1991R2568 — FI — 09.08.2012 — 024.001

Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentointitarkoituksiin. Toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä.

Muutettu:





Oikaisu







(*) Tätä asiakirjaa ei ole julkaistu suomenkielisenä.









▼B

KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 2568/91,

annettu 11 päivänä heinäkuuta 1991,

oliiviöljyn ja uutetun oliiviöljyn ominaisuuksista sekä niiden määritysmenetelmistä







EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon rasva-alan yhteisestä markkinajärjestelystä 22 päivänä syyskuuta 1966 annetun neuvoston asetuksen 136/66/ETY ( 1 ), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (ETY) N:o 3577/90 ( 2 ), ja erityisesti sen 35 a artiklan, sekä katsoo, että sekä katsoo, että asetuksen 136/66/ETY liitteessä määrätään kussakin jäsenvaltiossa sekä yhteisön maiden välisessä ja kolmansien maiden kanssa käytävässä kaupassa kaupan pidettävän puristetun oliiviöljyn ja uutetun oliiviöljyn nimityksistä ja määritelmistä, eri öljytyyppien erottamiseksi toisistaan kunkin tyypin fysikaalis-kemialliset ominaisuudet ja neitsytöljyn aistinvaraiset ominaisuudet on syytä määritellä kyseisten tuotteiden puhtauden ja laadun takaamiseksi, sanotun kuitenkaan rajoittamatta muiden voimassa olevien tätä koskevien säännösten soveltamista, eri öljytyyppien ominaisuuksien esiintyminen olisi määritettävä yhtenäisesti kaikkialla yhteisössä; tätä varten on syytä vahvistaa yhteisön menetelmät kemiallista määritystä ja aistinvaraista arviointia varten; siirtymäkauden aikana olisi kuitenkin sallittava jäsenvaltioissa sovellettavien muiden määritysmenetelmien käyttö ottaen kuitenkin huomioon, että jos tulokset ovat erilaisia, yhteisellä menetelmällä saadut tulokset ovat ratkaisevia, oliiviöljyn fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien sekä määritysmenetelmien määritteleminen johtaa yhdistetyn nimikkeistön 15 ryhmän lisähuomautusten mukauttamiseen, neitsytöljyn aistinvaraisten ominaisuuksien arviointimenetelmään kuuluu valituista ja koulutetuista maistajista koostuvien raatien muodostaminen; tämän vuoksi olisi säädettävä tällaisen järjestelyn luomiseen tarvittavasta määräajasta; ottaen huomioon joidenkin jäsenvaltioiden vaikeudet maistajien raadin muodostamisessa olisi sallittava muiden jäsenvaltioiden raatien käyttö, oliivijätteiden tuontiin sovellettavan tuontimaksujärjestelmän moitteettoman toiminnan varmistamiseksi olisi säädettävä yhtenäisestä menetelmästä näiden tuotteiden öljypitoisuuden määrittämiseksi, on suotavaa säätää ennen tämän asetuksen voimaantuloa pakatun öljyn myyntiä koskevasta määräajasta, jottei kaupalle aiheutuisi haittaa, on syytä kumota komission asetus (ETY) N:o 1058/77 ( 3 ), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (ETY) N:o 1858/88 ( 4 ), ja rasvojen hallintokomitea ei ole antanut lausuntoa puheenjohtajansa asettamassa määräajassa, ON ANTANUT TÄMÄN ASETUKSEN:







▼M20

1 artikla

1. Öljyjä, joiden ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 1 ja 2 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevan 1 kohdan a ja b alakohdassa tarkoitettuina neitsytoliiviöljyinä.

2. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 3 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 1 c kohdassa tarkoitettuna oliivilamppuöljynä.

3. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 4 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 2 kohdassa tarkoitettuna jalostettuna oliiviöljynä.

4. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 5 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 3 kohdassa tarkoitettuna jalostetusta oliiviöljystä ja neitsytoliiviöljystä valmistettuna oliiviöljynä.

5. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 6 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 4 kohdassa tarkoitettuna raakana oliivin puristemassaöljynä.

6. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 7 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 5 kohdassa tarkoitettuna jalostettuna oliivin puristemassaöljynä.

7. Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 8 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 6 kohdassa tarkoitettuna oliivin puristemassaöljynä.

▼B

2 artikla

1 Niiden öljyjen, joista määrätään liitteessä I, ominaisuudet määritetään seuraavia määritysmenetelmiä noudattaen:

— oleiinihappoprosentteina ilmaistavien vapaiden rasvahappojen määrittäminen liitteen II menetelmällä,

— peroksidiluvun määrittäminen liitteen III menetelmällä,

▼M19

— vahapitoisuuden määrittäminen liitteen IV menetelmällä,

▼B

— sterolipitoisuuden määrittäminen liitteen V menetelmällä,

— erytrodiolin ja uvaolin määrittäminen liitteen VI menetelmällä,

▼M21

— 2-glyseryylimonopalmitaatin prosenttiosuuden määrittäminen liitteen VII menetelmällä,

▼M20 —————

▼B

— spektrofotometrinen määritys liitteen IX menetelmällä,

— rasvahappokoostumuksen määrittäminen liitteiden X A ja X B menetelmällä,

— haihtuvien halogeeniliuottimien määrittäminen liitteen XI menetelmällä,

— neitsytoliiviöljyn aistinvaraisten ominaisuuksien arviointi liitteen XII menetelmällä 2 kohdan mukaisesti sovellettuna,

▼M20 —————

▼M11

— stigmastadieenien määritykseen liitteessä XVII kuvattu menetelmä,

▼M13

— triglyseridien koostumuksen määritykseen ECN42:na liitteessä XVIII kuvattu menetelmä,

▼M19

— alifaattisten alkoholien pitoisuuden määrittäminen liitteen XIX menetelmällä,

▼M23

— vahojen, rasvahappojen metyyliestereiden ja rasvahappojen etyyliestereiden pitoisuuksien määrittäminen liitteen XX kapillaarikaasukromatografiamenetelmällä.

▼M19

2. Kansallisilta viranomaisilta tai näiden edustajilta edellytettävistä neitsytoliiviöljyjen aistinvaraisten ominaisuuksien tarkistuksesta vastaavat jäsenvaltioiden hyväksymät maistajaraadit.

Ensimmäisessä kohdassa tarkoitetun oliiviöljyn aistinvaraisten ominaisuuksien katsotaan olevan yhdenmukaisia ilmoitetun oliiviöljyluokan kanssa, jos asianomaisen jäsenvaltion hyväksymä raati vahvistaa kyseisen luokituksen.

Jos hyväksytty raati ei vahvista ilmoitusta ilmoitetun oliiviöljyluokan aistinvaraisten ominaisuuksien osalta, kansalliset viranomaiset tai niiden edustajat teettävät asianomaisen pyynnöstä muilla hyväksytyillä raadeilla kaksi seurantamääritystä, joista ainakin toisen tekee asianomaisen tuottajajäsenvaltion hyväksymä raati. Kyseisten ominaisuuksien katsotaan olevan yhdenmukaisia ilmoitettujen ominaisuuksien kanssa, jos ilmoitettu luokitus vahvistetaan molemmissa seurantamäärityksissä. Päinvastaisessa tapauksessa seurantamäärityksen kustannuksista vastaa asianomainen, sanotun kuitenkaan rajoittamatta seuraamusten soveltamista.

▼M17

3. Kun on kyse kansallisten viranomaisten tai niiden edustajien tekemästä 1 kohdan mukaisesta öljyn ominaisuuksien toteamisesta, näytteenotto tehdään koenäytteen valmistelua ja näytteenottoa koskevia kansainvälisiä standardeja EN ISO 661 ja EN ISO 5555 noudattaen. Poiketen siitä, mitä standardissa EN ISO 5555 olevassa 6.8 kohdassa määrätään, edellä mainituista öljyistä koostuvien erien, joissa tuotetta lähinnä olevan pakkauksen vetoisuus on enintään 100 litraa, näytteenotto tehdään kuitenkin tämän asetuksen liitteen I a mukaisesti.

▼M19

Rajoittamatta standardin EN ISO 5555 ja standardissa EN ISO 661 olevan 6 luvun määräysten soveltamista näytteet on sijoitettava viipymättä valolta ja lämmöltä suojattuun paikkaan ja lähetettävä laboratorioon määritettäviksi viimeistään:

— lokakuun ja toukokuun välisenä aikana näytteenottoa seuraavana kymmenentenä työpäivänä, ja

— kesäkuun ja syyskuun välisenä aikana näytteenottoa seuraavana viidentenä työpäivänä.

▼M17

4. ►M20 Edellä 3 kohdassa tarkoitettua todentamista varten liitteissä II, III, IX, X ja XII tarkoitetut määritykset ja tapauksen mukaan kansallisessa lainsäädännössä säädetyt vastamääritykset on tehtävä ennen vähimmäissäilymisajan päättymistä. Jos näyte otetaan yli neljä kuukautta ennen vähimmäissäilyvyysajan päättymistä, kyseiset määritykset on tehtävä neljän kuukauden kuluessa näytteenotosta. Mainitussa asetuksessa säädettyihin muihin määrityksiin ei sovelleta määräaikoja. ◄

Jos määritysten tulokset eivät vastaa ilmoitetun oliiviöljyluokan tai ilmoitetun uutetun oliiviöljyn luokan ominaisuuksia, asianomaisen on ilmoitettava asiasta kuukauden kuluessa ensimmäisessä alakohdassa tarkoitetun määräajan päättymisestä, jollei näytettä ole otettu vähintään kuukautta ennen vähimmäissäilymisajan päättymistä.

▼M19

5. Määritystuloksia verrataan suoraan tässä asetuksessa säädettyihin rajoihin oliiviöljyjen ominaisuuksien määrittelemiseksi 1 kohdassa säädettyjä menetelmiä noudattaen.

▼M20

2 a artikla

Kansalliset viranomaiset tai näiden edustajat voivat todentaa oliiviöljyn tai oliivin puristemassaöljyn yhdenmukaisuuden ilmoitetun luokan kanssa joko:

a) tekemällä liitteessä I säädetyt määritykset missä tahansa järjestyksessä;

b) tai seuraamalla päätöksentekokaaviota koskevassa liitteessä I b säädettyä järjestystä kunnes päästään johonkin kyseisessä kaaviossa mainittuun päätökseen.

▼M19 —————

▼M5

►M19 3 ◄ artikla

Kun öljyn aistinvaraisten ominaisuuksien havaitaan olevan erilaiset kuin sen nimityksestä johtuvat ominaisuudet, kyseisen jäsenvaltion on sovellettava hallinnollisia rahamääräisiä seuraamuksia, joiden määrä vahvistetaan havaitun poikkeaman vakavuuden mukaisesti, sanotun kuitenkaan rajoittamatta muiden mahdollisten seuraamusten soveltamista.

Poikkeaman arvioinnissa otetaan erityisesti huomioon tavanomaisissa olosuhteissa säilytetyn öljyn ominaisuuksien luonnollinen kehittyminen.

Jäsenvaltioiden on annettava komissiolle tiedoksi kunkin vuosipuoliskon alussa havaittujen poikkeamien määrä ja luonne sekä edellisen vuosipuoliskon aikana sovelletut seuraamukset.

▼M5

4 artikla

▼M19

1. Jäsenvaltiot voivat hyväksyä maistajaraateja, jotta kansalliset viranomaiset tai niiden edustajat voivat arvioida ja valvoa aistinvaraisia ominaisuuksia.

Jäsenvaltioiden on vahvistettava hyväksymistä koskevat edellytykset etenkin siten, että:

— liitteessä XII olevan 4 kohdan edellytykset täyttyvät,

— raadin puheenjohtajan koulutuksesta vastaa laitos jäsenvaltion tässä tarkoituksessa hyväksymin edellytyksin,

— hyväksynnän pätevyys ratkaistaan jäsenvaltion käyttöönottamassa vuotuisessa valvontajärjestelmässä saatujen tulosten perusteella.

Kunkin jäsenvaltion on toimitettava komissiolle luettelo hyväksytyistä raadeista ja tämän kohdan mukaisesti toteutetuista toimenpiteistä.

▼M5

2. Jos jäsenvaltiolla on vaikeuksia maistajien raadin perustamisessa omalle alueelleen, se voi käyttää toisen jäsenvaltion hyväksyttyä maistajien raatia.

3. Kunkin jäsenvaltion on laadittava luettelo ammattijärjestöjen tai ammattien välisten järjestöjen 1 kohdan edellytysten mukaisesti perustamista maistajien raadeista ja niiden on valvottava näiden edellytysten noudattamista.

▼M19 —————

▼B

6 artikla

1 Oliiviöljyn erottamisesta syntyneen öljykakun ja muiden yhdistetyn nimikkeistön CN-koodeihin 2306 90 11 ja 2306 90 19 kuuluvien jätteiden öljypitoisuus määritetään liitteen XV menetelmän mukaisesti.

2 Edellä 1 kohdassa tarkoitettu öljypitoisuus ilmaistaan öljyn painoprosenttina kuiva-aineesta.

▼M20

7 artikla

Haitallisten aineiden osalta sovelletaan niiden esiintymistä koskevia yhteisön säännöksiä.

Halogeeniliuottimien pitoisuuden osalta raja-arvot ovat kaikkien oliiviöljyluokkien osalta seuraavat:

— Kunkin havaitun halogeeniliuottimen enimmäispitoisuus 0,1 mg/kg

— Havaittujen halogeeniliuottimien summan enimmäispitoisuus 0,2 mg/kg

▼B

8 artikla

1 Jäsenvaltioiden on ilmoitettava komissiolle tämän asetuksen soveltamiseksi toteutetut toimenpiteet.

2 Kunkin vuosipuoliskon alussa jäsenvaltioiden on toimitettava komissiolle tiedoksi yhteenveto edellisen vuosipuoliskon aikana tehtyjen määritysten tuloksista.

Rasvojen hallintokomitea tutkii nämä tulokset asetuksen N:o 136/66/ETY 39 artiklassa säädettyä menettelyä noudattaen.

9 artikla

Kumotaan asetus (ETY) N:o 1058/77.

10 artikla

1 Tämä asetus tulee voimaan seuraavana päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä. Liitteen XII menetelmä on kuitenkin otettava käyttöön ►M1 1 päivästä marraskuuta 1992 ◄ , interventioon liittyviä toimia lukuun ottamatta.

▼M5

Tämä menetelmä ei koske ennen 1 päivää marraskuuta 1992 pakattuja neitsytoliiviöljyjä.

▼B

2 Tämä asetus ei koske ennen tämän asetuksen voimaantuloa pakattua ja 31 päivään lokakuuta 1992 asti kaupan pidettyä oliiviöljyä tai uutettua oliiviöljyä.

Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa.









LIITTEET

Yhteenveto







Liite I Oliiviöljyjen ominaisuudet Liite I a Näytteenotto oliiviöljystä tai uutetusta oliiviöljystä koostuvista eristä, joissa tuotetta lähinnä olevan pakkauksen vetoisuus on enintään 100 litraa Liite I b Päätöksentekokaavio Liite II ►M21 Vapaiden rasvahappojen määrittäminen kylmämenetelmällä ◄ Liite III Peroksidiluvun määrittäminen Liite IV ►M6 Vahapitoisuuden määrittäminen kapillaarikaasukromatografisella menetelmällä ◄ Liite V Sterolien rakenteen ja pitoisuuden määrittäminen kapillaarikaasukromatografisella menetelmällä Liite VI Erytrodioli- ja uvaolipitoisuuden määrittäminen Liite VII ►M21 2-glyseryylimonopalmitaatin prosenttiosuuden määrittäminen ◄ ▼M20 ————— ▼B Liite IX Spektrofotometrinen määritys Liite X A Rasvahappojen metyyliestereiden määrittäminen kaasukromatografisella menetelmällä Liite X B Rasvahappojen metyyliestereiden valmistaminen Liite XI Haihtuvien halogeeniliuottimien pitoisuuden määrittäminen oliiviöljystä Liite XII Neitsytoliiviöljyn aistinvarainen arviointi ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Liite XV Oliivijätteen öljypitoisuus Liite XVI Jodiluvun määrittäminen Liite XVII Menetelmä stigmastadieenien määrittämiseksi kasviöljyistä Liite XVIII: Menetelmä triglyseridien koostumuksen määrittämiseksi ECN42:na Liite XIX Alifaattisten alkoholien pitoisuuden määritysmenetelmä ▼M23 Liite XX Vahojen, rasvahappojen metyyliestereiden ja rasvahappojen etyyliestereiden pitoisuuksien määrittäminen kapillaarikaasukromatografiamenetelmällä

▼M23









LIITE I

OLIIVIÖLJYJEN OMINAISUUDET







Luokka Rasvahappojen metyyliesterit (FAME) ja rasvahappojen etyyliesterit (FAEE) Happopitoisuus (%) (*) Peroksidilu ku mEq O2/kg (*) Vahat mg/kg (**) 2-glyseryylimonopalmitaatti (%) Stigmastadieeni mg/kg (1) HPLC:llä määritetyn ja teoreettisesti lasketun ECN42:n välinen ero K232 (*) K270 (*) Delta-K (*) Aistinvarainen arvio Virheen mediaani (Md) (*) Aistinvarainen arvio Hedelmäisyyden mediaani (Mf) (*) 1. Ekstra-neitsytoliiviöljy Σ FAME + FAEE ≤ 75 mg/kg tai 75 mg/kg <Σ FAME + FAEE ≤ 150 mg/kg ja (FAEE/FAME) ≤ 1,5 ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % > 14 % 2. Neitsytoliiviöljy — ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 ►C1 Md ≤ 3,5 ◄ Mf > 0 ≤ 1,0 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus > 14 % 3. Lamppuoliiviöljy — > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 0,9 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — ►C1 Md > 3,5 (2) ◄ — ≤ 1,1 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % > 14 % 4. Jalostettu oliiviöljy — ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % > 14 % 5. Jalostetusta oliiviöljystä ja neitsytoliiviöljystä valmistettu oliiviöljy — ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % > 14 % 6. Raaka oliivin puristemassaöljy — — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Jalostettu oliivin puristemassaöljy — ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Oliivin puristemassaöljy — ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — —







Luokka Rasvahappojen pitoisuus (1) Trans-oleiiniisomeerien summa (%) Translinoliisomeerien ja translinoleeniisomeerien summa (%) Sterolikoostumus Kokonaissterolit (mg/kg) Erytrodioli ja uvaoli (%) (**) Myristiinihappo (%) Linoleenihappo (%) Arakidonihappo (%) Eikoseenihappo (%) Beheenihappo (%) Lignoseriinihappo (%) Kolesteroli (%) Brassikasteroli (%) Kampesteroli (%) Stigmasteroli (%) Beetasitosteroli (%) (2) Delta-7-stigmasteroli (%) 1. Ekstra-neitsytoliiviöljy ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Neitsytoliiviöljy ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Lamppuoliiviöljy ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) 4. Jalostettu oliiviöljy ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Jalostetusta oliiviöljystä ja neitsytoliiviöljystä valmistettu oliiviöljy ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Raaka oliivin puristemassaöljy ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (4) 7. Jalostettu oliivin puristemassaöljy ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Oliivin puristemassaöljy ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5

▼M20









LIITE I a

Näytteenotto oliiviöljyistä tai oliivin puristemassaöljyistä, jotka toimitetaan vetoisuudeltaan enintään 100 litraa olevissa tuotetta lähinnä olevissa pakkauksissa

Tätä näytteenottomenetelmää sovelletaan enintään 125 000 litran suuruisiin oliiviöljyn tai oliivin puristemassaöljyn toimituksiin, joissa tuotetta lähinnä olevan pakkauksen vetoisuus on enintään 100 litraa.

Yli 125 000 litraa sisältävä toimitus on jaettava enintään 125 000 litran eriin. Alle 125 000 litran toimitus muodostaa yhden erän. Menetelmää sovelletaan kaikkiin eriin.

Perusnäytteiden vähimmäislukumäärä määräytyy erän koon mukaan 1 kohdassa olevan taulukon mukaisesti.

Perusnäytteiden lukumäärä riippuu tuotetta lähinnä olevien pakkausten vetoisuudesta 2.1 kohdassa säädetyn taulukon mukaisesti.

Toimituksella, perusnäytteellä ja laboratorionäytteellä tarkoitetaan standardissa EN ISO 5555 tarkoitettuja määritelmiä.

Ilmaisulla ”erä” tarkoitetaan kaikkia myyntiyksiköitä, jotka on tuotettu, valmistettu ja pakattu sellaisissa olosuhteissa, että kunkin tällaisen myyntiyksikön sisältämää öljyä pidetään yhdenmukaisena kaikkien analyyttisten ominaisuuksien osalta.

1. PERUSNÄYTTEIDEN LUKUMÄÄRÄ

Perusnäytteiden vähimmäislukumäärä määräytyy erän koon mukaan seuraavan taulukon mukaisesti:







Erän koko (litroina) alle Perusnäytteiden vähimmäislukumäärä 7 500 2 25 000 3 75 000 4 125 000 5

Samaan perusnäytteeseen kuuluviksi tuotetta lähinnä oleviksi pakkauksiksi on valittava erässä vierekkäin olevat pakkaukset.

Epäselvissä tapauksissa jäsenvaltioiden on lisättävä perusnäytteiden lukumäärää.

2. PERUSNÄYTTEEN SISÄLTÖ

2.1 Perusnäyte muodostuu seuraavasti:







Jos tuotetta lähinnä olevien pakkausten vetoisuus on: Perusnäytteeksi valitaan: a) vähintään 5 litraa a) kolmen tuotetta lähinnä olevan pakkauksen öljy b) vähintään 3 litraa mutta enintään 5 litraa b) kolmen tuotetta lähinnä olevan pakkauksen öljy c) vähintään 2 litraa mutta enintään 3 litraa c) kolmen tuotetta lähinnä olevan pakkauksen öljy d) vähintään 1 litra mutta enintään 2 litraa d) kuuden tuotetta lähinnä olevan pakkauksen öljy e) vähintään 0,75 litraa mutta enintään 1 litra e) kuuden tuotetta lähinnä olevan pakkauksen öljy f) enintään 0,75 litraa f) kolminkertaisesti öljy mahdollisimman vähäisestä määrästä pakkauksia, joiden kokonaisvetoisuus ylittää 1,5 litraa

2.2 Perusnäytteet on säilytettävä tuotetta lähinnä olevissa pakkauksissa kunnes määritykset tehdään. Tämän jälkeen perusnäytteiden öljy jaetaan tarvittaessa kolmeksi laboratorionäytteeksi, jotta voidaan tehdä:

a) liitteissä II, III, IX ja X tarkoitetut määritykset;

b) liitteessä XII tarkoitettu määritys;

c) muut määritykset.

2.3 Perusnäytteen muodostavien pakkausten öljy on jaettava kansallisessa lainsäädännössä säädettyjä valvontamenettelyjä noudattaen.

3. MÄÄRITYKSET JA TULOKSET

a) Kukin 1 kohdassa tarkoitettu perusnäyte jaetaan standardissa EN ISO 5555 olevan 2.5 kohdan mukaisesti laboratorionäytteiksi seuraavien määritysten tekemiseksi: — asetuksen 2 artiklan 1 kohdan ensimmäisessä luetelmakohdassa tarkoitettu vapaiden rasvahappojen määrittäminen, — asetuksen 2 artiklan 1 kohdan toisessa luetelmakohdassa tarkoitettu peroksidiluvun määrittäminen, — asetuksen 2 artiklan 1 kohdan kahdeksannessa luetelmakohdassa tarkoitettu spektrofotometrinen määritys, — asetuksen 2 artiklan 1 kohdan yhdeksännessä luetelmakohdassa tarkoitettu rasvahappokoostumuksen määrittäminen.

b) Jos jollekin samasta erästä otetulle perusnäytteelle tehdyn a alakohdassa tarkoitetun määrityksen tulokset eivät kokonaisuudessaan vastaa ilmoitetun öljyluokan ominaisuuksia, koko kyseinen erä on todettava vaatimusten vastaiseksi. Jos kullekin samasta erästä otetulle perusnäytteelle tehtyjen a alakohdassa tarkoitettujen määritysten tulokset eivät ole yhdenmukaiset — kyseisten menetelmien toistettavuusominaisuudet huomioon ottaen — koko erä on todettava epäyhdenmukaiseksi ja jokaiselle perusnäytteelle on tehtävä muut vaadittavat määritykset. Päinvastaisessa tapauksessa muut vaaditut määritykset tehdään vain yhdelle kyseisestä erästä otetulle perusnäytteelle.

c) Jos jokin b alakohdan toisen alakohdan mukaisten määritysten tulos ei vastaa ilmoitetun öljyluokan ominaisuuksia, koko kyseinen erä on todettava vaatimusten vastaiseksi. Jos kaikki b alakohdan toisen alakohdan mukaisten määritysten tulokset vastaavat ilmoitetun öljyluokan ominaisuuksia, koko kyseinen erä on todettava vaatimusten mukaiseksi.

▼M20









LIITE I b

PÄÄTÖKSENTEKOJÄRJESTELMÄ SEN TODENTAMISEKSI, ONKO OLIIVIÖLJYNÄYTE ILMOITETUN LUOKAN MUKAINEN

Sen määrittäminen, onko oliiviöljy tai oliivin puristemassaöljy ilmoitetun luokan mukainen, voidaan tehdä:

a) joko tekemällä liitteessä I vahvistettujen ominaisuuksien noudattamisen todentamiseksi säädetyt määritykset missä tahansa järjestyksessä;

b) tai tekemällä päätöksentekokaavioon sisältyvät määritykset siinä esitetyssä järjestyksessä kunnes päästään johonkin kyseisessä kaaviossa mainittuun päätökseen.

Erikseen on tehtävä saastuttavia aineita ja halogenoituja liuottimia koskevat määritykset, joita tarvitaan Euroopan yhteisöjen vaatimusten noudattamisen todentamiseksi.

Päätöksentekokaaviota sovelletaan kaikkiin oliiviöljyn ja oliivin puristemassaöljyn luokkiin. Se koostuu taulukoista 1—11, joita on käytettävä kyseessä olevan öljyn ilmoitetun luokan mukaan yleistaulukossa esitetyssä järjestyksessä.

Taulukkoa 11 tulkitaan seuraavasti:

— Yhtäläisyysmerkki (=) tarkoittaa reittiä, jota seurataan, jos edellisessä laatikossa esitetyt edellytykset täyttyvät (myöntävä vastaus). Kolme pistettä (…) tarkoittaa reittiä, jota seurataan, jos edellytykset eivät täyty.

— Taulukoissa 1—11 olevien laatikoiden otsakkeet viittaavat tässä asetuksessa säädettyihin määrityksiin tämän liitteen lisäyksessä 1 olevan vastaavuustaulukon mukaisesti.

— Taulukoiden 1—11 kielteistä päätöstä kuvastavissa ympyröissä esiintyvät kirjaimet vastaavat tämän liitteen lisäyksessä 2 mainittuja suuntaa-antavia tietoja. Ne eivät sellaisenaan edellytä määritysten jatkamista eivätkä tarkoita, että esitetyt oletukset pitäisivät paikkansa.

Yleistaulukko

Taulukko 1

Taulukko 2

Taulukko 3

Taulukko 4

Taulukko 5

Taulukko 6

Taulukko 7

Taulukko 8

Taulukko 9

Taulukko 10

Taulukko 11









Lisäys 1

Tämän asetuksen liitteiden ja päätöksentekokaaviossa tarkoitettujen määritysten väliset vastaavuudet







▼M21 — Happopitoisuus Liite II Vapaiden rasvahappojen määrittäminen kylmämenetelmällä ▼M20 — Peroksidiluku Liite III Peroksidiluvun määrittäminen — Spektrofotometrinen määritys ultraviolettivalossa Liite IX Spektrofotometrinen määritys — Aistinvarainen arviointi Liite XII Neitsytoliiviöljyn aistinvarainen arviointi — Stigmasta-3,5-dieeni Liite XVII Menetelmä stigmastadieenien määrittämiseksi kasviöljyistä — Rasvahappojen trans-isomeerit Liite X a ja Rasvahappojen metyyliestereiden määrittäminen kaasukromatografisella menetelmällä Liite X b Rasvahappojen metyyliestereiden valmistamismenetelmä — Rasvahappojen koostumus Liite X a ja Rasvahappojen metyyliestereiden määrittäminen kaasukromatografisella menetelmällä Liite X b Rasvahappojen metyyliestereiden valmistamismenetelmä — ΔECN42 Liite XVIII Triglyseridien koostumuksen määrittäminen ECN42:na (teoreettisen koostumuksen ja todellisen koostumuksen välinen ero) — Sterolien koostumus ja kokonaissterolit Liite V Sterolien rakenteen ja pitoisuuden määrittäminen kapillaarikaasukromatografisella menetelmällä — Erytrodioli ja uvaoli Liite VI Erytrodioli- ja uvaolipitoisuuden määrittäminen — Vahat Liite IV Vahapitoisuuden määrittäminen kapillaarikaasukromatografisella menetelmällä — Alifaattiset alkoholit Liite XIX Alifaattisten alkoholien pitoisuuden määrittäminen kaasukromatografisesti kapillaarikolonnilla ▼M21 — 2-asemassa olevat tyydyttyneet rasvahapot Liite VII 2-glyseryylimonopalmitaatin prosenttiosuuden määrittäminen ▼M20









Lisäys 2

Taulukko 1

a) Ks. neitsytöljy tai lamppuöljy (Laatukriteeri — taulukko 2, tai laatu- ja puhtauskriteeri — taulukko 4)

b) Ks. lamppuöljy (Laatu- ja puhtauskriteeri — taulukko 4)

Taulukko 2

a) Ks. lamppuöljy (Laatu- ja puhtauskriteeri — taulukko 4)

b) Ks. ekstraneitsytoliiviöljy (Laatukriteeri — taulukko 1)

Taulukko 3

a) Jalostetun öljyn (oliivi- tai muun öljyn) esiintyminen

b) Oliivin puristemassaöljyn esiintyminen

Taulukko 4

a) Ks. ekstraneitsytoliiviöljy ja neitsytoliiviöljy (Laatukriteerit — taulukko 1 ja 2)

b) Jalostetun öljyn (oliivi- tai muun öljyn) esiintyminen

c) Oliivin puristemassaöljyn esiintyminen

d) Esteröityjen öljyjen esiintyminen

Taulukko 7

a) Oliivin puristemassaöljyn esiintyminen

b) Esteröityjen öljyjen esiintyminen

Taulukko 8

a) Jalostetun öljyn (oliivi- tai muun öljyn) esiintyminen

b) Ks. lamppuöljy (Laatu- ja puhtauskriteeri — taulukko 4)

c) Esteröityjen öljyjen esiintyminen

Taulukko 11

a) Esteröityjen öljyjen esiintyminen

▼B









LIITE II

▼M21

VAPAIDEN RASVAHAPPOJEN MÄÄRITTÄMINEN KYLMÄMENETELMÄLLÄ

▼B

1 TARKOITUS

Vapaiden rasvahappojen määrittäminen oliiviöljyistä. Vapaiden rasvahappojen pitoisuus ilmaistaan tavanomaisesti laskettuna happamuutena.

1.1 Periaate

Näyte liuotetaan liuotinseokseen ja vapaat rasvahapot titrataan kaliumhydroksidin etanoliliuoksella.

1.2 Reagenssit

Kaikkien reagenssien on oltava määritykseen hyväksyttyä analyysilaatua ja veden on oltava joko tislattua tai vastaavaa puhtausastetta.

1.2.1 Dietyylieetteri ja 95-prosenttinen etanoli (V/V), yhtä suuret tilavuusosat kumpaakin. Huom.: Dietyylieetteri on helposti syttyvää ja voi muodostaa räjähtäviä peroksideja. Sen käytössä on oltava erittäin varovainen. Seos, johon on lisätty 0,3 ml fenoliftaleiiniliuosta (1.2.3) 100 ml:aan, neutraloidaan juuri ennen käyttöä kaliumhydroksidiliuoksella (1.2.2), Huom.: Jos ei voida käyttää dietyylieetteriä, voidaan käyttää etanolin ja tolueenin seosta. Etanoli voidaan tarvittaessa korvata 2-propanolilla.

1.2.2 Kaliumhydroksidi titrattuna etanoliliuoksena, c(KOH) noin 0,1 mol/l tai tarvittaessa c(KOH) noin 0,5 mol/l. Kaliumhydroksidin etanoliliuoksen tarkka väkevyys on tunnettava ja tarkistettava juuri ennen käyttöä. Käytetään liuosta, joka on valmistettu vähintään viisi vuorokautta ennen käyttöä ja dekantoitu ruskeaan lasipulloon, jossa on kumitulppa. Liuoksen on oltava väritöntä tai oljenkeltaista. Huom.: Väritön, stabiili kaliumhydroksidiliuos voidaan valmistaa seuraavasti. Kuumennetaan kiehuvaksi 1 000 ml etanolia, johon on lisätty 8 g kaliumhydroksidia ja 0,5 g alumiinilastuja, ja keitetään seosta yksi tunti palautusjäähdyttimen kanssa. Tislataan välittömästi. Tisleeseen liuotetaan tarvittava määrä kaliumhydroksidia. Annetaan seistä useita vuorokausia ja dekantoidaan kirkas neste, joka on kaliumkarbonaattisakan yläpuolella. Liuos voidaan myös valmistaa ilman tislausta seuraavasti: lisätään 4 ml alumiinibutylaattia 1 000 ml:aan etanolia ja seoksen annetaan seistä joitakin vuorokausia. Dekantoidaan sakan yläpuolinen neste ja liuotetaan siihen tarvittava määrä kaliumhydroksidia. Liuos on käyttövalmis.

1.2.3 Fenoliftaleiini, 10 g liuotettuna litraan 95- tai 96-prosenttista etanolia (V/V) tai, jos rasva on kovin tummaa, alkalisini, 20 g liuotettuna litraan 95- tai 96-prosenttista etanolia (V/V).

1.3 Välineistö

Tavanomainen laboratoriovälineistö ja erityisesti:

1.3.1 Analyysivaaka

1.3.2 Erlenmeyerpullo, 250 ml

1.3.3 Byretti, 10 ml, mitta-asteikon jakoväli 0,05 ml.

1.4 Suoritus

1.4.1 Näytteen esikäsittely määritystä varten Määritys tehdään suodatetusta näytteestä. Jos veden ja epäpuhtauksien kokonaispitoisuus on pienempi kuin 1 %, voidaan määritys tehdä näytteestä sellaisenaan.

1.4.2 Näytteenotto Näyte otetaan oletetun happamuuden perusteella seuraavan taulukon mukaan:



Oletettu happoluku Näytemäärä (g) Näytteen punnitustarkkuus (g) < 1 20 0,05 1—4 10 0,02 4—15 2,5 0,01 15—75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Näyte punnitaan erlenmeyerpullossa (1.3.2).

1.4.3 Määritys Näyte (1.4.2) liuotetaan 50—150 ml:aan ennalta neutraloitua dietyylieetteri/etanoli-seosta (1.2.1). Titrataan, koko ajan sekoittaen, 0,1 mol/l kaliumhydroksidiliuoksella (1.2.2) (ks. Huom. 2), kunnes indikaattorin väri muuttuu (fenoliftaleiinin vaaleanpunainen väri säilyy vähintään 10 sekunnin ajan). Huom. 1 Titrattu kaliumhydroksidin etanoliliuos (1.2.2) voidaan korvata kalium- tai natriumhydroksidin vesiliuoksella, jos lisätty vesi ei aiheuta faasien erottumista. Huom. 2 Jos 0,1 mol/l kaliumhydroksidiliuosta tarvitaan enemmän kuin 10 ml, käytetään 0,5 mol/l liuosta. Huom. 3 Jos liuos samenee titrattaessa, liuotinseosta (1.2.1) lisätään tarpeen mukaan, kunnes liuos on kirkasta.

1.5 Happamuus: ilmaistuna oleiinihappoprosentteina

Happamuus painoprosentteina ilmaistuna on:

jossa:

V = titratun kaliumhydroksidiliuoksen tilavuus millilitroina;

c = titratun kaliumhydroksidiliuoksen tarkka pitoisuus moolia/litra;

M = tuloksen ilmaisemiseen käytetyn hapon moolimassa g/mol (= 282);

m = näytteen massa grammoina.

Tulos on kahden määrityksen tulosten aritmeettinen keskiarvo.









LIITE III

PEROKSIDILUVUN MÄÄRITTÄMINEN

1 TARKOITUS

Tämä standardi kuvaa rasvojen ja öljyjen peroksidiluvun määritysmenetelmän.

2 SOVELTAMISALA

Tämä standardi soveltuu eläin-ja kasvirasvojen sekä -öljyjen tutkimiseen.

3 MÄÄRITELMÄ

Peroksidiluku ilmaisee näytteessä olevien kaliumjodidia hapettavien aineiden määrän (ilmaistuna aktiivisen hapen milliekvivalentteina kilogrammaa kohti) tässä kuvatuissa koeolosuhteissa.

4 PERIAATE

Näyte liuotetaan etikkahapon ja kloroformin seokseen ja käsitellään kaliumjodidilla. Vapautuva jodi titrataan natriumtiosulfaattiliuoksella.

5 VÄLINEISTÖ

Käytettävien laitteiden on oltava puhtaita siten, että niissä ei ole mitään hapettavia tai pelkistäviä aineita.

Huom.:

Hiottuja lasipintoja ei saa rasvata.

5.1 Punnituslasi, 3 ml.

5.2 Lasipulloja, vetoisuus noin 250 ml, hiotut suut ja tulpat, etukäteen kuivattu ja täytetty puhtaalla, kuivalla inerttikaasulla (typellä tai mieluummin hiilidioksidilla).

5.3 Byretti, 25 tai 50 ml, mitta-asteikon jakoväli 0,1 ml.

6 REAGENSSIT

6.1 Analyysilaatuinen kloroformi, josta happi on poistettu puhtaalla, kuivalla inerttikaasuvirralla tapahtuvalla kaasuhuuhtelulla.

6.2 Analyysilaatuinen jääetikka, josta happi on poistettu puhtaalla, kuivalla inerttikaasuvirralla tapahtuvalla kaasuhuuhtelulla.

6.3 Kaliumjodidin tuore, kyllästetty vesiliuos, joka ei sisällä jodia eikä jodaatteja.

6.4 Natriumtiosulfaatin vesiliuos, 0,01 tai 0,002 N, normalisoitu huolellisesti juuri ennen käyttöä.

6.5 Tärkkelysliuos, 10 g/l vesidispersio, liukoisesta luonnon tärkkelyksestä valmistettu tuore liuos.

7 NÄYTE

Huolehditaan siitä, että näyte otetaan ja säilytetään pimeässä ja kylmässä, ja että sen lasisissa säilytysastioissa ei ole tyhjää tilaa. Astiat on suljettava ilmatiiviisti joko hiotuilla lasitulpilla tai korkilla.

8 SUORITUS

Määritys tehdään hajapäivänvalossa tai keinovalossa. Näyte punnitaan 0,001 g:n tarkkuudella punnituslasissa (5.1) tai, ellei sellaista ole, pullossa (5.2). Tarvittava näytemäärä riippuu oletetusta peroksidiluvusta seuraavan taulukon mukaan:







Oletettu peroksidiluku (meq O2/kg) Näytemäärä (g) 0—12 5,0—2,0 12—20 2,0—1,2 20—30 1,2—0,8 30—50 0,8—0,5 50—90 0,5—0,3

Avataan pullo (5.2) ja asetetaan sisään punnituslasi, jossa on näyte. Lisätään 10 ml kloroformia (6.1). Liuotetaan näyte nopeasti sekoittaen. Lisätään 15 ml etikkahappoa (6.2), sitten 1 ml kaliumjodidiliuosta (6.3). Suljetaan pullo nopeasti, ravistetaan yksi minuutti ja annetaan seistä tasan viisi minuuttia pimeässä 15—25 °C:n lämpötilassa.

Lisätään noin 75 ml tislattua vettä. Vapautunut jodi titrataan natriumtiosulfaattiliuoksella (6.4) (jos oletettu peroksidiluku on alle 12, käytetään 0,002 N liuosta ja jos se on yli 12, käytetään 0,01 N liuosta) voimakkaasti sekoittaen ja indikaattorina käytetään tärkkelysliuosta (6.5).

Samasta näytteestä tehdään kaksi määritystä.

Sokeakoe tehdään samanaikaisesti. Jos sen tulos on suurempi kuin 0,05 ml 0,01 N natriumtiosulfaattiliuosta (6.4), ovat reagenssit olleet epäpuhtaita ja ne on vaihdettava.

9 TULOSTEN ESITTÄMINEN

Peroksidiluku (PV), ilmaistuna aktiivisen hapen milliekvivalentteina kilogrammaa kohti, saadaan kaavasta:

jossa:

V = määritykseen käytetyn normalisoidun natriumtiosulfaattiliuoksen (6.4) määrä millilitroina, korjattuna sokeakokeen tuloksilla;

T = määritykseen käytetyn natriumtiosulfaattiliuoksen (6.4) tarkka normaalisuus;

m = näytteen massa grammoina.

Tulos on kahden määrityksen tulosten aritmeettinen keskiarvo.

▼M21









LIITE IV

VAHAPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN KAPILLAARIKAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ

1. TARKOITUS

Tällä menetelmällä määritetään oliiviöljyjen vahapitoisuus. Vahat eroavat toisistaan hiiliatomien lukumäärän suhteen. Tätä menetelmää voidaan käyttää erityisesti tekemään ero puristamalla saadun oliiviöljyn ja puristemassasta saadun öljyn välillä.

2. PERIAATE

Rasva, johon on lisätty soveltuva sisäinen standardi, fraktioidaan kromatografisesti hydratoitua silikageeliä sisältävässä kolonnissa; koeolosuhteissa ensimmäisenä eluoitunut jae (jonka polaarisuus on triglyseridien polaarisuutta heikompi) otetaan talteen ja määritetään suoraan kapillaarikaasukromatografian avulla.

3. VÄLINEISTÖ

3.1 Erlenmeyer-pullo, 25 ml.

3.2 Lasikolonni kaasukromatografiaa varten, sisähalkaisija 15,0 mm ja pituus 30–40 cm, varustettu hanalla.

3.3 Soveltuva kaasukromatografialaitteisto, joka toimii kapillaarikolonnin kanssa ja jossa on suoraan kolonniin johtava näytteensyöttöjärjestelmä. Laitteiston osat ovat: 3.3.1 termostaattisäätöinen lämpötilaohjelmoitu uuni kolonnille, 3.3.2 kylmäinjektori, näytteen syöttämiseksi suoraan kolonniin, 3.3.3 liekki-ionisaatiodetektori ja muuntajavahvistin, 3.3.4 integroiva piirturi, joka toimii muuntajavahvistimen (3.3.3) kanssa ja jonka vastenopeus on enintään 1 sekunti ja jonka paperin nopeutta voidaan säätää. (On myös mahdollista käyttää tietokonepohjaisia järjestelmiä, joissa kaasukromatografin tiedot saadaan tietokoneen avulla.) 3.3.5 lasinen tai kvartsilasinen kapillaarikolonni, jonka pituus on 8–12 m ja sisähalkaisija 0,25–0,32 mm ja jonka sisäpinta on päällystetty stationäärifaasilla siten, että nestekerroksen paksuus on 0,10–0,30 μm. (Käyttövalmiina ostettavat stationäärifaasit ovat tyyppiä SE 52 tai SE 54.)

3.4 Mikroruisku, kolonniin suoraan syöttämiseksi, 10 μl, jossa on kiinteä neula.

3.5 Sähkökäyttöinen sekoittaja.

3.6 Pyöröhaihduttaja.

3.7 Muhveliuuni.

3.8 Analyysivaaka, jonka tarkkuus ± 0,1 mg.

3.9 Laboratorion tavanomaiset lasivälineet.

4. REAGENSSIT

4.1 Silikageeliä, jonka hiukkaskoko 60–200 μm. Silikageeli laitetaan uuniin 500 °C:n lämpötilaan vähintään 4 tunniksi. Jäähdytetään ja lisätään vettä 2 % silikageelin määrästä. Sekoitetaan massan homogenoimiseksi. Säilytetään pimeässä vähintään 12 tuntia ennen käyttöä.

4.2 N-heksaani, kromatografialaatua.

4.3 Etyylieetteriä, kromatografialaatua.

4.4 N-heptaani, kromatografialaatua.

4.5 Lauryyliarakidaatin standardiliuos, 0,1 % (m/V) liuos heksaanissa (sisäinen standardi). (On myös mahdollista käyttää palmityylipalmitaattia tai myristyylistearaattia.) 4.5.1 Sudan 1 (1-fenyyliatso)-2-naftoli).

4.6 Kantajakaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua.

4.7 Apukaasut: — puhdas vety, kaasukromatografialaatua, — puhdas ilma, kaasukromatografialaatua.

5. SUORITUS

5.1 Kromatografiakolonnin esikäsittely

Suspendoidaan 15 g silikageeliä (4.1) n-heksaaniin (4.2) ja laitetaan kolonniin (3.2). Annetaan laskeutua itsestään ja autetaan laskeutumista sähkökäyttöisellä sekoittajalla (3.5), jotta saadaan homogeenisempi kromatografiakerros. Suodatetaan läpi 30 ml n-heksaania mahdollisten epäpuhtauksien poistamiseksi. Punnitaan vaa’alla (3.8) tarkasti 500 mg näytettä 25 ml:n erlenmeyerpulloon (3.1), lisätään sopiva määrä sisäistä standardia (4.5) oletetun vahapitoisuuden mukaan. Esimerkiksi: lauryyliarakidaattia lisätään 0,1 mg, jos on kyse oliiviöljystä, ja 0,25–0,5 mg, jos kyse on puristemassaöljystä. Siirretään näin valmistettu näyte kahden 2 ml:n n-heksaaniannoksen avulla kromatografiakolonniin (4.2).

Liuottimen annetaan valua, kunnes se on 1 mm absorboimisaineen pinnan yläpuolella, minkä jälkeen suodatetaan läpi 70 ml n-heksaania luonnostaan esiintyvien n-alkaanien poistamiseksi. Aloitetaan kromatografinen eluointi keräämällä 180 ml n-heksaani/etyylieetteriseosta, suhde 99:1, valumisnopeuden ollessa noin 15 tippaa 10 sekunnissa. Näyte eluoidaan lämpötilassa 22 °C ± 4.

Huom.

— N-heksaani/etyylieetteriseos, suhde 99:1, on valmistettava uudelleen joka päivä.

— Vahojen eluoitumisen tarkkailemiseksi silmämääräisesti liuosnäytteeseen on mahdollista lisätä 100 μl 1-prosenttista sudania eluutioliuoksessa. Koska sudanin retentioaika sijoittuu vahojen ja triglyseridien välille, eluointi keskeytetään, kun väri saavuttaa kromatografiakolonnin pohjan, sillä tällöin kaikki vahat ovat eluoituneet.

Tällä tavoin saatu jae kuivataan pyöröhaihduttimessa (3.6), kunnes lähes kaikki liuotin on saatu poistettua. Viimeiset 2 ml liuotinta poistetaan heikon typpivirtauksen avulla, minkä jälkeen lisätään 2–4 ml n-heptaania.

5.2 Kaasukromatografinen määritys

5.2.1 Esivalmistelut

Kolonni asennetaan kaasukromatografiin (3.3) siten, että alkupää yhdistetään on-column -järjestelmään ja loppupää detektoriin. Tarkistetaan kaasukromatografialaitteiden toimivuus (kaasuliitäntöjen kunto, detektorin ja piirturijärjestelmän suoritusteho jne.).

Jos kolonnia ei ole aikaisemmin käytetty, se on ensin valmisteltava käyttöön. Kevyt kaasuvirtaus johdetaan kolonnin läpi ja kaasukromatografi käynnistetään. Lämmitetään asteittain siten, että lämpötila on noin neljän tunnin kuluttua kohonnut 350 °C:een. Tätä lämpötilaa pidetään yllä vähintään kaksi tuntia, jonka jälkeen laitteisto säädetään käyttöolosuhteisiin (kaasuvirtojen säätö, liekin sytytys, kytkeminen elektroniseen piirturiin (3.3.4), uunin lämpötilan säätö kolonnia varten, detektorin lämpötilasäätö jne.) ja signaali säädetään niin, että sen herkkyys on vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin on arvioitu määrityksessä tarvittavan. Saadun pohjaviivan on oltava suora, siinä ei saa olla minkäänlaisia piikkejä eikä ryömintää mihinkään suuntaan.

Jos ilmenee negatiivista suoraviivaista ryömintää, se on merkki kolonnin liitäntöjen vuotamisesta; positiivinen ryömintä johtuu kolonnin riittämättömästä valmistelusta.

5.2.2 Toimintaolosuhteiden valinta

Yleisesti kromatografia tehdään seuraavissa käyttöolosuhteissa:

— kolonnin lämpötila: —



20 °C minuutissa 5 °C minuutissa 20 °C minuutissa aluksi 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— detektorin lämpötila: 350 °C,

— injektoidun aineen määrä: 1 μl n-heptaaniliuosta (2–4 ml),

— kantajakaasut: helium tai vety valitun kaasun optimaalisella lineaarinopeudella (ks. lisäys),

— laitteen herkkyys siten että seuraavat edellytykset täyttyvät:

Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin ominaisuuksien perusteella, jotta kaikki vahat saadaan erotettua, jotta piikkien erotuskyky on riittävä (ks. kuva) ja jotta sisäisen standardin C32 retentioaika on 18 ± 3 minuuttia. Edustavimpien vahojen piikin on oltava vähintään 60 % asteikon pohjasta.

Piikkien integrointiparametrit asetetaan niin, että huomioon otettavien piikkien pinta-alat voidaan arvioida oikein.

Huom.Koska lopullinen lämpötila on korkea, sallitaan positiivinen siirtymä, joka saa kuitenkin olla enintään 10 % asteikon alarajasta.

5.3 Määritys

Imetään 10 μl:n mikroruiskuun 1 μl liuosta; vedetään männällä neula tyhjäksi. Työnnetään neula injektiolaitteeseen ja 1–2 sekunnin kuluttua injektoidaan nopeasti; noin 5 sekunnin kuluttua vedetään neula hitaasti pois.

Piirturi pidetään käynnissä, kunnes vahat ovat eluoituneet täydellisesti.

Pohjaviivan on koko ajan oltava vaatimusten mukainen.

5.4 Piikkien tunnistaminen

Eri piikkien tunnistaminen suoritetaan retentioaikojen perusteella ja vertaamalla samoissa olosuhteissa määritettyihin vahojen seoksiin, joiden retentioajat tunnetaan.

Kuva 1 esittää neitsytoliiviöljyn vahojen kromatogrammia.

5.5 Kvantitatiivinen arviointi

Sisäisen standardin ja C40–C46 -alifaattisten esterien piikkien pinta-alat lasketaan integraattorilla.

Lasketaan kunkin esterin vahapitoisuus, ilmoitettuna mg/kg rasvaa, seuraavasti:

jossa:

Ax = kunkin esterin piikin pinta-ala neliömillimetreinä

As = kunkin sisäisen standardin piikin pinta-ala neliömillimetreinä

ms = lisätyn sisäisen standardin massa milligrammoina

m = määritystä varten otetun näytteen massa grammoina.

6. TULOSTEN ILMOITTAMINEN

C40–C46:n eri vahojen pitoisuuksien summa ilmoitetaan mg/kg rasvaa (ppm).

Huom.Määritetään piikkien pinta-aloista niiden komponenttien määrät, joissa on parillinen määrä C-atomeja välillä C40–C46, jäljempänä olevassa kuvassa esitetyn oliiviöljyn vahojen kromatogrammin mukaisesti. Jos C46-esteri esiintyy kahtena piikkinä, sen tunnistamiseksi on syytä analysoida oliivinpuristemassaöljyn vahojen jae, jossa C46:n piikki on helppo tunnistaa, koska se on selvästi hallitsevin.

Tulokset ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.

KUVA

Oliiviöljyn vahojen kromatogrammi ( 5 )

Merkkien selitykset::

I.S. = lauryyliarakidaatti

1 = diterpeeniesterit

2 + 2′ = C40-esterit

3 + 3′ = C42-esterit

4 + 4′ = esterit C44

5 = C46-esterit

6 = steroliesterit ja triterpeenialkoholi.









Lisäys

Kaasun lineaarinopeuden määrittäminen

Injektoidaan 1–3 μl metaania (tai propaania) tavanomaisiin käyttöolosuhteisiin säädettyyn kaasukromatografialaitteistoon. Mitataan aika, jonka kaasu kulkee kolonnin läpi, alkaen injektiohetkestä piikin muodostumiseen (tM).

Lineaarinopeus, cm/s, saadaan kaavasta L/tM, jossa L on kolonnin pituus senttimetreinä ja tM on aika sekunteina sekuntikellolla mitattuna.

▼B









LIITE V

STEROLIEN RAKENTEEN JA PITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN KAPILLAARIKAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ

1 TARKOITUS

Tällä menetelmällä voidaan määrittää yksittäisten sterolien määrät ja niiden kokonaismäärä rasvoissa ja öljyissä.

2 PERIAATE

Rasva tai öljy, johon on lisätty a-kolestanoli sisäiseksi standardiksi, saippuoidaan kaliumhydroksidin etanoliliuoksella ja saippuoitumaton aines uutetaan etyylieetterillä. Sterolifraktio erotetaan saippuoitumattomasta uutteesta ohutkerroskromatografialla käyttäen emäksistä silikageelilevyä. Silikageelistä saadut sterolit muutetaan trimetyylisilyylieettereiksi ja määritetään kapillaarikaasukromatografialla.

3 VÄLINEISTÖ

3.1 Pullo, 250 ml, jossa on hiokset ja palautusjäähdytin.

3.2 Erotussuppilo, 500 ml.

3.3 Pulloja, 250 ml.

3.4 Ohutkerroskromatografialaitteisto, jonka levyjen koko on 20 × 20 cm.

3.5 Ultraviolettivalo, jonka aallonpituus on 366 tai 254 nm.

3.6 Mikroruiskuja, 100 μl ja 500 μl

3.7 Lasisintterisuodatinsuppilo, jonka huokoskoko on G 3 (15—40 μm), halkaisija noin 2 cm ja korkeus noin 5 cm ja jossa on liitäntä tyhjiösuodatusta varten sekä koirashios 12/21.

3.8 Tyhjiöimupullo, 50 ml, jossa on naarashios 12/21, joka sopii suodatinsuppiloon (3.7).

3.9 Koeputki, 10 ml, jossa on kartiomainen pohja ja ilmatiivis tulppa.

3.10 Kaasukromatografi, johon sopii kapillaarikolonni ja johon kuuluu virtauksenjakojärjestelmä, jonka osat ovat: 3.10.1 Termostaattisäätöinen kolonniuuni, joka säilyttää halutun lämpötilan noin ± 1 °C:n tarkkuudella; 3.10.2 Höyrystämisyksikkö, jonka lämpötilaa voi säätää ja jonka höyrystämisosa on persilanoitua lasia; 3.10.3 Liekki-ionisaatiodetektori ja muuntajavahvistin; 3.10.4 Integraattori-piirturi, joka sopii käytettäväksi muuntajavahvistimen kanssa.

3.11 Lasinen tai kvartsilasinen kapillaarikolonni, jonka pituus on 20—30 m ja sisähalkaisija 0,25—0,32 mm ja jonka sisäpinta on päällystetty nesteellä SE-52 tai SE-54 tai vastaavalla siten, että nestekerroksen paksuus on 0,10—0,30 mm.

3.12 Mikroruisku, jossa on karkaistu neula, kaasukromatografiaa varten, 10 μl.

4 REAGENSSIT

4.1 Kaliumhydroksidin noin 2 N etanoliliuos: 130 g kaliumhydroksidia (vähintään 85-prosenttista) liuotetaan 200 ml:aan tislattua vettä samalla jäähdyttäen ja lisätään etanolia niin, että liuosta on yksi litra. Liuosta säilytetään tiiviisti suljetuissa, tummasta lasista valmistetuissa pulloissa (etanoli 95 % V/V).

4.2 Etyylieetteri, analyysilaatua.

4.3 Vedetön natriumsulfaatti, analyysilaatua.

4.4 Silikageelillä päällystetyt lasilevyt, paksuudeltaan 0,25 mm, ilman fluoresenssi-indikaattoria (voidaan ostaa käyttövalmiina).

4.5 Kaliumhydroksidin 0,2 N etanoliliuos: liuotetaan 13 g kaliumhydroksidia 20 ml:aan tislattua vettä ja lisätään etanolia niin, että liuosta on yksi litra.

4.6 Bentseeni, kromatografiaa varten (5.2.2).

4.7 Asetoni, kromatografiaa varten (5.2.2).

4.8 Heksaani, kromatografiaa varten (5.2.2).

4.9 Etyylieetteri, kromatografiaa varten (5.2.2).

4.10 Puhdas kloroformi, analyysilaatua (5.2.2).

4.11 Ohutkerroskromatografian vertailuliuos: ►M6 2 prosenttinen ◄ kolesterolin tai fytosterolin kloroformiliuos.

4.12 2,7-dikloorifluoreseiini, 0,2-prosenttinen etanoliliuos. Liuos tehdään lievästi emäksiseksi lisäämällä muutama tippa kaliumhydroksidin 2 N alkoholiliuosta.

4.13 Vedetön pyridiini, kromatografiaa varten.

4.14 Heksametyylidisilatsaani.

4.15 Trimetyylikloorisilaani.

4.16 Sterolien trimetyylisilyylieettereiden standardiliuokset. Ne valmistetaan vasta käyttöhetkellä steroleista, jotka saadaan niitä sisältävistä öljyistä.

4.17 α-kolestanoli 0,2-prosenttisena (m/V) kloroformiliuoksena (sisäinen standardi).

4.18 Kantajakaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua.

4.19 Apukaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua.

5 MENETTELY

5.1 Saippuoitumattomien aineiden esikäsittely 5.1.1 250 ml:n pulloon lisätään 500 ml:n mikroruiskulla sellainen tilavuusmäärä 0,2-prosenttista α-kolestanolin kloroformiliuosta (4.17) jonka sisältämä α-kolestanolin määrä on noin 10 % sterolin määrästä siinä osanäytteessä, joka on pullossa määritettävänä. Esimerkiksi 5 gramman oliiviöljynäytteeseen lisätään 500 μl 0,2-prosenttista α-kolestanoliliuosta, ja jos näytteenä on ►M6 ————— ◄ uutettua oliiviöljyä, lisätään 1 500 μl α-kolestanolia. Haihdutetaan kuiviin typpivirrassa ja punnitaan tarkalleen 5 g kuivattua, suodatettua näytettä samaan pulloon. ►M6 ————— ◄ Öljyt, jotka sisältävät paljon kolesterolia, voivat tuottaa piikin, jonka retentioaika on sama kuin kolestanolin. Jos käy näin, sterolifraktio on määritettävä kahdesti niin, että toisella kertaa käytetään sisäistä standardia ja toisella ei ►M6 tai käyttää kolestanolin sijasta betulinolia ◄ . 5.1.2 Lisätään 50 ml kaliumhydroksidin 2 N etanoliliuosta, käynnistetään palautusjäähdytin ja kuumennetaan vesihauteessa hiljalleen kiehuvaksi koko ajan voimakkaasti sekoittaen, kunnes saippuoituminen on tapahtunut (liuos kirkastuu). Kuumentamista jatketaan vielä 20 minuuttia, sitten lisätään 50 ml tislattua vettä jäähdyttimen yläpäästä, irrotetaan jäähdytin ja jäähdytetään pullo noin 30 °C:n lämpötilaan. 5.1.3 Pullon sisältämä seos siirretään kvantitatiivisesti 500 ml:n erotussuppiloon käyttäen huuhteena yhteensä noin 50 ml tislattua vettä. Lisätään noin 80 ml etyylieetteriä, ravistetaan voimakkaasti noin 30 sekunnin ajan ja annetaan seistä niin, että kerrokset erottuvat (Huom. 1). Pohjalla oleva vesifaasi siirretään toiseen erotussuppiloon. Vesifaasi uutetaan vielä kaksi kertaa samalla tavoin käyttäen 60—70 ml etyylieetteriä kummallakin kerralla. Huom. 1 Mahdollinen emulsio voidaan hajottaa lisäämällä pieni määrä etanolia tai metanolia suihkeena. 5.1.4 Kaikki eetteriuutteet yhdistetään yhteen erotussuppiloon ja pestään tislatulla vedellä (50 ml kerralla), kunnes pesuvesi on neutraalia. Kun pesuvesi on poistettu, eetteriuutteet kuivataan vedettömällä natriumsulfaatilla, suodatetaan vedettömän natriumsulfaatin läpi etukäteen punnittuun 250 ml:n pulloon ja pestään suppilo ja suodatin pienillä määrillä etyylieetteriä. 5.1.5 Eetteriä haihdutetaan niin, että sitä on ainoastaan muutama millilitra, jäännös kuivataan sitten pienessä alipaineessa tai typpivirrassa ja lopuksi kuivataan lämpökaapissa, jonka lämpötila on 100 °C, noin 15 minuutin ajan, jäännös jäähdytetään eksikkaattorissa ja punnitaan.

5.2 Sterolifraktion erottaminen 5.2.1 Emäksisten levyjen valmistelu: upotetaan silikageelilevyt (4.4) kokonaan kaliumhydroksidin 0,2 N etanoliliuokseen (4.5) kymmeneksi sekunniksi, minkä jälkeen niiden annetaan kuivua kaksi tuntia vetokaapissa ja lopuksi yksi tunti 100 °C:ssa lämpökaapissa. Kun levyt on otettu lämpökaapista, niitä säilytetään kalsiumkloridia sisältävässä eksikkaattorissa käyttöhetkeen saakka (näin käsitellyt levyt on käytettävä 15 päivän kuluessa). Huom. 2 Kun sterolifraktion erottamiseen käytetään emäksisiä silikageelilevyjä, ei ole tarpeen käsitellä saippuoitumattomia aineita alumiinioksidilla. Näin kaikki happamat aineet (rasvahapot ja muut hapot) jäävät lähtöviivalle. Sterolivyöhyke erottuu selvästi alifaattisten ja terpeenisten alkoholien vyöhykkeestä. 5.2.2 Bentseeni-asetoniseosta (95:5, V/V) kaadetaan kehitysastiaan niin, että sitä on noin 1 cm. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää heksaani-etyylieetteriseosta (65:35, V/V). Kehitysastia suljetaan sopivalla kannella ja annetaan seistä avaamatta vähintään puoli tuntia, jotta syntyy neste-höyrytasapaino. Astian sisäseinille voidaan kiinnittää suodatinpaperisuikaleita, jotka ulottuvat eluointiaineeseen. Tämä lyhentää kehitysaikaa lähes kolmanneksella ja aineosat eluoituvat tasaisemmin. Huom. 3 Kehitysliuos on vaihdettava uuteen ennen jokaista koetta, jotta eluointiolosuhteet olisivat täysin toistettavissa. 5.2.3 Saippuoitumattomista aineista (5.1.5) valmistetaan noin 5-prosenttinen kloroformiliuos, jota levitetään 0,3 ml kromatografialevylle (5.2.1) mahdollisimman ohuena ja tasaisena nauhana 100 ml:n mikroruiskulla noin 2 cm:n päähän levyn reunasta. Asetetaan 2—3 ml sterolien vertailuliuosta (4.11) lähtöviivan tasalle levyn reunaan niin että sterolivyöhyke voidaan tunnistaa kehityksen jälkeen. 5.2.4 Levy asetetaan kehitysastiaan, joka on valmisteltu 5.2.2 kohdan ohjeiden mukaan. Ympäristön lämpötilan on oltava 15—20 °C. Astian kansi suljetaan heti ja annetaan levyn eluoitua, kunnes liuotinrintama on siirtynyt noin 1 cm:n päähän levyn yläreunasta. Levy otetaan kehitysastiasta ja liuotin haihdutetaan kuumassa ilmavirrassa tai panemalla levy joksikin aikaa vetokaappiin. 5.2.5 Levylle suihkutetaan ohuelti ja tasaisesti 2,7-dikloorifluoreseiiniliuosta. Sterolivyöhyke voidaan tunnistaa ultraviolettivalossa siitä, että se on samassa kohdassa kuin vertailuliuoksen vyöhyke. Vyöhykkeen ääriviivat merkitään mustalla kynällä fluoresenssin rajoja seuraten. 5.2.6 Silikageelikerros raaputetaan rajatulta alueelta metallilastalla. Saatu aines hienonnetaan, siirretään suodatinsuppiloon (3.7), lisätään 10 ml kuumaa kloroformia, sekoitetaan huolellisesti metallilastalla ja suodatetaan suodatinsuppiloon liitettyyn pulloon (3.8) tyhjiöllä. Suppiloon jäänyt aines pestään kolme kertaa noin 10 ml:lla etyylieetteriä, ja suodos kerätään suodatinsuppiloon liitettyyn pulloon. Suodosta haihdutetaan, kunnes sen tilavuus on noin 4—5 ml ja jäännösliuos kaadetaan etukäteen punnittuun 10 ml:n koeputkeen (3.9). Liuosta kuivataan alhaisella lämmöllä kevyessä typpivirrassa; jäännös liuotetaan muutamaan tippaan asetonia, kuivataan jälleen ja pidetään kymmenisen minuuttia 105 °C:ssa lämpökaapissa, jäähdytetään eksikkaattorissa ja punnitaan. Koeputkessa oleva jäännös sisältää sterolifraktion.

5.3 Trimetyylisilyylieettereiden valmistus 5.3.1 Koeputkessa olevaan sterolifraktioon lisätään silylointireagenssia, jossa on pyridiiniä, heksametyylidisilatsaania ja trimetyylikloorisilaania tilavuussuhteessa 9:3:1 (Huom. 4), 50 ml jokaista koeputkessa olevaa sterolimilligrammaa kohti niin, että kosteutta ei pääse mukaan (Huom. 5). Huom. 4 Käyttövalmiita liuoksia on kaupallisesti saatavana; lisäksi muita silylointireagensseja, kuten esim. bistrimetyylisilyylitrifluoriasetamidi + 1 % trimetyylikloorisilaania; reagenssi laimennetaan samalla määrällä vedetöntä pyridiiniä. 5.3.2 Koeputki suljetaan tulpalla, ravistetaan varovasti (ei ylösalaisin), kunnes sterolit ovat täysin liuenneet. Annetaan seistä vähintään 15 minuuttia huoneenlämmössä ja sentrifugoidaan sitten muutaman minuutin ajan; kirkas liuos on nyt valmis kaasukromatografista määritystä varten. Huom. 5 Lievä sameus on tavallista eikä ole haitaksi. Valkoiset hiutaleet tai vaaleanpunaiseksi värjäytyminen ovat merkkejä kosteudesta tai reagenssien muuttumisesta. Jos näitä ilmenee, koe on uusittava.

5.4 Kaasukromatografinen määritys 5.4.1 Esivalmistelut ja kolonnin valmistelu 5.4.1.1 Kapillaarikolonni asennetaan kaasukromatografialaitteistoon niin, että kolonnin alkupää kiinnitetään höyrystimeen, joka on liitetty virtauksenjakojärjestelmään, ja kolonnin loppupää kiinnitetään detektoriin. Tarkistetaan kaasukromatografisten laitteiden toiminta (kaasuliitännän tiiviys, detektorin, virtauksenjakojärjestelmän ja piirturin toimivuus, jne.) 5.4.1.2 Jos kapillaarikolonnia ei ole aikaisemmin käytetty, se on ensin valmisteltava käyttöön. Pieni määrä kaasua johdetaan kolonnin läpi, käynnistetään kaasukromatografi ja aloitetaan asteittainen lämmittäminen, jota jatketaan, kunnes lämpötila on kohonnut vähintään 20 °C korkeammaksi kuin käyttölämpötila (Huom. 6). Korkeaa lämpötilaa pidetään yllä vähintään kaksi tuntia, minkä jälkeen kromatografialaitteisto saatetaan käyttövalmiiksi (kaasuvirran ja erotuksen säätö, liekinsytytys, elektronisen piirturin kytkeminen, uunin lämpötilan säätö kolonnia varten, detektorin ja injektorin säätö, jne.) ja signaalia rekisteröidään herkkyydellä, joka on vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin määrityksessä käytettävä. Saadun perusviivan on oltava suora, eikä siinä saa olla minkäänlaisia piikkejä eikä siirtymää mihinkään suuntaan. Jos ilmenee negatiivista suoraviivaista siirtymää, se on merkki kolonnin liitäntöjen vuodosta, ja jos ilmenee positiivista siirtymää, se johtuu kolonnin riittämättömästä valmistelusta. Huom. 6 Esivalmistelulämpötilan on aina oltava vähintään 20 °C alempi kuin käytetyn stationäärifaasin korkein lämpötila. 5.4.2 Toimintaolosuhteiden valinta 5.4.2.1 Käyttöolosuhteiden ohjearvot ovat seuraavat: — kolonnin lämpötila: 260 ± 5 °C, — höyrystimen lämpötila: 280 °C, — detektorin lämpötila: 290 °C, — kantajakaasun lineaarinopeus: heliumille 20—35 cm/s ja vedylle 30—50 cm/s, — jakosuhde: 1:50 — 1:100, — laitteiston herkkyys: 4—16 kertaa vähimmäisvaimennus, — rekisteröintiherkkyys: 1—2 mV täydestä asteikosta, — paperin nopeus: 30—60 cm/h, — injektoidun aineen määrä: 0,5—1 ml TMSE-liuosta. Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin ominaisuuksien mukaan niin, että saadaan seuraavat vaatimukset täyttävä kromatogrammi: — β-sitosterolin retentioajan on oltava 20 ± 5 minuuttia, — kampesterolin piikki: oliiviöljylle (pitoisuus keskimäärin 3 %) 15 ± 5 % täydestä asteikosta, soijaöljylle (pitoisuus keskimäärin 20 %) 80 ± 10 % täydestä asteikosta, — kaikki mukana olevat sterolit on voitava erottaa toisistaan. Lisäksi kunkin piikin jälkeen piirturin tulee palata perusviivalle ennen uuden piikin alkua. Tämä ei ole kuitenkaan tarpeen, jos piikki TRR 1,02:ssa pystytään mittaamaan kohtisuoraan. 5.4.3 Määritys 5.4.3.1 Imetään 10 ml:n mikroruiskuun 1 ml heksaania, sitten 0,5 ml ilmaa ja tämän jälkeen 0,5 ml—1 ml näyteliuosta; lopuksi männällä vedetään vielä neula tyhjäksi. Neula työnnetään septumin läpi injektiopesään ja 1—2 sekunnin kuluttua seos injektoidaan nopeasti, odotetaan noin viisi sekuntia, jonka jälkeen neula vedetään pois hitaasti. 5.4.3.2 Rekisteröintiä jatketaan, kunnes näytteessä olevien sterolien TMSE on kokonaan eluoitunut. Perusviivan on koko ajan oltava 5.4.1.2 kohdan vaatimusten mukainen. 5.4.4 Piikkien tunnistaminen Yksittäiset piikit tunnistetaan niiden retentioajan perusteella sekä vertaamalla sterolien TMSE-seokseen, joka on määritetty samoissa olosuhteissa. Sterolit eluoituvat seuraavassa järjestyksessä: kolesteroli, brassikasteroli, 24-metyleenikolesteroli, kampestroli, kampestanoli, stigmasteroli, Δ7-kampesteroli, Δ5,23-stigmastadienoli, klerosteroli, β-sitosteroli, sitostanoli, Δ5-avenasteroli, Δ5,24-stigmastadienoli, Δ7-sigmastenoli, Δ7-avenasteroli. Sitosterolin retentioajat SE-52- ja SE-54-kolonneille on esitetty taulukossa 1. Kuvat 1 ja 2 esittävät eräiden öljyjen tyypillisiä kromatogrammeja. 5.4.5 Kvantitatiivinen arviointi 5.4.5.1 Lasketaan α-kolestanolin ja sterolien piikkien pinta-alat integraattorin avulla. Sellaisten aineiden piikit, jotka eivät esiinny taulukossa 1, jätetään huomiotta. α-kolestanolin vastekerroin on 1. 5.4.5.2 Lasketaan yksittäisten sterolien pitoisuus milligrammoina 100 g:ssa rasvaa tai öljyä seuraavasta kaavasta: jossa: Ax = x-sterolin piikin pinta-ala ►M6 ————— ◄ ; As = α-kolestanolin piikin pinta-ala ►M6 ————— ◄ ; ms = lisätyn α-kolestanolin massa milligrammoina; m = määritykseen käytetyn näytteen massa grammoina.

6 TULOSTEN ESITTÄMINEN

6.1 Ilmoitetaan yksittäisten sterolien pitoisuus milligrammoina 100 g:ssa rasvaa tai öljyä ja niiden pitoisuuksien summa, ”kokonaissterolimäärä”.

6.2 Lasketaan yksittäisen sterolin prosenttiosuus sitä vastaavan piikin suhteellisena osuutena kaikkien sterolipiikkien yhteenlasketusta pinta-alasta. Jossa: Ax = x:n piikin pinta-ala; A = kaikkien sterolien piikkien yhteenlaskettu pinta-ala.









LISÄYS

Kaasun lineaarinopeuden määrittäminen

Kaasukromatografialaitteisto säädetään tavallisia käyttöolosuhteita vastaavaksi, injektoidaan 1—3 ml metaania (tai propaania) ja mitataan aika, jonka kuluessa kaasu kulkee kolonnin läpi, injektointihetkestä piikin muodostumiseen (tM).

Lineaarinopeus cm/s saadaan kaavasta L/tM, jossa L on kolonnin pituus senttimetreinä ja tM on mitattu aika sekunteina.







Taulukko 1 Sterolien suhteelliset retentioajat Piikki Nimi Suhteellinen retentioaika Kolonni SE 54 Kolonni SE 52 1 kolesteroli Δ-5-kolesten-3β-oli 0,67 0,63 2 kolestanoli 5α-kolestan-3β-oli 0,68 0,64 3 brassikasteroli [24S]-24-metyyli-Δ-5,22-kolestadien-3β-oli 0,73 0,71 4 24-metyleenikolesteroli 24-metyleeni-Δ-5,24-kolestadien-3β-oli 0,82 0,80 5 kampestroli [24R]-24-metyyli-Δ-5-kolesten-3β-oli 0,83 0,81 6 kampestanoli [24R]-24-metyyli-kolestan-3β-oli 0,85 0,82 7 stigmasteroli [24S]-24-etyyli-Δ-5,22-kolestadien-3β-oli 0,88 0,87 8 Δ-7-kampesteroli [24R]-24-metyyli-Δ-7-kolesten-3β-oli 0,93 0,92 9 Δ-5,23 stigmastadienoli [24R,S]-24-etyyli-Δ-5,23-kolestadien-3β-oli 0,95 0,95 10 klerosteroli [24S]-24-etyyli-Δ-5,25-kolestadien-3β-oli 0,96 0,96 11 β-sitosteroli [24R]-24-etyyli-Δ-5-kolestan-3β-oli 1,00 1,00 12 sitostanoli 24-etyyli-kolestan-3β-oli 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasteroli [24Z]-24-etyylideeni-5-kolesten-3β-oli 1,03 1,03 14 Δ-5,24-stigmastadienoli [24R,S]-24-etyyli-Δ-5,24-kolestadien-3β-oli 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenoli [24R,S]-24-etyyli-Δ-7,24-kolestadien-3β-oli 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasteroli [24Z]-24-etyylideeni-Δ-7-kolesten-3β-oli 1,16 1,16

Kuva 1

Raakaoliiviöljyn sterolifraktion kaasukromatogrammi

Kuva 2

Puhdistetun oliiviöljyn sterolifraktion kaasukromatogrammi









LIITE VI

ERYTRODIOLI- JA UVAOLIPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN

JOHDANTO

Erytrodioli, jolla yleensä tarkoitetaan dioleja erytrodioli ja uvaoli yhdessä, on joillekin rasvoille ja öljyille tyypillinen saippuoitumattoman osan aine. Sen pitoisuus on selvästi kohonnut uutetussa oliiviöljyssä; puristetussa oliiviöljyssä ja rypälesiemenöljyssä sitä on vähän, joten sen esiintyminen voi olla merkki siitä, että joukkoon on lisätty uutettua oliiviöljyä.

1 TARKOITUS

Tällä menetelmällä voidaan määrittää rasvan tai öljyn erytrodiolipitoisuus.

2 PERIAATE

Rasva tai öljy saippuoidaan kaliumhydroksidin etanoliliuoksella. Saippuoitumaton osa uutetaan etyylieetterillä ja puhdistetaan johtamalla se alumiinioksidikolonnin läpi, minkä jälkeen saippuoitumattomat aineet erotetaan silikageelilevyillä ohutkerroskromatografialla. Tällöin steroli- ja erytrodiolifraktiovyöhykkeet erottuvat.

Levyltä saadut sterolit ja erytrodioli muutetaan trimetyylisilyylieettereiksi ja määritetään kaasukromatografialla.

Tulos ilmoitetaan erytrodiolin prosenttiosuutena erytrodiolin ja sterolien seoksesta.

3 VÄLINEISTÖ

3.1 Sama kuin liitteessä V (Sterolien määritys).

4 REAGENSSIT

4.1 Samat kuin liitteessä V (Sterolien määritys).

4.2 Vertailuliuoksena erytrodiolin 0,5-prosenttinen kloroformiliuos.

5 SUORITUS

5.1 Saippuoitumattoman osan esikäsittely.

Kuten liitteessä V olevassa 5.1.2 kohdassa.

5.2 Erytrodiolin ja sterolien erottaminen.

5.2.1 Ks. menettely liitteessä V olevassa 5.2.1 kohdassa.

5.2.2 Ks. sama menettely liitteessä V olevassa 5.2.2 kohdassa.

5.2.3 Valmistetaan saippuoitumattomasta aineksesta 5-prosenttinen kloroformiliuos. Levitetään 0,3 ml liuosta mahdollisimman ohueksi ja tasaiseksi viivaksi 0,1 ml:n mikroruiskulla noin 1,5 cm:n päähän levyn alareunasta. Asetetaan muutama mikrolitra erytrodioli- ja kolesteroliliuosta vertailua varten levyn reunaan.

5.2.4 Asetetaan levy kehitysastiaan, joka on esikäsitelty kuten 5.2.1 kohdassa. Ympäristön lämpötilan on oltava noin 20 °C. Astia suljetaan heti kannella ja annetaan eluoitua, kunnes liuotinrintama on noussut noin 1 cm:n päähän levyn yläreunasta. Levy otetaan kehitysastiasta ja liuotin haihdutetaan kuumassa ilmavirrassa.

5.2.5 Levylle suihkutetaan tasaisesti 2,7-dikloorifluoreseiiniliuosta. Kun levyä tarkastellaan ultraviolettivalossa, sterolin ja erytrodiolin vyöhykkeet voidaan tunnistaa kohdistamalla ne vertailuliuoksen vyöhykkeisiin. Vyöhykkeet merkitään pisteellä, joka on juuri fluoresenssialueen reunojen ulkopuolella.

5.2.6 Silikageeli raaputetaan levystä irti metallilastalla merkityn alueen kohdalta. Irrotettu aines pannaan 50 ml:n pulloon. Lisätään 15 ml kuumaa kloroformia, ravistetaan hyvin ja suodatetaan suppilon läpi, jossa on huokoinen suodatin, johon silikageeli jää. Pestään kolme kertaa kuumalla kloroformilla (noin 10 ml kerralla) ja kerätään suodos 100 ml:n pulloon. Suodosta haihdutetaan, kunnes sitä on 4—5 ml, siirretään se punnittuun, kartiomaisella pohjalla varustettuun 10 ml:n sentrifugiputkeen, kuivatetaan typpivirrassa miedolla lämmöllä ja punnitaan.

5.3 Trimetyylisilyylieetterien valmistus

Kuten liitteessä V olevassa 5.3 kohdassa.

5.4 Kaasukromatografinen määritys

Kuten liitteessä V olevassa 5.4 kohdassa.

Kaasukromatografisen määrityksen olosuhteiden on oltava sellaiset, että ne täyttävät sterolien määritysvaatimukset ja että lisäksi erytrodiolin ja uvaolin TMSE:t erottuvat.

Kun näyte on injektoitu, rekisteröintiä jatketaan, kunnes näytteessä olevat sterolit, erytrodioli ja uvaoli ovat kokonaan eluoituneet. Tämän jälkeen tunnistetaan piikit (erytrodiolin ja uvaolin retentioajat ovat noin 1,45 ja 1,55 suhteessa β-sitosteroliin) ja piikkien pinta-alat lasketaan kuten steroleille.

6 TULOSTEN ESITTÄMINEN

Jossa:

A1 = erytrodiolin piikin pinta-ala ►M6 ————— ◄ ;

A2 = uvaolin piikin pinta-ala ►M6 ————— ◄ ;

Asterolit = sterolien piikkien yhteenlaskettu pinta-ala ►M6 ————— ◄ ;

Tulos ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.

▼M21









LIITE VII

2-GLYSERYYLIMONOPALMITAATIN PROSENTTIOSUUDEN MÄÄRITTÄMINEN

1. TARKOITUS JA SOVELTAMISALA

Tällä menetelmällä määritetään triglyseridin 2-asemassa olevan palmitiinihapon prosenttiosuus 2-glyseryylimonopalmitaatin määrityksen avulla.

Menetelmää sovelletaan kasviöljyihin, jotka ovat nestemäisiä huoneenlämmössä (20 °C).

2. PERIAATE

Öljynäyte valmistellaan ja käsitellään haimalipaasin avulla: kun triglyseridimolekyyli hydrolysoidaan osittain ja spesifisesti 1- ja 3-asemassa, jäävät jäljelle 2-asemassa olevat monoglyseridit. 2-glyseryylimonopalmitaatin prosenttiosuus monoglyseridijakeessa määritetään silyloinnin jälkeen käyttäen kapillaarikaasukromatografista määritystä.

3. VÄLINEISTÖ

3.1 Erlenmeyer-pullo, 25 ml.

3.2 Dekantterilaseja, 100, 250 ja 300 ml.

3.3 Lasikolonni kromatografiaa varten (sisähalkaisija 21–23 mm, pituus 400 mm), varustettuna sintterilasilevyllä ja hanalla.

3.4 Koeputkia, 10, 50, 100 ja 200 ml.

3.5 Kolveja, 100 ja 250 ml.

3.6 Pyöröhaihduttaja.

3.7 Kartiopohjaisia sentrifugiputkia, 10 ml, hiottu tulppa.

3.8 Sentrifugi 10 ja 100 ml:n putkia varten.

3.9 Termostaatti, joka ylläpitää lämpötilaa 40 °C ± 0,5 °C.

3.10 Mittapipettejä, 1 ja 2 ml.

3.11 Injektioruisku, 1 ml.

3.12 Mikroruisku, 100 μl.

3.13 Suppilo, 1 000 ml

3.14 Kapillaarikolonnilla varustettu kaasukromatografi, jossa on kolonniin liitetty kylmäinjektori, jonka avulla näyte voidaan syöttää suoraan koloniin, sekä uuni, joka pysyy valitussa lämpötilassa yhden celsiusasteen tarkkuudella.

3.15 Kolonniin liitetty kylmäinjektori, näytteen syöttämiseksi suoraan kolonniin.

3.16 Liekki-ionisaatiodetektori ja analysaattori.

3.17. Integroiva piirturi, joka toimii analysaattorin kanssa ja jonka vastenopeus on enintään 1 sekunti ja jonka paperin nopeutta voidaan säätää.

3.18 Lasinen tai kvartsilasinen kapillaarikolonni, jonka pituus on 8–12 m ja sisähalkaisija 0,25–0,32 mm ja jonka sisäpinta on päällystetty 5-prosenttisella metyylipolysiloksaanilla tai fenyylimetyylipolysiloksaanilla siten, että nestekerroksen paksuus on 0,10–0,30 μm, ja jota voidaan käyttää 370 °C:n lämpötilassa.

3.19 Mikroruisku, 10 μl, jossa on vähintään 7,5 cm:n kiinteä neula, jonka avulla näyte voidaan syöttää suoraan kolonniin.

4. REAGENSSIT

4.1 Silikageeli, jonka hiukkaskoko 0,063–0,200 mm (70/280 mesh) ja joka valmistetaan seuraavasti: Silikageeli pannaan posliiniastiaan, kuivataan lämpökaapissa 160 °C:n lämpötilassa neljän tunnin ajan, minkä jälkeen jäädytetään eksikkaattorissa huoneenlämmössä. Lisätään vettä 5 % silikageelin painosta seuraavasti: punnitaan 500 ml:n erlenmeyer-pulloon 152 g silikageeliä, lisätään 8 g tislattua vettä, suljetaan pullo ja ravistetaan varovasti siten, että vesi jakautuu tasaisesti. Säilytetään vähintään 12 tuntia ennen käyttöä.

4.2 N-heksaani, kromatografialaatua.

4.3 Isopropanoli

4.4 Isopropanoli, vesiliuos 1/1 (V/V)

4.5 Haimalipaasi. Käytettävän lipaasiaktiivisuuden on oltava 2,0–10 lipaasiyksikköä/mg. (Haimalipaasia, jonka aktiivisuus on 2–10 yksikköä/mg, on saatavilla valmiina.)

4.6 Tri-hydroksimetyyliaminometaani-puskuriliuos: lisätään vesiliuokseen suolahappoa 1 M, kunnes pH on 8 (tarkistetaan potentiometrillä) (1/1 V/V)

4.7 Natriumkolaatti (entsyymilaatua), 0,1 % vesiliuos (käytettävä 15 päivän kuluessa valmistamisesta).

4.8 Kalsiumkloridi, vesiliuos 22 %.

4.9 Dietyylieetteri, kromatografialaatua.

4.10 Kehitysliuos: n-heksaani/etyylieetteriseos (87/13) (V/V)

4.11 Natriumhydroksidi, 12-painoprosenttinen liuos.

4.12 1-prosenttinen fenoliftaleiiniliuos etanolissa.

4.13 Kantajakaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua.

4.14 Apukaasut: vety, vähintään 99-prosenttinen, kuiva ja ilman orgaanisia aineita, ja vesi kaasukromatografista laatua, sama puhtausaste.

4.15 Silylointireagenssi: Pyridiinin, heksametyylidisilatsaanin ja trimetyylikloorisilaanin seos 9/3/1 (V/V/V). (Käyttövalmiita liuoksia on kaupallisesti saatavana. Voidaan käyttää myös muita silylointireagensseja, kuten esim. bis-trimetyylisilyylitrifluoriasetamidi + 1 % trimetyylikloorisilaania; reagenssi laimennetaan samalla määrällä vedetöntä pyridiiniä.)

4.16 Standardit: puhtaat monoglyseridit tai monoglyseridien seokset, joiden prosenttiosuuksien mukainen tunnettu koostumus on samanlainen kuin näytteen.

5. MENETTELY

5.1 Näytteen valmistelu

5.1.1 Öljyjä, joiden vapaiden happojen pitoisuus on alle 3 %, ei tarvitse neutraloida ennen silikageelikolonnikromatografiaa. Öljyt, joiden vapaiden happojen pitoisuus on yli 3 %, on neutraloitava 5.1.1.1 kohdan mukaisesti. 5.1.1.1 1 000 ml:n suppiloon (3.13) kaadetaan 50 g öljyä ja 200 ml n-heksaania. Lisätään 100 ml isopropanolia ja 12-prosenttista natriumhydroksidiliuosta (4.11) määrä, joka vastaa öljyn vapaiden rasvahappojen määrää lisättynä 5 prosentilla. Ravistetaan voimakkaasti yhden minuutin ajan. Lisätään 100 ml tislattua vettä, ravistetaan uudelleen ja annetaan seistä. Kun erottuminen on tapahtunut, pohjalla oleva saippuoitunut kerros poistetaan. Myös mahdolliset välikerrokset (liimamaiset ja liukenemattomat aineet) poistetaan. Neutraalin öljyn heksaaniliuos pestään useita kertoja isopropanolin ja tislatun veden liuoksella, 50–60 ml, suhteessa 1:1 (V/V) (4.4), kunnes fenoliftaleiinin vaaleanpunainen väri on hävinnyt. Poistetaan suurin osa heksaania höyrystämällä tyhjiössä (käyttäen esim. kiertohaihdutinta) ja siirretään öljy 100 ml:n kolviin (3.5). Kuivataan öljy tyhjiössä, kunnes liuotin on kokonaan haihtunut. Tämän vaiheen jälkeen öljyn happopitoisuuden on oltava alle 0,5 %.

5.1.2 Kaadetaan 1,0 g edellä kuvatulla tavalla käsiteltyä öljyä 25 ml:n erlenmeyer-pulloon (3.1) ja liuotetaan se 10 ml:aan kehitysliuosta (4.10). Liuoksen annetaan seistä vähintään 15 minuuttia ennen silikageelikolonnikromatografiaa. Jos liuos on sameaa, se sentrifugoidaan optimaalisten edellytysten varmistamiseksi kromatografiaa varten. (Voidaan käyttää käyttövalmiita 500 mg:n SPE-silikageelipatruunoita.)

5.1.3 Kromatografiakolonnin esikäsittely Kolonniin (3.3) kaadetaan noin 30 ml kehitysliuosta (4.10) ja kolonnin alaosaan työnnetään lasisauvalla pumpulituppo; painetaan tuppoa ilman poistamiseksi. Valmistetaan dekantterilasissa suspensio, jossa on 25 g silikageeliä (4.1) ja noin 80 ml kehitysliuosta, ja kaadetaan se suppilon avulla kolonniin. Varmistetaan, että kaikki silikageeli on syötetty kolonniin; pestään kehitysliuoksella (4.10), avataan hana ja annetaan nesteen tulla pylväästä, kunnes sen pinta on noin 2 mm piihappogeelin yläpinnan yläpuolella.

5.1.4 Kolonnikromatografia Punnitaan 25 ml:n erlenmeyer-pulloon (3.1) tarkasti 1,0 g 5.1 kohdan mukaisesti valmistettua näytettä. Liuotetaan näyte 10 ml:aan kehitysliuosta (4.10). Kaadetaan liuos 5.1.3 kohdan mukaisesti valmisteltuun kromatografikolonniin. Vältetään koskemasta kolonnin pintaa. Hana avataan ja liuottimen annetaan tulla pylväästä, kunnes sen pinta on silikageelin pinnan tasolla. Annetaan kehittyä 150 ml:ssa kehitysliuosta. Säädetään virtaukseksi 2 ml/minuutissa (siten että 150 ml valuu 60–70 minuutissa). Eluaatti kerätään 250 ml:n taarattuun kolviin. Liuotin haihdutetaan tyhjiössä ja sen jäänteet poistetaan typpivirtauksen avulla. Punnitaan pullo ja lasketaan kerätty uute. (Jos käytetään käyttövalmiita SPE-silikageelipatruunoita, toimitaan seuraavasti: Lisätään 1 ml liuosta (5.1.2) patruunoihin, jotka on etukäteen käsitelty 3 ml:lla n-heksaania. Kun liuos on suodattunut, annetaan kehittyä 4 ml:ssa n-heksaania/dietyylietteriä 9/1 (V/V). Eluaatti kerätään 10 ml:n putkeen ja haihdutetaan kuiviin typpivirtauksen alla. Kuiva jäännös käsitellään haimalipaasin (5.2) avulla. Rasvahappokoostumus on ehdottomasti tarkistettava sekä ennen SPE-patruunan käyttöä että sen jälkeen.

5.2 Hydrolyysi haimalipaasin avulla

5.2.1 Mitataan sentrifugin putkeen 0,1 g 5.1 kohdan mukaisesti valmisteltua öljyä. Lisätään 2 ml puskuriliuosta (4.6), 0,5 ml natriumkolaattiliuosta (4.7) ja 0,2 ml kalsiumkloridiliuosta sekoittaen hyvin jokaisen lisäyksen jälkeen. Putki suljetaan hiotulla tulpalla ja asetetaan heti termostoituun hauteeseen, jonka lämpötila on 40 °C ± 0,5.

5.2.2 Putkeen lisätään 20 mg lipaasia, ravistetaan varovasti (niin että tulppa ei pääse kastumaan), asetetaan putki termostoituun hauteeseen tasan 2 minuutiksi ja poistetaan, minkä jälkeen ravistetaan voimakkaasti tasan 1 minuutti ja annetaan jäähtyä.

5.2.3 Lisätään 1 ml dietyylieetteriä, suljetaan pullo ja ravistetaan voimakkaasti, sentrifugoidaan ja siirretään eetteriliuos mikroruiskulla puhtaaseen ja kuivaan putkeen.

5.3 Silanoitujen johdannaisten ja kaasukromatografian valmistelu

5.3.1 Lisätään mikroruiskulla 10 ml:n kartiopohjaiseen putkeen 100 μl liuosta (5.2.3).

5.3.2 Liuotin haihdutetaan heikossa typpivirrassa, lisätään 20 μl silylointireagenssia (4.15), suljetaan putki tulpalla ja annetaan seistä 20 minuuttia.

5.3.3 Lisätään 1–5 ml n-heksaania (kromatografiaolosuhteiden mukaisesti). Tuloksena on liuos kaasukromatografiaa varten.

5.4 Kaasukromatografia

Käyttöolosuhteet ovat seuraavat:

— Injektorin (kolonniin liitetty kylmäinjektori) lämpötila matalampi kuin liuoksen kiehumislämpötila (68 °C),

— Detektorin lämpötila: 350 °C,

— Kolonnin lämpötila: uunin lämpötila ohjelmoidaan seuraavasti: 60 °C yhden minuutin ajan, lisätään 15 °C minuutissa kunnes lämpötila on 180 °C, minkä jälkeen lisätään 5 °C minuutissa kunnes lämpötila on 340 °C, minkä jälkeen lämpötila pidetään 340 °C:ssa 13 minuutin ajan,

— Kantajakaasut: vety tai helium sopivalla lineaarinopeudella kuvassa 1 esitetyn resoluution saavuttamiseksi. C54-triglyseridin retentioajan on oltava 40 ± 5 minuuttia (ks. kuva 2). (Jäljempänä esitetyt käyttöolosuhteet ovat ohjeellisia. Käyttäjän on optimoitava ne halutun resoluution saavuttamiseksi. 2-glyseryylimonopalmitaatin piikin korkeuden on oltava vähintään 10 % piirturin asteikosta.),

— Injektoidun aineen määrä: 0,5–1 μl n-heksaaniliuosta (5 ml) (5.3.3.).

5.4.1 Piikkien tunnistaminen

Yksittäiset monoglyseridit tunnistetaan retentioaikojen perusteella ja suhteessa niihin, jotka on saatu samoissa olosuhteissa määritetyillä monoglyseridien standardiseoksilla.

5.4.2 Kvantitatiivinen arviointi

Jokaisen piikin pinta-ala lasketaan elektronisen integraattorin avulla.

6. TULOSTEN ESITTÄMINEN

Glyseryylimonopalmitaatin prosenttiosuus lasketaan sitä vastaavan piikin suhteellisena osuutena kaikkien monoglyseridien piikkien yhteenlasketusta pinta-alasta (ks. kuva 2) seuraavan kaavan mukaisesti:

Glycéril monopalmitate (%):

NdT: Glycéril monopalmitate = glyseryylimonopalmitaatti jossa:

Ax = glyseryylimonopalmitaatin piikin pinta-ala

ΣA = kaikkien monoglyseridien piikkien pinta-alojen summa.

Tulos ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.

7. MÄÄRITYSSELOSTE

Määritysselosteessa on oltava:

— viittaus tähän menetelmään,

— näytteen tunnistamiseksi tarvittavat tiedot,

— määrityksen tulos,

— poikkeamiset tästä menetelmästä riippumatta siitä, johtuvatko ne asianomaisten päätöksestä vai jostain muusta syystä,

— laboratorion tunnistetiedot, määrityspäivä ja määrityksestä vastaavien allekirjoitukset.

Kuva 1

Kromatogrammi silylointireaktion tuotteista, saatu lipaasikäsittelyllä jalostetusta oliiviöljystä, johon lisätty 20 % esteröityä öljyä (100 %).

Selityksiä:: Acides gras libres = vapaat rasvahapot Huile d’olive raffinée = jalostettu oliiviöljy + 20 % huile estérifiée = + 20 % esteröityä öljyä 1–2 monopalmitine = 1–2-monopalmitiini 1–2 mono C18 insat. = tyydyttymätön C18, 1–2-mono- Squalene = skvaleeni

Kuva 2

Kromatogrammi:

A) esteröimätön oliiviöljy, lipaasikäsittelyn jälkeen; silyloinnin jälkeen; näissä olosuhteissa (kapillaarikolonni 8–12 m) vahajae eluoituu samassa ajassa kuin diglyseridijae tai hieman sen jälkeen. Triglyseridipitoisuus saa lipaasikäsittelyn jälkeen olla enintään 15 %. Merkkien selitykset:: 1 = Vapaat rasvahapot 2 = Monoglyseridit 3 = Diglyseridit 4 = Triglyseridit * = 2-monopalmitiini ** = C54-triglyseridi

Kromatogrammi:

B) esteröity öljy lipaasikäsittelyn jälkeen; silyloinnin jälkeen; näissä olosuhteissa (kapillaarikolonni 8–12 m) vahajae eluoituu samassa ajassa kuin diglyseridijae tai hieman sen jälkeen. Triglyseridipitoisuus saa lipaasikäsittelyn jälkeen olla enintään 15 % Merkkien selitykset: 1 = Vapaat rasvahapot 2 = Monoglyseridit 3 = Diglyseridit 4 = Triglyseridit * = 2-monopalmitiini ** = C54-triglyseridi

8. SELITYKSIÄ

LIPAASIN VALMISTUS

Myynnissä on lipaaseja, joiden aktiivisuus on tyydyttävä. On myös mahdollista valmistaa niitä laboratoriossa seuraavasti:

Jäähdytetään 5 kg tuoretta sian haimaa 0 °C:seen. Poistetaan ympäröivä kiintorasva ja kalvot ja jauhetaan sekoittimessa niin, että syntyy tahnamainen neste. Tahnaan lisätään 2,5 l vedetöntä asetonia ja sekoitetaan 4–6 tuntia, minkä jälkeen liuos sentrifugoidaan. Jäännöstä uutetaan vielä kolme kertaa samalla tilavuusmäärällä vedetöntä asetonia, sitten kaksi kertaa asetonin ja dietyylieetterin seoksella 1:1 (V/V) ja kaksi kertaa dietyylieetterillä.

Jäännös kuivataan tyhjiössä 48 tuntia, jotta saadaan stabiili jauhe, joka säilyy kauan jääkaapissa ja kuivissa olosuhteissa.

LIPAASIAKTIIVISUUDEN TARKISTAMINEN

Valmistetaan oliiviöljyemulsio seuraavasti:

Sekoitetaan 165 ml arabikumiliuosta (100 g/l), 15 g jäämurskaa ja 20 ml neutraloitua öljyä sekoittimella.

Lisätään 50 ml:n dekantterilasiin 10 ml tätä emulsiota, sitten 0,3 ml natriumkolaattiliuosta (0,2 g/ml) ja sitten 20 ml tislattua vettä.

Dekantterilasi asetetaan termostoituun hauteeseen, jonka lämpötila on 37 °C. Upotetaan pH-mittarin elektrodit nesteeseen ja asetetaan spiraalisekoitin paikoilleen.

Lisätään natriumhydroksidiliuosta (0,1 N) tipoittain byretin avulla, kunnes pH on 8,3.

Lisätään sama tilavuusmäärä lipaasijauheen vesisuspensiota (0,1 g/ml lipaasia). Heti kun pH on 8,3, käynnistetään sekuntikello ja aloitetaan natriumhydroksidiliuoksen tiputtaminen sellaisella nopeudella, että pH pysyy koko ajan 8,3:ssa. Liuoksen kulutus luetaan joka minuutti.

Tiedot kirjataan koordinaatistoon, jossa x-akselilla on aika ja y-akselilla on pH:n säilyttämiseen tarvittavan emäsliuoksen määrä millilitroina. Tuloksena on oltava lineaarinen kuvaaja.

Lipaasiaktiviteetti, joka mitataan lipaasiyksikköinä mg:aa kohden, saadaan seuraavasti:

jossa:

A aktiviteetti lipaasiyksikköä/mg

V natriumhydroksidiliuoksen (0,1 N) määrä millilitroina minuutissa (kuvaajasta laskettuna)

N natriumhydroksidiliuoksen normaalisuus

m lipaasinäytteen paino mg:oina.

Lipaasiyksikkö on se määrä entsyymiä, joka tarvitaan vapauttamaan 10 mikroekvivalenttia happoa minuutissa.

▼M20 —————

▼B









LIITE IX

SPEKTROFOTOMETRINEN MÄÄRITYS

JOHDANTO

Spektrofotometrinen määritys ultraviolettivalossa antaa tietoa rasvan laadusta, sen säilymisestä ja muutoksista, joita käsittelyt ovat siinä aiheuttaneet.

Tässä menetelmässä käytetyillä aallonpituuksilla tapahtuva absorptio johtuu konjugoiduista dieeni-ja trieenijärjestelmistä. Nämä absorptiot ilmaistaan ominaisekstinktiona (ekstinktio, joka tapahtuu tiettyyn liuottimeen valmistetun 1-prosenttisen rasvaliuoksen 1 cm:n paksuisessa kerroksessa), josta tavallisesti käytetään merkkiä K (nimitetään myös ”ekstinktiokertoimeksi”).

1 TARKOITUS

Tällä menetelmällä voidaan tutkia rasvoja spektrofotometrisesti ultraviolettivalossa.

2 PERIAATE

Rasva liuotetaan määrättyyn liuottimeen ja liuoksen ekstinktio mitataan tietyllä aallonpituudella käyttäen vertailuliuoksena puhdasta liuotinta. Yksittäiset ekstinktiot lasketaan spektrofotometrin lukemista.

3 VÄLINEISTÖ

3.1 Spektrofotometri, joka mittaa ekstinktion ultraviolettivalossa aallonpituuksilla 220—360 nm, yhden nanometrin tarkkuudella.

3.2 Suorakaiteen muotoisia kvartsikyvettejä kansineen, optinen väli 1 cm. Vedellä tai muulla sopivalla liuottimella täytettynä kyvettien antamien lukemien ero saa olla enintään 0,01 ekstinktioyksikköä.

3.3 Mittapulloja, 25 ml.

▼M6

3.4 Kromatografiakolonni, jonka yläosan pituus on 270 mm ja halkaisija 35 mm ja jonka alaosan pituus on 270 mm ja halkaisija 10 mm.

▼B

4 REAGENSSIT

4.1 Iso-oktaani (2,2,4—trimetyylipentaani), spektrofotometristä laatua: verrattuna tislattuun veteen sen läpäisysuhteen on oltava vähintään 60 % aallonpituudella 220 nm ja vähintään 95 % aallonpituudella 250 nm, tai — sykloheksaani, spektrofotometristä laatua: tislattuun veteen verrattuna sen läpäisysuhteen on oltava vähintään 40 % 220 nm:ssä ja vähintään 95 % 250 nm:ssä. ▼M6 ————— ▼B

4.2 Emäksistä alumiinioksidia kromatografiakolonnia varten; esikäsittely ja tarkistus kuvataan lisäyksessä 1.

4.3 n-heksaani, kromatografiaa varten.

5 MENETTELY

5.1 Näytteen tulee olla täysin homogeenista eikä siinä saa olla suspendoituneita epäpuhtauksia. Öljyt, jotka ovat huoneenlämmössä nestemäisiä, suodatetaan paperin läpi noin 30 °C:ssa, kiinteät rasvat homogenoidaan ja suodatetaan lämpötilassa, joka ei saa olla yli 10 °C korkeampi kuin niiden sulamispiste.

5.2 Punnitaan noin 0,25 g näytettä, joka on esikäsitelty edellä kuvatulla tavalla, 25 ml:n mittapulloon, joka täytetään liuottimella ja homogenoidaan. Syntyvän liuoksen on oltava täysin kirkasta. Jos ilmenee sameutta tai sakkaa, liuos suodatetaan nopeasti paperin läpi.

5.3 Kyvetti täytetään saadulla liuoksella ja ekstinktiot mitataan sopivalla aallonpituudella 232—276 nm; käytetty liuotin toimii vertailuliuoksena. Saatujen ekstinktioarvojen on oltava 0,1—0,8; jollei tällaisia tuloksia saada, koe on uusittava käyttäen vahvempia tai laimeampia liuoksia tarpeen mukaan.

5.4 Kun on tarpeen määrittää ominaisekstinktio alumiinioksidilla tapahtuvan puhdistamisen jälkeen, toimitaan seuraavasti: kromatografiakolonniin pannaan 30 g emäksistä alumiinioksidia heksaaniin suspendoituna, adsorbentin annetaan laskeutua ja ylimääräinen heksaani poistetaan niin, että sitä on noin 1 cm alumiinioksidin päällä. Liuotetaan 10 g rasvaa homogenoituna ja suodatettuna 5.1 kohdan mukaisesti 100 ml:aan heksaania ja kaadetaan liuos kolonniin. Eluaatti kerätään talteen ja liuotin haihdutetaan tyhjiössä alle 25 °C:ssa. Näin saatu rasva käsitellään välittömästi 5.2 kohdan mukaisesti.

6 TULOSTEN ESITTÄMINEN

6.1 Lasketaan ominaisekstinktiot (ekstinktiokertoimet) eri aallonpituuksilla seuraavasta kaavasta: jossa: Kλ = ominaisekstinktio aallonpituudella λ; Eλ = aallonpituudella λ mitattu ekstinktio; c = liuoksen väkevyys g/100 ml; s = kyvetin paksuus, cm Tulokset ilmoitetaan kahden desimaalin tarkkuudella.

6.2 Oliiviöljyn spektrofotometrinen määritys ETY:n virallisissa asetuksissa tarkoitetun virallisen menetelmän mukaan vaatii ominaisekstinktion määrittämisen iso-oktaaniliuoksessa aallonpituuksilla 232 ja 270 nm ja ΔK:n laskemisen kaavasta: jossa Km on ominaisekstinktio aallonpituudella m, maksimaalisen absorption aallonpituuden ollessa noin 270 nm.









LISÄYS I

Alumiinioksidin esikäsittely ja sen aktiivisuuden tarkistus

A.1.1 Alumiinioksidin esikäsittely Etukäteen 380—400 °C uunissa kolmen tunnin ajan kuivattu alumiinioksidi asetetaan ilmatiiviiseen astiaan. Tislattua vettä lisätään suhteessa 5 ml/100 g alumiinioksidia, astia suljetaan välittömästi, sitä ravistetaan useita kertoja ja annetaan sitten seistä vähintään 12 tuntia ennen käyttöä.

A.1.2 Alumiinioksidin aktiivisuuden tarkistaminen Esikäsitellään kromatografiakolonni 30 g:lla alumiinioksidia. Seurataan 5.4 kohdan ohjeita ja johdetaan kolonnin läpi seos, jossa on: — 95 % neitsytoliiviöljyä, jonka ominaisekstinktio on alle 0,18 aallonpituudella 268 nm, — 5 % maapähkinäöljyä, joka on käsitelty valkaisumaalla sen puhdistuksen aikana ja jonka ominaisekstinktio on vähintään 4 aallonpituudella 268 nm. Seos johdetaan kolonnin läpi ja jos sen ominaisekstinktio on yli 0,11 aallonpituudella 268 nm, alumiinioksidi on kelvollista; muutoin sen hydrataatioastetta on lisättävä.









LISÄYS II

Spektrofotometrin kalibrointi

A.2 Laitteisto tulee tarkistaa säännöllisesti (vähintään puolen vuoden välein), sekä aallonpituuksien vastaavuuden että lukematarkkuuden suhteen. A.2.1 Aallonpituuslukema voidaan tarkistaa joko elohopeahöyrylampulla tai sopivien suodattimien avulla. A.2.2 Valokennon ja valomonistimen antamat lukemat voidaan tarkistaa seuraavasti: punnitaan 0,2 g spektrofotometrisesti puhdasta kaliumkromaattia ja liuotetaan se 0,05 N kaliumhydroksidiliuokseen 1 000 ml:n mittapulloon niin, että liuosta on 1 000 ml. Mitataan tasan 25 ml tätä liuosta 500 ml:n mittapulloon ja täytetään pullo kaliumhydroksidiliuoksella. Näin saadun liuoksen ekstinktio mitataan aallonpituudella 275 nm ja käytetään kaliumhydroksidiliuosta vertailuliuoksena. Mitatun ekstinktion on oltava 0,200 ± 0,005, kun käytetään 1 cm:n optista kyvettiä.









LIITE X A

RASVAHAPPOJEN METYYLIESTEREIDEN MÄÄRITTÄMINEN KAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ

1 SOVELTAMISALA

Tämä menetelmä antaa yleisohjeita kaasukromatografian käyttöön, kun tarkoituksena on määrittää liitteessä X B kuvatulla menetelmällä saadun rasvahappojen metyyliestereiden seoksen koostumus kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti.

Menetelmä ei sovellu polymeroitujen rasvahappojen tutkimiseen.

2 REAGENSSIT

2.1 Kantajakaasu

Inertti kaasu (typpi, helium, argon, vety, jne.), huolellisesti kuivattu; ei saa sisältää happea yli 10 mg/kg.

Huom. 1

Vety, jota voidaan käyttää kantajakaasuna ainoastaan kapillaarikolonneissa, kaksinkertaistaa määritysnopeuden, mutta sen käyttö on vaarallista. Turvalaitteita on kuitenkin saatavana.

2.2 Apukaasut

2.2.1 Vety (puhtaus ≥ 99,9 %), ei saa sisältää orgaanisia epäpuhtauksia.

2.2.2 Ilmaa tai happea, ei saa sisältää orgaanisia epäpuhtauksia.

2.3 Vertailustandardi

Rasvahappojen puhtaiden metyyliestereiden seos tai sellaisen tunnetun rasvan metyyliestereitä, jotka ovat mahdollisimman samanlaisia kuin tutkittava rasva.

Monityydyttymättömien rasvahappojen hapettumista on vältettävä.

3 VÄLINEISTÖ

Tässä annetut ohjeet koskevat tavallista kaasukromatografista laitteistoa, joko täytetyllä kolonnilla tai kapillaarikolonnilla varustettua, sekä liekki-ionisaatiodetektoria. Muutkin laitteistot, jotka ovat yhtä tehokkaita ja joiden erotuskyky on 4.1.2. kohdan mukainen, ovat sopivia.

3.1 Kaasukromatografi

Kaasukromatografissa on oltava seuraavat osat.

3.1.1 Injektiojärjestelmä Käytetään injektiojärjestelmää, joka sopii: a) täytettyyn kolonniin, jonka kuollut tilavuus on mahdollisimman pieni (tässä tapauksessa injektiojärjestelmää tulee voida kuumentaa 20—50 °C kolonnia korkeampaan lämpötilaan); tai b) kapillaarikolonniin, jolloin sen on oltava erityisesti tähän käyttöön suunniteltu. Järjestelmä voi olla jakajatyyppiä tai jakajaton, kolonniin liitetty (on-column) injektori. Huom. 2 Jos näytteessä on ainoastaan sellaisia rasvahappoja, joissa on vähintään 16 hiiliatomia, voidaan käyttää liikkuvaa neulainjektoria.

3.1.2 Uuni Uunin tulee pystyä lämmittämään kolonni vähintään 260 °C:n lämpötilaan ja pitämään se valitussa lämpötilassa 1 °C:n tarkkuudella, jos kyse on täytetystä kolonnista, ja 0,1 °C:n tarkkuudella, jos kyse on kapillaarikolonnista. Viimeksimainittu vaatimus on erittäin tärkeä, jos käytetään kvartsilasiputkea. Lämpötilaohjelmoidun laitteen käyttöä suositellaan kaikissa tapauksissa ja erityisesti rasvahapoille, joissa on alle 16 hiiliatomia.

3.1.3 Täytetty kolonni 3.1.3.1 Kolonni on valmistettu aineesta, joka ei reagoi tutkittavien aineiden kanssa (esim. lasi tai ruostumaton teräs); kolonnin mitat ovat seuraavat: a) pituus: 1—3 m. Pitkäketjuisten rasvahappojen (> C20) tutkimiseen käytetään suhteellisen lyhyttä kolonnia. Tutkittaessa happoja, joissa on 4—6 hiiliatomia, suositeltava kolonnin pituus on 2 m; b) sisähalkaisija: 2—4 mm. Huom. 3 Jos tutkittavana on monityydyttymättömiä happoja, joissa on enemmän kuin kolme kaksoissidosta, ne saattavat hajota kolonnissa, joka on ruostumatonta terästä. Huom. 4 Voidaan myös käyttää järjestelmää, jossa on täytetty kaksoiskolonni. 3.1.3.2 Täyte, joka koostuu seuraavista aineista: a) tukiaine: happopestyä ja silanoitua piimaata tai muuta sopivaa, inerttiä tukiainetta, jonka raekokojakauma on kapea (25 mm:n vaihtelu 125 ja 200 mm:n välillä) niin, että keskimääräinen raekoko on suhteessa kolonnin pituuteen ja sisähalkaisijaan; b) stationäärifaasi: polyesterityyppinen polaarinen neste (esim. dietyleeniglykolipolysukkinaatti, butaanidiolipolysukkinaatti, etyleeniglykolipolyadipaatti jne.), syanosilikonit tai jokin muu neste, joka saa aikaan kromatografisen erottumisen (ks. kohta 4). Stationäärifaasin osuuden on oltava 5—20 % (m/m) täytteestä. Joissakin erotteluissa voidaan käyttää polaaritonta stationäärifaasia. 3.1.3.3 Kolonnin valmistelu Kun kolonni on irrotettu detektorista, uuni kuumennetaan vähitellen 185 °C:seen ja inerttikaasua johdetaan 20—60 ml minuutissa juuri täytetyn kolonnin läpi, vähintään 16 tunnin ajan tässä lämpötilassa ja sitten vielä kaksi tuntia 195 °C:ssa.

3.1.4 Kapillaarikolonni 3.1.4.1 Putki, joka on valmistettu analysoitaville aineille inertistä aineesta (tavallisesti lasista tai kvartsilasista). Sisähalkaisijan on oltava 0,2—0,8 mm. Sisäpinta on käsiteltävä sopivalla menetelmällä (esim. pintakäsittely, inaktivointi) ennen kuin se päällystetään stationäärifaasikerroksella. Useimmissa tapauksissa riittävä pituus on 25 m. 3.1.4.2 Stationäärifaasi, pääasiassa polyglykolityyppiä [poly(etyleeniglykoli) 20 000], polyesterityyppiä (butaanidiolipolysukkinaatti) tai polaarista polysiloksaanityyppiä (syanosilikonit). Kytketyt kolonnit (kolonniverkot) ovat myös sopivia. Huom. 5 On olemassa vaara, että polaariset polysiloksaanit vaikeuttavat linoleenihapon ja C20-happojen erottumista ja tunnistamista. Päällysteen on oltava ohut, 0,1 — 0,2 mm. 3.1.4.3 Kolonnin kokoaminen ja esivalmistelut Tavanomaisia varotoimenpiteitä on noudatettava kapillaarikolonnien kokoamisessa, ts. kolonnin sijoittelu uuniin (tukirakenteet), liitosten valinta ja asennus (tiiviys), kolonnin päiden liittäminen injektiojärjestelmään ja detektoriin (mahdollisimman vähän kuollutta tilaa). Kantajakaasuvirta johdetaan kolonnin läpi (esimerkiksi 0,3 baaria, 30 kPa, 25 m pitkään kolonniin, jonka sisähalkaisija on 0,3 mm). Kolonni esilämmitetään ohjelmoimalla uuni niin, että lämpötila nousee 3 °C minuutissa huoneenlämmöstä sellaiseen lämpötilaan, joka on 10 °C alhaisempi kuin stationäärifaasin hajoamislämpötila. Uuni pidetään tässä lämpötilassa yhden tunnin ajan, kunnes perusviiva on tasoittunut. Lämpötila palautetaan 180 °C:seen ja työskentelyä jatketaan vakiolämpötilassa. Huom. 6 Esivalmisteltuja kolonneja voi myös ostaa.

3.1.5 Detektori, joka kestää korkeampaa lämpötilaa kuin kolonni.

3.2 Ruisku

Ruiskun enimmäistilavuuden on oltava 10 ml ja jakovälin 0,1 ml.

3.3 Piirturi

Kun piirturin käyrää käytetään määritettävän seoksen koostumuksen laskemiseen, tarvitaan elektroninen, erittäin tarkka piirturi, joka sopii yhteen muun laitteiston kanssa. Piirturilla on oltava seuraavat ominaisuudet:

a) vasteaika alle 1,5 s, mieluummin 1 s (vasteaika on aika, joka kuluu, kun piirturin kärki siirtyy nollasta 90 %:iin, kun yhtäkkiä annetaan 100 %:n signaali);

b) paperin leveys vähintään 20 cm;

c) paperin nopeutta on voitava säätää 0,4:stä 2,5 cm:iin minuutissa.

3.4 Integraattori tai laskin (valinnainen)

Elektronisen integraattorin tai laskimen avulla tulos voidaan laskea nopeasti ja tarkasti. Sen on annettava lineaarinen vaste riittävällä herkkyydellä ja perusviivan poikkeaman korjauksen tulee olla riittävä.

4 SUORITUS

Toimenpiteet alakohdissa 4.1—4.3 koskevat liekki-ionisaatiodetektorin käyttöä.

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää kaasukromatografista laitetta, jossa on lämmönjohtokyvyn ilmaisin (katarometri). Koeolosuhteita on tällöin muutettava 6 kohdan mukaan.

4.1 Koeolosuhteet

4.1.1 Ihanteellisten koeolosuhteiden valinta 4.1.1.1 Täytetty kolonni Seuraavat muuttujat on otettava huomioon olosuhteita valittaessa: a) kolonnin pituus ja halkaisija; b) stationäärifaasin ominaisuudet ja määrä; c) kolonnin lämpötila; d) kantajakaasuvirta; e) tarvittava erotuskyky; f) näytteen määrä, joka on valittava siten, että detektori ja elektrometri yhdessä antavat lineaarisen vasteen; g) määrityksen kesto. Taulukoissa 1 ja 2 annetut arvot johtavat yleensä haluttuihin tuloksiin, eli vähintään 2 000 teoreettista pohjaa yhtä kolonnimetriä kohti metyylistearaatilla, kun se eluoidaan noin 15 minuutissa. Injektorin lämpötilan tulisi olla noin 200 °C ja detektorin lämpötilan tulisi olla vähintään yhtä suuri kuin kolonnin, jos laitteisto antaa siihen mahdollisuuden. Liekki-ionisaatiodetektoriin johdetun vedyn virtausnopeuden suhde kantajakaasun nopeuteen on yleensä 1:2 — 1:1 kolonnin halkaisijan mukaan. Hapen virtaus on noin 5—10 kertaa suurempi kuin vedyn.



Taulukko 1 Kolonnin sisähalkaisija (mm) Kantajakaasun virtausnopeus (ml/min) 2 15—25 3 20—40 4 40—60



Taulukko 2 Stationäärifaasin pitoisuus % (m/m) Kolonnin lämpötila °C 5 175 10 180 15 185 20 185 4.1.1.2 Kapillaarikolonni Kapillaarikolonnien tehokkuus- ja permeabiliteettiominaisuuksien vuoksi aineosien erottuminen ja määrityksen kesto riippuvat voimakkaasti kantajakaasun virtausnopeudesta kolonnissa. Tämän vuoksi toimintaolosuhteet on valittava tätä parametria (eli kolonnin täytehäviötä) muuttamalla sen mukaan, halutaanko parantaa erotuskykyä vai saada tulos nopeasti.

4.1.2 Teoreettisten pohjien määrän (tehokkuuden) ja erotuskyvyn määrittäminen (ks. kuva 1) Määritys tehdään metyylistearaatin ja metyylioleaatin seoksesta, jossa on suunnilleen yhtä paljon molempia (esim. kaakaovoin metyyliestereistä). Näytteen määrä, kolonnin lämpötila ja kantajakaasun virtaus valitaan niin, että mahdollisimman suuri osa metyylistearaatin piikistä piirtyy noin 15 minuuttia liuottimen piikin jälkeen ja että metyylistearaattipiikki täyttää noin kolme neljännestä koko asteikosta. Teoreettisten pohjien määrä n lasketaan kaavasta: ja erotuskyky R kaavasta: jossa: dr1 on retentioetäisyys millimetreinä, alkaen kromatogrammin alusta metyylistearaattipiikin huippuun; W1 ja W2 ovat metyylistearaatin ja metyylioleaatin piikkien leveydet millimetreinä, mitattuina kohdista, joissa piikkikäyrän käännepisteisiin piirretyt tangentit leikkaavat perusviivan; Δ metyylistearaatin ja metyylioleaatin piikkien huippujen väli millimetreinä; ▼M2 ja resoluutioluku Ir, kaavalla jossa: a = pienimmän piikin korkeus, mitattuna suhteessa perusviivaan, b = kahden vierekkäisen piikin muodostaman laakson alimman pisteen korkeus, mitattuna suhteessa perusviivaan. ▼B Kuva 1 Kromatogrammi teoreettisten pohjien lukumäärän (tehokkuuden) ja erotuskyvyn määrittämiseksi Koeolosuhteet on valittava siten, että saadaan vähintään 2 000 teoreettista pohjaa kolonnimetriä kohti metyylistearaatille ja että erotuskyky on vähintään 1,25.

4.2 Näytteenotto

Injektoidaan ruiskulla (3.2) kolonniin 0,1 — 2 ml metyyliesterien liuosta, joka on valmistettu liitteessä X B esitetyn menetelmän mukaan.

Jos estereissä ei ole liuottimia, valmistetaan noin 100 mg/ml:n liuos heptaaniin (kaasukromatografista laatua) ja injektoidaan 0,1 — 1 ml tätä liuosta.

Jos määritetään aineosia, joita on vähän, näytteen määrää voidaan suurentaa (enintään kymmenkertaiseksi).

4.3 Määritys

Koeolosuhteiden tulee yleensä olla kohdan 4.1.1 mukaiset.

Alhaisempien kolonnilämpötilojen käyttö on kuitenkin mahdollista, kun määritetään rasvahappoja, joissa on alle 12 hiiliatomia, tai voidaan käyttää korkeampia lämpötiloja, jos rasvahapoissa on yli 20 hiiliatomia.

Näissä tapauksissa voidaan käyttää lämpötilan ohjelmointia. Esimerkiksi jos näytteessä on rasvahappojen metyyliestereitä, joissa on alle 12 hiiliatomia, näyte voidaan injektoida 100 °C:ssa (tai 50—60 °C:ssa, jos mukana on voihappoa) ja ohjelmoida lämpötila nousemaan 4—8 °C/min, kunnes saavutetaan optimilämpötila. Joissakin tapauksissa menetelmät voidaan yhdistää.

Ohjelmoidun lämmityksen jälkeen eluointia jatketaan vakiolämpötilassa, kunnes kaikki aineosat ovat eluoituneet. Jos laitteen lämpötilaa ei voida ohjelmoida, käytetään kahta lämpötilaa, jotka ovat 100—195 °C.

On suositeltavaa tehdä määritys tarvittaessa kahdessa polaarisuudeltaan erilaisessa faasissa, jotta varmistutaan siitä, että mukana ei ole toisen piikin alle jääviä piikkejä, esimerkiksi jos näytteessä on yhtä aikaa C18:3 ja C20:0 tai C18:3 ja C18:2 konjugoituneina.

4.4 Vertailukromatogrammin ja -kuvaajan valmistaminen

Määritetään vertailustandardiseos (2.3) käyttäen samoja koeolosuhteita kuin näytettä määritettäessä, ja mitataan rasvahappojen retentioajat tai -etäisyydet. Puolilogaritmipaperille piirretään jokaista tyydyttymättömyysastetta varten kuvaaja, jossa on retentioajan tai -etäisyyden logaritmi hiiliatomien määrän funktiona; suoraketjuisten ja tyydyttymättömyysasteeltaan samojen estereiden kuvaajien tulisi olla suoria vakiolämpötilassa. Suorien tulisi olla suunnilleen yhdensuuntaiset.

On vältettävä olosuhteita, joissa piikki jää toisen alle, ts. erotuskyky ei riitä erottamaan kahta aineosaa.

5 TULOSTEN ESITTÄMINEN

5.1 Kvalitatiivinen määritys

Näytteen metyyliesteripiikit tunnistetaan 4.4 alakohdassa mainittujen käyrien avulla, tarvittaessa interpoloimalla.

5.2 Kvantitatiivinen määritys

5.2.1 Koostumuksen määrittäminen Joitakin poikkeuksia lukuun ottamatta voidaan käyttää sisäisen normalisoinnin menetelmää, jossa oletetaan että kromatogrammi kuvaa näytteen kaikkia aineosia, eli että piikkien yhteenlaskettu pinta-ala vastaa aineosia sataprosenttisesti (täydellinen eluoituminen). Jos laitteistoon kuuluu integraattori, käytetään sen antamia tuloksia. Muussa tapauksessa jokaisen piikin pinta-ala lasketaan kertomalla sen korkeus leveydellä piikin puolivälistä mitattuna ja ottaen huomioon piirturissa mahdollisesti käytetyt vaimennukset.

5.2.2 Laskentamenetelmät 5.2.2.1 Yleinen tapaus Lasketaan tietyssä aineosassa olevien metyyliesterien pitoisuus massaprosentteina määrittämällä piikin pinta-alan suhteellinen osuus kaikkien piikkien yhteenlasketusta pinta-alasta seuraavan kaavan avulla: jossa: Ai on aineen i piikin pinta-ala; A on kaikkien piikkien yhteenlaskettu pinta-ala. Tulos annetaan yhden desimaalin tarkkuudella. Huom. 7 Tässä yleisessä tapauksessa laskun tuloksen katsotaan perustuvan siihen, että suhteelliset pinta-alat vastaavat massojen prosentuaalisia suhteita. Tapauksissa, joissa näin ei voida olettaa, menetellään 5.2.2.2 alakohdan mukaan. 5.2.2.2 Korjauskertoimien käyttö Tapauksissa, joissa rasvahapossa esimerkiksi on vähemmän kuin kahdeksan hiiliatomia tai hapossa on sekundaarisia ryhmiä, taikka kun käytetään lämmön johtumiseen perustuvaa detektoria tai kun tulosten on oltava mahdollisimman tarkkoja, on käytettävä korjauskertoimia muutettaessa piikkien pinta-alojen prosenttiosuuksia aineosien massaprosenteiksi. Korjauskertoimet määritetään kromatogrammista, joka saadaan tarkoin tunnettujen metyyliestereiden vertailuseoksesta samoissa olosuhteissa, joissa näyte määritettiin. Vertailuseoksen aineen i prosentuaalinen massaosuus saadaan kaavasta: jossa: mi on vertailuseoksen aineen i massa; Sm on vertailuseoksen eri aineosien massojen summa. Lasketaan aineen i prosentuaalinen pinta-alaosuus vertailuseoksen (4.4) kromatogrammista: jossa: Ai on aineen i piikin pinta-ala; A on kaikkien piikkien pinta-alojen summa. Korjauskerroin saadaan kaavasta: Yleensä korjauskertoimet ilmoitetaan suhteessa KC16:een; tällöin suhteelliset kertoimet ovat: Näytteen jokaisen aineen i määrä prosenttiosuutena metyyliestereiden massasta on: Tulos annetaan yhden desimaalin tarkkuudella. 5.2.2.3 Sisäisen standardin käyttö Tietyissä määrityksissä (esimerkiksi jos kaikkien rasvahappojen määriä