1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 1
Το έγγραφο αυτό συνιστά βοήθηµα τεκµηρίωσης και δεν δεσµεύει τα κοινοτικά όργανα
►B ΑΠΟΦΑΣΗ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ
της 15ης Ιουλίου 1994
σχετικά µε τις υγειονοµικές προϋποθέσεις και την κτηνιατρική πιστοποίηση για την εισαγωγή
σπέρµατος βοοειδών από τρίτες χώρες
(94/577/ΕΚ)
(ΕΕL 221της 26.8.1994, σ. 26)
Τροποποιείται από:
Επίσηµη Εφηµερίδα
αριθ. σελίδα ηµεροµηνία
►M1Απόφαση 1999 /495/ΕΚ της Επιτροπής της 1ης Ιουλίου 1999 L 192 56 24.7.1999
►M2Απόφαση 2004 /52/ΕΚ της Επιτροπής της 9ης Ιανουαρίου 2004 L 10 67 16.1.2004
▼B
ΑΠΟΦΑΣΗ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ
της 15ης Ιουλίου 1994
σχετικά µε τις υγειονοµικές προϋποθέσεις και την κτηνιατρική
πιστοποίηση για την εισαγωγή σπέρµατος βοοειδών από τρίτες
χώρες
(94/577/ΕΚ)
Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,
Έχοντας υπόψη:
τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Κοινότητας,την οδηγία 88 /407/ΕΟΚ του Συµβουλίου της 14ης Ιουνίου 1988
για τον καθορισµό των απαιτήσεων υγειονοµικού ελέγχου πουισχύουν στις ενδοκοινοτικές συναλλαγές και στις εισαγωγέςσπέρµατος βοοειδών (
1),όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την
οδηγία 93 /60/ΕΟΚ(2),και ιδίως τα άρθρα 10 και 11,
Εκτιµώντας:ότι, βάσει της απόφασης 90 /14/ΕΟΚ της Επιτροπής (
3),όπως
τροποποιήθηκε τελευταία από την απόφαση 91 /276/ΕΟΚ(4),
θεσπίστηκε κατάλογος τρίτων χωρών, εφεξής αναφερόµενος ως
«κατάλογος τρίτων χωρών »,από τις οποίες τα κράτη µέλη
επιτρέπουν την εισαγωγή σπέρµατος εκτρεφόµενων βοοειδών ·
ότι η υγειονοµική κατάσταση στο Ισραήλ έχει ως αποτέλεσµα
τον αποκλεισµό των εισαγωγών από τη χώρα αυτή βάσει τηςαπόφασης 91 /277/ΕΟΚ της Επιτροπής (
5)·
ότι οι αποφάσεις 91 /479/ΕΟΚ(6), 91/549/ ΕΟΚ(7), 92/123/ ΕΟΚ(8),
92/124/ΕΟΚ(9), 92/125/ ΕΟΚ(10), 92/126/ ΕΟΚ(11), 92/127/ ΕΟΚ(12),
92/128/ΕΟΚ(13), 92/386/ ΕΟΚ(14), 92/387/ ΕΟΚ(15)και 92/445/
ΕΟΚ(16)της Επιτροπής, καθορίζουν τις υγειονοµικές προϋποθέ-
σεις και την κτηνιατρική πιστοποίηση για την εισαγωγή βόειουσπέρµατος από τις Ηνωµένες Πολιτείες της Αµερικής, τον
Καναδά, την Πολωνία, τη Φινλανδία, τη Νέα Ζηλανδία, την
Αυστρία, την Ελβετία, τη Σουηδία, την Ουγγαρία, τη Νορβηγίακαι την Τσεχοσλοβακία αντίστοιχα ·
ότι η οδηγία 93 /60/ΕΟΚ, η οποία πρέπει να τεθεί σε ισχύ στα
κράτη µέλη το αργότερο µέχρι την 1η Ιουλίου 1994, τροποποιεί
την οδηγία 88 /407/ΕΟΚ, µε αποτέλεσµα να κρίνεται απαραίτητη
η τροποποίηση των ανωτέρω αποφάσεων σχετικά µε τις τρίτεςχώρες·ότι, για να απλουστευθεί και να διασαφηνιστεί η κοινο-
τική νοµοθεσία σχετικά µε τα θέµατα αυτά, είναι αναγκαίο νασυγκεντρωθούν οι ανωτέρω αποφάσεις σε ένα κείµενο και νακαταργηθούν αυτές που ισχύουν για κάθε χώρα χωριστά ·
ότι, λαµβανοµένων υπόψη των διατάξεων της συµφωνίας για τον
Ευρωπαϊκό Οικονοµικό Χώρο, δεν είναι αναγκαίο να διατηρ-ηθούν τα κτηνιατρικά πιστοποιητικά για τις εισαγωγές1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 2
(1)ΕΕ αριθ. L 194της 22. 7. 1988, σ. 10 .
(2)ΕΕ αριθ. L 186της 28. 7. 1993, σ. 28 .
(3)ΕΕ αριθ. L8της 11. 1. 1990, σ. 71 .
(4)ΕΕ αριθ. L 135της 30. 5. 1991, σ. 58 .
(5)ΕΕ αριθ. L 135της 30. 5. 1991, σ. 60 .
(6)ΕΕ αριθ. L 258της 16. 9. 1991, σ. 1 .
(7)ΕΕ αριθ. L 298της 29. 10. 1991, σ. 6 .
(8)ΕΕ αριθ. L4 8της 22. 2. 1992, σ. 1 .
(9)ΕΕ αριθ. L4 8της 22. 2. 1992, σ. 10 .
(10)ΕΕ αριθ. L4 8της 22. 2. 1992, σ. 19 .
(11)ΕΕ αριθ. L4 8της 22. 2. 1992, σ. 28 .
(12)ΕΕ αριθ. L4 8της 22. 2. 1992, σ. 37 .
(13)ΕΕ αριθ. L4 8της 22. 2. 1992, σ. 46 .
(14)ΕΕ αριθ. L 204της 21. 7. 1992, σ. 13 .
(15)ΕΕ αριθ. L 204της 21. 7. 1992, σ. 22 .
(16)ΕΕ αριθ. L 247της 27. 8. 1992, σ. 1 .
▼B
σπέρµατος βοοειδών από την Αυστρία, Φινλανδία, Νορβηγία και
Σουηδία·
ότι σύµφωνα µε τη γνώµη της επιστηµονικής κτηνιατρικής
επιτροπής, απαιτείται συµπληρωµατική εξέταση για επιζωοτική
αιµορραγική νόσο ·
ότι ο Καναδάς είναι η µόνη χώρα που οι συνήθεις εξετάσεις για
την εν λόγω νόσο γίνονται προ της συλλογής του σπέρµατος ανάεξάµηνο ·ότι, γι'αυτόν το λόγο, είναι ανάγκη να χορηγηθεί µια
µεταβατική περίοδος για τη θέση σε ισχύ της παρούσαςαπόφασης σε ό,τι αφορά τον Καναδά, ώστε οι καναδικές κτηνια-
τρικές αρχές να έχουν αρκετό χρόνο για να εισαγάγουν τις νέες
δοκιµές στο σύνηθες πρόγραµµά τους ·
ότι, εξάλλου, µετά από τις πρόσφατες προόδους όσον αφορά την
κατανόηση της επιδηµιολογίας της νόσου της blue-tongue, µπορεί
πλέον να επιτραπεί η εισαγωγή βόειου σπέρµατος από τηνΑυσταλία ·
ότι, ως φαίνεται, η υγειονοµική κατάσταση των ζώων στις χώρες
του καταλόγου τρίτων χωρών είναι καλή και ελεγχόµενη βάσει
σωστά διαρθρωµένων και οργανωµένων κτηνιατρικών υπηρεσιώνόσον αφορά τις νόσους που µεταδίδονται µε το σπέρµα ·
ότι οι υπεύθυνες κτηνιατρικές αρχές των τρίτων χωρών έχουν
αναλάβει να κοινοποιούν στην Επιτροπή και στα κράτη µέλη,εντός 24ωρών, µε τηλετύπηµα ή τηλεοµοιοτυπία, την επιβε-
βαίωση της εκδήλωσης µιας εκ των νόσων που αναφέρονται
στον κατάλογο Α του διεθνούς γραφείου επιζωοτιών (ΟΙΕ) ήοποιαδήποτε αλλαγή στο πρόγραµµα εµβολιασµών που αφοράοποιαδήποτε εξ αυτών των νόσων ή, εν ευθέτω χρόνω, τηνεµφάνιση νόσων του καταλόγου Β του ΟΙΕ και την οποιαδήποτε
αλλαγή των κανόνων εισαγωγής που αφορούν εκτρεφόµενα ζώα ή
σπέρµα ή έµβρυα των ζώων αυτών ·
ότι οι υπεύθυνες κτηνιατρικές αρχές των χωρών που αναφέρονται
στον κατάλογο των τρίτων χωρών, έχουν αναλάβει ναεποπτεύουν επισήµως την έκδοση των πιστοποιητικών πουαναφέρονται στην παρούσα απόφαση και να µεριµνούν ώστεόλα τα σχετικά πιστοποιητικά, οι παρεκκλίσεις και τα αποτελέ-
σµατα των εργαστηριακών εξετάσεων, στα οποία είναι δυνατόν
να έχει βασιστεί η πιστοποίηση, να παραµένουν σε επίσηµοφάκελο, επί δώδεκα µήνες τουλάχιστον, µετά την αποστολή τουσπέρµατος στο οποίο αναφέρονται ·
ότι οι υπεύθυνες κτηνιατρικές αρχές των τρίτων χωρών έχουν
αναλάβει να εγκρίνουν επισήµως τα κέντρα συλλογής σπέρµατος
για την εξαγωγή βόειου σπέρµατος προς την Ευρωπαϊκή
Κοινότητα, όπως απαιτείται βάσει του άρθρου 9 της οδηγίας 88 /
407/ΕΟΚ·
ότι οι υγειονοµικές προϋποθέσεις και η κτηνιατρική πιστο-
ποίηση πρέπει να προσαρµόζονται ανάλογα µε την κατάστασητης υγείας των ζώων στην αντίστοιχη τρίτη χώρα ·
ότι τα µέτρα που προβλέπονται στην παρούσα απόφαση είναι
σύµφωνα µε τη γνώµη της Μόνιµης Κτηνιατρικής Επιτροπής,
ΕΞΕ∆ΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΑΠΟΦΑΣΗ:
Άρθρο 1
Τα κράτη µέλη επιτρέπουν την εισαγωγή βόειου σπέρµατος το
οποίο πληροί τους όρους που αναφέρονται στα πιστοποιητικάτου µέρους 1 των παραρτηµάτων Α, Β, Γ και ∆ και µόνον απότις τρίτες χώρες που εµφαίνονται στο µέρος 2 των παραρτηµάτωνΑ, Β, Γ και ∆.
Εντούτοις, τα κράτη µέλη επιτρέπουν την εισαγωγή από τον
Καναδά και µέχρι τις 31 ∆εκεµβρίου 1994, σπέρµατος βοοειδών1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 3
▼B
που συλλέχθηκε και υποβλήθηκε σε επεξεργασία σύµφωνα µε
την απόφαση 91 /549/ΕΟΚ.
Άρθρο 2
Οι αποφάσεις 91 /479/ΕΟΚ, 92 /123/ΕΟΚ, 92 /124/ΕΟΚ, 92 /125/
ΕΟΚ, 92 /126/ΕΟΚ, 92 /127/ΕΟΚ, 92 /128/ΕΟΚ, 92 /386/ΕΟΚ, 92 /
387/ΕΟΚ και 92 /445/ΕΟΚ καταργούνται. Η απόφαση 91 /549/
ΕΟΚ καταργείται από την 1η Ιανουαρίου 1995.
Άρθρο 3
Ωστόσο, οι διατάξεις που αφορούν τον Καναδά και αναφέρονται
στο ά ρθρο 1 πρώτο εδάφιο, εφαρµόζονται από την 1η Ιανουαρίου1995.
Άρθρο 4
Η παρούσα απόφαση απευθύνεται στα κράτη µέλη.1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 4
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Α
ΜΕΡΟΣ 1
ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΥΓΕΙΑΣ ΤΩΝ ΖΩΩΝ
για εισαγωγή σπέρµατος βοοειδών
1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 5
▼B
1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 6
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 7
▼M2
ΜΕΡΟΣ 2
Κατάλογος των χωρών οι οποίες επιτρέπεται να χρησιµοποιούν το
υπόδειγµα του κτηνιατρικού πιστοποιητικού του µέρους Ι του παραρτή-
µατος Α
Κωδικός ISO Χώρα Παρατηρήσεις
CH Ελβετία
NZ Νέα Ζηλανδία
RO Ρουµανία
CY Κύπρος (*)
CZ Τσεχική ∆ηµοκρατία (*)
EE Εσθονία (*)
HU Ουγγαρία (*)
LT Λιθουανία (*)
LV Λεττονία (*)
MT Μάλτα (*)
PL Πολωνία (*)
SI Σλοβενία (*)
SK Σλοβακία (*)
(*)Ισχύει µόνον έως ότου το προσχωρούν κράτος γίνει κράτος µέλος της
Κοινότητας.1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 8
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Β
ΜΕΡΟΣ 1
ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΥΓΕΙΑΣ ΤΩΝ ΖΩΩΝ
για εισαγωγή σπέρµατος βοοειδών από τις Ηνωµένες Πολιτείες Αµερικής
1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 9
▼B
1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 10
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 11
▼B
ΜΕΡΟΣ 2
Κατάλογος των χωρών οι οποίες επιτρέπεται να χρησιµοποιούν το
υπόδειγµα του κτηνιατρικού πιστοποιητικού του µέρους 1 του παραρτή-
µατος Β
ΗΝΩΜΕΝΕΣ ΠΟΛΙΤΕΙΕΣ ΤΗΣ ΑΜΕΡΙΚΗΣ1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 12
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Γ
ΜΕΡΟΣ 1
ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΥΓΕΙΑΣ ΤΩΝ ΖΩΩΝ
για εισαγωγή σπέρµατος βοοειδών
1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 13
▼B
1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 14
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 15
▼B
ΜΕΡΟΣ 2
Κατάλογος των χωρών οι οποίες επιτρέπεται να χρησιµοποιούν το
υπόδειγµα του κτηνιατρικού πιστοποιητικού του µέρους 1 του παραρτή-
µατος Γ
ΚΑΝΑ∆ΑΣ Εκτός από την περιφέρεια της κοιλάδας Okanagan της
Βρετανικής Κολοµβίας η οποία ορίζεται ως η περιοχή που
περικλείεται από τη γραµµή που ξεκινά από τα σύνορα
Καναδά/Ηνωµένων Πολιτειών µε γεωγραφικές συντετα-
γµένες 120 º15′γεωγραφικό µήκος, 49 ºγεωγραφικό πλάτος
βορείως έως σηµείο γεωγραφικού µήκους 119 º15′,γεωγρα-
φικού πλάτους 50 º15′βορειοανατολικά έως σηµείο
γεωγραφικού µήκους 119 º, 50º15 ′γεωγραφικού πλάτους
νοτίως έως το σηµείο των συνόρων Καναδά /Ηνωµένων
Πολιτειών µε συντεταγµένες 118 º15′γεωγραφικό µήκος και
49ºγεωγραφικό πλάτος.1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 16
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ∆
ΜΕΡΟΣ 1
ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΥΓΕΙΑΣ ΤΩΝ ΖΩΩΝ
για εισαγωγή σπέρµατος βοοειδών
1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 17
▼B
1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 18
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 19
▼B
ΜΕΡΟΣ 2
Κατάλογος των χωρών οι οποίες επιτρέπεται να χρησιµοποιούν το
υπόδειγµα του κτηνιατρικού πιστοποιητικού του µέρους 1 του παραρτή-
µατος ∆
ΑΥΣΤΡΑΛΙΑ1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 20
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ε
Πρωτόκολλο της παρεµποδιστικής ή ανταγωνιστικής ενζυµατικής ανοσοα-
πορροφητικής µεθόδου δοκιµής Elisaχρησιµοποιώντας ένα κατά οµάδα
ειδικό µονοκλωνικό αντίσωµα για την ανίχνευση αντισωµάτων του ιού
της νόσου bluetongue
Η ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΙΚΗ ΜΕΘΟ∆ΟΣ ELISAΓΙΑ ΤΗ ΝΟΣΟ ΤΗΣ BLUE-
TONGUEΜΕ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ ΜΟΝΟΚΛΩΝΙΚΟΥ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ 3 -
17-Α3
Η µέθοδος είναι ικανή να ανιχνεύσει αντισώµατα όλων των γνωστών
οροτύπων του ιού της νόσου της bluetongue (BTV).
Η αρχή της µεθόδου είναι η διακοπή της αντίδρασης µεταξύ του αντι-
γόνου τους BTVκαι ενός κατά οµάδα ειδικού µονοκλωνικού
αντισώµατος (3 -17-Α3) µε την προσθήκη αραιωµένων διαλυµάτων δοκιµα-
στικού ορού. Τα αντισώµατα του BTVπου υπάρχουν στο δοκιµαστικό ορό
παρεµποδίζουν την ικανότητα αντίδρασης του µονοκλωνικού αντισώ-
µατος (Mad)και προκαλούν µια µείωση στην αναµενόµενη ανάπτυξη
χρώµατος κατά την προσθήκη του ενζυµατικού υποστρώµατος.
ΜΕΣΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ
1.Τρυβλία µικροτιτλοδότησης επίπεδου πυθµένα.
2.Αντιγόνο: παρασκευασµένο όπως περιγράφεται κατωτέρω.
3.Παρεµποδιστικό ρυθµιστικό διάλυµα: 5 %(β/ο) αποξηραµένη σκόνη
γάλακτος «Marvel», 0,1 % ( ο/ο)Tween-20 ( υπό µορφή σιροπίου του
πολυοξυαιθυλενοσορβιτόνιου του µονολαυρικού οξέος) σε PBS.
4.Μονοκλωνικό αντίσωµα: 3 -17-Α3 (υπό µορφή υπερκειµένου ιστοκαλ-
λιέργειας υβριδώµατος) διατηρηµένο στους −20oCή λυοφιλιµένο,
αραιωµένο κατά 1 /50µε παρεµποδιστικό ρυθµιστικό διάλυµα πριν από
τη χρήση, κατά της οµάδας ειδικού πολυπεπτιδίου p7.
5.Συζευκτικό: αντιγλοβουλίνη ποντικού από κόνικλο (απορροφηθείσα
και εκχυλισθείσα) συνεζευγµένη µε υπεροξειδάση αγριοραπανιού και
διατηρούµενη στο σκοτάδι στους 4oC.
6.Υπόστρωµα και χρωµογόνο: 0,2 gmορθοφαινυλενοδιαµίνης ( OPD)
διαλυµένα σε ρυθµιστικό διάλυµα συνιστώµενο από 2,553 gmκιτρικού
οξέος και 4,574 gmδι-υδροορθοφωσφορικού νατρίου συµπληρωµένου
ως τα 500 mlµε απεσταγµένο νερό, διαιρεµένου σε δόσεις των 25 ml
και διατηρούµενο στο σκοτάδι στους −20oC,µε 12µl/25mlυπερο-
ξειδάσης του υδρογόνου (30 %β/ο) να προστίθενται αµέσως πριν από
τη χρήση.
ΝΑ ΧΕΙΡΙΖΕΣΘΕ ΠΡΟΣΕΚΤΙΚΑ ΤΟ OPD — ΝΑ ΦΟΡΟΥΝΤΑΙ
ΓΑΝΤΙΑ —ΠΙΘΑΝΟΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΙΟΓΟΝΟ
7.Ένα γραµµοµόριο θειικού οξέος: 26,6 mlοξεός προστίθενται σε 473,4
mlαπεσταγµένου νερού.
ΥΠΕΝΘΥΜΙΣΗ —ΠΑΝΤΑ ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΟΞΕΟΣ ΣΕ ΝΕΡΟ, ΠΟΤΕ
ΝΕΡΟΥ ΣΕ ΟΞΥ
8.Περιστροφικά παλινδροµούµενος αναδευτήρας.
9.Τρυβλίο ανάγνωσης για Elisa (η δοκιµή µπορεί να αναγνωριστεί
οπτικά).1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 21
▼B
1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 22
▼B
ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ ∆ΟΚΙΜΗΣ
Μάρτυρας αναφοράςΗ σειρά 1 Α -Θ είναι ένας µάρτυρας αναφοράς (τυφλός έλεγχος) απτελού-
µενος από αντιγόνο BTVκαι συζευκτικό. Αυτός µπορεί να
χρησιµοποιηθεί για να ουδετεροποιήσει το τρυβλίο ανάγνωσης ELISA.
Έλεγχος Mab
Η σειρά 2 Α -Θ είναι ο έλεγχος του µονοκλωνικού αντισώµατος και
αποτελείται από αντιγόνο BTV,µονοκλωνικό αντίσωµα και συζευκτικό.
Αυτός αντιπροσωπεύει ένα αρνητικό έλεγχο. Ο µέσος των αναγνωζό-
µενων τιµών οπτικής πυκνότητας από αυτήν τη σειρά ελέγχου
αντιπροσωπεύει το 0 %επίπεδο παρεµπόδισης.
Θετικός έλεγχοςΗ σειρά 3 Α -Θ είναι ο θετικός έλεγχος. Αυτός αποτελείται από αντιγόνο
BTV,αραιωµένα διαλύµατα θετικού αντιορού, Mabκαι συζευκτικό. Αυτός
περιλαµβάνεται σαν ένας δείκτης ότι η δοκιµή λειτουργεί κανονικά και
ότι παρόµοια επίπεδα παρεµπόδισης πρέπει να παραληφθούν από δοκιµή
σε δοκιµή.
∆οκιµαστικός ορόςΣτο ανωτέρω σχέδιο δοκιµής, 18 οροί µπορούν να εξεταστούν σε λόγους
αραίωσης 1 /4, 1/8και 1/16.Αυτό θα δώσει κάποια ένδειξη του τίτλου του
αντισώµατος στο δοκιµαστικό ορό. Το εύρος αραίωσης µπορεί να
επεκταθεί περαιτέρω για να αποκτηθούν τίτλοι αραίωσης ορού τελικού
σηµείου. Εναλλακτικά, για ορολογικές µελέτες µεγάλης κλίµακας, ο
ορός θα µπορούσε να εξεταστεί σε µία µόνο αραίωση (1 /2και 1/4)σαν
µία γρήγορη δοκιµή διαχωρισµού.
∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ
1.Αραιώνεται αντιγόνο BTVσε προτιτλοδοτηµένη συγκέντρωση σε PBS,
υπερηχείται σύντοµα για να διασπαρούν συσπειρωµένα σωµατίδια ιού
(εάν δεν υπάρχει υπερηχητής, γίνεται ζωηρός σιφωνισµός) και
προστίθεται 50µ lσε όλες τις κοιλότητες του τρυβλίου ELISA.Οι
πλευρές του τρυβλίου κτυπούνται ελαφρά για να διασκορπιστεί το
αντιγόνο.
2.Επώαση στους 37
oCεπί 60 λεπτά πάνω σε περιστροφικό αναδευτήρα.
Τα τρυβλία πλένονται τρεις φορές υπερχειλίζοντας και αδειάζοντας
τις κοιλότητες µε µη αποστειρωµένο PBSκαι αποστύπτονται σε απορ-
ροφητικό χαρτί.
3.Προστίθενται 50 µ lπαρεµποδιστικού ρυθµιστικού διαλύµατος ανά
κοιλότητα. Προστίθεται δοκιµαστικός ορός και θετικός ορός στις
κατάλληλες κοιλότητες και αραιώνεται κατά µήκος του τρυβλίου
χρησιµοποιώντας ένα σιφώνιο πολλών διαύλων. ∆εν προστίθεται ορός
στο µάρτυρα αναφοράς ή τον έλεγχο Mab.
4.Αµέσως µετά την προσθήκη του δοκιµαστικού ορού, αραιώνεται το
Mabσε παρεµποδιστικό ρυθµιστικό διάλυµα (σε προτιτλοδοτηµένη
αραίωση) και προστίθενται 50 µ lσε όλες τις κοιλότητες του τρυβλίου
εκτός από το µάρτυρα αναφοράς.
5.Επώαση στους 37oCεπί 60 λεπτά πάνω σε περιστροφικό αναδευτήρα.
Έκπλυση τρεις φορές µε PBSκαι απόστυψη.
6.Αραίωση συµπυκνώµατος αντιποντικού από κόνικλο σε 1 /5000σε
ρυθµιστικό διάλυµα παρεµπόδισης και προσθήκη 50 µ lσε όλες τις
κοιλότητες του τρυβλίου.
7.Επώαση στους 37oCεπί 60 λεπτά πάνω σε περιστροφικό αναδευτήρα.
Έκπλυση τρεις φορές µε PBSκαι απόστυψη.
8.ΤοOPDαποψύχεται και αµέσως πριν από τη χρήση προστίθενται 12 µ l
30 %υπεροξειδίου του υδρογόνου σε κάθε 25 ml OPD. Προστίθενται
50 µlσε όλες τις κοιλότητες του τρυβλίου. Αφήνεται να αναπτυχθεί
το χρώµα επί 10 περίπου λεπτά και η αντίδραση διακόπτεται µε 1 Μ
θειικού οξέος (50 µ lανά κοιλότητα). Το χρώµα πρέπει να αναπτυχθεί
στις κοιλότητες ελέγχου Mabκαι σε αυτές τις κοιλότητες που περιέ-
χουν ορό χωρίς κανένα αντίσωµα του BTV.
9.Εξετάζονται τα τρυβλία και µετρούνται τα αποτελέσµατα είτε οπτικά
είτε χρησιµοποιώντας φασµατοφωτοµετρικό αναγνωστήρα.
ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
Υπολογίζεται ο µέσος των µετρήσεων OD (απορρόφησης) από τους ελέγ-
χουςMab.Αυτός αντιπροσωπεύει το 0 %επίπεδο παρεµπόδισης. Οι1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 23
▼B
µετρήσεις οπτικής πυκνότητας του δοκιµαστικού ορού εκφράζονται σαν
ποσοστό τιµής παρεµπόδισης χρησιµοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση:
Ποσοστ´ο τιµής παρεµπ ´οδισης ¼100/C0DOµε παρουσία δοκιµαστικού ορού
DOµε απουσία δοκιµαστικού ορού/C2100
Τιµές παρεµπόδισης µεγαλύτερες από 40 %σε µία αραίωση ορού κατά 1 /
4θεωρούνται θετικές. Η οπτική ανάγνωση είναι δυνατή καθώς παρεµπό-
διση 40%είναι η χαµηλότερη τιµή εύκολα διακρινόµενη µε γυµνό µάτι.1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 24
▼B
ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ ΓΙΑ ∆ΟΚΙΜΗ ELISA BTV
1.Εκπλύονται 10 σειρές συνενωµένων κυττάρων ΒΗΚ -21τρεις φορές
µε µέσο Eagleελεύθερο ορού και µολύνονται µε ορότυπο 1 του ιού
της γαγγραινώδους κόρυζας µε µέσο Eagleορού.
2.Επωάζονται στους 37oCκαι εξετάζονται καθηµερινά για κυτοπαθολο-
γικό σύµπτωµα (ΚΠΣ).
3.Όταν το ΚΠΣ έχει φανεί στο 80 —9 0% της κυτταρικής στρώσης
κάθε σειράς, ο ιός συλλέγεται µε δόνηση κάθε ακινητοποιηµένου
κυττάρου από γυαλί.
4.Φυγοκέντρηση στις 2 000-3 000 rpm προς ιζηµατοποίηση των
κυττάρων.
5.Το υπερκείµενο απορρίπτεται και τα κύτταρα επαναιωρούνται σε
περίπου 30 ml PBSπου περιέχει 1 % «Sarkosyl» και 2mlφαινυλοµεθυ-
λοσουλφονυλοφθορίδιο (ρυθµιστικό διάλυµα λύσης). Αυτό µπορεί να
κάνει τα κύτταρα να σχηµατίσουν ένα πήγµα και περισσότερο ρυθµι-
στικό διάλυµα λύσης µπορεί να προστεθεί για να µειώσει το
φαινόµενο αυτό.
Προσοχή: το φαινυλοµεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο είναι επικίνδυνο.
Να χρησιµοποιείται µε εξαιρετική προσοχή.
6.Τα κύτταρα αποκόπτονται επί 60 δευτερόλεπτα χρησιµοποιώντας
στέλεχος υπερηχητή µε πλάτος 30 µικρών.
7.Φυγοκέντρηση στις 10000rpm επί 10 λεπτά.
8.Το υπερκείµενο αποθηκεύεται στους +4oCκαι το εναποµείναν
κυτταρικό ίζηµα επαναιωρείται σε 10 -20 mlρυθµιστικού διαλύµατος
λύσης.
9.Υπερήχηση και διαύγαση, διατηρώντας το υπερκείµενο σε κάθε
στάδιο, τρεις φορές συνολικά.
10.Τα υπερκείµενα συγκεντρώνονται και φυγοκεντρούνται στις 24000rpm
επί 120 λεπτά στους +4oCπάνω από ένα στρώµα 5 ml 40 %
σουκρόζης (β /οσ εPBS)χρησιµοποιώντας σωλήνες φυγόκεντρου
Beckmann των 30mlκαι κινητήρα SW 38.
11.Το υπερκείµενο απορρίπτεται, οι σωλήνες στεγνώνονται εντελώς και
το ίζηµα επαναιωρείται σε PBSµε υπερήχηση. Το αντιγόνο διατη-
ρείται σε επιµέρους δόσεις στους −7 0oC.
ΤΙΤΛΟ∆ΟΤΗΣΗ ΤΟΥ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ BTVΓΙΑELISA
Αντιγόνο ιού γαγγραινώδους κόρυζας για ELISAτιτλοδοτείται µε την
έµµεση ELISA. ∆ιπλασιαζόµενες αραιώσεις τους αντιγόνου τιτλοδο-
τούνται εναντίον µιας σταθερής αραίωσης (1 /50)του µονοκλωνικού
αντισώµατος 3 -17-Α3. Το πρωτόκολλο έχει ως εξής:
∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ
1.Αραιώνεται αντιγόνο BTVσεPBSκατά µήκος του τρυβλίου µικροτι-
τλοδότησης σε σειρά διπλασιαζόµενης αραίωσης (50µ l/κοιλότητα)
χρησιµοποιώντας σιφώνιο πολλών διαύλων.
2.Επώαση επί µία ώρα στους 37oCπάνω σε περιοστροφικό αναδευτήρα.
3.Τα τρυβλία εκπλύονται τρεις φορές µε PBS.
4.Προστίθενται 50 µ lµονοκλωνικού αντισώµατος 3 -17-Α3 (αραιωµένου
κατά 1/50)σε κάθε κοιλότητα του τρυβλίου µικροτιτλοδότησης.
5.Επώαση επί µία ώρα στους 37oCπάνω σε περιστροφικό αναδευτήρα.
6.Τα τρυβλία εκπλύονται τρεις φορές µε PBS.
7.Προστίθενται 50 µ lαντιγλοβουλίνης ποντικού από κόνικλο συνεζευ-
γµένη µε υπεροξειδάση αγριοραπανιού, αραιωµένη σε µία
προτιτλοδοτηµένη βέλτιστη συγκέντρωση, σε κάθε κοιλότητα του
τρυβλίου µικροτιτλοδότησης.
8.Επώαση επί µία ώρα στους 37oCπάνω σε περιστροφικό αναδευτήρα.
9.Προστίθεται χρωµογόνο και υπόστρωµα όπως περιγράφηκε προηγού-
µενα. Η αντίδραση διακόπτεται µετά από 10 λεπτά µε τη προσθήκη 1
γραµµοµόριου θειικού οξέος (50 µ l/κοιλότητα).
Κατά την ανταγωνιστική µέθοδο, το µονοκλωνικό αντίσωµα πρέπει να
πλεονάζει, για αυτό επιλέγεται µία αραίωση του αντιγόνου που βρίσκεται
πάνω σε καµπύλη τιτλοδότησης (όχι στη περιοχή οριζοντιοποίησης) που
δίνει περίπου 0.80 ODµετά από 10 λεπτά.1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 25
▼B
Πρωτόκολλο της δοκιµής ανασοδιάχυσης σε αγάρ αγάρ για την ανίχνευση
αντισωµάτων της επιζωοτικής αιµορραγικής νόσου
Η δοκιµή ανασοδιάχυσης σε αγάρ αγάρ διεξάγεται σύµφωνα µε το
ακόλουθο πρωτόκολλο:
ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ
1.Αντιγόνο
Το καθιζάνον αντιγόνο παρασκευάζεται σε οποιοδήποτε σύστηµα
κυτταροκαλλιέργειας που ευνοεί την ταχεία ανάπτυξη του(των)
κατάλληλου(ων) οροτύπυ(ων) του ιού της επιζωοτικής αιµορραγικής
νόσου. Συνιστάται η χρήση κυττάρων ΒΗΚ ή Vero.Το αντιγόνο
υπάρχει στο υπερπλέον υγρό µετά το πέρας της ανάπτυξης του ιού,
αλλά απαιτείται σπειροειδής συγκέντρωση 50 -100για να υπάρξει
αποτέλεσµα. Αυτό είναι δυνατόν να επιτευχθεί µε οποιαδήποτε διαδι-
κασία σταθερής πρωτεϊνικής συγκέντρωσης ·ο ιός που εµπεριέχεται
στο αντιγόνο µπορεί να αδρανοποιηθεί µε την προσθήκη 0,3 %β-
προπιολακτόνης.
2.Γνωστός θετικός όρος ελέγχου
Χρησιµοποιώντας διεθνή ορό αναφοράς και αντιγόνο παράγεται
εθνικός ορός πρότυπο, ο οποίος τυποποιείται ως η πλέον κατάλληλη
αναλογία σε σύγκριση µε το διεθνή ορό αναφορά, αφού υποβληθεί σε
ξηρά ψύξη και χρησιµοποιείται ως γνωστός ορός ελέγχου σε κάθε
δοκιµή.
3.Υπό δοκιµή ορός
∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ
1.Παρασκευάζεται διάλυµα 1 %αγαρόζης σε ρυθµιστικό διάλυµα
βορικού άλατος ή άλατος βαρβιτόλης, µε pH 8,5έως 9 και στη συνέ-
χεια εγχύεται σε τρυβλίο petriµε ελάχιστο βάθος 3,0 mm.
2.Χαράσσεται στο αγάρ αγάρ για την εκτέλεση της δοκιµής, σχέδιο
επτά κοιλοτήτων απαλλαγµένων υγρασίας, εκάστη των οποίων έχει
διάµετρο 5,0 mm.Το σχέδιο αποτελείται από µία κεντρική κοιλότητα
και έξι κοιλότητες περιφερειακά τοποθετηµένες γύρω από την
κεντρική σε κύκλο ακτίνας 3 mm.
3.Γεµίζουµε την κεντρική κοιλότητα µε το αντιγόνο πρότυπο. Τις περι-
φερειακές κοιλότητες 2, 4και 6 τις γεµίζουµε µε το γνωστό θετικό
ορό, τις κοιλότητες 1, 3 και 5 τις γεµίζουµε µε τον υπό δοκιµή ορό.
4.Το σύστηµα υποβάλλεται σε επώαση για χρονικό διάστηµα 72 ωρών,
σε θερµοκρασία δωµατίου, σε κλειστό υγρό θάλαµο.
ΕΡΜΗΝΕΙΑ
Ένας ορός υπό δοκιµή είναι θετικός όταν σχηµατίζει µια ειδική γραµµή
ιζήµατος µε το αντιγόνο και όταν σχηµατίζει πλήρη γραµµή ταυτο-
ποίησης µε τον ορό ελέγχου. Ένας ορός υπό δοκιµή είναι αρνητικός
όταν δεν σχηµατίζει την ειδική γραµµή ιζήµατος µε το αντιγόνο και
όταν δεν κάµπτει τη γραµµή του ορού ελέγχου. Τα τρυβλία petriπρέπει
να εξετάζονται πάνω σε σκοτεινό φόντο και να χρησιµοποιείται έµµεσος
φωτισµός.1994D0577 — EL — 19.01.2004 — 002.001 — 26