A)

Esto-ELISA- tai kilpaileva (kompetitiivinen) ELISA-testi on tehtävä seuraavalla tavalla: Kilpailevalla ELISA-testillä, jossa käytetään monoklonaalista 3-17-A3-vasta-ainetta, voidaan havaita kaikki bluetongue-tautiviruksen (BTV) tunnetut serotyypit. Testissä on periaatteena, että BTV-antigeenin ja ryhmäspesifisen monoklonaalisen vasta-aineen (3-17-A3) reaktio keskeytetään lisäämällä testiseerumia. Testiseerumissa olevat BTV-vasta-aineet estävät monoklonaalisen vasta-aineen (MAb) reagoinnin ja heikentävät odotettua värimuutosta entsyymimerkityn hiirivasta-aineen ja kromogeenin/substraatin lisäämisen jälkeen. Seerumit voidaan testata yhtenä 1:5 laimennoksena (spot-testimenetelmä – lisäys 1) tai ne voidaan titrata (seerumin titrausmenetelmä – lisäys 2) kunnes saadaan positiivisen reaktion laimennuspäätepiste. Positiivisena pidetään yli 50 %:n inhibitioarvoja. Aineet ja reagenssit: 1. Tarkoituksenmukaiset ELISA-mikrotiitterilevyt. 2. Antigeeni: soluista erotettuna konsentraattina, valmistetaan jäljempänä kuvatulla tavalla ja säilytetään joko – 20 °C:ssa tai – 70 °C:ssa. 3. Estopuskuri: 0,3 % BTV-negatiivista täysikasvuisen naudan seerumia sisältävää fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), 0,1 % (v/v) Tween-20:tä (polyoksietyleeni-sorbitoni-monolauraatti-siirapin muodossa) PBS:ssa. 4. Monoklonaalinen vasta-aine: 3-17-A3 (hybridomakudosviljelmän supernatanttina), kohdistettu ryhmäspesifistä VP7 polypeptidiä vastaan, varastoidaan – 20 °C:ssa tai kylmäkuivataan, laimennetaan estopuskurilla 1/100 ennen käyttöä. 5. Konjugaatti: kanin antihiiriglobuliini (absorboituna ja eluoituna), retikkaperoksidaasiin konjugoituna ja säilytettynä pimeässä 4 °C:ssa. 6. Kromogeeni ja substraatti: ortofenyleenidiamiini (OPD-kromogeeni) loppupitoisuutena 0,4 mg/ml steriilissä tislatussa vedessä. Vetyperoksidi (30 % w/v-substraatti) 0,05 % v/v lisätään välittömästi ennen käyttöä (5μl H2O2 / 10 ml OPD). (OPD:tä on käsiteltävä varoen – on käytettävää kumikäsineitä – tuotetta epäillään mutageeniseksi.) 7. Rikkihappoa, 1 M: 26,6 ml happoa lisätään 473,4 ml:aan tislattua vettä. (Huom: happo on aina lisättävä veteen, ei koskaan vettä happoon.) 8. Orbital-ravistelija. 9. ELISA-levynlukija (testi voidaan lukea silmämääräisesti). Testitapa Cc: konjugaattikontrolli (ei seerumia / ei monoklonaalista vasta-ainetta); C++: vahva positiivinen seerumikontrolli; C+: heikko positiivinen seerumikontrolli; C-: negatiivinen seerumikontrolli; Cm: monoklonaalinen vasta-ainekontrolli (ei seerumia).



LISÄYS 1 Spot-laimennuksen (1:5) testikaavake (40 seerumia/levy) Kontrollit Testiseerumit 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



LISÄYS 2 Seerumititraation testikaavake (10 seerumia/levy) Kontrollit Testiseerumit 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1:5 1:5 B Cc C- 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Testitapa: Konjugaattikontrolli (Cc) : BTV-antigeenia ja konjugaattia sisältävät kuopat 1A ja 1B ovat sokeakoe, jolla voidaan kalibroida ELISA-lukija. MAb-kontrolli (Cm) : Sarakkeet 1 ja 2, rivit G ja H ovat monoklonaalinen vasta-ainekontrolli, joka sisältää BTV-antigeenia, monoklonaalista vasta-ainetta ja konjugaattia. Kuopista näkyy enimmäisväri. Tämän kontrollin optisen tiheyden keskiarvo vastaa 0 prosentin inhibitioarvoa. Positiivinen kontrolli (C++, C+) : Sarakkeet 1 ja 2, rivit C-D-E-F. Nämä kuopat sisältävät BTV-antigeenia, BTV:n vahvaa ja heikkoa positiivista antiseerumia, MAb:ta ja konjugaattia. Negatiivinen kontrolli (C-) : Kuopat 2A ja 2B ovat negatiivisia kontrolleja, jotka sisältävät BTV-antigeenia, BTV:n negatiivista antiseerumia, MAb:ta ja konjugaattia. Testiseerumit : Laajamittaisissa serologisissa tutkimuksissa ja nopeissa seulontatesteissä seerumit voidaan testata yhtenä laimennoksena 1:5 (lisäys 1). Vaihtoehtoisesti 10 seerumia voidaan testata laimennusvälillä 1:5–1:640 (lisäys 2). Tulokseksi saadaan tietoja testiseerumien vasta-aineiden pitoisuuksista. Menettely: 1. BTV-antigeeni laimennetaan pitoisuudeltaan esititrattuun puskuroituun suolaliuokseen (PBS). Sonikoidaan hetken aikaa yhteen kasautuneiden virusten hajottamiseksi (ellei tätä laitetta ole käytettävissä, pipetoidaan voimakkaasti) ja liuosta annostellaan 50 μl ELISA-levyn jokaiseen kuoppaan. Reunoja naputtamalla antigeeni jaetaan tasaisesti levylle. 2. Inkuboidaan 37 °C:ssa 60 minuuttia orbital-ravistelijassa. Levyt pestään kolmeen kertaan huuhtelemalla ja kuopat tyhjennetään epästeriilillä puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kuivataan imupaperilla. 3. Kontrollikuopat: Lisätään 100 μl estopuskuria Cc-kuoppiin. Lisätään 50 μl positiivisia ja negatiivisia kontrolliseerumeita laimennoksena 1:5 (10 μl seerumeita + 40 μl estopuskuria) kuoppiin C-, C+ ja C++. Lisätään 50 μl estopuskuria MAb-kontrollikuoppiin. Spot-titrausmenetelmä: Jokaista testiseerumia lisätään laimennoksena 1:5 (10 μl seerumeita + 40 μl estopuskuria) estopuskurissa kahteen rinnakkaiskuoppaan riveillä 3–12. tai Seerumin titrausmenetelmä: Kustakin testinäytteestä valmistetaan 1:2 laimennossarja (1:5–1:640) estopuskurissa poikki levyn kahdeksaan kuoppaan käyttäen yhtä kuoppariviä (riveille 3–12). 4. Heti testiseerumien lisäämisen jälkeen MAb laimennetaan 1:100 estopuskurilla ja levyn kaikkiin kuoppiin sokeakoekuoppaa lukuun ottamatta lisätään 50 μl. 5. Inkuboidaan 37 °C:ssa 60 minuuttia orbital-ravistelijassa. Levyt pestään kolmeen kertaan PBS:llä ja kuivataan imupaperilla. 6. Kanin hiirivasta-aineen konsentraatti laimennetaan suhteessa 1/5 000 estopuskuriin ja levyn kaikkiin kuoppiin lisätään 50 μl. 7. Inkuboidaan 37 °C:ssa 60 minuuttia orbital-ravistelijassa. Levyt pestään kolmeen kertaan PBS:llä ja kuivataan imupaperilla. 8. Ortofenyleenidiamiinidihydrokloridi (OPD) sulatetaan ja välittömästi ennen käyttöä lisätään 5 μl 30-prosenttista vetyperoksidia jokaista OPD:n 10 ml:aa kohti. Levyn jokaiseen kuoppaan lisätään 50 μl. Värin muuttumista odotetaan noin 10 minuuttia ja reaktio keskeytetään 1 M:lla rikkihappoa (50 μl/kuoppa). Värin pitäisi muuttua MAb-kontrollikuopissa ja BTV-vasta-aineettomissa seerumikuopissa. 9. Levyt tutkitaan joko silmämääräisesti tai spektrofotometrin avulla ja tulokset kirjataan. Tulosten määritys: Tietokoneohjelmiston avulla tulostetaan OD-arvot (optinen tiheys) ja inhibitioprosentti (PI) testi- ja kontrolliseerumeille vertaamalla tuloksia antigeenikontrollikuoppien keskiarvoihin. OD- ja PI-arvoja käytetään arvioitaessa, onko testitulos hyväksyttävissä rajoissa. MAb-kontrollin (antigeeni sekä MAb, jos ei testiseerumeita) yläraja-arvot (UCL) ja alaraja-arvot (LCL) ovat OD-arvojen 0,4 ja 1,4 välillä. Kaikki ne levyt, jotka eivät täytä edellä olevia perusteita, on hylättävä. Jos tietokoneohjelmistoa ei ole käytettävissä, OD-arvot tulostetaan ELISA-tulostimella. 100 %:n arvoa vastaava OD-arvon keskiarvo lasketaan antigeenikontrollikuopille. 50 %:n OD-arvo määritetään ja kunkin näytteen positiivisuus ja negatiivisuus lasketaan manuaalisesti. Inhibitioprosentti (PI) -arvo = 100 – (kunkin testikontrollin OD / Cm:n OD:n keskiarvo) × 100. Negatiivista kontrolliseerumia sisältävien rinnakkaiskuoppien PI-arvojen olisi oltava välillä + 25 % ja – 25 % ja rinnakkaisten nollakoekuoppien PI-arvojen välillä + 95 % ja + 105 %. Näiden rajojen ulkopuolella olevat arvot eivät välttämättä merkitse sitä, ettei lukemaa voisi hyväksyä, mutta viittaavat siihen, että on kehittymässä taustaväri. Vahvojen positiivisen kontrolliseerumien PI-arvojen olisi oltava välillä + 81 % ja + 100 % ja heikkojen positiivisten kontrolliseerumien välillä + 51 % ja + 80 %. Testiseerumien diagnostinen raja-arvo on 50 % (PI 50 % tai OD 50 %). Näytteet, joiden PI-arvot ovat > 50 %, ovat negatiivisia. Rinnakkaiskuoppien raja-arvot ylittäviä tai alittavia näytteitä pidetään epäilyttävinä. Tällaiset näytteet voidaan testata uudelleen spot-testillä ja/tai titraamalla. Positiiviset näytteet voidaan titrata, jolloin selviää näytteen positiivisuuden taso. Silmämääräinen tulosten luku: Positiiviset ja negatiiviset näytteet erottaa silmämääräisesti helposti; heikkojen positiivisten tai vahvojen negatiivisten näytteiden silmämääräinen tulkinta saattaa olla vaikeampaa. BTV-ELISA-antigeenin esikäsittely: 1. 40–60 Roux-pulloa, joissa on BHK-21-soluviljelmää, pestään kolme kertaa seerumittomalla Eagle-kasvualustalla ja infektoidaan BTV:n serotyypin 1 avulla seerumittomalla Eagle-kasvualustalla. 2. Inkuboidaan 37 °C:ssa ja solutuhovaikutus (CPE) tutkitaan päivittäin. 3. Kun CPE tulee esille 90–100 prosenttisesti jokaisen Roux-pullon solulevyllä, virus kerätään ravistamalla solut irti seinämästä. 4. Solut sentrifugoidaan pohjalle nopeudella 2 000–3 000 kierrosta minuutissa. 5. Supernatantti heitetään pois ja solut suspendoidaan uudelleen noin 30 ml:ssa puskuroitua suolaliuosta (PBS), jossa on 1 % ”Sarkosyliä” ja 2 ml fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (lysis-puskuri). Tämä voi aiheuttaa solujen hyytelöitymistä, jolloin on lisättävä enemmän lysis-puskuria. (Huom: Fenyylimetyylisulfonyylifluoridi on vaarallista, sitä on käsiteltävä äärimmäisen huolellisesti.) 6. Soluja sonikoidaan 60 sekuntia 30 mikronin amplitudilla toimivan ultraäänisondin avulla. 7. Sentrifugoidaan kymmenen minuutin ajan nopeudella 10 000 kierrosta minuutissa. 8. Supernatantti varastoidaan + 4 °C:seen ja pohjalla oleva solunappi suspendoidaan uudelleen 10–20 ml:aan lysis-puskuria. 9. Sonikoidaan ja sentrifioidaan. Supernatantti kerätään talteen kussakin vaiheessa, kaikkiaan kolme kertaa. 10. Kerätyt supernatantit yhdistetään ja sentrifugoidaan nopeudella 24 000 kierrosta minuutissa (100,000 g) 120 minuutin ajan + 4 °C:n lämpötilassa 5 ml:n tyynyllä 40 %:sta sakkaroosia (w/v PBS:ssä) käyttäen Beckmannin 30 ml:n sentrifugiputkia ja SW 28 -roottoria. 11. Supernatantti heitetään pois, putket tyhjennetään hyvin ja solunappi suspendoidaan uudelleen puskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) ultraäänen avulla. Antigeeni varastoidaan määräosissa – 20 °C:ssa. BTV-ELISA-antigeenin titraus: Bluetongue-taudin ELISA-antigeeni titrataan epäsuoralla ELISA-tekniikalla. Antigeenin kaksoislaimennokset titrataan monoklonaaliseen vasta-aineen 3-17-A3 vakiolaimennoksella (1/100). Testitapa on seuraava: 1. BTV-antigeeni laimennetaan 1:20 PBS:llä mikrotiitterilevyllä kaksoislaimennosten (50 μl/kuoppa) sarjana käyttäen monikanavapipettiä. 2. Inkuboidaan orbital-ravistelijassa tunnin ajan 37 °C:ssa. 3. Levyt pestään puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) kolme kertaa. 4. Monoklonaalista vasta-ainetta 3-17-A3 (laimennos 1/100) lisätään 50 μl mikrotiitterilevyn jokaiseen kuoppaan. 5. Inkuboidaan orbital-ravistelijassa tunnin ajan 37 °C:ssa. 6. Levyt pestään puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) kolme kertaa. 7. Mikrotiitterilevyn jokaiseen kuoppaan pannaan 50 μl kanin hiirivasta-aineglobuliinia konjugoituneena retikka-peroksidaasiin, joka on laimennettu esititrattuun optimaaliseen pitoisuuteen. 8. Inkuboidaan orbital-ravistelijassa tunnin ajan 37 °C:ssa. 9. Lisätään substraatti ja kromogeeni kuten edellä. Reaktio pysäytetään 10 minuutin kuluttua lisäämällä 1 M:sta rikkihappoa (50 μl/kuoppa). Koska vertailukokeessa monoklonaalista vasta-ainetta on oltava ylimäärin, on valittava antigeenilaimennos, joka on titrauskäyrällä (eikä tasaisella alueella), joka antaa suunnilleen 0,8 OD:n kymmenen minuutin jälkeen.