1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 1
Το έγγραφο αυτό συνιστά βοήθηµα τεκµηρίωσης και δεν δεσµεύει τα κοινοτικά όργανα
►B ΤΡΙΤΗ Ο∆ΗΓΙΑ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ
της 27ης Απριλίου 1972
περί καθορισµού κοινοτικών µεθόδων αναλύσεως για τον επίσηµο έλεγχο των ζωοτροφών
(72/199/ΕΟΚ)
(ΕΕL 123της 29.5.1972, σ. 6)
Τροποποιείται από:
Επίσηµη Εφηµερίδα
αριθ. σελίδα ηµεροµηνία
►M1Οδηγία 81 /680/ΕΟΚ της Επιτροπής της 30ής Ιουλίου 1981 L 246 32 29.8.1981
▼B
ΤΡΙΤΗ Ο∆ΗΓΙΑ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ
της 27ης Απριλίου 1972
περί καθορισµού κοινοτικών µεθόδων αναλύσεως για τον επίσηµο
έλεγχο των ζωοτροφών
(72/199/ΕΟΚ)
Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,
Έχοντας υπόψη:
τη συνθήκη περί ιδρύσεως της Ευρωπαϊκής Οικονοµικής
Κοινότητος,
την οδηγία του Συµβουλίου της 20ής Ιουλίου 1970 περί
εισαγωγής κοινοτικών τρόπων λήψεως δειγµάτων και µεθόδωναναλύσεως για τον επίσηµο έλεγχο των ζωοτροφών (
1),και ιδίως
το άρθρο 2,
Εκτιµώντας:
ότι η ανωτέρω οδηγία προβλέπει ότι οι επίσηµοι έλεγχοι των
ζωοτροφών, προς διαπίστωση του αν τηρούνται οι όροι, οι οποίοιέχουν καθορισθεί δυνάµει νοµοθετικών, κανονιστικών ή διοικη-τικών διατάξεων για την ποιότητα ή τη σύνθεση των
ζωοτροφών, διενεργούνται κατά τους κοινοτικούς τρόπους
λήψεως των δειγµάτων και σύµφωνα µε τις κοινοτικές µεθόδουςαναλύσεως ·
ότι οι οδηγίες 71 /250/ΕΟΚ και 71 /393/ΕΟΚ της Επιτροπής της
15ης Ιουνίου 1971 (
2)και 18ης Νοεµβρίου 1971 (3)έχουν ήδη
καθορίσει ορισµένο αριθµό κοινοτικών µεθόδων αναλύσεως ·ότι
λαµβανοµένης υπόψη της προόδου των εργασιών, η οποία έχειέκτοτε πραγµατοποιηθεί, πρέπει ν 'αποφασίσει τρίτη σειρά
µεθόδων ·
ότι τα προβλεπόµενα στην οδηγία αυτή µέτρα είναι σύµφωνα µε
τη γνώµη της Μόνιµης Επιτροπής Ζωοτροφών,
ΕΞΕ∆ΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ Ο∆ΗΓΙΑ:
Άρθρο1
Τα Κράτη Μέλη καθορίζουν ότι οι αναλύσεις για τον επίσηµο
έλεγχο των ζωοτροφών ως προς τις περιεκτικότητες αυτών σεάµυλο, ακατέργαστες πρωτεΐνες, ακατέργαστες πρωτεΐνεςδιαλυτές υπό της πεψίνης και του υδροχλωρικού οξέος και εις
γκοσσυπόλη ( Gossypol), ελεύθερη και συνολική, καθώς και τη
δραστικότητα της πεψίνης, διενεργούνται κατά τις µεθόδους,που περιγράφονται στο παράρτηµα Ι της οδηγίας αυτής.
Άρθρο2
Τα Κράτη Μέλη καθορίζουν ότι οι αναλύσεις για τον επίσηµο
έλεγχο των ζωοτροφών προς το σκοπό ανιχνεύσεως και αναγνω-
ρίσεως αντιβιοτικών της οµάδας των τετρακυκλινών ως και σεό,τι αφορά τις περιεκτικότητες των τροφών σε χλωροτετρακυ-κλίνη, οξυτετρακυκλίνη, τετρακυκλίνη, νηριοµυκίνη, τυροζίνη,νικοτιανοµυκίνη, διενεργούνται κατά τις µεθόδους, οι οποίεςπεριγράφονται στο παράρτηµα IIτης οδηγίας αυτής.1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 2
(1)ΕΕ αριθ. Ν 170 της 3.8.1970, σ. 2 .
(2)ΕΕ αριθ. Ν 155 της 12.7.1971, σ. 13 .
(3)ΕΕ αριθ. Ν 279 της 20.12.1971, σ. 7 .▼M1
▼B
▼M1
Άρθρο3
Τα Κράτη Μέλη θέτουν σε ισχύ την 1η Ιουλίου 1973 το αργό-
τερο τις αναγκαίες νοµοθετικές, κανονιστικές ή διοικητικές
διατάξεις για να συµµορφωθούν προς την παρούσα οδηγία.Ενηµερώνουν αµέσως περί αυτού την Επιτροπή.
Άρθρο4
Η παρούσα οδηγία απευθύνεται στα Κράτη Μέλη.1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 3
▼B
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι
1.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΜΥΛΟΥ
—Πολωµετρική µέθοδος —
1.Αντικείµενο και πεδίο εφαρµογής
Η µέθοδος αυτή επιτρέπει τον προσδιορισµό της περιεκτικότητος σε
άµυλο και σε προϊόντα διασπάσεως των υψηλών µοριακών βαρών
αµύλου των ζωοτροφών, εξαιρέσει των περιεχουσών λοβούς, πολτόν,
φύλλα ή αποξηραµένους ριζικούς κόµβους τεύτλων, πολτόν γεωµήλων,
αφυδατωµένους σακχαροµύκητες, προϊόντα πλούσια σε ινουλίνη (ως
επί παραδείγµατι λοβοί και άλευρον ηλιάνθου) ή υπολείµµατα εκ της
τήξεως λιπών.
2.Αρχή
Η µέθοδος περιλαµβάνει δύο προσδιορισµούς. Κατά τον πρώτο, το
δείγµα υφίσταται επεξεργασία εν θερµώ µε αραιωµένο υδροχλωρικό
οξύ. Ύστερα από καθορισµό και διήθηση, µετριέται η στροφική
ικανότητα του διαλύµατος µε πολωµέτρηση.
Κατά τον δεύτερο, το δείγµα εκχυλίζεται µε αιθανόλη 40 %.Κατόπιν
οξύνσεως του διηθήµατος µε τη χρήση υδροχλωρικού οξέος, καθορι-
σµού και διηθήσεως, µετριέται η στροφική ικανότητα µε τις αυτές
συνθήκες όπως και στον πρώτο προσδιορισµό.
Η διαφορά µεταξύ των δύο µετρήσεων πολλαπλασιαζόµενη επί ένα
γνωστό συντελεστή δίδει την περιεκτικότητα του δείγµατος σε άµυλο.
3.Αντιδραστήρια
3.1Υδροχλωρικό οξύ 25 %(κ.β.), d: 1,126.
3.2Υδροχλωρικό οξύ 1,128 %(κ.ό.).
Η συµπύκνωση πρέπει να ελέγχεται µε ογκοµετρική τιτλοδότηση,
µε τη χρήση διαλύµατος υδροξειδίου του νατρίου 0,1 Nπαρουσία
ερυθρού του µεθυλίου 0,1 %(κ.ό.) σε αιθανόλη 94 %(κ.ό.). 10 ml
= 30,94 ml τουNaOH 0,1 N.
3.3∆ιάλυµα Carrez I: ∆ιαλύονται σε ύδωρ 21,9 gοξεικού ψευδαργύρου
Zn (CH3COO)2·2 H2Oκαι 3 gανύδρου οξεικού οξέος. Συµπλη-
ρούνται δι 'ύδατος έως 100 ml.
3.4∆ιάλυµα Carrez II: ∆ιαλύονται εις ύδωρ 10,6 gσιδηροκυανιούχου
καλίου K4[Fe(CN)6]·3 H2O.Συµπληρούνται δι 'ύδατος έως 100 ml.
3.5Αιθανόλη 40 %(κ.ό.), d: 0,948εις 20 ºC.
4.Συσκευές
4.1Κωνική φιάλη ( Erlenmeyer) 250 ml εσµυρδωµένου στοµίου συνδε-
δεµένη µετά καθέτου ψυκτήρος.
4.2Πολώµετρο ή σακχαρόµετρο.
5.Τρόπος εργασίας
5.1Προετοιµασία του δείγµατος
Κονιοποιείται το δείγµα σε τρόπο ώστε να διέρχεται όλη η
ποσότητα αυτού δια µέσου κοσκίνου στρογγυλών οπών διαµέτρου
0,5mm.
5.2Προσδιοριµός της συνολικής στροφικής ικανότητας ( PήS)(ιδέ παρα-
τήρηση 7.1)
Ζυγίζονται 2,5 γραµ. κονιοποιηµένου δείγµατος µε προσέγγιση
1mgκαι εισάγονται εντός ογκοµετρικής φιάλης των 100 ml.
Προστίθενται 25 mlυδροχλωρικού οξέος (3.2), ανακινούνται προς
επίτευξιν καλής κατανοµής της ποσότητος του δείγµατος και
προστίθενται εκ νέου έτερα 25 mlυδροχλωρικού οξέος (3.2).
Εµβαπτίζεται η φιάλη εντός ζέοντος υδρολούτρου και κατά τη
διάρκεια των πρώτων εποµένων 3 πρώτων λεπτών ανακινείται
ισχυρώς και σταθερώς προς αποφυγή σχηµατισµού συσσωµατώ-
σεων. Η ποσότητα του ύδατος στο υδρόλουτρο πρέπει να είναι
επαρκής για να επιτρέπει τη διατήρηση του λουτρού στο σηµείο1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 4
▼B
βρασµού κατά το χρονικό διάστηµα της παραµονής της φιάλης
εντός αυτού. Η φιάλη δεν πρέπει να εξέρχεται του λουτρού κατά
τη διάρκεια της ανακινήσεως. Μετά πάροδο 15 πρώτων λεπτών
ακριβώς εξάγεται η φιάλη εκ του λουτρού, προστίθενται 30 ml
ψυχρού ύδατος και ψύχεται αµέσως εις 20 ºC.
Προστίθενται 5 mlδιαλύµατος Carrez I(3.3) και ανακινείται επί εν
πρώτον λεπτόν. Προστίθενται ακολούθως 5 mlδιαλύµατος Carrez II
(3.4)και ανακινείται εκ νέου επί εν πρώτον λεπτόν. Συµπληρούται
ο όγκος της φιάλης δι 'ύδατος, οµοιογενοποιείται και διηθείται.
Εάν το διήθηµα δεν είναι πλήρως διαυγές (σπανία περίπτωση)
επαναλαµβάνεται ο προσδιορισµός µε τη χρησιµοποίηση µεγαλυ-
τέρων ποσοτήτων διαλυµάτων Carrez I καιII,επί παραδείγµατι
10ml.
Μετριέται ακολούθως η στροφική ικανότητα του διαλύµατος εντός
σωλήνος 200 mmδια του πολωµέτρου ή σακχαροµέτρου.
5.3Προσδιορισµός της στροφικής ικανότητος ( P′ήS′)των διαλυτών
προσµίξεων εις αιθανόλην 40 %
Ζυγίζονται 5 gδείγµατος µε προσέγγιση 1 mg,εισάγονται εντός
ογκοµετρικής φιάλης των 100 mlκαι προστίθενται 80 mlπερίπου
αιθανόλης (3.5) (βλέπε παρατήρηση 7.2). Αφήνεται η φιάλη σε
ηρεµία επί 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Κατά τη διάρκεια
του χρονικού αυτού διαστήµατος ανακινείται ισχυρώς 6 φορές
κατά τέτοιο τρόπο ώστε η ποσότητα του δείγµατος να αναµιχθεί
καλά µε την αιθανόλη. Συµπληρούται ακολούθως ο όγκος µετά
αιθανόλης (3.5), οµοιογενοποιείται και διηθείται.
Εισάγονται µε σιφώνιο 50 mlτου διηθήµατος ( =2,5 gδείγµατος)
εντός της κωνικής φιάλης των 250 ml,προστίθενται 2,1 ml
υδροχλωρικού οξέος (3,1) και ανακινείται ισχυρώς. Προσαρµό-
ζεται κάθετος ψυκτήρας στην κωνική φιάλη και βυθίζεται αύτη
εντός ζέοντος υδρολούτρου.
Μετά 15 πρώτα λεπτά ακριβώς εξάγεται η κωνική φιάλη από το
υδρόλουτρο, µεταγγίζεται το περιεχόµενο αυτής εντός ογκοµε-
τρικής φιάλης των 100 mlεκπλύνοντας δι 'ελαφρώς ψυχρού
ύδατος και ψύχεται µέχρις 20 ºC.
∆ιαυγάζεται ακολούθως µε τη χρήση των διαλυµάτων Carrez I(3.3)
καιII (3.4),συµπληρούται ο όγκος δι 'ύδατος, οµοιογενοποιείται,
διηθείται και µετριέται η στροφική ικανότητα όπως υποδεικνύεται
εις 5.2, δευτέρα και τρίτη παράγραφος.
6.Υπολογισµός των αποτελεσµάτων
Η επί τοις εκατό περιεκτικότητα σε άµυλο του δείγµατος υπολογίζεται
ως ακολούθως:
6.1Μετρήσεις διενεργούµενες δια πολωµέτρου
Επί τοις εκατ ´ο αµύλου ¼2000 P /C0P0ðÞ
α½/C13820º
D
όπου:
P= συνολική στροφική ικανότης εις βαθµούς
P′ =στροφική ικανότης εις βαθµούς διαλυτών
προσµίξεων εις αιθανόλην 40 %
α½/C13820º
D =η ειδική στροφική ικανότης καθαρού αµύλου.
Αι συµβατικώς παραδεδεγµέναι τιµαί του
συντελεστού αυτού είναι αι κάτωθι:
+ 185,9º: άµυλον ορύζης
+ 195,4º: άµυλον γεωµήλων
+ 184,6º: άµυλον αραβοσίτου
+ 182,7º: άµυλον σίτου
+ 181,5º: άµυλον κριθής
+ 181,3º: άµυλον βρώµης
+ 184,0º: έτεροι τύποι και µίγµατα αµύλου των συνθέτων
τροφών1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 5
▼B
6.2Μετρήσεις διενεργούµεναι δια σακχαροµέτρου
Επί τοις εκατ ´ο αµύλου ¼2000
α½/C13820º
D/C12N /C10;665 ðÞ S/C0S0ðÞ
100¼26;6N S /C0S0ðÞ
α½/C13820º
D
όπου:
S= συνολική στροφική ικανότητα σε σακχαροµετρικούς
βαθµούς.
S′=στροφική ικανότητα σε σακχαροµετρικούς βαθµούς των
διαλυτών προσµίξεων, σε αιθανόλην 40 %.
N= βάρος σε gσακχαρόζης εντός 100 mlύδατος, παρέχοντα
στροφική ικανότητα 100 σακχαροµετρικών βαθµών εντός
σωλήνος 200 mm.
16,29 gδια γαλλικά σακχαρόµετρα,
26,00 gδια γερµανικά σακχαρόµετρα,
20,00 gδι'έτερα σακχαρόµετρα.
α½/C13820º
D=ειδική στροφική ικανότητα καθαρού αµύλου (ιδέ 6.1).
6.3Επαναληπτικότητα
Η διαφορά των αποτελεσµάτων των διενεργουµένων δύο παραλ-
λήλων προσδιορισµών του αυτού δείγµατος δεν πρέπει να
υπερβαίνει το 0,4 σε απόλυτη τιµή για περιεκτικότητα αµύλου
µικρότερη του 40 %και 1,1 %σε σχετική τιµή για περιεκτικότητα
αµύλου ίση ή µεγαλύτερη του 40 %.
7.Παρατηρήσεις
7.1Εάν το δείγµα περιέχει ανθρακικά άλατα πλέον του 6 %εκπεφρα-
σµένα σε ανθρακικά άλατα ασβεστίου, πρέπει αυτά να
εξουδετερωθούν δια κατεργασίας µε τη χρήση της απαιτουµένης
ακριβούς ποσότητος αραιωµένου θειικού οξέος, προ του προσδιο-
ρισµού της συνολικής στροφικής ικανότητος.
7.2Στην περίπτωση προϊόντων µε υψηλή περιεκτικότητα σε λακτόζη,
όπως η σκόνη ορρού γάλακτος ή το αποβουτυρωµένο γάλα, διενερ-
γούνται τα κάτωθι κατόπιν προσθήκης 80 mlαιθανόλης (3.5).
Προσαρµόζεται κάθετος ψυκτήρ στη φιάλη, εµβαπτίζεται η φιάλη
σε υδρόλουτρο 50 ºCεπί 30 πρώτα λεπτά. Αφήνεται ακολούθως να
ψυχθεί και συνεχίζεται η ανάλυση όπως υποδεικνύεται ανωτέρω
υπό 5.3.
2.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΑΚΑΤΕΡΓΑΣΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ
1.Αντικείµενο και πεδίο εφαρµογής
Η µέθοδος επιτρέπει τον συµβατικό προσδιορισµό της περιεκτι-
κότητος ζωοτροφών σε ακατέργαστες πρωτεΐνες βάσει της
περιεκτικότητος σε άζωτο, όπως αυτό προσδιορίζεται µε τη µέθοδο
Kjeldahl.
2.Αρχή
Το δείγµα µεταλλοποιείται µε την υγρή οδό. Το όξινο διάλυµα αλκα-
λοποιείται δια διαλύµατος υδροξειδίου του νατρίου. Η
απελευθερούµενη αµµωνία αποµακρύνεται µε απόσταξη και συλλέ-
γεται εντός καθορισµένης ποσότητος θειικού οξέος, η περίσσεια του
οποίου τιτλοδοτείται δια διαλύµατος υδροξειδίου του νατρίου.
3.Αντιδραστήρια
3.1Θειικό κάλιο χηµικώς καθαρό χ.κ.
3.2Καταλύτης: οξείδιον χαλκού CuOχ.κ. ή θειικός χαλκός
κρυσταλλωµένος CuSO4.5 H2Oχ.κ., ή υδράργυρος, ή οξείδιο του
υδραργύρου HgOχ.κ.
3.3Κοκκοποιηµένος ψευδάργυρος χ.κ.
3.4Θειικό οξύ χ.κ., d: 1,84
3.5Θειικό οξύ 0,1 N.
3.6Θειικό οξύ 0,5 N.1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 6
▼B
3.7∆είκτης ερυθρού του µεθυλίου: διαλύοµεν 300 mgερυθρού του
µεθυλίου εντός 100 mlαιθανόλης 95 -96% (κ.ό).
3.8∆ιάλυµα 40 %(κ.ό) υδροξειδίου του νατρίου.
3.9∆ιάλυµα υδροξειδίου του νατρίου 0,1 N.
3.10∆ιάλυµα υδροξειδίου του νατρίου 0,25 N.
3.11Κεκορεσµένο διάλυµα θειούχου νατρίου χ.κ.
3.12∆ιάλυµα 8 %(κ.ό) θειικού νατρίου, Nα2S2O3·5H2Oχ.κ.
3.13Κίσηρις σε κόκκους, πλυµένη σε υδροχλωρικό οξύ και ασβεστο-
ποιηµένη.
4.Συσκευές
Συσκευές µεταλλοποιήσεως και αποστάξεως κατά Kjeldahl ( ιδέ παρα-
τήρηση 7.1).
5.Τρόπος εργασίας
5.1Μεταλλοποίηση
Ζυγίζεται 1 gδείγµατος µε προσέγγιση 1 mgκαι εισάγεται εντός
της φιάλης της συσκευής µεταλλοποιήσεως. Προστίθενται 10 g
θειικού καλίου (3.1), η ενδεδειγµένη ποσότητα καταλύτου (3.2)
(0,3 έως 0,4 gοξείδιο του χαλκού ή 0,9 έως 1,2 gθειικού χαλκού
ή µια σταγών υδραργύρου ή 0,6 έως 0,7 gοξειδίου του υδραρ-
γύρου), 25 mlθειικού οξέος (3.4) και µερικοί κόκκοι κισήρεως
(3.13). Οµοιογενοποιείται. Θερµαίνεται η φιάλη, µετρίως κατ '
αρχή ανακινουµένη από καιρό σε καιρό µέχρι ανθρακοποιήσεως
της µάζης και εξαφανίσεως του αφρού. Ακολούθως θερµαίνεται
ισχυρότερα µέχρις ότου το υγρό βράσει σταθερώς. Αποφεύγεται
η υπερθέρµανση των τοιχωµάτων και η προσκόλληση επ 'αυτών
οργανικών σωµατιδίων. Όταν το διάλυµα καταστεί διαυγές και
άχρουν (ή ανοικτόν πράσινον παρουσία καταλύτου µε βάση το
χαλκό), διατηρείται ο βρασµός επί 1 εισέτι ώρα. Αφήνεται εν
συνεχεία να ψυχθεί.
5.2Απόσταξη
Προστίθενται µετά προσοχής 250 έως 350 mlύδατος, ανακινου-
µένου συγχρόνως για την ταχεία διάλυση των θειικών αλάτων,
και αφήνεται να ψυχθεί.
Προστίθενται ακολούθως µερικοί κόκκοι ψευδαργύρου (3.3).
Εισάγεται εντός της συλλεκτικής φιάλης της συσκευής αποστά-
ξεως ακριβώς µετρηθείσα ποσότης 25 mlθειικού οξέος 0,1 N (3.5)
ή 0,5 N (3.6), αναλόγως της υποτιθεµένης περιεκτικότητος σε
άζωτο (ίδε παρατήρηση 7.2) και µερικές σταγόνες δείκτου ερυθρού
του µεθυλίου (3.7).
Συνδέεται η φιάλη µετά του ψυκτήρος της συσκευής αποστάξεως
και εµβαπτίζεται το άκρον του ψυκτήρος εντός του υγρού το οποίο
περιέχεται στη συλλεκτική φιάλη µέχρι βάθους τουλάχιστον 1 εκ.
(ιδέ παρατήρηση 7.3). Εισάγονται βραδέως εντός της φιάλης 100 ml
διαλύµατος 40 %υδροξειδίου του νατρίου (3.8). Αν χρησιµοποιείται
καταλύτης µε βάση το χαλκό, εισάγονται επί πλέον εντός της
φιάλης είτε 10 mlδιαλύµατος θειούχου νατρίου (3.11), είτε 25 ml
διαλύµατος θειικού νατρίου (3.12).
Θερµαίνεται η φιάλη κατά τρόπο ώστε εντός 30 πρώτων λεπτών να
έχουν αποσταχθεί περί τα 150 mlυγρού. Μετά το πέρας του
χρονικού αυτού διαστήµατος, ελέγχεται η ουδετερότητα του
προκύψαντος αποστάγµατος δια χάρτου του ηλιοτροπίου. Αν η
αντίδραση είναι αλκαλική συνεχίζεται η απόσταξη. ∆ιακόπτεται
αυτή όταν το απόσταγµα εµφανίζεται ουδέτερο στον χάρτη του
ηλιοτροπίου. Κατά τη διάρκεια της αποστάξεως ανακινείται από
καιρού σε καιρό το περιεχόµενο της συλλεκτικής φιάλης και
εποπτεύεται ο χρωµατισµός αυτής. Εάν αυτός στρέφεται προς
κίτρινον, προστίθεται αµέσως επακριβώς µετρούµενος όγκος
θειικού οξέος 0,1 N (3.5),ή 0,5 N (3.6).
5.3Ογκοµετρική τιτλοδότηση
Τιτλοδοτείται εντός της συλλεκτικής φιάλης η περίσσεια του
θειικού οξέος δια διαλύµατος υδροξειδίου του νατρίου 0,1 N (3.9),1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 7
▼B
ή 0,25 N (3.10), αναλόγως της κανονικότητος του χρησιµοποιη-
µένου θειικού οξέος, µέχρις ότου ο χρωµατισµός στραφεί προς
ανοικτό κίτρινο.
5.4Έλεγχος της µεθόδου
Για να εξακριβωθεί αν τα αντιδραστήρια είναι απαλλαγµένα
αζώτου, διενεργείται τυφλό πείραµα (αποστάξεως και ογκοµε-
τρικής τιτλοδοτήσεως), απουσία του προς ανάλυση δείγµατος.
Προς έλεγχο της ακριβείας της µεθόδου διενεργείται ανάλυση
(µεταλλοποίηση, απόσταξη και ογκοµετρική τιτλοδότηση) 1,5 έως
2,0gακετανιλιδίου χ.κ. (Σ.Τ. 114 ºC· % N: 10,36) παρουσία 1 g
σακχαρόζης απηλλαγµένης αζώτου ·εν (1) gακετανιλιδίου κατανα-
λίσκει 14,80 mlθειικού οξέος 0,5 N.
6.Υπολογισµός των αποτελεσµάτων
Προσδιορίζεται ο όγκος του καταναλωθέντος θειικού οξέος, 1 ml
θειικού οξέος 0,1 Nαντιστοιχεί εις 1,4 mgαζώτου. Πολλαπλασιάζεται
η ποσότητα αζώτου µε τον συντελεστή 6,25. Το αποτέλεσµα εκφρά-
ζεται επί τοις εκατό του δείγµατος.
Επαναληπτικότητα
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων των διενεργουµένων δύο
παραλλήλων προσδιορισµών του αυτού δείγµατος δεν πρέπει να υπερ-
βαίνει το:
— 0,2σε απόλυτη τιµή για περιεκτικότητα σε ακατέργαστες
πρωτεΐνες, µικρότερη του 20 %·
— 1,0% σε σχετική τιµή για περιεκτικότητες περιλαµβανόµενες
µεταξύ 20 και 40 %·
— 0,4σε απόλυτη τιµή για περιεκτικότητες ανώτερες του 40 %.
7.Παρατηρήσεις
7.1Ορισµένες συσκευές, οι οποίες απαιτούν µετάγγιση µεταξύ µεταλ-
λοποιήσεως και αποστάξεως, δύνανται να χρησιµοποιούνται. Στην
περίπτωση αυτή, η µετάγγιση πρέπει να διενεργείται χωρίς
απώλεια.
7.2Για προϊόντα πτωχά σε αζωτούχους ύλες ο όγκος του θειικού
οξέος 0,1 N,ο οποίος εισάγεται εντός της συλλεκτικής φιάλης,
είναι δυνατό να µειωθεί, αν είναι απαραίτητο σε 10 ή 15 mlκαι
να συµπληρωθεί έως 25 mlδι'ύδατος.
7.3Αν η φιάλη της συσκευής αποστάξεως δεν είναι εφοδιασµένη µετά
σταγονοµετρικού χωνίου, προστίθεται το διάλυµα του υδροξειδίου
του νατρίου αµέσως προ της συνδέσεως της φιάλης µετά του
ψυκτήρος και αφήνεται να ρέει το υγρό βραδέως κατά µήκος των
πλευρών του καταψύκτου κατά τρόπο αποφεύγοντα την ανάµιξη
αυτού µετά του οξίνου διαλύµατος.
3.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΑΚΑΤΕΡΓΑΣΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΩΝ
∆ΙΑΛΥΤΩΝ ΥΠΟ ΤΗΣ ΠΕΨΙΝΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ Υ∆ΡΟΧΛΩΡΙΚΟΥ
ΟΞΕΟΣ
1.Αντικείµενο και πεδίο εφαρµογής
Η µέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισµό του µέρους των ακατεργάστων
πρωτεϊνών των διαλυτών υπό της πεψίνης και του υδροχλωρικού οξέος
υπό καθορισµένες συνθήκες. Η µέθοδος είναι εφαρµόσιµη για όλες τις
τροφές.
2.Αρχή
Το δείγµα υπόκειται σε κατεργασία επί 48 ώρες εις 40 ºCµετά διαλύ-
µατος υδροχλωρικής πεψίνης. Το αιώρηµα διηθείται και η
περιεκτικότητα σε άζωτο του διηθήµατος προσδιορίζεται κατά την
περιγραφοµένη µέθοδο προσδιορισµού των ακατεργάστων πρωτεϊνών.
3.Αντιδραστήρια
3.1Υδροχλωρικό οξύ, d: 1,125.
3.2Υδροχλωρικό οξύ 0,075 N.1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 8
▼B
3.3 2.0 U/mg πεψίνης ·η δραστικότητα αυτή καθορίζεται κατά τη
µέθοδο η οποία περιγράφεται στο 4ο µέρος του παρόντος παραρτή-
µατος και πρέπει να ελέγχεται κατά τη µέθοδο αυτή.
3.4Προσφάτως παρασκευασθέν διάλυµα πεψίνης 0,02 %(κ.ό) περίπου
εις υδροχλωρικό οξύ (3.2) ·δραστικότης: 400 U/l.
3.5Αντιαφρώδες γαλάκτωµα (σιλικόνη επί παραδείγµατι).
3.6Όλα τα αντιδραστήρια τα οποία αναφέρονται εις το 3 της µεθόδου
του προσδιορισµού των ακατεργάστων πρωτεϊνών.
4.Συσκευές
4.1Υδρόλουτρο ή επωαστικός κλίβανος, ρυθµιζόµενος σε 40 ºC ± 1 ºC.
4.2Συσκευές µεταλλοποιήσεως και αποστάξεως κατά Kjeldahl.
5.Τρόπος εργασίας
5.1Προετοιµασία του διαλύµατος (ίδε παρατήρηση 7.2)
Ζυγίζονται 2 gδείγµατος µε προσέγγιση 1 mg.Εισάγεται η
ποσότης του δείγµατος εντός ογκοµετρικής φιάλης των 500 mlκαι
προστίθενται 450 mlδιαλύµατος υδροχλωρικής πεψίνης (3.4)
πρότερον θερµανθείσης εις 40 ºC.Ανακινείται κατά τρόπο ώστε ν '
αποφεύγεται η δηµιουργία συσσωµατώσεων. Ελέγχεται αν το pH
του αιωρήµατος είναι µικρότερο του 1,7. Η φιάλη τίθεται εντός
του υδρολούτρου ή του επωαστικού κλιβάνου (4.1) και αφήνεται
εκεί επί 48 ώρες. Ανακινείται κατόπιν 8, 24 και 32 ωρών. Μετά
48 ώρες, προστίθενται 15 mlυδροχλωρικού οξέος (3.1), ψύχεται
µέχρι 20 ºC,συµπληρούται ο όγκος µε ύδωρ και διηθείται.
5.2Μεταλλοποίηση
Λαµβάνονται 250 mlτου διηθήµατος και εισάγονται εντός της
φιάλης της συσκευής αποστάξεως (4.2). Προστίθενται τα
απαραίτητα για τη µεταλλοποίηση αντιδραστήρια, ως δεικνύεται
εις 5.1, δευτέρα φράσις της µεθόδου του προσδιορισµού των
ακατεργάστων πρωτεϊνών.
Οµοιογενοποιείται και θερµαίνεται µέχρι βρασµού. Αν σχηµατι-
σθεί αφρός προστίθενται µερικές σταγόνες αντιαφρώδους
γαλακτώµατος (3.5). ∆ιατηρείται ο βρασµός ισχυρός µέχρι
πλήρους σχεδόν εξατµίσεως του ύδατος. Ελαττούται η ένταση της
θερµάνσεως και εξαλείφεται µετά προσοχής και το τελευταίο
ίχνος ύδατος. Όταν το διάλυµα παρουσιάζεται διαυγές και άχρουν
(ή ανοικτό πράσινο επί παρουσία καταλύτου µε βάση το χαλκό),
συνεχίζεται ο βρασµός επί 1 ώρα ακόµη. Ακολούθως αφήνεται να
ψυχθεί.
5.3Απόσταξη και ογκοµετρική τιτλοδότηση
∆ιενεργείται όπως υποδεικνύεται εις 5.2 και 5.3 της µεθόδου του
προσδιορισµού των ακατεργάστων πρωτεϊνών.
5.4Τυφλό πείραµα
∆ιενεργείται τυφλό πείραµα εφαρµοζοµένου του ανωτέρω τρόπου
εργασίας, απουσία του προς ανάλυση δείγµατος.
6.Υπολογισµός των αποτελεσµάτων
Αφαιρείται ο όγκος του καταναλωθέντος θειικού οξέος δια τυφλού
πειράµατος εκ του ηναλωθέντος υπό της ποσότητος του δείγµατος.
1mlθειικού οξέος 0,1 Nαντιστοιχεί εις 1,4 mgαζώτου.
Πολλαπλασιάζεται η ποσότης του αζώτου επί τον συντελεστή 6,25. Το
αποτέλεσµα εκφράζεται επί τοις εκατό του δείγµατος.
Επαναληπτικότητα
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων των διενεργουµένων δύο
παραλλήλων προσδιορισµών επί του αυτού δείγµατος δεν πρέπει να
υπερβαίνει το:
— 0,4εις απόλυτο τιµή, για περιεκτικότητες µικρότερες του 20 %·
— 2,0% εις σχετική τιµή, για περιεκτικότητες περιλαµβανόµενες
µεταξύ 20 και 40 %·1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 9
▼B
— 0,8εις απόλυτο τιµή, για περιεκτικότητες ανώτερες του 40 %.
7.Παρατηρήσεις
7.1Οι επιτυγχανόµενες τιµές υπό της παρούσης µεθόδου δεν
συνδέονται αµέσως µετά της πεπτικότητος invivo .
7.2Τα προϊόντα των οποίων η περιεκτικότητα σε λιπαρές ουσίες
υπερβαίνει το 10 %πρέπει προηγουµένως να υφίστανται απολί-
πανση δι 'εκχυλίσεως δια πετρελαϊκού αιθέρος (σ.ζ. 40 —60 ºC).
4.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ∆ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΟΣ ΤΗΣ ΠΕΨΙΝΗΣ
1.Αντικείµενο και πεδίο εφαρµογής
Η µέθοδος επιτρέπει τον έλεγχο της δραστικότητος της χρησιµο-
ποιουµένης πεψίνης για τον προσδιορισµό των ακατεργάστων
πρωτεϊνών των διαλυτών υπό της πεψίνης και του υδροχλωρικού
οξέος.
2.Αρχή
Η αιµοσφαιρίνη υφίσταται κατεργασία υπό καθορισµένας συνθήκας
δια πεψίνης εις περιβάλλον υδροχλωρικού οξέος. Το µέρος των µη
υδρολυοµένων πρωτεϊνών κατακρηµνίζεται δια τριχλωροξεικού οξέος.
Στο διήθηµα προστίθεται υδροξείδιον του νατρίου και αντιδραστήριο
Folin-Ciocalteu. Η οπτική πυκνότητα του διαλύµατος αυτού µετράται
σε 750 nmκαι η αντιστοιχούσα ποσότητα τυροζίνης αναγιγνώσκεται
επί καµπύλης µετρήσεων.
Ορισµός: Ως µονάδα πεψίνης ορίζεται η ποσότητα εκείνου του ενζύµου
το οποίο, υπό τας συνθήκας της µεθόδου, απελευθερώνει κατά πρώτο
λεπτό ποσότητα οµάδων υδροξυλαρίνης των οποίων ο χρωµατισµός
υπό του αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteu έχει οπτική πυκνότητα αντι-
στοιχούσα προς εκείνη µιας µmoleτυροζίνης κεχρωσµένης µε τις
αυτές συνθήκες.
3.Αντιδραστήρια
3.1Υδροχλωρικό οξύ 0,2 N.
3.2Υδροχλωρικό οξύ 0,06 N.
3.3Υδροχλωρικό οξύ 0,025 N.
3.4∆ιάλυµα 5 %(κ.ό.) τριχλωροξεικού οξέος.
3.5∆ιάλυµα υδροξειδίου του νατρίου 0,5 N.
3.6Αντιδραστήριον Folin-Ciocalteu: Εισάγονται 100 gβολφραµικού
νατρίου ( Na2WO4.2H2O), 25 g µολυβδαινικού νατρίου
(Na2MoO4.2H2O)και 700 mlύδατος εντός φιάλης στρογγυλεµένου
πυθµένος των 2 λίτρων µετά εσµυριδωµένου στοµίου.
Προστίθενται 50 mlφωσφορικού οξέος ( d: 1,71)και 100 mlπυκνού
υδροχλωρικού οξέος ( d: 1,19), προσαρµόζεται στη φιάλη κάθετος
ψυκτήρ, θερµαίνεται µέχρι βρασµού και διατηρείται το διάλυµα
σε ήρεµο βρασµό επί 10 ώρες. Αφήνεται να ψυχθεί, αποσυνδέεται
ο κάθετος ψυκτήρ, προστίθενται 175 gθειικού λιθίου
(Li2SO4.2H2O), 50 ml ύδατος και 1 mlβρωµίου. Βράζει επί 15 πρώτα
λεπτά προς αποµάκρυνση της περισσείας βρωµίου.
Αφήνεται να ψυχθεί, µεταγγίζεται το διάλυµα σε ογκοµετρική
φιάλη 1 λίτρου, συµπληρώνεται ο όγκος δι 'ύδατος, οµοιογενο-
ποιείται και διηθείται. ∆εν πρέπει να παραµείνει πρασινωπός
χρωµατισµός. Προ της εργασίας, αραιούται 1 όγκος του αντι-
δραστηρίου µετά 2 όγκων ύδατος.
3.7∆ιάλυµα αιµοσφαιρίνης: Ζυγίζεται ποσότητα αιµοσφαιρίνης,
πρωτεϊνικό υπόστρωµα κατά Anson, (2 γραµµάρια περίπου) τα
οποία αντιστοιχούν εις 354 mgαζώτου (1)και εισάγονται ταύτα
εντός φιάλης 200 mlµετά εσµυριδωµένου στοµίου. Προστίθενται
µερικά mlυδροχλωρικού οξέος (3.2), συνδέεται η φιάλη µετά της
αντλίας κενού και ανακινείται µέχρι πλήρους διαλύσεως της
αιµοσφαιρίνης. ∆ιακόπτεται το κενό και προστίθεται ανακινώντας1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 10
(1)Προσδιορίζεται η περιεκτικότης αζώτου µε την ηµιµικροµέθοδον Kjeldahl
(θεωρητική περιεκτικότης: 17,7 %αζώτου).
▼B
υδροχλωρικό οξύ (3.2) µέχρι συµπληρώσεως 100 ml.Παρασκευά-
ζεται αµέσως προ της χρήσεως .
3.8Πρότυπον διάλυµα τυροζίνης: ∆ιαλύονται 181,2 mgτυροζίνης
εντός υδροχλωρικού οξέος (3.1) και συµπληρούται µέχρις ενός (1)
λίτρου δια του ιδίου οξέος (αρχικό διάλυµα). Λαµβάνονται 20,0 ml
και αραιούνται εις 100 mlδι'υδροχλωρικού οξέος (3.1). Εν (1) ml
του διαλύµατος αυτού περιέχει 0,2 µmoleτυροζίνης.
4.Συσκευές
4.1Υδρόλουτρο ρυθµιζόµενο εις 25 ºC ± 0,1 ºC δι'υπερθερµοστάτου.
4.2Φασµατοφωτόµετρο.
4.3Χρονόµετρο, ακρίβεια: 1 δευτερόλεπτο.
4.4 pH-µέτρο.
5.Τρόπος εργασίας
5.1Προετοιµασία του διαλύµατος (ιδέ παρατήρηση 7.1)
∆ιαλύονται 150 mgπεψίνης εντός 100 mlυδροχλωρικού οξέος
(3.2). Λαµβάνονται δια του σιφωνίου 2 mlδιαλύµατος, εισάγονται
ταύτα εντός ογκοµετρικής φιάλης των 50 mlκαι συµπληρούται ο
όγκος δι 'υδροχλωρικού οξέος (3.3). Το pH,ελεγχόµενο δια του
pH-µέτρου, πρέπει να είναι 1,6 ± 0,1.Εµβαπτίζεται η φιάλη εντός
του υδρολούτρου (4.1).
5.2Υδρόλυση
Εισάγονται δια του σιφωνίου εντός του δοκιµαστικού σωλήνος
5,0mlδιαλύµατος αιµοσφαιρίνης (3.7), θερµαίνονται εις 25 ºC
εντός του υδρολούτρου (4.1), προστίθεται 1,0 mlδιαλύµατος
πεψίνης, ως τούτο επιτυγχάνεται εις 5.1 και αναµιγνύεται δια της
χρήσεως υαλίνης ράβδου, πεπλατυσµένης εις εν άκρον δια 10
περίπου κινήσεων εµπρός και πίσω. ∆ιατηρείται ο δοκιµαστικός
σωλήν εντός του υδρολούτρου εις 25 ºCεπί 10 πρώτα λεπτά
ακριβώς, µετρούµενα από της προσθήκης διαλύµατος πεψίνης (η
διάρκεια και η θερµοκρασία πρέπει µετά σχολαστικότητος να
παρακολουθούνται). Προστίθενται ακολούθως 10,0 mlδιαλύµατος
τριχλωροξεικού οξέος (3.4) θερµανθέντων προηγουµένως εις 25 ºC,
οµοιογενοποιείται και διηθείται δια ξηρού φίλτρου.
5.3Ανάπτυξη χρωµατισµού και µέτρηση της οπτικής πυκνότητος
Λαµβάνονται δια του σιφωνίου 5,0 mlδιηθήµατος, εισάγονται
ταύτα εντός κωνικής φιάλης 50 ml,προστίθενται 10,0 mlδιαλύ-
µατος υδροξειδίου του νατρίου (3.5) και, ανακινώντας σταθερά,
3,0mlτου αραιωµένου αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteu (3.6). Μετά
από 5 έως 10 πρώτα λεπτά προσδιορίζεται η οπτική πυκνότητα
του διαλύµατος στο φασµατοφωτόµετρο εις 750 nmεντός κυψε-
λίδων πάχους 1 cm,δια συγκρίσεως µεθ 'ύδατος.
5.4Τυφλό πείραµα
Για κάθε προσδιορισµό διενεργείται τυφλό πείραµα ως
ακολούθως:
Εισάγεται δια του σιφωνίου δοκιµαστικού σωλήνος ποσότης 5,0 ml
διαλύµατος αιµοσφαιρίνης (3.7), θερµαίνεται σε 25 ºCεντός υδρο-
λούτρου (4.1), προστίθενται 10,0 mlδιαλύµατος τριχλωροξεικού
οξέος (3.4), πρότερον θερµανθέντος εις 25 ºC,οµοιογενοποιείται
και προστίθεται ακολούθως 1,0 mlδιαλύµατος πεψίνης ως αύτη
επιτυγχάνεται εις 5.1. Αναµιγνύεται δια της χρήσεως υαλίνης
ράβδου και διατηρείται ο δοκιµαστικός σωλήν εντός του υδρολού-
τρου εις 25 ºCεπί 10 πρώτα λεπτά ακριβώς (4.1).
Οµοιογενοποιείται και διηθείται σε ξηρό φίλτρο. Ακολουθείται ο
τρόπος εργασίας όπως υποδεικνύεται εις 5.3.
5.5Καµπύλη µετρήσεων
Εισάγονται εντός κωνικών φιαλών των 50 mlόγκοι 1.0, 2.0, 3.0, 4.0
και 5.0 mlτου προτύπου διαλύµατος τυροζίνης (3.8), ανταποκρινό-
µενοι αντιστοίχως σε ποσότητες τυροζίνης 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 και
1.0µmoles.Συµπληρούται η σειρά δια µάρτυρος απηλλαγµένου
τυροζίνης. Συµπληρούνται οι όγκοι µέχρι 5.0 mlδια της χρήσεως
υδροχλωρικού οξέος (3.1). Προστίθενται 10,0 mlδιαλύµατος υδρο-1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 11
▼B
ξειδίου του νατρίου (3.5) και, ανακινώντας σταθερά, 3,0 mlαραιω-
µένου αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteu (3.6). Μετριέται η οπτική
πυκνότητα όπως αποδεικνύεται στο 5.3, τελευταία φράση. Σύρεται
η καµπύλη µετρήσεων δια τοποθετήσεως των οπτικών πυκνοτήτων
έναντι των ποσοτήτων τυροζίνης.
6.Υπολογισµός των αποτελεσµάτων
Αναγιγνώσκεται επί της καµπύλης µετρήσεων η ποσότητα της τυρο-
ζίνης, εις µmole,η αντιστοιχούσα στην οπτική πυκνότητα του
κεχρωσµένου διαλύµατος, διορθωµένου επί τη βάσει τυφλού πειρά-
µατος.
Η δραστικότητα της πεψίνης εις µmoleτυροζίνης ανά mgκαι ανά
πρώτο λεπτό εις 25 ºCδίδεται υπό του τύπου:
Μον´αδες αν´αmg U =mgðÞ ¼0;32α
p
όπου:
α=ποσότης τυροζίνης, εις µmole,αναγιγνωσκοµένης επί της
καµπύλης µετρήσεων ·
p=βάρος εις mgτης ποσότητος πεψίνης προστεθείσης εις 5.2.
7.Παρατηρήσεις
7.1Η ποσότης πεψίνης η οποία πρόκειται να διαλυθεί πρέπει να είναι
τοιαύτη ώστε, κατά την τελική φωτοµετρική µέτρηση, ναεπιτυγχάνεται οπτική πυκνότητα 0,35 ± 0,035.
7.2Οι επιτυγχανόµενες δύο µονάδες ανά mgδια της παρούσης
µεθόδου αντιστοιχούν εις: 3,64 χιλιοµονάδες Anson/mg (µmole
τυροζίνης /mgεπί εν (1) πρώτο λεπτό εις 35,5 ºC),ή
36 400εµπορικές µονάδες /g (µmole τυροζίνης /gεπί 10 minεις
35,5ºC).
5.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣΤΗΣΕΛΕΥΘΕΡΑΣΚΑΙΣΥΝΟΛΙΚΗΣΓΚΟΣΣΥ-
ΠΟΛΗΣ
1.Αντικείµενο και πεδίο εφαρµογής
Η µέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισµό της ελευθέρας γκοσσυπόλης
(gossypol), της συνολικής γκοσσυπόλης και των χηµικώς σχετιζοµένων
ουσιών εντός σπόρων, αλεύρων και πλακούντων βάµβακος ως και
εντός συνθέτων τροφών οι οποίες περιέχουν τις ουσίες αυτές. Το
κατώτατο όριο προσδιορισµού είναι 20 ppm.
2.Αρχή
Η γκοσσυπόλη ( gossypol) εκχυλίζεται παρουσία 3 -αµινο-1-προπανόλης,
είτε δια µίγµατος ισοπροπανόλης και εξανίου δια τον προσδιορισµό
της ελευθέρας γκοσσυπόλης, είτε δια διµεθυλοφορµαµίδης δια τον
προσδιορισµό της συνολικής γκοσσυπόλης. Η γκοσσυπόλη µετατρέ-
πεται δια της ανιλίνης σε γκοσσυπόλη -διανιλίνη, της οποίας η
οπτική πυκνότητα µετριέται εις 440 nm.
3.Αντιδραστήρια
3.1Μίγµα ισοπροπανόλης -εξανίου: Αναµιγνύονται 60 µέρη κατ 'όγκον
ισοπροπανόλης χ.κ. εις 40 µέρη κατ 'όγκον κανονικού εξανίου.
3.2∆ιαλυτικόν µέσον Α: Τίθενται εντός ογκοµετρικής φιάλης του
ενός λίτρου 500 mlπερίπου του µίγµατος ισοπροπανόλης -εξανίου
(3.1), 2 ml 3-αµινο-1-προπανόλης, 8 mlανύδρου οξεικού οξέος και
50mlύδατος. Συµπληρούται ο όγκος δια µίγµατος ισοπροπανόλης -
εξανίου (3.1). Το αντιδραστήριο αυτό παραµένει σταθερό επί µια
εβδοµάδα.
3.3∆ιαλυτικό µέσο Β: Τίθενται δια σιφωνίου εντός ογκοµετρικής
φιάλης των 100 ml, 2 ml 3- αµινο-1-προπανόλης και 10 mlανύδρου
οξεικού οξέος. Ψύχεται σε θερµοκρασία περιβάλλοντος και
συµπληρούται ο όγκος δια Ν,Ν -διµεθυλοφροµαµίδης. Το αντιδρα-
στήριο τούτο παραµένει σταθερό για µια εβδοµάδα.
3.4Ανιλίνη χ.κ.: Αν η οπτική πυκνότητα του τυφλού πειράµατος υπερ-
βαίνει το 0,022 ,αποστάζεται η ανιλίνη επί κόνεως ψευδαργύρου δι '
απορρίψεως των πρώτων και των τελευταίων 10 %µερών του1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 12
▼B
αποστάγµατος. Εντός πωµατισµένης φαιάς φιάλης και εντός
ψυγείου, το αντιδραστήριο αυτό διατηρείται επί πολλούς µήνες.
3.5Πρότυπον διάλυµα γκοσσυπόλης ( gossypol) Α: Τίθενται εντός
ογκοµετρικής φιάλης των 250 ml, 27,9 mg οξεικής γκοσσυπόλης.
∆ιαλύεται και συµπληρούται ο όγκος δια του διαλυτικού µέσου Α
(3.2). Εισάγονται δια σιφωνίου 50 mlτου διαλύµατος τούτου εντός
ογκοµετρικής φιάλης των 250 mlκαι συµπληρούται ο όγκος δια
του διαλυτικού µέσου Α. Η συµπύκνωση της γκοσσυπόλης του
διαλύµατος τούτου είναι 0,02 mg/ml.Αφήνεται εν ηρεµία επί µια
ώρα σε θερµοκρασία περιβάλλοντος προ της χρήσεως.
3.6Πρότυπο διάλυµα γκοσσυπόλης Β: Τίθενται εντός ογκοµετρικής
φιάλης των 50 ml, 27,9 mg οξεικής γκοσσυπόλης. ∆ιαλύεται και
συµπληρούται ο όγκος µε το διαλυτικό µέσο Β (3.3). Η
συµπύκνωση της γκοσσυπόλης του διαλύµατος τούτου είναι
0,5mg/ml.
Τα πρότυπα διαλύµατα γκοσσυπόλης Α και Β παραµένουν σταθερά επί
24 ώρας εφ 'όσον διατηρούνται µακράν του φωτός.
4.Συσκευές
4.1Αναµίκτης (ανατροπεύς): 35 περίπου στροφών ανά πρώτο λεπτό.
4.2Φασµατοφωτόµετρον.
5.Τρόπος εργασίας
5.1Ποσότητα δείγµατος
Η ποσότητα δείγµατος εξαρτάται από την υποτιθέµενη περιεκτι-
κότητα του δείγµατος σε γκοσσυπόλη. Είναι προτιµότερο η
εργασία να εκτελείται επί µικράς ποσότητος δείγµατος και επί
σχετικώς µεγάλου µέρους της ποσότητος του διηθήµατος, ώστε να
επιτυγχάνεται επαρκής ποσότητα γκοσσυπόλης για τη διενέργεια
επακριβούς φωτοµετρικής µετρήσεως. Για τον προσδιορισµό της
ελεύθερης γκοσσυπόλης εντός των σπόρων βάµβακος, των αλεύρων
βάµβακος και των βαµβακοπλακούντων, η ποσότητα του δείγµατος
δεν πρέπει να υπερβαίνει το ένα γραµµάριο ·για σύνθετες τροφές
είναι δυνατό να ανέρχεται έως 5 γραµµάρια. Μέρος της ποσότητος
του διηθήµατος 10 mlείναι επαρκές για τις περισσότερες των
περιπτώσεων. Αυτό πρέπει να περιέχει 50 έως 100 µgγκοσσυ-
πόλης.Για τον προσδιορισµό της συνολικής γκοσσυπόλης, η
ποσότητα του δείγµατος πρέπει να κυµαίνεται µεταξύ 0,5 έως 5
γραµµάρια, ώστε µέρος της ποσότητος του διηθήµατος 2 µlνα
περιέχει 40 έως 200 µgγκοσσυπόλης.
Η ανάλυση πρέπει να διενεργείται σε θερµοκρασία περιβάλλοντος περί
τους 20ºC.
5.2Προσδιορισµός ελεύθερης γκοσσυπόλης
Η ποσότητα του δείγµατος εισάγεται εντός φιάλης χαµηλού περι-
λαιµίου των 250 ml,της οποίας ο πυθµήν είναι καλυµµένος δι '
υαλοκόνεως. ∆ια του σιφωνίου προστίθενται 50 mlδιαλυτικού
µέσου Α (3.2), πωµατίζεται η φιάλη και αναµιγνύονται επί µια
ώρα εντός του αναµίκτου. ∆ιηθείται δια ξηρού φίλτρου και συλλέ-
γεται το διήθηµα εντός µικράς φιάλης χαµηλού περιλαιµίου. Κατά
τη διάρκεια της διηθήσεως καλύπτεται το χωνί δι 'υάλου ωρολο-
γίου. Εισάγονται δια του σιφωνίου εντός δύο ογκοµετρικών
φιαλών των 25 ml (Α και Β) αντιστοίχως τα αυτά µέρη των ποσο-
τήτων του διηθήµατος τα οποία περιέχουν 50 έως 100 µg
γκοσσυπόλης. Συµπληρούται ο όγκος, εφ 'όσον παρίσταται
ανάγκη, µέχρι 10 mlδια της χρήσεως διαλυτικού µέσου Α (3.2).
Συµπληρούται ακολούθως το περιεχόµενο της φιάλης (Α) µέχρι
του όγκου αυτής δια µίγµατος ισοπροπανόλης -εξανίου (3.1). Το
διάλυµα αυτό θα χρησιµοποιηθεί σαν διάλυµα αναφοράς για τη
µέτρηση του διαλύµατος του δείγµατος.
Εισάγονται δια σιφωνίου 10 mlτου διαλυτικού µέσου Α (3.2) εντός
των δύο άλλων ογκοµετρικών φιαλών 25 ml (Γ και ∆) αντιστοίχως.
Συµπληρούται ο όγκος του περιεχοµένου της φιάλης (Γ) µε µίγµα
ισοπροπανόλης -εξανίου (3.1). Το διάλυµα αυτό θα χρησιµοποιηθεί
σαν διάλυµα αναφοράς για τη µέτρηση του διαλύµατος του τυφλού
πειράµατος.
Προστίθενται 2 mlανιλίνης (3.4) εντός εκάστης των φιαλών (∆)
και (Β) αντιστοίχως. Θερµαίνονται επί 30 πρώτα λεπτά επί ζέοντος1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 13
▼B
υδρολούτρου για την ανάπτυξη του χρωµατισµού. Ψύχονται σε
θερµοκρασία δωµατίου, συµπληρούνται οι όγκοι δια µίγµατος
ισοπροπανόλης -εξανίου (3.1), οµοιογενοποιούνται και αφήνονται
σε ηρεµία επί µια ώρα.
Προσδιορίζεται η οπτική πυκνότητα του διαλύµατος του τυφλού
πειράµατος (∆) δια συγκρίσεως µετά του διαλύµατος αναφοράς (Γ)
και η οπτική πυκνότητα του διαλύµατος του δείγµατος (Β) δια
συγκρίσεως µετά του διαλύµατος αναφοράς (Α) στο φασµατοφωτό-
µετρο σε 440 nm,εντός υαλίνων κυψελίδων 1 cm.
Αφαιρείται η οπτική πυκνότητα του διαλύµατος του τυφλού πειρά-
µατος από εκείνης του διαλύµατος του δείγµατος ( =διορθωµένη
οπτική πυκνότητα). Εκ της τιµής αυτής υπολογίζεται η περιεκτι-
κότητα της ελεύθερης γκοσσυπόλης, όπως υποδεικνύεται στο 6.
5.3Προσδιορισµός της συνολικής γκοσσυπόλης
Εισάγεται ποσότητα δείγµατος περιέχουσα 1 έως 5 mgγκοσσυ-
πόλης εντός ογκοµετρικής φιάλης των 50 mlκαι προστίθενται
10mlδιαλυτικού µέσου Β (3.3). Προετοιµάζεται συγχρόνως ένα
τυφλό πείραµα µε την εισαγωγή 10 mlδιαλυτικού µέσου Β (3.3)
εντός ετέρας ογκοµετρικής φιάλης των 50 ml.Θερµαίνονται οι
δύο φιάλες επί 30 πρώτα λεπτά εντός ζέοντος υδρολούτρου.
Ψύχονται σε θερµοκρασία δωµατίου και συµπληρούται το περιεχό-
µενο εκάστης φιάλης µέχρι πληρώσεως του όγκου αυτής δια του
µίγµατος ισοπροπανίου -εξανίου (3.1). Οµοιογενοποιείται και
αφήνεται εν ηρεµία για χρονικό διάστηµα 10 έως 15 πρώτων
λεπτών, ακουλούθως διηθείται και συλλέγεται το διήθηµα εντός
φιάλης χαµηλού περιλαιµίου.
Τίθενται 2 mlτου διηθήµατος του δείγµατος εντός δύο ογκοµε-
τρικών φιαλών των 25 mlαντιστοίχως και 2 mlτου διηθήµατος
του τυφλού πειράµατος εντός δύο ετέρων φιαλών των 25 mlαντι-
στοίχως. Λαµβάνεται µια φιάλη εξ εκάστης σειράς και
συµπληρούνται τα αντίστοιχα περιεχόµενα µέχρις 25 mlδια
µίγµατος ισοπροπανόλης -εξανίου (3.1). Τα διαλύµατα ταύτα θα
χρησιµοποιηθούν σαν διαλύµατα αναφοράς.
Προστίθενται 2 mlανιλίνης (3.4) εντός των δύο ετέρων φιαλών
αντιστοίχως. Θερµαίνονται επί 30 πρώτα λεπτά επί ζέοντος υδρο-
λούτρου για την ανάπτυξη του χρωµατισµού. Ψύχονται σε
θερµοκρασία δωµατίου, συµπληρούνται µέχρι 25 mlµε το µίγµα
ισοπροπανόλης -εξανίου (3.1), οµοιογενοποιούνται και αφήνονται
σε ηρεµία επί 1 ώρα.
Προσδιορίζεται η οπτική πυκνότητα, όπως δεικνύεται στο 5.2 για
την ελεύθερη γκοσσυπόλη. Εκ της τιµής υπολογίζεται η περιεκτι-
κότητα της συνολικής γκοσσυπόλης, όπως δεικνύεται στο 6.
6.Υπολογισµός των αποτελεσµάτων
Ο υπολογισµός των αποτελεσµάτων είναι δυνατό να διενεργηθεί είτε
εκ της ειδικής οπτικής πυκνότητος (6.1), είτε δι 'αναφοράς στην
καµπύλη µετρήσεων (6.2).
6.1Με την ειδική οπτική πυκνότητα
Υπό τας περιγραφείσας συνθήκας είναι οι ακόλουθοι:
ελεύθερη γκοσσυπόλη: E1%
1c m ¼625
συνολική γκοσσυπόλη: E1%
1c m ¼600
Η περιεκτικότητα σε ελεύθερη και συνολική γκοσσυπόλη του
δείγµατος δίδεται υπό του κάτωθι τύπου:
γκοσσυπ ´ολη%¼E/C11250
E1%
1c m/C1p/C1a
όπου:
E=διορθωµένη οπτική πυκνότητα, προσδιοριζόµενη όπως δείχ-
νεται στο 5.2,
p=ποσότητα δείγµατος σε γραµµάρια,
α=µέρος ποσότητος του διηθήµατος εις ml.1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 14
▼B
6.2∆ι'αναφοράς στην καµπύλη µετρήσεων
6.2.1Ελεύθερη γκοσσυπόλη
Προετοιµάζονται 2 σειρές από 5 ογκοµετρικές φιάλες των
25ml.Εισάγονται δια του σιφωνίου εντός των φιαλών
εκάστης σειράς όγκοι 2,0 — 4,0 — 6,0 — 8,0 και 10,0 mlτου
προτύπου διαλύµατος γκοσσυπόλης Α (3,5). Συµπληρούνται
οι όγκοι έως 10 mlδιαδιαλυτικού µέσου Α (3.2). Συµπλη-
ρούται εκάστη σειρά δια µάρτυρος αποτελουµένου εκ µιας
ογκοµετρικής φιάλης των 25 mlπεριέχουσα µόνο 10 ml
διαλυτικού µέσου Α (3.2).
Συµπληρούνται µέχρις 25 mlοι όγκοι των φιαλών της πρώτης
σειράς (συµπεριλαµβανοµένου του µάρτυρος) δια του
µίγµατος ισοπροπανόλης -εξανίου (3.1) (σειρά αναφοράς).
Προστίθενται 2 mlανιλίνης (3.4) εντός εκάστης φιάλης της
δεύτερης σειράς (συµπεριλαµβανοµένου του µάρτυρος).
Θερµαίνονται επί 30 πρώτα λεπτά επί ζέοντος υδρολούτρου
για την ανάπτυξη του χρωµατισµού. Ψύχονται σε θερµο-
κρασία δωµατίου, συµπληρούνται οι όγκοι δια του µίγµατος
ισοπροπανόλης -εξανίου (3.1), οµοιογενοποιούνται και
αφήνονται σε ηρεµία επί µια ώρα (πρότυπος σειρά).
Προσδιορίζεται µε τις υποδεικνυόµενες συνθήκες στο 5.2 η
οπτική πυκνότητα των διαλυµάτων της προτύπου σειράς δια
συγκρίσεως µε τα αντίστοιχα διαλύµατα της σειράς
αναφοράς. Σύρεται η καµπύλη µετρήσεων δια θέσεως των
οπτικών πυκνοτήτων έναντι των ποσοτήτων της γκοσσυ-
πόλης (εις µg).
6.2.2Συνολική γκοσσυπόλη
Προετοιµάζονται εξ (6) ογκοµετρικές φιάλες των 50 ml.
Εισάγονται εντός της πρώτης φιάλης 10 mlδιαλυτικού µέσου
Β (3.3) και εντός των υπολοίπων 2,0 — 4,0 — 6,0 — 8,0, και
10,0mlπροτύπου διαλύµατος γκοσσυπόλης Β (3.6) αντι-
στοίχως. Συµπληρούται το περιεχόµενο εκάστης φιάλης δια
10mlδιαλυτικού µέσου Β (3.3). Θερµαίνονται επί 30 πρώτα
λεπτά επί ζέοντος υδρολούτρου. Ψύχονται σε θερµοκρασία
δωµατίου, συµπληρούνται οι όγκοι δια µίγµατος ισοπροπα-
νόλης -εξανίου (3.1) και οµοιογενοποιούνται.
Εισάγονται 2,0 mlτων διαλυµάτων τούτων εντός δύο σειρών
εξ 6 ογκοµετρικών φιαλών των 25 mlαντιστοίχως. Συµπλη-
ρούται έως 25 mlτο περιεχόµενο των φιαλών της πρώτης
σειράς δια µίγµατος ισοπροπανόλης -εξανίου (3.1) (σειρά
αναφοράς).
Προστίθενται 2 mlανιλίνης (3.4) εντός εκάστης φιάλης της
δευτέρας σειράς. Θερµαίνονται επί 30 πρώτα λεπτά επί
ζέοντος υδρολούτρου. Ψύχονται σε θερµοκρασία δωµατίου,
συµπληρούνται οι όγκοι δια µίγµατος ισοπροπανόλης -
εξανίου (3.1), οµοιογενοποιούνται και αφήνονται σε ηρεµία
επί µια ώρα (πρότυπος σειρά).
Προσδιορίζεται µε τις υποδεικνυόµενες συνθήκες στο 5.2 η
οπτική πυκνότητα των διαλυµάτων της προτύπου σειράς δια
συγκρίσεως µε τα αντίστοιχα διαλύµατα της σειράς
αναφοράς. Σύρεται η καµπύλη µετρήσεων δια θέσεως
οπτικών πυκνοτήτων έναντι των ποσοτήτων της γκοσσυ-
πόλης (εις µg).
6.3Επαναληπτικότητα
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων των διενεργουµένων δύο
παραλλήλων προσδιορισµών επί του αυτού δείγµατος δεν πρέπει
να υπερβαίνει το:
— 15%σε σχετική τιµή, για τις περιεκτικότητες σε γκοσσυπόλη
µικρότερης των 500 ppm,
— 75 ppm σε απόλυτη τιµή, για περιεκτικότητες συµπεριλαµβανό-
µενες µεταξύ 500 και 750 ppm,
— 10% σε σχετική τιµή, για περιεκτικότητες ανώτερες των
750ppm.1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 15
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II
1.ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΤΗΣ ΟΜΑ∆ΟΣ
ΤΩΝ ΤΕΤΡΑΚΥΚΛΙΝΩΝ
1.Αντικείµενο και πεδίο εφαρµογής
Η µέθοδος επιτρέπει την ανίχνευση και αναγνώριση των αντιβιοτικών
της οµάδος των τετρακυκλινών εντός των τροφών οι οποίες περιέχουν
τουλάχιστον 0,1 ppmαντιβιοτικών, των συµπεπυκνωµένων τροφών και
των προµιγµάτων.
2.Αρχή
Το δείγµα υπόκειται σε εκχύλιση δια µίγµατος µεθανόλης και
υδροχλωρικού οξέος. Το εκχύλισµα χρωµατογραφείται επί χάρτου
ανοδικής κλίµακος εν συγκρίσει µετά των διαλυµάτων αναφοράς. Τα
αντιβιοτικά ανιχνεύονται και αναγνωρίζονται δια συγκρίσεως των
τιµών Rfαυτών µεθ 'εκείνων των προτύπων ουσιών είτε δια φθορισµού
σε λυχνίες UV (µεγάλη περιεκτικότητα αντιβιοτικών), είτε δια βιοαυ-
τογραφίας εντός µέσου άγαρος εµβολιασµένου µετά B.cereus .
3.Αντιδραστήρια και µέσον καλλιεργείας
3.1Ρυθµιστικό διάλυµα, pH3,5
Μονόυδρο κιτρικό οξύ χ.κ. 10,256 g
Μονόξινο φωσφορικό νάτριο Na2HPO42H2Oχ.κ.7,45 g
Ακετόνη χ.κ. 300 ml
Ύδωρ απεσταγµένο σε 1000 ml
3.2Φωσφορικό ρυθµιστικό διάλυµα, pH5,5
∆ισόξινο φωσφορικό κάλιο KH2PO4χ.κ. 130,86 g
Μονόξινο φωσφορικό νάτριο Na2HPO4.
2H2Oχ.κ.6,947 g
Ύδωρ απεσταγµένο σε 1000 ml
3.3∆ιάλυση I:Μίγµα καθαρής νιτροµεθάνης /καθαρού χλωροφορ-
µίου/διχλωριδρίνης α: 20 /10/1,5κατ'όγκον. Παρα-
σκευάζεται κατά τη στιγµή της χρήσεως.
3.4∆ιάλυση II:Μίγµα καθαρής νιτροµεθάνης /καθαρού χλωροφορ-
µίου/πικολίνης α: 20 /10/3κατ'όγκον. Προετοιµά-
ζεται κατά τη στιγµή της χρήσεως.
3.5Μίγµα καθαρής µεθανόλης /υδροχλωρικού οξέος ( d: 1,19): 98/2
κατ'όγκον.
3.6Υδροχλωρικό οξύ 0,1 N.
3.7Αµµωνία, d: 0,91.
3.8Πρότυπες ουσίες: Χλωροτετρακυκλίνη, οξυτετρακυκλίνη, τετρα-
κυκλίνη, η δραστικότητα των οποίων εκφράζεται σε
υδροχλωρικό άλας.
3.9Μικροοργανισµοί: B.cereusATCCno11.778
Συντήρηση του µητρικού υλικού, προετοιµασία του αιωρήµατος
των σπορίων και του εµβολιασµού του µέσου καλλιεργείας: εφαρ-
µόζονται οι οδηγίες εις 3.1 και 3.2 της µεθόδου του
προσδιορισµού της χλωροτετρακυκλίνης, οξυτετρακυκλίνης και
τετρακυκλίνης δια της διαχύσεως επί άγαρος, η οποία αποτελεί
το αντικείµενο του δευτέρου µέρους του παρόντος παραρτήµατος.1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 16
▼B
3.10Μέσον καλλιεργείας (1)
Γλυκόζη 1g
Θρυψική πεπτόνη 10 g
Εκχύλισµα κρέατος 1,5 g
Εκχύλισµα µαγιάς µπύρας 3g
Άγαρ 20 g
Απεσταγµένον ύδωρ εις 1000 ml
Ρυθµίζεται το pHεις 5,8 τη στιγµή της χρήσεως.
3.11∆ιάλυµα 0,1 %(κ.ό) χλωριούχου 2,3,5 -τριφαινυλοτετραζολίου και
5%(κ.ο.) διάλυµα γλυκόζης.
4.Συσκευές
4.1Συσκευή ανιούσης χρωµατογραφίας επί χάρτου (ύψος χάρτου: 25
εκατ).
Χάρται Schleicher καιSchüll 2040 b ή 2043 bή ισοδύναµοι.
4.2Φυγοκεντρική συσκευή.
4.3Επωαστικός κλίβανος, ρυθµισµένος εις 30 ºC.
4.4Λαµπτήρ UVγια την ανίχνευση φθορισµού.
4.5Υάλινες πλάκες των 20 ×30περίπου εκατοστών, που επιτρέπουν
την προσαρµογή δίσκου βιοαυτογραφίας.
5.Πρότυπο διάλυµα
5.1Αρχικά διαλύµατα
Παρασκευάζονται εκ των προτύπων ουσιών (3.8) και δια της
χρήσεως υδροχλωρικού οξέος (3.6), διαλύµατα των οποίων η
συγκέντρωση αναλογεί αντιστοίχως εις 500 µgχλωροτετρακυ-
κλίνης -HCl,οξυτετρακυκλίνης -HClανάml.
5.2∆ιαλύµατος αναφοράς δια την ανίχνευση δια UVτου φωτός
Τα διαλύµατα (5.1) αραιούνται δια φωσφορικού ρυθµιστικού διαλύ-
µατος (3.2) προς επίτευξη διαλυµάτων των οποίων η συγκέντρωση
αναλογεί εις 100 mgχλωροτετρακυκλίνης -HCl,οξυτετρακυκλίνης -
HClκαι τετρακυκλίνης -HClανάml.
5.3∆ιαλύµατα αναφοράς για την ανίχνευση δια βιοαυτογραφίας
Τα διαλύµατα (5.1) αραιούνται δια φωσφορικού ρυθµιστικού διαλύ-
µατος (3.2) προς επίτευξη διαλυµάτων των οποίων η συγκέντρωση
αναλογεί εις 5 µgχλωροτετρακυκλίνης -HCl,οξυτετρακυκλίνης -HCl
και τετρακυκλίνης -HClανάml.
6.Εκχύλιση
Όταν η υποτιθέµενη περιεκτικότητα σε αντιβιοτικό είναι µικρότερη
των 10 ppm,δύναται να χρησιµοποιηθεί το δείγµα είτε οµοιογενοποιη-
µένο, είτε το λεπτότατο δια κοσκινίσµατος αποχωρισθέν µέρος αυτού,
δεδοµένου ότι τα αντιβιοτικά ευρίσκονται κατά προτίµηση εντός του
µέρους τούτου.
Φέρεται το δείγµα εις αιώρηση εντός του µίγµατος (3.5) και φυγοκεν-
τρείται. Συλλέγεται το επί πλέον υγρό προς χρησιµοποίηση ως έχει ή
ενδεχοµένως αραιωµένο δια του διαλύµατος (3.5) προς επίτευξη
συγκεντρώσεων αντιβιοτικού 100 µg (6.1)και 5 µg (6.2)περίπου ανά ml.1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 17
(1)Οποιοδήποτε µέσο καλλιεργείας του εµπορίου αναλόγου συνθέσεως και το
οποίο δίδει τα αυτά αποτελέσµατα είναι δυνατό να χρησιµοποιηθεί.
▼B
7.Ανίχνευση και αναγνώριση
7.1Χρωµατογραφία
Εµβαπτίζεται ο χάρτης εντός του ρυθµιστικού διαλύµατος pH 3,5
(3.1).Αποµακρύνεται η περίσσεια υγρού δια πιέσεως του χάρτου
µεταξύ τεµαχίων χαρτίνου ξηρού φίλτρου. Τοποθετούνται
ακολούθως επί του χάρτου όγκοι 0,01 mlτων διαλυµάτων αναφοράς
(5.2 και 5.3) και του εκχυλίσµατος (6.1 και 6.2). ∆ια την επίτευξη
καλού διαχωρισµού, η ενδεδειγµένη περιεκτικότητατου χάρτου σε
υγρασία είναι αποφασιστική ·ενδεχοµένως αφήνεται να ξεραθεί
ελαφρώς.
Εµφανίζεται δι 'ανιούσης χρωµατογραφίας. Χρησιµοποιείται η
διάλυση I(3.3)δι'ανίχνευση δια βιοαυτογραφίας, η διάλυση II
(3.4)δι'ανίχνευση δια φωτός UV.Όταν το ύψος του διαλυτικού
µέσου έχει ανέλθει εις 15 -20εκατοστά (µια ώρα και 30 πρώτα
λεπτά περίπου), διακόπτεται η χρωµατογραφία και ξεραίνεται ο
χάρτης.
7.2Ανίχνευση δια φωτός UV
Όταν η περιεκτικότητα σε αντιβιοτικά είναι υψηλότερη του 1 µg/
cm2σε ακτινοβολία λαµπτήρος UV (4.4) κατόπιν κατεργασίας του
χρωµατογράµµατος δι 'ατµών αµµωνίας (3.7) παρατηρούνται χρυσο-
κίτρινα στίγµατα φθορισµού.
7.3Ανίχνευση δια βιοαυτογραφίας
Εκχύνεται το µέσο καλλιεργείας (3.10), προηγουµένως εµβολια-
σθέντος δια B. cereus (3.9),επί των υαλίνων πλακών (4.5) και
τοποθετείται ο χάρτης επί του µέσου καλλιεργείας. Κατόπιν
επαφής 5 πρώτων λεπτών, αποσπάται ο χάρτης και τοποθετείται
ούτος επί ετέρας θέσεως του µέσου καλλιεργείας, όπου παραµένει
κατά τη διάρκεια της περιόδου επωάσεως. Επωάζεται ακολούθως
επί µια νύκτα εντός του κλιβάνου εις 30 ºC.Η παρουσία αντιβιο-
τικού της οµάδος των τετρακυκλινών δηλώνεται δια της
εµφανίσεως ευκρινών ζωνών παρεµποδίσεως εντός του θολωµένου
µέσου καλλιέργειας.
Για τη σταθεροποίηση του χρωµατογράµµατος, εξατµίζεται το
διάλυµα (3.11) επί του χάρτου, κατόπιν επωάσεως.
7.4Αναγνώριση
Οι σχετικές τιµές Rfτων αντιβιοτικών της οµάδος των τετρακυ-
κλινών δίδονται κατωτέρω. Οι τιµές αυτές δύνανται να
διαφοροποιούνται µερικώς, αναλόγως της ποιότητος του χάρτου
και της περιεκτικότητος αυτού σε υγρασία:
Χλωροτετρακυκλίνη ( CTC) 0,60
Τετρακυκλίνη ( TC) 0,40
Οξυτετρακυκλίνη ( OTC) 0,20
4-épi-CTC 0,15
4-épi-TC 0,134-épi-OTC 0,10
Οι ενώσεις «épi»έχουν αντιβιοτική δραστικότητα µικρότερη
εκείνης των κανονικών ενώσεων.
2.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΧΛΩΡΟΤΕΤΡΑΚΥΚΛΙΝΗΣ, ΟΞΥΤΕΤΡΑ-
ΚΥΚΛΙΝΗΣ ΚΑΙ ΤΕΤΡΑΚΥΚΛΙΝΗΣ
Α. ∆ΙΑ ∆ΙΑΧΥΣΕΩΣ ΕΠΙ ΑΓΑΡΟΣ
1.Αντικείµενο και πεδίο εφαρµογής
Η µέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισµό της χλωροτετρακυκλίνης
(CTC),της οξυτετρακυκλίνης ( OTC)και της τετρακυκλίνης ( TC)εντός
των τροφών, των συµπεπυκνωµένων τροφών και των προµιγµάτων. Το
κατώτερο όριο του προσδιορισµού είναι 5 ppm.Περιεκτικότητες
µικρότερες των 5 ppmδύνανται να εκτιµηθούν δια γραφικής παρεµ-
βολής.1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 18
▼B
2.Αρχή
Για περιεκτικότητες ίσες ή µικρότερες των 50 ppm,το δείγµα
υπόκειται σε εκχύλιση δι 'αραιάς φορµαµίδης. Για περιεκτικότητες
µεγαλύτερες των 50 ppm,τούτο υπόκειται σε εκχύλιση δια µίγµατος
ακετόνης, ύδατος και υδροχλωρικού οξέος για τον προσδιορισµό της
CTCκαι δια µίγµατος µεθενόλης και υδροχλωρικού οξέος για τον
προσδιορισµό της OTCκαι της TC.
Τα εκχυλίσµατα αραιούνται ακολούθως και η αντιβιοτική τους δραστι-
κότητα προσδιορίζεται µε τη µέτρηση της διαχύσεως της CTC,της
OTCή της TCεντός µέσου άγαρος το οποίο έχει σπαρθεί δια του B.
cereus .Η διάχυση καθίσταται πρόδηλος µε το σχηµατισµό ζωνών
παρεµποδίσεως παρουσία του µικροοργανισµού. Η διάµετρος των
ζωνών αυτών είναι ευθέως ανάλογη του λογαρίθµου της συγκεντρώ-
σεως του αντιβιοτικού.
3.Μικροοργανισµός: B.cereusATCCNo11.778
3.1Συντήρηση του µητρικού υλικού
Εµβολιάζεται ο B. cereus επί επικλινούς άγαρος εντός σωλήνος
ληφθησοµένου εκ του µέσου καλλιεργείας (4.1), απηλλαγµένου εκ
κυανού του µεθυλίου και βορικού οξέος .Επωάζεται επί µια νύκτα εις
30ºCπερίπου. ∆ιατηρείται η καλλιέργεια εντός ψυγείου και
επανεµβολιάζεται το επικλινές άγαρ ανά 14ήµερο.
3.2Παρασκευή αιωρήµατος σπορίων
Συλλέγονται τα έµβρυα βακτήρια εκ σωλήνος επικλινούς άγαρος
(3.1) δια της χρήσεως 2 µέχρι 3 mlφυσιολογικού ορρού (4.5).
Ενσπείρεται δια του αιωρήµατος τούτου φιάλη Rouxπεριέχουσα
300mlτου µέσου καλλιεργείας (4.1), απηλλαγµένου εκ κυανού του
µεθυλίου και βορικού οξέος ,του οποίου η συµπύκνωση εις (άγαρ)
είναι 3 έως 4 %.Επωάζεται επί 3 µέχρι 5 ηµέρες εις 28 -30 ºC,
συλλέγονται ακολούθως τα σπόρια εντός 15 mlαιθανόλης (4.6),
κατόπιν ελέγχου της σποροπαραγωγής σε µικροσκόπιο, και οµοιο-
γενοποιείται. Το αιώρηµα αυτό δύναται να διατηρηθεί εντός
ψυγείου το λιγότερο επί 5 µήνες.
∆ια προκαταρκτικών δοκιµών επί πλακών µετά του βασικού µέσου
του προσδιορισµού (4.1), καθορίζεται η ποσότητα του εµβολίου η
οποία επιτρέπει την επίτευξη για διαφόρους συµπυκνώσεις των
χρησιµοποιουµένων αντιβιοτικών, τις µεγαλύτερες κατά το δυνατό
ζώνες παρεµποδίσεως οι οποίες παραµένουν εισέτι καθαρές. Οι
ποσότητες αυτές είναι γενικώς της τάξεως των 0,2 µέχρι 0,3 ml/
1000 ml. Ο εµβολιασµός του µέσου καλλιεργείας διενεργείται
µεταξύ 50 και 60 ºC.
4.Μέσα καλλιεργείας και αντιδραστήρια
4.1Βασικό µέσο προσδιορισµού (1)
Γλυκόζη 1g
Θρυψική πεπτόνη 10 g
Εκχύλισµα κρέατος 1,5 g
Εκχύλισµα µαγιάς µπύρας 3g
Άγαρ αναλόγως της ποσότητος 10-20 g
«Tween 80» 1 ml
Φωσφορικό ρυθµιστικό διάλυµα, pH 5,5
(4.2) 10 ml
∆ιάλυµα 5 %(κ.ο.) βορικού οξέος 15 ml
Αιθαναλικό διάλυµα 0,5 %εις κυανούν του
µεθυλενίου 4m l
Απεσταγµένο ύδωρ σε 1000 ml
Ρυθµίζεται εις pH 5,8αµέσως προ της χρήσεως1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 19
(1)Οποιοδήποτε µέσο καλλιεργείας του εµπορίου αναλόγου συνθέσεως και το
οποίο δίνει αυτά τα αποτελέσµατα είναι δυνατό να χρησιµοποιηθεί.
▼B
4.2Φωσφορικό ρυθµιστικό διάλυµα, pH5,5
∆ισόξινο φωσφορικό κάλιο KH2PO4χ.κ. 130,86 g
Μονόξινο φωσφορικό νάτριο Na2HPO4.
2H2Oχ.κ. 6,947 g
Ύδωρ απεσταγµένο σε 1000 ml
4.3Φωσφορικό ρυθµιστικό διάλυµα, pH 5,5,αραιωµένο κατά 1 /10
4.4Φωσφορικό ρυθµιστικό διάλυµα, pH8
∆ισόξινο φωσφορικό κάλιο KH2PO4χ.κ. 1,407 g
Μονόξινο φωσφορικό νάτριο Na2HPO4.
2H2Oχ.κ. 57,539 g
Απεσταγµένο ύδωρ σε 1000 ml
4.5Αποστειρωµένος φυσιολογικός ορρός
4.6Αιθανόλη 20 %(κ.ο.)
4.7Υδροχλωρικό οξύ 0,1 N
4.8Φορµαµίδη 70 %(κ.ό): προετοιµάζεται ολίγον προ της χρησιµο-
ποιήσεως και ρυθµίζεται εις pH 4,5δια της χρήσεως θειικού
οξέος 2 Nπερίπου.
4.9Μίγµα καθαρής ακετόνης ύδατος υδροχλωρικού οξέος ( d: 1,19):
65/33/2κατ'όγκον.
4.10Μίγµα καθαράς αιθανόλης υδροχλωρικού οξέος ( d: 1,19): 98/2 κατ'
όγκον.
4.11Πρότυποι ουσίαι: CTC, OTC, TC, η δραστικότητα των οποίων
είναι εκπεφρασµένη εις υδροχλωρικό άλας.
5.Πρότυπα διαλύµατα
5.1Χλωροτετρακυκλίνη
Από πρότυπο διάλυµα (4.11), παρασκευάζεται µε τη χρήση
υδροχλωρικού οξέος (4.7) αρχικό διάλυµα, η συµπύκνωση του
οποίου αναλογεί σε 500 µgχλωροτετρακυκλίνης -HClανάml.Το
διάλυµα αυτό διατηρείται επί µια εβδοµάδα εντός ψυγείου.
Από το αρχικό αυτό διάλυµα, παρασκευάζεται πρότυπο διάλυµα
εργασίας S8,η συµπύκνωση του οποίου αναλογεί σε 0,2 µgχλωρο-
τετρακυκλίνης -HClανάml.Η αραίωση γίνεται µε τη χρήση του
φωσφορικού ρυθµιστικού διαλύµατος, pH 5,5αραιωµένου κατά 1 /
10 (4.3), στο οποίο έχει προστεθεί 0,01 %άµυλο µέλαν (1).
Παρασκευάζονται ακολούθως δια διαδοχικών αραιώσεων (1 +1 )µε
τη χρήση του ρυθµιστικού διαλύµατος (4.3) οι κάτωθι συµπυκνώ-
σεις:
S40,1 µg/ml
S20,05 µg/ml
S10,025 µg/ml
5.2Οξυτετρακυκλίνη
Εις υποδείξεις στο 5.1, παρασκευάζεται εξ αρχικού διαλύµατος η
συµπύκνωση του οποίου αναλογεί σε 400 µgοξυτετρακυκλίνης -
HClανάml,πρότυπο διάλυµα εργασίας S8σε 1,6 µgοξυτετρακυ-
κλίνης -HClανάmlκαι οι κάτωθι συµπυκνώσεις:
S40,8 µg/ml
S20,4 µg/ml
S10,2 µg/ml1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 20
(1)Το µέλαν άµυλο χρησιµοποιείται για τον χαρακτηρισµό των ζωνών παρεµποδί-
σεως των προτύπων διαλυµάτων (µπλέ δακτύλιοι).
▼B
5.3Τετρακυκλίνη
Κατά τις υποδείξεις στο 5.1, παρασκευάζεται εξ αρχικού διαλύ-
µατος η συµπύκνωση του οποίου αναλογεί εις 500 µg
τετρακυκλίνης -HClανάml,πρότυπο διάλυµα εργασίας S8σε 1,0 µg
τετρακυκλίνης -HClανάmlκαι οι κάτωθι συµπυκνώσεις:
S40,5 µg/ml
S20,25 µg/ml
S10,125 µg/ml
6.Εκχύλιση
6.1Περιεκτικότητες ίσες ή κατώτερες των 50 ppm
Η ποσότητα του δείγµατος υπόκειται σε επεξεργασία για
ποσότητες φορµαµίδης (4.8), κατά τις ενδείξεις οι οποίες δίδονται
στον ακόλουθο πίνακα. Ανακινείται επί 30 πρώτα λεπτά επί παλλο-
µένης τραπέζης. Αραιούται αµέσως κατόπιν δια της χρήσεως
φωσφορικού ρυθµιστικού διαλύµατος (4.3), κατά τις ενδείξεις οι
οποίες δίδονται στον ακόλουθο πίνακα, προς επίτευξη της συµπυ-
κνώσεως U8.Η συµπύκνωση σε φορµαµίδη του διαλύµατος αυτού
δεν πρέπει να υπερβαίνει το 40 %.Φυγοκεντρείται ή εκχύνεται
προς επίτευξη διαυγούς διαλύµατος.
Προετοιµάζονται ακολούθως οι συµπυκνώσεις U4,U2καιU1δια
διαδοχικών αραιώσεων (1 +1 )µε τη χρήση του φωσφορικού ρυθµι-
στικού διαλύµατος (4.3).
Αντιβιοτικό CTC OTC TC
Υποτιθέµενη περιε-
κτικότητα σε ppm 10 50 10 50 10 50
Ποσότητα δείγµατος
σε γραµµάρια 10 10 24 9,6 20 10
mlφορµαµίδης (4.8) 100 100 80 100 80 100
mlφωσφορικού
ρυθµιστικού διαλύ-
µατος (4.3)αραίωση
1: 5
(α)αραίωση
1: 25
(β) 70 200 120αραίωση
1: 5
(α)
Συµπύκνωση U8σε
µg/ml 0,2 0,2 1,6 1,6 1,0 1,0
(α)Λαµβάνονται 20 mlεκχυλίσµατος και συµπληρούνται µέχρι 100 mlδια του ρυθµιστικού διαλύ-
µατος εντός ογκοµετρικής φιάλης.
(β)Λαµβάνονται 4 mlεκχυλίσµατος και συµπληρούνται µέχρι 100 mlδια του ρυθµιστικού διαλύ-
µατος εντός ογκοµετρικής φιάλης.
6.2Περιεκτικότητες ανώτερες των 50 ppm
6.2.1Χλωροτετρακυκλίνη
Ποσότητα δείγµατος 2 έως 10 γραµµαρίων, αναλόγως της
υποτιθεµένης περιεκτικότητος σε αντιβιοτικό του δείγµατος
ή της εγγυήσεως του εργοστασίου παρασκευής του, τυγχάνει
κατεργασίας δια µίγµατος (4.9) 20πλασίου του όγκου του.
Ανακινείται επί 30 πρώτα λεπτά επί της παλλοµένης
τραπέζης. Ελέγχεται ότι το pHαυτού παραµένει µικρότερο
του 3 κατά τη διάρκεια της εκχυλίσεως. Ενδεχοµένως, ρυθµί-
ζεται εις pH 3 (δια της χρήσεως οξεικού οξέος 10 %επί
ορυκτών ενώσεων). Λαµβάνεται µέρος της ποσότητος του
εκχυλίσµατος και ρυθµίζεται το pHσε 5,5 δια της χρήσεως
φωσφορικού ρυθµιστικού διαλύµατος, pH 8 (4.4) παρουσία
πρασίνης βρωµιοκρεζόλης (στρεφοµένης εκ κιτρίνης εις
κυανήν). Αραιούται δια της χρήσεως φωσφορικού ρυθµι-
στικού διαλύµατος, pH 5,5αραιωµένου κατά 1 /10 (4.3) προς
επίτευξιν της συµπυκνώσεως U8(ιδέ 6.1).
Προετοιµάζονται εν συνεχεία οι συµπυκνώσεις U4,U2καιU1δια διαδοχικών αραιώσεων (1 +1 )δια της χρήσεως φωσφο-
ρικού ρυθµιστικού διαλύµατος (4.3).1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 21
▼B
6.2.2Οξυτετρακυκλίνη και τετρακυκλίνη
Επαναλαµβάνονται οι εργασίες όπως δείκνυται εις 6.2.1 δι '
αντικαταστάσεως του µίγµατος (4.9) δια του µίγµατος (4.10).
7.Μεθοδολογία προσδιορισµού
7.1Εµβολιασµός του µέσου καλλιεργείας
Εµβολιάζεται σε 50 —6 0º C το βασικό µέσο καλλιεργείας του
προσδιορισµού (4.1) δια του αιωρήµατος των σπορίων (3.2).
7.2Προετοιµασία των δίσκων
Η διάχυση επί άγαρος πραγµατοποιείται επί δίσκων οι οποίοι
περιέχουν τα 4 συµπυκνωµένα των προτύπων διαλυµάτων ( S8,S4,
S2,S1)και τα τέσσερα συµπυκνώµατα του εκχυλίσµατος ( U8,U4,
U2,U1).Έκαστος δίσκος πρέπει να περιέχει απαραιτήτως τα 4
συµπυκνώµατα του προτύπου διαλύµατος και του εκχυλίσµατος.
Για τον σκοπό αυτό εκλέγονται δίσκοι τοιούτων διαστάσεων, ώστε
εντός του µέσου άγαρος να δύνανται να σχηµατισθούν τουλάχιστον
8 κοιλότητες διαµέτρου 10 έως 13 mm.Υπολογίζεται η ποσότητα
του εµβολιασµένου µέσου καλλιεργείας (7.1), η απαιτουµένη για
την επίτευξη οµοιοµόρφου καλύψεως πάχους 2 mmπερίπου. Είναι
προτιµότερο να χρησιµοποιούνται σαν δίσκοι επίπεδες υάλινες
πλάκες, οι οποίες είναι εφοδιασµένες µετά τελείως επιπέδου
δακτυλίου εξ αλουµινίου ή εκ πλαστικού υλικού διαµέτρου
200mmκαι ύψους 20 mm.
Εισάγονται δια του σιφωνίου εντός των κοιλοτήτων επακριβώς
µετρούµενες ποσότητες διαλύµατος αντιβιοτικού και κυµαινόµενες
µεταξύ 0,10 και 0,15 ml,αναλόγως της διαµέτρου των κοιλοτήτων.
Για κάθε δείγµα διενεργούνται 4 τουλάχιστον επαναλήψεις της
διαχύσεως για κάθε µια από τις συµπυκνώσεις, κατά τρόπο ώστε
έκαστος προσδιορισµός ν 'αποτελεί εκτίµηση προερχοµένη από
32 ζώνες παρεµποδίσεως.
7.3Επώαση
Επωάζονται οι δίσκοι επί 18 περίπου ώρες εις 28 —3 0º C .
8.Εκτίµηση
Μετριέται η διάµετρος των ζωνών παρεµποδίσεως, κατά προτίµηση
δια προβολής. Σηµειούνται οι µετρήσεις επί ηµιλογαριθµικού χάρτου,
ο οποίος δίνει το λογάριθµο των συµπυκνώσεων ως προς τις διαµέ-
τρους των ζωνών παρεµποδίσεως. Σύρονται οι ευθείες του προτύπου
διαλύµατος και του εκχυλίσµατος. Εν απουσία αλληλεπιδράσεως οι
δύο ευθείες πρέπει να είναι παράλληλες.
Ο λογάριθµος της σχετικής δραστικότητος υπολογίζεται µε τον
ακόλουθο τύπο:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ :0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Πραγµατική δραστικότητα =υποτιθέµενη δραστικότητα ×σχετική
δραστικότητα.
9.Επαναληπτικότητα
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων των διενεργηθέντων δύο
παραλλήλων προσδιορισµών επί του αυτού δείγµατος δεν πρέπει να
υπερβαίνει το 10 %σε σχετική τιµή.
Β. ∆ΙΑ ΘΟΛΟΜΕΤΡΗΣΕΩΣ
1.Αντικείµενο και πεδίο εφαρµογής
Η µέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισµό της χλωροτετρακυκλίνης
(CTC),της οξυτετρακυκλίνης ( OTC)και της τετρακυκλίνης ( TC)σε
συµπυκνώσεις ανώτερες του 1 g/kg,υπό τον όρο ότι ουδεµία υφίσταται
αλληλεπίδραση από άλλη πρόσµιξη ουσιών στις οποίες οφείλεται η
θόλωση των εκχυλισµάτων. Η µέθοδος αυτή είναι ταχύτερη της
µεθόδου δια διαχύσεως επί άγαρος.1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 22
▼B
2.Αρχή
Το δείγµα υπόκειται σε εκχύλιση µε µίγµα ακετόνης, ύδατος και
υδροχλωρικού οξέος για τον προσδιορισµό της CTCκαι µε µίγµα
µεθανόλης και υδροχλωρικού οξέος για τον προσδιορισµό της OTC
και της TC.
Τα εκχυλίσµατα αραιούνται ακολούθως και τα αντιβιοτικά αποτελέ-
σµατα αυτών προσδιορίζονται µε τη µέτρηση της φωτοπερατότητος
δι'ενός µέσου καλλιεργείας, το οποίο έχει σπαρθεί µετά του Staphylo-
coccus aureus και στο οποίο έχει προστεθεί αντιβιοτικό. Η
φωτοπερατότητα είναι συνάρτηση της συµπυκνώσεως του αντιβιο-
τικού.
3.Μικροοργανισµός: StaphylococcusaureusK141 (1)
3.1∆ιατήρηση του µητρικού υλικού
Εµβολιάζεται ο S. aureus επί επικλινούς άγαρος εντός σωλήνος
αποτελουµένου εκ του µέσου καλλιεργείας (4.1), εις το οποίο έχει
προστεθεί 1,5 µέχρι 3 %άγαρ(αναλόγως της ποιότητος). Επωάζεται
κατά τη διάρκεια µιας νύκτας εις 37 ºC.Η καλλιέργεια διατηρείται
στο ψυγείο και επανεµβολιάζεται επί επικλινούς άγαρος κάθε 4
εβδοµάδες. Προετοιµάζονται συγχρόνως οι υποκαλλιέργειες για
εργαστηριακή χρήση.
3.2Παρασκευή του εµβολίου
Επανεµβολιάζεται υποκαλλιέργεια επί επικλινούς άγαρος, 24 ώρας
προ της χρησιµοποιήσεως, η οποία επωάζει κατά τη διάρκεια της
νύκτας σε 37 ºC.∆ηµιουργείται αιώρηµα δια της τοποθετήσεως του
συνόλου της καλλιεργείας σωλήνος άγαρος εντός 2 mlπερίπου του
βασικού µέσου (4.1) και το αιώρηµα µεταφέρεται ακολούθως υπό
συνθήκας αποστειρώσεως εντός 100 mlπερίπου του αυτού βασικού
µέσου (4.1). Επωάζει εντός υδρολούτρου εις 37 ºC,µέχρις ότου η
ανάπτυξη του γένους εισέλθει στη λογαριθµική αυτή φάση (1 ώρα
και 30 πρώτα λεπτά έως 3 ώρες.)
4.Μέσα καλλιεργείας και αντιδραστήρια
4.1Βασικό µέσο προσδιορισµού (2)
Πεπτόνη 5g
Εκχύλισµα µαγιάς µπύρας 1,5 g
Εκχύλισµα κρέατος 1,5 g
Χλωριούχο νάτριο 3,5 g
Γλυκόζη 1,0 g
∆ισόξινο φωσφορικό κάλιο KH2PO4χ.κ. 1,32 g
Μονόξινο φωσφορικό κάλιο K2HPO4χ.κ. 3,68 g
Απεσταγµένον ύδωρ σε 1000 ml
pHκατόπιν αποστειρώσεως: 6,8 έως 7,0
4.2Φωσφορικό ρυθµιστικό διάλυµα, pH4,5
∆ισόξινο φωσφορικό κάλιο KH2PO4χ.κ. 13,6 g
Απεσταγµένον ύδωρ σε 1000 ml
4.3Υδροχλωρικό οξύ 0,1 N
4.4Μίγµα καθαράς ακετόνης /ύδατος /υδροχλωρικού οξέος ( d: 1,19): 65/
33/2κατά όγκο.
4.5Μίγµα καθαρής µεθανόλης /υδροχλωρικού οξέος ( d: 1,19): 98/2
κατά όγκο.
4.6∆ιάλυµα φορµαλδεΰδης 10 %περίπου (κ.ο.).1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 23
(1)Το γένος τούτο, αποµονωθέν υπό του LUFAεις Κίελο, αναπτύσσεται ταχύτερα
τουS. aureus ATCC 6538 P .
(2)Οποιοδήποτε µέσο καλλιεργείας του εµπορίου, αναλόγου συνθέσεως και το
οποίο δίδει τα αυτά αποτελέσµατα, είναι δυνατό να χρησιµοποιηθεί.
▼B
4.7Πρότυπες ουσίες: CTC, OTC, TC, η δραστικότητα των οποίων είναι
εκπεφρασµένη σε υδροχλωρικό άλας.
5.Πρότυπο διάλυµα
Παρασκευάζεται εκ της προτύπου ουσίας (4.7) και µε τη χρήση
υδροχλωρικού οξέος (4.3) αρχικό διάλυµα, η συµπύκνωση του οποίου
αναλογεί σε 400 έως 500 µg CTC-HCl, OTC-HCl ήTC-HClανάml.Το
διάλυµα αυτό διατηρείται εντός ψυγείου επί µια εβδοµάδα.
6.Εκχύλιση
6.1Χλωροτετρακυκλίνη
Εισάγεται εντός ογκοµετρικής φιάλης των 200 ή 250 mlποσότητα
δείγµατος 1 έως 2 γραµµαρίων. Προστίθενται 100 mlπερίπου
µίγµατος (4.4) και ανακινείται επί 30 πρώτα λεπτά επί παλλοµένης
τραπέζης. Συµπληρούται ο όγκος δια φωσφορικού ρυθµιστικού
διαλύµατος, pH 4,5 (4.2). Οµοιογενοποιείται και αφήνεται να
καθιζάνει.
6.2Οξυτετρακυκλίνη και τετρακυκλίνη
Εισάγεται εντός ογκοµετρικής φιάλης των 200 ή 250 mlποσότητα
δείγµατος 1 έως 2 γραµµαρίων. Προστίθενται 100 mlπερίπου
µίγµατος (4.5) και ανακινείται επί 30 πρώτα λεπτά επί παλλοµένης
τραπέζης. Συµπληρούται ο όγκος δια φωσφορικού ρυθµιστικού
διαλύµατος, pH 4,5 (4.2). Οµοιογενοποιείται και αφήνεται να
καθιζάνει.
7.Μεθοδολογία προσδιορισµού
7.1Παρασκευή των προτύπων σειρών και του εκχυλίσµατος
Αραιούνται δια της χρήσεως του φωσφορικού διαλύµατος pH 4,5
(4.2)το πρότυπον διάλυµα(5) και το εκχύλισµα(6) προς επίτευξη
σειράς συµπυκνώσεων οι οποίες επιτρέπουν για έκαστο προσδιο-
ρισµό τη χάραξη προτύπου καµπύλης και για έκαστο
προσδιορισµό την παρεµβολή επί της καµπύλης ταύτης δύο τουλά-
χιστον σχετικών τιµών του εκχυλίσµατος. Τα αραιώµατα πρέπει να
εκλέγονται συναρτήσει των συνθηκών αναπτύξεως του γένους, οι
οποίες δύνανται να διαφέρουν από εργαστηρίου σε εργαστήριο.
Γενικώς η διαδικασία η οποία ακολουθείται έχει ως κάτωθι:
7.1.1Χλωροτετρακυκλίνη
Αραιούται δια της χρήσεως του φωσφορικού ρυθµιστικού
διαλύµατος (4.2) το πρότυπο διάλυµα(5) προς επίτευξηπροτύπου διαλύµατος εργασίας, η συµπύκνωση του οποίου
αναλογεί σε 0,2 µg CTC-HCl ανάml.Παρασκευάζονται
ακολούθως δια της χρήσεως του φωσφορικού ρυθµιστικού
διαλύµατος (4.2), ως υποδεικνύεται κατωτέρω και εντός των
δοκιµαστικών σωλήνων του προσδιορισµού, 6 αραιώµατα εις
διπλούν.
mlπροτύπου διαλύ-
µατος εργασίαςmlφωσφορικού
ρυθµιστικού διαλύ-
µατος (4.2)Συµπύκνωση εις
CTC-HCl
(µg/ml)
0,7 0,3 0,14
0,6 0,4 0,12
0,55 0,45 0,11
0,45 0,55 0,09
0,4 0,6 0,08
0,3 0,7 0,06
Αραιούται το εκχύλισµα (6.1) δια της χρήσεως φωσφορικού
ρυθµιστικού διαλύµατος (4.2) προς επίτευξη υποτιθέµενης
συµπυκνώσεως εις CTC - HCl 0,12 µg/ml. Εισάγεται 1 mlτου
διαλύµατος τούτου εντός 2 σωλήνων και 0,75 ml (= 0,09 µg)
εντός δύο ετέρων σωλήνων. Συµπληρούται ο όγκος των 2
τελευταίων σωλήνων µέχρις 1 mlδια του φωσφορικού ρυθµι-
στικού διαλύµατος (4.2).1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 24
▼B
7.1.2Οξυτετρακυκλίνη και τετρακυκλίνη
Αραιούται δια της χρήσεως του φωσφορικού ρυθµιστικού
διαλύµατος (4.2) το πρότυπο διάλυµα(5) προς επίτευξη
προτύπου διαλύµατος εργασίας η συµπύκνωση του οποίου
αναλογεί εις 0,6 µg OTC - HCl ήTC - HCl ανάml.Παρα-
σκευάζονται ακολούθως δια της χρήσεως φωσφορικού
ρυθµιστικού διαλύµατος (4.2), όπως υποδεικνύεται κατωτέρω,
και εντός των δοκιµαστικών φιαλών του προσδιορισµού, 7
αραιώµατα εις διπλούν.
mlπροτύπου διαλύ-
µατος εργασίαςmlφωσφορικού
ρυθµιστικού διαλύ-
µατος (4.2)Συµπύκνωση εις
OTC - HCl ήTC -
HCl
(µg/ml)
0,9 0,1 0,54
0,8 0,2 0,48
0,7 0,3 0,42
0,6 0,4 0,36
0,4 0,6 0,24
0,3 0,7 0,18
0,2 0,8 0,12
Αραιούται το εκχύλισµα (6.2) δια της χρήσεως φωσφορικού
ρυθµιστικού διαλύµατος (4.2) προς επίτευξη υποτιθέµενης
συµπυκνώσεως εις OTC-HCl ήTC-HCl, 0,48 µg/ml. Εισάγεται
1mlτου διαλύµατος τούτου εντός 2 σωλήνων και 0,5 ml
(0,24 µg) εντός 2 ετέρων σωλήνων. Συµπληρούται ο όγκος
των 2 τελευταίων σωλήνων µέχρις 1 mlδια φωσφορικού
ρυθµιστικού διαλύµατος (4.2).
7.2Εµβολιασµός του µέσου καλλιεργείας
∆ια του εµβολίου (3.2) κατά τρόπο ώστε να επιτυγχάνεται στο
φωτόµετρο σε 590 nmφωτοπερατότητα 85 %εντός κοιλότητος 5 cm
ή9 2%εντός κοιλότητος 2 cm,της συσκευής εχούσης ρυθµισθεί µε
100%φωτοπερατότητος δια του ανεµβολιάσθου βασικού µέσου
(4.1).
7.3∆ιασπορά σπορίων
Εισάγονται εντός εκάστου σωλήνος (7.1.1 ή 7.1.2) 9 mlτου εµβο-
λιασµένου µέσου καλλιεργείας (7.2). Η πλήρωση των σωλήνων
πρέπει να γίνεται υπό συνθήκας καθαριότητος, αλλά όχι απαραι-
τήτως υπό συνθήκας αποστειρώσεως.
7.4Επώαση
Η επώαση πρέπει να γίνεται υποχρεωτικώς εντός υδρολούτρου, η
θερµοκρασία του οποίου διατηρείται οµοιογενής σε 37 ºC ± 0,1 ºC
δι'ανακινήσεως. Ο χρόνος επωάσεως πρέπει να εκλέγεται κατά
τρόπο επιτρέποντα τη χάραξη των καµπυλών φωτοπερατότητος, η
κλίση των οποίων είναι η ενδεδειγµένη δι 'επακριβείς µετρήσεις
(γενικώς 2 ώρες και 30 πρώτα λεπτά έως 3 ώρες). Ακολούθως
διακόπτεται η περαιτέρω ανάπτυξη δια ταχείας εκχύσεως 1 ml
διαλύµατος φορµαλδεΰδης (4.6) εντός εκάστου σωλήνος.
7.5Μέτρηση της αναπτύξεως
Μετρώνται οι φωτοπερατότητες δια φωτοµέτρου εις 590 nmρυθµι-
ζοµένης της συσκευής σε 100 %φωτοπερατότητα δια του πλέον
διαυγούς προτύπου διαλύµατος (η οποία αντιστοιχεί στην υψηλό-
τερη περιεκτικότητα αντιβιοτικού). Ένεκα των ελαφρών
διαφορών θολότητος τας οποίας παρουσιάζουν οι διάφοροι
σωλήνες, συνιστάται η χρησιµοποίηση κοιλοτήτων 2 cmτουλάχι-
στον, και κατά προτίµηση 5 cm.
8.Υπολογισµός των αποτελεσµάτων
Σύρεται γραφικώς η πρότυπος καµπύλη επί χιλιοστοµετρικού χάρτου
φέροντος τις µετρήσεις φωτοπερατότητος ως προς τις αντιβιοτικές
συµπυκνώσεις. Παρεµβάλλονται επί της καµπύλης οι σχετικές µετρή-
σεις του εκχυλίσµατος. Υπολογίζεται η περιεκτικότητα του δείγµατος
σε αντιβιοτικό.1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 25
▼B
9.Επαναληπτικότητα
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων των διενεργουµένων δύο
παραλλήλων προσδιορισµών επί του αυτού δείγµατος δεν πρέπει να
υπερβαίνει το 10 %σε σχετική τιµή.
3.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΝΗΡΙΟΜΥΚΙΝΗΣ ( OLÉANDOMYCINE)
—δια διαχύσεως επί άγαρος —
1.Αντικείµενο και πεδίο εφαρµογής
Η µέθοδος επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισµό της νηριοµυκίνης
(oléandomycine) εντός των ζωοτροφών, των συµπεπυκνωµένων τροφών
και των προσµιγµάτων, ακόµη και επί παρουσία τετρακυκλίνης. Το
κατώτατο όριο του προσδιορισµού είναι 0,5 ppm.
2.Αρχή
Το δείγµα υπόκειται σε εκχύλιση µετ 'αραιωµένου µεθανολικού διαλύ-
µατος της Τρι(υδροξυµεθυλό) αµινοµεθάνης. Κατόπινφυγοκεντρήσεως, το εκχύλισµα αραιούται και η αντιβιοτική δραστι-
κότητά του προσδιορίζεται δια της µετρήσεως της διαχύσεως της
νηριοµυκίνης ( oléandomycine) εντός µέσου άγαρος το οποίο έχει
σπαρθεί µετά του B.cereus .Η διάχυση υποδεικνύεται δια του σχηµατι-
σµού ζωνών παρεµποδίσεως παρουσία του µικροοργανισµού. Η
διάµετρος των ζωνών αυτών είναι ευθέως ανάλογος του λογαρίθµου
της συµπυκνώσεως του αντιβιοτικού.
3.Μικροοργανισµός B. cereus K 250 TR (
1)(ανθεκτικός σε τετρακυ-
κλίνες)
3.1Συντήρηση µητρικού υλικού
Εµβολιάζεται ο B. cereus επί επικλινούς άγαρος εντός σωλήνος
αποτελουµένου εκ του µέσου καλλιεργείας (4.1) και στο οποίο
έχουν προστεθεί 100 µgοξυτετρακυκλίνης ανά 5 ml.Επωάζεται
για µια νύκτα εις 30 ºCπερίπου. Η καλλιέργεια διατηρείται στο
ψυγείο και επανεµβολιάζεται κάθε 4 εβδοµάδες επί επικλινούς
άγαρος.
3.2Παρασκευή του αιωρήµατος σπορίων
Συλλέγονται τα έµβρυα εκ σωλήνος επικλινούς άγαρος (3.1) δια
της χρήσεως 3 mlπερίπου φυσιολογικού ορρού (4.3). ∆ια του
αιωρήµατος τούτου σπείρεται φιάλη Rouxπεριέχουσα 300 mlτου
µέσου καλλιεργείας (4.1) του οποίου η συµπύκνωση εις άγαρ είναι 3
έως 4%.Επωάζει επί 3 έως 5 ηµέρας εις 28 — 30 ºC, συλλέγονται
ακολούθως τα σπόρια εντός 15 mlαιθανόλης (4.4), κατόπιν
ελέγχου της σποροπαραγωγής σε µικροσκόπιο, και οµοιογενο-
ποιείται. Το αιώρηµα τούτο δύναται να διατηρηθεί εντός ψυγείου
το λιγότερο επί 5 µήνας.
∆ια προκαταρκτικών δοκιµών επί πλακών µετά του βασικού µέσου
του ποσοτικού προσδιορισµού (4.2) καθορίζεται η ποσότητα του
εµβολίου η οποία επιτρέπει την επίτευξη, για διαφόρους συµπυ-
κνώσεις της χρησιµοποιουµένης νηριοµυκίνης ( Oléandomycine)
των µεγαλυτέρων κατά το δυνατό ζωνών παρεµποδίσεως, οι οποίες
παραµένουν ακόµη καθαρές. Οι ποσότητες αυτές είναι γενικώς της
τάξεως των 0,1 µέχρι 0,2 ml/1000 ml. Ο εµβολιασµός του µέσου
καλλιεργείας λαµβάνει χώρα σε 60 ºC.
4.Μέσα καλλιεργείας και αντιδραστήρια
4.1Μέσο διατηρήσεως του µητρικού υλικού (2)
Γλυκόζη 1g
Θρυψική πεπτόνη 10 g
Εκχύλισµα κρέατος 1,5 g
Εκχύλισµα µαγιάς µπύρας 3g1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 26
(1)Γένος αποµονωθέν υπό του LUFAστο Κίελο.
(2)Οποιοδήποτε µέσο καλλιεργείας του εµπορίου, αναλόγου συνθέσεως και το
οποίο δίδει τα αυτά αποτελέσµατα, είναι δυνατό να χρησιµοποιηθεί.
▼B
Άγαρ, αναλόγως της ποιότητος 1 0—2 0g
Απεσταγµένο ύδωρ σε 1000 ml
Ρυθµίζεται σε pH 6,5κατά τη στιγµή της χρησιµοποιήσεως.
4.2Βασικό µέσο προσδιορισµού (1)
Το µέσο (4.1) ρυθµιζόµενο σε pH 8,8
4.3Αποστειρωµένος φυσιολογικός ορρός
4.4Αιθανόλη 20 %(κ.ό)
4.5Καθαρή µεθανόλη
4.6∆ιάλυµα 0,5 %(κ.ό) τρι (υδροξυµεθυλο) αµινο -µεθάνη χ.κ.
4.7∆ιάλυµα εκχυλίσεως
Καθαρή µεθανόλη 50 ml
Απεσταγµένο ύδωρ 50 ml
Τρι(υδροξυµεθυλο)
αµινο-µεθάνη χ.κ.0,5 g
4.8Πρότυπος ουσία νηριοµυκίνη ( oléandomycine) γνωστής δραστι-
κότητος.
5.Πρότυπο διάλυµα
∆ιαλύεται µέρος της προτύπου ουσίας (4.8) εντός 5 mlµεθανόλης (4.5)
και αραιούται δια του διαλύµατος (4.6) προς επίτευξη συµπυκνώσεως
σε νηριοµυκίνη ( oléandomycine) 100 µg/ml.
Επί τη βάσει του προτύπου τούτου αρχικού διαλύµατος, παρασκευά-
ζεται δια της αραιώσεως µετά του διαλύµατος (4.6) πρότυπο διάλυµα
εργασίας S8περιέχον 0.1 µgνηριοµυκίνης ( oléandomycine) ανάml.
Παρασκευάζονται ακολούθως δια διαδοχικών αραιώσεων (1 +1 )δια
της χρήσεως του διαλύµατος (4.6) αι κάτωθι συµπυκνώσεις:
S40,05 µg/ml
S20,025 µg/ml
S10,0125 µg/ml
6.Εκχύλιση
Λαµβάνεται αναλόγως της υποτιθεµένης περιεκτικότητος του
δείγµατος ένα δοκιµαστικό δείγµα 2 έως 10 γραµµαρίων, προστίθενται
10mlτου διαλύµατος (4.7) και ανακινείται επί 30 λεπτά επί της παλλο-
µένης τραπέζης.
Φυγοκεντρείται, λαµβάνεται ένα µέρος υποπολλαπλάσιο του εκχυλί-
σµατος και διαλύεται δια του διαλύµατος (4.6) για να ληφθεί η
υποτιθέµενη συµπύκνωση σε νηριοµυκίνη ( oléandomycine) της τάξεως
των 0,1 µg/ml (= U8).Παρασκευάζονται ακολούθως οι συµπυκνώσεις
U4,U2καιU1δια διαδοχικών αραιώσεων (1 +1 )δια της χρήσεως του
διαλύµατος (4.6).
7.Μέθοδος ποσοτικού προσδιορισµού
7.1Εµβολιασµός του µέσου καλλιεργείας
Εµβολιάζεται εις 60 ºCτο βασικό µέσο καλλιεργείας του προσδιο-
ρισµού (4.2) δια του αιωρήµατος των σπορίων (3.2).
7.2Προετοιµασία των δίσκων
Η διάχυση επί άγαρος λαµβάνει χώρα επί δίσκων οι οποίοι περιέ-
χουν τις 4 συµπυκνώσεις του προτύπου διαλύµατος ( S8,S4,S2,S1)
και τις 4 συµπυκνώσεις εργασίας ( U8,U4,U2,U1).Έκαστος δίσκος1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 27
(1)Οποιοδήποτε µέσο καλλιεργείας του εµπορίου, αναλόγου συνθέσεως και το
οποίο δίδει τα αυτά αποτελέσµατα, είναι δυνατό να χρησιµοποιηθεί.
▼B
πρέπει να περιέχει απαραιτήτως τις 4 συµπυκνώσεις του προτύπου
διαλύµατος και του εκχυλίσµατος.
Για τον σκοπό αυτό εκλέγονται δίσκοι τοιούτων διαστάσεων ώστε
επί του µέσου άγαρος να δύνανται να σχηµατισθούν τουλάχιστον 8
κοιλότητες διαµέτρου 10 έως 13 mm.Υπολογίζεται η ποσότητα του
εµβολιασµένου µέσου καλλιεργείας (7.1), η οποία απαιτείται για
την επίτευξη οµοιοµόρφου καλύψεως πάχους 2 mmπερίπου. Είναι
προτιµότερο να χρησιµοποιούνται σαν δίσκοι επίπεδες υάλινες
πλάκες οι οποίες είναι εφοδιασµένες µετά τελείως επιπέδου
δακτυλίου εξ αλουµινίου ή εκ πλαστικής ύλης διαµέτρου 200 mm
και ύψους 20 mm.
Εισάγονται δια του σιφωνίου εντός των κοιλοτήτων επακριβώς
µετρούµενες ποσότητες διαλύµατος αντιβιοτικού, κυµαινόµενες
µεταξύ 0,10 και 0,15 ml,αναλόγως της διαµέτρου των κοιλοτήτων.
Για κάθε δείγµα, διενεργούνται 4 τουλάχιστον επαναλήψεις της
διαχύσεως µεθ 'εκάστης των συµπυκνώσεων κατά τρόπο ώστε
έκαστος ποσοτικός προσδιορισµός ν 'αποτελεί εκτίµηση προερχο-
µένη εκ 32 ζωνών παρεµποδίσεως.
7.3Επώαση
Οι δίσκοι επωάζουν επί 18 περίπου ώρες σε 28 —30 ºC.
8.Εκτίµηση
Μετριέται η διάµετρος των ζωνών παρεµποδίσεως κατά προτίµηση δια
προβολής. Σηµειούνται οι µετρήσεις επί ηµιλογαριθµικού χάρτου, ο
οποίος δίδει τον λογαριασµό των συµπυκνώσεων ως προς τις διαµέ-
τρους των ζωνών παρεµποδίσεως. Σύρονται οι ευθείες του προτύπου
διαλύµατος και του εκχυλίσµατος. Απουσία αλληλεπιδράσεως, οι δύο
ευθείες πρέπει να είναι παράλληλες.
Ο λογάριθµος της σχετικής δραστικότητος υπολογίζεται δια του
ακολούθου τύπου:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ :0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Πραγµατική δραστικότητα =υποτιθεµένη δραστικότητα ×σχετική
δραστικότητα.
9.Επαναληπτικότητα
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων των διενεργουµένων δύο
παραλλήλων προσδιορισµών επί του αυτού δείγµατος δεν πρέπει να
υπερβαίνει το 10 %σε σχετική τιµή.
4.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΤΥΡΟΖΙΝΗΣ
—δια διαχύσεως επί άγαρος —
1.Αντικείµενο και πεδίο εφαρµογής
Η µέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισµό της τυροζίνης εντός των
ζωοτροφών, των συµπεπυκνωµένων τροφών και των προµιγµάτων. Το
κατώτατο όριο του ποσοτικού προσδιορισµού είναι 2 ppm.
2.Αρχή
Το δείγµα κατεργάζεται δια φωσφορικού ρυθµιστικού διαλύµατος σε
pH 8,πρότερον θερµανθέντος σε 80 ºCκαι υπόκειται ακολούθως σε
εκχύλιση δια µεθανόλης. Κατόπιν φυγοκεντρήσεως, το εκχύλισµα
αραιούται και η αντιβιοτική αυτού δραστικότητα προσδιορίζεται µε
τη µέτρηση της διαχύσεως της τυροζίνης εντός µέσου άγαρος, το
οποίο έχει σπαρθεί µετά του Sarcina lutea .Η διάχυση υποδεικνύεται
δια του σχηµατισµού ζωνών παρεµποδίσεως παρουσία µικροοργανι-
σµού. Η διάµετρος των ζωνών αυτών είναι ευθέως ανάλογη του
λογαρίθµου της συµπυκνώσεως του αντιβιοτικού.1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 28
▼B
3.Μικροοργανισµός: SarcinaluteaATCCNo9341
3.1Συντήρηση του µητρικού υλικού
Εµβολιάζεται ο Sarcina lutea επί επικλινούς άγαρος, εντός
σωλήνος, ληφθησοµένου εκ του µέσου καλλιεργείας (4.1), ρυθµι-
σθέντος εις pH 7,0.Επωάζεται επί µια νύκτα σε 35 ºC,περίπου. Η
καλλιέργεια διατηρείται εντός ψυγείου και επανεµβολιάζεται καθ '
έκαστον µήνα επί επικλινούς άγαρος.
3.2Παρασκευή του αιωρήµατος των βακτηριδίων
Συλλέγονται τα βακτηρίδια εξ ενός σωλήνος επικλινούς άγαρος
(3.1) προσφάτου παρασκευής δια της χρήσεως 2 —3m lφυσιολο-
γικού ορρού (4.4). ∆ια του αιωρήµατος τούτου σπείρεται φιάλη
Rouxπεριέχουσα 250 mlµέσου καλλιεργείας (4.1), ρυθµισθέντος
σεpH 7,0.Επωάζεται επί 24 ώρες σε 35 ºC,συλλέγονται τα βακτη-
ρίδια δια της χρήσεως 25 mlφυσιολογικού ορρού (4.4). Το
αιώρηµα αυτό οµοιογενοποιείται και αραιούται προς επίτευξη
φωτοπερατότητος 75 %περίπου σε 650 nm.
Το αιώρηµα αυτό διατηρούµενο εντός ψυγείου είναι δυνατό να
χρησιµοποιείται επί µια εβδοµάδα.
∆ια προκαταρκτικών δοκιµών επί πλακών µετά του βασικού µέσου
του ποσοτικού προσδιορισµού (4.1), καθορίζεται η ποσότητα του
εµβολίου, η οποία επιτρέπει την επίτευξη για διαφόρους συµπυ-
κνώσεις της χρησιµοποιουµένης τυροζίνης των µεγαλύτερων κατά
το δυνατό ζωνών παρεµποδίσεως οι οποίες παραµένουν ακόµη
καθαρές. Ο εµβολιασµός του µέσου καλλιεργείας λαµβάνει χώρα
σε 48 —5 0º C .
4.Μέσα καλλιεργείας και αντιδραστήρια
4.1Βασικό µέσο προσδιορισµού (1)
Γλυκόζη 1g
Θρυψική πεπτόνη 10 g
Εκχύλισµα κρέατος 1,5 g
Εκχύλισµα µαγιάς µπύρας 3g
Άγαρ, αναλόγως της ποιότητος 1 0—2 0g
Απεσταγµένο ύδωρ 1000 ml
Ρυθµίζεται κατά τη στιγµή της χρησιµοποιήσεως σε pH 7,0για τη
διατήρηση του µητρικού υλικού και την παρασκευή του αιωρή-
µατος των βακτηρίων, και σε pH 2,0για τον προσδιορισµό.
4.2Φωσφορικό ρυθµιστικό διάλυµα, pH8
∆ισόξινο φωσφορικό κάλιο KH2PO4χ.κ. 0,523 g
Μονόξινο φωσφορικό νάτριο K2HPO4χ.κ. 16,730 g
Απεσταγµένο ύδωρ σε 1000 ml
4.3Φωσφορικό ρυθµιστικό διάλυµα, pH7
∆ισόξινο φωσφορικό κάλιο KH2PO4χ.κ. 5,5 g
Μονόξινο φωσφορικό νάτριο K2HPO4χ.κ. 13,6 g
Απεσταγµένο ύδωρ σε 1000 ml
4.4Αποστειρωµένος φυσιολογικός ορρός
4.5Καθαρή µεθανόλη
4.6Μεθανόλη 10 %(κ.ό)1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 29
(1)Οποιοδήποτε µέσο καλλιεργείας του εµπορίου, αναλόγου συνθέσεως και το
οποίο δίδει τα αυτά αποτελέσµατα, είναι δυνατό να χρησιµοποιηθεί.
▼B
4.7Μίγµα φωσφορικού ρυθµιστικού διαλύµατος (4.2) καθαράς µεθα-
νόλης: 60 /40κατ'όγκον.
4.8Πρότυπος ουσία: τυροζίνη γνωστής δραστικότητος.
5.Πρότυπα διαλύµατα
Ξηραίνεται η πρότυπος ουσία (4.8) επί τρεις ώρες σε 60 ºCεντός
ξηραντηρίου κενού (5 mmυδραργύρου). Ζυγίζονται 10 —5 0m g εντός
ογκοµετρικής φιάλης, διαλύονται εντός 5 mlµεθανόλης (4.5) και
αραιούται το διάλυµα δια του φωσφορικού ρυθµιστικού διαλύµατος,
pH 7 (4.3) προς επίτευξη συµπυκνώσεως σε τυροζίνη βάσεως 1000 µg/
ml.
Επί τη βάσει του αρχικού τούτου διαλύµατος δι 'αραιώσεως µετά του
µίγµατος (4.7) παρασκευάζεται πρότυπο διάλυµα εργασίας S8περιέχον
2µgτυροζίνη βάσεως ανά ml.
Παρασκευάζονται ακολούθως δια διαδοχικών αραιώσεων (1 +1 )δια
της χρήσεως του µίγµατος (4.7), οι κάτωθι συµπυκνώσεις:
S41 µg/ml
S20,5 µg/ml
S10,25 µg/ml
6.Εκχύλιση
Για τις συµπυκνωµένες τροφές, λαµβάνεται ποσότητα δείγµατος 10 g.
Για τα προµίγµατα και τις τροφές, ποσότητα δείγµατος 20 g.
Προστίθενται 60 mlφωσφορικού ρυθµιστικού διαλύµατος, pH 8 (4.2),
πρότερον θερµανθέντος σε 80 ºC,και οµοιογενοποιείται επί 2 πρώτα
λεπτά (οικιακός αναµίκτης, Ultra-turrax κλπ.).
Αφήνεται ακολούθως εν ηρεµία επί 10 πρώτα λεπτά, προστίθενται
40mlµεθανόλης (4.5) και οµοιογενοποιείται επί 5 πρώτα λεπτά. Φυγο-
κεντρείται, λαµβάνεται µέρος της ποσότητος του εκχυλίσµατος και
αραιούται δια του µίγµατος (4.7) προς επίτευξη µιας υποτιθεµένης
συµπυκνώσεως σε τυροζίνη 2 µg/ml (= U8).Παρασκευάζονται
ακολούθως οι συµπυκνώσεις U4,U2καιU1δια διαδοχικών αραιώσεων
(1+1 )δια της χρήσεως του µίγµατος (4.7).
Για περιεκτικότητες µικρότερες των 10 ppm,εξατµίζεται το εκχύλισµα
µέχρι ξηρού εντός περιστρεφοµένου εξατµιστού σε 35 ºCκαι
διαλύεται το υπόλειµµα σε µεθανόλη 40 % (4.6).
7.Μεθοδολογία προσδιορισµού
7.1Εµβολιασµός του µέσου καλλιεργείας
Εµβολιάζεται το βασικό µέσον καλλιεργείας (4.1), εις 48 — 50 ºC,
ρυθµισµένο σε pH 8,0,δια του αιωρήµατος των βακτηρίων (3.2).
7.2Προετοιµασία των χώρων
Η διάλυση επί άγαρος πραγµατοποιείται επί δίσκων οι οποίοι
περιέχουν τις 4 συµπυκνώσεις του προτύπου διαλύµατος ( S8,S4,S2,
S1)και τις 4 συµπυκνώσεις του εκχυλίσµατος ( U8,U4,U2,U1).
Έκαστος δίσκος πρέπει να περιέχει απαραιτήτως τις 4 συµπυκνώ-
σεις του προτύπου διαλύµατος και του εκχυλίσµατος.
Για τον σκοπό αυτό εκλέγονται δίσκοι τοιούτων διαστάσεων ώστε
εντός του µέσου άγαρος να δύνανται να σχηµατισθούν τουλάχιστον
8 κοιλότητες διαµέτρου 10 — 13 mm. Υπολογίζεται η ποσότητα
εµβολιασµένου µέσου καλλιεργείας (7.1) η οποία απαιτείται για
την επίτευξη οµοιοµόρφου καλύψεως πάχους 2 mmπερίπου. Είναι
προτιµότερο να χρησιµοποιούνται ως δίσκοι επίπεδες υάλινες
πλάκες οι οποίες είναι εφοδιασµένες µετά τελείως επιπέδου
δακτυλίου εξ αλουµινίου ή εκ πλαστικής ύλης διαµέτρου 200 mm
και ύψους 20 mm.
Εισάγονται δια του σιφωνίου, εντός των κοιλοτήτων, επακριβώς
µετρούµενες ποσότητες διαλύµατος αντιβιοτικού, κυµαινόµενες
µεταξύ 0,10 και 0,15 ml,αναλόγως της διαµέτρου των κοιλοτήτων.
Για κάθε δείγµα διενεργούνται 4 τουλάχιστον επαναλήψεις της
διαχύσεως µεθ 'εκάστης των συµπυκνώσεων, κατά τρόπο ώστε
έκαστος προσδιορισµός να αποτελεί εκτίµηση προερχοµένη εκ 32
ζωνών παρεµποδίσεως.1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 30
▼B
7.3Επώαση
Οι χώροι επωάζονται επί µια νύκτα σε 35 —3 7º C .
8.Εκτίµηση
Μετριέται η διάµετρος των ζωνών παρεµποδίσεως, κατά προτίµηση
δια προβολής. Οι µετρήσεις σηµειούνται επί ηµιλογαριθµικού χάρτου,
ο οποίος δίδει το λογάριθµο των συµπυκνώσεων ως προς τις διαµέ-
τρους των ζωνών παρεµποδίσεως. Σύρονται οι ευθείες του προτύπου
διαλύµατος και του εκχυλίσµατος. Εν απουσία αλληλεπιδράσεως, οι
δύο ευθείες πρέπει να είναι παράλληλες.
Ο λογάριθµος της σχετικής δραστικότητος υπολογίζεται δια του
ακολούθου τύπου:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ :0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Πραγµατική δραστικότητα =υποτιθεµένη δραστικότητα ×σχετική
δραστικότητα.
9.Επαναληπτικότητα
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων των διενεργουµένων δύο
παραλλήλων ποσοτικών προσδιορισµών επί του αυτού δείγµατος δεν
πρέπει να υπερβαίνει το 10 %σε σχετική τιµή.
5.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΝΙΚΟΤΙΑΝΟΜΥΚΙΝΗΣ ( VIRGINIAMY-
CINE)
—δια διαχύσεως επί άγαρος —
1.Αντικείµενο και πεδίο εφαρµογής
Η µέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισµό της νικοτιανοµυκίνης ( virginia-
mycine) εντός των τροφών, των συµπεπυκνωµένων τροφών και των
προµιγµάτων. Το κατώτατο όριο του ποσοτικού προσδιορισµού είναι
2ppm.
2.Αρχή
Το δείγµα υπόκειται σε εκχύλιση δια διαλύµατος µεθανόλης Tween 80.
Κατόπιν φυγοκεντρήσεως ή διηθήσεως, το εκχύλισµα αραιούται και η
αντιοβιοτική αυτού δραστικότητα προσδιορίζεται δια µετρήσεως της
διαχύσεως της νικοτιανοµυκίνης ( virginiamycine) εντός µέσου άγαρος
το οποίο έχει σπαρθεί δια του Sarcina lutea. Η διάχυση υποδεικνύεται
δια του σχηµατισµού ζωνών παρεµποδίσεως παρουσία του µικροοργα-
νισµού. Η διάµετρος των ζωνών αυτών είναι ευθέως ανάλογος του
λογαρίθµου της συµπυκνώσεως του αντιβιοτικού.
3.Μικροοργανισµός: SarcinaluteaATCCNo9341
3.1Συντήρηση του µητρικού υλικού
Εµβολιάζεται ο S. lutea εντός σωλήνος επί επικλινούς άγαρος
ληφθησοµένου εκ του µέσου καλλιεργείας (4.1). Επωάζεται επί
µια νύκτα σε 35 ºCπερίπου. Η καλλιέργεια διατηρείται εντός
ψυγείου και επανεµβολιάζεται κάθε 14 ηµέρες επί επικλινούς
άγαρος.
3.2Παρασκευή του αιωρήµατος βακτηριδίων
Συλλέγονται τα έµβρυα εξ ενός σωλήνος επικλινούς άγαρος (3.1),
προσφάτως παρασκευασθέντος δια της χρήσεως 2 έως 3 mlφυσιο-
λογικού ορρού (4.3). ∆ια του αιωρήµατος αυτού σπείρεται φιάλη
Rouxπεριέχουσα 250 mlµέσου καλλιεργείας (4.1). Επωάζεται επί
24 ώρες εις 35 ºC,συλλέγονται τα βακτηρίδια δια της χρήσεως
25mlφυσιολογικού ορρού (4.3). Το αιώρηµα αυτό οµοιογενο-
ποιείται και αραιούται για την επίτευξη φωτοπερατότητος 75 %
περίπου σε 650 nm.Το αιώρηµα αυτό, το διατηρούµενο εντός
ψυγείου, είναι δυνατό να χρησιµοποιείται για µια εβδοµάδα.
∆ια προκαταρκτικών δοκιµών επί πλακών µετά του βασικού µέσου
του ποσοτικού προσδιορισµού (4.1), καθορίζεται η ποσότητα του1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 31
▼B
εµβολίου η οποία επιτρέπει την επίτευξη, δια διαφόρους συµπυ-
κνώσεις, της χρησιµοποιουµένης virginiamycine, των µεγαλυτέρων
κατά το δυνατό ζωνών παρεµποδίσεως οι οποίες παραµένουν
ακόµη καθαρές. Ο εµβολιασµός της καλλιεργείας λαµβάνει χώρα
σε 48 —5 0º C .
4.Μέσα καλλιεργείας και αντιδραστήρια
4.1Βασικό µέσο του ποσοτικού προσδιορισµού (1)
Γλυκόζη 1g
Θρυψική πεπτόνη 10 g
Εκχύλισµα κρέατος 1,5 g
Εκχύλισµα µαγιάς µπύρας 3g
Άγαρ, αναλόγως της ποιότητος 1 0—2 0g
Απεσταγµένο ύδωρ σε 1000 ml
Ρυθµίζεται προ της χρήσεως εις pH 6,5.
4.2Φωσφορικό ρυθµιστικό διάλυµα, pH6
∆ισόξινο φωσφορικό κάλιο KH2PO4χ.κ. 8,0 g
Μονόξινο φωσφορικό κάλιο K2HPO4χ.κ. 2,0 g
Απεσταγµένο ύδωρ σε 1000 ml
4.3Αποστειρωµένος φυσιολογικός ορρός
4.4Καθαρή µεθανόλη
4.5Μίγµα φωσφορικού ρυθµιστικού διαλύµατος (4.2) καθαράς µεθα-
νόλης: 80 /20κατ'όγκον.
4.6∆ιάλυµα µεθανόλης «Tween 80» 0,5% χ.κ.
4.7Πρότυπος ουσία: νικοτιανοµυκίνης ( virginiamycine) γνωστής
δραστηριότητος.
5.Πρότυπα διαλύµατα
Παρασκευάζεται διάλυµα µεθανόλης της προτύπου ουσίας (4.7)
περιέχον 800 µg virginiamycine ανάml.Εκ του αρχικού τούτου διαλύ-
µατος, παρασκευάζεται δι 'αραιώσεως δια του διαλύµατος (4.5)
πρότυπο διάλυµα εργασίας S8περιέχον 1 µgνικοτιανοµυκίνης ( virginia-
mycine) ανά ml.Παρασκευάζονται ακολούθως δια διαδοχικών
αραιώσεων (1 +1 )δια της χρήσεως του µίγµατος (4.5), οι κάτωθι
συµπυκνώσεις:
S40,5 µg/ml
S20,25 µg/ml
S10,125 µg/ml
6.Εκχύλιση
6.1Προϊόντα των οποίων η περιεκτικότης σε νικοτιανοµυκίνη είναι ίση ή
µικροτέρα των 50 ppm
Λαµβάνεται ποσότητα δείγµατος 10 έως 20 g,προστίθενται 100 ml
διαλύµατος (4.6) και ανακινείται επί 30 πρώτα λεπτά επί παλλο-
µένης τραπέζης. Φυγοκεντρείται ή διηθείται, λαµβάνονται 20 ml
του διαυγούς διαλύµατος και εξατµίζονται µέχρι ξηρού εντός περι-
στρεφοµένου εξατµιστού. ∆ιαλύεται το υπόλειµµα σε 20 mlή
περισσότερα του µίγµατος (4.5) προς επίτευξη υποτιθεµένης
συµπυκνώσεως σε νικοτιανοµυκίνη ( virginiamycine) 1 µg/ml (= U8).
Παρασκευάζονται ακολούθως συµπυκνώσεις U4,U2καιU1δια
διαδοχικών αραιώσεων (1 +1 )δια της χρήσεως του µίγµατος (4.5).1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 32
(1)Οποιοδήποτε µέσο καλλιεργείας του εµπορίου, αναλόγου συνθέσεως και το
οποίο δίδει τα αυτά αποτελέσµατα, είναι δυνατό να χρησιµοποιηθεί.
▼B
6.2Προϊόντα των οποίων η περιεκτικότης σε νικοτιανοµυκίνη ( virginiamy-
cine)είναι ανωτέρα των 50 ppm
Λαµβάνεται ποσότητα δείγµατος 1 έως 10 g,προστίθενται 100 ml
διαλύµατος (4.6) και ανακινείται επί 30 πρώτα λεπτά επί παλλο-
µένης τραπέζης. Φυγοκεντρείται ή διηθείται και αραιούται
ακολούθως δια του µίγµατος (4.5) προς επίτευξη µιας υποτιθέµενης
συµπυκνώσεως εις νικοτιανοµυκίνη 1 µg/ml (= U8).Παρασκευά-
ζονται ακολούθως οι συµπυκνώσεις U4,U2καιU1όπως
υποδεικνύεται εις 6.1.
7.Μεθοδολογία προσδιορισµού
7.1Εµβολιασµός του µέσου καλλιεργείας
Εµβολιάζεται το βασικό µέσο καλλιεργείας (4.1) εις 48 — 50 ºC,
δια του αιωρήµατος των βακτηρίων (3.2).
7.2Προετοιµασία των δίσκων
Η διάχυση επί άγαρος λαµβάνει χώρα επί δίσκων οι οποίοι περιέ-
χουν τις συµπυκνώσεις του προτύπου διαλύµατος ( S8,S4,S2,S1)και
τις 4 συµπυκνώσεις του εκχυλίσµατος ( U8,U4,U2,U1).Έκαστος
δίσκος πρέπει να περιέχει απαραιτήτως τέσσερις (4) συµπυκνώ-
σεις του προτύπου διαλύµατος και του εκχυλίσµατος.
Προς τον σκοπό αυτό εκλέγονται δίσκοι τοιούτων διαστάσεων
ώστε εντός του µέσου άγαρος να δύνανται να σχηµατισθούν τουλά-
χιστον 8 κοιλότητες διαµέτρου 10 έως 13 mm.Υπολογίζεται η
ποσότητα του εµβολιασµένου µέσου καλλιεργείας (7.1) η οποία
απαιτείται για την επίτευξηοµοιοµόρφου καλύψεως πάχους 2 mm
περίπου. Είναι προτιµότερο να χρησιµοποιούνται ως δίσκοι
επίπεδες υάλινες πλάκες οι οποίες είναι εφοδιασµένες µετά
τελείως επιπέδου δακτυλίου εξ αλουµινίου ή εκ πλαστικής ύλης
διαµέτρου 200 mmκαι ύψους 20 mm.
Εισάγονται δια του σιφωνίου, εντός των κοιλοτήτων, επακριβώς
µετρούµενες ποσότητες διαλύµατος αντιβιοτικού, κυµαινόµενες
µεταξύ 0,10 και 0,15 ml,αναλόγως της διαµέτρου των κοιλοτήτων.
Για έκαστο δείγµα διενεργούνται 4 τουλάχιστον επαναλήψεις της
διαχύσεως µεθ 'εκάστης των συµπυκνώσεων, κατά τρόπο ώστε
έκαστος προσδιορισµός να αποτελεί εκτίµηση προερχοµένη εκ 32
ζωνών παρεµποδίσεως.
7.3Επώαση
Επωάζονται οι δίσκοι επί 18 ώρες περίπου εις 28 —3 0º C .
8.Εκτίµηση
Μετριέται η διάµετρος των ζωνών παρεµποδίσεως, κατά προτίµηση
δια προβολής. Οι µετρήσεις σηµειούνται επί ηµιλογαριθµικού χάρτου,
ο οποίος δίδει το λογάριθµο των συµπυκνώσεων ως προς τις διαµέ-
τρους των ζωνών παρεµποδίσεως.
Σύρονται οι ευθείες του προτύπου διαλύµατος και του εκχυλίσµατος.
Εν απουσία αλληλεπιδράσεως, οι δύο ευθείες πρέπει να είναι
παράλληλες.
Ο λογάριθµος της σχετικής δραστικότητος υπολογίζεται µε τον
ακόλουθο τύπο:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ :0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Πραγµατική δραστικότητα =υποτιθεµένη δραστικότητα ×σχετική
δραστικότητα.
9.Επαναληπτικότητα
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων, των διενεργουµένων δύο
παραλλήλων προσδιορισµών επί του αυτού δείγµατος, δεν πρέπει να
υπερβαίνει το 10 %,σε σχετική τιµή.1972L0199 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 33