menettelyn yksityiskohtia kuvataan validointirapor ­
tin liitteessä III (4).
 
Levyt ja solujen esi-inkubointi  
21. Edellä 19 kohdassa tarkoitetulla tavalla käsiteltyjen 24-kuoppalevyjen tar ­
vittava määrä riippuu testattavien kemikaalien määrästä ja viljelyyn käytet ­
tyihin astioihin sisältyvien solujen konfluenssista. Pääsääntöisesti yksi solu ­
viljelypullo (75 cm  2 ) soluja, joiden konfluenssi on 80–90 %, tuottaa tar ­
peeksi soluja yhdestä puolelletoista levylle (24-kuoppalevy), ja tavoitetiheys 
on 200 000–300 000 solua millilitrassa, mikä johtaa arviolta 50–60 % konf ­
luenssiin kuopissa 24 tunnin viljelyn aikana (kuva 2). Tämä on tyypillisesti optimaalinen solutiheys hormonin tuottamiseksi testissä. Korkeammilla ti ­
heysasteilla T:n ja E2:n tuotantotapaa muutetaan. Ennen kuin testi tehdään 
ensimmäisen kerran, suositellaan, että erilaisia istutustiheyksiä (200 000–300 000 solua millilitraa kohti) testataan ja että näin kuopissa 24 tunnin viljelyn aikana aikaansaatu 50–60 % konfluenssi valitaan lisäko ­
keita varten.
 
Kuva 2  
Mikrovalokuva H295R-soluista istutustiheydellä 50 % 24-kuoppalevyllä 24 tunnin 
viljelyn jälkeen otettuna kuopan laidalta (A) ja keskeltä (B)
  
22. Kasvatusliuos poistetaan pipetillä soluviljelypullosta ja solut huuhdellaan 3 
kertaa steriilillä PBS:llä (ilman Ca  2+ Mg 2+ ). Entsyymiliuosta (joka on sekoi ­
tettu PBS:ään) lisätään, jotta solut irtoavat soluviljelypullosta. Sopivan ajan 
kuluttua siitä, kun solut irtoavat, entsyymien toiminta olisi päätettävä lisää ­
mällä lopullista kasvatusliuosta suhteessa 3 × entsyymikäsittelyyn käytetty tilavuus. Solut sijoitetaan sentrifugiputkeen, sentrifugoidaan huoneenläm ­
mössä, supernatantti poistetaan ja solupelletti suspensoidaan jälleen 
lopulliseen kasvatusliuokseen. Solutiheys lasketaan käyttäen esimerkiksi 
hemosytometriä tai solulaskijaa. Soluliuosta olisi laimennettava haluttuun
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 894
 
levytiheyteen ja sekoitettava huolellisesti, jotta homogeeninen solutiheys 
varmistetaan. Solut päällystetään 1 millilitralla soluliuosta kuoppaa kohti, 
ja levyt ja kuopat merkitään. Istutetut levyt inkuboidaan 37 °C:ssa ja ilman seoksessa, johon sisältyy 5 % CO
 2 :ta normaali-ilmanpaineessa, 24 tunnin 
ajan, jotta solut voivat kiinnittyä kuoppiin.  
LAADUVALVONTAA KOSKEVAT EDELLYTYKSET  
23. On tärkeää, että kuoppiin asetetaan annostuksen aikana liuoksia ja näytteitä 
tarkka määrä, koska nämä määrät määrittävät pitoisuudet, joita käytetään testitulosten laskennassa.
 
24. Kunkin laboratorion olisi osoitettava hormonimittausjärjestelmänsä herkkyys 
ennen soluviljelmän aloittamista ja sitä seuraavia testejä (29–31 kohta).  
25. Jos käytetään vasta-aineisiin perustuvia hormonin mittaustestejä, testattavia 
kemikaaleja olisi analysoitava sen perusteella, mikä on niiden potentiaali häiritä T:n ja E2:n määrän selvittämiseen käytettävää mittausjärjestelmää 
(siten kuin se esitetään 32 kohdassa) ennen testauksen aloittamista.
 
26. Testiliuottimeksi suositellaan DMSO:ta. Jos käytetään muuta liuotinta, olisi 
määriteltävä seuraava:  
— testikemikaalin, forskoliinin ja prokloratsin liukoisuus liuottimessa, ja  
— sytotoksisuus liuottimen pitoisuuden funktiona.  
On suositeltavaa, että suurinta sallittua liuottimen pitoisuutta ei ylitetä niin, 
että se on laimennusaineena olevan vähiten sytotoksisen liuottimen pitoi ­
suutta yli kymmenen kertaa suurempi.  
27. Ennen kuin testi tehdään ensimmäisen kerran, laboratorion olisi tehtävä 
soveltuvuutta koskeva koe, jossa osoitetaan, että laboratorio pystyy ylläpi ­
tämään ja luomaan asianmukaisen soluviljelmän ja testiolosuhteet, joita edellytetään 33–35 kohdassa tarkoitettua kemikaalin testausta varten.
 
28. Kun testi aloitetaan käyttäen uutta erää, ennen uuden solujen erän käyttä ­
mistä olisi käytettävä apuna kontrollikuoppalevyä, jolla arvioidaan solujen tehokkuutta, kuten kuvataan 36 ja 37 kohdassa.
 
Hormonien mittausjärjestelmän tehokkuus  
Menetelmän herkkyys, tarkkuus, täsmällisyys ja ristireaktiivisuus näytemat ­
riisin kanssa  
29. Kukin laboratorio voi käyttää valitsemaansa hormonien mittausjärjestelmää 
analysoimaan H295R-solujen tuottamaa T:tä ja E2:ta niin kauan, kuin se 
täyttää suorituskykyä koskevat kriteerit, kuten määritysrajan. Nämä ovat tavanomaisesti T:n osalta 100 pg/ml ja E2:n osalta 10 pg/ml, ja ne perus ­
tuvat validointitutkimuksissa havaittuihin hormonin perustasoihin. Kuitenkin 
korkeammat tai alemmat tasot voivat olla asianmukaisia riippuen testin 
suorittavan laboratorioiden saavuttamista hormonien perustasoista. Ennen kuin laadunvalvontalevy tutkitaan ja testiajot suoritetaan, laboratorion olisi osoitettava, että käytettävällä hormonitestillä voidaan mitata hormonien pi ­
toisuuksia lopullisessa kasvatusliuoksessa tarpeeksi tarkasti ja täsmällisesti 
siten, että testi täyttää taulukossa 1 ja 5 eritellyt laadunvalvontakriteerit, ja
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 895
 
se analysoi kasvatusliuosta, johon on lisätty kontrollihormoni. Lopulliseen 
kasvatusliuokseen lisätään ainakin kolme pitoisuutta kustakin hormonista 
(eli 100, 500 ja 2 500 pg/ml testosteronia; 10, 50 ja 250 pg/ml E2:ta; tai alhaisimpia mahdollisia pitoisuuksia, jotka perustuvat valitun hormonin mit ­
tausjärjestelmän havaitsemisrajoihin, voidaan käyttää T:n ja E2:n alhaisim ­
pia lisättäviä pitoisuuksia varten) ja ne analysoidaan. Näytteiden, joita ei ole 
uutettu, mitattujen hormonipitoisuuksien olisi oltava alle 30 % nimellisistä pitoisuuksista, ja vaihtelu saman näytteen toisten mittauksien osalta ei saisi ylittää 25:tä prosenttia (ks. myös taulukko 8 täydentävistä laadunvalvontak ­
riteereistä). Jos nämä laadunvalvontakriteerit täytetään, oletetaan, että valittu 
hormonien mittausta koskeva testi on riittävän tarkka, täsmällinen ja että se ei reagoi ristiin viljelynesteen komponenttien (näytematriisi) kanssa niin, että voidaan olettaa, että sillä vaikutetaan merkittävästi kokeen tulokseen. 
Tässä tapauksessa näytteitä ei tarvitse uuttaa ennen hormonien mittausta.
 
30. Jos taulukoissa 1 ja 8 olevat laadunvalvontakriteerit eivät täyty, voi esiintyä 
merkittävää matriisivaikutusta, ja olisi tehtävä koe uutetulla kasvatusliu ­
oksella, johon on lisätty kontrollihormoni. Uuttamista koskevaan menette ­
lyyn liittyvä esimerkki sisältyy validointiraportin liitteeseen II (4). Uutettu ­
jen näytteiden hormonipitoisuuksien mittauksia olisi tehtävä kolme (  1 ). Jos 
voidaan osoittaa, että kasvatusliuoksen komponentit eivät häiritse uuttami ­
sen jälkeen hormonien havaitsemista koskevaa menettelyä, joka määritellään laadunvalvontakriteereissä, kaikki muut kokeet olisi tehtävä käyttäen uutet ­
tuja näytteitä. Jos laadunvalvontakriteerejä ei voida täyttää uuttamisen jäl ­
keen, käytetty hormonien mittausjärjestelmä ei sovellu H295R-testin tavoit ­
teita varten. Tässä tapauksessa olisi käytettävä toista hormonien havaitse ­
mista koskevaa menettelyä.
 
Standardikäyrä  
31. Liuotinkontrollin hormonipitoisuuksien olisi oltava standardikäyrän lineaa ­
risen mittausalueen puitteissa. Liuotinkontrollin arvojen pitäisi olla mie ­
luummin lineaarisen mittausalueen keskiosassa, jotta varmistetaan, että hor ­
monisynteesin induktio ja inhibitio voidaan mitata. Mitattavat kasvatusliu ­
oksen laimennokset (tai uutokset) valitaan tämän mukaisesti. Lineaarinen 
suhde määritellään sopivalla tilastollisella lähestymistavalla.  
Kemikaalin interferenssiä koskeva testi  
32. Jos vasta-aineisiin perustuvia testejä, kuten entsyymivälitteisiä immunosor ­
benttimäärityksiä (ELISA-testit) ja radioimmunoanalyysejä käytetään mittaa ­
maan hormoneja, kutakin kemikaalia olisi testattava sen osalta, häiritseekö 
se mahdollisesti hormonin mittausjärjestelmää, jota käytetään, ennen kuin varsinainen kemikaalien testaus aloitetaan (validointiraportin lisäys III (4)), koska jotkut kemikaalit voivat häiritä näitä testejä (17). Jos esiintyy inter ­
ferenssiä, jonka vaikutus testosteronin ja/tai E2:n hormonin perustuotannon 
osalta on ≥ 20 %, kaikkien testikemikaalien kantaliuoksen laimennoksista 
olisi tehtävä testi, jossa arvioidaan, häiritseekö kemikaali hormonituotantoa
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 896  
( 1 ) Huom.  Jos edellytetään ekstratktiota, kutakin ekstraktiota varten tehdään kolme rinnak ­
kaista mittausta. Kukin näyte otetaan vain kerran.
 (Chemical Hormone Assay Interference Test) (kuten testi, jota kuvataan 
validointiraportin liitteessä III (4) olevassa 5.0 kohdassa), ja tunnistettava 
raja-annos, joka aiheuttaa merkittävän interferenssin ( ≥ 20 %). Jos interfe ­
renssi on alle 30 %, tuloksia voidaan korjata interferenssin osalta. Jos se on yli 30 %, tiedot eivät ole päteviä, ja näitä pitoisuuksia koskevat tiedot on 
hylättävä. Jos testikemikaali aiheuttaa merkittävää interferenssiä hormoni ­
mittausjärjestelmässä enemmän kuin yhdessä ei-sytotoksisessa pitoisuudes ­
sa, olisi käytettävä erilaista hormonimittausjärjestelmää. Jotta kemikaaliepä ­
puhtauksien aiheuttama interferenssi vältetään, suositellaan, että hormonit 
uutetaan kasvatusliuoksesta sopivaa liuotinta käyttäen. Validointiraportissa 
esitetään mahdollisia menetelmiä (4).
 
Taulukko 1  
Hormonien mittausjärjestelmien suorituskriteerit  
Parametri Kriteeri  
Mittausmenetelmän herkkyys Määritysraja 
T: 100 pg/ml; E2: 10 pg/ml (  a ) 
Hormonien uuttamistehokkuus (ai ­
noastaan silloin, kun uuttamista tar ­
vitaan) Keskimääräinen talteenotto (perus ­
tuen kolmen näytekappaleen toimen ­
piteisiin) hormonimäärien, johon on lisätty ainetta, osalta ei saisi poiketa 
yli 30:tä % määrästä, joka lisättiin. 
Kemikaalien aiheuttama interfe ­
renssi (ainoastaan vasta-aineisiin 
perustuvat järjestelmät) Ei merkittävää ( ≥ 30 % kyseisen hor ­
monin perustuotannosta) ristireaktii ­
visuutta minkään solujen tuottaman 
hormonin kanssa (
 b ) ( c ) 
( a ) Huom.  Mittausmenetelmän rajat perustuvat taulukossa 5 annetun hormonin perus ­
tuotannon arvoihin ja ne ovat tulosperusteiset. Jos voidaan saada aikaan laajempi 
hormonin perustuotanto, raja voi olla laajempi. 
( b ) Jotkut T:n vasta-aineet voivat reagoida ristiin androstendionin ja E2:n vasta-aineet 
estronin kanssa, jolloin prosenttiosuus on suurempi. Tällaisissa tapauksissa ei ole 
mahdollista määrittää tarkasti vaikutuksia 17 β-hydroksisteroididehydrogenaasille. 
Näillä tiedoilla voidaan kuitenkin tarjota hyödyllistä tietoa estrogeenin ja andro ­
geenin tuotannon vaikutuksista yleensä. Tällaisissa tapauksissa tiedot olisi il ­
maistava androgeenivasteena tai estrogeenivasteena E2:n ja T:n sijasta. 
( c ) Näihin sisältyvät: kolesteroli, pregnenoloni, progesteroni, 11-deoksikortikosteroni, 
kortikosteroni, aldosteroni, 17-alfa-pregnenoloni, 17-alfa-progesteroni, deoksikor ­
tisoli, kortisoli, DHEA, androsteenidioni, estroni.  
Laboratorion pätevyyttä koskeva testi  
33. Laboratorion olisi osoitettava ennen tuntemattomien kemikaalien testausta, 
että se voi luoda ja ylläpitää asianmukaista soluviljelmää ja testiolosuhteita, 
joita tarvitaan testin onnistuneeseen suorittamiseen, tekemällä laboratorion pätevyyttä koskevan testin. Koska testin suorittaminen liittyy suoraan testin suorittavan laboratorion henkilöstöön, näitä menettelyjä olisi toistettava osit ­
tain, jos laboratorion henkilöstössä tapahtuu muutoksia.
 
34. Tämä pätevyyttä mittaava testi suoritetaan samoissa olosuhteissa, jotka on 
esitetty 38–40 kohdassa, niin että solut altistetaan seitsemälle kasvavalle 
pitoisuudelle voimakkaita, kohtalaisen voimakkaita ja heikkoja induktoreja 
ja inhibiittoreita sekä negatiiviselle kemikaalille (ks. taulukko 2). Testatta ­
viin kemikaaleihin sisältyvät erityisesti voimakas induktori forskoliini (CAS-nro 66575-29-9); voimakas inhibiittori prokloratsi (CAS-nro 67747- 
09-5) kohtalaisen voimakas induktori atratsiini (CAS-nro 1912-24-9) koh ­
talaisen voimakas inhibiittori aminoglutetimidi (CAS-nro 125-84-8); heikko
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 897
 
induktori (E2:n tuotanto) ja heikko inhibiittori (T:n tuotanto) bisfenoli A 
(CAS-nro 80-05-7) ja negatiivinen kemikaali istukkagonadotropiini (hCG) 
(CAS-nro 9002-61-3), kuten esitetään taulukossa 2. Erillisillä levyillä teh ­
dään testiajo kaikista kemikaalista käyttäen taulukossa 6 esitettyä muotoa. Yksi laadunvalvontalevy (taulukko 4, 36–37 kohta) olisi sisällytettävä jo ­
kaiseen päivittäiseen testiajoon pätevyyden osoittamiseen tarkoitettuja kemi ­
kaaleja varten.
 
Taulukko 2  
Pätevyyden osoittamiseen tarkoitetut kemikaalit ja altistuspitoisuudet  
Pätevyyden osoittamiseen 
tarkoitettu kemikaali Testin pitoisuudet ( μM) 
Prokloratsi 0 (  a ), 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 
Forskoliini 0 (  a ), 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 
Atratsiini 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
Aminoglutetimidi 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
Bisfenoli A 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
HCG 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100  
( a ) Liuotinkontrolli (DMSO) (0), 1 μl DMSO/kuoppa.  
H295R:n altistaminen pätevyyden osoittamiseen tarkoitetuille kemikaaleille 
olisi tehtävä 24-kuoppalevyllä laboratorion pätevyyttä koskevan testin aika ­
na. Annosteluyksikkö on μM kaikissa testikemikaalin annoksissa. Annokset 
olisi annosteltava DMSO:hon 0,1 % v/v kuoppaa kohti. Kaikkia testipitoi ­
suuksia olisi testattava kolmessa eri kuopassa (taulukko 6). Kustakin kemi ­
kaalista tehdään testiajo erillisellä levyllä. Kuhunkin päivittäiseen testiajoon 
sisältyy yksi laadunvalvontalevy.  
35. Solujen elinkykyä ja hormoneja koskevat analyysit olisi suoritettava siten 
kuin 42–46 kohdassa esitetään. Raja-arvo (alhaisin havaittavan vaikutuksen 
aiheuttava pitoisuus, LOEC) ja luokittelu olisi ilmoitettava ja sitä olisi ver ­
rattava taulukossa 3 esitettyihin arvoihin. Tietoja pidetään hyväksyttävinä, jos niissä noudatetaan LOEC-arvoja ja luokittelupäätöstä, joka esitetään taulukossa 3.
 
Taulukko 3  
Raja-arvot (LOEC-arvot) ja pätevyyden osoittamiseen tarkoitettuja kemikaaleja koskeva 
luokittelupäätös  
CAS-nro LOEC (μM) Luokittelupäätös 
T E2 T E2  
Prokloratsi 67747-09-5 ≤ 0,1 ≤ 1,0 + (  v ) (inhibitio) + (inhibitio) 
Forskoliini 66575-29-9 ≤ 10 ≤ 0,1 + (induktio) + (induktio) 
Atratsiini 1912-24-9 ≤ 100 ≤ 10 + (induktio) + (induktio) 
Aminogluteti ­
midi 125-84-8 ≤ 100 ≤ 100 + (inhibitio) + (inhibitio)  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 898
 
CAS-nro LOEC (μM) Luokittelupäätös 
T E2 T E2  
Bisfenoli A 80-05-7 ≤ 10 ≤ 10 + (inhibitio) + (induktio) 
HCG 9002-61-3 ei so ­
velleta ei so­
velleta negatiivinen negatiivinen  
( v ) +, positiivinen 
ei sovelleta: Ei sovelleta, koska mitään muutoksia ei pitäisi tapahtua negatiivisen kontrollin ei-sytotoksisille 
pitoisuuksille altistamisen jälkeen.  
Laadunvalvontalevy  
36. Laadunvalvontalevyä käytetään varmistamaan H295R-solujen toiminta va ­
kiomuotoisissa soluviljelyolosuhteissa ja laatimaan määritystiedot hormoni ­
pitoisuuksille liuotinkontrolleissa, positiivisissa ja negatiivisissa kontrol ­
leissa sekä ajan mittaan suoritettavissa muissa laadunvalvontatoimissa.  
— H295R-solujen tehokkuutta olisi testattava käyttämällä laadunvalvonta ­
levyä kustakin uudesta ATCC-erästä, tai sen jälkeen, kun aikaisemmin 
pakastettuja soluja käytetään ensimmäisen kerran, ellei tälle soluerälle ole tehty laboratorion pätevyyttä koskevaa testiajoa (32–34 kohta).
 
— Laadunvalvontalevyllä tehdään täydellinen arviointi testiolosuhteista 
(kuten solujen elinkyky, liuotinkontrollit, negatiiviset ja positiiviset kontrollit sekä testin sisäinen ja testien välinen vaihtelu) kemikaaleja 
testattaessa, ja sen pitäisi sisältyä kuhunkin testiajoon.
 
37. Laadunvalvontatesti tehdään 24-kuoppalevyllä. Sen osalta noudatetaan sa ­
maa inkubointia, annostusta, solujen elinkykyä/sytotoksisuutta, hormonien 
uuttamista ja hormonien analyysiä koskevia menettelyitä, joita kuvattiin 
testikemikaalien osalta 38–46 kohdassa. Laadunvalvontalevyyn sisältyy pelkkää kasvatusliuosta sisältäviä kohtia, liuotinkontrolleja ja kaksi pitoi ­
suutta tunnettua E2:n ja T:n synteesin induktoria (forskoliini, 1 ja 10 μM) 
ja inhibiittoria (prokloratsi, 0,1 ja 1 μM). Lisäksi MeOH:ia käytetään vali ­
tuissa kuopissa positiivisena kontrollina elinkykyä/sytotoksisuutta koske ­
vassa testissä. Yksityiskohtainen kuvaus levyn asettelusta esitetään taulu ­
kossa 4. Laadunvalvontalevyn osalta täytettävät kriteerit luetellaan taulu ­
kossa 5. Hormonin perustuotannon vähimmäismäärä T:n ja E2:n osalta olisi 
täytettävä liuotinkontrollikuopissa ja nollakoekuopissa.
 
Taulukko 4  
Laadunvalvontalevyn asettelu, jossa testataan altistamattomien H295R-solujen toimintaa 
ja tunnetuille E2:n ja T:n tuotannon inhibiittoreille (PRO = prokloratsi) ja 
stimulaattoreille (FOR = forskoliini) altistettuja soluja. Alistamiskokeen päätyttyä ja kasvatusliuoksen poiston jälkeen kaikkiin MeOH-kuoppiin lisätään 70 % metanoliliuosta positiivisena kontrollina sytotoksisuudelle (ks. sytotoksisuutta koskeva 
koe, validointiraportin lisäys III (4))
 
1 2 3 4 5 6  
A Nollako ­
e ( a ) Nollako­
e ( a ) Nollako­
e ( a ) Nollakoe (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Nollakoe (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Nollakoe (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) 
B DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 899
 
1 2 3 4 5 6  
C FOR 1 
μM FOR 1 
μM FOR 1 
μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM 
D FOR 10 
μM FOR 10 
μM FOR 10 
μM PRO 1 μM PRO 1 μM PRO 1 μM 
( a ) Nollakokeen kuoppiin sisältyy pelkästään kasvatusliuosta (eli ei liuotinta). 
( b ) Metanoli (MeOH) lisätään altistuksen jälkeen, ja kasvatusliuos poistetaan näistä kuopista. 
( c ) DMSO-liuotinkontrolli (1 μl/kuoppa).  
Taulukko 5  
Laadunvalvontalevyn suorituskriteerit  
T E2  
Hormonin perustuotanto 
liuotinkontrollissa ≥ 5 kertaa määritys ­
raja ≥ 2,5 kertaa määritys ­
raja 
Induktio (10 μM fors­
koliini) ≥ 1,5 kertaa liuotin ­
kontrolli ≥ 7,5 kertaa liuotin ­
kontrolli 
Inhibitio (1 μM proklo ­
ratsi) ≤ 0,5 kertaa liuotin ­
kontrolli ≤ 0,5 kertaa liuotin ­
kontrolli  
KEMIKAALIALTISTUSTA KOSKEVA MENETTELY  
38. Esi-inkuboinnin jälkeen solut otetaan pois inkubaattorista (21 kohta) ja niitä 
tarkastellaan mikroskoopilla. Tarkoitus on varmistaa, että ne ovat hyvässä 
kunnossa (kiinnittyminen, morfologia) ennen annostelua.  
39. Solut sijoitetaan biosuojakaappiin, lopullinen kasvatusliuos poistetaan ja 
korvataan uudella lopullisella kasvatusliuoksella (1 ml/kuoppa). DMSO:ta 
pidetään parhaana liuottimena tätä testimenetelmää varten. Jos on syitä 
käyttää muita liuottimia, tieteellisiä perusteita olisi selvitettävä. Solut altis ­
tetaan testikemikaalille lisäämällä 1 μl asianmukaista kantaliuosta 
DMSO:hon (ks. validointiraportin lisäys II (4)) 1 ml lopullista kasvatusliu ­
osta kohti (kuopan tilavuus). Tämän perusteella DMSO:n lopullinen pitoi ­
suus kuopissa on 0,1 %. Riittävän sekoituksen varmistamiseksi yleensä pi ­
detään etusijaisena, että testikemikaalin asianmukaista kantaliuosta DMSO:ssa sekoitetaan lopullisen kasvatusliuoksen kanssa, jotta kunkin an ­
noksen osalta saadaan haluttu lopullinen pitoisuus, ja että seos lisätään 
kuhunkin kuoppaan välittömästi vanhan lopullisen kasvatusliuoksen poista ­
misen jälkeen. Jos tätä vaihtoehtoa käytetään, DMSO:n pitoisuuden (0,1 %) pitäisi pysyä tasaisena kaikissa kuopissa. Kuoppia, joihin sisältyy kaksi 
suurinta pitoisuutta, arvioidaan visuaalisesti saostumien tai sameuden muo ­
dostumisen osalta. Tämä on merkki siitä, että testikemikaalin liukoisuus on puutteellista. Arvioinnissa käytetään binokulaariluuppia. Jos tällaisia olosuh ­
teita (saostumat, sameuden muodostumat) havaitaan, tutkitaan myös kuopat, 
joihin sisältyy alempia pitoisuuksia (ja niin edelleen), ja pitoisuudet, jotka 
eivät täysin liuenneet liuokseen, poistetaan myöhemmistä arvioinneista ja analyyseistä. Levy siirretään jälleen inkubaattoriin 37
 o C:een ja ilman se ­
okseen, johon sisältyy 5 % CO  2 :ta normaali-ilmanpaineessa, 48 tunnin ajak ­
si. Testikemikaalin levyn asettelu esitetään taulukossa 6. Kantaliuokset 1–7 
osoittavat testikemikaalin annoksien kasvavan määrän sijainnin.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 900
 
Taulukko 6  
Annostelukaava H295R-solujen altistamiselle testikemikaaleilla 24-kuoppalevyllä  
1 2 3 4 5 6  
A DMSO DMSO DMSO Kantaliuos 
4 Kantaliuos 
4 Kantaliuos 
4 
B Kantaliuos 1 Kantaliuos 1 Kantaliuos 1 Kantaliuos 
5 Kantaliuos 
5 Kantaliuos 
5 
C Kantaliuos 2 Kantaliuos 2 Kantaliuos 2 Kantaliuos 
6 Kantaliuos 
6 Kantaliuos 
6 
D Kantaliuos 3 Kantaliuos 3 Kantaliuos 3 Kantaliuos 
7 Kantaliuos 
7 Kantaliuos 
7 
40. Altistukseen käytetyt levyt poistetaan inkubaattorista 48 tunnin jälkeen ja 
jokainen levy tutkitaan mikroskoopilla solujen kunnon (kiinnittyminen, 
morfologia, solutiheys) ja sytotoksisuutta koskevien merkkien osalta. Kun ­
kin kuopan kasvatusliuos jaetaan kahteen yhtä suureen annokseen (kukin noin 490 μl) ja siirretään kahteen erilliseen asianmukaisesti merkittyyn pul ­
loon (eli yhtenä eränä, jotta kutakin kuoppaa varten tarjotaan ylimääräinen 
näyte). Kasvatusliuos poistetaan solujen kuivumisen estämiseksi vaaka- tai 
pystyrivi kerrallaan ja korvataan kasvatusliuoksella, joka on tarkoitettu solun elinkykyä/sytotoksisuutta koskevaan testiin. Jos solun elinkykyä/syto ­
toksisuutta ei mitata välittömästi, kuhunkin kuoppaan lisätään 200 μl 
PBS:ää, johon sisältyy Ca
 2+ ja Mg  2+ . Kasvatusliuokset pakastetaan – 
80 °C:een jatkokäsittelyyn, jossa analysoidaan hormonien pitoisuuksia (ks. 44–46 kohta). Kasvatusliuoksessa – 80 °C:een pakastettu T ja E2 pysyy yleensä vakaana ainakin kolme kuukautta, ja kussakin laboratoriossa olisi 
dokumentoitava hormonien vakautta varastoinnin aikana.
 
41. Välittömästi kasvatusliuoksesta poistamisen jälkeen kunkin altistukseen käy ­
tetyn levyn solujen elinkyky/sytotoksisuus arvioidaan.  
Solujen elinkyvyn määrittäminen  
42. Solujen elinkykyä/sytotoksisuutta koskevaa testiä voidaan käyttää määrittä ­
mään testikemikaalin potentiaalinen vaikutus solujen elinkykyyn. Testillä pitäisi pystyä tarjoamaan todellinen järjestelmä kuopassa olevien elinkykyis ­
ten solujen (elävien solujen) prosenttiosuuden määrittämiseksi, tai sillä pi ­
täisi osoittaa, että se on suoraan verrattavissa Live/Dead®-testiin (sen line ­
aariseen funktioon) (ks. validointiraportin lisäys III (4)). Vaihtoehtoinen testi, jonka on osoitettu toimivan yhtä hyvin, on MTT-testi (3-(4,5-dimetyy ­
litiatsoli-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi-testi) (18). Solujen elinky ­
vyn (elävien solujen) arviointi edellä esitettyjä menetelmiä soveltamalla on 
suhteellinen mittaus, joka ei välttämättä osoita lineaarisia suhteita kuopan solujen absoluuttisen määrän kanssa. Tästä syystä analyysin suorittajan olisi tehtävä samanaikainen subjektiivinen silmämääräinen arvio kustakin kuo ­
pasta. Liuotinkontrolleista ja kahdesta suurimmasta ei-sytotoksisesta pitoi ­
suudesta olisi otettava digitaalikuvia ja ne olisi arkistoitava, jotta myöhem ­
min voidaan arvioida todellista solutiheyttä, jos tätä edellytetään. Jos silmä ­
määräinen arvio tai elinkykyyn/sytotoksisuutta koskeva testi osoittaa, että 
solujen määrä on nähtävästi lisääntynyt, tämä on tarkistettava. Jos solujen 
määrän lisääntyminen tarkistetaan, tämä olisi mainittava tutkimusselostees ­
sa. Solujen elinkyky ilmaistaan suhteessa liuotinkontrollien keskimääräiseen vasteeseen, missä elinkykyisten (elävien) solujen osuus on 100 %. Tämä 
lasketaan tarvittaessa käytettyä solujen elinkykyä/sytotoksisuutta koskevaa 
testiä varten. MTT-testin osalta voidaan käyttää seuraavaa kaavaa:
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 901
 
% elinkykyisiä (eläviä) soluja =  (vaste kuopassa – keskimääräinen 
MeOH-käsitellyssä (= 100 % kuolleita) kuopissa) ÷ (keskimääräinen vaste 
liuotinkontrollin kuopissa – keskimääräinen vaste MeOH-käsitellyissä (= 100 % kuolleita) kuopissa)
 
43. Kuoppia, joissa elävien solujen osuus on 80 % alhaisempi kuin liuotinkont ­
rollin kuoppien keskimääräinen elinkyky (= 100 % eläviä soluja), ei pitäisi sisällyttää lopulliseen tietojen analyysiin. Steroidogeneesin inhibitiota, jota 
esiintyy, kun sytotoksisuus on lähes 20 %, olisi arvioitava huolellisesti, jotta 
varmistetaan, ettei sytotoksisuus ole syy inhibitioon.
 
Hormonien analyysi  
44. Kukin laboratorio voi käyttää valitsemaansa hormonien mittausjärjestelmää 
T:n ja E2:n analyysiin. Kasvatusliuoksen ylimääräisiä eriä kustakin koeryh ­
mästä voidaan käyttää valmistelemaan laimennoksia, jotta pitoisuus saadaan 
sisällytettyä standardikäyrän lineaarisen osan puitteisiin. Kuten 29 kohdassa todettiin, kaikkien laboratorion olisi osoitettava, että niiden hormonimitta ­
ukseen käytetty järjestelmä (kuten ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) täyt ­
tää laadunvalvontakriteerit siten, että siinä analysoidaan lopullista kasvatus ­
liuosta — johon on lisätty kontrollihormoni –, ennen kuin laadunvalvontaa koskevat testiajot tai kemikaalien testaus suoritetaan. Jotta varmistetaan, että testijärjestelmän komponentit eivät häiritse hormonimittausta, hormonit voi ­
daan joutua uuttamaan kasvatusliuoksesta ennen mittausta (ks. 30 kohta 
olosuhteista, joiden vallitessa siirtoa edellytetään tai sitä ei edellytetä). On suositeltavaa, että uuttaminen suoritetaan validointiraportin liitteessä III (4) tarkoitettuja menettelyitä noudattaen.
 
45. Jos hormonituotannon mittaukseen käytetään kaupallista testipakkausta, hor ­
monianalyysi olisi suoritettava testipakkauksen valmistajan antaman käsi ­
kirjan mukaisesti. Useimmilla valmistajilla on oma menettely, jolla hormo ­
nianalyysit suoritetaan. Näytteiden laimennoksia on muutettava niin, että liuotinkontrollin odotettavissa olevat hormonipitoisuudet sijoittuvat yksittäi ­
sen testin standardikäyrän lineaarisen mittausalueen keskelle (validointira ­
portin lisäys III (4)). Standardikäyrän lineaarisen mittausalueen ulkopuolella olevat arvot olisi hylättävä.
 
46. Lopulliset hormonipitoisuudet lasketaan seuraavasti:  
Esimerkki: 
Uutettu: 450 μl kasvatusliuosta 
Sekoitetaan määrään: 250 μl testin puskuriainetta 
Laimennus testissä: 1:10 (näyte tuodaan standardikäyrän li ­
neaarisen mittausalueen sisälle) 
Hormonien pitoisuus testissä: 150 pg/ml (on jo mukautettu pitoisuu ­
teen ml testattua näytettä kohti) 
Talteenotto: 89 % Lopullinen hormonipitoisuus = (Hormonipitoisuus (ml kohti) ÷ talteen ­
otto) (laimennustekijä) 
Lopullinen hormonipitoisuus = (150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 
10 = 936,3 pg/ml
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 902
 
Testipitoisuuksien valinta  
47. Olisi tehtävä ainakin kaksi toisistaan riippumatonta testiajoa. Ellei ennak ­
koon saatavilla olevissa tiedoissa, jotka liittyvät esimerkiksi 
liukoisuusraja-arvoihin tai sytotoksisuuteen, tarjota perustaa testipitoisuuk ­
sien valinnalle, suositellaan, että ensimmäisen testiajon testipitoisuudet si ­
joitetaan logaritmisin välein log  10 , jossa 10  –3 M on maksimipitoisuus. Jos 
kemikaali liukenee ja se ei ole sytotoksinen missään testatussa pitoisuudessa 
ja ensimmäinen testiajo oli kaikkien pitoisuuksien osalta negatiivinen, tämä tulisi vahvistaa vielä yhdessä testiajossa soveltaen samoja edellytyksiä kuin ensimmäisessä testiajossa (taulukko 7). Jos ensimmäisen testiajon tulokset 
ovat epävarmoja  (eli kerrannaismuutos on tilastollisesti merkitsevä liuotin ­
kontrolliin nähden ainoastaan yhdessä pitoisuudessa) tai positiivinen (eli kerrannaismuutos kahdessa tai useammassa vierekkäisessä pitoisuudessa on tilastollisesti merkittävä), testi olisi toistettava taulukossa 7 esitetyllä 
tavalla mukauttamalla valittuja testipitoisuuksia. Testipitoisuuksia testia ­
joissa kaksi ja kolme (jos ne tehdään) olisi mukautettava ensimmäisen testi ­
ajon sellaisten näytepitoisuuksien perusteella, jotka aiheuttivat vaikutuksia puolen log:n pitoisuusvälejä käyttämällä (eli jos alkuperäinen testiajo pitoi ­
suuksilla 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1 000 μM johti induktioihin 1 ja 10 
μM käsittelypitoisuuksilla, toisella testiajolla testattavien pitoisuuksien olisi 
oltava 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 μM), ellei alempia pitoisuuksia pidä 
käyttää alhaisimman havaittavan vaikutuksen aiheuttavan pitoisuuden saa ­
vuttamiseksi. Jälkimmäisessä tapauksessa ainakin viittä pitoisuutta, jotka 
alittavat ensimmäisessä testiajossa testatun alimman pitoisuuden, olisi käy ­
tettävä toisessa testiajossa käyttäen puolen log:n välejä. Jos toisessa testi ­
ajossa ei vahvisteta ensimmäistä testiajoa (eli tilastollista merkitsevyyttä ei 
esiinny aikaisemmin positiiviseksi testatussa pitoisuudessa ± 1 pitoisuuden 
lisäys), kolmas koe voidaan suorittaa käyttäen alkuperäisiä testiolosuhteita. Epäselviä tuloksia ensimmäisessä testiajossa pidetään negatiivisina, jos ha ­
vaittua vaikutusta ei voida vahvistaa missään kahdessa peräkkäisessä testi ­
ajossa. Epäselviä tuloksia pidetään positiivisina vasteina (vaikutus), kun 
vaste voidaan vahvistaa ainakin yhdessä muussa testiajossa, jossa on ± 1 pitoisuuden lisäys (ks. 55 kohta tietojen tulkintaa koskevan menettelyn 
osalta)
 
Taulukko 7  
Päätösmatriisi mahdollisille tuloksia koskeville skenaarioille  
Testiajo 1 Testiajo 2 Testiajo 3 Päätös 
Skenaario Päätös Skenaario Päätös Skenaario Myönteinen Kielteinen  
Negatiivinen Vahvista (  a ) Negatiivinen Lopeta X 
Negatiivinen Vahvista (  a ) Positiivinen Tarkenna (  b ) Negatii ­
vinen X 
Epäselvä (  c ) Tarkenna (  b ) Negatiivinen Vahvista (  a ) Negatii ­
vinen X 
Epäselvä (  c ) Tarkenna (  b ) Negatiivinen Vahvista (  a ) Positiivi ­
nen X 
Epäselvä (  c ) Tarkenna (  b ) Positiivinen X 
Positiivinen Tarkenna (  b ) Negatiivinen Vahvista (  a ) Positiivi ­
nen X ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 903
 
Testiajo 1 Testiajo 2 Testiajo 3 Päätös 
Skenaario Päätös Skenaario Päätös Skenaario Myönteinen Kielteinen  
Negatiivinen Vahvista (  b ) Positiivinen Tarkenna (  b ) Positiivi ­
nen X 
Positiivinen Tarkenna (  b ) Positiivinen Lopeta X  
( a ) Vahvista edellinen testiajo käyttämällä samaa koesuunnittelua. 
( b ) Tee uusi testiajo käyttäen puolen login pitoisuusvälejä (ryhmitä pitoisuudet, joiden testi erosi huomattavasti edellisessä 
kokeessa). 
( c ) Kerrannaismuutos yhdessä pitoisuudessa poikkeaa tilastollisesti merkitsevästi liuotinkontrollista.  
Laadunvalvonta testilevyllä  
48. Sen lisäksi, että laadunvalvontalevyn kriteerit täyttyvät, muut laadunvalvon ­
takriteerit, jotka koskevat hyväksyttävää vaihtelua rinnakkaisten levyjen vä ­
lillä, rinnakkaisia kokeita, hormonien mittausjärjestelmien lineaarisuutta ja herkkyyttä, samaa näytettä koskevien rinnakkaisten hormonien mittausten vaihtelua ja hormonilisäyksien talteenottoprosenttia kasvatusliuoksen uutta ­
misen jälkeen (jos tämä tehdään, katso 30 kohta uuttamista koskevista vaa ­
timuksista), olisi täytettävä, ja ne esitetään taulukossa 8. Tietojen pitäisi sopia hyväksyttäviin vertailuväleihin, jotka määritellään kutakin sellaista parametria kohden, jota tarkastellaan täydentävää arviointia varten. Jos 
nämä kriteerit eivät täyty, taulukossa olisi todettava, että kyseinen näyte 
ei täytä laadunvalvontakriteerejä, ja näytettä olisi analysoitava uudelleen tai se olisi poistettava tietokokonaisuudesta.
 
Taulukko 8  
Hyväksyttävät vertailuvälit ja/tai vaihtelu (%) H295R-testin testilevyn 
parametreja varten.  
LOQ: hormonien mittausjärjestelmän määritysraja. CV: variaatiokerroin; SC: 
liuotinkontrolli; DPM: hajoaminen minuuttia kohti (disintegration per 
minute)  
Vertailu välillä T E2  
Hormonin perustuotanto 
liuotinkontrollissa Kertaväli suurempi kuin 
LOQ ≥ 5-kertainen ≥ 2,5-kertainen 
Altistuskokeet — levyllä, 
variaatiokerroin liuotin ­
kontrolleja varten (rinnak ­
kaiset levyt) Absoluuttiset pitoisuudet ≤ 30 % ≤ 30 % 
Altistuskokeet — levyjen 
välillä, variaatiokerroin liuotinkontrolleja varten (toistetut kokeet) Kerrannaismuutos ≤ 30 % ≤ 30 % 
Hormonien mittausmene ­
telmän herkkyys Liuotinkontrolliin liittyvä 
havaittavissa oleva kerta ­
vähennys ≥ 5-kertainen ≥ 2,5-kertainen 
Hormonien mittausmene ­
telmä — toistetut toimenpi ­
teet, variaatiokerroin liotin ­
kontrolleja varten (
 a ) Absoluuttiset pitoisuudet ≤ 25 % ≤ 25 % 
Kasvatusliuoksen uuttami ­
nen — sisäisen 3H-standar ­
din uudelleenkäyttö (jos sovelletaan) DPM ≥ 65 % nimellinen
 
( a ) Viittaa samaa näytettä koskeviin toistettuihin toimenpiteisiin.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 904
 
TIETOJEN ANALYSOINTI JA RAPORTOINTI  
Tietojen analysointi  
49. Kemiallisesti muunnetun hormonintuotannon suhteellisen lisäyksen/vähen ­
nyksen arvioimiseksi tuloksia olisi normalisoitava kunkin testilevyn liuotin ­
kontrollin keskiarvoon nähden, ja tulokset olisi ilmaistava muutoksena suh ­
teessa liuotinkontrolliin kullakin testilevyllä. Kaikki tiedot ilmaistaan keski ­
määräisenä ± 1 keskihajontana.  
50. Ainoastaan hormonitiedot kuopista, joissa sytotoksisuus on alle 20 %, pi ­
täisi sisällyttää tietojen analysointiin. Suhteelliset muutokset lasketaan seuraavasti:
 
Suhteellinen muutos =  (hormonien pitoisuus kussakin kuopassa) ÷ (keski ­
määräinen hormonipitoisuus kaikissa liuotinkontrollin kuopissa).  
51. Jos kuopan silmämääräinen tutkimus tai 42 kohdassa kuvattu elinkykyä/sy ­
totoksisuutta koskeva testi osoittaa, että solujen määrä on nähtävästi lisään ­
tynyt, tämä on tarkistettava. Jos solujen määrän lisääntyminen tarkistetaan, tämä olisi mainittava tutkimusselosteessa.
 
52. Ennen tilastoanalyysien tekoa oletuksia normaalisuudesta ja varianssien ho ­
mogeenisuudesta olisi arvioitava. Normaalisuutta olisi arvioitava käyttä ­
mällä tavallisia todennäköisyyskuvioita tai muita asianmukaisia tilastotie ­
teellisiä menetelmiä (kuten Shapiron-Wilkin testi). Jos tiedot (kertamuutok ­
set) eivät jakaudu normaalisti, tietoja olisi pyrittävä mukauttamaan lähelle 
normaalia jakaumaa. Jos tiedot jakautuvat normaalisti tai ovat lähellä nor ­
maalia jakaumaa, kemikaalipitoisuutta koskevien ryhmien ja liuotinkontrol ­
lien välisiä eroja olisi analysoitava käyttämällä parametrista testiä (kuten Dunnettin testiä), jossa  pitoisuus  on riippumaton muuttuja ja  vaste  (kerta­
muutos) on riippuva muuttuja. Jos tiedot eivät jakaudu normaalisti, olisi 
käytettävä asianmukaista ei-parametrista testiä (kuten Kruskal Wallis -testiä, Steel's Many-one rank -testiä) Eroja pidetään merkitsevinä, kun  p ≤ 0,05. 
Tilastollisia arviointeja tehdään kunkin kuopan keskimääräisten arvojen pe ­
rusteella. Ne edustavat riippumattomia kaksoismääritettyjä datapisteitä. On 
odotettavissa, että ensimmäisen testiajon annosten suuren välin (log
 10 -as­
teikko) vuoksi monissa tapauksissa ei ole mahdollista määritellä selvää pitoisuus-vaste-suhdetta, jossa kaksi suurinta annosta on sigmoidikäyrän 
lineaarisessa osassa. Tästä syystä ensimmäisessä testiajossa tai kaikissa 
muissa tietojen kartoitustoimissa, missä tämä olosuhde esiintyy (eli missä ei voida arvioida suurinta tehokkuutta), sovelletaan edellä mainitut tyypin 1 kiinteitä muuttujia koskevia tilastotietoja.
 
53. Jos enemmän kuin kaksi datapistettä on käyrän lineaarisessa osassa ja jos 
suurin tehokkuus voidaan laskea — kuten on odotettavissa joissakin toisissa testiajoissa, jotka suoritetaan käyttäen puolen login pitoisuusvälejä — to ­
dellisten pitoisuuksien laskentaan olisi käytettävä probitti- tai logittimallia 
taikka muuta asiaankuuluvaa regressiomallia (kuten EC50 ja EC20).
 
54. Tulokset olisi annettava graafisessa (pylväskuvaajat edustavat keskiarvoa 
+/– 1 keskihajonta) ja taulukkomuodossa (LOEC/NOEC, vaikutuksen suunta ja suurimman vasteen voimakkuus, joka kuuluu tietojen annos-vasteosaan) (ks. esimerkkiä varten kuva 3) Tietojen arviointia pide ­
tään pätevänä ainoastaan, jos se perustuu ainakin kahteen toisistaan riippu ­
mattomasti suoritettuun testiajoon. Testiä tai testiajoa pidetään riippumatto ­
man, jos se on suoritettu eri päivänä käyttäen uudenlaisia liuoksia ja kont ­
rollia. Testiajossa 2 ja 3 (tarvittaessa) käytettyjen pitoisuuksien mittausalu ­
etta voidaan suunnitella ja toteuttaa testiajon 1 tulosten perusteella, jotta 
määritellään paremmin LOEC:in sisältämä annos-vaste-alue (ks. 47 kohta).
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 905
 
Kuva 3  
Esimerkki H295R-testin suorittamisen aikana saatujen tietojen esittämisestä ja arvioinnista graafisessa ja 
taulukkomuodossa.  
Asteriskit osoittavat tilastollisesti merkittävät erot liuotinkontrolliin nähden ( p < 0,05). LOEC: alhaisin 
havaittavan vaikutuksen aiheuttava pitoisuus; Maksimimuutos: missä tahansa pitoisuudessa havaitun vasteen 
suurin vahvuus verrattuna keskimääräiseen liuotinkontrollin vasteeseen (= 1)
  
Chemical LOEC Max Change  
Forskolin 0,01 0,15 fold 
Letrozole 0,001 29 fold  
Tietojen tulkintaa koskeva menettely  
55. Testikemikaalia pidetään positiivisena, jos koetoiminnan suhde kontrolliin 
on tilastollisesti erilainen ( p ≤ 0,05) liuotinkontrolliin nähden kahden vie ­
rekkäisen pitoisuuden osalta ainakin kahdessa toisistaan riippumattomassa testiajossa (taulukko 7). Testikemikaalia pidetään negatiivisena kahden riip ­
pumattoman negatiivisen testiajon perusteella, tai kolmen testiajon perus ­
teella, jos kaksi niistä on negatiivista ja yksi epäselvä tai positiivinen. Jos 
kolmessa riippumattomassa kokeessa saadut tiedot eivät täytä taulukossa 7 lueteltuja päätöskriteereitä, koetulokset eivät ole tulkittavissa. Tuloksia, joissa pitoisuudet ylittävät liukoisuusrajat tai solumyrkyllisyyspitoisuuden 
rajat, ei pitäisi sisällyttää tulosten tulkintaan.
 
Tutkimusseloste  
56. Tutkimusselosteessa on annettava seuraavat tiedot:  
Testauslaitos  
— laitoksen nimi ja sijainti  
— tutkimusjohtaja ja muu henkilöstö ja heidän tutkimusta koskevat vastuu ­
alueensa  
— testin alku- ja päättymispäivä  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 906
 
Testikemikaali, reagenssit ja kontrollit  
— testikemikaalin, reagenssien ja kontrollien tunnistetiedot (nimi/CAS-nro 
tarvittaessa) lähde, erän/annoksen numero, puhtaus, toimittaja ja kuvaus  
— testikemikaalin fysikaalinen olomuoto ja asiaankuuluvat fysikokemialli ­
set ominaisuudet  
— varastointiolosuhteet ja testikemikaalien, reagenssien ja kontrollien val ­
mistuksen menettely ja valmistustiheys  
— testikemikaalin stabiilius.  
Solut  
— solujen lähde ja tyyppi  
— testissä käytettyjen solujen pasaasinumerot (solujen jakamiskerran tun ­
niste)  
— soluviljelmien ylläpitoa koskevien menettelyiden kuvaus.SEQ>  
Vaatimukset ennen testiä (jos sovelletaan)  
— testin, jossa arvioidaan, häiritseekö kemikaali hormonituotantoa (Chemi ­
cal Hormone Assay Interference Test), kuvaus ja siitä saadut tulokset  
— hormonien uuton tehokkuutta koskevien toimenpiteiden kuvaus ja tulok ­
set 
— standardikäyrät ja kalibrointikäyrät kaikille toteutettaville analyyttisille 
määrityksille  
— valittujen analyyttisten määritysten määritysrajat.  
Testiolosuhteet:  
— kasvatusliuoksien koostumus  
— testikemikaalin pitoisuus  
— solutiheys (arvioidut ja mitatut solutiheydet 24 tunnin ja 48 tunnin 
välein)  
— testikemikaalin liukoisuus (liukoisuusraja, jos se määritetään)  
— inkubointiaika ja -olosuhteet.  
Testin tulokset  
— käsittelemättömät tiedot kustakin kontrollin ja testikemikaalin kuopasta 
— kaikki toiset toimet, jotka esitetään alkuperäistiedoissa, jotka saadaan 
hormonintuotannon mittaamiseen käytetyllä välineellä (esim. optinen 
tiheys, fluoresenssiyksiköt, hajoaminen minuuttia kohti)  
— normaalisuuden validointi tai selvitys tietojen muunnoksesta  
— keskimääräiset vasteet +/– 1 keskihajonta, kutakin mitattua kuoppaa 
kohti  
— sytotoksisuustiedot (testipitoisuudet, jotka aiheuttavat sytotoksisuutta)  
— vahvistus siitä, että laadunvalvontavaatimukset täytettiin  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 907
 
— suhteellinen muutos verrattuna liuotinkontrolliin, jota on korjattu syto ­
toksisuuden osalta  
— pylväskuvaaja, joka osoittaa suhteen (kerrannaismuutos) kussakin pitoi ­
suudessa, keskihajonnan ja tilastollisen merkityksen, kuten esitettiin 
49–54 kohdassa.  
Tietojen tulkinta  
— sovella tietojen tulkintaa koskeva menettelyä tuloksiin ja käsittele 
havaintoja.  
Pohdinta  
— käykö tutkimuksesta ilmi mahdollisuus, että gluko- ja mineraalikortikoi ­
deja koskevien reittien epäsuorat vaikutukset ovat voineet vaikuttaa 
T/E2-tietoihin?  
Päätelmät  
KIRJALLISUUSVIITTEET  
(1) OECD (2002), OECD:n hormonaalisten haitta-aineiden testausta ja arvi ­
ointia koskevat käsitteelliset puitteet (OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals), tämän 
liitteen B.54 luvussa oleva lisäys 2.
 
(2) Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., Wu, 
R. and Giesy, J.P. (2006), Human adrenocarcinoma (H295R) cells for 
rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone pro ­
duction,  Toxicol. Appl. Pharmacol.,  217, 114–124.  
(3) Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., 
Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., and Giesy, J. P. (2007), The OECD validation program of the H295R steroidgenesis 
assay for the identification of in vitro inhibitors or inducers of testosterone 
and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies.  
Env. Sci. Pollut. Res ., 14, 23–30.
 
(4) OECD (2010),  Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis 
Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production , 
OECD Series of Testing and Assessment No. 132, ENV/JM/MO ­
NO(2010)31, Paris. Available at [http://www.oecd.org/docu ­
ment/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_ 1_1_1,00.html]  
(5) OECD (2010),  Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for 
Steroidogenesis,  OECD Series of Testing and Assessment No. 133, 
ENV/JM/MONO(2010)32, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/docu ­
ment/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_ 1_1_1,00.html]  
(6) Battelle (2005), Detailed Review Paper on Steroidogenesis, Available at: 
[http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_fi ­
nal_3_29_05.pdf]  
(7) Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., 
Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S. and Giesy, J. P. (2004), 
Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Steroi ­
dogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR,  Toxicol. 
Sci., 81, 78–89.  
(8) Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. and Van den Berg, M. 
(2002), Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells,  
Toxicol. Appl. Pharmacol.,  182, 44–54.
 
(9) Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M. and Conolly, R.B. 
(2010), Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to 
predict biochemical response to endocrine-active chemicals: Model deve ­
lopment for metyrapone,  Environ. Health Perspect.,  118: 265–272.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 908
 
(10) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Assessment of chemical effects on aromatase activity using the H295R cell 
line, Environ. Sci. Poll. Res.,  17:1137–1148.  
(11) Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., 
Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. and La Rocca, R. V. (1990), Establishment and characterization of a human adrenocorti ­
cal carcinoma cell line that expresses Multiple pathways of steroid bio ­
synthesis,  Cancer Res.,  50, 5488–5496.
 
(12) He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, 
M.G., Martin, J.W. and Giesy, J.P. (2010), Ozonation attenuates the ste ­
roidogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water in 
the H295R cell line,  Chemosphere,  80:578–584.  
(13) Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., 
Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. and Giesy, J.P. (2005), Quantitative RT-PCR methods for evaluating 
toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell line,  
Environ. Sci. Technol.,  39:2777–2785.
 
(14) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 and T production using the H295R cell line,  Environ. Sci. Pol. Res.,  
17:1137–1148.
 
(15) Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., 
Mcgee, E. A., Wester, R. and Mason, J. I. (1993), Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids,  J. Clin. 
Endocrinol. Metab.,  77, 731–737.
 
(16) Tämän liitteen B.55 luku, ”Rotilla tehtävä Hershbergerin biotesti: lyhytaikai ­
nen seulontatesti androgeenisista (antiandrogeenisista) ominaisuuksista”.  
(17) Shapiro, R., and Page, L.B. (1976), Interference by 2,3-dimercapto-1- 
propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay,  J. Lab. Clin. Med.,  
2, 222–231.  
(18) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for growth and survival: 
application to proliferation and cytotoxicity assays,  J. Immunol. Methods.,  
65, 55–63.  
(19) Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999). Biochemical differences between rat 
and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs 
of these two species, Biochemistry. 38:1598–1606.  
(20) Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006), 
Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 
26:484–492.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 909
 
Lisäys  
MÄÄRITELMÄT:  
Konfluenttisuudella  tarkoitetaan peittävyyttä tai jakaantuvuutta, joka sallitaan 
soluille kasvatusliuoksessa.  
Kemikaalilla  tarkoitetaan ainetta tai aineiden seosta.  
Variaatiokertoimella  tarkoitetaan keskihajonnan ja aritmeettisen keskiarvon osa ­
määrää  
CYP:llä  tarkoitetaan sytokromin P450 mono-oksigenaaseja, niistä tuotettua 
geeni- ja entsyymiperhettä, joka osallistuu erilaisten biokemiallisten reaktioiden katalysointiin, mukaan lukien steroidihormonien synteesi ja aineenvaihdunta.
 
DPM:llä  tarkoittaa hajoamista minuuttia kohti (disintegration per minute). Ky ­
seessä on tietyssä määrässä radioaktiivista materiaalia oleva atomien määrä, jonka 
havaitaan hajoavan yhden minuutin aikana.  
E2:lla  tarkoitetaan 17 β-estradolia, nisäkkäiden elimistön tärkeintä estrogeenia.  
H295R -soluilla tarkoitetaan ihmisen adreno-karsinooma-soluja, jotka ovat fysio ­
logisilta ominaispiirteiltään sikiön erilaistumattomia lisämunuaisen soluja ja jotka ilmentävät kaikkia streroidogeneesin entsyymejä. Ne ovat saatavilla ATCC:ltä.
 
Pakastusliuosta  käytetään pakastamaan ja varastoimaan pakastettuja soluja. Se 
koostuu kasvatusliuoksen kantaliuoksesta, johon lisätään BD NuSerum -see ­
ruminkorviketta ja dimetyylisulfoksidia.  
Lineaarisella mittausalueella  tarkoitetaan vaihteluväliä hormonin mittausjärjes ­
telmän standardikäyrällä, jossa tulokset ovat verrannollisia näytteessä läsnä ole ­
van analyytin pitoisuuteen.  
Määritysrajalla  tarkoitetaan pienintä määrää kemikaalia, joka voidaan erottaa 
siitä, että kyseistä kemikaalia ei esiinny (tyhjä arvo) todetulla luottamustasolla. 
Tässä menetelmässä testijärjestelmien valmistaja määrittelee tavanomaisesti mää ­
ritysrajan, jos ei toisin ilmoiteta.  
LOEC:illa  tarkoitetaan alhaisimman havaittavaan vaikutuksen aiheuttavaa pitoi ­
suutta, jossa testireaktio poikkeaa tilastollisesti liuotinkontrollista.  
NOEC:illa  tarkoitetaan pitoisuutta, joka aiheuta havaittavaa vaikutusta, mikä on 
korkein testattu pitoisuus, jos testi ei tarjoa positiivista reaktiota.  
Pasaasilla  tarkoitetaan niiden kertojen lukumäärää, jolloin solut jaetaan sen jäl ­
keen kun viljelmä aloitetaan pakastetusta varastosta (jakamiskerta). Ensimmäisen 
pakastetusta varastosta aloitetun viljelmän pasaasinumero on yksi (1). Solut, jotka 
jaetaan yhden kerran merkitään pasaasinumerolla 2.  
PBS:llä  tarkoitetaan Dulbeccon fosfaattipuskuroitua suolaliuosta.  
Laadunvalvonnalla  tarkoitetaan toimenpiteitä, joita tarvitaan validien tietojen 
varmistamiseen.  
Laadunvalvontalevyllä  tarkoitetaan 24-kuoppalevyä, johon sisältyy positiivisen 
ja negatiivisen kontrollin kaksi pitoisuutta, joilla seurataan uuden soluerän tehok ­
kuutta tai jolla tarjotaan kemikaalien testauksen ohessa positiivinen kontrolli 
testille.  
Testiajolla  tarkoitetaan erillistä koetta, jossa käytetään uudenlaisia liuoksia ja 
kontrolleja.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 910
 
Kasvatusliuoksen kantaliuoksella  tarkoitetaan muiden reagenssien valmistelua 
varten käytettävää ainetta. Se koostuu 1:1 seoksesta DMEM-kasvatusliuosta (Dul ­
becco's Modified Eagle's Medium) ja DMEM/F12-kasvatusliuosta (Ham's F-12 Nutrient mixture) 15 mM:ssa Hepes-puskuria ilman fenoolipunaa tai natriumbi ­
karbonaattia. Natriumbikarbonaatti lisätään puskuriksi, ks. validointiraportin li ­
säys II (4).
 
Lopullinen kasvatusliuos  koostuu kasvatusliuoksen kantaliuoksesta, johon on 
lisätty ainetta BD seeruminkorvike ja ITS+ premium mix, ks. validointiraportin lisäys II (4).
 
Steroidogeneesillä  tarkoitetaan synteesireittiä, joka johtaa kolesterolista useisiin 
steroidihormoneihin. Useat reaktion välituotteet steroidisynteesireitillä, kuten pro ­
gesteroni ja testosteroni, ovat jo itsessään tärkeitä hormoneja, mutta ne toimivat 
myös esiasteena synteesireitin loppupäässä oleville hormoneille (lopputuote).  
T:llä  tarkoitetaan testosteronia, yhtä nisäkkäiden elimistön kahdesta tärkeimmästä 
androgeenista.  
Testikemikaalilla  tarkoitetaan mitä tahansa ainetta tai seosta, jota testataan käyt ­
tämällä tätä testimenetelmää.  
Testilevyllä  tarkoitetaan levyä, jolla H295R-solut altistetaan testikemikaaleille. 
Testilevyille sisältyy liuotinkontrolli ja testikemikaali seitsemällä pitoisuustasolla kolmena kappaleena.
 
Trypsiini 1X:llä  tarkoitetaan laimennettua liuosta, joka koostuu 
trypsiini-entsyymistä, haiman seriiniproteasista, jota käytetään irrottamaan soluja 
viljelylevyiltä, ks. validointiraportin lisäys III (4).  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 911
 
B.58.  SIIRTOGEENISTEN JYRSIJÖIDEN SOMAATTISTEN SOLUJEN 
JA SUKUSOLUJEN GEENIMUTAATIOTESTIT  
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 488 (2013). EU:n testime ­
netelmiä on saatavilla laajasta valikoimasta  in vitro  -mutaatiotestejä, joissa 
voidaan havaita kromosomi- ja/tai geenimutaatioita.  In vivo  -päätetapahtu ­
mia (eli kromosomimuutokset ja ennakoimaton DNA-synteesi) varten on 
käytössä testimenetelmiä; niillä ei kuitenkaan mitata geenimutaatioita.Siirto ­
geenisten jyrsijöiden mutaatiotestit täyttävät geenimutaatioiden osalta käy ­
tännöllisten ja laajasti saatavilla olevien  in vivo  -testien tarpeen.  
2. Siirtogeenisten jyrsijöiden mutaatiotestejä on tarkasteltu laajasti uudelleen 
(24)(33). Niissä käytetään siirtogeenisiä rottia ja hiiriä, joissa on useita 
kopioita kromosomisesti integroituja plasmideja tai faagien sukkulavektorei ­
ta. Siirtogeeneihin sisältyy reportterigeenejä, joilla havaitaan monenlaisia mutaatioita, joita testikemikaalit indusoivat  in vivo .
 
3. Jyrsijässä aiheutuvat mutaatiot merkitään muistiin ottamalla siirtogeeni tal ­
teen ja analysoimalla reportterigeenin fenotyyppiä bakteeri-isännässä, joka on reportterigeenin osalta vaillinainen. Siirtogeenisten jyrsijöiden geenimu ­
taatiotesteissä mitataan mutaatioita, joita ovat aiheuttaneet geneettisesti neut ­
raalit geenit, jotka on otettu talteen lähes mistä tahansa jyrsijän kudoksesta. 
Tästä syystä näissä testeissä kierretään useita nykyisiä rajoituksia, jotka liittyvät endogeenisten geenien  in vivo - geenimutaatioita koskevaan tutki ­
mukseen (kuten rajallinen määrä testiin sopivia kudoksia, negatiivinen/po ­
sitiivinen valinta mutaatioita vastaan).
 
4. Todisteet viittaavat siihen, että siirtogeenit vastaavat mutageeneihin samalla 
tavoin kuin endogeenisiin geeneihin erityisesti, kun kyseessä on emäsparien korvauksen, lukukehysmutaatioiden ja pienten deleetioiden ja insertioiden havainnointi (24).
 
5. Genotoksisuuden testaamista käsittelevissä kansainvälisissä työryhmissä (In ­
ternational Workshops on Genotoxicity Testing, IWGT) on hyväksytty siir ­
togeenisten jyrsijöiden geenimutaatiotestien sisällyttäminen geenimutaatioi ­
den detektioon  in vivo , ja se on suositellut testiprotokollaa niiden toteutta ­
mista varten (15)(29). Tämä testimenetelmä perustuu näihin suosituksiin. 
Täydentävä analyysi, jolla tuetaan tämän testiprotokollan käyttämistä, sisäl ­
tyy lähteeseen (16).  
6. On odotettavissa, että tulevaisuudessa voi olla mahdollista yhdistää siirto ­
geenisten jyrsijöiden geenimutaatiotestit toistuvan annostelun toksisuustut ­
kimuksiin (tämän liitteen B.7 luku). Tietoja tarvitaan kuitenkin sen varmis ­
tamiseksi, että siirtogeenisten jyrsijöiden geenimutaatiotestien herkkyyteen ei vaikuteta altistusajan lopun ja näytteenottoajan välisellä lyhyemmällä 
yhden vuorokauden ajanjaksolla, jota sovelletaan toistuvan annostelun tut ­
kimuksissa, verrattuna siirtogeenisten jyrsijöiden geenimutaatiotesteissä käy ­
tettyyn kolmeen vuorokauteen. Tarvitaan myös tietoja jotka osoittavat, että toistuvan annostelun tutkimuksiin ei vaikuteta haitallisesti, koska tavan ­
omaisten jyrsijäkantojen sijaan käytetään siirtogeenisiä jyrsijäkantoja. Kun 
nämä tiedot ovat saatavilla, tätä testimenetelmää päivitetään.
 
7. Keskeisten termien määritelmät esitetään liitteessä.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 912
 
ALUSTAVAT NÄKÖKOHDAT  
8. Siirtogeenisten jyrsijöiden geenimutaatiotestit, joiden osalta on saatavilla 
tarpeeksi tietoa, jotta niitä voidaan käyttää tässä testimenetelmässä, ovat:  
lacZ bacteriophage mouse -malli (MutaäMouse -malli);  lacZ  plasmid mouse 
-malli;  gpt delta ( gpt ja Spi  – )mouse ja rat -mallit;  lacI  mouse -malli ja  lacI  
rat -malli (Big Blue® -malli), sellaisina kuin ne suoritetaan tavanomaisissa 
olosuhteissa. Lisäksi positiivista valintaa koskevaa  cII-testiä voidaan käyttää 
arvioimaan mutaatioita Big BlueÒ- ja MutaäMouse-malleissa. Mutageneesiä siirtogeenisten jyrsijöiden geenimutaatiotestien malleissa arvioidaan normaa ­
listi mutaatiofrekvenssillä; lisätietoja voidaan saada tarvittaessa mutaatioiden 
molekyylianalyysillä (ks. 24 kohta).
 
9. Nämä jyrsijöiden  in vivo  geenimutaatiotestit soveltuvat erityisesti mutagee ­
nisuusvaaran arvioimiseen, sillä testin vasteet riippuvat  in vivo  metaboloin ­
nista, farmakokinetiikasta, DNA:n korjautumisprosesseista ja transleesio-DNA-synteesistä, joskin näissä saattaa esiintyä eroja lajien ja kudosten sekä DNA-vaurioiden tyyppien välillä. Geenimutaatioita koskeva  
in vivo  -testi on hyödyllinen, jotta  in vitro  -järjestelmässä havaittua muta ­
geenistä vaikutusta tutkitaan enemmän ja jotta suoritetaan testitulosten seur ­
anta käyttäen muita  in vivo  -päätetapahtumia (24). Sen lisäksi, että gee ­
nimutaatiot ovat syy-yhteydellisiä syövän syntyyn, ne muodostavat olennai ­
sen päätetapahtuman, jolla ennustetaan mutaatioon perustuvia muita kuin 
syöpäsairauksia somaattisissa kudoksissa (12)(13) sekä sairauksia, jotka tart ­
tuvat ituradan välityksellä.
 
10. Jos on näyttöä siitä, että testikemikaali tai merkityksellinen metaboliitti ei 
ulotu mihinkään kohdekudoksiin, siirtogeenisten jyrsijöiden geenimutaatio ­
testien suorittaminen ei ole tarkoituksenmukaista.  
TESTIN PERIAATE  
11. Edellä 8 kohdassa kuvatuissa testeissä kohdegeeni on alkuperältään bakteeri 
tai bakteriofagi, ja tapa saada näyte jyrsijän genomisesta DNA:sta on siir ­
togeenin sitoutuminen λ-bakteriofaagiin tai plasmidisukkulavektoriin. Me ­
nettelyyn sisältyy genomisen DNA:n ekstraktio jyrsijän kohdekudoksesta, genomisen DNA:n  in vitro  -käsittely (eli λ-vektorien pakkaaminen tai plas ­
midien ligaatio ja elektroporaatio sukkulavektorin tuottamiseksi) ja sitä seu ­
raava mutaatioiden seulonta bakteeri-isännissä sopivissa olosuhteissa. Tes ­
tissä käytetään neutraaleja siirtogeenejä, jotka voidaan helposti kerätä useimmista kudoksista.
 
12. Jyrsijöiden geenimutaatiota mittaavassa perustestissä jyrsijä altistetaan ke ­
mikaalille tietyn ajanjakson ajan. Kemikaalit voidaan antaa minkä tahansa 
annostelureitin, myös implantaation kautta (esim. lääkinnällisten laitteiden 
testaus). Sitä ajanjaksoa kokonaisuudessaan, jolloin eläimelle annetaan an ­
noksia, kutsutaan  altistusajaksi . Altistusta seuraa ennen lopettamista yleensä 
ajanjakso, jonka aikana kemikaalia ei anneta ja jonka aikana korjaamattomat 
DNA-vauriot kiinnittyvät stabiileihin mutaatioihin. Tätä ajanjaksoa kutsu ­
taan ammattikirjallisuudessa usein ilmenemisajaksi (manifestation time), kiinnitysajaksi (fixation time) tai ilmentymisajaksi (expression time), tämän ajanjakson loppua kutsutaan näytteenottoajaksi (15)(29). Eläimen lopettami ­
sen jälkeen genominen DNA eristetään testin kohteena olevasta kudoksesta 
(kudoksista) ja se puhdistetaan.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 913
 
13. Tiedot yhdestä kudoksesta eläintä kohti useista pakkauksista/ligaatioista 
kootaan yleensä yhteen ja mutaatiotaajuus arvioidaan yleensä käyttäen yh ­
teensä 10  5 ja 10  7 plakkia muodostavaa tai pesäkkeitä muodostavaa yksik ­
köä. Jos käytetään positiivisia valintamenetelmiä, plakkia muodostavien yk ­
siköiden kokonaismäärä määritellään käyttäen erillisiä ei-selektiivisiä 
maljoja.  
14. Positiivisia valintamenetelmiä on kehitetty, jotta mutaatioiden seulontaa  hel­
potetaan  gpt-geenissä ( gpt delta mouse and rat  -malli,  gpt  – -fenotyyppi 
(20)(22)(28)) ja  lacZ- geenissä (Muta™Mouse- tai  lacZ  plasmid mouse 
-malli (3)(10)(11)(30));  lacI -geenimutaatiot Big Blue® -eläimissä seulotaan 
non-selektiivisellä mallilla, jossa mutantit seulotaan värillisten (sinisten) plakkien syntymisen välityksellä. Käytössä on myös positiivinen valintame ­
nettely, jolla havaitaan pistemutaatioita, jotka syntyvät λ-bakteriofaagin suk ­
kulavektorin  cII-geenissä (Big Blue® mouse -malli tai rat -malli ja Muta™ ­
Mouse -malli (17)) ja deleetiomutaatioina λ red-  ja gam -geeneissä(Spi
 – - 
valinta  gpt delta mouse- ja rat-malleissa (21)(22)(28)).  Mutaatiotaajuus  las­
ketaan jakamalla siirtogeenin mutaatioita sisältävien plakkien/plasmidien 
määrä samasta DNA-näytteestä kerättyjen plakkien/plasmidien kokonais ­
määrän kanssa. Siirtogeenisten jyrsijöiden geenimutaatiotutkimuksissa il ­
moitettu parametri on mutaatiotaajuus. Lisäksi  mutaatiotaajuus  voidaan 
määritellä niiden solujen osuudeksi, joissa on  yksittäisiä  mutaatioita; tämä 
laskentatapa vaatii korjausta kloonaalisen laajenemisen osalta sekvensoi ­
malla kerätyt mutantit (24).  
15. Mutaatioita, joita tutkitaan  lacI-, lacZ-, cII-  ja gpt point mutation  -mallien 
testeissä, koostuvat pääosin emäsparin korvautumista koskevista mutaatiois ­
ta, lukukehysmutaatioista ja pienistä insertioista/deleetioista. Näiden mutaa ­
tiotyyppien suhteellinen osuus spontaanien mutaatioiden keskuudessa on samankaltainen, mikä voidaan havaita endogeenisessa  Hprt -geenissä. Suuria 
deleetioita havaitaan ainoastaan Spi
 – -valintaaja  lacZ  plasmid -malleja kos ­
kevassa testissä (24). Testin kannalta merkittävät mutaatiot ovat hiirelle tai 
rotalle aiheutuvat  in vivo  -mutaatiot.  In vitro-  ja ex vivo  -mutaatiot, jotka 
voivat aiheutua faagin/plasmidin näytteenoton, replikoinnin tai korjautumi ­
sen aikana, ovat erittäin harvinaisia, ja ne voidaan joissain järjestelmissä 
erityisesti havaita tai sulkea pois bakteeri-isäntää/positiivista valintaa koske ­
valla järjestelmällä.  
MENETELMÄN KUVAUS  
Testin valmistelu  
Eläinlajin valinta  
16. Tällä hetkellä on saatavilla useita siirtogeenisten hiirten geenimutaatioiden 
seulontamalleja, ja näitä on käytetty laajemmin kuin siirtogeenisiä rottia 
koskevia malleja. Jos rotta on selkeästi tarkoituksenmukaisempi malli 
kuin hiiri (esim. jos tutkitaan karsinogeneesin mekanismia ainoastaan rotilla esiintyvästä kasvaimesta, jos saatetaan tiedot vastaavuussuhteeseen rotilla tehtävien myrkyllisyystutkimusten kanssa tai jos rotan metabolian tiedetään 
olevan ihmisen metabolian kannalta edustavampi), olisi harkittava siirtogee ­
nisiä rottia koskevien mallien käyttöä.
 
Koe-eläinen häkit ja ruokinta  
17. Koe-eläinhuoneen lämpötilan pitäisi olla ihanteellisesti 22 °C (± 3 °C). 
Vaikka suhteellisen kosteuden pitäisi olla vähintään 30 % eikä mielellään yli 70 % muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, pitäisi kuitenkin 
pyrkiä 50–60 %:n suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa olisi käytettävä kei ­
novalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, jonka jälkeen 12 tuntia
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 914
 
pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruo ­
kavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. Ravinnon valintaan voi 
vaikuttaa tarve varmistaa sopiva sekoitus testikemikaalia, kun sitä annetaan tätä reittiä. Samaa sukupuolta olevat eläimet olisi pidettävä häkeissä pienissä ryhmissä (enintään viisi), jos minkäänlaista aggressiivista käytöstä ei ole 
odotettavissa. Eläimet voivat olla häkissä yksittäin, jos tämä on tieteellisesti 
perusteltua.
 
Eläinten valmistelu  
18. Terveet nuoret ja sukukypsät täysikasvuiset eläimet (8–12 viikon ikäiset 
käsittelyn alkaessa) jaetaan satunnaisesti kontrolli- ja testiryhmiin. Jokainen 
eläinyksilö tunnistetaan. Eläimiä totutetaan laboratorio-olosuhteisiin vähin ­
tään viiden vuorokauden ajan. Häkit on sijoitettava siten, että niiden sijain ­
nista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Tutkimuksen al ­
kaessa eläinten painonvaihtelun olisi oltava vähäistä, ja se saa vaihdella 
korkeintaan ± 20 % kunkin sukupuolen tavanomaisesta keskiarvosta.  
Annosten valmistelu  
19. Kiinteät testattavat kemikaalit liuotetaan tai sekoitetaan asianmukaisiin liuot ­
timiin tai kantaja-aineisiin taikka lisätään ravintoon tai juomaveteen, ennen kuin ne annetaan koe-eläimille. Nestemäiset testattavat kemikaalit voidaan 
antaa suoraan tai laimentaa ennen antamista. Testikemikaaleja voidaan antaa 
hengitystien kautta tapahtuvan altistamisen osalta kaasuna, höyrynä tai kiin ­
teänä/nestemäisenä aerosolina niiden fysikokemiallisista ominaisuuksista riippuen. Testikemikaali on valmisteltava juuri ennen altistusta, paitsi jos 
säilyvyys on osoitettu stabiliteettitutkimuksilla.
 
Testiolosuhteet  
Liuotin/kantaja-aine  
20. Liuottimella/kantaja-aineella ei saa olla myrkkyvaikutuksia käytetyillä an ­
nostasoilla, eikä sen käyttöön saa liittyä epäilyjä mahdollisista kemiallisista reaktioista tutkittavan kemikaalin kanssa. Jos käytetään muita kuin hyvin 
tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita, niiden käyttö on perusteltava yhteenso ­
pivuuden osoittavilla tutkimustuloksilla. Vesipitoisen liuottimen/kantaja-ai ­
neen käyttöä on harkittava ensisijaisesti aina, kun se on mahdollista.
 
Positiiviset kontrollit  
21. Tavanomaisesti käytetään rinnakkaisia positiivisen kontrollin eläimiä. Kui ­
tenkin laboratoriot, joiden pätevyys on osoitettu (ks. 23 kohta) ja jotka 
soveltavat rutiininomaisesti näitä testejä, edellisen positiivisen kontrollin koe-eläimien DNA voidaan sisällyttää kuhunkin tutkimukseen, jotta mene ­
telmän onnistunut lopputulos vahvistetaan. Tällaiset edellisten kokeiden 
DNA:t olisi saatava samoilta lajeilta ja tutkimuksen kohteena olevista ku ­
doksista, ja ne olisi säilytettävä asianmukaisesti (ks. 36 kohta). Kun käyte ­
tään rinnakkaisia positiivisia kontrolleja, niitä ei tarvitse antaa samaa reittiä kuin testikemikaalia; olisi kuitenkin oltava tiedossa, että positiiviset kont ­
rollit aiheuttavat mutaatioita yhdessä tai useammassa testikemikaalin koh ­
dekudoksessa. Positiivisen kontrollin kemikaalien annokset olisi valittava siten, että aiheutetaan heikkoja tai kohtalaisia vaikutuksia, joilla arvioidaan kriittisesti kokeen suorituskykyä ja herkkyyttä. Taulukkoon 1 sisältyy esi ­
merkkejä positiivisen kontrollin kemikaaleista ja joistain niiden 
kohdekudoksista.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 915
 
Taulukko 1  
Esimerkkejä positiivisen kontrollin kemikaaleista ja joistain niiden kohdekudoksista  
Positiivisen kontrollin kemi ­
kaali ja CAS-nro Einecs-nimi ja Einecs-nro Ominaisuudet Mutaation kohdekudos 
Rotta Hiiri  
N-etyyli-N-nitrosourea 
(CAS-nro 759-73-9) N-etyyli-N-nitrosourea 
(212-072-2) Suoraan vaikuttava 
mutageeni Maksa, 
keuhkot Luuydin, paksusuoli, 
paksusuolen epiteeli, suolisto, maksa, 
keuhkot, perna, mu ­
nuainen, munasolu ­
jen granuloosasolut, uroksen sukusolut 
Etyylikarbamaatti (uretaa ­
ni) 
(CAS-nro 51-79-6) Uretaani 
(200-123-1) Mutageeni, edel ­
lyttää metabolista 
aktivointia, mutta 
aiheuttaa ainoas ­
taan heikkoja vai ­
kutuksia Luudin, etumaha, 
ohutsuoli, maksa, 
keuhkot, perna 
2,4 diaminotolueeni 
(CAS-nro 95-80-7) 4-metyyli-m-fenylee ­
nidiamiini 
(202-453-1) Mutageeni, edel ­
lyttää metabolista 
aktivointia, myös positiivinen Spi
 – - 
testissä Maksa Maksa 
Bentso(a)pyreeni 
(CAS-nro 50-32-8) Bentso[def]kryseeni 
(200-028-5) Mutageeni, edel ­
lyttää metabolista 
aktivointia Maksa, 
keuhkot Luudin, rinta, paksu ­
suoli, etumaha, rau ­
hasmaha, sydän, 
maksa, keuhkot, uroksen sukusolut
 
Negatiiviset kontrollit  
22. Negatiivisia kontrolleja, joissa käytetään pelkkää liuotinta tai kantaja-ainetta 
ja joita käsitellään muuten samalla tavalla kuin koeryhmiä, olisi sisällytet ­
tävä kuhunkin näytteenottokertaan. Jos käytettävissä ei ole aikaisempia tai 
julkaistuja kontrollitietoja, joissa osoitetaan, että valittu liuotin/kantaja-aine 
ei aiheuta mitään haitallisia tai mutageenisiä vaikutuksia, olisi käytettävä myös kontrollia, jossa eläimiä ei käsitellä, kutakin näytteenottokertaa kohti, jotta kantaja-ainekontrollin hyväksyttävyys voidaan todeta.
 
Laboratorioiden pätevyyden varmistaminen  
23. Näiden testien pätevyys olisi varmistettava osoittamalla, että niillä voidaan 
tuottaa julkaistujen tietojen (24) perusteella edellytettyjä tuloksia, kun ky ­
seessä ovat: 1) mutaatiotaajuudet positiivisen kontrollin kemikaalien kanssa 
(mukaan lukien heikot vasteet), kuten ne, jotka luetellaan taulukossa 1, 
ei-mutageenit, kantaja-ainekontrollit; ja 2) siirtogeenin talteenotto genomi ­
sesta DNA:sta (esim. pakkauksien tehokkuus).  
Mutanttien sekvensointi  
24. Mutanttien DNA-sekvensointia ei tarvita sääntelyyn liittyvien vaatimusten 
osalta erityisesti, jos saadaan selkeä positiivinen tai negatiivinen tulos. Sek ­
vensointitiedot voivat olla kuitenkin hyödyllisiä, kun tarkastellaan yksilöi ­
den välistä korkeaa vaihtelua. Näissä tapauksissa sekvensointia voidaan 
käyttää, jotta ”jackpot-mutaatioiden” tai klonaalisten tapahtumien mahdolli ­
suus suljetaan pois, tunnistamalla tietystä kudoksesta peräisin olevien ainut ­
laatuisten mutanttien osuus. Noin 10 mutantin sekvensointi kutakin kudosta 
ja kutakin eläintä kohti pitäisi riittää sen määrittämiseksi, vaikuttavatko 
klonaaliset mutantit mutaatiotaajuuteen; jopa 25 mutantin sekvensointi voi  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 916
 
olla tarpeen, jotta mutaatiotaajuutta korjataan matemaattisesti klonaalisuu ­
den osalta. Mutanttien sekvensointia voidaan myös harkita, kun mutaatiotaa ­
juudessa havaitaan pientä lisäystä (eli kun ylitetään jonkin verran käsittele ­
mättömän kontrollin arvot). Erot käsiteltyjen ja käsittelemättömien eläinten mutanttiryhmien mutaatiokirjon välillä voivat tukea mutageenistä vaikutusta 
(29). Mutaatiokirjo voi olla myös hyödyllinen mekanististen hypoteesien 
kehittämiseksi. Kun sekvensointi sisällytetään tutkimussuunnitelmaan, täl ­
laisten tutkimusten suunnittelussa olisi erityisesti otettava huomioon, etenkin näytettä kohti sekvensointujen mutanttien määrän osalta, riittävän tilastolli ­
sen voiman aikaansaaminen sovellettavan tilastollisen mallin mukaisesti (ks. 
43 kohta).
 
TESTIN SUORITTAMINEN  
Eläinten lukumäärä ja sukupuoli  
25. Eläinten lukumäärä ryhmää kohti olisi määriteltävä ennalta, jotta näin tar ­
jotaan riittävä tilastollinen voima havaita ainakin mutaatiotaajuuden kaksin ­
kertaistuminen. Ryhmä koostuu vähintään viidestä eläimestä; jos tilastolli ­
nen voima ei riitä, eläinten määrää on lisättävä tarpeen mukaan. Normaalisti 
olisi käytettävä uroksia. Voi olla tapauksia, joissa pelkästään naaraiden 
testaaminen on perusteltua; esimerkiksi silloin, kun testataan nimenomaan naisia varten tarkoitettuja lääkkeitä tai kun tutkitaan nimenomaan naisten aineenvaihduntaa. Jos sukupuolten välillä on huomattavia eroja myrkylli ­
syysvaikutusten tai metaboloitumisen osalta, tarvitaan uroksilla ja naarailla 
suoritettavia malleja.
 
Altistusaika  
26. Koska seulonnan perusteella mutaatiot kertyvät kussakin käsittelyssä, tarvi ­
taan toistuvan annostelun tutkimusta, jossa annos annetaan päivittäin 28 vuorokauden ajan. Tätä pidetään yleisesti hyväksyttävänä, koska näin tu ­
otetaan riittävä kertymä heikkojen mutageenien aiheuttamia mutaatioita ja 
koska tarjotaan riittävän pitkä altistusaika mutaatioiden seulonnalle elimissä, joiden proliferaatio on hidasta. Vaihtoehtoiset käsittelytavat voivat sopiva joihinkin arviointeihin, ja näitä vaihtoehtoisia annostussuunnitelmia olisi 
perusteltava tieteellisesti testiprotokollassa. Altistusten kesto ei saisi olla 
lyhyempi kuin ajanjakso, jota tarvitaan kaikkien asiaankuuluvien entsyy ­
mien täydelliseen induktioon, ja lyhyempikestoisten altistusten vuoksi voi ­
daan joutua käyttämään useita näytteenottoaikoja, jotka ovat asianmukaisia 
elimille, joiden proliferaatioaste on erilainen. Joka tapauksessa kaikkia saa ­
tavilla olevia tietoja (esim. yleisestä myrkyllisyydestä tai metaboloitumisesta ja farmakokinetiikasta) olisi käytettävä, kun protokollaa perustellaan erityi ­
sesti, jos edellä mainituista vakiomuotoisista suosituksista poiketaan. Vaikka 
herkkyyttä lisättäisiin kahdeksan viikkoa pidemmillä altistusajoilla, niitä 
pitäisi selvittää ja perustella, koska pitkät altistusajat voivat tuottaa ilmeistä kasvua mutaatiotaajuudessa kloonaalisen laajenemisen välityksellä (29).
 
Annostasot  
27. Annostasojen pitäisi perustua samasta annostelureitistä tehdyn yleistä toksi ­
suutta mittaavan raja-annostutkimuksen tuloksiin tai olemassa oleviin suba ­
kuuttia toksisuutta koskeviin tutkimuksiin. Saman jyrsijäkannan 
ei-siirtogeenisiä eläimiä voidaan käyttää annosrajojen määrittelyssä. Annos ­
vastetietojen saamisen vuoksi päätestin täydelliseen tutkimukseen olisi si ­
sällyttävä negatiivinen kontrolliryhmä (ks. 22 kohta) ja vähintään kolme toisistaan asianmukaiselle välille sijoitettua annostasoa, paitsi silloin, kun 
on käytetty raja-annosta (ks. 28 kohta). Suurimman annoksen olisi oltava 
suurin siedettävä annos. Suurin siedettävä annos määritellään annokseksi,
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 917
 
joka aiheuttaa sellaisia myrkyllisyysoireita, että samaan annostussuunnitel ­
maan perustuvan korkeamman annostason voidaan odottaa johtavan kuole ­
maan. Kemikaalit, joilla on spesifisiä biologisia vaikutuksia pieninä myr ­
kyttöminä annoksina (kuten hormonit ja mitogeenit), ja kemikaalit, joissa esiintyy toksikokineettisten ominaisuuksien saturaatiota, voivat olla annos ­
ten asettamista koskevien kriteerien osalta poikkeustapauksia, ja niitä olisi 
arvioitava tapauskohtaisesti. Käytetyillä annostasoilla olisi katettava mittaus ­
alue, joka ulottuu enimmäismäärästä vähäiseen toksisuuteen tai toksisuuden puuttumiseen.
 
Raja-annostesti  
28. Jos raja-annoksen määrittelyä koskevissa kokeissa tai samankaltaisista jyr ­
sijäkannoista olemassa olevissa tiedoissa osoitetaan, että käsittelyjärjestel ­
mässä, jossa annetaan vähintään raja-annos (ks. jäljempänä), ei tuoteta mi ­
tään havaittavia myrkyllisyysvaikutuksia ja jos genotoksisuutta ei oleteta rakenteellisesti samankaltaisia kemikaaleja koskevien tietojen perusteella, täydellinen tutkimus kolmella eri annostasolla ei ole ehkä välttämätön. 
Kun kyseessä on 28 vuorokauden altistusaika (eli 28 päivittäistä käsittelyä), 
raja-annos on 1 000 mg/painokilo/vrk. Kun altistusaika on 14 päivää tai lyhyempi, raja-annos on 2 000 mg/painokilo/vrk (28 päivittäisestä käsitte ­
lystä poikkeavat annostelusuunnitelmat olisi perusteltava tieteellisesti proto ­
kollassa; ks. 26 kohta).
 
Antotapa  
29. Testikemikaalia annetaan yleensä letkuruokinnassa mahaletkun tai sopivan 
intubaatiokanyylin kautta. Yleensä testin suunnittelussa olisi otettava huo ­
mioon oletettu ihmisen altistusreitti. Sen vuoksi muut altistusreitit (kuten altistus juomaveden välityksellä, ihonalaista tai laskimonsisäistä reittiä, pai ­
kallisesti iholle applikoituna, inhalaationa, henkitorveen tiputettuna, ravin ­
non tai implantaation kautta) voivat olla hyväksyttäviä, jos niitä voidaan perustella. Injektiota vatsaonteloon ei suositella, koska se ei ole ihmisen kannalta fysiologisesti merkityksellinen altistusreitti. Suurin letkuruokinnan 
tai injektion avulla kerralla annettava nestemäärä määräytyy koe-eläimen 
koon mukaan. Tilavuus ei saisi ylittää 2:ta ml/100 g eläimen painoa. Tätä suurempien määrien käyttöä olisi perusteltava. Poikkeuksena tästä ovat är ­
syttävät tai syövyttävät aineet, joiden kohdalla voidaan yleensä todeta vai ­
kutusten voimistuminen suurempia pitoisuuksia käytettäessä. Testiaineen 
nestemäärän tilavuusvaihtelu minimoidaan pitoisuutta muuttamalla, jotta kaikilla annostasoilla varmistetaan tilavuudeltaan sama nestemäärä.
 
Näytteenottoaika  
Somaattiset solut  
30. Näytteenottoaika on kriittinen muuttuja, koska se määräytyy sen ajanjakson 
perusteella, jota tarvitaan mutaatioiden fiksoitumiseen. Tämä ajanjakso on kudosspesifinen ja se vaikuttaa liittyvän solupopulaation korvautumista kos ­
kevaan ajanjaksoon. Luuydin ja suolisto reagoivat nopeasti ja maksa paljon 
hitaammin. Sopiva kompromissi mutaatiotaajuuksien mittaamiseksi nopeasti 
ja hitaasti proliferoituvissa kudoksissa on 28 peräkkäisen vuorokauden kä ­
sittely (kuten 26 kohdassa todetaan) ja kolmen vuorokauden näytteenotto lopullisen käsittelyn jälkeen; voi olla mahdollista, että mutaatiotaajuuden 
maksimi ei ilmene näissä olosuhteissa sellaisten kudosten osalta, joiden 
proliferaatio on hidasta. Jos tällaisilla kudoksilla on erityistä merkitystä, myöhempi 28 päivän näytteenottoajankohta, joka seuraa 28 päivän altistus ­
aikaa, voi olla tarkoituksenmukaisempi (16)(29). Tällaisissa tapauksissa 
myöhempi aika korvaisi 3 päivän näytteenottoajan ja edellyttäisi tieteellisiä 
perusteluja.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 918
 
Sukusolut  
31. Siirtogeenisillä jyrsijöillä tehtävät testit soveltuvat hyvin tutkimuksiin, jotka 
koskevat geenimutaatioiden syntyä uroksen sukusoluissa (7)(8)(27), joissa spermatogeneesin ajoitus ja kinetiikka on määritelty hyvin (27). Koska 
analyysia varten saatavilla olevia munasoluja on vähän jopa superovulaation 
jälkeen ja koska oosyytissä ei ole DNA-synteesiä, siirtogeenisten eläinten testeissä ei voida määritellä naaraiden sukusolujen mutaatiota (31).
 
32. Uroksen sukusolujen näytteenottoajat olisi valittava niin, että näytteet ote ­
taan sarjasta altistettuja solutyyppejä koko sukusolujen kehityksen ajan ja että soluja on altistettu tarpeeksi vaiheessa, joka on näytteenoton kohteena. Kehittyvien sukusolujen kehittymisaika spermatogoniaalisista kantasoluista 
kypsiksi siittiöiksi, jotka siirtyvät siemenjohtimeen/lisäkiveksen häntään, on 
hiirellä noin 49 vuorokautta (36) ja rotalla noin 70 vuorokautta (34)(35). Kolmen päivän näytteenottoaikana, joka seuraa 28 vuorokauden altistusta, siemenjohtimen/lisäkiveksen hännästä (7)(8) kerätty siemenneste edustaa 
solupopulaatiota, joka on altistettu suunnilleen spermatogeneesin jälkipuo ­
liskolla. Tähän sisältyy siis meioottinen ja postmeioottinen vaihe, mutta ei spermatogoniota tai kantasoluja koskevaa vaihetta. Jotta siemenjohtimen/li ­
säkiveksen hännän soluista, jotka olivat siittiökehityksen kantasoluja altis ­
tusaikana, otetaan näyte asianmukaisesti, altistuksen jälkeen tarvitaan täy ­
dentävää 7 viikon (hiiret) tai 10 viikon (rotat) näytteenottoaikaa.
 
33. Soluihin, jotka irrotetaan siementiehyeistä 28 + 3 vuorokauden jälkeen, si ­
sältyy sekapopulaatioita, joita on käsitelty kehittyvien sukusolujen kaikissa 
eri vaiheissa (7)(8). Näytteenotolla näistä soluista geenimutaation seulontaa 
varten ei tarjota yhtä täsmällistä arviointia vaiheista, jolloin sukusolujen mutaatioita aiheutetaan, kuin silloin, jos näyte otetaan siemenjohtimesta/li ­
säkiveksen hännästä (koska tiehyeistä otetussa näytteissä esiintyy sukusolu ­
jen tyyppien osalta vaihtelua ja näytteeseen sisältyy joitain somaattisia so ­
luja, jotka kontaminoivat tämän solupopulaation). Solunäytteen otto siemen ­
tiehyistä siemenjohtimen/lisäkiveksen hännän siemennesteen näytteiden li ­
säksi pelkästään 28 + 3 vuorokauden näytteenotto-ohjelmassa tarjoaa kui ­
tenkin jotain tietoja soluista, jotka on altistettu sukusolujen useampien ke ­
hitysvaiheiden aikana, ja tämä voi olla hyödyllinen keino seuloa joitain sukusolujen mutageenejä.
 
Tarkkailu  
34. Yleisiä kliinisiä havaintoja pitäisi tehdä ainakin kerran päivässä, mieluiten 
samaan aikaan joka päivä ottaen huomioon se, milloin annoksen antamisen jälkeen ennakoidut vaikutukset ovat suurimmillaan. Eläinten terveydentila on kirjattava. Kaikkien eläinten sairastuvuutta ja kuolleisuutta on havainnoi ­
tava ainakin kahdesti vuorokaudessa. Kaikki eläimet olisi punnittava ainakin 
kerran viikossa ja lopetettaessa. Ravinnon kulutus olisi mitattava ainakin kerran viikossa. Mikäli testikemikaalia annostellaan juomaveteen, veden kulutusta olisi mitattava, kun vesi vaihdetaan tai ainakin kerran viikossa. 
Eläimet, joilla ilmenee ei-letaaleja merkkejä liiallisesta myrkytysvaikutuk ­
sesta, olisi lopetettava ennen tutkimusajan päättymistä (23).
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 919
 
Kudosnäytteiden kerääminen  
35. Kudosnäytteiden keräämistä koskevat perusteet olisi määritettävä selkeästi. 
Koska mutaatioiden muodostumista voidaan tutkia lähes kaikista kudoksis ­
ta, kerättävien kudosten valinnan olisi perustuttava tutkimuksen suorittami ­
sen taustalla olevaan syyhyn ja olemassa oleviin tutkittavana olevan kemi ­
kaalin mutageenisyyttä, karsinogeenisyyttä tai toksisuutta koskeviin tietoi ­
hin. Tärkeisiin tarkasteltaviin näkökohtiin pitäisi sisältyä altistusreitti (joka 
perustuu todennäköisiin ihmisen altistumista koskevaan reittiin (reitteihin)), ennustettava kudosjakauma ja mahdollinen vaikutusmekanismi. Jos tausta ­
tietoja ei ole, useita tutkimuksen kannalta mahdollisesti merkittäviä somaat ­
tisia kudoksia voidaan kerätä. Niiden pitäisi edustaa nopeasti lisääntyviä, 
hitaasti lisääntyviä ja kontaktikohdan kudoksia. Lisäksi siemenjohtimen/li ­
säkiveksen hännän siittiöitä ja siementiehyeiden kehittyviä sukusoluja (ku ­
ten kuvataan 32 ja 33 kohdassa) olisi kerättävä, ja ne olisi säilytettävä, jos 
myöhemmin tarvitaan lisätutkimuksia sukusolujen mutageenisyydestä. Elin ­
ten painot olisi mitattava. Suurempien elinten osalta kaikista eläimistä olisi punnittava sama ala.
 
Kudoksien ja DNA:n säilyttäminen  
36. Kudokset (tai kudoshomogenaatit) olisi säilytettävä –70 °C:ssa tai alem ­
massa lämpötilassa, ja niitä voidaan käyttää DNA:n eristämiseen viiden vuoden aikana. Eristetty DNA, joka varastoidaan jäähdytettynä 4 °C:een asianmukaisessa puskuriliuoksessa, olisi käytettävä mutaatioanalyysia varten 
optimaalisesti vuoden sisällä.
 
Kudosten valitseminen mutaatioanalyysia varten  
37. Kudosten valinnan olisi perustuttava seuraaviin näkökohtiin: 1) altistusreitti 
tai ensimmäinen kontaktikohta (esim. rauhasmaha, jos annos annetaan suun kautta; keuhkot, jos annos annetaan inhalaationa; tai iho, jos käytetään 
paikallisesti ihon alueelle aplikoitavaa annosta); ja 2) yleisiä myrkyllisyys ­
vaikutuksia koskevissa tutkimuksessa havaitut farmakokineettiset parametrit, jotka osoittavat kudoksen disposition, pidättymisen tai kertymisen, tai myr ­
kyllisyysvaikutuksien kohde-elimet. Jos tutkimukset suoritetaan karsinogee ­
nisyystutkimusten seurantaa varten, olisi tarkasteltava karsinogeenisyysvai ­
kutuksien kohdekudoksia. Kudosten valitsemisella tutkimusta varten pitäisi maksimoida sellaisten kemikaalien havaitsemista, jotka toimivat suoraan  in 
vitro  -mutageeneinä, metaboloituvat nopeasti, jotka ovat erittäin reaktiivisia 
tai huonosti imeytyviä tai joiden kohdekudos määräytyy altistusreitin perus ­
teella (6).
 
38. Jos taustatietoja ei ole käytettävissä — ja kun otetaan huomioon altistusrei ­
tistä johtuva kontaktikohta –, olisi arvioitava maksan ja ainakin yhden 
nopeasti jakaantuvan kudoksen (kuten rauhasmaha, luuydin) mutageenisyyt ­
ta. Useimmissa tapauksissa edellä mainitut vaatimukset voidaan saavuttaa kahden huolellisesti valitun kudoksen analyyseista, mutta joissain tapauk ­
sessa tarvitaan kolmea tai useampaa kudosta. Jos on syytä tarkastella eri ­
tyisesti sukusoluihin aiheutuvia vaikutuksia, kuten positiivisia vasteita so ­
maattisissa soluissa, sukusolujen kudoksia olisi arvioitava mutaatioiden osalta.
 
Mittausmenetelmät  
39. Vakiomuotoisia laboratoriomenettelyjä tai julkaistuja menetelmiä mutanttien 
seulomiseksi saadaan suositelluista siirtogeenisiä eläimiä koskevista malleis ­
ta: lacZ  lambda bacteriophage and plasmid -malli (30);  lacI  mouse -malli 
(2)(18);  gpt delta mouse -malli (22);  gpt delta rat -malli (28);  cII-malli (17). 
Muutoksia olisi perusteltava ja dokumentoitava asianmukaisesti. Tietoja 
useista pakkauksista voidaan yhdistää ja käyttää, jotta saadaan sopiva määrä plakkeja tai pesäkkeitä. Tarve suurelle määrälle pakkausten reaktioita — jotta saadaan sopiva määrä plakkeja — voi kuitenkin olla osoitus heikkolaa ­
tuisesta DNA:sta. Tällaisissa tapauksissa tietoja olisi tarkasteltava varovai ­
sesti, koska ne voivat olla epäluotettavia. Plakkien tai pesäkkeiden optimaa ­
lista kokonaismäärää DNA-näytettä kohti sääntelee tilastollinen todennäköi ­
syys seuloa riittävän monta mutanttia tietyllä spontaanimutaatiotaajuudella. 
Yleisesti ottaen tarvitaan vähintään 125 000–300 000 plakkia, jos spontaa ­
nimutaatiotaajuus on 3 × 10
 –5 (15). Big Blue®  lacI  -testimallin osalta on  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 920
 
tärkeää osoittaa, että koko sarja mutanttien värin fenotyyppejä voidaan hav ­
aita sisällyttämällä sopivia värikontrolleja rinnakkain kunkin maljauksen 
kanssa. Kudoksia ja saatua näytteitä (eriä) olisi käsiteltävä ja analysoitava käyttäen lohkokoetta, jossa kantaja-ainekontrollin/liuotinkontrollin ryhmän, positiivisen kontrollin ryhmän (jos sitä käytetään) tai positiivisen 
kontrolli-DNA:n ryhmän (tarvittaessa) ja kunkin koeryhmän erät käsitellään 
yhdessä.
 
TIEDOT JA RAPORTOINTI  
Tulosten käsittely  
40. Yksittäisiä eläimiä koskevat tiedot olisi esitettävä taulukossa. Kokeellinen 
yksikkö on eläin. Raporttiin olisi sisällyttävä kustakin eläimestä plakkia 
muodostavien yksiköiden tai pesäkkeitä muodostavien yksiköiden kokonais ­
määrä, mutanttien määrä ja kunkin kudoksen mutaatiotaajuus. Jos esiintyy useita reaktioita pakkausta/vapautumista kohti, olisi ilmoitettava reaktioiden 
määrä DNA-näytettä kohti. Tiedot kustakin yksittäisestä reaktiosta olisi säi ­
lytettävä, mutta ainoastaan plakkia muodostavien yksiköiden tai pesäkkeitä muodostavien yksiköiden kokonaismäärä olisi ilmoitettava. Tiedot 34 koh ­
dassa tarkoitetuista myrkyllisyysvaikutuksista ja kliinisistä oireista olisi il ­
moitettava. Sekventointitulokset olisi esitettävä kustakin analysoidusta mu ­
tantista. Tästä johtuvat mutaatiotaajuutta koskevat laskelmat kustakin eläi ­
mestä ja kudoksesta olisi esitettävä.
 
Tilastollinen arviointi ja tulosten tulkinta  
41. Positiivisen tuloksen määrittelemistä varten on useita kriteerejä, kuten an ­
noksesta riippuva mutaatiotaajuuden lisääntyminen, tai mutaatiotaajuuden selkeä lisääntyminen yhdessä koeryhmässä verrattuna liuotinta/kantaja-ai ­
netta saavaan kontrolliryhmään. Vähintään kolmea annosryhmää olisi ana ­
lysoitava, jotta tarjotaan riittävästi tietoa altistumis-vastesuhdetta koskevaa 
analyysia varten. Vaikka tulosten biologinen merkitys on ensisijainen näkö ­
kohta, asianmukaisia tilastollisia menetelmiä voidaan käyttää apuna testin tulosten arvioinnissa (4)(14)(15)(25)(26). Käytetyissä tilastollisissa testeissä 
kokeellisena yksikkönä olisi pidettävä eläintä.
 
42. Testikemikaalia, joiden osalta tulokset eivät täytä edellä mainittuja kriteerejä 
missään kudoksessa, pidetään tässä testissä ei-mutageenisenä. Negatiivisen 
tuloksen biologista merkitystä varten kudosten altistus olisi vahvistettava.  
43. DNA:n sekvensointianalyysien osalta on saatavilla useita tilastollisia mene ­
telmiä, joilla tuetaan tulosten tulkintaa (1)(5)(9)(19).  
44. Sen tarkastelemisella, ovatko havaitut arvot aikaisemman kontrollin arvojen 
puitteissa, voidaan antaa ohjeita, kun arvioidaan vasteen biologista merki ­
tystä (32).  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 921
 
Tutkimusseloste  
45. Tutkimusselosteessa on annettava seuraavat tiedot:  
Testikemikaali:  
— tunnistetiedot mukaan lukien CAS-numero, jos tiedossa,  
— lähde, erän numero, jos saatavilla  
— fysikaalinen olomuoto ja puhtaus  
— tutkimuksen suorittamiselle merkitykselliset fysikaalis-kemialliset omi ­
naisuudet  
— testikemikaalin stabiilius, jos tiedossa  
Liuotin/kantaja-aine:  
— kantaja-aineen valintaperusteet  
— tutkittavan aineen liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja-aineessa, 
jos tiedossa  
— ruoka-aineen, juomaveden tai inhalaatioiden formulointi  
— formulointien analyyttiset määritelmät (kuten stabiilius, homogeenisyys, 
nimelliset pitoisuudet)  
Koe-eläinlajit:  
— käytetty eläinlaji/kanta ja perustelu sen valinnalle  
— eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli  
— toimittaja, häkit, ravinto ja niin edelleen  
— eläinten yksilöllinen paino testin alussa, myös painon vaihteluväli, kes ­
kiarvo ja keskihajonta kussakin ryhmässä.  
Testiolosuhteet:  
— positiiviset ja negatiiviset (kantaja-aine/liuotin) kontrollitiedot  
— raja-annostutkimuksen tulokset  
— annostasojen valintaperusteet  
— testikemikaalin valmistelun yksityiskohdat  
— yksityiskohtaiset tiedot testikemikaalin antotavasta  
— antotavan valintaperusteet  
— eläinten myrkyllisyysvaikutusten mittaamista koskevat menetelmät, 
missä käytetään tarvittaessa histopatologisia tai verianalyyseja, ja tiedot 
siitä, kuinka usein eläimiä koskevat havainnot ja ruumiinpainon mitta ­
ukset otettiin  
— menettelyt, joilla varmistetaan, että testikemikaali välittyi kohdekudok ­
seen tai verenkiertoon, jos saadaan negatiivisia tuloksia  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 922
 
— todellinen annos (mg/painokilo/vrk), joka lasketaan ravintoon/juomave ­
teen sekoitetun testikemikaalin pitoisuudesta (ppm) ja kulutuksesta tar ­
vittaessa  
— yksityiskohtaiset tiedot ravinnon ja veden laadusta  
— yksityiskohtaiset tiedot koe- ja näyteaikataulusta ja perustelut valinnoille  
— lopettamistapa  
— menetelmät eristää ja säilöä kudoksia  
— menetelmät eristää jyrsijöiden genomista DNA:ta, eristää siirtogeeni ge ­
nomisesta DNA:sta ja kuljettaa siirtogeeninen DNA bakteeri-isäntään  
— kaikkien solujen, mittaussarjojen ja reagenssien lähde ja eränumerot 
(tarvittaessa)  
— mutanttien laskemista koskevat menetelmät  
— mutanttien molekyylianalyysi ja käyttö klonaalisuuden ja/tai mutaatio ­
taajuuden laskennan korjaamisessa (tarvittaessa)  
Tulokset:  
— eläimen kunto koeaikaa ennen ja sen aikana, mukaan lukien toksisuus ­
oireet  
— ruumiin ja elinten painot lopetettaessa  
— kunkin kudoksen/eläimen osalta mutanttien lukumäärä, arvioitujen plak ­
kien tai pesäkkeiden lukumäärä, mutaatiotaajuus  
— kunkin kudoksen/eläinryhmän osalta pakkausreaktioiden lukumäärä 
DNA-näytettä kohti, mutanttien kokonaismäärä, keskimääräinen mutaa ­
tiotaajuus, keskihajonta  
— annos-vastesuhde, jos mahdollista  
— kunkin kudoksen/eläimen osalta yksittäisten mutanttien lukumäärä, kes ­
kimääräinen mutaatiotaajuus, jos mutaatioista on tehty molekyyliana ­
lyysi  
— rinnakkaiset ja aikaisemmat negatiivista kontrollia koskevat tiedot, joi ­
hin sisältyvät vaihteluvälit, keskiarvot ja keskihajonta  
— rinnakkaiset positiivista kontrollia (tai ei-rinnakkaiset DNA:n positiivista 
kontrollia) koskevat tiedot  
— analyyttiset määritelmät, jos saatavilla (kuten DNA, pakkauksessa käy ­
tetyt pitoisuudet, DNA:n sekvensointitiedot)  
— käytetyt tilastolliset analyysit ja menetelmät  
Tulosten pohdinta  
Päätelmä  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 923
 
KIRJALLISUUSVIITTEET  
(1) Adams,  W.T. and T.R.  Skopek  (1987), ‘Statistical  Test  for the Comparison 
of Samples from Mutational Spectra’,  J. Mol. Biol ., 194: 391–396.  
(2) Bielas, J.H. (2002), ‘A more Efficient Big Blue® Protocol Improves Trans ­
gene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measurement’,  
Mutation Res. , 518: 107–112.  
(3) Boerrigter, M.E., M.E. Dollé, H.-J. Martus, J.A. Gossen and J. Vijg 
(1995), ‘Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying  in vivo  
Mutations’  Nature , 377(6550): 657–659  
(4) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1995), ‘Statistical Design and Analysis of 
Mutation Studies in Transgenic Mice’  , Environ. Mol. Mutagen , 25(3): 
246–255.  
(5) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1996), ‘Mutational Spectra in Transgenic 
Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency’,  Environ. Mol. Mutagen,  28: 405–413.
 
(6) Dean, S.W., T.M. Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio 
and V. Thybaud (1999), ‘Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can 
Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing  in vivo  for the 
Detection of Site-of-contact Mutagens’,  Mutagenesis , 14(1): 141–151.  
(7) Douglas, G.R., J. Jiao, J.D. Gingerich, J.A. Gossen and L.M. Soper(1995), 
‘Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced by Ethyl ­
nitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of  lacZ  Transgenic Mice’,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 92: 
7485–7489.
 
(8) Douglas, G.R ., J.D. Gingerich, L.M. Soper and J. Jiao (1997), ‘Toward an 
Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells’,  Mutation Res. , 388(2–3): 197–212.
 
(9) Dunson, D.B. and K.R. Tindall (2000), ‘Bayesian Analysis of Mutational 
Spectra’,  Genetics , 156: 1411–1418.  
(10) Gossen, J.A., W.J. de Leeuw, C.H. Tan, E.C. Zwarthoff, F. Berends, P.H. 
Lohman, D.L. Knook and J. Vijg(1989), ‘Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations’  
in vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,  86(20): 7971–7975.
 
(11) Gossen, J.A. and J. Vijg (1993), ‘A Selective System for lacZ-Phage using 
a Galactose-sensitive  E. coli  Host’,  Biotechniques , 14(3): 326, 330.  
(12) Erikson, R.P. (2003), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer’,  Mutation Res. , 543: 125–136.  
(13) Erikson, R.P. (2010), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer: an Update’,  Mutation Res. , 705: 96–106.  
(14) Fung, K.Y., G.R. Douglas and D. Krewski (1998), ‘Statistical Analysis of  
lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays’,  
Mutagenesis , 13(3): 249–255.  
(15) Heddle, J.A., S. Dean, T. Nohmi, M. Boerrigter, D. Casciano, G.R. Doug ­
las, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.C. Mirsalis, H.-J Martus, T.R. Sko ­
pek, V. Thybaud, K.R.Tindall and N. Yajima (2000), ‘In vivo Transgenic Mutation Assays’,  Environ. Mol. Mutagen ., 35: 253–259.
 
(16) Heddle, J.A., H.-J. Martus and G.R. Douglas (2003),‘Treatment and Samp ­
ling Protocols for Transgenic Mutation Assays’,  Environ. Mol. Mutagen. , 
41: 1–6.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 924
 
(17) Jakubczak, J.L., G. Merlino, J.E. French, W.J. Muller, B. Paul, S. Adhya 
and S. Garges (1996), ‘Analysis of Genetic Instability during Mammary 
Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for  in vivo  Mu­
tations in a Bacteriophage λ Transgene TARGET’,  Proc. Natl. Acad. Sci. 
USA, 93(17): 9073–9078.  
(18) Kohler, S.W., G.S. Provost, P.L. Kretz, A. Fieck, J.A. Sorge and J.M. 
Short (1990), ‘The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Mu ­
tagenicity Testing’, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8): 212–218.  
(19) Lewis P.D., B. Manshian, M.N. Routledge, G.B. Scott and P.A. Burns 
(2008), ‘Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra 
using Multivariate Data Analysis’, Carcinogenesis, 29(4): 772–778.  
(20) Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, 
M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda and T. Sofuni 
(1996), ‘A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi  – 
and 6-thioguanine Selections’, Environ. Mol. Mutagen., 28(4): 465–470.  
(21) Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. 
Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda and T. Sofuni (1999), ‘Spi  – Selection: an 
Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice’,  
Environ. Mol. Mutagen ., 34(1): 9–15.  
(22) Nohmi, T., T. Suzuki and K.I. Masumura (2000), ‘Recent Advances in the 
Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays’,  Mutation Res. , 
455(1–2): 191–215.  
(23) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, N  o 19, 
ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.  
(24) OECD (2009), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation 
Assays, Series on Testing and Assessment, N  o 103, ENV/JM/MO ­
NO(2009)7, OECD, Paris.  
(25) Piegorsch, W.W., B.H. Margolin, M.D. Shelby, A. Johnson, J.E. French, 
R.W. Tennant and K.R. Tindall (1995), ‘Study Design and Sample Sizes 
for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay’, Environ. Mol. Mutagen., 
25(3): 231–245.  
(26) Piegorsch, W.W., A.C. Lockhart, G.J. Carr, B.H. Margolin, T. Brooks, … 
G.R. Douglas, U.M. Liegibel, T. Suzuki, V. Thybaud, J.H. van Delft and 
N.J. Gorelick (1997), ‘Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory Stu ­
dy’, Mutation. Res., 388(2–3): 249–289.
 
(27) Singer, T.M., I.B. Lambert, A. Williams, G.R. Douglas and C.L. Yauk 
(2006), ‘Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and 
Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic 
Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays’, Mutation. Res., 598: 164–193.
 
(28) Toyoda-Hokaiwado, N., T. Inoue, K. Masumura, H. Hayashi, Y. Kawa ­
mura, Y. Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa and T. Nohmi (2010), ‘Integration of in vivo Genotoxicity and 
Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats: 
in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Struc ­
tural Isomers’, Toxicol. Sci., 114(1): 71–78.
 
(29) Thybaud, V., S. Dean, T. Nohmi, J. de Boer, G.R. Douglas, B.W. Glick ­
man, N.J. Gorelick, J.A. Heddle, R.H. Heflich, I. Lambert, H.-J. Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki and N. Yajima (2003), ‘ In vivo  Transgenic Mu ­
tation Assays’,  Mutation Res ., 540: 141–151.
 
(30) Vijg, J. and G.R. Douglas (1996), ‘Bacteriophage λ and Plasmid  lacZ 
Transgenic Mice for studying Mutations’  in vivo  in: G. Pfeifer (ed.),  Te­
chnologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II,  Plenum 
Press, New York, NY, USA, s. 391–410.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 925
 
(31) Yauk, C.L., J.D. Gingerich, L. Soper, A. MacMahon, W.G. Foster and 
G.R. Douglas (2005), ‘A  lacZ  Transgenic Mouse Assay for the Detection 
of Mutations in Follicular Granulosa Cells’,  Mutation Res ., 578(1–2): 
117–123.  
(32) Hayashi, M., K. Dearfield, P. Kasper, D. Lovell, H.-J. Martus, V. Thybaud 
(2011), ‘Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Da ­
ta’, Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007.  
(33) OECD (2011),  Retrospective Performance Assessment of OECD Test 
Guideline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays , Series on Testing and Assessment, N
 o 145, ENV/JM/MO ­
NO(2011)20, OECD, Paris.  
(34) Clermont, Y. (1972), ‘Kinetics of spermatogenesis in mammals seminife ­
rous epithelium cycle and spermatogonial renewal’. Physiol. Rev. 52: 198–236.
 
(35) Robaire, B., Hinton, B.T., and Oregbin-Crist, M.-C. (2006), ‘The Epidi ­
dymis’, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., Ri ­
chards, J.S., and P. M, Wassarman (eds.), Physiology of Reproduction, 
Elsevier, the Netherlands, s. 1071–1148.  
(36) Russell, L.B. (2004), ‘Effects of male germ-cell stage on the frequency, 
nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse’, 
Genetica, 122: 25–36.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 926
 
Lisäys  
MÄÄRITELMÄT:  
Altistusaika : se ajanjakso kokonaisuudessaan, jolloin eläimelle annetaan 
annoksia.  
Emäsparin korvautuminen : mutaatiotyyppi, joka johtaa yhden DNA:n nukleo ­
tidiemäksen korvautumisen toisella DNA:n nukleotidiemäksellä.  
Kapsidi : viruspartikkelin kuorena oleva proteiini.  
Kemikaali : aine tai aineiden seos.  
Kloonaalinen laajeneminen : useiden solujen tuotanto yhdestä solusta (mutant ­
tisolu).  
Pesäkkeitä muodostava yksikkö : elinkykyisten (elävien) bakteerien määrän 
mitta.  
Konkatameeri : pitkä jatkuva biomolekyyli, joka koostuu moninkertaisista sa ­
manlaisista kopioista, jotka liittyvät sarjaan.  
Cos-kohta : 12 nukleotidin segmentti yksijuosteisesta DNA:sta, joka on olemassa 
lambda-faagin (bakteriofagi lambda) kaksijuosteisen genomin kummassakin päässä.  
Deleetio : mutaatio, jossa genomista häviää yksi tai useampi (peräkkäinen) 
nukleotidi.  
Elektroporaatio : sähköiskujen käyttäminen, jolla lisätään solun kalvojen läpäi ­
sykykyä.  
Endogeeninen geeni : genomiin kuuluva geeni.  
Ekstrabinomiaalinen vaihtelu : suurempi vaihtelu populaation osuuden toiston 
arviossa kuin oletettaisiin, jos populaatio olisi binomijakautunut.  
Lukukehysmutaatio : geneettinen mutaatio, jonka aiheuttavat useiden nukleoti ­
dien insertiot tai deleetiot ja jota ei voida jakaa tasan kolmella DNA-sekvensissä, 
joka koodaa proteeinia/peptidiä.  
Insertio : yhden tai useamman nukleotidin emäsparin liittyminen 
DNA-sekvenssiin.  
Jackpot-mutaatio : suuri määrä mutantteja, jotka syntyivät klonaalisella laajenta ­
misella yhdestä mutaatiosta.  
Suuret deleetiot : usean kiloemäksen deleetiot DNA:ssa (jotka havaitaan tehok ­
kaasti Spi  – selection- ja lacZ plasmid -mallin testeissä).  
Ligaatio : DNA-molekyylien kahden pään välinen kovalenttinen side käyttäen 
DNA-ligaasia.  
Mitogeeni : kemikaali, joka stimuloi solua kiihdyttämään solunjakautumista käyn ­
nistäen mitoosin (eli solun jakautumisen).  
Neutraali geeni : geeni, johon positiivinen tai negatiivinen selektiivinen paine ei 
vaikuta.  
Pakkaus : infektoivan faagin partikkeleiden, jotka ovat peräisin faagin kapsidin ja 
häntäproteiinien preparaatiosta, ja faagin DNA-molekyylien konkatameerin syn ­
teesi. Käytetään yleisesti pakkaamaan DNA:ta, joka on kloonattu lambdavektoriin (jota erottavat cos-kohdat), infektoiviksi lambdahiukkasiksi.
 
Pakkaustehokkuus : tehokkuus, jolla pakatut bakteriofagit vastaanotetaan 
bakteeri-isännässä.  ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 927
 
Plakin muodostava yksikkö (PFU) : elinkykyisten bakteriofagien määrän mitta.  
Pistemutaatio : yleinen termi mutaatiolle, joka vaikuttaa vain lyhyeen 
DNA-sekvenssiin mukaan lukien pienet insertiot, deleetiot ja emäsparin 
korvautumiset.  
Positiivinen valinta : menettely, jonka perusteella ainoastaan mutantit voivat sel ­
viytyä.  
Reportterigeeni : geeni, jonka mutanttigeenituote on helposti havaittavissa  
Näytteenottoaika : se eläimen lopettamista edeltävän ajanjakson loppu, jonka 
aikana kemikaalia ei anneta ja jonka aikana korjaamattomat DNA-vauriot kiin ­
nittyvät stabiileihin mutaatioihin.  
Sukkulavektori : vektori, joka on muodostunut niin, että se voi toimia kahdessa 
eri isäntäsolutyypissä; vastaavasti DNA:ta, joka liitetään sukkulavektoriin, voi ­
daan testata tai käsitellä kahdessa eri solutyypissä tai kahdessa eri organismissa.  
Testikemikaali : mikä tahansa aine tai seos, jota testataan käyttämällä tätä testi ­
menetelmää.  
Siirtogeeninen : sellainen organismi (tai organismiin liittyvä tai siitä peräisin 
oleva organismi), jonka genomia on muutettu siirtämällä siihen toisen lajin geeni tai geenejä.
 ▼M5 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 928
 
OSA C: EKOMYRKYLLISYYDEN MÄÄRITTÄMISMENETELMÄT  
SISÄLLYSLUETTELO 
C.1. AKUUTTI MYRKYLLISYYS KALALLE C.2. AKUUTIN IMMOBILISAATION TESTI 
C.3. MAKEAN VEDEN LEVIEN JA SYANOBAKTEERIEN KAS ­
VUNESTYMISTESTI 
C.4. BIOHAJOAVUUDEN MÄÄRITYS OSA I. YLEISTÄ OSA II. DOC DIE-AWAY-KOE (Menetelmä C.4-A) 
OSA III. MUUNNELTU OECD-SEULONTAKOE (Menetelmä C.4-B) 
OSA IV. HIILIDIOKSIDIN MUODOSTUMISKOE (Menetelmä C.4-C) OSA V. MANOMETRINEN RESPIROMETRIAKOE (Menetelmä C.4-D) OSA VI. SULJETUN PULLON MENETELMÄ (Menetelmä C.4-E) OSA VII. MITI-KOE (Menetelmä C.4-F) C.5. HAJOAMINEN — BIOKEMIALLINEN HAPENKULUTUS C.6. HAJOAMINEN — KEMIALLINEN HAPENKULUTUS C.7. HAJOAMINEN — ABIOOTTINEN HAJOAMINEN: HYDRO ­
LYYSI PH:NFUNKTIONA 
C.8. MYRKYLLISYYSTUTKIMUS MADOILLA C.9. BIOLOGINEN HAJOAMINEN — ZAHN-WELLENS-TESTI C.10. SIMULAATIOTUTKIMUS: AEROBINEN VIEMÄRILIETTEEN 
KÄSITTELY: C.10-A: AKTIIVILIETEYKSIKÖT – C.10-B: BIO ­
KALVOT 
C.11. BIOLOGINEN HAJOAMINEN — AKTIIVILIETTEEN SOLU ­
HENGITYKSEN INHIBITIOTESTI 
C.12. BIOLOGINEN HAJOAMINEN — MODIFIOITU SCAS-TESTI C.13. BIOKERTYVYYS: TESTI KALOILLA LÄPIVIRTAUSOLO ­
SUHTEISSA 
C.14. KALANPOIKASILLA TEHTÄVÄ KASVUTESTI C.15. KALAN ALKIO- JA RUSKUAISPUSSIVAIHEEN POIKA ­
SILLA TEHTÄVÄ LYHYTAIKAINEN MYRKYLLISYYS ­
TESTI 
C.16. MEHILÄISET — SUUN KAUTTA TAPAHTUNEEN ALTIS ­
TUKSEN JÄLKEEN ILMENEVÄN VÄLITTÖMÄN MYRKYL ­
LISYYDEN TESTI 
C.17. MEHILÄISET — KOSKETUS ALTISTUKSEN JÄLKEEN IL ­
MENEVÄN VÄLITTÖMÄN MYRKYLLISYYDEN TESTI 
C.18. ADSORPTIO/DESORPTIO ERÄTASAPAINOMENETELMÄÄ 
KÄYTTÄEN
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 929
 
C.19. MAA-AINEKSIIN JA VIEMÄRILIETTEESEEN SOVELLETTA ­
VAN ADSORPTIOKERTOIMEN  (K  OC ) MÄÄRITYS KOR ­
KEAN SUORITUSKYVYN NESTEKROMATOGRAFIALLA 
(HPLC) 
C.20. LISÄÄNTYMISTESTI VESIKIRPULLA  (DAPHNIA MAGNA)  
C.21. MAAPERÄN MIKROBIT: TYPEN MUUNTUMISTESTI C.22. MAAPERÄN MIKROBIT: HIILEN MUUNTUMISTESTI C.23. KEMIKAALIEN AEROBINEN JA ANAEROBINEN HAJOAMI ­
NEN MAAPERÄSSÄ 
C.24. AEROBINEN JA ANAEROBINEN HAJOAMINEN VESIYM ­
PÄRISTÖN SEDIMENTTIJÄRJESTELMISSÄ 
C.25. AEROBINEN MINERALISAATIO PINTAVEDESSÄ – BIOHA ­
JOAVUUDEN SIMULAATIOTESTI 
C.26. LIMASKOJEN ( LEMNA  SP.) KASVUNESTYMISTESTI
 
▼M4 
C.27. MYRKYLLISYYSTESTI CHIRONOMID-ELIÖLLÄ VESI-SED- 
IMENTTISYSTEEMISSÄ KÄYTTÄEN SEDIMENTTIÄ, JO ­
HON TUTKITTAVAA AINETTA ON LISÄTTY 
C.28. MYRKYLLISYYSTESTI CHIRONOMID-ELIÖLLÄ VESI-SED- 
IMENTTISYSTEEMISSÄ KÄYTTÄEN VETTÄ, JOHON TUT ­
KITTAVAA AINETTA ON LISÄTTY 
C.29. BIOHAJOAVUUS – CO  2 SULJETUISSA ASTIOISSA (HEADS ­
PACE-TESTI) 
C.30. BIOKERTYVYYS MAALLA ELÄVISSÄ HARVASUKASMA ­
DOISSA  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 930
 
C.1 AKUUTTI MYRKYLLISYYS KALALLE  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Tällä menetelmällä voidaan määrittää aineen akuutti tappava myrkyl ­
lisyys kalalle makeassa vedessä. Sopivimman testimenetelmän (staat ­
tinen, puolistaattinen tai läpivirtaus) löytämiseksi on suositeltavaa hankkia mahdollisuuksien mukaan tietoa aineen vesiliukoisuudesta, höyrynpaineesta, kemiallisesta stabiiliudesta, dissosiaatiovakiosta ja 
biohajoavuudesta. Näin voidaan varmistaa, että aineen pitoisuus py ­
syy lähes vakiona koejakson aikana.
 
Kokeen suunnittelussa ja tulosten tulkinnassa on otettava huomioon 
mahdolliset lisätiedot (esimerkiksi aineen rakennekaava, puhtausaste, 
merkittävien epäpuhtauksien laatu ja pitoisuus, lisäaineiden läsnäolo 
ja määrä sekä n-oktanoli/vesi-jakautumiskerroin).  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Akuutti myrkyllisyys on selvästi havaittava haitta, joka aiheutuu 
eliölle lyhyen ajan kuluessa aineelle altistumisen jälkeen. Kuvatta ­
vassa kokeessa akuutti myrkyllisyys ilmaistaan tappavan pitoisuuden 
mediaanina (LC  50 ). Tappavaa pitoisuutta käytettäessä 50 % vedessä 
olevasta kalaerästä kuolee määritetyn altistusajan kuluessa.  
Testattavan aineen kaikki pitoisuudet ilmaistaan painoyksikköinä ti ­
lavuutta kohti (mg/l). Pitoisuus voidaan ilmaista myös painoyksik ­
köinä painoa kohti (mg/kg  -1 ). 
1.3 VERTAILUAINEET  
Vertailuainetta testaamalla voidaan osoittaa, että laboratorio-olosuh ­
teissa testattavien lajien vaste ei ole merkittävästi muuttunut.  
Kuvattavaa koetta varten ei ole määritetty vertailuainetta.  
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Rajatestin (100 mg/l) avulla voidaan osoittaa, että LC  50 -arvo on suu ­
rempi kuin rajatestipitoisuus.  
Kaloja altistetaan veteen lisätylle aineelle eri pitoisuuksia käyttäen 96 
tunnin ajan. Kuolleisuus kirjataan vähintään 24 tunnin väliajoin ja 
mahdollisuuksien mukaan lasketaan kunkin havaintohetken pitoisuus, joka on tappanut 50 % kaloista (LC
 50 ). 
1.5 LAATUKRITEERIT  
Laatukriteerejä on sovellettava sekä rajatestiin että kattavaan testiin.  
Kontrolliryhmien kuolleisuus kokeen päätyttyä ei saa ylittää 10:tä % 
(tai yhtä kalaa, jos ryhmän koko on alle kymmenen kalaa).  
Veteen liuenneen hapen pitoisuuden on ollut oltava yli 60 % testi ­
lämpötilan ilmakyllästymisarvosta.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 931
 
Testattavan aineen pitoisuuden on koko testin ajan oltava vähintään 
80 % alkupitoisuudesta.  
Jos aine liukenee helposti veteen muodostaen stabiilin liuoksen (aine 
ei merkittävästi haihdu, pilkkoudu, hydrolysoidu tai adsorboidu), al ­
kupitoisuutta voidaan pitää nimellisenä pitoisuutena. On esitettävä 
todisteet siitä, että pitoisuudet on pidetty vakiona testin ajan ja että 
laatukriteerit on täytetty.  
Jos aine  
i) on huonosti veteen liukenevaa,  
ii) pystyy muodostamaan stabiileja emulsioita tai dispersioita,  
iii) ei ole stabiilia vesiliuoksissa,  
alkupitoisuutena pidetään liuoksesta mitattua pitoisuutta (jos tämä ei 
ole teknisesti mahdollista, pitoisuus mitataan vesipatsaasta) testin 
alussa. Pitoisuus määritetään tasapainon saavuttamisen jälkeen, 
mutta ennen testattavien kalojen lisäämistä.  
Tällaisissa tapauksissa testin kuluessa on tehtävä lisämittauksia, 
joilla voidaan varmistaa todelliset altistuspitoisuudet ja laatukritee ­
rien täyttyminen.  
pH-arvo saa vaihdella enintään yhden yksikön verran.  
1.6 MENETELMÄKUVAUS  
Käytettävissä on kolme erityyppistä menetelmää:  
Staattinen koe  
Tässä myrkyllisyyskokeessa vesiliuos ei virtaa (liuokset pysyvät 
muuttumattomina testin ajan).  
Puolistaattinen koe  
Tässä kokeessa vesiliuos ei virtaa, mutta se vaihdetaan säännöllisesti 
(esimerkiksi 24 tunnin väliajoin) eräkohtaisesti.  
Läpivirtauskoe  
Myrkyllisyyskoe, jossa testikammioiden vesi vaihtuu jatkuvasti. Tes ­
tattava kemikaali kulkeutuu veden mukana.  
1.6.1  Reagenssit  
1.6.1.1  Testattavien aineiden liuokset  
Valmistetaan halutun pitoisia kantaliuoksia liuottamalla ainetta ioni ­
soimattomaan veteen tai kohdan 1.6.1.2 mukaiseen veteen.  
Halutut testipitoisuudet valmistetaan kantaliuosta laimentamalla. jos 
testataan suuria pitoisuuksia, aine voidaan liuottaa suoraan laimen ­
nusveteen.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 932
 
Yleensä aineita ei pidä testata liukoisuusrajan ylittävinä pitoisuuksi ­
na. Joidenkin aineiden kohdalla — esimerkiksi sellaisten, jotka liu ­
kenevat huonosti veteen (suuri P  ow -arvo) ja sellaisten, jotka muodos ­
tavat dispersioita todellisen liuoksen sijasta — on hyväksyttävää käyttää liukoisuusrajan ylittävää testipitoisuutta, jotta voidaan var ­
mistaa, että ainetta on liuennut mahdollisimman paljon ja että liuos 
on stabiili. On kuitenkin tärkeää, että tämä pitoisuus ei muutoin häiritse testijärjestelmää (esimerkiksi muodostamalla veden pinnalle kalvon, joka estää veden hapettumisen).
 
Jos aine liukenee huonosti veteen, kantaliuoksen valmistamisessa tai 
aineen dispergoimisessa testiliuokseen voidaan käyttää apuna ultra ­
äänidispersiota, orgaanisia liuottimia, emulsioliuottimia tai dispergoi ­
misaineita. Jos tällaisia apuaineita käytetään, kaikkien testipitoisuuk ­
sien on sisällettävä sama määrä apuainetta ja erillinen kalojen kont ­
rolliryhmä on altistettava testisarjan apuainepitoisuudelle. Tällaisten 
apuaineiden pitoisuudet on pidettävä mahdollisimman matalina, ei ­
vätkä ne koskaan saa ylittää arvoa 100 mg/l testiliuosta.  
Koe suoritetaan ilman pH-arvon säätöjä. Jos havaitaan merkkejä pH- 
arvon merkittävästä muutoksesta, on suositeltavaa tehdä toinen koe, 
jossa käytetään pH-säätöä, ja raportoida tulokset. Tässä tapauksessa kantaliuoksen pH-arvo säädetään samaksi kuin laimennusveden pH- arvo, ellei tätä vastaan ole erityistä syytä. Suositeltavat pH-säätöai ­
neet ovat HCl ja NaOH; pH-säätö on tehtävä siten, ettei kantaliu ­
oksen testiainepitoisuus muutu merkittävästi. Jos pH-säädön seurauk ­
sena tapahtuu jokin kemiallinen reaktio tai testiaine saostuu, ilmiö on raportoitava.
 
1.6.1.2  Säilytys- ja laimennusvesi  
Voidaan käyttää juomavettä (jossa ei ole potentiaalisesti vaarallisia 
pitoisuuksia klooria, raskasmetalleja tai muita aineita), hyvänlaatuista 
luonnonvettä tai sekoitevettä (katso liitettä I). Suositeltavat kovuus ­
arvot ovat 10–250 mg/l CaCO  3 ja suositeltavat pH-arvot 6,0–8,5.  
1.6.2  Laite  
Laitteiden on oltava kemiallisesti inerttiä materiaalia. Seuraavat lait ­
teet tarvitaan:  
— automaattinen laimennusjärjestelmä (läpivirtauskoetta varten),  
— happimittari,  
— laite veden kovuuden määritykseen,  
— lämpötilan säätölaite,  
— pH-mittari.  
1.6.3  Testattavat kalat  
Kalojen on oltava terveitä, eikä niissä saa olla näkyviä epämuodos ­
tumia.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 933
 
Lajit valitaan käytännöllisten seikkojen perusteella. Tällaisia perus ­
teita ovat esimerkiksi ympärivuotinen saatavuus, ylläpidon helppous, 
soveltuvuus testaukseen, suhteellinen kemikaaliherkkyys ja muut ta ­
loudelliset, biologiset sekä ekologiset tekijät, joilla voi olla vaikutus ­
ta. Kalalajien valinnassa on otettava huomioon myös saatujen tieto ­
jen vertailukelpoisuus ja voimassa oleva kansainvälinen yhdenmu ­
kaistaminen (viite 1).  
Luettelo tätä koetta varten suositeltavista kalalajeista on liitteessä 
2. Suositeltavia lajeja ovat seeprakala ja kirjolohi.  
1.6.3.1  Säilytys  
Kalat on mieluiten otettava yhdestä ainoasta samanpituisesta ja -ikäi ­
sestä kannasta. Kaloja on säilytettävä vähintään 12 päivän ajan seu ­
raavissa olosuhteissa:  
Täyttötapa  
Täyttötavan on oltava sopiva järjestelmää ja kalalajia ajatellen.  
Vesi 
Katso kohtaa 1.6.1.2.  
Valo  
Päivittäisen valojakson pituus on 12–16 tuntia.  
Liuenneen hapen pitoisuus  
Vähintään 80 % kyllästysarvosta.  
Ruokinta  
Kaloja ruokitaan kolme kertaa viikossa tai päivittäin. Ruokinta lope ­
tetaan 24 tuntia ennen kokeen alkua.  
1.6.3.2  Kuolleisuus  
48 tunnin asettumisajan jälkeen kuolleisuus kirjataan seuraavia kri ­
teerejä soveltaen:  
— yli 10 % populaatiosta seitsemässä päivässä:  
koko erä hylätään  
— 5–10 % populaatiosta:  
tarkkailujaksoa jatketaan seitsemällä päivällä. Ellei lisäkuollei ­
suutta esiinny, erä hyväksytään  
— alle 5 % populaatiosta:  
erä hyväksytään.  
1.6.4  Sopeutuminen  
Kaloja on altistettava kokeessa käytettävälle vedelle ja lämpötilalle 
vähintään seitsemän päivän ajan ennen kalojen käyttöä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 934
 
1.6.5  Testin suorittaminen  
Ennen varsinaista testiä voidaan tehdä alueenmäärityskoe, jonka avulla 
saadaan tietoja varsinaisessa testissä käytettävistä pitoisuuksista.  
Testiryhmän lisäksi käytetään kontrolliryhmää, jota ei altisteta aineel ­
le. Jos aineen liuottamiseen on käytetty apuainetta, on käytettävä 
toista kontrolliryhmää, joka altistetaan apuaineelle.  
Valitaan staattinen, puolistaattinen tai läpivirtaukseen perustuva me ­
netelmä testattavan aineen fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuk ­
sien mukaan.  
Kalat altistetaan aineelle seuraavasti:  
— aika: 96 tuntia,  
— eläinten määrä: vähintään 7 kalaa pitoisuutta kohti,  
— säiliöt: tilavuus on mukautettava kuormitussuosituksen mukaan,  
— kuormitus: staattista ja puolistaattista koetta varten kuormituksen 
enimmäisarvoksi suositellaan 1 g/l (läpivirtausjärjestelmissä kuor ­
mitus voi olla suurempi),  
— aineen pitoisuus: vähintään viisi pitoisuutta, jotka poikkeavat toi ­
sistaan kertoimella, jonka enimmäisarvo on 2,2, ja jotka kattavat kuolleisuusalueen 0–100 % mahdollisimman hyvin,
 
— vesi: katso kohtaa 1.6.1.2,  
— valo: 12–16 tuntia valoa päivittäin,  
— lämpötila: lajille sopiva lämpötila (katso liitettä 2), joka saa vaih ­
della yksittäisen kokeen aikana enintään ± 1  o C, 
— veteen liuennut happi: vähintään 60 % valitun lämpötilan ilma ­
kyllästymisarvosta,  
— ruokinta: kaloja ei ruokita.  
Kalat tutkitaan ensimmäisten 2–4 tunnin aikana ja vähintään 24 tunnin 
väliajoin. Kalat katsotaan kuolleiksi, jos pyrstön koskettaminen ei tuota mitään reaktiota eikä hengitysliikkeitä voi havaita. Kuolleet kalat poistetaan ja kuolleisuudet kirjataan. Näkyvistä poikkeavuuksista pide ­
tään kirjaa. Näitä ovat esimerkiksi tasapainon menettäminen ja muu ­
tokset uintitavassa, hengitystoiminnoissa sekä pigmentaatiossa.
 
Liuoksen pH, liuennut happi ja lämpötila mitataan päivittäin.  
Rajatesti  
Tämän testimenetelmän avulla voidaan suorittaa rajatesti pitoisuu ­
della 100 mg/l, millä osoitetaan, että LC  50 -arvo on suurempi kuin 
rajapitoisuus.  
Jos aineesta ei saada vesiliuosta, jonka pitoisuus on 100 mg/l, raja ­
testi tehdään pitoisuudella, joka vastaa aineen liukoisuutta (tai enim ­
mäispitoisuutta, jolla saadaan stabiili dispersio) käytettävään veteen 
(katso myös kohtaa 1.6.1.1).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 935
 
Rajatestiin tarvitaan 7–10 kalaa ja samankokoinen kontrolliryhmä 
(yksi tai kaksi kontrolliryhmää). (Binomiteorian mukaan LC  50 -arvo 
on 99,9 prosentin varmuudella suurempi kuin rajatestissä käytetty pitoisuus, jos yhtään kalaa kymmenestä ei kuole. Jos käytetään 7, 8 tai 9 kalaa, nollakuolleisuus osoittaa vähintään 99 prosentin var ­
muudella, että LC
 50 -arvo on suurempi kuin käytetty pitoisuus.)  
Jos kaloja kuolee, on tehtävä kattava testi. Jos havaitaan vaikutuksia, 
jotka eivät ole hengenvaarallisia, ne on kirjattava.  
2. TIEDOT JA ARVIOINTI  
Jokaista havaintohetkeä (24:ää, 48:aa, 72:ta ja 96:ta tuntia) kohden 
piirretään jokaisen suositellun altistusjakson kuolleisuusprosentti pi ­
toisuuden funktiona logaritmitodennäköisyyspaperille.  
LC 50 -arvo ja luottamusvälit (p = 0,05) arvioidaan havaintohetkittäin 
mahdollisuuksien mukaan yleisiä menetelmiä käyttäen. Arvot pyöris ­
tetään yhteen tai enintään kahteen merkitsevään numeroon (esi ­
merkki pyöristyksestä kahteen merkitsevään numeroon: 173,5 > 170; 0,127 > 0,13; 1,21 > 1,2).
 
Jos pitoisuus/vaste ( %) -käyrä on liian jyrkkä LC  50 -arvon laskemi ­
seksi, arvon graafinen arvio on riittävän tarkka.  
Jos kaksi peräkkäistä pitoisuutta (käyttäen kerrointa 2,2) antavat tu ­
lokseksi vain 0 %:n ja 100 %:n kuolleisuuden, nämä kaksi arvoa 
riittävät osoittamaan alueen, johon LC  50 osuu.  
Jos todetaan, että testattavan aineen stabiiliutta tai homogeenisuutta 
ei voida ylläpitää, tämä on raportoitava ja otettava huomioon tulosten 
tulkinnassa.  
3. RAPORTOINTI  
Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat 
tiedot:  
— kalan tiedot kunkin pitoisuuden osalta (tieteellinen nimi, kanta, 
toimittaja, mahdolliset esikäsittelyt, koko ja määrä),  
— laimennusveden lähde ja tärkeimmät kemialliset ominaisuudet 
(pH, kovuus, lämpötila),  
— kantaliuoksen ja testiliuoksen valmistustapa, jos aine on huonosti 
veteen liukenevaa,  
— mahdollisten apuaineiden pitoisuudet,  
— luettelo käytetyistä pitoisuuksista ja käytettävissä olevat tiedot 
testattavan kemikaalin näiden pitoisuuksien stabiiliudesta käyte ­
tyssä testiliuoksessa,  
— käytetyt menetelmät ja saadut tulokset, jos on tehty kemiallisia 
analyysejä,  
— mahdollisen rajatestin tulokset,  
— käytetyn menetelmän valintaperusteet ja yksityiskohtaiset tiedot 
(staattinen, puolistaattinen, annostelunopeus, läpivirtausnopeus, 
onko käytetty ilmastusta, kalakuormitus jne.),  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 936
 
— laitteen kuvaus,  
— valo-olosuhteet,  
— testiliuokscn liuenneen hapen pitoisuus, pH-arvo ja lämpötila 24 
tunnin väliajoin,  
— todisteet laatukriteereiden täyttämisestä,  
— taulukko, josta ilmenee kumulatiivinen kuolleisuus kussakin pi ­
toisuudessa ja kontrolliryhmän (sekä tarvittaessa apuaineen kont ­
rolliryhmän) tulokset kunakin suositeltuna tarkkailuajankohtana,  
— pitoisuus/vaste ( %) -käyrä kokeen päätyttyä,  
— mahdollisuuksien mukaan LC  50 -arvot kunakin suositeltuna tark ­
kailuajankohtana (95 prosentin luottamusrajoin),  
— LC  50 -arvon määrityksessä käytetyt tilastolliset menetelmät,  
— mahdollisen vertailuainetta avulla saadut tulokset,  
— suurin testiliuoksen pitoisuus, joka ei ole aiheuttanut kuollei ­
suutta kokeen aikana,  
— pienin testiliuoksen pitoisuus, joka on aiheuttanut 100 prosentin 
kuolleisuuden kokeen aikana.  
4. VIITTEET  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the 
Council C(81) 30 final and updates.  
(2) AFNOR — Determination of the acute toxity of a subs ­
tance to  Brachydanio rerio  — Static and Flow Through 
methods — NFT 90-303 June 1985.  
(3) AFNOR — Determination of the acute toxity of a subs ­
tance to  Salmo gairdneri  — Static and Flow Through met ­
hods — NFT 90-305 June 1985.  
(4) ISO 7346/1, 11 and /3 — Water Quality — Determination 
of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio  Hamilton-Buchanan —  Teleostei, 
Cyprinidae).  Part 1: Static method. Part 2: Semi-static met ­
hod. Part 3: Flow-through method.
 
(5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtli ­
nien für Probenahme und Normung von Wasseruntersu ­
chungsmethoden — Part II 1974.  
(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) 
und L(15).  
(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.  
(8) NEN 6506 — Water — Bepaling van de akute toxiciteit 
met behulp van  Poecilia reticulata,  1980.  
(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute 
toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. 
The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aqua ­
tic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75- 009, 1975.
 
(10) Environmental Protection Agency, Environmental monito ­
ring and support laboratory, Office of Research and Deve ­
lopment, EPA-600/4-78-012, January 1978.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 937
 
(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Cont ­
rol, Part IV, 16 March 1979.  
(12) Standard methods for the examination of water and waste ­
water, 14th edition, APHA-AWWA-WPCK, 1975.  
(13) Commission of the European Communities, Inter-Labora ­
tory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC 
Study D.8368, 22 March 1979.
 
(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten 
Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die Ökotoxikologische Bewertung von Um ­
weltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 
1986.
 
(15) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method for 
evaluating dose effects experiments, J. Pharm. and Exp. Therap., 1949, vol 96, 99.
 
(16) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Grif ­
fin, Weycombe, U. K, 1978.  
(17) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I 
Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793–821.
 
(18) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II 
Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, 
vol. 4, 3–32.  
(19) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aqua ­
tic Toxicology and Hasard Evaluation (edited by F. I. Ma ­
yer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and 
Materials. ASTM STP 634, 1977, 65–84.  
(20) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and 
Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC
 50 . US EPA.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 938
 
Lisäys 1  
Sekoitevesi  
Esimerkki sopivasta laimennusvedestä  
Kaikkien kemikaalien on oltava analyyttistä laatua.  
Veden on oltava hyvänlaatuista tislattua tai ionisoimatonta vettä, jonka johtavuus 
on alle 5 μS/cm  -1 . 
Veden tislauslaite ei saa sisältää kuparista valmistettuja osia.  
Kantaliuokset  
CaCl  2 x 2 H  2 O (kalsiumklorididihydraatti): 
Liuotetaan veteen ja laimennetaan litran tilavuuteen 11,76 g 
MgSO  4 x 7 H  2 O (magnesiumsulfaattiheptahydraatti): 
Liuotetaan veteen ja laimennetaan litran tilavuuteen 4,93 g 
NaHCO  3 (natriumvetykarbonaatti): 
Liuotetaan veteen ja laimennetaan litran tilavuuteen 2,59 g 
KO (kaliumkloridi): 
Liuotetaan veteen ja laimennetaan litran tilavuuteen 0,23 g  
Sekoitettu laimennusvesi  
25 ml kutakin kantaseosta sekoitetaan ja liuos laimennetaan litran tilavuuteen.  
Liuosta ilmastetaan, kunnes liuenneen hapen pitoisuus saavuttaa ilmakyllästymis ­
arvon.  
pH-arvon on oltava 7,8 ± 0,2.  
pH:ta säädetään tarvittaessa NaOH:lla (natriumhydroksidilla) tai HCl:llä (suola ­
hapolla).  
Näin valmistettu sekoitevesi pannaan syrjään noin 12 tunniksi, eikä sitä tarvitse 
enää ilmastaa.  
Liuoksen Ca- ja Mg-ionien yhteenlaskettu pitoisuus on 2,5 millimoolia/1. Ca- ja 
Mg-ionien suhde on 4:1 ja Na- ja K-ionien suhde 10:1. Liuoksen kokonaisalkali ­
suus on 0,8 millimoolia/1.  
Mahdolliset poikkeavuudet laimennusveden valmistuksessa eivät saa vaikuttaa 
veden koostumukseen tai sen ominaisuuksiin.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 939
 
Liite 2  
Suositeltavat kalalajit  
Suositeltava laji Suositeltava testi ­
lämpötila-alue 
( o C) Koe-eläimen suo ­
siteltava koko ­
naispituus (cm)  
Bracbydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Hamilton-Buchanan) seeprakala 20–24 3,0 ± 0,5  
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)  
(Rafinesque) Fathead minnow 20–24 5,0 ± 2,0  
Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Linnaeus 1758) karppi 20–24 6,0 ± 2,0  
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) Cyp ­
rinodontidae  (Tomminck et Schlegel 1850) 
Red killifish 20–24 3,0 ± 1,0  
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)  
(Peters 1859) miljoonakala 20–24 3,0 ± 1,0  
Lepomis macrochirus(Teleostei, Centrarchi ­
dae) (Rafinesque Linnaeus 1758) Bluegill 20–24 5,0 ± 2,0  
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmoni ­
dae) (Walbaum 1988) kirjolohi 12–17 6,0 ± 2,0  
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae)  (Lin­
naeus 1758) säyne 20–24 6,0 ± 2,0  
Saatavuus  
Edellä luetellut kalalajit ovat helposti viljeltävissä tai yleisesti saatavissa läpi 
koko vuoden. Niitä voidaan viljellä kalanviljelylaitoksissa tai laboratorioissa, edellyttäen, että sairauden ja loisten esiintymistä valvotaan. Näin saadaan terveitä 
koe-eläimiä, joiden tausta on tiedossa. Näitä kalalajeja on saatavana suuressa 
osassa maailmaa.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 940
 
Liite 3  
Pitoisuusesimerkki: prosentuaalinen kuolleisuus  
Esimerkki LC  50 -määrityksestä logaritmitodennäköisyyspaperin avulla
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 941
 
C.2. DAPHNIA  SP. AKUUTIN IMMOBILISAATION TESTI  
1. MENETELMÄ  
Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta TG 2002 (2004).  
1.1 JOHDANTO  
Tällä menetelmällä testataan akuuttia myrkyllisyyttä arvioimalla kemi ­
kaalien vaikutuksia vesikirppuihin  (Daphnia).  Jo olemassa olevia tes ­
timenetelmiä käytetään hyväksi mahdollisuuksien mukaan (1) (2) (3).  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Tässä testimenetelmässä käytetään seuraavia määritelmiä:  
EC 50 : pitoisuus, jossa 50 % vesikirpuista arvioidaan immobilisoitu ­
van määrätyn altistusajan kuluessa. Jos käytetään muuta määritelmää, se on ilmoitettava viittauksineen.
 
Immobilisaatio:  Eläimet, jotka eivät kykene uimaan 15 sekunnin 
kuluessa sen jälkeen, kun testiastiaa on heilutettu varovasti, katsotaan 
immobilisoituneiksi (vaikka ne voisivat edelleen liikuttaa tuntosarvi ­
aan).  
1.3 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Nuoria vesikirppuja (testin alussa alle 24 tunnin ikäisiä) altistetaan 
testiaineelle sopivaksi arvioidulla pitoisuusalueella 48 tunnin ajan. 
Immobilisaatio kirjataan 24 ja 48 tunnin kuluttua ja sitä verrataan 
kontrolliarvoihin. Tulokset analysoidaan EC  50 :n laskemiseksi 48 tun ­
nin kohdalla (katso määritelmät kohdassa 1.2). EC  50 :n määrittely 24 
tunnin kohdalla on vapaaehtoista.  
1.4 TESTIAINETTA KOSKEVAT TIEDOT  
Testiaineen vesiliukoisuus ja höyrynpaine on oltava tiedossa, ja ai ­
neen kvantifioimiseksi testiliuoksissa on oltava käytettävissä luotet ­
tava analyysimenetelmä, jonka saantoteho on raportoitu, ja määritys ­
raja pitäisi olla saatavissa. Tarpeellisia tietoja ovat mm. rakennekaa ­
va, aineen puhtaus, stabiilisuus vedessä tai valossa, P  ow ja helpon 
biohajoavuuden testin (ks. testimenetelmä C.4) tulokset.  
Huom.: Ohjeita sellaista tapausta varten, kun fysikokemialliset ominai ­
suudet tekevät testiaineista vaikeasti testattavia: kirjallisuusviite (4).  
1.5 VERTAILUAINEET  
Testiolosuhteiden luotettavuuden varmistamiseksi EC  50 voidaan tes ­
tata vertailuaineella. Tätä tarkoitusta varten suositellaan kansainväli ­
sissä yhteistutkimuksissa (ring test) käytettyjä myrkyllisiä kemikaa ­
leja (1) (5) (  1 ). Suosituksena on, että vertailuaineella tehtävä koe tai 
kokeet suoritetaan joka kuukausi ja ainakin kahdesti vuodessa.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 942  
( 1 ) Näiden monilaboratoriotestien tulosten sekä oikaistun ISO 634 -standardin mukaan kali ­
umdikromaatin (K  2 Cr 2 O7) EC50 (24 h) sijoittuu välille 0,6 mg/l–1,7 mg/l.
 1.6 LAATUVAATIMUKSET  
Jotta testi olisi validi, seuraavien vaatimusten on täytyttävä:  
— Kontrolleissa (mukaan lukien liuotusapuaineen sisältävä kontrolli) 
enintään 10 % vesikirpuista saa immobilisoitua.  
— Liuenneen hapen pitoisuuden testin lopussa on oltava ≥ 3 mg/l 
kontrolli- ja koeastioissa.  
Huom.: Ensimmäinen vaatimus merkitsee, että enintään 10 prosenttia 
kontrollivesikirpuista saa immobilisoitua tai osoittaa muita sairauden 
tai stressin merkkejä, esimerkiksi värimuutoksia tai epätavallista 
käyttäytymistä (esim. jääminen pysyvästi vedenpinnalle).  
1.7 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.7.1  Laitteet  
Astioiden ja muiden laitteiden, jotka joutuvat kosketuksiin testiliu ­
osten kanssa, on oltava kokonaan lasia tai muuta kemiallisesti inerttiä materiaalia. Testiastiat ovat tavallisesti lasisia koeputkia tai dekanteril ­
aseja. Ne on puhdistettava ennen jokaista käyttöä laboratorion nor ­
maaleilla menettelyillä. Koeastiat on peitettävä väljästi, jotta vältettäi ­
siin veden menetys haihtumisen kautta ja pölyn pääsy liuoksiin. Haih ­
tuvat aineet pitäisi testata täysin suljetuissa astioissa, jotka ovat tar ­
peeksi suuria, ettei happipitoisuus muodostu rajoittavaksi tekijäksi tai 
alene liiaksi (ks. kohta 1.6 ja kohdan 1.8.3 ensimmäinen alakohta).
 
Lisäksi tarvitaan joitakin tai kaikkia seuraavista laitteista: happimit ­
tari (joka on varustettu mikroelektrodilla tai muulla sopivalla laitteel ­
la, jolla voidaan mitata liuennut happi pienitilavuuksisissa näytteis ­
sä); pH-mittari; asianmukaiset laitteet lämpötilan säätöön; laitteet or ­
gaanisiin yhdisteisiin sitoutuneen hiilen kokonaispitoisuuden (TOC) mittaamiseen; laitteet kemiallisen hapenkulutuksen (COD) mittaa ­
miseen; laitteet veden kovuuden mittaamiseen jne.
 
1.7.2  Testiorganismi  
Testissä suositellaan käytettäväksi  Daphnia magna  Straus -organis ­
mia. Muita sopivia vesikirppulajeja (e.g.  Daphnia pulex)  saa myös 
käyttää. Testin alussa eläinten on oltava alle 24 tunnin ikäisiä, ja 
ominaisuuksien vaihtelun vähentämiseksi suositellaan painokkaasti, että ne eivät ole ensimmäistä sikiösarjaa. Niiden olisi oltava peräisin terveestä varastokannasta (ts. niissä ei saa näkyä merkkejä stressistä, 
kuten korkeaa kuolleisuutta, koiraita ja lepomunia, viivästymistä en ­
simmäisten sikiöiden tuottamisessa, värihäiriöisiä eläimiä jne.). Kaik ­
kien tietyssä testissä käytettävien organismien on oltava peräisin saman vesikirppukannan viljelystä. Varastokannan eläimiä on pidet ­
tävä samanlaisissa viljelyoloissa (valo, lämpötila, viljelyneste) kuin 
testissä käytettäviä. Jos testissä käytettävä viljelyneste eroaa vesikir ­
pun viljelyssä normaalisti käytetystä viljelynesteestä, on hyvä nou ­
dattaa käytäntöä, että eläimet totutetaan viljelyoloihin ennen testiä. 
Viljelystä saatuja vesikirppuja on tätä varten pidettävä laimennusve ­
dessä testilämpötilassa vähintään 48 tunnin ajan ennen testin alkua.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 943
 
1.7.3  Viljely- ja laimennusvesi  
Luonnonvesi (pinta- tai pohjavesi), synteettinen vesi tai talousvesi, 
josta on poistettu kloori, ovat hyväksyttäviä viljely- ja laimennusve ­
siä, jos vesikirput voivat elää siinä viljelyn, totuttamisen ja testauk ­
sen ajan osoittamatta stressaantumisen merkkejä. Mikä tahansa vesi, 
joka täyttää liitteessä 1 mainitut hyväksyttävän liuoksen kemialliset ominaisuudet, soveltuu käytettäväksi testissä. Veden laadun on oltava tasainen testin ajan. Synteettinen vesi voidaan valmistaa lisäämällä 
tietyt määrät reagensseja (tunnustettu analyyttinen laatu) deionisoi ­
tuun tai tislattuun veteen. Kirjallisuusviitteissä (1) ja (6) ja liitteessä 2 annetaan esimerkkejä synteettisestä vedestä. On huomattava, että 
tunnettuja kelatoivia aineita sisältäviä viljelynesteitä, kuten M4- ja 
M7-viljelynesteitä (ks. liite 2), ei suositella metalleja sisältävien ai ­
neiden testaukseen. pH-arvon pitäisi olla 6–9.  Daphnia Magna  -or­
ganismia varten suositellaan kovuutta 140–250 mg/l (CaCO3), mutta 
muita  Daphnia -organismeja varten käy myös vähäisempi kovuus. 
Laimennusvettä voidaan ilmastaa ennen testin alkua, jotta liuenneen hapen pitoisuus saavuttaa kyllästymispisteen.
 
Jos käytetään luonnonvettä, laatuparametrit on tarkistettava vähintään 
kahdesti vuodessa tai aina kun on epäilystä siitä, että nämä ominai ­
suudet ovat voineet muuttua merkittävästi (ks. edellinen kohta ja liite 
1). Lisäksi on määritettävä raskasmetallit (esim. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd 
ja Ni). Käytettäessä vettä, josta on poistettu kloori, suositellaan päi ­
vittäistä kloorianalyysiä. Jos laimennusvesi on pinta- tai pohjavesiläh ­
teestä, johtokyky, orgaanisiin yhdisteisiin sitoutuneen hiilen kokonais ­
pitoisuus (TOC) tai kemiallinen hapenkulutus (COD) on mitattava.  
1.7.4  Testiliuokset  
Halutun pitoiset testiliuokset valmistetaan yleensä laimentamalla va ­
rastoliuosta. Varastoliuokset olisi mieluiten tehtävä liuottamalla tes ­
tiaine laimennusveteen. Liuottimien, emulgointiaineiden tai disper ­
gointiaineiden käyttöä olisi mahdollisuuksien mukaan vältettävä. 
Niitä voidaan kuitenkin tarvita joissakin tapauksissa sopivan väke ­
vyisen varastoliuoksen valmistamiseksi. Kirjallisuusviitteessä (4) on tietoa sopivien liuottimien, emulgointiaineiden tai dispergointiainei ­
den käytöstä. Testiaineen pitoisuus testiliuoksissa ei saa missään ta ­
pauksessa ylittää aineen liukoisuusrajaa laimennusvedessä.
 
Testi on suoritettava säätämättä pH:ta. Jos pH ei pysy välillä 6–9, 
voidaan suorittaa toinen testi, jossa varastoliuoksen pH säädetään 
vastaamaan laimennusveden pH:ta ennen testiaineen lisäämistä. pH:ta säädettäessä on huolehdittava siitä, että varastoliuoksen pitoi ­
suus ei muutu merkittävässä määrin ja ettei aiheuteta kemiallisia 
reaktioita eikä saostumista testiaineessa. Suositeltavia aineita ovat 
HCl ja NaOH.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 944
 
1.8 MENETTELY  
1.8.1  Altistusolosuhteet  
1.8.1.1  Testi- ja kontrolliryhmät  
Koeastiat täytetään sopivaan tilavuuteen laimennusvedellä ja testi ­
aineen sisältävillä liuoksilla. Ilman ja veden tilavuuden keskinäisen 
suhteen astiassa pitäisi olla sama sekä testi- että kontrolliryhmässä. Vesikirput pannaan astioihin. Kutakin testipitoisuutta ja kontrolliryh ­
mää varten olisi käytettävä vähintään 20 eläintä, mielellään jaettuina 
neljään viiden eläimen ryhmään. Kutakin eläintä varten olisi varat ­
tava vähintään 2 ml testiliuosta (ts. 10 ml testiliuosta viittä vesikirp ­
pua ja yhtä koeastiaa kohti). Testi suoritetaan siten, että liuos vaihtuu 
semistaattisissa oloissa tai läpivirtausolosuhteissa, jos testiaineen pi ­
toisuus ei ole stabiili.
 
Testisarjan lisäksi on suoritettava yksi laimennusvesikontrollisarja ja 
tarvittaessa myös yksi liuotusapuaineen sisältävä kontrollisarja.  
1.8.1.2  Testipitoisuudet  
Varsinaisen testin pitoisuusalueiden määrittämiseksi voidaan tehdä 
pitoisuusalueen määrittelykoe, jollei testiaineen myrkyllisyydestä ole saatavilla tietoa. Tätä varten vesikirput altistetaan useille testi ­
aineen pitoisuuksille laajoin pitoisuusvälein. Viisi vesikirppua on 
altistettava kullekin pitoisuudella enintään 48 tunnin ajaksi. Rinnak ­
kaiskokeita ei tarvita. Altistusaika voidaan lyhentää (esim. 24 tuntiin tai tämän alle), jos pitoisuusalueen määrittelyyn sopivat tiedot saa ­
daan lyhyemmässä ajassa.
 
Kokeessa pitäisi olla vähintään viisi testipitoisuutta geometrisessa 
sarjassa, eikä kerroin saisi olla suurempi kuin 2,2. Jos käytetään 
vähempää määrää pitoisuuksia, tämä on perusteltava. Suosituksena 
on, että suurin testattava pitoisuus johtaa 100 prosentin immobilisaa ­
tioon ja että pienin testattava pitoisuus ei aiheuta havaittavaa vaiku ­
tusta.  
1.8.1.3  Inkubaatio-olosuhteet  
Lämpötilan pitäisi olla välillä 18–22  o C ja pysyä kussakin yksittäi ­
sessä testissä vakiona (± 1  o C). Testissä suositellaan käytettäväksi 
sykliä, jossa on 16 tuntia valoa ja 8 tuntia pimeyttä. Myös jatkuva 
pimeys hyväksytään, erityisesti jos testiaine on epästabiili valossa.  
Koeastioita ei saa ilmastaa testin aikana. Testi suoritetaan säätämättä 
pH:ta. Vesikirppuja ei saa ruokkia testin aikana.  
1.8.1.4  Kesto  
Testin kesto on 48 tuntia.  
1.8.2  Huomautukset  
Kunkin koeastian osalta on tarkistettava 24 ja 48 tunnin kuluttua 
testin alusta, onko siinä immobilisoituneita vesikirppuja (ks. mää ­
ritelmät kohdassa 1.2). Immobilisaation lisäksi on kirjattava mahdol ­
linen epänormaali käyttäytyminen tai ulkonäkö.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 945
 
1.8.3  Mittaukset  
Liuennut happi ja pH määritetään testin alussa ja lopussa kontrollissa 
(tai kontrolleissa) ja testiaineen suurimmassa pitoisuudessa. Kontrol ­
leissa todetun liuenneen hapen pitoisuuden olisi oltava laatuvaa ­
timuksen mukainen (ks. kohta 1.6). pH-arvo ei tavallisesti saisi vaih ­
della enemmän kuin 1,5 yksikköä yksittäisessä testissä. Lämpötila mitataan yleensä kontrolliastioista tai ilmasta, ja sitä on rekisteröitävä mielellään jatkuvaluonteisesti testin aikana tai vähintään testin alussa 
ja lopussa.
 
Vähintään suurin ja pienin testiaineen pitoisuus olisi mitattava testin 
alussa ja lopussa (4). Tulokset on suositeltavaa määritellä mitattujen 
pitoisuuksien perusteella. Jos on näyttöä siitä, että testattavan aineen pitoisuus on pysynyt tyydyttävällä tavalla ± 20 prosentissa nimellis ­
pitoisuudesta tai mitatusta alkupitoisuudesta koko testin ajan, tulokset 
voivat perustua nimellispitoisuuksiin tai alkupitoisuuksiin.
 
1.9 RAJA-ANNOSTESTI  
Tässä testimenetelmässä kuvattuja menettelyjä käyttäen voidaan suo ­
rittaa raja-annostesti, jossa testiaineen pitoisuus on 100 mg/l tai sama 
kuin aineen liukoisuusraja-arvo testissä käytettävässä viljelynesteessä 
(sen mukaan, kumpi on alempi), sen osoittamiseksi, että EC  50 on 
suurempi kuin kyseinen pitoisuus. Raja-annostesti on suoritettava 20 vesikirpulla (jotka suositellaan jaettaviksi neljään viiden eläimen 
ryhmään). Kontrollissa (tai kontrolleissa) niitä on oltava sama määrä. 
Jos immobilisaatiota havaitaan, on tehtävä täydellinen testi. Mahdol ­
linen epänormaali käyttäytyminen on kirjattava.
 
2. TULOKSET  
Tulokset on esitettävä taulukkomuodossa siten, että sekä testi- että 
kontrolliryhmistä ilmoitetaan käytetty vesikirppujen määrä ja immo ­
bilisaatio kunakin havaintoajankohtana. Prosentuaalinen immobilisaa ­
tio 24 ja 48 tunnin kohdalla on esitettävä graafisesti testipitoisuuk ­
sien funktiona. Tulokset analysoidaan sopivilla tilastomenetelmillä 
(esim. probittianalyysi), ja kuvaajien kulmakertoimet ja EC  50 laske­
taan 95 prosentin luottamusvälillä (p = 0,05) (7) (8).  
Jos EC  50 :n tavanomaiset laskentamenetelmät eivät sovellu saatuun 
aineistoon, sitä suurinta pitoisuutta, joka ei aiheuta immobilisaatiota, ja sitä pienintä pitoisuutta, joka aiheuttaa 100 prosentin immobilisaa ­
tion, on käytettävä likiarvon laskemiseen siten, että EC
 50 katsotaan 
kyseisten kahden pitoisuuden geometriseksi keskiarvoksi.  
3. RAPORTOINTI  
3.1 TESTISELOSTE  
Testiselosteessa on ilmoitettava seuraavat tiedot:  
Testiaine:  
— fysikaalinen olomuoto ja fysikokemialliset ominaisuudet, jos 
niillä on merkitystä,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 946
 
— kemialliset tunnistetiedot, mukaan lukien puhtaus.  
Koelajit:  
— Daphnian  laji ja hankintapaikka tai alkuperä (jos se tunnetaan) 
sekä käytetyt viljelyolosuhteet (mm. ravinnon lähde, tyyppi ja määrä, ruokintatiheys).
 
Koeolosuhteet:  
— koeastioiden kuvaus: astioiden tyyppi, liuoksen tilavuus, vesi ­
kirppujen määrä koeastiaa kohti, koeastioiden (rinnakkaiskokeet) 
määrä pitoisuutta kohti,  
— varasto- ja testiliuosten valmistusmenetelmät (mahdollisen liuot ­
timen tai dispergointiaineen nimi ja pitoisuus on ilmoitettava),  
— laimennusvedet: lähde ja veden laatu (pH, kovuus, Ca/Mg-suhde, 
Na/K-suhde, emäksisyys, johtokyky jne.); synteettisen veden 
koostumus (jos käytetty),  
— inkubaatio-olosuhteet: lämpötila, valon voimakkuus ja jaksoittai ­
suus, liuennut happi, pH jne.  
Tulokset:  
— niiden vesikirppujen määrä ja prosentuaalinen osuus, joka immo ­
bilisoituivat tai osoittivat haitallisia vaikutuksia (mm. epänor ­
maali käyttäytyminen) kontrolleissa ja kussakin testiryhmässä ku ­
nakin havaintoajankohtana, sekä havaittujen vaikutusten luonne,  
— vertailuaineella tehdyn testin tulokset ja päivämäärä (jos käytet ­
tävissä),  
— nimelliset testipitoisuudet sekä tulokset kaikista analyyseistä, 
joilla määritetään testiaineen pitoisuus koeastioissa; lisäksi on ilmoitettava menetelmän saantoteho sekä määritysraja,
 
— kaikki testin aikana tehdyt fysikokemialliset lämpötilan, pH:n ja 
liuenneet hapen pitoisuuden mittaustulokset,  
— EC  50 immobilisaatiolle 48 tunnin kohdalla, luottamusvälit, 
EC 50 :n laskemiseen käytetyn sovitetun mallin graafiset kuvaajat, 
annos-vastekäyrien kulmakertoimet ja niiden keskivirhe; EC  50 :n 
määrittämiseen käytettyjen tilastomenetelmien kuvaus (jos nämä 
tulokset määritettiin myös 24 tunnin kohdalla, myös ne on ilmoi ­
tettava),  
— selitykset mahdolliseen testimenetelmästä poikkeamiseen ja vai ­
kuttiko poikkeaminen tuloksiin.  
4. KIRJALLISUUSVIITTEET  
1. ISO 6341. (1996). Water quality — Determination of the inhibi ­
tion of the mobility of  Daphnia magna  Straus (Cladocera, Crus ­
tacea) — Acute toxicity test. Third edition, 1996.  
2. EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test Guid ­
elines — Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater 
Daphnids.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 947
 
3. Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute 
Lethality Test Using  Daphnia  spp. EPS 1/RM/11. Environment 
Canada, Ottawa, Ontario, Canada.  
4. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Sa ­
fety Publication. Series on Testing and Assessment. No. 23. Paris 
2000.  
5. Commission of the European Communities. Study D8369. 
(1979). Inter-laboratory Test Programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to  Daph­
nia.
 
6. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211:  
Daphnia magna  Reproduction Test, adopted September 1998.  
7. Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC50. In Aqua ­
tic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 — American Society for Tes ­
ting and Materials. Pp. 65–84.
 
8. Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3  rd 
ed. London. Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 948
 
LIITE 1  
JOITAKIN HYVÄKSYTTÄVÄN LAIMENNUSVEDEN KEMIALLISIA 
OMINAISUUKSIA  
Aine Pitoisuus  
Hiukkaset < 20 mg/l 
Orgaanisiin yhdisteisiin sitoutuneen hiilen kokonaismäärä < 2 mg/l 
Ammoniakki (ionisoitumaton) < 1 μg/l 
Jäännöskloori < 10 μg/l 
Orgaanista fosforia sisältävien torjunta-aineiden kokonais ­
määrä < 50 ng/l 
Orgaanista klooria sisältävien torjunta-aineiden kokonais ­
määrä ja polyklooratut bifenyylit < 50 ng/l 
Orgaanisiin yhdisteisiin sitoutuneen kloorin kokonaismäärä < 25 ng/l  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 949
 
Liite 2  
ESIMERKKEJÄ SOPIVASTA SYNTEETTISESTÄ TESTIVEDESTÄ  
ISO-testivesi (1)  
Varastoliuokset (yksi aine) Synteettinen vesi valmistetaan 
lisäämällä seuraavat määrät 
varastoliuosta 1 litraan vettä (*) Aine 1 vesilitraan lisätty 
määrä (*)  
Kalsiumkloridi 
CaCl  2 , 2H  2 O 11,76 g 25 ml 
Magnesiumsulfaatti 
MgSO  4 , 7H  2 O 4,93 g 25 ml 
Natriumbikarbonaatti 
NaHCO  3 2,59 g 25 ml 
Kaliumkloridi 
KCl 0,23 g 25 ml  
(*) Veden on oltava sopivan puhdasta, esimerkiksi deionisoitua, tislattua tai käänteisosmoo ­
silla puhdistettua, ja johtavuus ei saisi olla yli 10 μS.cm  -1 . 
Elendt M7- ja M4-viljelynesteet  
Totuttaminen Elendt M7- ja M4-viljelynesteeseen  
Joissakin laboratorioissa on ollut vaikeuksia, kun ne ovat siirtäneet vesikirput 
suoraan M4- tai M7-viljelynesteeseen. Siirto onnistuu paremmin totuttamalla 
vesikirput asteittain uuteen viljelynesteeseen: ensin siirretään entisestä viljelynes ­
teestä 30-prosenttiseen, sitten 60-prosenttiseen ja lopulta 100-prosenttiseen Elendt-viljelynesteeseen. Totuttamisvaiheen pitää mahdollisesti olla jopa kuukau ­
den pituinen.
 
Valmistelu  
Hivenaineet  
Ensin valmistetaan erilliset varastoliuokset (I) yksittäisistä mineraaleista sopivan 
puhtaaseen (esim. deionisoituun, tislattuun tai käänteisosmoosilla puhdistettuun) 
veteen. Näistä eri varastoliuoksista (I) valmistetaan yksi ainoa varastoliuos (II), jossa on kaikkia hivenaineita (yhdistetty liuos), ts.:
 
Varastoliuokset I (yksi aine) Veteen lisätty määrä 
(mg/l) Pitoisuus (M4-viljely ­
nesteessä) kertainen Valmistettaessa yhdistettyä varastoliuosta II lisä ­
tään veteen seuraavat määrät varastoliuosta I 
(ml/l) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 1,0 0,25 
MnCl  2 . 4H  2 O 7 210 20 000 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 950
 
Varastoliuokset I (yksi aine) Veteen lisätty määrä 
(mg/l) Pitoisuus (M4-viljely ­
nesteessä) kertainen Valmistettaessa yhdistettyä varastoliuosta II lisä ­
tään veteen seuraavat määrät varastoliuosta I 
(ml/l) 
M4 M7  
RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25 
SrCl  2 . 6H  2 O 3 040 20 000 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 1,0 0,25 Na
 2 MoO  4 . 2H  2 O 1 230 20 000 1,0 0,25 
CuCl  2 . 2H  2 O 335 20 000 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 1,0 1,0 
CoCl  2 . 6H  2 O 200 20 000 1,0 1,0 
KI 65 20 000 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20 000 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 1,0 1,0 
Na 2 EDTA . 2H  2 O 5 000 2 000 — — 
FeSO  4 . 7H  2 O 1 991 2 000 — — 
Sekä Na  2 EDTA- että FeSO  4 -liuokset valmistetaan erikseen, yhdistetään ja autoklavoidaan välittömästi. 
Tuloksena on: 
21Fe-EDTA-liuos 1 000 20,0 5,0  
M4- ja M7-viljelyneste  
M4- ja M7-viljelynesteet valmistetaan käyttäen varastoliuosta II, makroravinteita 
ja vitamiineja seuraavasti:  
Veteen lisätty määrä 
(mg/l) Pitoisuus (M4-viljely ­
nesteessä) -kertainen Viljelynesteen valmistamiseen tarvittava varastoli ­
uoksen määrä (ml/l) 
M4 M7  
Varastoliuos II (yhdistetyt 
hivenaineet) 20 50 50 
Makroravinteiden varastoli ­
uos (yksittäisiä aineita) 
CaCl  2 · 2H  2 O 293 800 1 000 1,0 1,0 
MgSO  4 · 7H  2 O 246 600 2 000 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 · 9H  2 O 50 000 5 000 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 0,1 0,1  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 951
 
Veteen lisätty määrä 
(mg/l) Pitoisuus (M4-viljely ­
nesteessä) -kertainen Viljelynesteen valmistamiseen tarvittava varastoli ­
uoksen määrä (ml/l) 
M4 M7  
Yhdistetty vitamiinien va ­
rastoliuos — 10 000 0,1 0,1 
Yhdistetty vitamiinien varastoliuos valmistetaan lisäämällä kaikkia kolmea vitamiinia 1 litraan vettä seuraavasti: 
Tiamiini-hydrokloridi 750 10 000 
Syaani-kobalamiini (B  12 ) 10 10 000 
Biotiini 7,5 10 000  
Yhdistetty vitamiinien varastoliuos säilytetään jäädytettynä pienissä erissä. Vita ­
miinit lisätään viljelynesteeseen vähän ennen käyttöä.  
Huom.: Jotta suolat eivät saostuisi lopullista viljelynesteliuosta valmistettaessa, 
varastoliuokset lisätään 500–800 ml:aan deionisoitua vettä ja täytetään 
sitten 1 litraksi.  
Huom.: M4-viljelynesteen kokoonpanoa koskeva ensimmäinen julkaisuviite on 
Elendt, B.P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructural 
approach to antennal damage in  Daphnia magna  Straus. Protoplasma, 
154, 25–33.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 952
 
C.3. MAKEAN VEDEN LEVIEN JA SYANOBAKTEERIEN 
KASVUNESTYMISTESTI  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 201, 2006 (1).  
1.1 JOHDANTO  
Testimenetelmiä tarkistetaan ja päivitetään säännöllisesti tieteen ke ­
hityksen perusteella. Testimenetelmää C.2 oli tarkistettava, jotta sii ­
hen olisi voitu lisätä uusia lajeja ja jotta olisi voitu täyttää vaaranar ­
viointia ja kemikaalien luokitusta koskevat vaatimukset. Tarkistus 
perustuu laajaan käytännön kokemukseen, tieteen kehitykseen leviin kohdistuvien myrkyllisyystutkimusten alalla sekä testimenetelmän 
aiemman version laajaan käyttöön sääntelyssä.
 
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Tässä testimenetelmässä käytetään seuraavia määritelmiä ja lyhenteitä:  
Biomassa : Populaatiossa olevan elävän materiaalin kuivapaino il ­
maistuna tiettyä tilavuutta kohden, esimerkiksi milligrammoina levää 
yhtä litraa testiliuosta kohden. Yleensä ”biomassa” määritellään mas ­
saksi, mutta tässä testissä sillä tarkoitetaan massaa tilavuutta kohden. Tässä testissä biomassaa mitataan usein myös epäsuorasti esimerkiksi 
solumäärien ja fluoresenssin avulla, minkä vuoksi ”biomassa”-termi 
käsittää myös nämä korvaavat menetelmät.
 
Variaatiokerroin : Parametrin vaihtelua ilmaiseva dimensioton suure, 
joka määritellään keskihajonnan ja keskiarvon suhteeksi. Se voidaan ilmaista myös prosenttiarvona. Rinnakkaisten kontrolliviljelmien kes ­
kimääräisen spesifisen kasvunopeuden keskimääräinen variaatioker ­
roin lasketaan seuraavasti:
 
1. Keskimääräisen spesifisen kasvunopeuden variaatiokerroin laske ­
taan (prosentteina) kunkin rinnakkaisviljelmän päivittäisistä tai jaksoittaisista kasvunopeuksista.
 
2. Lasketaan kaikkien kohdassa 1 laskettujen arvojen keskiarvo, 
jotta saadaan rinnakkaisten kontrolliviljelmien päivittäisen 
tai jaksoittaisen spesifisen kasvunopeuden keskimääräinen variaa ­
tiokerroin.  
ECx : Testiviljelyaineeseen liuenneen testiaineen pitoisuus, jossa tes ­
tattavan eliön kasvu vähenee x prosenttia (esimerkiksi 50 prosenttia) määrätyn altistusajan kuluessa (altistusaika on mainittava erikseen, 
jos se poikkeaa testin kokonaiskestosta tai normaalista kestosta). 
Jotta kasvunopeudesta ja tuotoksesta johdetut EC-arvot erottuisivat selvästi toisistaan, edellisestä käytetään symbolia ”E
 r C” ja jälkimmäi ­
sestä symbolia ”E  y C”. 
Viljelyaine : Täydellinen synteettinen ravinneliuos, jossa testilevät 
kasvavat, kun ne altistetaan testiaineelle. Yleensä testiaine on liuen ­
nut testiviljelyaineeseen.  
Kasvunopeus  (keskimääräinen spesifinen kasvunopeus ): Biomas ­
san logaritminen kasvu altistuksen aikana.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 953
 
Pienin havaittavan vaikutuksen aiheuttava pitoisuus (LOEC) : 
Pienin testattu pitoisuus, jossa aineella havaitaan olevan tietyn altis ­
tusajan kuluessa tilastollisesti merkittävä kasvua vähentävä vaikutus verrattuna kontrolliin (kun p < 0,05). Ehtona on myös, että kaikilla LOEC-pitoisuutta suuremmilla testipitoisuuksilla on oltava vähintään 
yhtä suuri haitallinen vaikutus kuin LOEC-pitoisuudella. Jos nämä 
kaksi ehtoa eivät täyty, on annettava tyhjentävä selitys siitä, miten LOEC-pitoisuus (ja myös NOEC-pitoisuus) on valittu.
 
Pitoisuus, joka ei aiheuta havaittavaa vaikutusta (NOEC) : Lähin 
LOEC-pitoisuutta pienempi testipitoisuus.  
Vastemuuttuja : Muuttuja, jonka avulla arvioidaan myrkyllisyyttä. 
Vastemuuttuja johdetaan erilaisia laskentamenetelmiä käyttämällä 
mistä tahansa mitatusta muuttujasta, joka kuvaa biomassaa. Tässä 
menetelmässä kasvunopeudet ja tuotos ovat vastemuuttujia, jotka on johdettu mittaamalla biomassaa suoraan tai käyttämällä edellä mainittuja korvaavia menetelmiä.
 
Spesifinen kasvunopeus : Vastemuuttuja, joka määritellään havain ­
noitavan parametrin (tässä testimenetelmässä biomassan) luonnollis ­
ten logaritmien erotuksen ja vastaavan ajanjakson väliseksi suhteeksi.  
Tuotos : Altistusajan lopussa mitattu biomassaa ilmaisevan mittaus ­
muuttujan arvo, josta on vähennetty altistusajan alussa mitattu saman mittausmuuttujan arvo.
 
1.3 TESTIN SOVELTAMISALA  
Tätä testimenetelmää voidaan parhaiten soveltaa vesiliukoisiin ainei ­
siin, jotka todennäköisesti pysyvät veteen liuenneina testiolosuhteis ­
sa. Testattaessa aineita, jotka ovat haihtuvia, voimakkaasti adsorboi ­
via, värillisiä tai huonosti veteen liukenevia, tai aineita, jotka voivat vaikuttaa testiviljelyaineessa olevien ravinteiden tai kivennäisainei ­
den saantiin, voi olla tarpeen tehdä tiettyjä mukautuksia tässä kuvat ­
tuun menetelmään (esimerkiksi suljettu järjestelmä ja koeastioiden erityisvalmistelu). Kirjallisuusviitteissä (2), (3) ja (4) annetaan ohjeita joistakin sopivista mukautuksista.
 
1.4 TESTIN PERIAATE  
Testin tavoitteena on määrittää testattavan aineen vaikutukset makean 
veden viherlevien ja/tai syanobakteereiden kasvuun. Eksponentiaa ­
lisesti kasvavat koe-eliöt altistetaan testiaineelle panosviljelmissä yleensä 72 tunnin ajan. Vaikka testi on suhteellisen lyhyt, sillä voi ­
daan arvioida useaan sukupolveen kohdistuvia vaikutuksia.
 
Järjestelmän vasteena on kasvun väheneminen sarjassa leväviljelmiä 
(testiyksiköitä), jotka on altistettu testiaineen eri pitoisuuksille. Vas ­
tetta arvioidaan altistuspitoisuuden funktiona vertaamalla sitä rinnak ­
kaisten, altistumattomien kontrolliviljelmien keskimääräiseen kas ­
vuun. Jotta järjestelmän vaste myrkkyvaikutuksiin ilmenisi kokonaan (optimaalinen herkkyys), viljelmien kasvua ei rajoiteta vaan niiden annetaan kasvaa eksponentiaalisesti olosuhteissa, joissa on riittävästi 
ravinteita ja valonsaanti on jatkuvaa, kunnes spesifisen kasvunopeu ­
den pieneneminen on mitattavissa.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 954
 
Kasvua ja kasvun estymistä kvantifioidaan mittaamalla leväbiomassa 
ajan funktiona. Leväbiomassa määritetään kuivapainona tilavuutta 
kohden, esimerkiksi milligrammoina levää yhtä litraa testiliuosta kohden. Kuivapainoa on kuitenkin vaikea mitata, minkä vuoksi käy ­
tetään korvaavia parametreja. Useimmin käytettyjä ovat solumäärät. 
Muita korvaavia parametreja ovat muun muassa solutilavuus, fluore ­
senssi ja optinen tiheys. Mitatun korvaavan parametrin ja biomassan välinen muuntokerroin on tunnettava.
 
Testin loppupisteenä on kasvun estyminen, joka ilmenee biomassan 
logaritmisesta kasvusta (keskimääräisestä spesifisestä kasvunopeu ­
desta) altistusaikana. Testiliuossarjassa mitattujen keskimääräisten spesifisten kasvunopeuksien avulla määritetään pitoisuus, jossa kas ­
vunopeus vähenee ennalta määrätyn prosenttimäärän x verran (esi ­
merkiksi 50 prosenttia). Kyseinen pitoisuus ilmoitetaan E
 r C x -arvona 
(esimerkiksi E  r C 50 ). 
Käytettäessä tätä menetelmää EU:n sääntelykehyksessä pitäisi tulok ­
set laskea keskimääräisten spesifisten kasvunopeuksien perusteella jäljempänä 2.2 kohdassa selostetuista syistä. Toinen testimenetel ­
mässä käytetty vastemuuttuja on tuotos, jota voidaan tarvita joissakin 
maissa erityisten sääntelyvaatimusten täyttämiseksi. Tuotoksella tar ­
koitetaan altistusajan lopussa mitatun biomassan ja altistusajan alussa mitatun biomassan erotusta. Testiliuossarjassa mitatun tuotoksen 
avulla määritetään pitoisuus, jossa tuotos vähenee ennalta määrätyn 
prosenttimäärän x verran (esimerkiksi 50 prosenttia). Kyseinen pitoi ­
suus ilmoitetaan E
 y C x -arvona (esimerkiksi E  y C 50 ). 
Tilastollisesti voidaan määrittää myös pienin havaittavan vaikutuksen 
aiheuttava pitoisuus (LOEC) sekä pitoisuus, joka ei aiheuta havait ­
tavaa vaikutusta (NOEC).  
1.5 TESTIAINETTA KOSKEVAT TIEDOT  
Testiainetta koskevia tietoja, joista voi olla hyötyä päätettäessä tes ­
tiolosuhteista, ovat rakennekaava, puhtaus, stabiilius valossa, stabii ­
lius testiolosuhteissa, valonabsorbointiominaisuudet, pK  a ja muuntu ­
mistutkimusten tulokset, mukaan luettuna biohajoavuus vedessä.  
Testiaineen vesiliukoisuus, oktanoli/vesi-jakaantumiskerroin (P  ow ) ja 
höyrynpaine on tunnettava, ja testiliuoksissa olevan testiaineen kvan ­
tifioimiseen tarvitaan validoitu menetelmä, jonka saantoteho ja ha ­
vaitsemisraja tunnetaan.  
1.6 VERTAILUAINE  
Testimenetelmä voidaan tarkistaa testaamalla vertailuaine (-aineet), 
kuten 3,5-dikloorifenoli, jota on käytetty kansainvälisessä yhteistut ­
kimuksessa (4). Viherleviä viljeltäessä vertailuaineena voidaan käyt ­
tää myös kaliumdikromaattia. Vertailuaine olisi hyvä testata vähin ­
tään kahdesti vuodessa.  
1.7 TESTIN VALIDITEETTI  
Jotta testi olisi validi, sen on täytettävä seuraavat vaatimukset:  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 955
 
— Biomassan on täytynyt kasvaa kontrolliviljelmissä eksponentiaa ­
lisesti vähintään 16-kertaiseksi 72 tunnin testijakson aikana. 
Tämä vastaa spesifistä kasvunopeutta 0,92 päivää kohden. Useimmin käytetyillä lajeilla kasvunopeus on yleensä huomatta ­
vasti suurempi (ks. lisäys 1). Tämä vaatimus ei välttämättä täyty 
käytettäessä lajeja, jotka kasvavat hitaammin kuin lisäyksessä 1 
luetellut lajit. Siinä tapauksessa testijaksoa on pidennettävä, jotta kontrolliviljelmissä saavutettaisiin vähintään 16-kertainen kasvu, ja kasvun on oltava eksponentiaalista koko testijakson ajan. Tes ­
tijaksoa voidaan lyhentää 48 tuntiin saakka rajoittamattoman eks ­
ponentiaalisen kasvun ylläpitämiseksi koko testin ajan, jos kas ­
vukerroin on vähintään 16.
 
— Kontrolliviljelmien jaksoittaisten spesifisten kasvunopeuksien (72 
tunnin testeissä päivät 0–1, 1–2 ja 2–3) keskimääräinen variaa ­
tiokerroin (ks. ”Variaatiokerroin” kohdassa 1.2) saa olla enintään 35 prosenttia. Jaksoittaisen spesifisen kasvunopeuden laskemista 
käsitellään jäljempänä kohdassa 2.2.1. Tämä vaatimus koskee 
rinnakkaisia kontrolliviljelmiä varten laskettujen variaatiokertoi ­
mien keskiarvoa.
 
— Rinnakkaisten kontrolliviljelmien keskimääräisten spesifisten kas ­
vunopeuksien variaatiokerroin saa olla koko testijakson aikana enintään 7 prosenttia, jos testeissä käytetään lajeja  Pseudokirch ­
neriella subcapitata  ja Desmodesmus subspicatus . Käytettäessä 
muita, harvemmin testattuja lajeja tämä arvo saa olla enintään 
10 prosenttia.
 
1.8 MENETELMÄN KUVAUS  
1.8.1  Välineet  
Koeastioiden ja muiden välineiden, jotka joutuvat kosketuksiin tes ­
tiliuosten kanssa, on oltava kokonaan lasia tai muuta kemiallisesti inerttiä materiaalia. Ne on pestävä huolellisesti, jotta mitkään orgaa ­
niset tai epäorgaaniset epäpuhtaudet eivät vaikuttaisi leväkasvuun tai 
testiliuosten koostumukseen.
 
Koeastiat ovat yleensä lasipulloja, jotka ovat niin suuria, että viljel ­
män tilavuus riittää testin aikaisiin mittauksiin ja CO  2 :n siirtyminen 
ilmakehästä on riittävää (ks. kohdan 1.8.9 toinen kappale). Nesteti ­
lavuuden täytyy olla riittävän suuri analyyttisiä määrityksiä varten (ks. kohdan 1.8.11 viides kappale).
 
Lisäksi tarvitaan seuraavia välineitä (kaikkia tai joitakin niistä):  
— Viljelylaite: Suosituksena on käyttää kaappia tai kammiota, jossa 
valittua inkubointilämpötilaa voidaan pitää yllä ± 2 °C:n tarkkuu ­
della.  
— Valonmittauslaitteet: On tärkeää muistaa, että valon voimakkuu ­
den mittausmenetelmä ja erityisesti mittausanturin (keräimen) 
tyyppi vaikuttavat mitattuun arvoon. Mittauksissa olisi mieluim ­
min käytettävä pyöreää (4 π) mittausanturia (joka reagoi suoraan 
valoon ja heijastuneeseen valoon mistä tahansa kulmasta mitta ­
ustason ylä- ja alapuolelta) tai 2 π:n mittausanturia (joka reagoi 
valoon mistä tahansa kulmasta mittaustason yläpuolelta).  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 956
 
— Leväbiomassan määrityslaite: Solumäärä, joka on yleisin leväbio ­
massan sijasta käytetty parametri, voidaan laskea käyttämällä 
elektronista hiukkaslaskinta, laskukammiolla varustettua mikros ­
kooppia tai virtaussytometria. Muita biomassan sijasta käytettyjä parametreja voidaan mitata virtaussytometrilla, fluorimetrilla, 
spektrofotometrilla tai kolorimetrilla. On hyödyllistä laskea solu ­
määrän ja kuivapainon välinen muuntokerroin. Jotta mittaukset onnistuisivat spektrofotometrilla pienissä biomassapitoisuuksissa, voi olla tarpeen käyttää kyvettejä, joissa valotien pituus on vä ­
hintään 4 cm.
 
1.8.2  Koe-eliöt  
Testissä voidaan käyttää monia kiinnittymättömiä mikrolevä- ja sya ­
nobakteerilajeja. Lisäyksessä 1 lueteltujen kantojen on todettu sovel ­
tuvan tähän testimenetelmään.  
Jos testissä käytetään muita lajeja, niiden kanta ja/tai alkuperä on 
ilmoitettava. Lisäksi on varmistettava, että testiin valitun levän eks ­
ponentiaalista kasvua voidaan pitää yllä testiolosuhteissa koko testi ­
jakson ajan.  
1.8.3  Viljelyaine  
Testiä varten suositetaan kahta vaihtoehtoista viljelyainetta: OECD- 
ja AAP-viljelyainetta. Niiden koostumus esitetään lisäyksessä 2. On 
syytä huomata, että näiden kahden viljelyaineen alkuperäinen pH- arvo ja puskurikapasiteetti (joka säätelee pH:n kasvua) ovat erilaisia, minkä vuoksi ne voivat antaa erilaisia tuloksia varsinkin, kun testa ­
taan ionisoivia aineita.
 
Viljelyaineita voidaan joutua mukauttamaan esimerkiksi silloin, kun 
testataan metalleja ja kelatoivia aineita tai kun testaus suoritetaan 
erilaisilla pH-arvoilla. Mukautetun viljelyaineen käyttö on perustel ­
tava ja kuvattava yksityiskohtaisesti (3)(4).  
1.8.4  Biomassan alkupitoisuus  
Biomassan alkupitoisuuden on oltava sama kaikissa testiviljelmissä 
ja niin pieni, että kasvu on eksponentiaalista koko inkubointiajan 
ilman, että ravinteet uhkaavat loppua. Biomassan alkupitoisuus saa olla enintään 0,5 mg/l kuivapainona ilmaistuna. Suosituksena on käyttää seuraavia solujen alkupitoisuuksia:  
Pseudokirchneriella subcapitata  5 x 10
 3 –10  4 solua/ml  
Desmodesmus subspicatus  2–5 x 10  3 solua/ml  
Navicula pelliculosa  10  4 solua/ml  
Anabaena flos-aquae  10  4 solua/ml  
Synechococcus leopoliensis  5 x 10  4 –10  5 solua/ml  
1.8.5  Testiaineen pitoisuudet  
Pitoisuusalue, jolla vaikutuksia todennäköisesti esiintyy, voidaan 
määrittää alueenmäärityskokeiden avulla. Varsinaista testiä varten 
on valittava vähintään viisi pitoisuutta, jotka muodostavat geometri ­
sen sarjan, jonka suhdeluku on enintään 3,2. Suurempikin suhdeluku voi olla aiheellinen, jos testiaineella saadaan laakea pitoisuus-vaste ­
käyrä. Pitoisuussarjan tulisi käsittää pitoisuusalue, jolla levän kasvu ­
nopeus hidastuu 5–75 prosenttia.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 957
 
1.8.6  Toistot ja kontrollit  
Testiin on kuuluttava kolme toistoa kutakin pitoisuutta kohden. Jos 
NOEC-pitoisuutta ei tarvitse määrittää, koejärjestelyä voidaan muut ­
taa lisäämällä pitoisuuksien määrää ja vähentämällä toistojen määrää 
pitoisuutta kohden. Kontrollitoistoja on oltava vähintään kolme, ja 
niitä on mieluimmin tehtävä kaksi kertaa enemmän kuin kutakin testipitoisuutta kohden tehtyjä toistoja.
 
Testiaineen pitoisuuksien analyyttisiä määrityksiä varten voidaan val ­
mistaa erillinen testiliuossarja (ks. kohdan 1.8.11 neljäs ja kuudes 
kappale).  
Jos testiaine on liuotettava liuottimella, koejärjestelyyn on kuuluttava 
ylimääräisiä kontrolliviljelmiä, jotka sisältävät liuotinta samana pitoi ­
suutena kuin testiviljelmät.  
1.8.7  Inokulaattiviljelmän valmistaminen  
Jotta testissä käytettävät levät sopeutuisivat testiolosuhteisiin ja oli ­
sivat eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa, kun ne siirrostetaan testili ­
uoksiin, testiviljelyaineeseen valmistetaan 2–4 päivää ennen testin 
alkua inokulaattiviljelmä. Leväbiomassaa on säädeltävä siten, että 
eksponentiaalinen kasvu jatkuu inokulaattiviljelmässä testin alkuun saakka. Inokulaattiviljelmää inkuboidaan samoissa olosuhteissa kuin testiviljelmiä. Biomassan kasvu inokulaattiviljelmässä mitataan sen 
varmistamiseksi, että kasvu vastaa testissä käytettävän kannan nor ­
maalia kasvua viljelyolosuhteissa. Lisäyksessä 3 annetaan yksi esi ­
merkki levänviljelymenetelmistä. Inokulaattiviljelmässä voidaan jou ­
tua käynnistämään toinen lisäysvaihe, jotta testin aikana ei tapahtuisi 
synkronista solunjakautumista.
 
1.8.8  Testiliuosten valmistaminen  
Viljelyaineen pitoisuuden ja testilevien biomassan alkupitoisuuden 
on oltava samat kaikissa testiliuoksissa. Halutun pitoiset testiliuokset 
valmistetaan yleensä sekoittamalla testiaineen kantaliuos viljely ­
aineen ja inokulaattiviljelmän kanssa. Kantaliuokset valmistetaan yleensä liuottamalla testattava aine testiviljelyaineeseen.
 
Liuottimia, kuten asetonia, t-butyylialkoholia ja dimetyyliformami ­
dia, voidaan käyttää kantoaineina, kun testiviljelyaineeseen lisätään 
huonosti veteen liukenevia aineita (2)(3). Liuottimen pitoisuus saa 
olla enintään 100 μl/l, ja kaikkiin testisarjan viljelmiin (kontrollivil ­
jelmät mukaan luettuina) on lisättävä samanpitoista liuotinta.  
1.8.9  Inkubointi  
Koeastiat suljetaan ilmaa läpäisevillä tulpilla. Astioita ravistellaan ja 
ne asetetaan viljelylaitteeseen. Niitä on ravisteltava ja sekoitettava koko testin ajan, jotta levät pysyisivät suspendoituneina ja CO
 2 :n 
siirtyminen liuoksiin helpottuisi. Viljelmien lämpötila pidetään alu ­
eella 21–24 °C (säätötarkkuus ± 2 °C). Käytettäessä muita kuin lisäyksessä 1 lueteltuja lajeja, kuten trooppisia lajeja, lämpötila voi olla korkeampikin, kunhan validiteettivaatimukset täyttyvät. Suositel ­
tavaa on sijoittaa pullot satunnaiseen järjestykseen ja vaihtaa niiden 
paikkaa inkubaattorissa päivittäin.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 958
 
Yleensä kontrolliviljelyaineen pH-arvo saa vaihdella kokeen aikana 
enintään 1,5 yksikköä. Kun on kyse metalleista ja yhdisteistä, jotka 
ionisoituvat osittain jotakuinkin samassa pH:ssa kuin testissä, pH- muutoksia voidaan joutua rajoittamaan tarkkojen ja toistettavien tu ­
losten saamiseksi. Muutokset voidaan rajoittaa teknisesti alle 0,5 
yksikköön varmistamalla, että CO
 2 :ta siirtyy riittävän nopeasti il ­
masta testiliuokseen. Tämä voidaan tehdä esimerkiksi lisäämällä ra ­
vistelunopeutta. Toinen mahdollisuus on vähentää CO  2 :n tarvetta 
pienentämällä biomassan alkupitoisuutta tai lyhentämällä testin kes ­
toa. 
Pintaa, jolla viljelmät inkuboidaan, on valaistava tasaisella loisteva ­
lolla, esimerkiksi kylmänvalkoisella tai päivänvalon kaltaisella valol ­
la. Levien ja syanobakteerien valontarpeet vaihtelevat eri kantojen välillä. Valon voimakkuus on valittava koe-eliön mukaan. Suositel ­
tuja viherlevälajeja varten valon voimakkuus on valittava siten, että 
se on testiliuosten tasolla 60–120 μE·m
 –2 ·s –1 , kun se mitataan sopi ­
valla mittausanturilla fotosynteesille suotuisalla aallonpituusalueella 400–700 nm. Eräät lajit, erityisesti  Anabaena flos-aquae , kasvavat 
hyvin heikommassakin valaistuksessa ja voivat vahingoittua suurilla 
valon voimakkuuksilla. Tällaisia lajeja varten keskimääräinen valon voimakkuus on valittava alueelta 40–60 μE·m
 –2 ·s –1 . (Jos valonmit ­
tauslaitteet on kalibroitu lux-yksikköä varten, suositeltu valonvoi ­
makkuus 60–120 μE·m  –2 ·s –1 vastaa suunnilleen kylmänvalkoisen 
valon voimakkuusaluetta 4 440–8 880 lux.) Valon voimakkuus saa vaihdella enintään ± 15 prosenttia inkubointialueen keskimääräisestä valon voimakkuudesta.
 
1.8.10  Testin kesto  
Testi kestää yleensä 72 tuntia. Se voi kestää myös lyhyemmän tai 
pitemmän ajan, jos kaikki kohdassa 1.7 esitetyt validiteettivaatimuk ­
set täyttyvät.  
1.8.11  Mittaukset ja analyyttiset määritykset  
Kussakin pullossa oleva leväbiomassa määritetään ainakin kerran 
päivässä testijakson aikana. Jos mittauksissa käytetään testiliuoksesta pipetoituja pieniä tilavuuksia, niitä ei saa korvata vastaavilla tila ­
vuuksilla.
 
Biomassa mitataan laskemalla solut manuaalisesti mikroskoopin 
avulla tai käyttämällä elektronista hiukkaslaskinta (solunlaskenta ja/ ­
tai biovolyymin määritys). Muutkin tekniikat, kuten virtaussytomet ­
ria, klorofyllin  in vitro - tai in vivo  -fluoresenssin määritys (6)(7) tai 
optisen tiheyden määritys, ovat sallittuja, jos voidaan osoittaa, että ne korreloivat tyydyttävästi biomassan kanssa testin biomassa-arvoilla.
 
Liuosten pH mitataan testin alussa ja lopussa.  
Jos käytettävissä on analyysimenetelmä, jolla testiaine voidaan mää ­
rittää testissä käytetyllä pitoisuusalueella, testiliuokset on analysoita ­
va, jotta voidaan tarkistaa alkupitoisuudet sekä altistuspitoisuuksien 
säilyminen testin aikana.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 959
 
Jos altistuspitoisuudet todennäköisesti vaihtelevat alle 20 prosenttia 
nimellisarvoista testin aikana, voi olla riittävää analysoida testiaineen 
pitoisuus testin alussa ja lopussa pienessä ja suuressa testipitoisuu ­
dessa sekä pitoisuudessa, joka on lähellä oletettua EC  50 -arvoa. Kaik ­
kien testipitoisuuksien analysointia testin alussa ja lopussa suositel ­
laan silloin, kun pitoisuudet eivät pysyttele 80:n ja 120 prosentin 
välillä nimellispitoisuudesta. Jos testiaine on haihtuva, epästabiili tai voimakkaasti adsorboivia, suosituksena on ottaa analysoitaviksi lisänäytteitä 24 tunnin välein altistusajan kuluessa, jotta testiaineen 
häviö olisi helpommin määritettävissä. Tällaisia aineita varten tarvi ­
taan ylimääräisiä toistoja. Kaikissa tapauksissa testiaineen pitoisuudet tarvitsee määrittää vain yhdestä toistossa käytetystä astiasta (tai kaik ­
kien toistoissa käytettyjen astioiden yhdistetystä sisällöstä) kutakin 
testipitoisuutta kohden.
 
Testiviljelyaineita, jotka on valmistettu erityisesti altistuspitoisuuk ­
sien analysoimiseksi testin aikana, on käsiteltävä samalla tavalla kuin testaukseen käytettyjä liuoksia, toisin sanoen niihin on siirros ­
tettava leviä ja niitä on inkuboitava samoissa olosuhteissa. Jos liu ­
enneen testiaineen pitoisuus on analysoitava, voi olla tarpeen erottaa levät viljelyaineesta. Levien erottaminen on mieluimmin tehtävä sentrifugoimalla käyttämällä pientä g-voimaa, joka riittää kuitenkin 
niiden erottamiseen.
 
Jos on näyttöä siitä, että testattavan aineen pitoisuus on pysynyt 
tyydyttävästi ± 20 prosentin rajoissa nimellispitoisuudesta tai mita ­
tusta alkupitoisuudesta koko testin ajan, tulosten analysointi voi pe ­
rustua nimellispitoisuuksiin tai mitattuihin alkupitoisuuksiin. Jos pi ­
toisuus poikkeaa enemmän kuin ± 20 prosenttia nimellispitoisuudesta tai mitatusta alkupitoisuudesta, tulosten analysoinnin on perustuttava pitoisuuksien geometriseen keskiarvoon altistuksen aikana tai mallei ­
hin, jotka kuvaavat testiaineen pitoisuuden vähenemistä (3)(8).
 
Leväkasvun estymistesti on dynaamisempi testijärjestelmä kuin 
useimmat muut lyhytaikaiset kokeet, joilla testataan aineiden myrkyl ­
lisyyttä vesieliöille. Sen vuoksi todellisten altistuspitoisuuksien mää ­
ritys voi olla vaikeaa varsinkin, kun on kyse adsorboituvista aineista, joita testataan pienillä pitoisuuksilla. Jos aine tällaisissa tapauksissa katoaa liuoksesta adsorboitumalla kasvavaan leväbiomassaan, se ei 
kuitenkaan merkitse sitä, että se olisi kadonnut koko testijärjestel ­
mästä. Analysoitaessa testin tuloksia on tarkistettava, liittyykö testi ­
aineen pitoisuuden väheneminen testin aikana kasvun estymisen vä ­
henemiseen. Jos näin on, voidaan harkita sopivan mallin käyttöä 
kuvaamaan testiaineen pitoisuuden pienemistä (8). Muussa tapauk ­
sessa voi olla aiheellista analysoida tuloksia (nimellisten tai mitattujen) alkupitoisuuksien pohjalta.
 
1.8.12  Muut havainnot  
Mikroskoopin avulla on varmistettava, että inokulaattiviljelmä näyt ­
tää normaalilta ja terveeltä, sekä tutkittava testin lopussa levissä 
esiintyvät epänormaaliudet (jotka voivat johtua altistumisesta testi ­
aineelle).  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 960
 
1.8.13  Rajatesti  
Joissakin tapauksissa, esimerkiksi silloin, kun alustava testi osoittaa, 
että testiaineella ei ole myrkkyvaikutuksia pitoisuusarvoon 100 mg·l
 –1 saakka tai siihen liukoisuusrajaan asti, joka testiaineella 
on testiviljelyaineessa (sen mukaan, kumpi näistä on pienempi), voi ­
daan tehdä rajatesti, jossa verrataan yhden kontrolliryhmän ja yhden käsitellyn ryhmän vasteita (pitoisuudessa 100 mg·l
 –1 tai liukoisuus ­
rajaa vastaavassa pitoisuudessa). On erittäin suotavaa analysoida al ­
tistuspitoisuus rajatestin tueksi. Kaikki edellä kuvatut testiolosuhteet 
ja validiteettivaatimukset koskevat myös rajatestiä, lukuun ottamatta käsiteltyjen toistojen määrää, jonka on oltava vähintään kuusi. Kont ­
rolli- ja käsitellyn ryhmän vastemuuttujia voidaan analysoida Studen ­
tin t-testin kaltaisella tilastotutkimuksella, jossa verrataan keskiarvo ­
ja. Jos näiden kahden ryhmän varianssit eivät ole yhtä suuria, on tehtävä erisuuruisiin variansseihin mukautettu t-testi.
 
1.8.14  Muunnos voimakkaan värillisille aineille  
Säteilytyksen (valon voimakkuuden) pitäisi olla tässä koemenetel ­
mässä käytetyn alueen korkeimmassa päässä, vähintään 120 μE·m
 –2 ·s –1 . 
Valotietä on lyhennettävä vähentämällä koeliuosten tilavuutta 
(5–25 ml).  
Näytteitä on ravistettava riittävästi, jotta levät altistuvat hyvin tiheään 
säteilytykselle viljelmän pinnalla.  
2. TIEDOT  
2.1 KASVUKÄYRIEN PIIRTÄMINEN  
Koeastioissa oleva biomassa voidaan ilmaista mittauksissa käytetyn 
korvaavan parametrin (esimerkiksi solumäärän ja fluoresenssin) yk ­
sikkönä.  
Biomassan määritetty pitoisuus testi- ja kontrolliviljelmissä esitetään 
kasvukäyrien piirtämistä varten taulukkona, josta ilmenevät myös 
testiaineen pitoisuudet ja mittausajankohdat, jotka on rekisteröity vä ­
hintään täysien tuntien tarkkuudella. Tässä ensimmäisessä vaiheessa voi olla hyödyllistä käyttää sekä logaritmiasteikkoja että lineaarisia asteikkoja, mutta logaritmisasteikot ovat pakollisia ja antavat yleensä 
paremman kuvan kasvun vaihteluista testijakson aikana. On syytä 
huomata, että kun eksponentiaalista kasvua kuvataan logaritmiastei ­
kolla, tuloksena on suora viiva, ja viivan kaltevuus ilmaisee spesifi ­
sen kasvunopeuden.
 
Käyrien avulla tutkitaan, kasvavatko kontrolliviljelmät oletetulla no ­
peudella eksponentiaalisesti koko testin ajan. Kaikkia datapisteitä ja 
käyrien muotoa tarkastellaan kriittisesti, ja raakatiedot ja menetelmät 
tarkistetaan mahdollisten virheiden havaitsemiseksi. Erityisesti tarkis ­
tetaan ne datapisteet, jotka näyttävät poikkeavan systemaattisen vir ­
heen vuoksi. Jos havaitaan ilmeisiä menetelmävirheitä ja/tai niitä 
pidetään hyvin todennäköisinä, kyseinen datapiste merkitään vie ­
raaksi havainnoksi eikä sitä oteta huomioon myöhemmässä tilastoa ­
nalyysissä. (Jos leväpitoisuus on nolla yhdessä kahdesta tai kolmesta toistoissa käytetyssä astiassa, tämä voi olla merkki siitä, että levien 
siirrostamista astiaan ei ole tehty oikein tai astiaa ei ole puhdistettu 
kunnolla). Testiraportissa on perusteltava selvästi, minkä vuoksi da ­
tapiste on hylätty vieraana havaintona. Hyväksyttäviä syitä ovat ai ­
noastaan (harvinaiset) menetelmävirheet eikä pelkästään huono tark ­
kuus. Tämäntyyppisissä ongelmissa ei ole kovin hyödyllistä yrittää 
tunnistaa vieraita havaintoja tilastomenetelmien avulla, eivätkä tällai ­
set menetelmät voi korvata asiantuntijan arviota. Vieraat havainnot (jotka on merkitty sellaisiksi) tulisi säilyttää niiden datapisteiden 
joukossa, jotka merkitään myöhemmin graafisiin tai taulukkomuotoi ­
siin esityksiin.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 961
 
2.2 VASTEMUUTTUJAT  
Testin tarkoituksena on määrittää testiaineen vaikutukset levien kas ­
vuun. Tässä testimenetelmässä kuvataan kahta eri vastemuuttujaa, koska jäsenvaltiot suosivat erilaisia käytänteitä ja asettavat erilaisia 
sääntelyvaatimuksia. Jotta testitulokset voitaisiin hyväksyä kaikissa 
jäsenvaltioissa, vaikutuksia olisi arvioitava käyttämällä molempia vastemuuttujia a ja b, joita kuvataan jäljempänä.
 
a) Keskimääräinen spesifinen kasvunopeus: tämän vastemuuttujan 
laskentaperusteena on biomassan logaritminen kasvu päivää koh ­
den testijakson aikana.  
b) Tuotos: tällä vastemuuttujalla tarkoitetaan testin lopussa mitattua 
biomassaa, josta on vähennetty testin alussa mitattu biomassa.  
Käytettäessä tätä menetelmää EU:n sääntelykehyksessä pitäisi tulok ­
set laskea keskimääräisten spesifisten kasvunopeuksien perusteella jäljempänä selostetuista syistä. On syytä huomata, että näiden kahden 
vastemuuttujan avulla lasketut myrkyllisyysarvot eivät ole vertailu ­
kelpoisia, mikä on otettava huomioon käytettäessä testin tuloksia. Jos testiolosuhteet ovat tämän testimenetelmän mukaiset, keskimääräi ­
seen spesifiseen kasvunopeuteen perustuvat EC
 x -arvot (E  r C x ) ovat 
yleensä suurempia kuin tuotokseen perustuvat arvot (E  y C x ), mikä 
johtuu niiden matemaattisista perusteista. Tätä ei siis pidä tulkita siten, että näiden kahden vastemuuttujan herkkyydet olisivat erilaiset, vaan arvojen välinen ero on puhtaasti matemaattinen. Keskimääräi ­
nen spesifinen kasvunopeus perustuu yleiseen kasvumalliin, joka ku ­
vaa levien eksponentiaalista kasvua rajoittamattomissa viljelmissä, joista toksisuus arvioidaan kasvunopeuteen kohdistuvien vaikutusten perusteella ottamatta huomioon kontrollin spesifisen kasvunopeuden 
absoluuttista tasoa, pitoisuus-vastekäyrän kaltevuutta tai testin kestoa. 
Tuotosta kuvaavaan vastemuuttujaan perustuvat tulokset riippuvat sen sijaan kaikista näistä muista muuttujista. E
 y C x riippuu kussakin 
testissä käytetyn levälajin spesifisestä kasvunopeudesta ja suurim ­
masta spesifisestä kasvunopeudesta, joka voi vaihdella eri lajien ja jopa eri leväkantojen välillä. Tätä vastemuuttujaa ei saa käyttää ver ­
tailtaessa eri levälajien tai eri kantojenkaan herkkyyttä myrkyllisille 
aineille. Vaikka tieteen kannalta on parempi arvioida myrkyllisyyttä 
keskimääräisen spesifisen kasvunopeuden perusteella, tähän testime ­
netelmään on otettu mukaan myös tuotokseen perustuvat myrkylli ­
syyden arvioinnit, koska niillä voidaan täyttää eräiden maiden nykyi ­
set sääntelyvaatimukset.
 
2.2.1  Keskimääräinen kasvunopeus  
Tietyn ajanjakson keskimääräinen spesifinen kasvunopeus lasketaan 
biomassan logaritmisena kasvuna soveltamalla seuraavaa kaavaa ku ­
hunkin kontrolli- ja käsittelyryhmän astiaan:  
μ i–j ¼ lnX j – lnX i 
t j – t i (päivä  –1 ) 
jossa  
μ i–j keskimääräinen spesifinen kasvunopeus aikavälillä  i–j 
X i biomassa hetkellä  i 
X j biomassa hetkellä  j. ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 962
 
Kullekin testiryhmälle ja kontrolliryhmälle lasketaan kasvunopeuden 
keskiarvo varianssiestimaatteineen.  
Keskimääräinen spesifinen kasvunopeus lasketaan koko testin ajalta 
(yleensä päivästä 0 päivään 3) käyttämällä lähtöarvona siirrostetun biomassan nimellisarvoa mitatun lähtöarvon sijasta, koska näin saa ­
daan yleensä parempi tarkkuus. Biomassan mitattua alkupitoisuutta 
voidaan käyttää, jos inokulaatin pieni biomassa voidaan määrittää 
riittävän tarkasti biomassan mittauslaitteella (esimerkiksi virtaussyto ­
metrilla). Lisäksi määritetään jaksoittainen kasvunopeus, joka saa ­
daan laskemalla spesifiset kasvunopeudet kultakin päivältä testin ai ­
kana (päivät 0–1, 1–2 ja 2–3), ja tutkitaan, pysyykö kontrolliryhmän 
kasvunopeus vakiona (ks. validiteettivaatimukset, kohta 1.7). Jos spesifinen kasvunopeus on huomattavasti pienempi ensimmäisenä päivänä kuin spesifisten kasvunopeuksien keskiarvo, se voi olla 
merkki viivevaiheesta. Vaikka viivevaihe voidaan minimoida ja pois ­
taa käytännössä kokonaan kontrolliviljelmistä esiviljelmän asianmu ­
kaisella lisäyksellä, testiaineelle altistetuissa viljelmissä viivevaihe voi osoittaa toipumista toksisuuden aiheuttamasta alkustressistä tai 
vähentynyttä altistumista, joka johtuu testiaineen häviämisestä (esi ­
merkiksi sorptiosta levämassaan) alkuvaiheen altistumisen jälkeen. Tällöin voidaan tarkastella jaksoittaista kasvunopeutta, jonka avulla voidaan arvioida testiaineen vaikutuksia altistusaikana. Merkittävät 
erot jaksoittaisen kasvunopeuden ja keskimääräisen kasvunopeuden 
välillä osoittavat, että kasvu poikkeaa jatkuvasta eksponentiaalisesta kasvusta, jolloin kasvukäyriä on syytä tarkastella lähemmin.
 
Kasvunopeuden prosentuaalinen estyminen kussakin käsitellyssä 
toistossa lasketaan seuraavan kaavan avulla:  
%I r ¼ μ C – μ T 
μ C Ü 100  
jossa  
%I r keskimääräisen spesifisen kasvunopeuden prosentuaalinen esty ­
minen  
μ C keskimääräisen spesifisen kasvunopeuden ( μ) keskiarvo kontrol ­
liryhmässä  
μ T keskimääräinen spesifinen kasvunopeus käsitellyssä toistossa.  
Jos testiliuosten valmistamisessa käytetään liuottimia, kasvunopeu ­
den prosentuaalinen estyminen on laskettava liuottimia sisältävistä 
kontrolliviljelmistä eikä niistä kontrolliviljelmistä, joissa ei ole liuot ­
timia.  
2.2.2  Tuotos  
Tuotos lasketaan vähentämällä testin lopussa mitatusta biomassasta 
testin alussa mitattu biomassa kontrolli- ja käsittelyryhmän kunkin 
astian osalta. Kullekin testipitoisuudelle ja kontrollille lasketaan kas ­
vunopeuden keskiarvo varianssiestimaatteineen. Tuotoksen prosentu ­
aalinen estyminen (% I  y ) voidaan laskea kutakin käsiteltyä toistoa 
varten seuraavasti:  
%I y ¼ ðY C – Y T Þ 
Y C Ü 100 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 963
 
jossa  
% I  y tuotoksen prosentuaalinen estyminen  
Y C tuotoksen keskiarvo kontrolliryhmässä  
Y T tuotoksen arvo käsitellyssä toistossa.  
2.3 PITOISUUS-VASTEKÄYRÄN PIIRTÄMINEN  
Prosentuaalinen estyminen merkitään graafisesti suhteessa testiaineen 
pitoisuuden logaritmiin. Näin saatuja pisteitä tarkastellaan huolelli ­
sesti ottamatta huomioon datapisteitä, joita pidettiin ensimmäisessä 
vaiheessa vieraina havaintoina. Datapisteiden kautta vedetään tasai ­
sesti muuttuva viiva joko silmämääräisesti tai interpoloimalla tieto ­
koneen avulla, jotta pitoisuuden ja vasteen suhteesta saataisiin alus ­
tava käsitys. Tämän jälkeen käytetään tarkempaa menetelmää, mie ­
luimmin tietokonepohjaista tilastomenetelmää. Sen perusteella, mihin tietoja aiotaan käyttää, mikä on niiden laatu (tarkkuus) ja määrä ja mitä välineitä on käytettävissä niiden analysoimiseen, voidaan päät ­
tää, että tietojen analysointi lopetetaan tähän vaiheeseen (mikä on 
joskus hyvin aiheellisestakin), ja ainoastaan lukea keskeiset arvot EC
 50 ja EC  10 (ja/tai EC  20 ) silmämääräisesti piirretyltä käyrältä (ks. 
myös jäljempänä oleva kohta stimuloivista vaikutuksista). Päteviä 
syitä olla käyttämättä tilastomenetelmää ovat muun muassa seuraavat 
syyt:  
— Vaikka tietoja käsiteltäisiin tietokoneistetulla menetelmällä, tu ­
lokset eivät olisi sen luotettavampia kuin jos tiedot olisi annettu 
asiantuntijan arvioitaviksi. Tällaisissa tapauksissa on jopa mah ­
dollista, että eräillä tietokoneohjelmilla ei saada minkäänlaista luotettavaa tulosta (esimerkiksi sen vuoksi, että iteraatiot eivät konvergoidu).
 
— Tietokoneohjelmilla ei pystytä käsittelemään kunnolla stimuloin ­
nin aiheuttamia kasvuvasteita (ks. jäljempänä).  
2.4 TILASTOMENETELMÄT  
Tavoitteena on saada kvantitatiivinen pitoisuus–vaste-suhde regressi ­
oanalyysin avulla. Painotettua lineaarista regressiota voidaan käyttää sen jälkeen, kun vastetiedoille on tehty linearisoiva muunnos – esi ­
merkiksi probitti-, logitti- tai Weibull-yksiköiksi (9) – mutta suosi ­
teltavampaa on käyttää epälineaarisia regressiomenetelmiä, joilla voi ­
daan paremmin käsitellä tiedoissa väistämättä esiintyviä epäsäännöl ­
lisyyksiä sekä poikkeamia tasaisista jakaumista. Lähestyttäessä tilaa, 
jossa kasvu ei esty ollenkaan tai estyminen on täydellistä, lineari ­
soiva muunnos voi suurentaa epäsäännöllisyyksiä ja haitata siten analyysiä (9). On syytä huomata, että standardianalyysimenetelmät, joissa käytetään probitti-, logitti- tai Weibull-muunnoksia, on tarkoi ­
tettu dikotomisia tietoja varten (kun vasteita on kaksi, esimerkiksi 
kuolleisuus tai eloonjääminen), minkä vuoksi niitä on mukautettava, jos niitä aiotaan käyttää kasvu- tai tuotostietojen analysointiin. Kir ­
jallisuusviitteissä (10), (11) ja (12) kuvataan erityismenetelmiä, joilla 
EC
 x -arvot voidaan määrittää jatkuvista tiedoista. Epälineaarisen reg ­
ressioanalyysin käyttöä käsitellään tarkemmin lisäyksessä 4.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 964
 
Kunkin vastemuuttujan analysoimiseksi käytetään pitoisuus–vaste- 
suhdetta, jonka avulla lasketaan EC  x -arvojen piste-estimaattit. Jokai ­
selle estimaatille on määritettävä 95 prosentin luottamusväli, jos se on mahdollista. Vastetietojen ja regressiomallin välinen yhteensopi ­
vuuden aste on arvioitava joko graafisesti tai tilastollisesti. Regres ­
sionanalyysi on tehtävä käyttämällä yksittäisiä toistojen vasteita eikä 
käsittelyryhmien keskiarvoja. Jos epälineaariseen käyrän sovitus on vaikeaa tai mahdotonta, koska tiedot ovat liian hajallaan, ongelma voidaan kiertää tekemällä regressio ryhmien keskiarvoille, mikä on 
käytännöllinen tapa vähentää mahdollisten vieraiden havaintojen vai ­
kutusta. Tämän vaihtoehdon käyttö on mainittava testiraportissa ta ­
vanomaisesta menetelmästä poikkeavana keinona, jota on käytetty sen vuoksi, että käyrän sovittaminen yksittäisiin toistoihin ei antanut 
hyvää tulosta.
 
EC 50 -estimaatit ja luottamusvälit voidaan saada myös käyttämällä 
lineaarista interpolointia bootstrap-menetelmän kanssa (13), jos käy ­
tettävissä olevat regressiomallit tai -menetelmät eivät sovellu kyseis ­
ten tietojen käsittelyyn.  
Jotta voidaan arvioida LOEC-pitoisuus ja siten myös NOEC-pitoi ­
suus sekä testiaineen vaikutukset kasvunopeuteen, käsiteltyjen liuos ­
ten keskiarvoja on verrattava varianssianalyysitekniikoiden avulla (ANOVA). Sen jälkeen on verrattava kunkin pitoisuuden keskiarvoa kontrolliryhmän keskiarvoon käyttämällä sopivaa moniulotteista ver ­
tailumenetelmää tai trenditestimenetelmää. Dunnettin tai Williamsin 
testi voi olla käyttökelpoinen (14)(15)(16)(17)(18). Lisäksi on arvi ­
oitava, pitääkö ANOVA-oletus varianssin homogeenisuudesta paik ­
kansa. Arviointi voidaan tehdä graafisesti tai virallisen testin avulla 
(18). Sopivia testejä ovat Levenen ja Bartlettin testit. Jos oletus 
varianssin homogeenisuudesta ei pidä paikkaansa, tilanne on joskus korjattavissa tietojen logaritmimuunnoksella. Jos varianssin hetero ­
geenisuus on erittäin suuri eikä se ole korjattavissa muunnoksella, 
on harkittava analysointia sellaisilla menetelmillä kuin Jonckheeren 
alaspäin askeltava trenditesti. Kirjallisuusviitteessä (12) annetaan li ­
säohjeita NOEC-arvon määrittämisestä.
 
Tieteen viimeaikaisen kehityksen perusteella on suositeltu, että NO ­
EC-käsitteestä luovuttaisiin ja se korvattaisiin regressioanalyysiin pe ­
rustuvilla EC  x :n piste-estimaateilla. Sopivaa x:n arvoa ei ole vielä 
vahvistettu tätä levätestiä varten. Sopivalta vaikuttaisi väli 
10–20 prosenttia (valitun vastemuuttujan mukaan), ja suositeltavaa 
on ilmoittaa sekä EC  10 - että EC  20 -arvo.  
2.5 KASVUN EDISTYMINEN  
Pienissä pitoisuuksissa havaitaan joskus kasvun edistymistä (negatii ­
vista estymistä). Tämä voi johtua joko hormesis-vaikutuksesta (”tok ­
sisuudesta johtuva kasvun edistyminen”) tai stimuloivien kasvuteki ­
jöiden lisäämisestä testiaineen kanssa testissä käytettyyn minimaa ­
liseen viljelyaineeseen. On muistettava, että epäorgaanisten ravintei ­
den lisäämisellä ei pitäisi olla suoranaista vaikutusta, koska testiliu ­
oksessa on oltava ravinteita ylimäärin koko testin ajan. Pieniannok ­
sinen stimulointi voidaan yleensä jättää huomioimatta EC  50 -arvon 
laskemisessa, jollei se ole hyvin merkittävää. Jos se on merkittävää tai jos EC
 x -arvo on laskettava pientä x:n arvoa varten, voi olla 
tarpeen käyttää erityismenetelmiä. Stimuloinnin aiheuttamien vastei ­
den poistamista tietojen analysoinnista olisi vältettävä mahdollisuuk ­
sien mukaan, ja jos käytettävissä oleva käyränsovitusohjelmisto ei pysty käsittelemään vähäistä stimulointia, voidaan käyttää lineaarista 
interpolointia yhdessä bootstrap-menetelmän kanssa. Jos stimulointi 
on hyvin merkittävää, voidaan harkita hormesis-mallin käyttöä (19).
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 965
 
2.6 MUUSTA KUIN TOKSISUUDESTA JOHTUVA KASVUN ESTY ­
MINEN  
Valoa absorboivat testimateriaalit voivat hidastaa kasvunopeutta, 
koska varjostus vähentää käytettävissä olevan valon määrää. Tällaiset 
fysikaaliset vaikutukset olisi erotettava myrkkyvaikutuksista muutta ­
malla testiolosuhteita, ja fysikaalisista vaikutuksista olisi raportoitava erikseen. Tästä annetaan ohjeita kirjallisuusviitteissä (2) ja (3).
 
3. RAPORTOINTI  
3.1 TESTIRAPORTTI  
Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:  
Testiaine:  
— fysikaalinen olomuoto ja fysikokemialliset ominaisuudet, joilla 
on merkitystä, muun muassa vesiliukoisuuden raja-arvo,  
— kemialliset tunnistetiedot, mukaan luettuna puhtaus.  
Koelajit:  
— kanta, sen toimittaja tai lähde ja viljelyolosuhteet.  
Testiolosuhteet:  
— testin alkamispäivä ja kesto,  
— koejärjestelyn kuvaus: koeastiat, viljelmien tilavuudet ja biomas ­
san tiheys testin alussa,  
— viljelyaineen koostumus,  
— testipitoisuudet ja toistot (esimerkiksi toistojen määrä, testipitoi ­
suuksien määrä ja testissä käytetty geometrinen porrastus),  
— kuvaus testiliuosten valmistamisesta, muun muassa liuottimien 
käyttö,  
— viljelylaite,  
— valon voimakkuus ja laatu (lähde, homogeenisuus),  
— lämpötila,  
— testatut pitoisuudet: nimelliset testipitoisuudet ja mahdolliset tu ­
lokset analyyseistä, joilla on määritetty testiaineen pitoisuus koe ­
astioissa. Menetelmän saantoteho ja määritysraja testimatriisissa on ilmoitettava,
 
— kaikki poikkeamat tästä testimenetelmästä,  
— biomassan määritysmenetelmä sekä näyttö mitatun parametrin ja 
kuivapainon korrelaatiosta.  
Tulokset:  
— pH-arvot kokeen alussa ja lopussa kaikista käsittelyistä,  
— kussakin pullossa oleva biomassa kunakin mittausajankohtana 
sekä biomassan mittausmenetelmä,  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 966
 
— kasvukäyrät (biomassa ajan funktiona),  
— kunkin käsitellyn toiston lasketut vastemuuttujat sekä toistojen 
keskiarvot ja variaatiokerroin,  
— pitoisuuden ja vaikutuksen suhteen graafinen esitys,  
— myrkyllisyyden arvioinnit vastemuuttujien osalta, esimerkiksi 
EC 50 , EC  10 ja EC  20 , ja vastaavat luottamusvälit; LOEC- ja NO ­
EC-pitoisuudet, jos ne on laskettu, ja niiden määrityksessä käy ­
tetyt tilastomenetelmät,  
— jos on käytetty ANOVA-analyysiä, havaittavissa olevan vaiku ­
tuksen suuruus (esimerkiksi vähiten merkitsevä erotus),  
— mahdollinen kasvun edistyminen käsitellyissä liuoksissa,  
— muut havaitut vaikutukset, esimerkiksi levien morfologiset muu ­
tokset,  
— tulosten pohdinta, mukaan luettuna mahdolliset vaikutukset, joita 
tästä testimenetelmästä poikkeamisella on ollut testin tuloksiin.  
4. KIRJALLISUUS  
(1) OECD TG 201 (2006) Freshwater Alga and Cyanobacteria, 
Growth Inhibition Test  
(2) ISO 1998: Water quality – Guidance for algal growth inhibition 
tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water. ISO/DIS 14442.
 
(3) OECD 2000: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing 
of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23.
 
(4) ISO 1998: Water quality – Sampling – Part 16: General Gui ­
dance for Biotesting. ISO 5667-16.  
(5) ISO 1993: Water quality – Algal growth inhibition test. ISO 
8692.  
(6) Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro 
fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525–2531.
 
(7) Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. In vivo fluorescence determi ­
nations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanog ­
raphy 22,5 (1977), s. 919–925.  
(8) Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. 
(2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem 22, 2073–2079.
 
(9) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 
19, 713–718.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 967
 
(10) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157–167.  
(11) Bruce, R.D. and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11:1485–1494.
 
(12) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
(13) Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assess ­
ment Center Technical Report 05–88. USEPA, Duluth, MN.  
(14) Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc. 50: 1096–1121.  
(15) Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics 20: 482–491.  
(16) Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27: 103–117.  
(17) Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28: 510–531.  
(18) Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition. Wiley, New York.  
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93–96.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 968
 
Lisäys 1  
Testiin sopivat kannat  
Viherlevät  
— Pseudokirchneriella subcapitata  (aiemmin  Selenastrum capricornutum ), 
ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG  
— Desmodesmus subspicatus  (aiemmin  Scenedesmus subspicatus ) 86.81 SAG  
Piilevät  
— Navicula pelliculosa , UTEX 664  
Syanobakteerit  
— Anabaena flos-aquae , UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A  
— Synechococcus leopoliensis , UTEX 625, CCAP 1405/1  
Kantojen alkuperä  
Suositellut kannat ovat saatavissa vain yhtä levää sisältävinä viljelminä seuraa ­
vista kokoelmista (jotka luetellaan aakkosjärjestyksessä):  
ATCC: American Type Culture Collection  
10801 University Boulevard  
Manassas, Virginia 20110–2209  
USA  
CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa  
Institute of Freshwater Ecology,  
Windermere Laboratory  
Far Sawrey, Amblerside  
Cumbria  
LA22 0LP  
UK 
Sammlung von Algenkulturen  
Albrecht-von-Haller-Institut  
Universität Göttingen  
Nikolausberger Weg 18  
3400 Göttingen  
GERMANY  
UTEX Culture Collection of Algae  
Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology  
School of Biological Sciences  
the University of Texas at Austin  
Austin, Texas 78712  
USA ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 969
 
Suositeltujen lajien ulkonäkö ja ominaisuudet  
P. subcapitata D. subspicatus N. pelliculosa A. flos-aquae S. leopoliensis  
Ulkonäkö Kaarevia ja 
kierteisiä yk ­
sittäisiä soluja Soikeita, 
yleensä yksit ­
täisiä soluja Sauvoja Soikeiden so ­
lujen muodos ­
tamia ketjuja Sauvoja 
Koko (pituus × leveys) μm 8–14 × 2–3 7–15 × 3–12 7,1 × 3,7 4,5 × 3 6 × 1 
Solutilavuus ( μm 3 /solu) 40–60 (  1 ) 60–80 (  1 ) 40–50 (  1 ) 30–40 (  1 ) 2,5 (  2 ) 
Solujen kuivapaino (mg/solu) 2–3 × 10  –8 3–4 × 10  –8 3–4 × 10  –8 1–2 × 10  –8 2–3 × 10  –9 
Kasvunopeus (  3 ) (päivä  –1 ) 1,5–1,7 1,2–1,5 1,4 1,1–1,4 2,0–2,4  
( 1 ) Elektronisella hiukkaslaskimella mitattuna. 
( 2 ) Koon perusteella laskettuna. 
( 3 ) Yleisimmin havaittu kasvunopeus OECD-viljelyaineessa, kun valon voimakkuus on noin 70 μE·m  –2 ·s –1 ja lämpötila 21 °C.  
Suositeltujen koelajien viljelyä ja käsittelyä koskevat erityissuositukset  
Pseudokirchneriella subcapitata ja Desmodesmus subspicatus  
Näitä viherleviä on yleensä helppo ylläpitää erilaisissa viljelyaineissa. Kantako ­
koelmia pitävät laitokset antavat tietoja sopivista viljelyaineista. Solut ovat 
yleensä yksittäisinä soluina, ja solutiheys on helposti mitattavissa elektronisen hiukkaslaskimen tai mikroskoopin avulla.
 
Anabaena flos-aquae  
Kantaviljelmää voidaan pitää erilaisissa viljelyaineissa. On erityisen tärkeää huo ­
lehtia siitä, että panoskasvatuksessa ei ohiteta kasvun viivevaihetta vaihdon yh ­
teydessä, koska muuten palautuminen on vaikeaa.  
Anabaena flos-aquae  muodostaa solurihmoista vyyhtimäisiä kasaumia. Näiden 
kasaumien koko voi vaihdella viljelyolosuhteiden mukaan. Voi olla tarpeen rik ­
koa nämä kasaumat, jos biomassan määrityksessä käytetään mikroskooppilasken ­
taa tai elektronista hiukkaslaskinta.  
Rihmojen pilkkomiseen voidaan käyttää osanäytteiden ultraäänihajotusta, millä 
voidaan vähentää laskentatulosten vaihtelevuutta. Solut voivat kuitenkin tuhou ­
tua, jos ultraäänihajotusta jatketaan kauemmin kuin rihmojen pilkkominen lyhyemmiksi kappaleiksi edellyttää. Ultraäänihajotuksen voimakkuuden ja keston on oltava sama kaikissa käsittelyissä.
 
Hemosytometrilla lasketaan riittävän monta kenttää (vähintään 400 solua) vaih ­
televuuden tasoittamiseksi. Tämä parantaa mikroskooppisten tiheysmääritysten luotettavuutta.
 
Kun solurihmat on pilkottu huolellisella ultraäänihajotuksella, Anabaena-solujen 
kokonaistilavuus voidaan määrittää elektronisella hiukkaslaskimella. Ultraäänih ­
ajotuksen energia on säädettävä siten, etteivät solut rikkoudu.  
Käyttämällä Vortex-ravistelijaa tai muuta vastaavaa menetelmää varmistetaan, 
että leväsuspensio, jota käytetään koeastioiden siirostamiseen, on hyvin sekoitettu 
ja homogeeninen.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 970
 
Koeastiat on sijoitettava tasoravistelijaan, joka tekee edestakaista tai orbitaalilii ­
kettä frekvenssillä 150 rpm. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää jaksoittaista ravis ­
telua, joka vähentää Anabaenan taipumusta muodostaa rykelmiä. Jos rykelmiä kuitenkin muodostuu, on varmistettava, että biomassan mittauksia varten saadaan edustavia näytteitä. Ennen näytteiden ottoa voi olla tarpeen ravistella astioita 
voimakkaasti levärykelmien hajottamiseksi.
 
Synechococcus leopoliensis  
Kantaviljelmää voidaan pitää erilaisissa viljelyaineissa. Kantakokoelmia pitävät 
laitokset antavat tietoja sopivista viljelyaineista.  
Synechococcus leopoliensis  kasvaa yksittäisinä sauvanmuotoisina soluina. Solut 
ovat hyvin pieniä, mikä vaikeuttaa mikroskooppilaskennan käyttöä biomassan mittauksissa. Elektroniset hiukkaslaskimet, joilla voidaan laskea jopa noin 1 μm:n suuruisia hiukkasia, ovat käyttökelpoisia. Lisäksi voidaan käyttää  in vitro  
-fluoresenssimittauksia.
 
Navicula pelliculosa  
Kantaviljelmää voidaan pitää erilaisissa viljelyaineissa. Kantakokoelmia pitävät 
laitokset antavat tietoja sopivista viljelyaineista. Viljelyaineissa on oltava silik ­
aattia.  
Navicula pelliculosa  voi tietyissä kasvuolosuhteissa muodostaa kasaumia. Lipi ­
dituotannon vuoksi leväsolut pyrkivät joskus kerääntymään pintakalvoon. Siinä tapauksessa on ryhdyttävä erityistoimiin, jotta biomassan määritykseen saadaan 
edustavat osanäytteet. Voimakas ravistelu esimerkiksi Vortex-ravistimella voi olla 
tarpeen.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 971
 
Lisäys 2  
Viljelyaine  
Tässä testimenetelmässä voidaan käyttää jompaakumpaa seuraavista viljelyaineista:  
OECD-viljelyaine: alkuperäinen OECD:n testiohjeen nro 201 mukainen viljely ­
aine, joka on myös ISO 8692 -standardin mukainen.  
Yhdysvaltojen ympäristönsuojeluviraston (US EPA) viljelyaine AAP, joka on 
myös ASTM-standardin mukainen.  
Näitä viljelyaineita valmistettaessa on käytettävä reagenssi- tai analyysilaatua 
olevia kemikaaleja ja deionisoitua vettä.  
AAP-viljelyaineen (US EPA) ja OECD:n testiohjeen nro 201 mukaisen viljelyaineen 
koostumus  
Komponentit EPA OECD 
mg/l mM mg/l mM  
NaHCO  3 15,0 0,179 50,0 0,595 
NaNO  3 25,5 0,300 
NH  4 Cl 15,0 0,280 
MgCl  2 ·6(H  2 O) 12,16 0,0598 12,0 0,0590 
CaCl  2 ·2(H  2 O) 4,41 0,0300 18,0 0,122 
MgSO  4 ·7(H  2 O) 14,6 0,0592 15,0 0,0609 
K 2 HPO  4 1,044 0,00599 
KH  2 PO 4 1,60 0,00919 
FeCl  3 ·6(H  2 O) 0,160 0,000591 0,0640 0,000237 
Na 2 EDTA·2(H  2 O) 0,300 0,000806 0,100 0,000269 (*) 
H 3 BO 3 0,186 0,00300 0,185 0,00299 
MnCl  2 ·4(H  2 O) 0,415 0,00201 0,415 0,00210 
ZnCl  2 0,00327 0,000024 0,00300 0,0000220 
CoCl  2 ·6(H  2 O) 0,00143 0,000006 0,00150 0,00000630 
Na 2 MoO  4 ·2(H  2 O) 0,00726 0,000030 0,00700 0,0000289 
CuCl  2 ·2(H  2 O) 0,000012 0,00000007 0,00001 0,00000006 
pH 7,5 8,1  
(*) EDTA:n ja raudan moolisuhde on hieman suurempi kuin yksi. Näin estetään raudan saostumisen ja mini ­
moidaan samalla raskasmetalli-ionien kelatoituminen.  
Testissä, jossa käytetään  Navicula pelliculosa  -piilevää, molempiin viljelyainei ­
siin on lisättävä Na  2 SiO  3 ·9H  2 O:ta, kunnes Si-pitoisuudeksi saadaan 1,4 mg/l.  
Viljelyaineen pH saadaan, kun viljelyaineen karbonaattijärjestelmä ja CO  2 :n osa­
paine ilmassa ovat päässeet tasapainoon. Viljelyaineen pH:n ja molaarisen bikar ­
bonaattipitoisuuden likimääräinen suhde 25 °C:ssa saadaan seuraavan kaavan 
avulla:  
PH eq = 11,30 + log [HCO  3 ] ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 972
 
Kun NaHCO  3 on 15 mg/l, pH  eq = 7,5 (US EPA -viljelyaine), ja kun NaHCO  3 on 
50 mg/l, pH  eq = 8,1 (OECD-viljelyaine).  
Testiviljelyaineen alkuainekoostumus  
Alkuaine EPA OECD 
mg/l mg/l  
C 2,144 7,148 
N 4,202 3,927 
P 0,186 0,285 
K 0,469 0,459 
Na 11,044 13,704 
Ca 1,202 4,905 
Mg 2,909 2,913 
Fe 0,033 0,017 
Mn 0,115 0,115  
OECD-viljelyaineen valmistus  
Ravinne Pitoisuus kantaliuoksessa 
Kantaliuos 1: makroravinteet  
NH  4 Cl 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 
MgSO  4 ·7H  2 O 
KH  2 PO 4 1,5 g·l  –1 
1,2 g·l  –1 
1,8 g·l  –1 
1,5 g·l  –1 
0,16 g·l  –1 
Kantaliuos 2: rauta  
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 64 mg·l  –1 
100 mg·l  –1 
Kantaliuos 3: hivenaineet  
H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 185 mg·l  –1 
415 mg·l  –1 
3 mg·l  –1 
1,5 mg·l  –1 
0,01 mg·l  –1 
7 mg·l  –1 
Kantaliuos 4: bikarbonaatti  
NaHCO  3 50 g·l  –1 
Na 2 SiO  3 ·9H  2 0 
Kantaliuokset steriloidaan kalvosuodatuksella (keskimääräinen huokoskoko 
0,2 μm) tai autoklavoimalla (120 °C, 15 min). Liuoksia säilytetään pimeässä 
4 °C:n lämpötilassa.  
Kantaliuoksia 2 ja 4 ei saa autoklavoida, vaan ne on steriloitava kalvosuodatuk ­
sella. ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 973
 
Viljelyaine valmistetaan lisäämällä veteen sopiva määrä kantaliuoksia 1–4:  
Noin 500 ml:aan steriloitua vettä lisätään:  
— 10 ml kantaliuosta 1  
— 1 ml kantaliuosta 2  
— 1 ml kantaliuosta 3  
— 1 ml kantaliuosta 4.  
Liuokseen lisätään steriloitua vettä, kunnes tilavuus on 1 000 ml.  
Sen jälkeen on odotettava niin kauan kunnes viljelyaine ja ilman CO  2 ovat 
päässeet tasapainoon. Tarvittaessa liuokseen johdetaan tätä varten steriiliä suoda ­
tettua ilmaa muutaman tunnin ajan.  
AAP-viljelyaineen valmistus  
A1.1 Lisätään 1 ml kutakin kohdassa A1.2.1–A1.2.7 mainittua kantaliuosta 
noin 900 ml:aan deionisoitua tai tislattua vettä ja laimennetaan liuos 1 
litraksi.  
A1.2 Makroravinteita sisältävät kantaliuokset valmistetaan liuottamalla seura ­
avat aineet 500 ml:aan deionisoitua tai tislattua vettä. Reagenssit 
A1.2.1, A1.2.2, A1.2.3 ja A1.2.4 voidaan yhdistää yhdeksi kantaliu ­
okseksi.  
A1.2.1  NaNO  3 –12,750 g  
A1.2.2  MgCl  2 · 6H 2 O–6,082 g  
A1.2.3  CaCl  2 · 2H 2 O–2,205 g  
A1.2.4  Mikroravinteita sisältävä kantaliuos  – (ks. A1.3)  
A1.2.5  MgSO  4 ·7H  2 O–7,350 g  
A1.2.6  K  2 HPO  4 –0,522 g  
A1.2.7  NaHCO  3 –7,500 g  
A1.2.8  Na  2 SiO  3 ·9H  2 O – ks. huomautus A1.1.  
HUOMAUTUS A1.1  – Käytetään vain piilevälajien viljelyssä. Voidaan 
lisätä suoraan (202,4 mg) tai kantaliuoksessa, jotta viljelyaineen lopul ­
liseksi Si-pitoisuudeksi saadaan 20 mg/l.  
A1.3 Makroravinteita sisältävä kantaliuos valmistetaan liuottamalla seuraavat 
aineet 500 ml:aan deionisoitua tai tislattua vettä.  
A1.3.1  H  3 BO 3 –92,760 mg  
A1.3.2  MnCl  2 ·4H  2 O– 207,690 mg  
A1.3.3  ZnCl  2 –1,635 mg  
A1.3.4  FeCl  3 ·6H  2 O–79,880 mg  
A1.3.5  CoCl  2 ·6H  2 O–0,714 mg  
A1.3.6  Na  2 MoO  4 ·2H  2 O–3,630 mg  
A1.3.7  CuCl  2 ·2H  2 O–0,006 mg  
A1.3.8  Na  2 EDTA·2H  2 O– 150,000 mg  
[Dinatrium(eteenidinitrilo)tetra-asetaatti]  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 974
 
A1.3.9  Na  2 SeO  4 ·5H  2 O–0,005 mg – ks. huomautus A1.2.  
HUOMAUTUS A1.2  – Käytetään kantaviljelmien viljelyaineessa vain, 
kun viljellään piilevälajeja.  
A1.4 Säädetään pH arvoon 7,5 ± 0,1 käyttämällä 0,1  N tai 1,0  N NaOH:a tai 
HCl:a.  
A1.5 Viljelyaine suodatetaan steriiliin astiaan kalvosuodattimen läpi, jonka 
huokoskoko on 0,22 μm, jos käytetään hiukkaslaskinta. Jollei käytetä 
hiukkaslaskinta, huokoskoko on 0,45 μm. 
A1.6 Viljelyainetta säilytetään käyttöön saakka pimeässä noin 4 °C:een läm ­
pötilassa.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 975
 
Lisäys 3  
Esimerkki levänviljelymenetelmästä  
Yleisiä huomautuksia  
Tässä kuvattavan menetelmän avulla voidaan viljellä leviä myrkyllisyyskokeita 
varten.  
Sopivien menetelmien avulla on varmistettava, että leväviljelmissä ei ole baktee ­
ritartuntaa. Aina on varmistettava, että viljelmissä esiintyy vain yhtä levälajia. 
Tämä pätee myös käytettäessä akseenisia viljelmiä.  
Bakteerien tai muiden levien pääsy viljelmään on estettävä tekemällä kaikki 
toimet steriileissä olosuhteissa.  
Välineet ja materiaalit  
Ks. testimenetelmän kohta ”Välineet”.  
Leväviljelmien tuottaminen  
Ravintoliuosten (viljelyaineiden) valmistus:  
Kaikki viljelyaineen ravintosuolat valmistetaan väkevänä kantaliuoksena, ja niitä 
säilytetään pimeässä ja viileässä. Liuokset steriloidaan suodattamalla tai autokla ­
voimalla.  
Viljelyaine valmistetaan lisäämällä sopiva määrä kantaliuosta steriiliin tislattuun 
veteen. Samalla on huolehdittava siitä, ettei synny infektioita. Jos viljelyaine on 
kiinteää, lisätään 0,8 prosenttia agaria.  
Kantaviljelmä:  
Kantaviljelmät ovat pieniä leväviljelmiä, jotka siirretään säännöllisesti tuoreeseen 
viljelyaineeseen, jossa ne toimivat testin alkumateriaalina. Jos viljelmiä ei käytetä 
säännöllisesti, ne valutetaan kallistettuihin agarputkiin. Putket siirretään tuoree ­
seen viljelyaineeseen vähintään kahden kuukauden väliajoin.  
Kantaviljelmiä viljellään sopivaa viljelyainetta sisältävissä erlenmeyerpulloissa 
(tilavuus noin 100 ml). Jos leviä inkuboidaan 20 °C:ssa jatkuvassa valaistuksessa, siirrot on tehtävä viikoittain.
 
Siirrossa ”vanhan” viljelmän osa siirretään steriilin pipetin avulla tuoretta vilje ­
lyainetta sisältävään pulloon. Jos laji on nopeasti kasvava, alkupitoisuuden on oltava noin sadasosa vanhan viljelmän pitoisuudesta.
 
Lajin kasvunopeus voidaan määrittää kasvukäyrän avulla. Näin on mahdollista 
arvioida, kuinka usein viljelmä on siirrettävä uuteen viljelyaineeseen. Siirto on 
tehtävä ennen kuin viljelmä kuolee.  
Esiviljely:  
Esiviljelyn avulla saadaan levämäärä, joka on sopiva testiviljelmien siirrostuk ­
seen. Esiviljelmää inkuboidaan testiolosuhteissa, ja viljelmä käytetään sen ollessa 
vielä eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa, yleensä 2–4 päivän pituisen inkubaa ­
tion jälkeen. Leväviljelmät, jotka sisältävät epämuodostuneita tai poikkeavia so ­
luja, on hylättävä.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 976
 
Lisäys 4  
Tietojen analysointi epälineaarisen regression avulla  
Yleisiä huomautuksia  
Levätesteissä ja muissa testeissä, joissa mitataan mikro-organismien kasvua (bio ­
massan kasvua), vastetta kuvaava muuttuja on luonnostaan jatkuva ja metrinen: 
prosessin nopeus, jos käytetään kasvunopeutta, ja sen integraali ajan funktiona, 
jos käytetään biomassaa. Molempia muuttujia verrataan toistoina tehtyjen altistu ­
mattomien kontrollien vastaavaan keskimääräiseen vasteeseen ottaen huomioon, että kontrollit reagoivat maksimaalisesti kulloisinkiin olosuhteisiin; levätestissä 
valo ja lämpötila ovat pääasialliset määräävät tekijät. Järjestelmä voi olla jakau ­
tunut tai homogeeninen, ja biomassaa voidaan pitää jatkumona ottamatta huomi ­
oon yksittäisiä soluja. Tämän järjestelmän vastetyypin varianssin jakautuminen riippuu ainoastaan testiolosuhteista (joille on luonteenomaista virheiden logarit ­
miset normaalijakaumat tai normaalijakaumat). Tämä poikkeaa tyypillisistä diko ­
tomisista vasteista biologisissa testeissä, joissa oletetaan usein, että yksittäisten organismien toleranssi (jolle on tyypillistä binomijakauma) on hallitseva varians ­
sikomponentti. Tällöin kontrollivasteet ovat nolla tai taustan tasoa.
 
Normalisoitu tai suhteellinen vaste r pienenee yksinkertaisessa tapauksessa tasai ­
sesti 1:stä (ei kasvun estymistä) 0:aan (100-prosenttinen estyminen). On muistet ­
tava, että kaikkiin vasteisiin liittyy virhe ja että ilmeinen negatiivinen kasvun 
estyminen voi laskelmissa johtua pelkästään satunnaisvirheestä.  
Regressioanalyysi  
Mallit  
Regressioanalyysin tavoitteena on kuvata pitoisuus-vastekäyrää matemaattisena 
regressiofunktiona Y = f (C) tai yleisemmin F (Z), jossa Z = log C. Käänteisesti funktio C = f
 –1 (Y) antaa mahdollisuuden laskea EC  x -arvot, kuten EC  50 -, EC  10 - 
ja EC  20 -arvot, ja niiden 95 prosentin luottamusvälit. Useiden yksinkertaisten 
matemaattisten funktioiden on todettu soveltuvan pitoisuus–vaste-suhteen kuvaa ­
miseen leväkasvun estymistesteissä. Niihin kuuluvat muun muassa logistinen kaava, epäsymmetrinen Weibull-jakauma ja logaritminen normaalijakauma, jotka 
ovat kaikki S-käyriä, jotka lähestyvät asymptoottisesti arvoa yksi, kun C → 0, ja 
nollaa, kun C → ääretön.
 
Jatkuvan kynnysfunktion malleja (esimerkiksi Kooijmanin malli, joka kuvaa po ­
pulaation kasvun estymistä, Kooijman et al., 1996) on hiljattain ehdotettu vaih ­
toehdoiksi asymptoottisille malleille. Tällaisissa malleissa oletetaan, että vaiku ­
tuksia ei esiinny tiettyä kynnysarvoa EC0+ pienemmillä pitoisuuksilla. Tämä pitoisuus arvioidaan ekstrapoloimalla vaste–pitoisuus-suhde siten, että se leikkaa 
pitoisuusakselin, käyttämällä yksinkertaista jatkuvaa funktiota, joka ei ole diffe ­
rentioituva lähtöpisteessä.
 
Analyysinä voi olla jäännösneliösummien yksinkertainen minimointi (kun vari ­
anssin oletetaan olevan vakio) tai painotettujen neliösummien yksinkertainen 
minimointi, jos varianssin heterogeenisuus kompensoidaan.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 977
 
Menettely  
Menettely on seuraava: Valitaan sopiva funktionaaliyhtälö Y = f (C) ja sovitetaan 
se tietoihin epälineaarisella regressiolla. Tässä yhteydessä on parempi käyttää jokaisesta yksittäisestä pullosta tehtyjä mittauksia kuin toistojen keskiarvoja, jotta tiedoista saataisiin mahdollisimman paljon informaatiota. Toisaalta käytännön 
kokemus viittaa siihen, että jos varianssi on suuri, toistojen keskiarvoilla saadaan 
luotettavampi matemaattinen arviointi, johon tiedoissa esiintyvät satunnaisvirheet eivät vaikuta yhtä paljon kuin jos jokainen yksittäinen datapiste säilytettäisiin.
 
Sovitettu käyrä ja mitatut tiedot esitetään graafisesti, minkä jälkeen tutkitaan, 
onko käyrä sovitettu asianmukaisesti. Jäännösten analysointi voi olla erityisen 
käyttökelpoinen keino tähän tarkoitukseen. Jos pitoisuus–vaste-käyrän kuvaa ­
miseen valittu funktionaalinen suhde ei kuvaa hyvin koko käyrää tai jotain sen olennaista osaa, kuten vastetta pienillä pitoisuuksilla, valitaan toisenlainen käy ­
ränsovitus, esimerkiksi Weibull-funktion kaltainen epäsymmetrinen käyrä sym ­
metrisen käyrän sijasta. Negatiiviset inhibitiot voivat olla ongelmallisia muun 
muassa logaritmisen normaalijakauman yhteydessä ja voivat vaatia vaihtoehtoisen regressiofunktion käyttöä. Ei ole suositeltavaa merkitä näitä negatiivisia arvoja nollaksi tai antaa niille pientä positiivista arvoa, koska se vääristää virhejakau ­
maa. Voi olla aiheellista tehdä erilliset käyränsovitukset joillekin käyrän osille, 
esimerkiksi sille osalle, jossa kasvun estyminen on pientä, EC
 pieni x  -estimaattien 
määrittämiseksi. Sovitetusta yhtälöstä lasketaan (käänteisfunktiolla C = f  –1 (Y)) 
EC x :n luonteenomaiset piste-estimaatit, ja niistä ilmoitetaan ainakin EC  50 -arvo ja 
yksi tai kaksi EC  pieni x  -arvoa. Käytännön testauksesta saadut kokemukset ovat 
osoittaneet, että levätestillä saadaan yleensä kohtuullisen tarkka arviointi pitoi ­
suuksilla, joilla kasvun estyminen on 10-prosenttista, jos datapisteitä on riittävästi ja pienillä pitoisuuksilla ei esiinny kasvun edistymistä häiritsevänä tekijänä. 
EC
 20 -estimaatin tarkkuus on yleensä huomattavasti parempi kuin EC  10 -estimaa­
tin, koska EC  20 sijaitsee yleensä pitoisuus–vaste-käyrän keskiosan lähes lineaa ­
risessa osassa. Joskus EC  10 -arvoa voi olla vaikea tulkita kasvun edistymisen 
vuoksi. Sen vuoksi on suositeltavaa ilmoittaa aina myös EC  20 -arvo, vaikka 
EC 10 -arvo saadaankin yleensä riittävän tarkasti.  
Painotuskertoimet  
Testissä varianssi ei yleensä ole vakio, ja tavallisesti siihen sisältyy suhteellinen 
komponentti. Sen vuoksi on hyödyllistä tehdä painotettu regressio rutiininomai ­
sesti. Tähän analyysin tarvittavien painotuskertoimien oletetaan yleensä olevan 
käänteisesti verrannollisia varianssiin:  
W i = 1/Var(r  i ) 
Monet regressio-ohjelmat antavat mahdollisuuden tehdä painotettu regressioana ­
lyysi painotuskertoimilla, jotka valitaan taulukosta. Painotuskertoimet voidaan helposti normalisoida kertomalla ne luvulla n/ ∑ w
 i (jossa n on datapisteiden 
määrä), jotta niiden summa olisi yksi.  
Vasteiden normalisointi  
Normalisointi kontrollien keskimääräisen vasteen avulla aiheuttaa joitakin peri ­
aatteellisia ongelmia ja johtaa melko mutkikkaaseen varianssirakenteeseen. Vaste ­
arvojen jakaminen kontrollien keskimääräisellä vastearvolla kasvunestymispro ­
sentin määrittämiseksi aiheuttaa lisävirheen, joka johtuu kontrollien keskiarvoon 
liittyvästä virheestä. Jollei tämä virhe ole mitättömän pieni, regressioon sovellet ­
tavat painotuskertoimet ja luottamusvälit on korjattava ottaen huomioon kovari ­
anssi kontrollin kanssa (17). On tärkeää, että kontrollien keskimääräinen vaste 
arvioidaan hyvin tarkasti, jotta voidaan minimoida suhteellisen vasteen kokonais ­
varianssi. Varianssi saadaan seuraavasti:  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 978
 
(Alaindeksi i tarkoittaa pitoisuutta i ja alaindeksi 0 tarkoittaa kontrolleja.)  
Y i = suhteellinen vaste = r  i /r 0 = 1 – I = f (C  i ) 
kun varianssi on:  
Var (Y  i ) = Var (r  i /r 0 ) e¼ (∂Y i /∂ r i ) 2 ·Var(r  i ) + (∂ Y i /∂ r 0 ) 2 ·Var (r  0 ) 
ja koska  
(∂ Y i / ∂ r i ) = 1/r  0 and (∂ Y i / ∂ r 0 ) = r  i /r 0 2 
kun data on normaalisti jakautunut ja m  i ja m  0 ovat toistoja:  
Var(r  i ) = σ 2 /m i 
suhteellisen vasteen Y  i kokonaisvarianssi on:  
Var(Y  i ) = σ 2 /(r 0 2 m i ) + r  i 2 · σ 2 /r 0 4 m 0 
Kontrollien keskiarvoon liittyvä virhe on kääntäen verrannollinen niiden kontrol ­
litoistojen määrän neliöjuureen, joista keskiarvo on laskettu. Joskus voi olla aiheellista ottaa mukaan aiempia tietoja, jotta virhettä voidaan pienentää merkit ­
tävästi. Vaihtoehtoisena menetelmänä on, että tietoja ei normalisoida eikä abso ­
luuttisia vasteita soviteta, kontrolleja koskevat vastetiedot mukaan luettuina, vaan 
kontrollivasteen arvo otetaan käyttöön lisäparametrina, joka sovitetaan epälineaa ­
risella regressiolla. Käytettäessä tavanomaista kahden parametrin regressioyhtä ­
löä, tämä menetelmä edellyttää kolmen parametrin sovittamista ja vaatii sen 
vuoksi enemmän datapisteitä kuin sellaisten tietojen epälineaarinen regressio, 
jotka on normalisoitu käyttämällä ennalta määritettyä kontrollivastetta.
 
Käänteiset luottamusvälit  
On melko monimutkaista laskea epälineaarisen regression luottamusvälit estimoi ­
malla käänteisfunktion avulla, eikä tätä vaihtoehtoa ole saatavilla tavanomaisissa 
tilasto-ohjelmistopaketeissa. Likimääräiset luottamusvälit voidaan saada tavan ­
omaisilla ohjelmilla, joita käytetään epälineaarisen regression laskemiseen, käyt ­
tämällä uudelleenparametrisointia (Bruce ja Versteeg, 1992), jolloin matemaatti ­
nen kaava kirjoitetaan uudelleen käyttämällä haluttuja piste-estimaatteja, esimer ­
kiksi EC  10 - ja EC  50 -arvoa, arvioitavina parametreina. (Funktioksi valitaan 
I = f (α, β, pitoisuus) ja käytetään määritelmäsuhteita f ( α, β, EC  10 ) = 0,1 ja 
f (α, β, EC  50 ) = 0,5 korvaamaan f ( α, β, pitoisuus) vastaavalla funktiolla g (EC  10 , 
EC 50 , pitoisuus).)  
Laskenta voidaan tehdä suoraan (Andersen et al, 1998) säilyttämällä alkuperäinen 
yhtälö ja käyttämällä Taylorin laajennusta r  i :n ja r  0 :n keskiarvojen ympäristössä.  
Viimeaikoina on käytetty yhä enemmän ”bootstrap”-menetelmiä. Näissä menetel ­
missä arvioidaan empiiristä varianssijakaumaa käyttämällä mitattuja tietoja ja 
tiheää uusintanäytteiden ottoa, jota ohjataan satunnaislukugeneraattorilla.  
Kirjallisuus  
Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentra ­
tions in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625–1632.  
Bruce, R.D. and Versteeg, D.J.(1992). A Statistical Procedure for Modelling 
Continuous Ecotoxicity Data. Env. Toxicol. Chem.11, 1485–1494.  
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. 
(1998): Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405–420.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 979
 
C.4 BIOHAJOAVUUDEN MÄÄRITYS  
OSA I  YLEISTÄ  
I.1 JOHDANTO  
Jäljempänä kuvataan kuusi menetelmää, joiden avulla voidaan tutkia 
kemikaalin biohajoavuutta aerobisessa vesiliuoksessa. Menetelmät 
ovat seuraavat:  
a) Liukoinen orgaaninen hiili (DOC — Dissolved Organic Carbon) 
Die-Away -menetelmä C.4-A,  
b) Muunneltu OECD-seulonta (DOC Die-Away) -menetelmä C.4-B,  
c) Hiilidioksidin (CO  2 ) muodostus (muunneltu Sturm-testi) — me ­
netelmä C.4-C  
d) Manometrinen respirometria -menetelmä C.4-D  
e) Suljettu pullo -menetelmä C.4-E  
f) MITI (Ministry of International Trade and Industry, Japani) -me ­
netelmä C.4-E  
Menetelmäkuvausten osassa I on kunkin testin yleiskuvaus. Osissa 
II–VII on kuvattu menetelmän erityispiirteet. Liitteissä on määritel ­
miä, suureyhtälöitä ja ohjeita.  
OECD-maiden laboratorioiden välinen, vuonna 1988 suoritettu testi 
osoitti, että menetelmillä saadut tulokset ovat yhtenäiset. Menetelmää 
valittaessa on kuitenkin otettava huomioon testattavan aineen fysi ­
kaaliset ominaisuudet.  
I.2 MENETELMÄN VALINTA  
Sopivimman menetelmän löytämiseksi on hankittava tietoja aineen 
kemiallisesta liukoisuudesta, höyrynpaineesta ja adsorptio-ominai ­
suuksista. Aineen kemiallinen rakenne tai kaava on selvitettävä teo ­
reettisten arvojen laskentaa tai mitattujen parametrien — esimerkiksi ThOD:n, ThCO
 2 :n, DOC:n, TOC:n ja COD:n — tarkistamista varten 
(katso liitteitä I ja II).  
Kemikaaleja, joiden vesiliukoisuus on vähintään 100 mg/l, voidaan 
tutkia kaikilla menetelmillä, edellyttäen, etteivät kemikaalit ole haih ­
tuvia tai adsorboivia. Huonosti veteen liukenevia, haihtuvia tai ad ­
sorboivia kemikaaleja varten soveltuvat menetelmät luetellaan taulu ­
kossa 1. Esimerkkejä huonosti veteen liukenevien ja haihtuvien ke ­
mikaalien käsittelymahdollisuuksista kuvataan liitteessä III. Lievästi haihtuvia kemikaaleja voidaan testata DOC Die-Away -menetelmällä, edellyttäen että testausastiassa on riittävä kaasutila (astian on oltava 
suljettua tyyppiä). Tällöin on tehtävä abioottisia tarkistuksia mahdol ­
lista fysikaalista hukkaa ajatellen.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 980
 
Taulukko 1  
Testimenetelmien soveltuvuus  
Testi Analyyttinen menetelmä Soveltuvuus 
huonosti liuke ­
nevat aineet haihtuvat aineet adsorboivat ai ­
neet 
DOC Die-Away Liuennut orgaaninen hiili — — +/- 
Muunneltu OECD Die-Away Liuennut orgaaninen hiili — — +/- CO
 2 :n muodostus Respirometria: CO  2 :n muo­
dostus + — + 
Manometrinen respirometria Manometrinen respiromet ­
ria: hapenkulutus + +/- + 
Suljettu pullo Respirometria: liuennut 
happi +/- + + 
MITI Respirometria: hapenkulu ­
tus + +/- +  
Tulosten tulkintaa varten tarvitaan tietoja testattavan aineen pääosien 
puhtaudesta tai niiden suhteellisista osuuksista, etenkin jos tuloksena 
saatavat arvot ovat pieniä tai marginaalisia.  
Sopivan testauspitoisuuden löytämiseksi on suositeltavaa selvittää 
aineen myrkyllisyys bakteereille (liite IV). Näiden tietojen avulla voidaan usein varmistaa oikea tulkinta, jos tuloksena saatu biohajoa ­
vuus on heikko.
 
I.3 VERTAILUAINEET  
Menetelmän tarkistamiseksi biohajoavuuskriteerin täyttäviä vertailu ­
kemikaaleja testataan rinnan testiajojen kanssa tarkoitukseen sopi ­
vassa pullossa.  
Sopivia vertailukemikaaleja ovat (vastatislattu) aniliini, natriumaset ­
aatti ja natriumbentsoaatti, jotka kaikki hajoavat näiden menetelmien mukaan käsiteltynä, myös ilman siirrosaineen lisäystä.
 
On ehdotettu sellaisen vertailukemikaalin etsimistä, jolla olisi hyvä 
biohajoavuus, mutta joka edellyttäisi siirrosaineen lisäystä. Tarkoi ­
tukseen on ehdotettu kaliumvetyftalaattia, josta on kuitenkin saatava 
lisätodisteita, ennen kuin se voidaan hyväksyä vertailuaineeksi.  
Respirometrisissä testeissä typpeä sisältävät yhdisteet voivat häiritä 
hapenottoa nitrifikaation vuoksi (katso liitteitä II ja V).  
I.4 TESTIMENETELMIEN PERIAATE  
Testattavaa ainetta, joka on liuotettu tai suspendoitu epäorgaaniseen 
aineeseen, siirrostetaan ja inkuboidaan aerobisissa olosuhteissa pime ­
ässä tai heikossa valaistuksessa. Testiliuoksen siirrostuksesta saadun DOC-määrän on oltava mahdollisimman pieni testattavasta aineesta 
saatuun DOC-määrään verrattuna. Siirrosaineen endogeeninen aktivi ­
teetti otetaan huomioon ajamalla rinnan taustakokeita käyttäen pelkää siirrosainetta ilman testattavaa ainetta, vaikka solujen endogeeninen aktiviteetti testattavan aineen vaikutusten vuoksi ei ole täysin sama 
kontrolliliuoksessa ja testiliuoksessa. Menetelmien tarkistamiseksi 
ajetaan rinnakkaiskoe vertailuainetta käyttäen.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 981
 
Hajoamisvaiheen jälkeen seuraa yleensä parametrien (esimerkiksi 
DOC:n, CO  2 -tuotannon ja hapenoton) määritys. Biohajoavuusvai ­
heen alku ja loppu voidaan todeta tekemällä mittauksia riittävän usein. Jos käytetään automaattisia respirometrejä, mittaaminen on jatkuvaa. DOC-arvo mitataan eräissä tapauksissa toisen parametrin 
mittauksen yhteydessä, mutta tavallisimmin DOC-mittaus tehdään 
kokeen alussa ja lopussa. Spesifisen kemiallisen analyysin avulla voidaan määrittää myös testattavan aineen primaarinen hajoaminen ja mahdollisesti muodostuvat välituotteet (pakollinen osa MITI-tes ­
tiä).
 
Kokeen kesto on yleensä 28 päivää. Koe voidaan keskeyttää aiem ­
min, jos biohajoavuuskäyrässä on vähintään kolmen mittauksen pi ­
tuinen tasanne. Koetta voidaan myös jatkaa 28. päivän jälkeen, jos biohajoavuuskäyrästä nähdään, että biohajoamisvaihe on alkanut, mutta ei vielä ole saavuttanut tasannetta 28. päivän kohdalla.
 
I.5 LAATUKRITEERIT  
I.5.1 Toistettavuus  
Biohajoavuuden ominaisuuksien ja siirrosaineksena käytettyjen yh ­
distettyjen bakteeriviljelmien ominaisuuksien vuoksi määritykset on 
tehtävä vähintään kaksi kertaa.  
Käytäntö on osoittanut, että mitä suurempi on kokeen alussa testiliu ­
okseen lisättyjen pieneliöiden pitoisuus, sitä vähäisempi on toistojen välinen vaihtelu. Rengastesteillä on voitu osoittaa, että eri laborato ­
rioista saadut tulokset voivat vaihdella merkittävästi. Niiden aineiden 
osalta, joiden biohajoavuus on hyvä, on kuitenkin yleensä saatu varsin yhteneviä tuloksia.
 
I.5.2 Kokeen hyväksyminen  
Koe hyväksytään, jos kemikaalin hajoamisarvojen ero biohajoavuus ­
käyrän tasanteen kohdalla (testin alussa tai 10-päiväisen jakson lo ­
pussa) toistojen ääriarvojen osalta on enintään 20 % ja jos vertailu ­
aineen prosentuaalinen hajoaminen on saavuttanut hyvän biohajoa ­
vuuden tason 14 päivän kuluessa. Jos jompikumpi näistä ehdoista ei täyty, koe on toistettava. Koska menetelmien valinnanvara on vähäi ­
nen, pienet arvot eivät välttämättä tarkoita sitä, ettei aineen bioha ­
joavuus luonnonympäristössä voisi olla hyvä. Pienet arvot osoittavat 
kuitenkin, että aineen biohajoavuuden määrittämiseksi tarvitaan lisä ­
tutkimuksia.
 
Jos myrkyllisyystestissä, jossa käytetään sekä testattavaa ainetta että 
vertailukemikaalia, saadaan tulokseksi hajoaminen, joka 14 päivän kuluessa on DOC-pohjaisena enintään 35 % tai THOD- tai 
ThCO
 2 -pohjaisena enintään 25 %, voidaan olettaa, että testattavalla 
kemikaalilla on inhibitonsia ominaisuuksia (katso myös liitettä IV). Tällöin koesarja on toistettava, mahdollisesti pienempää kemikaalin 
pitoisuutta tai suurempaa siirrosaineen pitoisuutta käyttäen, ei kuiten ­
kaan yli 30 mg:aa kuiva-ainetta litraa kohti.
 
I.6 YLEISIÄ MENETELMIÄ JA VALMISTELUJA  
Taulukossa 2 on yhteenveto testiin sovellettavista yleisistä olosuh ­
teista. Yksittäisten kokeiden laitteet ja olosuhteet kuvataan tarkem ­
min kokeiden omissa menetelmäkuvauksissa.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 982
Taulukko 2  
Testiolosuhteet  
Koe DOC Die- 
Away CO 2 -muodostus Manometrinen 
respirometria Muunneltu 
OECD-seulonta Suljettu pullo MITI (I)  
Testattavan 
aineen pitoi ­
suus 
mg/l 100 2–10 100 
mg DOC/l 10–40 10–20 10–40 
mg ThOD/1 50–100 5–10 
Siirrosaineen 
pitoisuus (so ­
luja/l, liki ­
arvo) ≤ 30 mg/l SS 
tai ≤ 100 ml jätevettä/l 
(10 7 – 10  8 ) 0,5 ml se ­
kundaarista 
jätevettä/l 
(10 5 ) ≤ 5 ml jäte ­
vettä/l 
(10 4 -10 6 ) 30 mg/l SS 
(10 7 -10 8 ) 
Epäorgaa ­
nisen liuok ­
sen koostu ­
mus (mg/l): 
P 116 11,6 29 
N 1,3 0,13 1,3 
Na 86 8,6 17,2 
K 122 12,2 36,5 
Mg 2,2 2,2 6,6 Ca 9,9 9,9 29,7 
Fe 0,05 - 0,1 0,05 - 0,1 0,15 
pH 7,4 ± 0,2 suositus: 7,0 Lämpötila 22 ± 2
 o C 25 ± 1  o C 
DOC = Liuennut orgaaninen hiili ThOD = Teoreettinen ha ­
pentarve SS = Suspendoitunut 
kuiva-aine  
I.6.1 Laimennusvesi  
Laimennukseen käytetään ionivaihdettua tai tislattua vettä, jossa ei 
ole inhibitoorisia pitoisuuksia myrkyllisiä aineita (esimerkiksi Cu  ++ - 
ioneja). Vedessä saa olla enintään 10 % testattavasta materiaalista 
saatua orgaanista hiiltä. Erittäin puhtaan veden käyttö on oleellista suurten tausta-arvojen välttämiseksi. Veteen voi tulla saasteita luon ­
taisista epäpuhtauksista, ioninvaihtohartseista tai bakteereista ja le ­
vistä liuenneista aineista. Koesarjoittain on käytettävä samaa vesie ­
rää, jolle on ensin tehtävä DOC-analyysi. Suljetun pullon koetta varten tätä tarkistusta ei tarvita, mutta veden hapenkulutuksen on oltava pieni.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 983
 
I.6.2 Epäorgaanisten ainesosien kantaliuos  
Testiliuokset valmistetaan epäorgaanisia aineita sisältävistä kantaliu ­
oksista. Jäljempänä luetellut kantaliuokset soveltuvat (sopivasti lai ­
mennettuina) seuraaviin menetelmiin: DOC Die-Away, muunneltu 
OECD-seulonta, CO  2 -muodostus, manometrinen respirometria, sulje ­
tun pullon koe.  
Laimennuskertoimet ja MITI-kokeen epäorgaanisen liuoksen spesifi ­
nen valmistelutapa mainitaan kunkin kokeen otsikon alla.  
Kantaliuokset:  
Valmistetaan seuraavat kantaliuokset analyyttisen puhtaita reagens ­
seja käyttäen: 
a) Kaliumdivetyortofosfaattia, KH  2 PO 4 8,50 g 
Dikaliummonovetyortofosfaattia, K  2 HPO  4 21,75 g 
Dinatriummonovetyortofosfaattidihydraattia, 
Na 2 HPO  4 x 2H  2 O 33,40 g 
Ammoniumkloridia, NH  4 CI 0,50 g 
Liuotetaan veteen ja laimennetaan litran tilavuu ­
teen. Liuoksen pH-arvon on oltava 7,4. 
b) Kalsiumkloridia, CaCl  2 27,50 g 
tai kalsiumklorididihydraattia, CaCl  2 x 2H  2 O 36,40 g 
Liuotetaan veteen ja laimennetaan litran tilavuu ­
teen. 
c) Magnesiumsulfaattiheptahydraattia, MgSO  4 x 
7H 2 O 22,50 g 
Liuotetaan veteen ja laimennetaan litran tilavuu ­
teen. 
d) Rauta(III)kloridi-heksahydraattia, FeCl  3 x 6H  2 O 0,25 g 
Liuotetaan veteen ja laimennetaan litran tilavuu ­
teen.  
Huomautus:  Jotta liuosta ei tarvitsisi valmistaa välittömästi ennen 
käyttöä, siihen voidaan lisätä tippa väkevää suolahappoa tai 0,4 g EDTA:ta litraa kohti.
 
I.6.3 Kemikaaleista valmistetut kantaliuokset  
Jos aineen liukoisuus on yli 1 g/1, 1–10 g testattavaa tai kontrollina 
käytettävää kemikaalia liuotetaan ionivaihdettuun veteen ja liuos lai ­
mennetaan yhden litran tilavuuteen. Muussa tapauksessa kantaliuos voidaan valmistaa epäorgaaniseen liuokseen tai kemikaalia voidaan lisätä suoraan epäorgaaniseen liuokseen. Huonosti liukenevien kemi ­
kaalien käsittely kuvataan liitteessä ITL MITI-kokeessa (menetelmä 
C.4-F) ei saa käyttää liuottimia tai emulgaattoreita.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 984
 
I.6.4 Siirrosaine  
Siirrosaine voi olla peräisin useasta lähteestä: aktivoidusta lietteestä, 
jätevedestä (ilman kloorikäsittelyä), pintavedestä, maa-aineksesta tai näiden seoksesta. Jos DOC Die-Away-, CO
 2 -muodostus- ja mano ­
metrinen respirometria -kokeissa käytetään aktiivilietettä, se on otet ­
tava käsittelylaitoksesta tai laboratoriolaitoksesta, johon syötetään pääosin kotitalouksista tulevaa jätevettä. Muista lähteistä otetun siir ­
rosaineen on todettu aiheuttavan varsin epäyhtenäisiä tuloksia. 
Muunneltua OECD-seulontamenetelmää ja suljetun pullon menetel ­
mää varten tarvitaan matalapitoista siirrosainetta ilman lieteflokkeja. Tällöin suositellaan talousveden esikäsittelylaitoksesta tai laboratorio ­
laitokscsta saatua sekundaarista jätevettä. MITI-menetelmää varten 
tarvittava siirrosaine saadaan sekoittamalla eri lähteistä saatuja aineita (tarkempi kuvaus löytyy MITI-menetelmän otsikon alta).
 
I.6.4.1  Siirrosaine aktiivilietteestä  
Aktiivilietenäyte otetaan sellaisenaan pääosin kotitalouksien jätevettä 
käsittelevän vedenpuhdistamon tai laboratoriolaitoksen ilmastussäili ­
östä. Tarvittaessa karkeat hiukkaset poistetaan suodattamalla hienon seulan läpi, minkä jälkeen liete pidetään aerobisena.
 
Lietteen annetaan asettua tai se sentrifugoidaan (esimerkiksi 1 100 g 
10 minuutin ajan) karkeiden hiukkasten poiston jälkeen. Pintaliete 
hylätään. Lietettä voidaan pestä epäorgaanisessa liuoksessa. Väke ­
vöity liete suspendoidaan epäorgaaniseen liuokseen (lopullinen pitoi ­
suus 3–5 g kuiva-ainetta/1) ja säilötään ilmastettuna.  
Lietteen on tultava tehokkaasti toimivasta, perinteisen tekniikan mu ­
kaisesta laitoksesta. Jos liete on otettava suurkuormituslaitoksesta tai jos epäillään lietteen sisältävän inhibiittoreita, liete on pestävä. Liete 
sekoitetaan hyvin, minkä jälkeen uudelleen suspendoitunut liete saa 
asettua tai se sentrifugoidaan. Pintaliete hylätään ja pesty liete sus ­
pendoidaan uudelleen uuteen epäorgaaniseen liuokseen. Menettelyä toistetaan, kunnes voidaan katsoa, ettei lietteessä ole enää ylimää ­
räistä substraattia tai inhibiittoria.
 
Kun liete on täysin uudelleensuspendoitunut (tai jos lietettä käytetään 
sellaisenaan), näyte kerätään välittömästi ennen käyttöä. Suspendoi ­
tuneen kuiva-aineen pitoisuus määritetään näytteestä.  
Yksi vaihtoehto on lisäksi aktiivilietteen homogenointi (3–5 g sus ­
pendoitunutta kuiva-ainetta/l). Lietettä käsitellään mekaanisessa se ­
koittimessa keskinopeudella 2 minuutin ajan. Sekoitetun lietteen an ­
netaan asettua 30 minuutin ajan (tai tarvittaessa kauemmin), ja neste 
dekantoidaan. Näin saatua nestettä käytetään siirrosaineena (pitoi ­
suus: 10 ml/l epäorgaanista liuosta).  
I.6.4.2  Muita siirrosainelähteitä  
Siirrosainetta voidaan valmistaa myös pääosin kotitalouksien jäte ­
vettä käsittelevän laitoksen tai laboratoriolaitoksen sekundaarisesta 
jätevedestä. Kerätään tuore näyte, joka pidetään aerobisena kuljetuk ­
sen ajan. Näytteen annetaan asettua tunnin ajan tai se suodatetaan karkean suodatinpaperin läpi. Näin saatua dekantoitua jätevettä tai 
suodosta säilytetään aerobisena, kunnes sitä tarvitaan. Tämäntyyp ­
pistä siirrosainetta voidaan käyttää enintään 100 ml liuoslitraa kohti.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 985
 
Siirrosainetta voidaan ottaa myös pintavedestä. Esimerkiksi joen tai 
järven pintavedestä otetaan näyte, jota säilytetään aerobisena, kunnes 
sitä tarvitaan. Tarvittaessa siirrosaine voidaan väkevöidä suodatta ­
malla tai sentrifugoimalla.  
I.6.5 Siirrosaineen esikäsittely  
Esikäsittelyn avulla siirrosaine voidaan sopeuttaa testiolosuhteisiin, 
mutta ei testattavaan kemikaaliin. Esikäsittelyssä aktiivilietettä ilmas ­
tetaan epäorgaanisessa liuoksessa tai sekundaarisessa jätevedessä 5–7 päivän ajan testilämpötilassa. Esikäsittelyn avulla on mahdollista 
saada tarkempia tuloksia, koska tausta-arvot jäävät pois. MITI-me ­
netelmän avulla valmistettua siirrosainetta ei tarvitse esikäsitellä.
 
I.6.6 Abioottiset tarkistukset  
Tarvittaessa testattavan aineen mahdollinen abioottinen hajoaminen 
on tarkistettava määrittämällä DOC:n poistuma, hapenotto tai hiilidi ­
oksidinmuodostus steriilistä vertailunäytteestä, jossa ei ole siirros ­
ainetta. Sterilointi tehdään kalvosuodatuksella (0,2–0,45 μm) tai li­
säämällä sopiva määrä soveltuvaa myrkyllistä ainetta. Jos käytetään 
kalvosuodatusta, näytteet on otettava aseptisesti steriiliyden varmis ­
tamiseksi. Ellei testattavan kemikaalin adsorptiomahdollisuutta ole voitu sulkea pois, testeihin, joissa mitataan biohajoamista DOC:n 
poistuman avulla (etenkin käytettäessä aktiivilietettä siirrosaineena), 
on sisällytettävä abioottinen (siirrostettu ja myrkytetty) vertailunäyte.
 
I.6.7 Pullojen määrä  
Tyypillisessä kokeessa käytettävä pullomäärä mainitaan kunkin ko ­
keen otsikon alla.  
Seuraavia pullotyyppejä voidaan käyttää:  
— Testisuspensio: pullossa testattavaa ainetta ja siirrosainetta  
— Siirrosaineen taustanäyte: pullossa pelkkää siirrosainetta  
— Menetelmän vertailunäyte: pullossa vertailu- ja siirrosainetta  
— Steriili abioottinen vertailunäyte: steriili pullo, jossa on testatta ­
vaa ainetta  
— Adsorptiotarkistus: pullossa testattavaa ainetta, siirrosainetta ja 
steriloivaa ainetta  
— Myrkyllisyyskoe: pullossa testattavaa ainetta, vertailuainetta ja 
siirrosainetta.  
Testisuspension ja siirrosaineen taustanäytteen määritykset on ehdot ­
tomasti tehtävä rinnan. On suositeltavaa tehdä myös muiden pullojen 
määritykset rinnan.  
Tämä ei ehkä aina ole mahdollista. On tärkeää, että otetaan riittävä 
määrä näytteitä tai lukemia, jotta 10-päiväisen jakson aikana syntyvä 
prosentuaalinen poistuma voidaan määrittää.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 986
 
I.7 TIEDOT JA ARVIOINTI  
D t -arvon laskennassa käytetään prosentuaalista hajoamista, paramet ­
rin kaksoismittausten keskiarvoja molempien testisäiliöiden osalta ja siirrosaineen taustanäytettä. Laskentaan käytettävät suureyhtälöt mai ­
nitaan jäljempänä kunkin kokeen yhteydessä. Hajoaminen esitetään 
graafisessa muodossa (10-päiväinen jakso merkitään). Lasketaan ja raportoidaan saavutettu prosentuaalinen poistuma 10-päiväisen jak ­
son lopussa samoin kuin käyrän tasanteen arvo tai arvo kokeen pää ­
tyttyä (valitaan sopivampi arvo).
 
Respirometrisissä testeissä typpeä sisältävät yhdisteet voivat häiritä 
hapenottoa nitrifikaation vuoksi (katso liitteitä II jaV).  
I.7.1 DOC-määrityksen avulla mitattu hajoaminen  
Lasketaan jokaisen näytteenoton ajankohdan prosentuaalisen hajon ­
nan arvo D  t kutakin testattavaa ainetta kohti DOC-kaksoismittausten 
keskiarvoja käyttäen (kaksoismittausten avulla voidaan vahvistaa ko ­
keen hyväksyttävyys — katso kohtaa 1,5.2). D  t -arvo lasketaan seu ­
raavan suureyhtälön avulla:  
D t ¼ 1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C b0 Í Î  
Ü 100  
jossa  
D t = prosentuaalinen hajoaminen ajankohtana t,  
C o = siirrostetun, testiainetta sisältävän viljelmän keskimääräinen 
DOC-pitoisuus kokeen alussa (mg DOC/l),  
C t = siirrostetun, testiainetta sisältävän viljelmän keskimääräinen 
DOC-pitoisuus hetkellä t (mg DOC/l),  
C bo = siirrostetun, taustanäytteenä käytettävän epäorgaanisen 
liuoksen keskimääräinen DOC-pitoisuus kokeen alussa (mg DOC/l)
 
C bt = siirrostetun, taustanäytteenä käytettävän epäorgaanisen 
liuoksen keskimääräinen DOC-pitoisuus hetkellä t (mg 
DOC/l).  
Kaikki pitoisuudet mitataan kokeellisesti.  
I.7.2 Spesifisen analyysin avulla mitattava hajoaminen  
Jos käytettävissä on spesifisiä analyyttisiä tietoja primaarinen bioha ­
joaminen voidaan laskea seuraavan suureyhtälön avulla:  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
jossa:  
D t = prosentuaalinen hajonta hetkellä t (yleensä 28 päivää)  
S a = testattavan aineen jäännösmäärä (mg) siirrostetussa liuoksessa 
kokeen lopussa  
S b = testattavan aineen jäännösmäärä (mg) taustanäytteessä (vettä/ ­
liuosta, johon on lisätty vain testattavaa ainetta)  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 987
 
I.7.3 Abioottinen hajoaminen  
Jos käytetään abioottista, steriiliä vertailunäytettä, prosentuaalinen 
abioottinen hajoaminen voidaan laskea seuraavan suureyhtälön avulla:  
prosentuaalinen abioottinen hajoaminen  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
jossa  
C s(o) = steriilin vertailunäytteen DOC-pitoisuus päivänä 0 (kokeen 
alussa)  
C s(t) = steriilin vertailunäytteen DOC-pitoisuus päivänä t  
I.8 RAPORTOINTI  
Testiraporttiin tulee mahdollisuuksien mukaan sisällyttää seuraavat 
tiedot:  
— testattavat aineet ja vertailuaineet sekä niiden puhtausluokka,  
— testiolosuhteet,  
— siirrosaineen laatu ja ottopaikka (-paikat), pitoisuus ja mahdolliset 
esikäsittelyt,  
— jäteveden teollisuusjätteiden osuus ja laatu (jos tunnetaan),  
— kokeen kesto ja lämpötila,  
— mahdollisten huonosti liukenevien käsittely,  
— käytetty testimenetelmä; kaikista muutoksista on annettava tie ­
teelliset perustelut ja selvitykset,  
— tietolomake,  
— mahdollisesti havaitut inhibiitioilmiöt,  
— mahdollisesti havaittu abioottinen hajoaminen,  
— spesifiset kemialliset analyysitiedot (jos käytettävissä),  
— välituotteiden analyyttiset tiedot (jos käytettävissä),  
— käyrät, jotka esittävät testattavan aineen ja vertailuaineiden pro ­
sentuaalisen hajoamisen ajan funktiona; lepovaihe, hajoamisvaihe, 10-päiväinen jakso ja kaltevuus on merkittävä selvästi (liite I). Jos 
testi täyttää testikriteent, käyrässä voidaan käyttää testattavan ai ­
neen prosentuaalisen hajoamisen keskiarvoa,
 
— prosentuaalinen poistuma 10-päiväisen jakson jälkeen ja käyrän 
tasanteella tai kokeen lopussa.  
OSA II.  DOC DIE-AWAY-KOE  (menetelmä C.4-A)  
II. 1 MENETELMÄN PERIAATE  
Mitattu tilavuus siirrostettua epäorgaanista liuosta, jossa on tunnettu 
pitoisuus testattavaa ainetta (10–40 mg DOC/l) ainoana nimellisenä 
hiililähteenä, ilmastetaan heikossa valossa tai pimeässä pitäen yllä 
lämpötilaa 22 ± 2  o C. ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 988
 
Hajoamista seurataan usein tehtävien DOC-analyysien avulla 28 päi ­
vän jakson aikana. Hajoamisaste lasketaan ilmaisemalla poistuneen 
DOC:n (siirrostetun taustanäytteen arvolla korjattuna) prosenttiosuus alkupitoisuudesta. Primaarisen biohajoamisen aste voidaan laskea myös inkubaation alussa ja lopussa tehdyn kemiallisen analyysin 
avulla.
 
II.2 MENETELMÄKUVAUS  
II.2.1  Laite  
a) erlenmeyerpulloja (tilavuudeltaan esimerkiksi 250 ml–2 1) DOC- 
analyysin edellyttämän tilavuuden mukaan,  
b) ravistuskone pulloja varten (koneessa on oltava automaattinen 
lämpötilan säätö tai sitä on käytettävä lämpötilasäädetyssä huo ­
neessa, ja sen on pystyttävä ylläpitämään aerobisia olosuhteita 
kaikissa pulloissa),  
c) sopivin kalvoin varustettu suodatuslaite,  
d) DOC-analysaattori,  
e) liuenneen hapen määrityslaite,  
f) sentrifugi.  
II.2.2  Epäorgaanisen liuoksen valmistus  
Kantaliuoksen valmistus kuvataan kohdassa I.6.2.  
10 ml a-liuosta sekoitetaan 800 ml:aan laimennusvettä, lisätään b-, c- 
ja d-liuosta 1 ml kutakin ja laimennetaan liuos yhden litran tilavuu ­
teen.  
II.2.3  Siirrosaineen valmistelu ja esikäsittely  
Siirrosaineen lähteinä voidaan käyttää aktiivilietettä, jätevettä, pinta ­
vettä, maata tai näiden sekoitusta.  
Katso kohtia I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 ja I.6.5.  
II.2.4  Pullojen valmistelu  
Pannaan epäorgaanista liuosta 2 litran erlenmeyerpulloihin esimer ­
kiksi 800 ml:n annoksina. Riittävä määrä testattavan aineen ja ver ­
tailuaineen kantaliuosta lisätään eri pulloihin siten, että saadaan ke ­
mikaalipitoisuus, joka vastaa pitoisuutta 10–40 ml DOC/l. Tarkiste ­
taan pH ja säädetään se tarvittaessa arvoon 7,4. Pullot siirrostetaan aktiivilietteellä tai muulla siirrosaineella (katso kohtaa I.6.4) siten, että lopullinen pitoisuus on enintään 30 mg suspendoitunutta kui ­
va-ainetta/l. Valmistetaan myös siirrosaineen vertailunäytteet epäor ­
gaaniseen liuokseen, mutta ilman testattavaa kemikaalia ja vertailu ­
kemikaalia.
 
Tarvittaessa testattavan kemikaalin mahdolliset inhibitooriset ominai ­
suudet on tarkistettava siirrostamalla yhteen pulloista epäorgaanista 
liuosta, jossa on vertailukelpoiset pitoisuudet testattavaa kemikaalia ja vertailukemikaalia.
 
Tarvittaessa valmistetaan myös erillinen steriili pullo, jonka avulla 
tarkistetaan testattavan kemikaalin abioottinen hajoaminen käyttäen 
kemikaalin liuosta, johon ei ole lisätty siirrosainetta (katso kohtaa 
I.6.6).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 989
 
Jos epäillään, että testattava kemikaali adsorboituu merkittävissä 
määrin esimerkiksi lasiin tai lietteeseen, voidaan tehdä alustava ke ­
mikaalin adsorption todennäköisen laajuuden määritys, jonka perus ­
teella voidaan arvioida testimenetelmän soveltuvuutta tälle kemikaa ­
lille (katso taulukkoa 1). Alustavaa määritystä varten pulloon lisätään 
testattavaa ainetta, siirrosainetta ja sterilointiainetta.  
Kaikkien pullojen sisältö laimennetaan epäorgaanisella liuoksella yh ­
den litran tilavuuteen. Sekoituksen jälkeen jokaisesta pullosta otetaan näyte alkuperäisen DOC-pitoisuuden määritystä varten (katso liitettä 
II.4). Pullojen suut peitetään esimerkiksi alumiinifoliolla siten, että 
ilma pääsee vapaasti vaihtumaan pullon ja ympäristön välillä. Tämän jälkeen pullot pannaan ravistuskoneeseen kokeen aloittamista varten.
 
II.2.5  Tyypillisen kokeen pullomäärä  
Pullot 1 ja 2: Testisuspensio  
Pullot 3 ja 4: Siirrosaineen taustanäyte  
Pullo 5: Menetelmän vertailunäyte  
Seuraavia pulloja on käytettävä tarpeen mukaan, ja niiden käyttö on 
muutenkin suositeltavaa:  
Pullo 6: Steriili abioottinen vertailunäyte  
Pullo 7: Adsorption vertailunäyte  
Pullo 8: Myrkyllisyystarkistus  
Katso myös kohtaa I.6.7.  
II.2.6  Testin suorittaminen  
Testin aikana kunkin pullon DOC-pitoisuus määritetään kahdesti tie ­
tyin välein. Määritykset on tehtävä riittävän usein, jotta voidaan mää ­
rittää 10-päiväisen jakson alku ja prosentuaalinen poistuma tämän jakson lopussa. Määrityksiä varten otetaan pienin mahdollinen määrä testisuspensiota.
 
Ennen näytteenottoa pulloista haihtunut vesimäärä on kompensoitava 
lisäämällä pulloihin tarpeellinen määrä laimennusvettä (I.6.1). Pullo ­
jen sisältö sekoitetaan huolellisesti varmistaen, että pullojen seinä ­
miin kiinnittynyt aines liukenee tai suspendoituu ennen näytteen ­
ottoa. Näytteet kalvosuodatetaan tai sentnfugoidaan heti näytteenoton jälkeen (katso liitettä II.4). Ellei näytteitä analysoida samana päivänä, niitä voidaan säilyttää 2–4
 o C:ssa enintään 48 tuntia tai alle 
–18  o C:ssa, jos ne joutuvat odottamaan tätä pitempään.  
II.3 TIEDOT JA RAPORTOINTI  
II.3.1  Tulosten käsittely  
Annetun hetken t prosentuaalinen hajoaminen lasketaan kohdan 
I.7.1 mukaan (DOC-määritys) ja vaihtoehtoisesti kohdan 
I.7.2 mukaan (spesifinen analyysi).  
Tulokset kirjataan jäljempänä kuvattavaan tietolomakkeeseen.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 990
 
II.3.2  Tulosten hyväksyttävyys  
Katso kohtaa I.5.2.  
II.3.3  Raportointi  
Katso kohtaa I.8.  
II.4 TIETOLOMAKE  
Ohessa on esimerkki tietolomakkeesta.  
DOC DIE-AWAY -KOE  
1 LABORATORIO  
2 KOKEEN ALKUPÄIVÄMÄÄRÄ  
3 TESTATTAVA AINE  
Nimi:  
Kantaliuoksen pitoisuus: mg/l kemikaalina  
Liuoksen alkupitoisuus, t  o : mg/l kemikaalina  
4 SIIRROSAINE  
Lähde:  
Käsittelyt:  
Esikäsittely (jos esikäsittely on tehty):  
Reaktioseoksen pitoisuus suspendoitunutta kuiva-ainetta: mg/l  
5 HIILIMÄÄRITYKSET  
Hiilianalysaattori:  
Pullon numero DOC-arvo n päivän jälkeen (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Testattavaa kemi ­
kaalia ja siirros ­
ainetta 
1 a 1 
a 2 
a:n keskiarvo 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b:n keskiarvo 
C b(t) ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 991
 
Pullon numero DOC-arvo n päivän jälkeen (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Siirrosaineen taus ­
tanäyte ilman tes ­
tattavaa kemikaa ­
lia 3 c 1 
c 2 
c:n keskiarvo C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d:n keskiarvo 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. LÄHDETIETOJEN ARVIOINTI  
Pullon numero Prosentuaalinen hajoaminen n päivän jälkeen 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Keskiarvo ­
(*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) Jos D  1 - ja D  2 -arvojen ero on suuri, arvojen keskiarvoa ei pidä käyttää  
Huomautus:  Vertailukemikaalien ja myrkyllisyysvertailunäytteiden 
osalta tiedot voidaan esittää samalla tavoin kuin tässä.  
7. ABIOOTTINEN TARKISTUS  (valinnainen)  
Aika (päivää) 
0 t  
Steriilin vertailunäytteen DOC-pitoisuus 
(mg/l) C s(o) C s(t) 
Prosentuaalinenabioottinenhajoavuus  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. SPESIFINEN KEMIALLINEN ANALYYSI  (valinnainen)  
Testattavan kemikaalin jäännös ­
määrä kokeen lopussa (mg/l) Prosentuaalinen primaarinen ha ­
joaminen  
Steriili vertailunäyte s  b ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 992
 
Testattavan kemikaalin jäännös ­
määrä kokeen lopussa (mg/l) Prosentuaalinen primaarinen ha ­
joaminen  
Siirrostettu testiliuos S  a S b Ä S a 
S b Ü 100 
OSA III  MUUNNELTU OECD-SEULONTAKOE  (menetelmä 
C.4-B)  
III.1 MENETELMÄN PERIAATE  
Mitattuun tilavuuteen epäorgaanista liuosta, jossa on tunnettu pitoi ­
suus testattavaa ainetta (10–40 mg DOC/l) ainoana nimellisenä hii ­
lilähteenä, siirrostetaan 0,5 ml jätevettä liuoslitraa kohti. Seos ilmas ­
tetaan heikossa valossa tai pimeässä pitäen yllä lämpötilaa 22 ± 2  o C. 
Hajoamista seurataan usein tehtävien DOC-analyysien avulla 28 päi ­
vän jakson aikana. Hajoamisaste lasketaan ilmaisemalla poistuneen 
DOC:n (siirrostetun taustanäytteen arvolla korjattuna) prosenttiosuus 
alkupitoisuudesta. Primaarisen biohajoamisen aste voidaan laskea myös inkubaation alussa ja lopussa tehtävän kemiallisen analyysin avulla.
 
III.2 MENETELMÄKUVAUS  
III.2.1 Laite  
a) erlenmeyerpulloja (tilavuudeltaan esimerkiksi 250 ml–21) DOC- 
analyysin edellyttämän tilavuuden mukaan,  
b) ravistuskone pulloja varten (koneessa on oltava automaattinen 
lämpötilan säätö tai sitä on käytettävä lämpötilasäädetyssä huo ­
neessa, ja sen on pystyttävä ylläpitämään aerobisia olosuhteita 
kaikissa pulloissa),  
c) sopivin kalvoin varustettu suodatuslaite,  
d) DOC-analysaattori,  
e) liuenneen hapen määrityslaite,  
f) sentrifugi.  
III.2.2  Epäorgaanisen liuoksen valmistus  
Kantaliuoksen valmistus kuvataan kohdassa I.6.2.  
10 ml a-liuosta sekoitetaan 80 ml:aan laimennusvettä, lisätään b-, c- 
ja d-liuosta 1 ml kutakin ja laimennetaan liuos yhden litran tilavuu ­
teen.  
Tässä menetelmässä siirrostukseen käytetään vain 0,5 ml jätevettä/l, 
joten liuosta on eräissä tapauksissa rikastettava hivenaineilla ja kas ­
vutekijöillä. Tämä tehdään lisäämällä liuokseen jokaista lopullista 
liuoslitraa kohti 1 ml kutakin seuraavaa liuosta:  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 993
 
Hivenaineliuos: 
Mangaanisulfaattitetrahydraatti, MnSO  4 · 4H  2 O 39,9 mg 
Boorihappoa, H  3 BO 3 57,2 mg 
Sinkkisulfaattiheptahydraatti, ZnSO  4 ·7H 2 O 42,8 mg 
Ammoniumheptamolybdaatti (NH  4 ) 6 Mo 7 O 24 34,7 mg 
Rautakelaatti (FeCl  3 -etyleenidiamiinitetraetikkahappo) 100,0 mg 
Liuotetaan laimennusveteen ja laimennetaan 1 000 ml:n 
tilavuuteen. 
Vitamiiniliuos: 
Hiivauute 15,0 mg  
Hiivauute liuotetaan 100 ml:aan vettä. Liuos steriloidaan kalvolla, 
jonka huokoskoko on 0,2 mikronia, tai käytetään sellaisenaan.  
III.2.3  Siirrosaineen valmistelu ja esikäsittely  
Siirrosaineen lähteenä käytetään pääosin kotitalousjätevesiä puhdista ­
vasta käsittelylaitoksesta tai laboratoriolaitoksesta saatavaa sekundaa ­
rista jätevettä. (Katso kohtia 1.6.4.2 ja 1.6.5.)  
Käytetään 0,5 ml siirrosainetta epäorgaanisen liuoksen litraa kohti.  
III.2.4  Pullojen valmistelu  
Epäorgaanista liuosta pannaan 2 litran erlenmeyerpulloihin esimer ­
kiksi 800 ml:n annoksina. Riittävä määrä testattavan aineen ja ver ­
tailuaineen kantaliuosta lisätään eri pulloihin siten, että saadaan ke ­
mikaalipitoisuus, joka vastaa pitoisuutta 10–40 ml DOC/l. Tarkiste ­
taan pH ja säädetään se tarvittaessa arvoon 7,4. Pullot siirrostetaan 
0,5 ml:lla jätevettä pulloissa olevaa liuoslitraa kohti (katso kohtaa 
I.6.4.2). Valmistetaan myös siirrosaineen vertailunäytteet epäorgaa ­
niseen liuokseen, mutta ilman testattavaa kemikaalia ja vertailukemi ­
kaalia.  
Tarvittaessa testattavan kemikaalin mahdollisten inhibitooriset omi ­
naisuudet on tarkistettava siirrostamalla yhteen pulloista epäorgaa ­
nista liuosta, jossa on vertailukelpoiset pitoisuudet testattavaa kemi ­
kaalia ja vertailukemikaalia.  
Tarvittaessa valmistetaan myös erillinen steriili pullo, jonka avulla 
tarkistetaan testattavan kemikaalin abioottinen hajoaminen. Tällöin 
käytetään kemikaalin liuosta, johon ei ole lisätty siirrosainetta (katso kohtaa I.6.6).
 
Jos epäillään, että testattava kemikaali adsorboituu merkittävissä 
määrin esimerkiksi lasiin tai lietteeseen, voidaan tehdä alustava ke ­
mikaalin adsorption todennäköisen laajuuden määritys, jonka perus ­
teella voidaan arvioida testimenetelmän soveltuvuutta tälle kemikaa ­
lille (katso taulukkoa 1). Alustavaa määritystä varten pulloon lisätään 
testattavaa ainetta, siirrosainetta ja sterilointiainetta.  
Kaikkien pullojen sisältö laimennetaan epäorgaanisella liuoksella yh ­
den litran tilavuuteen. Sekoituksen jälkeen jokaisesta pullosta otetaan näyte alkuperäisen DOC-pitoisuuden määritystä varten (katso liitettä II.4). Pullojen suut peitetään esimerkiksi alumiinifoliolla siten, että 
ilma pääsee vapaasti vaihtumaan pullon ja ympäristön välillä. Tämän 
jälkeen pullot pannaan ravistuskoneeseen kokeen aloittamista varten.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 994
 
III.2.5  Tyypillisen kokeen pullomäärä  
Pullot 1 ja 2: Testisuspensio  
Pullot 3 ja 4: Siirrosaineen taustanäyte  
Pullo 5: Menetelmän vertailunäyte  
Seuraavia pulloja on käytettävä tarpeen mukaan, ja niiden käyttö on 
muutenkin suositeltavaa:  
Pullo 6: Steriili abioottinen vertailunäyte  
Pullo 7: Adsorption vertailunäyte  
Pullo 8: Myrkyllisyystarkistus  
Katso myös kohtaa I.6.7.  
III.2.6  Testin suorittaminen  
Testin aikana kunkin pullon DOC-pitoisuus määritetään kahdesti tie ­
tyin välein. Määritykset on tehtävä riittävän usein, jotta voidaan mää ­
rittää 10-päiväisen jakson alku ja prosentuaalinen poistuma tämän jakson lopussa. Määrityksiä varten otetaan pienin mahdollinen määrä testisuspensiota.
 
Ennen näytteenottoa pulloista haihtunut vesimäärä on kompensoitava 
lisäämällä pulloihin tarpeellinen määrä laimennusvettä (I.6.1). Pullo ­
jen sisältö sekoitetaan huolellisesti varmistaen, että pullojen seinä ­
miin kiinnittynyt aines liukenee tai suspendoituu ennen näytteen ­
ottoa. Näytteet kalvosuodatetaan tai sentrifugoidaan heti näytteenoton jälkeen (katso liitettä II.4). Ellei näytteitä analysoida samana päivänä, niitä voidaan säilyttää 2–4
 o C:ssa enintään 48 tuntia tai alle 
–18  o C:ssa, jos ne joutuvat odottamaan tätä pitempään.  
III.3 TIEDOT JA RAPORTOINTI  
III.3.1  Tulosten käsittely  
Annetun ajankohdan t prosentuaalinen hajoaminen lasketaan kohdan 
I.7.1 mukaan (DOC-määritys) ja vaihtoehtoisesti kohdan 
I.7.2 mukaan (spesifinen analyysi).  
Tulokset kirjataan jäljempänä kuvattavaan tietolomakkeeseen.  
III.3.2 Tulosten hyväksyttävyys  
Katso kohtaa I.5.2.  
III.3.3 Raportointi  
Katso kohtaa I.8.  
III.4 TIETOLOMAKE  
Ohessa on esimerkki tietolomakkeesta.  
MUUNNELTU OECD-SEULONTAKOE  
1 LABORATORIO  
2 KOKEEN ALKUPÄIVÄMÄÄRÄ  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 995
 
3 TESTATTAVA AINE  
Nimi:  
Kantaliuoksen pitoisuus: mg/l kemikaalina  
Liuoksen alkupitoisuus, t  0 : mg/l kemikaalina  
4 SIIRROSAINE  
Lähde:  
Käsittelyt:  
Esikäsittely (jos esikäsittely on tehty):  
Reaktioseoksen pitoisuus suspendoitunutta kuiva-ainetta: mg/l  
5 HIILIMÄÄRITYKSET  
Hiilianalysaattori:  
Pullon numero DOC-arvo n päivän jälkeen mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Testattavaa kemi ­
kaalia ja siirros ­
ainetta 1 a 1 
a 2 
a:n keskiarvo 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b:n keskiarvo 
C b(t) 
Siirrosaineen taus ­
tanäyte ilman tes ­
tattavaa kemikaa ­
lia 3 c 1 
c 2 
c:n keskiarvo C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d:n keskiarvo 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. LÄHDETIETOJEN ARVIOINTI  
Pullon numero Prosentuaalinen hajoaminen n päivän jälkeen 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 996
 
Pullon numero Prosentuaalinen hajoaminen n päivän jälkeen 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Keskiarvo ­
(*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) Jos D  1 - ja D  2 -arvojen ero on suuri, arvojen keskiarvoa ei pidä käyttää  
Huomautus:  Vertailukemikaalien ja myrkyllisyysvertailunäytteiden 
osalta tiedot voidaan esittää samalla tavoin kuin tässä.  
7. ABIOOTTINEN TARKISTUS  (valinnainen)  
Aika (päivää) 
0 t  
Steriilin vertailunäytteen DOC-pitoisuus 
(mg/l) C s(o) C s(t) 
Prosentuaalinen abioottinen hajoavuus  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. SPESIFINEN KEMIALLINEN ANALYYSI  (valinnainen)  
Testattavan kemikaalin jäännös ­
määrä kokeen lopussa (mg/l) Prosentuaalinen primaarinen ha ­
joaminen  
Steriili vertailunäyte s  b 
Siirrostettu testiliuos s  a S b Ä S a 
S b ñ100  
OSA IV. HIILIDIOKSIDIN MUODOSTUMISKOE (mene ­
telmä C.4-C)  
IV.1 MENETELMÄN PERIAATE  
Mitattu tilavuus siirrostettua epäorgaanista liuosta, jossa on tunnettu 
pitoisuus testattavaa ainetta (10–20 mg DOC tai TOC/1) ainoana 
nimellisenä hiililähteenä, ilmastetaan johtamalla liuoksen läpi hiilidi ­
oksiditonta ilmaa, jonka virtausta säädetään. Ilmastus tehdään hei ­
kossa valossa tai pimeässä. Hajoamista seurataan 28 päivän ajan määrittämällä muodostuvan hiilidioksidin määrä. Tätä varten hiilidi ­
oksidi kerätään barium- tai natriumhydroksidiin, ja hiilidioksidimäärä 
mitataan titraamalla jäännöshydroksidi tai mittaamalla epäorgaanisen hiilen määrä. Testattavasta kemikaalista muodostetun hiilidioksidin määrä (korjattuna siirrostetun taustanäytteen arvolla) ilmaistaan 
ThCO
 2 -prosenttiarvona. Biohajoamisaste voidaan laskea myös inku ­
baation alussa ja lopussa tehtävän DOC-analyysin avulla.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 997
 
IV.2 MENETELMÄKUVAUS  
IV.2.1  Laite  
a) pulloja (tilavuudeltaan 2–5 litraa), jotka on varustettu lähes pullon 
pohjaan ulottuvalla ilmastusletkulla ja ulostulolla,  
b) magneettisia sekoittimia (kun tutkitaan huonosti liukenevia kemi ­
kaaleja),  
c) kaasuabsorptiopulloja,  
d) ilmanvirtauksen säätö- ja mittauslaite,  
e) kaasunpesulaite, jonka avulla saadaan hiilidioksiditonta ilmaa 
(vaihtoehtoisesti voidaan käyttää painepulloista otetun hiilidioksi ­
dittoman hapen ja hiilidioksidittoman typen seosta suhteessa 
20 % happea ja 80 % typpeä),  
f) hiilidioksidin määrityslaite, jonka toiminta perustuu titraukseen tai 
epäorgaanisen hiilen analysointiin,  
g) kalvosuodatin (valinnainen),  
h) DOC-analysaattori (valinnainen).  
IV.2.2  Epäorgaanisen liuoksen valmistus  
Kantaliuoksen valmistus kuvataan kohdassa I.6.2.  
10 ml a-liuosta sekoitetaan 800 ml:aan laimennusvettä, lisätään b-, 
c- ja d-liuosta 1 ml kutakin ja laimennetaan liuos yhden litran 
tilavuuteen.  
IV.2.3  Siirrosaineen valmistelu ja esikäsittely  
Siirrosaineen lähteinä voidaan käyttää aktiivilietettä, jätevettä, pinta ­
vettä, maata tai näiden sekoitusta.  
Katso kohtia I.6.4, 1.6.4.1, I.6.4.2 ja I.6.5.  
IV.2.4  Pullojen valmistelu  
Seuraavassa kappaleessa kuvattavat tilavuudet ja painot koskevat 5 l:n 
pulloja, joissa on 3 1 suspensiota. Myös tätä pienempiä tilavuuksia voidaan käyttää arvoja korjaamalla, edellyttäen, että muodostunut hiilidioksidi voidaan mitata riittävän tarkasti.
 
2 400 ml epäorgaanista liuosta johdetaan 5 l:n pulloihin. Pulloihin lisä ­
tään sopiva määrä valmistettua aktiivilietettä (katso kohtia I.6.4 ja I.6.5), niin että lopullisessa 3 l:n liuoksessa on enintään 30 mg suspendoitunutta kuiva-ainetta litraa kohti. Vaihtoehtoisesti voidaan ensin laimentaa 
valmistettu liete suspensioksi (500–1 000 mg/l epäorgaanista liuosta) 
ja lisätä tämän jälkeen alikvootti 5 l;n pulloon siten, että lopullinen pitoisuus on 30 mg/l. Vaihtoehtoinen menetelmä on tarkempi. Myös muita siirroslähteitä voidaan käyttää (katso kohtaa I.6.4.2).
 
Siirrostetuista seoksista poistetaan hiilidioksidi ilmastamalla niitä yön 
yli hiilidioksidittomalla ilmalla.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 998
 
Testattavaa ainetta ja vertailuainetta lisätään pulloihin erikseen kan ­
taliuoksen tunnettuna tilavuutena (jokaista pitoisuutta kohti tarvitaan 
kaksi pulloa), niin että pullojen sisällön DOC- tai TOC-pitoisuus on 10–20 mg/l. Muutama pullo tarvitaan siirrosainekontrolleiksi, joten niihin ei lisätä kemikaaleja. Huonosti liukenevat aineet lisätään suo ­
raan pulloihin tunnettuna painona tai tilavuutena (katso liitettä III).
 
Yhden pullon avulla voidaan tarvittaessa selvittää testattavan kemi ­
kaalin inhibitoorisia ominaisuuksia. Tähän pulloon lisätään testatta ­
vaa kemikaalia ja vertailukemikaalia, niin että niiden pitoisuudet ovat samat kuin muissa pulloissa.
 
Tarvittaessa selvitetään steriilin pullon ja siirrostamattoman kemikaa ­
liliuoksen avulla, onko testattava kemikaali abioottisesti hajoavaa (katso kohtaa I.6.6). Sterilointi tehdään lisäämällä liuokseen myrkyl ­
listä ainetta sopivana pitoisuutena.
 
Kaikkien pullojen suspensioiden tilavuus säädetään 3 l:ksi lisäämällä 
pulloihin epäorgaanista liuosta, joka on ilmastettu hiilidioksiditto ­
malla ilmalla. Vaihtoehtoisesti pulloista voidaan ottaa näytteet DOC-analyysiä (katso liitettä II.4) tai spesifistä analyysiä varten. Kunkin pullon ilmaventtiiliin liitetään absorptiopullo.
 
Jos käytetään bariumhydroksidia, jokaiseen 5 l:n testipulloon lii ­
tetään sarjaan kolme absorptiopulloa, joissa kaikissa on 100 ml 
0,0125-molaarista bariumhydroksidia. Liuoksessa ei saa olla saostu ­
nutta sulfaattia tai karbonaattia, ja liuoksen väkevyys on määritettävä välittömästi ennen liuoksen käyttöä. Jos käytetään natriumhydroksi ­
dia, jokaiseen testipulloon liitetään kaksi loukkua. Toisen loukun 
avulla tarkistetaan, että kaikki hiilidioksidi on imeytynyt ensimmäi ­
seen loukkuun. Imeytyspulloina käytetään pullotyyppiä, jossa on see ­
rumipullon suljin, Jokaiseen pulloon lisätään 200 ml 0,05-molaarista natriumhydroksidia. Tämä määrä riittää absorboimaan kaiken hiilidi ­
oksidin, joka syntyy testattavan kemikaalin hajoamistuotteena. Nat ­
riumhydroksidiliuos sisältää aina — myös vastavalmistettuna — pie ­
nen määrän karbonaattia, joka kompensoidaan vähentämällä tausta ­
näytteen karbonaatin määrää.
 
IV.2.5  Tyypillisen kokeen pullomäärä  
Pullot 1 ja 2: Testisuspensio  
Pullot 3 ja 4: Siirrosaineen taustanäyte  
Pullo 5: Menetelmän vertailunäyte  
Seuraavia pulloja on käytettävä tarpeen mukaan, ja niiden käyttö on 
muutenkin suositeltavaa:  
Pullo 6: Steriili abioottinen vertailunäyte  
Pullo 7: Myrkyllisyystarkistus  
Katso myös kohtaa I.6.7.  
IV.2.6  Testin suorittaminen  
Testi aloitetaan johtamalla suspensioiden läpi hiilidioksidittomia il ­
makuplia virtausnopeudella 30–100 ml/ minuutti. Hiilidioksidiabsor ­
bentista otetaan säännöllisin välein näytteitä suspensioiden hiilidiok ­
sidipitoisuuden analyysiä varten. Ensimmäisen kymmenen päivän jakson näytteenottoväliksi suositellaan kahta tai kolmea päivää. Tä ­
män jälkeen näytteitä otetaan joka viides päivä 28. päivään asti 10- 
päiväisen jakson löytämiseksi.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 999
 
Päivänä 28 otetaan näytteet mahdollista DOC-analyysiä tai spesifistä 
analyysiä varten, mitataan suspensioiden pH ja lisätään jokaiseen 
pulloon 1 ml väkevää suolahappoa. Tämän jälkeen hiilidioksidi pois ­
tetaan testisuspensioista yön yli jatkuvalla pullojen ilmastuksella, Viimeinen hiilidioksidianalyysi tehdään 29. päivänä.
 
Hiilidioksidianalyysipäivinä pulloa lähinnä oleva bariumhydroksidi- 
imeytin irrotetaan pullosta ja hydroksidiliuos titrataan 0,05-molaa ­
risella suolahapolla. Indikaattorina käytetään fenoliftaleiinia. Sarjan 
jäljellä olevat imeyttimet siirretään lähemmäksi testipulloa, ja sarjan 
loppuun lisätään uusi, 100 ml tuoretta 0,0125-molaarista bariumhyd ­
roksidia sisältävä imeytin. Titrauksia tehdään tarvittaessa (jos esimer ­
kiksi ensimmäiseen loukkuun kertyy paljon sakkaa, titraus on tehtävä 
ennen kuin sakkaa alkaa kertyä toiseen loukkuun) — kuitenkin vä ­
hintään viikoittain. Jos absorbenttina käytetään natriumhydroksidia, ruiskuun imetään pieni määrä natriumhydroksidiliuosta (tarvittava määrä vaihtelee käytettävän hiilianalysaattorin mukaan) lähinnä tes ­
tipulloa olevasta imeyttimestä. Jos muodostunut hiilidioksidi halutaan 
analysoida heti, näyte ruiskutetaan hiilianalysaattorin epäorgaaniseen hiileen.
 
Toisen loukun sisältö analysoidaan vain testin lopussa, jotta hiilidi ­
oksidin mahdollisen läpipääsyn aiheuttama virhe voitaisiin korjata.  
IV.3 TIEDOT JA RAPORTOINTI  
IV.3.1  Tulosten käsittely  
Imeyttimeen jäänyt hiilidioksidimäärä lasketaan titrauksen jälkeen 
seuraavan suureyhtälön avulla:  
mgCO  2 = (100 x C  B - 0,5 x V x C  A ) x 44  
jossa  
V = imeyttimen 100 ml:n sisällön titraukseen käytetty suola ­
happo (ml)  
C B = bariumhydroksidiliuoksen väkevyys (M)  
C A = suolahappohuoksen väkevyys (M).  
Jos C  B = 0,0125 M, C  A = 0,05 M ja 100 ml:n puhtaan bariumhyd ­
roksidiliuoksen titraustulokseksi saadaan 50 ml, hiilidioksidin paino 
voidaan laskea seuraavasti:  
0; 05 
2 Ü 44 Ü ml HCI titrattu ¼ 1; 1 Ü ml HCI  
Tässä tapauksessa titraukseen käytetty suolahappotilavuus voidaan 
muuntaa hiilidioksidin painoksi käyttämällä kerrointa 1,1.  
Titrausarvojen avulla lasketaan pelkän siirrosaineen ja siirrosaineen 
ja testattavan kemikaalin seoksen muodostaman hiilidioksidin painot. Näiden painojen ero vastaa pelkän testattavan kemikaalin muodosta ­
man hiilidioksidin painoa.
 
Jos esimerkiksi pelkän siirrosaineen titrauksesta saadaan tulokseksi 
48 ml ja siirrosaineen sekä testattavan kemikaalin seoksen titrauk ­
sesta 45 ml, määrät ovat seuraavat:  
Siirrosaineen CO  2 = 1,1 x (50 - 48) = 2,2 mg.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1000
 
Siirrosaineen ja testattavan kemikaalin seoksen CO  2 = 1,1 x (50 - 
45) = 5,5 mg.  
Täten testattavan kemikaalin muodostama CO  2 = 3,3 mg.  
Prosentuaalinen biohajoavuus lasketaan seuraavan suureyhtälön avulla:  
hajoaminen ð%Þ ¼ muodostunut CO  2 ðmgÞ Ü 100 
ThCO  2 Ü lisätty määrä testattavaa kemikaalia  ðmgÞ 
tai 
hajoaminen ð%Þ ¼ muodostunut CO  2 ðmgÞ Ü 100 
lisätty TOC Ä määrä Ü 3; 67 
jossa 3,67 on hiili-hiilidioksidimuunnoskerroin.  
Minkä tahansa aikavälin jälkeinen prosentuaalinen hajoaminen saa ­
daan kumuloimalla kunkin päivän laskettujen ThCO  2 -arvojen pro ­
senttiluvut mittaushetkeen asti.  
Natriumhydroksidiabsorbenteille muodostetun hiilidioksidin määrä 
voidaan laskea milligrammoina epäorgaanista hiiltä (IC) kertomalla absorbentin IC-pitoisuus absorbentin tilavuudella.
 
Prosentuaalinen hajoaminen voidaan laskea seuraavan suureyhtälön 
avulla:  
ThCO  2 Ä % ¼ testipullon mg IC Ä vertailunäytten mg IC 
testattavan kemikaalin mukana lisätty mg TOC  Ü 100  
DOC-poistumat voidaan haluttaessa laskea kohdan I.7 mukaan. Tu ­
lokset kirjataan tietolomakkeelle yhdessä muiden tulosten kanssa.  
IV.3.2  Tulosten hyväksyttävyys  
Testin alussa epäorgaanisessa liuoksessa olevan kemikaalisuspension 
IC-pitoisuus saa olla enintään 5 % TC-arvosta, ja testin lopussa 
siirrostuksen taustahuoksen hiilidioksidin kokonaismuodoslus saa 
yleensä olla enintään 40 mg/l. Jos tulokseksi saadaan 70 mg CO  2 /1 
ylittäviä arvoja, tietoja ja koetekniikoita on tarkasteltava erityisen kriittisesti.
 
Katso myös kohtaa I.5.2.  
IV.3.3  Raportointi  
Katso kohtaa I.8.  
IV.4 TIETOLOMAKE  
Ohessa on esimerkki tietolomakkeesta.  
HIILIDIOKSIDIN MUODOSTUMISKOE  
1. LABORATORIO  
2. KOKEEN ALKUPÄIVÄMÄÄRÄ  
3. TESTATTAVA AINE  
Nimi:  
Kantaliuoksen pitoisuus: mg/l kemikaalina  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1001
 
Liuoksen alkupitoisuus, t  0 : mg/l kemikaalina  
Pulloon lisätty kokonaismäärä hiiltä (C): mg C  
ThCO  2 : mg CO  2 
4. SIIRROSAINE  
Lähde:  
Käsittelyt:  
Esikäsittely (jos esikäsittely on tehty):  
Reaktioseoksen pitoisuus suspendoitunutta kuiva-ainetta: mg/l  
5. HIILIDIOKSIDIN MUODOSTUS JA HAJOAVUUS  
Menetelmä: Ba(OH)  2 /NaOH/muu  
Aika 
(päivä) Testiliuoksen muodos ­
tunut 
CO 2 (mg) Taustanäytteen muo ­
dostunut 
CO 2 (mg) Kumulatiivinen muo ­
dostunut CO  2 
(testiliuos vähennet ­
tynä taustaliuoksen 
keskiarvolla) ThCO  2 
kumulatiivinen  CO  2 
ThCO  2 Ü 100  
1 
2 keskiarvo 3 
4 keskiarvo 1 2 1 2 keskiarvo  
0 
n 1 
n 2 
n 3 
28 
Huomautus: Vertailukemikaalien ja myrkyllisyysvertailunäytteiden 
osalta tiedot voidaan esittää samalla tavoin kuin tässä.  
6. HIILIANALYYSI  (valinnainen)  
Hiilianalysaattori:  
Aika (päivä) Taustanäyte mg/l Testattava kemikaali mg/1  
0 C  b(o) C o 
28 (*) C  b(t) C t 
(*) tai inkubaation lopussa  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1002
 
DOC Ä poistuma ð%Þ ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bðtÞ 
1 Ä C o Ä C bðoÞ Î 
Ü 100  
7. ABIOOTTINEN HAJOAMINEN  (valinnainen)  
Abioottinen hajoaminen  ð%Þ ¼ Steriilin pullon CO  2 Ä muodostus 28 : päivän jälkeen ðmgÞ 
ThCO  2 ðmgÞ Ü 100 
OSA V  MANOMETRINEN RESPIROMETRIAKOE  (mene­
telmä C.4-D)  
V.l TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Mitattua tilavuutta siirrostettua epäorgaanista liuosta, jossa on tun ­
nettu pitoisuus testattavaa kemikaalia (100 mg kemikaalia/l testatta ­
vaa ainetta — ThOD-pitoisuus vähintään 50–100 mg/l) ainoana ni ­
mellisenä orgaanisena hiililähteenä, ravistetaan suljetussa pullossa vakiolämpötilassa (vaihteluväli enintään ± 1
 o C) enintään 28 päivän 
ajan. Hapenkulutus määritetään joko mittaamalla (elektrolyyttisesti 
muodostettu) happimäärä, joka tarvitaan pitämään respirometripullon 
kaasun tilavuus vakiona, tai mittaamalla laitteen tilavuuden tai pai ­
neen muutos (tai molempien yhdistelmä). Muodostunut hiilidioksidi imeytetään kaliumhydroksidiliuokseen tai muuhun sopivaan absor ­
benttiin. Testattavan kemikaalin hapenkulutus (korjattuna pelkän siir ­
rosaineen hapenkulutuksella, joka mitataan rinnakkaisen taustanäyt ­
teen avulla) ilmaistaan ThOD- tai COD-prosenttiarvona. Haluttaessa voidaan laskea myös primaarinen biohajonta inkubaation alussa ja 
lopussa tehtävän spesifisen analyysin tuloksien avulla tai määrittää 
lopullinen biohajonta DOC-analyysin avulla.
 
V.2 MENETELMÄKUVAUS  
V.2.1  Laite  
a) tarkoitukseen sopiva respirometri,  
b) lämpötilan säätöjärjestelmä (enintään ± 1  o C:n vaihteluväli),  
c) kalvosuodatin (valinnainen),  
d) hiilisuodatin (valinnainen).  
V.2.2  Epäorgaanisen liuoksen valmistus  
Kantaliuoksen valmistus kuvataan kohdassa I.6.2.  
10 ml a-liuosta sekoitetaan 800 ml:aan laimennusvettä, lisätään 1 ml 
b-, c- ja d-liuosta sekä laimennetaan liuos yhden litran tilavuuteen.  
V.2.3  Siirrosaineen valmistelu ja esikäsittely  
Siirrosaineen lähteinä voidaan käyttää aktiivilietettä, jätevettä, pinta ­
vettä, maata tai näiden sekoitusta.  
Katso kohtia I.6.4, I.6.4.1,1.6.4.2 ja I.6.5.  
V.2.4  Pullojen valmistelu  
Valmistetaan erilliset erät testi- ja kontrolliliuosta liuottamalla testat ­
tavaa ainetta ja vertailuainetta epäorgaaniseen liuokseen (100 mg 
kemikaalia/l — vähintään 50–100 mg ThOD/1) kantaliuoksia käyt ­
täen. ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1003
 
ThOD-arvo lasketaan käyttäen oletuksena ammoniumsuolojen muo ­
dostusta, ellei odotettavissa ole nitrifikaatiota, missä tapauksessa las ­
kelmien on perustuttava nitraattien muodostukseen (katso liitettä II.2).
 
Määritetään pH-arvot ja säädetään ne tarvittaessa  
arvoon 7,4 ± 0,2. Huonosti liukenevat aineet lisätään myöhemmin 
(katso jäljempänä).  
Testattavan kemikaalin myrkyllisyysmäärityksissä epäorgaaniseen 
liuokseen on valmistettava erillinen liuos, jossa on testattavaa kemi ­
kaalia ja vertailukemikaalia samoina pitoisuuksina kuin yksittäisissä 
liuoksissa.  
Jos tarvitaan hapen fysikaalis-kemiallisen kulutuksen mittauksia, val ­
mistetaan liuos, jossa on testattavaa kemikaalia pitoisuutena, joka vastaa arvoa 100 mg ThOD/1. Liuos steriloidaan lisäämällä siihen 
sopivaa myrkyllistä ainetta (katso kohtaa I.6.6).
 
Lisätään tarvittavat tilavuudet testattavaa kemikaalia ja vertailukemi ­
kaalia vähintään kahteen pullosarjaan. Tarvittaessa lisätään erillisiin pulloihin pelkkää epäorgaanista liuosta (siirrostarkistusta varten), tes ­
tattavan kemikaalin ja vertailukemikaalin seosliuosta sekä steriiliä 
liuosta.
 
Jos testattava kemikaali on huonosti liukenevaa, se voidaan lisätä 
tässä vaiheessa tunnettuna painomääränä tai sitä voidaan käsitellä liitteessä III kuvatulla tavalla. Hiilidioksidi-imeyttimiin lisätään kali ­
umhydroksidia, kalkkisoodapellettejä tai muuta absorbenttia.
 
V.2.5  Tyypillisen kokeen pullomäärä  
Pullot 1 ja 2: Testisuspensio  
Pullot 3 ja 4: Siirrosaineen taustanäyte  
Pullo 5: Menetelmän vertailunäyte  
Seuraavia pulloja on käytettävä tarpeen mukaan, ja niiden käyttö on 
muutenkin suositeltavaa:  
Pullo 6: Steriili vertailunäyte  
Pullo 7: Myrkyllisyystarkistus  
Katso myös kohtaa I.6.7.  
V.2.6  Testin suorittaminen  
Kun pullojen lämpötila on oikea, niihin siirrostetaan valmistettua 
aktiivilietettä tai muuta siirrosainetta testiohjelman mukaan. Suspen ­
doituneen kuiva-aineen pitoisuus saa olla enintään 30 mg/l. Pullot pannaan ravistuslaitteeseen, joka käynnistetään. Pullojen ilmatiiviy ­
den tarkastuksen jälkeen aloitetaan hapenkulutuksen mittaukset. Oh ­
jelmanmukaisten mittausten lisäksi ei yleensä tarvita muuta valvontaa 
kuin päivittäisiä lämpötilan ja ravistustoiminnon tarkastuksia,
 
Hapenkulutus lasketaan säännöllisten ja tiheiden mittausten tulosten 
perusteella laitevalmistajan ohjeiden mukaan. Inkubaation lopussa (yleensä 28 päivän kuluttua) mitataan pulloissa olevien liuosten 
pH-arvot, mikä on erityisen tärkeää, jos hapenkulutusarvot ovat pie ­
niä tai suurempia kuin ThOD
 NH4 (typpeä sisältävät yhdisteet).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1004
 
Tarvittaessa kokeen alussa ja lopussa otetaan respirometripulloista 
näytteet DOC:n tai spesifisen kemikaalin analyysiä varten (katso lii ­
tettä II.4). Kokeen alussa tehtävän näytteenoton yhteydessä on var ­
mistettava, että pulloon jäljelle jäävä testisuspension tilavuus on tun ­
nettu. Kun happea kuluttava yhdiste sisältää typpeä, nitriitti- ja nit ­
raattipitoisuuksien suureneminen 28 päivän aikana määritetään nitri ­
fikaation vaatima hapenkulutus huomioon ottaen (katso liitettä V).  
V.3 TIEDOT JA RAPORTOINTI  
V.3.1  Tulosten käsittely  
Testattavan kemikaalin hapenkulutus (mg) tunnetun ajan kuluessa 
(korjattuna siirrostetun taustanäytteen hapenkulutuksella) jaetaan tes ­
tattavan kemikaalin käytetyllä painolla. Tulokseksi saadaan BOD- 
arvo ilmaistuna hapen painona testattavan kemikaalin painoa kohti:  
BOD ¼ ðtestattavan kemikaalin O  2 Ä kulutus ðmgÞ Ä taustanäytten O  2 Ä kulutus ðmgÞÞ 
ðpullossa olevan testattavan kemikaalin määrä  ðmgÞÞ 
= mg O2 mg:aa testattavaa kemikaalia kohti  
Prosentuaalinen biohajoavuus voidaan laskea näin:  
Prosentuaalinen biohajoavuus  ¼ % ThOD ¼ BODðmg O  2=mg kemikaaliaÞ 
ThODðmg O  2 kemikaaliaÞ Ü 100 
tai näin:  
% COD ¼ BODðmg O  2=mg kemikaaliaÞ 
CODðmg O  2 kemikaaliaÞ Ü 100 
Huomautus: Molemmat menetelmät eivät välttämättä anna tulokseksi 
samaa arvoa. Jälkimmäisen menetelmän käyttöä suositellaan.  
Kun testattava aine sisältää typpeä, käytetään joko NH  4 :n tai NO  3 :n 
perusteella laskettua ThOD-arvoa sen mukaan, mitä nitrifikaation 
esiintymisen suhteen on odotettavissa (katso liitettä II.2). Jos nitrifi ­
kaatio on vain osittaista, nitrifikaation hapenkulutuksen korjaus las ­
ketaan nitriitti- ja nitraattipitoisuuksien muutoksen perusteella (katso 
liitettä V).  
Jos tehdään myös orgaanisen hiilen tai spesifisen kemikaalin mää ­
ritykset, prosentuaalinen hajoaminen lasketaan kohdassa I.7 kuvatun menetelmän mukaan.
 
Tulokset kirjataan oheisiin tietolomakkeisiin.  
V.3.2  Tulosten hyväksyminen  
Siirrostuksen taustanäytteen hapenkulutus on yleensä 20–30 mg O  2 /l. 
Arvo saa olla 28 päivän kuluessa enintään 60 mg/l. Jos arvo on tätä suurempi, tietoja ja koetekniikoita on tarkasteltava erityisen kriitti ­
sesti. Jos pH-arvo on alueen 6–8,5 ulkopuolella ja testattavan kemi ­
kaalin hapenkulutus on alle 60 %, testattavan kemikaalin pitoisuutta on pienennettävä ja testi on toistettava.
 
Katso myös kohtaa I.5.2.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1005
 
V.3.3  Raportointi  
Katso kohtaa I.8.  
V.4 TIETOLOMAKE  
Jäljempänä on esimerkki tietolomakkeesta.  
MANOMETRINEN RESPIROMETRIAKOE  
1. LABORATORIO  
2. KOKEEN ALKUPÄIVÄMÄÄRÄ  
3. TESTATTAVA AINE  
Nimi:  
Kantaliuoksen pitoisuus: mg/l  
Liuoksen alkupitoisuus, C  o : mg/l  
Testipullon tilavuus (V): ml  
ThOD tai COD: mg O  2 / mg testattavaa ainetta (NH  4 , NO  3 ) 
4. SIIRROSAINE  
Lähde:  
Käsittelyt:  
Esikäsittelyt:  
Seoksen suspendoituneen kuiva-aineen pitoisuus: mg/l  
5. HAPENKULUTUS: BIOHAJOAVUUS  
Aika (päivää) 
0 7 14 21 28  
O 2 -kulutus 
(mg), testattava 
kemikaali 1 
2 
a, keskiarvo 
O 2 -kulutus 
(mg), tausta ­
näyte 3 
4 
b, keskiarvo 
Korjattu BOD 
(mg) (a 1 - b m ) 
(a 2 - b m ) 
BOD mg:aa 
testattavaa ke ­
mikaalia kohti ða 1 Ä bÞ 
C o V 
ða 2 Ä bÞ 
C o V ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1006
 
Aika (päivää) 
0 7 14 21 28  
Hajoaminen 
(%) 
BOD 
ThOD Ü 100 D 1 (a 1 ) 
D 2 (a 2 ) 
Keskiarvo (*)  
V = testipullon sisällön tilavuus 
(*) Jos D  1 - ja D  2 -arvojen ero on suuri, arvojen keskiarvoa ei pidä käyttää.  
Huomautus:  Vertailukemikaalien ja myrkyllisyysvertailunäytteiden 
osalta tiedot voidaan esittää samalla tavoin kuin tässä.  
6. NITRIFIKAATIOKORJAUS  (katso liitettä V)  
Päivä 0 28 Erotus  
(i) Nitraattipitoisuus (mg N/litra) (N) 
(ii) Happiekvivalentti (4,57 x N x V (mg) — — (iii) Nitriittipitoisuus (mg N/litra) (N) (iv) Happiekvivalentti (3,43 x N x V) (mg) — — (ii + iv) Kokonaishappiekvivalentti — —
 
7. HIILIANALYYSI  (valinnainen)  
Hiilianalysaattori:  
Aika (päivä) Taustanäyte (mg/l) Testattava kemikaali (mg/l)  
0 (C  blo ) (C  o ) 
28 (*) (C  blt ) (C  t ) 
(*) tai inkubaation lopussa  
Prosentuaalinen DOC  Ä poistuma ¼ ð1 Ä C t Ä C blt 
C o Ä C blo Þ Ü 100 
8. SPESIFINEN KEMIKAALI  (valinnainen)  
S b = fysikaalis-kemiallisen (steriilin) vertailunäytteen pitoisuus 
28 päivän kuluttua  
S a = siirrostettujen pullojen pitoisuus 28 päivän kuluttua  
Prosentuaalinen biohajoavuus  ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
9. ABIOOTTINEN HAJOAVUUS  (valinnainen)  
a = steriilien pullojen hapenkulutus (mg) 28 päivän kuluttua  
hapenkulutus mg : aa testattavaa kemikaalia kohti  ¼ a 
C o V ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1007
 
(Katso jaksoja 1 ja 3.)  
Prosentuaalinen abioottinen hajoavuus  ¼ a Ü 100 
C o V Ü ThOD  
hapenkulutus mg:aa testattavaa kemikaalia kohti =  
OSA VI  SULJETUN PULLON MENETELMÄ  (menetelmä 
C.4-E)  
VI.1 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Testattavan kemikaalin ja epäorgaanisen liuoksen seokseen (2–5 mg 
kemikaalia/l) siirrostetaan suhteellisen pieni määrä sekapopulaatiosta otettuja mikroeliöitä. Näin saatua seosta pidetään täysissä, suljetuissa 
pulloissa pimeässä ja vakiolämpötilassa. Hajoamista seurataan analy ­
soimalla liuennutta happea 28 päivän ajan. Testattavan kemikaalin hapenkulutus vähennettynä siirrostetun taustanäytteen hapenkulutuk ­
sella ilmaistaan ThOD- tai COD-prosenttilukuna.
 
VI.2 MENETELMÄKUVAUS  
VI.2.1  Laite  
a) Lasitulpalla varustettuja BOD-pulloja (vetoisuudeltaan esimer ­
kiksi 250–300 ml).  
b) Vesihaude tai inkubaattori, jossa pulloja voidaan pitää vakioläm ­
pötilassa (vaihteluväli enintään ± 1  o C) ja pimeässä.  
c) Suuria lasipulloja (2–5 l) epäorgaanisen liuoksen valmistusta ja 
BOD-pullojen täyttöä varten.  
d) Happielektrodi ja happimittari tai Winkler-titrauksen edellyttämät 
varusteet ja reagenssit.  
VI.2.2  Epäorgaanisen liuoksen valmistus  
Kantaliuoksen valmistus kuvataan kohdassa I.6.2.  
Sekoitetaan a-, b-, c- ja d-liuosta 1 ml kutakin ja laimennetaan liuos 
yhden litran tilavuuteen.  
VI.2.3  Siirrosaineen valmistelu  
Siirrosaine saadaan yleensä pääosin kotitalouksien jätevettä käsittele ­
vän laitoksen tai laboratoriolaitoksen sekundaarisesta jätevedestä. 
Myös pintavettä voidaan käyttää. Yleensä käytetään 0,05–5 ml suo ­
dosta epäorgaanisen liuoksen litraa kohti. Tarvittaessa määrätystä päästövedestä saadun siirrosaineen optimaalinen testitilavuus on mää ­
ritettävä kokeellisesti (katso kohtia I.6.4.2 ja I.6.5).
 
VI.2.4  Pullojen valmistelu  
Epäorgaanista liuosta ilmastetaan voimakkaasti 20 minuutin ajan. Jo ­
kaiseen testisarjaan on käytettävä samasta erästä otettua epäorgaanista 
liuosta. Epäorgaaninen liuos on yleensä käyttövalmis, kun sitä on pidetty testilämpötilassa 20 tunnin ajan. Tarkistuksena määritetään liuenneen hapen pitoisuus, jonka arvo saa olla enintään 9 mg/l liuok ­
sen lämpötilan ollessa 20
 o C. Ilmalla kyllästetyn liuoksen kaikki siir ­
rot ja täytöt on tehtävä kuplia välttäen, esimerkiksi sifonien avulla.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1008
 
Valmistellaan rinnakkaiset ryhmät BOD-pulloja, joiden avulla voi ­
daan toteuttaa rinnakkaisia koesarjoja testattavan kemikaalin ja ver ­
tailukemikaalin määritystä varten. BOD-pulloja on valmisteltava sel ­
lainen määrä (siirrosaineen taustanäytepullot mukaan lukien), että voidaan tehdä vähintään kaksinkertaiset hapenkulutuksen mittaukset 
halutuin välein (esimerkiksi 0, 7, 14, 21 ja 28 päivän kuluttua). 
Joissakin tapauksissa suurempi määrä pulloja on tarpeen 10-päiväi ­
sen jakson löytämiseksi.
 
Ilmalla kyllästettyä epäorgaanista liuosta kaadetaan suuriin pulloihin. 
Pullot täytetään kolmannekseen asti. Sitten eri pulloihin lisätään riit ­
tävä määrä testattavan kemikaalin ja vertailukemikaalin kantaliuosta, niin että kemikaalien lopullinen pitoisuus on enintään 10 mg/l. Eril ­
lisessä suuressa pullossa olevaan taustanäytteeseen ei lisätä kemikaa ­
leja.
 
Siirrosaineen aktiviteetin varmistamiseksi BOD-pullojen liuenneen 
hapen pitoisuutta ei saa päästää alle arvon 0,5 mg/l, mikä rajoittaa testattavan kemikaalin pitoisuuden arvoon 2 mg/l. Jos yhdiste on 
huonosti liukenevaa tai jos sillä on pieni ThOD-arvo, voidaan käyt ­
tää pitoisuutta 5–10 mg/l. Joissakin tapauksissa on suositeltavaa ajaa rinnakkaisia testisarjoja kahta eri pitoisuutta (esimerkiksi arvoja 2 mg/l ja 5 mg/l) käyttäen. ThOD-arvo lasketaan yleensä ensisijai ­
sesti ammoniumsuolojen muodostuksesta, ellei odotettavissa ole nit ­
rifikaatiota, missä tapauksessa laskelmien on perustuttava nitraattien muodostukseen (ThOD
 NO3 , katso liitettä II.2). Jos nitrifikaatio on 
vain osittaista, nitrifikaation hapenkulutuksen korjaus lasketaan nit ­
riitti- ja nitraattipitoisuuksien muutoksen perusteella (katso liitettä V).  
Jos on tarpeen määrittää testattavan kemikaalin myrkyllisyys (jos 
esimerkiksi aiempien kokeiden tuloksena on saatu pieni biohajoa ­
vuusarvo), myrkyllisyysmääritystä varten on valmisteltava erillinen 
pullosarja.  
Erilliseen suureen pulloon lisätään ilmastettua epäorgaanista liuosta 
(suunnilleen kolmannes pullon tilavuudesta), testattavaa kemikaalia 
ja vertailukemikaalia, niin että lopulliset pitoisuudet ovat samat kuin 
muissa suurissa pulloissa.  
Suurissa pulloissa olevat liuokset siirrostetaan sekundaarisella jäteve ­
dellä (0,5–5 ml/l) tai muulla siirrosaineella (esimerkiksi jokivedellä, 
katso kohtaa I.6.4.2). Lopuksi pullojen sisältö laimennetaan epäor ­
gaanisella liuoksella täyteen tilavuuteen. Riittävä sekoittuminen var ­
mistetaan käyttämällä pullon pohjaan asti ulottuvaa letkua.  
VI.2.5  Tyypillisen kokeen pullomäärä  
Tyyppillisessä ajossa käytetään seuraavia pulloja:  
— vähintään 10:tä pulloa, joissa on testattavaa kemikaalia ja siirros ­
ainetta (testisuspensio),  
— vähintään 10:tä pulloa, jossa on pelkkää siirrosainetta (siirros ­
aineen taustanäyte),  
— vähintään 10:tä pulloa, jossa on vertailukemikaalia ja siirros ­
ainetta (menetelmän tarkistusnäyte).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1009
 
— Tarvittaessa käytetään lisäksi 6:ta pulloa, joissa on testattavaa 
kemikaalia, vertailukemikaalia ja siirrosainetta (myrkyllisyystar ­
kistus). 10-päiväisen jakson löytämisen varmistamiseksi tarvitaan kuitenkin kaksinkertainen pullomäärä.
 
VI.2.6 Testin suorittaminen  
Kutakin valmisteltua liuosta annostellaan heti vastaaviin BOD-pullo ­
ryhmiin letkulla, joka ulottuu suuren pullon alimpaan neljännekseen 
(ei pohjaan). BOD-pullot täytetään kokonaan. Ilmakuplat poistetaan 
koputtamalla pulloja kevyesti. Nollahetkipullojen liuenneen hapen määritys tehdään heti Winkler- tai elektrodimenetelmällä. Pullojen 
sisältö voidaan säästää myöhemmin tehtävää Winkler-analyysia var ­
ten lisäämällä pulloihin mangaani(II)sulfaattia ja natriumhydroksidia (ensimmäistä Winkler-reagenssia). Huolella suljettuja pulloja, joissa happi on sidottuna ruskeaan mangaani(III)oksidihydraattiin, säilyte ­
tään pimeässä 10–20
 o C:ssa enintään 24 tuntia ennen Winkler-me ­
netelmän seuraavien vaiheiden aloittamista. Loput rinnakkaispullot suljetaan varmistaen, ettei pulloihin jää ilmakuplia, minkä jälkeen pulloja inkuboidaan pimeässä 20
 o C:ssa. Jokaista pullosarjaa kohti 
on käytettävä kattavaa rinnakkaissarjaa, joka sisältää siirrostettua 
taustanäytettä. Jokaisesta sarjasta on poimittava koko 28 päivän in ­
kubaatiojakson ajan säännöllisin välein (vähintään kerran viikossa) vähintään kaksi pulloa liuenneen hapen analyysiä varten.
 
Viikoittaisten näytteiden avulla pitäisi voida arvioida prosentuaalinen 
poistuma 14-päiväisen jakson aikana, ja 3–4 päivän välein tapahtu ­
van näytteenoton avulla pitäisi voida määrittää 10-päiväinen jakso, mikä edellyttää noin kaksinkertaisen pullomäärän käyttöä.
 
Jos testattava aine sisältää typpeä, nitrifikaation aiheuttama hapenku ­
lutus on otettava huomioon. Korjaus tehdään määrittämällä ensin liuenneen hapen pitoisuus O
 2 -elektrodilla, minkä jälkeen BOD-pul ­
losta otetaan näyte nitriitti- ja nitraattianalyysia varten. Hapenkulutus 
lasketaan nitriitti- ja nitraattipitoisuuden kasvun perusteella (katso liitettä V).
 
VI.3 TIEDOT JA RAPORTOINTI  
V.3.1  Tulosten käsittely  
Ensin lasketaan kunkin jakson jälkeinen BOD-arvo vähentämällä 
siirrosaineen taustanäytteen hapenpoistuma (mg O  2 /l) testattavan ai ­
neen hapenpoistumasta. Näin korjattu poistuma jaetaan testattavan kemikaalin pitoisuudella (mg/l), jolloin saadaan spesifinen BOD- arvo ilmaistuna hapen painona (mg) testattavan kemikaalin painoa 
(mg) kohti. Prosentuaalinen biohajoavuus lasketaan jakamalla spesi ­
finen BOD-arvo spesifisellä liitteen II.2 mukaan lasketulla ThOD- arvolla tai liitteessä II.3 esitettävän analyysin avulla määritetyllä 
COD-arvolla seuraavasti:
 
BOD ¼ testattavan kemikaalin O  2 Ä kulutus ðmgÞ Ä taustanäytten O  2 Ä kulutus ðmgÞ 
pullossa olevan testattavan kemikaalin määrä  ðmgÞ ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1010
 
= mg O  2 mg:aa testattavaa kemikaalia kohti  
Prosentuaalinen hajoavuus  ¼ BOD ðmg O  2=mg kemikaaliaÞ 
ThODðmg O  2=mg kemikaaliaÞ Ü 100 
tai 
Prosentuaalinen hajoavuus  ¼ BOD ðmg O  2=mg kemikaaliaÞ 
CODðmg O  2=mg kemikaaliaÞ Ü 100 
On otettava huomioon, että molemmat menetelmät eivät välttämättä 
anna tulokseksi samaa arvoa. Ensin mainitun menetelmän käyttöä 
suositellaan.  
Jos testattava aine sisältää typpeä, on käytettävä NH  4 :n tai NO  3 :n 
perusteella laskettua ThOD-arvoa sen mukaan, mitä nitrifikaation suhteen on odotettavissa (katso liitettä II.2). Jos nitrifikaatio on vain osittaista, nitrifikaation hapenkulutuksen korjaus lasketaan nit ­
riitti- ja nitraattipitoisuuksien muutoksen perusteella (katso liitettä V).
 
VI.3.2  Tulosten hyväksyminen  
Kun 28 päivää on kulunut, siirrostuksen taustanäytteen hapenpo ­
istuma ei saa ylittää arvoa 1,5 mg liuennutta happea litraa kohti. 
Jos arvo on suurempi, koetekniikoita on tarkasteltava erityisen kriit ­
tisesti. Testipullojen hapen jäännöspitotsuus ei saa missään vaiheessa 
alittaa arvoa 0,5 mg/l. Näin pienet happipitoisuudet ovat hyväksyt ­
täviä vain siinä tapauksessa, että liuenneen hapen määritysmenetelmä on riittävän tarkka mittaamaan tällaisia pitoisuuksia.
 
Katso myös kohtaa I.5.2.  
VI.3.3  Raportointi  
Katso kohtaa 1.8.  
VI.4 TIETOLOMAKE  
Jäljempänä on esimerkki tietolomakkeesta.  
SULJETUN PULLON MENETELMÄ  
1. LABORATORIO  
2. KOKEEN ALKUPÄIVÄMÄÄRÄ  
3. TESTATTAVA AINE  
Nimi:  
Kantaliuoksen pitoisuus: mg/l  
Liuoksen alkupitoisuus: mg/l  
ThOD tai COD: mg O  2 / mg testattavaa ainetta  
4. SIIRROSAINE  
Lähde:  
Käsittelyt:  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1011
 
Esikäsittelyt:  
Pitoisuus testiseoksessa: mg/l  
5. DO-MÄÄRITYS  
Menetelmä: Winkler/elektrodi  
Pulloanalyysit  
Inkubaatioaika (d) DO (mg/l) 
0 n  1 n 2 
Taustanäyte (ilman 
kemikaalia) 1 C  1 
2 C  2 
Keskiarvo 
m b ¼ C 1 þ C 2 
2 
Testattava kemikaali 1 a  1 
2 a  2 
Keskiarvo 
m t ¼ a 1 þ a 2 
2 
Huomautus: Vertailukemikaalien ja myrkyllisyysvertailunäytteiden 
osalta tiedot voidaan esittää samalla tavoin kuin tässä.  
6. NITRIFIKAATIOKORJAUS  (katso liitettä V)  
Inkubaatioaika (d) 0 n  1 n 2 n 3 
(i) Nitraattipitoisuus (mg N/l) 
(ii) Nitraattipitoisuuden muutos (mg N/l) — (iii) Happiekvivalentti (mg/l) — (iv) Nitriittipitoisuus (mg N/l) (v) Nitriittipitoisuuden muutos (mg N/l) — (vi) Happiekvivalentti (mg/l) — (ii + vi) Kokonaishappiekvivalentti (mg/l) —
 
7. DO-VÄHENNYS: PROSENTUAALINEN HAJOAMINEN  
Vähennys päivän n jälkeen (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
PULLO 1: (m  to - m  tx ) (m  bo - m  bx ) 
PULLO 2: (m  to rm tx ) (m  bo - m  bx ) ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1012
 
Vähennys päivän n jälkeen (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
PULLO 1: 
% D  1 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
testipitoisuus Ü kemikaalin ThOD 
PULLO 2: 
% D  1 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
testipitoisuus Ü kemikaalin ThOD 
% D keskiarvo (*) =  D 1 ÄD 2 
2 
(*) Jos D  1 ja D  2 -arvojen ero on suuri, arvojen keskiarvoa ei pidä käyttää.  
m t0 = testipullon arvo hetkellä 0  
m tx = testipullon arvo hetkellä x  
m b0 = taustanäytteen keskiarvo hetkellä 0  
m bx = taustanäytteen keskiarvo hetkellä x  
Käytetään myös osan 6, kohtien iii ja vi mukaista nitrifikaatiokorja ­
usta. 
8. TAUSTANÄYTTEEN DO-VÄHENNYKSET  
Taustanäytteen hapenkulutus on (m  b0 -m b28 ) mg/l. Taustanäyt ­
teen hapenkulutus on tärkeä tekijä kokeen hyväksyttävyyden kannalta. Hapenkulutus ei saa ylittää arvoa 1,5 mg/l.
 
OSA VII  MITI-KOE  (menetelmä C.4-F)  
VII. 1 MENETELMÄN PERIAATE  
Testattavaa kemikaalia lisätään epäorgaaniseen liuokseen, jota siir ­
rostetaan erikoisviljelmästä otetuilla, adaptoimattomilla mikroeliöillä. 
Liuosta tai suspensiota hämmennetään ja sen hapenkulutusta mita ­
taan automaattisella laitteella 28 päivän ajan pimennetyssä ja sulje ­
tussa respirometrissä lämpötilassa 25 ± 1  o C. Muodostunut hiilidiok ­
sidi imeytetään kalkkisoodaan. Biohajoavuus ilmaistaan prosentuaa ­
lisena hapenkulutuksena (taustanäytteen kulutuksella korjattuna) teo ­
reettisesta hapenkulutuksesta (ThOD). Prosentuaalinen primaarinen biohajoavuus lasketaan spesifisen, inkubaation alussa ja lopussa teh ­
tävän kemiallisen analyysin perusteella. Lisäksi voidaan tehdä DOC- 
analyysi.
 
VII.2 MENETELMÄKUVAUS  
VII.2.1  Laite  
a) Automaattinen elektrolyyttinen BOD-mittari tai respirometri, 
jossa on 6 kpl 300 ml:n pulloja ja kupit CO  2 -absorbenttia varten  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1013
 
b) Huone, jossa on vakiolämpötila, tai vesihaude, jonka lämpötila 
voidaan pitää arvossa 25  o C (suurin sallittu vaihteluväli ± 1  o C) 
c) Kalvosuodatinlaite (valinnainen)  
d) Hiilianalysaattori (valinnainen).  
VII.2.2  Epäorgaanisen liuoksen valmistus  
Valmistetaan seuraavat kantaliuokset käyttäen analyyttisen puhtaita 
reagensseja ja vettä (I.6.1): 
a) Monokaliumdivetyortofosfaattia, KH  2 PO 4 8,50 g 
Dikaliummonovetyortofosfaattia, K  2 HPO  4 21,75 g 
Dinatriummonovetyortofosfaattidodekahydraattia, 
Na 2 HPO  4 x 12H  2 O 44,60 g 
Ammoniumkloridia, NH  4 Cl 1,70 g 
Liuotetaan veteen ja laimennetaan litran tilavuu ­
teen. 
Liuoksen pH-arvon on oltava 7,2. 
b) Magnesiumsulfaattiheptahydraattia, MgSO  4 7 H  2 O 22,50 g 
Liuotetaan veteen ja laimennetaan litran tilavuu ­
teen. 
c) Kalsiumkloridia, CaCl  2 27,50 g 
Liuotetaan veteen ja laimennetaan litran tilavuu ­
teen. 
d) Rauta(III)kloridiheksahydraattia, FeCl  3 x 6H  2 O 0,25 g 
Liuotetaan veteen ja laimennetaan litran tilavuu ­
teen.  
Otetaan 3 ml kutakin liuosta a, b, c ja d ja laimennetaan litran 
tilavuuteen.  
VII.2.3  Siirrosaineen valmistelu  
Kerätään tuoreita näytteitä vähintään kymmenestä paikasta, pääosin 
alueilta, joilla käytetään ja päästetään useita eri kemikaaleja. Kerä ­
tään esimerkiksi kuntien ja teollisuuslaitosten jätevesilaitoksista, jois ­
ta, järvistä ja muista sopivista paikoista 1 l:n näytteitä (esimerkiksi 
lietettä, pintamaata ja vettä), jotka sekoitetaan huolellisesti. Kelluva 
aines poistetaan. Kun seos on laskeutunut, pintalietteen pH säädetään natriumhydroksidilla tai fosforihapolla arvoon 7  ± 1.
 
Sopiva tilavuus suodatettua pintalietettä lisätään aktiivilieteastiaan ja 
nestettä ilmastetaan noin 23,5 tunnin ajan. Kolmekymmentä minuut ­
tia ilmastuksen päättymisen jälkeen suunnilleen kolmasosa pintaliet ­
teestä kaadetaan pois ja laskeutuneeseen aineeseen lisätään poiskaa ­
dettua liuosta vastaava määrä liuosta, jonka pH-arvo on 7 ja joka 
sisältää 0,1 % glukoosia, 0,1 % peptonia ja 0,1 % monokaliumorto ­
fosfaattia. Tämän jälkeen ilmastus käynnistetään uudelleen. Menet ­
tely toistetaan kerran päivässä. Lietejärjestelmän käytössä on nouda ­
tettava huolellisuutta: päästövesien on oltava kirkkaita, lämpötila on 
pidettävä arvossa 25 ± 2  o C, pH-arvon on oltava 7 ± 1, lietteen on 
laskeuduttava hyvin, ilmastuksen on oltava riittävää liuoksen jatku ­
van aerobisuuden varmistamiseksi, lietteessä on oltava yksisoluisia 
eliöitä ja lietteen aktiivisuutta on testattava vertailuaineeseen verrat ­
tuna vähintään joka kolmas kuukausi. Lietettä ei saa käyttää siirros ­
aineena, ennen kuin se on ollut järjestelmässä vähintään kuukauden. Neljä kuukautta vanhempaa lietettä ei saa käyttää. Tämän jälkeen 
näytteitä on otettava vähintään 10 paikasta säännöllisin väliajoin 
(kerran kolmessa kuukaudessa).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1014
 
Jotta tuoreen ja vanhan lietteen aktiivisuus voitaisiin pitää samalla 
tasolla, käytössä olevan aktiivilietteen suodatettua pintalietettä sekoi ­
tetaan samaan tilavuuteen vastavalmistettua sekoitetta, jonka osat ovat peräisin 10:stä eri paikasta. Tämän jälkeen seosta viljellään edellä kuvatulla tavalla. Lietettä otetaan siirrosaineeksi 18–24 tuntia 
yksikön syötön jälkeen.
 
VII.2.4  Pullojen valmistelu  
Valmistellaan seuraavat kuusi pulloa:  
Pullo 1: testattavaa kemikaalia laimennusvedessä (100 mg/l)  
Pullot 2, 3 ja 4: testattavaa kemikaalia epäorgaanisessa liuoksessa 
(100 mg/l)  
Pullo 5: vertailukemikaalia (esimerkiksi aniliinia) epäorgaanisessa 
liuoksessa (100 mg/l)  
Pullo 6: pelkkää epäorgaanista liuosta.  
Huonosti liukenevia testattavia kemikaaleja lisätään suoraan painon 
tai tilavuuden mukaan, tai niitä käsitellään liitteessä II kuvattavalla 
tavalla (liuottimia tai emulgaattoreita ei kuitenkaan saa käyttää). Imeytinkuppeihin lisätään CO
 2 -absorbenttia. Pullojen 2, 3 ja 4 pH 
säädetään arvoon 7,0.  
VI1.2.5  Testin suorittaminen  
Pulloihin 2, 3 ja 4 (testisuspensiot), 5 (aktiviteettikontrolli) ja 6 
(siirrostuksen taustanäyte) lisätään pieni tilavuus siirrosainetta, niin 
että suspendoituneen kuiva-aineen lopullinen pitoisuus on 30 mg/l. Pulloon 1 ei lisätä siirrosainetta. Pullot asetetaan sekoituslaitteeseen, pullojen ilmatiiviys tarkistetaan, sekoittimet käynnistetään ja hapen ­
kulutuksen mittaus aloitetaan pimeässä. Lämpötila, sekoituslaite ja 
hapenkulutuksen kulometrinen rekisteröintilaite on tarkistettava päi ­
vittäin. Pullojen sisällön mahdolliset värimuutokset on merkittävä muistiin. Kuuden pullon hapenkulutus luetaan suoraan esimerkiksi 
BOD-käyriä tuottavasta kuusikärkisestä piirturista. Kun inkubaatio 
on päättynyt (yleensä 28 päivän kuluttua), pullojen sisällön pH-arvot mitataan. Sitten määritetään jäljelle jääneen testattavan kemikaalin ja mahdollisen välituotteen pitoisuus sekä (jos kyseessä on vesiliukoi ­
nen aine) DOC-pitoisuus (katso liitettä II.4). Haihtuvien kemikaalien 
kohdalla on noudatettava erityistä huolellisuutta. Jos nitrifikaatiota on odotettavissa, nitriitti- ja nitraattipitoisuus määritetään mahdollisuuk ­
sien mukaan.
 
VII.3 TIEDOT JA RAPORTOINTI  
VII.3.1  Tulosten käsittely  
Testattavan kemikaalin hapenkulutus (mg) määrätyn ajan kuluttua, 
korjattuna siirrostuksen taustanäytteen kulutuksella, jaetaan testatta ­
van kemikaalin painolla. Tuloksena saadaan BOD-arvo ilmaistu ha ­
pen painona kemikaalin painoa kohti (mg/mg), seuraavan suureyhtä ­
lön mukaan:  
BOD ¼ testattavan kemikaalin O  2 Ä kulutus ðmgÞ Ä taustanäytten O  2 Ä kulutus ðmgÞ 
testattavan kemikaalin paino  ðmgÞ 
= mg O  2 /mg testattavaa kemikaalia  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1015
 
Prosentuaalinen biohajoavuus lasketaan seuraavan suureyhtälön 
mukaan:  
Prosentuaalinen biohajoavuus  ¼ % ThOD ¼ BOD ðmg O  2=mg kemikaaliaÞ 
ThOD ðmg O  2=mg kemikaaliaÞ Ü 100 
Seosten osalta ThOD lasketaan yksinkertaisten yhdisteiden tapaan 
alkuaineanalyysin perusteella. Käytettävä ThOD-arvo (ThOD  NH4 tai 
ThOD  NO3 ) valitaan sen mukaan, esiintyykö nitrifikaatiota vai ei 
(katso liitettä II.2). Jos nitrifikaatio on vain osittaista, nitrifikaation 
hapenkulutuksen korjaus lasketaan nitriitti- ja nitraattipitoisuuksien 
muutoksen perusteella (katso liitettä V).  
Prosentuaalinen primaarinen biohajoavuus lasketaan spesifisen lähtö ­
kemikaalin poistuman perusteella (katso osaa I.7.2).  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
Jos pullossa 1 on on havaittu testattavan kemikaalin häviötä fysikaa ­
lis-kemiallisen poistuman mittauksen yhteydessä, häviö on raportoi ­
tava. Tällöin prosentuaalisen biohajoavuuden laskennassa käytetään 
pullon 1 testattavan kemikaalin pitoisuutta (S  b ) 28 päivän kuluttua.  
Jos DOC-määrityksiä (valinnainen toimi) tehdään, lopullinen prosen ­
tuaalinen biohajoavuus lasketaan seuraavan suureyhtälön mukaan (katso kohtaa I.7.1):
 
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C bo Î 
Ü 100 
Jos pullossa 1 on havaittu DOC-häviötä fysikaalis-kemiallisen po ­
istuman mittauksen yhteydessä, prosentuaalisen biohajoavuuden las ­
kennassa käytetään tämän pullon DOC-pitoisuutta.  
Tulokset kirjataan oheisiin tietolomakkeisiin.  
VII.3.2  Tulosten hyväksyminen  
Siirrostuksen taustanäytteen hapenkulutus on yleensä 20-30 mg O  2 /l. 
Arvo saa olla 28 päivän kuluessa enintään 60 mg/l. Jos arvo on tätä suurempi, tietoja ja koetekniikoita on tarkasteltava erityisen kriitti ­
sesti. Jos pH-arvo on alueen 6–8,5 ulkopuolella ja testattavan kemi ­
kaalin hapenkulutus on alle 60 %, testattavan kemikaalin pitoisuutta on pienennettävä ja testi on toistettava.
 
Katso myös kohtaa I.5.2.  
Jos aniliinin hapenkulutuksen perusteella laskettu prosentuaalinen 
hajoaminen ei ylitä 7 päivän kuluessa arvoa 40 % ja 14 päivän kuluessa arvoa 65 %, koe hylätään.
 
VII.3.3  Raportointi  
Katso kohtaa I.8.  
VII.4 TIETOLOMAKE  
Jäljempänä on esimerkki tietolomakkeesta.  
MITI (I) -KOE  
1. LABORATORIO  
2. KOKEEN ALKUPÄIVÄMÄÄRÄ  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1016
 
3. TESTATTAVA AINE  
Nimi:  
Kantaliuoksen pitoisuus: mg/l kemikaalina  
Liuoksen alkupitoisuus, C  o : mg/l kemikaalina  
Seoksen tilavuus, V: ml  
ThOD: mg O  2 /l 
4. SIIRROSAINE  
Lietteen näytteenottopaikat: 
1) … 6) … 
2) … 7) … 
3) … 8) … 4) … 9) … 
5) … 10) …
 
Aktiivilietteen suspendoituneen kuiva-aineen pitoisuus, kun ak ­
tiivilietettä on akklimatisoitu synteettisellä jätevedellä = … mg/l  
Aktiivilietteen tilavuus lopullisen seoksen tilavuutta (litraa) koh ­
ti: = … ml  
Lietteen pitoisuus lopullisessa seoksessa = … mg/l  
5. HAPENKULUTUS: BIOHAJOAVUUS  
Käytetyn respirometrin tyyppi:  
Aika (päivää) 
0 7 14 21 28  
O 2 -kulutus (mg), 
testattava kemi ­
kaali a 1 
a 2 
a 3 
O 2 -kulutus (mg), 
taustanäyte b 
Korjattu O  2 -kulu­
tus (mg) (a 1 -b) 
(a 2 -b) 
(a 3 -b) 
BOD testattavan 
kemikaalin painoa 
(mg) kohti ða Ä bÞ 
C o V Pullo 1 
Pullo 2 Pullo 3 
Prosentuaalinen 
hajoavuus
 
BOD 
ThOD Ü 100 1 
2 
3 
keskiarvo (*)  
(*) Jos toistoarvojen ero on suuri, toistoarvojen keskiarvoa ei pidä käyttää.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1017
 
Huomautus: Vertailukemikaalien osalta tiedot voidaan esittää samalla 
tavoin kuin tässä.  
6. HIILIANALYYSI  (valinnainen)  
Hiilianalysaattori:  
Pullo DOC DOC-poistuma 
( %) Keskiarvo 
Mitattu arvo Korjattu arvo  
Vesi + testattava aine a — — 
Liete + testattava aine b  1 b l -c 
Liete + testattava aine b  2 b 2 -c 
Liete + testattava aine b  3 b 3 -c 
Taustanäyte c — — —  
Prosentuaalinen DOC  Ä poistuma ¼ a 1 Ä ðb Ä cÞ 
a Ü 100 
7. SPESIFISEN KEMIKAALIN ANALYYTTISET TIEDOT  
Testattavan kemikaalin jäännösmäärä 
kokeen lopussa Prosentuaalinen hajoaminen  
Veteen sekoitettu taustanäyte S  b 
Siirrostettu näyte s a1 
s a2 
s a3 
Prosentuaalinenhajoaminen  ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
Pullojen a  1 , a 2 ja a  3 prosentuaalinen hajoaminen lasketaan vas ­
taavalla tavalla.  
8. HUOMAUTUKSET  
Jos käytettävissä on käyrä, johon on piirretty BOD-arvot ajan 
funktiona, se on liitettävä raporttiin.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1018
 
LIITE I  
LYHENTEITÄ JA MÄÄRITELMIÄ  
DO: ”Dissolved oxygen” (mg/l) -Vesinäytteeseen liuenneen hapen pitoisuus.  
BOD: ”Biochemical oxygen demand” (g) — Happimäärä, jonka pieneliöt ku ­
luttavat testattavan yhdisteen metaboloinnin yhteydessä. BOD ilmais ­
taan myös hapenkulutuksena (g) testattavan aineen painoa (g) kohti 
(katso menetelmää C.5).  
COD: ”Chemical oxygen demand” (g) — Hapenkulutus, kun testattavaa yh ­
distettä hapetetaan kuumalla, happamalla dikromaatilla. Suure, joka il ­
maisee hapetuskelpoisen aineksen määrän yhdisteessä. COD ilmaistaan 
myös hapenkulutuksena (g) testattavan aineen massaa (g) kohti (katso menetelmää C.6).
 
DOC: ”Dissolved organic carbon” — Liuoksessa oleva orgaaninen hiili tai 
orgaaninen hiili, joka läpäisee 0,45 μm:n suodattimen tai jää pinnalle, 
kun liuosta on sentrifugoitu nopeudella 40 000 m.s  -2 (± 4 000 g) 
15 minuutin ajan.  
ThOD: ”Theoretical oxygen demand” (mg) — Happimäärä, joka tarvitaan ke ­
mikaalin täydelliseen hapettamiseen. Lasketaan molekyylikaavan avulla (katso liitettä II.2). ThOD ilmaistaan hapenkulutuksena (mg) testattavan 
aineen massaa kohti (mg).
 
ThCO  2 : ”Theoretical carbon dioxide” (mg) — Hiilidioksidimäärä, joka lasketaan 
saatavan testattavan aineen tunnetusta tai mitatusta, epäorgaaniseen 
muotoon muunnetusta hiilestä. ThCO  2 ilmaistaan myös muodostuneen 
hiilidioksidin painona (mg) testattavan aineen massaa (mg) kohti.  
TOC: ”Total organic carbon” — Näytteen orgaanisen hiilen summa liuoksesta 
ja supensiosta mitattuna.  
IC: ”Inorganic carbon” — Epäorgaaninen hiili.  
TC: ”Total carbon” — Näytteen orgaanisen ja epäorgaanisen hiilen summa.  
Primaarinen biohajoaminen  
Biologisen aktiviteetin aiheuttama aineen kemiallisen rakenteen muuttuminen, 
jonka seurauksena aine menettää spesifisen ominaisuutensa.  
Lopullinen (aerobinen) biohajoaminen  
Hajoamisen taso, joka saavutetaan, kun eliöt ovat hyödyntäneet testattavan aineen 
täysin. Tämän prosessin tuloksena syntyy hiilidioksidia, vettä, epäorgaanisia suo ­
loja ja uutta mikrobista solukkoa (biomassaa).  
Helposti biohajoava  
Tietyt lopullisen biohajoamisen seulontatestit läpäisseiden kemikaalien yleisluo ­
kitus. Kyseiset testit ovat niin tiukkoja, että tällaisten aineiden voidaan katsoa 
olevan nopeasti ja täydellisesti biohajoavia vedessä ja aerobisissa olosuhteissa.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1019
 
Itsestään biohajoava  
Kemikaali, jonka tiedetään varmojen todisteiden perusteella olevan primäärisesti 
tai lopullisesti biohajoava kaikissa tunnetuissa biohajoavuustesteissä.  
Käsiteltävyys  
Yhdisteiden poistettavuus jätevedestä sen biologisen käsittelyn yhteydessä ilman 
käsittelyprosessien normaalille toiminnalle koituvia häiriöitä. Helposti biohajo ­
avat yhdisteet ovat yleensä käsiteltäviä, mutta kaikki itsestään biohajoavat yhdis ­
teet eivät. Myös abioottisia prosesseja tapahtuu.  
Latenssiaika  
Aika, joka kuluu vaimennuskokeessa / die-away –kokeessa siirroshetkestä vähin ­
tään 10 %:n hajoamistason saavuttamiseen. Latenssiaika on usein erittäin vaihte ­
leva, ja sen toistettavuus on huono.  
Hajoamisaika  
Hajoamisaika on latenssiajan päättymistä seuraava, 90 %:n hajoamistason saa ­
vuttamiseen kuluva ajanjakso.  
10-päiväinen jakso  
10 %:n hajoamistason saavuttamista seuraavat 10 päivää.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1020
 
LIITE II  
SOPIVIEN YHTEENVETOPARAMETRIEN LASKENTA JA MÄÄRITYS  
Joissakin menetelmissä tarvitaan määrättyjä yhteenvetoparametreja. Näiden arvo ­
jen laskeminen kuvataan jäljempänä. Parametrien käyttö kuvataan yksittäisten menetelmien yhteydessä.
 
1. Hiilimäärä  
Hiilimäärä lasketaan tunnetusta alkuainekokoonpanosta tai määritetään tes ­
tattavan aineen alkuaineanalyysin avulla.  
2. Teoreettinen hapenkulutus (ThOD)  
ThOD-arvo voidaan laskea alkuainekokoonpanosta tai määrittää alkuainea ­
nalyysin avulla. Jos alkuainekokoonpano on esimerkiksi:  
C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s 
eikä nitrifikaatiota tapahdu, ThOD-arvo voidaan laskea seuraavan suureyh ­
tälön avulla:  
ThOD  NH4 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä cl Ä 3 nÞ þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW  mg/mg  
Jos tapahtuu nitrifikaatiota, ThOD-arvo voidaan laskea seuraavan suureyhtälön avulla:  
ThOD  NO3 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä clÞ þ 5=2 n þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW  mg/mg  
3. Kemiallinen hapenkulutus (COD)  
Kemiallinen hapenkulutus (COD) määritetään menetelmän C.6 mukaan.  
4. Liuennut orgaaninen hiili (DOC)  
Määritelmän mukaan liuennut orgaaninen hiili (DOC) on kemikaalin tai 
seoksen veteen liuennut aines, joka läpäisee 0,45 μm:n suodattimen.  
Testiastioista otetaan näytteet, jotka suodatetaan heti kalvosuodatinlaittees ­
sa. Suodoksen ensimmäinen 20 ml:n osuus (jos käytetään pieniä suodatti ­
mia, määrä voi olla pienempi) hylätään. Hiilianalyysiä varten käytetään 
10–20 ml (tai pienempi määrä, jos näyte annetaan ruiskulla; määrä vaihte ­
lee hiilianalysaattorin mukaan). DOC-pitoisuus määritetään orgaanisella hii ­
lianalysaattorilla, jonka tarkkuuden on oltava riittävä sellaisten pitoisuuk ­
sien mittaamiseen, jotka ovat enintään 10 % testin alussa vallinneesta DOC- 
pitoisuudesta.  
Jos suodatettuja näytteitä ei pystytä analysoimaan samana päivänä, niitä 
voidaan säilyttää 2–4  o C:n lämpötilassa enintään 48 tuntia. Jos säilytysaika 
on tätä pitempi, näytteitä on säilytettävä - 18  o C:ssa tai tätä alhaisemmassa 
lämpötilassa.  
Huomautuksia:  
Hydrofiilisyyden parantamiseksi kalvosuodattimet on usein kyllästetty pin ­
ta-aktiivisilla aineilla. Tämän vuoksi suodattimessa voi olla useita millig ­
rammoja liukoista orgaanista hiiltä, mikä voi häiritä biohajoavuusmäärityk ­
siä. Pinta-aktiiviset aineet ja muut liukoiset orgaaniset yhdisteet poistetaan keittämällä suodattimia ionisoimattomassa vedessä tunnin ajan. Käsittely toistetaan kolme kertaa. Keittämisen jälkeen suodattimia voidaan säilyttää 
vedessä viikon ajan. Jos käytetään kertakäyttösuodattimia, jokainen erä on 
tarkastettava liukenevan orgaanisen hiilen suhteen.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1021
 
Joidenkin kalvosuodatintyyppien kohdalla testattavaa kemikaalia voi kiin ­
nittyä suodattimeen adsorption kautta. Siksi on suositeltavaa varmistaa, että 
testattava kemikaali ei kiinnity käytettävään suodattimeen.  
TOC:n ja DOC:n osuudet näytteessä voidaan määrittää  sentrifugoimalla  
(4 000 g: 40 000 ms  -2 , 15 minuuttia) suodatuksen asemesta. Sentrifugoinnin 
tuloksiin ei voi luottaa, jos alkuperäinen DOC-pitoisuus on pienempi kuin 
10 mg/l, koska tällöin kaikki bakteerit eivät välttämättä poistu tai baktee ­
riplasman orgaaninen hiili liukenee uudelleen.  
VIITTEET  
— Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th 
ed, Am. Publ. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen De ­
mand, 1965, p 65.  
— Wagner, R. Von Wasser, 1976, Vol. 46, 139.  
— DIN-Entwurf 38 409 Teil 41 — Deutsches Einheitsverfahren zur Was ­
ser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs — 
und Stoffkenngrößen (Gruppe H). Bestimmung des chemischen Sauers ­
toffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschuß Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e. V.
 
— Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble com ­
pounds. Chemosphere, 1984, Vol. 13(1), 169.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1022
 
Liite III  
HUONOSTI LIUKENEVIEN AINEIDEN BIOHAJOAVUUDEN 
ARVIOINTI  
Huonosti liukenevien aineiden biohajoavuustesteissä on otettava huomioon eräitä 
erityisseikkoja, jotka kuvataan jäljempänä.  
Homogeenisten nesteiden kohdalla ei yleensä ole näytteenotto-ongelmia. Kiinteät 
aineet sen sijaan on suositeltavaa homogenisoida sopivalla tavalla. Kun tarvitaan 
muutaman milligramman suuruinen, edustava näyte paljon epäpuhtauksia sisältä ­
västä kemikaaliseoksesta tai aineesta, on noudatettava erityistä tarkkuutta.  
Testin aikana voidaan käyttää erilaisia hämmennysmenetelmiä. Hämmennyksen 
on oltava riittävää pitämään kemikaali dispergoituneena, mutta ei niin voimakas ­
ta, että syntyy ylikuumenemista, vaahdonmuodostusta tai tarpeettoman suuria 
leikkaavia voimia.  
Stabiili dispersio voidaan tuottaa myös emulgaattorin avulla. Testiolosuhteissa 
emulgaattori ei saa olla bakteereille myrkyllinen tai biohajoava, eikä se saa 
aiheuttaa vaahdonmuodostusta.  
Liuottimia koskevat vaatimukset ovat samat kuin emulgaattoreiden kohdalla.  
Kiinteitä kantoaineita ei ole suositeltavaa käyttää kiinteiden aineiden testauksessa. 
Ne voivat kuitenkin sopia öljymäisten aineiden testaukseen.  
Kun käytetään apuaineita (emulgaattoreita, liuottimia tai kantoaineita), testiin on 
sisällytettävä apuainetta sisältävä taustanäyte.  
Huonosti liukenevien aineiden biohajoavuusmäärityksissä voidaan käyttää mitä 
tahansa kolmesta edellä kuvatusta respirometriatestistä (CO  2 -, BOD- tai MITI- 
menetelmää).  
VIITTEET  
— de Morsier, A. et al. Biodegradation tests for poorly soluble compounds. 
Chemosphere, 1987, Vol. 16, 833.  
— Gerike, P. The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. 
Chemosphere, 1984, Vol. 13, 169.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1023
 
Liite 4  
BIOHAJOAVUUDEN ARVIOINTI, KUN EPÄILLÄÄN, ETTÄ 
TESTATTAVA KEMIKAALI ON SIIRROSAINEELLE MYRKYLLINEN  
Jos biohajoavuustesti osoittaa, että kemikaali ei ole biohajoava, jäljempänä ku ­
vattavan menetelmän avulla voidaan tarvittaessa määrittää, johtuuko tämä inhibi ­
tiosta vai testattavan kemikaalin inerttiydestä (Reynolds et al., 1987).  
Myrkyllisyys- ja biohajoavuustesteissä on käytettävä samaa tai samankaltaista 
siirrosainetta.  
Kun kemikaalin biohajoavuutta testataan, kemikaalin myrkyllisyyttä voidaan ar ­
vioida käyttämällä aktiivilietteen hengityksenestotestiä (direktiivi 88/302/ETY), BOD-määritystä tai kasvunestomenetelmää yhdessä tai erikseen.
 
Jos testattavan aineen myrkyllisyyden aiheuttamaa inhibitiota on vältettävä, eh ­
dotetaan, että testattavan aineen pitoisuus pidetään biohajoavuustesteissä enintään kymmenesosana myrkyllisyystestin tuloksena saadusta EC
 50 -arvosta (tai pienem ­
pänä kuin EC  20 -arvo). Yhdisteet, joiden EC  50 -arvo on suurempi kuin 300 mg/l, 
eivät todennäköisesti aiheuta myrkyllisyysongelmia hyvää biohajoavuutta testat ­
taessa.  
Jos aineen EC  50 -arvo on pienempi kuin 20 mg/l, testissä on odotettavissa ongel ­
mia. Tällöin testattavaa ainetta on käytettävä pieninä pitoisuuksina, joten suljetun pullon testimenetelmää tai
 14 C-merkittyjä aineita suositellaan. Vaihtoehtoisesti 
voidaan käyttää siirrosaineen akklimatisointia, joka mahdollistaa testattavan ai ­
neen annostelun suurempina pitoisuuksina kuin edellä mainittuja menetelmiä käytettäessä (tällöin hyvää biohajoavuutta ei kuitenkaan voida määrittää).
 
VIITTEET  
Reynolds, L. et al. Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for 
biodegradability. Chemosphere, 1987, Vol. 16, 2259.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1024
 
Liite V  
NITRIFIKAATION AIHEUTTAMAN HAPENKULUTUKSEN HÄIRIÖN 
KORJAUS  
Kun typpeä sisältämättömän aineen biohajoavuutta arvioidaan hapenkulutuksen 
avulla, nitrifikaation aiheuttama virhe on marginaalinen (enintään 5 %) siitä 
huolimatta, että liuoksen ammoniakin typpi hapettuu epäsäännöllisesti testattavaa 
ainetta ja taustanäytettä sisältävissä astioissa. Jos testattava aine sisältää typpeä, nitrifikaation aiheuttamat virheet voivat olla suuria.
 
Jos nitrifikaatiota on tapahtunut, mutta vain osittain, reaktioseoksen havaittua 
hapenkulutusta voidaan korjata sen happimäärän osalta, joka tarvitaan ammonia ­
kin hapettamiseen nitriitiksi ja nitraatiksi. Tämä edellyttää sitä, että inkubaation 
aikana syntyvät nitriitti- ja nitraattipitoisuuksien muutokset määritetään seuraa ­
vien suureyhtälöiden avulla:  
Yhtälöstä 1 nähdään, että ammoniumkloridin (NH  4 Cl:n) typpisisällön (28 g) ha ­
pettamiseen nitriitiksi tarvitaan 96 g happea, eli kerroin on 3,43 (96/28). 
2 NH  4 Cl + 3 O  2 = 2 HNO  2 + 2 HCl + 2 H  2 O (1) 
2 HNO  2 + O  2 = 2 HNO  3 (2) 
Summayhtälö on seuraava 2 NH
 4 Cl + 4 O  2 = 2 HNO  3 + 2 HCl + 2 H  2 O (3)  
Yhtälöstä 3 nähdään samoin, että 28 g:n typpimäärän hapettamiseen nitraatiksi 
tarvitaan 128 g happea, eli kerroin on 4,57 (128/28).  
Koska reaktiot tapahtuvat  peräkkäin  ja erilaisten bakteerien vaikutuksesta, nitriit ­
tipitoisuus voi vaihdella. Jos se on pieni, nitraattipitoisuus on vastaavasti suu ­
rempi. Tällöin nitraatin muodostukseen kuluva happimäärä on 4,57 kerrottuna nitraattipitoisuuden kasvulla ja nitriitinmuodostukseen kuluva happimäärä on 3,43 kerrottuna nitriittipitoisuuden kasvulla. Jos nitriittipitoisuus on pienentynyt, 
hapenkulutus on - 3,43 kerrottuna pitoisuuden pienenemisellä.
 
Tästä seuraa, että 
nitraatinmuodostuksen kuluttama happimäärä = 4,57 x nitriitti ­
pitoisuuden kasvu (4) 
ja 
nitriitinmuodostuksen kuluttama happimäärä = 3,43 x nitriittipi ­
toisuuden kasvu (5) 
ja 
nitriittipitoisuuden pienenemisen myötä hävinnyt happimäärä = - 
3,43 x nitraattipitoisuuden pieneneminen, (6) 
joten 
nitrifikaation aiheuttama hapenkulutus = ± 3,43 x nitriittipitoi ­
suuden muutos + 4,57 x nitraattipitoisuuden kasvu, (7) 
mistä seuraa, että 
hiilen hapettumiseen kuluva happimäärä = havaittu yhteiskulutus 
— nitrifikaatioon kuluva happimäärä. (8) 
Jos vain hapettuneen typen kokonaismäärä määritetään, voidaan olettaa, että 
nitrifikaation edellyttämä hapenkulutus on suunnilleen 4,57 x hapettuneen typen kasvu.
 
Tämän jälkeen hiilen hapettumisen edellyttämää, korjattua happimäärää verrataan 
ThOD NH  3 -arvoon (katso liitettä II).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1025
 
C.5 HAJOAMINEN — BIOKEMIALLINEN HAPENKULUTUS  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Tällä menetelmällä mitataan kiinteiden tai nestemäisten orgaanisten 
aineiden biokemiallista hapenkulutusta (BOD).  
Testin tiedot koskevat vesiliukoisia aineita, mutta testillä voidaan — 
ainakin periaatteessa — testata myös haihtuvia ja huonosti veteen liukenevia aineita.
 
Menetelmää voidaan soveltaa vain sellaisiin orgaanisiin aineisiin, 
jotka eivät estä bakteerien toimintaa testipitoisuutta käytettäessä. 
Jos testattava aine ei liukene testipitoisuutta käytettäessä, aineen riit ­
tävä dispersio voidaan varmistaa erikoismenetelmien (esimerkiksi ultraäänidispersion) avulla.
 
Jos tulokseksi saadaan pieniä arvoja, tulosten tulkinnassa ja testipi ­
toisuuksien valinnassa voidaan käyttää kemikaalien myrkyllisyystie ­
toja. 
1.2 YKSIKÖT JA MÄÄRITELMÄT  
Määritelmän mukaan BOD on liuenneen hapen massa, joka tarvitaan 
testattavan aineen annetun liuostilavuuden biokemialliseen hapetta ­
miseen annetuissa olosuhteissa.  
Tulokset ilmaistaan BOD-massana (g) testattavan aineen massaa (g) 
kohti.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Sopivan vertailuaineen käyttöä siirrosaineen aktiviteetin tarkistami ­
seksi suositellaan.  
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Tunnettuun määrään ainetta, joka on liuotettu tai dispergoitu hyvin 
ilmastettuun, sopivaan liuokseen, siirrostetaan mikroeliöitä, ja siirros ­
tettua liuosta inkuboidaan pimeässä ja vakiolämpötilassa.  
BOD-arvo määritetään liuenneen hapen alku- ja loppupitoisuuden 
perusteella. Testin kesto on 5–28 päivää.  
Rinnan testiliuoksen kanssa on käytettävä taustaliuosta, jossa ei ole 
testattavaa ainetta.  
1.5 LAATUKRITEERIT  
BOD-määritystä ei hyväksytä aineen biohajoavuuden määrityksenä. 
BOD-määritystä voidaan käyttää vain seulontatestinä.  
1.6 MENETELMÄKUVAUS  
Aineesta valmistetaan alustava liuos tai dispersio, jonka BOD-pitoi ­
suus on sopiva testimenetelmää varten. Liuoksen tai dispersion 
BOD-arvo määritetään sopivan kansallisen tai kansainvälisen stan ­
dardisoidun menetelmän avulla.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1026
 
2. TIEDOT JA ARVIOINTI  
Alustavan liuoksen BOD-arvo lasketaan valitun menetelmän mu ­
kaan, ja tulos muunnetaan BOD-massaksi (g) testattavan aineen mas ­
saa (g) kohti.  
3. RAPORTOINTI  
Käytetty menetelmä ilmoitetaan.  
Ilmoitettavan biokemiallisen hapenkulutuksen arvon on oltava vähin ­
tään kolmen hyväksyttävän mittauksen keskiarvo.  
Kaikki tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulosten tulkinnan 
kannalta, on ilmoitettava. Tämä koskee erityisesti epäpuhtauksia, ai ­
neen fysikaalista olomuotoa, myrkyllisyyttä ja muita aineen ominai ­
suuksia, jotka voivat vaikuttaa tuloksiin.  
Jos apuainetta on käytetty biologisen nitrifikaation estämiseksi, tämä 
on raportoitava.  
4. VIITTEET  
Seuraavassa on esimerkkejä standardisoiduista menetelmistä:  
NF T 90-103: Determination of the biochemical oxygen demand.  
NBN 407: Biochemical oxygen demand.  
NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik 
(BZV).  
The determination of biochemical oxygen demand, Methods for 
the examination of water and associated materials, HMSO, Lon ­
don. 
ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n 
days. ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1027
 
C.6 HAJOAMINEN — KEMIALLINEN HAPENKULUTUS  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Menetelmällä mitataan kiinteiden ja nestemäisten aineiden kemial ­
lista hapenkulutusta (COD) valvotuissa laboratorio-olosuhteissa ha ­
luttua standardisoitua menettelyä noudattaen.  
Testattavan aineen kemiallisen kaavan tunteminen (onko aine halo ­
geenisuola, orgaanisen aineen ferrisuola, orgaaninen klooriyhdiste 
tms.) helpottaa testin suorittamista ja tulosten tulkintaa.  
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Kemiallinen hapenkulutus on aineen hapetettavuuden mitta. Aineen 
kemiallinen hapenkulutus ilmaistaan hapetusaineen kulutusta vastaa ­
vana happimääränä, kun ainetta hapetetaan valvotuissa laboratorio- olosuhteissa.
 
Kemiallinen hapenkulutus ilmaistaan COD-massana (g) testattavan 
aineen massaa (g) kohti.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Uutta ainetta tutkittaessa ei aina tarvitse käyttää vertailuaineita. Ver ­
tailuaineita käytetään lähinnä menetelmän toimivuuden ajoittaiseen tarkistamiseen ja verrattaessa tuloksia muiden menetelmien avulla 
saatuihin tuloksiin.
 
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Tunnettua määrää veteen liuotettua tai dispergoitua ainetta hapetetaan 
kaliumdikromaatilla väkevässä rikkihapossa vastavirtaperiaatteen mu ­
kaan kahden tunnin ajan. Katalysaattorina käytetään hopeasulfaattia. Dikromaattijäännös määritetään standardisoidulla ferriammoniumsul ­
faatilla titraamalla.
 
Jos testattava aine sisältää klooria, liuokseen lisätään 
elohopeasulfaattia (*) kloridin aiheuttaman häiriön vähentämiseksi.  
1.5 LAATUKRITEERIT  
Koska COD-arvon määritysmenetelmä on tulkinnanvarainen,  
COD-arvo on ”hapetettavuusindikaattori” ja sellaisenaan käytännöl ­
linen tapa mitata orgaanista ainetta.  
Jotkin rengasyhdisteet ja monet haihtuvat aineet (esimerkiksi lyhyt ­
ketjuiset rasvahapot) eivät hapetu tässä testissä täysin.  
1.6 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Valmistetaan aineen alustava liuos tai dispersio siten, että tuloksena 
saatava COD-arvo on 250–600 mg/l.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1028  
(*) Elohopeasuoloja sisältävät liuokset on käytön jälkeen käsiteltävä siten, ettei ympäristöön 
pääse elohopeaa.
 Huomautuksia:  
Jos aine on huonosti liukenevaa tai dispergoitumatonta, testilaittee ­
seen voidaan panna veteen sekoitettuna hienoksi jauhettua tai neste ­
mäistä ainetta, joka vastaa määrältään noin 5 mg:aa COD:tä.  
Kemiallinen hapenkulutus (COD) voidaan usein — etenkin huonosti 
liukenevien aineiden kohdalla — määrittää käyttäen menetelmän muunnosta, joka perustuu paineentasaajalla varustettuun suljettuun 
järjestelmään (H. Kelkenberg, 1975). Muunnoksen avulla voidaan 
usein tehdä menestyksekkäästi kvantitatiivinen määritys aineista (esi ­
merkiksi etikkahaposta), joiden määrittäminen perinteisellä menetel ­
mällä on vaikeaa. Menetelmää ei kuitenkaan voida soveltaa pyridii ­
niin. Kaliumdikromaattipitoisuuden (katso viitettä 1) nostaminen ar ­
voon 0,25 N (0,0416 M) mahdollistaa testattavan aineen suorapun ­
nituksen 5–10 mg:n annoksena, mikä on tärkeää huonosti veteen liukenevien aineiden COD-määrityksessä (katso viitettä 2).
 
Muussa tapauksessa COD-arvo määritetään sopivan kansallisen tai 
kansainvälisen standardisoidun menetelmän avulla.  
2. TIEDOT JA ARVIOINTI  
Testipullojen sisällön COD lasketaan valitun normalisoidun menetel ­
män mukaan ja muunnetaan COD-massaksi (g) testatun aineen mas ­
saa (g) kohti.  
3. RAPORTOINTI  
Raportissa on oltava maininta käytetystä vertailumenetelmästä.  
Ilmoitetun kemiallisen hapenkulutuksen arvon on oltava vähintään 
kolmen mittauksen keskiarvo. Kaikki tiedot ja huomautukset, joilla 
on merkitystä tulosten tulkinnan kannalta, on ilmoitettava. Tämä koskee erityisesti epäpuhtauksia, aineen fysikaalista olomuotoa, myr ­
kyllisyyttä tai aineen muita tunnettuja ominaisuuksia, jotka voivat 
vaikuttaa tuloksiin.
 
Jos kloridin häiritsevä vaikutus on pyritty minimoimaan elohopea ­
sulfaatilla, tämä on raportoitava.  
4. VIITTEET  
1) Kelkenberg, H., Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 
vol. 8, 146.  
2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphcre, 1984, vol. 13, 169.  
Seuraavassa on esimerkkejä normalisoiduista menetelmistä.  
NBN T 91-201 Determination of the chemical oxygen de ­
mand.  
ISBN O 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate 
value) of polluted and waste waters.  
NF T 90-101 Determination of the chemical oxygen demand.  
DS 217 = water analysis Determination of the chemical oxy ­
gen demand.  
DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen de ­
mand (COD) within the range above 15 mg per litre.  
NFN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.  
ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichromate 
methods.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1029
 
C.7. HAJOAMINEN — ABIOOTTINEN HAJOAMINEN: 
HYDROLYYSI PH:N FUNKTIONA  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro TG 111 (2004).  
1.1 JOHDANTO  
Kemikaalit voivat päästä pintavesiin esimerkiksi suoraan laskettuina, 
lentosumutuksen yhteydessä, valumana sekä viemäröinnin, jätteiden käsittelyn, teollisuuden, kotitalouden tai maanviljelyn päästöinä ja 
ilmakehän laskeumina. Ne voivat sen jälkeen hajota vesissä kemial ­
listen (esim. hydrolyysi ja hapettuminen), valokemiallisten ja/tai mik ­
robiprosessien kautta. Tässä testiohjeessa kuvataan laboratoriotesti ­
menetelmä, jolla voidaan arvioida kemikaalien abioottinen hydrolyyt ­
tinen hajoaminen vesiympäristössä pH-arvoilla, jotka siellä tavalli ­
sesti vallitsevat (pH 4–9). Menetelmä perustuu jo olemassa oleviin testiohjeisiin (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
 
Kokeissa määritetään i) testiaineen hydrolyysinopeus pH:n funktiona 
ja ii) hydrolyysituotteet, joille organismit voivat altistua, sekä niiden muodostumis- ja hajoamisnopeudet. Tällaisia tutkimuksia voivat edellyttää kemikaalit, jotka annostellaan suoraan veteen tai jotka pää ­
tyvät ympäristöön edellä mainittujen muiden reittien kautta.
 
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Katso liite 2.  
1.3 MENETELMÄN SOVELTAMISALA  
Testi soveltuu kemiallisille aineille (merkityille tai merkitsemättömil ­
le), joille on olemassa analyysimenetelmä, jota voidaan soveltaa riit ­
tävällä tarkkuudella ja herkkyydellä. Tässä kuvattua menetelmää voi ­
daan soveltaa lievästi haihtuviin ja haihtumattomiin yhdisteisiin, 
jotka ovat riittävän vesiliukoisia. Menetelmää ei voida soveltaa ke ­
mikaaleihin, jotka haihtuvat helposti vedestä (esim. savuavat aineet tai orgaaniset liuottimet) ja jotka eivät siis säily liuoksessa tässä kuvatuissa testiolosuhteissa. Testiä voi olla vaikea toteuttaa aineilla, 
joiden vesiliukoisuus on hyvin vähäinen (8).
 
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Testiaine lisätään steriileihin vesipohjaisiin puskuriliuoksiin, joilla on 
eri pH-arvot (pH 4, 7 ja 9). Liuoksia inkuboidaan sitten pimeässä valvotuissa laboratorio-olosuhteissa (vakiolämpötiloissa). Puskuriliu ­
oksissa oleva testiaine ja hydrolyysituotteet analysoidaan sopivin vä ­
liajoin. Kun testiaine on merkitty jollain merkkiaineella (esim.
 14 C), 
massatase voidaan määrittää helpommin.  
Testimenetelmä on suunniteltu monivaiheiseksi liitteessä 1 kuvatulla 
tavalla. Kukin vaihe riippuu edellisen vaiheen tuloksista.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1030
 
1.5 TESTIAINETTA KOSKEVAT TIEDOT  
Hydrolyysinopeuden mittaamiseen voidaan käyttää merkittyä tai 
merkitsemätöntä testiainetta. Merkittyä testiainetta suositellaan yleensä hydrolyysireittien tutkimiseen ja massataseen määrittämiseen. 
On kuitenkin tapauksia, joissa merkkiaineen käyttö ei ole ehdotto ­
man välttämätöntä.
 14 C on suositeltava leima, mutta muitakin iso ­
tooppeja, kuten  13 C, 15 N tai  3 H, voidaan käyttää. Leiman pitäisi 
mahdollisuuksien mukaan sijaita molekyylin stabiileimmassa osassa 
tai osissa. Jos testiainemolekyyli sisältää esimerkiksi yhden renkaan, 
tämä rengas täytyy merkitä. Jos testiaine sisältää kaksi tai useampia renkaita, saatetaan tarvita erillinen testi kunkin merkityn renkaan 
reitin arvioimiseksi ja tarvittavan tiedon saamiseksi hydrolyysituot ­
teiden muodostumisesta. Testiaineen puhtausasteen tulisi olla vähin ­
tään 95 %.
 
Ennen hydrolyysitestin tekemistä testiaineesta on oltava saatavilla 
seuraavat tiedot:  
(a) vesiliukoisuus [testimenetelmä A.6];  
(b) liukoisuus orgaanisiin liuottimiin;  
(c) höyrynpaine [testimenetelmä A.4] ja/tai Henryn lain vakio;  
(d) n-oktanoli/vesi-jakaantumiskerroin [testimenetelmä A. 8];  
(e) dissosiaatiovakio (pK  a ) [OECD:n testiohje 112] (9);  
(f) suoran ja epäsuoran valokemiallisen muuntumisen nopeus ve ­
dessä (valoherkän aineen ollessa kyseessä).  
Käytettävissä on oltava analyysimenetelmät testiaineen kvantifioimi ­
seksi sekä tarvittaessa hydrolyysituotteiden tunnistamiseksi ja kvan ­
tifioimiseksi vesiliuoksista (katso myös kohta 1.7.2).  
1.6 VERTAILUAINEET  
Mikäli mahdollista, hydrolyysituotteiden tunnistukseen ja kvantifi ­
ointiin on käytettävä vertailuaineita. Menetelminä käytetään spektros ­
kopiaa ja kromatografiaa tai muita menetelmiä, joiden herkkyys on sopiva.
 
1.7 LAATUVAATIMUKSET  
1.7.1  Saanto  
Vähintään kahden puskuriliuoksen tai niiden uutteiden analysointi 
heti testiaineen lisäämisen jälkeen antaa alustavia tietoja analyysime ­
netelmän toistettavuudesta ja testiaineen lisäämismenetelmän tasai ­
suudesta. Saanto testin myöhemmissä vaiheissa määritetään vastaa ­
van massataseen mukaan (kun käytetään merkittyä ainetta). Saanto ­
jen tulisi olla 90–110 % sekä merkittyä että merkitsemätöntä ainetta käytettäessä (7). Jos tätä on teknisesti vaikea saavuttaa, merkitsemät ­
tömien aineiden osalta hyväksytään 70 prosentin saanto, mutta tämä 
on perusteltava.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1031
 
1.7.2  Analyysimenetelmän toistettavuus ja herkkyys  
Testiaineen ja hydrolyysituotteiden myöhempään kvantifiointiin käy ­
tettävän analyysimenetelmän tai -menetelmien toistettavuus voidaan tarkistaa kaksoismäärittämällä samat puskuriliuokset (tai niiden uut ­
teet) sen jälkeen, kun on muodostunut riittävästi hydrolyysituotteita 
kvantifioitavaksi.
 
Analyysimenetelmän on oltava riittävän herkkä, jotta sen avulla voi ­
daan kvantifioida testiaineen pitoisuudet, jotka ovat 10 % alkuperäi ­
sestä pitoisuudesta tai tätä vähemmän. Tarvittaessa analyysimenetel ­
mien pitäisi olla myös riittävän herkkiä, jotta niiden avulla voidaan (milloin tahansa tutkimuksen aikana) kvantifioida hydrolyysituotteet, jotka ovat 10 prosenttia tai enemmän annostellusta testiaineesta, ja 
kvantifioinnin on oltava mahdollista pitoisuuksissa, jotka ovat 25 % 
suurimmasta pitoisuudesta tai tätä vähemmän.
 
1.7.3  Hydrolyysin kineettisten mittaustietojen luottamusvälit  
Luottamusvälit on laskettava ja esitettävä kaikille regressiokertoimille, 
nopeusvakioille, puoliintumisajoille ja mahdollisille muille kineetti ­
sille parametreille (esim. DT50).  
1.8 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.8.1  Laitteet  
Testi on suoritettava lasiastioissa (esimerkiksi koeputkissa tai pullois ­
sa), tarvittaessa pimeässä ja steriileissä olosuhteissa, paitsi jos esi ­
tiedot (kuten n-oktanoli-vesi-jakaantumiskerroin) osoittavat, että tes ­
tiaine saattaa kiinnittyä lasiin. Tällöin voidaan harkita jonkin muun materiaalin, esimerkiksi teflonin, käyttöä. Jos testiaineen tiedetään 
kiinnittyvän lasiin, ongelmaa voidaan helpottaa myös yhdellä tai 
useammilla seuraavista tavoista:
 
— Määritetään testiastiaan kiinnittyneen testiaineen ja hydrolyysitu ­
otteiden massa.  
— Käytetään ultraäänihaudetta.  
— Pestään kaikki lasitavarat liuottimella kunkin näytteenottokerran 
jälkeen.  
— Käytetään kaupallisia valmisteita.  
— Lisätään testiaine järjestelmään lisäliuottimen avulla; tällöin lisä ­
liuottimen on oltava aine, joka ei hydrolysoi testiainetta.  
Yleensä vaatimuksena on, että eri testiliuosten inkubointiin käytetään 
lämpötilakontrolloituja vesihauderavistimia tai termostaattisesti ohjat ­
tuja inkubaattoreita.  
Testissä tarvitaan tavanomaisia laboratoriolaitteita, erityisesti seuraa ­
via: 
— pH-mittari,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1032
 
— analyyttiset laitteet, kuten GC-, HPLC- ja TLC-laitteet, mukaan 
luettuina radioaktiivisten tai muiden kuin radioaktiivisten merkki ­
aineiden osoittamiseen soveltuvat järjestelmät tai käänteinen iso ­
tooppilaimennusmenetelmä,  
— tunnistukseen käytettävät laitteet (esimerkiksi MS-, GC-MS-, 
HPLC-MS-spektrometri tai NMR-laite),  
— nestetuikelaskin,  
— erotussuppilot neste-neste-uuttoa varten,  
— liuosten ja uutteiden konsentrointivälineet (esimerkiksi pyörö ­
haihdutin),  
— lämpötilakontrolloitu laite (esim. vesihaude).  
Esimerkiksi seuraavia kemiallisia reagensseja tarvitaan:  
— orgaaniset liuottimet (analyysilaatu), kuten heksaani tai dikloo ­
rimetaani,  
— tuikeneste,  
— puskuriliuokset (tiedot kohdassa 1.8.3).  
Kaikki hydrolyysitesteissä käytettävät lasiastiat, vesi (reagenssilaatu) 
ja puskuriliuokset on steriloitava.  
1.8.2  Testiaineen annostelu  
Testiaine annostellaan vesiliuoksena eri puskuriliuoksiin (katso liite 
3). Jos riittävä liukeneminen sitä edellyttää, testiaineen annostelussa voidaan käyttää pieniä määriä veteen sekoittuvia liuottimia (esimer ­
kiksi asetonitriiliä, asetonia tai etanolia), mutta niiden määrä ei saa 
yleensä olla enempää kuin 1 tilavuusprosentti. Mikäli liuottimia aio ­
taan käyttää suurempina pitoisuuksina (esim. kun on kyse huonoliu ­
koisista testiaineista), tämä sallitaan vain, jos voidaan osoittaa, että liuottimella ei ole vaikutusta testiaineiden hydrolyysiin.
 
Kaupallisten valmisteiden käyttö testissä ei ole yleensä suositeltavaa, 
koska ei voida sulkea pois sitä mahdollisuutta, että valmisteen aine ­
sosat voivat vaikuttaa hydrolyysiprosessiin. Mikäli on kuitenkin kyse huonosti vesiliukoisista aineista tai lasiin kiinnittyvistä aineista (katso kohta 1.8.1), kaupallisten valmisteiden käyttö voi olla sopiva vaih ­
toehto.
 
Testiainetta saisi käyttää vain yhdessä pitoisuudessa, joka ei saisi olla 
yli 0,01 M tai yli puolet kyllästymispitoisuudesta (katso liite 1).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1033
 
1.8.3  Puskuriliuokset  
Hydrolyysitesti olisi toteutettava pH-arvoilla 4, 7 ja 9. Tätä varten 
puskuriliuokset olisi valmistettava käyttäen reagenssilaadun kemikaa ­
leja ja vettä. Joitain sopivia puskurijärjestelmiä esitellään liitteessä 
3. On huomattava, että puskurijärjestelmä voi vaikuttaa hydrolyysin 
nopeuteen. Jos tällainen vaikutus havaitaan, olisi käytettävä jotain muuta puskurijärjestelmää1 (
 1 ). 
Kunkin puskuriliuoksen pH olisi tarkistettava kalibroidulla pH-mit ­
tarilla vähintään pH-yksikön kymmenesosan tarkkuudella ja vaa ­
ditussa lämpötilassa.  
1.8.4  Koeolosuhteet  
1.8.4.1  Testilämpötila  
Hydrolyysikokeet on suoritettava vakioiduissa lämpötiloissa. Ekst ­
rapolointitarkoituksia varten on tärkeää, että lämpötilaa ylläpidetään 
vähintään tarkkuudella 0,5  o C. 
Alustava testi (vaihe 1) olisi suoritettava lämpötilassa 50  o C, jos 
testiaineen hydrolyyttinen käyttäytyminen on tuntematon. Seuraavan 
vaiheen kineettiset testit olisi suoritettava vähintään kolmessa lämpö ­
tilassa (mukaan lukien 50  o C:ssa suoritettava testi), ellei vaiheen 1 
testissä todettu, että testiaine on hydrolyyttisesti stabiili. Suositeltava lämpötila-alue on 10–70
 o C (mielellään siten, että ainakin yksi käy ­
tetty lämpötila on alle 25  o C). Tämä lämpötila-alue kattaa raportoin ­
tilämpötilan 25  o C ja useimmat kentällä vallitsevat lämpötilat.  
1.8.4.2  Valo ja happi  
Kaikki hydrolyysitestit on suoritettava käyttäen sopivaa menetelmää, 
jolla vältetään fotolyyttiset vaikutukset. Happi pitäisi pyrkiä poista ­
maan kaikin sopivin tavoin (esim. poreiluttamalla heliumia, typpeä tai argonia viiden minuutin ajan ennen liuoksen valmistamista).
 
1.8.4.3  Testin kesto  
Alustavan testin kesto on viisi päivää, ja myöhempien vaiheiden 
testejä tulisi jatkaa, kunnes 90 % testiaineesta on hydrolysoitunut, tai 30 päivän ajan sen mukaan, kumpi on varhaisempi.
 
1.8.5  Testin suorittaminen  
1.8.5.1  Alustava testi (vaihe 1)  
Alustava testi suoritetaan lämpötilassa 50 ± 0,5  o C ja pH-arvoilla 4,0, 
7,0 ja 9,0. Jos viiden päivän jälkeen havaittu hydrolyysi on vähem ­
män kuin 10 % (t  0,5 25 o C > 1 vuosi), testiaine katsotaan hydrolyyt ­
tisesti stabiiliksi ja lisätestausta ei yleensä tarvita. Jos aineen tiede ­
tään olevan epästabiili sellaisissa ympäristön lämpötiloissa (  2 ), joissa 
aine esiintyy, alustavaa testiä ei vaadita. Analyysimenetelmän on oltava riittävän tarkka ja herkkä, jotta sillä voidaan havaita 10 pro ­
sentin vähennys alkuperäisestä pitoisuudesta.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1034  
( 1 ) Mabey ja Mill suosittelevat boraatti- tai asetaattipuskurin käyttöä fosfaattipuskurin sijaan 
(11). 
( 2 ) Tällainen tieto voi olla peräisin muista lähteistä, kuten rakenteellisesti samankaltaisten 
yhdisteiden hydrolyysitiedoista (kirjallisuudesta) tai muista alustavista semikvantitatii ­
visista hydrolyysitesteistä, joissa testiainetta on testattu aiemmassa kehitysvaiheessa.
 1.8.5.2  Epästabiilien aineiden hydrolyysi (vaihe 2)  
Seuraavan vaiheen testi suoritetaan niillä pH-arvoilla, joilla testiaine 
todettiin epästabiiliksi alustavassa testissä. Testiaineen puskuriliu ­
osten lämpötila säädetään valittuihin lämpötiloihin termostaatin avul ­
la. Ensimmäisen kertaluvun reaktioiden testaamiseksi kukin reaktio ­
liuos analysoidaan sellaisin aikavälein, että saadaan ainakin kuusi datapistettä, yleensä alueella, joka vastaa 10–90 prosentin hydrolyy ­
siä. Yksittäiset rinnakkaiset testinäytteet (vähintään kaksi rinnak ­
kaista näytettä erillisissä reaktioastioissa) otetaan ja niiden sisältö 
analysoidaan kussakin vähintään kuudesta näytteenottoajankohdasta (ts. vähintään kaksitoista kaksoismääritettyä datapistettä). Ei riitä, että 
käytetään yhtä ainoaa näytettä, josta otetaan yhtä suuret määrät tes ­
tiliuosta kunakin näytteenottoajankohtana, koska tämä ei mahdollista vaihtelukertoimen määritystä ja voi johtaa ongelmiin testiliuoksen kontaminoitumisen vuoksi. Tämän vaiheen lopussa (ts. kun hydro ­
lyysi on 90-prosenttinen tai 30 päivän jälkeen) on suoritettava testi 
steriiliyden vahvistamiseksi. Jos hajoamista ei havaita, steriiliystestiä ei katsota tarpeelliseksi.
 
1.8.5.3  Hydrolyysituotteiden tunnistaminen (vaihe 3)  
Hydrolyysituotteet ja ainakin sellaiset, jotka edustavat > 10 %:a an ­
nostellusta määrästä, on tunnistettava sopivilla analyysimenetelmillä.  
1.8.5.4  Vapaaehtoiset lisätestit  
Hydrolyyttisesti epästabiili testiaine voi edellyttää lisätestejä myös 
muilla pH-arvoilla kuin 4, 7 ja 9. Esimerkiksi fysiologisia tarkoituk ­
sia varten voidaan tarvita happamampien olosuhteiden testi (esim. pH 1,2), jossa käytetään yhtä ainoaa fysiologisesti relevanttia läm ­
pötilaa (37
 o C). 
2. TULOKSET  
Testiaineen ja hydrolyysituotteiden määrät annetaan prosentteina an ­
nostellusta lähtöpitoisuudesta ja tarvittaessa yksikkönä mg/l kunkin 
näytteenottovälin osalta ja kunkin pH-arvon ja testilämpötilan osalta. 
Lisäksi massatase pitäisi antaa prosentteina annostellusta lähtöpitoi ­
suudesta, jos on käytetty leimattua testiainetta.  
Testiaineen pitoisuuksista ajan funktiona olisi annettava graafinen 
esitys logaritmiasteikolla. Mahdolliset hydrolyysituotteet ja ainakin sellaiset, jotka edustavat ≥ 10 %:a annostellusta määrästä, on tunnis ­
tettava ja niiden pitoisuuksia koskevat tiedot esitettävä samalla ta ­
valla graafisesti logaritmiasteikolla kuin alkutuotteen osalta siten, että 
niiden muodostumis- ja hajoamisnopeudet voidaan määrittää.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1035
 
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Puoliintumisajat tai DT  50 -arvot on määriteltävä tarkemmin sopivalla 
kinetiikkamalliin perustuvalla laskutavalla. Puoliintumisaikojen arvot ja/tai DT
 50 -arvot (mukaan luettuina luottamusvälit) on ilmoitettava 
kunkin pH-arvon ja lämpötilan osalta. Samalla on ilmoitettava käy ­
tetty malli, kinetiikan kertaluku ja determinaatiokerroin (r  2 ). Tarvit­
taessa laskelmat on tehtävä myös hydrolyysituotteista.  
Suoritettaessa nopeustutkimuksia eri lämpötiloissa pseudo-ensimmäi ­
sen kertaluvun hydrolyysireaktion nopeusvakiot (k  obs = k  hav ) pitäisi 
esittää lämpötilan funktiona. Laskemisen täytyisi pohjautua sekä hydrolyysityypeittäin (happokatalysoitu, neutraali tai emäskatalysoi ­
tu) eriteltyihin havaittuihin nopeusvakioihin (vastaavasti k
 H , k neutraali  
tai k  OH ) että Arrheniuksen yhtälöön:  
k obs ¼ k H ½H þ â þ k neutral þ k OH ½OH Ä â ¼ ∑ 
i¼H;neutral ;OH A i e ÄB i=T 
jossa A  i ja B  i ovat regressiovakioita parhaiten sopivien suorien vas ­
taavasta leikkauskohdasta ja kulmakertoimesta. Vakiot on saatu line ­
aarisella regressiolla kuvaajasta ln (k  i ) vs. 1/T. Soveltamalla Arrheni ­
uksen yhtälöä hapon katalysoimaan, neutraaliin tai emäksen kataly ­
soimaan hydrolyysiin voidaan pseudo-ensimmäisen kertaluvun hyd ­
rolyysin nopeusvakiot ja siten myös puoliintumisajat laskea muille lämpötiloille, joille ei ole mahdollista toteuttaa suoraa, kokeellista 
nopeusvakion määrittämistä (10).
 
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI JA TULKINTA  
Useimpien hydrolyysireaktioiden reaktionopeus on lähellä ensimmäi ­
sen kertaluvun reaktion nopeutta, joten puoliintumisajat riippuvat pi ­
toisuudesta (katso yhtälö 4 liitteessä 2). Tämä merkitsee sitä, että 
välillä 10  -2 -10 -3 määritetyt laboratoriotulokset ovat siirrettävissä ym ­
päristöolosuhteisiin ( ≤ 10 -6 M) (10). Mabey ja Mill (11) mainitsevat 
useita esimerkkejä puhtaassa vedessä ja luonnonvesissä mitattujen hydrolyysinopeuksien hyvästä keskinäisestä vastaavuudesta useiden 
kemikaalien osalta, edellyttäen että sekä pH että lämpötila oli mitattu.
 
3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
3.1 TESTISELOSTE  
Testiselosteessa on annettava seuraavat tiedot:  
Testiaine:  
— yleisnimi, kemiallinen nimi, CAS-numero, rakennekaava (josta 
käy ilmi leiman sijainti käytettäessä radioaktiivista merkkiainetta) 
ja merkitykselliset fysikokemialliset ominaisuudet (katso kohta 1.5),
 
— testiaineen puhtaus (epäpuhtaudet),  
— merkkiaineella leimatun kemikaalin leiman puhtaus ja molaarinen 
aktiivisuus tapauksen mukaan.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1036
 
— Puskuriliuokset:  
— valmistusajankohdat ja –tiedot,  
— käytetyt puskurit ja vedet,  
— puskuriliuosten molaarisuus ja pH.  
Testiolosuhteet:  
— testien suorituspäivämäärät,  
— testiaineen annosteltu määrä,  
— testiaineen annostelutapa ja annostelussa käytetyt liuottimet 
(tyyppi ja määrä),  
— testiaineen sisältävien puskuriliuosten inkuboinnissa käytetty vo ­
lyymi,  
— kuvaus käytetystä inkubointijärjestelmästä,  
— pH ja lämpötila testin aikana,  
— näytteenottoajankohdat,  
— erotusmenetelmä(t),  
— menetelmät testiaineen ja hydrolyysituotteiden kvantifioimiseksi 
ja tunnistamiseksi puskuriliuoksista,  
— rinnakkaisnäytteiden määrä.  
Tulokset:  
— käytettyjen analyysimenetelmien toistettavuus ja herkkyys,  
— saannot (kohdassa 1.7.1 annetaan validissa testissä saavutettavat 
prosenttiarvot),  
— rinnakkaisnäytteiden mittaustulokset ja keskiarvot taulukkomuo ­
dossa,  
— massatase testien aikana ja niiden lopuksi (kun käytetään merk ­
kiainetta),  
— alustavan testin tulokset,  
— tulosten pohdinta ja tulkinta,  
— kaikki alkuperäiset mittaustulokset ja luvut.  
Seuraavat tiedot tarvitaan vain, kun määritetään hydrolyysinopeus:  
— graafiset esitykset testiaineiden ja tarvittaessa hydrolyysituottei ­
den pitoisuuksista ajan funktiona ja kussakin pH-arvossa ja läm ­
pötilassa,  
— Arrheniuksen yhtälöstä saadut tulokset lämpötilalle 20  o C/25  o C, 
mukana pH, nopeusvakio [h  -1 tai päivä  -1 ], puoliintumisaika tai 
DT 50 , lämpötilat [  o C] (mukaan luettuina luottamusvälit) sekä 
korrelaatiokertoimet (r  2 ) tai vastaavat tiedot,  
— ehdotettu hydrolyysireitti.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1037
 
4. KIRJALLISUUSVIITTEET  
(1) OECD (1981). Hydrolysis as a Function of pH. OECD Guid ­
eline for Testing of Chemicals Nr. 111, adopted 12 May 1981.  
(2) US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 
796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25  o C. Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate.  
(3) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
(4) European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC 
amending Council Directive 91/414/EEC concerning the pla ­
cing of plant protection products on the market. Annex V: Fate and Behaviour in the Environment.
 
(5) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). App ­
lication for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of 
the product and its metabolites in soil, water and air.  
(6) BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des 
Verhaltensvon Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (Octo ­
ber 1980).  
(7) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
(8) OECD (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures, OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assess ­
ment Nr.23.
 
(9) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994 — 2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.
 
(10) Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997) 
Recommended changes in pesticide fate study guidelines for 
improving input to computer models. (Text version of oral presentation at the 14
 th Annual Meeting of the Society of 
Environmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, Novem ­
ber 1993).  
(11) Mabey, W. and Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis 
of organic compounds in water under environmental conditi ­
ons. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383–415.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1038
 
Liite 1  
Vaiheittainen hydrolyysitestimalli
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1039
 
Liite 2  
Määritelmät ja yksiköt  
Kaikissa tapauksissa on käytettävä  kansainvälisen SI-standardin mukaisia yk ­
sikköjä.  
Testiaine:  mikä tahansa aine, joko lähtöaine tai merkitykselliset hajoamistuotteet.  
Muuntumistuotteet:  kaikki aineet, jotka syntyvät testiaineen bioottisista tai abi ­
oottisista muuntumisreaktioista.  
Hydrolyysituotteet:  kaikki aineet, jotka syntyvät testiaineen hydrolyyttisistä 
muuntumisreaktioista.  
Hydrolyysi:  testiaineen RX reaktio veden kanssa sillä lopputuloksella, että 
ryhmä X vaihtuu OH:n kanssa reaktiokeskuksessa. 
RX + HOH → ROH + HX [1]  
Tässä yksinkertaistetussa prosessissa nopeus, jolla RX:n pitoisuus vähenee, on 
seuraavien kaavojen mukainen: 
nopeus = k [H  2 O] [RX] toisen kertaluvun reaktio 
tai 
nopeus = k [RX] ensimmäisen kertaluvun reaktio  
riippuen reaktionopeutta määräävästä vaiheesta. Koska vettä on paljon enemmän 
kuin testiainetta, tämäntyyppinen reaktio kuvataan yleensä pseudo-ensimmäisen kertaluvun reaktiona, jossa havaittu nopeusvakio on 
k
 obs = k [H  2 O] [2]  
ja reaktionopeus voidaan määrittää lausekkeesta (*)  
k obs ¼ 1 
t ln C o 
C t [3] 
jossa  
t = aika  
ja C  o , C t = RX:n pitoisuudet ajankohdissa 0 ja t.  
Tämän vakion yksiköiden dimensio on (aika)  -1 , ja reaktion puoliintumisaika 
(aika, jossa 50 % RX:stä on reagoinut) on  
t 0;5 ¼ ln2 
k obs [4] 
Puoliintumisaika:  (t 0,5 ) on aika, joka kuluu testiaineen 50-prosenttiseen hydro ­
lyysiin tapauksissa, joissa hajoaminen voidaan kuvata ensimmäisen kertaluvun 
kinetiikan avulla; se ei riipu pitoisuudesta.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1040  
(*) Jos mittaustulosten esitys logaritmisessa asteikossa ajan funktiona ei osoita lineaarista 
funktiota (joka vastaa ensimmäisen kertaluvun reaktionopeutta), yhtälöä [3] ei voida 
käyttää testiyhdisteen hydrolyysivakion määrittämiseen.
 DT 50 (häviämisaika 50):  aika, jonka kuluessa testiaineen pitoisuus vähenee 
50 %:lla; se eroaa puoliintumisajasta t  0,5 , kun reaktio ei ole ensimmäisen kerta ­
luvun kinetiikan reaktio.  
k:n arvioiminen eri lämpötiloissa  
Kun nopeusvakiot tiedetään kahdessa lämpötilassa, nopeusvakiot voidaan laskea 
muiden lämpötilojen osalta käyttämällä Arrheniuksen yhtälöä:  
k ¼ A Ü e Ä E 
R Ü T or ln k ¼ ÄE 
R Ü T þ ln A 
Kun ln k esitetään graafisesti 1/T:n funktiona, saadaan suora viiva, jonka kul ­
makerroin on -E/R.  
Tällöin:  
k = eri lämpötiloissa mitattu nopeusvakio  
E = aktivaatioenergia [kJ/mol]  
T = absoluuttinen lämpötila [K]  
R = kaasuvakio [8,314 J/mol.K]  
Aktivaatioenergia lasketaan regressioanalyysillä tai seuraavalla yhtälöllä:  
E ¼ R Ü ln k 2 Ä ln k 1 
1 
T 1 Ä 1 
T 2 Ê Ì  
Tällöin: T  2 >T 1 . ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1041
 
Liite 3  
Puskurijärjestelmät  
A. CLARK JA LUBS:  
Clarkin ja Lubsin puskuriseokset  (*) 
Koostumus pH  
0,2 N HC1 JA 0,2 N KC1 20  o C:ssa  
47,5 ml. HC1 + 25 ml. KC1 laimennettuna 100 ml:aan 1,0 
32,25 ml. HC1 + 25 ml. KC1 laimennettuna 100 ml:aan 1,2 
20,75 ml. HC1 + 25 ml. KC1 laimennettuna 100 ml:aan 1,4 13,15 ml. HC1 + 25 ml. KC1 laimennettuna 100 ml:aan 1,6 
8,3 ml. HC1 + 25 ml. KC1 laimennettuna 100 ml:aan 1,8 
5,3 ml. HC1 + 25 ml. KC1 laimennettuna 100 ml:aan 2,0 
3,35 ml. HC1 + 25 ml. KC1 laimennettuna 100 ml:aan 2,2  
0,1 M kaliumbiftalaatti + 0,1 N HC1 20
 o C:ssa  
46,70 ml. 0,1 N HC1 + 50 ml. biftalaattia 100 ml:aan 2,2 
39,60 ml. 0,1 N HC1 + 50 ml. biftalaattia 100 ml:aan 2,4 32,95 ml. 0,1 N HC1 + 50 ml. biftalaattia 100 ml:aan 2,6 26,42 ml. 0,1 N HC1 + 50 ml. biftalaattia 100 ml:aan 2,8 
20,32 ml. 0,1 N HC1 + 50 ml. biftalaattia 100 ml:aan 3,0 
14,70 ml. 0,1 N HC1 + 50 ml. biftalaattia 100 ml:aan 3,2 
9,90 ml. 0,1 N HC1 + 50 ml. biftalaattia 100 ml:aan 3,4 5,97 ml. 0,1 N HC1 + 50 ml. biftalaattia 100 ml:aan 3,6 
2,63 ml. 0,1 N HC1 + 50 ml. biftalaattia 100 ml:aan 3,8  
0,1 M kaliumbiftalaatti + 0,1 N NaOH 20
 o C:ssa  
0,40 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biftalaattia 100 ml:aan 4,0 
3,70 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biftalaattia 100 ml:aan 4,2 
7,50 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biftalaattia 100 ml:aan 4,4 
12,15 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biftalaattia 100 ml:aan 4,6 
17,70 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biftalaattia 100 ml:aan 4,8  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1042  
(*) Näissä taulukoissa ilmoitetut pH-arvot on laskettu potentiaalimittausten perusteella käyttäen Sörensenin vakio ­
yhtälöitä (1909). Vastaavat pH-arvot ovat 0,04 yksikköä suuremmat kuin taulukossa olevat arvot.
 Koostumus pH  
23,85 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biftalaattia 100 ml:aan 5,0 
29,95 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biftalaattia 100 ml:aan 5,2 35,45 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biftalaattia 100 ml:aan 5,4 
39,85 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biftalaattia 100 ml:aan 5,6 
43,00 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biftalaattia 100 ml:aan 5,8 
45,45 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biftalaattia 100 ml:aan 6,0  
0,1 M monokaliumfosfaatti + 0,1 N NaOH 20
 o C:ssa  
5,70 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfaattia 100 ml:aan 6,0 8,60 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfaattia 100 ml:aan 6,2 
12,60 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfaattia 100 ml:aan 6,4 
17,80 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfaattia 100 ml:aan 6,6 
23,45 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfaattia 100 ml:aan 6,8 29,63 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfaattia 100 ml:aan 7,0 35,00 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfaattia 100 ml:aan 7,2 
39,50 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfaattia 100 ml:aan 7,4 
42,80 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfaattia 100 ml:aan 7,6 45,20 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfaattia 100 ml:aan 7,8 46,80 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfaattia 100 ml:aan 8,0  
0,1 M H3B03 0,1 M KC1:ssa + 0,1 N NaOH 20
 o C:ssa  
2,61 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. boorihappoa 100 ml:aan 7,8 
3,97 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. boorihappoa 100 ml:aan 8,0 5,90 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. boorihappoa 100 ml:aan 8,2 8,50 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. boorihappoa 100 ml:aan 8,4 
12,00 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. boorihappoa 100 ml:aan 8,6 
16,30 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. boorihappoa 100 ml:aan 8,8 21,30 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. boorihappoa 100 ml:aan 9,0 26,70 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. boorihappoa 100 ml:aan 9,2
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1043
 
32,00 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. boorihappoa 100 ml:aan 9,4 
36,85 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. boorihappoa 100 ml:aan 9,6 
40,80 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. boorihappoa 100 ml:aan 9,8 43,90 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. boorihappoa 100 ml:aan 10,0
 
B. KOLTHOFF JA VLEESCHHOUWER:  (*) 
Kolthoffin ja Vleeschhouwerin sitraattipuskurit  
Koostumus pH  
0,1 M monokaliumsitraatti ja 0,1 N HC1 18  o C:ssa  (*) 
49,7 ml. 0,1 N HC1 + 50 ml. sitraattia 100 ml:aan 2,2 43,4 ml. 0,1 N HC1 + 50 ml. sitraattia 100 ml:aan 2,4 
36,8 ml. 0,1 N HC1 + 50 ml. sitraattia 100 ml:aan 2,6 
30,2 ml. 0,1 N HC1 + 50 ml. sitraattia 100 ml:aan 2,8 23,6 ml. 0,1 N HC1 + 50 ml. sitraattia 100 ml:aan 3,0 
17,2 ml. 0,1 N HC1 + 50 ml. sitraattia 100 ml:aan 3,2 
10,7 ml. 0,1 N HC1 + 50 ml. sitraattia 100 ml:aan 3,4 
4,2 ml. 0,1 N HC1 + 50 ml. sitraattia 100 ml:aan 3,6  
0,1 M monokaliumsitraatti ja 0,1 N NaOH 18
 o C:ssa  (*) 
2,0 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. sitraattia 100 ml:aan 3,8 
9,0 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. sitraattia 100 ml:aan 4,0 
16,3 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. sitraattia 100 ml:aan 4,2 
23,7 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. sitraattia 100 ml:aan 4,4 
31,5 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. sitraattia 100 ml:aan 4,6 39,2 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. sitraattia 100 ml:aan 4,8 46,7 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. sitraattia 100 ml:aan 5,0 
54,2 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. sitraattia 100 ml:aan 5,2 
61,0 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. sitraattia 100 ml:aan 5,4 68,0 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. sitraattia 100 ml:aan 5,6 
74,4 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. sitraattia 100 ml:aan 5,8 
81,2 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. sitraattia 100 ml:aan 6,0
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1044  
(*) Lisätään pieni tymolikide tai muuta samantyyppistä ainetta homesienien kasvun estämi ­
seksi.
 C. SÖRENSEN:  
Sörensenin boraattiseokset  
Koostumus 
Sörensen 
18 o C Walbum, pH 
ml. Borax ml. HC1/NaO 
H 10 o C 40  o C 70  o C 
0,05 M borax + + 0,1 N HC1  
5,25 4,75 7,62 7,64 7,55 7,47 
5,50 4,50 7,94 7,98 7,86 7,76 
5,75 4,25 8,14 8,17 8,06 7,95 6,00 4,00 8,29 8,32 8,19 8,08 6,50 3,50 8,51 8,54 8,40 8,28 7,00 3,00 8,08 8,72 8,56 8,40 7,50 2,50 8,80 8,84 8,67 8,50 8,00 2,00 8,91 8,96 8,77 8,59 8,50 1,50 9,01 9,06 8,86 8,67 9,00 1,00 9,09 9,14 8,94 8,74 9,50 0,50 9,17 9,22 9,01 8,80 
10,00 0,00 9,24 9,30 9,08 8,86  
0,05 M borax + + 0,1 N NaOH  
10,0 0,0 9,24 9,30 9,08 8,86 
9,0 1,0 9,36 9,42 9,18 8,94 
8,0 2,0 9,50 9,57 9,30 9,02 
7,0 3,0 9,68 9,76 9,44 9,12 6,0 4,0 9,97 10,06 9,67 9,28
 
Sörensenin fosfaattiseokset  
Koostumus pH  
0,0667 M monokaliumfosfaatti + 0,0667 M dinatriumfosfaatti 20  o C:ssa  
99,2 ml KH  2 PO 4 + 0,8 ml Na  2 HPO  4 5,0 
98,4 ml KH  2 PO 4 + 1,6 ml Na  2 HPO  4 5,2 
97,3 ml KH2PO4 + 2,7 ml Na  2 HPO  4 5,4 
95,5 ml KH2PO4 + 4,5 ml Na  2 HPO  4 5,6 
92,8 ml KH  2 PO 4 + 7,2 ml Na  2 HPO  4 5,8 
88,9 ml KH  2 PO 4 + 11,1 ml Na  2 HPO  4 6,0 
83,0 ml KH  2 PO 4 + 17,0 ml Na  2 HPO  4 6,2 
75,4 ml KH  2 PO 4 + 24,6 ml Na  2 HPO  4 6,4 
65,3 ml KH  2 PO 4 + 34,7 ml Na  2 HPO  4 6,6 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1045
 
53,4 ml KH  2 PO 4 + 46,6 ml Na  2 HPO  4 6,8 
41,3 ml KH  2 PO 4 + 58,7 ml Na  2 HPO  4 7,0 
29,6 ml KH  2 PO 4 + 70,4 ml Na  2 HPO  4 7,2 
19,7 ml KH  2 PO 4 + 80,3 ml Na  2 HPO  4 7,4 
12,8 ml KH  2 PO 4 + 87,2 ml Na  2 HPO  4 7,6 
7,4 ml KH  2 PO 4 + 92,6 ml Na  2 HPO  4 7,8 
3,7 ml KH  2 PO 4 + 96,3 ml Na  2 HPO  4 8,0 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1046
 
C.8 MYRKYLLISYYSTUTKIMUS MADOILLA  
KEINOMAATESTI  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Tässä laboratoriokokeessa testattavaa ainetta lisätään keinotekoiseen 
maahan, jossa matoja pidetään 14 vuorokautta. Tämän ajan kuluttua (ja valinnaisesti 7 vuorokauden kuluttua) aineen tappava vaikutus matoihin tutkitaan. Tällä testillä voidaan suhteellisen lyhyen ajan 
kuluessa seuloa ravinnon yhteydessä saatujen tai ihon kautta imey ­
tyneiden kemikaalien vaikutukset matoihin.
 
1.2 MÄÄRITELMÄ JA YKSIKKÖ  
LC 50 : Aineen pitoisuus, jonka arvioidaan tappavan 50 % koe-eläi ­
mistä koeajan kuluessa.  
1.3 VERTAILUAINE  
Vertailuainetta käytetään ajoittain osoittamaan, että testin herkkyys ei 
ole merkittävästi muuttunut.  
Vertailuaineena suositellaan käytettäväksi analyysilaatuista klooriase ­
tamidia.  
1.4 TESTIN PERIAATE  
Koska mullan koostumus vaihtelee, tässä testissä käytetään tarkoin 
määritettyä keinotekoista savimaata.  Eisenia foetida  -lajin (ks. lisä ­
yksen huomautus) täysikasvuisia matoja kasvatetaan koostumuksel ­
taan tunnetussa keinotekoisessa savimaassa, johon on lisätty testatta ­
vaa ainetta erisuuruisina pitoisuuksina. Astioiden sisältö levitetään tarjottimelle 14 vuorokauden (ja valinnaisesti 7 vuorokauden) kulut ­
tua testin alkamisesta ja elossaolevien matojen määrä lasketaan ku ­
takin pitoisuutta kohden.
 
1.5 LAATUKRITEERIT  
Testi on suunniteltu siten, että se on mahdollisimman helppo toistaa 
suhteessa käytettyyn substraattiin ja organismiin. Kontrollien kuollei ­
suus saa olla korkeintaan 10 % testin lopussa, muussa tapauksessa 
testi hylätään.  
1.6 TESTIN KUVAUS  
1.6.1  Materiaalit  
1.6.1.1 T e s t i s s ä k ä y t e t t ä v ä s u b s t r a a t t i  
Testin perussubstraattina käytetään määrätyn laatuista keinotekoista 
maata.  
a) Perussubstraatti (prosentit tarkoittavat kuivapainoa):  
— 10 % rahkasuoturvetta (pH mahdollisimman tarkoin 5,5–6,0, 
ei näkyviä kasvijäänteitä ja hienoksi jauhettuna),  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1047
 
— 20 % kaoliniittisavea, jossa kaoliniitin osuuden olisi oltava yli 
50 %,  
— noin 69 % teollista kvartsihiekkaa (pääosin hienoa hiekkaa, 
jossa yli 50 % 0,05–0,2 mm:n hiukkasia). Ellei aine ole kyllin vesiliukoista, kutakin koeastiaa kohden varataan 10 g, johon testattava aine myöhemmin sekoitetaan.
 
— noin 1 % jauhettua, kemiallisesti puhdasta kalsiumkarbonaat ­
tia (CaCO  3 ), jolla pH-arvoksi säädetään 6,0 ± 0,5.  
b) Testissä käytettävä substraatti:  
Testissä käytettävä substraatti sisältää perussubstraattia, testatta ­
vaa ainetta ja ionisoimatonta vettä.  
Vesipitoisuus on noin 25–42 % perussubstraatin kuivapainosta. 
Substraatin vesipitoisuus määritetään kuivaamalla näyte vakiopai ­
noon 105  o C:n lämmössä. Päävaatimuksena on, että keinomaata 
on kostutettava siten, ettei siihen jää seisovaa vettä. Testattava aine on sekoitettava tasaisesti substraattiin. Testattavan aineen ja substraatin yhdistämistapa on ilmoitettava.
 
c) Kontrollisubstraatti:  
Kontrollisubstraatti sisältää perussubstraattia ja vettä. Lisäaineita 
käytettäessä valmistetaan toinen kontrollisubstraatti, joka sisältää 
saman määrän lisäainetta.  
1.6.1.2 K o e a s t i a t  
Noin litran vetoisiin lasiastioihin (jotka peitetään muovikannella, 
lautasella tai rei'itetyllä muovikalvolla) laitetaan märkää koe- tai kontrollisubstraattia 500 g:n kuivapainoa vastaava määrä.
 
1.6.2  Koeolosuhteet  
Astiat laitetaan ilmastoituun kammioon, jossa on 20 ± 2  o C:n läm­
pötila ja jatkuva valaistus. Valon voimakkuuden on oltava 400–800 
luxia.  
Koeaika on 14 vuorokautta, mutta kuolleisuus voidaan määrittää 
myös seitsemän vuorokauden kuluttua testin aloittamisesta.  
1.6.3  Testin suorittaminen  
T e s t i s s ä k ä y t e t t ä v ä t p i t o i s u u d e t  
Testattavan aineen pitoisuudet ilmoitetaan aineen painona suhteessa 
perussubstraatin kuivapainoon (mg/kg).  
R a j a - a n n o s t e s t i  
Raja-annostestillä voidaan määrittää pitoisuusrajat, jotka aiheuttavat 
0–100 % kuolleisuuden. Näiden rajojen perusteella määrätään varsi ­
naisessa testissä käytettävät pitoisuudet.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1048
 
Seuraavat pitoisuudet on testattava: 1 000, 100, 10, 1, 0,1 mg testat ­
tavaa ainetta/kg testissä käytettyä substraattia (kuivapaino).  
Mikäli varsinainen testi tehdään täydellisenä, kunkin pitoisuuden ja 
yhden alustamattoman kontrollin testaaminen 10 madon erällä saattaa olla riittävän tarkka raja-annostesti.
 
V a r s i n a i n e n t e s t i  
Raja-annostestin tulosten perusteella määritetään vähintään viisi pi ­
toisuutta geometrisenä sarjana, joka kattaa 0–100 % kuolleisuuden, 
ja jonka erottava vakiotekijä on korkeintaan 1,8.  
Tätä pitoisuussarjaa käyttävillä testeillä olisi voitava arvioida LC  50 - 
arvo ja sen luotettavuusrajat mahdollisimman tarkasti.  
Varsinaisessa testissä käytetään vähintään neljää testiryhmää kullakin 
annostasolla sekä neljää altistamatonta kontrolliryhmää, joissa on 
kussakin 10 matoa. Tuloksia ilmoitettaessa näistä rinnakkaisryhmistä ilmoitetaan keskiarvot ja keskipoikkeamat.
 
Kun kaksi peräkkäistä pitoisuutta, joiden erottava tekijä on 1,8, an ­
tavat ainoastaan 0 % ja 100 % kuolleisuuden, nämä kaksi arvoa 
riittävät osoittamaan LC  50 -välin.  
T e s t i s s ä k ä y t e t t ä v ä n p e r u s s u b s t r a a t i n j a t e s t a t ­
t a v a n a i n e e n s e o s  
Testissä käytettävä substraatti on valmistettava, jos mahdollista, il ­
man muita lisäaineita kuin vettä, ionisoimattomaan veteen tai muu ­
hun liuottimeen emulgoitu tai dispergoitu testattava aine sekoitetaan perussubstraattiin tai suihkutetaan tasaisesti sen pintaan hienolla kro ­
matografisella tai vastaavalla sumuttimella juuri ennen testin alkua.
 
Jos aine ei liukene veteen, se voidaan liuottaa mahdollisimman pie ­
neen määrään jotakin orgaanista liuotinta (esimerkiksi heksaamiin, 
asetoniin tai kloroformiin).  
Vain herkästi haihtuvia liuottimia voidaan käyttää testattavan aineen 
liuottamiseen, dispergoimiseen tai emulgoimiseen. Testissä käytet ­
tävä substraatti on tuuletettava ennen käyttöä. Haihtuneen veden 
määrä on korvattava. Kontrollin on sisällettävä sama määrä apuai ­
netta.  
Ellei testattavaa ainetta voida liuottaa, dispergoida tai emulgoida 
orgaanisiin liuottimiin, 10 g hienoksi jauhettua kvartsihiekkaa ja kuivapainoltaan 500 grammaan keinomaata tarvittava määrä testatta ­
vaa ainetta yhdistetään ja sekoitetaan 490 grammaan (kuivapaino) 
testissä käytettävää substraattia.
 
Kutakin koe-erää varten laitetaan lasiastiaan 500 gramman kuivapai ­
noa vastaava määrä märkää koesubstraattia ja asetetaan 10 matoa koesubstraatin pinnalle. Matoja on tätä ennen sopeutettu 24 tuntia 
samanlaiseen märkään perussubstraattiin, jonka jälkeen ne on pesty 
nopeasti ja liika vesi imeytetty suodatinpaperiin.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1049
 
Astiat peitetään rei'itetyillä muovikansilla, lautasilla tai kalvolla kui ­
vumisen estämiseksi ja pidetään koeolosuhteissa 14 vuorokautta.  
Määritykset suoritetaan 14 vuorokauden (ja valinnaisesti 7 vuoro ­
kauden) kuluttua testin alkamisesta. Substraatti levitetään lasia tai ruostumatonta terästä olevalle levylle. Madot tutkitaan ja elossa ole ­
vien matojen määrä lasketaan. Mato katsotaan kuolleeksi, ellei se 
reagoi keveään mekaaniseen etupään ärsytykseen.
 
Jos tutkimus tehdään 7 vuorokauden kuluttua, sama substraatti laite ­
taan takaisin astiaan ja elossa olevat madot sen pinnalle.  
1.6.4  Koeorganismit  
Koeorganismeina käytetään täysikasvuisia  Eisenia foetida  -matoja 
(ks. lisäyksen huomautus) (vähintään kahden kuukauden ikäisiä ma ­
toja, joilla on clitellum-paksunnos), joiden märkäpaino on 
300–600 mg. (Kasvatus — ks. lisäys.)  
2. TULOKSET  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY JA ARVIOINTI  
Ilmoitetaan testatun aineen pitoisuudet ja matojen kuolleisuuspro ­
sentti kutakin pitoisuutta kohden.  
Mikäli LC  50 -arvo ja luotettavuusrajat (p = 0,05) pystytään määrittä ­
mään tulosten perusteella, määritys on tehtävä jotakin standardime ­
netelmää käyttäen (Litchfield ja Wilcoxon, 1949 tai vastaava mene ­
telmä). LC  50 ilmoitetaan milligrammoina testattavaa ainetta testissä 
käytettyä substraattikilogrammaa (kuivapaino) kohden.  
Jos pitoisuuskäyrän kaltevuus on liian jyrkkä LC  50 -arvon laskemi ­
seksi, graafinen arvio tästä arvosta riittää.  
Kun kaksi peräkkäistä pitoisuutta, joiden erottava tekijä on 1,8, an ­
tavat ainoastaan 0 % ja 100 % kuolleisuuden, nämä kaksi arvoa 
riittävät osoittamaan LC  50 -välin.  
3. RAPORTOINTI  
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tie ­
dot: 
— vakuutus, että koe on suoritettu edellä olevien laatuvaatimusten 
mukaisesti,  
— tehty testi (raja-annostesti ja/tai varsinainen testi),  
— tarkka selostus koeolosuhteista tai vakuutus, että testi on suori ­
tettu menetelmän mukaisesti; poikkeamat on ilmoitettava,  
— tarkka selostus siitä, millä tavoin testattava aine sekoitettiin tes ­
tissä käytettyyn substraattiin,  
— tiedot koeorganismeista, (laji, ikä, keskipaino ja painorajat, elin- 
ja kasvatusolosuhteet, hankintapaikka),  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1050
 
— LC  50 -arvon määritysmenetelmä,  
— testitulokset ja kaikki käytetyt tiedot,  
— selostus koe-organismeissa havaituista oireista tai käyttäytymis ­
muutoksista,  
— kontrollien kuolleisuus,  
— LC  50 tai korkein testattu pitoisuus, joka ei aiheuttanut kuollei ­
suutta ja alin testattu pitoisuus, joka aiheutti 100 % kuolleisuuden 14 vuorokauden (sekä valinnaisesti 7 vuorokauden) kuluttua tes ­
tin alkamisesta,
 
— pitoisuus/vastekäyrä,  
— vertailuaineella joko tästä testistä tai aikaisemmista laaduntarkkai ­
lukokeista saadut tulokset.  
4. LÄHDELUETTELO  
1) OECD, Paris, 1981,  Test Guideline 207,  Decision of the Council 
C(81) 30 final.  
2) Edwards, C. A. and Lofty, J.R., 1977,  Biology of Earthworms,  
Chapman and Hall, London, 331 s.  
3) Bouche, M. B., 1972,  Lombriciens de France, Ecologie et Sys ­
tematique,  Institut National de la Recherche Agronomique, 671 
s. 
4) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F, A simplified method of eva ­
luation dose effect experiments,  J. Pharm. Exs. Therap.,  vol. 96, 
1949, s. 99.  
5) Euroopan yhteisöjen komissio,  Development of a standardized 
laboratory method for assessing the toxicity of chemical subs ­
tances to earthworms,  Report EUR 8714 EN, 1983.  
6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für Land- und 
Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag ”Toxizitätstest am Regenworm  Eisenia foetida  in künstlichem Boden” in: 
Rudolph/Boje,  Ökotoxikologie,  ecomed, Landsberg, 1986.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1051
 
Lisäys  
Matojen lisääminen ja kasvatus ennen testausta  
Matoja lisättäessä 30–50 täysikasvuista matoa pannaan tuoretta substraattia sisäl ­
tävään lisääntymislaatikkoon 14 vuorokauden ajaksi. Niitä voidaan käyttää li ­
sääntymiseen useita kertoja. Munista syntyneitä matoja käytetään kokeisiin niiden 
tultua täysikasvuisiksi (määritellyissä olosuhteissa parin kolmen kuukauden ku ­
luttua).  
Kasvatus- ja lisääntymisolosuhteet  
Ilmastoitu kammio: 20 ± 2  o C:n lämpötila ja jatkuva valaistus (valon voimak ­
kuus 400-800 luxia).  
Lisäyslaatikot: matalia 10–20 litran vetoisia astioita.  
Substraatti:  Eisenia foetida  -matoja voidaan kasvattaa eläinten lannas ­
sa. Suositeltava lisäysalusta on sekoitus, jossa on 50 % turvetta ja 50 % hevosen tai lehmän lantaa. Elatusalustan 
pH-arvon on oltava 6–7 (säädetään kalsiumkarbonaatilla) ja 
sen ionijohtavuuden alhainen (alle 6 mm hos tai 0,5 % suolapitoisuus). 
Substraatin on oltava kosteaa, mutta ei märkää.
 
Edellä esitetyn lisäksi voidaan käyttää muitakin menettely ­
tapoja.  
Huom. Eisenia foetidaa  on kahta rotua, jotka eräät taksonomit ovat erottaneet eri 
lajeiksi (Bouche, 1972). Ne ovat morfologisesti samanlaisia, mutta toisen,  Eisenia 
foetida foetidan , jaokkeissa on tyypillinen poikittainen raidoitus tai juovaisuus 
kun taas toiselta, vaihtelevan punaväriseltä  Eisenia foetida andreilta , raidoitus 
puuttuu.  Eisenia foetida andrei  on suositeltavin koelaji. Muitakin lajeja voidaan 
käyttää, tarvittavien menetelmien ollessa käytössä  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1052
 
C.9 BIOLOGINEN HAJOAMINEN  
ZAHN-WELLENS-TESTI  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Tämän menetelmän tarkoituksena on määrittää vesiliukoisten haihtu ­
mattomien orgaanisten aineiden mahdollinen lopullinen biologinen hajoaminen, kun ne altistetaan suurehkoille mikro-organismipitoi ­
suuksille staattisessa testissä.
 
Kiinteiden aineiden suspensioissa voi tapahtua fysikaalis-kemiallista 
adsorpiota, ja tämä on otettava huomioon tuloksia tulkittaessa (ks. 
3.2). 
Tutkittavista aineista käytetään 50–400 mg/l DOC-arvoja tai 
100–1 000 mg/l COD-arvoja vastaavaa pitoisuutta (DOC= dissolved organic carbon, liuennut orgaaninen hiili; COD= chemical oxygen demand, kemiallinen hapenkulutus). Näiden suurehkojen pitoisuuk ­
sien etuna on analyyttinen luotettavuus. Yhdisteet, joilla on myrkyl ­
lisiä ominaisuuksia, voivat hidastaa hajoamistapahtumaa tai estää sen.
 
Tässä menetelmässä testattavan aineen lopullisen biologisen hajoa ­
misen määrittämiseen käytetään liuenneen orgaanisen hiilen määrää 
tai kemiallista hapenkulutusta.  
Samanaikaisesti käytetyllä ominaisella analyysimenetelmällä voidaan 
määrittää aineen biologinen primaarihajoaminen (alkuperäisen kemi ­
allisen rakenteen häviäminen).  
Tällä menetelmällä voidaan tutkia vain sellaisia orgaanisia aineita, 
jotka testissä käytetyn pitoisuuden osalta täyttävät seuraavat edelly ­
tykset:  
— ne ovat vesiliukoisia koeolosuhteissa,  
— niiden höyrynpaine on mitätön koeolosuhteissa,  
— ne eivät estä bakteeritoimintaa,  
— ne adsorboituvat käytetyssä testissä vain rajoitetusti,  
— ne eivät poistu testiliuoksesta vaahtoamisen vuoksi.  
Tiedot testattavan materiaalin pääaineosien suhteellisista osuuksista 
auttavat tulosten tulkinnassa, varsinkin jos tulokset ovat alhaisia tai 
marginaalisia.  
Tiedot aineen myrkyllisyydestä mikro-organismeille auttavat alhais ­
ten tulosten tulkinnassa ja oikeiden pitoisuuksien valinnassa.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1053
 
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Testin lopussa saavutettu hajoamisaste ilmoitetaan muodossa ”Biolo ­
ginen hajoaminen Zahn-Wellens-testissä”  
D T ð%Þ ¼ " 
1 Ä ðC T Ä C B Þ 
ðC A Ä C BA Þ # 
Ü 100 
jossa  
D T = biologinen hajoaminen ( %) ajan hetkellä T,  
C A = testattavan seoksen DOC (tai COD)-arvot mitattuna kol ­
men tunnin kuluttua testin alkamisesta (mg/l), (DOC  = 
dissolved organic carbon, liuennut orgaaninen hiili; COD = chemical oxygen demand, kemiallinen hapenkulutus),
 
C T = testattavan seoksen DOC- tai COD-arvot näytteenottohet ­
kellä (mg/l),  
C B = nollakokeen DOC- tai COD-arvot näytteenottoaikana 
(mg/l),  
CBA = nollakokeen DOC- tai COD-arvot mitattuna kolmen tunnin 
kuluttua testin alkamisesta (mg/l).  
Hajoamisaste pyöristetään lähimpään kokonaiseen prosenttiin.  
Hajoamisprosentti ilmoitetaan testattavasta aineesta poistuneen 
liuenneen orgaanisen hiilen (tai kemiallisen hapenkulutuksen) poistu ­
maprosenttina.  
Kolmen tunnin kuluttua määritetyn arvon ja lasketun tai mieluimmin 
määritetyn alkuarvon ero voi antaa hyödyllistä tietoa aineen poistu ­
masta (ks. 3.2, tulosten tulkinta).  
1.3 VERTAILUAINEET  
Uusia aineita tutkittaessa vertailuaineista saattaa joissakin tapauksissa 
olla hyötyä. Sopivia vertailuaineita ei kuitenkaan voida vielä suosi ­
tella.  
1.4 TESTIN PERIAATE  
Laitetaan aktiivilietettä, mineraaliravinteita ja testattavaa ainetta ai ­
noana hiilen lähteenä sisältävää vesiliuosta 1–4 litran vetoiseen, se ­
koittajalla ja ilmastajalla varustettuun lasiastiaan. Seosta sekoitetaan 
ja ilmastetaan 20–25  o C:n lämpötilassa hajavalossa tai pimeässä 
enintään 28 päivää. Hajoamistapahtumaa seurataan määrittämällä DOC- (tai COD-)arvot suodatetusta liuoksesta päivittäin tai jotakin muuta määräaikaa noudattaen. Kukin määräajoin mitattu DOC- (tai 
COD-) poistuma suhteessa kolme tuntia testin alkamisen jälkeen 
suoritettuun määritykseen ilmoitetaan biologisena hajoamisprosent ­
tina ja se osoittaa senhetkisen hajoamisasteen. Tulos esitetään graa ­
fisesti suhteessa aikaan, jolloin saadaan biologinen hajoamiskäyrä.
 
Alkuperäisen molekyylipitoisuuden biologisesta hajoamisesta johtu ­
vat muutokset voidaan mitata käyttämällä jotakin analyyttistä mene ­
telmää (biologinen primaarihajoaminen).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1054
 
1.5 LAATUVAATIMUKSET  
Tämän testin toistettavuus on todettu tyydyttäväksi rengasreaktion 
avulla.  
Menetelmän herkkyys määräytyy suurelta osin nollatestin vaihtele ­
vuuden ja jossakin määrin liuenneen orgaanisen hiilen määritystark ­
kuuden sekä liuoksen sisältämän testattavan aineen pitoisuuden mu ­
kaan.  
1.6 TESTIN KUVAUS  
1.6.1  Testin valmistelu  
1.6.1.1 R e a g e n s s i t  
Testissä käytetty vesi: juomavettä, jonka orgaaninen hiilipitoisuus on 
< 5 mg/l. Kalsium- ja magnesiumionien yhteispitoisuus saa olla enintään 2,7 mmol/1, muussa tapauksessa on suoritettava tarvittava laimennus ionisoimattomalla tai tislatulla vedellä. 
Rikkihappo, analyyttinen laatu (A. R.): 50 g/l 
Natriumhydroksidiliuos, A. R.: 40 g/l 
Mineraaliravinneliuos: liuotetaan litraan ionisoimatonta 
vettä: 
ammoniumkloridia, NH
 4 Cl, A. R.: 38,5 g, 
natriumdivetyfosfaattia, NaH  2 PO 4 .2H  2 O, A. R.: 33,4 g, 
kaliumdivetyfosfaattia, KH  2 PO 4 , A. R.: 8,5 g, 
dikaliummonovetyfosfaattia K  2 HPO  4 , A. R.: 21,75 g.  
Seos toimii sekä ravinteena että puskurijärjestelmänä.  
1.6.1.2 L a i t t e e t  
Lasiastioita, joiden vetoisuus on 1–4 litraa (esimerkiksi sylinterimäi ­
siä astioita).  
Sähkösekoittaja, jossa on varrellinen lasi- tai metallisekoitin (sekoit ­
timen on pyörittävä 5–10 cm astian pohjan yläpuolella). Vaihtoeh ­
toisesti voidaan käyttää magneettisekoitinta, jossa sauvan pituus on 
7–10 cm.  
Lasiputki, jonka sisähalkaisija on 2-4 mm, ilmastusta varten. Putken 
pään on oltava noin 1 cm astian pohjasta.  
Sentrifugi (noin 3 550 g).  
pH-mittari.  
Liuenneen hapen mittari.  
Paperisuodattimia.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1055
 
Kalvosuodatinlaite.  
Kalvosuodattimia, huokoskoko 0,45 μm. Kalvosuodattimia voidaan 
käyttää, jos on varmistuttu siitä, että ne eivät vapauta hiiltä eivätkä 
absorboi testattavaa ainetta suodatusvaiheessa.  
Analyysilaitteet orgaanisen hiilen pitoisuuden ja kemiallisen hapen 
tarpeen määritystä varten.  
1.6.1.3 I n o k u l a a t o n v a l m i s t u s  
Biologisesta käsittelylaitoksesta peräisin oleva aktiiviliete pestään 
sentrifugoimalla (toistuvasti) tai antamalla sen laskeutua testissä käy ­
tettävässä vedessä (edellä).  
Aktiivilietteen on oltava laadultaan soveltuvaa. Tällaista lietettä on 
saatavilla hyvin toimivasta jätevesien käsittelylaitoksesta. Jotta liet ­
teessä olisi mahdollisimman monta bakteerilajia tai -kantaa, saattaa olla tarpeen sekoittaa useasta lähteestä otettuja inokulaatteja (esimer ­
kiksi eri jätteenkäsittelylaitokset, maaperä, jokivedet jne.). Seos kä ­
sitellään edellä selostetulla tavalla.
 
Aktiivilietteen tehokkuuden tarkistus — ks. ”toimivuuskontrolli” jäl ­
jempänä.  
1.6.1.4 K o e l i u o s t e n v a l m i s t u s  
Koeastiaan pannaan 500 ml testissä käytettävää vettä, 2,5 ml/l mi ­
neraaliravinneliuosta ja aktiivilietettä niin paljon, että sen määrä lo ­
pullisessa seoksessa vastaa 0,2 - 1,0 g/l kuiva-ainetta. Testattavasta 
aineesta valmistettua varastoliuosta lisätään niin paljon, että lopulli ­
sen seoksen DOC-pitoisuus on 50–400 mg/l. Vastaavat COD-arvot ovat 100–1 000 mg/l. Testissä käytettävää vettä lisätään niin paljon, että liuoksen kokonaismääräksi saadaan 1–4 litraa. Kokonaismäärä 
riippuu siitä, kuinka monta näytettä otetaan DOC- tai COD-mää ­
rityksiä varten ja paljonko seosta tarvitaan analyyseihin.
 
Yleensä kaksi litraa on riittävä määrä. Testiin sisältyy vähintään yksi 
kontrolliastia (nollakoe), joka sisältää ainoastaan aktiivilietettä ja mi ­
neraaliravinneliuosta ja testissä käytettyä vettä niin paljon, että sen 
kokonaismäärä on sama kuin koeastioissa oleva.  
1.6.2  Testin suorittaminen  
Koeastioita sekoitetaan magneetti- tai potkurisekoittajalla hajavalossa 
tai pimeässä huoneessa 20–25  o C:n lämpötilassa. Ilmastus tehdään 
paineilmalla, joka puhdistetaan tarvittaessa pesupullon ja vanusuodat ­
timen avulla. On pidettävä huolta siitä, ettei liete laskeudu eikä hap ­
pipitoisuus putoa alle 2 mg/l.  
pH-arvo on tarkistettava määräajoin (esimerkiksi päivittäin) ja pH- 
arvoksi säädettävä tarvittaessa 7–8.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1056
 
Haihtunut nestemäärä korvataan ennen kutakin näytteenottoa lisää ­
mällä tarvittava määrä ionisoimatonta tai tislattua vettä. Suositeltavaa 
on merkitä nesteen taso astian kylkeen ennen testin aloittamista. Uusi merkintä tehdään kunkin näytteenoton jälkeen (ilmastamatta ja se ­
koittamatta). Ensimmäiset näytteet otetaan aina kolmen tunnin kulut ­
tua testin alkamisesta, jotta voidaan todeta, adsorboituuko testattava 
aine aktiivilietteeseen.
 
Testattavan aineen häviämistä seurataan DOC- tai COD-määrityksin, 
jotka tehdään päivittäin tai muuten säännöllisin väliajoin. Koeastiasta 
ja nollakoeastiasta otetut näytteet suodatetaan huolellisesti pestyn paperisuodattimen läpi. Ensimmäiset 5 ml testattavan aineen suo ­
dosta heitetään pois. Vaikeasti suodatettavat lietteet voidaan poistaa 
suodatusta edeltävällä 10 minuutin sentrifugoinnilla. DOC- ja COD- 
määritykset tehdään vähintään kahtena kappaleena. Testin kesto on enintään 28 päivää.
 
Huom.  Sameina pysyvät näytteet suodatetaan kalvosuodattimella. 
Kalvosuodattimet eivät saa päästää eivätkä adsorboida mitään orgaa ­
nista ainetta.  
A k t i i v i l i e t t e e n t o i m i v u u s k o n t r o l l i  
Kuhunkin koesarjaan on sisällytettävä tunnettua ainetta sisältävä koe ­
astia aktiivilietteen toiminnan testaamista varten. Dietyleeniglykoli on osoittautunut tähän tarkoitukseen sopivaksi.
 
A d a p t a a t i o  
Kun analyysejä tehdään suhteellisen lyhyin väliajoin (esim. päivittäin), 
adaptaatio voidaan selvästi todeta hajoamiskäyrältä (ks. kuva 2). Sen 
vuoksi testiä ei saa aloittaa juuri ennen viikonloppua.  
Jos adaptaatio tapahtuu koeajan lopulla, koetta voidaan jatkaa, kun ­
nes hajoaminen loppuu.  
Huom.  Jos adaptoituneesta lietteestä tarvitaan laajempia tietoja, sa ­
maa aktiivilietettä testataan uudelleen saman koemateriaalin kanssa 
seuraavasti:  
Sekoitus ja ilmastus lopetetaan ja aktiivilietteen annetaan laskeutua. 
Kelluva neste poistetaan, testissä käytettyä vettä lisätään, kunnes kokonaismäärä on kaksi litraa, sekoitetaan 15 minuuttia ja annetaan laskeutua uudelleen. Kun kelluva neste on jälleen poistettu, testi 
uusitaan jäljellä olevalla lietteellä samaa materiaalia käyttäen 1.6.1.4 
ja 1.6.2 kohtien mukaisesti. Aktiiviliete voidaan myös erottaa sent ­
rifugoimalla selkeyttämisen sijasta.
 
Adaptoinutta lietettä voidaan sekoittaa tuoreeseen lietteeseen siten, 
että kuivapainopitoisuus on 0,2–1 g/l.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1057
 
A n a l y y s i t  
Näytteet suodatetaan yleensä huolellisesti pestyllä paperisuodatti ­
mella (pesuun käytetään ionisoimatonta vettä).  
Sameiksi jäävät näytteet suodatetaan kalvosuodattimella (0,45 μm). 
Näytteiden suodoksista (ensimmäiset 5 ml kaadetaan pois) määrite ­
tään TOC-mittauslaitteen avulla DOC- ja/tai COD-pitoisuudet kah ­
tena kappaleena. Ellei suodosta analysoida samana päivänä, se on 
säilytettävä jääkaapissa seuraavaan päivään. Pidempää säilytysaikaa 
ei suositella.  
COD-pitoisuus määritetään näytesuodoksista COD-analyysilaitteilla 
allaolevassa lähdeviitteessä (2) esitetyllä tavalla.  
2. TULOKSET JA NIIDEN ARVIOINTI  
DOC- ja/tai COD-pitoisuudet määritetään näytteistä vähintään kah ­
tena kappaleena edelläolevan 1.6.2 kohdan mukaisesti. Aikana T 
tapahtunut hajoaminen lasketaan 1.2 kohdassa annetun kaavan (ja 
määritelmien) mukaisesti.  
Hajoamisaste pyöristetään lähimpään kokonaiseen prosenttiin. Testin 
lopussa saavutettu hajoamisaste ilmoitetaan muodossa ”Biologinen hajoaminen Zahn-Wellens-testissä”.
 
Huomautus:  Jos täydellinen hajoaminen tapahtuu ennen testin loppua 
ja tämä tulos varmistetaan uudella analyysillä seuraavana päivänä, koe voidaan lopettaa.
 
3. RAPORTOINTI  
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat koh ­
dat: 
— aineen alkupitoisuus,  
— kaikki muut testattua ainetta, vertailuainetta ja nollakoetta koske ­
vat tiedot ja tutkimustulokset,  
— pitoisuus kolmen tunnin kuluttua,  
— hajoamiskäyrä ja selostus,  
— koeorganismien hankintapaikka ja -aika, adaptaatioaste, käytetyt 
pitoisuudet jne.,  
— testausmenetelmään tehtyjen muutosten tieteelliset perustelut.  
3.2 TULOSTEN TULKINTA  
DOC- (COD)-poistuma, joka tapahtuu asteittain päivien tai viikkojen 
kuluessa, osoittaa testattavan aineen biologisen hajoamisen.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1058
 
Fysikaalis-kemiallisella adsorptiolla voi kuitenkin eräissä tapauksissa 
olla tietty vaikutus, joka ilmenee testin alussa ensimmäisten kolmen 
tunnin aikana tapahtuvana täydellisenä tai osittaisena poistumana ja kontrolli- ja koeliuosten kelluvien nesteiden eron pysymisenä odot ­
tamattoman pienenä.
 
Lisätutkimuksia tarvitaan, jos biologinen hajoaminen (tai osittainen 
biologinen hajoaminen) ja adsorptio halutaan erottaa toisistaan.  
Tämä voidaan tehdä usealla tavalla, mutta luotettavin tapa on käyttää 
kelluvaa nestettä tai lietettä inokulaattina perussarjan testissä (mie ­
luimmin respirometritestissä).  
Testattavia aineita, joiden DOC- (COD)-poistuma ilman adsorptiota 
on tässä testissä korkea, voidaan pitää biologisesti hajoavina. Osit ­
tainen poistuma ilman adsorptiota osoittaa, että kemikaali hajoaa biologisesti ainakin jossakin määrin. Alhainen tai nollapoistuma saat ­
taa johtua testattavan aineen mikro-organismeihin kohdistuvasta in ­
hibitiosta, joka voi myös ilmetä lietteen liukenemisena ja häviämise ­
nä, jolloin kelluva neste on sameaa. Koe on uusittava käyttämällä testattavasta aineesta alhaisempaa pitoisuutta.
 
Suurempi herkkyys saadaan käyttämällä yhdistekohtaista analyysime ­
netelmää tai  14 C:llä merkittyä testattavaa ainetta. Mikäli testattava 
yhdiste on merkitty  14 C:llä,  14 CO 2 :n toteaminen osoittaa, että biolo ­
gista hajoamista on tapahtunut.  
Kun tulokset ilmoitetaan ensisijaisena hajoamisena, alkuperäisen tes ­
tattavan aineen reagoimattomuuteen johtanut kemiallinen rakenne ­
muutos tulisi mahdollisuuksien mukaan selvittää.  
Analyysimenetelmän kelpoisuus on ilmoitettava samoin kuin nolla ­
kokeen elatusaineesta saatu vaste.  
4. LÄHDELUETTELO  
1) OECD, Paris, 1981,  Test Guideline 302 B,  Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final.  
2) Annex V C.9 Degradation: Chemical Oxygen Demand, Commis ­
sion Directive 84/449/EEC, Official Journal of the European 
Communities, No L 251, 19.9.1984.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1059
 
Lisäys  
ARVIOINTIESIMERKKI 
Orgaaninen yhdiste: 4-Etoksibentsoehappo 
Teoreettinen testipitoisuus: 600 mg/l Teoreettinen DOC: 390 mg/l 
Inokulaatti: Jätteenpuhdistuslaitoksen nimi 
Pitoisuus: 1 gramma kuivamateriaalia/litra Adaptaatioaste: ei adaptoitunut Analyysi: DOC-määritys 
Näytteen koko: 3 ml 
Kontrollialue: Dietyleeniglykoli Yhdisteen myrkyllisyys: Ei myrkyllisiä vaikutuksia alle 1 000 mg/l 
Käytetty testi: Fermentaatioputkitesti
 
Ajat Kontrolliaine Testattava aine 
DOC (  1 ) 
mg/l DOC (  1 ) 
mg/l netto DOC 
mg/l Hajoaminen 
% DOC (  1 ) 
mg/l netto DOC 
mg/l Hajoaminen 
% 
0 — — 300,0 — — 390,0 — 
3 tuntia 4,0 298,0 294,0 2 371,6 367,6 6 1 päivä 6,1 288,3 282,2 6 373,3 367,2 6 2 päivää 5,0 281,2 276,2 8 360,0 355,0 9 5 päivää 6,3 270,5 264,2 12 193,8 187,5 52 6 päivää 7,4 253,3 245,9 18 143,9 136,5 65 7 päivää 11,3 212,5 201,2 33 104,5 93,2 76 8 päivää 7,8 142,5 134,7 55 58,9 51,1 87 9 päivää 7,0 35,0 28,0 91 18,1 11,1 97 10 päivää 18,0 37,0 19,0 94 20,0 2,0 99
 
( 1 ) Kolminkertaisten määritysten keskiarvo.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1060
 
Kuva 1  
Esimerkkejä biologisista hajoamiskäyristä
  
Kuva 1  
Esimerkkejä lietten adaptaatiosta
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1061
 
C.10  SIMULAATIOTUTKIMUS: AEROBINEN VIEMÄRILIETTEEN 
KÄSITTELY: C.10-A: AKTIIVILIETEYKSIKÖT – C.10-B: BIOKALVOT  
C.10-A: Aktiivilieteyksiköt  
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 303 (2001). 1950-lu ­
vulla havaittiin, että uudet pinta-aktiiviset aineet aiheuttivat liiallista vaah ­
toutumista jätevedenpuhdistamoissa ja joissa. Aerobinen käsittely ei poista ­
nut niitä kokonaan, ja ne rajoittivat joissakin tapauksissa muun orgaanisen 
aineksen poistoa. Tästä syystä käynnistettiin useita tutkimuksia siitä, miten 
pinta-aktiiviset aineet voidaan poistaa jätevesistä ja miten jäteveden puhdis ­
tus tehoaa teollisuuden tuottamiin uusiin kemikaaleihin. Tähän tarkoitukseen käytettiin malliyksiköitä, jotka edustivat kahta aerobisen biologisen jäteve ­
den puhdistuksen päätyyppiä (aktiivilietettä ja biosuodatusta eli tihkusuoda ­
tusta). Olisi ollut epäkäytännöllistä ja hyvin kallista jakaa jokaista uutta kemikaalia ja seurata kaikkia suuria jätevedenpuhdistamoja edes paikallis ­
esti.
 
ALUSTAVAT HUOMIOT  
Aktiivilieteyksiköt  
2. Simuloitujen aktiivilieteyksikköjen kooksi on ilmoitettu 300–2 000 ml. Osa 
jäljitteli tarkasti täyden mittakaavan puhdistamoja, ja niissä oli lietteen sel ­
keytyssäiliö, josta selkeytetty liete pumpattiin takaisin ilmastusaltaaseen, kun 
taas toisissa ei ollut lainkaan selkeytystiloja. Tästä esimerkkinä Swisher (1). Laitteen koko on kompromissi: toisaalta sen on oltava riittävän iso, jotta se 
on mekaanisesti toimiva eikä näytteiden tarvittava tilavuus häiritse sen toi ­
mintaa, mutta toisaalta ei saa olla niin iso, että se vaatii liian suuren tilan tai liikaa materiaaleja.
 
3. Kaksi laitetyyppiä, joita on käytetty laajasti tyydyttävin tuloksin, ovat Hus ­
mannin yksiköt (2), joita käytettiin pinta-aktiivisten aineiden tutkimuksissa, 
ja huokoiset astiat (3)(4). Nämä on kuvattu tässä testimenetelmässä. Myös muita laitteita, kuten Eckenfelderin (5), on käytetty onnistuneesti. Koska tämän simulaatiotutkimuksen toteuttaminen on melko kallista ja työlästä, 
rinnalla tutkittiin yksinkertaisempia ja halvempia seulontatestejä, jotka on 
kuvattu tämän liitteen luvun C.4 kohdassa A-F (6). Kokemus monista pinta-aktiivisista aineista ja muista kemikaaleista on osoittanut, että ne, jotka läpäisivät seulontatestit (helposti biohajoavat), hajosivat myös simulaatiotut ­
kimuksessa. Osa aineista, jotka eivät läpäisseet seulontatestejä, läpäisi luon ­
taisen biohajoavuuden testit (tämän liitteen luvut C.12 (7) ja C.19 (8)), mutta vain osa jälkimmäisistä hajosi simulaatiotutkimuksessa, kun taas ne kemikaalit, jotka eivät läpäisseet luontaisen biohajoavuuden testejä, eivät 
hajonneet simulaatiotutkimuksissa (9)(10)(11).
 
4. Simulaatiotutkimukset, joissa käytetään yhtä testiolosuhteiden joukkoa, ovat 
riittäviä joihinkin tarkoituksiin. Tulokset ilmaistaan testikemikaalin tai liu ­
enneen orgaanisen hiilen (DOC) poistumaprosentteina. Tällainen testi kuva ­
taan tässä testimenetelmässä. Tässä tekstissä on useita eri muunnelmia toisin 
kuin tämän luvun edellisessä versiossa, jossa kuvattiin vain yhdentyyppinen  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1062
 
laite, jolla käsiteltiin synteettistä jätevettä yhdistettyinä yksikköinä käyttä ­
mällä suhteellisen yksinkertaista lietteen poistumatapaa. Tekstissä kuvataan 
vaihtoehtoisia laitetyyppejä, toimintatapoja sekä jäteveden ja lietteen poistu ­
matapoja. Tämä teksti seuraa tarkasti ISO 11733 -standardin (12) tekstiä, joka on tarkistettu huolellisesti, joskaan testimenetelmää ei ole validoitu 
laboratorioiden välisessä tutkimuksessa.
 
5. Muissa tarkoituksissa testikemikaalin pitoisuus poistovirrassa on tiedettävä 
tarkemmin, ja kattavampi menetelmä on tarpeen. Esimerkiksi lietteen poistu ­
manopeutta on kontrolloitava tarkasti joka päivä ja koko testin keston ajan, 
ja yksiköitä on käytettävä eri poistumanopeuksilla. Jos halutaan käyttää täysin kattavaa menetelmää, testit on tehtävä kahdessa tai kolmessa eri lämpötilassa. Birch (13)(14) kuvaa tällaisen menetelmän, josta on yhteen ­
veto lisäyksessä 6. Nykytietojen perusteella ei kuitenkaan voida päätellä, 
mitä kineettisiä malleja voidaan soveltaa kemikaalien biologiseen hajoami ­
seen jäteveden puhdistuksessa ja yleensä vesiympäristössä. Monodin kineet ­
tinen malli, joka on annettu esimerkkinä lisäyksessä 6, soveltuu ainoastaan 
kemikaaleihin, joiden pitoisuus on vähintään 1 mg/l, mutta joidenkin mie ­
lestä tätäkään ei ole vielä näytetty toteen. Lisäyksessä 7 on viitattu testeihin, joissa pitoisuudet vastaavat paremmin todellisia pitoisuuksia jätevesissä, 
mutta nämä testit sekä lisäyksessä 6 luetellut testit on kuvattu vain lisäyk ­
sissä, eikä niitä ole annettu erillisinä testimenetelminä.
 
Suodattimet  
6. Simuloidut biosuodattimet ovat jääneet paljon vähemmälle huomiolle, ken ­
ties siksi, että ne ovat hankalampia ja isokokoisempia kuin simuloidut aktii ­
vilietelaitokset. Gerike  et al  kehittivät biologisia suodatinyksiköitä ja käyt ­
tivät niitä yhdistettyinä yksiköinä (15). Nämä suodattimet olivat suhteellisen suuria (korkeus 2 m, tilavuus 60 l), ja kuhunkin tarvittiin jätevettä jopa 2 l/h. Baumann  et al  (16) simuloivat biologisia suodattimia upottamalla polyeste ­
rifleeceliuskoja konsentroituun aktiivilietteeseen puoleksi tunniksi ja kiinnit ­
tämällä liuskat sitten 1 m:n putkiin (sisähalkaisija 14 mm). Testikemikaali, joka oli mineraalisuolaliuoksen ainoa C-lähde, syötettiin pystysuuntaiseen putkeen, ja biologinen hajoaminen arvioitiin mittaamalla DOC poistovirrassa 
ja CO
 2 syntyneessä kaasussa.  
7. Biosuodattimia on simuloitu toisella tavalla (15). Pyöriviin putkiin, jotka oli 
kallistettu pieneen vaakasuuntaiseen kulmaan, syötettiin jätevettä (noin 250 
ml/h) testikemikaalin kanssa ja ilman testikemikaalia, ja kerätystä poistovir ­
rasta analysoitiin DOC ja/tai spesifinen testikemikaali.  
TESTIN PERIAATE  
8. Tämän menetelmän tarkoitus on määrittää poistuma ja aerobisten 
mikro-organismien aiheuttama vesiliukoisten orgaanisten kemikaalien pri ­
maarinen ja/tai lopullinen biohajoaminen jatkuvatoimisessa testijärjestelmäs ­
sä, joka simuloi aktiivilieteprosessia. Helposti biohajoava orgaaninen aine ja 
orgaaninen testikemikaali ovat mikro-organismien hiilen ja energian lähteet.  
9. Kahta jatkuvatoimista testiyksikköä (aktiivilietelaitoksia tai huokoisia astioi ­
ta) käytetään rinnakkain identtisissä, testin tarkoitukseen soveltuvissa olo ­
suhteissa. Normaalisti hydraulisen retentioajan keskiarvo on 6 h ja lietteen 
iän keskiarvo (retentioaika) on 6–10 päivää. Lietettä poistetaan kahdella eri menetelmällä. Lisättävän testikemikaalin pitoisuus on tavallisesti 10–20 mg/l liuennutta orgaanista hiiltä (DOC), ja sitä lisätään vain toisen yksikön tulo ­
veteen (orgaaninen aine). Toista yksikköä käytetään kontrolliyksikkönä, jolla 
määritetään orgaanisen aineen biologinen hajoaminen.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1063
 
10. Poistovedestä otetaan usein näytteitä, joista määritetään mieluiten DOC tai 
sitten kemiallinen hapenkulutus (COD) ja testikemikaalin pitoisuus (tarvit ­
taessa) tekemällä sen yksikön poistoveden ominaisanalyysi, johon testikemi ­
kaalia lisätään. Poistoveden DOC- tai COD-pitoisuuden erot testi- ja kont ­
rolliyksiköissä johtuvat oletettavasti testikemikaalista tai sen orgaanisista 
metaboliiteista. Tätä eroa verrataan tuloveden DOC- tai COD-pitoisuuteen, 
joka johtuu testikemikaalin lisäämisestä, jotta testikemikaalin poistuma voi ­
daan määrittää.  
11. Biologinen hajoaminen voidaan tavallisesti erottaa biosorptiosta tarkastele ­
malla huolellisesti poistuma-aikakäyrää, ja se voidaan yleensä vahvistaa biohajoamisen testillä käyttämällä akklimatisoitua inokulaattia yksiköstä, jo ­
hon lisätään testikemikaalia.
 
TESTIKEMIKAALIA KOSKEVIA TIETOJA  
12. Testikemikaalin puhtauden, vesiliukoisuuden sekä haihtuvuus- ja 
adsorptio-ominaisuuksien on oltava tiedossa, jotta tulokset voidaan tulkita 
oikein. Haihtuvia ja liukenemattomia kemikaaleja ei tavallisesti voida testata ilman erityisiä varotoimia (katso lisäys 5). Kemiallisen rakenteen tai vähintään empiirisen kaavan on oltava tiedossa, jotta voidaan laskea teoreettiset arvot 
ja/tai tarkistaa mitatut parametriarvot, kuten teoreettinen hapenkulutus 
(ThOD), liuennut orgaaninen hiili (DOC) ja kemiallinen hapenkulutus (COD).
 
13. Tieto testikemikaalin toksisuudesta mikro-organismeille (katso lisäys 4) voi 
olla hyödyllinen soveltuvia testipitoisuuksia valittaessa ja olennainen mata ­
lien biohajoavuusarvojen oikean tulkinnan kannalta.  
KYNNYSARVOT  
14. Tämän pinta-aktiivisten aineiden primaarisen biologisen hajoamisen simulaa ­
tiotutkimuksen (toteamiskokeen) alkuperäisessä sovelluksessa spesifisen ke ­
mikaalin poistuman on oltava vähintään 80 prosenttia, jotta pinta-aktiivista 
ainetta voidaan markkinoida. Jos 80 prosentin arvoa ei saavuteta, tätä simu ­
laatiotutkimusta (toteamiskoetta) voidaan soveltaa ja pinta-aktiivista ainetta voidaan markkinoida vain, jos yli 90 prosenttia spesifisestä kemikaalista poistuu. Yleensä ei ole epäselvää, läpäisevätkö kemikaalit testin, ja saatua 
poistumaprosenttia voidaan käyttää laskettaessa todennäköistä pitoisuutta 
ympäristössä, jota käytetään kemikaalin vaarallisuuden arvioinnissa. Tulok ­
set noudattavat yleensä kaikki tai ei mitään -periaatetta. Useissa puhtaiden 
kemikaalien tutkimuksissa DOC:n poistumaprosentti oli yli 90 prosenttia yli 
kolmessa neljäsosassa tapauksista ja yli 80 prosenttia yli 90 prosentissa kemikaaleista, joissa ilmeni merkittävää biohajoavuutta.
 
15. Suhteellisen harvaa kemikaalia (esim. pinta-aktiivista ainetta) esiintyy jätev ­
edessä tässä testissä käytettyinä pitoisuuksina (noin 10 mg C/l). Osa kemi ­
kaaleista saattaa olla inhiboivia näinä pitoisuuksina, kun taas toisten kemi ­
kaalien poistumiskinetiikka saattaa olla erilainen, kun pitoisuus on pieni. 
Hajoamista voidaan arvioida tarkemmin käyttämällä muunneltuja menetel ­
miä ja realistisen pieniä testikemikaalin pitoisuuksia, ja kerättyjen tietojen perusteella voidaan laskea kineettiset vakiot. Tarvittavia kokeellisia teknii ­
koita ei ole kuitenkaan vielä validoitu täysin eikä kineettisiä malleja, jotka 
kuvaavat biohajoamisreaktioita, ole määritetty (katso lisäys 7).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1064
 
VERTAILUKEMIKAALIT  
16. Jotta voidaan varmistaa, että kokeellinen menetelmä suoritetaan oikein, tes ­
tikemikaaleja tutkittaessa on hyvä testata välillä kemikaaleja, joiden käyt ­
täytyminen on tiedossa. Tällaisia kemikaaleja ovat esimerkiksi adipiinihap ­
po, 2-fenyylifenoli, 1-naftoli, difeenihappo ja 1-naftoehappo (9)(10)(11).  
TESTITULOSTEN TOISTETTAVUUS  
17. Simulaatiokokeiden tutkimuksista on laadittu paljon vähemmän raportteja 
kuin biohajoavuuskokeiden tutkimuksista. (Samanaikaisten) rinnakkaisnäyt ­
teiden toistettavuus on hyvä (10–15 %), kun testikemikaali on hajonnut 
vähintään 80-prosenttisesti, mutta vaihteluväli on suurempi, jos kemikaalin hajoavuus on heikompi. Lisäksi joiden rajatapausten osalta on kirjattu hy ­
vinkin erilaisia tuloksia (kuten 10 % ja 90 %) eri ajankohtina 9-viikkoisen 
testijakson aikana.
 
18. Kahdella erityyppisellä laitteella saaduissa tuloksissa ei ole havaittu juu ­
rikaan eroa, mutta tietyt kemikaalit hajoavat kotitalousjätevedessä kattavam ­
min ja yhtenäisemmin kuin OECD:n synteettisessä jätevedessä.  
TESTAUSMENETELMÄN KUVAUS  
Laite  
Testijärjestelmä  
19. Yhden testikemikaalin testijärjestelmään kuuluu testiyksikkö ja kontrolliyk ­
sikkö, mutta jos tehdään vain ominaisanalyysit (primaarinen biohajoaminen), 
tarvitaan pelkästään testiyksikkö. Yhtä kontrolliyksikköä voidaan käyttää 
useita testiyksikköjä varten huolimatta siitä, käytetäänkö testiyksiköissä sa ­
maa vai eri testikemikaaleja. Jos yksiköt yhdistetään (lisäys 3), jokaista testiyksikköä varten on oltava oma kontrolliyksikkö. Testijärjestelmä voi 
olla simuloitu aktiivilietelaitos, Husmannin yksikkö (lisäys 1, kuva 1) tai 
huokoinen astia (lisäys 1, kuva 2). Joka tapauksessa tarvitaan riittävän isot säiliöt tulo- ja poistovedelle sekä pumput, joilla annostellaan tulovesi joko testikemikaalin kanssa sekoitettuna tai erikseen.
 
20. Jokaisessa aktiivilietelaitoksessa on ilmastusastia, jonka tunnettu tilavuus on 
noin 3 litraa aktiivilietettä, ja erotusastia (toissijainen selkeytin), johon mah ­
tuu noin 1,5 litraa. Tilavuuksia voidaan muuttaa hieman säätämällä erotus ­
astian korkeutta. Astiat voivat olla erikokoisia, jos hydraulinen kuormitus on vastaava. Jos testihuoneen lämpötilaa ei voida pitää halutulla alueella, on suositeltavaa käyttää astioita, joissa on vesivaippa, ja lämpötilasäädeltyä 
vettä. Aktiiviliete kierrätetään paineilmapumpulla tai annostelupumpulla 
erottimesta ilmastusastiaan joko jatkuvasti tai säännöllisin väliajoin.
 
21. Huokoisten astioiden järjestelmään kuuluu huokoinen kartiokulmapohjainen 
sisäsylinteri, joka on vähän isommassa samanmuotoisessa astiassa, joka on tehty läpäisemättömästä muovista. Huokoiseen astiaan soveltuva materiaali on huokoinen polyeteeni, jonka suurin huokoskoko on 90 μm ja paksuus 
2 mm. Liete erottuu käsitellystä orgaanisesta aineesta kulkeutuessaan huo ­
koisen seinämän läpi. Poistovirrat keräytyvät rengasmaiseen tilaan, josta tapahtuu ylivuotoa keräämisastiaan. Selkeytymistä ei tapahdu, joten lietettä ei palauteta. Koko järjestelmä voidaan asentaa lämpösäädeltyyn vesihautee ­
seen. Huokoiset astiat tukkeutuvat, joten ylivuotoa voi tapahtua alkuvaiheis ­
sa. Jos näin käy, vaihda huokoinen sisäkappale. Ota ensin liete lapolla
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1065
 
astiasta puhtaaseen ämpäriin ja poista tukkeutunut sisäkappale. Pyyhi läpäi ­
semätön ulkosylinteri, asenna puhdas sisäkappale paikalleen ja pane liete 
takaisin astiaan. Kaavi tukkeutuneen sisäkappaleen reunoihin tarttunut liete huolellisesti ja siirrä se puhtaaseen astiaan. Puhdista tukkeutuneet astiat ensin hienolla vesisuihkulla, jotta jäljelle jäänyt liete poistuu, ja liota niitä 
ensin laimennetussa natriumhypokloriittiliuoksessa ja sitten vedessä. Huuh ­
tele astiat lopuksi huolellisesti vedellä.
 
22. Kummankin järjestelmän ilmastusastioissa tapahtuvaan lietteen ilmastukseen 
on käytettävä soveltuvaa tekniikkaa, kuten sintrattuja kuutioita ja paine ­
ilmaa. Ilma puhdistetaan tarvittaessa kuljettamalla se soveltuvan suodattimen 
läpi ja pesemällä se. Järjestelmän läpi täytyy kulkea riittävästi ilmaa, jotta 
aerobiset olosuhteet säilyvät ja lietehiutaleet pysyvät suspendoituneina koko testin ajan.
 
Suodatinlaite tai sentrifugi  
23. Kalvosuodatin, jonka huokoskoko on sopiva (aukon nimellishalkaisija 0,45 
μm) ja joka adsorboi liukoisia orgaanisia kemikaaleja ja vapauttaa mahdol ­
lisimman vähän orgaanista hiiltä. Jos käytettävät suodattimet vapauttavat orgaanista hiiltä, poista orgaaninen hiili pesemällä suodattimet huolellisesti 
kuumalla vedellä. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää sentrifugia, jolla voidaan 
saavuttaa 40 000 m/s
 2 :n kiihtyvyys.  
Analyysilaitteet  
24. Laite, joka tarvitaan seuraavien seikkojen määrittämiseen:  
— DOC (liuennut orgaaninen hiili) ja TOC (orgaanisen hiilen kokonaispi ­
toisuus) tai COD (kemiallinen hapenkulutus)  
— spesifinen kemikaali, jos tarpeen  
— suspendoitunut kiintoaines, pH, happipitoisuus vedessä  
— lämpötila, happamuus ja emäksisyys  
— ammonium, nitriitti ja nitraatti, jos testi tehdään nitrifioivissa olosuhteissa.  
Vesi 
25. Vesijohtovesi, jossa DOC on alle 3 mg/l. Määritä emäksisyys, jos se ei ole 
tiedossa.  
26. Deionisoitu vesi, jossa DOC on alle 2 mg/l.  
Orgaaninen aine  
27. Orgaanisena aineena voidaan käyttää synteettistä jätevettä, kotitalousjäte ­
vettä tai näiden yhdistelmää. On osoitettu (11)(14), että pelkän kotitalousjä ­
teveden käyttö nostaa usein DOC:n poistumaprosenttia ja sallii jopa sellais ­
ten kemikaalien poistumisen ja biologisen hajoamisen, jotka eivät hajoa biologisesti käytettäessä OECD:n synteettistä jätevettä. Lisäksi kotitalousjä ­
teveden jatkuva tai ajoittainen lisääminen stabiloi usein aktiivilietettä, olen ­
naisen tärkeä hyvä selkeytyvyys mukaan lukien. Niinpä kotitalousjäteveden 
käyttö on suositeltavaa. Mittaa jokaisen uuden orgaanisen aine-erän DOC- tai COD-pitoisuus. Orgaanisen aineen happamuuden tai emäksisyyden täy ­
tyy olla tiedossa. Orgaaniseen aineeseen voi olla tarpeen lisätä soveltuvaa 
puskuria (natriumvetykarbonaattia tai kaliumdivetyfosfaattia), jos happa ­
muus tai emäksisyys on matala, jotta ilmastusastian pH on 7,5 ± 0,5 testin aikana. Lisättävän puskurin määrä ja lisäämisen ajankohta on päätettävä tapauskohtaisesti. Kun seoksia käytetään jatkuvasti tai ajoittaisesti, seoksen 
DOC-arvo (tai COD-arvo) on pidettävä suurin piirtein samana esimerkiksi 
laimentamalla seosta vedellä.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1066
 
Synteettinen jätevesi  
28. Liuota yhteen litraan vesijohtovettä: 160 mg peptonia, 110 mg lihauutetta, 
30 mg ureaa, 28 mg vedetöntä dikaliumvetyfosfaattia (K  2 HPO  4 ), 7 mg 
natriumkloridia (NaCl), 4 mg kalsiumklorididihydraattia (CaCl  2 .2H  2 O), 2 
mg magnesiumsulfaattiheptahydraattia. Tämä OECD:n synteettinen jätevesi 
on esimerkki, ja siinä tulovirtauksen DOC-pitoisuuden keskiarvo on noin 100 mg/l. Vaihtoehtoisesti voi käyttää muita koostumuksia, joiden DOC-pitoisuus on suunnilleen sama ja jotka ovat lähempänä oikeaa jätevet ­
tä. Jos tarvitaan tulovettä, jonka pitoisuus on pienempi, laimenna synteettistä 
jätevettä (esimerkiksi 1:1) vesijohtovedellä, jotta pitoisuudeksi saadaan noin 50 mg/l. Nitrifioivat organismit kasvavat hyvin tällaisessa laimeassa tulov ­
edessä, ja laimennus on hyvä tehdä, jos aikomuksena on tutkia nitrifioivien 
jätevedenpuhdistamojen simulointia. Tätä synteettistä jätevettä voidaan val ­
mistaa tislattuun veteen väkevöidyssä muodossa. Se säilyy viikon noin 1 °C:n lämpötilassa. Laimenna tarvittaessa vesijohtovedellä. (Tämä aine ei ole 
tyydyttävä, sillä esimerkiksi typpipitoisuus on hyvin korkea ja hiilipitoisuus 
suhteellisen matala, mutta parempia ehdotuksia ei ole tehty, lukuun otta ­
matta fosfaatin lisäämistä puskurina ja peptonin lisäämistä).
 
Kotitalousjätevesi  
29. Käytä tuoretta selkeytettyä jätevettä, jota kerätään päivittäin puhdistamosta, 
johon tulee pääasiassa kotitalousjätevettä. Jätevesi kerätään ennen primaa ­
rista sedimentaatiota primaarisen sedimentaatioaltaan ylivuotokanavasta tai 
aktiivilietelaitoksen syötöstä, eikä siinä saa juurikaan olla karkeita hiukkasia. 
Jätevettä voidaan käyttää, kun sitä on säilytetty usea päivä (ei kuitenkaan yleensä yli seitsemän päivää) noin 4 °C:n lämpötilassa, jos voidaan todistaa, 
että DOC (tai COD) ei ole laskenut merkittävästi (alle 20 %) säilytyksen 
aikana. Jotta järjestelmän häiriöitä voidaan välttää, jokaisen uuden erän DOC (tai COD) on säädettävä ennen käyttöä soveltuvaan vakioarvoon esi ­
merkiksi vesijohtovedellä laimentamalla.
 
Aktiiviliete  
30. Ota aktiivilietettä ymppäystä varten asianmukaisesti toimivan jätevedenpuh ­
distamon ilmastussäiliöstä tai laboratoriolaitoksesta, johon syötetään pääosin 
kotitalouksista tulevaa jätevettä.  
Testikemikaalin kantaliuokset  
31. Jos kemikaalin liukoisuus on riittävä, valmista kantaliuokset, joiden pitoi ­
suus on soveltuva (esim. 1–5 g/l), deionisoituun veteen tai synteettisen jäteveden mineraaleihin. (Liukenemattomat ja haihtuvat kemikaalit, katso lisäys 5.) Määritä kantaliuoksen DOC ja orgaanisen hiilen 
kokonaispitoisuus (TOC) ja toista mittaukset jokaiselle uudelle erälle. Jos 
DOC- ja TOC-arvon ero on yli 20 prosenttia, tarkista testikemikaalin vesi ­
liukoisuus. Varmista, että saanto on riittävän hyvä (tavallisesti > 90 prosent ­
tia on odotettavissa), vertaamalla nimellisarvoon DOC-arvoa tai testikemi ­
kaalin pitoisuutta, joka on mitattu kantaliuoksen ominaisanalyysilla. Var ­
mista etenkin dispersioiden osalta, voidaanko DOC-arvoa käyttää analyytti ­
senä parametrina vai voidaanko käyttää ainoastaan testikemikaalikohtaista analyysimenetelmää. Näytteet on sentrifugoitava, jos kyseessä on dispersio. 
Mittaa jokaisen uuden erän DOC, COD tai testikemikaali ominaisanalyy ­
silla.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1067
 
32. Määritä kantaliuoksen pH. Äärimmäiset arvot viittaavat siihen, että kemikaa ­
lin lisääminen saattaa vaikuttaa testijärjestelmän aktiivilietteen pH-arvoon. 
Jos näin käy, neutraloi kantaliuos pienillä määrillä epäorgaanista happoa tai emästä, kunnes pH on 7 ± 0,5, mutta vältä testikemikaalin saostumista.
 
MENETTELY  
33. Menettely kuvataan aktiivilietelaitoksia varten. Sitä on muokattava hieman, 
jos käytössä on huokoisten astioiden järjestelmä.  
Siirrosaineen valmistelu  
34. Testijärjestelmään lisätään testin alussa siirrosaineena aktiivilietettä tai siir ­
rosainetta, joka sisältää pienen määrän mikro-organismeja. Pidä siirrosaine 
ilmastettuna huoneenlämmössä käyttöön asti ja käytä se 24 tunnin kuluessa. Jos käytetään aktiivilietettä, ota aktiivilietenäyte tehokkaan biologisen jäte ­
vedenpuhdistamon ilmastussäiliöstä tai laboratoriopuhdistamosta, johon tulee 
lähinnä kotitalousjätevettä. Jos tarkoituksena on simuloida nitrifioivia olo ­
suhteita, ota lietettä nitrifioivasta jätevedenpuhdistamosta. Määritä suspen ­
doituneen kiintoaineksen pitoisuus ja väkevöi liete tarvittaessa selkeyttämäl ­
lä, jotta testijärjestelmään lisättävä tilavuus on mahdollisimman pieni. Var ­
mista, että kuiva-aineen alkupitoisuus on noin 2,5 g/l.
 
35. Jälkimmäisessä tapauksessa inokulaattina käytetään 2–10 ml/l biologisen 
jätevedenpuhdistamon poistovettä. Jotta saadaan mahdollisimman monta eri bakteerilajia, voi olla hyvä lisätä eri lähteistä, kuten esimerkiksi pintav ­
edestä, saatuja inokulaatteja. Tällöin aktiiviliete kehittyy ja kasvaa testijär ­
jestelmässä.
 
Orgaanisen aineen annostelu  
36. Varmista, ettei tulo- ja poistoveden säiliössä tai tuloveden säiliöistä tulevissa 
ja poistoveden säiliöön johtavissa putkissa ole mikrobikasvustoja puhdista ­
malla ne huolellisesti ennen testiä ja testin aikana. Kokoa testijärjestelmät 
huoneessa, jonka lämpötilaa säädellään (tavallisesti 20–25 °C) tai käytä tes ­
tiyksiköitä, joissa on vesivaippa. Valmista riittävä määrä tarvittavaa orgaa ­
nista ainetta (kohdat 27–29). Täytä ilmastusastia ja erotin aluksi orgaanisella aineella ja lisää inokulaatti (kohdat 34 ja 35). Aloita ilmastus siten, että liete 
pysyy suspensiossa ja aerobisessa tilassa, ja aloita tuloveden annostelu ja 
selkeytetyn lietteen kierrätys. Annostele orgaanista ainetta säiliöistä testi- ja kontrolliyksiköiden ilmastusastioihin (kohdat 20 ja 21) ja kerää poistovedet vastaaviin säiliöihin. Jotta hydraulinen retentioaika on normaali eli 6 h, 
orgaanista ainetta pumpataan nopeudella 0,5 l/h. Varmista nopeus mittaa ­
malla päivittäin annosteltu orgaaninen aine sen perusteella, paljonko säili ­
öissä olevan aineen tilavuus on pienentynyt. Toinen annostelutapa on tar ­
peen, jos halutaan määrittää kemikaalien ajoittaisen vapautumisen tai äkki ­
kuormituksen vaikutuksia.
 
37. Jos orgaanista ainetta valmistetaan päivää pidemmäksi ajaksi, se on jäähdy ­
tettävä noin 4 °C:ssä tai säilytettävä muulla soveltuvalla tavalla, jotta mik ­
robien kasvu ja biologinen hajoaminen voidaan estää testiyksiköiden ulko ­
puolella (kohta 29). Jos käytetään synteettistä jätevettä, voidaan valmistaa 
väkevöitetty kantaliuos (esim. kymmenen kertaa normaalia väkevämpi, kohta 28), jota voidaan säilyttää noin 4 °C:ssa. Tämä kantaliuos voidaan sekoittaa hyvin sopivaan määrään vesijohtovettä ennen käyttöä tai se voi ­
daan pumpata suoraan samalla, kun sopiva määrä vesijohtovettä pumpataan 
erikseen.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1068
 
Testikemikaalin annostelu  
38. Lisää sopiva määrä testikemikaalin kantaliuosta (kohta 31) tuloveden säili ­
öön tai annostele se suoraan ilmastusastiaan erillisellä pumpulla. Tuloveden testipitoisuuden keskiarvon on normaalisti oltava 10–20 mg/l (DOC), eikä 
suurin pitoisuus saa olla yli 50 mg/l. Jos testikemikaalin vesiliukoisuus on 
alhainen tai toksisia vaikutuksia on odotettavissa, laske pitoisuus arvoon 5 mg/l DOC tai jopa sen alle, mutta vain silloin, jos soveltuva ominaisanalyysi on käytettävissä ja sellainen tehdään (dispergoidut testikemikaalit, jotka liu ­
kenevat huonosti veteen, voidaan lisätä erityisillä annostelumenetelmillä, 
katso lisäys 5).
 
39. Aloita testikemikaalin lisääminen, kun järjestelmän toiminta on vakiintunut 
ja se poistaa DOC:ta orgaanisesta aineesta tehokkaasti (noin 80 %). Ennen 
testikemikaalin lisäämistä on tärkeää tarkistaa, että kaikki yksiköt toimivat 
yhtä tehokkaasti. Jos näin ei ole, yleensä auttaa, kun lietteet sekoitetaan keskenään ja jaetaan uudelleen yhtä suuriin osiin eri yksiköihin. Kun käy ­
tössä on aktiivilieteinokulaatti (noin) 2,5 g/l (kuivapaino), testikemikaalia 
voidaan lisätä testin alusta saakka, sillä suurenevien määrien lisäämisessä 
suoraan on se etu, että aktiiviliete saattaa adaptoitua testikemikaaliin parem ­
min. Huolimatta siitä, millä tavalla testikemikaalia lisätään, virtausnopeus ja/tai säiliön tai säiliöiden tilavuudet on suositeltavaa mitata säännöllisin 
väliajoin.
 
Aktiivilietteen käsittely  
40. Aktiivilietteen kiintoaineksen pitoisuus stabiloituu tavallisesti raja-arvojen 
sisään testin kuluessa käytetystä inokulaatista huolimatta. Alue on 1–3 g/l (kuivapaino) orgaanisen aineen laadun ja pitoisuuden, käyttöolosuhteiden, mikro-organismien luonteen ja testikemikaalin vaikutuksen mukaan.
 
41. Määritä suspendoitunut kiintoaines ilmastusastioissa vähintään kerran vii ­
kossa ja heitä ylimääräinen liete pois, jotta pitoisuus pysyy alueella 1–3 g/l (kuivapaino), tai kontrolloi, että lietteen iän keskiarvo pysyy vakiona eli yleensä 6–10 päivää. Jos lietteen retentioajaksi valitaan esimerkiksi 8 
päivää, poista joka päivä 1/8 aktiivilietteen ilmastusastiassa olevasta tilavuu ­
desta ja hävitä se. Toista sama päivittäin tai käytä automaattista jaksoittai ­
sesti toimivaa pumppua, jos mahdollista. Suspendoituneen kiintoaineksen pitoisuuden pitäminen vakiona tai tarkoin rajatulla alueella ei pidä vakiona 
lietteen retentioaikaa (SRT). Se on muuttuja, joka määrittää testikemikaalin 
pitoisuusarvon poistovedessä.
 
42. Poista testin aikana vähintään kerran päivässä ilmastusastian ja erotusastian 
seiniin tarttunut liete, jotta se suspendoituu uudelleen. Estä biokalvon kasvu 
tarkastamalla ja puhdistamalla kaikki putket ja letkut säännöllisesti. Kierrätä 
selkeytetty liete erotusastiasta ilmastusastiaan mieluiten jaksoittaisella pump ­
pauksella. Huokoisia astioita käytettäessä kierrätystä ei tehdä, mutta varmis ­
ta, että puhtaat sisäastiat ovat paikallaan, ennen kuin astian tilavuus nousee 
merkittävästi (kohta 21).  
43. Husmannin yksiköissä lietteen selkeytyminen voi olla heikkoa ja lietettä voi 
hävitä. Tilanteen voi korjata käyttämällä testi- ja kontrolliyksiköissä rinnak ­
kain yhtä tai useaa seuraavista menetelmistä:  
— tuoretta lietettä tai hiutaloittamisainetta (esimerkiksi 2 ml/astia, 50 g/l 
FeCl  3 ) voidaan lisätä säännöllisin väliajoin, kuten kerran viikossa, mutta 
varmista, ettei FeCl  3 aiheuta testikemikaalin reaktioita tai saostumista  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1069
 
— paineilmapumpun tilalle voidaan vaihtaa peristalttinen pumppu, jolloin 
voidaan käyttää lietteen kierrätysvirtausta, joka vastaa suunnilleen tulo ­
veden virtausta, ja selkeytettyyn lietteeseen voi kehittyä anaerobinen alue (paineilmapumpun geometria rajoittaa palautetun lietteen vähim ­
mäisvirtausnopeuden noin 12-kertaiseksi tulovirtaukseen verrattuna)
 
— lietettä voidaan pumpata jaksoittaisesti erottimesta ilmastusastiaan 
(esim. 5 minuutin pumppaus 2,5 tunnin välein, kun kierrätetään 
1–1,5 l/h)  
— vaahtoamisen aiheuttamaa poistumista voidaan estää käyttämällä 
myrkytöntä vaahtoutumatonta ainetta (kuten silikoniöljyä), jonka pi ­
toisuus on pienin mahdollinen  
— ilmaa voidaan kuljettaa erottimessa olevan lietteen läpi lyhyinä sy ­
käyksinä (esim. 10 sekuntia kerran tunnissa)  
— orgaanista ainetta voidaan annostella jaksoittaisesti ilmastusastiaan 
(esim. 3–10 minuuttia kerran tunnissa).  
Näytteenotto ja näytteiden analyysi  
44. Mittaa säännöllisin väliajoin ilmastusastioissa olevan aktiivilietteen liuen ­
neen hapen pitoisuus, lämpötila ja pH-arvo. Varmista, että happea on aina 
riittävästi (> 2 mg/l) ja että lämpötila pysyy vaaditulla alueella (yleensä 
20–25 °C). Pidä pH arvossa 7,5 ± 0,5 annostelemalla ilmastusastiaan tai tuloveteen pieniä määriä epäorgaanista emästä tai happoa tai nostamalla orgaanisen aineen puskurointitehoa (katso kohta 27). Kun nitrifikaatiota 
tapahtuu, syntyy happoa. Kun 1 mg typpeä hapettuu, syntyvä määrä vastaa 
noin 7:ää mg CO
 3 :ta. Mittaustiheys määräytyy mitattavan parametrin ja 
järjestelmän vakauden mukaan ja voi vaihdella päivästä viikkoon.  
45. Mittaa kontrolli- ja testiastioiden tuloveden DOC tai COD. Mittaa testike ­
mikaalin pitoisuus testitulovirrasta ominaisanalyysillä tai arvioi se kantaliu ­
oksen pitoisuuden (kohta 31), käytetyn tilavuuden ja testiyksikköön annos ­
tellun lietemäärän perusteella. Testikemikaalin pitoisuuden laskeminen on suositeltavaa, sillä se vähentää pitoisuustietojen vaihtelua.
 
46. Ota kerätystä poistovedestä soveltuvat näytteet (esim. 24 h:n komposiitit) ja 
suodata ne sellaisen kalvon läpi, jonka huokoskoko on 0.45 μm, tai sentri ­
fugoi kiihtyvyydellä 40 000 m/s  2 noin 15 minuutin ajan. Sentrifugointia 
käytetään, jos suodattaminen on hankalaa. Mittaa lopullinen biohajoaminen määrittämällä DOC tai COD vähintään kaksi kertaa sekä tarvittaessa pri ­
maarinen biohajoaminen testikemikaalin ominaisanalyysilla.
 
47. COD-arvon käytöstä voi seurata analyyttisiä ongelmia, jos pitoisuus on 
pieni, joten on suositeltavaa käyttää tarpeeksi suurta testipitoisuutta (noin 30 mg/l). Jos kemikaali on voimakkaasti adsorboiva, adsorboituneen kemi ­
kaalin määrä lietteessä on suositeltavaa mitata testikemikaalikohtaisella ana ­
lyysimenetelmällä.
 
48. Näytteenottotiheys määräytyy testin odotetun keston mukaan. Suositeltu ti ­
heys on kolmesti viikossa. Kun yksiköt toimivat tehokkaasti, odota testike ­
mikaalin lisäämisen jälkeen 1–6 viikkoa, jotta tasapainotila saavutetaan. 
Tasannevaiheessa (kohta 59), joka kestää yleensä 3 viikkoa, on suositeltavaa 
määrittää vähintään 15 kelvollista arvoa testituloksen arviointia varten. Testi voidaan lopettaa, kun poistumisaste on riittävä (esim. > 90 %) ja käytettä ­
vissä ovat nämä 15 arvoa, jotka edustavat joka päivä 3 viikon ajan tehtyjä 
analyyseja. Yleensä testin ei ole tarkoitus kestää yli 12:ta viikkoa testike ­
mikaalin lisäämisen jälkeen.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1070
 
49. Jos liete nitrifioituu ja jos testikemikaalin vaikutusta nitrifikaatioon halutaan 
tutkia, analysoi ammonia ja/tai nitriitti ja nitraatti testi- ja kontrolliyksiköi ­
den poistoveden näytteistä vähintään kerran viikossa.  
50. Kaikki analyysit on tehtävä mahdollisimman pian. Tämä koskee erityisesti 
typen määritystä. Jos analysointia on lykättävä, säilytä näytteitä täysissä ja tiiviisti suljetuissa pulloissa pimeässä tilassa, jonka lämpötila on noin 4 °C. 
Jos näytteitä on säilytettävä yli 48 h, säilytä ne pakastamalla, hapottamalla 
(esim. 10 ml/l rikkihappoliuosta, jonka pitoisuus on 400 g/l) tai lisäämällä soveltuvaa myrkyllistä ainetta (esim. 20 ml/l elohopea(II)kloridiliuosta, jonka pitoisuus on 10 g/l). Varmista, ettei säilömistapa vaikuta analyysin 
tuloksiin.
 
Testiyksiköiden yhdistäminen  
51. Jos yksiköt yhdistetään pareiksi (lisäys 3), vaihda päivittäin sama määrä 
aktiivilietettä (150–1 500 ml, kun ilmastusastiassa on 3 litraa nestettä) testi ­
yksikön ja sen kontrolliyksikön ilmastusastioiden välillä. Jos testikemikaali adsorboituu voimakkaasti lietteeseen, vaihda vain erottimien kelluva neste. Käytä kummassakin tapauksessa korjauskerrointa, kun lasket testituloksia 
(kohta 55).
 
TIEDOT JA RAPORTOINTI  
Tulosten käsittely  
52. Laske testikemikaalin DOC- tai COD-poistumaprosentti jokaisen ajoitetun 
arvioinnin osalta käyttämällä kaavaa:  
D t ¼ C s Ä ðE Ä E o Þ 
C s Ü 100 
jossa  
D t = DOC- tai COD-poistumaprosentti aikana t  
C s = testikemikaalista johtuva DOC tai COD tulovedessä, mieluiten kan ­
taliuoksesta arvioituna (mg/l)  
E = testipoistovirrasta mitattu DOC- tai COD-arvo aikana t (mg/l)  
E o = kontrollipoistovirrasta mitattu DOC- tai COD-arvo aikana t (mg/l)  
53. Orgaanisen aineen DOC- tai COD-poistumisaste kontrolliyksikössä auttaa 
arvioimaan aktiivilietteen biologista hajoamistoimintaa testin aikana. Laske 
poistumaprosentti seuraavan kaavan avulla:  
D B ¼ C M Ä E o 
C M Ü 100 
jossa  
D B = kontrolliyksikön orgaanisen aineen DOC- tai 
COD-poistumaprosentti aikana t  
C M = DOC tai COD kontrollitulovirran orgaanisessa aineessa (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1071
 
Orgaanisen aineen ja testikemikaalin aiheuttaman DOC- tai 
COD-poistumaprosentin testiyksikössä voi haluttaessa laskea kaavalla:  
D T ¼ C T Ä E 
C T Ü 100 
jossa  
D T = testitulovirran DOC- tai COD-poistumaprosentti yhteensä  
C T = testitulovirran DOC tai COD yhteensä tai laskettuna kantaliuoksista 
(mg/l)  
54. Laske testikemikaalin poistuma, jos se on mitattu ominaisanalyysillä jokai ­
sella arviointikerralla, seuraavalla kaavalla:  
D ST ¼ S i Ä S e 
S i Ü 100 
jossa  
D ST = testikemikaalin primaarinen poistumaprosentti aikana t  
S i = testikemikaalin mitattu tai arvioitu pitoisuus testitulovirrassa (mg/l)  
S e = testikemikaalin mitattu pitoisuus testipoistovirrassa aikana t (mg/l)  
55. Jos yksiköt oli yhdistetty, kompensoi lietteen vaihtamisen aiheuttama testi ­
kemikaalin laimentuminen ilmastusastiassa korjauskertoimella (katso lisäys 3). Jos hydraulisen retentioajan keskiarvo oli 6 h ja puolet ilmastusastian aktiivilietetilavuudesta vaihdettiin, määritetyt päivittäiset poistuma-arvot (D
 t , 
kohta 52) on korjattava seuraavalla kaavalla, jotta saadaan testikemikaalin 
todellinen poistuma-aste, D  tc : 
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
Testitulosten ilmaiseminen  
56. Esitä poistumaprosentti D  t (tai D  tc ) ja D  st , jos käytettävissä, graafisesti ajan 
funktiona (katso lisäys 2). Testikemikaalin (sellaisenaan tai COD:na) poistu ­
makäyrän muodosta voidaan tehdä joitakin päätelmiä poistumaprosessista.  
Adsorptio  
57. Jos testikemikaalin DOC-poistuma on korkea testin alusta saakka, testike ­
mikaali poistuu todennäköisesti adsorboitumalla aktiivilietteen kiintoainek ­
seen. Tämän voi todistaa määrittämällä adsorboituneen testikemikaalin omi ­
naisanalyysillä. Adsorboituvien kemikaalien DOC-poistuma ei yleensä pysy 
korkeana koko testin ajan. Tavallisesti poistumisaste on korkea aluksi ja laskee sitten hiljalleen tasapainoarvoon. Jos adsorboituva testikemikaali ai ­
heutti kuitenkin tavalla tai toisella mikrobipopulaation adaptoitumista, testi ­
kemikaalin DOC-poistuma nousee myöhemmin ja saavuttaa korkean tasan ­
nearvon.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1072
 
Lag-vaihe  
58. Samoin kuin staattisissa seulontatesteissä, monet testikemikaalit vaativat 
lag-vaiheen eli latenssiajan, ennen kuin biologinen hajoaminen on täydellis ­
tä. Lag-vaiheen aikana hajoavat bakteerit sopeutuvat tai adaptoituvat eikä 
testikemikaalia poistu juuri lainkaan. Sen jälkeen alkaa näiden bakteerien 
alkukasvu. Tämä vaihe loppuu ja hajoamisvaiheen katsotaan alkavan, kun noin 10 prosenttia testikemikaalin alkuperäisestä määrästä on poistunut (ad ­
sorptio huomioiden, jos sitä tapahtuu). Lag-vaihe on usein erittäin vaihtele ­
va, ja sen toistettavuus on huono.
 
Tasannevaihe  
59. Jatkuvassa testissä poistumakäyrän tasannevaihe on vaihe, jossa hajoaminen 
on maksimaalista. Tasannevaiheen on kestettävä vähintään 3 viikkoa, ja sen 
aikana on mitattava noin 15 kelvollista arvoa.  
Testikemikaalin keskimääräinen poistumisaste  
60. Laske testikemikaalin tasannevaiheen poistumisarvojen (D  t ) keskiarvo. Kun 
se pyöristetään lähimpään kokonaislukuun (1 %), saadaan testikemikaalin poistumisaste. On myös suositeltavaa laskea keskiarvon 95 prosentin luot ­
tamusväli.
 
Orgaanisen aineen poistuminen  
61. Esitä kontrolliyksikön orgaanisen aineen DOC- tai COD-poistumaprosentti 
(D B ) graafisesti ajan funktiona. Ilmoita poistumisasteen keskiarvo samoin 
kuin testikemikaalin osalta (kohta 60).  
Viite biologisesta hajoamisesta  
62. Jos testikemikaali ei adsorboidu merkittävästi aktiivilietteeseen ja poistu ­
makäyrän muoto vastaa tyypillistä biologisen hajoamisen käyrää, jossa nä ­
kyvät lag-, hajoamis- ja tasannevaihe (kohdat 58 ja 59), mitattua poistumaa voidaan pitää biologisesta hajoamisesta johtuvana. Jos poistuminen on aluksi 
runsasta, simulaatiotutkimuksella ei voida erottaa biologisia ja abioottisia 
eliminaatioprosesseja. Jos näin käy tai jos biologisesta hajoamisesta on muu ­
ten epävarmuutta (esim. haihtumista tapahtuu), analysoi adsorboituneet tes ­
tikemikaalit tai testaa biologista hajoavuutta tilastotieteellisillä lisätesteillä 
niiden parametrien perustella, jotka viittaavat selvästi biologisiin prosessei ­
hin. Tällaisia testejä ovat hapen kulutuksen menetelmät (tämän liitteen luvut C.4 D, E ja F (6)), hiilidioksidin tuotannon mittaustesti (tämän liitteen luku C.4 C (6)) ja ISO Headspace -menetelmä (18) käyttämällä simulaatiotutki ­
muksessa altistunutta inokulaattia. Jos sekä DOC-poistuma että spesifisen 
kemikaalin poistuma on mitattu, poistumaprosenttien merkittävät erot (en ­
simmäinen on matalampi kuin jälkimmäinen) viittaavat siihen, että poistov ­
edessä on orgaanisia välituotteita, jotka saattavat hajota heikommin kuin 
lähtökemikaali.
 
Testitulosten luotettavuus  
63. Inokulaatin tavanomaisesta biohajoamiskäyttäytymisestä saadaan tietoa, jos 
orgaanisen aineen poistumisaste (kohta 53) kontrolliyksikössä määritetään. Testi on luotettava, jos DOC- tai COD-poistumisaste kontrolliyksikössä tai 
-yksiköissä on > 80 prosenttia kahden viikon kuluttua eikä epätavallisia 
havaintoja ole tehty.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1073
 
64. Jos käytettiin helposti biohajoavaa vertailukemikaalia, biologisen hajoavuu ­
den asteen (D  t , kohta 52) pitäisi olla yli 90 prosenttia.  
65. Jos testi tehdään nitrifioivissa olosuhteissa, keskimääräisen ammoniumtypen 
pitoisuuden poistovesissä pitäisi olla < 1 mg/l ja nitriittitypen < 2 mg/l.  
66. Jos nämä kriteerit (kohdat 63–65) eivät täyty, toista testi käyttämällä inoku ­
laattia, joka on peräisin toisesta lähteestä, testaa vertailukemikaali ja tarkista kaikki kokeelliset menetelmät.
 
Testiraportti  
67. Testiraportissa on ilmoitettava seuraavat tiedot:  
Testikemikaali:  
— tunnistetiedot  
— fysikaalinen olomuoto ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, jos niillä 
on merkitystä.  
Testiolosuhteet:  
— testijärjestelmän tyyppi, mahdolliset haihtuvien ja liukenemattomien ke ­
mikaalien testausta varten tehdyt muutokset  
— orgaanisen aineen tyyppi  
— teollisuusjäteveden osuus jätevedestä ja sen ominaisuudet, jos tiedossa  
— inokulaatti, ominaisuudet ja näytteenottopaikka tai -paikat, pitoisuus ja 
mahdollinen esikäsittely  
— testikemikaalin kantaliuos: DOC- ja TOC-pitoisuus, valmistustapa, mah ­
dollinen suspensio, käytetty testipitoisuus, syyt jos DOC ei ole alueella 
10–20 mg/l, lisäystapa, ensimmäisen lisäyksen päivämäärä, mahdolliset muutokset
 
— lietteen keskimääräinen ikä ja keskimääräinen hydraulinen retentioaika, 
lietteen poistumatapa, tilavuuden kasvun estämistavat, lietteen häviämi ­
nen jne.  
— käytetyt analyyttiset tekniikat  
— testilämpötila  
— lietteen tilavuuden kasvun ominaisuudet, lietteen tilavuusindeksi (SVI), 
kiinteiden aineiden osuus liuoksessa (MLSS)  
— mahdolliset poikkeamat standardimenetelmistä ja olosuhteet, jotka ovat 
voineet vaikuttaa tuloksiin.  
Testitulokset:  
— kaikki mitatut tiedot (DOC, COD, ominaisanalyysit, pH, lämpötila, hap ­
pipitoisuus, suspendoitunut kiintoaines, N-kemikaalit, mikäli aiheellista)  
— kaikki lasketut D  t - (tai D  tc -), D  B - ja D  St -arvot taulukoituina sekä poistu ­
makäyrät  
— lag- ja tasannevaiheen tiedot, testin kesto, testikemikaalin ja kontrolliyk ­
sikön orgaanisen aineen poistumisaste sekä tilastotiedot ja lausumat bio ­
logisesta hajoavuudesta ja testin luotettavuudesta  
— tulosten pohdinta.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1074
 
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) Swisher RD (1987). ”Surfactant Biodegradation”, 2. painos. Marcel Dekker 
Inc. New York, s. 1085.  
2) German Government (1962). Ordinance of the degradability of detergents in 
washing and cleaning agents. Bundesgesetzblatt, Pt.1 No. 49: 698–706.  
3) Painter HA and King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing 
biodegradability. Technical Report No.70, Water Research Centre, Medmen ­
ham, UK.  
4) Painter HA and King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature 
on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. 
Res. 12: 909–915.  
5) Eckenfelder, W.W (19) US EPA.  
6) Tämän liitteen luku C.4 Biohajoavuuden määritys.  
7) Tämän liitteen luku C.12 Biologinen hajoaminen – modifioitu SCAS-testi.  
8) Tämän liitteen luku C.19 Maa-aineksiin ja viemärilietteeseen sovellettavan 
adsorptiokertoimen (K  OC ) määritys korkean suorituskyvyn nestekromatogra ­
fialla.  
9) Gerike P and Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability 
determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3:157–173.
 
10) Gerike P and Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and conclu ­
sions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45–55.  
11) Painter HA and Bealing D (1989). Experience and data from the OECD 
activated sludge simulation test. s. 113–138, In: Laboratory tests for simu ­
lation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
 
12) ISO 11733 (1995; tarkistettu 2004). Evaluation of the elimination and bio ­
degradability of organic substances in an aqueous medium – activated sludge simulation test.
 
13) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol. Deterg.: 33–48.  
14) Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 
(2): 340–343.  
15) Gerike P, Fischer WK and Holtmann W (1980). Biodegradability determi ­
nations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat.Res. 14: 753–758.
 
16) Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung 
zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF – Z. Umweltc ­
hem. Ökotox. 10: 214–220.  
17) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. 
Methods for the examination of waters and associated materials. s. 91–98 
ISBN 011 751661 9.  
18) ISO 14593 (1998). Water Quality – Evaluation in an aqueous medium of 
the ultimate biodegradability of organic compounds. Method by the analysis of inorganic carbon in sealed vessels.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1075
 
Lisäys 1  
Kuva 1  
Biologisen hajoamisen määrityslaitteisto  
Husmannin yksikkö
  
A. Säiliö  
B. Annostelupumppu  
C. Ilmastuskammio (3 l)  
D. Selkeytysastia  E. Paineilmapumppu  
F. Keräämisastia  
G. Ilmastin  
H. Ilmavirtausmittari  
Kuva 2  
Biologisen hajoamisen määrityslaitteisto  
Huokoinen astia
  
A. Säiliö  
B. Annostelupumppu  
C. Huokoinen ilmastusastia  
D. Ulompi läpäisemätön astia  E. Keräämisastia  
F. Diffuusori  
G. Ilmavirtausmittari  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1076
 
Kuva 3  
Kolmen litran huokoisen ilmastusastian yksityiskohdat
  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1077
 
Lisäys 2  
Esimerkki poistumakäyrästä
  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1078
 
Lisäys 3  
[INFORMATIIVINEN]  
TESTIYKSIKÖIDEN YHDISTÄMINEN  
Koska pyrkimyksenä oli yhtäläistää lietteiden mikrobipopulaatiot testiyksikössä, 
johon tulee jätevettä ja testikemikaalia, sekä kontrolliyksikössä, johon tulee vain 
jätevettä, lietettä alettiin vaihtaa yksiköstä toiseen päivittäin (1). Tätä menetelmää kutsutaan yhdistämiseksi ja pareiksi yhdistetyiksi yksiköiksi. Yhdistämistä tehtiin alun perin Husmannin aktiivilieteyksiköissä, mutta sitä on tehty myös huokoisia 
astioita käytettäessä (2)(3). Yhdistämättömien ja yhdistettyjen yksiköiden tulok ­
sissa ei havaittu suuria eroja niin Husmannin yksiköissä kuin huokoisissa asti ­
oissakaan, joten yksiköiden yhdistämiseen on turha käyttää aikaa ja nähdä vaivaa.
 
Kun lietettä vaihdetaan, poistuma voi vaikuttaa merkittävältä, sillä osa testikemi ­
kaalista siirretään ja testikemikaalin pitoisuudet testi- ja kontrollipoistovirrassa 
yhtäläistyvät. Siksi on käytettävä korjauskertoimia, jotka määräytyvät vaihdetun osuuden ja keskimääräisen hydraulisen retentioajan mukaan. Laskennasta on jul ­
kaistu lisätietoa (1).
 
Laske korjattu DOC- tai COD-poistumisaste seuraavalla kaavalla:  
D tc ¼ ðD t Ä 100 · a · r=12Þ=ð1 Ä a · r=12Þ% 
jossa  
D tc = korjattu DOC- tai COD-poistumaprosentti  
D t = määritetty DOC- tai COD-poistumaprosentti  
a = vaihdettu osuus aktiivilieteyksiköiden tilavuudesta  
r = hydraulisen retentioajan keskiarvo (h)  
Jos esimerkiksi puolet ilmastussäiliön tilavuudesta vaihdetaan (a = 0,5) ja hyd ­
raulisen retentioajan keskiarvo on 6 h, korjauskaava on seuraava:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations 
via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units 
of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131–1135.  
2) Painter HA, Bealing DJ (1989). Experience and Data from the OECD Acti ­
vated Sludge Simulation Test. s. 113–138. In: Laboratory Tests for Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen 
BN, Muntau H, Angeletti G.
 
3) Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for 
Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, UK.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1079
 
Lisäys 4  
AKTIIVILIETTEEN INHIBITION ARVIOINTI  
Käsittely testikemikaaleilla  
1. On mahdollista, että kemikaali (tai jätevesi) ei hajoa tai poistu simulaatiotut ­
kimuksessa, ja sillä saattaa jopa olla inhibitiovaikutus lietteen 
mikro-organismeihin. Toiset kemikaalit hajoavat biologisesti, kun pitoisuus on pieni, mutta ovat inhiboivia, kun pitoisuus on suuri (hormeesi). Inhibitio ­
vaikutukset saattavat paljastua alkuvaiheessa tai ne voidaan määrittää toksi ­
suustestillä, jossa käytetään samaa tai identtistä inokulaattia kuin simulaatio ­
tutkimuksessa (1). Tällaisia menetelmiä ovat hapenkulutuksen estäminen (tä ­
män liitteen luku C.11 (2) ja ISO 8192(3)) tai lietteen organismien kasvun estäminen (ISO 15522 (4)).
 
2. Simulaatiotutkimuksessa mahdolliset inhibitiovaikutukset ilmenevät siinä, että 
testiastian ja kontrolliastian poistoveden liuenneen orgaanisen hiilen (DOC) tai kemiallisen hapenkulutuksen (COD) ero on suurempi kuin testikemikaalin 
mukana lisätty DOC. Toisin ilmaistuna käsiteltävän orgaanisen aineen 
DOC-poistumaprosentti (ja biokemiallinen hapentarve eli BOD, kemiallinen hapenkulutus eli COD ja/tai NH
 + 4 ) laskee testikemikaalin vaikutuksesta. Jos 
näin käy, testi on toistettava siten, että testikemikaalin pitoisuutta lasketaan, 
kunnes saavutetaan taso, jossa inhibitiota ei tapahdu. Pitoisuutta voi olla hyvä laskea vielä lisää, kunnes testikemikaali hajoaa biologisesti. Jos testikemikaali (tai jätevesi) kuitenkin vaikuttaa prosessiin haitallisesti kaikilla testatuilla pi ­
toisuuksilla, kemikaalia on luultavasti vaikeaa tai mahdotonta käsitellä biolo ­
gisesti, mutta testi voi kuitenkin olla hyvä toistaa käyttämällä aktiivilietettä, joka on peräisin toisesta lähteestä, ja/tai totuttaa liete asteittaisesti.
 
3. Jos taas testikemikaali poistuu biologisesti simulaatiotutkimuksen ensimmäi ­
sessä yrityksessä, pitoisuutta on lisättävä, jos kemikaalin mahdollisen inhibi ­
tiovaikutuksen selvittäminen on tarpeen.  
4. Kun inhibition astetta määritetään, on hyvä pitää mielessä, että aktiivilietteen 
populaatio voi muuttua, joten mikro-organismit saattavat kehittää ajan myötä toleranssin inhiboivalle kemikaalille.
 
5. Inhibitioasteen laskenta:  
Testi- ja kontrolliyksikön (BOD:n, DOC:n, COD:n jne.) kokonaispoistumap ­
rosentti R  o , lasketaan seuraavasti:  
R o ¼ 100 ðI Ä EÞ=I % 
jossa:  
I = testi- tai kontrolliastian tuloveden BOD-, DOC-, COD-pitoisuus jne. 
(mg/l)  
E = vastaava pitoisuus poistovedessä (mg/l).  
I- ja E-arvot on korjattava siten, että testikemikaalista johtuva DOC testiyk ­
sikössä huomioidaan, sillä muuten saadaan väärä inhibitioprosentti.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1080
 
Testikemikaalin aiheuttaman inhibition aste lasketaan seuraavasti:  
inhibitioprosentti ¼ 100 ðR c Ä R t Þ=R c 
jossa:  
R c = poistumaprosentti kontrolliastioissa  
R t = poistumaprosentti testiastioissa  
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) Reynolds L et al. (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be 
assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259.  
2) Tämän liitteen luku C.11 Biologinen hajoaminen – aktiivilietteen soluhengi ­
tyksen inhibitiotesti.  
3) ISO 8192 (2007) Water quality – Test for inhibition of oxygen consumption 
by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation.  
4) ISO 15522 (1999) Water Quality – Determination of the inhibitory effect of 
water constituents on activated sludge microorganisms.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1081
 
Lisäys 5  
Heikosti veteen liukenevat testikemikaalit – haihtuvat kemikaalit  
Heikosti veteen liukenevat kemikaalit  
Heikosti veteen liukenevien ja liukenemattomien kemikaalien käytöstä jäteveden ­
puhdistusta simuloivissa testeissä on julkaistu vähän raportteja (1)(2)(3).  
Ei ole yhtä testikemikaalin dispergointitapaa, joka soveltuisi kaikille liukenemat ­
tomille kemikaaleille. ISO 10634 -standardissa (4) kuvataan neljä tapaa, joista kaksi vaikuttaa soveltuvan testikemikaalien dispergointiin simulaatiotutkimusta varten: emulgointiaineiden käyttö ja/tai ultraäänienergia. Syntyvän dispersion 
stabiliteetti on määritettävä vähintään 24 tunnin ajalta. Sen jälkeen riittävän sta ­
biloituneet dispersiot, joita sekoitetaan jatkuvasti säiliössä (kohta 38), annostel ­
laan ilmastussäiliöön erillään kotitalousjätevedestä (tai synteettisestä jätevedestä).
 
Jos dispersiot ovat stabiileja, tutki, miten testikemikaali voidaan määrittää disper ­
goituneessa muodossa. DOC ei todennäköisesti sovellu tarkoitukseen, joten tes ­
tikemikaalia varten on määritettävä spesifinen analyysimenetelmä, jota voidaan 
soveltaa poistoveteen, poistoveden kiintoainekseen ja aktiivilietteeseen. Sen jäl ­
keen testikemikaalin kohtalo aktiivilieteprosessin simulaatiossa määritetään nes ­
tefaasissa ja kiinteässä faasissa. Näin saadaan massatase, jonka perusteella pää ­
tetään, onko testikemikaali hajonnut biologisesti. Tämä voi kuitenkin viitata vain 
primaariseen biohajoamiseen. Lopullinen biohajoaminen on pyrittävä osoittamaan 
soveltamalla nopean biologisen hajoavuuden respirometrista testiä (tämän liitteen luku C.4. C, F tai D (5)) ja käyttämällä inokulaattina lietettä, joka on altistunut testikemikaalille simulaatiotutkimuksessa.
 
Haihtuvat kemikaalit  
Jätevedenpuhdistuksen simulaatioiden soveltaminen haihtuviin kemikaaleihin on 
kyseenalaista ja ongelmallista. Haihtuvien kemikaalien käytöstä simulaatiotutki ­
muksissa on julkaistu vain vähän raportteja, samoin kuin heikosti veteen liuke ­
nevista testikemikaaleistakin. Perinteinen täysin sekoittava laite mukautetaan tii ­
vistämällä ilmastus- ja selkeytyssäiliöt, mittaamalla ja kontrolloimalla ilmavirta ­
usta virtausmittareilla sekä keräämällä haihtuva orgaaninen aine kuljettamalla 
ulostuleva kaasu erottimien läpi. Joissakin tapauksissa käytetään tyhjiöpumppua, 
jolla ulostuleva kaasu ohjataan ”kylmäerottimen” läpi tai erottimeen (purge trap), jossa on Tenaxia ja silikageeliä, kaasukromatografista analyysiä varten. Erotti ­
messa oleva testikemikaali voidaan määrittää analyyttisesti.
 
Testi tehdään kahdessa osassa. Ensin yksiköitä käytetään ilman lietettä, mutta 
niissä on synteettistä jätevettä ja testikemikaalia, jota pumpataan ilmastussäiliöön. 
Kaasunäytteitä kerätään tulovedestä, poistovedestä ja ulostulevasta kaasusta, ja niitä analysoidaan parin päivän ajan. Kerättyjen tietojen perusteella voidaan las ­
kea järjestelmästä haihtuneen testikemikaalin prosenttimäärä (R
 vs ). 
Sen jälkeen tehdään normaali biologinen testi (lietteen kanssa) identtisissä olo ­
suhteissa kuin haihtuvuustutkimus (stripping). DOC- tai COD-mittaukset tehdään 
myös, jotta nähdään, toimivatko yksiköt tehokkaasti. Ajoittaisilla analyyseillä 
määritetään testikemikaali tulovedessä, poistovedessä ja ulostulevassa kaasussa testin ensimmäisessä osiossa. Adaptoitumisen jälkeen analyysejä tehdään useam ­
min. Tasapainotilassa saaduista tiedoista voidaan jälleen laskea testikemikaalin 
poistumaprosentti nestefaasista kaikilla prosesseilla (R
 T ) (fyysiset ja biologiset) 
sekä järjestelmästä haihtunut osuus (R  V ). ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1082
 
Laskelma:  
a) Ei-biologisessa testissä järjestelmästä haihtuneen testimateriaalin määrä pro ­
sentteina (R  VP ) voidaan laskea seuraavasti:  
R VP ¼ S VP 
S IP · 100 
jossa  
R VP = testikemikaalin poistuminen haihtumalla (%)  
S VP = erottimeen kerätty testikemikaali ilmaistuna vastaavana pitoisuutena 
nestefaasissa (mg/l)  
S IP = testikemikaalin pitoisuus tulovedessä (mg/l).  
b) Biologisessa testissä järjestelmästä haihtuneen testimateriaalin määrä prosent ­
teina (R  V ) voidaan laskea seuraavasti:  
R V ¼ S V 
S I · 100 
jossa  
R V = testikemikaalin poistuminen haihtumalla biologisessa testissä (%)  
S V = erottimeen biologisessa testissä kerätty testikemikaali ilmaistuna vas ­
taavana pitoisuutena nestemäisessä tulovirrassa (mg/l)  
S I = testikemikaalin pitoisuus tulovedessä (mg/l).  
c) Biologisessa testissä kaikissa prosesseissa poistuneen testikemikaalin prosent ­
timäärä (R  T ) saadaan seuraavasti:  
R T ¼ 1 Ä S E 
S I · 100 
jossa  
S E = testikemikaalin pitoisuus (nestemäisessä) poistovirrassa (mg/l).  
d) Niinpä biohajoamisen ja adsorption poistama prosenttiosuus (R  BA ) voidaan 
laskea seuraavasti.  
R BA ¼ ðR T Ä R V Þ 
Erillisillä testeillä on määritettävä, adsorboituuko testikemikaali. Jos adsorboi ­
tuu, lisäkorjaus voi olla tarpeen.  
e) Biologisesta (R  v ) ja ei-biologisesta (R  vp ) testijärjestelmästä haihtuneen testi ­
kemikaalin osuuden vertailu osoittaa, miten biologinen käsittely on vaikutta ­
nut testikemikaalin päästöön ilmakehään.  
Esimerkki:  bentseeni  
Lietteen retentioaika = 4 päivää  
Synteettinen jätevesi, retentioaika = 8 h  
S IP = S  I = 150 mg/l  
S VP = 150 mg/l (S  EP = 0) 
S V = 22,5 mg/l  
S E = 50 μg/l ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1083
 
Niinpä  
R VP = 100 %, R  V = 15 %  
R T = 100 % ja R  BA = 85 %.  
Bentseenin ei oletettu adsorboituneen lietteeseen.  
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl 
alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939–854.  
2) Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the 
aquatic environment. CRC Press. Boston, USA.  
3) Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic 
compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control 
Fed. 55: 97.  
4) ISO 10634 (1995) Water Quality – Guidance for the preparation and treat ­
ment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evalua ­
tion of their biodegradability in an aqueous medium.  
5) Tämän liitteen luku C.4 Biohajoavuuden määritys.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1084
 
Lisäys 6  
Lietteen retentioajan (SRT) vaikutus kemikaalien käsiteltävyyteen  
JOHDANTO  
1. Päätekstissä kuvatun menetelmän tarkoitus on varmistaa, voivatko testatut 
kemikaalit (yleensä tunnetusti luontaisesti biohajoavia, mutta eivät helposti 
biohajoavia) hajota biologisesti jätevedenpuhdistamon asettamissa rajoissa. Tulokset ilmaistaan poistumaprosenttina ja biologisena hajoamisprosenttina. Aktiivilieteyksiköiden toimintaolosuhteet ja tuloveden valinta sallivat hyvin 
suuren vaihtelun testikemikaalin pitoisuudessa poistovedessä. Testit tehdään 
vain yhdellä lietteen kiintoaineksen nimellisellä pitoisuudella tai yhdellä nimellisellä lietteen retentioajalla (SRT), ja kuvatut lietteen poistumatavat voivat aiheuttaa SRT-arvon merkittävää vaihtelua testin kuluessa, sekä päi ­
västä toiseen että päivän aikana.
 
2. Tässä muunnelmassa (1)(2) SRT:tä kontrolloidaan paljon tiukemmissa ra ­
joissa jokaisen 24 tunnin jakson aikana (kuten suuressa mittakaavassakin tapahtuu), jolloin pitoisuus poistovesissä on paljon yhtenäisempi. Kotitalo ­
usjätevesi on suositeltavaa, koska sillä saadaan yhtenäisemmät ja korkeam ­
mat poistumaprosentit. Lisäksi tutkitaan useiden SRT-arvojen vaikutuksia, ja tarkemmassa tutkimuksessa voidaan määrittää eri lämpötilojen vaikutuksia pitoisuuteen poistovedessä.
 
3. Vielä ei ole yleistä yksimielisyyttä siitä, mitkä kineettiset mallit toimivat, 
kun kemikaalit hajoavat biologisesti jätevedenpuhdistuksessa vallitsevissa olosuhteissa. Kerättyihin tietoihin päätettiin soveltaa Monodin bakteerikas ­
vun ja substraatin hyödyntämisen mallia (1)(2), sillä menetelmä oli tarkoi ­
tettu vain suurina tonnimäärinä tuotetuille kemikaaleille, jolloin pitoisuudet 
jätevedessä ovat yli 1 mg/l. Yksinkertaistetun mallin ja tehtyjen olettamusten luotettavuus määritettiin käyttämällä joukkoa alkoholietoksylaatteja, joiden primaarisen biohajoavuuden aste vaihteli (2)(3).
 
Huomautus:  Tämä menetelmämuunnelma vasta suurta osaa kohdassa C.10- 
A kuvatun testimenetelmän tekstistä, ja tästä eteenpäin anne ­
taan vain siitä poikkeavat tiedot.  
TESTIN PERIAATE  
4. Huokoisia aktiivilieteastioita, jotka on suunniteltu helpottamaan seoksen 
(melkein) jatkuvaa poistumaa ja jotka mahdollistavat lietteen retentioajan 
(SRT tai θ s ) hyvin tarkan seurannan, käytetään yhdistämättömässä tilassa 
useilla lietteen retentioajoilla ja valinnaisesti myös useissa lämpötiloissa. Retentioaika on yleensä 2–10 vuorokautta ja lämpötila 5–20 °C. Jätevesi, 
joka on mieluiten kotitalousjätevettä, ja testikemikaaliliuos annostellaan erik ­
seen yksiköihin nopeudella, jolla saadaan tarvittava lietteen retentioaika (3–6 tuntia) ja testikemikaalin tarvittava pitoisuus tulovedessä. Kontrolliyksiköitä, joihin ei lisätä testikemikaalia, käytetään rinnakkain vertailua varten.
 
5. Muun tyyppisiä laitteita voidaan myös käyttää, mutta silloin on varmistet ­
tava huolellisesti, että SRT:n kontrollointi onnistuu hyvin. Jos käytetään esimerkiksi laitoksia, joissa on laskeutin, kiintoaineksen hävikki laitoksen poistoveden mukana voi olla tarpeen huomioida. Lisäksi on ryhdyttävä eri ­
tyisiin varotoimiin, jotta laskeuttimessa olevan lietteen määrän vaihtelusta 
johtuvat virheet voidaan välttää.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1085
 
6. Yksiköitä käytetään kaikissa valituissa olosuhteissa, ja kun tasapainotila on 
saavutettu, testikemikaalin keskimääräiset pitoisuudet poistovesissä tasapai ­
notilassa ja valinnaisesti DOC määritetään noin 3 viikon pituisen jakson aikana. Testikemikaalin poistumaprosentin ja valinnaisesti DOC:n arvioinnin lisäksi ilmaistaan laitoksen toimintaolosuhteiden ja poistovirran pitoisuuden 
välinen suhde graafisessa muodossa. Tästä voidaan laskea alustavat kineet ­
tiset vakiot ja ennustaa olosuhteet, joissa testikemikaalia voidaan käsitellä.
 
TESTIKEMIKAALIA KOSKEVIA TIETOJA  
7. Luvun C.10 A kohdat 12 ja 13 pätevät.  
KYNNYSARVOT  
8. Luvun C.10 A kohdat 14 ja 15 pätevät.  
VERTAILUTESTIKEMIKAALI  
9. Luvun C.10 A kohta 16 pätee.  
TESTITULOSTEN TOISTETTAVUUS  
10. Luvun C.10 A kohdat 17 ja 18 pätevät.  
MENETELMÄN KUVAUS  
Laite  
11. Soveltuva laite on muunneltu huokoinen astia (lisäys 6.1). Siinä on huokoi ­
sesta polypropeenista valmistettu sisäastia (tai sisäkappale), jonka paksuus on 3,2 mm ja huokoskoko noin 90 μm ja jossa on puskuhitsausliitos. (Siksi 
se on tukevampi kuin tämän luvun C.10 A kohdassa 21 kuvattu yksikkö). 
Sisäastia asetetaan läpäisemättömään polyeteeniseen ulkoastiaan, jossa on kaksi osaa: pyöreä pohja, johon porataan reiät kahta ilmaletkua ja lietteen ­
poistoletkua varten, ja yläsylinteri, joka ruuvataan kiinni pohjaan ja jonka 
ulostulo on sijoitettu siten, että se antaa tunnetun tilavuuden (3 l) huokoiseen 
astiaan. Toisessa ilmaletkussa on diffuusorikivi. Toisen pää on avoin, ja se on sijoitettu kohtisuorassa astiassa olevaan kiveen. Tämä järjestelmä tuottaa tarvittavan turbulenssin, jotta astian sisältö sekoittuu täydellisesti, ja sillä 
saadaan liuenneen hapen pitoisuuksiksi yli 2 mg/l.
 
12. Soveltuva määrä yksiköitä pidetään kontrolloiduissa lämpötiloissa alueella 
5–20 °C (± 1 °C) joko vesihauteessa tai huoneissa, joiden lämpötila on 
vakio. Tarvitaan pumput, joilla testikemikaali ja selkeytetty jätevesi voidaan annostella tarvittavalla nopeudella ilmastusastioihin (testikemikaali 0–1,0 ml/min ja jätevesi 0–25 ml/min), ja kolmas pumppu, jolla jäteliete poistetaan 
ilmastusastioista. Jotta jätelietteen virtausnopeus saadaan vaadittavalle hyvin 
alhaiselle tasolle, pumppuja käytetään suurella nopeudella ja jaksoittaisesti ajastimen avulla (esim. 10 sekuntia minuutissa ja pumpun tuotto 3 ml/min, jolloin poistumanopeudeksi saadaan 0,5 ml/min).
 
Suodatinlaite tai sentrifugi  
13. Luvun C10 A kohta 23 pätee.  
Analyysilaitteet  
14. Luvun C.10 A kohta 24 pätee.  
Vesi ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1086
 
15. Luvun C.10 A kohdat 25 ja 26 pätevät.  
Orgaaninen aine  
16. Luvun C.10 A kohta 27 pätee.  
Synteettinen jätevesi  
17. Luvun C.10 A kohta 28 pätee.  
Kotitalousjätevesi  
18. Luvun C.10 A kohta 29 pätee.  
Aktiiviliete  
19. Luvun C10 A kohta 30 pätee.  
Testikemikaalin kantaliuokset  
20. Luvun C.10 A kohdat 31 ja 32 pätevät.  
MENETTELY  
Inokulaatin valmistus  
21. Vain luvun C.10 A kohta 34 pätee – käytä aktiivilietettä (noin 2,5 g/l).  
Testiyksiköiden määrä  
22. Yksinkertaisessa testissä, jolla mitataan esimerkiksi poistumaprosenttia, tar ­
vitaan vain yksi SRT, mutta 4 tai 5 STR-arvoa on tarpeen, jotta saadaan 
alustavien kineettisten vakioiden laskemiseen tarvittavat tiedot. Valitut arvot 
ovat yleensä välillä 2–10 päivää. Käytännössä on kätevää tehdä testi saman ­
aikaisesti neljällä tai viidellä SRT:llä yhdessä lämpötilassa. Laajoissa tutki ­
muksissa samoja SRT-arvoja tai ehkä eri arvoja käytetään muissa lämpöti ­
loissa (5–20 °C). Primaarisessa biohajoamisessa (pääkäyttö) tarvitaan 
yleensä vain yksi yksikkö yhtä olosuhdejoukkoa kohden. Lopullisessa bio ­
hajoamisessa tarvitaan kuitenkin kontrolliyksikkö jokaista olosuhdejoukkoa kohden. Kontrolliyksikköön lisätään jätevettä mutta ei testikemikaalia. Jos 
käytetyssä jätevedessä epäillään olevan testikemikaalia, kontrolliyksiköiden 
käyttö on tarpeen primaarisen biohajoamisen arvioinnissa ja laskelmiin on tehtävä tarvittavat korjaukset.
 
Orgaanisen aineen ja testikemikaalin annostelu  
23. Luvun C.10 A kohdat 36 ja 39 pätevät, mutta huomioi, että testikemikaa ­
liliuos annostellaan erikseen ja että käytössä on useita lietteen poistumano ­
peuksia. Seuraa tulo- ja poistoveden virtausnopeuksia sekä lietteen poistu ­
maa säännöllisesti, esimerkiksi kahdesti päivässä, ja säädä ne tarvittaessa 
± 10 prosentin sisään. Jos analyysimenetelmissä ilmenee ongelmia, kun käytetään kotitalousjätevettä, tee testi synteettisellä jätevedellä, mutta var ­
mista, että eri aine antaa verrattavissa olevat kineettiset tiedot.
 
Aktiivilieteyksiköiden käsittely  
24. Luvun C.10 A kohdat 40–43 pätevät, mutta kontrolloi SRT:tä vain lietteen 
”jatkuvalla” poistumalla.  
Näytteenotto ja näytteiden analyysi  
25. Luvun C.10 A kohdat 44–50 pätevät, paitsi että testikemikaalin pitoisuus on 
määritettävä ja valinnaisesti DOC. COD:ta ei käytetä.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1087
 
TIEDOT JA RAPORTOINTI  
Tulosten käsittely  
26. Luvun C.10 A kohdat 52–54 pätevät.  
Testitulosten ilmaiseminen  
27. Luvun C.10 A kohdat 56–62 pätevät.  
Kineettisten vakioiden laskenta  
28. On realistisempaa antaa testikemikaalin keskimääräinen pitoisuus tasapaino ­
tilassa ja kuvata, miten se vaihtelee laitoksen toimintaolosuhteissa, kuin antaa primaarinen biohajoamisprosentti. Tämän voi tehdä tarkastelemalla 
lisäyksessä 6.2 annettua kaavaa (6), jolla saadaan K
 S -, μ m - ja θ SC -arvot 
(kriittinen lietteen retentioaika).  
(Vaihtoehtoisesti likimääräiset K  S - ja μm-arvot saadaan käyttämällä yksin ­
kertaista tietokone-ohjelmaa, jolla kaavasta 2 (lisäys 6.2) laskettu teoreetti ­
nen kaava sovitetaan saatuihin kokeellisiin arvoihin. Vaikka mikään ratkaisu ei ole ainutlaatuinen, saadaan K
 S - ja μm-arvot, jotka ovat kohtuullisen lä ­
hellä.)  
Tulosten vaihtelevuus  
29. On yleistä, että yksittäisille kemikaaleille saadaan erilaisia kineettisten para ­
metrien arvoja. Arvellaan, että lietteen kasvuolosuhteilla sekä testissä vallit ­
sevilla olosuhteilla (kuten kohdassa 5 ja muissa testeissä) on suuri vaikutus saatuihin arvoihin. Grady  et al  (4) ovat käsitelleet tätä vaihtelevuutta yhdestä 
näkökulmasta ja ehdottaneet, että termejä ”olemassa oleva” ja ”ominainen” 
pitäisi soveltaa kahteen ääriolosuhteeseen, jotka edustavat fysiologisen tilan 
ääripäitä, joita viljelmä voi saavuttaa kineettisen kokeen aikana. Jos tilan ei anneta muuttua testin aikana, kineettisten parametrien arvot heijastavat sen ympäristön olosuhteita, joista mikro-organismit on otettu. Näitä arvoja kut ­
sutaan ”olemassa oleviksi”. Toisessa ääripäässä testin olosuhteet ovat sellai ­
set, että ne sallivat proteiinisynteesijärjestelmän täydellisen kehittymisen ja siten suurimman mahdollisen kasvunopeuden, saatuja kineettisiä parametreja kutsutaan ”ominaisiksi”, ja ne määräytyvät ainoastaan substraatin luonteen ja 
viljelmässä olevien bakteerien tyypin mukaan. Ohjenuorana on, että ole ­
massa olevat arvot saadaan pitämällä substraatin pitoisuuden ja kompetent ­
tien mikro-organismien välinen suhde (S
 o /X o ) pienenä, esim. 0,025, ja omi ­
naiset arvot saadaan, kun suhde on korkea eli vähintään 20. Kummassakin 
tapauksessa S  o -arvon pitää olla yhtä suuri tai suurempi kuin Ks-arvo (puo ­
likyllästysvakio).  
30. Vaihtelevuudesta ja muista biohajoavuuden kinetiikan näkökulmista keskus ­
teltiin hiljattain pidetyssä SETAC-työpajassa (5). Raportoidut ja suunnitellut 
tutkimukset selventävät jätevedenpuhdistamojen kinetiikkaa, jotta olemassa olevat tiedot voidaan tulkita paremmin, ja niissä ehdotetaan paremmin so ­
veltuvia suunnitelmia tulevia testimenetelmiä varten.
 
KIRJALLISUUSVIITTEET:  
1) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol Deterg.: 33–48.  
2) Birch RR (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 
340–343.  
3) Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage 
treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411–422.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1088
 
4) Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic para ­
meter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. 
Wat. Res., 30 (3): 742–748.  
5) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4–6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1089
 
Lisäys 6.1  
Huokoinen astia, jossa SRT-kontrolli
  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1090
 
Lisäys 6.2  
Kineettisten vakioiden laskenta  
1. Jos oletetaan, että Monodin kinetiikka pätee ja otetaan huomioon aktiivisen 
kiintoaineen ja substraatin massatase aktiivilietejärjestelmässä (1), saadaan seuraavat tasapainotilan lausekkeet:
 
1 
θ s ¼ μ m · S 1 
K s þ S 1 Ä K d [1] 
tai 
S 1 ¼ K s · ð1 þ K d · θ s Þ 
θ s · ðμ m Ä K d Þ Ä 1 [2] 
jossa  
S 1 = substraatin pitoisuus poistovedessä (mg/l)  
K S = puolikyllästysvakio; pitoisuus, jossa μ = μ m /2 (mg/l)  
μ = spesifinen kasvunopeus (d  –1 ) 
μ m = μ m :n enimmäisarvo (d  –1 ) 
K d = aktiivisen kiintoaineen spesifinen hajoamisnopeus (d  –1 ) 
θ S = lietteen retentioajan keskiarvo, SRT (d)  
Tästä yhtälöstä voi tehdä seuraavat päätelmät:  
i) Pitoisuus poistovedessä ei ole riippuvainen pitoisuudesta tulovedessä 
(S 0 ). Niinpä biohajoamisprosentti vaihtelee tuloveden pitoisuuden (S  0 ) 
mukaan.  
ii) Ainoa laitoksen kontrolliparametri, joka vaikuttaa S  1 -arvoon, on lietteen 
retentioaika ( θ S ). 
iii) Tietylle pitoisuudelle tulovedessä (S  0 ) on kriittinen lietteen retentioaika:  
1 
θ SC ¼ μ s · S 0 
K s þ S 0 Ä K d [3] 
jossa  
θ SC = lietteen kriittinen retentioaika, jonka alla kompetentit 
mikro-organismit huuhtoutuvat laitoksesta.  
iv) Koska yhtälön (2) muut parametrit liittyvät kasvukinetiikkaan, lämpötila 
vaikuttaa todennäköisesti poistoveden substraattitasoon ja lietteen kriit ­
tiseen ikään. Toisin sanoen tietynasteiseen käsittelyyn vaadittava lietteen 
retentioaika kasvaa, kun lämpötila laskee.  
2. Kun otetaan huokoisten astioiden kiintoaineen massatase ja oletetaan, että 
kiintoaineen pitoisuus poistovedessä (X  2 ) on pienempi kuin ilmastusastiassa 
(X 1 ), lietteen retentioaika:  
θ s ¼ V · X 1 
ðQ 0 Ä Q 1 Þ · X 2 þ Q 1 · X 1 [4] ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1091
 
ja 
θ s ¼ V · X 1 
Q 1 · X 1 ¼ V 
Q 1 
jossa  
V = ilmastusastian tilavuus (l)  
X 1 = kiintoaineen pitoisuus ilmastusastiassa (mg/l)  
X 2 = kiintoaineen pitoisuus poistovedessä (mg/l)  
Q 0 = tuloveden virtausnopeus (l/d)  
Q 1 = jätelietteen virtausnopeus (l/d)  
Niinpä lietteen retentioaikaa voidaan kontrolloida missä tahansa ennalta va ­
litussa arvossa kontrolloimalla jätelietteen virtausnopeutta Q  1 . 
Päätelmät  
3. Tämän testin päätarkoitus on mahdollistaa pitoisuuden arviointi poistov ­
edessä ja siten testikemikaalin määrä vesissä, joihin päästöt kohdistuvat.  
4. Kun esitetään S  1 , vs. θ S , lietteen kriittisen retentioajan θ SC arviointi voi olla 
helppoa (esim. käyrä 3 kuvassa 1). Jos tämä ei ole mahdollista, θ SC sekä 
likimääräiset μ m - ja K  S -arvot voidaa laskea esittämällä S  1 , vs. S  1 •θ S . 
Järjestämällä yhtälö (1) uudelleen saadaan  
S 1 · θ s 
1 þ θ s · K d ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [5] 
Jos K  d on pieni, 1 + θ s • K  d ~ 1 ja [5]:stä tulee:  
S 1 · θ s ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [6] 
Niinpä käyrän pitäisi olla suora viiva (katso kuva 2), jonka kaltevuus on 
1/μ m ja joka leikkaa kuvaajan K  S /μ m , myös θ S ~1/μ m . ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1092
 
Kuva 1  
Kolme lämpötilaa, viisi SRT-arvoa
  
Kuva 2  
Regressiokuvaaja SRT S  1 vs. S  1 , kun lämpötila on = 5 °C
  
Sanasto:  
pitoisuus poistovedessä  
käyrä  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1093
 
Lisäys 7  
TESTAUS PIENELLÄ PITOISUUSALUEELLA ( μg/l) 
1. Monia kemikaaleja esiintyy vesiympäristössä ja jopa jätevedessä hyvin pie ­
ninä pitoisuuksina ( μg/l). Näin pieninä pitoisuuksina ne eivät todennäköi ­
sesti toimi ensisijaisina substraatteina, jotka aiheuttavat kasvua, vaan hajo ­
avat todennäköisemmin kasvua aiheuttamattomina toissijaisina substraatteina 
samaan aikaan kuin joukko luonnossa esiintyviä hiilikemikaaleja. Siksi täl ­
laisten kemikaalien hajoaminen ei sovi lisäyksessä 6 kuvattuun malliin. On olemassa monia soveltuvia malleja, ja jätevedenpuhdistamoissa vallitsevissa olosuhteissa usea malli saattaa toimia samanaikaisesti. Tämän ongelman 
ratkaisemiseksi tarvitaan paljon lisää tutkimusta.
 
2. Sillä välin voidaan noudattaa päätekstissä kuvattua menetelmää (luku C.10 
A), mutta ainoastaan primaarisen biohajoamisen osalta, kun käytetään so ­
veltuvan pieniä pitoisuuksia (< 100 μg/l) ja validoitua analyyttistä menetel ­
mää. Biohajoamisprosentti voidaan laskea (katso testimenetelmän kohta 54), 
kun abioottiset prosessit (adsorptio, haihtuvuus jne.) otetaan huomioon. Esi ­
merkkinä tästä on Nyholmin ja kumppaneiden tutkimus (1)(2), jossa käytet ­
tiin 4 tunnin jaksoa täyttö- ja poistojärjestelmässä. He ilmoittivat 
pseudo-ensimmäisen kertaluvun vakiot viidelle kemikaalille, joita lisättiin 
synteettiseen jäteveteen pitoisuudella 5–100 μg/l. (Lopulliseen biohajoami ­
seen voidaan käyttää  14 C-leimattuja testikemikaaleja. Tämän kuvaus ei 
kuulu tämän testimenetelmän alaan, sillä menetelmistä ei ole vielä sovittu, 
joskin ISO 14592 -standardissa (3) ehdotetussa menetelmässä on ohjeita  
14 C-leimattujen kemikaalien käytöstä.  
SCAS-testi  
3. Myöhemmin ehdotettiin yksinkertaisempaa kaksivaiheista testiä (4)(5)(6). 
Puolijatkuvan aktiivilietteen (SCAS) menetelmän jälkeen SCAS-yksiköistä otetuille näytteille tehdään lyhytaikaisia kineettisiä testejä. SCAS-järjestelmää käytetään tunnetuilla lietteen poistumanopeuksilla (toisin 
kuin alkuperäisessä C.12-testimenetelmässä), ja siihen syötetään OECD:n 
synteettistä jätevettä tai kotitalousjätevettä. Synteettistä jätevettä muutettiin (koska pH-arvo muuttui ja liete selkeytyi heikosti) lisäämällä siihen fosfaat ­
tia puskurina, hiivauutetta, rauta(III)kloridia ja hivenainesuoloja, ja COD 
nostettiin noin arvoon 750 mg/l lisäämällä peptonin ja lihauutteen pitoisuut ­
ta. Yksiköt toimivat 24 tunnin jaksoissa: ilmastus 23 h, lietteen poistuma, selkeyttäminen, kelluvan nesteen (poistoveden) poisto ja sen jälkeen synteet ­
tisen jäteveden ja testikemikaalin lisäys, enintään 100 μg/l, (eli suunnilleen 
sama pitoisuus kuin lyhytaikaisessa testissä). Kerran viikossa 10 prosenttia lietteen kokonaismäärästä korvattiin tuoreella lietteellä, jotta mikrobipopu ­
laatio pysyy tasapainossa.
 
4. Testikemikaalin pitoisuudet mitataan testin alussa ja ilmastuksen lopussa, ja 
testiä jatketaan, kunnes saavutetaan testikemikaalin vakiopoistuma. Tässä 
kestää yhdestä viikosta useaan kuukauteen.  
Lyhytaikainen testi  
5. Lyhyellä testillä (esim. 8 tuntia) määritetään testikemikaalin hajoamisen 
(pseudo)-ensimmäisen kertaluvun kinetiikan nopeusvakio aktiivilietteessä, jolla on tunnettu mutta eri alkuperä ja historia. Erityisesti lietenäytteitä otetaan SCAS-reaktoreista – ilmastusjakson lopussa, kun orgaanisen subst ­
raatin pitoisuus on pieni – adaptaatiokokeen (kohdat 3, 4) aikana. Lietettä 
voidaan ottaa vertailutarkoituksessa myös rinnakkaisesta SCAS-yksiköstä,
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1094
 
jota ei altisteta testikemikaalille. Lietteen ja testikemikaalin seokset, joita 
lisätään vähintään kahdella pitoisuudella alueella 1–50 μg/l, ilmastetaan li ­
säämättä synteettistä jätevettä tai muuta orgaanista substraattia. Liuoksessa jäljellä oleva testikemikaali määritetään säännöllisin välein kemikaalin ha ­
joavuuden mukaan, esimerkiksi kerran tunnissa, jaksona, jonka pituus ei saa 
olla yli 24 h. Näytteet sentrifugoidaan ennen asianmukaista analyysiä.
 
Laskelmat  
6. SCAS-yksiköiden tietojen perusteella lasketaan testikemikaalin poistumapro ­
sentti (kohta 54). Lisäksi voidaan laskea keskimääräinen nopeusvakio K  1 
(kiintoaineiden pitoisuuden suhteen normalisoitu) seuraavasti:  
K 1 ¼ 1=t · ln C e 
C i · 1=SSð1=g hÞ 
jossa  
t = ilmastusaika (23 h)  
C e = pitoisuus ilmastusjakson lopussa ( μg/l) 
C i = pitoisuus ilmastusjakson alussa ( μg/l) 
SS = aktiivilietteen kiintoaineen pitoisuus (g/l)  
7. Lyhytaikaisessa testissä jäljellä oleva log%-pitoisuus esitetään käyränä suh ­
teessa aikaan, ja käyrän ensimmäisen osan (hajoaminen 10–50 prosenttia) kulmakerroin vastaa (pseudo)-ensimmäisen kertaluvun kinetiikan vakiota K
 1 . 
Vakio normalisoidaan suhteessa lietteen kiintoaineen pitoisuuteen jakamalla 
kulmakertoimet kiinteiden aineiden pitoisuudella. Raportoidun tuloksen täy ­
tyy sisältää myös tiedot testikemikaalin ja kiintoaineen alkuperäisistä pitoi ­
suuksista, lietteen retentioajasta, lietteen lisäyksestä ja lähteestä sekä mah ­
dollisesta aiemmasta altistuksesta testikemikaalille.  
Tulosten vaihtelevuus  
8. Vaihtelevuudesta ja muista biohajoavuuden kinetiikan näkökulmista keskus ­
teltiin hiljattain pidetyssä SETAC-työpajassa (7). Raportoidut ja suunnitellut 
tutkimukset selventävät jätevedenpuhdistamojen kinetiikkaa, jotta olemassa olevat tiedot voidaan tulkita paremmin, ja niissä ehdotetaan paremmin so ­
veltuvia suunnitelmia tulevia testimenetelmiä varten.
 
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A and Schultz 
B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. 
Biodegradability. Wat. Res. 26: 339–353.  
2) Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, and Ostfeldt P (1993). 
Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505–1510.
 
3) ISO 14592 (ISO/TC 147/ SC5/ WG4, N264) (1998). Water Quality – Eva ­
luation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concent ­
rations in water.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1095
 
4) Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP and Frimer-Larsen H (1996). 
Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in acti ­
vated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851–864.
 
5) Berg UT and Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in 
semi-continuous activated sludge reactors with low ( μg/l range) and standard 
(ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711–735.  
6) Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodegra ­
dability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Copenhagen.
 
7) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, SG. Feitjel, T. 
King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4–6  th Sept. 1996. SETAC- Europe, 
Brussels.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1096
 
C.10-B: Biokalvot  
JOHDANTO  
1. Simulaatiotutkimuksia tehdään tavallisesti kemikaaleille, jotka eivät ole lä ­
päisseet biohajoavuuden seulontatestiä (tämän liitteen luvun C.4 kohta A–F (9)), mutta ovat läpäisseet luontaisen biohajoavuuden testin. Poikkeustilan ­
teissa simulaatiotutkimuksia voidaan tehdä myös mille tahansa kemikaalille, 
josta tarvitaan lisää tietoa, ja etenkin suurina tonnimäärinä tuotetuille kemi ­
kaaleille. Tällöin sovelletaan tavallisesti aktiivilietetestiä (C.10 A). Joissakin tapauksissa tarvitaan kuitenkin spesifistä tietoa siitä, miten kemikaali käyt ­
täytyy jätevedenpuhdistusmenetelmissä, joissa käytetään biokalvoja (biosuo ­
datus eli tihkusuodatus, biorotaattorit ja leijukerros). Tätä tarkoitusta varten 
on kehitetty useita erilaisia laitteita.
 
2. Gerike  et al.  (1) käyttivät suuria, pilottimittakaavaisia biologisia suodattimia, 
jotka yhdistettiin toisiinsa. Nämä suodattimet veivät paljon tilaa ja vaativat suhteellisen suuria määriä jätevettä tai synteettistä jätevettä. Truesdale  et al . 
(2) kuvasivat pienempiä suodattimia (halkaisija 1,8 m × 15,2 cm), joihin 
syötettiin luonnollista jätevettä, jossa ei ollut pinta-aktiivista ainetta, mutta tarvittavat tilavuudet olivat edelleen melko suuria. Biokalvon ”kypsymiseen” kului jopa 14 viikkoa, ja testiaineena käytetyn pinta-aktiivisen aineen en ­
simmäisen lisäyksen jälkeen kesti vielä 4–8 viikkoa, ennen kuin mukautu ­
minen tapahtui.
 
3. Baumann  et al.  (3) kehittivät huomattavasti pienemmän suodattimen, jossa 
biokalvoa tukevana inerttinä aineena käytettiin ”polyesterifleeceä”, jota oli liotettu aiemmin aktiivilietteessä. Testikemikaalia käytettiin ainoana hiilen 
lähteenä, ja biohajoavuutta arvioitiin mittaamalla liuennut orgaaninen 
hiili (DOC) tulo- ja poistovedessä sekä ulostulevan kaasun CO
 2 -määrän 
perusteella.  
4. Gloyna  et al.  (4) käyttivät hyvin erilaista lähestymistapaa. He keksivät pyö ­
rivän putkireaktorin. Pyörivän putken sisäpintaan kasvatettiin biokalvo tun ­
netulle pinta-alalle syöttämällä tulovettä putken yläpäästä, kun putki oli 
kallistettu pieneen vaakasuuntaiseen kulmaan. Reaktoria on käytetty pinta-aktiivisten aineiden biohajoavuuden tutkimiseen (5) sekä biokalvon 
optimaalisen paksuuden ja kalvon läpi tapahtuvan diffuusion tutkimiseen 
(6). Jälkimmäisenä mainitut tekijät jatkokehittivät reaktoria muokkaamalla sitä mm. siten, että ulostulevasta kaasusta voidaan määrittää CO
 2 . 
5. Yhdistyneen kuningaskunnan SCA (Standing Committee of Analysts) on 
hyväksynyt pyörivän putkireaktorin kemikaalien biohajoavuuden (7) sekä 
jätevesien käsiteltävyyden ja toksisuuden (8) määrittämisen vakiomenetel ­
mäksi. Tässä kuvatun menetelmän etuja ovat yksinkertaisuus, pieni koko, toistettavuus ja orgaanisen aineen suhteellisen pienet tilavuudet.
 
TESTIN PERIAATE  
6. Synteettistä jätevettä tai kotitalousjätevettä sekä testikemikaalia lisätään se ­
koitettuna tai erikseen hitaasti pyörivän, kallistetun putken sisäpinnalle. Si ­
säpintaan kasvaa biosuodatusaineessa esiintyviä mikro-organismeja vastaava mikro-organismikerros. Reaktorin toimintaolosuhteet valitaan siten, että or ­
gaanisen aineen poistuminen ja tarvittaessa ammoniumin hapettuminen on 
riittävää.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1097
 
7. Putken poistovesi kerätään ja laskeutetaan ja/tai suodatetaan, ennen kuin 
liuennut orgaaninen hiili (DOC) ja/tai testikemikaali analysoidaan spesifi ­
sellä menetelmällä. Kontrolliyksiköitä, joihin ei lisätä testikemikaalia, käy ­
tetään rinnakkain samoissa olosuhteissa vertailua varten. Poistoveden DOC-pitoisuuksien erot testi- ja kontrolliyksikössä johtuvat oletettavasti tes ­
tikemikaalista ja sen orgaanisista metaboliiteista. Tätä eroa verrataan lisätyn 
kemikaalin pitoisuuteen (DOC:na), jotta voidaan laskea testikemikaalin po ­
istuma.
 
8. Biohajoaminen voidaan tavallisesti erottaa biosorptiosta tarkastelemalla 
poistuma-aikakäyrää huolellisesti. Tulos voidaan yleensä vahvistaa biohajoa ­
vuuden testillä (hapenkulutus tai hiilidioksidin tuotanto), jossa käytetään 
sopeutunutta inokulaattia, joka on otettu testin loputtua reaktoreista, joihin 
testikemikaalia lisättiin.  
TESTIKEMIKAALIA KOSKEVIA TIETOJA  
9. Testikemikaalin puhtauden, vesiliukoisuuden sekä haihtuvuus- ja 
adsorptio-ominaisuuksien on oltava tiedossa, jotta tulokset voidaan tulkita oikein.
 
10. Haihtuvia ja heikosti liukenevia kemikaaleja ei tavallisesti voida testata 
ilman erityisiä varotoimia (katso luvun C.10 A lisäys 5). Kemiallisen raken ­
teen tai vähintään empiirisen kaavan on oltava tiedossa, jotta voidaan laskea 
teoreettiset arvot ja/tai tarkistaa mitatut parametriarvot, kuten teoreettinen hapenkulutus (ThOD) ja DOC.
 
11. Tieto testikemikaalin toksisuudesta mikro-organismeille (katso luvun C.10 A 
lisäys 4) voi olla hyödyllinen soveltuvia testipitoisuuksia valittaessa ja olen ­
nainen matalien biohajoavuusarvojen oikean tulkinnan kannalta.  
KYNNYSARVOT  
12. Alun perin pinta-aktiivisten aineiden primaarisen biohajoamisen täytyi olla 
vähintään 80 prosenttia, jotta kemikaalia voitiin markkinoida. Jos 80 pro ­
sentin arvoa ei saavuteta, tätä simulaatiotutkimusta (toteamiskoetta) voidaan 
soveltaa ja pinta-aktiivista ainetta voidaan markkinoida vain, jos yli 90 prosenttia spesifisestä kemikaalista poistuu. Yleensä ei ole epäselvää, läpäi ­
sevätkö kemikaalit testin, ja poistumaprosenttia voidaan käyttää laskettaessa 
todennäköistä pitoisuutta ympäristössä, jota käytetään kemikaalin vaaralli ­
suuden arvioinnissa. Useissa puhtaiden kemikaalien tutkimuksissa DOC:n poistumaprosentti oli yli 90 prosenttia yli kolmessa neljäsosassa tapauksista ja yli 80 prosenttia yli 90 prosentissa kemikaaleista, joissa ilmeni merkittä ­
vää biohajoavuutta.
 
VERTAILUKEMIKAALIT  
13. Jotta voidaan varmistaa, että kokeellinen menetelmä suoritetaan oikein, on 
hyvä testata välillä kemikaaleja, joiden käyttäytyminen on tiedossa. Tällaisia 
kemikaaleja ovat esimerkiksi adipiinihappo, 2-fenyylifenoli, 1-naftoli, difee ­
nihappo ja 1-naftoehappo.  
TESTITULOSTEN TOISTETTAVUUS  
14. Yhdistyneen kuningaskunnan laboratorion mukaan suhteellinen keskihajonta 
oli testien sisällä 3,5 prosenttia ja testien välillä 5 prosenttia (7).  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1098
 
MENETELMÄN KUVAUS  
Laite  
Pyörivät putkireaktorit  
15. Laite (lisäyksen 8 kuvat 1 ja 2) koostuu akryyliputkikehikosta. Jokaisen 
putken pituus on 30,5 cm ja sisähalkaisija 5 cm, ja niitä kannattavat metal ­
litukikehikossa olevat kumireunustetut pyörät. Jokaisessa putkessa on asen ­
nusreuna, jonka syvyys on noin 0,5 cm, jotta se pysyy pyörillä. Sisäpinta on karhennettu karkealla teräsvillalla, ja yläpäässä (syöttöpäässä) on 0,5 senttiä 
syvä sisäreuna, joka pitää nesteen sisällä. Putket on kallistettu vaakasuun ­
taisesti noin yhden asteen kulmaan, jotta vaadittu kontaktiaika saavutetaan, kun testiainetta lisätään puhtaaseen putkeen. Kumipyöriä pyöritetään hitaal ­
la, muuttuvanopeuksisella moottorilla. Putkien lämpötilaa kontrolloidaan 
asentamalla ne lämpötilasäädettyyn huoneeseen.
 
16. Kun jokainen putkireaktori suljetaan hieman suurempaan suljettuun putkeen 
ja varmistetaan, että liitokset ovat kaasutiiviitä, ulostuleva CO  2 -kaasu voi ­
daan kerätä emäksiseen liuokseen myöhempää mittausta varten (6).  
17. Jokaisesta putkesta kerätään 24 tunnin tuotos orgaanista ainetta ja mahdol ­
lisesti lisättyä testikemikaalia 20 l:n säilytysastiaan (A) (katso kuva 2). 
Testikemikaaliliuos voidaan tarvittaessa annostella erikseen. Lähellä jokaisen säilytysastian pohjaa on ulostulo, joka on yhdistetty soveltuvalla letkulla 
(esim. silikonikumisella) peristalttisen pumpun (B) kautta lasiseen tai akryy ­
liseen syöttöputkeen, joka tulee 2–4 cm kallistetun putken (C) ylemmän pään (syöttöpään) sisään. Poistoveden annetaan tippua kallistetun putken alapäästä, josta se kerätään toiseen säilytysastiaan (D). Poistovesi selkeyte ­
tään tai suodatetaan ennen analyysiä.
 
Suodatinlaite-sentrifugi  
18. Näytteiden suodattamiseen käytettävä kalvosuodatin, jonka huokoskoko on 
sopiva (aukon nimellishalkaisija 0,45 μm) ja joka adsorboi orgaanisia kemi ­
kaaleja tai vapauttaa mahdollisimman vähän orgaanista hiiltä. Jos käytettävät suodattimet vapauttavat orgaanista hiiltä, poista orgaaninen hiili pesemällä suodattimet huolellisesti kuumalla vedellä. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää 
sentrifugia, jolla voidaan saavuttaa 40 000 m/s
 2 :n kiihtyvyys.  
19. Analyysilaitteet seuraavia määrityksiä varten:  
— DOC / orgaanisen hiilen kokonaispitoisuus (TOC) tai kemiallinen 
hapenkulutus (COD)  
— spesifinen kemikaali (HPLC, GC jne.) tarvittaessa  
— pH, lämpötila, happamuus ja emäksisyys  
— ammonium, nitriitti ja nitraatti, jos testit tehdään nitrifioivissa olosuh ­
teissa.  
Vesi 
20. Vesijohtovesi, jossa DOC:tä on alle 3 mg/l.  
21. Tislattu tai deionisoitu vesi, jossa DOC:tä on alle 2 mg/l.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1099
 
Orgaaninen aine  
22. Orgaanisena aineena voidaan käyttää synteettistä jätevettä, kotitalousjäte ­
vettä tai näiden yhdistelmää. On osoitettu, että pelkän kotitalousjäteveden käyttö nostaa usein DOC:n poistumaprosenttia (aktiivilieteyksiköissä) ja sal ­
lii jopa sellaisten kemikaalien biologisen hajoamisen, jotka eivät hajoa bio ­
logisesti käytettäessä OECD:n synteettistä jätevettä. Niinpä kotitalousjäteve ­
den käyttö on suositeltavaa. Mittaa jokaisen uuden orgaanisen aine-erän DOC-pitoisuus (tai COD-pitoisuus). Orgaanisen aineen happamuuden tai 
emäksisyyden täytyy olla tiedossa. Orgaaniseen aineeseen voi olla tarpeen 
lisätä soveltuvaa puskuria (natriumvetykarbonaattia tai kaliumvetyfosfaattia), jos happamuus tai emäksisyys on matala, jotta pH on 7,5 ± 0,5 reaktorissa 
testin aikana. Lisättävän puskurin määrä ja lisäämisen ajankohta on pää ­
tettävä tapauskohtaisesti.
 
Synteettinen jätevesi  
23. Liuota yhteen litraan vesijohtovettä: 160 mg peptonia, 110 mg lihauutetta, 
30 mg ureaa, 28 mg vedetöntä dikaliumvetyfosfaattia (K  2 HPO  4 ), 7 mg 
natriumkloridia (NaCl), 4 mg kalsiumklorididihydraattia (CaCl  2 .2H  2 O), 2 
mg magnesiumsulfaattiheptahydraattia (MgSO  4 .7H  2 O). Tämä OECD:n syn ­
teettinen jätevesi on esimerkki, ja siinä tulovirtauksen DOC-pitoisuuden keskiarvo on noin 100 mg/l. Vaihtoehtoisesti voi käyttää muita koostumuk ­
sia, joiden DOC-pitoisuus on suunnilleen sama ja jotka ovat lähempänä 
oikeaa jätevettä. Tätä synteettistä jätevettä voidaan valmistaa tislattuun ve ­
teen väkevöidyssä muodossa. Se säilyy viikon noin 1 °C:n lämpötilassa. Laimenna tarvittaessa vesijohtovedellä. (Tämä aine ei ole tyydyttävä, sillä 
esimerkiksi typpipitoisuus on hyvin korkea ja hiilipitoisuus suhteellisen ma ­
tala, mutta parempia ehdotuksia ei ole tehty, lukuun ottamatta fosfaatin lisäämistä puskurina ja peptonin lisäämistä).
 
Kotitalousjätevesi  
24. Käytä tuoretta selkeytettyä jätevettä, jota kerätään päivittäin puhdistamosta, 
johon tulee pääasiassa kotitalousjätevettä. Jätevesi kerätään primaarisen se ­
dimentaatioaltaan ylivuotokanavasta tai aktiivilietelaitoksen syötöstä, eikä siinä saa juurikaan olla karkeita hiukkasia. Jätevettä voidaan käyttää, kun sitä on säilytetty usea päivä noin 4 °C:n lämpötilassa, jos voidaan todistaa, 
että DOC (tai COD) ei ole laskenut merkittävästi (alle 20 %) säilytyksen 
aikana. Jotta järjestelmän häiriöt voidaan välttää, jokaisen uuden erän DOC (tai COD) on säädettävä soveltuvaan vakioarvoon esimerkiksi vesijohtove ­
dellä laimentamalla.
 
Voiteluaine  
25. Peristalttisen pumpun rullat voidaan voidella glyserolilla tai oliiviöljyllä. 
Kumpikin aine sopii silikonikumisiin letkuihin.  
Testikemikaalin kantaliuokset  
26. Jos kemikaalin liukoisuus on riittävä, valmista kantaliuokset, joiden pitoi ­
suus on soveltuva (esim. 1–5 g/l), deionisoituun veteen tai synteettisen jäteveden mineraaleihin. Tietoa liukenemattomista kemikaaleista on luvun 
C.10-A lisäyksessä 5. Tämä menetelmä soveltuu haihtuville kemikaaleille 
ilman, että putkireaktoreihin tarvitsee tehdä muutoksia (kohta 16). Määritä kantaliuoksen DOC ja TOC ja toista mittaukset jokaiselle uudelle erälle. Jos DOC- ja TOC-arvon välinen ero on yli 20 prosenttia, tarkista testikemikaalin 
vesiliukoisuus. Varmista, että saanto on riittävän hyvä (tavallisesti > 90 
prosenttia on odotettavissa), vertaamalla nimellisarvoon DOC-arvoa tai
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1100
 
testikemikaalin pitoisuutta, joka on mitattu kantaliuoksen ominaisanalyysilla. 
Varmista etenkin dispersioiden osalta, voidaanko DOC-arvoa käyttää ana ­
lyyttisenä parametrina vai voidaanko käyttää ainoastaan testikemikaalikoh ­
taista analyysimenetelmää. Näytteet on sentrifugoitava, jos kyseessä on dis ­
persio. Mittaa jokaisen uuden erän DOC, COD tai testikemikaali ominaisa ­
nalyysilla.  
27. Määritä kantaliuoksen pH. Äärimmäiset arvot viittaavat siihen, että kemikaa ­
lin lisääminen saattaa vaikuttaa testijärjestelmän aktiivilietteen pH-arvoon. Jos näin käy, neutraloi kantaliuos pienillä määrillä epäorgaanista happoa tai 
emästä, kunnes pH on 7 ± 0,5, mutta vältä testikemikaalin saostumista.
 
MENETTELY  
Orgaanisen aineen valmistelu annostusta varten  
28. Varmista, ettei tulo- ja poistoveden säiliössä tai tuloveden säiliöistä tulevissa 
ja poistoveden säiliöön johtavissa putkissa ole mikrobikasvustoja puhdista ­
malla ne huolellisesti ennen testiä ja testin aikana.  
29. Valmista tuoretta synteettistä jätevettä (kohta 23) päivittäin joko kiinto ­
aineesta tai väkevöidystä kantaliuoksesta laimentamalla sitä sopivassa suh ­
teessa vesijohtovedellä. Mittaa tarvittava määrä sylinteriin ja lisää se puhta ­
aseen tuloveden säiliöön. Jos tarpeen, lisää synteettiseen jäteveteen tarvittava määrä testikemikaalin tai vertailukemikaalin kantaliuosta ennen laimentamis ­
ta. Jos testikemikaalin häviötä on käytännöllistä tai tarpeellista välttää, val ­
mista erillinen laimennettu testikemikaaliliuos erillisessä säiliössä ja syötä se 
kallistettuihin putkiin erillisellä annostelupumpulla.
 
30. Vaihtoehtoisesti (ja mieluiten) voidaan käyttää selkeytettyä kotitalousjäte ­
vettä (kohta 24), joka kerätään päivittäin tuoreena, jos mahdollista.  
Pyörivien putkireaktoreiden toiminta  
31. Yhden testikemikaalin arviointiin tarvitaan kaksi identtistä putkireaktoria, ja 
ne kootaan huoneessa, jonka lämpötilaa säädellään (tavallisesti 22 ± 2 °C).  
32. Säädä peristalttinen pumppu pumppaamaan orgaanista ainetta (ilman testi ­
kemikaalia) nopeudella 250 ± 25 ml/h kallistettuihin putkiin, joita pyörite ­
tään nopeudella 18 ± 2 rpm. Voitele pumpun putket aluksi voiteluaineella 
(kohta 25) ja toista voitelu säännöllisesti, jotta putket toimivat asianmukai ­
sesti ja kestävät pitkään.  
33. Säädä putkien kallistuskulma vaakasuuntaisesti siten, että puhtaaseen put ­
keen syötetyn liuoksen viipymäaika on 125 ± 12,5 sekuntia. Arvioi retentio ­
aika lisäämällä syötettävään liuokseen ei-biologista merkkiainetta (esim. 
NaCl, inertti väriaine): huippupitoisuuden saavuttamiseen poistovedessä ku ­
luvaa aikaa pidetään keskimääräisenä retentioaikana (kun kalvo on suurim ­
millaan, retentioaika voi nousta noin 30 minuuttiin).  
34. Näiden nopeuksien ja aikojen on todettu tuottavan riittävät (> 80 %) DOC- 
(tai COD-) poistumat ja tuottavan nitrifioitua poistovettä. Virtausnopeutta on muutettava, jos poistuma ei ole riittävää tai jos on tarkoitus simuloida tietyn puhdistuslaitoksen toimintaa. Säädä jälkimmäisessä tapauksessa orgaanisen 
aineen annostelunopeutta, kunnes reaktorin toiminta vastaa puhdistuslaitok ­
sen toimintaa.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1101
 
Ymppäys  
35. Ilmalevinteinen ymppäys voi riittää käynnistämään mikro-organismien kas ­
vun, kun käytetään synteettistä jätevettä. Muussa tapauksessa lisää 1 ml/l selkeytettyä jätevettä syötteeseen 3 päivän ajan.
 
Mittaukset  
36. Tarkista säännöllisesti, että annosnopeudet ja pyörimisnopeudet ovat vaa ­
dituissa rajoissa. Mittaa myös poistoveden pH varsinkin, jos nitrifikaatio on odotettavissa.
 
Näytteenotto ja näytteiden analyysi  
37. Näytteenoton menetelmä, malli ja tiheys valitaan testin tarkoituksen mukai ­
sesti. Tulo- ja poistovedestä voi ottaa hetkellisiä näytteitä tai kerätä näytteitä pitemmällä aikavälillä (esim. 3–6 h). Ota ensimmäisellä jaksolla (ilman 
testikemikaalia) näytteitä kahdesti viikossa. Suodata näytteet kalvojen läpi 
tai sentrifugoi kiihtyvyydellä 40 000 m/s
 2 noin 15 minuutin ajan (kohta 18). 
Näytteet voi olla tarpeen selkeyttää ja/tai karkeasuodattaa ennen kalvosuo ­
datusta. Määritä DOC (tai COD) ainakin kahdesti ja tarvittaessa BOD, am ­
monium ja nitriitti/nitraatti.  
38. Kaikki analyysit on tehtävä mahdollisimman pian näytteiden keräämisen ja 
valmistelun jälkeen. Jos analysointia on lykättävä, säilytä näytteitä täysissä 
ja tiiviisti suljetuissa pulloissa pimeässä tilassa, jonka lämpötila on noin 4 °C. Jos näytteitä on säilytettävä yli 48 tuntia, säilö ne pakastamalla, hap ­
ottamalla tai lisäämällä soveltuvaa myrkyllistä kemikaalia (esim. 20 ml/l 
elohopea(II)kloridiliuosta, jonka pitoisuus on 10 g/l). Varmista, ettei säilö ­
mistapa vaikuta analyysin tuloksiin.
 
Esivaihe  
39. Tässä vaiheessa pintabiokalvo kasvaa optimaaliseen paksuuteen. Siinä kestää 
yleensä noin 2 viikkoa, mutta ei kuitenkaan yli 6 viikkoa. DOC-poistuma 
(tai COD-poistuma) (kohta 44) kasvaa ja saavuttaa tasannearvon. Kun kum ­
massakin putkessa saavutetaan vastaavat tasannearvot, toinen putki valitaan kontrolliputkeksi testin loppuvaiheen ajaksi. Putkien toiminnan on pysyttävä 
yhdenmukaisena tämän ajan.
 
Testikemikaalin lisääminen  
40. Lisää tässä vaiheessa testikemikaali toiseen reaktoriin vaaditussa pitoisuu ­
dessa, yleensä 10–20 mg C/l. Kontrolliin tulee edelleenkin pelkkää orgaa ­
nista ainetta.  
Akklimatisaatiojakso  
41. Jatka DOC:n (tai COD:n) analysointia kahdesti viikossa, ja jos halutaan 
arvioida primaarista biohajoamista, mittaa myös testikemikaalin pitoisuus ominaisanalyysillä. Odota testikemikaalin ensimmäisen lisäyksen jälkeen 
1–6 viikkoa (tai kauemmin erityisolosuhteissa), jotta akklimatisaatio tapah ­
tuu. Kun poistumaprosentti (kohdat 43–45) saavuttaa enimmäisarvon, mää ­
ritä 12–15 luotettavaa arvoa tasannevaiheessa noin 3 viikon aikana keski ­
määräisen poistumaprosentin arviointia varten. Testi on valmis, jos saavute ­
taan riittävän korkea poistumisaste. Yleensä testin ei ole tarkoitus kestää yli 
12 viikkoa testikemikaalin ensimmäisen lisäämisen jälkeen.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1102
 
Kalvon irtoaminen liuskoina  
42. Ylimääräistä kalvoa irtoaa säännöllisin väliajoin liuskoina putkista. Varmista 
tulosten vertailukelpoisuuden säilyminen antamalla testin kattaa vähintään kaksi täyttä kasvu- ja irtoamisjaksoa.
 
TIEDOT JA RAPORTOINTI  
Tulosten käsittely  
43. Laske testikemikaalin DOC-poistumaprosentti (tai COD-poistumaprosentti) 
jokaisen ajoitetun arvioinnin osalta käyttämällä kaavaa:  
D t ¼ 100 ½C s Ä ðE Ä E o Þâ=C s % 
jossa  
D t = DOC-poistumaprosentti (tai COD-poistumaprosentti) aikana t  
Cs = testikemikaalin aiheuttama tuloveden DOC-pitoisuus (tai 
COD-pitoisuus), mieluiten arvioituna kantaliuoksen pitoisuuden ja li ­
sätyn tilavuuden perusteella (mg/l)  
E = testipoistovirrasta mitattu DOC-arvo (tai COD-arvo) aikana t (mg/l)  
Eo = kontrollipoistovirrasta mitattu DOC-arvo (tai COD-arvo) aikana t 
(mg/l)  
Tee samat laskelmat vertailukemikaalille, jos sellaista testataan.  
Kontrollireaktorin toiminta  
44. Orgaanisen aineen DOC-poistumisaste (tai COD-poistumisaste) (D  B ) kont­
rollireaktoreissa antaa hyödyllistä tietoa, kun biokalvon biohajoamistoimin ­
taa arvioidaan testin aikana. Laske poistumaprosentti seuraavan kaavan avul ­
la: 
D B ¼ 100 ð1 Ä E o=C m Þ % 
jossa  
Cm = DOC (tai COD) kontrollitulovirran orgaanisessa aineessa (mg/l).  
45. Laske testikemikaalin poistuma (D  ST ), jos se on mitattu, ominaisanalyysillä 
jokaisella arviointikerralla seuraavalla kaavalla:  
DST ¼ 100 ð1 Ä S e=S i Þ % 
jossa  
Si = testikemikaalin mitattu tai mieluiten arvioitu pitoisuus testitulovir ­
rassa (mg/l)  
Se = testikemikaalin mitattu pitoisuus testipoistovirrassa aikana t (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1103
 
Jos analyysimenetelmällä saadaan jätevedessä positiivinen arvo, joka vastaa 
arvoa S  c mg/l laske poistumaprosentti (D  SC ) seuraavalla kaavalla:  
DSC ¼ 100 ðS i Ä S e þ S c Þ=ðS i þ S c Þ % 
Testitulosten ilmaiseminen  
46. Esitä poistumaprosentti D  t ja D  ST (tai D  SC ), jos käytettävissä, graafisesti ajan 
funktiona (katso lisäys 2, luku C.10-A). Tasannevaiheessa otettujen 12–15 
D T -arvon (ja D  ST -arvon, jos käytettävissä) kokonaisluvuksi pyöristetty keski ­
arvo ja keskihajonta ovat testikemikaalin poistumaprosentti. Poistumakäyrän 
muodosta voidaan tehdä joitakin päätelmiä poistumisprosessista.  
Adsorptio  
47. Jos testikemikaalin DOC-poistuma on korkea testin alussa, testikemikaali 
poistuu todennäköisesti adsorboitumalla biokalvoon. Tämän todistaminen voi olla mahdollista määrittämällä kalvosta liuskoina irronneeseen kiinto ­
aineeseen adsorboitunut testikemikaali. Adsorboituvien kemikaalien 
DOC-poistuma ei tavallisesti pysy korkeana koko testin ajan. Tavallisesti poistumisaste on korkea aluksi ja laskee sitten hiljalleen tasapainoarvoon. Jos adsorboitunut testikemikaali aiheutti kuitenkin mikrobipopulaation adap ­
toitumista, testikemikaalin DOC-poistuma nousee myöhemmin ja saavuttaa 
korkean tasannearvon.
 
Lag-vaihe  
48. Samoin kuin staattisissa seulontatesteissä, monet testikemikaalit vaativat 
lag-vaiheet, ennen kuin biologinen hajoaminen on täydellistä. Lag-vaiheen 
aikana kompetentit bakteerit adaptoituvat eikä testikemikaalia poistu juuri 
lainkaan. Sen jälkeen alkaa näiden bakteerien alkukasvu. Tämä vaihe loppuu ja hajoamisvaiheen katsotaan alkavan suunnilleen silloin, kun noin 10 pro ­
senttia testikemikaalin alkuperäisestä määrästä on poistunut (adsorptio huo ­
mioiden, jos sitä tapahtuu). Lag-vaihe on usein erittäin vaihteleva, ja sen 
toistettavuus on huono.
 
Tasannevaihe  
49. Jatkuvassa testissä poistumakäyrän tasannevaihe on vaihe, jossa hajoaminen 
on maksimaalista. Tasannevaiheen on kestettävä vähintään 3 viikkoa, ja sen 
aikana on mitattava noin 12–15 kelvollista arvoa.  
Testikemikaalin keskimääräinen poistumisaste  
50. Laske testikemikaalin tasannevaiheen poistumisarvojen D  t (ja D  st , jos käy­
tettävissä) keskiarvo. Kun se pyöristetään lähimpään kokonaislukuun (1 %), saadaan testikemikaalin poistumisaste. On myös suositeltavaa laskea keski ­
arvon 95 prosentin luottamusväli. Laske samoin kontrolliastiassa olevan 
orgaanisen aineen keskimääräinen poistumisaste (D
 B ). ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1104
 
Viite biologisesta hajoamisesta  
51. Jos testikemikaali ei adsorboidu merkittävästi biokalvoon ja poistumakäyrän 
muoto vastaa tyypillistä biologisen hajoamisen käyrää, jossa näkyvät lag-, hajoamis- ja tasannevaihe (kohdat 48 ja 49), mitattua poistumaa voidaan 
pitää biologisesta hajoamisesta johtuvana. Jos poistuminen on aluksi runsas ­
ta, simulaatiotutkimuksella ei voida erottaa biologisia ja abioottisia eliminaa ­
tioprosesseja. Jos näin käy tai jos biologisesta hajoamisesta on muuten epävarmuutta (esim. haihtumista tapahtuu), analysoi adsorboituneet testike ­
mikaalit kalvonäytteissä tai testaa biologista hajoavuutta tekemällä lisää ti ­
lastollisia (seulonta)testejä niiden parametrien perusteella, jotka viittaavat selvästi biologisiin prosesseihin. Tällaisia testejä ovat hapenkulutuksen me ­
netelmät (tämän liitteen luku C.4, D, E ja F) (9) tai testi, joka mittaa CO
 2 - 
tuotantoa (tämän liitteen luku C.4-C tai kohta Headspace-menetelmä) (10). Käytä inokulaattina ennalta altistettua biokalvoa asianmukaisesta reaktorista.
 
52. Jos sekä DOC-poistuma että spesifisen kemikaalin poistuma on mitattu, 
poistumaprosenttien merkittävät erot (ensimmäinen on matalampi kuin jäl ­
kimmäinen) viittaavat siihen, että poistovesissä on orgaanisia välituotteita, 
jotka saattavat hajota heikosti. Niitä on tutkittava.  
Testitulosten luotettavuus  
53. Testi on luotettava, jos DOC-poistumisaste (tai COD-poistumisaste) (D  B ) 
kontrolliyksiköissä on > 80 prosenttia kahden viikon kuluttua eikä epätaval ­
lisia havaintoja ole tehty.  
54. Jos helposti biohajoavaa (vertailu)kemikaalia on testattu, biohajoamisen as ­
teen pitäisi olla > 90 prosenttia, eikä kahden rinnakkaistuloksen ero saa olla 
yli 5 prosenttia. Jos nämä kaksi ehtoa eivät täyty, tarkista kokeelliset me ­
netelmät ja/tai hanki kotitalousjätevettä toisesta lähteestä.  
55. Samoin kahden testikemikaalia käsittelevän rinnakkaisyksikön (jos käytössä) 
biohajoamisarvojen ero ei saa olla yli 5 prosenttia. Jos tämä kriteeri ei täyty, mutta poistumisasteet ovat korkeita, jatka analyysiä vielä kolme viikkoa. Jos poistumisaste on matala, tutki testikemikaalin inhibitiovaikutuksia, jos ne 
eivät ole tiedossa, ja toista testi käyttämällä testikemikaalin alempaa pitoi ­
suutta, jos se on mahdollista.
 
Testiraportti  
56. Testiraportissa on ilmoitettava seuraavat tiedot:  
Testikemikaali:  
— tunnistetiedot  
— fysikaalinen olomuoto ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, jos niillä 
on merkitystä.  
Testiolosuhteet:  
— mahdolliset testijärjestelmän muutokset varsinkin, jos testataan liukene ­
mattomia tai haihtuvia aineita  
— orgaanisen aineen tyyppi  
— teollisuusjäteveden osuus jätevedestä ja sen ominaisuudet, jos käytössä 
ja tiedossa  
— inokulaatiomenetelmä  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1105
 
— testikemikaalin kantaliuos – DOC (liuennut orgaaninen hiili) ja TOC 
(orgaanisen hiilen kokonaispitoisuus), valmistustapa, onko suspensio, 
käytetty testipitoisuus tai -pitoisuudet, syyt jos DOC ei ole alueella 10–20 mg/l, lisäystapa, ensimmäisen lisäyksen päivämäärä, mahdolliset pitoisuuden muutokset
 
— hydraulisen retentioajan keskiarvo (ilman kasvua), putken pyörimisnope ­
us, keskimääräinen kallistuskulma, jos mahdollista  
— tiedot liuskoina irtoamisesta, aika ja voimakkuus  
— testilämpötila ja -alue  
— käytetyt analyyttiset tekniikat.  
Testitulokset:  
— kaikki mitatut tiedot, DOC, COD, ominaisanalyysit, pH, lämpötila, 
N-kemikaalit, mikäli aiheellista  
— kaikki lasketut D  t - (tai D  tc -), D  B - ja D  S -arvot taulukoituina sekä poistu ­
makäyrät  
— lag- ja tasannevaiheiden tiedot, testin kesto, testikemikaalin tai vertailu ­
kemikaalin (jos testattu) ja kontrolliyksikön orgaanisen aineen poistumi ­
saste sekä tilastotiedot ja lausumat biologisesta hajoavuudesta ja testin luotettavuudesta
 
— tulosten pohdinta.  
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations 
in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. Res. 14: 753–758.
 
2) Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic deter ­
gents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable 
material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441–444.  
3) Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung zur 
Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF – Z. Umweltc ­
hem. Ökotox. 10: 214–220.  
4) Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental 
trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355–1357.  
5) Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional trickling 
filter. JAOCS 43: 92–94.  
6) Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by 
films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865–881.  
7) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, Lon ­
don. 
8) Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, London.
 
9) Tämän liitteen luku C.4 Biohajoavuuden määritys, A–F.  
10) ISO 14593 (1998). Water Quality-Evaluation in an aqueous medium of the 
ultimate biodegradability of organic substances. Method by analysis of rele ­
ased inorganic carbon in sealed vessels.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1106
 
Lisäys 8  
Kuva 1  
Pyörivät putket
  
Sanasto:  
tasokuva  
näkymä A/B  
vetävät pyörät  
välipyörät  
moottori  
alennusvaihde  
sisälaippa  
kallistusmekanismi  
kartiopyörävaihde  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1107
 
Kuva 2  
Virtauskaavio
  
A: syöttöallas  
B: peristalttinen pumppu  
C: pyörivä putki  
D: poistoveden keräysastia  
MÄÄRITELMÄT:  
Testikemikaali:  Tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos.  
Kemikaalit: UNCED-sopimuksissa ja niihin liittyvissä asiakirjoissa termiä ”ke ­
mikaali” käytetään laajassa merkityksessä, joka kattaa kaikki aineet, tuotteet, 
seokset, valmisteet yms., joita olemassa olevissa järjestelmissä voidaan käyttää.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1108
 
C.11.  BIOLOGINEN HAJOAMINEN  
AKTIIVILIETTEEN SOLUHENGITYKSEN INHIBITIOTESTI  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Tässä kuvatun menetelmän avulla arvioidaan testattavan aineen vai ­
kutus mikro-organismeihin määrittämällä soluhengitysaste tietyissä olosuhteissa, joissa testattavaa ainetta on läsnä eri suuruisina pitoi ­
suuksina.
 
Tällä seulontamenetelmällä voidaan nopeasti määrittää aineet, jotka 
saattavat vaikuttaa haitallisesti aerobisiin mikrobikasvustoihin sekä 
määrittää testattavien aineiden biologisiin hajoamiskokeisiin sopivat pitoisuudet, joilla ei ole inhibitiovaikutusta.
 
Ennen varsinaista koetta voidaan tehdä raja-annostesti. Sen avulla 
määritetään varsinaisessa kokeessa käytettävien pitoisuuksien rajat.  
Tutkimussuunnitelma sisältää kaksi kontrollia, joissa ei käytetä tut ­
kittavaa ainetta, toinen koesarjan alussa ja toinen koesarjan lopussa. Jokainen aktiiviliete-erä tulee lisäksi tarkistaa vertailuaineen avulla.
 
Tämä menetelmä soveltuu parhaiten sellaisten aineiden tutkimiseen, 
jotka vesiliukoisuutensa ja alhaisen haihtuvuutensa ansiosta todennä ­
köisesti jäävät veteen.  
Rajoitetusti väliaineisiin liukenevien aineiden EC  50 -määritys saattaa 
olla vaikeaa.  
Hapenkulutukseen perustuvat tulokset saattavat olla harhaanjohtavia, 
mikäli testattavalla aineella on taipumusta osallistua hapettavaan fos ­
forylaatioon.  
Seuraavat tiedot helpottavat testin suorittamista:  
— vesiliukoisuus,  
— höyrynpaine,  
— rakennekaava,  
— aineen puhtaus.  
Suositus:  
Aktiiviliete saattaa sisältää patogeenejä ja sitä on sen vuoksi käsitel ­
tävä varoen.  
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Soluhengitysasteella tarkoitetaan aerobisessa lietteessä olevien jäte ­
veden mikro-organismien hapenkulutusta, joka yleensä ilmoitetaan 
muodossa mg O  2 /mg lietettä tunnissa.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1109
 
Kun lasketaan testattavan aineen tietyn pitoisuuden inhibitiovaikutus, 
soluhengitysaste ilmoitetaan prosentteina kahden kontrollin soluhen ­
gitysasteen keskiarvosta:  
Í 
1 Ä 2R s 
Rc 1 þ Rc  2 Î 
Ü 100 ¼ procentuell hämming  
jossa:  
R s = testatun aineen hapenkulutusaste koepitoisuuden,  
Rc 1 = hapenkulutusaste, kontrolli 1,  
Rc 2 = hapenkulutusaste, kontrolli 2.  
Tässä menetelmässä EC  50 :llä tarkoitetaan testattavan aineen pitoi ­
suutta, jota käytettäessä hengitysaste on 50 % kokeessa käytetyn 
kontrollin soluhengitysasteesta.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Vertailuaineena suositellaan käytettäväksi 3,5-dikloorifenolia, joka 
on tunnettu hengitysinhibiittori. Jokaisen aktiiviliete-erän EC  50 testa­
taan tällä aineella, jotta voidaan varmistua siitä, että lietteen herkkyys ei ole epänormaali.
 
1.4 TESTIN PERIAATE  
Standardiannoksella synteettistä jätevesiravinnetta ravitun aktiiviliet ­
teen soluhengitysaste mitataan 30 minuutin ja/tai kolmen tunnin kon ­
taktiajan kuluttua. Saman aktiivilietteen soluhengitysaste mitataan samoissa koeolosuhteissa, kun siihen on lisätty erisuuruisia pitoi ­
suuksia testattavaa ainetta. Testattavan aineen tietyn pitoisuuden in ­
hiboiva vaikutus ilmaistaan prosentteina kahden kontrollin soluhen ­
gitysasteen keskiarvosta. EC
 50 -arvo lasketaan eri pitoisuuksilla teh ­
dyistä määrityksistä.  
1.5 LAATUVAATIMUKSET  
Testitulokset ovat hyväksyttäviä, jos  
— kahden kontrollin hengitysasteissa on korkeintaan 15 %:n ero,  
— 3,5-dikloorifenolin EC  50 -arvo (30 minuuttia ja/tai 3 tuntia) on 
välillä 5–30 mg/l.  
1.6 TESTIN KUVAUS  
1.6.1  Reagenssit  
1.6.1.1 T e s t a t t a v a s t a a i n e e s t a t e h d y t l i u o k s e t  
Tutkimuksen alkaessa testattavasta aineesta tehdään tuore liuos käyt ­
tämällä varastoliuosta. Varastohuoksen soveltuva pitoisuus on 0,5 
g/l, kun testi suoritetaan alla selostettua menettelytapaa noudattaen.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1110
 
1.6.1.2 K o n t r o l 1 i a i n e l i u o s  
3,5-dikloorifenoliliuos voidaan valmistaa esimerkiksi seuraavasti: liu ­
otetaan 0,5 g 3,5-dikloorifenolia 10 ml:aan 1 M NaOH:a, laimenne ­
taan noin 30 ml:aan tislatulla vedellä, liuokseen sekoitetaan 0,5 M 
H 2 SO 4 :a kunnes saostuminen alkaa — tähän tarvitaan noin 8 ml 0,5 
M H  2 SO 4 :ää — ja lopuksi seoksesta tehdään litra liuosta lisäämällä 
tislattua vettä. Liuoksen pH on tällöin 7–8.  
1.6.1.3 S y n t e e t t i n e n j ä t e v e s i  
Synteettinen jätevesiravinneliuos valmistetaan liuottamalla seuraavat 
ainemäärät litraan vettä:  
— 16 g peptonia,  
— 11 g lihauutetta,  
— 3 g ureaa,  
— 0,7 g NaCl,  
— 0,4 g CaCl  2 .2H  2 O, 
— 0,2 g MgSO  4 .7H  2 O, 
— 2,8 g K  2 HPO  4 . 
Huomautus 1:  Tämä synteettinen jätevesi on 100-kertainen tiiviste 
OECD:n teknisessä raportissa ”Proposed method for the determina ­
tion of the biodegrability of surfactants used in synthetic detergents” 
(June 11, 1976) esitetystä jätevedestä, paitsi että se sisältää myös dikaliumvetyfosfaattia.
 
Huomautus 2:  Ellei ravintoainetta käytetä välittömästi valmistuksen 
jälkeen, sitä säilytetään pimeässä 0–4  o C:n lämpötilassa enintään vii ­
kon ajan. Aineen koostumus ei saa muuttua säilytyksen aikana. Ra ­
vintoaine voidaan myös steriloida ennen säilytystä tai peptoni ja 
lihauute voidaan lisätä vasta juuri ennen testin suorittamista. Ennen käyttöä liuos sekoitetaan huolellisesti ja sen pH säädetään.
 
1.6.2  Laitteet  
Mittauslaite: Mittauslaitetta ei ole tarkoin määrätty. Nesteen yläpuo ­
lella ei saisi kuitenkaan olla tilaa ja elektrodin olisi sovittava tiukasti 
mittapullon kaulaan.  
Testiin tarvitaan tavanomaisia laboratoriovälineitä ja erityisesti jäl ­
jempänä lueteltuja laitteita:  
— mittauslaite,  
— ilmastuslaite,  
— pH-elektrodi |a mittauslaite,  
— O  2 -elektrodi.  
1.6.3  Inokulaatin valmistus  
Testissä käytetään mikrobi-inokulaattia, joka on tehty pääasiassa ko ­
titalousjätevesiä puhdistavan laitoksen aktiivilietteestä.  
Suuret hiukkaset poistetaan antamalla laboratorioon tuodun lietteen 
selkeytyä jonkin aikaa, esim. 15 minuuttia, jonka jälkeen hienojakoi ­
sempi pintakerros otetaan talteen. Toinen tapa on sekoittaa lietettä 
sekoittimella muutaman sekunnin ajan.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1111
 
Jos lietteessä arvellaan olevan inhiboivaa ainetta, liete pestään vesi ­
johtovedellä tai isotonisella liuoksella. Sentrifugoinnin jälkeen kel ­
luva neste poistetaan (tämä menettely toistetaan kolme kertaa).  
Pieni määrä lietettä kuivataan ja punnitaan. Tämän perusteella voidaan 
laskea, paljonko märkää lietettä on sekoitettava veteen, jotta saadaan 
aktiivilieteliuos, jonka kiinteiden aineiden osuus on 2–4 g/l. Tämä taso edellyttää 0,8–1,6 gramman pitoisuutta litrassa testiliuosta, kun käytetään jäljempänä suositeltua menettelytapaa.
 
Ellei lietettä voida käyttää hankintapäivänä, lisätään edellä seloste ­
tulla tavalla valmistettuun aktiivilietteeseen 50 ml synteettistä jäte ­
vettä litraa kohden. Seosta ilmastetaan 20 ± 2  o C:n lämpötilassa yön 
yli ja pidetään ilmastettuna, kunnes se käytetään seuraavana päivänä. Ennen käyttöä pH määritetään ja pH-arvoksi säädetään 6–8. Kiinteiden aineiden osuus liuoksessa määritetään edellisessä 
kappaleessa selostetulla tavalla.
 
Jos samaa liete-erää käytetään useana peräkkäisenä päivänä (enintään 
neljänä päivänä), lietteeseen lisätään jokaisen käyttöpäivän iltana 
synteettistä jätevettä 50 ml litraa kohden.  
1.6.4  Testin suorittaminen  
Kesto/kontaktiaika: 30 minuuttia ja/tai kolme tuntia, jonka 
kuluessa tapahtuu ilmastus 
Vesi: juomavettä (tarpeen vaatiessa kloori 
poistettu) 
Ilmansaanti: puhdasta, öljytöntä ilmaa. Ilman virtaus 
0,5–1 l/minuutti 
Määrityslaite: tasapohjainen pullo, esim. BOD-pullo Happimittari: piirturilla varustettu happielektrodi 
Ravinneliuos: synteettinen jätevesi (ks. edellä) 
Testattava aine: testissä käytetään testin alkaessa valmis ­
tettua tuoretta liuosta 
Vertailuaine: esim. 3,5-dikloorifenoli (vähintään 
kolme pitoisuutta) 
Kontrollit: inokuloitu näyte ilman testattavaa 
ainetta 
Lämpötila: 20 ± 2
 o C. 
Jäljempänä esitettyä menettelytapaa voidaan noudattaa sekä testatta ­
van aineen että vertailuaineen osalta kolmen tunnin kontaktiajan tes ­
tissä.  
Testiin tarvitaan useita astioita (esim. yhden litran dekantterilaseja).  
Testissä on käytettävä vähintään viittä pitoisuutta, joiden vakioero on 
enintään 3,2.  
Kokeen alkaessa eli ajassa ”0” tehdään 300 ml liuosta liuottamalla 
16 ml synteettistä jätevettä veteen. Tähän lisätään 200 ml mikrobi- 
inokulaattia ja näin saatu seos (500 ml) kaadetaan ensimmäiseen 
astiaan (ensimmäinen kontrolli C  1 ). ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1112
 
Koeastioita ilmastetaan jatkuvasti, jotta liuennut O  2 ei pääse laske ­
maan alle 2,5 mg/l, ja jotta juuri ennen soluhengityksen mittaamista 
O 2 -pitoisuus olisi noin 6,5 mg/l.  
Ajassa ”15 minuuttia” (15 minuuttia on valinnainen, mutta käyttö ­
kelpoinen aika) edelläoleva toistetaan, paitsi että 100 ml testattavan 
aineen varastoliuosta lisätään 16 ml:aan synteettistä jätevettä. Sen 
jälkeen lisätään vettä, jotta saadaan 300 ml liuosta ja mikrobi-inoku ­
laatti, jolloin määräksi tulee 500 ml. Seos kaadetaan astiaan numero kaksi ja ilmastetaan kuten edellä. Tämä toistetaan 15 minuutin välein 
muuttaen testattavan aineen varastohuoksen määrää siten, että saa ­
daan sarja astioita, joissa on testattavaa ainetta eri suuruisina pitoi ­
suuksina. Lopuksi valmistetaan toinen kontrolli (C
 2 ). 
Kolmen tunnin kuluttua kirjataan pH; ensimmäisestä astiasta otettu 
hyvin sekoitettu näyte kaadetaan määrityslaitteeseen ja soluhengity ­
saste mitataan enintään 10 minuutin ajalta.  
Sama toimenpide suoritetaan kunkin astian osalta 15 minuutin välein 
siten, että jokaisen astian kontaktiaika on kolme tuntia.  
Jokainen mikrobi-inokulaattierä testataan vertailuaineella samalla ta ­
voin.  
Kun määritykset suoritetaan 30 minuutin kontaktiajan jälkeen, me ­
nettelytapaa täytyy muuttaa (esim. yksi happimittari ei riitä).  
Jos kemiallisen hapenkulutuksen mittaus on tarpeen, valmistetaan 
koeastioita, jotka sisältävät testattavaa ainetta, synteettistä jätevesira ­
vinnetta ja vettä, mutta ei aktiivilietettä. Hapenkulutus määritetään ja kirjataan 30 minuutin ja/tai kolmen tunnin (kontaktiaika) ilmastuksen jälkeen.
 
2. TULOKSET JA NIIDEN ARVIOINTI  
Soluhengitysaste lasketaan piirturilta väliltä 6,5 mg O  2 /l–2,5 mg O  2 /l 
tai 10 minuutin ajalta soluhengitysasteen ollessa alhainen. Hengity ­
saste on määritettävä hengityskäyrän lineaarisesta kohdasta.  
Elleivät kahden kontrollin soluhengitysasteet ole 15 %:n sisällä toi ­
sistaan tai vertailuaineen EC  50 (30 minuuttia ja/tai kolme tuntia) ole 
hyväksyttävä (5–30 mg/l käytettäessä 3,5-dikloorifenolia), testiä ei voida hyväksyä ja se on uusittava.
 
Prosentuaalinen inhibitio määritetään kunkin pitoisuuden osalta (ks. 
1.2). Se esitetään pitoisuutta kohden log-normaali- (tai log-todennä ­
köisyys-) paperilla ja johdetaan EC  50 -arvo.  
EC 50 -arvojen 95 %:n luotettavuusrajat lasketaan standardimenetelmiä 
käyttäen.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1113
 
3. RAPORTOINTI  
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tie ­
dot: 
— testattava aine: kemiallinen rakenne,  
— testausmenetelmä: aktiivilietteen hankintapaikka, pitoisuus ja 
mahdollinen esikäsittely,  
— koeolosuhteet:  
— seoksen pH ennen soluhengityksen määrittämistä,  
— koelämpötila,  
— kokeen kesto,  
— vertailuaine ja siitä määritetty EC  50 , 
— abioottinen hapen yhteytys (mikäli esiintyy),  
— tulokset:  
— kaikki määritystulokset,  
— inhibitiokäyrä ja EC  50 -arvon laskutapa,  
— EC  50 mikäli mahdollista 95 %:n varmuusrajoin, EC  20 ja 
EC 80 , 
— kaikki tarkkailutulokset ja tämän testausmenetelmän muutok ­
set, joilla saattaa olla vaikutusta tuloksiin.  
3.2 TULOSTEN TULKINTA  
EC 50 -arvoa on pidettävä ainoastaan viitteenä testattavan aineen mah ­
dollisista myrkyllisistä vaikutuksista, jotka kohdistuvat jäteveden 
puhdistukseen aktiivilietemenetelmällä tai jäteveden mikro-organis ­
meihin, koska ympäristössä syntyviä monimutkaisia keskinäisiä vai ­
kutuksia ei pystytä tarkoin simuloimaan laboratoriokokeissa. Ammo ­
niakin hapettumista inhiboivien testattavien aineiden inhibitiokäyrät 
saattavat lisäksi olla epätyypillisiä. Niitä on tulkittava varovaisuutta noudattaen.
 
4. LÄHDELUETTELO  
1) Kansainvälinen standardi ISO 8192-1986.  
2) Broecker, B., Zahn, R.,  Water Research  11, 1977, s. 165.  
3) Brown, D., Hitz, H. R., Schaefer, L.,  Chemosphere  10, 1981, s. 
245. 
4) ETAD, (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs 
Manufacturing Industries),  Recommended Method  No 103, selos ­
tettu myöskin seuraavissa:  
5) Robra, B.,  Wasser/Abwasser  117, 1976, s. 80.  
6) Schefer, W.,  Textdveredlung  6, 1977, s. 247.  
7) OECD, Paris, 1981,  Test Guideline 209,  Decision of the Council 
C(84) 30 final.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1114
 
C.12.  BIOLOGINEN HAJOAMINEN  
MODIFIOITU SCAS-TESTI  
1. MENETELMÄ  
1.1 JOHDANTO  
Menetelmän tarkoituksena on arvioida vesiliukoisten, haihtumatto ­
mien orgaanisten aineiden mahdollinen lopullinen biologinen hajoa ­
minen, kun ne altistetaan pitkäksi ajaksi mikro-organismien suurille pitoisuuksille. Mikro-organismien elinkykyä pidetään edellä tämän 
ajan kuluessa lisäämällä selkeytettyä jätevesiravinnetta 
päivittäin. (Viikonloppuina tarvittava jätevesi voidaan varastoida 4
 o C:ssa. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää OECD:n toteamiskokeen 
synteettistä jätevettä.)  
Liuokseen suspensoituneisiin kiinteisiin aineosiin voi tapahtua fysi ­
kaalis-kemiallista adsorptiota ja tämä on otettava huomioon tuloksia 
tulkittaessa (ks. 3.2).  
Nestefaasin pitkän pidätysajan (36 tuntia) ja ravinteiden ajoittaisen 
lisäämisen vuoksi koe ei simuloi jätevesipuhdistamossa vallitsevia 
olosuhteita. Testattavilla aineilla saadut tulokset viittaavat siihen, 
että biologinen hajoamispotentiaali on testissä suuri.  
Tämä testi antaa erittäin sopivat puitteet testattavan yhdisteen hajot ­
tamiseen sopivien mikro-organismien valinnalle ja/tai adaptaatiolle. 
(Menetelmällä voidaan myös tuottaa adaptoituja inokulaatteja muita kokeita varten.)
 
Tässä menetelmässä liuenneen orgaanisen hiilen pitoisuuden mää ­
ritystä käytetään testattavien aineiden lopullisen biologisen hajoami ­
sen arviointiperusteena. Liuenneen hiilen määrittäminen happamaksi tekemisen ja huuhtelun jälkeen on suositeltavampaa kuin sen mää ­
rittäminen C
 kokonais  -C epaorgaaninen  erona.  
Samanaikaisesti käytetyllä ominaisanalyysimenetelmällä voidaan 
määrittää aineen biologinen primaarihajoaminen (alkuperäisen kemi ­
allisen rakenteen häviäminen).  
Tällä menetelmällä voidaan tutkia vain sellaisia orgaanisia aineita, 
jotka testissä käytetyn pitoisuuden osalta täyttävät seuraavat edelly ­
tykset:  
— ovat vesiliukoisia (vähintään 20 mg liuennutta orgaanista hiiltä/l),  
— joiden höyrynpaine on mitätön,  
— eivät estä bakteeritoimimaa,  
— eivät merkitsevästi absorboidu käytetyssä testissä,  
— eivät poistu testiliuoksesta vaahtoamisen vuoksi.  
Testattavan aineen sisältämä orgaaninen hiili on määritettävä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1115
 
Tiedot testattavan materiaalin pääaineosien suhteellisista osuuksista 
auttavat tulosten tulkinnassa, varsinkin jos tulokset ovat alhaisia tai 
marginaalisia.  
Tiedot aineen myrkyllisistä vaikutuksista mikro-organismeihin ovat 
avuksi alhaisten tulosten tulkinnassa ja oikeiden pitoisuuksien valin ­
nassa.  
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
C T = testattavan yhdisteen pitoisuus joko selkeytetyssä jätevedessä 
olevana tai siihen lisättynä orgaanisena hiilenä ilmastusjakson 
alkaessa (mg/l),  
C 1 = testissä käytetyn liuoksen kelluvaan nesteeseen liuenneen or ­
gaanisen hiilen pitoisuus ilmastusjakson lopussa (mg/l),  
C c = kontrolliliuoksen kelluvaan nesteeseen liuenneen orgaanisen 
hiilen pitoisuus ilmastusjakson lopussa (mg/l),  
Tässä menetelmässä biologinen hajoaminen ilmenee orgaanisen hiilen 
katoamisena. Biologinen hajoaminen voidaan ilmaista seuraavasti:  
1. Prosentuaalinen poistuma D  da päivittäin lisätyn aineen määrästä:  
D da ¼ C T Ä ðC t Ä C c Þ 
C T ñ100  (1)  
jossa  
D da = hajoaminen/päivittäinen lisäys.  
2. Prosentuaalinen poistuma  D ssd aineen määrästä päivän alkaessa:  
D ssd ¼ 2C T þ C ti Ä C ci Ä 3C  tðiþlÞ þ 3C  cðiþlÞ 
2C T þ C ti Ä C ci Ü 100 [2(a)]  
≈ 2C T Ä 2ðC t Ä C c Þ 
2C T þ ðC t Ä C c Þ Ü 100 [2(b)]  
jossa  
D ssd = hajoaminen/aine päivän alkaessa;  
indeksit i ja (i + 1) viittaavat määrityspäivään.  
Yhtälöä 2 (a) suositellaan käytettäväksi, mikäli poistoveteen liu ­
ennut orgaaninen hiili vaihtelee päivästä toiseen, kun taas yhtälö 2 
(b) sopii käytettäväksi määrän pysyessä suhteellisen vakiona päi ­
västä päivään.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1116
 
1.3 VERTAILUAINEET  
Tutkittaessa uutta ainetta vertailuaineista saattaa joissakin tapauksissa 
olla apua, mutta mitään tiettyä vertailuainetta ei kuitenkaan suositella.  
Joidenkin yhdisteiden rengasreaktioiden tulokset esitetään lisäyksessä 
1, jotta menetelmä voidaan kalibroida aika ajoin ja suorittaa tulosten vertailua jotakin toista menetelmää käytettäessä.
 
1.4 TESTIN PERIAATE  
Jätevesipuhdistamosta peräisin olevaa aktiivilietettä pannaan puolijat ­
kuvaan aktiivilieteyksikköön (semi-continuous activated sludge unit, SCAS). Testattava yhdiste selkeytetään, lisätään selkeytettyä kotita ­
lousjätevettä ja seosta ilmastetaan 23 tuntia. Tämän jälkeen ilmastus 
lopetetaan, lietteen annetaan selkeytyä ja kelluva neste poistetaan.
 
Ilmastuskammioon jäävään lietteeseen sekoitetaan uusi määräannos 
testattavaa yhdistettä ja jätevettä ja sykli toistetaan.  
Biologinen hajoaminen määritetään mittaamalla kelluvasta nesteestä 
liuenneen orgaanisen hiilen pitoisuus. Saatua arvoa verrataan kont ­
rolliin, johon on lisätty ainoastaan selkeytettyä jätevettä.  
Ominaisanalyyttisellä menetelmällä voidaan määrittää biologisesta 
hajoamisesta johtuvat muutokset alkuperäismolekyylin pitoisuudessa 
(biologinen primaarihajoaminen).  
1.5 LAATUVAATIMUKSET  
Tämän liuenneen orgaanisen hiilen poistumiseen perustuvan mene ­
telmän toistettavuutta ei vielä ole vahvistettu. (Biologisen primaa ­
rihajoamisen osalta saadaan hyvin tarkkoja tietoja aineista, joiden 
hajoavuus on hyvä.)  
Menetelmän herkkyys riippuu suuresti nollakokeen vaihteluista ja 
jonkin verran myös liuenneen orgaanisen hiilen määrityksen tarkkuu ­
desta sekä nesteessä olevan testattavan yhdisteen määrästä kunkin 
syklin alussa.  
1.6 TESTIN KUVAUS  
1.6.1  Testin valmistelu  
Testiä varten varataan puhtaita ilmastusyksiköitä tai vaihtoehtoisesti 
alkuperäinen 1,5 litran SCAS-testiyksikkö ja ilmaputki kutakin tes ­
tattavaa ainetta ja kontrollia varten (kuva 1). Koeyksikköihin pum ­
pataan vanusuodattimella puhdistettua paineilmaa, jossa ei ole orgaa ­
nista hiiltä, ja joka on esikyllästetty vedellä haihtumisesta johtuvan 
hävikin vähentämiseksi.  
Pääasiassa kotitalousjätevettä käsittelevästä puhdistamosta otetaan 
nestenäyte, jossa on 1–4 g kiinteitä aineita litraa kohden. Tätä nes ­
tettä tarvitaan kutakin ilmastusyksikköä kohden noin 150 ml.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1117
 
Testattavasta aineesta tehdään varastoliuokset tislattuun veteen. Tar ­
vittava pitoisuus on yleensä 400 mg/l orgaanista hiiltä, joka antaa 
testattavan yhdisteen pitoisuudeksi 20 mg/l hiiltä kunkin ilmastus ­
syklin alkaessa, ellei biologista hajoamista tapahdu.  
Suurempia pitoisuuksia voidaan käyttää, jos mikro-organismeihin 
kohdistuvat myrkkyvaikutukset eivät ole esteenä sille.  
Varastoliuosten orgaanisen hiilen pitoisuus määritetään.  
1.6.2  Koeolosuhteet  
Testi on suoritettava 20–25  o C:n lämpötilassa.  
Testissä käytetään korkeita aerobisia mikro-organismipitoisuuksia 
(1–4 g/l suspendoituja kiinteitä aineita) ja tehokas retentioaika on 
36 tuntia. Jätevesiravinteessa oleva hiilipitoinen aines hapettuu suu ­
resti yleensä kahdeksan tunnin kuluessa ilmastussyklin alkamisesta. Sen jälkeen lietteessä tapahtuu endogeenista uloshengitystä ilmastuk ­
sen loppuajan, ja tämän ajan kuluessa testattava yhdiste on ainoa 
substraatti, ellei tämäkin metaboloidu helposti. Nämä ominaisuudet yhdessä päivittäisen uudelleenymppäyksen kanssa, kun kotitalousjä ­
tevettä käytetään ravinteena, antavat hyvät mukautumis- ja biologiset 
hajoamisedellytykset.
 
1.6.3  Testin suorittaminen  
Pääasiassa kotitalousjätevettä käsittelevästä aktiivilietelaitoksesta, tai 
laboratorioyksiköstä, hankittu nesteseos pidetään aerobisena labora ­
toriokäyttöön asti. Kuhunkin ilmastus- ja kontrolliyksikköön pannaan 150 ml nesteseosta (alkuperäistä SCAS-yksikköä käytettäessä käyte ­
tään kymmenkertaista määrää) ja ilmastus aloitetaan. Ilmastus lope ­
tetaan 23 tunnin kuluttua ja lietteen annetaan selkeytyä 45 minuuttia. 
Kunkin astian hana avataan vuorollaan ja 100 ml erä kelluvaa nes ­
tettä poistetaan. Juuri ennen käyttöä hankittua selkeytettyä kotitalo ­
usjätevettä lisätään 100 ml kuhunkin ilmastusyksikköön jäävään liet ­
teeseen ja ilmastus aloitetaan uudelleen. Tässä vaiheessa ei lisätä 
testattavaa ainetta ja yksikköihin lisätään ainoastaan kotitalousjäte ­
vettä päivittäin, kunnes selkeytyksen jälkeinen kelluva neste on kir ­
kasta. Tähän kuluu yleensä korkeintaan kaksi viikkoa, jolloin kellu ­
vaan nesteeseen liuenneen orgaanisen hiilen määrä jokaisen ilmas ­
tussyklin lopussa lähestyy vakio arvoa.
 
Tämän ajan lopussa yksiköissä olevat lietteet sekoitetaan keskenään 
ja 50 ml näin yhdistettyä lietettä lisätään kuhunkin yksikköön.  
Kontrolliyksikköihin lisätään 95 ml selkeytettyä jätevettä ja 5 ml 
vettä ja testiyksikköihin 95 ml selkeytettyä jätevettä ja 5 ml testat ­
tavan yhdisteen varastoliuosta (400 mg/l). Ilmastus aloitetaan jälleen ja sitä jatketaan 23 tuntia. Sen jälkeen lietteen annetaan selkeytyä 
45 minuuttia, kelluva neste poistetaan ja siitä analysoidaan liuennut 
orgaaninen hiilipitoisuus.
 
Edellä esitetyt täyttö- ja poistotoimenpiteet suoritetaan testin aikana 
päivittäin.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1118
 
Ennen selkeytystä voi olla tarpeen puhdistaa yksikön seinämät, jotta 
nestepinnan yläpuolelle ei pääse kertymään kiinteitä aineita. Kutakin 
yksikköä varten on varattava oma kaavin tai harja, jotta yksikköjen välillä ei pääse tapahtumaan kontaminaatiota.
 
Kelluvissa nesteissä oleva liuennut orgaaninen hiili tulee mieluimmin 
määrittää päivittäin, mutta harvemminkin tapahtuvat määritykset ovat 
hyväksyttäviä. Ennen analyysiä nesteet suodatetaan pestyillä 0,45 μm 
kalvosuodattimilla tai sentrifugoidaan. Kalvosuodattimet ovat sopi ­
via, jos ne eivät vapauta hiiltä eivätkä absorboi ainetta suodatusvai ­
heessa. Aineen lämpötila sentrifugissa ei saa ylittää 40  o C:+ta.  
Testin kestoaikaa ei ole määrätty testattaessa yhdisteitä, jotka hajo ­
avat heikosti tai ei lainkaan, mutta kokemus on osoittanut, että ajan 
tulisi yleensä olla vähintään 12 viikkoa ja korkeintaan 26 viikkoa.  
2. TULOKSET JA NIIDEN ARVIOINTI  
Koe- ja kontrolliyksikköjen kelluviin nesteisiin liuenneen orgaanisen 
hiilen arvot esitetään käyränä suhteessa aikaan.  
Kun biologinen hajoaminen saavutetaan, testissä saavutettu taso lä ­
henee kontrollien tasoa. Kun ero on pysyvä kolmessa peräkkäisessä määrityksessä, määrityksiä tehdään vielä tietojen tilastollisen käsitte ­
lyn edellyttämä määrä ja testattavan yhdisteen biologinen hajoamisp ­
rosentti lasketaan (Dj
 a tai D  ssd , ks. 1.2).  
3. RAPORTOINTI  
3.1 TUTKIMUSSELOSTUS  
Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tie ­
dot: 
— kaikki jätevettä ja käytettyä koeyksikköä koskevat tiedot ja tes ­
tattavalla aineella ja mahdollisella vertailuaineella saadut tulokset 
sekä nollakokeen tulokset,  
— lämpötila,  
— poistumakäyrä ja selostus, laskutapa (ks. 1.2),  
— aktiivilietteen ja jäteveden hankintapaikka ja -aika, adaptaatiotie ­
dot, pitoisuus jne.,  
— testausmenetelmään tehtyjen muutosten tieteelliset perustelut,  
— allekirjoitus ja päiväys.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1119
 
3.2 TULOSTEN TULKINTA  
Koska testattava aine ei ole tällä menetelmällä biologisesti helposti 
hajoavaa, pelkästään biologisesta hajoamisesta johtuva liuennut or ­
gaaninen hiili poistuu yleensä vähitellen päivien tai viikkojen kulu ­
essa, paitsi milloin mukautuminen tapahtuu äkillisesti, mikä näkyy 
äkillisenä poistumana muutamien viikkojen kuluttua.  
Fysikaalis-kemiallisella adsorptiolla voi joskus olla huomattava vai ­
kutus. Tähän viittaa lisätyn liuenneen orgaanisen hiilen täydellinen 
tai osittainen poistuma kokeen alussa. Sen jälkeinen kehitys riippuu 
adsorption asteesta sekä poistettuun poistovirtaan suspendoituneiden kiinteiden aineiden pitoisuudesta. Kontrollin ja kokeen kelluviin nes ­
teisiin liuenneen orgaanisen hiilipitoisuuden ero kasvaa tavallisesti 
asteittain kokeen alun alhaisesta arvosta ja tämä ero pysyy sitten 
saavuttamallaan uudella tasolla testin loppuajan, ellei adaptaatiota tapahdu.
 
Lisätutkimuksia tarvitaan, mikäli biologinen hajoaminen (tai osittai ­
nen biologinen hajoaminen) ja adsorptio halutaan erottaa toisistaan. 
Tämä voidaan tehdä usealla tavalla, mutta luotettavin tapa on käyttää 
kelluvaa nestettä tai lietettä inokulaattina perussarjan testissä (mie ­
luimmin respirometritestissä).  
Testattavia aineita, joiden liuenneen orgaanisen hiilen täydellinen tai 
osittainen poistuma ilman adsorptiota on tässä testissä korkea, voi ­
daan pitää biologisesti hajoavina. Osittainen poistuma ilman adsorp ­
tiota osoittaa, että kemikaali hajoaa biologisesti ainakin jossakin määrin.
 
Alhainen tai nollapoistuma saattaa johtua testattavan aineen mikro- 
organismeihin kohdistuvasta inhibitiovaikutuksesta, joka voi myös 
ilmetä lietteen liukenemisena ja häviämisenä, jolloin kelluva neste on sameaa. Koe on uusittava testattavan aineen alhaisemmalla pitoi ­
suudella.
 
Suurempi herkkyys saadaan käyttämällä ominaisanalyysiä tai  14 C:llä 
merkittyä testattavaa ainetta. Mikäli testattava yhdiste on merkitty  
14 C:llä,  14 CO 2 :n toteaminen osoittaa, että biologista hajoamista on 
tapahtunut.  
Kun tulokset ilmoitetaan myös primaarihajoamisena, alkuperäisen 
testattavan aineen reagoimattomuuteen johtanut kemiallinen rakenne ­
muutos tulisi mahdollisuuksien mukaan selvittää.  
Analyysimenetelmän kelpoisuus samoin kuin nollakokeen elatus ­
aineesta saatu vaste on ilmoitettava.  
4. LÄHDELUETTELO  
1) OECD, Paris, 1981,  Test Guideline 302 A,  Decision of the Coun ­
cil C(81)30 final.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1120
 
Lisäys 1  
SCAS-testi: esimerkki tuloksista  
Aine C T 
(mg/l) C t — C  c 
(mg/1) Biologinen ha ­
joamisprosentti, 
D da , Kokeen kesto 
(päiviä)  
4-asetyyliaminobentseemsulfonaatt] 17,2 2,0 85 40 
Tetrapropyleembentseenisulfonaatti 17,3 8,4 51,4 40 4-nitrofenoli 16,9 0,8 95,3 40 
Dietyleeniglykoli 16,5 0,2 98,8 40 
Aniliini 16,9 1,7 95,9 40 Syklopentaanitetrakarboksylaatti 17,9 3,2 81,1 120
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1121
 
Lisäys 2  
Esimerkki koelaitteesta  
Figure 1
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1122
 
C.13.  BIOKERTYVYYS: TESTI KALOILLA 
LÄPIVIRTAUSOLOSUHTEISSA  
1. MENETELMÄ  
Tämä biokertyvyysmenetelmä on toisinto OECD:n testausohjeesta 
N:o 305 (1996).  
1.1 JOHDANTO  
Tällä menetelmällä karakterisoidaan kemiallisten aineiden biokerty ­
mispotentiaalia kaloihin läpivir-tausolosuhteissa. Vaikka läpivirtauso ­
losuhteissa suoritettu testaus on paras, puolistaattiset olosuhteet ovat 
hyväksyttäviä, jos validiteetti on varmistettu.  
Menetelmässä annetaan riittävän tarkat ohjeet testin suorittamiseksi 
samalla kun on mahdollista mukauttaa koejärjestelyä laboratorioiden erityisolosuhteisiin ja testattavien aineiden erilaisiin ominaisuuksiin. Luotettavimmin voidaan testata stabiileja orgaanisia aineita, joiden 
log P
 ow -arvot ovat 1,5–6,0 (1), mutta myös erityisen lipofiilisiä ai ­
neita (logP  ow > 6,0). Alustava arvio tällaisten erityisen lipofiilisten 
aineiden biokertyvyystekijälle (bioconcentration factor, BCF), josta käytetään joskus merkintää K
 B , on todennäköisesti korkeampi kuin 
laboratoriokokeista saatava biokertyvyystekijä tasapainotilassa 
(BCF  SS ). Orgaanisille aineille, joiden log P  ow -arvot saattavat olla 
jopa 9,0, voidaan saada biokertyvyystekijän alustavia arvioita Bintei ­
nin et al (2) yhtälön avulla. Biokertyvyyspotentiaalia luonnehtivia 
muuttujia ovat mm. kertymävakio (k  1 ), poistumavakio (k  2 ) ja BCF  SS . 
Radioaktiivisilla isotoopeilla leimatut aineet saattavat helpottaa vesi- 
ja kalanäytteiden analysointia, ja niitä voi käyttää sen arvioimiseksi, 
onko hajoamistuotteet tunnistettava ja kvantifioitava. Jos mitataan radioaktiivisten jäämien kokonaismäärä (esim. polttamalla tai kudosta liuottamalla), BCF perustuu perusyhdisteeseen, mahdollisesti jäljellä 
oleviin aineenvaihduntatuotteisiin sekä assimiloituneeseen hiileen. 
Radioaktiivisten jäämien kokonaismäärään perustuva BCF ei siis ole välttämättä suoraan verrattavissa BCF:ään, joka on johdettu pel ­
kästään perusyhdisteen spesifisestä kemiallisesta analyysistä.
 
Jos käytetään radioaktiivisia leimoja, voidaan tehdä puhdistustoimen ­
piteitä perusyhdisteeseen perustuvan BCF:n määrittämiseksi, ja tär ­
keimmät aineenvaihduntatuotteet voidaan karakterisoida, jos se kat ­
sotaan tarpeelliseksi. On myös mahdollista yhdistää kalan aineen ­
vaihduntatutkimus ja biokertyvyystutkimus, jossa kudoksissa esiinty ­
vät jäämät analysoidaan ja tunnistetaan.  
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Biokertyvyys (biokonsentraatio)  on organismissa tai sen pinnalla (sen 
tietyssä kudoksessa) olevan testattavan aineen pitoisuuden lisäänty ­
minen verrattuna testattavan aineen pitoisuuteen väliaineessa.  
Biokertyvyystekijä  (bioconcentration factor BCF tai K  B ) minä tahansa 
tämän kertyvyystestin kertymä-vaiheen ajankohtana on testattavan aineen pitoisuus kalassa (kalan pinnalla) tai tietyssä kalan kudoksessa 
[C
 f , ug/g (ppm)] jaettuna kyseisen aineen pitoisuudella väliaineessa 
[C w , μg/ml (ppm)].  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1123
 
Biokertyvyystekijä tasapainotilassa  (steady state) (BCF  SS tai K  B ) ei 
muutu merkittävästi pitkän ajanjakson aikana, kun testattavan aineen 
pitoisuus väliaineessa on vakio tänä aikana.  
Tasapainotila  saavutetaan kalassa esiintyvän testattavan aineen mää ­
rää (C  t ) ajan funktiona esittävässä käyrässä silloin, kun käyrä on 
aika-akselin suuntainen, kolme peräkkäistä vähintään kahden vuoro ­
kauden välein otetuista näytteistä tehtyä C  t -määritystä ovat samat ± 
20 prosenttia eikä näiden kolmen näytteenottoajanjakson välillä ole merkittäviä eroja. Yhdistettyjä näytteitä määritettäessä vaaditaan vä ­
hintään neljä peräkkäistä määritystä. Kun testataan aineita, joiden 
kertyminen kudoksiin tapahtuu hitaasti, välit voivat olla pikemmin ­
kin seitsemän vuorokautta.
 
Biokertyvyystekijöitä,  jotka lasketaan suoraan kineettisistä nopeusva ­
kioista (k  1 /k 2 ) sanotaan kineettisiksi kertyvyystekijöiksi BCF  k . 
Oktanoli-vesi-jakautumiskerroin  (PJ on kemiallisen aineen n-oktano ­
liliukoisuuden ja vesiliukoisuuden suhde tasapainotilassa (menetelmä 
A.8), josta käytetään myös merkintää K  ow . P ow :n logaritmia käyte ­
tään merkitsemään kemiallisen aineen biokertyvyyttä vesieliöissä.  
Altistumis- eli kertymisvaibe  on aika, jona kalat altistetaan testatta ­
valle kemikaalille.  
Kertymävakio  (K  1 ) on numeerinen arvo, joka määrittelee testattavan 
aineen pitoisuuden lisääntymisen nopeuden kalassa tai kalan pinnalla 
(tai sen tietyssä kudoksessa), kun kalat altistetaan kyseiselle kemi ­
kaalille (k  1 :n laatu on päivää  -1 ). 
Poistumavaihe (altistuksen jälkeinen vaihe)  on se ajanjakso (sen jäl ­
keen kun testattavat kalat on siirretty testattavaa ainetta sisältävästä väliaineesta sellaiseen väliaineeseen, jossa ei ole kyseistä ainetta), 
jonka aikana kyseisen aineen (netto)poistumaa testattavista kaloista 
(tai niiden tietyistä kudoksista) tutkitaan.
 
Poistumavakio  (k 2 ) on numeerinen arvo, joka kuvaa testattavan ai ­
neen pitoisuuden alenemisen nopeutta kalassa (tai sen tietyssä ku ­
doksessa), kun kalat on siirretty testattavaa ainetta sisältävästä väli ­
aineesta sellaiseen väliaineeseen, jossa ei ole kyseistä ainetta (k  2 :n 
laatu on päivää  1 ). 
1.3 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Testissä on kaksi vaihetta: kertymävaihe (altistusvaihe) ja poistumav ­
aihe (altistuksen jälkeinen vaihe). Kertymävaiheessa yhtä lajia olevat erilliset kalaryhmät altistetaan vähintään kahdelle testattavan aineen pitoisuudelle. Kalat siirretään tämän jälkeen poistumavaihetta varten 
sellaiseen väliaineeseen, jossa ei ole testattavaa ainetta. Kokeessa on 
aina oltava poistumavaihe, ellei aineen kertyminen kertymisvaiheen aikana ole ollut mitättömän pieni (esim. BCF alle 10). Testattavan aineen pitoisuutta kalassa tai kalan pinnalla (tai sen tietyssä kudok ­
sessa) seurataan testin molempien vaiheiden aikana. Kahden testipi ­
toisuuden lisäksi pidetään kalojen vertailuryhmää samoissa olosuh ­
teissa (lukuun ottamatta testattavan aineen läsnäoloa), jotta biokerty ­
vyyskokeessa mahdollisesti havaittavia haitallisia vaikutuksia voi ­
daan verrata vertailukelpoiseen vertailuryhmään ja jotta saadaan tes ­
tattavan aineen taustapitoisuudet.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1124
 
Kertymisvaihe on 28 vuorokautta, jollei osoiteta, että tasapainotila on 
saavutettu aikaisemmin. Kertymisvaiheen kestoa ja tasapainotilan 
saavuttamiseen tarvittavaa aikaa voidaan ennustaa liitteessä 3 olevan yhtälön avulla. Poistumavaihe aloitetaan siirtämällä kalat puhtaaseen kammioon samaan väliaineeseen, jossa ei ole testattavaa ainetta. 
Biokertyvyystekijä lasketaan mahdollisuuksien mukaan sekä kalassa 
olevan pitoisuuden C
 f ja vedessä olevan pitoisuuden C  w suhteena 
(BCF  SS ), kun tasapainotila näyttää olevan saavutettu, että kineetti ­
senä biokertyvyystekijänä (BCF  K ) kertymävakion k  1 ja poistuma-va ­
kion k  2 suhteena, kun oletetaan, että reaktio noudattaa ensimmäisen 
asteen kinetiikkaa. Jos on ilmeistä, että reaktio ei noudata ensimmäi ­
sen asteen kinetiikkaa, olisi käytettävä monimutkaisempia malleja (liite 5).
 
Jos tasapainotilaa ei ole saavutettu 28 vuorokaudessa, kertymav ­
aihetta on pidennettävä, kunnes tasapainotila saavutetaan, tai 60 vuo ­
rokauteen, sen mukaan, kumpi on ensin; minkä jälkeen aloitetaan 
poistumavaihe.  
Kertymävakio, poistumavakio (tai vakiot, jos käytetään monimutkai ­
sempia malleja), biokertyvyystekijä ja mahdollisuuksien mukaan näi ­
den muuttujien luottamusvälit lasketaan mallista, joka parhaiten ku ­
vaa testattavan aineen mitattuja pitoisuuksia kaloissa ja vedessä.  
BCF ilmaistaan kalan kokonaismärkäpainoa kohti. Erityissyistä voi 
kuitenkin käyttää tiettyjä kudoksia tai elimiä (esim. lihas, maksa), jos 
kala on riittävän suurikokoinen tai jos se voidaan jakaa syötävään 
(filee) ja syömäkelvottomaan (sisälmykset) osaan. Koska monien orgaanisten aineiden biokertyvyyspotentiaalin ja lipofiilisyyden vä ­
lillä on selvä suhde, on myös testattavan kalan rasvapitoisuuden ja 
kyseisten aineiden havaitun biokertyvyyden välillä vastaava suhde. 
Jotta tästä johtuvaa testitulosten vaihtelua hyvin lipofiilisten aineiden (log P
 ow > 3) osalta voidaan pienentää, biokertyvyys olisi ilmaistava 
sekä rasvapitoisuutta että kokonaiselopainoa kohti.  
Rasvapitoisuus olisi mahdollisuuksien mukaan määritettävä samasta 
biologisesta aineksesta, jota käytetään testattavan aineen pitoisuuden 
määrittämiseksi.  
1.4 TESTATTAVAA AINETTA KOSKEVAT TIEDOT  
Ennen biokertyvyystestin suorittamista pitäisi testattavasta aineesta 
olla käytettävissä seuraavat tiedot:  
a) aineen vesiliukoisuus  
b) oktanoli-vesi-jakautumiskerroin P  ow (josta käytetään myös mer ­
kintää K  ow , ja joka määritetään HPLC-menetelmällä, liite A.8)  
c) hydrolyysi  
d) valomuuntuminen vedessä määritettynä oikeassa tai jäljitellyssä 
auringonvalossa ja samoissa säteilyolosuhteissa kuin ne, joissa 
biokertyvyyskoe tehdään (3)  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1125
 
e) pintajännitys (aineet, joiden log P  ow :ta ei voida määrittää)  
f) höyrynpaine  
g) nopea biologinen hajoavuus (tapauksen mukaan).  
Muita tarvittavia tietoja ovat toksisuus testissä käytettävälle kalala ­
jille, mieluiten asymptoottinen (ajasta riippumaton) LC  50 . Koeliu­
oksissa ja biologisessa aineksessa olevan testattavan aineen kvantifi ­
oimiseksi täytyy olla käytettävissä sopiva määritysmenetelmä, jonka 
tarkkuus, täsmällisyys ja herkkyys tunnetaan, ja samoin on oltava 
olemassa näytteen valmistusta ja säilyttämistä koskevat yksityiskoh ­
taiset tiedot. Testattavan aineen määritysraja sekä vedessä että kalan kudoksissa pitäisi myös olla tiedossa. Käytettäessä
 14 C-merkittyä 
testattavaa ainetta on tunnettava epäpuhtauksiin liittyvän radioaktii ­
visuuden prosenttiosuus.  
1.5 TESTIN LUOTETTAVUUS (VALIDITEETTI)  
Testi on luotettava (validi), jos  
— lämpötilavaihtelu on vähemmän kuin ± 2  o C, 
— liuenneen hapen pitoisuus ei laske alemmaksi kuin 60 % kyllästy 
misarvosta,  
— testattavan aineen pitoisuus testauskammiossa pidetään 20 pro ­
sentin rajoissa kertymävaiheessa mitattujen arvojen keskiarvosta,  
— kuolleisuus tai muut haitalliset vaikutukset tai sairaudet sekä 
vertailu- että koekaloissa on alle 10 % testin lopussa; jos koe kestää useita viikkoja tai kuukausia, kuolleisuuden tai muiden haitallisten vaikutuksien olisi oltava molemmissa ryhmissä alle 
5 % kuukautta kohti, eikä se saisi kaikkiaan olla enemmän 
kuin 30 %.
 
1.6 VERTAILUAINEET  
Tunnetun biokertyvyyskyvyn omaavien vertailuyhdisteiden käyttö 
olisi hyödyllistä koejärjestelyjen tarkistamiseksi tarvittaessa. Vielä ei kuitenkaan voida suositella mitään tiettyjä aineita.
 
1.7 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.7.1  Laitteisto  
Missään laitteiston osissa ei saisi käyttää materiaaleja, jotka voivat 
liueta, sorboitua tai uuttua ja vaikuttaa kaloihin haitallisesti. Tavalli ­
sia laatikon- tai lieriönmuotoisia säiliöitä, jotka on tehty kemiallisesti inertistä aineesta ja jotka ovat kooltaan sopivia syöttönopeus huomi ­
oon ottaen, voidaan käyttää. Pehmeää muoviletkua pitäisi käyttää 
mahdollisimman vähän. Mieluummin käytetään teflonista (R), ruos ­
tumattomasta teräksestä ja/tai lasista valmistettua putkea/letkua. Ko ­
kemus on osoittanut, että aineille, joilla on korkea adsorptiokorroin, 
kuten synteettiset pyretroidit, voi olla tarpeen käyttää silanoitua lasia. 
Tällöin välineet on heitettävä pois käytön jälkeen.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1126
 
1.7.2  Vesi  
Testissä käytetään yleensä luonnon vettä, jonka on oltava pilaantu ­
matonta ja laadultaan tasaista. Laimennusveden on oltava laadultaan sellaista, että kokeeseen valitut kalat elävät siinä totuttautumis-vai ­
heen ja testin aikana ilman, että niiden ulkonäössä tai käyttäytymi ­
sessä havaitaan mitään epänormaalia muutosta. Olisi ihanteellista pystyä osoittamaan, että koelaji elää, kasvaa ja lisääntyy laimen ­
nus-vedessä (esim. laboratoriokasvatuksessa tai koko sukupolven 
kierron käsittävässä toksisuustestissä). Vedestä on tunnettava ainakin 
pH, kovuus, kiinteiden aineiden kokonaispitoisuus, orgaanisissa yh ­
disteissä olevan hiilen kokonaismäärä ja mieluiten myös ammonium- 
ioni- ja nitriittipitoisuus sekä emäksisyys ja merieliöiden osalta suo ­
lapitoisuus. Kalojen hyvinvoinnille tärkeät tekijät tunnetaan hyvin, mutta liitteessä 1 annetaan suositeltavat enimmäispitoisuudet useille makean ja meriveden testivesien muuttujille.
 
Veden laadun on oltava tasainen testin ajan. pH-arvo voi olla 
6,0–8,5, mutta vaihtelun on pysyttävä tietyn testin ajan 0,5 pH-yk ­
sikön sisällä. Sen varmistamiseksi, ettei laimennusvesi vaikuta liikaa 
testituloksiin (esimerkiksi kompleksoimalla testattavaa ainetta) tai 
vaikuta haitallisesti kalakannan vointiin, näytteitä olisi otettava sään ­
nöllisin väliajoin määrityksiä varten. Raskasmetallit (esim. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), tärkeimmät anionit ja kationit (esim. Ca, Mg, Na, 
K, Cl, SO
 4 ), torjunta-aineet (esim. orgaanista fosforia ja orgaanista 
klooria sisältävien torjunta-aineiden kokonaispitoisuudet), orgaanisen hiilen kokonaispitoisuus ja suspendoitunect kiinteät aineet olisi mää ­
ritettävä esimerkiksi kolmen kuukauden välein, jos laimennusveden 
laatu tiedetään suhteellisen vakioksi. Jos veden laadun on osoitettu 
pysyvän vakiona ainakin vuoden ajan, määrityksiä voidaan tehdä harvemmin (esim. kuuden kuukauden välein).
 
Luonnosta peräisin olevien hiukkasten samoin kuin orgaanisen hiilen 
kokonaismäärän (TOC) laimennusvedessä olisi oltava mahdollisim ­
man alhainen, jotta testiaine ei absorboituisi orgaanisen aineen pin ­
taan, mikä vähentäisi sen biologista hyötyosuutta (4). Suurin hyväk ­
syttävä arvo on 5 mg/l hiukkasille (kuiva-aine, joka ei läpäise 
0,45 μm:n suodatinta) ja 2 mg/l orgaanisen hiilen kokonaismäärälle 
(katso liite 1). Vesi on tarvittaessa suodatettava ennen käyttöä. Tes ­
tattavista kaloista (ulosteet) ja ruoanjätteistä peräisin olevan orgaa ­
nisen hiilen määrän pitäisi olla mahdollisimman alhainen. Koko tes ­
tin aikana orgaanisen hiilen pitoisuus testausastiassa ei saa ylittää testattavasta aineesta ja mahdollisesti käytetystä liuotusaineesta pe ­
räisin olevaa pitoisuutta yli 10 milligrammalla litraa kohti (± 20 %).
 
1.7.3  Testiliuokset  
Testattavasta aineesta tehdään kantaliuos, jonka pitoisuus on sopiva. 
Kantaliuos valmistetaan mieluiten joko sekoittamalla tai sekoitta ­
malla voimakkaasti testattava aine laimennusveteen. Liuottimien tai liuotusaineiden (dispergoivien aineiden) käyttöä ei suositella. Niitä 
voi kuitenkin joskus käyttää, jotta saadaan tehdyksi väkevä kantaliu ­
os. Sallittuja liuottimia ovat etanoli, metanoli, etyleeniglykolimono ­
metyylieetteri, etyleeniglykolidimetyylieetteri, dimetyyliformamidi ja trietyleeniglykoli. Sallittuja liuotusaineita ovat Cremophor RH40, 
Tween 80, 0,01 % metyyliselluloosa ja HCO-40. Helposti biohajoa ­
via aineita käytettäessä on oltava varovainen, koska ne voivat aihe ­
uttaa ongelmia bakteerikasvuston takia läpivirtaustesteissä. Testattava aine voi olla leimattu radioaktiivisella aineella ja sen pitäisi olla 
mahdollisimman puhdasta kemiallisesti (mielellään esimerkiksi yli 
98-prosenttista).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1127
 
Läpivirtaustestissä on käytettävä testattavan aineen kantaliuosta jat ­
kuvasti annostelevaa ja laimentavaa järjestelmää (esim. annostel ­
upumppua, laimenninta, kyllästävää järjestelmää) testipitoisuuksien annostelemiseksi testikammioihin. Testikammioiden veden pitäisi vaihtua mielellään ainakin viisi kertaa vuorokaudessa. Läpivirtaus ­
malli on paras, mutta jos sitä ei voida käyttää (jos se esimerkiksi 
haittaa testattavia eliöitä), voidaan käyttää puolistaattista järjestelmää, mikäli validiteettikriteerit täyttyvät. Kantaliuosten ja laimennusveden virtausnopeudet on tarkistettava sekä 48 h ennen testiä että vähintään 
kerran päivässä testin aikana. Tässä tarkistuksessa mitataan myös 
läpivirtausnopeus kaikissa testikammioissa ja varmistetaan, ettei se vaihtele yli 20 %:a yhdessä kammiossa tai kammioiden välillä.
 
1.7.4  Lajin valinta  
Tärkeitä perusteita lajin valinnassa ovat se, että lajia on helposti 
saatavilla, sitä voi saada sopivan kokoisina yksilöinä ja sitä voidaan helposti ylläpitää laboratoriossa. Muita perusteita kalalajin valitsemi ­
selle voivat olla virkistyskäyttö, kaupallinen tai ekologinen merkitys 
sekä samanlainen herkkyys, onnistunut käyttö aikaisemmin ym.
 
Suositeltavat lajit luetellaan liitteessä 2. Muita lajeja voidaan käyttää, 
mutta testausmenetelmää voi joutua muuttamaan siten, että saadaan 
sopivat koeolosuhteet. Tällaisessa tapauksessa olisi selostettava syyt lajin valitsemiseen ja koemenetelmä.
 
1.7.5  Kalojen olosuhteet testauskammioissa  
Kalojen kantapopulaatiota totutetaan vähintään kahden viikon ajan 
testauslämpötilassa ja kaloja ruokitaan riittävästija samantyyppisellä rehulla kuin se, jota annetaan testin aikana.
 
Kuolleiden kalojen määrä kirjataan 48 tunnin alkutotuttelun jälkeen, 
jonka jälkeen noudatetaan seuraavia periaatteita:  
— jos kuolleita kaloja on yli 10 % populaatiosta seitsemän vuoro ­
kauden aikana, koko erä hylätään,  
— jos kuolleita kaloja on 5–10 % populaatiosta seitsemän vuoro ­
kauden aikana, kaloja totutetaan vielä seitsemän vuorokautta,  
— jos kuolleita kaloja on alle 5 % populaatiosta seitsemän vuoro ­
kauden aikana, erä hyväksytään, mutta jos kuolleita on yli 5 % seuraavien seitsemän vuorokauden aikana, koko erä hylätään.
 
On tarkastettava, ettei testeissä käytettävissä kaloissa ole havaittavia 
tauteja tai poikkeavuuksia. Sairaat kalat on heitettävä pois. Kaloja ei 
saisi hoitaa sairauden takia kahden viikon aikana ennen testiä tai 
testin aikana.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1128
 
1.8 TESTIN SUORITTAMINEN  
1.8.1  Esitesti  
Voi olla hyvä tehdä esitesti lopullisen kokeen olosuhteiden optimoi ­
miseksi, esim. testattavan aineen pitoisuuden (pitoisuuksien) valitse ­
minen, kertymä- ja poistumavaiheen kesto.  
1.8.2  Altistumisolosuhteet  
1.8.2.1 K e r t y m ä v a i h e e n k e s t o  
Kertymävaiheen kestoa voi arvioida käytännön kokemuksen perus ­
teella (esim. aiemmasta kemikaalin kertyvyystutkimuksesta) tai tie ­
tyistä kokemusperäisistä suhteista käyttämällä joko testattavan aineen vesiliukoisuutta tai oktanoli-vesi-jakaantumiskerrointa koskevia tie ­
toja (ks. liite 3).
 
Kertymävaiheen on kestettävä 28 vuorokautta, ellei voida osoittaa, 
että tasapainotila on saavutettu aikaisemmin. Jos tasapainotilaa ei ole saavutettu 28 vuorokauden kuluessa, kertymävaihetta jatketaan ja mittauksia tehdään, kunnes tasapainotila saavutetaan tai 60 vuoro ­
kautta on kulunut, sen mukaan, kumpi tapahtuu aiemmin.
 
1.8.2.2 P o i s t u m a v a i h e e n k e s t o  
Puolet kertymävaiheesta riittää tavallisesti asianmukaiseen (esim. 
95 %) vähenemiseen kalaan kertyneessä aineessa (katso liite 3, ar ­
vioinnin selostus). Jos 95 prosentin vähenemiseen pääseminen kestää 
erittäin kauan, esimerkiksi yli kaksi kertaa kertymävaiheen normaali 
kesto (ts. yli 56 vuorokautta), voidaan hyväksyä lyhyempi aika (ts. kunnes testattavan aineen pitoisuus on alle 10 % tasapainotilasta). 
Jos aineen kertymä- ja poistumakinetiikka on monimutkaisempi kuin 
yhden osaston mallissa, jota voidaan kuvata ensimmäisen asteen kinetiikalla, on poistumavaiheen oltava pitempi poistumavakion mää ­
rittämiseksi. Tämä aika voidaan kuitenkin määrätä esim. sen perus ­
teella, kuinka kauan testattavan aineen pitoisuus kalassa pysyy mää ­
ritysrajan yläpuolella.
 
1.8.2.3 T e s t i k a l o j e n m ä ä r ä  
Kalojen lukumäärän jokaista testipitoisuutta kohti on oltava sellainen, 
että on saatavilla vähintään neljä kalaa näytettä kohti. Jos tarvitaan 
suurempaa tilastotehoa, tarvitaan enemmän kaloja näytettä kohti.  
Jos käytetään täysikasvuisia kaloja, ilmoitetaan, ovatko ne koiraita, 
naaraita vai molempia. Jos käytetään molempia sukupuolia, on osoi ­
tettava ennen totuttautumisvaihetta, että erot rasva-ainepitoisuudessa 
sukupuolien välillä ovat merkityksettömät. Määritystä varten voi olla 
tarpeen yhdistää kaikki koiraat ja kaikki naaraat.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1129
 
Jokaiseen testiin on valittava samanpainoisia kaloja, jolloin pienim ­
pien on painettava vähintään kaksi kolmasosaa suurimmista. Kaik ­
kien pitäisi olla samaa vuosiluokkaa ja peräisin samasta lähteestä. Koska paino ja ikä näyttävät vaikuttavan joskus merkittävästi BCF- arvoihin (1), on ne kirjattava tarkasti. Suositellaan, että osa näyteka ­
loista punnitaan ennen testiä keskipainon arvioimiseksi.
 
1.8.2.4 K a l o j e n l a s t a a m i n e n t e s t i k a m m i o o n  
Vesimäärän on oltava suuri suhteessa kalojen määrään, jotta C  w 
laskee mahdollisimman vähän, kun kalat lisätään kammioon testin 
alussa, ja myös siksi, ettei liuenneen hapen pitoisuus laske. On tär ­
keää, ettei kaloja lisätä kammioon liian nopeasti. Joka tapauksessa 
lastausnopeudeksi suositellaan normaalisti 0,1–1,0 g kalaa (märkä ­
painona) litraa vettä kohti vuorokaudessa. Lastaus voidaan tehdä nopeammin, jos osoitetaan, että testattavan aineen pitoisuus voidaan 
pitää nimellisarvossa ± 20 prosenttia eikä liuenneen hapen pitoisuus 
laske alemmaksi kuin 60 prosenttia kyllästyneisyysarvosta.
 
Valittaessa sopiva lastaustapa on otettava huomioon kalalajin luon ­
nollinen elinympäristö. Esimerkiksi pohjakalat voivat vaatia samaa 
vesitilavuutta kohti suuremman pohjapinta-alan kuin pelagiset kal ­
alajit.  
1.8.2.5 R u o k k i m i n e n  
Totuttamisvaiheessa ja testin aikana kalojen ravinnossa noudatetaan 
ruokavaliota, jonka rasvapitoisuus ja valkuaisaineiden kokonaispitoi ­
suus tunnetaan. Rehua annetaan riittävästi niin, että kalat pysyvät 
terveinä ja niiden paino ei laske. Rehua annetaan päivittäin totutta ­
misvaiheessa ja testin aikana noin 1–2 % kalan painosta vuorokau ­
dessa. Tällöin useimpien kalalajien rasvapitoisuus pysyy suhteellisen 
vakiona testin aikana. Rehun määrä olisi laskettava uudelleen esi ­
merkiksi kerran viikossa, jotta kalan paino ja rasvapitoisuus pysyisi ­
vät samana. Tässä laskutoimituksessa kussakin kammiossa olevien kalojen paino voidaan arvioida viimeksi kyseisestä kammiosta näyt ­
teeksi otetun kalan painosta. Kammiossa olevia kaloja ei punnita.
 
Syömättä jäänyt rehu ja ulosteet poistetaan testikammioista päivittäin 
vähän ruokinnan jälkeen (30 minuuttia – 1 tunti). Kammiot pidetään mahdollisimman puhtaina koko testin ajan, jotta orgaanisen aineksen 
pitoisuus pysyy mahdollisimman alhaisena, koska orgaaninen hiili 
saattaa vaikuttaa haitallisesti testattavan aineen biologiseen hyötyo ­
suuteen (1).
 
Koska monet rehut on valmistettu kalajauhoista, on määritettävä, 
onko rehussa testattavaa ainetta. On suotavaa määrittää myös, onko 
rehussa torjunta-aineita ja raskasmetalleja.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1130
 
1.8.2.6 V a l o j a l ä m p ö t i l a  
Valoisa aika on tavallisesti 12–16 tuntia. Lämpötilan pitäisi olla kal ­
alajille sopiva eikä se saisi vaihdella enempää kuin ± 2  o C. Valais ­
tuksen tyyppi ja ominaisuudet on tunnettava. Testattavan aineen 
mahdollinen muuntuminen tutkimuksen säteilyolosuhteissa on otet ­
tava huomioon. Valaistusolosuhteiden olisi oltava asianmukaiset, ja on vältettävä kalojen altistumista epäluonnolliselle valolle. Joskus voi olla tarpeen suodattaa pois alle 290 nm:n UV-säteily.
 
1.8.2.7 T e s t i p i t o i s u u d e t  
Kalat altistetaan läpivirtausolosuhteissä vähintään kahdelle testatta ­
van aineen pitoisuudelle vedessä. Tavallisesti valitaan korkeampi (tai korkein) testattavan aineen pitoisuus siten, että se on noin 1 % 
aineen akuutista asymptoottisesta LC
 50 -arvosta ja vähintään 10 kertaa 
korkeampi kuin sen havaitsemis-raja vedessä käytettävällä määritys ­
menetelmällä.  
Korkein testipitoisuus voidaan myös määrittää jakamalla akuutti 96 
tunnin LC  50 -arvo asianmukaisella akuutti/krooninen-suhteella (asian ­
mukaiset suhteet joillekin kemikaaleille voivat olla noin 3–100). Jos 
se on mahdollista, valitaan toinen pitoisuus (toiset pitoisuudet) siten, 
että sen ero edelliseen pitoisuuteen on kymmenkertainen, jos tämä ei ole mahdollista, kun otetaan huomioon kriteeri ”1 % LC
 50 -arvosta” 
ja määritysraja, voidaan käyttää pienempää tekijää kuin 10 tai harkita  
l4 C-leimatun aineen käyttöä. Mikään testipitoisuus ei saa olla suu ­
rempi kuin testattavan aineen liukoisuus.  
Jos käytetään liuotusainetta, sen pitoisuus ei saisi olla suurempi kuin 
0,1 ml/l, pitoisuuden on oltava sama kaikissa testiastioissa. Sen 
osuus orgaanisen hiilen kokonaismäärästä, samoin kuin testattavan aineen osuus, on tunnettava. Näitä aineita on kuitenkin pyrittävä välttämään mahdollisimman täydellisesti.
 
1.8.2.8 K o n t r o l l i t  
Testisarjan lisäksi on tehtävä yksi kontrolli laimennusvedellä tai — 
jos liuotusainetta on käytetty — yksi kontrolli, jossa on liuotusainet ­
ta, jos on osoitettu, ettei liuotusaine vaikuta kaloihin. Ellei tätä ole 
osoitettu, on tehtävä molemmat kontrollit.  
1.8.3  Veden laatua koskevien mittausten taajuus  
Testin aikana on mitattava liuennut happi, TOC (orgaanisen hiilen 
kokonaismäärä), pH ja lämpötila kaikista astioista. Veden kokonais ­
kovuus ja suola, mikäli se on aiheellista, mitataan kontrolleista ja 
yhdestä astiasta, jossa on korkeampi (korkein) pitoisuus. Vähintään on mitattava kolme kertaa liuennut happi ja suola, mikäli aiheellista (alussa, kertymävaiheen keski- ja loppuvaiheessa) ja kerran viikossa 
poistumavaiheen aikana. TOC on mitattava testin alussa (24 ja 48 
tuntia ennen kertymävaiheen alkua), ennen kalojen lisäämistä astiaan ja vähintään kerran viikossa sekä kertymä- että poistumisvaiheen aikana. Lämpötila on mitattava joka päivä, pH kunkin vaiheen alussa 
ja lopussa ja kovuus kerran testin aikana. Lämpötilaa olisi mieluiten 
mitattava jatkuvasti vähintään yhdessä astiassa.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1131
 
1.8.4  Näytteenotto ja mittaukset kaloista ja vedestä  
1.8.4.1 N ä y t t e e n o t o n a i k a t a u l u  
Testattavan aineen pitoisuuden määrittämiseen käytetyistä testaus ­
kammioista otetaan vesinäyte ennen kalojen lisäystä sekä kertymä- 
ja poistumisvaiheen aikana. Vedestä on otettava näytteet vähintään 
samoina aikoina kuin kaloista ja ennen ruokkimista. Kertymävaiheen aikana määritetään testattavan aineen pitoisuudet sen tarkistamiseksi, täyttyvätkö validiteettikriteerit.
 
Kaloista otetaan näyte ainakin viidesti kertymävaiheen aikana ja nel ­
jästi poistumavaiheen aikana. Koska voi olla joskus vaikea laskea kohtuullisen tarkkaa arviota BCF-arvosta tämän näytemäärän perus ­
teella (erityisesti, jos näyttää siltä, että poistuma noudattaa muuta 
kuin yksinkertaista ensimmäisen asteen kinetiikkaa), voi olla suosi ­
teltavaa ottaa näytteitä tiheämmin molemmissa vaiheissa (katso liite 4). Ylimääräiset näytteet säilytetään ja analysoidaan vain, jos ensim ­
mäisen analyysikierroksen tulokset osoittautuvat riittämättömiksi 
BCF:n laskemiseksi halutulla tarkkuudella.
 
Hyväksyttävästä näytteenottoaikataulusta on esimerkki liitteessä 
4. Muunlaisia aikatauluja voi laskea helposti käyttäen muita oletet ­
tuja P  ow -arvoja 95 prosentin kertymään tarvittavan altistusajan laske ­
miseksi.  
Näytteenottoa jatketaan kertymävaiheen aikana, kunnes saavutetaan 
tasapainotila tai 28 vuorokauden ajan, kumpi tapahtuu aikaisemmin. 
Jos tasapainotilaa ei ole saavutettu 28 vuorokauden kuluessa, näyt ­
teenottoa jatketaan, kunnes tasapainotila saavutetaan tai 60 vuoro ­
kauden ajan, sen mukaan, kumpi tapahtuu aikaisemmin. Ennen pois ­
tumisvaiheen aloittamista kalat siirretään puhtaisiin kammioihin.  
1.8.4.2 N ä y t t e e n o t t o j a n ä y t t e i d e n v a l m i s t u s  
Vesinäytteet otetaan esimerkiksi lapolla inertin putken/letkun kautta 
kammion keskivaiheilla olevasta kohdasta. Koska sen enempää suo ­
datuksella kuin sentrifugoinnillakaan ei aina ilmeisesti voida erottaa toisistaan niitä testattavan aineen osia, joita kala ei biohyödynnä ja joita se biohyödyntää (erityisesti superlipofiilisten kemikaalien, ts. 
kemikaalien, joiden log P
 ow > 5) osalta) (1) (5), näytteille ei tarvitse 
välttämättä tehdä näitä toimenpiteitä.  
Sen sijaan on huolehdittava siitä, että kammiot pidetään mahdolli ­
simman puhtaina, ja orgaanisen hiilen kokonaismäärää on seurattava 
sekä kertymä- että poistumavaiheessa.  
Sopiva määrä kaloja (normaalisti vähintään neljä) otetaan testikam ­
mioista kutakin näytettä varten. Näytteeksi otetut kalat huuhdellaan nopeasti vedellä, kuivataan (pyyhkeellä), tapetaan välittömästi sopi ­
vimmalla ja inhimillisimmällä tavalla ja punnitaan.
 
On suositeltavaa tehdä määritykset kaloista ja vedestä heti näyttee ­
noton jälkeen, jotta ei tapahtuisi hajoamista tai muuta ainehävikkiä ja jotta voidaan laskea likimääräiset kertymä- ja poistumanopeudet tes ­
tin edetessä. Kun näytteet määritetään heti, voidaan myös nähdä 
nopeasti, milloin tasapainotila on saavutettu.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1132
 
Jos näytteitä ei voi määrittää heti, ne säilytetään sopivalla tavalla. 
Ennen testin aloittamista on hankittava tietoja kyseisen testattavan 
aineen oikeasta säilytystavasta, esimerkiksi pakastamisesta, säilyttä ­
misestä 4  o C:ssa, säilytysajasta, uuttamisesta jne.  
1.8.4.3 M ä ä r i t y s m e n e t e l m ä n l a a t u  
Koska koko menetelmä riippuu olennaisesti testattavan aineen mää ­
ritykseen käytettävän menetelmän tarkkuudesta, täsmällisyydestä ja 
herkkyydestä, on todettava kokeellisesti, että kyseisessä menetel ­
mässä kemiallisen määrityksen täsmällisyys ja toistettavuus samoin kuin testattavan aineen saalis sekä vedestä että kaloista ovat tyydyt ­
täviä. On myös tarkastettava, ettei testattavaa ainetta ole laimennuk ­
seen käytetyssä vedessä mitattavia määriä.
 
Tarvittaessa testissä saadut C  w - ja C  f -arvot korjataan kontrollien saa ­
liin ja tausta-arvojen suhteen. Kalaja vesinäytteitä käsitellään koko ajan siten, että kontaminoituminen ja hävikki (joka voi johtua esi ­
merkiksi adsorboitumisesta näytteenottolaitteistoon) ovat mahdolli ­
simman pienet.
 
1.8.4.4 K a l a n ä y t t e i s t ä t e h t ä v ä t m ä ä r i t y k s e t  
Jos testissä käytetään radioaktiivisia merkkiaineita, on mahdollista 
määrittää kokonaisradioaktiivisuus (ts. perusyhdiste ja siitä syntyneet 
aineenvaihduntatuotteet) tai näytteet voidaan puhdistaa siten, että 
perusyhdiste voidaan määrittää erikseen. Myös tärkeimmät aineen ­
vaihduntatuotteet voidaan karakterisoida tasapainotilassa tai kerty ­
mävaiheen lopussa, sen mukaan, kumpi tapahtuu aikaisemmin. Jos 
BCF on ≥ 1 000 % ilmaistuna radioaktiivisten jäämien kokonaismää ­
ränä, voi olla suositeltavaa — ja tiettyihin luokkiin kuuluvien kemi ­
kaalien kuten torjunta-aineiden ollessa kyseessä erittäin suositeltavaa — tunnistaa ja määrittää kvantitatiivisesti hajoamistuotteet, joiden 
määrä on > 10 % kalan kudoksissa tasapainotilassa olevista jäämistä. 
Jos kaloista tunnistetaan ja määritetään kvantitatiivisesti ≥ 10 %:n 
luokkaa olevia hajoamistuotemääriä, niin on suositeltavaa tunnistaa ja määrittää kvantitatiivisesti hajoamistuotteet myös testivedestä.
 
Testattavan aineen pitoisuus olisi tavallisesti määritettävä kustakin 
yksittäisestä punnitusta kalasta. Jos tämä ei ole mahdollista, voidaan samaan aikaan otetut näytekalat yhdistää, mutta yhdistäminen rajoit ­
taa tilastomenetelmiä, joita voidaan käyttää tulosten käsittelyyn. Jos 
on tärkeää, että käytetään tiettyä ja tietyn tehoista tilastollista mene ­
telmää, pitäisi testissä olla riittävä määrä kaloja, jotta haluttu kalojen yhdistäminen ja tilastollinen teho voidaan ottaa huomioon (6) (7).
 
BCF pitäisi ilmaista sekä kokonaismärkäpainoa kohti että erittäin 
lipofiilisten aineiden osalta myös rasvapitoisuutta kohti. Kalojen ras ­
vapitoisuus määritetään jokaisen näytteenoton yhteydessä, jos mah ­
dollista. Sopivia menetelmiä on käytettävä rasvapitoisuuden määrit ­
tämiseksi (liitteessä 3 olevat viitteet 8 ja 2). Kloroformi-metanoliuut ­
toa voi suositella standardimenetelmänä (9). Eri menetelmillä ei 
saada samoja arvoja (10), joten on tärkeää kuvailla käytetty mene ­
telmä. Aina kun se on mahdollista, rasvat olisi määritettävä samasta uutteesta, josta testattava aine määritetään, koska rasvat täytyy usein 
poistaa uutteesta ennen kuin sitä voi käyttää kromatografiseen mää ­
ritykseen. Kalan rasvapitoisuus (mg/kg märkäpainoa kohti) kokeen lopussa ei saisi poiketa rasvapitoisuudesta kokeen alussa enempää kuin ±25  %. Kudoksen kiinteän aineen prosenttiosuus pitää myös 
ilmoittaa, jotta rasvapitoisuus voidaan muuntaa märkäarvosta kuiva- 
arvoksi.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1133
 
2. MÄÄRITYSTULOKSET  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Testattavan aineen kertymäkäyrä saadaan esittämällä kalassa tai ka ­
lan pinnalla (tai määritellyissä kudoksissa) kertymävaiheen aikana 
olevan aineen pitoisuus ajan funktiona aritmeettisella asteikolla, jos 
käyrä osoittaa tasapainotilaa (ts. käyrä on suunnilleen asymptoottinen aika-akselin kanssa), tasapainotilaa vastaava BCF
 ss lasketaan kaa ­
vasta  
C f as steady Ä stateðmeanÞ 
C w as steady Ä stateðmeanÞ 
Jos tasapainotilaa ei saavuteta, voi olla mahdollista laskea vaaralli ­
suuden arviointiin riittävän tarkka BCF  SS 80 (1,6/kJ prosentin tai 95 
prosentin (3,0/k  2 )”tasapainon” perusteella.  
Myös konsentraatiotekijä (BCF  k ) määritetään kahden ensimmäisen 
asteen kineettisen vakion suhteena (k  1 /k 2 ). Poistumisvakio (k  2 ) mää­
ritetään tavallisesti poistumakäyrästä (ts. käyrästä, joka kuvaa testat ­
tavan aineen pitoisuuden vähenemistä kalassa ajan funktiona). Ker ­
tymävakio (k  1 ) lasketaan sitten, kun tunnetaan k  2 ja jokin kertymä ­
käyrästä saatu C  f :n arvo, (katso myös liite 5). Paras menetelmä 
BCF  k :n ja nopeusvakioiden k  1 ja k  2 laskemiseksi on estimoida tie ­
tokoneella epälineaariset parametrit (11). Muuten voidaan käyttää 
graafisia menetelmiä k  1 ja k  2 :n määrittämiseksi. Jos poistumakäyrä 
ei selvästikään noudata ensimmäisen asteen kinetiikkaa, pitäisi käyt ­
tää monimutkaisempia malleja (katso liitteessä 3 olevat viitteet) ja 
pyytää neuvoa biostatistiikan asiantuntijoilta.  
2.2 TULOSTEN TULKINTA  
Tulosten tulkinnassa on oltava varovainen, jos testiliuoksista mitatut 
tulokset ovat lähellä määritysmenetelmän havaitsemisrajaa.  
Selvät kertymä- ja poistumakäyrät osoittavat hyviä biokonsentraatio ­
tuloksia. Vaihtelun kertymä/poistu-mavakioissa kahden testi pitoisuu ­
den välillä pitäisi olla alle 20 %. Jos havaitaan merkittäviä eroja kertymä-/poistumanopeuksien välillä käytettyjen kahden testipitoi ­
suuden välillä, ne on kirjattava ja selitettävä, jos voidaan. BCF:ien 
luotettavuusväli hyvin suunnitelluissa kokeissa on yleensä lähellä ± 20:tä prosenttia.
 
3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
Testiraportissa on ilmoitettava seuraavat tiedot:  
3.1 TESTATTAVA AINE  
— fysikaalinen olomuoto ja fysikokemialliset ominaisuudet, jos 
niillä on merkitystä;  
— kemialliset tunnistetiedot (mukaan lukien orgaanisen hiilen pitoi ­
suus tarvittaessa);  
— jos aine on radioaktiivisesti leimattu, leimatun atomin (leimattu ­
jen atomien) tarkka sijainti ja epäpuhtauksiin liittyvän radioaktii ­
visuuden määrä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1134
 
3.2 TESTATTAVA LAJI  
— tieteellinen nimi, kanta, lähde, mahdollinen esikäsittely, totutta ­
mistiedot, ikä, koko jne.  
3.3 TESTIOLOSUHTEET  
— käytetty testimenettely, esim. läpivirtaus- tai puolistaattinen;  
— käytetty valaistustyyppi ja valon ominaisuudet sekä valoperio ­
di(t);  
— testimenetelmän kuvaus, esim. testikammioiden lukumäärä ja ko ­
ko, veden vaihtumisnopeus, rinnakkaisnäytteiden määrä, kalojen lukumäärä nnnakkaisnäytteessä, testipitoisuuksien lukumäärä, kertymä- ja poistumavaiheiden kesto, kala- ja vesinäytteiden 
näytteenottotaajuus;
 
— kantaliuosten valmistus ja niiden uusimistaajuus (liuotusaine ja 
sen pitoisuus sekä sen osuus testivedessä olevan orgaanisen hii ­
len kokonaismäärästä on ilmoitettava, jos liuotusainetta käyte 
tään);  
— nimelliset testipitoisuudet, testikammioissa mitattujen arvojen 
keskiarvot ja niiden keskihajonnat ja menetelmä, jolla ne on laskettu;
 
— laimennusveden alkuperä, mahdolliset esikäsittelyt, osoitukset ka ­
lojen kyvystä elää tässä vedessä sekä vettä koskevat tiedot: pH, 
kovuus, lämpötila, liuenneen hapen pitoisuus, jäännöskloorin ta ­
sot (jos ne on mitattu), orgaanisen hiilen kokonaispitoisuus, sus ­
pensiossa olevat kiinteät aineet, testiväliaineen suolapitoisuus (jos 
aiheellista) ja muut mahdolliset mittaukset;  
— testikammioissa olevan veden laatu, pH, kovuus, TOC, lämpötila 
ja liuenneen hapen pitoisuus;  
— yksityiskohtaiset tiedot ruokkimisesta (esim. rehutyyppi, sen al ­
kuperä, koostumus — vähintään rasva- ja valkuaisainepitoisuus 
mahdollisuuksien mukaan, annetut määrät ja syöttötaajuus);  
— kala- ja vesinäytteiden käsittelyä koskevat tiedot, mukaan lukien 
testattavan aineen valmistusta, säilyttämistä, uuttamista ja mää ­
ritysmenetelmiä (ja niiden täsmällisyyttä) sekä rasvapitoisuutta 
koskevat tiedot (JOS on mitattu).  
3.4 TULOKSET:  
— mahdollisista esikokeista saadut tulokset;  
— vertailukalojen ja kussakin altistuskammiossa olevien kalojen 
kuolleisuus sekä mahdollinen tavalli suudesta poikkeava käyttäy ­
tyminen;  
— kalojen rasvapitoisuus (jos se on määritetty testin yhteydessä);  
— testattavan kemikaalin kertymää ja poistumaa kuvaavat käyrät 
(mukaan lukien kaikki mittaustu lokset) ja tasapainotilan saavut ­
tamiseen tarvittu aika;  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1135
 
— C  t ja C  w (sekä keskihajonta ja vaihteluväli, jos aiheellista) kaik ­
kien näytteenottoaikojen osalta (C  1 ilmaistuna mikrogrammoina 
grammaa märkäpainoa kohti tai ppm:inä koko kalaa tai sen tiet ­
tyjä kudoksia, esim. rasvakudosta kohti, ja C mikrogrammoina millilitraa kohti eli ppm:inä); C
 w -arvot verrokkisarjalle (tausta) 
on myös ilmoitettava;  
— tasapainotilassa mitattu biokonsentraatiotekijä (BCF  ss ) ja/tai ki ­
neettinen konsentraatiotekijä (BCF  k ) sekä mahdolliset 95 prosen ­
tin luotettavuusvälit kertymä- ja poistumavakioille (kaikki ilmais ­
tuna eläimen tai sen tiettyjen kudosten kokonaispainoa tai koko ­
naisrasvapitoisuutta kohti, jos ne on mitattu), luotettavuusvälit ja keskihajonta, jos ovat saatavina, sekä tuloksiin sovellettu tieto ­
kone analyysi kullekin käytetylle testipitoisuudelle;
 
— jos on käytetty radioaktiivisesti leimattuja aineita, voidaan tarvit ­
taessa esittää mahdollisten havait tujen aineenvaihduntatuotteiden kertymistä koskevat tiedot;
 
— mahdolliset epätavalliset tapahtumat testin aikana, poikkeamat 
näistä menettelyistä ja muut mahdolliset asiaan liittyvät tiedot.  
On vältettävä ilmoittamasta ”ei havaittu havaitsemisrajalla”. 
Menetelmää ja koejärjestelyä on kehitettävä ennen testiä, koska 
edellä mainitunlaisia tuloksia ei voi käyttää nopeusvakioiden laske ­
miseen.  
4. KIRJALLISUUSVIITTEET  
(1) Connell D.W.  (1988).  Bioaccumulacion behaviour of persis ­
tent chemicals with aquatic organisms.Rev. Environ. Con ­
tam. Toxicol. 102, pp 117–156.  
(2) Bintein S., Devillers, J. and Karcher W. (1993). Nonlinear 
dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water par ­
tition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Rese ­
arch, 1, 2–390.  
(3) OECD, Paris (1996). Direct Phototransformation of chemi ­
cals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. 
No 3.
 
(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: Comparison 
of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to 
the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, 
Denmark.
 
(1) (5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality 
Initiative Technical Support Doc. for the Procedure to De ­
termine Bioaccumulation Factors. July 1994.  
(6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesti ­
cide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane Rockville, MD 
20852, July 1975.  
(7) US EPA (1974). Section 5, A(l). Analysis of Human Adi ­
pose Tissue, in Analysis of Pesticide Recidues in Human and Environmental Samples, Thompson J.F. (ed.) Research 
Triangle Park, N.C. 27711.
 
(8) Compaan H. (1980) in ”The determination of the possible 
effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation”, Ch. 
2.3, Part II. Government Publishing Office, The Hague, 
The Netherlands.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1136
 
(9) Gardner et al. (1995). Limn. & Oceanogr. 30, 1099–1105.  
(10) Randall R.C., Lee H., Ozretich R.J., Lake J.L. and Pruell 
R.J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for norma ­
lising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp 1431–1436.
 
(11) CEC. Bioconcentration of chemical substances in fish: the 
flow-through method-Ring Test Programme, 
1984–1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen 
and N. Nyholm.  
(12) ASTME E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice 
for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Salt ­
water Bivalve Molluscs.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1137
 
Liite 1  
Hyväksyttävän laimennusveden kemialliset ominaisuudet  
Aine Raja-pitoisuus  
1 Kiinteät aineet/hiukkaset 5 mg/l 
2 Orgaanisen hiilen kokonaismäärä 2 mg/l 3 Ionisoitumaton ammoniakki l μg/1 
4 Jäännöskloori 10 μg/l 
5 Orgaanista fosforia sisältävien torjunta-aineiden koko ­
naismäärä 50 ng/l 
6 Orgaanista klooria sisältävät torjunta-aineet ja polyk ­
looratut bife-nyylit 50 ng/1 
7 Orgaanisen kloorin kokonaismäärä 25 ng/1 
8 Alumiini 1 μg/l 
9 Arseeni 1 μg/1 
10 Kromi 1 ng/1 
1 1 Koboltti 1 ng/1 
12 Kupari 1 μg/l 
13 Rauta 1 μg/l 
14 Lyijy 1 μg/l 
15 Nikkeli 1 μg/l 
16 Sinkki 1 μg/l 
17 Kadmium 100 ng/1 18 Elohopea 100 ng/1 19 Hopea 100 ng/1
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1138
 
Liite 2  
Testaukseen suositellut kalalajit  
Suositeltu laji Suositeltu lämpö ­
tilaväli (  o C) Suositeltu koe- 
eläimen koko ­
naispituus (cm)  
1 Danio rerio  ( 1 )(Teleostei, Cyprinidae)  (Hamilton-Bu ­
chanan) seeprakala 20–25 3,0 ± 0,5 
2 Pimepbales promelas (Teleostei, Cyprinidae)  (Rafi­
nesque) paksupäämutu 20–25 5,0 ± 2,0 
3 Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae)  (Linnaeus) 
karppi 20–25 5,0 ± 3,0 
4 Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae)  (Temminck 
and Schlegel) (engl. ricefish) 20–25 4,0 ± 1,0 
5 Poecilia reticuIata (Teleostei, Poeciliidae)  (Peters) 
(engl. guppy) 20–25 3,0 ± 1,0 
6 Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae)  
(Rafinesque) isoaurinkoahven 20–25 5,0 ± 2,0 
7 Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae)  (Wal­
baum) kirjolohi 13–17 8,0 ± 4,0 
8 Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae)  
(Linnaeus) kolmipiikki 18–20 3,0 ± 1,0  
( 1 ) Meyer A., Orti G. (1993} Proc. Royal Society of London, Series B., Vol. 252, p. 231.  
Erilaisia suisto- ja merikalalajeja on käytetty eri maissa, esimerkiksi: 
(engl.) Spot  Leiostomus xanthurus  
(engl.) Sheepshead minnow  Cyprinodon variegatus  
Hopeakylki  Menidia beryllina  
(engl.) Shiner perch  Cymatogaster aggregata  
(engl.) English sole, eräs kielikampela  Parophrys vetulus  
Simppu  Leptocottus armatus  
Kolmipiikki  Gasterosteus aculeatus  
Meriahven  Dicentraeus labrax  
Salakka  AIburnus alburnus  
Kalojen saatavuus  
Edellä olevassa taulukossa lueteltuja makean veden kaloja on helppo kasvattaa ja/tai niitä on 
helposti saatavissa läpi vuoden, kun taas meri- tai suistokalalajeja on lähinnä saatavissa vastaavissa 
maissa. Niitä voidaan kasvattaa joko kalanviljelylaitoksissa tai laboratorioissa taudeilta ja loisilta valvotuissa olosuhteissa niin, että saadaan terveitä koe-eläimiä, joiden alku/sukuperä tunnetaan. Näitä kaloja on saatavissa monissa osissa maailmaa.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1139
 
Liite 3  
Kertymä- ja poistumavaiheen keston arvioiminen  
1. Kertymdvaiheen keston arvioiminen  
Ennen testin suorittamista voidaan saada arvio k  2 :sta ja siten jokin prosent ­
timäärä tasapainotilan saavuttamiseksi tarvittavasta ajasta, kun tunnetaan 
empiirisiä suhteita k  2 :n ja n-oktanoli-vesi -jakautumiskertoimen (P  ow ) tai 
k 2 :n ja vesiliukoisuuden (s) välillä.  
Arvio k  2 :sta (vuorokautta  1 ) saadaan esimerkiksi seuraavasta empiirisestä 
suhteesta: 
log 10 k 2 = -0,414 log  10 (P ow ) + 1,47 (r  2 = 0,95) (yhtälö 1)  
Muita suhteita on viitteessä (2).  
Jos jakautumiskerrointa (P  ow ) ei tunneta, voidaan tehdä arvio (3), jos tun ­
netaan aineen vesiliukoisuus (s): 
log 10 (P ow ) = 0,862 log  10 (s) + 0,710 (r  2 = 0,994) (yhtälö 2)  
jossa  
s = liukoisuus (moolia/l): (n = 36).  
Nämä suhteet koskevat vain kemiallisia aineita, joiden log P  ow -arvot ovat 
2–6,5 (4).  
Aika, joka tarvitaan jonkin prosenttiasteisen tasapainotilan saavuttamiseksi, 
voidaan saada k  2 -arviota soveltamalla yleisestä kertymä- ja poistumav ­
aihetta kuvaavasta yhtälöstä (ensimmäisen asteen kinetiikka):  
dC f 
dt ¼ k 1 · C w Ä k 2 · C f 
tai jos C  w on vakio:  
C f ¼ k 1 
k 2 · C w ð1 Ä e Äk 2 t Þ (yhtälö 3)  
Kun lähestytään tasapainotilaa (t — ∞), yhtälö 3 voidaan muuttaa (5) (6) 
seuraavasti:  
C f ¼ k 1 
k 2: C w or C f /C w = k  1 /k 2 = BCF  
Tällöin k  1 /k 2 .C w lähenee pitoisuutta kalassa ”tasapainotilassa” (C  t, s ). 
Yhtälö 3 voidaan kirjoittaa seuraavasti:  
C f ¼ C f;s ð1 Ä e Äk 2 t Þ or C f 
C fs ¼ 1 Ä e Äk 2 t (yhtälö 4)  
Soveltamalla yhtälöä 4 voidaan arvioida jonkin prosenttiasteen tasapainoti ­
lan saavuttamiseksi tarvittava aika, kun k, on arvioitu ensin yhtälöstä 1 tai 2.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1140
 
Tilastollisesti paras kertymävaiheen kesto tilastollisesti hyväksyttävien tu ­
losten saamiseksi (BCF  k ) on aika, joka tarvitaan, jotta kalassa olevan tes ­
tattavan aineen pitoisuuden logaritmia lineaarisen ajan funktiona kuvaava käyrä tulee keskikohtaansa, eli 1,6/k, tai 80 % tasapainotilasta, mutta ei enempää kuin 3,0 k
 2 / tai 95 % tasapainotilasta (7).  
Aika, joka tarvitaan 80-prosenttisen tasapainotilan saavuttamiseen on 
(yhtälö 4):  
0; 80 ¼ 1 Ä e Äk 2 t 80 tai t  80 ¼ 1; 6 
k 2 (yhtälö 5)  
Samaten 95 % tasapainotilasta on:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 (yhtälö 6)  
Esimerkiksi kertymävaiheen (uptake phase, up) kesto testattavalle aineelle, 
jonka log P  ow = 4, olisi (käyttäen yhtälöitä 1, 5, 6): 
log 10 k 2 = - 0,414.(4) + 1,47 k  2 = 0,652 vrk  -1 
up (80 %) = 1,6/0,652; ts. 2,45 vrk (59 tuntia)  
tai up (95 %) = 3,0/0,652; ts. 4,60 vrk (110 tuntia).  
Samaten testattavalle aineelle, jonka s = 10  -5 mol/l (log(s) = —5,0), ker ­
tymävaiheen kesto olisi (käyttäen yhtälöitä 1, 2, 5, 6):  
log 10 (P ow ) =- 0,862 (- 5,0) + 0,710 = 5,02  
log 10 k 2 = - 0,414 (5,02) + 1,47  
k 2 = 0,246 vrk  -1 
up (80 %) = 1,6/0,246; ts. 6,5 vrk (156 tuntia)  
tai up (95 %) = 3,0/0,246; ts. 12,2 vrk (293 tuntia).  
Vaihtoehtoisesti yhtälöä  
t eq = 6,54 × 10  3 P ow + 55,31 (tuntia)  
voidaan käyttää tosiasiallisen tasapainotilan saavuttamiseksi tarvittavan ajan 
laskemiseen (4).  
2. Poistumavaiheen keston arvioiminen  
Ennakkoarvio ajasta, joka tarvitaan eläimeen kertyneen aineen pitoisuuden 
jonkin prosenttimäärän poistumiseen, voidaan myös saada kertymä- ja po ­
istumavaihetta (ensimmäisen asteen kinetiikka) kuvaavasta yleisestä yhtä ­
löstä (1) (8).  
Oletetaan, että C  w on poistumavaiheessa nolla. Yhtälö saa seuraavan muo ­
don: 
dC f 
dt ¼ Äk 2 C f or C  f ¼ C f;o · e Äk 2 t ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1141
 
jossa C  t.o on pitoisuus poistumavaiheen alussa. Siten saavutetaan 50 pro ­
sentin poistuma ajankohtana (t  50 ): 
C f 
C f;o ¼ 1 
2 ¼ e Äk 2 t 50 or t 50 ¼ 0; 693 
k 2 
Samaten 95 prosentin poistuma saavutetaan ajankohtana:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 
Jos 80 %:n kertymää käytetään ensimmäisessä vaiheessa (1,6/k  2 ) ja 95 
prosentin poistumaa poistumavaiheessa (3,0/k  2 ), niin poistumavaihe on 
suunnilleen kaksi kertaa niin pitkä kuin kertymävaihe.  
On kuitenkin tärkeää huomata, että nämä arviot perustuvat siihen, että 
kertymä- ja poistumavaihe noudattavat ensimmäisen asteen kinetiikkaa. Jos näin ei selvästikään ole, on käytettävä monimutkaisempia malleja (esim. viite (1)).
 
Kirjallisuusviitteet ( liite 3 ) 
(1) Spacie A. and Hamelink J.L. (1982), Alternative models for describing 
the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, pp 309–320.
 
(2) Kristensen P. (1991), Bioconcentration in fish: comparison of BCF's 
derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particu ­
late matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.
 
(3) Chiou CT. and Schmedding D.W. (1982), Partitioning of organic 
compounds in octano!-water Systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), 
pp 4–10.  
(4) Hawker D.W. and Connell D.W. (1988), Influence of partition coeffi ­
cient of lipophilie compounds on bioconcentration kinetics with fish. 
Wat. Res. 22 (6), pp 701—707.  
(5) Branson D.R., Blau G.E, Alexander H.C. and Neely \X'.B. (1975), 
Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp 785–-792.  
(6) Ernst W. (1985), Accumulation in aquatic organisms. In: Appraisal of 
tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P.H. Part 4.4 
pp 243–255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd N.Y.
 
(7) Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff 
M.W. (1977), Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. 
Eng. 55, pp 614–622.
 
Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980), Toxicokinetics in fish: 
Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp 3–19.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1142
 
LIITE 4  
Teoreettinen esimerkki kertymätestin aikataulusta aineille, joiden log P  ow = 4 
Kalanäytteiden otto Näytteenottoaikataulu 
Vesinäytteiden lukumäärä Kalojen lukumäärä näy ­
tettä kohti Vaadittu vähimmäis-taa ­
juus (vrk) Lisä-näytteet  
Kertymä-vaihe - 1 
0 2 (*) 
2 lisättävä 45-80 kalaa 
1. 0,3 0,4 2 
(2) 4 
(4) 
2. 0,6 0,9 2 
(2) 4 
(4) 
3. 1,2 1,7 2 
(2) 4 
(4) 
4. 2,4 3,3 2 
(2) 4 
(4) 
5. 4,7 2 6 
Poistuma-vaihe Siirto veteen, jossa ei 
ole testattavaa kemi ­
kaalia 
6. 5,0 5,3 4 
(4) 
7 5,9 7,0 4 
(4) 
8. 9,3 11,2 4 
(4) 
9. 14,0 17,5 6 
(4) 
(*) Vedestä otetaan näyte, kun kammioon on lisätty vähintään 3 kammion tilavuutta vettä. 
Suluissa olevat luvut ovat mahdollisten lisänäytteiden (vesi, kala) määrä.  
Huom. : Ennen testiä tehty arvio k  2 :lle, kun log P  ow on 4,0 on 0,652 vrk  -1 . Koko kokeen kesto on 3 X up = 3 x 4,6 vrk eli 14 vrk. 
Ottovaiheen (up) arviota varten katso liite 3.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1143
 
Liite 5  
Mallin valitseminen  
Biokertymistulosten on yleensä oletettu noudattavan ”kohtuullisesti” yksinker ­
taista kahden osaston ja kahden muuttujan mallia. Sen osoittaa suora kuvaaja, joka vastaa kalassa poistumavaiheessa havaittuja pitoisuuksia, kun ne esitetään 
puolilogaritmipaperilla. (Jos näistä pitoisuuksista ei muodostu suoraa kuvaajaa, 
olisi käytettävä monimutkaisempia malleja, katso esim. Spacie ja Hamelink, liitteen 3 viite 1).
 
Graafinen menetelmä poistumavakion k  2 määrittämiseksi  
Kussakin kalanäytteessä mitattu testattavan aineen pitoisuus esitetään näytteen ­
ottoajankohdan funktiona puolilogaritmipaperilla. Tämän kuvaajan kulmakerroin on k
 2 . 
k 2 ¼ ln ðC f1=C f2 Þ 
t 2 Ä t 1
 
On huomattava, että poikkeamat suorasta viivasta voivat viitata monimutkaisem ­
paan poistumaan kuin ensimmäisen asteen kinetiikkaa noudattavaan poistumaan. 
Graafista menetelmää voidaan käyttää sellaisten poistumatyyppien selvittämiseen, 
jotka poikkeavat ensimmäisen asteen kinetiikasta.  
Graafinen menetelmä kertymävakion k  1 määrittämiseksi  
Kun tunnetaan k  2 , lasketaan k  1 seuraavasti:  
k 1 ¼ C f k 2 
C w Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ (yhtälö 1).  
C f :n arvo luetaan mittaustuloksista saadun tasaisen käyrän keskikohdasta, kun 
pitoisuuden logaritmi on esitetty ajan funktiona (aritmeettisella asteikolla).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1144
 
Kertymä- ja poistumavakioiden laskeminen tietokoneella  
Biokertyvyystekijä sekä k  1 - ja k  2 -nopeusvakiot lasketaan mieluiten tietokoneella 
käyttäen epälineaarisia parametrien arviointimenetelmiä. Tällaisilla ohjelmilla saa ­
daan arvot k  1 :lle ja k  2 :lle, jos on sarja peräkkäisiä aikakonsentraatiotuloksia ja 
malli:  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü 1 Ä e Äk 2 t Ê Ì  
0 < t < t  c (yhtälö 2).  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü e Äk 2 ðtÄt c Þ Ä e Äk 2 t Ê Ì  
t > t  c (yhtälö 3).  
joissa t  c = aika, jolloin kertymävaihe loppuu.  
Tällä menetelmällä saadaan myös k  1 :n ja k  2 :n keskihajonnan keskivirheet.  
Koska k  2 voidaan useimmissa tapauksissa arvioida poistumiskäyrästä suhteellisen 
suurella tarkkuudella ja koska k  1 ja k  2 korreloivat vahvasti, jos ne arvioidaan 
samanaikaisesti, voi olla suositeltavaa laskea ensin k  2 poistumavaiheen tuloksista 
ainoastaan ja laskea sitten k  1 kertymävaiheen tuloksista käyttäen epälineaarisen 
regression menetelmää.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1145
 
C.14.  KALANPOIKASILLA TEHTÄVÄ KASVUTESTI  
1. MENETELMÄ  
Tämä kasvun mittaukseen perustuva myrkyllisyystesti on toisinto 
OECD:n testiohjeesta nro 215 (2000).  
1.1 JOHDANTO  
Testin tarkoituksena on arvioida vaikutukset, jotka pitkäaikaisella 
altistuksella kemikaaleille on kalanpoikasten kasvuun. Testi perustuu Euroopan unionissa kehitettyyn ja rengastestattuun (1) (3) menetel ­
mään, jolla arvioidaan kemikaalien vaikutus kirjolohen poikasen  
(Oncorynchus mykiss)  kasvuun läpivirtausolosuhteissa. Muitakin hy ­
vin dokumentoituja lajeja voidaan käyttää. Kokemusta on esimer ­
kiksi seeprakalalla  (Danio rerio ) (2) (4) (5) ja medakalla ( Oryzias 
latipes)  (6) (7) (8) tehdyistä kasvutesteistä.
 
Ks. myös osan C Yleisjohdanto.  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
LOEC (Lowest Observed Effect Concentration, pienin havaitta ­
van vaikutuksen aiheuttava pitoisuus):  Pienin testiaineen testattu 
pitoisuus, jolla aineen havaitaan aiheuttavan merkitsevän vaikutuksen (arvolla p < 0,05) verrattuna kontrolliin. Kuitenkin kaikilla LOEC- 
tasoa suuremmilla testipitoisuuksilla on oltava vähintään yhtä haital ­
linen vaikutus kuin LOEC-tasolla.
 
NOEC (No Observed Effect Concentration, vaikutukseton 
pitoisuus):  Välittömästi LOEC-tasoa pienempi testipitoisuus.  
EC X : tässä testimenetelmässä se testiaineen pitoisuus, joka aiheuttaa 
x prosentin muutoksen kalan kasvunopeudessa verrattuna kontrollei ­
hin. 
Lastaustiheys:  kalojen märkäpaino tilavuusyksikköä kohti.  
Varastotiheys:  kalojen lukumäärä tilavuusyksikköä kohti.  
Yksittäisen kalan spesifinen kasvunopeus:  yksittäisen kalan kasvu ­
nopeus verrattuna sen alkupainoon.  
Tankkikohtainen keskimääräinen spesifinen kasvunopeus:  tankin 
populaation keskimääräinen kasvunopeus yhdessä pitoisuudessa.  
Spesifinen pseudokasvunopeus:  yksittäisen kalan kasvunopeus ver ­
rattuna tankkipopulaation keskimääräiseen alkupainoon.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1146
 
1.3 TESTIN PERIAATE  
Eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa olevat kalanpoikaset punnitaan 
ja pannaan testiastioihin, jossa ne altistetaan useille veteen liuotettu ­
jen testiaineiden subletaaleille pitoisuuksille mieluiten läpivirtausolo ­
suhteissa, tai jos se ei ole mahdollista, sopivissa puolistaattisissa 
(staattinen järjestelmä, jossa liuokset vaihdetaan) olosuhteissa. Testin kesto on 28 vuorokautta. Kalat ruokitaan päivittäin. Rehun määrä suhteutetaan kalojen alkupainoon, ja se voidaan laskea uudelleen 
14 vuorokauden kuluttua. Testin lopussa kalat punnitaan uudelleen. 
Vaikutukset kasvunopeuteen analysoidaan käyttämällä regressiomal ­
lia sen pitoisuuden estimoimiseksi, joka aiheuttaisi x prosentin vai ­
kutuksen kasvunopeuteen, ts. EC
 X (esim. EC  10 ,EC,  20 tai EC  30 ). 
Vaihtoehtoisesti tuloksia voidaan verrata kontrolliarvoihin pienim ­
män havaittavan vaikutuksen aiheuttavan pitoisuuden arvioimiseksi ja siitä edelleen sen pitoisuuden arvioimiseksi, joka ei aiheuta ha ­
vaittavaa vaikutusta.
 
1.4 TESTIAINETTA KOSKEVAT TIEDOT  
Välittömän myrkyllisyyden testin (ks. menetelmä C.l), joka on mie ­
luiten tehty tähän testiin valitulla lajilla, tulosten pitäisi olla käytet ­
tävissä. Tämä tarkoittaa sitä. että testiaineen vesiliukoisuus ja 
höyrvnpaine tunnetaan, että käytettävissä on luotettava analyyttinen 
menetelmä aineen kvantifioimiseksi testiliuoksissa ja että menetel ­
män tarkkuus ja detektioraja tunnetaan ja ne on raportoitu.  
Hyödyllisiä tietoja ovat mm. rakennekaava, aineen puhtaus, stabii ­
lisuus vedessä ja valossa, pK  a , P OW . ja nopean biohajoavuuden testin 
tulokset (ks. menetelmä C.4).  
1.5 TESTIN LUOTETTAVUUS  
Testi on luotettava, jos  
— kontrollien kuolleisuus ei ole suurempi kuin 10 % testin lopussa,  
— kontrollikalojen keskimääräinen paino on noussut niin paljon, 
että voidaan osoittaa merkitseväksi katsottu kasvunopeuden mi ­
nimivaihtelu. Rengastestissä (2) on osoitettu, että kirjolohelle kontrollikalojen keskimää räisen painon on noustava 28 vuoro ­
kaudessa vähintään puolella (ts. 50 %) verrattuna niiden alku ­
painoon. Esim: alkupaino: 1 g/kala (= 100 %), loppupaino 28 vuorokauden kuluttua: ≥ 1,5 g/kala ( ≥ 150 %),
 
— liuenneen hapen pitoisuus on vähintään 60 % ilman kyllästys ­
arvosta koko testin ajan.  
— veden lämpötila vaihtelee enintään 1  o C testiastioiden välillä mil ­
loin tahansa testin aikana ja poikkeaa enintään 2  o C siitä lämpötila- 
alueesta, joka on määritelty kyseiselle testilajille (lisäys 1).  
1.6 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.6.1  Laitteet ja tarvikkeet  
Tavallisia laboratoriolaitteita ja erityisesti seuraavat:  
— a) happi- ja pH-mittarit:  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1147
 
— b) laitteet veden kovuuden ja emäksisyyden mittaamiseen;  
— c) asianmukaiset laitteet lämpötilan säätöön ja mieluiten sen jat ­
kuvaan seurantaan;  
— d) tankkeja, jotka ovat kemiallisesti inerttiä materiaalia ja riittä ­
vän suuria suhteessa suositeltuun lastaus- ja varastotiheyteen (ks. kohta 1.8.5 ja lisäys 1);
 
— e) riittävän tarkka vaaka (ts. ± 0,5 %).  
1.6.2  Vesi  
Testissä voidaan käyttää mitä tahansa sellaista vettä, jossa testilaji 
elää ja kasvaa sopivan kauan. Veden laadun pitäisi pysyä vakiona testin ajan. Veden pH:n olisi oltava välillä 6,5–8,5, mutta kunkin 
testin aikana se ei saa vaihdella enempää kuin 0,5 pH-yksikköä. 
Suositeltava veden kovuus on yli 140 mg/l (CaCO
 3 ). Sen varmista ­
miseksi, ettei laimennusvesi vaikuta liikaa testituloksiin (esimerkiksi kompleksoimalla testattavaa ainetta), näytteitä olisi otettava säännöl ­
lisin väliajoin määrityksiä varten. Raskasmetallit (esim. Cu, Pb, Zn, 
Hg, Cd, Ni), tärkeimmät anionit ja kationit (esim. Ca, Mg, Na. K, C1, SO
 4 ), torjunta-aineet (esim. orgaanista fosforia ja orgaanista 
klooria sisältävien torjunta-aineiden kokonaispitoisuudet), orgaanisiin 
yhdisteisiin sitoutuneen hiilen kokonaispitoisuus ja suspendoituneet 
kiinteät aineet olisi määritettävä esimerkiksi kolmen kuukauden vä ­
lein, jos laimennusveden laatu tiedetään suhteellisen vakioksi. Jos veden laadun on osoitettu pysyvän vakiona ainakin vuoden ajan, 
määrityksiä voidaan tehdä harvemmin (esim. kuuden kuukauden vä ­
lein). Lisäyksessä 2 luetellaan joitakin hyväksyttävän laimennusve ­
den ominaisuuksia.
 
1.6.3  Testiliuokset  
Halutunpitoiset testiliuokset valmistetaan varastoliuoksista laimenta ­
malla.  
Varastoliuos valmistetaan mieluiten yksinkertaisesti sekoittamalla 
testattava aine laimennusveteen käyttäen mekaanisia menetelmiä tai ultraääntä. Saturaatiopylväitä (liukoisuuspylväitä) voidaan käyttää riittävän väkevän varastoliuoksen valmistamiseksi.
 
Liuottimien tai liuotusapuaineiden (dispergointiaineiden) käyttö voi 
olla tarpeen joissakin tapauksissa riittävän väkevän varastoliuoksen 
valmistamiseksi. Sopivia liuottimia ovat esimerkiksi asetoni, etanoli, 
metanoli, dimetyylisulfoksidi, dimenyliformamidi ja trietyleeniglyko ­
li. Sopivia dispergointiaineita ovat esimerkiksi Cremophor RH40, Tween 80, 0,01-prosenttincn metyyliselluloosa ja HCO- 
40. Helposti biohajoavia aineita (kuten asetonia) ja/tai helposti haih ­
tuvia aineita käytettäessä on oltava varovainen, koska ne voivat ai ­
heuttaa ongelmia bakteerikasvuston takia läpivirtaustesteissä. Jos käytetään liuotusapuaineita, niillä ei saa olla merkittävää vaikutusta 
kalojen kasvuun eikä näkyviä haitallisia vaikutuksia kalanpoikasiin. 
Se on osoitettava ainoastaan liuotinta sisältävän kontrollin avulla.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1148
 
Läpivirtaustesteissä on käytettävä testiaineen varastoliuosta jatkuvasti 
annostelevaa ja laimentavaa järjestelmää (esim. annostelupumppua, 
laimenninta, kyllästävää järjestelmää) eri pitoisuuksia sisältävien näytteiden annostelemiseksi testiastioihin. Varastoliuosten ja laimen ­
nusveden virtausnopeudet on tarkistettava säännöllisin väliajoin, mie ­
luiten kerran päivässä, ja virtausnopeus saisi vaihdella enintään 10 % 
koko testin aikana. Rengastestissä (3) on osoitettu, että hyväksyttävä vedenvaihtotaajuus on kirjolohelle 6 litraa grammaa kalaa kohti päi ­
vässä (ks. kohta 1.8.2.2).
 
Puolistaattisissa (joissa liuokset vaihdetaan) testeissä kasvatusnesteen 
vaihtoväli riippuu testiaineen stabiilisuudesta, mutta vaihtoa suositel ­
laan kerran päivässä, jos alustavista stabiilisuustesteistä (ks. kohta 1.4) tiedetään, ettei testiaineen pitoisuus pysy vakiona (ts. se ei ole 
välillä 80–120 % nimellisarvosta tai se laskee alle 80 prosenttiin 
mitatusta alkupitoisuudesta) vaihtojen välillä, olisi harkittava läpivir ­
taustestiä.
 
1.6.4  Kalalajin valinta  
Kirjolohi  (Oncorhynchus mykiss ) on suositeltava laji tähän testiin, 
koska rengastestissä on eniten kokemusta siitä (1) (3). Muutakin 
hyvin dokumentoitua lajia saa käyttää, mutta testimenetelmää on 
mahdollisesti mukautettava, jotta testiolosuhteet olisivat sopivat. Ko ­
kemusta on esim. seeprakalasta  (Danio rerio)  (4) (5) ja medakasta  
(Oryzias latipes)  (6) (7) (8). Tällaisessa tapauksessa olisi selostettava 
syyt lajin ja koemenetelmän valitsemiseen.  
1.6.5  Kalojen hoito  
Testikalat on valittava yhdestä populaatiosta, mieluiten samasta poi ­
kueesta, jota on pidetty vähintään kaksi viikkoa ennen testiä saman ­
laatuisessa vedessä ja samanlaisissa valaistusolosuhteissa kuin ne, 
joita käytetään testissä. Kaloille olisi annettava ravintoa vähintään 
2 % ja mieluiten 4 % elopainoa kohti päivässä niiden kasvatus- aikana ja testin aikana.
 
Kalojen kuolleisuus rekisteröidään 48 tunnin sopeutumisajanjakson 
jälkeen. Tämän jälkeen sovelletaan seuraavia perusteita:  
— jos kuolleisuus on yli 10 % populaatiosta seitsemässä vuorokau ­
dessa: koko erä hylätään,  
— jos kuolleisuus on välillä 5-10 % populaatiosta: kaloja totutetaan 
vielä seitsemän päivää. Jos kuolleisuus on yli 5 % näiden toisten 
seitsemän päivän aikana, koko erä hylätään,  
— jos kuolleisuus on alle 5 % populaatiosta seitsemässä vuorokau ­
dessa: erä hyväksytään.  
Kaloille ei saisi antaa mitään hoitoa sairautta varten testiä edeltävien 
kahden viikon aikana eikä testin aikana.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1149
 
1.7 TESTIN SUUNNITTELU  
”Testin suunnittelu” tarkoittaa testipitoisuuksien lukumäärän ja pitoi ­
suusvälien valintaa, tankkien lukumäärää kutakin pitoisuutta kohti ja kalojen lukumäärää tankkia kohti. Testi pitäisi suunnitella mieluiten 
niin, että otetaan huomioon
 
— a) tutkimuksen tarkoitus;  
— b) käytettävä tilastollisen analyysin menetelmä;  
— c) kokeessa tarvittavien resurssien saatavuus ja kustannukset.  
Tavoitteita ilmoitettaessa olisi mahdollisuuksien mukaan spesifioita ­
va, millä tilastollisella teholla tietynsuuruinen ero (esim. kasvunopeu ­
dessa) on osoitettava tai vaihtoehtoisesti millä tarkkuudella EC  X 
(esim. kun x = 10, 20 tai 30, ja mieluiten vähintään 10) on estimoi ­
tava. Muuten tutkimuksen kokoa ei voida määritellä tarkasti.  
On tärkeää huomata, että suunnitelma, joka on optimaalinen (hyö ­
dyntää resurssit parhaiten) yhdelle tilastoanalyysimenetelmälle, ei ole välttämättä optimaalinen toiselle menetelmälle. LOEC/NOEC-arvon 
estimoinnille suositeltava suunnitelma ei siis olisi sama kuin regres ­
sioanalyysiä varten suositeltava.
 
Useimmissa tapauksissa regressioanalyysi on parempi kuin varians ­
sianalyysi. Syitä ovat käsitelleet Stephan ja Rogers (9). Jos kuiten ­
kaan ei löydetä sopivaa regressiomallia (r  2 < 0,9), olisi käytettävä 
NOEC|LOEC-menetelmää.  
1.7.1  Regressioanalyysille suositeltava testisuunnitelma  
Regressioanalyysillä käsiteltävän testin suunnitelmassa on otettava 
huomioon seuraavat seikat:  
— a) Testissä käytettävien pitoisuuksien on katettava vaikutuspitoi ­
suus (esim. EC  10, 20, 30  ) ja se pitoisuusalue, joka on merkityksel ­
linen kyseisen testiaineen kannalta. Tarkkuus, jolla vaikutuspitoi ­
suuksien estimaatit voidaan tehdä, on paras, kun vaikutuspitoi ­
suus sijoittuu testattujen pitoisuuksien keskialueelle. Alustava pi ­
toisuusalueen määrittely voi auttaa sopivien testipitoisuuksien va ­
linnassa.  
— b) Jotta tilastollinen mallitus olisi mahdollista, testissä pitäisi olla 
vähintään yksi kontrollitankki ja viisi muuta tankkia, joissa on eri 
pitoisuudet. Jos käytetään liuotusapuaineita, on testisarjan lisäksi 
määritettävä yksi kontrolli, joka sisältää liuotusapuainetta suurim ­
massa testipitoisuudessa (ks. kohdat 1.8.3 ja 1.8.4),  
— c) Sopivaa geometrista tai logaritmista sarjaa (10) (ks. lisäys 3) 
voidaan käyttää. On suositeltavaa tehdä pitoi suuksista logaritmi ­
nen sarja.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1150
 
— d) Jos käytettävissä on enemmän kuin kuusi tankkia, lisätankit 
olisi käytettävä joko rinnakkaismäärityksiin tai niissä olevat pi ­
toisuudet olisi sijoitettava koko pitoisuusalueen yli, jotta pitoi ­
suuksien eroja voidaan pie nentää. Kumpikin tapa on yhtä hyvä.  
1.7.2  Varianssianalyysillä (ANOVA) käsiteltävälle NOEC/LOEC-me ­
netelmälle suositeltava testisuunnitelma  
Kullekin pitoisuudelle pitäisi olla mieluiten rinnakkaiset tankit, ja 
tilastollinen analyysi pitäisi tehdä tankkien tasolla (11). Ilman rin ­
nakkaisia tankkeja ei voida tehdä korjauksia tankkien välisen vaih ­
telun ottamiseksi huomioon sen vaihtelun lisäksi, joka johtuu yksit ­
täisistä kaloista. Kokemus on kuitenkin osoittanut (12), että tankkien 
välinen vaihtelu on erittäin pieni verrattuna tankin sisäiseen (ts. ka ­
lojen väliseen) vaihteluun. Suhteellisen hyväksyttävä vaihtoehto on siksi tehdä tilastollinen analyysi yksittäisten kalojen tasolla.
 
Tavanomaisesti käytetään vähintään viittä testipitoisuutta geometri ­
sessa sarjassa, jolloin kerroin ei mielellään saa ylittää arvoa 3,2.  
Yleensä kun testeissä on rinnakkaisia tankkeja, rinnakkaisten kont ­
rollitankkien lukumäärän ja siten kalojen määrän pitäisi olla kaksi kertaa niiden määrä kussakin testipitoisuudessa, joiden pitäisi olla samansuuruiset (13) (14) (15). Jos sen sijaan ei käytetä rinnakkaisia 
tankkeja, kontrolliryhmän kalojen lukumäärän olisi oltava sama kuin 
niiden lukumäärä kussakin testipitoisuudessa.
 
Jos ANOVA-analyysin on määrä perustua tankkeihin eikä yksittäisiin 
kaloihin (mikä edellyttäisi joko kalojen yksilöllistä merkitsemistä tai 
spesifisen pseudokasvunopeuden käyttöä (ks. kohta 2.1.2)), on rin ­
nakkaisia tankkeja oltava niin paljon, että kutakin pitoisuutta varten käytettävien tankkien välinen keskihajonta voidaan määrittää. Tämä 
tarkoittaa sitä. etta virhettä koskevien vapausasteiden määrän varians ­
sianalyysissä on oltava vähintään 5 (11). Jos vain kontrolleista on rinnakkaiset, on vaara, että virheen vaihtelu vääristyy, koska se voi kasvaa kyseessä olevan kasvunopeuden keskiarvon mukana. Koska 
kasvunopeus todennäköisesti pienenee pitoisuuden noustessa, tämä 
saattaa johtaa vaihtelun estimointiin liian suureksi.
 
l.8. MENETTELY  
l.8.l Kalojen valinta ja punnitus  
On tärkeää minimoida kalojen painon vaihtelu testin alussa. Lisäyk ­
sessä 1 mainitaan, minkälainen kokovaih-telu sopii tähän testiin suo ­
sitelluille eri lajeille. Testissä käytettävässä koko kalaerässä yksittäis ­
ten kalojen painot eivät saisi vaihdella testin alussa mielellään enem ­
pää kuin ±10 % aritmeettisesta keskiarvosta eikä missään tapauk ­
sessa enemmän kuin 25 %. Suositellaan, että punnitaan alustava 
erä kaloja keskimääräisen painon arvioimiseksi.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1151
 
Kantapopulaatiota ei saisi ruokkia 24 tuntiin ennen testin alkua. 
Kalat valitaan sitten satunnaistetusti. Kalat anestetisoidaan yleisellä 
anestesia-aineella (esim. vesiliuos, jossa on 100 mg/l trikaiinimetaa ­
nisulfonaattia (MS 222), joka on neutralisoitu lisäämällä kaksi osaa natriumbikarbonaattia yhtä osaa MS 222:ta kohti) ja punnitaan yk ­
sittäin (märkäpaino; pyyhekuivattuna) Lisäyksessä 1 mainitulla tark ­
kuudella. Kalat, joiden paino on annetuissa rajoissa, otetaan testiin ja jaetaan satunnaistetusti testiastioihin. Kalojen kokonaismärkäpaino kussakin testiastiassa kirjataan. Anestesia samoin kuin kalojen käsit ­
tely (kuten kuivaaminen ja punnitus) voi aiheuttaa kalanpoikasille, 
erityisesti pienikokoisille kaloille, stressiä ja vaurioita. Kalanpoikasia on siksi käsiteltävä äärimmäisen varoen stressin ja vahingoittumisen välttämiseksi.
 
Kalat punnitaan uudelleen päivänä 28 (ks. kohta 1.8.6), Jos katso ­
taan, että ruoka-annos on laskettava uudelleen, kalat voidaan punnita uudelleen päivänä 14 (ks. kohta 1.8.2.3). Muitakin menetelmiä, kuten 
valokuvaamista, voidaan käyttää kalojen koon muutosten määrittämi ­
seksi. Rehun määrä voidaan siten mukauttaa koon muutoksiin.
 
1.8.2  Altistusolosuhteet  
1.8.2.1  Testin kesto  
Testin kesto on ≥ 28 vuorokautta.  
1.8.2.2  Lastaus- ja varastotiheys  
On tärkeää, että lastaus- ja varastotiheys ovat käytetylle kalalajille 
sopivia (ks. lisäys 1). Jos varastotiheys on liian suuri, ahtaus aiheut ­
taa stressiä, jonka seurauksena kasvunopeus laskee ja kalat voivat 
sairastua. Jos varas-totiheys on liian pieni, voi aiheutua territoriaa ­
likäyttäytymistä, joka voi myös vaikuttaa kasvuun. Joka tapauksessa lastaustiheyden pitäisi olla niin pieni, että liuenneen hapen pitoisuus 
voidaan pitää vähintään arvossa 60 % ilman ilmastusta. Rengastes ­
tissä (3) on osoitettu, että hyväksyttävä lastaustiheys kirjolohelle on 16 kirjolohta (paino 3–5 g) 40 litrassa. Suositeltava veden vaihtamis ­
taajuus testin aikana on 6 litraa grammaa kohti kalaa vuorokaudessa.
 
1.8.2.3  Ruokkiminen  
Kaloille pitäisi antaa sopivaa ravintoa (lisäys 1) riittävästi, jotta kas ­
vunopeus on hyväksyttävä. On varottava, ettei vedessä kasva mikro ­
beja eikä se samennu. Kirjolohelle mainitut edellytykset todennäköi ­
sesti täyttävä ruokintatiheys on 4 % elopainosta vuorokaudessa (3) 
(16) (17) (18). Päiväannos voidaan jakaa kahteen yhtä suureen osaan 
ja antaa kahtena kertana päivässä. Ruokintojen välin on oltava vä ­
hintään 5 tuntia. Annoksen määrä perustuu kalojen kokonaispainoon kutakin testiastiaa kohti testin alussa. Jos kalat punnitaan uudelleen 
päivänä 14, annos lasketaan uudelleen. Kaloja ei saa ruokkia 24 
tuntiin ennen punnitusta.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1152
 
Syömättä jäänyt rehu ja ulosteet on poistettava testiastioista päivittäin 
puhdistamalla tankkien pohjat huolellisesti imulaitteella.  
1.8.2.4  Valo ja lämpötila  
Valoisan ajan ja testiveden lämpötilan pitäisi olla sopivia käytetylle 
testilajille (lisäys 1).  
1.8.3  Testipitoisuudet  
Yleensä tarvitaan viisi testipitoisuutta riippumatta testisuunnitelmasta 
(ks. kohta 1.7.2). Jos testiaineen myrkyllisyydestä on aiempia tietoja (esim. akuutista testistä ja/tai alustavista pitoisuusalueen määrityksis ­
tä), ne auttavat sopivien testipitoisuuksien valinnassa. Jos käytetään 
vähempää kuin viittä testipitoisuutta, se on perusteltava. Suurin tes ­
tipitoisuus ei saisi olla suurempi kuin aineen liukoisuus veteen.
 
Kun varastoliuosten valmistuksessa käytetään jotakin liuotusapuai ­
netta, sen lopputilavuus testiastioissa ei saisi olla suurempi kuin 0,1 ml/l, ja tilavuuden pitäisi olla sama kaikissa testiastioissa (ks. 
kohta 1.6.3). Näiden aineiden käyttöä on kuitenkin vältettävä mah ­
dollisimman pitkälle.
 
1.8.4  Kontrollit  
Laimennusvesikontrollien lukumäärä riippuu testisuunnitelmasta (ks. 
kohdat 1.7–1.7.2). Jos käytetään liuotusapuainetta, testiin on otettava mukaan yhtä monta liuotusapuainekontrollia kuin laimennusvesikont ­
rolleja.
 
1.8.5  Analyyttisten määritysten ja mittausten taajuus  
Testiaineen pitoisuudet on määritettävä säännöllisin määräajoin testin 
aikana (ks. jäljempänä).  
Läpivirtaustesteissä laimennusveden ja myrkyllistä ainetta sisältävän 
varastoliuoksen virtausnopeudet on tarkistettava säännöllisin välia ­
join, mieluiten kerran päivässä, ja virtausnopeus saisi vaihdella enin ­
tään 10 prosenttia koko testin aikana. Jos testiainepitoisuuksien od ­
otetaan pysyvän 20 prosentin sisällä nimellisarvosta (ts. välillä 80–120 %, ks. kohdat 1.6.2 ja 1.6.3), suositellaan, että määritetään vähintään suurimmat ja pienimmät pitoisuudet testin alussa ja viikon 
välein sen jälkeen, jos testiaineen pitoisuuden ei odoteta pysyvän 20 
prosentin sisällä nimellisarvosta (aineen stabiilisuutta koskevien tie ­
tojen perusteella), on analysoitava kaikki pitoisuudet noudattaen sa ­
manlaista järjestelmää.
 
Puolistaattisissa (jossa liuokset vaihdetaan) testeissä suositellaan, että 
määritetään vähintään suurimmat ja pienimmät pitoisuudet tuoreesta 
liuoksesta ja juuri ennen liuoksen vaihtoa testin alussa ja viikon 
välein sen jälkeen, jos testiainepitoisuuksien odotetaan pysyvän 20 prosentin sisällä nimellisarvosta. Jos testiaineen pitoisuuden ei od ­
oteta pysyvän 20 prosentin sisällä nimellisarvosta, on analysoitava 
kaikki pitoisuudet noudattaen samanlaista järjestelmää kuin stabiilim ­
mille aineille.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1153
 
Suositellaan, että tulosten perusteina käytetään mitattuja pitoisuuksia. 
Jos kuitenkin on näyttöä siitä, että testiaineen pitoisuus pysyy tyy ­
dyttävästi 20 prosentin sisällä nimellispitoisuudesta tai mitatusta al ­
kupitoisuudesta koko testin ajan, tulosten perustana voidaan käyttää nimellispitoisuuksia tai mitattuja pitoisuuksia.
 
Näytteet voivat edellyttää sentrifugointia tai suodatusta (esim. 0,45 
um:n huokoskoon suotimella). Sentrifugointia suositellaan. Jos testi ­
aine ei adsorboidu suotimiin, voi myös suodatus olla hyväksyttävää.  
Liuennut happi, pH ja lämpötila on mitattava testin aikana kaikista 
testiastioista. Veden kokonaiskovuus, emäksisyys ja suolapitoisuus (jos sillä on merkitystä) mitataan kontrolleista ja yhdestä astiasta, jossa on suurin pitoisuus. Vähintään olisi mitattava liuennut happi 
ja suolapitoisuus (jos sillä on merkitystä) kolmesti (testin alussa, 
keskivaiheilla ja lopussa). Suositellaan, että puolistaattisissa testeissä liuennut happi mitataan useammin, mieluiten ennen kutakin veden 
vaihtoa ja sen jälkeen tai vähintään kerran viikossa. pH olisi mitat ­
tava kunkin vedenvaihdon alussa ja lopussa puolistaattisissa testeissä ja vähintään viikoittain läpivirtaustesteissä. Kovuus ja emäksisyys olisi mitattava kerran testin aikana. Lämpötilaa olisi mielellään seu ­
rattava jatkuvasti vähintään yhdessä testiastiassa.
 
1.8.6  Havainnot  
Paino: Testin lopussa on määritettävä kaikkien elossa olevien kalojen 
märkäpaino (pyyhekuivattuna) joko ryhmittäin testiastiaa kohti tai yksittäin. Punnitseminen testiastiaa kohti on parempi kuin yksittäis ­
ten kalojen punnitseminen, jolloin kalat olisi merkittävä yksilöllisesti. 
Jos mitataan kunkin kalan paino yksilöspesifisen kasvunopeuden määrittämiseksi, olisi valittava sellainen merkintätapa, joka ei stres ­
saisi eläimiä (kylmämerkinnän vaihtoehdot, esim. hienon värillisen 
siiman käyttö, voivat olla sopivia).
 
Kaloja on havainnoitava päivittäin testin aikana, ja kaikki ulkoiset 
poikkeavuudet (kuten verenvuoto, värin muutokset) olisi pantava 
merkille. Mahdolliset kuolemantapaukset on kirjattava ja kuolleet 
kalat poistettava mahdollisimman nopeasti tankista. Kuolleiden kalo ­
jen tilalle ei panna uusia, sillä lastaus- ja varastotiheys ovat niin suuret, että kunkin tankin kalojen määrän muutokset eivät vaikuta 
kasvuun. Ruokkimistaajuutta on kuitenkin mukautettava.
 
2. MÄÄRITYSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Suositellaan, että sekä testin suunnittelussa että analysoinnissa on 
mukana tilastotieteilijä, koska menetelmä mahdollistaa huomattavaa 
joustoa kokeen suunnittelussa. Esim. testiastioiden lukumäärä, testi ­
pitoisuuksien lukumäärä ja kalojen lukumäärä voivat olla erilaiset.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1154
 
Kasvunopeuksia ei lasketa sellaisille testiastioille, joissa kuolleisuus 
on yli 10 %. Kuolleisuus olisi kuitenkin ilmoitettava kaikille testipi ­
toisuuksille.  
Riippumatta tulosten analysointiin käytettävästä menetelmästä kes ­
keinen käsite on spesifinen kasvunopeus r ajankohtien t  1 , ja t  2 välillä. 
Se voidaan määritellä useilla tavoilla riippuen siitä, onko kalat mer ­
kitty yksilöllisesti vai ei ja siitä, tarvitaanko tankin keskiarvoa.  
r 1 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100  
r 2 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100  
r 3 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100  
jossa  
r 1 = yksittäisen kalan spesifinen kasvunopeus  
r 2 = tankkikohtainen keskimääräinen kasvunopeus  
r 3 = spesifinen pseudokasvunopeus  
W 1 , W  2 = tietyn kalan paino ajankohdalla t  1 , ja t  2 
log e W 1 = yksittäisen kalan painon logaritmi testin alussa  
log e , W  2 = yksittäisen kalan painon logaritmi testin lopussa  
log e W 1 = w  1 -arvojen logaritmien keskiarvo tankin kaloille testin 
alussa  
log e W 2 = w  2 -arvojen logaritmien keskiarvo tankin kaloille testin 
alussa  
t 1 ,t 2 = aika (päiviä) testin alussa ja lopussa  
r 1 , r 2 , r 3 voidaan laskea ajalle 0–28 vuorokautta ja tarvittaessa (ts. 
kun päivänä 14 on tehty mittaus) ajalle 0–14 vuorokautta ja 14–28 
vuorokautta.  
2.1.1  Tulosten regressioanalyysi (pitoisuus-vastemallitus)  
Tässä analyysimenetelmässä sovitetaan sopiva matemaattinen vastaa ­
vuussuhde spesifisen kasvunopeuden ja pitoisuuden välille, ja sen 
avulla voidaan estimoida EC  x ts. mikä tahansa LC-arvo. Tämä me ­
netelmä ei edellytä r-arvon laskemista yksittäisille kaloille (r  1 ); sen 
sijaan analyysi perustuu tankkia kohti määritettyyn keskiarvoon (r  2 ). 
Jälkimmäinen menetelmä on suositeltava. Se on parempi myös pie ­
nikokoisille kalalajeille.  
Tankkikohtainen keskimääräinen spesifinen kasvunopeus (r  2 ) esite­
tään kuvaajassa pitoisuuden funktiona, jotta voidaan tarkastella pitoi ­
suus-vastesuhdetta.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1155
 
Jotta r  2 -arvon ja pitoisuuden välinen suhde voidaan ilmaista, on 
valittava sopiva malli, ja valinnan tueksi on esitettävä asianmukaiset 
perustelut.  
Jos elossa olevien kalojen määrä tankeissa on erilainen, on mallin 
sovitus — olipa se yksinkertainen tai epälineaarinen — painotettava siten, että siinä otetaan huomioon ryhmien epätasainen koko.
 
Mallin sovitusmenetelmän on oltava sellainen, että voidaan estimoida 
esim. EC  20 ja laskea sen hajonta (joko keskivirhe tai luottamusväli). 
Sovitetun mallin kuvaaja on esitettävä mittaustulosten kanssa, jotta 
mallin sopivuus voidaan nähdä (8) (18) (19) (20).  
2.1.2  Tulosten analysointi LOEC-arvon estimoimiseksi  
Jos testissä on rinnakkaiset tankit kaikilla pitoisuuksilla, LOEC-arvon 
estimointi voi perustua tankkikohtaisen keskimääräisen spesifisen 
kasvunopeuden varianssianalyysiin (ANOVA) (ks. kohta 2.1), jonka jälkeen sopivalla menetelmällä (esim. Dunnettin tai Williamsin tes ­
tillä (12) (13) (14) (21) verrataan kullakin pitoisuudella saatua r- 
arvoa kontrollien keskimääräiseen r-arvoon, jotta voidaan tunnistaa 
pienin pitoisuus, jolla kyseinen ero on merkitsevä todennäköisyysta ­
solla 0,05. Jos parametristen menetelmien edellyttämät vaatimukset eivät täyty –epänormaali jakauma (esim. Shapiro-Wilkin testi) tai 
heterogeeninen varianssi (Bartlettin testi) — olisi harkittava mittaus ­
tulosten muuntamista varianssien homogenisoimiseksi ennen ANO ­
VA-analyysiä tai painotetun ANOVAn tekemistä.
 
Jos testissä ei ole rinnakkaisia tankkeja kaikilla pitoisuuksilla, tank ­
keihin perustuva ANOVA on epäherkkä tai mahdoton suorittaa. Täl ­
laisessa tilanteessa on hyväksyttävää perustaa ANOVA yksittäisten 
kalojen spesifiseen pseudokasvunopeuteen r  3 . 
Kunkin testipitoisuuden keskimääräistä r  3 -arvoa voidaan sitten ver ­
rata kontrollien keskimääräiseen r  3 -arvoon. LOEC-arvo voidaan sit ­
ten määrittää kuten edellä. On todettava, että tässä menetelmässä ei voida ottaa lainkaan huomioon suurempaa tankkien välistä vaihtelua 
kuin minkä yksittäisten kalojen välinen vaihtelu selittää. Kokemus on 
kuitenkin osoittanut (9), että tankkien välinen vaihtelu on erittäin pieni verrattuna tankinsisäiseen (ts. kalojen väliseen) vaihteluun. Jos analyysi ei ota huomioon yksittäisiä kaloja, on selostettava suu ­
resti poikkeavien näytteiden tunnistamiseen käytetty menetelmä ja 
perusteltava se.
 
2.2 TULOSTEN TULKINTA  
Tulosten tulkinnassa on oltava varovainen, jos testiliuosten myrkyl ­
lisen aineen pitoisuudet ovat lähellä määritysmenetelmän havaitse ­
misrajaa tai jos puolistaattisessa testissä testiaineen pitoisuus ennen liuoksen vaihtoa on pienempi kuin juuri valmistetussa liuoksessa.
 
2.3 TESTISELOSTE  
Testiselosteessa on annettava seuraavat tiedot:  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1156
 
2.3.1  Testiaine  
— fysikaalinen olomuoto ja fysikokemialliset ominaisuudet, jos 
niillä on merkitystä,  
— kemialliset tunnistetiedot, mukaan luettuna puhtausaste, ja testi ­
aineen kvantifiointiin käytettävä analyyttinen menetelmä (tarvit ­
taessa).  
2.3.2  Testissä käytettävät kalalajit  
— mahdollisesti tieteellinen nimi,  
— kanta, koko, toimittaja, mahdolliset esikäsittelyt jne.  
2.3.3  Koeolosuhteet:  
— käytetty testimenetelmätyyppi (esim. puolistaattinen tai läpivirta ­
usmenetelmä, lastaustiheys, varastotiheys),  
— testin suunnittelu (esim. testiastioiden, testipitoisuuksien ja rin ­
nakkaisten näytteiden lukumäärä, kalojen lukumäärä astiaa koh ­
ti), 
— varastoliuosten valmistusmenetelmä ja nesteen vaihtojen väli 
(liuotusapuaine ja sen pitoisuus on ilmoitet tava, jos sellaista 
käytetään),  
— nimelliset testipitoisuudet, mitattujen arvojen keskiarvot ja niiden 
keskihajonnat testiastioissa, niiden laske miseen käytetty mene ­
telmä sekä näyttö siitä, että mittaukset on tehty todella liuoksessa olevasta testi aineesta,
 
— laimennukseen käytetyn veden ominaisuudet: pH, kovuus, läm ­
pötila, liuenneen hapen pitoisuus, jäännösklooripitoisuus (jos se on mitattu), orgaanisiin yhdisteisiin sitoutuneen hiilen kokonais ­
määrä, suspensiossa olevat kiinteät aineet, testiväliaineen suola ­
pitoisuus (jos se on mitattu) ja muut mahdolliset mittaukset,
 
— testiastioissa olevan veden laatu: pH, kovuus, lämpötila ja liuen ­
neen hapen pitoisuus,  
— yksityiskohtaiset tiedot ruokinnasta (esim. rehu(je)n tyyppi, alku ­
perä, annettu määrä ja antotaajuus).  
2.3.4  Tulokset:  
— näyttö siitä, että kontrollit täyttivät eloonjäämistä koskevan vali ­
diteettivaatimuksen, ja missä tahansa pitoi suudessa esiintynyttä kuolleisuutta koskevat tarkat tiedot,
 
— käytetyt analyyttiset tilastomenetelmät, rinnakkaisnäyte- tai kala ­
perusteiset tilastot, mittaustulosten käsittely ja käytettyjen teknii ­
koiden perustelut,  
— taulukoidut mittaustulokset yksittäisten kalojen painoista ja kes ­
kimääräisistä painoista päivinä 0, 14 {jos on mitattu) ja 28, tankkikohtaiset keskimääräiset kasvunopeudet tai spesifiset pseu ­
dokasvunopeudet ajan jaksoille 0–28 vuorokautta tai mahdolli ­
sesti ajanjaksoille 0–14 ja 14–28 vuorokautta,
 
— tilastollisen analyysin (ts. regressioanalyysin tai ANOVAn) tulok ­
set mieluiten taulukko- ja kuvaajamuodossa sekä LOEC-arvo (p 
= 0,05) ja NOEC-arvo tai EC  x -arvo sekä keskivirheet, jos mah ­
dollista,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1157
 
— kalojen mahdolliset epätavalliset reaktiot ja testiaineen aiheutta ­
mat mahdolliset näkyvät vaikutukset.  
3. LÄHDELUETTELO  
(1) Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals 
(CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for 
Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. 
WRc Report No PRD 1388-M/2.  
(2) Ashley S., Mallett M. J. and Grandy N. J. (1990). EEC Ring 
Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on 
the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.
 
(3) Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic 
chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, pp. 1855–1870.  
(4) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., 
Munk R., Scholz N. and Höfte B. B. (1991). Effect of 3,4- dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish  (Bra­
chydanio rerio ): rcsults of a comparative laboratory study. 
Ecotox. Environ. Safety, 21, pp. 157–164.
 
(5) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biologi ­
cal field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Pub ­
lish. Tokio, Japan.  
(6) Holcombe, G. VV., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., 
Leonard, E. N. and Johnson, R. D. (199 5). Acute and long- term effects of nine chemicals on the Japanese medaka ( Ory­
zias latipes ). Arch. Environ. Conta. Toxicol.28, pp. 287–297.
 
(7) Benoit, D. A., Holcombe, G. VV. and Spehar, R. L. (1991). 
Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese 
medaka ( Oryzias latipes ). Ecological Research Series EPA- 
600/3-91-063. US Environmental Protection Agency, Duluth. Minnesota.
 
(8) Stephan C. E. and Rogers J. W. (1985). Advantages of using 
regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposi ­
um, ASTM STP 891, R. C. Bahner and D. J. Hansen, eds., 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, pp. 328-338.
 
(9) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity 
tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, 
Ontario, Report EPS l/RM/28, 81 pp.
 
(10) Cox D. R. (1958). Planning of experiments, Wiley Edt.  
(11) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests 
for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts 
on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10- 
12 December 1991.
 
(12) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp. 1096-1121.
 
(13) Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, pp. 482-491.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1158
 
(14) Williams D. A. (1971). A test for differences between treat ­
ment means when several dose levels are compared with a zero 
dose control. Biometrics 27, pp. 103-117.  
(15) Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994). A 
technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout,  Oncor­
hynchus mykiss:  effect of feeding level. Aquaculture 120, pp. 
123-133.
 
(16) Quinton, J. C. and Blake, R. W. (1990). The effect of feed 
cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout,  Oncorhynchus mykiss.  Journal of Fish Biolo ­
gy, 37, pp. 33-41.
 
(17) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. 
Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 pp.
 
(18) Bruce, R. D. and Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. 
Chem. 11, pp. 1485-1494.  
(19) DeGraeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, 
J. H., Dean, Marcus, M. D. and McIntyre, D. O. (1989). Pre ­
cision of EPA seven-day fathead minnow larval survival and 
growth test; intra and interlaboratory study. Report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power Research Institute, Palo Alto, CA.
 
(20) Norbert-King T. J. (1988). An interpolation estimate for chro ­
nic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection 
Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota. Te ­
ch. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. 12 pp.
 
(21) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28, pp. 510-531.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1159
 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1160
 ▼B 
Lisäys 1  
TESTIIN SUOSITELLUT KALALAJIT JA SOPIVAT TESTIOLOSUHTEET  
Laji Suositeltu lämpöti ­
la-alue 
( o C) Valojaksot 
(tuntia) Suositellut kalojen 
painorajat testin 
alussa 
(g) Vaadittu mittaustark ­
kuus Lastaustiheys 
(g/l) Varastotiheys 
(litraa kohti) Rehu Testin kesto 
(vrk) 
Suositellut kalalajit:  
Oncorhynchus mykiss  
Kirjolohi 12,5–16,0 12–16 1–5 100 mg 1,2–2,0 4 Kaupallinen lohikalojen poi ­
kasten kuivarehu ≥ 28 
Muita hyvin dokumentoituja 
lajeja:  
Danio rerio  
Seeprakala 21–25 12–16 0,050–0,100 1 mg 0,2–1,0 5–10 Elävää ravintoa  (Brachionus 
Artemia)  ≥ 28 
Oryzias latipes  
Medaka 21–25 12–16 0,050–0,100 1 mg 0,2–1,0 5–20 Elävää ravintoa  (Brachionus 
Artemia)  ≥ 28
Lisäys 2  
JOITAKIN HYVÄKSYTTÄVÄN LAIMENNUSVEDEN KEMIALLISIA 
OMINAISUUKSIA  
Aine Pitoisuus  
Kiinteät aineet < 20 mg/1 
Orgaanisiin yhdisteisiin sitoutuneen hiilen kokonaismäärä < 2 mg/l 
Ammoniakki (ionisoitumaton) < 1 μg/l 
Jäännöskloori < 10 μg/l 
Orgaanista fosforia sisältävien torjunta-aineiden koko ­
naismäärä < 50 ng/1 
Orgaanista klooria sisältävien torjunta-aineiden koko ­
naismäärä ja polyklooratut bifebyylit < 50 ng/1 
Orgaanisiin yhdisteisiin sitoutuneen kloorin kokonais ­
määrä < 25 ng/1  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1161
 
Lisäys 3  
Myrkyllisyystestiin soveltuvien pitoisuuksien logaritmiset sarjat (9)  
Sarake välillä 100-10 tai välillä 10-1 olevien pitoisuuksien lukumäärä)(*) 
1 2 3 4 5 6 7  
100 100 100 100 100 100 100 
32 46 56 63 68 72 75 10 22 32 40 46 52 56 
3,2 10 18 25 32 37 42 
1,0 4,6 10 16 22 27 32 
2,2 5,6 10 15 19 24 1,0 3,2 6,3 10 14 18 
1,8 4,0 6,8 10 13 1,0 2,5 4,6 7,2 10 
1,6 3,2 5,2 7,5 
1,0 2,2 3,7 5,6 
1,5 2,7 4,2 1,0 1,9 3,2 
1,4 2,4 1,0 1,8 
1,3 
1,0
 
(*) Sarakkeesta voi valita viiden (tai useamman) peräkkäisen pitoisuuden sarjan. Sarakkeessa (x) olevien pitoisuuksien keskiväl illä 
olevia arvoja on sarakkeessa (2x + 1). Luetellut arvot voivat olla prosenttiosuuksina tilavuusyksikköä tai painoyksikköä kohti 
ilmaistuja pitoisuuksia (mg/l tai μg/l). Arvot voidaan tarvittaessa jakaa tai kertoa kymmenen potensseilla. Saraketta 1 voidaan 
käyttää, jos myrkyllisyystaso on hyvin epävarma  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1162
 
C.15  KALAN ALKIO- JA RUSKUAISPUSSIVAIHEEN POIKASILLA 
TEHTÄVÄ LYHYTAIKAINEN MYRKYLLISYYSTESTI  
1. MENETELMÄ  
Tämä lyhytaikainen myrkyllisyystesti on toisinto OECD:n testi ­
ohjeesta nro 212 (1998).  
1.1 JOHDANTO  
Tämä lyhytaikainen kalan alkio- ja ruskuaispussivaiheen poikasilla 
tehtävä myrkyllisyystesti on lyhytaikainen testi, jossa altistetaan testi ­
aineelle varhaisessa kehitysvaiheessa olevia kalan alkioita juuri he ­
delmöityneistä munista ruskuaispussivaiheen loppuun asti. Alkio- ja 
ruskuaispussivaihetestissä ci anneta ravintoa, joten testi pitäisi lopet ­
taa vaiheessa, jossa ruskuaispussivaihealkio saa vielä ravintonsa rus ­
kuaispussista.  
Testissä on tarkoitus määrittää kemikaalien letaalit ja rajoitetussa 
määrin subletaalit vaikutukset tietyn lajin tietyissä kehitysvaiheissa 
oleviin poikasiin. Tästä testistä saatavat tiedot olisivat hyödyllisiä, 
koska a) testin avulla voitaisiin muodostaa yhteys letaalien ja suble ­
taalien vaikutusten välille, b) sitä voitaisiin käyttää joko täydellisen varhaiskehitysvaiheiden testin tai pitkäaikaisten myrkyllisyystestien 
seulontatestinä ja c) sillä voitaisiin testata lajeja, joiden kasvatusme ­
netelmät eivät ole vielä niin kehittyneet, että hallittaisiin vaihe, jol ­
loin eläin siirtyy endogeenisestä ravinnonotosta eksogeeniseen ravin ­
nonottoon.
 
Olisi muistettava, että kemikaalien pitkäaikainen myrkyllisyys ka ­
loille voidaan yleensä arvioida tarkasti vain testeillä, jotka kattavat 
kaikki kalan elinkierron vaiheet. Jos altistetaan vain tietyissä kehi ­
tysvaiheissa olevia kaloja, testin herkkyys kärsii, ja pitkäaikainen myrkyllisyys voidaan aliarvioida. Sen vuoksi on odotettavissa, että 
alkio- ja ruskuaispussivaihetesti on vähemmän herkkä kuin täydelli ­
nen varhaiskehitysvaiheiden testi, erityisesti kun kysymyksessä ovat erittäin lipofiiliset (log P
 ow > 4) kemikaalit ja sellaiset kemikaalit, 
joiden myrkyllisyysvaikutus on spesifinen. Kuitenkin voidaan odot ­
taa, että kyseisten kahden testin väliset herkkyyserot ovat pienempiä 
kemikaaleilla, joilla on epäspesifinen narkoottinen vaikutus (1).  
Ennen tämän testin julkaisemista useimmat tiedot alkio- ja ruskuais ­
pussivaiheen kaloilla on saatu makeassa vedessä elävällä  Danio rerio  
Hamilton-Buchanan -kalalla (Teleostei, Cyprinidae; yleinen nimi seeprakala). Tällä kalalla suoritettavasta testistä annetaan siksi yksi ­
tyiskohtaisemmat ohjeet lisäyksessä 1. Muitakin lajeja, joista on ko ­
kemusta, voidaan kuitenkin käyttää (Taulukot 1 A ja 1 B).
 
1.2 MÄÄRITELMÄT  
LOEC (Lowest Observed Effect Concentration):  Pienin testi ­
aineen testattu pitoisuus, jolla aineen havaitaan aiheuttavan merkit ­
sevän vaikutuksen (arvolla p < 0,05) verrattuna kontrolliin. Kuiten ­
kin kaikilla LOEC-tasoa suuremmilla testipitoisuuksilla on oltava 
vähintään yhtä haitallinen vaikutus kuin LOEC-tasolla.  
NOEC (No Observed Effect Concentration):  Välittömästi LOEC- 
tasoa pienempi testipitoisuus.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1163
 
1.3 TESTIN PERIAATE  
Alkio- ja ruskuaispussivaiheessa olevia kaloja altistetaan veteen liu ­
otetun testiaineen eri pitoisuuksille. Testi voidaan tehdä testiaineesta riippuen joko puolistaattisena tai läpivirtaustestinä. Testin alussa he ­
delmöityneet munat pannaan testiastioihin, ja testi lopetetaan juuri 
ennen kuin mahdollisten toukkien ruskuaispussi on imeytynyt täy ­
dellisesti yhdessäkään testiastiassa tai ennen kuin kontrolleissa hav ­
aitaan ravinnonpuutteesta johtuvia kuolemantapauksia. Letaalit ja 
subletaalit vaikutukset arvioidaan ja niitä verrataan kontrolliarvoihin 
pienimmän havaittavan vaikutuksen aiheuttavan pitoisuuden arvioi ­
miseksi ja siitä edelleen sen pitoisuuden arvioimiseksi, joka ei ai ­
heuta havaittavaa vaikutusta. Vaihtoehtoisesti vaikutukset voidaan 
arvioida käyttämällä regressiomallia sen pitoisuuden estimoimiseksi, joka aiheuttaisi tietyn prosentuaalisen vaikutuksen (ts. LC/EC
 X , jossa 
x on määritelty prosenttiarvo).  
1.4 TESTIAINETTA KOSKEVAT TIEDOT  
Välittömän myrkyllisyyden testin (ks. menetelmä C.1) tulosten pitäisi 
olla käytettävissä. Mieluiten samalla lajilla tehdyn testin tuloksista voi olla hyötyä valittaessa sopivaa pitoisuusaluetta varhaisten kehi ­
tysvaiheiden testiin. Testiaineen vesiliukoisuuden (myös liukoisuu ­
den testissä käytettävään veteen) ja höyrynpaineen pitäisi olla tiedos ­
sa. Käytettävissä pitäisi olla myös tarkkuudeltaan ja määritysrajaltaan tunnettu sopiva analyyttinen menetelmä aineen määrittämiseksi kvan ­
titatiivisesti testiliuoksissa.
 
Testiainetta koskevia tietoja, joista on hyötyä testiolosuhteiden mää ­
rittelemiseksi, ovat mm. rakennekaava, aineen puhtaus, valostabii ­
lisuus, stabiilisuus testiolosuhteissa, pKa, P  ow ja helpon biohajoavuu ­
den testin tulokset (ks. menetelmä C.4).  
1.5 TESTIN LUOTETTAVUUS  
Testi on luotettava, jos  
— hedelmöityneiden munien eloonjäämisaste kontrolleissa ja ta ­
pauksen mukaan ainoastaan liuotinta sisältävissä astioissa on vä ­
hintään yhtä suuri kuin lisäyksissä 2 ja 3 on määritelty,  
— liuenneen hapen pitoisuus on 60-100 % ilman kyllästysarvosta 
koko testin ajan,  
— veden lämpötila vaihtelee enintään ± 1,5  o C testiastioiden välillä tai 
peräkkäisinä päivinä milloin tahansa testin aikana ja on niissä ra ­
joissa, jotka on määritelty kyseiselle testilajille (lisäykset 2 ja 3).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1164
 
1.6 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.6.1  Testiastiat  
Mitä tahansa lasista tai kemiallisesti inertistä materiaalista valmistet ­
tua astiaa voi käyttää. Astian pitäisi olla riittävän suuri kalamäärään 
nähden (ks. kohta 1.7.1.2). Suositellaan, että testiastiat sijoitetaan 
satunnaistetusti koealueelle. Satunnaistettu eristetty sijoittelu siten, että kussakin käsittelyssä olevia testiastioita on kussakin eristetyssä sijoituspaikassa, on parempi kuin täysin satunnaistettu järjestely, jos 
laboratoriossa on järjestelmällisiä vaikutuksia, jotka voidaan hallita 
eristyksellä. Jos eristystä käytetään, se on otettava huomioon tulostie ­
tojen käsittelyssä. Testiastiat olisi suojattava ei-toivotuilta häiriöiltä.
 
1.6.2  Kalalajin valinta  
Suositeltavat kalalajit luetellaan taulukossa 1 A. Muitakin lajeja voi ­
daan käyttää (esimerkkejä annetaan taulukossa 1 B), mutta testime ­
netelmää on silloin ehkä muutettava, jotta testiolosuhteet olisivat sopivat. Tällaisessa tapauksessa olisi selostettava syyt lajin ja koe ­
menetelmän valitsemiseen.
 
1.6.3  Siitoskalojen kasvatus  
Siitoskannan kasvatuksesta tyydyttävissä oloissa annetaan yksityis ­
kohtaiset ohjeet OECD:n testiohjeessa nro 210 (  1 ) ja viitteissä (2) 
(3) (4) (5) (6).  
1.6.4  Alkioiden ja toukkien käsittely  
Alkioiden ja toukkien altistus voidaan tehdä ison astian sisällä ole ­
vissa pienemmissä astioissa, joiden laidoissa tai päädyissä on verkot, 
jolloin testiliuos pääsee virtaamaan astian läpi. Pienten astioiden läpi 
johdetaan pyörteeton virtaus ripustamalla astiat varteen, jota voidaan nostaa ja laskea astiassa siten, että eliöt ovat nestepinnan alla koko ajan. Myös lappoa ja nesteenlisäysjärjestelmää voidaan käyttää. He ­
delmöityneitä lohensukuisten kalojen munia voidaan pitää telineissä 
tai verkoissa, joiden reiät ovat niin suuret, että toukat putoavat niistä läpi kuoriuduttuaan. Pasteur-pipettejä voidaan käyttää alkioiden ja toukkien poistamiseksi puolistaattisissa testeissä, jossa neste vaihde ­
taan päivittäin (ks. kohta 1.6.6).
 
Jos munien pitämiseksi isossa testiastiassa käytetään telineitä, ritilöitä 
tai verkkoja, ne olisi poistettava toukkien kuoriutumisen jälkeen (  1 ). 
Verkot pitäisi kuitenkin säilyttää kalojen karkaamisen estämiseksi. 
Jos toukkia on siirrettävä, niitä ei saisi ottaa vedestä ilmaan eikä 
verkkoja saisi käyttää kalojen irrottamiseksi munatelineistä (tämä varokeino ei ehkä ole tarpeen, jos käytetään kestävämpiä kalalajeja, kuten karppeja). Siirtoajankohta vaihtelee lajeittain, eikä siirto ehkä 
ole aina välttämätöntä. Puolistaattisessa menetelmässä voidaan käyt ­
tää dekanterilaseja tai matalia astioita, ja niihin voi tarvittaessa kiin ­
nittää verkon hieman pohjan yläpuolelle. Jos astiat ovat riittävän suuria kalamäärään nähden (ks. 1.7.1.2), alkioita tai toukkia ei 
ehkä tarvitse siirtää.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1165  
( 1 ) OECD, Pariisi, 1992, Test Guideline 210, Fish. Early-life Stage Toxicity Test.
 1.6.5  Vesi  
Testivedeksi käy vesi, joka täyttää lisäyksessä 4 mainitut hyväksyt ­
tävän laimennusveden kemiallisia ominaisuuksia koskevat vaatimuk ­
set ja jossa testilaji säilyy elossa vähintään yhtä kauan kuin lisäyk ­
sissä 2 ja 3 edellytetään. Veden laadun on oltava tasainen testin 
ajan. pH:n vaihtelu ei saisi olla suurempi kuin ± 0,5 pH-yksikköä. Sen varmistamiseksi, ettei laimennusvesi vaikuta liikaa testituloksiin (esimerkiksi kompleksoimalla testattavaa ainetta) tai haitallisesti sii ­
toskalakannan vointiin, näytteitä olisi otettava säännöllisin väliajoin 
määrityksiä varten. Raskasmetallit (esim. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), tärkeimmät anionit ja kationit (esim. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO
 4 ), 
torjunta-aineet (esim. orgaanista fosforia ja orgaanista klooria sisäl ­
tävien torjunta-aineiden kokonaispitoisuudet), orgaanisiin yhdisteisiin sitoutuneen hiilen kokonaispitoisuus ja suspendoituneet kiinteät ai ­
neet olisi määritettävä esimerkiksi kolmen kuukauden välein, jos 
laimennusveden laatu tiedetään suhteellisen vakioksi. Jos veden laa ­
dun on osoitettu pysyvän vakiona ainakin vuoden ajan, määrityksiä voidaan tehdä harvemmin (esim. kuuden kuukauden välein).
 
1.6.6  Testiliuokset  
Halutunpitoiset testiliuokset valmistetaan varastoliuoksista laimenta ­
malla.  
Varastoliuos valmistetaan sekoittamalla testattava aine laimennusve ­
teen käyttäen mieluiten mekaanisia menetelmiä tai ultraääntä. Satu ­
raatiopylväitä (liukoisuuspylväitä) voi käyttää riittävän väkevän va ­
rastoliuoksen valmistamiseksi. Liuottimien tai dispergointiaineiden (liuotusapuaineiden) käyttöä on vältettävä, jos mahdollista. Ne voivat 
kuitenkin olla joskus välttämättömiä riittävän väkevän varastoliu ­
oksen valmistamiseksi. Sopivia liuottimia ovat esimerkiksi asetoni, etanoli, metanoli, dimetyyliformamidi ja trietyleeniglykoli. Sopivia dispergointiaineita ovat esimerkiksi Cremophor RH40, Tween 80, 
0,01-prosenttinen metyyliselluloosa ja HCO-40. Helposti biohajoavia 
aineita (kuten asetonia) ja/tai helposti haihtuvia aineita käytettäessä on oltava varovainen, koska ne voivat aiheuttaa ongelmia baktee ­
rikasvuston takia läpivirtaustesteissä. Jos käytetään liuotusapuaineita, 
niillä ei saa olla merkittävää vaikutusta eloonjäämiseen eikä näkyviä 
haitallisia vaikutuksia varhaisiin kehitysvaiheisiin. Tämä on osoitet ­
tava pelkkää liuotinta sisältävällä kontrollilla. Tällaisten aineiden käyttöä on kuitenkin pyrittävä välttämään aina, kun se on mahdol ­
lista.
 
Puolistaattisessa testissä voidaan käyttää kahta eri liuoksenvaihtome ­
netelmää: i) uudet testiliuokset valmistetaan puhtaissa astioissa ja 
elossa pysyneet munat ja toukat siirretään varovasti uusiin astioihin 
pienessä määrässä vanhaa liuosta välttäen kosketusta ilman kanssa tai ii) testieliöt pidetään astioissa ja osa (vähintään kolme neljäsosaa) testivedestä vaihdetaan. Kasvatusnesteen vaihtoväli riippuu testiaineen 
stabiilisuudesta, mutta vaihtoa suositellaan kerran päivässä. Jos alus ­
tavista stabiilisuustesteistä (ks. kohta 1.4) tiedetään, ettei testiaineen pitoisuus pysy vakiona (ts. se ei ole välillä 80-120 % nimellisarvosta tai se laskee alle 80 prosentin mitatusta alkupitoisuudesta) vaihtojen 
välillä, olisi harkittava läpivirtaustestiä. Joka tapauksessa olisi varot ­
tava stressaamasta toukkia veden vaihdon yhteydessä.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1166
 
Läpivirtaustesteissä on käytettävä testiaineen varastoliuosta jatkuvasti 
annostelevaa ja laimentavaa järjestelmää (esim. annostelupumppua, 
laimenninta, kyllästävää järjestelmää) testipitoisuuksien annostelemi ­
seksi testiastioihin. Varastoliuosten ja laimennusveden virtausnopeu ­
det on tarkistettava säännöllisin väliajoin, mieluiten kerran päivässä, 
ja virtausnopeus saisi vaihdella enintään 10 % koko testin aikana. 
Virtausnopeus, joka on vähintään viisi kertaa testiastian tilavuus 24 tunnissa, on havaittu sopivaksi (2).
 
1.7 MENETTELY  
Kirjallisuudesta löytyy hyödyllistä tietoa kalan alkio- ja ruskuaispus ­
sivaiheen myrkyllisyystestin suorituskyvystä. Joitakin esimerkkejä on tämän ohjeen kirjallisuusluettelossa (7) (8) (9).
 
1.7.1  Altistusolosuhteet  
1.7.1.1  Testin kesto  
Testi olisi aloitettava 30 minuutin kuluessa munien hedelmöityksestä. 
Alkiot upotetaan testiliuokseen ennen alkiolevyn jakaantumisvaihetta tai mahdollisimman pian sen jälkeen, ja joka tapauksessa ennen 
gastrulavaiheen alkamista. Jos munat on hankittu kaupalliselta toi ­
mittajalta, ei testiä voi ehkä aloittaa heti hedelmöityksen jälkeen. Koska testin herkkyys voi kärsiä huomattavasti aloituksen viivästy ­
misen johdosta, testi olisi aloitettava 8 tunnin kuluessa hedelmöityk ­
sestä. Koska toukkia ei ruokita altistuksen aikana, testi olisi lopetet ­
tava juuri ennen kuin mahdollisten toukkien ruskuaispussi on imey ­
tynyt täydellisesti yhdessäkään testiastiassa tai ennen kuin kontrol ­
leissa havaitaan ravinnonpuutteesta johtuvia kuolemantapauksia.Tes ­
tin kesto riippuu käytetystä lajista. Lisäyksissä 2 ja 3 annetaan joi ­
takin suosituksia testin kestosta.
 
1.7.1.2  Kalojen lisääminen testiastiaan  
Hedelmöityneiden munien määrän testin alussa pitäisi olla riittävä 
tilastollista käsittelyä varten. Munat olisi jaettava satunnaistetusti 
eri käsittelyryhmiin, ja yhtä pitoisuutta kohti olisi käytettävä vähin ­
tään 30 hedelmöitynyttä munaa tasaisesti jaettuina (tai niin tasaisesti kuin mahdollista, koska voi olla vaikeaa saada aikaan yhtä suuria 
eriä joillakin lajeilla) vähintään kolmeen rinnakkaiseen testiastiaan. 
Kalojen määrän (biomassa testiliuoksen tilavuusyksikköä kohti) pi ­
täisi olla niin pieni, että liuenneen hapen pitoisuus voidaan pitää vähintään arvossa 60 % ilman ilmastusta. On suositeltu, että läpivir ­
taustesteissä kalojen määrä saa olla enintään 5 g/l per 24 tuntia ja 
enintään 5 g/l liuosta minä tahansa ajankohtana (2).
 
1.7.1.3  Valo ja lämpötila  
Valoisan ajan ja testiveden lämpötilan pitäisi olla sopivia käytetylle 
testilajille (lisäykset 2 ja 3). Lämpötilan seurantaa varten voi olla 
tarpeen ylimääräinen testiastia.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1167
 
1.7.2  Testipitoisuudet  
Tavallisesti tarvitaan viisi testiaineen pitoisuutta, joiden välinen ero 
on vakio ja enintään 3,2-kertainen. Käyrää, jossa esitetään LC  50 
välittömän myrkyllisyystestin altistusajan funktiona, olisi käytettävä 
apuna valittaessa testipitoisuusaluetta. Vähemmän kuin viisi pitoi ­
suutta voi olla riittävä määrä esim. raja-arvotesteissä, ja pitoisuuksien väli voi olla pienempi joissakin tapauksissa. Jos käytetään alle viittä testipitoisuutta, se on perusteltava. Pitoisuuksia, jotka ovat suurempia 
kuin 96 tunnin LC
 50 , tai 100 mg/l (näistä alhaisempi arvo), ei tarvitse 
testata. Kemikaaleja ei pitäisi testata niiden liukoisuusrajaa suurem ­
missa pitoisuuksissa.  
Kun testiliuosten valmistuksessa käytetään jotakin liuotusapuainetta 
(ks. kohta 1.6.6), sen lopputilavuus testiastioissa ei saisi olla suu ­
rempi kuin 0,1 ml/1, ja tilavuuden pitäisi olla sama kaikissa testias ­
tioissa.  
1.7.3  Kontrollit  
Testisarjan lisäksi on määritettävä yksi laimennusvesikontrolli (ja 
rinnakkaiset) sekä tapauksen mukaan yksi kontrolli, jossa on liuotu ­
sapuainetta (ja asianmukaiset rinnakkaiset).  
1.7.4  Analyyttisten määritysten ja mittausten taajuus  
Testiaineen pitoisuudet on määritettävä määräajoin testin aikana.  
Suositellaan, että puolistaattisissa testeissä, joissa testiainepitoisuuden 
odotetaan pysyvän 20 prosentin sisällä nimellisarvosta (ts. välillä 80- 
120 %; ks. kohta 1.4 ja 1.6.6), analysoidaan vähintään suurin ja pienin pitoisuus juuri valmistetusta liuoksesta ja juuri ennen liuoksen vaihtoa vähintään kolme kertaa testin aikana tasaisin väliajoin (ts. 
samasta liuoksesta otetaan näyte, kun liuos on juuri valmistettu ja 
liuosta vaihdettaessa).
 
Jos testiaineen pitoisuuden ei odoteta pysyvän 20 prosentin sisällä 
nimellisarvosta (aineen stabiilisuutta koskevien tietojen perusteella), on analysoitava kaikki pitoisuudet tuoreesta liuoksesta ja liuosta 
vaihdettaessa noudattaen samanlaista järjestelmää (eli vähintään 
kolme kertaa testin aikana tasaisin väliajoin). Ennen liuoksen vaihtoa tehtävä määritys tarvitsee tehdä vain yhdestä rinnakkaisnäytteestä kullakin testipitoisuudella. Määritysten väli saa olla enintään seitse ­
män vuorokautta. Suositellaan, että tulosten perusteina käytetään mi ­
tattuja pitoisuuksia. Jos kuitenkin on näyttöä siitä, että testiaineen pitoisuus pysyy tyydyttävästi 20 prosentin sisällä nimellispitoisuu ­
desta tai mitatusta alkupitoisuudesta koko testin ajan, tulosten perus ­
tana voidaan käyttää nimellispitoisuutta tai mitattua alkupitoisuutta.
 
Läpivirtaustesteille sopii samanlainen näytteenottojärjestelmä kuin 
puolistaattisille testeille (vaikka ”vanhoja” liuoksia ei mitata). Jos testi kuitenkin kestää yli seitsemän vuorokautta, voi olla suositelta ­
vaa lisätä näytteiden lukumäärää ensimmäisen viikon aikana (esim. 
kolme sarjaa määrityksiä) sen varmistamiseksi, että testipitoisuudet 
ovat pysyneet stabiileina.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1168
 
Näytteet voivat edellyttää sentrifugointia tai suodatusta (esim. 
0,45 μm:n huokoskoon suotimella). Koska sen enempää sentrifugoi ­
malla kuin suodattamallakaan ei aina pystytä erottamaan testiaineen biologisesti hyödyntämiskelvotonta osaa biologisesti hyödynnettävästä osasta, näytteille ei tarvitse välttämättä tehdä kyseisiä toimenpiteitä.
 
Liuennut happi, pH ja lämpötila on mitattava testin aikana kaikista 
testiastioista. Veden kokonaiskovuus ja suolapitoisuus, jos se on merkityksellinen, mitataan kontrolleista ja yhdestä astiasta, jossa on suurin pitoisuus. Liuennut happi ja suolapitoisuus, jos se on merki ­
tyksellinen, olisi mitattava kolmesti (testin alussa, keskivaiheilla ja 
lopussa). Suositellaan, että puolistaattisissa testeissä liuennut happi mitataan useammin, mieluiten ennen kutakin veden vaihtoa ja sen jälkeen tai vähintään kerran viikossa. pH olisi mitattava kunkin ve ­
denvaihdon alussa ja lopussa puolistaattisissa testeissä ja vähintään 
viikoittain läpivirtaustesteissä. Kovuus olisi mitattava kerran testin aikana. Lämpötila olisi mitattava päivittäin, ja sitä olisi mielellään 
seurattava jatkuvasti vähintään yhdessä testiastiassa.
 
1.7.5  Havainnot  
1.7.5.1  Alkiokehityksen vaiheet  
Alkiokehitysvaihe altistuksen alussa (ts. gastrulaatiovaihe) olisi varmis ­
tettava mahdollisimman tarkasti. Siinä voidaan käyttää sopivasti säily ­
tettyä ja kirkastettua edustavaa näytettä munista. Kuvauksia ja kuvia 
alkiokehitykscn vaiheista löytyy kirjallisuudesta (2) (5) (10) (11).  
1.7.5.2  Kuoriutuminen ja eloonjääminen  
Kuoriutumisesta ja eloonjäämisestä olisi tehtävä havaintoja vähintään 
kerran päivässä, ja yksilöiden lukumäärät on kirjattava. Voi olla 
toivottavaa tehdä havaintoja tiheämmin testin alussa (esim. 
30 minuutin välein kolmen ensimmäisen tunnin aikana), koska jois ­
sakin tapauksissa elossapysymisaika voi olla merkityksellisempi kuin kuolemantapauksien lukumäärä (esim. silloin kun on välittömiä 
myrkkyvaikutuksia). Kuolleet alkiot ja toukat olisi poistettava heti, 
kun ne havaitaan, koska ne voivat hajota nopeasti. Kuolleita yksilöitä poistettaessa on oltava erittäin varovainen, ettei vieressä olevia munia tai toukkia kosketa tai vahingoiteta fyysisesti, sillä ne ovat hyvin 
herkkiä ja hauraita. Kuolemantapaukset todetaan eri kehitysvaiheessa 
eri tavoin:
 
— munat:  erityisesti varhaisvaiheissa läpikuultavuus vähenee ja väri 
muuttuu, mikä johtuu valkuaisaineiden hyytymisestä ja/tai saos ­
tumisesta, josta on seurauksena valkoinen väri ja läpinäkymättö ­
myys,  
— alkiot:  vartalo ei liiku ja/tai sydän ei lyö ja/tai läpinäkymättö ­
myys tai värinmuutos sellaisessa lajissa, jonka alkiot ovat nor ­
maalisti läpikuultavia,  
— toukat:  toukat eivät liiku ja/tai niiden hengitysliikkeet puuttuvat 
ja/tai sydän ei lyö ja/tai keskushermosto on valkoinen ja läpinä ­
kymätön ja/tai toukka ei reagoi mekaanisiin ärsykkeisiin.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1169
 
1.7.5.3  Epänormaali ulkonäkö  
Sellaisten toukkien, joiden ruumiinmuodossa havaitaan epänormaa ­
lisuutta ja/tai pigmentaatiota, lukumäärä, sekä ruskuaispussin absorp ­
tioaste olisi kirjattava määräajoin testin kestosta ja kuvatun epänor ­
maalisuuden laadusta riippuen. Huomattakoon, että epänormaaleja 
alkioita ja toukkia esiintyy luonnollisesti, ja niiden määrä voi olla useita prosentteja kontroll(e)issa joissakin lajeissa. Epänormaalit eläi ­
met olisi vain poistettava testiastioista, kun ne kuolevat.
 
1.7.5.4  Epänormaali käyttäytyminen  
Epänormaali käyttäytyminen, esimerkiksi hyperventilaatio, koordi ­
noimaton uinti ja epätyypillinen liikkumattomuus, olisi kirjattava so ­
pivin väliajoin testin aikana. Vaikka tällaisia vaikutuksia on vaikea kvantifioida, niiden havainnoiminen voi auttaa kuolleisuusdatan tul ­
kinnassa, ts. niistä voi saada tietoa aineen myrkkyvaikutuksen laa ­
dusta.
 
1.7.5.5  Pituus  
Suositellaan, että testin lopussa mitataan yksilöiden pituus. Voidaan 
käyttää vakio-, lovi- tai kokonaispituutta. Jos pyrstöevä tai muut evät ovat syöpyneet, on käytettävä vakiopituutta. Hyvin tehdyssä testissä 
kontrollirinnakkaisten pituuden vaihtelukerroin saisi olla enintään 
20 %.
 
1.7.5.6  Paino  
Testin lopussa voidaan punnita yksittäiset eläimet. Kuivapaino (24 
tuntia, 60  o C) on suositeltavampi kuin märkäpaino (eläimet kuivataan 
pinnalta). Hyvin tehdyssä testissä kontrollirinnakkaisten painon vaih ­
telukerroin saisi olla enintään 20 %.  
Näistä havainnoista saadaan tietoja seuraaviin tilastollisiin analyysei ­
hin: 
— kertyvä kuolleisuus,  
— terveiden toukkien lukumäärä testin lopussa,  
— aika kuoriutumisvaiheen alkuun ja loppuun (ts. kun 90 % kuo ­
riutunut kussakin rinnakkaisnäytteessä),  
— kunakin päivänä kuoriutuneiden toukkien lukumäärä,  
— elossa olevien eläinten pituus (ja paino) testin lopussa,  
— epämuodostuneiden tai epätavalliselta näyttävien toukkien luku ­
määrä,  
— epätavallisesti käyttäytyvien toukkien lukumäärä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1170
 
2. MÄÄRITYSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Suositellaan, että sekä testin suunnittelussa että analysoinnissa on 
mukana tilastotieteilijä, koska menetelmä mahdollistaa huomattavan 
vaihtelun kokeen suunnittelussa. Esim. testiastioiden lukumäärä, tes ­
tipitoisuuksien lukumäärä, hedelmöityneiden munien lukumäärä tes ­
tin alussa ja mitattava muuttuja voivat vaihdella. Koska testi voidaan suunnitella monella tavalla, tässä ei anneta erityisohjeita tilastomene ­
telmistä.
 
Jos on tarkoitus arvioida LOEC/NOEC, on variaatiot analysoitava 
kussakin rinnakkaisten joukossa varianssianalyysillä (ANOVA) tai 
kontingenssitaulukkomenetelmillä. Jos halutaan tehdä yhteisvertailu yksittäisten pitoisuuksien ja kontrollien välillä, Dunnettin menetel ­
mästä voi olla hyötyä (12) (13). Muitakin hyviä esimerkkejä on 
saatavilla (14) (15). ANOVAA tai muita menetelmiä käyttämällä 
saatujen vaikutusten suuruus (ts. testin suorituskyky) olisi laskettava ja ilmoitettava. On huomattava, etteivät kaikki kohdassa 1.7.5.6 lue ­
tellut havainnot sovellu ANOVA-analyysiin. Esimerkiksi kertyvä 
kuolleisuus ja testin lopussa elossa olevien toukkien määrät voitaisiin 
analysoida probittimenetelmillä.
 
Jos on tarkoitus arvioida LC/EC  X , olisi sovitettava sopiva(t) käyrä(t), 
kuten logistinen käyrä, kyseessä oleviin mittaustietoihin käyttäen jotakin tilastomenetelmää, kuten pienimmän neliösumman menetel ­
mää tai epälineaarista pienimmän neliösumman menetelmää. Käy ­
rissä on käytettävä sellaisia muuttujia, että haluttu LC/EC
 x ja sen 
vakiopoikkeama voidaan estimoida suoraan. Se helpottaa suuresti luottamusrajojen laskemista LC/EC
 x :lle. Sovitusmenetelmän olisi ol ­
tava sellainen, että sen avulla voitaisiin arvioida sovituksen onnistu ­
misen (tai sen puutteen) merkitsevyys. Ellei ole painavia syitä muun ­
suuruisten luottamusvälien käyttöön, olisi ilmoitettava kaksipuolinen 95 prosentin luottamuusväli. Käyrien sovittamiseen voidaan käyttää graafisia menetelmiä. Regressioanalvysi soveltuu kaikkiin kohdassa 
1.7.5.6 mainittuihin havaintoihin.
 
2.2 TULOSTEN TULKINTA  
Tulosten tulkinnassa on oltava varovainen, jos testiliuoksista mitatut 
myrkyllisen aineen pitoisuudet ovat lähellä määritysmenetelmän ha ­
vaitsemisrajaa. Myös aineen liukoisuustuloa suuremmilla pitoisuuk ­
silla saatujen tulosten tulkinnassa on oltava varovainen.  
2.3 TEST1SELOSTE  
Testiselosteessa on annettava seuraavat tiedot:  
2.3.1  Testiaine  
— fysikaalinen olomuoto ja fysikokemialliset ominaisuudet, jos 
niillä on merkitystä,  
— kemialliset tunnistetiedot, mukaan luettuna puhtaus, ja testiaineen 
kvantifiointiin käytettävä analyyttinen menetelmä (tarvittaessa).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1171
 
2.3.2  Testissä käytettävät kalalajit  
— tieteellinen nimi, kanta, siitoskalojen lukumäärä (ts. kuinka 
monta naarasta käytettiin testissä käytettyjen munien tuottami ­
seen), hedelmöityneiden munien toimittaja ja keräysmenetelmä 
sekä munien myöhempi käsittely.  
2.3.3  Koeolosuhteet:  
— käytetty testimenetelmätyyppi (esim. puolistaattinen tai läpivirta ­
usmenetelmä, aika hedelmöitymisestä testin alkuun, testiastiaan lisättyjen emokalojen määrä),
 
— valoisa aika (valoisat aikajaksot),  
— testin suunnittelu (esim. testiastioiden ja rinnakkaisten näytteiden 
lukumäärä, alkioiden määrä kussakin rinnakkaisastiassa),  
— varastoliuosten valmistusmenetelmä ja nesteen vaihtojen väli 
(liuotusapuaine ja sen pitoisuus on ilmoitettava, jos sellaista käy ­
tetään),  
— nimelliset testipitoisuudet, mitatut arvot, niiden keskiarvot ja kes ­
kihajonnat testiastioissa, niiden laskemiseen käytetty menetelmä 
sekä näyttö siitä, että mittaukset on tehty liuoksessa olevasta testiaineesta, mikäli testiaine on vesiliukoinen testipitoisuuksia pienemmissä pitoisuuksissa,
 
— laimennukseen käytetyn veden ominaisuudet: pH, kovuus, läm ­
pötila, liuenneen hapen pitoisuus, jäännösklooripitoisuudet (jos ne on mitattu), orgaanisiin yhdisteisiin sitoutuneen hiilen koko ­
naismäärä, suspensiossa olevat kiinteät aineet, testiväliaineen suo ­
lapitoisuus (jos se on mitattu) ja muut mahdolliset mittaukset,
 
— testiastioissa olevan veden laatu: pH, kovuus, lämpötila ja liuen ­
neen hapen pitoisuus.  
2.3.4  Tulokset:  
— mahdollisista alustavista kokeista saadut testiaineen stabiilisuutta 
koskevat tulokset,  
— näyttö siitä, että kontrollit täyttivät yleiset testilajin elinkyvyn 
hyväksyttävyyttä koskevat vaatimukset (lisäykset 2 ja 3),  
— alkio- ja toukkavaiheen sekä yleistä kuolleisuutta/elinkykyä kos ­
kevat tulokset,  
— päivien lukumäärä kuoriutumiseen ja kuoriutuneiden toukkien 
lukumäärä,  
— pituus (ja paino),  
— mahdollisten epämuodostumien ilmaantuvuus ja kuvaus,  
— mahdollisten käyttäytymismuutosten ilmaantuvuus ja kuvaus,  
— tulosten tilastollinen analyysi ja käsittely,  
— ANOVALLA analysoiduille testeille LOEC (pienin havaittavan 
vaikutuksen aiheuttava pitoisuus) arvolla p = 0,05 ja NOEC (pitoisuus, joka ei aiheuta havaittavaa vaikutusta) kullekin arvi ­
oidulle vasteelle sekä käytettyjen tilastomenetelmien kuvaus ja 
ilmoitus havaitun vaikutuksen suuruudesta,
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1172
 
— regressiotekniikoilla arvioiduille testeille LC/EC  x ja luottamusvä ­
lit sekä sen laskemiseen käytetyn sovitusmallin kuvaaja.  
— selitys mahdollisiin poikkeamiin tästä testimenetelmästä.  
3. LÄHDELUETTELO  
(1) Kristensen P. (1990). Evaluation of the Sensitivity of Short 
Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, 60 pp. June 1990.
 
(2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life- 
Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing 
and Materials. E 1241-88. 26 pp.  
(3) Brauhn J. L. and Schoettger R. A. (1975). Acquisition and 
Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, 
Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research Se ­
ries, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.  
(4) Brungs W. A. and Jones B. R. (1977). Temperature Criteria for 
Freshwater Fish: Protocol and Procedures, p. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.
 
(5) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish  
(Brachydanio rerio)  in Fisheries Research. A Literature Revi ­
ew. J. Biol. 10, pp. 121-173.  
(6) Legault R. (1958). A Technique for Controlling the Time of 
Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish,  Brachy­
danio rerio  (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, pp. 328-330.  
(7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander 
B. and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval To ­
xicity Test with Zebrafish  (Brachydanio rerio)  Using Chro ­
mium and Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and 
Chemistry, 6, pp. 61-71.  
(8) Birge J. W., Black J. A. and Westerman A. G. (1985). Short- 
term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Esti ­
mating Chronic Values for Single Compounds and Complex 
Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, pp. 807-821.
 
(9) Van Leeuwen C. J., Espeldoom A. and Mol F. (1986). Aquatic 
Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Com ­
pounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout  (Salmo 
gairdneri).  J. Aquatic Toxicology, 9, pp. 129-145.  
(10) Kirchen R. V. and W. R. West (1969). Teleostean Develop ­
ment. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply 
Company.  
(11) Kirchen R. V. and W. R. West (1976). The Japanese Medaka. 
Its care and Development. Carolina Biological Supply Compa ­
ny, North Carolina. 36 pp.  
(12) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, pp. 1096-1121.  
(13) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons 
with a Control. Biometrics, 20, pp. 482-491.  
(14) Mc Clave J. T., Sullivan J. H. and Pearson J.G. (1980). Sta ­
tistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Procee ­
dings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Phila ­
delphia.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1173
 
(15) Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M. and Hermes J. (1990). 
Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early 
Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, pp. 321-334.  
(16) Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life 
Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 1/RM/28, December 1992, 81 pp.
 
(17) Dave G. and Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead 
and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, B rachydanio 
rerio.  Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 
21, pp. 126-134.  
(18) Meyer A., Bierman C. H. and Orti G. (1993). The phylogene ­
tic position of the Zebrafish  (Danio rerio),  a model system in 
developmental biology — an invitation to the comperative 
methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: pp. 
231-236.  
(19) Ghillebaert F., Chaillou C., Deschamps F. and Roubaud P. 
(1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and En ­
vironmental Safety 32, pp. 19-28.
 
(20) US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese Meda ­
ka, Oryzias latipes.  EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 1991, 
EPA, Duluth.  
(21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage 
Toxicity Tests with Japanese Medaka,  (Oryzias latipes ). EPA 
report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.  
(22) De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic T. 
L, Reichenbach N. G., Dean J. H. and Marcus M, D. (1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow 
(Pimephales promelas)  larval survival and growth test: an int ­
ra- and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, pp. 1189-1203.
 
(23) Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, 
Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estua ­
rine and Marine fish.
 
(24) Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New develop ­
mental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., Dordrecht, 280 pp.
 
(25) Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, in: 
W. S. Hoar and D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, Academic press, pp. 1-58.
 
Taulukko 1 A  
Kalalajit, joita suositellaan käytettäväksi testissä  
Makean veden kalat  
Oncorhynchus  mykiss 
Kirjolohi (9) (16)  
Danio rerio  
Seeprakala (7) (17) (18)  
Cyprinus caprio  
Karppi (8) (19)  
Oryzias latipes  
Medaka (20) (21)  
Pimephales promelas  
Paksupäämutu (8) (22)  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1174
 
Taulukko 1 B  
Esimerkkejä muista hyvin dokumentoiduista lajeista, joita on myös käytetty  
Makean veden kalat Suolaisen veden kalat  
Carassius  auratus 
Kultakala (8)  Menidia peninsulae  
Tidewater silverside (23) (24) (25) 
Lepomis  macrochirus  
Isoaurinkoahven (8)  Clupea harengus  
Silli (24) (25)  
Gadus morhua  
Turska (24) (25)  
Cyprinodon variegatus  
Loistohammaskarppi (23) (24) (25)  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1175
 
LISÄYS 1  
OHJEITA SEEPRAKALAN ( BRACHYDANIO RERIO ) ALKIO- JA 
RUSKUAISPUSSIVAIHEEN POIKASILLA TEHTÄVÄN 
MYRKYLLISYYSTESTIN SUORITTAMISEKSI  
JOHDANTO  
Seeprakala on peräisin Intian Coromandel-rannikolta, jossa se asuu voimakkaasti 
virtaavissa joissa. Se on yleinen karpinsukuinen akvaariokala, ja ohjeita sen hoi ­
dosta ja kasvatuksesta annetaan trooppisia kaloja koskevissa kirjoissa. Seepra-kalan biologiaa ja käyttöä kalatutkimuksessa on selostettu viitteessä Laale (1).
 
Seeprakala on harvoin pitempi kuin 45 mm. Ruumis on lieriömäinen, ja siinä on 
7–9 tummansinistä vaakasuoraa hopeanhohtavaa raitaa. Raidat päättyvät pyrstö- 
ja peräeviin. Selkä on oliivinvihreä. Koiraat ovat naaraita hoikempia. Naarailla on voimakkaampi hopeanväri kuin koirailla ja niiden vatsa on isompi, erityisesti ennen mätimunien laskua.
 
Aikuiset kalat sietävät suuria lämpötilan, pH:n ja veden kovuuden vaihteluja. 
Jotta kalat olisivat terveitä ja tuottaisivat hyvälaatuisia munia, niille on kuitenkin tarjottava hyvät elinolot.
 
Parittelun yhteydessä koiras jahtaa ja puskee naarasta, ja mätimunat hedelmöit ­
tyvät, kun naaras laskee munat. Munat ovat läpikuultavia ja liukkaita ja vajoavat 
pohjaan. Aikuiset kalat voivat syödä niitä. Valo vaikuttaa paritteluun. Jos aa ­
muvalo on riittävä, seeprakala parittelee yleensä aamunkoiton jälkeisinä tunteina.  
Naaras voi tuottaa useita satoja munia viikon välein.  
EMOKALAT, LISÄÄNTYMINEN JA VARHAISET KEHITYSVAIHEET  
Valitaan sopiva määrä terveitä kaloja ja pidetään niitä sopivanlaatuisessa vedessä 
(esim. lisäys 4) vähintään 2 viikkoa ennen aiottua parittelua. Kalaryhmän pitäisi antaa paritella vähintään kerran ennen kuin tuotetaan testiä varten tarkoitettu munaerä. Kalojen määrä tänä aikana saisi olla enintään 1 gramma kalaa litrassa. 
Kalojen määrä voi olla suurempi, jos vesi vaihdetaan säännöllisesti tai käytetään 
puhdistusjärjestelmää. Kasvatustankkien lämpötilan olisi oltava 25 ± 2
 o C. Ka­
loille pitäisi antaa vaihtelevaa ravintoa, jossa voi olla esimerkiksi sopivaa kau ­
pallista kuivarehua, eläviä vasta kuoriutuneita Arthemia-vesikirppuja, surviais ­
sääskiä, Daphnia-vesikirppuja ja ankyrimatoja (Enchytracids).  
Seuraavassa selostetaan kaksi menetelmää, joilla on saatu käytännössä riittävä 
määrä terveitä, hedelmöityneitä munia testiä varten:  
i) Kahdeksan naarasta ja 16 koirasta pannaan tankkiin, jossa on 50 litraa lai ­
mennusvettä ja joka on suojattu suoralta auringonvalolta. Tankin annetaan 
olla mahdollisimman häiriöttä vähintään 48 tuntia. Testiä edeltävänä päivänä 
iltapäivällä akvaarion pohjalle asetetaan parittelutarjotin, jossa on 5–7 cm korkea kehys (pleksilasia tai muuta sopivaa materiaalia), 2–5 mm:n isoreikäi ­
nen verkko yläosassa ja 10–30 μm:n hieno verkko pohjassa. Kehyksen iso ­
reikäiseen verkkoon kiinnitetään useita auki kierretystä nailonnarusta tehtyjä 
”parittelupuita”. Kun kalat ovat olleet pimeässä 12 tuntia, sytytetään heikko valo, joka käynnistää parittelun. Kahdesta neljään tuntia parittelun jälkeen tarjotin otetaan pois ja munat kerätään. Tarjotin estää kaloja syömästä munia, 
ja samalla munat on helppo kerätä siitä. Kalaryhmän pitäisi antaa paritella 
vähintään kerran ennen kuin tuotetaan testiä varten tarkoitettu munaerä.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1176
 
ii) Viidestä kymmeneen koiras- ja naaraskalaa kasvatetaan yksittäin vähintään 2 
viikkoa ennen aiottua parittelua. 5–10 päivän kuluttua naaraiden vatsat ovat 
isot ja genitaalinystyt näkyviä. Koiraskaloilla ei ole kyseisiä nystyjä. Parittelu tapahtuu parittelutankeissa, joissa on verkosta tehty valepohja (kuten edellä). Tankki täytetään laimennusvedellä niin, että vettä on verkon päällä 5–10 cm. 
Yksi naaras ja kaksi koirasta pannaan tankkiin päivää ennen aiottua parittelua. 
Veden lämpötilaa nostetaan vähitellen yhden asteen korkeammalle kuin totut ­
telulämpötila. Valo sammutetaan ja tankki jätetään mahdollisimman häiriöttä. Aamulla sytytään heikko valo, joka käynnistää parittelun. Kahdesta neljään 
tuntia parittelun jälkeen kalat otetaan pois ja munat kerätään. Jos tarvitaan 
enemmän munia kuin yhdeltä naaraalta saadaan, käytetään useampia paritte ­
lutankkeja. Kirjaamalla yksittäisten naaraiden jälkeläistentuotto ennen testiä (munien määrä ja laatu) voidaan valita parhaimmat naaraat poikasten tuottoon.
 
Munat olisi siirrettävä testiastioihin ohuilla lasiputkilla (sisähalkaisija vähintään 
4 mm), joissa on imututti. Munien kanssa tulevan veden määrän pitäisi olla mahdollisimman pieni. Munat ovat vettä raskaampia ja putoavat putkesta. Munat (ja toukat) eivät saisi joutua kosketuksiin ilman kanssa. Munista pitäisi ottaa 
näytteitä ja tutkia niitä mikroskoopissa sen varmistamiseksi, ettei ensimmäisissä 
kehitysvaiheissa esiinny epänormaaleja ilmiöitä. Munia ei saa desinfioida.
 
Munien kuolleisuus on suurin ensimmäisten 24 tunnin aikana hedelmöityksestä. 
Kuolleisuus on tänä aikana usein 5–40 prosenttia. Munat hajoavat hedelmöitty ­
misen epäonnistumisen tai kehityshäiriöiden takia. Munien laatu näyttää riippu ­
van naaraista, koska jotkut naaraat tuottavat jatkuvasti hyvälaatuisia munia ja toiset eivät koskaan. Myös kehittymis- ja kuoriutumisnopeus vaihtelevat munae ­
rien välillä. Jos munien hedelmöitys on onnistunut, munat ja ruskuaispussiv ­
aiheen toukat (eloonjäämisprosentti yli 90) pysyvät hyvin elossa. Munat kuoriu ­
tuvat 25
 o C:n lämpötilassa 3–5 päivää hedelmöityksen jälkeen, ja ruskuaispussi 
absorboituu noin 13 päivää hedelmöityksen jälkeen.  
Hisaoka ja Battle (2) ovat kuvanneet hyvin sikiökehityksen. Koska munat ja 
toukat (kuoriutumisen jälkeen) ovat läpinäkyviä, kalojen kehitystä voidaan seu ­
rata ja epämuodostumia havainnoida. Noin 4 tuntia parittelun jälkeen hedelmöi ­
tymättömät munat voidaan erottaa hedelmöityneistä (3). Tätä tutkimusta varten 
munat ja toukat pannaan pieniin astioihin ja niitä tarkastellaan mikroskoopissa.  
Lisäyksessä 2 kuvataan varhaisiin kehitysvaiheisiin sovellettavat testiolosuhteet. 
Optimiarvo pH:lle on 7,8 ja laimennusveden kovuudelle 250 mg CaCO  3 /l. 
LASKUTOIMITUKSET JA TILASTOLLINEN KÄSITTELY  
Suositellaan, että tulosten käsittelyssä on kaksi vaihetta. Ensin käsitellään tilas ­
tollisesti kuolleisuutta, epänormaalia kehittymistä ja kuoriutumisaikaa koskevat 
tulostiedot. Sitten arvioidaan tilastollisesti ruumiin pituus niillä pitoisuuksilla, 
joilla ei havaittu haitallisia vaikutuksia edellä mainituissa muuttujissa. Tällaista menettelyä suositellaan, koska myrkky saattaa tappaa selektiivisesti pieniä kaloja, viivästyttää kuoriutumista ja aiheuttaa vakavia epämuodostumia, mikä johtaa vää ­
ristyneisiin pituuden mittauksiin. Lisäksi tällä tavoin menettelemällä saadaan 
suunnilleen sama määrä kaloja käsittelyä kohti, mikä varmistaa testin validiteetin.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1177
 
LC 50 - JA EC-  50 -MÄÄRITYKSET  
Eloonjääneiden munien ja toukkien määrä lasketaan prosentteina ja korjataan 
kontrollien kuolleisuuden suhteen Abbottin kaavalla (4):  
P ¼ 100 Ä C Ä P 
C Ü 100 Í Î  
jossa  
P = korjattu eloonjäämisprosentti  
P' = testipitoisuudessa havaittu eloonjäämisprosentti  
C = kontrollien eloonjäämisprosentti  
Jos mahdollista, LC  50 määritetään sopivalla menetelmällä testin lopussa.  
Jos EC  50 -tilastoihin halutaan sisällyttää epämuotoisuudet, ohjeita on viitteessä 
Stephan (5).  
LOEC:N JA NOEC:N ESTIMOINTI  
Muna- ja ruskuaispussitestin tarkoitus on verrata kontrolleja ja nollasta poikkea ­
via pitoisuuksia, ts. määrittää LOEC. Sen vuoksi olisi käytettävä yhteisvertailu ­
menetelmiä (6) (7) (8) (9) (10).  
LÄHDELUETTELO  
(1) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish  (Brachydanio 
rerio)  in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, pp. 
121–173.  
(2) Hisaoka K. K. and Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of 
the Zebrafish  Brachydanio rerio  (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 311 
pp. 
(3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling  
(Brachydanio rerio  Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 
2, pp. 173–181.  
(4) Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, 
Great Britain, pp. 1–333.  
(5) Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster and W. F. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, pp. 69–81.
 
(6) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing 
Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, pp. 1096–1121.  
(7) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a 
Control. Biometrics, 20, pp. 482–491.  
(8) Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means 
when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. 
Biometrics, 27, pp. 103–117.  
(9) Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a 
Zero Dose Control. Biometrics 28, pp. 519–531.  
(10) Sokal R. R. and Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of 
Statistics in Biological Research, W. H. Freeman and Co., San Francisco.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1178
 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1179
 ▼B 
Lisäys 2  
TESTIOLOSUHTEET, TESTIN KESTO JA ELOONJÄÄMISKRITEERIT SUOSITELLUILLE LAJEILLE  
Laji Lämpötila 
CO Suolapitoisuus 
(0/00) Valoisa aika 
(tuntia) Kehitysvaiheiden kesto 
(päivää) 
Tyypillinen testin kesto Kontrollien eloonjäämisprosentti 
(vähintään) 
Alkio Ruskuaispussi Kuoriutumispro ­
sentti Kuoriutumisen 
jälkeen  
MAKEAN VEDEN KALA  
Brachydanio rerio  
Seeprakala 25 ± 1 — 12–16 3-5 8–10 Mahdollisimman pian hedelmöityksen jäl ­
keen (varhainen gastrulavaihe) — 5 vrk kuoriutumisen jälkeen (8–10 vrk) 80 90  
Oncorhynchus mykiss  
Kirjolohi 10 ± 1 (
 1 ) 
12 ± 1 (  2 ) — 0 (*) 30–35 25–30 Mahdollisimman pian hedelmöityksen jäl ­
keen (varhainen gastrulavaihe) — 20 vrk 
kuoriutumisen jälkeen (50–55 vrk) 66 70  
Cyprinus carpio  
Karppi 21–25 — 12–16 5 > 4 Mahdollisimman pian hedelmöityksen jäl ­
keen (varhainen gastrulavaihe) — 4 vrk kuoriutumisen jälkeen (8–9 vrk) 80 75  
Oryzias latipes  
Medaka 24 ± 1 (
 1 ) 
23 ± 1 (  2 ) — 12–16 8–11 4–8 Mahdollisimman pian hedelmöityksen jäl ­
keen (varhainen gastrulavaihe) — 5 vrk 
kuoriutumisen jälkeen 13–16 vrk) 80 80  
Pimephales promelas  
Paksupäämutu 25 ± 2 — 16 4–5 5 Mahdollisimman pian hedelmöityksen jäl ­
keen (varhainen gastrulavaihe) — 4 vrk 
kuoriutumisen jälkeen (8–9 vrk) 60 70  
( 1 ) Alkioille. 
( 2 ) Toukille. 
(*) Alkiot ja toukat pidetään pimeässä viikon ajan kuoriutumisen jälkeen paitsi silloin, kun niitä tarkastellaan. Sen jälkeen h eikko valaistus testin loppuun asti.
 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1180
 ▼B 
Lisäys 3  
Testiolosuhteet, testin kesto ja eloonjäämiskriteerit muille hyvin dokumentoiduille lajeille  
Laji Lämpötila (  o C) Suolapitoisuus 
(0/00) Valoisa aika 
(tuntia) Kehitysvaiheiden kesto (vrk) 
Tyypillinen alkio- ja ruskuaispussivaihetestin kesto Kontrollien eloonjaamisprosentti 
Alkiovaihe Ruskuais-pussiv ­
aihe Kuoriutumispro ­
sentti Kuoriutumisen 
jälkeen  
MAKEAN VEDEN KALAT  
Carassius auratus  
Kultakala 24 ± 1 — — 3–4 > 4 Mahdollisimman pian hedelmöityksen jäl ­
keen (varhainen gastrulavaihe) — 4 vrk 
kuoriutumisen jälkeen (7 vrk) — 80  
Leopomis macrochirus  
Isoaurinkoahven 21 ± 1 — 16 3 > 4 Mahdollisimman pian hedelmöityksen jäl ­
keen (varhainen gastrulavaihe) — 4 vrk kuoriutumisen jälkeen (7 vrk) — 75 
SUOLAISEN VEDEN KALAT  
Menidia peninsulae  
Tidewater silverside 22–25 15–22 12 1,5 10 Mahdollisimman pian hedelmöityksen jäl ­
keen (varhainen gastrulavaihe) — 5 vrk 
kuoriutumisen jälkeen (6–7 vrk) 80 60  
Clupea harengus  
Silli 10 ± 1 8–15 12 20–25 3–5 Mahdollisimman pian hedelmöityksen jäl ­
keen (varhainen gastrulavaihe) — 3 vrk 
kuoriutumisen jälkeen (23–27 vrk) 60 80  
Gadus morhua  
Turska 5 ± 1 5–30 12 14–16 3–5 Mahdollisimman pian hedelmöityksen jäl ­
keen (varhainen gastrulavaihe) — 3 vrk kuoriutumisen jälkeen (18 vrk) 60 80  
Cyprinodon variegatus  
Loistohammaskarppi 25 ± 1 15–30 12 — — Mahdollisimman pian hedelmöityksen jäl ­
keen (varhainen gastrulavaihe) — 4/7 vrk 
kuoriutumisen jälkeen (28 vrk) > 75 80
Lisäys 4  
JOITAKIN HYVÄKSYTTÄVÄN LAIMENNUSVEDEN KEMIALLISIA 
OMINAISUUKSIA  
Aine Pitoisuus  
Kiinteät aineet < 20 mg/l 
Orgaanisiin yhdisteisiin sitoutuneen hiilen kokonaismäärä < 2 mg/l 
Ammoniakki (ionisoitumaton) < 1 μg/l 
Jäännöskloori < 10 μg/l 
Orgaanista fosforia sisältävien torjunta-aineiden koko ­
naismäärä < 50 ng/l 
Orgaanista klooria sisältävien torjunta-aineiden koko ­
naismäärä ja polyklooratut bifebyylit < 50 ng/l 
Orgaanisiin yhdisteisiin sitoutuneen kloorin kokonais ­
määrä < 25 ng/l  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1181
 
C.16.  MEHILÄISET — SUUN KAUTTA TAPAHTUNEEN 
ALTISTUKSEN JÄLKEEN ILMENEVÄN VÄLITTÖMÄN 
MYRKYLLISYYDEN TESTI  
1. MENETELMÄ  
Tämä välittömän myrkyllisyyden testimenetelmä on toisinto OECD:n 
testiohjeesta nro 213 (1998).  
1.1 JOHDANTO  
Tämä myrkyllisyystesti on laboratoriomenetelmä, jonka tarkoituk ­
sena on arvioida kasvinsuojeluaineiden ja muiden kemikaalien väli ­
töntä myrkyllisyyttä täysikasvuisille työmehiläisille oraalisen eli suun kautta tapahtuneen altistuksen jälkeen.
 
Arvioitaessa kemikaalien myrkyllisiä ominaisuuksia voidaan vaatia 
välittömän myrkyllisyyden määrittämistä mehiläisillä oraalisen altis ­
tuksen jälkeen esimerkiksi silloin, kun mehiläisten altistuminen tie ­
tylle kemikaalille on todennäköistä. Välittömän myrkyllisyyden testi 
tehdään mehiläisille myrkyllisten torjunta-aineiden ja muiden kemi ­
kaalien aineelle ominaisen myrkyllisyyden määrittämiseksi. Testitu ­
loksien avulla määritellään lisäarvioinnin tarve. Tätä menetelmää voidaan käyttää erityisesti ohjelmissa, joissa torjunta-aineista mehi ­
läisille aiheutuvaa vaaraa arvioidaan vaiheittain, jolloin laboratoriossa 
tehtävien myrkyllisyystestien jälkeen edetään puoliksi kenttäolosuh ­
teissa tehtäviin kokeisiin ja kenttäkokeisiin (1). Torjunta-aineita voi ­
daan testata sekä tehoaineina että valmisteina.
 
Mehiläisten herkkyyden ja testimenetelmän tarkkuuden todentami ­
seksi olisi käytettävä myrkyllistä standardia.  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Välitön myrkyllisyys suun kautta:  Haittavaikutukset, jotka ilmene ­
vät enintään 96 tunnin kuluttua siitä, kun testiainetta on annettu yksi annos suun kautta.
 
Annos:  Nautitun testiaineen määrä. Annos ilmaistaan testiaineen 
massana ( μg) testieläintä kohti ( μg/mehiläinen). Todellista annosta 
kutakin mehiläistä kohti ei voida laskea, koska mehiläisiä ruokitaan yhtenä ryhmänä, mutta keskimääräinen annos voidaan arvioida (nau ­
titun testiaineen kokonaismäärä / testimehiläisten lukumäärä yhdessä 
häkissä).
 
LD 50 ((puolet tappava annos) suun kautta annosteltuna:  Tilastol­
lisesti laskettu yksittäinen annos, joka aiheuttaa kuoleman 50 %:ssa 
eläimistä suun kautta annosteltuna. LD  50 ilmaistaan mikrogrammana 
testiainetta mehiläistä kohti. Kun on kysymys torjunta-aineesta, tes ­
tiaine voi olla joko tehoaine tai valmiste, jossa on yksi tai useampia 
tehoaineita.  
Kuolleisuus:  Eläin katsotaan kuolleeksi, kun se on täysin liikkuma ­
ton. 
1.3 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Täysikasvuisia työmehiläisiä ( Apis mellifera)  altistetaan sarjalle sak ­
karoosiliuokseen liuotetun testiaineen annoksia. Mehiläisille annetaan tämän jälkeen sakkaroosiliuosta, jossa ei ole testiainetta. Kuolleisuus 
kirjataan päivittäin vähintään 48 tunnin ajan, ja sitä verrataan kont ­
rolliarvoihin. Jos kuolleisuus lisääntyy 24 tunnin ja 48 tunnin välillä, mutta kontrollien kuolleisuus pysyy hyväksytyllä tasolla eli < 10 %, testiä jatketaan enintään 96 tuntiin saakka. Tulokset analysoidaan ja 
lasketaan 24 tunnin ja 48 tunnin LD
 50 sekä 72 tunnin ja 96 tunnin 
LD 50 , jos testiä on jatkettu.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1182
 
1.4 TESTIN LUOTETTAVUUS  
Testi on luotettava, jos:  
— keskimääräinen kuolleisuus kaikilla kontrolleilla ei ole suurempi 
kuin 10 % testin lopussa, ja  
— myrkyllisen standardin LD  50 on määritellyissä rajoissa.  
1.5 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.5.1  Mehiläisten kerääminen  
Testissä olisi käytettävä samaa rotua olevia täysikasvuisia työmehi ­
läisiä. Niiden pitäisi olla saman ikäisiä, samalla tavalla ruokittuja jne. 
Testimehiläisten olisi oltava asianmukaisesti ruokittuja ja hyväkun ­
toisia, niissä ei saisi olla tauteja ja ne olisi otettava emollisista pe ­
sistä. Yhdyskuntien fysiologinen tila ja aiempi historia pitäisi tuntea. 
Mehiläiset olisi kerättävä sen päivän aamuna, jolloin ne käytetään, tai 
edellisenä iltana ja pidettävä testiolosuhteissa seuraavaan päivään. Sikiöttömiltä kakuilta kerätyt mehiläiset ovat sopivia. Keräämistä 
aikaisin keväällä tai myöhään syksyllä olisi vältettävä, koska mehi ­
läisten fysiologia on erilainen näinä aikoina. Jos testit on tehtävä aikaisin keväällä tai myöhään syksyllä, mehiläisten voi antaa kuoriu ­
tua lämpökaapissa ja niitä voi kasvattaa viikon verran ”mesileivällä” 
(kakusta kerätyllä siitepölyllä) ja sakkaroosiliuoksella. Kemiallisilla 
aineilla kuten antibiooteilla ja varroapunkkilääkkeillä käsiteltyjä me ­
hiläisiä ei saisi käyttää myrkyllisyystesteihin neljään viikkoon vii ­
meisen käsittelyn lopusta.
 
1.5.2  Häkit ja ruokinta  
Häkkien on oltava helposti puhdistettavia ja niissä on oltava hyvä 
ilmanvaihto. Kaikkia sopivia materiaaleja voi käyttää, kuten ruostu ­
matonta terästä, metalliverkkoa tai muovia, tai häkit voivat olla ker ­
takäyttöisiä puuhäkkejä. Kymmenen mehiläistä häkkiä kohti on so ­
pivin määrä. Testihäkkien on oltava kooltaan riittävän tilavia mehi ­
läismäärälle.  
Mehiläisiä olisi pidettävä pimeässä koehuoneessa lämpötilassa 25 ± 
2 o C. Suhteellinen kosteus, jonka pitäisi olla normaalisti 50-70 %, 
olisi rekisteröitävä koko testin ajan. Käsittelytoimenpiteet ja havain ­
not voidaan suorittaa (päivän)valossa. Ravintona käytetään sakkaroo ­
siliuosta, jonka pitoisuus on 500 g/l (50 % w/v). Testiannosten an ­
tamisen jälkeen ravintoa on annettava  ad libitum.  Ruokintajärjestel ­
män olisi oltava sellainen, että ravinnonotto voidaan rekisteröidä jokaista häkkiä kohti (ks. kohta 1.6.3.1). Ravinnon annosteluun voi ­
daan käyttää lasiputkea, joka on n. 50 mm pitkä ja 10 mm paksu ja 
jonka pää kapenee niin, että halkaisija on noin 2 mm.
 
1.5.3  Mehiläisten valmistelu  
Kerätyt mehiläiset jaetaan satunnaisesti testihäkkeihin, jotka sijoite ­
taan satunnaisesti koehuoneeseen.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1183
 
Mehiläisiä voidaan pitää ilman ravintoa enintään 2 tuntia ennen tes ­
tin alkua. Suositellaan, että mehiläisiä pidetään ilman ravintoa ennen 
käsittelyä, jotta niiden suolen sisältö olisi samanlainen testin alkaes ­
sa. Kuolevat mehiläiset on hylättävä, ja niiden tilalle on otettava terveitä mehiläisiä ennen testin aloittamista.
 
1.5.4  Annosten valmistus  
Jos testiaine on vesiliukoinen, se voidaan liuottaa suoraan 50-pro ­
senttiseen sakkaroosiliuokseen. Tekniset valmisteet ja huonosti vesi ­
liukoiset aineet voidaan liuottaa esimerkiksi sellaisen orgaanisen liuottimen tai emulgointi- tai dispergointiaineen avulla, jonka myr ­
kyllisyys mehiläisille on vähäinen (esim. asetoni, dimetyyliformami ­
di, dimetyylisulfoksidi). Liuotinapuaineen pitoisuus riippuu testi ­
aineen liukoisuudesta, ja sen pitäisi olla sama kaikille testattaville pitoisuuksille. Yhden prosentin pitoisuus on yleensä hyväksyttävä, 
eikä sitä saisi ylittää.
 
On myös valmistettava asianmukaiset kontrolliliuokset. Jos testi ­
aineen liuottamiseen on käytetty liuotinta tai dispergointiainetta, pi ­
täisi käyttää kahta erillistä kontrolliaineiden ryhmää: toinen olisi ve ­
siliuos ja toinen sakkaroosiliuos, jossa on liuotinta / kantaja-ainetta siinä pitoisuudessa kuin sitä käytetään annosteluliuoksissa.
 
1.6 TESTIN SUORITUS  
1.6.1  Testi- ja kontrolliryhmät  
Testiannosten ja rinnakkaismääritysten määrän on täytettävä tilastol ­
liset vaatimukset LD  50 :n määrittämiseksi 95 %:n luottamusvälein. 
Tavallisesti vaaditaan viisi annosta, joiden pitoisuudet ovat geomet ­
risessa sarjassa, jonka kerroin on enintään 2,2, ja jotka kattavat 
LD 50 :n määrittämiseksi tarvittavan pitoisuusalueen. Laimennustekijä 
ja annosteltavien pitoisuuksien lukumäärä on kuitenkin määriteltävä myrkyllisyyskäyrän (kuolleisuus annoksen funktiona) kulmakertoi ­
men mukaan, ja tulosten analysointiin valittu tilastollinen menetelmä 
on myös otettava huomioon. Alustavilla testeillä on määriteltävä sopivat annostelupitoisuudet.
 
Sama testipitoisuusannos olisi annettava vähintään kolmelle rinnak ­
kaiselle testiryhmälle, joista kussakin on kymmenen mehiläistä. Tes ­
tisarjan lisäksi olisi oltava vähintään kolme kontrollierää, joista kus ­
sakin on kymmenen mehiläistä. Käytetyille liuottimille tai kantaja- 
aineille (ks. kohta 1.5.4) on oltava myös kontrollierät.  
1.6.2  Myrkyllinen standardi  
Testisarjassa on oltava myös myrkyllinen standardi. Siitä on oltava 
vähintään kolme annosta, jotka kattavat odotetun LD  50 -arvon. Kuta ­
kin testiannosta varten on oltava vähintään kolme rinnakkaishäkkiä, 
joista kussakin kymmenen mehiläistä. Suositeltava myrkyllinen stan ­
dardi on dimetoaatti, jonka 24 tunnin LD  50 -arvon on raportoitu ole ­
van alueella 0,10 - 0,35 μg tehoainetta / mehiläinen (2). Muutkin 
myrkylliset standardit ovat hyväksyttäviä, jos toimitetaan riittävästi 
tietoja odotetun annos-vastesuhteen todentamiseksi (esim. parationi).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1184
 
1.6.3  Altistus  
1.6.3.1  Antotapa  
Kullekin mehiläisten testiryhmälle on annettava 100-200 μl 50-pro­
senttista sakkaroosin vesiliuosta, joka sisältää testiainetta sopivassa 
pitoisuudessa. Aineille, jotka ovat niukkaliukoisia, joiden myrkylli ­
syys on vähäinen tai joiden pitoisuus valmisteessa on pieni, tarvitaan suurempi nestetilavuus, koska on käytettävä aineiden suurempia osuuksia sakkaroosiliuoksessa. Ryhmää kohti kulunutta käsitellyn 
ravinnon määrää on seurattava. Kun ravinto on nautittu (tavallisesti 
3-4 tunnin kuluessa), ruokintalaite on poistettava häkistä ja sen tilalle on pantava pelkästään sakkaroosiliuosta. Sitä annetaan sitten  ad li­
bitum . Joitakin aineita mehiläiset eivät ehkä syö, kun aineiden pitoi ­
suus on suuri. Enintään 6 tunnin kuluttua nauttimatta jäänyt käsitelty ravinto otetaan pois ja korvataan sakkaroosiliuoksella. Nautitun kä ­
sitellyn ravinnon määrä on arvioitava (esim. mittaamalla jäljelle jää ­
neen ravinnon tilavuus / paino).
 
1.6.3.2  Testin kesto  
Testin kestoksi suositellaan 48 tuntia sen jälkeen kun testiliuos on 
korvattu sakkaroosiliuoksella. Jos kuolleisuus nousee edelleen yli 10 
prosentilla ensimmäisten 24 tunnin jälkeen, koetta on jatkettava enin ­
tään 96 tuntiin saakka edellyttäen, ettei kontrollien kuolleisuus ole suurempi kuin 10 %.
 
1.6.4  Havainnot  
Kuolleisuus kirjataan 4 tunnin kuluttua testin alusta ja sen jälkeen 24 
tunnin ja 48 tunnin kuluttua (ts. annoksen antamisesta). Jos on tar ­
peen jatkaa havainnointia, havainnot on tehtävä 24 tunnin välein enintään 96 tuntiin saakka.
 
Ryhmää kohti kuluneen ravinnon määrä olisi arvioitava. Vertaamalla 
käsitellyn ja käsittelemättömän ravinnon nauttimisnopeutta 6 tunnin 
kuluessa voidaan saada käsitys käsitellyn ravinnon maittavuudesta.  
Kaikki epänormaali käyttäytyminen testauksen aikana on kirjattava.  
1.6.5  Raja-annostesti  
Joissakin tapauksissa (esim. kun testiaineen myrkyllisyys oletetaan 
alhaiseksi) voidaan tehdä raja-arvotesti, jolloin käytetään 100 μg 
tehoainetta mehiläistä kohti sen osoittamiseksi, että LD  50 on kyseistä 
arvoa suurempi. Raja-annostestissä olisi käytettävä samaa menettelyä 
kuin varsinaisessa testissä, ts. siinä on oltava kolme rinnakkaistesti ­
ryhmää annosta kohti, tarvittavat kontrollit, myrkyllinen standardi, ja nautitun käsitellyn ravinnon määrä on arvioitava. Jos esiintyy kuol ­
leisuutta, on tehtävä täydellinen tutkimus. Jos havaitaan subletaaleja 
vaikutuksia (ks. kohta 1.6.4), ne on kirjattava.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1185
 
2. MÄÄRITYSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
2.1 MÄÄRITYSTULOKSET  
Määritystulokset on esitettävä taulukoituna, ja esityksestä on käytävä 
ilmi kussakin testiryhmässä sekä kontrolliryhmässä ja myrkyllistä 
standardia saaneessa ryhmässä käytettyjen mehiläisten lukumäärä, 
kuolleisuus kunakin havainnointihetkenä ja niiden mehiläisten luku ­
määrä, joissa havaitaan haittavaikutuksia. Kuolleisuustulokset on analysoitava sopivilla tilastomenetelmillä (esim. probittianalyysi, liu ­
kuva keskiarvo, binomiaalinen todennäköisyys) (3) (4). Annos-vas ­
tekuvaajat tehdään kutakin suositeltua havainnointiajankohtaa kohti, ja kuvaajien kulmakertoimet ja puolet tappava annos (LD
 50 ) laske­
taan 95 prosentin luottamusvälillä. Kontrollikuolleisuudesta johtuvat 
korjaukset voitaisiin tehdä Abbottin korjauksella (4) (5). Jos käsitel ­
tyä ravintoa ei ole nautittu kokonaan, olisi määritettävä nautitun testiaineen annos ryhmää kohti. LD
 50 , olisi ilmaistava mikrogram ­
moina testiainetta mehiläistä kohti.  
2.2 TESTISELOSTE  
Testiselosteessa on oltava seuraavat tiedot:  
2.2.1  Testiaine:  
— fysikaalinen olomuoto ja asian kannalta merkitsevät fysikokemi ­
alliset ominaisuudet (esim. stabiilisuus vedessä, höyrynpaine),  
— kemialliset tunnistetiedot, mukaan lukien rakennekaava ja puh ­
taus (ts. torjunta-aineille tunnistetiedot ja tehoaine(id)en pitoi ­
suus).  
2.2.2  Testilaji:  
— tieteellinen nimi, rotu, ikä suunnilleen (viikkoa), keräysmenetel ­
mä, keräyspäivä,  
— testimehiläisten keräykseen käytettyjä pesiä koskevat tiedot, mu ­
kaan lukien esim. mehiläisten terveydentila, mahdolliset täysikas ­
vuisten taudit, mahdolliset esikäsittelyt.  
2.2.3  Testiolosuhteet:  
— koetilojen lämpötila ja suhteellinen kosteus,  
— häkkien tyyppi, koko ja materiaali,  
— varasto- ja testiliuosten valmistusmenetelmät (jos on käytetty 
liuotinta, sen nimi ja pitoisuus on mainittava),  
— testin suunnittelu, esim. testipitoisuudet ja niiden määrä, kontrol ­
lien lukumäärä sekä kutakin testipitoisuutta ja kontrollia kohti 
rinnakkaisten häkkien määrä ja mehiläisten määrä häkkiä kohti,  
— testin päivämäärä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1186
 
2.2.4  Tulokset:  
— mahdolliset alustavan annosaluetutkimuksen tulokset,  
— käsittelemättömät tulokset: kuolleisuus kullakin testipitoisuudella 
ja kullakin havainnointihetkellä,  
— annos-vastekuvaajat testin lopussa,  
— testiaineen ja myrkyllisen standardin LD  50 -arvot 95 prosentin 
luottamusvälein kullakin suositellulla havainnointihetkellä,  
— LD  50 -arvon määrittämiseen käytetyt tilastomenetelmät,  
— kontrollien kuolleisuus,  
— muut havaitut tai mitatut biologiset vaikutukset ja mehiläisissä 
mahdollisesti havaitut epänormaalit vasteet,  
— mahdolliset poikkeamat tässä kuvatuista testimenettelyistä ja 
kaikki mahdollisesti tärkeät tiedot.  
3. LÄHDELUETTELO  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products — Honeybees. EPPO Bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151- 165. March 1993.
 
(2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity 
tests on honeybees ( Apis mellifera  L.) 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research, 22, pp. 119-125.  
(3) Litchfield. J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol, and Ex ­
per. Ther., 96, pp. 99-113.  
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, Lon ­
don and New York.  
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol., 18, pp. 265-267.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1187
 
C.17  MEHILÄISET — KOSKETUSALTISTUKSEN JÄLKEEN 
ILMENEVÄN VÄLITTÖMÄN MYRKYLLISYYDEN TESTI  
1. MENETELMÄ  
Tämä välittömän myrkyllisyyden testimenetelmä on toisinto OECD:n 
testausohjeesta N:o 214 (1998).  
1.1 JOHDANTO  
Tämä myrkyllisyystesti on laboratoriomenetelmä, jonka tarkoituk ­
sena on arvioida kasvinsuojeluaineiden ja muiden kemikaalien väli ­
töntä myrkyllisyyttä täysikasvuisille työmehiläisille kosketusaltistuk ­
sen jälkeen.  
Arvioitaessa kemikaalien myrkyllisiä ominaisuuksia voidaan vaatia 
välittömän myrkyllisyyden määrittämistä mehiläisillä kosketusaltis ­
tuksen jälkeen esimerkiksi silloin, kun mehiläisten altistuminen tie ­
tylle kemikaalille on todennäköistä. Kosketusaltistuksen jälkeen il ­
menevän välittömän myrkyllisyyden testin tarkoituksena on määrittää 
mehiläisille myrkyllisten torjunta-aineiden ja muiden kemikaalien ai ­
neelle ominainen myrkyllisyys. Testituloksien avulla määritellään li ­
säarvioinnin tarve. Tätä menetelmää voidaan käyttää erityisesti oh ­
jelmissa, joissa torjunta-aineista mehiläisille aiheutuvaa vaaraa arvi ­
oidaan vaiheittain, jolloin laboratoriossa tehtävien myrkyllisyystes ­
tien jälkeen edetään puoliksi kenttäolosuhteissa tehtäviin kokeisiin ja kenttäkokeisiin (1). Torjunta-aineita voidaan testata sekä teho ­
aineina että valmisteina.
 
Mehiläisten herkkyyden ja testimenetelmän tarkkuuden todentami ­
seksi olisi käytettävä myrkyllistä standardia.  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Kosketusaltistuksen jälkeen ilmenevä välitön myrkyllisyys:  Hait­
tavaikutukset, jotka ilmenevät enintään 96 tunnin kuluttua siitä, kun 
testiainetta on aplikoitu paikallisesti yksi annos.  
Annos:  Aplikoidun testiaineen määrä. Annos ilmaistaan testiaineen 
massana ( μg) testieläintä kohti ( μg/mehiläinen).  
LD 50 (puolet tappava annos) ihon kautta annosteltuna:  Tilastol­
lisesti laskettu yksittäinen annos, joka aiheuttaa kuoleman 50 %:ssa 
eläimistä ihon kautta annosteltuna. LD  50 ilmaistaan mikrogrammana 
testiainetta mehiläistä kohti. Kun on kysymys torjunta-aineesta, tes ­
tiaine voi olla joko tehoaine tai valmiste, jossa on yksi tai useampia 
tehoaineita.  
Kuolleisuus:  Eläin katsotaan kuolleeksi, kun se on täysin liikkuma ­
ton. 
1.3 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Täysikasvuisia työmehiläisiä  (Apis mellifera)  altistetaan sopivaan 
kantaja-aineeseen liuotetun testiaineen annoksille siten, että ainetta aplikoidaan suoraan rintakehälle (tippoina). Testin kesto on 48 h. 
Jos kuolleisuus kasvaa 24 tunnin ja 48 tunnin välillä kontrollien 
kuolleisuuden pysyessä hyväksyttävällä tasolla, ts. < 10 %, testiä pitäisi jatkaa enintään 96 tuntiin saakka. Kuolleisuus kirjataan päi ­
vittäin, ja sitä verrataan kontrolliarvoihin. Tuloksista lasketaan LD
 50 
24 tunnin ja 48 tunnin kuluttua sekä 72 tunnin ja 96 tunnin kuluttua, 
jos testiä on jatkettu.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1188
 
1.4 TESTIN LUOTETTAVUUS  
Testi on luotettava, jos:  
— keskimääräinen kuolleisuus kaikilla kontrolleilla ci ole suurempi 
kuin 10 % testin lopussa, ja  
— myrkyllisen standardin LD  50 on määritellyissä rajoissa.  
1.5 TESTIN KUVAUS  
1.5.1  Mehiläisten kerääminen  
Testiin pitäisi käyttää nuoria täysikasvuisia työmehiläisiä, ts. sellai ­
sia, jotka ovat saman ikäisiä, samalla tavoin ruokittuja, saman rotui ­
sia jne. Testimehiläisten olisi oltava asianmukaisesti ruokittuja ja 
hyväkuntoisia, niissä ei saisi olla tauteja ja ne olisi kerättävä emol ­
lisista pesistä, joiden fysiologinen tila ja aiempi historia tunnetaan. Mehiläiset olisi kerättävä sen päivän aamuna, jolloin ne käytetään, tai 
edellisenä iltana ja pidettävä testiolosuhteissa seuraavaan päivään. 
Sikiöttömiltä kakuilta kerätyt mehiläiset ovat sopivia. Keräämistä aikaisin keväällä tai myöhään syksyllä olisi vältettävä, koska mehi ­
läisten fysiologia on erilainen näinä aikoina. Jos testit on tehtävä 
aikaisin keväällä tai myöhään syksyllä, mehiläisten voi antaa kuoriu ­
tua lämpökaapissa ja niitä voi kasvattaa viikon verran ”mesileivällä” (kakusta kerätyllä siitepölyllä) ja sakkaroosiliuoksella. Kemiallisilla aineilla kuten antibiooteilla ja varroapunkkilääkkeillä käsiteltyjä me ­
hiläisiä ei saisi käyttää myrkyllisyystesteihin neljään viikkoon vii ­
meisen käsittelyn lopusta.
 
1.5.2  Häkit ja ruokinta  
Häkkien on oltava helposti puhdistettavia ja niissä on oltava hyvä 
ilmanvaihto. Kaikkia sopivia materiaaleja voi käyttää, kuten ruostu ­
matonta terästä, metalliverkkoa tai muovia, tai häkit voivat olla ker ­
takäyttöisiä puuhäkkejä. Testihäkkien on oltava kooltaan riittävän tilavia mehiläismäärälle. Kymmenen mehiläistä häkkiä kohti on so ­
pivin määrä
 
Mehiläisiä olisi pidettävä pimeässä koehuoneessa lämpötilassa 25 ± 
2 o C. Suhteellinen kosteus, jonka pitäisi olla normaalisti 50-70 %, 
olisi rekisteröitävä koko testin ajan. Käsittelytoimenpiteet ja havain ­
not voidaan suorittaa (päivän)valossa. Ravintona käytetään sakkaroo ­
siliuosta, jonka pitoisuus on 500 g/l (50 % w/v), ja sitä annetaan  ad 
libitum  testin ajan annostelulaitteen avulla, joka voi olla lasiputki 
(n. 50 mm pitkä ja 10 mm paksu ja jonka pää kapenee niin, että 
halkaisija on noin 2 mm).  
1.5.3  Mehiläisten valmistelu  
Mehiläiset voidaan keräyksen jälkeen anestesoida hiilidioksidilla tai 
typpikaasulla, jotta testiaine voidaan aplikoida. Anestesia-ainetta on 
käytettävä mahdollisimman pieni määrä ja mahdollisimman lyhyen aikaa. Kuolevat mehiläiset on hylättävä, ja niiden tilalle on otettava terveitä mehiläisiä ennen testin aloittamista.
 
1.5.4  Annosten valmistelu  
Testiaine aplikoidaan kantaja-aineeseen, ts. orgaaniseen liuottimeen 
tai veteen tehtynä liuoksena, jossa on vettymistä edistävää ainetta. Orgaanisista liuottimista suositeltavin on asetoni, mutta muitakin or ­
gaanisia liuottimia, joiden myrkyllisyys mehiläisille on vähäinen, 
voidaan käyttää (esim. dimetyyliformamidia tai dimetyylisulfoksidia). 
Orgaanisiin kantaja-aineisiin liukenemattomien veteen dispergoitujen valmisteiden ja erittäin polaaristen orgaanisten kemikaalien aplikointi voi olla helpompaa, jos niiden liuokset tehdään laimeaan kaupalli ­
seen vettymistä edistävään aineeseen (esim. Agral, Cittowett, Lubrol, 
Triton, Tween).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1189
 
Testissä olisi käytettävä asianmukaisia kontrolliliuoksia, ts. jos testi ­
aineen liuottamiseen on käytetty liuotinta tai dispergointiainetta, pi ­
täisi käyttää kahta erillistä kontrolliryhmää: sellaista, joka on käsi ­
telty vedellä ja sellaista, joka on käsitelty liuottimella tai dispergoin ­
tiaineella.  
1.6 TESTIN SUORITUS  
1.6.1  Testi- ja kontrolliryhmät  
Testiannosten ja rinnakkaismääritysten määrän on täytettävä tilastol ­
liset vaatimukset LD  50 :n määrittämiseksi 9 5 %:n luottamusvälein. 
Tavallisesti vaaditaan viisi annosta, joiden pitoisuudet ovat geomet ­
risessa sarjassa, jonka kerroin on enintään 2,2, ja jotka kattavat LD
 50 :n määrittämiseksi tarvittavan pitoisuusalueen. Annosteltavien 
pitoisuuksien lukumäärä on kuitenkin määriteltävä myrkyllisyyskäy ­
rän (kuolleisuus annoksen funktiona) kulmakertoimen mukaan, ja tulosten analysointiin valittu tilastollinen menetelmä on myös otet ­
tava huomioon. Alustavilla testeillä on määriteltävä sopivat annostel ­
upitoisuudet.
 
Sama testipitoisuusannos olisi annettava vähintään kolmelle rinnak ­
kaiselle testiryhmälle, joista kussakin on kymmenen mehiläistä.  
Testisarjan lisäksi olisi oltava vähintään kolme kontrollierää, joista 
kussakin on kymmenen mehiläistä. Jos käytetään orgaanista liuotinta tai vettymistä edistävää ainetta, on testissä oltava myös orgaanista liuotinta tai vettymistä edistävää ainetta varten kolme kontrollierää, 
joista kussakin on kymmenen mehiläistä.
 
1.6.2  Myrkyllinen standardi  
Testisarjassa on oltava myös myrkyllinen standardi. Siitä on oltava 
vähintään kolme annosta, jotka kattavat odotetun LD  50 -arvon. Kuta ­
kin testiannosta varten on oltava vähintään kolme rinnakkaishäkkiä, joista kussakin kymmenen mehiläistä. Suositeltava myrkyllinen stan ­
dardi on dimetoaatti, jonka 24 tunnin LD
 50 -arvo on alueella 0,10 - 
0,30 μg tehoainetta / mehiläinen (2). Muutkin myrkylliset standardit 
ovat hyväksyttäviä, jos toimitetaan riittävästi tietoja odotetun annos- vastesuhteen todentamiseksi (esim. parationi).
 
1.6.3  Altistus  
1.6.3.1  Antotapa  
Anestesoidut mehiläiset käsitellään yksitellen. Mehiläiset jaetaan sa ­
tunnaistetusti eri testiannos- ja kontrolliryhmiin. Liuosta, joka sisältää 
1 mikrolitran testiainetta sopivassa pitoisuudessa, aplikoidaan mikro ­
aplikaattorilla kunkin mehiläisen rintakehän selkäpuolelle. Muita ti ­
lavuuksia voi käyttää, jos se on perusteltua. Mehiläiset jaetaan apli ­
kaation jälkeen testihäkkeihin ja niille annetaan sakkaroosiliuosta.  
1.6.3.2  Testin kesto  
Testin keston olisi oltava mieluiten 48 tuntia. Jos kuolleisuus nousee 
edelleen yli 10 prosentilla 24 tunnin ja 48 tunnin välillä, testiä on 
jatkettava, kuitenkin enintään 96 tuntiin saakka, edellyttäen, ettei 
kontrollien kuolleisuus ole suurempi kuin 10 %.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1190
 
1.6.4  Havainnot  
Kuolleisuus kirjataan 4 tunnin kuluttua annostelusta ja 24 tunnin 
sekä 48 tunnin kuluttua. Jos on tarpeen jatkaa havainnointia, havain ­
toja on tehtävä 24 tunnin väliajoin enintään 96 tuntiin saakka, mikäli 
kontrollikuolleisuus ei ylitä 10:tä prosenttia.  
Kaikki epänormaali käyttäytyminen testin aikana on kirjattava.  
1.6.5  Raja-annostesti  
Joissakin tapauksissa (esim. kun testiaineen myrkyllisyys oletetaan 
alhaiseksi) voidaan tehdä raja-arvotesti, jolloin käytetään 100 μg 
tehoainetta mehiläistä kohti sen osoittamiseksi, että LD  50 on kyseistä 
arvoa suurempi. Raja-annostestissä olisi käytettävä samaa menettelyä 
kuin varsinaisessa testissä, ts. siinä on oltava kolme rinnakkaistesti ­
ryhmää annosta kohti, tarvittavat kontrollit ja myrkyllinen standardi. Jos esiintyy kuolleisuutta, on tehtävä täydellinen tutkimus. Jos hav ­
aitaan subletaaleja vaikutuksia (ks. kohta 1.6.4), ne on kirjattava.
 
2. MÄÄRITYSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
2.1 MÄÄRITYSTULOKSET  
Määritystulokset on esitettävä taulukoituna, ja esityksestä on käytävä 
ilmi kussakin testiryhmässä sekä kontrolliryhmässä ja myrkyllistä standardia saaneessa ryhmässä käytettyjen mehiläisten lukumäärä, kuolleisuus kunakin havainnointihetkenä ja niiden mehiläisten luku ­
määrä, joissa havaitaan haittavaikutuksia. Kuolleisuustulokset on 
analysoitava sopivilla tilastomenetelmillä (esim. probittianalyysi, liu ­
kuva keskiarvo, binomiaalinen todennäköisyys) (3) (4). Annos-vas ­
tekuvaajat tehdään kutakin suositeltua havainnointiajankohtaa (ts. 24, 
48 ja tarvittaessa 72 ja 96 tuntia) kohti, ja kuvaajien kulmakertoimet 
ja puolet tappava annos (LD
 50 ) lasketaan 95 prosentin luottamusvä ­
lillä. Kontrollikuolleisuudesta johtuvat korjaukset voitaisiin tehdä Abbottin korjauksella (4) (5). LD
 5() olisi ilmaistava mikrogrammoina 
testiainetta mehiläistä kohti.  
2.2 TESTISELOSTE  
Testiselosteessa on oltava seuraavat tiedot:  
2.2.1  Testiaine:  
— fysikaalinen olomuoto ja fysikokemialliset ominaisuudet (esim. 
stabiilisuus vedessä, höyrynpaine),  
— kemialliset tunnistetiedot, mukaan lukien rakennekaava ja puh ­
taus (ts. torjunta-aineille tunnistetiedot ja tehoaine(id)en pitoi ­
suus).  
2.2.2  Testilajit:  
— tieteellinen nimi, rotu, ikä suunnilleen (viikkoa), keräysmenetel ­
mä, keräyspäivä,  
— testimehiläisten keräykseen käytettyjä pesiä koskevat tiedot, mu ­
kaan lukien esim. mehiläisten terveydentila, mahdolliset täysikas ­
vuisten taudit, mahdolliset esikäsittelyt.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1191
 
2.2.3  Testiolosuhteet:  
— koetilojen lämpötila ja suhteellinen kosteus,  
— häkkien tyyppi, koko ja materiaali,  
— testiaineen antotapa, esim. käytetty kantaja-aine, aplikoidun tes ­
tiliuoksen tilavuus, käytetty anestesia-aine,  
— testin suunnittelu, esim. testiannokset ja niiden lukumäärä, kont ­
rollien lukumäärä sekä kutakin testiannosta ja kontrollia kohti 
rinnakkaisten häkkien määrä ja mehiläisten määrä häkkiä kohti,  
— testin päivämäärä.  
2.2.4  Tulokset:  
— mahdolliset raja-annostutkimuksen tulokset,  
— käsittelemättömät tulokset: kuolleisuus kullakin testipitoisuudella 
ja kullakin havainnointihetkellä,  
— annos-vastekuvaajat testin lopussa,  
— testiaineen ja kontrollin LD  50 -arvot 95 % prosentin luottamusvä ­
lein kullakin havainnointihetkellä,  
— LD  50 -arvon määrittämiseen käytetyt tilastomenetelmät,  
— kontrollien kuolleisuus,  
— muut havaitut tai mitatut biologiset vaikutukset ja mehiläisten 
mahdolliset epänormaalit vasteet,  
— mahdolliset poikkeamat tässä kuvatuista testimenettelyistä ja 
kaikki mahdollisesti tärkeät tiedot.  
3. VIITTEET  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products — Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151- 165. March 1993.
 
(2) Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees ( Apis mellifera  L.), 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research 22, pp. 119-125.
 
(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Ex ­
per. Ther., 96, pp. 99-113.  
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, Lon ­
don and New York.  
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 8, pp. 265-267.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1192
 
C.18  ADSORPTIO/DESORPTIO ERÄTASAPAINOMENETELMÄÄ 
KÄYTTÄEN  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä on toisinto OECD TG 106:sta, maa-aineksen 
adsorptio/desorptio-ominaisuuksien määrittämiseksi erätasapainome ­
netelmää käyttäen (2000).  
1.1 JOHDANTO  
Menetelmässä otetaan huomioon ”ring”-testi sekä maa-aineksen va ­
litsemista koskeva seminaari (1) (2) (3) (4) adsorptiotestin kehittä ­
miseksi samoin kuin kansallisella tasolla käytettävät ohjeet (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11).
 
Adsorptio- ja desorptiotutkimuksista saadaan hyödyllisiä tietoja ke ­
mikaalien kulkeutumisesta ja niiden jakautumisesta biosfäärin maa-, vesi- ja ilmakerroksiin (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21). Tietoja voidaan käyttää esimerkiksi sen ennustamiseksi tai ar ­
vioimiseksi, miten kemikaalit hajoavat (22) (23), muuntuvat tai jou ­
tuvat eliöihin (24), uuttuvat maalajien läpi (16) (18) (19) (21) (25) (26) (27) (28), haihtuvat maa-aineksesta (21) (29) (30) tai huuhtou ­
tuvat maan pintakerroksista luonnonvesiin (18) (31) (32). Adsorptio ­
tietoja voidaan käyttää vertailu- ja mallintamistarkoituksiin (19) (33) 
(34) (35).
 
Kemikaalin jakautuminen maa-ainekseen ja vesifaasiin on monimut ­
kainen prosessi, joka riippuu lukuisista eri tekijöistä: aineen kemial ­
lisesta luonteesta (12) (36) (37) (38) (39) (40), maa-aineksen omi ­
naisuuksista (4) (12) (13) (14) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49) sekä ilmastollisista tekijöistä kuten sateista, lämpötilasta, aurin ­
gosta ja tuulista. Näin ollen kemikaalin maa-aineksessa tapahtuvaan 
adsorptioprosessiin liittyviä moninaisia ilmiöitä ja mekanismeja ei voida täysin määritellä yksinkertaistetulla laboratoriomallilla, kuten tässä esitetyllä menetelmällä. Vaikka tällä menetelmällä ei ole mah ­
dollista kattaa kaikkia ympäristön kannalta mahdollisia tapauksia, se 
antaa kuitenkin riittävästi tietoa kemikaalin adsorboitumisesta ympä ­
ristön kannalta merkityksellisellä tavalla.
 
Katso myös yleinen johdanto.  
1.2 SOVELTAMISALA  
Menetelmän tarkoituksena on arvioida, miten kemikaalit adsorboitu ­
vat maa-ainekseen tai desorboituvat siitä. Tavoitteena on saada sorp ­
tioarvo, jota voidaan käyttää ennustamaan jakautumista erilaisissa 
ympäristöolosuhteissa; tätä varten määritetään tasapainotilan adsorp ­
tiokertoimet kemikaalille erilaisissa maa-aineksissa maa-aineksen ominaisuuksien (esimerkiksi orgaanisen hiilen pitoisuus, savipitoi ­
suus ja maaperän rakenne sekä pH) funktiona. On käytettävä erilaisia 
maalajeja, jotta tietyn aineen ja luonnossa esiintyvien maa-ainesten väliset vuorovaikutukset voidaan kattaa mahdollisimman laajasti.
 
Tässä menetelmässä adsorptio edustaa kemikaalin sitoutumista maa- 
ainesten pintakerroksiin; siinä ei erotella erilaisia adsorptioprosesseja (fysikaalinen ja kemiallinen adsorptio) eikä esim. pintakatalysoitua hajoamista, massa-adsorptiota tai kemiallista reaktiota. Adsorptiota, 
joka tapahtuu maa-aineksesta syntyviin kolloidipartikkeleihin (halkai ­
sija < 0,2 μm), ei ole otettu huomioon.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1193
 
Tärkeimpinä adsorptiokäyttäytymiseen vaikuttavina maa-ainekseen 
liittyvinä muuttujina pidetään orgaanisen hiilen pitoisuutta (3) (4) 
(12) (13) (14) (41) (4 3) (44) (45) (46) (47) (48); savipitoisuutta ja maaperän rakennetta (3) (4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) sekä ionisoituvien yhdisteiden pH:ta (3) (4) (42). Muut maa-ainek ­
seen liittyvät muuttujat, joilla saattaa olla vaikutusta tietyn aineen 
adsorptioon/desorptiooon ovat efektiivinen kationinvaihtokyky (ECEC), amorfisen raudan ja alumiinioksidien pitoisuus, erityisesti tulivuorialueiden ja trooppisten maa-ainesten (4) tapauksessa, samoin 
kuin ominaispinta-ala (49) ovat tärkeitä.
 
Testillä on tarkoitus arvioida kemikaalin adsorboitumista erityyppi ­
siin maalajeihin, joiden orgaanisen hiilen pitoisuus, savipitoisuus ja maaperän rakenne sekä pH vaihtelevat eri tavoin. Testi käsittää 
kolme tasoa:
 
Taso 1  : Alustava tutkimus, jolloin määritetään:  
— maa-aines/liuos-suhde,  
— adsorptiotasapainotilan saavuttamiseksi tarvittava aika ja 
adsorboituneen testiaineen määrä tasapainotilassa,  
— testiaineen adsorboituminen koeastioiden pintoihin sekä 
testiaineen stabiilius testijakson aikana.  
Taso 2  : Seulontatesti: adsorptiokinetiikka tutkitaan viidessä erilai ­
sessa maalajissa yhdellä pitoisuudella ja määritetään jakau ­
tumiskertoimet K  d ja K  OC . 
Taso 3  : Freundlichin adsorptioisotermien määritys, jotta voidaan 
määrittää pitoisuuden vaikutus maa-aineksiin tapahtuvan ad ­
sorption laajuuteen.  
Desorptiokinetiikka ja Freundlichin desorptioisotermit (li ­
säys 1).  
1.3 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Symboli Määritelmä Yksiköt  
A t i adsorboitumisprosentti ajanhetkellä t  i % 
A eq adsorboitumisprosentti adsorptiotasapainotilassa %  
m s ads ðt i Þ maa-ainekseen adsorboituneen testiaineen massa ajanhet ­
kellä t  i μg 
m s ads ðΔt i Þ maa-ainekseen adsorboituneen testiaineen massa aikavälillä 
Δt i μg 
m s ads ðeqÞ maa-ainekseen adsorboituneen testiaineen massa adsorp ­
tiotasapainossa μg 
m 0 testiaineen massa koeputkessa, adsorptiotestin alussa μg 
m m ads ðt i Þ testiaineen massa mitattuna  v a A määräosassa ajanhetkellä t  i μg 
m aq ads ðeqÞ aineen massa liuoksessa adsorptiotasapainotilassa μg 
m soil maa-ainesfaasin määrä, maa-aineksen kuiva-aineena il ­
maistuna g ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1194
 
Symboli Määritelmä Yksiköt  
C st aineen varastoliuoksen massakonsentraatio μg cm  -3 
C o maa-aineksen kanssa kosketuksiin joutuvan testiliuoksen 
massakonsentraatio alussa μg cm  -3 
C aq ads ðt i Þ aineen massakonsentraatio vesifaasissa analyysin suorituk ­
sen ajanhetkellä t  i μg cm  -3 
C s ads ðeqÞ maa-ainekseen adsorboituneen aineen konsentraatio ad ­
sorptiotasapainotilassa μg g -1 
C aq ads ðeqÞ aineen massakonsentraatio vesifaasissa adsorptiotasapaino ­
tilassa μg cm  -3 
V 0 adsorptiotestin aikana maa-aineksen kanssa kosketuksiin 
joutuvan vesifaasin alkutilavuus cm 3 
v a A määräosan tilavuus, jossa testiaine mitataan cm  3 
K d jakautumiskerroin adsorptiolle cm  3 g -1 
K oc orgaanisen hiilen suhteen normalisoitu adsorptiokerroin cm  3 g -1 
K om orgaanisen aineksen suhteen normalisoitu jakautumisker ­
roin cm 3 g 1 
K F ads Freundlichin adsorptiokerroin 
l/n Freundlichin eksponentti  
D t i desorboitumisprosentti ajanhetkellä t  1 % 
D Δt i desorboitumisprosentti aikavälillä Δt i % 
K des näennäinen desorptiokerroin cm  3 g -1 
K F des Freundlichin desorptiokerroin  
m aq des ðt i Þ maa-aineksesta desorboituneen testiaineen massa ajanhet ­
kellä t  1 μg 
m m des ðΔt i Þ maa-aineksesta desorboituneen testiaineen massa aikavä ­
lillä Δt i μg 
m m des ðeqÞ analyyttisesti määritetyn aineen massa vesifaasissa de ­
sorptiotasapainotilassa μg 
m aq des ðeqÞ desorboituneen testiaineen kokonaismassa desorptiotasa ­
painotilassa μg 
m s des ðΔt i Þ maa-ainekseen adsorboituneeksi jääneen aineen massa ai ­
kavälin Δt i jälkeen μg 
m aq A epätäydellisestä tilavuustäydennyksestä johtuen adsorptio ­
tasapainotilan ulkopuolelle jääneen aineen massa μg 
C s des ðeqÞ maa-ainekseen adsorboituneeksi jääneen testiaineen pitoi ­
suus desorptiotasapainotilassa μg g -1 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1195
 
Symboli Määritelmä Yksiköt  
C aq des ðeqÞ testiaineen massakonsentraatio vesifaasissa desorptiotasa ­
painotilassa μg cm  -3 
V T maa-aineksen kanssa kosketuksiin joutuvan vesifaasin ko ­
konaistilavuus sarjamenetelmällä suoritettavan desorptioki ­
netiikkakokeen aikana cm 3 
V R adsorptiotasapainotilan saavuttamisen jälkeen koeputkesta 
poistetun supernatantin tilavuus, joka korvataan samalla 
tilavuudella 0,01 M CaCl  2 -liuosta cm 3 
v a D koeputkesta (i) analyysitarkoituksiin otetun määräosan ti ­
lavuus sarjamenetelmällä suoritettavan desorptiokinetiik ­
kakokeen aikana cm 3 
V ra i D koeputkesta (i) testiaineen mittaamiseksi otetun liuoksen 
tilavuus desorptiokinetiikkakokeessa (rinnakkaismenetel ­
mä) cm 3 
V r F koeputkesta testiaineen mittaamiseksi otetun liuoksen tila ­
vuus desorptiotasapainotilassa cm 3 
MB massatase % 
m E maa-aineksesta ja koeastiaseinämistä kahdessa vaiheessa 
uutetun testiaineen kokonaismassa μg 
V rec adsorptiotasapainotilan saavuttamisen jälkeen talteen otetun 
supernatantin tilavuus cm 3 
P ow oktanol-vesijakautumiskerroin 
pKa hajoamisvakio 
S w vesiliukoisuus g'"  1 
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Tunnetut tilavuudet testiaineliuoksia, merkitsemättöminä tai radio ­
aktiivisesti merkittyinä, tunnettuina pitoisuuksina 0,01 M CaCl  2 :ssa 
lisätään kuivapainoltaan tunnettuihin maa-ainesnäytteisiin, jotka on 
esitasapainotettu 0,01 M CaCl  2 :ssa. Seosta ravistellaan riittävästi. 
Maa-ainessuspensiot sentrifugoidaan, suodatetaan haluttaessa ja vesi ­
faasi analysoidaan. Maa-ainesnäytteeseen adsorboituneen testiaineen 
määrä lasketaan liuoksessa alussa olleen testiaineen määrän ja ko ­
keen lopussa jäljellä olevan määrän välisenä erotuksena (epäsuora menetelmä).
 
Vaihtoehtoisesti adsorboituneen testiaineen määrä voidaan määrittää 
myös suoraan maa-ainesanalyysin avulla (suora menetelmä). Tätä 
menettelytapaa, johon kuuluu asteittainen maa-aineksen uutto sopi ­
valla liuottimella, suositellaan silloin, kun aineen liuoskonsentraatioe ­
roja ei voida täsmällisesti määrittää. Esimerkkejä tällaisista tapauk ­
sista ovat testiaineen adsorboituminen koeastioiden pintaan, testi ­
aineen epästabiilius kokeen aikana, heikko adsorptio, mikä aiheuttaa vain pienen konsentraatiomuutoksen liuoksessa, sekä voimakas ad ­
sorptio, mikä saa aikaan alhaisen konsentraation, jota ei voida täs ­
mällisesti määrittää, jos käytetään radioaktiivisesti merkittyä ainetta, 
maa-aineksen uutto voidaan välttää suorittamalla maa-ainesfaasin analyysi polttoa ja nestetuikelaskentaa käyttäen. Nestetuikelaskenta on kuitenkin epäspesifinen tekniikka, jolla ei voida erottaa lähtö ­
aineita ja muunnostuotteita; siksi sitä olisi käytettävä ainoastaan sil ­
loin, kun testikemikaali on stabiili koko tutkimuksen keston ajan.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1196
 
1.5 TESTIAINETTA KOSKEVAT TIEDOT  
Kemiallisten reagenssien on oltava analyysilaatua. Suositellaan mer ­
kitsemättömien, koostumukseltaan tunnettujen ja mieluiten puhtau ­
deltaan vähintään 95-prosenttisten testiaineiden käyttöä tai koostu ­
mukseltaan ja radio-isotooppipuhtaudeltaan tunnettujen radioaktii ­
visesti merkittyjen testiaineiden käyttöä. Jos merkkiaineiden puoliin ­
tumisajat ovat lyhyitä, on tehtävä hajoamiskorjauksia.  
Testiaineesta on oltava seuraavat tiedot ennen adsorptio-desorptiotes ­
tin suorittamista:  
a) vesiliukoisuus (A.6);  
b) höyrynpaine (A.4) ja/tai Henryn lain vakio;  
c) abioottinen hajoaminen: hydrolyysi pH:n funktiona (C.7);  
d) jakautumiskerroin (A.8);  
e) biologinen hajoavuus (C.4) tai aerobinen ja anaerobinen muuntu ­
minen maa-aineksessa;  
f) ionisoituvien aineiden pKa;  
g) suora fotolyysi vedessä (eli UV-Vis-absorptiospektri vedessä, 
kvanttisaanto) ja fotohajoaminen maa-aineksessa.  
1.6 TESTIN SOVELTUVUUS  
Testi soveltuu kemiallisille aineille, joille on olemassa analyysime ­
netelmä, jota voidaan soveltaa riittävällä tarkkuudella. Tärkeä muut ­
tuja, joka voi vaikuttaa tulosten luotettavuuteen, erityisesti epäsuoraa 
menetelmää käytettäessä, on testiaineen stabiilius testin aikana. Siksi 
edellytyksenä on tarkistaa stabiilius alustavassa tutkimuksessa; jos testin aikana havaitaan muuttumista, suositellaan, että varsinainen 
tutkimus suoritetaan analysoimalla sekä maa-aines- että vesifaasi.
 
Tätä testiä suoritettaessa ongelmia saattavat aiheuttaa testiaineet, joi ­
den vesiliukoisuus on alhainen (S  w < 10  -4 g l -1 ), tai paljon varauksia 
sisältävät aineet. Vaikeudet johtuvat siitä, että konsentraatiota vesi ­
faasissa ei voida tällöin mitata analyyttisesti riittävällä tarkkuudella. 
Näissä tapauksissa tarvitaan lisävaiheita. Ohjeita näiden ongelmien ratkaisemiseksi annetaan tätä menetelmää koskevissa kappaleissa.
 
Kun testataan haihtuvia aineita, on huolehdittava siitä, ettei käsittelyn 
aikana tapahdu häviöitä.  
1.7 MENETELMÄN KUVAUS  
1.7.1  Laitteet ja kemialliset reagenssit  
Standardi laboratoriolaitteisto, erityisesti seuraavat:  
a) Koeputket tai astiat kokeiden suorittamiseksi. On tärkeää, että 
nämä koeputket tai astiat  
— sopivat suoraan sentrifugiin aineiden käsittelystä ja siirtämi ­
sestä johtuvien virheiden minimoimiseksi,  
— ovat inertistä materiaalista, mikä minimoi testiaineen adsor ­
boitumisen niiden pinnalle.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1197
 
b) Ravistelulaite: kääntelevä ravistelija tai vastaava laitteisto; raviste ­
lulaitteen on pidettävä maa-aines suspensiona sekoituksen aikana.  
c) Sentrifugi: mieluiten suurinopeuksinen, esimerkiksi keskipako ­
voima > 3 000 g, lämpötilaltaan säädettävä, pystyy erottelemaan halkaisijaltaan yli 0,2 μm olevat partikkelit vesiliuoksesta. Säiliöt 
on pidettävä suljettuina ravistelun ja sentrifugoinnin aikana haih ­
tuvuus- ja vesihäviöiden välttämiseksi. Korkkeihin kohdistuvan adsorboitumisen minimoimiseksi on käytettävä deaktivoituja korkkeja, kuten teflonpäällysteisiä kierrekorkkeja.
 
d) Valinnainen: suodatuslaite; huokoisuudeltaan 0,2 μm:n steriilit 
kertakäyttösuodattimet. Suodatinmateriaalin valintaan on kiinni ­
tettävä erityistä huomiota, jotta testiaine ci tartu siihen; orgaanista 
suodatinmateriaalia ei suositella niukkaliukoisille testiaineille.  
e) Analyysivälineet, jotka soveltuvat testikemikaalin konsentraation 
mittaamiseen.  
f) Laboratoriouuni, joka voidaan pitää lämpötilassa 103-110  o C. 
1.7.2  Maa-ainesten luonnehdinta ja valinta  
Maa-aineksista on määritettävä kolme ominaisuutta, joiden katsotaan 
pääasiassa vaikuttavan adsorptiokykyyn. Nämä ovat orgaaninen hiili, 
savipitoisuus ja maaperän rakenne sekä pH. Kuten jo mainittiin 
(katso soveltamisala}, muutkin maa-aineksen fysikaalis-kemialliset ominaisuudet voivat vaikuttaa tietyn aineen adsorptioon ja desorpti ­
oon, ja ne täytyy ottaa huomioon kyseisissä tapauksissa.
 
Maa-aineksen luonnehdinnassa käytettävät menetelmät ovat hyvin 
tärkeitä, ja niillä voi olla merkittävä vaikutus tuloksiin. Siksi suosi ­
tellaan, että maa-aineksen pH mitataan 0,01 M CaCl  2 -liuoksessa 
(liuos, jota käytetään adsorptio/desorptiotestissä) ISO-menetelmän 
10390-1 mukaisesti). Myös muita tärkeitä maa-aineksen ominaisuuk ­
sia suositellaan määritettäväksi standardimenetelmien mukaisesti (ISO Handbook of soil analysis). Tällöin sorptiotietojen analysointi 
voi perustua yleisesti standardoituihin maa-ainesta koskeviin muut ­
tujiin. Joitakin käytössä olevien maa-aineksen analysointia ja luon ­
nehdintaa koskevien standardimenetelmien ohjeita löytyy lähteistä 50-52. Maa-aineksen testimenetelmien kalibrointiin suositellaan ver ­
tailumaa-ainesten käyttöä.
 
Ohjeita maa-ainesten valitsemiseksi adsorptio/desorptiokokeisiin an ­
netaan taulukossa 1. Seitsemän valittua maa-ainesta kattaa lauhkeilla 
maantieteellisillä alueilla esiintyvät maalajit. Ionisoituvien testiainei ­
den ollessa kyseessä valittujen maa-ainesten olisi katettava laaja pH- alue, jotta aineen adsorboituminen ionisoituneessa ja ionisoitumatto ­
massa muodossa voidaan arvioida. Ohjeita siitä, kuinka montaa eri ­
laista maa-ainesta käytetään testin eri vaiheissa, annetaan 1.9 koh ­
dassa ”Testin suorittaminen”.
 
Jos muita maalajeja pidetään edellä mainittuja soveltuvampina, niistä 
on määritettävä samat muuttujat ja niillä on oltava erilaisia ominai ­
suuksia samalla tavoin kuin taulukossa 1 on esitetty, vaikka ne eivät 
täyttäisikään täsmälleen perusteita.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1198
 
Taulukko 1  
Ohjeet maa-ainesnäytteiden valitsemiseksi adsorptio-desorptiokokeisiin  
Maalaji pH-alue (0,01 M 
CaCl  2 :ssa) Orgaanisen hiilen pi ­
toisuus ( %) Savipitoisuus ( %) Maaperän rakenne (  1 ) 
1 4,5 - 5,5 1,0 - 2,0 65-80 savi 
2 > 7,5 3,5 - 5,0 20-40 hiuesavi 
3 5,5 - 7,0 1,5 - 3,0 15-25 hiesusavi 4 4,0 - 5,5 3,0 - 4,0 15-30 savikko 5 < 4,0 - 6,0 (
 2 ) < 0,5 - 1,5 (  2 ) ( 3 ) < 10-15 (  2 ) savinen hiekka 
6 > 7,0 < 0,5 - 1,0 (  2 ) ( 3 ) 40-65 hiuesavi/savi 
7 < 4,5 > 10 < 10 hiekka / savinen 
hiekka  
( 1 ) FAO- ja US-järjestelmän mukaisesti (85). 
( 2 ) Vastaavien muuttuja-arvojen olisi mieluiten oltava annetulla alueella. Jos sopivan maa-ainesmateriaalin löytämisessä 
kuitenkin ilmenee vaikeuksia, annettujen vähimmäisarvojen alapuolelle jäävät arvot hyväksytään. 
( 3 ) Maa-ainekset, joiden orgaanisen hiilen pitoisuus on alle 0,3 %, voivat häiritä orgaanisen aineen pitoisuuden ja 
adsorption välistä korrelaatiota. Siksi suositellaan käytettäväksi maa-aineksia, joiden orgaanisen hiilen vähimmäispi ­
toisuus on 0,3 %.  
1.7.3  Maa-ainesnäytteiden kerääminen ja säilytys  
1.7.3.1  Kerääminen  
Mitään erityistä näytteenottotekniikkaa tai -välineitä ei suositella; 
näytteenottotekniikka määräytyy tutkimuksen tarkoituksen mukaisesti (53) (54) (55) (56) (57) (58).
 
Seuraavat seikat on otettava huomioon:  
a) yksityiskohtaiset tiedot kenttäalueen sijainnista, kasvillisuudesta ja 
aiemmasta käytöstä (torjunta-aine- ja/tai lannoitekäsittelyt, biolo ­
giset lisäykset) tai tahattomasta kontaminaatiosta ovat välttämät ­
tömät. Maa-ainesten näytteenotossa olisi noudatettava näytteen ­
ottopaikan kuvausta koskevia ISO-standardin 10381-6 suosituk ­
sia; 
b) näytteenottopaikka on määriteltävä UTM:n (Universal Transversal 
Mercator –projektio / European Horizontal Datum) mukaisesti tai maantieteellisten koordinaattien mukaisesti; näin tietyn maa-ai ­
neksen uudelleen kerääminen myöhemmin on mahdollista tai 
tästä voi olla apua määriteltäessä maa-aineksia eri maissa käytet ­
tyjen erilaisten luokitusjärjestelmien mukaisesti. Lisäksi A-kerrok ­
sesta olisi kerättävä ainoastaan enintään 20 cm:n syvyydeltä. Eri ­
tyisesti maalajista nro 7 on otettava näyte O
 h -kerroksesta, jos sitä 
esiintyy maa-aineksen osana.  
Maa-ainesnäytteet on kuljetettava sellaisissa säiliöissä ja lämpöolo ­
suhteissa, jotka takaavat, etteivät alkuperäiset maa-aineksen ominai ­
suudet muutu merkittävästi.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1199
 
1.7.3.2  Säilytys  
Käytetään mieluiten tuoreita kentältä otettuja maa-aineksia. Ainoas ­
taan silloin, kun tämä ei ole mahdollista, maa-aines säilytetään huo ­
neenlämpötilassa ja pidetään ilmakuivana. Mitään takarajaa säilytyk ­
selle ei suositella, mutta maa-ainekset, joita on säilytetty yli kolme 
vuotta, on analysoitava uudelleen ennen käyttöä niiden orgaanisen hiilen pitoisuuden, pH:n ja kationinvaihtokyvyn (CEC) osalta.
 
1.7.3.3  Maa-ainesnäytteiden käsittely ja valmistelu testiä varten  
Maa-ainekset ilmakuivataan huoneenlämpötilassa (mieluiten lämpöti ­
lassa 20-25  o C). Kokonaisuuden pilkkominen on suoritettava mah ­
dollisimman varovasti, jotta maaperän alkuperäinen rakenne muut ­
tuisi mahdollisimman vähän. Maa-ainekset seulotaan partikkeliko ­
koon < 2 mm; seulonnassa noudatetaan maa-ainesten näytteenottoa koskevia ISO-standardin suosituksia (ISO 10381-6). Huolellista ho ­
mogenointia suositellaan sen vuoksi, että se parantaa tulosten uusit ­
tavuutta. Kunkin maa-aineksen kosteuspitoisuus määritetään kol ­
mesta määräosasta kuumentamalla lämpötilassa 105
 o C, kunnes pai ­
nonmuutos ei ole merkittävä (noin 12 h). Kaikissa laskelmissa maa- 
aineksen massalla tarkoitetaan uunikuivaa massaa eli maa-aineksen 
kosteuspitoisuuskorjattua painoa.  
1.7.4  Testiaineen valmistus maa-ainekseen lisättäväksi  
Testiaine liuotetaan tislattuun tai deionisoituun veteen valmistettuun 
0,01 M CaCl  2 -liuokseen; CaCl  2 -liuosta käytetään vesipitoisena liuo ­
tinfaasina parantamaan sentrifugointia ja minimoimaan kationinvaih ­
toa. Varastoliuoksen konsentraation on mieluiten oltava suuruusluo ­
kaltaan tuhatkertainen käytetyn analyysimenetelmän herkkyyteen 
verrattuna. Tällöin tällä menetelmällä saadaan tarkkoja mittauksia; lisäksi varastoliuoskonsentraation on oltava testiaineen vesiliukoi ­
suusrajaa pienempi.
 
Varastoliuos valmistetaan mieluiten juuri ennen sen lisäämistä maa- 
ainesnäytteisiin, ja se säilytetään suljettuna pimeässä 4  o C:n lämpö ­
tilassa. Säilytysaika riippuu testiaineen stabiiliudesta ja sen konsent ­
raatiosta liuoksessa.  
Ainoastaan niukkaliukoisille aineille (S  w < 10  -4 g l -1 ) saatetaan 
tarvita soveltuvaa liuottavaa ainetta silloin, kun testiaineen liuottami ­
nen on vaikeaa. Tämän liuottavan aineen on sekoituttava veteen 
(esim. metanoli tai asetonitriili); sen konsentraatio ei saa ylittää 
yhtä prosenttia varastoliuoksen kokonaistilavuudesta ja sitä saa olla enintään tämän verran testiaineliuoksessa, joka joutuu kosketuksiin maa-aineksen kanssa (mieluiten alle 0,1 %). Se ei myöskään saa olla 
pinta-aktiivinen aine eikä se saa osallistua solvataatioreaktioihin tes ­
tikemikaalin kanssa. Liuottavan aineen käytöstä on määrättävä ja sen käyttö on perusteltava tuloksia raportoitaessa.
 
Toisena vaihtoehtona on lisätä niukkaliukoinen testiaine koejärjestel ­
mään siten, että testiaine liuotetaan orgaaniseen liuottimeen, ja mää ­
räosa tästä lisätään järjestelmään, jossa on maa-ainesta ja tislattuun 
tai deionisoituun veteen valmistettua 0,01 M CaCl  2 -liuosta. Orgaa ­
nisen liuottimen pitoisuus vesifaasissa on pidettävä mahdollisimman alhaisena, tavallisesti alle 0,1 prosentin. Testiaineen lisäys orgaa ­
nisessa liuoksessa voi vaikuttaa virheellisesti tilavuusmäärän toistet ­
tavuuteen. Näin ollen lisävirhe on mahdollinen, kun testiaineen ja 
lisäliuottimen konsentraatiot eivät ole samat kaikissa testeissä.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1200
 
1.8 EDELLYTYKSET ADSORPTIO-DESORPTIOTESTIN SUORIT ­
TAMISELLE  
1.8.1  Analyysimenetelmä  
Tärkeimmät tekijät, jotka voivat vaikuttaa sorptiomittausten tarkkuu ­
teen, ovat sekä liuos- että adsorptiofaasien analyyseissä käytettävän 
analyyttisen menetelmän tarkkuus, testiaineen stabiilius ja puhtaus, sorptiotasapainotilan saavuttamisaste, liuoskonsentraatiomuutoksen suuruus, maa-aines/liuos-suhde sekä muutokset maa-aineksen raken ­
teessa tasapainoprosessin aikana (35) (59-62). Lisäyksessä 2 esitetään 
joitakin esimerkkejä tarkkuutta koskevista kysymyksistä.
 
Käytetyn analyysimenetelmän luotettavuus on tarkistettava sillä kon ­
sentraatioalueella, joka todennäköisesti esiintyy testin aikana. Kokeen 
suorittaja voi vapaasti kehittää soveltuvan menetelmän, jonka tark ­
kuus, täsmällisyys, uusittavuus, herkkyys ja saanto ovat tarkoituksen ­
mukaisia. Ohjeita tällaisen testin suorittamiseksi saadaan jäljempänä 
esitettävästä kokeesta.  
Sopivaa määrää 0,01 M CaCl  2 -liuosta, esimerkiksi 100 cm  3 , ravis­
tellaan 4 tunnin ajan yhdessä maa-ainesmäärän kanssa, esimerkiksi 20 g, jonka adsorptiokyky on hyvä, eli jonka orgaanisen hiilen pitoi ­
suus ja savipitoisuus on korkea; nämä painot ja tilavuudet voivat 
vaihdella analyysitarpeiden mukaisesti. Sopivana lähtökohtana voi ­
daan pitää maa-aines/liuos-suhdetta 1:5. Seos sentrifugoidaan ja ve ­
sifaasi voidaan suodattaa. Vesifaasiin lisätään tietty tilavuusmäärä 
testiaineen varastoliuosta, jotta saadaan nimellinen konsentraatio sille 
konsentraatioalueelle, joka todennäköisesti esiintyy testin aikana. Tämä tilavuusmäärä ei saa ylittää 10:tä prosenttia vesifaasin loppu ­
tilavuudesta — tällöin se muuttaa esitasapainotusliuoksen ominai ­
suuksia mahdollisimman vähän. Liuos analysoidaan.
 
Testaukseen on sisällytettävä yksi nollakoe, jossa on vain maa-aines 
ja CaCl  2 -liuos (ilman testiainetta), jotta voidaan tarkistaa, johtuuko 
analyysimenetelmästä artefaktoja ja maa-aineksesta matriisivaikutuk ­
sia. 
Analyysimenetelmät, joita voidaan käyttää sorptiomittauksiin, käsit ­
tävät kaasu-nestekromatografian (GLC), korkean suorituskyvyn nes ­
tekromatografian (HPLC), spektrofotometrian (esimerkiksi GC-mas ­
saspektrometria, HPLC-massaspektrometria) ja nestetuikelaskennan (vain radioaktiivisesti merkityille aineille). Käytetystä analyysimene ­
telmästä riippumatta pidetään sopivana, että saannot ovat 90-110 
prosenttia nimellisarvosta. Jotta kromatografisen erotuksen jälkeen 
voidaan tulos detektoida ja arvioida, analyyttisen menetelmän herk ­
kyyden olisi oltava suuruusluokaltaan nimelliskonsentraatiota vähin ­
tään kaksi kertaluokkaa pienempi.
 
Adsorptiotutkimuksiin käytettävän analyysimenetelmän ominaisuudet 
ja herkkyys ovat tärkeitä tekijöitä määriteltäessä koeolosuhteita ja testin koko suorituskykyä. Tässä menetelmässä noudatetaan yleisiä koekäytäntöjä ja annetaan suosituksia ja ohjeita vaihtoehtoisille rat ­
kaisuille, jos analyysimenetelmä tai laboratoriomahdollisuudet asetta ­
vat rajoituksia.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1201
 
1.8.2  Optimaalisten maa-aines/liuos-suhteiden valinta  
Sopivien maa-aines/liuos-suhteiden valinta sorptiotutkimuksiin riip ­
puu jakautumiskertoimesta K  d ja halutusta suhteellisesta adsorboitu ­
misasteesta. Aineen konsentraationmuutos liuoksessa taas vaikuttaa 
adsorptioyhtälöön perustuvan mittauksen tilastolliseen tarkkuuteen ja on osoitus analyyttisen menetelmän herkkyydestä. Siksi käytännössä on hyödyllistä valita muutama kiinteä suhde, joilla adsorboitumisp ­
rosentti on yli 20 prosenttia ja mieluiten > 50 prosenttia (62); 
samalla on huolehdittava siitä, että testiaineen konsentraatio vesifaa ­
sissa on riittävän korkea tarkan mittauksen mahdollistamiseksi. 
Tämä on erityisen tärkeää silloin, kun adsorboitumisprosentit ovat 
suuria.
 
Sopiva lähestymistapa soveltuvien maa-aines/vesi-suhteiden valitsemi ­
seksi perustuu joko alustavissa tutkimuksissa tai hyväksytyin arvioin ­
titekniikoin (lisäys 3) arvioituun K  d -arvoon. Soveltuvan suhteen va ­
linta voidaan tehdä sitten K  d :n funktiona esitetyn maa-aines/liuos-suh ­
dediagrammin pohjalta määrätyille adsorboitumisprosenteille (kuva 1). 
Esityksessä oletetaan, että adsorptioyhtälö on lineaarinen (  1 ). Sopiva 
suhde saadaan järjestämällä K  d :n yhtälö (4) yhtälön (1) muotoon:  
V 0 
m soil ¼ Í 
m 0 
m s ads ðeqÞ Ä 1 Î 
K d (1) 
tai sen logaritmiseen muotoon olettaen että R = m  soil /V 0 ja 
A eq % / 100 =  m s ads ðeqÞ 
m 0 
logR ¼ ÄlogK  d þ log " 
ðA eq %=100Þ 
ð1 Ä A eq %=100Þ # (2)
 
Kuva 1 : Maa-aines-liuos-suhteiden ja K  d :n välinen yhteys testiaineen 
erilaisilla adsorboitumisprosenteilla.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1202  
( 1 ) C s ads ðeqÞ ¼ K  d · C aq ads ðeqÞ:
 Kuvassa 1 esitetään tarvittavat maa-aines/liuos-suhteet K  d :n funk­
tiona eri adsorboitumisasteille. Esimerkiksi maa-aines/liuos-suhteen 
ollessa 1:5 ja K  d :n ollessa 20 adsorboituminen on 80 prosentin luok ­
kaa. Jotta saavutettaisiin 50 prosentin adsorboituminen samalla K  d - 
arvolla, on käytettävä suhdetta 1:25. Tällainen lähestymistapa sopi ­
van maa-aines/liuos-suhteiden valitsemisessa antaa tutkijalle jousta ­
vuutta.  
Vaikeammin käsiteltäviä tapauksia ovat ne, joissa kemikaali on voi ­
makkaasti tai hyvin heikosti adsorboitunut. Silloin kun adsorboitu ­
minen on heikkoa, suositellaan maa-aines/liuos-suhteeksi 1:1, vaik ­
kakin eräille hyvin orgaanisille maalajeille saatetaan tarvita pienem ­
piä suhteita lietteen saamiseksi. Pienten liuoskonsentraatiomuutosten 
mittaamiseksi käytettävien analyysimenetelmien kanssa on oltava huolellinen: muutoin adsorptiomittaukset ovat epätarkkoja. Toisaalta K
 d -jakautumiskertoimien ollessa hyvin suuria saatetaan maa-aines/ ­
liuos-suhteissa mennä jopa suhteisiin 1:100, jotta liuokseen jäisi mer ­
kittävä määrä kemikaalia. Huolellisuutta on kuitenkin noudatettava hyvän sekoituksen varmistamiseksi ja systeemin tasapainottumiseen on jätettävä riittävästi aikaa. Vaihtoehtoisena lähestymistapana on 
ennustaa K
 d -arvo arviointitekniikkoja käyttäen, esimerkiksi P  ow -ar­
voihin (lisäys 3) perustuvaa tekniikkaa käyttäen. Tämä voi olla hyö ­
dyllistä erityisesti heikosti adsorboituville/polaarisille kemikaaleille, joiden P
 ow < 20, ja lipofiilisille tai helposti sorboituville kemikaa ­
leille, joiden P  ow > 10  4 . 
1.9 TESTIN SUORITTAMINEN  
1.9.1  Koeolosuhteet  
Kaikki kokeet suoritetaan huoneenlämpötilassa ja vakiolämpötilassa 
20-25  o C, jos mahdollista.  
Sentrifugoinnilla olisi voitava erottaa liuoksesta yli 0,2 μm:n kokoi ­
set partikkelit. Tätä pidetään kiintoainepartikkelin ja kolloidipartik ­
kelin raja-arvona. Ohjeita sentrifugointiolosuhteiden määrittelemi ­
seksi annetaan lisäyksessä 4.  
Jos sentrifugoinnilla ei voida poistaa yli 0,2 μm:n kokoisia partikke ­
leita, voidaan käyttää sentrifugoinnin ja yli 0,2 μm:n suodattimilla 
suoritettavan suodatuksen yhdistelmää. Näiden suodattimien on ol ­
tava sopivaa inerttiä materiaalia, jotta niiden pinnalle takertumisesta 
aiheutuvat testiaineen häviöt voitaisiin välttää. Joka tapauksessa on osoitettava, ettei suodatuksen aikana tapahdu testiainehäviöitä.
 
1.9.2  Taso 1 — Alustava tutkimus  
Alustavan tutkimuksen tarkoitus on selvitetty jo kohdassa ”Sovelta ­
misala”. Ohjeita kyseisen tutkimuksen toteuttamiseksi annetaan jäl ­
jempänä esitettävässä kokeessa.  
1.9.2.1  Optimaalisten maa-aines/liuos-suhteiden valitseminen  
Käytetään kahta maalajia ja kolmea maa-aines/liuos-suhdetta (kuusi 
koetta). Toisessa maalajissa orgaanisen hiilen pitoisuus on korkea ja 
savipitoisuus matala, ja toisessa maalajissa orgaanisen hiilen pitoi ­
suus on matala ja savipitoisuus korkea. Suositellaan seuraavia suh ­
teita:  
— 50 g maa-ainesta ja 50 cm  3 testiaineen vesiliuosta (suhde 1/1),  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1203
 
— 10 g maa-ainesta ja 50 cm  3 testiaineen vesiliuosta (suhde 1/5),  
— 2 g maa-ainesta ja 50 cm  3 testiaineen vesiliuosta (suhde 1/25).  
Vähimmäismäärä maa-ainesta, jolla koe voidaan suorittaa, riippuu 
laboratoriomahdollisuuksista ja käytettyjen analyysimenetelmien suo ­
rituskyvystä. Käytettäväksi suositellaan kuitenkin vähintään l:tä grammaa ja mieluiten 2:ta grammaa maa-ainesta luotettavien testitu ­
losten saamiseksi.
 
Yhdelle vertailunäytteelle. jossa on ainoastaan testiainetta 0,01 M 
CaCl  2 -liuoksessa (ei maa-ainesta), suoritetaan täsmälleen samat toi ­
menpiteet kuin testisysteemeille, jotta testiaineen stabiilius CaCl  2 - 
liuoksessa ja sen mahdollinen adsorboituminen koeastioiden pinnalle voidaan tarkistaa.
 
Nollakokeella, jossa on sama määrä maa-ainesta ja liuoksen koko ­
naistilavuus 50 cm  3 0,01 M CaCl  2 -liuosta (ilman testiainetta), suori ­
tetaan samat testaustoimenpiteet kutakin maa-ainesta kohden. Tämä toimii taustavertailuna analyysin aikana häiritsevien aineiden tai kon ­
taminoituneiden maa-ainesten havaitsemiseksi.
 
Kaikki kokeet, vertailu- ja nollakokeet mukaan lukien, suoritetaan 
vähintään rinnakkaisnäytteillä. Tutkimusta varten valmistettavien 
näytteiden kokonaismäärä voidaan laskea käytettävän menetelmän mukaisesti.
 
Alustava tutkimus ja varsinainen tutkimus tehdään yleisesti ottaen 
samoilla menetelmillä. Poikkeuksista mainitaan tarvittaessa.  
Ilmakuivatut maa-ainesnäytteet saatetaan tasapainoon ravistelemalla 
niitä vähintään 45 cm  3 :n kanssa 0,01 M CaCl  2 -liuosta yön yli (12 h) 
ennen koepäivää. Myöhemmin lisätään tietty tilavuusmäärä testi ­
aineen varastoliuosta, jotta lopputilavuudeksi saadaan 50 cm  3 . Tämän 
lisättävän varastoliuoksen tilavuus ei saa ylittää 10:tä prosenttia ve ­
sifaasin lopputilavuudesta (50 cm  3 ), jotta esitasapainotusliuoksen 
ominaisuudet muuttuisivat mahdollisimman vähän, ja sen olisi mie ­
luiten oltava sellainen, että maa-aineksen kanssa kosketuksiin joutu ­
van testiaineen alkukonsentraatio C  0 on suuruusluokaltaan vähintään 
satakertainen analyysimenetelmän herkkyyteen verrattuna; tällainen konsentraatio takaa tarkkojen mittausten suorittamisen myös silloin, kun adsorptio on voimakas (> 90 %) ja sen, että adsorptioisotermit 
voidaan myöhemmin määrittää. Suositellaan myös, jos mahdollista, 
ettei aineen alkukonsentraatio (C
 0 ) ylittäisi puolta siitä, mikä on sen 
liukoisuusraja.  
Jäljempänä esitetään esimerkki siitä, kuinka varastoliuoksen konsent ­
raatio (C  st ) lasketaan. Oletetaan, että toteamisraja on 0,01 μg cm  -3 ja 
adsorptio 90 prosenttia; tällöin maa-aineksen kanssa kosketuksiin 
joutuvan testiaineen alkukonsentraation olisi mieluiten oltava 1 μg cm
 -3 (suuruusluokaltaan satakertainen toteamisrajaan verrattuna). 
Oletetaan, että varastoliuosta lisätään suositeltu enimmäismäärä eli 
5 cm  3 45 cm  3 :iin 0,01 M CaCl  2 -tasapainoliuosta (= varastoliuos 
10 % vesifaasin 50 cm  3 :n kokonaistilavuudesta), jolloin varastoliu ­
oksen konsentraation on oltava 10 μg cm  -3 ; tämä on suuruusluokal ­
taan tuhatkertainen analyysimenetelmän toteamisrajaan verrattuna.  
Vesifaasin pH on mitattava ennen ja jälkeen maa-aineksen kanssa 
kosketuksiin joutumista, koska tällä on tärkeä merkitys koko adsorp ­
tioprosessissa, erityisesti ionisoituvien aineiden ollessa kyseessä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1204
 
Seosta ravistellaan, kunnes adsorptiotasapainotila on saavutettu. Aika 
tasapainotilan saavuttamiseksi maa-aineksissa vaihtelee suuresti ke ­
mikaalin ja maa-aineksen mukaisesti; 24 tunnin jakso on yleensä riittävä (77). Alustavassa tutkimuksessa näytteitä voidaan kerätä jär ­
jestyksessä 48 tunnin sekoitusjakson aikana (esimerkiksi 4, 8, 24, 48 
tunnin kohdalla). Analyysiajat on kuitenkin sovitettava joustavasti 
laboratorion työaikataluluun.
 
Testiaineen vesiliuoksen analysoimiseksi on kaksi vaihtoehtoa: a) 
rinnakkaismenetelmä ja b) sarjamenetelmä. On korostettava sitä, että vaikka rinnakkaismenetelmä vie kokeellisesti enemmän aikaa, tulosten matemaattinen käsittely on yksinkertaisempaa (liite 5). Käy ­
tettävän menetelmän valitsee kuitenkin kokeen suorittaja, jonka on 
otettava huomioon käytettävissä olevat mahdollisuudet ja resurssit laboratoriossa.
 
a) Rinnakkaismenetelmä: valmistetaan samalla maa-aines/liuos-suh ­
teella niin monta näytettä kuin adsorptiokinetiikan tutkimiseksi 
halutaan näytteenottohetkiä. Sentrifugoinnin ja mahdollisen suo ­
datuksen jälkeen ensimmäisen koeputken vesifaasi otetaan talteen mahdollisimman tarkasti ja mitataan esimerkiksi 4 tunnin jälkeen, vastaavasti toiselle koeputkelle 8 tunnin, kolmannelle koeputkelle 
24 tunnin jälkeen ja niin edelleen.
 
b) Sarjamenetelmä: kullekin maa-aines/liuos-suhteelle valmistetaan 
ainoastaan yksi kaksoisnäyte. Tietyin aikavälein seos sentrifugoi ­
daan faasien erottamiseksi. Vesifaasista otetaan pieni määräosa, josta testiaine analysoidaan välittömästi: koe jatkuu sitten alkupe ­
räisellä seoksella. Jos käytetään suodatusta sentrifugoinnin jäl ­
keen, laboratoriossa olisi oltava mahdollisuudet pienten vesipi ­
toisten määräosien suodatuskäsittelyyn. Suositellaan, että otettujen määräosien kokonaismäärä ei ylitä yhtä prosenttia liuoksen koko ­
naistilavuudesta. Tämä siksi, ettei maa-aines/liuos-suhde muut ­
tuisi merkittävästi ja ettei testin aikana adsorboituvissa olevan liukoisen massan määrä myöskään vähenisi.
 
Adsorboitumisprosentti, lasketaan kullakin ajanhetkellä ( A t i ) nimel­
lisen alkukonsentraation pohjalta ja näytteenottohetkellä ( A t i ) mitattu 
konsentraatio korjataan nollakoearvon perusteella. Ajan funktiona 
esitettäviä käyriä (kuva 1, liite 5) käytetään tasapainotilan saavutta ­
misen arvioimiseksi (  1 ). Lasketaan myös K  d -arvo tasapainotilassa. 
Tämän K  d -arvon pohjalta valitaan kuvasta 1 sopivat maa-aines/ ­
liuos-suhteet siten, että adsorboitumisprosentti on yli 20 prosenttia, 
mieluiten > 50 prosenttia (61). Kaikki diagrammeissa käytettävät yhtälöt ja periaatteet esitetään kohdassa ”Tulokset ja niiden rapor ­
tointi” sekä lisäyksessä 5.
 
1.9.2.2  Adsorptiotasapainotilan saavuttamisajan määrittäminen ja adsorboi ­
tuneen testiaineen määrittäminen tasapainotilassa  
Kuten jo mainittiin, ajan funktiona esitettävien  A t i tai C aq ads -käyrien 
avulla on mahdollista arvioida adsorptiotasapainotilan saavuttamista 
ja adsorboituneen testiaineen määrää tasapainotilassa. Lisäyksessä 5 esitetyissä kuvissa 1 ja 2 on esimerkkejä tällaisista käyristä. Tasa ­
painottumisaika on se aika, jonka systeemi tarvitsee tasapainon saa ­
vuttamiseen.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1205  
( 1 ) Vesifaasissa olevan testiaineen konsentraatiota  C aq ads ajan funktiona kuvaavia diagram ­
meja voidaan käyttää myös tasapainotilan saavuttamisen arviointiin (katso kuva 2 lisä ­
yksessä 5).
 Jos jotain tiettyä maa-ainesta tutkittaessa tasapainotilaa ei saavuteta, 
vaan konsentraatio nousee jatkuvasti, tämä voi johtua sekoittavista 
tekijöistä kuten biohajoamisesta tai hitaasta diffuusiosta. Biohajoami ­
nen voidaan osoittaa toistamalla koe steriloitua maa-ainesnäytettä käyttäen. Jos tasapainotilaa ei tällöinkään saavuteta, kokeen suoritta ­
jan on etsittävä muita ilmiöitä, jotka saattaisivat liittyä kyseisiin tut ­
kimuksiin: tämä voidaan tehdä muuntelemalla koeolosuhteita sopi ­
vasti (lämpötila, ravisteluajat, maa-aines/liuos-suhteet). Kokeen suo ­
rittajan päätettävissä on, jatkaako hän testin suoritusta, vaikka tasa ­
painotila saattaa jäädä saavuttamatta.
 
1.9.2.3  Adsorptio koeastian pintaan ja testiaineen stabiilius  
Joitakin tietoja testiaineen adsorboitumisesta koeastioiden pintaan 
samoin kuin sen stabiiliudesta voidaan johtaa vertailunäytteiden ana ­
lysoinnista. Jos havaitaan konsentraation pienenevän enemmän kuin 
analyysimenetelmän keskivirhe, kyseessä saattaa olla abioottinen ha ­
joaminen ja/tai adsorptio koeastian pintaan. Nämä ilmiöt voidaan 
erottaa toisistaan siten, että astian seinämät huuhdellaan huolellisesti 
tunnetulla määrällä sopivaa liuotinta ja analysoidaan pesuliuos testi ­
aineen osalta. Jos adsorptiota koeastioiden pintaan ei havaita, vähen ­
nys osoittaa testiaineen abioottista epästabiiliutta. Jos adsorboitumista 
havaitaan, koeastiamateriaali on vaihdettava. Tästä kokeesta saatuja 
tietoja koeastioiden pintaan tapahtuvasta adsorboitumisesta ei voida kuitenkaan ekstrapoloida suoraan maa-aines/liuos-kokeeseen. Maa-ai ­
neksen läsnäolo vaikuttaa tähän adsorboitumiseen.
 
Lisätietoja testiaineen stabiiliudesta voidaan johtaa määrittämällä ko ­
konaismassatase kokeen aikana. Tämä tarkoittaa sitä, että testiaine 
määritetään vesifaasista, maa-ainesuutteista ja koeastian seinämistä. 
Lisätyn testikemikaalin massan ja vesifaasissa olevien testikemikaa ­
limassojen ja maa-aineksesta sekä koeastiaseinämistä saatujen uuttei ­
den summan välinen ero on yhtä kuin hajonnut ja/tai haihtunut ja/tai 
uuttumaton massa. Massataseen määrittämiseksi adsorptiotasapaino ­
tila on saavutettava koejakson aikana.  
Massatase määritetään sekä maa-aineksesta että yhdestä sellaisesta 
maa-aines/liuos-suhteesta maa-ainesta kohden, josta vähenee yli 20 prosenttia ja mieluiten > 50 prosenttia tasapainotilassa. Kun suhteen ­
määrityskokeen lopussa on viimeinen näyte vesifaasista määritetty 48 
tunnin jälkeen, faasit erotetaan sentrifugoimalla, ja mahdollisesti suo ­
dattamalla. Vesifaasi otetaan talteen mahdollisimman tarkasti, ja so ­
pivaa uuttoliuotinta (uuttokerroin vähintään 95 %) lisätään maa-ai ­
nekseen testiaineen uuttamiseksi. Suositellaan vähintään kahta peräk ­
käistä uuttoa. Testiaine määritetään maa-aines- ja koeastiauutteista ja 
lasketaan massatase (yhtälö 10, ”Tiedot ja raportointi”). Jos se on alle 90 prosenttia, katsotaan, että testiaine on epästabiili testin aikana. Tutkimukset voivat kuitenkin yhä jatkua, kunhan testiaineen epästa ­
biilius otetaan huomioon; tässä tapauksessa varsinaiseen tutkimuk ­
seen suositellaan molempien faasien analysointia.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1206
 
1.9.2.4  Taso 2 — Adsorptiokinetiikka yhdellä testiainekonsentraatiolla  
Käytetään viittä maa-ainesta, jotka valitaan taulukosta 1. Näihin vii ­
teen maa-ainekseen olisi hyvä sisällyttää kaikki alustavassa tutkimuk ­
sessa käytetyt maa-ainekset tai joitakin niistä. Tällöin tasoa 2 ei tar ­
vitse toistaa alustavassa tutkimuksessa käytetyille maa-aineksille.  
Tasapainotilan saavuttamisaika, maa-aines/liuos-suhde, maa-ainesnä ­
ytteen paino, maa-aineksen kanssa kosketuksiin joutuvan vesifaasin tilavuus ja testiaineen konsentraatio liuoksessa valitaan alustavan 
tutkimuksen tulosten perusteella. Analyysi on suoritettava mieluiten 
noin 2, 4, 6, 8 (mahdollisesti myös 10) ja 24 tunnin kontaktiajan jälkeen; ravisteluaika voidaan ulottaa enintään 48 tuntiin silloin, kun kemikaali tarvitsee pidemmän ajan tasapainotilan saavuttamiseen 
suhteenmääritystulosten perusteella. Analyysiaikoihin voidaan kui ­
tenkin suhtautua joustavasti.
 
Jokainen koe (yksi maa-aines ja yksi liuos) suoritetaan vähintään 
rinnakkaisnäytteillä tulosten varianssin arvioimiseksi. Jokaisessa ko ­
keessa suoritetaan yksi nollakoe. Siinä käytetään maa-ainesta ja 0,01 
M CaCl  2 -liuosta ilman testiainetta, ja painon ja tilavuuden on oltava 
samat kuin varsinaisessa kokeessa. Vertailunäytteelle, jossa on ai ­
noastaan testiainetta 0,01 M CaCl  2 -liuoksessa (ilman maa-ainesta), 
suoritetaan sama testimenettely, jotta voitaisiin varautua yllättäviin 
tilanteisiin.  
Adsorboitumisprosentti lasketaan kullakin ajanhetkellä,  A t i ja/tai ai­
kavälillä  A Δt i (tarpeen mukaan) ja esitetään ajan funktiona. Laske ­
taan myös jakautumiskerroin K  d tasapainotilassa samoin kuin orgaa ­
nisen hiilen suhteen normalisoitu adsorptiokerroin K  oc . (ei-polaa ­
risille orgaanisille kemikaaleille).  
Adsorptiokinetiikkatestin tulokset  
Lineaarinen K  d -arvo on yleensä tarkka kuvaamaan sorptiokäyttäyty ­
mistä maa-aineksessa (35) (78) ja se kuvaa kemikaalien luontaista kulkeutumista maaperässä. Esimerkiksi kemikaaleja, joiden K
 d ≤ 
1 cm  3 g -1 , pidetään yleensä helposti kulkeutuvina. MacCall et al. 
(16) ovat kehittäneet K  oc -arvoihin perustuvan kulkeutuvuusluokitus ­
kaavion. Lisäksi käytetään K  oc :n ja DT-50  6 :n väliseen suhteeseen (  1 ) 
(32) (79) perustuvia uuttumisluokituskaavioita.  
Virheanalyysitutkimusten mukaan (61) alle 0,3 cm  3 g -1 olevia K  d - 
arvoja ei myöskään voida arvioida tarkasti vesifaasikonsentraation 
pienenemisen pohjalta, ei edes silloin, kun käytetään soveltuvinta (tarkkuuden kannalta soveltuvinta) maa-aines/liuos-suhdetta, eli 1:1. Tällaisessa tapauksessa suositellaan molempien faasien, sekä 
maa-aineksen että liuoksen, analysointia.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1207  
( 1 ) DT-50: aika, jolloin 50 % testiaineesta on hajonnut.
 Edellä esitettyjen huomautusten pohjalta suositellaan, että kemikaalin 
adsorptiokäyttäytymistä ja mahdollista kulkeutumista maaperässä 
koskevaa tutkimusta jatketaan määrittämällä Freundlichin adsorptioi ­
sotermit näille systeemeille. K  d :n tarkka määrittäminen kyseisille 
systeemeille on mahdollista tässä testimenetelmässä esitettävän koe ­
järjestelyn avulla. Täsmällinen määritys on mahdollinen, jos K  d ker­
rottuna maa-aines/liuos-suhteella antaa tulokseksi arvon > 0.3 silloin, kun mittaukset perustuvat vesifaasikonsentraation pienenemiseen (epäsuora menetelmä), tai arvon > 0,1 silloin, kun molemmat faasit 
analysoidaan (suora menetelmä) (61).
 
1.9.2.5  Taso 3 — Adsorptioisotermit ja desorptiokinetiikka/ ­
desorptioisotermit  
1.9.2.5.1 A d s o r p t i o i s o t e r m i t  
Käytetään viittä testiainekonsentraatiota, jotka kattavat mieluiten 
kaksi suuruusluokkaa; näitä konsentraatioita valittaessa on otettava 
huomioon vesiliukoisuus ja syntyvät tasapainokonsentraatiot vesiliu ­
oksissa. Kullakin maa-aineksella on säilytettävä sama maa-aines/ ­
liuos-suhde läpi tutkimuksen. Adsorptiotesti suoritetaan edellä kuva ­
tulla tavalla lukuun ottamatta sitä, että vesifaasi analysoidaan vain 
kerran ja sillä ajanhetkellä, joka tarvitaan tasapainotilan saavuttami ­
seen (ja joka määritettiin edellä 2-tason kokeessa). Liuoksen tasa ­
painokonsentraatiot määritetään ja adsorboitunut määrä lasketaan tes ­
tiaineen vähentymisestä liuoksesta tai suoraa menetelmää käyttäen. 
Adsorboitunut massa maa-aineksen massayksikköä kohden esitetään testiaineen tasapainokonsentraation funktiona (katso ”Tulokset ja nii ­
den raportointi”).
 
Adsorptioisotermikokeen tulokset  
Tähän mennessä esitetyistä matemaattisista adsorptiomalleista 
Freundlichin isotermi on se, jota useimmin käytetään adsorptiopro ­
sessien kuvaamiseen. Yksityiskohtaisempia tietoja adsorptiomallien 
tulkinnasta ja merkityksestä esitetään lähteissä (41) (45) (80) (81) (82).
 
Huomautus:  Eri aineiden K  F -arvojen (Freundlichin adsorptiokertoi ­
mien) vertailu on mahdollista ainoastaan silloin, kun nämä K  F -arvot 
ilmaistaan samoina yksikköinä (83).  
1.9.2.5.2 D e s o r p t i o k i n e t i i k k a  
Tämän kokeen tarkoituksena on tutkia, adsorboituuko kemikaali 
maa-ainekseen reversiibelisti vai irreversiibelisti. Tämä tieto on tär ­
keä, koska desorptioprosessilla on tärkeä merkitys myös kemikaalin 
käyttäytymisessä maaperässä kenttäolosuhteissa. Desorptiotiedot ovat 
lisäksi käyttökelpoisia syöttötietoja uuttumista kuvaavassa tietokone ­
mallintamisessa ja liuenneita aineita sisältävien valumien simuloin ­
nissa. Jos halutaan tehdä desorptiotutkimus, suositellaan, että jäljem ­
pänä kuvattava tutkimus suoritetaan jokaiselle systeemille, jolle edel ­
lisessä adsorptiokinetiikkakokeessa on ollut mahdollista määrittää tarkka K
 d -arvo.  
Kuten adsorptiokinetiikkatutkimuksessakin, desorptiokinetiikkako ­
keessa on käytettävissä kaksi vaihtoehtoa: a) rinnakkaismenetelmä ja b) sarjamenetelmä. Käytettävän menetelmän valitsee kokeen suo ­
rittaja, jonka on otettava huomioon käytettävissä olevat mahdollisuu ­
det ja resurssit laboratoriossa.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1208
 
a) Rinnakkaismenetelmä: jokaiselle maa-ainekselle, joka valitaan de ­
sorptiotutkimukseen, valmistetaan näytteet samalla maa-aines/ ­
liuos-suhteella ja niin monta näytettä kuin desorptiokinetiikan tutkimiseksi halutaan näytteenottohetkiä. Mieluiten käytetään sa ­
moja aikavälejä kuin adsorptiokinetiikkakokeessa; kokonaisaikaa 
voidaan kuitenkin tarvittaessa pidentää systeemin desorptiotasa ­
painotilan saavuttamiseksi. Jokaisessa kokeessa (yksi maa-aines, yksi liuos) suoritetaan yksi nollakoe. Siinä on maa-ainesta ja 0,01 M CaCl
 2 -liuosta ilman testiainetta, ja painon ja tilavuuden on 
oltava samat kuin varsinaisessa kokeessa. Vertailunäytteenä suo ­
ritetaan testiaineelle 0,01 M CaCl  2 -liuoksessa (ilman maa-ainesta) 
sama testimenettely. Kaikkia maa-aines-liuos-seoksia ravistellaan, kunnes adsorptiotasapainotila on saavutettu (mikä määritettiin 2- 
tason kokeessa). Tämän jälkeen faasit erotetaan sentrifugoimalla 
ja vesifaasit poistetaan mahdollisimman tarkasti. Poistettu liuosti ­
lavuus korvataan samalla tilavuudella 0,01 M CaCl
 2 -liuosta, joka 
ei sisällä testiainetta, ja uusia seoksia ravistellaan uudelleen. En ­
simmäisen koeputken vesifaasi otetaan talteen mahdollisimman 
tarkasti ja mitataan esimerkiksi 2 tunnin jälkeen, toisen koeputken vesifaasi 4 tunnin, kolmannen koeputken 6 tunnin jälkeen ja niin edelleen, kunnes desorptiotasapainotila on saavutettu.
 
b) Sarjamenetelmä: adsorptiokinetiikkakokeen jälkeen seos sentrifu ­
goidaan ja vesifaasi poistetaan mahdollisimman tarkasti. Poistettu liuostilavuus korvataan yhtä suurella tilavuudella 0,01 M CaCl
 2 - 
liuosta, joka ei sisällä testiainetta. Uutta seosta ravistellaan, kun ­
nes desorptiotasapainotila on saavutettu. Tämän ajanjakson aikana seosta sentrifugoidaan tietyin aikavälein faasien erottamiseksi. Testiaine määritetään pienestä määräosasta vesifaasia välittömästi; 
tämän jälkeen koe jatkuu alkuperäisellä seoksella. Kunkin yksit ­
täisen määräosan tilavuuden on oltava alle yhden prosentin ko ­
konaistilavuudesta. Seokseen lisätään sama määrä tuoretta 0,01 M CaCl
 2 -liuosta maa-aines/liuos-suhteen säilyttämiseksi, ja ravistelu 
jatkuu seuraavan aikavälin ajan.  
Desorboitumisprosentti lasketaan kullakin ajanhetkellä  ðD t i Þ ja/tai 
aikavälillä ðD Δt i Þ (tutkimuksen tarpeiden mukaisesti) ja se esitetään 
ajan funktiona. Lasketaan myös tasapainotilan desorptiokerroin K  des . 
Kaikki käytettävät yhtälöt esitetään kohdassa ”Tulokset ja niiden raportointi” sekä lisäyksessä 5.
 
Desorptiokinetiikkakokeen tulokset  
Yleisten ajan funktiona esitettävien desorboitumisprosentti-  D t i ja 
adsorboitumisprosentti-  A t i diagrammien avulla on mahdollista arvi ­
oida adsorptioprosessin reversiibeliyttä. Vaikka desorptiotasapainoti ­
lan saavuttamiseen menisikin jopa kaksinkertainen aika adsorptiota ­
sapainotilan saavuttamiseen verrattuna ja kokonaisdesorptio olisi yli 75 prosenttia adsorboituneesta maarasta, adsorptiota pidetään rever ­
siibelinä.
 
1.9.2.5.3 D e s o r p t i o i s o t e r m i t  
Freundlichin desorptioisotermit määritetään maa-aineksista, joita on 
käytetty adsorptioisotermikokeessa. Desorptiotesti suoritetaan koh ­
dassa ”Desorptiokinetiikka” kuvatulla tavalla lukuun ottamatta sitä, 
että vesifaasi analysoidaan vain kerran, desorptiotasapainotilassa. Lasketaan desorboituneen testiaineen määrä. Maa-ainekseen desorp ­
tiotasapainotilassa adsorboituneeksi jääneen testiaineen pitoisuus esi ­
tetään liuoksessa olevan testiaineen tasapainokonsentraation funk ­
tiona (katso ”Tulokset ja niiden raportointi” sekä lisäys 5).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1209
 
2. TULOKSET JA NIIDEN RAPORTOINTI  
Analyysitiedot esitetään taulukkomuodossa (katso lisäys 6). Niissä 
esitetään yksittäiset mittaukset ja lasketut keskiarvot sekä adsorptioi ­
sotermien graafiset kuvaajat. Laskutoimitukset tehdään jäljempänä 
kuvatulla tavalla.  
Testin tarkoituksia varten sovitaan, että 1 cm  3 vesiliuosta painaa 1 g. 
Näin maa-aines/liuos-suhde voidaan ilmaista yksikköinä w/w tai w/ ­
vol samalla numerolla.  
2.1 ADSORPTIO  
Adsorptio ( A t i ) määritellään maa-ainekseen adsorboituneen aineen 
prosenttiosuutena testin alussa lisätystä aineen määrästä. Jos testiaine 
on stabiili eikä adsorboidu merkittävästi astiaseinämiin,  A t i lasketaan 
kullakin ajanhetkellä t  i seuraavan yhtälön mukaisesti:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ·100 
m 0 ð%Þ (3) 
jossa:  
A t i = adsorboitumisprosentti ajanhetkellä t  i ( %) 
m s ads ðt i Þ = maa-ainekseen adsorboituneen testiaineen massa ( μg) 
ajanhetkellä t  i 
m o = testiaineen massa koeputkessa testin alussa ( μg). 
Yksityiskohtaiset tiedot siitä, kuinka adsorboitumisprosentti  A t i las­
ketaan rinnakkais- ja sarjamenetelmälle, annetaan liitteessä 5.  
Jakautumiskerroin K  d on maa-ainesfaasissa olevan aineen pitoisuu ­
den ja vesiliuoksessa olevan aineen massakonsentraation välinen suhde koeolosuhteissa adsorptiotasapainotilassa.
 
K d ¼ C s ads ðeqÞ 
C aq ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (4) 
jossa:  
C s ads ðeqÞ = maa-ainekseen adsorboituneen aineen pitoisuus ad ­
sorptiotasapainotilassa ( μg g  -1 ) 
C aq ads ðeqÞ = vesifaasissa olevan aineen massakonsentraatio adsorp ­
tiotasapainotilassa ( μg cm  -3 ). Tämä konsentraatio 
määritetään analyyttisesti nollakokeiden antamat arvot huomioon ottaen
 
m s ads ðeqÞ = maa-ainekseen adsorboituneen aineen massa adsorp ­
tiotasapainotilassa ( μg) 
m aq ads ðeqÞ = liuoksessa olevan aineen massa adsorptiotasapainoti ­
lassa (μg) 
m soil = maa-ainesfaasin määrä, maa-aineksen kuiva-aineena 
ilmaistuna (g)  
V o = maa-aineksen kanssa kosketuksiin joutuvan vesifaasin 
alkutilavuus (cm  3 ). 
A eq :n ja K  d :n välinen suhde saadaan yhtälöstä  
K d ¼ A eq 
100 Ä A eq · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (5) ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1210
 
jossa:  
A eq = adsorboitumisprosentti adsorptiotasapainotilassa, %.  
Orgaanisen hiilen suhteen normalisoitu adsorptiokerroin K  oc liittää 
jakautumiskertoimen K  d maa-ainesnäytteen orgaanisen hiilen pitoi ­
suuteen:  
K oc ¼ K d · 100 
%OC  (cm  3 g -1 ) (6) 
jossa:  
% oc = maa-ainesnäytteessä olevan orgaanisen hiilen prosentti ­
osuus (g g  -1 ). 
K oc -kerroin edustaa yksittäistä arvoa, joka kuvaa pääasiassa ei-polaa ­
risten orgaanisten kemikaalien jakautumista maa-aineksessa tai sedi ­
mentissä olevaan orgaaniseen hiileen ja veteen. Näiden kemikaalien adsorboituminen korreloi sorboivan kiintoaineen orgaanisten ainesten 
pitoisuuden kanssa (7); näin ollen K
 oc -arvot riippuvat humusjakeiden 
erityisominaisuuksista, joiden sorptiokyvyt vaihtelevat huomattavasti — tämä johtuu eroista alkuperässä, syntytavassa ja niin edelleen.
 
2.1.1  Adsorptioisotermit  
Freundlichin adsorptioisotermien yhtälö liittää adsorboituneen testi ­
aineen määrän tasapainotilassa liuoksessa olevan testiaineen konsent ­
raatioon (yhtälö 8).  
Mittaustuloksia käsitellään kuten kohdassa ”Adsorptio”. Kullekin 
koeputkelle lasketaan adsorptiotestin jälkeen maa-ainekseen adsor ­
boituneen testiaineen pitoisuus ( C s ads ðeqÞ, ilmaistu muualla muodossa 
x/m). Oletetaan, että tasapainotila on saavutettu ja että  C s ads ðeqÞkuvaa 
tasapainoarvoa:  
C s ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m soil ¼ h 
C 0 Ä C aq ads ðeqÞ i
:V 0 
m soil (μg g  -1 ) (7) 
Yhtälö (8) on Freundlichin adsorptioyhtälö:  
C s ads ðeqÞ ¼ K F ads:C aq ads ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (8) 
tai lineaarisessa muodossa:  
logC  s ads ðeqÞ ¼ logK  F ads þ 1=n·logC  aq ads ðeqÞ (9) 
jossa:  
K F ads = Freundlichin adsorptiokerroin; sen yksikkö on cm  3 g -1 
ainoastaan silloin, kun l/n = 1; kaikissa muissa tapauk ­
sissa kulmakerroin 1/n esiintyy  K F ads :n laatua osoittavassa 
yksikössä  ads (μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
n = regressiovakio: l/n vaihtelee yleensä välillä 0,7 - 1,0, 
mikä osoittaa, että sorptiotiedot ovat usein hieman epäli ­
neaarisia.  
Piirretään yhtälöt (8) ja (9) ja lasketaan  K F ads ja l/n -arvot regressi ­
oanalyysillä yhtälöä 9 käyttäen. Lasketaan myös logaritmiyhtälön 
korrelaatiokerroin r  2 . Esimerkit tällaisista käyristä esitetään kuvassa 2.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1211
 
Kuva 2.  Freundlichin adsorptiokäyrä, normaali ja linearisoitu  
2.1.2  Massatase  
Massatase (MB) on se aineen prosenttiosuus testin alussa lisätystä 
aineen nimellismäärästä, joka voidaan ottaa analyyttisesti talteen ad ­
sorptiotestin jälkeen.  
Tulokset käsitellään eri tavalla, kun liuotin sekoittuu täysin veteen. 
Veteen sekoittuvan liuottimen tapauksessa tulokset voidaan käsitellä 
kuten kohdassa ”Desorptio” liuotinuuton avulla talteen saadun aineen 
määrän määrittämiseksi. Jos liuotin sekoittuu veteen niukasti, on talteenotettu määrä mitattava.
 
Massatase MB adsorptiolle lasketaan seuraavasti: oletetaan, että te ­
kijä (m  E ) vastaa maa-aineksesta ja koeastiaseinämistä orgaanisella 
liuottimella uutettujen testikemikaalimassojen summaa:  
MB ¼ Ê 
V rec ·C aq ads ðeqÞ þ m E Ì 
·100 
V 0 ·C 0 ð%Þ (10) 
jossa:  
MB = massatase ( %)  
m E = kahdessa vaiheessa maa-aineksesta ja koeastiaseinämistä 
uutetun testiaineen kokonaismassa ( μg) 
C o = maa-aineksen kanssa kosketuksiin joutuvan testiliuoksen 
massakonsentraatio alussa ( μg cm  -3 ) 
V rec = adsorptiotasapainotilan saavuttamisen jälkeen talteen otetun 
supernatantin tilavuus (cm  -3 ) 
2.2 DESORPTIO  
Desorptio (D) määritellään desorboituneen testiaineen prosenttiosuu ­
tena aiemmin adsorboituneen aineen määrästä koeolosuhteissa:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ ·100ð%Þ (11) 
jossa:  
D t i = desorboitumisprosentti ajanhetkellä t  1 ( %) ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1212
 
m aq des ðt i Þ = maa-aineksesta desorboituneen testiaineen massa t  i 
(μg) ajanhetkellä t  i 
m s ads ðeqÞ = maa-ainekseen adsorboituneen testiaineen massa ad ­
sorptiotasapainotilassa ( μg). 
Yksityiskohtaiset tiedot siitä, kuinka lasketaan desorboitumisprosentti  
D t i rinnakkais- ja sarjamenetelmälle, annetaan lisäyksessä 5.  
Näennäinen desorptiokerroin (K  des ) on koeolosuhteissa maa-ainesfa ­
asiin jääneen aineen pitoisuuden suhde desorboituneen aineen mas ­
sakonsentraatioon vesiliuoksessa silloin, kun desorptiotasapainotila on saavutettu:
 
K des ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m aq des ðeqÞ V T 
m soil (cm  3 g -1 ) (12) 
jossa:  
K des = desorptiokerroin (cm  3 g -1 ) 
m aq des ðeqÞ = maa-aineksesta desorboituneen testiaineen kokonais ­
massa desorptiotasapainotilassa ( μg) 
V T = maa-aineksen kanssa desorptiokinetiikkatestin aikana 
kosketuksiin joutuvan vesifaasin kokonaistilavuus (cm
 3 ). 
Ohjeet  m  aq des ðeqÞ:n laskemiseksi annetaan lisäyksessä 5 kohdassa 
”Desorptio”.  
Huomautus:  
Jos edeltävä adsorptiotesti suoritettiin rinnakkaismenetelmää käyttä ­
en, niin yhtälössä (12) esiintyvä tilavuus V  T oletetaan yhtä suureksi 
kuin V  o . 
2.2.1  Desorptioisotermit  
Freundlichin desorptioisotermien yhtälö yhdistää maa-ainekseen ad ­
sorboituneeksi jääneen testiaineen pitoisuuden liuoksessa olevan tes ­
tiaineen konsentraatioon desorptiotasapainotilassa (yhtälö 16).  
Kullekin koeputkelle lasketaan maa-ainekseen adsorboituneeksi jää ­
neen aineen pitoisuus desorptiotasapainotilassa seuraavasti:  
C s des ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m soil (μg g  -1 ) (13) 
m aq des ðeqÞmääritellään seuraavasti:  
m aq des ðeqÞ ¼ m m des ðeqÞ· V 0 
V r F Ä m aq A (μg) (14) 
jossa:  
C s des ðeqÞ = maa-ainekseen adsorboituneeksi jääneen testiaineen 
pitoisuus desorptiotasapainotilassa ( μg g  -1 ) 
m m des ðeqÞ = vesifaasista desorptiotasapainotilassa analyyttisesti 
määritetyn aineen massa ( μg) ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1213
 
m aq A = epätäydellisestä tilavuustäydennyksestä johtuen ad ­
sorptiotasapainotilan ulkopuolelle jääneen testiaineen 
massa (μg) 
m aq des ðeqÞ = liuoksessa olevan aineen massa adsorptiotasapainoti ­
lassa (μg) 
m aq A ¼ m aq ads ðeqÞ· Í V 0 Ä V R 
V 0 Î (15) 
V r F = koeputkesta testiaineen mittaamiseksi otetun liuoksen tila ­
vuus, desorptiotasapainotilassa (cm  3 ) 
V R = koeputkesta adsorptiotasapainotilan saavuttamisen jälkeen 
poistetun supernatantin tilavuus, joka korvataan samalla tila ­
vuudella 0,01 M CaCl  2 -liuosta (cm  3 ). 
Yhtälö (16) on Freundlichin desorptioyhtälö:  
C s des ðeqÞ ¼ K F des ·C aq des ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (16) 
tai lineaarisessa muodossa:  
logC  s des ðeqÞ ¼ logK  F des þ 1=n·logC  aq des ðeqÞ (17) 
jossa:  
K F des = Freundlichin desorptiokerroin  
n = regressiovakio  
C aq des ðeqÞ = vesifaasissa olevan aineen massakonsentraatio desorp ­
tiotasapainotilassa ( μg cm  -3 ). 
Yhtälöt (16) ja (17) voidaan piirtää ja  K F des ja l/n -arvot lasketaan 
regressioanalyysin avulla yhtälöä 17 käyttäen.  
Huomautus:  
Jos Freundlichin adsorptio- tai desorptioeksponentti l/n on yhtä kuin 
1, Freundlichin adsorption tai desorption sitoutumisvakio ( K F ads ja 
K F des ) on yhtä suuri kuin adsorptio- tai desorptiotasapainovakiot (vas ­
taavasti K  d ja K  des ), jolloin C  S vs C  aq -käyrät ovat lineaariset. Jos 
eksponentit ovat erisuuria kuin 1, C  s vs C  aq -käyrät eivät ole lineaa ­
risia ja adsorptio- ja desorptiovakiot vaihtelevat isotermien eri koh ­
dissa.  
2.2.2  Testiraportti  
Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:  
— Käytettyjen maa-ainesnäytteiden täydelliset tunnistetiedot, johon 
sisältyy:  
— maantieteellinen sijainti (leveysasteet, pituusasteet),  
— näytteenottopäivämäärä,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1214
 
— käyttömuoto (esimerkiksi maatalousmaa, metsä),  
— näytteenottosyvyys,  
— hiekka-, liete- ja savipitoisuus,  
— pH-arvot (0,01 M CaCl  2 :ssa),  
— orgaanisen hiilen pitoisuus,  
— orgaanisen aineksen pitoisuus,  
— typpipitoisuus,  
— C/N-suhde,  
— kationinvaihtokyky (mmol/kg),  
— kaikki maa-ainesnäytteiden keräämiseen ja säilyttämiseen liittyvät 
tiedot,  
— soveltuvin osin kaikki testiaineen adsorptio-desorptiotulkinnan 
kannalta merkitykselliset tiedot,  
— kunkin muuttujan määrittämiseksi käytettyjen menetelmien kirjal ­
lisuusviitteet,  
— testiainetta koskevat tiedot soveltuvin osin,  
— koelämpötilat,  
— sentrifugointiolosuhteet,  
— analyysimenetelmä testiaineen analysoimiseksi,  
— perustelut kaikelle liuottavien aineiden käytölle testiaineen varas ­
toliuosten valmistuksessa,  
— selvitykset laskelmissa tehdyistä korjauksista,  
— tiedot taulukkomuodossa (liite 6) ja graafiset esitykset,  
— kaikki tiedot ja havainnot, jotka helpottavat testitulosten tulkin ­
taa. 
3. LÄHDELUETTELO  
(1) Kukowski H. and Brümmer G, (1987). Investigations on the 
Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02 045, Part II.
 
(2) Fränzle O., Kuhnt G. and Vetter L., (1987). Selection of Rep ­
resentative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02 045, Part I.
 
(3) Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, 
Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication 
No 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, 
ISPRA, December 1994.  
(4) OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD 
Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18- 20 January 1995 (June 1995).
 
(5) US Environment Protection Agency: Pesticide Assessment 
Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, 
Scries 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, 
Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1215
 
(6) US Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and 
Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 
835-Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, OPPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/ ­
Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996.
 
(7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for De ­
termining a Sorption Constant (K  oc ) for an Organic Chemical 
in Soil and Sediments.  
(8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Guid ­
elines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.  
(9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): App ­
lication for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
 
(10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 
1988): Criteria for registration of pesticides as especially dan ­
gerous to health or especially harmful to the environment.  
(11) BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant Pro ­
tection Products, Biological Research Centre for Agriculture and Forestry, Braunschweig, Germany.
 
(12) Calvet R., (1989), ”Evaluation of adsorption coefficients and 
the prediction of the mobilities of pesticides in soils”, in Met ­
hodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review).
 
(13) Calvet R., (1980), ”Adsorption-Desorption Phenomena” in In ­
teractions between herbicides and the soil. (R. J. Hance ed.), Academic Press, London, pp. 83-122.
 
(14) Hasset J. J., and Banwart W.L., (1989), ”The sorption of non ­
polar organics by soils and sediments” in Reactions and Mo ­
vement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, pp. 31-44.
 
(15) van Genuchten M. Th., Davidson J. M., and Wierenga P. J., 
(1974), ”An evaluation of kinetic and equilibrium equations for 
the prediction of pesticide movement through porous media”. 
Soil Sci. Soc. Am. Proc., Vol. 38(1), pp. 29-35.  
(16) McCall P. J., Laskowski D. A., Swann R. L., and Dishburger 
H. J., (1981), ”Measurement of sorption coefficients of organic 
chemicals and their use, in environmental fate analysis”, in 
Test Protocols for Environmental Fate and Movement of To ­
xicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washing ­
ton DC.  
(17) Lambert S. M., Porter P. E., and Schieferrstein R. H., (1965), 
”Movement and sorption of chemicals applied to the soil”. Weeds, 13, pp. 185-190.
 
(18) Rhodes R. C., Belasco I. J., and Pease H. L., (1970) ”Deter ­
mination of mobility and adsorption of agrochemicals in soils”. 
J.Agric.Food Chem., 18, pp. 524-528.  
(19) Russell M. H., (1995), ”Recommended approaches to assess 
pesticide mobility in soil” in Environmental Behavior of Ag ­
rochemicals (ed. T. R. Roberts and P. C. Kearney). John Wiley 
& Sons Ltd.  
(20) Esser H. O., Hemingway R. J., Klein W., Sharp D. B., Vonk J. 
W. and Holland P. T., (1988), ”Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides”, 
IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, 
pp. 901-932.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1216
 
(21) Guth J. A., Burkhard N., and D. O. Eberle, (1976), ”Experi ­
mental models for studying the persistence of pesticides in 
soils”. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, pp. 137-157, BCPC, Surrey, UK.
 
(22) Furminge C. G. L, and Osgerby J. M., (1967), ”Persistence of 
herbicides in soil”. J. Sci. Fd Agric., 18, pp. 269-273.  
(23) Burkhard N., and Guth J. A., (1981), ”Chemical hydrolysis of 
2-Chloro-4,6-bis(alkylamino)-1,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption”. Pestic. 
Sci. 12, pp. 45-52.
 
(24) Guth J. A., Gerber H. R., and Schlaepfer T., (1977). ”Effect of 
adsorption, movement and persistence on the biological avai ­
lability of soil-applied pesticides”. Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, pp. 961-971.
 
(25) Osgerby J. M., (1973), ”Process affecting herbicide action in 
soil”. Pestic. Sci., 4, pp. 247-258.  
(26) Guth J. A., (1972), ”Adsorptions- und Einwascheverhalten von 
Pflanzenschutzmitteln in Böden”. Schr. Reihe Ver. Wass. -Bo ­
den-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, pp. 143-154.  
(27) Hamaker J. W., (1975), ”The interpretation of soil leaching 
experiments”, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V.H. freed), pp. 135-172. Plenum Press. NY.
 
(28) Helling C. S., (1971). ”Pesticide mobility in soils”. Soil Sci. 
Soc. Amer. Proc, 35, pp. 732-210.  
(29) Hamaker J. W., (1972), ”Diffusion and volatilization” in Or ­
ganic chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring and J. 
W. Hamaker eds). Vol. 1, pp. 49-143.  
(30) Burkhard N. and Guth J. A., (1981), ”Rate of volatilisation of 
pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results 
with those determined in a laboratory model system”. Pestic. Sci. 12, pp. 37-44.
 
(31) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R.F., and Enfield C.G., 
(1984), ”Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of Pesticide Was ­
tes, pp. 297-325, Acs Symp. Ser. 2 59, American Chemical 
Society, Washington, DC.
 
(32) Gustafson D. I., (1989), ”Groundwater ubiquity score: a simple 
method for assessing pesticide leachability”. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), pp. 339-357.
 
(33) Leistra M., and Dekkers W. A., (1976). ”Computed effects of 
adsorption kinetics on pesticide movement in soils”. J. of Soil 
Sci., 28, pp. 340-350.  
(34) Bromilov R. H., and Leistra M., (1980), ”Measured and simu ­
lated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils”. Pest. Sci., 11, pp. 389-395.
 
(35) Green R. E., and Karickoff S. W., (1990), ”Sorption estimates 
for modeling”, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., 
Book Series no. 2, pp. 80-101,
 
(36) Lambert S. M., (1967), ”Functional relationship between sorp ­
tion in soil and chemical structure”. J. Agri. Food Chem., 15, 
pp. 572-576.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1217
 
(37) Hance R. J., (1969), ”An empirical relationship between che ­
mical structure and the sorption of some herbicides by soils”. 
J. Agri. Food Chem., 17, pp. 667-668.  
(38) Briggs G. G., (1969), ”Molecular structure of herbicides and 
their sorption by soils”. Nature, 223, 1288.  
(39) Briggs G. G., (1981). ”Theoretical and experimental relations ­
hips between soil adsorption, octanol-water partition coeffici ­
ents, water solubilities, bioconcentration factors, and the para ­
chor”. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050-1059.  
(40) Sabljic A., (1984), ”Predictions of the nature and strength of 
soil sorption of organic polutance by molecular topology”. J. 
Agric. Food Chem., 32, pp. 243-246.  
(41) Bailey G. W., and White J. L., (1970), ”Factors influencing the 
adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil”. Residue Rev., 32, pp. 29-92.
 
(42) Bailey G. W., J. L. White and Y. Rothberg, (1968). ”Adsorp ­
tion of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate”. Soil Sci. Soc. Amer. 
Proc. 32: pp. 222-234.
 
(43) Karickhoff S. W., (1981), ”Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”. Chemosphere 10, pp. 833-846.
 
(44) Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), ”Soil Sorption 
of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners”. Environ. Toxi ­
col. Safety 21, pp. 1-17.  
(45) Hamaker J. W., and Thompson J. M., (1972), ”Adsorption in 
organic chemicals” in Organic Chemicals in the Soil Environ ­
ment (Goring C.A.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, pp. 49-143.
 
(46) Deli J., and Warren G. F., 1971, ”Adsorption, desorption and 
leaching of diphenamid in soils”. Weed Sci. 19: pp. 6 7-69.  
(47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J. M. and Santelmann, 
(1975). ”Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils”. Weed Science, Vol. 23, pp. 454-457.
 
(48) Haues M. H. B., Stacey M., and Thompson J. M., (1968), 
”Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic preparati ­
ons” in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p. 75, International. Atomic Energy Agency, Vienna.
 
(49) Pionke H. B., and Deangelis R. J., (1980). ”Methods for dist ­
ributing pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase”, CREAMS, in A Field Scale Model for Che ­
micals, Run-off and Erosion from Agricultural Management 
Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report.
 
(50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality — Ge ­
neral aspects; chemical and physical methods of analysis; bio ­
logical methods of analysis. First Edition (1994).  
(51) Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. 
Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11  th edition.  
(52) Black, Evans D. D., White J. L., Ensminger L. E., and Clark F. 
E., eds. ”Methods of Soil Analysis”, Vol 1 and 2, American 
Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1218
 
(53) ISO/D1S 10381-1 Soil Quality — Sampling — Part 1: Gui ­
dance on the design of sampling programmes.  
(54) 1SO/D1S 10381-2 Soil Quality — Sampling — Part 2: Gui ­
dance on sampling techniques.  
(55) ISO/DIS 10381-3 Soil Quality — Sampling — Part 3: Gui ­
dance on safety of sampling.  
(56) ISO/DIS 10381-4 Soil Quality — Sampling — Part 4: Gui ­
dance on the investigation of natural and cultivated soils.  
(57) ISO/DIS 10381-5 Soil Quality — Sampling — Part 5: Gui ­
dance on the investigation of soil contamination of urban and industrial sites.
 
(58) ISO 10381-6, 1993: Soil Quality — Sampling — Part 6: Gui ­
dance on the collection, handling and storage of soil for the 
assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.  
(59) Green R. E., and Yamane V. K., (1970), ”Precision in pesti ­
cide adsorption measurements”. Soil Sci. Am. Proc., 34, pp. 
353-354.  
(60) Grover R., and Hance R. J., (1970), ”Effect of ratio of soil to 
water on adsorption of linuron and atrazine”. Soil Sci., pp. 109-138.
 
(61) Boesten, J. J. T. I, ”Influence of soil/liquid ratio on the ex ­
perimental error of sorption coefficients in pesticide/soil syste ­
m”. Pest. Sci. 1990, 30, pp. 31-41.  
(62) Boesten, J. J. T. I. ”Influence of soil/liquid ratio on the ex ­
perimental error of sorption coefficients in relation to OECD 
guideline 106”. Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26-29 April 1994.
 
(63) Bastide J., Cantier J. M., et Coste C., (1980), ”Comportement 
de substances herbicides dans le sol en fonction de leur struc ­
ture chimique”. Weed Res. 21, pp. 227-231.  
(64) Brown D. S., and Flagg E. W., (1981), ”Empirical prediction 
of organic pollutants sorption in natural sediments”. J. Envi ­
ron.Qual., 10(3), pp. 382-386.  
(65) Chiou C. T., Porter P. E., and Schmedding D. W., (1983), 
”Partition equilibria of non-ionic organic compounds between 
soil organic matter and water”. Environ. Sci. Technol., 17(4), 
pp. 227-231.  
(66) Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984), ”Sorption of organic 
substances by soils and sediments”. J. Environm. Sci. Health, B19 (3), pp. 297-312.
 
(67) Vowles P. D., and Mantoura R. E. C., (1987), ”Sediment-water 
partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons”. Chemosphere, 16(1), pp. 109-116.
 
(68) Lyman W. J., Reehl W. F., and Rosenblatt D. H., (1990). 
Handbook of Chemical Property Estimation Methods. Environ ­
mental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC.
 
(69) Keniga E. E., and Goring, C. A. I., (1980). ”Relationship 
between water solubility, soil sorption, octanol-water partitio ­
ning and concentration of chemicals in the biota” in Aquatic 
Toxicology (eds J.G. Eaton, et al.), pp. 78-115, ASTM STP 
707, Philadelphia.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1219
 
(70) Chiou C. T., Peters L. J., and Freed V. H., (1979), ”A physical 
concept of soil-water equilibria for non-ionic organic compo ­
unds”. Science, Vol. 206, pp. 831-832.  
(71) Hassett J. J., Banwart W. I., Wood S. G., and Means J. C., 
(1981), ”Sorption of/-Naphtol: implications concerning the li ­
mits of hydrophobic sorption”. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, pp. 
38-42.  
(72) Karickhoff S. W., (1981), ”Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”. Chemosphere Vol. 10(8), pp. 833-846.
 
(73) Moreale A., van Bladel R., (1981), ”Adsorption de 13 herbi ­
cides et insecticides par le sol. Relation solubilite-reactivite”. 
Revue de l'Agric, 34 (4), pp. 319-322.  
(74) Müller M., Kördel W., (1996). ”Comparison of screening met ­
hods for the determination/estimation of adsorption coefficients on soil”. Chemosphere, 32(12), pp. 249 3-2504.
 
(75) Kördel W., Kotthoff G., Müller M., (1995), ”HPLC — scree ­
ning method for the determination of the adsorption coefficient on soil — results of a ring test”. Chemosphere 30 (7), pp. 1 3 73-1384.
 
(76) Kördel W., Stutte J., Kotthoff G., (1993), ”HPLC — screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on 
soil — comparison of different stationary phases”. Chemosp ­
here 27 (12), pp. 2341-2352.  
(77) Hance, R. J., (1967), ”The Speed of Attainment of Sorption 
Equilibria in Some Systems Involving Herbicides”. Weed Re ­
search, Vol. 7, pp. 29-36.  
(78) Koskinen W. C., and Harper S. S., (1990), ”The retention 
processes: mechanisms” in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. 
Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.
 
(79) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R. F., and Enfield C. G. 
(1984), ”Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of Pesticide Was ­
tes, pp. 297-325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical 
Society, Washington, DC.
 
(80) Giles C. H., (1970), ”Interpretation and use of sorption isot ­
herms” in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37, pp. 14-32.
 
(81) Giles, C. H.; McEwan J. H.; Nakhwa, S.N. and Smith, D., 
(1960), ”Studies in adsorption: XI. A system of classification 
of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of adsorption mechanisms and in measurements of pesticides sur ­
face areas of soils”. J. Chem. Soc, pp. 3973-93.
 
(82) Calvet R., Tercé M., and Arvien J. C., (1980), ”Adsorption des 
pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caractéristiques 
générales de l'adsorption”. Ann. Agron. 31: pp. 239-251.  
(83) Bedbur E., (1996), ”Anomalies in the Freundlich equation”, 
Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environ ­
ment, 13-15 May 1996, Stratford-upon-Avon, UK.  
(84) Guth, J. A., (1985), ”Adsorption/desorption”, in Joint Interna ­
tional Symposium, Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment, July 1-3, Canterbury, UK.
 
(85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1220
 
LISÄYS 1  
Testikaavio
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1221
 
Lisäys 2  
ANALYYSIMENETELMÄN TARKKUUDEN JA KONSENTRAATIO ­
MUUTOKSEN VAIKUTUS ADSORPTIOTULOSTEN TARKKUUTEEN  
Seuraavasta taulukosta (84) käy ilmi, että silloin kun alkuperäisen massan 
(m aq ads ðeqÞ = 110 μg) ja liuoksessa olevan testiaineen tasapainomassan 
(m s ads ðeqÞ = 100 μg) välinen ero on hyvin pieni, 5 prosentin virhe tasapainokon ­
sentraation mittaustuloksissa johtaa 50 prosentin virheeseen maa-ainekseen ad ­
sorboituneen aineen pitoisuuslaskelmissa ( m s ads ðeqÞ) ja 52,4 prosentin virheeseen 
K d -laskelmissa. 
Maa-aineksen määrä m  soil = 10 g 
Liuoksen tilavuus V  o =100 cm  3 
m aq ads ðeqÞ 
(μg) C aq ads ðeqÞ 
(μg cm  -3 ) R m  s ads ðeqÞä 
(μg) C s ads ðeqÞä 
(μg g -1 ) R‡ K  d * R‡  
KUN A = 9 %
 m 0 ¼ 110 μg tai 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
100 1,000 todell. 
arvo 10 1,00 todell. 
arvo 1 
101 1,010 1 % 9 0,90 10 % 0,891 10,9 % 
105 1,050 5 % 5 0,50 50 % 0,476 52,4 % 109 1,090 9 % 1 0,10 90 % 0,092 90,8 %  
KUN A = 55 %
 m 0 ¼ 110 μg tai 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
50,0 0,500 todell. 
arvo 60,0 6,00 todell. 
arvo 12,00 
50,5 0,505 1 % 59,5 5,95 0,8 % 11,78 1,8 % 
52,5 0,525 5 % 57,5 5,75 4,0 % 10,95 8,8 % 55,0 0,550 10 % 55,0 5,50 8,3 % 10,00 16,7 %  
KUN A = 99 %
 m 0 ¼ 110 μg tai 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
1,100 0,011 todell. 
arvo 108,9 10,89 todell. 
arvo 990 
1,111 0,01111 1 % 108,889 10,8889 0,01 % 980 1,0 % 
1,155 0,01155 5 % 108,845 10,8845 0,05 % 942 4,8 % 
1,21 0,0121 10 % 108,790 10,8790 0,10 % 899 9,2 %  
äm s ads ðeqÞ = m 0 Ä m aq ads ðeqÞ; C s ads ðeqÞ ¼ h 
C 0 Ä C aq ads ðeqÞ i 
V 0 
m soil:Kd ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ V 0 
m soil 
m s ads ðeqÞ = maa-ainesfaasissa olevan testiaineen massa tasapainotilassa, μg 
m aq ads ðeqÞ = vesifaasissa olevan testiaineen massa tasapainotilassa, μg 
C s ads ðeqÞ = testiaineen pitoisuus maa-ainesfaasissa tasapainotilassa, μg g  -1 
C aq ads ðeqÞ = testiaineen massakonsentraatio vesifaasissa tasapainotilassa, μg cm-  3 
R = analyyttinen virhe  m aq ads ðeqÞ:n määrityksessä  
R‡ = analyyttisestä virheestä R johtuva laskettu virhe.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1222
 
LISÄYS 3  
K d :N ARVIOINTITEKNIIKAT  
1. Arviointitekniikoiden avulla on mahdollista ennustaa K  d -arvoja, jotka pe ­
rustuvat korrelaatioon esimerkiksi P  ow -arvojen kanssa (12) (39) (63-68), 
vesiliukoisuustietojen kanssa (12) (19) (21) (39) (68-73) tai käänteisfaasi- 
HPLC:sta johdettujen polaarisuustietojen kanssa (74-76). Taulukoissa 1 ja 2 
esitetyt K  oc tai K  om -arvot on laskettu näistä yhtälöistä ja K  d sitten epä ­
suorasti yhtälöistä:  
K oc ¼ K d · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ K  om ¼ K d 
1; 724 · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ 
2. Tämä korrelaatiokäsite perustuu kahteen oletukseen: 1) aineen adsorboitu ­
miseen vaikuttaa pääasiassa juuri maa-aineksen orgaaninen aines; ja 2) 
kyseeseen tulevat vuorovaikutukset ovat pääasiassa polaarittomia. Täten 
näitä korrelaatioita ei voida soveltaa polaarisiin aineisiin tai soveltaminen voidaan ulottaa vain tiettyyn rajaan asti, ja niitä ei voida soveltaa silloin, kun orgaanisen aineksen pitoisuus maa-aineksessa on hyvin pieni (12). 
Vaikka tyydyttäviä P
 ow :n ja adsorption (19) välisiä korrelaatioita onkin 
löydetty, samaa ei voida sanoa vesiliukoisuuden ja adsorboitumisasteen (19) (21) välisistä yhteyksistä; tutkimustulokset ovat toistaiseksi hyvin ris ­
tiriitaisia.
 
3. Joitakin esimerkkejä adsorptiokertoimen ja oktanoli-vesi-jakautumiskertoi ­
men välisistä korrelaatioista samoin kuin suhteesta vesiliukoisuuteen esite ­
tään taulukoissa 1 ja 2.  
Taulukko 1.  
Esimerkkejä adsorptiojakautumiskertoimen ja oktanoli-vesi-jakautumiskertoimen välisistä korrelaatioista; 
lisäesimerkkejä lähteistä (12) (68).  
Aineet Korrelaatiot Tekijät  
Substituoidut ureat log K  om = 0,69 + 0,52 log P  ow Briggs (1981) (39) 
Klooratut aromaatit log K  oc = - 0,779 + 0,904 log P  ow . Chiou  et al . (1983) (65) 
Erilaiset torjunta-aineet log K  om = 4,4 + 0,72 log P  oW Gerstl ja Mingelgrin (1984) (66) 
Aromaattiset hiilivedyt log K  oc = - 2,53 + 1,15 log P  ow Vowles ja Mantoura (1987) (67)  
Taulukko 2.  
Esimerkkejä adsorptiojakautumiskertoimen ja vesiliukoisuuden välisistä korrelaatioista; katso 
lisäesimerkkejä lähteistä (68) (69).  
Aineet Korrelaatiot Tekijät  
Erilaiset torjunta-aineet log K  om = 3,8 - 0,561 log S  w Gerstl ja Mingelgrin (1984) (66) 
Alifaattiset, aromaattiset 
klooratut aineet log K  om = (4,040 +/- 0,038) - (0,557 
+/- 0,012) log S  w Chiou  et al . (1979) (70) 
α-naftoli log K  oc = 4,273 - 0,686 log S  w Hasset et al. (1981) (71) 
Sykliset, alifaattiset aromaat ­
tiset aineet log K  oc = - 1,405 - 0,921 log S  w - 
0,00953 (mp-25) Karickhoff (1981) (72) 
Erilaiset yhdisteet log K  om = 2,75 - 0,45 log S  w Moreale van Blade (1982) (73)  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1223
 
Lisäys 4  
SENTRIFUGOINTIOLOSUHTEIDEN LASKEMINEN  
1. Sentrifugointiaika saadaan seuraavasta kaavasta olettaen, että partikkelit 
ovat pallomaisia:  
t ¼ 9 
2 η 
ω 2 rp 2 ρ s Ä ρ aq Ä Ö " #  
ln ðR b=R t Þ (1) 
Yksinkertaisuuden vuoksi kaikki muuttujat esitetään muina kuin SI-yksik ­
köinä (g, cm),  
jossa:  
ω pyörimisnopeus (=2 π rpm/60), rad s  -1 
rpm kierrosta minuutissa  
η liuoksen viskositeetti, g s  -1 cm -1 
r p partikkelin säde, cm  
ρ s maa-aineksen tiheys, g cm  -3 
ρ aq liuoksen tiheys, g cm  -3 
R t etäisyys sentrifugipyörijän keskikohdasta sentrifugiputkessa olevan 
liuoksen yläpintaan, cm  
R b etäisyys sentrifugipyörijän keskikohdasta sentrifugiputken 
pohjaan, cm  
R b -R t maa-aines/liuos-seoksen pituusmitta sentrifugiputkessa, cm.  
Käytännössä lasketut ajat yleensä kaksinkertaistetaan täydellisen erottumi ­
sen varmistamiseksi.  
2. Yhtälöä (1) voidaan edelleen yksinkertaistaa, jos oletetaan, että liuoksen 
viskositeetti ( η) ja tiheys ( ρ aq ) on yhtä suuri kuin veden viskositeetti ja 
tiheys lämpötilassa 25  o C; tällöin η = 8,95 x 10  -3 g s  -1 cm -1 ja ρ aq = 
1,0 g. cm  -3 . 
Tämän jälkeen sentrifugointiaika saadaan yhtälöstä (2):  
t ¼ 3:7 
rpmð Þ  2 · r p 2 ρ s Ä 1ð Þ  ln Rb 
Rt (2) 
3. Yhtälöstä (2) käy ilmi, että sentrifugointiolosuhteiden eli ajan (t) ja nopeu ­
den (rpm) määrittäminen perustuu kahteen tärkeään muuttujaan, jotta mää ­
rätynkokoiset partikkelit saadaan erotetuksi (tässä tapauksessa säde on 0,1 μm): 1) maa-aineksen tiheys ja 2) seoksen pituus sentrifugiputkessa 
(R
 b -R t ), eli väli, jolla esiintyy maa-ainespartikkeleita liuoksen yläreunasta 
koeputken pohjaan; tällöin on selvää, että kun putkessa olevan seoksen tilavuus on sama, seoksen pituus koeputkessa riippuu koeputken säteen neliöstä.
 
4. Kuvassa 1 esitetään, kuinka sentrifugointinopeuden (rpm) funktiona esitetty 
sentrifugointiaika (t) vaihtelee eri maa-ainestiheyksillä ( ρ s ) (kuva 1b) ja 
silloin, kun seoksen pituus sentrifugiputkissa on erilainen (kuva 2a). Ku ­
vassa 1a näkyy selvästi maa-aineksen tiheyden vaikutus; esimerkiksi klas ­
sisella 3 000 rpm:n sentrifugoinnilla sentrifugointiaika on noin 240 minuuttia, kun maa-aineksen tiheys on 1,2 g/cm
 3 , ja vain 
50 minuuttia, kun tiheys on 2,0 g/cm  3 . Vastaavasti kuvasta 1b näkyy, 
kuinka klassisella 3 000 rpm:n sentrifugoinnilla sentrifugointiaika on noin 
50 minuuttia, kun seoksen pituus on 10 cm, ja vain 7 minuuttia, kun pituus on 1 cm. Sentrifugointituloksen kannalta on edullisinta, jos putkessa olevan seoksen pituus on mahdollisimman pieni, ja käsittely taas on helpointa, jos 
putkessa olevan seoksen pituus on suuri; tässä on löydettävä paras komp ­
romissi.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1224
 
5. Lisäksi silloin, kun määritellään koeolosuhteita maa-aines/liuos-faasien erot ­
telemiseksi, on tärkeää ottaa huomioon mahdollinen kolmannen ”pseudo ­
faasin” eli kolloidien olemassaolo. Näillä partikkeleilla, joiden koko on alle 0,2 μm, voi olla merkittävä vaikutus aineen koko adsorptiomekanismiin 
maa-ainessuspensiossa. Kun sentrifugointi suoritetaan edellä kuvatulla ta ­
valla, jäävät kolloidit vesifaasiin ja joutuvat analyysiin yhdessä vesifaasin 
kanssa. Tällöin tiedot niiden vaikutuksista jäävät saamatta.
 
Jos suorittavalla laboratoriolla on ultrasentrifugointi- tai ultrasuodatusmah ­
dollisuus, aineen adsorptiota/desorptiota maa-aineksessa voidaan tutkia sy ­
vemmin, mukaan lukien tiedot aineen adsorboitumisesta kolloideihin. Täl ­
löin olisi käytettävä ultrasentrifugointinopeutta 60 000 rpm/min tai ultra ­
suodatusta suodatinhuokoisuudella 100 000 Daltonia, jotta nämä kolme fa ­
asia voidaan erottaa: maa-aines, kolloidit, liuos. Testimenetelmää on myös muunneltava tämän mukaisesti, jotta kaikista kolmesta faasista voitaisiin 
suorittaa aineen analysointi.
 
Kuva 1a.
  
Sentrifugointinopeuden (rpm) funktiona esitetyn sentrifugointiajan (t) vaih ­
telu eri maa-ainestiheyksille  
(ρ s ) . R  t = 10 cm, R  b -R t = 10 cm, η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 ja p  aq = 
1,0 g cm  -3 , kun 25  o C. 
Kuva 1b.
  
Sentrifugointinopeuden (rpm) funktiona esitetyn sentrifugointiajan (t) 
vaihtelu silloin, kun sentrifugiputkessa olevan seoksen pituus on erilainen 
(Rb - Rt) = L; R  t = 10 cm, η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 , p aq = 1,0 g cm  -3 kun 
25 o C ja (ρ s ) = 2,0 g cm  -3 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1225
 
LISÄYS 5  
ADSORPTION A ( %) JA DESORPTION D ( %) LASKEMINEN  
Menettelyn aikakaavio on:
  
Kaikissa laskelmissa oletetaan, että testiaine on stabiili eikä adsorboidu merkit ­
tävästi astiaseinämiin.  
ADSORPTIO A (A %)  
a) Rinnakkaismenetelmä  
Adsorboitumisprosentti lasketaan kullekin koeputkelle (i) kullakin ajanhet ­
kellä (t  i ) seuraavan yhtälön mukaisesti:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 (%) (1) 
Tämän yhtälön tekijät voidaan puolestaan laskea seuraavasti: 
m 0 = C  0 · V 0 (μg) (2)  
m s ads ðt i Þ ¼ m  0 Ä C aq ads ðt i Þ · V 0 (μg) (3) 
joissa:  
A t i = adsorboitumisprosentti ( %) ajanhetkellä t  i 
m s ads ðt i Þ = testiaineen massa maa-aineksessa ajanhetkellä t  i , kun analyysi 
suoritetaan ( μg) 
m o = testiaineen massa koeputkessa testin alussa ( μg) 
C o = maa-aineksen kanssa kosketuksiin joutuvan testiliuoksen mas ­
sakonsentraatio alussa ( μg cm  -3 ) ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1226
 
C aq ads ðt i Þ = aineen massakonsentraatio vesifaasissa ajanhetkellä t  i, kun 
analyysi suoritetaan ( μg cm  -3 ); tämä konsentraatio määritetään 
analyyttisesti ottaen huomioon nollakokeista saadut arvot  
V o = maa-aineksen kanssa kosketuksiin joutuvan testiliuoksen al ­
kutilavuus (cm  3 ). 
Adsorboitumisprosenttien arvot  A t i tai C aq ads ðt i Þ esitetään ajan funktiona ja 
määritetään aika, joka kuluu sorptiotasapainotilan saavuttamiseen. Esimerk ­
kejä tällaisista käyristä esitetään kuvassa 1 ja kuvassa 2.
  
Kuva 1.  
adsorptiotasapainokäyrä
  
Kuva 2.  
Testiaineen massakonsentraatio vesifaasissa (C  aq ) ajan funktiona  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1227
 
b) Sarjamenetelmä  
Seuraavissa yhtälöissä otetaan huomioon, että adsorptiokoe suoritetaan mit ­
taamalla testiaine vesifaasin pienistä määräosista ja määrätyin aikavälein.  
— Kullakin aikavälillä maa-ainekseen adsorboituneen aineen määrä laske ­
taan seuraavasti:  
— emsimmâisella aikavâlilla Δt i = t i - t 0 
m s ads ðΔt 1 Þ ¼ m  0 Ä m m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î (4) 
— toisellä aikavälillä Δt 2 = t 2 - t 1 
m s ads ðΔt 2 Þ ¼ m m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î 
Ä m m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î (5) 
— kolmannella aikavälillä Δt 3 = t 3 - t 2 
m s ads ðΔt 3 Þ ¼ m m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î 
Ä m  m ads ðt 3 Þ · Í 
V 0 Ä 2 · v a A 
v a A Î (6) 
— ninnellä aikavälillä Δt n = t n - t n-1 
m s ads ðΔt n Þ ¼ m  m ads ðt nÄ1 Þ · Í 
V 0 Ä ðn Ä 2Þ · v a A 
v a A Î 
Ä m m ads ðt n Þ · V 0 Ä ðn Ä 1Þ · v a A Ê Ì  
v a A 0 
@ 1 
A (7) 
— Adsorboitumisprosentti kullakin aikavälillä,  A Δt i , lasketaan seuraavaa yhtälöä käyttäen:  
A Δt i ¼ m s ads ðΔt i Þ 
m 0 · 100 ð%Þ (8) 
kun taas adsorboitumisprosentti  A t i ajanhetkellä t  i saadaan yhtälöstä:  
A t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m s ads ðjÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (9) 
Adsorptioarvot  A t i tai A Δt i (tutkimuksen tarpeiden mukaisesti) esitetään 
ajan funktiona ja määritetään aika, joka kuluu sorptiotasapainotilan saa ­
vuttamiseen.  
— Ajanhetkellä, jolloin tasapainotila on saavutettu t  eq : 
— maa-ainekseen adsorboituneen testiaineen massa on:  
m s ads ðeqÞ ¼ Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (10) ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1228
 
— liuoksessa olevan testiaineen massa on:  
m aq ads ðeqÞ ¼ m  0 Ä Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (11) 
— ja adsorboitumisprosentti tasapainotilassa on:  
A eq ¼ m s ads ðeqÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (12) 
Edellä käytetyt muuttujat määritellään seuraavasti:  
m s ads ðΔt 1 Þ; m s ads ðΔt 2 Þ; :::; m s ads ðΔt n Þ = maa-ainekseen aikavälillä Δ t1 , 
Δ t2 ,..., Δ tn adsorboituneeksi jää ­
neen aineen massa ( μg) 
m m ads ðt 1 Þ; m m ads ðt 2 Þ; :::; m n ads ðt n Þ = määräosasta  v  a A mitatun aineen 
massa ajanhetkellä t  1 , t 2 ,t n (μg) 
m s ads ðeqÞ = maa-ainekseen adsorboituneen ai ­
neen massa adsorptiotasapainoti ­
lassa (μg) 
m s ads ðeqÞ = liuoksessa olevan aineen massa ad ­
sorptiotasapainotilassa ( μg) 
v a A = määräosan tilavuus, josta testiaine 
mitataan (cm  3 ) 
A Δt i = aikaväliä Δt i vastaava adsorboitu ­
misprosentti ( %)  
A eq = adsorboitumisprosentti adsorptiota ­
sapainotilassa ( %).  
DESORPTIO D ( %)  
Ajanhetki t  0 , jolloin desorptiokinetiikkakoe alkaa, on hetki, jolloin talteenotettu 
testiaineliuos, jonka tilavuus on suurimmillaan kun adsorptiotasapainotila on saa ­
vutettu, korvataan yhtä suurella tilavuusmäärällä 0,01 M CaCl  2 -liuosta.  
a) Rinnakkaismenetelmä  
Ajanhetkellä t  i mitataan testiaineen massa koeputkesta i ( V i 
r ) otetusta vesi ­
faasista ja desorboitunut massa lasketaan seuraavan yhtälön mukaisesti:  
m aq des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V 0 
v r i Î 
Ä m aq A (13) 
Desorptiotasapainotilassa t  i = t eq ja siten  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ 
Aikavälillä ( Δt i ) desorboituneen testiaineen massa saadaan yhtälöstä:  
m aq des ðΔt i Þ ¼ m  aq des ðt i Þ Ä Σ 
j ¼ 1 i ¼ 1 
m aq des ðjÞ (14) 
Desorboitumisprosentti lasketaan:  
ajanhetkellä t  i yhtälöstä:  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1229
 
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (15) 
ja aikavälillä ( Δt i ) yhtälöstä:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (16) 
jossa  
D t i = desorboitumisprosentti ajanhetkellä t  i ( %) 
D Δt i = aikaväliä Δt i vastaava desorboitumisprosentti ( %)  
m aq des ðt 1 Þ = ajanhetkellä t  i desorboituneen testiaineen massa ( μg) 
m aq des ðΔt 1 Þ = aikavälillä Δt i desorboituneen testiaineen massa ( μg) 
m m des ðt i Þ = analyyttisesti mitatun testiaineen massa ajanhetkellä t  i 
liuostilavuudessa  V r i , joka otetaan analyysiä varten ( μg) 
m aq A = epätäydellisen tilavuustäydennyksen vuoksi adsorptiotasa ­
painotilan ulkopuolelle jääneen testiaineen massa ( μg) 
m aq A ¼ m aq ads ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  (17) 
m aq ads ðeqÞ = liuoksessa olevan testiaineen massa adsorptiotasapainotilassa 
(μg) 
V R = adsorptiotasapainotilan saavuttamisen jälkeen koeputkesta 
poistetun supernatantin tilavuus, joka korvataan samalla tila ­
vuusmäärällä 0,01 M CaCl  2 -liuosta (cm  3 ) 
V r i = testiaineen mittaamiseksi koeputkesta (i) otetun liuoksen tila ­
vuus, desorptiokinetiikkakokeessa (cm  3 ). 
Desorptioarvot  D t i tai D Δt i (tutkimustarpeiden mukaisesti) esitetään ajan 
funktiona, ja desorptiotasapainotilan saavuttamiseen kuluva aika määrite ­
tään.  
b) Sarjamenetelmä  
Seuraavissa yhtälöissä otetaan huomioon se, että edeltänyt adsorptiokoe on 
suoritettu määrittämällä testiaine vesifaasin pienistä määräosista  ðv A 
a Þ (sarja­
menetelmä 1.9 kohdassa ”Testin suorittaminen”). Oletetaan, että: a) adsorp ­
tiokinetiikkakokeen jälkeen koeputkesta poistetun supernatantin tilavuus on korvattu samalla tilavuusmäärällä 0,01 M CaCl
 2 -liuosta (V  R ) ja b) maa-ainek ­
sen kanssa kosketuksiin joutuvan vesifaasin kokonaistilavuus (V  T ) säilyy 
desorptiokinetiikkakokeen aikana vakiona ja se saadaan yhtälöstä:  
V T ¼ V  0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v a A ðiÞ (18) ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1230
 
Ajanhetkellä t  i : 
— Testiaineen massa mitataan pienistä määräosista  ðv a D Þ ja desorboitunut 
massa lasketaan seuraavan yhtälön mukaisesti:  
m aq des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A · V T Ä ði Ä 1Þ · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A (19) 
— Desorptiotasapainotilassa t  i = t eq ja siten  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ. 
— Desorboitumisprosentti  D t i lasketaan seuraavasta yhtälöstä:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (20) 
Aikavälillä ( Δt i ): 
Kullakin aikavälillä desorboituneen aineen määrä lasketaan seuraavasti:  
— ensimmäisellä aikavälillä Δt 1 = t 1 - t 0 
m aq des ðΔt 1 Þ ¼ m  m des ðt 1 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A and m  s des ðt 1 Þ ¼ m  s aq ðeqÞ Ä m aq des ðΔt 1 Þ (21) 
— toisellä aikavälillä Δt 2 = t 2 - t 1 
m aq des ðΔt 2 Þ ¼ m  m des ðt 2 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq des ðΔt 1 Þ · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A Ä m  aq A · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
and 
m s des ðt 2 Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä m  aq des ðΔt 1 Þ þ m aq des ðΔt 2 Þ h i  
(22) 
— ninnellä aikavälillä n  th Δt n = t n - t n-1 
m aq des ðΔt n Þ ¼ Ï 
m m des ðt n Þ · V T 
v a D Í Î 
Ä m  aq A · V T Ä n Ä 1ð Þ  · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 nÄ1 V T Ä n Ä ið Þ  · v a D Ê Ì  
V T · m aq des ðΔt i Þ 0 
@ 1 
A # 
and 
m s des ðt n Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 n 
m aq des ðΔt i Þ (23) 
Lopuksi lasketaan desorboitumisprosentti kullakin aikavälillä,  D Δt i , seuraa­
vaa yhtälöä käyttäen:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (24) 
kun taas desorboitumisprosentti  D t i , ajanhetkellä t  i saadaan yhtälöstä:  
D t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m aq des ðjÞ 
m s ads ðeqÞ · 100 ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (25) ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1231
 
jossa edellä käytetyt muuttujat määritellään seuraavasti:  
m des 
aq ðΔt 1 Þ, m des 
aq ðΔt 2 Þ,... , m des 
s ðΔt n Þ = maa-ainekseen aikavälillä Δt 1 , 
Δt 2 , ..., Δt n adsorboituneeksi 
jääneen aineen massa ( μg) 
m des 
s ðΔt 1 Þ, m des 
s ðΔt 2 Þ,... , m des 
s ðΔt n Þ = aikavälillä Δt 1 , Δt 2 , ..., Δt n de­
sorboituneen testiaineen massa 
(μg) 
m des 
m ðt 1 Þ, m des 
m ðt 2 Þ,... , m des 
m ðt n Þ = määräosasta  ðv D 
a Þ mitatun ai ­
neen massa ajanhetkellä t  1 , t 2 , 
..., t  n (μg) 
V T = maa-aineksen kanssa kosketuk ­
siin joutuvan vesifaasin koko ­
naistilavuus sarjamenetelmällä suoritetun desorptiokinetiikka ­
kokeen aikana (cm
 3 ) 
m A 
aq = epätäydellisen tilavuustäyden ­
nyksen vuoksi adsorptiotasapai ­
notilan ulkopuolelle jääneen testiaineen massa ( μg)
 
m A 
aq ¼ V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 
Ä V R 
V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 0 
B B B @ 1 
C C C A · m
 ads 
aq ðeqÞ (26) 
V R = adsorptiotasapainotilan saavut ­
tamisen jälkeen koeputkesta poistetun supernatantin tilavuus, 
joka korvataan samalla tilavuus ­
määrällä 0,01 M CaCl
 2 -liuosta 
(cm  3 ) 
v D 
a = sarjamenetelmällä suoritetun de ­
sorptiokinetiikkakokeen aikana 
koeputkesta (i) analysoitavaksi otetun määräosan tilavuus (cm
 3 ) 
v D 
a ≤ 0; 02 · V T (27) ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1232
 
LISÄYS 6  
ADSORPTIO-DESORPTIO MAA-AINEKSISSA: TULOSTEN RAPORTOINTILOMAKE  
Testattu aine:  
Testattu maa-aines:  
Maa-aineksen kuiva-ainepitoisuus (105  o C. 12 h): %  
Lämpötila:  o C 
Analyysimenetelmän soveltuvuus  
Punnittu maa-aines g 
Maa-aines: kuivapaino g 
CaCl  2 -liuoksen tilavuus cm  3 
Loppuliuoksen nimelliskonsentraatio μg cm  -3 
Loppuliuoksen analyyttinen konsentraatio μg cm  -3 
Käytetyn analyysimenetelmän periaate: Analyysimenetelmän kalibrointi:  
Testattu aine:  
Testattu maa-aines:  
Maa-aineksen kuiva-ainepitoisuus (105  o C, 12 h): %  
Lämpötila:  o C 
Käytetty analyysimenetelmä: Epäsuora  □ Rinnakkais  □ Sarja  □ 
Suora □ 
Adsorptiotesti: testinäytteet  
Symboli Yksikkö Tasapainottu ­
misaika Tasapainottu ­
misaika Tasapainottu ­
misaika Tasapainottu ­
misaika  
Koeputki n:o 
Punnittu maa-aines — g Maa-aines: m
 soil g 
Veden tilavuus punnitussa maa- 
aineksessa (laskettu) V WS cm 3 
Maa-aineksen tasapainottami ­
seksi käytetyn 0,01 M CaCl  2 - 
liuoksen tilavuus cm 3 
Varastoliuoksen tilavuus cm  3 
Maa-aineksen kanssa kosketuk ­
siin joutuvan vesifaasin koko ­
naistilavuus V 0 cm 3 
Testiliuoksen alkukonsentraatio C  0 μg cm  -3 
Testiaineen massa testin alussa m  0 μg ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1233
 
Symboli Yksikkö Tasapainottu ­
misaika Tasapainottu ­
misaika Tasapainottu ­
misaika Tasapainottu ­
misaika  
Ravistelun ja sentrifugoinnin jälkeen  
EPÄSUORA MENETELMÄ 
Rinnakkaismenetelmä 
Testiaineen konsentraatio vesi ­
faa-sissa nollakokeen korjaus huomioituna
 C aq ads ðt i Þ μg cm  -3 
Sarjamenetelmä 
Testiaineen mitattu massa mää ­
räosassa V  A a m m ads ðt i Þ μg 
SUORA MENETELMÄ 
Maa-ainekseen adsorboituneen 
testiaineen massa  m s ads ðt i Þ μg 
Adsorption laskeminen 
Adsorptio  A  t i % 
A Δt i % 
Keskiarvo 
Adsorptiokerroin K  d cm 3 g -1 
Keskiarvo 
Adsorptiokerroin K  oc cm 3 g -1 
Keskiarvo  
Testattu aine:  
Testattu maa-aines:  
Maa-aineksen kuiva-ainepitoisuus (105  o C, 12 h): %  
Lämpötila:  o C 
Adsorptiotesti: nolla- ja vertailukokeet  
Symboli Yksikkö Nollakoe Nollakoe Vertailukoe  
Koeputki n:o 
Punnitut maa-ainekset g 0 0 
Veden määrä punnitussa maa-ainek ­
sessa (laskettu) cm 3 — — 
Lisätyn 0,01 M CaCl  2 ,-liuoksen tila ­
vuus cm 3 
Lisätyn testiaineen varastoliuoksen ti ­
lavuus cm 3 0 0 
Vesifaasin kokonaistilavuus (laskettu) cm  3 — —  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1234
 
Symboli Yksikkö Nollakoe Nollakoe Vertailukoe  
Vesifaasissa olevan testiaineen alku ­
konsentraatio μg cm  -3 
Ravistelun ja sentrifugoinnin jälkeen  
Konsentraatio vesifaasissa μg cm  -3 
Huomautus: sarakkeita voidaan tarvittaessa lisätä.  
Testattu aine:  
Testattu maa-aines:  
Maa-aineksen kuiva-ainepitoisuus (105  o C, 12 h): %  
Lämpötila:  o C 
Massatase  
Symboli Yksikkö  
Koeputki n:o 
Punnittu maa-aines — g 
Maa-aines: kuivapaino ms  oil g 
Punnitussa maa-aineksessa olevan veden 
tilavuus (laskettu) V WS ml 
Maa-aineksen tasapainottamiseksi käyte ­
tyn 0,01 M CaCl  2 -liuoksen määrä ml 
Varastoliuoksen tilavuus cm  3 
Maa-aineksen kanssa kosketuksiin joutu ­
van vesifaasin kokonaistilavuus V 0 cm 3 
Testiliuoksen C  0 μg cm  -3 
Tasapainottumisaika — h  
Ravistelun ja sentrifugoinnin jälkeen  
Testiainekonsentraatio vesifaasissa ad ­
sorptiotasapainotilassa nollakokeen kor ­
jaus huomioituna  C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
Tasapainottumisaika t  eq h 
1. laimennus liuotinta käyttäen 
Poistetun vesifaasin tilavuus V  rec cm 3 
Lisätyn liuottimen tilavuus ΔV cm  3 
1. uutto liuotinta käyttäen 
Analysaattorisignaali — liuotin S  E1 eril. 
Testiaineen konsentraatio liuottimessa C  E1 μg cm  -3 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1235
 
Symboli Yksikkö  
Maa-aineksesta ja astiaseinämistä uutetun 
aineen massa m E1 μg 
2. laimennus liuotinta käyttäen 
Poistetun liuottimen tilavuus ΔV s cm 3 
Lisätyn liuottimen tilavuus ΔV' cm  3 
2. uutto liuotinta käyttäen 
Analysaattorisignaali — liuotinfaasi S  E2 eril. 
Testiaineen konsentraatio liuottimessa C  E2 μg cm  -3 
Maa-aineksesta ja astiaseinämistä uutetun 
aineen massa m E2 μg 
Kahdessa vaiheessa uutetun testiaineen 
kokonaismassa m E μg 
Massatase MB %  
Testattu aine:  
Testattu maa-aines:  
Maa-aineksen kuiva-ainepitoisuus (105  o C, 12 h):  
Lämpötila:  
Adsorptioisotermit  
Symboli Yksikkö  
Koeputki n:o 
Punnittu maa-aines — g Maa-aines: kuivapaino E g Veden tilavuus punnitussa maa- 
aineksessa (laskettu) V
 WS cm 3 
Maa-aineksen tasapainottami ­
seksi käytetyn 0,01 M CaCl  2 - 
liuoksen tilavuus cm 3 
Lisätyn varastoliuoksen tilavuus cm  3 
Maa-aineksen kanssa kosketuk ­
siin joutuvan vesifaasin koko ­
naistilavuus (laskettu) V 0 cm 3 
Liuoskonsentraatio C  0 μg cm  -3 
Tasapainottumisaika — h  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1236
 
Symboli Yksikkö  
Ravistelun ja sentrifugoinnin jälkeen  
Aineen konsentraatio vesifaa ­
sissa nollakokeen korjaus huo ­
mioituna  C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
Lämpötila  o C 
Maa-ainesyksikköä kohden ad ­
sorboitunut massa  C s ads ðeqÞ μg g  -1 
Regressioanalyysi:  
K F ads -arvo:  
l/n-arvo:  
regressiokerroin r  2 : 
Testattu aine:  
Testattu maa-aines:  
Maa-aineksen kuiva-ainepitoisuus (105  o C, 12 h):  
Lämpötila: 
Käytetty analyysimenetelmä: Epäsuora  □ Rinnakkais  □ Sarja  □ 
Desorptiotesti  
Symboli Yksiköt Aikaväli Aikaväli Aikaväli Aikaväli  
Adsorptiovaiheesta saatavan koeputken 
n:o 
Maa-ainekseen adsorboituneen aineen 
massa adsorptiotasapainotilassa  m s ads ðeqÞ μg 
Poistetun vesifaasin tilavuus, korvataan 
0,01 M CaCl  2 :lla V R cm 3 
Maa-aineksen kanssa kos ­
ketuksiin joutuvan vesi ­
faasin kokonaistilavuus RM V  0 cm 3 
SM V  T cm 3 
Epätäydellisen tilavuustäydennyksen 
vuoksi adsorptiotasapainotilan ulkopuo ­
lelle jäävän testiaineen massa  m aq A μg 
Desorptiokinetiikka  
Ajanhetkellä t  i mitatun maa-aineksesta 
desorboituneen aineen massa  m m des ðt i Þ μg 
Koeputkesta (i) testiaineen 
mittaamiseksi otetun 
liuoksen tilavuus RM V  r i cm 3 
SM v  a D cm 3 
Ajanhetkellä t  i maa-aineksesta desorboi ­
tuneen aineen massa (laskettu)  m aq des ðt i Þ μg 
Aikavälillä Δt i maa-aineksesta desorboi ­
tuneen aineen massa (laskettu)  m aq des ðΔt i Þ μg ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1237
 
Symboli Yksiköt Aikaväli Aikaväli Aikaväli Aikaväli  
Desorboitumisprosentti  
Desorptio ajanhetkellä t  i D ti % 
Desorptio aikavälillä Δt i D Δt i % 
Näennäinen desorptiokerroin K  des 
RM: Rinnakkaismenetelmä  
SM: Sarjamenetelmä  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1238
 
C.19  MAA-AINEKSIIN JA VIEMÄRILIETTEESEEN SOVELLETTAVAN 
ADSORPTIOKERTOIMEN (K  oc ) MÄÄRITYS KORKEAN 
SUORITUSKYVYN NESTEKROMATOGRAFIALLA (HPLC)  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä on toisinto OECD:n testimenetelmästä TG 121 
(2000).  
1.1 JOHDANTO  
Aineiden sorptiokäyttäytymistä maa-aineksiin ja viemärilietteeseen 
voidaan kuvata muuttujilla, jotka voidaan määrittää kokeellisesti tes ­
timenetelmällä C 18. Tärkeä muuttuja on adsorptiokerroin, joka on määritelmän mukaan aineen maa-aineksessa tai viemärilietteessä ole ­
van konsentraation ja adsorptiotasapainossa vesifaasissa olevan kon ­
sentraation suhde. Maa-aineksen orgaanisen hiilen pitoisuuden suh ­
teen normalisoitua adsorptiokerrointa K
 oc voidaan käyttää osoitta ­
maan kemiallisen aineen sitoutumiskykyä maa-aineksen tai viemäri ­
lietteen orgaaniseen ainekseen, jolloin eri kemikaaleja voidaan ver ­
rata. Tämä muuttuja voidaan arvioida vesiliukoisuuden ja n-oktanoli- vesijakautumiskertoimen suhteen tehtyjen korrelaatioiden avulla (1) (2) (3) (4) (5) {6} (7).
 
Tässä testiohjeessa kuvatussa menetelmässä käytetään HPLC:tä ad ­
sorptiokertoimen K  oc määrittämiseksi maa-aineksessa ja viemäriliet ­
teessä (8). Estimaatit ovat luotettavampia kuin QSAR-laskelmista 
saadut (9). Estimointimenetelmänä tämä menetelmä ei kuitenkaan 
voi täysin korvata testimenetelmässä C 18 kuvattua erätasapainome ­
netelmää. Estimoitua K  oc -arvoa voidaan kuitenkin käyttää valittaessa 
testimuuttujia testimenetelmän C 18 mukaan tehtäviin adsorptio-de ­
sorptiokokeisiin laskemalla K  d (jakautumiskerroin) tai K  f (Freundli­
chin adsorptiokerroin) yhtälöstä 3 (jakso 1.2).  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
K d : jakautumiskerroin: liuenneen testiaineen tasapainokonsentraatioi ­
den C suhde kaksifaasijärjestelmässä, joka koostuu sorbentista (maa- 
aines tai viemäriliete) ja vesifaasista. Arvo on paljas luku, jos kon ­
sentraatiot on ilmaistu molemmissa faaseissa painoyksiköissä. Jos vesifaasin konsentraatio ilmaistaan painoyksikköinä tilavuusyksikköä 
kohti, laatu on ml · g
 -1 . K d voi vaihdella sorbentin ominaisuuksien 
mukaan, ja se voi olla konsentraatiosta riippuvainen.  
K d ¼ C soil 
C aq or C sludge 
C aq (1) 
jossa:  
C soil = testiaineen tasapainokonsentraatio maa-aineksessa 
(μg · g -1 ) 
C sludge  = testiaineen tasapainokonsentraatio viemärilietteessä 
(μg · g -1 ) 
C aq| = testiaineen tasapainokonsentraatio vesifaasissa ( μg · g -1 , 
μg · ml  -1 ). ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1239
 
K f : Freundlichin adsorptiokerroin: testiaineen konsentraatio maa-ai ­
neksessa tai viemärilietteessä (x/m), kun tasapainokonsentraatio ve ­
sifaasissa (C  aq ) on yksi; laatu on μg · g -1 sorbenttia. Arvo voi vaih ­
della sorbentin ominaisuuksien mukaan.  
log x 
m ¼ logK  f þ 1 
n ·logC  aq (2) 
jossa:  
x/m = sorbentin määrään m (g) adsorboituneen testiaineen määrä x 
(μg) tasapainotilassa  
l/n = Freundlichin adsorptioisotermikuvaajan kulmakerroin  
C aq = testiaineen tasapainokonsentraatio vesifaasissa ( μg · ml  -1 ) 
AtC aq ¼ 1; logK  f ¼ log x 
m 
K oc : Sorbentin orgaanisen hiilen pitoisuuden (f  oc ) suhteen normali ­
soitu aineen jakautumiskerroin (K  d ) tai ainetta koskeva Freundlichin 
adsorptiokerroin (K  f ). Erityisesti ionisoitumattomille kemikaaleille se 
osoittaa suunnilleen aineen ja sorbentin välisen adsorption määrän, ja sen avulla voidaan verrata eri kemikaaleja. K
 d :n ja K  f :n laaduista 
riippuen K  oc voi olla laaduton tai sen laatu voi olla ml · g -1 tai 
μg · g -1 orgaanista ainetta.  
Koc ¼ Kd 
foc ððlaaduton tai ml ·g Ä1 Þtai Kf 
foc ðμg·g Ä1 Þ (3) 
K oc :n ja K  d :n suhde ei ole aina lineaarinen, ja siten K  oc -arvot voivat 
vaihdella maa-ainesten välillä, mutta vaihtelun määrä on paljon pie ­
nempi kuin K  d - tai K  f -arvojen vaihtelu.  
Adsorptiokerroin (K  oc ) johdetaan kapasiteettikertoimesta (k'} käyttä ­
mällä kuvaajaa, jossa log k' esitetään log K  oc :n funktiona valikoi ­
duille vertailuyhdisteille.  
k 0 ¼ t R Ä t 0 
t 0 (4) 
jossa:  
t R = testiaineen ja vertailuaineen HPLC-retentioaika (minuuttia)  
t 0 = HPLC:n kuollut aika (minuuttia) (ks. jakso 1.8.2).  
P ow : Oktanoli-vesijakautumiskerroin: n-oktanoliin liukenevan ja ve ­
teen liukenevan aineen konsentraatioiden suhde, joka on laaduton 
suure.  
Pow ¼ Coktanoli 
Caq ð¼ KowÞ (5) 
1.3 VERTAILUAINEET  
Aineen rakennekaava, puhtaus ja hajoamisvakio (tarvittaessa) olisi 
tiedettävä ennen kuin menetelmää käytetään. Veteen ja orgaanisiin 
liuottimiin liukenemista, oktanoli-vesijakautumiskerrointa ja hydro ­
lyysiominaisuuksia koskevat tiedot ovat hyödyllisiä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1240
 
Jotta mitatut HPLC-retentiotulokset voidaan korreloida aineen ad ­
sorptiokertoimen K  oc kanssa, on laadittava kalibrointikuvaaja, jossa 
log K  oc esitetään log k':n funktiona. Kuvaajassa on oltava vähintään 
kuusi referenssipistettä, joista vähintään yhden on oltava testiaineen odotetun arvon yläpuolella ja yhden sen alapuolella. Menetelmän 
tarkkuus paranee huomattavasti, jos vertailuaineet ovat rakenteeltaan 
testiaineen kaltaisia. Jos tällaisia tietoja ci ole saatavilla, käyttäjän on valittava sopivat kalibrointiaineet. Siinä tapauksessa olisi valittava rakenteellisesti heterogeenisiä aineita. Käyttökelpoisia aineita ja 
K
 oc -arvoja esitetään viemärilietteelle lisäyksen taulukossa 1 ja maa- 
aineksille taulukossa 3. Jos valitaan muita kalibrointiaineita, ne on perusteltava.
 
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
HPLC tehdään analyyttisillä pylväillä, jotka on pakattu kaupallisesti 
saatavilla lipofiilisiä ja polaarisia osia sisältävillä syanopropyylipoh ­
jaisilla kiinteillä faaseilla. Stationaarifaasina käytetään suhteellisen 
polaarista silikamatriisipohjaista ainetta: 
— O — Si — CH  2 — CH  2 — CH  2 — CN 
silika pooliton spacer-aine polaarinen 
osa 
Testimenetelmän periaate on samankaltainen kuin testimenetelmän A 
8 (jakautumiskerroin, HPLC-menetelmä) periaate. Kun testiaine kul ­
kee pylvään läpi liikkuvan faasin mukana, se reagoi stationaarifaasin kanssa. Koska testiaine jakautuu liikkuvaan ja stationaariseen faasiin, 
sen kulku hidastuu. Koska stationaarifaasissa on sekä polaarisia että 
poolittomia paikkoja, sekä molekyylin polaariset että poolittomat ryhmät voivat reagoida samalla tavalla kuin maa-aineksen tai viemä ­
rilietteen sisältämän orgaanisen aineksen kanssa. Tämän ansiosta voi ­
daan määrittää pylvääseen liittyvän retentioajan ja orgaaniseen ainee ­
seen tapahtuvan imeytymisen adsorptiokertoimen välinen suhde.
 
pH:lla on huomattava vaikutus sorptiokäyttäytymiseen erityisesti po ­
laarisilla aineilla. Maanviljelysmaa-aineksissa tai viemärivesien käsit ­
telylaitosten tankeissa pH vaihtelee tavallisesti välillä 5,5 - 7,5. Ioni ­
soituville aineille olisi tehtävä kaksi testiä sekä ionisoituneessa että 
ionittomassa muodossa sopivissa puskuriliuoksissa, mutta vain silloin, kun vähintään 10 % testiaineesta dissosioituu välillä pH 5,5 - 7,5.
 
Koska arviointiin käytetään vain HPLC-pylvästä koskevan retentioajan 
ja adsorptiokertoimen välistä suhdetta, kvantitatiivista määritysmenetel ­
mää ei tarvita ja vain retentioajan määritys on tarpeen. Jos on käytettä ­
vissä sopivia vertailuaineita ja koeolosuhteet ovat vakioidut, tämä me ­
netelmä on nopea ja tehokas keino arvioida adsorptiokerroin K  oc . 
1.5 TESTIN SOVELTAMISALA  
HPLC-menetelmä sopii sellaisille kemiallisille aineille (riippumatta 
siitä, onko niissä erityisiä merkkiaineita tai esim. radioaktiivista lei ­
maa), joille on käytettävissä sopiva detektiomenetelmä (esim. spekt ­
rofotometrinen tai radioaktiivisen säteilyn mittalaite) ja jotka pysyvät riittävän stabiileina kokeen aikana. Menetelmä voi olla erityisen hyvä sellaisille aineille, joita on vaikea tutkia muunlaisissa koejärjeste ­
lyissä (ts. haihtuvat aineet tai aineet, jotka eivät liukene veteen sel ­
laisessa pitoisuudessa, että se voidaan mitata tarkasti; aineet, joilla on suuri affiniteetti inkubaatiojärjestelmien pintaan). Menetelmää voi ­
daan käyttää seoksille, joiden eluutiovyöhykkeet eivät erotu toisis ­
taan. Silloin olisi ilmoitettava testiseokseen sisältyvien yhdisteiden 
log K
 oc -arvojen ylä- ja alarajat.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1241
 
Epäpuhtaudet voivat joskus aiheuttaa ongelmia HPLC-tulosten tul ­
kinnassa, mutta ne eivät juurikaan aiheuta ongelmia, jos testiaine 
voidaan tunnistaa analyyttisesti ja erottaa epäpuhtauksista.  
Menetelmä on validoitu lisäyksessä olevassa taulukossa 1 luetelluille 
aineille. Sitä sovellettiin myös useille muille kemikaaleille, jotka 
kuuluivat seuraaviin kemiallisiin luokkiin:  
— aromaattiset amiinit (esim. trifluraliini, 4-kloorianiliini, 3,5-dinit ­
roaniliini, 4-metyylianiliini, N-metyylianiliini, 1-naftyyliamiini)  
— aromaattiset karboksyylihappoesterit (esim. bentsoehappometyy ­
liesteri, 3,5-dinitrobentsoehappometyyliesteri)  
— aromaattiset hiilivedyt (esim. tolueeni, ksyleeni, etyylibentseeni, 
nitrobentseeni)  
— aryylioksifenoksipropionihappoesterit (esim. diklofoppi-metyyli, 
fenoksaproppi-etyyli, fenoksaproppi-P-etyyli)  
— bentsimidatsoli- ja imidatsolifungisidit (esim. karbendatsiimi, fu ­
beridatsoli, triatsoksidi)  
— karboksyylihappoamidit (esim. 2-klooribentsamidi, N,N-dimetyy ­
libentsamidi, 3,5-dinitrobentsamidi, N-metyylibentsamidi, 2-nitro ­
bentsamidi, 3-nitrobentsamidi)  
— klooratut hiilivedyt (esim. endosulfaani, DDT, heksaklooribent ­
seeni, kvintotseeni, 1,2,3-triklooribentseeni)  
— orgaanisia fosforiyhdisteitä sisältävät torjunta-aineet (esim. atsin ­
fossi-metyyli, disulfotoni, fenamifossi, isofenfossi, pyratsofossi, sulprofossi, triatsofossi)
 
— fenolit (esim. fenoli, 2-nitrofenoli, 4-nitrofenoli, pentakloorifeno ­
li, 2,4,6-trikloorifenoli, 1-naftoli)  
— tenyyliurea-johdannaiset (esim. isoproturoni, monolinuroni, pen ­
sykuroni)  
— väriaineet (esim. Acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct Red 
81) 
— polyaromaattiset hiilivedyt (esim. asenafteeni, naftaleeni)  
— 1,3,5-triatsiinia sisältävät kasvinsuojeluaineet (esim. prometryyni, 
propatsiini, simatsiini, terbutryyni)  
— triatsolijohdannaiset (esim. tebukonatsoli, triadimefoni, tradime ­
noli, triapentenoli).  
Menetelmä ei sovellu aineille, jotka reagoivat joko eluentin tai sta ­
tionaarifaasin kanssa. Se ei myöskään sovellu aineille, jotka reagoi ­
vat spesifisellä tavalla epäorgaanisten yhdisteiden kanssa (jos esim. muodostuu klusterikomplekseja saven mineraalien kanssa). Mene ­
telmä ei mahdollisesti sovellu myöskään pinta-aktiivisille aineille, 
epäorgaanisille yhdisteille eikä vahvoille tai melko vahvoille hapoille ja emäksille. Välillä 1,5 - 5,0 olevia log K
 oc -arvoja voidaan mää ­
rittää. Ionisoituvat yhdisteet on määritettävä käyttäen puskuroitua 
liikkuvaa faasia, mutta on varottava, etteivät puskurin sisältämät ai ­
neet tai testiaine saostu.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1242
 
1.6 LAATUVAATIMUKSET  
1.6.1  Tarkkuus  
Testiaineen adsorptiokerroin voidaan tavallisesti arvioida ± 0,5 loga ­
ritmiyksikön tarkkuudella verrattuna erätasapainomenetelmällä mää ­
ritettyyn arvoon (ks. lisäyksessä oleva taulukko 1). Suurempaan tark ­
kuuteen voidaan päästä, jos vertailuaineet ovat rakenteellisesti testi ­
aineen kaltaisia.  
1.6.2  Toistettavuus  
Määritykset olisi tehtävä vähintään kaksoismäärityksinä. Yksittäisistä 
mittauksista lasketut log K  oc -arvot eivät saisi erota toisistaan enem ­
män kuin 0,25 logaritmiyksikköä.  
1.6.3  Uusittavuus  
Menetelmää sovellettaessa saadut kokemukset tukevat käsitystä me ­
netelmän validiteetista. Kun HPLC-menetelmää tutkittiin 48 aineella 
(enimmäkseen torjunta-aineita), joista oli saatavilla luotettavia maa- 
ainesten K  oc :tä koskevia tietoja, saatiin korrelaatiokertoimeksi R = 
0,95 (10) (11).  
Menetelmän parantamiseksi ja validoimiseksi tehtiin laboratorioiden 
välinen vertailukoe, johon osallistui 11 laboratoriota (12). Tulokset esitetään lisäyksessä olevassa taulukossa 2.
 
1.7 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.7.1  Adsorptiokertoimen alustava määritys  
Oktanoli-vesijakautumiskerrointa P  ow (= K  ow ) ja (jossain määrin) 
vesiliukoisuutta voidaan käyttää osoittamaan adsorption määrää eri ­
tyisesti ionisoitumattomille yhdisteille, ja siten sen avulla voidaan alustavasti määrittää kyseeseen tuleva mittausalue. Useille kemikaa ­
liryhmille on julkaistu useita käyttökelpoisia korrelaatioita (1) (2) (3) 
(4) (5) (6) (7).
 
1.7.2  Laitteet  
Menetelmässä tarvitaan nestekromatografi, jossa on pulssittomasti 
toimiva pumppu ja sopiva detektori. On suositeltavaa käyttää injek ­
tioventtiiliä ja injektiosilmukkaa. Pylvään pakkausaineena on käytet ­
tävä kaupallista kemiallisesti sidottua silikapohjaista syaanopropyy ­
lihartsia (esim. Hypersil ja Zorbax CN). Samaa ainetta oleva esipyl ­
väs voidaan liittää injektiojärjestelmän ja analyyttisen pylvään väliin. 
Eri valmistajien pylväiden erotustehot voivat erota huomattavasti 
toisistaan. Ohjeellisesti pitäisi pyrkiä seuraavanlaisiin kapasiteettiker ­
toimiin k': log k' > 0,0, kun log K  oc = 3,0 ja log k' > -0,4, kun log 
K oc = 2,0 käytettäessä metanoli/vesiseosta (55/45 %) liikkuvana faa ­
sina. 
1.7.3  Liikkuva faasi  
Useita liikkuvia faaseja on testattu, ja seuraavia kahta suositetaan:  
— metanoli/vesi (55/45 % v/v)  
— metanoli/0,01 M sitraattipuskuri, pH 6,0 (55/45 % v/v)  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1243
 
Eluutioliuoksen valmistukseen on käytettävä HPLC-laatuista metano ­
lia ja tislattua vettä tai sitraattipuskuria. Seoksesta poistetaan kaasut 
ennen käyttöä. Eluution pitäisi olla isokraattinen. Jos metanoli-vesi ­
seokset eivät sovellu, voidaan kokeilla muita orgaanisen liuottimen ja veden seoksia, esim. etanoli-vesi- tai asetonitriili-vesiseoksia. Ioni ­
soituville yhdisteille suositetaan puskuriliuoksen käyttöä pH:n pitä ­
miseksi vakiona. Suolan saostumista ja pylvään suoritustehon hei ­
kentymistä on pyrittävä välttämään. Se voi tapahtua käytettäessä tiettyjä orgaanisia faaseja ja puskuriseoksia.
 
Mitään sellaisia lisäaineita kuten ioniparireagensseja ei saa käyttää, 
koska ne voivat vaikuttaa stationaarifaasin sorptio-ominaisuuksiin. Tällaiset stationaarifaasin muutokset voivat olla palautumattomia. 
Siksi kokeet, joissa käytetään lisäaineita, on ehdottomasti tehtävä 
eri pylväillä.
 
1.7.4  Liuotetut aineet  
Testi- ja vertailuaine olisi liuotettava liikkuvaan faasiin.  
1.8 TESTIN SUORITUSTEHO  
1.8.1  Testiolosuhteet  
Lämpötila olisi rekisteröitävä mittausten aikana. Suositellaan, että 
käytetään termostoitua pylvästä, jotta voidaan varmistaa vakio-olo ­
suhteet kalibrointimittausten ja alustavien ajojen sekä testiaineen määritysten aikana.
 
1.8.2  Kuollut aika t  o 
Kuollut aika t  o voidaan määrittää kahdella eri menetelmällä (ks. 
myös jakso 1.2).  
1.8.2.1  Kuolleen ajan t  o määritys homologisen sarjan avulla  
Tämän menetelmän on osoitettu antavan luotettavia ja vakioituja t  o - 
arvoja. Menetelmä selostetaan yksityiskohtaisesti testimenetelmässä 
A.8: Partitiokerroin (n-oktanoli/vesi), HPLC-menetelmä.  
1.8.2.2  Kuolleen ajan t  o määritys inerteillä aineilla, jotka eivät tartu pylvää ­
seen 
Tämä menetelmä perustuu formamidi-, urea- tai natriumnitraattiliu ­
osten injektoimiseen. Määritykset olisi tehtävä vähintään kaksois ­
määrityksinä.  
1.8.3  Retentioaikojen t  R määritys  
Vertailuaineet olisi valittava kuten jaksossa 1.3 selostetaan. Ne voi ­
daan injektoida seosstandardina retentioaikojen määrittämiseksi, mi ­
käli on vahvistettu, että toisten vertailuaineiden läsnäolo ei vaikuta yksittäisten vertailuaineiden retentioaikoihin. Kalibrointi olisi tehtävä 
säännöllisin väliajoin vähintään kahdesti päivässä, jotta pylväiden 
mahdolliset suorituskyvyn muutokset voidaan selittää. Kalibrointiajot olisi tehtävä mieluiten ennen testiaineen injektioita ja niiden jälkeen, jotta voidaan varmistaa, etteivät retentioajat ole muuttuneet. Testi ­
aineet injektoidaan erikseen mahdollisimman pieninä määrinä (pyl ­
vään ylikuormituksen estämiseksi), ja niiden retentioajat määritetään.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1244
 
Määritysten luotettavuuden lisäämiseksi olisi tehtävä vähintään kak ­
soismääritykset. Yksittäisistä mittauksista lasketut log K  oc -arvot eivät 
saisi erota toisistaan enemmän kuin 0,25 logaritmiyksikköä.  
1.8.4  Arviointi  
Kapasiteettikertoimet k' lasketaan valittujen vertailuaineiden kuol ­
leesta ajasta t  o ja retentioajoista t  R yhtälön 4 avulla (ks. jakso 1.2). 
Laaditaan kuvaaja, jossa esitetään vertailuaineiden log k' -arvot erä ­
tasapainokokeesta saatujen, lisäyksen taulukoissa 1 ja 3 esitettyjen 
vertailuaineita koskevien log K  oc -arvojen funktiona. Testiaineen log 
K oc -arvo määritetään sen log k' -arvon perusteella kyseisen kuvaajan 
avulla. Jos testiaineen log K  oc osoittautuu todellisten tulosten perus ­
teella olevan kalibrointialueen ulkopuolella, testi olisi toistettava 
käyttäen sopivampia vertailuaineita.  
2. MITTAUSTULOKSET JA TESTISELOSTEET  
Testiselosteessa on esitettävä tai selostettava seuraavat asiat:  
— testiaineiden ja vertailuaineiden tunnistetiedot ja niiden puhtaus 
sekä pK  a -arvot tarvittaessa,  
— laitteet ja toimintaolosuhteet, esim. analyyttisen (ja esi-) pylvään 
tyyppi ja mitat, detektiomenetelmä, liikkuva faasi (ainesten suh ­
teelliset osuudet ja pH), lämpötila-alue mittausten aikana,  
— kuollut aika ja sen määrittämiseen käytetty menetelmä,  
— pylvääseen injektoitujen testiaineiden ja vertailuaineiden määrät,  
— kalibrointiin käytettyjen vertailuaineiden retentioajat,  
— sovitettua regressiokuvaajaa (log k' vs log K  oc ) koskevat tiedot ja 
itse kuvaaja,  
— testatun yhdisteen keskimääräinen retentioaika ja estimoitu d log 
K oc -arvo,  
— kromatogrammit.  
3. KIRJALLISUUSVIITTEET  
(1) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). (1990). 
Handbook of chemical property estimation methods, Chapt. 4, 
McGraw-Hill, New York.  
(2) J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the 
adsorption coefficient (K  oc ) for soils by HPLC. Chemosphere, 
17, 167.  
(3) G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relations ­
hips between soil adsorption, octanol-water partition coeffici ­
ents, water solubilities, bioconcentration factors, and the pa ­
rachor. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050-1059.  
(4) C. T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition 
equilibria of nonionic organic compounds between soil orga ­
nic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, pp. 227-231.  
(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic subs ­
tances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, 
pp. 297-312.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1245
 
(6) C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical 
concept of soil water equilibria for nonionic organic compo ­
unds, Science, 106, pp. 831-832.  
(7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, pp. 833-846.
 
(8) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application 
of the HPLC-screening method for the determination of the 
adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35 ­
(1/2), pp. 121-128.  
(9) M. Mueller, W. Kördel (1996).Comparison of screening met ­
hods for the estimation of adsorption coefficients on soil. 
Chemosphere, 32(12), pp. 2493-2504.  
(10) W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphe ­
re, 27(12), pp. 2341-2352.
 
(11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of 
nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measure ­
ments and experience with the applicability of the modified 
OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, pp. 285-304.  
(12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Muller (1995). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), pp. 1373-1384.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1246
 
LISÄYS  
Taulukko 1  
Maa-ainesten ja viemärilietteiden K  oc -arvojen ja kartoittavan HPLC menetelmän perusteella laskettujen arvojen 
vertailu  ( 1 ) ( 2 ) 
Aine CAS-nro Log K  oc 
viemäriliet ­
teet Log K  oc 
HPLC Δ Log K  oc 
maa-ainek ­
set Log K  oc 
HPLC Δ 
Atratsiini 1912-24-9 1,66 2,14 0,48 1,81 2,20 0,39 
Linuroni 330-55-2 2,43 2,96 0,53 2,59 2,89 0,30 Fentioni 55-38-9 3,75 3,58 0,17 3,31 3,40 0,09 Monuroni 150-68-5 1,46 2,21 0,75 1,99 2,26 0,27 Fenantreeni 85-01-8 4,35 3,72 0,63 4,09 3,52 0,57 Bentsoehappofenyyliesteri 93-99-2 3,26 3,03 0,23 2,87 2,94 0,07 Bentsamidi 55-21-0 1,60 1,00 0,60 1,26 1,25 0,01 4-Nitrobcntsamidi 619-80-7 1,52 1,49 0,03 1,93 1,66 0,27 Asetanilidi 103-84-4 1,52 1,53 0,01 1,26 1,69 0,08 Aniliini 62-53-3 1,74 1,47 0,27 2,07 1,64 0,43 2,5-Dikloorianiliini 95-82-9 2,45 2,59 0,14 2,55 2,58 0,03
 
( 1 ) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption 
coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), s. 121–128. 
( 2 ) W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludge s. 
Chemosphere, 35 (1/2), s. 107–119.  
Taulukko 2  
Tulokset 11 laboratorion välisestä vertailusta, jonka tarkoituksena oli parantaa ja validoida HPLC-menetelmä  ( 1 ) 
Aine CAS-nro log K  oc K oc log K  oc 
[OECD 106] [HPLC-menetelmä]  
Atratsiini 1912-24-9 1,81 78 ± 16 1,89 
Monuroni 150-68-5 1,99 100 ± 8 2,00 Triapentenoli 77608-88-3 2,37 292 ± 58 2,47 Linuroni 330-55-2 2,59 465 ± 62 2,67 Fentioni 55-38-9 3,31 2062 ± 648 3,31
 
( 1 ) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil- 
results of a ring test. Chemosphere, 30(7), s. 1373–1384.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1247
 
Taulukko 3  
Kartoittavaan HPLC-menetelmään suositellut vertailuaineet; tiedot perustuvat maa-ainesten adsorptiotuloksiin  
Vertailuaine CAS-nro Erätasapainosta 
saadut log K  oc 
-arvojen keski ­
arvot K oc -tulosten 
lukumäärä Log S.D. Lähde  
Asetanilidi 103-84-4 1,25 4 0,48 (  a ) 
Fenoli 108-95-2 1,32 4 0,70 (  a ) 
2-Nitrobentsamidi 610-15-1 1,45 3 0,90 (  b ) 
N, N-Dimetyylibentsamidi 611-74-5 1,52 2 0,45 (  a ) 
4-Metyylibentsamidi 619-55-6 1,78 3 1,76 (  a ) 
Metyylibentsoaatti 93-58-3 1,80 4 1,08 (  a ) 
Atratsiini 1912-24-9 1,81 3 1,08 (  c ) 
Isoproturoni 34123-59-6 1,86 5 1,53 (  c ) 
3-Nitrobentsamidi 645-09-0 1,95 3 1,31 (  b ) 
Aniliini 62-53-3 2,07 4 1,73 (  a ) 
3,5-Dinitrobentsamidi 121-81-3 2,31 3 1,27 (  b ) 
Karbendatsiimi 10605-21-7 2,35 3 1,37 (  c ) 
Triadimenoli 55219-65-3 2,40 3 1,85 (  c ) 
Triatsoksidi 72459-58-6 2,44 3 1,66 (  c ) 
Triatsofossi 24017-47-8 2,55 3 1,78 (  c ) 
Linuroni 330-55-2 2,59 3 1,97 (  c ) 
Naftaleeni 91-20-3 2,75 4 2,20 (  a ) 
Endosulfaani-dioli 2157-19-9 3,02 5 2,29 (  c ) 
Metiokarbi 2032-65-7 3,10 4 2,39 (  c ) 
Acid Yellow 219 63405-85-6 3,16 4 2,83 (  a ) 
1,2,3-Triklooribentseeni 87-61-6 3,16 4 1,40 (  a ) 
γ-HCH 58-89-9 3,23 5 2,94 (  a ) 
Fentioni 55-38-9 3,31 3 2,49 (  c ) 
Direct Red 81 2610-11-9 3,43 4 2,68 (  a ) 
Pyratsofossi 13457-18-6 3,65 3 2,70 (  c ) 
α-Endosulfaani 959-98-8 4,09 5 3,74 (  c ) 
Diklofoppi-metyyli 51338-27-3 4,20 3 3,77 (  c ) 
Fenantreeni 85-01-8 4,09 4 3,83 (  a ) 
Basic Blue 41 (seos) 26850-47-5 
12270-13-2 4,89 4 4,46 (  a ) 
DDT 50-29-3 5,63 1 — (  b ) 
( a ) W. Kördel. J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D 
Report No 106 01 044 (1994). 
( b ) B.V. Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Chemosphere, 22. s. 285–304. 
( c ) Data provided by industry.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1248
 
C.20.  LISÄÄNTYMISTESTI VESIKIRPULLA ( DAPHNIA MAGNA ) 
1. MENETELMÄ  
Tämä lisääntymismyrkyllisyyden testimenetelmä on toisinto OECD:n 
testiohjeesta TG 211 (1998).  
1.1 JOHDANTO  
Testin pääasiallinen tarkoitus on määrittää kemikaalien vaikutus ve ­
sikirpun lisääntymistuotokseen.  
1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT  
Emoeläimet:  Naarasvesikirput, jotka ovat mukana testin alussa ja 
joiden lisääntymistuotos määritetään.  
Jälkeläiset:  Nuoret vesikirput, joita emoeläimet tuottavat testin aikana.  
LOEC (Lowest Observed Effect Concentration):  Pienin testipitoi ­
suus, jolla aineen havaitaan aiheuttavan tilastollisesti merkittävän vaikutuksen (todennäköisyystasolla p < 0,05) lisääntymiseen ja emo ­
kuolleisuuteen kontrolliin verrattuna tietyllä altistusajanjaksolla. Kai ­
killa LOEC:tä suuremmilla testipitoisuuksilla on kuitenkin oltava vähintään yhtä suuri haittavaikutus kuin LOEC-tasolla havaittu vai ­
kutus. Jos nämä kaksi eivät täyty, on annettava täydellinen selitys 
siitä, miten LOEC (ja myös NOEC) on valittu.
 
NOEC (No Observed Effect Concentration):  LOEC:tä pienempi 
testipitoisuus, jolla ei ole kontrolliin verrattuna tietyllä altistusajan ­
jaksolla tilastollisesti merkittävää vaikutusta (todennäköisyystasolla p 
< 0,05).  
EC X : Veteen liuotetun testiaineen pitoisuus, joka aiheuttaa x prosen ­
tin laskun vesikirpun lisääntymisessä tietyllä altistusajanjaksolla.  
Ominaiskasvu:  Populaation kasvu, jossa yhdentyvät lisääntyminen 
ja ikäspesifinen kuolleisuus (20) (21) (22). Dynaamisessa tasapai ­
nossa olevassa populaatiossa ominaiskasvu on nolla. Suurenevissa 
populaatioissa se on positiivinen ja pienenevissä negatiivinen. Nega ­
tiivinen arvo johtaa luonnollisesti lopulta populaation häviämiseen.  
Osoittamisraja:  Pienin pitoisuus, joka voidaan osoittaa, mutta ei 
mitata kvantitatiivisesti.  
Määritysraja:  Pienin pitoisuus, joka voidaan mitata kvantitatiivisesti.  
Kuolleisuus:  Eläin katsotaan kuolleeksi, kun se ei liiku, ts. ei pysty 
uimaan tai sen raajoissa tai takaruumiissa ei havaita mitään liikettä sen jälkeen kun testiastiaa on ravisteltu varovasti 15 sekuntia. (Jos 
käytetään muuta määritelmää, se on ilmoitettava testiselosteessa ja 
sille on annettava lähdeviite.)
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1249
 
1.3 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Nuoria naarasvesikirppuja (emot), joiden ikä on alle 24 tuntia testin 
alussa, altistetaan testiaineelle, jota on lisätty veteen useissa pitoi ­
suuksissa. Testin kesto on 21 vuorokautta. Testin lopussa määritetään 
vielä testin lopussa elossa olevien emojen tuottamien elävien jälke ­
läisten kokonaismäärä. Tämä tarkoittaa sitä, että testin aikana kuol ­
leiden aikuisten tuottamia poikasia ei sisällytetä tulokseen. Emojen lisääntymistuotos voidaan ilmaista muillakin tavoin (esim. elävien 
jälkeläisten määrä eläintä kohti päivässä siitä päivästä lähtien, jolloin 
jälkeläisiä havaittiin ensimmäisen kerran), mutta nämä pitäisi ilmoit ­
taa testin lopussa elossa olevien emojen tuottamien elävien jälkeläis ­
ten kokonaismäärän lisäksi. Testiaineelle altistettujen eläinten lisään ­
tymistuotosta verrataan kontrolli(e)n tuotokseen LOEC:n määrittämi ­
seksi ja siten myös NOEC:n määrittämiseksi. Tuloksia analysoidaan lisäksi mahdollisuuksien mukaan regressiomenetelmällä sellaisen pi ­
toisuuden arvioimiseksi, joka aiheuttaisi x prosentin laskun lisäänty ­
mistuotoksessa (ts. EC
 50 , EC  20 tai EC  10) ). 
Myös emojen eloonjääminen ja ensimmäisten sikiöiden tuottamisen 
ajankohta on ilmoitettava. Muita testiaineeseen liittyviä, esim. kas ­
vuun (pituus) ja mahdollisesti lisääntymisen ominaisnopeuteen koh ­
distuvia vaikutuksia voidaan tutkia.  
1.4 TESTIAINETTA KOSKEVAT TIEDOT  
Vesikirpulla tehdyn välittömän myrkyllisyyden testin tulokset (ks. 
menetelmä C.2, osa I) pitäisi olla saatavilla. Tuloksesta voi olla hyötyä valittaessa lisääntymistestiin sopivaa testipitoisuusaluetta. 
Testiaineen vesiliukoisuuden ja höyrynpaineen pitäisi olla tiedossa, 
ja aineen määrittämiseksi testiliuoksissa pitäisi olla käytettävissä luo ­
tettava analyyttinen menetelmä, jonka avulla voidaan ilmoittaa myös 
saantoteho ja määritysraja.
 
Sellaisia tietoja, joista voi olla hyötyä testiolosuhteiden määrittelemi ­
sessä, ovat mm. rakennekaava, aineen puhtaus, stabiilisuus valossa, stabiilisuus testiolosuhteissa, pKa, P
 ow . ja helpon biohajoavuuden 
testin (ks. menetelmä C.4) tulokset.  
1.5 TESTIN LUOTETTAVUUS  
Jotta testi olisi luotettava, kontrolli(e)n pitäisi täyttää seuraavat kri ­
teerit:  
— emojen (naarasvesikirppujen) kuolleisuus on enintään 20 % testin 
lopussa,  
— testin lopussa elossa olevan emon tuottamia eläviä jälkeläisiä on 
keskimäärin vähintään 60.  
1.6 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.6.1  Laitteisto  
Astioiden ja muiden laitteiden, jotka joutuvat kosketuksiin testiliu ­
osten kanssa, on oltava kokonaan lasia tai muuta kemiallisesti inerttiä 
materiaalia. Testiastiat ovat tavallisesti lasisia dekantterilaseja.  
Lisäksi tarvitaan joitakin tai kaikkia seuraavista laitteista:  
— happimittari (joka on varustettu mikroelektrodilla tai muulla so ­
pivalla laitteella, jolla voidaan mitata liuennut happi pienitila ­
vuuksisissa näytteissä),  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1250
 
— asianmukaiset laitteet lämpötilan säätöön,  
— pH-mittari,  
— laitteet veden kovuuden mittaamiseen,  
— laitteet veden orgaanisiin yhdisteisiin sitoutuneen hiilen koko ­
naispitoisuuden (TOC) mittaamiseen tai kemiallisen hapenkulu ­
tuksen (COD) mittaamiseen,  
— asianmukaiset laitteet valojärjestelmän ja valon intensiteetin sää ­
töön.  
1.6.2  Testiorganismi  
Testissä olisi käytettävä  Daphnia magna  Straus -organismia. Muita 
vesikirppulajeja saa käyttää, jos ne täyttävät asianmukaiset vaatimuk ­
set (kontrollien lisääntymistuottavuutta koskevan vaatimukset pitäisi olla ominainen kyseiselle vesikirppulajille). Jos käytetään muita ve ­
sikirppulajeja, niiden täytyy olla selvästi tunnistettuja ja niiden käy ­
tön perusteltua.
 
Klooni olisi mieluiten tunnistettava genotyypin määrityksellä. Tutki ­
muksissa (1) on osoitettu, että kloonin A (joka on peräisin IRC ­
HA:sta Ranskasta) (3) lisääntymistuottavuus täyttää jatkuvasti vaa ­
timuksen, jonka mukaan tässä menetelmässä kuvatuissa olosuhteissa tuotto on keskimäärin vähintään 60 jälkeläistä kutakin elävää emoa kohti. Muutkin kloonit ovat kuitenkin hyväksyttäviä, jos vesikirppu ­
viljelmän osoitetaan täyttävän testiä koskevan validiteettiperusteen.
 
Testin alussa eläinten on oltava alle 24 tunnin ikäisiä, eivätkä ne saa 
olla ensimmäistä sikiösarjaa. Niiden olisi oltava peräisin terveestä varastokannasta (ts. niissä ei saa näkyä merkkejä stressistä kuten 
korkeaa kuolleisuutta, koiraita ja lepomunia, viivästymistä ensim ­
mäisten sikiöiden tuottamisessa, värihäiriöisiä eläimiä jne.). Varasto ­
kannan eläimiä on pidettävä samanlaisissa viljelyoloissa (valo, läm ­
pötila, viljelyneste, ravinto ja eläinten määrä tilavuusyksikköä kohti) 
kuin testissä käytettäviä. Jos testissä käytettävä viljelyneste eroaa 
vesikirpun viljelyssä normaalisti käytetystä viljelynesteestä, on hyvä noudattaa käytäntöä, että eläimet totutetaan viljelyoloihin ennen testiä noin kolmen viikon ajan (ts. yhden sukupolven ajan), jotta 
emojen stressaantuminen vältettäisiin.
 
1.6.3  Testissä käytettävä viljelyneste  
Testiin suositellaan täysin määriteltyä viljelynestettä. Siten voidaan 
välttää sellaisten lisäaineiden (esim. levät, maaperäuute) käyttö, joi ­
den ominaisuuksia ei voida hallita täydellisesti, ja parannetaan siten 
mahdollisuuksia laboratorioiden väliseen vakiointiin. Elendtin M4- 
(4) ja M7-viljelynesteet (ks. lisäys 1) on todettu sopiviksi tähän tarkoitukseen. Muitakin viljelynesteitä (esim. (5) (6)) voidaan käyt ­
tää, jos vesikirppuviljelmän osoitetaan täyttävän testiä koskevan va ­
liditeettiperusteen.
 
Jos käytetään viljelynestettä, jossa on kemiallisesti määrittelemättö ­
miä lisäaineita, lisäaineet on spesifioitava selvästi ja testiselosteessa on annettava tietoa niiden koostumuksesta, erityisesti hiilipitoisuu ­
desta, koska se voi vaikuttaa annettavaan ravintoon. Suositellaan, 
että orgaanisen lisäaineen varastovalmisteen orgaanisiin yhdisteisiin sitoutuneen hiilen kokonaispitoisuus (TOC) ja/tai kemiallinen hapen ­
kulutus (COD) määritetään ja valmisteen vaikutus testissä käytettä ­
vän viljelynesteen TOC- ja/tai COD-arvoihin arvioidaan. Viljelynes ­
teen TOC-tason olisi oltava (ennen levien lisäämistä) alle 2 mg/l (7).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1251
 
Kun testataan metalleja sisältäviä aineita, on tärkeää ottaa huomioon, 
että testissä käytettävän viljelynesteen ominaisuudet (esim. kovuus, 
kelaatiokyky) voivat vaikuttaa testiaineen myrkyllisyyteen. Tästä syystä on toivottavaa käyttää kemiallisesti määriteltyä viljelynestettä. Tällä hetkellä kuitenkin ainoat kemiallisesti määritellyt viljelynesteet, 
joiden tiedetään sopivan  Daphnia magnan  pitkäaikaiseen viljelyyn, 
ovat Elendtin M4 ja M7. Molemmissa viljelynesteissä on kelatoivaa ainetta EDTA:ta. On osoitettu (2), että kadmiumin ”näennäinen myr ­
kyllisyys” on yleensä pienempi, kun testi tehdään M4- ja M7-vilje ­
lynestcessä kuin nesteessä, joka ei sisällä EDTA:ta. M4- ja M7-vil ­
jelynesteitä ei siksi suositella metalleja sisältävien aineiden testauk ­
seen, ja myös muita viljelynesteitä, joissa on tunnettuja kelatoivia aineita, olisi vältettävä. Metalleja sisältäville aineille voi olla suosi ­
teltavaa käyttää jotain muuta viljelynestettä, esimerkiksi ASTM:n 
rekonstituoitua kovaa makeaa vettä (7), joka ei sisällä EDTA:ta ja johon on lisätty leväuutetta (8). Tämä ASTM:n kovan makean veden ja leväuutteen yhdistelmä sopii myös vesikirpun pitkäaikaiseen vil ­
jelyyn ja testaukseen (2), vaikka sillä on vielä lievä kelatoiva vaiku ­
tus, joka johtuu lisätyn leväuutteen orgaanisista aineista.
 
Testin alussa ja sen aikana liuenneen hapen pitoisuuden olisi oltava 
yli 3 mg/l. pH:n olisi oltava välillä 6-9, eikä se saisi yleensä vaih ­
della enemmän kuin 1,5 yksikköä testin aikana. Kovuudeksi suosi ­
tellaan yli 140 mg/l (ilmaistuna CaCO  3 :na). Tällä ja suuremmalla 
pitoisuudella tehdyissä testeissä on osoitettu validiteettiperusteiden 
mukaista lisääntymistuottavuutta (9) (10).  
1.6.4  Testiliuokset  
Halutun pitoiset testiliuokset valmistetaan yleensä laimentamalla va ­
rastoliuosta. Varastoliuokset olisi mieluiten tehtävä liuottamalla aine 
testissä käytettävään viljelynesteeseen.  
Orgaanisia liuottimia tai dispergointiaineita voidaan tarvita joissakin 
tapauksissa sopivan väkevyisen varastoliuoksen valmistamiseksi, mutta tällaisten aineiden käyttöä olisi vältettävä. Sopivia liuottimia ovat esim. asetoni, etanoli, metanoli, dimetyyliformamidi ja trietylee ­
niglykoli. Sopivia dispergointiaineita ovat esim. Cremophor RH40, 
0,01-prosenttinen metyyliselluloosa ja HCO-40. Missään tapauksessa testiaineen pitoisuus testi-liuoksissa ei saa ylittää aineen liukoisuus ­
rajaa testissä käytettävässä viljelynesteessä.
 
Liuottimia käytetään sellaisen varastoliuoksen valmistamiseksi, joka 
voidaan annostella veteen tarkasti. Edellä mainitut liuottimet eivät 
ole myrkyllisiä eivätkä lisää aineen vesiliukoisuutta siinä pitoisuu ­
dessa, jota liuottimelle suositellaan lopullisessa testissä käytettävässä viljelynesteessä (ts. ≤ 0,1 ml/l).
 
Dispergointiaineet voivat helpottaa tarkkaa annostelua ja dispergoin ­
tia. Edellä mainitut dispergointiaineet eivät ole myrkyllisiä eivätkä lisää aineen vesiliukoisuutta siinä pitoisuudessa, jota dispergointi ­
aineelle suositellaan lopullisessa testissä käytettävässä viljelynes ­
teessä (ts. ≤ 0,1 ml/l).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1252
 
1.7 TESTIN SUUNNITTELU  
Testiaineet jaetaan testiastioihin, joita on tämän jälkeen käsiteltävä 
satunnaistetusti. Jollei satunnaisteta, saattaa tästä johtua systemaatti ­
nen virhe, joka voidaan tulkita pitoisuudesta aiheutuvaksi vaikutuk ­
seksi. Erityisesti jos koeastioita käsitellään annostelu- tai pitoisuus ­
järjestyksessä, saattaa jokin aikaan liittyvä tekijä, kuten työntekijän väsymys tai muu virhe, aiheuttaa voimakkaampia vaikutuksia suu ­
remmilla pitoisuuksilla. Jos lisäksi olosuhteet testin alussa tai ympä ­
ristöolosuhteet, kuten sijoituspaikka laboratoriossa, saattavat vaikut ­
taa testituloksiin, olisi harkittava testin eristämistä.
 
1.8 TESTIN SUORITUS  
1.8.1  Altistumisolosuhteet  
1.8.1.1  Testin kesto  
Testin kesto on 21 vuorokautta.  
1.8.1.2  Vesikirppujen määrä testiastiassa  
Emoja pidetään testiastiassa yksi eläin astiaa kohti. Astiaan pannaan 
50-100 ml viljelynestettä.  
Suurempi tilavuus voi olla joskus tarpeen testiaineen pitoisuuden 
määritykseen käytettävän analyyttisen menetelmän vaatimusten vuoksi, vaikka rinnakkaisnäytteet voidaan myös yhdistää kemiallista analyysiä varten. Jos tilavuus on yli 100 ml, vesikirpulle annettavaa 
annosta on ehkä suurennettava, jotta varmistetaan ravinnon riittävyys 
ja validiteettiperusteiden noudattaminen. Läpivirtaustesteille voidaan harkita muunlaisia suoritustapoja teknisistä syistä (esimerkiksi neljä 10 vesikirpun ryhmää suuressa testitilavuudessa), mutta kaikki muu ­
tokset testin suunnittelussa on kirjattava.
 
1.8.1.3  Eläinten lukumäärä  
Puolistaattisissa oloissa tehtävässä testissä on oltava vähintään 10 
yksittäin kasvatettua vesikirppua kutakin testipitoisuutta kohti ja vä ­
hintään 10 yksittäin pidettyä vesikirppua kontrollisarjassa.  
Läpivirtaustesteissä 40 vesikirppua neljään 10 vesikirpun ryhmään 
jaettuna on osoittautunut sopivaksi (1). Pienempääkin määrää eläimiä 
voi käyttää. Suositellaan vähintään 20:tä vesikirppua pitoisuutta kohti 
jaettuna kahdeksi tai useammaksi yhtä monta vesikirppua käsittä ­
väksi rinnakkaisnäytteeksi (esim. neljä rinnakkaista, joista kussakin viisi vesikirppua). On huomattava, että jos vesikirppuja kasvatetaan 
ryhminä, lisääntymistuotosta ei voi ilmaista elävien jälkeläisten ko ­
konaismääränä testin lopussa elossa olevia emoja kohti, jos emoja kuolee. Tällöin lisääntymistuotos olisi ilmaistava elävien jälkeläisten kokonaismääränä testin alussa mukana olevia emoja kohti.
 
1.8.1.4  Ruokkiminen  
Puolistaattisissa oloissa tehtävässä testissä vesikirppuja olisi ruokit ­
tava mieluiten joka päivä mutta ainakin kolmesti viikossa (ts. silloin 
kun viljelyneste vaihdetaan). Jos tästä poiketaan (esim. läpivirtaus ­
testissä), siitä olisi ilmoitettava.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1253
 
Testin aikana emojen ruokavalion pitäisi koostua mieluiten seuraa ­
vien lajien (yhden tai useamman) elävistä levistä:  Chlorella  sp.,  
Selenastrum capricornutum  (nykyisin  Pseudokirchneriella subcapi ­
tata (11)) ja  Scenedesmus subspicatus.  Ruokavalion pitäisi perustua 
siihen orgaanisen hiilen (C) määrään, joka on annettava kullekin 
emolle. Tutkimuksissa (12) on osoitettu, että annokset 0,1 - 0,2 
mg C/vesikirppu/vrk riittävät vesikirpulla siihen, että jälkeläisiä saa ­
daan riittävä määrä, jotta testin validiteettiperusteet täyttyvät. Ravin ­
toannos voidaan annostella joko vakionopeudella koko testin ajan tai 
haluttaessa voidaan alussa käyttää alhaisempaa nopeutta, jota lisätään 
testin aikana emojen kasvun huomioon ottamiseksi. Tällöinkin an ­
noksen on pysyttävä samana suositellulla alueella 0,1 - 0,2 mg C/vesikirppu/vuorokausi koko testin ajan.
 
Jos käytetään muita menetelmiä (kuten leväsolujen määrää tai valon 
absorptiota) vaaditun ravintoannoksen määrittämiseksi esimerkiksi siksi, että hiilipitoisuuden määritys on aikaa vievää, laboratorioiden 
on laadittava omat nomogramminsa, josta saadaan leväviljelmän hii ­
lipitoisuus (ks. lisäys 2, ohjeet nomogrammien laatimiseksi). Nomog ­
rammit olisi tarkistettava vähintään kerran vuodessa ja useamminkin, jos levien viljelyolosuhteet muuttuvat. On havaittu että valon absorp ­
tio on parempi menetelmä hiilipitoisuuden määrittämiseksi kuin so ­
lumäärä (1 3).
 
Vesikirpulle olisi annettava ravinnoksi konsentroitua leväsuspensiota, 
jotta testiastioihin lisätyn levänviljelynesteen tilavuus olisi mahdolli ­
simman pieni. Leviä voidaan konsentroida sentrifugoimalla, jonka jälkeen ne suspendoidaan uudelleen veteen, deionisoituun veteen 
tai vesikirpun viljelynesteeseen.
 
1.8.1.5  Valo  
16 tuntia valoa, jonka intensiteetti on enintään 15-20 μE · m -2 · s -1 . 
1.8.1.6  Lämpötila  
Testissä käytettävän viljelynesteen lämpötilan on oltava 18-22  o C. 
Lämpötila ei saisi kuitenkaan, jos mahdollista, vaihdella missään testissä enempää kuin 2
 o C kyseisissä rajoissa (esim. 18-20, 19-21 
tai 20-22  o C). Lämpötilan seuraamista varten voi olla tarpeen lisätä 
yksi testiastia.  
1.8.1.7  Ilmastus  
Testiastioita ei saa ilmastaa testin aikana.  
1.8.2  Testipitoisuudet  
Kokeessa pitäisi olla yleensä vähintään viisi testipitoisuutta geomet ­
risessa sarjassa, eikä kerroin saisi olla suurempi kuin 3,2. Kutakin pitoisuutta kohti olisi käytettävä asianmukaista rinnakkaisnäytteiden määrää, (ks. kohta 1.8.1.3). Jos pitoisuuksien määrä on vähemmän 
kuin viisi, se on perusteltava. Aineita ei saisi testata niiden liukoi ­
suusrajaa suuremmassa pitoisuudessa.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1254
 
Pitoisuusalueen valinnassa on otettava huomioon seuraavat seikat:  
i) Jos tarkoitus on määrittää LOEC/NOEC, pienimmän testipitoi ­
suuden on oltava niin pieni, ettei hedelmällisyys tällä pitoisuu ­
della ole merkitsevästi pienempi kuin kontrollilla. Mikäli näin ei 
ole, testi on toistettava vielä pienemmällä pitoisuudella.  
ii) Jos tarkoitus on määrittää LOEC/NOEC, suurimman testipitoi ­
suuden on oltava niin suuri, että hedelmällisyys tällä pitoisuu ­
della on merkitsevästi pienempi kuin kontrolleilla. Mikäli näin ei 
ole, testi on toistettava suuremmalla pitoisuudella.  
iii) Jos arvioidaan EC  X lisääntymisvaikutuksille, suositellaan, että 
käytetään niin suurta määrää pitoisuuksia, että EC  X voidaan mää ­
rittää asianmukaisella luotettavuustasolla. Jos arvioidaan EC  50 
lisääntymisvaikutuksille, suositellaan, että suurin testipitoisuus 
on suurempi kuin kyseinen EC  50 . Muuten EC  50 :n luottamusväli 
on kovin suuri ja voi olla mahdotonta arvioida tyydyttävästi 
sovitetun mallin asianmukaisuutta, vaikka onkin mahdollista ar ­
vioida EC  50 . 
iv) Testipitoisuuden joukossa ei saisi olla sellaista pitoisuutta, jolla 
olisi tilastollisesti merkitsevä vaikutus täysikasvuisten eläinten eloonjäämiseen, koska testi ei silloin olisi enää pelkästään lisään ­
tymistesti, vaan yhdistetty lisääntymis- ja kuolleisuustesti, joka 
vaatisi paljon monimutkaisempaa tilastollista analyysiä.
 
Aikaisemmat tiedot testiaineen myrkyllisyydestä (esim. välittömän 
myrkyllisyyden testistä ja/tai alustavista pitoisuuskartoitustesteistä 
saadut tiedot) auttanevat sopivien testipitoisuuksien valitsemisessa.  
Jos testiliuosten valmistuksessa käytetään liuottimia tai dispergointi ­
aineita (ks. kohta 1.6.4), niiden lopullinen pitoisuus testiastioissa 
saisi olla enintään 0,1 ml/l, ja sen olisi oltava sama kaikissa testias ­
tioissa.  
1.8.3  Kontrollit  
Testisarjan lisäksi on määritettävä yksi viljelynestettä sisältävä kont ­
rollisarja ja tapauksen mukaan yksi kontrollisarja. joka sisältää liuo ­
tinta tai dispergointiainetta. Mahdollisen liuottimen tai dispergointi ­
aineen pitoisuuden olisi oltava sama kuin testiainetta sisältävissä 
testiastioissa. Riittävä määrä rinnakkaisnäytteitä olisi määritettävä 
(ks. kohta 1.8.1.3).  
Yleensä hyvin suoritetussa testissä kontrollinäytteiden emojen tuot ­
tamien elävien jälkeläisten määrän keskiarvon vaihtelukerroin saisi 
olla enintään 25 %, ja tämä olisi ilmoitettava testeille, joissa käyte ­
tään yksittäin kasvatettuja eläimiä.  
1.8.4  Testissä käytettävän viljelynesteen vaihto  
Viljelynesteen vaihtoväli riippuu testiaineen stabiilisuudesta. mutta 
viljelyneste pitäisi vaihtaa vähintään kolme kertaa viikossa. Jos tes ­
tiainepitoisuus alustavien testien perusteella (ks. kohta 1.4) ei ole stabiili (ts. ei ole välillä 80-120 % nimellispitoisuudesta tai laskee alle 80 prosentin mitatusta alkupitoisuudesta) pisimmän hyväksytyn 
vaihtovälin aikana (ts. 3 vrk), olisi harkittava viljelynesteen vaihta ­
mista useammin tai siirtymistä läpivirtaustestiin.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1255
 
Kun viljelyneste vaihdetaan puolistaattisessa testissä, valmistetaan 
toinen sarja testiastioita ja emovesikirput siirretään niihin esim. so ­
pivan kokoisella lasipipetillä. Vesikirpun kanssa siirrettävän viljely ­
nesteen tilavuuden pitäisi olla mahdollisimman pieni.  
1.8.5  Havainnot  
Testin aikana tehtyjen havaintojen tulokset olisi kirjattava testilomak ­
keille (ks. lisäys 3 ja 4). Jos on tehtävä muita mittauksia (ks. 1.3 ja 1.8.8), on ehkä tehtävä lisähavaintoja.
 
1.8.6  Jälkeläiset  
Kunkin emon tuottamat jälkeläiset olisi mieluiten otettava astiasta ja 
laskettava päivittäin ensimmäisistä jälkeläisistä lähtien, jotta ne eivät söisi aikuisille tarkoitettua ravintoa. Tässä testissä tarvitsee laskea 
vain elävät jälkeläiset, mutta kuolleiden munien tai poikasten esiin ­
tyminen olisi kirjattava.
 
1.8.7  Kuolleisuus  
Emojen kuolleisuus olisi kirjattava mieluiten päivittäin tai ainakin 
silloin, kun poikaset lasketaan.  
1.8.8  Muut muuttujat  
Vaikka tämän menetelmän pääasiallisena tarkoituksena on lisäänty ­
misvaikutusten arviointi, on mahdollista, että muitakin vaikutuksia esiintyy siinä määrin, että ne voidaan analysoida tilastollisesti. Kas ­
vumittaukset ovat hyvin toivottavia, koska niistä saa mahdollisia 
subletaaleja vaikutuksia koskevia tietoja, jotka voivat olla hyödylli ­
sempiä kuin pelkästään lisääntymisen määrittäminen. Emojen pituu ­
den (ts. pituus ilman pyrstörankaa) mittausta testin lopussa suositel ­
laan. Muita muuttujia, jotka voidaan mitata tai laskea, ovat esim. 
emon ikä ensimmäisten (ja myöhempien) jälkeläisten syntyessä, jäl ­
keläisten lukumäärä ja koko, ennenaikaisesti syntyneiden jälkeläisten määrä, koiraiden tai lepomunien esiintyminen sekä populaation omi ­
naiskasvunopeus.
 
1.8.9  Analyyttisten määritysten ja mittausten taajuus  
Happipitoisuus, lämpötila, veden kovuus ja pH olisi mitattava vähin ­
tään kerran viikossa sekä tuoreesta että vanhasta viljelynesteestä, 
kontroll(e)ista ja testistä, jossa on suurin testiaineen pitoisuus.  
Testin aikana testiaineen pitoisuus määritetään säännöllisin väliajoin.  
Suositellaan, että puolistaattisissa testeissä, joissa testiaineen pitoi ­
suuden odotetaan pysyvän ± 20 prosentissa (ts. välillä 80-120 %) 
nimellispitoisuudesta (ks. kohta 1.4 ja 1.8.4), suurimmat ja pienim ­
mät testissä käytetyt pitoisuudet määritetään tuoreista testiliuoksista ja viljelynestettä vaihdettaessa kerran ensimmäisen testiviikon aikana (ts. määritys olisi tehtävä samasta liuoksesta, kun se on tuore ja kun 
se vaihdetaan). Nämä määritykset olisi tehtävä tämän jälkeen uudel ­
leen vähintään viikon välein.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1256
 
Testeissä, joissa testiaineen pitoisuuden ei odoteta pysyvän ± 20 pro ­
sentissa nimellisarvosta, on välttämätöntä määrittää testipitoisuudet 
sekä tuoreesta liuoksesta että liuosta vaihdettaessa. Kuitenkin jos mi ­
tattu testiaineen alkupitoisuus ei ole ± 20 prosentissa nimellisarvosta, mutta jos on riittävästi näyttöä siitä, että alkupitoisuudet ovat toistetta ­
via ja stabiileja (ts. välillä 80-120 % alkupitoisuudesta), viikolla 2 ja 3 
voitaisiin määrittää vain suurin ja pienin testipitoisuus. Joka tapauk ­
sessa testiaineen pitoisuus tarvitsee määrittää liuosta vaihdettaessa vain yhdestä rinnakkaisnäytteestä kullekin pitoisuudelle.
 
Jos kyseessä on läpivirtaustesti, samanlainen näytteenotto-ohjelma on 
sopiva kuin puolistaattisissa testeissä (vaikka ”vanhasta” liuoksesta ei tehdä määritystä). Voi kuitenkin olla suositeltavaa lisätä näytteen ­
ottoajankohtia ensimmäisen viikon aikana (esim. kolme määrityssar ­
jaa) sen varmistamiseksi, että testipitoisuudet ovat pysyneet muuttu ­
mattomina. Tällaisissa testeissä laimentimen ja testiaineen virtausno ­
peus on tarkistettava päivittäin.
 
Jos on näyttöä siitä, että testattavan aineen pitoisuus on pysynyt 
tyydyttävällä tavalla ± 20 prosentissa nimellispitoisuudesta tai alku ­
pitoisuudesta koko testin ajan, tulokset voivat perustua nimellispitoi ­
suuksiin tai alkupitoisuuksiin. Jos poikkeama nimellispitoisuudesta 
tai alkupitoisuudesta on suurempi kuin ± 20 %, tulokset olisi ilmais ­
tava aikapainotettuina keskiarvoina (ks. lisäys 5).  
2. MÄÄRITYSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Tämän testin tarkoituksena on määrittää testiaineen vaikutus elävien 
jälkeläisten kokonaismäärään testin lopussa elossa olevien emojen 
määrää kohti. Elävien jälkeläisten kokonaismäärä emojen määrää kohti olisi laskettava jokaiselle testiastialle (ts. rinnakkaisnäytteille). Jos jos ­
sakin rinnakkaisnäytteessä emo kuolee testin aikana tai osoittautuu 
koiraaksi, kyseinen rinnakkaisnäyte jätetään testin ulkopuolelle. Ana ­
lyysi perustuu silloin pienempään määrään rinnakkaisnäytteitä.
 
Kun selvitettäessä kemikaalin vaikutuksia lisääntymistuotokseen 
määritetään LOEC ja siitä NOEC, on laskettava kaikkien rinnakkais ­
näytteiden keskimääräinen lisääntymistuotos kullekin pitoisuudelle ja painotettu jäännösvakiopoikkeama. Tämä voidaan tehdä varianssia ­
nalyysillä (ANOVA). Kunkin pitoisuuden keskiarvoa on tämän jäl ­
keen verrattava kontrollien keskiarvoon käyttämällä sopivaa vertailu ­
menetelmää. Dunnettin tai Williamsin testit voivat olla hyödyllisiä (14) (15) (16) (17). On myös tarkistettava, pitääkö ANOVAn olet ­
tamus varianssin homogeenisuudesta paikkansa. Suositellaan, että 
tämä tehdään graafisesti mieluummin kuin formaalilla merkitsevyys ­
testillä (18); sopiva vaihtoehto on Bartlettin testi. Jos oletus ei pidä paikkaansa, on harkittava tulostietojen muuntamista varianssien ta ­
soittamiseksi ennen ANOVAa tai painotetun ANOVAn tekemistä. 
ANOVAlla määritetty havaittavan vaikutuksen suuruus (ts. pienin 
merkitsevä ero) olisi laskettava ja ilmoitettava.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1257
 
Sellaisen pitoisuuden arvioimiseksi, joka aiheuttaisi 50 prosentin pie ­
nenemisen lisääntymistuotoksessa (ts. EC  50 ), tulostietoihin olisi so ­
vitettava jokin sopiva käyrä, kuten logistinen käyrä, käyttämällä jo ­
takin tilastomenetelmää, kuten pienimmän neliösumman menetelmää. Käyrään voitaisiin valita sellaiset muuttujat, että EC
 50 ja sen keski ­
virhe voidaan määrittää käyrästä suoraan. Tämä helpottaisi suuresti 
EC 50 :n luottamusrajojen laskemista. Ellei ole erityisiä syitä käyttää 
erilaisia luottamusrajoja, kaksipuolinen 95 prosentin raja olisi ilmoi ­
tettava. Sovitusmenetelmän pitäisi mielellään olla sellainen, että voi ­
daan arvioida sovituksen onnistumisen (tai sen puutteen) merkitse ­
vyys. Tämä voidaan tehdä graafisesti tai jakamalla jäännösneliö ­
summa sovituksen onnistumista ja puhdasta virhettä koskeviin kom ­
ponentteihin ja tekemällä merkitsevyystesti sovituksen onnistumisel ­
le. Koska korkeaan hedelmällisyyteen johtavilla käsittelyillä on to ­
dennäköisesti suurempi tuotettujen nuorten yksilöiden määrän vari ­
anssi kuin alhaiseen hedelmällisyyteen johtavilla käsittelyillä, olisi harkittava havaittujen arvojen painottamista siten, että ne heijastaisi ­
vat eri käsittelyryhmien erilaisia variansseja (ks. taustatietoa viit ­
teessä 18).
 
Lopullisen rengastestin (2) tulostietoja analysoitaessa niihin sovitet ­
tiin logistinen käyrä käyttämällä seuraavaa mallia, vaikka muitakin sopivia malleja voi käyttää:
 
Y ¼ c 
1 þ x x 0 Ê Ì  
b 
jossa:  
Y = nuorten eläinten kokonaismäärä testin lopussa elossa olevaa 
aikuista eläintä kohti (laskettu kullekin testiastialle)  
x: = testiaineen pitoisuus  
c = nuorten eläinten oletettu määrä, kun x = 0  
x 0 = populaation EC  50 -arvo  
b = kulmakertoimen laskemisessa käytetty muuttuja.  
Tämä malli sopii todennäköisesti moniin tapauksiin, mutta kaikkiin 
testeihin se ei ehkä sovi. Mallin validiteetti olisi tarkistettava, kuten 
edellä on mainittu. Joissakin tapauksissa sopiva malli voi olla sel ­
lainen, jossa pienet pitoisuudet aiheuttavat huomattavia vaikutuksia (19).
 
Muita vaikutuksiin liittyviä pitoisuuksia, kuten EC  10 tai EC  20 , voi­
daan myös arvioida, vaikka voi olla parempi käyttää mallissa erilai ­
sia muuttujia kuin EC  50 :n arvioimiseksi käytettyjä.  
2.2 TESTISELOSTE  
Testiselosteessa on annettava seuraavat tiedot:  
2.2.1  Testiaine  
— fysikaalinen olomuoto ja fysikokemialliset ominaisuudet, jos 
niillä on merkitystä,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1258
 
— kemialliset tunnistetiedot, mukaan lukien puhtaus.  
2.2.2  Koelajit  
— kyseessä oleva klooni (onko genotyyppi määritetty), hankinta ­
paikka tai alkuperä (jos se tunnetaan) sekä käytetyt viljelyolosuh ­
teet. Jos käytetään muuta lajia kuin  Daphnia magna,  se on pe ­
rusteltava ja ilmoitettava.  
2.2.3  Koeolosuhteet:  
— käytetty testimenetelmä (esim. puolistaattinen tai läpivirtausme ­
netelmä, vesikirppujen lukumäärä litrassa kokeen alussa,  
— valoisa aika ja valon intensiteetti,  
— testin suunnittelu (esim. rinnakkaisnäytteiden määrä, emojen 
määrä rinnakkaisnäytettä kohti),  
— käytetty viljelyneste yksityiskohtaisesti,  
— mahdollisesti käytetyn orgaanisen aineen koostumus, alkuperä, 
valmistusmenetelmä, varastovalmisteiden TOC/COD, testissä 
käytetyn viljelynesteen TOC/COD:n arviointi,  
— yksityiskohtaiset ruokintaa koskevat tiedot, mukaan lukien määrä 
(mg C/vesikirppu/vrk) ja esim. rehu(je)n tyyppi, myös mahdol ­
listen levien spesifiset nimet (lajit) ja kanta, jos ne tunnetaan, sekä viljelyolosuhteet,
 
— varastoliuosten valmistusmenetelmä ja viljelynesteen vaihtotaa ­
juus (mahdollisen liuottimen tai dispergointiaineen nimi ja pitoi ­
suus on ilmoitettava).  
2.2.4  Tulokset:  
— mahdollisista alustavista testiaineen stabiilisuutta koskevista ko ­
keista saadut tulokset,  
— nimelliset testipitoisuudet ja kaikkien analyysien tulokset, joissa 
on määritetty testiaineen pitoisuus testiastiassa (ks. esimerkiksi 
annetut tuloslomakkeet, lisäys 4); myös menetelmän saantoteho ja määritysraja olisi ilmoitettava,
 
— testiastioissa käytetyn veden laatu (ts. pH, lämpötila ja liuenneen 
hapen pitoisuus sekä tarvittaessa TOC ja/tai COD ja veden ko ­
vuus) (ks. esimerkiksi annettu tuloslomake, lisäys 3),  
— täydelliset kirjaustiedot kunkin emon elävistä jälkeläisistä (ks. 
esimerkiksi annettu tuloslomake, liite 3),  
— emojen kuolemantapausten lukumäärä ja päivämäärät (ks. esimer ­
kiksi annettu tuloslomake, lisäys 3,  
— kontrollihedelmällisyyden vaihtelukerroin (joka perustuu elävien 
jälkeläisten kokonaismäärään testin lopussa elossa olevaa emoa 
kohti),  
— kuvaaja, josta käy ilmi elävien jälkeläisten kokonaismäärä testin 
lopussa elossa olevaa emoa kohti (kullekin rinnakkaisnäytteelle) testiaineen pitoisuuden funktiona,
 
— LOEC (Lowest Observed Effect Concentration) lisääntymiselle; 
käytettyjen tilastomenetelmien kuvaus; maininta siitä, minkä ko ­
koinen vaikutus voitiin osoittaa; NOEC (No Observed Effect 
Concentration) lisääntymiselle tarvittaessa; tapauksen mukaan 
myös LOEC/NOEC emojen kuolleisuudelle olisi ilmoitettava,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1259
 
— tarvittaessa EC  X lisääntymiselle, luottamusvälit, sen laskemiseen 
käytetyn sovitetun mallin graafinen kuvaaja, annos-vastekäyrän 
kulmakerroin ja sen keskivirhe,  
— muut havaitut biologiset vaikutukset tai muut mittaukset: ilmoi ­
tetaan kaikki mahdolliset havaitut tai mitatut biologiset vaikutuk ­
set (esim. emojen kasvu) sekä kaikki asianmukaiset perustelut,  
— selitykset testimenetelmästä poikkeamiseen.  
3. LÄHDELUETTELO  
(1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on 
the Daphnia magna  Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 
20-21 March 1993.  
(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series 
on Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring 
Test of the  Daphnia magna  Reproduction Test Paris. 1997.  
(3) Baird D. J., Barber J., Bradley M. C., Soares A. M. V. M. and 
Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity 
to acute toxic stress using clones of  Daphnia magna  Strauss. 
Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, pp. 257-265.  
(4) Elendt B. P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An 
ultrastructural approach to antennal damage in  Daphnia magna  
Straus. Protoplasma, 154, pp. 25-33.  
(5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of 
Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Or ­
ganisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.
 
(6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring 
waters as standard medium for culturing  Daphnia magna.  Bull. 
Environ. Contam. Toxicol., 47, pp. 775-782.  
(7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity 
Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729- 
88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia P.A. 20 pp.
 
(8) Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley 
M. C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of  
Daphnia magna  Straus for use in ecotoxicological tests; prob ­
lems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Con ­
ference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Løkke, H. 
Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.), pp. 144-148.  
(9) Parkhurst B. R., Forte J. L. and Wright G. P. (1981). Repro ­
ducibility of a life-cycle toxicity test with  Daphnia magna.  
Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26, pp. 1-8.  
(10) Cowgill U. M. and Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two 
cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. 
Arch. Hydrobiol., 120(2), pp. 185-196.  
(11) Korshikov (1990).  Pseudokirchneriella subcapitata  Hindak, F- 
1990. Biologice Prace, 36, 209.  
(12) Sims I. R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a stan ­
dard Daphnia  juvenile production test. Environmental Toxico ­
logy and Chemistry, 12, pp. 2053-2058.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1260
 
(13) Sims 1. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the 
relationship between total organic carbon with three commonly 
used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol.. 128, pp. 459-466.
 
(14) Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, pp. 1096-1121.  
(15) Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, pp. 482-491.  
(16) Williams D. A. (1971). A test for differences between treat ­
ment means when several dose levels are compared with a zero 
dose control. Biometrics 27, pp. 103-117.  
(17) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28, pp. 510-531.  
(18) Draper N. R. and Smith H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition, Wiley, N.Y.  
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, pp. 93-96.  
(20) Wilson E. O. and Bossert, W. H. (1971). A Primer of Popu ­
lation Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.  
(21) Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. 
McGraw-Hill Series in Population Biology, New York, pp. ­
532. 
(22) Meyer J. S., Ingersoll C. G., McDonald L. L. and Boyce M. S. 
(1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap tcchniques. Ecology, 67, pp. 1156-1166.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1261
 
Lisäys 1  
KEMIALLISESTI MÄÄRITELTYJEN ELENDT M7- JA 
M4-VILJELYNESTEIDEN VALMISTUS  
Totuttaminen Elendt M7- ja M4-viljelynesteeseen  
Joissakin laboratorioissa on ollut vaikeuksia, kun ne ovat siirtäneet vesikirput 
suoraan M4- (1) tai M7-viljelynesteeseen. Siirto onnistuu paremmin totuttamalla 
vesikirput asteittain uuteen viljelynesteeseen: ensin siirretään entisestä viljelynes ­
teestä 30-prosenttiseen, sitten 60-prosenttiseen ja lopulta 100-prosenttiseen Elendt-viljelynesteeseen. Totuttamisvaiheen pitää mahdollisesti olla jopa kuukau ­
den pituinen.
 
VALMISTELU  
Hivenaineet  
Ensin valmistetaan erilliset varastoliuokset (1) yksittäisistä hivenaineista sopivalla 
tavalla, esim. deionisoimalla, tislaamalla tai käänteisosmoosilla puhdistettuun ve ­
teen. Näistä eri varastoliuoksista (1) valmistetaan yksi ainoa varastoliuos (11), jossa on kaikkia hivenaineita (yhdistetty liuos), ts:
 
Varastoliuokset I 
(yksi aine) Veteen lisätty 
määrä 
(mg/l) Pitoisuus (M4-vil ­
jelynesteessä) 
(-kertainen) Valmistettaessa yhdistettyä varastoliu ­
osta II lisätään veteen seuraavat määrät 
varastoliuoksia I 
(ml/l) 
M 4 M 7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 1,0 0,25 
MnCl  2 * 4 H  2 O 7 210 20 000 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25 RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25 SrCl
 2 * 6 H  2 o 3 040 20 000 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 1,0 0,25 
Na 2 MoO  4 * 2 H  2 O 1 260 20 000 1,0 0,25 
CuCl  2 * 2 H  2 O 335 20 000 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 1,0 1,0 
CoCl  2 * 6 H  2 O 200 20 000 1,0 1,0 
KI 65 20 000 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20 000 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 1,0 1,0 
Na 2 EDTA * 2 H  2 O 5 000 2 000 — — 
FeSO  4 * 7 H  2 O 1 991 2 000 — — 
Sekä Na  2 EDTA- että FeSO  4 -liuokset valmistetaan erikseen, yhdistetään ja autoklavoidaan välittömästi. Tuloksena on: 
21 Fe-EDTA-liuos 1 000 20,0 5,0  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1262
 
M4- ja M7-viljelyneste  
M4- ja M7-viljelynesteet valmistetaan käyttäen varastoliuosta II, makroravinteita 
ja vitamiineja seuraavasti:  
Veteen lisätty 
määrä 
(mg/l) Pitoisuus (M4-vil ­
jelynesteessä) 
(-kertainen) Viljelynesteen valmistamiseen tarvittava 
varastoliuoksen määrä 
(ml/l) 
M 4 M 7  
Varastoliuos II yhdistetyt hivenaineet 20 50 50 
Makroravinteiden varastoliuos (yksittäisiä aineita) 
CaCl  2 * 2 H  2 O 293 800 1 000 1,0 1,0 
MgSO  4 * 7 H  2 O 246 600 2 000 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 * 9 H  2 O 50 000 5 000 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 0,1 0,1 
Yhdistetty vitamiinien varastoliuos — 10 000 0,1 0,1 Yhdistetty vitamiinien varastoliuos valmistetaan lisäämällä kaikkia kolmea vitamiinia 1 litraan vettä seuraavasti: Tiamiinihydrokloridi 750 10 000 — — 
Syaanikobalamiini (B
 12 ) 10 10 000 — — 
Biotiini 7,5 10 000 — —  
Yhdistetty vitamiinien varastoliuos säilytetään jäädytettynä pienissä erissä. Vitamiinit lisätään viljelynesteeseen vähän ennen  käyttöä.  
Huom.  Jotta suolat eivät saostuisi lopullista viljelynesteliuosta valmistettaessa, varastoliuokset lisätään 500-800 ml:aan deionisoi tua vettä 
ja täytetään sitten 3 litraksi.  
Huom.  M4-viljelynesteen kokoonpanoa koskeva ensimmäinen julkaisuviite on Elendt, B.P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an 
ultrastructural approach to antennal damage in  Daphnia magna  Straus. Protoplasma, 154, s. 25-33.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1263
 
Lisäys 2  
ORGAANISIIN YHDISTEISIIN SITOUTUNEEN HIILEN 
KOKONAISMÄÄRÄN (TOC) MÄÄRITYS JA NOMOGRAMMIN 
LAATIMINEN LEVÄREHUN TOC-PITOISUUDELLE  
Levärehun hiilipitoisuutta ei tunnetusti mitata suoraan, vaan se määritetään kor ­
vaavilla menetelmillä kuten levysolujen määrän tai valon absorption perusteella 
laadittujen nomogrammien avulla.  
TOC olisi mitattava mieluummin korkeassa lämpötilassa tapahtuvan oksidaation 
avulla kuin UV- tai persulfaattimenetelmällä. (ks. The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinants 1979, 
HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).
 
Nomogrammin laatimista varten levät olisi erotettava viljelynesteestä sentrifugoi ­
malla, jonka jälkeen ne suspendoidaan uudelleen tislattuun veteen. Korvaava muuttuja ja TOC-pitoisuus määritetään kustakin näytteestä (kolme rinnakkaista). 
Tislattuun veteen perustuvat nollanäytteet määritetään ja niiden TOC-pitoisuus 
vähennetään levänäytteen TOC-pitoisuudesta.
 
Nomogrammin olisi oltava lineaarinen tarvittavalla hiilipitoisuusalueella. Jäljem ­
pänä annetaan esimerkkejä.  
Huom. Näitä nomogrammeja ei saisi käyttää muuntamiseen. Jokaisen laborato ­
rion on laadittava omat nomogrammit.
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1264
 
▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1265
 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1266
 ▼B 
LISÄYS 3  
ESIMERKKI LOMAKKEESTA, JOHON KIRJATAAN VILJELYNESTEEN VAIHDOT, FYSIKAALISET JA/TAI KEMIALLISET SEURANTATIEDOT, RUOKKIMINEN. 
VESIKIRPUN LISÄÄNTYMINEN JA TÄYSIKASVUISTEN KUOLLEISUUS  
Koe nro: Aloituspvm: Klooni: Viljelyneste Ravintotyyppi: Testiaine: Nimellispitoisuus: 
Päivä 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
Viljelynesteen vaihto 
(rasti) 
pH (  1 ) tuore 
vanha 
O 2 mg/l (  1 ) tuore 
vanha 
Lämpötila (  o C) (  1 ) tuore 
vanha 
Ruokkiminen (rasti) 
Elävien jälkeläisten 
määrä (  2 ) Yhteensä 
Astia 1 
2 
3 4 5
 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1267
 ▼B 
Koe nro: Aloituspvm: Klooni: Viljelyneste Ravintotyyppi: Testiaine: Nimellispitoisuus: 
Päivä 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
6 
7 8 9 10 
Yhteensä 
Kumulatiivinen aikuisten 
kuolleisuus (
 3 ) 
( 1 ) Ilmoitettava, mitä astiaa käytettiin kokeeseen. 
( 2 ) Kuolleet aikuiset kirjataan merkinnällä ”M” asianomaiseen ruutuun. 
( 3 ) Abortoituneet jälkeläiset kirjataan merkinnällä ”AB” asianomaiseen ruutuun.
 Lisäys 4  
ESIMERKKI LOMAKKEESTA, JOHON KIRJATAAN KEMIALLISTEN MÄÄRITYSTEN TULOKSET  
(a) Mitatut pitoisuudet  
Nimellispitoi ­
suus Viikon 1 näyte Viikon 2 näyte Viikon 3 näyte 
tuore vanha tuore vanha tuore vanha  
(b) Mitatut pitoisuudet prosentteina nimellisarvoista  
Nimellispitoi ­
suus Viikon 1 näyte Viikon 2 näyte Viikon 3 näyte 
tuore vanha tuore vanha tuore vanha  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1268
 
Lisäys 5  
AIKAPAINOTETUN KESKIARVON LASKEMINEN  
Aikapainotettu keskiarvo  
Koska testiaineen pitoisuus voi laskea viljelynesteen vaihtojen välillä, on harkit ­
tava, mikä pitoisuus olisi valittava edustamaan sitä pitoisuusaluetta, jossa emo ­
vesikirppu on elänyt. Valinnan pitäisi perustua sekä biologisiin että tilastollisiiin 
näkökohtiin. Jos esimerkiksi oletetaan, että lisääntymiseen vaikuttaa lähinnä huip ­
pupitoisuus, olisi käytettävä suurinta pitoisuutta. Jos taas oletetaan, että myrkyl ­
lisen aineen kerääntynyt tai pitkän aikavälin vaikutus on tärkeämpi, keskipitoi ­
suus sopii paremmin. Silloin käytettäväksi sopiva asianmukainen keskiarvo on 
aikapainotettu keskipitoisuus, koska siinä otetaan huomioon hetkellisten pitoi ­
suuksien vaihtelu ajan funktiona.  
Kuva 1  
Esimerkki aikapainotetusta keskiarvosta
  
Kuvassa 1 on (yksinkertaistettu) esimerkki testistä, joka kestää seitsemän päivää 
ja jossa viljelyneste vaihdetaan päivinä 0, 2 ja 4.  
— Ohut sahaviiva kuvaa pitoisuutta eri ajankohtina. Pitoisuuden laskun oletetaan 
noudattavan eksponentiaalista hajoamisprosessia.  
— Kuusi kuvaajaan merkittyä pistettä edustavat havaittuja pitoisuuksia, jotka on 
mitattu kunkin vaihtoperiodin alussa ja lopussa.  
— Paksu yhtenäinen viiva esittää aikapainotetun keskiarvon sijaintia.  
Aikapainotettu keskiarvo lasketaan siten, että aikapainotetun keskiarvon kuvaajan 
alle jäävä pinta-ala on yhtä suuri kuin pitoisuuskäyrän alle jäävä pinta-ala. Edellä 
olevaa esimerkkiä varten tehty laskutoimitus kuvataan taulukossa 1.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1269
 
Taulukko 1  
Aikapainotetun keskiarvon laskeminen  
Vaihto nro Päiviä Conc 0 Conc 1 Ln(Conc 0) Ln(Conc 1) Pinta-ala  
1 2 10,000 4,493 2,303 1,503 13,767 
2 2 11,000 6,037 2,398 1,798 16,544 3 3 10,000 4,066 2,303 1,403 19,781 
Päivien kokonaismäärä: 7 Kokonaispin ­
ta-ala 50,091 
Aikapaino ­
tettu keski ­
arvo 7,156
 
”Päiviä” on vaihtojen välissä olevien päivien määrä  
”Conc 0” on kunkin vaihtoperiodin alussa mitattu pitoisuus  
”Conc 1” on kunkin vaihtoperiodin lopussa mitattu pitoisuus  
”Ln(Conc 0)” on Conc 0:n luonnonlogaritmi  
”Ln(Conc 1)” on Conc 1:n luonnonlogaritmi  
”Pinta-ala” on kutakin vaihtoperiodia vastaavan eksponentiaalisen käyrän alle jäävä pinta-ala  
Pinta Ä ala ¼ Conc 0 Ä Conc 1 
LnðConc 0Þ Ä LnðConc 1Þ Ü Päiviä  
Aikapainotettu keskiarvo on kokonaispinta-ala jaettuna päivien kokonaismäärällä.  
Vesikirpun lisääntymistestiä varten taulukon on tietysti katettava 21 päivää.  
On selvää, että kun havaintoja tehdään vain kunkin vaihtoperiodin alussa ja 
lopussa, ei voida olla varmoja siitä, että hajoaminen on todella eksponentiaalista. Erilaisesta käyrästä olisi seurauksena erilainen pinta-ala. Eksponentiaalinen ha ­
joamisprosessi ei kuitenkaan ole epätodennäköinen, ja sitä kuvaava käyrä on 
todennäköisesti paras, jota voidaan käyttää, kun muuta tietoa ei ole.
 
On kuitenkin esitettävä varoitus siltä varalta, että kemiallisessa määrityksessä ei 
havaita kyseistä ainetta lainkaan vaihtoperiodin lopussa. Ellei voida arvioida, kuinka nopeasti aine on hävinnyt liuoksesta, on mahdotonta saada todenmukaista 
pinta-alaa käyrän alle ja myös mahdotonta määrittää järkevää aikapainotettua 
keskiarvoa.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1270
 
C.21.  MAAPERÄN MIKROBIT: TYPEN MUUNTUMISTESTI  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä on toisinto OECD:n testiohjeesta nro 216 (2000).  
1.1 JOHDANTO  
Tämän menetelmän tarkoitus on tutkia laboratoriomenetelmin kemi ­
kaalien pitkäaikaisvaikutuksia maaperän mikrobien typpeä muunta ­
vaan toimintaan (typen transformaatioon) kerta-altistuksen jälkeen. 
Menetelmä perustuu pääosin EPPO:n (Euroopan ja Välimeren mai ­
den kasvinsuojelujärjestön) (1) suosituksiin. Myös muita, esimerkiksi Saksan Biologische Bundesanstaltin (2), Yhdysvaltain ympäristön ­
suojeluviraston (3), SETACin (4) ja Kansainvälisen standardisoimis ­
järjestön (5) laatimia ohjeita on otettu huomioon. Menetelmässä käy ­
tettävien maanäytteiden määrästä ja tyypistä on sovittu maalajin ja sedimentin valintaa käsitelleessä OECD:n työryhmässä, joka kokoon ­
tui Belgiratessa Italiassa vuonna 1995 (6). Maanäytteiden kerää ­
miseen, käsittelyyn ja varastointiin liittyvät suositukset perustuvat ISO:n ohjeisiin (7) sekä Belgiraten työryhmän suosituksiin. Testi ­
aineiden toksisten ominaisuuksien arvioinnin yhteydessä voi olla tar ­
peen määrittää niiden vaikutukset maaperän mikrobien toimintaan, 
esimerkiksi kun tarvitaan tietoja kasvinsuojeluaineiden mahdollisista sivuvaikutuksista maaperän pieneliöstöön tai kun on odotettavissa maaperän mikrobien altistuminen muille kemikaaleille kuin kasvin ­
suojeluaineille. Typen muuntumistestin avulla voidaan määrittää ky ­
seisten kemikaalien vaikutukset maaperän pieneliöstöön. Jos testatta ­
vat aineet ovat maatalouskemikaaleja (esimerkiksi kasvinsuojelu ­
aineita, lannoitteita tai metsätalouskemikaaleja), on tehtävä sekä ty ­
pen että hiilen muuntumistestit. Jos testattavat aineet ovat muita kuin 
maataloudessa käytettäviä kemikaaleja, pelkkä typen muuntumistesti riittää. Mikäli kyseisten kemikaalien typen muuntumistestistä saadut EC
 50 -arvot ovat kaupallisissa nitrifikaatiota estävissä aineissa (esi ­
merkiksi nitrapyriini) esiintyvällä alueella, hiilen muuntumistesti voi ­
daan tehdä lisätietojen saamiseksi.  
Maaperä muodostuu elävästä ja elottomasta aineesta, joka esiintyy 
erilaisina, heterogeenisina seoksina. Mikrobeilla on tärkeä osuus vil ­
javien maannosten orgaanisen aineen hajottamisessa ja muuttamises ­
sa, ja monet eliölajit vaikuttavat maannoksen viljavuuden eri tekijöi ­
hin. Kaikki pitkäaikaiset vaikutukset näihin biokemiallisiin prosessei ­
hin saattavat muuttaa ravinnekiertoa, jolloin maannoksen viljavuus saattaa muuttua. Hiilen ja typen muuntuminen tapahtuu kaikissa vil ­
javissa maannoksissa. Vaikka nämä prosessit aiheuttava mikrobi ­
yhteisö on erilainen eri maalajeissa, muuntumisreitit ovat olennaisilta osin samat.
 
Tässä kuvatun menetelmän tarkoitus on osoittaa testiaineen pitkä ­
aikaiset haittavaikutukset typen muuntumisprosessiin aerobisissa pin ­
tamaissa. Menetelmän avulla voidaan myös arvioida aineiden vaiku ­
tusta maaperän pieneliöstön aiheuttamaan hiilen muuntumiseen. Nit ­
raatin muodostuminen tapahtuu hiili-typpisidosten hajoamisen jäl ­
keen. Jos siis nitraatin tuotannon havaitaan olevan samalla tasolla 
käsitellyissä maanäytteissä ja kontrollinäytteissä, on hyvin todennä ­
köistä, että pääasialliset hiilisidosten hajoamisreitit toimivat hyvin. Menetelmässä käytettävän kasvualustan (jauhettu sinimailasseos) hii ­
li-typpisuhde on edullinen (yleensä 12/1-16/1). Tästä syystä hiilen 
puute ei ole merkittävää testin aikana, ja jos kemikaali vahingoittaa 
mikrobiyhteisöjä, ne saattavat toipua 100 päivän kuluessa.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1271
 
Tämän menetelmän perustana olevat testit ovat olleet tarkoitettuja 
pääasiassa aineille, joiden maaperään päätyvä määrä on ennakoita ­
vissa. Tällaisia aineita ovat esimerkiksi kasvinsuojeluaineet, sillä nii ­
den annostelu pellolle tiedetään. Maataloudessa käytettävien kemi ­
kaalien kohdalla riittää, kun testataan kaksi annostasoa oletetun an ­
nostelutiheyden mukaan. Maataloudessa käytettävien kemikaalien 
osalta voidaan testata tehoaine tai kaupallinen valmiste. Tässä esite ­
tyn menetelmän soveltamisala ei kuitenkaan rajoitu maataloudessa käytettäviin kemikaaleihin. Muuttamalla sekä maaperään annostelta ­
van testiaineen määrää että tulosten arviointia menetelmällä voidaan 
testata myös sellaisia kemikaaleja, joiden maaperään päätyvästä mää ­
rästä ei ole tietoa. Muista kuin maataloudessa käytettävistä kemikaa ­
leista määritetään useiden konsentraatioiden vaikutukset typen muun ­
tumiseen. Testitulosten perusteella laaditaan annos-vastekäyrä ja las ­
ketaan EC
 x -arvot, joissa x on määritelty vaikutus prosentteina.  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Typen muuntuminen:  mikrobien toiminnan tuloksena ammonifikaa ­
tio- ja nitrifikaatioprosessin kautta tapahtuva, typpeä sisältävän or ­
gaanisen aineen lopullinen hajoaminen vastaavaksi epäorgaaniseksi 
lopputuotteeksi, nitraatiksi.  
EC X (efektiivinen konsentraatio):  maaperässä esiintyvä testiaineen 
konsentraatio, joka estää typen muuntumista nitraatiksi x prosentilla.  
EC 50 (efektiivinen mediaanikonsentraatio):  maaperässä esiintyvä 
testiaineen konsentraatio, joka estää typen muuntumista nitraatiksi 50 prosentilla.
 
1.3 VERTAILUAINE  
Ei käytössä.  
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Seulottua maa-ainesta parannetaan jauhetulla kasviseoksella, ja se 
joko käsitellään testiaineella tai jätetään käsittelemättä (kontrollinäy ­
te). Maataloudessa käytettäviä kemikaaleja testattaessa suositellaan käytettäväksi vähintään kahta testikonsentraatiota, ja ne tulee valita 
suhteessa suurimpaan konsentraatioon, jonka odotetaan esiintyvän 
kentällä. Näytteitä inkuboidaan, päivinä 0, 7, 14 ja 28 käsitellyt näytteet ja kontrollinäytteet uutetaan sopivaan liuottimeen, ja uut ­
teista määritetään nitraattimäärät. Nitraatinmuodostuksen nopeutta 
käsitellyissä näytteissä verrataan vastaavaan nopeuteen kontrollinäyt ­
teissä ja käsiteltyjen näytteiden ja kontrollinäytteiden välinen prosen ­
tuaalinen ero lasketaan. Kaikkia testejä jatketaan vähintään 28 päivän ajan. Jos päivänä 28 käsiteltyjen näytteiden ja kontrollinäytteiden 
välinen ero on 25 % tai enemmän, mittauksia jatketaan (enintään 
100 päivään asti). Jos testattavana on muu kuin maataloudessa käy ­
tettävä kemikaali, maanäytteisiin lisätään sarja testiaineen konsent ­
raatioita ja muodostuneen nitraatin määrä mitataan käsitellyistä näyt ­
teistä ja kontrollinäytteistä 28 päivän inkubaation jälkeen. Useita 
konsentraatioita käyttäneiden testien tulokset analysoidaan regressio ­
mallia käyttäen ja EC
 x -arvot lasketaan (EC  50 , EC  25 ja/tai EC  10 ). 
Katso kohta Määritelmät.  
1.5 TESTIN VALIDITEETTI  
Maataloudessa käytettävien kemikaalien testitulosten arviot perustu ­
vat suhteellisen pieniin eroihin (esimerkiksi keskiarvo ± 25 %) kä ­
siteltyjen näytteiden ja kontrollinäytteiden nitraattikonsentraatioiden välillä, joten kontrollinäytteiden suuri vaihtelu voi johtaa virheellisiin 
tuloksiin. Tästä syystä rinnakkaisten kontrollinäytteiden välisen vaih ­
telun tulisi olla alle ± 15 %.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1272
 
1.6 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.6.1  Laitteet  
Testissä käytetään säiliöitä, jotka on valmistettu kemiallisesti inertistä 
materiaalista. Säiliöiden koon tulee sopia maanäytteiden inkubaatio ­
menettelyyn (joko massana tai sarjana erillisiä maanäytteitä, katso 
kohta 1.7.1.2). On syytä varmistaa, että veden haihtuminen testin aikana on minimaalista ja kaasujen vaihtuminen on mahdollista (tes ­
tisäiliö voidaan esimerkiksi peittää rei’itetyllä polyetyleenikalvolla). 
Testattaessa helposti haihtuvia aineita tulee käyttää kannellisia ja 
kaasutiiviitä säiliöitä. Niiden koon tulisi olla sellainen, että maanäyte täyttää noin neljäsosan niiden tilavuudesta.
 
Testissä käytetään seuraavia tavanomaisia laboratoriovälineitä:  
— sekoituslaite: mekaaninen ravistin tai vastaava laite,  
— sentrifugi (3 000 g) tai suodatin (käytetään nitraattia sisältämä ­
töntä suodatinpaperia),  
— nitraattianalyysia varten riittävän herkkä mittalaite, jonka mitta ­
ustulos on toistettavissa.  
1.6.2  Testattavien maalajien valinta ja määrä  
Testissä käytetään yhtä maalajia. Näytteeksi valittavan maannoksen 
suositeltavat ominaisuudet ovat seuraavat:  
— hiekkapitoisuus: vähintään 50 % ja enintään 75 %,  
— pH: 5,5 - 7,5,  
— orgaanisen hiilen pitoisuus: 0,5 - 1,5 %  
— mikrobibiomassa mitataan (8)(9), ja sen hiilipitoisuuden tulee olla 
vähintään 1 % maaperän orgaanisen hiilen kokonaispitoisuudesta.  
Useimmissa tapauksissa tällainen maannos edustaa pahinta mahdol ­
lista tapausta, koska testiaineen adsorboituminen on minimaalista ja 
sen saatavuus pieneliöstölle maksimaalista. Tämän takia ei yleensä 
ole tarpeen testata muita maalajeja. Kuitenkin joissain olosuhteissa, esimerkiksi kun testiainetta ennakoidaan käytettäväksi ennen kaikkea happamien metsämaiden tapaisissa maannoksissa tai kun kemikaali 
on elektrostaattisesti varautunut, voi olla tarpeen käyttää testissä 
myös toista maalajia.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1273
 
1.6.3  Maanäytteiden kerääminen ja varastointi  
1.6.3.1  Kerääminen  
Käytettävissä tulisi olla yksityiskohtaiset tiedot näytteenkeräyspaikan 
historiasta. Näitä tietoja ovat tarkka paikka, kasvipeite, kasvinsuoje ­
luainekäsittelyjen päivämäärät, käsittelyt orgaanisilla ja epäorgaa ­
nisilla lannoitteilla, biologisten materiaalien lisäykset tai satunnaiset saastumiskerrat. Näytteenkeräyspaikaksi valitun paikan tulisi olla pit ­
käaikainen. Sopivia paikkoja ovat jatkuvasti laidunmaana käytettävät 
alueet, vuosittain korjattavien viljakasvien (paitsi maissin) pellot tai 
tiheään kylvetyt viherkesannot. Näytteenottopaikaksi soveltuu alue, jota ei ole käsitelty kasvinsuojeluaineilla vähintään vuoteen ennen 
näytteenottoa. Soveltuvalla alueella ei myöskään ole käytetty orgaa ­
nista lannoitetta vähintään kuuteen kuukauteen. Mineraalilannoittei ­
den käyttö on hyväksyttävää vain silloin, kun se on viljeltävän kas ­
vin vaatimusten mukaista, ja maanäytteet voidaan tällöin ottaa vasta 
vähintään kolmen kuukauden kuluttua lannoitteen käytöstä. Näyttei ­
den ottamista maasta, jota on käsitelty biosidin tavoin vaikuttavalla lannoitteella (esimerkiksi kalsiumsyanamidilla), tulisi välttää.
 
Näytteenottoa tulisi välttää pitkien (yli 30 päivää) kuivien tai vedellä 
kyllästymisjaksojen aikana tai välittömästi niiden jälkeen. Auratuilla 
mailla näytteet on otettava 0-20 cm:n syvyydestä. Nurmimailla (lai ­
tumilla) tai muilla maa-alueilla, joita ei aurata pitkään aikaan (vähin ­
tään yhteen kasvukauteen), näytteenoton enimmäissyvyys voi olla 
hiukan yli 20 cm (esimerkiksi 25 cm).  
Maanäytteet tulee kuljettaa säiliöissä ja sellaisessa lämpötilassa, jossa 
maanäytteen alkuperäiset ominaisuudet eivät muutu merkittävästi.  
1.6.3.2  Varastointi  
Käytetyn maa-aineksen on mahdollisuuksien mukaan oltava äskettäin 
maasta otettua. Jos varastointi on välttämätöntä, maanäytteet voidaan 
varastoida pimeässä 4 (±2) C:n lämpötilassa enintään kolmen kuu ­
kauden ajan. Näytteiden varastoinnin aikana on varmistettava, että olosuhteet ovat aerobiset. Jos näytteet on kerätty alueilta, joilla maa ­
perä on jäässä vähintään kolme kuukautta vuodesta, varastointi kuu ­
den kuukauden ajan - 18 — - 22
 o C:n lämpötilassa voi tulla kysy ­
mykseen. Varastoitavien näytteiden mikrobibiomassa mitataan ennen 
kutakin koetta. Biomassan hiilipitoisuuden tulee olla vähintään 1 % 
näytteen orgaanisen hiilen kokonaispitoisuudesta (katso kohta 1.6.2).  
1.6.4  Näytteiden käsittely ja valmistelu testiä varten  
1.6.4.1  Esi-inkubaatio  
Jos näytettä on varastoitu (katso kohta 1.6.3.2), suositellaan sen esi- 
inkuboimista 2-28 päivän ajan. Esi-inkubaation aikana näytteen läm ­
pötilan ja kosteuspitoisuuden tulisi olla samanlaiset kuin testissä 
käytetyt (katso kohdat 1.6.4.2 ja 1.7.1.3).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1274
 
1.6.4.2  Fysiko-kemialliset ominaisuudet  
Näytteestä puhdistetaan manuaalisesti suuret hiukkaset (esimerkiksi 
kivet ja kasvinosat), minkä jälkeen se märkäseulotaan liikaa kuivaa ­
matta 2 mm:n tai tätä pienempään raekokoon. Näytteen kosteuspitoi ­
suus tulee säätää tislatulla tai ionipuhdistetulla vedellä 40-60 %:iin 
maksimaalisesta vedenpidätyskyvystä.  
1.6.4.3  Parannus orgaanisella substraatilla  
Maanäytettä tulee parantaa sopivalla orgaanisella substraatilla, esi ­
merkiksi jauhetulla sinimailas-ruohoseoksella (pääaineksena  Medi­
cago sativa),  jonka hiili-typpisuhde on 12/1-16/1. Suositeltu sini ­
mailasen ja maa-aineksen suhde on 5 g sinimailasta yhteen kiloon maa-ainesta (kuivapaino).
 
1.6.5  Testiaineen valmistelu näytteeseen annostelua varten  
Testiaine annostellaan tavallisesti kantaja-aineen avulla. Kantaja-ai ­
neena voi olla vesi (vesiliukoisten testiaineiden tapauksessa) tai inertti kiintoaine, kuten hieno kvartsihiekka (raekoko 0,1 - 
0,5 mm). Muita nestemäisiä kantaja-aineita kuin vettä (esimerkiksi 
orgaanisia liuottimia, kuten asetonia ja kloroformia) tulee välttää, koska ne saattavat vahingoittaa pieneliöstöä. Jos kantaja-aineena käy ­
tetään hiekkaa, se voidaan pinnoittaa testiaineella, joka on liuotettu 
tai suspendoitu sopivaan liuottimeen. Tällaisissa tapauksissa liuotin tulee poistaa haihduttamalla ennen kuin kantaja-aine sekoitetaan maa-ainekseen. Jotta testiaine leviäisi näytteessä optimaalisesti, suo ­
sitellaan suhteeksi 10 g hiekkaa yhtä näytteen kuivapainokiloa kohti. 
Kontrollinäytteet käsitellään vastaavalla määrällä pelkkää vettä ja/tai kvartsihiekkaa.
 
Testattaessa helposti haihtuvia kemikaaleja tulisi mahdollisuuksien 
mukaan välttää aineen hävikkiä käsittelyn aikana ja pyrkiä varmista ­
maan aineen tasainen leviäminen näytteeseen (esimerkiksi ruiskutta ­
malla testiaine näytteeseen useisiin kohtiin).  
1.6.6  Testikonsentraatiot  
Jos testataan maataloudessa käytettäviä kemikaaleja, tulee käyttää 
ainakin kahta konsentraatiota. Pienemmän konsentraation tulee ku ­
vastaa vähintään testiaineen käytännössä maaperään pääsevää mak ­
simimäärää, ja suuremman konsentraation puolestaan tulee olla pie ­
nemmän kerrannainen. Maanäytteeseen lisättävät testiaineen konsent ­
raatiot lasketaan olettaen, että aine imeytyy tasaisesti 5 cm:n syvyy ­
teen ja että maamassan tiheyden arvo on 1,5. Testattaessa maatalou ­
dessa käytettäviä, suoraan maaperään annosteltavia kemikaaleja tai 
kemikaaleja, joiden maaperään pääsevä määrä on ennakoitavissa, suositeltavat testikonsentraatiot ovat suurin odotettavissa oleva kon ­
sentraatio ympäristössä (Predicted Environmental Concentration, 
PEC) sekä mainittu konsentraatio kerrottuna viidellä. Testattaessa 
aineita, joita ennakoidaan annosteltaviksi maaperään useita kertoja kasvukaudessa, testikonsentraatio tulee johtaa kertomalla odotetta ­
vissa oleva ympäristössä havaittava enimmäiskonsentraatio ennakoi ­
tujen annostelukertojen määrällä. Suurin testikonsentraatio ei kuiten ­
kaan saa olla suurempi kuin kymmenen kertaa suurin yksittäinen annos. Jos testataan muita kuin maataloudessa käytettäviä kemikaa ­
leja, tulee testissä käyttää vähintään viiden konsentraation geomet ­
rista sarjaa. Valittujen testikonsentraatioiden tulee kattaa EC
 x -arvojen 
määrittämiseksi tarvittava alue.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1275
 
1.7 TESTIN SUORITUS  
1.7.1  Altistusolosuhteet  
1.7.1.1  Testinäytteet ja kontrollinäytteet  
Jos testataan maataloudessa käytettäviä kemikaaleja, maanäyte jae ­
taan kolmeen samanpainoiseen osaan. Kahteen osaan sekoitetaan 
testiaineen sisältävää kantaja-ainetta ja kolmanteen sekoitetaan kan ­
taja-ainetta, joka ei sisällä testiainetta (kontrollinäyte). On suositelta ­
vaa käyttää vähintään kolmea rinnakkaisnäytettä sekä testi- että kont ­
rollinäytteestä. Jos testataan muita kuin maataloudessa käytettäviä 
kemikaaleja, maanäyte jaetaan kuuteen samanpainoiseen osaan. Vii ­
teen osaan sekoitetaan testiaineen sisältävää kantaja-ainetta ja kuu ­
denteen sekoitetaan kantaja-ainetta, joka ei sisällä testiainetta. On 
suositeltavaa käyttää kolmea rinnakkaisnäytettä sekä testi- että kont ­
rollinäytteestä. Testiaineen tasainen leviäminen testinäytteisiin tulee varmistaa. Sekoittamisen aikana on vältettävä näytteen tiivistämistä 
tai muotoutumista palloksi.
 
1.7.1.2  Maanäytteiden inkubointi  
Maanäytteiden inkubointi voidaan toteuttaa kahdella tavalla: massana 
testi- ja kontrollinäytteestä tai sarjana yksittäisiä, samankokoisia osa ­
näytteitä testi- ja kontrollinäytteestä. Helposti haihtuvien aineiden 
testi on kuitenkin toteutettava sarjalle yksittäisiä osanäytteitä. Kun maanäytteet inkuboidaan massana, kutakin testi- ja kontrollinäytettä valmistetaan suuri määrä, josta analysoitavat osanäytteet otetaan tar ­
peen mukaan testin aikana. Alun perin valmistettava testi- ja kont ­
rollinäytteen määrä riippuu osanäytteiden koosta, analysoitavien rin ­
nakkaisnäytteiden määrästä sekä arvioitujen näytteenottokertojen enimmäismäärästä. Massana inkuboidut maanäytteet tulee sekoittaa 
huolellisesti ennen osanäytteen ottoa. Kun maanäytteet inkuboidaan 
yksittäisten näytteiden sarjana, kukin testi- ja kontrollimassanäyte jaetaan tarvittaviin osanäytteisiin, joita sitten käytetään tarpeen mu ­
kaan. Kokeissa, joissa näytteenottokertoja ennakoidaan olevan enem ­
män kuin kaksi, osanäytteitä tulee valmistaa riittävästi kaikkia rin ­
nakkaisnäytteitä ja näytteenottokertoja varten. Vähintään kolme tes ­
tattavan maanäytteen rinnakkaisnäytettä tulee inkuboida aerobisissa olosuhteissa (katso kohta 1.7.1.1). Kaikkien testien aikana tulee käyt ­
tää asianmukaisia säiliöitä, joissa on riittävästi ilmatilaa, jotta välte ­
tään anaerobisten olosuhteiden kehittyminen. Kun testataan haihtuvia aineita, testi tulee aina tehdä sarjalle yksittäisiä osanäytteitä.
 
1.7.1.3  Testiolosuhteet ja testin kesto  
Testi toteutetaan pimeässä 20 (±2)  o C:n huoneenlämmössä. Maanäyt ­
teiden kosteuspitoisuus tulee pitää testin aikana 40-60 %:ssa näytteen maksimaalisesta vedenpidätyskyvystä (katso kohta 1.6.4.2) vaihtelu ­
välillä ± 5 %. Tarvittaessa voidaan lisätä tislattua, ionipuhdistettua 
vettä.
 
Testien vähimmäiskesto on 28 päivää. Testattaessa maataloudessa 
käytettäviä kemikaaleja verrataan testi- ja kontrollinäytteiden nitraa ­
tinmuodostusnopeutta. Jos näiden ero on yli 25 % päivänä 28, testiä 
jatketaan, kunnes saavutetaan 25 %:n tai tätä pienempi ero, tai sadan päivän ajan sen mukaan, kumpaan menee vähemmän aikaa. Testat ­
taessa muita kuin maataloudessa käytettäviä kemikaaleja testi lope ­
tetaan 28 päivän kuluttua. Päivänä 28 määritetään nitraattimäärät 
testi- ja kontrollinäytteissä sekä lasketaan EC
 x -arvot.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1276
 
1.7.2  Näytteenotto ja näytteiden analyysi  
1.7.2.1  Näytteenottoaikataulu  
Jos testataan maataloudessa käytettäviä kemikaaleja, maanäytteistä 
analysoidaan nitraatti päivinä 0, 7, 14 ja 28. Jos testiä on jatkettava, 
jatkomittaukset tehdään 14 päivän välein päivästä 28 lähtien.  
Jos testataan muita kuin maataloudessa käytettäviä kemikaaleja, tulee 
käyttää vähintään viittä testikonsentraatiota ja näytteistä analysoidaan nitraatti testin alussa (päivä 0) ja altistusjakson lopussa (28 päivää). Tarvittaessa voidaan tehdä välimittaus esimerkiksi päivänä 
7. Päivänä 28 saatavien tietojen mukaan määritetään kemikaalin 
EC
 x -arvo. Haluttaessa voidaan raportoida maanäytteen alkuperäinen 
nitraattimäärä päivän 0 tietojen perusteella.  
1.7.2.2  Maanäytteiden analyysi  
Muodostuneen nitraatin määrä määritetään kaikista testi- ja kontrol ­
linäytteiden rinnakkaisnäytteistä kullakin näytteenottokerralla. Nit ­
raatti erotetaan maanäytteestä ravistamalla näytettä sopivassa liuotti ­
messa, esimerkiksi kaliumkloridiliuoksessa (0,1 M). Suositeltava 
suhde on 5 ml kaliumkloridiliuosta maanäytteen yhtä kuivapainog ­
rammaa kohti. Erotuksen optimoimiseksi maanäytteen ja liuottimen sisältävien säiliöiden tulee olla täytetty vain puolilleen. Sekoituksia 
ravistellaan 150 rpm 60 minuutin ajan. Sekoitukset sentrifugoidaan 
tai suodatetaan ja nestefaasista analysoidaan nitraatti. Nestemäiset uutteet, joissa ei ole hiukkasia, voidaan säilyttää ennen analyysia - 20 ± 5
 o C:n lämpötilassa enintään kuuden kuukauden ajan.  
2. MÄÄRITYSTULOKSET  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Jos tutkitaan maataloudessa käytettäviä kemikaaleja, kaikissa rinnak ­
kaisnäytteissä muodostuneen nitraatin määrä raportoidaan ja kaikkien 
rinnakkaisnäytteiden keskiarvoista laaditaan taulukko. Typen muun ­
tumisnopeudet tulee arvioida asianmukaisilla ja yleisesti hyväksy ­
tyillä tilastollisilla menetelmillä (esimerkiksi F-testi, 5 %:n merkitse ­
vyystaso). Muodostuneen nitraatin määrät ilmoitetaan milligram ­
moina per maanäytteen kuivapainokilo per päivä. Kunkin käsittelyn yhteydessä ilmenevää nitraatinmuodostusnopeutta verrataan kontrol ­
linäytteeseen ja prosentuaalinen ero kontrollinäytteeseen verrattuna 
lasketaan.
 
Jos testataan muita kuin maataloudessa käytettäviä kemikaaleja, kus ­
sakin rinnakkaisnäytteessä muodostuneen nitraatin määrä määritetään ja laaditaan annos-vastekäyrä EC
 x -arvojen arvioimista varten. Testi ­
näytteissä 28 päivän jälkeen havaittuja nitraattimääriä (mg / maa ­
näytteen kuivapainokilo) verrataan kontrollinäytteissä havaittuihin 
nitraattimääriin. Näistä tiedoista lasketaan prosentuaaliset estoarvot kaikille testikonsentraatioille. Laaditaan kuvaaja, jossa nämä prosent ­
tiarvot esitetään konsentraation funktiona, ja EC
 x -arvot lasketaan ti ­
lastollisin menetelmin. Luottamusvälit (p = 0,95) lasketuille EC  x - 
arvoille määritetään myös standardimenetelmillä (10)(11)(12).  
Suuria typpimääriä sisältävät testiaineet saattavat vaikuttaa testin ai ­
kana syntyvän nitraatin määrään. Jos näitä aineita testataan suurilla konsentraatioilla (esimerkiksi kemikaalit, joita ennakoidaan annostel ­
tavan toistuvasti), testiin tulee sisällyttää asianmukaiset kontrollit 
(esimerkiksi maanäyte ja testiaine ilman kasviseosta). Näistä kontrol ­
leista saadut tiedot tulee ottaa huomioon EC
 x -arvojen laskennassa.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1277
 
2.2 TULOSTEN TULKINTA  
Kun maataloudessa käytettävien kemikaalien testituloksia arvioita ­
essa nitraatinmuodostusnopeuden ero alimman testiaineannostuksen (joka vastaa ennakoitua enimmäiskonsentraatiota) ja kontrollinäyt ­
teen välillä on 25 % tai vähemmän millä tahansa näytteenottokerralla 
päivän 28 jälkeen, voidaan arvioida, että testiaineella ei ole pitkä ­
aikaista vaikutusta typen muuntumiseen maaperässä. Arvioitaessa muita kuin maataloudessa käytettäviä kemikaaleja tuloksissa esite ­
tään EC
 50 -, EC  25 - ja/tai EC  10 -arvot.  
3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
Testiselosteessa on annettava seuraavat tiedot.  
Tunnistetiedot testinäytteestä, mukaan lukien:  
— näytteenottopaikan maantieteellinen sijainti (leveys- ja pituusaste),  
— näytteenottopaikan historia (esimerkiksi kasvipeite, käsittelyt kas ­
vinsuojeluaineilla, lannoitekäsittelyt, satunnainen saastuminen),  
— käyttötapa (esimerkiksi maanviljelysmaa, metsä),  
— näytteenottosyvyys (cm),  
— hiekka-/siltti-/savipitoisuus ( % kuivapainosta),  
— pH (vedessä),  
— orgaanisen hiilen pitoisuus ( % kuivapainosta),  
— typpipitoisuus ( % kuivapainosta),  
— alkuperäinen nitraattikonsentraatio (mg nitraattia / kg kuivapai ­
noa),  
— kationinvaihtokyky (mmol/kg),  
— mikrobibiomassa prosentteina orgaanisen hiilen kokonaismäärästä,  
— viitetiedot kunkin parametrin määritysmenetelmästä,  
— tiedot maanäytteiden keräämisestä ja varastoinnista,  
— maaperän esi-inkubointitiedot tarvittaessa.  
Testiaine:  
— fysikaalinen olomuoto ja tarvittaessa fysiko-kemialliset ominai ­
suudet,  
— tarvittaessa kemialliset tunnistetiedot, mukaan lukien rakennekaava, 
puhtaus (esimerkiksi kasvinsuojeluaineista tehoaineen prosentti ­
osuus), typpipitoisuus.  
Kasvualusta:  
— kasvualustan lähde,  
— koostumus (esimerkiksi sinimailanen, sinimailas-ruohoseos),  
— hiili- ja typpipitoisuus ( % kuivapainosta),  
— seulan reiän koko (mm).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1278
 
Testiolosuhteet:  
— tiedot maanäytteen parantamisesta orgaanisella kasvualustalla,  
— testiaineen konsentraatioiden määrä ja tarvittaessa niiden valinta ­
perusteet,  
— tiedot testiaineen annostelusta maahan,  
— inkubaatiolämpötila,  
— näytteen kosteuspitoisuus testin alussa ja sen aikana,  
— näytteen inkubointitapa (massana tai useina erillisinä osanäytteinä),  
— rinnakkaisnäytteiden määrä,  
— näytteenottoajankohdat,  
— menetelmä nitraatin uuttamiseksi näytteestä.  
Tulokset:  
— nitraatin analysoinnissa käytetty menetelmä ja laitteisto,  
— taulukko nitraattimittausten yksittäisistä arvoista ja keskiarvoista,  
— testi -ja kontrollinäytteiden rinnakkaisnäytteiden välinen vaihtelu,  
— laskuihin tehtyjen korjausten selitykset tarvittaessa,  
— nitraatinmuodostusnopeuden prosentuaalinen vaihtelu kullakin 
näytteenottokerralla tai soveltuvin osin EC  50 -arvo 95 %:n luotta ­
musvälein, muu EC  x -arvo (joko EC  25 tai EC  10 ) luottamusvälein 
ja annos-vastekäyrä,  
— tulosten tilastollinen käsittely,  
— kaikki tulosten tulkinnan kannalta hyödylliset tiedot ja havainnot.  
4. LÄHDELUETTELO  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
 
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (toinen painos 1990).
 
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guid ­
elines; Proposed rule. 28. syyskuuta 1987.  
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, 
Pub. SETAC-Europe, Bryssel.  
(5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality — Determination of Nit ­
rogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influ ­
ence of Chemicals on these Processes. Technical Committee 
ISO/TC 190/SC 4:  Soil Quality  — Biological Methods.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1279
 
(6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Se ­
lection of Soils/Sediments, Belgirate, Italia, 18. 
-20. tammikuuta 1995.  
(7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality — Sampling. Guidance on 
the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
 
(8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 1: Substrate-induced respiration 
method.  
(9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 2: Fumigation-extraction method.  
(10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and 
Exper. Ther., 96, 99-113.  
(11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. Kolmas painos, Cambrid ­
ge, Lontoo ja New York.  
(12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 
Griffin, Weycombe, Iso-Britannia.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1280
 
C.22.  MAAPERÄN MIKROBIT: HIILEN MUUNTUMISTESTI  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä on toisinto OECD:n testiohjeesta nro 217 (2000).  
1.1 JOHDANTO  
Tämän menetelmän tarkoitus on tutkia laboratoriomenetelmin kasvin ­
suojeluaineiden ja mahdollisesti muiden kemikaalien pitkäaikaisia 
vaikutuksia maaperän mikrobien hiiltä muuntavaan toimintaan ker ­
ta-altistuksen jälkeen. Testi perustuu pääosin Euroopan ja Välimeren alueen kasvinsuojelujärjestön (OEPP) antamiin suosituksiin (1). Myös muiden elinten, esimerkiksi Saksan Biologische Bundesans ­
taltin (2), Yhdysvaltain ympäristönsuojeluviraston (3), ja SETACin 
(4) laatimat ohjeet on otettu huomioon. Menetelmässä käytettävien maanäytteiden määrästä ja tyypistä on sovittu maalajin ja sedimentin valintaa käsitelleessä OECD:n työryhmässä, joka kokoontui Belgira ­
tessa Italiassa vuonna 1995 (5). Maanäytteiden keräämiseen, käsitte ­
lyyn ja varastointiin liittyvät suositukset perustuvat ISO:n ohjeisiin (6) sekä Belgiraten työryhmän suosituksiin.
 
Testiaineiden toksisten ominaisuuksien arvioinnin yhteydessä voi 
olla tarpeen määrittää niiden vaikutukset maaperän mikrobien toimin ­
taan, esimerkiksi silloin kun tarvitaan tietoja kasvinsuojeluaineiden 
mahdollisista sivuvaikutuksista maaperän pieneliöstöön tai kun on odotettavissa maaperän mikrobien altistuminen muille kemikaaleille kuin kasvinsuojeluaineille. Hiilen muuntumistestin tarkoituksena on 
määrittää kyseisten kemikaalien vaikutukset maaperän pieneliöstöön. 
Jos testattavat aineet ovat maatalouskemikaaleja (esimerkiksi kasvin ­
suojeluaineita, lannoitteita tai metsätalouskemikaaleja), on tehtävä sekä hiilen että typen muuntumistestit. Jos testattavat aineet ovat 
muita kuin maatalouskemikaaleja, pelkkä typen muuntumistesti riit ­
tää. Mikäli kyseisten kemikaalien typen muuntumistestistä saadut EC
 50 -arvot ovat kaupallisissa nitrifikaatiota estävien aineiden (esi ­
merkiksi nitrapyriini) alueella, hiilen muuntumistesti voidaan tehdä 
lisätietojen saamiseksi.  
Maaperä muodostuu elävästä ja elottomasta aineesta, joka esiintyy 
erilaisina, heterogeenisina seoksina. Mikrobeilla on tärkeä osuus vil ­
javien maannosten orgaanisen aineen hajottamisessa ja muuntamises ­
sa, ja monet eliölajit vaikuttavat maannoksen viljavuuden eri tekijöi ­
hin. Kaikki pitkäaikaiset vaikutukset näihin biokemiallisiin prosessei ­
hin saattavat muuttaa ravinnekiertoa, jolloin maannoksen viljavuus saattaa muuttua. Hiilen ja typen muuntumista tapahtuu kaikissa vil ­
javissa maannoksissa. Vaikka nämä prosessit aiheuttava mikrobi ­
yhteisö on erilainen eri maalajeissa, muuntumisreitit ovat olennaisilta 
osin samat.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1281
 
Tässä kuvatun menetelmän tarkoitus on todeta testiaineen pitkäaikai ­
set haittavaikutukset hiilen muuntumisprosessiin aerobisissa pinta ­
maissa. Testin avulla voidaan havaita hiiltä muuntavien mikrobi ­
yhteisöjen koon ja toiminnan muutoksia, koska testi altistaa mikrobi ­
yhteisöt sekä kemialliselle stressille että hiilenpuutteelle. Testissä 
käytetään hiekkaista maannosta, joka sisältää niukasti orgaanista ai ­
netta. Maannos käsitellään testiaineella ja inkuboidaan olosuhteissa, joissa mikrobien aineenvaihdunta on nopeaa. Tällaisissa olosuhteissa maannoksen sisältämä helposti saatava hiili loppuu nopeasti. Tämä 
aiheuttaa hiilenpuutteen, joka sekä tappaa mikrobisoluja että aiheut ­
taa horroksen ja/tai lepoitiöiden muodostumisen. Jos testiä jatketaan yli 28 päivän ajan, näiden reaktioiden summa voidaan mitata (käsit ­
telemätöntä maa-ainesta sisältävistä) kontrollinäytteistä metabolisesti 
aktiivisen mikrobibiomassan asteittain etenevänä vähenemisenä (7). 
Jos hiilikadosta kärsivän maa-aineksen biomassaan kohdistuu testio ­
losuhteissa jonkin kemikaalin vaikutus, testinäytteen biomassa ei mahdollisesti palaudu samalle tasolle kuin kontrollinäytteen. Niinpä 
testiaineen milloin tahansa testin aikana aiheuttamat häiriöt kestävät 
usein testin loppuun asti.
 
Tämän menetelmän perustana olevat testit ovat olleet tarkoitetut pää ­
asiassa aineille, joiden maaperään päätyvä määrä on ennakoitavissa. 
Tällaisia aineita ovat esimerkiksi kasvinsuojeluaineet, sillä niiden 
levitystiheys pellolle tiedetään. Maataloudessa käytettävien kemikaa ­
lien osalta riittää kahden sellaisen annoksen testaaminen, jotka ku ­
vastavat oletettua levitysannosta. Maatalouskemikaalit voidaan testata 
tehoaineena tai (kaupallisena) valmisteena. Tässä esitetyn menetel ­
män soveltamisala ei kuitenkaan rajoitu kemikaaleihin, joiden ympä ­
ristössä havaittavat konsentraatiot ovat ennustettavissa. Muuttamalla sekä maannokseen levitettävän testiaineen määrää että tulosten arvi ­
ointitapaa menetelmällä voidaan testata myös sellaisia kemikaaleja, 
joiden maaperään päätyvää määrää ei tunneta. Muista kuin maatalou ­
dessa käytettävistä kemikaaleista määritetään useiden konsentraatioi ­
den vaikutukset hiilen muuntumiseen. Testitulosten perusteella laa ­
ditaan annos-vastekäyrä ja lasketaan EC
 x -arvot, joissa x on mää ­
ritelty vaikutus prosentteina.  
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Hiilen muuntuminen:  mikrobien toiminnan tuloksena tapahtuva or ­
gaanisen aineen hajoaminen epäorgaaniseksi lopputuotteeksi, hiilidi ­
oksidiksi.  
EC X (efektiivinen konsentraatio):  maaperässä esiintyvä testiaineen 
konsentraatio, joka estää hiilen muuntumista hiilidioksidiksi x pro ­
sentilla.  
EC 50 (efektiivinen mediaanikonsentraatio):  maaperässä esiintyvä 
testiaineen konsentraatio, joka estää hiilen muuntumista hiilidioksi ­
diksi 50 prosentilla.  
1.3 VERTAILUAINE  
Ei käytössä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1282
 
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Seulottua maa-ainesta joko käsitellään testiaineella tai käsittely jäte ­
tään tekemättä (kontrollinäyte). Maataloudessa käytettäviä kemikaa ­
leja testattaessa suositellaan käytettäväksi vähintään kahta testikon ­
sentraatiota, ja ne tulee valita suhteessa suurimpaan konsentraatioon, 
jonka odotetaan esiintyvän testattavassa ympäristössä. Inkubaatioajan (0, 7, 14 ja 28 päivää) jälkeen käsiteltyihin näytteisiin ja kontrolli ­
näytteisiin sekoitetaan glukoosia, ja glukoosin aiheuttaman soluhen ­
gityksen nopeutta mitataan yhtäjaksoisesti 12 tunnin ajan. Soluhen ­
gitysnopeus ilmoitetaan vapautuneena hiilidioksidina (milligrammaa hiilidioksidia/kuivapainokilo/tunti) tai kulutettuna happena (millig ­
rammaa happea / maanäytteen kilo / tunti). Soluhengitysnopeuden 
keskiarvoa käsitellyissä näytteissä verrataan vastaavaan nopeuteen kontrollinäytteissä ja käsiteltyjen näytteiden ja kontrollinäytteiden välinen prosentuaalinen ero lasketaan. Kaikkia testejä jatketaan vä ­
hintään 28 päivän ajan. Jos päivänä 28 käsiteltyjen näytteiden ja 
kontrollinäytteiden välinen ero on 25 % tai enemmän, mittauksia jatketaan 14 päivän välein enintään 100 päivään asti. Jos testattavana on muu kuin maataloudessa käytettävä kemikaali, maanäytteisiin li ­
sätään sarja testiaineen konsentraatioita, ja muodostuneen glukoosin 
aiheuttama soluhengitysnopeus (muodostuneen hiilidioksidin tai ku ­
lutetun hapen määrän keskiarvo) mitataan käsitellyistä näytteistä ja kontrollinäytteistä 28 päivän inkubaation jälkeen. Useita konsentraa ­
tioita käyttäneiden testien tulokset analysoidaan regressiomallia käyt ­
täen ja EC
 x -arvot lasketaan (EC  50 , EC  25 ja/tai EC  10 ). Katso kohta 
Määritelmät.  
1.5 TESTIN VALIDITEETTI  
Maatalouskemikaalien testitulosten arviot perustuvat suhteellisen pie ­
niin eroihin (esimerkiksi keskiarvo ±25 %) käsitellyissä näytteissä ja kontrollinäytteissä vapautuneen hiilidioksidin tai näytteiden kulutta ­
man hapen välillä, joten kontrollinäytteiden suuri vaihtelu voi johtaa 
virheellisiin tuloksiin. Tästä syystä rinnakkaisten kontrollinäytteiden 
välisen vaihtelun pitäisi olla alle ±15 %.
 
1.6 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.6.1  Laitteet  
Testissä käytetään säiliöitä, jotka on valmistettu kemiallisesti inertistä 
materiaalista. Säiliöiden on sovittava kooltaan maanäytteiden inku ­
baatiomenettelyyn (joko koko massana tai sarjana erillisiä maanäyt ­
teitä, katso kohta 1.7.1.2). Testin aikana on syytä varmistaa, että 
veden haihtuminen on mahdollisimman vähäistä ja että kaasujen 
vaihtuminen on mahdollista (testisäiliö voidaan esimerkiksi peittää rei’itetyllä polyetyleenikalvolla). Testattaessa helposti haihtuvia ai ­
neita tulee käyttää kannellisia ja kaasutiiviitä säiliöitä. Niiden koon 
tulisi olla sellainen, että maanäyte täyttää noin neljäsosan niiden 
tilavuudesta.
 
Glukoosin aiheuttaman soluhengityksen mittaamiseksi tarvitaan inku ­
bointijärjestelmä ja mittauslaitteet, joilla voidaan mitata hiilidioksidin tuotantoa tai hapen kulutusta. Tällaisia järjestelmiä ja mittauslaitteita kuvataan jäljempänä mainituissa kirjallisuusviitteissä (8) (9) (10) 
(11).
 
1.6.2  Testattavien maalajien valinta ja määrä  
Testissä käytetään yhtä maalajia. Näytteeksi valittavan maannoksen 
suositeltavat ominaisuudet ovat seuraavat:  
— hiekkapitoisuus: vähintään 50 % ja enintään 75 %,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1283
 
— pH: 5,5 - 7,5,  
— orgaanisen hiilen pitoisuus: 0,5 - 1,5 %,  
— mikrobibiomassa mitataan (12)(13), ja sen hiilipitoisuuden tulee 
olla vähintään 1 % maaperän orgaanisen hiilen kokonaispitoisuu ­
desta.  
Useimmissa tapauksissa tällainen maannos on hankalin mahdollinen 
tapaus, koska testiaineen adsorboituminen on minimaalista ja sen saatavuus pieneliöstölle maksimaalista. Tämän vuoksi ei yleensä 
ole tarpeen testata muita maalajeja. Kuitenkin joissain olosuhteissa, 
esimerkiksi kun testiainetta ennakoidaan käytettäväksi runsaasti en ­
nen kaikkea happamien metsämaiden tapaisissa maannoksissa tai kun kemikaali on elektrostaattisesti varautunut, voi olla tarpeen käyttää 
testissä toista maalajia.
 
1.6.3  Maanäytteiden kerääminen ja varastointi  
1.6.3.1  Kerääminen  
Näytteenkeräyspaikasta tulisi olla käytettävissä yksityiskohtaiset 
taustatiedot. Näitä tietoja ovat tarkka sijainti, kasvipeite, kasvinsuo ­
jeluainekäsittelyjen päivämäärät, käsittelyt orgaanisilla ja epäorgaa ­
nisilla lannoitteilla, biologisten materiaalien lisäykset tai satunnaiset saastumiskerrat. Näytteenkeräyspaikaksi valitun paikan tulisi olla pit ­
käaikainen. Sopivia paikkoja ovat jatkuvasti laidunmaana käytettävät 
alueet, vuosittain korjattavien viljakasvien (paitsi maissin) pellot tai 
tiheään kylvetyt viherkesannot. Näytteenottopaikaksi soveltuu alue, jota ei ole käsitelty kasvinsuojeluaineilla vähintään vuoteen ennen näytteenottoa. Soveltuvalla alueella ei myöskään ole käytetty orgaa ­
nista lannoitetta vähintään kuuteen kuukauteen. Mineraalilannoittei ­
den käyttö on hyväksyttävää vain silloin, kun se on viljeltävän kas ­
vin kannalta tarpeen; maanäytteet voidaan tällöin ottaa vasta vähin ­
tään kolmen kuukauden kuluttua lannoitteen käytöstä. Näytteiden 
ottamista maasta, jota on käsitelty biosidin tavoin vaikuttavalla lan ­
noitteella (esimerkiksi kalsiumsyanamidilla), tulisi välttää.
 
Näytteenottoa tulisi välttää pitkien (yli 30 päivän) kuivuuden tai 
vettymisjaksojen aikana tai välittömästi niiden jälkeen. Auratuilla 
mailla näytteet on otettava 0-20 cm:n syvyydestä. Nurmimailla (lai ­
tumilla) tai muilla maa-alueilla, joita ei aurata pitkään aikaan (vähin ­
tään yhteen kasvukauteen), näytteenoton enimmäissyvyys voi olla 
hiukan yli 20 cm (esimerkiksi enintään 25 cm). Maanäytteet on 
kuljetettava säiliöissä sellaisessa lämpötilassa, jossa maanäytteen al ­
kuperäiset ominaisuudet eivät muutu merkittävästi.  
1.6.3.2  Varastointi  
Käytetyn maa-aineksen on oltava mieluiten äskettäin maasta otettua. 
Jos on välttämätöntä käyttää laboratoriossa varastoitua maa-ainesta, 
maanäytteet voidaan varastoida pimeässä 4 (±2)  o C:n lämpötilassa 
enintään kolmen kuukauden ajan. Näytteiden varastoinnin aikana on varmistettava, että olosuhteet ovat aerobiset. Jos näytteet on kerätty 
alueilta, joilla maaperä on jäässä vähintään kolme kuukautta vuodes ­
ta, varastointi kuuden kuukauden ajan - 18
 o C:n lämpötilassa voi 
tulla kysymykseen. Varastoitavien näytteiden mikrobibiomassa mita ­
taan ennen kutakin koetta. Biomassan hiilipitoisuuden on oltava vä ­
hintään 1 % näytteen orgaanisen hiilen kokonaispitoisuudesta (katso 
kohta 1.6.2).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1284
 
1.6.4  Näytteiden käsittely ja valmistelu testiä varten  
1.6.4.1  Esi-inkubaatio  
Jos näytettä on varastoitu (katso kohta 1.6.4.2 ja 1.7.1.3), suositel ­
laan sen esi-inkuboimista 2-28 päivän ajan. Esi-inkubaation aikana 
näytteen lämpötilan ja kosteuspitoisuuden tulisi olla samanlaiset kuin 
testissä käytetyt (katso kohdat 1.6.4.2 ja 1.7.1.3)  
1.6.4.2  Fysiko-kemialliset ominaisuudet  
Näytteestä puhdistetaan manuaalisesti suuret vieraat esineet (esimer ­
kiksi kivet ja kasvinosat), minkä jälkeen se märkäseulotaan liikaa 
kuivaamatta enintään 2 mm:n raekokoon. Näytteen kosteuspitoisuus 
tulee säätää tislatulla tai ionipuhdistetulla vedellä 40-60 %:iin maksi ­
maalisesta vedenpidätyskyvystä.  
1.6.5  Testiaineen valmistelu näytteeseen annostelua varten  
Testiaine annostellaan tavallisesti kantaja-aineen avulla. Kantaja-ai ­
neena voi olla vesi (vesiliukoisten testiaineiden yhteydessä) tai inertti 
kiintoaine, kuten hieno kvartsihiekka (raekoko 0,1 - 0,5 mm). Muita 
nestemäisiä kantaja-aineita kuin vettä (esimerkiksi orgaanisia liuotti ­
mia, kuten asetonia ja kloroformia) tulee välttää, koska ne saattavat vahingoittaa pieneliöstöä. Jos kantaja-aineena käytetään hiekkaa, se 
voidaan pinnoittaa testiaineella, joka on liuotettu tai suspendoitu 
sopivaan liuottimeen. Tällaisissa tapauksissa liuotin tulee poistaa haihduttamalla ennen kuin kantaja-aine sekoitetaan maannokseen. Jotta testiaine leviäisi näytteessä optimaalisesti, suositellaan suhteeksi 
10 g hiekkaa yhtä näytteen kuivapainokiloa kohti. Kontrollinäytteet 
käsitellään vastaavalla määrällä pelkkää vettä ja/tai kvartsihiekkaa.
 
Testattaessa helposti haihtuvia kemikaaleja tulisi mahdollisuuksien 
mukaan välttää aineen hävikkiä käsittelyn aikana ja pyrkiä varmista ­
maan aineen tasainen leviäminen näytteeseen (esimerkiksi ruiskutta ­
malla testiaine näytteeseen useisiin kohtiin).  
1.6.6  Testikonsentraatiot  
Jos testataan maataloudessa käytettäviä kemikaaleja tai muita kemi ­
kaaleja, joiden pitoisuus ympäristössä on ennustettavissa, tulee käyt ­
tää ainakin kahta konsentraatiota. Pienemmän konsentraation tulee 
kuvastaa vähintään testiaineen käytännössä maaperään pääsevää 
enimmäismäärää, ja suuremman konsentraation puolestaan tulee olla pienemmän kerrannainen. Maanäytteeseen lisättävät testiaineen konsentraatiot lasketaan olettaen, että aine imeytyy tasaisesti 5 cm:n 
syvyyteen ja että maamassan tiheyden arvo on 1,5. Testattaessa maa ­
taloudessa käytettäviä, suoraan maaperään levitettäviä kemikaaleja tai kemikaaleja, joiden maaperään pääsevä määrä on ennakoitavissa, 
suositeltavat testikonsentraatiot ovat suurin odotettavissa oleva kon ­
sentraatio ympäristössä sekä mainittu konsentraatio kerrottuna viidel ­
lä. Testattaessa mahdollisesti useita kertoja kasvukaudessa maaperään levitettäviä aineita testikonsentraatio johdetaan kertomalla suurin od ­
otettavissa oleva konsentraatio ympäristössä ennakoitujen levitysker ­
tojen määrällä. Suurin testikonsentraatio voi kuitenkin olla enintään kymmenen kertaa suurempi kuin suurin yksittäinen annos.
 
Jos testataan muita kuin maataloudessa käytettäviä kemikaaleja, tulee 
testissä käyttää vähintään viiden konsentraation geometrista sarjaa. 
Valittujen testikonsentraatioiden tulee kattaa EC  x -arvojen määrittämi ­
seksi tarvittava alue.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1285
 
1.7 TESTIN SUORITUS  
1.7.1  Altistusolosuhteet  
1.7.1.1  Testinäytteet ja kontrollinäytteet  
Jos testataan maataloudessa käytettäviä kemikaaleja, maanäyte jae ­
taan kolmeen samanpainoiseen osaan. Kahteen osaan sekoitetaan 
testiaineen sisältävää kantaja-ainetta ja kolmanteen sekoitetaan kan ­
taja-ainetta, joka ei sisällä testiainetta (kontrollinäyte). On suositelta ­
vaa käyttää vähintään kolmea rinnakkaisnäytettä sekä testi- että kont ­
rollinäytteestä. Jos testataan muita kuin maataloudessa käytettäviä 
kemikaaleja, maanäyte jaetaan kuuteen samanpainoiseen osaan. Vii ­
teen osaan sekoitetaan testiaineen sisältävää kantaja-ainetta ja kuu ­
denteen sekoitetaan kantaja-ainetta, joka ei sisällä testiainetta. On 
suositeltavaa käyttää kolmea rinnakkaisnäytettä sekä testi- että kont ­
rollinäytteestä. Testiaineen tasainen leviäminen testinäytteisiin tulee varmistaa. Sekoittamisen aikana on vältettävä näytteen tiivistämistä 
tai muotoutumista palloksi.
 
1.7.1.2  Maanäytteiden inkubointi  
Maanäytteiden inkubointi voidaan toteuttaa kahdella tavalla: massana 
testi- ja kontrollinäytteestä tai sarjana yksittäisiä, samankokoisia osa ­
näytteitä testi- ja kontrollinäytteestä. Helposti haihtuvien aineiden testi on kuitenkin toteutettava sarjalle yksittäisiä osanäytteitä. Kun 
maanäytteet inkuboidaan massana, kutakin testi- ja kontrollinäytettä 
valmistetaan suuri määrä, josta analysoitavat osanäytteet otetaan tar ­
peen mukaan testin aikana. Alun perin valmistettava testi- ja kont ­
rollinäytteen määrä riippuu osanäytteiden koosta, analysoitavien rin ­
nakkaisnäytteiden määrästä sekä arvioitujen näytteenottokertojen 
enimmäismäärästä. Massana inkuboidut maanäytteet tulee sekoittaa huolellisesti ennen osanäytteen ottoa. Kun maanäytteet inkuboidaan yksittäisten näytteiden sarjana, kukin testi- ja kontrollimassanäyte 
jaetaan tarvittaviin osanäytteisiin, joita sitten käytetään tarpeen mu ­
kaan. Kokeissa, joissa näytteenottokertoja ennakoidaan olevan enem ­
män kuin kaksi, osanäytteitä tulee valmistaa riittävästi kaikkia rin ­
nakkaisnäytteitä ja näytteenottokertoja varten. Vähintään kolme tes ­
tattavan maanäytteen rinnakkaisnäytettä tulee inkuboida aerobisissa 
olosuhteissa (katso kohta 1.7.1.1). Kaikkien testien aikana tulee käyt ­
tää asianmukaisia säiliöitä, joissa on riittävästi ilmatilaa, jotta välte ­
tään anaerobisten olosuhteiden kehittyminen. Kun testataan haihtuvia 
aineita, testi tulee aina tehdä sarjalle yksittäisiä osanäytteitä.
 
1.7.1.3  Testiolosuhteet ja testin kesto  
Testi toteutetaan pimeässä 20 (±2)  o C:n huoneenlämmössä. Maanäyt ­
teiden kosteuspitoisuus tulee pitää testin aikana 40-60 %:ssa näytteen maksimaalisesta vedenpidätyskyvystä (katso kohta 1.6.4.2) vaihtelu ­
välillä ±5 %. Tarvittaessa voidaan lisätä tislattua, ionipuhdistettua 
vettä.
 
Testien vähimmäiskesto on 28 päivää. Testattaessa maataloudessa 
käytettäviä kemikaaleja verrataan testi- ja kontrollinäytteissä vapau ­
tuneen hiilidioksidin tai kulutetun hapen määrää. Jos näiden ero on 
yli 25 % päivänä 28, testiä jatketaan, kunnes saavutetaan enintään 
25 % suuruinen ero, tai 100 päivän ajan sen mukaan, kumpaan kuluu vähemmän aikaa. Testattaessa muita kuin maataloudessa käytettäviä kemikaaleja testi lopetetaan 28 päivän kuluttua. Päivänä 
28 määritetään vapautuneen hiilidioksidin tai kulutetun hapen määrät 
testi- ja kontrollinäytteissä sekä lasketaan EC
 x -arvot.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1286
 
1.7.2  Näytteenotto ja näytteiden analyysi  
1.7.2.1  Näytteenottoaikataulu  
Jos testataan maataloudessa käytettäviä kemikaaleja, maanäytteistä 
analysoidaan glukoosin aiheuttama soluhengitysnopeus päivinä 0, 
7, 14 ja 28. Jos testiä on jatkettava, jatkomittaukset tehdään 14 
päivän välein päivästä 28 lähtien.  
Jos testataan muita kuin maataloudessa käytettäviä kemikaaleja, tulee 
käyttää vähintään viittä testikonsentraatiota, ja näytteistä analysoi ­
daan glukoosin aiheuttama soluhengitys testin alussa (päivä 0) ja 
altistusjakson lopussa (28 päivää). Tarvittaessa voidaan tehdä väli ­
mittaus esimerkiksi päivänä 7. Päivänä 28 saatuja tietoja käytetään kemikaalin EC
 x -arvon määrittämiseksi. Haluttaessa voidaan arvioida 
maanäytteen alkuperäinen metabolisesti aktiivisen mikrobibiomassan 
määrä päivän 0 tietojen perusteella (12).  
1.7.2.2  Glukoosin aiheuttaman soluhengitysnopeuden mittaaminen  
Glukoosin aiheuttama soluhengitysnopeus mitataan kustakin testi- ja 
kontrollinäytteestä jokaisella näytteenottokerralla. Maanäytteisiin se ­
koitetaan sellainen glukoosimäärä, joka riittää aiheuttamaan välittö ­
mästi maksimaalisen soluhengitysvasteen. Kullekin maalajille riittävä 
määrä voidaan määrittää testaamalla esitestissä sarja glukoosipitoi ­
suuksia (14). Hiekkamaannoksille, joiden orgaanisen hiilen pitoisuus on 0,5 - 1,5 %, riittävä annos on kuitenkin yleensä 2 000 - 4 000 mg 
glukoosia / maanäytteen kuivapainokilo. Glukoosi voidaan jauhaa 
hienoksi yhdessä puhtaan kvartsihiekan kanssa (10 g hiekkaa / maa ­
näytteen kuivapainokilo) ja sekoittaa tasaisesti maanäytteeseen.
 
Glukoosilla parannettuja maanäytteitä inkuboidaan laitteessa, josta 
soluhengitysnopeus voidaan mitata joko jatkuvasti, joka tunti tai 
joka toinen tunti (katso kohta 1.6.1) 20  o C:n (±2) lämpötilassa. Va ­
pautunut hiilidioksidi tai kulutettu happi mitataan yhtäjaksoisesti 12 tunnin aikana. Mittaukset tulee aloittaa mahdollisimman pian eli 1-2 tunnin kuluttua glukoosin lisäämisestä. Mitataan 12 tunnin aikana 
vapautuneen hiilidioksidin tai kulutetun hapen kokonaismäärä ja 
määritetään soluhengityksen keskinopeus.
 
2. MÄÄRITYSTULOKSET  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Jos tutkitaan maatalouskemikaaleja, kunkin rinnakkaisnäytteessä va ­
pautuneen hiilidioksidin tai kunkin maanäytteen kuluttaman hapen 
määrä raportoidaan, ja kaikkien rinnakkaisnäytteiden keskiarvoista 
laaditaan taulukko. Tulokset tulee arvioida asianmukaisilla ja ylei ­
sesti hyväksytyillä tilastollisilla menetelmillä (esimerkiksi F-testi, 5 %:n merkitsevyystaso). Glukoosin aiheuttama soluhengitysnopeus 
ilmoitetaan milligrammoina hiilidioksidia / maanäytteen kuivapaino ­
kilo / tunti tai milligrammoina happea / maanäytteen kuivapainokilo / tunti. Kustakin testinäytteestä saatua hiilidioksidin muodostumisno ­
peuden keskiarvoa tai hapen kulutusnopeuden keskiarvoa verrataan 
kontrollinäytteen arvoihin ja lasketaan prosentuaalinen poikkeama 
kontrollista.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1287
 
Jos testataan muita kuin maataloudessa käytettäviä kemikaaleja, kus ­
sakin rinnakkaisnäytteessä vapautuneen hiilidioksidin tai kulutetun 
hapen määrä määritetään ja laaditaan annos-vastekäyrä EC  x -arvojen 
arvioimista varten. Testinäytteistä 28 päivän jälkeen havaittuja glu ­
koosin aiheuttaman soluhengitysnopeuden arvoja (mg hiilidioksidia / 
maanäytteen kuivapainokilo / tunti tai mg happea / maanäytteen 
kuivapainokilo / tunti) verrataan kontrollinäytteistä havaittuihin ar ­
voihin. Näistä tiedoista lasketaan prosentuaaliset estoarvot kaikille testikonsentraatioille. Laaditaan kuvaaja, jossa esitetään prosenttio ­
suudet konsentraation funktiona, ja EC
 x -arvot lasketaan tilastollisin 
menetelmin. Luottamusvälit (p = 0,95) lasketuille EC  x -arvoille mää ­
ritetään myös standardimenetelmillä (15)(16)(17).  
2.2 TULOSTEN TULKINTA  
Kun maatalouskemikaalien testituloksia arvioitaessa soluhengitysno ­
peuden ero alimman testiaineannostuksen (joka vastaa ennakoitua 
enimmäiskonsentraatiota) ja kontrollinäytteen välillä on 25 % tai 
vähemmän millä tahansa näytteenottokerralla päivän 28 jälkeen, voi ­
daan arvioida, että testiaineella ei ole pitkäaikaista vaikutusta hiilen muuntumiseen maaperässä. Arvioitaessa muita kuin maatalouskemi ­
kaaleja tuloksissa esitetään EC
 50 -, EC  25 -ja/tai EC  10 -arvot.  
3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
TESTISELOSTE  
Testiselosteessa on annettava seuraavat tiedot:  
Testinäytteen täydelliset tunnistetiedot mukaan luettuina  
— näytteenottopaikan maantieteellinen sijainti (leveys- ja pituusaste),  
— näytteenottopaikkaa koskevat taustatiedot (esimerkiksi kasvipeite, 
käsittelyt kasvinsuojeluaineilla, lannoitekäsittelyt, satunnainen 
saastuminen),  
— käyttötapa (esimerkiksi viljelysmaa, metsä),  
— näytteenottosyvyys (cm),  
— hiekka-/siltti-/savipitoisuus ( % kuivapainosta)  
— pH (vedessä),  
— orgaanisen hiilen pitoisuus ( % kuivapainosta),  
— typpipitoisuus ( % kuivapainosta),  
— kationinvaihtokyky (mmol/kg),  
— alkuperäinen mikrobibiomassa prosentteina orgaanisen hiilen ko ­
konaismäärästä,  
— viitetiedot kunkin parametrin määrittelymenetelmästä,  
— tiedot maanäytteen keräämisestä ja varastoinnista,  
— tiedot maanäytteen esi-inkubaatiosta.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1288
 
Testiaine:  
— fysikaalinen olomuoto ja tarvittaessa fysiko-kemialliset ominai ­
suudet,  
— tarvittaessa kemialliset tunnistetiedot, mukaan luettuna rakenne ­
kaava, puhtaus (esimerkiksi kasvinsuojeluaineista tehoaineen pro ­
senttiosuus), typpipitoisuus.  
Testiolosuhteet:  
— tiedot maanäytteen parantamisesta orgaanisella kasvualustalla,  
— testiaineen käytettyjen konsentraatioiden määrä ja tarvittaessa nii ­
den valintaperusteet,  
— tiedot testiaineen annostelusta näytteeseen,  
— inkubaatiolämpötila,  
— näytteen kosteuspitoisuus testin alussa ja sen aikana,  
— näytteen inkubointitapa (massana tai useina erillisinä osanäytteinä),  
— rinnakkaisnäytteiden määrä,  
— näytteenottoajankohdat.  
Tulokset:  
— soluhengitysnopeuden mittauksessa käytetty menetelmä ja lait ­
teisto,  
— taulukko hiilidioksidi- tai happimittausten yksittäisistä arvoista ja 
keskiarvoista,  
— testi- ja kontrollinäytteiden rinnakkaisnäytteiden välinen vaihtelu,  
— laskuihin tehtyjen korjausten selitykset tarvittaessa,  
— glukoosin aiheuttaman soluhengitysnopeuden prosentuaalinen 
vaihtelu kullakin näytteenottokerralla tai soveltuvin osin EC  50 - 
arvo 95 %:n luottamusvälein, muu EC  x -arvo (joko EC  25 tai 
EC 10 ) luottamusvälein ja annos-vastekäyrä,  
— tulosten tilastollinen käsittely tarvittaessa,  
— kaikki tulosten tulkinnan kannalta hyödylliset tiedot ja havainnot.  
4. LÄHDELUETTELO  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
 
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (toinen painos, 1990).
 
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guid ­
elines; Proposed rule. 28. syyskuuta 1987.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1289
 
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, 
Pub. SETAC-Europe, Bryssel.  
(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Se ­
lection of Soils/Sediments, Belgirate, Italia, 18. -20. tammikuuta 1995.
 
(6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality — Sampling. Guidance on 
the collection, handling and storage of soil for the assessment 
of aerobic microbial processes in the laboratory.  
(7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for 
Pesticide Experiments, teoksessa ”Pesticide Effects on Soil 
Microflora”. Toim. L. Somerville and M.P. Greaves, luku 3: 
45-60.  
(8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, teoksessa ”Methods 
of Soil Analysis — Part 2: Chemical and Microbiological Properties”. Agronomy Monograph № 9. Toim. A.L. Page, 
R.H. Miller and D.R. Keeney. 41: 831-871.
 
(9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality — Guidance on Laboratory 
Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.  
(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality — Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals 
in soil under aerobic conditions.  
(11) Heinemeyer, O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. 
(1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81.
 
(12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 1: Substrate-induced respiration method.
 
(13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 2: Fumigation- extraction method.  
(14) Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die 
Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenüber Pflan ­
zenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Inf ­
luence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the 
Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbi ­
cide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113-120.
 
(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and 
Exper. Ther., 96, 99-113.  
(16) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3. painos, toim., Camb ­
ridge, Lontoo ja New York.  
(17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 
Griffin, Weycombe, Iso-Britannia.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1290
 
(1) C.23. KEMIKAALIEN AEROBINEN JA ANAEROBINEN 
HAJOAMINEN MAAPERÄSSÄ  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä on toisinto OECD:n testiohjeesta nro 307 (2002)  
1.1 JOHDANTO  
Tämä menetelmä perustuu aikaisempiin ohjeisiin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 
ja 9. Kuvatun testimenetelmän tarkoitus on arvioida kemikaalien aerobista ja anaerobista hajoamista maaperässä. Testien avulla mää ­
ritetään i) testiaineen hajoamisnopeus sekä ii) sellaisten hajoamistu ­
otteiden laatu, joille kasvit ja maaperän mikrobit saattavat altistua, ja niiden muodostumis- ja häviämisnopeus. Nämä tutkimukset on teh ­
tävä kemikaaleille, joita levitetään suoraan maaperään tai jotka to ­
dennäköisesti päätyvät maaperään. Laboratoriotutkimusten tulosten 
pohjalta voidaan myös kehittää vastaavissa kenttätutkimuksissa käy ­
tettäviä näytteenotto- ja analyysikäytäntöjä.
 
Hajoamisreittien arvioimiseksi riittää yleensä aerobinen ja anaerobi ­
nen testi yhdellä maannostyypillä (8)(10)(11). Hajoamisnopeuksien määrittämiseksi on käytettävä sen lisäksi vähintään kolmea maannos ­
tyyppiä (8)(10).
 
Belgiratessa Italiassa vuonna 1995 pidetyssä maannosten ja sedi ­
menttien valintaa käsitelleessä OECD:n työryhmän kokouksessa so ­
vittiin erityisesti tässä testissä käytettävien maannosten määrästä ja tyypeistä (10). Testattavien maannostyyppien pitää edustaa kattavasti ympäristöolosuhteita, joissa testiainetta käytetään tai joissa päästöt 
tapahtuvat. Esimerkiksi testattaessa kemikaaleja, joiden päästöjä saat ­
taa tapahtua subtrooppisissa tai trooppisissa ilmastotyypeissä, täytyy käyttää FAO:n järjestelmän mukaisia Ferrasol (rauta-alu-maannos)- ja Nitosol (hohtosavimaannos) -tyyppejä. Työryhmä esitti myös maa ­
näytteiden keräämiseen, käsittelyyn ja varastointiin liittyviä suosituk ­
sia, jotka perustuvat ISO:n ohjeisiin (15). Menetelmässä otetaan huo ­
mioon myös riisin kosteikkoviljelyyn käytettävät maannokset.
 
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Testiaine:  mikä tahansa aine, joko alkutuote tai merkitykselliset ha ­
joamistuotteet.  
Hajoamistuotteet:  kaikki aineet, jotka syntyvät testiaineen biootti ­
sista tai abioottisista hajoamisreaktioista, mukaan luettuina CO  2 ja 
tuotteet, jotka ovat sitoutuneissa jäämissä.  
Sitoutuneet jäämät:  maaperässä, kasveissa tai eläimissä esiintyvät 
yhdisteet, jotka uuttamisen jälkeen säilyvät matriisissa alkutuotteen tai sen metaboliitin (metaboliittien) / hajoamistuotteiden muodossa. Uuttomenetelmä ei saa olennaisesti muuttaa itse yhdisteitä tai matrii ­
sin rakennetta. Sidoksen luonnetta voidaan osittain selventää matrii ­
sia muuttavilla uuttomenetelmillä ja kehittyneillä analyysitekniikoilla. Tähän mennessä on tunnistettu tällä tavalla esimerkiksi kovalentit ioni- ja sorptiosidokset sekä sulkeuma-aineet. Yleisesti voidaan to ­
deta, että sitoutuneiden jäämien muodostuminen vähentää aineen 
biologista saatavuutta ja hyötyosuutta merkittävästi (12) [vuodelta 1984 olevaan IUPAC-nimikkeistön tehty muutos (13)].
 
Aerobinen hajoaminen:  reaktiot, joihin osallistuu molekyylistä hap ­
pea (14).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1291
 
Anaerobinen hajoaminen:  reaktiot, joihin ei osallistu molekyylistä 
happea (14).  
Maaperä:  pienten organismien (pääasiassa mikro-organismien) elo ­
peräiseksi tekemä sekoitus mineraalisia ja orgaanisia kemiallisia ai ­
nesosia, joista jälkimmäisiin sisältyy suuren hiili- ja typpipitoisuuden sisältäviä yhdisteitä sekä molekyylipainoltaan suuria yhdisteitä. Maa ­
perää voidaan käsitellä kahdessa eri tilassa:
 
a) luonnontilaisena eli siinä muodossa, johon se on ajan kuluessa 
kehittynyt maannostyypilleen luonteenomaisiksi kerrostumiksi;  
b) häiriintyneenä eli siinä muodossa, jossa se yleensä esiintyy viljel ­
lyissä peltomaissa tai tätä testimenetelmää varten kaivetuissa näytteissä (14).
 
Mineralisaatio:  orgaanisen yhdisteen täydellinen hajoaminen 
CO 2 :ksi ja H  2 O:ksi aerobisissa olosuhteissa sekä CH  4 :ksi, CO  2 :ksi 
ja H  2 O:ksi anaerobisissa olosuhteissa. Tässä testimenetelmässä käy ­
tettäessä merkkiaineena  l4 C:ta mineralisaatio tarkoittaa laajaa hajoa ­
mista, jonka aikana merkitty hiiliatomi hapettuu ja vapautuu asian ­
mukainen määrä  14 CO 2 :ta (14).  
Puoliintumisaika:  t 0,5 on aika, joka kuluu testiaineen 50-prosentti ­
seen hajoamiseen tapauksissa, joissa hajoaminen voidaan kuvata en ­
simmäisen asteen kinetiikan avulla. Puoliintumisaika ei riipu kon ­
sentraatiosta.  
Häviämisaika 50 (DT  50 ): aika, jonka kuluessa testiaineen konsent ­
raatio vähenee 50 %:lla; tämä arvo on eri kuin puoliintumisaika t  0,5 
silloin kun hajoamista ei voi kuvata ensimmäisen asteen kinetiikan 
avulla.  
Häviämisaika 75 (DT  75 ): aika, jonka kuluessa testiaineen konsent ­
raatio vähenee 75 %:lla.  
Häviämisaika 90 (DT  90 ): aika, jonka kuluessa testiaineen konsent ­
raatio vähenee 90 %:lla.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Hajoamistuotteiden karakterisointiin ja/tai tunnistukseen spektrosko ­
pia- ja krotomatografiamenetelmillä olisi käytettävä vertailuaineita.  
1.4 TESTIN SOVELLUSALA  
Menetelmää voidaan soveltaa kaikkiin kemiallisiin aineisiin (joita ei 
ole merkitty merkkiaineella tai jotka on merkitty radioaktiivisella merkkiaineella), joiden analysointiin on olemassa riittävän tarkka ja 
herkkä menetelmä. Tässä kuvattua menetelmää voidaan soveltaa lie ­
västi haihtuviin, haihtumattomiin, vesiliukoisiin tai veteen liukene ­
mattomiin yhdisteisiin. Menetelmää ei voida soveltaa kemikaaleihin, jotka haihtuvat helposti maaperästä (esimerkiksi savuavat aineet tai 
orgaaniset liuottimet) ja jotka eivät siis säily maaperässä tässä kuva ­
tuissa testiolosuhteissa.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1292
 
1.5 TESTIAINETTA KOSKEVAT TIEDOT  
Hajoamisnopeuden mittaamiseen voidaan käyttää merkittyä tai mer ­
kitsemätöntä testiainetta. Merkkiaineen (leiman) käyttö on välttämä ­
töntä tutkittaessa hajoamisreittejä ja määritettäessä massatasetta.  14 C 
on suositeltava merkkiaine, mutta muitakin isotooppeja, kuten  13 C:ta,  
15 N:ta,  3 H:ta tai  32 P:ta voidaan käyttää. Leiman pitäisi mahdollisuuk ­
sien mukaan sijaita molekyylin stabiileimmassa osassa tai osissa (  1 ). 
Testiaineen puhtausasteen tulisi olla vähintään 95 %.  
Ennen kuin tehdään testi, joka koskee aerobista ja anaerobista hajoa ­
mista maaperässä, testiaineesta täytyy selvittää seuraavat tiedot:  
a) vesiliukoisuus (menetelmä A.6);  
b) liukoisuus orgaanisiin liuottimiin;  
c) höyrynpaine (menetelmä A.4) ja Henryn lain vakio  
d) n-oktanoli/vesi-jakaantumiskerroin (menetelmä A.8);  
e) kemiallinen pysyvyys pimeässä (hydrolyysi) (menetelmä C.7);  
f) pK  a , jos molekyylilla on taipumus protonoitua tai deprotonoitua 
[OECD:n ohje 112] (16).  
Muita tarpeellisia tietoja saattavat olla tiedot testiaineen myrkyllisyy ­
destä maaperän mikrobeille [testimenetelmät C.21 ja C.22] (16).  
Testiaineen sekä sen hajoamistuotteiden määrien mittaamiseen ja 
tunnistukseen on oltava käytettävissä sopivat analyysimenetelmät (myös uutto-ja puhdistusmenetelmät).
 
1.6 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Maanäytteet käsitellään testiaineella ja inkuboidaan pimeässä Erlen ­
meyer-pulloissa tai läpivirtausjärjestelmässä valvotuissa laboratorio- olosuhteissa (lämpötilan ja maaperänäytteen kosteuspitoisuuden ol ­
lessa vakio). Maanäytteet uutetaan sopivin väliajoin ja niistä analy ­
soidaan alkutuote ja hajoamistuotteet. Myös helposti haihtuvat hajoa ­
mistuotteet kerätään analysoitaviksi sopivien absorptiolaitteiden avul ­
la. Kun käytetään
 14 C-merkkiainetta, voidaan eri mineralisaationo ­
peudet mitata ottamalla talteen näytteessä kehittynyt  14 CO 2 , jolloin 
massatase sekä muodostuneet maannokseen sitoutuneet jäämät voi ­
daan määrittää.  
1.7 LAATUVAATIMUKSET  
1.7.1  Saanto  
Vähintään kahden maanäytteen uutto ja analysointi heti testiaineen 
lisäämisen jälkeen antaa alustavia tietoja analyysimenetelmän toistet ­
tavuudesta ja sen testiaineeseen lisäämisen tasaisuudesta. Saanto tes ­
tin myöhemmissä vaiheissa saadaan massataseista. Saantojen tulisi 
olla 90-110 % käytettäessä merkkiainetta (S) ja 70-110 %, kun merkkiainetta ei käytetä (3).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1293  
( 1 ) Jos testiainemolekyyli sisältää esimerkiksi yhden renkaan, tämä rengas täytyy merkitä; 
jos testiainemolekyyli sisältää kaksi tai useampia renkaita, saatetaan tarvita erillinen testi 
kunkin merkityn renkaan reitin arvioimiseksi ja tarvittavan tiedon saamiseksi hajoamis ­
tuotteiden muodostumisesta.
 1.7.2  Analyysimenetelmän toistettavuus ja herkkyys  
Analyysimenetelmän toistettavuus (lukuun ottamatta alussa tehtävän 
uuton tehokkuutta) testiaineen ja hajoamistuotteiden kvantifioinnin osalta voidaan varmistaa kaksoismäärittämällä samasta maannoksesta 
tehty uute, jota on inkuboitu niin kauan, että hajoamistuotteita on 
ehtinyt muodostua.
 
Testiaineen ja hajoamistuotteiden osalta analyysimenetelmän osoitus ­
rajan (LOD) on oltava vähintään 0,01 mg ·kg -1 maanäytettä (testiaine) 
tai 1 % käytetystä annoksesta sen mukaan, kumpi on pienempi. 
Kvantifiointiraja (LOQ) on myös määritettävä.  
1.7.3  Hajoamisreaktiossa saatujen mittaustulosten tarkkuus (luotetta ­
vuus)  
Hajoamista kuvaavan käyrän luotettavuudesta saadaan tarvittavat tie ­
dot tekemällä regressioanalyysi testiaineen konsentraatioista ajan funktiona, jolloin voidaan laskea puoliintumisaikojen luottamusvälit (kun reaktio noudattaa näennäistä ensimmäisen asteen kinetiikkaa) tai 
DT
 50 -arvot sekä tarvittaessa DT  75 - ja DT  90 -arvot.  
1.8 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.8.1  Laitteet ja kemialliset reagenssit  
Inkubointijärjestelmänä voi olla staattinen suljettu järjestelmä tai so ­
piva läpivirtausjärjestelmä (7)(17). Esimerkit maanäytteen inkuboin ­
tiin soveltuvasta läpivirtausjärjestelmästä ja Erlenmeyer-pullosta ovat 
kuvissa 1 ja 2. Molemmilla järjestelmillä on omat etunsa ja rajoituk ­
sensa (7)(17).  
Testiin tarvitaan tavanomaisia laboratoriolaitteita ja erityisesti seuraa ­
via: 
— analyyttisiä laitteita, kuten GLC-, HPLC- ja TLC-laitteet, mukaan 
luettuina radioaktiivisten tai muiden kuin radioaktiivisten merkki ­
aineiden osoittamiseen soveltuvat järjestelmät tai käänteinen iso ­
tooppilaimennusmenetelmä,  
— tunnistukseen käytettävät laitteet (esimerkiksi MS-, GC-MS-, 
HPLC-MS-spektrometri tai NMR-laite),  
— nestetuikelaskin,  
— hapetin radioaktiivisten aineiden polttamista varten,  
— sentrifugi,  
— uuttovälineet (esimerkiksi sentrifugiputkia kylmäuuttoa varten ja 
Soxhlet-uuttolaite jatkuvaa takaisinvirtausuuttoa varten),  
— liuosten ja uutteiden konsentrointivälineet (esimerkiksi pyörö ­
haihdutin),  
— vesihaude,  
— mekaaninen sekoituslaite (esimerkiksi sekoituskone tai pyörivä 
sekoitin).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1294
 
Esimerkiksi seuraavia kemiallisia reagensseja tarvitaan:  
— NaOH, analyysilaatu, 2 mol · dm  -3 , tai muu sopiva emäs (esi ­
merkiksi KOH, etanoliamiini),  
— H  2 SO 4 , analyysilaatu, 0,05 mol · dm  -3 , 
— etyleeniglykoli, analyysilaatu,  
— kiinteät absorptiomateriaalit, kuten natronkalkki ja polyuretaa ­
nitulpat,  
— orgaaniset liuottimet, analyysilaatu, kuten asetoni tai metanoli,  
— tuikeneste.  
1.8.2  Testiaineen annostelu  
Maanäytteeseen annostelua ja levittämistä varten testiaine voidaan 
liuottaa (ionipuhdistettuun tai tislattuun) veteen tai tarvittaessa pie ­
nimpään mahdolliseen määrään asetonia tai muuta orgaanista liuo ­
tinta (6), jossa testiaine on riittävän liukoinen ja stabiili. Valittu liuotin ei kuitenkaan saa vaikuttaa merkittävästi maaperän mikrobien toimintaan (katso kohdat 1.5 ja 1.9.2-1.9.3). Testissä on vältettävä 
käyttämästä mikrobien toimintaa estävien liuottimien, kuten klorofor ­
min, dikloorimetaanin ja muiden halogenoitujen liuottimien käyttöä.
 
Testiaine voidaan annostella myös kiinteässä muodossa, esimerkiksi 
sekoitettuna kvartsihiekkaan (6) tai pieneen maanäytteen osanäyttee ­
seen, joka on ilmakuivattu ja steriloitu. Jos testiaine lisätään liuotti ­
men avulla, liuottimen on annettava haihtua ennen testiainetta sisäl ­
tävän osanäytteen lisäämistä alkuperäiseen epästeriiliin maanäyttee ­
seen.  
Testattaessa yleiskemikaaleja, jotka joutuvat maaperään pääasiassa 
jätevesilietteen kautta tai maatalouskäytön yhteydessä, testiaine on ensin lisättävä lietteeseen, joka sitten annostellaan maanäytteeseen (katso kohdat 1.9.2 ja 1.9.3).
 
Kaupallisten valmisteiden käyttäminen testissä ei ole yleensä suosi ­
teltavaa. Se voi kuitenkin tulla kysymykseen esimerkiksi heikosti 
liukenevien testiaineiden kohdalla.  
1.8.3  Maannokset  
1.8.3.1  Muunnoksen valinta  
Hajoamisreitin määrittämiseksi voidaan käyttää edustavaa maannos ­
tyyppiä. Suositeltava maannostyyppi on [FAO:n ja USDA:n luoki ­
tuksen mukaan (18)] hiekkapitoinen hiesu, silttipitoinen hiesu, hiesu tai hiesupitoinen hiekka, jonka pH on 5,5 - 8,0, orgaanisen hiilen pitoisuus 0,5 - 2,5 % ja mikrobibiomassa vähintään 1 % orgaanisen 
hiilen kokonaismäärästä (10).
 
Hajoamisnopeuden määrittämiseksi on lisäksi testattava vähintään 
kolme erilaista edustavaa maannostyyppiä. Kunkin maannostyypin 
orgaanisen hiilen pitoisuuden, pH:n, savipitoisuuden ja mikrobibio ­
massan on oltava erilaiset (10).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1295
 
Kaikista maannostyypeistä on tutkittava ainakin rakenne (hiekka-, 
siltti- ja saviprosentti) [FAO:n ja USDA:n luokituksen mukaan (18)] 
ja määritettävä pH, kationinvaihtokyky, orgaaninen hiili, bulkkitihe ­
ys, vedenpidätyskyky (  1 ) ja mikrobibiomassa (vain aerobisissa tes ­
teissä). Tulosten tulkinnassa muistakin maannoksen ominaisuuksia 
koskevista tiedoista voi olla hyötyä. Maannoksen ominaisuuksia voi ­
daan määrittää lähteissä (19), (20), (21), (22) ja (23) suositeltujen menetelmien avulla. Mikrobibiomassa on määritettävä substraatin in ­
dusoiman soluhengityksen (SIR) menetelmällä (25)(26) tai muulla 
vastaavalla menetelmällä (20).
 
1.8.3.2  Maanäytteiden kerääminen, käsittely ja varastointi  
Yksityiskohtaiset taustatiedot maanäytteiden keruupaikasta on oltava 
saatavilla. Tarvittavat tiedot ovat tarkka paikka, kasvipeite, kemikaa ­
likäsittelyt, käsittelyt orgaanisilla ja epäorgaanisilla lannoitteilla, bio ­
logisten materiaalien lisääminen tai muu saastuminen. Hajoamistes ­
tissä ei pitäisi käyttää maannoksia, joita on käsitelty testiaineella tai sen kanssa rakenteellisesti analogisella aineella edeltävän neljän vuo ­
den aikana (10)(15).
 
Maa-aineksen on oltava äskettäin maasta otettua (A-horisontista eli 
ylimmän 20 cm:n kerroksesta), ja sen vesipitoisuuden tulisi olla seu ­
lomiseen sopiva. Näytteenottoa muista maannostyypeistä kuin kosteik ­
koviljelmistä on vältettävä pitkien (> 30 päivää) kuivuus-, jäätymis- tai 
tulvajaksojen (14) aikana tai heti niiden jälkeen. Maanäytteet on kul ­
jetettava siten, että niiden vesipitoisuus muuttuu mahdollisimman vä ­
hän, ja ne on säilytettävä pimeässä ja ilmavassa tilassa. Tähän tarkoi ­
tukseen sopii yleensä löyhästi sidottu polyetyleenipussi.  
Maanäytteet on käsiteltävä mahdollisimman pian näytteenoton jäl ­
keen. Kasvit, maaperän suuremmat eliöt ja kivet on poistettava ennen näytteen seulomista 2 mm:n seulalla, joka poistaa pikkukivet, eläimet 
ja kasvinosat. Näytteen liiallista kuivaamista ja murskaamista ennen 
seulontaa on vältettävä (15).
 
Kun näytteen ottaminen pellolta on talvella vaikeaa (maan ollessa 
jäässä tai lumikerroksen peitossa), näyte voidaan ottaa maannoseräs ­
tä, joka on varastoitu kasvihuoneessa kasvipeitteen alla (esimerkiksi ruohon tai ruohon ja apilan sekoituksen alla). Testissä on erittäin suotavaa käyttää juuri kerättyjä näytteitä, mutta jos kerätty ja käsi ­
telty näyte on varastoitava ennen testin alkua, varastointiolosuhteiden 
on oltava asianmukaiset ja varastointiajan lyhyt (4 ± 2
 o C enintään 
kolmen kuukauden ajan), jotta mikrobien toiminta ei keskeydy (  2 ). 
Biomuuntumiskokeissa käytettävien maanäytteiden keräämistä, käsit ­
telyä ja varastointia koskevat yksityiskohtaiset ohjeet esitetään läh ­
deviitteissä (8)(10)(15)(26)(27).  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1296  
( 1 ) Maannoksen vedenpidätyskyky voidaan mitata joko vedenpidätyslukuna, vedenpidätys ­
kykynä tai imupaineena (pF). Lisätietoja asiasta on liitteessä 1. Testiraportissa on ilmoi ­
tettava, onko maannoksen vedenpidätysominaisuudet ja bulkkitiheys määritetty luonnon ­
tilaisista vai häiriintyneistä (käsitellyistä) maannosnäytteistä. 
( 2 ) Viimeaikaiset tutkimustulokset osoittavat, että myös lauhkeilta ilmastovyöhykkeiltä ke ­
rätyt maannokset voidaan varastoida - 20  o C:ssa yli kolmen kuukauden ajan (28)(29) 
mikrobien toiminnan siitä merkittävästi häiriintymättä.
 Ennen kuin käsitelty maannos testataan, se on esi-inkuboitava, jotta 
siinä olevat siemenet saadaan itämään ja voidaan poistaa ja jotta 
mikrobien aineenvaihdunnan tasapaino ehtii palautua ennalleen, kun näyte siirretään näytteenotto- tai varastointiolosuhteista inku ­
bointiolosuhteisiin. Yleensä riittää 2-28 päivän inkubointijakso, jonka 
aikana lämpötila- ja kosteusolosuhteet vastaavat varsinaisen testin 
olosuhteita (15). Yhteenlaskettu varastointi- ja esi-inkubointiaika saa olla enintään kolme kuukautta.
 
1.9 TESTIN SUORITUS  
1.9.1  Testiolosuhteet  
1.9.1.1  Testilämpötila  
Koko testijakson aikana maanäytteitä on inkuboitava pimeässä tasai ­
sessa lämpötilassa, joka muistuttaa niitä ilmasto-olosuhteita, joissa 
testiainetta käytetään tai joissa sen päästöt tapahtuvat. Kaikkien lauh ­
keissa ilmasto-olosuhteissa maaperään päätyvien testiaineiden lämpö ­
tilaksi suositellaan 20 (± 2)  o C. Lämpötilaa on tarkkailtava testin 
aikana.  
Testattaessa kemikaaleja, joiden käyttö tai päästöt tapahtuvat kyl ­
memmissä ilmasto-olosuhteissa (esimerkiksi pohjoisen pallonpuolis ­
kon maissa, syys-/talvikauden aikana), on inkuboitava lisänäytteitä 
myös alhaisemmassa lämpötilassa (esimerkiksi 10 (± 2)  o C). 
1.9.1.2  Kosteuspitoisuus  
Aerobisissa olosuhteissa tehtävissä hajoamistesteissä maanäytteen 
kosteuspitoisuuden (  1 ) pF-arvoa tulisi säädellä niin, että se on 2,0 - 
2,5 (3). Maaperän kosteuspitoisuus ilmoitetaan veden massana kui ­
van maannoksen massaa kohti, ja sitä on tarkkailtava säännöllisesti (esimerkiksi kahden viikon välein) punnitsemalla inkubointiastiat ja 
korvaamalla veden menetys lisäämällä näytteeseen vettä (mieluiten 
steriilisti suodatettua vesijohtovettä). Nestettä lisättäessä testiaineen ja/tai hajoamistuotteiden hävikki haihtumalla ja/tai fotolyysi (jos sitä tapahtuu) on estettävä tai pidettävä mahdollisimman vähäisenä.
 
Kun hajoamistesti on tehtävä anaerobisissa olosuhteissa ja kosteik ­
koviljellyissä maanäytteissä, maanäyte kyllästetään vedellä upotta ­
malla se veteen.  
1.9.1.3  Aerobiset inkubaatio-olosuhteet  
Läpivirtausjärjestelmissä aerobiset olosuhteet säilytetään vaihtamalla 
näyteastian ilma säännöllisin väliajoin tai ilmastamalla jatkuvasti kosteutetulla ilmalla. Erlenmeyer-pulloissa ilmanvaihtoa pidetään 
yllä diffuusion avulla.
 
1.9.1.4  Steriilit aerobiset olosuhteet  
Haluttaessa selvittää abioottisen hajoamisen merkitystä testiaineelle 
maanäytteet voidaan steriloida (lisätietoja sterilointimenetelmistä on 
lähdeviitteissä 16 ja 29), käsitellä steriilillä testiaineella (esimerkiksi 
suodattamalla liuos steriilin suodattimen läpi) ja ilmastaa se kosteu ­
tetulla steriilillä ilmalla kohdan 1.9.1.3 mukaisesti. Kosteikkoviljel ­
lyissä maanäytteissä maannos ja vesi steriloidaan ja näyte inkuboi ­
daan kohdassa 1.9.1.6 kuvatulla tavalla.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1297  
( 1 ) Maanäyte ei saa olla liian kostea eikä liian kuiva, jotta maaperän pieneliöiden ilmastus ja 
ravitsemustila pysyy sopivana. Optimaalisen mikrobien kasvun kannalta suositeltava 
kosteuspitoisuus on 40-60 % vedenpidätyskyvystä ja paine 0,1 - 0,33 bar (6). Jälkim ­
mäinen arvo vastaa pF-arvoja 2,0 - 2,5. Eri maannostyyppien tyypilliset kosteuspitoisuu ­
det esitetään liitteessä 2.
 1.9.1.5  Anaerobiset inkubaatio-olosuhteet  
Anaerobisten olosuhteiden luomiseksi ja ylläpitämiseksi testiaineella 
käsitelty maanäyte, joka on inkuboitu aerobisissa olosuhteissa 30 päivän tai yhden puoliintumisajan tai DT
 50 :n ajan (sen mukaan, mi ­
hin kuluu vähimmin aikaa) kyllästetään vedellä (1-3 cm:n vesiker ­
ros), ja inkubointijärjestelmä huuhdellaan inertillä kaasulla (esimer ­
kiksi typellä tai argonilla) (  1 ). Testijärjestelmästä on voitava mitata 
pH, happipitoisuus ja hapetus-pelkistyspotentiaali, ja siinä on oltava 
haihtuvien aineiden talteenottolaitteet. Käytettäessä Erlenmeyer-pul ­
loista koostuvaa järjestelmää sen on oltava suljettu, jotta vältetään ilman tunkeutuminen järjestelmään diffuusion kautta.
 
1.9.1.6  Kosteikkoviljellyn maanäytteen inkubaatio-olosuhteet  
Testattaessa aineen hajoamista riisin kosteikkoviljelyyn käytetyssä 
maannoksessa maanäyte upotetaan noin 1-5 cm:n syvyiseen veteen 
ja testiaine lisätään vesifaasiin (9). Suositeltava maakerroksen pak ­
suus on vähintään 5 cm. Järjestelmän ilmansaannista huolehditaan samaan tapaan kuin aerobisissakin olosuhteissa. Vesikerroksen pH:ta, 
happipitoisuutta ja hapetus-pelkistyspotentiaalia tarkkaillaan ja ne il ­
moitetaan testiselosteessa. Ennen hajoamistestin aloittamista näytettä on esi-inkuboitava vähintään kahden viikon ajan (katso kohta 
1.8.3.2).
 
1.9.1.7  Testin kesto  
Nopeutta ja hajoamisreittejä koskevat tutkimukset eivät tavallisesti saa 
kestää yli 120 päivää (  2 ) (3)(6)(8), koska sen jälkeen mikrobien toimin ­
nan odotetaan vähenevän keinotekoisessa laboratoriojärjestelmässä, jo ­
hon ei tule luonnollista ravinnetäydennystä. Testiä voidaan jatkaa pi ­
tempään (esimerkiksi 6 tai 12 kuukautta) (8) silloin kun se on tarpeen 
testiaineen ja pääasiallisten hajoamistuotteiden muodostumisen ja ha ­
joamisen määrittämiseksi. Tätä pidemmät inkubointiajat on perustel ­
tava testiselosteessa, ja niiden yhteydessä on esitettävä biomassan mit ­
taustulokset inkubointijaksojen aikana ja niiden lopussa.  
1.9.2  Testin suoritus  
Noin 50-200 g maanäytettä (kuivapaino) asetetaan kuhunkin inku ­
baatiopulloon (katso liitteessä 3 olevat kuvat 1 ja 2) ja maanäyte käsitellään testiaineella käyttäen jotakin kohdassa 1.8.2 kuvattua me ­
netelmää. Jos testiaine annostellaan orgaanisten liuotinten avulla, ne 
on poistettava näytteestä haihduttamalla. Sen jälkeen maanäyte se ­
koitetaan huolellisesti lastalla ja/tai ravistamalla pulloa. Jos testi teh ­
dään kosteikkoviljellylle maanäytteelle, maannos ja vesi on sekoitet ­
tava huolellisesti testiaineen lisäämisen jälkeen. Käsitellyistä näyt ­
teistä on analysoitava pieniä määräosia (esimerkiksi 1 g), jotta voi ­
daan varmistua sen tasaisesta leviämisestä näytteeseen. Vaihtoehtoi ­
nen tapa on kuvattu alla.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1298  
( 1 ) Pintamaissa ja jopa jankossa vallitsevat yleensä aerobiset olosuhteet, kuten käy ilmi EY:n 
rahoittamasta tutkimushankkeesta [K. Takagi et al. (1992). Microbial diversity and acti ­
vity in subsoils: Methods, field site, seasonal variation in subsoil temperatures and 
oxygen contents. Proc. Internat. Symp. Environm. Aspects Pesticides Microbiol., 270- 
277, 17-21 August 1992, Sigtuna, Ruotsi]. Anaerobisia olosuhteita esiintyy vain ajoittain 
maannosten tulvimisen aikaan rankkasateiden jälkeen tai riisipeltojen kosteikkoviljelyssä. 
( 2 ) Aerobiset testit voidaan lopettaa paljon ennen 120:tä päivää, jos lopullinen hajoamisreitti 
ja lopullinen mineralisaatio on selkeästi tapahtunut siihen mennessä. Testi voidaan lo ­
pettaa 120 päivän kuluttua tai silloin kun vähintään 90 % testiaineesta on hajonnut, mutta 
vasta silloin kun CO  2 :ta on muodostunut vähintään 5 %.
 Annostellaan määrä siten, että se vastaa kasvinsuojeluaineen käyttö ­
ohjeissa suositeltua suurinta annostusta ja tasaista leviämistä käytet ­
tyyn syvyyteen (esimerkiksi maannoksen ylin 10 cm:n kerros (  1 ). 
Esimerkiksi kemikaaleille, jotka levitetään kasvien lehtiin tai maan ­
noksen päälle ilman, että ne tunkeutuvat kasviin tai maannokseen, 
sopiva annostelumäärä kuhunkin astiaan lasketaan 2,5 cm:n annoste ­
lusyvyyden mukaan. Kemikaaleille, jotka tunkeutuvat maannokseen, sopiva annostelusyvyys on aineen käyttöohjeissa ilmoitettu tunkeu ­
tumissyvyys. Yleiskemikaaleille annostus on arvioitava tärkeimmän 
leviämisreitin mukaan. Jos aineen pääasiallinen leviäminen maannok ­
seen tapahtuu esimerkiksi jätevesilietteen kautta, kemikaali on annos ­
teltava lietteeseen konsentraationa, joka vastaa lietteen ennakoitua konsentraatiota. Maannokseen lisättävän lietteen määrän on vastat ­
tava maatalousmaihin tavanomaisesti lisättävää lietemäärää. Jos 
tämä konsentraatio ei ole riittävä pääasiallisten hajoamistuotteiden havaitsemiseksi, erillisten suuremman konsentraation sisältävien näytteiden inkubointi voi olla hyödyllistä. On kuitenkin syytä välttää 
liian suuria annosmääriä, koska ne haittaavat maaperän mikrobien 
toimintaa (katso kohdat 1.5 ja 1.8.2).
 
Vaihtoehtoisesti myös suurempi maanäyte-erä (esimerkiksi 1-2 kg) 
voidaan käsitellä testiaineella, sekoittaa seos huolellisesti sopivassa sekoituslaitteessa ja sitten siirtää se pienissä 50-200 g:n annoksissa 
inkubointipulloihin (esimerkiksi näytekauhan avulla). Käsitellystä 
maanäyte-erästä on analysoitava testiaine pieninä määräosina (esi ­
merkiksi 1 g) aineen tasaisen leviämisen varmistamiseksi. Tämä me ­
netelmä on suositeltava, koska sen avulla testiaine saadaan levitettyä 
maanäytteeseen tasaisesti.
 
Myös käsittelemättömät maanäytteet inkuboidaan samoissa (aerobi ­
sissa) olosuhteissa kuin testiaineella käsitellyt näytteet. Näitä näyt ­
teitä käytetään biomassan mittaamiseen testien aikana ja niiden lo ­
puksi.  
Jos testiaine annostellaan maanäytteeseen orgaanisen liuottimen tai 
liuottimien avulla, samalla määrällä liuotinta tai liuottimia käsitellyt maanäytteet inkuboidaan samoissa (aerobisissa) olosuhteissa kuin testiaineella käsitellyt näytteet. Näistä näytteistä mitataan biomassa 
testin aluksi, sen aikana ja sen lopuksi, jotta liuottimen tai liuottimien 
vaikutus mikrobibiomassaan voidaan tarkistaa.
 
Pullot, jotka sisältävät käsitellyt maanäytteet, joko kiinnitetään ku ­
vassa 1 esitettyyn läpivirtausjärjestelmään tai suljetaan kuvassa 2 esitettyyn absorptiokolonnilla. (katso liite 3).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1299  
( 1 ) Alkuperäinen konsentraatio pinta-alan perusteella voidaan laskea seuraavasta yhtälöstä:  
C soil mg =kg soil ½ â ¼ A½kg=haâ·10 6 ½mg =kgâ 
l½mâ·10 4 ½m 2=haâ·d kg  soil=m 3 h i  
C soil = Alkuperäinen konsentraatio maanäytteessä [mg ·kg -1 ] 
A = Annostus [kg ·ha -1 ]; l = maannoksen paksuus tutkittavassa ympäristössä [m]; 
d = maannoksen kuivabulkkitiheys [kg ·m -3 ]. 
Nyrkkisääntö on, että annostuksella 1 kg ·ha -1 maannoksen konsentraatioksi tulee noin 
1 mg·kg -1 kymmenen sentin kerroksena (olettaen, että bulkkitiheys on 1 g ·cm -3 ).
 1.9.3  Näytteenotto ja mittaus  
Rinnakkaiset inkubaatiopullot poistetaan sopivin väliajoin, maanäyt ­
teet uutetaan sopivilla liuottimilla, joilla on eri polariteetti, ja niistä analysoidaan testiaine ja/tai hajoamistuotteet. Hyvin suunnitellussa 
testissä on varauduttava siihen, että joka näytteenottokerralla tarvi ­
taan kaksi pulloa. Myös absorptioliuokset tai kiinteät absorptiomate ­
riaalit poistetaan tietyin väliajoin (7 päivän välein ensimmäisen kuu ­
kauden aikana ja sen jälkeen 17 päivän välein) kunkin maanäytteen 
inkuboinnin aikana ja sen lopuksi, ja niistä analysoidaan haihtuvat 
hajoamistuotteet. Heti testiaineen annostelun jälkeen (päivän 0 näyte) otetun maanäytteen lisäksi testeihin tulisi sisällyttää ainakin viisi eri 
väliajoin tehtyä testiä. Näytteenottoajat on valittava siten, että testi ­
aineen hajoamisajat sekä hajoamistuotteiden muodostumis- ja hajoa ­
misajat voidaan määrittää (esimerkiksi 0, 1, 3 ja 7 päivää; 2 ja 3 viikkoa; 1, 2 ja 3 kuukautta).
 
Käytettäessä  14 C-merkkiainetta uuttumattomien radioaktiivisten ainei ­
den määrä määritetään polttamalla, ja kullekin näytteenottoajalle las ­
ketaan massatase.  
Anaerobisen ja kosteikkoviljelynäytteen osalta testiaine ja hajoamis ­
tuotteet analysoidaan yhdistetystä maa- ja vesifaasista, tai maa- ja vesifaasit erotetaan suodattamalla tai sentrifugoimalla ennen uuttoa 
ja analyysia.
 
1.9.4  Vapaaehtoiset lisätestit  
Aerobisella epästeriilillä testillä, joissa käytetään muita lämpötiloja ja 
näytteen kosteuspitoisuuksia, voidaan arvioida maaperän lämpötilan 
ja kosteuspitoisuuden vaikutusta testiaineen ja/tai sen hajoamistuot ­
teiden hajoamisnopeuteen maaperässä.  
Uuttumattomia radioaktiivisia aineita voidaan lisäksi yrittää karakte ­
risoida esimerkiksi ylikriittisellä nesteuutolla.  
2. MITTAUSTULOKSET  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Testiaineen, hajoamistuotteiden, haihtuvien aineiden (vain prosenttei ­
na) ja uuttumattomien aineiden määrät on ilmoitettava prosentteina 
alkuperäisestä konsentraatiosta ja tarvittaessa mg ·kg -1 maanäytettä 
(kuivapaino) kutakin näytteenottokertaa kohti. Massatase ilmoitetaan prosenttina alkuperäisestä konsentraatiosta kutakin näytteenottokertaa 
kohti. Esittämällä testiaineen konsentraatiot ajan funktiona voidaan 
arvioida aineen hajoamisen puoliintumisaika tai DT
 50 -arvo. Pääasial ­
liset hajoamistuotteet olisi tunnistettava ja niiden konsentraatiot olisi myös esitettävä ajan funktiona, jolloin voidaan määrittää niiden muo ­
dostumis- ja hajoamisnopeus. Pääasiallinen hajoamistuote on mikä 
tahansa tuote, jota esiintyy milloin tahansa testin aikana ≥ 10 % 
testiaineen annoksesta.
 
Talteen otetut haihtuvat yhdisteet antavat viitteitä testiaineen ja sen 
hajoamistuotteiden haihtuvuuspotentiaalista maaperässä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1300
 
Tarkemmat puoliintumisaikojen tai DT  50 -arvojen sekä tarvittaessa 
DT 75 - ja DT  90 -arvojen määritykset on tehtävä asianmukaisen kineet ­
tisen mallin mukaisilla laskelmilla. Puoliintumisajan ja DT  50 -arvojen 
ilmoittamisen yhteydessä on kuvattava käytetty malli, kinetiikan aste ja määrityskerroin (r
 2 ). Ensimmäisen asteen kinetiikan käyttö on 
yleensä suositeltavaa paitsi silloin, kun r  2 < 0,7. Tarvittaessa laskel ­
mat on tehtävä myös pääasiallisista hajoamistuotteista. Esimerkkejä sopivista malleista on esitetty lähteissä 31-35.
 
Testattaessa muodostumis- ja hajoamisnopeuksia eri lämpötiloissa 
hajoamisnopeudet on kuvattava lämpötilan funktiona testissä käyte ­
tyn lämpötila-alueen sisällä käyttäen Arrheniuksen lakia muodossa:  
k ¼ A·e ÄB=T or lnk ¼ 1nA Ä B 
T 
missä ln A ja B ovat Y-akselin leikkauspisteestä ja kulmakertoimesta 
saatavat regressiovakiot suoralle, joka saadaan ln k- ja 1/T-arvon lineaarisen regressioanalyysin tuloksena, k on nopeusvakio lämpöti ­
lassa T ja T on lämpötila Kelvin-asteina. Jos aineen hajoamista sää ­
telee mikrobien toiminta, on otettava huomioon lämpötila-alue, jolla Arreheniuksen laki on validi.
 
2.2 TULOSTEN ARVIOINTI JA TULKINTA  
Vaikka testit toteutetaan keinotekoisessa laboratoriojärjestelmässä, 
tulosten perusteella voidaan arvioida testiaineen hajoamisnopeutta sekä hajoamistuotteiden muodostumis- ja hajoamisnopeutta kenttäo ­
losuhteissa (36)(37).
 
Testiaineen hajoamisreitin tutkimus antaa tietoja siitä, miten aineen 
rakenne muuttuu maaperässä kemiallisten reaktioiden ja mikrobien 
toiminnan tuloksena.  
3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
TESTISELOSTE  
Testiselosteessa on annettava seuraavat tiedot.  
Testiaine:  
— yleisnimi, kemiallinen nimi, CAS-numero, rakennekaava (josta 
käy ilmi leiman sijainti käytettäessä radioaktiivista merkkiainetta) ja merkitykselliset fysiko-kemialliset ominaisuudet (katso kohta 1.5),
 
— testiaineen puhtaus (epäpuhtaudet),  
— merkkiaineena käytetyn kemikaalin radiokemiallinen puhtaus ja 
spesifinen aktiivisuus (tarvittaessa).  
Vertailuaineet:  
— hajoamistuotteen karakterisointiin ja/tai tunnistukseen käytettävän 
vertailuaineen kemiallinen nimi ja rakenne.  
Testimaannokset:  
— keruupaikkaa koskevat tiedot,  
— näytteenottopäivä ja -menetelmä,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1301
 
— maannosten ominaisuudet, kuten pH, orgaanisen hiilen pitoisuus, 
rakenne (hiekka-, siltti- ja saviprosentti), kationinvaihtokyky, 
bulkkitiheys, vedenpidätysominaisuudet ja mikrobibiomassa,  
— jos maannosta on varastoitu, varastointiaika ja varastointiolosuh ­
teet. 
Testiolosuhteet:  
— testien suorituspäivämäärät,  
— testiaineen annosteltu määrä,  
— käytetyt liuottimet ja testiaineen annostelutapa,  
— käsitellyn maanäytteen alkuperäinen paino ja sen paino kullakin 
näytteenottokerralla,  
— kuvaus käytetystä inkubointijärjestelmästä,  
— ilman virtausnopeus (vain läpivirtausjärjestelmien osalta),  
— koejärjestelmän lämpötila,  
— maanäytteen kosteuspitoisuus inkuboinnin aikana,  
— mikrobibiomassa aerobisten testien aluksi, niiden aikana ja niiden 
lopuksi,  
— pH, happikonsentraatio ja hapetus-pelkistyspotentiaali anaerobis ­
ten testien ja kosteikkoviljeltyjen näytteiden testien aluksi, niiden 
aikana ja niiden lopuksi,  
— erotusmenetelmä(t),  
— testiaineen ja pääasiallisten hajoamistuotteiden kvantifiointi- ja 
tunnistusmenetelmät maanäytteissä ja absorptiomateriaaleissa,  
— rinnakkaisnäytteiden ja kontrollinäytteiden määrä.  
Tulokset:  
— mikrobien aktiivisuuden määritystulos,  
— käytettyjen analyysimenetelmien toistettavuus ja herkkyys,  
— saanto (validin testin prosenttiarvot on esitetty kohdassa 1.7.1),  
— tulokset taulukkomuodossa, ilmoitetaan prosentteina alkuperäi ­
sestä annoksesta ja tarvittaessa mg ·kg -1 maanäytettä (kuivapaino),  
— massatase testien aikana ja niiden lopuksi,  
— maannoksen uuttumattoman (sitoutuneen) radioaktiivisuuden tai 
jäämien karakterisointi,  
— vapautuneen CO  2 :n ja muiden helposti haihtuvien yhdisteiden 
määritys,  
— testiaineen ja tarvittaessa pääasiallisten hajoamistuotteiden kon ­
sentraatiot maanäytteessä esitettynä ajan funktiona,  
— testiaineen ja tarvittaessa pääasiallisten hajoamistuotteiden puo ­
liintumisaika tai DT  50 -, DT  75 - ja DT  90 -arvot luottamusvälein,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1302
 
— arvio abioottisen hajoamisen nopeudesta steriileissä olosuhteissa,  
— arvio testiaineen ja tarvittaessa pääasiallisten hajoamistuotteiden 
hajoamiskinetiikasta,  
— arvio oletetuista hajoamisreiteistä tarvittaessa,  
— tulosten pohdinta ja tulkinta,  
— käsittelemättömät tulokset (esimerkiksi näytteestä saadut kroma ­
togrammit, hajoamisnopeutta koskevat laskelmat ja hajoamistuot ­
teiden tunnistusmenetelmät).  
4. LÄHDELUETTELO  
(1) US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide As ­
sessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.
 
(2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
(3) European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC 
of 14 July 1995 amending Council Directive 91/414/EEC con ­
cerning the placing of plant protection products on the market. Annex II, Part A and Annex III, Part A: Fate and Behaviour in the Environment.
 
(4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). App ­
lication for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
 
(5) BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflan ­
zenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutz ­
mitteln im Boden — Abbau, Umwandlung und Metabolismus.  
(6) ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality — Guidance on labo ­
ratory tests for biodegradation of organic chemicals in soil — 
Part 1: Aerobic conditions.  
(7) ISO 14239 (1997). Soil Quality — Laboratory incubation sys ­
tems for measuring the mineralization of organic chemicals in 
soil under aerobic conditions.  
(8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, toim.  
(9) MAFF — Japan 2000 — Draft Guidelines for transformation 
Studies of pesticides in soil — Aerobic metabolism study in soil under paddy field conditions (flooded).
 
(10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Se ­
lection of Soils/Sediments. Belgirate, Italia, 18.-20. tammikuuta 1995.
 
(11) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. Teoksessa 
Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, toim.), Academic Press, 123-157.
 
(12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley — VCH 
(1998).  
(13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984)  
(14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981)  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1303
 
(15) ISO 10381-6 (1993). Soil Quality — Sampling — Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for 
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.  
(16) Annex V to Dir. 67/548/EEC  
(17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the 
fate of pesticides in soil. Teoksessa Progress in Pesticide Bio ­
chemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, toim. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114.
 
(18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
26:305 (1962).  
(19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mine ­
ralogical Methods. A. Klute, toim. Agronomy Series No 9, 2. 
painos.  
(20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Mic ­
robiological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kel ­
ney, toim. Agronomy Series No 9, 2. painos.  
(21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality 
— General aspects; chemical and physical methods of analysis; 
biological methods of analysis. 1. painos.  
(22) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologi ­
schen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologi ­
schen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  
(23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Boden ­
kunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.  
(24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978). A physiological met ­
hod for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215-221.
 
(25) ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality — Determination of 
soil microbial biomass — Part 1: Substrate-induced respiration 
method. Part 2: fumigation-extraction method.  
(26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of soils for 
pesticide experiments. Teoksessa Pesticide Effects on Soil Mic ­
roflora. L. Somerville, M.P. Greaves, toim. Taylor & Francis, 45-60.
 
(27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation 
in the environment: Aerobic and biotransformation of pestici ­
des in aqueous environment. Proceedings of the 16  th Sympo­
sium on Environmental Science of Pesticide, 105-120.  
(28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on 
biochemical processes in soil. Teoksessa Pesticides, Soil Mic ­
robiology and Soil Quality, 59-63 (SETAC-Europe).  
(29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., 
Stenström J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and 
cold storage of soil on microbial activities and biomass. Teok ­
sessa Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SETAC-Europe).
 
(30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of et ­
hylene oxide on soil microbial content and some Chemical 
characteristics. Plant and Soil 102, 197-200.  
(31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte 
auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Bo ­
den. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1304
 
(32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical mo ­
delling to the soil persistence and accumulation of pesticides. 
Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Her ­
bicides, 181-199.  
(33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, 
R.W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. Teok ­
sessa ”Environmental Dynamics of Pesticides”. R. Haque and 
V.H. Freed, toim., 135-172.  
(34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpre ­
tation and graphic representation of the degradational behavi ­
our of pesticide residues. II. Pflanzenschutz — Nachrichten 
Bayer 39, 188-204.  
(35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues. I. Pflanzenschutz — Nachrichten Bayer 33, 47- 
60. 
(36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dis ­
sipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, 1032-1041.
 
(37) Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. 
Teoksessa Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. 
Hance, toim.), Academic Press, 83-122.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1305
 
LIITE 1  
VEDEN JÄNNITYS, KENTTÄKAPASITEETTI (FC) JA VEDENPIDÄTYSKYKY 
(WHC)  ( 1 ) 
Vesipatsaan korkeus 
[cm] PF (  a ) bar (  b ) Huomautuksia  
10 7 7 10  4 kuiva maannos 
1,6 · 10 4 4,2 16 lakastumisraja 
10 4 4 10 
10 3 3 1 
6 · 10 2 2,8 0,6 
3,3 · 10 2 2,5 0,33 (  c ) 
kenttäkapasiteetin alue (  d ) 10 2 2 0,1 
60 1,8 0,06 33 1,5  9 
> > > > > > = 
> > > > > > ; 0,033 
10 1 0,01 vedenpidätyskyky (arvio) 
1 0 0,001 vedellä kyllästetty maannos
 
( a ) pF = vesipatsaan korkeuden (cm) logaritmi. 
( b ) 1 bar= 10  5 Pa. 
( c ) Vastaa noin 10 %:n vesipitoisuutta hiekassa, 35 %:n hiesussa ja 45 %:n savessa. 
( d ) Kenttäkapasiteetti ei ole vakio, vaan vaihtelee maannostyypin mukaan pF-arvojen 1,5 ja 2,5 välillä.  
Veden jännitys  mitataan vesipatsaan korkeutena (cm) tai baareina. Imupaineen laajan vaihtelun 
vuoksi jännitys ilmaistaan yksinkertaisesti pF-arvona, joka vastaa vesipatsaan korkeuden (cm) lo ­
garitmia.  
Kenttäkapasiteetti  on veden määrä, joka voi varastoitua ilmakehän paineessa luonnonmaannokseen 
2 päivän kuluessa pitkästä sadejaksosta tai riittävästä kastelusta. Tämä arvo määritetään luonnonti ­
laisesta maannoksesta tutkittavassa ympäristössä. Mittausta ei siis voida soveltaa käsiteltyihin maa ­
näyte-eriin laboratorio-olosuhteissa. FC-arvoissa, jotka on määritetty käsiteltyjen maanäytteiden 
perusteella, voi esiintyä suurta järjestelmällistä vaihtelua.  
Vedenpidätyskyky  (WHC) määritetään laboratoriossa sekä luonnontilaisesta että käsitellystä maan ­
noksesta kyllästämällä maapatsas vedellä kapillaari-ilmiön avulla. Tämä arvo on erityisen käyttö ­
kelpoinen käsiteltyjen maannosten yhteydessä ja se voi olla jopa 30 % suurempi kuin kenttäkapa ­
siteetti (1). Se on myös kokeellisesti helpompi määrittää kuin luotettava FC-arvo.  
Huomautukset  
( 1 ) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und 
petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1306
 
LIITE 2  
ERILAISTEN MAANNOSTYYPPIEN KOSTEUSPITOISUUDET (g vettä per 100 g kuivaa 
maannosta) ERI VALTIOISSA  
Maannoksen kosteuspitoisuus arvolla 
Maannos Valtio 
WHC (  1 ) pF= 1,8 pF = 2,5  
Hiekka Saksa 28,7 8,8 3,9 
Hiesupitoinen hiekka Saksa 50,4 17,9 12,1 
Hiesupitoinen hiekka Sveitsi 44,0 35,3 9,2 
Silttipitoinen hiesu Sveitsi 72,8 56,6 28,4 Savipitoinen hiesu Brasilia 69,7 38,4 27,3 Savipitoinen hiesu Japani 74,4 57,8 31,4 Hiekkapitoinen hiesu Japani 82,4 59,2 36,0 Silttipitoinen hiesu USA 47,2 33,2 18,8 Hiekkapitoinen hiesu USA 40,4 25,2 13,3
 
( 1 ) Vedenpidätyskyky  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1307
 
LIITE 3  
Kuva 1  
Esimerkki läpivirtausjärjestelmästä, jolla tutkitaan kemikaalien hajoamista 
maannoksessa  ( 1 ) ( 2 )
 
Kuva 2  
Esimerkki Erlenmeyer-pullosta, jolla tutkitaan kemikaalien hajoamista 
maannoksessa  ( 3 )
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1308  
( 1 ) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. Teoksessa Interactions between Herbi ­
cides and the Soil (R.J. Hance, toim.), Academic Press, 123–157. 
( 2 ) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. 
Teoksessa Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, toim. J. Wiley 
& Sons. Vol 1, 85–114. 
( 3 ) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau 
und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141–146.
 C.24.  AEROBINEN JA ANAEROBINEN HAJOAMINEN 
VESIYMPÄRISTÖN SEDIMENTTIJÄRJESTELMISSÄ  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä on toisinto OECD:n testiohjeesta nro 308 (2002).  
1.1 JOHDANTO  
Kemikaalit voivat päästä mataliin tai syviin pintavesiin esimerkiksi 
suoraan annosteltuina, lentosumutuksen yhteydessä, valumana sekä 
viemäröinnin, jätteiden käsittelyn, teollisuuden, kotitalouden tai 
maanviljelyn päästöinä ja ilmakehän laskeumina. Kuvatun testimene ­
telmän tarkoitus on arvioida laboratorio-olosuhteissa orgaanisten ke ­
mikaalien aerobista ja anaerobista hajoamista vesiympäristön sedi ­
menttijärjestelmissä. Menetelmä perustuu aikaisempiin ohjeisiin (1) ­
(2)(3)(4)(5)(6). Belgiratessa Italiassa vuonna 1995 pidetyssä maan ­
nosten ja sedimenttien valintaa käsitelleessä OECD:n työryhmän ko ­
kouksessa sovittiin erityisesti tässä testissä käytettävien sedimenttien 
lukumäärästä ja tyypeistä (7). Työryhmä esitti myös sedimenttinäyt ­
teiden keräämiseen, käsittelyyn ja varastointiin liittyviä suosituksia, jotka perustuvat ISO:n ohjeisiin (8). Testit ovat pakollisia kemikaa ­
leille, jotka tarkoituksella tai todennäköisesti päätyvät vesiympäris ­
töön edellä mainituilla tavoilla.
 
Luonnollisten vesiympäristön sedimenttijärjestelmien olosuhteet ovat 
usein aerobiset ylemmässä vesifaasissa. Sedimentin pintakerros voi olla joko aerobinen tai anaerobinen, kun taas syvemmällä sijaitseva sedimenttikerros on yleensä anaerobinen. Kaikkien näiden vaihtoeh ­
tojen huomioon ottamiseksi tässä asiakirjassa selostetaan sekä aero ­
bisia että anaerobisia testejä. Aerobisessa testissä simuloidaan aero ­
bista vesipatsasta, jonka alla on aerobinen sedimenttikerros ja sen alla anaerobinen gradientti. Anaerobisessa testissä simuloidaan täysin 
anaerobista vesi-sedimenttijärjestelmää. Jos olosuhteet edellyttävät 
merkittävää poikkeamista näistä suosituksista, esimerkiksi sedimen ­
tistä otettujen käsittelemättömien kairausnäytteiden tai testiaineelle mahdollisesti altistuneiden sedimenttien käyttöä, voidaan käyttää 
muita testimenetelmiä (9).
 
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Kaikissa tapauksissa on käytettävä kansainvälisen SI-standardin mu ­
kaisia yksikköjä.  
Testiaine:  mikä tahansa aine, joko alkutuote tai merkitykselliset ha ­
joamistuotteet.  
Hajoamistuotteet:  kaikki aineet, jotka syntyvät testiaineen biootti ­
sista tai abioottisista hajoamisreaktioista, mukaan luettuina CO  2 ja 
tuotteet, jotka ovat sitoutuneissa jäämissä.  
Sitoutuneet jäämät:  maaperässä, kasveissa tai eläimissä esiintyvät 
yhdisteet, jotka uuttamisen jälkeen säilyvät matriisissa alkutuotteen 
tai sen metaboliitin/hajoamistuotteen muodossa. Uuttomenetelmä ei 
saa olennaisesti muuttaa itse yhdisteitä tai matriisin rakennetta. Si ­
doksen luonnetta voidaan osittain selventää matriisia muuttavilla uut ­
tomenetelmillä ja kehittyneillä analyysitekniikoilla. Tähän mennessä 
on tunnistettu esimerkiksi kovalenttisia ioni- ja sorptiosidoksia sekä 
eri materiaalien sisään jääneitä aineita (sulkeuma-aineita) tällä mene ­
telmällä. Yleisesti voidaan todeta, että sitoutuneiden jäämien muo ­
dostuminen vähentää aineen biologista saatavuutta ja käytettävyyttä 
merkittävästi (10) [vuodelta 1984 olevaan IUPAC-nimikkeistöön 
tehty muutos (11)].  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1309
 
Aerobinen hajoaminen (muuntuminen):  reaktiot, jotka tapahtuvat 
molekyylisen hapen läsnäollessa (12).  
Anaerobinen hajoaminen:  reaktiot, joihin ei osallistu molekyylistä 
happea (12).  
Luonnonvedet:  esimerkiksi lammista, joista ja virroista saadut pin ­
tavedet.  
Sedimentti:  sekoitus mineraalisia ja orgaanisia kemiallisia aineksia, 
joista jälkimmäiset sisältävät paljon hiiltä ja typpeä sisältäviä suu ­
rimolekyylisiä aineita. Sedimentti kerrostuu luonnonvesiin ja muo ­
dostaa rajapinnan veteen.  
Mineralisaatio:  orgaanisen yhdisteen täydellinen hajoaminen 
CO 2 :ksi ja H  2 O:ksi aerobisissa olosuhteissa sekä CH  4 :ksi, CO  2 :ksi 
ja H  2 O:ksi anaerobisissa olosuhteissa. Kun käytetään leimana  l4 C:ta 
tässä testimenetelmässä, mineralisaatio tarkoittaa laajaa hajoamista, jonka aikana leimattu hiiliatomi hapettuu tai pelkistyy ja vapauttaa vastaavan määrän
 l4 CO 2 :ta tai CH  4 :ää. 
Puoliintumisaika:  t 0,5 on aika, joka kuluu testiaineen 50-prosentti ­
seen hajoamiseen tapauksissa, joissa hajoaminen voidaan kuvata en ­
simmäisen asteen kinetiikan avulla. Puoliintumisaika ei riipu kon ­
sentraatiosta.  
Häviämisaika 50 (DT  50 ): aika, jonka kuluessa testiaineen konsent ­
raatio vähenee 50 %:lla.  
Häviämisaika 75 (DT  75 ): aika, jonka kuluessa testiaineen konsent ­
raatio vähenee 75 %:lla.  
Häviämisaika 90 (DT  90 ): aika, jonka kuluessa testiaineen konsent ­
raatio vähenee 90 %:lla.  
1.3 VERTAILUAINEET  
Vertailuaineita on käytettävä hajoamistuotteiden karakterisointiin ja/ ­
tai tunnistukseen spektroskopia- ja krotomatografiamenetelmillä.  
1.4 TESTIAINETTA KOSKEVAT TIEDOT  
Hajoamisnopeuden mittaamiseen voidaan käyttää leimattua tai lei ­
maamatonta testiainetta, vaikka leimatun aineen käyttöä suositellaan. Merkkiaineen käyttö on välttämätöntä tutkittaessa hajoamisreittejä ja 
määritettäessä massatasetta.
 l4 C on suositeltava leima, mutta muitakin 
isotooppeja, kuten  13 C:ta,  15 N:ta,  3 H:ta tai  32 P:ta, voidaan käyttää. 
Leiman pitäisi mahdollisuuksien mukaan sijaita molekyylin stabii ­
leimmassa osassa tai osissa (  1 ). Testiaineen kemiallisen ja/tai radio ­
kemiallisen puhtausasteen on oltava vähintään 95 %.  
Ennen testin tekemistä testiaineesta on oltava saatavilla seuraavat 
tiedot:  
(a) vesiliukoisuus (menetelmä A.6);  
(b) liukoisuus orgaanisiin liuottimiin;  
(c) höyrynpaine (menetelmä A.4) ja Henryn lain vakio;  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1310  
( 1 ) Jos testiaine sisältää esimerkiksi yhden renkaan, tämä rengas täytyy merkitä; jos testiaine 
sisältää kaksi tai useampia renkaita, saatetaan tarvita erillinen testi kunkin merkityn 
renkaan reitin arvioimiseksi ja tarvittavan tiedon saamiseksi hajoamistuotteiden muodos ­
tumisesta.
 (d) n-oktanoli/vesi-jakaantumiskerroin (menetelmä A.8);  
(e) adsorptiokerroin (K  d , K f tai K  oc , tapauksen mukaan) (menetelmä 
C. 18);  
(f) hydrolyysi (menetelmä C.7);  
(g) dissosiaatiovakio (pK  a ) [OECD:n ohje 112] (13);  
(h) testiaineen kemiallinen rakenne ja merkkiaineen isotoopin sijain ­
ti, jos merkkiainetta käytetään.  
Huomautus:  Raportissa on ilmoitettava lämpötila, jossa mittaukset on 
tehty.  
Muita tarpeellisia tietoja saattavat olla tiedot testiaineen myrkyllisyy ­
destä mikrobeille, tiedot nopeasta ja/tai inherentistä biologisesta ha ­
joavuudesta sekä tiedot testiaineen aerobisesta ja anaerobisesta ha ­
joamisesta maaperässä.  
Käytettävissä on oltava analyysimenetelmät (myös uutto- ja puhdis ­
tusmenetelmät) testiaineen sekä sen hajoamistuotteiden kvantifioimi ­
seksi ja tunnistamiseksi vedestä ja sedimentistä (katso kohta 1.7.2).  
1.5 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Tässä kuvatussa menetelmässä käytetään yhtä aerobista ja yhtä anae ­
robista vesiympäristön sedimenttijärjestelmää (katso liite 1), jolloin 
voidaan  
i) mitata testiaineen muuttumisnopeus vesi-sedimenttijärjestelmässä;  
ii) mitata testiaineen muuttumisnopeus sedimentissä;  
iii) mitata testiaineen ja/tai sen hajoamistuotteiden mineralisaationo ­
peus (kun leimana on  14 C); 
(iv) tunnistaa ja määrittää hajoamistuotteet vesi- ja sedimenttifaasissa, 
mukaan luettuna massatase (kun käytetään merkkiainetta);  
(v) mitata testiaineen ja sen hajoamistuotteiden jakautuminen kah ­
teen faasiin pimeässä (esimerkiksi leväkukinnan välttämiseksi) 
tietyn inkubaatiojakson aikana vakiolämpötilassa. Puoliintumisa ­
jat, DT  50 -, DT  75 - ja DT  90 -arvot määritetään, jos mittaustulokset 
sallivat sen, mutta arvoja ei pidä ekstrapoloida pitkälle koejak ­
son yli (katso kohta 1.2).  
Sekä aerobiseen että anaerobiseen tutkimukseen tarvitaan vähintään 
kaksi sedimenttinäytettä ja näytteet niihin kuuluvista vesistä (7). Jois ­
sakin tapauksissa voi kuitenkin olla tarpeen käyttää useampia kuin 
kahta vesiympäristön sedimenttiä, esimerkiksi jos kemikaali voi 
esiintyä makean veden ympäristössä ja/tai merivesiympäristössä.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1311
 
1.6 TESTIN SOVELLUSALA  
Menetelmää voidaan soveltaa kaikkiin kemiallisiin aineisiin (leimaa ­
mattomiin tai radioaktiivisella isotoopilla leimattuihin), joiden analy ­
soimiseen on riittävän tarkka ja herkkä menetelmä. Tässä kuvattua 
menetelmää voidaan soveltaa lievästi haihtuviin, haihtumattomiin, ve ­
siliukoisiin tai veteen liukenemattomiin yhdisteisiin. Menetelmää ei voida soveltaa kemikaaleihin, jotka haihtuvat helposti vedestä (esi ­
merkiksi savuavat aineet tai orgaaniset liuottimet) ja jotka eivät siis 
säily vedessä ja/tai sedimentissä tässä kuvatuissa testiolosuhteissa.
 
Tähän mennessä menetelmällä on tutkittu kemikaalien muuntumista 
makeassa vedessä ja sedimenteissä, mutta periaatteessa menetelmää voidaan soveltaa jokisuisto- ja meriympäristöihin. Menetelmä ei so ­
vellu virtaavien vesien, kuten jokien, tai avomeren olosuhteiden si ­
mulointiin.
 
1.7 LAATUVAATIMUKSET  
1.7.1  Saanto  
Vähintään kahden maaperänäytteen uutto ja analysointi heti testi ­
aineen lisäämisen jälkeen antaa alustavia tietoja analyysimenetelmän toistettavuudesta ja sen testiaineeseen lisäämisen tasaisuudesta. Saanto testin myöhemmissä vaiheissa määritetään vastaavan massat ­
aseen mukaan. Saantojen tulisi olla 90-110 % käytettäessä merkki ­
ainetta (6) ja 70-110 %, kun merkkiainetta ei käytetä.
 
1.7.2  Analyysimenetelmän toistettavuus ja herkkyys  
Analyysimenetelmän toistettavuus (lukuun ottamatta alussa tehtävän 
uuton tehokkuutta) testiaineen ja hajoamistuotteiden määritysten 
osalta voidaan tarkistaa kaksoismäärittämällä samasta vesi- tai sedi ­
menttinäytteestä tehty uute, jota on inkuboitu niin kauan, että hajoa ­
mistuotteita on ehtinyt muodostua.  
Testiaineen ja hajoamistuotteiden osalta analyysimenetelmän osoitus ­
rajan (LOD) on oltava vähintään 0,01 mg ·kg -1 vesi- tai sedimentti ­
näytettä (testiaine) tai 1 % käytetystä annoksesta sen mukaan, kumpi on pienempi. Määritysraja (LOQ) on myös määritettävä.
 
1.7.3  Hajoamistesteissä saatujen tulosten luotettavuus  
Tiedot hajoamista kuvaavan käyrän luotettavuudesta saadaan teke ­
mällä regressioanalyysi testiaineen konsentraatioista ajan funktiona, jolloin voidaan laskea puoliintumisaikojen luottamusvälit (näennäisen 
ensimmäisen asteen kinetiikan osalta) tai DT
 50 -arvot sekä tarvittaessa 
DT 75 - ja DT  90 -arvot.  
1.8 MENETELMÄN KUVAUS  
1.8.1  Testijärjestelmä ja -laitteet  
Testi on suoritettava lasiastioissa (esimerkiksi pulloissa tai sentrifu ­
giputkissa), paitsi jos esitiedot (kuten n-oktanoli-vesi-jakaantumisker ­
roin tai sorptiotiedot) osoittavat, että testiaine saattaa kiinnittyä lasiin; tällöin voidaan harkita jonkin muun materiaalin, esimerkiksi teflonin, 
käyttöä. Jos testiaineen tiedetään kiinnittyvän lasiin, ongelmaa voi ­
daan helpottaa yhdellä tai usealla seuraavista tavoista:
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1312
 
— Määritetään lasiin kiinnittyneen testiaineen ja hajoamistuotteiden 
massa.  
— Pestään kaikki lasitavarat liuottimella testin päätyttyä.  
— Käytetään kaupallisia valmisteita (katso myös kohta 1.9.2).  
— Lisätään testiaine järjestelmään lisäliuottimen avulla; tällöin lisäli ­
uottimen on oltava aine, joka ei aiheuta testiaineen hajaantumista.  
Esimerkkejä tyypillisistä testilaitteista, eli läpivirtaus- ja Erlenmeyer- 
tyyppisistä järjestelmistä, on liitteissä 2 ja 3 (14). Muita käyttökelpoisia 
inkubointijärjestelmiä on esitetty lähteessä 15. Testilaitteiston on oltava rakenteeltaan sellainen, että ilman tai typen vaihto ja helposti haihtu ­
vien tuotteiden talteenotto on mahdollista. Laitteiston mittojen täytyy 
täyttää testivaatimukset (katso kohta 1.9.1). Ilmanvaihto voidaan jär ­
jestää joko varovaisena kuplailmastuksena tai viemällä ilmaa tai typpeä veden pinnalle. Jälkimmäisessä tapauksessa on suositeltavaa sekoittaa 
vettä varovasti ylhäältäpäin, jotta happi tai typpi leviäisi paremmin 
veteen. CO
 2 :ta sisältämätöntä ilmaa ei pidä käyttää, koska se saattaa 
nostaa veden pH-arvoa. Molemmissa tapauksissa sedimentin häiritse ­
minen ei ole suotavaa, ja sitä pitää mahdollisuuksien mukaan välttää. 
Haihtuvat kemikaalit on testattava Erlenmeyer-tyyppisessä järjestel ­
mässä sekoittamalla veden pintaa varovasti. Voidaan myös käyttää suljettuja säiliöitä, joiden ilmatilassa on joko ilmakehän ilmaa tai typ ­
peä ja astiat helposti haihtuvien aineiden talteen ottamiseksi (16). Ae ­
robisessa testissä vaatimuksena on ilmatilan kaasun säännöllinen vaih ­
tuminen, jolla kompensoidaan biomassan hapenkulutusta.
 
Sopivia erottimia helposti haihtuvien hajoamistuotteiden keräämiseen 
ovat muun muassa, mutta eivät ainoastaan, kaliumhydroksidi- tai 
natriumhydroksidiliuokset (1 mol · dm  -3 ) hiilidioksidin (  1 ) kerää­
miseen sekä etyleeniglykoli, etanoliamiini tai ksyleeniin liuotettu 2- prosenttinen parafiini orgaanisten yhdisteiden keräämiseen. Anaero ­
bisissa olosuhteissa muodostuneet helposti haihtuvat aineet, kuten 
metaani, voidaan kerätä esimerkiksi molekyyliseulalla. Tällaiset hel ­
posti haihtuvat aineet voidaan hapettaa esimerkiksi CO
 2 :ksi viemällä 
kaasu CuO:lla täytetyn kvartsiputken läpi 900  o C:n lämpötilassa ja 
erottamalla muodostunut CO  2 absorboivaan emäksiseen aineeseen 
(17).  
Testiaineen ja sen hajoamistuotteiden kemiallista analyysia varten 
tarvitaan laboratoriolaitteita (esimerkiksi GLC eli kaasu-nestekroma ­
tograafi, HPLC eli korkean suorituskyvyn nestekromatograafi ja TLC eli ohutlevykromatografialaite, MS eli massaspektrometri tai GC-MS 
eli kaasukromatograafi-massaspektrometri tai NMR eli ydinmagneet ­
tiseen resonanssiin perustuva tutkimuslaite) sekä detektiojärjestelmät radioaktiivisia merkkiaineita sisältäville tai leimaamattomille kemi ­
kaaleille. Käytettäessä radioaktiivisia merkkiaineita tarvitaan myös 
nestetuikelaskin ja poltto- eli hapetinlaite (sedimenttinäytteiden polt ­
tamiseen ennen radioaktiivisten aineiden analyysia.
 
Testissä voidaan tarvita myös muita tavanomaisia laboratoriolaitteita 
fysikaalis-kemiallisiin tai biologisiin määrityksiin (katso taulukko 1, kohta 1.8.2.2), lasitavaraa, kemikaaleja ja reagensseja.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1313  
( 1 ) Koska nämä emäksiset absorptioliuokset imevät myös tuuletusilman hiilidioksidin sekä 
aerobisissa testeissä soluhengityksen tuloksena syntyneen hiilidioksidin, ne on vaihdet ­
tava säännöllisesti, jotta vältetään niiden kyllästyminen ja siitä seuraava absorptiokyvyn 
menettäminen.
 1.8.2  Vesiympäristön sedimenttien valinta ja määrä  
Näytteenottopaikat on kaikissa tilanteissa valittava testin tarkoituksen 
mukaan. Näytteenottopaikkojen valinnassa on otettava huomioon va ­
luma-alueen ja yläjuoksun mahdolliset maanviljely-, teollisuus- tai 
kotitaloussyötteet. Testissä ei saa käyttää sedimenttejä, jotka ovat 
altistuneet testiaineelle tai sen kanssa rakenteellisesti analogiselle ai ­
neelle viimeisten neljän vuoden aikana.  
1.8.2.1  Sedimentin valinta  
Aerobisissa testeissä käytetään tavallisesti kahta sedimenttiä (7). Va ­
littujen kahden sedimentin on poikettava toisistaan orgaanisen hiilen pitoisuuden ja rakenteen osalta. Yhdessä sedimentissä on oltava suuri orgaanisen hiilen pitoisuus (2,5 - 7,5 %) ja hieno rakenne, toisessa 
taas pieni orgaanisen hiilen pitoisuus (0,5 - 2,5 %) ja karkea rakenne. 
Orgaanisen hiilen pitoisuuksien eron pitäisi yleensä olla vähintään 2 %. ”Hieno rakenne” merkitsee määritelmän mukaan > 50 %:n [savi + siltti] (
 1 ) -pitoisuutta, ja ”karkea rakenne” merkitsee < 
50 %:n [savi + siltti]-pitoisuutta. Kahden sedimentin [savi + siltti]- 
pitoisuuden välisen eron pitäisi yleensä olla vähintään 20 %. Jos kemikaali saattaa päästä myös merivesiin, vähintään yhden vesiym ­
päristösedimenttijärjestelmän on oltava peräisin merestä.
 
Pelkässä anaerobisessa testissä näytteet on otettava kahdesta sedi ­
mentistä (ja niihin kuuluvista vesistä) pintavesimassan anaerobiselta 
alueelta (7). Sekä sedimentti- että vesifaasi on käsiteltävä ja kulje ­
tettava huolellisesti hapettomissa olosuhteissa.  
Sedimenttien valintaan saattavat vaikuttaa muutkin parametrit, jotka 
on harkittava kussakin tapauksessa erikseen. Jos esimerkiksi testataan 
kemikaaleja, joiden muuntuminen ja/tai sorptio saattaa riippua pH- arvosta, sedimenttien pH-arvoalue on merkitsevä parametri. Sorption pH-riippuvuus saattaa heijastua testiaineen pK
 a -arvossa.  
1.8.2.2  Vesi-sedimenttinäytteiden karakterisointi  
Seuraavassa taulukossa on esitetty keskeiset parametrit, jotka on mi ­
tattava ja raportoitava (käytetyn menetelmän lisäksi) sekä veden että sedimentin osalta, sekä testin vaihe, jonka kuluessa ne on määritet ­
tävä. Näiden parametrien määritysmenetelmät esitetään lähteissä 18, 
19, 20 ja 21.
 
Lisäksi voi olla tarpeen mitata ja raportoida muitakin parametreja 
tapauskohtaisesti (esimerkiksi makean veden järjestelmistä hiukkaset, emäksisyys, kovuus, sähkönjohtokyky, NO
 3 /PO  4 (suhde ja erilliset 
arvot); sedimenteistä kationinvaihtokyky, vedenpidätyskyky, karbon ­
aatti, typen ja fosforin kokonaismäärä; merivesijärjestelmistä suolai ­
suus). Nitraatin, sulfaatin, biologisesti käyttökelpoisen raudan ja mahdollisesti muiden elektronin vastaanottajien analysoiminen sedi ­
menteistä ja vedestä voi myös olla tarpeen hapetus-pelkistysolosuh ­
teiden arviointia varten, erityisesti anaerobisen muuttumisen osalta.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1314  
( 1 ) [Savi + siltti] on sedimentin mineraaliosa, jonka raekoko on <50 μm.
 Vesi-sedimenttinäytteiden karakterisointiin tarvittavien parametrien mittaaminen (7)(22)(23)  
Parametri Testin vaihe 
Näytteen­
otto kentältä Jälkikäsit ­
tely Akklimati ­
soitumisen 
alku Testin alku Testin 
aikana Testin loppu  
Vesi 
Alkuperä/lähde X 
Lämpötila X 
pH X X X X X 
Orgaanisen hiilen kokonaispitoi ­
suus X X X 
O 2 -pitoisuus (*) X X X X X 
Hapetus-pelkistvspotentiaali (*) X X X X  
Sedimentti  
Alkuperä/lähde X 
Kerroksen paksuus X 
pH X X X X X 
Partikkelien kokojakauma X Orgaanisen hiilen kokonaispitoi ­
suus X X X X 
Mikrobibiomassa (*) X X X 
Hapetus-pelkistyspotentiaali (**) Havain ­
not (väri/ haju) X X X X
 
(*) Aerobisissa tutkimuksissa mikrobien hengitysnopeusmenetelmä (26), savutusmenetelmä (27) tai pesäkkeiden laske ­
minen Petri-maljassa (esimerkiksi bakteerit, aktinomykeetit eli sädesienet, sienet ja pesäkkeiden kokonaismäärä); 
anaerobisissa tutkimuksissa metaanin muodostumisnopeus. 
(**) Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että veden happipitoisuuden ja hapetus-pelkistyspotentiaalin mittauksilla 
ei ole sen paremmin mekanistista kuin ennustavaa arvoa, kun kysymys on pintavesien mikrobipopulaatioiden 
kasvusta ja kehityksestä (24)(25). Parempia välineitä aerobisen biomuuntumisen nopeuden ja reittien tulkintaan ja 
arvioimiseen voivat olla biokemiallinen hapenkulutus (näytteenoton yhteydessä sekä testin alussa ja lopussa mitat ­
tuna) sekä hivenaineiden/makroravinteiden Ca, Mg ja Mn konsentraatiot (testin alussa ja lopussa) vedessä sekä N:n ja P:n kokonaismäärät sedimentissä (näytettä otettaessa sekä testin lopussa).
 
1.8.3  Näytteiden kerääminen, käsittely ja varastointi  
1.8.3.1  Kerääminen  
Sedimenttinäytteitä otettaessa on sovellettava ISO:n pohjasedimentti ­
näytteiden ottamista koskevaa alustavaa ohjetta (S). Sedimenttinäyt ­
teet on otettava sedimentin ylimmästä kerroksesta (5-10 cm ylärajas ­
ta) koko kerroksen alueelta. Sedimenttiin kuuluvat vesinäytteet on kerättävä samasta paikasta ja samaan aikaan kuin sedimenttinäytekin. 
Anaerobisia tutkimuksia varten sedimenttinäyte ja siihen kuuluva 
vesinäyte on otettava ja kuljetettava hapettomissa olosuhteissa (28) ­
(katso kohta 1.8.2.1). Joitakin näytteenottovälineitä kuvataan läh ­
teissä (8)(23).
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1315
 
1.8.3.2  Käsittely  
Sedimentti erotetaan vedestä suodattamalla ja märkäseulotaan 
2 mm:n seulalla käyttäen ylimäärää tutkimuspaikalta otettua vettä, joka sitten heitetään pois. Tunnetut määrät sedimenttiä ja vettä se ­
koitetaan halutussa suhteessa (katso kohta 1.9.1) inkubointipulloissa 
ja valmistellaan akklimatisaatiojaksoa varten (katso kohta 1.8.4). Kun kyseessä on anaerobinen tutkimus, kaikki käsittelyn vaiheet on teh ­
tävä hapettomissa olosuhteissa (29)(30)(31)(32)(33).
 
1.8.3.3  Varastointi  
Sedimentti- ja vesinäytteet on mieluiten käytettävä juuri kerättyinä, 
mutta jos näytteiden varastointi on välttämätöntä, sedimentti ja vesi 
on seulottava edellä kuvatulla tavalla ja varastoitava yhdessä vedellä kyllästettynä (6-10 cm:n vesikerroksessa) pimeässä, 4 ± 2
 o C (  1 ) 
-asteen lämpötilassa enintään neljän viikon ajan (7)(8)(23). Aerobi ­
siin tutkimuksiin tarkoitetut näytteet on varastoitava niin, että ilmaa 
on vapaasti saatavilla (esimerkiksi avoimissa säiliöissä); anaerobisiin tutkimuksiin tarkoitetut näytteet puolestaan on varastoitava hapetto ­
missa olosuhteissa. Kuljetuksen ja varastoinnin aikana sedimentti- ja 
vesinäytteet eivät saa jäätyä eikä sedimentti kuivua.
 
1.8.4  Sedimentti- ja vesinäytteiden valmistelu testiä varten  
Ennen testiaineen lisäämistä näytteen on käytävä läpi akklimatisaa ­
tiojakso, jonka aikana kukin sedimentti- ja vesinäyte sijoitetaan var ­
sinaisessa testissä käytettävään inkubaatiosäiliöön, ja akklimatisaa ­
tion on tapahduttava täsmälleen samoissa olosuhteissa kuin testin inkubaatiojakson (katso kohta 1.9.1). Akklimatisaatiojakso on tar ­
peen, jotta järjestelmä saavuttaa kohtuullisen stabiilin tilan pH:n, 
veden happikonsentraation, sedimentin ja veden hapetus-pelkistyspo ­
tentiaalin sekä faasien makroskooppisen erottumisen osalta. Akk ­
limatisaatiojakson suositeltu kesto on tavallisesti viikosta kahteen 
viikkoon, kuitenkin enintään neljä viikkoa. Tänä aikana mitatut mää ­
ritystulokset on raportoitava.
 
1.9 TESTIN SUORITUS  
1.9.1  Testiolosuhteet  
Testi on suoritettava inkubointilaitteistossa (katso kohta 1.8.1), jossa 
veden ja sedimentin tilavuuden suhde on 3:1-4:1 ja sedimenttiker ­
roksen paksuus on 2,5 cm (± 0,5 cm). Vähintään 50 g sedimenttiä 
(kuivapaino) suositellaan laitettavaksi inkubaatiosäiliöön.  
Testi on suoritettava pimeässä vakioidussa lämpötilassa, jonka alue 
voi olla 10-30  o C. Suositeltava lämpötila on 20 ± 2  o C. Tarvittaessa 
voidaan tapauskohtaisesti käyttää toista, alempaa lämpötilaa (esimer ­
kiksi 10  o C), sen mukaan, millaisia tietoja testistä halutaan saada. 
Inkubointilämpötilaa on tarkkailtava ja se on raportoitava.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1316  
( 1 ) Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että varastointi 4  o C:n lämpötilassa saattaa 
vähentää sedimentin orgaanisen hiilen pitoisuutta, mikä puolestaan saattaa vähentää mik ­
robien toimintaa (34).
 1.9.2  Testiaineen käsittely ja annostelu  
Testissä käytetään yhtä testiaineen konsentraatiota (  1 ). Kun testiaine 
on suoraan vesimassaan annosteltava kasvinsuojeluaine, aineen käyt ­
töohjeissa oleva enimmäisannos tulkitaan enimmäisannostelumääräk ­
si, joka lasketaan testisäiliössä olevan veden pinta-alan mukaan. 
Muissa tapauksissa testikonsentraation on perustuttava ympäristö ­
päästöjen perusteella tehtyihin ennusteisiin. Testiaineen oikea kon ­
sentraatio on valittava huolellisesti, jotta voidaan karakterisoida ha ­
joamistuotteiden muodostuminen ja hajoaminen sekä niiden hajoa ­
misreitit. Suurempienkin (esimerkiksi 10-kertaisten) testiaineannosten käyttö voi olla tarpeen tilanteissa, joissa testiaineen konsentraatiot 
ovat testin alussa lähellä havaitsemisrajaa ja/tai joissa pääasiallisia 
hajoamistuotteita ei voida helposti havaita, kun niiden osuus on 10 % testiaineen annostelumäärästä. Jos käytetään suurempia testi ­
aineen konsentraatioita, ne eivät saa merkittävästi haitata vesi-sedi ­
menttijärjestelmän mikrobien toimintaa. Jotta testiaineen konsentraa ­
tio erikokoisissa säiliöissä olisi sama, testiaineen määrää voidaan mukauttaa säiliön vesipatsaan syvyyden mukaan suhteessa veden syvyyteen tutkittavassa ympäristössä (oletusarvo on 100 cm, mutta 
muitakin syvyyksiä voidaan käyttää). Esimerkkilaskelma on 
liitteessä 4.
 
Ihannetapauksessa testiaine annostellaan vesiliuoksena testijärjestel ­
män vesifaasiin. Pakottavista syistä testiaineen annostelussa ja levit ­
tämisessä voidaan käyttää pieniä määriä veteen sekoittuvia liuottimia (esimerkiksi asetonia ja etanolia), mutta niiden määrä ei saa olla enempää kuin 1 % v/v, eivätkä ne saa haitata testijärjestelmän mik ­
robien toimintaa. Testiaineen vesiliuos on valmistettava huolella; 
täydellisen homogeenisyyden varmistamiseksi voi olla tarpeen käyt ­
tää kehitinkolonneja ja esisekoitusta. Kun vesiliuos on lisätty testi ­
järjestelmään, on suositeltavaa sekoittaa vettä varovasti siten, että 
sedimenttiä häiritään mahdollisimman vähän.
 
Kaupallisten valmisteiden käyttö testissä ei ole yleensä suositeltavaa, 
koska valmisteen ainesosat voivat vaikuttaa testiaineen ja/tai hajoa ­
mistuotteiden jakautumiseen vesi- ja sedimenttifaasin välillä. Se voi 
kuitenkin tulla kysymykseen esimerkiksi veteen heikosti liukenevien testiaineiden kohdalla.
 
Inkubointisäiliöiden määrä riippuu näytteenottokertojen määrästä 
(katso kohta 1.9.3). Testissä on oltava riittävästi mitattavia näytteitä, sillä kullakin näytteenottokerralla kuluu kaksi mittausnäytettä. Jos kustakin vesiympäristön sedimenttijärjestelmästä tehdään kontrolli ­
näyte, niitä ei käsitellä testiaineella. Kontrollinäytteitä voidaan käyt ­
tää sedimentin mikrobibiomassan sekä veden ja sedimentin orgaa ­
nisen hiilen kokonaismäärän määrittämiseen testin lopuksi. Kahta kontrollinäytettä (yksi kontrollinäyte kustakin vesiympäristön sedi ­
mentistä) voidaan käyttää akklimatisaatiojakson aikana tarvittavien 
vesi- ja sedimenttiparametrien tarkkailemiseen (katso taulukko koh ­
dassa 1.8.2.2). Jos testiaine annostellaan liuottimen avulla, tarvitaan lisäksi kaksi kontrollinäytettä, jotta voidaan mitata testijärjestelmän 
haittavaikutukset mikrobien toimintaan.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1317  
( 1 ) Kahden konsentraation käyttäminen voi olla hyödyllistä testattaessa kemikaaleja, jotka 
päätyvät pintavesiin eri reittejä ja esiintyvät niissä merkittävästi erilaisina konsentraa ­
tioina, kunhan pienempi konsentraatio on analysoitavissa riittävän tarkasti.
 1.9.3  Testin kesto ja näytteenotto  
Testi saa tavallisesti kestää enintään 100 päivää (6), ja sitä on jat ­
kettava niin kauan, kunnes hajoamisreitit sekä jakautuminen veteen ja sedimenttiin on selvitetty tai 90 % testiaineesta on hävinnyt muun ­
tumisen tai haihtumisen kautta. Näytteenottokertoja on oltava ainakin 
kuusi (mukaan luettuna näytteenottokerta 0), ja ennen testiä voidaan tehdä vapaaehtoinen esitesti (katso kohta 1.9.4), jonka aikana pää ­
tetään asianmukaiset näytteenottojärjestelyt sekä testin kesto, mikäli 
riittäviä tietoja testiaineesta ei ole saatavissa aikaisemmista tutkimuk ­
sista. Kun testataan hydrofobisia aineita, testin alkuvaiheessa saa ­
tetaan tarvita ylimääräisiä näytteenottoajankohtia, jotta voidaan mää ­
rittää testiaineen jakautumisnopeus vesifaasin ja sedimenttifaasin vä ­
lillä.
 
Asianmukaisina näytteenottoaikoina inkubointisäiliöt (rinnakkaisnä ­
ytteineen) irrotetaan kokonaisuudessaan analyysia varten. Sedimentti 
ja sen päällä oleva vesi analysoidaan erikseen (  1 ). Pintavesi on pois ­
tettava varovasti niin, että sedimenttiä häiritään mahdollisimman vä ­
hän. Testiaineen ja hajoamistuotteiden eristämisessä ja karakterisoin ­
nissa on noudatettava asianmukaisia analyysikäytäntöjä. Myös inku ­
bointisäiliöön tai haihtuvien aineiden erottimen putkiin mahdollisesti adsorboitunut materiaali on huolellisesti poistettava.
 
1.9.4  Vapaaehtoinen esitesti  
Jos testin kestoa ja näytteenottokäytäntöä ei voida päättää muiden 
testiainetta koskevien relevanttien tutkimusten perusteella, vapaa ­
ehtoinen esitesti voi olla tarpeen. Esitesti on tehtävä samoissa olo ­
suhteissa, joissa varsinainen testi suunnitellaan tehtävän. Jos esitesti 
tehdään, olennaiset testiolosuhteet ja määritystulokset on lyhyesti raportoitava.
 
1.9.5  Mittaukset ja analyysi  
Jokaisella näytteenottokerralla mitataan ja raportoidaan testiaineen ja 
hajoamistuotteiden konsentraatio vedessä ja sedimentissä (konsent ­
raationa ja prosenttina testiaineen annostellusta määrästä). Yleisesti voidaan todeta, että hajoamistuotteet, jotka havaitaan ≥ 10 %:n pi ­
toisuuksina annostellusta radioaktiivisesta aineesta vesi-sedimenttiko ­
konaisjärjestelmässä millä tahansa näytteenottokerralla, on tunnistet ­
tava, paitsi mikäli muulle menettelylle on pätevät perusteet. On myös syytä harkita sellaisten hajoamistuotteiden tunnistusta, joiden kon ­
sentraatiot kasvavat jatkuvasti testin aikana, vaikka niiden konsent ­
raatiot eivät ylittäisikään edellä esitettyjä rajoja, koska tämä voi merkitä tuotteiden pysyvyyttä. Nämä seikat on harkittava tapauskoh ­
taisesti ja perustelut on esitettävä testiselosteessa.
 
Määritystulokset kaasujen tai helposti haihtuvien aineiden (CO  2 :n ja 
vastaavien helposti haihtuvien orgaanisten yhdisteiden) erotinjärjes ­
telmistä on raportoitava kullakin näytteenottokerralla. Mineralisaatio ­
nopeus on myös raportoitava. Uuttumattomat (sitoutuneet) jäämät sedimentissä on raportoitava kullakin näytteenottokerralla.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1318  
( 1 ) Tapauksissa, joissa anaerobiset hajoamistuotteet voivat hapettua uudelleen nopeasti, on 
huolehdittava anaerobisten olosuhteiden säilymisestä näytteenoton ja analyysin aikana.
 2. MITTAUSTULOKSET  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
Lisätyn radioaktiivisen aineen kokonaismassatase tai saanto (katso 
kohta 1.7.1) on laskettava jokaisella näytteenottokerralla. Määritys ­
tulokset on raportoitava prosenttina lisätystä radioaktiivisesta ainees ­
ta. Radioaktiivisen aineen jakautuminen veden ja sedimentin välille on raportoitava konsentraationa ja prosenttiosuutena jokaisella näyt ­
teenottokerralla.
 
Testiaineen puoliintumisaika, DT  50 - ja tarvittaessa DT  75 - ja DT  90 - 
arvot on laskettava luottamusväleineen (katso kohta 1.7.3). Tiedot testiaineen häviämisnopeudesta vedessä ja sedimentissä saadaan asi ­
anmukaisin arviointimenetelmin. Tällaisia voivat olla näennäisen en ­
simmäisen asteen kinetiikan käyttö, graafisia tai numeerisia ratkaisuja 
käyttävät empiiriset käyrän sovitukset sekä monimutkaisemmat arvi ­
ointimenetelmät, joissa käytetään esimerkiksi yhden tai usean lohkon malleja. Lisätietoja on esitetty lähteissä (35)(36)(37).
 
Kaikissa lähestymistavoissa on omat vahvuutensa ja heikkoutensa, ja 
niiden monimutkaisuus vaihtelee suuresti. Ensimmäisen asteen kine ­
tiikka voi yksinkertaistaa hajoamis- ja jakautumisprosesseja liikaa, mutta tapauksissa, joissa sitä voidaan käyttää, sen avulla saadaan suure (nopeusvakio tai puoliintumisaika), joka on helppotajuinen ja 
käyttökelpoinen simulaatiomallinnuksessa ja ennustettujen ympäris ­
tökonsentraatioiden laskennassa. Empiirisillä lähestymistavoilla tai lineaarisilla muunnoksilla voidaan tuottaa paremmin aineistoon sopi ­
via käyriä ja siten tarkempia arvioita puoliintumisajoista, DT
 50 - ja 
tarvittaessa DT  75 - ja DT  90 -arvoista. Derivoitujen vakioiden käyttö ­
kelpoisuus on kuitenkin rajoitettua. Lohkomalleilla voidaan luoda riskien arviointia varten useita käyttökelpoisia vakioita, jotka kuva ­
avat hajoamisnopeutta eri lohkoissa sekä kemikaalin jakautumista. 
Lohkomalleja on käytettävä myös pääasiallisten hajoamistuotteiden 
muodostumis- ja hajoamisnopeusvakioiden arviointiin. Valitun me ­
netelmän on kaikissa tapauksissa oltava perusteltu, ja testaajan on esitettävä sovituksen hyvyys graafisesti ja/tai tilastollisesti.
 
3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN  
3.1 TESTISELOSTE  
Testiselosteessa on annettava seuraavat tiedot:  
Testiaine:  
— yleisnimi, kemiallinen nimi, CAS-numero, rakennekaava 
(josta käy ilmi leiman tai leimojen sijainti käytettäessä radio ­
aktiivista merkkiainetta) ja merkitykselliset fysiko-kemialliset 
ominaisuudet,  
— testiaineen puhtaus (epäpuhtaudet),  
— merkkiaineena käytetyn kemikaalin radiokemiallinen puhtaus 
ja molaarinen aktiivisuus tapauksen mukaan.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1319
 
Vertailuaineet:  
— hajoamistuotteen karakterisointiin ja/tai tunnistukseen käytet ­
tävän vertailuaineen kemiallinen nimi ja rakenne.  
Testissä käytettävät sedimentti- ja vesinäytteet:  
— vesiympäristöstä otetun sedimentin keräyspaikan tai -paikko ­
jen sijainti ja kuvaus, mukaan luettuna taustatiedot saastumi ­
sesta, jos ne ovat saatavissa,  
— täydelliset tiedot vesi-sedimenttijärjestelmän keräämisestä, va ­
rastoinnista (jos näytettä on varastoitu) sekä akklimatisaatiosta,  
— vesi-sedimenttinäytteiden ominaisuudet kohdan 1.8.2.2 taulu ­
kon mukaan.  
Testiolosuhteet:  
— testissä käytetty järjestelmä (esimerkiksi läpivirtaus- tai Erlen ­
meyer-järjestelmä, ilmastus- ja sekoitustapa, veden tilavuus, 
sedimentin massa, sekä vesi- että sedimenttikerroksen pak ­
suus ja testisäiliöiden mitat),  
— testiaineen annostelu testijärjestelmään: testissä käytetyt kon ­
sentraatiot, rinnakkais- ja kontrollinäytteiden määrä, testi ­
aineen annostelutapa (esimerkiksi liuottimen käyttö),  
— inkubointilämpötila,  
— näytteenottoajat,  
— eristysmenetelmät ja -tehokkuudet sekä analyysimenetelmät ja 
osoitusrajat,  
— hajoamistuotteiden karakterisointi- ja tunnistusmenetelmät,  
— testin aikana tapahtuneet poikkeamat testiohjeista tai suositel ­
luista olosuhteista.  
Tulokset:  
— edustavien analyysien mittaustulokset (kaikki mittaustulokset 
on tallennettava laboratorion arkistoon),  
— käytettyjen analyysimenetelmien toistettavuus ja herkkyys,  
— saanto (validin testin prosenttiarvot on esitetty kohdassa 
1.7.1),  
— tulokset taulukkomuodossa, ilmoitetaan testiaineen ja tarvitta ­
essa pääasiallisten hajoamistuotteiden sekä uuttumattomien 
radioaktiivisten aineiden prosenttiosuutena alkuperäisestä an ­
noksesta ja tarvittaessa mg · kg  -1 vedessä, sedimentissä ja 
kokonaisjärjestelmässä (vain prosentteina),  
— massatase testien aikana ja niiden lopuksi,  
— graafinen esitys testiaineen muuntumisesta vesi- ja sediment ­
tiosajärjestelmissä sekä kokonaisjärjestelmässä (mineralisaatio 
mukaan luettuna),  
— mineralisaationopeudet,  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1320
 
— testiaineen ja tarvittaessa pääasiallisten hajoamistuotteiden 
puoliintumisaika sekä tarvittaessa DT  50 -, DT  75 - ja DT  90 -arvot 
vedessä, sedimentissä ja kokonaisjärjestelmässä,  
— arvio testiaineen ja tarvittaessa pääasiallisten hajoamistuottei ­
den hajoamiskinetiikasta,  
— arvio oletetuista hajoamisreiteistä tapauksen mukaan,  
— tulosten pohdinta.  
4. LÄHDELUETTELO  
(1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the 
registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment system. Ger ­
many.
 
(2) Commission for registration of pesticides: Application for re ­
gistration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the 
product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). The Netherlands.
 
(3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary guid ­
eline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United 
Kingdom.
 
(4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic 
(Laboratory) — Anaerobic and aerobic. Canada. pp 35-37.  
(5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. Che ­
mistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, Anaerobic aquatic metabolism.
 
(6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing 
the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.
 
(7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the 
OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, 
Italy, 18-20 January 1995.  
(8) ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality — Sampling — Part 
12: Guidance on sampling of bottom sediments.  
(9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation 
test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 
712-C-98-080.  
(10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).  
(11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).  
(12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981).  
(13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Tes ­
ting of Chemicals.  
(14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) 
Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. 
BCPC — Pests and Diseases, 3B-4, 149-158.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1321
 
(15) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the 
fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry 
(D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85-114. J. Wiley & Sons.
 
(16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inocu ­
lation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 
631-637.
 
(17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of 
detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with  14 C-la­
belled model surfactants. Water Research 21, 661-667.  
(18) Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy Mo ­
nograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.  
(19) APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water 
and Wastewater (17  th edition). American Public Health Asso ­
ciation, American Water Works Association and Water Pollu ­
tion Control Federation, Washington D.C.  
(20) Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Applications. 
Longman.  
(21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential mea ­
surements. Anal. Chemistry 44, 1038-1039.  
(22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on tes ­
ting procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop ”A Meeting of Experts on Guidelines for Static 
Field Mesocosms Tests”, 3-4 July 1991.
 
(23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on 
sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine 
environments. From the Workshop On Sediment Toxicity As ­
sessment (WOSTA), 8-10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach.
 
(24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide biot ­
ransformation in surface waters: multivariate analyses of envi ­
ronmental factors at field sites. Water Research 31, 2858-2868.  
(25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). 
Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329-338.
 
(26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon 
requirements of actively-metabolising microbial populations under  in-situ  conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197-203.
 
(27) ISO-14240-2. (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 2: Fumigation- extraction method.  
(28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the 
Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sedi ­
ment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13-21.  
(29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for 
determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850-857.
 
(30) Birch, R.R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, 
U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening 
of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 
1527-1550.  
(31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic biodegrada ­
tion tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 1499-1509.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1322
 
(32) Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A batch test for asses ­
sing the mineralisation of  14 C-radiolabelled compounds under 
realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597- 3603.
 
(33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic che ­
micals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 
712-C-98-090.  
(34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sedi ­
ment characteristics and drying sediment on sorption coeffici ­
ents of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxi ­
col. 58, 961-968.  
(35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical interp ­
retation and graphic representation of the degradational beha ­
viour of pesticide residues II. Pflanzenschutz — Nachrichten Bayer, 39, 187-203.
 
(36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues I. Pflanzenschutz — Nachrichten Bayer, 33, 47- 60.
 
(37) Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment 
model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water 
systems. Brighton Crop Protection Conference — Pest and Diseases, pp 1349-1354.
 ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1323
 
LIITE 1  
AEROBISIIN JA ANAEROBISIIN TESTIJÄRJESTELMIIN LIITTYVIÄ 
OHJEITA  
Aerobinen testijärjestelmä  
Tässä menetelmässä kuvattu aerobinen testijärjestelmä koostuu aerobisesta vesi ­
kerroksesta (tyypillinen happikonsentraatio on 7-10 mg · l -1 ) ja sedimenttikerrok ­
sesta, joka on aerobinen pinnalta ja anaerobinen sen alta (tyypillinen hapetus- pelkistyspotentiaalien (E
 h ) keskiarvo sedimentin anaerobisella alueella on 
- 80 ... - 190 mV). Kussakin inkubointiyksikössä viedään kosteutettua ilmaa 
veden pinnalle riittävän happimäärän varmistamiseksi ilmatilassa.  
Anaerobinen testijärjestelmä  
Anaerobisessa testijärjestelmässä testimenettely on olennaisilta osin sama kuin 
aerobisessa järjestelmässä sillä poikkeuksella, että kussakin inkubointiyksikössä 
veden pinnalle viedään kosteutettua typpeä riittävän typpimäärän varmistamiseksi 
ilmatilassa. Sedimenttiä ja vettä voidaan pitää anaerobisina heti, kun hapetus- pelkistyspotentiaali (E
 h ) on alle - 100 mV.  
Anaerobisessa testissä mineralisaation arviointiin kuuluu myös näytteessä kehit ­
tyneen hiilidioksidin ja metaanin mittaus.  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1324
 
LIITE 2  
ESIMERKKI LÄPIVIRTAUSJÄRJESTELMÄSTÄ
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1325
 
LIITE 3  
ESIMERKKI ERLENMEYER-LAITTEESTA (BIOMETER)
  ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1326
 
LIITE 4  
ESIMERKKILASKELMA TESTIAINEEN ANNOSTELUSTA 
TESTISÄILIÖIHIN  
Lieriön sisähalkaisija: = 8 cm 
Vesipatsaan syvyys sedimentti poisluettuna: = 12 cm Pinta-ala: 3,142 x4
 2 = 50,3 cm  2 
Annostus: 500 g testiainetta/ha vastaa 5 μg/cm  2 
Yhteensä μg: 5 x 50,3 = 251,5 μg 
Mukautettu määrä suhteessa 100 cm:n syvyy ­
teen: 12 x 251,5 ÷ 100 = 30,18 μg 
Vesipatsaan tilavuus: 50,3 x 12 = 603 ml 
Konsentraatio vedessä: 30,18 ÷ 603 = 0,050 μg/ml tai 50 μg/l ▼B 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1327
 
C.25.  AEROBINEN MINERALISAATIO PINTAVEDESSÄ – 
BIOHAJOAVUUDEN SIMULAATIOTESTI  
1 MENETELMÄ  
Tämä menetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 309 (2004) (1).  
1.1 JOHDANTO  
Tämän testin tarkoituksena on mitata aerobisessa luonnonvedessä 
pienenä pitoisuutena olevan testiaineen biohajoavuus ajan funktiona 
ja kvantifioida havainnot kineettisten nopeuslausekkeiden muodossa. 
Tämä simulaatiotesti on laboratoriossa panoskokeena ( batch ) suori­
tettava ravistelutesti, jossa määritetään luonnon pintavesinäytteissä (makea vesi, murtovesi tai merivesi) olevien orgaanisten aineiden 
aerobisen biohajoavuuden nopeudet. Se perustuu ISO/DIS 14592–1 
-testiin (2) ja sisältää myös osia testimenetelmistä C.23 ja C.24 (3)(4). Jos testi on pitkäkestoinen, panosprosessi voidaan korvata puolijat ­
kuvalla prosessilla, jotta estettäisiin testiorganismin huononeminen. 
Simulaatiotestin ensijaisena tavoitteena on määrittää testiaineen mi ­
neralisaatio pintavedessä, ja mineralisaatio muodostaa perustan ha ­
joamiskinetiikan esittämiselle. Toissijaisesti testissä voidaan tutkia primaarista hajoamista ja merkittävien muuntumistuotteiden muodos ­
tumista. Muuntumistuotteiden yksilöinti ja mahdollisuuksien mukaan 
niiden pitoisuuksien määrittäminen on erityisen tärkeää, kun on kyse hitaasti mineralisoituvista aineista (esim.
 14 C:n kokonaisjäännöksen 
puoliintumisaikojen ollessa yli 60 päivää). Analyysitekniikoiden ra ­
joitusten vuoksi merkittävien muuntumistuotteiden yksilöinti ja nii ­
den pitoisuuksien määritys edellyttävät tavallisesti testiaineen käyttöä suurempina pitoisuuksina (esim. > 100 μg/l).
 
Pieni pitoisuus merkitsee tässä testissä pitoisuutta (esim. alle 1 μg/l – 
100 μg/l), joka on tarpeeksi alhainen, jotta testin biohajoavuuskine ­
tiikka vastaa ympäristössä ennakoitavaa biohajoavuuskinetiikkaa. Testissä käytetyssä luonnonvedessä olevien biohajoavien hiilisubst ­
raattien kokonaismassaan verrattuna testiaine, joka on pienenä pitoi ­
suutena, on toissijainen substraatti. Tämä merkitsee, että ennakoitu 
biohajoavuuskinetiikka on ensimmäistä kertalukua (ei kasvua) ja että testiaine voi hajota metabolisten reaktioiden sivuvaikutuksena (cometabolism). Ensimmäisen kertaluvun kinetiikassa hajoamisnopeus 
(mg/L/päivä) on suhteessa substraatin pitoisuuteen, joka pienenee ajan 
myötä. Aidossa ensimmäisen kertaluvun kinetiikassa spesifinen hajoa ­
misen nopeusvakio k ei riipu ajasta eikä pitoisuudesta. Toisin sanoen k:n arvo ei vaihtele merkittävästi kokeen aikana eikä muutu lisättä ­
essä pitoisuutta kokeiden välillä. Spesifinen hajoamisen nopeusvakio 
vastaa pitoisuuden suhteellista muutosta aikayksikköä kohti: k = (1/ ­
C) · (dC/dt). Vaikka kuvatuissa olosuhteissa ennakoidaan ensimmäi ­
sen kertaluokan kinetiikkaa, eräät mahdolliset olosuhteet voivat suosia 
muuntyyppistä kinetiikkaa. Reaktio voi poiketa ensimmäisen kertalu ­
vun kinetiikasta esimerkiksi siinä tapauksessa, jos aineensiirtoon liit ­
tyvät ilmiöt, kuten diffuusionopeus (ei biologisen reaktion nopeus) rajoittaa biotransformaation nopeutta. Data voidaan kuitenkin lähes 
aina kuvata pseudo-ensimmäisen kertaluvun kinetiikan mukaisesti, 
jolloin nopeusvakio voi olla pitoisuudesta riippuvainen.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1328
 
Kokeen suunnittelun ja tulosten tulkinnan tueksi pitäisi etukäteen 
olla käytettävissä (esim. vakioseulontatesteistä saatavia) tietoja testi ­
aineen biohajoavuudesta suuremmilla pitoisuuksilla sekä tietoja abi ­
oottisesta hajoavuudesta, muuntumistuotteista ja relevanteista fysi ­
kaalis-kemiallisista ominaisuuksista.  14 C-leimalla merkittyjen testi ­
aineiden käyttö ja  14 C:n faasijakauman määritys testin lopussa mah ­
dollistavat lopullisen biohajoavuuden määrityksen. Käytettäessä lei ­
maamattomia testiaineita lopullinen biohajoavuus voidaan arvioida vain siinä tapauksessa, että testataan suurempi pitoisuus ja että kaikki 
pääasialliset muuntumistuotteet tunnetaan.
 
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Primaarinen biohajoaminen : Mikro-organismien aiheuttama kemi ­
allisen aineen rakenteellinen muutos (transformaatio), jonka seurauk ­
sena aine menettää kemiallisen rakenteensa.  
Funktionaalinen biohajoaminen : Mikro-organismien aiheuttama 
kemiallisen aineen rakenteellinen muutos (transformaatio), jonka seu ­
rauksena aine menettää jonkin erityisen ominaisuuden.  
Lopullinen (aerobinen) biohajoaminen : Mikro-organismien aiheut ­
tama kemiallisen aineen hajoaminen hapen vaikutuksesta hiilidioksi ­
diksi, vedeksi ja muiden aineiden kivennäissuoloiksi (mineralisaatio) sekä uuden biomassan ja orgaanisten mikrobiologisten biosynteesitu ­
otteiden tuottaminen.
 
Mineralisaatio : Mikro-organismien aiheuttama kemiallisen aineen 
tai orgaanisen aineen hajoaminen hapen vaikutuksen vuoksi hiilidi ­
oksidiksi, vedeksi ja muiden aineiden kivennäissuoloiksi.  
Lag-vaihe : Aika testin alusta siihen, kun hajottavien mikro-organis ­
mien adaptaatio on tapahtunut ja kemiallisen aineen tai orgaanisen aineen biohajoamisaste on havaittavalla tasolla (esim. 10 % bioha ­
joamisen teoreettisesta enimmäistasosta tai tätä alempi, riippuen mit ­
taustekniikan tarkkuudesta).
 
Biohajoamisen enimmäistaso : Kemiallisen aineen tai orgaanisen 
aineen se prosentteina ilmaistu biohajoamistaso testissä, jonka jäl ­
keen biohajoamista ei enää tapahdu testissä.  
Ensisijainen substraatti : Kaikki luonnolliset hiilen ja energian läh ­
teet, joiden ansiosta mikrobibiomassa voi kasvaa ja säilyä.  
Toissijainen substraatti : Substraatin osa, joka on niin pienenä pi ­
toisuutena, että sen biohajoamisesta vapautuu vain merkityksettömiä 
määriä hiiltä ja energiaa kompetenteille mikro-organismeille verrat ­
tuna hiileen ja energiaan, jotka vapautuvat pääasiallisten substraatin osien (ensisijaisten substraattien) hajoamisesta.
 
Hajoamisen nopeusvakio : Ensimmäisen kertaluvun tai pseudo-en ­
simmäisen kertaluvun kinetiikan nopeusvakio k (d  –1 ), joka ilmaisee 
hajoamisprosessien nopeuden. Panoskokeessa k estimoidaan lag-vai ­
hetta seuraavasta hajoamiskäyrän ensimmäisestä osasta.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1329
 
Puoliintumisaika, t  1/2 (d): Ensimmäisen kertaluokan reaktion nopeu ­
den kuvaamiseen käytettävä parametri. Se on aikaväli, joka vastaa 
pitoisuuden vähenemistä puoleen. Puoliintumisajan ja hajoamisen nopeusvakion välinen yhtälö on t
 1/2 = ln2/k.  
Hajoamisen puoliintumisaika, DT  50 (d): Biohajoamistestien tulok ­
sen kvantifiointiin käytettävä parametri. Se on aikaväli (mukaan lu ­
ettuna lag-vaihe), joka tarvitaan 50 prosentin biohajoamisen saavut ­
tamiseen.  
Havaitsemisraja (LOD) ja määritysraja (LOQ) : Havaitsemisraja 
(limit of detection , LOD) on se aineen pitoisuus, jonka alapuolella 
ainetta ei voida erottaa määritysartefaktoista. Määritysraja ( limit of 
quantification , LOQ) on se aineen pitoisuus, jonka alapuolella pitoi ­
suutta ei voida määritää hyväksyttävällä tarkkuudella.  
Liennut orgaaninen hiili ( dissolved organic carbon , DOC) : Se 
orgaanisen hiilen osa vesinäytteessä, jota ei voida erottaa testiohjeen mukaisella faasierotuksella, esimerkiksi sentrifugioimalla nopeudella 40 000 ms
 –2 15 minuutin ajan tai kalvosuodatuksella käyttäen kal ­
voja, joiden huokoskoko on 0,2 μm–0,45 μm. 
Orgaanisen  14 C:n kokonaisaktiivisuus ( total organic  14 C activity , 
TOA) : Orgaaniseen hiileen liittyvä  14 C-kokonaisaktiivisuus.  
Liukoisen orgaanisen  14 C:n aktiivisuus ( dissolved organic  14 C ac­
tivity , DOA) : Liukoiseen orgaaniseen hiileen liittyvä  14 C-kokonaisak ­
tiivisuus.  
Partikkelimuodossa olevan orgaanisen  14 C:n aktiivisuus ( particu­
late organic  14 C activity , POA) : Partikkelimuodossa olevaan orgaa ­
niseen hiileen liittyvä  14 C-kokonaisaktiivisuus.  
1.3 TESTIN SOVELLUSALA  
Tätä simulaatiotestiä voidaan soveltaa pieninä pitoisuuksina testatta ­
viin haihtumattomiin tai lievästi haihtuviin orgaanisiin aineisiin. Käytettäessä pulloja, joita ei ole suljettu ilmalta (esim. vanutupoilla suljettuja pulloja), käytännössä haihtumattomina voidaan pitää 
aineita, joiden Henryn lain vakio on alle noin 1 Pa·m
 3 /mol (arviolta 
10 –5 atm·m  3 /mol). Käytettäessä suljettuja pulloja, joissa on vapaa 
ilmatila, voidaan testata lievästi haihtuvia aineita (joiden Henryn lain vakio on < 100 Pa·m
 3 /mol tai < 10  –3 atm·m  3 /mol) ilman vuotoja 
testijärjestelmästä.  14 C-leimattuja aineita voidaan menettää CO  2 :n 
poiston yhteydessä, jos tarvittaviin varokeinoihin ei ryhdytä. Tällai ­
sissa tilanteissa voi olla tarpeen imeyttää CO  2 absorboivaan emäksi ­
seen aineeseen testijärjestelmän sisällä tai käyttää ulkoista CO  2 -ab­
sorbointijärjestelmää (suora  14 CO 2 :n määritys; ks. liite 3). Biohajoa ­
vuuskinetiikan määrittämiseksi testiaineen pitoisuuden on oltava sen vesiliukoisuusrajan alapuolella. On huomattava, että lähdekirjallisuu ­
desta saadut vesiliukoisuuden arvot voivat olla merkittävästi suurem ­
pia kuin testiaineen liukoisuus luonnonvedessä. Erityisen huonosti 
veteen liukenevien testiaineiden liukoisuus voidaan määrittää myös käyttämällä testattavaa luonnonvettä.
 
Menetelmää voidaan käyttää biohajoavuuden simulointiin pintav ­
edesssä, jossa ei ole karkeita hiukkasia (”pelaginen testi”), tai same ­
assa pintavedessä esimerkiksi lähellä veden ja sedimentin rajapintaa 
(”suspendoituneen sedimentin testi”).  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1330
 
1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE  
Testi suoritetaan panoskokeena ( batch ) inkuboimalla testiainetta joko 
pelkästään pintavedellä (pelaginen testi) tai pintavedellä, jossa on suspendoitunutta kiintoainesta tai sedimenttiä kuiva-aineena 0,01– ­
1 g/L (suspendoituneen sedimentin testi). Tällä tavoin testillä simu ­
loidaan vesistöä, jossa on suspendoitunutta kiintoainesta tai uudelleen suspendoitunutta sedimenttiä. Useimmissa pintavesissä suspendoitunut kiintoaines tai sedimetti on tyypillisesti pitoisuuksina, jotka sijoittuvat 
mainitun asteikon alapäähän. Testipulloja inkuboidaan pimeässä ym ­
päristön lämpötilassa aerobisissa olosuhteissa ja jatkuvasti sekoittaen. Ainakin kahta testiaineen pitoisuutta tulisi käyttää, jotta hajoavuuski ­
netiikka voidaan määrittää. Pitoisuuksien välillä tulisi olla 5–10-kertai ­
nen ero, ja niiden tulisi edustaa pitoisuuksia, joiden odotetaan vallitse ­
van ympäristössä. Testiaineen enimmäispitoisuus ei saisi olla yli 100 μg/L. Suosituksena on kuitenkin, että se on alle 10 μg/L. Näin 
varmistetaan, että biohajoavuus noudattaa ensimmäisen kertaluvun ki ­
netiikkaa. Vähimmäispitoisuus ei saisi olla yli 10 μg/L, mutta suosi ­
tuksena on, että se on 1–2 μg/L tai alle 1 μg/L. Näin pieni pitoisuus 
mahdollistaa normaalisti riittävän analyysin käytettäessä kaupallisesti 
saatavilla olevia
 14 C-leimattuja aineita. Analyysimenetelmien rajoitus ­
ten vuoksi testiaineen pitoisuutta on usein mahdoton mitata vaaditta ­
valla tarkkuudella, jos annosteltu testiaineen pitoisuus ≤ 100 μg/L (ks. 
kohta 1.7.2, toinen kappale). Suurempia testiaineen pitoisuuksia 
(> 100 μg/L ja joskus > 1 mg/L) voidaan käyttää merkittävien muun ­
tumistuotteiden yksilöintiin ja niiden pitoisuuksien määritykseen tai jos käytettävissä ei ole analyysimenetelmää, jonka havaitsemisraja on tar ­
peeksi alhainen. Jos testiainetta testataan suurina pitoisuuksina, tulok ­
sia ei ehkä ole mahdollista käyttää ensimmäisen kertaluvun vakion ja 
puoliintumisajan estimointiin, koska hajoaminen ei todennäköisesti seuraa ensimmäisen kertaluvun kinetiikkaa.
 
Hajoamista seurataan sopivin aikavälein mittaamalla joko jäännös-  
14 C tai testiaineen jäännöspitoisuus (jos käytetään erityistä kemial ­
lista analyysia).  14 C-leima molekyylin stabiileimmassa osassa var ­
mistaa sen, että koko mineralisaatio voidaan määrittää. Jos  14 C-leima 
on vähemmän stabiilissa molekyylin osassa tai jos käytetään erityistä kemiallista analyysia, voidaan arvioida vain primaarinen biohajoami ­
nen. Stabiilein osa ei kuitenkaan välttämättä sisällä molekyylin toi ­
minnan kannalta relevanttia osaa (joka voidaan kytkeä erityiseen ominaisuuteen, kuten toksisuuteen, bioakkumulaatioon jne.). Tällöin voi olla tarkoituksenmukaista käyttää
 14 C-leimattua testiainetta kysei ­
sessä toiminnan kannalta relevantissa osassa, jos on määrä seurata 
erityisen ominaisuuden eliminaatiota.  
1.5 TESTIAINETTA KOSKEVAT TIEDOT  
Sekä radioaktiivisella merkkiaineella leimattuja että leimaamattomia 
testiaineita voidaan käyttää tässä testissä.  14 C on suositeltava leima, 
ja sen pitäisi tavallisesti sijaita molekyylin stabiileimmassa osassa tai 
osissa (ks. myös kohta 1.4). Jos on kyse aineista, joissa on useampi 
kuin yksi aromaattinen rengas, on suositeltavaa, että yksi tai useampi hiili kussakin renkaassa varustetaan
 14 C-leimalla. Lisäksi suositel ­
laan, että helposti hajoavien liitosten kummallakin puolella yksi tai 
useampi hiili varustetaan  14 C-leimalla. Testiaineen kemiallisen ja/tai 
radiokemiallisen puhtauden tulisi olla > 95 %. Kun on kyse radio ­
aktiivisella merkkiaineella merkityistä aineista, suositeltava spesifi ­
nen aktiivisuus on noin 50 μCi/mg (1,85 MBq) tai tämän yli, jotta 
helpotettaisiin  14 C-mittauksia pienillä lähtöpitoisuuksilla tehtävissä 
testeissä. Testiaineesta tulisi olla käytettävissä seuraavat tiedot:  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1331
 
— vesiliukoisuus [testimenetelmä A.6],  
— liukoisuus orgaanisiin liuottimiin (liuottimella käsitellyt aineet tai 
huonosti veteen liukenevat aineet),  
— dissosiaatiovakio (pKa), jos aine protonoituu tai deprotonoituu 
[OECD TG 112] (5),  
— höyrynpaine [testimenetelmä A.4] ja Henryn lain vakio,  
— kemiallinen stabiilius vedessä ja pimeässä (hydrolyysi) [testime ­
netelmä C.7].  
Testattaessa huonosti veteen liukenevia aineita merivedessä voi olla 
hyödyllistä tietää myös ulossuolautumisvakio (Setschenowin vakio) 
K s , joka voidaan määrittää seuraavasta lausekkeesta: log (S/S”) = K  s 
C m , missä S on aineen liukenevuus makeassa vedessä ja S” aineen 
liukenevuus merivedessä ja C  m molaarinen suolapitoisuus.  
Jos testi suoritetaan ”suspendoituneen sedimentin testinä”, myös seu ­
raavien tietojen tulisi olla käytettävissä:  
— n-oktanoli/vesi-jakaantumiskerroin [testimenetelmä A.8],  
— adsorptiokerroin [testimenetelmä C.18].  
Myös seuraavat tiedot voivat olla hyödyllisiä:  
— ympäristöpitoisuus, jos se tiedetään tai on estimoitu,  
— testiaineen toksisuus mikro-organismeille [testimenetelmä C.11],  
— nopea biohajoavuus ( ready biodegradability ) ja/tai aineen luon ­
tainen biohajoavuus ( inherent biodegradability ) [testimenetelmät 
C.4 A–F, C.12, C.9, OECD TG 302 (5)],  
— aerobinen tai anaerobinen biohajoavuus maassa sekä muuntumis ­
tutkimusten tulokset (sedimentti/vesi) [menetelmät C.23, C.24].  
1.6 VERTAILUAINE  
Vertailuaineena tulisi käyttää ainetta, joka on helposti hajoava aero ­
bisissa olosuhteissa (esim. aniliini tai natriumbentsoaatti). Aniliinin ja natriumbentsoaatin odotettu hajoamisaika on yleensä alle 2 viikkoa. Vertailuaineiden tarkoituksena on varmistaa, että testiveden mikro ­
biologinen aktiviteetti on tietyissä rajoissa, ts. että vedessä on aktii ­
vinen mikrobipopulaatio.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1332
 
1.7 LAATUKRITEERIT  
1.7.1  Saanto  
Kukin alkuperäinen testipitoisuus tulisi välittömästi testiaineen lisää ­
misen jälkeen tarkistaa mittaamalla  14 C-aktiviteetti tai (jos on kyse 
testiaineesta, jota ei ole leimattu merkkiaineella) kemiallisella analyy ­
silla vähintään kahdessa näytteessä. Tämä tarjoaa tietoa analyysime ­
netelmän sovellettavuudesta ja toistettavuudesta ja testiaineen jakau ­
man tasaisuudesta. Tavallisesti myöhemmissä tulosten analyyseissä 
käytetään alussa mitattua  14 C-aktiivisuutta tai testiaineen pitoisuutta 
eikä nimellispitoisuutta, koska tällä tavoin voidaan ottaa huomioon sorptiosta ja annosteluvirheistä johtuvat häviöt.
 14 C-leimatun testi ­
aineen osalta saanto testin lopussa ilmoitetaan massataseena (ks. 
kohta 1.8.9.4, viimeinen kappale). Ihannetapauksessa massataseen tulisi radioaktiivisella merkkiaineella leimattuja aineita käytettäessä olla 90–110 %, ja analyyttisen tarkkuuden tulisi olla sellainen, että 
merkitsemättömien testiaineiden alkuperäiseksi saannoksi testin 
alussa saadaan 70–110 %. Näitä vaihteluvälejä tulisi pitää tavoitteina eikä perusteina testin hyväksynnälle. Vaihtoehtoisesti analyyttinen tarkkuus voidaan määrittää testiaineelle alkuperäistä pitoisuutta pie ­
nemmällä pitoisuudella sekä merkittäville muuntumistuotteille.
 
1.7.2  Analyysimenetelmän toistettavuus ja herkkyys  
Analyysimenetelmän toistettavuus (mukaan luettuna alussa tehtävän 
uuton tehokkuus) testiaineen ja tapauksen mukaan muuntumistuottei ­
den kvantifioimiseksi tulisi tarkistaa viidellä rinnakkaisella analyy ­
silla pintaveden yksittäisistä uutteista.  
Analyysimenetelmän havaitsemisrajan (LOD) tulisi testiaineen ja 
muuntumistuotteiden osalta olla mahdollisuuksien mukaan ainakin 1 % testijärjestelmään annostellusta alkuperäisestä määrästä. Mää ­
ritysrajan (LOQ) tulisi olla 10 % annostellusta pitoisuudesta tai 
tätä alempi. Monien orgaanisten aineiden ja niiden muuntumistuot ­
teiden kemialliset analyysit edellyttävät usein, että testiaine annostel ­
laan suhteellisen suurina pitoisuuksina (> 100 μg/L).
 
1.8 TESTIMENETELMÄN KUVAUS  
1.8.1  Laitteet  
Testi voidaan tehdä sopivan suuruisissa (esim. 0,5 tai 1,0 litran) er ­
lenmeyerpulloissa tai sylinteripulloissa, jotka on suljettu silikoni- tai 
kumitulpilla, tai seerumipulloissa, joissa on hiidioksidia läpäisemät ­
tömät kannet (esim. butyylikumikalvo). Toisena vaihtoehtona on suorittaa testi useilla pulloilla ja ottaa niiden joukosta kunakin näyt ­
teenottoajankohtana näytteeksi vähintään kahden pullon sisältö (ks. 
kohta 1.8.9.1, viimeinen kappale). Jos testiaineet ovat haihtumatto ­
mia eikä niitä ole leimattu radioaktiivisella merkkiaineella, kaasutii ­
viitä tulppia tai kansia ei vaadita; väljät puuvillatupot, jotka estävät 
kontaminaation ympäröivästä ilmasta, riittävät (ks. kohta 1.8.9.1, 
toinen kappale). Lievästi haihtuvat aineet tulisi testata biometer-tyyp ­
pisessä järjestelmässä, jossa veden pintaa sekoitetaan kevyesti. Bak ­
teerikontaminaation estämiseksi astiat voidaan vaihtoehtoisesti steri ­
lisoida kuumentamalla tai autoklaavikäsittelyllä ennen käyttöä. Li ­
säksi käytetään seuraavia tavanomaisia laboratoriolaitteita:
 
— ravistin tai magneettisekoittimet testipullojen jatkuvaa sekoitta ­
mista varten,  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1333
 
— sentrifugi,  
— pH-mittari,  
— sameusmittari sameuden nefelometristä määritystä varten,  
— uuni tai mikroaaltouuni kuiva-ainemäärityksiä varten,  
— kalvosuodatin,  
— autoklaavi tai uuni lasiastioiden sterilointia varten,  
— laitteet  14 C-leimattujen aineiden käsittelyyn,  
— laitteet, joilla kvantifioidaan  14 C-aktiivisuus CO  2 :n imeytysliu ­
oksista otetuissa näytteissä ja tarvittaessa sedimenttinäytteissä,  
— analyysilaitteet testiaineen (ja vertailuaineen) määritystä varten, 
jos käytetään erityistä kemiallista analyysia (esim. kaasukroma ­
tografi tai korkean paineen nestekromatografi).  
1.8.2  Testiaineen varastoliuokset  
Testi- ja vertailuaineen varastoliuosten valmistamiseen käytetään 
deionisoitua vettä (ks. kohta 1.8.7, ensimmäinen kappale). Deioni ­
soidussa vedessä ei saa olla aineita, jotka voivat olla toksisia mikro- organismeille, eikä liukoista orgaanista hiiltä (DOC) yli 1 mg/L (6).
 
1.8.3  Pintaveden otto ja kuljetus  
Pintaveden näytteenottopaikka tulisi valita siten, että se vastaa testin 
tarkoitusta. Näytteenottopaikkojen valinnassa on otettava huomioon mahdollinen maanviljelyn, teollisuuden ja kotitalouksien vaikutus. Jos tiedetään, että vesiympäristö on kontaminoitunut testiaineen tai 
sitä rakenteeltaan vastaavien aineiden vaikutuksesta edellisten neljän 
vuoden aikana, sitä ei pitäisi käyttää testiveden ottoon, jollei nimen ­
omaisena tarkoituksena ole tutkia hajoamisnopeuksia jo altistuneissa kohteissa. Veden pH-arvo ja lämpötila tulisi mitata näytteenottopai ­
kassa. Lisäksi tulisi kirjata näytteenottosyvyys ja vesinäytteen ulko ­
näkö (esim. väri ja sameus). Happipitoisuus ja hapetus-pelkistyspo ­
tentiaali (redoxpotentiaali) vedessä ja sedimentin pintakerroksessa mitataan aerobisten ominaisuuksien osoittamiseksi, elleivät ne käy 
selville vesinäytteen ulkonäöstä ja kohteessa aiemmin saaduista ko ­
kemuksista. Pintavesi tulisi kuljettaa täysin puhdistetussa astiassa. Kuljetuksen aikana näytteen lämpötila ei saa merkittävästi ylittää testissä käytettävää lämpötilaa. Viilentäminen 4 °C:seen on suositel ­
tavaa, jos kuljetuksen kesto on yli 2–3 tuntia. Vesinäyte ei saa jää ­
tyä.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1334
 
1.8.4  Pintaveden säilytys ja valmistelu  
Testi on suositeltavaa aloittaa yhden päivän kuluessa näytteenotosta. 
Jos vettä joudutaan säilyttämään, säilytysaika on minimoitava, eikä se saa missään tapauksessa ylittää neljää viikkoa. Vesinäytettä olisi 
pidettävä 4 °C:ssa ilmastettuna sen käyttöön saakka. Karkeat hiuk ­
kaset poistetaan ennen käyttöä esimerkiksi suodattamalla nailonsuo ­
dattimen (aukkokoko noin 100 μm) tai karkean paperisuodattimen 
läpi tai sedimentoimalla.
 
1.8.5  Sellaisen vesinäytteen valmistelu, johon on lisätty sedimenttiä 
(vaihtoehtoinen)  
Suspendoituneen sedimentin testissä pintasedimenttiä lisätään luon ­
nonveden (joka on suodatettu karkeiden hiukkasten poistamiseksi kohdassa 1.8.4 kuvatulla tavalla) sisältäviin pulloihin 
suspension aikaansaamiseksi. Suspendoituneen kiintoaineksen pitoi ­
suuden pitäisi olla 0,01–1 g/L. Pintasedimentin tulisi olla samasta kohteesta, josta vesinäyte otettiin. Kulloisestakin vesiympäristöstä riippuen pintasedimentille voi olla ominaista joko suuri orgaanisen 
hiilen määrä (2,5–7,5 %) ja hienojakoisuus tai matala orgaanisen 
hiilen määrä (0,5–2,5 %) ja karkeajakoisuus (3). Pintasedimentti voidaan valmistaa seuraavasti: sedimentistä otetaan useita kairausnä ­
ytteitä käyttäen läpinäkyvää muoviputkea, ja ylemmät aerobiset ker ­
rokset (pinnasta enintään 5 mm:n syvyyteen) leikataan pois välittö ­
mästi näytteenoton jälkeen ja yhdistetään. Näin saatava sedimentti ­
näyte kuljetetaan säiliössä, jossa on laaja vapaa ilmatila, jotta sedi ­
mentti pysyisi aerobisissa olosuhteissa (näyte on viilennettävä 
4 °C:seen, jos kuljetus kestää yli 2–3 tuntia). Sedimenttinäyte sus ­
pendoidaan testiveteen suhteessa 1:10 ja pidetään 4 °C:ssa ilmastet ­
tuna aina käyttöön saakka. Jos sedimenttiä joudutaan säilyttämään, säilytysaika on minimoitava, eikä se saa missään tapauksessa ylittää 
neljää viikkoa.
 
1.8.6  Puolijatkuva menettely (vaihtoehtoinen)  
Pitkä inkuboimisaika (useita kuukausia) voi olla tarpeen, jos lag- 
vaihe kestää pitkään ennen kuin merkittävää testiaineen hajoamista voidaan mitata. Jos tämä tiedetään jo aikaisempien testien perusteel ­
la, testissä voidaan alusta lähtien käyttää puolijatkuvaa menettelyä, 
jossa osa testivedestä tai suspensiosta korvataan määräajoin uudella vedellä. Vaihtoehtoisesti normaali panoskoe ( batch ) voidaan muuttaa 
testin aikana puolijatkuvaksi testiksi, jos testiaineen hajoamista ei ole 
tapahtunut noin 60 päivän kuluessa panostestimenettelyä käyttäen 
(ks. kohta 1.8.8.3, toinen kappale).
 
1.8.7  Testiaineen (tai vertailuaineen) lisääminen  
Jos aineen vesiliukoisuus on suuri (> 1 mg/L) ja haihtuvuus pieni 
(Henryn lain vakio < 1 Pa·m  3 /mol tai < 10  –5 atm·m  3 /mol), varasto ­
liuos voidaan valmistaa deionisoituun veteen (ks. kohta 1.8.2), minkä 
jälkeen sopiva määrä varastoliuosta lisätään testiastioihin, kunnes 
haluttu pitoisuus on saavutettu. Lisätyn varastoliuoksen määrä tulisi pitää mahdollisimman pienenä (mahdollisuuksien mukaan < 10 % lopullisesta nestevolyymista). Toisena mahdollisuutena on liuottaa 
testiaine suurempana volyyminä testiveteen; tätä voidaan pitää vaih ­
toehtona orgaanisten liuottimien käytölle.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1335
 
Jos muuta mahdollisuutta ei ole, haihtumattomien ja heikosti veteen 
liukenevien aineiden varastoliuokset tulisi valmistaa käyttämällä 
haihtuvaa orgaanista liuotinta, mutta testijärjestelmään lisätyn liuot ­
timen määrä ei saisi ylittää 1 % (v/v) eikä vaikuttaa haitallisesti mikrobiologiseen aktiivisuuteen. Liuotin ei saa vaikuttaa testiaineen 
stabiiliuteen vedessä. Liuotin tulisi poistaa, kunnes sitä on jäljellä 
äärimmäisen pieni määrä, jottei se lisäisi merkittävästi testiveden tai suspension DOC-pitoisuutta. Tämä tulisi tarkistaa ainekohtaisella analyysillä tai DOC-analyysilla, jos se on mahdollista (6). Huoleh ­
dittaessa siitä, että lisätyn liuottimen määrä rajoitetaan välttämättö ­
mään, on samalla varmistettava, että testiainemäärä voi liueta lopul ­
lisessa testiveden määrässä. Myös muita tapoja annostella testiaine testiastioihin voidaan käyttää (ks. (7) ja (8)). Jos testiaineen annos ­
telussa käytetään orgaanista liuotinta, liuotinkontrolleja, jotka sisältä ­
vät pelkästään testivettä (ilman lisättyjä aineita) sekä testivettä, johon on lisätty vertailuaine, on käsiteltävä samalla tavoin kuin aktiivisia testiastioita, joissa on testiaine kantoaineenaan liuotin. Liuotinkont ­
rollien tarkoituksena on tutkia liuottimen mikrobipopulaatiolle mah ­
dollisesti aiheuttamia haitallisia vaikutuksia vertailuaineen hajoami ­
sen perusteella.
 
1.8.8  Testiolosuhteet  
1.8.8.1  Testilämpötila  
Inkubaation tulisi tapahtua pimeässä (suositeltava vaihtoehto) tai hei ­
kossa valossa säädellyssä (± 2 °C) lämpötilassa, joka voi olla ym ­
päristön lämpötila tai 20–25 °C:n vakiolämpötila. Ympäristön läm ­
pötila voi olla joko näytteen oma lämpötila näytteenottoajankohtana 
tai ympäristön keskilämpötila näytteenottopaikassa.  
1.8.8.2  Sekoittaminen  
Testipulloja sekoitetaan ravistelemalla tai hämmentämällä niitä jatku ­
vasti, jotta hiukkaset ja mikro-organismit pysyisivät suspendoitunei ­
na. Sekoittaminen myös auttaa hapen siirtymistä avoimesta ilmati ­
lasta nesteeseen, niin että voidaan ylläpitää riittäviä aerobisia olosuh ­
teita. Testipullot asetetaan ravistimeen (noin 100 rpm), tai niitä se ­
koitetaan magneettisekoittimella. Sekoittamisen on oltava jatkuvaa. 
Ravistelun tai hämmentämisen on kuitenkin oltava mahdollisimman 
varovaista siten, että suspensio juuri ja juuri pysyy homogeenisena.  
1.8.8.3  Testin kesto  
Testi ei saisi tavallisesti kestää yli 60 päivää, jollei käytetä puolijat ­
kuvaa prosessia, jossa testisuspensiota korvataan määrävälein uudella 
(ks. kohta 1.8.6 ja liite 2). Testin kesto panoskokeessa voidaan kui ­
tenkin pidentää enimmillään 90 päivään, jos testiaineen hajoaminen on alkanut ensimmäisten 60 päivän aikana. Hajoamista seurataan sopivin aikavälein määrittämällä
 14 C-jäännösaktiivisuus tai muodos ­
tunut  14 CO 2 (ks. kohta 1.8.9.4) ja/tai kemiallisella analyysilla (kohta 
1.8.9.5). Inkubaatioajan on oltava riittävän pitkä, jotta hajoamispro ­
sessi voidaan arvioida. On suositeltavaa, että hajoamisen laajuus on yli 50 %. Hitaasti hajoavien aineiden osalta hajoamisen laajuuden on 
oltava riittävä (tavallisesti yli 20 %), jotta hajoamiskinetiikan nope ­
usvakio voidaan estimoida.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1336
 
Happipitoisuus ja pH on mitattava testijärjestelmässä määrävälein, 
jolleivät nämä mittaukset ole tarpeettomia samasta kohteesta otetuilla 
vesi- ja sedimenttinäytteillä tehdyistä vastaavista testeistä saadun ko ­
kemuksen perusteella. Vedessä tai sedimentissä paljon suurempina pitoisuuksina olevien ensisijaisten substraattien metabolismi saattaa 
joissain olosuhteissa johtaa CO
 2 :n muodostumiseen ja hapen häviä ­
miseen siinä määrin, että se muuttaa merkittävästi koeolosuhteita testin aikana.
 
1.8.9  Menettely  
1.8.9.1  Testipullojen valmistelu pelagiseen testiin  
Sopiva määrä testivettä siirretään testipulloihin, enintään noin kolma ­
sosa pullon volyymistä ja vähintään noin 100 ml. Jos käytetään 
useita pulloja (joiden joukosta otetaan näytteeksi kokonaisten pullo ­
jen sisältö kunakin näytteenottoajankohtana), sopiva testiveden määrä on niin ikään noin 100 ml, koska pienet näytemäärät voivat vaikuttaa 
lag-vaiheen pituuteen. Testiaine lisätään varastoliuoksesta 
kohdissa 1.8.2 ja 1.8.7 kuvatulla tavalla. Ainakin kahta eri testi ­
aineen pitoisuutta, jotka poikkeavat toisistaan 5–10-kertaisesti, tulisi käyttää hajoamiskinetiikan määrittämiseksi ja sen nopeusvakion las ­
kemiseksi. Kummakin valitun pitoisuuden pitäisi olla alle 100 μg/L 
ja mieluiten välillä < 1–10 μg/L.
 
Testipullot suljetaan ilma- ja CO  2 -tiiviillä tulpilla tai kansilla. Haih ­
tumattomille testikemikaaleille, joita ei ole merkitty  14 C-leimalla, 
soveltuvat väljät vanutupot, jotka estävät kontaminaation ilmasta 
(ks. kohta 1.8.1). Edellytyksenä on kuitenkin, että mahdollisten mer ­
kittävien hajoamistuotteiden tiedetään olevan hajoamattomia ja että käytetään epäsuoraa CO
 2 -pitoisuuden määritystä (ks. liite 3).  
Testipulloja inkuboidaan valitussa lämpötilassa (ks. kohta 1.8.8.1). 
Testin alussa (ennen biohajoamisen alkamista, ks. kohta 1.7.1) ote ­
taan näytteitä kemiallista analyysia tai  14 C-mittauksia varten ja sen 
jälkeen sopivin välein testin aikana. Näytteenotto voidaan suorittaa ottamalla osanäyte (esim. 5 ml) kustakin rinnakkaisesta näytteestä tai 
ottamalla näytteeksi kokonaisia testipulloja kunakin näytteenottoajan ­
kohtana. Testiaineen mineralisaatio voidaan määrittää joko epäsuo ­
rana tai suorana määrityksenä (ks. liite 3). Hajoamisvaiheen aikana (eli lag-vaiheen päätyttyä) tarvitaan tavallisesti vähintään viisi näyt ­
teenottoa, jotta nopeusvakio voidaan estimoida luotettavasti, jollei 
voida perustella, että kolme näytteenottoa riittää nopeasti hajoaville aineille. Jos aine ei ole nopeasti hajoava, hajoamisvaiheen aikana voidaan helposti tehdä lisää mittauksia, jolloin k:n estimointiin käy ­
tetään enemmän datapisteitä. Näytteenottoa varten ei voida vahvistaa 
aikaväliä, koska biohajoamisen nopeus vaihtelee. Suosituksena on kuitenkin, että näyte otetaan kerran viikossa, jos hajoaminen on hi ­
dasta. Jos testiaine on nopeasti hajoava, näytteenoton tulisi tapahtua 
kerran päivässä ensimmäisten kolmen päivän aikana ja sen jälkeen 
joka toinen tai kolmas päivä. Joissain olosuhteissa, esimerkiksi hyvin nopeasti hydrolisoituvien aineiden tapauksessa, voi olla tarpeen ottaa näytteet tunnin välein. Ennen testiä on suositeltavaa tehdä esitutki ­
mus sopivan näytteenottovälin määrittämiseksi. Jos käytettävissä on 
oltava näytteitä myöhempiä erityisiä analyyseja varten, näytteitä ote ­
taan enemmän ja analysoitavat näytteet valitaan kokeen lopussa vas ­
takkaisessa järjestyksessä siten, että viimeiset näytteet analysoidaan 
ensin (näytteiden stabiiliudesta varastoinnin aikana ks. kohta 1.8.9.5, 
toinen kappale).
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1337
 
1.8.9.2  Testipullojen ja näytteiden lukumäärä  
Testipulloja tarvitaan seuraavasti:  
— testipullot: ainakin kaksi testipulloa kutakin testiaineen pitoi ­
suutta varten (suositeltava määrä on vähintään kolme) tai useam ­
pia testipulloja kutakin pitoisuutta kohti, jos kunakin näytteen ­
ottoajankohtana otetaan otetaan näytteeksi kokonaisia pulloja (ly ­
henne F  T ), 
— testipullot massataseen laskemista varten: ainakin kaksi testipul ­
loa kutakin pitoisuutta kohti (lyhenne F  M ), 
— nollanäyte ilman testiainetta: ainakin yksi taustanäytepullo, joka 
sisältää pelkästään testivettä (lyhenne F  B ), 
— vertailukontrolli: kaksi testipulloa, joissa on vertailuaine (esim. 
aniliini tai natriumbentsoaattia 10 μg/l) (lyhenne F  C ). Vertailu ­
kontrollin tarkoituksena on vahvistaa tietyn mikrobiologisen ak ­
tiviteetin olemassaolo. Radioaktiivista vertailuainetta voidaan käyttää, jos se on käytännöllistä, myös siinä tapauksessa, että testiaineen hajoamista seurataan kemiallisella analyysilla,
 
— steriili kontrolli: yksi tai kaksi testipulloa, jotka sisältävät steri ­
loitua testivettä, jotta voidaan tutkia mahdollista abioottista ha ­
joamista tai muuta testiaineen ei-biologista häviämistä (lyhenne F
 S ). Biologinen aktiivisuus voidaan lopettaa testiveden autoklaa ­
vikäsittelyllä (20 min 121 °C:ssa) tai lisäämällä myrkyllistä ai ­
netta (esim. natriumatsidia (NaN  3 ) 10–20 g/l, elohopeakloridia 
(HgCl  2 ) 100 mg/l tai formaliinia 100 mg/l) tai gammasäteilytyk ­
sellä. Käytettäessä HgCl  2 :a siitä tulisi huolehtia myrkyllisenä jät ­
teenä. Steriilien olosuhteiden luominen veteen ei ole helppoa, jos 
se sisältää sedimenttiä suurina määrinä. Tässä tapauksessa suosi ­
tellaan autoklaavikäsittelyn toistamista (esim. suorittamalla se kolmesti). Tällöin tulisi ottaa huomioon, että sedimentin sorp ­
tio-ominaisuudet voivat muuttua autoklaavikäsittelyn vuoksi,
 
— liuotinkontrollit, jotka sisältävät pelkästään testivettä sekä testi ­
vettä, johon on lisätty vertailuaine; kutakin kontrollia kohti kaksi testipulloa, jotka sisältävät saman määrän liuotinta ja joita käsi ­
tellään samalla tavoin kuin testiaineen annostelemisessa. Tarkoi ­
tuksena on tutkia mahdollisia liuoksen haitallisia vaikutuksia 
määrittämällä vertailuaineen hajoaminen.
 
Testiä suunniteltaessa tulisi ottaa huomioon, miten testien määrän 
lisääminen vaikuttaa näytteenottoajankohtien määrään. Tarvittavien testipullojen tarkka määrä riippuu hajoamisen laskentaan käytetystä 
menetelmästä (ks. kohta 1.8.9.1, kolmas kappale; kohta 1.8.9.4 ja 
liite 3).
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1338
 
Kustakin testipullosta tulisi ottaa kaksi osanäytettä (esim. 5 ml) ku ­
nakin näytteenottoajankohtana. Jos käytetään useampia pulloja, joi ­
den joukosta otetaan näytteet kokonaisten pullojen sisältöinä, vähin ­
tään kahden testipullon sisältö tulisi ottaa näytteeksi kunakin näyt ­
teenottoajankohtana (ks. kohta 1.8.9.1, ensimmäinen kappale).  
1.8.9.3  Testipullojen valmistelu suspendoituneen sedimentin testiä varten 
[vaihtoehtoinen]  
Tarvittavat määrät testivettä ja (tarvittaessa) sedimenttiä lisätään tes ­
tipulloihin (ks. kohta 1.8.5). Testipullot valmistellaan suspendoitu ­
neen sedimentin testiä varten samalla tavoin kuin pelagista testiä varten (ks. kohdat 1.8.9.1 ja 1.8.9.2). Suosituksena on käyttää see ­
rumipulloja tai niiden muotoisia testipulloja. Suljetut testipullot ase ­
tetaan ravistimeen vaaka-asentoon.
 14 C-leimalla varustamattomia 
haihtumattomia aineita sisältävät avoimet testipullot asetetaan pysty ­
asentoon. Tässä tapauksessa suositellaan sekoitusta magneettisekoit ­
timella, jossa käytetään lasipinnoitteisia magneettisauvoja. Tarvitta ­
essa testipulloja on ilmastettava aerobisten olosuhteiden ylläpitämi ­
seksi.  
1.8.9.4  Radiokemialliset määritykset  
Muodostunut  14 CO 2 mitataan epäsuorana ja suorana määrityksenä 
(ks. liite 3).  14 CO 2 :n epäsuora määritys tapahtuu määrittämällä tes ­
tissä käytetyn veden tai suspension alkuperäisen  14 C-aktiivisuuden ja 
näytteenottoajankohtana mitatun jäännösaktiivisuuden kokonaismää ­
rän välinen erotus sen jälkeen, kun näyte on happamoitettu pH- 
arvoon 2–3 ja CO  2 poistettu. Koska epäorgaaninen hiili poistetaan, 
mitattu jäännösaktiivisuus on peräisin orgaanisesta materiaalista. Epäsuoraa
 14 CO 2 :n määritystä ei tulisi käyttää, jos tes ­
tiaineen muuntumisen aikana muodostuu merkittäviä haihtuvia 
muuntumistuotteita (ks. liite 3).  14 CO 2 :n muodostuminen tulisi mah ­
dollisuuksien mukaan mitata suorana määrityksenä (ks. liite 3) ku ­
nakin näytteenottoajankohtana vähintään yhdessä testipullossa. Tällä menettelyllä voidaan tarkistaa sekä massatase että biohajoamisproses ­
si, mutta sitä voidaan käyttää vain suljetuilla testipulloilla tehtävissä 
testeissä.
 
Jo muodostunut  14 CO 2 mitataan suorana määrityksenä testin aikana, 
tätä varten tulisi varata enemmän testipulloja testin alussa. Suoraa  
14 CO 2 :n määritystä suositellaan, jos testiaineen muuntumisen aikana 
muodostuu merkittäviä haihtuvia muuntumistuotteita. Lisätestipullot happamoitetaan kunakin näytteenottoajankohtana pH-arvoon 2–3 ja
 
14 CO 2 erotetaan sisäiseen tai ulkoiseen imeyttimeen (ks. liite 3).  
14 C-leimatun testiaineen ja merkittävien muuntumistuotteiden pitoi ­
suudet voidaan vaitoehtoisesti määrittää käyttämällä radiokromatog ­
rafiaa (esim. RAD-TLC-ohutkerroskromatografiaa) tai HPLC:tä ra ­
diokemiallisella detektiolla.  
Vaihtoehtoisesti voidaan määrittää jäljellä olevan radioaktiivisuuden 
faasijakauma (ks. liite 1) ja jäljellä oleva testiaine ja muuntumistu ­
otteet.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1339
 
Testin lopussa massatase tulisi määrittää suoralla  14 CO 2 :n mittauk ­
sella käyttäen erillisiä testipulloja, joista ei ole otettu näytteitä testin 
aikana (ks. liite 3).  
1.8.9.5  Erityinen kemiallinen analyysi  
Jos käytettävissä on herkkä erityinen analyysimenetelmä, primaa ­
rinen biohajoaminen voidaan arvioida mittaamalla testiaineen koko ­
naisjäännöspitoisuus sen sijaan, että käytettäisiin radioaktiivisia merkkiaineita. Käytettäessä radioaktiivisella merkkiaineella leimattua testiainetta (kokonaismineralisaation mittaamiseksi) erityisiä kemial ­
lisia analyyseja voidaan tehdä samanaikaisesti, sillä niiden avulla 
voidaan saada hyödyllisiä lisätietoja ja arvioida menettelyä. Erityistä kemiallista analyysia voidaan myös käyttää testiaineen hajoamisen aikana syntyneiden muuntumistuotteiden mittaamiseksi, ja tätä suo ­
sitellaan aineille, joiden mineraalisaatio tapahtuu yli 60 päivän puo ­
liintumisajoin. Testiaineen pitoisuus ja muuntumistuotteet kunakin näytteenottoajankohtana tulisi mitata ja kirjata testiselosteeseen (pi ­
toisuutena ja prosenttiosuutena). Yleisesti muuntumistuotteet, joiden 
prosenttiosuuden todetaan olevan ≥ 10 % annostellusta pitoisuudesta 
minä tahansa näytteenottoajankohtana, olisi yksilöitävä, ellei ole pe ­
rusteltua jättää tätä tekemättä. Lisäksi on harkittava sellaisten muun ­
tumistuotteiden yksilöimistä, joiden pitoisuudet kasvavat jatkuvasti 
testin aikana, vaikka niiden pitoisuudet eivät ylittäisi edellä mainittua rajaa, sillä pitoisuuden jatkuva kasvu voi olla merkkinä pysyvyydes ­
tä. Muuntumistuotteiden analyysia steriileissä kontrolleissa olisi har ­
kittava, jos testiaineen nopean abioottisen muuntumisen (esim. hyd ­
rolyysin) katsotaan olevan mahdollista. Muuntumistuotteiden kvanti ­
fioinnin ja yksilöinnin tarvetta tulisi harkita tapauskohtaisesti, ja se tulisi perustella testiselosteessa. Uuttomenetelmiä, joissa käytetään 
orgaanista liuotinta, tulisi soveltaa kyseistä analyysimenetelmää var ­
ten annettuja ohjeita noudattaen.
 
Kaikki näytteet varastoidaan ilmatiiviisti 2–4 °C:n lämpötilassa, jos 
analyysi tehdään 24 tunnin sisällä (suositeltava vaihtoehto). Tätä pitempää säilytystä varten näytteet olisi jäädytettävä alle –18 °C:seen tai säilöttävä kemiallisesti. Happamoittaminen ei ole 
suositeltava keino näytteiden säilömiseksi, koska happamoitetut näyt ­
teet voivat olla epästabiileja. Jos näytteitä ei analysoida 24 tunnin kuluessa ja niitä säilytetään pitempään, olisi tehtävä tutkimus niiden stabiiliudesta varastoinnin aikana, jotta voidaan osoittaa kyseisten 
kemikaalien stabiilius alle –18 °C:n lämpötilassa tai säilöntäoloissa. 
Jos analyysimenetelmä edellyttää joko liuotinuuttoa tai kiinteäfaasi ­
uuttoa (SPE), uutto tulisi tehdä välittömästi näytteenoton jälkeen tai enintään 24 tunnin kylmävarastoinnin jälkeen.
 
Analyysimenetelmän herkkyydestä riippuen voidaan tarvita suurem ­
pia näytemääriä kuin 1.8.1 kohdassa mainitaan. Testi voidaan hel ­
posti suorittaa yhden litran testivolyymeilla 2–3 litran testipulloissa, 
jolloin voidaan ottaa noin 100 ml:n suuruisia näytteitä.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1340
 
2. TULOKSET JA TESTISELOSTE  
2.1 TULOSTEN KÄSITTELY  
2.1.1  Tulosten graafinen esitys  
Näytteenottoajat pyöristetään tuntien kokonaisluvuksi (jollei aine ha ­
joa merkittävästi minuuteissa tai muutamassa tunnissa), mutta ei päi ­
vien kokonaisluvuksi. Testiaineen jäännösaktiivisuuden (  14 C-leimat­
tujen aineiden osalta) tai jäännöspitoisuuden (leimaamattomien ainei ­
den osalta) estimaatit esitetään graafisesti ajan funktiona sekä lineaa ­
risena että puolilogaritmisena käyränä (ks. kuvat 1a ja 1b). Jos ha ­
joamista on tapahtunut, testipulloista F  T saatuja tuloksia verrataan 
testipulloista F  S saatuihin tuloksiin. Jos testiaineen sisältävistä testi ­
pulloista (F  T ) ja steriileistä testipulloista (F  S ) saatujen tulosten keski ­
arvot poikkeavat alle 10 %, voidaan olettaa, että todettu hajoaminen on pääasiassa abioottista. Jos hajoaminen testipulloissa F
 S on vähäi­
sempää, tuloksia voidaan käyttää testipulloilla F  T saatujen tulosten 
korjaamiseen (vähennys) biohajoamisen laajuuden estimoimiseksi. 
Jos merkittävistä muuntumistuotteista tehdään (vaihtoehtoisia) lisäa ­
nalyyseja, niiden muodostumista ja hajoamista koskevat käyrät tulisi esittää testiaineen hajoamiskäyrän lisäksi.
 
Lag-vaiheen kesto t  L estimoidaan hajoamiskäyrästä (puolilogaritmi ­
sesta käyrästä) ekstrapoloimalla sen lineaarinen osa tasolle, jolla ha ­
joaminen on nolla, tai vaihtoehtoisesti määrittämällä aika noin 
10 prosentin hajoamiselle (ks. kuvat 1a ja 1b). Puolilogaritmisesta 
käyrästä estimoidaan ensimmäisen kertaluvun nopeusvakio k ja sen keskivirhe lineaarisella regressiolla kuvaajasta ln (
 14 C-jäännösaktii ­
visuus tai testiaineen pitoisuus) vs. aika. Erityisesti  14 C-mittausten 
osalta käytetään ainoastaan käyrän ensimmäiseen lineaariseen osaan 
liittyviä tuloksia, ja tällöin mieluummin pientä määrää tarkkoja tu ­
loksia kuin suurempaa määrää epätarkempia tuloksia. Epätarkkuu ­
della tarkoitetaan tässä muun muassa suositeltuun  14 C-jäännösaktii ­
visuuden suoraan määritykseen liittyviä ominaisvirheitä (ks. jäljem ­
pänä). Joskus voi olla tarkoituksenmukaista laskea kaksi eri nopeus ­
vakiota, jos hajoaminen tapahtuu kahdessa vaiheessa. Tätä varten määritellään kaksi eri vaihetta hajoamiskäyrässä. Nopeusvakio (k) 
ja puoliintumisaika (t
 ½ = ln2/k) tulisi laskea kullekin rinnakkaiselle 
näytteelle siinä tapauksessa, että niistä otetaan osanäytteitä; keski ­
arvoja voidaan käyttää siinä tapauksessa, että näytteeksi otetaan ko ­
konaisia testipulloja kunakin näytteenottoajankohtana (ks. kohta 
1.8.9.2, viimeinen kappale). Käytettäessä ensin mainittua menettelyä 
nopeusvakio ja puoliintumisaika olisi ilmoitettava kullekin yksittäi ­
selle rinnakkaiselle näytteelle sekä lisäksi keskiarvona keskivirhei ­
neen. Jos testiainetta on käytetty suurina pitoisuuksina, hajoamis ­
käyrä voi poiketa merkittävästi suorasta viivasta (puolilogaritminen 
kuvio) ja reaktio ei ehkä edusta ensimmäisen kertaluvun kinetiikkaa. Puoliintumisajan määrittäminen ei tällöin ole mielekästä. Rajoitettuun tulosjoukkoon voidaan kuitenkin soveltaa pseudo-ensimmäisen ker ­
taluvun kinetiikkaa ja estimoida hajoamisen puoliintumisaika DT
 50 
(aika, jossa saavutetaan 50 % hajoamisesta). On kuitenkin muistet ­
tava, että valitun tulosjoukon ulkopuolella hajoamisaikaa ei voida ennustaa käyttäen DT
 50 :a, joka on vain tietyn tulosjoukon kuvaaja. 
Tilastolaskelmia ja käyrän sovitusta helpottavia analyysivälineitä on 
helposti saatavilla, ja tällaisten ohjelmistojen käyttö on suositeltavaa.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1341
 
Jos käytetään erityistä kemiallista analyysia, primaarisen hajoamisen 
nopeusvakiot ja puoliintumisajat estimoidaan edellä kuvatulla tavalla 
kokonaismineralisaatiolle. Jos primaarinen hajoaminen rajoittaa reak ­
tion nopeutta, voidaan käyttää datapisteitä koko hajoamisajalta. (  14 C- 
aktiivisuuden mittauksista poiketen kyseiset mittaukset tehdään suo ­
rina määrityksinä.)  
Jos käytetään  14 C-leimattuja aineita, massatase tulisi ilmaista prosent ­
tiosuutena annostellusta alkuperäisestä pitoisuudesta ainakin testin 
lopussa.  
2.1.2  Jäännösaktiivisuus  
Kun orgaanisen aineen  14 C-leimattu osa biohajoaa, suurin osa  14 C:stä 
muuttuu  14 CO 2 :ksi ja osa käytetään biomassan kasvuun ja/tai solu ­
nulkoisten metaboliittien synteesiin. Aineen täydestä eli ”lopullises ­
ta” biohajoamisesta ei sen vuoksi ole tuloksena, että sen sisältämä 
hiili muuttuu 100-prosenttisesti  14 CO 2 :ksi. Biosynteesin kautta muo ­
dostuneisissa tuotteissa oleva  14 C vapautuu myöhemmin hitaasti  
14 CO 2 :na ”sekundaarisen mineralisaation” vuoksi. Näistä syistä or ­
gaanisen  14 C-jäännösaktiivisuuden (joka on mitattu CO  2 :n poiston 
jälkeen) tai muodostuneen  14 CO 2 :n käyrät ajan funktiona ulottuvat 
hajoamisen päättymisajankohdan yli (” tailing ”). Tämä monimutkais ­
taa tulosten kineettistä tulkintaa, minkä vuoksi vain käyrän ensim ­
mäistä osaa (joka alkaa lag-vaiheen päättymisestä ja päättyy ennen 
50 prosentin hajoamisen saavuttamista) tulisi normaalisti käyttää ha ­
joamisen nopeusvakion estimoinnissa. Jos testiainetta on hajonnut, orgaanisen
 14 C:n jäännösaktiivisuus on aina suurempi kuin jäljellä 
olevan vielä hajoamattoman testiaineen  14 C-aktiivisuus. Jos testi ­
aineen hajoamisreaktio on ensimmäistä kertalukua ja konstantti frak ­
tio α mineralisoituu CO  2 :ksi,  14 C:n häviämiskäyrän (orgaanisen  
14 C:n kokonaismäärä vs. aika) alkukaltevuus on α kertaa testiaineen 
(tai tarkemmin sanoen testiaineen  14 C-leimalla merkityn osan) pitoi ­
suutta kuvaavan vastaavan käyrän kaltevuus. Orgaanisen  14 C:n ko­
konaisaktiivisuuden korjaamattomien mittausten perusteella lasket ­
tuun hajoamisen nopeusvakioon liittyy virhemarginaali. Kirjallisuu ­
dessa kuvataan menetelmiä estimoida testiaineen pitoisuudet mita ­
tuista radiokemiallisista aktiivisuuksista erilaisten yksinkertaistusole ­
tusten perusteella (2)(9)(10)(11). Näitä menetelmiä voidaan parhaiten soveltaa nopeasti hajoaviin aineisiin.
 
2.2 TULOSTEN TULKINTA  
Jos todetaan, että k ei riipu pitoisuuden lisäämisestä (toisin sanoen 
jos laskettu k:n arvo on suunnilleen sama testiaineen eri pitoisuuk ­
silla), ensimmäisen kertaluvun nopeusvakion voidaan olettaa edusta ­
van käytettyjä testiolosuhteita (testiaine, vesinäyte ja testilämpötila). 
Se, missä määrin tulokset voidaan yleistää tai ekstrapoloida muita järjestelmiä koskeviksi, on määritettävä asiantuntija-arviona. Jos tes ­
tiainetta käytetään suurena pitoisuutena ja hajoaminen ei siksi nou ­
data ensimmäisen kertaluvun kinetiikkaa, tuloksia ei voida käyttää 
ensimmäisen kertaluvun nopeusvakion tai vastaavan puoliintumisajan suoraan estimointiin. Tällaisesta testistä, jossa testiainetta käytetään suurena pitoisuutena, saatuja tuloksia voidaan ehkä silti kuitenkin 
käyttää mineralisaation kokonaisasteen estimointiin ja/tai muuntumis ­
tuotteiden havaitsemiseen ja kvantifiointiin.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1342
 
Jos muiden häviämisprosessien kuin biohajoamisen (esim. hydrolyy ­
sin tai haihtumisen) nopeudet tunnetaan, ne voidaan vähentää testin 
aikana todetusta nettohäviämisnopeudesta, jolloin saadaan summittai ­
nen estimaatti biohajoamisnopeudelle. Hydrolyysiä koskeva data voi ­
daan saada esimerkiksi steriilistä kontrollista tai rinnakkaisesta tes ­
tistä, jossa käytetään suurempaa testiaineen pitoisuutta.  
14 CO 2 :n epäsuoraa ja suoraa määritystä (ks. kohta 1.8.9.4 ja liite 3) 
voidaan käyttää vain mitattaessa sitä, missä määrin testiaine minera ­
lisoituu CO  2 :ksi. Radiokromatografiaa (RAD-TLC) tai HPLC:tä voi ­
daan käyttää analysoitaessa  14 C-leimatun testiaineen pitoisuuksia ja 
merkittävien muuntumistuotteiden muodostumista (ks. kohta 1.8.9.4, 
kolmas kappale). Puoliintumisajan suoran estimoinnin ehtona on, 
ettei merkittäviä muuntumistuotteita ole (muuntumistuote on merkit ­
tävä, jos se on ≥ 10 % testiaineen annostellusta määrästä). Jos mer ­
kittäviä muuntumistuotteita on, on tehtävä yksityiskohtainen arviointi 
tuloksista. Tähän voi sisältyä muuntumistuotteiden uusi testaaminen 
ja/tai yksilöinti (ks. kohta 1.8.9.5, ensimmäinen kappale), jollei muuntumistuotteiden muodostumista voida kohtuudella arvioida ko ­
kemuksen perusteella (esim. tiedot hajoamisreitistä). Koska se, missä 
määrin testiaineessa oleva hiili muuttuu CO
 2 :ksi, vaihtelee (riippuen 
paljolti testiaineen ja mahdollisten muiden substraattien pitoisuudes ­
ta, testiolosuhteista ja mikrobiyhteisöstä), tämän testin perusteella ei voida tehdä suoraa estimointia lopullisesta biohajoamisesta kuten 
DOC Die-Away -testissä, vaan testissä saatava tulos vastaa respiro ­
metrisessä testissä saatavaa tulosta. Mineralisaatioaste on näin ollen pienempi tai yhtä suuri kuin lopullisen biohajoamisen vähimmäista ­
so. Jotta lopullisesta biohajoamisesta saataisiin täydellisempi käsitys 
(mineralisaatio ja sitoutuminen biomassaan),
 14 C:n faasijakauman 
analyysi tulisi tehdä testin lopussa (ks. liite 1). Hiukkasissa oleva  
14 C koostuu bakteeribiomassaan sitoutuneesta  14 C:sta ja orgaanisiin 
partikkeleihin kiinnittyneestä  14 C:sta.  
2.3 TESTIN VALIDITEETTI  
Jos vertailuaine ei hajoa ennakoidussa ajassa (aniliinin ja natrium ­
bentsoaatin odotettu hajoamisaika on yleensä alle 2 viikkoa), testin validiteettia on epäiltävä ja se on tarkistettava. Vaihtoehtoisesti testi 
toistetaan uudella vesinäytteellä. Menetelmän ISO-yhteistutkimuk ­
sessa ( ring test ), johon osallistui seitsemän laboratoriota eri puolilla 
Eurooppaa, ”adaptoituneet” hajoamisen nopeusvakiot aniliinille vaih ­
telivat välillä 0,3–1,7 päivä
 –1 . Keskiarvo oli 0,8 päivä  –1 20 o C:ssa 
keskivirheellä ± 0,4 päivä  –1 (t ½ = 0,9 päivää). Lag-vaiheet keskivät 
tyypillisesti 1–7 päivää. Tutkituissa testivesissä kirjattiin olevan bak ­
teeribiomassa, joka vastaa 10  3 –10  4 pesäkkeitä muodostavaa yksikköä 
(CFU) ml:ssa. Hajoamisnopeudet runsasravinteisissa keskieurooppa ­
laisissa vesissä olivat suurempia kuin pohjoisissa oligotrofisissa ve ­
sissä, mikä voi johtua eroista ravinteisuudessa tai aiemmasta altistuk ­
sessa kemiallisille aineille.  
Kokonaissaannon (massataseen) tulisi testin lopussa olla 90–110 % 
radioaktiivisella leimalla merkittyjen aineiden osalta, ja alkuperäisen saannon testin alussa tulisi olla 70–110 % leimaamattomien aineiden 
osalta. Näitä vaihteluvälejä tulisi kuitenkin pitää pelkästään tavoit ­
teina eikä perusteina testin hyväksymiselle.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1343
 
3. TESTISELOSTE  
Testin tyyppi (onko kyseessä pelaginen vai suspendoituneen sedi ­
mentin testi) on ilmoitettava selvästi testiselosteessa, jossa on lisäksi oltava ainakin seuraavat tiedot:
 
Testiaine ja vertailuaine(et):  
— testi- ja vertailuaineen yleisnimet, kemialliset nimet (mieluiten 
IUPAC ja/tai CAS-nimet), CAS-numerot, rakennekaavat (radio ­
aktiivista merkkiainetta käytettäessä maininta siitä, missä mole ­
kyylin osassa  14 C on) ja relevantit fysikaalis-kemialliset ominai ­
suudet (ks. kohdat 1.5 ja 1.6),  
— muuntumistuotteiden yksilöinnissä ja niiden pitoisuuksien mää ­
rittämisessä standardeina käytettävien aineiden kemialliset nimet, CAS-numerot, rakennekaavat (radioaktiivista merkkiainetta käy ­
tettäessä maininta siitä, missä molekyylin osassa
 14 C on) ja rele ­
vantit fysikaalis-kemialliset ominaisuudet,  
— testi-vertailuaineen puhtaus (epäpuhtaudet),  
— merkkiaineella leimatun kemikaalin radiokemiallinen puhtaus ja 
spesifinen aktiivisuus (tapauksen mukaan).  
Pintavesi:  
Vesinäytteestä on ilmoitettava seuraavat vähimmäistiedot:  
— näytteenottopaikan sijainti ja kuvaus, mukaan luettuina taustatie ­
dot saastumisesta, jos ne ovat saatavissa,  
— näytteenottopäivä ja -ajankohta,  
— ravinteet (kokonais-N, ammonium, nitriitti, nitraatti, kokonais-P, 
liuennut ortofosfaatti),  
— näytteenottosyvyys,  
— näytteen ulkonäkö (esim. väri ja sameus),  
— DOC ja TOC,  
— biokemiallinen hapentarve (BOD),  
— lämpötila ja pH näytteenottopaikassa näytteenottoajankohtana,  
— happipitoisuus ja hapetus-pelkistyspotentiaali (redoxpotentiaali) 
(vain siinä tapauksessa, että aerobiset olosuhteet eivät ole ilmei ­
set), 
— suolapitoisuus tai johtavuus (meri- ja murtoveden tapauksessa),  
— suspendoitunut kiintoaines (jos näyte on samea),  
— mahdolliset muut relevantit tiedot näytteenottopaikasta näytteen ­
ottoajankohtana (esim. tiedot jokien tai merivirtojen nykyisistä tai 
aiemmista virtausnopeuksista, merkittävistä päästöistä paikan lä ­
heisyydessä ja päästöjen tyypistä, näytteenottoajankohtaa edeltä ­
neet sääolot),  
ja vaihtoehtoisesti:  
— mikrobibiomassa (esim. AODC (suoralaskenta akridiiniorans ­
sivärjäyksen jälkeen) tai pesäkkeitä muodostavat yksiköt),  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1344
 
— epäorgaaninen hiili,  
— klorofylli a:n pitoisuus spesifisenä leväbiomassan arviona.  
Jos tehdään suspendoituneen sedimentin testi, tulisi lisäksi antaa 
seuraavat tiedot sedimentistä:  
— sedimentin keräyssyvyys,  
— sedimentin ulkonäkö (värillinen, sakkainen, lietteinen 
tai hiekkainen),  
— koostumus (esim. prosentteina karkeaa hiekkaa, hienoa hiekkaa, 
lietettä ja savea),  
— suspendoituneen kiintoaineksen kuivapaino g/l, orgaanisen hiilen 
kokonaispitoisuus tai WLOI (painonmenetys kuumennuksen jäl ­
keen) orgaanisen ainesisällön mittana,  
— pH,  
— happipitoisuus ja hapetus-pelkistyspotentiaali (redoxpotentiaali) 
(vain siinä tapauksessa, että aerobiset olosuhteet eivät ole ilmei ­
set). 
Testiolosuhteet:  
— keräyksen ja laboratoriotestissä käytön välinen aika, näytteen va ­
rastointi ja esikäsittely, kokeiden tekopäivät,  
— annosteltu testiaineen määrä, testipitoisuus ja vertailuaine,  
— testiaineen annostelumenetelmä, mukaan luettuna mahdollinen 
liuottimien käyttö,  
— käytetty pintaveden ja sedimentin (jos sitä käytetään) volyymi ja 
kullakin aikavälillä näytteeksi otettu volyymi,  
— kuvaus käytetystä testijärjestelmästä.  
Jos testiä ei ole tarkoitus tehdä pimeässä, tiedot ”heikon valon” 
olosuhteista;  
— tiedot steriilien kontrollien valmistukseen käytettävästä menetel ­
mästä tai menetelmistä (esim. lämpötila, autoklaavikäsittelyjen 
ajankohta ja lukumäärä),  
— inkubointilämpötila,  
— tiedot analyysitekniikoista ja menetelmästä tai menetelmistä, joita 
käytetään radiokemiallisiin mittauksiin sekä massataseen tarkista ­
miseen ja faasijakauman mittauksiin (jos ne tehdään),  
— rinnakkaisnäytteiden määrä.  
Tulokset:  
— saantoprosentit (ks. kohta 1.7.1),  
— käytettyjen analyysimenetelmien toistettavuus ja herkkyys, mu ­
kaan luettuina havaitsemisraja (LOD) ja määritysraja (LOQ) 
(ks. kohta 1.7.2),  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1345
 
— kaikki mitatut tiedot (mukaan luettuina näytteenottoajankohdat) 
ja lasketut arvot taulukkomuodossa sekä hajoamiskäyrät; kunkin 
testipitoisuuden ja kunkin rinnakkaisen testipullon osalta ilmoite ­
taan lineaarinen korrelaatiokerroin logaritmisen käyrän kaltevuu ­
delle, arvioitu lag-vaihe ja ensimmäisen kertaluvun tai pseudo- 
ensimmäisen kertaluvun nopeuskerroin (jos mahdollista) sekä 
vastaava hajoamisen puoliintumisaika (t  50 ), 
— relevantit arvot ilmoitetaan yksittäisissä rinnakkaisnäytteissä saa ­
tujen tulosten keskiarvoina (esim. lag-vaiheen pituus, hajoamisen 
nopeusvakio ja hajoamisen puoliintumisaika (t  50 )), 
— järjestelmä luokitellaan joko ei-adaptoituneeksi tai adaptoitu ­
neeksi päätellen hajoamiskäyrän ulkonäöstä ja mahdollisesta tes ­
tipitoisuuden vaikutuksesta,  
— lopullisen massatasetarkistuksen tulokset ja faasijakaumamittaus ­
ten tulokset (jos ne on tehty),  
— mineralisoitunut  14 C-fraktio ja (käytettäessä erityisiä analyyseja) 
primaarisen hajoamisen lopullinen taso,  
— merkittävien muuntumistuotteiden yksilöinti, molaarinen pitoi ­
suus ja prosenttiosuus (ks. kohta 1.8.9.5, ensimmäinen kappale) 
(tapauksen mukaan),  
— oletettu muuntumisreitti (tapauksen mukaan),  
— tulosten pohdinta.  
4. KIRJALLISUUS  
1. OECD TG 309 (2004) Aerobic Mineralisation in surface water – 
Simulation Biodegradation Test.  
2. ISO/DIS 14592-1 (1999) Water quality – Evaluation of the ae ­
robic biodegradability of organic compounds at low concentra ­
tions – Part 1: Shake flask batch test with surface water or 
surface water/sediment suspensions.  
3. Testing Method C.24. Aerobic and anaerobic transformation in 
aquatic sediments.  
4. Testing Method C.23. Aerobic and anaerobic transformation in 
soil. 
5. OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, 
Paris.  
6. ISO 8245 (1999). Water quality – Guidelines on the determina ­
tion of total organic carbon (TOC) and dissolved organic carbon 
(DOC).  
7. ISO 10634 (1995). Water quality – Guidance for the preparation 
and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the 
subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous 
medium.  
8. OECD draft (2000). Guidance Document on aquatic toxicity 
testing of difficult substances and mixtures. Environmental He ­
alth and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. 
No 22.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1346
 
9. Simkins, S. and Alexander, M. (1984). Models for mineraliza ­
tion kinetics with the variables of substrate concentration and 
population density. Appl. Environ. Microbiol.47, 394–401.  
10. Ingerslev, F. and N. Nyholm. (2000). Shake-flask test for deter ­
mination of biodegradation rates of  14 C-labeled chemicals at low 
concentrations in surface water systems. Ecotoxicol. Environ. 
Saf. 45, 274–283.  
11. ISO/CD 14592–1 (1999). Ring test report: Water Quality – 
Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations part 1 – report of 1998/1999 ring-test. Shake flask batch test with surface water or surface water/ ­
sediment suspensions.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1347
 
Liite 1  
14 C:n faasijakauma  
Testimenettelyn tarkistamiseksi orgaanisen  14 C:n kokonaisaktiivisuuden (TOA) 
normaalimittausten lisäksi tulisi tehdä massataseen mittauksia tekemällä muodos ­
tuneen  14 CO 2 :n suora määritys sen jälkeen, kun se on erotettu imeyttimeen (ks. 
liite 3). Positiivinen  14 CO 2 :n muodostuminen on itsessään suora osoitus siitä, että 
kyseessä on biohajoaminen eikä abioottinen hajoaminen tai muu häviämisproses ­
si, kuten haihtuminen tai sorptio. Hyödyllisiä lisätietoja, jotka tarkentavat bioha ­
joamisen luonnetta, voidaan saada mittauksista, jotka koskevat TOA:n jakautu ­
mista liukoiseen hiileen (liukoisen orgaanisen  14 C:n aktiivisuus, DOA) ja partik ­
kelimuodossa olevaan hiileen (partikkelimuodossa olevan orgaanisen  14 C:n aktii­
visuus, POA) sen jälkeen, kun partikkelimuodossa oleva hiili on erotettu kalvo ­
suodatuksella tai sentrifugoimalla. POA muodostuu mikrobibiomassaan ja muihin 
partikkeleihin kiinnittyneestä testiaineesta sekä siitä testiaineessa olevasta hiilestä, 
joka on käytetty uuden solumateriaalin synteesiin ja joka näin ollen sisältyy biomassan hiukkasfraktioon. Liukoisen orgaanisen
 14 C:n muodostuminen voidaan 
arvioida määrittämällä DOA biohajoamisen lopussa (biohajoamista ajan funktiona 
kuvaavan käyrän tasanne).  
Jäännös-  14 C:n faasijakauma estimoidaan valituissa näytteissä suodattamalla näyt ­
teitä kalvosuodattimella, jonka huokoskoko on 0,22–0,45 μm ja jonka materiaali 
ei adsorboi merkittäviä määriä testiainetta (polykarbonaattisuodattimet voivat olla sopivia). Jos testiaineen sorptio suodattimeen on liian suurta, jotta sen voisi jättää 
huomiotta (tarkistettava ennen koetta), nopeaa sentrifugointia (2 000 g; 10 min) 
voidaan käyttää suodatuksen sijaan.
 
Suodosta tai sentrifugaattia käsitellään siten, kuin kuvataan liitteessä 3 suodatta ­
mattomien näytteiden osalta. Kalvosuodattimet liuotetaan sopivaan tuikenestee ­
seen, minkä jälkeen laskenta tapahtuu tavalliseen tapaan, yleensä käyttäen pel ­
kästään ulkoisen standardin menetelmää vaimennuksen korjaamiseen tai käyttä ­
mällä hapetinta. Jos on käytetty sentrifugointia, hiukkasfraktiosta muodostettu pelletti suspendoidaan uudelleen 1–2 ml:aan tislattua vettä ja pannaan tuikelas ­
kentapulloon. Tämän jälkeen tehdään kaksi huuhtelua käyttäen 1 ml tislattua 
vettä, ja huuhteluvesi lisätään pulloon. Tarvittaessa suspensio voidaan yhdistää geeliin nestetuikelaskennan suorittamiseksi.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1348
 
Liite 2  
Puolijatkuva prosessi  
Inkubointia voidaan joutua jatkamaan pitkään, jopa useita kuukausia, jotta hei ­
kosti hajoavat aineet hajoaisivat riittävästi. Testin kesto ei tavallisesti saisi ylittää 60:tä päivää, jollei alkuperäisen vesinäytteen ominaisuuksia pidetä yllä uudista ­
malla testisuspensiota. Testin kesto voidaan kuitenkin pidentään enimmillään 90 
päivään ilman, että testisuspensiota tarvitsee uudistaa, jos testiaineen hajoaminen on alkanut ensimmäisten 60 päivän aikana.
 
Inkuboinnin kestäessä pitkään mikrobiyhteisön diversiteetti voi vähentyä eri hä ­
viämisprosessien vuoksi ja siksi, että olennaisia ravinteita ja primaarisia hii ­
lisubstraatteja saattaa hävitä vesinäytteestä. Siksi suositellaan käytettäväksi puo ­
lijatkuvaa testiä, jolla hitaasti hajoavien aineiden hajoamisnopeus voidaan mää ­
rittää riittävästi. Puolijatkuvaa prosessia tulisi käyttää testin alusta alkaen, jos aiemman kokemuksen perusteella odotetaan tarvittavan kolmen kuukauden inku ­
bointiaika, jotta testiaine hajoaisi 20 prosenttia. Vaihtoehtoisesti normaali panos ­
testi ( batch ) voidaan muuttaa testin aikana puolijatkuvaksi testiksi, jos testiaineen 
hajoamista ei ole tapahtunut noin 60 päivän kuluessa panostestimenettelyä käyt ­
täen. Puolijatkuva menettely voidaan lopettaa ja testiä jatkaa panostestinä, kun 
hajoamista on tapahtunut merkittävästi (esim. > 20 %).
 
Puolijatkuvassa testissä noin kolmasosa testisuspension määrästä korvataan kah ­
den viikon välein vasta otetulla uudella vedellä, johon on lisätty testiaine alku ­
peräisessä pitoisuudessa. Samoin sedimentti lisätään uuteen veteen alkuperäisessä 
pitoisuudessa (0,01–1 g/l), jos tehdään (vaihtoehtoinen) suspendoituneen sedi ­
mentin testi. Tehtäessä testiä suspendoituneella kiinteällä sedimentillä on tärkeää, että järjestelmä pidetään täysin suspendoituneena myös korvattaessa vettä uudella ja että kiintoaineksen ja veden oloaika järjestelmässä on sama, koska muuten 
järjestelmä ei ehkä halutulla tavalla vastaa homogeenista vesijärjestelmää, jossa 
ei ole faaseja. Näistä syistä suspendoituneen sedimentin alkuperäisen pitoisuuden tulisi puolijatkuvaa menettelyä käytettäessä mieluiten olla annetun vaihteluvälin alapäässä.
 
Testiohjeen mukainen testiaineen lisääminen edellyttää, että testiaineen alkupe ­
räistä pitoisuutta ei ylitetä testisuspension osittaisen uudistamisen yhteydessä ja 
että näin vältetään adaptaatio, joka usein tapahtuu, kun testiaine on suurina pitoisuuksina. Koska prosessiin kuuluu sekä uudelleensiirrostus että poistuneiden ravinteiden ja primaaristen substraattien korvaaminen, alkuperäinen mikrobidiver ­
siteetti palautuu ennalleen ja testin kestoa voidaan jatkaa periaatteessa loputto ­
miin. Puolijatkuvaa menettelyä käytettäessä on tärkeää huomata, että testiaineen jäännöspitoisuus on korjattava kunkin uudistamisen yhteydessä lisättyihin ja pois ­
tettuihin testiainemääriin nähden. Testiaineen kokonaispitoisuuden ja liukoisen 
pitoisuuden voidaan katsoa olevan samoja sellaisten yhdisteiden tapauksessa, 
joiden osalta sorptio on vähäinen. Sorptio on testiohjeen mukaisissa olosuhteissa (0,1–1 g kiintoainesta/l) merkityksetön (< 5 %) aineille, joiden log K
 ow < 3 
(koskee neutraaleja, lipofiilisiä yhdisteitä). Tämä käy ilmi seuraavasta esimerkis ­
tä: 0,1 g/l kiintoainesta vastaa karkeasti 10 mg:aa hiiltä litraa kohti (hiilifraktio 
f C = 0,01). Olkoon  
(testiaineen) log K  ow = 3 
K oc = 0,42 × K  ow 
ja jakaantumiskerroin, K  d = f C × K  oc 
Tällöin liuennut fraktio kokonaispitoisuudesta (C-vesi (C  w )/C-kokonais (C  t ) on:  
C w /C t = 1/(1 + K  d × SS) = 1(1 + K  oc × f  C × SS) = 1/ ­
(1 + 0,42 × 10  3 × 0,01 × 0,1 × 10  –3 ) = 0,999  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1349
 
Liite 3  
14 CO  2 :n määritys  
Epäsuora  14 CO  2 :n määritys  
Normaalimittauksissa epäsuora menetelmä on tavallisesti vähiten aikaa vievä ja 
tarkin menetelmä, jos testiaine ei ole haihtuva eikä muodosta haihtuvia muuntu ­
mistuotteita. Suodattamattomia näytteitä (esim. 5 ml kukin) lisätään tuikelasken ­
tapulloihin. Sopiva alkuperäinen aktiivisuus näytteissä on 5 000 dpm–10 000 dpm (80–170 Bq), ja sen on oltava vähintään noin 1 000 dpm. CO
 2 poistetaan sen jälkeen, kun näyte on happamoitettu pH-arvoon 
2–3 yhdellä tai kahdella tipalla väkevää H  3 PO 4 :a tai HCl:a. CO  2 voidaan poistaa 
poreiluttamalla ilmalla noin 1/2–1 tunnin ajan. Vaihtoehtoisesti pulloja voidaan ravistaa voimakkaasti 1–2 tunnin ajan (esim. mikrotiitterilevyjen ravistimessa) tai jättää kevyempään ravistukseen yön yli. CO
 2 :n poiston tehokkuus on tarkistettava 
(ja tarvittaessa jatkettava ilmastus- tai ravistusaikaa). Vesinäytteiden laskentaan 
sopiva tuikeneste lisätään, näyte homogenisoidaan sekoittimessa ja radioaktii ­
visuus määritetään nestetuikelaskennalla vähentäen nollanäytteissä havaittu taus ­
ta-aktiivisuus (F  B ). Jollei testivesi ole selvästi värjääntynyt tai sisällä suurta 
hiukkaspitoisuutta, näytteissä havaittava vaimennus on tavallisesti yhtä suurta 
kaikissa ja sen korjaamiseksi riittää ulkoisen standardin käyttö. Jos testivesi on selvästi värjääntynyttä, vaimennus voidaan joutua korjaamaan sisäisen standardin lisäyksellä. Jos hiukkaspitoisuus on suuri, homogeenistä liuosta tai geeliä ei ehkä 
saada aikaan tai vaimennus saattaa vaihdella merkittävästi näytteiden välillä. 
Tällöin voidaan käyttää jäljempänä testilietteille kuvattua menetelmää. Jos testi suoritetaan suspendoituneen sedimentin testinä,
 14 CO 2 :n epäsuora mittaus voi ­
daan tehdä ottamalla homogeeninen 10 ml:n näyte testivettä/suspensiota ja erot ­
tamalla faasit sentrifugoimalla sopivalla nopeudella (esim. 40 000 m/s  2 15 min). 
Vesifaasia käsitellään sitten edellä kuvatulla tavalla. Partikkelimuodossa olevan  
14 C:n aktiivisuus (POA) määritetään suspendoimalla sedimentti uudelleen pie ­
neen määrään tislattua vettä, panemalla se tuikelaskentapulloihin ja lisäämällä 
tuikeneste geelin muodostamiseksi (tätä varten on olemassa erityisiä tuikenestei ­
tä). Hiukkasten luonteesta (esim. niiden orgaanisen aineen sisällöstä) riippuen näytettä voidaan käsitellä yön yli kudoksen liukenemista edistävällä aineella ja sen jälkeen homogenisoida sekoittimessa ennen tuikenesteen 
lisäämistä. Vaihtoehtoisesti POA voidaan määrittää hapen määrän ylittävällä pol ­
tolla käyttäen hapetinta. Sisäiset standardit tulisi aina ottaa lukuun laskennassa, ja vaimennus voi olla tarpeen korjata sisäisen standardin lisäyksellä kunkin yksit ­
täisen näytteen osalta.
 
Suora  14 CO  2 :n määritys  
Jos muodostuneesta  14 CO 2 :sta tehdään suora määritys, testiin tulisi ottaa useam ­
pia testipulloja testin alussa. Kussakin mittauskohdassa otetaan näytteeksi koko ­
naisia testipulloja, niiden sisältö happamoitetaan pH-arvoon 2–3 ja kerätään  
14 CO 2 sisäiseen (testin alussa kunkin testipullon sisään asetettuun) tai ulkoiseen 
absorbointijärjestelmään. Absorboivana aineena voidaan käyttää emästä (esim. 1 N NaOH -liuos tai NaOH-pelletti), etanoliamiinia tai etanoliamiinipoh ­
jaista absorbenttia tai kaupallisesti saatavilla olevia absorbentteja.
 14 CO 2 :n suoraa 
määritystä varten testipullot tulisi sulkea esimerkiksi butyylikumikalvolla.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1350
 
Kuva 1a  
Esimerkki aritmeettisesta käyrästä (jäännösaktiivisuus vs. aika)
  
Kuva 1b  
Esimerkki puolilogaritmisesta käyrästä (ln jäännösaktiivisuus vs. aika)
  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1351
 
C.26.  LIMASKOJEN ( LEMNA  SP.) KASVUNESTYMISTESTI  
1. MENETELMÄ  
Tämä menetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 221, 2006 (1). 
EU:n viranomaiset ovat olleet laajalti sitä mieltä, että  Lemna -testi 
on sopiva vaihtoehto levätestille silloin, kun aineet ovat voimakkaan 
värisiä (2)(3).  
1.1 JOHDANTO  
Tällä testimenetelmällä arvioidaan aineiden myrkyllisyyttä  Lemna - 
sukua (limaskat) oleville makean veden kasveille. Menetelmä perus ­
tuu olemassa oleviin testiohjeisiin (4)(5)(6)(7)(8)(9), mutta niitä on muutettu viimeaikaisten tutkimustulosten ja keskeisiä kysymyksiä 
koskevien konsultointien pohjalta. Ehdotettu menetelmä on validoitu 
kansainvälisellä yhteistutkimuksella (ring test) (10).
 
Testimenetelmässä kuvataan myrkyllisyyden testausta, jossa käyte ­
tään Lemna gibba - ja Lemna minor  -lajeja. Kumpaakin lajia on 
tutkittu laajalti ja käytetty edellä mainituissa standardeissa.  Lemna - 
suvun lajien taksonomia on hankala, koska fenotyyppejä on monta. Vaikka  Lemna -suvussa voi esiintyä geneettistä vaihtelevuutta vas ­
teessa myrkyllisiin aineisiin, vaihtelevuuden syistä ei toistaiseksi 
ole saatavilla riittävästi tietoja, joiden pohjalta voitaisiin suositella 
tietyn kloonin käyttöä tässä testimenetelmässä. On syytä huomata, että testiä ei suoriteta aksenikaalisesti, vaan testin eri vaiheissa to ­
teutetaan toimia, joilla muista eliöistä johtuva kontaminaatio pyritään 
pitämään mahdollisimman pienenä.
 
Testimenetelmässä kuvataan yksityiskohtaisesti testausta, jossa testi ­
liuos vaihtuu (semistaattinen ja läpivirtausmenetelmä) tai ei vaihdu (staattinen menetelmä). Testin tavoitteista ja sääntelyvaatimuksista 
riippuen on suositeltavaa harkita semistaattisten tai läpivirtausmene ­
telmien käyttöä muun muassa sellaisten aineiden testauksessa, jotka häviävät nopeasti liuoksesta haihtumisen, valohajoamisen, saostumi ­
sen tai biohajoavuuden vuoksi. Tästä annetaan tarkempia ohjeita 
kirjallisuusviitteessä (11).
 
1.2 MÄÄRITELMÄT  
Tässä testimenetelmässä käytetään seuraavia määritelmiä ja lyhenteitä:  
Biomassa : Populaatiossa olevan elävän materiaalin kuivapaino. 
Tässä testissä biomassaa mitataan usein epäsuorasti esimerkiksi ver ­
sojen lukumäärän tai pinta-alan avulla, minkä vuoksi ”biomassa”- 
termi viittaa myös näihin korvaaviin menetelmiin.  
Kloroosi : Versosolukon kellastuminen.  
Klooni : Eliö tai solu, joka on saanut alkunsa yhdestä yksilöstä su ­
vuttoman lisääntymisen tuloksena. Samaan klooniin kuuluvat yksilöt ovat siis geneettisesti identtisiä.
 
Kolonia : Versojen muodostama yhdyskunta, jossa emo- ja tytäryk ­
silöt (yleensä 2–4 yksilöä) ovat kiinnittyneet toisiinsa. Kutsutaan 
joskus kasviksi.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1352
 
EC x : Testiviljelyaineeseen liuenneen testiaineen pitoisuus, jossa  
Lemna n kasvu vähenee x prosenttia (esimerkiksi 50 prosenttia) mää ­
rätyn altistusajan kuluessa (altistusaika on mainittava erikseen, jos se poikkeaa testin kokonaiskestosta tai normaalista kestosta). Jotta kas ­
vunopeudesta ja tuotoksesta johdetut EC-arvot erottuisivat selvästi 
toisistaan, edellisestä käytetään symbolia ”E
 r C” ja jälkimmäisestä 
symbolia ”E  y C”, joiden jälkeen mainitaan mittausmuuttuja, esimer ­
kiksi E  r C (versojen lukumäärä).  
Läpivirtaustesti : Testi, jossa testiliuokset vaihtuvat jatkuvasti.  
Verso : Limaskakasvin yksittäinen lehden kaltainen rakenne. Se on 
pienin lisääntymiskykyinen yksikkö eli yksilö.  
Kupruisuus : Kupuroiden tai turpoamien esiintyminen versoissa.  
Kasvu : Mittausmuuttujan, kuten versojen lukumäärän, kuivapainon, 
märkäpainon tai versojen pinta-alan, kasvaminen testijakson aikana.  
Kasvunopeus  (keskimääräinen spesifinen kasvunopeus ): Biomas ­
san logaritminen kasvu altistuksen aikana.  
Pienin havaittavan vaikutuksen aiheuttava pitoisuus (LOEC) : 
Pienin testattu pitoisuus, jossa aineella havaitaan olevan tietyn altis ­
tusajan kuluessa tilastollisesti merkittävä kasvua vähentävä vaikutus verrattuna kontrolliin (kun p < 0,05). Ehtona on myös, että kaikilla LOEC-pitoisuutta suuremmilla testipitoisuuksilla on oltava vähintään 
yhtä suuri haitallinen vaikutus kuin LOEC-pitoisuudella. Jos nämä 
kaksi ehtoa eivät täyty, on annettava tyhjentävä selitys siitä, miten LOEC-pitoisuus (ja myös NOEC-pitoisuus) on valittu.
 
Mittausmuuttujat : Kaikentyyppiset muuttujat, jotka mitataan testin 
päätepisteen ilmaisemiseksi yhden tai useamman erilaisen vastemuut ­
tujan avulla. Tässä menetelmässä mittausmuuttujia ovat versojen lu ­
kumäärä, versojen pinta-ala sekä tuorepaino ja kuivapaino.  
Monokulttuuri : Yhtä kasvilajia sisältävä viljelmä.  
Nekroosi : Kuollut (valkoinen tai veden turvottama) versosolukko.  
Pitoisuus, joka ei aiheuta havaittavaa vaikutusta (NOEC) : Lähin 
LOEC-pitoisuutta pienempi testipitoisuus.  
Fenotyyppi : Eliön havaittavissa olevat ominaisuudet, jotka määräy ­
tyvät eliön geenien ja ympäristön välisestä vuorovaikutuksesta.  
Vastemuuttujat : Muuttujat, joiden avulla arvioidaan myrkyllisyyttä. 
Vastemuuttujat johdetaan erilaisia laskentamenetelmiä käyttämällä mistä tahansa mitatusta muuttujasta, joka kuvaa biomassaa. Tässä 
menetelmässä kasvunopeudet ja tuotos ovat vastemuuttujia, jotka 
on johdettu mittausmuuttujista, kuten versojen lukumäärästä, verso ­
jen pinta-alasta, tuorepainosta tai kuivapainosta.
 
Semistaattinen (ajoittaisvaihtoinen) testi : Testi, jossa testiliuos 
vaihdetaan tietyin väliajoin testin aikana.  
Staattinen testi : Testi, jossa testiliuosta ei vaihdeta testin aikana.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1353
 
Testin päätepiste : Kuvaa yleistä tekijää, joka testin tavoitteen mu ­
kaisesti muuttuu testikemikaalin vaikutuksesta verrattuna kontrolliin. 
Tässä menetelmässä testin päätepisteenä on kasvun estyminen, joka voidaan ilmaista erilaisilla vastemuuttujilla, jotka perustuvat yhteen tai useampaan mittausmuuttujaan.
 
Testiviljelyaine : Täydellinen synteettinen ravinneliuos, jossa testi ­
kasvit kasvavat, kun ne altistetaan testiaineelle. Yleensä testiaine liuotetaan testiviljelyaineeseen.
 
Tuotos : Altistusajan lopussa mitattu biomassaa ilmaisevan mittaus ­
muuttujan arvo, josta on vähennetty altistusajan alussa mitattu saman mittausmuuttujan arvo.
 
1.3 TESTIN PERIAATE  
Lemna -sukuun kuuluvien eksponentiaalisesti kasvavien kasviviljel ­
mien annetaan kasvaa seitsemän päivän ajan monokulttuureina testi ­
aineen eri pitoisuuksissa. Testin tavoitteena on kvantifioida testi ­
aineeseen liittyvät vaikutukset kasvien kasvuun tämän ajan kuluessa tiettyjen mittausmuuttujien arvioinnin perusteella. Ensisijaisena mit ­
tausmuuttujana on versojen lukumäärä. Lisäksi mitataan ainakin yhtä 
muuta mittausmuuttujaa (versojen kokonaispinta-alaa, kuivapainoa tai tuorepainoa), koska eräät aineet voivat vaikuttaa huomattavasti enemmän muihin mittausmuuttujiin kuin versojen lukumäärään. Tes ­
tiaineeseen liittyvien vaikutusten kvantifioimiseksi testiliuoksissa ta ­
pahtunutta kasvua verrataan kontrolliryhmässä tapahtuneeseen kas ­
vuun, minkä jälkeen määritetään pitoisuus, jossa kasvu estyy ennalta määrätyn prosenttimäärän x verran (esimerkiksi 50 prosenttia). Ky ­
seinen pitoisuus ilmoitetaan EC
 x -arvona (esimerkiksi EC  50 ). 
Testin loppupisteenä on kasvun estyminen, joka ilmenee mittaus ­
muuttujan logaritmisesta kasvusta (keskimääräisestä spesifisestä kas ­
vunopeudesta) altistusaikana. Testiliuossarjassa mitattujen keskimää ­
räisten spesifisten kasvunopeuksien avulla määritetään pitoisuus, 
jossa kasvunopeus vähenee ennalta määrätyn prosenttimäärän x ver ­
ran (esimerkiksi 50 prosenttia). Kyseinen pitoisuus ilmoitetaan E  r C x - 
arvona (esimerkiksi E  r C 50 ). 
Toinen testimenetelmässä käytetty vastemuuttuja on tuotos, jota voi ­
daan tarvita joissakin maissa erityisten sääntelyvaatimusten täyttämi ­
seksi. Sillä tarkoitetaan altistusajan lopussa mitattua mittausmuuttu ­
jien arvoa, josta on vähennetty altistusajan alussa mitattu mittaus ­
muuttujien arvo. Testiliuossarjassa mitatun tuotoksen avulla määrite ­
tään pitoisuus, jossa tuotos vähenee ennalta määrätyn prosenttimää ­
rän x verran (esimerkiksi 50 prosenttia). Kyseinen pitoisuus ilmoite ­
taan E  y C x -arvona (esimerkiksi E  y C 50 ). 
Tilastollisesti voidaan määrittää myös pienin havaittavan vaikutuksen 
aiheuttava pitoisuus (LOEC) sekä pitoisuus, joka ei aiheuta havait ­
tavaa vaikutusta (NOEC).  
1.4 TESTIAINETTA KOSKEVAT TIEDOT  
Käytettävissä on oltava analyysimenetelmä, jolla testiviljelyaineessa 
oleva testiaine voidaan kvantifioida riittävän herkästi.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1354
 
Testiainetta koskevia tietoja, joista voi olla hyötyä päätettäessä tes ­
tiolosuhteista, ovat rakennekaava, puhtaus, vesiliukoisuus, stabiilius 
vedessä ja valossa, pK  a , K ow , höyrynpaine ja biohajoavuus. Vesiliu ­
koisuutta ja höyrynpainetta voidaan käyttää laskettaessa Henryn va ­
kiota, josta voidaan päätellä, onko todennäköistä, että testiainetta 
häviää merkittävästi testin aikana. Tämän perusteella voidaan päättää, 
vaativatko tällaiset häviöt erityistoimia. Jos testiaineen liukoisuutta ja stabiiliutta koskevat tiedot ovat epäluotettavia, nämä ominaisuudet olisi arvioitava testiolosuhteissa, toisin sanoen siinä viljelyaineessa, 
lämpötilassa ja valaistuksessa, joita testissä käytetään.
 
Jos on erityisen tärkeää säädellä testiviljelyaineen pH:ta, esimerkiksi 
testattaessa metalleja tai hydrolyyttisesti epästabiileja aineita, on suo ­
siteltavaa lisätä testiviljelyaineeseen puskuria (ks. 1.7.4 kohdan en ­
simmäinen kappale). Kirjallisuusviitteessä (11) annetaan lisäohjeita 
sellaisten aineiden testauksesta, joiden fysikaaliskemialliset ominai ­
suudet vaikeuttavat niiden testaamista.  
1.5 VERTAILUAINE  
Testimenetelmä voidaan tarkistaa testaamalla vertailuaine (-aineet), 
kuten 3,5-dikloorifenoli, jota on käytetty kansainvälisessä yhteistut ­
kimuksessa (10). Vertailuaine on suotavaa testata vähintään kahdesti vuodessa tai, jos testausta tehdään harvemmin, rinnakkain määritet ­
täessä testiaineen myrkyllisyyttä.
 
1.6 TESTIN VALIDITEETTI  
Jotta testi olisi validi, versojen lukumäärän on kaksinkertaistuttava 
kontrolliviljelmässä alle 2,5 päivässä (60 tunnissa), mikä vastaa noin seitsenkertaista kasvua seitsemän päivän kuluessa, kun keskimääräi ­
nen spesifinen kasvunopeus on 0,275 päivää kohden. Käytettäessä 
tässä testimenetelmässä kuvattuja testiliuoksia ja -olosuhteita tämä 
vaatimus voidaan täyttää käyttämällä staattista testausta (8). Vaa ­
timus voidaan oletettavasti täyttää myös sellaisissa testiolosuhteissa, joissa käytetään semistaattista tai läpivirtausmenetelmää. Kaksinker ­
taistumisajan laskemista käsitellään tarkemmin kohdassa 2.1.
 
1.7 MENETELMÄN KUVAUS  
1.7.1  Välineet  
Kaikkien välineiden, jotka joutuvat kosketuksiin testiliuosten kanssa, 
on oltava kokonaan lasia tai muuta kemiallisesti inerttiä materiaalia. 
Viljelyyn ja testaukseen käytettävien lasiastioiden on oltava steriilejä, 
ja ne on puhdistettava kemiallisista epäpuhtauksista, jotka voivat päästä testiviljelyaineeseen. Koeastioiden on oltava niin tilavia, että eri kolonioiden versot voivat kasvaa kontrolliastioissa peittämättä 
toisiaan testin lopussa. Ei ole haitaksi, vaikka juuret ulottuvat testi ­
astioiden pohjaan, mutta on suositeltavaa, että kaikki koeastiat ovat syvyydeltään vähintään 20 mm ja tilavuudeltaan vähintään 100 ml. Koeastioiden valinnalla ei ole muuten ratkaisevaa merkitystä, jos 
nämä vaatimukset täyttyvät. Sopivan kokoiset dekantterilasit, kitey ­
tysmaljat ja lasiset petrimaljat ovat kaikki osoittautuneet käyttökel ­
poisiksi. Haihtumisen ja tahattoman kontaminaation minimoimiseksi koeastiat on peitettävä, mutta samalla on huolehdittava riittävästä 
ilmanvaihdosta. Koeastiat ja varsinkaan niiden sulkimet eivät saa 
varjostaa tai muuttaa valon spektriominaisuuksia.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1355
 
Viljelmiä ja koeastioita ei saa säilyttää toistensa kanssa. Sen vuoksi 
on paras käyttää erillisiä ilmastoituja kasvatuskaappeja, inkubaatto ­
reita tai huoneita. Valaistuksen ja lämpötilan on oltava säädettävissä, ja ne on pidettävä tasaisina (ks. kohta 1.7.8).
 
1.7.2  Koe-eliö  
Testissä käytetään  Lemna gibba - tai Lemna minor  -lajia. Myrkylli ­
syyden testauksessa käytettyjä limaskalajeja kuvataan lyhyesti lisä ­
yksessä 1. Kasvimateriaali voidaan hankkia kantakokoelmasta, toi ­
sesta laboratoriosta tai luonnosta. Jos kasvit kerätään luonnosta, niitä 
on viljeltävä testissä käytettävässä viljelyaineessa vähintään kahdek ­
san viikkoa ennen käyttöä. Paikoissa, joista alkuviljelmien kasvit kerätään, ei saa olla ilmeisiä kontaminaatiolähteitä. Jos kasvit hanki ­
taan toisesta laboratoriosta tai kantakokoelmasta, niitä on viljeltävä 
vastaavalla tavalla kolmen viikon ajan. Kasvimateriaalin lähde sekä testauksessa käytettävät lajit ja klooni (jos tiedossa) on aina ilmoi ­
tettava.
 
Testissä on käytettävä monokulttuureita, joissa ei ole muita organis ­
meja, kuten leviä tai alkueläimiä, näkyvinä epäpuhtauksina.  L. minor  
-lajin terveet kasvit ovat kolonioina, joissa on 2–5 versoa, kun taas  
L. gibba  -lajin terveissä kolonioissa voi olla jopa seitsemän versoa.  
Testissä käytettävät kasvit on valittava huolellisesti, koska niiden 
laatu ja yhtenäisyys vaikuttavat merkittävästi testin tulokseen. Tes ­
tissä on käytettävä nuoria, nopeasti kasvavia kasveja, joissa ei ole 
näkyviä vaurioita tai värimuutoksia (kloroosia). Hyvälaatuisen viljel ­
män tunnistaa siitä, että siinä esiintyy runsaasti vähintään kahdesta versosta koostuvia kolonioita. Jos viljelmässä on monia yksittäisiä versoja, se on merkki ympäristörasituksesta, kuten ravinteiden puut ­
teesta, eikä testissä saa käyttää tällaisista viljelmistä peräisin olevaa 
kasvimateriaalia.
 
1.7.3  Viljely  
Viljelmien ylläpidon helpottamiseksi (esimerkiksi silloin, kun  Lem­
na-testejä ei aiota tehdä tiettynä aikana) niitä voidaan säilyttää nor ­
maalia heikommassa valaistuksessa ja alhaisemmassa lämpötilassa (4–10 °C). Viljelyä käsitellään tarkemmin lisäyksessä 2. Jos viljel ­
mässä näkyy merkkejä levien ja muiden eliöiden aiheuttamasta kon ­
taminaatiosta,  Lemna -versoista on otettava osanäyte, jolle tehdään 
pintasterilointi, jonka jälkeen se siirretään tuoreeseen viljelyaineeseen 
(ks. lisäys 2). Jäljelle jäävä kontaminoitunut viljelmä on heitettävä 
pois.
 
Riittävä määrä kolonioita siirretään aseptisesti vähintään seitsemän 
päivää ennen testausta tuoreeseen steriiliin viljelyaineeseen, ja kolo ­
nioita viljellään 7–10 päivän ajan testiolosuhteissa.  
1.7.4  Testiviljelyaine  
Lemna minor - ja Lemna gibba  -lajia varten suositetaan erilaisia vil ­
jelyaineita, joita kuvataan jäljempänä. On syytä harkita huolellisesti pH-puskurin lisäämistä testiviljelyaineeseen (MOPS (4-morfoliinipro ­
paanisulfonihappo, CAS-numero: 1132-61-2; EINECS-numero: 214- 
478-5)  L. minor  -lajin viljelyaineeseen ja NaHCO
 3 L. gibba  -lajin 
viljelyaineeseen), jos testiviljelyaineen epäillään voivan reagoida tes ­
tiaineen kanssa ja vaikuttaa sen myrkyllisyyden ilmentymiseen. 
Steinbergin viljelyainetta (12) voidaan käyttää, jos validiteettivaa ­
timukset täyttyvät.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1356
 
Ruotsalaisen standardin (SIS) mukaisen  Lemna -viljelyaineen muun ­
nosta suositetaan käytettäväksi testauksessa, jossa viljellään ja käy ­
tetään  L. minor  -lajia. Tämän viljelyaineen koostumus esitetään 
lisäyksessä 3.  
Lisäyksessä 3 kuvattua 20X-AAP-viljelyainetta suositetaan käytettä ­
väksi testauksessa, jossa viljellään ja käytetään  L. gibba  -lajia.  
L. minor  -lajille soveltuu myös lisäyksessä 3 kuvattu Steinbergin 
viljelyaine, mutta sitä voidaan käyttää myös  L. gibba  -lajin viljelyssä, 
jos validiteettivaatimukset täyttyvät.  
1.7.5  Testiliuokset  
Testiliuokset valmistetaan yleensä laimentamalla kantaliuosta. Testi ­
aineen kantaliuokset valmistetaan tavallisesti liuottamalla testiaine 
viljelyaineeseen.  
Testiaineen suurin testattu pitoisuus ei yleensä saa ylittää kyseisen 
aineen vesiliukoisuutta testiolosuhteissa. On kuitenkin huomattava, että Lemna -suvun lajit kelluvat pinnalla ja voivat altistua aineille, 
jotka kerääntyvät veden ja ilman rajapintaan (esimerkiksi huonosti 
veteen liukenevat tai hydrofobiset aineet taikka pinta-aktiiviset ai ­
neet). Tällaisissa olosuhteissa kasvit altistuvat muille kuin liuoksessa olevalle aineille, ja testipitoisuudet voivat testiaineen ominaisuuksista 
riippuen ylittää vesiliukoisuuden. Jos testiaine liukenee huonosti ve ­
teen, voi olla tarpeen valmistaa kyseisestä aineesta väkevä kantaliuos tai dispersio käyttämällä orgaanista liuotinta tai dispergointiainetta, joilla voidaan helpottaa tarkkojen testiainemäärien lisäämistä testivil ­
jelyaineeseen sekä testiaineen dispersiota ja liukenemista. Tällaisten 
aineiden käyttöä on vältettävä mahdollisimman pitkälle. Jos liuotti ­
mia tai dispergointiaineita käytetään apuna testiliuosten valmistukses ­
sa, niistä ei saa aiheutua fytotoksisuutta. Asetoni ja dimetyyliforma ­
midi ovat esimerkkejä yleisesti käytetyistä liuottimista, jotka eivät 
aiheuta fytotoksisuutta pitoisuuden ollessa enintään 100 μ1·l
 –1 . Jos 
liuotinta tai dispergointiainetta käytetään, sen lopullinen pitoisuus on 
ilmoitettava ja pidettävä mahdollisimman pienenä ( ≤ 100 μl·l –1 ), ja 
liuoksen tai dispergointiaineen pitoisuuden on oltava sama kaikissa käsitellyissä ja kontrolliliuoksissa. Dispergointiaineiden käytöstä an ­
netaan lisäohjeita kirjallisuusviitteessä (11).
 
1.7.6  Testi- ja kontrolliryhmät  
Sopivat testipitoisuudet on helpompi valita, jos testiaineen myrkylli ­
syydestä  Lemna -lajeille on saatavilla aiempia tietoja esimerkiksi alus ­
tavista pitoisuusalueen määrityskokeista. Lopullisessa myrkyllisyys ­
testissä on yleensä oltava vähintään viisi testipitoisuutta, jotka muo ­
dostavat geometrisen sarjan. Testipitoisuuksien suhdeluvun ei tulisi 
olla suurempi kuin 3,2, mutta suurempikin suhdeluku sallitaan, jos 
pitoisuus-vastekäyrä on laakea. Vähemmän kuin viiden pitoisuuden käyttö on perusteltava. Jokaisesta testipitoisuudesta on tehtävä vähin ­
tään kolme toistoa.
 
Valittaessa testin pitoisuusaluetta (pitoisuusalueen määritystä ja/tai 
lopullista myrkyllisyystestiä varten) on otettava huomioon seuraavat 
näkökohdat:  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1357
 
— EC  x -pitoisuuden määrittämiseksi testipitoisuudet on valittava si ­
ten, että EC  x -arvo on kyseisellä pitoisuusalueella, jotta saavutet ­
taisiin riittävä luottamustaso. Esimerkiksi EC  50 -pitoisuutta arvioi ­
taessa suurimman testipitoisuuden on ylitettävä EC  50 -arvo. Jos 
EC 50 -arvo on testin pitoisuusalueen ulkopuolella, vastaavat luot ­
tamusvälit ovat suuria, jolloin voi olla mahdotonta arvioida mal ­
lin tilastollista sopivuutta.  
— Jos tavoitteena on arvioida LOEC- tai NOEC-pitoisuus, pienim ­
män testipitoisuuden on oltava niin pieni, että kasvu ei ole mer ­
kittävästi vähäisempää kuin kontrolliryhmässä. Suurimman testi ­
pitoisuuden on myös oltava niin suuri, että kasvu on huomatta ­
vasti vähäisempää kuin kontrolliryhmässä. Muussa tapauksessa 
testi on toistettava käyttämällä toista pitoisuusaluetta (jollei suu ­
rin pitoisuus ole liukoisuusrajalla tai jollei se ole suurin vaadittu rajapitoisuus, esimerkiksi 100 mg·l
 –1 ). 
Jokaiseen testiin on kuuluttava kontrolliryhmä, jossa ravinneliuos, 
versojen ja kolonioiden lukumäärä, ympäristöolosuhteet ja menettelyt ovat samat kuin testiryhmässä mutta ilman testiainetta. Jos apuna 
käytetään liuotinta tai dispergointiainetta, testiin on kuuluttava yli ­
määräinen kontrollikäsittely, jossa liuottimen tai dispergointiaineen pitoisuus on sama kuin testiainetta sisältävissä astioissa. Toistoissa kontrolliastioiden (ja liuotinta käytettäessä liuotinta sisältävien asti ­
oiden) lukumäärän on oltava vähintään yhtä suuri kuin kunkin testi ­
pitoisuuden testaamiseen käytettyjen astioiden lukumäärä ja mielel ­
lään kaksinkertainen.
 
Jos NOEC-pitoisuutta ei tarvitse määrittää, testimenetelmää voidaan 
muuttaa lisäämällä pitoisuuksien määrää ja vähentämällä toistojen määrää pitoisuutta kohden. Kontrollitoistoja on kuitenkin oltava vä ­
hintään kolme.
 
1.7.7  Altistus  
Koloniat, jotka koostuvat 2–4 näkyvästä versosta, siirretään siirrosviljel ­
mästä ja jaetaan satunnaisesti koeastioihin aseptisissa olosuhteissa. Jokaisessa koeastiassa on oltava yhteensä 9–12 versoa. Versoja ja 
kolonioita on oltava yhtä monta kaikissa koeastioissa. Tästä testimene ­
telmästä saadut kokemukset ja yhteistutkimusten (ring tests) tulokset ovat osoittaneet, että jos jokaista käsittelyä kohden tehdään kolme toistoa, joissa kaikissa on aluksi 9–12 versoa, käsittelyjen välillä voidaan 
jo havaita kasvueroja, jotka vastaavat 4–7 prosentin inhibitiota, jos se 
lasketaan kasvunopeuden perusteella (ja 10–15 prosentin inhibitiota, jos se lasketaan tuotoksen perusteella) (10).
 
Koeastiat on sijoitettava inkubaattoriin satunnaistetusti, jotta valon 
voimakkuuden ja lämpötilan spatiaalisista eroista johtuvat vaikutuk ­
set olisivat mahdollisimman pienet. Vaatimuksena on myös, että jo ­
kaisella havainnointikerralla käytetään lohkoittaista järjestystä tai as ­
tioiden satunnaistettua uudelleensijoittelua (joka voidaan tehdä use ­
amminkin).  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1358
 
Jos alustava stabiiliustesti osoittaa, että testiaineen pitoisuutta ei 
voida pitää yllä testin ajan eli 7 päivää (toisin sanoen mitattu pitoi ­
suus vähenee alle 80 prosenttiin mitatusta alkupitoisuudesta), on suositeltavaa käyttää semistaattista testijärjestelmää. Siinä tapauk ­
sessa koloniat on altistettava vasta valmistetuille testi- ja kontrolliliu ­
oksille ainakin kahdesti testin aikana (esimerkiksi päivinä 3 ja 5). 
Testiaineen stabiiliudesta riippuu, kuinka usein koloniat on altistet ­
tava vastavalmistetulle viljelyaineelle. Testattaessa hyvin epästabii ­
leja tai haihtuvia aineita pitoisuuksien pitäminen lähes vakioina voi 
vaatia useampia altistuskertoja. Joissakin tapauksissa voi olla tarpeen 
käyttää läpivirtausmenetelmää (11)(13).
 
Tähän testimenetelmään ei kuulu versojen altistaminen ruiskuttamal ­
la, mutta sitä käsitellään kirjallisuusviitteessä (14).  
1.7.8  Inkubaatio-olosuhteet  
Testissä käytetään tasaista lämpimän- tai kylmänvalkoista loistevaloa, 
jotta valon voimakkuudeksi saadaan 85–135 μE·m  –2 ·s –1 , kun se mi ­
tataan fotosyynteesille suotuisalla aallonpituusalueella (400–700 nm) pisteissä, jotka ovat samalla etäisyydellä valolähteestä kuin  Lemna - 
versot (tämä vastaa voimakkuusaluetta 6 500–10 000 luksia). Valon 
voimakkuus ei saa vaihdella enempää kuin ± 15 prosenttia testialu ­
een yläpuolella. Valoilmaisin- ja valonmittausmenetelmä ja erityisesti anturityyppi vaikuttavat mittausarvoon. Pallomaiset anturit (jotka rea ­
goivat valoon mistä tahansa kulmasta mittaustason ylä- 
ja alapuolelta) ja kosinikorjaimella varustetut anturit (jotka reagoivat valoon mistä tahansa kulmasta mittaustason yläpuolelta) ovat suosi ­
teltavampia kuin yksisuuntaiset anturit. Ensin mainitut antavat suu ­
rempia lukemia mitattaessa tässä kuvatun kaltaista monipisteistä va ­
lonlähdettä.
 
Lämpötilan on oltava koeastioissa 24 ± 2 °C. Yleensä kontrollivil ­
jelyaineen pH-arvo saa kokeen aikana vaihdella enintään 1,5 yksikön 
verran. Tätä suurempi poikkeama ei kuitenkaan mitätöi testiä, jos 
validiteettivaatimusten voidaan osoittaa täyttyvän. Erityistapauksissa, esimerkiksi testattaessa epästabiileja aineita tai metalleja, on kiinni ­
tettävä erityistä huomiota pH:n vaihteluun. Tästä annetaan lisäohjeita 
kirjallisuusviitteessä (11).
 
1.7.9  Kesto  
Testi päättyy seitsemän päivän kuluttua kasvien siirtämisestä koeasti ­
oihin.  
1.7.10  Mittaukset ja analyyttiset määritykset  
Testin alussa lasketaan ja kirjataan koeastioissa olevien versojen 
lukumäärä. Tällöin on laskettava kaikki esiin työntyvät ja selvästi 
näkyvät versot. Normaaleilta ja epänormaaleilta vaikuttavien versojen 
määrä lasketaan testin alussa, vähintään joka kolmas päivä altistuk ­
sen aikana (eli ainakin kaksi kertaa seitsemän päivän jakson aikana) sekä kokeen päättyessä. Kasvien kehityksessä tapahtuvat muutokset 
rekisteröidään. Niitä ovat esimerkiksi versojen koossa ja ulkonäössä 
tapahtuvat muutokset, merkit nekroosista, kloroosista tai kupruisuu ­
desta, kolonian hajoaminen tai kelluvuuden heikkeneminen sekä muutokset juurien pituudessa ja ulkonäössä. Lisäksi on rekisteröitävä 
testiviljelyaineen erityiset ominaisuudet (esimerkiksi liukenematto ­
man materiaalin esiintyminen ja levien kasvu koeastiassa).
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1359
 
Versojen lukumäärän laskemisen lisäksi testin aikana arvioidaan 
myös testiaineen vaikutuksia yhteen (tai useampaan) seuraavista mit ­
tausmuuttujista:  
i) versojen kokonaispinta-ala;  
ii) kuivapaino;  
iii) tuorepaino.  
Versojen kokonaispinta-alaan liittyy se etu, että se voidaan määrittää 
jokaisesta testi- ja kontrolliastiasta testin alussa, sen aikana ja sen lopussa. Kuiva- tai tuorepaino on määritettävä testin alussa siirros ­
viljelmästä otetusta näytteestä, jonka on oltava edustava näyte testin 
käynnistämiseen käytetystä materiaalista, sekä testin lopussa jokai ­
sesta testi- ja kontrolliastiasta otetusta kasvimateriaalista. Jos verso ­
jen pinta-alaa ei mitata, on parempi mitata kuivapaino tuorepainon 
sijasta.
 
Versojen kokonaispinta-ala, kuivapaino ja tuorepaino voidaan mää ­
rittää seuraavasti:  
i) Versojen kokonaispinta-ala : Kaikkien kolonioiden versojen ko ­
konaispinta-ala voidaan määrittää kuva-analyysillä. Koeastiasta ja kasveista voidaan ottaa siluettikuva videokameralla (esimer ­
kiksi sijoittamalla koeastia valolaatikon päälle), ja näin saatu 
kuva digitalisoidaan. Koeastiassa olevien versojen kokonaispin ­
ta-ala voidaan määrittää tekemällä kalibrointi tunnetun pinta-alan tasokuvioiden avulla. Tällöin on huolehdittava siitä, että koe ­
astian reunan aiheuttamat vaikutukset eivät vääristä määritystä. 
Vaihtoehtoisena mutta työläämpänä menetelmänä on valokuvata koeastiat ja kasvit, leikata näin saatu kolonioiden siluetti ja mää ­
rittää niiden pinta-ala käyttämällä lehtialan analysaattoria. Muut ­
kin tekniikat voivat olla käyttökelpoisia (esimerkiksi kolonioiden 
siluetin pinta-alan ja tietyn pinta-alayksikön välinen painosuhde paperin painon mukaan laskettuna).
 
ii) Kuivapaino : Jokaisesta koeastiasta kerätään kaikki koloniat, jotka 
huuhdotaan tislatulla tai deionisoidulla vedellä. Kolonioissa oleva ylimääräinen vesi imeytetään paperiin, minkä jälkeen niitä kuivataan 60 °C:ssa, kunnes niiden paino on vakio. Juurenpal ­
aset on otettava mukaan. Kuivapaino on ilmoitettava vähintään 
0,1 mg:n tarkkuudella.
 
iii) Tuorepaino : Kaikki koloniat siirretään ennalta punnittuihin po ­
lystyreeniputkiin (tai muihin inerttiä materiaalia oleviin putkiin), 
joiden pyöreissä pohjissa on pieniä (1 mm) aukkoja. Putkia sent ­
rifugoidaan kierrosluvulla 3 000 rpm huoneenlämmössä 10 minuutin ajan. Putket, jotka sisältävät näin kuivatut koloniat, 
punnitaan uudelleen, ja tuorepaino lasketaan vähentämällä pun ­
nitustuloksesta tyhjän putken paino.
 
1.7.10.1  Mittausten ja analyyttisten määritysten tiheys  
Käytettäessä staattista testimenetelmää kunkin käsittelyn liuoksen pH 
on mitattava testin alussa ja lopussa. Jos testimenetelmä on semis ­
taattinen, pH on mitattava jokaisesta erästä ”tuoretta” testiliuosta 
ennen kutakin vaihtoa ja myös vastaavista ”käytetyistä” liuoksista.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1360
 
Valon voimakkuus kasvatuskaapissa, inkubaattorissa tai huoneessa 
on mitattava pisteistä, jotka ovat samalla etäisyydellä valolähteestä 
kuin Lemna -versot. Mittaukset on tehtävä ainakin kerran testin aika ­
na. Viljelyaineen lämpötila surrogaattiastiassa, jota säilytetään kasva ­
tuskaapissa, inkubaattorissa tai huoneessa samoissa olosuhteissa, on 
mitattava vähintään kerran päivässä.  
Testiaineen pitoisuudet määritetään testin aikana sopivin väliajoin. 
Staattisissa testeissä vähimmäisvaatimuksena on määrittää pitoisuudet 
testin alussa ja lopussa.  
Semistaattisissa testeissä, joissa testiaineen pitoisuuden ei oleteta py ­
syvän ± 20 prosentin rajoissa nimellispitoisuudesta, on analysoitava kaikki vastavalmistetut testiliuokset ja samat liuokset käytettyinä 
kunkin vaihdon yhteydessä (ks. 1.7.7 kohdan kolmas kappale). Kui ­
tenkin niissä testeissä, joissa testiaineen mitattu alkupitoisuus ei ole ± 20 prosentin rajoissa nimellispitoisuudesta, mutta joissa voidaan antaa riittävä näyttö siitä, että alkupitoisuudet ovat toistettavissa ja 
stabiileja (toisin sanoen 80–120 prosenttia alkupitoisuudesta), kemi ­
alliset määritykset voidaan tehdä ainoastaan suurimmista ja pienim ­
mistä testipitoisuuksista. Kaikissa tapauksissa on testiaineen pitoisuu ­
det ennen vaihtoa määritettävä vain yhdestä toistossa käytetystä as ­
tiasta (tai kaikkien toistoissa käytettyjen astioiden yhdistetystä sisäl ­
löstä) kutakin testipitoisuutta kohden.
 
Läpivirtaustestissä voidaan käyttää samanlaista näytteenottomenette ­
lyä kuin semistaattisessa testissä ja tehdä analyysi testin alussa, puo ­
livälissä ja lopussa, mutta ”käytettyjen” liuosten mittaaminen ei ole 
aiheellista. Tämäntyyppisessä testissä laimenteen ja testiaineen tai 
testiaineen kantaliuoksen virtausnopeus on tarkistettava päivittäin.  
Jos on näyttöä siitä, että testattavan aineen pitoisuus on pysynyt 
tyydyttävästi ± 20 prosentin rajoissa nimellispitoisuudesta tai mita ­
tusta alkupitoisuudesta koko testin ajan, tulosten analysointi voi pe ­
rustua nimellispitoisuuksiin tai mitattuihin alkupitoisuuksiin. Jos pi ­
toisuus poikkeaa enemmän kuin ± 20 prosenttia nimellispitoisuudesta 
tai mitatusta alkupitoisuudesta, tulosten analysoinnin on perustuttava pitoisuuksien geometriseen keskiarvoon altistuksen aikana tai mallei ­
hin, jotka kuvaavat testiaineen pitoisuuden vähenemistä (11).
 
1.7.11  Rajatesti  
Joissakin tapauksissa, esimerkiksi silloin, kun alustava testi osoittaa, 
että testiaineella ei ole myrkkyvaikutuksia pitoisuusarvoon 100 mg·l  –1 
saakka tai siihen liukoisuusrajaan asti, joka testiaineella on testivil ­
jelyaineessa (sen mukaan, kumpi näistä on pienempi), voidaan tehdä rajatesti, jossa verrataan yhden kontrolliryhmän ja yhden käsitellyn ryhmän vasteita (pitoisuudessa 100 mg·l
 –1 tai liukoisuusrajaa vastaa ­
vassa pitoisuudessa). On erittäin suotavaa analysoida altistuspitoisuus 
rajatestin tueksi. Kaikki edellä kuvatut testiolosuhteet ja validiteetti ­
vaatimukset koskevat myös rajatestiä, lukuun ottamatta käsiteltyjen toistojen määrää, joka on kaksinkertaistettava. Kontrolli- ja käsitel ­
lyssä ryhmässä tapahtunutta kasvua voidaan analysoida Studentin t- 
testin kaltaisella tilastotutkimuksella, jossa verrataan keskiarvoja.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1361
 
2. TIEDOT JA NIIDEN RAPORTOIMINEN  
2.1 KAKSINKERTAISTUMISAIKA  
Seuraavan kaavan avulla, jota sovelletaan kontrolliastioita koskeviin 
tietoihin, voidaan määrittää versojen lukumäärän kaksinkertaistumis ­
aika (T  d ) ja varmistaa samalla, että testi täyttää tämän validiteettivaa ­
timuksen (kohta 1.6):  
T d = ln 2/μ 
Kaavassa μ on keskimääräinen spesifinen kasvunopeus, joka laske ­
taan kohdan 2.2.1 ensimmäisessä ja toisessa kappaleessa kuvatulla tavalla.
 
2.2 VASTEMUUTTUJAT  
Testin tarkoituksena on määrittää testattavan aineen vaikutukset  Lem­
nan kasvuun. Tässä testimenetelmässä kuvataan kahta eri vastemuut ­
tujaa, koska jäsenvaltiot suosivat erilaisia käytänteitä ja asettavat erilaisia sääntelyvaatimuksia. Jotta testitulokset voitaisiin hyväksyä 
kaikissa jäsenvaltioissa, vaikutuksia olisi arvioitava käyttämällä mo ­
lempia vastemuuttujia a ja b, joita kuvataan jäljempänä.
 
a) Keskimääräinen spesifinen kasvunopeus: Tämä vastemuuttuja 
lasketaan kontrolleista ja kustakin käsitellystä ryhmästä seuraa ­
vien kahden muuttujan avulla: versojen lukumäärän logaritmi ­
arvossa tietyn (päivinä ilmaistun) ajan kuluessa tapahtunut muu ­
tos ja jonkin toisen mittausmuuttujan (versojen kokonaispinta- 
alan, kuivapainon tai tuorepainon) logaritmiarvossa tietyn (päi ­
vinä ilmaistun) ajan kuluessa tapahtunut muutos. Tätä kasvuno ­
peutta kutsutaan joskus suhteelliseksi kasvunopeudeksi (15).  
b) Tuotos: Tämä vastemuuttuja lasketaan seuraavien kahden muut ­
tujan avulla: versojen lukumäärän muutokset ja jonkin toisen 
mittausmuuttujan (versojen kokonaispinta-alan, kuivapainon tai tuorepainon) muutokset kontrolleissa ja kussakin käsitellyssä ryhmässä testin loppuun saakka.
 
On syytä huomata, että näiden kahden vastemuuttujan avulla lasketut 
myrkyllisyysarvot eivät ole vertailukelpoisia, mikä on otettava huo ­
mioon käytettäessä testin tuloksia. Jos testiolosuhteet ovat tämän 
testimenetelmän mukaiset, keskimääräiseen spesifiseen kasvunopeu ­
teen perustuvat EC  x -arvot (E  r C x ) ovat yleensä suurempia kuin tuo ­
tokseen perustuvat arvot (E  y C x ), mikä johtuu niiden matemaattisista 
perusteista. Tätä ei pidä tulkita siten, että näiden kahden vastemuut ­
tujan herkkyydet olisivat erilaiset, vaan arvojen välinen ero on puh ­
taasti matemaattinen. Keskimääräinen spesifinen kasvunopeus perus ­
tuu yleiseen kasvumalliin, joka kuvaa limaskan eksponentiaalista kasvua rajoittamattomissa viljelmissä, joista toksisuus arvioidaan kas ­
vunopeuteen kohdistuvien vaikutusten perusteella ottamatta huomi ­
oon kontrollin spesifisen kasvunopeuden absoluuttista tasoa, pitoi ­
suus-vastekäyrän kaltevuutta tai testin kestoa. Tuotosta kuvaavaan vastemuuttujaan perustuvat tulokset riippuvat sen sijaan kaikista 
näistä muista muuttujista. E
 y C x riippuu kussakin testissä käytetyn 
limaskalajin spesifisestä kasvunopeudesta ja suurimmasta spesifisestä kasvunopeudesta, joka voi vaihdella eri lajien ja jopa eri kloonien välillä. Tätä vastemuuttujaa ei saa käyttää vertailtaessa eri limaska ­
lajien tai eri kloonienkaan herkkyyttä myrkyllisille aineille. Vaikka 
tieteen kannalta on parempi arvioida myrkyllisyyttä keskimääräisen spesifisen kasvunopeuden perusteella, tähän testimenetelmään on otettu mukaan myös tuotokseen perustuvat myrkyllisyyden arvioin ­
nit, jotta voidaan täyttää eräiden maiden nykyiset sääntelyvaatimuk ­
set.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1362
 
Myrkyllisyyden arviointien on perustuttava sekä versojen lukumää ­
rään että johonkin toiseen mittausmuuttujaan (versojen kokonaispin ­
ta-alaan, kuivapainoon tai tuorepainoon), koska eräät aineet voivat vaikuttaa enemmän muihin mittausmuuttujiin kuin versojen lukumää ­
rään. Tätä vaikutusta ei havaittaisi laskemalla pelkästään versojen 
lukumäärä.
 
Versojen lukumäärä ja muut kirjatut mittausmuuttujat (versojen ko ­
konaispinta-ala, kuivapaino tai tuorepaino) esitetään taulukkona, 
josta ilmenevät myös testiaineen pitoisuudet kussakin mittauksessa. Kun tietoja analysoidaan myöhemmin esimerkiksi LOEC-, NOEC- tai EC
 x -pitoisuuden arvioimiseksi, analyysin perustana on käytettävä 
yksittäisistä toistoista saatuja arvoja eikä kunkin käsitellyn ryhmän 
laskettuja keskiarvoja.  
2.2.1  Keskimääräinen spesifinen kasvunopeus  
Tietyn ajanjakson keskimääräinen spesifinen kasvunopeus lasketaan 
kasvumuuttujien – versojen lukumäärän ja jonkin toisen mittaus ­
muuttujan (versojen kokonaispinta-alan, kuivapainon tai tuorepainon) – logaritmisena kasvuna soveltamalla seuraavaa kaa ­
vaa kaikkiin kontrolliliuosten ja käsiteltyjen liuosten toistoihin:
 
μ i–j ¼ lnðN j Þ – lnðN i Þ 
t 
jossa  
— μ i–j = keskimääräinen spesifinen kasvunopeus aikavälillä i–j  
— N  i = testi- tai kontrolliryhmän astiasta määritetty mittaus ­
muuttujan arvo hetkellä i  
— N  j = testi- tai kontrolliryhmän astiasta määritetty mittaus ­
muuttujan arvo hetkellä j  
— t = aikaväli i–j.  
Kullekin käsittely- ja kontrolliryhmälle lasketaan kasvunopeuden 
keskiarvo varianssiestimaatteineen.  
Keskimääräinen spesifinen kasvunopeus on laskettava koko testijak ­
solta (edellä olevassa kaavassa hetki ”i” tarkoittaa testin alkua ja hetki ”j” testin päättymistä). Kullekin testipitoisuudelle ja kontrollille 
lasketaan keskimääräisen spesifisen kasvunopeuden keskiarvo vari ­
anssiestimaatteineen. Sen lisäksi on määritettävä jaksoittaiset kasvu ­
nopeudet, jotta voidaan arvioida testiaineen vaikutuksia koko altis ­
tusaikana (esimerkiksi analysoimalla logaritmisia kasvukäyriä). Mer ­
kittävät erot jaksoittaisen kasvunopeuden ja keskimääräisen kasvuno ­
peuden välillä osoittavat, että kasvu poikkeaa jatkuvasta eksponenti ­
aalisesta kasvusta, jolloin kasvukäyriä on syytä tarkastella lähemmin. Siinä tapauksessa varovaisena lähestymistapana on verrata käsitelty ­
jen viljelmien spesifisiä kasvunopeuksia suurimman kasvunestymisen 
aikana kontrollien vastaaviin kasvunopeuksiin samana aikana.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1363
 
Kasvunopeuden prosentuaalinen estyminen (I  r ) voidaan sen jälkeen 
laskea kutakin testipitoisuutta varten (käsittelyryhmässä) seuraavan 
kaavan avulla:  
% I r ¼ ðμ C – μ T Þ 
μ C Ü 100  
jossa  
— %I  r = keskimääräisen spesifisen kasvunopeuden prosentuaa ­
linen estyminen  
— μ C = μ:n keskiarvo kontrolliryhmässä  
— μ T = μ:n keskiarvo käsittelyryhmässä.  
2.2.2  Tuotos  
Tuotokseen kohdistuvat vaikutukset määritetään seuraavien kahden 
mittausmuuttujan avulla: versojen lukumäärä ja jokin toinen mittaus ­
muuttuja (versojen kokonaispinta-ala, kuivapaino tai tuorepaino), joka mitataan jokaisesta koeastiasta testin alussa ja lopussa. Jos toi ­
sena mittausmuuttujana käytetään kuivapainoa tai tuorepainoa, testin 
alussa oleva biomassa määritetään samasta erästä otetun versonäyt ­
teen avulla, jota on käytetty koeastioiden siirrostamiseen (ks. kohdan 1.7.3 toinen kappale). Kullekin testipitoisuudelle ja kontrol ­
lille lasketaan tuotoksen keskiarvo varianssiestimaatteineen. Tuotok ­
sen prosentuaalinen estyminen (% I
 y ) voidaan laskea kutakin käsit ­
telyryhmää varten seuraavasti:  
% I y ¼ ðb C – b T Þ 
b C Ü 100  
jossa  
— % I  y = tuotoksen prosentuaalinen estyminen  
— b  C = kontrolliryhmän lopullinen biomassa, josta on vähen ­
netty sen biomassa testin alussa  
— b  C = käsittelyryhmän lopullinen biomassa, josta on vähen ­
netty sen biomassa testin alussa.  
2.2.3  Pitoisuus-vastekäyrien piirtäminen  
Pitoisuus-vastekäyrät piirretään merkitsemällä y-akselille vastemuut ­
tujan keskimääräinen prosentuaalinen estyminen (vastemuuttujana on I
 r tai I  y , joka lasketaan 2.2.1 kohdan viimeisen kappaleen 
tai 2.2.2 kohdan mukaan) ja x-akselille testiaineen pitoisuuden loga ­
ritmi.  
2.2.4  EC  x -pitoisuuden arviointi  
EC x -pitoisuuden estimaattien (esimerkiksi EC  50 -arvon) on perustut ­
tava sekä keskimääräiseen spesifiseen kasvunopeuteen (E  r C x ) että 
tuotokseen (E  y C x ). Näistä kummankin on puolestaan perustuttava 
versojen lukumäärään ja johonkin toiseen mittausmuuttujaan (verso ­
jen kokonaispinta-alaan, kuivapainoon tai tuorepainoon), koska eräät 
testiaineet vaikuttavat eri tavalla versojen lukumäärään kuin muihin 
mittausmuuttujiin. Tavoitteena on siis saada myrkyllisyysparamet ­
reiksi seuraavat neljä EC  x -arvoa kutakin laskettua kasvunestymista ­
soa x kohden: E  r C x (versojen lukumäärä); E  r C x (versojen kokonais ­
pinta-ala, kuivapaino tai tuorepaino); E  y C x (versojen lukumäärä) ja 
E y C x (versojen kokonaispinta-ala, kuivapaino tai tuorepaino).  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1364
 
2.3 TILASTOMENETELMÄT  
Tavoitteena on saada kvantitatiivinen pitoisuus-vastesuhde regressi ­
oanalyysin avulla. Painotettua lineaarista regressiota voidaan käyttää sen jälkeen, kun vastetiedoille on tehty linearisoiva muunnos – esi ­
merkiksi probitti-, logitti- tai Weibull-yksiköiksi (16) – mutta suosi ­
teltavampaa on käyttää epälineaarisia regressiomenetelmiä, joilla voi ­
daan paremmin käsitellä tiedoissa väistämättä esiintyviä epäsäännöl ­
lisyyksiä sekä poikkeamia tasaisista jakaumista. Lähestyttäessä tilaa, 
jossa kasvu ei esty ollenkaan tai estyminen on täydellistä, lineari ­
soiva muunnos voi suurentaa epäsäännöllisyyksiä ja haitata siten analyysiä (16). On syytä huomata, että standardianalyysimenetelmät, 
joissa käytetään probitti-, logitti- tai Weibull-muunnoksia, on tarkoi ­
tettu dikotomisia tietoja varten (kun vasteita on kaksi, esimerkiksi kuolleisuus tai eloonjääminen), minkä vuoksi niitä on mukautettava, jos niitä aiotaan käyttää kasvu- tai tuotostietojen analysointiin. Kir ­
jallisuusviitteissä (17), (18) ja (19) kuvataan erityismenetelmiä, joilla 
EC
 x -arvot voidaan määrittää jatkuvista tiedoista.  
Kunkin vastemuuttujan analysoimiseksi käytetään pitoisuus-vastesuh ­
detta, jonka avulla lasketaan EC  x -arvojen piste-estimaatit. Jokaiselle 
estimaatille on määritettävä 95 prosentin luottamusväli, jos se on mahdollista. Vastetietojen ja regressiomallin välinen yhteensopivuu ­
den aste on arvioitava joko graafisesti tai tilastollisesti. Regressiona ­
nalyysi on tehtävä käyttämällä yksittäisiä toistojen vasteita eikä kä ­
sittelyryhmien keskiarvoja.
 
EC 50 -estimaatit ja luottamusvälit saadaan myös käyttämällä lineaa ­
rista interpolointia bootstrap-menetelmän kanssa (20), jos käytettä ­
vissä olevat regressiomallit tai -menetelmät eivät sovellu kyseisten 
tietojen käsittelyyn.  
LOEC-pitoisuuden ja siten myös NOEC-pitoisuuden arvioimiseksi 
on verrattava käsiteltyjen liuosten keskiarvoja käyttämällä varians ­
sianalyysitekniikoita (ANOVA). Sen jälkeen on verrattava kunkin pitoisuuden keskiarvoa kontrolliryhmän keskiarvoon käyttämällä so ­
pivaa moniulotteista vertailumenetelmää tai trenditestimenetelmää. 
Dunnettin tai Williamsin testi voi olla käyttökelpoinen (21)(22)(23) ­
(24). Lisäksi on arvioitava, pitääkö ANOVA-oletus varianssin homo ­
geenisuudesta paikkansa. Arviointi voidaan tehdä graafisesti tai vi ­
rallisen testin avulla (25). Sopivia testejä ovat Levenen ja Bartlettin 
testit. Jos oletus varianssin homogeenisuudesta ei pidä paikkaansa, tilanne on joskus korjattavissa tietojen logaritmimuunnoksella. Jos varianssin heterogeenisuus on erittäin suuri eikä se ole korjattavissa 
muunnoksella, on harkittava analysointia sellaisilla menetelmillä kuin 
Jonckheeren alaspäin askeltava trenditesti. Kirjallisuusviitteessä (19) annetaan lisäohjeita NOEC-arvon määrittämisestä.
 
Tieteen viimeaikaisen kehityksen perusteella on suositeltu, että NO ­
EC-käsitteestä luovuttaisiin ja se korvattaisiin regressioanalyysiin pe ­
rustuvilla EC  x :n piste-estimaateilla. Sopivaa x:n arvoa ei ole vielä 
vahvistettu tätä  Lemna -testiä varten. Sopivalta vaikuttaisi väli 
10–20 prosenttia (valitun vastemuuttujan mukaan), ja on suositelta ­
vaa ilmoittaa sekä EC  10 - että EC  20 -arvo.  
3. RAPORTOINTI  
3.1 TESTIRAPORTTI  
Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:  
Testiaine:  
— fysikaalinen olomuoto ja fysikokemialliset ominaisuudet, mukaan 
luettuna vesiliukoisuuden raja-arvo,  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1365
 
— kemialliset tunnistetiedot (esimerkiksi CAS-numero), mukaan lu ­
ettuna puhtaus.  
Koelajit:  
— tieteellinen nimi, klooni (jos tiedossa) ja alkuperä.  
Testiolosuhteet:  
— testauksessa käytetty menetelmä (staattinen, semistaattinen 
tai läpivirtausmenetelmä),  
— testin alkamispäivä ja kesto,  
— testiviljelyaine,  
— koejärjestely: koeastiat ja niiden sulkimet, liuostilavuudet, kolo ­
nioiden ja versojen lukumäärä koeastiaa kohden testin alussa,  
— testipitoisuudet (nimellis- ja mitatut pitoisuudet tapauksen mu ­
kaan) sekä toistojen määrä pitoisuutta kohden,  
— kanta- ja testiliuosten valmistusmenetelmät, mukaan luettuina tie ­
dot mahdollisesta liuottimen tai dispergointiaineen käytöstä,  
— lämpötila testin aikana,  
— valolähde, valon voimakkuus ja homogeenisuus,  
— testi- ja kontrolliviljelyaineen pH-arvot,  
— testiaineen pitoisuudet ja analyysimenetelmä sekä laadunarvioin ­
tiin tarvittavat tiedot (validointitutkimukset, analyysien keskihajo ­
nnat ja luottamusvälit),  
— versojen lukumäärän ja muiden mittausmuuttujien, kuten kuiva ­
painon, tuorepainon tai versojen kokonaispinta-alan, määritysme ­
netelmät,  
— kaikki poikkeamat tästä testimenetelmästä.  
Tulokset:  
— raakatiedot: versojen lukumäärä ja muut mittausmuuttujat jokai ­
sessa testaukseen ja toistoihin käytetyssä koeastiassa kullakin havainnointi- ja analysointikerralla,
 
— kunkin mittausmuuttujan keskiarvot ja keskihajonnat,  
— kutakin pitoisuutta vastaavat kasvukäyrät (suosituksena on käyt ­
tää mittausmuuttujan logaritmimuunnosta, ks. 2.2.1 kohdan toi ­
nen kappale),  
— kaksinkertaistumisaika/kasvunopeus kontrollissa versojen luku ­
määrän avulla laskettuna,  
— kunkin käsitellyn toiston lasketut vastemuuttujat sekä toistojen 
keskiarvot ja variaatiokerroin,  
— pitoisuuden ja vaikutuksen välisen suhteen graafinen esitys,  
— myrkyllisyysarvioinnin päätepisteiden estimaatit vastemuuttujien 
osalta, esimerkiksi EC  50 , EC  10 ja EC  20 , ja vastaavat luottamus ­
välit; LOEC- ja/tai NOEC-pitoisuus, jos ne on laskettu, ja niiden 
määrityksessä käytetyt tilastomenetelmät,  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1366
 
— jos on käytetty ANOVA-analyysiä, havaittavissa olevan vaiku ­
tuksen suuruus (esimerkiksi vähiten merkitsevä erotus),  
— mahdollinen kasvun edistyminen käsittelyissä liuoksissa,  
— näkyvät merkit fytotoksisuudesta ja testiliuoksia koskevat havain ­
not, 
— tulosten pohdinta, mukaan luettuna mahdolliset vaikutukset, joita 
tästä testimenetelmästä poikkeamisella on ollut testin tuloksiin.  
4. KIRJALLISUUS  
(1) OECD TG 221 (2006)  Lemna  Sp. Growth Inhibition Test.  
(2) The use of  Lemna  studies for coloured substances is detailed in 
Section 13.5.3 of the EU Manual of Decisions dated July 2006, at http://ecb.jrc.ec.europa.eu/new-chemicals.
 
(3) Guidance on information requirements and chemical safety as ­
sessment – Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; Table 
7.8.3 Summary of difficult substance testing issues, available at  
http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/ ­
information_requirements_en.htm?time=1234958685#A.  
(4) ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415-91 (hyväk ­
sytty uudelleen vuonna 1998). s. 733–742. Annual Book of 
ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environ ­
mental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Cons ­
hohocken, PA.  
(5) USEPA – United States Environmental Protection Agency. 
(1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  
Lemna  spp., ”Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8 s.  
(6) AFNOR – Association Française de Normalisation. (1996). XP 
T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de  
Lemna minor . 10 s.  
(7) SIS – Svenska standardiseringsinstitutet (1995). Vattenunder ­
sökningar – Bestämning av tillväxthämning (7 dygn) hos flytb ­
ladsväxten  Lemna minor , andmat. SS 02 82 13. 15 s.  
(8) Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for 
Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Mac ­
rophyte,  Lemna minor . EPS 1/RM/37–120 s.  
(9) Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registra ­
tion of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Eva ­
luation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.
 
(10) Sims I., Whitehouse P., and Lacey R. (1999). The OECD  
Lemna  Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing 
of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency.
 
(11) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Tes ­
ting of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmen ­
tal Health and Safety Publications, Series on Testing and As ­
sessment No. 23.  
(12) ISO DIS 20079. Water Quality – Determination of the Toxic 
Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed 
(Lemna minor ) – Duckweed Growth Inhibition Test.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1367
 
(13) Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with 
duckweed ( Lemna minor  L.). Environmental Research Labora ­
tory – Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA- 600/3-77 108. Syyskuu 1977.
 
(14) Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bioassays 
with a floating plant ( Lemna minor ) for effects of sprayed and 
dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, s. 353–359.  
(15) Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the assess ­
ment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, s. 481–483.
 
(16) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 
19, s. 713–718.  
(17) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, s. 157–167.
 
(18) Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxico ­
logy and Chemistry, 11, s. 1485–1494.  
(19) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
(20) Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assess ­
ment Center Technical Report 05–88. USEPA, Duluth, MN.  
(21) Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, s. 1096–1121.  
(22) Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, s. 482–491.  
(23) Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics, 27: 103–117.  
(24) Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28: 510–531.  
(25) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, s. 93–96.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1368
 
Lisäys 1  
Lemna  spp:n kuvaus  
Limaskaksi yleisesti kutsuttu vesikasvi  Lemna  spp. kuuluu  Lemnaceae -heimoon. 
Siihen kuuluu neljä sukua, joiden lajeja esiintyy kaikkialla maailmassa. Niiden erilaisia ulkomuotoja ja taksonomiaa on käsitelty perusteellisesti kirjallisuusviit ­
teissä (1)(2).  Lemna gibba  ja Lemna minor  ovat lauhkean vyöhykkeen alueille 
luonteenomaisia lajeja. Niitä käytetään yleisesti myrkyllisyystesteissä. Molem ­
milla lajeilla on kelluva tai vedenalainen levymäinen verso, ja kunkin verson alapinnan keskiosasta lähtee hyvin ohut juuri.  Lemna  spp. kukkii hyvin harvoin 
ja lisääntyy kasvullisesti tuottamalla uusia versoja (3). Nuoremmat kasvit ovat 
vanhempiin kasveihin verrattuna yleensä vaaleampia, niillä on lyhyemmät juuret ja niissä on kaksi tai kolme erikokoista versoa.  Lemna -suvun kasvit sopivat 
erittäin hyvin laboratoriokokeisiin pienen kokonsa, yksinkertaisen rakenteensa, 
suvuttoman lisääntymisensä ja lyhyen generaatioaikansa ansiosta (4)(5).
 
Koska kasvien herkkyys luultavasti vaihtelee lajista toiseen, herkkyyttä vertailta ­
essa hyväksytään ainoastaan lajin sisäiset vertailut.  
Kirjallisuutta: esimerkkejä testauksessa käytetyistä  Lemna -lajeista:  
Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga  Ceramium 
strictum  and the duckweed  Lemna aequinoctialis  in aquatic ecotoxicological 
bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.
 
Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of  Lemna major  as a 
function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935–941.  
Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). 
OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., ”Public draft”. 
EPA 712-C-96-156. 8 s.  
Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Déter ­
mination de l'inhibition de la croissance de  Lemna minor . 10 s.  
SIS – Svenska standardiseringsinstitutet (1995). Vattenundersökningar – Bestäm ­
ning av tillväxthämning (7 dygn) hos flytbladsväxten  Lemna minor , andmat. SS 
02 82 13. 15 s.  
Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static 
Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415-91 (hyväksytty uudelleen vuonna 
1998). S. 733–742.  
United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 
850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., ”Public draft”. EPA 
712-C-96-156. 8 s.  
Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981).  Lemna  (duckweed) as an 
indicator of water pollution. I. The sensitivity of  Lemna paucicostata  to heavy 
metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959–1969.  
Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of 
metals by duckweed ( Lemna perpusilla ). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87–96.  
Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assess ­
ment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481–483.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1369
 
Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity 
and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102–2111.  
Lemna -lajien hankintalähteitä  
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria  
Department of Botany, University of Toronto  
Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2  
Puhelin: +1-416-978-3641  
Faksi:+1-416-978-5878  
Sähköposti: jacreman@botany.utoronto.ca  
http://www.botany.utoronto.ca/utcc  
North Carolina State University  
Forestry Dept  
Duckweed Culture Collection  
Campus Box 8002  
Raleigh, NC 27695-8002  
United States  
Puhelin: 001 (919) 515-7572  
Sähköposti: astomp@unity.ncsu.edu  
Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University  
SE-106 91 Stockholm  
Sweden  
Puhelin: +46 8 674 7240  
Faksi: +46 8 674 7636  
Federal Environmental Agency (UBA)  
FG III 3.4  
Schichauweg 58  
12307 Berlin  
Germany  
Sähköposti: lemna@uba.de  
http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm  
Kirjallisuus  
(1) Hillman, W.S. (1961). The  Lemnaceae  or duckweeds: A review of the desc ­
riptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221–287.  
(2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed 
(Lemnaceae ). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, 
Switzerland.  
(3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human uti ­
lization of duckweeds ( Lemnaceae  family). ISBN 82-991150-0-0. The Agri ­
cultural Research Council of Norway, University of Oslo.  
(4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common 
duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1–14.  
(5) Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environ ­
mental Research, 52:7–22.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1370
 
Lisäys 2  
Kantaviljelmän ylläpito  
Kantaviljelmiä voidaan säilyttää alhaisissa lämpötiloissa (4–10 °C) suhteellisen 
pitkiä aikoja käynnistämättä niitä uudelleen.  Lemna -kasvien viljelyaine voi olla 
sama kuin testauksessa käytetty viljelyaine, mutta kantaviljelmissä voidaan käyt ­
tää myös muita ravinteikkaita viljelyaineita.  
Joukko nuoria, vaaleanvihreitä kasveja siirretään säännöllisesti aseptisella mene ­
telmällä uusiin, tuoretta viljelyainetta sisältäviin viljelyastioihin. Jatkoviljelmiä voidaan käynnistää jopa kolmen kuukauden väliajoin tässä liitteessä ehdotetuissa viileissä olosuhteissa.
 
Kasveja viljeltäessä on käytettävä kemiallisesti puhtaita (happopestyjä) ja sterii ­
lejä lasisia kasvatusastioita sekä aseptisia käsittelytekniikoita. Jos esimerkiksi 
levät tai sienet kontaminoivat kantaviljelmän, on ryhdyttävä toimiin näiden eli ­
öiden poistamiseksi. Levät ja useimmat muut kontaminoivat eliöt voidaan poistaa pintasteriloinnilla. Kontaminoituneesta kasvimateriaalista otetaan näyte, ja juuret 
leikataan pois. Materiaalia ravistellaan puhtaassa vedessä voimakkaasti, minkä 
jälkeen se upotetaan 0,5 tilavuusprosentin natriumhypokloriittiliuokseen, jossa sitä pidetään 30 sekunnista 5 minuuttiin. Sen jälkeen kasvimateriaali huuhdellaan 
steriilillä vedellä ja siirretään erinä tuoretta viljelyainetta sisältäviin kasvatusasti ­
oihin. Monet versot kuolevat tämän käsittelyn jälkeen varsinkin, jos altistusajat ovat pitkiä, mutta osa eloon jäävistä versoista on yleensä vapautunut kontaminaa ­
tiosta. Näitä versoja voidaan käyttää uusien viljelmien siirrostamiseen.
 ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1371
 
Lisäys 3  
Viljelyaine  
L. minor - ja L. gibba  -lajin viljelyyn suositellaan eri viljelyaineita.  L. minor  -lajin 
viljelyyn suositellaan ruotsalaisen standardin (SIS) mukaisen viljelyaineen muun ­
nosta, kun taas  L. gibba  -lajin viljelyyn suositellaan 20X-AAP-viljelyainetta. 
Kummankin viljelyaineen koostumus esitetään jäljempänä. Näitä viljelyaineita 
valmistettaessa on käytettävä reagenssi- tai analyysilaatua olevia kemikaaleja ja deionisoitua vettä.
 
Ruotsalaisen standardin (SIS) mukainen viljelyaine Lemnan viljelyä varten  
— Kantaliuokset I–V steriloidaan autoklaavikäsittelyllä (120 °C, 15 minuuttia) 
tai kalvosuodatuksella (huokoskoko noin 0,2 μm). 
— Kantaliuos VI (ja valinnaisesti kantaliuos VII) voidaan steriloida vain kalvo ­
suodatuksella; näitä liuoksia ei saa autoklavoida.  
— Steriilejä kantaliuoksia säilytetään viileässä ja pimeässä. Kantaliuokset I–V on 
heitettävä pois kuuden kuukauden kuluttua. Kantaliuosta VI (ja valinnaista kantaliuosta VII) voidaan säilyttää yhden kuukauden ajan.
 
Kantaliuoksen 
numero Aine Pitoisuus kantali ­
uoksessa (g·l  –1 ) Pitoisuus valmis ­
tetussa viljely ­
aineessa (mg·l  –1 ) Valmistettu viljelyaine 
Alkuaine Pitoisuus (mg·l  –1 ) 
I NaNO  3 
KH  2 PO 4 8,50 
1,34 85 
13,4 Na; N 
K; P 32; 14 
6,0; 2,4 
II MgSO  4 · 7H  2 O 15 75 Mg; S 7,4; 9,8 
III CaCl  2 · 2H  2 O 7,2 36 Ca; Cl 9,8; 17,5 
IV Na 2 CO 3 4,0 20 C 2,3 
V H 3 BO 3 
MnCl  2 · 4H  2 O 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 
ZnSO  4 · 7H  2 O 
CuSO  4 · 5H  2 O 
Co(NO  3 ) 2 · 6H  2 O 1,0 
0,20 
0,010 0,050 0,0050 
0,010 1,00 
0,20 
0,010 0,050 0,0050 
0,010 B 
Mn 
Mo Zn Cu 
Co 0,17 
0,056 
0,0040 0,011 0,0013 
0,0020 
VI FeCl
 3 · 6H  2 O 
Na 2 -EDTA·2H  2 O 0,17 
0,28 0,84 
1,4 Fe 
— 0,17 
— 
VII MOPS (puskuri) 490 490 — —  
— Yksi litra SIS-viljelyainetta valmistetaan lisäämällä seuraavat aineet 
900 ml:aan deionisoitua vettä:  
— 10 ml kantaliuosta I  
— 5 ml kantaliuosta II  
— 5 ml kantaliuosta III  
— 5 ml kantaliuosta IV  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1372
 
— 1 ml kantaliuosta V  
— 5 ml kantaliuosta VI  
— 1 ml kantaliuosta VII (valinnaisesti).  
Huomautus:  Eräitä testiaineita varten voidaan tarvita ylimääräistä kantaliuosta VII 
(MOPS-puskuria) (ks. 1.4 kohdan viimeinen kappale).  
— Viljelyaineen pH säädetään arvoon 6,5 ± 0,2 käyttämällä 0,1 tai 1 mol HCl:a 
tai NaOH:a, minkä jälkeen lisätään deionisoitua vettä, kunnes tilavuus on yksi litra.
 
20X-AAP-viljelyaine  
Kantaliuokset valmistetaan steriiliin tislattuun tai deionisoituun veteen.  
Steriilejä kantaliuoksia säilytetään viileässä ja pimeässä. Tällaisissa olosuhteissa 
kantaliuokset säilyvät ainakin 6–8 viikkoa.  
20X-AAP-viljelyainetta varten valmistetaan viisi ravinnepitoista kantaliuosta (A1, 
A2, A3, B ja C) käyttämällä reagenssilaatua olevia kemikaaleja. Viljelyaineen 
valmistamiseksi lisätään 20 ml kutakin ravinnepitoista kantaliuosta noin 850 ml:aan deionisoitua vettä. Viljelyaineen pH säädetään arvoon 7,5 ± 0,1 käyttämällä 0,1 tai 1 mol HCl:a tai NaOH:a, minkä jälkeen lisätään deionisoitua 
vettä, kunnes tilavuus on yksi litra. Sen jälkeen viljelyaine suodatetaan steriiliin 
astiaan kalvosuodattimen läpi, jonka huokoskoko on noin 0,2 μm.
 
Testauksessa käytettävä viljelyaine on valmistettava 1–2 päivää ennen käyttöä, 
jotta pH stabiloituisi. Viljelyaineen pH on tarkistettava ennen käyttöä ja tarvitta ­
essa säädettävä uudelleen lisäämällä 0,1 tai 1 M NaOH:a tai HCl:a, kuten edellä on kuvattu.
 
Kantaliuoksen 
numero Aine Pitoisuus kantaliu ­
oksessa (g·l  –1 ) ( 1 ) Pitoisuus valmiste ­
tussa viljely ­
aineessa (mg·l  –1 ) ­
(*) Valmistettu viljelyaine 
Alkuaine Pitoisuus (mg·l  –1 ) ­
(*) 
A1 NaNO  3 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 26 
12 4,4 510 
240 90 Na; N 
Mg Ca 190; 84 
58,08 24,04 
A2 MgSO
 4 ·7H  2 O 15 290 S 38,22 
A3 K 2 HPO  4 ·3H  2 O 1,4 30 K; P 9,4; 3,7 
B H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 0,19 
0,42 
0,16 
0,30 3,3 mg·l
 –1 
1,4 mg·l  –1 
7,3 mg·l  –1 
0,012 mg·l  –1 3,7 
8,3 
3,2 
6,0 66 μg·l
 –1 
29 μg·l –1 
145 μg·l –1 
0,24 μg·l –1 B 
Mn 
Fe 
— Zn Co 
Mo 
Cu 0,65 
2,3 
0,66 
— 31 μg·l
 –1 
7,1 μg·l –1 
58 μg·l –1 
0,080 μg·l –1 
C NaHCO  3 15 300 Na; C 220; 43  
(*) Jollei toisin ilmoiteta.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1373
 
Alaviite:  Teoreettisesti sopiva lopullinen bikarbonaattipitoisuus (jossa pH:ta ei tarvitse säätää 
kovin paljon) on 15 mg/l (ei siis 300 mg/l). 20X-AAP-viljelyaineen aiemmassa käy ­
tössä, muun muassa tätä testimenetelmää koskevassa yhteistutkimuksessa, bikarbon ­
aattipitoisuus on kuitenkin ollut 300 mg/l. (I. Sims, P. Whitehouse and R. Lacey. (1999) The OECD  Lemna  Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of 
draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environ ­
ment Agency.)
 
Steinbergin viljelyaine (ISO 20079 -standardin mukaan)  
Pitoisuudet ja kantaliuokset  
— Muutettua Steinbergin viljelyainetta käytetään ISO 20079 -standardissa ai ­
noastaan  Lemna minor  -lajin viljelyyn (koska standardissa ei sallita muita 
lajeja), mutta testit ovat osoittaneet, että sillä voidaan saada hyviä tuloksia myös  Lemna gibba  -lajin viljelyssä.
 
— Viljelyainetta valmistettaessa on käytettävä reagenssi- tai analyysilaatua ole ­
via kemikaaleja ja deionisoitua vettä.  
— Ravinneliuos valmistetaan kantaliuoksesta tai 10 kertaa väkevämmästä vilje ­
lyaineesta, jolloin liuoksen pitoisuus saadaan mahdollisimman suureksi ilman 
saostumista.  
Taulukko 1  
pH-stabiloitu Steinbergin viljelyaine (muutettu Altenburgerin mukaan)  
Aine Ravinneliuos  
Makroravinteet  moolipaino mg/l mmol/l  
KNO  3 101,12 350,00 3,46 
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 236,15 295,00 1,25 
KH  2 PO 4 136,09 90,00 0,66 
K 2 HPO  4 174,18 12,60 0,072 
MgSO  4 · 7H  2 O 246,37 100,00 0,41  
Mikroravinteet  moolipaino μg/l μmol/l 
H 3 BO 3 61,83 120,00 1,94 
ZnSO  4 · 7H  2 O 287,43 180,00 0,63 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 241,92 44,00 0,18 
MnCl  2 · 4H  2 O 197,84 180,00 0,91 
FeCl  3 · 6H  2 O 270,21 760,00 2,81 
EDTA-dinatriumdihydraatti 372,24 1 500,00 4,03  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1374
 
Taulukko 2  
Kantaliuokset (makroravinteet)  
1. Makroravinteet (50-kertainen väkevöinti)  g/l  
Kantaliuos 1:  
KNO  3 17,50 
KH  2 PO 4 4,5 
K 2 HPO  4 0,63 
Kantaliuos 2:  
MgSO  4 · 7H  2 O 5,00  
Kantaliuos 3:  
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 14,75  
Taulukko 3  
Kantaliuokset (mikroravinteet)  
2. Mikroravinteet (1 000-kertainen väkevöinti)  mg/l  
Kantaliuos 4:  
H 3 BO 3 120,0  
Kantaliuos 5:  
ZnSO  4 · 7H  2 O 180,0  
Kantaliuos 6:  
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 44,0  
Kantaliuos 7:  
MnCl  2 · 4H  2 O 180,0  
Kantaliuos 8:  
FeCl  3 · 6H  2 O 760,00 
EDTA-dinatriumdihydraatti 1 500,00  
— Kantaliuokset 2 ja 3 voidaan yhdistää, samoin kuin kantaliuokset 4–7 (ottaen 
samalla huomioon vaaditut pitoisuudet).  
— Jotta kantaliuokset säilyisivät pitempään, ne voidaan autoklavoida 121 °C:ssa 
20 minuutin ajan tai niille voidaan tehdä steriili suodatus (huokoskoko 
0,2 μm). Kantaliuoksen 8 steriili suodatus (huokoskoko 0,2 μm) on erittäin 
suositeltavaa.  
Steinbergin (muutetun) viljelyaineen lopullisen pitoisuuden valmistaminen  
— Lisätään 20 ml kantaliuoksia 1, 2 ja 3 (ks. taulukko 2) noin 900 ml:aan 
deionisoitua vettä saostumisen ehkäisemiseksi.  
— Lisätään 1,0 ml kantaliuoksia 4, 5, 6, 7 ja 8 (ks. taulukko 3).  
— Liuoksen pH:n on oltava 5,5 ± 0,2 (säädetään lisäämällä mahdollisimman 
vähän NaOH-liuosta tai HCl:a).  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1375
 
— Lisätään vettä, kunnes tilavuus on 1 000 ml.  
— Jos kantaliuokset on steriloitu ja niihin on käytetty sopivaa vettä, uutta ste ­
rilointia ei tarvita. Jos lopullinen viljelyaine steriloidaan, autoklaavikäsittelyn 
jälkeen (20 minuuttia 121 °C:ssa) on lisättävä kantaliuosta 8.  
Steinbergin (muutetun) viljelyaineen kymmenkertainen väkevöinti väli ­
aikaista varastointia varten  
— Lisätään 20 ml kantaliuoksia 1, 2 ja 3 (ks. taulukko 2) noin 30 ml:aan vettä 
saostumisen ehkäisemiseksi.  
— Lisätään 1,0 ml kantaliuoksia 4, 5, 6, 7 ja 8 (ks. taulukko 3). Lisätään vettä, 
kunnes tilavuus on 100 ml.  
— Jos kantaliuokset on steriloitu ja niihin on käytetty sopivaa vettä, uutta ste ­
rilointia ei tarvita. Jos lopullinen viljelyaine steriloidaan, autoklaavikäsittelyn 
jälkeen (20 minuuttia 121 °C:ssa) on lisättävä kantaliuosta 8.  
— Viljelyaineen pH:n on (lopullisessa pitoisuudessa) oltava 5,5 ± 0,2.  ▼M1 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1376
 
C.27  MYRKYLLISYYSTESTI CHIRONOMID-ELIÖLLÄ VESI-SEDI ­
MENTTISYSTEEMISSÄ KÄYTTÄEN SEDIMENTTIÄ, JOHON TUTKIT ­
TAVAA AINETTA ON LISÄTTY  
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 218 (2004). Tällä 
testimenetelmällä on tarkoitus arvioida pitkäaikaisen kemikaalialtistuksen 
vaikutuksia makean veden kaksisiipisen  Chironomus -lajin (surviaissääsken) 
toukkiin, jotka elävät sedimentissä. Menetelmä perustuu  Chironomus ripa ­
rius- ja Chironomus tentans  -toksisuustestimenettelyihin, jotka on kehitetty 
Euroopassa (1)(2)(3) ja Pohjois-Amerikassa (4)(5)(6)(7)(8) ja vahvistettu 
yhteistutkimuksissa (ring-test) (1)(6)(9). Myös muita hyvin dokumentoituja chironomid-lajeja, kuten  Chironomus yoshimatsui  (10)(11), voidaan käyttää.
 
2. Tässä testimenetelmässä altistus tapahtuu lisäämällä sedimenttiin testiainetta. 
Soveltuvan altistuksen valinta määräytyy testin sovellustarkoituksen mu ­
kaan. Testiaineen lisäämisellä sedimenttiin on tarkoitus simuloida kemikaa ­
lin pysyvää kertymää sedimenttiin. Tässä altistusjärjestelmässä tutkittavaa 
ainetta lisätään vesi-sedimenttisysteemin sedimenttiin.  
3. Aineet, joita sedimentissä elävillä eliöillä testataan, säilyvät yleensä sedi ­
mentissä pitkään. Sedimentissä elävien eliöiden altistamiseen voidaan käyt ­
tää useita reittejä. Jokaisen altistusreitin suhteellinen tärkeys sekä toksiseen 
kokonaisvaikutukseen vaadittava aika määräytyvät käytettävän kemikaalin fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien mukaan. Jos kyseessä on voimak ­
kaasti adsorboiva aine (esim. log K
 ow > 5) tai aine, joka sitoutuu kovalent ­
tisesti sedimenttiin, kontaminoituneen ravinnon nauttiminen voi olla tärkeä 
altistusreitti. Jotta hyvin rasvahakuisten aineiden myrkyllisyyttä ei aliarvioi ­
da, voidaan harkita ravinnon lisäämistä sedimenttiin ennen testiaineen lisää ­
mistä. Jotta kaikki mahdolliset altistusreitit voidaan huomioida, tämä testi ­
menetelmä keskittyy pitkäaikaiseen altistukseen. Testin kesto on 20–28 päi ­
vää C. riparius - ja C. yoshimatsui  -lajeille ja 28–65 päivää  C. tentans  
-lajille. Jos lyhytaikaisia tietoja tarvitaan tiettyyn tarkoitukseen, kuten epä ­
vakaan kemikaalin vaikutusten tutkimiseen, ylimääräiset rinnakkaisnäytteet 
voidaan poistaa 10 päivän jälkeen.  
4. Mitatut tutkittavat ominaisuudet ovat kuoriutuneiden täysikasvuisten koko ­
naismäärä ja kuoriutumiseen kulunut aika. Jos lyhytaikaiset lisätiedot ovat 
tarpeen, toukkien eloonjäämistä ja kasvua on suositeltavaa mitata vasta kymmenen päivän kuluttua käyttämällä ylimääräisiä rinnakkaisnäytteitä.
 
5. Synteettisen sedimentin käyttö on suositeltavaa. Synteettisellä sedimentillä 
on useita etuja luonnolliseen sedimenttiin verrattuna:  
— kokeellinen vaihtelu vähenee, koska sedimentti on toistettava ”vakiomat ­
riisi”, eikä kontaminoitumattomia ja puhtaita sedimenttilähteitä tarvitse etsiä
 
— testit voidaan aloittaa milloin tahansa ilman, että testisedimentin kausi ­
vaihtelua esiintyy, sedimentistä ei tarvitse poistaa alkuperäiselimistöä esikäsittelyllä ja lisäksi synteettisen sedimentin käyttö pienentää kuluja, joita rutiinitestaukseen tarvittavan sedimenttimäärän keräämisestä ken ­
tältä syntyy
 
— synteettisen sedimentin käyttö sallii toksisuuden vertailun ja aineiden 
lajittelemisen myrkyllisyyden mukaan.  
6. Käytetyt määritelmät on esitetty lisäyksessä 1.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1377
 
TESTIN PERIAATE  
7. Surviaissääsken munatoukat altistetaan testikemikaalin pitoisuusalueelle 
vesi-sedimenttisysteemeissä. Testiainetta lisätään sedimenttiin, ja munatou ­
kat siirretään dekantterilaseihin, joissa sedimentin ja veden pitoisuudet on 
stabiloitu. Surviaissääskien kuoriutumisaste ja kehittymisnopeus mitataan 
testin lopussa. Toukkien eloonjäänti ja paino voidaan myös tarvittaessa mi ­
tata 10 päivän kuluttua (käytättämällä soveltuvia ylimääräisiä rinnakkaisnä ­
ytteitä). Nämä tiedot analysoidaan regressiomallilla, jolla arvioidaan pitoi ­
suus, joka aiheuttaa X prosentin laskun kuoriutumisessa tai toukkien eloon ­
jäännissä tai painossa (esim. EC  15 , EC  50 ), tai tilastollisen hypoteesin testillä, 
jolla määritetään NOEC/LOEC. Jälkimmäinen vaihtoehto edellyttää vaiku ­
tusarvojen vertaamista vertailuarvoihin tilastotutkimuksilla.  
TESTIAINETTA KOSKEVIA TIETOJA  
8. Testiaineen vesiliukoisuuden, höyrynpaineen, mitatun tai lasketun erottumi ­
sen erottuminen sedimenttiin sekä stabiiliuden vedessä ja sedimentissä on oltava tiedossa. Käytössä on oltava luotettava analyysimenetelmä, jolla tes ­
tiaine voidaan kvantifioida sedimentin päällä olevassa vedessä, huokosve ­
dessä ja sedimentissä, ja menetelmän tarkkuus ja havaitsemisraja tunnetaan 
ja ne on raportoitu. Hyödyllisiä tietoja ovat esimerkiksi rakennekaava ja testiaineen puhtaus. Myös testiaineen kemiallinen kohtalo (esim. häviämi ­
nen, abioottinen ja bioottinen hajoaminen) on hyödyllistä tietää. Kirjallisuus ­
viitteessä (12) annetaan lisäohjeita sellaisten aineiden testauksesta, joiden 
fysikaalis-kemialliset ominaisuudet vaikeuttavat niiden testaamista.
 
VERTAILUKEMIKAALIT  
9. Testimenettelyn ja testiolosuhteiden luotettavuus voidaan tarkistaa testaa ­
malla ajoittain vertailukemikaaleja. Esimerkkejä vertailumyrkyistä, joita on 
käytetty onnistuneesti yhteistutkimuksissa ja validointitutkimuksissa: lindaa ­
ni, trifluraliini, pentakloorifenoli, kadmiumkloridi ja kaliumkloridi (1)(2)(5)(6)(13).
 
TESTIN LUOTETTAVUUS  
10. Testi on luotettava, jos  
— kuoriutuvuus kontrolleissa on vähintään 70 prosenttia testin lopussa 
(1)(6)  
— C. riparius  ja C. yoshimatsui  aikuistuvat kontrolliastioissa 12–23 päivän 
kuluessa astiaan laittamisesta.  C. tentans  vaatii 20–65 päivää  
— testin lopussa mitataan jokaisen astian pH ja liuenneen hapen pitoisuus. 
Happipitoisuuden täytyy olla vähintään 60 prosenttia ilman 
kyllästysarvosta (ASV) käytetyssä lämpötilassa, ja sedimentin päällä ole ­
van veden pH-arvon pitää olla 6–9 kaikissa testiastioissa  
— veden lämpötila vaihtelee enintään ± 1,0 °C. Veden lämpötilaa voidaan 
kontrolloida tasalämpöisessä huoneessa, jolloin huoneen lämpötila on 
tarkistettava soveliain väliajoin.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1378
 
MENETELMÄN KUVAUS  
Testiastiat  
11. Tutkimus tehdään 600 ml:n dekantterilaseissa, joiden halkaisija on 8 cm. 
Muitakin astioita voidaan käyttää, kunhan sedimentin ja sen päällä olevan veden syvyys on sopiva. Sedimentin pinta-alan on oltava riittävä, jotta tilaa on 2–3 cm
 2 toukkaa kohden. Sedimenttikerroksen ja sen päällä olevan ve ­
den syvyyden suhteen on oltava 1:4. Testiastioiden ja muiden testijärjestel ­
män kanssa kosketuksissa olevien välineiden on oltava kokonaan lasia tai muuta kemiallisesti inerttiä materiaalia (esim. teflonia).
 
Lajin valinta  
12. Paras laji tähän testiin on  Chironomus riparius . Chironomus tentans  sovel­
tuu myös, mutta sen käsittely on hankalampaa ja se edellyttää pidempää testijaksoa. Myös  Chironomus yohimatsui  -lajia voidaan käyttää. Tietoa  
Chironomus riparius  -lajin kasvatusmenetelmistä on lisäyksessä 2. Myös 
muiden lajien kasvatusolosuhteista on saatavissa tietoa:  Chironomus tentans  
(4) and  Chironomus yoshimatsui  (11). Lajin tunnistus on varmistettava en ­
nen testiä, mutta sitä ei ole tarpeen tehdä ennen joka testiä, jos eliöt ovat 
peräisin omasta kasvattamosta.
 
Sedimentti  
13. Synteettisen sedimentin (keinosedimentin) käyttö on suositeltavaa. Jos kui ­
tenkin käytetään luonnollista sedimenttiä, se on kuvailtava (vähintään pH, 
orgaaninen kokonaishiilipitoisuus, mutta myös muut parametrit, kuten C/N- 
suhde ja rakeisuus ovat suositeltavia), eikä siinä saa olla kontaminaatiota tai muita organismeja, jotka saattavat kilpailla chironomid-eliöiden kanssa tai syödä ne. Lisäksi on suositeltavaa, että luonnollista sedimenttiä sopeutetaan 
ennen chironomid-eliöillä tehtävää myrkyllisyystestiä seitsemän päivää sa ­
moille olosuhteille, jotka testissä vallitsevat. Tätä testiä varten suositellaan seuraavaa synteettistä sedimenttiä, joka perustuu testimenetelmässä C.8 (14) käytettyyn keinomaahan (1)(15)(16):
 
a) 4–5 % (kuivapaino) turvetta: pH mahdollisimman tarkoin 5,5–6,0; on 
tärkeää käyttää ainoastaan ilmakuivattua jauhemaista turvetta, joka on 
jauhettu hienoksi (hiukkaskoko ≤ 1 mm)  
b) 20 % (kuivapaino) kaoliniittisavea (kaoliniitin osuus mieluiten yli 30 %)  
c) 75–76 % (kuivapaino) kvartsihiekkaa (pääosin hienoa hiekkaa, yli 50 
prosenttia 50–200 μm:n hiukkasia)  
d) deionisoitua vettä lisätään, kunnes lopullisen seoksen kosteus on 30- 
50 %  
e) kemiallisesti puhdasta kalsiumkarbonaattia (CaCO  3 ) lisätään, jotta lopul ­
lisen sedimenttiseoksen pH-arvoksi tulee 7,0 ± 0,5 orgaanisen hiilen pitoisuuden on oltava lopullisessa seoksessa 2 % (± 0,5 %). Sitä voidaan säätää lisäämällä sopiva määrä turvetta ja hiekkaa kohtien a) ja c) mu ­
kaisesti.
 
14. Turpeen, kaoliniittisaven ja hiekan alkuperän on oltava tiedossa. Tarkista, 
ettei sedimentin ainesosissa ole kemikaalista kontaminaatiota (esim. raskas ­
metalleja, orgaanisia klooriyhdisteitä ja orgaanisia fosforiyhdisteitä). Esi ­
merkki synteettisen sedimentin valmistuksesta on lisäyksessä 3. Myös kui ­
vien ainesosien sekoittaminen on hyväksyttävää, jos voidaan osoittaa, että 
sedimentin ainesosat eivät erotu (esim. kelluvia turvehiukkasia) veden lisää ­
misen jälkeen ja että turve tai sedimentti on sopeutunut tarpeeksi.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1379
 
Vesi 
15. Testivedeksi soveltuu vesi, joka täyttää lisäyksissä 2 ja 4 luetellut laimen ­
nusveden kemialliset ominaisuudet. Kasvatus- ja testivedeksi soveltuu mikä tahansa vesi, luonnonvesi (pinta- tai pohjavesi), synteettinen vesi (katso 
lisäys 2) tai talousvesi, josta on poistettu kloori, jos surviaissääsket voivat 
elää siinä viljelyn ja testauksen ajan osoittamatta stressaantumisen merkkejä. Testiveden pH-arvon on oltava testin alussa 6–9, eikä kokonaiskovuus Ca ­
CO
 3 :na saa olla yli 400 mg/l. Jos kovuusionien ja testiaineen välillä epäil ­
lään yhteisvaikutusta, on kuitenkin käytettävä pehmeämpää vettä (tässä ta ­
pauksessa ei saa käyttää Elendt M4 -viljelynestettä). Samantyyppistä vettä on käytettävä koko tutkimuksen ajan. Lisäyksessä 4 luetellut vedenlaadun 
ominaisuudet on mitattava vähintään kahdesti vuodessa tai aina kun on 
epäilystä siitä, että nämä ominaisuudet ovat voineet muuttua merkittävästi.
 
Kantaliuokset – sedimentit, joihin on lisätty testiainetta  
16. Sedimentit, joiden pitoisuus on haluttu, valmistetaan yleensä lisäämällä tes ­
tiaineliuosta suoraan sedimenttiin. Testiaineen kantaliuos, joka on liuotettu 
deionisoituun veteen, sekoitetaan synteettiseen sedimenttiin valssauskoneel ­
la, sekoittimella tai käsin. Jos testiaine liukenee huonosti veteen, se voidaan liuottaa käyttämällä pienintä mahdollista määrää soveltuvaa orgaanista liuo ­
tinta (esim. heksaania, asetonia tai kloroformia). Seuraavaksi liuokseen se ­
koitetaan 10 g hienoa kvartsihiekkaa yhtä testiastiaa kohden. Sen jälkeen liuottimen annetaan haihtua. Sitä ei saa jäädä hiekkaan yhtään. Seuraavaksi hiekkaan sekoitetaan sopiva määrä sedimenttiä jokaista dekantterilasia var ­
ten. Testiaineen liuottamiseen, dispergoimiseen tai emulgointiin saa käyttää 
vain helposti haihtuvia aineita. On pidettävä mielessä, että testiaineen ja hiekkaseoksen mukana tuleva hiekka on otettava huomioon sedimentin val ­
mistuksessa (eli sedimentin valmistukseen on käytettävä pienempi määrä 
hiekkaa). Varmista huolellisesti, että sedimenttiin lisättävä testiaine sekoittuu 
sedimenttiin hyvin ja tasaisesti. Homogeenisuusasteen voi määrittää tarvit ­
taessa analysoimalla osanäytteitä.
 
TESTISUUNNITELMA  
17. ”Testisuunnitelma” tarkoittaa testipitoisuuksien lukumäärän ja pitoisuusvä ­
lien valintaa, astioiden lukumäärää kutakin pitoisuutta kohti ja toukkien lukumäärää astiaa kohti. Suunnitelmat EC-pisteen arviointia, NOEC:n mää ­
ritystä ja rajatestin tekemistä varten on kuvattu.
 
Regressioanalyysille suositeltava testisuunnitelma  
18. Testissä käytettävien pitoisuuksien on katettava vaikutuspitoisuus (esim. 
EC 15 , EC  50 ) ja se pitoisuusalue, joka on merkityksellinen kyseisen testi ­
aineen kannalta.Tarkkuus ja etenkin luotettavuus, jolla vaikutuspitoisuuksien 
(EC  x ) estimaatit voidaan tehdä, paranee yleensä, kun vaikutuspitoisuus si ­
joittuu testattujen pitoisuuksien alueelle. Ekstrapolointia paljon matalimman positiivisen pitoisuuden alle tai korkeimman pitoisuuden ylle on vältettävä. 
Alustava pitoisuusalueen määrittely voi auttaa sopivien testipitoisuuksien 
valinnassa (katso kohta 27).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1380
 
19. Jos halutaan arvioida EC  x , jokaisesta pitoisuudesta tarvitaan vähintään viisi 
testipitoisuutta ja kolme rinnakkaisnäytettä. On joka tapauksessa suositelta ­
vaa käyttää riittäviä testipitoisuuksia, jotta mallin estimointi onnistuu hyvin. Pitoisuuksien välinen kerroin ei saa olla yli kaksi (poikkeus voidaan tehdä, jos annosvastekäyrä on loiva). Käsittelyssä käytettävien toistojen määrää 
voidaan laskea, jos eri vasteita aiheuttavien testipitoisuuksien määrää noste ­
taan. Jos toistojen määrää lisätään tai testipitoisuuden välejä pienennetään, testin luottamusväli yleensä kapenee. Toistoja tarvitaan lisää, jos halutaan arvioida toukkien eloonjäänti ja kasvu 10 päivän aikana.
 
NOEC:n/LOEC:n estimointiin suositeltava testisuunnitelma  
20. Jos halutaan arvioida LOEC tai NOEC, on käytettävä vähintään viittä tes ­
tipitoisuutta ja vähintään neljää rinnakkaisnäytettä, eikä pitoisuuksien väli ­
nen kerroin saa olla yli kaksi. Rinnakkaisnäytteiden määrän on oltava riit ­
tävän suuri, jotta tilastollinen voima on riittävä ja kontrollista havaitaan 20 
prosentin ero viiden prosentin merkitsevyystasolla (p = 0,05). Kehittymis ­
nopeuteen soveltuu yleensä varianssianalyysi (ANOVA), kuten Dunnett-testi ja Williams-testi (17)(18)(19)(20). Kuoriutumisasteeseen voidaan käyttää 
Cochran-Armitagen testiä, Fisherin tarkkaa testiä (Bonferronin korjauksella) 
tai Mantel-Haenszelin testiä.
 
Rajatesti  
21. Rajatesti (yksi testipitoisuus ja kontrolli) voidaan tehdä, jos alustavassa 
pitoisuusalueen määrityksessä ei havaittu vaikutuksia. Rajatestin tarkoituk ­
sena on tehdä testi riittävän suurella pitoisuudella, jotta päättäjät voivat sulkea pois testiaineen mahdolliset toksiset vaikutukset, ja raja asetetaan pitoisuuteen, jota ei odoteta esiintyvän missään tilanteessa. Suositeltava 
arvo on 1 000 mg/kg (kuivapaino). Yleensä vähintään kuusi rinnakkaisnäy ­
tettä sekä testi- että kontrollinäytteestä on tarpeen. On osoitettava, että tilas ­
tollinen voima on riittävä, jotta kontrollista havaitaan 20 prosentin ero viiden prosentin merkitsevyystasolla (p = 0,05). Jos vaste on metrinen (kehittymis ­
nopeus ja paino), t-testi on soveltuva tilastollinen menetelmä, jos tiedot 
täyttävät tämän testin vaatimukset (normaalisuus, homogeeniset vaihtelut). Jos vaatimukset eivät täyty, voidaan käyttää t-testiä, jossa varianssit ovat heterogeenisia, tai parametritonta testiä, kuten Wilcoxon-Mann-Whitheyn 
testiä. Fisherin tarkka testi soveltuu kuoriutumisasteeseen.
 
MENETTELY  
Altistumisolosuhteet  
Vesi-sedimenttisysteemin valmistelu käyttäen sedimenttiä, johon tutkittavaa 
ainetta on lisätty  
22. Testimenetelmässä C.8: Myrkyllisyystutkimus madoilla kuvattu lisäysmene ­
telmä on suositeltava tapa lisätä testiainetta (14). Sedimentit, joihin testiaine on lisätty, asetetaan astioihin ja niiden päälle lisätään vettä, kunnes sedi ­
mentin ja veden tilavuussuhde on 1:4 (katso kohdat 11 ja 15). Sedimentti ­
kerroksen syvyyden on oltava 1,5–3 cm. Sedimentin voi peittää muovikie ­
kolla, kun testivettä lisätään vesipatsaaseen, jotta sedimentin ainesosien erot ­
tuminen ja hienon materiaalin resuspensio voidaan välttää, mutta kiekko on 
poistettava heti tämän jälkeen. Myös muut välineet voivat olla sopivia.
 
23. Testiastiat on peitettävä (esim. lasilevyillä). Jos vettä haihtuu tutkimuksen 
aikana, lisää vettä, kunnes veden tilavuus on alkuperäisellä tasolla. Käytä 
tähän tarkoitukseen tislattua tai deionisoitua vettä, jotta suoloja ei keräydy.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1381
 
Stabilointi  
24. Kun sedimenttiin on lisätty testiaine ja sedimentin yläpuolelle on lisätty vesi, 
testiaineen on hyvä antaa erottua vesifaasista sedimenttiin (3)(4)(6)(13). Tämä on suositeltavaa tehdä samassa lämpötilassa ja ilmastuksessa, joita 
testissä käytetään. Sopiva tasapainottumisaika määräytyy sedimentin ja ke ­
mikaalin mukaan, ja se voi vaihdella tunneista päiviin tai harvinaisissa ta ­
pauksissa jopa viikkoihin (4–5 viikkoa). Koska monet kemikaalit voisivat hajota tässä ajassa, tasapainotilaa ei jäädä odottamaan, vaan tasapainottumi ­
sajaksi suositellaan 48 tuntia. Tämän tasapainottumisajan jälkeen testiaineen 
pitoisuus on mitattava sedimentin yläpuolisessa vedessä, huokosvedessä ja sedimentissä vähintään suurimmassa pitoisuudessa ja alemmassa pitoisuu ­
dessa (katso kohta 38). Näiden testiaineen analyyttisten määritysten perus ­
teella voidaan laskea massatase, ja tulokset voidaan ilmoittaa mitattujen pitoisuuksien pohjalta.
 
Testiorganismien lisääminen  
25. Neljä tai viisi päivää ennen testiorganismien lisäämistä munamassat otetaan 
viljelmistä ja pannaan pieniin astioihin kasvatusalustassa. Alustana voidaan 
käyttää kantaliuoksesta saatua kypsynyttä alustaa tai vasta valmistettua alus ­
taa. Jälkimmäisessä tapauksessa kasvatusalustaan lisätään pieni määrä ravin ­
toa, kuten viherlevää ja/tai muutama pisara hienoksi jauhetuista kalanruoka ­
hiutaleista saatua suodosta (katso lisäys 2). Käytä ainoastaan vastamunittuja 
munamassoja. Tavallisesti toukat alkavat kuoriutua muutama päivä munimi ­
sen jälkeen ( Chironomus riparius  2–3 vrk lämpötilassa 20 °C,  Chironomus 
tentans  1–4 vrk lämpötilassa 23 °C ja  Chironomus yoshimatui  1–4 vrk 
lämpötilassa 25 °C), ja toukkien kasvu tapahtuu neljässä vaiheessa, joista 
jokainen kestää 4–8 päivää. Testissä käytetään ensimmäisen kehitysvaiheen 
munatoukkia (2–3 tai 1–4 vrk kuoriutumisen jälkeen). Sääskien kehitysvai ­
heen voi tarkistaa pääkapselin leveydestä (6).  
26. Kaksikymmentä munatoukkaa sijoitetaan satunnaisesti tylpällä pipetillä jo ­
kaiseen testiastiaan, jossa on testiainetta sisältävää sedimenttiä ja vettä. Ve ­
den ilmastus on lopetettava, kun toukkia lisätään testiastioihin eikä sitä saa aloittaa 24 tuntiin toukkien lisäämisen jälkeen (katso kohdat 25 ja 32). Käytetyn testisuunnitelman (katso kohdat 19 ja 20) mukaisesti toukkien 
määrä pitoisuutta kohti on vähintään 60 EC-pisteen arviointia varten ja 80 
NOEC-määritystä varten.
 
Testipitoisuudet  
27. Raja-annostesti voi auttaa määrittämään pitoisuusaluetta varsinaista testiä 
varten. Tähän tarkoitukseen käytetään testiaineen pitoisuuksia laajoin pitoi ­
suusvälein. Jotta surviaissääskien pintatiheys on sama, jota käytetään varsi ­
naisessa testissä, surviaissääsket altistetaan jokaiselle testiaineen pitoisuu ­
delle siksi aikaa, että sopivat testipitoisuudet voidaan arvioida. Rinnakkais ­
näytteitä ei tarvita.  
28. Varsinaisessa testissä käytettävät testipitoisuudet päätetään raja-annostestin 
perusteella. Käytössä on oltava vähintään viisi pitoisuutta, jotka valitaan 
kohdissa 18 ja 20 kuvatulla tavalla.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1382
 
Kontrollit  
29. Testissä on käytettävä kontrolliastioita, joissa on sedimenttiä mutta ei testi ­
ainetta, ja soveltuvaa määrää rinnakkaisnäytteitä (katso kohdat 19–20). Jos testiaineen lisäyksessä on käytetty liuotinta (katso kohta 16), sedimentin 
liuotinkontrolli on lisättävä.
 
Testijärjestelmä  
30. Käytettävät järjestelmät ovat staattisia. Puolistaattisia tai läpivirtausjärjestel ­
miä, joissa sedimentin yläpuolinen vesi uusiutuu ajoittain tai jatkuvasti, 
voidaan käyttää poikkeustapauksissa, kuten jos vedenlaatu ei sovellu testi ­
organismille tai vaikuttaa kemialliseen tasapainoon (esim. liuenneen hapen pitoisuus laskee liian matalaksi, eritystuotteiden pitoisuus nousee liian kor ­
keaksi tai sedimentistä uuttuu mineraaleja, jotka vaikuttavat pH-arvoon ja/tai 
veden kovuuteen). Yleensä muut sedimentin päällä olevan veden laatua kohentavat toimet, kuten ilmastus, ovat kuitenkin riittäviä ja suositeltavia.
 
Ravinto  
31. Toukkia on ruokittava mieluiten päivittäin tai vähintään kolmesti viikossa. 
Riittävä määrä kalanruokaa (suspensiona vedessä tai hienoksi jauhettuna, esim. TetraMin tai TetraPhyll, lisätietoja lisäyksessä 2) on 0,25–0,5 mg 
(0,35–0,5 mg  C. yoshimatui  -lajille) päivässä toukkaa kohden ensimmäisten 
10 päivän aikana. Tätä vanhemmat toukat voivat tarvita vähän enemmän ruokaa: 0,5–1 mg päivässä toukkaa kohden pitäisi riittää testin loppuun saakka. Ravinnon määrää täytyy pienentää kaikissa käsittelyissä ja kontrol ­
leissa, jos sienikasvua ilmenee tai kontrolleissa esiintyy kuolleisuutta. Jos 
sienikasvua ei saada loppumaan, testi on toistettava. Jos kyseessä on voi ­
makkaasti adsorboiva aine (esim. log K
 ow > 5) tai aine, joka sitoutuu ko ­
valenttisesti sedimenttiin, organismien eloonjääntiin ja luontaiseen kasvuun 
tarvittava ravinnon määrä voidaan lisätä synteettiseen sedimenttiin ennen 
stabiloitumisvaihetta. Tässä tapauksessa on käytettävä kalanruoan sijaan kas ­
viainesta, kuten 0,5 prosenttia (kuivapaino) nokkosen ( Urtica dioica ), val­
komulperin ( Morus alba ), valkoapilan ( Trifolium repens ), pinaatin ( Spinacia 
oleracea ) tai muun kasviaineksen ( Cerophyl  tai alfaselluloosa) hienoksi jau ­
hettuja lehtiä.  
Inkubaatio-olosuhteet  
32. Sedimentin päällä olevaa vettä aletaan ilmastaa varovasti mieluiten 24 tuntia 
toukkien lisäämisen jälkeen, ja ilmastusta jatketaan testin loppuun saakka (on pidettävä huoli, ettei liuenneen hapen pitoisuus laske alle 60 prosenttiin ilman kyllästysarvosta). Ilmastus tapahtuu lasisella Pasteur-pipetillä, joka on 
kiinnitetty 2–3 senttiä sedimenttikerroksen yläpuolelle (yksi tai muutama 
kupla sekunnissa). Haihtuvia kemikaaleja testattaessa voidaan harkita, jäte ­
täänkö vesi-sedimenttisysteemi ilmastamatta.
 
33. Testi tehdään vakiolämpötilassa 20 °C (± 2 °C). Suositeltu lämpötila  C. 
tentans  -lajille on 23 °C (± 2 °C) ja  C. yoshimatui  -lajille 25 °C (± 2 °C). 
Valoisa aika on 16 tuntia, ja valon voimakkuuden pitää olla 500–1 000 
luksia.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1383
 
Altistuksen kesto  
34. Altistus alkaa, kun toukat lisätään astioihin, joissa on testiainetta, ja kont ­
rolliastioihin. Altistuksen enimmäiskesto on 28 vuorokautta lajeille  C. ripa­
rius ja C. yoshimatsui , ja 65 vuorokautta lajille  C. tentans . Jos sääsket 
kuoriutuvat aikaisemmin, testi voidaan lopettaa vähintään viisi päivää sen 
jälkeen, kun viimeinen surviaissääski on kasvanut täysikasvuiseksi kontrol ­
lissa.  
Havainnot  
Kuoriutuminen  
35. Kehitysaika ja täysin kuoriutuneiden uros- ja naarassääskien yhteismäärä 
määritetään. Urokset tunnistaa helposti sulkamaisista tuntosarvista.  
36. Testiastioita on tarkkailtava vähintään kolmesti viikossa ja epänormaalia 
käyttäytymistä on arvioitava silmämääräisesti (esim. sedimentistä poistumi ­
nen, epätavallinen uinti) kontrolliin verrattuna. Sääsket on laskettava päivit ­
täin, kun kuoriutuminen on odotettavissa. Täysikasvuisten sääskien suku ­
puoli ja lukumäärä kirjataan päivittäin. Tunnistuksen jälkeen sääsket poiste ­
taan astioista. Ennen testin loppua mahdollisesti munitut munamassat on 
kirjattava ylös ja poistettava, jottei sedimenttiin tule lisää toukkia. Myös 
niiden näkyvissä olevien koteloiden määrä, jotka eivät ole kuoriutuneet, on merkittävä ylös. Kuoriutumisen mittausohjeet ovat lisäyksessä 5.
 
Kasvu ja eloonjäänti  
37. Jos tiedot 10 vuorokauden toukkien eloonjäännistä ja kasvusta tarvitaan, 
testin alussa on otettava käyttöön ylimääräisiä testiastioita myöhempää käyt ­
töä varten. Toukat seulotaan ylimääräisten astioiden sedimentistä 250 μm:n 
seulalla. Kuolleiksi lasketaan toukat, jotka eivät liiku tai reagoi mekaanisiin ärsykkeisiin. Myös ne toukat, joita ei otettu talteen, lasketaan kuolleiksi 
(mikrobit ovat saattaneet hajottaa testin alussa kuolleet toukat). Eloonjää ­
neiden toukkien (tuhkaton) kuivapaino testiastiaa kohden määritetään ja yksilön keskimääräinen kuivapaino astiassa lasketaan. On hyödyllistä mää ­
rittää, missä kehitysvaiheessa eloonjääneet toukat ovat. Tähän tarkoitukseen 
voidaan mitata kunkin toukan pääkapselin leveys.
 
Mittaukset  
Testiaineen pitoisuus  
38. Ennen testin aloittamista (eli toukkien lisäämistä) otetaan sedimenttinäytteet 
(bulk) vähintään yhdestä astiasta käsittelyä kohden, jotta testiaineen pitoi ­
suus sedimentissä voidaan määrittää. On suositeltavaa, että vähintään ylä ­
puolisen veden, huokosveden ja sedimentin näytteet analysoidaan testin 
alussa (katso kohta 24) ja lopussa suurimmassa pitoisuudessa ja matalam ­
massa pitoisuudessa. Testiaineen pitoisuudesta saadaan tietoa testiaineen käyttäytymisestä ja jakautumisesta vesi-sedimenttisysteemissä.
 
39. Jos välimittauksia tehdään (esim. päivänä 7) ja analyysiin tarvitaan suuria 
näytteitä, joiden ottaminen testiastioista vaikuttaisi testijärjestelmään, ana ­
lyyttisiin määrityksiin käytetään ylimääräisistä testiastioista otettuja näytteitä. Näitä astioita käsitellään samalla tavoin kuin testiastioita (mukaan lukien 
testiorganismien lisääminen), mutta niitä ei käytetä biologiseen havainnoin ­
tiin.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1384
 
40. Huokosveden suositeltava eristystapa on sentrifugointi (esim. 10 000 g ja 
4 °C 30 minuutin ajan). Jos on kuitenkin osoitettu, että testiaine ei adsor ­
boidu suotimiin, voi myös suodatus olla hyväksyttävää. Joskus pitoisuuksien analysointi huokosvedestä ei ole mahdollista, koska näyte on liian pieni.
 
Fysikaalis-kemialliset parametrit  
41. Testiastioiden pH ja lämpötila on mitattava asiaankuuluvasti (katso kohta 
10). Kovuus ja ammoniakki on mitattava kontrolliastioissa ja yhdessä testi ­
astiassa suurimmalla pitoisuudella testin alussa ja lopussa.  
TIEDOT JA RAPORTOINTI  
Tulosten käsittely  
42. Tämän testin tarkoituksena on määrittää testiaineen vaikutus uros- ja naa ­
rassääskien kehittymisnopeuteen ja täysin kuoriutuneiden sääskien kokonais ­
määrään. 10 päivän testissä määritetään vaikutukset toukkien eloonjääntiin ja painoon. Jos eri sukupuolten herkkyydessä ei ilmene tilastollisesti merkitse ­
vää eroa, urosten ja naaraiden tulokset voidaan yhdistää tilastollisia analyy ­
sejä varten. Sukupuolten väliset herkkyyserot voidaan määrittää tilastotie ­
teellisesti esimerkiksi χ
 2 -r × 2 -taulukkotestillä. Toukkien eloonjäänti ja 
yksilön keskimääräinen kuivapaino astiaa kohden määritetään 10 päivän 
kuluttua, jos tarpeen.  
43. Kuivapainoon perustuvat vaikutuspitoisuudet lasketaan mieluiten testin 
alussa mitattujen sedimenttipitoisuuksien perusteella (katso kohta 38).  
44. EC  50 :n tai minkä tahansa muun EC  x :n piste-estimaattia laskettaessa astia ­
kohtaisia tilastotietoja voidaan käyttää aitoina toistoina. Laskettaessa minkä tahansa EC
 x -arvon luottamusväliä astioiden välinen vaihtelu on otettava 
huomioon tai vaihtoehtoisesti osoitettava vaihtelu niin pieneksi, että se voi ­
daan jättää huomiotta. Jos malliin sovelletaan pienimmän neliösumman me ­
netelmää, astiakohtaisiin tilastotietoihin on sovellettava muunnosta, jotta va ­
rianssin homogeenisuus paranee. EC  x -arvot on kuitenkin laskettava sen jäl ­
keen, kun vaste on muunnettu takaisin alkuperäisarvoon.  
45. Kun NOEC/LOEC on tarkoitus määrittää tilastollisen hypoteesin testillä, 
astioiden välinen vaihtelu on huomioitava esimerkiksi hierarkkisella ANO ­
VAlla. Robustimpia testejä (21) voidaan käyttää soveltuvissa tilanteissa, kun 
tavalliset ANOVAn oletukset eivät täyty.  
Kuoriutumisaste  
46. Kuoriutumisasteet ovat dikotomisia tietoja, ja ne voidaan analysoida 
Cochran-Armitagen testillä, jota sovelletaan alaspäin askeltavasti, kun mo ­
notoninen annosvaste on odotettavissa, ja näitä tietoja pidetään tämän odo ­
tuksen mukaisina. Jos näin ei ole, voidaan käyttää Fisherin tarkkaa testiä tai Mantel-Haenszelin testiä, jossa p-arvot on korjattu Bonferroni-Holmin me ­
netelmällä. Jos on näyttöä siitä, että saman pitoisuuden toistojen välinen 
varianssi on suurempi kuin binomijakauma antaa edellyttää (ylihajonta), 
voidaan käyttää Cochran-Armitagen testiä tai Fisherin tarkkaa testiä (21).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1385
 
Kuoriutuneiden sääskien määrä astiassa (ne) määritetään, ja summa jaetaan 
lisättyjen sääskien määrällä (na):  
ER ¼ n e 
n a 
jossa:  
ER = kuoriutumisaste  
n e = kuoriutuneiden sääskien määrä astiassa  
n a = astiaan lisättyjen toukkien määrä  
47. Kun näytekoko on suuri ja ylihajontaa esiintyy, paras vaihtoehto on pitää 
kuoriutumisastetta jatkuvana vasteena ja käyttää esimerkiksi Williamsin tes ­
tiä, kun monotoninen annosvaste on odotettavissa ja yhdenmukainen kuo ­
riutumisastetietojen kanssa. Dunnettin testi soveltuu, kun monotonisuutta ei 
esiinny. Näytekoko määritetään tässä suureksi, jos sekä kuoriutuneiden että kuoriutumattomien toukkien määrä on toistossa (astiassa) yli viisi.
 
48. Jos halutaan soveltaa ANOVA-menetelmiä, ER-arvot on ensin muunnettava 
arcsin-neliöjuuri-muunnoksella tai Tukey-Freemanin muunnoksella, jotta 
saadaan likimääräinen normaalijakauma ja varianssi tasoittuu. 
Cochran-Armitagen testiä, Fisherin tarkkaa testiä (Bonferroni) tai Mantel-Haenszelin testiä voidaan soveltaa, kun käytetään absoluuttisia frek ­
venssejä. Arcsin-neliöjuuri-muunnosta sovelletaan ottamalla kuoriutumisas ­
teen neliöjuuren käänteinen sini (sin
 –1 ). 
49. Kuoriutumisasteissa EC  x -arvot lasketaan käyttämällä regressioanalyysiä (tai 
esim. probit- (22), logit- tai Weibull-mallia tai soveltuvaa kaupallista ohjel ­
mistoa). Jos regressioanalyysi epäonnistuu (esim. osittaisia vasteita on alle kaksi), käytetään muita parametrittomia menetelmiä, kuten liukuvaa keski ­
arvoa tai yksinkertaista interpolaatiota.
 
Kehittymisnopeus  
50. Keskimääräinen kehittymisaika edustaa keskimääräistä ajanjaksoa toukkien 
lisäämisestä (testipäivä 0) kokeellisen sääskikohortin kuoriutumiseen. (Aidon 
kehittymisajan laskennassa on huomioitava toukkien ikä lisäyshetkellä.) Ke ­
hittymisnopeus on kehittymisajan käänteisluku (yksikkö: 1/vrk) ja edustaa päivässä tapahtuvaa toukkien kehittymistä. Kehittymisnopeuden käyttö on suositeltavaa näiden sedimentin toksisuuskokeiden arvioinnissa, sillä sen 
varianssi on pienempi ja se on homogeenisempi ja lähempänä normaalija ­
kaumaa kuin kehittymisaika. Siksi tehokkaita parametritestimenetelmiä käy ­
tetään mieluummin kehittymisnopeuden kuin kehittymisajan kanssa. Kun kehittymisnopeus on jatkuva vaste, EC
 x -arvot voidaan estimoida regressioa ­
nalyysillä (esim. (23), (24)).  
51. Seuraavissa tilastollisissa testeissä oletetaan, että tarkastuspäivänä × havaittu 
sääskimäärä kuoriutuu päivän x ja päivän x-l välissä (l = tarkastusvälin pituus, yleensä 1 päivä). Keskimääräinen kehittymisnopeus astiassa ( x) las­
ketaan seuraavasti:
 
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1386
 
jossa:  
x: keskimääräinen kehittymisnopeus astiassa  
i: tarkastusvälin indeksi  
m: tarkastusvälien enimmäismäärä  
ƒ i : tarkastusvälissä i kuoriutuneiden sääskien määrä  
n e : testin lopussa kuoriutuneiden sääskien kokonaismäärä (=  P ƒ i ) 
x i : tarkastusvälissä i kuoriutuneiden sääskien kehittymisnopeus  
x i ¼ 1 Í 
day  i Ä 1 i 
2 Î 
jossa:  
day  i : tarkastuspäivä (päivää lisäyksen jälkeen)  
l i : tarkastusvälin i pituus (päivissä, yleensä 1 päivä)  
Testiraportti  
52. Testiraportin on sisällettävä vähintään seuraavat tiedot:  
Testiaine:  
— fysikaalinen olomuoto ja tarvittaessa fysikaalis-kemialliset ominaisuudet 
(vesiliukoisuus, höyrynpaine, jakaantumiskerroin maa-aineksessa (tai se ­
dimentissä, jos saatavissa), stabiilisuus vedessä jne.)  
— kemialliset tunnistetiedot (yleisnimi, kemiallinen nimi, rakennekaava, 
CAS-numero jne.) sekä puhtaus ja testiaineen kvantifioinnissa käytetty analyysimenetelmä.
 
Testilajit:  
— käytetyt koe-eläimet: lajit, tieteellinen nimi, eliöiden lähde ja kasvatuso ­
losuhteet  
— tiedot munamassojen ja toukkien käsittelystä  
— koe-eläinten ikä testiastioihin lisättäessä.  
Testiolosuhteet:  
— käytetty sedimentti, eli luonnollinen vai synteettinen sedimentti  
— luonnollisen sedimentin osalta sedimentin näytteenottopaikan sijainti ja 
kuvaus, mukaan lukien, jos mahdollista, kontaminaatiohistoria, ominai ­
suudet: pH, orgaanisen hiilen pitoisuus, C/N-suhde ja rakeisuus (tarvit ­
taessa)  
— synteettisen sedimentin valmistus: ainesosat ja niiden ominaisuudet (or ­
gaanisen hiilen pitoisuus, pH, kosteus jne. testin alussa)  
— testiveden valmistus (jos käytetään synteettistä vettä) ja ominaisuudet 
(happipitoisuus, pH, johtavuus, kovuus jne. testin alussa)  
— sedimentin ja sen päällä olevan veden syvyys  
— sedimentin päällä olevan veden ja huokosveden tilavuus, märän sedi ­
mentin paino huokosveden kanssa ja ilman huokosvettä  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1387
 
— testiastiat (materiaali ja koko)  
— tapa, jolla testiaine lisättiin sedimenttiin: käytetyt pitoisuudet, toistojen 
määrä ja mahdollisen liuottimen käyttö  
— vesi-sedimenttisysteemin stabilointivaihe: kesto ja olosuhteet  
— inkubaatio-olosuhteet: lämpötila, valojakso ja valon voimakkuus, ilmas ­
tus (taajuus ja voimakkuus)  
— yksityiskohtaiset tiedot syöttämisestä, kuten ravinnon tyyppi, valmistus, 
määrä ja syöttöaikataulu.  
Tulokset:  
— kaikki nimelliset testipitoisuudet, mitatut testipitoisuudet ja tulokset kai ­
kista analyyseistä, joilla määritettiin testiaineen pitoisuus testiastiassa  
— testiastioissa olevan veden laatu, eli pH, lämpötila, liuennut happi, ko ­
vuus ja ammoniakki  
— mahdollinen haihtuneen testiveden korvaus  
— kuoriutuneiden uros- ja naarassääskien määrä astiassa päivää kohden  
— kuoriutumattomien toukkien määrä astiassa  
— toukkien keskimääräinen kuivapaino astiaa kohden, kehitysasteittain jos 
tarpeen  
— kuoriutumisprosentti rinnakkaisnäytteessä ja testipitoisuudessa (uros- ja 
naarassääsket yhteensä)  
— täysin kuoriutuneiden sääskien keskimääräinen kehittymisnopeus rinnak ­
kaisnäytteessä ja testissä (uros- ja naarassääsket yhteensä)  
— toksisten tutkittavien ominaisuuksien estimaatit, kuten EC  x (ja siihen 
liittyvät luottamusvälit), NOEC ja/tai LOEC, ja niiden määrittämiseen käytetyt tilastolliset menetelmät
 
— tulosten pohdinta, mukaan luettuna mahdolliset vaikutukset, joita tästä 
testimenetelmästä poikkeamisella on ollut testin tuloksiin.  
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Develop ­
ment and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and 
H.Köpp. Berlin 1995.  
2) Fleming R  et al.  (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Final Report to the European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
 
3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bio ­
assays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Works ­
hop held in the Netherlands.  
4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the To ­
xicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. 
pp 1125–1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; 
Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
 
5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1388
 
6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second 
edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
 
7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates.  
8) US-EPA/OPPTS 850,1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment to ­
xicity using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  (Chi­
ronomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National Water 
Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
 
10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insectici ­
des in  Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.  
11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47–57.  
12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publica ­
tions, Series on Testing and Assessment No. 23.  
13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of To ­
xicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference 
Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.  
14) Tämän liitteen testimenetelmä C.8: Myrkyllisyystutkimus madoilla.  
15) Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163–1175.  
16) Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303.
 
17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing se ­
veral treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096–1121.  
18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics, 20: 482–491.  
19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 
103–117.  
20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics, 28: 510–531.  
21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clus ­
tered binary data. Biometrics 48: 577–585.  
22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.  
23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494.  
24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298–312.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1389
 
Lisäys 1  
MÄÄRITELMÄT  
Tässä testimenetelmässä käytetään seuraavia määritelmiä:  
Synteettinen sedimentti  on luonnollisen sedimentin fyysisiä ainesosia jäljittele ­
vistä materiaaleista valmistettu seos.  
Yläpuolinen vesi  on testiastiassa sedimentin päällä oleva vesi.  
Huokosvesi  on sedimenttirakeiden välissä olevaa vettä.  
Sedimentti, johon on lisätty testiaine.  
Testikemikaali:  Tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1390
 
Lisäys 2  
Chironomus riparius  -lajin kasvatussuosituksia  
1. Chironomus -toukkia voi kasvattaa kiteytysmaljoissa tai suurissa astioissa. 
Astian pohjalle levitetään noin 5–10 mm:n paksuinen kerros hienoa kvartsi ­
hiekkaa. Myös piimaa (esim. Merck, tuotenro 8117) on osoitettu soveltu ­
vaksi substraatiksi (ohuempi, enintään muutaman millimetrin paksuinen ker ­
ros riittää). Sen jälkeen lisätään monta senttiä soveltuvaa vettä. Jos haihtu ­
mista tapahtuu, kuivuminen on estettävä lisäämällä vettä tarvittaessa. Vesi voidaan vaihtaa tarvittaessa. Varovainen ilmastus on tarpeen. Toukkien kas ­
vatusastioita on säilytettävä soveltuvassa häkissä, jotta kuoriutuvat aikuiset 
eivät pääse pakenemaan. Häkin on oltava tarpeeksi tilava, jotta kuoriutuneet 
aikuiset mahtuvat parveilemaan. Muutoin parittelua ei välttämättä tapahdu (vähimmäiskoko on n. 30 × 30 × 30 cm).
 
2. Häkkejä säilytetään huoneenlämmössä tai huoneessa, jonka lämpötila on 
vakioitu (20 ± 2 °C). Valoisa jakso on 16 tuntia (voimakkuus n. 1 000 luksia), pimeys 8 tuntia. On ilmoitettu, että lisääntyminen voi estyä, jos ilman suhteellinen kosteus on alle 60 prosenttia.
 
Laimennusvesi  
3. Mitä tahansa soveltuvaa luonnollista tai synteettistä vettä voidaan käyttää. 
Kaivovesi, talousvesi, josta on poistettu kloori, ja keinotekoinen neste (esim. Elendtin ”M4”- tai ”M7”-liuos, ks. jäljempänä) ovat yleisesti käytettyjä. Vesi on ilmastettava ennen käyttöä. Kasvatusvesi voidaan tarvittaessa uusia 
kaatamalla tai lappamalla käytetty vesi kasvatusastioista varoen tuhoamasta 
toukkaputkia.
 
Toukkien ruokinta  
4. Chironomus -toukat ruokitaan kalojen hiutaleruoalla (TetraMin®, TetraP ­
hyll® tai muu vastaava kaupallinen kalanruoka), jota annetaan noin 250 mg astiaa kohden päivässä. Ruoka voidaan antaa kuivana jauheena tai sus ­
pensiona vedessä: 1,0 g hiutaleruokaa lisätään 20 ml:aan laimennusvettä ja 
seos sekoitetaan homogeeniseksi. Tätä valmistetta voi antaa noin 5 ml astiaa kohden päivässä (ravista ennen käyttöä). Vanhoille toukille voi antaa enem ­
män ruokaa.
 
5. Ruokkimista säädellään vedenlaadun mukaan. Jos kasvatusalusta muuttuu 
sameaksi, ravinnon määrää on vähennettävä. Ravinnon määrän lisäämistä on seurattava tarkasti. Jos ravintoa on liian vähän, toukat siirtyvät kohti 
vesipatsasta, ja jos ravintoa on liian paljon, mikrobien toiminta voi lisääntyä 
ja happipitoisuudet laskea. Kumpikin vaihtoehto voi laskea kasvunopeutta.
 
6. Vähän viherlevän (esim.  Scenedesmus subspicatus , Chlorella vulgaris ) so­
luja voidaan lisätä, kun uusia kasvatusastioita perustetaan.  
Kuoriutuneiden aikuisten ruokinta  
7. Eräät kokeen suorittajat ovat ehdottaneet, että kylläisessä sakkaroosiliu ­
oksessa liotettu vanutuppo saattaa riittää kuoriutuneiden aikuisten ravinnoksi.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1391
 
Kuoriutuminen  
8. Kun lämpötila on 20 ± 2 °C, toukkien kasvatusastioista alkaa kuoriutua 
aikuisia noin 13–15 päivän kuluttua. Urokset tunnistaa helposti sulkamai ­
sista tuntosarvista.  
Munamassat  
9. Kun kasvatushäkissä on aikuisia, kaikista toukkien kasvatusastioista on tar ­
kistettava kolme kertaa viikossa, onko niissä hyytelömäisiä munamassoja. 
Jos munamassoja on, ne on poistettava varovasti. Ne siirretään pieneen 
astiaan, jossa on pieni määrä kasvatusvettä. Munamassoja voi käyttää uuden viljelyastian perustamiseen (esim. 2–4 munamassaa astiaa kohden) tai toksi ­
suustesteihin.
 
10. Munatoukkien pitäisi kuoriutua 2–3 päivän kuluttua.  
Uusien viljelyastioiden perustaminen  
11. Kun viljelmät on perustettu, uuden toukkaviljelyastian voi aloittaa testivaa ­
timusten mukaan kerran viikossa tai harvemmin. Vanhat astiat poistetaan, 
kun aikuiset sääsket ovat kuoriutuneet. Näin saadaan säännöllisesti aikuisia 
mahdollisimman vähäisellä vaivalla.  
Testiliuosten ”M4” ja ”M7” valmistus  
12. Elendt (1990) kuvasi ”M4”-liuoksen. ”M7”-liuos valmistetaan samoin kuin 
”M4” lukuun ottamatta taulukossa 1 merkittyjä aineita, joiden pitoisuus on neljä kertaa pienempi ”M7”-liuoksessa kuin ”M4”-liuoksessa. ”M7”-liuosta koskeva julkaisu on valmisteilla (Elendt, henkilökohtainen viesti). Testiliu ­
osta ei valmisteta Elendtin ja Biasin mukaan (1990), sillä kantaliuosten 
valmistusta varten annetut NaSiO
 3 -, 5 H  2 O-, NaNO  3 -, KH  2 PO 4 - ja 
K 2 HPO  4 -pitoisuudet eivät ole riittäviä.  
”M7”-liuoksen valmistus  
13. Jokainen kantaliuos (I) valmistetaan erikseen, ja näistä kantaliuoksista (I) 
valmistetaan yhdistetty kantaliuos (II) (katso taulukko 1). ”M7”-liuos val ­
mistetaan täyttämällä 50 millilitraa yhdistettyä kantaliuosta (II) ja taulukossa 
2 annetut määrät jokaista makroravinteiden kantaliuosta 1 litraksi deionisoi ­
tua vettä. Vitamiinien kantaliuos valmistetaan lisäämällä deionisoituun ve ­
teen kolmea vitamiinia taulukon 3 mukaisesti, ja 0,1 millilitraa yhdistettyä vitamiinien kantaliuosta lisätään lopulliseen ”M7”-liuokseen vähän ennen 
käyttöä. (Vitamiinien kantaliuos säilytetään jäädytettynä pienissä erissä.) 
Liuos ilmastetaan ja stabiloidaan.
 
KIRJALLISUUSVIITTEET  
BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Development 
and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 
1995.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1392
 
Taulukko 1  
Hivenaineiden kantaliuokset M4- ja M7-liuosta varten  
Kantaliuokset (I) Määrä (mg), joka 
täytetään 1 lit ­
raksi deionisoitua 
vettä Yhdistetyn kantaliuoksen (II) 
valmistus: Sekoita seuraavat määrät 
(ml) kantaliuoksia (I) ja täytä 1 
litraksi deionisoitua vettä Lopulliset pitoisuudet testiliuoksissa 
(mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na
 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Nämä aineet ovat erilaiset M4- ja M7-liuoksissa, kuten edellä kerrottiin. 
( 2 ) Nämä liuokset valmistetaan erikseen. Sitten ne kaadetaan yhteen ja käsitellään välittömästi autoklaavissa.  
Taulukko 2  
Makroravinteiden kantaliuokset M4- ja M7-liuosta varten  
Määrä, joka täytetään 
1 litraksi deionisoitua 
vettä 
(mg) Lisätyn makroravinteiden 
kantaliuoksen määrä M4- ja 
M7-liuosten valmistuksessa 
(ml/l) Lopulliset pitoisuudet 
testiliuoksissa M4 ja 
M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1393
 
Taulukko 3  
Vitamiinien kantaliuos M4- ja M7-liuosta varten. Kaikki kolme vitamiiniliuosta yhdistetään 
yhdeksi vitamiinien kantaliuokseksi.  
Määrä, joka täytetään 1 
litraksi deionisoitua 
vettä 
(mg) Lisätyn vitamiinien kantaliu ­
oksen määrä M4- ja M7- 
liuosten valmistuksessa 
(ml/l) Lopulliset pitoisuudet 
testiliuoksissa M4 ja M7 
(mg/l)  
Tiamiinihydrokloridi 750 0,1 0,075 
Syaanikobalamiini 
(B12) 10 0,1 0,0010 
Biotiini 7,5 0,1 0,00075  
KIRJALLISUUSVIITTEET  
Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 
25–33.  
Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157–1167.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1394
 
Lisäys 3  
SYNTEETTISEN SEDIMENTIN VALMISTUS  
Sedimentin koostumus  
Synteettisen sedimentin koostumuksen on oltava seuraavanlainen:  
Ainesosa Ominaisuudet Prosenttiosuus 
sedimentin kuivapai ­
nosta 
Turve Rahkasuoturvetta, pH mah ­
dollisimman tarkoin 5,5–6,0, 
ei näkyviä kasvijäänteitä, hie ­
noksi jauhettuna (hiukkas ­
koko ≤ 1 mm) ja ilmakuivat ­
tuna 4–5 
Kvartsihiekka Raekoko: > 50 prosenttia 
hiukkasista on oltava kokoa 
50–200 μm 75–76 
Kaoliniittisavi Kaoliniittipitoisuus ≥ 30 % 20 
Orgaaninen hiili Säädetään lisäämällä turvetta 
ja hiekkaa 2 (± 0,5) 
Kalsiumkarbonaatti CaCO  3 , jauhettu, kemialli ­
sesti puhdas 0,05–0,1 
Vesi Johtavuus ≤ 10 μS/cm 30–50  
Valmistelut  
Turve ilmakuivataan ja jauhetaan hienoksi. Tarvittava määrä turvejauhetta sus ­
pendoidaan deionisoituun veteen käyttämällä tehokasta homogenisointilaitetta. 
Suspension pH-arvoksi säädetään 5,5 ± 0,5 CaCO  3 :lla. Suspension annetaan 
vakioitua vähintään kahden päivän ajan sekoittamalla sitä varovasti lämpötilassa 20 ± 2 °C, jotta pH stabiloituu ja saadaan stabiili mikrobikomponentti. Sen jälkeen pH mitataan uudelleen. Arvon pitäisi olla 6,0 ± 0,5. Sen jälkeen turve ­
suspensioon sekoitetaan muut ainesosat (hiekka ja kaoliniittisavi) ja deionisoitu 
vesi, jotta saadaan homogeenistä sedimenttiä, jonka vesipitoisuus on 30–50 pro ­
senttia sedimentin kuivapainosta. Lopullisen seoksen pH mitataan vielä kerran, ja se säädetään tarvittaessa CaCO
 3 :lla alueelle 6,5–7,5. Sedimentistä otetaan näyt ­
teitä, joista määritetään kuivapaino ja orgaanisen hiilen pitoisuus. On suositelta ­
vaa, että synteettistä sedimenttiä sopeutetaan ennen chironomid-eliöillä tehtävää myrkyllisyystestiä seitsemän päivää samoille olosuhteille, jotka testissä vallitse ­
vat.
 
Säilytys  
Synteettisen sedimentin kuivia ainesosia voi säilyttää kuivassa ja viileässä pai ­
kassa huoneenlämmössä. Valmistettua (märkää) sedimenttiä ei saa säilyttää ennen käyttöä tässä testissä. Se on käytettävä heti valmistuksen lopussa olevan 7 päivän sopeutusajan jälkeen.
 
KIRJALLISUUSVIITTEET  
Tämän liitteen luku C.8. Myrkyllisyystutkimus madoilla.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tu ­
bificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. 
Safety 39: 10–20.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1395
 
Lisäys 4  
Hyväksyttävän laimennusveden kemialliset ominaisuudet  
Aine Pitoisuudet  
Hiukkaset < 20 mg/l 
Orgaanisen hiilen kokonaismäärä < 2 mg/l Ionisoitumaton ammoniakki < 1 μg/l 
Kovuus CaCO
 3 :na < 400 mg/l (*) 
Jäännöskloori < 10 mg/l Orgaanista fosforia sisältävien torjunta-aineiden koko ­
naismäärä < 50 ng/l 
Orgaanista klooria sisältävien torjunta-aineiden ja po ­
lykloorattujen bifenyylien kokonaismäärä < 50 ng/l 
Orgaanisen kloorin kokonaismäärä < 25 ng/l
 
(*) Jos kovuusionien ja testiaineen välillä epäillään yhteisvaikutusta, on kuitenkin käytettävä 
pehmeämpää vettä (tässä tapauksessa ei saa käyttää Elendt M4 -viljelynestettä).  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1396
 
Lisäys 5  
Chironomid-toukkien kuoriutumisen tarkkailuohjeet  
Dekantterilaseihin asetetaan pyydykset kuoriutuneita toukkia varten. Näitä pyy ­
dyksiä tarvitaan päivästä 20 lähtien testin loppuun saakka. Alla on esimerkki käytetystä pyydyksestä:
 
A: polyamidiverkko  
B: ylösalaisin käännetyt muovikupit  
C: reunukseton altistusdekantterilasi  D: verkkoaukot vedenvaihtoa varten  
E: vettä  
F: sedimentti  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1397
 
C.28  MYRKYLLISYYSTESTI CHIRONOMID-ELIÖLLÄ VESI-SEDI ­
MENTTISYSTEEMISSÄ KÄYTTÄEN VETTÄ, JOHON TUTKITTAVAA 
AINETTA ON LISÄTTY  
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 219 (2004). Tällä testime ­
netelmällä on tarkoitus arvioida pitkäaikaisen kemikaalialtistuksen vaikutuk ­
sia makean veden kaksisiipisen  Chironomus -lajin (surviaissääsken) toukkiin, 
jotka elävät sedimentissä. Menetelmä perustuu pääosion BBA:n ohjeistuk ­
seen, jossa käytetään vesi-sedimenttisysteemiä, keinomaata ja vesipatsaan 
altistusmenetelmää (1). Siinä huomioidaan myös  Chironomus riparius - ja 
Chironomus tentans  -lajien toksisuustestimenettelyt, jotka on kehitetty Eu ­
roopassa ja Pohjois-Amerikassa (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) ja vahvistettu yhteistut ­
kimuksissa (ring-test) (1)(6)(9). Myös muita hyvin dokumentoituja 
chironomid-lajeja, kuten  Chironomus yoshimatsui  (10)(11), voidaan käyttää.  
2. Tässä testimenetelmässä altistaminen tapahtuu lisäämällä testiainetta veteen. 
Soveltuvan altistuksen valinta määräytyy testin sovellustarkoituksen mu ­
kaan. Vesialtistuksessa, jossa testiainetta lisätään vesipatsaaseen, tarkoituk ­
sena on simuloida torjunta-aineiden lentosumutusta. Se kattaa alkuhuippu ­
pitoisuudet huokosvedessä. Menetelmä on hyödyllinen myös muuntyyppi ­
sissä altistuksissa (mukaan lukien kemikaalivuoto) lukuun ottamatta kerty ­
misprosesseja, jotka kestävät kauemmin kuin testijakso.  
3. Aineet, joita sedimentissä elävillä eliöillä testataan, säilyvät yleensä sedi ­
mentissä pitkään. Sedimentissä elävien eliöiden altistamiseen voidaan käyt ­
tää useita reittejä. Jokaisen altistusreitin suhteellinen tärkeys sekä toksiseen 
kokonaisvaikutukseen vaadittava aika määräytyvät käytettävän kemikaalin 
fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien mukaan. Jos kyseessä on voimak ­
kaasti adsorboiva aine (esim. log K  ow > 5) tai aine, joka sitoutuu kovalent ­
tisesti sedimenttiin, kontaminoituneen ravinnon nauttiminen voi olla tärkeä 
altistusreitti. Jotta hyvin rasvahakuisten aineiden myrkyllisyyttä ei aliarvioi ­
da, voidaan harkita ravinnon lisäämistä sedimenttiin ennen testiaineen lisää ­
mistä. Jotta kaikki mahdolliset altistusreitit voidaan huomioida, tämä testi ­
menetelmä keskittyy pitkäaikaiseen altistukseen. Testin kesto on 20–28 päi ­
vää C. riparius - ja C. yoshimatsui  -lajeille ja 28–65 päivää  C. tentans  
-lajille. Jos lyhytaikaisia tietoja tarvitaan tiettyyn tarkoitukseen, kuten epä ­
vakaiden kemikaalien vaikutusten tutkimiseen, ylimääräiset rinnakkaisnäyt ­
teet voidaan poistaa 10 päivän jälkeen.  
4. Mitatut tutkittavat ominaisuudet ovat kuoriutuneiden täysikasvuisten koko ­
naismäärä ja kuoriutumiseen kulunut aika. Jos lyhytaikaiset lisätiedot ovat tarpeen, toukkien eloonjäämistä ja kasvua on suositeltavaa mitata vasta kymmenen päivän kuluttua käyttämällä ylimääräisiä rinnakkaisnäytteitä.
 
5. Synteettisen sedimentin käyttö on suositeltavaa. Synteettisellä sedimentillä 
on useita etuja luonnolliseen sedimenttiin verrattuna:  
— kokeellinen vaihtelu vähenee, koska sedimentti on toistettava ”vakiomat ­
riisi”, eikä kontaminoitumattomia ja puhtaita sedimenttilähteitä tarvitse 
etsiä 
— testit voidaan aloittaa milloin tahansa ilman, että testisedimentin kausi ­
vaihtelua esiintyy, sedimentistä ei tarvitse poistaa alkuperäiselimistöä esikäsittelyllä ja lisäksi synteettisen sedimentin käyttö pienentää kuluja, 
joita rutiinitestaukseen tarvittavan sedimenttimäärän keräämisestä ken ­
tältä syntyy
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1398
 
— synteettisen sedimentin käyttö sallii toksisuuden vertailun ja aineiden 
lajittelemisen myrkyllisyyden mukaan: testien, joissa käytettiin luonnol ­
lista sedimenttiä ja synteettistä sedimenttiä, toksisuustiedot olivat verrat ­
tavissa useiden kemikaalien osalta (2).  
6. Käytetyt määritelmät on esitetty lisäyksessä 1.  
TESTIN PERIAATE  
7. Surviaissääsken munatoukat altistetaan testiaineen pitoisuusalueelle 
vesi-sedimenttisysteemeissä. Testi aloitetaan lisäämällä munatoukkia dekant ­
terilaseihin, joissa on vesi-sedimenttisysteemiä, ja lisäämällä sen jälkeen 
testiainetta veteen. Surviaissääskien kuoriutumisaste ja kehittymisnopeus mi ­
tataan testin lopussa. Toukkien eloonjäänti ja paino voidaan myös tarvitta ­
essa mitata 10 päivän kuluttua (käytättämällä soveltuvia ylimääräisiä rinnak ­
kaisnäytteitä). Nämä tiedot analysoidaan regressiomallilla, jolla arvioidaan 
pitoisuus, joka aiheuttaa X prosentin laskun kuoriutumisessa, toukkien eloonjäännissä tai painossa (esim. EC
 15 , EC  50 ), tai tilastollisen hypoteesin 
testillä, jolla määritetään NOEC/LOEC. Jälkimmäinen vaihtoehto edellyttää 
vaikutusarvojen vertaamista vertailuarvoihin tilastotutkimuksilla.  
TESTIAINETTA KOSKEVIA TIETOJA  
8. Testiaineen vesiliukoisuuden, höyrynpaineen, mitatun tai lasketun erottumi ­
sen erottuminen sedimenttiin sekä stabiiliuden vedessä ja sedimentissä on oltava tiedossa. Käytössä on oltava luotettava analyysimenetelmä, jolla tes ­
tiaine voidaan kvantifioida sedimentin päällä olevassa vedessä, huokosve ­
dessä ja sedimentissä, ja menetelmän tarkkuus ja havaitsemisraja tunnetaan ja ne on raportoitu. Hyödyllisiä tietoja ovat esimerkiksi rakennekaava ja testiaineen puhtaus. Myös testiaineen kemiallinen kohtalo (esim. häviämi ­
nen, abioottinen ja bioottinen hajoaminen) on hyödyllistä tietää. Kirjallisuus ­
viitteessä (12) annetaan lisäohjeita sellaisten aineiden testauksesta, joiden fysikaalis-kemialliset ominaisuudet vaikeuttavat niiden testaamista.
 
VERTAILUKEMIKAALIT  
9. Testimenettelyn ja testiolosuhteiden luotettavuus voidaan tarkistaa testaa ­
malla ajoittain vertailukemikaaleja. Esimerkkejä vertailumyrkyistä, joita on 
käytetty onnistuneesti yhteistutkimuksissa ja validointitutkimuksissa: lindaa ­
ni, trifluraliini, pentakloorifenoli, kadmiumkloridi ja kaliumkloridi. 
(1)(2)(5)(6)(13).  
TESTIN LUOTETTAVUUS  
10. Testi on luotettava, jos  
— kuoriutuvuus kontrolleissa on vähintään 70 prosenttia testin lopussa 
(1)(6)  
— C. riparius  ja C. yoshimatsui  aikuistuvat kontrolliastioissa 12–23 päivän 
kuluessa astiaan laittamisesta.  C. tentans  vaatii 20–65 päivää  
— testin lopussa mitataan jokaisen astian pH ja liuenneen hapen pitoisuus. 
Happipitoisuuden täytyy olla vähintään 60 prosenttia ilman 
kyllästysarvosta (ASV) käytetyssä lämpötilassa, ja sedimentin päällä ole ­
van veden pH-arvon pitää olla 6–9 kaikissa testiastioissa  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1399
 
— veden lämpötila vaihtelee enintään ± 1,0 °C. Veden lämpötilaa voidaan 
kontrolloida tasalämpöisessä huoneessa, jolloin huoneen lämpötila on 
tarkistettava soveliain väliajoin.  
MENETELMÄN KUVAUS  
Testiastiat  
11. Tutkimus tehdään 600 ml:n dekantterilaseissa, joiden halkaisija on 8 cm. 
Muitakin astioita voidaan käyttää, kunhan sedimentin ja sen päällä olevan veden syvyys on sopiva. Sedimentin pinta-alan on oltava riittävä, jotta tilaa 
on 2–3 cm
 2 toukkaa kohden. Sedimenttikerroksen ja sen päällä olevan ve ­
den syvyyden suhteen on oltava 1:4. Testiastioiden ja muiden testijärjestel ­
män kanssa kosketuksissa olevien välineiden on oltava kokonaan lasia tai 
muuta kemiallisesti inerttiä materiaalia (esim. teflonia).  
Lajin valinta  
12. Paras laji tähän testiin on  Chironomus riparius . Chironomus tentans  sovel­
tuu myös, mutta sen käsittely on hankalampaa ja se edellyttää pidempää 
testijaksoa. Myös  Chironomus yohimatsui  -lajia voidaan käyttää. Tietoa  
Chironomus riparius  -lajin kasvatusmenetelmistä on lisäyksessä 2. Myös 
muiden lajien kasvatusolosuhteista on saatavissa tietoa:  Chironomus tentans  
(4) and  Chironomus yoshimatsui  (11). Lajin tunnistus on varmistettava en ­
nen testiä, mutta sitä ei ole tarpeen tehdä ennen joka testiä, jos eliöt ovat 
peräisin omasta kasvattamosta.  
Sedimentti  
13. Synteettisen sedimentin (keinosedimentin) käyttö on suositeltavaa. Jos kui ­
tenkin käytetään luonnollista sedimenttiä, se on kuvailtava (vähintään pH, 
orgaaninen kokonaishiilipitoisuus, mutta myös muut parametrit, kuten C/N- suhde ja rakeisuus ovat suositeltavia), eikä siinä saa olla kontaminaatiota tai muita organismeja, jotka saattavat kilpailla chironomid-eliöiden kanssa tai 
syödä ne. Lisäksi on suositeltavaa, että luonnollista sedimenttiä sopeutetaan 
ennen chironomid-eliöillä tehtävää myrkyllisyystestiä seitsemän päivää sa ­
moille olosuhteille, jotka testissä vallitsevat. Tätä testiä varten suositellaan seuraavaa synteettistä sedimenttiä, joka perustuu testimenetelmässä C.8 (14) 
käytettyyn keinomaahan (1)(15)(16):
 
a) 4–5 % (kuivapaino) turvetta: pH mahdollisimman tarkoin 5,5–6,0; on 
tärkeää käyttää ainoastaan ilmakuivattua jauhemaista turvetta, joka on 
jauhettu hienoksi (hiukkaskoko ≤ 1 mm)  
b) 20 % (kuivapaino) kaoliniittisavea (kaoliniitin osuus mieluiten yli 30 %)  
c) 75–76 % (kuivapaino) kvartsihiekkaa (pääosin hienoa hiekkaa, yli 50 
prosenttia 50–200 μm:n hiukkasia)  
d) deionisoitua vettä lisätään, kunnes lopullisen seoksen kosteus on 30–50 %  
e) kemiallisesti puhdasta kalsiumkarbonaattia (CaCO  3 ) lisätään, jotta lopul ­
lisen sedimenttiseoksen pH-arvoksi tulee 7,0 ± 0,5  
f) orgaanisen hiilen pitoisuuden on oltava lopullisessa seoksessa 2 % 
(± 0,5 %). Sitä voidaan säätää lisäämällä sopiva määrä turvetta ja hiek ­
kaa kohtien a ja c mukaisesti.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1400
 
14. Turpeen, kaoliniittisaven ja hiekan alkuperän on oltava tiedossa. Tarkista, 
ettei sedimentin ainesosissa ole kemikaalista kontaminaatiota (esim. raskas ­
metalleja, orgaanisia klooriyhdisteitä ja orgaanisia fosforiyhdisteitä). Esi ­
merkki synteettisen sedimentin valmistuksesta on lisäyksessä 3. Myös kui ­
vien ainesosien sekoittaminen on hyväksyttävää, jos voidaan osoittaa, että 
sedimentin ainesosat eivät erotu (esim. kelluvia turvehiukkasia) veden lisää ­
misen jälkeen ja että turve tai sedimentti on sopeutunut tarpeeksi.  
Vesi 
15. Testivedeksi soveltuu vesi, joka täyttää lisäyksissä 2 ja 4 luetellut laimen ­
nusveden kemialliset ominaisuudet. Kasvatus- ja testivedeksi soveltuu mikä tahansa vesi, luonnonvesi (pinta- tai pohjavesi), synteettinen vesi (katso lisäys 2) tai talousvesi, josta on poistettu kloori, jos surviaissääsket voivat 
elää siinä viljelyn ja testauksen ajan osoittamatta stressaantumisen merkkejä. 
Testiveden pH-arvon on oltava testin alussa 6–9, eikä kokonaiskovuus Ca ­
CO
 3 :na saa olla yli 400 mg/l. Jos kovuusionien ja testiaineen välillä epäil ­
lään yhteisvaikutusta, on kuitenkin käytettävä pehmeämpää vettä (tässä ta ­
pauksessa ei saa käyttää Elendt M4 -viljelynestettä). Samantyyppistä vettä 
on käytettävä koko tutkimuksen ajan. Lisäyksessä 4 luetellut vedenlaadun ominaisuudet on mitattava vähintään kahdesti vuodessa tai aina kun on epäilystä siitä, että nämä ominaisuudet ovat voineet muuttua merkittävästi.
 
Kantaliuokset – vesi, johon on lisätty testiainetta  
16. Testipitoisuudet lasketaan vesipatsaan eli sedimentin päällä olevan veden 
pitoisuuksien perusteella. Halutunpitoiset testiliuokset valmistetaan tavalli ­
sesti kantaliuoksista laimentamalla. Kantaliuokset valmistetaan mieluiten liu ­
ottamalla testiainetta testiviljelyaineeseen. Liuottimien tai dispergointiainei ­
den käyttö voi olla tarpeen joissakin tapauksissa riittävän väkevän kantaliu ­
oksen valmistamiseksi. Esimerkkejä sallituista liuottimista ovat asetoni, eta ­
noli, metanoli, etyleeniglykolimonoetyylieetteri, etyleeniglykolidimetyylieet ­
teri, dimetyyliformamidi ja trietyleeniglykoli. Sallittuja dispergointiaineita ovat Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % metyyliselluloosa ja HCO-40. Liuotusapuaineen pitoisuuden on oltava mahdollisimman pieni lopullisessa 
testiviljelyaineessa ( ≤ 0,1 ml/l), ja sen on oltava sama kaikissa käsittelyissä. 
Jos käytetään liuotusapuaineita, niillä ei saa olla merkittävää vaikutusta eloonjäämiseen eikä näkyviä haitallisia vaikutuksia varhaisiin kehitysvaihei ­
siin. Se on osoitettava ainoastaan liuotinta sisältävän kontrollin avulla. Näi ­
den aineiden käyttöä on kuitenkin vältettävä mahdollisimman pitkälle.
 
TESTISUUNNITELMA  
17. ”Testisuunnitelma” tarkoittaa testipitoisuuksien lukumäärän ja pitoisuusvä ­
lien valintaa, astioiden lukumäärää kutakin pitoisuutta kohti ja toukkien 
lukumäärää astiaa kohti. Suunnitelmat EC-pisteen arviointia, NOEC:n mää ­
ritystä ja rajatestin tekemistä varten on kuvattu. Regressioanalyysi on pa ­
rempi vaihtoehto kuin hypoteesin testaus.  
Regressioanalyysille suositeltava testisuunnitelma  
18. Testissä käytettävien pitoisuuksien on katettava vaikutuspitoisuus (esim. 
EC 15 , EC  50 ) ja se pitoisuusalue, joka on merkityksellinen kyseisen testi ­
aineen kannalta. Tarkkuus ja etenkin luotettavuus, jolla vaikutuspitoisuuk ­
sien (EC  x ) estimaatit voidaan tehdä, paranee yleensä, kun vaikutuspitoisuus  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1401
 
sijoittuu testattujen pitoisuuksien alueelle. Ekstrapolointia paljon matalim ­
man positiivisen pitoisuuden alle tai korkeimman pitoisuuden ylle on väl ­
tettävä. Alustava pitoisuusalueen määrittely voi auttaa sopivien testipitoi ­
suuksien valinnassa (katso kohta 27).  
19. Jos halutaan arvioida EC  x , jokaisesta pitoisuudesta tarvitaan vähintään viisi 
testipitoisuutta ja kolme rinnakkaisnäytettä. On joka tapauksessa suositelta ­
vaa käyttää riittäviä testipitoisuuksia, jotta mallin estimointi onnistuu hyvin. 
Pitoisuuksien välinen kerroin ei saa olla yli kaksi (poikkeus voidaan tehdä, 
jos annosvastekäyrä on loiva). Käsittelyssä käytettävien toistojen määrää voidaan laskea, jos eri vasteita aiheuttavien testipitoisuuksien määrää noste ­
taan. Jos toistojen määrää lisätään tai testipitoisuuden välejä pienennetään, 
testin luottamusväli yleensä kapenee. Toistoja tarvitaan lisää, jos halutaan 
arvioida toukkien eloonjäänti ja kasvu 10 päivän aikana.
 
NOEC:n/LOEC:n estimointiin suositeltava testisuunnitelma  
20. Jos halutaan arvioida LOEC tai NOEC, on käytettävä vähintään viittä 
testipitoisuutta ja vähintään neljää toistoa, eikä pitoisuuksien välinen kerroin saa olla yli kaksi. Toistojen määrän on oltava riittävän suuri, jotta tilastolli ­
nen voima on riittävä ja kontrollista havaitaan 20 prosentin ero viiden 
prosentin merkitsevyystasolla (p = 0,05). Kehittymisnopeuteen soveltuu 
yleensä varianssianalyysi (ANOVA), kuten Dunnett-testi ja Williams-testi (17)(18)(19)(20). Kuoriutumisasteeseen voidaan käyttää Cochran-Armitagen testiä, Fisherin tarkkaa testiä (Bonferronin korjauksella) tai 
Mantel-Haenszelin testiä.
 
Rajatesti  
21. Rajatesti (yksi testipitoisuus ja kontrolli) voidaan tehdä, jos alustavassa 
pitoisuusalueen määrityksessä ei havaittu vaikutuksia. Rajatestin tarkoituk ­
sena on osoittaa, että testiaineen toksisuusarvo on suurempi kuin testattu 
rajapitoisuus. Tässä testimenetelmässä ei voida suositella pitoisuutta, joten asia jätetään sääntelyviranomaisten harkittavaksi. Yleensä vähintään kuusi rinnakkaisnäytettä sekä testi- että kontrollinäytteestä on tarpeen. On osoitet ­
tava, että tilastollinen voima on riittävä, jotta kontrollista havaitaan 20 pro ­
sentin ero viiden prosentin merkitsevyystasolla (p = 0,05). Jos vaste on metrinen (kehittymisnopeus ja paino), t-testi on soveltuva tilastollinen me ­
netelmä, jos tiedot täyttävät tämän testin vaatimukset (normaalisuus, homo ­
geeniset vaihtelut). Jos vaatimukset eivät täyty, voidaan käyttää t-testiä, 
jossa varianssit ovat heterogeenisia, tai parametritonta testiä, kuten Wilcoxon-Mann-Whitheyn testiä. Fisherin tarkka testi soveltuu kuoriutumi ­
sasteeseen.
 
MENETTELY  
Altistumisolosuhteet  
Vesi-sedimenttisysteemin valmistelu käyttäen vettä, johon tutkittavaa ainetta 
on lisätty  
22. Testiastioihin lisätään sopiva määrä synteettistä sedimenttiä (katso kohdat 
13–14 ja lisäys 3), jotta kerroksen paksuus on vähintään 1,5 cm. Vettä lisä ­
tään, kunnes sen syvyys on 6 cm (katso kohta 15). Sedimenttikerroksen ja veden syvyyden suhde ei saa olla yli 1:4, eikä sedimenttikerroksen paksuus 
saa olla yli 3 cm. Vesi-sedimenttisysteemiä on ilmastettava varovasti seitse ­
män päivää ennen testiorganismien lisäämistä (katso kohta 14 ja lisäys 3). Sedimentin voi peittää muovikiekolla, kun vettä kaadetaan päälle, jotta sedi ­
mentin ainesosien erottuminen ja hienon materiaalin resuspensio voidaan 
välttää, mutta kiekko on poistettava heti tämän jälkeen. Myös muut välineet 
voivat olla sopivia.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1402
 
23. Testiastiat on peitettävä (esim. lasilevyillä). Jos vettä haihtuu tutkimuksen 
aikana, lisää vettä, kunnes veden tilavuus on alkuperäisellä tasolla. Käytä 
tähän tarkoitukseen tislattua tai deionisoitua vettä, jotta suoloja ei keräydy.  
Testiorganismien lisääminen  
24. Neljä tai viisi päivää ennen testiorganismien lisäämistä munamassat otetaan 
viljelmistä ja pannaan pieniin astioihin kasvatusalustassa. Alustana voidaan käyttää kantaliuoksesta saatua kypsynyttä alustaa tai vasta valmistettua alus ­
taa. Jälkimmäisessä tapauksessa kasvatusalustaan lisätään pieni määrä ravin ­
toa, kuten viherlevää ja/tai muutama pisara hienoksi jauhetuista kalanruoka ­
hiutaleista saatua suodosta (katso lisäys 2). Käytä ainoastaan vastamunittuja munamassoja. Tavallisesti toukat alkavat kuoriutua muutama päivä munimi ­
sen jälkeen ( Chironomus riparius  2–3 vrk lämpötilassa 20 °C,  Chironomus 
tentans  1–4 vrk lämpötilassa 23 °C ja  Chironomus yoshimatui  1–4 vrk 
lämpötilassa 25 °C), ja toukkien kasvu tapahtuu neljässä vaiheessa, joista jokainen kestää 4–8 päivää. Testissä käytetään ensimmäisen kehitysvaiheen 
munatoukkia (2–3 tai 1–4 vrk kuoriutumisen jälkeen). Sääskien kehitysvai ­
heen voi tarkistaa pääkapselin leveydestä (6).
 
25. Kaksikymmentä munatoukkaa sijoitetaan satunnaisesti tylpällä pipetillä jo ­
kaiseen testiastiaan, jossa on testiainetta sisältävää sedimenttiä ja vettä. Ve ­
den ilmastus on lopetettava, kun toukkia lisätään testiastioihin eikä sitä saa aloittaa 24 tuntiin toukkien lisäämisen jälkeen (katso kohdat 24 ja 32). Käytetyn testisuunnitelman (katso kohdat 19 ja 20) mukaisesti toukkien 
määrä pitoisuutta kohti on vähintään 60 EC-pisteen arviointia varten ja 80 
NOEC-määritystä varten.
 
26. 24 tuntia toukkien lisäämisen jälkeen sedimentin päällä olevaan veteen li ­
sätään testiainetta, ja aloitetaan kevyt ilmastus. Pieni määrä testiaineliuosta 
lisätään pipetillä vedenpinnan alle. Sen jälkeen sedimentin päällä oleva vesi 
sekoitetaan varoen häiritsemästä sedimenttiä.  
Testipitoisuudet  
27. Raja-annostesti voi auttaa määrittämään pitoisuusaluetta varsinaista testiä 
varten. Tähän tarkoitukseen käytetään testiaineen pitoisuuksia laajoin pitoi ­
suusvälein. Jotta surviaissääskien pintatiheys on sama, jota käytetään varsi ­
naisessa testissä, surviaissääsket altistetaan jokaiselle testiaineen pitoisuu ­
delle siksi aikaa, että sopivat testipitoisuudet voidaan arvioida. Rinnakkais ­
näytteitä ei tarvita.  
28. Varsinaisessa testissä käytettävät testipitoisuudet päätetään raja-annostestin 
perusteella. Käytössä on oltava vähintään viisi pitoisuutta, jotka valitaan kohdissa 18 ja 20 kuvatulla tavalla.
 
Kontrollit  
29. Testissä on käytettävä kontrolliastioita, joissa on sedimenttiä mutta ei testi ­
ainetta, ja soveltuvaa määrää rinnakkaisnäytteitä (katso kohdat 19–20). Jos 
testiaineen lisäyksessä on käytetty liuotinta (katso kohta 16), sedimentin 
liuotinkontrolli on lisättävä.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1403
 
Testijärjestelmä  
30. Käytettävät järjestelmät ovat staattisia. Puolistaattisia tai läpivirtausjärjestel ­
miä, joissa sedimentin yläpuolinen vesi uusiutuu ajoittain tai jatkuvasti, voidaan käyttää poikkeustapauksissa, kuten jos vedenlaatu ei sovellu testi ­
organismille tai vaikuttaa kemialliseen tasapainoon (esim. liuenneen hapen 
pitoisuus laskee liian matalaksi, erityistuotteiden pitoisuus nousee liian kor ­
keaksi tai sedimentistä uuttuu kivennäisaineita, jotka vaikuttavat pH-arvoon ja/tai veden kovuuteen). Yleensä muut sedimentin päällä olevan veden laa ­
tua kohentavat toimet, kuten ilmastus, ovat kuitenkin riittäviä ja suositelta ­
via.
 
Ravinto  
31. Toukkia on ruokittava mieluiten päivittäin tai vähintään kolmesti viikossa. 
Riittävä määrä kalanruokaa (suspensiona vedessä tai hienoksi jauhettuna, esim. TetraMin tai TetraPhyll, lisätietoja lisäyksessä 2) on 0,25–0,5 mg 
(0,35–0,5 mg  C. yoshimatui  -lajille) päivässä toukkaa kohden ensimmäisten 
10 päivän aikana. Tätä vanhemmat toukat voivat tarvita vähän enemmän ruokaa: 0,5–1 mg päivässä toukkaa kohden pitäisi riittää testin loppuun saakka. Ruoan määrää pitää pienentää kaikissa käsittelyissä ja säädellä, jos 
sienikasvua ilmenee tai kontrolleissa esiintyy kuolleisuutta. Jos sienikasvua 
ei saada loppumaan, testi on toistettava. Jos kyseessä on voimakkaasti ad ­
sorboiva aine (esim. log K
 ow >5) tai aine, joka sitoutuu kovalenttisesti sedi ­
menttiin, organismien eloonjääntiin ja luontaiseen kasvuun tarvittava ravin ­
non määrä voidaan lisätä synteettiseen sedimenttiin ennen stabiloitumisvai ­
hetta. Tässä tapauksessa on käytettävä kalanruoan sijaan kasviainesta, kuten 0,5 prosenttia (kuivapaino) nokkosen ( Urtica dioica ), valkomulperin ( Morus 
alba), valkoapilan ( Trifolium repens ), pinaatin ( Spinacia oleracea ) tai muun 
kasviaineksen ( Cerophyl  tai alfaselluloosan) hienoksi jauhettuja lehtiä.
 
Inkubaatio-olosuhteet  
32. Sedimentin päällä olevaa vettä aletaan ilmastaa varovasti mieluiten 24 tuntia 
toukkien lisäämisen jälkeen, ja ilmastusta jatketaan testin loppuun saakka (on pidettävä huoli, ettei liuenneen hapen pitoisuus laske alle 60 prosenttiin ilman kyllästysarvosta). Ilmastus tapahtuu lasisella Pasteur-pipetillä, joka on 
kiinnitetty 2–3 senttiä sedimenttikerroksen yläpuolelle (yksi tai muutama 
kupla sekunnissa). Haihtuvia kemikaaleja testattaessa voidaan harkita, jäte ­
täänkö vesi-sedimenttisysteemi ilmastamatta.
 
33. Testi tehdään vakiolämpötilassa 20 °C (± 2 °C). Suositeltu lämpötila  C. 
tentans  -lajille on 23 °C (± 2 °C) ja  C. yoshimatui  -lajille 25 °C (± 2 °C). 
Valoisa aika on 16 tuntia, ja valon voimakkuuden pitää olla 500–1 000 luksia.
 
Altistuksen kesto  
34. Altistus alkaa, kun toukat lisätään astioihin, joissa on testiainetta, ja kont ­
rolliastioihin. Altistuksen enimmäiskesto on 28 vuorokautta lajeille  C. ripa­
rius ja C. yoshimatsui , ja 65 vuorokautta lajille  C. tentans . Jos sääsket 
kuoriutuvat aikaisemmin, testi voidaan lopettaa vähintään viisi päivää sen 
jälkeen, kun viimeinen surviaissääski on kasvanut täysikasvuiseksi kontrol ­
lissa.  
HAVAINNOT  
Kuoriutuminen  
35. Kehitysaika ja täysin kuoriutuneiden uros- ja naarassääskien yhteismäärä 
määritetään. Urokset tunnistaa helposti sulkamaisista tuntosarvista.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1404
 
36. Testiastioita on tarkkailtava vähintään kolmesti viikossa ja epänormaalia 
käyttäytymistä on arvioitava silmämääräisesti (esim. sedimentistä poistumi ­
nen, epätavallinen uinti) kontrolliin verrattuna. Sääsket on laskettava päivit ­
täin, kun kuoriutuminen on odotettavissa. Täysikasvuisten sääskien suku ­
puoli ja lukumäärä kirjataan päivittäin. Tunnistuksen jälkeen sääsket poiste ­
taan astioista. Ennen testin loppua mahdollisesti munitut munamassat on 
kirjattava ylös ja poistettava, jottei sedimenttiin tule lisää toukkia. Myös niiden näkyvissä olevien koteloiden määrä, jotka eivät ole kuoriutuneet, on merkittävä ylös. Kuoriutumisen mittausohjeet ovat lisäyksessä 5.
 
Kasvu ja eloonjäänti  
37. Jos tiedot 10 vuorokauden toukkien eloonjäännistä ja kasvusta tarvitaan, 
testin alussa on otettava käyttöön ylimääräisiä testiastioita myöhempää käyt ­
töä varten. Toukat seulotaan ylimääräisten astioiden sedimentistä 250 μm:n 
seulalla. Kuolleiksi lasketaan toukat, jotka eivät liiku tai reagoi mekaanisiin 
ärsykkeisiin. Myös ne toukat, joita ei otettu talteen, lasketaan kuolleiksi 
(mikrobit ovat saattaneet hajottaa testin alussa kuolleet toukat). Eloonjää ­
neiden toukkien (tuhkaton) kuivapaino testiastiaa kohden määritetään ja yksilön keskimääräinen kuivapaino astiassa lasketaan. On hyödyllistä mää ­
rittää, missä kehitysvaiheessa eloonjääneet toukat ovat. Tähän tarkoitukseen 
voidaan mitata kunkin toukan pääkapselin leveys.
 
Mittaukset  
Testiaineen pitoisuus  
38. Vähintään sedimentin päällä olevan veden, huokosveden ja sedimentin näyt ­
teet analysoidaan testin alussa (mieluiten yksi tunti testiaineen lisäämisen jälkeen) ja lopussa suurimmassa pitoisuudessa ja matalammassa pitoisuu ­
dessa. Testiaineen pitoisuudesta saadaan tietoa testiaineen käyttäytymisestä 
ja jakautumisesta vesi-sedimenttisysteemissä. Sedimenttinäytteen ottaminen testin alussa voi vaikuttaa testijärjestelmään (esim. testitoukkia poistuu), joten testin alussa ja testin aikana tehtäviä analyyttisiä määrityksiä varten 
on tarvittaessa käytettävä ylimääräisiä testiastioita (katso kohta 39). Sedi ­
mentin mittaukset eivät välttämättä ole tarpeen, jos testiaineen jakautuminen veden ja sedimentin välille on määritetty selkeästi vesi/sedimentti-tutkimuk ­
sessa vastaavissa olosuhteissa (esim. sedimentin ja veden suhde, sovelluksen 
tyyppi, orgaanisen hiilen pitoisuus sedimentissä).
 
39. Jos välimittauksia tehdään (esim päivänä 7) ja analyysiin tarvitaan suuria 
näytteitä, joiden ottaminen testiastioista vaikuttaisi testijärjestelmään, ana ­
lyyttisiin määrityksiin käytetään ylimääräisistä testiastioista otettuja näytteitä. Näitä astioita käsitellään samalla tavoin kuin testiastioita (mukaan lukien testiorganismien lisääminen), mutta niitä ei käytetä biologiseen havainnoin ­
tiin.
 
40. Huokosveden suositeltava eristystapa on sentrifugointi (esim. 10 000 g ja 
4 °C 30 minuutin ajan). Jos on kuitenkin osoitettu, että testiaine ei adsor ­
boidu suotimiin, voi myös suodatus olla hyväksyttävää. Joskus pitoisuuksien 
analysointi huokosvedestä ei ole mahdollista, koska näyte on liian pieni.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1405
 
Fysikaalis-kemialliset parametrit  
41. Testiastioiden pH ja lämpötila sekä testiveteen liuennut happi on mitattava 
asiaankuuluvasti (katso kohta 10). Kovuus ja ammoniakki on mitattava kontrolliastioissa ja yhdessä testiastiassa suurimmalla pitoisuudella testin 
alussa ja lopussa.
 
TIEDOT JA RAPORTOINTI  
Tulosten käsittely  
42. Tämän testin tarkoituksena on määrittää testiaineen vaikutus uros- ja naa ­
rassääskien kehittymisnopeuteen ja täysin kuoriutuneiden sääskien kokonais ­
määrään. 10 päivän testissä määritetään vaikutukset toukkien eloonjääntiin ja painoon. Jos eri sukupuolten herkkyydessä ei ilmene tilastollisesti merkitse ­
vää eroa, urosten ja naaraiden tulokset voidaan yhdistää tilastollisia analyy ­
sejä varten. Sukupuolten väliset herkkyyserot voidaan määrittää tilastotie ­
teellisesti esimerkiksi χ
 2 -r × 2 -taulukkotestillä. Toukkien eloonjäänti ja 
yksilön keskimääräinen kuivapaino astiaa kohden määritetään 10 päivän 
kuluttua, jos tarpeen.  
43. Vaikutuspitoisuudet ilmaistaan pitoisuuksina sedimentin päällä olevassa ve ­
dessä, ja vaikutuspitoisuudet lasketaan mieluiten testin alussa mitattujen 
sedimenttipitoisuuksien perusteella (katso kohta 38).  
44. EC  50 :n tai minkä tahansa muun EC  x :n piste-estimaattia laskettaessa astia ­
kohtaisia tilastotietoja voidaan käyttää aitoina toistoina. Laskettaessa minkä 
tahansa EC  x -arvon luottamusväliä astioiden välinen vaihtelu on otettava 
huomioon tai vaihtoehtoisesti osoitettava vaihtelu niin pieneksi, että se voi ­
daan jättää huomiotta. Jos malliin sovelletaan pienimmän neliösumman me ­
netelmää, astiakohtaisiin tilastotietoihin on sovellettava muunnosta, jotta va ­
rianssin homogeenisuus paranee. EC  x -arvot on kuitenkin laskettava sen jäl ­
keen, kun vaste on muunnettu takaisin alkuperäisarvoon.  
45. Kun NOEC/LOEC on tarkoitus määrittää tilastollisen hypoteesin testillä, 
astioiden välinen vaihtelu on huomioitava esimerkiksi hierarkkisella ANO ­
VAlla. Robustimpia testejä (21) voidaan käyttää soveltuvissa tilanteissa, kun tavalliset ANOVAn oletukset eivät täyty.
 
Kuoriutumisaste  
46. Kuoriutumisasteet ovat dikotomisia tietoja, ja ne voidaan analysoida 
Cochran-Armitagen testillä, jota sovelletaan alaspäin askeltavasti, kun mo ­
notoninen annosvaste on odotettavissa, ja näitä tietoja pidetään tämän odo ­
tuksen mukaisina. Jos näin ei ole, voidaan käyttää Fisherin tarkkaa testiä tai Mantel-Haenszelin testiä, jossa p-arvot on korjattu Bonferroni-Holmin me ­
netelmällä. Jos on näyttöä siitä, että saman pitoisuuden toistojen välinen 
varianssi on suurempi kuin binomijakauma antaa edellyttää (ylihajonta), 
voidaan käyttää Cochran-Armitagen testiä tai Fisherin tarkkaa testiä (21).
 
47. Kuoriutuneiden sääskien määrä astiassa (n  e ) määritetään, ja summa jaetaan 
lisättyjen sääskien määrällä (n  a ): 
ER ¼ n e 
n a ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1406
 
jossa:  
ER = kuoriutumisaste  
n e = kuoriutuneiden sääskien määrä astiassa  
n a = astiaan lisättyjen toukkien määrä  
48. Kun näytekoko on suuri ja ylihajontaa esiintyy, paras vaihtoehto on pitää 
kuoriutumisastetta jatkuvana vasteena ja käyttää esimerkiksi Williamsin tes ­
tiä, kun monotoninen annosvaste on odotettavissa ja yhdenmukainen kuo ­
riutumisastetietojen kanssa. Dunnettin testi soveltuu, kun monotonisuutta ei 
esiinny. Näytekoko määritetään tässä suureksi, jos sekä kuoriutuneiden että 
kuoriutumattomien toukkien määrä on toistossa (astiassa) yli viisi.  
49. Jos halutaan soveltaa ANOVA-menetelmiä, ER-arvot on ensin muunnettava 
arcsin-neliöjuuri-muunnoksella tai Freeman-Tukeyn muunnoksella, jotta saa ­
daan likimääräinen normaalijakauma ja varianssi tasoittuu. 
Cochran-Armitagen testiä, Fisherin tarkkaa testiä (Bonferroni) tai Mantel-Haenszelin testiä voidaan soveltaa, kun käytetään absoluuttisia frek ­
venssejä. Arcsin-neliöjuuri-muunnosta sovelletaan ottamalla kuoriutumisas ­
teen neliöjuuren käänteinen sini (sini
 –1 ). 
50. Kuoriutumisasteissa EC  x -arvot lasketaan käyttämällä regressioanalyysiä (tai 
esim. probit- (22), logit- tai Weibull-mallia tai soveltuvaa kaupallista ohjel ­
mistoa). Jos regressioanalyysi epäonnistuu (esim. osittaisia vasteita on alle kaksi), käytetään muita parametrittomia menetelmiä, kuten liukuvaa keski ­
arvoa tai yksinkertaista interpolaatiota.
 
Kehittymisnopeus  
51. Keskimääräinen kehittymisaika edustaa keskimääräistä ajanjaksoa toukkien 
lisäämisestä (testipäivä 0) kokeellisen sääskikohortin kuoriutumiseen. (Aidon kehittymisajan laskennassa on huomioitava toukkien ikä lisäyshetkellä.) Ke ­
hittymisnopeus on kehittymisajan käänteisluku (yksikkö: 1/vrk) ja edustaa 
päivässä tapahtuvaa toukkien kehittymistä. Kehittymisnopeuden käyttö on 
suositeltavaa näiden sedimentin toksisuuskokeiden arvioinnissa, sillä sen varianssi on pienempi ja se on homogeenisempi ja lähempänä normaalija ­
kaumaa kuin kehittymisaika. Siksi tehokkaita parametritestimenetelmiä käy ­
tetään mieluummin kehittymisnopeuden kuin kehittymisajan kanssa. Kun 
kehittymisnopeus on jatkuva vaste, EC
 x -arvot voidaan estimoida regressioa ­
nalyysillä (esim. (23) ja (24)).  
52. Seuraavissa tilastollisissa testeissä oletetaan, että tarkastuspäivänä x havaittu 
sääskimäärä kuoriutuu päivän x ja päivän x-l välissä (l = tarkastusvälin 
pituus, yleensä 1 päivä). Keskimääräinen kehittymisnopeus astiassa ( x) las­
ketaan seuraavasti:  
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e 
jossa:  
x: keskimääräinen kehittymisnopeus astiassa  
i: tarkastusvälin indeksi  
m: tarkastusvälien enimmäismäärä  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1407
 
ƒ i : tarkastusvälissä i kuoriutuneiden sääskien määrä  
n e : testin lopussa kuoriutuneiden sääskien kokonaismäärä (=  P ƒ i ) 
x i : tarkastusvälissä i kuoriutuneiden sääskien kehittymisnopeus  
x i ¼ 1= Í 
day  i Ä l i 
2 Î 
jossa:  
day  i : tarkastuspäivä (päivää lisäyksen jälkeen)  
l i : tarkastusvälin i pituus (päivissä, yleensä 1 päivä)  
Testiraportti  
53. Testiraportin on sisällettävä vähintään seuraavat tiedot:  
Testiaine:  
— fysikaalinen olomuoto ja tarvittaessa fysikaalis-kemialliset ominaisuudet 
(vesiliukoisuus, höyrynpaine, jakaantumiskerroin maa-aineksessa (tai se ­
dimentissä, jos saatavissa), stabiilisuus vedessä jne.)  
— kemialliset tunnistetiedot (yleisnimi, kemiallinen nimi, rakennekaava, 
CAS-numero jne.) sekä puhtaus ja testiaineen kvantifioinnissa käytetty 
analyysimenetelmä.  
Testilajit:  
— käytetyt koe-eläimet: lajit, tieteellinen nimi, eliöiden lähde ja kasvatuso ­
losuhteet  
— tiedot munamassojen ja toukkien käsittelystä  
— koe-eläinten ikä testiastioihin lisättäessä.  
Testiolosuhteet:  
— käytetty sedimentti, eli luonnollinen vai synteettinen sedimentti  
— luonnollisen sedimentin osalta sedimentin näytteenottopaikan sijainti ja 
kuvaus, mukaan lukien, jos mahdollista, kontaminaatiohistoria, ominai ­
suudet: pH, orgaanisen hiilen pitoisuus, C/N-suhde ja rakeisuus (tarvit ­
taessa)  
— synteettisen sedimentin valmistus: ainesosat ja niiden ominaisuudet (or ­
gaanisen hiilen pitoisuus, pH, kosteus jne. testin alussa)  
— testiveden valmistus (jos käytetään synteettistä vettä) ja ominaisuudet 
(happipitoisuus, pH, johtavuus, kovuus jne. testin alussa)  
— sedimentin ja sen päällä olevan veden syvyys  
— sedimentin päällä olevan veden ja huokosveden tilavuus, märän sedi ­
mentin paino huokosveden kanssa ja ilman huokosvettä  
— testiastiat (materiaali ja koko)  
— kantaliuosten valmistusmenetelmät ja testipitoisuudet  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1408
 
— testiaineen lisääminen: käytetyt testipitoisuudet, toistojen määrä ja mah ­
dollisen liuottimen käyttö  
— inkubaatio-olosuhteet: lämpötila, valojakso ja valon voimakkuus, ilmas ­
tus (taajuus ja voimakkuus)  
— yksityiskohtaiset tiedot syöttämisestä, kuten ravinnon tyyppi, valmistus, 
määrä ja syöttöaikataulu.  
Tulokset:  
— kaikki nimelliset testipitoisuudet, mitatut testipitoisuudet ja tulokset kai ­
kista analyyseistä, joilla määritettiin testiaineen pitoisuus testiastiassa  
— testiastioissa olevan veden laatu, eli pH, lämpötila, liuennut happi, ko ­
vuus ja ammoniakki  
— mahdollinen haihtuneen testiveden korvaus  
— kuoriutuneiden uros- ja naarassääskien määrä astiassa päivää kohden  
— kuoriutumattomien toukkien määrä astiassa  
— toukkien keskimääräinen kuivapaino astiaa kohden, kehitysasteittain jos 
tarpeen  
— kuoriutumisprosentti rinnakkaisnäytteessä ja testipitoisuudessa (uros- ja 
naarassääsket yhteensä)  
— täysin kuoriutuneiden sääskien keskimääräinen kehittymisnopeus rinnak ­
kaisnäytteessä ja testissä (uros- ja naarassääsket yhteensä)  
— toksisten tutkittavien ominaisuuksien estimaatit, kuten EC  x (ja siihen 
liittyvät luottamusvälit), NOEC ja/tai LOEC, ja niiden määrittämiseen käytetyt tilastolliset menetelmät
 
— tulosten pohdinta, mukaan luettuna mahdolliset vaikutukset, joita tästä 
testimenetelmästä poikkeamisella on ollut testin tuloksiin.  
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Develop ­
ment and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. 
Köpp. Berlin 1995.  
2) Fleming R  et al.  (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Final Report to the European Commission. Report No: EC 
3738. August 1994. WRc, UK.  
3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bio ­
assays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Works ­
hop held in the Netherlands.  
4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the To ­
xicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125–1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; 
Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
 
5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.  
6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second 
edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated 
June 1994.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1409
 
7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates.  
8) US-EPA/OPPTS 850,1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment to ­
xicity using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  (Chi­
ronomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National Water 
Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
 
10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insectici ­
des in  Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.  
11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47–57.  
12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publica ­
tions, Series on Testing and Assessment No. 23.  
13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of To ­
xicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
 
14) Tämän liitteen luku C.8: Myrkyllisyystutkimus madoilla.  
15) Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163–1175.  
16) Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303.
 
17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing se ­
veral treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096–1121.  
18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics 20: 482–491.  
19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 
103–117.  
20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics 28: 510–531.  
21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clus ­
tered binary data. Biometrics 48: 577–585.  
22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.  
23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494.  
24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298–312.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1410
 
Lisäys 1  
MÄÄRITELMÄT  
Tässä testimenetelmässä käytetään seuraavia määritelmiä:  
Synteettinen sedimentti  on luonnollisen sedimentin fyysisiä ainesosia jäljittele ­
vistä materiaaleista valmistettu seos.  
Yläpuolinen vesi  on testiastiassa sedimentin päällä oleva vesi.  
Huokosvesi  on sedimenttirakeiden välissä olevaa vettä.  
Vesi, johon on lisätty testiaine.  
Testikemikaali:  Tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1411
 
Lisäys 2  
Chironomus riparius  -lajin kasvatussuosituksia  
1. Chironomus -toukkia voi kasvattaa kiteytysmaljoissa tai suurissa astioissa. 
Astian pohjalle levitetään noin 5–10 mm:n paksuinen kerros hienoa kvartsi ­
hiekkaa. Myös piimaa (esim. Merck, tuotenro 8117) on osoitettu soveltu ­
vaksi substraatiksi (ohuempi, enintään muutaman millimetrin paksuinen ker ­
ros riittää). Sen jälkeen lisätään monta senttiä soveltuvaa vettä. Jos haihtu ­
mista tapahtuu, kuivuminen on estettävä lisäämällä vettä tarvittaessa. Vesi voidaan vaihtaa tarvittaessa. Varovainen ilmastus on tarpeen. Toukkien kas ­
vatusastioita on säilytettävä soveltuvassa häkissä, jotta kuoriutuvat aikuiset 
eivät pääse pakenemaan. Häkin on oltava tarpeeksi tilava, jotta kuoriutuneet 
aikuiset mahtuvat parveilemaan. Muutoin parittelua ei välttämättä tapahdu (vähimmäiskoko on n. 30 × 30 × 30 cm).
 
2. Häkkejä säilytetään huoneenlämmössä tai huoneessa, jonka lämpötila on 
vakioitu (20 ± 2 °C). Valoisa jakso on 16 tuntia (voimakkuus n. 1 000 luksia), pimeys 8 tuntia. On ilmoitettu, että lisääntyminen voi estyä, jos ilman suhteellinen kosteus on alle 60 prosenttia.
 
Laimennusvesi  
3. Mitä tahansa soveltuvaa luonnollista tai synteettistä vettä voidaan käyttää. 
Kaivovesi, talousvesi, josta on poistettu kloori, ja keinotekoinen neste (esim. Elendtin ”M4”- tai ”M7”-liuos, ks. jäljempänä) ovat yleisesti käytettyjä. Vesi on ilmastettava ennen käyttöä. Kasvatusvesi voidaan tarvittaessa uusia 
kaatamalla tai lappamalla käytetty vesi kasvatusastioista varoen tuhoamasta 
toukkaputkia.
 
Toukkien ruokinta  
4. Chironomus -toukat ruokitaan kalojen hiutaleruoalla (TetraMin®, TetraP ­
hyll® tai muu vastaava kaupallinen kalanruoka), jota annetaan noin 250 mg astiaa kohden päivässä. Ruoka voidaan antaa kuivana jauheena tai sus ­
pensiona vedessä: 1,0 g hiutaleruokaa lisätään 20 ml:aan laimennusvettä ja 
seos sekoitetaan homogeeniseksi. Tätä valmistetta voi antaa noin 5 ml astiaa kohden päivässä (ravista ennen käyttöä). Vanhoille toukille voi antaa enem ­
män ruokaa.
 
5. Ruokkimista säädellään vedenlaadun mukaan. Jos kasvatusalusta muuttuu 
sameaksi, ravinnon määrää on vähennettävä. Ravinnon määrän lisäämistä on seurattava tarkasti. Jos ravintoa on liian vähän, toukat siirtyvät kohti 
vesipatsasta, ja jos ravintoa on liian paljon, mikrobien toiminta voi lisääntyä 
ja happipitoisuudet laskea. Kumpikin vaihtoehto voi laskea kasvunopeutta.
 
6. Vähän viherlevän (esim.  Scenedesmus subspicatus , Chlorella vulgaris ) so­
luja voidaan lisätä, kun uusia kasvatusastioita perustetaan.  
Kuoriutuneiden aikuisten ruokinta  
7. Eräät kokeen suorittajat ovat ehdottaneet, että kylläisessä sakkaroosiliu ­
oksessa liotettu vanutuppo saattaa riittää kuoriutuneiden aikuisten ravinnoksi.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1412
 
Kuoriutuminen  
8. Kun lämpötila on 20 ± 2 °C, toukkien kasvatusastioista alkaa kuoriutua 
aikuisia noin 13–15 päivän kuluttua. Urokset tunnistaa helposti sulkamai ­
sista tuntosarvista.  
Munamassat  
9. Kun kasvatushäkissä on aikuisia, kaikista toukkien kasvatusastioista on tar ­
kistettava kolme kertaa viikossa, onko niissä hyytelömäisiä munamassoja. 
Jos munamassoja on, ne on poistettava varovasti. Ne siirretään pieneen astiaan, jossa on pieni määrä kasvatusvettä. Munamassoja voi käyttää uuden viljelyastian perustamiseen (esim. 2–4 munamassaa astiaa kohden) tai toksi ­
suustesteihin.
 
10. Munatoukkien pitäisi kuoriutua 2–3 päivän kuluttua.  
Uusien viljelyastioiden perustaminen  
11. Kun viljelmät on perustettu, uuden toukkaviljelyastian voi aloittaa testivaa ­
timusten mukaan kerran viikossa tai harvemmin. Vanhat astiat poistetaan, kun aikuiset sääsket ovat kuoriutuneet. Näin saadaan säännöllisesti aikuisia mahdollisimman vähäisellä vaivalla.
 
Testiliuosten ”M4” ja ”M7” valmistus  
12. Elendt (1990) kuvasi ”M4”-liuoksen. ”M7”-liuos valmistetaan samoin kuin 
”M4” lukuun ottamatta taulukossa 1 merkittyjä aineita, joiden pitoisuus on 
neljä kertaa pienempi ”M7”-liuoksessa kuin ”M4”-liuoksessa. ”M7”-liuosta koskeva julkaisu on valmisteilla (Elendt, henkilökohtainen viesti). Testiliu ­
osta ei valmisteta Elendtin ja Biasin mukaan (1990), sillä kantaliuosten 
valmistusta varten annetut NaSiO
 3 -, 5 H  2 O-, NaNO  3 -, KH  2 PO 4 - ja 
K 2 HPO  4 -pitoisuudet eivät ole riittäviä.  
”M7”-liuoksen valmistus  
13. Jokainen kantaliuos (I) valmistetaan erikseen, ja näistä kantaliuoksista (I) 
valmistetaan yhdistetty kantaliuos (II) (katso taulukko 1). ”M7”-liuos val ­
mistetaan täyttämällä 50 millilitraa yhdistettyä kantaliuosta (II) ja taulukossa 2 annetut määrät jokaista makroravinteiden kantaliuosta 1 litraksi deionisoi ­
tua vettä. Vitamiinien kantaliuos valmistetaan lisäämällä deionisoituun ve ­
teen kolmea vitamiinia taulukon 3 mukaisesti, ja 0,1 millilitraa yhdistettyä vitamiinien kantaliuosta lisätään lopulliseen ”M7”-liuokseen vähän ennen käyttöä. (Vitamiinien kantaliuos säilytetään jäädytettynä pienissä erissä.) 
Liuos ilmastetaan ja stabiloidaan.
 
Taulukko 1  
Hivenaineiden kantaliuokset M4- ja M7-liuosta varten  
Kantaliuokset (I) Määrä (mg), joka 
täytetään 1 lit ­
raksi deionisoitua 
vettä Yhdistetyn kantaliuoksen (II) val ­
mistus: Sekoita seuraavat määrät 
(ml) kantaliuoksia (I) ja täytä 1 lit ­
raksi deionisoitua vettä Lopulliset pitoisuudet testiliuoksissa 
(mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1413
 
Kantaliuokset (I) Määrä (mg), joka 
täytetään 1 lit ­
raksi deionisoitua 
vettä Yhdistetyn kantaliuoksen (II) val ­
mistus: Sekoita seuraavat määrät 
(ml) kantaliuoksia (I) ja täytä 1 lit ­
raksi deionisoitua vettä Lopulliset pitoisuudet testiliuoksissa 
(mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na
 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na2EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Nämä aineet ovat erilaiset M4- ja M7-liuoksissa, kuten edellä kerrottiin. 
( 2 ) Nämä liuokset valmistetaan erikseen. Sitten ne kaadetaan yhteen ja käsitellään välittömästi autoklaavissa.  
Taulukko 2  
Makroravinteiden kantaliuokset M4- ja M7-liuosta varten  
Määrä, joka täytetään 
1 litraksi deionisoitua 
vettä 
(mg) Lisätyn makroravinteiden 
kantaliuoksen määrä M4- ja 
M7-liuosten valmistuksessa 
(ml/l) Lopulliset pitoisuudet 
testiliuoksissa M4 ja 
M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1414
 
Taulukko 3  
Vitamiinien kantaliuos M4- ja M7-liuosta varten  
Kaikki kolme vitamiiniliuosta yhdistetään yhdeksi vitamiinien kantaliuokseksi.  
Määrä, joka täytetään 1 
litraksi deionisoitua 
vettä 
(mg) Lisätyn vitamiinien kantaliu ­
oksen määrä M4- ja M7- 
liuosten valmistuksessa 
(ml/l) Lopulliset pitoisuudet 
testiliuoksissa M4 ja M7 
(mg/l)  
Tiamiinihydrokloridi 750 0,1 0,075 
Syaanikobalamiini 
(B12) 10 0,1 0,0010 
Biotiini 7,5 0,1 0,00075  
KIRJALLISUUSVIITTEET  
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and 
validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 
1995.  
Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25–33.  
Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157–1167.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1415
 
Lisäys 3  
SYNTEETTISEN SEDIMENTIN VALMISTUS  
Sedimentin koostumus  
Synteettisen sedimentin koostumuksen on oltava seuraavanlainen:  
Ainesosa Ominaisuudet Prosenttiosuus 
sedimentin kuivapai ­
nosta 
Turve Rahkasuoturvetta, pH mah ­
dollisimman tarkoin 5,5–6,0, 
ei näkyviä kasvijäänteitä, hie ­
noksi jauhettuna (hiukkas ­
koko ≤ 1 mm) ja ilmakuivat ­
tuna 4–5 
Kvartsihiekka Raekoko: > 50 prosenttia 
hiukkasista on oltava kokoa 
50–200 μm 75–76 
Kaoliniittisavi Kaoliniittipitoisuus ≥ 30 % 20 
Orgaaninen hiili Säädetään lisäämällä turvetta 
ja hiekkaa 2 (± 0,5) 
Kalsiumkarbonaatti CaCO  3 , jauhettu, kemialli ­
sesti puhdas 0,05–0,1 
Vesi Johtavuus ≤ 10 μS/cm 30–50  
Valmistelut  
Turve ilmakuivataan ja jauhetaan hienoksi. Tarvittava määrä turvejauhetta sus ­
pendoidaan deionisoituun veteen käyttämällä tehokasta homogenisointilaitetta. 
Suspension pH-arvoksi säädetään 5,5 ± 0,5 CaCO  3 :lla. Suspension annetaan 
vakioitua vähintään kahden päivän ajan sekoittamalla sitä varovasti lämpötilassa 20 ± 2 °C, jotta pH stabiloituu ja saadaan stabiili mikrobikomponentti. Sen jälkeen pH mitataan uudelleen. Arvon pitäisi olla 6,0 ± 0,5. Sen jälkeen turve ­
suspensioon sekoitetaan muut ainesosat (hiekka ja kaoliniittisavi) ja deionisoitu 
vesi, jotta saadaan homogeenistä sedimenttiä, jonka vesipitoisuus on 30–50 pro ­
senttia sedimentin kuivapainosta. Lopullisen seoksen pH mitataan vielä kerran, ja se säädetään tarvittaessa CaCO
 3 :lla alueelle 6,5–7,5. Sedimentistä otetaan näyt ­
teitä, joista määritetään kuivapaino ja orgaanisen hiilen pitoisuus. On suositelta ­
vaa, että synteettistä sedimenttiä sopeutetaan ennen chironomid-eliöillä tehtävää myrkyllisyystestiä seitsemän päivää samoille olosuhteille, jotka testissä vallitse ­
vat.
 
Säilytys  
Synteettisen sedimentin kuivia ainesosia voi säilyttää kuivassa ja viileässä pai ­
kassa huoneenlämmössä. Valmistettua (märkää) sedimenttiä ei saa säilyttää ennen käyttöä tässä testissä. Se on käytettävä heti valmistuksen lopussa olevan 7 päivän sopeutusajan jälkeen.
 
KIRJALLISUUSVIITTEET:  
Tämän liitteen luku C.8. Myrkyllisyystutkimus madoilla.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tu ­
bificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. 
Safety 39: 10–20.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1416
 
Lisäys 4  
Hyväksyttävän laimennusveden kemialliset ominaisuudet  
Aine Pitoisuudet  
Hiukkaset < 20 mg/l 
Orgaanisen hiilen kokonaismäärä < 2 mg/l Ionisoitumaton ammoniakki < 1 μg/l 
Kovuus CaCO
 3 :na < 400 mg/l (*) 
Jäännöskloori < 10 mg/l Orgaanista fosforia sisältävien torjunta-aineiden koko ­
naismäärä < 50 ng/l 
Orgaanista klooria sisältävien torjunta-aineiden ja po ­
lykloorattujen bifenyylien kokonaismäärä < 50 ng/l 
Orgaanisen kloorin kokonaismäärä < 25 ng/l
 
(*) Jos kovuusionien ja testiaineen välillä epäillään yhteisvaikutusta, on kuitenkin käytettävä 
pehmeämpää vettä (tässä tapauksessa ei saa käyttää Elendt M4 -viljelynestettä).  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1417
 
Lisäys 5  
Chironomid-toukkien kuoriutumisen tarkkailuohjeet  
Dekantterilaseihin asetetaan pyydykset kuoriutuneita toukkia varten. Näitä pyy ­
dyksiä tarvitaan päivästä 20 lähtien testin loppuun saakka. Alla on esimerkki käytetystä pyydyksestä:
 
A: polyamidiverkko  
B: ylösalaisin käännetyt muovikupit  
C: reunukseton altistusdekantterilasi  D: verkkoaukot vedenvaihtoa varten  
E: vettä  
F: sedimentti  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1418
 
C.29  BIOHAJOAVUUS – CO  2 SULJETUISSA ASTIOISSA 
(HEADSPACE-TESTI)  
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 310 (2006). Testime ­
netelmällä voidaan arvioida kemikaalien biohajoavuutta, ja sen avulla saa ­
daan vastaavaa tietoa kuin tämän liitteen luvussa C.4, A–F kuvatuilla kuu ­
della testimenetelmällä. Niinpä kemikaalia, jonka tulokset ovat positiiviset tässä testimenetelmässä, voidaan pitää helposti biohajoavana, eli se hajoaa 
nopeasti ympäristössä.
 
2. Vakiintunut hiilidioksidimenetelmä (CO  2 ) (1), joka perustuu Sturmin alku ­
peräiseen testiin (2) ja jolla arvioidaan orgaanisten kemikaalien biohajoa ­
vuutta mittaamalla mikrobien toiminnan tuloksena syntyvää hiilidioksidia, on tavallisesti ensimmäinen vaihtoehto, kun testataan heikosti liukenevia 
ja voimakkaasti adsorboivia kemikaaleja. Sitä käytetään myös liukeneville 
(mutta ei haihtuville) kemikaaleille, sillä monet pitävät hiilidioksidin muo ­
dostumista ainoana pitävänä todisteena mikrobien toiminnasta. Liuenneen orgaanisen hiilen poistumista voivat aiheuttaa fyysis-kemialliset prosessit – 
adsorptio, haihtuminen, saostuminen, hydrolyysi – sekä mikrobien toiminta, 
ja monet ei-biologiset reaktiot kuluttavat happea. Orgaaniset kemikaalit har ­
voin tuottavat hiilidioksidia abioottisesti. Alkuperäisessä ja muunnetussa Sturmin testissä (1)(2) CO
 2 :ta poistetaan nestefaasista absorboiviin astioihin 
kuplittamalla (sparging) eli hiilidioksidia poistetaan kuplittamalla ilmaa nes ­
tefaasin läpi. Larsonin versiossa (3)(4) CO  2 siirretään puolestaan reaktio ­
astiasta absorboiviin materiaaleihin kuljettamalla hiilidioksidia sisältämätöntä ilmaa kaasutilan (headspace) läpi ja lisäksi ravistamalla testiastiaa jatkuvasti. 
Ainoastaan Larsonin muunnoksessa reaktioastiaa ravistetaan. Liukenematto ­
mia aineita sekoitetaan standardissa ISO 9439 (5) ja alkuperäisessä yhdys ­
valtalaisessa versiossa (6), joissa kummassakin käytetään kuplitusta (spar ­
ging) kaasutilan vaihdon sijaan. Toisessa virallisessa US EPA -menetel ­
mässä (7), joka perustuu Gledhillin menetelmään (8), ravistettu reaktioastia 
suljetaan ilmatiiviisti, ja tuotettu CO
 2 sidotaan astiassa olevaan emäkseen 
suoraan kaasufaasista, kuten klassisissa Warburgin/Barcroftin respirometri ­
pulloissa.  
3. On kuitenkin osoitettu, että epäorgaaninen hiili (IC) kerääntyy standardin 
Sturmin muunnetun testin aikana väliaineessa useisiin kemikaaleihin (9). 
Epäorgaanisen hiilen pitoisuus oli jopa 8 mg/l aniliinin (20 mg C/l) hajoa ­
misen aikana. Siten CO  2 :n sitominen emäkseen ei antanut oikeaa kuvaa 
siitä, miten paljon CO  2 :ta tuotettiin mikrobiologisesti hajoamisen aikana. 
Tästä syystä vaatimus, että > 60 prosenttia ThCO  2 :sta on kerättävä 10-päi ­
väisen jakson aikana (10 %:n hajoamistason saavuttamista seuraavat 10 päi ­
vää), jotta testikemikaali voidaan luokitella helposti biohajoavaksi, ei täyty joidenkin sellaisten kemikaalien osalta, jotka määriteltäisiin helposti bioha ­
joaviksi DOC-poistuman perusteella.
 
4. Kun hajoamisprosentti on alempi kuin odotettu arvo, epäorgaanista hiiltä 
saattaa kerääntyä testiliuokseen. Silloin hajoavuutta voidaan arvioida muilla 
nopean biohajoavuuden testeillä.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1419
 
5. Sturmin menetelmän muiden heikkouksien (vaivalloinen, aikaa vievä, alt ­
tiimpi koevirheille eikä sovellu haihtuville kemikaaleille) vuoksi oli aiemmin 
alettu etsiä Gledhillin tekniikan lisäksi toista suljetun astian menetelmää läpivirtausjärjestelmien (10)(11) sijaan. Boatman  et al  (12) tarkastelivat 
aiempia menetelmiä ja ottivat käyttöön suljetun kaasutilan järjestelmän, 
jossa CO
 2 vapautetaan kaasutilaan inkubaation jälkeen happamoittamalla 
väliaine. CO  2 mitattiin kaasukromatografisella (GC)/IC-analyysillä auto ­
maattisesti kaasutilasta otetuista näytteistä, mutta nestefaasin liuennutta epä ­
orgaanista hiiltä (DIC) ei huomioitu. Lisäksi käytetyt astiat olivat hyvin 
pieniä (20 ml) ja niissä oli vain 10 ml:aa väliainetta, mikä aiheutti ongelmia 
esimerkiksi, kun liukenemattomia testikemikaaleja lisättiin hyvin pieniä määriä. Lisäksi siirrostetussa liuoksessa ei välttämättä ole ollenkaan tai tar ­
peeksi mikro-organismeja, jotka pystyvät hajottamaan testikemikaaleja.
 
6. Nämä vaikeudet voitettiin Struijsin ja Stoltenkampin (13) sekä Birchin ja 
Fletcherin (14) itsenäisissä tutkimuksissa. Jälkimmäiset saivat inspiraation 
anaerobisen biohajoavuuden testissä käytetystä laitteesta (15). Ensimmäi ­
sessä menetelmässä (13) CO  2 mitataan kaasutilassa happamoittamisen ja 
tasapainottumisen jälkeen, kun taas jälkimmäisessä (14) DIC mitataan 
sekä kaasu- että nestefaasissa, ilman käsittelyä. Yli 90 prosenttia muodos ­
tuneesta IC:stä oli nestefaasissa. Kummassakin menetelmässä on etunsa Sturmin testiin verrattuna, sillä niissä testijärjestelmä on pienempi ja hel ­
pompi käsitellä, haihtuvia kemikaaleja voidaan testata ja mahdollinen viive 
tuotetun CO
 2 :n mittauksessa vältetään.  
7. Nämä kaksi lähestymistapaa yhdistettiin ISO Headspace CO  2 -standardissa 
(16), joka rengastestattiin (17). Nykyinen testimenetelmä perustuu juuri tä ­
hän standardiin. Noita kahta lähestymistapaa on käytetty myös US EPA -menetelmässä (18). CO
 2 :n mittaamiseen suositellaan kahta menetelmää eli 
CO 2 kaasutilassa happamoittamisen jälkeen (13) ja IC nestefaasissa emäk ­
sisen aineen lisäämisen jälkeen. Jälkimmäisen menetelmän otti käyttöön Peterson, kun tälle Headspace-menetelmälle, joka oli muunnettu luontaisen biohajoavuuden mittausta varten, tehtiin laboratorioiden välinen 
CONCAWE-tutkimus (19). Tähän testimenetelmään on sisällytetty muutok ­
set, jotka tehtiin vuonna 1992 (20) tämän liitteen lukuun C.4 Biohajoavuu ­
den määritys, joten olosuhteet (väliaine, kesto jne.) ovat muuten samat kuin muutetussa Sturmin testissä (20). Birch ja Fletcher (14) ovat osoittaneet, että 
tällä Headspace-testillä saatiin samoilla kemikaaleilla hyvin samankaltaisia 
tuloksia kuin tarkistettujen testimenetelmien OECD:n yhteistutkimuksissa (21).
 
TESTIN PERIAATE  
8. Testikemikaali (tavallisesti 20 mg C/l), joka on ainoa hiilen ja energia lähde, 
inkuboidaan puskuri-mineraalisuolaliuoksessa, johon on siirrostettu sekapo ­
pulaatiosta otettuja mikroeliöitä. Testi tehdään suljetuissa pulloissa, joissa on 
ylätilassa ilmaa, joka toimii happivarastona aerobista biohajoamista varten. 
Testikemikaalin lopullisen aerobisen biohajoamisen tuottama CO  2 määrite­
tään mittaamalla, kuinka paljon enemmän epäorgaanista hiiltä muodostuu testipulloissa verrattuna pulloihin, joissa on vain siirrostettua liuosta. Bioha ­
joaminen ilmaistaan ThIC-arvona, joka perustuu alun perin lisätyn testike ­
mikaalin (orgaanisena hiilenä) määrään.
 
9. DOC-poistuma ja/tai testikemikaalin primäärisen biohajoamisen laajuus voi ­
daan myös mitata (20).  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1420
 
TESTIKEMIKAALIA KOSKEVIA TIETOJA  
10. Testikemikaalin orgaanisen hiilen pitoisuuden (% w/w) on oltava tiedossa 
kemiallisen rakenteen tai mittauksen perusteella, jotta hajoamisprosentti voi ­
daan laskea. Jos testikemikaalit ovat haihtuvia, mitattu tai laskettu Henryn 
lain vakio auttaa määrittämään soveltuvan kaasutilan ja nestetilavuuden suh ­
teen. Testikemikaalin toksisuus mikro-organismeille on hyvä olla tiedossa, kun valitaan soveltuvaa testipitoisuutta ja tulkitaan heikosta biohajoavuu ­
desta kertovia tuloksia. Inhibitiota on suositeltavaa kontrolloida, ellei olet 
tiedossa, että testikemikaali ei estä mikrobien toimintaa (katso kohta 24).
 
MENETELMÄN SOVELTUVUUS  
11. Tätä testiä voidaan soveltaa vesiliukoisiin ja liukenemattomiin testikemikaa ­
leihin, mutta testikemikaalin hyvä dispersio on varmistettava. Kun käytetään suositeltua kaasutilan ja nestetilavuuden välistä suhdetta 1:2, voidaan testata haihtuvia kemikaaleja, joiden Henryn lain vakio on enintään 50 Pa m
 3 mo­
l –1 , sillä testikemikaalin osuus kaasutilassa ei ole yli 1 prosenttia (13). Kaa ­
sutilan tilavuuden on oltava pienempi, kun testataan tätä haihtuvampia ke ­
mikaaleja, mutta niiden biologinen hyötyosuus voi asettaa rajoituksia var ­
sinkin, jos ne liukenevat heikosti veteen. Käyttäjien on kuitenkin valittava 
kaasutilan ja nestetilavuuden suhde sekä testikemikaalin pitoisuus siten, että 
happi riittää täydelliseen aerobiseen biohajoamiseen (esimerkiksi suuren substraattipitoisuuden ja pienen kaasutilavuuden käyttöä on vältettävä). Oh ­
jeet ovat kirjallisuusviitteissä (13)(23).
 
VERTAILUKEMIKAALIT  
12. Testimenetelmän toimivuus tarkistetaan testaamalla rinnakkaisesti vertailu ­
kemikaalia, jonka biohajoavuus on tiedossa. Tähän tarkoitukseen voidaan 
käyttää aniliinia, natriumbentsoaattia tai etyleeniglykolia, kun testataan ve ­
siliukoisia kemikaaleja, ja 1-oktanolia, kun testataan heikosti liukenevia ke ­
mikaaleja (13). Näiden kemikaalien biohajoavuuden täytyy olla > 60 % 
ThIC 14 päivän kuluessa.  
TOISTETTAVUUS  
13. Menetelmän ISO-yhteistutkimuksessa (17) saatiin seuraavat tulokset, kun 
käytettiin suositeltuja olosuhteita ja hiilen pitoisuus testikemikaalissa oli 20 mg C/l.
 
Testikemikaali Biohajoavuuden kes ­
kiarvo 
(28 vrk) Variaatiokerroin 
(%) Laboratorioiden 
määrä  
Aniliini 90 16 17 
1-oktanoli 85 12 14  
Testin sisäinen variaatio (toistettavuus) oli pieni, kun käytettiin aniliinia. 
Variaatiokerroin oli enintään 5 prosenttia lähes kaikissa testiajoissa. Kah ­
dessa tapauksessa toistettavuus oli huonompi, ja suurempi variaatio johtui luultavasti suuresta IC:n tuotannosta nollakokeissa (kontrolleissa). Toistetta ­
vuus oli huonompi käytettäessä 1-oktanolia, mutta se oli silti alle 10 pro ­
senttia 79 prosentissa testiajoista. Suurempi testin sisäinen variaatio saattoi 
johtua annosteluvirheistä, sillä suljettuihin testipulloihin injektoitiin pieni määrä (3–4 μl) 1-oktanolia. Variaatiokertoimet ovat suuremmat, kun käyte ­
tään testikemikaalin pienempiä pitoisuuksia ja varsinkin kun pitoisuus on 
alle 10 mg C/l. Tämä voidaan estää osittain pienentämällä epäorgaanisen 
hiilen kokonaismäärää (TIC) inokulaatissa.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1421
 
14. Kun EU:n yhteistutkimuksessa (24) viittä pinta-aktiivista ainetta lisättiin 
pitoisuudella 10 mg C/l, saatiin seuraavat tulokset.  
Testikemikaali Biohajoavuuden kes ­
kiarvo 
(28 vrk) Variaatioker ­
roin 
(%) Laboratorioiden 
määrä  
Tetraprolyleeni 
Bentseenisulfonaatti 17 45 10 
Di-iso-oktyylisulfo- 
sukkinaatti 
(anioninen) 72 22 9 
Heksadekyyli-trimetyy ­
li (*) 
Ammoniumkloridi 
(kationinen) 75 13 10 
Iso-nonyylifenoli- 
(etoksylaatti)  9 
(ioniton) 41 32 10 
Kokamidopropyyli 
Dimetyylihydroksi 
Sulfobetaiini (amfoteerinen) 60 23 11
 
(*) Toksisuutta neutraloitiin lisäämällä SiO  2 :ta. 
Tulokset osoittavat, että variaatio oli yleensä suurempi, jos pinta-aktiivinen 
aine oli huonosti hajoava. Testin sisäinen variaatio oli alle 15 prosenttia yli 
90 prosentissa tapauksista. Suurin variaatio oli 30–40 prosenttia.  
HUOMAUTUS: Useimmat pinta-aktiiviset aineet eivät ole yksimolekyylisiä 
lajeja, vaan isomeerien, homologien jne. sekoituksia. Ne 
hajoavat erilaisten latenssiaikojen jälkeen ja erilaisilla ki ­
neettisillä nopeuksilla, jolloin käyrät ovat loivia ja epäsel ­
viä eikä 60 prosentin kynnysarvoa välttämättä saavuteta 10-päiväisessä jaksossa, vaikka yksin testattuna jokainen 
yksittäinen molekyylilaji saavuttaisi > 60 prosentin kyn ­
nysarvon 10 päivässä. Sama voi ilmetä myös muissa mo ­
nimutkaisissa seoksissa.
 
MENETELMÄN KUVAUS  
Laite  
15. Tavallinen laboratoriolaite ja lisäksi:  
a) lasisia seerumipulloja, suljettu butyylikumitulpalla ja alumiinisulkimilla. 
Suositeltu koko on 125 ml, jolloin kokonaistilavuus on noin 160 ml (tässä tapauksessa jokaisen pullon tilavuuden pitää olla tunnetusti 160 ± 1 ml). Pienempää astiaa voidaan käyttää, kun tulokset täyttävät koh ­
dissa 66 ja 67 kuvatut ehdot
 
b) hiilianalysaattori tai muu väline (esim. kaasukromatografi) epäorgaanisen 
hiilen mittaamista varten  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1422
 
c) ruiskuja, joiden tarkkuus on suuri, kaasu- ja nestenäytteitä varten  
d) orbital-ravistelija ympäristössä, jonka lämpötila on vakioitu  
e) hiilidioksiditonta ilmaa – tätä voidaan valmistaa kuljettamalla ilmaa 
sooda-kalkkirakeiden läpi tai käyttämällä kaasuseosta, jossa on 80 pro ­
senttia N  2 :ta ja 20 prosenttia 0  2 :ta (valinnainen) (katso kohta 28)  
f) kalvosuodatin, huokoskoko 0,20–0,45 μm (valinnainen)  
g) orgaanisen hiilen analysaattori (valinnainen).  
Reagenssit  
16. Käytä pelkästään analyysilaatuisia reagensseja.  
Vesi 
17. Tislattu tai deionisoitu vesi, jonka orgaaninen kokonaishiilipitoisuus on ≤ 1 
mg/l. Tämä edustaa alkuperäistä, testikemikaalin suositellun annoksen anta ­
maa ≤ 5 prosentin orgaanista hiilipitoisuutta.  
Mineraalisuolakasvatusalustan kantaliuokset  
18. Kantaliuokset ja mineraalisuolakasvatusalusta vastaavat standardia ISO 
14593 (16) ja luvun C.4 biohajoavuuden testejä (20). Suuremman ammoni ­
umkloridipitoisuuden (2,0 g/l eikä 0,5 g/l) käyttö on tarpeen vain poikke ­
ustapauksissa, kuten jos testikemikaalin pitoisuus on > 40 mg C/l. Kantaliu ­
okset säilytetään jääkaapissa ja hävitetään kuuden kuukauden kuluttua tai aiemmin, jos on merkkejä saostumisesta tai mikrobikasvustosta. Valmista seuraavat kantaliuokset:
 
a) kaliumdivetyfosfaatti (KH  2 PO 4 ) 8,50 g  
dikaliumvetyfosfaatti (K  2 HPO  4 ) 21,75 g  
dinatriumvetyfosfaattidihydraatti (Na  2 HPO  4 2H 2 O) 33,40 g  
ammoniumkloridi (NH  4 Cl) 0,50 g  
Liuota veteen ja täytä 1 litraksi. Liuoksen pH-arvon on oltava 7,4 (± 0,2). 
Jos näin ei ole, valmista uusi liuos.  
b) kalsiumklorididihydraatti (CaCl  2. 2H 2 O) 36,40 g  
Liuota veteen ja täytä 1 litraksi.  
c) magnesiumsulfaattiheptahydraatti (MgSO  4. 7H 2 O) 22,50 g  
Liuota veteen ja täytä 1 litraksi.  
d) rauta(III)kloridiheksahydraatti (FeCl  3. 6H 2 0) 0,25 g  
Liuota veteen, täytä 1 litraksi ja lisää yksi tippa väkevöityä HCl-liuosta.  
Epäorgaanisen liuoksen valmistus  
19. Sekoita 10 ml liuosta (a) ja noin 800 ml vettä (kohta 17), lisää sitten 1 ml 
liuoksia (b), (c) ja (d) ja täytä sitten vedellä 1 litraksi (kohta 17).  
Muut reagenssit  
20. Väkevöity ortofosforihappo (H  3 PO 4 ) (massa tilavuutta kohti > 85 %).  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1423
 
Natriumhydroksidiliuos 7M  
21. Liuota 280 g natriumhydroksidia (NaOH) 1 litraan vettä (kohta 17). Määritä 
tämän liuoksen DIC-pitoisuus ja huomioi arvo testitulosta laskettaessa (katso kohdat 55 ja 61), etenkin kohdassa 66 (b) annetun laatuvaatimuksen kan ­
nalta. Valmista uusi liuos, jos DIC-pitoisuus on liian suuri.
 
Testikemikaali  
22. Valmista kantaliuos riittävän vesiliukoisesta testikemikaalista veteen (kohta 
17) tai testiviljelyaineeseen (kohta 19). On suositeltavaa, että pitoisuus on satakertainen verrattuna lopulliseen testissä käytettävään pitoisuuteen. Kan ­
taliuoksen pH-arvon säätäminen voi olla tarpeen. Kantaliuos lisätään epäor ­
gaaniseen liuokseen, jotta lopullinen orgaanisen hiilen pitoisuus on 2–40 mg C/l, mieluiten 20 mg C/l. Jos käytetty pitoisuus on tätä alempi, tarkkuus saattaa kärsiä. Liukenevat ja liukenemattomat nestemäiset kemikaalit voi 
lisätä astioihin suoraan ruiskulla, jonka tarkkuus on suuri. Heikosti liukene ­
vat ja liukenemattomat testikemikaalit saattavat vaatia erityiskäsittelyä (25). Vaihtoehdot ovat seuraavat:
 
a) tunnettujen punnittujen määrien lisääminen suoraan  
b) ultraäänidispersio ennen lisäystä  
c) dispersio käyttämällä tarvittavia emulgointiaineita, jotta voidaan määrittää 
ennen lisäystä, onko niillä inhiboivia tai stimuloivia vaikutuksia mikro ­
bien toimintaan  
d) nestemäisten testikemikaalien adsorptio tai liuotus soveltuvaan haihtu ­
vaan liuottimeen, inerttiin aineeseen tai kantaja-aineeseen (esim. lasikui ­
tusuodattimeen), minkä jälkeen mahdollinen liuotin haihdutetaan ja tun ­
netut määrät lisätään suoraan  
e) testikemikaaliliuoksen tunnetun tilavuuden lisääminen helposti haihtu ­
vaan liuottimeen tyhjässä testiastiassa, minkä jälkeen liuotin haihdute ­
taan.  
Aineiden ja liuottimien, joita käytetään kohdissa (c), (d) ja (e), mahdolliset 
stimuloivat tai inhiboivat vaikutukset mikrobien toimintaan on testattava 
(katso kohta 42(b)).  
Vertailukemikaali  
23. Valmista (liukenevan) vertailukemikaalin kantaliuos veteen (kohta 17). On 
suositeltavaa, että pitoisuus on satakertainen verrattuna lopulliseen testissä käytettävään pitoisuuteen (20 mg C/l).
 
Inhibition tarkistus  
24. Testikemikaalit eivät usein hajoa merkittävästi biohajoavuuden määrittämi ­
seen käytetyissä olosuhteissa. Yksi mahdollinen syy on, että testikemikaali 
estää inokulaattia pitoisuudella, jossa sitä lisätään testiin. Testiin voidaan sisällyttää inhibition tarkistus, mikä helpottaa inhibition tunnistamista (ta ­
kautuvasti) mahdolliseksi syyksi tai osatekijäksi. Inhibition tarkistuksella 
voidaan myös sulkea pois tällaiset vaikutukset ja osoittaa, että nollahajoa ­
minen tai heikko hajoaminen liittyy ainoastaan siihen, että testikemikaalit eivät ole alttiita mikrobihyökkäykselle testiolosuhteissa. Testikemikaalin tok ­
sisuudesta (aerobisille) mikro-organismeille saadaan tietoa valmistamalla tes ­
tiviljelyaine, joka sisältää testikemikaalia ja vertailukemikaalia (kohta 19), 
kumpaakin lisättävinä pitoisuuksina (katso kohdat 22 ja 23).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1424
 
Siirrosaine  
25. Siirrosaine voi olla peräisin monesta eri lähteestä: aktiivilietteestä, jätev ­
edestä (ilman kloorikäsittelyä), pintavedestä, maa-aineksesta tai näiden se ­
oksesta (20). Lähteen biohajoamistoiminta on tarkistettava vertailukemikaa ­
lin avulla. Oli lähde mikä tahansa, aiemmin testikemikaalille altistuneita 
mikro-organismeja ei saa käyttää, jos menetelmää käytetään nopean bioha ­
joavuuden testaamiseen.  
Varoitus: aktiiviliete, jätevesi ja poistovesi sisältävät patogeenisiä organis ­
meja, ja niitä on käsiteltävä varoen.  
26. Kokemuksen perusteella siirrosaineen optimaalinen tilavuus täyttää seuraavat 
ehdot:  
— mahdollistaa riittävän biohajoamistoiminnan  
— hajottaa vertailukemikaalia määrätyssä määrin (katso kohta 66)  
— antaa 10  2 –10  5 pesäkkeitä muodostavaa yksikköä millilitraa kohden lo ­
pullisessa seoksessa  
— antaa normaalisti suspendoituneen kiintoaineen pitoisuudeksi 4 mg/l lo ­
pullisessa seoksessa, kun käytetään aktiivilietettä. Pitoisuus voi olla enin ­
tään 30 mg/l, mutta se voi nostaa CO  2 -tuotantoa merkittävästi nollako ­
keissa (26)  
— antaa alle 10 prosenttia testikemikaalin antamasta alkuperäisestä orgaa ­
nisen hiilen pitoisuudesta  
— 1–10 ml siirrosainetta 1 testiliuoslitraa kohden.  
Aktiiviliete  
27. Aktiiviliete kerätään tuoreena pääosin kotitalouksien jätevettä käsittelevän 
vedenpuhdistamon tai laboratoriolaitoksen ilmastussäiliöstä. Tarvittaessa kar ­
keat hiukkaset poistetaan suodattamalla (esim. 1 mm  2 :n verkkoseulalla), 
minkä jälkeen liete pidetään aerobisena.  
28. Lietteen annetaan asettua tai se sentrifugoidaan (esimerkiksi 1 100 × g 10 
minuutin ajan) karkeiden hiukkasten poiston jälkeen. Pintaliete hylätään. Lietettä voidaan pestä epäorgaanisessa liuoksessa. Väkevöity liete suspen ­
doidaan epäorgaaniseen liuokseen (lopullinen pitoisuus 3–5 g 
kuiva-ainetta/1) ja säilötään ilmastettuna.
 
29. Lietteen on tultava tehokkaasti toimivasta, perinteisen tekniikan mukaisesta 
laitoksesta. Jos liete on otettava suurkuormituslaitoksesta tai jos epäillään 
lietteen sisältävän inhibiittoreita, liete on pestävä. Liete sekoitetaan hyvin, minkä jälkeen uudelleen suspendoitunut liete saa asettua tai se sentrifugoi ­
daan. Pintaliete hylätään ja pesty liete suspendoidaan uudelleen uuteen epä ­
orgaaniseen liuokseen. Menettelyä toistetaan, kunnes voidaan katsoa, ettei 
lietteessä ole enää ylimääräistä substraattia tai inhibiittoria.
 
30. Kun liete on täysin uudelleensuspendoitunut (tai jos lietettä käytetään sel ­
laisenaan), näyte kerätään välittömästi ennen käyttöä. Suspendoituneen 
kuiva-aineen pitoisuus määritetään näytteestä.  
31. Yksi vaihtoehto on lisäksi aktiivilietteen homogenointi (3–5 g suspendoitu ­
nutta kuiva-ainetta/l). Lietettä käsitellään Waring-sekoittimessa keskinopeu ­
della 2 minuutin ajan. Sekoitetun lietteen annetaan asettua 30 minuutin ajan 
(tai tarvittaessa kauemmin), ja neste dekantoidaan. Näin saatua nestettä käy ­
tetään siirrosaineena (pitoisuus: 10 ml/l epäorgaanista liuosta).  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1425
 
32. CO  2 :n muodostumista nollakokeessa voidaan vähentää vielä lisää ilmasta ­
malla lietettä yön yli ilmalla, joka ei sisällä hiilidioksidia. Käytä 4 mg/l 
aktiivilietteen kiintoainesta siirrosaineen pitoisuutena tässä testissä (13).  
Sekundaarinen jätevesi  
33. Siirrosaineen lähteenä voidaan käyttää myös pääosin kotitalousjätevesiä puh ­
distavasta käsittelylaitoksesta tai laboratoriolaitoksesta saatavaa sekundaa ­
rista jätevettä. Säilytä näyte aerobisissa olosuhteissa ja käytä se näytteen ­
ottopäivänä tai esikäsittele tarvittaessa. Karkeat hiukkaset poistetaan suodat ­
tamalla jätevesi karkealla suodattimella ja pH-arvo mitataan.  
34. IC-pitoisuutta lasketaan ilmalla, joka ei sisällä hiilidioksidia (kohta 15 e), 
tunnin ajan samalla, kun pH pidetään arvossa 6,5 ortofosforihapolla (kohta 20). pH-arvo palautetaan alkuperäiseen arvoon natriumhydroksidilla (kohta 21), ja näytteen annetaan asettua noin tunnin, minkä jälkeen siirrosaineeksi 
otetaan soveltuva tilavuus pintalietettä. Hiilidioksidittoman ilman käyttö las ­
kee siirrosaineen IC-pitoisuutta. Kun suodatetun, ilmakäsitellyn jäteveden suositeltua enimmäistilavuutta (100 ml) litraa kohden käytettiin siirrosainee ­
na, kontrolliastioiden IC-pitoisuus oli 0,4–1,3 mg/l (14), mikä vastaa 2–6,5 
prosenttia, kun hiilen pitoisuus testikemikaalissa on 20 mg C/l, ja 4–13 
prosenttia, kun hiilen pitoisuus on 10 mg C/l.
 
Pintavedet  
35. Soveltuvasta pintavedestä otetaan näyte. Näytettä säilytetään aerobisissa olo ­
suhteissa, ja se on käytettävä näytteenottopäivänä. Näyte väkevöidään tar ­
vittaessa suodattamalla tai sentrifugoimalla. Jokaisessa testiastiassa käytettä ­
vän siirrosaineen tilavuuden on täytettävä kohdassa 26 annetut ehdot.  
Maa-ainekset  
36. Soveltuvasta maa-aineksesta otetaan näyte enintään 20 cm maan pinnan alta. 
Kivet, kasvien jäännökset ja selkärangattomat poistetaan maanäytteestä, 
minkä jälkeen se seulotaan 2 mm:n verkkosiivilällä (jos näyte on niin mär ­
kä, ettei sitä voi seuloa heti, anna sen kuivua osittain). Näytettä säilytetään aerobisissa olosuhteissa, ja se on käytettävä näytteenottopäivänä. (Jos näy ­
tettä kuljetetaan löysästi suljetussa mustassa polyeteenikassissa, sitä voidaan 
säilyttää kassissa kuukauden 2–4 °C:n lämpötilassa).
 
Siirrosaineen esikäsittely  
37. Esikäsittelyn avulla siirrosaine voidaan sopeuttaa testiolosuhteisiin, mutta ei 
testattavaan kemikaaliin. Esikäsittely voi vähentää CO  2 :n muodostumista 
nollakokeessa. Esikäsittelyssä testiaineen pitoisuudeksi laimennetaan 30 
mg/l, ja sen jälkeen aktiivilietettä ilmastetaan kostella ilmalla, joka ei sisällä hiilidioksidia, 5–7 päivän ajan testilämpötilassa.
 
TESTIMENETELMÄ  
Pullojen määrä  
38. Testiin tarvittava pullojen määrä (kohta 15 a) määräytyy analyysitiheyden ja 
testin keston mukaan.  
39. On suositeltavaa, että kolme pulloa analysoidaan rinnakkain riittävien aika ­
välien jälkeen, jotta 10-päiväinen jakso voidaan tunnistaa. Vähintään viisi testipulloa (kohta 15 a) sarjoista (a), (b) ja (c) (ks. kohta 42) analysoidaan 
testin lopussa, jotta biohajoavuuden keskiarvolle voidaan laskea 95 prosentin 
luottamusvälit.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1426
 
Siirrostettu liuos  
40. Siirrosainetta käytetään pitoisuudella 4 mg litrassa aktiivilietteen kiintoainet ­
ta. Valmista riittävä määrä siirrostettua liuosta juuri ennen käyttöä lisäämällä esimerkiksi 2 ml sopivasti käsiteltyä aktiivilietettä (kohdat 27–32) pitoisuu ­
della 2 000 mg/l yhteen litraan mineraalisuolakasvatusalustaa (kohta 19). Jos 
käytetään sekundaarista jätevettä, lisää enintään 100 ml jätevettä (kohta 33) 900 ml:aan mineraalisuolakasvatusalustaa (kohta 19) ja laimenna siirros ­
aineella 1 litraksi.
 
Pullojen valmistelu  
41. Siirrostetun liuoksen alikvootteja annostellaan rinnakkaispulloihin siten, että 
kaasutilan (headspace) ja nesteen suhde on 1:2 (jos pullon tilavuus on esim. 
160 ml, lisää 107 ml). Muitakin suhteita voi käyttää, mutta katso kohdassa 
11 annettu varoitus. Kun käytetään muuntyyppistä siirrosainetta, on varmis ­
tettava huolellisesti, että siirrostettu liuos on sekoitettu hyvin, jotta se ja ­
kautuu tasaisesti testipulloihin.  
42. Pullosarjoihin (kohta 15 a) kuuluvat seuraavat osat:  
a) testiastiat (F  T ), jotka sisältävät testikemikaalia  
b) kontrollipullot (F  B ), jotka sisältävät vain testiviljelyainetta ja siirrosainet ­
ta. Lisäksi testikemikaalin siirtämiseen testiastioihin voidaan tarvita ke ­
mikaaleja, liuottimia, aineita ja lasikuitusuodattimia  
c) astiat (F  C ), jotka sisältävät vertailukemikaalia testimenettelyn tarkista ­
mista varten  
d) tarvittaessa astiat (F  I ), joilla tarkistetaan testikemikaalin inhibitiovaikutus 
ja joissa on sekä testikemikaalia että vertailukemikaalia samoissa pitoi ­
suuksissa (kohta 24) kuin pulloissa F  T ja F  C 
e) astiat (F  S ), joilla tarkistetaan mahdollinen abioottinen hajoaminen (a) plus 
50 mg/l HgCl  2 :ta tai muulla tavoin steriloituna (esim. autoklaavissa).  
43. Vesiliukoiset testikemikaalit ja vertailukemikaalit lisätään vesipitoisina kan ­
taliuoksina (kohdat 22, 23 ja 24), kunnes pitoisuus on 10–20 mg C/l.  
44. Liukenemattomat testikemikaalit ja liukenemattomat vertailukemikaalit lisä ­
tään pulloihin eri tavoin (katso kohdat 22 a–e) testikemikaalin luonteen 
mukaan. Ne lisätään joko ennen siirrostettua liuosta tai sen jälkeen testike ­
mikaalin käsittelyn mukaan. Jos käytössä on jokin kohdissa 22 a–e anne ­
tuista menetelmistä, kontrollipulloja F  B (kohta 42 b) käsitellään muuten 
samoin, mutta ilman testikemikaalia tai vertailukemikaalia.  
45. Haihtuvat testikemikaalit injektoidaan suljettuihin pulloihin (kohta 47) mik ­
roruiskulla. Annos lasketaan injektoidun tilavuuden ja testikemikaalin tihey ­
den mukaan.  
46. Astioihin lisätään tarvittaessa vettä, jotta nestetilavuus on sama jokaisessa 
astiassa. On varmistettava, että kaasutilan ja nesteen suhde (yleensä 1:2) ja 
testikemikaalin pitoisuus ovat sellaisia, että kaasutilassa on riittävästi happea 
täydellistä biohajoamista varten.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1427
 
47. Sen jälkeen kaikki pullot suljetaan esimerkiksi butyylikumikalvolla tai alu ­
miinikorkilla. Haihtuvat testikemikaalit lisätään tässä vaiheessa (kohta 45). 
Jos testiliuoksen DOC-pitoisuuden laskua halutaan seurata ja alkuperäisen IC-pitoisuuden nollahetken analyysejä (steriilit kontrollit, kohta 42 e) tai muita analyysejä halutaan tehdä, ota sopivan kokoinen näyte testiastiasta. 
Hävitä testiastia ja sen sisältö tämän jälkeen.
 
48. Suljetut pullot asetetaan pyörivään ravistimeen (kohta 15 d), jonka ravistus ­
nopeus riittää pitämään pullojen sisällön hyvin sekoitettuna ja suspendoitu ­
neena (esim. 150–200 rpm), ja niitä inkuboidaan pimeässä lämpötilassa 20 °C ± 1 °C.
 
Näytteenotto  
49. Näytteenottotapa määräytyy lag-vaiheen ja testikemikaalin biohajoamisen 
kineettisen nopeuden mukaan. Pullot analysoidaan näytteenottopäivänä, joita pidetään vähintään kerran viikossa tai useammin (esim. kahdesti viikossa), 
jos täydellinen hajoamiskäyrä on tarpeen. Tarvittava määrä rinnakkaispulloja 
(F
 T , F B ja F  C sekä F  I ja F  S , jos käytössä) otetaan ravistajasta (ks. kohta 42). 
Testin normaali kesto on 28 päivää. Jos biohajoamiskäyrä osoittaa, että 
tasannevaihe on saavutettu ennen päivää 28, testi voidaan lopettaa jo aikai ­
semmin. Ota näytteet viidestä pullosta, jotka on varattu testipäivän 28 ana ­
lysointia varten, ja laske tulosten perusteella luottamusvälit tai biohajoamisp ­
rosentin variaatiokerroin. Inhibition ja abioottisen hajoamisen tarkistusta var ­
ten varatuista pulloista ei tarvitse ottaa näytteitä yhtä usein kuin muista 
pulloista. Riittää, kun näyte otetaan päivänä 1 ja 28.  
Epäorgaanisen hiilen (IC) analyysi  
50. Pullojen CO  2 -tuotanto määritetään mittaamalla epäorgaanisen hiilen (IC) pi ­
toisuuden nousu inkubaation aikana. Testin aikana tuotetun IC:n mittaa ­
miseen on kaksi suositeltavaa menetelmää, jotka on kuvattu alla. Koska näiden menetelmien tulokset voivat poiketa hieman toisistaan, käytä vain yhtä menetelmää yhdessä testiajossa.
 
51. Menetelmä (a) on suositeltava, jos siirrosaineessa on todennäköisesti jään ­
teitä lasisuodatinpaperista ja/tai liukenemattomasta testikemikaalista. Ana ­
lyysi voidaan tehdä kaasukromatografilla, jos hiilianalysaattoria ei ole käy ­
tettävissä. On tärkeää, että pullot ovat testilämpötilassa tai sitä lähellä, kun kaasutilan kaasua analysoidaan. Menetelmä (b) voi olla helpompi, jos labo ­
ratoriossa käytetään hiilianalysaattoreita IC:n mittaamiseen. On tärkeää, että 
natriumhydroksidiliuos (kohta 21), jolla CO
 2 muunnetaan karbonaatiksi, on 
vasta valmistettu tai sen IC-pitoisuus on tunnettu, jotta se voidaan huomi ­
oida testituloksia laskettaessa (ks. kohta 66 b.)  
Menetelmä (a): happamoittaminen pH-arvoon < 3  
52. Ennen jokaista analyysierää IC-analysaattori kalibroidaan käyttämällä sovel ­
tuvaa IC-standardia (esim. 1 % w/w CO  2 :ta N  2 :ssa). Väkevöity ortofosfori ­
happo (kohta 20) injektoidaan jokaisen pullon kalvon läpi, jotta siirrosaineen 
pH-arvoksi tulee < 3 (esim. 1 ml, kun testiviljelyaineen tilavuus on 107 ml). Pullot asetetaan takaisin ravistajaan. Kun pulloja on ravistettu yksi tunti testilämpötilassa, ne otetaan pois ravistajasta, kaasualikvootit (esim. 1 ml) 
otetaan jokaisen pullon kaasutilasta ja injektoidaan IC-analysaattoriin. Mita ­
tut IC-pitoisuudet rekisteröidään (mg C/l).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1428
 
53. Tämä menetelmä perustuu siihen, että kun pH-arvo on happamoitettu alle 
kolmeen ja tasapainotus tehty lämpötilassa 20 °C, CO  2 :n jakautumisen tes ­
tipullojen neste- ja kaasufaasin välillä tasapainovakio on 1,0 pitoisuutena mitattuna (13). Tämä on osoitettava vähintään kerran seuraavalla tavalla:
 
Valmistele pullot, joissa IC:tä on 5 ja 10 mg/l, käyttämällä vedetöntä nat ­
riumkarbonaattia (Na  2 CO 3 ) ja vettä, joka ei sisällä CO  2 :ta ja joka valmiste ­
taan happamoittamalla veden pH-arvoksi 6,5 ortofosrofihapolla (kohta 20). Kuplita yön yli ilmalla, joka ei sisällä CO
 2 :ta, ja nosta pH neutraaliksi 
emäksellä. Varmista, että kaasutilan ja nesteen tilavuuksien suhde on sama 
kuin testeissä (esim. 1:2). Happamoita ja tasapainota kohdan 52 ohjeiden 
mukaisesti ja mittaa IC-pitoisuudet sekä kaasutilasta että nestefaasista. Tar ­
kista, että nämä kaksi pitoisuutta ovat samat koevirheen sisällä. Jos näin ei ole, työvaiheet on käytävä läpi. IC:n jakautumista neste- ja kaasufaasin 
välille ei tarvitse tarkistaa aina, kun testi tehdään. Se voidaan tehdä kalib ­
roinnin yhteydessä.
 
54. Jos DOC-poistumaa halutaan mitata (vain vesiliukoiset testikemikaalit), 
näytteet otetaan erillisten (happamoittamattomien) pullojen nestefaasista, kal ­
vosuodatetaan ja injektoidaan DOC-analysaattoriin. Näitä pulloja voidaan 
tarvittaessa käyttää muihin analyyseihin, primaarisen biohajoamisen mittaa ­
mista varten.  
Menetelmä (b): CO  2 :n muuntaminen karbonaatiksi  
55. IC-analysaattori kalibroidaan ennen jokaista analyysierää soveltuvalla stan ­
dardilla, kuten natriumbikarbonaattiluoksella (NaHCO  3 ) vedessä, joka ei 
sisällä CO  2 :ta (ks. kohta 53), IC-pitoisuus 0–20 mg/l. Natriumhydroksidili ­
uos (7M, kohta 21) (esim. 1 ml, kun testiviljelyaineen tilavuus on 107 ml) injektoidaan kalvon läpi jokaiseen pulloon, josta näyte otetaan, ja pulloja 
ravistetaan 1 tunti testilämpötilassa. Käytä samaa NaOH-liuosta kaikissa 
tiettynä päivänä analysoitavissa pulloissa. Samaa liuosta ei kuitenkaan tar ­
vitse käyttää testin kaikilla näytteenottokerroilla. Jos IC:n absoluuttiset nolla-arvot tarvitaan kaikilla näytteenottokerroilla, NaOH-liuoksen IC on 
määritettävä aina ennen käyttöä. Pullot otetaan pois ravistajasta, ja niiden 
annetaan tasaantua. Jokaisen pullon nestefaasista otetaan sopiva tilavuus (esim. 50–1 000 μl) ruiskulla. Nämä näytteet injektoidaan 
IC-analysaattoriin, ja IC-pitoisuudet merkitään ylös. On varmistettava, että 
käytettävä analysaattori soveltuu tällä menetelmällä tuotettujen emäksisten 
näytteiden käsittelyyn.
 
56. Tämä menetelmä perustuu siihen, että kun emästä on lisätty ja pulloja 
ravistettu, IC-pitoisuus kaasutilassa on hyvin pieni. Tämä on tarkistettava 
vähintään kerran käyttämällä IC-standardeja, lisäämällä emästä, tasapainot ­
tamalla ja mittaamalla IC-pitoisuus sekä kaasutilassa että nestefaasissa (ks. kohta 53). Pitoisuuden pitäisi olla lähes nolla kaasutilassa. Tätä virtuaalisesti täydellisen CO
 2 -absorption tarkistusta ei tarvitse tehdä aina, kun testi teh ­
dään.  
57. Jos DOC-poistumaa halutaan mitata (vain vesiliukoiset testikemikaalit), 
näytteet otetaan erillisten pullojen (joihin ei ole lisätty emästä) nestefaasista, kalvosuodatetaan ja injektoidaan DOC-analysaattoriin. Näitä pulloja voidaan 
tarvittaessa käyttää muihin analyyseihin, primaarisen biohajoamisen mittaa ­
mista varten.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1429
 
TIEDOT JA RAPORTOINTI  
Tulosten laskeminen  
58. Jos oletetaan, että testikemikaali on mineralisoitunut sataprosenttisesti 
CO 2 :ksi, kontrollien tuotannon ylittävä ThIC on yhtä kuin jokaiseen testi ­
pulloon testin alussa lisätty TOC, eli:  
ThIC ¼ TOC : 
Yhdessä pullossa olevan epäorgaanisen hiilen kokonaismassa (TIC) (mg) 
on: 
TIC ¼ ðmg C nesteessä þ mg C kaasutilassa Þ 
¼ ðV L Ü C L Þ þ ðV H Ü C H Þ Yhtälö [1]  
jossa:  
V L = nesteen tilavuus pullossa (litraa)  
CL = IC-pitoisuus nesteessä (mg/l hiilenä)  
VH = kaasutilan tilavuus (litraa)  
CH = IC-pitoisuus kaasutilassa (mg/l hiilenä).  
TIC-laskelmat tässä testissä IC:n mittaamiseen käytettyä kahta analyysime ­
netelmää varten on kuvattu kohdissa 60 ja 61. Biohajoamisprosentti ( % D ) 
saadaan seuraavasti: 
%D ¼ ðTIC  t Ä TIC  b Þ 
TOC Ü 100 Yhtälö [2]  
jossa:  
TICt = mg TIC testipullossa aikana t  
TICb = keskimääräinen mg TIC vertailupulloissa aikana t  
TOC = alun perin testiastiaan lisätty mg TOC.  
Biohajoamisprosentti % D lasketaan testipulloille (F  T ), vertailupulloille (F  C ) 
ja mahdollisille inhibition seurantaan tarkoitetuille pulloille (F  I ) kuhunkin 
näytteenottoaikaan mennessä tuotetun TIC:n määrästä.  
59. Jos TIC-pitoisuus on noussut merkittävästi steriileissä kontrolleissa (F  S ) tes­
tijakson aikana, voidaan päätellä, että testikemikaali on hajonnut abiootti ­
sesti. Tämä on huomioitava laskettaessa D:tä kaavalla [2].  
Happamoittaminen pH-arvoon < 3  
60. Koska happamoittaminen pH-arvoon < 3 ja tasapainottaminen tasapainottaa 
TIC-pitoisuuden neste- ja kaasufaasissa, ainoastaan kaasufaasin IC-pitoisuus mitataan. Kaava [1]
 TIC ¼ ðV L þ V H Þ Ü C H ¼ V B Ü C H , jossa V  B = see­
rumipullon tilavuus.  
CO  2 :n muuntaminen karbonaatiksi  
61. Tässä menetelmässä laskelmat tehdään kuten kaavassa [1], mutta kaasufaa ­
sin hyvin pieni IC-määrä jätetään huomioimatta, eli  V  H Ü C H ¼ 0, ja  
TIC ¼ V L Ü C L . ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1430
 
Tulosten ilmaiseminen  
62. Biohajoamiskäyrä saadaan esittämällä biohajoamisprosentti D suhteessa in ­
kubaatioaikaan ja lag-vaihe, biohajoamisvaihe, 10-päiväinen jakso ja tasan ­
nevaihe eli vaihe, jolloin maksimaalinen hajoaminen on saavutettu ja bio ­
hajoamiskäyrä on loiventunut, ilmaistaan, jos mahdollista. Jos rinnakkaistes ­
tipulloista F  T saadaan verrattavissa olevat tulokset (ero < 20 %), piirretään 
keskiarvokäyrä (ks. lisäys 2, kuva 1). Jos näin ei ole, jokaista astiaa varten piirretään oma käyrä. Tasannevaiheen biohajoamisprosentin keskiarvo mää ­
ritetään tai korkein arvo arvioidaan (esim. kun käyrä laskee tasannevaihees ­
sa), mutta jälkimmäisessä tapauksessa on tärkeää varmistaa, että arvo ei ole poikkeava havainto. Kirjaa tämä biohajoamisen enimmäistaso testiraporttiin 
testikemikaalin biohajoamisasteena. Jos testiastioiden määrä ei riittänyt ta ­
sannevaiheen osoittamiseen, keskiarvo lasketaan testin viimeisenä päivänä mitatuista tiedoista. Tämä viimeinen arvo, viiden rinnakkaisnäytteen keski ­
arvo, osoittaa biohajoamisprosentin määritystarkkuuden. Kirjaa ylös myös 
10-päiväisen jakson lopussa saatu arvo.
 
63. Vertailukemikaalin F  C käyrä laaditaan samalla tavalla, ja samoin abioottisen 
eliminaation tarkistuksen F  S ja inhibition tarkistuksen F  I , jos ne olivat käy ­
tössä.  
64. TIC:n määrät kontrollipulloissa (F  B ) kirjataan samoin kuin pulloissa F  S 
(abioottinen tarkistus), jos sellaiset olivat käytössä.  
65. Laske F  I -astioiden D ainoastaan seoksen vertailukomponentin odotetun teo ­
reettisen IC-saannin perusteella. Jos päivänä 28 [(D  FC ( 1 ) – D  FI ( 2 ))/D  FC ] × 
100 > 25 %, voidaan olettaa, että testikemikaali esti siirrosaineen toimintaa, 
mikä voi selittää testiolosuhteissa saadut matalat D  FT -arvot. Tässä tapauk ­
sessa testi voidaan toistaa käyttämällä alempaa testipitoisuutta ja mielellään vähentämällä DIC:n määrää siirrosaineessa ja kontrollipulloissa muodostu ­
vaa TIC:tä, sillä muutoin alempi pitoisuus heikentää menetelmän tarkkuutta. 
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää toista siirrosainetta. Jos TIC-pitoisuus nou ­
see merkittävästi (> 10 %) F
 S -pullossa (abioottinen), abioottisia hajoamisp ­
rosesseja on voinut tapahtua.  
Tulosten luotettavuus  
66. Testi on luotettava, jos  
a) keskimääräinen hajoamisprosentti astioissa F  C , jotka sisältävät vertailu ­
kemikaalia, on > 60 prosenttia 14. inkubaatiopäivään mennessä ja  
b) TIC:n keskimääräinen määrä kontrollipulloissa F  B testin lopussa on > 3 
mg C/l.  
Jos nämä ehdot eivät täyty, testi on toistettava käyttämällä toisesta lähteestä 
saatua siirrosainetta ja/tai testivaiheet on käytävä läpi. Jos esimerkiksi on ­
gelmana on suuri IC-tuotanto kontrollipulloissa, on noudatettava kohdissa 27–32 annettuja ohjeita.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1431  
( 1 ) Hajoamisprosentti astioissa F  C , jotka sisältävät vertailuainetta 
( 2 ) Hajoamisprosentti astioissa F  I
 67. Jos testikemikaali ei saavuteta arvoa 60 % ThIC ja se on osoitettu 
ei-inhiboivaksi (kohta 65), testi voidaan toistaa käyttämällä suurempaa siir ­
rosaineen pitoisuutta (enintään 30 mg/l aktiivilietettä ja 100 ml jätevettä/l) tai eri lähteestä saatua siirrosainetta, varsinkin jos hajoaminen oli suuruu ­
deltaan 20–60 prosenttia.
 
Tulosten tulkinta  
68. Jos biohajoaminen on > 60 % ThIC 10-päiväisen jakson aikana tässä tes ­
tissä, testikemikaali on helposti biohajoava aerobisissa oloissa.  
69. Jos kynnysarvoa 60 % ThIC ei saavuteta, määritä aineen pH-arvo pulloissa, 
joita ei ole muutettu happamaksi tai emäksiseksi. Jos arvo on alle 6,5, 
nitrifikaatiota on voinut tapahtua. Toista tässä tapauksessa testi käyttämällä 
puskuriliuosta, jonka pitoisuus on suurempi.  
Testiraportti  
70. Laadi taulukko, johon merkitään jokaisen testipullon (F  T ), vertailupullon 
(F C ) ja mahdollisten inhibition seurantaan tarkoitettujen pullojen (F  I ) % 
D-arvo jokaisena näytteenottopäivänä. Jos rinnakkaispulloista saadaan ver ­
rattavissa olevat tulokset, piirrä käyrä arvon % D keskiarvosta ajan suhteen. 
Kirjaa ylös TIC:n määrä kontrollipulloissa (F  B ) ja steriileissä kontrollipul ­
loissa (F  S ) DOC ja/tai muut määreet sekä niiden poistumaprosentit.  
71. Määritä % D -arvon keskiarvo tasannevaiheessa tai käytä korkeinta arvoa, 
jos biohajoamiskäyrä laskee tasannevaiheessa, ja anna tämä arvo testikemi ­
kaalin biohajoamisasteena. Jälkimmäisessä tapauksessa on tärkeää varmistaa, 
että korkein arvo ei ole poikkeava arvo.  
72. Testiraportin on sisällettävä seuraavat tiedot:  
Testikemikaali:  
— yleisnimi, kemiallinen nimi, CAS-numero, rakennekaava ja merkityksel ­
liset fysikaalis-kemialliset ominaisuudet  
— testikemikaalin puhtaus (epäpuhtaudet),  
Testiolosuhteet:  
— viittaus tähän testimenetelmään  
— käytetyn testijärjestelmän kuvaus (astian tilavuus, kaasutilan ja nesteen 
suhde, sekoitustapa jne.)  
— testikemikaalin ja vertailukemikaalin lisääminen testijärjestelmään: käy ­
tetty testipitoisuus ja jokaiseen pulloon annostellun hiilen määrä, mah ­
dollinen liuottimien käyttö  
— käytetyn siirrosaineen tiedot, mahdollinen esikäsittely  
— inkubointilämpötila  
— IC-analyysin periaatteen validointi  
— käytetyn IC-analysaattorin (ja muiden käytettyjen analyysimenetelmien) 
pääominaisuudet  
— rinnakkaisnäytteiden määrä.  
Tulokset:  
— raakatiedot ja lasketut biohajoavuusarvot taulukkomuodossa  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1432
 
— testi- ja vertailukemikaalin hajoamisprosenttikäyrä suhteessa aikaan, 
lag-vaihe, hajoamisvaihe, 10-päiväinen jakso ja kulmakerroin  
— poistumaprosentti tasannevaiheessa, testin lopussa ja 10-päiväisen jakson 
jälkeen  
— syyt mahdolliseen testitulosten hylkäämiseen  
— muut käytetyn menetelmän kannalta merkitykselliset tiedot  
— tulosten pohdinta.  
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) Tämän liitteen luku C.4 Biohajoavuuden määritys – hiilidioksidin muodos ­
tumiskoe (Menetelmä C.4-C).  
2) Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test 
for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 159–167.
 
3) Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic 
organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153–1161.  
4) Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide reco ­
very in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195–1210.
 
5) ISO 9439 (1990; tarkistettu 1999). Water Quality – Evaluation of ultimate 
aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium – Car ­
bon dioxide evolution Test (Sturm).  
6) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
 
7) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substances Washington, DC.  
8) Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: Li ­
near alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922–929.  
9) Weytjens D, Van Ginneken I and Painter HA (1994). The recovery of 
carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 
28: 801–812.  
10) Ennis DM and Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing bio ­
degradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181–185.  
11) Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). 
Appl. Env. Microbiol. 35: 51–53.  
12) Boatman RJ, Cunningham SL and Ziegler DA (1986). A method for mea ­
suring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233–243.
 
13) Struijs J and Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved 
carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 
204–211.  
14) Birch RR and Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic 
carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 
23: 507–524.  
15) Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust H, 
and Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegrada ­
tion. Chemosphere 19: 1527–1550.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1433
 
16) ISO 14593, (1999) Water Quality – Evaluation of ultimate aerobic biodeg ­
radability of organic compounds in an aerobic medium-method by analysis 
of inorganic carbon in sealed vessels (C0  2 headspace test).  
17) Battersby NS (1997). The ISO headspace CO  2 biodegradation test, Che ­
mosphere 34: 1813–1822.  
18) US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed ves ­
sel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic 
Substance, Washington, DC.  
19) Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR 
and Starkey M (1999). An ”inherent” biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 
3219–3235.
 
20) Tämän liitteen luku C.4 Biohajoavuuden määritys.  
21) OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodeg ­
radability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris.
 
22) Tämän liitteen luku C.11 Aktiivilietteen soluhengityksen inhibitiotesti.  
23) Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale 
for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. 
Biodegradation 6: 319–327.  
24) EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO  2 method: application to 
surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, 
May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.  
25) ISO 10634 (1996) Water Quality – Guidance for the preparation and treat ­
ment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent eva ­
luation of their biodegradability in an aqueous medium.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1434
 
Lisäys 1  
LYHENTEET JA MÄÄRITELMÄT  
IC: ”Inorganic carbon” – Epäorgaaninen hiili  
ThCO  2 : ”Theoretical carbon dioxide” (mg) – Hiilidioksidimäärä, joka lasketaan 
saatavan testattavan aineen tunnetusta tai mitatusta, epäorgaaniseen muotoon muunnetusta hiilestä. ThCO
 2 ilmaistaan myös muodostuneen hiilidioksidin pai ­
nona (mg) testattavan kemikaalin massaa (mg) kohti.  
DOC:  ”Dissolved organic carbon” – Liuoksessa oleva orgaaninen hiili tai orgaa ­
ninen hiili, joka läpäisee 0,45 μm:n suodattimen tai jää pinnalle, kun liuosta on 
sentrifugoitu nopeudella 40 000 ms  -2 (n. 4 000 g) 15 minuutin ajan.  
DIC:  ”Dissolved inorganic carbon” – liuennut epäorgaaninen hiili  
ThIC:  ”Theoretical inorganic carbon” – teoreettinen epäorgaaninen hiili  
TIC:  ”Total inorganic carbon” – epäorgaanisen hiilen kokonaismäärä  
Helposti biohajoava:  Tietyt lopullisen biohajoamisen seulontatestit läpäisseiden 
kemikaalien yleisluokitus. Kyseiset testit ovat niin tiukkoja, että tällaisten ainei ­
den voidaan katsoa olevan nopeasti ja täydellisesti biohajoavia vedessä ja aero ­
bisissa olosuhteissa.  
10-päiväinen jakso:  10 prosentin hajoamistason saavuttamista seuraavat 10 päi ­
vää. 
Itsestään/luontaisesti biohajoava:  Kemikaali, jonka tiedetään varmojen todistei ­
den perusteella olevan primäärisesti tai lopullisesti biohajoava kaikissa tunne ­
tuissa biohajoavuustesteissä.  
Lopullinen aerobinen biohajoaminen:  Hajoamisen taso, joka saavutetaan, kun 
eliöt ovat hyödyntäneet testattavan aineen täysin. Tämän prosessin tuloksena 
syntyy hiilidioksidia, vettä, epäorgaanisia suoloja ja uutta mikrobista solukkoa (biomassaa).
 
Mineralisaatio:  Orgaanisen yhdisteen täydellinen hajoaminen CO  2 :ksi ja 
H 2 O:ksi aerobisissa olosuhteissa sekä CH  4 :ksi, CO  2 :ksi ja H  2 O:ksi anaerobisissa 
olosuhteissa.  
Lag-vaihe:  Aika testin alusta siihen, kun hajottavien mikro-organismien sopeutu ­
minen ja/tai adaptaatio on tapahtunut ja testikemikaalin tai orgaanisen aineen bio ­
hajoamisaste on havaittavalla tasolla (esim. 10 prosenttia biohajoamisen teoreetti ­
sesta enimmäistasosta tai tätä alempi, riippuen mittaustekniikan tarkkuudesta).  
Hajoamisvaihe:  Hajoamisaika on lag-vaiheen päättymistä seuraava, 90 prosentin 
hajoamistason saavuttamiseen kuluva ajanjakso.  
Tasannevaihe:  Tasannevaihe on vaihe, jolloin maksimaalinen hajoaminen on 
saavutettu ja biohajoamiskäyrä on loiventunut.  
Testikemikaali:  Tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1435
 
Lisäys 2  
Esimerkki biohajoamiskäyrästä  
Kuva 1  
1-oktanolin biologinen hajoaminen CO  2 -kaasutilatestissä (headspace)
  
Sanasto  
biohajoaminen  
hajoamisvaihe  
biologisen hajoamisen enimmäistaso  
tasannevaihe:  
10-päiväinen jakso  
testin kesto (päiviä)  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1436
 
C.30  BIOKERTYVYYS MAALLA ELÄVISSÄ HARVASUKASMA ­
DOISSA  
JOHDANTO  
1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 317 (2010). Ympäris ­
tökohtaloon liittyvistä testimenetelmistä Biokertyvyys: testi kaloilla läpivir ­
tausolosuhteissa (tämän liitteen luku C.13 (49)) julkaistiin vuonna 1996 ja Biokertyvyys pohjaeläiminä lietteessä elävissä harvasukasmadoissa (53) jul ­
kaistiin vuonna 2008. Vesiympäristöstä saatujen biokertyvyystietojen ekst ­
rapolointi maalla eläviin organismeihin, kuten lieroihin, on vaikeaa tai mah ­
dotonta. Testikemikaalin rasvahakuisuuteen perustuvia mallilaskelmia, kuten (14) (37), käytetään tätä nykyä, kun arvioidaan kemikaalien biologista ker ­
tymistä maahan, kuten esimerkiksi EU:n teknisessä ohjeessa (19). 
Osa-aluekohtaisen testimenetelmän tarvetta on jo käsitelty, esim. (55). Täl ­
lainen menetelmä on erityisen tärkeä, kun arvioidaan sekundaarista myrky ­
tystä maaravintoketjuissa (4). Useissa kansallisissa testimenetelmissä käsitel ­
lään biokertymistä muissa organismeissa kuin kaloissa. Esimerkkinä (2) ja 
(72). ASTM (American Society for Testing and Materials) (3) on kehittänyt 
menetelmän, jolla voidaan mitata saastuneen maa-aineksen biokertymistä lieroihin ( Eisenia fetida,  Savigny) ja änkyrimatoihin. Kansainvälisesti hy ­
väksytty menetelmä biokertymisen määrittämiseen maaperässä, johon testi ­
ainetta on lisätty, edistää kemikaalien riskinarviointia maa-alueen ekosystee ­
meissä (25) (29).
 
2. Maata syövät selkärangattomat altistuvat maaperään sitoutuneille kemikaa ­
leille. Näiden eläinten joukossa maalla elävillä harvasukasmadoilla on tärkeä rooli maaperän rakenteessa ja toiminnassa (15) (20). Nämä harvasukasmadot 
elävät maassa ja osittain maan pinnalla (erityisesti karikkeessa). Ne ovat 
usein runsaimpia lajeja biomassalla mitattuna (54). Koska nämä eläimet aiheuttavat maaperän bioturbaatiota ja ovat saaliseläimiä, niillä voi olla suuri vaikutus kemikaalien biologiseen hyötyosuuteen muille organismeille, kuten 
selkärangattomille (kuten petopunkeille ja kovakuoriaisille, esim. (64)) tai 
selkärankaisille saalistajille (kuten ketuille ja lokeille) (18) (62). Osa maalla elävien harvasukasmatojen lajeista, joita käytetään nykyään ekotoksikologi ­
sissa testeissä, on kuvattu liitteessä 5.
 
3. ASTM:n oppaassa ”Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxi ­
city or Bioaccumulation Tests with the Lumbricid Earthworm Eisenia fetida 
and the Enchytraeid Potworm Enchytraeus albidus” (3) on paljon tärkeää ja 
hyödyllistä tietoa nykyisen maaperän biokertyvyyden testimenetelmän toi ­
minnasta. Muita asiakirjoja, joihin tässä testimenetelmässä viitataan, ovat tämän liitteen luku C.13 Biokertyvyys: testi kaloilla läpivirtausolosuhteissa 
(49) ja OECD:n testiohje nro 315: Biokertyvyys pohjaeläiminä lietteessä 
elävissä harvasukasmadoissa (53). Lisäksi testimenetelmän tietolähteinä on käytetty käytännön kokemusta maaperän biokertymistutkimuksista ja julkais ­
tua kirjallisuutta, kuten (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) 
(78) ja (79).
 
4. Tämä testimenetelmä soveltuu lähinnä stabiileille, neutraaleille orgaanisille 
kemikaaleille, jota adsorboituvat maaperään. Maaperään liittyvien stabiilei ­
den metalliorgaanisten yhdisteiden biokertyvyyden testaaminen voi olla mahdollista tällä testimenetelmällä. Menetelmää voidaan soveltaa myös me ­
talleihin ja muihin hivenaineisiin.
 
ENNAKKOEDELLYTYS  
5. Kemikaalin biokertyminen maalla eläviin harvasukasmatoihin on mitattu 
raskasmetalleilla (ks. esim. (63)) ja pysyvillä orgaanisilla kemikaaleilla, joi ­
den log K  ow -arvo on välillä 3,0–6,0, esim. (40). Tällaiset testit koskevat 
myös seuraavia aineita:  
— kemikaalit, joiden log K  ow -arvo on yli 6,0 (superhydrofobiset kemikaa ­
lit) ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1437
 
— kemikaalit, jotka kuuluvat sellaisten orgaanisten kemikaalien luokkaan, 
jotka voivat tunnetusti biokertyä eläviin organismeihin, kuten 
pinta-aktiiviset tai hyvin adsorboituvat kemikaalit  
— kemikaalit, joiden rakenteelliset ominaisuudet viittaavat mahdolliseen 
biokertyvyyteen, kuten tunnetusti biokertyvien kemikaalien analogit  
— metallit.  
6. Testikemikaalin tiedot, kuten yleisnimi, kemiallinen nimi (mieluiten 
IUPAC-nimi), rakennekaava, CAS-numero, puhtaus, turvallisuus ja varotoi ­
met, asianmukaiset säilytysolosuhteet ja analyysimenetelmät, on selvitettävä ennen tutkimusta. Lisäksi seuraavien seikkojen on oltava tiedossa:
 
a) vesiliukoisuus  
b) oktanoli/vesi-jakautumiskerroin K  ow 
c) maa-vesijakautumiskerroin K  oc 
d) höyrynpaine  
e) hajoavuus (esim. maassa, vedessä)  
f) tunnetut metaboliitit.  
7. Radioaktiivisesti merkittyjä ja merkitsemättömiä testikemikaaleja voidaan 
käyttää. Radioaktiivisesti merkittyjen kemikaalien käyttö on kuitenkin suo ­
siteltavaa, sillä se helpottaa analyysiä. Päätös tehdään havaitsemisrajojen tai 
lähtökemikaalin ja metaboliittien mittaustarpeen perusteella. Jos käytetään radioaktiivisesti merkittyä testikemikaalia ja mitataan radioaktiivisten jää ­
mien kokonaismäärää, on tärkeää, että radioaktiiviset jäämät sekä maa ­
perässä että testiorganismeissa kuvataan lähtötestikemikaalin prosentteina 
ja merkitään ei-lähtökemikaaleiksi esimerkiksi tasapainotilassa tai kertymäv ­
aiheen lopulla otetuissa näytteissä, jotta lähtötestikemikaalin ja maaperän metaboliittien biokertyvyystekijä (BAF) voidaan laskea (ks. kohta 50). Tässä 
kuvattua menetelmää on muokattava esimerkiksi käyttämällä riittävää bio ­
massaa, kun mitataan orgaanisia testikemikaaleja tai metalleja, joita ei ole merkitty radioaktiivisesti. Kun mitataan radioaktiivisten jäämien kokonais ­
määrää (nestetuikelaskennalla uuton jälkeen, polttamalla tai kudosta liuotta ­
malla), biokertyvyystekijä perustuu lähtötestikemikaaliin ja metaboliitteihin. 
BAF-laskennan on suositeltavaa perustua lähtötestikemikaalin pitoisuuteen organismeissa ja radioaktiivisten jäämien kokonaismäärään. BAF-arvosta lasketaan BSAF-kerroin, joka ilmaisee biokertyvyyttä maaperästä maaeliös ­
tön lajeihin, normalisoituna matojen rasvapitoisuuden ja maaperän orgaa ­
nisen hiilen pitoisuuden (OC) suhteen, jotta eri biokertyvyystestien tuloksia voidaan vertailla.
 
8. Testikemikaalin toksisuuden testissä käytetyille lajeille on oltava tiedossa 
(esim. vaikutuspitoisuus ECx tai tappava pitoisuus LCx kertymävaiheessa). Ks. esim. (19). Testikemikaalin valitun pitoisuuden on oltava mieluiten noin 
1 prosentti sen akuutista asymptoottisesta LC50-arvosta ja vähintään 10 
kertaa korkeampi kuin sen havaitsemisraja maassa käytettävällä määritysme ­
netelmällä. On suositeltavaa käyttää subletaalien tutkittavien ominaisuuksien pitkäaikaisista tutkimuksista saatuja toksisuusarvoja, jos sellaisia on käytet ­
tävissä (51) (52). Jos tietoja ei ole saatavissa, välittömän myrkyllisyyden 
testistä saadaan hyödyllistä tietoa (ks. esim. (23)).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1438
 
9. Testiliuoksissa, maaperässä ja biologisessa aineksessa olevan kemikaalin 
kvantifioimiseksi täytyy olla käytettävissä sopiva määritysmenetelmä, jonka 
tarkkuus, täsmällisyys ja herkkyys tunnetaan. Käytettävissä on oltava myös näytteen valmistusta ja säilyttämistä koskevat tiedot sekä materiaalin käyt ­
töturvallisuustiedotteet. Testattavan aineen havaitsemisrajojen sekä maassa 
että madon kudoksissa pitäisi myös olla tiedossa. Käytettäessä 14C-merkit ­
tyä testattavaa ainetta, on tunnettava ominaisradioaktiivisuus (esim. Bq mol-1) ja epäpuhtauksiin liittyvän radioaktiivisuuden prosenttiosuus. Testi ­
kemikaalin ominaisradioaktiivisuuden on oltava tarpeeksi korkea, jotta ana ­
lysointi helpottuu, eivätkä käytetyt testipitoisuudet saa aiheuttaa toksisia 
vaikutuksia.
 
10. Testi voidaan tehdä keinomaalla tai luonnonmaalla. Käytetyn luonnonmaan 
ominaisuudet, kuten maan tai sen ainesosien alkuperä, pH, orgaanisen hiilen 
pitoisuus, hiukkaskokojakauma (hiekan, siltin ja saven prosenttiosuudet) ja vedensitomiskyky (WHC), on tiedettävä ennen testin aloittamista (3) (48).
 
TESTIN PERIAATE  
11. Testikemikaalin biokertymistä kuvaavia parametreja ovat 
biokertyvyystekijä (BAF), kertymävakio (k  s ) ja poistumisvakio (k  e ). Mää­
ritelmät ovat lisäyksessä 1.  
12. Testissä on kaksi vaihetta: kertymävaihe (altistusvaihe) ja poistumavaihe 
(altistuksen jälkeinen vaihe). Kertymävaiheen aikana matojen rinnakkaiset testiryhmät altistetaan maalle, johon on lisätty testikemikaalia. Testieläinten lisäksi on matojen kontrolliryhmä, jotka altistetaan muuten identtisille olo ­
suhteille, mutta ilman testikemikaalia. Testiorganismien kuivapaino ja ras ­
vapitoisuus mitataan. Mittaukset voidaan tehdä kontrolliryhmän madoille. Analyyttiset tausta-arvot saadaan analysoimalla kontrollimatojen ja maan näytteitä. Poistumavaiheessa madot siirretään maahan, joka ei sisällä testi ­
kemikaalia. Poistumavaihe tarvitaan muulloin kuin silloin, kun testikemikaa ­
lin kertymä on ollut hyvin vähäinen altistusvaiheen aikana. Poistumav ­
aiheesta saadaan tietoa siitä, millä nopeudella testiorganismit erittävät testi ­
kemikaalia (esim. (27)). Jos tasapainotilaa ei saavuteta kertymävaiheen ai ­
kana, kineettisten parametrien – kineettisen biokertyvyystekijän BAFk, 
kertymis- ja poistumisvakioiden – määrityksen on hyvä perustua kertymä- ja poistumisvaiheen tulosten samanaikaiseen sovittamiseen. Testikemikaalin pitoisuutta madoissa ja matojen pinnalla seurataan testin kummassakin vai ­
heessa.
 
13. Kertymävaiheen aikana mittauksia tehdään näytteenottoajankohtina enintään 
14 vuorokauden (änkyrimadot) tai 21 vuorokauden ajan (lierot), kunnes 
tasapainotila saavutetaan (11) (12) (67). Tasapainotila saavutetaan, kun pi ­
toisuutta madoissa suhteessa aikaan esittävä käyrä on aika-akselin suuntai ­
nen ja kolme peräkkäistä vähintään kahden vuorokauden välein otetuista 
näytteistä tehtyä pitoisuusmääritystä eroavat enintään ± 20 prosenttia tilas ­
tollisen vertailun perusteella (esim. varianssianalyysi tai regressioanalyysi).  
14. Poistumavaiheessa testiorganismit siirretään astioihin, joissa on samaa subst ­
raattia mutta ei testikemikaalia. Poistumavaiheen aikana mittauksia tehdään 
näytteenottoaikoina 14 vuorokautta (änkyrimadot) tai 21 vuorokautta (lierot), ellei analyyttinen määritys osoita aiemmin, että testikemikaalin jäämät ovat laskeneet madoissa 90 prosenttia. Testikemikaalin pitoisuus madoissa 
poistumavaiheen jälkeen raportoidaan eliminoitumattomina jääminä. Tasa ­
painotilan biokertyvyystekijä (BAFss) lasketaan mieluiten sekä madoissa
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1439
 
(Ca) ja maassa (Cs) olevan pitoisuuden suhteena, kun tasapainotila näyttää 
olevan saavutettu, että kineettisenä biokertyvyystekijänä (BAFK) maan ker ­
tymävakion (ks) ja poistumavakion (ke) 2 suhteena (määritelmät ovat lisä ­
yksessä 1), kun oletetaan, että reaktio noudattaa ensimmäisen asteen kine ­
tiikkaa (tietoa laskelmista on lisäyksessä 2). Jos on ilmeistä, että reaktio ei 
noudata ensimmäisen asteen kinetiikkaa, on käytettävä muita malleja.  
15. Kertymävakio, poistumavakio (tai vakiot, jos käytetään muita malleja), ki ­
neettinen biokertyvyystekijä (BAFK) ja mahdollisuuksien mukaan näiden 
muuttujien luottamusvälit lasketaan tietokonemalleista (ohjeet ovat lisäyk ­
sessä 2). Mallin soveltuvuuden voi määrittää esimerkiksi korrelaatiokertoi ­
mella tai determinaatiokertoimella (soveltuvuus on hyvä, jos kerroin on lähellä yhtä) tai khii
 2 -testillä. Myös keskivirheen koko tai arvioitujen para ­
metrien luottamusväli voivat kuvata mallin soveltuvuutta.  
16. Jos testikemikaali on hyvin lipofiilinen, testitulosten vaihtelua voi vähentää 
ilmaisemalla biokertyvyystekijät suhteessa rasvapitoisuuteen ja orgaanisen 
hiilen pitoisuuteen (kilossa maan orgaanista hiiltä, kilossa madon rasvamää ­
rässä). Tämä perustuu siihen, että tietyissä kemikaalien luokissa biokerty ­
vyyspotentiaalin ja rasvahakuisuuden välillä on selvä suhde, mikä osoitettu kalojen osalta (47). Kalan rasvapitoisuuden ja näiden kemikaalien biokerty ­
vyyden välillä on suhde. Samanlaisia korrelaatioita on havaittu pohjaeliöissä. 
Tästä esimerkkinä (30) (44). Korrelaatio on osoitettu myös maalla elävien harvasukasmatojen osalta (esim. (5) (6) (7) (14)). Jos matojen kudosta on 
saatavilla riittävästi, eläinten rasvapitoisuus voidaan määrittää käyttämällä 
samaa biologista ainesta, jota käytettiin testikemikaalin pitoisuuden määrit ­
tämiseen. Rasvapitoisuus voidaan mitata myös kontrollieläimistä.
 
TESTIN LUOTETTAVUUS  
17. Testi on luotettava, jos seuraavat ehdot täyttyvät sekä kontrolli- että käsit ­
telyryhmässä:  
— Testin lopussa yleinen kuolleisuus kertymä- ja poistumavaiheen aikana 
ei saa olla yli 10 prosenttia (lierot) tai 20 prosenttia (änkyrimadot) 
käytettyjen matojen kokonaismäärästä.  
— Eisenia fetida - ja Eisenia andrei  -lajien keskimääräinen painohäviö, joka 
mitataan kertymävaiheen ja poistumavaiheen lopussa, ei saa olla yli 20 
prosenttia verrattuna jokaisen jakson alun alkuperäiseen tuorepainoon 
(f.w.).  
MENETELMÄN KUVAUS  
Testilajit  
18. Biokertyvyystesteihin suositellaan useita maalla elävien harvasukasmatojen 
lajeja. Yleisimmin käytetyt lajit tunkioliero eli kompostiliero ( Eisenia fetida ) 
tai Eisenia andrei  (Lumbricidae), änkyrimato ( Enchytraeus albidus ), Enc­
hytraeus crypticus  ja Enchytraeus luxuriosus  (Enchytraeidae)) on kuvattu 
lisäyksessä 5.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1440
 
Laite  
19. Missään laitteiston osissa ei saisi käyttää materiaaleja, jotka voivat liuottaa 
tai adsorboida testikemikaalia, joista voi liueta muita kemikaaleja ja jotka voivat vaikuttaa haitallisesti testieläimiin. Testissä voidaan käyttää normaa ­
leja suorakulmaisia tai lieriömäisiä astioita, jotka on valmistettu kemiallisesti 
inertistä materiaalista ja jotka ovat riittävän tilavia testimatojen määrään nähden. Ruostumatonta terästä, muovia tai lasia voidaan käyttää laitteissa ja välineissä, jotka ovat kosketuksissa testiliuosten kanssa. Testiastiat on 
peitettävä siten, että madot eivät pääse karkaamaan, mutta astiaan täytyy 
kuitenkin päästä riittävästi ilmaa. Jos käytettävän kemikaalin adsorptioker ­
roin on korkea, kuten synteettisillä pyretroideilla, voi olla tarpeen käyttää 
silanoitua lasia. Tällöin välineet on heitettävä pois käytön jälkeen (49). 
Radioaktiivisesti merkittyjä testiaineita ja haihtuvia kemikaaleja on estettävä karkaamasta. Testiastioista mahdollisesti haihtuvat jäämät on kerättävä lou ­
kuilla (esim. kaasunpesupulloilla), joissa on soveltuvaa adsorbenttia.
 
Maa-aines  
20. Testissä käytettävän maa-aineksen on oltava laadultaan sellaista, että testi ­
organismit elävät ja mielellään myös lisääntyvät siinä totuttautumisvaiheen ja testin aikana ilman, että niiden ulkonäössä tai käyttäytymisessä havaitaan 
mitään epänormaalia muutosta. Matojen kuuluu kaivautua maa-ainekseen.
 
21. Tämän liitteen luvussa C.8 (48) kuvattua keinomaata suositellaan käytettä ­
väksi substraattina testeissä. Ohjeet keinomaan valmistamisesta biokerty ­
vyystestejä varten ja keinomaan säilytysohjeet annetaan lisäyksessä 4. Ilma ­
kuivattua keinomaata voidaan säilyttää huoneenlämpötilassa käyttöön asti.  
22. Myös saastumattomalta paikalta kerättyä luonnonmaata voidaan käyttää tes ­
teissä ja/tai kasvatuksessa. Luonnonmaasta on annettava vähintään alkuperä 
(keräyspaikka), pH, orgaanisen hiilen pitoisuus, hiukkaskokojakauma (hie ­
kan, siltin ja saven prosenttiosuudet), suurin mahdollinen vedensitomiskyky (WHCmax) ja vesipitoisuus prosentteina (3). Hyödyllistä tietoa saadaan, kun 
maa-aineksesta tai sen ainesosista analysoidaan mikrosaasteet ennen sen 
käyttöä. Jos käytettävä maa-aines on peräisin viljelysmaasta, sitä ei saa olla käsitelty kasvinsuojeluaineilla tai lannoitettu hoidetuista eläimistä saa ­
dulla lannalla vähintään vuoteen eikä orgaanisilla lannoitteilla vähintään 
kuuteen kuukauteen ennen näytteenottoa (50). Luonnonmaan käsittely ennen 
laboratoriossa tehtäviä ekotoksikologisia testejä harvasukasmadoilla kuva ­
taan kohdassa (3). Jos käytetään luonnonmaata, säilytysaika laboratoriossa 
on pidettävä mahdollisimman lyhyenä.
 
Testikemikaalin lisääminen  
23. Testikemikaali lisätään maa-ainekseen. Testikemikaalin fysikaaliskemialliset 
ominaisuudet on otettava huomioon. Jos testikemikaali on vesiliukoinen, se 
on liuotettava kokonaan veteen ennen sekoittamista maa-ainekseen. Heikosti 
veteen liukenevien testikemikaalien suositellussa lisäysmenetelmässä yksi tai monta (keino)maan ainesosaa pinnoitetaan testikemikaalilla. Esimerkiksi kvartsihiekkaa tai sen osaa voidaan liottaa liuoksessa, jossa on testikemikaa ­
lia ja soveltuvaa orgaanista liuotinta. Liuoksen annetaan hitaasti haihtua 
kuivaksi. Sen jälkeen testikemikaalilla pinnoitettu osio sekoitetaan märkään
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1441
 
maahan. Tässä menetelmässä on se suuri etu, että maahan ei lisätä lainkaan 
liuotinta. Kun käytetään luonnonmaata, testikemikaali voidaan lisätä ilma ­
kuivattuun maa-ainekseen, kuten edellä on kuvattu keinomaan osalta, tai sekoittaa märkään maahan, minkä jälkeen mahdollinen liuotusapuaine haih ­
dutetaan. Märän maan ja liuottimien kosketusta on vältettävä, jos suinkin 
mahdollista. Seuraavat seikat on otettava huomioon (3):
 
— Jos liuottimena käytetään muuta kuin vettä, liuottimen on oltava veteen 
sekoittuvaa ja/tai se on voitava poistaa muulla tavoin (kuten haihdutta ­
malla), jotta maa-ainekseen jää vain testikemikaalia.  
— Jos liuotinkontrolli on käytössä, negatiivista kontrollia ei tarvita. Liuo ­
tinkontrollissa on oltava korkein pitoisuus maahan lisättyä liuotinta. 
Käytettävän liuottimen on oltava peräisin samasta erästä, josta kantaliuos 
on tehty. Liuottimen toksisuus ja haihtuvuus sekä testikemikaalin liuke ­
nevuus valittuun liuottimeen ovat tärkeimmät kriteerit soveltuvan liuo ­
tusapuaineen valinnassa.  
24. Jos kemikaali liukenee heikosti veteen ja orgaanisiin liuottimiin, haluttu 
testipitoisuus saadaan sekoittamalla testikemikaaliin 2,0–2,5 g hienoksi jau ­
hettua kvartsihiekkaa testiastiaa kohden esimerkiksi huhmareella. Tämä kvartsihiekan ja testikemikaalin seos lisätään esikostutettuun maahan ja se ­
koitetaan hyvin soveltuvaan määrään deionisoitua vettä, jotta saadaan tarvit ­
tava kosteuspitoisuus. Lopullinen seos jaetaan testiastioihin. Sama toistetaan jokaista testipitoisuutta varten, ja lisäksi valmistellaan asianmukainen kont ­
rolli, jossa on 2,0–2,5 g hienoksi jauhettua kvartsihiekkaa testiastiaa kohden.
 
25. Testikemikaalin pitoisuus maassa on määritettävä testikemikaalin lisäämisen 
jälkeen. Ennen testiorganismien lisäämistä on varmistettava, että testikemi ­
kaali on jakautunut homogeenisesti maahan. Käytetty lisäysmenetelmä ja tietyn lisäysmenetelmän valintaperusteet ilmoitetaan (24).
 
26. Ihanteellisessa tilanteessa maa ja huokosvesifaasi ovat tasapainossa ennen 
organismien lisäämistä. Suositeltava tasapainotusjakso on neljä päivää läm ­
pötilassa 20 °C. Useilla heikosti veteen liukenevilla orgaanisilla kemikaa ­
leilla vie päiviä tai kuukausia, ennen kuin adsorboituneet ja liuotetut fraktiot ovat aidosti tasapainossa. Tutkimuksen tarkoituksen vaatiessa, esimerkiksi 
ympäristöolosuhteita jäljiteltäessä, maata, johon testikemikaalia on lisätty, 
voidaan ”kypsyttää” pidempäänkin, esimerkiksi kolme viikkoa lämpötilassa 20 °C, kun kyseessä ovat metallit (22).
 
Testiorganismien viljely  
27. Madot pidetään mieluiten pysyvästi laboratorioviljelmässä.  Eisenia fetidan , 
Eisenia andrein  ja Enchytraeid -lajien laboratorioviljelyohjeet ovat lisäyk ­
sessä 5 (ks. myös (48) (51) (52)).  
28. Testeissä käytettävillä madoilla ei saa olla havaittavia sairauksia, poikkea ­
vuuksia tai loisia.  
TESTIN SUORITTAMINEN  
29. Testiorganismit altistetaan testikemikaalille kertymävaiheessa. Kertymäv ­
aiheen pituus on 14 vuorokautta (änkyrimadot) tai 21 vuorokautta (lierot), 
ellei jo aiemmin voida osoittaa, että tasapainotila on saavutettu.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1442
 
30. Poistumavaiheessa madot siirretään maahan, joka ei sisällä testikemikaalia. 
Ensimmäinen näyte otetaan 4–24 h poistumavaiheen alkamisen jälkeen. 
Esimerkkejä 21-päiväisen kertymävaiheen ja 21-päiväisen poistumavaiheen näytteenoton aikatauluista on lisäyksessä 3.
 
Testiorganismit  
31. Monien maalla elävien änkyrimatolajien yksilöpaino on hyvin pieni (esim.  
Enchytraeus albidus  -yksilöiden märkäpaino 5–10 mg ja  Enchytraeus cryp ­
ticus - ja Enchytraeus luxuriosus  -lajien vähemmän). Jotta paino voidaan 
mitata ja kemiallinen analyysi tehdä, voi olla tarpeen yhdistää rinnakkaisten testiastioiden madot (eli kaikkia rinnakkaisastian matoja käytetään yhteen kudosanalyysiin). Jokaiseen rinnakkaisastiaan lisätään 20 änkyrimatoa, ja 
rinnakkaisnäytteitä on oltava vähintään kolme. Jos testikemikaalin analyyt ­
tinen havaitsemisraja on korkea, matoja saatetaan tarvita enemmän. Jos testilajin yksilöpaino on tätä suurempi ( Eisenia fetida  ja Eisenia andrei ), 
voidaan käyttää rinnakkaisnäyteastioita, joissa on vain yksi yksilö.
 
32. Testissä käytettävien lierojen on painettava suunnilleen yhtä paljon (esim.  
Eisenia fetidan  ja Eisenia andrein  yksilöpainon on oltava 250–600 mg). 
Änkyrimatojen (esim.  Enchytraeus albidus ) pituuden on oltava noin 1 cm. 
Kaikkien tietyssä testissä käytettävien matojen on oltava peräisin samasta 
lähteessä, ja eläinten on oltava aikuisia ja sukukypsiä (ks. lisäys 5). Koska 
eläimen paino ja ikä saattavat vaikuttaa BAF-arvoihin (esim. rasvapitoisuu ­
den vaihtelun ja/tai munien vuoksi), nämä parametrit on kirjattava täsmälli ­
sesti ja huomioitava tuloksia tulkittaessa. Lisäksi BAF-arvoihin vaikuttaa 
myös munakoteloiden mahdollinen muniminen altistusjaksolla. On suositel ­
tavaa, että testimatojen alaryhmä punnitaan ennen testiä, jotta keskimääräi ­
nen märkä- ja kuivapaino voidaan arvioida.  
33. Maa-mato-suhteen on oltava korkea, jotta testikemikaalin pitoisuuden lasku 
maassa voidaan minimoida kertymisjakson aikana.  Eisenia fetida - ja Eisenia 
andrei  -lajeille maata on oltava vähintään 50 g (kuivapaino) matoa kohden, 
ja änkyrimadoille suositellaan vähintään 10–20 g maata (kuivapaino) testi ­
astiaa kohden. Astiassa olevan maakerroksen paksuuden on oltava 2–3 cm 
(änkyrimadot) tai 4–5 cm (lierot).  
34. Testissä käytetyt madot poistetaan viljelmästä (esim. änkyrimadot korupih ­
deillä). Aikuiset eläimet siirretään käsittelemättömään testimaahan totuttau ­
tumista varten ja ruokitaan (ks. kohta 36). Jos testiolosuhteet poikkeavat 
viljelyolosuhteista, 24–72 tunnin totuttamisjakso on riittävä, jotta madot ehtivät sopeutua testioloihin. Totuttamisjakson jälkeen lierot huuhdellaan siirtämällä ne lasimaljoihin (esim. petrimaljoihin), joissa on puhdasta vettä. 
Lierot punnitaan, ennen kuin ne lisätään testimaahan. Ennen punnitusta 
ylimääräinen vesi poistetaan madoista painamalla niitä varovasti astian reu ­
naa vasten tai taputtelemalla ne varovasti kuiviksi kevyesti kostutetulla pa ­
periliinalla.
 
35. Testiorganismien kaivautumiskäyttäytymistä havainnoidaan ja tiedot kirja ­
taan ylös. Kun testeissä käytetään lieroja, eläimet (kontrolli- ja testieläimet) yleensä kaivautuvat maahan parissa tunnissa. Tarkista asia 24 tunnin kulu ­
essa siitä, kun madot on lisätty testiastioihin. Jos lierot eivät kaivaudu 
maahan (esim. yli 10 prosenttia on kaivautumatta yli puolet aikaa kertymäv ­
aiheesta), testiolosuhteet eivät ole sopivat tai testiorganismit eivät ole
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1443
 
terveitä. Tällöin testi on lopetettava ja aloitettava alusta. Änkyrimadot elävät 
lähinnä maan huokosissa, ja niiden ruumiinpeite on usein vain osittaisessa 
kosketuksessa ympäröivään substraattiin. Kaivautuvien ja ei-kaivautuvien änkyrimatojen altistuksen oletetaan olevan vastaava, eikä testiä tarvitse vält ­
tämättä toistaa, jos änkyrimadot eivät kaivaudu.
 
Ruokinta  
36. Ruokintaa on harkittava, jos käytetään maata, jossa orgaanisiin yhdisteisiin 
sitoutuneen hiilen kokonaispitoisuus on matala. Kun käytetään keinomaata, lieroille on suositeltavaa antaa kerran viikossa 7 mg kuivatettua lantaa yhtä grammaa maata (kuivapaino) kohden ja änkyrimadoille 2–2,5 mg jauhettuja 
kaurahiutaleita viikossa yhtä grammaa maata (kuivapaino) kohden (11). En ­
simmäinen ravintoannos sekoitetaan maahan heti testiorganismien lisäämisen jälkeen. Viljelmissä on suositeltavaa käyttää samantyyppistä ravintoa (katso lisäys 5).
 
Valo ja lämpötila  
37. Testeissä testiastioiden ympäristössä käytetään kontrolloitua valon ja pimeän 
vaihtelua siten, että 16 tuntia on valoisaa ja 8 tuntia pimeää. Valon suosi ­
teltava voimakkuus on 400–800 luksia (3). Lämpötilan on oltava 20 ± 2 °C koko testin ajan.
 
Testipitoisuudet  
38. Testissä käytetään yhtä pitoisuutta. Lisäpitoisuutta tai -pitoisuuksia saa käyt ­
tää vain perustellusta syystä. Jos testikemikaalin toksisuus (ECx) on lähellä analyyttistä havaitsemisrajaa, on suositeltavaa käyttää radioaktiivisesti mer ­
kittyä testikemikaalia, jonka ominaisradioaktiivisuus on korkea. Metallien 
osalta pitoisuuden on oltava taustatasoa korkeampi kudoksissa ja maassa.
 
Rinnakkaisnäytteet  
39. Kineettisissä mittauksissa (kertymä- ja poistumavaihe), käsiteltyjen rinnak ­
kaisastioiden määrä on vähintään kolme näytteenottokertaa kohden. Rinnak ­
kaisnäytteitä on valmistettava niin monta, että ne riittävät kaikkiin näytteen ­
ottokertoihin kertymä- ja poistumavaiheen aikana.  
40. Biologisiin havaintoihin ja mittauksiin (esim. kuivapainon ja märkäpainon 
suhde, rasvapitoisuus) ja matojen ja maan taustapitoisuuksien analysointiin 
tarvitaan vähintään 12 rinnakkaisastiaa negatiivista kontrollia varten (neljä alussa, neljä kertymävaiheen lopussa ja neljä poistumavaiheen lopussa), jos ei käytetä muuta liuotinta kuin vettä. Jos testikemikaalin lisäämisessä käy ­
tetään jotakin liuotusapuainetta, käsiteltyjen rinnakkaisnäytteiden lisäksi tar ­
vitaan liuotinkontrolli (neljä rinnakkaisastiaa alussa, neljä kertymävaiheen lopussa ja neljä poistumavaiheen lopussa), jossa on kaikki muut ainesosat testattavaa ainetta lukuun ottamatta. Tässä tapauksessa voidaan valmistella 
vielä neljä negatiivista kontrolliastiaa (ei liuotinta) valinnaista näytteenottoa 
varten kertymävaiheen lopussa. Rinnakkaisnäytteitä verrataan biologisesti liuotinkontrolliin, jotta saadaan tietoa liuottimen mahdollisesta vaikutuksesta testiorganismeihin. On suositeltavaa perustaa varalle riittävä määrä ylimää ­
räisiä rinnakkaisastioita (esim. kahdeksan) käsittelyä ja kontrollia/kontrolleja 
varten.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1444
 
Maan laatua koskevien mittausten taajuus  
41. Maan pH, maan kosteuspitoisuus ja lämpötila (jatkuva) testihuoneessa mi ­
tataan kertymä- ja poistumavaiheen alussa ja lopussa. Maan kosteuspitoisuus tarkistetaan kerran viikossa punnitsemalla testiastiat ja vertaamalla todellista 
painoa alkuperäiseen painoon testin alussa. Vedenhukka korvataan lisää ­
mällä deionisoitua vettä.
 
Näytteenotto ja analyysit madoista ja maasta  
42. Esimerkki lierojen ja änkyrimatojen biokertymistestien kertymä- ja poistu ­
mavaiheen aikataulusta on lisäyksessä 3.  
43. Testiastioista otetaan maanäyte, josta määritetään testikemikaalin pitoisuus 
ennen matojen lisäämistä sekä kertymä- ja poistumavaiheen aikana. Testin 
aikana testikemikaalin pitoisuudet määritetään madoista ja maasta. Koko ­
naispitoisuudet maassa mitataan. Pitoisuudet huokosvedessä voidaan myös 
mitata haluttaessa. Tässä tapauksessa perusteet ja soveltuvat menetelmät on 
määritettävä ennen tutkimuksen aloittamista ja sisällytettävä raporttiin.  
44. Madoista ja maasta otetaan näyte vähintään kuusi kertaa kertymä- ja poistu ­
mavaiheen aikana. Jos testikemikaalin stabiilisuus on osoitettu, maa-analyysien määrää voi vähentää. On suositeltavaa analysoida vähintään kolme rinnakkaisnäytettä kertymävaiheen alussa ja lopussa. Jos kertymäv ­
aiheen lopussa mitattu pitoisuus maassa poikkeaa alkuperäisestä pitoisuu ­
desta yli 30 prosenttia, myös muina päivinä otetut maanäytteet on analysoi ­
tava.
 
45. Poista kunakin näytteenottoajankohtana madot tietyn rinnakkaisnäytteen 
maasta (esim. levittämällä rinnakkaisnäytteen maa-aines matalalle vadille ja poimimalla madot pehmeillä korupihdeillä) ja huuhtaise madot vedellä 
matalassa lasi- tai teräsastiassa. Poista ylimääräinen vesi (ks. kohta 34). 
Siirrä madot varovasti esipunnittuun astiaan ja punnitse ne heti suolen si ­
sältö mukaan lukien.
 
46. Sen jälkeen lierojen ( Eisenia ) annetaan tyhjentää suoli yli esim. kostealle 
suodatinpaperille peitetyssä petrimaljassa (ks. kohta 34). Kun suoli on tyh ­
jennetty, matojen paino määritetään, jotta mahdollinen biomassan lasku tes ­
tin aikana voidaan määrittää (katso kohdassa 17 annetut luotettavuuskritee ­
rit). Änkyrimadot punnitaan ja kudokset analysoidaan ilman suolen tyhjen ­
tämistä, sillä se on teknisesti vaikeaa matojen pienen koon vuoksi. Kun lopullinen painon määritys on tehty, madot tapetaan heti soveliaimmalla 
tavalla (esim. nestemäisellä typellä tai pakastamalla alle –18 °C:n lämpöti ­
lassa).
 
47. Poistumavaiheen aikana madot korvaavat kontaminoituneen suolensisällön 
puhtaalla maalla. Siitä syystä matojen, jotka eivät tyhjennä suolta (tässä yhteydessä änkyrimatojen), heti poistumavaiheen jälkeen tehdyissä mittauk ­
sissa on mukana suolen kontaminoitunut maa. Vedessä elävien harvasukas ­
matojen osalta oletetaan, että poistumavaiheen ensimmäisten 4–24 tunnin 
jälkeen kontaminoitunut suolen sisältö on korvautunut puhtaalla sedimentil ­
lä, esim. (46). Vastaavia löydöksiä on raportoitu lieroista radioaktiivisesti merkityn kadmiumin ja sinkin kertymisen tutkimuksissa (78). Änkyrimadoil ­
la, joiden suolta ei ole tyhjennetty, tätä poistumavaiheen ensimmäistä näy ­
tettä voidaan pitää kudospitoisuutena suolen tyhjennyksen jälkeen. Jotta kontaminoitumattoman maan laimentava vaikutus testattavan aineen pitoi ­
suuteen poistumavaiheessa voidaan huomioida, suolen sisällön paino voi ­
daan arvioida madon märkäpainon ja tuhkapainon tai madon kuivapainon ja 
tuhkapainon suhteesta.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1445
 
48. Maa- ja matonäytteet on suositeltavaa analysoida heti poistamisen jälkeen 
(1–2 päivän kuluessa), jotta hajoaminen ja muu hävikki voidaan välttää, ja 
keskimääräiset kertymä- ja poistumanopeudet on suositeltavaa laskea testin kuluessa. Jos analyysi viivästyy, näytteitä säilytetään asianmukaisella taval ­
la, kuten pakastamalla ( ≤ –18 °C).
 
49. On tarkistettava, että kyseisessä menetelmässä kemiallisen analyysin tark ­
kuus ja toistettavuus sekä testikemikaalin saalis maa- ja matonäytteistä ovat 
tyydyttävät. Havaitsemisraja (LOD) ja määritysraja (LOQ) on raportoitava. 
On myös tarkistettava, että testikemikaalia ei havaita kontrolliastioissa taus ­
tapitoisuutta suurempina pitoisuuksina. Kun testikemikaalin pitoisuus testi ­
organismissa Ca on > 0 kontrollimadoissa, se on sisällytettävä kineettisten 
parametrien laskentaan (ks. lisäys 2). Kaikkia näytteitä on käsiteltävä koko testin ajan siten, että esim. kontaminaatio ja hävikki (joka johtuu esim. testikemikaalin adsorboitumisesta näytteenottovälineeseen) on mahdollisim ­
man vähäistä).
 
50. Kun testikemikaalit ovat radioaktiivisesti merkittyjä, voidaan analysoida läh ­
tökemikaali ja metaboliitit. Lähtötestikemikaalin ja metaboliittien kvantifi ­
ointi tasapainotilassa tai kertymävaiheen lopussa antaa tärkeää tietoa. Sen jälkeen näytteet ”puhdistetaan” siten, että lähtötestikemikaali voidaan mää ­
rittää erikseen. Jos yksittäiset metaboliitit muodostavat yli 10 prosenttia 
analysoidun näytteen tai näytteiden radioaktiivisuudesta, näiden metaboliit ­
tien tunnistus on suositeltavaa.
 
51. Kokonaissaanto sekä testikemikaalin saanto madoista, maasta ja mahdolli ­
sista loukuista, joissa on adsorbentteja haihtuneen testikemikaalin keräystä varten, on kirjattava ylös ja raportoitava.
 
52. Tietystä testiastiasta otetut yksilöt voidaan yhdistää, jos kyseessä ovat än ­
kyrimadot, jotka ovat pienempiä kuin lierot. Jos yhdistäminen vähentää 
rinnakkaisnäytteiden määrää, soveltuvien tilastomenetelmien määrä laskee. Jos tietty tilastomenetelmä ja tilastollinen voima ovat tarpeen, testissä on oltava yhdistämisen, tarvittavien menetelmien ja tilastollisen voiman edel ­
lyttämä määrä rinnakkaisastioita.
 
53. BAF on suositeltavaa ilmaista kokonaiskuivapainon funktiona ja tarvittaessa 
(esim. hyvin hydrofobiset kemikaalit) rasvapitoisuuden funktiona. Rasvapi ­
toisuus on määritettävä soveltuvilla menetelmillä (tähän tarkoitukseen mu ­
kautetaan olemassa olevia menetelmiä, esim. (31) (58)). Näissä menetel ­
missä käytetään kloroformi-metanoliuuttoa. Kloorattujen liuottimien käyttöä 
on kuitenkin hyvä välttää. Käytä kohdassa (17) kuvattua Blighin ja Dyerin menetelmän muunnosta (9). Koska eri menetelmillä ei välttämättä saada samoja arvoja, on tärkeää kuvailla käytetty menetelmä. Ihanteellisessa ta ­
pauksessa (jos esim. matokudosta on riittävästi) rasva-analyysi tehdään sa ­
malle näytteelle tai uutteelle, josta testattava aine määritetään, koska rasvat täytyy usein poistaa uutteesta ennen kuin sitä voi käyttää kromatografiseen määritykseen (49). Rasvapitoisuus voidaan mitata myös kontrollieläimistä 
BAF-arvojen normalisointia varten. Jälkimmäinen vaihtoehto vähentää väli ­
neiden kontaminaatiota testikemikaalilla.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1446
 
TIEDOT JA RAPORTOINTI  
Tulosten käsittely  
54. Testikemikaalin kertymäkäyrä saadaan esittämällä madoissa tai matojen pin ­
nalla kertymävaiheen aikana oleva testikemikaalin pitoisuus ajan funktiona aritmeettisella asteikolla. Jos käyrä osoittaa tasannevaihetta tai tasapainotilaa (määritelmät ovat lisäyksessä 1), tasapainotilan biokertymiskerroin BAF las ­
ketaan seuraavalla kaavalla:
 
C a tasapainotilassa tai kertymävaiheen lopussa  ðkeskiarvoÞ 
C s tasapainotilassa tai kertymävaiheen lopussa ðkeskiarvoÞ 
C a on testikemikaalin pitoisuus testiorganismissa  
C s on testikemikaalin pitoisuus maassa  
55. Jos tasapainotilaa ei saavuteta, BAFss-arvon sijaan määritetään nopeusvaki ­
oihin perustuva BAF  K seuraavasti:  
— Määritä kertyvyyskerroin (BAF  K ) kertymävakion (k  s ) ja poistumavakion 
(k e ) suhteena.  
— Kertymä- ja poistumanopeudet on hyvä laskea samaan aikaan (ks. kaava 
11 lisäyksessä 2).  
— Poistumavakio (k  e ) määritetään yleensä poistumakäyrästä, joka kuvaa 
testiaineen pitoisuutta madoissa poistumavaiheessa. Kertymävakio (k  s ) 
lasketaan tunnetulla k  e -arvolla ja C  a -arvolla, joka saadaan kertymäkäy ­
rästä (ks. lisäys 2). Paras menetelmä BAF  K :n ja nopeusvakioiden k  s ja k  e 
laskemiseksi on estimoida tietokoneella epälineaariset parametrit. Jos on 
ilmeistä, ettei poistuma noudata ensimmäisen asteen kinetiikkaa, on käy ­
tettävä monimutkaisempia malleja.  
Testiraportti  
56. Testiraporttiin on sisällytettävä seuraavat tiedot:  
Testikemikaali:  
— käytettävissä olevat tiedot testikemikaalin välittömästä tai pitkäaikaistok ­
sisuudesta (esim. EC  x , LC  x„ NOEC) maalla eläville harvasukasmadoille  
— puhtaus, fysikaalinen olomuoto ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, 
esim. log K  ow , vesiliukoisuus  
— kemialliset tunnistetiedot, testattavan aineen lähde, mahdollisen liuotti ­
men tunnistetiedot ja pitoisuus  
— jos testikemikaali on radioaktiivisesti leimattu, leimattujen atomien 
tarkka sijainti, ominaisradioaktiivisuus ja radiokemiallinen puhtaus.  
Testilajit:  
— tieteellinen nimi, kanta, lähde, mahdollinen esikäsittely, totuttamistiedot, 
ikä, koko jne.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1447
 
Testiolosuhteet:  
— käytetty testimenetelmä  
— käytetty valaistustyyppi ja valon ominaisuudet sekä valojakso(t)  
— testisuunnitelman kuvaus (esim. testiastioiden määrä ja koko, maan 
massa ja maakerroksen korkeus, rinnakkaisnäytteiden määrä, matojen määrä rinnakkaisnäytettä kohden, testipitoisuuksien määrä, kertymä- ja 
poistumavaiheen kesto, näytteenottotaajuus)
 
— testiastian materiaalin valintaperusteet  
— testattavan aineen valmistelu ja lisäys sekä tietyn menetelmän valintape ­
rusteet  
— nimelliset testipitoisuudet, testiastioissa mitattujen arvojen keskiarvot ja 
niiden keskihajonnat sekä menetelmä, jolla arvot on laskettu  
— keinomaan ainesosien lähde tai maa-aineksen alkuperä, jos käytetään 
luonnollista maata, mahdollisen esikäsittelyn kuvaus, kontrollien tulokset (eloonjäänti, biomassan kehitys, lisääntyminen), maan ominaisuudet (pH, 
orgaanisen hiilen kokonaispitoisuus, hiukkaskokojakauma eli hiekan, sil ­
tin ja saven prosenttiosuudet, WHC
 max , vesipitoisuus prosentteina testin 
alussa ja lopussa sekä muut tehdyt mittaukset)  
— yksityiskohtaiset tiedot maa- ja matonäytteiden käsittelystä, mukaan lu ­
kien tiedot testattavan aineen säilytyksestä, lisäämistavasta, uutosta ja analyysimenetelmistä (sekä tarkkuudesta) matojen ja maan osalta sekä 
rasvapitoisuudesta (jos mitattu) ja testiaineen saannista.
 
Tulokset:  
— kontrollimatojen ja jokaisessa testiastiassa olevien matojen kuolleisuus 
sekä mahdolliset havainnot epätavallisesta käyttäytymisestä (esim. maan välttely, lisääntymisen puute änkyrimatojen biokertyvyystestissä)
 
— maan ja testiorganismien kuiva- ja märkäpainon suhde (hyödyllinen 
normalisointia varten)  
— matojen märkäpainot jokaisella näytteenottokerralla, lierojen märkäpai ­
not testin alussa sekä jokaisella näytteenottokerralla ennen suolen tyh ­
jennystä ja sen jälkeen  
— testiorganismien rasvapitoisuus (jos määritetty)  
— käyrät, jotka osoittavat testikemikaalin kertymä- ja poistumakinetiikan 
madoissa, ja aika tasapainotilan saavuttamiseen  
— C  a ja C  s (tarvittaessa keskihajonta ja alue) kaikille näytteenottoajankoh ­
dille (C  a ilmaistaan muodossa grammaa kilossa koko ruumiin märkä- ja 
kuivapainoa ja C  s muodossa grammaa kilossa maan märkä- ja kuiva ­
painoa) jos eliöstön-maaperän kertyvyyskerroin (BSAF) tarvitaan (esim. 
kahden tai usean testin tulosten vertailuun, kun eläinten rasvapitoisuus 
poikkeaa toisistaan), C  a voidaan ilmaista myös muodossa grammaa ki ­
lossa organismin rasvamäärässä ja C  s muodossa grammaa kilossa maan 
orgaanista hiiltä (OC)  
— BAF (kiloa maata kilossa matoa), maan kertymävakio k  s (grammaa 
maata kilossa matoa, päivä  –1 ), poistumavakio k  e (päivää  –1 ) ja BSAF 
(kiloa maan orgaanista hiiltä kilossa madon rasvamäärässä) voidaan 
myös ilmoittaa  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1448
 
— jos mitattu: maassa ja testieläimissä havaitut lähtökemikaalin, metaboliit ­
tien ja sitoutuneiden jäämien prosenttiosuudet (esim. testikemikaalin, jota 
ei voida uuttaa tavallisilla uuttomenetelmillä, määrä prosentteina)  
— tietojen tilastollisessa analysoinnissa käytetyt menetelmät.  
Tulosten arviointi  
— kohdassa 17 annettujen luotettavuusehtojen täyttyminen  
— odottamattomat tai epätavalliset tulokset, kuten testikemikaalin epätäy ­
dellinen poistuminen testieläimistä.  
KIRJALLISUUSVIITTEET  
1) Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane ( γ-HCH) 
in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra.  
2) ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American 
Society for Testing and Materials, E 1688–00a.  
3) ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil 
toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm  Eisenia 
fetida  and the Enchytraeid potworm  Enchytraeus albidus.  ASTM Interna ­
tional, E1676-04: s. 26  
4) Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger G 
(2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The 
Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): 
Bioaccumulation – New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235–276.
 
5) Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The 
toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms ( Eisenia andrei ): 
Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93–99.  
6) Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W&Hermens J 
(1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms ( Eise­
nia andrei ): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 154–165.  
7) Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel C 
(1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms ( Eise­
nia andrei ). Ecotox. Environ. Safety 31: 185–191.  
8) Bell AW (1958). The anatomy of  Enchytraeus albidus , with a key to the 
species of the genus  Enchytraeus.  Ann. Mus. Novitat. 1902: 1–13.  
9) Bligh EG and Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and 
purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911–917.  
10) Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. INRA, 
Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, s. 671.  
11) Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein P (2001a). 
Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestri ­
schen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416.
 
12) Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bioaccu ­
mulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes  Enchytraeus 
luxuriosus  and Enchytraeus albidus  (Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). 
Hydrobiologia 463: 185–196.  
13) Conder JM and Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures 
of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm  Eisenia 
fetida.  J. Soils Sediments 3: 13–20.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1449
 
14) Connell DW and Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to 
Earthworm System. Chemosphere 20: 91–100.  
15) Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 
37: 2–29.  
16) Didden W (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, 
B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd., The 
Netherlands, s. 555–576.  
17) De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH 
interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. 
Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing 
Programme.  
18) Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, Jenni-Eiermann S, Ba ­
chmann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey follo ­
wing field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. 
Contam. Toxicol. 29: 140–145.  
19) Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1907/2006, annettu 
18 päivänä joulukuuta 2006, kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lu ­
pamenettelyistä ja rajoituksista (REACH), Euroopan kemikaaliviraston pe ­
rustamisesta, direktiivin 1999/45/EY muuttamisesta sekä neuvoston asetuksen (ETY) N:o 793/93, komission asetuksen (EY) N:o 1488/94, neu ­
voston direktiivin 76/769/ETY ja komission direktiivien 91/155/ETY, 
93/67/ETY, 93/105/EY ja 2000/21/EY kumoamisesta, EUVL L 396, 
30.12.2006, s. 1.
 
20) Edwards CA and Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. 
Third Edition, Chapman&Hall, London, s. 426.  
21) OECD (2008),  Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates , 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris
 
22) Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th and Römbke J (2009). 
Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisi ­
erten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Re ­
port to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt 
Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: s. 149 Ladattavissa osoitteessa: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf
 
23) Elmegaard N and Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). Safety factors in 
pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and 
acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325: s. 57
 
24) Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxi ­
city test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. 
Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.  
25) EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection 
products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection 
Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195–208.  
26) Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk 
assessment? Chemosphere 32: 1897–1905.  
27) Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, 
Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumula ­
tion. Chemosphere 29: 1501–1514.  
28) Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexa ­
chlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Di ­
chlorprop) beim Regenwurm  Lumbricus rubellus  (Oligochaeta, Lumbrici ­
dae). Dissertation University Mainz, s. 156.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1450
 
29) Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von Pflan ­
zenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF – Z. Umweltchem, Ökotox. 15: 
78–84.  
30) Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for biocon ­
centration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225–1231.
 
31) Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods for 
lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 
1099–1105.  
32) Hawker DW and Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of 
lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701–707.
 
33) Hund-Rinke K and Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for soil 
assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sedi ­
ments 1: 15–20.  
34) Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der 
Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. Teoksessa: 
Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W.&Eisentraeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59–81.
 
35) ISO 11268–2 (1998) Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms 
(Eisenia fetida ). Part 2: Determination of effects on reproduction.  
36) Jaenike J (1982). ”E isenia foetida ” is two biological species. Megadrilogica 
4: 6–8.  
37) Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of 
organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 
17: 2080–2090.  
38) Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). 
Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in  Eisenia andrei  (Oli­
gochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953–961.  
39) Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, DeJong 
A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability of poly ­
cyclic aromatic hydrocarbons to earthworms ( Eisenia andrei , Oligochaeta) 
in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 767–775.
 
40) Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the 
routes of exposure for organic chemicals in the earthworm,  Eisenia andrei  
(Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399–3404.  
41) Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). Compa ­
rison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305–312.
 
42) Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and func ­
tion in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217–232.  
43) Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von  14 C-Hexachlorbenzol 
und  14 C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University 
München, s. 137.  
44) Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aroma ­
tic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod  Pontoporeia hoyi.  
Environ. Sci. Toxicol. 23: 588–595.  
45) Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accu ­
mulation in  Lumbricus rubellus  under laboratory conditions compared with 
accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17–26.  
46) Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging 
for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with  
Lumbriculus variegates.  Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244–1249.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1451
 
47) Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log 
K ow /log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumu ­
lation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim.
 
48) Tämän liitteen luku C.8: Myrkyllisyystutkimus madoilla.  
49) Tämän liitteen luku C.13. Biokertyvyys: testi kaloilla läpivirtausolosuhteissa.  
50) Tämän liitteen luku C.21. Maaperän mikrobit: typen muuntumistesti.  
51) OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, 
Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.  
52) OECD (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia And ­
rei), Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, 
OECD, Paris . 
53) OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, 
Paris.  
54) Petersen H and Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna 
populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287–388.  
55) Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. Teoksessa: Handbook of Ecotoxico ­
logy Vol. 1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378–396.  
56) Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen 
der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser-Ko ­
effzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77–81.  
57) Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of 
cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm  Eisenia 
fetida.  RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.  
58) Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation 
of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envi ­
ron.Toxicol. Chem. 10: 1431–1436.  
59) Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulations ­
tests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S.  
60) Römbke J and Moser Th (1999). Organisation and performance of an in ­
ternational ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: s. 373
 
61) Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, In: 
Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W.&Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105–129.
 
62) Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W,Canton JH (1993). 
Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Se ­
condary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, Part 
2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107–127.  
63) Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). 
Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development 
and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110–2120.  
64) Schlosser H-J and Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für 
Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit 
Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 
413–433.  
65) Schmelz R and Collado R (1999).  Enchytraeus luxuriosus  sp. nov., a new 
terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 
57: 93–100.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1452
 
66) Sims R W and Gerard BM (1985). Earthworms, In: Kermack, D. 
M.&Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) 
No. 31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.  
67) Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares 
AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557–2563.
 
68) Spacie A and Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the 
bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309–320.  
69) Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, Scroggins 
RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm ecotoxicolo ­
gy. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac 
Press, Pensacola, 67–81.
 
70) Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM 
(2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail  Orchesella cincta.  Environ. Toxi ­
col. Chemistry 22: 1167–1171.
 
71) UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation – Bewertungskonzept 
und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.  
72) US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of 
sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second Edi ­
tion, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, 
MN, March 2000.  
73) Van Brummelen TC and Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination 
of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod  Porcellio scaber.  Arch. Environ. 
Contam. Toxicol. 31: 277–285.  
74) Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the toxi ­
city of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earth ­
worms (Ed. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW&Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB).
 
75) Van Gestel CA and Ma W-C (1990). An approach to quantitative 
structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. Che ­
mosphere 21: 1023–1033.  
76) Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). 
Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil inver ­
tebrates. Environmental Pollution 136: 409–417.  
77) Venter JM and Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm  
Eisenia fetida  (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161–165.  
78) Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van 
Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm  Lumbricus rubellus  exposed to contaminated floodplain 
soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843–1851.
 
79) Widianarko B and Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival 
analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402–406.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1453
 
Lisäys 1  
MÄÄRITELMÄT  
Biokertyvyys  on organismissa tai sen pinnalla olevan testikemikaalin pitoisuuden 
lisääntyminen verrattuna testikemikaalin pitoisuuteen väliaineessa. Biokertymistä aiheuttaa biokonsentraatio ja biomagnifikaatio (katso seuraavat kohdat).
 
Biokonsentraatio  on organismissa tai sen pinnalla olevan testikemikaalin pitoi ­
suuden lisääntyminen, joka johtuu ainoastaan kemikaalin kertymisestä ympäröi ­
västä väliaineesta (ruumiin pinnan ja syödyn maan kautta), verrattuna testikemi ­
kaalin pitoisuuteen väliaineessa.  
Biomagnifikaatio  on organismissa tai sen pinnalla olevan testikemikaalin pitoi ­
suuden lisääntyminen, joka johtuu pääasiassa kontaminoituneen ravinnon tai saa ­
liin nauttimisesta, verrattuna testikemikaalin pitoisuuteen ravinnossa tai saaliissa. Biomagnifikaatio voi aiheuttaa testattavan aineen siirtymistä tai kertymistä ravin ­
toverkoissa.
 
Poistuminen  on testikemikaalin poistumista testiorganismikudoksesta aktiivisilla 
tai passiivisilla prosesseilla riippumatta siitä, onko ympäröivässä väliaineessa 
testattavaa ainetta vai ei.  
Biokertyvyystekijä  (BAF) minä tahansa tämän kertyvyystestin kertymävaiheen 
ajankohtana on testikemikaalin pitoisuus testiorganismissa tai sen pinnalla (C  a , 
grammaa kilossa madon kuivapainoa) jaettuna kyseisen kemikaalin pitoisuudella väliaineessa (C
 s , grammaa kilossa maan kuivapainoa). BAF ilmoitetaan kiloina 
maata kilossa matoa.  
Biokertyvyystekijä tasapainotilassa  (BAF  ss ) ei muutu merkittävästi pitkän ajan ­
jakson aikana, kun testikemikaalin pitoisuus väliaineessa on vakio tänä aikana 
(C s , grammaa kilossa maan kuivapainoa).  
Biokertyvyystekijöitä , jotka on laskettu suoraan maan kertymävakion (k  s ) ja 
poistumavakion (k  e ) suhteesta (katso jäljempänä), sanotaan kineettisiksi  bioker­ 
tyvyystekijöiksi (BAF  K ). 
Eliöstön-maaperän kertyvyyskerroin  (BSAF) on testikemikaalin rasvan suhteen 
normalisoitu pitoisuus testiorganismissa tai sen pinnalla jaettuna orgaanisen hiilen suhteen normalisoidulla pitoisuudella maassa tasapainotilassa. C
 a ilmaistaan 
grammoina kilossa organismin rasvamäärässä, ja C  s grammoina kilossa maan 
orgaanista ainesta. BSAF ilmaistaan kiloina orgaanista hiiltä kilossa rasvaa.  
Tasannevaihe  tai tasapainotila  on altistusvaiheessa samanaikaisesti tapahtuvien 
kertymä- ja poistumaprosessien välinen tasapainotila. Tasapainotila saavutetaan 
BAF:ää ajan funktiona esittävässä käyrässä silloin, kun käyrä on aika-akselin suuntainen, kolme peräkkäistä vähintään kahden vuorokauden välein otetuista näytteistä tehtyä BAF-määritystä poikkeavat enintään ± 20 prosenttia eikä näiden 
kolmen näytteenottoajanjakson välillä ole tilastollisesti merkitseviä eroja. Kun 
testataan kemikaaleja, jotka kertyvät hitaasti, välit voivat olla pikemminkin seit ­
semän vuorokautta (49).
 
Orgaaninen hiili-vesi-jakautumiskerroin  (K oc ) on kemikaalin maan orgaanisen 
hiilen fraktiossa olevan pitoisuuden ja vedessä tasapainotilassa olevan pitoisuu ­
den välinen suhde.  
Oktanoli-vesi-jakautumiskerroin  (K  ow ) on kemikaalin n-oktanoliliukoisuuden 
ja vesiliukoisuuden suhde tasapainotilassa, josta käytetään myös merkintää P  ow . 
Logaritmia K  ow (log K  ow ) käytetään ilmaisemaan kemikaalin biokertyvyyspoten ­
tiaalia vesieliöissä.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1454
 
Kertymä- eli altistumisvaihe  on aika, jona testiorganismit altistetaan testatta ­
valle kemikaalille.  
Maan kertymävakio  (k s ) on numeerinen arvo, joka määrittää kuinka nopeasti 
testiaineen pitoisuus nousee testiorganismissa tai sen pinnalla, koska testiainetta kertyy maafaasista. k
 s ilmaistaan grammoina maata kilossa matoa, d  -1 . 
Poistumavaihe  alkaa, kun testiorganismit on siirretty kontaminoituneesta väli ­
aineesta sellaiseen väliaineeseen, jossa ei ole testattavaa ainetta. Poistumavaiheen 
aikana tutkitaan kyseisen testikemikaalin (netto)poistumaa testiorganismeista.  
Poistumavakio  (k e ) on numeerinen arvo, joka kuvaa testattavan aineen pitoisuu ­
den alenemisen nopeutta testiorganismissa tai sen pinnalla, kun testiorganismit on siirretty testattavaa ainetta sisältävästä väliaineesta sellaiseen väliaineeseen, jossa 
ei ole kyseistä ainetta. k
 e :n laatu on päivää  -1 ). 
Testikemikaali:  Tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1455
 
Lisäys 2  
Kertymä- ja poistumaparametrien laskeminen  
Biokertymistestin tärkein tutkittava ominaisuus on biokertyvyystekijä BAF. Mi ­
tattu BAF voidaan laskea jakamalla pitoisuus testiorganismissa C  a pitoisuudella 
maassa C  s tasapainotilassa. Jos tasapainotilaa ei saavuteta kertymävaiheessa, 
BAF  K lasketaan nopeusvakioista eikä BAFss-arvosta. On kuitenkin ilmoitettava, 
perustuuko BAF tasapainotilan pitoisuuksiin vai nopeusvakioihin.  
Kineettinen biokertyvyystekijä (BAF  K ), maan kertymävakio (k  s ) ja poistumava ­
kio (k  e ) lasketaan yleensä tietokoneella käyttäen epälineaarisia parametrien arvi ­
ointimenetelmiä kohdassa (68) kuvattujen mallien perusteella. Kun tietokoneelle syötetään sarja peräkkäisiä aikapitoisuustuloksia ja mallikaavat: 
C
 a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [yhtälö 1]  
tai 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [yhtälö 2]  
jossa  
C a = kemikaalin pitoisuus madoissa [grammaa kilossa märkä- tai kuivapainoa]  
k s = kertymävakio kudoksessa [grammaa maata kilossa matoa, d-1]  
C s = kemikaalin pitoisuus maassa [grammaa kilossa märkä- tai kuivapainoa]  
k e = poistumavakio [d-1]  
t c = aika kertymävaiheen lopussa  
nämä ohjelmat laskevat BAF  K -, k  s - ja k  e -arvot.  
Kun taustapitoisuus ei-altistuneissa madoissa esim päivänä 0 poikkeaa merkittä ­
västi nollasta (näin voi käydä esim. metallien kanssa), taustapitoisuus (C  a,0 ) on 
sisällytettävä näihin yhtälöihin seuraavasti: 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [yhtälö 3]  
ja 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [yhtälö 4]  
Jos massaa havaitaan testikemikaalin pitoisuuden merkittävää laskua kertymäv ­
aiheen aikana, voidaan käyttää seuraavia malleja, esim. (67) (79): 
C s ¼ C 0 ðe –k 0 t Þ [yhtälö 5]  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1456
 
jossa  
C s = kemikaalin pitoisuus maassa [grammaa kilossa märkä- tai kuivapainoa]  
k 0 = hajoamisen nopeusvakio maassa [d-1]  
C 0 = kemikaalin alkuperäinen pitoisuus maassa [grammaa kilossa märkä- tai 
kuivapainoa] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü ðe –k 0 t Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [yhtälö 6] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü e –k 0 tc Ä e –k e tc ä e ÄkðtÄtcÞ t > t  c [yhtälö 7]  
jossa  
C a = kemikaalin pitoisuus madoissa [grammaa kilossa märkä- tai kuivapainoa]  
k s = kertymävakio kudoksessa [grammaa maata kilossa matoa, d-1]  
k 0 = hajoamisen nopeusvakio maassa [d-1]  
k e = poistumavakio [d-1]  
t c = aika kertymävaiheen lopussa.  
Kun tasapainotila saavutetaan kertymävaiheessa (eli t = ∞), yhtälö 1 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [yhtälö 1]  
voidaan muuttaa seuraavasti:  
C a ¼ k s 
k e Ü C s 
tai 
C a=C s ¼ k s=k e ¼ BAF  K [yhtälö 8]  
Tällöin k  s /k e x C  s lähenee testiaineen pitoisuutta matokudoksissa tasapainotilassa 
(C a,ss ). 
Eliöstön-maaperän kertyvyyskerroin (BSAF) voidaan laskea seuraavasti: 
BSAF ¼ BAF  K ä f oc 
f lip [yhtälö 9]  
jossa f  oc on maan orgaanisen hiilen fraktio ja f  lip on matojen rasvan fraktio, joista 
kumpikin määritetään mieluiten testissä otetuista näytteistä. Ne perustuvat kuiva ­
painoon tai märkäpainoon.  
Poistumakinetiikkaa voidaan mallintaa poistumavaiheen tietojen avulla ja sovel ­
tamalla seuraavaa malliyhtälöä ja tietokonepohjaisia epälineaarisia parametrien arviointimenetelmiä. Jos ajan suhteen esitetyt datapisteet viittaavat testiaineen 
pitoisuuden jatkuvaan eksponentiaaliseen laskuun eläimissä, poistumisen ajallista 
esiintymistä voidaan kuvata yhden lohkon mallilla (yhtälö 9). 
C
 a ðtÞ ¼ C a;ss Ü e –k e t [yhtälö 10]  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1457
 
Toisinaan poistumisprosessit vaikuttavat kaksivaiheisilta: C  a laskee nopeasti al ­
kuvaiheissa, mutta poistumisen myöhemmissä vaiheissa testattavat aineet poistu ­
vat hitaammin, esim. (27) (68). Nämä kaksi vaihetta voidaan tulkita olettamalla, että organismissa on kaksi eri lohkoa, joista testattava aine poistuu eri nopeuk ­
silla. Tällöin on tutustuttava asiaa käsittelevään kirjallisuuteen, esim. (38) (39) 
(40) (78).
 
Edellä annettuja malliyhtälöitä käyttämällä voidaan laskea myös kineettiset para ­
metrit (k  s ja k  e ) yhdellä kertaa soveltamalla ensimmäisen asteen kineettistä mallia 
samanaikaisesti kaikkiin kertymä- ja poistumavaiheen tietoihin. Tällaisen kerty ­
mä- ja poistumavakioiden yhdistetyn laskennan kuvaus on viitteissä (40), (72) ja 
(69). 
C a ¼ " 
K s 
K e · C s ð1 Ä e –k e t Þ Ü ðm ¼ 1Þ # 
þ " 
K s 
k e Ü C s ðe ÄK e ðtÄt c Þ Ä e –K e t Þ Ü ðm ¼ 2Þ # 
[yhtälö 11]  
Huomautus:  Kun kertymä- ja poistumaparametrit estimoidaan samanaikaisesti 
yhdistetyistä kertymä- ja poistumatiedoista, yhtälön 11 ”m” on kuvaaja, joka sallii tietokoneohjelman määrittää yhtälön alaehdot niitä vastaavan vaiheen datajoukkoihin ja tehdä arvioinnin oikein 
(m = 1 kertymävaiheelle, m = 2 poistumavaiheelle).
 
Siitä huolimatta malliyhtälöiden käytössä on noudatettava varovaisuutta varsin ­
kin, kun testikemikaalin biologisessa hyötyosuudessa tai (bio)hajoamisessa tapah ­
tuu muutoksia testin aikana (ks. esim. (79)).  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1458
 
Lisäys 3  
ESIMERKKEJÄ BIOKERTYVYYSTESTIEN AIKATAULUISTA  
Testi lieroilla  
a) Kertymävaiheessa 8 näytteenottopäivää kineettisten tietojen laskentaa varten  
Päivä Toiminnot  
– 6 Valmistellun maa-aineksen sopeuttaminen 48 tunnin ajan 
– 4 Testikemikaaliliuoksen lisääminen maafraktioon, mahdollisen 
liuottimen haihdutus, maan ainesosien sekoitus, maan jakaminen testiastioihin, testiolosuhteiden vakauttaminen 4 päivän ajan (3 
viikkoa, jos maahan lisätään metallia) 
– 3 – – 1 Testiorganismien erottaminen viljelmästä totuttautumista varten, 
maan ainesosien valmistelu ja kostutus 
0 Kosteuden ja maan pH-arvon mittaus, maanäytteiden ottaminen 
käsitellyistä astioista ja liuotinkontrolleista testikemikaalien pitoi ­
suuden määrittämistä varten, ravintoannoksen lisääminen, mato ­
jen punnitus ja satunnaistettu jakaminen testiastioihin, riittävän matojen alanäytteiden säilyttäminen analyyttisten tausta-arvojen, märkä- ja kuivapainon sekä rasvapitoisuuden määrittämistä var ­
ten, kaikkien testiastioiden punnitus maan kosteuden kontrolloin ­
tia varten, tuloilman kontrollointi, jos käytössä on suljettu testi ­
järjestelmä 
1 Tuloilman kontrollointi, matojen käyttäytymisen ja lämpötilan 
kirjaaminen, maa- ja matonäytteiden ottaminen testattavan aineen 
pitoisuuden määrittämistä varten 
2 Sama kuin päivänä 1 3 Tuloilman kontrollointi, matojen käyttäytyminen ja lämpötila 4 Sama kuin päivänä 1 
5–6 Sama kuin päivänä 3 
7 Sama kuin päivänä 1, ravintoannoksen lisääminen, maan kosteu ­
den kontrollointi punnitsemalla testiastiat uudelleen ja haihtuneen 
veden korvaaminen 
8–9 Sama kuin päivänä 3 
10 Sama kuin päivänä 1 
11–13 Sama kuin päivänä 3 
14 Sama kuin päivänä 1, ravintoannoksen lisääminen, maan kosteu ­
den kontrollointi punnitsemalla testiastiat uudelleen ja haihtuneen veden korvaaminen 
15–16 Sama kuin päivänä 3 
17 Sama kuin päivänä 1 
18–20 Sama kuin päivänä 3
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1459
 
Päivä Toiminnot  
21 Sama kuin päivänä 1, lämpötilan ja maan pH-arvon mittaaminen, 
maan kosteuden kontrollointi punnitsemalla testiastiat uudelleen, 
kertymävaiheen loppu, matojen siirtäminen jäljellä olevista altis ­
tetuista rinnakkaisnäytteistä poistumavaihetta varten astioihin, joissa on puhdasta maata (ei suolen tyhjennystä), maa- ja mato ­
näytteet liuotinkontrolleista 
Esialtistustoimet (tasapainovaihe) on ajoitettava testikemikaalin 
ominaisuuksien mukaan. 
Päivänä 3 kuvatut toimet tehdään päivittäin (vähintään kaikkina 
arkipäivinä).
 
b) Poistumavaihe  
Päivä Toiminnot  
– 6 Maan ainesosien valmistelu ja kostutus, valmistellun 
maa-aineksen sopeuttaminen 48 tunnin ajan 
– 4 Maan ainesosien sekoitus, maan jakaminen testiastioihin, inku ­
baatio testiolosuhteissa 4 päivän ajan 
0 (kertymävaiheen 
loppu) Lämpötilan ja maan pH-arvon mittaus, matojen punnitus ja sa ­
tunnaistettu jakaminen testiastioihin, ravintoannoksen lisääminen, matojen siirtäminen jäljellä olevista altistetuista rinnakkaisnäyt ­
teistä astioihin, joissa on puhdasta maata, maa- ja matonäytteet 
4–6 tunnin kuluttua testikemikaalin pitoisuuden määrittämistä 
varten 
1 Tuloilman kontrollointi, matojen käyttäytymisen ja lämpötilan 
kirjaaminen, maa- ja matonäytteiden ottaminen testikemikaalin 
pitoisuuden määrittämistä varten 
2 Sama kuin päivänä 1 3 Tuloilman kontrollointi, matojen käyttäytyminen ja lämpötila 4 Sama kuin päivänä 1 
5–6 Sama kuin päivänä 3 
7 Sama kuin päivänä 1, ravintoannoksen lisääminen, maan kosteu ­
den kontrollointi punnitsemalla testiastiat uudelleen ja haihtuneen veden korvaaminen 
8–9 Sama kuin päivänä 3 
10 Sama kuin päivänä 1 
11–13 Sama kuin päivänä 3 
14 Sama kuin päivänä 1, ravintoannoksen lisääminen, maan kosteu ­
den kontrollointi punnitsemalla testiastiat uudelleen ja haihtuneen veden korvaaminen 
15–16 Sama kuin päivänä 3 
17 Sama kuin päivänä 1
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1460
 
Päivä Toiminnot  
18–20 Sama kuin päivänä 3 
21 Sama kuin päivänä 1, lämpötilan ja maan pH-arvon mittaus, 
maan kosteuden kontrollointi punnitsemalla testiastiat uudelleen, maa- ja matonäytteet liuotinkontrolleista 
Maa valmistellaan ennen poistumavaihetta samoin kuin ennen 
kertymävaihetta 
Päivänä 3 kuvatut toimet tehdään päivittäin (vähintään kaikkina 
arkipäivinä).
 
Testi änkyrimadoilla  
a) Kertymävaiheessa 8 näytteenottopäivää kineettisten tietojen laskentaa varten  
Päivä Toiminnot  
– 6 Valmistellun maa-aineksen sopeuttaminen 48 tunnin ajan 
– 4 Testikemikaaliliuoksen lisääminen maafraktioon, mahdollisen 
liuottimen haihdutus, maan ainesosien sekoitus, maan jakaminen testiastioihin, testiolosuhteiden vakauttaminen 4 päivän ajan (3 
viikkoa, jos maahan lisätään metallia) 
– 3 – – 1 Testiorganismien erottaminen viljelmästä totuttautumista varten, 
maan ainesosien valmistelu ja kostutus 
0 Kosteuden ja maan pH-arvon mittaus, maanäytteiden ottaminen 
käsitellyistä astioista ja liuotinkontrolleista testikemikaalien pitoi ­
suuden määrittämistä varten, ravintoannoksen lisääminen maahan, matojen punnitus ja satunnaistettu jakaminen testiastioihin, riittä ­
vän matojen alanäytteiden säilyttäminen analyyttisten 
tausta-arvojen, märkä- ja kuivapainon sekä rasvapitoisuuden mää ­
rittämistä varten, kaikkien testiastioiden punnitus maan kosteuden kontrollointia varten, tuloilman kontrollointi, jos käytössä on sul ­
jettu testijärjestelmä 
1 Tuloilman kontrollointi, matojen käyttäytymisen ja lämpötilan 
kirjaaminen, maa- ja matonäytteiden ottaminen testattavan aineen 
pitoisuuden määrittämistä varten 
2 Sama kuin päivänä 1 3 Tuloilman kontrollointi, matojen käyttäytyminen ja lämpötila 4 Sama kuin päivänä 1 
5–6 Sama kuin päivänä 3 
7 Sama kuin päivänä 1, ravintoannoksen lisääminen maahan, maan 
kosteuden kontrollointi punnitsemalla testiastiat uudelleen ja 
haihtuneen veden korvaaminen 
9 Sama kuin päivänä 1 
10 Sama kuin päivänä 3
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1461
 
Päivä Toiminnot  
11 Sama kuin päivänä 1 
12–13 Sama kuin päivänä 3 
14 Sama kuin päivänä 1, ravintoannoksen lisääminen maahan, läm ­
pötilan ja maan pH-arvon mittaaminen, maan kosteuden kontrol ­
lointi punnitsemalla testiastiat uudelleen, kertymävaiheen loppu, matojen siirtäminen jäljellä olevista altistetuista rinnakkaisnäyt ­
teistä poistumavaihetta varten astioihin, joissa on puhdasta maata 
(ei suolen tyhjennystä), maa- ja matonäytteet liuotinkontrolleista 
Esialtistustoimet (tasapainovaihe) on ajoitettava testikemikaalin 
ominaisuuksien mukaan 
Päivänä 3 kuvatut toimet tehdään päivittäin (vähintään kaikkina 
arkipäivinä).
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1462
 
Lisäys 4  
Keinomaan valmistus- ja säilytyssuosituksia  
Koska tietystä lähteestä peräisin olevaa luonnonmaata ei välttämättä ole saatavana 
vuoden ympäri ja koska luonnonmaan sisältämät organismit ja mikrosaasteet 
voivat vaikuttaa testiin, tässä testissä on suositeltavaa käyttää keinomaata, joka on kuvattu tämän liitteen luvussa C.8 Myrkyllisyystutkimus madoilla (48). Useat testilajit pystyvät elämään, kasvamaan ja lisääntymään tässä keinomaassa, ja testi- 
ja viljelyolosuhteiden yhdenmukaisuus on mahdollisimman suuri sekä laborato ­
rion sisällä että laboratorioiden välillä.
 
Maan ainesosat 
Turve: 10 % Rahkasuoturve OECD:n ohjeen 207 (48) 
mukaisesti 
Kvartsihiekka: 70 % Teollinen kvartsihiekka (ilmakuivattu), rae ­
koko: yli 50 prosenttia hiukkasista on oltava 
50–200 μm, mutta kaikkien hiukkasten on 
oltava alle ≤ 2 mm 
Kaoliniittisavi: 20 % Kaoliniittipitoisuus ≥ 30 % 
Kalsiumkarbonaatti: ≤ 1 % CaCO  3 , jauhettu, kemiallisesti puhdas  
Haluttaessa keinomaan orgaanisen hiilen pitoisuutta voidaan pienentää esimer ­
kiksi laskemalla turpeen määrän 4–5 prosenttiin kuivamaasta ja lisäämällä hiekan määrää vastaavasti. Kun orgaanisen hiilen pitoisuus pienenee, testikemikaalin 
adsorboituminen maahan (orgaaniseen hiileen) saattaa heikentyä ja testikemikaa ­
lin saatavuus madoille nousta (74). On osoitettu, että  Enchytraeus albidus  ja 
Eisenia fetida  täyttävät lisääntymiskriteerit, kun luonnonmaan orgaanisen hiilen 
pitoisuus on matala, esim. 2,7 prosenttia (33), (60). Kokemuksen mukaan sama 
saadaan aikaan keinomaassa käyttämällä 5 prosenttia turvetta.
 
Valmistelut  
Maan kuivat ainesosat sekoitetaan perusteellisesti (esim. suurella laboratoriose ­
koittimella). Tämä tehdään noin viikko ennen testin alkua. Sekoitetun kuivamaan 
ainekset kostutetaan deionisoidulla vedellä vähintään 48 tuntia ennen testattavan 
aineen lisäämistä, jotta happamuus ehtii vakiintua. pH-määritystä varten käyte ­
tään maan ja 1 M KCl -liuoksen sekoitusta suhteessa 1:5. Jos pH-arvo ei ole 
vaaditulla alueella (6,0 ± 0,5), maahan lisätään riittävä määrä CaCO  3 :ta tai val ­
mistetaan uusi maaerä.  
Keinomaan suurin mahdollinen vedensitomiskyky (WHC) määritetään standardin 
ISO 11268-2 (35) mukaisesti. Vähintään kaksi vuorokautta ennen testin aloitta ­
mista kuiva keinomaa kostutetaan lisäämällä deionisoitua tai synteettistä vettä, 
kunnes vesipitoisuus on noin puolet lopullisesta. Lopullisen vesipitoisuuden on oltava 40–60 prosenttia suurimmasta mahdollisesta vedensitomiskyvystä (WHCmax). Testin alussa esikostutettu maa jaetaan yhtä moneen erään kuin 
testissä käytetään pitoisuuksia ja kontrolleja, ja kosteuspitoisuus säädetään 40–60 
prosenttiin WHC
 max -arvosta testattavan aineen liuoksella ja/tai lisäämällä deioni ­
soitua tai synteettistä vettä. Kosteuspitoisuus määritetään testin alussa ja lopussa (lämpötilassa 105 °C). Kosteuspitoisuuden on oltava optimaalinen lajeille. Kos ­
teuspitoisuuden voi tarkistaa myös seuraavasti: kun maata puristetaan varovasti 
käsin, sormien välissä pitäisi näkyä pieniä vesipisaroita.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1463
 
Säilytys  
Keinomaan kuivia ainesosia voidaan säilyttää huoneenlämmössä käyttöön asti. 
Valmistettua, esikostutettua maata voidaan säilyttää viileässä enintään kolme 
vuorokautta ennen testiaineen lisäämistä. Veden haihtumista on ehkäistävä. Kun maahan on lisätty testiaine, maa on käytettävä heti, ellei ole tiedossa, että tiettyä maata voidaan säilyttää ilman, että se vaikuttaa testattavan aineen toksi ­
suuteen ja biologiseen hyötyosuuteen. Näytteitä maasta, johon testiainetta on 
lisätty, voidaan säilyttää kyseisen testiaineen suositelluissa säilytysolosuhteissa analyysiin saakka.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1464
 
Lisäys 5  
Maalla elävien harvasukasmatojen lajit, joita suositellaan maan 
biokertyvyystestejä varten  
Lierot  
Suositeltu testilaji on  Eisenia fetida  (Savigny 1826), joka kuuluu 
Lumbricidae-heimoon. Vuodesta 1972 lähtien on erotettu kaksi alalajia  Eisenia 
fetida  ja Eisenia andrei  (10). Jaeniken (36) mukaan ne ovat aidosti eri lajeja.  
Eisenia fetida  on helppo tunnistaa segmenttien kirkkaankeltaisista väleistä, kun 
taas Eisenia andrei  on yhtenäisen tummanpunainen. Ne ovat todennäköisesti 
kotoisin Mustanmeren alueelta. Nykyisin ne ovat levinneet ympäri maailmaa ja etenkin ihmisen muokkaamiin elinympäristöihin, kuten tunkioihin. Kumpaakin 
lajia voidaan käyttää ekotoksikologisissa ja biokertyvyystesteissä.
 
Eisenia fetidaa  ja Eisenia andreita  myydään kaupallisesti esim. kalansyötiksi. 
Niiden elinaika on lyhyt verrattuna muihin  Lumbricidae -heimon lieroihin, ja ne 
tulevat sukukypsiksi noin 2–3 kuukauden iässä (huoneenlämmössä). Optimaa ­
linen lämpötila on noin 20–24 °C. Lierot elävät mieluiten kosteassa alustassa, 
jonka pH on lähes neutraali ja joka sisältää paljon orgaanista ainesta. Koska näitä 
lajeja on käytetty yleisesti standardoiduissa ekotoksikologisissa testeissä noin 25 vuoden ajan, niiden kasvattaminen on vakiintunutta (48) (77).
 
Kumpaakin lajia voidaan kasvattaa hyvin erilaisissa eläinjätteissä. ISO:n suosit ­
telema kasvatusalusta (35) on hevosen- tai lehmälantaa ja turvetta suhteessa 
50:50. Kasvatusalustan pH-arvon on oltava noin 6–7 (sitä säädellään kalsiumkar ­
bonaatilla). Ionisen johtavuuden on oltava matala (alle 6 mS/cm tai suolapitoi ­
suus alle 0,5 %) eikä kasvatusalustassa saa olla liikaa ammoniakkia tai eläinten 
virtsaa. Kaupallista puutarhamultaa, joka ei sisällä lisäaineita, OECD:n mukaista 
keinomaata (48) tai näiden kahden sekoitusta suhteessa 50:50 voidaan myös käyttää. Alustan on oltava kostea mutta ei liian märkä. Kasvatuslaatikon sovel ­
tuva koko on 10–50 litraa.
 
Jotta saadaan vakioikäisiä ja -painoisia matoja, viljelmä on paras aloittaa muna ­
koteloilla. Munakoteloita saadaan lisäämällä aikuisia matoja kasvatuslaatikkoon, 
jossa on tuoretta substraattia. Käytännön kokemus on osoittanut, että hyvä jälke ­
läistuotto saavutetaan, kun matojen tiheys on noin 100 aikuista matoa substraat ­
tikiloa (märkäpaino) kohden. Aikuiset madot poistetaan 28 vuorokauden kuluttua. 
Munakoteloista kuoriutuneita lieroja käytetään testaukseen, kun ne ovat sukukyp ­
siä vähintään 2 kuukauden mutta alle 12 kuukauden kuluttua.  
Edellä kuvattujen lajien matoja voidaan pitää terveinä, jos ne liikkuvat alustassa 
mutta eivät yritä lähteä siitä pois ja lisääntyvät jatkuvasti. Hyvin hidas liikkumi ­
nen tai keltainen peräpää ( Eisenia fetida  -lajilla) viittaa substraatin ehtymiseen. 
Tällöin on suositeltavaa lisätä tuoretta substraattia ja/tai vähentää eläinten määrää 
laatikossa.  
Valikoitua lisäviitemateriaalia  
Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean 
Soc. London, 6: 1–58.  
Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Land ­
wirtsch. 7: 1–81.  
Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests 
mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
 
Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. 
Oikos 28: 49–55.  
Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 
180–201.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1465
 
Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. 
London 31: 1–171.  
Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. Teoksessa: 
Earthworm Ecology – from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chap ­
man & Hall, London. s. 331–338.  
Änkyrimadot  
Suositeltava laji on  Enchytraeus albidus , Henle 1837.  Enchytraeus albidus  on 
nivelmatojen pääjakson harvasukasmatojen alaluokan  Enchytraeidae -heimon suu ­
rimpia lajeja (jopa 15 mm), ja se on levinnyt ympäri maailmaa, esim. (8).  Enc­
hytraeus albidusta  esiintyy merellisissä, limnisissä ja maaluontotyypeissä lähinnä 
hajoavassa orgaanisessa aineessa (levä, komposti) ja harvoin niityillä (42). Tämä 
laaja ekologinen sietokyky ja eräät morfologiset variaatiot viittaavat siihen, että lajista saattaa olla eri rotuja.
 
Enchytraeus albidusta  myydään kaupallisesti kalanruoaksi. On tarkistettava, ettei 
viljelmä ole kontaminoitunut jollakin, yleensä pienemmällä lajilla (60). Jos kon ­
taminaatiota ilmenee, kaikki madot on pestävä vedellä petrimaljassa. Sen jälkeen aikuiset  Enchytraeus albidus  -madot valitaan (stereomikroskoopilla) uuden viljel ­
män perustamista varten. Kaikki muut madot hävitetään. Näiden matojen elinikä 
on lyhyt, sillä kypsyyden saavuttaminen kestää 33 vuorokaudesta (18 °C:n läm ­
pötilassa) 74 vuorokauteen (12 °C:n lämpötilassa). Testiin saa käyttää ainoastaan viljelmiä, joita on säilytetty ongelmitta laboratoriossa vähintään 5 viikkoa (yhden 
sukupolven).
 
Muut  Enchytraeus -suvun lajit ovat myös soveltuvia, ja etenkin  Enchytraeus lu ­
xuriosus.  Tämä laji on todellinen maaeläjä, ja se on kuvattu äskettäin (65). Jos 
käytetään muita  Enchytraeus -lajeja, ne on tunnistettava selvästi ja lajin valinta ­
perusteet on raportoitava.  
Enchytraeus crypticus  (Westheide & Graefe 1992) -laji kuuluu samaan ryhmään 
kuin Enchytraeus luxuriosus . Sitä ei ole varmuudella todettu kentällä, vaan lajia 
on kuvattu vain lieroviljelmissä ja komposteissa (Römbke 2003). Siksi lajin 
alkuperäisiä ekologisia vaatimuksia ei tunneta. Tuoreet laboratoriotutkimukset 
erilaisissa maaperissä ovat kuitenkin vahvistaneet, että tällä lajilla on laaja sieto ­
kyky maan ominaisuuksille, kuten pH:lle ja koostumukselle (Jänsch  et al.  2005). 
Tätä lajia on käytetty viime vuosina usein ekotoksikologisissa tutkimuksissa 
helpon kasvatuksen ja testauksen vuoksi (esim. Kuperman  et al.  2003). Madot 
ovat kuitenkin pieniä, (3–12 mm, keskimäärin 7 mm) (Westheide & Müller 1996), joten niitä on vaikeampi käsitellä kuin  Enchytraeus albidus  -lajia. Kun 
tätä lajia käytetään  Enchytraeus albiduksen  sijaan, testiastia voi haluttaessa olla 
pienempi. Lisäksi on otettava huomioon, että tämä laji lisääntyy erittäin nopeasti. 
Generaatioaika on alle 20 vuorokautta lämpötilassa 20 ± 2 °C (Achazi et al. 1999), ja vielä lyhyempi tätä korkeammassa lämpötilassa.
 
Enchytraeus albidus  -lajin änkyrimatoja (sekä muita  Enchytraeus -lajeja) voidaan 
kasvattaa suurissa muovilaatikoissa (esim. 30 × 60 × 10 cm tai 20 × 12 × 8 cm 
pienikokoisille madoille), joissa on keinomaan ja kaupallisen, kontaminoitumat ­
toman ja lisäaineettoman puutarhamullan seosta. Kompostiainesta on vältettävä, sillä se voi sisältää myrkyllisiä kemikaaleja, kuten raskasmetalleja. Kasvatus ­
maasta on poistettava eläimistö pakastamalla se kolme kertaa ennen käyttöä. 
Puhdasta keinomaata voidaan myös käyttää, mutta lisääntymisnopeus voi olla hitaampi kuin sekoitetuissa substraateissa. Substraatin pH-arvon on oltava 6,0 ± 0,5. Viljelmää pidetään inkubaattorissa lämpötilassa 15 ± 2 °C ilman valoa. 
Yli 23 °C:n lämpötilaa on vältettävä. Keino- tai luonnonmaan on oltava kosteaa, 
mutta ei märkää. Kun maata painetaan kevyesti kädellä, näkyviin pitäisi tulla vain pieniä vesipisaroita. Hapettomia olosuhteita on aina vältettävä (jos esimer ­
kiksi käytetään kantta, kannessa on oltava tarpeeksi reikiä, jotta ilmanvaihto on 
riittävää). Kasvatusmaa on ilmastettava sekoittamalla sitä varovasti kerran vii ­
kossa.
 ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1466
 
Madot ruokitaan vähintään kerran viikossa ruokahalun mukaisesti kaurahiutaleil ­
la, jotka pannaan koloon maanpinnan alle ja peitetään maalla. Jos astiassa on 
jäljellä edellisellä ruokintakerralla annettua ruokaa, ruoanmäärää säädetään vas ­
taavasti. Jos jäljellä olevassa ravinnossa kasvaa sientä, vaihda kaurahiutaleet uu ­
siin. Lisääntymistä voi stimuloida antamalla kaurahiutaleiden lisäksi kaupallista 
vitaminoitua proteiinijauhetta kahden viikon välein. Kolmen kuukauden kuluttua 
eläimet siirretään vasta valmistettuun viljelmään tai kasvatusalustaan. Kaurahiu ­
taleet, joita säilytetään suljetuissa astioissa, on käsiteltävä autoklaavissa tai kuu ­
mennettava ennen käyttöä, jotta infektiot ja jauhopunkit (esim.  Glyzyphagus  sp., 
Astigmata, Acarina) tai petopunkit (esim.  Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles , Ga­
masida, Acarina) voidaan välttää. Ruoka jauhetaan desinfioinnin jälkeen, jotta se on helppo levittää maan pinnalle. Muita mahdollisia ravinnonlähteitä ovat leivon ­
tahiiva tai TetraMin
 ® -kalanruoka.  
Kasvatusolosuhteet ovat yleensä riittävän hyvät, jos madot eivät yritä poistua 
substraatista, madot liikkuvat maassa nopeasti, matojen ulkopinta on kiiltävä ja 
siihen on tarttunut maahiukkasia, madot ovat vaaleita ja näkyvissä on eri ikäisiä matoja. Matoja voidaan pitää terveinä, jos ne lisääntyvät jatkuvasti.
 
Valikoitua lisäviitemateriaalia  
Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from 
former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing 
success of the annelid  Enchytraeus crypticus  (Enchytraeidae, Oligochaeta). 
Newsletter on Enchytraeidae 6: 117–126.  
Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological re ­
quirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Revi ­
ews 13: 51–83.  
Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, 
Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of  Enchytraeus crypticus  (Oligo­
chaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the 
nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651–656.  
Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. 
Pedobiologia 47: 607–616.  
Westheide W ja Graefe U (1992). Two new terrestrial  Enchytraeus  species 
(Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479–488.  
Westheide W ja Müller MC (1996). Cinematographic documentation of enchyt ­
raeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263–267.  ▼M4 2008R0440 — FI — 24.08.2014 — 005.001 — 1467