2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 1
Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentointitarkoituksiin.Toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä.
►B KOMISSION PÄÄTÖS,
tehty►C1 14 päivänä elokuuta 2002 ◄,
neuvoston direktiivin 96/23/EY täytäntöönpanosta määritysmenetelmien suorituskyvyn ja tulosten
tulkinnan osalta
(tiedoksiannettu numerolla K(2002) 3044)
(ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)
(2002/657/EY)
(EYVL L 221, 17.8.2002, s. 8)
Muutettu:
virallinen lehti
N:o sivu päivämäärä
►M1Komission päätös 2003/181/EY, tehty 13 päivänä maaliskuuta 2003 L 71 17 15.3.2003
Oikaistu:
►C1Oikaisu, EYVL L 239, 6.9.2002, s. 66 (2002/657/EY)
▼B
KOMISSION PÄÄTÖS,
tehty►C1 14 päivänä elokuuta 2002 ◄,
neuvoston direktiivin 96/23/EY täytäntöönpanosta määritysmene-
telmien suorituskyvyn ja tulosten tulkinnan osalta
(tiedoksiannettu numerolla K(2002) 3044)
(ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)
(2002/657/EY)
EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka
ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen,
ottaa huomioon elävissä eläimissä ja niistä saatavissa tuotteissa olevien
tiettyjen aineiden ja niiden jäämien osalta suoritettavista tarkastustoi-menpiteistä ja direktiivien 85/358/ETY ja 86/469/ETY sekä päätösten
89/187/ETY ja 91/664/ETY kumoamisesta 29 päivänä huhtikuuta
1996 annetun neuvoston direktiivin 96/23/EY (
1) ja erityisesti sen 15
artiklan 1 kohdan toisen kappaleen,
sekä katsoo seuraavaa:
(1)Eläimistä saatavissa tuotteissa olevat jäämät ovat kansantervey-
dellinen ongelma.
(2)Eräiden elävistä eläimistä ja eläintuotteista seurattavien aineidenja niiden jäämien määrittämistä varten tehtävää virallista näyttee-nottoa koskevista yksityiskohtaisista säännöistä 23 päivänähelmikuuta 1998 tehdyssä komission päätöksessä 98/179/EY (
2)
säädetään, että näytteitä saavat analysoida ainoastaan sellaiset
laboratoriot, joille toimivaltainen viranomainen on myöntänytluvan virallista jäämävalvontaa varten.
(3)Virallista jäämävalvontaa varten hyväksyttyjen laboratorioidentuottamien määritystulosten laatu ja vertailtavuus on varmistet-tava. Tähän olisi päästävä käyttämällälaadunvalvontajärjestelmiä ja erityisesti soveltamalla yhteistenmenettelyjen ja suorituskykyvaatimusten mukaisesti validoituja
menetelmiä ja varmistamalla jäljitettävyys yleisiin standardeihin
tai yhteisesti sovittuihin standardeihin.
(4)Virallista elintarvikkeiden tarkastusta koskevista lisätoimenpi-teistä 29 päivänä lokakuuta 1993 annetussa neuvostondirektiivissä 93/99/ETY (
3) ja komission päätöksessä 98/179/EY
vaaditaan, että viralliset valvontalaboratoriot on akkreditoitavaISO-standardin 17025 (1) mukaisesti tammikuusta 2002 alkaen.Päätöksen 98/179/EY mukaan hyväksyttyjen laboratorioiden on
oltava mukana kansainvälisesti tunnustetussa ulkopuolisessa
laadunarviointi- ja akkreditointiohjelmassa. Hyväksyttyjen labor-atorioiden on lisäksi osoitettava pätevyytensä osallistumallasäännöllisesti ja menestyksekkäästi kansallisten vertailulaborator-ioiden tai yhteisön vertailulaboratorioiden tunnustamiin taijärjestämiin asianmukaisiin kelpoisuuden testausohjelmiin.
(5)Yhteisön vertailulaboratorioiden, kansallisten vertailulaborator-ioiden ja kansallisten valvontalaboratorioiden verkko toimii
direktiivin 96/23/EY nojalla, ja sen tarkoituksena on parantaa
koordinointia.
(6)Direktiivin 96/23/EY antamisen jälkeen analyyttinen kemia onkehittynyt niin paljon, että rutiinimenetelmien ja vertailumenetel-mien käsite on vanhentunut. Se on korvattusuorituskykyperusteita soveltavalla lähestymistavalla, jossavahvistetaan seulonta- ja varmistusmenetelmien validointiperus-teet ja -menettelyt.2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 2
(1) EYVL L 125, 23.5.1996, s. 10.
(2) EYVL L 65, 5.3.1998, s. 31.
(3) EYVL L 290, 24.11.1993, s. 14.
▼B
(7)Virallisten valvontalaboratorioiden testitulosten tulkintaa varten
on sovittava yhteisistä perusteista, jotta voidaan varmistaa
neuvoston direktiivin 96/23/EY yhdenmukainen täytäntöönpano.
(8)On säädettävä määritysmenetelmän suorituskykyä koskevienvähimmäisvaatimusten (minimum required performance limits,MRPL) asteittaisesta vahvistamisesta aineille, joille ei olevahvistettu sallittuja raja-arvoja, ja erityisesti aineille, joiden
käyttö yhteisössä ei ole sallittua tai on erityisesti kielletty.
Tämän tarkoituksena on varmistaa neuvoston direktiivin 96/23/EY yhdenmukainen täytäntöönpano.
(9)Raskasmetallien ja arsenikin jäämien havaitsemiseksi käytettä-vistä vertailumenetelmistä 26 päivänä syyskuuta 1990 tehtyä
komission päätöstä 90/515/ETY (
1), vaikutukseltaan hormonaa-
listen tai tyrostaattisten aineiden jäämien määritysmenetelmistä14 päivänä huhtikuuta 1993 tehtyä päätöstä 93/256/ETY (
2)j a
jäämien havaitsemiseksi käytettävistä vertailumenetelmistä jakansallisten vertailulaboratorioiden luettelosta 15 päivänä huhti-kuuta 1993 tehtyä komission päätöstä 93/257/ETY (
3), sellaisena
kuin se on viimeksi muutettuna päätöksellä 98/536/EY (4), on
tarkasteltu uudelleen tieteellisen ja teknisen tiedon kehityksenhuomioon ottamiseksi. Niiden soveltamisala ja säännökset onhavaittu vanhentuneiksi, ja ne olisi näin ollen kumottava tälläpäätöksellä.
(10)Olisi säädettävä siirtymäkaudesta, jotta virallisten näytteidenmääritysmenetelmät voitaisiin mukauttaa tämän päätöksensäännösten mukaisesti.
(11)Tässä päätöksessä säädetyt toimenpiteet ovat elintarvikeketjua jaeläinten terveyttä käsittelevän pysyvän komitean lausunnonmukaiset,
ON TEHNYT TÄMÄN PÄÄTÖKSEN:
1 artikla
Aihe ja soveltamisala
Tässä päätöksessä säädetään määritysmenetelmien käyttämisestä direk-
tiivin 96/23/EY 15 artiklan 1 kohdan toisen virkkeen mukaisestiotettujen virallisten näytteiden testauksessa ja vahvistetaan yhteiset
perusteet virallisissa valvontalaboratorioissa kyseisistä näytteistä
saatujen määritystulosten tulkitsemiseksi.
Tätä päätöstä ei sovelleta aineisiin, joista on annettu tarkempia
säännöksiä yhteisön muussa lainsäädännössä.
2 artikla
Määritelmät
Tässä päätöksessä sovelletaan neuvoston direktiivissä 96/23/EY ja
tämän päätöksen ►
M1liitteessä I ◄annettuja määritelmiä.
3 artikla
Määritysmenetelmät
Jäsenvaltioiden on varmistettava, että direktiivin 96/23/EY mukaisesti
otetut viralliset näytteet analysoidaan menetelmillä, jotka
a) on dokumentoitu mieluiten ISO-standardin 78-2 (6) mukaisissa
testausohjeissa;2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 3
(1) EYVL L 286, 18.10.1990, s. 33.
(2) EYVL L 118, 14.5.1993, s. 64.
(3) EYVL L 118, 14.5.1993, s. 75.
(4) EYVL L 251, 11.9.1998, s. 39.
▼B
b) ovat tämän päätöksen ►M1liitteessä I ◄olevan 2 osan
säännösten mukaisia;
c) on validoitu tämän päätöksen ►M1liitteessä I ◄olevassa 3
osassa selostettujen menettelyjen mukaisesti;
d) ovat 4 artiklan mukaisesti vahvistettavien asiaankuuluvien suoritus-
kykyä koskevien vähimmäisvaatimusten (MPRL) mukaisia.
4 artikla
Suorituskykyä koskevat vähimmäisvaatimukset
Jäsenvaltioiden on varmistettava, että seuraavien aineiden havaitsemi-
sessa käytetyt analyyttiset menetelmät vastaavat liitteessä II säädettyjämääritysmenetelmän suorituskykyä koskevia vähimmäisvaatimuksia(minimum required performance limits, MRPL) kyseisessä liitteessätarkoitettujen matriisien mukaisesti:
a) kloramfenikoli
b) nitrofuraanin aineenvaihduntatuotteet
c) medroksiprogesteroniasetaatti
5 artikla
Laadunvalvonta
Jäsenvaltioiden on varmistettava direktiivin 96/23/EY mukaisesti otet-
tujen näytteiden määritystulosten laatu, erityisesti seurantatesteillä ja/tai kalibrointituloksilla ISO-standardin 17025 (1) luvun 5.9 mukaisesti.
6 artikla
Tulosten tulkinta
1. Määritystulosta on pidettävä vaatimusten vastaisena, jos ylitetään
analyytin varmistusmenetelmässä määritelty päätöksentekoon oikeut-tava raja.
2. Jos aineelle on vahvistettu sallittu raja-arvo, päätösraja on se
konsentraatio, jonka yläpuolella voidaan päättää tilastollisella varmuu-della 1 – α,että sallittu raja on todella ylitetty.
3. Jos aineelle ei ole vahvistettu sallittua raja-arvoa, päätösraja on
alin konsentraatio, jolla menetelmä pystyy erottamaan tilastollisellavarmuudella 1 – α,että kyseistä analyyttiä on näytteessä.
4. Direktiivin 96/23/EY liitteessä I olevassa A ryhmässä mainituilla
aineilla α-virhe saa olla enintään 1 %. Kaikilla muilla aineilla α-virhe
saa olla enintään 5 %.
7 artikla
Kumoaminen
Kumotaan päätökset 90/515/ETY, 93/256/ETY ja 93/257/ETY.
8 artikla
Siirtymäsäännökset
Direktiivin 96/23/EY liitteessä I olevassa A ryhmässä mainituille
aineille saa käyttää virallisten näytteiden määritysmenetelmiä, jotkatäyttävät päätöksessä 90/515/ETY, 93/256/ETY ja 93/257/ETY asetetut
perusteet, enintään kaksi vuotta tämän päätöksen voimaantulon jälkeen.
Direktiivin 96/23/EY liitteessä I olevassa B ryhmässä mainituilleaineille nykyisin käytettävien menetelmien on oltava tämän päätöksenmukaisia viimeistään viisi vuotta tämän päätöksen soveltamispäivänjälkeen.2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 4
▼M1
▼B
▼B
9 artikla
Soveltamispäivä
Tätä päätöstä sovelletaan 1 päivästä syyskuuta 2002.
10 artikla
Osoitus
Tämä päätös on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 5
▼B
LIITEI
MÄÄRITYSMENETELMIÄ KOSKEVAT SUORITUSKYKYVAATI-
MUKSET, MUUT VAATIMUKSET JA MENETTELYT
1MÄÄRITELMÄT
1.1 (Menetelmän) tarkkuus: Testituloksen ja hyväksytyn vertailuarvon (2)
välisen eron suuruus. Sen määrittävät oikeellisuus ja täsmällisyys (tois-
totarkkuus).
1.2 Alfa ( α)-virhe: Todennäköisyys, että testattu näyte on vaatimustenmu-
kainen, vaikka mittaustulos osoittaa, että se olisi vaatimustenvastainen
(”väärä päätös vaatimustenvastaisuudesta”).
1.3 Analyytti: Aine, joka on osoitettava, tunnistettava ja/tai kvantifioitava,
sekä sen määrityksen aikana muodostuvat johdokset.
1.4 Beeta ( β)-virhe: Todennäköisyys, että testattu näyte on oikeasti vaati-
mustenvastainen, vaikka mittaustulos osoittaa, että se olisi
vaatimustenmukainen (”väärä päätös vaatimustenmukaisuudesta”).
1.5 Systemaattinen virhe: Odotetun testituloksen ja hyväksytyn vertai-
luarvon (2) välisen eron suuruus.
1.6 Kalibrointistandardi: Mittauksessa käytettävä standardi, jonka avulla
voidaan mitattavan aineen määrä määrittää siten, että se voidaan laskea
vertailuaineen perusteella.
1.7 Sertifioitu vertailumateriaali (CRM): Materiaali, jolla on ilmoitettu
olevan tietty analyyttipitoisuus.
1.8 Yhteiskromatografia: Menetelmä, jossa uute jaetaan kahteen osaan
ennen kromatografointia. Toinen osanäyte kromatografoidaan sellaise-
naan. Toinen osa sekoitetaan standardianalyytin kanssa, joka on
tarkoitus mitata. Tämä seos kromatografoidaan myös. Lisätyn standar-
dianalyytin määrän on oltava samanlainen kuin uutteen sisältämän
tutkittavan analyytin arvioitu määrä. Menetelmä on suunniteltu paranta-
maan analyytin tunnistusta käytettäessä kromatografisia menetelmiä,
erityisesti kun sopivaa sisäistä standardia ei ole käytettävissä.
1.9 Kollaboraatiotutkimus: Sama näyte analysoidaan samalla menetelmällä
menetelmän suorituskykyarvojen määrittämiseksi. Tutkimus kattaa
mittauksen satunnaisvirheen ja laboratorion systemaattisen virheen.
1.10 Varmistusmenetelmä: Menetelmä, jolla saadaan täydelliset tiedot tai
täydentäviä tietoja, joiden avulla aine voidaan tunnistaa yksiselitteisesti
ja tarvittaessa kvantifioida tietyllä tasolla.
1.11 Päätösraja (CC α):Raja, jonka kohdalla ja yläpuolella voidaan päätellä
virhetodennäköisyydellä α,että näyte on vaatimustenvastainen.
1.12 Osoituskyky (CC β):Pienin ainepitoisuus, joka voidaan osoittaa,
tunnistaa ja/tai kvantifioida näytteessä virhetodennäköisyydellä ß.
Aineille, joille ei ole vahvistettu sallittua rajaa, osoituskyky on alhaisin
konsentraatio, jolla kyseinen menetelmä pystyy osoittamaan oikeasti
kontaminoidut näytteet tilastollisella varmuudella 1 – β.Josaineille on
vahvistettu sallittu raja, tämä merkitsee, että osoituskyky on se konsen-
traatio, jolla kyseinen menetelmä pystyy osoittamaan sallitut
rajakonsentraatiot tilastollisella varmuudella 1 – β.
1.13 Väkevöity näytemateriaali: Näyte, johon on lisätty tunnettu määrä osoi-
tettavaa analyyttiä.
1.14 Laboratorioidenvälinen tutkimus (vertailu): Kaksi tai useampi laborator-
iota järjestää, suorittaa ja arvioi samasta näytteestä tehdyt testaukset,
jotka tehdään ennaltamäärätyissä olosuhteissa. Tarkoituksena on
määrittää testin suorituskyky. Tarkoituksen mukaan tutkimus voidaan
luokitella kollaboraatiotutkimukseksi tai pätevyystutkimukseksi.
1.15 Sisäinen standardi (IS): Aine, jota näyte ei sisällä ja jonka fysikaalis-
kemialliset ominaisuudet ovat mahdollisimman samankaltaiset tunnistet-
tavan analyytin kanssa. Tätä ainetta lisätään jokaiseen näytteeseen ja
jokaiseen kalibrointistandardiin.
1.16 Laboratorionäyte: Laboratorioon lähetettäväksi valmistettu näyte, joka
on tarkoitustutkia tai tes tata.
1.17 Tietty taso: Näytteessä olevan aineen tai analyytin pitoisuus, joka on
merkityksellinen sen kannalta, onko aine lainsäädännön vaatimusten
mukainen.2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 6
▼B
1.18 Suorituskykyä koskeva vähimmäisvaatimus (MPRL): Pienin näytteessä
oleva analyyttipitoisuus, joka on ainakin voitava osoittaa ja varmistaa.
Aineille, joille ei ole vahvistettu sallittuja rajoja, on tarkoitus yhdenmu-
kaistaa menetelmien analyyttistä suorituskykyä koskevat vaatimukset.
1.19 Suorituskykyarvo: Funktionaalinen ominaisuus, jonka voidaan katsoa
liittyvän kyseiseen analyyttiseen menetelmään. Se voi olla esimerkiksi
spesifisyys, tarkkuus, oikeellisuus, täsmällisyys, toistettavuus, uusitta-
vuus, saanto, osoituskyky ja häiriönkestävyys (olosuhdeherkkyys).
1.20 Suorituskykyvaatimukset: Suorituskykyarvoja koskevat vaatimukset,
joiden perusteella voidaan päätellä, että kyseinen analyyttinen mene-
telmä sopii tarkoitukseen ja tuottaa luotettavia tuloksia.
1.21 Sallittu raja(-arvo): Jäämien enimmäisraja, enimmäistaso tai muu enim-
mäistoleranssi, joka on vahvistettu muualla yhteisön lainsäädännössä.
1.22 Täsmällisyys (toistotarkkuus): Ennaltamäärätyissä olosuhteissa saatujen
toisistaan riippumattomien testitulosten eron suuruus. Täsmällisyysilmaistaan tavallisesti epätäsmällisyytenä ja se lasketaan testituloksen
keskihajontana. Suuri keskihajonta merkitsee vähäistä täsmällisyyttä (2).
1.23 Pätevyystutkimus: Sama näyte analysoidaan siten, että laboratoriot
saavat itse valita menetelmänsä, kunhan menetelmiä käytetään rutiinio-
losuhteissa. Tutkimuksessa on noudatettava ISO-ohjetta 43-1 (3) ja 43-
2 (4) ja sen avulla voidaan arvioida menetelmien uusittavuutta.
1.24 Kvalitatiivinen menetelmä: Analyyttinen menetelmä, joka tunnistaa
aineen sen kemiallisten, biologisten tai fysikaalisten ominaisuuksien
perusteella.
1.25 Kvantitatiivinen menetelmä: Analyyttinen menetelmä, jolla määritetään
aineen määrä tai massafraktio siten, että se voidaan ilmaista numeeri-
sena arvona asianmukaisissa yksiköissä.
1.26 Reagenssinollakoe: Kokonainen määritys, joka tehdään ilman näytean-
nosta tai jossa käytetään vastaavaa määrää sopivaa liuotinta
näyteannoksen sijasta.
1.27 Saanto: Analyyttisessä menetelmässä talteen saadun aineen prosenttio-
suus aineen oikeasta konsentraatiosta. Saantotekijä määritetään
validoinnin yhteydessä, jos sertifioituja vertailumateriaaleja ei ole
käytettävissä.
1.28 Vertailumateriaali: Materiaali, jonka yksi tai useampi ominaisuus on
vahvistettu validoidulla menetelmällä siten, että materiaalia voidaan
käyttää laitteen kalibrointiin tai määritysmenetelmän todentamiseen.
1.29 Toistettavuus: Täsmällisyys toistettavuusolosuhteissa (2).
1.30 Toistettavuusolosuhteet: Sama henkilö tekee samassa laboratoriossa
samoilla laitteilla samoista näytteistä toisistaan riippumattomat testa-
ukset samalla menetelmällä (2).
1.31 Uusittavuus: Täsmällisyys uusittavuusolosuhteissa (2) (4).1.32 Uusittavuusolosuhteet: Eri henkilöt tekevät eri laboratorioissa eri lait-
teilla samoista näytteistä testaukset samalla menetelmällä (2) (4).
1.33 Häiriönkestävyys: Analyyttisen menetelmän herkkyys sellaisten koeolo-
suhteiden muutoksille, jotka voidaan kuvata sellaisten näytemateriaalien,
analyyttien, säilytysolosuhteiden, ympäristöolosuhteiden sekä näytteen
valmisteluolosuhteiden avulla, joiden vallitessa menetelmää voidaan
käyttää esitetyssä muodossa tai määritetyin pienin muutoksin. Sellaiset
koeolosuhteiden muutokset, jotka käytännössä voivat vaihdella (esimer-
kiksi reagenssien stabiilisuus, näytteen koostumus, pH, lämpötila) ja
vaikuttaa määritystuloksiin, on ilmoitettava.
1.34 Näytteen nollakoe: Kokonainen määritys, joka tehdään analyyttiä
sisältämättömästä näytteestä otetusta näyteannoksesta.
1.35 Seulontamenetelmät: Menetelmät, joilla osoitetaan aineen tai ainer-
yhmän olemassaolo tietyllä tasolla. Tällaisten menetelmien
näytteenkäsittelykapasiteetti on suuri, ja niillä on tarkoitus seuloa suuri
määrä näytteitä mahdollisesti vaatimustenvastaisten tulosten havaitsemi-
seksi. Menetelmät on erityisesti suunniteltu välttämään väärät
vaatimustenmukaiset tulokset.
1.36 Yhden laboratorion tutkimus (sisäinen validointi): Yhdessä laborator-
iossa analysoidaan yhdellä menetelmällä samat tai erilaiset
näytemateriaalit eri olosuhteissa perustelluin pitkin aikavälein.
1.37 Spesifisyys: Menetelmän kyky erottaa mitattava analyytti muista
aineista. Tämä ominaisuus määräytyy ensisijaisesti määritykseen2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 7
▼B
käytettävän menetelmän mukaan, mutta se voi vaihdella yhdisteen tai
matriisin tyypin mukaan.
1.38 Standardilisäys: Menettely, jossa testinäyte jaetaan kahteen (tai sitä
useampaan) näyteannokseen. Yksi annos analysoidaan sellaisenaan, ja
muihin näyteannoksiin lisätään tunnetut määrät standardianalyyttiä
ennen määritystä. Lisätyn standardiaineen määrän on oltava kahdesta
viiteen kertaa niin suuri kuin näytteen sisältämän analyytin arvioitu
määrä. Menetelmä on suunniteltu analyytin pitoisuuden määrittämiseksi
näytteestä ottaen huomioon määritysmenetelmän saanto.
1.39 Standardianalyytti: Analyytti, joka sisältää tunnetun ja sertifioidun
määrän puhtausasteeltaan tunnettua ja sertifioitua ainetta ja jota voidaan
siten käyttää määrityksessä vertailuaineena.
1.40 Aine: Erityisen tai määritellyn kemiallisen koostumuksen omaava aine
ja sen metaboliitit.
1.41 Testiannos: Ainemäärä, joka on otettu testinäytteestä, johon testi tai
havainto kohdistuu.
1.42 Testinäyte: Laboratorionäytteestä valmistettu näyte, josta testiannokset
otetaan.
1.43 Oikeellisuus: Suuresta määrästä testituloksia saadun keskiarvon ja
hyväksytyn vertailuarvon välisen eron suuruus. Oikeellisuus ilmaistaan
yleensä systemaattisen virheen muodossa (2).
1.44 Yksikkö: ISO-standardissa 31 (20) ja direktiivissä 71/354/ETY (19)
selostetut yksiköt.
1.45 Validointi: Vahvistaminen tutkimalla ja tosiasiallista näyttöä esittämällä,
että erityiset vaatimukset tiettyä aiottua tarkoitusta varten täyttyvät (1).
1.46 Laboratorionsisäinen uusittavuus: Täsmällisyys, johon päästään samassa
laboratoriossa ennaltamäärätyissä olosuhteissa (jotka liittyvät esim.
menetelmiin, testimateriaaleihin, määrityksen tekijöihin ja ympäristöön)
perustellulla pitkällä aikavälillä.
2MÄÄRITYSMENETELMIÄ KOSKEVAT SUORITUSKYKYPERUS-
TEET JA MUUT VAATIMUKSET
Muita kuin seuraavassa esitettyjä analyyttisiä menetelmiä tai niiden yhdistelmiä
saa käyttää seulontaan tai varmistukseen vain, jos voidaan osoittaa, että ne
täyttävät tässä päätöksessä säädetyt asianmukaiset vaatimukset.
2.1 YLEISET VAATIMUKSET
2.1.1 Näytteiden käsittely
Näytteet on otettava ja niitä on käsiteltävä ja prosessoitava siten, että
määritettävän aineen osoitusmahdollisuus on mahdollisimman suuri.
Näytteenkäsittelymenetelmien on estettävä analyyttien tahaton kontami-
naatio tai häviäminen.
2.1.2 Testien suoritus
2.1.2.1 Saanto
Saanto on määritettävä jokaisesta näyte-erästä, mikäli käytetään kiinteää
korjaustekijää. Jos saanto on sallituissa rajoissa, kiinteää korjaustekijää
voidaan käyttää. Muussa tapauksessa on käytettävä kyseisen näyte-erän
omaa saantotekijää, paitsi jos käytetään näytteen sisältämän analyytin
spesifistä saantotekijää, jolloin näytteessä olevan analyytin kvantitatii-
vinen määritys on tehtävä standardilisäysmenetelmällä (kohta 3.5) tai
sisäisen standardin avulla.
2.1.2.2 Spesifisyys
Menetelmän on pystyttävä erottamaan analyytti muista aineista koeolo-
suhteissa. Siitä, missä määrin se on mahdollista, on esitettävä arvio. On
käytettävä strategioita, joilla pyritään estämään mahdolliset interferenssit
muiden aineiden (esim. kyseisen jäämän homologien, analogien tai
metaboliatuotteiden) kanssa käytettäessä kuvattua mittaustekniikkaa. On
ensiarvoisen tärkeää selvittää kaikki interferenssit, jotka voivat aiheutua
matriisin aineosista.
2.2 SEULONTAMENETELMÄT
Seulontatarkoituksiin on direktiivin 96/23/EY mukaisesti käytettävä vain niitä
analyyttisiä menetelmiä, joista voidaan dokumentoidusti ja jäljitettävissä olevalla
tavalla osoittaa, että menetelmä on validoitu ja että sen väärien vaatimustenmu-2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 8
▼B
kaisten tulosten osuus ( β-virhe) on alle 5 % tietyllä tasolla. Jos tuloksen
epäillään osoittavan vaatimustenvastaisuutta, se on vahvistettava varmistusmene-
telmän avulla.
2.3 ORGAANISTEN JÄÄMIEN JA KONTAMINANTTIEN VARMISTUSME-
NETELMÄT
Orgaanisten jäämien tai kontaminanttien varmistusmenetelmien on annettava
tietoa analyytin kemiallisesta rakenteesta. Sen vuoksi pelkästään kromatogra-
fiaan perustuvat menetelmät, joissa ei käytetä osoitukseen spektrometriaa, eivät
sovellu sellaisenaan varmistusmenetelmiksi. Jos jokin tekniikka ei ole tarpeeksi
spesifinen, tarvittava spesifisyys on saavutettava analyyttisillä menetelmillä,
jotka koostuvat sopiviksi katsotuista puhdistuksen, kromatografisen erotuksen ja
spektrometrisen detektion yhdistelmistä.
Seuraavien menetelmien tai menetelmäyhdistelmien katsotaan olevan sopivia
orgaanisten jäämien tai kontaminanttien tunnistamiseen mainituille aineryhmille:
Taulukko 1
Sopivia varmistusmenetelmiä orgaanisille jäämille ja kontaminanteille
MittaustekniikkaDirektiivin 96/23/EY
liitteessä I mainitut
aineetRajoitukset
Neste- tai kaasukromato-
grafia ja massaspektrome-
triaRyhmät A ja B Vain josens in tehdään kromatografinen erotus
joko on-line- tai off-line
Vain jos rekisteröidään koko massaspektri tai
käytetään ainakin 3:a (ryhmä B) tai 4:ää
(ryhmä A) tunnistuspistettä, jos ei rekisteröidä
koko massaspektriä
Neste- tai kaasukromato-
grafia ja infrapuna-
(IR)spektrometriaRyhmät A ja B IR-absorptiospektrometriaa koskevat erityis-
vaatimukset on täytettävä
Nestekromatografia ja full-
scan-DAD (diodirivide-
tektio)Ryhmä B UV-absorptiospektrometriaa koskevat erityis-
vaatimukset on täytettävä
Nestekromatografia-fluore-
senssiRyhmä B Vain molekyyleille, joilla esiintyy luontaista
fluoresenssia sekä molekyyleille, joilla esiintyy
fluoresenssia joko transformaation tai derivaa-
tion jälkeen.
Nestekromatografia ja full-
scan-UV-VIS-spektrome-
triaRyhmä B Kaksiulotteinen HPTLC ja yhteiskromatografia
ovat pakollisia.
Kaasukromatografia-elek-
tronisieppausdetektioRyhmä B Vain joskäytetään kahta kolonnia, joilla on eri
polariteetti
Nestekromatografia-immu-
nogrammiRyhmä B Vain joskäytetään vähintään kahta erilais ta
kromatografiajärjestelmää tai toista, riippuma-
tonta osoitusmenetelmää
Nestekromatografia-UV-
VIS (yksi aallonpituus)Ryhmä B Vain joskäytetään vähintään kahta erilais ta
kromatografiajärjestelmää tai toista, riippuma-
tonta osoitusmenetelmää
2.3.1 Yhteiset suorituskykyperusteet ja vaatimukset
Varmistusmenetelmien on annettava tietoa analyytin kemiallisesta raken-
teesta. Jos useampi kuin yksi yhdiste antaa saman vasteen, menetelmällä
ei voi erottaa kyseisiä yhdisteitä. Yleisesti pelkästään kromatografiaan
perustuvat menetelmät, joissa ei käytetä osoitukseen spektrometriaa,
eivät sovellu sellaisenaan varmistusmenetelmiksi.
Jos menetelmässä käytetään sopivaa sisäistä standardia, se on lisättävä
näyteannokseen uuttoprosessin alussa. Saatavuuden mukaan on
käytettävä joko analyytin vakaita isotooppimerkittyjä muotoja, jotka
soveltuvat erityisesti massaspektrometriseen osoitukseen, tai yhdisteitä,
jotka ovat rakenteellisesti lähellä analyyttiä.
Jos sopivaa sisäistä standardia ei ole käytettävissä, analyytin tunnistus
on varmistettava yhteiskromatografialla. Kromatografiassa saa tulla
vain yksi piikki, jolloin piikin korkeuden (tai pinta-alan) lisääntyminen
vastaa lisätyn analyytin määrää. Käytettäessä kaasu- tai nestekromato-
grafiaa piikin puolikorkeuden leveyden on oltava välillä 90—110 %2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 9
▼B
alkuleveydestä, ja retentioajat saavat poiketa toisistaan korkeintaan 5 %.
Ohutkerroskromatografiamenetelmissä (TLC) vain analyytiksi oletettu
täplä saa vahvistua. Uutta täplää ei saa syntyä, ja täplän ulkomuoto ei
saa muuttua.
Vertailumateriaalia tai väkevöityä materiaalia, joka sisältää tunnetut
määrät analyyttiä, jonka pitoisuus on lähellä joko jäämien sallittua
määrää tai päätösrajaa (vaatimustenvastainen valvontanäyte), sekä vaati-
mustenmukaisia valvontamateriaaleja ja nollareagensseja, olisi syytäviedä läpi koko prosessin samanaikaisesti kunkin analysoitavan
koenäyte-erän kanssa. Uutteiden injektiojärjestys määrityslaitteeseen on
seuraava: reagenssinollanäyte, vaatimustenmukainen valvontanäyte,
varmistettavat näytteet, vaatimustenmukainen valvontanäyte uudelleen
ja lopuksi vaatimustenvastainen valvontanäyte. Kaikki poikkeamat tästä
järjestyksestä on perusteltava.
2.3.2 Muita suorituskykyperusteita ja vaatimuksia kvantitatiivisia
määritysmenetelmiä varten
2.3.2.1 Kvantitatiivisten menetelmien oikeellisuus
Sertifioidun vertailuaineen toistomääritysten kokeellisesti määritetyn,
saannon suhteen korjatun keskimääräisen massaosuuden poikkeamanvertailuarvosta on oltava seuraavien rajojen sisällä:
Taulukko 2
Kvantitatiivisten menetelmien vähimmäisoikeellisuus
Massaosuus Rajat
≤1µg/kg – 50 % — + 20 %
>1 µg/kg—10 µg/kg – 30 % — + 10 %
≥10µg/kg – 20 % — + 10 %
Jos tällaista sertifioitua vertailuainetta ei ole saatavissa, on hyväk-
syttävää arvioida mittausten oikeellisuus lisäämällä nollamatriisiin
tunnettu määrä analyyttiä ja laskemalla saanto. Keskimääräisen saannon
suhteen korjatut mittaustulokset ovat hyväksyttäviä, jos ne ovat taulu-
kossa 2 esitetyissä rajoissa.
2.3.2.2 Kvantitatiivisten menetelmien täsmällisyys
Laboratorioiden välinen vaihtelukerroin (CV) vertailumateriaalin tai
väkevöidyn materiaalin toistomäärityksille uusittavuusolosuhteissa eisaa olla suurempi kuin Horwitzin yhtälöllä laskettu taso. Yhtälö on seur-
aava:
Vaihtelukerroin CV = 2
(1 — 0.5 log C)
missä C on massaosuus 10:n potenssina (esim. 1 mg/g = 10-3).
Esimerkkejä annetaan taulukossa 3.
Taulukko 3
Esimerkkejä kvantitatiivisten menetelmien uusittavuuteen liittyvistä vaihtelukertoimista
tietyillä analyytin massaosuuksilla
Massaosuus Uusittavuus-CV (%)
1µg/kg (*)
10µg/kg (*)
100 µg/kg 23
1 000 µg/kg (1 mg/kg) 16
(*) Jos massaosuus on pienempi kuin 100 µg/kg, Horwitzin yhtälö antaa liian suuria arvoja. Siksi konsen-
traatioiden, jotka ovat pienemmät kuin 100 µg/kg, vaihtelukertoimien on oltava mahdollisimman pienet.
Toistettavuusolosuhteissa tehdyille määrityksille laboratorion sisäinen
vaihtelukerroin on tavallisesti välillä puolet ja kaksi kolmasosaa edellä
mainituista arvoista. Laboratorion sisäisissä uusittavuusolosuhteissa
tehdyille määrityksille laboratorion sisäinen vaihtelukerroin ei saa olla
suurempi kuin uusittavuuteen liittyvä vaihtelukerroin.2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 10
▼B
Aineille, joille on vahvistettu sallittu raja, menetelmän on taattava labor-
atorion sisäinen uusittavuus, joka ei ole suurempi kuin uusittavuuteen
liittyvä vastaava vaihtelukerroin konsentraatiolla 0,5 × sallittu raja.
2.3.3 Massaspektrometrisiä osoitusmenetelmiä koskevat suorituskykyper-
usteet ja muut vaatimukset
Massaspektrometriset menetelmät sopivat varmistaviksi menetelmiksi
vain joko on-line- tai off-line-kromatografian jälkeen.
2.3.3.1 Kromatografinen erotus
GC-MS-menetelmissä kromatografinen erotus on tehtävä kapillaariko-
lonneilla. LC-MS-menetelmissä kromatografinen erotus on tehtävä
sopivilla LC-kolonneilla. Kaikissa tapauksissa analyytin pienin hyväk-
syttävä retentioaika on kaksi kertaa kolonnin tyhjätilavuutta vastaavaretentioaika. Testiannoksessa olevan analyytin retentioajan (tai suhteel-
lisen retentioajan) on vastattava kalibrointiaineen retentioaikaa
määrätyn retentioaikaikkunan puitteissa. Retentioaikaikkunan on oltava
oikeassa suhteessa kromatografiajärjestelmän erotuskykyyn. Analyytin
kromatografisen retentioajan ja sisäisen standardin retentioajan suhteen,
eli analyytin suhteellisen retentioajan, on vastattava kalibrointiliuoksen
suhteellista retentioaikaa ± 0,5 prosentin toleranssin puitteissa (GC) tai
± 2,5 prosentin toleranssin puitteissa (LC).
2.3.3.2 Massaspektrometrinen detektio
Massaspektrometridetektiossa on käytettävä esimerkiksi seuraavia MS-
menetelmiä: täydelliset massaspektrit (full scan) tai selektiivinen ioni-
monitorointi (SIM) sekä MS-MS
n-menetelmät, kuten selektiivinen
reaktiomonitorointi (SRM), tai muita sopivia MS- tai MS-MSn-mene-
telmiä yhdessä asianmukaisten ionisaatiomoodien kanssa. Korkean
erotuskyvyn massaspektrometria (HRMS): Erotuskyvyn on yleensä
oltava koko massa-alueella suurempi kuin 10 000 käyttäen 10 % laakson
määritelmää.
Full scan: Kun massaspektrometrinen määritys tehdään rekisteröimällä
full-scan-spektrit, kaikkien mitattujen diagnostisten ionien (molekyyli-
ioni, sen karakteristiset adduktiotuotteet, karakteristiset fragmentti-ionit
ja isotooppi-ionit), joiden suhteellinen intensiteetti kalibrointistandardin
vertailuspektrissä on yli 10 %, mukanaolo on pakollista.
SIM: Kun massaspektrometrinen määritys tehdään fragmentografialla,
molekyyli-ionin on mielellään oltava yksi valituista diagnostisista
ioneista (molekyyli-ioni, sen karakteristiset adduktiotuotteet, karakteris-
tiset fragmentti-ionit ja kaikki niiden isotooppi-ionit). Valitut
diagnostiset ionit eivät saa olla peräisin yksinomaan samasta molekyylin
osasta. Kunkin diagnostisen ionin signaali-kohinasuhteen on oltava
≥3:1.
Full scan ja SIM: Osoitettavien ionien suhteellisten intensiteettien,
jotka esitetään prosenttiosuutena suurimman intensiteetin omaavan ionin
tai siirtymän intensiteetistä, on vastattava kalibrointistandardin intensi-
teettejä joko kalibrointiliuoksissa tai analyytillä väkevöidyissä
näytteissä. Pitoisuuksien on oltava vertailukelpoiset, mittausolosuhteiden
samat ja toleranssit seuraavan taulukon mukaiset:
Taulukko 4
Suurimmat sallitut ionien suhteellisten intensiteettien toleranssit erilaisia massaspektro-
metrisia menetelmiä käytettäessä
Suhteellinen intensiteetti
(% peruspiikistä)EI-GC-MS
(suhteellinen)GC-MS-MS, GC-MSn
LC-MS, LC-MSn
(suhteellinen)
>5 0% ±1 0% ±2 0%
> 20 %—50 % ± 15 % ± 25 %
> 10 %—20 % ± 20 % ± 30 %
≤10 % ± 50 % ± 50 %
Massaspektridatan tulkinta: Diagnostisten ionien ja/tai prekursori/
tuoteioniparien suhteelliset intensiteetit on tunnistettava vertaamalla
spektrejä tai integroimalla yksittäiset massasignaalit. Jos käytetään taus-
takorjausta, sitä on käytettävä samalla tavalla koko erässä (ks. 2.3.1,
kohta 4) ja se on ilmoitettava selkeästi.2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 11
▼B
Full scan: Jos täydelliset spektrit mitataan yhdessä massaspektrome-
trissä, määrityksessä on oltava vähintään neljä ionia, joiden suhteellinen
intensiteetti verrattuna peruspiikkiin on vähintään 10 %. Molekuläärisen
ionin on oltava mukana, jos sen suhteellinen intensiteetti vertailuspek-
trissä on vähintään 10 %. Vähintään neljän ionin on oltava suhteellisten
ioni-intensiteettien maksimaalisten sallittujen toleranssien rajoissa
(taulukko 5). Tietokoneavusteista kirjastohakua voidaan käyttää. Tässä
tapauksessa testinäytteiden massaspektridatan ja kalibrointiliuoksen
datan välisen suhteen on oltava suurempi kuin kriittinen vastaavuus-
tekijä. Tämä tekijä on määritettävä validointiprosessin yhteydessä
kullekin analyytille sellaisten spektrien perusteella, jotka täyttävät
jäljempänä esitetyt vaatimukset. Näytematriisin ja detektorin (ilmai-
simen) suorituskyvyn aiheuttama vaihtelu spektreissä on selvitettävä.
SIM: Jos massafragmentteja mitataan muilla kuin full-scan-menetel-
millä, tuloksia on tulkittava tunnistuspisteiden avulla. Direktiivin 96/23/
EY liitteen I ryhmän A aineiden varmistukseen on vaadittava vähintään
neljä tunnistuspistettä. Direktiivin 96/23/EY liitteen I ryhmän B aineiden
varmistukseen vaaditaan vähintään kolme tunnistuspistettä. Seuraavassa
taulukossa esitetään, kuinka monta tunnistuspistettä eri massaspektrome-
triset perusmenetelmät ”ansaitsevat”. Jotta varmistuksen edellyttämät
tunnistuspisteet voidaan myöntää ja tunnistuspisteiden summa laskea:
a) on mitattava vähintään yksi ionisuhde; ja
b) kaikkien relevanttien mitattujen ionisuhteiden on täytettävä yllä
kuvatut vaatimukset; ja
c) tunnistuspisteiden vähimmäismäärän saavuttamiseksi voidaan
yhdistää enintään kolme eri menetelmää.
Taulukko 5
Erilaisten massafragmenttiluokkien ja saatujen tunnistuspisteiden välinen suhde
MS-menetelmä Tunnistuspisteitä ionia kohti
Matalan erotuskyvyn massaspektrometri
(LR)1,0
LR-MSnprekursori-ioni 1,0
LR-MSnsiirtymätuotteet 1,5
HRMS 2,0
HR-MSnprekursori-ioni 2,0
HR-MSnsiirtymätuotteet 2,5
Huomautuksia:
(1) Kukin ioni voidaan laskea vain kerran.
(2) GC-MS, jossa käytetään elektroni-iskuionisaatiota, katsotaan eri menetelmäksi kuin GC-MS, jossa
käytetään kemiallista ionisaatiota.
(3) Eri analyyttejä voidaan käyttää lisäämään tunnistuspisteiden lukumäärää vain, jos johdosten reaktioke-
miat ovat erilaisia.
(4) Direktiivin 96/23/EY liitteen I ryhmän A aineille, jos määrityksessä käytetään jotakin seuraavista
tekniikoista: full-scan -diodirividetektoriin (DAD) kytketty HPLC, fluoresenssidetektoriin kytketty
HPLC, immunogrammiin kytketty HPLC tai kaksiulotteinen TLC kytkettynä spektrometriseen detek-tioon; enintään yksi tunnistuspiste voidaan tuottaa, mikäli menetelmien relevantit vaatimukset täyttyvät.
(5) Siirtymätuotteet sisältävät sekä tytärtuotteet että niiden tytärtuotteet.
Taulukko 6
Esimerkkejä eri tekniikoilla ja niiden yhdistelmillä saatavien tunnistuspisteiden määristä
(n = kokonaisluku)
Tekniikka (tekniikat) Ionien lukumäärä Tunnistus-pisteet
GC-MS (EI tai CI) N n
GC-MS (EI ja CI) 2 (EI) + 2 (CI) 4
GC-MS (EI tai CI) 2
johdosta2 (johdosA) + 2 (johdos
B)4
LC-MS N n
GC-MS-MS 1 prekursori ja 2 tytärtä 4
LC-MS-MS 1 prekursori ja 2 tytärtä 4
GC-MS-MS 2 prekursori-ionia,
kummallakin 1 tytär52002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 12
▼B
Tekniikka (tekniikat) Ionien lukumäärä Tunnistus-pisteet
LC-MS-MS 2 prekursori-ionia,
kummallakin 1 tytär5
LC-MS-MS-MS 1 prekursori, 1 tytär ja 2
tyttärentytärtä5,5
HRMS N 2 n
GC-MS ja LC-MS 2 + 2 4
GC-MS ja HRMS 2 + 1 4
2.3.4 Infrapunadetektioon kytkettyä kromatografiaa koskevat suoritusky-
kyperusteet ja muut vaatimukset
Riittävät piikit: Riittäviä piikkejä ovat kalibrointistandardin infrapu-
naspektrin absorptiomaksimit, jotka täyttävät seuraavat vaatimukset:
2.3.4.1 Infrapunadetektio
Absorptiomaksimi: Oltava aaltolukualueella 4 000—500 cm-1.
Absorption intensiteetti: Ei saa olla pienempi kuin
a) spesifinen mooliabsorbanssi = 40 suhteessa piikin perusviivaan, eikä
b) suhteellinen absorbanssi = 12,5 % alueella 4 000—500 cm-1sijait-
sevan intensiivisimmän piikin absorbanssista,
kun molemmat mitataan suhteessa nolla-absorbanssiin, ja 5 % alueella
4 000—500 cm-1sijaitsevan intensiivisimmän piikin absorbanssista, kun
molemmat mitataan suhteessa niiden piikin perustasoon.
Huomautus: Vaikka a kohdan mukaisesti määritetyt riittävät piikit ovat
teoriassa suositeltavampia, b kohdan piikit on käytännössä helpompi
määrittää.
Analyysissä on määritettävä sellaisten analyytin infrapunaspektrissä
olevien piikkien lukumäärä, joiden frekvenssit vastaavat kalibrointistan-
dardin spektrissä olevaa riittävää piikkiä ± 1 cm-1:n rajoissa.
2.3.4.2 Infrapunaspektridatan tulkinta
Absorptiota on esiinnyttävä analyytin spektrin kaikilla alueilla, jotka
vastaavat kalibrointistandardin vertailuspektrissä olevaa riittävää piikkiä.
Kalibrointistandardin infrapunaspektrissä vaaditaan vähintään kuusi
riittävää piikkiä. Jos riittävien piikkien määrä on alle kuusi (7), kyseistä
infrapunaspektriä ei saa käyttää vertailuspektrinä. ”Tuloksen”, toisin
sanoen analyytin infrapunaspektristä havaittujen riittävien piikkien
prosentuaalisen osuuden, on oltava vähintään 50. Jos riittävän piikin
suhteen ei saada täyttä vastaavuutta, analyytin spektrin relevantin alueen
on vastattava yhteensopivan piikin aluetta. Menetelmää voidaan soveltaa
vain sellaisiin absorptiopiikkeihin näytteen spektrissä, joiden intensiteetti
on vähintään kolme kertaa kahden piikin välinen taustakohina.
2.3.5 Suorituskykyperusteet ja muut vaatimukset määritettäessä
analyyttiä nestekromatografialla yhdessä muiden detektiomenetel-
mien kanssa
2.3.5.1 Kromatografinen erotus
Sisäistä standardia on käytettävä, jos soveltuvaa ainetta on saatavissa.
Sen on oltava mieluiten analyyttiä muistuttava standardi, jonka reten-
tioaika on lähellä analyytin retentioaikaa. Analyytin on eluoiduttava
vastaavalle kalibrointistandardille samoissa koeolosuhteissa tyypillisessä
retentioajassa. Pienin hyväksyttävä analyytin retentioaika on oltava kaksi
kertaa kolonnin tyhjätilavuutta vastaava retentioaika. Analyytin reten-
tioajan suhde sisäisen standardin retentioaikaan, ts. analyytin
suhteellisen retentioajan, on oltava sama kuin kalibrointistandardin
suhteellinen retentioaika asianmukaisessa matriisissa ± 2,5 %:n rajoissa.
2.3.5.2 Full-scan-UV/VIS-detektio
Menetelmän on täytettävä nestekromatografiamenetelmiin sovellettavat
suorituskykyperusteet.
Analyytin spektrissä esiintyvien absorptiomaksimien on oltava samoilla
aallonpituuksilla kuin kalibrointistandardin absorptiomaksimit detek-
tiojärjestelmän resoluution rajoissa. Diodirividetektiossa se on2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 13
▼B
tavallisesti ± 2 nm. Yli 220 nm:ssä analyytin spektri ei silmämääräisesti
tarkasteltuna saa erota kalibrointistandardin spektristä niillä kummankin
spektrin alueilla, joissa suhteellinen absorbanssi on vähintään 10 %.
Tämä peruste täyttyy, kun spektrissä esiintyvät samat maksimit ja
näiden kahden spektrin ero ei ole suurempi kuin 10 % kalibrointistan-
dardin absorbanssista missään tarkastelukohdassa. Tietokoneavusteista
kirjastohakua ja vertailua käytettäessä testinäytteiden massaspektridatan
ja kalibrointiliuoksen datan suhteen on oltava suurempi kuin kriittinen
vastaavuustekijä. Tämä tekijä on määritettävä validointiprosessin yhtey-
dessä kullekin analyytille sellaisten spektrien perusteella, jotka täyttävät
edellä esitetyt vaatimukset. Näytematriisin ja detektorin suorituskyvyn
aiheuttama vaihtelu spektreissä on selvitettävä.
2.3.5.3 Fluorimetristä detektiota koskevat suorituskykyperusteet
Menetelmän on täytettävä nestekromatografiamenetelmiin sovellettavat
suorituskykyperusteet.
Tämä koskee molekyyleja, joilla esiintyy luontaista fluoresenssia sekä
molekyyleja, joilla esiintyy fluoresenssia joko transformaation tai deri-
vaation jälkeen. Virittymis- ja emissioaallonpituudet ja kromatografiset
olosuhteet on valittava siten, että nollanäyteuutteissa esiintyvät interfer-
oivat komponentit minimoidaan.
Analyytin piikkiä lähinnä olevan piikin huipun on oltava vähintään
yhden täyden piikinleveyden etäisyydellä korkeudella 10 % analyytti-
piikin enimmäiskorkeudesta.
2.3.5.4 Suorituskykyperusteet analyytin määrittämiseksi LC-immunogrammi
-menetelmällä
LC-immunogrammi ei yksinään riitä käytettäväksi varmistusmene-
telmänä.
Menetelmän on täytettävä nestekromatografiamenetelmiin sovellettavat
vaatimukset.
Etukäteen määriteltyjen laadunvalvontaparametrien, kuten epäspesifisen
sitoutumisen, valvontanäytteiden suhteellisen sitoutumisen ja nollanäyt-
teen absorbanssin on oltava määritysmenetelmän validoinnin yhteydessä
saatujen raja-arvojen sisällä.
Immunogrammi on tehtävä vähintään viidestä jakeesta.
Kunkin jakeen on oltava alle puolet piikin leveydestä.
Jakeen, joka sisältää suurimman pitoisuuden analyyttiä, on oltava sama
epäillyssä näytteessä, vaatimustenvastaisessa valvontanäytteessä ja stan-
dardissa.
2.3.5.5 Analyytin määrittäminen nestekromatografialla UV/VIS-detektion kanssa
(yksi aallonpituus)
Nestekromatografia yhdessä UV/VIS-detektion kanssa (yksi aallonpi-
tuus) ei sovellu yksinään varmistusmenetelmäksi.
Analyytin piikkiä lähinnä olevan piikin huipun on oltava vähintään
yhden täyden piikinleveyden etäisyydellä korkeudella 10 % analyytti-
piikin enimmäiskorkeudesta.
2.3.6 Suorituskykyperusteet ja muut vaatimukset analyytin määrittämi-
seksi kaksiulotteisella ohutkerroskromatografialla yhdessä full-scan-
UV/VIS-spektrometridetektion kanssa
Kaksiulotteinen HPTLC ja yhteiskromatografia ovat pakollisia.
Analyytin RF-arvojen on vastattava standardien RF-arvoja ± 5 %:n
rajoissa.
Analyytin ja standardin aiheuttamien täplien on oltava ulkonäöltään
samanlaisia.
Samanväristen täplien tapauksessa lähimmän täplän keskuksen
etäisyyden analyytin täplän keskuksesta on oltava vähintään puolet
täplien halkaisijoiden summasta.
Analyytin spektri ei silmämääräisesti tarkasteltuna saa erota standardin
spektristä, kuten full-scan-UV/VIS-detektiota käsittelevässä kohdassa
selostetaan.
Tietokoneavusteista kirjastohakua ja vertailua käytettäessä testinäyt-
teiden massaspektridatan ja kalibrointiliuoksen datan suhteen on oltava
suurempi kuin kriittinen vastaavuustekijä. Tämä tekijä on määritettävä
validointiprosessin yhteydessä kullekin analyytille sellaisten spektrien2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 14
▼B
perusteella, jotka täyttävät edellä esitetyt vaatimukset. Näytematriisin ja
detektorin suorituskyvyn aiheuttama vaihtelu spektreissä on selvitettävä.
2.3.7 Suorituskykyperusteet ja muut vaatimukset määritettäessä
analyyttiä kaasukromatografialla yhdessä elektronisieppausdetek-
tion (ECD) kanssa
Sisäistä standardia on käytettävä, jos soveltuvaa ainetta on saatavissa.
Sen on oltava mieluiten samantapainen aine, jonka retentioaika on
lähellä analyytin retentioaikaa. Analyytin on eluoiduttava vastaavalle
standardille samoissa koeolosuhteissa ominaisessa retentioajassa. Pienin
hyväksyttävä analyytin retentioaika on oltava kaksi kertaa kolonnin
tyhjätilavuutta vastaava retentioaika. Analyytin retentioajan suhde
sisäisen standardin retentioaikaan, ts. analyytin suhteellisen retentioajan,
on oltava sama kuin kalibrointistandardin suhteellinen retentioaika
asianmukaisessa matriisissa ± 0,5 %:n rajoissa. Analyytin piikkiä
lähinnä olevan piikin huipun on oltava vähintään yhden täyden piikinle-
veyden etäisyydellä korkeudella 10 % analyyttipiikin
enimmäiskorkeudesta. Lisätietojen saamiseksi voidaan käyttää yhteiskro-
matografiaa.
2.4 ALKUAINEIDEN VARMISTUSMENETELMÄT
Kemiallisten alkuaineiden varmistusanalyysien on perustuttava yksiselitteiseen
tunnistukseen sekä tarkkaan ja täsmälliseen kvantifiointiin kyseisen kemiallisen
alkuaineen yksilöllisten fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien (kuten emit-
toidun tai absorboidun säteilyn kyseiselle alkuaineelle ominaisen aallonpituuden
tai atomimassan) perusteella.
Seuraavia menetelmiä tai niiden yhdistelmiä pidetään sopivina kemiallisten
alkuaineiden tunnistamiseen:
Taulukko 7
Sopivia varmistusmenetelmiä kemiallisille alkuaineille
Tekniikka Mitattava muuttuja
Differentiaalipulssitekniikalla tehtävä anodinen
liuotusvoltammetriaSähköinen signaali
Atomiabsorptiospektrometria
Liekki Absorptioaallonpituus
Hydridien muodostuminen Absorptioaallonpituus
Kylmä höyry Absorptioaallonpituus
Elektroterminen atomisaatio (grafiittiuuni) Absorptioaallonpituus
Atomiemissiospektrometria
Induktiivisesti kytketty plasma Emissioaallonpituus
Massaspektrometria
Induktiivisesti kytketty plasma Massa—varaus-suhde
2.4.1 Yhteiset suorituskykyperusteet ja muut vaatimukset varmistusmene-
telmille
Vertailumateriaalia tai väkevöityä materiaalia, joka sisältää tunnetut
määrät analyyttiä, jonka pitoisuus on lähellä joko jäämien sallittua
määrää tai päätösrajaa (vaatimustenvastainen valvontanäyte), sekä vaati-
mustenmukaisia valvontamateriaaleja ja nollareagensseja olisi syytä
viedä läpi koko prosessin samanaikaisesti kunkin analysoitavan
koenäyte-erän kanssa. Uutteiden suositeltu injektiojärjestys määrityslait-
teeseen on seuraava: reagenssinollanäyte, vaatimustenmukainen
valvontanäyte, varmistettavat näytteet, vaatimustenmukainen valvonta-
näyte ja lopuksi vaatimustenvastainen valvontanäyte. Kaikki
poikkeamat tästä on perusteltava.
Useimmat määritystekniikat vaativat yleensä orgaanisen matriisin
täydellisen digestion, jotta analyytti saataisiin liuokseen ennen
määritystä. Tämä voidaan saavuttaa käyttäen mikroaaltomineralisaatio-
menetelmiä, jotka minimoivat analyyttien hävikin tai kontaminaation
riskin. Määrityksessä on käytettävä hyvälaatuisia dekontaminoituja teflo-
nastioita. Jos käytetään muita märkä- tai kuivadigestiomenetelmiä,
hävikki- tai kontaminaatioilmiöiden poissulkemiseen tarvittava doku-
mentoitu näyttö on oltava saatavilla. Digestion asemesta voidaan
joissakin tapauksissa käyttää erotusmenetelmiä (kuten uuttamista), joilla2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 15
▼B
erotetaan ja/tai väkevöidään analyytit matriisin komponenteista ja joilla
näytteet voidaan konsentroida ennen kuin ne syötetään määrityslaittee-
seen.
Kalibroinnin suhteen on muistettava, että analyysille vahvistettuja
työskentelyrajoja ei saa ylittää. Tämä koskee sekä ulkoista kalibrointia
että standardilisäysmenetelmää. Käytettäessä ulkoista kalibrointia kali-
brointistandardit on ehdottomasti valmistettava näyteliuoksen
koostumusta mahdollisimman hyvin vastaavaan liuokseen. Taustakor-
jausta on myös käytettävä, jos erityiset määritysolosuhteet sitä
edellyttävät.
2.4.2 Muita suorituskykyperusteita ja vaatimuksia kvantitatiivisia
määritysmenetelmiä varten
2.4.2.1 Kvantitatiivisten menetelmien oikeellisuus
Kun alkuaineiden sertifioidun vertailumateriaalin analyysia toistetaan,
pitoisuuden kokeellisesti määritetyn keskiarvon poikkeaman sertifioi-
dusta arvosta on oltava ± 10 %:n sisällä. Jos tällaista
vertailumateriaalia ei ole saatavissa, on hyväksyttävää arvioida
mittausten oikeellisuus lisäämällä tuntemattomiin näytteisiin tunnettuja
määriä alkuainetta ja määrittämällä saanto. On huomattava, että toisin
kuin analyytti, lisätty alkuaine ei ole kemiallisesti sidottuna todellisessa
matriisissa, ja tämän vuoksi tällä menetelmällä saadut tulokset ovat
vähemmän valideja kuin sertifioidulla vertailumateriaalilla saadut
tulokset. Saantoa koskevat mittaustulokset ovat hyväksyttäviä vain, jos
ne ovat ± 10 %:n sisällä tavoitearvosta.
2.4.2.2 Kvantitatiivisten menetelmien täsmällisyys
Kun näytteen analyysia toistetaan laboratorion sisäisissä uusittavuusolo-
suhteissa, laboratorion sisäinen keskiarvon vaihtelukerroin (CV) ei saa
ylittää seuraavia arvoja:
Taulukko 8
Esimerkkejä kvantitatiivisiin menetelmiin liittyvistä vaihtelukertoimista tietyillä
analyytin massaosuuksilla
Massaosuus CV (%)
≥10µg/kg—100 µg/kg 20
> 100 µg/kg—1 000 µg/kg 15
≥1 000 µg/kg 10
2.4.3 Erityisvaatimukset DPASV-menetelmää (differentiaalipulssiteknii-
kalla tehtävä anodinen liuotusvoltammetria) varten
On erittäin tärkeää tuhota näytteissä olevat orgaaniset aineet ennen
DPASV-määritystä. Voltammogrammeissa ei saa näkyä orgaanisista
aineista johtuvia leveitä signaaleja. Epäorgaaniset matriisikomponentit
voivat vaikuttaa DPASV:n piikkien korkeuteen. Kvantifiointi on tämänvuoksi tehtävä standardilisäysmenetelmällä. Menetelmän mukana on
toimitettava esimerkkejä näyteliuoksen tyypillisistä voltammogram-
meista.
2.4.4 Erityisvaatimukset atomiabsorptiospektrometriaa (AAS) varten
Tämä tekniikka on alkuainekohtainen ja edellyttää sen vuoksi kvantifioi-
tavasta alkuaineesta riippuvaista kokeellisten asetusten optimointia.
Mikäli mahdollista, tulokset on tarkistettava kvalitatiivisesti ja kvantita-
tiivisesti käyttämällä vaihtoehtoisia absorptioviivoja (parhaassatapauksessa on valittava kaksi erillistä viivaa). Kalibrointistandardit on
valmistettava liuosmatriisiin, joka vastaa mitattavaa näyteliuosta
mahdollisimman tarkkaan (esimerkiksi happokonsentraation tai modi-
fiointiaineiden koostumuksen osalta). Nolla-arvojen minimoimiseksi
kaikkien reagenssien tulee olla puhtainta saatavilla olevaa laatua.
Näytteen höyrystys- ja/tai atomisointimenetelmän mukaisesti voidaan
erottaa AAS:n eri lajeja.
2.4.4.1 Erityisvaatimukset liekki-AAS:aa varten
Mittalaitteen asetukset on optimoitava jokaista alkuainetta varten. Erityi-
sesti kaasun koostumus ja virtausnopeus on tarkistettava. Tausta-
absorption aiheuttamien interferenssien välttämiseksi on käytettävä
jatkuvaa lähdekorjainta. Tuntemattomien matriisien kohdalla on tarkas-
tettava, tarvitaanko taustakorjausta.2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 16
▼B
2.4.4.2 Erityisvaatimukset grafiittiuuni-AAS:aa varten
Laboratoriossa tapahtunut kontaminaatio vaikuttaa usein tarkkuuteen,
kun määritetään erittäin pieniä pitoisuuksia grafiittiuunitekniikalla.
Tämän vuoksi on syytä käyttää erittäin puhtaita reagensseja, deionisoitua
vettä ja inertteja muovivälineitä näytteiden ja standardien käsittelyssä.
Mittalaitteen asetukset on optimoitava jokaista alkuainetta varten. Erityi-
sesti esikäsittely- ja atomisointiolosuhteet (lämpötila, aika) sekä
matriisimodifikaatio on tarkistettava.
Työskentely isotermisissa atomisointiolosuhteissa (esimerkiksi poikit-
tainen lämmitetty grafiittiputki, jossa on L'vov-tasanne (8)) vähentää
matriisin vaikutusta analyytin atomisaatioon. Yhdessä matriisin modifi-
kaation ja Zeeman-taustakorjauksen (9) kanssa voidaan kvantifiointi
tehdä kalibrointikäyrän avulla, joka perustuu standardien vesiliuosten
mittaukseen.
2.4.5 Erityisvaatimukset hydridien muodostukseen perustuvaa atomiab-
sorptiospektrometriaa varten
Orgaaniset yhdisteet, jotka sisältävät esimerkiksi arseenia, vismuttia,
germaniumia, lyijyä, antimonia, seleeniä, tinaa ja telluuria, voivat olla
hyvin vakaita ja vaatia hapettavaa hajotusta, jotta alkuaineen koko-
naismäärä voitaisiin määrittää oikein. Tämän vuoksi on suositeltavaa
käyttää mikroaaltodigestiota tai korkeapainetuhkausta voimakkaasti
hapettavissa olosuhteissa. Erityistä huomiota on kiinnitettävä alkuai-
neiden täydelliseen ja uusittavissa olevaan muuntumiseen vastaaviksi
hydrideiksi.
Arseenihydridin muodostuminen suolahappoliuoksessa NaBH4:n kanssa
määräytyy As:n hapettumisasteen mukaan (As III: nopea muodostu-
minen, As V: pidempi muodostumisaika). Jotta vältettäisiin
järjestelmän lyhyestä reaktioajasta johtuva herkkyyden pieneneminen
As V:n määrityksessä virtausinjektiotekniikalla, As V on redusoitava
As III:ksi hapettavan hajotuksen jälkeen. Kaliumjodidi/askorbiinihappo
tai kysteiini soveltuvat tähän. Nollaliuokset, kalibrointiliuokset ja näyte-
liuokset on käsiteltävä samalla tavalla. Kun määritykset tehdään
erämenetelmällä, voidaan molemmat As-laadut määrittää tämän vaikut-
tamatta tarkkuuteen. As V -hydridin hitaan muodostumisen vuoksi
kalibrointi on tehtävä piikkialueen integroinnin avulla. Mittalaitteen
asetukset on optimoitava. Hydridin atomisaattoriin siirtävän kaasun
virtaus on erityisen tärkeä, ja se on tarkistettava.
2.4.6 Erityisvaatimukset kylmähöyryatomiabsorptiospektrometriaa varten
Kylmähöyrytekniikkaa käytetään vain elohopean määritykseen. Alkuai-
nemuotoisen elohopean haihtumis- ja adsorptiohäviöiden vuoksi koko
määritys vaatii erityistä huolellisuutta. Reagenssien tai ympäristön
aiheuttamaa saastumista on huolellisesti vältettävä.
Elohopeaa sisältävät orgaaniset yhdisteet vaativat hapettavaa hajotusta,
jotta elohopean kokonaismäärä saataisiin mitattua oikein. Hajotukseen
on käytettävä tiiviisti suljettuja järjestelmiä, joissa käytetään mikroaalto-
hajotusta tai korkeapainetuhkausta. Elohopean kanssa kosketuksissa
olleet laitteet ja tarvikkeet on puhdistettava erityisen huolellisesti.
Virtausinjektiotekniikan käytöllä on etuja. Kun on kyseessä alhaiset
päätösrajat, suositellaan alkuainemuotoisen elohopean adsorptiota kulta/
platina-adsorptioaineeseen sekä termistä desorptiota. Kosteuden joutu-
mista adsorptioaineeseen tai kennoon on vältettävä, sillä kosteus haittaa
mittausta.
2.4.7 Erityisvaatimukset induktiivisesti kytkettyyn plasmaan perustuvaa
atomiemissiospektrometriaa (ICP-AES) varten
Induktiivisesti kytkettyyn plasmaan perustuva atomiemissiospektrome-
tria (10) on monialkuainemenetelmä, jonka avulla voidaan
samanaikaisesti mitata useita alkuaineita. ICP-AES-menetelmän käyttöä
varten näytteet on ensin digeroitava, jotta orgaaniset matriisit saadaan
hajotettua. Hajotukseen on käytettävä tiiviisti suljettuja järjestelmiä,
joissa käytetään mikroaaltodigestiota tai korkeapainetuhkausta. Mittalait-teen kalibroinnilla ja alkuaineen tai aallonpituuden valinnalla on tärkeä
merkitys tavoiteltaessa luotettavaa ICP-AES-analyysia. Lineaaristen
kalibrointikuvaajien tapauksessa mittalaitteen kalibrointiin vaaditaan
vain neljän konsentraation kalibrointiliuosten mittaus, sillä ICP-AES:n
kalibrointikäyrät ovat yleensä lineaarisia 4—6 konsentraatiokertaluokan
alueella. ICP-AES-järjestelmän kalibrointi on tavallisesti tehtävä
monialkuaineisen standardin avulla. Se on valmistettava liuoksessa,
jonka happokonsentraatio on sama kuin mitattavassa liuoksessa. Line-
aarisen kuvaajan osalta on tarkistettava alkuaineiden konsentraatiot.2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 17
▼B
Analyyttien emissioaallonpituudet on valittava määritettävien alkuai-
neiden konsentraatioille sopivaksi. Kun analyytin konsentraatio on
emissioviivan käyttöalueen ulkopuolella, on käytettävä toista emissio-
viivaa. Aluksi on valittava herkin emissioviiva (jossa ei esiinny
interferenssiä), sen jälkeen vähemmän herkkä viiva. Kun työskennellään
lähellä osoitusrajaa, kyseisen analyytin herkin emissioviiva on yleensä
paras valinta. ICP-AES:n suurimmat ongelmat ovat spektri- ja taustain-
terferenssit. Mahdollisia interferenssejä ovat esimerkiksi yksinkertainen
taustasiirtymä, luiskamainen taustasiirtymä, suora spektrien päällekkäi-
syys ja monimutkainen taustasiirtymä. Jokaisella interferenssin lajilla
on oma syynsä ja korjaustapansa. Matriisin mukaan on tehtävä interfer-
enssikorjauksia ja optimoitava suoritusmuuttujia. Joitakin interferenssejä
voidaan välttää laimentamalla tai muuttamalla matriiseja. Kunkin näyte-
erän kanssa on käsiteltävä vertailumateriaali ja väkevöity materiaali,
joissa on tunnettu määrä analyyttiä (analyyttejä) samoin kuin nollama-
teriaali, samalla tavalla kuin näytteet. Liukuman varalta standardi on
tarkistettava esimerkiksi kymmenen näytteen jälkeen. Kaikkien reagens-
sien ja plasmakaasun on oltava puhtainta saatavilla olevaa laatua.
2.4.8 Erityisvaatimukset induktiivisesti kytkettyä massaspektrometriaa
(ICP-MS) varten (11)
Keskimääräisen atomimassan omaavien metallien, kuten kromin,
kuparin ja nikkelin, määritys voi kärsiä muiden isobaaristen ja moniato-
misten ionien aiheuttamasta voimakkaasta interferenssistä. Tilanne
voidaan kiertää vain, jos käytettävissä on vähintään 7 000—8 000:n
erotuskyky. MS-tekniikkaan liittyviä vaikeuksia ovat laitteiden liukuma,
matriisivaikutukset sekä molekulaaristen ionien interferenssi (m/z < 80).
Laitteiden liukuman korjaus ja matriisivaikutusten korjaus vaativat
useita sisäisiä standardeja, jotka kattavat saman massa-alueen kuin
määritettävät alkuaineet.
Näytteissä olevan orgaanisen aineen täydellinen hajottaminen on tarpeen
ennen ICP-MS-mittauksia. Kuten AAS:n tapauksessa, haihtuvat alkuai-
neet, kuten jodi, on siirrettävä vakaaseen hapettumistilaan tiiviisti
suljetuissa astioissa tehdyn digestion jälkeen. Pahimman interferenssin
aiheuttavat argonin (plasmakaasun), vedyn, hiilen, typen ja hapen (liuo-
tinhapot, plasmakaasun epäpuhtaudet ja ilmakehän kaasut) sekä
näytematriisin molekulaariset ioniyhdistelmät. Interferenssien välttämi-
seksi vaaditaan täydellistä hajotusta, taustamittauksia sekä analyyttisten
massojen, johon joskus liittyy matalampi saanto (huonompi osoitusraja),
sekä liuotinhappojen (esim. typpihappo) oikeaa valintaa.
Määritettäviin alkuaineisiin kohdistuvat interferenssit on suljettava pois
valitsemalla sopivat analyyttiset massat, ja myös isotooppisuhteet on
varmistettava. Mittalaitteiden vaste, Fano-tekijät huomioon ottaen, on
tarkistettava sisäisten standardien avulla jokaista mittausta varten.
3VALIDOINTI
Validoinnissa on osoitettava, että määritysmenetelmä täyttää relevantteja suori-
tusarvoja koskevat vaatimukset.
Erityyppistä valvontaa varten käytetään erilaisia menetelmiä. Seuraavassa taulu-
kossa esitetään, mitkä suoritusarvot on todennettava millekin menetelmälle.
Taulukko 9
Määritysmenetelmien luokittelu määritettävien suoritusarvojen perusteella
Päätösraja
CCβPäätösraja
CCαOikeelli-
suus/
SaantoAnalyyt-
tinen tois-
totarkkuusSelektiivi-
syys/Spesi-
fisyysSoveltu-
vuus/
Häiriön-
kestävyys/
Stabiilisuus
Kvalitatii-
viset
mene-
telmätS+–––++
C++––++
Kvantitatii-
viset
mene-
telmätS+––+++
C++++++
S = seulontamenetelmät; C = varmistusmenetelmät; + = määritys on pakollista.2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 18
▼B
3.1 VALIDOINTIMENETTELYT
Tässä luvussa annetaan esimerkkejä ja/tai kirjallisuusviitteitä määritysmenetel-
mien validointimenettelyistä. Sen osoittamiseksi, että määritysmenetelmä
täyttää kyseistä suoritusarvoa koskevat vaatimukset, voidaan käyttää myös muita
tapoja, mikäli saavutetaan sama informaation taso ja laatu.
Validointi voidaan tehdä myös laboratorioidenvälisen tutkimuksen avulla. Sell-
aisia ovat vahvistaneet Codex Alimentarius, ISO ja IUPAC (12). Voidaan tehdä
myös yhden laboratorion tutkimus eli sisäinen validointi (13) (14). Tässä osassa
selostetaan yhden laboratorion tutkimus (sisäinen validointi), jossa sovelletaan
modulaarista lähestymistapaa. Tässä lähestymistavassa on
1. käytetystä validointimallista riippumattomia yhteisiä ominaisuuksia, ja
2. spesifisempiä mallista riippuvaisia menettelyjä, kuten taulukossa 10 seloste-
taan.
Taulukko 10
Mallista riippumattomat ja riippuvaiset suoritusarvomuuttujat
Validointi
Mallista riippumattomat suoritusar-
vomuuttujatMallista riippuvaiset suoritusarvomuuttujat
Yleiset suoritusominaisuudet
(3.1.1)Tavanomainen validointitapa
(3.1.2)Sisäinen validointitapa (3.1.3)
Spesifisyys Saanto Saanto
Oikeellisuus Toistettavuus Toistettavuus
Häiriönkestävyys: pienet
muutoksetLaboratorion sisäinen uusitta-
vuusLaboratorion sisäinen uusitta-
vuus
Stabiilisuus Uusittavuus Uusittavuus
Päätösraja (CC α) Päätösraja (CC α)
Detektiokyky (CC β) Detektiokyky (CC β)
Kalibrointikäyrät Kalibrointikäyrät
Häiriönkestävyys: suuret
muutoksetHäiriönkestävyys
3.1.1 Mallista riippumattomat suoritusominaisuudet
Valitusta validointimenetelmästä riippumatta on määritettävä seuraa-
vassa esitetyt suoritusarvot. Työmäärän vähentämiseksi eri parametrien
määrittämiseksi tehtyjä kokeita voidaan yhdistää huolellisesti suunni-
tellun ja tilastollisesti pätevän menettelyn mukaisesti.
3.1.1.1 Spesifisyys
Analyyttisissä menetelmissä kyky erottaa analyytti sitä läheisesti muis-
tuttavista aineista (isomeereista, metaboliiteista, hajoamistuotteista,
endogeenisista aineista, matriisin komponenteista jne.) on tärkeä. Inter-
ferenssien käsittelemiseksi tarvitaan kaksi lähestymistapaa.
Sitä varten on valittava mahdollisesti interferoivat aineet, ja relevantit
nollanäytteet on analysoitava mahdollisten interferenssien toteamiseksi
ja niiden vaikutusten arvioimiseksi.
— valitaan joukko kemiallisesti toisiaan lähellä olevia yhdisteitä (meta-
boliitteja, johdoksia jne.) tai muita aineita, joita todennäköisesti
esiintyy yhdessä tutkittavan yhdisteen kanssa, jota voi olla
näytteissä,
— analysoidaan sopiva määrä edustavia nollanäytteitä (n ≥20) ja
etsitään interferenssejä (signaaleja, piikkejä, ionien jälkiä) sillä
alueella, jossa kohteena olevan analyytin oletetaan eluoituvan,
— vastaavat nollanäytteet on lisäksi väkevöitävä relevanttiin konsen-
traatioon aineella, jotka todennäköisesti interferoivat analyytin
tunnistuksen ja/tai kvantifioinnin kanssa,
— määrityksen jälkeen on tutkittava:
— aiheuttaako aineen läsnäolo väärän tunnistuksen,
— vaikeuttaako yhden tai useamman interferenssin vaikutus
kohdeanalyytin tunnistusta,
— onko vaikutuskvantifiointiin huomattava.2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 19
▼B
3.1.1.2 Oikeellisuus
Tässä kappaleessa kuvataan oikeellisuuden (yksi tarkkuuden osatekijä)
määrittäminen. Oikeellisuus voidaan määrittää vain sertifioidun vertailu-
materiaalin (CRM) avulla. Sertifioituja vertailumateriaaleja on
käytettävä aina, kun sellainen on saatavilla. Menetelmä on kuvattu tark-
kaan standardissa ISO 5725-4 (5). Seuraavassa on esimerkki:
— analysoidaan kuusi CRM:n rinnakkaisnäytettä testiohjeiden mukai-
sesti,
— määritetään analyytin konsentraatio kussakin rinnakkaisnäytteessä,— lasketaan konsentraatioiden keskiarvo, keskihajonta ja vaihteluker-
roin (%),
— lasketaan oikeellisuus jakamalla tulokseksi saatu keskimääräinen
konsentraatio sertifioidulla arvolla (mitattu konsentraationa) ja kerro-
taan tulos sadalla prosentuaalisen tuloksen saamiseksi:
Oikeellisuus ( %) = keskimääräinen saannon suhteen korjattu konsen-
traatio × 100 / sertifioitu arvo.
Jos CRM:ää ei ole saatavissa, voidaan oikeellisuuden asemesta määrittää
saanto kohdassa 4.1.2.1 esitetyllä tavalla.
3.1.1.3 Sovellettavuus ja/tai häiriönkestävyys (pienet muutokset)
Näissä tutkimuksissa laboratorio aiheuttaa tarkoituksella pieniä, todelli-
sissa tilanteissa esiintyviä muutoksia ja tarkkailee niiden vaikutuksia.
Esitutkimuksessa on valittava näytteen esikäsittelyyn, puhdistukseen ja
määritykseen liittyviä tekijöitä, jotka voivat vaikuttaa mittaustuloksiin.
Näitä tekijöitä voivat olla määrityksen suorittava henkilö, reagenssien,
liuottimien, standardien ja näyteliuosten lähde ja ikä, lämmitysnopeus,
lämpötila, pH-arvo ja monet muut laboratoriossa esiintyvät tekijät.
Näitä muutoksia on varioitava sellaisessa kertaluokassa, joka vastaa
laboratorioissa yleensä esiintyviä poikkeamia.
— yksilöidään tuloksiin mahdollisesti vaikuttavia tekijöitä,
— muutetaan jokaista tekijää hieman,— tehdään häiriönkestävyystesti Youdenin menetelmällä (15) (16).
(Muitakin hyväksyttyjä menetelmiä voidaan käyttää, mutta Youdenin
menetelmään tarvitaan erityisen vähän aikaa ja vaivaa.) Menetelmä
perustuu osittaistekijämenetelmään. Eri tekijöiden välisiä riippu-
vuuksia ei voida osoittaa,
— jos jokin tekijä vaikuttaa huomattavasti mittaustuloksiin, tehdään
lisäkokeita, joiden perusteella voidaan päättää tämän tekijän hyväk-
syttävät rajat,
— sellaiset tekijät, jotka vaikuttavat huomattavasti tuloksiin, on ilmoi-
tettava selkeästi menetelmäkuvauksessa.
Perusajatus ei ole yhden muutoksen tutkiminen kerrallaan vaan useiden
muutosten tekeminen samalla kertaa. Olkoot esimerkiksi A, B, C, D, E,
F ja G seitsemän sellaisen tekijän nimellisarvot, joiden pieni muutta-
minen voisi vaikuttaa tuloksiin. Merkittäköön näiden tekijöiden
vaihtoehtoisia arvoja vastaavilla pienillä kirjaimilla a, b, c, d, e, f ja g.
Arvoista voidaan muodostaa 2
7eli 128 erilaista yhdistelmää.
On mahdollista valita sellainen kahdeksan yhdistelmän osajoukko, jossa
isot ja pienet kirjaimet ovat tasapainossa (Taulukko 11). Tehdään
kahdeksan määritystä, joissa käytetään valittujen tekijöiden (A—G)
yhdistelmää. Määritystulokset esitetään taulukossa 11 (S—Z).
Taulukko 11
Koejärjestely häiriönkestävyyden testausta varten (pienet muutokset)
Tekijän arvo
FMääritysyhdistelmän numero
12345678
A/a A A A A a a a a
B/b B B b B B B b b
C / c CcCcCcCcD/d D D d d d d D D
E / e EeEeeEeE
F / f FffFFffF
G / g GggGgGGg2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 20
▼B
Tekijän arvo
FMääritysyhdistelmän numero
12345678
Havaittu
tulosRSTUV W XYZ
Laskuesimerkkejä häiriönkestävyystestauksesta on kohdassa 3.3.
3.1.1.4 Stabiilisuus
On havaittu, että tutkittavan aineen tai näytteen matriisin komponenttien
riittämätön stabiilisuus säilytyksen tai määrityksen aikana voi aiheuttaa
huomattavia poikkeamia määritystuloksissa. Lisäksi myös kalibrointis-
tandardin stabiilisuus liuoksessa on tarkistettava. Analyytin stabiilisuus
on yleensä hyvin karakterisoitu eri säilytysoloissa. Säilytysolojen seur-
anta on osa laboratorion normaalia akkreditointijärjestelmää.
Seuraavassa on esimerkkejä siitä, miten stabiilisuus voidaan määrittää,
kun sitä ei tunneta.
Analyytin stabiilisuus liuoksessa
— valmistetaan analyyt(e)istä tuoreet kantaliuokset ja laimennetaan ne
testiohjeissa esitetyllä tavalla, jotta saadaan riittävä määrä (esim.
40) osanäytteitä kutakin valittua konsentraatiota kohti (pienimmän
vaaditun suoritusrajan lähellä aineille, joille ei ole vahvistettu
sallittua rajaa, tai sallitun rajan lähellä muille aineille). Valmistetaan
analyyttiliuokset sekä väkevöintiä että lopullista määritystä varten
sekä mahdolliset muut tarvittavat liuokset (esim. johdosstandardit),
— mitataan analyyttipitoisuus juuri valmistetussa liuoksessa testioh-
jeiden mukaisesti,
— siirretään asianmukaiset määrät liuosta sopiviin astioihin, merkitään
astiat ja säilytetään niitä seuraavan suunnitelman mukaisesti:
Taulukko 12
Analyytin stabiilisuuden määrittäminen liuoksessa
–2 0º C +4º C +2 0º C
Pimeässä 10 näytettä 10 näytettä 10 näytettä
Valossa 10 näytettä
— säilytysajaksi voidaan valita 1, 2, 3 tai 4 viikkoa tai tarvittaessa
pidempi aika, esimerkiksi siihen asti, kun ensimmäiset hajoami-
silmiöt ovat havaittavissa tunnistuksen ja/tai kvantifioinnin
yhteydessä. Enimmäissäilytysaika ja optimaaliset säilytysolosuhteet
on kirjattava,
— analyytin (analyyttien) konsentraation laskeminen kustakin
näytteestä on tehtävä käyttämällä tuoreen liuoksen konsentraatiota
100-prosenttisena arvona.
Jäljellä oleva analyytti (%) = Cix 100 / Ctuore
Cikonsentraatio tietyllä ajan hetkellä
Ctuoretuoreen liuoksen konsentraatio
Analyytin (analyyttien) stabiilisuus matriisissa
— aitoja näytteitä on käytettävä aina kun se on mahdollista. Jos aitoa
materiaalia ei ole saatavilla, on käytettävä analyytillä väkevöityä
matriisia,
— jos aitoa materiaalia on saatavilla, aineen konsentraatio näytteessä on
määritettävä materiaalin ollessa vielä tuoretta. Materiaalista voidaan
ottaa lisää näytteitä 1, 2, 4 ja 20 viikon kuluttua ja määrittää niiden
konsentraatiot. Kudoksen säilytyslämpötilan on oltava tarvittaessa
vähintään - 20 ºC,
— jos aitoa materiaalia ei ole käytettävissä, otetaan nollamateriaalia ja
homogenoidaan se. Materiaali jaetaan viiteen osaan. Osat
väkevöidään analyytillä, joka on mieluiten valmistettava pieneen
määrään vesiliuosta. Yksi osanäyte analysoidaan heti. Muita osanäyt-
teitä säilytetään vähintään - 20 ºC:n lämpötilassa, ja ne analysoidaan
1, 2, 4 ja 20 viikon kuluttua.2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 21
▼B
3.1.1.5 Kalibrointikäyrät
Kun kvantifiointiin käytetään kalibrointikäyriä:
— käyrän muodostamiseen on käytettävä vähintään viittä tasoa (nolla
mukaan lukien),
— käyrän toiminta-alue on kuvattava,
— käyrän matemaattinen kaava ja datapisteiden sovituksen hyvyys on
kuvattava,
— käyrän muuttujien hyväksyttävyysrajat on kuvattava.
Jos on tarvetta käyttää standardiliuokseen perustuvaa sarjakalibrointia,
kalibrointikäyrän muuttujille on esitettävä hyväksymisrajat (jotka voivat
vaihdella sarjojen välillä).
3.1.2 Tavanomaiset validointitavat
Muuttujien laskenta tavanomaisilla menetelmillä vaatii useita erillisiä
kokeita. Jokainen suoritusarvo on määritettävä kutakin suurta muutosta
kohti (ks. edellä oleva sovellettavuutta ja/tai häiriönkestävyyttä koskeva
kohta). Useita analyyttejä kattavissa menetelmissä voidaan analysoida
useita aineita samanaikaisesti, kunhan mahdollisesti merkitykselliset
interferenssit on etukäteen suljettu pois. Useita suoritusarvoja voidaan
määrittää samankaltaisella tavalla. Työmäärän vähentämiseksi onkin
suositeltavaa yhdistellä kokeita niin paljon kuin mahdollista (esim. tois-
tettavuus ja laboratorion sisäinen uusittavuus yhdessä spesifisyyden
kanssa tai nollanäytteiden määritys päätösrajan määritystä varten
yhdessä spesifisyyden testauksen kanssa).
3.1.2.1 Saanto
Jos käytettävissä ei ole sertifioitua vertailumateriaalia, saanto on
määritettävä kokeellisesti väkevöidyn nollamatriisin avulla esimerkiksi
seuraavalla tavalla:
— nollamateriaalista valmistetaan 18 osanäytettä. Kuusi osanäytettä
väkevöidään siten, että konsentraatio on 1, 1,5 tai 2 kertaa vähim-
mäissuoritusraja tai 0,5, 1 ja 1,5 kertaa sallittu raja,
— näytteet analysoidaan ja kunkin näytteen konsentraatio lasketaan,
— kunkin näytteen saanto lasketaan jäljempänä esitettävän yhtälön
avulla,
— keskimääräinen saanto ja vaihtelukerroin lasketaan kullakin tasolla
saaduista kuudesta tuloksesta,
— saanto- % = 100 × mitattu määrä / väkevöimismäärä.
Tätä tavanomaista menetelmää saannon määrittämiseksi voidaan käyttää
kohdassa 3.5 esitetyn standardilisäysmenetelmän muunnoksena, kun
— näyte katsotaan nollanäytteeksi eikä tutkittavaksi näytteeksi,
— analyytin määrän näytteessä (uuton jälkeen) (1) ja sen saannon (2)
katsotaan olevan samat molemmissa näyteannoksissa,
— testinäytteiden massat ovat samat, ja testiannosuutteiden tilavuudet
ovat samat,
— toiseen (väkevöityyn) testiannokseen lisätyn kalibrointistandardin
määrää merkitään xADD. (xADD = ρA.VA),
— x1 on nollanäytteen mitattu arvo ja x2 on toisen (väkevöidyn)
testiannoksen mitattu arvo,
— Täten saanto- % = 100 (x2 -x1) / xADD.
Jos jokin edellä mainituista ehdoista ei täyty tai sen ei uskota täyttyvän,
on saanto määritettävä täydellisen kaavan mukaan standardilisäysmene-
telmällä kohdan 3.5 mukaisesti.
3.1.2.2 Toistettavuus
— valmistetaan joukko näytteitä, joiden matriisit ovat identtiset ja jotka
on väkevöity niin, että konsentraatiot vastaavat 1, 1,5 ja 2 kertaa
vähimmäissuoritusrajaa tai 0,5, 1 ja 1,5 kertaa sallittua rajaa,
— määritys on tehtävä kullakin tasolla vähintään kuudelle rinnakkais-
näytteelle,
— näytteet analysoidaan,
— kunkin näytteen konsentraatio lasketaan,2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 22
(1) Analyytin määrä (yield): se näytteessä olevan analyytin massaosuus, joka on läsnä
lopullisessa uutteessa.
(2) Saanto (tässä): se näytteeseen lisätyn analyytin massaosuus, joka on läsnä lopullisessa
uutteessa. Muissa asiakirjan osissa oletetaan, että nämä kaksi arvoa ovat samat, ja näin
ollen käytetään ainoastaan termiä ”saanto”.
▼B
— väkevöityjen näytteiden keskimääräinen konsentraatio, keskihajonta
ja vaihtelukerroin (%) lasketaan,
— nämä vaiheet toistetaan ainakin kaksi kertaa,
— kaikkien väkevöityjen näytteiden keskimääräiset konsentraatiot ja
vaihtelukertoimet lasketaan.
3.1.2.3 Laboratorion sisäinen uusittavuus
— valmistetaan määrätystä testimateriaalista (joiden matriisi on sama
tai erilainen) joukko näytteitä, jotka on väkevöity analyytillä niin,
että konsentraatiot vastaavat 1, 1,5 ja 2 kertaa vähimmäissuoritus-
rajaa tai 0,5, 1 ja 1,5 kertaa sallittua rajaa,
— määritys on tehtävä kullakin tasolla vähintään kuudelle rinnakkais-
näytteelle,
— nämä vaiheet toistetaan ainakin kahdella muulla kerralla niin, että
laitteiden käyttäjä ja ympäristöolosuhteet, kuten reagenssien ja liuot-
timien erät, huonelämpötila, mittalaitteet jne. muuttuvat, mikäli
mahdollista,
— näytteet analysoidaan,— kunkin näytteen konsentraatio lasketaan,
— väkevöityjen näytteiden keskimääräinen konsentraatio, keskihajonta
ja vaihtelukerroin (%) lasketaan.
3.1.2.4 Uusittavuus
Kun uusittavuus on todennettava, laboratorioiden olisi osallistuttava
ISO-standardin 5725-2 (5) mukaisiin kollaboratiivisiin tutkimuksiin.
3.1.2.5 Päätösraja (CC α)
Päätösraja on vahvistettava tunnistuksen tai sekä tunnistuksen että kvan-
tifioinnin vaatimusten mukaisesti siten kuin osassa 2 ”Analyyttisiä
menetelmiä koskevat suorituskykyperusteet ja muut vaatimukset” on
selostettu.
Jos aineille ei ole vahvistettu sallittua rajaa, CC αvoidaan vahvistaa
— joko ISO-standardin 11843 (17) mukaisella kalibrointikäyrämene-
telmällä (jota tässä kutsutaan nettotilamuuttujan kriittiseksi arvoksi).
Tässä tapauksessa on käytettävä nollamateriaalia, joka väkevöidään
siten, että konsentraatio on vähimmäissuoritustason kohdalla ja sen
yläpuolella tasaisin välein. Näytteet analysoidaan. Tunnistuksen
jälkeen piirretään kuvaaja, jossa esitetään signaali lisätyn konsentraa-
tion funktiona. Päätösraja on yhtä suuri kuin y-akselin
leikkauspistettä vastaava konsentraatio plus 2,33 kertaa leikkauspis-
tettä vastaavan laboratorion sisäisen uusittavuuden keskihajonta.
Tämä koskee vain kvantitatiivisia analyyseja ( α= 1 %),
— tai analysoimalla vähintään 20 nollamateriaalia matriisia kohti, jotta
voitaisiin laskea signaali-kohinasuhde siinä aikaikkunassa, jossa
tutkittavan aineen oletetaan esiintyvän. Päätösrajana voidaan käyttää
signaali-kohinasuhdetta kerrottuna kolmella. Tämä koskee sekä
kvantitatiivisia että kvalitatiivisia analyyseja.
Jos aineille on vahvistettu sallittu raja, CC αvoidaan vahvistaa
— joko ISO-standardin 11843 (17) mukaisella kalibrointikäyrämene-
telmällä (jota tässä kutsutaan nettotilamuuttujan kriittiseksi arvoksi).
Tässä tapauksessa on käytettävä nollamateriaalia, joka väkevöidään
tasaisin välein sallittujen rajojen ympärillä. Näytteet analysoidaan.
Tunnistuksen jälkeen piirretään kuvaaja, jossa esitetään signaali
lisätyn konsentraation funktiona. Päätösraja on yhtä suuri kuin sallit-
tuja rajoja vastaava konsentraatio plus 1,64 kertaa laboratorion
sisäisen uusittavuuden keskihajonta ( α= 5 %),
— tai analysoimalla vähintään 20 sellaista nollamateriaalia matriisia
kohti, jotka on väkevöity analyyt(e)illä siten, että konsentraatio
vastaa sallittua rajaa. Päätösraja on yhtä suuri kuin sallittua rajaa
vastaava konsentraatio plus 1,64 kertaa vastaava keskihajonta
(α= 5 %).
Ks. myös 5 artikla ja kohta 3.2.
3.1.2.6 Detektiokyky (CC β)
Detektiokyky on määritettävä seulonnan, tunnistuksen tai tunnistuksen ja
kvantifioinnin vaatimusten mukaisesti siten kuin osassa 2 on esitetty.
Jos aineille ei ole vahvistettu sallittua rajaa, CC βvoidaan vahvistaa
— joko ISO-standardin 11843 (17) mukaisella kalibrointikäyrämene-
telmällä (jota tässä kutsutaan nettotilamuuttujan pienimmäksi
havaittavaksi arvoksi). Tässä tapauksessa on käytettävä edustavaa2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 23
▼B
nollamateriaalia, joka väkevöidään siten, että konsentraatio on
vähimmäissuoritustason kohdalla ja sen alapuolella tasaisin välein.
Näytteet analysoidaan. Tunnistuksen jälkeen piirretään kuvaaja, jossa
esitetään signaali lisätyn konsentraation funktiona. Detektiokyky on
yhtä suuri kuin päätösrajaa vastaava konsentraatio plus 1,64 kertaa
päätösrajaa vastaavan keskimääräisen mitatun pitoisuuden labora-
torion sisäisen uusittavuuden keskihajonta ( β= 5 %),
— analysoimalla matriisia kohti vähintään 20 sellaista nollamateriaali-
näytettä, jotka on väkevöity tutkittavalla aineella päätösrajan
mukaisiksi. Analysoidaan näytteet ja tunnistetaan analyytit. Detektio-
kyky on yhtä suuri kuin päätösraja plus 1,64 kertaa mitatun
pitoisuudenlaboratorion sisäisenuusittavuuden keskihajonta ( β=5%),
— jos kvantitatiivisia tuloksia ei ole saatavilla, detektiokyky voidaan
määrittää tutkimalla väkevöityä nollamateriaalia päätösrajan kohdalla
ja sen yläpuolella. Tässä tapauksessa menetelmän detektiokyky on
yhtä suuri kuin se konsentraatio, jolla esiintyy enää enintään 5 %
vääriä vaatimustenmukaisia tuloksia. Jotta taattaisiin määrityksen
luotettavuus, ainakin yhdellä konsentraatiotasolla on tehtävä ainakin
20 tutkimusta.
Jos aineille on vahvistettu sallittu raja, CC βvoidaan vahvistaa
— joko standardin ISO 11843 (17) mukaisella kalibrointikäyrämene-
telmällä (jota tässä kutsutaan nettotilamuuttujan pienimmäksi
havaittavaksi arvoksi). Tässä tapauksessa on käytettävä edustavaa
nollamateriaalia, joka väkevöidään tasaisin välein sallitun rajan
ympärillä. Analysoidaan näytteet ja tunnistetaan analyytit. Lasketaan
keskimääräisen mitatun pitoisuuden keskihajonta päätösrajan
kohdalla. Detektiokyky on yhtä suuri kuin päätösrajaa vastaava
konsentraatio plus 1,64 kertaa keskimääräisen mitatun pitoisuuden
laboratorion sisäisen uusittavuuden keskihajonta ( β= 5 %),
— tai analysoimalla matriisia kohti vähintään 20 sellaista nollamater-
iaalia, jotka on väkevöity analyyt(e)illä päätösrajaa vastaaviksi.
Detektiokyky on yhtä suuri kuin päätösraja plus 1,64 kertaa vastaava
keskihajonta ( β= 5 %).
Katso myös kohta 3.2.
3.1.2.7 Häiriönkestävyys (suuret muutokset)
Määritysmenetelmä on testattava erilaisissa koeolosuhteissa, joihin
kuuluvat esim. eri lajit, eri matriisit ja erilaiset näytteenotto-olosuhteet.
Tehtyjen muutosten on oltava suuria. Näiden muutosten merkitystä
voidaan arvioida esimerkiksi Youdenin menetelmällä (15) (16). Kukin
suoritusarvo on määritettävä kaikkien niiden suurten muutosten osalta,
joilla on osoitettu olevan merkittävä vaikutus määrityksen suoritusky-
kyyn.
3.1.3 Vaihtoehtoisten mallien mukainen validointi
Joskäytetään vaihtoehtois ia validointimenetelmiä, pohjana oleva malli
ja strategia ja siihen liittyvät vaatimukset, oletukset ja kaavat on
määriteltävä validointikuvauksessa tai niihin on vähintäänkin annettava
viitteet. Seuraavassa on esitetty esimerkki vaihtoehtoisesta mene-
telmästä. Jos käytetään esimerkiksi laboratorionsisäistä validointimallia,
suoritusarvot määritetään sellaisella tavalla, joka mahdollistaa suuriin
muutoksiin liittyvän validoinnin samassa validointimenettelyssä. Tämä
edellyttää koesuunnitelman laatimista validointia varten.
3.1.3.1 Koesuunnitelma
Koesuunnitelma määräytyy käytettyjen eläinlajien lukumäärän ja tutkit-
tavien tekijöiden mukaan. Koko validointimenettelyn ensimmäisessä
vaiheessa on otettava huomioon laboratoriossa tulevaisuudessa analysoi-
tavat näytepopulaatiot, jotta voitaisiin valita tärkeimmät eläinlajit ja
mittaustuloksiin mahdollisesti vaikuttavat tekijät. Tämän jälkeen on
valittava konsentraatioalue tarkoitukseen sopivalla tavalla tärkeäksi
katsotun tason perusteella.
Esimerkki:
— Validoitavalla määritysmenetelmällä voidaan tutkia useita
analyyttejä samanaikaisesti.
— On tunnistettu kaksi johtavan tekijän muunnosta (A ja B). Tekijöiden
tasoja yhdistellään näiden johtavien tekijöiden pohjalta. Johtaviatekijöitä voivat olla esimerkiksi eläinlaji tai matriisi. Tässä esimer-
kissä johtava tekijä vaihtelee kahdella tasolla eli tarkastellaan kahta
eri eläinlajia (lajit A ja B). Yleisesti on mahdollista vaihdella
johtavia tekijöitä useammalla kuin kahdella tasolla. Tämä lisää tehtä-
vien analyysien määrää.2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 24
▼B
— Valittuja tekijöitä varioidaan kahdella tasolla (joita merkitään
merkinnöillä + ja -).
Taulukko 13
Esimerkkejä validointimenettelyssä tärkeinä pidetyistä tekijöistä
Eläimen sukupuoli (tekijä 1)
Rotu (tekijä 2)Kuljetusolosuhteet (tekijä 3)
Säilytysolosuhteet (tekijä 4)
Näytteen tuoreus(tekijä 5)Lihotusolosuhteet (tekijä 6)
Eri suorittajat, joilla on erilainen kokemus (tekijä 7)
Taulukko 14
Mahdollinen koesuunnitelma edellä olevaa esimerkkiä varten
Laji Tekijä 1 Tekijä 2 Tekijä 3 Tekijä 4 Tekijä 5 Tekijä 6 Tekijä 7Näytteen
numero
A+ + + + – + – 1
A+ + – – + – – 2
A +–+–––+ 3
A +––++++ 4
A –++–+++ 5
A– + – + – – + 6
A ––+++–– 7A –––––+– 8
B +++++–+ 9
B ++–––++ 1 0
B +–+–++–1 1
B +––+––– 1 2
B –++–––– 1 3
B –+–+++–1 4
B– – + + – + + 1 5
B ––––+–+ 1 6
Koska kuhunkin näytteeseen (jokaiseen tekijätasojen yhdistelmään) on
lisättävä tutkittavaa ainetta neljällä eri konsentraatiolla, jotka ovat
lähellä valittua tasoa, ja koska jokaisella tasolla on analysoitava yksi
nollanäyte, koko validointimenettelyssä on suoritettava 5 x 16 = 80
analyysia.
Näistä 80:stä mittaustuloksesta voidaan laskea (13) (14):Saanto
— Toistettavuus konsentraatiotasoa kohti (s
ir)
— Laboratorion sisäinen uusittavuus konsentraatiotasoa kohti (siR)
— Päätösraja (CC α)
— Detektiokyky (CC β)
— Tehokkuuskäyrä ( β-virhe konsentraation funktiona (ks. 3.1.3.2))
— Häiriönkestävyys (suuret muutokset); häiriönkestävyys pienten
muutosten suhteen voidaan määrittää kohdan 3.1.1.3 mukaisesti)
— 16 näytteeseen liittyvää kalibrointikäyrää— 1 yleinen kalibrointikäyrä— Yleisen kalibrointikäyrän ennusteväli— Matriisin aiheuttamat poikkeamat (s
mat)
— Analyysiajon aiheuttamat poikkeamat (srun)2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 25
▼B
— Yksittäisten tekijöiden vaikutus mittaustuloksiin.
Näiden suoritusarvojen avulla menetelmän suorituskyky voidaan
arvioida perusteellisesti, sillä yksittäisten tekijöiden lisäksi tutkitaan
myös niiden yhdistelmien vaikutusta. Tämän koesuunnitelman avulla
on mahdollista päätellä, onko jokin valituista tekijöistä jätettävä pois
yleisestä kalibrointikäyrästä siksi, että se poikkeaa huomattavasti muiden
tekijöiden keskihajonnasta.
3.1.3.2 Tehokkuuskäyrä
Tehokkuuskäyrä antaa tietoja menetelmän detektiokyvystä valitulla
konsentraatioalueella. Se antaa tietoa tutkitun menetelmän β-virher-
iskistä. Tehokkuuskäyrän avulla voidaan laskea eri luokkiin (seulonta,
varmistus) tai tyyppeihin (kvalitatiivinen tai kvantitatiivinen) kuuluvien
menetelmien detektiokyky tietyllä β-virheellä (esimerkiksi 5 %).2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 26
▼B
Kuva 1:
Tehokkuuskäyrä
Kuvassa 1 on esimerkki määritysmenetelmän detektiokyvyn (CC β)graa-
fisesta määrittämisestä. Tällä nimenomaisella menetelmällä jäljellä oleva
väärän päätöksen tekemisen riski on 5 %, kun konsentraatio on 0,50 µg/
kg. Kun konsentraatio on 0,55 g/kg, väärän vaatimustenmukaisuutta
merkitsevän päätöksen riski pienenee 1 prosenttiin.
3.1.3.3 Uusittavuus
Menetelmän uusittavuuden määritys laboratorionsisäisellä validointime-
netelmällä vaatii toistuvaa osallistumista ISO:n ohjeiden 43-1 (3) ja 43-
2 (4) mukaiseen pätevyystutkimukseen. Laboratoriot saavat itse valita
menetelmänsä, kunhan menetelmiä käytetään rutiiniolosuhteissa. Labor-
atorion keskihajontaa voidaan käyttää menetelmän uusittavuuden
arvioimiseen.2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 27
▼B
3.2 ERILAISTEN ANALYYTTISTEN RAJOJEN GRAAFINEN ESITYS
Kuva 2:
Aineet, joille ei ole vahvistettu sallittua rajaa
2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 28
▼B
Kuva 3:
Aineet, joille on vahvistettu sallittu raja
2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 29
▼B
3.3 LASKUESIMERKKI HÄIRIÖNKESTÄVYYSTESTAUKSESTA PIENTEN
MUUTOSTEN SUHTEEN YOUDENIN MENETELMÄLLÄ (16)
Keskiarvojen (A) vertailu
AA=Σ(Ai)/4
AB=Σ(Bi)/4
AC=Σ(Ci)/4
AD=Σ(Di)/4
AE=Σ(Ei)/4
AF=Σ(Ei)/4
AG=Σ(Gi)/4
Aa=Σ(ai)/4
Ab=Σ(bi)/4
Ac=Σ(ci)/4
Ad=Σ(di)/4
Ae=Σ(ei)/4
Af=Σ(fi)/4
Ag=Σ(gi)/4Vertaa isojen kirjainten keskiarvoja (AA—AG) vastaavien pienten kirjainten
keskiarvoihin (Aa—Ag). Jos tekijällä on merkitystä, erotus on merkittävästi suur-
empi kuin muiden tekijöiden erotukset.
Laboratorioiden välisten, lähes väistämättömien erojen ei pitäisi vaikuttaa
häiriöitä hyvin sietävän menetelmän suorituskykyyn.
Jos mitään selkeää eroa ei ole, kyseiset seitsemän erotusta antavat oikeimman
kuvan satunnaisvirheestä.
Erotukset (Di) Erotusten neliöt (Di2)
Da=A–a= Σ(Ai)–Σ(ai)
Db=B–b= Σ(Bi)–Σ(bi)
Dc=C–c= Σ(Ci)–Σ(ci)
Dd=D–d= Σ(Di)–Σ(di)
De=E–e= Σ(Ei)–Σ(ei)
Df=F–f= Σ(Fi)–Σ(fi)
Dg=G–g= Σ(Gi)–Σ(gi)Da2= arvo a
Db2= arvo b
Dc2= arvo c
Dd2= arvo d
De2= arvo e
Df2= arvo f
Dg2= arvo g
Erotusten keskihajonta Di(SDi):
JosSDion merkittävästi suurempi kuin menetelmän keskihajonta laboratorion
sisäisissä uusittavuusolosuhteissa edellä selostetun mukaisesti, on itsestään
selvää, että kaikilla tekijöillä on yhdessä vaikutusta tulokseen, vaikka mikään
yksittäinen tekijä ei osoitakaan suurta vaikutusta, ja että menetelmä ei kestä
häiritä riittävän hyvin valittujen muutosten suhteen.
3.4 LASKUESIMERKKEJÄ SISÄISTÄ VALIDOINTIMENETTELYÄ
VARTEN
Esimerkkejä ja laskuja sisäistä validointia varten on kohdassa 3.1.3 (validointi
vaihtoehtoisten mallien mukaan) (13) (14).
3.5 ESIMERKKEJÄ STANDARDILISÄYSMENETELMÄÄ VARTEN
Testinäyte, joka sisältää analyyttiä määrän T, jaetaan kahteen testiannokseen 1
ja 2, joiden massat ovat m1ja m2. Testiannokseen 2 lisätään tilavuus VAanalyyt-
tiliuosta, jonka konsentraatio on ρA. Menetelmän erotus- ja puhdistusvaiheiden
jälkeen saadaan kaksi testiannosuutetta, joiden tilavuudet ovat V1ja V2. Tutkit-
tavan aineen saannon oletetaan olevan rc. Molemmat näytteet määritetään
mittausmenetelmällä, jonka herkkyys on b, ja analyyttiset vasteet ovat x1ja x2.
Jos oletetaan, että rc ja b ovat samoja alkuperäisessä näytteessä ja väkevöidyssä
näytteessä olevalle analyytille, pitoisuus T voidaan laskea kaavasta
T=x1.V1.ρA.VA/( x2.V2.m1-x1.V1.m2)
Menetelmän avulla voidaan määrittää saanto rc. Tämän jälkeen, edellä kuvatun
määrityksen lisäksi, osaan testiannosta 1 (tilavuus V3) lisätään tunnettu määrä
ρB.VBanalyyttiä, joka määritetään. Määritysvaste on x3, ja saanto on
rc = x2.V1.V2.ρB.VB/[ x3.V1.V3(T.m2+ρA.VA)-x2.V2.T.m1(V3-VB)]
Lisäksi on mahdollista laskea herkkyys b kaavasta2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 30
▼B
b=x1.V1/ rc.T.m1
Kaikki sovellusehdot ja yksityiskohdat on selostettu kirjallisuudessa (18).
4KÄYTETYT LYHENTEET
AAS atomiabsorptiospektrometria
AES atomiemissiospektrometriaAOAC-I Association of Official Analytical Chemists INTERNATIONALB sitoutunut osuus (immunologisissa määrityksissä)CI kemiallinen ionisaatio
CRM sertifioitu vertailumateriaali
CV vaihtelukerroin2 D kaksiulotteinenDAD diodirividetektioDPASV differentiaalipulssitekniikalla tehtävä anodinen liuotusvoltammetria
ECD elektronisieppausdetektio
EI elektroni-iskuionisaatioGC kaasukromatografiaHPLC korkean suorituskyvyn nestekromatografiaHPTLC korkean suorituskyvyn ohutkerroskromatografia
HRMS korkean erotuskyvyn (massaspektrometria)
ICP-AES induktiivisesti kytkettyyn plasmaan perustuva atomiemissiospektro-
metria
ICP-MS induktiivisesti kytkettyyn plasmaan perustuva massaspektrometria
IR infrapuna
ISO Kansainvälinen standardoimisjärjestöLC nestekromatografiaLR(MS) alhaisen erotuskyvyn (massaspektrometria)MRPL pienin vaadittu suoritusraja
MS massaspektrometria
m/z massan ja varauksen suhdeRF (analyyttitäplän) kulkeutuminen suhteessa liuotinvyöhykkeen eture-
unaan (TLC)
RSDL laboratorion suhteelliset keskihajonnat
SIM valitun ionin monitorointiTLC ohutkerroskromatografiaUV ultraviolettivaloVIS näkyvä valo
5KIRJALLISUUSVIITTEET
(1) ISO 17025: 1999 General requirement for the competence of calibration
and testing laboratories
(2) ISO 3534-1: 1993 Statistical Methods for quality control — Vol. 1
vocabulary and symbols
(3) ISO Guide 43-1:1997 Proficiency testing by interlaboratory comparisons
— Part 1: Development and operation of proficiency testing schemes
(4) ISO Guide 43-2:1997 Proficiency testing by interlaboratory comparisons
— Part 2: Selection and use of proficiency testing schemes by labora-
tory accreditation bodies
(5) ISO 5725:1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement
methods and results — Part 1: General principles and definitions; ISO
5725-2 Part 2: Basic method for the determination of repeatability and
reproducibility of a standard measurement method; Part 4: Basic
methods for the determination of the trueness of a standard measurement
method
(6) ISO 78-2:1999 Chemistry — Layouts for standards — Part 2: Methods
of chemical analysis2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 31
▼B
(7) W.G de Ruig and J.M Weseman ”A new approach to confirmation by
infrared spectrometry” J. Chemometrics 4 (1990) 61-77
(8) See e.g. May, T.W., Brumbaugh, W.G., 1982, Matrix modifier and
L'vov platform for elimination of matrix interferencesin the analys isof
fish tissues for lead by graphite furnace atomic absorption spectrometry:
Analytical Chemistry 54(7):1032-1037 (90353)
(9) Applicationsof Zeeman Graphite Furnace Atomic Abs orption Spectro-
metry in the Chemical Laboratory and in Toxicology, C. Minoia, S.
Caroli (Eds.), Pergamon Press (Oxford), 1992, pp. xxvi + 675
(10) Inductively Coupled Plasmas in Analytical Atomic Spectrometry, A.
Montaser, D. W. Golighty (Eds.), VCH Publishers, Inc. (New York),
1992
(11) Plasma Source Mass Spectrometry Developments and Applications, G.
Holland, S. D. Tanner (Eds.), The Royal Society of Chemistry, 1997,
pp. 329
(12) IUPAC (1995), Protocol for the design, conduct and interpretation of
method-performance studies, Pure & Applied Chem, 67, 331
(13) Jülicher, B., Gowik, P. and Uhlig, S. (1998) Assessment of detection
methods in trace analysis by means of a statistically based in-house vali-
dation concept. Analyst, 120, 173
(14) Gowik, P., Jülicher, B. and Uhlig, S. (1998) Multi-residue method for
non-steroidal anti-inflammatory drugs in plasma using high performance
liquid chromatography-photodiode-array detection. Method description
and comprehensive in-house validation. J. Chromatogr., 716, 221
(15) OAC-I Peer Verified Methods, Policies and Procedures, 1993, AOAC
International, 2200 Wilson Blvd., Suite 400, Arlington, Virginia 22201-
3301, USA
(16) W.J. Youden; Steiner, E.H.; ”Statistical Manual of the AOAC–Associa-
tion of Official Analytical Chemists”, AOAC-I, Washington DC: 1975,
p. 35 ff
(17) ISO 11843: 1997 Capability of detection — Part 1: Termsand defini-
tions, Part 2: Methodology in the linear calibration case Part 2:
Methodology in the linear calibration case
(18) R.W. Stephany & L.A. van Ginkel: ”Yield or recovery: a world of
difference”. Proceedings8th Euro Food Chem, Vienna, Aus tria
September 18—20 (1995) Federation of European Chemical Societies,
Event 206. ISBN 3-900554-17X, page 2—9
(19) Council Directive 71/354/EEC of 18 October 1971 on the approximation
of the lawsof the Member Statesrelating to unitsof meas urement Offi-
cial Journal L 243, 29/10/1971 P. 29
(20) ISO 31-0: 1992 Quantitiesand units— Part 0: General principles2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 32
▼M1
LIITE II
Määritysmenetelmän suorituskykyä koskevat vähimmäisvaatimukset (MRPL)
Aine ja/tai aineenvaihduntatuote Matriisit MRPL
Kloramfenikoli Liha
Kananmunat 0,3 µg/kg
Maito
Virtsa
Vesiviljelytuotteet
Hunaja
Medroksiprogesteroniasetaatti Sikojen munuaisrasva 1 µg/kg
Nitrofuraanin aineenvaihdunta-
tuotteet:
— furatsolidoni Siipikarjanliha 1 µg/kg kaikkien aineenvaih-
duntatuotteiden osalta— furaltadoni Vesiviljelytuotteet
— nitrofurantoiini
— nitrofuratsoni2002D0657 — FI — 15.03.2003 — 001.001 — 33