1976L0372 — FI — 03.05.1994 — 003.001 — 1
Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentointitarkoituksiin.Toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä.
►B SEITSEMÄS KOMISSION DIREKTIIVI,
annettu 1 päivänä maaliskuuta 1976,
yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten
(76/372/ETY)
(EYVL L 102, 15.4.1976, s. 8)
Muutettu:
virallinen lehti
N:o sivu päivämäärä
►M1 Komission direktiivi 81/680/ETY, annettu 30 päivänä heinäkuuta 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2 Komission direktiivi 92/95/ETY, annettu 9 päivänä marraskuuta 1992 L 327 54 13.11.1992
►M3 Commission Directive 94/14/EC of 29 March 1994 (*) L 94 30 13.4.1994
(*) Tätä asiakirjaa ei ole julkaistu suomenkielisenä.
▼B
SEITSEMÄS KOMISSION DIREKTIIVI,
annettu 1 päivänä maaliskuuta 1976,
yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten
(76/372/ETY)
EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka
ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen,ottaa huomioon yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmistä rehujen
virallista tarkastusta varten 20 päivänä heinäkuuta 1970 annetunneuvoston direktiivin (
1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna liit-
tymisasiakirjalla (2), ja erityisesti sen 2 artiklan,
sekä katsoo, ettämainitussa direktiivissä säädetään rehujen virallisen tarkastuksen suorit-
tamisesta yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmiä käyttäen sentodentamiseksi, että lakien, asetusten ja hallinnollisten määräystenrehujen laatua ja koostumusta koskevat vaatimukset tulevat täytetyksi,
useita yhteisön määritysmenetelmiä on jo vahvistettu 15 päivänä
kesäkuuta 1971 annetulla komission direktiivillä 71/250/ETY (
3), 18
päivänä marraskuuta 1971 annetulla komission direktiivillä 71/393/
ETY (4), 27 päivänä huhtikuuta 1972 annetulla komission direktiivillä
72/199/ETY (5), 5 päivänä joulukuuta 1972 annetulla komission direk-
tiivillä 73/46/ETY (6), 25 päivänä maaliskuuta 1974 annetulla
komission direktiivillä 74/203/ETY (7) ja 20 päivänä joulukuuta 1974
annetulla komission direktiivillä 75/84/ETY (8); työ on tämän jälkeen
edistynyt siinä määrin, että olisi hyväksyttävä seitsemäs ryhmä mene-
telmiä, ja
tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän rehukomitean
lausunnon mukaiset,
ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:
1 artikla
Jäsenvaltioiden on vaadittava, että rehujen virallisessa tarkastuksessa
aflatoksiini B1-pitoisuuden määritykset suoritetaan tämän direktiivin
liitteessä esitettyjen menetelmien mukaisesti.
2 artikla
Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edel-
lyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset voimaanviimeistään 1 päivänä lokakuuta 1976. Niiden on ilmoitettava tästäkomissiolle viipymättä.
3 artikla
Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.1976L0372 — FI — 03.05.1994 — 003.001 — 2
(1) EYVL N:o L 170, 3.8.1970, s. 2
(2) EYVL N:o L 73, 27.3.1972, s. 14
(3) EYVL N:o L 155, 12.7.1971, s. 13
(4) EYVL N:o L 279, 20.12.1971, s. 7
(5) EYVL N:o L 123, 29.5.1972, s. 6
(6) EYVL N:o L 83, 30.3.1973, s. 21
(7) EYVL N:o L 108, 22.4.1974, s. 7
(8) EYVL N:o L 32, 5.2.1975, s. 26▼M1
▼B
▼B
LIITE
AFLATOKSIINI B1:N MÄÄRITYS
A. YKSISUUNTAINEN OHUTLEVYKROMATOGRAFINEN MENETELMÄ
1 Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää raaka-aineiden ja suoraan
käytettävien rehujen aflatoksiini B1-pitoisuus. Tätä menetelmää ei
voida soveltaa sitrushedelmämassaa sisältäviin näytteisiin.
Määrityksen alaraja on 0,01 mg/kg (10 ppb).
Jos häiritsevät aineet haittaavat määritystä, se on aloitettava alusta
käyttäen B menetelmää (suuren erotuskyvyn nestekromatografia).
2 Periaate
Näyte uutetaan kloroformilla. Uute suodatetaan, saadusta nesteestä
otetaan erä, joka puhdistetaan silikageelipylväällä. Eluaatti haihdu-
tetaan ja jäännös liuotetaan uudelleen tiettyyn tilavuuteen
kloroformia tai bentseenin ja asetonitriilin seosta. Tästä liuoksesta
otetulle erälle tehdään ohutlevykromatografinen (TLC) ajo. Afla-
toksiini B1:n määrä todetaan kromatogrammista UV-valon avulla
joko visuaalisesti tai fluorodensitometrisesti vertaamalla tunnet-
tuihin määriin aflatoksiini B1-standardia. Rehuista uutetun
aflatoksiini B1:n tunnistus on varmennettava esitetyllä tavalla.
3 Reagenssit
Huom: Ellei toisin mainita, kaikkien reagenssien on oltava laatu-
luokaltaan ”analyysilaatua”.
3.1 Asetoni.
3.2 Kloroformi, stabiloitu 0,5-1,0 % etanolilla (96 % v/v).
3.3 n-Heksaani.
3.4 Metanoli.
3.5 Vedetön dietyylieetteri, peroksidivapaa.
3.6 Bentseeni-asetonitriiliseos: 98/2 (v/v).
3.7 Kloroformi(3.2)-metanoli(3.4) -seos: 97/3 (v/v).
3.8 Pylväskromatografiaan tarkoitettu silikageeli, partikkelikoko 0,05-
0,20 mm.
3.9 Absorboivaa puuvillaa, josta rasva on poistettu etukäteen klorofor-
milla, tai lasivillaa.
3.10 Vedetön, rakeinen natriumsulfaatti.3.11 Inertti kaasu, esim. typpi.
3.12 1 N kloorivetyhappo.
3.13 50 % (v/v) rikkihappo.
3.14 Happopestyä piimaata (hyflosupercel).
3.15 Silikageeli G-HR tai tätä vastaava, TLC:tä varten.
3.16 Standardiliuos, jossa on noin 0,1 µg/ml aflatoksiini B
1:tä klorofor-
missa (3.2) tai bentseeni/asetonitriili-seoksessa (3.6). Valmistettu
ja tarkistettu 7 kohdassa esitetyllä tavalla.
3.17 Kvalitatiivisiin määrityksiin tarvittava standardiliuos, jossa on noin
0,1 µg/ml aflatoksiini B1:tä ja B2:ta kloroformissa (3.2) tai bent-
seeni/asetonitriili-seoksessa (3.6). Nämä konsentraatiot ovat
ohjeellisia. Ne on valittava sellaisiksi, että molemmista aflatoksii-
neista saatavan fluoresenssin voimakkuus on samanlainen.
3.18 Ajoliuokset
3.18.1 Kloroformi(3.2)/asetoni(3.1): 9/1 (v/v), kyllästymätön kammi o;1976L0372 — FI — 03.05.1994 — 003.001 — 3
▼M2
▼B
▼B
3.18.2 Dietyylieetteri (3.5)/metanoli (3.4)/vesi: 96/3/1 (v/v), kyllästymätön
kammio;
3.18.3 Dietyylieetteri (3.5)/metanoli (3.4)/vesi: 94/4,5/1,5 (v/v/v),
kylläinen kammio;
3.18.4 Kloroformi (3.2)/metanoli (3.4): 94/6 (v/v), kylläinen kammio;
3.18.5 Kloroformi (3.2)/metanoli (3.4): 97/3 (v/v), kylläinen kammio.
4 Välineistö
4.1 Jauhatuslaite.
4.2 Ravistelija tai magneettisekoittaja.
4.3 Laskostettuja suodatinpapereita, Schleicher ja Schüll N:o 588 tai
vastaava, läpimitta 24 cm.
4.4 Lasinen kromatografiaputki (sisäläpimitta: 22 mm, pituus: 300 mm),
jossa on PTFE-hana ja 250 ml:n säiliö.
4.5 Tyhjiöpyöröhaihdutin ja 500 ml:n pyöreäpohjainen pullo.
4.6 500 ml:n hiostulpallisia erlenmayerkolveja.
4.7 TLC-laite.
4.8 Lasisia TLC-levyjä, 200 × 200 mm, jotka on käsitelty seuraavasti
(annetut määrät riittävät viiteen levyyn). Punnitaan 30 g silikageeli
G-HR:ää (3.15) erlenmayerkolviin. Lisätään 60 ml vettä, suljetaan
tulpalla ja ravistellaan minuutin ajan. Suspensio levitetään levyille
0,25 mm paksuksi yhtenäiseksi kerrokseksi. Annetaan kuivua
ilmassa ja säilytetään silikageeliä sisältävässä eksikaattorissa. Levyt
aktivoidaan käyttöön otettaessa pitämällä niitä lämpökaapissa
110 ºC:ssa tunnin ajan.
Valmiina hankittavat levyt ovat myös käyttökelpoisia, mikäli niillä
saadaan samanlaisia tuloksia kuin tässä esitetyllä tavalla tehdyillä
levyillä.
4.9 Pitkäaallonpituuksinen (360 nm) UV-lamppu. Säteilyn voimak-
kuuden tulee olla sellainen, että sillä on mahdollista havaita 1 ng:n
suuruinen aflatoksiini B1-täplä TLC-levyllä 10 cm:n etäisyydellä
lampusta.
4.10 Polyetyleenitulpallisia asteikolla varustettuja 10 ml:n putkia.
4.11 UV-spektrofotometri.
4.12 Fluorodensitometri (vaihtoehtoinen).
5 Suoritus
5.1 Näytteenesikäsittely(ks.”huomautukset”, Cosa, 1kohta).
Näyte jauhetaan niin, että se kokonaisuudessaan läpäisee 1 mm:n
seulan (ISO R 565 suosituksen mukainen).
5.2 Uutto
Punnitaan 50 g jauhettua ja homogenoitua näytettä 500 ml:n erlen-
mayerkolviin (4.6). Lisätään 25 g piimaata (3.14), 25 ml vettä ja
250 ml kloroformia (3.2). Kolvi suljetaan, ravistetaan tai sekoite-
taan 30 minuuttia laitteessa (4.2) ja suodatetaan laskostetun
suodatinpaperin läpi (4.3). Ensimmäiset 10 ml suodoksesta
heitetään pois ja sen jälkeen otetaan talteen 50 ml:n suuruinen erä.
5.3 Puhdistus pylväässä
Kromatografiaputken (4.4) alapäähän asetetaan puuvilla- tai lasivil-
latuppo (3.9), putkitäytetään kahdella kolmanneksella
tilavuudestaan kloroformilla (3.2) ja lisätään 5 g natriumsulfaattia
(3.10).
Tarkistetaan, että natriumsulfaattikerroksen yläpinta on tasainen,
jonka jälkeen lisätään pieninä erinä 10 g silikageeliä (3.8). Kunkin
lisäyksen jälkeen sekoitetaan varovasti ilmakuplien poistamiseksi.
Annetaan seistä 15 minuuttia ja tämän jälkeen lisätään varovasti
15 g natriumsulfaattia (3.10). Nesteen annetaan laskea, kunnes se
on juuri natriumsulfaattikerroksen yläpinnan yläpuolella.
Sekoitetaan keskenään 5.2 kohdassa talteen otettua uutetta 50 ml ja
100 ml n-heksaania (3.3) ja seos siirretään kvantitatiivisesti pylvää-
seen. Nesteen annetaan laskea, kunnes se on juuri1976L0372 — FI — 03.05.1994 — 003.001 — 4
▼B
natriumsulfaattikerroksen yläpuolella. Tämä pesuliuos heitetään
pois. Tämän jälkeen lisätään 100 ml dietyylieetteriä (3.5) ja sen
annetaan taas laskeutua natriumsulfaattikerroksen yläpintaan.
Näiden toimenpiteiden aikana on huolehdittava siitä, että virtausno-
peus on 8-12 ml minuutissa ja että pylväs ei pääse kuivumaan.
Ulostullut neste heitetään pois. Tämän jälkeen eluoidaan 150 ml:lla
kloroformi/metanoli-seosta (3.7) ja koko eluaatti kerätään talteen.
Viimeksi mainittu erä haihdutetaan miltei kuivaksi inertin kaasun
(3.11) alla pyöröhaihduttimessa (4.5), jossa lämpötila ei ylitä 50 ºC.
Jäännös siirretään kvantitatiivisesti kloroformilla (3.2) tai bentseeni-
asetonitriili-seoksella (3.6) 10 ml:n asteikolla varustettuun putkeen
(4.10). Liuos väkevöidään johtamalla sen pintaan inerttiä kaasua
(3.11), minkä jälkeen tilavuus säädetään 2 ml:ksi kloroformilla
(3.2) tai bentseeni-asetonitriili-seoksella (3.6).
5.4 Ohutlevykromatografia
TLC-levylle (4.8) pipetoidaan täplinä 2 cm:n etäisyydelle alareu-
nasta ja 2 cm:n välein jäljempänä esitetyt määrät standardiliuosta
ja uutetta:
— 10, 15, 20, 30 ja 40 µl aflatoksiini B1-standardiliuosta (3.16);
— 10 µl 5.3 kohdassa saatua uutetta ja tähän samaan kohtaan 20 µl
standardiliuosta (3.16);
— 10 ja 20 µl 5.3 kohdassa saatua uutetta.
Kromatogrammi kehitetään pimeässä yhdellä ajoliuoksista (3.18).
Ajoliuoksien valinta on tehtävä etukäteen pipetoimalla levylle 25 µl
kvalitatiivista standardiliuosta (3.17) ja tarkistamalla, että aflatok-
siini B1ja B2ovat kromatogrammin kehityksen jälkeen erottuneet
toisistaan täydellisesti.
Liuottimien annetaan haihtua pimeässä ja levyä valaistaan tämän
jälkeen UV-valolla siten, että se on 10 cm:n etäisyydellä lampusta
(4.9). Aflatoksiini B1-täplät fluoresoivat sinisinä.
5.5 Kvantitatiiviset määritykset
Määritetään joko visuaalisesti tai fluorodensitometrisesti jäljempänä
kuvatulla tavalla.
5.5.1 Visuaaliset mittaukset
Uutteessa olevan aflatoksiini B1:n määrä määritetään etsimällä stan-
dardiliuoksen täplistä se täplä, joka vastaa uutteesta saatujen täplien
fluoresenssin voimakkuutta. Tarvittaessa interpoloidaan. Uutteeseen
lisätyn standardiliuoksen täplän fluoresenssin on oltava voimak-
kaampi kuin 10 µl:sta uutetta saatu fluoresenssi eikä tällöin saa
esiintyä useampia kuin yksi havaittava täplä. Mikäli 10 µl:sta
uutetta saatu fluoresenssin voimakkuus on suurempi kuin 40 µl:sta
standardiliuosta saatu voimakkuus, uute laimennetaan 10- tai 100-
kertaisesti kloroformilla (3.2) tai bentseeni/asetonitriili-seoksella
(3.6), jonka jälkeen tälle suoritetaan uusi ohutlevykromatografinen
ajo.
5.5.2 Fluorodensitometriset mittaukset
Aflatoksiini B1-täplien fluoresenssin voimakkuus mitataan fluoro-
densitometrillä (4.12) käyttäen viritysaallonpituutena 365 nm ja
emissioaallonpituutena 443 nm. Aflatoksiini B1:n määrä uutteen
täplissä määritetään vertaamalla niiden fluoresenssin voimak-
kuuksia aflatoksiini B1-standardin täplien voimakkuuksiin.
5.6 Aflatoksiini B1:n tunnistamisen varmistus
Aflatoksiini B1:n tunnistaminen varmistetaan seuraavassa esitetyllä
tavalla.
5.6.1 Rikkihappokäsittely
Ruiskutetaan rikkihappoa (3.13) 5.4 kohdan mukaisesti saadulle
kromatogrammille. Aflatoksiini B1:n täplien fluoresenssin täytyy
muuttua UV-valossa sinisestä keltaiseksi.
5.6.2 Aflatoksiini B1-hemiasetaalin (aflatoksiini B2a)
muodostumisen sisältävä kaksisuuntainen kromatografia
Huom.: Seuraavassa esitetyt toimenpiteet on suoritettava noudat-
taen huolellisesti kuvassa 3 esitettyä kaaviota.
5.6.2.1 Liuosten pipetointi1976L0372 — FI — 03.05.1994 — 003.001 — 5
▼B
Levylle (4.8) tehdään liuotinrintamien liikkumisen rajoittamiseksi
kaksi vierekkäisten sivujen suuntaista suoraa uraa (6 cm sisäänpäin
kummaltakin sivulta). Levylle pipetoidaan kapillaaripipettejä tai
mikroruiskuja käyttäen täpliksi seuraavat liuokset:
—pisteeseen A: erä 5.3 kohdassa saadun näytteen puhdistettua
uutetta, joka sisältää noin 2,5 ng aflatoksiini B1:tä;
—pisteisiin B ja C: 25 µl standardiliuosta (3.16).
5.6.2.2 Kehitys
Kromatogrammi kehitetään suuntaan I pimeässä käyttäen kehityk-
seen ajoliuosta (3.18.1) (1 cm:n kerros kyllästämättömässä
kammiossa), kunnes liuotinrintama saavuttaa liuotinta rajoittavan
uran.
Levy otetaan kammiosta ja annetaan kuivua pimeässä
huoneenlämmössä viiden minuutin ajan. Ruiskutetaan kloorivety-
happoa (3.12) pisteet A ja B peittävää 2,5 cm leveää vyöhykettä
myöten (osoitettu viivoituksella kuvassa 3), kunnes se tummenee,
muu osa levystä suojataan lasilevyllä. Annetaan reagoida 10
minuuttia pimeässä ja kuivataan ilmavirralla huoneenlämmössä.
Kromatogrammi kehitetään seuraavaksi pimeässä suuntaan II,
käyttäen ajoliuosta (3.18.1) (1 cm:n kerros kyllästämättömässä
kammiossa) kunnes liuotinrintama saavuttaa liuotinta rajoittavan
uran. Levy poistetaan kammiosta ja sen annetaan kuivua
huoneenlämmössä.
5.6.2.3 Kromatogrammin tulkinta
Kromatogrammia tarkastellaan UV-valossa (4.9) ja siitä tarkistetaan
seuraavat piirteet:
a) C kohtaan pipetoidusta standardiliuoksesta peräisin oleva afla-
toksiini B1:n sinisen fluoresoivan täplän esiintyminen
(liikkumissuuntaan I).
b) Reagoimattoman (kloorivetyhapon kanssa) aflatoksiini B1:n
sinisen fluoresoivan täplän esiintyminen ja aflatoksiini B1-hemi-
asetaalin voimakkaamman sinisen fluoresoivan täplän
esiintyminen, jotka molemmat ovat peräisin B kohtaan pipetoi-
dusta standardiliuoksesta (liikkumissuuntaan II).
c) b kohdassa kuvattuja täpliä vastaavien täplien esiintyminen,
jotka ovat peräisin A kohtaan pipetoidusta näytteestä. Näiden
täplien asema määritetään ensin aflatoksiini B1:n etäisyydestä A
kohdasta liikkumissuunnassa I (sama kuin C kohtaan pipetoidun
standardin matka), ja tämän jälkeen aflatoksiini B1-hemiase-
taalin liikkumisetäisyydet tästä liikkumissuunnassa II (sama
kuin B kohtaan pipetoidun standardin liikkumamatka). Uutteesta
ja B kohtaan pipetoidusta standardista peräisin olevien hemiase-
taalitäplien fluoresenssivoimakkuuksien tulisi olla toisiaan
vastaavia.
6 Tulosten laskeminen
6.1 Visuaalisista mittauksista
Aflatoksiini B1:n pitoisuus ilmoitettuna µg/kg näytettä (ppb)
saadaan kaavasta:
S/C1Y/C1V
W/C1X
jossa:
Y on aflatoksiini B1:n standardiliuoksen (3.16) ja X on vastaavasti
samanlaisen fluoresenssivoimakkuuden omaavan uutteen tilavuus
mikrolitroina;
S = aflatoksiini B1-pitoisuus standardiliuoksessa (3.16) mikro-
grammoina millilitraa kohti;
V = uutteen lopputilavuus mikrolitroina ottaen huomioon kaikki
tarpeelliset laimennukset;
W = pylväässä puhdistetun uutteen tilavuutta vastaava näytteen
paino grammoina.1976L0372 — FI — 03.05.1994 — 003.001 — 6
▼B
6.2 Fluorodensitometrisistä mittauksista
Aflatoksiini B1:n pitoisuus mikrogrammoina/kg näytettä saadaan
kaavasta:
S/C1V
W/C1Y
jossa:Y = levylle täpläksi pipetoidun uutteen tilavuus mikrolitroina (10
tai 20 mikrolitraa);
S = uutetäplässä olevan aflatoksiini B
1:n määrä nanogrammoina
(suhteessa Y arvoon), joka on saatu mittauksista;
V = uutteen lopputilavuus mikrolitroina, ottaen huomioon kaikki
tarpeelliset laimennukset;
W = pylväässä puhdistetun uutteen tilavuutta vastaava näytteen
paino grammoina.
7 Standardiliuoksen (3.16) valmistus ja testaus
7.1 Aflatoksiini B1-pitoisuuden määritys
Aflatoksiini B1-standardiliuos tehdään pitoisuudeltaan 8-10 µg/ml
ja se valmistetaan kloroformiin (3.2) tai bentseeni/asetonitriili-seok-
seen (3.6). Absorptiospektri välillä 330-370 nm määritetään
spektrofotometrin avulla (4.11).
Absorbanssi (A) mitataan 363 nm:ssa kloroformiliuoksilla tai
348 nm:ssa bentseeni/asetonitriili-seoksilla.
Aflatoksiini B1:n konsentraatio mikrogrammoina millilitrassa
liuosta lasketaan seuraavista kaavoista:
312/C1A/C11000
20600kloroformiliuoksilla;
312/C1A/C11000
19800bentseeni=asetonitriili-seoksilla:
Valmistetaan päivänvalolta suojattuna sopiva laimennus käyttöstan-
dardiliuokseksi, jonka aflatoksiini B1-konsentraatio on noin 0,1 µg/
ml. Jääkaapissa 4 ºC:ssa säilytettynä tämä liuos säilyy kaksiviikkoa.
7.2 Kromatografisen puhtauden testaus
Levylle (4.8) pipetoidaan täpläksi 5 µl aflatoksiini B
1-standardi-
liuosta, jonka pitoisuus on 8-10 µg/ml (ks. 7.1). Kromatogrammi
kehitetään 5.4 kohdassa esitetyllä tavalla. Kromatogrammissa tulisi
UV-valossa näkyä ainoastaan yksi täplä eikä näytteen alkuperäisellä
pipetointivyöhykkeellä saa olla havaittavissa lainkaan fluoresenssia.
8 Toistettavuus
Saman henkilön samasta näytteestä tekemien kahden rinnakkaisen
määrityksen tulosten välinen ero ei saa ylittää:
— 25 %, suurempaan tulokseen verrattuna, suuruudeltaan välillä
10-20 µg/kg olevilla aflatoksiini B1-pitoisuuksilla;
— 5 µg, absoluuttisena arvona annettuna, välillä 20-50 µg/kg
olevilla aflatoksiini B1-pitoisuuksilla;
— 10 %, suurempaan arvoon verrattuna, yli50 µg/kg olevi lla
pitoisuuksilla.
9 Verrattavuus
Ks. kohta ”Huomautukset”, C osa, 2 kohta.1976L0372 — FI — 03.05.1994 — 003.001 — 7
▼M2
B. AFLATOKSIINI B1:N MÄÄRITYS: SUUREN EROTUSKYVYN NESTEK-
ROMATOGRAFINEN MENETELMÄ
1 Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää aflatoksiini B1-pitoisuus
rehuissa, mukaan lukien sitrushedelmämassaa sisältävät rehut.
Määrityksen alaraja on 0,001 mg/kg (1 ppb).
2Periaate
Näyteuutetaankloroformilla.Uutesuodatetaanjatästäotetaanerä,
jokapuhdistetaanensinFlorisil-patruunallajatämänjälkeenC18-
patruunalla.Lopullinenerotusjamäärityssuoritetaansuurenerotuskyvynnestekromatografialla(HPLC)käyttäenC
18-käänteis-
faasikolonniajatämänjälkeenkolonninjälkeisten
jodijohdannaistenvalmistusmahdollistaatoteamisenfluoresenssilla.
Huomautus:
Mykotoksiinitovaterittäinmyrkyllisiäaineita.Niiden käsittely on
suoritettavavetokaapissa.Erityisiinvarotoimiinon ryhdyttävä niiden
ollessakuivassamuodossa,silläneovat sähköstaattisia ja niillä
ontaipumustämänvuoksilevitätyöpinnoille.
3 Reagenssit
3.1 Kloroformi, stabiloitu 0,5-1,0 % (w/w) etanolilla. Ks. 10.2.
huomautus.
3.2 Metanoli, HPLC-laatua, 3.6 seoksen valmistamiseen.
3.3 Asetoni.3.4 Asetonitriili, HPLC-laatua.3.5 Eluointiliuottimet: Valmistetaan käyttöä edeltävänä päivänä tai
poistetaan ilma ultraäänikammiossa.
3.5.1 Asetoni(3.3)/vesi-seos, 98 + 2 (v + v).3.5.2 Vesi/metanoli -seos (3.2), 80 + 20 (v + v).3.5.3 Vesi/asetoni -seos (3.3), 85 + 15 (v + v).3.6 Liikkuva faasi HPLC:a varten.
Liikkuva faasi koostuu vedestä, metanolista (3.2) ja asetonitriilistä
(3.4), 130 + 70 + 40 (v + v + v).
HUOMAUTUS: Liikkuvan faasin koostumusta voidaan muuttaa
käytetyn HPLC-kolonnin erityisominaisuuksien mukaisesti.
3.7 Kylläinen jodiliuos. Lisätään 2 g jodia 400 ml:aan vettä. Sekoite-
taan vähintään 90 minuuttia ja suodatetaan kalvosuodattimen
(4.15) läpi. Kylläinen liuos on suojattava valolta valohajoamisen
estämiseksi.
3.8 Hapolla pesty Celite 545 tai vastaava tuote.
3.9 Florisil-patruuna (Waters SEP-PAK tai vastaava tuote).3.10 C
18-patruuna (Waters SEP-PAK taivastaava tuote).
3.11 Inertti kaasu, esim. typpi.3.12 Aflatoksiini B
1-standardiliuos kloroformissa, pitoisuus 10 µg/ml.
Liuoksen pitoisuus tarkistetaan seuraavasti: määritetään liuoksen
absorptiospektri välillä 330-370 nm spektrofotometriä (4.23)
käyttäen. Mitataan absorbanssi (A) 363 nm:ä lähellä olevan enim-
mäisabsorption kohdalta. Lasketaan liuoksen aflatoksiini B1-pitoisuus mikrogrammoina millilitrassa liuosta kaavalla:
pitoisuu s =mlð  Þ ¼312/C2A/C21000
22300¼13;991/C2A
3.1.2.1 Aflatoksiini B1:n standardikantaliuos kloroformissa.
Siirretään kvantitatiivisesti 2,5 ml aflatoksiini B1-standardiliuosta
(3.12) 50 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin asti kloroformilla
(3.1) Tämä liuos säilytetään alumiinifolioon käärityssä hyvin sulje-
tussa pullossa viileässä (4 ºC) ja pimeässä.
3.13 Aflatoksiini B1:n HPLC-standardiliuokset.1976L0372 — FI — 03.05.1994 — 003.001 — 8
µg
▼M2
HUOMAUTUS: Näiden liuosten valmistamiseen on käytettävä
hapolla pestyjä lasiastioita (ks. 4 kohta, välineistö).
3.13.1 Standardiliuos 4 ng/ml.
Annetaan standardikantaliuosta (3.12.1) sisältävän mittapullon
lämmetä alumiinifolioon käärittynä huoneenlämpöiseksi (muutaman
tunnin ajan). Siirretään 400 µl standardikantaliuosta (200 ng afla-
toksiini B1:tä) 50 ml:n mittapulloon ja haihdutetaan liuos kuivaksi
inertissä kaasuvirrassa (3.11). Liuotetaan saatu jäännös noin
20 ml:aan vesi/asetoni -seosta (3.5.3), täytetään pullon merkkiin
asti vesi/asetoni -seoksella ja sekoitetaan hyvin.
3.13.2 Standardiliuos 3 ng/ml.
Siirretään kvantitatiivisesti 7,5 ml standardiliuosta (3.13.1) 10 ml:n
mittapulloon, täytetään merkkiin asti vesi/asetoni -seoksella (3.5.3)
ja sekoitetaan hyvin.
3.13.3 Standardiliuos 2 ng/ml.
Siirretään kvantitatiivisesti 25 ml standardiliuosta (3.13.1) 50 ml:n
mittapulloon, täytetään merkkiin asti vesi/asetoni -seoksella (3.5.3)
ja sekoitetaan hyvin.
Tätä liuosta käytetään myös standardiliuoksena HPLC-ajon (5.5)
injektointien toistoihin.
3.13.4 Standardiliuos 1 ng/ml.
Siirretään kvantitatiivisesti 2,5 ml standardiliuosta (3.13.1) 10 ml:n
mittapulloon, täytetään merkkiin asti vesi/asetoni -seoksella (3.5.3)
ja sekoitetaan hyvin.
3.14 Ampulli, joka sisältää 1 ml:n seosta, joka koostuu kloroformissa
olevista aflatoksiineista B1,B2,G1ja G2, joiden pitoisuudet ovat
vastaavastinoi n 1, 0,5, 1 ja 0,5 µg/ml.
3.14.1 Kromatografisen erottumisen koeliuos.
Siirretään ampullin (3.14) sisältö lasitulpalla varustettuun
koeputkeen tai pieneen kierrekorkilliseen pulloon. Siirretään 40 µl
tätä liuosta lasitulpalliseen koeputkeen (happopesty) (4.22). Haih-
dutetaan kloroformi inertissä kaasuvirrassa (3.11) ja liuotetaan
uudelleen 10 ml:aan vesi/asetoni -seosta (3.5.3).
3.15 Varmistuskokeen (6) reagenssit.3.15.1 Kylläinen natriumkloridiliuos.
3.15.2 Vedetön, rakeinen natriumsulfaatti.
4 Välineistö
Varoitus: Hapolla pesemätön lasitavara voi aiheuttaa hävikkiä vesi-
pitoisissa aflatoksiiniliuoksissa. On huolehdittava erityisesti uuden
lasitavaran ja kertakäyttöisen lasitavaran, kuten automaattisen
injektorin pullojen ja Pasteur-pipettien käsittelystä. Tämän vuoksi
vesipitoisten aflatoksiini B
1-liuosten kanssa kosketukseen joutuvat
lasitavarat on upotettava laimeaan happoon (esimerkiksi rikkihappo,
2 mol/l) usean tunnin ajaksi ja huuhdeltava tämän jälkeen hyvin
tislatulla vedellä kaiken jäljellä olevan hapon poistamiseksi
(esimerkiksi kolme kertaa, tarkastus pH-paperilla). Tämä käsittely
on käytännössä suoritettava pyöreäpohjaiselle keittopullolle (4.4),
mittapulloille, mittalaseille, pulloille tai putkille, joita käytetään
standardiliuoksia ja lopullisia uutteita varten (erityisesti automaat-
tisen injektorin pulloille), ja Pasteur-pipeteille, jos niitä käytetään
standardiliuosten tai uutteiden siirtoon.
4.1 Jauhatus-sekoituslaite.
4.2 Seula, jonka silmäkoko on 1,0 mm (ISO R 565).
4.3 Mekaaninen ravistelija.
4.4 Pyöröhaihdutin ja 150-250 ml:n pyöreäpohjaisia keittopulloja.4.5 Suuren erotuskyvyn nestekromatografi, jonka injektorissa on
250 µl:n injektioon soveltuva silmukka. Silmukan osittainen tai
täydellinen täyttö on selitetty valmistajan toimittamissa ohjeissa.
4.6 HPLC-kolonni, joka on täytetty 3 µm:n tai 5 µm:n C
18-hiukkasilla.
4.7 Pulssiton pumppu kolonnin jälkeisen jodireagenssin annosteluun.1976L0372 — FI — 03.05.1994 — 003.001 — 9
▼M2
4.8 Ruostumattomasta teräksestä valmistettu T-yhde (1/16” × 0,75 mm),
jossa eiole kuollutta ti lavuutta.
4.9 Reaktiokierukka, teflonia tai ruostumatonta terästä. Kooltaan
3 000 × 0,5 mm − 5 000 × 0,5 mm olevia kierukoita voidaan
käyttää 5 µm:n tai3 µm:n HPLC-kolonni en kanssa.
4.10 Termostaattisesti säädeltävä 60 ºC:seen säädetty vesihaude, jonka
lämpötilan säädettävyys on vähintään 0,1 ºC.
4.11 Fluoresenssidetektori, jossa eksitaatioaallonpituutena on 365 nm ja
emissioaallopituutena 435 nm (suodatinlaitteissa emissioaallonpi-
tuus > 400 nm). Vähintään 0,05 ng aflatoksiini B1:tä on oltava
mahdollista havaita. Läpivirtauskyvettiin muodostuvien ilmakuplien
poistamiseksi on suositeltavaa muodostaa tietty vastapaine (esimer-
kiksi käyttäen paineensäädintä tai teflonista tai ruostumattomasta
teräksestä valmistettua detektorin ulostuloaukkoon yhdistettyä kier-
ukkaa).
4.12 Piirturi.4.13 Elektroninen integraattori (vaihtoehtoinen laite).4.14 Halkaisijaltaan 24 cm oleva laskostettu suodatinpaperi, Macherey-
Nagel 617 1/4 taivastaava.
4.15 Huokoisuudeltaan 0,45 µm oleva kalvosuodatin, Millipore HAWP
04700 taivastaava.
4.16 Vetoisuudeltaan 500 ml oleva tulpallinen erlenmeyerkolvi.4.17 Luer-liittimellä varustettu lasikolonni (sisähalkaisija noin 1 cm,
pituus noin 30 cm).
4.18 Kloroformia kestävä Luer-liittimellä varustettu hana (esim. Bio-rad
7328017, Analytichem A1 6078, J. T. Baker 4514 tai vastaava).
4.19 Vetoisuudeltaan 10 ml oleva kemikaaleja kestävä Luer-liittimellä
varustettu ruisku.
4.20 Vetoisuudeltaan 250 µl oleva HPLC-injektointiin sopiva ruisku (ks.
4.5).
4.21 Vetoisuudeltaan 100 µl oleva mikroruisku standardiliuosten valmis-
tamiseen (tarkastetaan punnitsemalla, että tarkkuus on 2 %:n
rajoissa).
4.22 Tulpalla ja 10 ml:n asteikolla varustettuja koeputkia.4.23 Spektrofotometri, jota voidaan käyttää absorptiospektrin UV-
alueella.
4.24 Varmistuskokeeseen (6) tarvittava välineistö.4.24.1 Hapolla huuhdeltu 100 ml:n erotussuppilo, jossa teflonhana.4.24.2 Lämpöblokki, 40-50 ºC.
5 Menettely
5.1 Näytteen esikäsittely
Näyte jauhetaan siten, että se läpäisee seulan (4.2.).
5.2 Näytteenotto
Punnitaan 50,0 g tällä tavoin esikäsiteltyä näytettä erlenmeyerkol-
viin (4.16).
5.3 Uutto
Lisätään näytteeseen (5.2) 25 g Celiteä (3.8), 250 ml kloroformia
(3.1) ja 25 ml vettä. Suljetaan pullo ja ravistellaan 30 minuuttia
mekaanisella ravistelijalla (4.3). Suodatetaan laskostetun suodatin-
paperin (4.14) läpi. Kerätään 50 ml suodosta. Tarvittaessa otetaan
suodoksesta osanäyte, joka laimennetaan 50 ml:ksi kloroformilla
siten, että aflatoksiini B
1-pitoisuus ei ylitä 4 ng/ml.1976L0372 — FI — 03.05.1994 — 003.001 — 10
▼M2
5.4 Puhdistus(toimenpiteetontehtäväilmanmerkittäviäkeskeytyksiä)
Varoitus:
— laboratorio, jossa määritykset suoritetaan, on suojattava päivän-
valolta. Tämä voidaan toteuttaa käyttäen:
1) ikkunoissa UV-säteilyä absorboivaa kalvoa sekä
himmentämällä valoa (ei suoraa auringonvaloa);
2) verhoja tai pimennyskaihtimia sekä keinovaloa (fluoresoivat
loisteputket ovat hyväksyttäviä);
— Aflatoksiinia sisältävät liuokset on suojattava valolta mahdolli-
simman hyvin (ne on säilytettävä pimeässä ja peitettävä
alumiinifoliolla).
5.4.1 Florisil SEP-PAK -puhdistus
5.4.1.1 Kolonni-patruuna-yhdistelmän esikäsittely
Liitetään hana (4.18) Florisil-patruunan (3.9) lyhyempään liitoso-
saan (ks. kuva 1). Pestään patruuna ja poistetaan ilma käyttäen
10 ml kloroformia (3.1) josta 8 ml painetaan nopeasti ruiskulla
(4.19) hanan kautta patruunan läpi. Patruunan pidempi liitososa
kiinnitetään lasikolonniin (4.17) ja jäljellä oleva 2 ml:n erä kloro-
formia johdetaan patruunan läpi kolonniin. Suljetaan hana.
Poistetaan ruisku.
5.4.1.2 Puhdistus
Kohdassa 5.3. kerätty suodos johdetaan kolonni-patruuna -yhdis-
telmään ja annetaan imeytyä painovoiman avulla. Huuhdellaan
5 ml:lla kloroformia (3.1) ja tämän jälkeen 20 ml:lla metanolia
(3.2). Heitetään eluaatit pois. Näiden toimenpiteiden aikana on
huolehdittava siitä, että kolonni -patruuna -yhdistelmä ei pääse
kuivumaan. Aflatoksiini B1eluoidaan 40 ml:lla asetoni/vesi -seosta
(3.5.1) ja koko eluaattikerätään talteen pyöröhai hduttajan (4.4)pyöreäpohjaiseen keittopulloon. Väkevöidään eluaatti pyöröhaihdut-
tajassa 40-50 ºC:n lämpötilassa kunnes asetonia ei enää tislaudu.
(Huomautus: Tässä vaiheessa nestettä jää pulloon noin 0,5 ml.
Kokemus on osoittanut, että lisähaihdutus ei ole haitaksi ja että josnestettä jää 0,5 ml, asetonia ei ole enää merkittäviä määriä jäljellä.
Asetonijäämät voivat aiheuttaa aflatoksiini B
1:n hävikkiä C18-
patruunalla). Lisätään 1 ml metanolia (3.2), ravistellaan pulloa afla-toksiini B
1:n liuottamiseksi, lisätään 4 ml vettä ja sekoitetaan.
Irrotetaan patruuna ja heitetään se pois. Huuhdellaan lasikolonnivedellä ja säästetään se C
18-puhdistusta varten.
5.4.2 C18-SEP-PAK -puhdistus
5.4.2.1. Kolonni-patruuna-yhdistelmän esikäsittely.
Liitetään hana (4.18) C18-patruunan lyhyempään liitososaan (3.10)
(ks. kuva 1). Huuhdellaan patruuna ja poistetaan ilma painaen
10 ml metanolia (3.2) nopeasti ruiskulla (4.19) hanan kautta patruu-
naan (patruunassa olevat ilmakuplat näkyvät vaaleina laikkuina
harmahtavaa taustaa vasten). Otetaan 10 ml vettä ja injektoidaan
8 ml:n erä patruunan läpi (siirryttäessä metanolista veteen on
vältettävä ilman pääsyä patruunaan). Patruunan pidempi liitososa
kiinnitetään lasikolonniin (4.17) ja jäljellä oleva 2 ml vettä johde-
taan patruunan läpi kolonniin. Suljetaan hana. Poistetaan ruisku.
5.4.2.2 Puhdistus
Siirretään kohdassa 5.4.1.2. kerätty uute kvantitatiivisesti kolonniin
(4.17), huuhdellaan pullo kaksikertaa 5 ml:lla vesi /metanoli-seosta
(3.5.2) ja annetaan sen imeytyä painovoiman avulla. Näiden
toimenpiteiden aikana on huolehdittava siitä, että kolonni-patruuna
-yhdistelmä ei pääse kuivumaan. (Jos patruunan viereiseen kaven-
nukseen kehittyy ilmakuplia, virtaus on pysäytettävä ja
lasikolonnin yläosaa on naputeltava kevyesti ilmakuplien poistami-
seksi. Tämän jälkeen jatketaan suoritusta). Eluoidaan 25 ml:lla
vesi/metanoli -seosta. Heitetään eluaatit pois. Aflatoksiini B1eluoi-
daan 50 ml:lla vesi/asetoni -seosta (3.5.3) ja koko eluaatti kerätääntalteen 50 ml:n mittapulloon. Täytetään merkkiin asti vedellä ja
sekoitetaan: tällä tavoin saatu koeliuos käytetään kromatografiaan
(5.5).
Varoitus: Lopullisen uutteen suodatus ennen injektointia HPLC:in
ei yleensä ole tarpeen. Jos tämä katsotaan tarpeelliseksi,
on vältettävä selluloosasuodattimia, koska ne voivat
johtaa aflatoksiini B
1:n hävikkiin. Teflonsuodattimet
ovat hyväksyttäviä.1976L0372 — FI — 03.05.1994 — 003.001 — 11
▼M2
5.5 Suuren erotuskyvyn nestekromatografia
(Laitteiston kokoonpano esitetään kuvassa 2). Laitteiden käyttökun-
toon saattamiselle ja stabiloitumiselle on varattava riittävästi aikaa.
Huomautus 1
Liikkuvan faasin ja kolonnin jälkeisen reagenssin virtausnopeudet
ovat vain ohjeellisia. Niitä voidaan muuttaa HPLC-kolonnin erityi-
sominaisuuksien mukaisesti.
Huomautus 2
Aflatoksiini B1:n vaste riippuu lämpötilasta. Tämän vuoksi on
tehtävä ryömintää korjaava kompensointi (ks. kuva 3). Injektoi-
malla määrätty määrä standardiliuosta (3.13.3) säännöllisin välein
(esimerkiksi joka kolmas injektio) näiden referenssistandardien
väliset aflatoksiini B1:n piikkien arvot voidaan korjata käyttäen
vasteiden keskiarvoa. Peräkkäisten standardiliuosten välisten erojen
on oltava hyvin pieniä (< 10 %). Tämän vuoksi injektiot on tehtävä
keskeytyksettä. Jos keskeyttäminen on tarpeen, keskeytystä
edeltävän viimeisen injektion ja keskeytyksen jälkeisen ensim-
mäisen injektion on oltava standardiliuoksen (3.13.3) injektointeja.
Koska kalibrointikäyrä on lineaarinen ja kulkee origon kautta,
näytteiden aflatoksiini B1:n määrät määritetään suoraan niitä
lähimpänä olevia standardiliuoksia käyttäen.
5.5.1 HPLC-pumpun säätäminen
HPLC-pumpun (4.5) virtausnopeus säädetään 5 µm:n tai 3 µm:n
HPLC-kolonnille (4.6) vastaavasti arvoon 0,5 tai 0,3 ml/min liik-
kuvaa faasia (3.6) käytettäessä.
5.5.2 Kolonnin jälkeisen pumpun säätäminen
Pumpun (4.7) virtausnopeudeksi säädetään 0,2-0,4 ml/min jodilla
kyllästettyä vesiliuosta (3.7) käytettäessä. Ohjeelliset virtausno-
peudet: suuruudeltaan noin 0,4 tai 0,2 ml/min olevat
virtausnopeudet ovat suositeltavia käytettäessä liikkuvalla faasilla
(3.6) näitä vastaavina nopeuksina 0,5 ja 0,3 ml/min.
5.5.3 Fluoresenssidetektori
Säädetään fluoresenssidetektorin (4.11) eksitaatioaallonpituus
365 nm:iin ja emissioaallonpituus 435 nm:iin (suodatinlaite
> 400 nm). Säädetään detektorin herkkyys siten, että piirturin poik-
keamaksi saadaan noin 80 % täydestä asteikosta 1 ng:lla
aflatoksiini B1:tä.
5.5.4 Injektori
Kaikkia liuoksia injektoidaan 250 µl injektorin valmistajan ohjeiden
mukaisesti.
5.5.5 Kromatografisen erottumisen tarkistus
Injektoidaan kromatografisen erottumisen koeliuos (3.14.1). Piik-
kien välisten käännepisteiden korkeuden on oltava alle 5 %
viereisten piikkien korkeuksien summasta.
5.5.6 Järjestelmän stabiilisuuden tarkistus
Ennen kutakin määrityssarjaa injektoidaan referenssistandardia
(3.13.3) useita kertoja kunnes piikkien pinta-alat eivät muutu
(Huomautus: Kahden peräkkäisen injektion aflatoksiini B1-piikit
eivät saa poiketa toisistaan yli 6 %). Suoritusta jatketaan
välittömästi lineaarisuuden tarkistuksella (5.5.7).
5.5.7 Lineaarisuuden tarkistus
Injektoidaan aflatoksiini B1-standardiliuoksia (3.13.1-3.13.4).
Käytetään joka kolmantena injektiona referenssistandardia (3.13.3)
vasteissa esiintyvän ryöminnän korjaamiseksi ( Huomautus: Refer-
enssistandardien piikkien vasteet eivät saa poiketa toisistaan yli
10 %:a 90 minuutin aikana). Ryömintä korjataan 7 kohdassa
esitetyn kaavan mukaisesti. Kalibrointikäyrän on oltava lineaarinen
ja kuljettava origon kautta Y-estimaatin kaksinkertaisen keski-
virheen rajoissa. Havaitut arvot eivät saa poiketa yli 3 %:a
nimellisarvoista. Jos nämä edellytykset täyttyvät, suoritusta jatke-
taan keskeytyksettä. Jos näin ei ole, on selvitettävä ongelman syy
ja tehtävä tarpeelliset korjaukset ennen suorituksen jatkamista.
5.5.8 Näyteuutteiden injektio1976L0372 — FI — 03.05.1994 — 003.001 — 12
▼M2
Injektoidaan puhdistetut uutteet (5.4.2.2.). Joka toisen näyteuutein-
jektion jälkeen injektoidaan uudelleen referenssistandardia (3.13.3)
käyttäen seuraavaa jaksotusta: referenssistandardi, uute, uute, refer-
enssistandardi, uute, uute, referenssistandardi jne.
6 Varmistuskoe
6.1 Uutteen (5.4.2.2) jatkokäsittely
Lisätään 5 ml natriumkloridiliuosta (3.15.1) 5.4.2.2. kohdassa
saatuun lopulliseen uutteeseen. Uutetaan erotussuppilossa (4.24.1)
kolme kertaa minuutin ajan käyttäen 2 ml kloroformia (3.1).
Suodatetaan saatu kloroformiuute noin 1 g:n suuruisen natriumsul-
faatti(3.15.2) -kerroksen läpi10 ml:n koeputkeen. Tähän voi daan
käyttää pientä halkaisijaltaan 4 cm olevaa suppiloa, jonka kaulaan
on asetettu lasivillatuppo ja tämän päälle noin 1 g natriumsulfaattia
(3.15.2).
Natriumsulfaattikerros pestään muutamalla millilitralla kloroformia
ja pesunesteet kerätään samaan koeputkeen. Kloroformiuute haih-
dutetaan kuivaksi samassa koeputkessa käyttäen lämpöblokkia
(4.24.2) ja jäännös liuotetaan uudelleen 1 ml:aan kloroformia.
6.2 Johdannaisen valmistaminen ja ohutlevykromatografia
Ks. neuvoston direktiivi 76/372/ETY, liite, A menetelmä, 5.6.2.
kohta.
7 Tulosten laskeminen
Näytteessä olevan aflatoksiini B1:n pitoisuus lasketaan käyttäen
kaavaa:
aflatoksiini 1:npitoisuus =kgB(          ) ¼m/C2V uute
Vm/C2M/C2Vs
Vk
jossa:
m = näytteen alfatoksiini B1:n piikkiä vastaava aflatoksiini
B1:n määrä nanogrammoina laskettuna seuraavasti:
m¼Pn ¨ayteðÞ
Ps t 1ðÞ þ Ps t 2ðÞ/C22r stðÞ
P(näyte) = näytteen aflatoksiini B1:n piikin pinta-ala
P(st1) = näytteen injektointia edeltävän referenssistandardin
(3.13.3) aflatoksiini B1:n piikin pinta-ala
P(st2) = näytteen injektointia seuraavan referenssistandardin
(3.13.3) aflatoksiini B1:n piikin pinta-ala
r(st) = injektoidun referenssistandardin (3.13.3) aflatoksiini
B1:n määrä nanogrammoina
Vm= injektoidun näyteuutteen tilavuus millilitroina
Vuute= näyteuutteen lopullinen tilavuus millilitroina ottaen
huomioon kaikki suoritetut laimennukset (5.3)
M = näytteen massa grammoina
Vs= Florisil-patruunaan (5.4.1.2) siirretyn suodoksen tila-
vuus millilitroina
Vk= näytteen uuttamiseen käytetyn kloroformin tilavuus
millilitroina
Jos määritys suoritetaan tämän ohjeen mukaisesti, kaava supistuu
muotoon:
aflatoksiini B1:n pitoisuus (µg/kg) = 20 × m.
7.1 Laskutoimitukset voidaan suorittaa myös käyttäen piikkien
korkeuksia.
8 Toistettavuus
Ks. 10.1 kohta.1976L0372 — FI — 03.05.1994 — 003.001 — 13
µg
▼M2
9 Uusittavuus
Ks. 10.1 kohta.
10 Huomautukset
10.1 Toistotarkkuus
Kansainvälisellä tasolla rehuseoksista suoritetussa yhteistutkimuk-
sessa (1) saatiin seuraavat taulukossa 1 esitetyt toistettavuus- ja
uusittavuustulokset. Tässä käytetty ilmaisu toistettavuus (r)
määritellään suurimmaksi lukusuhteeksi, joka ei ole merkitsevä
95 % todennäköisyydellä verrattaessa samasta näytteestä samassa
laboratoriossa ja samanlaisissa koeolosuhteissa saatua kahta tulosta
toisiinsa. Ilmaisu uusittavuus (R) määritellään samoin verrattaessa
kahdessa eri laboratoriossa saatuja tuloksia. Standardin ISO 3534-
1977 2.35 kohdan (2) ja komission päätöksen 89/610/ETY (3) mukai-
sesti r ja R esitetään taulukossa 1 myös variaatiokertoimina.
Taulukko 1
Toistettavuus (r) ja uusittavuus (R) ilmoitettuna ja variaatio-
kertoimina
(15 laboratoriota)
Pitoisuus r R CVr(*) CVR(*)
(µg/kg) (%) (%)
8 & 14 1,4 1,7 11 18
(*) CV = variaatiokerroin
10.2 Kloroformin (3.1) stabilointi
Florisil-patruunan adsorption erityisominaisuuksia voidaan muuttaa,
jos käytetään muita stabilointiaineita kuin etanolia. Tämä on
varmistettava 10.3 kohdan mukaiseksi, jos kuvattua kloroformia ei
ole saatavissa.
10.3 Tarkkuus
Menetelmän oikea soveltaminen on varmistettava suorittamalla
kaksoismittaukset varmistetuilla referenssiaineilla. Jos niitä ei ole
saatavissa, menetelmän toimivuus on varmistettava takaisinsaanto-
kokeilla, joissa nollanäytteisiin on lisätty tutkittavaa yhdistettä.
Keskiarvon ja todellisen arvon välinen poikkeama, ilmoitettuna
prosentteina todellisesta arvosta, ei saa olla rajojen −20 % ja
+ 10 % ulkopuolella.1976L0372 — FI — 03.05.1994 — 003.001 — 14
(1) Van Egmond, H. P., Heisterkamp, S. H. ja Paulsch, W. E. (1991). Food Additives and
Contaminants 8, 17-29
(2) ISO 3534-1977
(3) EYVL N:o L 351, 2.12.1989, s. 39
▼M2
Kuva 1: Kolonni-patrunna -yhdistelmä
Kuva 2: Kolonnin jälkeisten jodijohdannaisten valmistuksen
sisältävän nestekromatografialaitteiston kaavio1976L0372 — FI — 03.05.1994 — 003.001 — 15
▼M2
Kuva 3: Aflatoksiini B1:n vasteen ryömintäkompensointi
säännöllisin välein injektoidulla standardiliuoksella (3.13.3)
C. OBSERVATIONS CONCERNING METHODS A AND B
1Defatting
Samples containing more than 5 % fats must be defatted with light petroleum
(bp 40 to 60 ºC) after the preparations indicated in 5.1.
In such cases, the analytical results must be expressed in terms of the weight
of the non-defatted sample.
2Reproducibility of the results for Method A
The reproducibility of the results, i.e. the variation between the results
obtained by two or more laboratories on the same sample has been estimated
at:
± 50 % of the mean value for mean values of aflatoxin B, from 10 and up to
20 µg/kg;
± 10 µg/kg on the mean value for mean values greater than 20 and up to
50 µg/kg;
± 20 % of the mean value for mean values above 50 µg/kg.1976L0372 — FI — 03.05.1994 — 003.001 — 16
▼M3
▼B
LIITE
Kuva 1
Kuva 21976L0372 — FI — 03.05.1994 — 003.001 — 17
▼B
Kuva 31976L0372 — FI — 03.05.1994 — 003.001 — 18