1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 1
Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentointitarkoituksiin.Toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä.
►B KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 2568/91,
annettu 11 päivänä heinäkuuta 1991,
oliiviöljyn ja uutetun oliiviöljyn ominaisuuksista sekä niiden määritysmenetelmistä
(EYVL L 248, 5.9.1991, s. 1)
Muutettu:
virallinen lehti
N:o sivu päivämäärä
►M1 Komission asetus (ETY) N:o 3682/91, annettu 17 päivänä joulukuuta
1991L 349 36 18.12.1991
►M2 Komission asetus (ETY) N:o 1429/92, annettu 26 päivänä toukokuuta
1992L 150 17 2.6.1992
►M3 Komission asetus (ETY) N:o 1683/92, annettu 29 päivänä kesäkuuta
1992L 176 27 30.6.1992
►M4 Komission asetus (ETY) N:o 1996/92, annettu 15 päivänä heinäkuuta
1992L 199 18 18.7.1992
►M5 Komission asetus (ETY) N:o 3288/92, annettu 12 päivänä marraskuuta
1992L 327 28 13.11.1992
►M6 Komission asetus (ETY) N:o 183/93, annettu 29 päivänä tammikuuta
1993L 22 58 30.1.1993
►M7 muutettu commission Regulation (EEC) No 826/93 of 6 April 1993 (*) L 87 6 7.4.1993
►M8 Komission asetus (ETY) N:o 620/93, annettu 17 päivänä maaliskuuta
1993L 66 29 18.3.1993
►M9 Komission asetus (EY) N:o 177/94, annettu 28 päivänä tammikuuta 1994 L 24 33 29.1.1994
►M10 Komission asetus (EY) N:o 2632/94, annettu 28 päivänä lokakuuta 1994 L 280 43 29.10.1994
►M11 Komission asetus (EY) N:o 656/95, annettu 28 päivänä maaliskuuta 1995 L 69 1 29.3.1995
►M12 Komission asetus (EY) N:o 2527/95, annettu 27 päivänä lokakuuta 1995 L 258 49 28.10.1995
►M13 Komission asetus (EY) N:o 2472/97, annettu 11 päivänä joulukuuta 1997 L 341 25 12.12.1997
►M14 Komission asetus (EY) N:o 282/98, annettu 3 päivänä helmikuuta 1998 L 28 5 4.2.1998
►M15 Komission asetus (EY) N:o 2248/98, annettu 19 päivänä lokakuuta 1998 L 282 55 20.10.1998
►M16 Komission asetus (EY) N:o 379/1999, annettu 19 päivänä helmikuuta
1999L 46 15 20.2.1999
►M17 Komission asetus (EY) N:o 455/2001, annettu 6 päivänä maaliskuuta
2001L 65 9 7.3.2001
►M18 Komission asetus (EY) N:o 2042/2001, annettu 18 päivänä lokakuuta
2001L 276 8 19.10.2001
►M19 Komission asetus (EY) N:o 796/2002, annettu 6 päivänä toukokuuta
2002L 128 8 15.5.2002
►M20 Komission asetus (EY) N:o 1989/2003, annettu 6 päivänä marraskuuta
2003L 295 57 13.11.2003
(*) Tätä asiakirjaa ei ole julkaistu suomenkielisenä.
▼B
KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 2568/91,
annettu 11 päivänä heinäkuuta 1991,
oliiviöljyn ja uutetun oliiviöljyn ominaisuuksista sekä niiden
määritysmenetelmistä
EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka
ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen,
ottaa huomioon rasva-alan yhteisestä markkinajärjestelystä 22 päivänä
syyskuuta 1966 annetun neuvoston asetuksen 136/66/ETY (1), sellai-
sena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (ETY) N:o 3577/90 (
2), ja erityisesti sen 35 a artiklan,
sekä katsoo, että
asetuksen 136/66/ETY liitteessä määrätään kussakin jäsenvaltiossa sekä
yhteisön maiden välisessä ja kolmansien maiden kanssa käytävässäkaupassa kaupan pidettävän puristetun oliiviöljyn ja uutetun oliiviöljynnimityksistä ja määritelmistä,
eri öljytyyppien erottamiseksi toisistaan kunkin tyypin fysikaalis-
kemialliset ominaisuudet ja neitsytöljyn aistinvaraiset ominaisuudet onsyytä määritellä kyseisten tuotteiden puhtauden ja laadun takaamiseksi,sanotun kuitenkaan rajoittamatta muiden voimassa olevien tätä koske-vien säännösten soveltamista,
eri öljytyyppien ominaisuuksien esiintyminen olisi määritettävä yhte-
näisesti kaikkialla yhteisössä; tätä varten on syytä vahvistaa yhteisönmenetelmät kemiallista määritystä ja aistinvaraista arviointia varten;siirtymäkauden aikana olisi kuitenkin sallittava jäsenvaltioissa sovellet-tavien muiden määritysmenetelmien käyttö ottaen kuitenkin huomioon,
että jos tulokset ovat erilaisia, yhteisellä menetelmällä saadut tulokset
ovat ratkaisevia,
oliiviöljyn fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien sekä määritysmene-
telmien määritteleminen johtaa yhdistetyn nimikkeistön 15 ryhmänlisähuomautusten mukauttamiseen,
neitsytöljyn aistinvaraisten ominaisuuksien arviointimenetelmään
kuuluu valituista ja koulutetuista maistajista koostuvien raatienmuodostaminen; tämän vuoksi olisi säädettävä tällaisen järjestelynluomiseen tarvittavasta määräajasta; ottaen huomioon joidenkin jäsen-valtioiden vaikeudet maistajien raadin muodostamisessa olisi sallittava
muiden jäsenvaltioiden raatien käyttö,
oliivijätteiden tuontiin sovellettavan tuontimaksujärjestelmän moitteet-
toman toiminnan varmistamiseksi olisi säädettävä yhtenäisestämenetelmästä näiden tuotteiden öljypitoisuuden määrittämiseksi,
on suotavaa säätää ennen tämän asetuksen voimaantuloa pakatun öljyn
myyntiä koskevasta määräajasta, jottei kaupalle aiheutuisi haittaa,
on syytä kumota komission asetus (ETY) N:o 1058/77 (
3), sellaisena
kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (ETY) N:o 1858/88 (4), ja
rasvojen hallintokomitea ei ole antanut lausuntoa puheenjohtajansa
asettamassa määräajassa,
ON ANTANUT TÄMÄN ASETUKSEN:
1 artikla
1. Öljyjä, joiden ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I
olevassa 1 ja 2 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset,1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 2
(1) EYVL N:o 172, 30.9.1966, s. 3025/66
(2) EYVL N:o L 353, 17.12.1990, s. 23
(3) EYVL N:o L 128, 24.5.1977, s. 6
(4) EYVL N:o L 166, 1.7.1988, s. 10▼M20
▼M20
pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevan 1 kohdan a ja b
alakohdassa tarkoitettuina neitsytoliiviöljyinä.
2. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I
olevassa 3 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään
asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 1 c kohdassa tarkoitet-
tuna oliivilamppuöljynä.
3. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I
olevassa 4 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetäänasetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 2 kohdassa tarkoitettunajalostettuna oliiviöljynä.
4. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I
olevassa 5 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään
asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 3 kohdassa tarkoitettuna
jalostetusta oliiviöljystä ja neitsytoliiviöljystä valmistettuna olii-viöljynä.
5. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I
olevassa 6 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetäänasetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 4 kohdassa tarkoitettunaraakana oliivin puristemassaöljynä.
6. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I
olevassa 7 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään
asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 5 kohdassa tarkoitettunajalostettuna oliivin puristemassaöljynä.
7. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I
olevassa 8 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetäänasetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 6 kohdassa tarkoitettunaoliivin puristemassaöljynä.
2 artikla
1 Niiden öljyjen, joista määrätään liitteessä I, ominaisuudet
määritetään seuraavia määritysmenetelmiä noudattaen:
— oleiinihappoprosentteina ilmaistavien vapaiden rasvahappojen
määrittäminen liitteen II menetelmällä,
— peroksidiluvun määrittäminen liitteen III menetelmällä,
— vahapitoisuuden määrittäminen liitteen IV menetelmällä,
— sterolipitoisuuden määrittäminen liitteen V menetelmällä,
— erytrodiolin ja uvaolin määrittäminen liitteen VI menetelmällä,— triglyseridin 2-asemassa olevien tyydyttyneiden rasvahappojen
määrittäminen liitteen VII menetelmällä,
— spektrofotometrinen määritys liitteen IX menetelmällä,
— rasvahappokoostumuksen määrittäminen liitteiden X A ja X B
menetelmällä,
— haihtuvien halogeeniliuottimien määrittäminen liitteen XI mene-
telmällä,
— neitsytoliiviöljyn aistinvaraisten ominaisuuksien arviointi liitteen
XII menetelmällä 2 kohdan mukaisesti sovellettuna,
— stigmastadieenien määritykseen liitteessä XVII kuvattu menetelmä,
— triglyseridien koostumuksen määritykseen ECN42:na liitteessä
XVIII kuvattu menetelmä,1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 3
▼B
▼M19
▼B
▼M20
▼B
▼M20
▼M11
▼M13
▼M19
— alifaattisten alkoholien pitoisuuden määrittäminen liitteen XIX
menetelmällä.
2. Kansallisilta viranomaisilta tai näiden edustajilta edellytettävistä
neitsytoliiviöljyjen aistinvaraisten ominaisuuksien tarkistuksesta
vastaavat jäsenvaltioiden hyväksymät maistajaraadit.
Ensimmäisessä kohdassa tarkoitetun oliiviöljyn aistinvaraisten ominai-
suuksien katsotaan olevan yhdenmukaisia ilmoitetun oliiviöljyluokankanssa, jos asianomaisen jäsenvaltion hyväksymä raati vahvistaakyseisen luokituksen.
Jos hyväksytty raati ei vahvista ilmoitusta ilmoitetun oliiviöljyluokan
aistinvaraisten ominaisuuksien osalta, kansalliset viranomaiset tainiiden edustajat teettävät asianomaisen pyynnöstä muilla hyväksytyillä
raadeilla kaksi seurantamääritystä, joista ainakin toisen tekee asiano-
maisen tuottajajäsenvaltion hyväksymä raati. Kyseisten ominaisuuksienkatsotaan olevan yhdenmukaisia ilmoitettujen ominaisuuksien kanssa,jos ilmoitettu luokitus vahvistetaan molemmissa seurantamäärityksissä.Päinvastaisessa tapauksessa seurantamäärityksen kustannuksista vastaa
asianomainen, sanotun kuitenkaan rajoittamatta seuraamusten sovelta-
mista.
3. Kun on kyse kansallisten viranomaisten tai niiden edustajien
tekemästä 1 kohdan mukaisesta öljyn ominaisuuksien toteamisesta,näytteenotto tehdään koenäytteen valmistelua ja näytteenottoa koskeviakansainvälisiä standardeja EN ISO 661 ja EN ISO 5555 noudattaen.Poiketen siitä, mitä standardissa EN ISO 5555 olevassa 6.8 kohdassa
määrätään, edellä mainituista öljyistä koostuvien erien, joissa tuotetta
lähinnä olevan pakkauksen vetoisuus on enintään 100 litraa, näyttee-notto tehdään kuitenkin tämän asetuksen liitteen I a mukaisesti.
Rajoittamatta standardin EN ISO 5555 ja standardissa EN ISO 661
olevan 6 luvun määräysten soveltamista näytteet on sijoitettavaviipymättä valolta ja lämmöltä suojattuun paikkaan ja lähetettävä labor-
atorioon määritettäviksi viimeistään:
— lokakuun ja toukokuun välisenä aikana näytteenottoa seuraavana
kymmenentenä työpäivänä, ja
— kesäkuun ja syyskuun välisenä aikana näytteenottoa seuraavana
viidentenä työpäivänä.
4.►
M20 Edellä 3 kohdassa tarkoitettua todentamista varten liit-
teissä II, III, IX, X ja XII tarkoitetut määritykset ja tapauksen mukaankansallisessa lainsäädännössä säädetyt vastamääritykset on tehtävä
ennen vähimmäissäilymisajan päättymistä. Jos näyte otetaan yli neljä
kuukautta ennen vähimmäissäilyvyysajan päättymistä, kyseisetmääritykset on tehtävä neljän kuukauden kuluessa näytteenotosta.Mainitussa asetuksessa säädettyihin muihin määrityksiin ei sovelletamääräaikoja. ◄
Jos määritysten tulokset eivät vastaa ilmoitetun oliiviöljyluokan tai
ilmoitetun uutetun oliiviöljyn luokan ominaisuuksia, asianomaisen on
ilmoitettava asiasta kuukauden kuluessa ensimmäisessä alakohdassa
tarkoitetun määräajan päättymisestä, jollei näytettä ole otettu vähintäänkuukautta ennen vähimmäissäilymisajan päättymistä.
5. Määritystuloksia verrataan suoraan tässä asetuksessa säädettyihin
rajoihin oliiviöljyjen ominaisuuksien määrittelemiseksi 1 kohdassasäädettyjä menetelmiä noudattaen.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 4
▼M17
▼M19
▼M17
▼M19
▼M20
2 a artikla
Kansalliset viranomaiset tai näiden edustajat voivat todentaa oliiviöljyn
tai oliivin puristemassaöljyn yhdenmukaisuuden ilmoitetun luokan
kanssa joko:
a) tekemällä liitteessä I säädetyt määritykset missä tahansa järjestyk-
sessä;
b) tai seuraamalla päätöksentekokaaviota koskevassa liitteessä I b
säädettyä järjestystä kunnes päästään johonkin kyseisessä kaaviossamainittuun päätökseen.
►M193◄artikla
Kun öljyn aistinvaraisten ominaisuuksien havaitaan olevan erilaiset
kuin sen nimityksestä johtuvat ominaisuudet, kyseisen jäsenvaltion onsovellettava hallinnollisia rahamääräisiä seuraamuksia, joiden määrävahvistetaan havaitun poikkeaman vakavuuden mukaisesti, sanotunkuitenkaan rajoittamatta muiden mahdollisten seuraamusten sovelta-mista.
Poikkeaman arvioinnissa otetaan erityisesti huomioon tavanomaisissa
olosuhteissa säilytetyn öljyn ominaisuuksien luonnollinen kehittyminen.
Jäsenvaltioiden on annettava komissiolle tiedoksi kunkin vuosipuo-
liskon alussa havaittujen poikkeamien määrä ja luonne sekä edellisenvuosipuoliskon aikana sovelletut seuraamukset.
4 artikla
1. Jäsenvaltiot voivat hyväksyä maistajaraateja, jotta kansalliset vira-
nomaiset tai niiden edustajat voivat arvioida ja valvoa aistinvaraisia
ominaisuuksia.
Jäsenvaltioiden on vahvistettava hyväksymistä koskevat edellytykset
etenkin siten, että:
— liitteessä XII olevan 4 kohdan edellytykset täyttyvät,
— raadin puheenjohtajan koulutuksesta vastaa laitos jäsenvaltion tässä
tarkoituksessa hyväksymin edellytyksin,
— hyväksynnän pätevyys ratkaistaan jäsenvaltion käyttöönottamassa
vuotuisessa valvontajärjestelmässä saatujen tulosten perusteella.
Kunkin jäsenvaltion on toimitettava komissiolle luettelo hyväksytyistä
raadeista ja tämän kohdan mukaisesti toteutetuista toimenpiteistä.
2 Jos jäsenvaltiolla on vaikeuksia maistajien raadin perustamisessa
omalle alueelleen, se voi käyttää toisen jäsenvaltion hyväksyttyä mais-tajien raatia.
3 Kunkin jäsenvaltion on laadittava luettelo ammattijärjestöjen tai
ammattien välisten järjestöjen 1 kohdan edellytysten mukaisesti perus-tamista maistajien raadeista ja niiden on valvottava näiden edellytystennoudattamista.
6 artikla
1 Oliiviöljyn erottamisesta syntyneen öljykakun ja muiden yhdis-
tetyn nimikkeistön CN-koodeihin 2306 90 11 ja 2306 90 19 kuuluvienjätteiden öljypitoisuus määritetään liitteen XV menetelmän mukaisesti.
2 Edellä 1 kohdassa tarkoitettu öljypitoisuus ilmaistaan öljyn paino-
prosenttina kuiva-aineesta.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 5
▼M19
▼M5
▼M19
▼M5
▼M19
▼B
▼M20
7 artikla
Haitallisten aineiden osalta sovelletaan niiden esiintymistä koskevia
yhteisön säännöksiä.
Halogeeniliuottimien pitoisuuden osalta raja-arvot ovat kaikkien olii-
viöljyluokkien osalta seuraavat:
— Kunkin havaitun halogeeniliuottimen enimmäispitoisuus 0,1 mg/kg
— Havaittujen halogeeniliuottimien summan enimmäispitoisuus
0,2 mg/kg
8 artikla
1 Jäsenvaltioiden on ilmoitettava komissiolle tämän asetuksen sovel-
tamiseksi toteutetut toimenpiteet.
2 Kunkin vuosipuoliskon alussa jäsenvaltioiden on toimitettava
komissiolle tiedoksi yhteenveto edellisen vuosipuoliskon aikana
tehtyjen määritysten tuloksista.
Rasvojen hallintokomitea tutkii nämä tulokset asetuksen N:o 136/66/
ETY 39 artiklassa säädettyä menettelyä noudattaen.
9 artikla
Kumotaan asetus (ETY) N:o 1058/77.
10 artikla
1 Tämä asetus tulee voimaan seuraavana päivänä sen jälkeen, kun se
on julkaistu Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä . Liitteen XII
menetelmä on kuitenkin otettava käyttöön ►M11 päivästä marras-
kuuta 1992 ◄, interventioon liittyviä toimia lukuun ottamatta.
Tämä menetelmä eikoske ennen 1 päi vää marraskuuta 1992 pakattuja
neitsytoliiviöljyjä.
2 Tämä asetus eikoske ennen tämän asetuksen voi maantuloa
pakattua ja 31 päivään lokakuuta 1992 asti kaupan pidettyä oliiviöljyätai uutettua oliiviöljyä.
Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaise-
naan kaikissa jäsenvaltioissa.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 6
▼B
▼M5
▼B
▼B
LIITTEET
Yhteenveto
Liite I Oliiviöljyn ominaisuudet
Liite I a Näytteenotto oliiviöljystä tai uutetusta oliiviöljystä koostuvista
eristä, joissa tuotetta lähinnä olevan pakkauksen vetoisuus on
enintään 100 litraa
Liite I b Päätöksentekokaavio
Liite II Vapaiden rasvahappojen määrittäminen
Liite III Peroksidiluvun määrittäminen
Liite IV ►M6Vahapitoisuuden määrittäminen kapillaarikaasukroma-
tografisella menetelmällä ◄
Liite V Sterolien rakenteen ja pitoisuuden määrittäminen kapillaari-
kaasukromatografisella menetelmällä
Liite VI Erytrodioli- ja uvaolipitoisuuden määrittäminen
Liite VII Triglyseridin 2-asemassa olevien tyydyttyneiden rasvahap-
pojen määrittäminen
Liite IX Spektrofotometrinen määritys
Liite X A Rasvahappojen metyyliestereiden määrittäminen kaasukroma-
tografisella menetelmällä
Liite X B Rasvahappojen metyyliestereiden valmistaminen
Liite XI Haihtuvien halogeeniliuottimien pitoisuuden määrittäminen
oliiviöljystä
Liite XII Neitsytoliiviöljyn aistinvarainen arviointi
Liite XV Oliivijätteen öljypitoisuusLiite XVI Jodiluvun määrittäminen
Liite XVII Menetelmä stigmastadieenien määrittämiseksi kasviöljyistä
Liite XVIII: Menetelmä triglyseridien koostumuksen määrittämiseksi
ECN42:na
Liite XIX Alifaattisten alkoholien pitoisuuden määritysmenetelmä1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 7
▼M17
▼M20
▼B
▼M20
▼B
▼M20
▼M19
▼B
▼M11
▼M13
▼M19
LIITE I
OLIIVIÖLJYJEN OMINAISUUDET
LuokkaHappopitoi-
suus
(%)
(*)Peroksidi-luku
mEq 02/kg
(*)Vahat mg/kg
(**)2-asemassa
olevat tyydyt-
tyneet rasva-
hapot
(%)Stigmasta-
dieeni mg/
kg (1)HPLC:llä
määritetyn ja
teoreettisesti
lasketun
ECN42:n
välinen eroK232(*) K270(*) Delta-K (*)Aistinvarainen
arvio
Virheen
mediaani (Md)
(*)Aistinvarainen
arvio
Hedelmäi-
syyden
mediaani (Mf)
(*)
1. Ekstra-neitsytoliiviöljy ≤0,8 ≤20 ≤250 ≤1,5 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,50 ≤0,22 ≤0,01 Md = 0 Mf > 0
2. Neitsytoliiviöljy ≤2,0 ≤20 ≤250 ≤1,5 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,01 Md ≤2,5 Mf > 0
3. Lamppuoliiviöljy > 2,0 — ≤300 (3) ≤1,5 ≤0,50 ≤0,3 — — — Md > 2,5 (2)—
4. Jalostettu oliiviöljy ≤0,3 ≤5 ≤350 ≤1,8 — ≤0,3 — ≤1,10 ≤0,16 — —
5. Jalostetusta oliiviöljystä
ja neitsyt- oliiviöljystä
valmistettu oliiviöljy ≤1,0 ≤15 ≤350 ≤1,8 — ≤0,3 — ≤0,90 ≤0,15 — —
6. Raaka oliivin puristemas-
saöljy — — > 350 (4) ≤2,2 — ≤0,6 — — — — —
7. Jalostettu oliivin puriste-
massaöljy ≤0,3 ≤5 > 350 ≤2,2 — ≤0,5 — ≤2,00 ≤0,20 — —
8. Oliivin puristemassaöljy ≤1,0 ≤15 > 350 ≤2,2 — ≤0,5 — ≤1,70 ≤0,18 — —
(1) Sellaisten isomeerien yhteismäärä, joka voidaan (tai jota ei voida) erottaa kapillaarikolonnin avulla.
(2) Tai jos virheen mediaani on enintään 2,5 ja hedelmäisyyden mediaani 0.
(3) Kun öljyn vahapitoisuus on 300—350 mg/kg, sitä pidetään lamppuöljynä, jos alifaattisten alkoholien kokonaispitoisuus on enintään 350 mg/kg tai j os erytrodioli- ja uvaolipitoisuus on enintään 3,5 prosenttia.
(4) Kun öljyn vahapitoisuus on 300—350 mg/kg, sitä pidetään oliivin puristemassaöljynä, jos alifaattisten alkoholien kokonaispitoisuus on yli 350 m g/kg ja jos erytrodioli- ja uvaolipitoisuus on yli 3,5 prosenttia.▼M201991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 8
LuokkaRasvahappojen pitoisuus (1)
transo-
leeni-
isomeeri-
en
summa
(%)Transli-
noli-
isomeeri-
en ja
transli-
noleeni-
isomeeri-
en
summa
(%)Sterolien koostumus
Koko-
nais- ster-
olit
(mg/kg)Erytro-
dioli ja
uvaoli
(%) (**)Myristiini
(%)Linoleeni
(%)Arakidoni
(%)Eiko-
saeeni
(%)Beheeni
(%)Ligno-
seriini
(%)Koles-
teroli
(%)Brassika-
steroli
(%)Kampe-
steroli
(%)Stigma-
steroli
(%)Beeta-
sito-
steroli
(%) (2)Delta-7-
stigma-
steroli
(%)
1. Ekstra-neitsyto-
liiviöljy ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Kamp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
2. Neitsytoliiviöljy ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Kamp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
3. Lamppuoliiviöljy ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,10≤0,10 ≤0,5≤0,1≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥1 000≤4,5 (3)
4. Jalostettu olii-
viöljy ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Kamp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
5. Jalostetusta olii-
viöljystä ja
neitsyt- oliiviöl-
jystä valmistettu
oliiviöljy ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Kamp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
6. Raaka oliivin
puristemassaöljy ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,20≤0,10 ≤0,5≤0,2≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥2 500 > 4,5 (4)
7. Jalostettu oliivin
puristemassaöljy ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 < Kamp. ≥93,0 ≤0,5≥1 800 > 4,5
8. Oliivin puriste-
massaöljy ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 < Kamp. ≥93,0 ≤0,5≥1 600 > 4,5
(1) Muiden rasvahappojen pitoisuus (%): palmitiinihappo 7,5—20,0; palmitoleiinihappo: 0,3—3,5; heptadekaanihappo ≤0,3; heptadekeenihappo ≤0,3; steariinihappo 0,5—5,0; oleiinihappo 55,0—83,0; linolihappo: 3,5—21,0
(2) Seuraavien summa: delta-5-23-stigmastadieeni + kolesteroli + beetasitosteroli + sitostanoli + delta-5-avenasteroli + delta-5-24-stigmastad ieeni.
(3) Kun öljyn vahapitoisuus on 300—350 mg/kg, sitä pidetään lamppuöljynä, jos alifaattisten alkoholien kokonaispitoisuus on enintään 350 mg/kg tai j os erytrodioli- ja uvaolipitoisuus on enintään 3,5 prosenttia.
(4) Kun öljyn vahapitoisuus on 300—350 mg/kg, sitä pidetään oliivin puristemassaöljynä, jos alifaattisten alkoholien kokonaispitoisuus on yli 350 m g/kg ja jos erytrodioli- ja uvaolipitoisuus on yli 3,5 prosenttia.
Huom.
a) Määritystulokset on ilmaistava yhtä monen desimaalin tarkkuudella kuin kunkin ominaisuuden osalta esitetään. Viimeinen ilmaistava luku on pyö ristettävä yhdellä yksiköllä ylöspäin, jos sitä seuraava luku on suurempi kuin 4.
b) Jos yksikin ominaisuus poikkeaa annetuista arvoista, öljyn luokka muutetaan tai ilmoitetaan, ettei se täytä vaatimuksia puhtauden osalta.c) Öljyn laatuun viittaavat tähdellä (*) merkityt ominaisuudet tarkoittavat, että
— lamppuoliiviöljyn osalta sitä koskevia rajoja (lukuun ottamatta K232:ta) ei tarvitse noudattaa samanaikaisesti,
— jos jotain rajaa ei noudateta muiden neitsytoliiviöljyjen osalta, luokkaa muutetaan, mutta se säilyy edelleen luokiteltuna johonkin neitsytoli iviöljyluokkaan
d) Kaksi tähteä (**) ominaisuuden kohdalla tarkoittaa, että oliivin puristemassaöljyjen osalta siihen liittyviä rajoja ei ole välttämätöntä noud attaa samanaikaisesti.▼M201991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 9
▼M20
LIITE I a
Näytteenotto oliiviöljyistä tai oliivin puristemassaöljyistä, jotka toimitetaan
vetoisuudeltaan enintään 100 litraa olevissa tuotetta lähinnä olevissa
pakkauksissa
Tätä näytteenottomenetelmää sovelletaan enintään 125 000 litran suuruisiin olii-
viöljyn tai oliivin puristemassaöljyn toimituksiin, joissa tuotetta lähinnä olevan
pakkauksen vetoisuus on enintään 100 litraa.
Yli 125 000 litraa sisältävä toimitus on jaettava enintään 125 000 litran eriin.
Alle 125 000 litran toimitus muodostaa yhden erän. Menetelmää sovelletaan
kaikkiin eriin.
Perusnäytteiden vähimmäislukumäärä määräytyy erän koon mukaan 1 kohdassa
olevan taulukon mukaisesti.
Perusnäytteiden lukumäärä riippuu tuotetta lähinnä olevien pakkausten vetoisuu-
desta 2.1 kohdassa säädetyn taulukon mukaisesti.
Toimituksella, perusnäytteellä ja laboratorionäytteellä tarkoitetaan standardissa
EN ISO 5555 tarkoitettuja määritelmiä.
Ilmaisulla ’erä’ tarkoitetaan kaikkia myyntiyksiköitä, jotka on tuotettu, valmis-
tettu ja pakattu sellaisissa olosuhteissa, että kunkin tällaisen myyntiyksikön
sisältämää öljyä pidetään yhdenmukaisena kaikkien analyyttisten ominaisuuk-
sien osalta.
1. PERUSNÄYTTEIDEN LUKUMÄÄRÄ
Perusnäytteiden vähimmäislukumäärä määräytyy erän koon mukaan seur-
aavan taulukon mukaisesti:
Erän koko (litroina) alle Perusnäytteiden vähimmäislukumäärä
7 500 2
25 000 3
75 000 4
125 000 5
Samaan perusnäytteeseen kuuluviksi tuotetta lähinnä oleviksi pakkauksiksi
on valittava erässä vierekkäin olevat pakkaukset.
Epäselvissä tapauksissa jäsenvaltioiden on lisättävä perusnäytteiden
lukumäärää.
2. PERUSNÄYTTEEN SISÄLTÖ
2.1Perusnäyte muodostuu seuraavasti:
Jos tuotetta lähinnä olevien pakkausten
vetoisuus on:Perusnäytteeksivali taan:
a) vähintään 5 litraa a) kolmen tuotetta lähinnä olevan
pakkauksen öljy
b) vähintään 3 litraa mutta enintään
5 litraab) kolmen tuotetta lähinnä olevan
pakkauksen öljy
c) vähintään 2 litraa mutta enintään
3 litraac) kolmen tuotetta lähinnä olevan
pakkauksen öljy
d) vähintään 1 litra mutta enintään
2 litraad) kuuden tuotetta lähinnä olevan
pakkauksen öljy
e) vähintään 0,75 litraa mutta
enintään 1 litrae) kuuden tuotetta lähinnä olevan
pakkauksen öljy
f) enintään 0,75 litraa f) kolminkertaisesti öljy mahdolli-
simman vähäisestä määrästä
pakkauksia, joiden kokonaisve-
toisuus ylittää 1,5 litraa1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 10
▼M20
2.2Perusnäytteet on säilytettävä tuotetta lähinnä olevissa pakkauksissa
kunnes määritykset tehdään.Tämän jälkeen perusnäytteiden öljy
jaetaan tarvittaessa kolmeksi laboratorionäytteeksi, jotta voidaan
tehdä:
a) liitteissä II, III, IX ja X tarkoitetut määritykset;
b) liitteessä XII tarkoitettu määritys;
c) muut määritykset.
2.3Perusnäytteen muodostavien pakkausten öljy on jaettava kansallisessa
lainsäädännössä säädettyjä valvontamenettelyjä noudattaen.
3. MÄÄRITYKSET JA TULOKSET
a) Kukin 1 kohdassa tarkoitettu perusnäyte jaetaan standardissa EN ISO
5555 olevan 2.5 kohdan mukaisesti laboratorionäytteiksi seuraavien
määritysten tekemiseksi:
— asetuksen 2 artiklan 1 kohdan ensimmäisessä luetelmakohdassa
tarkoitettu vapaiden rasvahappojen määrittäminen,
— asetuksen 2 artiklan 1 kohdan toisessa luetelmakohdassa tarkoitettu
peroksidiluvun määrittäminen,
— asetuksen 2 artiklan 1 kohdan kahdeksannessa luetelmakohdassa
tarkoitettu spektrofotometrinen määritys,
— asetuksen 2 artiklan 1 kohdan yhdeksännessä luetelmakohdassa
tarkoitettu rasvahappokoostumuksen määrittäminen.
b) Jos jollekin samasta erästä otetulle perusnäytteelle tehdyn a alakohdassa
tarkoitetun määrityksen tulokset eivät kokonaisuudessaan vastaa ilmoi-
tetun öljyluokan ominaisuuksia, koko kyseinen erä on todettava
vaatimusten vastaiseksi.
Jos kullekin samasta erästä otetulle perusnäytteelle tehtyjen a alakoh-
dassa tarkoitettujen määritysten tulokset eivät ole yhdenmukaiset —
kyseisten menetelmien toistettavuusominaisuudet huomioon ottaen —
koko erä on todettava epäyhdenmukaiseksi ja jokaiselle perusnäytteelle
on tehtävä muut vaadittavat määritykset. Päinvastaisessa tapauksessa
muut vaaditut määritykset tehdään vain yhdelle kyseisestä erästä otetulle
perusnäytteelle.
c) Jos jokin b alakohdan toisen alakohdan mukaisten määritysten tulos ei
vastaa ilmoitetun öljyluokan ominaisuuksia, koko kyseinen erä on todet-
tava vaatimusten vastaiseksi.
Jos kaikki b alakohdan toisen alakohdan mukaisten määritysten tulokset
vastaavat ilmoitetun öljyluokan ominaisuuksia, koko kyseinen erä on
todettava vaatimusten mukaiseksi.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 11
▼M20
LIITE I b
PÄÄTÖKSENTEKOJÄRJESTELMÄ SEN TODENTAMISEKSI, ONKO
OLIIVIÖLJYNÄYTE ILMOITETUN LUOKAN MUKAINEN
Sen määrittäminen, onko oliiviöljy tai oliivin puristemassaöljy ilmoitetun luokan
mukainen, voidaan tehdä:
a) joko tekemällä liitteessä I vahvistettujen ominaisuuksien noudattamisen
todentamiseksi säädetyt määritykset missä tahansa järjestyksessä;
b) tai tekemällä päätöksentekokaavioon sisältyvät määritykset siinä esitetyssä
järjestyksessä kunnes päästään johonkin kyseisessä kaaviossa mainittuun
päätökseen.
Erikseen on tehtävä saastuttavia aineita ja halogenoituja liuottimia koskevat
määritykset, joita tarvitaan Euroopan yhteisöjen vaatimusten noudattamisen
todentamiseksi.
Päätöksentekokaaviota sovelletaan kaikkiin oliiviöljyn ja oliivin puristemas-
saöljyn luokkiin. Se koostuu taulukoista 1—11, joita on käytettävä kyseessä
olevan öljyn ilmoitetun luokan mukaan yleistaulukossa esitetyssä järjestyksessä.
Taulukkoa 11 tulkitaan seuraavasti:
— Yhtäläisyysmerkki (=) tarkoittaa reittiä, jota seurataan, jos edellisessä laati-
kossa esitetyt edellytykset täyttyvät (myöntävä vastaus). Kolme pistettä (…)
tarkoittaa reittiä, jota seurataan, jos edellytykset eivät täyty.
— Taulukoissa 1—11 olevien laatikoiden otsakkeet viittaavat tässä asetuksessa
säädettyihin määrityksiin tämän liitteen lisäyksessä 1 olevan vastaavuustau-
lukon mukaisesti.
— Taulukoiden 1—11 kielteistä päätöstä kuvastavissa ympyröissä esiintyvät
kirjaimet vastaavat tämän liitteen lisäyksessä 2 mainittuja suuntaa-antavia
tietoja. Ne eivät sellaisenaan edellytä määritysten jatkamista eivätkä tarkoita,
että esitetyt oletukset pitäisivät paikkansa.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 12
▼M20
Yleistaulukko1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 13

▼M20
Taulukko 11991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 14

▼M20
Taulukko 21991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 15

▼M20
Taulukko 31991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 16

▼M20
Taulukko 41991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 17

▼M20
Taulukko 51991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 18

▼M20
Taulukko 61991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 19

▼M20
Taulukko 71991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 20

▼M20
Taulukko 81991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 21

▼M20
Taulukko 91991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 22

▼M20
Taulukko 101991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 23

▼M20
Taulukko 111991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 24

▼M20
Lisäys 1
Tämän asetuksen liitteiden ja päätöksentekokaaviossa tarkoitettujen määritysten väliset vastaa-
vuudet
— Happopitoisuus Liite II Vapaiden rasvahappojen määrittä-
minen
— Peroksidiluku Liite III Peroksidiluvun määrittäminen
— Spektrofotometrinen määritys
ultraviolettivalossaLiite IX Spektrofotometrinen määritys
— Aistinvarainen arviointi Liite XII Neitsytoliiviöljyn aistinvarainen
arviointi
— Stigmasta-3,5-dieeni Liite XVII Menetelmä stigmastadieenien
määrittämiseksi kasviöljyistä
— Rasvahappojen trans-isomeerit Liite X a ja Rasvahappojen metyyliestereiden
määrittäminen kaasukromatografi-
sella menetelmällä
Liite X b Rasvahappojen metyyliestereiden
valmistamismenetelmä
— Rasvahappojen koostumus Liite X a ja Rasvahappojen metyyliestereiden
määrittäminen kaasukromatografi-
sella menetelmällä
Liite X b Rasvahappojen metyyliestereiden
valmistamismenetelmä
—∆ECN42 Liite XVIII Triglyseridien koostumuksen
määrittäminen ECN42:na (teoreet-
tisen koostumuksen ja todellisen
koostumuksen välinen ero)
— Sterolien koostumus ja kokonais-
sterolitLiite V Sterolien rakenteen ja pitoisuuden
määrittäminen kapillaarikaasukroma-
tografisella menetelmällä
— Erytrodioli ja uvaoli Liite VI Erytrodioli- ja uvaolipitoisuuden
määrittäminen
— Vahat Liite IV Vahapitoisuuden määrittäminen
kapillaarikaasukromatografisella
menetelmällä
— Alifaattiset alkoholit Liite XIX Alifaattisten alkoholien pitoisuuden
määrittäminen kaasukromatografi-
sesti kapillaarikolonnilla
— 2-asemassa olevat tyydyttyneet
rasvahapotLiite VII Triglyseridin 2-asemassa olevien
tyydyttyneiden rasvahappojenmäärittäminen.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 25
▼M20
Lisäys 2
Taulukko 1
a) Ks. neitsytöljy tai lamppuöljy (Laatukriteeri — taulukko 2 , tailaatu- ja
puhtauskriteeri — taulukko 4 )
b) Ks. lamppuöljy (Laatu- ja puhtauskriteeri — taulukko 4 )
Taulukko 2
a) Ks. lamppuöljy (Laatu- ja puhtauskriteeri — taulukko 4 )
b) Ks. ekstraneitsytoliiviöljy (Laatukriteeri — taulukko 1 )
Taulukko 3
a) Jalostetun öljyn (oliivi- tai muun öljyn) esiintyminen
b) Oliivin puristemassaöljyn esiintyminen
Taulukko 4
a) Ks. ekstraneitsytoliiviöljy ja neitsytoliiviöljy (Laatukriteerit — taulukko 1 ja
2)
b) Jalostetun öljyn (oliivi- tai muun öljyn) esiintyminen
c) Oliivin puristemassaöljyn esiintyminen
d) Esteröityjen öljyjen esiintyminen
Taulukko 7
a) Oliivin puristemassaöljyn esiintyminen
b) Esteröityjen öljyjen esiintyminen
Taulukko 8
a) Jalostetun öljyn (oliivi- tai muun öljyn) esiintyminen
b) Ks. lamppuöljy (Laatu- ja puhtauskriteeri — taulukko 4 )
c) Esteröityjen öljyjen esiintyminen
Taulukko 11
a) Esteröityjen öljyjen esiintyminen1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 26
▼B
LIITE II
VAPAIDEN RASVAHAPPOJEN MÄÄRITTÄMINEN
1 TARKOITUS
Vapaiden rasvahappojen määrittäminen oliiviöljyistä. Vapaiden rasvahap-
pojen pitoisuus ilmaistaan tavanomaisesti laskettuna happamuutena.
1.1 Periaate
Näyte liuotetaan liuotinseokseen ja vapaat rasvahapot titrataan kaliumhy-
droksidin etanoliliuoksella.
1.2 Reagenssit
Kaikkien reagenssien on oltava määritykseen hyväksyttyä analyysilaatua
ja veden on oltava joko tislattua tai vastaavaa puhtausastetta.
1.2.1 Dietyylieetteri ja 95-prosenttinen etanoli (V/V), yhtä suuret tilavuusosat
kumpaakin.
Huom.: Dietyylieetteri on helposti syttyvää ja voi muodostaa räjähtäviä
peroksideja. Sen käytössä on oltava erittäin varovainen.
Seos, johon on lisätty 0,3 ml fenoliftaleiiniliuosta (1.2.3) 100 ml:aan,
neutraloidaan juuri ennen käyttöä kaliumhydroksidiliuoksella (1.2.2),
Huom.: Jos ei voida käyttää dietyylieetteriä, voidaan käyttää etanolin ja
tolueenin seosta. Etanoli voidaan tarvittaessa korvata 2-propano-
lilla.
1.2.2 Kaliumhydroksidi titrattuna etanoliliuoksena, c(KOH) noin 0,1 mol/l tai
tarvittaessa c(KOH) noin 0,5 mol/l.
Kaliumhydroksidin etanoliliuoksen tarkka väkevyys on tunnettava ja
tarkistettava juuri ennen käyttöä. Käytetään liuosta, joka on valmistettu
vähintään viisi vuorokautta ennen käyttöä ja dekantoitu ruskeaan lasipul-
loon, jossa on kumitulppa. Liuoksen on oltava väritöntä tai oljenkeltaista.
Huom.: Väritön, stabiili kaliumhydroksidiliuos voidaan valmistaa seuraa-
vasti. Kuumennetaan kiehuvaksi 1 000 ml etanolia, johon on
lisätty 8 g kaliumhydroksidia ja 0,5 g alumiinilastuja, ja keitetään
seosta yksi tunti palautusjäähdyttimen kanssa. Tislataan
välittömästi. Tisleeseen liuotetaan tarvittava määrä kaliumhydrok-
sidia. Annetaan seistä useita vuorokausia ja dekantoidaan kirkas
neste, joka on kaliumkarbonaattisakan yläpuolella.
Liuos voidaan myös valmistaa ilman tislausta seuraavasti: lisätään
4 ml alumiinibutylaattia 1 000 ml:aan etanolia ja seoksen anne-
taan seistä joitakin vuorokausia. Dekantoidaan sakan yläpuolinen
neste ja liuotetaan siihen tarvittava määrä kaliumhydroksidia.
Liuos on käyttövalmis.
1.2.3 Fenoliftaleiini, 10 g liuotettuna litraan 95- tai 96-prosenttista etanolia (V/
V) tai, jos rasva on kovin tummaa, alkalisini, 20 g liuotettuna litraan 95-
tai 96-prosenttista etanolia (V/V).
1.3 Välineistö
Tavanomainen laboratoriovälineistö ja erityisesti:
1.3.1 Analyysivaaka1.3.2 Erlenmeyerpullo, 250 ml1.3.3 Byretti, 10 ml, mitta-asteikon jakoväli 0,05 ml.
1.4 Suoritus
1.4.1 Näytteen esikäsittely määritystä varten
Määritys tehdään suodatetusta näytteestä. Jos veden ja epäpuhtauksien
kokonaispitoisuus on pienempi kuin 1 %, voidaan määritys tehdä
näytteestä sellaisenaan.
1.4.2 Näytteenotto
Näyte otetaan oletetun happamuuden perusteella seuraavan taulukon
mukaan:1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 27
▼B
Oletettu happolukuNäytemäärä
(g)Näytteen punnitustark-
kuus
(g)
< 1 20 0,05
1—4 10 0,02
4—15 2,5 0,01
15—75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
Näyte punnitaan erlenmeyerpullossa (1.3.2).
1.4.3 Määritys
Näyte (1.4.2) liuotetaan 50—150 ml:aan ennalta neutraloitua dietyylieet-
teri/etanoli-seosta (1.2.1).
Titrataan, koko ajan sekoittaen, 0,1 mol/l kaliumhydroksidiliuoksella
(1.2.2) (ks. Huom. 2), kunnes indikaattorin väri muuttuu (fenoliftaleiinin
vaaleanpunainen väri säilyy vähintään 10 sekunnin ajan).
Huom. 1 Titrattu kaliumhydroksidin etanoliliuos (1.2.2) voidaan korvata
kalium- tai natriumhydroksidin vesiliuoksella, jos lisätty vesi ei
aiheuta faasien erottumista.
Huom. 2 Jos 0,1 mol/l kaliumhydroksidiliuosta tarvitaan enemmän kuin
10 ml, käytetään 0,5 mol/l liuosta.
Huom. 3 Jos liuos samenee titrattaessa, liuotinseosta (1.2.1) lisätään
tarpeen mukaan, kunnes liuos on kirkasta.
1.5 Happamuus: ilmaistuna oleiinihappoprosentteina
Happamuus painoprosentteina ilmaistuna on:
V/C2c/C2M
1 000/C2100
m¼V/C2c/C2M
10/C2m
jossa:
V = titratun kaliumhydroksidiliuoksen tilavuus millilitroina;
c = titratun kaliumhydroksidiliuoksen tarkka pitoisuus moolia/litra;M = tuloksen ilmaisemiseen käytetyn hapon moolimassa g/mol (= 282);
m = näytteen massa grammoina.
Tulos on kahden määrityksen tulosten aritmeettinen keskiarvo.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 28
▼B
LIITE III
PEROKSIDILUVUN MÄÄRITTÄMINEN
1 TARKOITUS
Tämä standardi kuvaa rasvojen ja öljyjen peroksidiluvun määritysmene-
telmän.
2 SOVELTAMISALA
Tämä standardi soveltuu eläin-ja kasvirasvojen sekä -öljyjen tutkimiseen.
3 MÄÄRITELMÄ
Peroksidiluku ilmaisee näytteessä olevien kaliumjodidia hapettavien
aineiden määrän (ilmaistuna aktiivisen hapen milliekvivalentteina kilo-
grammaa kohti) tässä kuvatuissa koeolosuhteissa.
4 PERIAATE
Näyte liuotetaan etikkahapon ja kloroformin seokseen ja käsitellään kalium-
jodidilla. Vapautuva jodi titrataan natriumtiosulfaattiliuoksella.
5 VÄLINEISTÖ
Käytettävien laitteiden on oltava puhtaita siten, että niissä ei ole mitään
hapettavia tai pelkistäviä aineita.
Huom.: Hiottuja lasipintoja ei saa rasvata.
5.1 Punnituslasi, 3 ml.5.2 Lasipulloja, vetoisuus noin 250 ml, hiotut suut ja tulpat, etukäteen kuivattu
ja täytetty puhtaalla, kuivalla inerttikaasulla (typellä tai mieluummin hiili-
dioksidilla).
5.3 Byretti, 25 tai 50 ml, mitta-asteikon jakoväli 0,1 ml.
6 REAGENSSIT
6.1 Analyysilaatuinen kloroformi, josta happi on poistettu puhtaalla, kuivalla
inerttikaasuvirralla tapahtuvalla kaasuhuuhtelulla.
6.2 Analyysilaatuinen jääetikka, josta happi on poistettu puhtaalla, kuivalla
inerttikaasuvirralla tapahtuvalla kaasuhuuhtelulla.
6.3 Kaliumjodidin tuore, kyllästetty vesiliuos, joka ei sisällä jodia eikä jodaat-
teja.
6.4 Natriumtiosulfaatin vesiliuos, 0,01 tai 0,002 N, normalisoitu huolellisesti
juuriennen käyttöä.
6.5 Tärkkelysliuos, 10 g/l vesidispersio, liukoisesta luonnon tärkkelyksestä
valmistettu tuore liuos.
7 NÄYTE
Huolehditaan siitä, että näyte otetaan ja säilytetään pimeässä ja kylmässä, ja
että sen lasisissa säilytysastioissa ei ole tyhjää tilaa. Astiat on suljettava
ilmatiiviisti joko hiotuilla lasitulpilla tai korkilla.
8 SUORITUS
Määritys tehdään hajapäivänvalossa tai keinovalossa. Näyte punnitaan
0,001 g:n tarkkuudella punnituslasissa (5.1) tai, ellei sellaista ole, pullossa
(5.2). Tarvittava näytemäärä riippuu oletetusta peroksidiluvusta seuraavan
taulukon mukaan:1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 29
▼B
Oletettu peroksidiluku
(meq O2/kg)Näytemäärä
(g)
0—12 5,0—2,0
12—20 2,0—1,2
20—30 1,2—0,8
30—50 0,8—0,5
50—90 0,5—0,3
Avataan pullo (5.2) ja asetetaan sisään punnituslasi, jossa on näyte. Lisätään
10 ml kloroformia (6.1). Liuotetaan näyte nopeasti sekoittaen. Lisätään
15 ml etikkahappoa (6.2), sitten 1 ml kaliumjodidiliuosta (6.3). Suljetaan
pullo nopeasti, ravistetaan yksi minuutti ja annetaan seistä tasan viisi
minuuttia pimeässä 15—25 ºC:n lämpötilassa.
Lisätään noin 75 ml tislattua vettä. Vapautunut jodi titrataan natriumtiosul-
faattiliuoksella (6.4) (jos oletettu peroksidiluku on alle 12, käytetään 0,002 N
liuosta ja jos se on yli 12, käytetään 0,01 N liuosta) voimakkaasti sekoittaen
ja indikaattorina käytetään tärkkelysliuosta (6.5).
Samasta näytteestä tehdään kaksimääri tystä.Sokeakoe tehdään samanaikaisesti. Jos sen tulos on suurempi kuin 0,05 ml
0,01 N natriumtiosulfaattiliuosta (6.4), ovat reagenssit olleet epäpuhtaita ja
ne on vaihdettava.
9 TULOSTEN ESITTÄMINEN
Peroksidiluku (PV), ilmaistuna aktiivisen hapen milliekvivalentteina kilo-
grammaa kohti, saadaan kaavasta:
PV¼
V/C2T/C21 000
m
jossa:
V = määritykseen käytetyn normalisoidun natriumtiosulfaattiliuoksen
(6.4) määrä millilitroina, korjattuna sokeakokeen tuloksilla;
T = määritykseen käytetyn natriumtiosulfaattiliuoksen (6.4) tarkka
normaalisuus;
m = näytteen massa grammoina.
Tulos on kahden määrityksen tulosten aritmeettinen keskiarvo.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 30
▼M6
LIITE IV
VAHAPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN KAPILLAARIKAASUKRO-
MATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ
1 TARKOITUS
Tällä menetelmällä määritetään koeolosuhteissa tiettyjen rasvojen vaha-
pitoisuus.
Tätä menetelmää voidaan käyttää erityisesti erottamaan puristamalla ja
uuttamalla saatu oliiviöljy.
2 PERIAATE
Rasva, johon on lisätty soveltuva sisäinen standardi, fraktioidaan kroma-
tografisesti hydratoitua silikageeliä sisältävässä kolonnissa;
koeolosuhteissa (joissa polaarisuus on triglyseridien polaarisuutta
heikompi) ensimmäisenä eluoitunut jae otetaan talteen ja määritetään
suoraan kapillaarikaasukromatografian avulla.
3 VÄLINEET
3.1 25 ml erlenmeyer-pullo.
3.2 Lasikolonni kromatografiaa varten, jonka sisähalkaisija on 15,0 mm ja
pituus 30 - 40 cm.
3.3 Soveltuva kaasukromatografialaitteisto ja kapillaarikolonni, jossa on
suoraan kolonniin johtava järjestelmä, jonka osat ovat:
3.3.1 termostaattisäätöinen uuni kolonnille, joka pitää halutun lämpötilan ± 1
ºC:n tarkkuudella,
3.3.2 kylmäinjektori, kolonniin suoraan syöttämiseksi,3.3.3 liekki-ionisaatiodetektori sekä muuntajavahvistin,3.3.4 soveltuva integraattoripiirturi, joka toimii muuntajavahvistimen (3.3.3)
kanssa ja jonka vastenopeus on enintään 1 sekunti ja jonka paperin
nopeutta voidaan säätää,
3.3.5 lasinen tai kvartsilasinen kapillaarikolonni: pituus 10 - 15 mm, sisähalk-
aisija 0,25 - 0,35 mm päällystettynä sisäpuolelta SE-52 tai SE-54
-nesteellä taivastaavalla, paksuudeltaan tasai sesti0,10 - 0,30 µm.
3.4 Mikroruisku, kolonniin suoraan syöttämiseksi, 10 µl, jossa on kovetettu
neula.
4 REAGENSSIT
4.1 Silikageeli 70 - 230 mesh, art. 7754 Merck.
Silikageeli laitetaan uuniin 500 ºC:n lämpötilaan 4 tunniksi. Jäähdy-
tetään ja lisätään 2 % vettä. Sekoitetaan massan homogenoimiseksi.
Säilytetään pimeässä vähintään 12 tuntia ennen käyttöä.
4.2 n-Heksaania, kromatografiaa varten.
4.3 Etyylieetteriä, kromatografiaa varten.
4.4 n-Heptaania, kromatografiaa varten.4.5 Lauryyliarakidaatin standardiliuos, 0,1 % (m/v) liuos heksaanissa
(sisäinen standardi).
4.6 Kantajakaasu: puhdas vety, kaasukromatografiaa varten.
4.7 Apukaasut:
— puhdas vety, kaasukromatografiaa varten,
— puhdas ilma, kaasukromatografiaa varten.
5 MENETTELY
5.1 Vahajakeen erottaminen
5.1.1 Kromatografiakolonnin esikäsittely
Suspendoidaan 15 g hydratoitua silikageeliä 2-prosenttiseen n-heksaa-
niin ja laitetaan kolonniin.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 31
▼M6
Annetaan tasaantua itsestään ja täydennetään tasaantumista sähkökäyt-
töisellä sekoittajalla, jotta saadaan homogeenisempi
kromatografiakerros. Suodatetaan läpi 30 ml n-heksaania mahdollisten
epäpuhtauksien poistamiseksi.
5.1.2 Kolonnikromatografia
Punnitaan tasan 500 mg näytettä 25 ml:n erlenmeyerpulloon, lisätään
sopiva määrä sisäistä standardia oletetun vahapitoisuuden mukaan.
Esimerkki: lisätään 0,1 mg lauryyliarakidaattia, jos on kysymys oliiviöl-
jystä ja 0,25 - 0,5 mg, jos on kyse uutetusta öljystä.
Siirretään näin valmistettu näyte kahden 2 ml:n n-heksaaniannoksen
avulla 5.1.1 kohdan mukaisesti käsiteltyyn kromatografiakolonniin.
Liuottimen annetaan valua, kunnes se on 1 mm absorboimisaineen
pinnan yläpuolella. Aloitetaan kromatografinen eluutio: kerätään 140
ml n-heksaani/etyylieetteriseosta, suhde 99:1, valumisnopeuden ollessa
noin 15 pisaraa 10 sekunnissa (2,1 ml minuutissa).
Tällä tavoin saatu jae kuivataan pyöröhaihduttimessa, kunnes lähes
kaikki liuotin on saatu poistettua. Viimeiset 2 tai 3 ml liuotinta poiste-
taan heikon typpivirtauksen avulla, jonka jälkeen lisätään 10 ml n-
heptaania.
5.2 Kaasukromatografinen määritys
5.2.1 Esivalmistelut ja kolonnin valmistelu
5.2.1.1 Kolonni asennetaan kaasukromatografiin siten, että tulosola yhdistetään
on-column -järjestelmään ja poistosola detektoriin.
Tarkistetaan kaasukromatografisten laitteiden toimivuus (kaasuliitäntöjen
kunto, detektorin ja piirturijärjestelmän tehokkuus jne.).
5.2.1.2 Jos kolonnia ei ole aikaisemmin käytetty, se on ensin valmisteltava
käyttöön. Kevyt kaasuvirtaus johdetaan kolonnin läpi ja käynnistetään
kaasukromatografi. Lämmitetään asteittain, kunnes lämpötila on
kohonnut vähintään 20 ºC korkeammaksi kuin käyttölämpötila
(huomautus). Tätä lämpötilaa pidetään yllä vähintään kaksi tuntia, jonka
jälkeen laitteisto säädetään käyttöolosuhteisiin (kaasuvirtojen säätö,
liekin sytytys, kytkeminen elektroniseen piirturiin, uunin lämpötilan
säätö kolonnia varten, detektorin säätö jne.) ja signaali säädetään niin,
että sen herkkyys on vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin on arvioitu
määrityksessä tarvittavan. Saadun pohjaviivan on oltava suora, siinä ei
saa olla minkäänlaisia piikkejä eikä ryömintää mihinkään suuntaan.
Jos ilmenee negatiivista suoraviivaista ryömintää, se on merkki kolonnin
epätäydellisistä liitännöistä; positiivinen ryömintä johtuu kolonnin
riittämättömästä valmistelusta.
Huom: Esivalmistelulämpötilan tulee aina olla vähintään 20 ºC alhai-
sempi kuin käytetyn eluentin korkein oletettu lämpötila.
5.2.2 Käyttöolosuhteiden valinta
5.2.2.1 Yleisesti noudatettavat käyttöolosuhteet ovat seuraavat:
— kolonnin lämpötila: aluksi 80 ºC, sen jälkeen lämpötilaa nostetaan 30
ºC minuutissa, kunnes saavutetaan 120 ºC ja ohjelmoidaan nouse-
maan sen jälkeen 5 ºC minuutissa, kunnes saavutetaan 340 ºC,
— detektorin lämpötila: 350 ºC,
— kantajakaasun lineaarinopeus: vedylle 20 - 35 cm/s,— laitteen herkkyys: 4 - 16 kertaa vähimmäisvaimennus,— piirturin herkkyys: 1 - 2 mV asteikon pohjasta,— paperin nopeus: 30 cm/h,
— injektoidun aineen määrä: 0,5 - 1 µl liuosta.
Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin
ominaisuuksien perusteella (jotta saadaan seuraavat edellytykset
täyttäviä kromatogrammeja: sisäisen standardin C 32 retentioaika on 25
± 2 minuuttia ja edustavimpien vahojen piikki on 60 - 100 % asteikon
pohjasta).
5.2.2.2 Piikkien integrointiparametrit asetetaan niin, että saadaan oikeat arvot
huomioon otettavien piikkien pinta-aloille.
5.2.3 Määrityksen suorittaminen
5.2.3.1 Imetään 10 µl:n mikroruiskuun 1 µl liuosta; vedetään männällä neula
tyhjäksi. Työnnetään neula injektiolaitteeseen ja 1 - 2 sekunnin kuluttua
injektoidaan nopeasti; noin 5 sekunnin kuluttua vedetään neula hitaasti
pois.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 32
▼M6
5.2.3.2 Piirturi pidetään käynnissä, kunnes vahat ovat eluoituneet täydellisesti.
Pohjaviivan on koko ajan oltava 5.2.1.2. kohdan vaatimusten mukainen.
5.2.4 Piikkien tunnistaminen
Eri piikkien tunnistaminen suoritetaan retentioaikojen perusteella ja
vertaamalla samoissa olosuhteissa määritettyihin vahojen seoksiin,
joiden retentioajat tunnetaan.
Kuva 1 esittää neitsytoliiviöljyn vahojen kromatogrammia.
5.2.5 Kvantitatiivinen arviointi5.2.5.1 Sisäisen standardin ja C 40 - C 46 alifaattisten esterien piikkien pinta-
alat lasketaan integraattorilla.
5.2.5.2 Lasketaan kunkin esterin vahapitoisuus, ilmoitettuna mg/kg rasvaa, seur-
aavalla kaavalla:
esteri(mg/kg) =A
x·ms·►M91 000◄
As·m
jossa:
Ax= kunkin esterin piikin pinta-ala
As= lauryyliarakidaattipiikin pinta-ala
ms= lisätyn lauryyliarakidaatin massa milligrammoina
m = määritystä varten otetun näytteen massa grammoina.
6 TULOSTEN ILMAISEMINEN
Eri vahojen pitoisuudet ja niiden summa ilmoitetaan mg: oina rasvaa
kilogrammaa kohti.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 33
▼M6
LISÄYS
Kaasun lineaarinopeuden määrittäminen
Injektoidaan1 - 3 µl metaania (tai propaania) tavanomaisiin käyttöolosuhteisiin
säädettyyn kaasukromatografialaitteistoon. Otetaan tarkka aika siitä, miten kauan
kaasu kulkee kolonnin läpi, alkaen injektiohetkestä piikin muodostumiseen (tM).
Lineaarinopeus, cm/s, saadaan kaavasta L/tM, jossa L on kolonnin pituus sentti-
metreinä ja tM on aika sekunteina sekuntikellolla mitattuna.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 34
▼M61991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 35
▼B
LIITE V
STEROLIEN RAKENTEEN JA PITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN
KAPILLAARIKAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ
1 TARKOITUS
Tällä menetelmällä voidaan määrittää yksittäisten sterolien määrät ja
niiden kokonaismäärä rasvoissa ja öljyissä.
2 PERIAATE
Rasva tai öljy, johon on lisätty a-kolestanoli sisäiseksi standardiksi, saip-
puoidaan kaliumhydroksidin etanoliliuoksella ja saippuoitumaton aines
uutetaan etyylieetterillä. Sterolifraktio erotetaan saippuoitumattomasta
uutteesta ohutkerroskromatografialla käyttäen emäksistä silikageelilevyä.
Silikageelistä saadut sterolit muutetaan trimetyylisilyylieettereiksi ja
määritetään kapillaarikaasukromatografialla.
3 VÄLINEISTÖ
3.1 Pullo, 250 ml, jossa on hiokset ja palautusjäähdytin.3.2 Erotussuppilo, 500 ml.3.3 Pulloja, 250 ml.
3.4 Ohutkerroskromatografialaitteisto, jonka levyjen koko on 20 × 20 cm.
3.5 Ultraviolettivalo, jonka aallonpituus on 366 tai 254 nm.3.6 Mikroruiskuja, 100 µl ja 500 µl3.7 Lasisintterisuodatinsuppilo, jonka huokoskoko on G 3 (15—40 µm),
halkaisija noin 2 cm ja korkeus noin 5 cm ja jossa on liitäntä tyhjiösuo-
datusta varten sekä koirashios 12/21.
3.8 Tyhjiöimupullo, 50 ml, jossa on naarashios 12/21, joka sopii suodatin-
suppiloon (3.7).
3.9 Koeputki, 10 ml, jossa on kartiomainen pohja ja ilmatiivis tulppa.
3.10 Kaasukromatografi, johon sopii kapillaarikolonni ja johon kuuluu
virtauksenjakojärjestelmä, jonka osat ovat:
3.10.1 Termostaattisäätöinen kolonniuuni, joka säilyttää halutun lämpötilan
noin ± 1 ºC:n tarkkuudella;
3.10.2 Höyrystämisyksikkö, jonka lämpötilaa voi säätää ja jonka höyrystämi-
sosa on persilanoitua lasia;
3.10.3 Liekki-ionisaatiodetektori ja muuntajavahvistin;3.10.4 Integraattori-piirturi, joka sopii käytettäväksi muuntajavahvistimen
kanssa.
3.11 Lasinen tai kvartsilasinen kapillaarikolonni, jonka pituus on 20—30 m ja
sisähalkaisija 0,25—0,32 mm ja jonka sisäpinta on päällystetty nesteellä
SE-52 taiSE-54 taivastaavalla si ten, että nestekerroksen paksuus on
0,10—0,30 mm.
3.12 Mikroruisku, jossa on karkaistu neula, kaasukromatografiaa varten, 10 µl.
4 REAGENSSIT
4.1 Kaliumhydroksidin noin 2 N etanoliliuos: 130 g kaliumhydroksidia
(vähintään 85-prosenttista) liuotetaan 200 ml:aan tislattua vettä samalla
jäähdyttäen ja lisätään etanolia niin, että liuosta on yksi litra. Liuosta
säilytetään tiiviisti suljetuissa, tummasta lasista valmistetuissa pulloissa
(etanoli95 % V/V).
4.2 Etyylieetteri, analyysilaatua.4.3 Vedetön natriumsulfaatti, analyysilaatua.
4.4 Silikageelillä päällystetyt lasilevyt, paksuudeltaan 0,25 mm, ilman fluor-
esenssi-indikaattoria (voidaan ostaa käyttövalmiina).
4.5 Kaliumhydroksidin 0,2 N etanoliliuos: liuotetaan 13 g kaliumhydrok-
sidia 20 ml:aan tislattua vettä ja lisätään etanolia niin, että liuosta on
yksili tra.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 36
▼B
4.6 Bentseeni, kromatografiaa varten (5.2.2).
4.7 Asetoni, kromatografiaa varten (5.2.2).4.8 Heksaani, kromatografiaa varten (5.2.2).4.9 Etyylieetteri, kromatografiaa varten (5.2.2).4.10 Puhdas kloroformi, analyysilaatua (5.2.2).4.11 Ohutkerroskromatografian vertailuliuos: ►
M62 prosenttinen ◄koles-
terolin tai fytosterolin kloroformiliuos.
4.12 2,7-dikloorifluoreseiini, 0,2-prosenttinen etanoliliuos. Liuos tehdään
lievästi emäksiseksi lisäämällä muutama tippa kaliumhydroksidin 2 N
alkoholiliuosta.
4.13 Vedetön pyridiini, kromatografiaa varten.4.14 Heksametyylidisilatsaani.4.15 Trimetyylikloorisilaani.
4.16 Sterolien trimetyylisilyylieettereiden standardiliuokset. Ne valmistetaan
vasta käyttöhetkellä steroleista, jotka saadaan niitä sisältävistä öljyistä.
4.17 α-kolestanoli 0,2-prosenttisena (m/V) kloroformiliuoksena (sisäinen
standardi).
4.18 Kantajakaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua.4.19 Apukaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua.
5 MENETTELY
5.1 Saippuoitumattomien aineiden esikäsittely
5.1.1 250 ml:n pulloon lisätään 500 ml:n mikroruiskulla sellainen tila-
vuusmäärä 0,2-prosenttista α-kolestanolin kloroformiliuosta (4.17) jonka
sisältämä α-kolestanolin määrä on noin 10 % sterolin määrästä siinä
osanäytteessä, joka on pullossa määritettävänä. Esimerkiksi 5 gramman
oliiviöljynäytteeseen lisätään 500 µl 0,2-prosenttista α-kolestanoliliuosta,
ja jos näytteenä on ►
M6 ◄uutettua oliiviöljyä, lisätään
1 500 µl α-kolestanolia.
Haihdutetaan kuiviin typpivirrassa ja punnitaan tarkalleen 5 g kuivattua,
suodatettua näytettä samaan pulloon.
►M6 ◄Öljyt, jotka sisältävät paljon kolesterolia,
voivat tuottaa piikin, jonka retentioaika on sama kuin kolestanolin. Jos
käy näin, sterolifraktio on määritettävä kahdesti niin, että toisella kertaa
käytetään sisäistä standardia ja toisella ei ►M6taikäyttää kolestanoli n
sijasta betulinolia ◄.
5.1.2 Lisätään 50 ml kaliumhydroksidin 2 N etanoliliuosta, käynnistetään
palautusjäähdytin ja kuumennetaan vesihauteessa hiljalleen kiehuvaksi
koko ajan voimakkaasti sekoittaen, kunnes saippuoituminen on tapah-
tunut (liuos kirkastuu). Kuumentamista jatketaan vielä 20 minuuttia,
sitten lisätään 50 ml tislattua vettä jäähdyttimen yläpäästä, irrotetaan
jäähdytin ja jäähdytetään pullo noin 30 ºC:n lämpötilaan.
5.1.3 Pullon sisältämä seos siirretään kvantitatiivisesti 500 ml:n erotussuppi-
loon käyttäen huuhteena yhteensä noin 50 ml tislattua vettä. Lisätään
noin 80 ml etyylieetteriä, ravistetaan voimakkaasti noin 30 sekunnin
ajan ja annetaan seistä niin, että kerrokset erottuvat (Huom. 1).
Pohjalla oleva vesifaasi siirretään toiseen erotussuppiloon. Vesifaasi
uutetaan vielä kaksi kertaa samalla tavoin käyttäen 60—70 ml etyylieet-
teriä kummallakin kerralla.
Huom. 1 Mahdollinen emulsio voidaan hajottaa lisäämällä pieni määrä
etanolia tai metanolia suihkeena.
5.1.4 Kaikki eetteriuutteet yhdistetään yhteen erotussuppiloon ja pestään tisla-
tulla vedellä (50 ml kerralla), kunnes pesuvesion neutraali a.
Kun pesuvesi on poistettu, eetteriuutteet kuivataan vedettömällä
natriumsulfaatilla, suodatetaan vedettömän natriumsulfaatin läpi etukä-
teen punnittuun 250 ml:n pulloon ja pestään suppilo ja suodatin pienillä
määrillä etyylieetteriä.
5.1.5 Eetteriä haihdutetaan niin, että sitä on ainoastaan muutama millilitra,
jäännös kuivataan sitten pienessä alipaineessa tai typpivirrassa ja lopuksi
kuivataan lämpökaapissa, jonka lämpötila on 100 ºC, noin 15 minuutin
ajan, jäännös jäähdytetään eksikkaattorissa ja punnitaan.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 37
▼B
5.2 Sterolifraktion erottaminen
5.2.1 Emäksisten levyjen valmistelu: upotetaan silikageelilevyt (4.4) kokonaan
kaliumhydroksidin 0,2 N etanoliliuokseen (4.5) kymmeneksi sekunniksi,
minkä jälkeen niiden annetaan kuivua kaksi tuntia vetokaapissa ja
lopuksiyksitunti100 ºC:ssa lämpökaapi ssa.
Kun levyt on otettu lämpökaapista, niitä säilytetään kalsiumkloridia
sisältävässä eksikkaattorissa käyttöhetkeen saakka (näin käsitellyt levyt
on käytettävä 15 päivän kuluessa).
Huom. 2 Kun sterolifraktion erottamiseen käytetään emäksisiä silikagee-
lilevyjä, ei ole tarpeen käsitellä saippuoitumattomia aineita
alumiinioksidilla. Näin kaikki happamat aineet (rasvahapot jamuut hapot) jäävät lähtöviivalle. Sterolivyöhyke erottuu
selvästi alifaattisten ja terpeenisten alkoholien vyöhykkeestä.
5.2.2 Bentseeni-asetoniseosta (95:5, V/V) kaadetaan kehitysastiaan niin, että
sitä on noin 1 cm. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää heksaani-etyylieet-
teriseosta (65:35, V/V). Kehitysastia suljetaan sopivalla kannella ja
annetaan seistä avaamatta vähintään puoli tuntia, jotta syntyy neste-
höyrytasapaino. Astian sisäseinille voidaan kiinnittää suodatinpaperisui-
kaleita, jotka ulottuvat eluointiaineeseen. Tämä lyhentää kehitysaikaa
lähes kolmanneksella ja aineosat eluoituvat tasaisemmin.
Huom. 3 Kehitysliuos on vaihdettava uuteen ennen jokaista koetta, jotta
eluointiolosuhteet olisivat täysin toistettavissa.
5.2.3 Saippuoitumattomista aineista (5.1.5) valmistetaan noin 5-prosenttinen
kloroformiliuos, jota levitetään 0,3 ml kromatografialevylle (5.2.1)
mahdollisimman ohuena ja tasaisena nauhana 100 ml:n mikroruiskulla
noin 2 cm:n päähän levyn reunasta. Asetetaan 2—3 ml sterolien vertai-
luliuosta (4.11) lähtöviivan tasalle levyn reunaan niin että sterolivyöhyke
voidaan tunnistaa kehityksen jälkeen.
5.2.4 Levy asetetaan kehitysastiaan, joka on valmisteltu 5.2.2 kohdan ohjeiden
mukaan. Ympäristön lämpötilan on oltava 15—20 ºC. Astian kansi
suljetaan heti ja annetaan levyn eluoitua, kunnes liuotinrintama on siir-
tynyt noin 1 cm:n päähän levyn yläreunasta. Levy otetaankehitysastiasta ja liuotin haihdutetaan kuumassa ilmavirrassa tai pane-
malla levy joksikin aikaa vetokaappiin.
5.2.5 Levylle suihkutetaan ohuelti ja tasaisesti 2,7-dikloorifluoreseiiniliuosta.
Sterolivyöhyke voidaan tunnistaa ultraviolettivalossa siitä, että se on
samassa kohdassa kuin vertailuliuoksen vyöhyke. Vyöhykkeen ääriviivat
merkitään mustalla kynällä fluoresenssin rajoja seuraten.
5.2.6 Silikageelikerros raaputetaan rajatulta alueelta metallilastalla. Saatu
aines hienonnetaan, siirretään suodatinsuppiloon (3.7), lisätään 10 ml
kuumaa kloroformia, sekoitetaan huolellisesti metallilastalla ja suodate-
taan suodatinsuppiloon liitettyyn pulloon (3.8) tyhjiöllä.
Suppiloon jäänyt aines pestään kolme kertaa noin 10 ml:lla etyylieet-
teriä, ja suodos kerätään suodatinsuppiloon liitettyyn pulloon. Suodosta
haihdutetaan, kunnes sen tilavuus on noin 4—5 ml ja jäännösliuos
kaadetaan etukäteen punnittuun 10 ml:n koeputkeen (3.9). Liuosta
kuivataan alhaisella lämmöllä kevyessä typpivirrassa; jäännös liuotetaan
muutamaan tippaan asetonia, kuivataan jälleen ja pidetään kymmenisen
minuuttia 105 ºC:ssa lämpökaapissa, jäähdytetään eksikkaattorissa ja
punnitaan.
Koeputkessa oleva jäännös sisältää sterolifraktion.
5.3 Trimetyylisilyylieettereiden valmistus
5.3.1 Koeputkessa olevaan sterolifraktioon lisätään silylointireagenssia, jossa
on pyridiiniä, heksametyylidisilatsaania ja trimetyylikloorisilaania tila-
vuussuhteessa 9:3:1 (Huom. 4), 50 ml jokaista koeputkessa olevaa
sterolimilligrammaa kohti niin, että kosteutta ei pääse mukaan (Huom.
5).
Huom. 4 Käyttövalmiita liuoksia on kaupallisesti saatavana; lisäksi
muita silylointireagensseja, kuten esim. bistrimetyylisilyylitri-
fluoriasetamidi + 1 % trimetyylikloorisilaania; reagenssi
laimennetaan samalla määrällä vedetöntä pyridiiniä.
5.3.2 Koeputki suljetaan tulpalla, ravistetaan varovasti (ei ylösalaisin), kunnes
sterolit ovat täysin liuenneet. Annetaan seistä vähintään 15 minuuttia
huoneenlämmössä ja sentrifugoidaan sitten muutaman minuutin ajan;
kirkas liuos on nyt valmis kaasukromatografista määritystä varten.
Huom. 5 Lievä sameus on tavallista eikä ole haitaksi. Valkoiset hiuta-
leet tai vaaleanpunaiseksi värjäytyminen ovat merkkejä1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 38
▼B
kosteudesta tai reagenssien muuttumisesta. Jos näitä ilmenee,
koe on uusittava.
5.4 Kaasukromatografinen määritys
5.4.1 Esivalmistelut ja kolonnin valmistelu
5.4.1.1 Kapillaarikolonni asennetaan kaasukromatografialaitteistoon niin, että
kolonnin alkupää kiinnitetään höyrystimeen, joka on liitetty virtauksen-
jakojärjestelmään, ja kolonnin loppupää kiinnitetään detektoriin.
Tarkistetaan kaasukromatografisten laitteiden toiminta (kaasuliitännän
tiiviys, detektorin, virtauksenjakojärjestelmän ja piirturin toimivuus,
jne.)
5.4.1.2 Jos kapillaarikolonnia ei ole aikaisemmin käytetty, se on ensin valmis-
teltava käyttöön. Pieni määrä kaasua johdetaan kolonnin läpi,
käynnistetään kaasukromatografi ja aloitetaan asteittainen lämmittä-
minen, jota jatketaan, kunnes lämpötila on kohonnut vähintään 20 ºC
korkeammaksi kuin käyttölämpötila (Huom. 6). Korkeaa lämpötilaa
pidetään yllä vähintään kaksi tuntia, minkä jälkeen kromatografialait-
teisto saatetaan käyttövalmiiksi (kaasuvirran ja erotuksen säätö,
liekinsytytys, elektronisen piirturin kytkeminen, uunin lämpötilan säätö
kolonnia varten, detektorin ja injektorin säätö, jne.) ja signaalia rekis-
teröidään herkkyydellä, joka on vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin
määrityksessä käytettävä. Saadun perusviivan on oltava suora, eikä
siinä saa olla minkäänlaisia piikkejä eikä siirtymää mihinkään suuntaan.
Jos ilmenee negatiivista suoraviivaista siirtymää, se on merkki kolonnin
liitäntöjen vuodosta, ja jos ilmenee positiivista siirtymää, se johtuu
kolonnin riittämättömästä valmistelusta.
Huom. 6 Esivalmistelulämpötilan on aina oltava vähintään 20 ºC alempi
kuin käytetyn stationäärifaasin korkein lämpötila.
5.4.2 Toimintaolosuhteiden valinta
5.4.2.1 Käyttöolosuhteiden ohjearvot ovat seuraavat:
— kolonnin lämpötila: 260 ± 5 ºC,
— höyrystimen lämpötila: 280 ºC,— detektorin lämpötila: 290 ºC,— kantajakaasun lineaarinopeus: heliumille 20—35 cm/s ja vedylle
30—50 cm/s,
— jakosuhde: 1:50 — 1:100,
— laitteiston herkkyys: 4—16 kertaa vähimmäisvaimennus,— rekisteröintiherkkyys: 1—2 mV täydestä asteikosta,— paperin nopeus: 30—60 cm/h,— injektoidun aineen määrä: 0,5—1 ml TMSE-liuosta.
Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin
ominaisuuksien mukaan niin, että saadaan seuraavat vaatimukset
täyttävä kromatogrammi:
—β-sitosterolin retentioajan on oltava 20 ± 5 minuuttia,
— kampesterolin piikki: oliiviöljylle (pitoisuus keskimäärin 3 %)
15 ± 5 % täydestä asteikosta, soijaöljylle (pitoisuus keskimäärin
20 %) 80 ± 10 % täydestä asteikosta,
— kaikki mukana olevat sterolit on voitava erottaa toisistaan. Lisäksi
kunkin piikin jälkeen piirturin tulee palata perusviivalle ennen uuden
piikin alkua. Tämä ei ole kuitenkaan tarpeen, jos piikki TRR
1,02:ssa pystytään mittaamaan kohtisuoraan.
5.4.3 Määritys
5.4.3.1 Imetään 10 ml:n mikroruiskuun 1 ml heksaania, sitten 0,5 ml ilmaa ja
tämän jälkeen 0,5 ml—1 ml näyteliuosta; lopuksi männällä vedetään
vielä neula tyhjäksi. Neula työnnetään septumin läpi injektiopesään ja
1—2 sekunnin kuluttua seos injektoidaan nopeasti, odotetaan noin viisi
sekuntia, jonka jälkeen neula vedetään pois hitaasti.
5.4.3.2 Rekisteröintiä jatketaan, kunnes näytteessä olevien sterolien TMSE on
kokonaan eluoitunut.
Perusviivan on koko ajan oltava 5.4.1.2 kohdan vaatimusten mukainen.
5.4.4 Piikkien tunnistaminen
Yksittäiset piikit tunnistetaan niiden retentioajan perusteella sekä vertaa-
malla sterolien TMSE-seokseen, joka on määritetty samoissa
olosuhteissa.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 39
▼B
Sterolit eluoituvat seuraavassa järjestyksessä: kolesteroli, brassikasteroli,
24-metyleenikolesteroli, kampestroli, kampestanoli, stigmasteroli, ∆7-
kampesteroli, ∆5,23 -stigmastadienoli, klerosteroli, β-sitosteroli, sitosta-
noli, ∆5-avenasteroli, ∆5,24 -stigmastadienoli, ∆7-sigmastenoli, ∆7-
avenasteroli.
Sitosterolin retentioajat SE-52- ja SE-54-kolonneille on esitetty taulu-
kossa 1.
Kuvat 1 ja 2 esittävät eräiden öljyjen tyypillisiä kromatogrammeja.
5.4.5 Kvantitatiivinen arviointi
5.4.5.1 Lasketaan α-kolestanolin ja sterolien piikkien pinta-alat integraattorin
avulla. Sellaisten aineiden piikit, jotka eivät esiinny taulukossa 1,
jätetään huomiotta. α-kolestanolin vastekerroin on 1.
5.4.5.2 Lasketaan yksittäisten sterolien pitoisuus milligrammoina 100 g:ssa
rasvaa taiöljyä seuraavasta kaavasta:
x-steroli=Ax·ms· 100
As·m
jossa:
Ax= x-sterolin piikin pinta-ala ►M6 ◄;
As=α-kolestanolin piikin pinta-ala ►M6 ◄;
ms= lisätyn α-kolestanolin massa milligrammoina;
m = määritykseen käytetyn näytteen massa grammoina.
6 TULOSTEN ESITTÄMINEN
6.1 Ilmoitetaan yksittäisten sterolien pitoisuus milligrammoina 100 g:ssa
rasvaa tai öljyä ja niiden pitoisuuksien summa, ”kokonaissterolimäärä”.
6.2 Lasketaan yksittäisen sterolin prosenttiosuus sitä vastaavan piikin
suhteellisena osuutena kaikkien sterolipiikkien yhteenlasketusta pinta-
alasta.
x-sterolin prosenttiosuus =Ax
ΣA· 100
Jossa:
Ax= x:n piikin pinta-ala;
ΣA = kaikkien sterolien piikkien yhteenlaskettu pinta-ala.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 40
▼B
LISÄYS
Kaasun lineaarinopeuden määrittäminen
Kaasukromatografialaitteisto säädetään tavallisia käyttöolosuhteita vastaavaksi,
injektoidaan 1—3 ml metaania (tai propaania) ja mitataan aika, jonka kuluessa
kaasu kulkee kolonnin läpi, injektointihetkestä piikin muodostumiseen (tM).
Lineaarinopeus cm/s saadaan kaavasta L/tM, jossa L on kolonnin pituus senttime-
treinä ja tMon mitattu aika sekunteina.
Taulukko 1
Sterolien suhteelliset retentioajat
Piikki NimiSuhteellinen reten-
tioaika
Kolonni
SE 54Kolonni
SE 52
1 kolesteroli ∆-5-kolesten-3 β-oli0,67 0,63
2 kolestanoli5 α-kolestan-3 β-oli0,68 0,64
3 brassikasteroli [24S]-24-metyyli- ∆-5,22-kolestadien-3 β-oli0,73 0,71
4 24-metyleenikolesteroli 24-metyleeni- ∆-5,24-kolestadien-3 β-oli0,82 0,80
5 kampestroli[24R]-24-metyyli - ∆-5-kolesten-3 β-oli0,83 0,81
6 kampestanoli[24R]-24-metyyli -kolestan-3 β-oli0,85 0,82
7 stigmasteroli [24S]-24-etyyli- ∆-5,22-kolestadien-3 β-oli0,88 0,87
8 ∆-7-kampesteroli[24R]-24-metyyli - ∆-7-kolesten-3 β-oli0,93 0,92
9 ∆-5,23 stigmastadienoli [24R,S]-24-etyyli- ∆-5,23-kolestadien-3 β-oli0,95 0,95
10 klerosteroli[24S]-24-etyyli - ∆-5,25-kolestadien-3 β-oli0,96 0,96
11 β-sitosteroli [24R]-24-etyyli- ∆-5-kolestan-3 β-oli1,00 1,00
12 sitostanoli 24-etyyli-kolestan-3 β-oli1,02 1,02
13 ∆-5-avenasteroli [24Z]-24-etyylideeni-5-kolesten-3 β-oli1,03 1,03
14 ∆-5,24-stigmastadienoli [24R,S]-24-etyyli- ∆-5,24-kolestadien-3 β-oli1,08 1,08
15 ∆-7-stigmastenoli [24R,S]-24-etyyli- ∆-7,24-kolestadien-3 β-oli1,12 1,12
16 ∆-7-avenasteroli [24Z]-24-etyylideeni- ∆-7-kolesten-3 β-oli1,16 1,161991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 41
▼B
Kuva 1
Raakaoliiviöljyn sterolifraktion kaasukromatogrammi
1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 42
▼B
Kuva 2
Puhdistetun oliiviöljyn sterolifraktion kaasukromatogrammi
1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 43
▼B
LIITE VI
ERYTRODIOLI- JA UVAOLIPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN
JOHDANTO
Erytrodioli, jolla yleensä tarkoitetaan dioleja erytrodioli ja uvaoli yhdessä,
on joillekin rasvoille ja öljyille tyypillinen saippuoitumattoman osan aine.
Sen pitoisuus on selvästi kohonnut uutetussa oliiviöljyssä; puristetussa
oliiviöljyssä ja rypälesiemenöljyssä sitä on vähän, joten sen esiintyminen
voi olla merkki siitä, että joukkoon on lisätty uutettua oliiviöljyä.
1 TARKOITUS
Tällä menetelmällä voidaan määrittää rasvan tai öljyn erytrodiolipitoisuus.
2 PERIAATE
Rasva tai öljy saippuoidaan kaliumhydroksidin etanoliliuoksella. Saippuoi-
tumaton osa uutetaan etyylieetterillä ja puhdistetaan johtamalla se
alumiinioksidikolonnin läpi, minkä jälkeen saippuoitumattomat aineet
erotetaan silikageelilevyillä ohutkerroskromatografialla. Tällöin steroli- ja
erytrodiolifraktiovyöhykkeet erottuvat.
Levyltä saadut sterolit ja erytrodioli muutetaan trimetyylisilyylieettereiksi
ja määritetään kaasukromatografialla.
Tulos ilmoitetaan erytrodiolin prosenttiosuutena erytrodiolin ja sterolien
seoksesta.
3 VÄLINEISTÖ
3.1 Sama kuin liitteessä V (Sterolien määritys).
4 REAGENSSIT
4.1 Samat kuin liitteessä V (Sterolien määritys).4.2 Vertailuliuoksena erytrodiolin 0,5-prosenttinen kloroformiliuos.
5 SUORITUS
5.1 Saippuoitumattoman osan esikäsittely.
Kuten liitteessä V olevassa 5.1.2 kohdassa.
5.2 Erytrodiolin ja sterolien erottaminen.
5.2.1 Ks. menettely liitteessä V olevassa 5.2.1 kohdassa.
5.2.2 Ks. sama menettely liitteessä V olevassa 5.2.2 kohdassa.5.2.3 Valmistetaan saippuoitumattomasta aineksesta 5-prosenttinen kloroformi-
liuos.
Levitetään 0,3 ml liuosta mahdollisimman ohueksi ja tasaiseksi viivaksi
0,1 ml:n mikroruiskulla noin 1,5 cm:n päähän levyn alareunasta. Asete-
taan muutama mikrolitra erytrodioli- ja kolesteroliliuosta vertailua varten
levyn reunaan.
5.2.4 Asetetaan levy kehitysastiaan, joka on esikäsitelty kuten 5.2.1 kohdassa.
Ympäristön lämpötilan on oltava noin 20 ºC. Astia suljetaan heti kannella
ja annetaan eluoitua, kunnes liuotinrintama on noussut noin 1 cm:n päähän
levyn yläreunasta. Levy otetaan kehitysastiasta ja liuotin haihdutetaan
kuumassa ilmavirrassa.
5.2.5 Levylle suihkutetaan tasaisesti 2,7-dikloorifluoreseiiniliuosta. Kun levyä
tarkastellaan ultraviolettivalossa, sterolin ja erytrodiolin vyöhykkeet
voidaan tunnistaa kohdistamalla ne vertailuliuoksen vyöhykkeisiin.
Vyöhykkeet merkitään pisteellä, joka on juuri fluoresenssialueen reunojen
ulkopuolella.
5.2.6 Silikageeli raaputetaan levystä irti metallilastalla merkityn alueen
kohdalta. Irrotettu aines pannaan 50 ml:n pulloon. Lisätään 15 ml kuumaa
kloroformia, ravistetaan hyvin ja suodatetaan suppilon läpi, jossa on
huokoinen suodatin, johon silikageeli jää. Pestään kolme kertaa kuumalla
kloroformilla (noin 10 ml kerralla) ja kerätään suodos 100 ml:n pulloon.
Suodosta haihdutetaan, kunnes sitä on 4—5 ml, siirretään se punnittuun,1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 44
▼B
kartiomaisella pohjalla varustettuun 10 ml:n sentrifugiputkeen, kuivatetaan
typpivirrassa miedolla lämmöllä ja punnitaan.
5.3 Trimetyylisilyylieetterien valmistus
Kuten liitteessä V olevassa 5.3 kohdassa.
5.4 Kaasukromatografinen määritys
Kuten liitteessä V olevassa 5.4 kohdassa.Kaasukromatografisen määrityksen olosuhteiden on oltava sellaiset, että
ne täyttävät sterolien määritysvaatimukset ja että lisäksi erytrodiolin ja
uvaolin TMSE:t erottuvat.
Kun näyte on injektoitu, rekisteröintiä jatketaan, kunnes näytteessä olevat
sterolit, erytrodioli ja uvaoli ovat kokonaan eluoituneet. Tämän jälkeen
tunnistetaan piikit (erytrodiolin ja uvaolin retentioajat ovat noin 1,45 ja
1,55 suhteessa β-sitosteroliin) ja piikkien pinta-alat lasketaan kuten stero-
leille.
6 TULOSTEN ESITTÄMINEN
Erytrodioli % =A
1+A2
A1+A2+ΣAsterolit× 100
Jossa:
A1= erytrodiolin piikin pinta-ala ►M6 ◄;
A2= uvaolin piikin pinta-ala ►M6 ◄;
ΣAsterolit= sterolien piikkien yhteenlaskettu pinta-ala
►M6 ◄;
Tulos ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 45
▼B
LIITE VII
TRIGLYSERIDIN 2-ASEMASSA OLEVIEN TYYDYTTYNEIDEN
RASVAHAPPOJEN MÄÄRITTÄMINEN
1 TARKOITUS
Tämä standardi kuvaa menetelmän, jolla määritetään sellaiset rasvojen ja
öljyjen rasvahapot, jotka ovat esteröityneet glyserolin 2-hiileen (keskim-
mäinen).
2 SOVELTAMISALA
Tätä menetelmää voidaan käyttää tutkittaessa öljyjä tai rasvoja, joiden
sulamispiste on alle 45 ºC, mikä johtuu haimalipaasin vaikutuksen erityis-
piirteistä.
Tämä menetelmä eisovellu varauksetta sellai sten rasvojen taiöljyjen
määritykseen, joiden rasvahapot sisältävät runsaasti enintään 12 hiiliatomia
sisältäviä rasvahappoja (kookosöljy ja palmunydinöljy, voirasva), voimak-
kaasti tyydyttymättömien rasvahappojen määritykseen (kaksoissidoksia on
enemmän kuin neljä) tai rasvahappojen määritykseen, jotka sisältävät
vähintään 20 hiiliatomia (kalojen ja merieläinten öljyt), eikä sellaisten
rasvahappojen määritykseen, jotka sisältävät muita happipitoisia ryhmiä
kuin happoryhmän.
3 PERIAATE
Rasva tai öljy neutraloidaan tarvittaessa liuottimessa. Rasva tai öljy
puhdistetaan johtamalla se alumiinioksidikolonnin läpi. Triglyseridit
hydrolysoidaan osittain haimalipaasin avulla määräajassa. Muodostuneet
monoglyseridit erotetaan ohutkerroskromatografialla ja esteröidään meta-
nolilla. Syntyneet metyyliesterit määritetään kaasunestekromatografialla.
4 VÄLINEISTÖ
4.1 Pullo, 100 ml.4.2 Pullo, 25 ml, jossa hios.4.3 Ilmajäähdytin, 1 m:n pituinen, sopii 4.2 kohdassa mainittuun pulloon.
4.4 Erlenmeyerpullo, 250 ml.
4.5 Dekantterilasi, 50 ml.4.6 Erotussuppilo, 500 ml.4.7 Lasikolonni kromatografiaa varten (sisähalkaisija 13 mm, pituus 400 mm),
varustettuna sintterilasilevyllä ja hanalla.
4.8 Sentrifugiputki, 10 ml, jossa hiottu lasitulppa.4.9 Byretti, 5 ml, jakoväli 0,05 ml.4.10 Injektioruisku, 1 ml, jossa ohut neula.4.11 Mikroruisku, josta saadaan 3—4 ml:n pisaroita.
4.12 Levitin ohutkerroskromatografiaa varten.
4.13 Lasilevyjä (20 × 20 cm) ohutkerroskromatografiaa varten.4.14 Lasinen kehitysastia, johon 20 × 20 cm:n levyt mahtuvat ja jossa on hiottu
lasikansi, ohutkerroskromatografiaa varten.
4.15 Sumutin ohutkerroskromatografiaa varten.
4.16 Uuni, jonka lämpötila on säädetty 103 ± 2 ºC:seen.4.17 Termostaatti, jota voidaan säätää 30—45 ºC:seen ja jonka tarkkuus on
0,5 ºC.
4.18 Kiertohaihdutin.
4.19 Sähkökäyttöinen värisevä ravistin, joka pystyy sekoittamaan voimakkaasti
sentrifugiputkea.
4.20 Ultraviolettivalo levyjen tarkastelua varten.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 46
▼B
Lipaasin aktiivisuuden mittaamiseksi:
4.21 pH-mittari.4.22 Spiraalisekoitin.
4.23 Byretti, 5 ml.
4.24 Sekuntikello.
Lipaasin mahdollista valmistusta varten:
4.25 Laboratoriosekoitin, joka soveltuu heterogeenisten aineiden dispergointiin
ja sekoittamiseen.
5 REAGENSSIT
5.1 n-heksaani tai sen puuttuessa petrolieetteri (kiehumispiste 30—50 ºC),
kromatografista laatua.
5.2 2-propanoli (tai etanoli), 95 % (V/V), analyysilaatua.
5.3 2-propanoli (tai etanoli), 1:1 vesiliuos.
5.4 Dietyylieetteri, joka ei sisällä peroksideja.
5.5 Asetoni.5.6 Muurahaishappo, vähintään 98 % (m/m).
5.7 Kehitysliuos: n-heksaania (5.1), dietyylieetteriä (5.4) ja muurahaishappoa
(5.6) suhteessa 70:30:1 (V/V/V).
5.8 Alumiinioksidi, aktivoitu, kromatografiaa varten, neutraalia, Brockmann I-
laatua.
5.9 Piidioksidijauhe, jossa sidosaine, ohutkerroskromatografiaan soveltuvaa
laatua.
5.10 Haimalipaasi, sopivaa laatua (Huomautukset 1 ja 2).
5.11 Natriumhydroksidi, 120 g/l vesiliuos.5.12 Suolahappo, 6 N vesiliuos.
5.13 Kalsiumkloridi (CaCl
2), 220 g/l vesiliuos.
5.14 Natriumkolaatti (entsymaattista laatua), 1 g/l vesiliuos.
5.15 Puskuriliuos: lisätään suolahappoa (5.12) tri-hydroksimetyyliaminome-
taanin 1 M vesiliuokseen, kunnes pH on 8 (tarkistetaan potentiometrillä).
5.16 Fenoliftaleiiniliuos (10 g/l) 95 % (V/V) etanolissa.
5.17 2,7-dikloorifluoreseiiniliuos (2 g/l) 95 % (V/V) etanolissa, joka tehdään
lievästi emäksiseksi lisäämällä yksi tippa 1 N natriumhydroksidiliuosta
100 ml:aa kohti.
Lipaasin aktiivisuuden määrittämiseksi:
5.18 Neutraloitua öljyä.5.19 Natriumhydroksidi, 0,1 N vesiliuos.
5.20 Natriumkolaatti (entsymaattista laatua), 200 g/l vesiliuos.
5.21 Arabikumi, 100 g/l vesiliuos.
6 NÄYTTEEN ESIKÄSITTELY
Jos näytteen happamuus on alle 3 % liitteen II mukaisesti määritettynä,
näyte puhdistetaan alumiinioksidilla suoraan 6.2. kohdan mukaan.
Jos happamuus on yli 3 % liitteen II mukaisesti määritettynä, näyte neutra-
loidaan ensin emäksellä liuottimen kanssa 6.1. kohdan mukaisesti ja
puhdistetaan sitten alumiinioksidilla 6.2. kohdan mukaisesti.
6.1Emäksellä neutraloiminen liuottimen kanssa
Pannaan erotussuppiloon (4.6) noin 10 g käsittelemätöntä öljyä ja lisätään
100 ml heksaania (5.1), 50 ml 2-propanolia (5.2), muutama tippa fenolifta-
leiiniliuosta (5.16) ja sellainen määrä natriumhydroksidiliuosta (5.11), joka
vastaa öljyn vapaata happamuutta lisättynä 0,3 %:lla.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 47
▼B
Ravistetaan voimakkaasti yhden minuutin ajan, lisätään 50 ml tislattua
vettä, ravistetaan uudelleen ja annetaan seistä.
Kun erottuminen on tapahtunut, pohjalla oleva saippuoitunut kerros poiste-
taan. Myös välikerrokset (liimamaiset ja liukenemattomat aineet)
poistetaan. Neutraloidun öljyn heksaaniliuos pestään useilla peräkkäisillä
2-propanolin liuoserillä (5.3) käyttäen 25—30 ml kerralla, kunnes fenolif-
taleiinin vaaleanpunainen väri katoaa.
Poistetaan suurin osa heksaania höyrystämällä tyhjiössä käyttäen kierto-
haihdutinta (4.18), kuivatetaan öljy tyhjiössä 30—40 ºC:n lämpötilassa
puhtaan typpivirran avulla, kunnes heksaani on kokonaan haihtunut.
6.2Puhdistaminen alumiinioksidilla
Valmistetaan suspensio, jossa on 15 g aktivoitua alumiinioksidia (5.8) ja
50 ml heksaania (5.1) ja kaadetaan se koko ajan sekoittaen kromatografia-
kolonniin (4.7).
Alumiinioksidin annetaan laskeutua tasaiseksi kerrokseksi ja liuottimen
annetaan valua niin, että sitä on noin 1—2 mm absorboimisaineen yläpuo-
lella. Pylvääseen kaadetaan varovastili uos, jossa on 5 g öljyä ja 25 ml
heksaania (5.1). Kolonnista valuva neste kerätään pyöreäpohjaiseen
pulloon (4.1).
7 KROMATOGRAFIALEVYJEN ESIKÄSITTELY
Lasilevyt (4.13) puhdistetaan huolellisesti etanolilla, petrolieetterillä ja
asetonilla, jotta pinta olisi täysin rasvaton.
Punnitaan 30 g piidioksidijauhetta (5.9) erlenmeyerpulloon (4.4). Lisätään
60 ml tislattua vettä. Suljetaan tulpalla ja ravistetaan voimakkaasti yhden
minuutin ajan. Siirretään suspensio välittömästi levittimeen (4.12) ja levi-
tetään puhtaille levyille noin 0,25 mm paksu kerros.
Levyjä kuivatetaan ilmassa 15 minuuttia ja sitten lämpökaapissa (4.16)
103 ± 2 ºC:ssa tunnin ajan.
Levyt jäähdytetään eksikkaattorissa huoneenlämpöisiksi ennen käyttöä.Käyttövalmiita levyjä on myös kaupallisesti saatavana.
8 SUORITUS
8.1Hydrolyysi haimalipaasin avulla
Punnitaan noin 0,1 g valmista näytettä sentrifugiputkeen (4.8). Jos näyte
on kiinteää rasvaa, se liuotetaan 0,2 ml:aan heksaania, jota tarvittaessa
lämmitetään hieman.
Putkeen lisätään 20 ml lipaasia (5.10) ja 2 ml puskuriliuosta (5.15). Ravis-
tetaan hyvin, mutta varovaisesti, ja lisätään sitten 0,5 ml
natriumkolaattiliuosta (5.14) ja 0,2 ml kalsiumkloridiliuosta (5.13). Putki
suljetaan hiotulla tulpalla, ravistetaan varovasti niin, että tulppa ei pääse
kastumaan ja asetetaan putki heti termostaattiin (4.17), jonka lämpötila on
40 ± 0,5 ºC. Ravistetaan käsin tasan yhden minuutin ajan. Putki otetaan
termostaatista ja sitä ravistetaan voimakkaasti sähkökäyttöisellä ravisti-
mella (4.19) tasan kaksi minuuttia. Jäähdytetään välittömästi juoksevalla
vedellä; lisätään 1 ml suolahappoa (5.12) ja 1 ml dietyylieetteriä (5.4).Suljetaan tulpalla ja ravistetaan voimakkaasti sähkökäyttöisellä ravisti-
mella. Annetaan seistä ja poistetaan orgaaninen kerros ruiskulla (4.10)
sentrifugoinnin jälkeen, jos se on tarpeen.
8.2Monoglyseridien erottaminen ohutkerroskromatografialla
Uute asetetaan kromatografialevylle mikroruiskun (4.11) avulla mahdolli-
simman ohuena ja tasaisena kerroksena noin 1,5 cm:n päähän levyn
alareunasta, niin kapeana viivana kuin mahdollista. Levy asetetaan kehity-
sastiaan (4.14), joka on hyvin kyllästetty, ja annetaan kehittyä
kehitysliuoksessa (5.7) noin 20 ºC:ssa, kunnes rintama on noussut noin
1 cm:n päähän levyn yläreunasta.
Levy kuivatetaan ilmassa kehitysastian lämpötilassa ja sille suihkutetaan
2,7-dikloorifluoreseiiniliuosta (5.17). Monoglyseridivyöhyke tunnistetaan
(R
fnoin 0,035) ultraviolettivalossa (4.20).1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 48
▼B
8.3Monoglyseridien määrittäminen kaasunestekromatografialla
Raaputetaan lastalla irti vyöhyke, joka erottui 8.2 kohdassa (välttäen otta-
masta mukaan ainesta, joka on jäänyt lähtöviivalle), ja kerätään se
metylointipulloon (4.2).
Raaputettua piidioksidia käsitellään suoraan menetelmällä, joka on kuvattu
liitteessä X B olevassa 4.1 kohdassa siten, että monoglyseridit muuttuvat
metyyliestereiksi; tämän jälkeen esterit tutkitaan kaasukromatografialla liit-
teessä X A kuvatulla tavalla.
9 TULOSTEN ESITTÄMINEN
Lasketaan 2-asemassa olevien rasvahappojen määrä yhden desimaalin tark-
kuudella (Huom. 3).
10 HUOMAUTUKSIA
Huom. 1 Lipaasin aktiivisuuden tarkistaminen.
Valmistetaan öljyemulsio sekoittamalla 165 ml arabikumiliuosta
(5.21), 15 g jäämurskaa ja 20 ml neutraloitua öljyä (5.18) ravis-
taen sopivalla sekoittimella.
Mitataan 10 ml tätä emulsiota dekantterilasiin (4.5), lisätään
0,3 ml natriumkolaattiliuosta (5.20) ja lopuksi 20 ml tislattua
vettä. Lasi asetetaan termostaattiin, jonka lämpötila on 37 ± 0,5 ºC
(Huom. 4). Upotetaan pH-mittarin (4.21) elektrodit nesteeseen ja
spiraalisekoitin (4.22) käynnistetään. Sen jälkeen lisätään
natriumhydroksidiliuosta (5.19) tipoittain byretin (4.23) avulla,
kunnes pH on 8,5.
Lisätään sopiva määrä lipaasivesisuspensiota (ks. jäljempänä).
Heti kun pH on 8,3, sekuntikello (4.24) käynnistetään ja aloite-
taan natriumhydroksidiliuoksen (5.19) tiputtaminen sellaisella
nopeudella, että pH pysyy koko ajan 8,3:ssa. Emäsliuoksen
kulutus luetaan joka minuutti.
Havainnot kirjataan graafisesti koordinaatistoon, jossa x-akselilla
on aika ja y-akselilla on pH:n säilyttämiseen tarvittavan
emäsliuoksen määrä millilitroina.
Tuloksena pitäisi olla suora.
Edellä mainittu lipaasisuspensio on 1:1 000 (m/m) suspensio
vedessä. Jokaista koetta varten olisi käytettävä sellainen määrä
tätä suspensiota, että emäsliuosta kuluu noin 1 ml 4—5 minuu-
tissa.
Tavallisesti tarvitaan noin 1—5 mg jauhetta.
Lipaasiyksikkö on se määrä entsyymiä, joka tarvitaan vapautta-
maan 10 mikroekvivalenttia happoa minuutissa. Näin saadaan
käytetyn jauheen aktiivisuus A, lipaasiyksikköinä mg:aa kohti,
kaavasta:
A¼V/C210
m
jossa:
V = natriumhydroksidiliuoksen (5.19) kulutus minuutissa suor-
alta laskettuna
m = jauhenäytteen massa milligrammoina.
Huom. 2 Lipaasin valmistus.
Lipaaseja, joiden aktiivisuus on tyydyttävä, voidaan ostaa
valmiina. On myös mahdollista valmistaa niitä laboratoriossa
seuraavasti:
Jäähdytetään 5 kg tuoretta sian haimaa 0 ºC:seen, poistetaan
ympäröivä kiintorasva ja kalvot ja jauhetaan sekoittimessa niin,
että syntyy tahnamainen neste. Tahnaan lisätään 2,5 l vedetöntä
asetonia ja sekoitetaan sekoittimella (4.25) 4—6 tuntia, minkä
jälkeen liuos sentrifugoidaan. Jäännöstä uutetaan vielä kolme
kertaa samalla tilavuusmäärällä asetonia, sitten kaksi kertaa
asetonin ja dietyylieetterin seoksella 1:1 (V/V) ja kaksi kertaa
dietyylieetterillä.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 49
▼B
Jäännös kuivataan tyhjiössä 48 tuntia, jotta saadaan stabiili jauhe,
jota on säilytettävä jääkaapissa.
Huom. 3 Kaikissa tapauksissa on suositeltavaa, että samasta näytteestä
määritetään aina rasvahappojen kokonaismäärä, koska tulosten
tulkintaa helpottaa, kun 2-asemassa olevien happojen määrää
voidaan verrata rasvahappojen kokonaismäärään.
Huom. 4 Kun käytetään nestemäistä öljyä, hydrolyysin lämpötilaksi
säädetään 37 ºC. Kun tutkitaan näytettä, se säädetään kuitenkin
40 ºC:seen, jotta voitaisiin tutkia kaikkia rasvoja, joiden sulamis-
piste on enintään 45 ºC.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 50
▼M20
▼B
LIITE IX
SPEKTROFOTOMETRINEN MÄÄRITYS
JOHDANTO
Spektrofotometrinen määritys ultraviolettivalossa antaa tietoa rasvan
laadusta, sen säilymisestä ja muutoksista, joita käsittelyt ovat siinä aiheutta-
neet.
Tässä menetelmässä käytetyillä aallonpituuksilla tapahtuva absorptio johtuu
konjugoiduista dieeni-ja trieenijärjestelmistä. Nämä absorptiot ilmaistaan
ominaisekstinktiona (ekstinktio, joka tapahtuu tiettyyn liuottimeen valmis-
tetun 1-prosenttisen rasvaliuoksen 1 cm:n paksuisessa kerroksessa), josta
tavallisesti käytetään merkkiä K (nimitetään myös ”ekstinktiokertoimeksi”).
1 TARKOITUS
Tällä menetelmällä voidaan tutkia rasvoja spektrofotometrisesti ultravioletti-
valossa.
2 PERIAATE
Rasva liuotetaan määrättyyn liuottimeen ja liuoksen ekstinktio mitataan
tietyllä aallonpituudella käyttäen vertailuliuoksena puhdasta liuotinta. Yksit-
täiset ekstinktiot lasketaan spektrofotometrin lukemista.
3 VÄLINEISTÖ
3.1 Spektrofotometri, joka mittaa ekstinktion ultraviolettivalossa aallonpituuk-
silla 220—360 nm, yhden nanometrin tarkkuudella.
3.2 Suorakaiteen muotoisia kvartsikyvettejä kansineen, optinen väli 1 cm.
Vedellä tai muulla sopivalla liuottimella täytettynä kyvettien antamien luke-
mien ero saa olla enintään 0,01 ekstinktioyksikköä.
3.3 Mittapulloja, 25 ml.
3.4 Kromatografiakolonni, jonka yläosan pituus on 270 mm ja halkaisija 35 mm
ja jonka alaosan pituus on 270 mm ja halkaisija 10 mm.
4 REAGENSSIT
4.1 Iso-oktaani (2,2,4—trimetyylipentaani), spektrofotometristä laatua: verrat-
tuna tislattuun veteen sen läpäisysuhteen on oltava vähintään 60 %
aallonpituudella 220 nm ja vähintään 95 % aallonpituudella 250 nm, tai
— sykloheksaani, spektrofotometristä laatua: tislattuun veteen verrattuna
sen läpäisysuhteen on oltava vähintään 40 % 220 nm:ssä ja vähintään
95 % 250 nm:ssä.
4.2 Emäksistä alumiinioksidia kromatografiakolonnia varten; esikäsittely ja
tarkistus kuvataan lisäyksessä 1.
4.3 n-heksaani, kromatografiaa varten.
5 MENETTELY
5.1 Näytteen tulee olla täysin homogeenista eikä siinä saa olla suspendoituneita
epäpuhtauksia. Öljyt, jotka ovat huoneenlämmössä nestemäisiä, suodatetaan
paperin läpi noin 30 ºC:ssa, kiinteät rasvat homogenoidaan ja suodatetaan
lämpötilassa, joka ei saa olla yli 10 ºC korkeampi kuin niiden sulamispiste.
5.2 Punnitaan noin 0,25 g näytettä, joka on esikäsitelty edellä kuvatulla tavalla,
25 ml:n mittapulloon, joka täytetään liuottimella ja homogenoidaan.
Syntyvän liuoksen on oltava täysin kirkasta. Jos ilmenee sameutta tai
sakkaa, liuos suodatetaan nopeasti paperin läpi.
5.3 Kyvetti täytetään saadulla liuoksella ja ekstinktiot mitataan sopivalla aallon-
pituudella 232—276 nm; käytetty liuotin toimii vertailuliuoksena.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 51
▼M6
▼B
▼M6
▼B
▼B
Saatujen ekstinktioarvojen on oltava 0,1—0,8; jollei tällaisia tuloksia saada,
koe on uusittava käyttäen vahvempia tai laimeampia liuoksia tarpeen
mukaan.
5.4 Kun on tarpeen määrittää ominaisekstinktio alumiinioksidilla tapahtuvan
puhdistamisen jälkeen, toimitaan seuraavasti: kromatografiakolonniin
pannaan 30 g emäksistä alumiinioksidia heksaaniin suspendoituna, adsor-
bentin annetaan laskeutua ja ylimääräinen heksaani poistetaan niin, että sitä
on noin 1 cm alumiinioksidin päällä.
Liuotetaan 10 g rasvaa homogenoituna ja suodatettuna 5.1 kohdan mukai-
sesti 100 ml:aan heksaania ja kaadetaan liuos kolonniin. Eluaatti kerätään
talteen ja liuotin haihdutetaan tyhjiössä alle 25 ºC:ssa.
Näin saatu rasva käsitellään välittömästi 5.2 kohdan mukaisesti.
6 TULOSTEN ESITTÄMINEN
6.1 Lasketaan ominaisekstinktiot (ekstinktiokertoimet) eri aallonpituuksilla seur-
aavasta kaavasta:
Kλ¼Eλ
c/C1s
jossa:
Kλ= ominaisekstinktio aallonpituudella λ;
Eλ= aallonpituudella λmitattu ekstinktio;
c = liuoksen väkevyys g/100 ml;s = kyvetin paksuus, cm
Tulokset ilmoitetaan kahden desimaalin tarkkuudella.
6.2 Oliiviöljyn spektrofotometrinen määritys ETY:n virallisissa asetuksissa
tarkoitetun virallisen menetelmän mukaan vaatii ominaisekstinktion
määrittämisen iso-oktaaniliuoksessa aallonpituuksilla 232 ja 270 nm ja
∆K:n laskemisen kaavasta:
∆K¼K
m/C0Km/C04þKmþ4
2
jossa Kmon ominaisekstinktio aallonpituudella m, maksimaalisen absorption
aallonpituuden ollessa noin 270 nm.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 52
▼B
LISÄYS I
Alumiinioksidin esikäsittely ja sen aktiivisuuden tarkistus
A.1.1 Alumiinioksidin esikäsittely
Etukäteen 380—400 ºC uunissa kolmen tunnin ajan kuivattu alumiiniok-
sidi asetetaan ilmatiiviiseen astiaan. Tislattua vettä lisätään suhteessa 5 ml/
100 g alumiinioksidia, astia suljetaan välittömästi, sitä ravistetaan useita
kertoja ja annetaan sitten seistä vähintään 12 tuntia ennen käyttöä.
A.1.2 Alumiinioksidin aktiivisuuden tarkistaminen
Esikäsitellään kromatografiakolonni 30 g:lla alumiinioksidia. Seurataan
5.4 kohdan ohjeita ja johdetaan kolonnin läpi seos, jossa on:
— 95 % neitsytoliiviöljyä, jonka ominaisekstinktio on alle 0,18 aallonpi-
tuudella 268 nm,
— 5 % maapähkinäöljyä, joka on käsitelty valkaisumaalla sen puhdis-
tuksen aikana ja jonka ominaisekstinktio on vähintään 4
aallonpituudella 268 nm.
Seos johdetaan kolonnin läpi ja jos sen ominaisekstinktio on yli 0,11
aallonpituudella 268 nm, alumiinioksidi on kelvollista; muutoin sen
hydrataatioastetta on lisättävä.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 53
▼B
LISÄYS II
Spektrofotometrin kalibrointi
A.2 Laitteisto tulee tarkistaa säännöllisesti (vähintään puolen vuoden välein),
sekä aallonpituuksien vastaavuuden että lukematarkkuuden suhteen.
A.2.1 Aallonpituuslukema voidaan tarkistaa joko elohopeahöyrylampulla tai
sopivien suodattimien avulla.
A.2.2 Valokennon ja valomonistimen antamat lukemat voidaan tarkistaa seuraa-
vasti: punnitaan 0,2 g spektrofotometrisesti puhdasta kaliumkromaattia ja
liuotetaan se 0,05 N kaliumhydroksidiliuokseen 1 000 ml:n mittapulloon
niin, että liuosta on 1 000 ml. Mitataan tasan 25 ml tätä liuosta 500 ml:n
mittapulloon ja täytetään pullo kaliumhydroksidiliuoksella.
Näin saadun liuoksen ekstinktio mitataan aallonpituudella 275 nm ja
käytetään kaliumhydroksidiliuosta vertailuliuoksena. Mitatun ekstinktion
on oltava 0,200 ± 0,005, kun käytetään 1 cm:n optista kyvettiä.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 54
▼B
LIITE X A
RASVAHAPPOJEN METYYLIESTEREIDEN MÄÄRITTÄMINEN
KAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ
1 SOVELTAMISALA
Tämä menetelmä antaa yleisohjeita kaasukromatografian käyttöön, kun
tarkoituksena on määrittää liitteessä X B kuvatulla menetelmällä saadun
rasvahappojen metyyliestereiden seoksen koostumus kvalitatiivisesti ja
kvantitatiivisesti.
Menetelmä ei sovellu polymeroitujen rasvahappojen tutkimiseen.
2 REAGENSSIT2.1 Kantajakaasu
Inertti kaasu (typpi, helium, argon, vety, jne.), huolellisesti kuivattu; ei
saa sisältää happea yli 10 mg/kg.
Huom. 1 Vety, jota voidaan käyttää kantajakaasuna ainoastaan kapil-
laarikolonneissa, kaksinkertaistaa määritysnopeuden, mutta
sen käyttö on vaarallista. Turvalaitteita on kuitenkin saatavana.
2.2 Apukaasut
2.2.1 Vety (puhtaus ≥99,9 %), ei saa sisältää orgaanisia epäpuhtauksia.
2.2.2 Ilmaa tai happea, ei saa sisältää orgaanisia epäpuhtauksia.
2.3 Vertailustandardi
Rasvahappojen puhtaiden metyyliestereiden seos tai sellaisen tunnetun
rasvan metyyliestereitä, jotka ovat mahdollisimman samanlaisia kuin
tutkittava rasva.
Monityydyttymättömien rasvahappojen hapettumista on vältettävä.
3 VÄLINEISTÖ
Tässä annetut ohjeet koskevat tavallista kaasukromatografista laitteistoa,
joko täytetyllä kolonnilla tai kapillaarikolonnilla varustettua, sekä liekki-
ionisaatiodetektoria. Muutkin laitteistot, jotka ovat yhtä tehokkaita ja
joiden erotuskyky on 4.1.2. kohdan mukainen, ovat sopivia.
3.1 Kaasukromatografi
Kaasukromatografissa on oltava seuraavat osat.
3.1.1 Injektiojärjestelmä
Käytetään injektiojärjestelmää, joka sopii:
a) täytettyyn kolonniin, jonka kuollut tilavuus on mahdollisimman pieni
(tässä tapauksessa injektiojärjestelmää tulee voida kuumentaa
20—50 ºC kolonnia korkeampaan lämpötilaan); tai
b) kapillaarikolonniin, jolloin sen on oltava erityisesti tähän käyttöön
suunniteltu. Järjestelmä voi olla jakajatyyppiä tai jakajaton, kolonniin
liitetty (on-column) injektori.
Huom. 2 Jos näytteessä on ainoastaan sellaisia rasvahappoja, joissa on
vähintään 16 hiiliatomia, voidaan käyttää liikkuvaa neulainjek-
toria.
3.1.2 Uuni
Uunin tulee pystyä lämmittämään kolonni vähintään 260 ºC:n lämpöti-
laan ja pitämään se valitussa lämpötilassa 1 ºC:n tarkkuudella, jos kyse
on täytetystä kolonnista, ja 0,1 ºC:n tarkkuudella, jos kyse on kapillaar-
ikolonnista. Viimeksimainittu vaatimus on erittäin tärkeä, jos käytetään
kvartsilasiputkea.
Lämpötilaohjelmoidun laitteen käyttöä suositellaan kaikissa tapauksissa
ja erityisesti rasvahapoille, joissa on alle 16 hiiliatomia.
3.1.3 Täytetty kolonni1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 55
▼B
3.1.3.1 Kolonni on valmistettu aineesta, joka ei reagoi tutkittavien aineiden
kanssa (esim. lasi tai ruostumaton teräs); kolonnin mitat ovat seuraavat:
a) pituus: 1—3 m. Pitkäketjuisten rasvahappojen (> C20) tutkimiseen
käytetään suhteellisen lyhyttä kolonnia. Tutkittaessa happoja, joissa
on 4—6 hiiliatomia, suositeltava kolonnin pituus on 2 m;
b) sisähalkaisija: 2—4 mm.
Huom. 3 Jos tutkittavana on monityydyttymättömiä happoja, joissa on
enemmän kuin kolme kaksoissidosta, ne saattavat hajota
kolonnissa, joka on ruostumatonta terästä.
Huom. 4 Voidaan myös käyttää järjestelmää, jossa on täytetty kaksois-
kolonni.
3.1.3.2 Täyte, joka koostuu seuraavista aineista:
a) tukiaine: happopestyä ja silanoitua piimaata tai muuta sopivaa,
inerttiä tukiainetta, jonka raekokojakauma on kapea (25 mm:n vaih-
telu 125 ja 200 mm:n välillä) niin, että keskimääräinen raekoko on
suhteessa kolonnin pituuteen ja sisähalkaisijaan;
b) stationäärifaasi: polyesterityyppinen polaarinen neste (esim. dietylee-
niglykolipolysukkinaatti, butaanidiolipolysukkinaatti,
etyleeniglykolipolyadipaatti jne.), syanosilikonit tai jokin muu neste,
joka saa aikaan kromatografisen erottumisen (ks. kohta 4). Stationää-
rifaasin osuuden on oltava 5—20 % (m/m) täytteestä. Joissakin
erotteluissa voidaan käyttää polaaritonta stationäärifaasia.
3.1.3.3 Kolonnin valmistelu
Kun kolonni on irrotettu detektorista, uuni kuumennetaan vähitellen
185 ºC:seen ja inerttikaasua johdetaan 20—60 ml minuutissa juuri
täytetyn kolonnin läpi, vähintään 16 tunnin ajan tässä lämpötilassa ja
sitten vielä kaksi tuntia 195 ºC:ssa.
3.1.4 Kapillaarikolonni3.1.4.1 Putki, joka on valmistettu analysoitaville aineille inertistä aineesta
(tavallisesti lasista tai kvartsilasista). Sisähalkaisijan on oltava
0,2—0,8 mm. Sisäpinta on käsiteltävä sopivalla menetelmällä (esim.
pintakäsittely, inaktivointi) ennen kuin se päällystetään stationäärifaasi-
kerroksella. Useimmissa tapauksissa riittävä pituus on 25 m.
3.1.4.2 Stationäärifaasi, pääasiassa polyglykolityyppiä [poly(etyleeniglykoli)
20 000], polyesterityyppiä (butaanidiolipolysukkinaatti) tai polaarista
polysiloksaanityyppiä (syanosilikonit). Kytketyt kolonnit (kolonniverkot)
ovat myös sopivia.
Huom. 5 On olemassa vaara, että polaariset polysiloksaanit vaikeuttavat
linoleenihapon ja C
20-happojen erottumista ja tunnistamista.
Päällysteen on oltava ohut, 0,1 — 0,2 mm.
3.1.4.3 Kolonnin kokoaminen ja esivalmistelut
Tavanomaisia varotoimenpiteitä on noudatettava kapillaarikolonnien
kokoamisessa, ts. kolonnin sijoittelu uuniin (tukirakenteet), liitostenvalinta ja asennus (tiiviys), kolonnin päiden liittäminen injektiojärjes-
telmään ja detektoriin (mahdollisimman vähän kuollutta tilaa).
Kantajakaasuvirta johdetaan kolonnin läpi (esimerkiksi 0,3 baaria,
30 kPa, 25 m pitkään kolonniin, jonka sisähalkaisija on 0,3 mm).
Kolonni esilämmitetään ohjelmoimalla uuni niin, että lämpötila nousee
3 ºC minuutissa huoneenlämmöstä sellaiseen lämpötilaan, joka on 10 ºC
alhaisempi kuin stationäärifaasin hajoamislämpötila. Uuni pidetään tässä
lämpötilassa yhden tunnin ajan, kunnes perusviiva on tasoittunut.
Lämpötila palautetaan 180 ºC:seen ja työskentelyä jatketaan
vakiolämpötilassa.
Huom. 6 Esivalmisteltuja kolonneja voi myös ostaa.
3.1.5 Detektori, joka kestää korkeampaa lämpötilaa kuin kolonni.
3.2 Ruisku
Ruiskun enimmäistilavuuden on oltava 10 ml ja jakovälin 0,1 ml.
3.3 Piirturi
Kun piirturin käyrää käytetään määritettävän seoksen koostumuksen
laskemiseen, tarvitaan elektroninen, erittäin tarkka piirturi, joka sopii1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 56
▼B
yhteen muun laitteiston kanssa. Piirturilla on oltava seuraavat ominai-
suudet:
a) vasteaika alle 1,5 s, mieluummin 1 s (vasteaika on aika, joka kuluu,
kun piirturin kärki siirtyy nollasta 90 %:iin, kun yhtäkkiä annetaan
100 %:n signaali);
b) paperin leveys vähintään 20 cm;
c) paperin nopeutta on voitava säätää 0,4:stä 2,5 cm:iin minuutissa.
3.4 Integraattori tai laskin (valinnainen)
Elektronisen integraattorin tai laskimen avulla tulos voidaan laskea
nopeasti ja tarkasti. Sen on annettava lineaarinen vaste riittävällä herk-
kyydellä ja perusviivan poikkeaman korjauksen tulee olla riittävä.
4 SUORITUS
Toimenpiteet alakohdissa 4.1—4.3 koskevat liekki-ionisaatiodetektorin
käyttöä.
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää kaasukromatografista laitetta, jossa on
lämmönjohtokyvyn ilmaisin (katarometri). Koeolosuhteita on tällöin
muutettava 6 kohdan mukaan.
4.1 Koeolosuhteet
4.1.1 Ihanteellisten koeolosuhteiden valinta4.1.1.1 Täytetty kolonni
Seuraavat muuttujat on otettava huomioon olosuhteita valittaessa:
a) kolonnin pituus ja halkaisija;
b) stationäärifaasin ominaisuudet ja määrä;
c) kolonnin lämpötila;
d) kantajakaasuvirta;
e) tarvittava erotuskyky;
f) näytteen määrä, joka on valittava siten, että detektori ja elektrometri
yhdessä antavat lineaarisen vasteen;
g) määrityksen kesto.
Taulukoissa 1 ja 2 annetut arvot johtavat yleensä haluttuihin tuloksiin,
eli vähintään 2 000 teoreettista pohjaa yhtä kolonnimetriä kohti metyy-
listearaatilla, kun se eluoidaan noin 15 minuutissa.
Injektorin lämpötilan tulisi olla noin 200 ºC ja detektorin lämpötilan
tulisi olla vähintään yhtä suuri kuin kolonnin, jos laitteisto antaa siihen
mahdollisuuden.
Liekki-ionisaatiodetektoriin johdetun vedyn virtausnopeuden suhde
kantajakaasun nopeuteen on yleensä 1:2 — 1:1 kolonnin halkaisijan
mukaan. Hapen virtaus on noin 5—10 kertaa suurempi kuin vedyn.
Taulukko 1
Kolonnin sisähalkaisija
(mm)Kantajakaasun virtausnopeus
(ml/min)
2 15—25
3 20—40
4 40—60
Taulukko 2
Stationäärifaasin pitoisuus
% (m/m)Kolonnin lämpötila
ºC
5 175
10 180
15 185
20 1851991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 57
▼B
4.1.1.2 Kapillaarikolonni
Kapillaarikolonnien tehokkuus- ja permeabiliteettiominaisuuksien vuoksi
aineosien erottuminen ja määrityksen kesto riippuvat voimakkaasti
kantajakaasun virtausnopeudesta kolonnissa. Tämän vuoksi toimintaolo-suhteet on valittava tätä parametria (eli kolonnin täytehäviötä)
muuttamalla sen mukaan, halutaanko parantaa erotuskykyä vaisaada
tulos nopeasti.
4.1.2 Teoreettisten pohjien määrän (tehokkuuden) ja erotuskyvyn määrittä-
minen (ks. kuva 1)
Määritys tehdään metyylistearaatin ja metyylioleaatin seoksesta, jossa on
suunnilleen yhtä paljon molempia (esim. kaakaovoin metyyliestereistä).
Näytteen määrä, kolonnin lämpötila ja kantajakaasun virtaus valitaan
niin, että mahdollisimman suuri osa metyylistearaatin piikistä piirtyy
noin 15 minuuttia liuottimen piikin jälkeen ja että metyylistearaattipiikki
täyttää noin kolme neljännestä koko asteikosta.
Teoreettisten pohjien määrä n lasketaan kaavasta:
n¼16dr1
W1/C20/C21
2
ja erotuskyky R kaavasta:
R¼2∆
W1þW2
jossa:
dr1on retentioetäisyys millimetreinä, alkaen kromatogrammin
alusta metyylistearaattipiikin huippuun;
W1ja W2ovat metyylistearaatin ja metyylioleaatin piikkien leveydet
millimetreinä, mitattuina kohdista, joissa piikkikäyrän
käännepisteisiin piirretyt tangentit leikkaavat perusviivan;
∆metyylistearaatin ja metyylioleaatin piikkien huippujen väli
millimetreinä;
ja resoluutioluku Ir, kaavalla
a
b
jossa:
a = pienimmän piikin korkeus, mitattuna suhteessa perusviivaan,
b = kahden vierekkäisen piikin muodostaman laakson alimman pisteen
korkeus, mitattuna suhteessa perusviivaan.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 58
▼M2
▼B
Kuva 1
Kromatogrammi teoreettisten pohjien lukumäärän (tehokkuuden) ja erotuskyvyn
määrittämiseksi
Koeolosuhteet on valittava siten, että saadaan vähintään 2 000 teoreet-tista pohjaa kolonnimetriä kohti metyylistearaatille ja että erotuskyky
on vähintään 1,25.
4.2 Näytteenotto
Injektoidaan ruiskulla (3.2) kolonniin 0,1 — 2 ml metyyliesterien
liuosta, joka on valmistettu liitteessä X B esitetyn menetelmän mukaan.
Jos estereissä ei ole liuottimia, valmistetaan noin 100 mg/ml:n liuos
heptaaniin (kaasukromatografista laatua) ja injektoidaan 0,1 — 1 ml
tätä liuosta.
Jos määritetään aineosia, joita on vähän, näytteen määrää voidaan suur-
entaa (enintään kymmenkertaiseksi).
4.3 Määritys
Koeolosuhteiden tulee yleensä olla kohdan 4.1.1 mukaiset.
Alhaisempien kolonnilämpötilojen käyttö on kuitenkin mahdollista, kun
määritetään rasvahappoja, joissa on alle 12 hiiliatomia, tai voidaan
käyttää korkeampia lämpötiloja, jos rasvahapoissa on yli 20 hiiliatomia.
Näissä tapauksissa voidaan käyttää lämpötilan ohjelmointia. Esimerkiksi
jos näytteessä on rasvahappojen metyyliestereitä, joissa on alle 12 hiilia-
tomia, näyte voidaan injektoida 100 ºC:ssa (tai 50—60 ºC:ssa, jos
mukana on voihappoa) ja ohjelmoida lämpötila nousemaan 4—8 ºC/
min, kunnes saavutetaan optimilämpötila. Joissakin tapauksissa mene-
telmät voidaan yhdistää.
Ohjelmoidun lämmityksen jälkeen eluointia jatketaan vakiolämpötilassa,
kunnes kaikki aineosat ovat eluoituneet. Jos laitteen lämpötilaa ei voida
ohjelmoida, käytetään kahta lämpötilaa, jotka ovat 100—195 ºC.
On suositeltavaa tehdä määritys tarvittaessa kahdessa polaarisuudeltaan
erilaisessa faasissa, jotta varmistutaan siitä, että mukana ei ole toisen1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 59
▼B
piikin alle jääviä piikkejä, esimerkiksi jos näytteessä on yhtä aikaa C18:3ja C20:0taiC18:3ja C18:2konjugoituneina.
4.4 Vertailukromatogrammin ja -kuvaajan valmistaminen
Määritetään vertailustandardiseos (2.3) käyttäen samoja koeolosuhteita
kuin näytettä määritettäessä, ja mitataan rasvahappojen retentioajat tai -
etäisyydet. Puolilogaritmipaperille piirretään jokaista tyydyttymättömyy-
sastetta varten kuvaaja, jossa on retentioajan tai -etäisyyden logaritmi
hiiliatomien määrän funktiona; suoraketjuisten ja tyydyttymättömyysas-
teeltaan samojen estereiden kuvaajien tulisi olla suoria
vakiolämpötilassa. Suorien tulisi olla suunnilleen yhdensuuntaiset.
On vältettävä olosuhteita, joissa piikki jää toisen alle, ts. erotuskyky ei
riitä erottamaan kahta aineosaa.
5 TULOSTEN ESITTÄMINEN5.1 Kvalitatiivinen määritys
Näytteen metyyliesteripiikit tunnistetaan 4.4 alakohdassa mainittujen
käyrien avulla, tarvittaessa interpoloimalla.
5.2 Kvantitatiivinen määritys
5.2.1 Koostumuksen määrittäminen
Joitakin poikkeuksia lukuun ottamatta voidaan käyttää sisäisen normal-
isoinnin menetelmää, jossa oletetaan että kromatogrammi kuvaa
näytteen kaikkia aineosia, eli että piikkien yhteenlaskettu pinta-ala
vastaa aineosia sataprosenttisesti (täydellinen eluoituminen).
Jos laitteistoon kuuluu integraattori, käytetään sen antamia tuloksia.
Muussa tapauksessa jokaisen piikin pinta-ala lasketaan kertomalla sen
korkeus leveydellä piikin puolivälistä mitattuna ja ottaen huomioon piir-
turissa mahdollisesti käytetyt vaimennukset.
5.2.2 Laskentamenetelmät5.2.2.1 Yleinen tapaus
Lasketaan tietyssä aineosassa olevien metyyliesterien pitoisuus massa-
prosentteina määrittämällä piikin pinta-alan suhteellinen osuus kaikkien
piikkien yhteenlasketusta pinta-alasta seuraavan kaavan avulla:
Ai
ΣA/C2100
jossa:
Aion aineen i piikin pinta-ala;
ΣA on kaikkien piikkien yhteenlaskettu pinta-ala.
Tulos annetaan yhden desimaalin tarkkuudella.
Huom. 7 Tässä yleisessä tapauksessa laskun tuloksen katsotaan perus-
tuvan siihen, että suhteelliset pinta-alat vastaavat massojen
prosentuaalisia suhteita. Tapauksissa, joissa näin ei voida
olettaa, menetellään 5.2.2.2 alakohdan mukaan.
5.2.2.2 Korjauskertoimien käyttö
Tapauksissa, joissa rasvahapossa esimerkiksi on vähemmän kuin
kahdeksan hiiliatomia tai hapossa on sekundaarisia ryhmiä, taikka kun
käytetään lämmön johtumiseen perustuvaa detektoria tai kun tulosten
on oltava mahdollisimman tarkkoja, on käytettävä korjauskertoimia
muutettaessa piikkien pinta-alojen prosenttiosuuksia aineosien massapro-
senteiksi.
Korjauskertoimet määritetään kromatogrammista, joka saadaan tarkoin
tunnettujen metyyliestereiden vertailuseoksesta samoissa olosuhteissa,
joissa näyte määritettiin.
Vertailuseoksen aineen iprosentuaalinen massaosuus saadaan kaavasta:
mi
Σm/C21001991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 60
▼B
jossa:
mion vertailuseoksen aineen i massa;
Sm on vertailuseoksen eri aineosien massojen summa.
Lasketaan aineen iprosentuaalinen pinta-alaosuus vertailuseoksen (4.4)
kromatogrammista:
Ai
ΣA/C2100
jossa:
Aion aineen ipiikin pinta-ala;
ΣA on kaikkien piikkien pinta-alojen summa.
Korjauskerroin saadaan kaavasta:
Ki¼mi/C2ΣA
Ai/C2Σm
Yleensä korjauskertoimet ilmoitetaan suhteessa KC16:een; tällöin suhteel-
liset kertoimet ovat:
K0
i¼Ki
KC16
Näytteen jokaisen aineen imäärä prosenttiosuutena metyyliestereiden
massasta on:
K0
i/C2Ai
ΣK0
i/C2Ai/C0/C1 /C2100
Tulos annetaan yhden desimaalin tarkkuudella.
5.2.2.3 Sisäisen standardin käyttö
Tietyissä määrityksissä (esimerkiksi jos kaikkien rasvahappojen määriä
ei tunneta, kuten silloin kun 16 ja 18 hiiliatomia sisältävien rasvahap-
pojen ohella esiintyy neljä ja kuusi hiiliatomia sisältäviä happoja tai
kun on tarpeen määrittää näytteessä olevien rasvahappojen absoluuttinen
määrä) on tarpeen käyttää sisäistä standardia. Usein käytetään rasvahap-
poja, joissa on 5, 15 tai 17 hiiliatomia. Sisäisen standardin
korjauskerroin on määritettävä tarvittaessa.
Aineen iprosentuaalinen massaosuus metyyliestereinä ilmaistuna
saadaan kaavasta:
ms/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
s/C2As/C2100
jossa:
Aion aineen ipiikin pinta-ala;
Ason sisäisen standardin piikin pinta-ala;
K′ion aineen ikorjauskerroin (suhteessa KC16:een);
K′son sisäisen standardin korjauskerroin (suhteessa KC16:een);
m on näytteen massa milligrammoina;
mson sisäisen standardin massa milligrammoina.
Tulos annetaan yhden desimaalin tarkkuudella.
6 TRANS-ISOMEERIEN MÄÄRITYKSEN ERITYISTAPAUS
Rasvahappojen, joiden hiiliatomien lukumäärä on 10-24, trans-
isomeerien pitoisuus voidaan määrittää erottamalla metyyliesterit
käyttäen kapillaarikromatografisia kolonneja, joilla on tietty polaarisuus.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 61
▼M2
▼M2
6.1 Piioksidista tehty kapillaarikolonni, sisähalkaisija 0,25-0,32 mm ja
pituus 50 m, varustettu syanopropysilikonipinnoitteella, jonka paksuus
on 0,1-0,3 µm (tyyppi SP 2340, tyyppi SP 2380, C. P. sil 88, Silor 10
ja vastaavat tyypit).
6.2 Metyyliesterit esikäsitellään liitteessä X B esitetyn menetelmän B
mukaisesti. Rasva-aineet, joiden vapaa happoisuus on yli 3 %, on ensin
neutraloitava liitteessä VII olevan 6.1 kohdan mukaisesti.
6.3 Työskentelyolosuhteet kaasukromatografiaa varten ovat kokonaisuudes-
saan seuraavat:
— kolonnin lämpötila: ohjelmoitu 150 ºC:n ja 230 ºC:n välille (esimer-
kiksi 165 ºC 15 minuutin ajan, minkä jälkeen lämpötilaa nostetaan
5 ºC minuutissa, kunnes lämpötila on 200 ºC),
— injektorin lämpötila: 250 ºC, jos käytetään jakajainjektorijärjes-
telmää, tai sama kuin kolonnin alkulämpötila, jos käytetään on
column -järjestelmää.
— detektorin lämpötila: 260 ºC,
— kantajakaasun (heliumia ja vetyä) virtausnopeus: 1,2 ml/min.
Ruiskutetun määrän on oltava sellainen, että käytetyissä herkkyysolo-
suhteissa arakidonihapon metyyliesteriä vastaavan piikin korkeus on
vähintään 20 % asteikon alarajasta.
6.4 Eri metyyliesterit tunnistetaan retentioaikojen perusteella: metyyliester-
eiden retentioaikoja verrataan vertailuseosten vastaaviin retentioaikoihin
(kuten 2.3 kohdassa esitetään).
”Trans”-rasvahappojen esterit eluoidaan ennen vastaavia ”cis”-
isomeerejä. Kuvassa 2 on esimerkki kromatogrammista.
Kuva 2
Kaasukromatogrammi, joka kuvaa rasvahappojen trans-isomeerien määritystä
kapillaarikolonnin avulla
6.5 Kolonnin 4.1.2 kohdan mukaisesti määritetyn tehokkuuden on oltava
sellainen, että se sallii tiettyjen kriittisten parien erottamisen, esimerkiksi
parin, joka muodostuu oleiinihapon piikistä ja transoleiinihappojen
massiivista, trans C 18:1/cis C 18:1, siten, että resoluutioluku on suur-
empikui n 2.
6.6 Eri ”trans”-rasvahappojen prosenttiosuus lasketaan niihin liittyvän piikin
pinta-alan ja kaikkien mukana olevien piikkien yhteenlasketun pinta-
alan välisen suhteen perusteella.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 62
▼M2
Seuraavien rasvahappojen prosenttiosuudet on otettava huomioon:
— 18-atomiset ”trans”-hapot (T 18:1), jotka sisältyvät tämän asetuksen
liitteessä I transoleiini-isomeerien yhteismäärään,
— oktadekadieeniset ”cis-trans”- ja ”trans-cis” -hapot [(CT/TC) 18:2],
jotka sisältyvät tämän asetuksen liitteessä I translinoli-isomeerien
yhteismäärään.
— oktadekatrieeniset ”trans-cis-trans”-, ”cis-cis-trans”-, ”cis-trans-cis-”
ja ”trans-cis-cis” -hapot [(TCT + CCT + CTC + TCC) 18:3], jotka
sisältyvät tämän asetuksen liitteessä I translinoleeni-isomeerien
yhteismäärään.
Huom. 8: Tämän menetelmän erityisominaisuudet huomioon ottaen
tulokset annetaan kahden desimaalin tarkkuudella.
►M27◄ERIKOISTAPAUS — KATAROMETRIDETEKTORIN KÄYTTÖ
(PERUSTUU LÄMMÖNJOHTOKYVYN MUUTOKSIIN)
Rasvahappojen metyyliestereiden seoksen kvantitatiiviseen ja kvalitatii-
viseen määritykseen voidaan käyttää myös kaasukromatografia, jonka
detektorin toiminta perustuu lämmönjohtokyvyn muutoksiin (kataro-
metri). Sellaista käytettäessä on 3 ja 4 kohdassa kuvattuja olosuhteita
muutettava taulukossa 3 esitetyllä tavalla.
Kvantitatiivista määritystä varten käytetään 5.2.2.2 kohdan mukaisia
korjauskertoimia.
Taulukko 3
Muuttuja Arvo taivaati mus
KolonniPi tuus: 2—4 m
Sisähalkaisija: 4 mm
Tukiaine Raekoko 160—200 mm
Stationäärifaasin määrä 15—25 % (m/m)
Kantajakaasu Helium tai vety, mahdollisimman
vähän happea
Apukaasut EikäytetäInjektorin lämpötila 40—60 ºC korkeampi kuin
kolonnin
Kolonnin lämpötila 180—200 ºC
Kantajakaasun virtausnopeus Tavallisesti 60—80 ml/min
Injektoitu määrä Tavallisesti 0,5—2 µl
►
M28◄KOESELOSTE
Koeselosteessa on ilmoitettava metyyliestereiden valmistusmenetelmät,
käytetty kaasukromatografinen menetelmä sekä saadut tulokset. Siinä
on myös mainittava kaikki menettelylliset yksityiskohdat, joista ei
määrätä tässä kansainvälisessä standardissa, tai joita pidetään valinnai-
sina, sekä kaikki tapahtumat, jotka ovat voineet vaikuttaa tuloksiin.
Koeselosteessa on oltava kaikki tarpeelliset tiedot, jotka tarvitaan
näytteen täydelliseen tunnistamiseen.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 63
▼B
▼M19
LIITE X B
OLIIVIÖLJYN JA OLIIVIN PURISTEMASSAÖLJYN RASVAHAP-
POJEN METYYLIESTEREIDEN VALMISTAMINEN
Oliiviöljyn ja oliivin puristemassaöljyn metyyliestereiden valmistamiseksi suosi-
tellaan seuraavia kahta menetelmää:
Menetelmä A: Transesteröinti kaliumhydroksidin metanoliliuoksella kylmässä.
Menetelmä B: Metylointi natriummetylaatin metanoliliuoksella kuumassa,
minkä jälkeen esteröinti happamassa ympäristössä.
Menetelmä valitaan määriteltävän analyyttisen parametrin ja öljyluokan perus-
teella seuraavasti:
a) E42-triglyseridien määritystulosten ja teoreettisten pitoisuuksien välisen eron
määrittäminen:
— menetelmää A sovelletaan kaikkien luokkien öljyihin sen jälkeen, kun
öljy on puhdistettu piihappogeelikolonnissa;
b) rasvahappokoostumuksen määrittäminen:
— menetelmää A sovelletaan suoraan seuraavien luokkien öljynäytteisiin:
— neitsytoliiviöljy, jonka vapaiden happojen pitoisuus on alle 3,3 %,
— puhdistettu oliiviöljy,— oliiviöljy (neitsytoliiviöljyn ja pudistetun oliiviöljyn sekoitus),— puhdistettu oliivin puristemassaöljy,— oliivin puristemassaöljy (neitsytoliiviöljyn ja puhdistetun oliivin
puristemassaöljyn sekoitus),
— menetelmää B sovelletaan sellaisenaan seuraavien luokkien öljynäyttei-
siin:
— neitsytoliiviöljy, jonka vapaiden happojen pitoisuus on yli 3,3 %,
— Raaka oliivin puristemassaöljy,
c) trans-isomeerien rasvahappojen määrittäminen:
— menetelmää A sovelletaan suoraan seuraavien luokkien öljynäytteisiin:
— neitsytoliiviöljy, jonka vapaiden happojen pitoisuus on alle 3,3 %,
— puhdistettu oliiviöljy,— oliiviöljy (neitsytoliiviöljyn ja pudistetun oliiviöljyn sekoitus),— puhdistettu oliivin puristemassaöljy,— oliivin puristemassaöljy (neitsytoliiviöljyn ja puhdistetun oliivin
puristemassaöljyn sekoitus),
— menetelmää A sovelletaan seuraavien luokkien öljyihin sen jälkeen, kun
öljy on puhdistettu piihappogeelikolonnissa:
— neitsytoliiviöljy, jonka vapaiden happojen pitoisuus on yli 3,3 %,
— raaka oliivin puristemassaöljy.
ÖLJYNÄYTTEIDEN PUHDISTAMINEN
Näytteet on tarvittaessa puhdistettava piihappogeelikolonnissa käyttäen liuotti-
mena heksaania/dietyylioksidia (87:13, v/v) IUPAC 2.507 -menetelmässä
kuvatulla tavalla.
Vaihtoehtoisesti voidaan tehdä kiinteäfaasiuutto piihappopatruunoita käyttäen.
Piihappopatruuna (1 g, 6 ml) laitetaan tyhjiöeluutiolaitteeseen ja pestään 6 ml:lla
heksaania. Tyhjiöinti lopetetaan, jottei kolonni kuivu. Kolonniin laitetaan
öljyliuos (noin 0,12 g) 0,5 ml:ssa heksaania. Tyhjiöidään, jotta liuos imeytyy
piihappoon, eluoidaan tyhjiössä 10 ml:lla heksaania/dietyylioksidia (87:13 v/v).
Homogenoidaan eluaatti kokonaan ja jaetaan se kahdeksi yhtä suureksi
näytteeksi. Toinen näyte haihdutetaan kuiviin alipaineessa pyöröhaihduttajassa
huoneenlämmössä. Jäännös liotetaan 1 ml:aan heptaania. Saadusta liuoksesta
voidaan määrittää rasvahapot kaasukromatografialla. Toinen näyte haihdutetaan
ja liuotetaan jäännös 1 ml:aan asetonia triglyseridien määrittämiseksi tarvittaessa
HPCL-menetelmällä.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 64
▼M19
RASVAHAPPOJEN METYYLIESTERIEN VALMISTUSMENETELMÄT
1 Menetelmä A: Transesteröinti kaliumhydroksidin metanoliliuoksella
kylmässä
1.1 Soveltamisala
Tätä nopeaa menetelmää sovelletaan oliiviöljyihin ja oliivin puristemas-
saöljyihin, joiden vapaiden happojen pitoisuus on alle 3,3 %. Vapaat
rasvahapot eivät esteröidy kaliumhydroksidilla. Rasvahappojen etyylies-
terit transesteröityvät hitaammin kuin glyseroliesterit, ja on mahdollista,
että ne metyloituvat vain osittain.
1.2 Periaate
Metyyliesterit muodostuvat transesteröitymällä kaliumhydroksidin meta-
noliliuoksessa välivaiheessa ennen saippuointia (ISO 5509:2000
-menetelmän 5 kohta, IUPAC 2.301 -menetelmän 5 kohta).
1.3 Reagenssit
Metanolia, jossa enintään 0,5 % (m/m) vettä.Heptaania kromatografiaa varten.Kaliumhydroksidin noin 2 N metanoliliuos, joka saadaan liuottamalla
11,2 grammaa kaliumhydroksidia 100 ml:aan metanolia.
1.4 Välineistö
Kierrekorkkisia koeputkia (tilavuus 5 ml), joiden korkissa PTFE-liitos.Mitta- tai automaattipipetit, 2 ja 0,2 ml.
1.5 Suoritus
Mitataan 5 ml:n kierrekorkilliseen koeputkeen noin 0,1 grammaa
näyteöljyä. Lisätään 2 ml heptaania ja ravistetaan. Lisätään 0,2 ml
kaliumhydroksidin 2 N metanoliliuosta, suljetaan tiiviisti PTFE-liitok-
sella varustetulla korkilla, ravistetaan voimakkaasti 30 sekuntia. Putken
annetaan seistä kunnes liuoksen pintakerros kirkastuu. Erotetaan pinta-
kerros, jossa metyyliesterit ovat. Heptaaniliuos voidaan injektoida
kromatografiin. Liuos on syytä säilyttää jääkaapissa kunnes se
määritetään kromatografilla. Liuosta ei suositella säilytettäväksi yli
12:ta tuntia.
2 Menetelmä B: Metylointi natriummetylaatin metanoliliuoksella
kuumassa, minkä jälkeen esteröinti happamassa ympäristössä
2.1 Soveltamisala
Tätä menetelmää sovelletaan oliiviöljyihin ja oliivin puristemassaöl-
jyihin, joiden vapaiden happojen pitoisuus on yli 3,3 %.
2.2 Periaate
Vapaiden rasvahappojen neutralointi ja glyseridien emäksinen metano-
lyysi, minkä jälkeen rasvahapot esteröidään happamassa ympäristössä
(IUPAC 2.301 -menetelmän 4.2 kohta).
2.3 Reagenssit
— heptaania kromatografiaa varten,
— metanolia, jossa enintään 0,05 % (m/m) vettä,
— natriummetylaatin 0,2 N metanoliliuos, joka saadaan liuottamalla 5 g
natriumia 1 000 ml:aan metanolia (voidaan valmistaa kaupallisesta
liuoksesta),
— fenoliftaleiinin 0,2 % metanoliliuos,— rikkihapon 1 N metanoliliuos, joka saadaan lisäämällä 3 ml 96 %:sta
rikkihappoa 100 ml:aan metanolia,
— natriumkloridin kyllästettyä vesiliuosta.
2.4 Välineistö
— tasapohjainen mittapullo, tilavuus 50 ml, pitkä- ja kapeakaulainen ja
hiosliitoksella varustettu,1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 65
▼M19
— palautusjäähdytin. Ilmapalautusjäähdytin (1 m), jossa hiosliitos,
— Kiehumakivi
— Lasisuppilo
2.5 Suoritus
Kaadetaan 0,25 g näyteöljyä hiottukaulaiseen 50 ml:n pulloon. Lisätään
lasisuppilon avulla 10 ml natriummetylaatin 0,2 N metanoliliuosta ja
kiehumakivi. Palautusjäädytin asennetaan paikoilleen, ravistetaan ja
keitetään kiehuvaksi. Liuoksen on muututtava kirkkaaksi noin 10 minuu-
tissa. Reaktio on käytännössä loppunut 15 minuutin kuluttua. Otetaan
pullo lämmönlähteestä, odotetaan palautuksen loppumista, poistetaan
jäähdyttäjä ja lisätään 2 tippaa fenoliftaleiiniliuosta. Lisätään muutama
ml rikkihapon 1 N metanoliliuosta kunnes se muuttuu värittömäksi,
minkä jälkeen lisätään vielä 1 ml. Kytketään jäähdytin päälle ja
kuumennetaan uudestaan kiehuvaksi noin 20 minuutin ajan. Otetaan
pullo lämmönlähteestä ja jäädytetään juoksevan veden alla. Poistetaan
jäähdyttäjä, lisätään 20 ml kyllästettyä natriumkloridiliuosta ja raviste-
taan. Lisätään 5 ml heptaania, suljetetaan pullo ja ravistetaan
voimakkaasti 15 sekuntia.
Annetaan erottua, kunnes molemmat faasit ovat täysin erottuneet.
Lisätään kyllästettyä natriumkloridiliuosta kunnes vesifaasi nousee
pullon kaulan alareunan tasalle. Pullon kaulassa oleva pintafaasi sisältää
metyyliesterit. Saatu liuos voidaan injektoida kaasukromatografiin.
Huom: Menetelmää B käytettäessä metylointi on tehtävä vetokaapissa.
2.6 Vaihtoehtoja menetelmän B mukaiselle metyloinnille
2.6.1Menetelmä C
2.6.1.1 Periaate
Määritettävä rasva tai öljy käsitellään vetykloridin metanoliliuoksella
suljetussa suppilossa 100 ºC:ssa.
2.6.1.2 Välineistö
— Noin 5 ml:n vahvaseinäinen lasisuppilo (korkeus 40—45 mm, halk-
aisija 14—16 mm).
— Mittapipettejä, 1 ja 2 ml.
2.6.1.3 Reagenssit
Kloorivetyhapon 2 % metanoliliuos, valmistettu kaasumaisesta kloorive-
tyhaposta ja vedettömästä metanolista (Huom. 1).
Heksaania kromatografiaa varten
Huom 1: On mahdollista käyttää kaupallisia kloorivetyhapon metanoli-
liuoksia. Pieniä määriä vetykloridikaasua voidaan helposti
valmistaa laboratoriossa lisäämällä kaupalliseen liuokseen
(p = 1,18) muutama tippa väkevää rikkihappoa. Metanoli
absorboi vetykloridihappoa hyvin nopeasti, minkä vuoksi se
on liuotettava varovasti, esimerkiksi johtamalla kaasu pieneen,
ylösalaisin olevaan pulloon, jonka suu koskettaa nestepintaa.
Vetykloridin metanoliliuosta voidaan valmistaa suuria määriä
etukäteen, sillä se säilyy pimeässä erittäin hyvin lasitulpalli-
sissa pulloissa. Reagenssi voidaan valmistaa myös
liuottamalla asetyylikloridia vedettömään metanoliin.
2.6.1.4 Suoritus
— Ennalta natriumsulfaatilla kuivattua ja suodatettua rasvaa tai öljyä
punnitaan 0,2 g lasipulloon ja lisätään 2 ml vetykloridin metanoli-
liuosta. Suljetaan pullo.
— Upotetaan pullo 100 ºC:een 40 minuutiksi.— Jäähdytetään pullo juoksevan veden alla, avataan ja lisätään 2 ml
tislattua vettä ja 1 ml heksaania.
— Sentrifugoidaan ja poistetaan heksaanifaasi, joka on valmis
käytettäväksi.
2.6.2Menetelmä D
2.6.2.1 Periaate
Määritettävää rasvaa tai öljyä kuumennetaan palautusjäähdyttimellä
varustetussa koeputkessa metanolin, heksaanin ja rikkihapon kanssa.
Syntyneet metyyliesterit uutetaan petrolieetterillä.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 66
▼M19
2.6.2.2 Välineistö
— Hiosliitoksella varustettu koeputki, tilavuus noin 20 ml, jossa noin
1 m:n pituinen ilmapalautusjäähdytin.
— Mittapipetti, 5 ml— Erotussuppilo, 50 ml
— Koeputkia, 10 ja 25 ml
— Kartiopohjainen koeputki, tilavuus 15 ml.
2.6.2.3 Reagenssit
— Metylointireagenssi: vedettömän metanolin, heksaanin ja väkevän
rikkihapon (p = 1,84) seos 75:25:1 (v/v/v).
— Petrolieetteri, 40—60 ºC.— Vedetön natriumsulfaatti.
2.6.2.4 Suoritus
Punnitaan 20 ml:n putkeen 0,1 g öljyä ja lisätään 5 ml metylointireagen-
ssia.
Palautusjäähdytin asennetaan paikoilleen ja koeputkea kuumennetaan 30
minuuttia kiehuvassa vesihauteessa (Huom. 2).
Seos siirretään kvantitatiivisesti 50 ml:n erotussuppiloon käyttäen 10 ml
tislattua vettä ja 10 ml petrolieetteriä. Ravistetaan voimakkaasti ja
odotetaan faasien erottumista. Erotetaan vesifaasi ja pestään eetterifaasi
kaksi kertaa 20 ml:lla tislattua vettä. Erotussuppiloon lisätään pieni
määrä vedetöntä natriumsulfaattia, ravistetaan, annetaan laskeutua
muutama minuutti ja suodatetaan. Suodos kerätään 15 ml:n kartiopohjai-
seen koeputkeen.
Liuotin haihdutetaan vesihauteessa typpivirrassa.
Huom. 2: Kiehumisen hillitsemiseksi koeputkeen asetetaan lasisauva ja
estetään vesihauteen lämpötilaa nousemasta yli 90 ºC:n.
3 Tarkkuusparametrit
Kansainvälisen oliiviöljyneuvoston menetelmässä COI/T.20/DOC. nro
24 esitetään menetelmien A ja B tarkkuuden tilastollinen arvio.
SUOSITUKSET OLIIVIÖLJYN JA OLIIVIN PURISTEMASSAÖLJYN
RASVAHAPPOJEN ESTERIEN KAASUKROMATOGRAFISTA
MÄÄRITYSTÄ VARTEN
1 Suoritus
Rasvahappojen esterien heksaaniliuosten kaasukromatografinen määritys
tehdään ISO 5508 -standardin mukaisesti käyttämällä kapillaarikolonnia
(pituus 50 m × sisähalkaisija 0,25 tai 0,32 mm), joka on varustettu
syanopropysilikonipinnoitteella, kuten trans-isomeerien rasvahappojen
määrittämiseksi on vahvistettu. (ks. COI/T.20/Asiakirja nro 17).
Kuviossa 1 esitetään rasvahappojen metyyli- ja etyyliestereitä sekä
metyyliestereiden trans-isomeerejä sisältävän oliivin puristemassaöljyn
tyypillinen kromatogrammi.
2 Laskeminen
2.1 Rasvahappokoostumuksen ja ECN42:n laskemiseksi on otettava
huomioon seuraavat rasvahapot:
Myristiinihappo (C14:0).
Palmitiinihappo (C16:0) Metyyli- ja etyyliestereitä vastaavien piikkien
pinta-alojen summa.
Palmitoleiinihappo (C16:1) Metyyliestereiden ω9-j a ω7-isomeerejä
vastaavien piikkien pinta-alojen summa.
Heptadekaanihappo (C17:0).Heptadekeenihappo (C17:1).
Steariinihappo (C18:0).
Oleiinihappo (C18:1) Metyyliestereiden ω9-j aω7-isomeerejä, etyylies-
terejä sekä metyyliestereiden trans-isomeerejä vastaavien piikkien pinta-
alojen summa.
Linolihappo (C18:2) Metyyli- ja etyyliesterejä ja metyyliestereiden
trans-isomeerejä vastaavien piikkien pinta-alojen summa.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 67
▼M19
Arakidiinihappo (C20:0).
Linoleenihappo (C18:3) Metyyliesterejä ja metyyliestereiden trans-
isomeerejä vastaavien piikkien pinta-alojen summa.
Eikosaeenihappo (C20:1).
Beheenihappo (C22:0).Lignoseriinihappo (C24:0).
Skvaleenia ei oteta huomioon kokonaispinta-alaa laskettaessa.
2.2 Trans-C18:1:n prosenttiosuutta laskettaessa käytetään kyseisen rasva-
hapon metyyliestereitä vastaavaa piikkiä. Trans-C18:2 ja trans-C18:3:n
summan saamiseksi lasketaan yhteen kaikki molempien rasvahappojen
trans-isomeerejä vastaavat piikit. Kokonaispinta-alan laskemiseksi
otetaan huomioon kaikki 2.1 kohdassa mainitut piikit. (ks. COI/T.20/
Asiakirja nro 17).
Kunkin rasvahapon prosenttiosuus lasketaan seuraavan kaavan mukai-
sesti:
% X = (pinta-ala X x 100) / (kokonaispinta-ala)
Kuvio 1: Metylaatiomenetelmällä kylmässä saatu oliivin puristemassaöljyn
kromatogrammi. Kromatogrammin piikit vastaavat metyyliestereitä, ellei toisin
mainita.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 68
▼B
LIITE XI
HAIHTUVIEN HALOGEENILIUOTTIMIEN PITOISUUDEN
MÄÄRITTÄMINEN OLIIVIÖLJYSTÄ
1 PERIAATE
Kaasukromatografinen määritys kaasutilatekniikalla (headspace) .
2 VÄLINEISTÖ
2.1 Kaasukromatografialaitteisto, johon kuuluu elektroninkaappausdetektori
(ECD).
2.2 Kaasutilalaitteisto (headspace) .
2.3 Kaasukromatografiakolonni, lasinen, pituus 2 m, halkaisija 2 mm, stationää-
rifaasi.
OV101 10 % tai vastaava, kalsinoituun, happopestyyn ja silanoituun
piimaahan imeytettynä, hiukkaskoko 80—100 mesh.
2.4 Kantaja- ja apukaasu: kaasukromatografiaan tarkoitettua typpeä, joka
soveltuu elektroninkaappausdetektorille.
2.5 Teflonpinnoitteisia lasipulloja, 10—15 ml, varustettu alumiinitulpalla, jossa
on sovitus näytteenottoruiskua varten.
2.6 Ilmatiiviisti sulkevat puristimet2.7 Kaasuruisku, 0,5—2 ml.
3 REAGENSSIT
Standardi: kaasukromatografista laatua olevia haihtuvia halogeeniliuottimia.
4 SUORITUS
4.1 Punnitaan tarkasti noin 3 g öljyä lasipulloon, jota ei enää käytetä uudestaan;
suljetaan se ilmatiiviisti. Pullo asetetaan termostaattiin 70 ºC:seen yhdeksi
tunniksi. Imetään ruiskulla varovasti 0,2—0,5 ml kaasutilaa. Injektoidaan
tämä näyte kaasukromatografialaitteiston kolonniin, joka on säädetty seuraa-
vasti:
— injektorin lämpötila: 150 ºC,
— kolonnin lämpötila: 70—80 ºC,— detektorin lämpötila: 200—250 ºC.
4.2 Vertailuliuokset. Valmistetaan standardiliuoksia puhdistetusta oliiviöljystä,
jossa ei ole lainkaan liuottimia, pitoisuudeltaan 0,05 — 1 ppm (mg/kg),
jotka vastaavat näytteen oletettua pitoisuutta. Halogeeniliuottimia voidaan
tarvittaessa laimentaa pentaanilla.
4.3 Kvantitatiivinen määritys. Verrataan toisiinsa näytteen piikkien korkeuksia
tai pinta-aloja sekä sen standardiliuoksen piikkien korkeuksia ja pinta-aloja,
jonka pitoisuuden oletetaan olevan lähinnä näytteen pitoisuutta. Jos suhteel-
linen poikkeama on suurempi kuin 10 %, määritys on tehtävä uudestaankäyttämällä eri standardiliuosta, kunnes suhteellinen poikkeama on alle
10 %. Määrä lasketaan yksittäisten injektioiden keskiarvon perusteella.
4.4 Tulosten esittäminen: ppm (mg/kg). Toteamisraja tässä menetelmässä on
0,01 mg/kg.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 69
▼M19
LIITE XII
NEITSYTOLIIVIÖLJYN AISTINVARAINEN ARVIOINTI
1 TARKOITUS JA SOVELTAMISALA
Tällä menetelmällä on tarkoitus vahvistaa asetuksen N:o 136/66/ETY liit-
teessä olevassa 1 kohdassa tarkoitettujen neitsytoliiviöljyjen aistinvaraisten
ominaisuuksien arvioimiseksi tarvittavat perusteet ja kuvata menetelmä
niiden luokittelemiseksi tältä osin.
Kuvattua menetelmää sovelletaan ainoastaan neitsytoliiviöljyjen luokitteluun
hedelmäisyyden ja virheiden määrän mukaan, jotka määrittää 4 kohdan
mukaisesti raadin muodostava ryhmä valittuja ja koulutettuja maistajia.
2 YLEISTÄ
Yleisen perussanaston, maistamishuoneen, yleisen menettelyn ja öljyjen
maistamislasien osalta suositellaan noudatettavaksi kansainvälisen oliiviöljy-
neuvoston ohjeita.
3 ERITYINEN SANASTO
3.1Positiiviset ominaisuudet
Hedelmäinen : oliivien lajikkeesta riippuvat, suoraan tai jälkivaiheessa
havaitut hajuaistimukset, jotka ovat ominaisia hyvänlaatuisista ja tuoreista,
raaoista tai kypsistä oliiveista saadulle öljylle.
Karvas : raaoista tai vielä kypsyvistä oliiveista saadun öljyn ominaismaku.
Pistävä : pistelevä suutuntuma, joka on ominainen kasvukauden alussa
pääasiassa vielä raaoista oliiveista tuotetuille öljyille.
3.2Negatiiviset ominaisuudet
Tunkkainen : maku, joka on ominainen kasoina varastoiduista oliiveista,
joissa käyminen on päässyt pitkälle, saadulle öljylle.
Homeinen, kostea : maku, joka on ominainen sellaisista oliiveista saadulle
öljylle, joita on säilytetty useita päiviä kosteissa olosuhteissa, joissa niihin
on päässyt kasvamaan sienirihmastoa ja hometta.
Sakkainen : maku, joka on ominainen öljylle, joka on ollut kosketuksissa
tynnyrien ja sammioiden pohjasakan kanssa.
Viinimäinen-etikkainen : eräille öljyille ominainen viiniä tai etikkaa muistut-
tava maku. Se johtuu pääasiassa oliivien käymisestä, joka johtaa
etikkahapon, etyyliasetaatin ja etanolin muodostumiseen.
Metallinen : maku, joka muistuttaa metallia. Se on ominainen öljylle, joka
on ollut pitkäaikaisessa kosketuksessa metallinpintojen kanssa murskauksen,
sekoituksen, puristuksen tai varastoinnin aikana.
Eltaantunut : hapettuneisiin öljyihin liittyvä maku.
Paistunut tai palanut : öljyille ominainen maku, joka johtuu liiallisesta tai
liian pitkästä kuumentamisesta valmistuksen aikana, varsinkin kun tahnaa
sekoitetaan ja kuumennetaan samanaikaisesti ja se tehdään sopimattomissa
lämpöolosuhteissa.
Heinämäinen-puumainen : eräiden kuivista oliiveista saatujen öljyjen maku.
Karkea : eräiden öljyjen aiheuttama paksu, tahmea tuntu suussa.
Rasvainen : öljyn maku, joka muistuttaa petrolia, rasvaa tai mineraaliöljyä.
Sivumaku : maku, joka syntyy kun öljy on ollut kauan kosketuksissa veden
kanssa.
Suolavesi : suolaliemessä säilötyistä oliiveista saadun öljyn maku.
Espartoheinä : uusien espartomattojen läpi puristetun öljyn maku. Se voi olla
erilainen sen mukaan, oliko mattojen esparto vihreää vai kuivaa.
Maa: pesemättömistä maahan pudonneista tai mutaisista oliiveista saadun
öljyn maku.
Toukkainen : oliivikärpäsen ( Bactrocera Oleae ) toukkien pilaamista olii-
veista saadun öljyn maku.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 70
▼M19
Kurkku : sellaisen öljyn maku, jota on säilytetty ilmatiiviissä peltiastioissa
liian kauan; se johtuu 2,6-nonadienaalin muodostumisesta.
4 RAATI
Jäsenvaltion nimittämään raatiin kuuluu puheenjohtaja ja 8—12 maistajaa.
Markkinointivuonna 2001/2002 maistajia voi kuitenkin olla alle 8.
Puheenjohtajalla on oltava vankka koulutus ja asiantuntemus, ja hänen on
tunnettava perusteellisesti kaikki öljytyypit. Hän on vastuussa raadista, sen
järjestämisestä ja toiminnasta, näytteiden valmistelemisesta, koodauksesta
ja esittelystä maistajille sekä tietojen keruusta ja niiden käsittelystä tilastol-
lisesti.
Puheenjohtaja valitsee maistajat. Lisäksi hän huolehtii maistajien koulutuk-
sesta ja näiden tehtävien valvonnasta varmistaakseen, että maistajien
soveltuvuus tehtäväänsä säilyy asianmukaisena.
Oliiviöljyn aistinvaraisten ominaisuuksien tarkastukseen osallistuvat mais-
tajat on kansainvälisen oliiviöljyneuvoston neitsytoliiviöljyn pätevien
maistajien valintaa, koulutusta ja valvontaa koskevien ohjeiden mukaisesti
valittava ja koulutettava sen mukaan, miten he pystyvät erottamaan toisis-
taan samankaltaisia näytteitä.
Raatien on sitouduttava osallistumaan havaintoja koskevien perusteiden
säännölliseksi valvomiseksi ja yhdenmukaistamiseksi kansallisella, yhteisön
tai kansainvälisellä tasolla suunniteltuihin aistinvaraisiin arviointeihin.
Lisäksi niiden on toimitettava asianomaiselle jäsenvaltiolle vuosittain tiedot
raadin kokoonpanosta ja hyväksyttynä raatina tehtyjen arviointien
lukumäärästä.
5 AISTINVARAINEN ARVIOINTIMENETTELY JA LUOKITTELU
5.1Miten maistaja käyttää profiililomaketta
Maistajan käyttämä profiililomake on tämän menetelmän lisäyksessä A.Kunkin raatiin kuuluvan maistajan on haistettava ja maistettava (
1) tarkastel-
tavaa maistelulasissa olevaa öljyä ja arvioitava haju-, maku- ja
suutuntumahavaintoja sekä kineettisiä havaintoja. Sen jälkeen hänen on
merkittävä profiililomakkeeseensa kunkin negatiivisen ja positiivisen
ominaisuuden voimakkuusaste.
Jos maistaja havaitsee negatiivisia ominaisuuksia, joita ei ole merkitty
profiililomakkeeseen, ne on merkittävä kohtaan ”muut” ja käytettävä niitä
tämän menetelmän 3.2 kohdassa määriteltyjä ilmaisuja, jotka parhaiten
kuvaavat kyseisiä ominaisuuksia.
5.2Miten raadin puheenjohtaja käyttää tietoja
Raadin puheenjohtajan on kerättävä kunkin maistajan täyttämät profiililo-
makkeet ja tarkistettava merkityt voimakkuusasteet. Jos havaitaan
poikkeavuuksia, puheenjohtaja pyytää maistajaa tarkistamaan profiililomak-
keensa ja tarvittaessa toistamaan kokeen.
Raadin puheenjohtaja voi viedä kunkin maistajan tiedot tietokonesovelluk-
seen mediaanin laskemiseksi (lisäys B). Kutakin näytettä koskevat tiedot
kootaan taulukkoon, jossa on sarakkeet kullekin 10:lle aistihavaintoa koske-
valle ilmaisulle ja maistajien lukumäärää vastaava määrä rivejä.
Kun vähintään puolet raadin jäsenistä on merkinnyt negatiivisen ominai-
suuden kohtaan ”muut”, raadin puheenjohtajan on laskettava kyseisen
ominaisuuden mediaani ja tehtävä vastaava luokitus.
Kun kyse on vaatimustenmukaisuustarkastuksina tai seurantamäärityksinä
tehdyistä arvioinneista, raadin puheenjohtajan on arvioitettava öljy aistinvar-
aisesti kolme kertaa vähintään yhden päivän välein. Ilmaisujen mediaani
lasketaan kaikkien profiililomakkeisiin kolmessa testissä merkittyjen tietojen
perusteella.
5.3Öljyjen luokittelu
Öljy luokitellaan jäljempänä esitettyihin luokkiin virheiden ja hedelmäi-
syyden mediaanin mukaan. Virheiden mediaanilla tarkoitetaan
voimakkaimmin havaitun negatiivisen ominaisuuden mediaania. Kyseisen1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 71
(1) Maistaja voi kieltäytyä maistamasta, jos hänen mielestään näytteessä on jokin erittäin
vastenmielinen ominaisuus. Tästä poikkeuksellisesta tapahtumasta on tehtävä merkintä
profiililomakkeeseen.
▼M19
negatiivisen ominaisuuden robustin variaatiokertoimen on oltava enintään
20 prosenttia.
a)Ekstra-neitsytoliiviöljy : virheiden mediaani on 0 ja hedelmäisyyden
mediaani yli 0;
b)neitsytoliiviöljy : virheiden mediaani on 0—2,5 ja hedelmäisyyden
mediaani yli 0;
c)yleisen kauppalaadun neitsytoliiviöljy : virheiden mediaani on 2,5—6,0
tai virheiden mediaani on korkeintaan 2,5 ja hedelmäisyyden mediaani 0;
d)neitsytoliivilamppuöljy : virheiden mediaani on yli 6,0.
Luokat c ja d korvataan kuitenkin 1 päivästä marraskuuta 2003 seuraa-
valla luokalla:
c)Oliivilamppuöljy : virheiden mediaani on yli 2,5 tai virheiden mediaani
on korkeintaan 2,5 ja hedelmäisyyden mediaani 0.
5.4Erityistapaukset
Jos jonkin muun positiivisen ominaisuuden kuin hedelmäisyyden mediaani
on yli 5,0, raadin puheenjohtaja tekee siitä merkinnän öljyn arviointitodis-
tukseen.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 72
▼M19
LISÄYS A
1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 73
▼M19
LISÄYS B
MEDIAANIN JA LUOTTAMUSVÄLIN LASKUTAPA
Mediaani
Mediaani on reaaliluku Xm, joka osoittaa, että todennäköisyys (P) siihen, että
jakauman arvot (X) ovat pienempiä kuin Xm, on korkeintaan 0,5 ja että sama-
naikaisesti todennäköisyys (P) siihen, että jakauman arvot ovat korkeintaan Xm,
on vähintään 0,5. Toisen määritelmän mukaan mediaani on 50. prosenttipiste
suuruusjärjestykseen asetetuista luvuista. Toisin sanoen mediaani on keskim-
mäinen suuruusjärjestykseen asetuista luvuista, jos niitä on pariton määrä, tai
kahden keskimmäisen luvun keskiarvo, jos suuruusjärjestykseen asetettuja lukuja
on parillinen määrä.
Robusti keskihajonta
Jotta mediaanin variaatiosta saataisiin luotettava arvio, on käytettävä Stuartin ja
Kendallin arviointimenetelmää robustin keskihajonnan määrittämiseksi. Asymp-
toottisen keskihajonnan (S) kaava sisältää arvot N ja IQR. N on havaintojen
lukumäärä ja IQR kvartiilivälin pituus eli kyseessä olevien tietojen variaation
robusti arvio (täsmälleen 50 prosenttia minkä tahansa todennäköisyysjakauman
havainnoista on kvartiilivälillä). Kvartiiliväli lasketaan laskemalla 75. ja 25.
prosenttipisteen välinen poikkeama.
IQR = 75. prosenttipiste - 25. prosenttipiste
Prosenttipiste on arvo Xpc, joka osoittaa että todennäköisyys (P) siihen, että
jakauman arvot ovat pienempiä kuin Xpc, on korkeintaan tietty prosentti, ja
että samanaikaisesti todennäköisyys siihen, että jakauman arvot ovat korkeintaan
Xpc, on vähintään kyseinen prosentti. Prosentti ilmoittaa tietyn jakauman arvon.
Kun kyseessä on mediaani, se on 50/100.
Prosenttipiste on siis jakauman arvo, joka vastaa tiettyä aluetta, joka onmääritelty jakauman tai tiheyden kaarelta. Esimerkiksi 25. prosenttipiste osoittaa
jakauman arvoa, joka vastaa aluetta kohdassa 0,25 tai25/100.
Robusti variaatiokerroin (%)
Robusti variaatiokerroin on puhdas (eli dimensioton) luku, joka osoittaa analy-
soitavan lukujoukon variaation prosenttiosuuden suhteessa mediaanin arvoon
Me. Tämän vuoksi kyseinen kerroin on erittäin hyödyllinen raadin jäsenten
luotettavuuden tarkistamiseksi.
95 prosentin luottamusväli suhteessa mediaaniin
95 prosentin luottamusväli (IC) (ensimmäisen lajin virheen arvo on 0,05 tai 5
prosenttia) kuvaa väliä, jolla mediaanin arvo voi vaihdella, jos koe olisi mahdol-
lista toistaa lukemattomia kertoja. Käytännössä luottamusväli osoittaa kokeen1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 74
▼M19
vaihteluväliä valituissa toimintaolosuhteissa, jos kokeen voisi toistaa useita
kertoja. Luottamusvälin, kuten robustin variaatiokertoimenkin avulla voidaan
arvioida kokeen luotettavuus.
I. C. Sup. = Me + (c.S)
I. C. Inf. = Me - (c.S)
jossa c on 1,96 kun luottamusvälion 0,95.
Luokittelu tehdään vertaamalla mediaanin arvoja menetelmän 5.3 kohdassa
määriteltyihin vertailuväleihin. Tietokonesovelluksen avulla luokittelu voidaan
esittää visuaalisesti tilastotiedoista koottuna taulukkona tai kaaviona.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 75
▼M20
▼M19
▼B
LIITE XV
1 OLIIVIJÄTTEEN ÖLJYPITOISUUS
1.1Välineistö
— sopiva uuttolaitteisto, johon voidaan liittää pyöreäpohjainen pullo,
200—250 ml,
— sähköllä lämmitettävä vesihaude, hiekkahaude tai levy,
— analyysivaaka,
— lämpökaappi, jonka voi säätää enintään 80 ºC:seen,
— sähköuunijossa termostaatti , jonka voisäätää 103 ± 2 ºC:seen ja johon
voi puhaltaa ilmaa tai jossa voi käyttää alipainetta,
— mekaaninen jauhin, joka on helppo puhdistaa ja jossa oliivijäännös
voidaan jauhaa ilman lämpötilan nousua tai mainittavaa vesi- tai öljypi-
toisuuden alenemista,
— uuttohylsy ja hydrofiilistä pumpulia tai suodatinpaperia, josta on pois-
tettu heksaaniin uuttuvat aineet,
— eksikkaattori,
— seula, jonka reikien halkaisija on 1 mm,
— kuivattuja hohkakiven palasia.
1.2Reagenssi
Teknistä n-heksaania, josta jää täydellisesti haihdutettuna alle 0,002 g
jäännöstä/100 ml.
2 SUORITUS
2.1Näytteen esikäsittely
Käytetään tarvittaessa mekaanista jauhinta näytteen jauhamiseksi niin
hienoksi, että se menee kokonaan seulan läpi; jauhin on ensin hyvin puhdis-
tettava.
Näytteestä käytetään noin 1/20 jauhatuslaitteen puhdistamiseen, heitetään
pois syntynyt jauhos, jauhetaan loput näytteestä ja kerätään se, sekoitetaan
huolellisesti ja määritetään viipymättä.
2.2Näytteenotto
Heti kun jauhaminen on päättynyt, punnitaan noin 10 g näytettä 0,01 g:n
tarkkuudella koetta varten.
2.3Uuttohylsyn esikäsittely
Näyte pannaan uuttohylsyyn, joka suljetaan hydrofiilisellä pumpulitupolla.
Jos käytetään suodatinpaperia, jauhettu näyte kääritään siihen.
2.4Esikuivaus
Jos oliivijäännös on hyvin kosteata (ts. kosteutta ja haihtuvia aineita on yli
10 %), näyte kuivataan asettamalla täytetty uuttohylsy (tai paperiin kääritty
näyte) lämpökaappiin sopivaksi ajaksi korkeintaan 80 ºC:seen, jotta kosteus
ja haihtuvat aineet vähenisivät alle 10 %:iin.
2.5Pyöreäpohjaisen pullon esikäsittely
Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella pullo, jossa on pari hohkakivikappaletta.
Hohkakivi kuivataan ensin uunissa 103 ± 2 ºC:ssa ja jäähdytetään eksikkaat-
torissa vähintään tunnin ajan.
2.6Ensimmäinen uutto
Uuttohylsy näytteineen (tai paperiin kääritty näyte) sijoitetaan uuttolaitteis-
toon. Pulloon kaadetaan tarpeellinen määrä heksaania. Pullo liitetään
uuttolaitteistoon ja asetetaan kokonaisuus sähkökäyttöiseen lämpöhautee-
seen. Lämpö säädetään niin, että refluksointinopeus on vähintään kolme
tippaa sekunnissa (kohtalainen, ei kova kiehuminen).
Neljän tunnin uuton jälkeen annetaan jäähtyä. Hylsy irrotetaan uuttolaitteis-
tosta ja pannaan ilmavirtaan, jotta suurin osa imeytyneestä liuottimesta
haihtuisi.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 76
▼B
2.7Toinen uutto
Hylsyn sisältö siirretään mikrojauhatuslaitteeseen ja jauhetaan niin hienoksi
kuin mahdollista. Jauhettu näyte kootaan tarkoin ja pannaan takaisin
hylsyyn, joka liitetään taas uuttolaitteistoon.
Jatketaan uuttoa vielä kaksi tuntia käyttäen samaa pyöreäpohjaista pulloa,
jossa on ensimmäinen uute.
Uuttopulloon kertyvän liuoksen on oltava kirkasta. Ellei näin ole, se suoda-
tetaan paperin läpi ja pullo ja suodatinpaperi pestään useaan kertaan
heksaanilla. Suodos ja pesuliuotin kerätään toiseen kuivattuun 1 mg:n tark-
kuudella taarattuun pulloon.
2.8Liuottimen poistaminen ja uutteen punnitseminen
Tislataan pois enin osa liuottimesta haihduttamalla sähkökäyttöisessä
hauteessa. Liuottimen jäänteet poistetaan kuumentamalla pulloa 20
minuuttia uunissa 103 ± 2 ºC:ssa. Liuottimen haihtumista voidaan edistää
puhaltamalla ajoittain uuniin ilmaa tai mieluummin inerttiä kaasua tai
käyttämällä alipainetta.
Pullo asetetaan eksikkaattoriin jäähtymään vähintään tunniksi ja punnitaan
1 mg:n tarkkuudella.
Kuumennetaan uudestaan samoissa olosuhteissa 10 minuuttia, jäähdytetään
eksikkaattorissa ja punnitaan uudelleen.
Näiden kahden punnitustuloksen ero saa olla enintään 10 mg. Ellei tähän
päästä, kuumennetaan jälleen 10 minuuttia, jäähdytetään ja punnitaan,
kunnes massan ero edelliseen on enintään 10 mg. Viimeisen punnituksen
tulos merkitään muistiin.
Samasta näytteestä tehdään kaksierimääri tystä.
3 TULOSTEN ESITTÄMINEN3.1Laskutapa ja kaava
a) Uutteen määrä ilmaistuna painoprosentteina saadusta tuotteesta on:
S=m
1×100
mojossa:
S = saadun tuotteen uutteen painoprosentti,
mo= näytteen paino grammoina,
m1= kuivatun uutteen paino grammoina.
Tulos on kahden rinnakkaiskokeen aritmeettinen keskiarvo, jos kokeen
toistettavuusehdot täyttyvät.
Tulos ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.
b) Uute ilmaistaan kuiva-aineena seuraavalla kaavalla:
S×100
100 − U= uutteen öljyprosenttikui vasta näytteestä
jossa:
S = saadun tuotteen uutteen painoprosenttiosuus [ks. a)],
U = kosteus ja haihtuvat aineet näytteessä.
3.2Toistettavuus
Saman kokeen tekijän peräkkäisten tai samanaikaisten rinnakkaiskokeiden
tulosten välinen ero ei saa olla yli 0,2 g heksaaniuutetta/100 g näytettä.
Jos tämä ehto eitäyty, koe toi stetaan kahdella uudella näytteellä. Jos ero on
yhä suurempi kuin 0,2 g, tulos on tehdyn neljän määrityksen aritmeettinen
keskiarvo.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 77
▼B
LIITE XVI
JODILUVUN MÄÄRITTÄMINEN
1 TARKOITUS
Tämä kansainvälinen standardi kuvaa menetelmän jodiluvun määrittämi-
seksi eläin-ja kasvirasvoista sekä -öljyistä, joihin tästedes viitataan sanalla
rasva.
2 MÄÄRITELMÄ
Tätä kansainvälistä standardia varten määritellään seuraavat käsitteet:
2.1 Jodiluku. u:näytteen absorboiman jodin massa tässä kansainvälisessä stan-
dardissa määrätyissä olosuhteissa.
Jodiluku ilmoitetaan grammoina jodia/100 g näytettä.
3 PERIAATE
Näyte liuotetaan liuottimeen ja lisätään Wijsin reagenssia. Tietyn ajan
kuluttua lisätään kaliumjodidin vesiliuosta ja vapautunut jodi titrataan
natriumtiosulfaattiliuoksella.
4 REAGENSSIT
Kaikkien reagenssien on oltava hyväksyttyä analyysilaatua.
4.1Kaliumjodidiliuos , 100 g/l, ei saa sisältää jodaatteja eikä vapaata jodia.
4.2Tärkkelysliuos.
Lisätään 5 g liukoista tärkkelystä 30 ml:aan vettä, lisätään tämä seos
1 000 ml:aan kiehuvaa vettä; annetaan kiehua kolme minuuttia ja jäähdy-
tetään.
4.3Natriumtiosulfaatti , standardi titrausliuos c(Na2S2O3.5 H2O) = 0,1 mol/l,
standardoitu enintään seitsemän päivää ennen käyttöä.
4.4Liuotin , valmistettu sekoittamalla yhtä suuret tilavuudet sykloheksaania ja
etikkahappoa.
4.5Wijsin reagenssi , joka sisältää jodimonokloridia etikkahapossa. On
käytettävä valmiina saatavaa Wijsin reagenssia.
Huom: Reagenssisi sältää 9 g ICI3:a ja 9 g I:a etikkahapossa.
5 VÄLINEISTÖ
Tavallinen laboratoriovälineistö ja erityisesti seuraavat:
5.1Punnituslaseja , jotka sopivat näytemäärän punnitsemiseen ja pulloon (5.2)
siirtämiseen.
5.2Erlenmeyerpulloja , 500 ml, hiotut lasitulpat, täysin kuivia.
6 NÄYTTEEN VALMISTAMINEN
Homogenoitu näyte kuivatetaan natriumsulfaatilla ja suodatetaan.
7 SUORITUS
7.1 Näytteenotto
Näytemäärä määräytyy oletetun jodiluvun perusteella taulukon 1 mukaisesti.
Taulukko 1
Oletettu jodilukuNäytteen määrä
(g)
alle 5 3,00
5—20 1,00
21—50 0,40
51—100 0,201991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 78
▼B
Oletettu jodilukuNäytteen määrä
(g)
101—150 0,13
151—200 0,10
Näytemäärä punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella punnituslasissa (5.1).
7.2 Määritys
Näyte pannaan 500 ml:n pulloon (5.2). Lisätään 20 ml liuotinta (4.5) rasvan
liuottamiseksi. Lisätään tasan 25 ml Wijsin reagenssia (4.6), suljetaan
tulpalla, ravistetaan ja jätetään pullo pimeään. Wijsin reagenssin kanssa ei
saa käyttää suupipettiä.
Sokeakoe valmistellaan samalla tavalla käyttäen liuotinta ja reagenssia
ilman näytettä.
Pullot jätetään pimeään tunniksi, jos näytteen oletettu jodiluku on alle 150;
jos oletettu jodiluku on yli 150 tai tuote on polymeroitunut tai hyvin hapet-
tunut, pullot jätetään pimeään kahdeksi tunniksi.
Ajan päätyttyä lisätään 20 ml kaliumjodidiliuosta (4.2) ja 150 ml vettä (4.1)
kuhunkin pulloon.
Titrataan standardilla natriumtiosulfaatin titrausliuoksella (4.4), kunnes jodin
aiheuttama keltainen väri on melkein hävinnyt. Lisätään pari tippaa tärkke-
lysliuosta (4.3) ja jatketaan titraamista, kunnes sininen väri juuri katoaa
liuosta voimakkaasti ravistettaessa.
Huom. Myös potentiometrinen titrauksen loppupisteen määrittäminen on
sallittua.
7.3 Määritysten lukumäärä
Samasta näytteestä tehdään kaksimääri tystä.
8 TULOSTEN ESITTÄMINEN
Jodiluku saadaan kaavasta
12;69 c V 1/C0V2 ðÞ
m
jossa:
c = käytetyn natriumtiosulfaattiliuoksen (4.4) tarkka pitoisuus, moolia/
litra;
V1= sokeakokeeseen käytetyn natriumtiosulfaattiliuoksen (4.4) tilavuus
millilitroina;
V2= määritykseen käytetyn natriumtiosulfaattiliuoksen (4.4) tilavuus
millilitroina;
m = näytemäärä (7.1) grammoina.
Tulos on kahden määrityksen tulosten aritmeettinen keskiarvo sillä ehdolla,
että toistettavuusehto täyttyy.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 79
▼M11
LIITE XVII
MENETELMÄ STIGMASTADIEENIEN MÄÄRITTÄMISEKSI
KASVIÖLJYISTÄ
1. TARKOITUS
Stigmastadieenien määritys kasviöljyistä, joissa näiden hiilivetyjen pitoi-
suudet ovat pieniä, kuten neitsytoliiviöljystä ja oliivin puristusjätteestä
saadusta raakaöljystä.
2. SOVELTAMISALA
Tätä standardia voidaan soveltaa kaikkiin kasviöljyihin; mittaustulokset
ovat kuitenkin luotettavia ainoastaan, jos näiden hiilivetyjen pitoisuus on
0,01—4,0 mg/kg. Menetelmä soveltuu erityisesti puhdistettujen kasviöl-
jyjen (oliivi, oliivin puristusjäte, auringonkukka, palmu tms.) toteamiseen
neitsytoliiviöljystä, sillä puhdistetut öljyt sisältävät stigmastadieeneja,
mutta neitsytöljyt eivät sisällä niitä.
3. PERIAATE
Saippuoitumattoman aineksen erottaminen. Steroidihiilivetyfraktion erotta-
minen pylväskromatografian avulla käyttäen silikageeliä ja
kapillaarikaasukromatografista määritystä.
4. LAITTEISTO
4.1 250 ml:n pulloja, joita voi käyttää palautusjäähdyttimen kanssa.4.2 Erotussuppiloita, joiden vetoisuus on 500 ml.4.3 Pyöreäpohjaisia 100 ml:n pulloja.
4.4 Pyöröhaihdutin (”rotavapori”).
4.5 Lasinen kromatografiakolonni (sisähalkaisija 1,5—2,0 cm, pituus 50 cm),
jossa on teflonhana ja jonka pohjalla on lasivillatulppa tai lasisintterievy.
Silikageelikolonni valmistellaan kaatamalla kromatografiakolonniin n.
5 cm kerros heksaania ja täyttämällä sen jälkeen kolonni silikageelin
heksaanilietteellä (15 g en 40 ml:ssa) käyttäen apuna heksaaniannoksia.
Annetaan seistä ja viimeistellään asettuminen kevyellä tärytyksellä.
Lisätään vedetöntä natriumsulfaattia noin 0,5 cm:n kerros ja eluoidaan
lopuksi liika heksaani.
4.6 Kaasukromatografi, jossa on liekki-ionisaatiodetektori, jakajatyyppinen tai
kylmä kolonniin liittyvä (on-column) injektori sekä uuni, joka on
ohjelmoitavissa ± 1 celsiusasteen tarkkuudella.
4.7 Kaasukromatografinen kvartsilasikapillaarikolonni (sisähalkaisija 0,25 tai
0,32 mm, pituus 25 m), joka on pinnoitettu 5-prosenttisella fenyylimetyy-
lisilikonifaasilla, jonka kerrospaksuus on 0,25 µm.
Huomautus 1:
Voidaan käyttää myös muita kolonneja, joiden polaarisuus on sama tai
pienempi.
4.8 Tallentava integraattori, jolla voidaan integroida pohjasta pohjaan.4.9 Liimatulla neulalla varustettu 5—10 µl:n mikroruisku kaasukromatogra-
fiaa varten.
4.10 Sähköinen kuumennusvaippa tai lämpölevy.
5. REAGENSSIT
Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua, ellei toisin määrätä.
Käytettävän veden tulee olla tislattua vettä tai puhtaudeltaan vähintään
vastaavaa.
5.1 Heksaania tai alkaaniseos, jonka aineosien kiehumispisteet ovat 65—70º C
ja joka on tislattu rektifioimiskolonnilla.
Huomautus 2:
Liuotin on tislattava epäpuhtauksien poistamiseksi.
5.2 96-prosenttista (v/v) etanolia.
5.3 Vedetöntä natriumsulfaattia.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 80
▼M11
5.4 Kaliumhydroksidin 10-prosenttista alkoholiliuosta. Lisätään 10 ml vettä
50 g:aan kaliumhydroksidia, sekoitetaan ja liuotetaan seos 500 ml:aan
etanolia.
Huomautus 3:
Kalilipeän alkoholiliuos muuttuu seistessään ruskeaksi. Liuos on valmis-
tettava uudelleen joka päivä ja pidettävä hyvin suljetuissa ruskeissa
lasipulloissa.
5.5 Silikageeliä 60 kaasukromatografiaa varten, 70—230 mesh (Merck ref.
7734 taisamanlai nen).
Huomautus 4:
Silikageeli voidaan yleensä ottaa käyttöön suoraan pakkauksesta ilman
mitään käsittelyä. Joissakin valmistuserissä esiintyy kuitenkin alhaista
aktiivisuutta, joka johtaa huonoon kromatografiseen erottumiseen. Tällöin
silikageeli on käsiteltävä seuraavasti: Silikageeli aktivoidaan kuumenta-
malla sitä vähintään neljä tuntia 550º C:n lämpötilassa. Kuumentamisen
jälkeen silikageelin annetaan jäähtyä eksikkaattorissa ja pannaan sitten
tulpalla suljettuun pulloon. Lisätään 2 % vettä ja ravistetaan, kunnes paak-
kuja ei näy ja jauhe virtaa vapaasti.
Jos silikageelin valmistuserä on sellainen, että se aiheuttaa kromatogram-
miin toisiaan häiritseviä huipuja, silikageeli on käsiteltävä edellä esitetyllä
tavalla. Vaihtoehtoinen tapa on käyttää erikoispuhdasta silikageeliä 60
(Merck, ref. 7754).
5.6 Kolesta-3,5-dieenin (Sigma, 99-prosenttinen puhtaus) varastoliuos
(200 ppm) heksaanissa (10 mg 50 ml:ssa).
5.7 Kolesta-3,5-dieenin standardiliuos heksaanissa, pitoisuus 20 ppm, saadaan
laimentamalla edellä mainitusta liuoksesta.
Huomautus 5:
5.6 ja 5.7 kohdassa tarkoitetut liuokset säilyvät huononematta vähintään
neljä kuukautta, jos niitä säilytetään alle 4º C:n lämpötilassa.
5.8 n-nonakosaanin heksaaniliuos, pitoisuus n. 100 ppm.
5.9 Kantajakaasu kromatografiaa varten: helium tai vety, puhtaus 99,9990 %.
5.10 Apukaasut liekki-ionisaatiodetektoria varten: vety, jonka puhtaus on
99,9990 %, ja puhdistettu ilma.
6. MENETTELY
6.1 Saippuoitumattoman aineksen valmistelu:
6.1.1 Punnitaan 20 ± 0,1 g öljyä 250 ml:n pulloon (4.1), lisätään 1 ml kolesta-
3,5-dieenin (20 µg) standardiliuosta ja 75 ml kalilipeän 10-prosenttista
alkoholiliuosta, kiinnitetään palautusjäähdytin ja keitetään hiljalleen 30
minuuttia. Otetaan näytteen sisältävä pullo pois lämpölähteestä ja anne-
taan liuoksen jäähtyä hieman (liuos ei saa jäähtyä kokonaan, sillä tällöin
näyte erottuu). Lisätään 100 ml vettä ja siirretään lios erotussuppiloon
(4.2) 100 ml:lla heksaania. Seosta ravistetaan voimakkaasti 30 sekuntia,
minkä jälkeen sen annetaan erottua kerroksiksi.
huomautus 6:
Jos muodostuu emulsio, joka ei häviä nopeasti, lisätään hieman etanolia.
6.1.2 Pohjalle jäävä vesifaasi siirretään toiseen erotussuppiloon ja uutetaan
uudelleen 100 ml:lla heksaania. Pohjalle jäävä osa juoksutetaan taas pois
ja heksaaniuute (yhdistettynä toisen erotussuppilon ainekseen) pestään
kolme kertaa 100 ml:lla etanoli-vesiseoksella (1:1), kunnes pH on
neutraali.
6.1.3 Heksaaniliuos johdetaan vedettömän natriumsulfaatin (50 g) läpi, pestään
20 ml:lla heksaania ja haihdutetaan kuivaksi pyöröhaihduttimessa 30º C:n
lämpötilassa matalassa paineessa.
6.2 Steroidihiilivetyjakeen erottaminen:
6.2.1 Jäännös siirretään fraktiointikolonniin käyttäen kahta yhden millilitran
heksaaniannosta, näyte johdetaan kolonniin antaen liuoksen pinnan vajota
natriumsulfaattikerroksen pinnan tasalle ja aloitetaan kromatografinen
eluointi heksaanilla käyttäen virtausnopeutta, joka on n. 1 ml/min.
Eluaatin ensimmäiset 20—30 ml heitetään pois ja seuraava 40 ml:n jae
otetaan talteen. Talteen otettu jae siirretään 100 ml:n pyöreäpohjaiseen
pulloon (4.3).1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 81
▼M11
Huomautus 7:
Ensimmäinen jae sisältää tyydyttyneitä hiilivetyjä (kuva 1a) ja toinen jae
steroidihiilivetyjä. Lisäeluointi tuottaa skvaleenia ja vastaavia yhdisteitä.
Jotta saavutetaan tyydyttyneiden ja steroidihiilivetyjen tarkka erottuminen,
jakeiden tilavuudet on määritettävä ihanteellisiksi. Tätä varten ensim-
mäisen jakeen tilavuus on valittava siten, että toista jaetta määritettäessä
tyydyttyneiden hiilivetyjen huippu on matala (ks. kuva 1c); jos niitä ei
ilmene ja standardihuippu on heikko, tilavuutta on pienennettävä. Joka
tapauksessa on tarpeetonta erottaa täysin ensimmäisen ja toisen jakeen
osia, sillä kaasukromatografisessa määrityksessä ei esiinny päällekkäisiä
huippuja, jos kaasukromatografiaolosuhteet säädetään 6.3.1 kohdan
mukaisesti. Toisen jakeen ihannetilavuutta ei yleensä tarvitse etsiä, sillä
myöhemmät osat erottuvat hyvin. Jos kutenkin esiintyy suuri huippu,
jonka retentioaika on n. 1,5 minuuttia lyhyempi kuin standardin, tämä
johtuu skvaleenista ja osoittaa huonoa erotuskykyä.
6.2.2 Toinen jae haihdutetaan kuivaksi haihduttimessa 30º C lämpötilassa mata-
lassa paineessa, ja jäännös liuotetaan välittömästi 0,2 ml:aan heksaania.
Liuos säilytetään jääkaapissa määritykseen asti.
Huomautus 8:
6.1.3 ja 6.2.2 kohdassa tarkoitettuja jakeita ei pidä säilyttää kuivana eikä
huoneenlämpötilassa. Liuotin on lisättävä heti kun jäännös on saatu, ja
liuoksia on tämän jälkeen säilytettävä jääkaapissa.
6.3 Kaasukromatografia
6.3.1 Työskentelyolosuhteet jakajakatyyppistä injektoria varten:
— Injektorin lämpötila: 300º C.
— Detektorin lämpötila: 320º C.— Tallentava intergraattori: integrointiparametrit on valittava siten, että
pinta-alat arvioidaan oikein. Integrointi pohjasta pohjaan on suositel-
tavaa.
— Herkkyys: noin 16 kertaa vähimmäisvaimennus.— Injektoitava liuosmäärä: 1 µl.
— Uunin lämpötilaohjelma: alussa 235º C 6 minuutin ajan, sen jälkeen
lämpötilaa kohotetaan 2º C/min, kunnes lämpötila on 285º C.
— Injektori, jossa on virtauksenjakaja 1:15.— Kantajakaasu: helium tai vety, paine n. 120 kPa.
Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kromatografin ja kolonnin ominaisuuk-
sien mukaan, jotta saavutetaan seuraavien vaatimusten mukainen
kromatogrammi: sisäisen standardin huippu n. 5 minuutin tarkkuudella
6.3.2 kohdassa tarkoitetussa ajassa; sisäisen standardin huipun on oltava
vähintään 80 prosenttia täydestä asteikosta.
Kaasukromatografijärjestelmä on tarkistettava ruiskuttamalla kolesta-
dieenin (5.6) varastoliuoksen ja n-nonakosaaniliuoksen (5.8) seosta.
Kolesta-3,5-dieenin huippu tulee esiintyä ennen n-notakosaanin huipua
(kuva1c); jos näin ei käy, voidaan menetellä kahdella tavalla: alentaa
uunin lämpötilaa ja/tai käyttää polaarisuudeltaan pienempää kolonnia.
6.3.2 Huipun tunnistaminen
Sisäisen standardin huippu esiintyy n. 19 minuutin kuluttua ja stigmasta-
3,5-dieenin huippu suhteellisella retentioajalla, joka on n. 1,29 (ks. kuva
1b). Stigmasta-3,5-dieenin mukana kulkee pieni määrä isomeeria, ja
yleensä molemmat sisältyvät samaan huippuun. Jos kolonni on kuitenkin
liian polaarinen tai sen erotuskyky on suuri, isomeerin huippu saattaa
näkyä erillisenä pinenä stigmasta-3,5-dieenihuippua välittömästi
edeltävänä huippuna (kuva 2). Jotta voidaan varmistaa, että eluoituvat
stigmastadieenit muodostavat vain yhden huipun, on suotavaa vaihtaa
kolonnin tilalle vähemmän polaarinen tai sisähalkaisijaltaan suurempi
kolonni.
Huomautus 9:
Stigmastadieeneja voidaan saada kromatografista vertailua varten
määrittämällä puhdistettua kasviöljyä ja käyttämällä pinempää näytettä
(1—2 g). Stigmastadieenit tuottavat voimakkaan ja helposti tunnistettava
huipun.
6.3.3 Kvantitatiivinen märitys
Stigmastadieenipitoisuus määritetään seuraavan kaavan avulla:stigmastadieenipitoisuus mg/kg =
As/C2Mc
Ac/C2Mo1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 82
▼M11
jossa As= stigmastadieenien huipun pinta-ala (jos huippu jakaantuu
kahden isomeerin huipuksi, näiden kahden huipun pinta-
alojen summa)
Ac= sisäisen standardin (kolestadieeni) huipun pinta-ala
Mc= lisätyn standardin massa mikrogrammoina
Mo= öljyn massa grammoina
Toteamisraja: noin 0,01 mg/kg.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 83
▼M11
Kuva 1
Kaasukromatogrammi, joka on saatu oliiviöljynäytteistä, jotka on
määritetty kvartsilasikapillaarikolonnissa (sisähalkaisija 0,25, pituus
25 m); kolonni on pinnoitettu 5-prosenttisella fenyylimetyylisilikonillaa,
kerrospaksuus 0,25 µm.
a) Neitsytöljyn ensimmäinen jae (30 ml), jossa näkyy standardin huippu.
b) Oliiviöljyn toinen jae (40 ml); öljy sisältää 0,10 mg/kg stigmastadiee-
neja.
c) Toinen jae (40 ml), joka sisältää pienen osuuden ensimmäistä jaetta.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 84
▼M11
Kuva 2
Kaasukromatogrammi, joka on saatu DB-5-kolonnilla määritetystä puhdis-
tetun oliiviöljyn näytteestä; kromatogrammissa näkyy stigmasta-3,5-
dieenin isomeeri.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 85
▼M13
LIITE XVIII
C42:TA SISÄLTÄVIEN TRIGLYSERIDIEN MÄÄRITYS (TEOREET-
TISEN KOOSTUMUKSEN JA TODELLISEN KOOSTUMUKSEN
VÄLINEN ERO)
1. Tarkoitus
Oliiviöljyjen triasyyliglyserolien (TAG:n) koostumuksen määrittäminen
ekvivalenttihiililukuina perustuen HPLC:llä (korkean suorituskyvyn
nestekromatografia) saatujen määritystulosten ja rasvahappokoostu-
muksen perusteella lasketun teoreettisen koostumuksen välisiin eroihin.
2. Soveltamisala
Standardia sovelletaan oliiviöljyihin. Menetelmä soveltuu pienten
siemenöljymäärien (joissa on paljon linoleiinihappoa) osoittamiseen
kaikissa oliiviöljyissä.
3. Periaate
C42-triasyyliglyserolien HPLC-analyysillä määritetty ja C42-triasyyligly-
serolien teoreettinen koostumus (joka lasketaan
rasvahappokoostumuksen GLC-määrityksen perusteela) vastaavat
tietyissä rajoissa toisiaan puhtaiden öljyjen osalta. Jos erotus on suur-
empi kuin asetuksessa kunkin öljytyypin osalta ilmoitetut arvot, on
öljyssä todennäköisesti siemenöljyjä.
4. Menetelmä
Mentelmä C42-triglyseridien teoreettisen koostumuksen laskemiseksi
sekä sen ja HPLC:llä saadun pitoisuuden välisen eron laskemiseksi
tapahtuu olennaisesti vertaamalla muilla menetelmillä saatuja määritys-
tuloksia; tässä voidaan erottaa kolme vaihetta: rasvahappokoostumuksen
määritys lasikapillaarikromatografialla, C42-triasyyliglyserolien teoreet-
tisen koostumuksen laskeminen ja C42-triasyyliglyserolien HPLC-
määritys.
4.1 Laitteisto
4.1.1 Pyörökolveja, 250 ml ja 500 ml4.1.2 Dekanterilaseja, 100 ml4.1.3 Lasinen kromatografiapylväs, sisähalkaisija 21 mm, pituus 450 mm,
jossa on tulppa ja standardoitu naaraspuolinen hios yläpäässä
4.1.4 Erotussuppiloita, 250 ml, joissa on standardoitu koiraspuolinen hios
alapäässä ja joka voidaan liittää pylvään yläpäähän
4.1.5 Lasisauva, pituus 600 mm
4.1.6 Lasisuppilo, halkaisija 80 mm4.1.7 Mittapulloja, 50 ml4.1.8 Mittapulloja, 20 ml4.1.9 Pyöröhaihduttaja4.1.10 Korkean suorituskyvyn nestekromatografi, jonka pylväs voidaan termos-
toida
4.1.11 Injektiolaite, jolla voidaan injisoida 10 µl
4.1.12 Ilmaisin: differentiaalirefraktometri. Koko asteikon herkkyyden pitäisi
olla vähintään 10
—4taitekerroinyksikköä.
4.1.13 Pyväs: Ruostumatonta terästä, pituus 250 mm ja sisähalkaisija 4,5 mm,
johon pakattu 5 µm:n piihappo- (silika-)partikkeleja, jotka sisältävät 22
— 23 % hiiltä oktadekyylisilaanin muodossa (huomautus 2).
4.1.14 Tulostin ja/tai integraattori
4.2 Reagenssit
Reagenssien pitäisi olla analyysipuhtausluokkaa. Eluointiliuottimista
pitää poistaa kaasut, ja niitä voi käyttää useaan kertaan ilman että se
vaikuttaa erotuksiin.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 86
▼M13
4.2.1 Petrolieetteri 40 — 60 ºC, kromatografialaatua
4.2.2 Etyylieetteri, peroksidivapaa, tislattu juuri ennen käyttöä
4.2.3 Lasikromatografian eluutioliuos: petrolieetterin ja etyylieetterin seos 87/
13 (v/v)
4.2.4 Piihappogeeli, 70 — 230 mesh, tyyppiä Merck 7734, jonka vesipitoisuus
on standardoitu 5 prosenttiin (w/w)
4.2.5 Lasivillaa
4.2.6 Asetoni
4.2.7 Asetonitriili4.2.8 Eluointiliuotin: asetonitriili + asetoni (kunkin osuus säädetään siten että
saadaan haluttu erotus; aloitetaan 50:50 -seoksella)
4.2.9 Liuottamisliuotin: asetoni4.2.10 Vertailutriglyseridit: joko käytetään kaupallisia triglyseridejä (tripalmi-
tiini, trioleiini jne.) ja kuvataan retentioajat ekvivalenttihiililuvun
funktiona tai tehdään vertailukromatogrammit soijaöljy-oliiviöljyseok-
sella suhteessa 30:70 ja puhtaalla oliiviöljyllä (katso huomautukset 3 ja
4 sekä kuvat 1, 2, 3 ja 4).
4.3 Näytteiden valmistus
Koska monista aineista voi tulla vääriä positiivisia tuloksia, näyte on
aina puhdistettava hapettuneissa öljyissä esiintyvien polaaristen aineiden
määrittämiseen tarkoitetun IUPAC-menetelmän 2.507 mukaan.
4.3.1 Kromatografiapylvään valmistelu
Pylväs (4.1.3) täytetään noin 30 ml:lla eluutioliuosta (4.2.3), siihen
pannaan hiukan lasivillaa (4.2.5), joka työnnetään pylvään pohjaan lasi-
sauvalla (4.1.5).
Suspendoidaan 100 ml:n dekanterilasiin 25 g piihappogeeliä (4.2.4)
80 ml:ssa eluutioliuosseosta (4.2.3), joka lisätään pylvääseen lasisup-
pilon (4.1.6) avulla.
Jotta piihappogeeli saadaan kokonaan siirretyksi pylvääseen, dekanteri-
lasia pestään eluutioliuoksella ja pesunesteet lisätään pylvääseen.
Tulppa avataan ja liuottimen annetaan tulla pylväästä, kunnes sen pinta
on noin 1 cm piihappogeelin pinnan yläpuolella.
4.3.2 Pylväskromatografia
Punnitaan 0,001 g:n tarkkuudella 2,5 ± 0,1 g öljyä, joka on etukäteen
suodatettu, homogenoitu ja josta on tarvittaessa poistettu vesi, 50 ml:n
mittapulloon (4.1.7). Öljy liuotetaan noin 20 ml:aan eluutioliuotinta
(4.2.3). Lämmitetään tarvittaessa liuottamisen helpottamiseksi. Annetaan
jäähtyä huoneenlämpötilaan, ja tilavuus säädetään merkkiin eluutioliuot-
timella.
20 ml tätä liuosta siirretään volymetrisellä pipetillä kohdan 4.3.1 mukai-
sesti valmisteltuun pylvääseen. Tulppa aukaistaan ja liuottimen annetaan
valua piihappogeelin pinnan tasolle.
Eluoidaan 150 ml:lla eluutioliuotinta (4.2.3). Eluutionopeus noin 2 ml/
min (150 ml menee pylvään läpi noin 60 — 70 minuutissa).
Eluaatti kerätään 250 ml:n pyörökolviin (4.1.1), joka on taarattu uunissa
ja punnittu tarkasti. Liuotin haihdutetaan alipaineessa (Rotavapor) ja
jäännös punnitaan. Siitä tehdään HPLC-analyysiin ja metyyliesterin
valmistukseen käytettävä liuos.
Pylväästä on saatava talteen vähintään 90 % näytteestä, kun on kyseessä
ekstraneitsyt-, neitsyt-, tavallinen puhdistettu ja oliiviöljyluokat, ja
vähintään 80 %, kun on kyseessä lamppu- ja jäännösoliiviöljyt.
4.4 HPLC-analyysi
4.4.1 Näytteiden valmistus kromatografiaan
Analysoitavasta näytteestä valmistetaan 5-prosenttinen liuos punnitsem-
malla 0,5 ± 0,001 g näytettä 10 ml:n asteikolliseen pulloon ja
täyttämällä 10 ml:ksi liuottamisliuottimella (4.2.9).1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 87
▼M13
4.4.2 Menetelmä
Kootaan kromatografialaitteisto. Eluutioliuotinta (4.2.8) pumpataan
nopeudella 1,5 ml/min laitteiston puhdistamiseksi. Odotetaan, kunnes
perusviiva on tasainen. Injisoidaan 10 µl näytettä, joka on valmistettu
kuten kohdassa 4.3 selostetaan.
4.4.3 Laskeminen ja tulosten ilmoittaminen
Käytetään sisäisen standardin menetelmää, ts. oletetaan, että triglyseri-
dien (C42-triglyserideistä C52-triglyserideihin) piikkien yhteenlasketut
pinta-alat ovat 100 %. Kunkin triglyseridin suhteellinen prosenttiosuus
lasketaan kaavalla:
% triglyseridiä = piikin pinta-ala × 100 / piikkien pinta-alojen summa
Tulokset ilmoitetaan vähintään kahden desimaalin tarkkuudella.Huomautus 1: Eluutiojärjestys voidaan määrittää laskemalla ekviva-
lenttihiililuvut, jotka määräytyvät usein yhtälön ECN = CN — 2n
perusteella, jossa CN on hiililuku ja n on kaksoissidosten määrä; se
voidaan laskea tarkemmin ottamalla huomioon kaksoissidoksen
alkuperä. Jos n
o,nlja nlnovat öljyhapon, linoleiinihapon ja linoleeni-
hapon kaksoissidokset, ekvivalenttilihiililuku voidaan laskea yhtälöstä
ECN = CN — dono—dlnl—dlnnln,
jossa kertoimet do,dlja dlnvoidaan laskea vertailutriglyseridien avulla.
Tässä menetelmässä eritellyissä oloissa suhde on lähellä seuraavaa:
ECN = CN — (2,60 no) — (2,35 nl) — (2,17 nln)
Huomautus 2: Esimerkkejä: Lichrosorb (Merck) RP18 Art 50333
Lichrosphere tai vastaava (Merck) 100
CH18 Art 50377
Huomautus 3: Usean triglyseridin avulla voi myös laskea erotuskyvyn
trioleiinin suhteen:
α= RT'/RT (trioleiini)
käyttämällä redusoitua retentioaikaa RT' = RT — RT liuotin.
Log α:aa f:n funktiona (jossa f on kaksoissidosten määrä) esittävän
kuvaajan avulla voidaan määrittää retentioarvot kaikille vertailutriglyser-
ideihin sisältyvien rasvahappojen triglyserideille — katso kuva 2.
Huomautus 4: Pylvään pitäisi olla niin tehokas, että trilinoleiinipiikki
erottuu selvästi niiden triglyseridien piikeistä, joiden retentioajat ovat
sitä lähellä. Eluutiota jatketaan aina C52:een asti.
Huomautus 5: Jotta saataisiin sellainen kromatogrammi, että kaikkien
tärkeiden piikkien pinta-alat voidaan mitata luotettavasti, on C50-trigly-
seridiä vastaavan toisen piikin korkeuden oltava 50 % koko asteikosta.
4.5 Triasyyliglyseridien koostumuksen laskeminen (mooliprosentteina)
rasvahappojen GLC-tuloksista
4.5.1 Rasvahapp okoostumuksen määritys
Rasvahappokoostumus määritetään asetuksen (ETY) N:o 2568/91 liit-
teessä X A esitetyllä ETY:n kaasukromatografimenetelmällä
lasipylväällä. Metyyliesterit valmistetaan liitteen X B mukaan (natrium-
metylaattialkoholiliuos).
4.5.2 Laskemisessa huomioon otettavat rasvahapot
Glyseridit ryhmitellään niiden ekvivalenttihiililuvun (ECN) mukaan
ottaen huomioon seuraavat vastaavuudet ECN:n ja rasvahappojen välillä.
Huomioon otetaan ainoastaan 16 ja 18 hiiliatomia sisältävät rasvahapot,
koska niillä on merkitystä oliiviöljylle.
Rasvahappo (FA) LyhennysMolekyyli-
paino (MW)ECN
Palmitiinihappo P 256,4 16
Palmitoleiinihappo Po 254,4 141991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 88
▼M13
Rasvahappo (FA) LyhennysMolekyyli-
paino (MW)ECN
Steariinihappo S 284,5 18
Öljyhappo O 282,5 16Linoleiinihappo L 280,4 14Linoleenihappo Ln 278,4 12
4.5.3 Rasvahappojen mooliprosentin laskeminen pinta-alaprosen-
teista
moolia
P¼pinta /C0ala/C0
%P
MW Pmoolia
S¼pinta /C0ala/C0
%S
MW Smoolia
Po¼pinta /C0ala/C0
%P o
MW Po/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(1)
moolia
O¼pinta /C0ala/C0
%O
MW Omoolia
L¼pinta /C0ala/C0
%L
MW Lmoolia
Ln¼pinta /C0ala/C0
%L n
MW Ln
4.5.4 Rasvahappojen muuntaminen mooliprosenteiksi
mooli-% P 1 ;2;3 ðÞ ¼moolia P /C3100
moolia P þSþPoþOþLþLn ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(2)mooli-% S 1 ;2;3 ðÞ ¼
moolia S /C3100
moolia P þSþPoþOþLþLn ðÞ
mooli-% Po 1 ;2;3 ðÞ ¼moolia Po /C3100
moolia P þSþPoþOþLþLn ðÞ
mooli-% O 1 ;2;3 ðÞ ¼moolia O /C3100
moolia P þSþPoþOþLþLn ðÞ
mooli-% L 1 ;2;3 ðÞ ¼moolia L /C3100
moolia P þSþPoþOþLþLn ðÞ
mooli-% Ln 1 ;2;3 ðÞ ¼moolia Ln /C3100
moolia P þSþPoþOþLþLn ðÞ
Tulos ilmoittaa kunkin rasvahapon prosenttiosuuden mooliprosentteina
TAG:n 1,2,3-asemassa.
Sitten lasketaan tyydyttyneiden rasvahappojen P ja S (SFA) ja tyydyt-
tymättömien rasvahappojen Po, O, L ja Ln (UFA) summa:
mooli-% SFA = mooli-% P + mooli-% S/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(3)mooli-% UFA = 100 − mooli-% SFA
4.5.5 Rasvahapp okoostumuksen laskeminen TAG:n 2- sekä 1,3-
asemissa
Rasvahapot jakautuvat kolmeen ryhmään seuraavasti: kaksi samanlaista
1- ja 3-asemien osalta ja yksi 2-aseman osalta siten, että tyydyttyneillä
(P ja S) ja tyydyttymättömillä hapoilla (Po, O, L ja Ln) on eri kertoimet.
4.5.5.1 2-asemassa tyydyttyneet rasvahapot [P(2) ja S(2)]
mooli-% P(2) = mooli-% P (1,2,3) * 0,06/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(4)mooli-% S(2) = mooli-% S (1,2,3) * 0,06
4.5.5.2 2-asemassa tyydyttymättömät rasvahapot [Po(2), O(2), L(2) ja Ln(2)]:1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 89
▼M13
mooli-% Po 2 ðÞ ¼mooli-% Po 1 ;2;3 ðÞ
mooli-% UFA/C3100/C0mooli-% P 2 ðÞ /C0 mooli-% S 2 ðÞ ½/C138/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(5)mooli-% O 2 ðÞ ¼
mooli-% O 1 ;2;3 ðÞ
mooli-% UFA/C3100/C0mooli-% P 2 ðÞ /C0 mooli-% S 2 ðÞ ½/C138
mooli-% L 2 ðÞ ¼mooli-% L 1 ;2;3 ðÞ
mooli-% UFA/C3100/C0mooli-% P 2 ðÞ /C0 mooli-% S 2 ðÞ ½/C138
mooli-% Ln 2 ðÞ ¼mooli-% Ln 1 ;2;3 ðÞ
mooli-% UFA/C3100/C0mooli-% P 2 ðÞ /C0 mooli-% S 2 ðÞ ½/C138
4.5.5.3 Rasvahapot 1,3-asemassa [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) ja
Ln(1,3)]:
mooli-% P 1 ;3ðÞ ¼mooli-% P 1 ;2;3 ðÞ /C0 mooli-% P 2 ðÞ
2þmooli-% P 1 ;2;3 ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(6)mooli-% S 1 ;3ðÞ ¼
mooli-% S 1 ;2;3 ðÞ /C0 mooli-% S 2 ðÞ
2þmooli-% S 1 ;2;3 ðÞ
mooli-% Po 1 ;3ðÞ ¼mooli-% Po 1 ;2;3 ðÞ /C0 mooli-% Po 2 ðÞ
2þmooli-% Po 1 ;2;3 ðÞ
mooli-% O 1 ;3ðÞ ¼mooli-% O 1 ;2;3 ðÞ /C0 mooli-% O 2 ðÞ
2þmooli-% O 1 ;2;3 ðÞ
mooli-% L 1 ;3ðÞ ¼mooli-% L 1 ;2;3 ðÞ /C0 mooli-% L 2 ðÞ
2þmooli-% L 1 ;2;3 ðÞ
mooli-% Ln 1 ;3ðÞ ¼mooli-% Ln 1 ;2;3 ðÞ /C0 mooli-% Ln 2 ðÞ
2þmooli-% Ln 1 ;2;3 ðÞ
4.5.6 Triglyseridien laskeminen
4.5.6.1 TAG:t, joissa on yksi rasvahappo (AAA, tässä LLL, PoPoPo)
mooli-% AAA ¼mooli-% A 1 ;3ðÞ /C3 mooli-% A 2 ðÞ/C3 mooli-% A 1 ;3ðÞ
10 000(7)
4.5.6.2 TAG:t, joissa on kaksi rasvahappoa (AAB, tässä PoPoL, PoLL)
mooli-% AAB ¼mooli-% A 1 ;3ðÞ /C3 mooli-% A 2 ðÞ/C3 mooli-% B 1 ;3ðÞ /C3 2
10 000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(8)
mooli-% ABA ¼
mooli-% A 1 ;3ðÞ /C3mooli-% B 2 ðÞ/C3mooli-% A 1 ;3ðÞ
10 000
4.5.6.3 TAG:t, joissa on kolme eri rasvahappoa (ABC, tässä OLLn, PLLn,
PoOLn, PPoLn)
mooli-% ABC ¼mooli-% A 1 ;3ðÞ /C3 mooli-% B 2 ðÞ/C3 mooli-% C 1 ;3ðÞ /C3 2
10 000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(9) mooli-% BCA ¼
mooli-% B 1 ;3ðÞ /C3 mooli-% C 2 ðÞ/C3 mooli-% A 1 ;3ðÞ /C3 2
10 000
mooli-% CAB ¼mooli-% C 1 ;3ðÞ /C3 mooli-% A 2 ðÞ/C3 mooli-% B 1 ;3ðÞ /C3 2
10 0001991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 90
▼M13
4.5.6.4 Triasyyliglyseridit, joissa on C42:ta
Seuraavat triglyseridit, joissa on C42:ta, on laskettu yhtälöistä 7, 8 ja 9
HPLC:ssä odotetussa eluointijärjestyksessä (tavallisesti vain kolme
piikkiä).
LLL
PoLL ja LPoL:n asemaisomeeriOLLn ja OLnL:n sekä LnOL:n asemaisomeeritPoPoL ja PoLPo:n asemaisomeeriPoOLn ja OPoLn:n sekä OLnPo:n asemaisomeeritPLLn ja LLnP:n sekä LnPL:n asemaisomeeritPoPoPoSLnLn ja LnSLn:n asemaisomeeriPPoLn ja PLnPo:n sekä PoPLn:n asemaisomeeritC
42:ta sisältävät triasyyliglyseridit saadaan näiden yhdeksän triasyyligly-
serolin ja niiden asemaisomeerien summana. Tulokset on ilmoitettava
vähintään kahden desimaalin tarkkuudella.
5. Tulosten arviointi
Laskemalla saatua teoreettista koostumusta ja HPLC:llä määritettyä
koostumusta verrataan. Jos HPLC-tulosten ja teoreettisten tulosten
välinen erotus on suurempi kuin asetuksessa kyseiselle öljyluokalle
ilmoitetut arvot, näyte sisältää siemenöljyä.
Huom. Tulokset annetaan yhdellä desimaalilla.
6. Esimerkki (numerot viittaavat menetelmää selostavan tekstin osiin)
4.5.1 Rasvahappojen mooliprosenttien laskeminen GLC-tulok-
sista (pinta-ala-%)
GLC:llä saadaan seuraavat tulokset rasvahappokoostumukselle:
FA
MWP
256,4S
284,5Po
254,4O
282,5L
280,4Ln
278,4
pinta-ala-% 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0
4.5.3 Pinta-alaprosenttien muuntaminen mooleiksi kaikille rasva-
hapoille:
moolia P ¼10
256 ;4¼0;03900 moolia P Katso kaava (1)
moolia S ¼3
284 ;5¼0;01054 moolia S Katso kaava (1)
moolia Po ¼1
254 ;4¼0;00393 moolia Po Katso kaava (1)
moolia O ¼75
282 ;5¼0;26549 moolia O Katso kaava (1)
moolia L ¼10
280 ;4¼0;03566 moolia L Katso kaava (1)
moolia Ln ¼1
278 ;4¼0;003594 moolia Ln Katso kaava (1)
Summa = 0,35822 moolia TAG:tä1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 91
▼M13
4.5.4 Rasvahappojen muuntaminen prosenteiksi
mooli-% P 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03900 moolia P /C3100
0;35822 moolia¼10;888 % Katso kaava (2)
mooli-% S 1 ;2;3 ðÞ ¼0;01054 moolia S /C3100
0;35822 moolia¼2;944 % Katso kaava (2)
mooli-% Po 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00393 moolia Po /C3100
0;35822 moolia¼1;097 % Katso kaava (2)
mooli-% O 1 ;2;3 ðÞ ¼0;26549 moolia O /C3100
0;35822 moolia¼74;113 % Katso kaava (2)
mooli-% L 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03566 moolia L /C3100
0;35822 moolia¼9;956 % Katso kaava (2)
mooli-% Ln 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00359 moolia Ln /C3100
0;35822 moolia¼1;003 % Katso kaava (2)
Kokonaismooli-% = 100,0 %
Tyydyttyneiden ja tyydyttymättömien rasvahappojen summa TAG:n
1,2,3-asemassa:
mooli-% SFA = 10,888 % + 2,944 % = 13,831 % Katso kaava (3)
mooli-% UFA = 100,000 % − 13,831 % = 86,169 % Katso kaava (3)
4.5.5 Rasvahapp okoostumuksen laskeminen TAG:n 2- ja 1,3-
asemassa
4.5.5.1 Tyydyttyneet rasvahapot 2-asemassa [P(2) ja S(2)]
mooli-% P(2) = 10,888 % * 0,06 = 0,653 mooli-% Katso kaava (4)
mooli-% S(2) = 2,944 % * 0,06 = 0,177 mooli-% Katso kaava (4)
4.5.5.2 Tyydyttymättömät rasvahapot 1,3-asemassa [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) ja
Ln(1,3)]
mooli-% Po 2 ðÞ ¼1;097 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 1;263 mooli-% Katso kaava (5)
mooli-% O 2 ðÞ ¼74;113 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 85;295 mooli-% Katso kaava (5)
mooli-% L 2 ðÞ ¼9;956 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 11;458 mooli-% Katso kaava (5)
mooli-% Ln 2 ðÞ ¼1;003 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 1;154 mooli-% Katso kaava (5)
4.5.5.3 Rasvahapot 1,3-asemassa [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) ja
Ln(1,3)]
mooli-% P 1 ;3ðÞ ¼10;888/C00;659
210;888¼16;005 mooli-% Katso kaava (6)
mooli-% S 1 ;3ðÞ ¼2;944/C00;177
22;944¼4;327 mooli-% Katso kaava (6)
mooli-% Po 1 ;3ðÞ ¼1;097/C01;263
21;097¼1;015 mooli-% Katso kaava (6)
mooli-% O 1 ;3ðÞ ¼74;113/C085;295
274;113¼68;522 mooli-% Katso kaava (6)
mooli-% L 1 ;3ðÞ ¼9;956/C011;458
29;956¼9;205 mooli-% Katso kaava (6)
mooli-% Ln 1 ;3ðÞ ¼1;003/C01;154
21;003¼0;927 mooli-% Katso kaava (6)1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 92
▼M13
4.5.6 Triasyyliglyserolien laskeminen
Lasketusta rasvahappokoostumuksesta sn-2 ja sn-1,3-asemissa (katso
edellä):
FA seuraavissa: 1,3-as. 2-as.
P 16,005 % 0,653 %
S 4,327 % 0,177 %Po 1,015 % 1,263 %
O 68,522 % 85,295 %
L 9,205 % 11,458 %Ln 0,927 % 1,154 %Summa 100,0 % 100,0 %
lasketaan seuraavat triasyyliglyserolit:
LLL
PoPoPoPoLL ja 1 asemaisomeeriSLnLn ja 1 asemaisomeeriPoPoL ja 1 asemaisomeeri
PPoLn ja 2 asemaisomeeriä
OLLn ja 2 asemaisomeeriäPLLn ja 2 asemaisomeeriäPoOLn ja 2 asemaisomeeriä
4.5.6.1 TAG:t, joissa on yksi rasvahappo (LLL, PoPoPo) Katso kaava (7)
mooli-% LLL ¼
9;205 % /C311;458 % /C39;205 %
10 000= 0,09708 moolia LLL
% mooli-% PoPoPo ¼1;015 % /C31;263 % /C31;015 %
10 000= 0,00013 moolia PoPoPo
4.5.6.2 TAG:t, joissa on kaksi rasvahappoa (PoLL, SLnLn, PoPoL) Katso kaava
(8)
mooli- % PoLL þLLPo ¼1;015 % /C311;458 % /C39;205 % /C32
10 000= 0,02141
mooli-% LPoL ¼9;205 % /C31;263 % /C39;205 %
10 000= 0,01070
0,03211 moolia PoLL
mooli-% SLnLn þLnLnS ¼4;327 % /C31;154 % /C30;927 % /C32
10 000= 0,00093
mooli-% LnSLn ¼0;927 % /C30;177 % /C30;927 %
10 000= 0,00002
0,00095 moolia SLnLn
mooli-% PoPoL þLPoPo ¼1;015 % /C31;263 % /C39;205 % /C32
10 000= 0,00236
mooli-% PoLPo ¼1;015 % /C311;458 % /C31;015 %
10 000= 0,00118
0,00354 moolia PoPoL1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 93
▼M13
4.5.6.3 TAG:t, joissa on kolme eri rasvahappoa (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn)
Katso kaava (9)
mooli-% PPoLn ¼16;005 % /C31;263 % /C30;927 % /C32
10 000= 0,00375
mooli-% LnPPo ¼0;927 % /C30;653 % /C31;015 % /C32
10 000= 0,00012
mooli-% PoLnP ¼1;015 % /C31;154 % /C316;005 % /C32
10 000= 0,00375
0,00762 moolia PPoLn
mooli-% OLLn ¼68;522 % /C311;458 % /C30;927 % /C32
10 000= 0,14577
mooli-% LnOL ¼0;927 % /C385;295 % /C39;205 % /C32
10 000= 0,14577
mooli-% LLnO ¼9;205 % /C31;154 % /C368;522 % /C32
10 000= 0,14577
0,43671 moolia OLLn
mooli-% PLLn ¼16;005 % /C311;458 % /C30;927 % /C32
10 000= 0,03400
mooli-% LnPL ¼0;927 % /C30;653 % /C39;205 % /C32
10 000= 0,00111
mooli-% LLnP ¼9;205 % /C31;154 % /C316;005 % /C32
10 000= 0,03400
0,06911 moolia PLLn
mooli-% PoOLn ¼1;015 % /C385;295 % /C30;927 % /C32
10 000= 0,01605
mooli-% LnPoO ¼0;927 % /C31;263 % /C368;522 % /C32
10 000= 0,01605
mooli-% OLnPo ¼68;522 % /C31;154 % /C31;015 % /C32
10 000= 0,01605
0,04815 moolia PoOLn
ECN42 = 0,69540 moolia TAG:a1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 94
▼M14
Kuva 1: log α:n muuttuminen f:n funktiona (f = kaksoissidosten
lukumäärä)
Huom: La = lauriinihappo My = myristiinihappo P = palmitiinihappo St
= steariinihappo O = oleiinihappo L = linolihappo Ln = linolee-
nihappo.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 95
▼M14
Kuva 2: Soijaöljy
Kuva 3: Soijaöljy / oliiviöljy 30/70
1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 96
▼M14
Kuva 4: Oliiviöljy
1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 97
▼M19
LIITE XIX
ALIFAATTISTEN ALKOHOLIEN PITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN
KAASUKROMATOGRAFISESTI KAPILLAARIKOLONNILLA
1 TARKOITUS
Tässä kuvataan menetelmä rasvojen tai öljyjen sisältämien yksinker-
taisten alifaattisten alkoholien pitoisuuden ja niiden
kokonaispitoisuuden määrittämiseksi.
2 MENETELMÄN PERIAATE
Rasva tai öljy, johon on lisätty 1-eikosanolia sisäiseksi standardiksi,
saippuoidaan kaliumhydroksidin avulla etanoliliuoksessa ja saippuoitu-
mattomat osat uutetaan eetterillä. Alkoholifraktio erotetaan
saippuoitumattomasta uutteesta kromatografian avulla emäksisellä silika-
geelilevyllä; silikageelistä saadut alkoholit muutetaan
trimetyylisilyylieettereiksi ja määritetään kapillaarikaasukromatografian
avulla.
3 VÄLINEISTÖ
3.1 Pullo, 250 ml, jossa on hiotut lasiliitännät sekä palautusjäähdytin.3.2 Erotussuppilo, 500 ml.3.3 Pulloja, 250 ml.3.4 Ohutkerroskromatografialaitteisto, jonka lasilevyjen koko on 20 × 20 cm.3.5 UV-valo, jonka aallonpituus on 366 tai 254 nm.3.6 Mikroruiskuja, 100 µl ja 500 µl.
3.7 Lasisintterisuodatinsuppilo, jonka huokoskoko on G 3 (15—40 mm),
halkaisija noin 2 cm ja korkeus noin 5 cm ja jossa on liitäntä tyhjiöimu-
suodatusta varten sekä koirashios 12/21.
3.8 Tyhjiöimupullo, 50 ml, jossa on suodatinsuppiloon (3.7) sopiva naara-
shios.
3.9 Koeputki, 10 ml, jossa on ilmatiivis tulppa ja kartiomainen pohja.3.10 Kaasukromatografi, jota voi käyttää kapillaarikolonnin kanssa ja johon
liittyy virtauksenjakojärjestelmä, jonka osat ovat:
3.10.1 termostaattisäätöinen kolonniuuni, joka säilyttää halutun lämpötilan noin
± 1 ºC:n tarkkuudella,
3.10.2 injektiolaite, jonka lämpötilaa voi säätää ja jonka höyrystämisosa on
persilanoitua lasia,
3.10.3 liekki-ionisaatiodetektori ja muuntajavahvistin,
3.10.4 integraattori-piirturi, joka toimii muuntajavahvistimen kanssa ja jonka
vasteaika on enintään 1 sekunti ja jonka paperin nopeutta voidaan
säätää.
3.11 Lasinen tai kvartsilasinen kapillaarikolonni, jonka pituus on 20—30 m ja
sisähalkaisija 0,25—0,32 mm ja jonka sisäpinta on päällystetty nesteellä
SE-52 taiSE-54 taivastaavalla si ten, että nestekerroksen paksuus on
0,10—0,30 µm.
3.12 Mikroruisku, jossa on karkaistu neula kaasukromatografiaa varten, 10 µl.
3.13 Analyysivaaka, herkkyys 1 mg (näyttö 0,1 mg:n tarkkuudella).
4 REAGENSSIT
4.1 Kaliumhydroksidi, noin 2 N etanoliliuos: 130 g kaliumhydroksidia
(vähintään 85-prosenttista) liuotetaan samalla jäähdyttäen 200 ml:aan
tislattua vettä ja lisätään etanolia niin, että liuosta on yksi litra. Liuos
säilytetään tiiviisti suljetuissa tummissa lasipulloissa.
4.2 Etyylieetteri, analyysilaatua.4.3 Vedetön natriumsulfaatti, analyysilaatua.4.4 Silikageelillä päällystetyt lasilevyt, ilman fluoresenssi-indikaattoria,
paksuudeltaan 0,25 mm (voidaan ostaa käyttövalmiina).1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 98
▼M19
4.5 Kaliumhydroksidin 0,2 N etanoliliuos: 13 g kaliumhydroksidia liuote-
taan 20 ml:aan tislattua vettä ja lisätään etanolia niin että liuosta on 1
litra.
4.6 Bentseeni, kromatografiaa varten (ks. 5.2.2).4.7 Asetoni, kromatografiaa varten (ks. 5.2.2).4.8 Heksaani, kromatografiaa varten (ks. 5.2.2).4.9 Etyylieetteri, kromatografiaa varten (ks. 5.2.2).4.10 Puhdas kloroformi, analyysilaatua.4.11 Vertailuliuos ohutkerroskromatografiaa varten: kolesterolin tai fytoster-
olin 5-prosenttinen kloroformiliuos.
4.12 2,7-dikloorifluoreseiinin 0,2-prosenttinen etanoliliuos. Liuos tehdään
lievästi emäksiseksi lisäämällä muutama tippa kaliumhydroksidin 2 N
alkoholiliuosta.
4.13 Vedetön pyridiini, kromatografiaa varten.
4.14 Heksametyylidisilatsaani.
4.15 Trimetyylikloorisilaani.4.16 Alifaattisten C
20—C28-alkoholien trimetyylisilyylieettereiden standardi-
liuokset. Ne valmistetaan puhtaiden alkoholien seoksista juuri ennen
käyttöä.
4.17 0,1-prosenttinen (m/V) 1-eikosanolin kloroformiliuos (sisäinen stan-
dardi).
4.18 Kantajakaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua.4.19 Apukaasut: typpi, kaasukromatografista laatua.
5 MENETTELY
5.1 Saippuoitumattoman osan esikäsittely
5.1.1 250 ml:n pulloon lisätään 500 µl:n mikroruiskulla sellainen tila-
vuusmäärä 0,1-prosenttista 1-eikosanolin kloroformiliuosta (4.17), jonka
sisältämä 1-eikosanolin määrä on suunnilleen 10 % määritystä varten
otettavan näytteen alifaattisten alkoholien määrästä. Esimerkiksi, jos
näytettä on 5 g ja se on oliiviöljyä, lisätään 250 µl 0,1-prosenttista 1-
eikosanoliliuosta, ja jos se on uutettua oliiviöljyä, lisätään 1 500 µl
liuosta.
Haihdutetaan liuos kuiviin typpivirrassa ja punnitaan tarkalleen 5 g
kuivaa, suodatettua näytettä samaan pulloon.
5.1.2 Lisätään 50 ml kaliumhydroksidin 2 N etanoliliuosta, palautusjäähdytin
käynnistetään ja liuosta kuumennetaan vesihauteessa hiljalleen kiehu-
vaksi koko ajan voimakkaasti sekoittaen, kunnes saippuoituminen on
tapahtunut (liuos kirkastuu). Kuumentamista jatketaan vielä 20 minuutin
ajan ja lisätään sitten 50 ml tislattua vettä jäähdyttimen läpi. Sen jälkeen
palautusjäähdytin irrotetaan ja pullo jäähdytetään noin 30 ºC:n lämpöti-
laan.
5.1.3 Pullon sisältö siirretään kvantitatiivisesti 500 ml:n erotussuppiloon
käyttämällä huuhteena yhteensä noin 50 ml tislattua vettä. Lisätään
noin 80 ml etyylieetteriä, ravistetaan voimakkaasti noin 30 sekuntia ja
annetaan seistä niin että kerrokset erottuvat (Huom. 1).
Pohjalla oleva vesifaasi siirretään toiseen erotussuppiloon. Vesifaasi
uutetaan vielä kaksi kertaa kuten edellä, käyttäen molemmilla kerroilla
60—70 ml etyylieetteriä.
Huom. 1: Mahdollinen emulsio voidaan hajottaa lisäämällä pieni määrä
etanolia tai metanolia suihkeena.
5.1.4 Eetteriuutteet yhdistetään yhteen erotussuppiloon ja pestään tislatulla
vedellä (50 ml kerrallaan), kunnes pesuvesion neutraali a.
Pesuvesi heitetään pois, eetteriuutteet kuivataan vedettömällä natrium-
sulfaatilla ja suodatetaan etukäteen punnittuun 250 ml:n pulloon ja
pestään suppilo ja suodatin pienillä määrillä etyylieetteriä.
5.1.5 Eetteriä haihdutetaan, kunnes sitä on hyvin vähän jäljellä, ja kuivataan
heikossa alipaineessa tai typpivirrassa; lopuksi kuivataan lämpökaapissa
100 ºC:ssa noin 15 min, jäännös jäähdytetään eksikkaattorissa ja punni-
taan.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 99
▼M19
5.2 Alkoholifraktioiden erottaminen
5.2.1 Emäksisten levyjen valmistelu: silikageelilevyt (4.4) upotetaan kokonaan
kaliumhydroksidin 0,2 N etanoliliuokseen (4.5) 10 sekunniksi, minkä
jälkeen niiden annetaan kuivua vetokaapissa kahden tunnin ajan ja
lopuksi yhden tunnin ajan lämpökaapissa 100 ºC:ssa.
Levyt otetaan lämpökaapista ja säilytetään kalsiumkloridia sisältävässä
eksikkaattorissa käyttöhetkeen asti (näin käsitellyt levyt on käytettävä
kahden viikon kuluessa).
Huom. 2: Kun käytetään emäksisiä silikageelilevyjä alkoholifraktion
erottamiseen, saippuoitumattomia aineita ei tarvitse käsitellä
alumiinilla. Täten kaikki happamat yhdisteet (rasvahapot ja
muut hapot) jäävät lähtöviivalle. Tällöin saadaan sekä alifaat-
tisten alkoholien vyöhyke että terpeenisten alkoholien
vyöhyke, jotka molemmat erottuvat selvästisteroli vyöhyk-
keestä.
5.2.2 Heksaanin ja etyylieetterin seos, 65:35 (V/V), kaadetaan kehitysastiaan
niin että sitä on noin 1 cm (*).
Astia suljetaan sopivalla kannella ja annetaan olla vähintään puoli tuntia
suljettuna, jotta neste ja höyry saavuttavat tasapainon. Suodatinpaperi-
suikaleita, jotka ulottuvat eluointiaineeseen, voidaan kiinnittää astian
sisäseinään. Näin kehitysaika lyhenee noin kolmanneksella ja aineosat
eluoituvat tasaisemmin.
Huom. 3: Seos on vaihdettava uuteen jokaista määritystä varten, jotta
eluointiolosuhteet olisivat täysin toistettavissa.
5.2.3 Saippuoitumattomasta osasta (5.1.5) valmistetaan noin 5-prosenttinen
kloroformiliuos ja 0,3 ml liuosta levitetään mahdollisimman ohuena ja
tasaisena nauhana käyttäen 100 µl:n mikroruiskua, noin 2 cm:n päähän
lasilevyn alareunasta. Asetetaan yhdelle levyn reunoista 2—3 µl alifaat-
tisten alkoholien vertailuliuosta (4.11) lähtöviivan tasalle, jotta
alifaattisten alkoholien vyöhyke olisi helppo tunnistaa kehittämisen
jälkeen.
5.2.4 Levy asetetaan kehitysastiaan, joka on valmisteltu 5.2.2 kohdan mukai-
sesti. Ympäristön lämpötilan on oltava 15—20 ºC. Astia suljetaan
kannella välittömästi, minkä jälkeen näytteen annetaan eluoitua, kunnes
liuotinrintama on noussut 1 cm:n päähän levyn yläreunasta.
Levy otetaan kehitysastiasta ja liuotin haihdutetaan kuumassa ilmavir-
rassa tai levy jätetään joksikin aikaa kuivumaan vetokaappiin.
5.2.5 Levylle suihkutetaan ohuelti ja tasaisesti 2,7-dikloori-fluoreseiiniliuosta.
Alifaattisten alkoholien vyöhyke erottuu ultraviolettivalossa tarkastel-
tuna vertailuliuostäplään verrattaessa; alifaattisten alkoholien
vyöhykkeen ja välittömästi sen yläpuolella olevan, terpeenialkoholeja
vastaavan vyöhykkeen muodostaman kokonaisuuden ympärille piirretään
viiva mustalla kynällä.
Huom. 4: Koska terpeenialkoholien vyöhyke sisältää näissä koeolosuh-
teissa huomattavan määrän alifaattisia alkoholeja, molemmat
vyöhykkeet on kerättävä talteen yhdessä.
5.2.6 Silikageelikerros raaputetaan rajatulta alueelta metallilastalla. Saatu
aines hienonnetaan, siirretään suodatinsuppiloon (3.7), lisätään 10 ml
kuumaa kloroformia, sekoitetaan huolellisesti metallilastalla ja suodate-
taan suodatinsuppiloon liitettyyn pulloon (3.8) tyhjiöllä.
Suppiloon jäänyt aines pestään kolme kertaa noin 10 ml:lla etyylieet-
teriä, ja suodos kerätään suodatinsuppiloon liitettyyn pulloon. Suodosta
haihdutetaan, kunnes sen tilavuus on noin 4—5 ml ja jäännösliuos
kaadetaan etukäteen punnittuun 10 ml:n koeputkeen (3.9). Liuosta
kuivataan alhaisella lämmöllä kevyessä typpivirrassa; jäännös liuotetaan
muutamaan tippaan asetonia, kuivataan jälleen ja pidetään kymmenisen
minuuttia 105 ºC:ssa lämpökaapissa, jäähdytetään eksikkaattorissa ja
punnitaan.
Koeputkessa oleva jäännös sisältää alkoholifraktion.
5.3 Trimetyylisilyylieetterien valmistelu
5.3.1 Koeputkessa olevaan alkoholifraktioon lisätään silylointireagenssi niin,
että kosteutta ei pääse mukaan (Huom. 6); mainittu reagenssi on seos,1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 100
(*) Erityisesti tällaisissa tapauksissa on käytettävä bentseenin ja asetonin eluointiseosta
95:5 (V/V), jotta vyöhykkeet eroaisivat hyvin.
▼M19
jossa on tilavuussuhteessa 9:3:1 pyridiiniä, heksametyylidisilatsaania ja
trimetyylikloorisilaania (Huom. 5); seosta tarvitaan 50 µl jokaista
alifaattisten alkoholien milligrammaa kohti.
Huom. 5: Käyttövalmiita liuoksia on kaupallisesti saatavana; lisäksi
muita silylointireagensseja, kuten esim. bis-trimetyylisilyyli-
trifluoriasetamidi + 1 % trimetyylikloorisilaania; reagenssi
laimennetaan samalla määrällä vedetöntä pyridiiniä.
Huom. 6: Lievä sameus on tavallista eikä ole haitaksi. Valkoiset hiuta-
leet tai vaaleanpunaiseksi värjäytyminen ovat merkkejä
kosteudesta tai reagenssien muuttumisesta. Jos näitä ilmenee,
koe on uusittava.
5.3.2 Koeputki suljetaan tulpalla ja sitä ravistetaan varovasti (ei ylösalaisin),
kunnes alifaattiset alkoholit ovat täysin liuenneet. Putken annetaan seistä
vähintään 15 minuuttia huoneenlämmössä ja sen jälkeen sitä sentrifugoi-
daan muutaman minuutin ajan; kirkas liuos on nyt valmis
kaasukromatografista määritystä varten.
5.4 Kaasukromatografinen määritys
5.4.1 Esivalmistelut ja kolonnin valmistelu
5.4.1.1 Kapillaarikolonni asennetaan kaasukromatografialaitteistoon niin, että
kolonnin alkupää kiinnitetään injektoriin, joka on liitetty virtauksenja-
kojärjestelmään, ja kolonnin loppupää kiinnitetään detektoriin.
Tarkistetaan kaasukromatografisten laitteiden toiminta (kaasuliitännän
tiiviys, detektorin, virtauksenjakojärjestelmän ja piirturin toimivuus jne.)
5.4.1.2 Jos kapillaarikolonnia ei ole aikaisemmin käytetty, se on ensin valmis-
teltava käyttöön. Pieni määrä kaasua johdetaan kolonnin läpi,
käynnistetään kaasukromatografi ja aloitetaan asteittainen lämmittä-
minen, jota jatketaan, kunnes lämpötila on kohonnut vähintään 20 ºC
korkeammaksi kuin käyttölämpötila (Huom. 7). Korkeaa lämpötilaa
pidetään yllä vähintään kaksi tuntia, minkä jälkeen kromatografialait-
teisto saatetaan käyttövalmiiksi (kaasuvirran ja erotuksen säätö,
liekinsytytys, elektronisen piirturin kytkeminen, uunin lämpötilan säätö
kolonnia varten, detektorin ja injektorin säätö jne.) ja signaalia rekis-
teröidään herkkyydellä, joka on vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin
määrityksessä käytettävä. Saadun perusviivan on oltava suora, eikä
siinä saa olla minkäänlaisia piikkejä eikä siirtymää mihinkään suuntaan.
Jos ilmenee negatiivista suoraviivaista siirtymää, se on merkki kolonnin
liitäntöjen vuodosta, ja jos ilmenee positiivista siirtymää, se johtuu
kolonnin riittämättömästä valmistelusta.
Huom. 7: Esivalmistelulämpötilan on aina oltava vähintään 20 ºC
alempi kuin käytetyn stationäärifaasin korkein lämpötila. 5.4.2
5.4.2 Käyttöolosuhteiden valinta
5.4.2.1 Käyttöolosuhteiden ohjearvot ovat seuraavat:
— kolonnin lämpötila: alussa isotermi säädetään 180 ºC:seen kahdek-
saksi minuutiksi ja ohjelmoidaan nousemaan sen jälkeen 5 ºC
minuutissa, kunnes saavutetaan 260 ºC:n lämpötila, joka pidetään
yllä seuraavat 15 minuuttia,
— höyrystimen lämpötila: 280 ºC,
— detektorin lämpötila: 290 ºC,— kantajakaasun lineaarinopeus: heliumille 20—35 cm/s, vedylle
30—50 cm/s,
— jakosuhde: 1:50—1:100,— laitteiston herkkyys: 4—16 kertaa vähimmäisvaimennus,— rekisteröintiherkkyys: 1—2 mV täydestä asteikosta,
— paperin nopeus: 30—60 cm/h,
— injektoidun aineen määrä: 0,5—1 µl trimetyylisilyylieetteriliuosta
(TMSE).
Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin
ominaisuuksien mukaan niin, että saadaan aikaan kromatogrammeja,
jotka täyttävät seuraavat vaatimukset:
—C
26-alkoholin retentioaika on 18 ± 5 minuuttia,
—C22-alkoholin piikki on 80 ± 20 % täydestä asteikosta oliiviöljylle ja
40 ± 20 % täydestä asteikosta siemenöljylle.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 101
▼M19
5.4.2.2 Näiden ehtojen täyttymisen tarkistamiseksi injektoidaan useaan kertaan
standardi TMSE alkoholiseosta, ja käyttöolosuhteita säädetään niin, että
saadaan parhaat mahdolliset tulokset.
5.4.2.3 Piikkien integrointiparametrit asetetaan niin, että saadaan oikeat arvot
huomioon otettaville piikeille.
5.4.3 Määritys
5.4.3.1 Imetään 10 µl:n mikroruiskuun 1 µl heksaania, sitten 0,5 µl ilmaa ja
tämän jälkeen 0,5—1 µl näyteliuosta; lopuksi männällä vedetään vielä
neula tyhjäksi. Neula työnnetään septumin läpi injektiopesään ja 1—2
sekunnin kuluttua seos injektoidaan nopeasti, odotetaan noin viisi
sekuntia, jonka jälkeen neula vedetään pois hitaasti.
5.4.3.2 Piirturi pidetään käynnissä, kunnes näytteessä olevien alifaattisten alko-
holien TMSE on eluoitunut täydellisesti. Perusviivan on koko ajan
oltava 5.4.1.2 kohdan vaatimusten mukainen.
5.4.4 Piikkien tunnistaminen
Yksittäiset piikit tunnistetaan retentioaikojen perusteella ja vertaamalla
alifaattisten alkoholien TMSE-seokseen, joka on määritetty samoissa
olosuhteissa.
Kuva 1 esittää neitsytoliiviöljyn alkoholifraktion kromatogrammia.
5.4.5 Kvantitatiivinen arviointi
5.4.5.1 1-eikosanolin ja C22,C24,C26ja C28alifaattisten alkoholien piikkien
pinta-alat lasketaan integraattorilla.
5.4.5.2 Lasketaan kunkin alifaattisen alkoholin pitoisuus milligrammoina
1 000 g:ssa rasvaa taiöljyä seuraavasti :
jossa:
Ax= x-alkoholin piikin pinta-ala
As= 1-eikosanolin piikin pinta-ala
ms= lisätyn 1-eikosanolin massa milligrammoina
m = näytteen massa grammoina.
6 TULOSTEN ESITTÄMINEN
Ilmoitetaan yksinkertaisten alifaattisten alkoholien pitoisuudet milli-
grammoina 1 000 g:ssa öljyä tai rasvaa sekä pitoisuuksien summa
alifaattisten alkoholien yhteenlaskettuna määränä.1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 102
▼M19
LISÄYS
Kaasun lineaarinopeuden määrittäminen
Kaasukromatografialaitteisto säädetään tavallisia käyttöolosuhteita varten ja
injektoidaan 1—3 µl metaania (tai propaania) sekä mitataan aika, jonka kuluessa
kaasu kulkee kolonnin läpi, injektointihetkestä piikin muodostumiseen (tM).
Lineaarinopeus (cm/s) saadaan kaavasta L/tM, missä L on kolonnin pituus sent-
timetreinä ja tM on mitattu aika
Kuva 1 — Neitsytöljyn alkoholifraktion kromatogrammi
1 = Eikosanoli
2 = Dokosanoli
3 = Trikosanoli
4 = Tetrakosanoli5 = Pentakosanoli6 = Heksakosanoli
7 = Heptakosanoli
8 = Oktakosanoli1991R2568 — FI — 01.11.2003 — 020.001 — 103