1991R2568 — FI — 11.10.2016 — 030.001

Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentoinnin apuväline eikä sillä ole oikeudellista vaikutusta. Unionin toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä. Säädösten todistusvoimaiset versiot on johdanto-osineen julkaistu Euroopan unionin virallisessa lehdessä ja ne ovat saatavana EUR-Lexissä. Näihin virallisiin teksteihin pääsee suoraan tästä asiakirjasta siihen upotettujen linkkien kautta.

Muutettu:





Oikaisu







(*) Tätä asiakirjaa ei ole julkaistu suomenkielisenä.









▼B

KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 2568/91,

annettu 11 päivänä heinäkuuta 1991,

oliiviöljyn ja uutetun oliiviöljyn ominaisuuksista sekä niiden määritysmenetelmistä







▼M20

1 artikla

1. Öljyjä, joiden ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 1 ja 2 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevan 1 kohdan a ja b alakohdassa tarkoitettuina neitsytoliiviöljyinä.

2. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 3 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 1 c kohdassa tarkoitettuna oliivilamppuöljynä.

3. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 4 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 2 kohdassa tarkoitettuna jalostettuna oliiviöljynä.

4. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 5 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 3 kohdassa tarkoitettuna jalostetusta oliiviöljystä ja neitsytoliiviöljystä valmistettuna oliiviöljynä.

5. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 6 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 4 kohdassa tarkoitettuna raakana oliivin puristemassaöljynä.

6. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 7 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 5 kohdassa tarkoitettuna jalostettuna oliivin puristemassaöljynä.

7. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 8 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 6 kohdassa tarkoitettuna oliivin puristemassaöljynä.

▼M26

2 artikla

1. Liitteessä I säädettyjen öljyjen ominaisuudet määritetään seuraavilla määritysmenetelmillä:

a) oleiinihappoprosentteina ilmaistavat vapaat rasvahapot määritetään liitteessä II esitetyllä menetelmällä;

b) peroksidiluku määritetään liitteessä III esitetyllä menetelmällä;

c) vahapitoisuus määritetään liitteessä IV esitetyllä menetelmällä;

d) sterolien ja triterpeenidialkoholien koostumus ja pitoisuus määritetään kapillaarikaasukromatografialla liitteessä V esitetyllä menetelmällä;

e) 2-glyseryylimonopalmitaatin prosenttiosuus määritetään liitteessä VII esitetyllä menetelmällä;

f) spektrofotometrinen määritys tehdään liitteessä IX esitetyllä menetelmällä;

▼M28

g) rasvahappokoostumus määritetään liitteessä X esitetyllä menetelmällä;

▼M26

h) haihtuvat halogeeniliuottimet määritetään liitteessä XI esitetyllä menetelmällä;

i) neitsytoliiviöljyn aistinvaraiset ominaisuudet arvioidaan liitteessä XII esitetyllä menetelmällä;

j) stigmastadieenit määritetään liitteessä XVII esitetyllä menetelmällä;

k) C42:ta sisältävien triglyseridien koostumus määritetään liitteessä XVIII esitetyllä menetelmällä;

▼M28

l) alifaattisten alkoholien ja triterpeenialkoholien pitoisuus määritetään liitteessä XIX esitetyllä menetelmällä;

▼M26

m) vahojen, rasvahappojen metyyliestereiden ja rasvahappojen etyyliestereiden pitoisuudet määritetään liitteessä XX esitetyllä menetelmällä.

▼M28 —————

▼M26

2. Kansallisilta viranomaisilta tai näiden edustajilta edellytettävistä neitsytoliiviöljyjen aistinvaraisten ominaisuuksien tarkistuksesta vastaavat jäsenvaltioiden hyväksymät maistajaraadit.

Ensimmäisessä kohdassa tarkoitetun oliiviöljyn aistinvaraisten ominaisuuksien katsotaan olevan yhdenmukaisia ilmoitetun oliiviöljyluokan kanssa, jos asianomaisen jäsenvaltion hyväksymä raati vahvistaa kyseisen luokituksen.

Jos raati ei vahvista ilmoitusta ilmoitetun oliiviöljyluokan aistinvaraisten ominaisuuksien osalta, kansalliset viranomaiset tai niiden edustajat teettävät asianomaisen pyynnöstä viipymättä muilla hyväksytyillä raadeilla kaksi seurantamääritystä, joista ainakin toisen tekee asianomaisen tuottajajäsenvaltion hyväksymä raati. Kyseisten ominaisuuksien katsotaan olevan yhdenmukaisia ilmoitettujen ominaisuuksien kanssa, jos ilmoitettu luokitus vahvistetaan molemmissa seurantamäärityksissä. Päinvastaisessa tapauksessa seurantamäärityksen kustannuksista vastaa asianomainen.

3. Kun on kyse kansallisten viranomaisten tai niiden edustajien tekemästä 1 kohdan mukaisesta öljyn ominaisuuksien toteamisesta, näytteenotto tehdään koenäytteen valmistelua ja näytteenottoa koskevia kansainvälisiä standardeja EN ISO 661 ja EN ISO 5555 noudattaen. Poiketen siitä, mitä standardissa EN ISO 5555 olevassa 6.8 kohdassa määrätään, silloin kun kyseessä ovat tällaiset pakkaukseen suorassa kosketuksessa olevat öljyt, näytteenotto tehdään kuitenkin tämän asetuksen liitteen I a mukaisesti. Kun kyseessä on pakkaamaton öljy, josta ei voida ottaa näytettä standardin EN ISO 5555 mukaisesti, näytteenotto tehdään jäsenvaltion toimivaltaisen viranomaisten ohjeiden mukaisesti.

Rajoittamatta standardin EN ISO 5555 ja standardissa EN ISO 661 olevan 6 luvun määräysten soveltamista näytteet on sijoitettava viipymättä valolta ja lämmöltä suojattuun paikkaan ja lähetettävä laboratorioon määritettäviksi viimeistään näytteenottoa seuraavana viidentenä työpäivänä; muussa tapauksessa näytteet on säilytettävä niin, että ne eivät heikenny tai vahingoitu kuljetuksen tai varastoinnin aikana ennen laboratorioon lähettämistä.

4. Edellä 3 kohdassa tarkoitettua todentamista varten liitteissä II, III, IX, XII ja XX tarkoitetut määritykset ja tapauksen mukaan kansallisessa lainsäädännössä säädetyt vastamääritykset on tehtävä ennen vähimmäissäilymisajan päättymistä, kun kyseessä ovat pakatut tuotteet. Kun kyseessä ovat pakkaamattomat öljyt, määritykset on tehtävä kuuden kuukauden kuluessa näytteenottokuukaudesta.

Muihin tässä asetuksessa säädettyihin määrityksiin ei sovelleta määräaikoja.

Jos määritysten tulokset eivät vastaa oliiviöljyn tai oliivin puristemassaöljyn ilmoitetun luokan ominaisuuksia, asianomaisen on ilmoitettava asiasta kuukauden kuluessa ensimmäisessä alakohdassa tarkoitetun määräajan päättymisestä, paitsi jos näyte on otettu vähimmäissäilymisajan päättymistä edeltävien kahden kuukauden kuluessa.

5. Määritystuloksia verrataan suoraan tässä asetuksessa säädettyihin rajoihin oliiviöljyjen ominaisuuksien määrittelemiseksi 1 kohdan ensimmäisessä alakohdassa säädettyjä menetelmiä noudattaen.

▼M25

2 a artikla

1. Tämän artiklan soveltamiseksi ”kaupan pidetyllä oliiviöljyllä” tarkoitetaan jäsenvaltion oliiviöljyn ja oliivin puristemassaöljyn kokonaismäärää, joka kulutetaan kyseisessä jäsenvaltiossa tai viedään sieltä.

2. Jäsenvaltioiden on sen varmistamiseksi, että kaupan pidetty oliiviöljy on ilmoitetun luokan mukaista, huolehdittava, että vaatimustenmukaisuustarkastukset tehdään valikoivasti riskianalyysin perusteella ja asianmukaisin aikavälein.

3. Riskien arviointiperusteisiin voi kuulua myös

a) öljyn luokka, tuotantokausi, öljyjen hinta suhteessa muihin kasviöljyihin, sekoitus- ja kauppakunnostustoimet, varastointitilat ja -olosuhteet, alkuperämaa, määränpäämaa, kuljetustapa tai erän suuruus;

b) toimijoiden asema kaupan pitämisen ketjussa, toimijoiden kaupan pitämä määrä ja/tai arvo, toimijoiden kaupan pitämät öljyluokat, kaupallisen toiminnan tyyppi, kuten puristus, varastointi, jalostus, sekoittaminen, pakkaaminen tai vähittäismyynti;

c) aiemmissa tarkastuksissa tehdyt havainnot mukaan lukien puutteiden lukumäärä ja tyyppi, kaupan pidettyjen öljyjen tavanomainen laatu tai käytettävien teknisten laitteiden suorituskyky;

d) toimijoiden laadunvarmistusjärjestelmien tai omavalvonnan luotettavuus kaupan pitämisen vaatimusten mukaisuuden osalta;

e) tarkastuksentehopaikka, erityisesti jos se on unioniin saapumispaikka, unionista lähtöpaikka tai paikka, jossa öljyt tuotetaan, kauppakunnostetaan, lastataan tai myydään loppukuluttajalle;

f) muut tiedot, jotka voivat osoittaa vaatimustenvastaisuusriskin.

4. Jäsenvaltioiden on vahvistettava etukäteen

a) erien vaatimustenvastaisuusriskin arviointiperusteet;

b) kunkin riskiluokan riskianalyysin perusteella toimijoiden tai erien ja/tai määrien vähimmäismäärät, joille on tehtävä vaatimustenmukaisuustarkastus.

Tuhatta jäsenvaltiossa kaupan pidettyä oliiviöljytonnia kohden on tehtävä vuosittain vähintään yksi vaatimustenmukaisuustarkastus.

5. Jäsenvaltioiden on varmistettava vaatimustenmukaisuus

a) tekemällä liitteessä I säädetyt määritykset missä tahansa järjestyksessä; tai

b) seuraamalla päätöksentekokaaviota koskevassa liitteessä I b säädettyä järjestystä, kunnes päästään johonkin kyseisessä kaaviossa mainittuun päätökseen.

▼M19 —————

▼M25

3 artikla

Jos havaitaan, ettei öljy vastaa luokan kuvausta, asianomaisen jäsenvaltion on sovellettava tehokkaita, oikeasuhteisia ja varoittavia seuraamuksia, jotka vahvistetaan havaitun poikkeaman vakavuuden mukaisesti, sanotun kuitenkaan rajoittamatta muiden mahdollisten seuraamusten soveltamista.

Jos tarkastuksissa havaitaan merkittäviä poikkeamia, jäsenvaltion on lisättävä kaupanpitämisen vaiheen, öljyluokan, alkuperän tai muiden seikkojen tarkastuksia.

▼M5

4 artikla

▼M19

1. Jäsenvaltiot voivat hyväksyä maistajaraateja, jotta kansalliset viranomaiset tai niiden edustajat voivat arvioida ja valvoa aistinvaraisia ominaisuuksia.

Jäsenvaltioiden on vahvistettava hyväksymistä koskevat edellytykset etenkin siten, että:

— liitteessä XII olevan 4 kohdan edellytykset täyttyvät,

— raadin puheenjohtajan koulutuksesta vastaa laitos jäsenvaltion tässä tarkoituksessa hyväksymin edellytyksin,

— hyväksynnän pätevyys ratkaistaan jäsenvaltion käyttöönottamassa vuotuisessa valvontajärjestelmässä saatujen tulosten perusteella.

Kunkin jäsenvaltion on toimitettava komissiolle luettelo hyväksytyistä raadeista ja tämän kohdan mukaisesti toteutetuista toimenpiteistä.

▼M5

2. Jos jäsenvaltiolla on vaikeuksia maistajien raadin perustamisessa omalle alueelleen, se voi käyttää toisen jäsenvaltion hyväksyttyä maistajien raatia.

3. Kunkin jäsenvaltion on laadittava luettelo ammattijärjestöjen tai ammattien välisten järjestöjen 1 kohdan edellytysten mukaisesti perustamista maistajien raadeista ja niiden on valvottava näiden edellytysten noudattamista.

▼M19 —————

▼B

6 artikla

1. Oliiviöljyn erottamisesta syntyneen öljykakun ja muiden yhdistetyn nimikkeistön CN-koodeihin 2306 90 11 ja 2306 90 19 kuuluvien jätteiden öljypitoisuus määritetään liitteen XV menetelmän mukaisesti.

2. Edellä 1 kohdassa tarkoitettu öljypitoisuus ilmaistaan öljyn painoprosenttina kuiva-aineesta.

▼M20

7 artikla

Haitallisten aineiden osalta sovelletaan niiden esiintymistä koskevia yhteisön säännöksiä.

Halogeeniliuottimien pitoisuuden osalta raja-arvot ovat kaikkien oliiviöljyluokkien osalta seuraavat:

— Kunkin havaitun halogeeniliuottimen enimmäispitoisuus 0,1 mg/kg

— Havaittujen halogeeniliuottimien summan enimmäispitoisuus 0,2 mg/kg

▼M25

7 a artikla

Luonnollisten henkilöiden, oikeushenkilöiden tai henkilöryhmittymien, joilla on hallussaan oliiviöljyä tai oliivin puristemassaöljyä jossakin vaiheessa puristamosta pullotusvaiheeseen mihin tahansa ammatillisiin tai kaupallisiin tarkoituksiin, on pidettävä jokaisen öljyluokan osalta kirjaa varastoonvienneistä ja varastostapoistoista.

Jäsenvaltion on varmistettava, että ensimmäisessä kohdassa säädettyä velvollisuutta noudatetaan asianmukaisesti.

▼M25

8 artikla

1. Jäsenvaltioiden on annettava tämän asetuksen täytäntöönpanotoimenpiteet komissiolle tiedoksi. Niiden on ilmoitettava komissiolle kaikista myöhemmistä muutoksista.

2. Jäsenvaltioiden on vuosittain viimeistään 31 päivänä toukokuuta annettava komissiolle kertomus tämän asetuksen täytäntöönpanosta edellisenä kalenterivuonna. Kertomuksessa on oltava vähintään oliiviöljyille tehtyjen vaatimustenmukaisuustarkastusten tulokset, jotka on ilmoitettava liitteessä XXI esitetyn mallin mukaisesti.

3. Tässä asetuksessa tarkoitetut ilmoitukset on tehtävä komission asetuksen (EY) N:o 792/2009 ( 1 ) mukaisesti.

▼B

9 artikla

Kumotaan asetus (ETY) N:o 1058/77.

10 artikla

1. Tämä asetus tulee voimaan seuraavana päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä. Liitteen XII menetelmä on kuitenkin otettava käyttöön ►M1 1 päivästä marraskuuta 1992 ◄ , interventioon liittyviä toimia lukuun ottamatta.

▼M5

Tämä menetelmä ei koske ennen 1 päivää marraskuuta 1992 pakattuja neitsytoliiviöljyjä.

▼B

2. Tämä asetus ei koske ennen tämän asetuksen voimaantuloa pakattua ja 31 päivään lokakuuta 1992 asti kaupan pidettyä oliiviöljyä tai uutettua oliiviöljyä.

Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa.









LIITTEET

Yhteenveto







Liite I Oliiviöljyjen ominaisuudet Liite I a Näytteenotto oliiviöljyistä tai oliivin puristemassaöljyistä, jotka toimitetaan tuotteeseen suorassa kosketuksessa olevissa pakkauksissa Liite I b Päätöksentekojärjestelmä sen todentamiseksi, onko oliiviöljynäyte ilmoitetun luokan mukainen Liite II Vapaiden rasvahappojen määrittäminen kylmämenetelmällä Liite III Peroksidiluvun määrittäminen Liite IV Vahapitoisuuden määrittäminen kapillaarikaasukromatografisella menetelmällä Liite V Sterolien ja triterpeenidialkoholien rakenteen ja pitoisuuden määrittäminen kapillaarikaasukromatografisella menetelmällä Liite VII ►M21 2-glyseryylimonopalmitaatin prosenttiosuuden määrittäminen ◄ ▼M20 ————— ▼B Liite IX Spektrofotometrinen määritys ultraviolettivalossa ▼M28 Liite X Rasvahappojen metyyliestereiden määrittäminen kaasukromatografisella menetelmällä ▼B Liite XI Haihtuvien halogeeniliuottimien pitoisuuden määrittäminen oliiviöljystä Liite XII Kansainvälisen oliivineuvoston menetelmä neitsytoliiviöljyjen aistinvaraista arviointia varten ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Liite XV Oliivijätteen öljypitoisuus Liite XVI Jodiluvun määrittäminen Liite XVII Menetelmä stigmastadieenien määrittämiseksi kasviöljyistä Liite XVIII ECN42-Triasyyliglyserolien teoreettisen koostumuksen ja todellisen koostumuksen välisen eron määritys Liite XIX ►M28 Alifaattisten alkoholien ja triterpeenialkoholien pitoisuuden määrittäminen kapillaarikaasukromatografisella menetelmällä ◄ ▼M23 Liite XX Vahojen, rasvahappojen metyyliestereiden ja rasvahappojen etyyliestereiden pitoisuuksien määrittäminen kapillaarikaasukromatografiamenetelmällä ▼M28 ————— ▼M25 Liite XXI 8 artiklan 2 kohdassa tarkoitetut oliiviöljyille tehtyjen vaatimustenmukaisuustarkastusten tulokset

▼M27









LIITE I

OLIIVIÖLJYJEN OMINAISUUDET







Luokka Rasva-happojen etyyliesterit (FAEE) (*) Happopitoisuus (%) (*) Peroksidiluku mEq O2/kg (*) Vahat mg/kg (**) 2-glyseryylimono-palmitaatti (%) Stigmastadieenit mg/kg (1) HPLC:llä määritetyn ja teoreettisesti lasketun ECN42:n välinen ero K232 (*) K268 tai K270 (*) δ-K (*) Aistinvarainen arvio Virheen mediaani (Md) (*) Aistinvarainen arvio Hedelmäisyyden mediaani (Mf) (*) 1. Ekstra-neitsytoliiviöljy FAEE ≤ 40 mg/kg (2013–2014 satovuosi) (2) FAEE ≤ 35 mg/kg (2014–2016 satovuosi) FAEE ≤ 30 mg/kg (satovuodesta 2016 eteenpäin) ≤ 0,8 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % > 14 % 2. Neitsytoliiviöljy — ≤ 2,0 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % > 14 % 3. Lamppuoliiviöljy — > 2,0 — C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (3) ≤ 0,9 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ |0,3| — — — Md > 3,5 (4) — ≤ 1,1 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % > 14 % 4. Jalostettu oliiviöljy — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % > 14 % 5. Jalostetusta oliiviöljystä ja neitsytoliiviöljystä valmistettu oliiviöljy — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % > 14 % 6. Raaka oliivin puristemassaöljy — — — C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (5) ≤ 1,4 — ≤ |0,6| — — — — — 7. Jalostettu oliivin puristemassaöljy — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,4 — ≤ |0,5| — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Oliivin puristemassaöljy — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,2 — ≤ |0,5| — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Isomeerien kokonaismäärä, joka voidaan (tai jota ei voida) erottaa kapillaarikolonnin avulla. (2) Rajaa sovelletaan 1 päivästä maaliskuuta 2014 alkaen tuotettuihin oliiviöljyihin. (3) Kun öljyn vahapitoisuus on 300–350 mg/kg, öljyä pidetään lamppuöljynä, jos alifaattisten alkoholien kokonaispitoisuus on enintään 350 mg/kg tai jos erytrodioli- ja uvaolipitoisuus on enintään 3,5 prosenttia. (4) Virheen mediaani voi olla 3,5 tai sen alle ja hedelmäisyyden mediaani 0. (5) Kun öljyn vahapitoisuus on 300–350 mg/kg, öljyä pidetään raakana oliivin puristemassaöljynä, jos alifaattisten alkoholien kokonaispitoisuus on yli 350 mg/kg ja jos erytrodioli- ja uvaolipitoisuus on yli 3,5 prosenttia.







Luokka Rasvahappokoostumus (1) Transoleiiniisomeerien summa (%) Translinoliisomeerien ja translinoleeniisomeerien summa (%) Sterolikoostumus Kokonaissterolit (mg/kg) Erytrodioli ja uvaoli (%) (**) Myristiinihappo (%) Linoleenihappo (%) Arakidonihappo (%) Eikoseenihappo (%) Beheenihappo (%) Lignoseriinihappo (%) Kolesteroli (%) Brassikasteroli (%) Kampesteroli (2) (%) Stigmasteroli (%) Näenn. β-sitosterolipit (3) (%) (**) δ-7- stigmastenoli (2) (%) 1. Ekstra-neitsytoliiviöljy ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Neitsytoliiviöljy ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Lamppuoliiviöljy ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (4) 4. Jalostettu oliiviöljy ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Jalostetusta oliiviöljystä ja neitsytoliiviöljystä valmistettu oliiviöljy ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Raaka oliivin puristemassaöljy ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (5) 7. Jalostettu oliivin puristemassaöljy ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Oliivin puristemassaöljy ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 (1) Muiden rasvahappojen pitoisuus (%): palmitiinihappo: 7,50–20,00; palmitoleiinihappo: 0,30–3,50; heptadekaanihappo: ≤ 0,30; heptadekeenihappo: ≤ 0,30; steariinihappo: 0,50–5,00; oleiinihappo: 55,00–83,00; linolihappo: 2,50–21,00. (2) Ks. tämän liitteen lisäys. (3) Näennäinen β-sitosterolipitoisuus: δ-5,23-stigmastadienoli + klerosteroli + β-sitosteroli + sitostanoli + δ-5-avenasteroli + δ-5,24-stigmastadienoli. (4) Kun öljyn vahapitoisuus on 300–350 mg/kg, öljyä pidetään lamppuöljynä, jos alifaattisten alkoholien kokonaispitoisuus on enintään 350 mg/kg tai jos erytrodioli- ja uvaolipitoisuus on enintään 3,5 prosenttia. (5) Kun öljyn vahapitoisuus on 300–350 mg/kg, öljyä pidetään raakana oliivin puristemassaöljynä, jos alifaattisten alkoholien kokonaispitoisuus on yli 350 mg/kg tai jos erytrodioli- ja uvaolipitoisuus on yli 3,5 prosenttia.

Huomautukset:

a) Analyysitulokset on ilmaistava yhtä monen desimaalin tarkkuudella kuin kunkin ominaisuuden osalta esitetään. Viimeinen luku on pyöristettävä yhdellä yksiköllä ylöspäin, jos sitä seuraava luku on suurempi kuin 4.

b) Jos öljyn yksikin ominaisuus poikkeaa annetuista arvoista, öljyn luokka muutetaan tai todetaan, ettei öljy täytä tässä asetuksessa säädettyjä puhtausvaatimuksia.

c) Öljyyn laatuun viittaavat tähdellä (*) merkityt ominaisuudet tarkoittavat seuraavaa: – lamppuoliiviöljyn ei tarvitse täyttää kaikkia raja-arvoja koskevia vaatimuksia samanaikaisesti, – jos neitsytoliiviöljy ei täytä jotain raja-arvoa koskevaa vaatimusta, öljyn luokka muutetaan, mutta se säilyy edelleen luokiteltuna johonkin neitsytoliiviöljyluokista.

d) Kaksi tähteä (**) oliiviöljyn jonkin laatuominaisuuden kohdalla tarkoittaa, että oliivin puristemassaöljyjen ei tarvitse täyttää kaikkia raja-arvoja koskevia vaatimuksia samanaikaisesti.









Lisäys

PÄÄTÖKSENTEKOJÄRJESTELMÄ

Kampesterolia koskeva päätöksentekokaavio neitsytoliiviöljyä ja ekstra-neitsytoliiviöljyä varten:

Muiden parametrien on vastattava asetuksen mukaisia rajoja.

δ-7-stigmastenolia koskeva päätöksentekojärjestelmä:

— ekstra-neitsytoliiviöljyä ja neitsytoliiviöljyä varten —

Muiden parametrien on vastattava asetuksen mukaisia rajoja.

— oliivin puristemassaöljyä varten (raaka ja jalostettu) —

▼M26









LIITE I a

NÄYTTEENOTTO OLIIVIÖLJYISTÄ TAI OLIIVIN PURISTEMASSAÖLJYISTÄ, JOTKA TOIMITETAAN TUOTTEESEEN SUORASSA KOSKETUKSESSA OLEVISSA PAKKAUKSISSA

Tätä näytteenottomenetelmää sovelletaan oliiviöljy- tai oliivin puristemassaöljyeriin, jotka toimitetaan suorassa kosketuksessa tuotteeseen olevissa pakkauksissa. Näytteenottomenetelmä vaihtelee sen mukaan, onko suorassa kosketuksessa tuotteeseen olevan pakkauksen vetoisuus yli viisi litraa vai ei.

Ilmaisulla ”erä” tarkoitetaan kaikkia myyntiyksiköitä, jotka on tuotettu, valmistettu ja pakattu sellaisissa olosuhteissa, että kunkin tällaisen myyntiyksikön sisältämää öljyä pidetään yhdenmukaisena kaikkien analyyttisten ominaisuuksien osalta. Erä on yksilöitävä Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivin 2011/91/EU ( 2 ) mukaisesti.

”Näyteyksiköllä” tarkoitetaan tuotteeseen kosketuksessa olevaan pakkaukseen sisältyvää öljymäärää, joka otetaan erästä satunnaisotannalla.

1. PERUSNÄYTTEEN SISÄLTÖ

1.1. Tuotteeseen kosketuksessa olevat, vetoisuudeltaan enintään viiden litran pakkaukset

Tuotteeseen kosketuksessa olevista, vetoisuudeltaan enintään viiden litran pakkauksista otetulla ”perusnäytteellä” tarkoitetaan erästä taulukon 1 mukaisesti otettujen näyteyksiköiden lukumäärää.







Taulukko 1 Perusnäytteen vähimmäiskoko muodostetaan seuraavasti Jos tuotteeseen kosketuksessa olevien pakkausten vetoisuus on Perusnäytteeksi valitaan a) vähintään 1 litra a) yhden tuotteeseen kosketuksessa olevan pakkauksen öljy b) alle 1 litra. b) pienin mahdollinen määrä pakkauksia, joiden vetoisuus yhteensä on vähintään 1,0 litraa.

Jokainen jäsenvaltio voi lisätä perusnäytteen muodostavien taulukossa 1 tarkoitettujen pakkausten määrää omien tarpeidensa mukaan (esimerkiksi, jotta aistinvaraisen arvioinnin voi tehdä eri laboratorio kuin kemialliset analyysit, vastamäärityksiä varten jne.).

1.2. Tuotteeseen kosketuksessa olevat, vetoisuudeltaan yli viiden litran pakkaukset

Tuotteeseen kosketuksessa olevista, vetoisuudeltaan yli viiden litran pakkauksista otetulla ”perusnäytteellä” tarkoitetaan edustavaa otosta kaikista näyteyksiköistä, jotka on saatu jakomenettelyn avulla ja taulukon 2 mukaisesti. Perusnäyte on muodostettava useista kappaleista.

Perusnäytteen ”kappaleella” tarkoitetaan kutakin perusnäytteeseen kuuluvaa pakkausta.







Taulukko 2 Valittavien näyteyksiköiden vähimmäismäärä Erään kuuluvien pakkausten lukumäärä Valittavien näyteyksiköiden vähimmäismäärä Enintään 10 1 11–150 2 151–500 3 501–1 500 4 1 501 –2 500 5 > 2 500 , tuhatta pakkausta kohden 1 ylimääräinen näyteyksikkö

Jotta tuotteeseen kosketuksessa olevien pakkausten näytteenoton määrää voidaan pienentää, näyteyksiköiden sisältö homogenisoidaan perusnäytteen valmistamiseksi. Eri näyteyksiköiden annokset kaadetaan yhteen säiliöön ja homogenisoidaan sekoittamalla siten, että näyte suojataan ilmalta mahdollisimman hyvin.

Perusnäytteen sisältö kaadetaan useisiin, vetoisuudeltaan vähintään 1,0 litran pakkauksiin, joista jokainen muodostaa perusnäytteen kappaleen.

Jokainen jäsenvaltio voi lisätä perusnäytteiden lukumäärää omien tarpeidensa mukaan (esimerkiksi, jotta aistinvaraisen arvioinnin voi tehdä eri laboratorio kuin kemialliset analyysit, vastamäärityksiä varten jne.).

Jokainen pakkaus on täytettävä siten, että pintaan jäävä ilmakerros on mahdollisimman pieni, ja pakkaus on suljettava asianmukaisesti ja sinetöitävä sen varmistamiseksi, että tuotetta ei voida muuttaa.

Kappaleet on merkittävä siten, että ne voidaan tunnistaa virheettömästi.

2. MÄÄRITYKSET JA TULOKSET

2.1. Kukin perusnäyte jaetaan standardissa EN ISO 5555 olevan 2.5 kohdan mukaisesti laboratorionäytteiksi, ja perusnäytteet määritetään liitteessä I b annetun päätöksentekojärjestelmän mukaisessa järjestyksessä tai muussa satunnaisessa järjestyksessä.

2.2. Jos määritysten kaikki tulokset vastaavat ilmoitetun öljyluokan ominaisuuksia, koko kyseinen erä on todettava vaatimusten mukaiseksi. Jos määritysten yksikin tulos ei vastaa ilmoitetun öljyluokan ominaisuuksia, koko kyseinen erä on todettava vaatimusten vastaiseksi.

3. ERÄN LUOKAN TARKISTAMINEN

3.1. Toimivaltainen viranomainen voi lisätä erän eri kohdista otettujen perusnäytteiden lukumäärää erän luokan tarkistamiseksi seuraavan taulukon mukaisesti:



Taulukko 3 Erän koon mukaan määritettävä perusnäytteiden lukumäärä Erän koko (litroina) Perusnäytteiden lukumäärä Alle 7 500 2 7 500 :sta alle 25 000 :een 3 25 500 :sta alle 75 000 :een 4 75 000 :sta alle 125 000 :een 5 125 000 ja sitä enemmän 6 + 1 kutakin 50 000 :ta litraa kohden Jokainen perusnäytteen muodostava näyteyksikkö on otettava samasta kohdasta erää; jokaisen perusnäytteen sijainti on merkittävä muistiin, ja siihen on laitettava selkeät tunnisteet. Jokainen perusnäyte muodostetaan 1.1 ja 1.2 kohdassa tarkoitettujen menettelyjen mukaisesti. Sen jälkeen jokaiselle perusnäytteelle tehdään 2 artiklan 1 kohdassa tarkoitetut määritykset.

3.2. Jos 2 artiklan 1 kohdassa tarkoitettujen määritysten tulokset eivät vähintään yhden perusnäytteen osalta vastaa ilmoitetun öljyluokan ominaisuuksia, koko kyseinen erä on todettava vaatimusten vastaiseksi.









LIITE I b

PÄÄTÖKSENTEKOJÄRJESTELMÄ SEN TODENTAMISEKSI, ONKO OLIIVIÖLJYNÄYTE ILMOITETUN LUOKAN MUKAINEN

Taulukko 1

Taulukko 2

Taulukko 3









Lisäys 1







Tämän asetuksen liitteiden ja päätöksentekokaaviossa tarkoitettujen määritysten väliset vastaavuudet — Happopitoisuus Liite II Vapaiden rasvahappojen määrittäminen kylmämenetelmällä — Peroksidiluku Liite III Peroksidiluvun määrittäminen — Spektrofotometrinen määritys ultraviolettivalossa Liite IX Spektrofotometrinen määritys — Aistinvarainen arviointi Liite XII Neitsytoliiviöljyn aistinvarainen arviointi — Etyyliesterit Liite XX Vahojen, rasvahappojen metyyliestereiden ja rasvahappojen etyyliestereiden pitoisuuksien määrittäminen kapillaarikaasukromatografisella menetelmällä — Stigmasta-3,5-dieeni Liite XVII Menetelmä stigmastadieenien määrittämiseksi kasviöljyistä ▼M28 — Rasvahappojen trans-isomeerit Liite X Rasvahappojen metyyliesterien määrittäminen kaasukromatografisella menetelmällä — Rasvahappojen koostumus Liite X Rasvahappojen metyyliesterien määrittäminen kaasukromatografisella menetelmällä ▼M26 — δ-ECN42 Liite XVIII ECN42:ta sisältävien triglyseridien koostutuksen määrittäminen (teoreettisen koostumuksen ja todellisen koostumuksen välinen ero) — Sterolien koostumus ja kokonaissterolit — Erytrodioli ja uvaoli Liite V Sterolien ja triterpeenidialkoholien rakenteen ja pitoisuuden määrittäminen kapillaarikaasukromatografisella menetelmällä — Vahat Liite IV Vahapitoisuuden määrittäminen kapillaarikaasukromatografisella menetelmällä ▼M28 — Alifaattiset alkoholit ja triterpeenialkoholit Liite XIX Alifaattisten alkoholien ja triterpeenialkoholien pitoisuuden määrittäminen kapillaarikaasukromatografisella menetelmällä ▼M26 — 2-asemassa olevat tyydyttyneet rasvahapot Liite VII 2-glyseryylimonopalmitaatin prosenttiosuuden määrittäminen

▼M29









LIITE II

VAPAIDEN RASVAHAPPOJEN MÄÄRITTÄMINEN KYLMÄMENETELMÄLLÄ

1. TARKOITUS JA SOVELTAMISALA

Tässä menetelmässä selostetaan vapaiden rasvahappojen määrittäminen oliiviöljyissä ja oliivin puristemassaöljyissä. Vapaiden rasvahappojen pitoisuus ilmaistaan öljyhappoprosentteina laskettuna happamuutena.

2. PERIAATE

Näyte liuotetaan liuotinseokseen ja vapaat rasvahapot titrataan kaliumhydroksidi- tai natriumhydroksidiliuoksella.

3. REAGENSSIT

Kaikkien reagenssien on oltava määritykseen hyväksyttyä analyysilaatua ja veden on oltava joko tislattua tai vastaavaa puhtausastetta.

3.1 Dietyylieetteri; 95-prosenttinen etanoli (v/v), yhtä suuret tilavuusosat kumpaakin. Seos, johon on lisätty 0,3 ml fenoliftaleiiniliuosta (3.3) 100 ml:aan, neutraloidaan juuri ennen käyttöä kaliumhydroksidiliuoksella (3.2). Huomautus 1: Dietyylieetteri on helposti syttyvää ja voi muodostaa räjähtäviä peroksideja. Sen käytössä on oltava erittäin varovainen. Huomautus 2: Jos ei voida käyttää dietyylieetteriä, voidaan käyttää etanolin ja tolueenin seosta. Etanoli voidaan tarvittaessa korvata 2-propanolilla.

3.2 Kalium- tai natriumhydroksidi titrattuna etanoli- tai vesiliuoksena, c(KOH) [tai c(NaOH9] noin 0,1 mol/l tai tarvittaessa c(KOH) [tai c(NaOH)] noin 0,5 mol/l. Kaupallisia liuoksia on saatavilla. Kaliumhydroksidiliuoksen (tai natriumhydroksidiliuksen) tarkka väkevyys on tunnettava ja tarkistettava juuri ennen käyttöä. Käytetään liuosta, joka on valmistettu vähintään viisi vuorokautta ennen käyttöä ja dekantoitu ruskeaan lasipulloon, jossa on kumitulppa. Liuoksen on oltava väritöntä tai oljenkeltaista. Jos kaliumhydroksidin (tai natriumhydroksidin) vesiliuosta käytettäessä havaitaan faasien erottumista, vesiliuos on korvattava etanoliliuoksella. Huomautus 3: Väritön, stabiili kaliumhydroksidiliuos (tai natriumhydroksidiliuos) voidaan valmistaa seuraavasti: Kuumennetaan kiehuvaksi 1 000 ml etanolia tai vettä, johon on lisätty 8 g kaliumhydroksidia (tai natriumhydroksidia) ja 0,5 g alumiinilastuja, ja keitetään seosta yksi tunti palautusjäähdyttimen kanssa. Tislataan välittömästi. Tisleeseen liuotetaan tarvittava määrä kaliumhydroksidia (tai natriumhydroksidia). Annetaan seistä useita vuorokausia ja dekantoidaan kirkas neste, joka on kaliumkarbonaattisakan (tai natriumkarbonaattisakan) yläpuolella. Liuos voidaan myös valmistaa ilman tislausta seuraavasti: lisätään 4 ml alumiinibutylaattia 1 000 ml:aan etanolia (tai vettä) ja seoksen annetaan seistä joitakin vuorokausia. Dekantoidaan seoksen yläpuolella oleva neste ja liuotetaan tarvittava määrä kaliumhydroksidia (tai natriumhydroksidia). Liuos on käyttövalmis.

3.3 Fenoliftaleiiniliuos 10 mg fenoliftaleiiniä litrassa 95–96-prosenttista etanolia (v/v) tai 20 g alkalisinistä 6B tai tymolftaleiiniä litrassa 95–96-prosenttista etanolia (v/v). Kun on kyse voimakkaan värisistä öljyistä, on käytettävä alkalisinistä tai tymolftaleiiniä.

4. VÄLINEISTÖ

Tavanomainen laboratoriovälineistö ja erityisesti:

4.1 Analyysivaaka

4.2 Erlenmeyerpullo, 250 ml

4.3 Byretti, 10 ml, A luokka, mitta-asteikon jakoväli 0,05 ml, tai vastaavanlainen automaattibyretti.

5. MENETTELY

5.1 Testinäytteen esikäsittely

Jos liuos on sameaa, se on suodatettava.

5.2 Näyte

Näyte otetaan oletetun happamuuden perusteella seuraavan taulukon mukaan:







Oletettu happamuus (öljyhappo g/100 g) Näytemäärä (g) Näytteen punnitustarkkuus (g) 0–2 10 0,02 > 2–7,5 2,5 0,01 > 7,5 0,5 0,001

Näyte punnitaan erlenmeyerpullossa (4.2).

5.3 Määritys

Näyte (5.2) liuotetaan 50–150 ml:aan ennalta neutraloitua dietyylieetteri/etanoli-seosta (3.1).

Titrataan, koko ajan sekoittaen, 0,1 mol/l kaliumhydroksidiliuoksella (tai natriumhydroksidiliuoksella (3.2) (ks. Huom. 4), kunnes indikaattorin väri muuttuu (värjäytyneen indikaattorin väri säilyy vähintään 10 sekunnin ajan).

Huomautus 4: Jos tarvittavan 0,1 mol/l -kaliumhydroksidiliuoksen (tai natriumhydroksidiliuoksen) määrä on yli 10 ml, on käytettävä 0,5 mol/l -liuosta tai muutettava näytemäärää oletetun vapaiden happojen pitoisuuden ja ehdotetun taulukon mukaisesti.

Huomautus 5: Jos liuos samenee titrattaessa, liuotinseosta (3.1) lisätään tarpeen mukaan, kunnes liuos on kirkasta.

Toinen määritys tehdään ainoastaan siinä tapauksessa, että ensimmäinen tulos on korkeampi kuin kyseiselle öljyn luokalle asetettu raja.

6. TULOSTEN ILMOITTAMINEN

Happamuus öljyhapon painoprosentteina ilmaistuna on:

jossa

V = käytetyn titratun kaliumhydroksidiliuoksen (tai natriumhydroksidiliuoksen) määrä millilitroina;

c = käytetyn titratun kaliumhydroksidiliuoksen (tai natriumhydroksidiliuoksen) tarkka pitoisuus moolia/litra;

M = 282 g/mol, öljyhapon moolimassa g/mol;

m = näytteen massa grammoina.

Öljyhappopitoisuus ilmoitetaan seuraavasti:

a) kahden desimaalin tarkkuudella, kun arvo on 0–1;

b) yhden desimaalin tarkkuudella, kun arvo on 1–100.

▼M30









LIITE III

PEROKSIDILUVUN MÄÄRITTÄMINEN

1. Soveltamisala

Tässä liitteessä kuvataan eläin- ja kasviöljyjen ja -rasvojen peroksidiluvun määritysmenetelmä.

2. Määritelmä

Peroksidiluku ilmaisee näytteessä olevien kaliumjodidia hapettavien aineiden määrän (ilmaistuna aktiivisen hapen milliekvivalentteina kilogrammaa kohti) tässä kuvatuissa koeolosuhteissa.

3. Periaate

Näyte liuotetaan etikkahapon ja kloroformin seokseen ja käsitellään kaliumjodidilla. Vapautuva jodi titrataan normalisoidulla natriumtiosulfaattiliuoksella.

4. Välineistö

Käytettävien laitteiden on oltava puhtaita siten, että niissä ei ole mitään hapettavia tai pelkistäviä aineita.

Huom. 1: Hiottuja lasipintoja ei saa rasvata.

4.1 Punnituslasi, 3 ml

4.2 Lasipulloja, vetoisuus noin 250 ml, hiotut suut ja tulpat, etukäteen kuivattu ja täytetty puhtaalla, kuivalla inerttikaasulla (typellä tai mieluummin hiilidioksidilla).

4.3 Byretti, vetoisuus 5 ml, 10 ml tai 25 ml, mitta-asteikon jakoväli vähintään 0,05 ml, mieluiten automaattinen nollatason säätö, tai vastaavanlainen automaattibyretti.

4.4 Analyysivaaka.

5. Reagenssit

5.1 Analyysilaatuinen kloroformi, josta happi on poistettu puhtaalla, kuivalla inerttikaasuvirralla tapahtuvalla kaasuhuuhtelulla.

5.2 Analyysilaatuinen jääetikka, josta happi on poistettu puhtaalla, kuivalla inerttikaasuvirralla tapahtuvalla kaasuhuuhtelulla.

5.3 Kaliumjodidin tuore, kyllästetty vesiliuos, joka ei sisällä jodia eikä jodaatteja. Liuotetaan noin 14 g kaliumjodidia noin 10 millilitraan vettä huoneenlämmössä.

5.4 Natriumtiosulfaatin vesiliuos 0,01 mol/l (vastaa 0,01 N), normalisoitu huolellisesti juuri ennen käyttöä. Valmistetaan päivittäin 0,01 mol/l natriumtiosulfaattiliuos 0,1 mol/l natriumtiosulfaatin standardiliuoksesta ennen käyttöä, tai määritetään tarkka normaalisuus. Kuten kokemus osoittaa, stabiilisuus on rajallinen ja riippuu pH-arvosta ja vapaan hiilidioksidin pitoisuudesta. Laimennukseen käytetään vain juuri keitettyä vettä, joka on mahdollisesti puhdistettu typen avulla. Jäljempänä kuvattavaa menetelmää suositellaan natriumtiosulfaattiliuoksen tarkan normaalisuuden määrittämiseksi: Punnitaan 0,001 g:n tarkkuudella 0,27–0,33 g kaliumjodaattia (mKIO3) mittapulloon (250 ml tai 500 ml) ja täytetään pullo vastakeitetyllä, huoneenlämpöiseksi jäähdytetyllä vedellä (V2). Pipetoidaan 5 ml tai 10 ml tätä kaliumjodaattiliuosta (V1) 250 ml:n erlenmeyerpulloon. Lisätään 60 ml vastakeitettyä vettä, 5 ml 4-molaarista suolahappoa ja 25–50 mg kaliumjodidia tai 0,5 ml kyllästettyä kaliumjodidiliuosta. Tämä liuos titrataan natriumtiosulfaattiliuoksella (V3) natriumtiosulfaattiliuoksen tarkan normaalisuuden määrittämiseksi. jossa mKIO3 on kaliumjodaatin massa grammoina V1 on kaliumjodaattiliuoksen tilavuus millilitroina (5 ml tai 10 ml) V2 on kaliumjodaattiliuoksen kokonaistilavuus millilitroina (250 ml tai 500 ml) V3 on natriumtiosulfaattiliuoksen tilavuus millilitroina wKIO3 on kaliumjodaatin puhtaus g/100 g mKIO3 on kaliumjodaatin molekyylimassa (214 g/mol) T on natriumtiosulfaattiliuoksen tarkka normaalisuus (mol/l).

5.5 Tärkkelysliuos, 10 g/l vesidispersio, liukoisesta luonnon tärkkelyksestä valmistettu tuore liuos. Voidaan käyttää myös vastaavia reagensseja.

6. Näyte

Huolehditaan siitä, että näyte otetaan ja säilytetään pimeässä ja kylmässä, ja että sen lasisissa säilytysastioissa ei ole tyhjää tilaa. Astiat on suljettava ilmatiiviisti joko hiotuilla lasitulpilla tai korkilla.

7. Menettely

Määritys tehdään hajapäivänvalossa tai keinovalossa. Näyte punnitaan 0,001 g:n tarkkuudella punnituslasissa (4.1) tai, ellei sellaista ole, pullossa (4.2). Tarvittava näytemäärä riippuu oletetusta peroksidiluvusta seuraavan taulukon mukaan:







Oletettu peroksidiluku (meq) Näytemäärä (g) 0–12 5,0–2,0 12–20 2,0–1,2 20–30 1,2–0,8 30–50 0,8–0,5 50–90 0,5–0,3

Avataan pullo (4.2) ja asetetaan sisään punnituslasi, jossa on näyte. Lisätään 10 ml kloroformia (5.1). Liuotetaan näyte nopeasti sekoittaen. Lisätään 15 ml etikkahappoa (5.2), sitten 1 ml kaliumjodidiliuosta (5.3). Suljetaan pullo nopeasti, ravistetaan yksi minuutti ja annetaan seistä tasan viisi minuuttia pimeässä 15–25 °C:n lämpötilassa.

Lisätään noin 75 ml tislattua vettä. Vapautunut jodi titrataan natriumtiosulfaattiliuoksella (5.4) voimakkaasti sekoittaen ja käytetään tärkkelysliuosta (5.5) indikaattorina.

Samasta näytteestä tehdään kaksi määritystä.

Sokeakoe tehdään samanaikaisesti. Jos sen tulos on suurempi kuin 0,05 ml 0,01 N natriumtiosulfaattiliuosta (5.4), ovat reagenssit olleet epäpuhtaita ja ne on vaihdettava.

8. Tulosten ilmoittaminen

Peroksidiluku (PV), ilmaistuna aktiivisen hapen milliekvivalentteina kilogrammaa kohti, saadaan kaavasta:

jossa

V = määritykseen käytetyn normalisoidun natriumtiosulfaattiliuoksen (5.4) määrä millilitroina, korjattuna sokeakokeen tuloksilla;

T = määritykseen käytetyn natriumtiosulfaattiliuoksen (5.4) tarkka normaalisuus (mol/l);

m = näytteen massa grammoina.

Tulos on kahden määrityksen tulosten aritmeettinen keskiarvo.

Määrityksen tulos ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.

▼M21









LIITE IV

VAHAPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN KAPILLAARIKAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ

1. TARKOITUS

Tällä menetelmällä määritetään oliiviöljyjen vahapitoisuus. Vahat eroavat toisistaan hiiliatomien lukumäärän suhteen. Tätä menetelmää voidaan käyttää erityisesti tekemään ero puristamalla saadun oliiviöljyn ja puristemassasta saadun öljyn välillä.

2. PERIAATE

Rasva, johon on lisätty soveltuva sisäinen standardi, fraktioidaan kromatografisesti hydratoitua silikageeliä sisältävässä kolonnissa; koeolosuhteissa ensimmäisenä eluoitunut jae (jonka polaarisuus on triglyseridien polaarisuutta heikompi) otetaan talteen ja määritetään suoraan kapillaarikaasukromatografian avulla.

3. VÄLINEISTÖ

3.1 Erlenmeyer-pullo, 25 ml.

3.2 Lasikolonni kaasukromatografiaa varten, sisähalkaisija 15,0 mm ja pituus 30–40 cm, varustettu hanalla.

3.3 Soveltuva kaasukromatografialaitteisto, joka toimii kapillaarikolonnin kanssa ja jossa on suoraan kolonniin johtava näytteensyöttöjärjestelmä. Laitteiston osat ovat: 3.3.1 termostaattisäätöinen lämpötilaohjelmoitu uuni kolonnille, 3.3.2 kylmäinjektori, näytteen syöttämiseksi suoraan kolonniin, 3.3.3 liekki-ionisaatiodetektori ja muuntajavahvistin, 3.3.4 integroiva piirturi, joka toimii muuntajavahvistimen (3.3.3) kanssa ja jonka vastenopeus on enintään 1 sekunti ja jonka paperin nopeutta voidaan säätää. (On myös mahdollista käyttää tietokonepohjaisia järjestelmiä, joissa kaasukromatografin tiedot saadaan tietokoneen avulla.) 3.3.5 lasinen tai kvartsilasinen kapillaarikolonni, jonka pituus on 8–12 m ja sisähalkaisija 0,25–0,32 mm ja jonka sisäpinta on päällystetty stationäärifaasilla siten, että nestekerroksen paksuus on 0,10–0,30 μm. (Käyttövalmiina ostettavat stationäärifaasit ovat tyyppiä SE 52 tai SE 54.)

3.4 Mikroruisku, kolonniin suoraan syöttämiseksi, 10 μl, jossa on kiinteä neula.

3.5 Sähkökäyttöinen sekoittaja.

3.6 Pyöröhaihduttaja.

3.7 Muhveliuuni.

3.8 Analyysivaaka, jonka tarkkuus ± 0,1 mg.

3.9 Laboratorion tavanomaiset lasivälineet.

4. REAGENSSIT

4.1 Silikageeliä, jonka hiukkaskoko 60–200 μm. Silikageeli laitetaan uuniin 500 °C:n lämpötilaan vähintään 4 tunniksi. Jäähdytetään ja lisätään vettä 2 % silikageelin määrästä. Sekoitetaan massan homogenoimiseksi. Säilytetään pimeässä vähintään 12 tuntia ennen käyttöä.

4.2 N-heksaani, kromatografialaatua.

4.3 Etyylieetteriä, kromatografialaatua.

4.4 N-heptaani, kromatografialaatua.

4.5 Lauryyliarakidaatin standardiliuos, 0,1 % (m/V) liuos heksaanissa (sisäinen standardi). (On myös mahdollista käyttää palmityylipalmitaattia tai myristyylistearaattia.) 4.5.1 Sudan 1 (1-fenyyliatso)-2-naftoli).

4.6 Kantajakaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua.

4.7 Apukaasut: — puhdas vety, kaasukromatografialaatua, — puhdas ilma, kaasukromatografialaatua.

5. SUORITUS

5.1 Kromatografiakolonnin esikäsittely

Suspendoidaan 15 g silikageeliä (4.1) n-heksaaniin (4.2) ja laitetaan kolonniin (3.2). Annetaan laskeutua itsestään ja autetaan laskeutumista sähkökäyttöisellä sekoittajalla (3.5), jotta saadaan homogeenisempi kromatografiakerros. Suodatetaan läpi 30 ml n-heksaania mahdollisten epäpuhtauksien poistamiseksi. Punnitaan vaa’alla (3.8) tarkasti 500 mg näytettä 25 ml:n erlenmeyerpulloon (3.1), lisätään sopiva määrä sisäistä standardia (4.5) oletetun vahapitoisuuden mukaan. Esimerkiksi: lauryyliarakidaattia lisätään 0,1 mg, jos on kyse oliiviöljystä, ja 0,25–0,5 mg, jos kyse on puristemassaöljystä. Siirretään näin valmistettu näyte kahden 2 ml:n n-heksaaniannoksen avulla kromatografiakolonniin (4.2).

Liuottimen annetaan valua, kunnes se on 1 mm absorboimisaineen pinnan yläpuolella, minkä jälkeen suodatetaan läpi 70 ml n-heksaania luonnostaan esiintyvien n-alkaanien poistamiseksi. Aloitetaan kromatografinen eluointi keräämällä 180 ml n-heksaani/etyylieetteriseosta, suhde 99:1, valumisnopeuden ollessa noin 15 tippaa 10 sekunnissa. Näyte eluoidaan lämpötilassa 22 °C ± 4.

Huom.

— N-heksaani/etyylieetteriseos, suhde 99:1, on valmistettava uudelleen joka päivä.

— Vahojen eluoitumisen tarkkailemiseksi silmämääräisesti liuosnäytteeseen on mahdollista lisätä 100 μl 1-prosenttista sudania eluutioliuoksessa. Koska sudanin retentioaika sijoittuu vahojen ja triglyseridien välille, eluointi keskeytetään, kun väri saavuttaa kromatografiakolonnin pohjan, sillä tällöin kaikki vahat ovat eluoituneet.

Tällä tavoin saatu jae kuivataan pyöröhaihduttimessa (3.6), kunnes lähes kaikki liuotin on saatu poistettua. Viimeiset 2 ml liuotinta poistetaan heikon typpivirtauksen avulla, minkä jälkeen lisätään 2–4 ml n-heptaania.

5.2 Kaasukromatografinen määritys

5.2.1 Esivalmistelut

Kolonni asennetaan kaasukromatografiin (3.3) siten, että alkupää yhdistetään on-column -järjestelmään ja loppupää detektoriin. Tarkistetaan kaasukromatografialaitteiden toimivuus (kaasuliitäntöjen kunto, detektorin ja piirturijärjestelmän suoritusteho jne.).

Jos kolonnia ei ole aikaisemmin käytetty, se on ensin valmisteltava käyttöön. Kevyt kaasuvirtaus johdetaan kolonnin läpi ja kaasukromatografi käynnistetään. Lämmitetään asteittain siten, että lämpötila on noin neljän tunnin kuluttua kohonnut 350 °C:een. Tätä lämpötilaa pidetään yllä vähintään kaksi tuntia, jonka jälkeen laitteisto säädetään käyttöolosuhteisiin (kaasuvirtojen säätö, liekin sytytys, kytkeminen elektroniseen piirturiin (3.3.4), uunin lämpötilan säätö kolonnia varten, detektorin lämpötilasäätö jne.) ja signaali säädetään niin, että sen herkkyys on vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin on arvioitu määrityksessä tarvittavan. Saadun pohjaviivan on oltava suora, siinä ei saa olla minkäänlaisia piikkejä eikä ryömintää mihinkään suuntaan.

Jos ilmenee negatiivista suoraviivaista ryömintää, se on merkki kolonnin liitäntöjen vuotamisesta; positiivinen ryömintä johtuu kolonnin riittämättömästä valmistelusta.

5.2.2 Toimintaolosuhteiden valinta

Yleisesti kromatografia tehdään seuraavissa käyttöolosuhteissa:

— kolonnin lämpötila: —



20 °C minuutissa 5 °C minuutissa 20 °C minuutissa aluksi 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— detektorin lämpötila: 350 °C,

— injektoidun aineen määrä: 1 μl n-heptaaniliuosta (2–4 ml),

— kantajakaasut: helium tai vety valitun kaasun optimaalisella lineaarinopeudella (ks. lisäys),

— laitteen herkkyys siten että seuraavat edellytykset täyttyvät:

Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin ominaisuuksien perusteella, jotta kaikki vahat saadaan erotettua, jotta piikkien erotuskyky on riittävä (ks. kuva) ja jotta sisäisen standardin C32 retentioaika on 18 ± 3 minuuttia. Edustavimpien vahojen piikin on oltava vähintään 60 % asteikon pohjasta.

Piikkien integrointiparametrit asetetaan niin, että huomioon otettavien piikkien pinta-alat voidaan arvioida oikein.

Huom.Koska lopullinen lämpötila on korkea, sallitaan positiivinen siirtymä, joka saa kuitenkin olla enintään 10 % asteikon alarajasta.

5.3 Määritys

Imetään 10 μl:n mikroruiskuun 1 μl liuosta; vedetään männällä neula tyhjäksi. Työnnetään neula injektiolaitteeseen ja 1–2 sekunnin kuluttua injektoidaan nopeasti; noin 5 sekunnin kuluttua vedetään neula hitaasti pois.

Piirturi pidetään käynnissä, kunnes vahat ovat eluoituneet täydellisesti.

Pohjaviivan on koko ajan oltava vaatimusten mukainen.

5.4 Piikkien tunnistaminen

Eri piikkien tunnistaminen suoritetaan retentioaikojen perusteella ja vertaamalla samoissa olosuhteissa määritettyihin vahojen seoksiin, joiden retentioajat tunnetaan.

Kuva 1 esittää neitsytoliiviöljyn vahojen kromatogrammia.

5.5 Kvantitatiivinen arviointi

Sisäisen standardin ja C40–C46 -alifaattisten esterien piikkien pinta-alat lasketaan integraattorilla.

Lasketaan kunkin esterin vahapitoisuus, ilmoitettuna mg/kg rasvaa, seuraavasti:

jossa:

Ax = kunkin esterin piikin pinta-ala neliömillimetreinä

As = kunkin sisäisen standardin piikin pinta-ala neliömillimetreinä

ms = lisätyn sisäisen standardin massa milligrammoina

m = määritystä varten otetun näytteen massa grammoina.

6. TULOSTEN ILMOITTAMINEN

C40–C46:n eri vahojen pitoisuuksien summa ilmoitetaan mg/kg rasvaa (ppm).

Huom.Määritetään piikkien pinta-aloista niiden komponenttien määrät, joissa on parillinen määrä C-atomeja välillä C40–C46, jäljempänä olevassa kuvassa esitetyn oliiviöljyn vahojen kromatogrammin mukaisesti. Jos C46-esteri esiintyy kahtena piikkinä, sen tunnistamiseksi on syytä analysoida oliivinpuristemassaöljyn vahojen jae, jossa C46:n piikki on helppo tunnistaa, koska se on selvästi hallitsevin.

Tulokset ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.

KUVA

Oliiviöljyn vahojen kromatogrammi ( 3 )

Merkkien selitykset::

I.S. = lauryyliarakidaatti

1 = diterpeeniesterit

2 + 2′ = C40-esterit

3 + 3′ = C42-esterit

4 + 4′ = esterit C44

5 = C46-esterit

6 = steroliesterit ja triterpeenialkoholi.









Lisäys

Kaasun lineaarinopeuden määrittäminen

Injektoidaan 1–3 μl metaania (tai propaania) tavanomaisiin käyttöolosuhteisiin säädettyyn kaasukromatografialaitteistoon. Mitataan aika, jonka kaasu kulkee kolonnin läpi, alkaen injektiohetkestä piikin muodostumiseen (tM).

Lineaarinopeus, cm/s, saadaan kaavasta L/tM, jossa L on kolonnin pituus senttimetreinä ja tM on aika sekunteina sekuntikellolla mitattuna.

▼M26









LIITE V

STEROLIEN JA TRITERPEENIDIALKOHOLIEN RAKENTEEN JA PITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN KAPILLAARIKAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ

1. TARKOITUS

Tällä menetelmällä voidaan määrittää yksittäisten sterolien ja triterpeenidialkoholien määrät ja niiden kokonaismäärä oliiviöljyissä ja oliivin puristemassaöljyissä.

2. PERIAATE

Öljy, johon on lisätty α-kolestanoli sisäiseksi standardiksi, saippuoidaan kaliumhydroksidin etanoliliuoksella ja saippuoitumaton aines uutetaan etyylieetterillä.

Steroli- ja triterpeenidialkoholifraktio erotetaan saippuoitumattomasta aineksesta ohutkerroskromatografialla käyttämällä emäksistä silikageelilevyä. Silikageelistä saadut fraktiot muutetaan trimetyylisilyylieettereiksi ja määritetään sen jälkeen kapillaarikaasukromatografialla.

3. VÄLINEISTÖ

Tavalliset laboratoriovälineet, erityisesti seuraavat:

3.1. Pullo, 250 ml, jossa on hiokset ja palautusjäähdytin.

3.2. Erotussuppilo, 500 ml.

3.3. Pulloja, 250 ml.

3.4. Ohutkerroskromatografialaitteisto (TLC), jonka levyjen koko on 20 × 20 cm.

3.5. Ultraviolettivalo, jonka aallonpituus on 254 tai 366 nm.

3.6. Mikroruiskuja, 100 μl ja 500 μl.

3.7. Lasisintterisuodatinsuppilo, jonka huokoskoko on G 3 (15–40 μm), halkaisija noin 2 cm ja korkeus 5 cm ja jossa on liitäntä tyhjiösuodatusta varten sekä koirashios.

3.8. Tyhjiöimupullo, 50 ml, jossa on suodatinsuppiloon (3.7 kohta) sopiva naarashios.

3.9. Koeputki, 10 ml, jossa on kartiomainen pohja ja ilmatiivis lasitulppa.

3.10. Kaasukromatografi, jota käytetään kapillaarikolonnin ja jakoinjektiojärjestelmän kanssa ja jonka osat ovat 3.10.1. termostaattisäätöinen kolonniuuni, joka säilyttää halutun lämpötilan noin ± 1 °C:n tarkkuudella, 3.10.2. injektoriyksikkö, jonka lämpötilaa voi säätää, jonka höyrystämisosa on persilanoitua lasia ja jossa on virtauksenjakojärjestelmä, 3.10.3. liekki-ionisaatiodetektori (FID), 3.10.4. tiedonkeruujärjestelmä, joka sopii käytettäväksi FID-detektorin kanssa (3.10.3 alakohta) ja jonka voi integroida manuaalisesti.

3.11. Kvartsilasinen kapillaarikolonni, jonka pituus on 20–30 m ja sisähalkaisija 0,25–0,32 mm ja jonka sisäpinta on päällystetty yhdisteellä, jossa on 5 prosenttia bifenyyliä ja 95 prosenttia dimetyylipolysiloksaania (SE-52 tai SE-54 stationäärifaasi tai vastaava) siten, että päällysteen paksuus on kauttaaltaan 0,10–0,30 μm.

3.12. Jakoinjektioon sopiva kiinteäneulallinen mikroruisku, 10 μl, kaasukromatografiaa varten.

3.13. Kalsiumkloridia sisältävä eksikkaattori.

4. REAGENSSIT

4.1. Vähintään 85-prosenttinen kaliumhydroksidi.

4.2. Kaliumhydroksidin noin 2 N etanoliliuos. 130 g kaliumhydroksidia (4.1 kohta) liuotetaan 200 ml:aan tislattua vettä samalla jäähdyttäen ja lisätään etanolia (4.10 kohta) niin, että liuosta on yksi litra. Liuosta säilytetään tiiviisti suljetuissa, tummasta lasista valmistetuissa pulloissa enintään kahden päivän ajan.

4.3. Etyylieetteri, analyysilaatua.

4.4. Kaliumhydroksidin noin 0,2 N etanoliliuos. 13 g kaliumhydroksidia (4.1 kohta) liuotetaan 20 ml:aan tislattua vettä ja lisätään etanolia (4.10 kohta) niin, että liuosta on yksi litra.

4.5. Vedetön natriumsulfaatti, analyysilaatua.

4.6. Silikageelillä päällystetyt lasilevyt (20 x 20 cm), paksuudeltaan 0,25 mm, ilman fluoresenssi-indikaattoria (voidaan ostaa käyttövalmiina).

4.7. Tolueeni, kromatografialaatua.

4.8. Asetoni, kromatografialaatua.

4.9. n-Heksaani, kromatografialaatua.

4.10. Etyylieetteri, kromatografialaatua.

4.11. Etanoli, analyysilaatua.

4.12. Etyyliasetaatti, analyysilaatua.

4.13. Ohutkerroskromatografian vertailuliuos: kolesterolin tai fytosterolin ja erytrodiolin viisiprosenttinen etyyliasetaattiliuos (4.11 kohta).

4.14. 2,7-dikloorifluoreseiini, 0,2-prosenttinen etanoliliuos. Liuos tehdään lievästi emäksiseksi lisäämällä muutama tippa kaliumhydroksidin 2 N alkoholiliuosta (4.2 kohta).

4.15. Vedetön pyridiini, kromatografialaatua (ks. huomautus 5).

4.16. Heksametyylidisilatsaani, analyysilaatua.

4.17. Trimetyylikloorisilaani, analyysilaatua.

4.18. Sterolien trimetyylisilyylieettereiden (TMSE) näyteliuokset. Ne valmistetaan vasta käyttöhetkellä steroleista ja erytrodiolista, jotka saadaan niitä sisältävistä öljyistä.

4.19. α-Kolesteroli, puhtausaste yli 99 prosenttia (puhtausaste on tarkastettava kaasukromatografisella määrityksellä).

4.20. α-Kolestanoli, sisäisen standardin mukainen liuos, 0,2-prosenttisena (m/v) etyyliasetaattiluoksena (4.11 kohta).

4.21. Fenoliftaleiini, 10 g liuotettuna litraan etanolia (4.10 kohta).

4.22. Kantajakaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua.

4.23. Apukaasut: vety, helium, typpi ja ilma, kaasukromatografista laatua.

4.24. n-Heksaanin (4.9 kohta) ja etyylieetterin (4.10 kohta) seos 65:35 (v/v).

4.25. Silylointireagenssi, jossa on pyridiiniä, heksametyylidisilatsaania ja trimetyylikloorisilaania tilavuussuhteessa 9:3:1.

5. MENETTELY

5.1. Saippuoitumattomien aineiden esikäsittely 5.1.1. 250 ml:n pulloon (3.1 kohta) lisätään 500 μl:n mikroruiskulla (3.6 kohta) sellainen tilavuusmäärä α-kolestanolin sisäisen standardin mukaista liuosta (4.20 kohta) jonka sisältämä kolestanolin määrä on noin 10 prosenttia sterolin määrästä näytteessä. Esimerkiksi 5 gramman oliiviöljynäytteeseen lisätään 500 μl α-kolestanoliliuosta (4.20 kohta), ja jos näytteenä on oliivin puristemassaöljyä, lisätään 1 500 μl α-kolestanoliliuosta. Haihdutetaan kuiviin kevyessä typpivirrassa lämpimässä vesihauteessa ja pullon jäähdyttyä punnitaan 5 ± 0,01 g kuivattua, suodatettua näytettä samaan pulloon. Huom. 1: Eläin- ja kasviperäiset rasvat ja öljyt, jotka sisältävät paljon kolesterolia, voivat tuottaa piikin, jonka retentioaika on lähes sama kuin kolestanolin. Jos käy näin, sterolifraktio on määritettävä kahdesti niin, että toisella kertaa käytetään sisäistä standardia ja toisella ei. 5.1.2. Lisätään 50 ml kaliumhydroksidin 2 N etanoliliuosta (4.2 kohta) ja hohkakiveä, käynnistetään palautusjäähdytin ja kuumennetaan vesihauteessa hiljalleen kiehuvaksi koko ajan voimakkaasti sekoittaen, kunnes saippuoituminen on tapahtunut (liuos kirkastuu). Kuumentamista jatketaan vielä 20 minuuttia, sitten lisätään 50 ml tislattua vettä jäähdyttimen yläpäästä, irrotetaan jäähdytin ja jäähdytetään pullo noin 30 °C:n lämpötilaan. 5.1.3. Pullon sisältämä seos siirretään kvantitatiivisesti 500 ml:n erotussuppiloon (3.2 kohta) käyttämällä useita annoksia tislattua vettä (50 ml). Lisätään noin 80 ml etyylieetteriä (4.10 kohta), ravistetaan voimakkaasti noin 60 sekunnin ajan siten, että paine poistetaan ajoittain kääntämällä erotussuppilo ylösalaisin ja avaamalla tulppa. Annetaan seistä, kunnes kaksi faasia ovat täysin erottuneet (huomautus 2). Sen jälkeen saippualiuos otetaan mahdollisimman tarkoin toiseen erotussuppiloon. Vesi-alkoholifaasi uutetaan vielä kaksi kertaa samalla tavoin käyttämällä 60–70 ml etyylieetteriä (4.10 kohta). Huom. 2: Mahdollinen emulsio voidaan hajottaa lisäämällä pieni määrä etanolia (4.11 kohta). 5.1.4. Yhdistetään kolme eetteriuutetta yhteen erotussuppiloon, joka sisältää 50 ml vettä. Pestään vedellä (50 ml kerralla), kunnes pesuvesi ei enää saa vaaleanpunaista väriä, kun siihen lisätään tippa fenoliftaleiiniliuosta (4.21 kohta). Kun pesuvesi on poistettu, suodatetaan vedettömän natriumsulfaatin (4.5 kohta) läpi etukäteen punnittuun 250 ml:n pulloon ja pestään suppilo ja suodatin pienillä määrillä etyylieetteriä (4.10 kohta). 5.1.5. Liuotin haihdutetaan haihduttimessa 30 °C lämpötilassa tyhjiössä. Lisätään 5 ml asetonia, ja haihtuva liuotin poistetaan kokonaan kevyessä ilmavirrassa. Jäännöstä kuivatetaan lämpökaapissa 103 ± 2 °C:n lämpötilassa 15 minuutin ajan. Jäähdytetään eksikkaattoreissa ja punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella.

5.2. Steroli- ja triterpeenidialkoholifraktion (erytrodioli + uvaoli) erottaminen 5.2.1. Emäksisten levyjen valmistelu ohutkerroskromatografiaa varten: silikageelilevyt (4.6 kohta) upotetaan kaliumhydroksidin 0,2 N etanoliliuokseen (4.5 kohta) noin neljän senttimetrin syvyyteen kymmeneksi sekunniksi, minkä jälkeen niiden annetaan kuivua kaksi tuntia vetokaapissa ja lopuksi yksi tunti 100 °C:ssa lämpökaapissa. Kun levyt on otettu lämpökaapista, niitä säilytetään kalsiumkloridia sisältävässä eksikkaattorissa (3.13 kohta) käyttöhetkeen saakka (näin käsitellyt levyt on käytettävä 15 päivän kuluessa). Huom. 3: Kun sterolifraktion erottamiseen käytetään emäksisiä silikageelilevyjä, ei ole tarpeen käsitellä saippuoitumattomia aineita alumiinioksidilla. Näin kaikki happamat aineet (rasvahapot ja muut hapot) jäävät lähtöviivalle. Sterolivyöhyke erottuu selvästi alifaattisten ja triterpeenisten alkoholien vyöhykkeestä. 5.2.2. Heksaani-etyylieetteriseosta (4.24 kohta) (huomautus 4) kaadetaan kehitysastiaan niin, että sitä on noin 1 cm. Kehitysastia suljetaan sopivalla kannella ja annetaan seistä avaamatta vähintään puoli tuntia, jotta syntyy neste-höyrytasapaino. Astian sisäseinille voidaan kiinnittää suodatinpaperisuikaleita, jotka ulottuvat eluointiaineeseen. Tämä lyhentää kehitysaikaa lähes kolmanneksella ja aineosat eluoituvat tasaisemmin. Huom. 4: Kehitysliuos on vaihdettava uuteen ennen jokaista koetta, jotta eluointiolosuhteet olisivat täysin toistettavissa. Vaihtoehtoisena liuottimena voidaan käyttää n-heksaani-etyylieetteriseosta (50:50, v/v). 5.2.3. Saippuoitumattomista aineista (5.1.5 alakohta) valmistetaan noin 5-prosenttinen etyyliasetaattiliuos (4.12 kohta), jota levitetään 0,3 ml ohuena ja tasaisena nauhana 100 μl:n mikroruiskulla kromatografialevyn (5.2.1 alakohta) alareunaan (2 cm). Asetetaan 2–3 μl aineiden vertailuliuosta (4.13 kohta) lähtöviivan tasalle niin, että steroli ja triterpeenidialkoholit voidaan tunnistaa kehityksen jälkeen. 5.2.4. Levy asetetaan kehitysastiaan, joka on valmisteltu 5.2.2 alakohdan ohjeiden mukaan. Ympäristön lämpötilan on oltava 15–20 °C (huomautus 5). Astian kansi suljetaan heti ja annetaan levyn eluoitua, kunnes liuotinrintama on siirtynyt noin 1 cm:n päähän levyn yläreunasta. Levy otetaan kehitysastiasta ja liuotin haihdutetaan kuumassa ilmavirrassa tai panemalla levy joksikin aikaa vetokaappiin. Huom. 5: Korkeampi lämpötila voi haitata erottelua. 5.2.5. Levylle suihkutetaan ohuelti ja tasaisesti 2,7-dikloorifluoreseiiniliuosta (4.14 kohta), ja se jätetään kuivumaan. Sterolin ja triterpeenidialkoholien vyöhykkeet voidaan tunnistaa ultraviolettivalossa kohdistamalla ne vertailuliuoksesta (4.13 kohta) syntyneisiin pisteisiin. Vyöhykkeiden ääriviivat merkitään mustalla kynällä fluoresenssin rajoja seuraten (ks. kuva 3, TLC-levy). 5.2.6. Silikageelikerros raaputetaan merkityltä alueelta metallilastalla. Saatu aines hienonnetaan, siirretään suodatinsuppiloon (3.7 kohta), lisätään 10 ml kuumaa etyyliasetaattia (4.12 kohta), sekoitetaan huolellisesti metallilastalla ja suodatetaan tyhjiössä. Suodos kerätään suodatinsuppiloon liitettyyn erlenmeyerpulloon (3.8 kohta). Pulloon jäänyt aines pestään kolme kertaa noin 10 ml:lla etyylieetteriä (4.3 kohta), ja suodos kerätään samaan, suodatinsuppiloon liitettyyn pulloon. Suodosta haihdutetaan, kunnes sen tilavuus on noin 4–5 ml, ja jäännösliuos kaadetaan etukäteen punnittuun 10 ml:n koeputkeen (3.9 kohta). Liuosta kuivataan alhaisella lämmöllä kevyessä typpivirrassa; jäännös liuotetaan muutamaan tippaan asetonia (4.8 kohta) ja kuivataan jälleen. Koeputkessa olevan jäännöksen on sisällettävä steroli- ja triterpeenidialkoholifraktio.

5.3. Trimetyylisilyylieettereiden valmistus 5.3.1. Koeputkessa olevaan steroli- ja triterpeenifraktioon lisätään 50 μl silylointireagenssia (4.25 kohta) (huomautus 6) jokaista koeputkessa olevaa sterolien ja triterpeenidialkoholien milligrammaa kohti niin, että kosteutta ei pääse mukaan (huomautus 7). Huom. 6: Käyttövalmiita liuoksia on kaupan. Saatavana on myös muita silylointireagensseja, kuten esim. bistrimetyylisilyylitrifluoriasetamidi + 1 % trimetyylikloorisilaania; reagenssi laimennetaan samalla määrällä vedetöntä pyridiiniä. Pyridiini voidaan korvata samalla määrällä asetonitriiliä. 5.3.2. Koeputki suljetaan tulpalla, ravistetaan varovasti (ei ylösalaisin), kunnes yhdisteet ovat täysin liuenneet. Annetaan seistä vähintään 15 minuuttia huoneenlämmössä ja sentrifugoidaan sitten muutaman minuutin ajan; kirkas liuos on nyt valmis kaasukromatografista määritystä varten. Huom. 7: Lievä sameus on tavallista eikä ole haitaksi. Valkoiset hiutaleet tai vaaleanpunaiseksi värjäytyminen ovat merkkejä kosteudesta tai reagenssien muuttumisesta. Jos näitä ilmenee, koe on uusittava (ainoastaan käytettäessä heksametyylidisilatsaania tai trimetyylikloorisilaania).

5.4. Kaasukromatografinen määritys 5.4.1. Esivalmistelut ja kapillaarikolonnin valmistelu 5.4.1.1. Kolonni (3.11 kohta) asennetaan kaasukromatografialaitteistoon kiinnittämällä kolonnin alkupää jakoinjektoriin ja kolonnin loppupää detektoriin. Tarkistetaan kaasukromatografisten laitteiden toiminta (kaasuliitännän tiiviys, detektorin, virtauksenjakojärjestelmän ja piirturin toimivuus, jne.) 5.4.1.2. Jos kapillaarikolonnia ei ole aikaisemmin käytetty, se on ensin valmisteltava käyttöön. Pieni määrä kaasua johdetaan kolonnin läpi, käynnistetään kaasukromatografi ja aloitetaan asteittainen lämmittäminen, jota jatketaan, kunnes lämpötila on kohonnut vähintään 20 °C korkeammaksi kuin käyttölämpötila (huomautus 8). Korkeaa lämpötilaa pidetään yllä vähintään kaksi tuntia, minkä jälkeen kromatografialaitteisto saatetaan käyttövalmiiksi (kaasuvirran ja erotuksen säätö, liekinsytytys, tietojärjestelmän kytkeminen, kolonnin, detektorin ja injektorin säätö jne.) ja signaalia rekisteröidään herkkyydellä, joka on vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin määrityksessä käytettävä. Saadun perusviivan on oltava suora, eikä siinä saa olla minkäänlaisia piikkejä eikä siirtymää mihinkään suuntaan. Jos ilmenee negatiivista suoraviivaista siirtymää, se on merkki kolonnin liitäntöjen vuodosta, ja jos ilmenee positiivista siirtymää, se johtuu kolonnin riittämättömästä valmistelusta. Huom. 8: Esivalmistelulämpötilan on aina oltava vähintään 20 °C alempi kuin käytetyn stationäärifaasin korkein lämpötila. 5.4.2. Toimintaolosuhteiden valinta 5.4.2.1. Käyttöolosuhteiden ohjearvot ovat seuraavat: — kolonnin lämpötila: 260 ± 5 °C, — injektorin lämpötila: 280–300 °C, — detektorin lämpötila: 280–300 °C, — kantajakaasun lineaarinopeus: heliumille 20–35 cm/s ja vedylle 30–50 cm/s, — jakosuhde: 1:50–1:100, — laitteiston herkkyys: 4–16 kertaa vähimmäisvaimennus, — rekisteröintiherkkyys: 1–2 mV täydestä asteikosta, — injektoidun aineen määrä: 0,5–1 μl TMSE-liuosta. Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin ominaisuuksien mukaan niin, että saadaan seuraavat vaatimukset täyttävä kromatogrammi: — β-sitosterolipiikin retentioaika on 20 ± 5 minuuttia, — kampesterolipiikki: oliiviöljylle (pitoisuus keskimäärin 3 %) 20 ± 5 % täydestä asteikosta, soijaöljylle (pitoisuus keskimäärin 20 %) 80 ± 10 % täydestä asteikosta, — kaikki mukana olevat sterolit on voitava erottaa toisistaan. Lisäksi kunkin piikin jälkeen piirturin tulee palata perusviivalle ennen uuden piikin alkua. Tämä ei ole kuitenkaan tarpeen, jos suhteellisen retentioajan (RRT) 1,02 piikki (sitostanoli) pystytään mittaamaan kohtisuoraan. 5.4.3. Määritys 5.4.3.1. Imetään 10 μl:n mikroruiskuun 1 μl heksaania, sitten 0,5 μl ilmaa ja tämän jälkeen 0,5–1 μl näyteliuosta; lopuksi männällä vedetään vielä neula tyhjäksi. Neula työnnetään septumin läpi injektoriin ja 1–2 sekunnin kuluttua seos injektoidaan nopeasti, odotetaan noin viisi sekuntia, jonka jälkeen neula vedetään pois hitaasti. Myös automaattista injektoria voidaan käyttää. 5.4.3.2. Rekisteröintiä jatketaan, kunnes näytteessä olevien triterpeenidialkoholien TMSE on kokonaan eluoitunut. Perusviivan on koko ajan oltava 5.4.1.2 alakohdan vaatimusten mukainen. 5.4.4. Piikkien tunnistaminen Yksittäiset piikit tunnistetaan niiden retentioajan perusteella sekä vertaamalla sterolien ja triterpeenidialkoholien TMSE-seokseen, joka on määritetty samoissa olosuhteissa (ks. lisäys). Sterolit ja triterpeenidialkoholit eluoituvat seuraavassa järjestyksessä: kolesteroli, brassikasteroli, ergosteroli, 24-metyleenikolesteroli, kampesteroli, kampestanoli, stigmasteroli, δ-7-kampesteroli, δ-5,23-stigmastadienoli, klerosteroli, β-sitosteroli, sitostanoli, δ-5-avenasteroli, δ-5,24-stigmastadienoli, δ-7-sigmastenoli, δ-7-avenasteroli, erytrodioli ja uvaoli. ß-Sitosterolin retentioajat SE-52- ja SE-54-kolonneille on esitetty taulukossa 1. Kuvat 1 ja 2 esittävät eräiden öljyjen tyypillisiä kromatogrammeja. 5.4.5. Kvantitatiivinen arviointi 5.4.5.1. Lasketaan α-kolestanolin sekä sterolien ja triterpeenidialkoholien piikkien pinta-alat tietojärjestelmän avulla. Sellaisten aineiden piikit jätetään huomiotta, jotka eivät esiinny taulukossa 1 (ergosterolin piikkiä ei lasketa). α-Kolestanolin vastekerroin on 1. 5.4.5.2. Lasketaan yksittäisten sterolien pitoisuus mg/kg:ssa rasvaa tai öljyä seuraavasta kaavasta: jossa: Ax = x-sterolin piikin pinta-ala, tietojärjestelmällä laskettuna; As = α-kolestanolin piikin pinta-ala, tietojärjestelmällä laskettuna; ms = lisätyn α-kolestanolin massa milligrammoina; m = määritykseen käytetyn näytteen massa grammoina.

6. TULOSTEN ESITTÄMINEN

6.1. Ilmoitetaan yksittäisten sterolien pitoisuus mg/kg:ssa rasvaa tai öljyä ja niiden pitoisuuksien yhteismäärä, ”kokonaissterolimäärä”. Yksittäisten sterolien sekä erytrodiolin ja uvaolin pitoisuudet ilmaistaan yhden desimaalin tarkkuudella. Kokonaisterolimäärä on ilmaistava kokonaislukuna.

▼M28

6.2. Lasketaan yksittäisen sterolin prosenttiosuus sitä vastaavan piikin suhteellisena osuutena kaikkien sterolipiikkien yhteenlasketusta pinta-alasta. jossa Ax = x:n piikin pinta-ala; ΣA = kaikkien sterolien piikkien yhteenlaskettu pinta-ala.

▼M26

6.3. Näennäinen β-sitosterolipitoisuus: δ-5-23-stigmastadienoli + klerosteroli + β-sitosteroli + sitostanoli + δ-5-avenasteroli + δ-5-24-stigmastadienoli.

6.4. Lasketaan erytrodiolin ja uvaolin prosentuaalinen osuus: jossa ΣA = sterolin kokonaispinta-ala, tietojärjestelmällä laskettuna; Er = erytrodiolin pinta-ala tietojärjestelmällä laskettuna; Uv = uvaolin pinta-ala tietojärjestelmällä laskettuna.









Lisäys

Kaasun lineaarinopeuden määrittäminen

Kaasukromatografialaitteisto säädetään tavallisia käyttöolosuhteita vastaavaksi, injektoidaan 1–3 μl metaania (tai propaania) ja mitataan aika, jonka kuluessa kaasu kulkee kolonnin läpi, injektointihetkestä piikin muodostumiseen (tM).

Lineaarinopeus cm/s saadaan kaavasta L/tM, jossa L on kolonnin pituus senttimetreinä ja tM on mitattu aika sekunteina.







Taulukko 1 Sterolien suhteelliset retentioajat Piikki Nimi Suhteellinen retentioaika Kolonni SE 54 Kolonni SE 52 1 kolesteroli Δ-5-kolesteeni-3-ß-oli 0,67 0,63 2 kolestanoli 5-α-kolestaani-3-ß-oli 0,68 0,64 3 brassicasteroli [24S]-24-metyyli-Δ-5,22-kolestadieeni-3-ß-oli 0,73 0,71 * ergosteroli [24S]-24-metyyli-Δ-5-7-22-kolestatrieeni-3-ß-oli 0,78 0,76 4 24-metyleenikolesteroli 24-metyleeni-Δ-5,24-kolestadieeni-3-ß-o1i 0,82 0,80 5 kampesteroli (24R)-24-metyyli-Δ-5-kolesteeni-3-ß-oli 0,83 0,81 6 kampestanoli (24R)-24-metyyli-kolestaani-3-ß-oli 0,85 0,82 7 stigmasteroli (24S)-24-etyyli-Δ-5,22-kolestadieeni-3-ß-oli 0,88 0,87 8 δ-7-kampesteroli (24R)-24-metyyli-Δ-7-kolesteeni-3-ß-oli 0,93 0,92 9 δ-5,23-stigmastadienoli (24R,S)-24-etyyli-Δ-5,23-koIestadieeni-3-ß-oli 0,95 0,95 10 klerosteroli (24S)-24-etyyli-Δ-5,25-kolestadieeni-3-ß-oli 0,96 0,96 11 ß-sitosteroli (24R)-24-etyyli-Δ-5-kolesteeni-3-ß-oli 1,00 1,00 12 sitostanoli 24-etyyli-kolestaani-3-ß-oli 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasteroli (24Z)-24-etyylideeni-Δ-kolesteeni-3-ß-oli 1,03 1,03 14 Δ-5-24-stigmastadienoli (24R,S)-24-etyyli-Δ-5,24-kolestadieeni-3-ß-oli 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenoli (24R,S)-24-etyyli-Δ-7-kolesteeni-3-ß-oli 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasteroli (24Z)-24-etyylideeni-Δ-7-kolesteeni-3-ß-oli 1,16 1,16 17 erytrodioli 5-α-oleaani-12-eeni-3-ß-28-dioli 1,41 1,41 18 uvaoli Δ-12-urseeni-3-ß-28-dioli 1,52 1,52

Kuva 1

Lamppuoliiviöljyn steroli- ja triterpeenidialkoholifraktion kaasukromatogrammi (jossa näkyy sisäisen standardin huippu)

Kuva 2

Puhdistetun oliiviöljyn steroli- ja triterpeenidialkoholifraktion kaasukromatogrammi (jossa näkyy sisäisen standardin huippu)

Kuva 3

Oliivin puristemassaöljyn TLC-levyn vyöhyke, joka on raaputettava sterolien ja triterpeenialkoholien määrittämiseksi.

1 – Skvaleeni

2 – Triterpeeniset ja alifaattiset alkoholit

3 – Sterolit ja triterpeenidialkoholit

4 – Alku; vapaat rasvahapot

▼M26 —————

▼M21









LIITE VII

2-GLYSERYYLIMONOPALMITAATIN PROSENTTIOSUUDEN MÄÄRITTÄMINEN

1. TARKOITUS JA SOVELTAMISALA

Tällä menetelmällä määritetään triglyseridin 2-asemassa olevan palmitiinihapon prosenttiosuus 2-glyseryylimonopalmitaatin määrityksen avulla.

Menetelmää sovelletaan kasviöljyihin, jotka ovat nestemäisiä huoneenlämmössä (20 °C).

2. PERIAATE

Öljynäyte valmistellaan ja käsitellään haimalipaasin avulla: kun triglyseridimolekyyli hydrolysoidaan osittain ja spesifisesti 1- ja 3-asemassa, jäävät jäljelle 2-asemassa olevat monoglyseridit. 2-glyseryylimonopalmitaatin prosenttiosuus monoglyseridijakeessa määritetään silyloinnin jälkeen käyttäen kapillaarikaasukromatografista määritystä.

3. VÄLINEISTÖ

3.1 Erlenmeyer-pullo, 25 ml.

3.2 Dekantterilaseja, 100, 250 ja 300 ml.

3.3 Lasikolonni kromatografiaa varten (sisähalkaisija 21–23 mm, pituus 400 mm), varustettuna sintterilasilevyllä ja hanalla.

3.4 Koeputkia, 10, 50, 100 ja 200 ml.

3.5 Kolveja, 100 ja 250 ml.

3.6 Pyöröhaihduttaja.

3.7 Kartiopohjaisia sentrifugiputkia, 10 ml, hiottu tulppa.

3.8 Sentrifugi 10 ja 100 ml:n putkia varten.

3.9 Termostaatti, joka ylläpitää lämpötilaa 40 °C ± 0,5 °C.

3.10 Mittapipettejä, 1 ja 2 ml.

3.11 Injektioruisku, 1 ml.

3.12 Mikroruisku, 100 μl.

3.13 Suppilo, 1 000 ml

3.14 Kapillaarikolonnilla varustettu kaasukromatografi, jossa on kolonniin liitetty kylmäinjektori, jonka avulla näyte voidaan syöttää suoraan koloniin, sekä uuni, joka pysyy valitussa lämpötilassa yhden celsiusasteen tarkkuudella.

3.15 Kolonniin liitetty kylmäinjektori, näytteen syöttämiseksi suoraan kolonniin.

3.16 Liekki-ionisaatiodetektori ja analysaattori.

3.17. Integroiva piirturi, joka toimii analysaattorin kanssa ja jonka vastenopeus on enintään 1 sekunti ja jonka paperin nopeutta voidaan säätää.

3.18 Lasinen tai kvartsilasinen kapillaarikolonni, jonka pituus on 8–12 m ja sisähalkaisija 0,25–0,32 mm ja jonka sisäpinta on päällystetty 5-prosenttisella metyylipolysiloksaanilla tai fenyylimetyylipolysiloksaanilla siten, että nestekerroksen paksuus on 0,10–0,30 μm, ja jota voidaan käyttää 370 °C:n lämpötilassa.

3.19 Mikroruisku, 10 μl, jossa on vähintään 7,5 cm:n kiinteä neula, jonka avulla näyte voidaan syöttää suoraan kolonniin.

4. REAGENSSIT

4.1 Silikageeli, jonka hiukkaskoko 0,063–0,200 mm (70/280 mesh) ja joka valmistetaan seuraavasti: Silikageeli pannaan posliiniastiaan, kuivataan lämpökaapissa 160 °C:n lämpötilassa neljän tunnin ajan, minkä jälkeen jäädytetään eksikkaattorissa huoneenlämmössä. Lisätään vettä 5 % silikageelin painosta seuraavasti: punnitaan 500 ml:n erlenmeyer-pulloon 152 g silikageeliä, lisätään 8 g tislattua vettä, suljetaan pullo ja ravistetaan varovasti siten, että vesi jakautuu tasaisesti. Säilytetään vähintään 12 tuntia ennen käyttöä.

4.2 N-heksaani, kromatografialaatua.

4.3 Isopropanoli

4.4 Isopropanoli, vesiliuos 1/1 (V/V)

4.5 Haimalipaasi. Käytettävän lipaasiaktiivisuuden on oltava 2,0–10 lipaasiyksikköä/mg. (Haimalipaasia, jonka aktiivisuus on 2–10 yksikköä/mg, on saatavilla valmiina.)

4.6 Tri-hydroksimetyyliaminometaani-puskuriliuos: lisätään vesiliuokseen suolahappoa 1 M, kunnes pH on 8 (tarkistetaan potentiometrillä) (1/1 V/V)

4.7 Natriumkolaatti (entsyymilaatua), 0,1 % vesiliuos (käytettävä 15 päivän kuluessa valmistamisesta).

4.8 Kalsiumkloridi, vesiliuos 22 %.

4.9 Dietyylieetteri, kromatografialaatua.

4.10 Kehitysliuos: n-heksaani/etyylieetteriseos (87/13) (V/V)

4.11 Natriumhydroksidi, 12-painoprosenttinen liuos.

4.12 1-prosenttinen fenoliftaleiiniliuos etanolissa.

4.13 Kantajakaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua.

4.14 Apukaasut: vety, vähintään 99-prosenttinen, kuiva ja ilman orgaanisia aineita, ja vesi kaasukromatografista laatua, sama puhtausaste.

4.15 Silylointireagenssi: Pyridiinin, heksametyylidisilatsaanin ja trimetyylikloorisilaanin seos 9/3/1 (V/V/V). (Käyttövalmiita liuoksia on kaupallisesti saatavana. Voidaan käyttää myös muita silylointireagensseja, kuten esim. bis-trimetyylisilyylitrifluoriasetamidi + 1 % trimetyylikloorisilaania; reagenssi laimennetaan samalla määrällä vedetöntä pyridiiniä.)

4.16 Standardit: puhtaat monoglyseridit tai monoglyseridien seokset, joiden prosenttiosuuksien mukainen tunnettu koostumus on samanlainen kuin näytteen.

5. MENETTELY

5.1 Näytteen valmistelu

5.1.1 Öljyjä, joiden vapaiden happojen pitoisuus on alle 3 %, ei tarvitse neutraloida ennen silikageelikolonnikromatografiaa. Öljyt, joiden vapaiden happojen pitoisuus on yli 3 %, on neutraloitava 5.1.1.1 kohdan mukaisesti. 5.1.1.1 1 000 ml:n suppiloon (3.13) kaadetaan 50 g öljyä ja 200 ml n-heksaania. Lisätään 100 ml isopropanolia ja 12-prosenttista natriumhydroksidiliuosta (4.11) määrä, joka vastaa öljyn vapaiden rasvahappojen määrää lisättynä 5 prosentilla. Ravistetaan voimakkaasti yhden minuutin ajan. Lisätään 100 ml tislattua vettä, ravistetaan uudelleen ja annetaan seistä. Kun erottuminen on tapahtunut, pohjalla oleva saippuoitunut kerros poistetaan. Myös mahdolliset välikerrokset (liimamaiset ja liukenemattomat aineet) poistetaan. Neutraalin öljyn heksaaniliuos pestään useita kertoja isopropanolin ja tislatun veden liuoksella, 50–60 ml, suhteessa 1:1 (V/V) (4.4), kunnes fenoliftaleiinin vaaleanpunainen väri on hävinnyt. Poistetaan suurin osa heksaania höyrystämällä tyhjiössä (käyttäen esim. kiertohaihdutinta) ja siirretään öljy 100 ml:n kolviin (3.5). Kuivataan öljy tyhjiössä, kunnes liuotin on kokonaan haihtunut. Tämän vaiheen jälkeen öljyn happopitoisuuden on oltava alle 0,5 %.

5.1.2 Kaadetaan 1,0 g edellä kuvatulla tavalla käsiteltyä öljyä 25 ml:n erlenmeyer-pulloon (3.1) ja liuotetaan se 10 ml:aan kehitysliuosta (4.10). Liuoksen annetaan seistä vähintään 15 minuuttia ennen silikageelikolonnikromatografiaa. Jos liuos on sameaa, se sentrifugoidaan optimaalisten edellytysten varmistamiseksi kromatografiaa varten. (Voidaan käyttää käyttövalmiita 500 mg:n SPE-silikageelipatruunoita.)

5.1.3 Kromatografiakolonnin esikäsittely Kolonniin (3.3) kaadetaan noin 30 ml kehitysliuosta (4.10) ja kolonnin alaosaan työnnetään lasisauvalla pumpulituppo; painetaan tuppoa ilman poistamiseksi. Valmistetaan dekantterilasissa suspensio, jossa on 25 g silikageeliä (4.1) ja noin 80 ml kehitysliuosta, ja kaadetaan se suppilon avulla kolonniin. Varmistetaan, että kaikki silikageeli on syötetty kolonniin; pestään kehitysliuoksella (4.10), avataan hana ja annetaan nesteen tulla pylväästä, kunnes sen pinta on noin 2 mm piihappogeelin yläpinnan yläpuolella.

5.1.4 Kolonnikromatografia Punnitaan 25 ml:n erlenmeyer-pulloon (3.1) tarkasti 1,0 g 5.1 kohdan mukaisesti valmistettua näytettä. Liuotetaan näyte 10 ml:aan kehitysliuosta (4.10). Kaadetaan liuos 5.1.3 kohdan mukaisesti valmisteltuun kromatografikolonniin. Vältetään koskemasta kolonnin pintaa. Hana avataan ja liuottimen annetaan tulla pylväästä, kunnes sen pinta on silikageelin pinnan tasolla. Annetaan kehittyä 150 ml:ssa kehitysliuosta. Säädetään virtaukseksi 2 ml/minuutissa (siten että 150 ml valuu 60–70 minuutissa). Eluaatti kerätään 250 ml:n taarattuun kolviin. Liuotin haihdutetaan tyhjiössä ja sen jäänteet poistetaan typpivirtauksen avulla. Punnitaan pullo ja lasketaan kerätty uute. (Jos käytetään käyttövalmiita SPE-silikageelipatruunoita, toimitaan seuraavasti: Lisätään 1 ml liuosta (5.1.2) patruunoihin, jotka on etukäteen käsitelty 3 ml:lla n-heksaania. Kun liuos on suodattunut, annetaan kehittyä 4 ml:ssa n-heksaania/dietyylietteriä 9/1 (V/V). Eluaatti kerätään 10 ml:n putkeen ja haihdutetaan kuiviin typpivirtauksen alla. Kuiva jäännös käsitellään haimalipaasin (5.2) avulla. Rasvahappokoostumus on ehdottomasti tarkistettava sekä ennen SPE-patruunan käyttöä että sen jälkeen.

5.2 Hydrolyysi haimalipaasin avulla

5.2.1 Mitataan sentrifugin putkeen 0,1 g 5.1 kohdan mukaisesti valmisteltua öljyä. Lisätään 2 ml puskuriliuosta (4.6), 0,5 ml natriumkolaattiliuosta (4.7) ja 0,2 ml kalsiumkloridiliuosta sekoittaen hyvin jokaisen lisäyksen jälkeen. Putki suljetaan hiotulla tulpalla ja asetetaan heti termostoituun hauteeseen, jonka lämpötila on 40 °C ± 0,5.

5.2.2 Putkeen lisätään 20 mg lipaasia, ravistetaan varovasti (niin että tulppa ei pääse kastumaan), asetetaan putki termostoituun hauteeseen tasan 2 minuutiksi ja poistetaan, minkä jälkeen ravistetaan voimakkaasti tasan 1 minuutti ja annetaan jäähtyä.

5.2.3 Lisätään 1 ml dietyylieetteriä, suljetaan pullo ja ravistetaan voimakkaasti, sentrifugoidaan ja siirretään eetteriliuos mikroruiskulla puhtaaseen ja kuivaan putkeen.

5.3 Silanoitujen johdannaisten ja kaasukromatografian valmistelu

5.3.1 Lisätään mikroruiskulla 10 ml:n kartiopohjaiseen putkeen 100 μl liuosta (5.2.3).

5.3.2 Liuotin haihdutetaan heikossa typpivirrassa, lisätään 20 μl silylointireagenssia (4.15), suljetaan putki tulpalla ja annetaan seistä 20 minuuttia.

5.3.3 Lisätään 1–5 ml n-heksaania (kromatografiaolosuhteiden mukaisesti). Tuloksena on liuos kaasukromatografiaa varten.

5.4 Kaasukromatografia

Käyttöolosuhteet ovat seuraavat:

— Injektorin (kolonniin liitetty kylmäinjektori) lämpötila matalampi kuin liuoksen kiehumislämpötila (68 °C),

— Detektorin lämpötila: 350 °C,

— Kolonnin lämpötila: uunin lämpötila ohjelmoidaan seuraavasti: 60 °C yhden minuutin ajan, lisätään 15 °C minuutissa kunnes lämpötila on 180 °C, minkä jälkeen lisätään 5 °C minuutissa kunnes lämpötila on 340 °C, minkä jälkeen lämpötila pidetään 340 °C:ssa 13 minuutin ajan,

— Kantajakaasut: vety tai helium sopivalla lineaarinopeudella kuvassa 1 esitetyn resoluution saavuttamiseksi. C54-triglyseridin retentioajan on oltava 40 ± 5 minuuttia (ks. kuva 2). (Jäljempänä esitetyt käyttöolosuhteet ovat ohjeellisia. Käyttäjän on optimoitava ne halutun resoluution saavuttamiseksi. 2-glyseryylimonopalmitaatin piikin korkeuden on oltava vähintään 10 % piirturin asteikosta.),

— Injektoidun aineen määrä: 0,5–1 μl n-heksaaniliuosta (5 ml) (5.3.3.).

5.4.1 Piikkien tunnistaminen

Yksittäiset monoglyseridit tunnistetaan retentioaikojen perusteella ja suhteessa niihin, jotka on saatu samoissa olosuhteissa määritetyillä monoglyseridien standardiseoksilla.

5.4.2 Kvantitatiivinen arviointi

Jokaisen piikin pinta-ala lasketaan elektronisen integraattorin avulla.

6. TULOSTEN ESITTÄMINEN

Glyseryylimonopalmitaatin prosenttiosuus lasketaan sitä vastaavan piikin suhteellisena osuutena kaikkien monoglyseridien piikkien yhteenlasketusta pinta-alasta (ks. kuva 2) seuraavan kaavan mukaisesti:

Glycéril monopalmitate (%):

NdT: Glycéril monopalmitate = glyseryylimonopalmitaatti jossa:

Ax = glyseryylimonopalmitaatin piikin pinta-ala

ΣA = kaikkien monoglyseridien piikkien pinta-alojen summa.

Tulos ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.

7. MÄÄRITYSSELOSTE

Määritysselosteessa on oltava:

— viittaus tähän menetelmään,

— näytteen tunnistamiseksi tarvittavat tiedot,

— määrityksen tulos,

— poikkeamiset tästä menetelmästä riippumatta siitä, johtuvatko ne asianomaisten päätöksestä vai jostain muusta syystä,

— laboratorion tunnistetiedot, määrityspäivä ja määrityksestä vastaavien allekirjoitukset.

Kuva 1

Kromatogrammi silylointireaktion tuotteista, saatu lipaasikäsittelyllä jalostetusta oliiviöljystä, johon lisätty 20 % esteröityä öljyä (100 %).

Selityksiä:: Acides gras libres = vapaat rasvahapot Huile d’olive raffinée = jalostettu oliiviöljy + 20 % huile estérifiée = + 20 % esteröityä öljyä 1–2 monopalmitine = 1–2-monopalmitiini 1–2 mono C18 insat. = tyydyttymätön C18, 1–2-mono- Squalene = skvaleeni

Kuva 2

Kromatogrammi:

A) esteröimätön oliiviöljy, lipaasikäsittelyn jälkeen; silyloinnin jälkeen; näissä olosuhteissa (kapillaarikolonni 8–12 m) vahajae eluoituu samassa ajassa kuin diglyseridijae tai hieman sen jälkeen. Triglyseridipitoisuus saa lipaasikäsittelyn jälkeen olla enintään 15 %. Merkkien selitykset:: 1 = Vapaat rasvahapot 2 = Monoglyseridit 3 = Diglyseridit 4 = Triglyseridit * = 2-monopalmitiini ** = C54-triglyseridi

Kromatogrammi:

B) esteröity öljy lipaasikäsittelyn jälkeen; silyloinnin jälkeen; näissä olosuhteissa (kapillaarikolonni 8–12 m) vahajae eluoituu samassa ajassa kuin diglyseridijae tai hieman sen jälkeen. Triglyseridipitoisuus saa lipaasikäsittelyn jälkeen olla enintään 15 % Merkkien selitykset: 1 = Vapaat rasvahapot 2 = Monoglyseridit 3 = Diglyseridit 4 = Triglyseridit * = 2-monopalmitiini ** = C54-triglyseridi

8. SELITYKSIÄ

LIPAASIN VALMISTUS

Myynnissä on lipaaseja, joiden aktiivisuus on tyydyttävä. On myös mahdollista valmistaa niitä laboratoriossa seuraavasti:

Jäähdytetään 5 kg tuoretta sian haimaa 0 °C:seen. Poistetaan ympäröivä kiintorasva ja kalvot ja jauhetaan sekoittimessa niin, että syntyy tahnamainen neste. Tahnaan lisätään 2,5 l vedetöntä asetonia ja sekoitetaan 4–6 tuntia, minkä jälkeen liuos sentrifugoidaan. Jäännöstä uutetaan vielä kolme kertaa samalla tilavuusmäärällä vedetöntä asetonia, sitten kaksi kertaa asetonin ja dietyylieetterin seoksella 1:1 (V/V) ja kaksi kertaa dietyylieetterillä.

Jäännös kuivataan tyhjiössä 48 tuntia, jotta saadaan stabiili jauhe, joka säilyy kauan jääkaapissa ja kuivissa olosuhteissa.

LIPAASIAKTIIVISUUDEN TARKISTAMINEN

Valmistetaan oliiviöljyemulsio seuraavasti:

Sekoitetaan 165 ml arabikumiliuosta (100 g/l), 15 g jäämurskaa ja 20 ml neutraloitua öljyä sekoittimella.

Lisätään 50 ml:n dekantterilasiin 10 ml tätä emulsiota, sitten 0,3 ml natriumkolaattiliuosta (0,2 g/ml) ja sitten 20 ml tislattua vettä.

Dekantterilasi asetetaan termostoituun hauteeseen, jonka lämpötila on 37 °C. Upotetaan pH-mittarin elektrodit nesteeseen ja asetetaan spiraalisekoitin paikoilleen.

Lisätään natriumhydroksidiliuosta (0,1 N) tipoittain byretin avulla, kunnes pH on 8,3.

Lisätään sama tilavuusmäärä lipaasijauheen vesisuspensiota (0,1 g/ml lipaasia). Heti kun pH on 8,3, käynnistetään sekuntikello ja aloitetaan natriumhydroksidiliuoksen tiputtaminen sellaisella nopeudella, että pH pysyy koko ajan 8,3:ssa. Liuoksen kulutus luetaan joka minuutti.

Tiedot kirjataan koordinaatistoon, jossa x-akselilla on aika ja y-akselilla on pH:n säilyttämiseen tarvittavan emäsliuoksen määrä millilitroina. Tuloksena on oltava lineaarinen kuvaaja.

Lipaasiaktiviteetti, joka mitataan lipaasiyksikköinä mg:aa kohden, saadaan seuraavasti:

jossa:

A aktiviteetti lipaasiyksikköä/mg

V natriumhydroksidiliuoksen (0,1 N) määrä millilitroina minuutissa (kuvaajasta laskettuna)

N natriumhydroksidiliuoksen normaalisuus

m lipaasinäytteen paino mg:oina.

Lipaasiyksikkö on se määrä entsyymiä, joka tarvitaan vapauttamaan 10 mikroekvivalenttia happoa minuutissa.

▼M20 —————

▼M28









LIITE IX

SPEKTROFOTOMETRINEN MÄÄRITYS ULTRAVIOLETTIVALOSSA

JOHDANTO

Spektrofotometrinen määritys ultraviolettivalossa antaa tietoa rasvan laadusta ja säilymisestä sekä muutoksista, joita käsittelyt ovat siinä aiheuttaneet. Tässä menetelmässä käytetyillä aallonpituuksilla tapahtuva absorptio johtuu konjugoiduista dieeni- ja trieenijärjestelmistä, jotka ovat peräisin hapetusprosesseista ja/tai puhdistusmenetelmistä. Nämä absorptiot ilmaistaan ominaisekstinktiona

(ekstinktio, joka tapahtuu tiettyyn liuottimeen valmistetun 1-prosenttisen w/v-rasvaliuoksen 10 mm:n paksuisessa kerroksessa), josta tavallisesti käytetään merkkiä K (kutsutaan myös ekstinktiokertoimeksi).

1. SOVELTAMISALA

Tässä liitteessä kuvataan menetelmä, jolla oliiviöljylle tehdään spektrofotometrinen määritys ultraviolettivalossa.

2. MENETELMÄN PERIAATE

Näyte liuotetaan määrättyyn liuottimeen ja liuoksen absorbanssi mitataan tietyllä aallonpituudella käyttäen vertailuliuoksena puhdasta liuotinta.

Lasketaan spesifinen ekstinktio iso-oktaanissa aallonpituuksilla 232 nm ja 268 nm tai sykloheksaanissa aallonpituuksilla 232 nm ja 270 nm, kun pitoisuus on 1 % w/v 10 mm:n kyvetissä.

3. VÄLINEISTÖ

3.1 Spektrometri, jolla voidaan mitata ultraviolettivalon aallonpituuksia (220–360 nm) yhden nanometrin tarkkuudella. Spektrometrin aallonpituus- ja absorbanssiasteikkojen tarkkuuden ja uusittavuuden sekä hajavalon osalta suositellaan säännöllisiä tarkastuksia. 3.1.1 Aallonpituusasteikko Voidaan tarkistaa käyttämällä vertailumateriaalia, joka muodostuu holmiumoksidia tai holmiumoksidiliuosta (sinetöity tai ei) sisältävästä optisesta lasisuodattimesta, jossa on selvät absorptiokaistat. Vertailumateriaali on tarkoitettu UV/VIS-spektrofotometrien, joiden spektrikaistan nominaaliset leveydet ovat enintään 5 nm, aallonpituusasteikkojen tarkistamiseen ja kalibrointiin. Mittaukset tehdään vertaamalla ilmanollanäytteeseen aallonpituudella 640–240 nm vertailumateriaalin ohjeiden mukaisesti. Perusviivan korjaus tehdään tyhjällä säteen reitillä jokaisessa raon leveyden muutoksessa. Standardin aallonpituudet on lueteltu vertailumateriaalin sertifikaatissa. 3.1.2 Absorbanssiasteikko Voidaan tarkistaa käyttäen kaupallisesti saatavilla olevaa sinetöityä vertailumateriaalia, jossa on hapanta kaliumdikromaattiliuosta tiettyinä pitoisuuksina ja sertifioidut absorbanssin arvot aallonpituudella λmax (4 kaliumdikromaattiliuosta perkloorihapossa sinetöityinä 4:ään UV-kvartsikyvettiin lineaarisuuden ja fotometrisen tarkkuuden vertailuarvon mittaamiseksi ultraviolettivalossa). Kaliumdikromaattiliuokset mitataan käytettyä happoa vastaan perusviivan korjauksen jälkeen vertailumateriaalin ohjeiden mukaisesti. Absorbanssiarvot on lueteltu vertailumateriaalin sertifikaatissa. Toinen mahdollisuus tarkistaa valokennon ja valomonistimen vastaus on seuraavanlainen: Punnitaan 0,2000 g spektrofotometrisesti puhdasta kaliumkromaattia ja liuotetaan se 0,05 N kaliumhydroksidiliuokseen 1 000 ml:n mittapulloon niin, että liuosta on 1 000 ml. Mitataan tasan 25 ml tätä liuosta 500 ml:n mittapulloon ja täytetään pullo kaliumhydroksidiliuoksella. Näin saadun liuoksen ekstinktio mitataan aallonpituudella 275 nm ja käytetään kaliumhydroksidiliuosta vertailuliuoksena. Mitatun ekstinktion on oltava 0,200 ± 0,005, kun käytetään 1 cm:n optista kyvettiä.

3.2 Suorakaiteen muotoisia kvartsikyvettejä kansineen, optinen väli 10 mm, joilla voidaan mitata ultraviolettivalon aallonpituuksia (220–360 nm). Vedellä tai muulla sopivalla liuottimella täytettynä kyvettien antamien lukemien ero saa olla enintään 0,01 ekstinktioyksikköä.

3.3 A-luokan mittapulloja, 25 ml.

3.4 Analyysivaaka, jonka tarkkuus 0,0001 g.

4. REAGENSSIT

Kaikkien määrityksessä käytettävien reagenssien on oltava hyväksyttyä analyysilaatua, jollei toisin mainita, ja veden on oltava joko tislattua tai demineralisoitua tai vastaavaa puhtausastetta.

Liuotin: Iso-oktaani (2,2,4-trimetyylipentaani) mitattavaksi aallonpituudella 232 nm ja 268 nm ja sykloheksaani mitattavaksi aallonpituudella 232 nm ja 270 nm; liuottimen absorbanssin on oltava alle 0,12 aallonpituudella 232 nm ja alle 0,05 aallonpituudella 270 nm suhteessa tislattuun veteen, mitattuna 10 mm:n kyvettiin.

5. MENETTELY

5.1 Näytteen on oltava täysin homogeenista eikä siinä saa olla suspendoituneita epäpuhtauksia. Jos näin ei ole, näyte suodatetaan paperin läpi noin 30 °C:ssa.

5.2 Punnitaan noin 0,25 g näytettä (1 mg:n tarkkuudella), joka on esikäsitelty edellä kuvatulla tavalla, 25 ml:n mittapulloon, joka täytetään merkkiin liuottimella ja homogenoidaan. Syntyvän liuoksen on oltava täysin kirkasta. Jos ilmenee sameutta tai sakkaa, liuos suodatetaan nopeasti paperin läpi. HUOM. Yleensä 0,25–0,30 g:n massa on riittävä neitsyt- ja ekstraneitsytoliiviöljyjen absorbanssimittauksiin aallonpituuksilla 268 ja 270 nm. Aallonpituudella 232 nm tehtäviin mittauksiin näytettä tarvitaan yleensä 0,05 g, joten tavallisesti valmistetaan kaksi erillistä liuosta. Oliivin puristemassaöljyjen, jalostettujen oliiviöljyjen ja väärennettyjen oliiviöljyjen absorbanssimittauksiin tarvitaan niiden suuremman absorbanssin vuoksi yleensä pienempi näyte, esim. 0,1 g.

5.3 Tarvittaessa korjataan perusviiva (220–290 nm) molemmissa kvartsikyveteissä (näyte ja vertailuliuos), täytetään näytteen sisältävä kvartsikyvetti testiliuoksella ja mitataan ekstinktiot aallonpituuksilla 232, 268 ja 270 nm vertailuliuoksena käytettyä liuotinta vastaan. Saatujen ekstinktioarvojen on oltava 0,1–0,8 tai spektrofotometrin lineaarisuusalueella, joka on tarkistettava. Jollei tällaisia tuloksia saada, koe on uusittava käyttäen vahvempia tai laimeampia liuoksia tarpeen mukaan.

5.4 Kun absorbanssi on mitattu aallonpituudella 268 tai 270 nm, mitataan aallonpituudet λmax, λmax + 4 ja λmax – 4. Näitä absorbanssiarvoja käytetään ominaisekstinktion variaation (ΔΚ) määrittämiseksi. HUOM. Aallonpituutena λmax pidetään liottimena käytetyn isotaanin osalta 268 nm ja sykloheksaanin osalta 270 nm.

6 TULOSTEN ESITTÄMINEN

6.1 Lasketaan ominaisekstinktiot (ekstinktiokertoimet) eri aallonpituuksilla seuraavasta kaavasta: jossa Kλ = ominaisekstinktio aallonpituudella λ Eλ = aallonpituudella λ mitattu ekstinktio c = liuoksen väkevyys g/100 ml s = kvartsikyvetin valotie senttimetreinä ilmaistuna kahden desimaalin tarkkuudella.

6.2 Ominaisekstinktion variaatio (ΔΚ) Ominaisekstinktion absoluuttisen arvon variaatio (ΔΚ) saadaan seuraavalla kaavalla: jossa Km on ominaisekstinktio maksimiabsorbtion aallopituuden ollessa 270 ja 268 nm käytetystä liuottimesta riippuen. Tulokset ilmaistaan kahden desimaalin tarkkuudella.









LIITE X

RASVAHAPPOJEN METYYLIESTERIEN MÄÄRITTÄMINEN KAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ

1. SOVELTAMISALA

Tässä liitteessä esitetään ohjeet kasvirasvoissa ja -öljyissä esiintyvien vapaiden ja sidottujen rasvahappojen määrittämiseksi kaasukromatografisella menetelmällä sen jälkeen kun ne on muunnettu rasvahappojen metyyliestereiksi.

Triasyyliglyseridien sidotut rasvahapot ja esteröintimenetelmästä riippuen vapaat rasvahapot muunnetaan rasvahappojen metyyliestereiksi, jotka määritetään kaasukromatografisella menetelmällä.

Tässä liitteessä kuvatun menetelmän avulla voidaan määrittää rasvahappojen metyyliesterit C12–C24, mukaan lukien tyydyttyneet, cis-kertatyydyttymättömät ja trans-kertatyydyttymättömät sekä cis-monityydyttymättömät ja trans-monityydyttymättömät rasvahappojen metyyliesterit.

2. PERIAATE

Rasvahappojen metyyliesterien kvantitatiiviseen määritykseen käytetään kaasukromatografista menetelmää. Rasvahappojen metyyliesterit valmistellaan A osan mukaisesti. Ne syötetään injektoriin ja höyrystetään. Rasvahappojen metyyliesterit erotetaan analyyttisissä kolonneissa, joilla on tietty polariteetti ja pituus. Rasvahappojen metyyliesterien havaitsemiseksi käytetään liekki-ionisaatiodetektoria. Määritysedellytykset esitetään B osassa.

Kun rasvahappojen metyyliestereitä määritetään liekki-ionisaatiodetektorin avulla, kantajakaasuna (liikkuva faasi) voidaan käyttää vetyä tai heliumia. Vety nopeuttaa erottumista ja antaa terävämmät piikit. Stationäärifaasi on mikroskooppisen ohut nestekerros kvartsilasista tehdyn inertin kiinteän pinnan päällä.

Kun analysoitavat haihtuvat yhdisteet kulkevat kapillaarikolonnissa, ne joutuvat vuorovaikutukseen kolonnin sisäpintaa verhoavan stationäärifaasin kanssa. Koska eri yhdisteiden vuorovaikutus on erilainen, ne eluoituvat eri aikaan. Tätä kutsutaan yhdisteen retentioajaksi tietyn määritysparametriyhdistelmän osalta. Eri yhdisteet tunnistetaan retentioaikoja vertaamalla.

A OSA

OLIIVIÖLJYN JA OLIIVIN PURISTEMASSAÖLJYN RASVAHAPPOJEN METYYLIESTERIEN VALMISTAMINEN

1. SOVELTAMISALA

Tässä osassa kuvataan rasvahappojen metyyliesterien valmistamista. Siihen sisältyy menetelmät oliiviöljyn ja oliivin puristemassaöljyn rasvahappojen metyyliesterien valmistamiseksi.

2. SOVELTAMISALA

Oliiviöljyn ja oliivin puristemassaöljyn rasvahappojen metyyliesterit valmistetaan transesteröimällä kaliumhydroksidin metanoliliuoksella huoneenlämmössä. Näytteen puhdistustarve ennen transesteröintiä riippuu näytteen vapaiden rasvahappojen pitoisuudesta ja määriteltävästä analyyttisestä parametrista, ja menetelmä voidaan valita seuraavan taulukon mukaisesti:







Öljyluokka Menetelmä Neitsytoliiviöljy, jonka happamuus ≤ 2,0 % 1. Rasvahapot 2. Transrasvahapot 3. ΔECN42 (sen jälkeen kun puhdistettu silikageelillä SPE) Jalostettu oliiviöljy Jalostetusta oliiviöljystä ja neitsytoliiviöljystä koostuva oliiviöljy Jalostettu oliivin puristemassaöljy Oliivin puristemassaöljy Neitsytoliiviöljy, jonka happamuus > 2,0 % Raaka oliivin puristemassaöljy 1. Rasvahapot (sen jälkeen kun puhdistettu silikageelillä SPE) 2. Transrasvahapot (sen jälkeen kun puhdistettu silikageelillä SPE) 3. ΔECN42 (sen jälkeen kun puhdistettu silikageelillä SPE)

3. MENETELMÄ

3.1 Transesteröinti kaliumhydroksidin metanoliliuoksella huoneenlämmössä

3.1.1 Periaate

Metyyliesterit muodostuvat transesteröitymällä kaliumhydroksidin metanoliliuoksessa välivaiheessa ennen saippuointia.

3.1.2 Reagenssit

3.1.2.1 Metanolia, jossa enintään 0,5 % (m/m) vettä.

3.1.2.2 Heksaania kromatografiaa varten

3.1.2.3 Heptaania kromatografiaa varten.

3.1.2.4 Dietyylieetteri, stabiloitu analyysia varten.

3.1.2.5 Asetonia kromatografiaa varten.

3.1.2.6 Eluutioliuotin öljyn puhdistamiseksi kolonni-/SPE-kromatografialla: heksaanin ja dietyylieetterin seos 87/13 (v/v).

3.1.2.7 Kaliumhydroksidi, noin 2 M metanoliliuos: Liuotetaan 11,2 g kaliumhydroksidia 100 ml:aan metanolia.

3.1.2.8 Piihappopatruunoita, 1 g (6 ml) kiinteäfaasiuuttoa varten.

3.1.3 Välineistö

3.1.3.1 Kierrekorkkisia koeputkia (tilavuus 5 ml), joiden korkissa PTFE-liitos.

3.1.3.2 Mitta- tai automaattipipetit, 2 ml ja 0,2 ml.

3.1.4 Öljynäytteiden puhdistaminen

Näytteet on tarvittaessa puhdistettava ajamalla öljy piihappopatruunan läpi kiinteäfaasiuuttona. Piihappopatruuna (3.1.2.8) pannaan tyhjiöeluutiolaitteeseen ja pestään 6 ml:lla heksaania (3.1.2.2) ilman tyhjiötä. Kolonniin pannaan öljyliuos (noin 0,12 g) 0,5 ml:ssa heksaania (3.1.2.2). Imeytetään liuos piihappoon ja eluoidaan 10 ml:lla heksaania/dietyylioksidia (87:13 v/v) (3.1.2.6). Homogenoidaan eluaatti kokonaan ja jaetaan se kahdeksi yhtä suureksi näytteeksi. Toinen näyte haihdutetaan kuiviin alipaineessa pyöröhaihduttajassa huoneenlämmössä. Jäännös liotetaan 1 ml:aan heptaania. Saadusta liuoksesta voidaan määrittää rasvahapot kaasukromatografialla. Toinen näyte haihdutetaan ja liuotetaan jäännös 1 ml:aan asetonia triglyseridien määrittämiseksi tarvittaessa HPCL-menetelmällä.

3.1.5 Menettely

Mitataan 5 ml:n kierrekorkilliseen koeputkeen (3.1.3.1) noin 0,1 grammaa näyteöljyä. Lisätään 2 ml heptaania (3.1.2.2) ja ravistetaan. Lisätään 0,2 ml kaliumhydroksidin metanoliliuosta (3.1.2.7), suljetaan tiiviisti PTFE-liitoksella varustetulla korkilla, ravistetaan voimakkaasti 30 sekuntia. Putken annetaan seistä kunnes liuoksen pintakerros kirkastuu. Erotetaan pintakerros, jossa metyyliesterit ovat. Heptaaniliuos voidaan injektoida kromatografiin. Liuos on syytä säilyttää jääkaapissa kunnes se määritetään kromatografilla. Liuosta ei suositella säilytettäväksi yli 12:ta tuntia.

B OSA

RASVAHAPPOJEN METYYLIESTERIEN ANALYSOINTI KAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ

1. SOVELTAMISALA

Tässä osassa annetaan yleisohjeita kapillaarikaasukromatografian käyttöön, kun tarkoituksena on määrittää A osassa kuvatulla menetelmällä saadun rasvahappojen metyyliesterien seoksen koostumus kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti.

Tätä osaa ei sovelleta polymeroitujen rasvahappojen tutkimiseen.

2. REAGENSSIT

2.1 Kantajakaasu

Inertti kaasu (helium tai vety), huolellisesti kuivattu; ei saa sisältää happea yli 10 mg/kg.

Huomautus 1: Vety kaksinkertaistaa määritysnopeuden, mutta sen käyttö on vaarallista. Turvalaitteita on kuitenkin saatavana.

2.2 Apukaasut

2.2.1 Vety (puhtaus ≥ 99,9 %), ei saa sisältää orgaanisia epäpuhtauksia.

2.2.2 Ilmaa tai happea, ei saa sisältää orgaanisia epäpuhtauksia.

2.2.3 Typpi (puhtaus > 99 %).

2.3 Vertailustandardi

Rasvahappojen puhtaiden metyyliestereiden seos tai sellaisen tunnetun rasvan metyyliesterit, jotka ovat mahdollisimman samanlaisia kuin tutkittava rasva. Oktadekeeni-, oktadekadieeni- ja oktadekatrieenihappojen metyyliesterien cis- ja trans-isomeerit ovat hyödyllisiä tyydyttymättömien happojen trans-isomeerien havaitsemiseksi.

Monityydyttymättömien rasvahappojen hapettumista on vältettävä.

3. VÄLINEISTÖ

Nämä ohjeet koskevat tavallista kapillaarikolonnilla varustettua kaasukromatografista laitteistoa sekä liekki-ionisaatiodetektoria.

3.1 Kaasukromatografi

Kaasukromatografissa on oltava seuraavat osat.

3.1.1 Injektiojärjestelmä

On käytettävä injektiojärjestelmää, jossa on kapillaarikolonnit, jolloin injektiojärjestelmän on oltava erityisesti suunniteltu tällaisten kolonnien kanssa käytettäväksi. Järjestelmä voi olla jakajatyyppiä tai jakajaton, kolonniin liitetty (on-column) injektori.

3.1.2 Uuni

Uunin tulee pystyä lämmittämään kolonni vähintään 260 °C:n lämpötilaan ja pitämään se valitussa lämpötilassa 0,1 °C:n tarkkuudella. Viimeksi mainittu vaatimus on erittäin tärkeä, jos käytetään kvartsilasiputkea.

Lämpötilaohjelmoidun laitteen käyttöä suositellaan kaikissa tapauksissa ja erityisesti rasvahapoille, joissa on alle 16 hiiliatomia.

3.1.3 Kapillaarikolonni

3.1.3.1 Putki, joka on valmistettu analysoitaville aineille inertistä aineesta (tavallisesti lasista tai kvartsilasista). Sisähalkaisijan on oltava 0,20–0,32 mm. Sisäpinta on käsiteltävä sopivalla menetelmällä (esim. pintakäsittely, inaktivointi) ennen kuin se päällystetään stationäärifaasikerroksella. Riittävä pituus rasvahapoille ja rasvahappojen cis- ja trans-isomeereille on 60 m.

3.1.3.2 Stationäärifaasi, polaarista polysiloksaanityyppiä (syanosilikonit) olevat kytketyt kolonnit (kolonniverkot) ovat sopivia. Huomautus 2: On olemassa vaara, että polaariset polysiloksaanit vaikeuttavat linoleenihapon ja C20-happojen erottumista ja tunnistamista. Päällysteen on oltava ohut, 0,1–0,2 μm.

3.1.3.3 Kolonnin kokoaminen ja esivalmistelut Tavanomaisia varotoimenpiteitä on noudatettava kapillaarikolonnien kokoamisessa, ts. kolonnin sijoittelu uuniin (tukirakenteet), liitosten valinta ja asennus (tiiviys), kolonnin päiden liittäminen injektiojärjestelmään ja detektoriin (mahdollisimman vähän kuollutta tilaa). Kantajakaasuvirta johdetaan kolonnin läpi (esimerkiksi 0,3 baaria, 30 kPa, 25 m pitkään kolonniin, jonka sisähalkaisija on 0,3 mm). Kolonni esilämmitetään ohjelmoimalla uuni niin, että lämpötila nousee 3 °C minuutissa huoneenlämmöstä sellaiseen lämpötilaan, joka on 10 °C alhaisempi kuin stationäärifaasin hajoamislämpötila. Uuni pidetään tässä lämpötilassa yhden tunnin ajan, kunnes perusviiva on tasoittunut. Lämpötila palautetaan 180 °C:seen ja työskentelyä jatketaan vakiolämpötilassa. Huomautus 3: Esivalmisteltuja kolonneja voi myös ostaa.

3.1.4 Liekki-ionisaatiodetektori ja muuntaja-vahvistin

3.2 Ruisku

Ruiskun enimmäistilavuuden on oltava 10 μl ja jakovälin 0,1 μl.

3.3 Tiedonkeruujärjestelmä

Verkkoon yhdistettävä tiedonkeruujärjestelmä detektoreineen sekä ohjelmisto piikkien integroimiseksi ja standardoimiseksi.

4. MENETTELY

Toimenpiteet kohdissa 4.1–4.3 koskevat liekki-ionisaatiodetektorin käyttöä.

4.1 Testiolosuhteet

4.1.1 Optimaalisten koeolosuhteiden valinta kapillaarikolonneille

Kapillaarikolonnien tehokkuus- ja permeabiliteettiominaisuuksien vuoksi aineosien erottuminen ja määrityksen kesto riippuvat voimakkaasti kantajakaasun virtausnopeudesta kolonnissa. Sen vuoksi koeolosuhteet on optimoitava muuttamalla tätä parametria (eli kolonnin täytehäviötä) sen mukaan, halutaanko parantaa erotuskykyä vai saada tulos nopeasti.

Seuraavat olosuhteet ovat osoittautuneet sopiviksi rasvahappojen metyyliesterien (C4–C26) erottamiseen. Esimerkkejä kromatogrammeista esitetään lisäyksessä B:







Injektorin lämpötila: 250 °C Detektorin lämpötila: 250 °C Uunin lämpötila: 165 °C:sta (8 min) 210 °C:seen nostaen lämpötilaa 2 °C/min Kantajakaasuna vety kolonnin pään paine: 179 kPa Kokonaisvirtaus: 154,0 ml/min Jakosuhde: 1:100 Injektiotilavuus: 1 μl

4.1.2 Resoluution määrittäminen (ks. lisäys A)

Viereisten piikkien I ja II resoluutio (R) lasketaan seuraavalla kaavalla:

R = 2 × ((dr(II) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) tai R = 2 × ((tr(II) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (United States Pharma