1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 1
Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentointitarkoituksiin.Toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä.
►B TOINEN KOMISSION DIREKTIIVI,
annettu 14 päivänä toukokuuta 1982,
kosmeettisten valmisteiden koostumuksen tarkastamisessa tarvittavia analyysimenetelmiä
koskevan jäsenvaltioiden lainsäädännön lähentämisestä
(82/434/ETY)
(EYVL L 185, 30.6.1982, s. 1)
Muutettu:
virallinen lehti
N:o sivu päivämäärä
►M1Komission direktiivi 90/207/ETY, annettu 4 päivänä huhtikuuta 1990 L 108 92 28.4.1990
▼B
TOINEN KOMISSION DIREKTIIVI,
annettu 14 päivänä toukokuuta 1982,
kosmeettisten valmisteiden koostumuksen tarkastamisessa tarvit-
tavia analyysimenetelmiä koskevan jäsenvaltioiden lainsäädännön
lähentämisestä
(82/434/ETY)
EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, JOKA
ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen,
ottaa huomioon kosmeettisia valmisteita koskevan jäsenvaltioiden
lainsäädännön lähentämisestä 27 päivänä heinäkuuta 1976 annetunneuvoston direktiivin 76/768/ETY(
1), sellaisena kuin se on viimeksi
muutettuna direktiivillä 79/661/ETY(2), ja erityisesti sen 8 artiklan 1
kohdan,
sekä katsoo, ettädirektiivissä 76/768/ETY säädetään kosmeettisten valmisteiden viralli-
sesta tarkastamisesta, jotta varmistettaisiin, että kosmeettistenvalmisteiden koostumusta koskevissa yhteisön säännöksissä asetettujavaatimuksia noudatetaan,
kaikki tarvittavat analyysimenetelmät olisi vahvistettava niin pian kuin
mahdollista; ensimmäinen vaihe tämän tavoitteen saavuttamiseksi on jototeutettu, kun komission direktiivissä 80/1335/ETY(
3) säädetään
tietyistä menetelmistä, ja toisena vaiheena on menetelmien määrittä-
minen hapettavien aineiden tunnistamiseksi ja vetyperoksidin
määrittämiseksi kosmeettisissa hiustenhoitovalmisteissa, tiettyjen hapet-tuvien väriaineiden tunnistamiseksi ja semikvantitatiiviseksimäärittämiseksi hiusten värjäysaineissa, nitriitin tunnistamiseksi jamäärittämiseksi, vapaan formaldehydin tunnistamiseksi ja määrittämi-
seksi, resorsinolin määrittämiseksi shampoissa ja hiusvesissä ja
metanolin määrittämiseksi suhteessa etanoliin tai 2-propanoliin, ja
tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat direktiivin 76/768/ETY
mukauttamista tekniikan kehitykseen käsittelevän komitean lausunnonmukaiset,
ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:
1 artikla
Jäsenvaltioiden on toteutettava kaikki tarvittavat toimenpiteet sen
varmistamiseksi, että kosmeettisten valmisteiden virallisessa tarkastuk-
sessa:
— hapettavien aineiden tunnistaminen ja vetyperoksidin määrittäminen
hiustenhoitovalmisteissa,
— tiettyjen hapettuvien väriaineiden tunnistaminen ja semikvantitatii-
vinen määrittäminen hiusten värjäysaineissa,
— nitriitin tunnistaminen ja määrittäminen,
— vapaan formaldehydin tunnistaminen ja määrittäminen,
— resorsinolin määrittäminen shampoissa ja hiusvesissä,— metanolin määrittäminen suhteessa etanoliin tai 2-propanoliin
suoritetaan liitteessä selostettujen menetelmien mukaisesti.
2 artikla
Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edel-
lyttämät lait, asetukset tai hallinnolliset määräykset voimaanviimeistään 31 päivänä joulukuuta 1983.1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 2
(1) EYVL N:o L 262, 27.9. 1976, s. 169
(2) EYVL N:o L 192, 31.7.1979, s. 35
(3) EYVL N:o L 383, 31.12.1980, s. 27
▼B
Niiden on ilmoitettava tästä komissiolle viipymättä.
3 artikla
Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 3
▼B
LIITE
I.HAPETTAVIEN AINEIDEN TUNNISTAMINEN JA VETYPEROK-
SIDIN MÄÄRITTÄMINEN HIUSTENHOITOVALMISTEISSA
TARKOITUS JA SOVELTAMISALA
Vetyperoksidin jodometrinen määrittäminen kosmeettisissa aineissa on mahdol-
lista vain, kun aine ei sisällä muita jodideista jodia muodostavia hapettavia
aineita. Tämän vuoksi on ennen vetyperoksidin jodometristä määrittämistä
tarpeen löytää ja tunnistaa aineessa mahdollisesti olevat muut hapettavat aineet.
Tämä tunnistaminen jakautuu kahteen vaiheeseen: ensimmäinen käsittää persul-
faatit, bromaatit ja vetyperoksidin ja toinen bariumperoksidin.
A. PERSULFAATTIEN, BROMAATTIEN JA VETYPEROKSIDIN TUNNIS-
TAMINEN
1 PERIAATE
Natriumpersulfaatti, kaliumpersulfaatti ja ammoniumpersul-
faatti; kaliumbromaatti, natriumbromaatti ja vetyperoksidi —
bariumperoksidista tai muualta peräisin oleva — tunnistetaan
laskevan paperikromatografian avulla, käyttäen kahta kehite-
liuosta.
2 REAGENSSIT
Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua.
2.1 0,5 % (m/v) vesipitoinen vertailuliuos seuraavista yhdisteistä:
2.1.1 Natriumpersulfaatti
2.1.2 Kaliumpersulfaatti
2.1.3 Ammoniumpersulfaatti
2.1.4 Kaliumbromaatti
2.1.5 Natriumbromaatti
2.1.6 Vetyperoksidi
2.2 Kehiteliuos A, 80 % (v/v) etanoli
2.3 Kehiteliuos B, bentseeni — metanoli — 3-metyyli-1-butanoli —
vesi (34:38:18:10 tilavuuksina)
2.4 Värjäysliuos A, 10 % (m/v) kaliumjodidin vesiliuos
2.5 Värjäysliuos B, 1 % (m/v) tärkkelyksen vesiliuos
2.6 Värjäysliuos C, 10 % (m/m) suolahappo
2.7 4 N suolahappoliuos
3 LAITTEET JA VARUSTEET
3.1 Kromatografiapaperi (Whatman-paperi N:o 3 ja 4 tai niitä
vastaava)
3.2 Mikropipetti, 1 µl
3.3 Mittapulloja, 100 ml
3.4 Laskostettuja suodattimia
3.5 Laskevan paperikromatografian laitteisto
4 NÄYTTEEN ESIKÄSITTELY
4.1 Vesiliukoiset valmisteet
Kustakin näytteestä tehdään kaksi liuosta liuottamalla erikseen
1 g ja 5 g valmistetta 100 ml:aan vettä. Kumpaakin näistä liuok-
sista käytetään 1 µl 5 kohdassa kuvatun paperikromatografian
suorittamiseksi.1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 4
▼B
4.2 Huonosti veteen liukenevat valmisteet
4.2.1 Näytteestä punnitaan 1 g ja 5 g ja dispergoidaan ne 50 ml:aan
vettä, täytetään vedellä 100 ml:aan saakka ja sekoitetaan.
Kumpikin dispersio suodatetaan laskostetun suodattimen (3.4)
läpi ja kumpaakin suodosta käytetään 1 µl 5 kohdassa kuvatun
paperikromatografian suorittamiseksi.
4.2.2 Valmistetaan taas kaksi dispersiota kustakin näytteestä disper-
goimalla 1 g ja 5 g näytettä 50 ml:aan vettä, tehdään
happamaksi laimealla suolahapolla (2.7), täytetään vedellä
100 ml:aan saakka ja sekoitetaan. Dispersiot suodatetaan laskos-
tetun suodattimen (3.4) läpi ja kumpaakin suodosta käytetään
1 µl 5 kohdassa kuvatun paperikromatografian suorittamiseksi.
4.3 Voiteet
Kutakin valmistetta dispergoidaan 5 g ja 20 g 100 ml:aan vettä
ja käytetään näitä dispersioita 5 kohdassa kuvatun paperikroma-
tografian suorittamiseksi.
5 MENETTELY
5.1 Sopiva määrä liuosta A (2.2) ja B (2.3) laitetaan kahteen erilli-
seen kromatografia-astiaan laskevan paperikromatografian
suorittamiseksi. Kromatografia-astioita kyllästetään vähintään
24 tuntia liuotinhöyryllä.
5.2 Lisätään 1 µl yhtä näyteliuosta ja yhtä vertailuliuosta, jotka on
valmistettu 4 ja 2.1 kohtien mukaisesti kuhunkin 40 cm pitkän
ja 20 cm leveän tai muun sopivan mallisen kromatografiapa-
perin (3.1) aloituspisteeseen (Whatman N:o 3 tai vastaava) ja
annetaan liuoksen haihtua ilmaan.
5.3 Kromatografiapaperi (5.2) laitetaan kromatografia-astiaan, joka
on täytetty kehiteliuoksella A (5.1) ja kehitetään, kunnes kehite-
liuos on edennyt 35 cm (noin 15 tuntia).
5.4 Toistetaan 5.2 ja 5.3 kohdassa kuvatut toiminnat käyttäen
kromatografiapaperia (Whatman N:o 4 tai vastaava) (3.1) ja
kehiteliuosta B. Kromatografoidaan, kunnes kehiteliuos on
edennyt 35 cm (noin 5 tuntia).
5.5 Kehittämisen jälkeen kromatogrammit poistetaan astiasta ja ne
kuivataan ilmassa.
5.6 Täplät kromatogrammissa saadaan näkyviin ruiskuttamalla sitä
peräkkäin:
5.6.1 värjäysliuoksella A (2.4) ja heti sen jälkeen värjäysliuoksella B
(2.5). Persulfaattitäplät ilmestyvät nyt ensin kromatogrammiin
ja niitä seuraavat vetyperoksiditäplät. Täplät merkitään kynällä;
5.6.2 värjäysliuoksella C (2.6) käyttäen kohdan 5.6.1 mukaisesti
käsiteltyä kromatogrammia; harmaansiniset täplät kromatogram-
missa osoittavat nyt valmisteen sisältämät bromaatit.
5.7 Edellä mainituissa ajo-olosuhteissa kehiteliuoksilla A (2.2) ja B
(2.3) ovat vertailuaineiden (2.1) Rf-arvot keskimäärin seuraavat:
Kehiteliuos A (2.2) Kehiteliuos B (2.3)
Natriumpersulfaatti 0,40 0,10
Kaliumpersulfaatti 0,40 0,02 + 0,05
Ammomiumpersulfaatti 0,50 0,10 + 0,20Natriumbromaatti 0,40 0,20
Kaliumbromaatti 0,40 0,10 + 0,20
Vetyperoksidi 0,80 0,801982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 5
▼B
B. BARIUMPEROKSIDIN TUNNISTAMINEN
1 PERIAATE
Bariumperoksidi tunnistetaan vetyperoksidin muodostumisesta
sen jälkeen, kun näyte (A.4.2) on tehty happamaksi sekä bariu-
mionin läsnäolosta.
— Kun persulfaatteja ei ole (A): lisätään laimeaa rikkihappoa
annokseen hapanta näyteliuosta (B.4.1), jonka seurauksena
muodostuu valkoinen bariumsulfaattisakka. Bariumionien
esiintyminen näytteessä (B.4.1) vahvistetaan taas paperikro-
matografialla kuten jäljempänä 5 kohdassa on kuvattu.
— Kun bariumperoksidia ja persulfaatteja esiintyy samanaikai-
sesti (B.4.2), sulatetaan saostuma (B.4.2) emäkseen;
suolahappoon liuottamisen jälkeen bariumionien esiinty-
minen sulatteen liuoksessa (B.4.2.3) vahvistetaan
paperikromatografialla ja/tai bariumsulfaatin saostumisella.
2 REAGENSSIT
2.1 Metanoli
2.2 36 % (m/m) väkevä suolahappo
2.3 6 N suolahappo
2.4 4 N rikkihappo
2.5 Roditsonihapon dinatriumsuola
2.6 Bariumkloridi (BaCl22H2O)
2.7 Vedetön natriumkarbonaatti
2.8 1 % (m/v) bariumkloridin vesiliuos
2.9 Kehiteliuos, joka koostuu metanolista, väkevästä suolahaposta
(36 %) ja vedestä (80:10:10 tilavuuksina)
2.10 Värjäysliuos, 0,1 % (m/v) roditsonihapon dinatriumsuolan vesi-
liuos, joka valmistetaan välittömästi ennen käyttöä.
3 LAITTEET
3.1 Mikropipetti, 5 µl
3.2 Platinaupokkaita
3.3 Mittapulloja, 100 ml
3.4 Kromatografiapaperia Schleicher and Schüll 2043 b tai
vastaava. Paperi puhdistetaan ajamalla sitä yön yli laskevan
kromatografian astiassa (A.3.5), jossa on kehiteliuosta (B.2.9),
jonka jälkeen se kuivataan.
3.5 Laskostettua suodatinpaperia
3.6 Tavallinen laite nousevan paperikromatografian suorittamiseksi
4 NÄYTTEEN ESIKÄSITTELY
4.1 Valmisteet, joissa ei ole persulfaatteja
4.1.1 Dispergoidaan 2 g valmistetta 50 ml:aan vettä ja säädetään
dispersion pH suolahapolla (B.2.3) suunnilleen arvoon 1.
4.1.2 Siirretään dispersio veden avulla 100 ml:n mittapulloon,
täytetään vedellä merkkiin saakka ja sekoitetaan. Tätä disper-
siota käytetään kohdassa 5 kuvatun paperikromatografia-
analyysin suorittamiseksi ja bariumin tunnistamiseksi sulfaatin
saostumisen avulla.
4.2 Valmisteet, joissa on persulfaatteja
4.2.1 Dispergoidaan 2 g valmistetta 100 ml:an vettä ja suodatetaan.
4.2.2 Lisätään kuivattuun saostumaan sen 7-10 kertainen painomäärä
natriumkarbonaattia (B.2.7), sekoitetaan ja sulatetaan seosta
platinaupokkaassa (B.3.2) puolen tunnin ajan.1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 6
▼B
4.2.3 Jäähdytetään huonelämpötilaan, liuotetaan sulate 50 ml:an vettä
ja suodatetaan (B.3.5).
4.2.4 Liuotetaan jäämä sulatteesta suolahappoon (B.2.3) ja täytetään
vedellä 100 ml:an. Tätä liuosta käytetään 5 kohdassa kuvatussa
paperikromatografia-analyysissä ja bariumin tunnistamisessa
sulfaatin saostumisen avulla.
5 MENETTELY
5.1 Sopiva määrä kehiteliuosta (B.2.9) laitetaan nousevan paperik-
romatografian astiaan ja kyllästetään astiaa vähintään 15 tunnin
ajan.
5.2 Kromatografiapaperille, joka on esikäsitelty B.3.4 kohdan
mukaisesti, lisätään 5 µl kutakin liuosta, jotka on valmistettu
B.4.1.2 ja B.4.2.4 kohdan mukaisesti, sekä vertailuliuosta B.2.8
kolmeen aloituspisteeseen.
5.3 Näyte- ja vertailutäplät kuivataan ilmassa. Kehitetään kromato-
grammia, kunnes kehiteliuos on noussut 30 cm.
5.4 Kromatogrammi poistetaan astiasta ja kuivataan ilmassa.5.5 Täplät kromatogrammissa saadaan näkyviin ruiskuttamalla
paperia värjäysliuoksella B.2.10. Jos näytteessä on bariumia,
kromatogrammille ilmestyy punaisia täpliä, joiden RF-arvo on
n. 0,10.
C. VETYPEROKSIDIN MÄÄRITTÄMINEN
1 PERIAATE
Vetyperoksidin jodometrinen määrittäminen perustuu seuraa-
vaan reaktioon:
H
2O2+2 H++2 I−→I2+2 H2O
Tämä reaktio etenee hitaasti, mutta sitä voidaan nopeuttaa
lisäämällä ammoniummolybdaattia. Muodostunut jodi
määritetään titrimetrisesti natriumtiosulfaatilla ja sen perusteella
lasketaan vetyperoksidipitoisuus.
2 MÄÄRITELMÄ
Edellä kuvatulla tavalla mitattu vetyperoksidipitoisuus ilmoite-
taan prosentteina (% m/m) valmisteen painosta.
3 REAGENSSIT
Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua.
3.1 2 N rikkihappo3.2 Kaliumjodidi3.3 Ammoniummolybdaatti
3.4 0,1 N natriumtiosulfaatti
3.5 10 % (m/v) kaliumjodidiliuos, joka on valmistettava
välittömästi ennen käyttöä
3.6 20 % (m/v) ammoniummolybdaattiliuos
3.7 1 % (m/v) tärkkelysliuos
4 LAITTEET
4.1 Dekantterilaseja, 100 ml
4.2 Byretti, 50 ml4.3 Mittapulloja, 250 ml4.4 Mittalaseja, 25 ja 100 ml4.5 Täyspipettejä, 10 ml1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 7
▼B
4.6 Erlenmeyerpulloja, 250 ml
5 MENETTELY
5.1 Punnitaan 100 ml:n dekantterilasiin 10 g (m grammaa) valmis-
tetta, joka sisältää noin 0,6 g vetyperoksidia. Näyte siirretään
veden avulla 250 ml:n mittapulloon, täytetään vedellä merkkiin
saakka ja sekoitetaan.
5.2 Näyteliuosta (5.1) pipetoidaan 10 ml 250 ml:n erlenmeyerpul-
loon (4.6) ja lisätään peräkkäin 100 ml 2N rikkihappoa (3.1),
20 ml kaliumjodidiliuosta (3.5) ja kolme tippaa ammoniummo-
lybdaattiliuosta (3.6).
5.3 Muodostunut jodi titrataan välittömästi 0,1 N natriumtiosulfaat-
tiliuoksella (3.4) ja juuri ennen kuin päätepiste on saavutettu
lisätään muutama millilitra tärkkelysliuosta indikaattoriksi
(3.7). 0,1 N Natriumtiosulfaatin (3.4) kulutus kirjataan millili-
troina (V).
5.4 Edellä 5.2 ja 5.3 kohdassa selostetulla tavalla suoritetaan
sokeakoe, jossa 10 ml:n näyteliuos korvataan 10 ml:lla vettä.
Kirjataan 0,1 N natriumtiosulfaatin kulutus millilitroina sokea-
kokeessa (Vo ml).
6 TULOSTEN LASKEMINEN
Valmisteen vetyperoksidipitoisuus lasketaan painoprosentteina
(% m/m) seuraavan kaavan mukaan:
% vetyperoksidia ¼V/C0Vo ðÞ /C2 1;7008 /C2250/C2100
m/C210/C21000
¼V/C0Vo ðÞ /C2 4;252
m
jossa:
m = analysoidun valmisteen määrä grammoina (5.1),
Vo = 0,1 N tiosulfaattiliuoksen kulutus millilitroina sokeatestissä
(5.4),
V = 0,1 N tiosulfaattiliuoksen kulutus millilitroina näyteliuoksen
titrauksessa (5.3).
7 TOISTETTAVUUS(1)
Valmisteella, joka sisältää noin 6 % m/m vetyperoksidia ei
saman näytteen rinnakkaismääritysten tulosten eron absoluut-
tinen arvo saa olla yli 0,2 %.
II.TIETTYJEN HAPETTUVIEN VÄRIAINEIDEN TUNNISTAMINEN JA
SEMIKVANTITATIIVINEN MÄÄRITTÄMINEN HIUSTEN VÄRJÄY-
SAINEISSA
1 TARKOITUS JA SOVELTAMISALA
Tämä menetelmä sopii seuraavien aineiden tunnistamiseen ja
semikvantitatiiviseen määrittämiseen voiteina tai nestemäisessä
muodossa olevissa hiustenvärjäysaineissa:
Aineet Tunnus
Fenyleenidiamiinit
o-fenyleenidiamiini (OPD)
m-fenyleenidiamiini (MPD)1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 8
(1) Standardin ISO 5725 mukaisesti
▼B
Aineet Tunnus
p-fenyleenidiamiini (liite V) (PPD)
Metyylifenyleenidiamiinit
4-metyyli-1,2-fenyleenidiamiini (tolueeni-3,4-
diamiini)(OTD)
4-Metyl-1,3-fenyleenidiamiini (tolueeni-2,4-
diamiini)(MTD)
2-Metyl-1,4-fenyleenidiamiini (tolueeni-2,5-
diamiini)(PTD)
Diaminofenolit
2,4-diaminofenoli (DAP)
Hydrokinoni
1,4-dihydroksibentseeni (H)
α-naftoli ( α-N)
Pyrogalloli
1,2,3-trihydroksibentseeni (P)
Resorsinoli
1,3-dihydroksibentseeni (R)
2 PERIAATE
Hapettuvat väriaineet uutetaan 96 % etanolilla pH-arvossa 10
voiteena tai nestemäisenä olevista värjäysaineista ja tunnistetaan
ohutkerroskromatografisesti, joko yksi- tai kaksisuuntaisesti.
Näiden aineiden semikvantitatiiviseksi määrittämiseksi
näytteiden kromatogrammeja verrataan neljän kehiteliuoksen
avulla samanaikaisesti ja mahdollisimman samanlaisissa olosuh-
teissa valmistettujen vertailuaineiden vastaaviin.
3 REAGENSSIT
Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua.
3.1 Etanoli, vedetön3.2 Asetoni3.3 Etanoli, 96 % v/v3.4 Ammoniakkiliuos, 25 %
(d
420= 0,91)
3.5 L(+)-askorbiinihappo3.6 Kloroformi3.7 Sykloheksaani3.8 Typpi, tekninen laatu3.9 Tolueeni
3.10 Bentseeni
3.11 n-butanoli3.12 2-butanoli3.13 Hypofosforihapoke, 50 % v/v -liuos3.14 Diatsoreagenssi, joko:
— 3-nitro-1-bentseenidiatsoniumklooribentseenisulfonaatti,
(stabiloituna suolana), kuten ”Red 2 JN - Francolor”,1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 9
▼B
— 2-kloro-4-nitro-1-bentseenidiatsoninaftaleenibentsoaatti
(stabiloituna suolana), kuten NNCD-reagenssi — viitenu-
mero 74150 FLUKA,
tai vastaava.
3.15 Hopeanitraatti3.16 p-dimetyyliaminobentsaldehydi
3.17 2,5-dimetyylifenoli
3.18 Ferrikloridiheksahydraatti
3.19 Suolahappo, 10 % m/v -liuos
3.20 Vertailuaineet
Vertailuaineet ovat samat kuin 1 kohdassa ”Tarkoitus ja sovel-
tamisala” mainitut. Mikäli määritetään amiiniyhdisteitä, on
vertailuaineen oltava joko hydrokloridi (mono tai di) tai vapaa
emäs.
3.21 Vertailuliuokset 0,5 % (m/v)
Valmistetaan 0,5 % (m/v) liuos kustakin 3.20 kohdassa maini-
tusta vertailuaineesta.
Punnitaan 50 mg ± 1 mg vertailuainetta 10 ml:n mittapulloon.Lisätään 5 ml 96 % etanolia (3.3) ja 250 mg askorbiinihappoa
(3.5).
Liuos tehdään alkaliseksi lisäämällä ammoniakkiliuosta (3.4)
niin, että pH-arvoksi tulee 10 (tarkastetaan indikaattoripaper-
illa).
Täytetään 96 % etanolilla (3.3) 10 ml:aan ja sekoitetaan.
Liuoksia voidaan säilyttää viikon ajan viileässä ja pimeässä
paikassa.
Tietyissä tapauksissa voi askorbiinihapon ja ammoniakin
lisäämisen jälkeen muodostua sakkaa. Sen on silloin annettava
laskeutua ennen kokeen jatkamista.
3.22 Kehiteliuokset
3.22.1 Asetoni-kloroformi-tolueeni (35:25:40 tilavuuksina)
3.22.2 Kloroformi-sykloheksaani-absoluuttinen etanoli-25 % ammo-
niakki (80:10:10:1 tilavuuksina)
3.22.3 Bentseeni-2-butanoli-vesi (50:25:25 tilavuuksina). Ravistetaan
hyvin ja käytetään ylempää kerrosta erottumisen jälkeen
huoneenlämmössä (20-25 ºC).
3.22.4 n-butanoli-kloroformi-reagenssi M (7:70:23 tilavuuksina).
Erotetaan huonelämpötilassa (20-25 ºC) huolellisesti ja
käytetään alempaa kerrosta.
Reagenssin M valmistaminen
Ammoniakkiliuosta, 25 % (v/v)
(3.4)24 tilavuusosaa
Hypofosforihapoketta, 50 % (3.13) 1 tilavuusosaa
Vettä 75 tilavuusosaa
Huomautus
Ammoniakkia sisältävät kehiteliuokset on ravistettava hyvin
välittömästi ennen käyttöä.
3.23 Indikaattoriaineet
3.23.1 Diatsoreagenssi
Valitusta reagenssistä (3.14) tehdään 5 %:n (m/v) vesiliuos.
Tämä liuos on tehtävä juuri ennen käyttöä.1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 10
▼B
3.23.2 Ehrlichinreagen ssi
Liuotetaan 2 g p-dimetyyliaminobentsaldehydiä (3.16)
100 ml:aan 10 %:ista (m/v) suolahapon vesiliuosta (3.19).
3.23.3 2,5-dimetyylifenoli-ferrikloridiheksahydraatti
Liuos 1:Liuotetaan 1 g dimetyylifenolia (3.17) 100 ml:aan 96 %
etanolia (3.3).
Liuos 2: Liuotetaan 4 g ferrikloridiheksahydraattia (3.18)
100 ml:aan 96 % etanolia (3.3).
Värjäyksessä näitä liuoksia ruiskutetaan erikseen, ensin liuosta
1, sitten liuosta 2.
3.23.4 Ammoniakkipitoinen hopeanitraatti
25 % ammoniakkia (3.4) lisätään hopeanitraatin (3.15) 5 % (m/
v) vesiliuokseen, kunnes sakka juuri liukenee. Tämä reagenssi
on valmistettava välittömästi ennen käyttöä. Ei voida säilyttää.
4 LAITTEET
4.1 Tavalliset ohutkerroskromatografiassa tarvittavat laboratoriolait-
teet.
4.1.1 Muovinen tai lasinen suojus, joka on suunniteltu sellaiseksi, että
kromatografialevy voidaan ympäröidä typellä täplien aplikoi-
misen ja kuivaamisen aikana. Tämä varotoimenpide on
tarpeen, koska tietyt väriaineet ovat herkkiä hapettumaan.
4.1.2 Mikroruisku 10 µl, jossa 0,2 µl:n asteikko ja neliöprofiilineula,
tai mieluummin 50 µl:n annostelija asennettuna telineeseen
siten, että levyä voidaan pitää typessä.
4.1.3 Silikageeli-ohutkerroslevyjä, käyttövalmiita, paksuus 0,25 mm,
mitoiltaan 20 × 20 cm (Macherey and Nagel, Silica G-HR, jotka
ovat muovilevyllä, tai vastaavia).
4.2 Sentrifuugi, 4 000 kierrosta/minuutti.
4.3 Sentrifuugiputkia, 10 ml, joissa PTFE-kierrekorkit, tai
vastaavat.
5 MENETTELY5.1 Näytteiden käsittely
Ensimmäiset 2-3 cm putkilosta puristetusta voiteesta heitetään
pois.
Etukäteen typellä käsiteltyyn sentrifuugiputkeen (4.3) laitetaan:
300 mg askorbiinihappoa ja 3 g voidetta tai 3 g homogenisoitua
nestettä.
Lisätään 25 % ammoniakkia (3.4) tipottain, kunnes pH on 10.
Täytetään 10 ml:aan 96 % etanolilla (3.3).
Homogenisoidaan typpiatmosfäärissä (3.8), peitetään tulpalla ja
sentrifugoidaan nopeudella 4 000 kierrosta minuutissa 10
minuutin ajan.
Käytetään supernatanttia.
5.2 Kromatografia
5.2.1 Levyjenaplikoin ti
Kromatografialevylle (4.1.3) laitetaan typpiatmosfäärissä (3.8)
1 µl kutakin yllämainituista vertailuliuoksista lähtöviivalle
yhdeksään pisteeseen, jotka ovat noin 1,5 cm:n päässä toisistaan
ja noin 1,5 cm päässä levyn reunasta.
Vertailuliuostäplät sijoitetaan seuraavasti:
123456789
R P H PPD DAP PTD OPD OTD MPD
MTD α-N1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 11
▼B
Sen lisäksi laitetaan pisteisiin 10 ja 11 kumpaankin 2 µl
koeliuosnäytteitä, jotka on saatu 5.1 kohdan mukaisesti.
Levyä pidetään typpiatmosfäärissä (3.8), siihen asti kun se
kromatografoidaan.
5.2.2 Kehittäminen
Levy laitetaan astiaan, joka on aiemmin käsitelty typellä (3.8),
kyllästetty yhdellä neljästä liuoksesta (3.22) ja annetaan kehittyä
huoneenlämmössä (20-25 ºC) pimeässä, kunnes kehiteliuos on
noussut noin 15 cm.
Levy poistetaan ja kuivataan typpiatmosfäärissä (3.8)
huonelämpötilassa.
5.2.3 Värjääminen
Levy värjätään välittömästi yhdellä neljästä 3.23 kohdassa esite-
tystä liuoksesta.
5.2.4 Tunnistaminen
Verrataan näytteestä saatua Rf-arvoa ja väriä kromatografoitujen
vertailuaineiden vastaaviin.
Taulukossa I ovat esimerkkinä Rf-arvot ja värit kullekin aineelle
käytetystä liuoksesta ja indikaattorista riippuen.
Epävarma tunnistus saadaan joskus varmistettua lisäysmene-
telmällä siten, että vastaavaa vertailuaineliuosta lisätään
näyteuutteeseen.
5.2.5 Semikvantitatiivinen määrittäminen
Verrataan silmämääräisesti kunkin 5.2.4 kohdan mukaisesti
tunnistetun aineen täplän värin intensiteettiä sopivaan vertai-
luaineen pitoisuuteen.
Jos yhden tai useamman näytteestä löydetyn aineen pitoisuus on
liian suuri, näyteuute laimennetaan ja mittaus toistetaan.1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 12
TAULUKKO I
Välittömästi värjäyksen jälkeen saadut Rf-arvot ja värit
Vertailuaine
(3.20)Kehiteliuos Indikaattoriaineet
Rf-arvot Syntyvät värit
(3.22.1) (3.22.2) (3.22.3) (3.22.4)Diatso
(3.23.1)Ehrlich
(3.23.2)Dimetyylifenoli
(3.23.3)AgNO3(3.23.4)
OPD 0,62 0,60 0,30 0,57 vaaleanruskea — — vaaleanruskea
MPD 0,40 0,60 0,47 0,48 violetin ruskea(*) keltainen vaaleanruskea vaaleanruskea
PPD 0,20 0,50 0,30 0,48 ruskea kirkkaanpu-
nainen(*)violetti harmaa
OTD 0,60 0,60 0,53 0,60 ruskea(*) vaaleanoranssi vaaleanruskea harmaanruskea
MTD 0,40 0,67 0,45 0,60 punertavan-
ruskea(*)keltainen ruskea musta
PTD 0,33 0,65 0,37 0,70 ruskea oranssi violetti(*) harmaa
DAP 0,07 — 0 0,05 ruskea(*) oranssi violetti ruskea
H 0,50 0,35 0,80 0,20 — oranssi violetti musta(*)
α-N 0,90 0,80 0,90 0,75 oranssiruskea — violetti(*) musta
P 0,37 — 0,67 0,05 ruskea hyvin vaalea
violettihyvin vaalea
ruskearuskea*
R 0,50 0,37 0,80 0,17 oranssi(*) vaaleanvioletti hyvin vaalea
ruskeavaaleanruskea
Huomaa: 1. OPD näkyy vain heikosti; liuosta (3.22.3) on käytettävä sen erottamiseksi selvästi OTD:stä.
2. (*) Osoittaa parhaan värinkehittymisen.▼B1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 13
▼B
6 KAKSISUUNTAINEN OHUTKERROSKROMATOGRAFIA-
TUTKIMUS
Tämä kaksisuuntainen kromatografiamenetelmä edellyttää
lisäksi seuraavien standardien ja reagenssien käyttöä.
6.1 Vertailuliuokset ja -aineet
6.1.1 ß-naftoli (ß-N)
6.1.2 2-aminofenoli (OAP)
6.1.3 3-aminofenoli (MAP)6.1.4 4-aminofenoli (PAP)
6.1.5 2-nitro-1,4-fenyleenidiamiini (2-NPPD)
6.1.6 4-nitro-1,2-fenyleenidiamiini (4-NOPD)
Kustakin näistä vertailuaineista valmistetaan 0,5 % m/v liuos,
kuten 3.21 kohdassa on kuvattu.
6.2 Kehiteliuos
6.2.1 Etyyliasetaatti-sykloheksaani-ammoniakkiliuos, 25 % (65:30:0,5
tilavuuksina)
6.3 Indikaatiomenetelmä
Ohutlevykromatografian kehitysastiaan laitetaan lasiastia, johon
lisätään noin 2 g jodikiteitä ja säiliösuljetaan sopivalla
kannella.
6.4 Kromatografia
6.4.1 Ohutkerroslevyn (4.1.3) absorptiopinnalle vedetään kaksi viivaa
kuvion 1 mukaisesti.
6.4.2 Typpiatmosfäärissä (4.1.1) lisätään 1-4 µl uutetta (5.1) lähtöpis-
teeseen 1 (kuvio 1), joka on 2 cm:n päässä kummastakin
viereisestä sivusta. Uutteen määrä riippuu täplien intensiteetistä
kromatogrammeilla (5.2).
6.4.3 Pisteiden 2 ja 3 (kuvio 1) kesken jaetaan 5.2 kohdan mukaisesti
tunnistetut tai tunnistetuiksi oletetut hapettuvat väriaineet
(pisteiden välinen etäisyys 1,5 cm). Lisätään 2 µl kutakin vertai-
luliuosta, paitsi DAP, jota on lisättävä 6 µl. Operaatio
suoritetaan typpiatmosfäärissä (6.4.2).
6.4.4 Toistetaan 6.4.3 kohdan operaatio lähtöpisteissä 4 ja 5 (kuvio 1)
ja levyä pidetään typpiatmosfäärissä siihen asti, kunnes se
kromatografoidaan (pisteiden välinen etäisyys 1,5 cm).
6.4.5 Kromatografia-astia käsitellään typellä (3.8) ja siihen laitetaan
sopiva määrä kehiteliuosta 3.22.2. Levy laitetaan säiliöön
(6.4.4) ja sitä kehitetään ensimmäisessä eluointisuunnassa
(kuvio 1) pimeässä. Eluoidaan, kunnes liuottimen reuna
saavuttaa levyyn merkityn viivan (n. 13 cm).
6.4.6 Levy poistetaan astiasta ja se laitetaan kromatografia-astiaan,
jota on etukäteen käsitelty typellä, ja haihdutetaan eluointi-
liuosta vähintään 60 minuutin ajan.
6.4.7 Mittalasilla laitetaan sopiva määrä eluointiliuosta (6.2) typellä
käsiteltyyn (3.8) astiaan, johon laitetaan 90º käännetty levy
astiasta (6.4.6) ja kromatografoidaan toisessa suunnassa (myös
pimeässä), kunnes liuottimen reuna saavuttaa absorptiopinnalle
vedetyn viivan. Levy otetaan pois säiliöstä ja eluointiliuos haih-
dutetaan ilmassa.
6.4.8 Levy laitetaan 10 minuutiksi kromatografia-astiaan, jossa on
jodihöyryä (6.3) ja tulkitaan kaksisuuntainen kromatogrammi
käyttäen samanaikaisesti kromatografoitujen vertailuaineiden
R
f-arvoja ja värejä (Taulukossa II opastetaan Rf-arvoja ja
värejä).
Huomaa:
Täplien värittymisen maksimoimiseksi tehty kromatogrammi
jätetään atmosfääriin tunniksi kehittämisen jälkeen.1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 14
▼B
6.4.9 Hapettuvien väriaineiden esiintymisen havaitseminen 6.4.8
kohdan mukaisesti voidaan vahvistaa toistamalla 6.4.1-6.4.8
kohdassa kuvatut toiminnot ja lisäämällä lähtöpisteeseen 1
6.4.2 kohdassa tarkoitetun uutteen päälle 1 µl 6.4.8 kohdassa
tunnistettuja vertailuaineita. Jos ylimääräisiä täpliä ei löydy
verrattaessa 6.4.8 kohdassa saadun kromatogrammin kanssa,
6.4.8 kohdan kromatogrammin tulkinta on oikein.1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 15
▼B
TAULUKKO II
Vertailuaineiden väri kromatografian ja jodihöyryssä kehittämisen jälkeen
Vertailuaineet Väri jodihöyryssä kehittämisen jälkeen
R beige
P ruskea
α-N violetti
β-N vaaleanruskea
H violetin ruskea
MPD keltaisen ruskea
PPD violetin ruskea
MTD tummanruskea
PTD keltaisen ruskea
DAP tummanruskea
OAP oranssi
MAP keltaisen ruskea
PAP violetin ruskea
2-NPPD ruskea
4-NOPD oranssi
Kuvio 1
1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 16
▼B
III.NITRIITIN TUNNISTAMINEN JA MÄÄRITTÄMINEN
A. TUNNISTAMINEN
1 TARKOITUS JA SOVELTAMISALA
Tämä menetelmä soveltuu nitriitin tunnistamiseen kosmeetti-
sissa valmisteissa, erityisesti voiteissa ja tahnoissa.
2 PERIAATE
Nitriitin esiintymisen osoittaa värillisten johdannaisten muodos-
tuminen 2-aminobentsaldehydifenyylihydratsonin kanssa
(Nitrin®).
3 REAGENSSIT
Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua.
3.1 Laimea rikkihappo: laimennetaan 2 ml väkevää rikkihappoa
(d420= 1,84) 11 ml:lla tislattua vettä.
3.2 Laimea suolahappo: laimennetaan 1 ml väkevää suolahappoa
(d420= 1,19) 11 ml:lla tislattua vettä.
3.3 Metanoli3.4 2-aminobentsaldehydifenyylihydratsonin (Nitrin® reagenssi)
metanoliliuos.
Punnitaan 2,0 g Nitriniä® ja siirretään se kvantitatiivisesti
100 ml:n mittapulloon. Lisätään tipoittain 4 ml laimeaa suola-
happoa (3.2) ja ravistellaan. Täytetään merkkiin saakka
metanolilla ja sekoitetaan, kunnes liuos on täysin kirkas. Liuosta
säilytetään ruskeassa lasipullossa (4.3).
4 LAITTEET
4.1 Dekantterilaseja, 50 ml4.2 Mittapulloja, 100 ml4.3 Ruskea lasipullo, 125 ml4.4 Lasilevy, 10 × 10 cm
4.5 Muovilasta
4.6 Suodatinpaperi, 10 × 10 cm
5 MENETTELY
5.1 Osa tutkittavasta näytteestä levitetään tasaisesti lasilevylle (4.4)
niin, että se peittää levyn pinnan enintään 1 cm:n paksuudelta.
5.2 Pala suodatinpaperia (4.6) liotetaan tislatussa vedessä. Suodatin-
paperi levitetään näytteen päälle ja painetaan näytteeseen
muovilastalla (4.5).
5.3 Odotetaan noin minuutti ja lisätään suodatinpaperin keskelle:
— kaksi tippaa laimeaa rikkihappoa (3.1),
— sen jälkeen kaksi tippaa Nitrin®-liuosta (3.4).
5.4 Viidestä kymmeneen sekunnin kuluttua suodatinpaperi poiste-
taan ja sitä tutkitaan päivänvaloa vasten. Nitriitin olemassaolon
ilmaisee suodatinpaperin värjäytyminen purppuranpunertavaksi.
Jos nitriittipitoisuus on pieni, punertavan purppura väri muuttuu
keltaiseksi 5-15 sekunnin kuluttua. Tämä värinmuutos tapahtuu
vasta yhden tai kahden minuutin kuluttua, jos nitriittiä on
suurina määrinä.
6 HUOMAUTUS
Punertavan purppuran värin intensiteetti ja aika, joka kuluu,
ennen kuin se muuttuu keltaiseksi voi olla osoituksena näytteen
nitriittipitoisuudesta.1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 17
▼B
B. MÄÄRITTÄMINEN
1 TARKOITUS JA SOVELTAMISALA
Menetelmässä kuvataan nitriitin määrittämistä kosmeettisissa
valmisteissa.
2 MÄÄRITELMÄ
Tämän menetelmän mukaisesti määritetty näytteen nitriittipitoi-
suus ilmaistaan natriumnitriitin painoprosentteina.
3 PERIAATE
Näyte laimennetaan vedellä ja selkeytetään, minkä jälkeen sen
sisältämän nitriitin annetaan reagoida sulfaniiliamidin ja N-1-
naftyylietyleenidiamiinin kanssa ja saadun värin absorbanssi
mitataan 538 nm:ssä.
4 REAGENSSIT
Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua.
4.1 Selkeytysreagenssit: näitä reagensseja ei saa käyttää pitempään
kuin viikon valmistamisesta.
4.1.1 Carrez I -reagenssi:
Liuotetaan 106 g kaliumsyaaniferraattia (II) K4Fe(CN)6·3 H2O,
tislattuun veteen ja laimennetaan vedellä 1 000 ml:aan.
4.1.2 Carrez II -reagenssi:
Liuotetaan 219,5 g sinkkiasetaattia, Zn(CH3COO)2·2 H2Oj a
30 ml jääetikkaa tislattuun veteen ja laimennetaan vedellä
1 000 ml:an.
4.2 Natriumnitriittiliuos:
Liuotetaan 0,500 g natriumnitriittiä tislattuun veteen 1000 ml
mittapulloon ja laimennetaan vedellä merkkiin saakka. Laimen-
netaan 10,0 ml tätä standardiperusliuosta 500 ml:ksi; 1 ml
viimeksi mainittua liuosta = 10 µg NaNO2:ta.
4.3 1N natriumhydroksidiliuos
4.4 0,2 % sulfaniiliamidihydrokloridi -liuos:
Liuotetaan 2,0 g sulfaniiliamidia 800 ml:an vettä lämmittäen.
Jäähdytetään ja lisätään 100 ml väkevää suolahappoa samalla
sekoittaen. Laimennetaan vedellä 1 000 ml:ksi.
4.5 5 N suolahappoliuos
4.6 N-1-naftyylireagenssi:
Tämä liuos on valmistettava käyttöpäivänä. Liuotetaan 0,1 g N-
1-naftyylietyleenidiamiinidihydrokloridia veteen ja laimenne-
taan vedellä 100 ml:aan saakka.
5 LAITTEET
5.1 Analyysivaaka
5.2 100, 250, 500 ja 1 000 ml:n mittapullot5.3 Pallo- tai mittapipettejä5.4 100 ml:n mittalaseja5.5 Laskostettuja suodatinpapereita, nitriitittömiä, halkaisija 15 cm
5.6 Vesihaude
5.7 Spektrofotometri, jossa 1 cm:n kyvetit5.8 pH-mittari5.9 10 ml:n mikrobyretti
5.10 250 ml:n dekantterilaseja1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 18
▼B
6 MENETTELY
6.1 Homogenisoitua näytettä punnitaan 0,5 g (m grammaa) 0,1 mg:n
tarkkuudella, se siirretään kvantitatiivisesti kuuman tislatun
veden avulla 250 ml dekantterilasiin (5.10), joka täytetään noin
150 ml:n tilavuuteen kuumalla tislatulla vedellä. Dekantterilasi
(5.10) laitetaan vesihauteeseen (5.6) 80 ºC:n lämpötilaan
puoleksi tunniksi. Tänä aikana sisältöä ravistellaan ajoittain.
6.2 Jäähdytetään huoneenlämpöiseksi ja lisätään, samalla sekoit-
taen, ensin 2 ml Carrez I -reagenssia (4.1.1) ja sitten 2 ml
Carrez II -reagenssia (4.1.2).
6.3 Lisätään 1N natriumhydroksidiliuosta (4.3) niin että pH-arvoksi
tulee 8,3. (Käytetään pH-mittaria (5.8)). Sisältösiirretään kvan-
titatiivisesti 250 ml mittapulloon (5.2) ja täytetään tislatulla
vedellä merkkiin saakka.
6.4 Sisältösekoitetaan ja suodatetaan laskostetun suodatinpaperin
läpi (5.5).
6.5 Pipetoidaan (5.3) sopiva määrä (V ml) kirkasta suodosta,
kuitenkin korkeintaan 25 ml, 100 ml mittapulloon (5.2) ja
täytetään tislatulla vedellä 60 ml:n tilavuuteen.
6.6 Sekoittamisen jälkeen lisätään 10,0 ml sulfaniiliamidihydrok-
loridi -liuosta (4.4) ja sen jälkeen 6,0 ml 5 N suolahappoa
(4.5). Sekoitetaan ja annetaan seistä viisi minuuttia. Lisätään
2,0 ml N-1-naftyylireagenssia (4.6), sekoitetaan ja annetaan
seistä kolme minuuttia. Laimennetaan vedellä merkkiin saakka
ja sekoitetaan.
6.7 Suoritetaan sokeakoe toistamalla 6.5 ja 6.6 kohdassa kuvatut
toiminnot lisäämättä N-1-naftyylireagenssia (4.6).
6.8 Mitataan (5.7) 6.6 kohdan mukaisesti saadun liuoksen absor-
banssi 538 nm:ssä sokealiuosta vastaan (6.7).
6.9 Luetaan standardikäyrältä (6.10) natriumnitriittipitoisuus mikro-
grammoina 100 ml:n liuosmäärää kohti (m1mikrogrammaa),
joka vastaa 6.8 kohdassa mitattua absorbanssia.
6.10 Tehdään standardikäyrä pitoisuuksille 0, 20, 40, 60, 80, 100 µg
natriumnitriittiä 100 ml:ssa käyttäen 10 µg/ml:n natriumnitriitti-
liuosta (4.2).
7 TULOSTEN LASKEMINEN
Näytteen natriumnitriittipitoisuus lasketaan painoprosentteina
seuraavan kaavan avulla:
% NaNO 2¼20250
V/C2m1/C210/C06/C2100
m¼m1
V/C2m/C240
jossa:
m = analysoitavaksi otettu näytemäärä grammoina (6.1),
m1= kohdan 6.9 mukainen natriumnitriittipitoisuus mikro-
grammoina,
V = mittauksessa käytetty suodoksen määrä millilitroina
(6.5).1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 19
▼B
8 TOISTETTAVUUS(1)
Natriumnitriittipitoisuuden ollessa noin 0,2 % m/m ei saman
näytteen rinnakkaismääritysten tulosten eron absoluuttinen arvo
saa olla enempää kuin 0,005 %.
IVVAPAAN FORMALDEHYDIN TUNNISTAMINEN JA MÄÄRITTÄ-
MINEN
1 TARKOITUS JA SOVELTAMISALA
Tässä menetelmässä kuvataan vapaan formaldehydin tunnista-
minen ja kaksi määrittämistapaa sen mukaan, esiintyykö
formaldehydin luovuttajia. Sitä voidaan soveltaa kaikille
kosmeettisille valmisteille.
1.1 Tunnistaminen
1.2 Yleinen määrittäminen 2,4-pentaanidionin avulla kolorime-
trisesti
Tätä menetelmää sovelletaan silloin, kun formaldehydiä on
käytetty yksin tai muiden säilytysaineiden kanssa, jotka eivät
ole formaldehydin luovuttajia.
Muussa tapauksessa ja mikäli tulos ylittää suurimman sallitun
pitoisuuden, on käytettävä seuraavaa varmistusmenetelmää.
1.3 Määrittäminen silloin kun formaldehydin luovuttajia
esiintyy
Edellä mainitussa menetelmässä (1.2) derivatisoinnin aikana
formaldehydin luovuttajat hajoavat ja johtavat liian korkeisiin
tuloksiin (sitoutuneet ja polymeroituneet formaldehydit).
Vapaa formaldehydi on erotettava nestekromatografisesti.
2 MÄÄRITELMÄ
Tämän menetelmän mukaisesti määritetty näytteen vapaan
formaldehydin pitoisuus ilmaistaan painoprosentteina.
3 TUNNISTAMINEN
3.1 Periaate
Vapaa ja sitoutunut formaldehydi muuttaa rikkihapon läsnäol-
lessa Schiffin reagenssin vaaleanpunaiseksi tai malvanväriseksi
(sinipunainen).
3.2 Reagenssit
Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua ja veden on
oltava ionivaihdettua.
3.2.1 Fuksiini3.2.2 Natriumsulfiittiheptahydraatti 7 H
2O:ssa
3.2.3 Väkevä suolahappo (d = 1,19)
3.2.4 Rikkihappo, n. 1 M
3.2.5 Schiffinreagen ssi:
100 mg fuksiinia (3.2.1) punnitaan dekantterilasiin ja liuotetaan
75 ml:an vettä 80 ºC:n lämpötilassa. Jäähdyttämisen jälkeen
lisätään 2,5 g natriumsulfiittia (3.2.2). Täytetään 100 ml:ksi.
Käytetään kahden viikon kuluessa.
3.3 Menettely
3.3.1 Punnitaan 2 g näytettä 10 ml:n dekantterilasiin.1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 20
(1) Standardin ISO 5725 mukaisesti.▼M1
▼M1
3.3.2 Lisätään kaksi tippaa rikkihappoa (3.2.4) ja 2 ml Schiffin
reagenssia (3.2.5). Tämän reagenssin on oltava käytettäessä
ehdottomasti väritöntä.
Ravistellaan ja jätetään seisomaan viideksi minuutiksi.
3.3.3 Jos viiden minuutin kuluessa havaitaan vaaleanpunainen tai
malvanvärinen sävy, on näytteessä formaldehydiä enemmän
kuin 0,01 % ja se on määritettävä vapaalle ja sitoutuneelle
formaldehydille sopivalla menetelmällä 4 ja tarvittaessa 5
kohdan mukaisella tavalla.
4 YLEINEN MÄÄRITYS 2,4-PENTAANIDIONIN AVULLA
KOLORIMETRISESTI
4.1 Periaate
Formaldehydi reagoi 2,4-pentaanidionin kanssa ammoniumase-
taatin läsnäollessa muodostaen 3,5-diasetyyli-1,4-
dihydrolutidiinia. Tämä uutetaan 1-butanolilla ja uutteen absor-
banssi mitataan 410 nm:ssä.
4.2 Reagenssit
Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua ja veden on
oltava ionivaihdettua.
4.2.1 Vedetön ammoniumasetaatti4.2.2 Väkevä etikkahappo, d
204 = 1,05
4.2.3 2,4-pentaanidioni, joka on juuri tislattu alennetussa paineessa
25 mm Hg 25 ºC - sen ei pitäisi absorboida 410 nm:ssä
4.2.4 1-butanoli4.2.5 Suolahappo, 1 M4.2.6 Suolahappo, n. 0,1 M4.2.7 Natriumhydroksidi, 1 M4.2.8 Tärkkelysliuos, joka on juuri valmistettu Euroopan farmakopean
ohjeen (1 g/50 ml vettä), (2. painos 1980, osa I-VII-1-1) mukai-
sesti
4.2.9 37-40 % w/v formaldehydiä4.2.10 Jodimittaliuos, 0,05 M4.2.11 Natriumtiosulfaattimittaliuos, 0,1 M
4.2.12 2,4-pentaanidionireagenssi:
1 000 ml:n mittapulloon liuotetaan:
— 150 g ammoniumasetaattia (4.2.1),
— 2 ml 2,4-pentaanidionia (4.2.3),— 3 ml etikkahappoa (4.2.2).
Täytetään vedellä merkkiin (liuoksen pH noin 6,4) asti.Tämä reagenssi on valmistettava juuri ennen käyttöä.
4.2.13 Reagenssi (4.2.12) ilman 2,4-pentaanidionia
4.2.14 Formaldehydistandardi: perusliuos
Kaadetaan 5 g formaldehydiä (4.2.9) 1 000 ml:n mittapulloon ja
täytetään vedellä merkkiin saakka.
Määritetään tämän liuoksen vahvuus seuraavasti:Otetaan 10,00 ml; lisätään 25,00 ml jodiliuosta (4.2.10) ja
10,00 ml natriumhydroksidiliuosta (4.2.7).
Annetaan seistä viisi minuuttia.Tehdään happamaksi 11 ml:lla HCl:ää (4.2.5) ja määritetään
ylimääräinen jodi natriumtiosulfaattiliuoksella (4.2.11) käyttäen
tärkkelysliuosta (4.2.8) indikaattorina.
1 ml kulutettua 0,05 M jodiliuosta (4.2.10) vastaa 1,5 mg:aa
formaldehydiä.1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 21
▼M1
4.2.15 Formaldehydistandardi: laimennettu liuos
Laimennetaan formaldehydin perusliuosta ensin 1/20 ja sitten 1/
100 vedellä. 1 ml tätä liuosta sisältää noin 1 µg:n formalde-
hydiä.
Lasketaan tarkka pitoisuus.
4.3 Laitteet
4.3.1 Tavalliset laboratoriolaitteet4.3.2 Faasinerotussuodatin, Whatman 1 PS (tai vastaava)4.3.3 Sentrifugi4.3.4 Vesihaude, jonka lämpötila 60 ºC
4.3.5 Spektrofotometri
4.3.6 1 cm:n kyvettejä.
4.4 Menettely
4.4.1 Näyteliuos
Punnitaan 100 ml:n mittapulloon 0,001 g:n tarkkuudella sell-
ainen määrä (grammoina) testinäytettä, että se vastaa noin
150µg:n oletettua formaldehydimäärää.
Täytetään vedellä merkkiin saakka ja sekoitetaan (liuos S).(Tarkistetaan, että pH on suunnilleen 6. Jos ei ole, korjataan
suolahappoliuoksella (4.2.6).)
50 ml:n erlenmeyerpulloon laitetaan:
— 10,00 ml liuosta S,
— 5,00 ml 2,4-pentaanidionireagenssia (4.2.12),— ionivaihdettua vettä siten, että lopullinen tilavuus on 30 ml.
4.4.2 Vertailuliuos
Mahdollinen virhe testinäytteen taustavärin johdosta estetään
käyttämällä tätä vertailuliuosta:
50 ml:n erlenmeyerpulloon laitetaan:
— 10,00 ml liuosta S,
— 5,00 ml reagenssia (4.2.13),— ionivaihdettua vettä siten, että lopullinen tilavuus on 30 ml.
4.4.3 Sokeakoe
50 ml:n erlenmeyerpulloon laitetaan:
— 5,0 ml 2,4-pentaanidionireagenssia (4.2.12),
— ionivaihdettua vettä siten, että lopullinen tilavuus on 30 ml.
4.4.4 Määrittäminen
4.4.4.1 Ravistetaan 4.4.1, 4.4.2 ja 4.4.3 kohtien seoksia. Laitetaan
erlenmeyerpullot vesihauteeseen 60 ºC:n lämpötilaan tarkalleen
10 minuutiksi. Annetaan jäähtyä kahden minuutin ajan jäävesi-
hauteessa.
4.4.4.2 Siirretään 50 ml:n erotussuppiloihin, joissa on 10 ml 1-butanolia
(4.2.4). Huuhdellaan kukin pullo 3-5 ml:lla vettä. Seosta ravis-
tellaan voimakkaasti täsmälleen 30 sekunnin ajan. Annetaan
erottua.
4.4.4.3 Suodatetaan 1-butanolifaasi kyvetteihin (4.3.2) Whatman-faasi-
nerotussuodattimen läpi. Voidaan käyttää myös sentrifugointia
(3 000 g viiden minuutin ajan).
4.4.4.4 Mitataan 4.4.1 kohdan näyteliuoksen uutteen absorbanssi A
1410 nm:ssä 4.4.2 kohdan vertailuliuoksen uutetta vastaan.
4.4.4.5 Samalla tavalla mitataan 4.4.3 kohdan sokealiuoksen uutteen
absorbanssi A21-butanolia vastaan.1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 22
▼M1
Huomaa: Kaikki nämä toimet on suoritettava 25 minuutin
kuluessa siitä, kun erlenmeyerpullot on laitettu
60 ºC:n vesihauteeseen.
4.4.5 Standardikäyrä
4.4.5.1 50 ml:n erlenmeyerpulloon laitetaan:
— 5,00 ml laimennettua standardiliuosta (4.2.15),
— 5,00 ml 2,4-pentaanidionireagenssia (4.2.12),— ionivaihdettua vettä siten, että lopullinen tilavuus on 30 ml.
4.4.5.2 Jatketaan, kuten 4.4.4 kohdassa on selostettu, ja mitataan absor-
banssi 1-butanolia (4.2.4) vastaan.
4.4.5.3 Toistetaan menettely 10, 15, 20 ja 25 ml:lla laimennettua stan-
dardiliuosta (4.2.15).
4.4.5.4 Nolla-arvon saamiseksi (reagenssien värjäytymistä vastaava)
toimitaan 4.4.4.5 kohdan mukaisesti.
4.4.5.5 Standardikäyrä tehdään nolla-arvon vähentämisen jälkeen
kustakin 4.4.5.1 ja 4.4.5.3 kohdassa saadusta absorbanssin
arvosta. Beerin laki on voimassa formaldehydille 30 µg:aan asti.
4.5 Tulosten laskeminen
4.5.1 Vähennetään A
1:stä A2ja luetaan standardikäyrältä (4.4.5.5)
näyteliuoksen (4.4.1) formaldehydin määrä C µg:na.
4.5.2 Lasketaan näytteen formaldehydipitoisuus (% m/m) seuraavan
kaavan avulla:
formaldehydipitoisuus % ¼C
103/C1m
jossa:
m = testiannoksen paino.
4.6 Toistettavuus (1)
Formaldehydipitoisuudelle 0,2 % ei saman näytteen rinnak-
kaismääritysten tulosten ero saa olla enempää kuin 0,005 %
määritettäessä 2,4-pentaanidionin avulla kolorimetrisesti.
Jos vapaan formaldehydin määrittämisestä saadaan suuremmat
tulokset kuin direktiivissä 76/768/ETY määrätyt enimmäispitoi-
suudet, toisin sanoen:
a) 0,05 %:n ja 0,2 %:n väliltä valmisteissa, joissa ei ole
merkintää,
b) yli 0,2 % valmisteissa, joissa joko on tai ei ole merkintää,
on suoritettava jäljempänä 5 kohdan mukainen määritys.
5 MÄÄRITTÄMINEN KUN FORMALDEHYDIN LUOVUT-
TAJIA ESIINTYY
5.1 Periaate
Erottunut formaldehydi muuntuu keltaiseksi lutidiinijohdannai-
seksi reagoidessaan 2,4-pentaanidionin kanssa
kolonninjälkeisessä reaktiokammiossa, ja saadun johdannaisen
absorbanssi mitataan 420 nm:ssä.
5.2 Reagenssit
Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua ja veden on
oltava ionivaihdettua.
5.2.1 HPLC laatua olevaa vettä tai vastaavan laatuista vettä
5.2.2 Vedetön ammoniumasetaatti1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 23
(1) Standardin ISO 5725 mukaisesti.
▼M1
5.2.3 Väkevä etikkahappo
5.2.4 2,4-pentaanidioni (pidetään 4 ºC:n lämpötilassa)5.2.5 Vedetön dinatriumfosfaatti5.2.6 85 % ortofosforihappo (d = 1,7)
5.2.7 HPLC-laatua oleva metanoli
5.2.8 Dikloorimetaani5.2.9 37-40 % m/v formaldehydiä
5.2.10 Natriumhydroksidi, 1 M
5.2.11 Suolahappo, 1 M5.2.12 Suolahappo, 0,002 M5.2.13 Tärkkelysliuos, joka on juuri valmistettu Euroopan farmakopean
ohjeen (ks. 4.2.8) mukaisesti
5.2.14 Jodimittaliuos, 0,05 M5.2.15 Natriumtiosulfaattimittaliuos, 0,1 M
5.2.16 Liikkuva faasi:
Dinatriumfosfaatin (5.2.5) vesiliuos, 0,006 M, pH säädetään
arvoon 2,1 ortofosforihapon (5.2.6) avulla.
5.2.17 Kolonninjälkeinen reagenssi:
1 000 ml:n mittapulloon liuotetaan:
— 62,5 g ammoniumasetaattia (5.2.2),
— 7,5 ml etikkahappoa (5.2.3),
— 5 ml 2,4-pentaanidionia (5.2.4).
Täytetään vedellä 1 000 ml:an asti (5.2.1).
Tämä reagenssi on pidettävä valolta suojattuna.Säilytysaika: korkeintaan kolme päivää 25 ºC:ssa.Värinmuutoksia ei saa tapahtua.
5.2.18 Formaldehydistandardi: perusliuos
Kaadetaan 10 g formaldehydiä (5.2.9) 1000 ml:n mittapulloon
ja täytetään vedellä merkkiin asti.
Määritetään tämän liuoksen pitoisuus seuraavasti:Otetaan 5,00 ml; lisätään 25,00 ml jodimittaliuosta (5.2.14) ja
10 ml natriumhydroksidiliuosta (5.2.10).
Annetaan seistä viisi minuuttia.Tehdään happamaksi 11,00 ml:lla HCl:ää (5.2.11) ja titrataan
ylimääräinen jodiliuos natriumtiosulfaattiliuoksella (5.2.15)
käyttäen tärkkelysliuosta (5.2.13) indikaattorina.
1 ml jodiliuosta (5.2.14) vastaa 1,5 mg:aa formaldehydiä.
5.2.19 Formaldehydistandardi: laimennettu liuos
Laimennetaan formaldehydin perusliuosta 1/100 sen alkuperäi-
sestä pitoisuudesta liikkuvalla faasilla (5.2.16). 1 ml tätä
liuosta sisältää n. 37 mg formaldehydiä.
Lasketaan tarkka pitoisuus.
5.3 Laitteet
5.3.1 Tavalliset laboratoriolaitteet5.3.2 HPLC-pumppu, vaimennettu
5.3.3 Vaimennettu matalapainepumppu reagenssille (tai toinen HPLC-
pumppu)
5.3.4 10 µl:n loop-injektori1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 24
▼M1
5.3.5 Kolonninjälkeinen reaktiokammio, jossa on seuraavat kompo-
nentit:
+ 1 litran kolmikaulapullo,
+ 1 litran pullon lämpöhaude,
+ kaksi Vigreux-kolonnia vähintään 10 levyllä, (ilmajäähdytys),+ 1,6 mm:n ruostumaton teräsputki (lämmönvaihtoon) -
sisähalkaisija 0,23 mm, pituus 400 mm,
+ 1,6 mm:n teflonputki - sisähalkaisija 0,30 mm, pituus 5 m
(”French knitting”, ks. liite 1),
+ T-kappale ilman kuollutta tilavuutta (Valco tai vastaava),+ kolme liitosta ilman kuollutta tilavuuttatai:valmis kolonninjälkeinen moduli Applied Biosystems PCRS
520 tai vastaava, jossa 1 ml:n reaktiokammio.
5.3.6 0,45 µm:n kalvosuodatin
5.3.7 SEP-PAK
RC18-patruuna tai vastaava
5.3.8 Kolonnit:
— Bischoff hypersil RP 18 (tyyppi NC, viiten:o C 25.46 1805)
(5µm, pituus = 250 mm, sisähalkaisija = 4,6 mm),
— tai Dupont, Zorbax ODS
(5µm, pituus = 250 mm, sisähalkaisija = 4,6 mm),
— tai Phase SEP, spherisorb ODS 2
(5µm, pituus = 250 mm, sisähalkaisija = 4,6 mm)
5.3.9 Esikolonni
Bischoff K1hypersil RP 18 (viite n:o KL G 6301 1805) (5 µm,
pituus 10 mm, tai vastaava)
5.3.10 Kolonni ja esikolonni liitetään Ecotube-järjestelmällä (viite A
1502 0508 Bischoff) tai vastaavalla
5.3.11 Laitteisto (5.3.5) asennetaan lisäyksessä 2 olevan lohkokaavion
mukaisesti.
Injektorin jälkeiset liitokset on pidettävä niin lyhyinä kuin
mahdollista. Tässä tapauksessa reaktiokammion ulostulon ja
detektorin sisääntulon välisen teräsputken on tarkoitus
jäähdyttää seos ennen detektoria ja detektorin lämpötila on
tuntematon, mutta vakio.
5.3.12 UV-näkyvän valon detektori
5.3.13 Piirturi5.3.14 Sentrifugi
5.3.15 Ultraäänihaude
5.3.16 Ravistelija (vortex tai vastaava).
5.4 Menettely
5.4.1 Standardikäyrä
Käyrä tehdään piirtämällä piikkien korkeudet laimennettujen
formaldehydistandardipitoisuuksien funktioina.
Valmistetaan standardiliuokset laimentamalla formaldehydin
vertailuliuosta (5.2.19) liikkuvalla faasilla (5.2.16):
— 1,00 ml liuosta (5.2.19) laimennettu 20,00 ml:ksi (n. 185 µg/
100 ml)
— 2,00 ml liuosta (5.2.19) laimennettu 20,00 ml:ksi (n. 370 µg/
100 ml)
— 5,00 ml liuosta (5.2.19) laimennettu 25,00 ml:ksi (n. 740 µg/
100 ml)
— 5,00 ml liuosta (5.2.19) laimennettu 20,00 ml:ksi (n. 925 µg/
100 ml)
Standardiliuoksia pidetään tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja
ne on valmistettava juuri ennen käyttöä.
Standardikäyrä on lineaarinen pitoisuuksille 1,00 - 15,00 µg/ml.1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 25
▼M1
5.4.2 Näytteidenesikäsittely
5.4.2.1 Emulsiot (voiteet, meikkivoiteet, silmämeikit)
Punnitaan 100 ml:n tulpalliseen pulloon 0,001 g:n tarkkuudella
sellainen määrä (m) testinäytettä (g), että se vastaa 100 µg:n
oletettua formaldehydimäärää.
Lisätään 20,00 ml dikloorimetaania (5.2.8) ja 20,00 ml suola-
happoa (5.2.12) tarkasti mitattuna.
Sekoitetaan ravistelijan (5.3.16) ja ultraäänihauteen (5.3.15)
avulla.
Erotetaan kaksi faasia sentrifugoimalla (3 000 g kahden
minuutin ajan). Sillä aikaa pestään patruuna (5.3.7) 2 ml:lla
metanolia (5.2.7) ja huuhdotaan 5 ml:lla vettä (5.2.1).
Lasketaan 4 ml uutteen vesifaasia käyttökuntoon saatetun
patruunan läpi, jätetään käyttämättä ensimmäiset 2 ml ja otetaan
talteen loppuosa.
5.4.2.2 Nesteet, shampoot
Punnitaan 100 ml:n tulpalliseen pulloon 0,001 g:n tarkkuudella
sellainen määrä (m) testinäytettä (g), että se vastaa 500 µg:n
oletettua formaldehydimäärää.
Täytetään liikkuvalla faasilla (5.2.16) merkkiin asti.
Suodatetaan liuos suodattimen (5.3.6) läpi ja lasketaan se edellä
(5.4.2.1) kuvatulla tavalla käyttökuntoon saatetun patruunan
(5.3.7) läpi.
Kaikki liuokset on injektoitava välittömästi valmistamisen
jälkeen.
5.4.3 Kromatografiaolosuhteet
— liikkuvan faasin virtausnopeus: 1 ml/min,
— reagenssin virtausnopeus: 0,5 ml/min,— kokonaisvirtausnopeus detektorin ulostulossa: 1,5 ml/min,
— injektiotilavuus: 10 µl,
— eluointilämpötila: Kun kyseessä on vaikeasti tapahtuva erot-
tuminen, kolonni upotetaan sulavan jään hauteeseen:
odotetaan, että lämpötila stabiloituu (15 - 20 min),
— kolonninjälkeisen reaktion lämpötila: 100 ºC,
— detektori: 420 nm.
Huomaa: Koko kromatografiajärjestelmä ja jälkikolonni on
huuhdottava vedellä käytön jälkeen (5.2.1). Jos järjes-
telmää ei käytetä yli kahteen päivään, on vedellä
huuhtomisen jälkeen huuhdottava vielä metanolilla
(5.2.7). Ennen järjestelmän uutta käyttöönottoa sen
läpi on ajettava vettä uudelleenkiteytymisen välttämi-
seksi.
5.5 Tulosten laskeminen
Emulsiot (5.4.2.1):
formaldehydipitoisuus % (m/m):
C/C110/C06/C1100
5m¼C/C110/C04
5m
Nesteet, shampoot:
Tässä tapauksessa kaava on seuraava:
C/C110/C06/C1100
m¼C/C110/C04
m
jossa:
m = analysoidun näytteen määrä grammoina (5.4.2.1),1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 26
▼M1
C = formaldehydipitoisuus µg/100 ml luettuna standardi-
käyrältä (5.4.1).
5.6 Toistettavuus (1)
Formaldehydipitoisuudelle 0,05 % ei saman näytteen rinnak-
kaismääritysten tulosten ero saa olla yli 0,001 %.
Formaldehydipitoisuudelle 0,2 % ei saman näytteen rinnak-
kaismääritysten tulosten ero saa olla yli 0,005 %.
V.RESORSINOLIN MÄÄRITTÄMINEN SHAMPOISSA JA HIUSVE-
SISSÄ
1 TARKOITUS JA SOVELTAMISALA
Tässä menetelmässä kuvataan resorsinolin kaasukromatogra-
finen määritys shampoissa ja hiusvesissä. Menetelmä soveltuu
näytteille, joissa pitoisuus on 0,1-2,0 painoprosenttia.
2 MÄÄRITELMÄ
Tämän menetelmän mukaisesti määritetty näytteen resorsinoli-
pitoisuus ilmaistaan painoprosentteina.
3 PERIAATE
Resorsinoli ja sisäisenä standardina lisätty 3,5-dihydroksito-
lueeni (5-metyyliresorsinoli) erotetaan näytteestä
ohutkerroskromatografisesti. Molemmat yhdisteet eristetään
raaputtamalla niiden täplät ohutkerroslevystä ja uuttamalla
metanolilla. Sen jälkeen uutetut yhdisteet kuivataan, silyloidaan
ja määritetään kaasukromatografisesti.
4 REAGENSSIT
Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua.
4.1 Suolahappo 25 % (m/m)
4.2 Metanoli4.3 Etanoli 96 % (v/v)4.4 Valmiita silikageeli-TLC-levyjä (muovi tai alumiini), joissa
fluoresoiva indikaattori. Deaktivoidaan seuraavasti: suihkutetaan
tavanomaisesti esipinnoitetut silikalevyt vedellä kiiltäviksi.
Annetaan suihkutettujen levyjen kuivua ilmassa huonelämpöti-
lassa 1-3 tuntia.
Huomaa: Jos levyjä ei deaktivoida, voi resorsinolihäviöitä
syntyä irreversiibelin silikalevyyn adsorpoitumisen johdosta.
4.5 Kehiteliuos; asetoni-kloroformi-etikkahappo (20:75:5 tilavuuk-
sina).
4.6 Resorsinolin standardiliuos; liuotetaan 400 mg resorsinolia
100 ml:aan 96 % etanolia (4.3) (1 ml vastaa 4 000 µg resorsi-
nolia).
4.7 Sisäinen standardiliuos; liuotetaan 400 mg 3,5-dihydroksito-
lueenia (DHT) 100 ml:aan 96 % etanolia (4.3) (1 ml vastaa
4 000 µg DHT:tä).
4.8 Standardiseos: sekoitetaan 10 ml liuosta 4.6 ja 10 ml liuosta 4.7
100 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin saakka 96 % etano-
lilla (4.3) ja sekoitetaan (1 ml vastaa 400 µg resorsinolia ja
400 µg DHT:tä).
4.9 Silylointiaineet:
4.9.1 N, O-bis-(trimetyylisilyyli)trifluoroasetamidi (BSTFA)
4.9.2 Heksametyylidisilatsaani (HMDS)4.9.3 Trimetyylikloorisilaani (TMCS)1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 27
(1) Standardin ISO 5725 mukaisesti.▼B
▼B
5 LAITTEET
5.1 Tavanomaiset ohutkerros- ja kaasukromatografiavälineet
5.2 Lasitarvikkeita
6 MENETTELY
6.1 Näytteen esikäsittely
6.1.1 Punnitaan valmistetta tarkasti 150 ml:n dekantterilasiin testa-
ttava osa valmistetta (m grammaa), joka sisältää noin 20-50 mg
resorsinolia.
6.1.2 Lisätään suolahappoa (4.1), kunnes seos on hapan (tarvitaan
noin 2-4 ml), lisätään 10 ml (40 mg DHT) sisäistä standardi-
liuosta (4.7) ja sekoitetaan. Siirretään etanolin (4.3) avulla
100 ml:n mittapulloon, täytetään etanolilla merkkiin saakka ja
sekoitetaan.
6.1.3 Laitetaan 250 µl liuosta (6.1.2) deaktivoidulle silikalevylle (4.4)
noin 8 cm pituiseksi katkeamattomaksi nauhaksi. Nauha on
pyrittävä saamaan niin kapeaksi kuin mahdollista.
6.1.4 Laitetaan 250 µl standardiliuosta (4.8) samalle levylle samalla
tavalla (6.1.3).
6.1.5 Lisätään 5 µl:n täplä kumpaakin liuosta 4.6 ja 4.7 kahteen
lähtöviivan pisteeseen yhdisteiden paikallistamisen helpottumi-
seksi levyn kehittämisen jälkeen.
6.1.6 Levy kehitetään ei-kyllästetyssä astiassa, joka on täytetty kehi-
teliuoksella 4.5, kunnes liuotin on noussut 12 cm lähtöviivasta;
tavallisesti tämä kestää noin 45 minuuttia. Levy kuivataan
ilmassa ja paikallistetaan resorsinoli/DHT-vyöhyke lyhytaalto-
UV-valossa (254 nm). Näillä kahdella yhdisteellä on suunnil-
leen samat Rf-arvot. Merkitään nauhat kynällä 2 mm
etäisyydellä nauhojen ulkopuolen tummasta reunaviivasta. Pois-
tetaan nämä vyöhykkeet ja kerätään kunkin nauhan adsorbentit
10 ml pulloihin.
6.1.7 Uutetaan adsorbentit, joissa on näyte ja standardiseos, kumpikin
seuraavalla tavalla:
lisätään 2 ml metanolia (4.2) ja uutetaan tunnin ajan koko ajan
sekoittaen. Suodatetaan seos ja toistetaan uuttamista vielä 15minuutin ajan 2 ml:lla metanolia.
6.1.8 Yhdistetään uutteet ja haihdutetaan liuos kuivattamalla yön yli
vakuumieksikaattorissa, joka on täytetty sopivalla kuivausai-
neella. Ei saa lämmittää.
6.1.9 Silyloidaan jäännökset (6.1.8) joko 6.1.9.1 tai 6.1.9.2 kohdan
mukaisesti.
6.1.9.1 Lisätään 200 µl BSTFA:ta (4.9.1) mikroruiskulla ja jätetään
seos suljettuun astiaan 12 tunniksi huonelämpötilaan.
6.1.9.2 Lisätään järjestyksessä 200 µl HMDS:ää (4.9.2) ja 100 µl
TMCS:ää (4.9.3) mikroruiskulla ja kuumennetaan seosta 30
minuutin ajan 60 ºC:n lämpötilassa suljetussa astiassa. Jäähdy-
tetään seos.
6.2 Kaasukromatografia
6.2.1 Kromatografianajo-olosuhteet
Kolonnin erotuskyvyn (R) on oltava joko 1,5 tai parempi,
jolloin:
R¼2d0R2/C0d0R1
W1þW2
jossa:
R1ja R2= kahden piikin retentioaika minuuteissa,
W1ja W2= samojen piikkien puolileveydet millimetreinä
d′ = piirturin nopeus millimetreinä minuutissa1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 28
▼B
Seuraavat kolonni- ja kaasukromatografian ajo-olosuhteet on
havaittu sopiviksi:
Kolonnin
materiaali:ruostumaton teräs
pituus: 200 cm
sisähalkai-
sija:=3m m
täyte: 10 % OV-17 Chromosorb WAW 100-120 mesh
Liekki-ionisaatiodetektori
Lämpötilat:
kolonni: 185 ºC (isoterminen)detektori: 250 ºC
injektori: 250 ºC
Kanto-
kaasu:typpi
virtaus: 45 ml/min.
Typen ja ilman virtauksen säädössä seurataan valmistajan
antamia ohjeita.
6.2.2 Ruiskutetaan 1-3 µl 6.1.9 kohdan mukaisesti saatuja liuoksia
kaasukromatografiin. Kutakin liuosta (6.1.9) ruiskutetaan viisi
kertaa, mitataan piikkien pinta-alat, lasketaan niiden keskiarvo
ja lasketaan piikkien pinta-alojen suhde: S = resorsinolin piikin
pinta-ala/DHT:n piikin pinta-ala.
7 TULOSTEN LASKEMINEN
Resorsinolin pitoisuus näytteessä, ilmaistuna painoprosentteina
(% m/m) saadaan seuraavasta kaavasta:
% resorsinolia ¼
4
M/C2Sn ¨ayte
S standardiseos
jossa:
M = näytemäärä grammoina (6.1.1),
S näyte = 6.2.2 mukainen näyteliuoksen piikkien
pinta-alojen keskiarvojen suhde,
S standardiseos = 6.2.2 mukainen standardiseoksen piikkien
pinta-alojen keskiarvojen suhde.
8 TOISTETTAVUUS(1)
Resorsinolipitoisuudelle noin 0,5 % ei saman näytteen rinnak-
kaismääritysten tulosten ero saa ylittää absoluuttista arvoa
0,025 %:a.
VI.METANOLIN MÄÄRITTÄMINEN SUHTEESSA ETANOLIIN TAI 2-
PROPANOLIIN
1 TARKOITUS JA SOVELTAMISALA
Tässä menetelmässä kuvataan kaikenlaisissa kosmeettisissa
valmisteissa (mukaan lukien aerosolit) olevan metanolin
kaasukromatografinen analyysi.
0-10 %:n suhteelliset tasot voidaan määrittää.1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 29
(1) Standardin ISO 5725 mukaisesti.
▼B
2 MÄÄRITELMÄ
Tämän menetelmän mukaisesti määritetty metanolipitoisuus
ilmaistaan metanolin painoprosentteina suhteessa etanoliin tai
2-propanoliin.
3 PERIAATE
Määritys suoritetaan kaasukromatografisesti.
4 REAGENSSIT
Käytetään reagensseja, jotka ovat analyysilaatua.
4.1 Metanoli
4.2 Absoluuttinen etanoli
4.3 2-Propanoli
4.4 Kloroformi, saatu vapaaksi alkoholeista pesemällä vedellä
5 LAITTEET
5.1 Kaasukromatografi, jossa on:
Katarometridetektori aerosolinäytteitä varten,
liekki-ionisaatiodetektori muita kuin aerosolinäytteitä varten.
5.2 Mittapulloja, 100 ml
5.3 Pipettejä, 2 ml, 20 ml, 0-1 ml
5.4 Mikroruiskuja 0-100 µl ja 0-5 µl
ja (vain aerosolinäytteitä varten) erityinen kaasutiivis ruisku,
jossa on luistiventtiili, (ks. näytteenottomenetelmä, kuvio 5)(1).
6 MENETTELY6.1 Näytteen esikäsittely
6.1.1 Aerosolivalmisteiden näytteenotto suoritetaan 22 päivänä joulu-
kuuta 1980(
1) annetun komission direktiivin 80/1335/ETY
liitteessä olevan kappaleen II mukaisesti, minkä jälkeen näytteet
analysoidaan kaasukromatografisesti 6.2.1 kohdassa annettujen
ohjeiden mukaisesti.
6.1.2 Muut kuin aerosolivalmisteet, joiden näytteenotto on suoritettu
edellä mainitun II kappaleen mukaisesti, laimennetaan vedellä
1-2 %:ksi etanolin tai 2-propanolin suhteen, minkä jälkeen ne
analysoidaan kaasukromatografisesti 6.2.2 kohdassa annettujen
ohjeiden mukaisesti.
6.2 Kaasukromatografia
6.2.1 Aerosolinäytteiden analysoinnissa käytetään katarometridetek-
toria.
6.2.1.1 Kolonnin täyte on 10 % Hallcomid M18 Chromosorb WAW
100-200 mesh.
6.2.1.2 Kolonnin erotuskyvyn (R) on oltava joko 1,5 tai suurempi,
jolloin:
R¼2d0R2/C0d0R1
W1þW2
jossa
R1ja R2= kahden piikin retentioaika minuuteissa,
W1ja W2= samojen piikkien puolileveydet millimetreinä,
d′ = piirturin nopeus millimetreinä minuutissa.
6.2.1.3 Tämä resoluutio voidaan saada seuraavissa ajo-olosuhteissa:1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 30
(1) EYVL N:o L 383, 31.12.1980, s. 27
▼B
Kolonnin materiaali: ruostumaton teräs
pituus: 3,5 metriä
halkaisija: 3 mm
Katarometrin siltajännite: 150 mAKantokaasu: helium — paine: 2,5 baaria;
virtaus: 45 ml/min.
Lämpötilat:
injektori: 150 ºC
detektori: 150 ºC
kolonniuuni: 65 ºC
6.2.2 Muut kuin aerosolinäytteet:
6.2.2.1 Kolonni täytetään Chromosorb 105:llä tai Porapak QS:llä ja
käytetään liekki-ionisaatiodetektoria.
6.2.2.2 Kolonnin erotuskyvyn (R) on oltava joko 1,5 tai suurempi,
jolloin:
R¼2
d0R2/C0d0R1Þ
W1þW2
jossa
R1ja R2= kahden piikin retentioaika minuuteissa,
W1ja W2= samojen piikkien puolileveydet millimetreinä,
d′ = piirturin nopeus millimetreinä minuutissa.
6.2.2.3 Tämä resoluutio on saatu seuraavissa ajo-olosuhteissa:
Kolonnin materiaali: ruostumaton teräs
pituus: 2 metriähalkaisija: 3 mm
Potentiometrin herkkyys: 8 × 10
−10A
kantokaasu: typpi — paine: 2,1 baaria;
virtaus: 40 ml/min
muut kaasut: vety — paine: 1,5 baaria;
virtaus: 20 ml/min
Lämpötilat:
injektori: 150 ºCdetektori: 230 ºC
kolonniuuni: 120º-130 ºC
7 STANDARDIKÄYRÄ
7.1 Edellä 6.2.1 kohdassa kuvatussa kaasukromatografiassa (Hall-
comid M 18 -kolonni) käytetään seuraavia standardiseoksia.
Nämä seokset valmistetaan mittaamalla pipeteillä, mutta tarkat
määrät todetaan punnitsemalla välittömästi kunkin lisäyksen
jälkeen pipetti tai pullo.
Suhteellinen vahvuus (m/m
%)Meta-
noli
(ml)Etanoli
tai 2-
propa-
noli
(ml)Täytetty klorofor-
milla tilavuuteen
keskimäärin 2,5 % 0,5 20 100 ml
keskimäärin 5,0 % 1,0 20 100 ml1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 31
▼B
Suhteellinen vahvuus (m/m
%)Meta-
noli
(ml)Etanoli
tai 2-
propa-
noli
(ml)Täytetty klorofor-
milla tilavuuteen
keskimäärin 7,5 % 1,5 20 100 ml
keskimäärin 10,0 % 2,0 20 100 ml
Injektoidaan 2-3 µl kromatografiin 6.2.1 kohdan ajo-olosuhteita
noudattaen.
Lasketaan kunkin seoksen piikkien pinta-alojen suhde (meta-
noli/etanoli) tai (metanoli/2-propanoli). Piirretään
standardikäyrä seuraavasti:
X-akseli: % metanolia suhteessa etanoliin tai 2-propanoliin,
Y-akseli: piikin pinta-alojen suhde (metanoli/etanoli) tai (meta-
noli/2-propanoli).
7.2 Edellä 6.2.2 kohdassa kuvatussa kaasukromatografiassa
(Porapak QS tai Chromosorb 105) käytetään seuraavia standar-
diseoksia. Nämä seokset valmistetaan mittaamalla pipeteillä,
mutta tarkat määrät todetaan punnitsemalla välittömästi kunkin
lisäyksen jälkeen pipetti tai pullo.
Suhteellinen vahvuus (m/m
%)Meta-
noli
(µl)Etanoli
tai 2-
propa-
noli
(ml)Täytetty vedellä
tilavuuteen
keskimäärin 2,5 % 50 2 100 ml
keskimäärin 5,0 % 100 2 100 ml
keskimäärin 7,5 % 150 2 100 ml
keskimäärin 10,0 % 200 2 100 ml
Injektoidaan 2-3 µl kromatografiin 6.2.2 kohdan olosuhteita
noudattaen.
Lasketaan kunkin seoksen piikkien pinta-alojen suhde (meta-
noli/etanoli) tai (metanoli/2-propanoli). Piirretään
standardikäyrä seuraavasti:
X-akseli: % metanolia suhteessa etanoliin tai 2-propanoliin,
Y-akseli: piikin pinta-alojen suhde (metanoli/etanoli) tai (meta-
noli/2-propanoli).
7.3 Standardikäyrän on oltava suora viiva.
8. TOISTETTAVUUS(1)
Metanolipitoisuudella 5 % suhteessa etanoliin tai 2-propanoliin
ei saman näytteen rinnakkaismääritysten tulosten ero saa olla
enempää kuin 0,25 %.1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 32
(1) Standardin ISO 5725 mukaisesti.
▼M1
Lisäys 1
”FRENCH KNITTING”, VALMISTUSOHJE
TARVITTAVAT VÄLINEET
— puupuola:
ulkohalkaisijaltaan 5 cm, jonka keskellä on halkaisijaltaan 1,5 cm:n reikä.
Puolaan laitetaan neljä teräsnaulaa (kuvioiden 1 ja 2 mukaisesti). Kahden
naulan välisen etäisyyden on oltava 1,8 cm ja niiden on oltava 0,5 cm:n
päässä reiästä,
— jäykkä neula (virkkuukoukun tyyppinen) teflonputken pujottamiseksi,— 5 m 1,6 mm:n teflonputkea, sisähalkaisija 0,3 mm.
VALMISTUSTAPA
”French knitting” aloitetaan siten, että teflonputki pujotetaan puolan yläpäästä
alapäähän keskiössä olevan reiän läpi (jätetään n. 10 cm putkea ulos puolan
pohjasta työnnettäväksi ketjun läpi punomisen yhteydessä). Putkea kierretään
neljän naulan ympäri vuoron perään kuvion 3 mukaisesti.
Punoksen ylä- ja alapää varmistetaan metallirenkailla ja ruuveilla. On pidettävä
huoli siitä, että teflon ei murru kiristettäessä. Kierretään putkea kunkin naulan
ympäri toinen kierros ja tehdään ”pistot” seuraavasti:
— nostetaan alempi putki ylemmän putken yli koukulla (ks. kuvio 4). Tämä
toistetaan joka naulan kohdalla järjestyksessä (1, 2, 3, 4 vastapäivään),
kunnes on tehty 5 m tai haluttu pituus punosta.
Putkea jätetään n. 10 cm punoksen sulkemiseksi. Putki pujotetaan kunkin neljän
lenkin läpi ja vedetään varovasti ketjun sulkemiseksi.
Huomaa: Markkinoilla on kolonnin jälkeiseen reaktiokammioon tarkoitettuja
”French knitting” -punoksia myytävänä (Supelco).1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 33
▼M1
Kaaviokuva puolasta
1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 34
▼M1
Lisäys 2
1 = HPLC pumppu (point 5.3.2)
2 = Injektioventtiili (point 5.3.4)
3 = Kolonni ja esikolonni4 = Reagenssipumppu
5 = T-kappale ilman kuollutta tilavuutta
5′= T-kappale (Vortex)
6-6′= Liitos ilman kuollutta tilavuuta
7 = ”Franch knitting”
7′= Reaktiokammio
8 = Kolmikaulapullo, jossa kiehuvaa vetta9 = Pullon lämpöhaude
10 = Jäähdyttäjä
11 = Lammonvaihdinputki ruostumatonta terästä11′= Lämmönvaihdin
12 = UV-näkyvän valon detektori
13 = PCRS 520 kolonninjälkeinen moduuli
5.3.5.
5.3.6.
1982L0434 — FI — 10.04.1990 — 001.001 — 35