1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 1
Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentointitarkoituksiin.Toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä.
►B KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 2568/91,
annettu 11 päivänä heinäkuuta 1991,
oliiviöljyn ja uutetun oliiviöljyn ominaisuuksista sekä niiden määritysmenetelmistä
(EYVL L 248, 5.9.1991, s. 1)
Muutettu:
virallinen lehti
N:o sivu päivämäärä
►M1 Komission asetus (ETY) N:o 3682/91, annettu 17 päivänä joulukuuta
1991L 349 36 18.12.1991
►M2 Komission asetus (ETY) N:o 1429/92, annettu 26 päivänä toukokuuta
1992L 150 17 2.6.1992
►M3 Komission asetus (ETY) N:o 1683/92, annettu 29 päivänä kesäkuuta
1992L 176 27 30.6.1992
►M4 Komission asetus (ETY) N:o 1996/92, annettu 15 päivänä heinäkuuta
1992L 199 18 18.7.1992
►M5 Komission asetus (ETY) N:o 3288/92, annettu 12 päivänä marraskuuta
1992L 327 28 13.11.1992
►M6 Komission asetus (ETY) N:o 183/93, annettu 29 päivänä tammikuuta
1993L 22 58 30.1.1993
►M7 muutettu commission Regulation (EEC) No 826/93 of 6 April 1993 (*) L 87 6 7.4.1993
►M8 Komission asetus (ETY) N:o 620/93, annettu 17 päivänä maaliskuuta
1993L 66 29 18.3.1993
►M9 Komission asetus (EY) N:o 177/94, annettu 28 päivänä tammikuuta 1994 L 24 33 29.1.1994
►M10 Komission asetus (EY) N:o 2632/94, annettu 28 päivänä lokakuuta 1994 L 280 43 29.10.1994
►M11 Komission asetus (EY) N:o 656/95, annettu 28 päivänä maaliskuuta 1995 L 69 1 29.3.1995
►M12 Komission asetus (EY) N:o 2527/95, annettu 27 päivänä lokakuuta 1995 L 258 49 28.10.1995
(*) Tätä asiakirjaa ei ole julkaistu suomenkielisenä.
▼B
KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 2568/91,
annettu 11 päivänä heinäkuuta 1991,
oliiviöljyn ja uutetun oliiviöljyn ominaisuuksista sekä niiden
määritysmenetelmistä
EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka
ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen,
ottaa huomioon rasva-alan yhteisestä markkinajärjestelystä 22 päivänä
syyskuuta 1966 annetun neuvoston asetuksen 136/66/ETY (1), sellaisena
kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (ETY) N:o 3577/90 (2), ja
erityisesti sen 35 a artiklan,
sekä katsoo, ettäasetuksen 136/66/ETY liitteessä määrätään kussakin jäsenvaltiossa sekä
yhteisön maiden välisessä ja kolmansien maiden kanssa käytävässäkaupassa kaupan pidettävän puristetun oliiviöljyn ja uutetun oliiviöljyn
nimityksistä ja määritelmistä,
eri öljytyyppien erottamiseksi toisistaan kunkin tyypin fysikaalis-
kemialliset ominaisuudet ja neitsytöljyn aistinvaraiset ominaisuudet on
syytä määritellä kyseisten tuotteiden puhtauden ja laadun takaamiseksi,sanotun kuitenkaan rajoittamatta muiden voimassa olevien tätä koske-vien säännösten soveltamista,
eri öljytyyppien ominaisuuksien esiintyminen olisi määritettävä yhte-
näisesti kaikkialla yhteisössä; tätä varten on syytä vahvistaa yhteisönmenetelmät kemiallista määritystä ja aistinvaraista arviointia varten;
siirtymäkauden aikana olisi kuitenkin sallittava jäsenvaltioissa sovellet-
tavien muiden määritysmenetelmien käyttö ottaen kuitenkin huomioon,että jos tulokset ovat erilaisia, yhteisellä menetelmällä saadut tuloksetovat ratkaisevia,
oliiviöljyn fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien sekä määritysmene-
telmien määritteleminen johtaa yhdistetyn nimikkeistön 15 ryhmänlisähuomautusten mukauttamiseen,
neitsytöljyn aistinvaraisten ominaisuuksien arviointimenetelmään
kuuluu valituista ja koulutetuista maistajista koostuvien raatien
muodostaminen; tämän vuoksi olisi säädettävä tällaisen järjestelyn
luomiseen tarvittavasta määräajasta; ottaen huomioon joidenkin jäsen-valtioiden vaikeudet maistajien raadin muodostamisessa olisi sallittavamuiden jäsenvaltioiden raatien käyttö,
oliivijätteiden tuontiin sovellettavan tuontimaksujärjestelmän moitteet-
toman toiminnan varmistamiseksi olisi säädettävä yhtenäisestämenetelmästä näiden tuotteiden öljypitoisuuden määrittämiseksi,
on suotavaa säätää ennen tämän asetuksen voimaantuloa pakatun öljyn
myyntiä koskevasta määräajasta, jottei kaupalle aiheutuisi haittaa,
on syytä kumota komission asetus (ETY) N:o 1058/77 (
3), sellaisena
kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (ETY) N:o 1858/88 (4), ja
rasvojen hallintokomitea ei ole antanut lausuntoa puheenjohtajansa
asettamassa määräajassa,
ON ANTANUT TÄMÄN ASETUKSEN:
1 artikla
1 Öljyjä, joiden ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I
olevassa 1, 2 ja 3 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset,1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 2
(1) EYVL N:o 172, 30.9.1966, s. 3025/66
(2) EYVL N:o L 353, 17.12.1990, s. 23
(3) EYVL N:o L 128, 24.5.1977, s. 6
(4) EYVL N:o L 166, 1.7.1988, s. 10
▼B
pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevissa 1 a, 1 b ja 1 c
kohdassa tarkoitettuina neitsytoliiviöljyinä.
2 Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I
olevassa 4 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetäänasetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 1 d kohdassa tarkoitet-
tuna oliivilamppuöljynä.
3 Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I
olevassa 5 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään
asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 2 kohdassa tarkoitettuna
puhdistettuna oliiviöljynä.
4 Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I
olevassa 6 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään
asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 3 kohdassa tarkoitettunaoliiviöljynä.
5 Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I
olevassa 7 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetäänasetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 4 kohdassa tarkoitettunaraakana uutettuna oliiviöljynä.
6 Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I
olevassa 8 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetäänasetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 5 kohdassa tarkoitettunapuhdistettuna uutettuna oliiviöljynä.
7 Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I
olevassa 9 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään
asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 6 kohdassa tarkoitettuna
uutettuna oliiviöljynä.
2 artikla
1 Niiden öljyjen, joista määrätään liitteessä I, ominaisuudet
määritetään seuraavia määritysmenetelmiä noudattaen:
— oleiinihappoprosentteina ilmaistavien vapaiden rasvahappojen
määrittäminen liitteen II menetelmällä,
— peroksidiluvun määrittäminen liitteen III menetelmällä,
— alifaattisten alkoholien määrittäminen liitteen IV menetelmällä,
— sterolipitoisuuden määrittäminen liitteen V menetelmällä,
— erytrodiolin ja uvaolin määrittäminen liitteen VI menetelmällä,
— triglyseridin 2-asemassa olevien tyydyttyneiden rasvahappojen
määrittäminen liitteen VII menetelmällä,
— trilinoleiinipitoisuuden määrittäminen liitteen VIII menetelmällä,
— spektrofotometrinen määritys liitteen IX menetelmällä,
— rasvahappokoostumuksen määrittäminen liitteiden X A ja X B
menetelmällä,
— haihtuvien halogeeniliuottimien määrittäminen liitteen XI mene-
telmällä,
— neitsytoliiviöljyn aistinvaraisten ominaisuuksien arviointi liitteen
XII menetelmällä 2 kohdan mukaisesti sovellettuna,
— öljyn puhdistuksen toteaminen liitteen XIII menetelmällä,
— stigmastadieenien määritykseen liitteessä XVII kuvattu menetelmä.
2 Aistinvaraiset ominaisuudet arvioi ►
M3maistaja, joka on aistin-
varaisen määrityksen asiantuntija tai jota asiantuntijat avustavat ◄
liitteen XII lomakkeessa esitettyä maistamismenettelyä noudattaen.Kun arvio on ristiriidassa tuotteen nimityksen kanssa, maistajan onannettava näyte maistajien raadin tutkittavaksi liitteen XII määräysten
mukaisesti.
Maistajien raadin on tehtävä mahdolliset uusintamääritykset näiden
määräysten mukaisesti.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 3
▼M11
▼B
▼B
Kun aistinvaraiset ominaisuudet arvioidaan interventiojärjestelmään
liittyvien toimien toteuttamisen aikana, maistajien raati tekee tämänarvion liitteen XII mukaisesti.
3 artikla
Edellä 2 artiklassa säädettyjen määritysmenetelmien käyttöönotto ei
estä jäsenvaltioita käyttämästä muita kokeiltuja ja tieteellisesti päteviämenetelmiä ►
M628 päivään helmikuuta 1993 ◄, jos tästä ei
aiheudu haittaa sellaisten tuotteiden liikkuvuudelle, jotka on yhteisönmenetelmin todettu voimassa olevien säännösten mukaisiksi. Ennen
tällaisten muiden menetelmien käyttöä jäsenvaltioiden on ilmoitettava
niistä komissiolle.
Kun jollakin näistä muista menetelmistä saadaan eri tulos kuin yhteisön
menetelmällä, viimeksi mainitulla menetelmällä saatua tulosta pidetäänratkaisevana.
3 a artikla
Jos kaupallisten liiketoimien kohteena olevan oliiviöljyn aistinvarai-
sissa ominaisuuksissa on poikkeamia, asianomaiset osapuolet voivatkääntyä valitsemansa hyväksytyn maistajien raadin puoleen.
3 b artikla
Kun öljyn aistinvaraisten ominaisuuksien havaitaan olevan erilaiset
kuin sen nimityksestä johtuvat ominaisuudet, kyseisen jäsenvaltion onsovellettava hallinnollisia rahamääräisiä seuraamuksia, joiden määrävahvistetaan havaitun poikkeaman vakavuuden mukaisesti, sanotunkuitenkaan rajoittamatta muiden mahdollisten seuraamusten sovelta-
mista.
Poikkeaman arvioinnissa otetaan erityisesti huomioon tavanomaisissa
olosuhteissa säilytetyn öljyn ominaisuuksien luonnollinen kehittyminen.
Jäsenvaltioiden on annettava komissiolle tiedoksi kunkin vuosipuo-
liskon alussa havaittujen poikkeamien määrä ja luonne sekä edellisen
vuosipuoliskon aikana sovelletut seuraamukset.
4 artikla
1 Aistinvaraisten ominaisuuksien arvioimiseksi jäsenvaltioiden on
perustettava maistajien raateja, jotka vastaavat näiden ominaisuuksienvirallisesta tarkastuksesta ja joiden on täytettävä seuraavat edellytykset:
— niiden on koostuttava valikoiduista maistajista, jotka on koulutettu
liitteen XII menetelmän sääntöjä noudattaen,
— niillä on oltava laitteet ja aineistot, joita tarvitaan edellä mainitun
menetelmän sääntöjen mukaisessa aistinvaraisessa arvioinnissa,
— niiden on käytettävä mainitun menetelmän edellyttämää oliiviöljyn
aistinvaraisen määrityksen erityissanastoa, profiililomaketta ja
arvostelutaulukkoa,
— niiden on järjestettävä aistinvaraisia arviointeja yhteisön tai
kansainvälisellä tasolla määräaikaistarkastusten ja havaitsemisperus-
teiden yhdenmukaistamiskokousten yhteydessä,
— niiden on toimitettava komissiolle vuosittain kaikki raatien perusta-
misessa tapahtuneita muutoksia ja hyväksytyn raadinominaisuudessa suoritettuja arviointikertoja koskevat tiedot.
Kunkin jäsenvaltion on hyväksyttävä raadit, jotka täyttävät edellä
esitetyt edellytykset ja jotka on perustettu sen omalle alueelle. Sen onvalittava niistä yksi raati vastaamaan tarkastusmäärityksistä.
Raateja, jotka jäsenvaltiot ovat perustaneet ennen 1 päivää marraskuuta
1992 liitteen XII menetelmän edellyttämiä sääntöjä noudattaen, on
pidettävä hyväksyttyinä tässä artiklassa tarkoitetulla tavalla.
Kunkin jäsenvaltion on annettava tiedoksi hyväksyttyjen raatien luet-
telo sekä komissiolle että jäsenvaltioille.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 4
▼M5
▼M5
2 Jos jäsenvaltiolla on vaikeuksia maistajien raadin perustamisessa
omalle alueelleen, se voi käyttää toisen jäsenvaltion hyväksyttyä mais-tajien raatia.
3 Kunkin jäsenvaltion on laadittava luettelo ammattijärjestöjen tai
ammattien välisten järjestöjen 1 kohdan edellytysten mukaisesti perus-tamista maistajien raadeista ja niiden on valvottava näiden edellytystennoudattamista.
5 artikla
Korvataan neuvoston asetuksen (ETY) N:o 2658/87 (
1) liitteessä I
olevan yhdistetyn nimikkeistön 15 ryhmän 2, 3 ja 4 lisähuomautustämän asetuksen liitteellä XIV.
6 artikla
1 Oliiviöljyn erottamisesta syntyneen öljykakun ja muiden yhdis-
tetyn nimikkeistön CN-koodeihin 2306 90 11 ja 2306 90 19 kuuluvienjätteiden öljypitoisuus määritetään liitteen XV menetelmän mukaisesti.
2 Edellä 1 kohdassa tarkoitettu öljypitoisuus ilmaistaan öljyn paino-
prosenttina kuiva-aineesta.
7 artikla
Muiden kuin liitteessä XI tarkoitettujen haitallisten aineiden osalta
sovelletaan niiden esiintymistä koskevia yhteisön säännöksiä.
8 artikla
1 Jäsenvaltioiden on ilmoitettava komissiolle tämän asetuksen sovel-
tamiseksi toteutetut toimenpiteet.
2 Kunkin vuosipuoliskon alussa jäsenvaltioiden on toimitettava
komissiolle tiedoksi yhteenveto edellisen vuosipuoliskon aikana
tehtyjen määritysten tuloksista.
Rasvojen hallintokomitea tutkii nämä tulokset asetuksen N:o 136/66/
ETY 39 artiklassa säädettyä menettelyä noudattaen.
9 artikla
Kumotaan asetus (ETY) N:o 1058/77.
10 artikla
1 Tämä asetus tulee voimaan seuraavana päivänä sen jälkeen, kun se
on julkaistu Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä . Liitteen XII
menetelmä on kuitenkin otettava käyttöön ►
M11 päivästä marras-
kuuta 1992 ◄, interventioon liittyviä toimia lukuun ottamatta.
Tämä menetelmä eikoske ennen 1 päi vää marraskuuta 1992 pakattuja
neitsytoliiviöljyjä.
2 Tämä asetus eikoske ennen tämän asetuksen voi maantuloa
pakattua ja 31 päivään lokakuuta 1992 asti kaupan pidettyä oliiviöljyätai uutettua oliiviöljyä.
Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaise-
naan kaikissa jäsenvaltioissa.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 5
(1) EYVL N:o L 256, 7.9.1987, s.1.▼M6
▼B
▼M5
▼B
▼B
LIITTEET
Yhteenveto
Liite I Oliiviöljyn ominaisuudet…
Liite II Vapaiden rasvahappojen määrittäminen…
Liite III Peroksidiluvun määrittäminen…Liite IV ►
M6Vahapitoisuuden määrittäminen kapillaarikaasukromato-
grafisella menetelmällä ◄…
Liite V Sterolien rakenteen ja pitoisuuden määrittäminen kapillaarikaa-
sukromatografisella menetelmällä …
Liite VI Erytrodioli- ja uvaolipitoisuuden määrittäminen…Liite VII Triglyseridin 2-asemassa olevien tyydyttyneiden rasvahappojen
määrittäminen…
Liite VIII Trilinoleiinipitoisuuden määrittäminen…Liite IX Spektrofotometrinen määritys…
Liite X A Rasvahappojen metyyliestereiden määrittäminen kaasukromato-
grafisella menetelmällä …
Liite X B Rasvahappojen metyyliestereiden valmistaminen …
Liite XI Haihtuvien halogeeniliuottimien pitoisuuden määrittäminen olii-
viöljystä …
Liite XII Neitsytoliiviöljyn aistinvarainen arviointi…
Liite XIII ►
M6Oliiviöljyn neutraloiminen ja värin poisto
laboratoriossa ◄…
Liite XIV Yhdistetyn nimikkeistön 15 ryhmän lisähuomautukset 2, 3 ja 4…Liite XV Oliivijätteen öljypitoisuus …
Liite XVI Jodiluvun määrittäminen…
Liite XVII Menetelmä stigmastadieenien määrittämiseksi kasviöljyistä …1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 6
▼M11
LIITE I
OLIIVIÖLJYN OMINAISUUDET
LuokkaHappa-
muus
mekv %Peroksidi-
luku
mekv O2/
kgHalogee-
niliuot-
timet
mg/kg (1)Vahat
mg/kgTriglyser-
idin 2-
asemassa
olevat
tyydytty-
neet
rasvahapot
%Stigmasta-
dieeni (2)
mg/kgErytrodioli
+ Uvauli
%Trilino-
leiini
%Koles-
teroli
%Brassikas-
teroli
%Kampes-
teroli
%Stigmas-
teroli
%Beetasi-
tosterol-
i(3)
%Delta-7-
stigmas-
teroli
%Kokonais-
sterolit
mg/kg
1. Ekstra-neitsytolii-
viöljy M 1,0 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 0,15 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Kamp. m 93,0 M 0,5 m 1000
2. Neitsytoliiviöljy M 2,0 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 0,15 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Kamp. m 93,0 M 0,5 m 10003. Yleisen kauppa-
laadun neitsytolii-
viöljy M 3,3 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 0,15 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Kamp. m 93,0 M 0,5 m 1000
4. Oliivilamppuöljy m 3,3 m 20 m 0,20 M 350 M 1,3 M 0,50 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 10005. Puhdistettu olii-
viöljy M 0,5 M 5 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Kamp. m 93,0 M 0,5 m 1000
6. Oliiviöljy M 1,5 M 15 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Kamp. m 93,0 M 0,5 m 10007. Raaka uutettu
oliiviöljy m 2,0 — — — M 1,8 m 12 M 0,7 M 0,5 M 0,1 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 2500
8. Puhdistettu uutettu
oliiviöljy M 0,5 M 5 M 0,20 — M 2,0 m12 M 0,6 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Kamp. m 93,0 M 0,5 m 1800
9. Uutettu oliiviöljy M 1,5 M 15 M 0,20 >350 M 2,0 >4,5 M 0,6 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Kamp. m 93,0 M 0,5 m 1600
M = suurin määrä, m = pienin määrä
(1) Elektroninkaappausdetektorin havaitsemien yhdisteiden yleinen yläraja.
Kunkin yksittäin havaitun yhdisteen yläraja on 0,10 mg/kg.
(2) Sellaisten isomeerien yhteismäärä, joka voidaan (tai ei voida) erottaa kapillaarikolonnin avulla.
(3) Delta-5,23-stigmastadienoli + sitosteroli + klerosteroli + sitostanoli + delta-5-avenasteroli + delta-5,24-stigmastadienoli.
Huom:
Öljy on hylättävä, jos yksikin ominaisuuksista poikkeaa vahvistetuista arvoista.▼M111991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 7
LuokkaHappopitoisuudetTransoleii-
niisome-
erien
yhteismääräTranslinoli
ja translion-
teeniisome-
erien
yhteismääräK232K270K270alumii-
nioksidikä-
sittelyn
jälkeenDelta KRaadin
arvostelu Myristiini
%Linoleeni
%Asakidoni
%Eikosieeni
%Behen
%Liestoseriini
%
1. Ekstra-neitsytolii-
viöljy M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,05 M 0,05 M 2,50 M 0,20 M 0,10 M 0,01 m 6,5
2. Neitsytoliiviöljy M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,05 M 0,05 M 2,60 M 0,25 M 0,10 M 0,01 m 5,53. Yleisen kauppa-
laadun neitsytolii-
viöljy M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,05 M 0,05 M 2,60 M 0,25 M 0,10 M 0,01 m 3,5
4. Oliivilamppuöljy M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,10 M 0,10 M 3,70 M 0,25 M 0,11 — < 3,5
5. Puhdistettu oliiviöljy M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,20 M 0,30 M 3,40 M 1,20 — M 0,16 —
6. Oliiviöljy M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,20 M 0,30 M 3,30 M 1,00 — M 0,13 —7. Raaka uutettu olii-
viöljy M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,3 M 0,2 M 0,20 M 0,10 —————
8. Puhdistettu uutettu
oliiviöljy M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,3 M 0,2 M 0,40 M 0,35 M 5,50 M 2,50 — M 0,25 —
9. Uutettu oliiviöljy M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,3 M 0,2 M 0,40 M 0,35 M 5,30 M 2,00 — M 0,20 —
M = suurin määrä, m = pienin määrä
Huom:
Öljy on hylättävä, jos yksikin ominaisuuksista poikkeaa vahvistetuista arvoista.
Jos K270ylittää kyseisen luokan raja-arvon, K270on määritettävä uudelleen alumiinioksidikäsittelyn jälkeen, jotta voitaisiin varmistua öljyn puhtaudesta.▼M111991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 8
▼B
LIITE II
VAPAIDEN RASVAHAPPOJEN MÄÄRITTÄMINEN
1 TARKOITUS
Vapaiden rasvahappojen määrittäminen oliiviöljyistä. Vapaiden rasvahap-
pojen pitoisuus ilmaistaan tavanomaisesti laskettuna happamuutena.
1.1 Periaate
Näyte liuotetaan liuotinseokseen ja vapaat rasvahapot titrataan kaliumhy-
droksidin etanoliliuoksella.
1.2 Reagenssit
Kaikkien reagenssien on oltava määritykseen hyväksyttyä analyysilaatua
ja veden on oltava joko tislattua tai vastaavaa puhtausastetta.
1.2.1 Dietyylieetteri ja 95-prosenttinen etanoli (V/V), yhtä suuret tilavuusosat
kumpaakin.
Huom.: Dietyylieetteri on helposti syttyvää ja voi muodostaa räjähtäviä
peroksideja. Sen käytössä on oltava erittäin varovainen.
Seos, johon on lisätty 0,3 ml fenoliftaleiiniliuosta (1.2.3) 100 ml:aan,
neutraloidaan juuri ennen käyttöä kaliumhydroksidiliuoksella (1.2.2),
Huom.: Jos ei voida käyttää dietyylieetteriä, voidaan käyttää etanolin ja
tolueenin seosta. Etanoli voidaan tarvittaessa korvata 2-propano-
lilla.
1.2.2 Kaliumhydroksidi titrattuna etanoliliuoksena, c(KOH) noin 0,1 mol/l tai
tarvittaessa c(KOH) noin 0,5 mol/l.
Kaliumhydroksidin etanoliliuoksen tarkka väkevyys on tunnettava ja
tarkistettava juuri ennen käyttöä. Käytetään liuosta, joka on valmistettu
vähintään viisi vuorokautta ennen käyttöä ja dekantoitu ruskeaan lasipul-
loon, jossa on kumitulppa. Liuoksen on oltava väritöntä tai oljenkeltaista.
Huom.: Väritön, stabiili kaliumhydroksidiliuos voidaan valmistaa seuraa-
vasti. Kuumennetaan kiehuvaksi 1 000 ml etanolia, johon on
lisätty 8 g kaliumhydroksidia ja 0,5 g alumiinilastuja, ja keitetään
seosta yksi tunti palautusjäähdyttimen kanssa. Tislataan
välittömästi. Tisleeseen liuotetaan tarvittava määrä kaliumhydrok-
sidia. Annetaan seistä useita vuorokausia ja dekantoidaan kirkas
neste, joka on kaliumkarbonaattisakan yläpuolella.
Liuos voidaan myös valmistaa ilman tislausta seuraavasti: lisätään
4 ml alumiinibutylaattia 1 000 ml:aan etanolia ja seoksen anne-
taan seistä joitakin vuorokausia. Dekantoidaan sakan yläpuolinen
neste ja liuotetaan siihen tarvittava määrä kaliumhydroksidia.
Liuos on käyttövalmis.
1.2.3 Fenoliftaleiini, 10 g liuotettuna litraan 95- tai 96-prosenttista etanolia (V/
V) tai, jos rasva on kovin tummaa, alkalisini, 20 g liuotettuna litraan 95-
tai 96-prosenttista etanolia (V/V).
1.3 Välineistö
Tavanomainen laboratoriovälineistö ja erityisesti:
1.3.1 Analyysivaaka1.3.2 Erlenmeyerpullo, 250 ml1.3.3 Byretti, 10 ml, mitta-asteikon jakoväli 0,05 ml.
1.4 Suoritus
1.4.1 Näytteen esikäsittely määritystä varten
Määritys tehdään suodatetusta näytteestä. Jos veden ja epäpuhtauksien
kokonaispitoisuus on pienempi kuin 1 %, voidaan määritys tehdä
näytteestä sellaisenaan.
1.4.2 Näytteenotto
Näyte otetaan oletetun happamuuden perusteella seuraavan taulukon
mukaan:1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 9
▼B
Oletettu happolukuNäytemäärä
(g)Näytteen punnitustark-
kuus
(g)
< 1 20 0,05
1—4 10 0,024—15 2,5 0,01
15—75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
Näyte punnitaan erlenmeyerpullossa (1.3.2).
1.4.3 Määritys
Näyte (1.4.2) liuotetaan 50—150 ml:aan ennalta neutraloitua dietyylieet-
teri/etanoli-seosta (1.2.1).
Titrataan, koko ajan sekoittaen, 0,1 mol/l kaliumhydroksidiliuoksella
(1.2.2) (ks. Huom. 2), kunnes indikaattorin väri muuttuu (fenoliftaleiinin
vaaleanpunainen väri säilyy vähintään 10 sekunnin ajan).
Huom. 1 Titrattu kaliumhydroksidin etanoliliuos (1.2.2) voidaan korvata
kalium- tai natriumhydroksidin vesiliuoksella, jos lisätty vesi ei
aiheuta faasien erottumista.
Huom. 2 Jos 0,1 mol/l kaliumhydroksidiliuosta tarvitaan enemmän kuin
10 ml, käytetään 0,5 mol/l liuosta.
Huom. 3 Jos liuos samenee titrattaessa, liuotinseosta (1.2.1) lisätään
tarpeen mukaan, kunnes liuos on kirkasta.
1.5 Happamuus: ilmaistuna oleiinihappoprosentteina
Happamuus painoprosentteina ilmaistuna on:
V/C2c/C2M
1 000/C2100
m¼V/C2c/C2M
10/C2m
jossa:
V = titratun kaliumhydroksidiliuoksen tilavuus millilitroina;
c = titratun kaliumhydroksidiliuoksen tarkka pitoisuus moolia/litra;M = tuloksen ilmaisemiseen käytetyn hapon moolimassa g/mol (= 282);
m = näytteen massa grammoina.
Tulos on kahden määrityksen tulosten aritmeettinen keskiarvo.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 10
▼B
LIITE III
PEROKSIDILUVUN MÄÄRITTÄMINEN
1 TARKOITUS
Tämä standardi kuvaa rasvojen ja öljyjen peroksidiluvun määritysmene-
telmän.
2 SOVELTAMISALA
Tämä standardi soveltuu eläin-ja kasvirasvojen sekä -öljyjen tutkimiseen.
3 MÄÄRITELMÄ
Peroksidiluku ilmaisee näytteessä olevien kaliumjodidia hapettavien
aineiden määrän (ilmaistuna aktiivisen hapen milliekvivalentteina kilo-
grammaa kohti) tässä kuvatuissa koeolosuhteissa.
4 PERIAATE
Näyte liuotetaan etikkahapon ja kloroformin seokseen ja käsitellään kalium-
jodidilla. Vapautuva jodi titrataan natriumtiosulfaattiliuoksella.
5 VÄLINEISTÖ
Käytettävien laitteiden on oltava puhtaita siten, että niissä ei ole mitään
hapettavia tai pelkistäviä aineita.
Huom.: Hiottuja lasipintoja ei saa rasvata.
5.1 Punnituslasi, 3 ml.5.2 Lasipulloja, vetoisuus noin 250 ml, hiotut suut ja tulpat, etukäteen kuivattu
ja täytetty puhtaalla, kuivalla inerttikaasulla (typellä tai mieluummin hiili-
dioksidilla).
5.3 Byretti, 25 tai 50 ml, mitta-asteikon jakoväli 0,1 ml.
6 REAGENSSIT
6.1 Analyysilaatuinen kloroformi, josta happi on poistettu puhtaalla, kuivalla
inerttikaasuvirralla tapahtuvalla kaasuhuuhtelulla.
6.2 Analyysilaatuinen jääetikka, josta happi on poistettu puhtaalla, kuivalla
inerttikaasuvirralla tapahtuvalla kaasuhuuhtelulla.
6.3 Kaliumjodidin tuore, kyllästetty vesiliuos, joka ei sisällä jodia eikä jodaat-
teja.
6.4 Natriumtiosulfaatin vesiliuos, 0,01 tai 0,002 N, normalisoitu huolellisesti
juuriennen käyttöä.
6.5 Tärkkelysliuos, 10 g/l vesidispersio, liukoisesta luonnon tärkkelyksestä
valmistettu tuore liuos.
7 NÄYTE
Huolehditaan siitä, että näyte otetaan ja säilytetään pimeässä ja kylmässä, ja
että sen lasisissa säilytysastioissa ei ole tyhjää tilaa. Astiat on suljettava
ilmatiiviisti joko hiotuilla lasitulpilla tai korkilla.
8 SUORITUS
Määritys tehdään hajapäivänvalossa tai keinovalossa. Näyte punnitaan
0,001 g:n tarkkuudella punnituslasissa (5.1) tai, ellei sellaista ole, pullossa
(5.2). Tarvittava näytemäärä riippuu oletetusta peroksidiluvusta seuraavan
taulukon mukaan:1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 11
▼B
Oletettu peroksidiluku
(meq O2/kg)Näytemäärä
(g)
0—12 5,0—2,0
12—20 2,0—1,220—30 1,2—0,830—50 0,8—0,5
50—90 0,5—0,3
Avataan pullo (5.2) ja asetetaan sisään punnituslasi, jossa on näyte. Lisätään
10 ml kloroformia (6.1). Liuotetaan näyte nopeasti sekoittaen. Lisätään
15 ml etikkahappoa (6.2), sitten 1 ml kaliumjodidiliuosta (6.3). Suljetaan
pullo nopeasti, ravistetaan yksi minuutti ja annetaan seistä tasan viisi
minuuttia pimeässä 15—25 ºC:n lämpötilassa.
Lisätään noin 75 ml tislattua vettä. Vapautunut jodi titrataan natriumtiosul-
faattiliuoksella (6.4) (jos oletettu peroksidiluku on alle 12, käytetään 0,002 N
liuosta ja jos se on yli 12, käytetään 0,01 N liuosta) voimakkaasti sekoittaen
ja indikaattorina käytetään tärkkelysliuosta (6.5).
Samasta näytteestä tehdään kaksimääri tystä.
Sokeakoe tehdään samanaikaisesti. Jos sen tulos on suurempi kuin 0,05 ml
0,01 N natriumtiosulfaattiliuosta (6.4), ovat reagenssit olleet epäpuhtaita ja
ne on vaihdettava.
9 TULOSTEN ESITTÄMINEN
Peroksidiluku (PV), ilmaistuna aktiivisen hapen milliekvivalentteina kilo-
grammaa kohti, saadaan kaavasta:
PV¼
V/C2T/C21 000
m
jossa:
V = määritykseen käytetyn normalisoidun natriumtiosulfaattiliuoksen
(6.4) määrä millilitroina, korjattuna sokeakokeen tuloksilla;
T = määritykseen käytetyn natriumtiosulfaattiliuoksen (6.4) tarkka
normaalisuus;
m = näytteen massa grammoina.
Tulos on kahden määrityksen tulosten aritmeettinen keskiarvo.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 12
▼M6
LIITE IV
VAHAPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN KAPILLAARIKAASUKRO-
MATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ
1 TARKOITUS
Tällä menetelmällä määritetään koeolosuhteissa tiettyjen rasvojen vaha-
pitoisuus.
Tätä menetelmää voidaan käyttää erityisesti erottamaan puristamalla ja
uuttamalla saatu oliiviöljy.
2 PERIAATE
Rasva, johon on lisätty soveltuva sisäinen standardi, fraktioidaan kroma-
tografisesti hydratoitua silikageeliä sisältävässä kolonnissa;
koeolosuhteissa (joissa polaarisuus on triglyseridien polaarisuutta
heikompi) ensimmäisenä eluoitunut jae otetaan talteen ja määritetään
suoraan kapillaarikaasukromatografian avulla.
3 VÄLINEET
3.1 25 ml erlenmeyer-pullo.
3.2 Lasikolonni kromatografiaa varten, jonka sisähalkaisija on 15,0 mm ja
pituus 30 - 40 cm.
3.3 Soveltuva kaasukromatografialaitteisto ja kapillaarikolonni, jossa on
suoraan kolonniin johtava järjestelmä, jonka osat ovat:
3.3.1 termostaattisäätöinen uuni kolonnille, joka pitää halutun lämpötilan ± 1
ºC:n tarkkuudella,
3.3.2 kylmäinjektori, kolonniin suoraan syöttämiseksi,3.3.3 liekki-ionisaatiodetektori sekä muuntajavahvistin,3.3.4 soveltuva integraattoripiirturi, joka toimii muuntajavahvistimen (3.3.3)
kanssa ja jonka vastenopeus on enintään 1 sekunti ja jonka paperin
nopeutta voidaan säätää,
3.3.5 lasinen tai kvartsilasinen kapillaarikolonni: pituus 10 - 15 mm, sisähalk-
aisija 0,25 - 0,35 mm päällystettynä sisäpuolelta SE-52 tai SE-54 -
nesteellä taivastaavalla, paksuudeltaan tasai sesti0,10 - 0,30 µm.
3.4 Mikroruisku, kolonniin suoraan syöttämiseksi, 10 µl, jossa on kovetettu
neula.
4 REAGENSSIT
4.1 Silikageeli 70 - 230 mesh, art. 7754 Merck.
Silikageeli laitetaan uuniin 500 ºC:n lämpötilaan 4 tunniksi. Jäähdy-
tetään ja lisätään 2 % vettä. Sekoitetaan massan homogenoimiseksi.
Säilytetään pimeässä vähintään 12 tuntia ennen käyttöä.
4.2 n-Heksaania, kromatografiaa varten.
4.3 Etyylieetteriä, kromatografiaa varten.
4.4 n-Heptaania, kromatografiaa varten.4.5 Lauryyliarakidaatin standardiliuos, 0,1 % (m/v) liuos heksaanissa
(sisäinen standardi).
4.6 Kantajakaasu: puhdas vety, kaasukromatografiaa varten.
4.7 Apukaasut:
— puhdas vety, kaasukromatografiaa varten,
— puhdas ilma, kaasukromatografiaa varten.
5 MENETTELY
5.1 Vahajakeen erottaminen
5.1.1 Kromatografiakolonnin esikäsittely
Suspendoidaan 15 g hydratoitua silikageeliä 2-prosenttiseen n-heksaa-
niin ja laitetaan kolonniin.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 13
▼M6
Annetaan tasaantua itsestään ja täydennetään tasaantumista sähkökäyt-
töisellä sekoittajalla, jotta saadaan homogeenisempi
kromatografiakerros. Suodatetaan läpi 30 ml n-heksaania mahdollisten
epäpuhtauksien poistamiseksi.
5.1.2 Kolonnikromatografia
Punnitaan tasan 500 mg näytettä 25 ml:n erlenmeyerpulloon, lisätään
sopiva määrä sisäistä standardia oletetun vahapitoisuuden mukaan.
Esimerkki: lisätään 0,1 mg lauryyliarakidaattia, jos on kysymys oliiviöl-
jystä ja 0,25 - 0,5 mg, jos on kyse uutetusta öljystä.
Siirretään näin valmistettu näyte kahden 2 ml:n n-heksaaniannoksen
avulla 5.1.1 kohdan mukaisesti käsiteltyyn kromatografiakolonniin.
Liuottimen annetaan valua, kunnes se on 1 mm absorboimisaineen
pinnan yläpuolella. Aloitetaan kromatografinen eluutio: kerätään 140
ml n-heksaani/etyylieetteriseosta, suhde 99:1, valumisnopeuden ollessa
noin 15 pisaraa 10 sekunnissa (2,1 ml minuutissa).
Tällä tavoin saatu jae kuivataan pyöröhaihduttimessa, kunnes lähes
kaikki liuotin on saatu poistettua. Viimeiset 2 tai 3 ml liuotinta poiste-
taan heikon typpivirtauksen avulla, jonka jälkeen lisätään 10 ml n-
heptaania.
5.2 Kaasukromatografinen määritys
5.2.1 Esivalmistelut ja kolonnin valmistelu
5.2.1.1 Kolonni asennetaan kaasukromatografiin siten, että tulosola yhdistetään
on-column -järjestelmään ja poistosola detektoriin.
Tarkistetaan kaasukromatografisten laitteiden toimivuus (kaasuliitäntöjen
kunto, detektorin ja piirturijärjestelmän tehokkuus jne.).
5.2.1.2 Jos kolonnia ei ole aikaisemmin käytetty, se on ensin valmisteltava
käyttöön. Kevyt kaasuvirtaus johdetaan kolonnin läpi ja käynnistetään
kaasukromatografi. Lämmitetään asteittain, kunnes lämpötila on
kohonnut vähintään 20 ºC korkeammaksi kuin käyttölämpötila
(huomautus). Tätä lämpötilaa pidetään yllä vähintään kaksi tuntia, jonka
jälkeen laitteisto säädetään käyttöolosuhteisiin (kaasuvirtojen säätö,
liekin sytytys, kytkeminen elektroniseen piirturiin, uunin lämpötilan
säätö kolonnia varten, detektorin säätö jne.) ja signaali säädetään niin,
että sen herkkyys on vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin on arvioitu
määrityksessä tarvittavan. Saadun pohjaviivan on oltava suora, siinä ei
saa olla minkäänlaisia piikkejä eikä ryömintää mihinkään suuntaan.
Jos ilmenee negatiivista suoraviivaista ryömintää, se on merkki kolonnin
epätäydellisistä liitännöistä; positiivinen ryömintä johtuu kolonnin
riittämättömästä valmistelusta.
Huom: Esivalmistelulämpötilan tulee aina olla vähintään 20 ºC alhai-
sempi kuin käytetyn eluentin korkein oletettu lämpötila.
5.2.2 Käyttöolosuhteiden valinta
5.2.2.1 Yleisesti noudatettavat käyttöolosuhteet ovat seuraavat:
— kolonnin lämpötila: aluksi 80 ºC, sen jälkeen lämpötilaa nostetaan 30
ºC minuutissa, kunnes saavutetaan 120 ºC ja ohjelmoidaan nouse-
maan sen jälkeen 5 ºC minuutissa, kunnes saavutetaan 340 ºC,
— detektorin lämpötila: 350 ºC,
— kantajakaasun lineaarinopeus: vedylle 20 - 35 cm/s,— laitteen herkkyys: 4 - 16 kertaa vähimmäisvaimennus,— piirturin herkkyys: 1 - 2 mV asteikon pohjasta,— paperin nopeus: 30 cm/h,
— injektoidun aineen määrä: 0,5 - 1 µl liuosta.
Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin
ominaisuuksien perusteella (jotta saadaan seuraavat edellytykset
täyttäviä kromatogrammeja: sisäisen standardin C 32 retentioaika on 25
± 2 minuuttia ja edustavimpien vahojen piikki on 60 - 100 % asteikon
pohjasta).
5.2.2.2 Piikkien integrointiparametrit asetetaan niin, että saadaan oikeat arvot
huomioon otettavien piikkien pinta-aloille.
5.2.3 Määrityksen suorittaminen
5.2.3.1 Imetään 10 µl:n mikroruiskuun 1 µl liuosta; vedetään männällä neula
tyhjäksi. Työnnetään neula injektiolaitteeseen ja 1 - 2 sekunnin kuluttua
injektoidaan nopeasti; noin 5 sekunnin kuluttua vedetään neula hitaasti
pois.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 14
▼M6
5.2.3.2 Piirturi pidetään käynnissä, kunnes vahat ovat eluoituneet täydellisesti.
Pohjaviivan on koko ajan oltava 5.2.1.2. kohdan vaatimusten mukainen.
5.2.4 Piikkien tunnistaminen
Eri piikkien tunnistaminen suoritetaan retentioaikojen perusteella ja
vertaamalla samoissa olosuhteissa määritettyihin vahojen seoksiin,
joiden retentioajat tunnetaan.
Kuva 1 esittää neitsytoliiviöljyn vahojen kromatogrammia.
5.2.5 Kvantitatiivinen arviointi5.2.5.1 Sisäisen standardin ja C 40 - C 46 alifaattisten esterien piikkien pinta-
alat lasketaan integraattorilla.
5.2.5.2 Lasketaan kunkin esterin vahapitoisuus, ilmoitettuna mg/kg rasvaa, seur-
aavalla kaavalla:
esteri(mg/kg) =A
x·ms·►M91 000◄
As·m
jossa:
Ax= kunkin esterin piikin pinta-ala
As= lauryyliarakidaattipiikin pinta-ala
ms= lisätyn lauryyliarakidaatin massa milligrammoina
m = määritystä varten otetun näytteen massa grammoina.
6 TULOSTEN ILMAISEMINEN
Eri vahojen pitoisuudet ja niiden summa ilmoitetaan mg: oina rasvaa
kilogrammaa kohti.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 15
▼M6
LISÄYS
Kaasun lineaarinopeuden määrittäminen
Injektoidaan1 - 3 µl metaania (tai propaania) tavanomaisiin käyttöolosuhteisiin
säädettyyn kaasukromatografialaitteistoon. Otetaan tarkka aika siitä, miten kauan
kaasu kulkee kolonnin läpi, alkaen injektiohetkestä piikin muodostumiseen (tM).
Lineaarinopeus, cm/s, saadaan kaavasta L/tM, jossa L on kolonnin pituus sentti-
metreinä ja tM on aika sekunteina sekuntikellolla mitattuna.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 16
▼M61991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 17
▼B
LIITE V
STEROLIEN RAKENTEEN JA PITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN
KAPILLAARIKAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ
1 TARKOITUS
Tällä menetelmällä voidaan määrittää yksittäisten sterolien määrät ja
niiden kokonaismäärä rasvoissa ja öljyissä.
2 PERIAATE
Rasva tai öljy, johon on lisätty a-kolestanoli sisäiseksi standardiksi, saip-
puoidaan kaliumhydroksidin etanoliliuoksella ja saippuoitumaton aines
uutetaan etyylieetterillä. Sterolifraktio erotetaan saippuoitumattomasta
uutteesta ohutkerroskromatografialla käyttäen emäksistä silikageelilevyä.
Silikageelistä saadut sterolit muutetaan trimetyylisilyylieettereiksi ja
määritetään kapillaarikaasukromatografialla.
3 VÄLINEISTÖ
3.1 Pullo, 250 ml, jossa on hiokset ja palautusjäähdytin.3.2 Erotussuppilo, 500 ml.3.3 Pulloja, 250 ml.
3.4 Ohutkerroskromatografialaitteisto, jonka levyjen koko on 20 × 20 cm.
3.5 Ultraviolettivalo, jonka aallonpituus on 366 tai 254 nm.3.6 Mikroruiskuja, 100 µl ja 500 µl3.7 Lasisintterisuodatinsuppilo, jonka huokoskoko on G 3 (15—40 µm),
halkaisija noin 2 cm ja korkeus noin 5 cm ja jossa on liitäntä tyhjiösuo-
datusta varten sekä koirashios 12/21.
3.8 Tyhjiöimupullo, 50 ml, jossa on naarashios 12/21, joka sopii suodatin-
suppiloon (3.7).
3.9 Koeputki, 10 ml, jossa on kartiomainen pohja ja ilmatiivis tulppa.
3.10 Kaasukromatografi, johon sopii kapillaarikolonni ja johon kuuluu
virtauksenjakojärjestelmä, jonka osat ovat:
3.10.1 Termostaattisäätöinen kolonniuuni, joka säilyttää halutun lämpötilan
noin ± 1 ºC:n tarkkuudella;
3.10.2 Höyrystämisyksikkö, jonka lämpötilaa voi säätää ja jonka höyrystämi-
sosa on persilanoitua lasia;
3.10.3 Liekki-ionisaatiodetektori ja muuntajavahvistin;3.10.4 Integraattori-piirturi, joka sopii käytettäväksi muuntajavahvistimen
kanssa.
3.11 Lasinen tai kvartsilasinen kapillaarikolonni, jonka pituus on 20—30 m ja
sisähalkaisija 0,25—0,32 mm ja jonka sisäpinta on päällystetty nesteellä
SE-52 taiSE-54 taivastaavalla si ten, että nestekerroksen paksuus on
0,10—0,30 mm.
3.12 Mikroruisku, jossa on karkaistu neula, kaasukromatografiaa varten, 10 µl.
4 REAGENSSIT
4.1 Kaliumhydroksidin noin 2 N etanoliliuos: 130 g kaliumhydroksidia
(vähintään 85-prosenttista) liuotetaan 200 ml:aan tislattua vettä samalla
jäähdyttäen ja lisätään etanolia niin, että liuosta on yksi litra. Liuosta
säilytetään tiiviisti suljetuissa, tummasta lasista valmistetuissa pulloissa
(etanoli95 % V/V).
4.2 Etyylieetteri, analyysilaatua.4.3 Vedetön natriumsulfaatti, analyysilaatua.
4.4 Silikageelillä päällystetyt lasilevyt, paksuudeltaan 0,25 mm, ilman fluor-
esenssi-indikaattoria (voidaan ostaa käyttövalmiina).
4.5 Kaliumhydroksidin 0,2 N etanoliliuos: liuotetaan 13 g kaliumhydrok-
sidia 20 ml:aan tislattua vettä ja lisätään etanolia niin, että liuosta on
yksili tra.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 18
▼B
4.6 Bentseeni, kromatografiaa varten (5.2.2).
4.7 Asetoni, kromatografiaa varten (5.2.2).4.8 Heksaani, kromatografiaa varten (5.2.2).4.9 Etyylieetteri, kromatografiaa varten (5.2.2).4.10 Puhdas kloroformi, analyysilaatua (5.2.2).4.11 Ohutkerroskromatografian vertailuliuos: ►
M62 prosenttinen ◄koles-
terolin tai fytosterolin kloroformiliuos.
4.12 2,7-dikloorifluoreseiini, 0,2-prosenttinen etanoliliuos. Liuos tehdään
lievästi emäksiseksi lisäämällä muutama tippa kaliumhydroksidin 2 N
alkoholiliuosta.
4.13 Vedetön pyridiini, kromatografiaa varten.4.14 Heksametyylidisilatsaani.4.15 Trimetyylikloorisilaani.
4.16 Sterolien trimetyylisilyylieettereiden standardiliuokset. Ne valmistetaan
vasta käyttöhetkellä steroleista, jotka saadaan niitä sisältävistä öljyistä.
4.17 α-kolestanoli 0,2-prosenttisena (m/V) kloroformiliuoksena (sisäinen
standardi).
4.18 Kantajakaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua.4.19 Apukaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua.
5 MENETTELY
5.1 Saippuoitumattomien aineiden esikäsittely
5.1.1 250 ml:n pulloon lisätään 500 ml:n mikroruiskulla sellainen tila-
vuusmäärä 0,2-prosenttista α-kolestanolin kloroformiliuosta (4.17) jonka
sisältämä α-kolestanolin määrä on noin 10 % sterolin määrästä siinä
osanäytteessä, joka on pullossa määritettävänä. Esimerkiksi 5 gramman
oliiviöljynäytteeseen lisätään 500 µl 0,2-prosenttista α-kolestanoliliuosta,
ja jos näytteenä on ►
M6 ◄uutettua oliiviöljyä, lisätään
1 500 µl α-kolestanolia.
Haihdutetaan kuiviin typpivirrassa ja punnitaan tarkalleen 5 g kuivattua,
suodatettua näytettä samaan pulloon.
►M6 ◄Öljyt, jotka sisältävät paljon kolesterolia,
voivat tuottaa piikin, jonka retentioaika on sama kuin kolestanolin. Jos
käy näin, sterolifraktio on määritettävä kahdesti niin, että toisella kertaa
käytetään sisäistä standardia ja toisella ei ►M6taikäyttää kolestanoli n
sijasta betulinolia ◄.
5.1.2 Lisätään 50 ml kaliumhydroksidin 2 N etanoliliuosta, käynnistetään
palautusjäähdytin ja kuumennetaan vesihauteessa hiljalleen kiehuvaksi
koko ajan voimakkaasti sekoittaen, kunnes saippuoituminen on tapah-
tunut (liuos kirkastuu). Kuumentamista jatketaan vielä 20 minuuttia,
sitten lisätään 50 ml tislattua vettä jäähdyttimen yläpäästä, irrotetaan
jäähdytin ja jäähdytetään pullo noin 30 ºC:n lämpötilaan.
5.1.3 Pullon sisältämä seos siirretään kvantitatiivisesti 500 ml:n erotussuppi-
loon käyttäen huuhteena yhteensä noin 50 ml tislattua vettä. Lisätään
noin 80 ml etyylieetteriä, ravistetaan voimakkaasti noin 30 sekunnin
ajan ja annetaan seistä niin, että kerrokset erottuvat (Huom. 1).
Pohjalla oleva vesifaasi siirretään toiseen erotussuppiloon. Vesifaasi
uutetaan vielä kaksi kertaa samalla tavoin käyttäen 60—70 ml etyylieet-
teriä kummallakin kerralla.
Huom. 1 Mahdollinen emulsio voidaan hajottaa lisäämällä pieni määrä
etanolia tai metanolia suihkeena.
5.1.4 Kaikki eetteriuutteet yhdistetään yhteen erotussuppiloon ja pestään tisla-
tulla vedellä (50 ml kerralla), kunnes pesuvesion neutraali a.
Kun pesuvesi on poistettu, eetteriuutteet kuivataan vedettömällä
natriumsulfaatilla, suodatetaan vedettömän natriumsulfaatin läpi etukä-
teen punnittuun 250 ml:n pulloon ja pestään suppilo ja suodatin pienillä
määrillä etyylieetteriä.
5.1.5 Eetteriä haihdutetaan niin, että sitä on ainoastaan muutama millilitra,
jäännös kuivataan sitten pienessä alipaineessa tai typpivirrassa ja lopuksi
kuivataan lämpökaapissa, jonka lämpötila on 100 ºC, noin 15 minuutin
ajan, jäännös jäähdytetään eksikkaattorissa ja punnitaan.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 19
▼B
5.2 Sterolifraktion erottaminen
5.2.1 Emäksisten levyjen valmistelu: upotetaan silikageelilevyt (4.4) kokonaan
kaliumhydroksidin 0,2 N etanoliliuokseen (4.5) kymmeneksi sekunniksi,
minkä jälkeen niiden annetaan kuivua kaksi tuntia vetokaapissa ja
lopuksiyksitunti100 ºC:ssa lämpökaapi ssa.
Kun levyt on otettu lämpökaapista, niitä säilytetään kalsiumkloridia
sisältävässä eksikkaattorissa käyttöhetkeen saakka (näin käsitellyt levyt
on käytettävä 15 päivän kuluessa).
Huom. 2 Kun sterolifraktion erottamiseen käytetään emäksisiä silikagee-
lilevyjä, ei ole tarpeen käsitellä saippuoitumattomia aineita
alumiinioksidilla. Näin kaikki happamat aineet (rasvahapot jamuut hapot) jäävät lähtöviivalle. Sterolivyöhyke erottuu
selvästi alifaattisten ja terpeenisten alkoholien vyöhykkeestä.
5.2.2 Bentseeni-asetoniseosta (95:5, V/V) kaadetaan kehitysastiaan niin, että
sitä on noin 1 cm. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää heksaani-etyylieet-
teriseosta (65:35, V/V). Kehitysastia suljetaan sopivalla kannella ja
annetaan seistä avaamatta vähintään puoli tuntia, jotta syntyy neste-
höyrytasapaino. Astian sisäseinille voidaan kiinnittää suodatinpaperisui-
kaleita, jotka ulottuvat eluointiaineeseen. Tämä lyhentää kehitysaikaa
lähes kolmanneksella ja aineosat eluoituvat tasaisemmin.
Huom. 3 Kehitysliuos on vaihdettava uuteen ennen jokaista koetta, jotta
eluointiolosuhteet olisivat täysin toistettavissa.
5.2.3 Saippuoitumattomista aineista (5.1.5) valmistetaan noin 5-prosenttinen
kloroformiliuos, jota levitetään 0,3 ml kromatografialevylle (5.2.1)
mahdollisimman ohuena ja tasaisena nauhana 100 ml:n mikroruiskulla
noin 2 cm:n päähän levyn reunasta. Asetetaan 2—3 ml sterolien vertai-
luliuosta (4.11) lähtöviivan tasalle levyn reunaan niin että sterolivyöhyke
voidaan tunnistaa kehityksen jälkeen.
5.2.4 Levy asetetaan kehitysastiaan, joka on valmisteltu 5.2.2 kohdan ohjeiden
mukaan. Ympäristön lämpötilan on oltava 15—20 ºC. Astian kansi
suljetaan heti ja annetaan levyn eluoitua, kunnes liuotinrintama on siir-
tynyt noin 1 cm:n päähän levyn yläreunasta. Levy otetaankehitysastiasta ja liuotin haihdutetaan kuumassa ilmavirrassa tai pane-
malla levy joksikin aikaa vetokaappiin.
5.2.5 Levylle suihkutetaan ohuelti ja tasaisesti 2,7-dikloorifluoreseiiniliuosta.
Sterolivyöhyke voidaan tunnistaa ultraviolettivalossa siitä, että se on
samassa kohdassa kuin vertailuliuoksen vyöhyke. Vyöhykkeen ääriviivat
merkitään mustalla kynällä fluoresenssin rajoja seuraten.
5.2.6 Silikageelikerros raaputetaan rajatulta alueelta metallilastalla. Saatu
aines hienonnetaan, siirretään suodatinsuppiloon (3.7), lisätään 10 ml
kuumaa kloroformia, sekoitetaan huolellisesti metallilastalla ja suodate-
taan suodatinsuppiloon liitettyyn pulloon (3.8) tyhjiöllä.
Suppiloon jäänyt aines pestään kolme kertaa noin 10 ml:lla etyylieet-
teriä, ja suodos kerätään suodatinsuppiloon liitettyyn pulloon. Suodosta
haihdutetaan, kunnes sen tilavuus on noin 4—5 ml ja jäännösliuos
kaadetaan etukäteen punnittuun 10 ml:n koeputkeen (3.9). Liuosta
kuivataan alhaisella lämmöllä kevyessä typpivirrassa; jäännös liuotetaan
muutamaan tippaan asetonia, kuivataan jälleen ja pidetään kymmenisen
minuuttia 105 ºC:ssa lämpökaapissa, jäähdytetään eksikkaattorissa ja
punnitaan.
Koeputkessa oleva jäännös sisältää sterolifraktion.
5.3 Trimetyylisilyylieettereiden valmistus
5.3.1 Koeputkessa olevaan sterolifraktioon lisätään silylointireagenssia, jossa
on pyridiiniä, heksametyylidisilatsaania ja trimetyylikloorisilaania tila-
vuussuhteessa 9:3:1 (Huom. 4), 50 ml jokaista koeputkessa olevaa
sterolimilligrammaa kohti niin, että kosteutta ei pääse mukaan (Huom.
5).
Huom. 4 Käyttövalmiita liuoksia on kaupallisesti saatavana; lisäksi
muita silylointireagensseja, kuten esim. bistrimetyylisilyylitri-
fluoriasetamidi + 1 % trimetyylikloorisilaania; reagenssi
laimennetaan samalla määrällä vedetöntä pyridiiniä.
5.3.2 Koeputki suljetaan tulpalla, ravistetaan varovasti (ei ylösalaisin), kunnes
sterolit ovat täysin liuenneet. Annetaan seistä vähintään 15 minuuttia
huoneenlämmössä ja sentrifugoidaan sitten muutaman minuutin ajan;
kirkas liuos on nyt valmis kaasukromatografista määritystä varten.
Huom. 5 Lievä sameus on tavallista eikä ole haitaksi. Valkoiset hiuta-
leet tai vaaleanpunaiseksi värjäytyminen ovat merkkejä1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 20
▼B
kosteudesta tai reagenssien muuttumisesta. Jos näitä ilmenee,
koe on uusittava.
5.4 Kaasukromatografinen määritys
5.4.1 Esivalmistelut ja kolonnin valmistelu
5.4.1.1 Kapillaarikolonni asennetaan kaasukromatografialaitteistoon niin, että
kolonnin alkupää kiinnitetään höyrystimeen, joka on liitetty virtauksen-
jakojärjestelmään, ja kolonnin loppupää kiinnitetään detektoriin.
Tarkistetaan kaasukromatografisten laitteiden toiminta (kaasuliitännän
tiiviys, detektorin, virtauksenjakojärjestelmän ja piirturin toimivuus,
jne.)
5.4.1.2 Jos kapillaarikolonnia ei ole aikaisemmin käytetty, se on ensin valmis-
teltava käyttöön. Pieni määrä kaasua johdetaan kolonnin läpi,
käynnistetään kaasukromatografi ja aloitetaan asteittainen lämmittä-
minen, jota jatketaan, kunnes lämpötila on kohonnut vähintään 20 ºC
korkeammaksi kuin käyttölämpötila (Huom. 6). Korkeaa lämpötilaa
pidetään yllä vähintään kaksi tuntia, minkä jälkeen kromatografialait-
teisto saatetaan käyttövalmiiksi (kaasuvirran ja erotuksen säätö,
liekinsytytys, elektronisen piirturin kytkeminen, uunin lämpötilan säätö
kolonnia varten, detektorin ja injektorin säätö, jne.) ja signaalia rekis-
teröidään herkkyydellä, joka on vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin
määrityksessä käytettävä. Saadun perusviivan on oltava suora, eikä
siinä saa olla minkäänlaisia piikkejä eikä siirtymää mihinkään suuntaan.
Jos ilmenee negatiivista suoraviivaista siirtymää, se on merkki kolonnin
liitäntöjen vuodosta, ja jos ilmenee positiivista siirtymää, se johtuu
kolonnin riittämättömästä valmistelusta.
Huom. 6 Esivalmistelulämpötilan on aina oltava vähintään 20 ºC alempi
kuin käytetyn stationäärifaasin korkein lämpötila.
5.4.2 Toimintaolosuhteiden valinta
5.4.2.1 Käyttöolosuhteiden ohjearvot ovat seuraavat:
— kolonnin lämpötila: 260 ± 5 ºC,
— höyrystimen lämpötila: 280 ºC,— detektorin lämpötila: 290 ºC,— kantajakaasun lineaarinopeus: heliumille 20—35 cm/s ja vedylle
30—50 cm/s,
— jakosuhde: 1:50 — 1:100,
— laitteiston herkkyys: 4—16 kertaa vähimmäisvaimennus,— rekisteröintiherkkyys: 1—2 mV täydestä asteikosta,— paperin nopeus: 30—60 cm/h,— injektoidun aineen määrä: 0,5—1 ml TMSE-liuosta.
Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin
ominaisuuksien mukaan niin, että saadaan seuraavat vaatimukset
täyttävä kromatogrammi:
—β-sitosterolin retentioajan on oltava 20 ± 5 minuuttia,
— kampesterolin piikki: oliiviöljylle (pitoisuus keskimäärin 3 %)
15 ± 5 % täydestä asteikosta, soijaöljylle (pitoisuus keskimäärin
20 %) 80 ± 10 % täydestä asteikosta,
— kaikki mukana olevat sterolit on voitava erottaa toisistaan. Lisäksi
kunkin piikin jälkeen piirturin tulee palata perusviivalle ennen uuden
piikin alkua. Tämä ei ole kuitenkaan tarpeen, jos piikki TRR
1,02:ssa pystytään mittaamaan kohtisuoraan.
5.4.3 Määritys
5.4.3.1 Imetään 10 ml:n mikroruiskuun 1 ml heksaania, sitten 0,5 ml ilmaa ja
tämän jälkeen 0,5 ml—1 ml näyteliuosta; lopuksi männällä vedetään
vielä neula tyhjäksi. Neula työnnetään septumin läpi injektiopesään ja
1—2 sekunnin kuluttua seos injektoidaan nopeasti, odotetaan noin viisi
sekuntia, jonka jälkeen neula vedetään pois hitaasti.
5.4.3.2 Rekisteröintiä jatketaan, kunnes näytteessä olevien sterolien TMSE on
kokonaan eluoitunut.
Perusviivan on koko ajan oltava 5.4.1.2 kohdan vaatimusten mukainen.
5.4.4 Piikkien tunnistaminen
Yksittäiset piikit tunnistetaan niiden retentioajan perusteella sekä vertaa-
malla sterolien TMSE-seokseen, joka on määritetty samoissa
olosuhteissa.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 21
▼B
Sterolit eluoituvat seuraavassa järjestyksessä: kolesteroli, brassikasteroli,
24-metyleenikolesteroli, kampestroli, kampestanoli, stigmasteroli, ∆7-
kampesteroli, ∆5,23 -stigmastadienoli, klerosteroli, β-sitosteroli, sitosta-
noli, ∆5-avenasteroli, ∆5,24 -stigmastadienoli, ∆7-sigmastenoli, ∆7-
avenasteroli.
Sitosterolin retentioajat SE-52- ja SE-54-kolonneille on esitetty taulu-
kossa 1.
Kuvat 1 ja 2 esittävät eräiden öljyjen tyypillisiä kromatogrammeja.
5.4.5 Kvantitatiivinen arviointi
5.4.5.1 Lasketaan α-kolestanolin ja sterolien piikkien pinta-alat integraattorin
avulla. Sellaisten aineiden piikit, jotka eivät esiinny taulukossa 1,
jätetään huomiotta. α-kolestanolin vastekerroin on 1.
5.4.5.2 Lasketaan yksittäisten sterolien pitoisuus milligrammoina 100 g:ssa
rasvaa taiöljyä seuraavasta kaavasta:
x-steroli=Ax·ms· 100
As·m
jossa:
Ax= x-sterolin piikin pinta-ala ►M6 ◄;
As=α-kolestanolin piikin pinta-ala ►M6 ◄;
ms= lisätyn α-kolestanolin massa milligrammoina;
m = määritykseen käytetyn näytteen massa grammoina.
6 TULOSTEN ESITTÄMINEN
6.1 Ilmoitetaan yksittäisten sterolien pitoisuus milligrammoina 100 g:ssa
rasvaa tai öljyä ja niiden pitoisuuksien summa, ”kokonaissterolimäärä”.
6.2 Lasketaan yksittäisen sterolin prosenttiosuus sitä vastaavan piikin
suhteellisena osuutena kaikkien sterolipiikkien yhteenlasketusta pinta-
alasta.
x-sterolin prosenttiosuus =Ax
ΣA· 100
Jossa:
Ax= x:n piikin pinta-ala;
ΣA = kaikkien sterolien piikkien yhteenlaskettu pinta-ala.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 22
▼B
LISÄYS
Kaasun lineaarinopeuden määrittäminen
Kaasukromatografialaitteisto säädetään tavallisia käyttöolosuhteita vastaavaksi,
injektoidaan 1—3 ml metaania (tai propaania) ja mitataan aika, jonka kuluessa
kaasu kulkee kolonnin läpi, injektointihetkestä piikin muodostumiseen (tM).
Lineaarinopeus cm/s saadaan kaavasta L/tM, jossa L on kolonnin pituus senttime-
treinä ja tMon mitattu aika sekunteina.
Taulukko 1
Sterolien suhteelliset retentioajat
Pi-
ik-
kiNimiSuhteellinen reten-
tioaika
Kolonni
SE 54Kolonni
SE 52
1 kolesteroli ∆-5-kolesten-3 β-oli0,67 0,63
2 kolestanoli5 α-kolestan-3 β-oli0,68 0,64
3 brassikasteroli [24S]-24-metyyli- ∆-5,22-kolestadien-3 β-oli0,73 0,71
4 24-metyleenikolesteroli 24-metyleeni- ∆-5,24-kolestadien-3 β-oli0,82 0,80
5 kampestroli[24R]-24-metyyli - ∆-5-kolesten-3 β-oli0,83 0,81
6 kampestanoli[24R]-24-metyyli -kolestan-3 β-oli0,85 0,82
7 stigmasteroli [24S]-24-etyyli- ∆-5,22-kolestadien-3 β-oli0,88 0,87
8 ∆-7-kampesteroli[24R]-24-metyyli - ∆-7-kolesten-3 β-oli0,93 0,92
9 ∆-5,23 stigmastadienoli [24R,S]-24-etyyli- ∆-5,23-kolestadien-3 β-oli0,95 0,95
10 klerosteroli[24S]-24-etyyli - ∆-5,25-kolestadien-3 β-oli0,96 0,96
11 β-sitosteroli [24R]-24-etyyli- ∆-5-kolestan-3 β-oli1,00 1,00
12 sitostanoli 24-etyyli-kolestan-3 β-oli1,02 1,02
13 ∆-5-avenasteroli [24Z]-24-etyylideeni-5-kolesten-3 β-oli1,03 1,03
14 ∆-5,24-stigmastadienoli [24R,S]-24-etyyli- ∆-5,24-kolestadien-3 β-oli1,08 1,08
15 ∆-7-stigmastenoli [24R,S]-24-etyyli- ∆-7,24-kolestadien-3 β-oli1,12 1,12
16 ∆-7-avenasteroli [24Z]-24-etyylideeni- ∆-7-kolesten-3 β-oli1,16 1,161991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 23
▼B
Kuva 1
Raakaoliiviöljyn sterolifraktion kaasukromatogrammi
1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 24
▼B
Kuva 2
Puhdistetun oliiviöljyn sterolifraktion kaasukromatogrammi
1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 25
▼B
LIITE VI
ERYTRODIOLI- JA UVAOLIPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN
JOHDANTO
Erytrodioli, jolla yleensä tarkoitetaan dioleja erytrodioli ja uvaoli yhdessä,
on joillekin rasvoille ja öljyille tyypillinen saippuoitumattoman osan aine.
Sen pitoisuus on selvästi kohonnut uutetussa oliiviöljyssä; puristetussa
oliiviöljyssä ja rypälesiemenöljyssä sitä on vähän, joten sen esiintyminen
voi olla merkki siitä, että joukkoon on lisätty uutettua oliiviöljyä.
1 TARKOITUS
Tällä menetelmällä voidaan määrittää rasvan tai öljyn erytrodiolipitoisuus.
2 PERIAATE
Rasva tai öljy saippuoidaan kaliumhydroksidin etanoliliuoksella. Saippuoi-
tumaton osa uutetaan etyylieetterillä ja puhdistetaan johtamalla se
alumiinioksidikolonnin läpi, minkä jälkeen saippuoitumattomat aineet
erotetaan silikageelilevyillä ohutkerroskromatografialla. Tällöin steroli- ja
erytrodiolifraktiovyöhykkeet erottuvat.
Levyltä saadut sterolit ja erytrodioli muutetaan trimetyylisilyylieettereiksi
ja määritetään kaasukromatografialla.
Tulos ilmoitetaan erytrodiolin prosenttiosuutena erytrodiolin ja sterolien
seoksesta.
3 VÄLINEISTÖ
3.1 Sama kuin liitteessä V (Sterolien määritys).
4 REAGENSSIT
4.1 Samat kuin liitteessä V (Sterolien määritys).4.2 Vertailuliuoksena erytrodiolin 0,5-prosenttinen kloroformiliuos.
5 SUORITUS
5.1 Saippuoitumattoman osan esikäsittely.
Kuten liitteessä V olevassa 5.1.2 kohdassa.
5.2 Erytrodiolin ja sterolien erottaminen.
5.2.1 Ks. menettely liitteessä V olevassa 5.2.1 kohdassa.
5.2.2 Ks. sama menettely liitteessä V olevassa 5.2.2 kohdassa.5.2.3 Valmistetaan saippuoitumattomasta aineksesta 5-prosenttinen kloroformi-
liuos.
Levitetään 0,3 ml liuosta mahdollisimman ohueksi ja tasaiseksi viivaksi
0,1 ml:n mikroruiskulla noin 1,5 cm:n päähän levyn alareunasta. Asete-
taan muutama mikrolitra erytrodioli- ja kolesteroliliuosta vertailua varten
levyn reunaan.
5.2.4 Asetetaan levy kehitysastiaan, joka on esikäsitelty kuten 5.2.1 kohdassa.
Ympäristön lämpötilan on oltava noin 20 ºC. Astia suljetaan heti kannella
ja annetaan eluoitua, kunnes liuotinrintama on noussut noin 1 cm:n päähän
levyn yläreunasta. Levy otetaan kehitysastiasta ja liuotin haihdutetaan
kuumassa ilmavirrassa.
5.2.5 Levylle suihkutetaan tasaisesti 2,7-dikloorifluoreseiiniliuosta. Kun levyä
tarkastellaan ultraviolettivalossa, sterolin ja erytrodiolin vyöhykkeet
voidaan tunnistaa kohdistamalla ne vertailuliuoksen vyöhykkeisiin.
Vyöhykkeet merkitään pisteellä, joka on juuri fluoresenssialueen reunojen
ulkopuolella.
5.2.6 Silikageeli raaputetaan levystä irti metallilastalla merkityn alueen
kohdalta. Irrotettu aines pannaan 50 ml:n pulloon. Lisätään 15 ml kuumaa
kloroformia, ravistetaan hyvin ja suodatetaan suppilon läpi, jossa on
huokoinen suodatin, johon silikageeli jää. Pestään kolme kertaa kuumalla
kloroformilla (noin 10 ml kerralla) ja kerätään suodos 100 ml:n pulloon.
Suodosta haihdutetaan, kunnes sitä on 4—5 ml, siirretään se punnittuun,1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 26
▼B
kartiomaisella pohjalla varustettuun 10 ml:n sentrifugiputkeen, kuivatetaan
typpivirrassa miedolla lämmöllä ja punnitaan.
5.3 Trimetyylisilyylieetterien valmistus
Kuten liitteessä V olevassa 5.3 kohdassa.
5.4 Kaasukromatografinen määritys
Kuten liitteessä V olevassa 5.4 kohdassa.Kaasukromatografisen määrityksen olosuhteiden on oltava sellaiset, että
ne täyttävät sterolien määritysvaatimukset ja että lisäksi erytrodiolin ja
uvaolin TMSE:t erottuvat.
Kun näyte on injektoitu, rekisteröintiä jatketaan, kunnes näytteessä olevat
sterolit, erytrodioli ja uvaoli ovat kokonaan eluoituneet. Tämän jälkeen
tunnistetaan piikit (erytrodiolin ja uvaolin retentioajat ovat noin 1,45 ja
1,55 suhteessa β-sitosteroliin) ja piikkien pinta-alat lasketaan kuten stero-
leille.
6 TULOSTEN ESITTÄMINEN
Erytrodioli % =A
1+A2
A1+A2+ΣAsterolit× 100
Jossa:
A1= erytrodiolin piikin pinta-ala ►M6 ◄;
A2= uvaolin piikin pinta-ala ►M6 ◄;
ΣAsterolit= sterolien piikkien yhteenlaskettu pinta-ala
►M6 ◄;
Tulos ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 27
▼B
LIITE VII
TRIGLYSERIDIN 2-ASEMASSA OLEVIEN TYYDYTTYNEIDEN
RASVAHAPPOJEN MÄÄRITTÄMINEN
1 TARKOITUS
Tämä standardi kuvaa menetelmän, jolla määritetään sellaiset rasvojen ja
öljyjen rasvahapot, jotka ovat esteröityneet glyserolin 2-hiileen (keskim-
mäinen).
2 SOVELTAMISALA
Tätä menetelmää voidaan käyttää tutkittaessa öljyjä tai rasvoja, joiden
sulamispiste on alle 45 ºC, mikä johtuu haimalipaasin vaikutuksen erityis-
piirteistä.
Tämä menetelmä eisovellu varauksetta sellai sten rasvojen taiöljyjen
määritykseen, joiden rasvahapot sisältävät runsaasti enintään 12 hiiliatomia
sisältäviä rasvahappoja (kookosöljy ja palmunydinöljy, voirasva), voimak-
kaasti tyydyttymättömien rasvahappojen määritykseen (kaksoissidoksia on
enemmän kuin neljä) tai rasvahappojen määritykseen, jotka sisältävät
vähintään 20 hiiliatomia (kalojen ja merieläinten öljyt), eikä sellaisten
rasvahappojen määritykseen, jotka sisältävät muita happipitoisia ryhmiä
kuin happoryhmän.
3 PERIAATE
Rasva tai öljy neutraloidaan tarvittaessa liuottimessa. Rasva tai öljy
puhdistetaan johtamalla se alumiinioksidikolonnin läpi. Triglyseridit
hydrolysoidaan osittain haimalipaasin avulla määräajassa. Muodostuneet
monoglyseridit erotetaan ohutkerroskromatografialla ja esteröidään meta-
nolilla. Syntyneet metyyliesterit määritetään kaasunestekromatografialla.
4 VÄLINEISTÖ
4.1 Pullo, 100 ml.4.2 Pullo, 25 ml, jossa hios.4.3 Ilmajäähdytin, 1 m:n pituinen, sopii 4.2 kohdassa mainittuun pulloon.
4.4 Erlenmeyerpullo, 250 ml.
4.5 Dekantterilasi, 50 ml.4.6 Erotussuppilo, 500 ml.4.7 Lasikolonni kromatografiaa varten (sisähalkaisija 13 mm, pituus 400 mm),
varustettuna sintterilasilevyllä ja hanalla.
4.8 Sentrifugiputki, 10 ml, jossa hiottu lasitulppa.4.9 Byretti, 5 ml, jakoväli 0,05 ml.4.10 Injektioruisku, 1 ml, jossa ohut neula.4.11 Mikroruisku, josta saadaan 3—4 ml:n pisaroita.
4.12 Levitin ohutkerroskromatografiaa varten.
4.13 Lasilevyjä (20 × 20 cm) ohutkerroskromatografiaa varten.4.14 Lasinen kehitysastia, johon 20 × 20 cm:n levyt mahtuvat ja jossa on hiottu
lasikansi, ohutkerroskromatografiaa varten.
4.15 Sumutin ohutkerroskromatografiaa varten.
4.16 Uuni, jonka lämpötila on säädetty 103 ± 2 ºC:seen.4.17 Termostaatti, jota voidaan säätää 30—45 ºC:seen ja jonka tarkkuus on
0,5 ºC.
4.18 Kiertohaihdutin.
4.19 Sähkökäyttöinen värisevä ravistin, joka pystyy sekoittamaan voimakkaasti
sentrifugiputkea.
4.20 Ultraviolettivalo levyjen tarkastelua varten.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 28
▼B
Lipaasin aktiivisuuden mittaamiseksi:
4.21 pH-mittari.4.22 Spiraalisekoitin.
4.23 Byretti, 5 ml.
4.24 Sekuntikello.
Lipaasin mahdollista valmistusta varten:
4.25 Laboratoriosekoitin, joka soveltuu heterogeenisten aineiden dispergointiin
ja sekoittamiseen.
5 REAGENSSIT
5.1 n-heksaani tai sen puuttuessa petrolieetteri (kiehumispiste 30—50 ºC),
kromatografista laatua.
5.2 2-propanoli (tai etanoli), 95 % (V/V), analyysilaatua.
5.3 2-propanoli (tai etanoli), 1:1 vesiliuos.
5.4 Dietyylieetteri, joka ei sisällä peroksideja.
5.5 Asetoni.5.6 Muurahaishappo, vähintään 98 % (m/m).
5.7 Kehitysliuos: n-heksaania (5.1), dietyylieetteriä (5.4) ja muurahaishappoa
(5.6) suhteessa 70:30:1 (V/V/V).
5.8 Alumiinioksidi, aktivoitu, kromatografiaa varten, neutraalia, Brockmann I-
laatua.
5.9 Piidioksidijauhe, jossa sidosaine, ohutkerroskromatografiaan soveltuvaa
laatua.
5.10 Haimalipaasi, sopivaa laatua (Huomautukset 1 ja 2).
5.11 Natriumhydroksidi, 120 g/l vesiliuos.5.12 Suolahappo, 6 N vesiliuos.
5.13 Kalsiumkloridi (CaCl
2), 220 g/l vesiliuos.
5.14 Natriumkolaatti (entsymaattista laatua), 1 g/l vesiliuos.
5.15 Puskuriliuos: lisätään suolahappoa (5.12) tri-hydroksimetyyliaminome-
taanin 1 M vesiliuokseen, kunnes pH on 8 (tarkistetaan potentiometrillä).
5.16 Fenoliftaleiiniliuos (10 g/l) 95 % (V/V) etanolissa.
5.17 2,7-dikloorifluoreseiiniliuos (2 g/l) 95 % (V/V) etanolissa, joka tehdään
lievästi emäksiseksi lisäämällä yksi tippa 1 N natriumhydroksidiliuosta
100 ml:aa kohti.
Lipaasin aktiivisuuden määrittämiseksi:
5.18 Neutraloitua öljyä.5.19 Natriumhydroksidi, 0,1 N vesiliuos.
5.20 Natriumkolaatti (entsymaattista laatua), 200 g/l vesiliuos.
5.21 Arabikumi, 100 g/l vesiliuos.
6 NÄYTTEEN ESIKÄSITTELY
Jos näytteen happamuus on alle 3 % liitteen II mukaisesti määritettynä,
näyte puhdistetaan alumiinioksidilla suoraan 6.2. kohdan mukaan.
Jos happamuus on yli 3 % liitteen II mukaisesti määritettynä, näyte neutra-
loidaan ensin emäksellä liuottimen kanssa 6.1. kohdan mukaisesti ja
puhdistetaan sitten alumiinioksidilla 6.2. kohdan mukaisesti.
6.1Emäksellä neutraloiminen liuottimen kanssa
Pannaan erotussuppiloon (4.6) noin 10 g käsittelemätöntä öljyä ja lisätään
100 ml heksaania (5.1), 50 ml 2-propanolia (5.2), muutama tippa fenolifta-
leiiniliuosta (5.16) ja sellainen määrä natriumhydroksidiliuosta (5.11), joka
vastaa öljyn vapaata happamuutta lisättynä 0,3 %:lla.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 29
▼B
Ravistetaan voimakkaasti yhden minuutin ajan, lisätään 50 ml tislattua
vettä, ravistetaan uudelleen ja annetaan seistä.
Kun erottuminen on tapahtunut, pohjalla oleva saippuoitunut kerros poiste-
taan. Myös välikerrokset (liimamaiset ja liukenemattomat aineet)
poistetaan. Neutraloidun öljyn heksaaniliuos pestään useilla peräkkäisillä
2-propanolin liuoserillä (5.3) käyttäen 25—30 ml kerralla, kunnes fenolif-
taleiinin vaaleanpunainen väri katoaa.
Poistetaan suurin osa heksaania höyrystämällä tyhjiössä käyttäen kierto-
haihdutinta (4.18), kuivatetaan öljy tyhjiössä 30—40 ºC:n lämpötilassa
puhtaan typpivirran avulla, kunnes heksaani on kokonaan haihtunut.
6.2Puhdistaminen alumiinioksidilla
Valmistetaan suspensio, jossa on 15 g aktivoitua alumiinioksidia (5.8) ja
50 ml heksaania (5.1) ja kaadetaan se koko ajan sekoittaen kromatografia-
kolonniin (4.7).
Alumiinioksidin annetaan laskeutua tasaiseksi kerrokseksi ja liuottimen
annetaan valua niin, että sitä on noin 1—2 mm absorboimisaineen yläpuo-
lella. Pylvääseen kaadetaan varovastili uos, jossa on 5 g öljyä ja 25 ml
heksaania (5.1). Kolonnista valuva neste kerätään pyöreäpohjaiseen
pulloon (4.1).
7 KROMATOGRAFIALEVYJEN ESIKÄSITTELY
Lasilevyt (4.13) puhdistetaan huolellisesti etanolilla, petrolieetterillä ja
asetonilla, jotta pinta olisi täysin rasvaton.
Punnitaan 30 g piidioksidijauhetta (5.9) erlenmeyerpulloon (4.4). Lisätään
60 ml tislattua vettä. Suljetaan tulpalla ja ravistetaan voimakkaasti yhden
minuutin ajan. Siirretään suspensio välittömästi levittimeen (4.12) ja levi-
tetään puhtaille levyille noin 0,25 mm paksu kerros.
Levyjä kuivatetaan ilmassa 15 minuuttia ja sitten lämpökaapissa (4.16)
103 ± 2 ºC:ssa tunnin ajan.
Levyt jäähdytetään eksikkaattorissa huoneenlämpöisiksi ennen käyttöä.Käyttövalmiita levyjä on myös kaupallisesti saatavana.
8 SUORITUS
8.1Hydrolyysi haimalipaasin avulla
Punnitaan noin 0,1 g valmista näytettä sentrifugiputkeen (4.8). Jos näyte
on kiinteää rasvaa, se liuotetaan 0,2 ml:aan heksaania, jota tarvittaessa
lämmitetään hieman.
Putkeen lisätään 20 ml lipaasia (5.10) ja 2 ml puskuriliuosta (5.15). Ravis-
tetaan hyvin, mutta varovaisesti, ja lisätään sitten 0,5 ml
natriumkolaattiliuosta (5.14) ja 0,2 ml kalsiumkloridiliuosta (5.13). Putki
suljetaan hiotulla tulpalla, ravistetaan varovasti niin, että tulppa ei pääse
kastumaan ja asetetaan putki heti termostaattiin (4.17), jonka lämpötila on
40 ± 0,5 ºC. Ravistetaan käsin tasan yhden minuutin ajan. Putki otetaan
termostaatista ja sitä ravistetaan voimakkaasti sähkökäyttöisellä ravisti-
mella (4.19) tasan kaksi minuuttia. Jäähdytetään välittömästi juoksevalla
vedellä; lisätään 1 ml suolahappoa (5.12) ja 1 ml dietyylieetteriä (5.4).Suljetaan tulpalla ja ravistetaan voimakkaasti sähkökäyttöisellä ravisti-
mella. Annetaan seistä ja poistetaan orgaaninen kerros ruiskulla (4.10)
sentrifugoinnin jälkeen, jos se on tarpeen.
8.2Monoglyseridien erottaminen ohutkerroskromatografialla
Uute asetetaan kromatografialevylle mikroruiskun (4.11) avulla mahdolli-
simman ohuena ja tasaisena kerroksena noin 1,5 cm:n päähän levyn
alareunasta, niin kapeana viivana kuin mahdollista. Levy asetetaan kehity-
sastiaan (4.14), joka on hyvin kyllästetty, ja annetaan kehittyä
kehitysliuoksessa (5.7) noin 20 ºC:ssa, kunnes rintama on noussut noin
1 cm:n päähän levyn yläreunasta.
Levy kuivatetaan ilmassa kehitysastian lämpötilassa ja sille suihkutetaan
2,7-dikloorifluoreseiiniliuosta (5.17). Monoglyseridivyöhyke tunnistetaan
(R
fnoin 0,035) ultraviolettivalossa (4.20).1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 30
▼B
8.3Monoglyseridien määrittäminen kaasunestekromatografialla
Raaputetaan lastalla irti vyöhyke, joka erottui 8.2 kohdassa (välttäen otta-
masta mukaan ainesta, joka on jäänyt lähtöviivalle), ja kerätään se
metylointipulloon (4.2).
Raaputettua piidioksidia käsitellään suoraan menetelmällä, joka on kuvattu
liitteessä X B olevassa 4.1 kohdassa siten, että monoglyseridit muuttuvat
metyyliestereiksi; tämän jälkeen esterit tutkitaan kaasukromatografialla liit-
teessä X A kuvatulla tavalla.
9 TULOSTEN ESITTÄMINEN
Lasketaan 2-asemassa olevien rasvahappojen määrä yhden desimaalin tark-
kuudella (Huom. 3).
10 HUOMAUTUKSIA
Huom. 1 Lipaasin aktiivisuuden tarkistaminen.
Valmistetaan öljyemulsio sekoittamalla 165 ml arabikumiliuosta
(5.21), 15 g jäämurskaa ja 20 ml neutraloitua öljyä (5.18) ravis-
taen sopivalla sekoittimella.
Mitataan 10 ml tätä emulsiota dekantterilasiin (4.5), lisätään
0,3 ml natriumkolaattiliuosta (5.20) ja lopuksi 20 ml tislattua
vettä. Lasi asetetaan termostaattiin, jonka lämpötila on 37 ± 0,5 ºC
(Huom. 4). Upotetaan pH-mittarin (4.21) elektrodit nesteeseen ja
spiraalisekoitin (4.22) käynnistetään. Sen jälkeen lisätään
natriumhydroksidiliuosta (5.19) tipoittain byretin (4.23) avulla,
kunnes pH on 8,5.
Lisätään sopiva määrä lipaasivesisuspensiota (ks. jäljempänä).
Heti kun pH on 8,3, sekuntikello (4.24) käynnistetään ja aloite-
taan natriumhydroksidiliuoksen (5.19) tiputtaminen sellaisella
nopeudella, että pH pysyy koko ajan 8,3:ssa. Emäsliuoksen
kulutus luetaan joka minuutti.
Havainnot kirjataan graafisesti koordinaatistoon, jossa x-akselilla
on aika ja y-akselilla on pH:n säilyttämiseen tarvittavan
emäsliuoksen määrä millilitroina.
Tuloksena pitäisi olla suora.
Edellä mainittu lipaasisuspensio on 1:1 000 (m/m) suspensio
vedessä. Jokaista koetta varten olisi käytettävä sellainen määrä
tätä suspensiota, että emäsliuosta kuluu noin 1 ml 4—5 minuu-
tissa.
Tavallisesti tarvitaan noin 1—5 mg jauhetta.
Lipaasiyksikkö on se määrä entsyymiä, joka tarvitaan vapautta-
maan 10 mikroekvivalenttia happoa minuutissa. Näin saadaan
käytetyn jauheen aktiivisuus A, lipaasiyksikköinä mg:aa kohti,
kaavasta:
A¼V/C210
m
jossa:
V = natriumhydroksidiliuoksen (5.19) kulutus minuutissa suor-
alta laskettuna
m = jauhenäytteen massa milligrammoina.
Huom. 2 Lipaasin valmistus.
Lipaaseja, joiden aktiivisuus on tyydyttävä, voidaan ostaa
valmiina. On myös mahdollista valmistaa niitä laboratoriossa
seuraavasti:
Jäähdytetään 5 kg tuoretta sian haimaa 0 ºC:seen, poistetaan
ympäröivä kiintorasva ja kalvot ja jauhetaan sekoittimessa niin,
että syntyy tahnamainen neste. Tahnaan lisätään 2,5 l vedetöntä
asetonia ja sekoitetaan sekoittimella (4.25) 4—6 tuntia, minkä
jälkeen liuos sentrifugoidaan. Jäännöstä uutetaan vielä kolme
kertaa samalla tilavuusmäärällä asetonia, sitten kaksi kertaa
asetonin ja dietyylieetterin seoksella 1:1 (V/V) ja kaksi kertaa
dietyylieetterillä.
Jäännös kuivataan tyhjiössä 48 tuntia, jotta saadaan stabiili jauhe,
jota on säilytettävä jääkaapissa.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 31
▼B
Huom. 3 Kaikissa tapauksissa on suositeltavaa, että samasta näytteestä
määritetään aina rasvahappojen kokonaismäärä, koska tulosten
tulkintaa helpottaa, kun 2-asemassa olevien happojen määrää
voidaan verrata rasvahappojen kokonaismäärään.
Huom. 4 Kun käytetään nestemäistä öljyä, hydrolyysin lämpötilaksi
säädetään 37 ºC. Kun tutkitaan näytettä, se säädetään kuitenkin
40 ºC:seen, jotta voitaisiin tutkia kaikkia rasvoja, joiden sulamis-
piste on enintään 45 ºC.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 32
▼B
LIITE VIII
TRILINOLEIINIPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN
1 TARKOITUS
Nestemäisten kasviöljyjen triglyseridien koostumuksen määritys niiden
ekvivalenttisen hiililuvun mukaan suuren erotuskyvyn nestekromatogra-
fialla.
Tämä standardi kuvaa menetelmän, jolla voidaan erottaa ja määrittää kvan-
titatiivisesti triglyseridit kasviöljyistä niiden moolimassan ja
tyydyttymättömyysasteen muodossa niiden ekvivalenttisen hiililuvun funk-
tiona (ks. huom. 1).
2 SOVELTAMISALA
Tämä standardi soveltuu kaikkien pitkäketjuisten rasvahappojen triglyser-
idejä sisältävien kasviöljyjen määrittämiseen. Menetelmä sopii erityisen
hyvin käytettäväksi, kun on löydettävä pieniä määriä puoliksi kuivuvia
öljyjä (joissa on paljon linolihappoa) kasviöljyistä, joissa oleiinihappo
(öljyhappo) on hallitseva tyydyttymätön rasvahappo (kuten oliiviöljyssä).
3 PERIAATE
Triglyseridit erotetaan ekvivalenttisen hiililuvun perusteella suuren erotus-
kyvyn nestekromatografian (käänteisfaasin) avulla ja kromatogrammeja
tulkitsemalla.
4 VÄLINEISTÖ
4.1 Suuren erotuskyvyn nestekromatografialaitteisto, jonka kolonnin lämpötilaa
voidaan säätää.
4.2 Ruisku 10 ml:n injektioihin.4.3 Detektori: differentiaalirefraktometri, jolla voidaan määrittää taitekerroin
10
−4yksikön tarkkuudella.
4.4 Kolonni: putki ruostumatonta terästä, pituus 250 mm, sisähalkaisija 4,5 mm,
jossa täytteenä halkaisijaltaan 5 mm:n piidioksidihiukkasia, joissa on
22—23 % hiiltä oktadekyylisilaanin muodossa (Huom. 2).
4.5 Piirturi ja/tai integraattori.
5 REAGENSSIT
Reagenssien on oltava analyysipuhtaita ja eluointiliuottimien kaasuttomia
(niitä voidaan käyttää useita kertoja ilman että se vaikuttaa erottumiseen).
5.1 Kloroformi.5.2 Asetoni.5.3 Asetonitriili.
5.4 Eluointiliuotin: asetonitriili + asetoni (aloitetaan sekoitussuhteella 50:50,
suhdetta muutetaan halutun erottumisen aikaansaamiseksi).
5.5 Liuotin: asetoni tai asetonin ja kloroformin seos (1:1).5.6 Vertailutriglyseridit: joko valmiina saatavat triglyseridit, kuten tripalmitiini,
trioleiini, jne. (retentioajat voidaan tällöin määrittää graafisesti ekvivalent-
tisen hiililuvun mukaan), tai käytetään soijaöljystä saatua
vertailukromatogrammia (ks. huom. 3 ja 4 ja kuvat 1 ja 2).
6 NÄYTTEIDEN VALMISTELU
Näytteestä valmistetaan 5-prosenttinen liuos punnitsemalla 0,5 ± 0,001 g
näytettä 10 ml:n mittapulloon ja lisäämällä liuotinta (5.5) niin, että liuosta
on 10 ml.
7 SUORITUS
7.1 Kromatografialaitteisto asetetaan käyttökuntoon. Ruiskutetaan eluointiliuo-
tinta (5.4) 1,5 ml/mm laitteiston puhdistamiseksi. Odotetaan, kunnes
piirturin antama perusviiva on suora.
Injektoidaan 10 µl 6 kohdan mukaisesti valmisteltua näytettä.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 33
▼B
8 TULOSTEN LASKEMINEN JA ESITTÄMINEN
Käytetään sisäisen normalisoinnin menetelmää, toisin sanoin oletetaan, että
eri triglyseridien piikkien pinta-alojen summa on 100 %.
Lasketaan jokaisen triglyseridin suhteellinen osuus yhden desimaalin tark-
kuudella kaavasta:
Triglyseridi % =piikin pinta-ala
piikkien yhteenlaskettu pinta-ala× 100
Huom.1 Eluoitumisjärjestys voidaan määrittää laskemalla ekvivalenttinen
hiililuku, joka usein määritellään kaavalla ECN = CN − 2n, jossa
CN on hiililuku ja n on kaksoissidosten määrä.
Laskelmaa voidaan tarkentaa ottamalla huomioon kaksoissidosten
alkuperä.
Jos no,nlja nlnovat oleiinihapon, linolihapon ja linoleenihapon
kaksoissidosten määrät, ekvivalenttinen hiililuku voidaan laskea
kaavasta:
ECN = CN − dono−dlnl−dlnnln,
jossa olevat kertoimet do,dlja dlnvoidaan laskea vertailutriglyseri-
dien avulla. Tässä menetelmässä käytetyissä olosuhteissa kaavasta
tulee suunnilleen seuraava:
ECN = CN − [2,60 no] − [2,35 nl] − [2,17 nln]
Huom. 2 Esimerkiksi: Lichrosorb (Merck) RP 18 Art 50333;
Lichrosphere (Merck) 100 CH18 Art 50377 tai
vastaava.
Huom. 3 On myös mahdollista laskea erotuskyky trioleiinin suhteen usean
vertailuglyseridin avulla,
α=R T′/RT′oleiini
käyttämällä korjattua retentioaikaa RT ′=R T−R Tliuotin.
Log α:n kuvaajasta f:n funktiona (f on kaksoissidosten lukumäärä)
voidaan määrittää kaikkien vertailutriglyseridien sisältämien rasva-
happojen triglyseridien retentioindeksit (ks. kuva 2).
Huom. 4 Kolonnin on oltava niin tehokas, että trilinoleiinin piikki (LLL)
erottuu selvästi niiden triglyseridien piikeistä, joiden retentioajat
ovat lähes samat.
Huom. 5 Jotta trilinoleiinipiikki saadaan erottumaan selvästi läheisistä
piikeistä tai mahdollisesti häiriöitä aiheuttavista aineista, oliivi-
lamppuöljyt ja jalostamattomat uutetut oliiviöljyt on puhdistettava
ennalta seuraavan menetelmän mukaisesti:
Absorboidaan 200 µl öljyä laimentamatta pieneen neste/kiinteä -
uuttoa varten tarkoitettuun piidioksidikolonniin (tyyppi SEP PAK
silica cartridge-waters part. n. 51 900).
Triglyseridit eluoidaan 20 ml:lla HPLC-laatuista vedetöntä
heksaania, enintään 20 sekuntia.
Eluoitu tuote kuivataan typpivirassa ja liuotetaan isopropanoliin tai
asetoniin (5 ml). Injektoidaan suuren erotuskyvyn nestekromato-
grafiin (HPLC) 10—20 µl. On tarkkailtava, että öljyn
rasvahappokoostumus on sama ennen puhdistusta ja sen jälkeen,
käytetyn määritysmenetelmän virherajoissa.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 34
▼M11
▼B
Kuva 1
Soijaöljynäytteen kromatogrammi
P = palmitiinihappo St = steariinihappo O = oleiinihappo (öljyhappo) L =
linolihappo Ln = linoleenihappo1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 35
▼B
Kuva 2
log α:n muuttuminen f:n funktiona (f = kaksoissidosten lukumäärä)
La = lauriinihappo My = myristiinihappo P = palmitiinihappo St = steariini-
happo O = oleiinihappo L = linolihappo Ln = linoleenihappo1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 36
▼B
LIITE IX
SPEKTROFOTOMETRINEN MÄÄRITYS
JOHDANTO
Spektrofotometrinen määritys ultraviolettivalossa antaa tietoa rasvan
laadusta, sen säilymisestä ja muutoksista, joita käsittelyt ovat siinä aiheutta-
neet.
Tässä menetelmässä käytetyillä aallonpituuksilla tapahtuva absorptio johtuu
konjugoiduista dieeni-ja trieenijärjestelmistä. Nämä absorptiot ilmaistaan
ominaisekstinktiona (ekstinktio, joka tapahtuu tiettyyn liuottimeen valmis-
tetun 1-prosenttisen rasvaliuoksen 1 cm:n paksuisessa kerroksessa), josta
tavallisesti käytetään merkkiä K (nimitetään myös ”ekstinktiokertoimeksi”).
1 TARKOITUS
Tällä menetelmällä voidaan tutkia rasvoja spektrofotometrisesti ultravioletti-
valossa.
2 PERIAATE
Rasva liuotetaan määrättyyn liuottimeen ja liuoksen ekstinktio mitataan
tietyllä aallonpituudella käyttäen vertailuliuoksena puhdasta liuotinta. Yksit-
täiset ekstinktiot lasketaan spektrofotometrin lukemista.
3 VÄLINEISTÖ
3.1 Spektrofotometri, joka mittaa ekstinktion ultraviolettivalossa aallonpituuk-
silla 220—360 nm, yhden nanometrin tarkkuudella.
3.2 Suorakaiteen muotoisia kvartsikyvettejä kansineen, optinen väli 1 cm.
Vedellä tai muulla sopivalla liuottimella täytettynä kyvettien antamien luke-
mien ero saa olla enintään 0,01 ekstinktioyksikköä.
3.3 Mittapulloja, 25 ml.
3.4 Kromatografiakolonni, jonka yläosan pituus on 270 mm ja halkaisija 35 mm
ja jonka alaosan pituus on 270 mm ja halkaisija 10 mm.
4 REAGENSSIT
4.1 Iso-oktaani (2,2,4—trimetyylipentaani), spektrofotometristä laatua: verrat-
tuna tislattuun veteen sen läpäisysuhteen on oltava vähintään 60 %
aallonpituudella 220 nm ja vähintään 95 % aallonpituudella 250 nm, tai
— sykloheksaani, spektrofotometristä laatua: tislattuun veteen verrattuna
sen läpäisysuhteen on oltava vähintään 40 % 220 nm:ssä ja vähintään
95 % 250 nm:ssä.
4.2 Emäksistä alumiinioksidia kromatografiakolonnia varten; esikäsittely ja
tarkistus kuvataan lisäyksessä 1.
4.3 n-heksaani, kromatografiaa varten.
5 MENETTELY
5.1 Näytteen tulee olla täysin homogeenista eikä siinä saa olla suspendoituneita
epäpuhtauksia. Öljyt, jotka ovat huoneenlämmössä nestemäisiä, suodatetaan
paperin läpi noin 30 ºC:ssa, kiinteät rasvat homogenoidaan ja suodatetaan
lämpötilassa, joka ei saa olla yli 10 ºC korkeampi kuin niiden sulamispiste.
5.2 Punnitaan noin 0,25 g näytettä, joka on esikäsitelty edellä kuvatulla tavalla,
25 ml:n mittapulloon, joka täytetään liuottimella ja homogenoidaan.
Syntyvän liuoksen on oltava täysin kirkasta. Jos ilmenee sameutta tai
sakkaa, liuos suodatetaan nopeasti paperin läpi.
5.3 Kyvetti täytetään saadulla liuoksella ja ekstinktiot mitataan sopivalla aallon-
pituudella 232—276 nm; käytetty liuotin toimii vertailuliuoksena.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 37
▼M6
▼B
▼M6
▼B
▼B
Saatujen ekstinktioarvojen on oltava 0,1—0,8; jollei tällaisia tuloksia saada,
koe on uusittava käyttäen vahvempia tai laimeampia liuoksia tarpeen
mukaan.
5.4 Kun on tarpeen määrittää ominaisekstinktio alumiinioksidilla tapahtuvan
puhdistamisen jälkeen, toimitaan seuraavasti: kromatografiakolonniin
pannaan 30 g emäksistä alumiinioksidia heksaaniin suspendoituna, adsor-
bentin annetaan laskeutua ja ylimääräinen heksaani poistetaan niin, että sitä
on noin 1 cm alumiinioksidin päällä.
Liuotetaan 10 g rasvaa homogenoituna ja suodatettuna 5.1 kohdan mukai-
sesti 100 ml:aan heksaania ja kaadetaan liuos kolonniin. Eluaatti kerätään
talteen ja liuotin haihdutetaan tyhjiössä alle 25 ºC:ssa.
Näin saatu rasva käsitellään välittömästi 5.2 kohdan mukaisesti.
6 TULOSTEN ESITTÄMINEN
6.1 Lasketaan ominaisekstinktiot (ekstinktiokertoimet) eri aallonpituuksilla seur-
aavasta kaavasta:
Kλ¼Eλ
c/C1s
jossa:
Kλ= ominaisekstinktio aallonpituudella λ;
Eλ= aallonpituudella λmitattu ekstinktio;
c = liuoksen väkevyys g/100 ml;s = kyvetin paksuus, cm
Tulokset ilmoitetaan kahden desimaalin tarkkuudella.
6.2 Oliiviöljyn spektrofotometrinen määritys ETY:n virallisissa asetuksissa
tarkoitetun virallisen menetelmän mukaan vaatii ominaisekstinktion
määrittämisen iso-oktaaniliuoksessa aallonpituuksilla 232 ja 270 nm ja
∆K:n laskemisen kaavasta:
∆K¼K
m/C0Km/C04þKmþ4
2
jossa Kmon ominaisekstinktio aallonpituudella m, maksimaalisen absorption
aallonpituuden ollessa noin 270 nm.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 38
▼B
LISÄYS I
Alumiinioksidin esikäsittely ja sen aktiivisuuden tarkistus
A.1.1 Alumiinioksidin esikäsittely
Etukäteen 380—400 ºC uunissa kolmen tunnin ajan kuivattu alumiiniok-
sidi asetetaan ilmatiiviiseen astiaan. Tislattua vettä lisätään suhteessa 5 ml/
100 g alumiinioksidia, astia suljetaan välittömästi, sitä ravistetaan useita
kertoja ja annetaan sitten seistä vähintään 12 tuntia ennen käyttöä.
A.1.2 Alumiinioksidin aktiivisuuden tarkistaminen
Esikäsitellään kromatografiakolonni 30 g:lla alumiinioksidia. Seurataan
5.4 kohdan ohjeita ja johdetaan kolonnin läpi seos, jossa on:
— 95 % neitsytoliiviöljyä, jonka ominaisekstinktio on alle 0,18 aallonpi-
tuudella 268 nm,
— 5 % maapähkinäöljyä, joka on käsitelty valkaisumaalla sen puhdis-
tuksen aikana ja jonka ominaisekstinktio on vähintään 4
aallonpituudella 268 nm.
Seos johdetaan kolonnin läpi ja jos sen ominaisekstinktio on yli 0,11
aallonpituudella 268 nm, alumiinioksidi on kelvollista; muutoin sen
hydrataatioastetta on lisättävä.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 39
▼B
LISÄYS II
Spektrofotometrin kalibrointi
A.2 Laitteisto tulee tarkistaa säännöllisesti (vähintään puolen vuoden välein),
sekä aallonpituuksien vastaavuuden että lukematarkkuuden suhteen.
A.2.1 Aallonpituuslukema voidaan tarkistaa joko elohopeahöyrylampulla tai
sopivien suodattimien avulla.
A.2.2 Valokennon ja valomonistimen antamat lukemat voidaan tarkistaa seuraa-
vasti: punnitaan 0,2 g spektrofotometrisesti puhdasta kaliumkromaattia ja
liuotetaan se 0,05 N kaliumhydroksidiliuokseen 1 000 ml:n mittapulloon
niin, että liuosta on 1 000 ml. Mitataan tasan 25 ml tätä liuosta 500 ml:n
mittapulloon ja täytetään pullo kaliumhydroksidiliuoksella.
Näin saadun liuoksen ekstinktio mitataan aallonpituudella 275 nm ja
käytetään kaliumhydroksidiliuosta vertailuliuoksena. Mitatun ekstinktion
on oltava 0,200 ± 0,005, kun käytetään 1 cm:n optista kyvettiä.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 40
▼B
LIITE X A
RASVAHAPPOJEN METYYLIESTEREIDEN MÄÄRITTÄMINEN
KAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ
1 SOVELTAMISALA
Tämä menetelmä antaa yleisohjeita kaasukromatografian käyttöön, kun
tarkoituksena on määrittää liitteessä X B kuvatulla menetelmällä saadun
rasvahappojen metyyliestereiden seoksen koostumus kvalitatiivisesti ja
kvantitatiivisesti.
Menetelmä ei sovellu polymeroitujen rasvahappojen tutkimiseen.
2 REAGENSSIT2.1 Kantajakaasu
Inertti kaasu (typpi, helium, argon, vety, jne.), huolellisesti kuivattu; ei
saa sisältää happea yli 10 mg/kg.
Huom. 1 Vety, jota voidaan käyttää kantajakaasuna ainoastaan kapil-
laarikolonneissa, kaksinkertaistaa määritysnopeuden, mutta
sen käyttö on vaarallista. Turvalaitteita on kuitenkin saatavana.
2.2 Apukaasut
2.2.1 Vety (puhtaus ≥99,9 %), ei saa sisältää orgaanisia epäpuhtauksia.
2.2.2 Ilmaa tai happea, ei saa sisältää orgaanisia epäpuhtauksia.
2.3 Vertailustandardi
Rasvahappojen puhtaiden metyyliestereiden seos tai sellaisen tunnetun
rasvan metyyliestereitä, jotka ovat mahdollisimman samanlaisia kuin
tutkittava rasva.
Monityydyttymättömien rasvahappojen hapettumista on vältettävä.
3 VÄLINEISTÖ
Tässä annetut ohjeet koskevat tavallista kaasukromatografista laitteistoa,
joko täytetyllä kolonnilla tai kapillaarikolonnilla varustettua, sekä liekki-
ionisaatiodetektoria. Muutkin laitteistot, jotka ovat yhtä tehokkaita ja
joiden erotuskyky on 4.1.2. kohdan mukainen, ovat sopivia.
3.1 Kaasukromatografi
Kaasukromatografissa on oltava seuraavat osat.
3.1.1 Injektiojärjestelmä
Käytetään injektiojärjestelmää, joka sopii:
a) täytettyyn kolonniin, jonka kuollut tilavuus on mahdollisimman pieni
(tässä tapauksessa injektiojärjestelmää tulee voida kuumentaa
20—50 ºC kolonnia korkeampaan lämpötilaan); tai
b) kapillaarikolonniin, jolloin sen on oltava erityisesti tähän käyttöön
suunniteltu. Järjestelmä voi olla jakajatyyppiä tai jakajaton, kolonniin
liitetty (on-column) injektori.
Huom. 2 Jos näytteessä on ainoastaan sellaisia rasvahappoja, joissa on
vähintään 16 hiiliatomia, voidaan käyttää liikkuvaa neulainjek-
toria.
3.1.2 Uuni
Uunin tulee pystyä lämmittämään kolonni vähintään 260 ºC:n lämpöti-
laan ja pitämään se valitussa lämpötilassa 1 ºC:n tarkkuudella, jos kyse
on täytetystä kolonnista, ja 0,1 ºC:n tarkkuudella, jos kyse on kapillaar-
ikolonnista. Viimeksimainittu vaatimus on erittäin tärkeä, jos käytetään
kvartsilasiputkea.
Lämpötilaohjelmoidun laitteen käyttöä suositellaan kaikissa tapauksissa
ja erityisesti rasvahapoille, joissa on alle 16 hiiliatomia.
3.1.3 Täytetty kolonni1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 41
▼B
3.1.3.1 Kolonni on valmistettu aineesta, joka ei reagoi tutkittavien aineiden
kanssa (esim. lasi tai ruostumaton teräs); kolonnin mitat ovat seuraavat:
a) pituus: 1—3 m. Pitkäketjuisten rasvahappojen (> C20) tutkimiseen
käytetään suhteellisen lyhyttä kolonnia. Tutkittaessa happoja, joissa
on 4—6 hiiliatomia, suositeltava kolonnin pituus on 2 m;
b) sisähalkaisija: 2—4 mm.
Huom. 3 Jos tutkittavana on monityydyttymättömiä happoja, joissa on
enemmän kuin kolme kaksoissidosta, ne saattavat hajota
kolonnissa, joka on ruostumatonta terästä.
Huom. 4 Voidaan myös käyttää järjestelmää, jossa on täytetty kaksois-
kolonni.
3.1.3.2 Täyte, joka koostuu seuraavista aineista:
a) tukiaine: happopestyä ja silanoitua piimaata tai muuta sopivaa,
inerttiä tukiainetta, jonka raekokojakauma on kapea (25 mm:n vaih-
telu 125 ja 200 mm:n välillä) niin, että keskimääräinen raekoko on
suhteessa kolonnin pituuteen ja sisähalkaisijaan;
b) stationäärifaasi: polyesterityyppinen polaarinen neste (esim. dietylee-
niglykolipolysukkinaatti, butaanidiolipolysukkinaatti,
etyleeniglykolipolyadipaatti jne.), syanosilikonit tai jokin muu neste,
joka saa aikaan kromatografisen erottumisen (ks. kohta 4). Stationää-
rifaasin osuuden on oltava 5—20 % (m/m) täytteestä. Joissakin
erotteluissa voidaan käyttää polaaritonta stationäärifaasia.
3.1.3.3 Kolonnin valmistelu
Kun kolonni on irrotettu detektorista, uuni kuumennetaan vähitellen
185 ºC:seen ja inerttikaasua johdetaan 20—60 ml minuutissa juuri
täytetyn kolonnin läpi, vähintään 16 tunnin ajan tässä lämpötilassa ja
sitten vielä kaksi tuntia 195 ºC:ssa.
3.1.4 Kapillaarikolonni3.1.4.1 Putki, joka on valmistettu analysoitaville aineille inertistä aineesta
(tavallisesti lasista tai kvartsilasista). Sisähalkaisijan on oltava
0,2—0,8 mm. Sisäpinta on käsiteltävä sopivalla menetelmällä (esim.
pintakäsittely, inaktivointi) ennen kuin se päällystetään stationäärifaasi-
kerroksella. Useimmissa tapauksissa riittävä pituus on 25 m.
3.1.4.2 Stationäärifaasi, pääasiassa polyglykolityyppiä [poly(etyleeniglykoli)
20 000], polyesterityyppiä (butaanidiolipolysukkinaatti) tai polaarista
polysiloksaanityyppiä (syanosilikonit). Kytketyt kolonnit (kolonniverkot)
ovat myös sopivia.
Huom. 5 On olemassa vaara, että polaariset polysiloksaanit vaikeuttavat
linoleenihapon ja C
20-happojen erottumista ja tunnistamista.
Päällysteen on oltava ohut, 0,1 — 0,2 mm.
3.1.4.3 Kolonnin kokoaminen ja esivalmistelut
Tavanomaisia varotoimenpiteitä on noudatettava kapillaarikolonnien
kokoamisessa, ts. kolonnin sijoittelu uuniin (tukirakenteet), liitosten
valinta ja asennus (tiiviys), kolonnin päiden liittäminen injektiojärjes-
telmään ja detektoriin (mahdollisimman vähän kuollutta tilaa).
Kantajakaasuvirta johdetaan kolonnin läpi (esimerkiksi 0,3 baaria,
30 kPa, 25 m pitkään kolonniin, jonka sisähalkaisija on 0,3 mm).
Kolonni esilämmitetään ohjelmoimalla uuni niin, että lämpötila nousee
3 ºC minuutissa huoneenlämmöstä sellaiseen lämpötilaan, joka on 10 ºC
alhaisempi kuin stationäärifaasin hajoamislämpötila. Uuni pidetään tässä
lämpötilassa yhden tunnin ajan, kunnes perusviiva on tasoittunut.
Lämpötila palautetaan 180 ºC:seen ja työskentelyä jatketaan
vakiolämpötilassa.
Huom. 6 Esivalmisteltuja kolonneja voi myös ostaa.
3.1.5 Detektori, joka kestää korkeampaa lämpötilaa kuin kolonni.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 42
▼B
3.2 Ruisku
Ruiskun enimmäistilavuuden on oltava 10 ml ja jakovälin 0,1 ml.
3.3 Piirturi
Kun piirturin käyrää käytetään määritettävän seoksen koostumuksen
laskemiseen, tarvitaan elektroninen, erittäin tarkka piirturi, joka sopii
yhteen muun laitteiston kanssa. Piirturilla on oltava seuraavat ominai-
suudet:
a) vasteaika alle 1,5 s, mieluummin 1 s (vasteaika on aika, joka kuluu,
kun piirturin kärki siirtyy nollasta 90 %:iin, kun yhtäkkiä annetaan
100 %:n signaali);
b) paperin leveys vähintään 20 cm;
c) paperin nopeutta on voitava säätää 0,4:stä 2,5 cm:iin minuutissa.
3.4 Integraattori tai laskin (valinnainen)
Elektronisen integraattorin tai laskimen avulla tulos voidaan laskea
nopeasti ja tarkasti. Sen on annettava lineaarinen vaste riittävällä herk-
kyydellä ja perusviivan poikkeaman korjauksen tulee olla riittävä.
4 SUORITUS
Toimenpiteet alakohdissa 4.1—4.3 koskevat liekki-ionisaatiodetektorin
käyttöä.
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää kaasukromatografista laitetta, jossa on
lämmönjohtokyvyn ilmaisin (katarometri). Koeolosuhteita on tällöin
muutettava 6 kohdan mukaan.
4.1 Koeolosuhteet
4.1.1 Ihanteellisten koeolosuhteiden valinta4.1.1.1 Täytetty kolonni
Seuraavat muuttujat on otettava huomioon olosuhteita valittaessa:
a) kolonnin pituus ja halkaisija;
b) stationäärifaasin ominaisuudet ja määrä;
c) kolonnin lämpötila;
d) kantajakaasuvirta;
e) tarvittava erotuskyky;
f) näytteen määrä, joka on valittava siten, että detektori ja elektrometri
yhdessä antavat lineaarisen vasteen;
g) määrityksen kesto.
Taulukoissa 1 ja 2 annetut arvot johtavat yleensä haluttuihin tuloksiin,
eli vähintään 2 000 teoreettista pohjaa yhtä kolonnimetriä kohti metyy-
listearaatilla, kun se eluoidaan noin 15 minuutissa.
Injektorin lämpötilan tulisi olla noin 200 ºC ja detektorin lämpötilan
tulisi olla vähintään yhtä suuri kuin kolonnin, jos laitteisto antaa siihen
mahdollisuuden.
Liekki-ionisaatiodetektoriin johdetun vedyn virtausnopeuden suhde
kantajakaasun nopeuteen on yleensä 1:2 — 1:1 kolonnin halkaisijan
mukaan. Hapen virtaus on noin 5—10 kertaa suurempi kuin vedyn.
Taulukko 1
Kolonnin sisähalkaisija
(mm)Kantajakaasun virtausnopeus
(ml/min)
2 15—25
3 20—40
4 40—601991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 43
▼B
Taulukko 2
Stationäärifaasin pitoisuus
% (m/m)Kolonnin lämpötila
ºC
5 175
10 180
15 185
20 185
4.1.1.2 Kapillaarikolonni
Kapillaarikolonnien tehokkuus- ja permeabiliteettiominaisuuksien vuoksi
aineosien erottuminen ja määrityksen kesto riippuvat voimakkaasti
kantajakaasun virtausnopeudesta kolonnissa. Tämän vuoksi toimintaolo-
suhteet on valittava tätä parametria (eli kolonnin täytehäviötä)
muuttamalla sen mukaan, halutaanko parantaa erotuskykyä vaisaada
tulos nopeasti.
4.1.2 Teoreettisten pohjien määrän (tehokkuuden) ja erotuskyvyn määrittä-
minen (ks. kuva 1)
Määritys tehdään metyylistearaatin ja metyylioleaatin seoksesta, jossa on
suunnilleen yhtä paljon molempia (esim. kaakaovoin metyyliestereistä).
Näytteen määrä, kolonnin lämpötila ja kantajakaasun virtaus valitaan
niin, että mahdollisimman suuri osa metyylistearaatin piikistä piirtyy
noin 15 minuuttia liuottimen piikin jälkeen ja että metyylistearaattipiikki
täyttää noin kolme neljännestä koko asteikosta.
Teoreettisten pohjien määrä n lasketaan kaavasta:
n¼16dr1
W1/C20/C21
2
ja erotuskyky R kaavasta:
R¼2∆
W1þW2
jossa:
dr1on retentioetäisyys millimetreinä, alkaen kromatogrammin
alusta metyylistearaattipiikin huippuun;
W1ja W2ovat metyylistearaatin ja metyylioleaatin piikkien leveydet
millimetreinä, mitattuina kohdista, joissa piikkikäyrän
käännepisteisiin piirretyt tangentit leikkaavat perusviivan;
∆metyylistearaatin ja metyylioleaatin piikkien huippujen väli
millimetreinä;
ja resoluutioluku Ir, kaavalla
a
b
jossa:
a = pienimmän piikin korkeus, mitattuna suhteessa perusviivaan,
b = kahden vierekkäisen piikin muodostaman laakson alimman pisteen
korkeus, mitattuna suhteessa perusviivaan.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 44
▼M2
▼B
Kuva 1
Kromatogrammi teoreettisten pohjien lukumäärän (tehokkuuden) ja erotuskyvyn
määrittämiseksi
Koeolosuhteet on valittava siten, että saadaan vähintään 2 000 teoreet-tista pohjaa kolonnimetriä kohti metyylistearaatille ja että erotuskyky
on vähintään 1,25.
4.2 Näytteenotto
Injektoidaan ruiskulla (3.2) kolonniin 0,1 — 2 ml metyyliesterien
liuosta, joka on valmistettu liitteessä X B esitetyn menetelmän mukaan.
Jos estereissä ei ole liuottimia, valmistetaan noin 100 mg/ml:n liuos
heptaaniin (kaasukromatografista laatua) ja injektoidaan 0,1 — 1 ml
tätä liuosta.
Jos määritetään aineosia, joita on vähän, näytteen määrää voidaan suur-
entaa (enintään kymmenkertaiseksi).
4.3 Määritys
Koeolosuhteiden tulee yleensä olla kohdan 4.1.1 mukaiset.
Alhaisempien kolonnilämpötilojen käyttö on kuitenkin mahdollista, kun
määritetään rasvahappoja, joissa on alle 12 hiiliatomia, tai voidaan
käyttää korkeampia lämpötiloja, jos rasvahapoissa on yli 20 hiiliatomia.
Näissä tapauksissa voidaan käyttää lämpötilan ohjelmointia. Esimerkiksi
jos näytteessä on rasvahappojen metyyliestereitä, joissa on alle 12 hiilia-
tomia, näyte voidaan injektoida 100 ºC:ssa (tai 50—60 ºC:ssa, jos
mukana on voihappoa) ja ohjelmoida lämpötila nousemaan 4—8 ºC/
min, kunnes saavutetaan optimilämpötila. Joissakin tapauksissa mene-
telmät voidaan yhdistää.
Ohjelmoidun lämmityksen jälkeen eluointia jatketaan vakiolämpötilassa,
kunnes kaikki aineosat ovat eluoituneet. Jos laitteen lämpötilaa ei voida
ohjelmoida, käytetään kahta lämpötilaa, jotka ovat 100—195 ºC.
On suositeltavaa tehdä määritys tarvittaessa kahdessa polaarisuudeltaan
erilaisessa faasissa, jotta varmistutaan siitä, että mukana ei ole toisen1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 45
▼B
piikin alle jääviä piikkejä, esimerkiksi jos näytteessä on yhtä aikaa C18:3ja C20:0taiC18:3ja C18:2konjugoituneina.
4.4 Vertailukromatogrammin ja -kuvaajan valmistaminen
Määritetään vertailustandardiseos (2.3) käyttäen samoja koeolosuhteita
kuin näytettä määritettäessä, ja mitataan rasvahappojen retentioajat tai -
etäisyydet. Puolilogaritmipaperille piirretään jokaista tyydyttymättömyy-
sastetta varten kuvaaja, jossa on retentioajan tai -etäisyyden logaritmi
hiiliatomien määrän funktiona; suoraketjuisten ja tyydyttymättömyysas-
teeltaan samojen estereiden kuvaajien tulisi olla suoria
vakiolämpötilassa. Suorien tulisi olla suunnilleen yhdensuuntaiset.
On vältettävä olosuhteita, joissa piikki jää toisen alle, ts. erotuskyky ei
riitä erottamaan kahta aineosaa.
5 TULOSTEN ESITTÄMINEN5.1 Kvalitatiivinen määritys
Näytteen metyyliesteripiikit tunnistetaan 4.4 alakohdassa mainittujen
käyrien avulla, tarvittaessa interpoloimalla.
5.2 Kvantitatiivinen määritys
5.2.1 Koostumuksen määrittäminen
Joitakin poikkeuksia lukuun ottamatta voidaan käyttää sisäisen normal-
isoinnin menetelmää, jossa oletetaan että kromatogrammi kuvaanäytteen kaikkia aineosia, eli että piikkien yhteenlaskettu pinta-ala
vastaa aineosia sataprosenttisesti (täydellinen eluoituminen).
Jos laitteistoon kuuluu integraattori, käytetään sen antamia tuloksia.
Muussa tapauksessa jokaisen piikin pinta-ala lasketaan kertomalla sen
korkeus leveydellä piikin puolivälistä mitattuna ja ottaen huomioon piir-
turissa mahdollisesti käytetyt vaimennukset.
5.2.2 Laskentamenetelmät5.2.2.1 Yleinen tapaus
Lasketaan tietyssä aineosassa olevien metyyliesterien pitoisuus massa-
prosentteina määrittämällä piikin pinta-alan suhteellinen osuus kaikkien
piikkien yhteenlasketusta pinta-alasta seuraavan kaavan avulla:
Ai
ΣA/C2100
jossa:
Aion aineen i piikin pinta-ala;
ΣA on kaikkien piikkien yhteenlaskettu pinta-ala.
Tulos annetaan yhden desimaalin tarkkuudella.
Huom. 7 Tässä yleisessä tapauksessa laskun tuloksen katsotaan perus-
tuvan siihen, että suhteelliset pinta-alat vastaavat massojen
prosentuaalisia suhteita. Tapauksissa, joissa näin ei voida
olettaa, menetellään 5.2.2.2 alakohdan mukaan.
5.2.2.2 Korjauskertoimien käyttö
Tapauksissa, joissa rasvahapossa esimerkiksi on vähemmän kuin
kahdeksan hiiliatomia tai hapossa on sekundaarisia ryhmiä, taikka kun
käytetään lämmön johtumiseen perustuvaa detektoria tai kun tulosten
on oltava mahdollisimman tarkkoja, on käytettävä korjauskertoimia
muutettaessa piikkien pinta-alojen prosenttiosuuksia aineosien massapro-
senteiksi.
Korjauskertoimet määritetään kromatogrammista, joka saadaan tarkoin
tunnettujen metyyliestereiden vertailuseoksesta samoissa olosuhteissa,
joissa näyte määritettiin.
Vertailuseoksen aineen iprosentuaalinen massaosuus saadaan kaavasta:
mi
Σm/C2100
jossa:
mion vertailuseoksen aineen i massa;1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 46
▼B
Sm on vertailuseoksen eri aineosien massojen summa.
Lasketaan aineen iprosentuaalinen pinta-alaosuus vertailuseoksen (4.4)
kromatogrammista:
Ai
ΣA/C2100
jossa:
Aion aineen ipiikin pinta-ala;
ΣA on kaikkien piikkien pinta-alojen summa.
Korjauskerroin saadaan kaavasta:
Ki¼mi/C2ΣA
Ai/C2Σm
Yleensä korjauskertoimet ilmoitetaan suhteessa KC16:een; tällöin suhteel-
liset kertoimet ovat:
K0
i¼Ki
KC16
Näytteen jokaisen aineen imäärä prosenttiosuutena metyyliestereiden
massasta on:
K0
i/C2Ai
ΣK0
i/C2Ai/C0/C1 /C2100
Tulos annetaan yhden desimaalin tarkkuudella.
5.2.2.3 Sisäisen standardin käyttö
Tietyissä määrityksissä (esimerkiksi jos kaikkien rasvahappojen määriä
ei tunneta, kuten silloin kun 16 ja 18 hiiliatomia sisältävien rasvahap-
pojen ohella esiintyy neljä ja kuusi hiiliatomia sisältäviä happoja tai
kun on tarpeen määrittää näytteessä olevien rasvahappojen absoluuttinen
määrä) on tarpeen käyttää sisäistä standardia. Usein käytetään rasvahap-
poja, joissa on 5, 15 tai 17 hiiliatomia. Sisäisen standardin
korjauskerroin on määritettävä tarvittaessa.
Aineen iprosentuaalinen massaosuus metyyliestereinä ilmaistuna
saadaan kaavasta:
ms/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
s/C2As/C2100
jossa:
Aion aineen ipiikin pinta-ala;
Ason sisäisen standardin piikin pinta-ala;
K′ion aineen ikorjauskerroin (suhteessa KC16:een);
K′son sisäisen standardin korjauskerroin (suhteessa KC16:een);
m on näytteen massa milligrammoina;
mson sisäisen standardin massa milligrammoina.
Tulos annetaan yhden desimaalin tarkkuudella.
6 TRANS-ISOMEERIEN MÄÄRITYKSEN ERITYISTAPAUS
Rasvahappojen, joiden hiiliatomien lukumäärä on 10-24, trans-
isomeerien pitoisuus voidaan määrittää erottamalla metyyliesterit
käyttäen kapillaarikromatografisia kolonneja, joilla on tietty polaarisuus.
6.1 Piioksidista tehty kapillaarikolonni, sisähalkaisija 0,25-0,32 mm ja
pituus 50 m, varustettu syanopropysilikonipinnoitteella, jonka paksuus
on 0,1-0,3 µm (tyyppi SP 2340, tyyppi SP 2380, C. P. sil 88, Silor 10
ja vastaavat tyypit).
6.2 Metyyliesterit esikäsitellään liitteessä X B esitetyn menetelmän B
mukaisesti. Rasva-aineet, joiden vapaa happoisuus on yli 3 %, on ensin
neutraloitava liitteessä VII olevan 6.1 kohdan mukaisesti.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 47
▼M2
▼M2
6.3 Työskentelyolosuhteet kaasukromatografiaa varten ovat kokonaisuudes-
saan seuraavat:
— kolonnin lämpötila: ohjelmoitu 150 ºC:n ja 230 ºC:n välille (esimer-
kiksi 165 ºC 15 minuutin ajan, minkä jälkeen lämpötilaa nostetaan
5 ºC minuutissa, kunnes lämpötila on 200 ºC),
— injektorin lämpötila: 250 ºC, jos käytetään jakajainjektorijärjes-
telmää, tai sama kuin kolonnin alkulämpötila, jos käytetään on
column -järjestelmää.
— detektorin lämpötila: 260 ºC,
— kantajakaasun (heliumia ja vetyä) virtausnopeus: 1,2 ml/min.
Ruiskutetun määrän on oltava sellainen, että käytetyissä herkkyysolo-
suhteissa arakidonihapon metyyliesteriä vastaavan piikin korkeus on
vähintään 20 % asteikon alarajasta.
6.4 Eri metyyliesterit tunnistetaan retentioaikojen perusteella: metyyliester-
eiden retentioaikoja verrataan vertailuseosten vastaaviin retentioaikoihin
(kuten 2.3 kohdassa esitetään).
”Trans”-rasvahappojen esterit eluoidaan ennen vastaavia ”cis”-
isomeerejä. Kuvassa 2 on esimerkki kromatogrammista.
Kuva 2
Kaasukromatogrammi, joka kuvaa rasvahappojen trans-isomeerien määritystä
kapillaarikolonnin avulla
6.5 Kolonnin 4.1.2 kohdan mukaisesti määritetyn tehokkuuden on oltava
sellainen, että se sallii tiettyjen kriittisten parien erottamisen, esimerkiksi
parin, joka muodostuu oleiinihapon piikistä ja transoleiinihappojen
massiivista, trans C 18:1/cis C 18:1, siten, että resoluutioluku on suur-
empikui n 2.
6.6 Eri ”trans”-rasvahappojen prosenttiosuus lasketaan niihin liittyvän piikin
pinta-alan ja kaikkien mukana olevien piikkien yhteenlasketun pinta-
alan välisen suhteen perusteella.
Seuraavien rasvahappojen prosenttiosuudet on otettava huomioon:
— 18-atomiset ”trans”-hapot (T 18:1), jotka sisältyvät tämän asetuksen
liitteessä I transoleiini-isomeerien yhteismäärään,
— oktadekadieeniset ”cis-trans”- ja ”trans-cis” -hapot [(CT/TC) 18:2],
jotka sisältyvät tämän asetuksen liitteessä I translinoli-isomeerien
yhteismäärään.
— oktadekatrieeniset ”trans-cis-trans”-, ”cis-cis-trans”-, ”cis-trans-cis-”
ja ”trans-cis-cis” -hapot [(TCT + CCT + CTC + TCC) 18:3], jotka
sisältyvät tämän asetuksen liitteessä I translinoleeni-isomeerien
yhteismäärään.
Huom. 8: Tämän menetelmän erityisominaisuudet huomioon ottaen
tulokset annetaan kahden desimaalin tarkkuudella.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 48
▼B
►M27◄ERIKOISTAPAUS — KATAROMETRIDETEKTORIN KÄYTTÖ
(PERUSTUU LÄMMÖNJOHTOKYVYN MUUTOKSIIN)
Rasvahappojen metyyliestereiden seoksen kvantitatiiviseen ja kvalitatii-
viseen määritykseen voidaan käyttää myös kaasukromatografia, jonka
detektorin toiminta perustuu lämmönjohtokyvyn muutoksiin (kataro-
metri). Sellaista käytettäessä on 3 ja 4 kohdassa kuvattuja olosuhteita
muutettava taulukossa 3 esitetyllä tavalla.
Kvantitatiivista määritystä varten käytetään 5.2.2.2 kohdan mukaisia
korjauskertoimia.
Taulukko 3
Muuttuja Arvo taivaati mus
KolonniPi tuus: 2—4 m
Sisähalkaisija: 4 mm
Tukiaine Raekoko 160—200 mm
Stationäärifaasin määrä 15—25 % (m/m)
Kantajakaasu Helium tai vety, mahdollisimman
vähän happea
Apukaasut Eikäytetä
Injektorin lämpötila 40—60 ºC korkeampi kuin
kolonnin
Kolonnin lämpötila 180—200 ºC
Kantajakaasun virtausnopeus Tavallisesti 60—80 ml/min
Injektoitu määrä Tavallisesti 0,5—2 µl
►M28◄KOESELOSTE
Koeselosteessa on ilmoitettava metyyliestereiden valmistusmenetelmät,
käytetty kaasukromatografinen menetelmä sekä saadut tulokset. Siinä
on myös mainittava kaikki menettelylliset yksityiskohdat, joista ei
määrätä tässä kansainvälisessä standardissa, tai joita pidetään valinnai-
sina, sekä kaikki tapahtumat, jotka ovat voineet vaikuttaa tuloksiin.
Koeselosteessa on oltava kaikki tarpeelliset tiedot, jotka tarvitaan
näytteen täydelliseen tunnistamiseen.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 49
▼B
LIITE X B
RASVAHAPPOJEN METYYLIESTEREIDEN VALMISTAMINEN
ASETUKSEN (ETY) N:O 72/77 LIITTEESSÄ VI OLEVASSA I JA II
KOHDASSA TAI TÄSSÄ KUVATULLA VAIHTOEHTOISELLA MENE-
TELMÄLLÄ
JOHDANTO
Menetelmän valinta riippuu rasvahappokoostumuksesta, tutkittavan rasvan
tai öljyn happamuudesta sekä suoritettavasta kaasukromatografisestamäärityksestä.
Täsmennyksiä:
— rasvoille ja öljyille, joiden rasvahapoissa on vähemmän kuin 12 hiilia-
tomia, soveltuvat ainoastaan menetelmät, joissa käytetään ilmatiiviisti
suljettua pulloa tai dimetyylisulfaattia,
— rasvoille ja öljyille, joiden happamuus on yli 3 %, soveltuvat ainoastaan
menetelmät, joissa käytetään metanolia, suolahappoa tai dimetyylisul-
faattia,
— trans-isomeerien kaasukromatografisiin määrityksiin soveltuvat
ainoastaan menetelmät, joissa käytetään natriummetylaattia tai dimetyy-
lisulfaattia,
— kun valmistetaan metyyliestereitä pienistä määristä rasvoja tai öljyjä,
jotka on eroteltu ohutkerroskromatografialla, on käytettävä metanoli-
heksaani-rikkihappomenetelmää.
Saippuoitumattomat osat voidaan jättää huomiotta, ellei niitä ole yli 3 %;
muussa tapauksessa metyyliesterit on valmistettava rasvahapoista.
1 TARKOITUS
Seuraavassa kuvataan viisi menetelmää rasvojen ja öljyjen metyyliester-
eiden valmistamiseksi:
a) natriummetylaatilla;
b) suljetussa pullossa natriummetylaatilla;
c) suljetussa pullossa vetykloridin metanoliliuoksella;
d) dimetyylisulfaatilla;
e) metanolilla, heksaanilla ja rikkihapolla.
Menetelmä A
2 PERIAATE
Määritettävää rasvaa tai öljyä kuumennetaan metanolissa ja natriummetylaa-
tissa käyttäen palautusjäähdytintä. Saadut metyyliesterit uutetaan
etyylieetterillä.
3 VÄLINEISTÖ
3.1 100 ml:n pullo ja palautusjäähdytin, jonka päähän on liitetty natronkalkki-
putki; lasihiokset.
3.2 50 ml:n mittakoeputkia.3.3 5 ml:n mittapipetti, jakoväli 0,1 ml.
3.4 250 ml:n erotussuppiloita.
3.5 200 ml:n pullo.
4 REAGENSSIT
4.1 Vedetön metanoli.
4.2 Natriummetylaatin noin 1-prosenttinen metanoliliuos; valmistetaan liuotta-
malla 0,34 g metallista natriumia 100 ml:aan vedetöntä metanolia.
4.3 Etyylieetteri.4.4 10-prosenttinen natriumkloridiliuos.
4.5 40—60 ºC:n lämpöistä petrolieetteriä.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 50
▼B
5 SUORITUS
5.1 Ennalta natriumsulfaatilla kuivattua ja suodatettua rasvaa tai öljyä punnitaan
2 g 100 ml:n pulloon. Lisätään 35 ml metanolia, asennetaan jäähdytin ja
keitetään muutama minuutti käyttäen palautusjäähdytintä.
5.2 Lämmittäminen lopetetaan, jäähdytin poistetaan ja lisätään nopeasti 3,5 ml
natriummetylaattiliuosta; asennetaan jäähdytin taas paikalleen ja keitetään
palautusjäähdytintä käyttäen vähintään kolme tuntia. Metylaatio on täydel-
linen, kun kaikki rasva on sulanut liuokseen ja reaktioseos on aivan kirkas
huoneenlämmössä.
5.3 Jäähdytetään ja kaadetaan seos 250 ml:n erotussuppiloon, lisätään 35—40 ml
etyylieetteriä, 100 ml vettä ja 5—6 ml 10-prosenttista natriumkloridiliuosta.
Ravistetaan ja annetaan kerrosten erottua; siirretään vesifaasi toiseen erotus-
suppiloon ja uutetaan uudelleen 25 ml:lla etyylieetteriä.
Eetteriuutteet yhdistetään ja lisätään 50 ml petrolieetteriä, jonka lämpötila
on 40—60 ºC; vesi erottuu ja voidaan poistaa.
Eetterifaasi pestään kolme kertaa 10—15 ml:n vesierillä, kuivataan natrium-
sulfaatilla, suodatetaan paperin läpi ja kerätään suodos 200 ml:n pulloon.
Liuotin haihdutetaan pois vesihauteessa puhtaassa typpivirrassa.
Menetelmä B
2 PERIAATE
Määritettävä rasva tai öljy käsitellään suljetussa pullossa natriummetylaatin
metanoliliuoksessa 85—90 ºC:ssa.
3 VÄLINEISTÖ
3.1 Vahvaseinäinen lasipullo, tilavuus noin 5 ml (korkeus 40—45 mm, halkai-
sija 14—16 mm).
3.2 1 ml:n mittapipetti, jakoväli 0,1 ml.
4 REAGENSSIT
4.1 Natriummetylaatin noin 1,5-prosenttinen metanoliliuos. Valmistetaan liuot-
tamalla 0,50 g metallista natriumia 100 ml:aan vedetöntä metanolia.
5 SUORITUS
5.1 Ennalta natriumsulfaatilla kuivattua ja suodatettua rasvaa tai öljyä punnitaan
2 g lasipulloon. Lisätään 0,3 g (noin 0,4 ml) natriummetylaattiliuosta, minkä
jälkeen pullo suljetaan sulattamalla se liekissä.
5.2 Pulloa kuumennetaan vesihauteessa pinnan alla kaksi tuntia 85—90 ºC:ssa
ja ravistetaan silloin tällöin; esteröityminen on täydellinen, kun pullon
sisältö on kirkas sen jälkeen kun glyseriini ja reagenssien jäännökset ovat
laskeutuneet.
5.3 Jäähdytetään huoneenlämmössä. Pullo avataan vasta, kun metyyliestereitä
aiotaan käyttää. Niitä ei tarvitse käsitellä muulla tavoin ennen kaasukroma-
tografialaitteistoon saattamista.
Menetelmä C
2 PERIAATE
Määritettävä rasva tai öljy käsitellään suljetussa pullossa metanolilla ja
suolahapolla 100 ºC:ssa.
3 VÄLINEISTÖ
3.1 Vahvaseinäinen lasipullo, jonka tilavuus on noin 5 ml (korkeus 40—45 mm,
halkaisija 14—16 mm).
3.2 1 ml:n ja 2 ml:n mittapipetit.
4 REAGENSSIT
4.1 Vetykloridin 2-prosenttinen metanoliliuos. Valmistetaan vetykloridikaasusta
ja vedettömästä metanolista (Huom. 1).
4.2 Heksaania kaasukromatografiaa varten.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 51
▼B
5 SUORITUS
5.1 Ennalta natriumsulfaatilla kuivattua ja suodatettua rasvaa tai öljyä punnitaan
0,2 g lasipulloon ja lisätään 2 ml vetykloridin metanoliliuosta. Pullo sulje-
taan liekillä.
5.2 Pulloa kuumennetaan vesihauteessa pinnan alla 40 minuuttia 100 ºC:ssa.5.3 Pullo jäähdytetään juoksevalla vedellä, avataan, lisätään 2 ml tislattua vettä
ja 1 ml heksaania. Sentrifugoidaan ja poistetaan heksaanifaasi, joka on
valmis käytettäväksi.
Menetelmä D
2 PERIAATE
Määritettävä rasva tai öljy saippuoidaan kaliumhydroksidin metanoliliuok-
sella ja käsitellään sitten dimetyylisulfaatilla. Kun lisätään suolahappoa,
muodostuneet metyyliesterit erottuvat heti. Kun niitä käsitellään alumiiniok-
sidilla sen jälkeen, saadaan erittäin puhtaita metyyliestereitä.
3 VÄLINEISTÖ
3.1 Vahvaseinäinen lasinen koeputki, tilavuus noin 20 ml, hiottu lasitulppa 10/
19 ja varmuussalpa.
3.2 Viisipalloisia palautusjäähdyttimiä, 10/19 hiosliitäntä.3.3 Lasisuodattimia, joissa sintrattu levy, G 2 -kokoa, halkaisija 20 mm.3.4 Kartiopohjaisia lasisia koeputkia, tilavuus noin 10 ml.3.5 1 ml:n ja 5 ml:n ruiskut.
4 REAGENSSIT
4.1 Kaliumhydroksidin 10-prosenttinen metanoliliuos kaasukromatografiaa
varten.
4.2 Vihreän bromokresoli-indikaattorin 0,05-prosenttinen metanoliliuos.
4.3 Dimetyylisulfaatti (15 ºC:ssa d = 1,335).4.4 Väkevää suolahappoa (d = 1,19), laimennettu 1:1 kaasukromatografiaan
tarkoitetulla metanolilla.
4.5 Brockmannin standardoitua alumiinioksidia adsorptiokromatografiaa varten.
5 SUORITUS
5.1 Natriumsulfaatilla kuivattua ja suodatettua rasvaa tai öljyä mitataan 2,2 ml
20 ml:n koeputkeen. Lisätään 5 ml kaliumhydroksidiliuosta ja pari kvart-
sikiveä kiehumisen hillitsemiseksi. Asennetaan palautusjäähdytin ja
kuumennetaan pienellä liekillä viisi minuuttia ravistellen; saippuoituminen
on täydellinen, kun liuos on kirkas. Jäähdytetään lopuksi juoksevalla vedellä
ja irrotetaan jäähdytin.
5.2 Lisätään kaksi tippaa indikaattoria ja hitaasti, käyttäen ruiskua, 1 ml dime-
tyylisulfaattia. Koeputki suljetaan ilmatiiviisti ja ravistetaan 2—3 minuuttia
upottaen usein putken pohja kiehuvaan vesihauteeseen; reaktio on täydel-
linen, kun indikaattorin väri muuttuu sinisestä keltaiseksi. Koeputki
jäähdytetään lopuksijuoksevalla vedellä, avataan ja li sätään 5 ml suola-
hapon metanoliliuosta.
5.3 Ravistellaan muutama sekunti, minkä jälkeen putkea pidetään kaltevassa
asennossa ja koputetaan sitä kevyesti. Tällöin metyyliesterit nousevat help-
ommin pintaan öljymäiseksi kerrokseksi (Huom. A).
Metyyliesterit imetään ruiskulla, pannaan alaspäin suippenevaan
koeputkeen, lisätään alumiinioksidia noin 1/4 metyyliesterien tilavuudesta,
ravistetaan ja suodatetaan paperin läpi.
Huom. A Jos metyyliesterit eivät erotu itsestään, koeputkeen lisätään 5 ml
vettä ja ravistetaan.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 52
▼B
Menetelmä E
2 PERIAATE
Määritettävää rasvaa tai öljyä kuumennetaan palautusjäähdyttimellä varuste-
tussa koeputkessa metanolin, heksaanin ja rikkihapon kanssa. Syntyneet
metyyliesterit uutetaan petrolieetterillä.
3 VÄLINEISTÖ
3.1 Tilavuudeltaan noin 20 ml:n koeputki, varustettuna noin 1 m:n pituisella
ilmapalautusjäähdyttimellä, jossa on lasihiokset.
3.2 Mittapipetti, 5 ml.3.3 Erotussuppilo, 50 ml.
3.4 Mittalaseja, 10 ml ja 25 ml.
3.5 Kartiopohjainen koeputki, 15 ml.
4 REAGENSSIT
4.1 Metylointireagenssi: vedettömän metanolin, heksaanin ja väkevän rikki-
hapon (d = 1,84) seos 75:25:1 (v/v/v).
4.2 Petrolieetteri, lämpötila 40—60 ºC.
4.3 Vedetön natriumsulfaatti.
5 SUORITUS
5.1 Levyltä raaputettu aines pannaan 20 ml:n koeputkeen ja lisätään 5 ml mety-
lointireagenssia.
5.2 Palautusjäähdytin asennetaan paikoilleen ja koeputkea kuumennetaan 30
minuuttia kiehuvassa vesihauteessa (Huom. 2).
5.3 Seos siirretään 50 ml:n erotussuppiloon käyttäen 10 ml tislattua vettä ja
10 ml petrolieetteriä. Ravistetaan voimakkaasti, annetaan faasien erottua,
poistetaan vesikerros ja pestään eetterikerros kahdesti 20 ml:lla tislattua
vettä. Erotussuppiloon lisätään pieni määrä vedetöntä natriumsulfaattia,
ravistetaan, annetaan laskeutua muutama minuutti ja suodatetaan. Suodos
kerätään 15 ml:n kartiopohjaiseen koeputkeen.
Liuotin haihdutetaan vesihauteessa typpivirrassa.
Huom. 1 Pieniä määriä vetykloridikaasua voidaan helposti valmistaa labor-
atoriossa lisäämällä kaupalliseen suolahappoon (r = 1,18)
muutama tippa väkevää rikkihappoa (r = 1,84). Vapautuva kaasu
on helppo kuivata johtamalla se kuplina väkevän rikkihapon läpi.
Metanoli absorboi vetykloridihappoa hyvin nopeasti, minkä vuoksi
se on liuotettava varovasti, esimerkiksi johtamalla kaasu pieneen,
ylösalaisin olevaan pulloon, jonka suu koskettaa nestepintaa.
Vetykloridin metanoliliuosta voidaan valmistaa suuria määriä
etukäteen, sillä se säilyy pimeässä erittäin hyvin lasitulpallisissa
pulloissa.
Huom. 2 Kiehumisen hillitsemiseksi koeputkeen asetetaan lasisauva ja
estetään vesihauteen lämpötilaa nousemasta yli 90 ºC:n.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 53
▼B
LIITE XI
HAIHTUVIEN HALOGEENILIUOTTIMIEN PITOISUUDEN
MÄÄRITTÄMINEN OLIIVIÖLJYSTÄ
1 PERIAATE
Kaasukromatografinen määritys kaasutilatekniikalla (head space) .
2 VÄLINEISTÖ
2.1 Kaasukromatografialaitteisto, johon kuuluu elektroninkaappausdetektori
(ECD).
2.2 Kaasutilalaitteisto (head space) .
2.3 Kaasukromatografiakolonni, lasinen, pituus 2 m, halkaisija 2 mm, stationää-
rifaasi.
OV101 10 % tai vastaava, kalsinoituun, happopestyyn ja silanoituun
piimaahan imeytettynä, hiukkaskoko 80—100 mesh.
2.4 Kantaja- ja apukaasu: kaasukromatografiaan tarkoitettua typpeä, joka
soveltuu elektroninkaappausdetektorille.
2.5 Teflonpinnoitteisia lasipulloja, 10—15 ml, varustettu alumiinitulpalla, jossa
on sovitus näytteenottoruiskua varten.
2.6 Ilmatiiviisti sulkevat puristimet2.7 Kaasuruisku, 0,5—2 ml.
3 REAGENSSIT
Standardi: kaasukromatografista laatua olevia haihtuvia halogeeniliuottimia.
4 SUORITUS
4.1 Punnitaan tarkasti noin 3 g öljyä lasipulloon, jota ei enää käytetä uudestaan;
suljetaan se ilmatiiviisti. Pullo asetetaan termostaattiin 70 ºC:seen yhdeksi
tunniksi. Imetään ruiskulla varovasti 0,2—0,5 ml kaasutilaa. Injektoidaan
tämä näyte kaasukromatografialaitteiston kolonniin, joka on säädetty seuraa-
vasti:
— injektorin lämpötila: 150 ºC,
— kolonnin lämpötila: 70—80 ºC,— detektorin lämpötila: 200—250 ºC.
4.2 Vertailuliuokset. Valmistetaan standardiliuoksia puhdistetusta oliiviöljystä,
jossa ei ole lainkaan liuottimia, pitoisuudeltaan 0,05 — 1 ppm (mg/kg),
jotka vastaavat näytteen oletettua pitoisuutta. Halogeeniliuottimia voidaan
tarvittaessa laimentaa pentaanilla.
4.3 Kvantitatiivinen määritys. Verrataan toisiinsa näytteen piikkien korkeuksia
tai pinta-aloja sekä sen standardiliuoksen piikkien korkeuksia ja pinta-aloja,
jonka pitoisuuden oletetaan olevan lähinnä näytteen pitoisuutta. Jos suhteel-
linen poikkeama on suurempi kuin 10 %, määritys on tehtävä uudestaankäyttämällä eri standardiliuosta, kunnes suhteellinen poikkeama on alle
10 %. Määrä lasketaan yksittäisten injektioiden keskiarvon perusteella.
4.4 Tulosten esittäminen: ppm (mg/kg). Toteamisraja tässä menetelmässä on
0,01 mg/kg.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 54
▼B
LIITE XII
NEITSYTOLIIVIÖLJYN AISTINVARAINEN ARVIOINTI
1 TARKOITUS
Tämän menetelmän tarkoituksena on vahvistaa neitsytoliiviöljyn makuo-
minaisuuksien arviointiperusteet sekä kehittää siihen tarvittavia
menetelmiä.
2 SOVELTAMISALA
Tässä kuvattu menetelmä soveltuu ainoastaan suoraan kulutukseen tarkoi-
tetun neitsytoliiviöljyn aistinvaraiseen arviointiin ja luokitteluun. Se
luokittelee neitsytöljyn numeerisella asteikolla, joka on suhteessa sen
maun aikaansaamaan aistihavaintoon, valikoitujen maistajien muodos-
taman raadin arvion mukaan.
3 AISTINVARAISEN ARVIOINNIN PERUSSANASTO
Ks. luku ”Aistinvarainen arviointi: yleinen perussanasto”.
4 OLIIVIÖLJYN ERIKOISSANASTOA
4.1 Miellyttävät aistimukset, jotka syntyvät neitsytoliiviöljyn tyypillisistä
laatuominaisuuksista:
Hedelmäinen: maku, joka muistuttaa hyvälaatuisten, tuoreiden ja sopivan
kypsinä poimittujen hedelmien makua ja tuoksua samalla kertaa.
Kypsän hedelmäinen: oliiviöljyn maku, kun se on valmistettu kypsistä
oliiveista; yleensä melko mieto tuoksu ja makea maku.
Vihreän hedelmäinen: oliiviöljyn maku, kun se on valmistettu vielä
vihreistä hedelmistä.
4.2 Aistimukset, jotka voivat olla jossain määrin miellyttäviä riippuen maun
voimakkuudesta ja joita ei voi pitää virheellisinä mutta jotka kuitenkin
rikkovat maun hedelmäisyyden kokonaisvaikutelmaa:
Omena: oliiviöljyn maku, joka muistuttaa omenaa.
Makea: miellyttävä maku, ei selvästi sokerinen; karvaat, suutasupistavat ja
pistävät maut eivät ole hallitsevia.
Ruohomainen: joidenkin öljyjen tyypillinen maku, joka muistuttaa juuri
leikatun ruohon hajua.
Vihreät lehdet (karvas): öljyn maku, joka johtuu liian vihreistä oliiveista
tai siitä, että oliivien mukana on murskattu lehtiä ja oksia.
Kirpeä: vihreiden tai vielä kypsyvien oliivien öljylle antama maku. Voi
olla miellyttävä tai epämiellyttävä, maun voimakkuuden mukaan.
Jumoava: joidenkin öljyjen aiheuttama jumoava, suutasupistava limakal-
voaistimus.
Pistävä: pistelevä makuaistimus, joka on tyypillinen satovuoden alussa,
pääasiassa vielä vihreistä oliiveista valmistetuille oliiviöljyille. Aistimus
johtuu fenolien vaikutuksesta kolmoishermon päihin, jotka ulottuvat koko
suuontelon alueelle.
Manteli: tämä maku saattaa esiintyä kahdessa muodossa: tuoreiden mante-
lien tyypillisenä makuna tai hyvälaatuisten kuivattujen mantelien
tyypillisenä makuna, jota voi erehtyä luulemaan alkavaksi eltaantumiseksi.
Maku huomataan selvästi erikoisena jälkimakuna, kun öljy jää kosketuk-
siin kielen ja kitalaen kanssa. Maku yhdistetään makeisiin,
miedontuoksuisiin öljyihin.
Lattea tai pehmeä: oliiviöljyn aistinvaraiset ominaisuudet ovat tuskin
havaittavia niiden aromaattisten aineiden haihtumisen vuoksi.
Heinä: joidenkin öljyjen maku muistuttaa kuivaa heinää.
4.3 Aistimukset, jotka ovat aina epämiellyttäviä, vaikka maku olisi voimak-
kuudeltaan tuskin havaittava, ja joita on pidettävä aistinvaraisina virheinä:
Espartoheinä: uusien espartomattojen läpi puristetun öljyn maku. Maku
vaihtelee sen mukaan, onko mattojen esparto vihreää vai kuivattua.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 55
▼M3
▼M3
Maa: maahanpudonneiden, mutaisten ja pesemättömien oliivien öljylle
antama maku. Joskus siihen liittyy homeinen maku.
Vanha tai sulkeutunut: tyypillinen maku, joka syntyy kun öljyä säilytetään
liian kauan varastointiastioissa. Maku voi syntyä myös öljyyn, joka on
liian kauan pakattuna.
Toukkainen: tyypillinen öljylle, joka on saatu oliivikärpäsen (Dacus oleae)
toukkien pilaamista oliiveista.
Metallinen: maku, joka muistuttaa metallia. Tyypillinen öljyille, jotka ovat
joutuneet pitkäaikaiseen kosketukseen metallipintojen tai muiden elintar-vikkeiden kanssa epäsuotuisissa olosuhteissa murskauksen, sekoituksen,
puristuksen tai varastoinnin aikana.
Homeinen, kostea: tyypillinen öljylle, joka on saatu oliiveista, joita on
säilytetty monta päivää kosteissa olosuhteissa kasoissa, jolloin niihin on
päässyt kasvamaan sienirihmastoa ja hometta.
Eltaantunut: kaikille öljyille ja rasvoille tyypillinen ja yhteinen maku,
joka syntyy kun ne hapettuvat ollessaan kauan kosketuksissa ilman kanssa.
Maku on epämiellyttävä eikä sitä voi korjata.
Tunkkainen: oliiviöljylle tyypillinen maku, kun öljy on saatu kasoina
varastoiduista oliiveista, joissa käyminen on edistynyt pitkälle.
Suolavesi: suolaliemessä säilötyistä oliiveista puristetun öljyn maku.
Puristusjäte: maku, joka muistuttaa oliivin puristusjätettä.
Saippuainen: haju-ja makuaistimus, joka muistuttaa vihersaippuaa.
Kasvisneste: maku, joka syntyy kun öljy on huonostidekantoi tu ja ollut
kauan kosketuksissa kasvisnesteen kanssa.
Viinimäinen-etikkainen: joidenkin öljyjen maku muistuttaa viiniä tai
etikkaa. Maku johtuu pääasiassa etikkahapon, etyyliasetaatin ja etanolin
epätavallisen runsaasta muodostumisesta ja sekoittumisesta oliiviöljyn
aromiin.
Kurkku: maku, joka syntyy, kun öljyä säilytetään ilmatiiviissä peltias-
tioissa liian kauan. Maku johtuu 2,6-nonadienaalin muodostumisesta.
Paistunut tai palanut: öljyjen maku, joka johtuu liiallisesta kuumentami-
sesta valmistuksen aikana, varsinkin kun tahnaa sekoitetaan ja
kuumennetaan samanaikaisesti ja se tehdään sopimattomissa olosuhteissa.
Sakkainen: tyypillinen maku öljylle, joka on saatu dekantoimalla maana-
laisten sammioiden pohjasakasta.
Puristusmatto: maku, joka johtuu siitä, että öljy on puristettu puhdistamat-
toman maton läpi, johon on jäänyt käynyttä jätettä.
Rasvainen: oliiviöljyn haju, joka johtuu tehtaalla puristus-tai uuttolaitteista
öljyyn joutuneesta petrolista, rasvasta ja mineraaliöljystä.
Karkea: öljyä maistettaessa suuhun jää paksu, tahmea tuntu.
5 LASI ÖLJYN MAISTAMISTA VARTEN
Ks. luku ”Lasi öljyn maistamista varten”.
6 MAISTAMISHUONE
Ks. luku ”Maistamishuoneen suunnittelu”.
7 VÄLINEISTÖ
Seuraavien välineiden, joita maistaja tarvitsee voidakseen suoriutua
tehtävästään, on oltava jokaisessa arvostelukopissa käden ulottuvilla:
— laseja (standardoituja), joissa on näytteet merkittynä tunnuksella, joka
koostuu kahdesta satunnaisesta numerosta tai numeroista ja kirjaimista.
Merkinnät on tehtävä hajuttomalla kynällä ja niiden on oltava pysyviä,
— lasien kansiksi kellolaseja, joissa on samat tunnukset,
— arviointilomake (ks. kuva 2) käyttöohjeineen,
— lyijykynä tai kuulakärkikynä,
— pieniä tarjottimia, joilla omenalohkoja,
— lasillinen huoneenlämpöistä vettä.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 56
▼B
▼B
8 MENETELMÄ
Tässä luvussa esitetään ne tiedot, jotka maistajalla on oltava, jotta hän voi
suorittaa neitsytoliiviöljyn aistinvaraisen arvostelun ja jotta voitaisiin stan-
dardoida maistajien tehtävät ja toiminta. Heidän on oltava tietoisia
oliiviöljyn maistamisen sekä yleisistä että erityisistä suosituksista.
8.1 Raadin (maistajien ryhmän) kokoajan tai vastuuhenkilön tehtävät
Raadin kokoajalla on oltava vankka koulutus ja asiantuntemus ja hänen on
tunnettava perusteellisesti kaikki käytetyt öljyt. Hän on raadin tärkein
henkilö ja on vastuussa sen järjestämisestä ja toiminnasta. Hänen tulee
kutsua raadin jäsenet kokoon riittävän ajoissa ja hänen on selvitettävä
maistajille heidän tehtävänsä, mutta hän ei saa tuoda esiin mitään näytettä
koskevaa mielipidettä.
Vastuuhenkilön on varmistettava välineiden riittävyys ja puhtaus,
näytteiden valmistelu ja merkintä, sekä tarjottava ne maistajille kokeentoteutussääntöjen edellyttämällä tavalla. Hänen tehtävänään on myös
tietojen keruu ja niiden tilastollinen käsittely niin, että saadaan mahdolli-
simman hyvä tulos pienellä vaivalla.
Raadin vastuuhenkilön on oltava taitava maistaja, tarkka kokeiden valmis-
telujen ja huolellinen kokeiden suoritusten suhteen ja hänen on oltava
taitava ja kärsivällinen kokeiden suunnittelussa ja suorittamisessa. Raadin
vastuuhenkilön tehtävänä on myös luoda jäsenten keskuudessa sellainen
henki, että kaikki kiinnostuvat ja innostuvat maistamisesta sekä haluavat
suoriutua mahdollisimman hyvin. Hänen tulee varmistua siitä, että kukaan
ei tiedä hänen mielipidettään näytteestä, sekä estää ketään raadin jäsentä
vaikuttamasta toisten mielipiteisiin. Hän myös valitsee, kouluttaa ja
valvoo maistajia, jotta näiden soveltuvuus tehtäväänsä säilyy riittävän
hyvänä.
8.2 Koeolosuhteet
8.2.1 Näytemäärä
Jokaisessa näytelasissa tulee olla 15 ml öljyä.
8.2.2 Maistamislämpötila
Öljynäytteiden lämpötilan tulee olla 28 ºC ± 2 ºC. Tämä lämpötila on
valittu siksi, että siinä on helpoin havaita aistinvaraisia eroja normaa-
lilämpötilassa, kun öljyä käytetään ruoan makua parantavana lisänä.
Toinen syy tämän lämpötilan valintaan on, että kylmemmässä öljyn
aromaattiset aineet tuskin pääsevät haihtumaan ja korkeammassa lämpöti-
lassa haihtuu aineita, jotka ovat ominaisia kuumennetulle öljylle.
8.2.3 Kokeen ajankohta
Aamupäivä on parasta aikaa maistaa öljyjä: on todettu, että päivän aikana
on jaksoja, jolloin maku- ja hajuaistimukset havaitaan parhaiten.
Maku- ja hajuherkkyys kohoavat ennen aterioita ja vähenevät aterioiden
jälkeen.
Tätä seikkaa ei saa kuitenkaan korostaa liikaa niin, että maistajat kärsivät
nälän tunteesta, joka häiritsee heitä ja vaikuttaa erottelukykyyn sekä
paremmuus-ja hyväksymiskriteereihin.
9 MAISTAJAT
Henkilöt, joita käytetään oliiviöljyn maistajina aistinvaraisissa kokeissa,
täytyy kouluttaa ja valita sen perusteella, miten hyviä he ovat erottamaan
samantyyppisiä näytteitä toisistaan; on pidettävä mielessä, että maistajan
tarkkuus paranee koulutuksen myötä (ks. asianomainen luku).
Kokeen suorittamiseen vaaditaan 8 — 12 maistajaa, mutta aina olisi
pidettävä varalla muutamia ylimääräisiä, jotka voivat korvata poisjääneet.
9.1 Yleisiä suosituksia maistajille ja ehdokkaille
Nämä suositukset koskevat ehdokkaiden ja maistajien toimintaa heidän
työaikanaan.
Kun raadin vastuuhenkilö pyytää maistajaa osallistumaan aistinvaraiseen
arvosteluun, tämän on saavuttava paikalle sovittuna aikana ja noudatettava
seuraavia ohjeita:
9.1.1 Hän ei saa tupakoida vähintään puoleen tuntiin ennen maistamista.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 57
▼B
9.1.2 Hän ei saa käyttää hajuvettä eikä muita kosmetiikkatuotteita, joiden
tuoksu saattaisi viipyä maistamiseen asti. Hänen on pestävä kätensä hajut-
tomalla tailähes hajuttomalla sai ppualla ja sen jälkeen huuhdeltava ja
kuivattava ne niin monta kertaa kuin on tarpeen kaikkien ylimääräisten
hajujen poistamiseksi.
9.1.3 Hän ei saa syödä mitään ainakaan tuntiin ennen maistamista.
9.1.4 Jos hän tuntee itsensä sairaaksi, varsinkin sellaisella tavalla, joka vaikuttaa
haju- ja makuaistiin, tai jos henkinen paine estää häntä keskittymästä
työhön, maistajan on ilmoitettava tästä raadin vastuuhenkilölle, jotta tämä
voi päättää maistajan osallistumisesta tai muusta suotavasta menettelystä,
ottaen huomioon, että kyseinen maistaja voi poiketa muiden maistajien
keskiarvosta.
9.1.5 Kun edellisten kohtien vaatimukset on täytetty, maistajan on mentävä
hänelle osoitettuun koppiin mahdollisimman rauhallisesti ja hiljaa.
9.1.6 Kun maistaja on istuutunut, hänen tulee tarkastaa, että kaikki tarpeellinen
on hyvin järjestetty ja paikoillaan ja että jokaisen näytelasin tunnus on
sama kuin sitä peittävässä kellolasissa oleva tunnus.
9.1.7 Maistajan on luettava huolellisesti arvostelulomakkeen ohjeet eikä hän saa
alkaa tarkastella näytettä ennen kuin on täysin selvillä siitä, mitä on määrä
tehdä. Jos hän on jostain epävarma, hänen on käännyttävä raadin
järjestäjän puoleen ja keskusteltava tämän kanssa kahden esiin tulleista
ongelmista.
9.1.8 Maistaja ottaa lasin käteensä, kun kansi on vielä paikoillaan, ja kallistaa ja
kiertää sitä niin, että öljy kastelee lasin sisäpintaa mahdollisimman paljon.
Tämän vaiheen jälkeen hän ottaa kannen pois ja haistaa näytettä vetämällä
henkeä tasaisesti, syvään ja hitaasti, kunnes hän on muodostanut
käsityksen tutkittavanaolevasta näytteestä. Haistaminen ei saa kestää yli
30 sekuntia. Ellei hän ole ehtinyt päätyä mihinkään tulokseen tässä ajassa,
hänen on odotettava hetki ennen kuin yrittää uudestaan. Kun haistamiskoe
on suoritettu, voidaan siirtyä maun arviointiin (sisältää haju-, maku- ja
tuntoaistimuksen). Tätä varten maistaja ottaa suuhunsa noin 3 ml öljyä.
On tärkeätä, että öljy leviää kaikkialle suuhun, suun etuosasta ja kielen
kärjestä sivuja pitkin suun takaosaan ja kitapurjeeseen, sillä kitalaen ja
kielen eri osat ovat tunnetusti eri tavoin herkkiä neljälle perusmaulle
makea, suolainen, hapan ja karvas.
On hyvin tärkeää antaa riittävän määrän öljyä levitä hyvin hitaasti kielen
yli kitapurjeeseen ja nieluun saakka, samalla kun maistaja keskittyy
siihen, missä järjestyksessä karvas ja pistävä aistimus tuntuvat; jos näin
ei tehdä, molemmat aistimukset saattavat jäädä huomaamatta joissakin
öljyissä ja toisaalta karvas maku saattaa jäädä pistävän maun peittämäksi.
Lyhyiden, peräkkäisten, suun kautta tapahtuvien sisäänhenkäisyjen avulla
maistaja saa näytteen leviämään kaikkialle suuhun ja voi aistia haihtuvia,
aromaattisia aineita nenän takaosassa.
Suutuntuma-aistimukset on myös otettava huomioon. Juoksevuus, tahmeus
ja terävyys tai pistävyys merkitään havaittaessa muistiin, ja jos kokeeseen
kuuluu näiden ominaisuuksien voimakkuuden arviointi, se tehdään.
9.1.9 Kun neitsytoliiviöljyä arvioidaan aistinvaraisesti, yhdellä maistamisker-
ralla arvioidaan ainoastaan yhtä näytettä, sillä muiden näytteiden välitön
arviointi saattaisi aiheuttaa kontrastivaikutuksen.
Koska peräkkäiset maistamiset aiheuttavat väsymistä ja aistiherkkyys
vähenee, on tärkeää käyttää jotakin tuotetta, joka poistaa öljyn suusta
ennen seuraavaa maistamista.
On suositeltavaa käyttää pientä omenapalaa (noin 15 g), jota pureskellaan
ja joka syljetään sitten sylkykuppiin. Sen jälkeen suu huuhdellaan pienellä
määrällä huoneenlämpöistä vettä. Maistamisten välillä pidetään vähintään
15 minuutin tauko.
9.2 Ehdokkaiden valinta
Valinnan tekee raadin vastuuhenkilö, jonka on henkilökohtaisesti haasta-
teltava ehdokkaita tutustuakseen heihin ja heidän oloihinsa. Maistajien
ruumiillisia ja henkisiä ominaisuuksia koskevat vaatimukset eivät ole
kovinkaan tiukat, sillä periaatteessa kuka tahansa normaali ihminen
soveltuu maistajaksi. Sellaiset tekijät kuin ikä, sukupuoli, tietyt tavat
(esimerkiksi tupakointi) ovat jääneet taka-alalle ja nykyään kiinnitetään
huomiota mm. terveyteen, henkilökohtaiseen kiinnostukseen sekä mahdol-
lisuuteen käyttää aikaa tällaiseen työhön.
Raadin vastuuhenkilön on haastattelun aikana selitettävä ehdokkaalle
tämän tuleva toimenkuva ja kerrottava, kuinka paljon aikaa tehtävä vaatii.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 58
▼B
Sitten hän merkitsee muistiin haastateltavalta saamiaan tietoja siitä, miten
kiinnostunut ja motivoitunut tämä on ja kuinka paljon tällä on tehtävään
aikaa käytettävissä. Seuraavaa kyselylomaketta voidaan käyttää apuna.
Raadin vastuuhenkilö käyttää näin kerättyjä tietoja maistajaehdokkaiden
karsintaan. Ehdokkaat, jotka osoittavat vähäistä kiinnostusta tämänkaltai-
seen työhön, joilla on vain vähän aikaa käytettävissään tai jotka eivät
pysty ilmaisemaan itseään selvästi, karsiutuvat.
9.3 Ryhmän ”keskimääräisen kynnyksen” määrittäminen ”tyypillisille
ominaisuuksille”
Valitaan huolellisesti neljä öljyä, joista jokainen edustaa mahdollisimman
voimakkaasti ja selvästi yhtä seuraavista ominaisuuksista: tunkkainen,
viinimäinen, eltaantunut ja karvas.
Valmistetaan mainituista öljyistä asteittain laimeneva näytesarja käyttäen
laimennukseen soveltuvaa kantaja-ainetta siten, että kunkin näytteen pitoi-
suus on puolet edellisen näytteen pitoisuudesta ja että kahta tai kolmea
laimeinta näytettä ei enää voi erottaa puhtaasta kantaja-aineesta.
Viimeisenä parina on oltava kaksi lasia kantaja-ainetta.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 59
▼B
Sarja täydennetään laseilla, joissa on korkeammat pitoisuudet, kunnes
sarjassa on kahdeksan lasia.
Näytteitä valmistetaan riittävät määrät eri pitoisuuksin siten, että jokaiselle
ehdokkaalle voidaan antaa kutakin ominaisuutta edustava täysi sarja.
”Keskimääräisen kynnyksen” määrittämiseksi jokaista öljyn ominaisuutta
varten annetaan jokaiselle ehdokkaalle yksi lasi, jossa on 15 ml mitä pitoi-
suutta tahansa, ja toinen lasi, jossa on 15 ml pelkkää kantaja-ainetta.
Kokeen jälkeen ehdokkaan on ilmoitettava, ovatko näytteet erilaisia vai
samanlaisia.
Sama koe on toistettava muillakin saman ominaisuuden pitoisuuksilla.
Jokaista pitoisuutta koskevien oikeiden vastausten määrä merkitään muis-
tiin ja ilmoitetaan tämä luku prosentteina kaikista suoritetuista kokeista.
Sitten merkitään havainnot koordinaatistoon siten, että kokeessa käytetyt
pitoisuudet ovat x-akselilla ja oikeiden vastausten prosenttiosuus y-akse-
lilla.
Kuvassa 1 on esimerkki kuvaajasta. Erotuskynnys on se x-akselin piste,
joka vastaa y-akselin (oikeat vastaukset) lukemaa 75 %.
Tämä kynnyspitoisuus voi olla erilainen eri öljyille, koska se riippuu
ominaisuuden voimakkuudesta; erotuskynnyksen on kuitenkin oltava
samanlainen eri raatien ehdokasryhmille, sillä se ei liity mihinkään tapaan
tai makutottumukseen. Tämän vuoksi se on vertailupiste, joka on sama
kaikille normaalien ihmisten ryhmille, ja sitä voidaan käyttää eri raatien
yhtenäistämiseksi niiden haju- ja makuaistiherkkyyden perusteella.
Kun ryhmälle on näin saatu kynnyspitoisuus, tehdään seuraavaa:
Valmistetaan sarja laimennoksia kynnyspitoisuudesta laimeampaan ja
väkevämpään suuntaan niin, että kynnyspitoisuus on kymmenes tällä
asteikolla. Silloin pitoisuudet 11 ja 12 ovat laimeammat ja niistä on siten
hyvin vaikea erottaa mukana olevan tietyn ominaisuuden omaavaa öljyä.
Kun otetaan pitoisuus C10lähtökohdaksi, voidaan muut laimennokset
valmistaa seuraavan kaavan avulla:
C10×an, jossa a on vakio, jonka arvo on 1,5, ja n on eksponentti, jonka
arvo on −2—9.
Esimerkki: oletetaan, että eltaantuneen öljyn erotuskynnys on 0,32; silloin
C10= 0,32 ja a = 1,5, jolloin laimennussarjan pitoisuudet ovat seuraavat:
Näyte 1 2 3 4 56789 1 0 1 1 1 2
Pitoisuus 12,30 8,20 5,47 3,65 2,43 1,62 1,08 0,72 0,48 0,32 0,21 0,14
Kun sama menettely toistetaan muille kolmelle öljyn ominaisuudelle ja
lähtökohdaksi otetaan niille saadut kynnyspitoisuudet, saadaan jokaiselle
öljyn ominaisuudelle samanlainen asteikko, joka vastaa kaikissa laborator-
ioissa samaa ominaisuuden vahvuutta, vaikka lähtöaineena käytettyjen
öljyjen makuvirheet olisivatkin eri vahvuisia.
9.4 Maistajien valinta voimakkuudenarviointimenetelmällä
Valintaan on otettava kaksi tai kolme kertaa enemmän ehdokkaita kuin
maistajia arvioidaan raatiin tarvittavan, jotta voidaan valita ne henkilöt,
joilla on paras herkkyys ja erotuskyky. On suositeltavaa käyttää aina
samaa tuotetta kuin se, jota on myöhemmin tarkoitus maistaa, tässä
tapauksessa oliiviöljyä.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 60
▼B
Kuva 1
Menetelmän valinnassa on kiinnitettävä huomiota menetelmän tehokkuu-
teen ja taloudellisuuteen: käytetyn öljyn määrään, tarvittaviin
näytemääriin ja valintaan kuluvaan aikaan. Valintamenetelmän tehokkuus
riippuu siitä, miten hyvät arvot se tuottaa kaikille kolmelle toisistaan riip-
puvalle tekijälle: a) kustannukset, jotka riippuvat kokeiden määrästä; b)
aiheettomasti hylättyjen pätevien ehdokkaiden suhteellinen osuus; c)
aiheettomasti hyväksyttyjen soveltumattomien ehdokkaiden suhteellinen
osuus;
Voimakkuudenarviointimenetelmä on esitelty ASTM:n (American Society
for Testing and Materials) julkaisussa STP (Special Technical Publication)
No 440, sivu 53. Valintamenetelmää on muutettu neljällä tavalla seuraa-
vasti:
1 sarjan näytemäärää on vähennetty;
2 aistiärsykkeiden valikoimaa on laajennettu tarkoituksena lisätä valinta-
perusteina olevien haju- ja makuvivahteiden määrää niin, että ne
vastaisivat öljyssä tavallisimmin ilmeneviä makuvirheitä;
3 sarjojen pitoisuussuhteita on vaihdeltu;4 tulosten tilastollista käsittelyä on muutettu.
Tarvittavat välineet
— pulloja taikolveja, 1 500 ml,
— tummasta lasista valmistettuja maistamislaseja,
— koeputkia ja mittalaseja 10, 15, 1 000 ja 1 500 ml.
Tarvittavat aineet
— Merck-parafiinia (viite 7 160, DAB 8, USP XX) tai öljyinen
kantaja-aine, joka on mauton ja hajuton (juuri puhdistettua olii-
viöljyä tai vastaavaa öljyä),
— öljyjä: tunkkainen, viinimäinen, eltaantunut ja karvas.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 61
▼B
9.4.1 Suoritus
Laimennosten valmistamisen jälkeen siirrytään valintamenettelyyn 25
ehdokkaan kanssa toistamalla seuraavat vaiheet jokaiselle maulle:
1 Valmistetaan yksi sarja jokaiselle ehdokkaalle, jokaiselle 12 maistami-
slasia, jotka on merkitty tunnuksella. Kaadetaan jokaiseen
maistamislasiin 15 ml jokaista laimennosta, jotka on valmistettu kaavan
C10×anmukaan.
2 Kun näytelasit on täytetty, niiden annetaan olla kannen alla maista-
mishuoneessa huoneenlämmössä 20—22 ºC:ssa vähintään tunti ennen
maistamisen alkamista, jotta öljy saavuttaa huoneen lämpötilan.
3 Kokeen vastuuhenkilö järjestää jokaisen sarjan 12 maistamislasia riviin
vahvimmasta laimeimpaan.
Tämän jälkeen ehdokkaita pyydetään suorittamaan koe yksin seuraavien
ohjeiden mukaan:
9.4.2 Ehdokkaille annettavat ohjeet
Ehdokkaiden edessä olevat 12 lasia sisältävät laimennoksia kustakin
neljästä ominaisuudesta: tunkkainen, viinimäinen, eltaantunut tai karvas.
Lasien sisällöt eroavat toisistaan tietyn tuoksun voimakkuuden perusteella;
voimakkain haju on vasemmanpuolimmaisessa lasissa ja oikealle siirryt-
täessä haju laimenee. Viimeisessä lasissa oikealla on niin heikko haju,
että sen havaitseminen voi olla mahdotonta.
Tee näin: tutustu sarjan jokaisen lasin hajuun. Aloita oikeanpuolimmai-
sesta (N:o 12) ja yritä todeta jokaisen hajun voimakkuus väsyttämättä
itseäsi liikaa.
Kun tunnet tottuneesi eri laseista lähtevien hajujen voimakkuuksien
eroihin, voit poistua huoneesta.
Sillä aikaa kokeen järjestäjä ottaa yhden maistamislasin sarjasta ja asettaa
sen oikeanpuolimmaisen (N:o 12) lasin kohdalle ja siirtää kaikkia muita
laseja niin, että rivi on taas aukoton. Maistaja palaa huoneeseen ja koe
jatkuu.
Koe on seuraavanlainen:
Siirretty lasi on pantava takaisin oikealle paikalleen laimennosten sarjassa.
Sitä varten lasia saa haistella ja verrata sitä kaikkiin muihin näytteisiin
niin monesti kuin on tarpeen. Kun haluat asettaa lasin takaisin oikealle
paikalleen sarjaan, muista, että sen hajun on oltava voimakkaampi kuin
sen oikealla puolella olevan lasin ja heikompi kuin sen vasemmalla
puolella olevan lasin. Tämä koe toistetaan siirtämällä vielä kolme muuta
lasia.
Edellä olevien ohjeiden lisäksi jokaisella maistajalla on oltava seuraavan-
lainen lomake, joka helpottaa kokeen suoritusta ja tulosten keruuta.
9.4.3 Tulosten kokoaminen
Raadin vastuuhenkilö kerää tulokset kaikilta ehdokkailta seuraavaan
taulukkoon helpottaakseen heiltä saatujen tietojen järjestämistä:
1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 62
▼B
9.4.4 Tilastollinen arvostelu
Tässä valintatilanteessa oikeille paikoilleen asetettavat lasit ovat samat
kaikille ehdokkaille. Tätä varten tehtävien tilastollisten laskutoimitusten
mukaan niiden on kuuluttava seuraaville paikoille kunkin ominaisuuden
sarjassa:
Tunkkainen (Tu) Viinimäinen (Vi) Eltaantunut (El) Karvas (Ka)
Lasit N:o Lasit N:o Lasit N:o Lasit N:o
(10, 5, 7, 2) (11, 3, 8, 6) (7, 4, 10, 2) (6, 3, 11, 9)
Lasin paikan sarjassa osoittavia lukuja ei saa muuttaa, sillä tilastollisissa
laskelmissa tätä koetta varten otetaan huomioon todennäköisyys, jolla
ehdokas asettaa lasin oikealle paikalle sattumalta.
Jotta ehdokkaiden olisi mahdollisimman vaikea saada tietoja toisiltaan,
raadin vastuuhenkilön on varmistettava, että:
1 ehdokkaat eivät voi olla yhteydessä keskenään. Eri ehdokkaiden lasien
tunnukset ovat erilaiset;
2 ehdokkaat eivät voi mitenkään saada selville, mitkä lasit on siirretty;
3 vaikka siirrettävät lasit ovat eri ehdokkaille samat, lasien siirtämisjär-
jestys on eri ehdokkaille erilainen.
Jokaisen ehdokkaan suoritus arvostellaan seuraavasti:Olkoon e
i
1,ei
2,…ei
12kaksitoista lasia, joissa on 12 laimennosta ominai-
suudesta i (i voi olla mikä tahansa neljästä ominaisuudesta: tunkkainen,
viinimäinen, eltaantunut ja karvas) heikkenevässä järjestyksessä.
Olkoon ei
kyksi siirretty lasi ja K ′ehdokkaan sille antama paikka sarjassa.
Arvot K ja K ′ovat siis kokonaislukuja 1—12, jotka vastaavat poistetun
lasin todellista paikkaa ja ehdokkaan sille antamaa paikkaa.
Olkoon T (suurin sallittu poikkeama)arvo, joka vahvistetaan etukäteen ja
joka tässä tapauksessa on 3. Jos K ′− K on suurempikui n T, ehdokas
hylätään ilman harkintaa (1).
Jos taas K ′− K on pienempi tai yhtä suuri kuin T, ehdokas hyväksytään ja
hän saa jatkaa kokeita, koska hän on näin osoittanut pystyvänsä sijoitta-
maan tutkittavan ominaisuuden takaisin tarkasti oikealle paikalleen tai
ainakin sitä lähellä oleva paikalle.
Tässä tapauksessa ehdokkaalle, joka on arvostellut yhden tietyn ominai-
suuden (pitoisuuden), esimerkiksi ominaisuudesta tunkkainen (Tu),
annetaan arvosana, joka on lasin oikean paikan ja ehdokkaan sille
antaman paikan erotuksen neliö. Toisin sanoen
Ph(Tu)=( K′−K )2.
Koska jokainen ehdokas suorittaa kokeen neljällä eri pitoisuudella jokaista
ominaisuutta kohti, ominaisuuden (tunkkainen) antama osittainen arvosana
on:
ZTu=PTu
h+PTu
j+PTu
l+PTu
m
Seuraavat esimerkit havainnollistavat menettelyä.
Esimerkki 1:
Oletetaan, että ehdokas A on antanut seuraavat paikkanumerot sarjasta
poistettujen lasien neljälle pitoisuudelle ominaisuudesta i:
Lasin oikea paikka
sarjassa
(K)Ehdokkaan antama
lasin paikka
(K′)Poikkeama oikeasta paikasta
(K′−K )
77 7 − 7 = 0
45 4 − 5 = − 1
10 6 10 − 6 = 4 (1)1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 63
(1) Raadin vastuuhenkilön on ohjattava ehdokasta niin, että koe etenee järkevästi eli ettei
ehdokas menetä herkkyyttään hajuaistin väsymisen takia.
▼B
Lasin oikea paikka
sarjassa
(K)Ehdokkaan antama
lasin paikka
(K′)Poikkeama oikeasta paikasta
(K′−K )
24 2 − 4 = − 2
(1) Tämä ehdokas hylätään tuloksen T 3 perusteella.
Esimerkki 2:
Oletetaan, että toinen ehdokas järjestää lasit tietyn ominaisuuden neljän
eri pitoisuuden suhteen seuraavasti:
Lasin oikea paikka
sarjassa
(K)Ehdokkaan antama
lasin paikka
(K′)Poikkeama oikeasta paikasta
(K′−K )
7 7 7−7=0
4 4 4−4=0
10 7 10 − 7 = 3
2 3 2−3=− 1
Tätä ehdokasta ei hylätä. Hänen tätä ominaisuutta koskevaksi arvosanak-
seen tulee:
Zi=02+02+32+ (−1)2=1 0
Ehdokkaan lopullinen arvosana, jonka perusteella hänet valitaan maista-
jaksi, riippuu kaikille neljälle ominaisuudelle annetuista vastauksista ja
voidaan laskea seuraavasti:
PhTu+PjTu+PlTu+PmTu=ZTu
PhVi+PjVi+PlVi+PmVi=ZVi
PhEl+PjEl+PlEl+PmEl=ZEl
PhKa+PjKa+PlKa+PmKa=ZKa
Z lopullinen = ZTu+…+ ZKa
jossa:
Tu = tunkkainen
Vi = viinimäinen
El = eltaantunut
Ka = karvas
Seuraavaksi on ratkaistava kysymys siitä, kuinka korkea Z-arvo ehdok-
kaalla saa olla, jotta hänen aistiherkkyyttään, hajumuistiaan ja
järjestelmällisyyttään voidaan vielä pitää riittävänä neljän ominaisuuden
osalta. On selvää, että Z on aina ei-negatiivinen luku ja että Z = 0
tarkoittaa, että ehdokas on sijoittanut jokaisen lasin oikealle paikalle ja
siis määrittänyt kaikki 16 voimakkuutta oikein (neljä jokaista ominaisuutta
kohti). Jos Z-arvo ei ole nolla, ehdokas on löytänyt voimakkuuksille
oikean suuruusluokan, mutta ei ole kyennyt sijoittamaan sitä juuri oikealle
paikalle, koska hänen erotuskykynsä on kokeessa käytetyllä asteikolla
riittämätön yhden tai useamman ominaisuuden suhteen.
Tämän vuoksi kriittinen arvo (Z) on syytä asettaa sellaiseksi, että jos
ehdokas olisi sijoittanut lasit sattumalta lähes oikein, todennäköisyys (a)
saada lopulliseksi arvosanaksi Z-arvo, joka on pienempi kuin kriittinen
arvo Zk, on riittävän pieni ja voidaan asettaa etukäteen. Toisin sanoen on
varmistettava, että tätä menetelmää käyttäen todennäköisyys valita raatiin
maistaja, jolla ei ole riittävää kykyä erottaa aistimusten voimakkuutta, on
pienempi kuin α.
Kun α:n arvo on vahvistettu (tässä tapauksessa 0,05), Zosaadaan muut-
tujan Z todennäköisyysjakaumasta, joka taas riippuu muuttujan p (K ′)
todennäköisyysjakaumasta.
Kun tarvittavat tilastolliset laskutoimitukset on tehty, saadaan kriittiseksi
arvoksiZk= 34.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 64
▼B
Kun kaikkien ehdokkaiden Z-arvo on laskettu, ehdokkaat, joiden Z-arvo
on suurempikui n 34, on hylättävä.
Edellisen esimerkin ehdokkaiden A ja B saamat arvosanat olivat seur-
aavat:
Ominaisuus Ehdokas A Ehdokas B
Tunkkainen (Tu) ZTu=1 0 ZTu=1 2
Viinimäinen (Vi) ZVi=1 0 ZVi=1 1
Eltaantunut (El) ZEl=1 0 ZEl=1 5
Karvas (Ka) ZKa=4 ZKa=0
Σ=3 4 Σ=3 8
Koska ehdokkailla on Z-arvot 34 ja 38, ehdokas A hyväksytään ja
ehdokas B hylätään. Kun kaikki ehdokkaat, joiden Z-arvo on yli 34, on
hylätty, asetetaan jäljelle jääneet paremmuusjärjestykseen ja 12 parasta
valitaan.
9.5 Koulutus
Koulutusvaiheen tärkeimmät tavoitteet ovat:
a) tutustuttaa maistajat neitsytoliiviöljyn moniin haju-, maku- ja suutuntu-
maominaisuuksiin;
b) opettaa maistajille aistinvaraisen arvostelun menetelmiä;
c) parantaa maistajien kykyä erottaa, tunnistaa ja arvioida aistinvaraisia
ominaisuuksia;
d) parantaa herkkyyttä ja muistia niin, että arviointien tulos on kaikkien
ominaisuuksien suhteen mahdollisimman tarkka ja yhdenmukainen.
Koulutukseen kuuluu yleensä useampia opetustilaisuuksia maistajien
mahdollisuuksien ja opetettavien asioiden mukaan; tilaisuuksien aikana
maistajat tutustuvat öljyihin itsenäisesti, keskustelevat kohtaamistaan
ongelmista vastuuhenkilön kanssa, sekä keskustelevat arvostelusta, jotta
päästäisiin mahdollisimman yhtenäisiin arvioihin ja mielipiteisiin.
Taso, jolle koulutuksessa päästään tietyn oppituntimäärän jälkeen, arvioi-
daan oikeiden vastausten prosenttiosuuden kasvun avulla — jos halutaan
käyttää karsintakokeita — tai analysoimalla raadin jäsenten arvosanojen
keskiarvon vaihtelua, kun käytetään kokeita, joissa on asteikko.
Koulutusvaiheen käytännön merkityksestä on keskusteltu paljon, mutta
tällä hetkellä sitä pidetään erittäin tehokkaana ja jopa välttämättömänä,
jos halutaan täsmällistä ja oikeaa aistinvaraista tietoa.
9.6 Suorituskyvyn seuranta
Kokeneiden maistajien raadit osallistuvat säännöllisesti maistajaisiin,
joissa aistinvaraiset arvioinnit vaativat heiltä paljon. Monet tärkeät
tekniset ja taloudelliset ratkaisut perustuvat heidän arvioihinsa; tämän
vuoksi valinnan ja koulutuksen jälkeen maistajien suorituksia on seurat-
tava, jotta varmistetaan heidän tulostensa tarkkuus.
Sen jälkeen kun raadit on muodostettu ja ne ovat suoriutuneet rutiiniko-
keista, niiden taso on tarkistettava sopivin ja säännöllisin väliajoin.
10 NEITSYTOLIIVIÖLJYN AISTINVARAISEN ARVIOINNIN MENE-
TELMÄ
Kun edellä esitetyt vaatimukset on täytetty, tarpeelliset tilat ja välineet
ovat käytettävissä ja raati valittu, jokaisen maistajan tulee haistaa ja
maistaa (1) määritettävän öljyn näytettä, joka hänelle maistamislasissa
tarjotaan; maistajan on määritettävä haju-, maku-, suutuntuma- ja kines-
teettiset ominaisuudet ja käytettävä niiden tunnistamisen ja
voimakkuusarvion merkitsemiseen lomaketta, jonka malli on kuvassa 2.
Seuraavana tehtävänä on arvioida öljyn laatu.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 65
(1) Maistaja voi kieltäytyä maistamasta, jos hänen mielestään näytteen hajussa on jokin
erittäin vastenmielinen ominaisuus; tästä poikkeuksellisesta tapahtumasta on tehtävä
merkintä arviointilomakkeeseen.
▼B
10.1 Kuvan 2 mukaisen lomakkeen käyttö (maun kuvaaminen ja laadun
arviointi).
Lomakkeen vasemmalla puolella on lueteltu oliiviöljyissä usein esiintyviä
tyypillisiä aistein havaittavia ominaisuuksia, jotka kuvaavat niiden makua.
Jos maistaja huomaa jonkin aistihavainnon, joka ei vastaa lomakkeessa
mainittuja laatusanoja, hänen tulee tehdä niistä merkintä kohtaan ”muut”
käyttäen mahdollisimman täsmällisesti kuvaavia sanoja.
Havaittavat aistiärsykkeet arvioidaan niiden suhteellisen voimakkuuden
mukaan merkitsemällä + -merki oikeaan sarakkeeseen seuraavien
määreiden mukaan:
1: tuskin havaittava,
2: heikko,
3: kohtalainen,4: voimakas5: erittäin voimakas.
Lomakkeen oikealla puolella on asteikko 1 — 9 (9 tarkoittaa poikkeuksel-
lisen hyvää laatua, 1 on huonoin laatu), johon maistaja merkitsee
kokonaisarvionsa tutkittavan öljyn laadusta yhdellä arvosanalla. Tämän
arvion on oltava sopusoinnussa samassa öljyssä havaittujen hyvien ja
huonojen ominaisuuksien kanssa, joiden arviot on merkitty vasempaan
reunaan.
Ensimmäinen sarake (virheet) on jaettu viiteen osaan. Öljyjen luokittelun
tulee perustua ennen kaikkea näiden makuvirheiden puuttumiseen tai
havaitsemiseen, sekä siihen, kuinka voimakkaita tai heikkoja nämä maku-
virheet ovat. Koska asteikko kuitenkin ulottuu 9 pisteeseen asti, on syytä
ottaa huomioon tiettyjä vivahteita ja ominaisuuksia, jotka on kuvattu
toisessa sarakkeessa (ominaisuudet) ja jotka auttavat pääsemään lopulli-
seen ratkaisuun laadullisessa kokonaisarvioinnissa.
10.2 Lopullinen arviointi
Raadin vastuuhenkilö kerää jokaisen maistajan täyttämät lomakkeet ja
tarkistaa, että aistinvaraiset ominaisuudet ja niistä profiililomakkeessa
annettu voimakkuusarvio ovat sopusoinnussa arviointilomakkeessa
esitetyn arvion kanssa. Jos nämä arviot poikkeavat huomattavasti toisis-
taan, järjestäjä pyytää maistajaa tarkistamaan arviointilomakkeensa.
Maistajan tulee tarvittaessa uusia koe.
Lopuksi raadin vastuuhenkilö tekee taulukon, johon tulevat koko raadin
antamat arvioinnit, ja laskee niiden aritmeettisen keskiarvon ja sen
virheen.
Jos mainittu virhe on menetelmän virhettä suurempi, koe on uusittava
koko ryhmän osalta.
Ainoastaan jos kyse on tarkistusmäärityksestä, ryhmän on toistettava koe
niin monta kertaa, että jokaisesta näytteestä saadaan kolme arviota. Lopul-
linen arvio on näiden arvioiden keskiarvo yhden desimaalin tarkkuudella.
Jos karvauden ja/tai pistävyyden voimakkuusarvioiden keskiarvo on yli
2,5, öljy on merkittävä sen mukaisesti ja arviointeihin on lisättävä, että
öljy on erityisen karvasta ja/tai pistävää.
Tulosten esittäminen: paneelin vastuuhenkilö määrää pisteiden keskiarvon
perusteella luokan, johon näyte luokitellaan liitteessä I määrättyjen raja-
arvojen mukaisesti. Tätä varten paneelin vastuuhenkilö soveltaa:
— markkinointivuoden 1992/93 aikana poikkeamaa + 1,5,
— markkinointivuodesta 1993/94 alkaen poikkeamaa + 1,
jos pisteiden keskiarvo on viisi tai enemmän.
Sallittuja poikkeamia ei kuitenkaan sovelleta öljyihin, joita koskevat inter-
ventioon liittyvät toimenpiteet
Määritystuloksen ja säädetyn raja-arvon välinen tilastollinen ero mene-
telmän toistettavuus- ja uusittavuusarvoissa sisältyy edellä olevissa
alakohdissa tarkoitettuihin sallittuihin poikkeamiin.
Kun asianomainen luokittelee öljyjä edellä mainittuina markkinointivuo-
sina soveltamatta säädettyjä poikkeamarajoja, hän voi merkitä1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 66
▼M12
▼M9
▼M5
▼M5
pakkauksen päälle tuotteen aistinvaraisen vähimmäisarvosanan, jota
voidaan tarkistaa kaupanpitämisajan kuluessa.
Maistajien raadin vastuuhenkilön on merkittävä määrityskertomukseen
ainoastaan luokka, johon näyte on luokiteltu. Kun maistaja suorittaa
kokeen 2 artiklan 2 kohdan ensimmäisen alakohdan mukaisesti, hänen on
sovellettava luokan määrityksessä samaa menettelyä.
Huom.: Näytteet on säilytettävä jääkaapissa kannen alla, kunnes ne on
määritetty, ja ne on pantava takaisin jääkaappiin jokaisen kokeen
jälkeen, kunnes kaikki kolme koetta on tehty.
Kuva 2
Neitsytoliiviöljy
1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 67
▼B
▼M3
▼B
AISTINVARAINEN ARVIOINTI: YLEINEN PERUSSANASTO
1 TARKOITUS
Tämän standardin tarkoitus on koota aistinvaraisessa arvioinnissa käytetyt
yleisimmät sanat ja niiden määritelmät.
2 SANASTO2.1 Yleistä sanastoa
Aistinvarainen arviointi (substantiivi):
tuotteen aistinvaraisten ominaisuuksien tutkiminen aistielinten avulla.
Havainto (substantiivi):
ulkoisten esineiden ja tapahtumien saattaminen tietoisuuteen aistien
avulla.
Aistinvarainen (adjektiivi) (ominaisuus):
kuvailee aistein havaittavaa tuotteen ominaisuutta.
Asiantuntija (substantiivi):
(aistinvaraisten ominaisuuksien tutkimisessa)
maistaja, joka on erikoistunut tietyn tuotteen aistinvaraiseen arviointiin ja
tuntee tuotteen valmistuksen sekä kuluttajien tottumukset.
Maistaja (substantiivi):
havaitsemiskykyinen, herkkä, koulutettu henkilö, joka on valittu arvioi-
maan elintarvikkeen aistein havaittavia ominaisuuksia.
Raati:
ryhmä maistajia, jotka on valittu ja koulutettu ja jotka kokoontuvat suorit-
tamaan tietyn elintarvikkeen aistinvaraista arviointia valvotuissa
olosuhteissa.
Aistimus (substantiivi):
subjektiivinen ilmiö, joka on seuraus aistihermojen ärsytyksestä. Tämän
ilmiön aistielin voi subjektiivisesti erottaa tai objektiivisesti määritellä,
ärsykkeen luonteen tailaadun ja voi makkuuden mukaan.
Herkkyys (substantiivi):
aistielinten kyky määrällisesti tai laadullisesti havaita heikkoja ärsykkeitä
tai pieniä eroja ärsykkeiden välillä.
Maistaminen (substantiivi):
tehtävä, johon kuuluu elintarvikkeen aistinvaraisten ominaisuuksien,
lähinnä hajun, maun, suutuntuman ja kinesteettisten ominaisuuksien
havaitseminen, määritys ja arviointi.
Hyväksyminen (substantiivi):
Yksilön tai ryhmän myönteinen suhtautuminen tuotteeseen.
Sopusointuisuus (substantiivi):
tuotteen ominaisuus, joka tarkoittaa miellyttävää kokonaisaistimusta.
Tämän aistimuksen saa aikaan tuotteen haju-, maku-, suutuntuma-ja kines-
teettisten ärsykkeiden esiintyminen sopivissa voimakkuussuhteissa.
Hyväksyttävyys (substantiivi):
asema, jonka tuote on saavuttanut, kun henkilö tai ryhmä on suhtautunut
myönteisesti sen aistinvaraisiin ominaisuuksiin.
Erottaminen (substantiivi):
kahden tai useamman ärsykkeen laadullinen ja/tai määrällinen erotta-
minen.
Kompensaatio (substantiivi):
ärsykkeiden yhteisvaikutus, jonka tuloksena kukin ärsyke havaitaan
heikompana kuin jos se esiintyisi yksin.
Ulkonäkö (substantiivi):1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 68
▼B
näköaistilla havaittavat aistinvaraiset ominaisuudet: koko, muoto, väri,
rakenne, sameus, kirkkaus, juoksevuus, vaahtoaminen ja kuohunta.
Ominaisuus (substantiivi):
aistein havaittava piirre.
2.2 Fysiologiset termit
Ärsyke (substantiivi):
fysikaalinen tai kemiallinen vaikute, joka saa aikaan tietyn reaktion sisäi-
sissä tai ulkoisissa aistireseptoreissa.
Makuaisti (substantiivi):
Aisti, jonka reseptorit sijaitsevat suussa, erityisesti kielessä; nämä resep-
torit aistivat erilaisia liukoisia aineita.
Maku (substantiivi):
kuvaa tuotteen ominaisuutta, joka ärsyttää makuhermoja saaden aikaan
aistimuksen, joka liittyy yhteen tai useampaan neljästä perusmausta:
makea, suolainen, hapan ja karvas.
Reseptori (substantiivi):
Aistielimen erikoistunutta kudosta, jota voidaan ärsyttää ja joka pystyy
ottamaan ärsykkeen vastaan ja muuttamaan sen hermoimpulssiksi.
Huom.: Reseptorit luokitellaan ärsykkeen energiamuodon perusteella
(valo, lämpö, ääni, ym.).
Hajuaisti (substantiivi):
hajuelinten kyky havaita ja erotella molekyylejä, jotka tulevat nenään
kaasuna ympäristöstä joko suoraan tai epäsuorasti.
Voimakkuus (substantiivi):
ominaisuuden vaikutuksen suuruus, joka voidaan mitata määrällisesti
asteikolla sen mukaan, miten selvästi aistimus ylittää havaintokynnyksen.
Mukautuminen (substantiivi):
ärsykkeen havaitsemisen herkkyyden hetkellinen muutos, joka johtuu
saman tai samantapaisen ärsykkeen jatkuvasta esiintymisestä.
Estyminen (substantiivi):
aistinelimen tai sen osan kyvyttömyys reagoida ärsykkeeseen, joka on
sopiva ja voimakkuudeltaan ärsytyskynnyksen ylittävä.
Vaste, reaktio (substantiivi):
toiminta, joka aistisoluissa tapahtuu, kun yksi tai useampi ärsyke vaikuttaa
siihen.
Vartalo (substantiivi):
suutuntuma, joka kuvailee elintarvikkeen tiheyttä, viskositeettiä, kiinteyttä
ja tiiviyttä.
Tuoksu (substantiivi):
raikas, miellyttävä, herkullinen hajuominaisuus.
Haistaa (verbi):
toiminta, jolla hankitaan hajuhavainto.
Objektiivinen (adjektiivi):
a) kohteen todenmukainen ja todennettavissa oleva tulkinta, jossa inhimil-
listen tekijöiden osuus on mahdollisimman pieni (esim. tottumus, tapa,
mieltymys).
b) kuvailee menetelmää, jossa aistiteknisesti tai laitteiden avulla vähen-
netään itse aiheutettuja virheitä mahdollisimman tehokkaasti.
Huom: Ilmaisua ”instrumentaalinen” ei suositella käytettäväksi syno-
nyyminä.
Subjektiivinen (adjektiivi):
kuvailee mielikuvaa, johon vaikuttavat aistihavainnon lisäksi aistijan
tunteet ja ajatukset.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 69
▼B
Kinesteettinen aistimus:
paineaistimus, joka syntyy, kun näytettä liikutetaan suuontelossa tai
kosketaan sitä sormin (esim. juustopalan puristaminen sormien välissä).
Kynnys (substantiivi):
Absoluuttinen kynnys:
aistiärsykkeen pienin arvo, joka saa aikaan:
— aistihavainnon (ärsytyskynnys tai havaintokynnys), tai
— aistihavainnon tunnistamisen (tunnistamiskynnys).
Erotuskynnys:pienin aistiärsykkeen voimakkuuden muutos, joka voidaan havaita.
Lopullinen kynnys:
ärsykkeen voimakkuus, jonka yläpuolella ei enää havaita voimakkuu-
seroja.
Preferenssikynnys:
pienin mahdollinen kynnyksen ylittävä ärsykkeen voimakkuus, joka
aiheuttaa miellyttävän tai torjuvan reaktion suhteessa neutraaliin ärsykkee-
seen, esimerkiksi jouduttaessa valitsemaan veden ja sokeriliuoksen välillä.
Huom: Absoluuttinen preferenssikynnys on eri asia kuin differentiaalinen
preferenssikynnys.
Kynnyksen alittava (adjektiivi):
absoluuttista kynnysarvoa heikompi.
Kynnyksen ylittävä (adjektiivi):
absoluuttista kynnysarvoa voimakkaampi.Aistiväsymys:
aistien mukautumisen muoto, jossa herkkyys vähenee.
Kompensaatio (substantiivi):
ärsykkeiden yhteisvaikutus, jonka tuloksena kukin ärsyke havaitaan
heikompana kuin jos se esiintyisi yksin.
Synerginen (adjektiivi):
tiettyjen aineiden yhteisvaikutus on suurempi kuin niiden vaikutusten
summa.
Kontrastivaikutus:kahden samanaikaisen tai peräkkäisen ärsykkeen eron herkempi havaitse-
minen.
Konvergenssin vastakohta.Konvergenssivaikutus:
kahden samanaikaisen tai peräkkäisen ärsykkeen eron vaikeampi havaitse-
minen.
Kontrastivaikutuksen vastakohta.
2.3 Aistinvaraisiin ominaisuuksiin liittyviä termejä
Happoinen (adjektiivi):
a) kuvaa useimpien happamien aineiden laimeiden liuosten pääasiallisinta
makua (esim. sitruunahappo, maitohappo, viinihappo);
b) kuvaa sellaisten puhtaiden aineiden tai niiden seosten ominaisuutta,
joissa esiintyy tämä maku.
Vastaava substantiivi on happoisuus.Hapan (adjektiivi):
Kuvaa haju-ja makuaistimusta, joka etupäässä koostuu yleensä käymisessä
syntyneestä haposta, ja elintarvikkeita, jotka aikaansaavat tämän aisti-
muksen.
Jotkin happamuutta aiheuttavat tekijät liittyvät elintarvikkeen käymiseen,
kuten maitohappo- tai etikkahappokäymiseen.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 70
▼B
Karvas (adjektiivi):
a) kuvaa sellaisten aineiden kuten kiniinin, kofeiinin ja tiettyjen alkaloi-
dien laimeiden vesiliuosten perusmakua;
b) kuvaa sellaisten puhtaiden aineiden tai niiden seosten ominaisuutta,
joissa esiintyy tämä maku.
Vastaava substantiivi on karvaus.
Suolainen (adjektiivi):
a) tyypillinen makuaistihavainto, jonka tavallisin aiheuttaja on natriumk-
loridiliuos;
b) kuvaa sellaisten puhtaiden aineiden tai niiden seosten ominaisuutta,
joissa esiintyy tämä maku.
Vastaava substantiivi on suolaisuus.
Makea (adjektiivi):
a) kuvaa aistihavaintoa, jonka pääasiallisin maku tulee sakkaroosin ja
vastaavien aineiden vesiliuoksista;
b) kuvaa sellaisten puhtaiden aineiden tai niiden seosten ominaisuutta,
joissa esiintyy tämä maku.
Vastaava substantiivi on makeus.
Supistava, jumoava (adjektiivi):
a) kuvaa monipuolista suuaistimusta, jonka aiheuttavat tiettyjen tanniinien
(esimerkiksi khakihedelmän ja oratuomen tanniinit) vesiliuokset;
b) kuvaa sellaisten puhtaiden aineiden tai niiden seosten ominaisuutta,
joissa esiintyy tämä maku.
Vastaava substantiivi on supistavuus tai jumoavuus.
Maku (substantiivi):
maku-, haju-, suutuntuma- ja kinesteettisten aistimusten kokonaisuus,
joiden avulla koehenkilö voi tunnistaa elintarvikkeen ja asettaa perusteet,
joiden mukaan tuote koetaan miellyttäväksi tai epämiellyttäväksi.
Maku (substantiivi):
a) aistimus, joka syntyy kun makunystyrä saa ärsykkeen jostain liukoi-
sesta aineesta;
b) aistimuksen ominaisuus, jonka tällaiset aineet saavat aikaan.
Perusmaku (substantiivi):
jokin neljästä tunnetusta perusmausta: makea, suolainen, hapan ja karvas.
Haju (substantiivi):
a) hajuaistin havaitsema aistimusten yhdistelmä, joka on saatu
hengittämällä sisään tiettyjä haihtuvia aineita;
b) aistimuksen ominaisuus, jonka mainitut aineet saavat aikaan.
Aromi (substantiivi):
a) hajuaistielinten epäsuorasti aistima miellyttävä aistimus elintarviketta
maistettaessa;
b) tavallisessa kielenkäytössä ja hajuvesistä puhuttaessa tätä termiä
käytetään joissakin kielissä myös silloin, kun aistimus saadaan suoraan
nenän kautta.
Jälkimaku (substantiivi):
aistimusten yhdistelmä, joka havaitaan sen jälkeen, kun ärsyke on
hävinnyt suusta, ja joka on erilainen kuin aikaisemmat aistimukset.
Aromaattinen (adjektiivi):
a) kuvaa puhtaiden aineiden tai seosten ominaisuutta silloin, kun niitä
maistettaessa syntyy aromiaistimus;
b) kuvaa tuotteita, jotka suoraan hajuaistin avulla tutkittuina ovat hyviltä
ja raikkailta tuoksuvia.
Rakenne (substantiivi):
elintarvikkeen kiinteän tai juoksevan olomuodon ominaisuuksia, joiden
yhdistelmä voi maistamisen yhteydessä olla ärsykkeenä erityisesti suussa
sijaitseville mekaanisille reseptoreille.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 71
▼B
Huom.: Tämä termi viittaa yksinomaan objektiivisiin ominaisuuksiin, ei
aistimuksiin, joiden syntymistä kuvataan yleistermeillä kuten
kiinteys, kuitumaisuus, rasvaisuus jne.
Purskuttaa (verbi):
elintarvikkeen liikuttelu kaikkialla suuontelossa niin, että se joutuu koske-
tuksiin kaikkien aistiherkkien alueiden kanssa, jotta kaikki syntyvät
suuaistimukset havaitaan.
Huom.: Tätä sanastoa voi laajentaa tutkimalla ISO-standardia 5492, osat
I—V ja muita julkaisuja, kuten J. L. Magnenin kirjoittamaa Les
cahiers techniques du Centre national de coordination des études
et recherches sur la nutrition et l'alimentation, jne.
ÖLJYNMAISTAMISLASI
1 TARKOITUS
Tämän standardin tarkoituksena on kuvata ruokaöljyjen aistivaraiseen
määritykseen (haju, maku) tarkoitettujen lasien ominaisuuksia.
Lisäksi kuvataan lämmitysjärjestelmä, joka tarvitaan riittävän lämpötilan
saavuttamiseksi ja ylläpitämiseksi määritystä varten.
2 LASIN KUVAUS
Kuvassa 1 näkyyvät lasin muoto ja mittasuhteet, jotka on suunniteltu niin,
että:
a) lasi on mahdollisimman vakaa, jotta se ei kaatuisi ja öljy läikkyisi;
b) lasin pohja sopii lämmityslaitteen syvennykseen niin, että lasin pohja
lämpenee tasaisesti;
c) lasin suussa on kavennus, jotta hajut keskittyisivät ja niiden tunnista-
minen helpottuisi;
d) lasi on valmistettu tummasta lasista, jotta maistaja ei voi erottaa öljyn
väriä, joka saattaisi vaikuttaa arvosteluun ja haitata määrityksen
puolueettomuutta.
2.1 Mitat
Lasin mitat ovat seuraavat (kuva 1):
— kokonaistilavuus … ............................. 1 3 0 m l ± 1 0 m l ,
— kokonaiskorkeus … ............................. 6 0 m m ± 1 m m ,
— suun halkaisija …. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 mm ± 1 mm,— leveimmän kohdan halkaisija …. . . . . . . . . . . . . . . . 70 mm ± 1 mm,— pohjan halkaisija …. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 mm ± 1 mm,— sivuseinämien paksuus … ....................... 1 , 5m m±0 , 2m m ,
— pohjan paksuus … . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 mm ± 1 mm.
Jokaisella lasilla tulee olla kantena kellolasi, jonka halkaisijan on oltava
noin 10 mm suurempi kuin lasin suun halkaisija. Kannen tarkoitus on
estää aromia haihtumasta pois ja pölyä laskeutumasta lasiin.
2.2 Lasin tekniset ominaisuudet
Lasin on oltava vahvaa, ja väriltään tummaa niin, että sisällön väriä ei voi
erottaa, eikä lasissa saa olla naarmuja tai kuplia.
Reunan on oltava sileä, tasainen ja ulospäin taivutettu.Lasin on oltava lämpökäsitelty niin, että se kestää kokeen aikana esiin-
tyvät lämpötilan muutokset.
2.3 Käyttöohje
Lasit pestään hajuttomalla pesuaineella ja huuhdellaan useaan kertaan,
kunnes pesuaine on saatu kokonaan pois. Lopuksi lasit huuhdellaan tisla-
tulla vedellä, minkä jälkeen lasit saavat valua hetken ja lopuksi ne
kuivataan eksikkaattoriuunissa.
Väkeviä happoja tai kromihappoa sisältäviä seoksia ei saa käyttää.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 72
▼B
Laseja säilytetään uunissa, kunnes niitä tarvitaan, tai kaapissa, jossa ne on
suojattu niin, ettei niihin tartu hajuja.
Ennen käyttöä jokaisen lasin hajuttomuus tarkistetaan haistamalla. Kokee-
seen valmistauduttaessa jokaiseen lasiin merkitään tunnus ja
muistiinpanoihin merkitään jokaista tunnusta vastaava öljy. Ainoastaan
kokeen järjestäjä saa tietää, mitkä tunnukset vastaavat mitäkin öljyjä.
3 NÄYTTEIDEN LÄMMITYSLAITE
Aistinvaraisesti arvosteltavan näytteen on oltava tietyssä lämpötilassa,
joka ruokaöljyille on 28 ± 2 ºC. Tätä varten maistamiskopissa on oltava
lämmityslaite jokaisen maistajan käden ulottuvilla (kuva 2). Se koostuu
alumiinilevystä, joka on vesihauteessa, jonka lämpötila pidetään termos-
taatilla tasaisena. Levyssä on sarja syvennyksiä, joihin lasien pohjat
sopivat. Lämmityslaitteen ja eri levyjen syvennyksissä olevien lasien
öljyn lämpötilaero ei saa olla yli ± 2 ºC.
Kuva 1 - Maistamislasi
(Mitat millimetreinä)1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 73
▼B
Kuva 2 - Näytteiden lämmityslaite (mitat millimetreinä)
MAISTAMISHUONEEN SUUNNITTELU
1 JOHDANTO
Maistamishuoneen tarkoituksena on luoda maistajille sopiva, mukava ja
yhtenäinen ympäristö, joka edistää työskentelyä ja varmistaa sen, että
jokainen koe voidaan toistaa ja uusia samanlaisissa olosuhteissa.
2 TARKOITUS
Tämän standardin tarkoituksena on määrittää vaatimukset, joita on nouda-
tettava maistamishuonetta suunniteltaessa.
3 YLEISIÄ VAATIMUKSIA SUUNNITTELUA JA TOTEUTTAMISTA
VARTEN
Suuruudesta riippumatta (ks. 3.1 kohta) tilojen on oltava seuraavien vaati-
musten mukaiset:1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 74
▼B
Tilojen tulee olla miellyttävät ja sopivasti valaistut (ks. 3.2 kohta), mutta
kuitenkin hillityt. Tämän vuoksi on suotavaa, että seinät ovat vaaleat ja
rauhoittavat, jotta syntyisi vapautunut tunnelma (1).
Tilojen on oltava helposti siivottavat ja mielellään äänieristetyt. Niissä on
oltava hyvä ilmanvaihto eikä niihin saa tulla vieraita hajuja mistään. Jos
sisälämpötila vaihtelee tuntuvasti, huoneen on oltava ilmastoitu, jotta
lämpötila pysyy 20—22 ºC:ssa.
3.1 Tilan tarve
Laboratorioiden ja yritysten tilankäyttö määrää usein maistamistilojen
koon. Tilaa on kuitenkin oltava niin paljon, että saadaan järjestettyä noin
10 koppia maistajille ja paikka, jossa näytteet voidaan valmistaa.
Tätä vähimmäiskokoa suuremmat tilat ovat suotavat, sillä tarvitaan tiloja,
joissa voi pestä näytelaseja, järjestellä elintarvikkeita maistamista varten ja
järjestää avoimia keskustelutilaisuuksia koko raadille.
3.2 Valaistus
Yleisvalaistuksen, päivänvalon tai lamppujen (esim. loisteputkien) valon
on oltava tasaisesti jakautunutta hajavaloa, joka on säädettävissä.
3.3 Lämpötila ja kosteus
Tilojen on oltava koko ajan miellyttävän lämpöiset ja ilman on oltava
sopivan kosteaa. Elleivät erityiset syyt muuta edellytä, suositellaan, että
ilman lämpötila on 20—22 ºC ja suhteellinen kosteus 60—70 %.
4 MAISTAMISKOPIT
4.1 Yleisiä ominaisuuksia
Maistamiskopit sijoitetaan rinnakkain riviin.Niiden on oltava samanlaiset ja väliseinien on oltava niin korkeat ja
leveät, että ne erottavat maistajat kokonaan toisistaan, kun nämä istuvat
paikoillaan.
Kopit voidaan rakentaa mistä tahansa sopivasta materiaalista, joka on
helppo pitää puhtaana (esimerkiksi puusta, lasitetusta vanerista, laminaat-
tilevyistä, jne.). Jos pintoja maalataan, niiden on oltava täysin hajuttomia,
kun maalion kui vunut.
Istuinten on oltava mukavat ja niiden korkeutta on voitava säätää.
Jokaisessa kopissa on oltava oma kohdevalaisin, jonka voimakkuutta ja
suuntaa voidaan säätää.
On suotavaa, että jokaisella maistajalla on käden ulottuvilla painonappi,
jota painettaessa kopin ulkopuolella syttyy valo, joka ilmoittaa muita
maistajia häiritsemättä vastuuhenkilölle, että maistaja on valmis, tarvitsee
lisää näytteitä, haluaa kysyä jotain, haluaa jonkin puuttuvan välineen tai
on havainnut jotakin poikkeavaa, jne.
4.2 Mittasuhteet
Koppien on oltava riittävän suuria ja mukavia. Yleensä ne ovat seuraavan-
kokoisia:
— leveys:
0,75 m (ilman pesuallasta),
0,85 m (pesualtaan kera),
— pituus:
0,50 m (pöytä),
0,20 m (lisätilaa väliseinää varten),
— väliseinien korkeus:
vähintään 0,60 m pöydän pinnasta,
— pöydän korkeus:
0,75 m.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 75
(1) Huoneen värit ja valaistus voivat vaikuttaa aistinvaraisten arviointien tuloksiin.
▼B
4.3 Tilojen järjestely
Pöytien pintojen on oltava helposti puhdistettavia.
Osa pöydän pinta-alasta varataan pesualtaalle, johon kuuluvasta hanasta
saa juoksevaa juomavettä. Jos se ei ole käytännössä mahdollista, tilaan
voi sijoittaa sylkymaljan, pesuvadin tms.
Koska näytteet on kokeen aikana säilytettävä tasaisessa lämpötilassa, joka
on alhaisempi tai korkeampi kuin huoneenlämpö, on suositeltavaa, että
sitä varten hankitaan sopivat laitteet (vesihaude, kuumennuslevy, jne.)
Erilaisia tarvikkeita (laseja ja muita pieniä esineitä) varten voidaan myös
kiinnittää hylly noin 1,10 m:n korkeudelle lattiasta.
Jos koppien sijoitus huoneessa on sopiva, on suotavaa asentaa luukku,
josta näytteet annetaan maistajalle. Luukku voi olla liukuva (kuva 1),
pyörivä, joka sopii erityisen hyvin korkeille näytelaseille tai -kupeille
(kuva 2) tai vaakatasossa saranoitu ovi, jos näytteet ovat matalissa
astioissa (kuva 3). Tärkeintä on, että näytteet mahtuvat astioissaan tarjotti-
mella aukosta sisään.
5 MUUT TILAT
Jos tilaa riittää, on suotavaa järjestää erillinen huone näytteiden valmista-
mista varten (ruuanlaittoon liittyvistä tai muista syistä), lasien ja laitteiden
käsittelyä varten sekä raadin yhteisiä keskusteluja varten ennen kokeiden
suoritusta tai niiden jälkeen. Jos tällaiset tilat on käytettävissä, niiden on
oltava puhtaat, eikä niistä saa kantautua maistajia häiritseviä ääniä tai
hajuja maistamishuoneeseen.
Kuvassa 4 on esimerkki maistamishuoneen järjestelystä ja muista tiloista.
Huom: Edellä on kuvattu ihanteelliset olosuhteet. Jos ei ole mahdollista
järjestää huonetta yksinomaan aistinvaraisen arvioinnin käyttöön,
voidaan kokeita järjestää tiloissa, jotka muuten täyttävät vähim-
mäisvaatimukset valaistuksen, äänieristyksen, lämpötilan ja
hajuttomuuden suhteen, ja rakentaa niihin koottavat ja purettavat
kopit, joiden tarkoitus on vain erottaa maistajat toisistaan.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 76
▼B
MAISTAMISKOPIN MITAT JA JÄRJESTELY
Kuva 1
1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 77
▼B
PYÖRIVÄ OVI, JOSTA NÄYTTEET VOIDAAN ANTAA
Kuva 2
1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 78
▼B
VAAKATASOSSA SARANOITU LUUKKU, JOSTA NÄYTTEET VOIDAAN
ANTAA
Kuva 3
1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 79
▼B
AISTINVARAISEN ARVIOINNIN LABORATORIO
Kuva 4 — Esimerkki maistamishuoneesta
1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 80
▼B
LIITE XIII
OLIIVIÖLJYN NEUTRALOIMINEN JA VÄRIN POISTO LABORATOR-
IOSSA
1 OLIIVIÖLJYN NEUTRALOINTI JA VÄRIN POISTO LABORATOR-
IOSSA
1.1 Öljyn neutralointi
1.1.1 Välineistö
— korkea dekantterilasi, 300 ml
— sentrifugi, jossa 100 ml:n koeputkia,— dekantterilasi, 250 ml,— pyöreäpohjaisia pulloja, 100 ml,— erotussuppilo, 1 l.
1.1.2 Reagenssit
— 12-prosenttinen natriumhydroksidin vesiliuos,
— 1-prosenttinen fenoliftaleiinin etanoliliuos,— puhdasta heksaania, analyysilaatua,— puhdasta isopropanolia, analyysilaatua.
1.1.3 Suoritus
a)Öljyt, joiden happoisuus oleiinihappona ilmaistuna on alle 30 %
Lämmitetään 65 ºC vesihauteessa korkeassa 300 ml:n dekantterilasissa
50 g käsittelemätöntä öljyä. Lisätään 12-prosenttista natriumhydroksi-
diliuosta määrä, joka vastaa öljyn vapaiden rasvahappojen määrää
lisättynä 5 prosentilla, ja sekoitetaan hiljaa koko ajan. Sekoittamista
jatketaan 65 ºC:ssa viiden minuutin ajan.
Seos siirretään 100 ml:n koeputkiin ja saippuoitunut osa erotetaan
sentrifugoimalla. Dekantoitu öljy kaadetaan 250 ml:n dekantterilasiin
ja pestään käyttäen 50—60 ml kiehuvaa tislattua vettä, joka poistetaan
lapon avulla. Pesut toistetaan niin monta kertaa, että kaikki saippuoi-
tunut aines on poistunut (ja fenoliftaleiinin vaaleanpunainen väri on
hävinnyt).
Öljy sentrifugoidaan, jotta kaikki vesi saadaan pois.
b)Öljyt, joiden happoisuus oleiinihappona ilmaistuna on yli 30 %
Sekoitetaan yhden litran erotussuppilossa 50 g käsittelemätöntä öljyä,
200 ml heksaania, 100 ml isopropanolia ja sellainen määrä 12-prosent-
tista natriumhydroksidia, joka vastaa öljyn vapaiden rasvahappojen
määrää lisättynä 0,3 prosentilla. Ravistetaan voimakkaasti yhden
minuutin ajan. Lisätään 100 ml tislattua vettä, ravistetaan uudelleen ja
annetaan seistä.
Kun kerrokset ovat erottuneet, lasketaan pohjalla oleva saippuoitunut
kerros pois. Kerrosten väliin muodostuu usein limainen liukenematto-
mien aineiden välikerros vesiliukoisen faasin päälle ja öljyfaasin alle;
myös tämä välikerros on poistettava.
Seuraavaksi neutraalin öljyn heksaaniliuos pestään isopropanolin ja
tislatun veden liuoksella, 50—60 ml, suhteessa 1:1 (V/V), kunnes feno-
liftaleiinin vaaleanpunainen väri on hävinnyt. Heksaani poistetaan sen
jälkeen kokonaan haihduttamalla tyhjiössä (esimerkiksi kiertohaihdutti-
messa).
1.2 Neutraloidun öljyn värin poistaminen
1.2.1 Välineistö
— pyöreäpohjainen kolvi, 250 ml, jossa kolme lasihioskaulaa, joihin
yhdistetään:
a) lämpömittari, joka näyttää yhden asteen tarkkuudella 90 ºC:seen
saakka;
b) mekaaninen sekoitin, joka pyörii 250—300 kierrosta minuutissa ja joka
sopii käytettäväksi tyhjiössä;1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 81
▼M6
▼B
▼B
c) tyhjiöpumppuliitäntä,
— tyhjiöpumppu, jossa on manometri, joka kykenee mittaamaan 15—30
millibaarin jäännöspaineen.
1.2.2 Suoritus
Punnitaan noin 100 g neutraloitua öljyä kolmikaulaiseen pulloon.
Lämpömittari ja sekoitin asennetaan paikalleen, liitetään tyhjiöpumppu ja
lämmitetään 90 ºC:seen koko ajan sekoittaen.
Lämpötila pidetään samana ja jatketaan sekoittamista, kunnes määritettävä
öljy on täysin vedetön (noin 30 minuuttia).
Avataan ja annetaan tyhjiön täyttyä ja lisätään 2—3 g aktivoitua valkaisu-
savea. Kytketään tyhjiöpumppu uudelleen niin, että jäännöspaine on
15—30 millibaaria ja lämpötila pidetään 90 ºC:ssa samalla sekoittaen
noin 250 kierrosta minuutissa 30 minuutin ajan.
Suodatetaan kuumana termostaattisäätöisessä lämpökaapissa
50—60 ºC:ssa.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 82
▼M6
LIITE XIV
YHDISTETYN NIMIKKEISTÖN 15 RYHMÄN LISÄHUOMAUTUKSET
2, 3 JA 4
2. A. Numeroihin 1509 - 1510 kuuluvat ainoastaan öljyt, jotka on saatu yksino-
maan oliiveja käsittelemällä ja joiden rasvahappo- ja steroliosuuksiin
liittyvät analyyttiset ominaisuudet ovat seuraavat:
Taulukko I — Rasvahappojen osuus prosentteina
kokonaisrasvahapoistaTaulukko II — Sterolien osuus prosentteina koko-
naissteroleista
Myristiinihappo M 0,1 Kolesteroli M 0,5
Linoleenihappo M 0,9 Brassikasteroli M 0,2
Arakiinihappo M 0,7 Kampesteroli M 4,0
Eikosaanihappo M 0,5 Stigmasteroli (1) < Kampesteroli
Beheenihappo M 0,3 Beeta-sitosteroli (2) m 93,0
Lignoseriinihappo M 0,5 Delta-7-stigmasteroli M 0,5
m = minimi
M = maksimi
(1) Ei koske oliivilamppuöljyjä (alanimike 1509 10 10) ja jalostamattomia uutettuja oliiviöljyjä (alanimike
1510 00 10).
(2) Delta-5-23-stigmastadienoli + klerosteroli + beeta-sitosteroli + sitostanoli + delta-5-avenasteroli + delta-
5-24-stigmastadienoli
Numeroihin 1509 - 1510 eivät kuulu kemiallisesti modifioidut oliiviöljyt
(erityisesti uudelleen esteröidyt öljyt) ja muiden öljyjen kanssa sekoitetut
oliiviöljyt. Uudelleen esteröidyn oliiviöljyn tai muiden kuin oliiviöljyjen
esiintyminen todetaan asetuksen (ETY) N:o 2568/91 liitteissä V, VII, X
A ja X B kuvattujen menetelmien avulla.
B. Alanimikkeeseen 1509 10 kuuluvat ainoastaan jäljempänä I ja II alakoh-
dassa luetellut oliiviöljyt, jotka on saatu käyttäen ainoastaan mekaanisia
tai muunlaisia fysikaalisia menettelyjä sellaisissa olosuhteissa, varsinkin
lämpötilan suhteen, jotka eivät aiheuta öljyn pilaantumista, ja joita ei ole
käsitelty muuten kuin pesemällä, dekantoimalla, sentrifugoimalla tai
suodattamalla. Liuottimilla oliiveista saadut öljyt kuuluvat nimikkeeseen
1510.
I. Alanimikkeen 1509 10 10 ”oliivilamppuöljy”, happamuudesta riippu-
matta, tarkoittaa oliiviöljyä, jossa on:
a)►M9vahoja◄enintään ►M9350◄mg/kg;
b) erytrodiolia ja uvaolia enintään 4,5 %;
c) triglyseridien 2-asemassa olevia tyydyttyneitä rasvahappoja
enintään 1,3 %;
d) öljyhapon trans-isomeerien summa pienempi kuin 0,10 % ja linoli-
ja linoleenihappojen transisomeerien summa pienempi kuin 0,10 %;
ja jolla on
e) yksi tai useampi seuraavista ominaisuuksista:
1) peroksidiluku, joka on suurempi kuin 20 mEq aktiivista happea/
kg;
2) haihtuvien halogenoitujen liuottimien määrä yhteensä suurempi
kuin 0,2 mg/kg tai niistä vähintään yhden määrä suurempi kuin
0,1 mg/kg;
3) K270 -ekstinktiokerroin on suurempi kuin 0,25 ja aktivoidulla
alumiinioksidilla tapahtuvan käsittelyn jälkeen enintään 0,11;
tietyillä öljyillä, joiden öljyhappona ilmoitettujen vapaiden
rasvahappojen määrä on suurempikui n 3,3 g/100 g, voi
asetuksen (ETY) N:o 2568/91 liitteen IX menetelmällä tehdyn
aktivoidulla alumiinioksidilla tapahtuvan käsittelyn jälkeen olla
K270-ekstinktiokerroin, joka on suurempi kuin 0,10; tällaisissatapauksissa niillä on oltava seuraavat ominaisuudet sen jälkeen,
kun ne edellä mainitun asetuksen liitteen XIII mukaisesti
neutraloitu ja tehty värittömiksi laboratoriossa:
— K270-ekstinktiokerroin enintään 1,20;1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 83
▼M6
— ekstinktiokertoimen poikkeama ( ∆K) alueella 270 nm saa
olla suurempi kuin 0,01 mutta enintään 0,16 eli:
∆K= Km− 0,5 − (Km − 4 + Km+4), jossa
Km on ekstinktiokerroin absorptiokäyrän huipun
aallonpituudella alueella 270 nm.
Km-4 ja Km+4 ovat ekstinktiokertoimet aallonpituuksilla,
jotka ovat 4 nm alhaisemmat ja
korkeammat kuin Km:n aallonpituus;
4) aistinvaraisia ominaisuuksia, joihin kuuluu hyväksyttävyysrajan
ylittäviä havaittavia virheitä ja asetuksen (ETY) N:o 2568/91
liitteen XII mukainen paneelin antama koetulos on pienempi
kuin 3,5.
II. Alanimikkeen 1509 10 90 ”muu neitsytoliiviöljy” tarkoittaa olii-
viöljyä, jolla on seuraavat ominaisuudet:
a) happosisältö öljyhappona ilmaistuna enintään 3,3 g/100 g;
b) peroksidiluku enintään 20 mEq aktiivista happea/kg;
c)►M9vahojen ◄määrä enintään ►M9250◄mg/kg;
d) haihtuvien halogenoitujen liuottimien määrä yhteensä enintään 0,2
mg/kg ja yhden määrä enintään 0,1 mg/kg;
e) K270-ekstinktiokerroin enintään 0,25 ja aktivoidulla alumiinioksi-
dilla tapahtuvan käsittelyn jälkeen enintään 0,1;
f) ekstinktiokertoimen poikkeama ( ∆K) alueella 270 nm enintään
0,01;
g) aistinvaraisia ominaisuuksia, joihin voi kuulua hyväksyttävyysrajan
alittavia havaittavia virheitä ja asetuksen (ETY) N:o 2568/91 liit-teen XII mukainen paneelin antama koetulos on vähintään 3,5;
h) erytrodiolin ja uvaolin määrä enintään 4,5 %;
i) triglyseridien 2-asemassa olevien tyydyttyneiden rasvahappojen
määrä enintään 1,3 %;
j) öljyhapon trans-isomeerien summa pienempi kuin 0,03 % ja linoli-
ja linoleenihapon transisomeerien summa pienempi kuin 0,03 %.
C. Alanimikkeeseen 1509 90 00 kuuluu oliiviöljy, joka on saatu käsitte-
lemällä alanimikkeeseen 1509 10 10 ja/tai 1509 10 90 kuuluvia öljyjä,
riippumatta siitä, onko niihin sekoitettu neitsytoliiviöljyä, ja jolla on seur-
aavat ominaisuudet:
a) happosisältö öljyhappona ilmaistuna enintään 3,3 g/100 g;
b)►
M9vahojen ◄määrä enintään 350 mg/kg;
c) K270 ekstinktiokerroin enintään 1,20;
d) ekstinktiokertoimen vaihtelu ( ∆Κ) alueella 270 nm enintään 0,16;
e) erytrodiolin ja uvaolin määrä enintään 4,5 %;
f) triglyseridien 2-asemassa olevien tyydyttyneiden rasvahappojen määrä
enintään 1,5 %;
g) öljyhapon trans-isomeerien summa pienempi kuin 0,20 % ja linoli- ja
linoleenihapon transisomeerien summa pienempi kuin 0,30 %.
D. Alanimikkeessä 1510 00 10 ”jalostamaton öljy” tarkoittaa erityisesti
uutettua oliiviöljyä, jolla on seuraavat ominaisuudet:
a) happosisältö öljyhappona ilmaistuna vähintään 2 g/100 g;
b) erytriodolin ja uvaolin määrä vähintään 12 %;
c) triglyseridien 2-asemassa olevien tyydyttyneiden rasvahappojen määrä
enintään 1,8 %;
d) öljyhapon trans-isomeerien summa pienempi kuin 0,20 % ja linoli- ja
linoleenihapon transisomeerien summa pienempi kuin 0,10 %.
E. Alanimikkeeseen 1510 00 90 kuuluvat öljyt, jotka on saatu käsittelemällä
alanimikkeeseen 1510 00 10 kuuluvia öljyjä, riippumatta siitä, onko niihin
sekoitettu neitsytoliiviöljyä, sekä öljyt joilla ei ole lisähuomautuksissa 2
B, 2 C ja 2 D tarkoitettuja ominaisuuksia. Tähän alanimikkeeseen kuulu-
vien öljyjen triglyseridien 2-asemassa olevien tyydyttyneiden
rasvahappojen määrän on oltava enintään 2 %, öljyhapon trans-
isomeerien summan pienempi kuin 0,40 % ja linoli- ja linoleenihapon
trans-isomeerien summan pienempi kuin 0,35 %.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 84
▼M9
▼M6
▼M6
3 Alanimikkeisiin 1522 00 31 ja 1522 00 39 eivät kuulu:
a) jäännökset, jotka on saatu käsittelemällä öljyä sisältäviä rasvoja, joiden
asetuksen (ETY) N:o 2568/91 liitteen XVI menetelmällä määritetty jodi-
luku on pienempi kuin 70 tai suurempi kuin 100;
b) jäännökset, jotka on saatu käsittelemällä öljyä sisältäviä rasvoja, joiden
jodiluku on välillä 70 - 100, mutta joiden beeta-sitosterolin (1) reten-
tioaikaa kuvaavan piikin pinta-ala asetuksen (ETY) N:o 2568/91 liitteen
V mukaan määritettynä on pienempi kuin 93 % sterolien piikkien koko-
naispinta-alasta.
4 Edellä mainittujen tuotteiden ominaisuuksien määrittämiseen käytetyt
määritysmenetelmät kuvataan asetuksen (ETY) N:o 2568/91 liitteissä.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 85
(1) Delta-5-23-stigmastadienoli + klerosteroli + beeta-sitosteroli + sitostanoli + delta-5-
avenasteroli + delta-5-24-stigmastadienoli
▼B
LIITE XV
1 OLIIVIJÄTTEEN ÖLJYPITOISUUS
1.1Välineistö
— sopiva uuttolaitteisto, johon voidaan liittää pyöreäpohjainen pullo,
200—250 ml,
— sähköllä lämmitettävä vesihaude, hiekkahaude tai levy,
— analyysivaaka,
— lämpökaappi, jonka voi säätää enintään 80 ºC:seen,
— sähköuunijossa termostaatti , jonka voisäätää 103 ± 2 ºC:seen ja johon
voi puhaltaa ilmaa tai jossa voi käyttää alipainetta,
— mekaaninen jauhin, joka on helppo puhdistaa ja jossa oliivijäännös
voidaan jauhaa ilman lämpötilan nousua tai mainittavaa vesi- tai öljypi-
toisuuden alenemista,
— uuttohylsy ja hydrofiilistä pumpulia tai suodatinpaperia, josta on pois-
tettu heksaaniin uuttuvat aineet,
— eksikkaattori,
— seula, jonka reikien halkaisija on 1 mm,
— kuivattuja hohkakiven palasia.
1.2Reagenssi
Teknistä n-heksaania, josta jää täydellisesti haihdutettuna alle 0,002 g
jäännöstä/100 ml.
2 SUORITUS
2.1Näytteen esikäsittely
Käytetään tarvittaessa mekaanista jauhinta näytteen jauhamiseksi niin
hienoksi, että se menee kokonaan seulan läpi; jauhin on ensin hyvin puhdis-
tettava.
Näytteestä käytetään noin 1/20 jauhatuslaitteen puhdistamiseen, heitetään
pois syntynyt jauhos, jauhetaan loput näytteestä ja kerätään se, sekoitetaan
huolellisesti ja määritetään viipymättä.
2.2Näytteenotto
Heti kun jauhaminen on päättynyt, punnitaan noin 10 g näytettä 0,01 g:n
tarkkuudella koetta varten.
2.3Uuttohylsyn esikäsittely
Näyte pannaan uuttohylsyyn, joka suljetaan hydrofiilisellä pumpulitupolla.
Jos käytetään suodatinpaperia, jauhettu näyte kääritään siihen.
2.4Esikuivaus
Jos oliivijäännös on hyvin kosteata (ts. kosteutta ja haihtuvia aineita on yli
10 %), näyte kuivataan asettamalla täytetty uuttohylsy (tai paperiin kääritty
näyte) lämpökaappiin sopivaksi ajaksi korkeintaan 80 ºC:seen, jotta kosteus
ja haihtuvat aineet vähenisivät alle 10 %:iin.
2.5Pyöreäpohjaisen pullon esikäsittely
Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella pullo, jossa on pari hohkakivikappaletta.
Hohkakivi kuivataan ensin uunissa 103 ± 2 ºC:ssa ja jäähdytetään eksikkaat-
torissa vähintään tunnin ajan.
2.6Ensimmäinen uutto
Uuttohylsy näytteineen (tai paperiin kääritty näyte) sijoitetaan uuttolaitteis-
toon. Pulloon kaadetaan tarpeellinen määrä heksaania. Pullo liitetään
uuttolaitteistoon ja asetetaan kokonaisuus sähkökäyttöiseen lämpöhautee-
seen. Lämpö säädetään niin, että refluksointinopeus on vähintään kolme
tippaa sekunnissa (kohtalainen, ei kova kiehuminen).
Neljän tunnin uuton jälkeen annetaan jäähtyä. Hylsy irrotetaan uuttolaitteis-
tosta ja pannaan ilmavirtaan, jotta suurin osa imeytyneestä liuottimesta
haihtuisi.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 86
▼B
2.7Toinen uutto
Hylsyn sisältö siirretään mikrojauhatuslaitteeseen ja jauhetaan niin hienoksi
kuin mahdollista. Jauhettu näyte kootaan tarkoin ja pannaan takaisin
hylsyyn, joka liitetään taas uuttolaitteistoon.
Jatketaan uuttoa vielä kaksi tuntia käyttäen samaa pyöreäpohjaista pulloa,
jossa on ensimmäinen uute.
Uuttopulloon kertyvän liuoksen on oltava kirkasta. Ellei näin ole, se suoda-
tetaan paperin läpi ja pullo ja suodatinpaperi pestään useaan kertaan
heksaanilla. Suodos ja pesuliuotin kerätään toiseen kuivattuun 1 mg:n tark-
kuudella taarattuun pulloon.
2.8Liuottimen poistaminen ja uutteen punnitseminen
Tislataan pois enin osa liuottimesta haihduttamalla sähkökäyttöisessä
hauteessa. Liuottimen jäänteet poistetaan kuumentamalla pulloa 20
minuuttia uunissa 103 ± 2 ºC:ssa. Liuottimen haihtumista voidaan edistää
puhaltamalla ajoittain uuniin ilmaa tai mieluummin inerttiä kaasua tai
käyttämällä alipainetta.
Pullo asetetaan eksikkaattoriin jäähtymään vähintään tunniksi ja punnitaan
1 mg:n tarkkuudella.
Kuumennetaan uudestaan samoissa olosuhteissa 10 minuuttia, jäähdytetään
eksikkaattorissa ja punnitaan uudelleen.
Näiden kahden punnitustuloksen ero saa olla enintään 10 mg. Ellei tähän
päästä, kuumennetaan jälleen 10 minuuttia, jäähdytetään ja punnitaan,
kunnes massan ero edelliseen on enintään 10 mg. Viimeisen punnituksen
tulos merkitään muistiin.
Samasta näytteestä tehdään kaksierimääri tystä.
3 TULOSTEN ESITTÄMINEN3.1Laskutapa ja kaava
a) Uutteen määrä ilmaistuna painoprosentteina saadusta tuotteesta on:
S=m
1×100
mo
jossa:
S = saadun tuotteen uutteen painoprosentti,
mo= näytteen paino grammoina,
m1= kuivatun uutteen paino grammoina.
Tulos on kahden rinnakkaiskokeen aritmeettinen keskiarvo, jos kokeen
toistettavuusehdot täyttyvät.
Tulos ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.
b) Uute ilmaistaan kuiva-aineena seuraavalla kaavalla:
S×100
100 − U= uutteen öljyprosenttikui vasta näytteestä
jossa:
S = saadun tuotteen uutteen painoprosenttiosuus [ks. a)],
U = kosteus ja haihtuvat aineet näytteessä.
3.2Toistettavuus
Saman kokeen tekijän peräkkäisten tai samanaikaisten rinnakkaiskokeiden
tulosten välinen ero ei saa olla yli 0,2 g heksaaniuutetta/100 g näytettä.
Jos tämä ehto eitäyty, koe toi stetaan kahdella uudella näytteellä. Jos ero on
yhä suurempi kuin 0,2 g, tulos on tehdyn neljän määrityksen aritmeettinen
keskiarvo.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 87
▼B
LIITE XVI
JODILUVUN MÄÄRITTÄMINEN
1 TARKOITUS
Tämä kansainvälinen standardi kuvaa menetelmän jodiluvun määrittämi-
seksi eläin-ja kasvirasvoista sekä -öljyistä, joihin tästedes viitataan sanalla
rasva.
2 MÄÄRITELMÄ
Tätä kansainvälistä standardia varten määritellään seuraavat käsitteet:
2.1 Jodiluku. u:näytteen absorboiman jodin massa tässä kansainvälisessä stan-
dardissa määrätyissä olosuhteissa.
Jodiluku ilmoitetaan grammoina jodia/100 g näytettä.
3 PERIAATE
Näyte liuotetaan liuottimeen ja lisätään Wijsin reagenssia. Tietyn ajan
kuluttua lisätään kaliumjodidin vesiliuosta ja vapautunut jodi titrataan
natriumtiosulfaattiliuoksella.
4 REAGENSSIT
Kaikkien reagenssien on oltava hyväksyttyä analyysilaatua.
4.1Kaliumjodidiliuos , 100 g/l, ei saa sisältää jodaatteja eikä vapaata jodia.
4.2Tärkkelysliuos.
Lisätään 5 g liukoista tärkkelystä 30 ml:aan vettä, lisätään tämä seos
1 000 ml:aan kiehuvaa vettä; annetaan kiehua kolme minuuttia ja jäähdy-
tetään.
4.3Natriumtiosulfaatti , standardi titrausliuos c(Na2S2O3.5 H2O) = 0,1 mol/l,
standardoitu enintään seitsemän päivää ennen käyttöä.
4.4Liuotin , valmistettu sekoittamalla yhtä suuret tilavuudet sykloheksaania ja
etikkahappoa.
4.5Wijsin reagenssi , joka sisältää jodimonokloridia etikkahapossa. On
käytettävä valmiina saatavaa Wijsin reagenssia.
Huom: Reagenssisi sältää 9 g ICI3:a ja 9 g I:a etikkahapossa.
5 VÄLINEISTÖ
Tavallinen laboratoriovälineistö ja erityisesti seuraavat:
5.1Punnituslaseja , jotka sopivat näytemäärän punnitsemiseen ja pulloon (5.2)
siirtämiseen.
5.2Erlenmeyerpulloja , 500 ml, hiotut lasitulpat, täysin kuivia.
6 NÄYTTEEN VALMISTAMINEN
Homogenoitu näyte kuivatetaan natriumsulfaatilla ja suodatetaan.
7 SUORITUS
7.1 Näytteenotto
Näytemäärä määräytyy oletetun jodiluvun perusteella taulukon 1 mukaisesti.
Taulukko 1
Oletettu jodilukuNäytteen määrä
(g)
alle 5 3,00
5—20 1,00
21—50 0,40
51—100 0,20
101—150 0,131991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 88
▼B
Oletettu jodilukuNäytteen määrä
(g)
151—200 0,10
Näytemäärä punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella punnituslasissa (5.1).
7.2 Määritys
Näyte pannaan 500 ml:n pulloon (5.2). Lisätään 20 ml liuotinta (4.5) rasvan
liuottamiseksi. Lisätään tasan 25 ml Wijsin reagenssia (4.6), suljetaan
tulpalla, ravistetaan ja jätetään pullo pimeään. Wijsin reagenssin kanssa ei
saa käyttää suupipettiä.
Sokeakoe valmistellaan samalla tavalla käyttäen liuotinta ja reagenssia
ilman näytettä.
Pullot jätetään pimeään tunniksi, jos näytteen oletettu jodiluku on alle 150;
jos oletettu jodiluku on yli 150 tai tuote on polymeroitunut tai hyvin hapet-
tunut, pullot jätetään pimeään kahdeksi tunniksi.
Ajan päätyttyä lisätään 20 ml kaliumjodidiliuosta (4.2) ja 150 ml vettä (4.1)
kuhunkin pulloon.
Titrataan standardilla natriumtiosulfaatin titrausliuoksella (4.4), kunnes jodin
aiheuttama keltainen väri on melkein hävinnyt. Lisätään pari tippaa tärkke-
lysliuosta (4.3) ja jatketaan titraamista, kunnes sininen väri juuri katoaa
liuosta voimakkaasti ravistettaessa.
Huom. Myös potentiometrinen titrauksen loppupisteen määrittäminen on
sallittua.
7.3 Määritysten lukumäärä
Samasta näytteestä tehdään kaksimääri tystä.
8 TULOSTEN ESITTÄMINEN
Jodiluku saadaan kaavasta
12;69 c V 1/C0V2 ðÞ
m
jossa:
c = käytetyn natriumtiosulfaattiliuoksen (4.4) tarkka pitoisuus, moolia/
litra;
V1= sokeakokeeseen käytetyn natriumtiosulfaattiliuoksen (4.4) tilavuus
millilitroina;
V2= määritykseen käytetyn natriumtiosulfaattiliuoksen (4.4) tilavuus
millilitroina;
m = näytemäärä (7.1) grammoina.
Tulos on kahden määrityksen tulosten aritmeettinen keskiarvo sillä ehdolla,
että toistettavuusehto täyttyy.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 89
▼M11
LIITE XVII
MENETELMÄ STIGMASTADIEENIEN MÄÄRITTÄMISEKSI
KASVIÖLJYISTÄ
1. TARKOITUS
Stigmastadieenien määritys kasviöljyistä, joissa näiden hiilivetyjen pitoi-
suudet ovat pieniä, kuten neitsytoliiviöljystä ja oliivin puristusjätteestä
saadusta raakaöljystä.
2. SOVELTAMISALA
Tätä standardia voidaan soveltaa kaikkiin kasviöljyihin; mittaustulokset
ovat kuitenkin luotettavia ainoastaan, jos näiden hiilivetyjen pitoisuus on
0,01—4,0 mg/kg. Menetelmä soveltuu erityisesti puhdistettujen kasviöl-
jyjen (oliivi, oliivin puristusjäte, auringonkukka, palmu tms.) toteamiseen
neitsytoliiviöljystä, sillä puhdistetut öljyt sisältävät stigmastadieeneja,
mutta neitsytöljyt eivät sisällä niitä.
3. PERIAATE
Saippuoitumattoman aineksen erottaminen. Steroidihiilivetyfraktion erotta-
minen pylväskromatografian avulla käyttäen silikageeliä ja
kapillaarikaasukromatografista määritystä.
4. LAITTEISTO
4.1 250 ml:n pulloja, joita voi käyttää palautusjäähdyttimen kanssa.4.2 Erotussuppiloita, joiden vetoisuus on 500 ml.4.3 Pyöreäpohjaisia 100 ml:n pulloja.
4.4 Pyöröhaihdutin (”rotavapori”).
4.5 Lasinen kromatografiakolonni (sisähalkaisija 1,5—2,0 cm, pituus 50 cm),
jossa on teflonhana ja jonka pohjalla on lasivillatulppa tai lasisintterievy.
Silikageelikolonni valmistellaan kaatamalla kromatografiakolonniin n.
5 cm kerros heksaania ja täyttämällä sen jälkeen kolonni silikageelin
heksaanilietteellä (15 g en 40 ml:ssa) käyttäen apuna heksaaniannoksia.
Annetaan seistä ja viimeistellään asettuminen kevyellä tärytyksellä.
Lisätään vedetöntä natriumsulfaattia noin 0,5 cm:n kerros ja eluoidaan
lopuksi liika heksaani.
4.6 Kaasukromatografi, jossa on liekki-ionisaatiodetektori, jakajatyyppinen tai
kylmä kolonniin liittyvä (on-column) injektori sekä uuni, joka on
ohjelmoitavissa ± 1 celsiusasteen tarkkuudella.
4.7 Kaasukromatografinen kvartsilasikapillaarikolonni (sisähalkaisija 0,25 tai
0,32 mm, pituus 25 m), joka on pinnoitettu 5-prosenttisella fenyylimetyy-
lisilikonifaasilla, jonka kerrospaksuus on 0,25 µm.
Huomautus 1:
Voidaan käyttää myös muita kolonneja, joiden polaarisuus on sama tai
pienempi.
4.8 Tallentava integraattori, jolla voidaan integroida pohjasta pohjaan.4.9 Liimatulla neulalla varustettu 5—10 µl:n mikroruisku kaasukromatogra-
fiaa varten.
4.10 Sähköinen kuumennusvaippa tai lämpölevy.
5. REAGENSSIT
Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua, ellei toisin määrätä.
Käytettävän veden tulee olla tislattua vettä tai puhtaudeltaan vähintään
vastaavaa.
5.1 Heksaania tai alkaaniseos, jonka aineosien kiehumispisteet ovat 65—70º C
ja joka on tislattu rektifioimiskolonnilla.
Huomautus 2:
Liuotin on tislattava epäpuhtauksien poistamiseksi.
5.2 96-prosenttista (v/v) etanolia.
5.3 Vedetöntä natriumsulfaattia.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 90
▼M11
5.4 Kaliumhydroksidin 10-prosenttista alkoholiliuosta. Lisätään 10 ml vettä
50 g:aan kaliumhydroksidia, sekoitetaan ja liuotetaan seos 500 ml:aan
etanolia.
Huomautus 3:
Kalilipeän alkoholiliuos muuttuu seistessään ruskeaksi. Liuos on valmis-
tettava uudelleen joka päivä ja pidettävä hyvin suljetuissa ruskeissa
lasipulloissa.
5.5 Silikageeliä 60 kaasukromatografiaa varten, 70—230 mesh (Merck ref.
7734 taisamanlai nen).
Huomautus 4:
Silikageeli voidaan yleensä ottaa käyttöön suoraan pakkauksesta ilman
mitään käsittelyä. Joissakin valmistuserissä esiintyy kuitenkin alhaista
aktiivisuutta, joka johtaa huonoon kromatografiseen erottumiseen. Tällöin
silikageeli on käsiteltävä seuraavasti: Silikageeli aktivoidaan kuumenta-
malla sitä vähintään neljä tuntia 550º C:n lämpötilassa. Kuumentamisen
jälkeen silikageelin annetaan jäähtyä eksikkaattorissa ja pannaan sitten
tulpalla suljettuun pulloon. Lisätään 2 % vettä ja ravistetaan, kunnes paak-
kuja ei näy ja jauhe virtaa vapaasti.
Jos silikageelin valmistuserä on sellainen, että se aiheuttaa kromatogram-
miin toisiaan häiritseviä huipuja, silikageeli on käsiteltävä edellä esitetyllä
tavalla. Vaihtoehtoinen tapa on käyttää erikoispuhdasta silikageeliä 60
(Merck, ref. 7754).
5.6 Kolesta-3,5-dieenin (Sigma, 99-prosenttinen puhtaus) varastoliuos
(200 ppm) heksaanissa (10 mg 50 ml:ssa).
5.7 Kolesta-3,5-dieenin standardiliuos heksaanissa, pitoisuus 20 ppm, saadaan
laimentamalla edellä mainitusta liuoksesta.
Huomautus 5:
5.6 ja 5.7 kohdassa tarkoitetut liuokset säilyvät huononematta vähintään
neljä kuukautta, jos niitä säilytetään alle 4º C:n lämpötilassa.
5.8 n-nonakosaanin heksaaniliuos, pitoisuus n. 100 ppm.
5.9 Kantajakaasu kromatografiaa varten: helium tai vety, puhtaus 99,9990 %.
5.10 Apukaasut liekki-ionisaatiodetektoria varten: vety, jonka puhtaus on
99,9990 %, ja puhdistettu ilma.
6. MENETTELY
6.1 Saippuoitumattoman aineksen valmistelu:
6.1.1 Punnitaan 20 ± 0,1 g öljyä 250 ml:n pulloon (4.1), lisätään 1 ml kolesta-
3,5-dieenin (20 µg) standardiliuosta ja 75 ml kalilipeän 10-prosenttista
alkoholiliuosta, kiinnitetään palautusjäähdytin ja keitetään hiljalleen 30
minuuttia. Otetaan näytteen sisältävä pullo pois lämpölähteestä ja anne-
taan liuoksen jäähtyä hieman (liuos ei saa jäähtyä kokonaan, sillä tällöin
näyte erottuu). Lisätään 100 ml vettä ja siirretään lios erotussuppiloon
(4.2) 100 ml:lla heksaania. Seosta ravistetaan voimakkaasti 30 sekuntia,
minkä jälkeen sen annetaan erottua kerroksiksi.
huomautus 6:
Jos muodostuu emulsio, joka ei häviä nopeasti, lisätään hieman etanolia.
6.1.2 Pohjalle jäävä vesifaasi siirretään toiseen erotussuppiloon ja uutetaan
uudelleen 100 ml:lla heksaania. Pohjalle jäävä osa juoksutetaan taas pois
ja heksaaniuute (yhdistettynä toisen erotussuppilon ainekseen) pestään
kolme kertaa 100 ml:lla etanoli-vesiseoksella (1:1), kunnes pH on
neutraali.
6.1.3 Heksaaniliuos johdetaan vedettömän natriumsulfaatin (50 g) läpi, pestään
20 ml:lla heksaania ja haihdutetaan kuivaksi pyöröhaihduttimessa 30º C:n
lämpötilassa matalassa paineessa.
6.2 Steroidihiilivetyjakeen erottaminen:
6.2.1 Jäännös siirretään fraktiointikolonniin käyttäen kahta yhden millilitran
heksaaniannosta, näyte johdetaan kolonniin antaen liuoksen pinnan vajota
natriumsulfaattikerroksen pinnan tasalle ja aloitetaan kromatografinen
eluointi heksaanilla käyttäen virtausnopeutta, joka on n. 1 ml/min.
Eluaatin ensimmäiset 20—30 ml heitetään pois ja seuraava 40 ml:n jae
otetaan talteen. Talteen otettu jae siirretään 100 ml:n pyöreäpohjaiseen
pulloon (4.3).1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 91
▼M11
Huomautus 7:
Ensimmäinen jae sisältää tyydyttyneitä hiilivetyjä (kuva 1a) ja toinen jae
steroidihiilivetyjä. Lisäeluointi tuottaa skvaleenia ja vastaavia yhdisteitä.
Jotta saavutetaan tyydyttyneiden ja steroidihiilivetyjen tarkka erottuminen,
jakeiden tilavuudet on määritettävä ihanteellisiksi. Tätä varten ensim-
mäisen jakeen tilavuus on valittava siten, että toista jaetta määritettäessä
tyydyttyneiden hiilivetyjen huippu on matala (ks. kuva 1c); jos niitä ei
ilmene ja standardihuippu on heikko, tilavuutta on pienennettävä. Joka
tapauksessa on tarpeetonta erottaa täysin ensimmäisen ja toisen jakeen
osia, sillä kaasukromatografisessa määrityksessä ei esiinny päällekkäisiä
huippuja, jos kaasukromatografiaolosuhteet säädetään 6.3.1 kohdan
mukaisesti. Toisen jakeen ihannetilavuutta ei yleensä tarvitse etsiä, sillä
myöhemmät osat erottuvat hyvin. Jos kutenkin esiintyy suuri huippu,
jonka retentioaika on n. 1,5 minuuttia lyhyempi kuin standardin, tämä
johtuu skvaleenista ja osoittaa huonoa erotuskykyä.
6.2.2 Toinen jae haihdutetaan kuivaksi haihduttimessa 30º C lämpötilassa mata-
lassa paineessa, ja jäännös liuotetaan välittömästi 0,2 ml:aan heksaania.
Liuos säilytetään jääkaapissa määritykseen asti.
Huomautus 8:
6.1.3 ja 6.2.2 kohdassa tarkoitettuja jakeita ei pidä säilyttää kuivana eikä
huoneenlämpötilassa. Liuotin on lisättävä heti kun jäännös on saatu, ja
liuoksia on tämän jälkeen säilytettävä jääkaapissa.
6.3 Kaasukromatografia
6.3.1 Työskentelyolosuhteet jakajakatyyppistä injektoria varten:
— Injektorin lämpötila: 300º C.
— Detektorin lämpötila: 320º C.— Tallentava intergraattori: integrointiparametrit on valittava siten, että
pinta-alat arvioidaan oikein. Integrointi pohjasta pohjaan on suositel-
tavaa.
— Herkkyys: noin 16 kertaa vähimmäisvaimennus.
— Injektoitava liuosmäärä: 1 µl.
— Uunin lämpötilaohjelma: alussa 235º C 6 minuutin ajan, sen jälkeen
lämpötilaa kohotetaan 2º C/min, kunnes lämpötila on 285º C.
— Injektori, jossa on virtauksenjakaja 1:15.— Kantajakaasu: helium tai vety, paine n. 120 kPa.
Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kromatografin ja kolonnin ominaisuuk-
sien mukaan, jotta saavutetaan seuraavien vaatimusten mukainen
kromatogrammi: sisäisen standardin huippu n. 5 minuutin tarkkuudella
6.3.2 kohdassa tarkoitetussa ajassa; sisäisen standardin huipun on oltava
vähintään 80 prosenttia täydestä asteikosta.
Kaasukromatografijärjestelmä on tarkistettava ruiskuttamalla kolesta-
dieenin (5.6) varastoliuoksen ja n-nonakosaaniliuoksen (5.8) seosta.
Kolesta-3,5-dieenin huippu tulee esiintyä ennen n-notakosaanin huipua
(kuva1c); jos näin ei käy, voidaan menetellä kahdella tavalla: alentaa
uunin lämpötilaa ja/tai käyttää polaarisuudeltaan pienempää kolonnia.
6.3.2 Huipun tunnistaminen
Sisäisen standardin huippu esiintyy n. 19 minuutin kuluttua ja stigmasta-
3,5-dieenin huippu suhteellisella retentioajalla, joka on n. 1,29 (ks. kuva
1b). Stigmasta-3,5-dieenin mukana kulkee pieni määrä isomeeria, ja
yleensä molemmat sisältyvät samaan huippuun. Jos kolonni on kuitenkin
liian polaarinen tai sen erotuskyky on suuri, isomeerin huippu saattaa
näkyä erillisenä pinenä stigmasta-3,5-dieenihuippua välittömästi
edeltävänä huippuna (kuva 2). Jotta voidaan varmistaa, että eluoituvat
stigmastadieenit muodostavat vain yhden huipun, on suotavaa vaihtaa
kolonnin tilalle vähemmän polaarinen tai sisähalkaisijaltaan suurempi
kolonni.
Huomautus 9:
Stigmastadieeneja voidaan saada kromatografista vertailua varten
määrittämällä puhdistettua kasviöljyä ja käyttämällä pinempää näytettä
(1—2 g). Stigmastadieenit tuottavat voimakkaan ja helposti tunnistettava
huipun.
6.3.3 Kvantitatiivinen märitys
Stigmastadieenipitoisuus määritetään seuraavan kaavan avulla:
stigmastadieenipitoisuus mg/kg =
As/C2Mc
Ac/C2Mo1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 92
▼M11
jossa As= stigmastadieenien huipun pinta-ala (jos huippu jakaantuu
kahden isomeerin huipuksi, näiden kahden huipun pinta-
alojen summa)
Ac= sisäisen standardin (kolestadieeni) huipun pinta-ala
Mc= lisätyn standardin massa mikrogrammoina
Mo= öljyn massa grammoina
Toteamisraja: noin 0,01 mg/kg.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 93
▼M11
Kuva 1
Kaasukromatogrammi, joka on saatu oliiviöljynäytteistä, jotka on
määritetty kvartsilasikapillaarikolonnissa (sisähalkaisija 0,25, pituus
25 m); kolonni on pinnoitettu 5-prosenttisella fenyylimetyylisilikonillaa,
kerrospaksuus 0,25 µm.
a) Neitsytöljyn ensimmäinen jae (30 ml), jossa näkyy standardin huippu.
b) Oliiviöljyn toinen jae (40 ml); öljy sisältää 0,10 mg/kg stigmastadiee-
neja.
c) Toinen jae (40 ml), joka sisältää pienen osuuden ensimmäistä jaetta.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 94
▼M11
Kuva 2
Kaasukromatogrammi, joka on saatu DB-5-kolonnilla määritetystä puhdis-
tetun oliiviöljyn näytteestä; kromatogrammissa näkyy stigmasta-3,5-
dieenin isomeeri.1991R2568 — FI — 31.10.1995 — 013.001 — 95