1978L0633 — FI — 20.12.1983 — 002.001 — 1
Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentointitarkoituksiin.Toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä.
►B KAHDEKSAS KOMISSION DIREKTIIVI,
annettu 15 päivänä kesäkuuta 1978,
yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten
(78/633/ETY)
(EYVL L 206, 29.7.1978, s. 43)
Muutettu:
virallinen lehti
N:o sivu päivämäärä
►M1Komission direktiivi 81/680/ETY, annettu 30 päivänä heinäkuuta 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Komission direktiivi 84/4/ETY, annettu 20 päivänä joulukuuta 1983 L 15 28 18.1.1984
▼B
KAHDEKSAS KOMISSION DIREKTIIVI,
annettu 15 päivänä kesäkuuta 1978,
yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten
(78/633/ETY)
EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka
ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen,ottaa huomioon yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmistä rehujen
virallista valvontaa varten 20 päivänä heinäkuuta 1970 annetunneuvoston direktiivin 70/373/ETY(
1), sellaisena kuin se on viimeksi
muutettuna liittymisasiakirjalla, ja erityisesti sen 2 artiklan,
sekä katsoo, ettäedellä mainitussa direktiivissä säädetään rehujen virallisen tarkastuksen
suorittamisesta yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmiä käyttäensen todentamiseksi, että lakien, asetusten ja hallinnollisten määräystenrehujen laatua ja koostumusta koskevat vaatimukset tulevat täytetyksi,
useita yhteisön määritysmenetelmiä on jo vahvistettu 15 päivänä
kesäkuuta 1971 annetulla komission direktiivillä 71/250/ETY(
2), 18
päivänä marraskuuta 1971 annetulla komission direktiivillä 71/393/
ETY(3), 27 päivänä huhtikuuta 1972 annetulla komission direktiivillä
72/199/ETY(4), 5 päivänä joulukuuta 1972 annetulla komission direk-
tiivillä 73/46/ETY(5), 25 päivänä maaliskuuta 1974 annetulla
komission direktiivillä 74/203/ETY(6), 20 päivänä joulukuuta 1974
annetulla komission direktiivillä 75/84/ETY(7) ja 1 päivänä maalis-
kuuta 1976 annetulla komission direktiivillä 76/372/ETY(8); työ on
tämän jälkeen edistynyt siinä määrin, että olisi hyväksyttävä kahdeksasryhmä menetelmiä, ja
tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän rehukomitean
lausunnon mukaiset,
ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:
1 artikla
1. Jäsenvaltioiden on vaadittava, että rehujen virallisessa tarkastuk-
sessa käytettävät sinkkibasitrasiinin, flavofosfolipolin, raudan, kuparin,mangaanin ja sinkin pitoisuusmääritykset suoritetaan tämän direktiivin
liitteessä esitettyjen menetelmien mukaisesti.
2 artikla
Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edel-
lyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset voimaanviimeistään 1 päivänä tammikuuta 1979. Niiden on ilmoitettava tästäkomissiolle viipymättä.
3 artikla
Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.1978L0633 — FI — 20.12.1983 — 002.001 — 2
(1) EYVL N:o L 170, 3.8.1970, s. 2
(2) EYVL N:o L 155, 12.7.1971, s. 13
(3) EYVL N:o L 279, 20.12.1971, s. 7
(4) EYVL N:o L 123, 29.5.1972, s. 6
(5) EYVL N:o L 83, 30.3.1973, s. 21
(6) EYVL N:o L 108, 22.4.1974, s. 7
(7) EYVL N:o L 32, 5.2.1975, s. 26
(8) EYVL N:o L 102, 15.4.1976, s. 8▼M1
▼B
▼B
LIITE
1.SINKKIBASITRASIININ MÄÄRITYS
- diffuusiolla agar-alustassa -
1. TARKOITUS JA SOVELTAMISALA
Menetelmällä on mahdollista määrittää rehujen ja esiseosten sinkkibasi-
trasiinipitoisuus. Määrityksen alaraja on 5 mg/kg (5 miljoonasosaa)(1).
2. PERIAATE
Näyte uutetaan metanoli/vesi/kloorivetyhappo-seoksella, jonka pH on 2.
Natriumsulfidilisäyksen avulla voidaan saostaa liukoiset kuparisuolat,
jotka saattaisivat häiritä määritystä. Uutteen pH säädetään arvoon 6,5,
väkevöidään (tarvittaessa) ja laimennetaan. Sen antibioottinen aktiivi-
suus määritetään mittaamalla sinkkibasitrasiinin diffuusio agar-
alustassa, johon on ympätty Micrococcus luteusta (flavusta) . Diffuusio
mitataan inhibitiovyöhykkeinä, jotka mikro-organismi muodostaa.
Näiden vyöhykkeiden läpimitta on käytetyissä antibioottikonsentraa-
tioissa suoraan verrannollinen antibioottikonsentraation logaritmiin.
3. MIKRO-ORGANISMI: ”MICROCOCCUS LUTEUS (FLAVUS)”
ATCC 10240
3.1 Kantaviljelmän kasvatus
Micrococcus luteus (flavus) ympätään putkiin, jotka sisältävät kasvatusa-
lustasta (4.1) valmistettuja agarvinopintoja. Inkuboidaan 24 tuntia
30 ºC:ssa, säilytetään jääkaapissa noin 4 ºC:ssa ja siirrostetaan uudestaan
joka toinen viikko.
3.2 Bakteerisuspension valmistus (a)
Äskettäin valmistetusta agar-vinopinnasta (3.1) kasvusto huuhdellaan 2-
3 ml:lla natriumkloridiliuosta (4.3). Suspensio siirrostetaan 250 ml:aan
kasvatusliuosta (4.1), joka on steriilissä Roux-pullossa ja inkuboidaan
18-20 tuntia 30 ºC:ssa. Kasvusto otetaan talteen 25 ml:aan natriumklor-
idiliuosta (4.3) ja homogenoidaan.
Suspensio laimennetaan suhteessa 1/10 natriumkloridiliuokseen (4.3).
Suspension valon transmission on oltava noin 75 % mitattuna 650 nm:ssa
1 cm:n kyvetissä natriumkloridiliuosta (4.3) vastaan. Suspensiota
voidaan säilyttää yhden viikon ajan noin 4 ºC:ssa.
4. KASVATUSALUSTAT JA REAGENSSIT
4.1 Kasvatusalusta (b)
Lihapeptoni 6,0 g
Tryptoni 4,0 g
Hiivauute 3,0 g
Lihauute 1,5 gGlukoosi 1,0 g
Agar 10,0-20,0 g
Vesi 1 000 mlpH 6,5-6,6 (steriloinnin jälkeen).
4.2 Määritysalusta (
b)
Tryptoni 10,0 g
Hiivauute 3,0 g
Lihauute 1,5 gGlukoosi 1,0 g
Agar 10,0 g-20,0 g
Tween 80 1 mlVesi 1 000 ml
pH 6,5 (steriloinnin jälkeen).1978L0633 — FI — 20.12.1983 — 002.001 — 3
(1) 1 mg rehulaatuluokkaa olevaa sinkkibasitrasiinia vastaa 42 kansainvälistä yksikköä
(k.y.).
(a) Voidaan käyttää muita menetelmiä edellyttäen, että niillä on osoitettu saatavan aikaan
samanlaisia bakteerisuspensioita.
(b) Voidaan käyttää mitä tahansa vastaavan koostumuksen omaavaa kaupallisesti saatavilla
olevaa kasvatusalustaa, jolla saadaan vastaavat tulokset.▼M2
▼M2
4.3 0,8 % (w/v) natriumkloridiliuos: liuotetaan 8 g natriumkloridia veteen,
laimennetaan 1 000 ml:ksi ja steriloidaan.
4.4 Metanoli/vesi/kloorivetyhappo (4.6) -seos: 80/17,5/2,5 (v/v/v).
4.5 Fosfaattipuskuriliuos, pH 6,5
Kaliumvetyfosfaatti, K2HPO422,15 g
Kaliumdivetyfosfaatti, KH2PO427,85 g
Vesi, täytetään 1 000 ml:ksi
4.6 Kloorivetyhappo tiheys1,18-1,19.
4.7 0,1 M kloorivetyhappo.4.8 1 M natriumhydroksidiliuos.4.9 Noin 0,5 M natriumsulfidiliuos.
4.10 0,04 % (w/v) bromikresolipunaliuos: liuotetaan 0,1 g bromikresolipunaa
18,5 ml:aan 0,01 M natriumhydroksidiliuosta. Tilavuus säädetään
250 ml:ksi vedellä ja homogenoidaan.
4.11 Standardiyhdiste: tunnetun aktiivisuuden (k.y.-yksikköinä) omaava sink-
kibasitrasiini.
5. STANDARDILIUOKSET
Punnitaan sellainen määrä sinkkibasitrasiinistandardia (4.11), joka vastaa
1 050 k.y.:ä (annetun aktiivisuuden mukaan). Lisätään 5 ml 0,1 M kloor-
ivetyhappoa (4.7) ja annetaan seistä 15 minuuttia. Lisätään 30 ml vettä,
säädetään pH arvoon 4,5 fosfaattipuskurilla (4.5) (noin 4 ml), tilavuus
säädetään 50 ml:ksi vedellä ja homogenoidaan (1 ml = 21 k.y.).
Tästä liuoksesta valmistetaan peräkkäin laimentaen fosfaattipuskuri-
liuoksella, pH 6,5 (4.5), seuraavat liuokset:
s
80,42 k.y/ml
s40,21 k.y/ml
s20,105 k.y/ml
s10,0525 k.y/ml
6. UUTTEEN VALMISTUS
6.1 Uutto
6.1.1 Esiseokset ja kivennäisrehut
Punnitaan 2,0-5,0 g näytettä, lisätään 29,0 ml seosta (4.4) ja 1,0 ml
natriumsulfidiliuosta (4.9) ja ravistellaan lyhyen aikaa. Tarkistetaan,
että pH-arvo on noin 2. Ravistellaan 10 minuuttia, lisätään 30 ml
fosfaattipuskuriliuosta (4.5), ravistellaan 15 minuuttia ja sentrifugoidaan.
Otetaan sopiva määrä supernatanttia ja säädetään sen pH arvoon 6,5 1 M
natriumhydroksidiliuoksella (4.8) käyttäen pH-mittaria tai bromikresoli-
punaindikaattoria (4.10).
Laimennetaan fosfaattipuskuriliuoksella (4.5), jotta oletetuksi sinkkibasi-
trasiinipitoisuudeksi saadaan 0,42 k.y./ml (= U8).
6.1.2 Valkuaiskonsentraatit
Punnitaan 10 g näytettä, lisätään 49,0 ml seosta (4.4) ja 1,0 ml natrium-
sulfidiliuosta (4.9) ja ravistellaan lyhyen aikaa. Tarkistetaan, että pH-
arvo on noin 2. Ravistellaan 10 minuuttia, lisätään 50 ml fosfaattipus-
kuriliuosta (4.5), ravistellaan 15 minuuttia ja sentrifugoidaan. Otetaan
sopiva määrä supernatanttia ja säädetään sen pH arvoon 6,5 1 M
natriumhydroksidiliuoksella (4.8) käyttäen pH-mittaria tai bromikresoli-
punaindikaattoria (4.10).
Haihdutetaan noin puoleen alkuperäisestä tilavuudestaan pyöröhaihdutti-
messa lämpötilassa, joka ei ylitä 35 ºC. Laimennetaan
fosfaattipuskuriliuoksella (4.5), jotta oletetuksi sinkkibasitrasiinipitoisuu-
deksi saadaan 0,42 k.y./ml (= U8).
6.1.3 Muut rehut
Punnitaan 10 g näytettä (20 g, jos oletettu sinkkibasitrasiinipitoisuus on
5 mg/kg). Lisätään 24,0 ml seosta (4.4) ja 1,0 ml natriumsulfidiliuosta
(4.9), homogenoidaan 10 minuuttia. Lisätään 25 ml fosfaattipuskuri-
liuosta (4.5), ravistellaan 15 minuuttia ja sentrifugoidaan. Otetaan 20 ml
supernatanttia ja säädetään sen pH arvoon 6,5 1 M natriumhydroksidi-
liuoksella käyttäen pH-mittaria tai bromikresolipunaindikaattoriliuosta
(4.10). Haihdutetaan noin 4 ml:ksi pyöröhaihduttajassa lämpötilassa,
joka ei ylitä 35 ºC. Laimennetaan fosfaattipuskuriliuoksella (4.5) siten,1978L0633 — FI — 20.12.1983 — 002.001 — 4
▼M2
että oletetuksi sinkkibasitrasiinipitoisuudeksi saadaan 0,42 k.y./ml (=
U8).
6.2 Määritysliuokset
Valmistetaan U8-liuoksesta liuokset U4(oletettu pitoisuus: 0,21 k.y./ml),
U2(oletettu pitoisuus: 0,105 k.y./ml) ja U1(oletettu pitoisuus:
0,0525 k.y./ml) fosfaattipuskuriliuoksella (4.5) peräkkäin laimentaen
(1 + 1) fosfaattipuskuriin (4.5).
7. MÄÄRITELTY MENETTELY
7.1 Siirrostus määritysalustaan
Bakteerisuspensio (3.2) siirrostetaan noin 50 ºC:ssa määritysalustaan
(4.2). Alustasta (4.2) valmistetuilla maljoilla tehdään esikokeet, joilla
määritetään eri sinkkibasitrasiinikonsentraatioissa suurimmat ja kirk-
kaimmat inhibitiovyöhykkeet antava bakteerisuspensiomäärä.
7.2 Maljojen valmistus
Diffuusio agarissa suoritetaan maljoilla käyttäen neljää standardiliuos-
konsentraatiota (S8,S4,S2,S1) ja neljää määritysliuoskonsentraatiota
(U8,U4,U2,U1). On välttämätöntä, että kuhunkin maljaan lisätään
nämä neljä uute- ja standardikonsentraatiota. Maljojen tulee olla
riittävän suuret, jotta agar-alustaan voidaan tehdä ainakin 8 reikää, jotka
ovat läpimitaltaan 10-13 mm ja joiden keskustat ovat vähintään 30 mm:n
päässä toisistaan. Voidaan käyttää lasilevyjä, joiden päälle asetetaan
alumiini- tai muovisylinteri, jonka läpimitta on 200 mm ja korkeus
20 mm.
Maljoille kaadetaan sellainen määrä 7.1 kohdan mukaisesti siirrostettua
alustaa (4.2), joka muodostaa noin 2 mm paksun kerroksen (kun malja
on vetoisuudeltaan 60 ml ja läpimitaltaan 200 mm). Jäähdytetään vaaka-suoralla alustalla, alustaan tehdään reiät ja niihin pipetoidaan tarkalleen
mitatut tilavuudet määritys- ja standardiliuoksia (läpimitasta riippuen
0,10-0,15 ml/reikä). Kutakin pitoisuutta käytetään ainakin neljä kertaa
siten, että kussakin määrityksessä suoritetaan arviointi 32 inhibitiovyö-
hykkeestä.
7.3 Inkubointi
Maljoja inkuboidaan 16-18 tuntia 30 ± 2 ºC:ssa.
8. LASKEMINEN
Inhibitiovyöhykkeiden läpimitta mitataan 0,1 mm:n tarkkuudella.
Kutakin pitoisuutta vastaavien mittausten keskiarvoista piirretään puoli-
logaritmipaperille kuvaaja, joka esittää konsentraatioiden logaritmiainhibitiovyöhykkeiden läpimittojen suhteen. Piirretään sekä standardi-
liuoksen että uutteen osalta parhainta sovitusta edustavat suorat
esimerkiksi seuraavasti:
Parhainta sovitusta edustava piste pienimmän standardipitoisuuden (SL)
osalta määritetään käyttäen kaavaa:
a) SL ¼
7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Parhainta sovitusta edustava piste suurimman standardipitoisuuden (SH)
osalta määritetään käyttäen kaavaa:
b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
10
Parhaimman sovituksen omaavat pisteet lasketaan samoin uutteen
pienimmän pitoisuuden (UL) ja uutteen suurimman pitoisuuden (UH)
osalta korvaamalla yllä olevissa kaavoissa S1,S2,S4ja S8U1:lla, U2:lla,
U4:lla ja U8:lla.
Lasketut SL- ja SH-arvot merkitään samalle kuvaajapaperille ja ne
yhdistetään parhaimman sovituksen omaavan suoran muodostamiseksi
standardiliuoksen osalta. Samoin merkitään UL- ja UH-arvot ja ne
yhdistetään parhaimman sovituksen omaavan suoran muodostamiseksi
uutteen osalta.
Jos häiritseviä tekijöitä ei esiinny, suorien pitäisi olla yhdensuuntaiset.
Käytännössä suoria voidaan pitää yhdensuuntaisina, jos arvot (SH-SL)
ja (UH-UL) eivät poikkea keskiarvostaan yli 10 %.1978L0633 — FI — 20.12.1983 — 002.001 — 5
▼M2
Jos suorat eivät ole yhdensuuntaiset, joko U1ja S1tai U8ja S8voidaan
hylätä ja SL, SH, UL ja UH laskea käyttäen vaihtoehtoisia kaavoja vaih-
toehtoisten parhaimman sovituksen omaavien suorien muodostamiseksi:
a′)S L=5s1þ2s2/C0s4
6tai5s2þ2s4/C0s8
6
b′)S H=5s4þ2s2/C0s1
6tai5s8þ2s4/C0s2
6
ja käyttäen samoja kaavoja UL:n ja UH:n tapauksissa. Yhdensuuntai-
suuden on oltava samojen periaatteiden mukainen. Tulosten laskeminen
kolmen pitoisuuden perusteella on mainittava määritysselosteessa.
Kun suoria pidetään yhdensuuntaisina, suhteellisen aktiivisuuden logar-
itmi (log A) lasketaan jollakin seuraavista kaavoista sen mukaan,
määritetäänkö yhdensuuntaisuus kolmella vai neljällä pitoisuudella:
Neljän pitoisuuden osalta
c) log A ¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
u4þu8þs4þs8/C0u1/C0u2/C0s1/C0s2
Kolmen pitoisuuden osalta
d) log A ¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4þs4/C0u1/C0s1
tai
d′) log A ¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
Näytteestä saadun uutteen aktiivisuus = vastaavan standardin aktiivisuus
×A
(U8=S8×A )
Jos suhteellisen aktiivisuuden havaitaan olevan alueen 0,5-2,0 ulkopuo-
lella, määritys suoritetaan uudelleen siten, että uutteen konsentraatiot
säädetään sopiviksi tai, jos tämä ei ole mahdollista, standardiliuosten
konsentraatiot säädetään sopiviksi. Kun suhteellista aktiivisuutta ei saada
tuotua vaaditulle alueelle, on mikä tahansa saatu tulos katsottava
likimääräiseksi ja tämä on mainittava määritysselosteessa.
Kun suoria ei pidetä yhdensuuntaisina, määritys toistetaan. Jos yhden-
suuntaisuutta ei vieläkään saada aikaan, määritystä ei voi pitää
hyväksyttävänä.
Tulokset ilmoitetaan milligrammoina sinkkibasitrasiinia rehukiloa
kohden.
9. TOISTETTAVUUS
Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten
välinen ero ei saa ylittää:
2 mg/kg, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, korkeintaan 10 mg/kg
olevien sinkkibasitrasiinipitoisuuksien osalta;
20 %, suurimpaan arvoon verrattuna, välillä 10-25 mg/kg olevien pitoi-
suuksien osalta;
5 mg/kg, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, välillä 25-50 mg/kg olevien
pitoisuuksien osalta;
10 %, suurimpaan arvoon verrattuna, yli 50 mg/kg olevien pitoisuuksien
osalta.1978L0633 — FI — 20.12.1983 — 002.001 — 6
▼B
2.FLAVOFOSFOLIPOLIN MÄÄRITYS DIFFUUSIOLLA AGARALUS-
TASSA
1 TARKOITUS JA SOVELTAMISALA
Menetelmällä on mahdollista määrittää rehujen, konsentraattien ja
esiseosten flavofosfolipolipitoisuus. Määrityksen alaraja on 1 mg/kg (1
miljoonasosa).
2 PERIAATE
Näyte refluksoidaan laimealla metanolilla. Sentrifugoinnin jälkeen uute
puhdistetaan tarvittaessa ioninvaihtohartseilla ja laimennetaan. Anti-
bioottinen aktiivisuus määritetään mittaamalla flavofosfolipolin
diffuusio agaralustalla, johon on ympätty Staphylococcus aureusta .
Diffuusio mitataan inhibitiovyöhykkeinä, jotka mikro-organismi
muodostaa. Vyöhykkeiden läpimitta on käytetyissä antibioottikonsen-
traatioissa suoraan verrannollinen antibioottikonsentraation logaritmiin.
3 MIKRO-ORGANISMI: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P
3.1 Kantaviljelmän kasvatus
Staphylococcus aureus ympätään putkiin, jotka sisältävät kasvatusalus-
tasta. (4.1) valmistettuja agarvinopintoja. Inkuboidaan 24 tuntia
37 ºC:ssa, säilytetään jääkaapissa noin 4 ºC:ssa ja siirrostetaan uudelleen
kuukausittain.
3.2 Bakteerisuspension valmistus (a)
Otetaan kaksi kantaviljelmää (3.1) sisältävää putkea ja siirrostetaan ne
uudelleen viikottain. Inkuboidaan 24 tuntia 37 ºC:ssa ja säilytetään
jääkaapissa noin 4 ºC:ssa.
Nämä kasvustot siirrostetaan 24 tuntia ennen määritystä kahdesta
putkesta neljään putkeen, jotka sisältävät kasvatusalustasta (4.1) valmis-
tettuja agarvinopintoja.
Inkuboidaan 16 - 18 tuntia 37 ºC:ssa. Kasvustosta valmistetaan
suspensio natriumkloridiliuokseen (4.3). Suspension valon transmission
on oltava noin 40 % mitattuna 578 nm:ssa 1 cm:n kyvetissä natriumk-
loridiliuosta (4.3) vastaan.
4 KASVATUSALUSTAT JA REAGENSSIT
4.1 Kasvatusalusta(a)
Lihapeptoni 6,0 g
Tryptoni 4,0 gHiivauute 3,0 g
Lihauute 1,5 g
Glukoosi 1,0 gAgar 15,0 gVesi 1 000 mlpH 6,5 (steriloinnin jälkeen)
4.2 Määritysalusta
4.2.1Pohjakerros(b)
Lihapeptoni 6,0 g
Hiivauute 3,0 gLihauute 1,5 gAgar 10,0 gVesi 1 000 ml
pH 6,5 (steriloinnin jälkeen)1978L0633 — FI — 20.12.1983 — 002.001 — 7
(a) Voidaan käyttää muita menetelmiä edellyttäen, että niillä saadaan aikaan samanlaisia
bakteerisuspensioita.
(1)(a) Voidaaan käyttää mitä tahansa koostumukseltaan vastaavaa kaupallisesti saatavilla
olevaa kasvatusalustaa, esim. Oxford Antibiotic Medium (CM 327), johon on lisätty
agaria Oxoid N:o 3 (L 13).
(2)(b) Voidaaan käyttää mitä tahansa koostumukseltaan vastaavaa kaupallisesti saatavilla
olevaa kasvatusalustaa, esim. Oxford Antibiotic Medium 2 (CM 335), johon on lisättyagaria Oxoid N:o 3 (L 13).
(
3)(c) Esim. Wacker Chemic GmbH, München, SE 2.
▼B
4.2.2Siirrostuskerros
Kasvatusalustaan (4.1) lisätään 2,0 g silikonipitoista vaahdonestoemul-
siota(c)
4.3 0,4 % (w/v) natriumkloridiliuos: liuotetaan 4 g natriumkloridia (analyy-
silaatua) veteen, laimennetaan 1 000 ml:ksi ja steriloidaan.
4.4 Metanoli, puhdas.
4.5 50 % (v/v) metanoli: 500 ml metanolia (4.4) laimennetaan 500 ml:lla
vettä.
4.6 80 % (v/v) metanoli: 800 ml metanolia (4.4) laimennetaan 200 ml:lla
vettä.
4.7 Tris(hydroksimetyyli)aminometaani, analyysilaatua.
4.8 1,5 % (w/v) metanolipitoinen kaliumkloridiliuos: liuotetaan 1,5 g
kaliumkloridia analyysilaatua 20 ml:aan vettä, täytetään 100 ml:ksi
metanolilla (4.4).
4.9 Kationinvaihtaja: Dowex 50 W × 8, 20-50 mesh, Na-muoto (Servan
tuoteluettelo n:o 41600) tai tätä vastaava.
4.10 Anioninvaihtaja: Dowex 1×2, 50-100 mesh, Cl-muoto (Servan tuoteluet-
telo n:o 41010) tai tätä vastaava. Ennen käyttöä pidetään 12-14 tuntia
80 % metanolissa (4.6).
4.11 Lasivillaa.4.12 pH-indikaattoripaperia (pH 6,6-8,1).
4.13 Askorbiinihappo.
4.14 Standardiyhdiste: tunnetun aktiivisuuden omaava flavofosfolipoli.
5 VÄLINEISTÖ
5.1 Lasisia kromatografiapylväitä, sisähalkaisija 9 mm, pituus 150-200 mm,
joiden alapään kavennetussa osassa on hana ja yläpäässä on hios (tipu-
tussuppiloon liittämistä varten (5.2)).
5.2 250 ml:n tiputussuppilo, jossa on hana ja hios.
5.3 250 ml:n hioksellinen erlenmeyerkolvi
5.4 Hioksellinen palautusjäähdytin.
6 STANDARDILIUOKSET
Liuotetaan tarkkaan punnittu määrä standardiyhdistettä (4.14) 50 %
metanoliin (4.5.) ja laimennetaan kantaliuokseksi, joka sisältää 100 µg
flavofosfolipolia millilitraa kohti. Tämä liuos säilyy 4 ºC:ssa tulpallisissa
pulloissa korkeintaan kaksi kuukautta.
Kantaliuoksesta valmistetaan peräkkäin laimentaen 50 % metanoliin
(4.5.) seuraavat liuokset:
S
80,2 µg/ml
S40,1 µg/ml
S20,05 µg/ml
S10,025µg/ml
7 UUTTEEN VALMISTUS
7.1 Uutto
7.1.1Konsentraatit, esiseokset ja mineraalirehut
Punnitaan 2-5 g näytettä ja lisätään noin 150 mg askorbiinihappoa
(4.13). Sekoitetaan erlenmayerpullossa (5.3) 150 ml:aan 50 %:sta meta-
nolia (4.5) ja säädetään pH alueelle 8,1-8,2 noin 400 mg:lla
tris(hydroksimetyyli)aminometaania (4.7). Tarkistetaan pH indikaattori-
paperilla (4.12). Annetaan seistä 15 minuuttia, säädetään pH uudelleen
alueelle 8,1-8,2 tris(hydroksimetyyli)aminometaanilla (4.7) ja refluksoi-
daan 10 minuuttia (4.5) koko ajan sekoittaen. Annetaan jäähtyä,
sentrifugoidaan ja uute dekantoidaan.
7.1.2Muut rehut
Punnitaan 5,0-30,0 g näytettä, joka sisältää vähintään 30 µg flavofosfo-
lipolia. Sekoitetaan erlenmeyerkolvissa (5.3) 150 ml:aan 50 % metanolia
(4.5) ja säädetään pH alueelle 8,1-8,2 noin 400 mg:lla tris(hydroksime-1978L0633 — FI — 20.12.1983 — 002.001 — 8
▼B
tyyli)aminometaania (4.7). Tarkistetaan pH indikaattoripaperilla (4.12).
Annetaan seistä 15 minuuttia, säädetään pH uudelleen alueelle 8,1-8,2
noin 400 mg:lla tris(hydroksimetyyli)aminometaania (4.7) ja refluksoi-
daan 10 minuuttia (4.5) koko ajan sekoittaen. Annetaan jäähtyä,
sentrifugoidaan ja uute dekantoidaan.
7.2 Puhdistus (tämä vaihe voidaan jättää pois konsentraatteja,
esiseoksia ja mineraalirehuja määritettäessä)
Sekoitetaan 110 ml uutetta ja 11 g kationinvaihtajaa (4.9), refluksoidaan
yhden minuutin ajan (5.4) koko ajan sekoittaen. Kationinvaihtaja erote-
taan sentrifugoimalla tai suodattamalla. Sekoitetaan 100 ml uutetta ja
150 ml metanolia (4.4) ja annetaan seistä 12-15 tuntia 4 ºC:ssa. Hahtu-
vamainen massa suodatetaan kylmänä.
Lasipylvään (5.1) alapäähän asetetaan lasivillatuppo (4.11), pylvääseen
kaadetaan 5 ml anioninvaihtajaa (4.10) ja pylväspes tään 100 ml:lla
80 %:sta metanolia (4.6). Pylvääseen siirretään suppilon (5.2) avulla
ainakin 100 ml:n suuruinen erä suodosta, jonka oletetaan sisältävän
16 µg flavofosfolipolia (200 ml 30 g:n suuruiseen rehunäytteeseen,
jonka pitoisuus on 1 mg/kg). Suodos laimennetaan tarvittaessa ennen
pylvääseen viemistä 80 % metanolilla (4.6), jotta oletetuksi flavofosfoli-
polipitoisuudeksi saataisiin 16 µg/100 ml. Virtausnopeuden tulee olla
noin 2 ml/ minuutti. Eluoitunut liuosheitetään pois . Tämän jälkeen
pylväspes tään 50 ml:lla 80 % metanolia (4.6.) ja eluoitunut liuos
heitetään pois.
Flavofosfolipoli eluoidaan metanolipitoisella kaliumkloridiliuoksella
(4.8). Virtausnopeuden tulee olla noin 2 ml/minuutti. Kerätään 50 ml
eluaattia asteikolliseen pulloon, lisätään 30 ml vettä ja homogenoidaan.
Tämän liuoksen flavofosfolipolipitoisuuden olisi oltava 0,2 µg/ml (= U8).
7.3 Määritysliuokset
Tarvittaessa (erityisesti silloin, kun puhdistusvaihe on jätetty pois),
laimennetaan 7.1.1 kohdassa saatu uute 50 % metanolilla (4.5) siten,
että oletetuksi flavofosfolipolipitoisuudeksi saadaan 0,2 µg/ml (=U8).
Valmistetaan U8-liuoksesta liuokset U4(oletettu pitoisuus: 0,1 µg/ml), U2(oletettu pitoisuus: 0,05 µg/ml) ja U1(oletettu pitoisuus: 0,025 µg/ml)
peräkkäin laimentaen (1 + 1) 50 % metanolilla (4.5).
8 MENETTELY
8.1 Siirrostus määritysalustaan
Bakteerisuspensio (3.2) siirrostetaan noin 50 ºC määritysalustaan (4.2.2).
Määritysalustasta (4.2.2) valmistetuilla maljoilla tehdään esikokeet.
Määritetään se bakteerisuspensiomäärä, jolla saadaan suurimmat ja kirk-
kaimmat inhibitiovyöhykkeet eri flavofosfolipolikonsentraatioilla (noin
30 ml/l).
8.2 Maljojen valmistus
Diffuusio agarissa suoritetaan maljoilla käyttäen neljä standardiliuoskon-
sentraatiota (S8,S4,S2,S1) ja neljä määritysliuoskonsentraatiota (U8,U4,
U2,U1). On välttämätöntä, että kuhunkin maljaan lisätään nämä
neljäuute- ja standardikonsentraatiota. Maljojen tulee olla riittävän
suuret, jotta agaralustaan voidaan tehdä ainakin kahdeksan reikää, jotka
ovat läpimitaltaan 10-13 mm ja joiden keskustat ovat vähintään 30 mm:n
päässä toisistaan. Voidaan käyttää lasilevyjä, joiden päälle asetetaan
alumiini- tai muovisylinteri, jonka läpimitta on 200 mm ja korkeus
20 mm.
Maljoille kaadetaan sellainen määrä kasvatusalustaa (4.2.1), että se
muodostaa noin 1,5 mm paksun kerroksen (45 ml 200 mm:n läpimittai-
seen maljaan). Maljat jäähdytetään vaakasuoralla alustalla ja tämän
päälle lisätään sellainen määrä 8.1 kohdan mukaisesti siirrostettua kasva-
tusalustaa (4.2.2), että se muodostaa 1 mm:n paksuinen kerroksen (30 ml
200 mm:n läpimittaiseen maljaan). Jäähdytetään vaakasuoralla alustalla,
tehdään reiät ja niihin pipetoidaan tarkalleen mitatut tilavuudet määritys-
ja standardiliuoksia (läpimitasta riippuen 0,10-0,15 ml reikää kohden).
Kutakin pitoisuutta käytetään ainakin neljä kertaa siten, että kussakin
määrityksessä suoritetaan arviointi 32 inhibitiovyöhykkeestä.
8.3 Inkubointi
Maljoja inkuboidaan 16-18 tuntia 28-30 ºC:ssa.1978L0633 — FI — 20.12.1983 — 002.001 — 9
▼B
9 LASKEMINEN
Inhibitiovyöhykkeiden läpimitta mitataan 0,1 mm:n tarkkuudella.
Kutakin pitoisuutta vastaavien mittausten keskiarvoista piirretään puoli-
logaritmipaperille kuvaaja, joka esittää konsentraatioiden logaritmia
inhibitiovyöhykkeiden läpimittojen suhteen. Piirretään sekä standardi-
liuoksen että uutteen osalta parhainta sovitusta edustavat suorat
esimerkiksi seuraavasti.
Parhainta sovitusta edustava piste matalimman standardipitoisuuden
(SL) osalta määritetään käyttäen kaavaa:
a) SL ¼7S1þ4S2þS4/C02S8
10
Parhainta sovitusta edustava piste suurimman standardipitoisuuden (SH)
osalta määritetään käyttäen kaavaa:
b) SH ¼7S8þ4S4þS2/C02S1
10
Parhaan sovituksen omaavat pisteet lasketaan samoin uutteen pienimmän
pitoisuuden (UL) ja uutteen korkeimman pitoisuuden (UH) osalta
korvaamalla yllä olevissa kaavoissa S1,S2,S4ja S8U1:lla, U2:lla, U4:lla
ja U8:lla.
Lasketut SL- ja SH-arvot merkitään samalle kuvaajapaperille ja ne
yhdistetään parhaimman sovituksen mukaisen suoran muodostamiseksi
standardiliuoksen osalta. Samoin merkitään UL- ja UH- arvot ja ne
yhdistetään parhaimman sovituksen omaavan suoran muodostamiseksi
uutteen osalta.
Jos häiritseviä tekijöitä ei esiinny, pitäisi suorien olla yhdensuuntaiset.
Käytännössä suorien voidaan katsoa olevan yhdensuuntaisia, jos arvot
(SH-SL) ja (UH-UL) eivät eroa keskiarvostaan yli 10 %.
Jos suorat eivät ole yhdensuuntaiset, joko U1ja S1tai U8ja S8voidaan
hylätä ja SL, SH, UL ja UH laskea käyttäen vaihtoehtoisia kaavoja vaih-
toehtoisten parhaimman sovituksen omaavien suorien muodostamiseksi:
a′)S L ¼5S1þ2S2/C0S4
6tai5S2þ2S4/C0S8
6
b′)S L ¼5S4þ2S2/C0S1
6tai5S8þ2S4/C0S2
6
ja käyttäen samoja kaavoja UL:n ja UH:n tapauksissa. Yhdensuuntai-
suuden on oltava samojen periaatteiden mukainen. Tulosten laskeminen
kolmen pitoisuuden perusteella on mainittava määritysselosteessa.
Kun suorien katsotaan olevan yhdensuuntaiset , suhteellisen aktiivi-
suuden logaritmi (log A) lasketaan jollakin seuraavista kaavoista:
Neljän pitoisuuden osalta
c) log A ¼U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8Þ/C20;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Kolmen pitoisuuden osalta
d) log A ¼U1þU2þU4/C0S1/C0S2/C0S4Þ/C20;401
U4þS4þU1/C0S1
tai
d′) log A ¼U2þU4þU8/C0S2/C0S4/C0S8Þ/C20;401
U8þS8/C0U2/C0S2
Todellinen aktiivisuus = oletettu aktiivisuus × suhteellinen aktiivisuus.
Kun suoria ei pidetä yhdensuuntaisina , määritystois tetaan. Josyhden-
suuntaisuutta ei vieläkään saada aikaan, lasketaan suhteellisen
aktiivisuuden logaritmi (log A) c kaavan avulla. Saatua tulosta on
pidettävä likimääräisenä ja tämä on mainittava määritysselosteessa.1978L0633 — FI — 20.12.1983 — 002.001 — 10
▼B
10 TOISTETTAVUUS
Samasta näytteestä suoritetun kahden määrityksen tulosten välinen ero ei
saa ylittää:
0,5 mg/kg, absoluuttisesti ilmoitettuna, välillä 1-2 mg/kg olevien flavo-
fosfolipolipitoisuuksien osalta;
25 %, suurimpaan arvoon verrattuna, välillä 2-10 mg/kg olevien pitoi-
suuksien osalta;
20 %, suurimpaan arvoon verrattuna, välillä 10-25 mg/kg olevien pitoi-
suuksien osalta;
5 mg/kg, absoluuttisesti ilmoitettuna välillä 25-50 mg/kg olevien pitoi-
suuksien osalta;
10 %, suurimpaan arvoon verrattuna, yli 50 mg/kg olevien pitoisuuksien
osalta.
3.RAUTA-, KUPARI-, MANGAANI- JA SINKKIHIVENAINEIDEN
MÄÄRITYS
1 TARKOITUS JA SOVELTAMISALA
Menetelmällä on mahdollista määrittää rehuista rauta-, kupari-,
mangaani- ja sinkkihivenaineet. Määrityksen alarajat ovat:
rauta (Fe): 20 mg/kg
kupari (Cu): 10 mg/kgmangaani (Mn): 20 mg/kgsinkki (Zn): 20 mg/kg
2 PERIAATE
Näytteestä tehdään liuos kloorivetyhappoon sen jälkeen, kun siinä
mahdollisesti esiintyvät orgaaniset aineet on hävitetty. Alkuaineet rauta,
kupari, mangaani ja sinkki määritetään sopivan laimennuksen jälkeen
atomiabsorbtiospektrometrisesti.
3 REAGENSSIT
Alustavat huomautuksetReagenssien ja analyysiliuosten valmistuksessa käytetään määritettävistä
kationeista vapaata vettä, joka on saatu joko tislaamalla se kaksi kertaa
borosilikaattilasista tai kvartsista valmistetussa tislauslaitteessa tai käsit-
telemällä se kaksi kertaa ioninvaihtohartsilla.
Reagenssien on oltava vähintään analyyttistä puhtausastetta (analyysi-
laatua). Reagenssien sisältämien määritettävien alkuaineiden pitoisuudet
on tarkistettava sokeakokeella. Tarvittaessa reagensseille on suoritettava
lisäpuhdistus.
Seuraavassa kuvattujen standardiliuosten tilalla voidaan käyttää kaupalli-
sesti saatavilla olevia standardiliuoksia, jos ne ovat takuulaatua ja ne on
tarkistettu ennen käyttöä.
3.1 Kloorivetyhappo, analyysilaatua, tiheys 1,19.3.2 6 N kloorivetyhappo, analyysilaatua.3.3 0,5 N kloorivetyhappo, analyysilaatua.3.4 38-40 % (v/v) fluorivetyhappo, jonka rautapitoisuus on alle 1 mg Fe/1 ja
haihdutusjäännös alle 10 mg (sulfaattina)/litra.
3.5 Rikkihappo, analyysilaatua, tiheys 1,84.3.6 Vetyperoksidi, analyysilaatua noin 100 tilavuusosaa happea (30 % (w/v).3.7 Rautastandardiliuos (1 000 µg Fe/ml), joka on valmistettu seuraavasti:
liuotetaan 1 g rautalankaa analyysilaatua 200 ml:aan 6 N kloorivety-
happoa (3.2), lisätään 16 ml vetyperoksidia (3.6) ja täytetään 1 litraksi
vedellä.
3.7.1 Rautakäyttöstandardiliuos (100 µg Fe/ml), joka on valmistettu laimenta-
malla standardiliuos (3.7) suhteessa 1 + 9 vedellä.
3.8 Kuparistandardiliuos (1 000 µg Cu/ml), joka on valmistettu seuraavasti:
liuotetaan 1 g jauhemaista kuparia analyysilaatua 25 ml:aan 6 N kloori-
vetyhappoa (3.2), lisätään 5 ml vetyperoksidia (3.6) ja täytetään 1
litraksi vedellä.1978L0633 — FI — 20.12.1983 — 002.001 — 11
▼B
3.8.1 Kuparikäyttöstandardiliuos (10 µg Cu/ml), joka on valmistettu laimenta-
malla standardiliuos (3.8) suhteessa 1 + 9 vedellä ja laimentamalla saatu
liuos suhteessa 1 + 9 vedellä.
3.9 Mangaanistandardiliuos (1 000 µg Mn/ml), joka on valmistettu seuraa-
vasti: liuotetaan 1 g jauhemaista mangaania analyysilaatua 25 ml:aan
6 N kloorivetyhappoa (3.2) ja täytetään 1 litraksi vedellä.
3.9.1 Mangaanikäyttöstandardiliuos (10 µg Mn/ml), joka on valmistettu
laimentamalla standardiliuos (3.9) suhteessa 1 + 9 vedellä ja laimenta-
malla saatu liuos suhteessa 1 + 9 vedellä.
3.10 Sinkkistandardiliuos (1 000 µg Zn/ml), joka on valmistettu seuraavasti:
liuotetaan 1 g nauhamaisessa tai lehtimäisessä muodossa olevaa sinkkiä
analyysilaatua 25 ml:aan 6 N kloorivetyhappoa (3.2) ja täytetään 1
litraksi vedellä.
3.10.1 Sinkkikäyttöstandardiliuos (10 µg Zn/ml), joka on valmistettu laimenta-
malla standardiliuos (3.10) suhteessa 1 + 9 vedellä ja laimentamalla
saatu liuos suhteessa 1 + 9 vedellä.
3.11 Lantaanikloridiliuos, joka on valmistettu seuraavasti: liuotetaan 12 g
lantaanioksidia 150 ml:aan vettä, lisätään 100 ml 6 N kloorivetyhappoa
(3.2) ja täytetään yhdeksi litraksi vedellä.
4 VÄLINEISTÖ
4.1 Muhveliuuni, jossa on lämpötilan säätölaitteella ja piirturi.4.2 Lasitavaroiden on oltava kestävää borosilikaattityyppiä. On suositeltavaa
käyttää välineitä, jotka on erityisesti tarkoitettu hivenaineiden määrityk-
siin.
4.3 Platinaupokas tai vaihtoehtoisesti kvartsiupokas.4.4 Atomiabsorbtiospektrofotometri, joka herkkyys ja tarkkuus täyttää
menetelmän vaatimukset vaaditulla alueella.
5 MENETTELY
5.1 Orgaanista ainetta sisältävät näytteet
5.1.1Polttaminen tuhkaksi ja analyysiin tarvittavan liuoksen valmistus (*)
i) Punnitaan 5-10 g näytettä 0,2 mg:n tarkkuudella kvartsi- tai platinau-
pokkaaseen (4.3) (ks. huomautus b, kuivataan kuivauskaapissa
105 ºC:ssa ja pannaan upokas kylmään muhveliuuniin (4.1). Uuni
suljetaan (katso c huomautus) ja lämpötila nostetaan vähitellen 450-
475 ºC:een noin 90 minuutin aikana. Lämpötila pidetään tässä 4-16
tuntia (esimerkiksi yön yli) hiilipitoisen materiaalin poistamiseksi ja
uuni avataan ja sen annetaan jäähtyä (ks. huomautus d).
Kostutetaan tuhka vedellä ja siirretään 250 ml:n dekantterilasiin.
Upokas pestään 5 ml:lla kloorivetyhappoa (3.1) ja liuos lisätään
hitaasti ja varovasti dekantterilasiin (tällöin voi esiintyä voimakas
reaktio, joka johtuu CO
2:n muodostumisesta). Kloorivetyhappo (3.1)
lisätäänpisaroittain samalla sekoittaen kunnes kupliminen on koko-
naan lakannut. Haihdutetaan kuivaksi ajoittain lasisauvalla
sekoittaen.
Jäännökseen lisätään 15 ml 6 N kloorivetyhappoa (3.2) ja noin
120 ml vettä. Sekoitetaan lasisauvalla, joka jätetään dekantterilasiin,
ja dekantterilasi peitetään kellonlasilla. Kuumennetaan varovasti
kiehumispisteeseen ja pidetään kiehumispisteessä kunnes enempää
tuhkaa ei havaita liukenevan. Suodatetaan tuhkavapaalla suodatinpa-
perilla ja suodos kerätään talteen 250 ml:n mittapulloon.
Dekantterilasi pestään ja suodatetaan 5 ml:lla kuumaa 6 N kloorive-1978L0633 — FI — 20.12.1983 — 002.001 — 12
(*) Vihreisiin rehuihin (tuoreisiin tai kuivattuihin) oletetaan sisältyvän suuria määriä
kasvissilikonia, joka saattaa sitoa mikromineraaleja, ja joka on siksi poistettava, sell-
aisten rehujen tarkastuksessa on siksi sovellettava seuraavaa muutettua menettelyä.
Menetellään 5.1.1 i kohdassa esitetyllä tavalla aina suodattamisvaiheeseen asti.Pestään suodatinpaperi, jossa on liukenemattomat jäämät kahteen kertaan kiehuvallavedellä ja siirretään ne platinaupokkaaseen (4.3). Poltetaan tuhkaksi muhveliuunissa(4.1) alle 550 Cº lämpötilassa kunnes kaikki hiilipitoinen aines on hävinnyt kokonaan.
Annetaan jäähtyä, lisätään muutama tippa vettä ja sen jälkeen 10-15 ml fluorivety-
happoa (3.4) ja haihdutetaan kuivaksi. Lisätään viisi tippaa rikkihappoa (3.5) jakuumennetaan kunnes valkoinen savu on haihtunut. Lisätään viisi tippaa suolahappoa6 N (3.2) ja noin 30 ml vettä, kuumennetaan ja suodatetaan liuos 250 ml:n vetoiseenmittapulloon ja täytetään merkkiin asti vedellä (HCl-pitoisuus on noin 0,5 N). Sen
jälkeen jatketaan menettelyä 5.1.3 kohdasta alkaen.
▼B
tyhappoa (3.2) sekä kaksi kertaa kiehuvalla vedellä. Mittapullo
täytetään merkkiin vedellä (HCl-konsentraatio noin 0,5 N).
ii) Jos suodatinpaperissa oleva jäännös on ulkonäöltään mustaa (hiiltä),
se viedään takaisin uuniin ja poltetaan uudelleen tuhkaksi 450-
475 ºC:ssa. Tämä poltto kestää vain muutaman tunnin (noin 3-5
tuntia) ja on suoritettu loppuun silloin, kun tuhka on ulkonäöltään
valkeaa tai lähesvalkeaa. Jäännösliuotetaan noin 2 ml:aan kloorive-
tyhappoa (3.1), haihdutetaan kuivaksi ja lisätään 5 ml 6 N
kloorivetyhappoa (3.2). Kuumennetaan, suodatetaan mittapulloon ja
täytetään merkkiin vedellä (HCl-konsentraatio noin 0,5 N).
Huomautukset:
a) Hivenaineita määritettäessä on tärkeää pitää jatkuvasti mielessä
erityisesti sinkistä, kuparista ja raudasta aiheutuvat saastumisriskit.
Tästä syystä näytteiden valmistuksessa käytetyt välineet eivät saa
sisältää näitä metalleja.
Yleisen saastumisriskin vähentämiseksi olisi työskenneltävä
pölyttömässä tilassa ja käytettävä huolellisesti puhdistettuja välineitä
ja lasitavaroita. Sinkin määritys on erityisen herkkää saastumiselle,
joka aiheutuu erityisesti lasitavaroista, reagensseista, pölystä jne.
b) Tuhkaksi poltettavan näytteen paino lasketaan rehun likimääräisestä
hivenainepitoisuudesta käytetyn spektrofotometrin herkkyyteen
suhteutettuna. Tiettyjen pieniä hivenainemääriä sisältävien rehujen
määrityson ehkä aloitettava 10-20 g:n näytteellä ja valmis taa lopul-
lista liuosta vain 100 ml.
c) Tuhkaksi poltto on suoritettava suljetussa uunissa ilmaa tai happea
lisäämättä.
d) Pyrometrin osoittama lämpötila ei saa olla yli 475 ºC.
5.1.2Spektrofotometrinen määritys
5.1.2.1 Standardiliuosten valmistus
Kutakin määritettävää alkuainetta varten valmistetaan 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1
ja 3.1.10 kohdassa mainituista käyttöstandardiliuoksista sarja standardi-
liuoksia siten, että kunkin standardiliuoksen HCl-pitoisuus on noin
0,5 N. Raudan, mangaanin ja sinkin lantaanikloridikonsentraatio vastaa
0,1 % (w/v) La. Valittujen hivenainekonsentraatioiden on oltava
käytetyn spektrofotometrin herkkyysalueella. Seuraavissa taulukoissa
annetaan esimerkinomaisesti erilaisia standardiliuoskoostumuksia;
käytetyn spektrofotometrin tyypistä ja herkkyydestä riippuen voi
kuitenkin olla tarpeen valita muita pitoisuuksia.
Rauta
µg Fe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5
käyttöstandardi-
liuoksen (3.7.1) ml-
määrä
(1 ml = 100 µg Fe) 0 0,5 1 2 3 4 5
+ ml 6 N HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml lantaanikloridiliuosta (3.11) ja täytetään 100 ml:ksi vedellä.
Kupari
µg Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
käyttöstandardi-
liuoksen (3.8.1) ml-
määrä
(1 ml = 100 µg Cu) 0 1 2 4 6 8 10
+ ml 6 N HCl (3.2) 8 8 8 8 8 8 8
Täytetään 100 ml:ksi vedellä.1978L0633 — FI — 20.12.1983 — 002.001 — 13
▼B
Mangaani
µg Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
käyttöstandardi-
liuoksen (3.9.1) ml-
määrä
(1 ml = 10 µg Mn) 0 1 2 4 6 8 10
+ ml 6 M HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml lantaanikloridiliuosta (3.11) ja täytetään 100 ml:ksi vedellä.
Sinkki
µg Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8
käyttöstandardi-
liuoksen (3.10.1)
ml-määrä
(1 ml = 10 µg Zn) 0 0,5 1 2 4 6 8
+ ml 6 M HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml lantaanikloridiliuosta (3.11) ja täytetään 100 ml:vedellä.
5.1.2.2 Liuoksen valmistus määritystä varten
Kuparin määritystä varten voidaan 5.1.1 kohdassa valmistettua liuosta
käyttää yleensä suoraan. Tarvittaessa sen pitoisuus tuodaan standardi-
liuosten alueelle, tästä otettu erä voidaan pipetoida 100 ml:n
mittapulloon ja täyttää merkkiin 0,5 N kloorivetyhapolla (3.3).
Raudan, mangaanin ja sinkin määritystä varten pipetoidaan erä 5.1.1
kohdassa valmistettua liuosta 100 ml:n mittapulloon, lisätään 10 ml
lantaanikloridiliuosta (3.11) ja täytetään merkkiin 0,5 N kloorivetyha-
polla (3.3.) (ks. myös 8 kohta Huomautus).
5.1.2.3 Sokeakoe
Sokeakoe suoritetaan samalla tavalla, mutta ilman määritettävää
näytettä.
Standardiliuosta ”0” ei saa käyttää sokeakokeena.
5.1.2.4 Atomiabsorptiomittaus
Standardiliuosten ja määritettävän liuoksen atomiabsorptio mitataan
hapettavalla ilma-asetyleeniliekillä seuraavilla aallonpituuksilla:
Fe: 248,3 nm
Cu: 324,8 nmMn: 279,5 nmZn: 213,8 nm
Kukin mittauss uoritetaan neljä kertaa.
5.2 Kivennäisrehut
Jos näyte ei sisällä orgaanista ainetta, ei ole tarpeen polttaa sitä tuhkaksi.
Suoritusta jatketaan 5.1.1 i kohdan toisesta kappaleesta. Haihdutus fluor-
ivetyhapolla voidaan jättää pois.
6 TULOSTEN LASKEMINEN
Määritettävässä liuoksessa oleva hivenainepitoisuus lasketaan kalibroin-
tikäyrältä ja tulosilmoitetaan milligrammoina hivenainetta
kilogrammassa näytettä (miljoonasosia).
7 TOISTETTAVUUS
Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten
välinen ero ei saa ylittää:
— 5 mg/kg, absoluuttisesti ilmoitettuna, korkeintaan 50 mg/kg olevien
hivenainepitoisuuksien osalta;
— 10 %, suurimpaan arvoon verrattuna, välillä 50-100 mg/kg olevien
pitoisuuksien osalta;1978L0633 — FI — 20.12.1983 — 002.001 — 14
▼B
— 10 mg/kg, absoluuttisesti ilmoitettuna, välillä 100-200 mg/kg olevien
pitoisuuksien osalta;
— 5 %, suurimpaan arvoon verrattuna, yli 200 mg/kg olevien pitoisuuk-
sien osalta.
8 HUOMAUTUS
Suuret fosfaattimäärät voivat häiritä raudan, mangaanin ja sinkin
määritystä. Tällainen häiriö on korjattavalantaanikloridiliuosta (3.11)
lisäämällä. Jos näytteen painosuhde on kuitenkinCaþMg
P>2;
voidaan lantaanikloridiliuoksen (3.11) lisäys määritettävään liuokseen ja
standardiliuoksiin jättää pois.1978L0633 — FI — 20.12.1983 — 002.001 — 15