1973L0046 — FI — 13.08.1998 — 003.001 — 1
Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentointitarkoituksiin.Toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä.
►B NELJÄS KOMISSION DIREKTIIVI
annettu 5 päivänä joulukuuta 1972
yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten
(73/46/ETY)
(EYVL L 83, 30.3.1973, s. 21)
Muutettu:
virallinen lehti
N:o sivu päivämäärä
►M1Komission direktiivi 81/680/ETY, annettu 30 päivänä heinäkuuta 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Komission direktiivi 92/89/ETY, annettu 3 päivänä marraskuuta 1992 L 344 35 26.11.1992
►M3Komission direktiivi 98/54/EY, annettu 16 päivänä heinäkuuta 1998 L 208 49 24.7.1998
▼B
NELJÄS KOMISSION DIREKTIIVI
annettu 5 päivänä joulukuuta 1972
yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten
(73/46/ETY)
EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka
ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen,
ottaa huomioon yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmistä rehujen
virallista tarkastusta varten 20 päivänä heinäkuuta 1970 annetunneuvoston direktiivin(
1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna 20
päivänä heinäkuuta 1972 annetulla direktiivillä 72/275/ETY(2), ja
erityisesti sen 2 artiklan,
sekä katsoo, että
mainitussa direktiivissä säädetään rehujen virallisen tarkastuksen suorit-
tamisesta yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmiä käyttäen sentarkastamiseksi, että rehujen laatua ja koostumusta koskevat lakien,asetusten ja hallinnollisten määräysten vaatimukset tulevat täytetyksi,
useita yhteisön määritysmenetelmiä on jo vahvistettu 15 kesäkuuta
1971 annetulla direktiivillä 71/250/ETY(
3), 18 päivänä marraskuuta
1971 annetulla direktiivillä 71/393/ETY(4) ja 27 päivänä huhtikuuta
1972 annetulla direktiivillä 72/199/ETY(5); työ on tämän jälkeen edis-
tynyt siinä määrin, että olisi hyväksyttävä neljäs ryhmä menetelmiä, ja
tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän rehukomitean
lausunnon mukaiset,
ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:
1 artikla
Jäsenvaltioiden on vaadittava, että rehujen virallisessa tarkastuksessa
käytettävät eläin- ja kasvirasvojen ja öljyjen kosteus- sekä rehujen
magnesium- ja raakakuitupitoisuusmääritykset suoritetaan tämän direk-tiivin liitteessä I esitettyjen menetelmien mukaisesti.
2 artikla
Jäsenvaltioiden on vaadittava, että rehujen virallisessa tarkastuksessa
käytettävät retinoli- (A-vitamiini) ►M3 ◄pitoisuusmää-
ritykset suoritetaan tämän direktiivin liitteessä II esitettyjenmenetelmien mukaisesti.
3 artikla
Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edel-
lyttämät lait, asetukset tai hallinnolliset määräykset voimaanviimeistään 1 päivänä tammikuuta 1974. Niiden on ilmoitettava tästäkomissiolle viipymättä.1973L0046 — FI — 13.08.1998 — 003.001 — 2
(1) EYVL N:o L 170, 3.8.1970, s. 2
(2) EYVL N:o L 171, 29.7.1972, s. 39
(3) EYVL N:o L 155, 12.7.1971, s. 13
(4) EYVL N:o L 279, 20.12.1971, s. 7
(5) EYVL N:o L 123, 29.5.1972, s. 6▼M1
▼B
▼M1
▼B
▼B
4 artikla
Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.1973L0046 — FI — 13.08.1998 — 003.001 — 3
▼B
LIITE I
1.ELÄIN- JA KASVIRASVOJEN JA ÖLJYJEN KOSTEUDEN
MÄÄRITYS
1.Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää eläin- ja kasvirasvojen ja öljyjen vesi-
pitoisuus ja haihtuvien aineiden pitoisuus.
2.Periaate
Näyte kuivataan vakiopainoon 103 ºC:ssa. Painohäviö määritetään punnitse-
malla.
3.Välineistö
3.1 Korroosionkestävästä materiaalista valmistettu tasapohjainen astia, jonka
läpimitta on 8-9 cm ja jonka korkeuson noin 3 cm.
3.2 Elohopealämpömittari, jossa on vahvistettu säiliö ja yläpäässä oleva
paisuntaputki ja joka on varustettu asteikolla noin 80 ºC:sta ainakin
110 ºC:seen ja jonka pituus on noin 10 cm.
3.3 Hiekkahaude tai sähkölevy.
3.4 Eksikkaattori, joka sisältää tehokasta kuivausainetta.
3.5 Analyysivaaka.
4.Menettely
Punnitaan mg:n tarkkuudella noin 20 g homogenisoitua näytettä kuivaan
punnittuun astiaan (3.1), jossa on lämpömittari (3.2). Näytettä kuumennetaan
hiekkahauteella tai sähkölevyllä (3.3), sekoittaen jatkuvasti lämpömittarilla
niin, että lämpötila saavuttaa 90 ºC:n noin 7 minuutissa.
Lämpöä vähennetään pitäen silmällä lautasen pohjasta nousevien kuplien
syntymisnopeutta. Lämpötila ei saa nousta yli 105 ºC. Sekoitusta jatketaan
astian pohjaa raaputtaen, kunnes kuplien muodostus lakkaa.
Kosteuden täydellisen poistumisen varmistamiseksi kuumennetaan useita
kertoja 103 ± 2 ºC:seen jäähdyttäen peräkkäisten kuumennusten välillä
93 ºC:seen. Sen jälkeen astian sisältöineen annetaan jäähtyä huoneen lämpöti-
laan eksikkaattorissa (3.4) ja punnitaan. Tämä menettely toistetaan niin
monta kertaa, että kahden peräkkäisen punnituksen välinen ero ei ole yli
2 mg:aa.
Huom. Näytteen painon kasvu toistettujen kuumennusten jälkeen viittaa
rasvan hapettumiseen. Tällaisessa tapauksessa tulos lasketaan siitä
punnituksesta, joka on tehty välittömästi ennen kuin paino on alkanut
lisääntyä.
5.Tulosten laskeminen
Kosteuspitoisuus, joka ilmoitetaan prosenttina näytteestä, saadaan kaavasta:
M1/C0M2 ðÞ /C1100
M0
jossa:
M0= näytteen paino grammoina,
M1= astian paino sisältöineen grammoina ennen kuumennusta,
M2= astian paino sisältöineen grammoina kuumennuksen jälkeen.
Tulokset, jotka ovat pienempiä kuin 0,05 %, on varustettava merkinnällä
”alle 0,05 %”.
ToistettavuusSamasta näytteestä suoritetun kahden samanaikaisen rinnakkaismäärityksen
ero ei saa olla yli 0,05 %.1973L0046 — FI — 13.08.1998 — 003.001 — 4
▼B
2.MAGNESIUMIN MÄÄRITYS
— atomiabsorptiospektrofotometrisesti —
1.Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää magnesiumin määrä rehuissa. Se
soveltuu erityisesti alle 5 %:n magnesiumpitoisuuksien määrittämiseen.
2.Periaate
Näyte poltetaan tuhkaksi, joka liuotetaan laimeaan kloorivetyhappoon. Jos
näyte ei sisällä orgaanisia aineita, se liuotetaan suoraan laimeaan kloorivety-
happoon. Liuos laimennetaan ja magnesiumpitoisuus määritetään
atomiabsorptiospektrofotometrisesti 285,2 nm:n aallonpituudella vertaamalla
standardiliuoksiin.
3.Reagenssit
3.1 Kloorivetyhappo, analyysilaatua, tiheys 1,16.
3.2 Väkevä kloorivetyhappo, analyysilaatua, tiheys 1,19.3.3 Magnesiumnauha tai -lanka tai magnesiumsulfaattiheptahydraatti, joka
on kuivattu huoneen lämpötilassa.
3.4 Strontiumsuolaliuos (kloridi tai nitraatti), jonka pitoisuus on 2,5 % (w/v)
strontiumia (= 76,08 g SrCl
2·6H2O, analyysilaatua, tai 60,38 g
Sr(NO3)2, analyysilaatua).
3.5 Magnesiumin standardiliuos: punnitaan mg:n tarkkuudella 1 g magne-
siumia (3.3), josta on tarkoin poistettu siinä ennen ollut oksidikerros, tai
vastaava määrä (10,143 g) magnesiumsulfaattiheptahydraattia (3.3). Siir-
retään se 1 000 ml:n mittapulloon, lisätään 80 ml kloorivetyhappoa (3.1),
annetaan sen liueta ja täytetään 1 000 ml:ksi vedellä. 1 ml tätä liuosta
sisältää 1 000 mg magnesiumia.
4.Välineistö
4.1 Platina-, kvartsi- tai posliinipolttoupokkaita.
4.2 Termostaattisäädöllä varustettu muhveliuuni.
4.3 Atomiabsorptiospektrofotometri.
5.Menettely
5.1 Näyteliuoksen valmistaminen
5.1.1Yksinomaan mineraalipitoisista aineista koostuvat rehut
Punnitaan mg:n tarkkuudella 5 g näytettä 500 ml:n vetoiseen
mittapulloon ja lisätään 250-300 ml vettä. Lisätään 40 ml kloorive-
tyhappoa (3.1), kuumennetaan kiehuvaksi ja annetaan nesteen
kiehua varovasti 30 minuuttia. Annetaan jäähtyä, täytetään merk-
kiin vedellä, sekoitetaan ja suodatetaan kuivaan dekantterilasiin
kuivan laskostetun suodattimen läpi. Heitetään pois ensimmäiset
30 ml suodoksesta. Piin esiintyessä käsitellään 5 g näytettä
riittävällä määrällä (15-30 ml) kloorivetyhappoa (3.2), haihdute-
taan kuivaksi vesihauteella ja viedään yhdeksi tunniksi
lämpökaappiin, jonka lämpötila on 105 ºC. Suoritusta jatketaan
5.1.2 kohdan kolmannesta virkkeestä.
5.1.2Pääasiassa mineraalipitoisista aineksista koostuvat rehut
Punnitaan milligramman tarkkuudella 5 g näytettä upokkaaseen ja
poltetaan näyte tuhkaksi 550 ºC:ssa muhveliuunissa, kunnes
muodostuu tuhkaa, jossa ei ole hiilipitoisia hiukkasia. Annetaan
jäähtyä. Piin poistamiseksi tuhkaan lisätään riittävä määrä (15-
30 ml) kloorivetyhappoa (3.2), haihdutetaan kuivaksi vesihauteella
ja viedään lämpökaappiin 105 ºC:seen yhden tunnin ajaksi.
Jäännös käsitellään 10 ml:lla kloorivetyhappoa (3.1) ja se siirretään
500 ml:n mittapulloon käyttäen lämmintä vettä. Annetaan tämän
jäähtyä ja täytetään pullo vedellä. Sekoitetaan ja suodatetaan
kuivaan astiaan kuivan laskostetun suodatinpaperin läpi. Ensim-
mäiset 30 ml suodosta heitetään pois.
5.1.3Pääasiassa orgaanisista aineista koostuvat rehut
Upokkaaseen punnitaan mg:n tarkkuudella 5 g näytettä ja poltetaan
550 ºC:ssa muhveliuunissa tuhkaksi, jossa ei ole hiilipitoisia
partikkeleita. Tuhka käsitellään 5 ml:lla kloorivetyhappoa (3.2),1973L0046 — FI — 13.08.1998 — 003.001 — 5
▼B
haihdutetaan kuivaksi vesihauteella ja kuivataan tämän jälkeen
yhden tunnin ajan 105 ºC:ssa lämpökaapissa, jotta pii saataisiin
liukenemattomaan muotoon. Tuhka käsitellään 5 ml:lla kloorivety-
happoa (3.1), siirretään 250 ml:n mittapulloon käyttäen lämmintä
vettä, sen lämpötila kohotetaan kiehumispisteeseen, jätetään
jäähtymään ja mittapullo täytetään merkkiin vedellä. Sekoitetaan
ja suodatetaan kuivaan astiaan kuivan laskostetun suodattimen
läpi. Ensimmäiset 30 ml suodoksesta heitetään pois.
5.2Atomiabsorptiomittaus
Laimentamalla standardiliuos (3.5) vedellä valmistetaan ainakin viiden
referenssiliuoksen sarja, joissa pitoisuudet kasvavat suhteessa spektrofo-
tometrin optimaaliseen mittausalueeseen. Kuhunkin liuokseen lisätään
10 ml strontiumsuolaliuosta (3.4) ja tämän jälkeen täytetään 100 ml:ksivedellä. Laimennetaan vedellä 5.1.1, 5.1.2 tai 5.1.3 kohdasta saatua
suodosta siten, että liuoksen magnesiumpitoisuus on referenssiliuosten
konsentraatioiden rajoissa. Tämän liuoksen kloorivetyhappopitoisuus ei
saa ylittää 0,4 N. Lisätään 10 ml strontiumsuolaliuosta (3.4) ja täytetään
pullo 100 ml:ksi vedellä. Määritettävän liuoksen ja referenssiliuosten
absorptio mitataan 285,2 nm:ssa.
6.Tulosten laskeminen
Lasketaan näytteessä olevan magnesiumin määrä suhteessa referenssiliuok-
siin. Tulokset ilmoitetaan prosentteina näytteestä.
ToistettavuusKahden samasta näytteestä suoritetun rinnakkaisen määrityksen tulosten ero
ei saa olla yli 5 % magnesiumin määrästä.
3.RAAKAKUIDUN MÄÄRITYS
1Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää rehuista sen rasvattoman orgaanisen
aineksen määrä, joka ei liukene happo- ja emäsliuokseen. Jäännöstä on peri-
nteisesti kutsuttu raakakuiduksi.
2Periaate
Näyte, josta tarvittaessa on poistettu rasva, käsitellään peräkkäin tietyn
väkevyisillä kiehuvilla rikkihappoja kaliumhydroksidiliuoksilla. Jäännös
erotetaan suodattamalla näyte lasisuodattimella, se pestään, kuivataan, punni-
taan ja poltetaan tuhkaksi 475-500 ºC:ssa. Tuhkaksi poltosta aiheutuva
painohäviö vastaa näytteen raakakuitupitoisuutta.
3Reagenssit
3.1 Rikkihappo, c = 0,13 mol/l
3.2 Kuohunestoaine (esimerkiksi n-oktanoli)3.3 Suodatuksen apuaine (Celite 545 tai vastaava), jota on kuumennettu
500 ºC:n lämpötilassa neljän tunnin ajan (8.6)
3.4 Asetoni
3.5 Petrolieetteri (kiehumispiste 40-60 ºC)
3.6. Suolahappo, c = 0,5 mol/l3.7 Kaliumhydroksidiliuos, c = 0,23 mol/l
4Välineistö
4.1 Lämmityslaitteisto rikkihappoliuoksella tai kaliumhydroksidiliuoksella
tehtävään kuumauuttoon. Lämmityslaitteistoon kuuluu suodatinupokkaan
(4.2) jalusta ja letku, jossa on ilmanpoisto- ja tyhjennysventtiili. Tarvit-
taessa laitteistoon saadaan paineilmaa. Ennen jokaista päivittäistä
käyttöönottoa laitteisto esilämmitetään keittämällä siinä vettä viiden
minuutin ajan.
4.2 Vetoisuudeltaan 50 ml:n suuruinen lasinen suodatinupokas, jossa on
huokoisuudeltaan 40-90 µm:n lasisintterisuodatin. Ennen ensimmäistä
käyttökertaa upokasta kuumennetaan 500 ºC:ssa muutaman minuutin
ajan, ja jäähdytetään (8.6).1973L0046 — FI — 13.08.1998 — 003.001 — 6
▼M2
▼M2
4.3 Vetoisuudeltaan vähintään 270 ml oleva sylinteri, jossa on kiehumisen
kestävä palautusjäähdytin.
4.4 Termostaattisäätöinen lämpökaappi
4.5 Termostaattisäätöinen muhveliuuni
4.6 Uuttoyksikkö, johon kuuluu suodatinupokkaan jalusta (4.2) ja poistoletku,
jossa on ilmanpoisto- ja tyhjennysventtiili
4.7 Osia lämmityslaitteiston (4.1), upokkaan (4.2) ja sylinterin (4.3) kokoami-
seen sekä kylmäuuttoyksikön (4.6) ja upokkaan liittämiseen
5Menettely
Punnitaan 0,001 g:n tarkkuudella 1 g esikäsiteltyä näytettä upokkaaseen (4.2)
(ks. huomautukset 8.1, 8.2, 8.3) ja lisätään 1 g suodatuksen apuainetta (3.3).
Liitetään suodatinupokas lämmityslaitteistoon (4.1), (4.2) ja tämän jälkeen
liitetään sylinteri (4.3) upokkaaseen. Sylinteri-upokasyhdistelmä täytetään
150 ml:lla kiehuvaa rikkihappoa (3.1) ja tarvittaessa lisätään muutama pisara
kuohunestoainetta (3.2). Neste saatetaan kiehuvaksi 5±2 minuutissa ja anne-
taan kiehua voimakkaasti tarkalleen 30 minuuttia.
Säädetään poistoletkun venttiili (4.1), ja suodatetaan rikkihappo tyhjössä
suodatinupokkaan läpi ja pestään jäännös kolme kertaa peräkkäin 30 ml:lla
kiehuvaa vettä huolehtien siitä, että jäännös suodatetaan kuivaksi jokaisen
pesukerran jälkeen.
Suljetaan tyhjennysventtiili, kaadetaan 150 ml kiehuvaa kaliumhydroksidi-
liuosta (3.7) sylinteriupokasyhdistelmään ja lisätään muutama pisara
kuohunestoainetta (3.2). Nesteen lämpötila kohotetaan kiehumispisteeseen
5±2 minuutissa ja annetaan kiehua voimakkaasti tarkalleen 30 minuuttia.
Suodatetaan ja toistetaan pesumenettelyt samalla tavoin kuin rikkihapon
kanssa.
Viimeisen pesun ja kuivauksen jälkeen upokas sisältöineen irrotetaan ja
upokas yhdistetään uudelleen kylmäuuttoyksikköön (4.6). Poistetaan ilma ja
pestään jäännös upokkaassa kolme kertaa peräkkäin 25 ml:lla asetonia (3.4)
huolehtien siitä, että jäännös kuivuu jokaisen pesukerran jälkeen.
Annetaan upokkaan kuivua vakiopainoon lämpökaapissa, jonka lämpötila on
130 ºC. Jokaisen kuivauksen jälkeen jäähdytetään eksikaattorissa ja punnitaan
nopeasti. Upokas asetetaan muhveliuuniin, jossa sen annetaan palaa tuhkaksi
vakiopainoon 475-500 ºC:ssa vähintään 30 minuuttia.
Jokaisen kuumennuksen jälkeen upokkaan annetaan jäähtyä ensin uunissa ja
tämän jälkeen eksikaattorissa ennen punnitusta.
Sokeakoe suoritetaan ilman näytettä. Mineralisoitumisesta johtuva painohäviö
ei saa olla yli 4 mg.
6Tulosten laskeminen
Raakakuitupitoisuus prosentteina näytteestä saadaan seuraavasti:
b/C0c ðÞ /C2 100
a
jossa:
a = näytteen paino grammoina
b = määrityksen aikana näytteen polttamisesta aiheutuva painohäviö gram-
moina
c = sokeakokeessa polttamisesta aiheutuva painohäviö grammoina
7Toistettavuus
Kahden samasta näytteestä suoritetun määrityksen tulosten välinen ero ei saa
olla yli:
— 0,3 itseisarvona, kun raakakuitupitoisuus on alle 10 %:n,
— 3 % suhteessa korkeampaan tulokseen, kun raakakuitupitoisuus on
vähintään 10 %.
8Huomautukset
8.1 Rehuista, jotka sisältävät yli 10 % öljyjä ja rasvoja, on rasva poistettava
ennen määritystä petrolieetterillä (3.5). Liitetään suodatinupokas sisäl-
töineen kylmäuuttoyksikköön (4.6), poistetaan ilma ja pestään jäännös
kolme kertaa 30 ml:lla petrolieetteriä. Varmistetaan, että jäännös on1973L0046 — FI — 13.08.1998 — 003.001 — 7
▼M2
kuiva. Yhdistetään upokas sisältöineen lämmityslaitteistoon (4.1) ja jatke-
taan 5 kohdassa esitetyllä tavalla.
8.2 Rehuista, jotka sisältävät öljyjä ja rasvoja, joita ei voida uuttaa suoraan
petrolieetterillä (3.5), rasva on poistettava 8.1 kohdassa esitetyllä tavalla
ja tämän jälkeen rasva on poistettava vielä uudelleen hapolla kiehutta-
misen jälkeen.
Hapolla kiehuttamisen ja sitä seuraavien pesujen jälkeen upokas sisäl-
töineen yhdistetään kylmäuuttoyksikköön (4.6) ja jäännöstä pestään
kolme kertaa 30 ml:lla asetonia ja tämän jälkeen kolme kertaa 30 ml:lla
petrolieetteriä. Suodatetaan tyhjössä kunnes jäännös on kuiva ja jatketaan
määritystä kaliumhydroksidikäsittelyllä 5 kohdassa esitetyllä tavalla.
8.3 Jos näyte sisältää yli 5 % karbonaatteja kalsiumkarbonaattina ilmaistuna,
upokas (4.2) yhdistetään punnittuine näytteineen lämmityslaitteistoon
(4.1). Näyte pestään kolme kertaa 30 ml:lla suolahappoa (3.6). Jokaisen
lisäämiskerran jälkeen odotetaan noin yksi minuutti ennen suodatuksen
aloittamista. Näyte pestään kerran 30 ml:lla vettä ja tämän jälkeen jatke-
taan 5 kohdassa esitetyllä tavalla.
8.4 Jos käytetään hyllymuotoista laitteistoa (useita upokkaita on liitetty
samaan lämmityslaitteistoon), kahta koetta samasta näytteestä ei saa suor-
ittaa samalla kertaa.
8.5 Jos kiehuttamisen jälkeen happo- ja emäsliuosten suodatus osoittautuu
vaikeaksi, käytetään lämmityslaitteiston tyhjennysletkun kautta saatavaa
paineilmaa ja tämän jälkeen jatketaan suodatusta.
8.6 Polttolämpötila ei saisi ylittää 500 ºC:tta lasisten suodatinupokkaiden
käyttöiän pidentämiseksi. Kuumennus- ja jäähdytysjaksojen aikana on
vältettävä suuria lämpötilanvaihteluita.1973L0046 — FI — 13.08.1998 — 003.001 — 8
▼B
LIITE II
1.RETINOLIN (A-VITAMIININ) MÄÄRITYS
1.Tarkoitus ja soveltamisala
Menetelmällä on mahdollista määrittää retinolin (A-vitamiinin) määrä
rehuissa, konsentraateissa ja esiseoksissa. Määrityksen alaraja on 10 000 ky/kg suuria väriainemääriä sisältävissä rehuissa ja 4 000 ky/kg muissa tapauk-
sissa(
1). Tuotteet luokitellaan kahteen ryhmään niiden oletetun
retinolipitoisuuden perusteella:
A-ryhmä: pitoisuus alle 200 000 ky/kg;
B-ryhmä: pitoisuus vähintään 200 000 ky/kg.
2.Periaate
Näyte hydrolysoidaan kuumassa kaliumhydroksidi-etanoli-liuoksessa ja anti-
oksidantin läsnäollessa tai typpiatmosfäärissä. Seos uutetaan 1,2-
dikloorietaanilla. Uute haihdutetaan kuivaksi ja käsitellään petrolieetterillä.
Liuokselle suoritetaan kromatografia aluminiumoksidipylväässä (B-ryhmän
tuotteilletarvitaan kromatografia vain tietyissä tapauksissa). A-ryhmän retino-
lipitoisuus määritetään mittaamalla Carr-Price-reaktion perusteella
muodostunut värillinen kompleksi spektrofotometrisesti 610 nm:ssä; B-
ryhmän retinoli määritetään spektrofotometrisesti UV:ssa 325 nm:ssä.
3.Reagenssit
a)A- ja B-ryhmän tuotteiden analysoimiseksi käytetyt reagenssit
3.1 96 % (v/v) etanoli3.2 10 % (w/v) natriumaskorbaattiliuos, analyysilaatua, tai3.3 puhdistettu typpi.
3.4 50 % (w/v) kaliumhydroksidiliuos, analyysilaatua.
3.5 1 N kaliumhydroksidiliuos, analyysilaatua.3.6 0,5 N kaliumhydroksidiliuos, analyysilaatua.3.7 1,2-dikloorietaani, analyysilaatua.3.8 Petrolieetteri, kiehumisväli 30-50 ºC. Puhdistetaan tarvittaessa seur-
aavasti: sekoitetaan 1 000 ml:aan petrolieetteriä 20 ml eriä väkevää
rikkihappoa, kunnes happo pysyy värittömänä. Poistetaan happo ja
pestään petroolieetteri 500 ml:lla vettä, sitten kaksi kertaa 250 ml:lla
10-%:ista (w/v) natriumhydroksidiliuosta ja lopuksi kolme kertaa
500 ml:lla vettä. Poistetaan vesifaasi, petrolieetteri kuivataan yhden
tunnin ajan aktiivihiilen ja vedettömän natriumsulfaatin päällä,
suodatetaan ja tislataan.
3.9 Aluminiumoksidi, joka on standardoitu Brockmannin mukaan:
hehkutetaan kahdeksan tunnin ajan 750 ºC:ssa, jäähdytetään eksik-
kaattorissa ja säilytetään ruskeassa hioslasipullossa. Ennen
käyttöönottoa punnitaan ruskeaan pulloon 10 g aluminiumoksidia ja
0,7 ml vettä, suljetaan tulpalla, ja pulloa kuumennetaan viiden
minuutin ajan kiehuvalla vesihauteella ravistellen. Annetaan
jäähtyä. Todennetaan näin valmistetun alumiinin aktiivisuus suoritta-
malla tunnetulle retinolimäärälle (3.17) (noin 500 ky) 5.3 ja 5.4
kohdan mukaiset vaiheet.
3.10 Emäksinen aluminiumoksidi, aktiivisuusaste 1 (Woelm, Merck tai
vastaava).
3.11 Puhdas dietyylieetteri. Poistetaan peroksidit ja jäljellä oleva vesi
kromatografisesti emäksisessä aluminiumoksidipylväässä (3.10)
(25 g aluminiumoksidia 250 ml:n dietyylieetterierää kohti).
3.12 Petrolieetteriliuokset (3.8), joissa on 4, 8, 12, 16 ja 20 % (v/v)
dietyylieetteriä (3.11).
3.13 0,5 M natriumsulfidiliuos 70 % (v/v) glyseriinissä, valmistettu
analyysilaatua olevasta natriumsulfidista.1973L0046 — FI — 13.08.1998 — 003.001 — 9
(1) 1 ky = 0,3 µg retinolia.
▼B
b)yksinomaan A-ryhmän tuotteiden määrittämiseen käytetyt reagenssit
3.14 Bentseeniä, analyysilaatua.
3.15 Kloroformi, analyysilaatua. Poistetaan etanoli, fosgeeni ja jäljellä
oleva vesi kromatografisesti emäksisessä aluminiumoksidipylväässä
(3.10) (50 g aluminiumoksidia 200 ml kloroformia kohti; on suosi-
teltavaa kromatografoida eluaatin ensimmäinen 50 ml toisen kerran).
3.16 Carr-Price-reagenssi: sekoitetaan noin 25 g antimonitrikloridia,
analyysilaatua (jota on säilytetty eksikkaattorissa), 100 ml:aan klor-
oformia (3.15) kunnesliuoson kylläis tä. Pieni
antimonitrikloridisakka ei aiheuta vaikeuksia. Lisätään 2 ml etikka-
happoanhydridiä analyysilaatua. Seos säilytetään jääkaapissa
ruskeassa hioslasipullossa. Liuosta voidaan säilyttää useita viikkoja.
3.17 Retinoli - standardoitu spektrofotometrisesti.
c)yksinomaan B-ryhmän tuotteiden määrittämiseen käytetyt reagenssit
3.18 Isopropanoli, kromatografiaa varten.
4.Välineistö
4.1 Vesihaude.
4.2 Tyhjiöhaihdutuslaitteisto varustettuna eri kokoisilla pyöreäpohjaisilla
kolveilla.
4.3 Lasista valmistettuja kromatografiaputkia (pituus 300 mm; sisäläpimitta
noin 13 mm).
4.4 Spektrofotometri, jossa käytetään 10 mm:n kyvettejä. UV-alueella suori-
tettavissa mittauksissa käytetään kvartsikyvettejä.
4.5 UV-lamppuja, jotka soveltuvat käyttöön 365 nm:ssä.
5.Menettely
Huom: Kaikki vaiheet on suoritettava suoralta valolta suojattuna tarvittaessa
ruskeasta lasista valmistetuissa välineissä.
5.1Tutkittava näyte
Punnitaan hienoksi jauhetusta näytteestä otaksutun retinolipitoisuuden
perusteella
0,1-1,0 g konsentraattia (pitoisuus suurempi kuin 20 000 ky/g);
3,0-5,0 g esiseosta (sisältää noin 400-20 000 ky/g);
10-20 g mineraaliseosta;
30 g A-ryhmän tuotteita
Tutkittava näyte laitetaan välittömästi 500 ml:n hiostulpalliseen pulloon.
5.2Hydrolyysi ja uutto (1)
Näytteeseen lisätään ensin 40 ml etanolia (3.1), sitten 2 ml natriumaskor-
baattiliuosta (3.2)(2), 10 ml kaliumhydroksidiliuosta (3.4) ja lopuksi 2 ml
natriumsulfidiliuosta (3.13).
Refluksoidaan 30 minuuttia 70-80 ºC:ssa ja annetaan seoksen jäähtyä
virtaavassa vedessä. Lisätään 50 ml etanolia (3.1) ja 100 ml 1,2-dikloor-
ietaania (3.7) pipetoimalla. Ravistetaan voimakkaasti ja supernatantti
dekantoidaan dekantterilasiin. Lisätään dekantterilasiin 150 ml kaliumhy-
droksidiliuosta (3.5), ravistellaan 10 sekuntia ja annetaan seoksen seistä,
kunneskerroks et ovat erottuneet. Otetaan dikloorietaanikerros(alempi
kerros) dekantointisäiliöön, lisätään 40 ml kaliumhydroksidiliuosta (3.6),
ravistellaan 10 sekunnin ajan ja annetaan tämän seistä, kunnes kerrokset
ovat erottuneet. Otetaan dikloorietaanikerrostalteen dekantointis äiliöön
ja pestään 6-8 kertaa 40 ml:n erillä vettä, kunnes tämä on vapaa alkalista
(fenoliftaleiinitesti). Dikloorietaanikerros otetaan talteen ja loput jäljelle
jääneestä vedestä poistetaan suodatinpaperilla.1973L0046 — FI — 13.08.1998 — 003.001 — 10
(1) Maitotuotteiden ja sellaisten tuotteiden osalta, joilla on taipumusta muodostaa kokkar-
eita tai turvota, kaksinkertaistetaan 5 artiklan 2 kohdan, 1 ja 2 alakohdassa, esitettyjen
reagenssien määrät.
(2) Natriumaskorbaattia ei tarvitse lisätä suoritettaessa hydrolyysi typpiatmosfäärissä.
▼B
Erä liuosta haihdutetaan kuivaksi tyhjiössä käyttäen vesihaudetta, jonka
lämpötila on 40 ºC. Jäännös käsitellään nopeasti 5 ml:lla petrolieetteriä
(3.8).
A-ryhmän tuotteiden osalta kromatografia suoritetaan 5.3.1 kohdan
mukaan.
B-ryhmän tuotteiden osalta liuoss iirretään 50 ml:n mittapulloon,
täytetään merkkiin petrolieetterillä (3.8), sekoitetaan ja mitataan optinen
tiheys5.4.2 kohdan mukaan.
5.3Kromatografia
5.3.1A-ryhmän tuotteet
Kromatografiaputki (4.3) täytetään 200 mm:n korkeuteen 10 g:lla
aluminiumoksidia (3.9), joka on aiemmin lietetty petrolieetteriin
(3.8). Putkeen pipetoidaan 5.2 kohdassa saatu liuos, ja tähän
lisätään välittömästi 20 ml petrolieetteriä (3.8). Eluoidaan
peräkkäin 10 ml:n erilläpetrolieetteriä, joissa on 4, 8, 12, 16 ja
20 % dietyylieetteriä (3.12), joko normaalipaineessa tai alipai-
neessa virtausnopeuden ollessa 2-3 pisaraa sekunnissa.
Karoteeni eluoituu ensin(1). Retinoli eluoituu tavallisesti petrolieet-
teriliuoksella, jossa on 20 % dietyylieetteriä (3.12). Eluoitumista
seurataan UV-valossa (pylvään säteilytys lyhyesti elohopealam-
pulla). Fluoresoiva retinolivyöhyke erottuu selvästi keltaisista
ksantofyllivyöhykkeistä, jotka tulevat tämän jälkeen. Retinolia
sisältävä eluoitunut fraktio otetaan talteen erlenmeyerpulloon.
5.3.2B-ryhmän tuotteet
Kromatografointi on suoritettava vain, jos 5.4.2 kohdassa saadut
optisen tiheyden mittaukset eivät ole 5.4.2 kohdassa esitettyjen
vaatimusten mukaisia.
Jos kromatografointi osoittautuu tarpeelliseksi, kromatografia-
pylvääseen pipetoidaan erä petrolieetteriin valmistettua liuosta,
joka on saatu 5.2 kohdassa ja joka sisältää noin 500 k.y. retinolia,
ja kromatografointi suoritetaan kuten 5.3.1 kohdassa esitetään.
5.4Optisen tiheyden mittaus
5.4.1A-ryhmän tuotteet
Eluaatti, joka sisältää 5.3.1 kohdan mukaisesti saadun retinolin,
haihdutetaan kuivaksi tyhjiössä. Jäännös käsitellään 2 ml:lla bent-
seeniä (3.14). Tästä liuoksesta otetaan 0,3 ml:a ja siihen lisätään
3 ml Carr-Price-reagenssia (3.16). Tästä kehittyy sininen väri.
Optinen tiheys mitataan spektrofotometrillä 610 nm:ssä tarkalleen
30 sekuntia reaktion alkamisesta. Retinolipitoisuus määritetään
standardikäyrän avulla, joka on saatu nousevia retinolistandardipi-
toisuuksia sisältävien bentseeniliuoksien perusteella.
Bentseeniliuokset on käsitelty Carr-Price-reagenssilla (2-16 IU reti-
nolistandardia (3.17), 0,3 ml:ssa bentseeniä (3.14) + 3 ml:ssa Carr-
Price-reagenssia (3.16)). Standardikäyrä on tarkistettava säännölli-
sesti ja usein käyttäen standardia ja juuri valmistettua Carr-Price-
reagenssiliuosta.
5.4.2B-ryhmän tuotteet
Otetaan erä 5.2 kohdan mukaisesti saatua petrolieetteriin valmis-
tettua liuosta, joka sisältää noin 200 ky retinolia. Tämä
haihdutetaan kuivaksi tyhjiössä ja jäännös käsitellään 25 ml:lla
isopropanolia (3.18). Optinen tiheys mitataan spektrofotometrissä
325, 310 ja 334 nm:ssä. Absorptiomaksimi sijaitsee 325 nm:ssä.
Liuoksen retinolipifoisuus lasketaan seuraavasti:
E325· 18,30 = ky retinolia/ml
Kuitenkin on optisten tiheyksien suhteiden
E310:E325ja E334:E325
oltava 6 : 7 = 0,857.1973L0046 — FI — 13.08.1998 — 003.001 — 11
(1) Karoteenipitoisuus voidaan määrittää mittaamalla optinen tiheys 450 nm:ssä;
E1%
1c m¼2600 :
▼B
Jos jokin näistä suhteista eroaa huomattavasti tästä arvosta (< 0,830
tai > 0,880), on ennen optisten tiheyksien mittausta suoritettava
kromatografointi 5.3.2 kohdassa esitetyn menetelmän mukaisesti.
Jos kromatografoinnin jälkeen suoritettava optisten tiheyksien
mittaus osoittaa, että edellä mainitut suhteet vielä eroavat huomat-
tavasti arvosta 0,857 (< 0,830 tai > 0,880), on mittaus suoritettava
A-ryhmän tuotteille annetun menetelmän mukaisesti.
6.Tulosten laskeminen
Näytteen retinolipitoisuus lasketaan huomioiden tutkittavan näytteen paino ja
määrityksen kuluessa suoritetut laimennukset. Tulokset ilmoitetaan ky:nä
retinolia rehukiloa kohti tai konsentraatti- tai esiseoskiloa kohti.
ToistettavuusKahden samasta näytteestä suoritetun rinnakkaismäärityksen tuloksen välinen
ero ei saa olla yli:
— 20 % retinolin määristä, jotka ovat alle 75 000 ky/kg;
— 15 000 ky, kun pitoisuudet ovat välillä 75 000-150 000 ky/kg;— 10 % retinolin määristä, jotka ovat välillä 150 000-250 000 ky/kg;— 25 000 ky, kun pitoisuudet ovat välillä 250 000-500 000 ky/kg;— 5 % retinolin määristä, jotka ovat suurempia kuin 500 000 ky/kg.1973L0046 — FI — 13.08.1998 — 003.001 — 12
▼M3