1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—1
Το έγγραφο αυτό συνιστά βοήθηµα τεκµηρίωσης και δεν δεσµεύει τα κοινοτικά όργανα
►B ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ (ΕΟΚ) αριθ. 2568/91ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ
της 11ης Ιουλίου 1991
σχετικά µε τον προσδιορισµό των χαρακτηριστικών των ελαιολάδων και των πυρηνελαίων
καθώς και µε τις µεθόδους προσδιορισµού
(ΕΕL248 της 5.9.1991, σ. 1)
Τροποποιείται από:
Επίσηµη Εφηµερίδα
αριθ. σελίδα ηµεροµηνία
►M1 Κανονισµός(ΕΟΚ) αριθ.3682/91 της Επιτροπής της 17ης ∆εκεµ-
βρίου 1991L349 36 18.12.1991
►M2 Κανονισµός(ΕΟΚ) αριθ.1429/92 της Επιτροπής της 26ης Μαΐου
1992L150 17 2.6.1992
►M3 Κανονισµός(ΕΟΚ) αριθ. 1683 /92της Επιτροπής της 29ης Ιουνίου
1992L176 27 30.6.1992
►M4 Κανονισµός(ΕΟΚ) αριθ. 1996 /92της Επιτροπής της 15ης Ιουλίου
1992L199 18 18.7.1992
►M5 Κανονισµός(ΕΟΚ) αριθ. 3288 /92της Επιτροπής της 12ης Νοεµ-
βρίου 1992L327 28 13.11.1992
►M6 Κανονισµός(ΕΟΚ) αριθ. 183/93της Επιτροπής της 29ης Ιανουα-
ρίου 1993L22 58 30.1.1993
►M7 όπως τροποποιήθηκε από τον κανονισµό (ΕΟΚ) αριθ.826/93 της
Επιτροπής της 6ης Απριλίου 1993L87 6 7.4.1993
►M8 Κανονισµός(ΕΟΚ) αριθ.620/93 της Επιτροπής της 17ης Μαρτίου
1993L66 29 18.3.1993
►M9 Κανονισµός(ΕΚ) αριθ.177/94 της Επιτροπής της 28ης Ιανουαρίου
1994L24 33 29.1.1994
►M10 Κανονισµός(ΕΚ) αριθ.2632/94 της Επιτροπής της 28ης Οκτω-
βρίου 1994L280 43 29.10.1994
►M11 Κανονισµός(ΕΚ) αριθ. 656/95της Επιτροπής της 28ης Μαρτίου
1995L69 1 29.3.1995
►M12 Κανονισµός(ΕΚ) αριθ.2527/95 της Επιτροπής της 27ης Οκτω-
βρίου 1995L258 49 28.10.1995
►M13 Κανονισµός(ΕΚ) αριθ. 2472/97της Επιτροπής της 11ης ∆εκεµ-
βρίου 1997L341 25 12.12.1997
►M14 Κανονισµός(ΕΚ) αριθ.282/98 της Επιτροπής της 3ης Φεβρουα-
ρίου 1998L28 5 4.2.1998
►M15 Κανονισµός(ΕΚ) αριθ.2248/98 της Επιτροπής της 19ης Οκτω-
βρίου 1998L282 55 20.10.1998
►M16 Κανονισµός(ΕΚ) αριθ.379/1999 της Επιτροπής της 19ης Φεβρουα-
ρίου 1999L46 15 20.2.1999
►M17 Κανονισµός(ΕΚ) αριθ. 455/2001 της Επιτροπής της 6ης Μαρτίου
2001L65 9 7.3.2001
►M18 Κανονισµός(ΕΚ) αριθ. 2042/2001 της Επιτροπής της 18ης Οκτω-
βρίου 2001L276 8 19.10.2001
1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—2
►M19 Κανονισµός(ΕΚ) αριθ. 796/2002 της Επιτροπής της 6ης Μαΐου
2002L128 8 15.5.2002
∆ιορθώνεται από:
►C1 ∆ιορθωτικό ΕΕL108 της 25.4.1992, σ. 57 (2568 /91)
►C2 ∆ιορθωτικό ΕΕL176 της 20.7.1993, σ. 26 (183 /93)
▼B
ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ (ΕΟΚ) αριθ. 2568/91ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ
της 11ης Ιουλίου 1991
σχετικά µε τον προσδιορισµό των χαρακτηριστικών των
ελαιολάδων και των πυρηνελαίων καθώς και µε τις µεθόδους
προσδιορισµού
Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,
Έχοντας υπόψη:
τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Οικονοµικής
Κοινότητας,
τον κανονισµό αριθ. 136/66/ ΕΟΚ του Συµβουλίου της 22ας
Σεπτεµβρίου 1966 περί δηµουργίας κοινής οργανώσεως αγοράςστον τοµέα των λιπαρών ουσιών (
1),όπως τροποποιήθηκε τελευ-
ταία από τον κανονισµό (ΕΟΚ) αριθ. 3577/90(2),και ιδίως το
άρθρο 35α,
Εκτιµώντας:
ότι στο παράρτηµα του κανονισµού αριθ. 136/66/ ΕΟΚ προβλέ-
πονται η περιγραφή και ο ορισµός των ελαιολάδων και τωνπυρηνελαίων που διατίθενται στο εµπόριο στο εσωτερικό κάθε
κράτους µέλους, καθώς και όσον αφορά τις ενδοκοινοτικές
συναλλαγές και τις συναλλαγές µε τις τρίτες χώρες ·
ότι, για να καταστεί δυνατός ο διαχωρισµός µεταξύ των διαφόρων
τύπων ελαίου, θα πρέπει να καθοριστούν τα φυσικοχηµικάχαρακτηριστικά κάθε ελαίου, καθώς και τα οργανοληπτικάχαρακτηριστικά των παρθένων ελαίων, κατά τρόπο που να διασ-φολίζεται η γνησιότητα και η ποιότητα των εν λόγω προϊόντων,
µε την επιφύλαξη των υπολοίπων διατάξεων, οι οποίες αφορούν
αυτό το θέµα·
ότι θα πρέπει να προσδιοριστούν κατά ενιαίο τρόπο σε
ολόκληρη την Κοινότητα τα χαρακτηριστικά των διαφόρων
τύπων ελαίου·ότι, προς το σκοπό αυτό, θα πρέπει να καθορι-
στούν οι µέθοδοι, χηµικής ανάλυσης και οργανοληπτικήςαξιολόγησης στην Κοινότητα ·ότι θα πρέπει, εντούτοις, να
επιτραπεί κατά τη διάρκεια µεταβατικής περιόδου η χρησιµο-
ποίηση άλλων µεθόδων ανάλυσης που εφαρµόζονται στα κράτη
µέλη, προβλέποντας παράλληλα ότι, σε περίπτωση που τα αποτε-λέσµατα παρουσιάζουν διαφορές, θα είναι καθοριστικά τααποτελέσµατα που έχουν ληφθεί µε βάση την ενιαία µέθοδο ·
ότι ο προσδιορισµός των φυσικοχηµικών χαρακτηριστικών του
ελαιολάδου και των µεθόδων ανάλυσης οδηγεί στην προσαρµογήτων συµπληρωµατικών επεξηγήσεων του κεφαλαίου 15 τηςσυνδυασµένης ονοµατολογίας ·
ότι στην µέθοδο αξιολόγησης των οργανοληπτικών χαρακτηρι-
στικών των παρθένων ελαίων περιλαµβάνεται η συγκρότηση
οµάδος δοκιµαστών που έχουν επιλεγεί και εξασκηθεί ειδικά γι '
αυτό·ότι είναι, εποµένως, σκόπιµο να προβλεφθεί η προθεσµία η
αναγκαία για την δηµιουργία µιας τέτοιας υποδοµής ·ότι, λαµβα-
νοµένων υπόψη των δυσκολιών που θα συναντήσουν ορισµένακράτη µέλη για την συγκρότηση οµάδων δοκιµαστών, είναισκόπιµο να δοθεί άδεια να καταφεύγουν στις υπάρχουσες οµάδες
άλλων κρατών µελλών ·
ότι, για να εξασφαλιστεί η ορθή λειτουργία του συστήµατος των
εισφορών που εφαρµόζονται κατά την εισαγωγή των ελαιοπυ-
ρήνων είναι σκόπιµο να προβλεφθεί µια ενιαία µέθοδος για τονκαθορισµό της περιεκτικότητας σε έλαιο των εν λόγω προϊόντων ·
ότι, για να µην προκληθεί ζηµιά στο εµπόριο, είναι σκόπιµο να
προβλεφθεί µια περιορισµένη περίοδος για την διάθεση του1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—3
(1)ΕΕ αριθ.L172 της 30. 9. 1966, σ. 3025 /66.
(2)ΕΕ αριθ.L353 της 17. 12. 1990, σ. 23 .
▼B
τυποποιηµένου ελαιολάδου πρό της ενάρξεως του παρόντος
κανονισµού·
ότι είναι σκόπιµο να καταργηθεί ο κανονισµός (ΕΟΚ) αριθ. 1058/
77της Επιτροπής(1),όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον
κανονισµό (ΕΟΚ) αριθ. 1858/88(2)·
ότι η Επιτροπή ∆ιαχείρισης Λιπαρών Ουσιών δεν διατύπωσε
γνώµη εντός της ταχθείσας προδεσµίας,
ΕΞΕ∆ΩΣΕ ΤΟΝ ΠΑΡΟΝΤΑ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟ:
Άρθρο 1
1. Θεωρούνται παρθένα ελαιόλαδα, κατά την έννοια του
σηµείου 1 στοιχεία α), β) και γ) του παραρτήµατος του κανονι-
σµού αριθ.136/66/ ΕΟΚ, τα έλαια των οποίων τα χαρακτηριστικά
είναι σύµφωνα µε εκείνα που αναφέρονται στο παράρτηµα I
σηµεία 1, 2 και 3 του παρόντος κανονισµού.
2. Θεωρείται µειονεκτικό παρθένο έλαιόλαδο, κατά την έννοια
του σηµείου 1 στοιχείο δ) του παραρτήµατος του κανονισµούαριθ.136/66/ ΕΟΚ, το ελαιόλαδο του οποίου τα χαρακτηριστικά
είναι σύµφωνα µε εκείνα που αναφέρονται στο παράρτηµα I
σηµείο 4 του παρόντος κανονισµού.
3. Θεωρείται εξευγενισµένο ελαιόλαδο, κατά την έννοια του
σηµείου 2 του παραρτήµατος του κανονισµού αριθ. 136/66/ ΕΟΚ,
το έλαιο του οποίου τα χαρακτηριστικά είναι σύµφωνα µε εκείνα
που αναφέρονται στο παράρτηµα Iσηµείο 5 του παρόντος κανο-
νισµού.
4. Θεωρείται ελαιόλαδο, κατά την έννοια του σηµείου 3 του
παραρτήµατος του κανονισµού 136 /66/ΕΟΚ, το έλαιο του οποίου
τα χαρακτηριστικά είναι σύµφωνα µε εκείνα που αναφέρονταιστο παράρτηµαIσηµείο 6 του παρόντος κανονισµού.
5. Θεωρείται ακατέργαστο πυρηνέλαιο ελιάς, κατά την έννοια
του σηµείου 4 του παραρτήµατος του κανονισµού αριθ. 136/66/
ΕΟΚ, το πυρηνέλαιο του οποίου τα χαρακτηριστικά είναισύµφωνα µε εκείνα που αναφέρονται στο παράρτηµα Iσηµείο 7
του παρόντος κανονισµού.
6. Θεωρείται εξευγενισµένο πυρηνέλαιο, κατά την έννοια του
σηµείου 5 του παραρτήµατος του κανονισµού αριθ. 136/66/ ΕΟΚ,
το πυρηνέλαιο του οποίου τα χαρακτηριστικά είναι σύµφωνα µεεκείνα που αναφέρονται στο παράρτηµα Iσηµείο 8 του παρόντος
κανονισµού.
7. Θεωρείται πυρηνέλαιο κατά την έννοια του σηµείου 6 του
παραρτήµατος του κανονισµού αριθ. 136/66/ ΕΟΚ, το έλαιο του
οποίου τα χαρακτηριστικά είναι σύµφωνα µε εκείνα που αναφέ-ρονται στο παράρτηµα Iσηµείο 9 του παρόντος κανονισµού.
8. Ωστόσο, για τις ►
M18 περιόδους εµπορίας 1998 /1999 έως
2002/2003◄,θεωρούνται επίσης ως παρθένα ελαιόλαδα, κατά
την έννοια του σηµείου 1α) β), γ) ή δ) του παραρτήµατος τουκανονισµού αριθ. 136/66/ ΕΟΚ, τα χύδην ή σε άµεση συσκευασία
για άµεση χρήση ελαιόλαδα καθαρού περιεχόµενου ίσου ή
ανώτερου των 100 χιλιογράµµων, τα οποία κατάγονται καθ '
ολοκληρίαν από το Μαρόκο, των οποίων τα χαρακτηριστικάείναι, αντίστοιχα, σύµφωνα προς εκείνα που προσδιορίζονταιστο παράρτηµα Ι σηµεία 1, 2, 3 και 4 του παρόντος κανονισµού
και, κατά παρέκκλιση των παραγράφων 1 και 2, των οποίων η
περιεκτικότητα σε λινολενικό οξύ ανέρχεται κατ 'ανώτατο όριο
σε 1,0%.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—4
(1)ΕΕ αριθ.L128 της 24. 5. 1977, σ. 6 .
(2)ΕΕ αριθ.L166 της 1. 7. 1988, σ. 10 .▼M15
▼B
Άρθρο 2
1. Ο προσδιορισµός των χαρακτηριστικών των ελαίων που
προβλέπονται στο παράρτηµα Iτου παρόντος κανονισµού
πραγµατοποιείται σύµφωνα µε τις εξής µεθόδους ανάλυσης:
—για τον προσδιορισµό των ελευθέρων λιπαρών οξέων, εκπεφ-
ρασµένων σε ποσοστό ελαϊκού οξέος, η µέθοδος πουαναφέρεται στο παράρτηµα II,
—για τον προσδιορισµό του αριθµού υπεροξειδίων, η µέθοδος
που αναφέρεται στο παράρτηµα III,
—για τον προσδιορισµό της περιεκτικότητας σε κηρούς, η
µέθοδος που αναφέρεται στο παράρτηµα IV,
—για τον προσδιορισµό των στερολών, η µέθοδος που αναφέ-
ρεται στο παράρτηµα V,
—για τον προσδιορισµό της ερυθροδιόλης, η µέθοδος που
αναφέρεται στο παράρτηµα VI,
—για τον προσδιορισµό των κεκορεσµένων λιπαρών οξεών στη
θέση 2 των τριγλυκεριδίων, η µέθοδος που αναφέρεται στοπαράρτηµαVII,
—για τον προσδιορισµό της συνθέσεως των τριγλυκεριδίων, η
µέθοδος που αναφέρεται στο παράρτηµα VIII,
—για την φασµατοφωτοµετρική ανάλυση, η µέθοδος που αναφέ-
ρεται στο παράρτηµα IX,
—για τον προσδιορισµό της συνθέσεως των λιπαρών οξέων, η
µέθοδος που αναφέρεται στα παραρτήµατα Α και Β.
—για τον προσδιορισµό των αλογονοµένων πτητικών υδρογονα-
νθράκων, η µέθοδος που αναφέρεται στο παράρτηµα XI,
—για την αξιολόγηση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών
των παρθένων ελαιολάδων, η µέθοδος που αναφέρεται στοπαράρτηµαXII,που εφαρµόζεται σύµφωνα µε την παράγραφο
2,
—για την δοκιµή του έξευγενισµού, η µέθοδος που αναφέρεται
στο παράρτηµαXIII,
—για τον προσδιορισµό των στιγµασταδιενίων, η µέθοδος που
αναφέρεται στο παράρτηµα XVII,
—για τον προσδιορισµό της συνθέσεως των τριγλυκεριδίων σε
ECN42, η µέθοδος που αναφέρεται στο παράρτηµα XVIII,
—για τον προσδιορισµό του περιεχοµένου σε αλειφατικές
αλκοόλες, η µέθοδος που αναφέρεται στο παράρτηµα XIX.
2. Η εκτίµηση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών των
παρθένων ελαιολάδων από τις εθνικές αρχές ή τους αντιπροσώ-
πους τους πραγµατοποιείται από οµάδες δοκιµαστών
αναγνωρισµένες από τα κράτη µέλη.
Τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά ενός ελαιολάδου που αναφέ-
ρονται στο πρώτο εδάφιο θεωρούνται σύµφωνα µε τη δηλούµενη
κατηγορία του ελαιολάδου αν η αναγνωρισµένη από το υπόψη
κράτος µέλος οµάδα επιβεβαιώσει τη συγκεκριµένη κατάταξη.
Στην περίπτωση που η αναγνωρισµένη οµάδα δεν επιβεβαιώσει
τη δήλωση σε ό,τι αφορά τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά της
κατηγορίας του δηλωθέντος ελαιολάδου, οι εθνικές αρχές ή οι
αντιπρόπωποί τους διενεργούν ύστερα από αίτηση του ενδιαφε-ροµένου δύο κατ 'έφεση αναλύσεις από άλλες αναγνωρισµένες
οµάδες, από τις οποίες η µία τουλάχιστον πραγµατοποιείται απόοµάδα αναγνωρισµένη από το κράτος µέλος παραγωγής τουελαιολάδου. Τα υπόψη χαρακτηριστικά θεωρούνται σύµφωνα µε1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—5
▼M19
▼B
▼M11
▼M13
▼M19
▼M19
τα δηλωθέντα αν οι δύο κατ 'έφεση αναλύσεις επιβεβαιώσουν τη
συγκεκριµένη κατάταξη. Σε αντίθετη περίπτωση τα έξοδα τωνκατέφεση αναλύσεων, µε την επιφύλαξη των κυρώσεων που
έχουν επιβληθεί, καταλογίζονται στον ενδιαφερόµενο.
3. Όσον αφορά τους ελέγχους που διενεργούνται από τις
εθνικές αρχές ή τους αντιπροσώπους τους για τον προσδιορισµότων χαρακτηριστικών των ελαίων που προβλέπονται στηνπαράγραφο 1, η δειγµατοληψία διενεργείται σύµφωνα µε τις διεθ-νείς προδιαγραφές ENISO661 καιENISO5555 σχετικά µε την
προετοιµασία δείγµατος υποβαλλόµενου σε δοκιµή και µε τη
δειγµατοληψία. Ωστόσο, κατά παρέκκλλιση από το σηµείο 6.8
της προδιαγραφής EN ISO 5555, για τις παρτίδες που αποτε-
λούνται από τα εν λόγω έλαια, σε άµεσες συσκευασίεςµικρότερες ή ίσες από 100 λίτρα, η δειγµατοληψία διενεργείταισύµφωνα µε το παράρτηµα Ια του παρόντος κανονισµού.
Με την επιφύλαξη των διατάξεων της προδιαγραφής ENISO5555
και του κεφαλαίου 6 της προδιαγραφής ENISO661, τα δείγµατα
προφυλάσσονται από το φως και από υψηλές θερµοκρασίες το
ταχύτερο δυνατό και αποστέλλονται στο εργαστήριο για τιςαναλύσεις το αργότερο:
—τη δέκατη εργάσιµη ηµέρα ύστερα από εκείνη της λήψης,
κατά τους µήνες Οκτώβριο έως Μάιο και
—την πέµπτη εργάσιµη ηµέρα ύστερα από εκείνη της λήψης,
κατά τους µήνες από Ιούνιο έως Σεπτέµβριο.
4. Για τους ελέγχους που προβλέπονται στην παράγραφο 3, οι
αναλύσεις που αναφέρονται στα παραρτήµατα ΙΙ, ΙΙΙ, ΙΧ και ΧΙΙκαθώς και, ενδεχοµένως, οι κατ 'αντιπαράθεση αναλύσεις που
προβλέπονται από τις εθνικές νοµοθεσίες διεξάγονται, πριν από
την ηµεροµηνία ελάχιστης διατηρησιµότητας. Στην περίπτωσηπου η δειγµατοληψία πραγµατοποιείται πριν από τους τέσσεριςµήνες που προηγούνται της λήξης της ηµεροµηνίας διατηρησι-µότητας, οι εν λόγω αναλύσεις θα πρέπει να πραγµατοποιούνται
το αργότερο πριν από το τέλος του τέταρτου µήνα που ακολουθεί
την ηµεροµηνία διενέργειας της δειγµατοληψίας. ∆εν εφαρµό-ζεται καµία αναβολή για τις άλλες αναλύσεις που προβλέπονταιαπό τον υπόψη κανονισµό.
Εκτός εάν η δειγµατοληψία πραγµατοποιήθηκε κάτω του ενός
µηνός πριν από την ηµεροµηνία της ελάχιστης διατηρησι-µότητας, στην περίπτωση κατά την οποία τα αποτελέσµατα των
αναλύσεων δεν αντιστοιχούν στα χαρακτηριστικά της κατηγο-
ρίας του ελαιόλαδου ή του πυρηνελαίου που δηλώθηκε, οενδιαφερόµενος ενηµερώνεται το αργότερο ένα µήνα πριν απότη λήξη της προθεσµίας που αναφέρεται στο πρώτο εδάφιο.
5. Ο προσδιορισµός των χαρακτηριστικών των ελαιολάδων
πραγµατοποιείται µε τις µεθόδους που προβλέπονται στηνπαράγραφο 1, και τα αποτελέσµατα των αναλύσεων συγκρίνονταιαπευθείας µε τα όρια που προβλέπονται από τον παρόντα κανο-
νισµό.
Άρθρο►M19 3◄
Στην περίπτωση που διαπιστώνεται ότι τα οργανοληπτικά
χαρακτηριστικά ενός ελαιολάδου διαφέρουν από εκείνα που
προκύπτουν από την ονοµασία του, το ενδιαφερόµενο κράτοςµέλος επιβάλλει, µε την επιφύλαξη άλλων ενδεχοµένων κυρώ-σεων, διοικητικές χρηµατικές ποινές, το ποσό των οποίωνκαθορίζεται ανάλογα µε την σοβαρότητα της διαπιστωθείσαςπαρατυπίας.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—6
▼M17
▼M19
▼M17
▼M19
▼M5
▼M5
Για την αξιολόγηση της παρατυπίας αυτής, λαµβάνεται υπόψη η
φυσική εξέλιξη των χαρακτηριστικών ενός ελαιολάδου πουδιατηρείται υπό κανονικές συνθήκες.
Τα κράτη µέλη ενηµερώνουν την Επιτροπή, στην αρχή κάθε
εξαµήνου, για τον αριθµό και τη φύση των διαπιστωθεισών παρα-τυπιών καθώς και τις κυρώσεις που επέβαλαν στη διάρκεια τουπροηγούµενου εξαµήνου.
Άρθρο 4
1. Για την εκτίµηση και τον έλεγχο από τις αρµόδιες αρχές ή
τον εκπρόσωπό τους των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών, τα
κράτη µέλη δύνανται να αναγνωρίζουν οµάδες δοκιµαστών.
Οι όροι αναγνώρισης καθορίζονται από τα κράτη µέλη έτσι,
κυρίως, ώστε:
—να ανταποκρίνονται στους όρους του παραρτήµατος XII
σηµείο 4,
—να διασφαλίζεται ότι η κατάρτιση του επικεφαλής της οµάδας
πραγµατοποιείται από ίδρυµα και υπό προϋποθέσεις αναγνω-
ρισµένες για το σκοπό αυτό από το κράτος µέλος,
—η εγκυρότητα των λαµβανόµενων αποτελεσµάτων των εξετά-
σεων να υπόκειται σε σύστηµα ετήσιου ελέγχουδιαµορφωµένο από το κράτος µέλος.
Κάθε κράτος µέλος κοινοποιεί στην Επιτροπή κατάλογο των
αναγνωρισµένων οµάδων καθώς και τα µέτρα που ελήφθησαν
σύµφωνα µε την παρούσα παράγραφο.
2. Στην περίπτωση που ένα κράτος αντιµετωπίζει δυσκολίες
για να συγκροτήσει επιτροπή δοκιµαστών στην επικράτειά του,µπορεί να προσφύγει σε αναγνωρισµένη επιτροπή δοκιµαστώνσε ένα άλλο κράτος µέλος.
3. Κάθε κράτος µέλος καθορίζει τον κατάλογο των επιτροπών
δοκιµαστών που συγκροτούνται από τις επαγγελµατικές ή διεπαγ-
γελµατικές οργανώσεις σύµφωνα µε τους όρους πουπεριγράφονται στην παράγραφο 1 και µεριµνά για την τήρησητων όρων αυτών.
Άρθρο 6
1. Η περιεκτικότητα σε έλαιο των ελαιοπυρήνων και των
άλλων υπολειµµάτων εκχύλισης του ελαιολάδου (κωδικός ΣΟ23069011 και23069019) προσδιορίζεται σύµφωνα µε τη µέθοδο
που αναφέρεται στο παράρτηµα XV.
2. Η περιεκτικότητα σε έλαιο που αναφέρεται στην
παράγραφο 1 είναι εκπεφρασµένη επί του 3 %κατά βάρος επί
ξηράς ουσίας.
Άρθρο 7
Εφαρµόζονται οι κοινοτικές διατάξεις οι σχετικές µε την
παρουσία ανεπιθύµητων ουσιών, εκτός των ουσιών που αναφέ-ρονται στο παράρτηµα XIτου παρόντος κανονισµού.
Άρθρο 8
1. Τα κράτη µέλη ανακοινώνουν στην Επιτροπή τα µέτρα που
έχουν λάβει για την εφαρµογή του παρόντος κανονισµού.
2. Τα κράτη µέλη κοινοποιούν στην Επιτροπή, στην αρχή
κάθε εξαµήνου τα αποτελέσµατα των αναλύσεων που πραγµατο-ποιήθηκαν κατά το προηγούµενο εξάµηνο.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—7
▼M19
▼M5
▼M19
▼B
▼B
Τα αποτελέσµατα αυτά εξετάζονται από την Επιτροπή ∆ιαχεί-
ρισης Λιπαρών Ουσιών σύµφωνα µε τη διαδικασία πουπροβλέπεται από το άρθρο 39 του κανονισµού αριθ. 136/66/ ΕΟΚ.
Άρθρο 9
Ο κανονισµός (ΕΟΚ) αριθ. 1058/77 καταργείται.
Άρθρο 10
1. Ο παρών κανονισµός αρχίζει να ισχύει την τρίτη ηµέρα από
τη δηµοσίευσή του στην Επίσηµη Εφηµερίδα των Ευρωπαϊκών
Κοινοτήτων.
Η εφαρµογή της µεθόδου του παραρτήµατος XIIαρχίζει από την
►
M11η Νοεµβρίου 1992 ◄,εξαιρουµένων των διαδικασιών
των σχετικών µε την παρέµβαση.
Η µέθοδος αυτή δεν εφαρµόζεται στα παρθένα ελαιόλαδα που
συσκευάζονται πριν από την 1η Νοεµβρίου 1992.
2. Ο παρών κανονισµός δεν ισχύει για τα ελαιόλαδα και τα
πυρηνέλαια που συσκευάστηκαν έως την ηµεροµηνία έναρξηςισχύος του παρόντος κανονισµού και τέθηκαν στο εµπόριο έωςτις 31 Οκτωβρίου 1992.
Ο παρών κανονισµός είναι δεσµευτικός ως προς όλα τα µέρη του
και ισχύει άµεσα σε κάθε κράτος µέλος.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—8
▼M5
▼B
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑΤΑ
Σύνοψη
ΠαράρτηµαI: Χαρακτηριστικά των ελαιολάδων …
Παράρτηµα Ια:∆ειγµατοληψία των παρτίδων ελαιόλαδου ή πυρη-
νελαίου ελιών σε άµεσες συσκευασίες των 100
λίτρων κατ'ανώτατο όριο…
ΠαράρτηµαII: Προσδιορισµός οξύτητας …
ΠαράρτηµαIII: Προσδιορισµός του αριθµού υπεροξειδίων …
ΠαράρτηµαIV: ►M6Προσδιορισµός της περιεκτικότητας σε
κηρούς διά χρωµατογραφίας αερίου φάσεως µε
τριχοειδή στήλη ◄…
ΠαράρτηµαV: Προσδιορισµός της σύνθεσης και του περιεχοµένου
των στερολών δι 'αερίου χρωµατογραφίας µε
τριχοειδή στήλη …
ΠαράρτηµαVI: Προσδιορισµός ερυθροδιόλης και ουβαόλης …
ΠαράρτηµαVII: Προσδιορισµός λιπαρών οξέων στη 2 -δέση στα
τριγλυκερίδια ελαίων και λιπών …
ΠαράρτηµαVIII: Προσδιορισµός περιεκτικότητας τριγλυκερίδιων …
ΠαράρτηµαIX: Φασµατοφωτοµετρική ανάλυσις στο υπεριώδες …
ΠαράρτηµαXA: Ανάλυση µεθυλεστέρων λιπαρών οξέων δι 'αερίου
χρωµατογραφίας …
ΠαράρτηµαXB: Παρασκευή µεθυλεστέρων λιπαρών οξέων σύµφωνα
µε το παράρτηµα VI,σηµείαIκαιIIτου κανονισµού
(ΕΟΚ) αριθ.72/77 ή σύµφωνα µε τη µέδοδο που
περιγράφεται κατωτέρω …
ΠαράρτηµαXI: Προσδιορισµός της περιεκτικότητας του
ελαιολάδου σε αλογονούχους πτητικούς διαλύτες
…
ΠαράρτηµαXII: Οργανοληπτική αξιολόγηση του παρθένου
ελαιολάδου…
ΠαράρτηµαXIII: ►M6Εξουδετέρωση και αποχρωµατισµός του
ελαιολάδου στο εργαστήριο ◄…
ΠαράρτηµαXV: Περιεκτικότητα σε έλαιο των ελαιοπυρήνων …
ΠαράρτηµαXVI: Προσδιορισµός του αριθµού ιωδίου …
ΠαράρτηµαXVII: Μέθοδος προσδιορισµού των στιγµασταδιενίων στα
φυτικά έλαια…
ΠαράρτηµαXVIII: Μέθοδος προσδιορισµού της σύστασης τριγλυκερί-
διων σεECN42…
ΠαράρτηµαXIX: Μέθοδος προσδιορισµού του περιεχοµένου σε
αλειφατικές αλκοόλες …1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—9
▼M17
▼B
▼C1
▼B
▼C1
▼B
▼M19
▼B
▼M11
▼M13
▼M19
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I
ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΟΥ ΕΛΑΙΟΛΑ∆ΟΥ
ΚατηγορίαΟξύτητα
(%)(*)∆είκτης
υπεροξει-
δίου
mEq02/
kg(*)Αλογονω-
µένοι
διαλύτες
mg/kg(*)(1)Κηροί
mg/kg(**)Κορεσµένα
λιπαρά
οξέα στη
θέση 2
τριγλυκε-
ρίδια
(%)Στιγµαστα-
διένια
mg/kg(2)∆ιαφορά
HPLC και
ECN42:
Θεωρη-
τικός
υπολογι-
σµόςK232(*) K270(*)K270ύστερα
από
διέλευση
υπεράνω
αλου-
µίνας(3)∆-Κ(*)Οργανολη-
πτική αξιο-
λόγηση
∆ιάµεση
τιµή του
ελαττώ-
µατος
(Με)(*)Οργανολη-
πτική αξιο-
λόγηση
∆ιάµεση
τιµή του
φρουτώ-
δους
(Μφ)(*)
1.Εξαιρετικό παρθένο
ελαιόλαδο≤1,0 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,50 ≤0,20 ≤0,10 ≤0,01 Md=0 Mf>0
2.Παρθένο ελαιόλαδο ≤2,0 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,10 ≤0,01 Md ≤2,5 Mf>0
3.Κουράντε παρθένο
ελαιόλαδο≤3,3 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,10 ≤0,01 Md ≤6,0(4)—
4.Λαµπάντε παρθένο
ελαιόλαδο>3,3 >20 >0,20 ≤300(5)≤1,3 ≤0,50 ≤0,3 ≤3,70 >0,25 ≤0,11 — Md>6 —
5. Εξευγενισµένο
ελαιόλαδο≤0,5 ≤5 ≤0,20 ≤350 ≤1,5 — ≤0,3 ≤3,40 ≤1,20 — ≤0,16 — —
6.Ελαιόλαδο ≤1,5 ≤15 ≤0,20 ≤350 ≤1,5 — ≤0,3 ≤3,30 ≤1,00 — ≤0,13 — —
7.Ακατέργαστο πυρη-
νέλαιο>0,5(**) — — >350(6)≤1,8 — ≤0 , 6 ——————
8. Εξευγενισµένο
πυρηνέλαιο≤0,5 ≤5 ≤0,20 >350 ≤2,0 — ≤0,5 ≤5,50 ≤2,50 — ≤0,25 — —
9.Πυρηνέλαιο ≤1,5 ≤15 ≤0,20 >350 ≤2,0 — ≤0,5 ≤5,30 ≤2,00 — ≤0,20 — —
(1)Συνολικό µέγιστο ανώτατο όριο για τις ολικές αλογονωµένες ενώσεις που ανιχνεύονται µε ανιχνευτή σύλληψης ηλεκτρονίων.
Για τα στοιχεία που ανιχνεύονται µεµονωµένα, το ανώτατο όριο είναι 0,10 mg/kg.
(2)Άθροισµα ισοµερών που θα µπορούσαν να διαχωριστούν (ή όχι) µε τριχοειδή στήλη.
(3)Για να προσδιοριστεί η παρουσία εξευγενισµένων ελαίων, όταν το K270υπερβαίνει το όριο της σχετικής κατηγορίας, πρέπει να πραγµατοποιηθεί νέος προσδιορισµός του K270ύστερα από διαβίβαση υπεράνω
αλουµίνας.
(4)Εάν η διάµεση τιµή του φρουτώδους ισούται µε 0, η διάµεση τιµή του ελαττώµατος πρέπει να είναι κατώτερη ή ίση µε 2,5.
(5)Τα έλαια µε περιεκτικότητα σε κηρούς που περιλαµβάνεται µεταξύ 300 mg/kg και 350mg/kg θεωρούνται ως λαµπάντε παρθένα ελαιόλαδα, αν οι ολικές αλειφατικές αλκοόλες είναι κατώτερες από ή ίσες µε
350mg/kg ή αν το ποσοστό σε ερυθροδιόλη και ουβαόλη είναι κατώτερο ή ίσο του 3,5.
(6)Τα έλαια µε περιεκτικότητα σε κηρούς που περιλαµβάνεται µεταξύ 300 mg/kg και 350mg/kg θεωρούνται ως ακατέργαστα πυρηνέλαια, αν οι ολικές αλειφατικές αλκοόλες είναι ανώτερες από 350 mg/kg και αν
το ποσοστό σε ερυθροδιόλη και ουβαόλη είναι ανώτερο του 3,5.▼M191991R2568—EL—22.05.2002—019.001—10
ΚατηγορίαΠεριεκτικότητα σε οξέα
Άθροισ-
µα των
ισοµερ-
ώνtrans-
ελαϊκού
οξέος
(%)Άθροισ-
µαtrans-
λινε-
λαϊκού
καιtrans-
λινολε-
νικού
οξέος
(%)Χολη-
στερόλη
(%)Βρασι-
καστε-
ρόλη
(%)Καµπι-
στερόλη
(%)Στιγµα-
στερόλη
(%)Β-σιτο-
στερόλη
(%)(1)∆-7-
στιγµα-
στερόλη
(%)Σύνολο
στερόλε-
ς
(mg/kg)Ερυθο-
διόλη
και
ουβαόλη
(%)(**)Μυρι-
στικό
(%)Λινολε-
νικό
(%)Αραχι-
δικό
(%)Εικοσα-
νικό
(%)Βεχε-
νικό
(%)Λιγνοκ-
ηρικό
(%)
1. Εξαιρετικό
παρθένο ελαιό-
λαδο≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1000 ≤4,5
2.Παρθένο ελαιό-
λαδο≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1000 ≤4,5
3. Κουράντε
παρθένο ελαιό-
λαδο≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1000 ≤4,5
4. Λαµπάντε
παρθένο ελαιό-
λαδο≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,10≤0,10 ≤0,5≤0,1≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥1000≤4,5(2)
5.Εξευγενισµένο
ελαιόλαδο≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1000 ≤4,5
6.Ελαιόλαδο ≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1000 ≤4,5
7. Ακατέργαστο
πυρηνέλαιο≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,20≤0,10 ≤0,5≤0,2≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥2500 >4,5(3)
8.Εξευγενισµένο
πυρηνέλαιο≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1800 >4,5
9.Πυρηνέλαιο ≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1600 >4,5
(1)Άθροισµα των:δ -5,23- στιγµασταδιενόλη +κλεροστερόλη+β-σιτοστερόλη+σιτοστανόλη+δ-5-αβεναστερόλη+δ-5,24- στιγµασταδιενόλη.
(2)Τα έλαια µε περιεκτικότητα σε κηρούς που περιλαµβάνεται µεταξύ 300 mg/kg και 350mg/kg θεωρούνται ως λαµπάντε παρθένα ελαιόλαδα, αν οι ολικές αλειφατικές αλκοόλες είναι κατώτερες από ή ίσες µε
350mg/kg ή αν το ποσοστό σε ερυθροδιόλη και ουβαόλη είναι κατώτερο ή ίσο του 3,5.
(3)Τα έλαια µε περιεκτικότητα σε κηρούς που περιλαµβάνεται µεταξύ 300 mg/kg και 350mg/kg θεωρούνται ως ακατέργαστα πυρηνέλαια, αν οι ολικές αλειφατικές αλκοόλες είναι ανώτερες από 350 mg/kg και αν
το ποσοστό σε ερυθροδιόλη και ουβαόλη είναι ανώτερο του 3,5.
Σηµειώσεις:
α) Τα αποτελέσµατα των αναλύσεων πρέπει να εκφράζονται αναγράφοντας τον ίδιο αριθµό δεκαδικών ψηφίων µε αυτά που προβλέπονται για κάθε χαρακτηριστι κό.
Ο τελευταίος αριθµός πρέπει να αυξάνεται κατά µία µονάδα εάν ο τελευταίος αριθµός υπερβαίνει το 4.
β) Αρκεί και ένα µόνο χαρακτηριστικό να µην συµφωνεί µε τις αναγραφόµενες αξίες ώστε το ελαιόλαδο να αλλάξει κατηγορία ή να δηλωθεί ότι δεν είναι σύµφων ο όσον αφορά την καθαρότητα.
γ) Τα χαρακτηριστικά που σηµειώνονται µε έναν αστερίσκο (*),τα οποία αναφέρονται στην ποιότητα του ελαιολάδου, συνεπάγονται ότι:
—για το λαµπάντε παρθένο ελαιόλαδο, τα σχετικά ανώτατα όρια (µε εξαίρεση το K232)µπορεί να µην πληρούνται συγχρόνως,
—για τα άλλα παρθένα ελαιόλαδα, η µη τήρηση τουλάχιστον ενός των ορίων αυτών συνεπάγεται αλλαγή κατηγορίας, παραµένοντας όµως σε µία των κατηγοριών τω ν παρθένων ελαιολάδων.
δ) Τα χαρακτηριστικά που αναγράφονται µε δύο αστερίσκους (**)συνεπάγονται ότι, για όλα τα πυρηνέλαια που αφορούν τα σχετικά όρια, µπορούν να πληρούνται συγχρόνως.▼M191991R2568—EL—22.05.2002—019.001—11
▼M17
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ια
∆ειγµατοληψία παρτίδων ελαιολάδου ή πυρηνελαίου ελιών σε άµεσες
συσκευασίες των 100 λίτρων κατ 'ανώτατο όριο
Η παρούσα µέθοδος δειγµατοληψίας εφαρµόζεται για παρτίδες
ελαιολάδου ή πυρηνελαίου ελιών κατ 'ανώτατο όριο125000 λίτρων, που
είναι συσκευασµένες σε άµεσες συσκευασίες το πολύ 100 λίτρων.
Όταν η συγκεκριµένη παρτίδα είναι µεγαλύτερη από 125000 λίτρα,
υποδιαιρείται σε ισόποσες επιµέρους παρτίδες, κατά προσέγγιση ίσες ή
κατώτερες των125000 λίτρων. Στις επιµέρους παρτίδες που καθορίζονται
µε τον τρόπο αυτό εφαρµόζεται η εν λόγο µέθοδος.
1.Περιεχόµενο βασικής δειγµατοληψίας
Κάθε βασική δειγµατοληψία έχει ως εξής:
α) στην περίπτωση κατά την οποία οι άµεσες συσκευασίες έχουν
χωρητικότητα µικρότερη ή ίση µε έξι λίτρα, το έλαιο µιας άµεσης
συσκευασίας κατανέµεται σε έξι περιέκτες ενός λίτρου, εκ των
οποίων:
—ένας περιέκτης για τις αναλύσεις που αναφέρονται στα παραρ-
τήµατα ΙΙ, ΙΙΙ,IXκαιXII,
—ένας άλλος για τις άλλες αναλύσεις και
—οι υπόλοιποι περιέκτες για ενδεχόµενες κατ 'αντιπαράθεση
αναλύσεις·
β) στην περίπτωση κατά την οποία οι άµεσες συσκευασίες έχουν
χωρητικότητα µεγαλύτερη ή ίση µε δύο λίτρα και κατώτερη από
έξι, το έλαιο τεσσάρων άµεσων συσκευασιών, εκ των οποίων:
—µια άµεση συσκευασία για τις αναλύσεις που αναφέρονται στα
παραρτήµατα ΙΙ, ΙΙΙ, IXκαιXII,
—ένα τρίτο µιας άλλης συσκευασίας για τις άλλες αναλύσεις,
—το υπόλοιπο έλαιο για τις ενδεχόµενες κατ 'αντιπαράθεση
αναλύσεις·
γ) στην περίπτωση κατά την οποία οι άµεσες συσκευασίες έχουν
χωρητικότητα µεγαλύτερη ή ίση 0,75 λίτρα και κατώτερη από δύο
λίτρα, το έλαιο έξι άµεσων συσκευασιών, εκ των οποίων:
—µια άµεση συσκευασία για τις αναλύσεις που αναφέρονται στα
παραρτήµατα ΙΙ, III,IX καιXII,
—µια άλλη συσκευασία για τις άλλες αναλύσεις και
—το υπόλοιπο έλαιο για τις ενδεχόµενες κατ 'αντιπαράθεση
αναλύσεις·
δ) στην περίπτωση κατά την οποία οι άµεσες συσκευασίες έχουν
χωρητικότητα κατώτερη από 0,75 λίτρα, το έλαιο του ελάχιστου
αριθµού συσκευασιών, των οποίων η συνολική χωρητικότητα υπερ-
βαίνει 4,5 λίτρα, µε την ακόλουθη κατανοµή:
—το έλαιο του ελάχιστου αριθµού συσκευασιών, των οποίων η
χωρητικότητα υπερβαίνει 0,75 λίτρα, προορίζεται για τις αναλύ-
σεις που αναφέρονται στα παραρτήµατα ΙΙ, III,IX,XII,
—η ίδια ποσότητα προορίζεται για τις άλλες αναλύσεις και
—το υπόλοιπο φυλάσσεται για τις ενδεχόµενες κατ 'αντιπαράθεση
αναλύσεις.
2.Αριθµός βασικών δειγµατοληψιών
Ο ελάχιστος αριθµός βασικών δειγµατοληψιών καθορίζεται συναρ-
τήσει του µεγέθους της παρτίδας σύµφωνα µε τον ακόλουθο πίνακα:
Μέγεθος της παρτίδας (λίτρα) µικρό-
τερο απόΕλάχιστος αριθµός βασικών δειγµα-
τοληψιών
7500 2
25000 3
75000 4
125000 51991R2568—EL—22.05.2002—019.001—12
▼M17
Οι άµεσες συσκευασίες µιας βασικής δειγµατοληψίας πρέπει να επιλέ-
γονται από γειτονικά σηµεία στην παρτίδα.
Σε περίπτωση αµφιβολίας, το κράτος µέλος αυξάνει τον αριθµό των
βασικών δειγµατοληψιών που πρέπει να διενεργηθούν.
3.Αναλύσεις και αποτελέσµατα
Κατά το δυνατό, τα έλαια πρέπει να φυλάσσονται στους αρχικούς
περιέκτες µέχρι τη στιγµή της ανάλυσης.
α) Έκαστο από τα ληφθέντα βασικά δείγµατα υποδιαιρείται σε
εργαστηριακά δείγµατα, σύµφωνα µε το σηµείο 2.25 της προδια-
γραφήςEN ISO 5555 προκειµένου να υποβληθεί στις ακόλουθες
αναλύσεις:
—προδιορισµός ελεύθερων λιπαρών οξέων, όπως αναφέρεται στο
άρθρο 2 παράγραφος 1 πρώτη περίπτωση,
—προσδιορισµός του δείκτη υπεροξειδίου, όπως αναφέρεται στο
άρθρο 2 παράγραφος 1 δεύτερη περίπτωση,
—φασµαφωτοµετρική ανάλυση, όπως αναφέρεται στο άρθρο 2
παράγραφος 1 όγδοη περίπτωση,
—σύνθεση σε λιπαρά οξέα, όπως αναφέρεται στο άρθρο 2
παράγραφος 1 ένατη περίπτωση.
β) Στην περίπτωση που για τουλάχιστον µία των βασικών δειγµατολη-
ψιών επί της ίδιας παρτίδας, τα αποτελέσµατα των αναλύσεων που
αναφέρονται στο στοιχείο α) δεν ανταποκρίνονται στο σύνολό τους
στα χαρακτηριστικά της κατηγορίας ελαίου που δηλώθηκε, το
σύνολο της παρτίδας θεωρείται ότι δεν πληροί τα χαρακτηριστικά
αυτά.
Στην περίπτωση που για καθεµία από τις βασικές δειγµατοληψίες
επί της ίδιας παρτίδας, όλα τα αποτελέσµατα των αναλύσεων που
αναφέρονται στο στοιχείο α) είναι οµοιογενή, λαµβανοµένων
υπόψη των χαρακτηριστικών επαναληψιµότητας των σχετικών
µεθόδων, και ανταποκρίνονται στα χαρακτηριστικά της κατηγορίας
ελαίου που δηλώθηκε, µια από τις βασικές δειγµατοληψίες επί της
εν λόγω παρτίδας υποβάλλεται στις υπόλοιπες αναλύσεις.
γ) Στην περίπτωση που ένα των αποτελεσµάτων των αναλύσεων που
αναφέρονται στο στοιχείο β) δεύτερο εδάφιο δεν ανταποκρίνεται
στα χαρακτηριστικά της κατηγορίας ελαίου που δηλώθηκε, το
σύνολο της υπόψη παρτίδας θεωρείται ως µη σύµφωνο προς τα
χαρακτηριστικά αυτά.
Στην περίπτωση που όλα τα αποτελέσµατα των αναλύσεων που
αναφέρονται στο στοιχείο β) δεύτερο εδάφιο ανταποκρίνονται στα
χαρακτηριστικά της κατηγορίας ελαίου που δηλώθηκε, το σύνολο
της παρτίδας θεωρείται σύµφωνο προς τα χαρακτηριστικά αυτά.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—13
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II
ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΞΥΤΗΤΑΣ
1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ
Ο προσδιορισµός ελεύθερων λιπαρών οξέων σε ελαιόλαδα. Η
περιεκτικότητα σε ελεύθερα λιπαρά οξέα εκφράζεται ως οξύτητα
υπολογισθείσα µε συµβατικό τρόπο.
1.1.Αρχή
∆ιαλύεται το δείγµα σε µείγµα διαλυτών και τα περιεχόµενα
ελεύθερα λιπαρά οξέα ογκοµετρούνται χρησιµοποιώντας διάλυµα
υδροξείδιου του καλίου σε αιθανόλη.
1.2.Αντιδραστήρια
Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αναγνωρισµένης αναλυτικής
καθαρότητας και το χρησιµοποιούµενο νερό να είναι απεσταγµένο
ή ισοδύναµης καθαρότητας.
1.2.1.Μείγµα διαιθυλαιθέρος αιθανόλης 95 %[µε αναλογία 1:1 ( V/V)].
Προσοχή: Ο διαιθυλαιθέρας είναι εξαιρετικά εύφλεκτος και µπορεί
να σχηµατίσει εκρηκτικά υπεροξείδια. Πρέπει να
λαµβάνεται ειδική µέριµνα κατά τη χρήση του.
Εξουδετερώνεται ακριβώς τη στιγµή χρησιµοποίησής του µε το
διάλυµα υδροξείδιου του καλίου (1.2.2), µε την προσθήκη 0,3 ml
διαλύµατος φαινολοφθαλεϊνης (1.2.3) ανά 100 mlµείγµατος.
Σηµείωση: Εάν δεν είναι δυνατό να χρησιµοποιηθεί διαιθυ-
λαιθέρας, µπορεί να χρησιµοποιηθεί µείγµα διαλυτών
που περιέχει αιθανόλη και τολουόλιο. Εάν χρειαστεί,
η αιθανόλη µπορεί να αντικατασταθεί από 2 -προπανόλη.
1.2.2. Πρότυπο διάλυµα υδροξειδίου του καλίου σε αιθανόλη, κανονι-
κότητας περίπου 0,1 mol/l ή, εάν χρειαστεί, περίπου 0,5 mol/l.
Η ακριβής συγκέντρωση του αιθανολικού διαλύµατος υδροξείδιου
του καλίου πρέπει να είναι γνωστή και να έχει ελεγχθεί ακριβώς
πριν χρησιµοποιηθεί. Χρησιµοποιείται διάλυµα παρασκευασµένο
τουλάχιστον πέντε ηµέρες πριν από τη χρήση και αποθηκευµένο
σε σκούρα (καστανή) γυάλινη φιάλη µε ελαστικό πώµα. Το διάλυµα
πρέπει να είναι άχρωµο ή χρώµατος αµυδρώς κίτρινου.
Σηµείωση: Ένα σταθερό άχρωµο διάλυµα υδροξείδιου του καλίου
µπορεί να παρασκευαστεί ως εξής:Φέρονται σε βρασµό
1000ml αιθανόλης µε 8gυδροξείδιου του καλίου και
0,5gρινισµάτων αργιλίου και συνεχίζεται επί µία ώρα
ο βρασµός µε κάθετο ψυκτήρα. Εκτελείται αµέσως
διήθηση. ∆ιαλύεται µέσα στο διήθηµα η απαιτούµενη
ποσότητα υδροξείδιου του καλίου. Αφήνονται επί
αρκετές ηµέρες και το διαυγές υπερκείµενο υγρό διαχω-
ρίζεται µε έκχυση από το ίζηµα ανθρακικού καλίου.
Το διάλυµα µπορεί επίσης να παρασκευαστεί χωρίς
διήθηση ως εξής:Σε 1000ml αιθανόλης προστίθενται
4mlβουτυλικού αργιλίου και το µείγµα αφήνεται επί
αρκετές ηµέρες. Το υπερκείµενο υγρό εκχύεται και
διαλύεται η απαιτούµενη ποσότητα υδροξείδιου του
καλίου. Το διάλυµα είναι έτοιµο προς χρήση.
1.2.3. Φαινολοφθαλεΐνη, διάλυµα 10 g/lσε αιθανόλη 95 -96 (V/V) ή
κυανούν της βρωµοφαινόλης (στην περίπτωση λιπών µε έντονο
χρώµα), διάλυµα 20 g/lσε αιθανόλη 95-96(V/V).
1.3.Όργανα
Συνηθισµένος εργαστηριακός εξοπλισµός, περιλαµβάνοντας:
1.3.1. Αναλυτικό ζυγό.
1.3.2. Κωνική φιάλη των 250 ml.
1.3.3. Προχοΐδα των 10 ml,βαθµονοµηµένη ανά 0,05 ml.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—14
▼B
1.4.∆ιαδικασία
1.4.1. Παρασκευή δείγµατος προς ανάλυση
Ο προσδιορισµός πραγµατοποιείπαι επί του διηθηµένου δείγµατος,
εάν η συνολική περιεκτικότητα σε υγρασία και ξένες προσµείξεις
είναι µικρότερη από 1 %,ο προσδιορισµός πραγµατοποιείται επί
που δείγµατος όπως έχει.
1.4.2. Ποσότης του δείγµατος δοκιµής
Η ποσότης του δείγµατος δοκιµής είναι ανάλογη µε την αναµενό-
µενη οξύτητα, σύµφωνα µε τον ακόλουθο πίνακα.
Αναµενόµενος δείκτης
οξύτηταςΜάζα δείγµατος
δοκιµήςΑκρίβεια ζύγισης
δείγµατος δοκιµής
<1 20 0,05
1µέχρι 4 10 0,02
4µέχρι 15 2,5 0,01
15µέχρι 75 0,5 0,001
>75 0,1 0,0002
Το δείγµα δοκιµής ζυγίζεται στην κωνική φιάλη (4.3.2).
1.4.3. Προσδιορισµός
Το δείγµα δοκιµής (1.4.2) διαλύεται σε 50 ως 150 mlτου προηγού-
µενα εξουδετερωµένου µείγµατος διαιθυλαιθέρος και αιθανόλης
(1.2.1).
Ογκοµετρείται µε ταυτόχρονη ανάδευση µε το διάλυµα 0,1 mol
υδροξείδιου του καλίου (1.2.2) (βλέπε σηµείωση 2) έως ότου
αλλάξει χρώµα ο δείκτης (το ρόδινο χρώµα της φαινολοφθαλεΐνης
επικρατεί επί τουλάχιστον 10 δευτερόλεπτα).
Σηµειώσεις:1.Το τιτλοδοτηµένο αιθανολικό διάλυµα υδροξειδίου
του καλίου (1.2.2) δύναται να αντικατασταθεί από
ένα υδατικό διάλυµα υδροξειδίου του καλίου ή του
νατρίου, εφόσον ο όγκος του εισαχθέντος ύδατος
δεν επιφέρει διαχωρισµό των φάσεων.
2.Εάν η απαραίτητη ποσότητα διαλύµατος του υδρο-
ξειδίου του καλίου 0,1 mol/l υπερβαίνει τα 10 ml,
χρησιµοποιείται ένα διάλυµα 0,5 mol/l.
3.Εάν το διάλυµα θολώνει κατά την ογκοµέτρηση,
προστίθεται µια ικανοποιητική ποσότητα µείγµατοςδιαλυτών προκειµένου να επιτευχθεί ένα διαυγές
διάλυµα.
1.5.Έκφραση της οξύτητας επί τοις %συγκέντρωσης ελαϊκού οξέος
Η οξύτητα, εκφρασµένη σε κατά βάρος εκατοστιαία αναλογία,
ισούται µε:
V/C2c/C2M
1000/C2100
m¼V/C2c/C2M
10/C2m
όπου:
Vείναι ο όγκος σε χιλιοστόλιτρα, του τιτλοδοτηµένου διαλύµατος
υδροξειδίου του καλίου που έχει χρησιµοποιηθεί,
cείναι η ακριβής συγκέντρωση, σε moles ανά λίτρο, του τιτλο-
δοτηµένου διαλύµατος υδροξειδίου του καλίου που έχει
χρησιµοποιηθεί,
Mείναι το γραµµοµοριακό βάρος, σε γραµµάρια ανά mole, του
οξέος που χρησιµοποιήθηκε για την έκφραση του αποτελέ-
σµατος (=282),
mείναι το βάρος, σε γραµµάρια, του δείγµατος δοκιµής.
Ως αποτέλεσµα λαµβάνεται ο αριθµητικός µέσος όρος ►M6δύο
προσδιορισµών ◄.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—15
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ III
ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΑΡΙΘΜΟΥ ΥΠΕΡΟΞΕΙ∆ΙΩΝ
1.ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ
Η προδιαγραφή αυτη περιγράφει µια µέθοδο προσδιορισµού του
αριθµού των υπεροξειδίων ελαίων και λιπών.
2.ΠΕ∆ΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ
►C1Η µέθοδος ◄αυτή είναι εφαρµόσιµη σε ζωικά και φυτικά
έλαια και λίπη.
3.ΟΡΙΣΜΟΣ
Ο αριθµός υπεροξειδίων εκφράζει την ποσότητα αυτών των συστα-
τικών του δείγµατος (εκφρασµένη σε χιλιοστοϊσοδύναµα ενεργού
οξυγόνου ανάkg)που οξειδώνουν το ιωδιούχο κάλιο κάτω από τις
περιγραφόµενες συνθήκες αναλύσεις.
4.ΑΡΧΗ
Το ληφθέν δείγµα διαλύεται σε µείγµα οξεικού οξέος και χλωροφόρ-
µιου και προστίθεται διάλυµα ιωδιούχου καλίου. Ογκοµέτρηση του
απελευθερούµενου ιωδίου µε πρότυπο διάλυµα θειοθειικού νατρίου.
5.ΟΡΓΑΝΑ
Όλος ο χρησιµοποιούµενος εξοπλισµός πρέπει να είναι απαλλα-
γµένος αναγωγικών ή οξειδωτικών ουσιών.
Σηµείωση: Να µην λιπαίνονται οι εσµυρισµένες επιφάνειες.
5.1.Γυάλινο κουτάλι των 3 ml.
5.2.Εσµυρισµένες φιάλες µε πώµατα, χωρητικότητας περίπου 250 ml,οι
οποίες προηγουµένως έχουν ξηρανθεί και στις οποίες έχει διαβιβά-
σθει αδρανές αέριο (άζωτο ή, προτιµότερα, διοξείδιο του άνθρακα).
5.3.Προχοΐδα των 25 ή 50 ml,βαθµολογηµένη ανά 0,1 ml.
6.ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ
6.1.Χλωροφόρµιο, αναλυτικής καθαρότητος, απαλλαγµένο οξυγόνου µε
διοχέτευση υπό πίεση, µέσα από αυτό, ρεύµατος καθαρού, ξηρού
αδρανούς αερίου.
6.2.Κρυσταλλικό οξεικό οξύ, αναλυτικής καθαρότητος, απαλλαγµένο
οξυγόνου µε διοχέτευση, υπό πίεση, µέσα από αυτό, καθαρού, ξηρού
αερίου.
6.3.Κεκορεσµένο υδατικό διάλυµα ΚΙ προσφάτως παρασκευασθέν, απαλ-
λαγµένο από ιώδιο και ιωδικά.
6.4.Πρότυπο διάλυµα ►C1θειθειικού ◄νατρίου 0,01 ή 0,002 N,τιτλο-
δοτηµένο µόλις πριν χρησιµοποιηθεί.
6.5.Υδατικό διάλυµα αµύλου 10 g/l,πρόσφατα παρασκευασµένο από
φυσικό διαλυτό άµυλο.
7.∆ΕΙΓΜΑ
Να ληφθεί µέριµνα για την παραλαβή και διατήρηση του δείγµατος
µακριά από φώς, θερµότητα και σε εντελώς γεµάτα γυάλινα δοχεία,
ερµητικά σφραγισµένα µε πώµατα, από αδιαφανές γυαλί ή φελλό.
8.ΠΟΡΕΙΑ ΑΝΑΛΥΣΕΩΣ
Η ανάλυση πρέπει να γίνεται µε διάχυτο φυσικό ή µε τεχνητό
φωτισµό. Ζυγίζεται σε γυάλινο κουτάλι (5.1) ή εάν αυτό δεν υπάρχει,
σε φιάλη (5.2) µε ακρίβεια 0,001 g,ποσότης του δείγµατος σύµφωνα
µε τον ακόλουθο πίνακα, ανάλογα µε τον αναµενόµενο αριθµό υπερο-
ξειδίων.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—16
▼B
Αναµενόµενος αριθµός υπεροξει-
δίων
(mEq)Βάρος δείγµατος σε gr
(g)
0-12 5,0-2,0
12-20 2,0-1,2
20-30 1,2-0,8
30-50 0,8-0,5
50-90 0,5-0,3
Αποπωµατίζεται µία φιάλη (5.2) και εισάγεται το γυάλινο κουτάλι
που περιέχει τη ζυγισθείσα ποσότητα του δείγµατος. Προστίθενται
10mlχλωροφόρµιου (6.1). ∆ιαλύεται το δείγµα γρήγορα µε
ανάδευση. Προστίθενται 15 mlοξικού οξέος (6.2), κατόπιν 1 ml
διαλύµατος ιωδιούχου καλίου (6.3). Πωµατίζεται γρήγορα, γίνεται
ανάδευση επί ένα λεπτό, και αφήνεται για 5 λεπτά ακριβώς, µακριά
από το φώς σε θερµοκρασία 15 έως 25 ºC.
Προστίθενται περίπου 75 mlαπεσταγµένου νερού. Το απελευθερού-
µενο ιώδιο ογκοµετρείται µε το διάλυµα του θειοθειικού νατρίου
(6.4) (διάλυµα 0,002 Nγια αναµενόµενες τιµές µικρότερες από 12,
και διάλυµα 0,01 Nγια αναµενόµενες τιµές πάνω από 12) µε ζωηρή
ανάδευση, χρησιµοποιώντας διάλυµα αµύλου (6.5) σαν δείκτη.
Εκτελούνται δύο ποσδιορισµοί στο ίδιο δοκιµαστικό δείγµα.
Εκτελείται ταυτόχρονα λευκός προσδιορισµός (τυφλός). Εάν το
αποτέλεσµα του τυφλού ξεπερνά τα 0,05 mlδιαλύµατος 0,01 N
θειοθειικού νατρίου (6.4), αντικαθίστανται τα αντιδραστήρια.
9.ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
Ο αριθµός υπεροξειδίων ( AY), εκπεφρασµένος σε χιλιοστοϊσοδύ-
ναµα ενεργού οξυγόνου ανά kg,δίνεται από τη σχέση:
AY¼V/C2T/C21000
m
όπουVείναι ο αριθµός των mlτου προτύπου διαλύµατος
θειοθειικού νατρίου (6.4) χρησιµοποιούµενου για την
ογκοµέτρηση, µετά την αφαίρεση του λευκού,
Tείναι η ακριβής κανονικότητα του διαλύµατος θειοθειικού
νατρίου (6.4) που χρησιµοποιείται,
mείναι το βάρος του δείγµατος σε g.
Σαν αποτέλεσµα λαµβάνεται ο αριθµητικός µέσος των δύο εκτελε-
σθέντων προσδιορισµών.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—17
▼M6
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IV
ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ ΚΗΡΟΥΣ ∆ΙΑ
ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΑΕΡΙΟΥ ΦΑΣΕΩΣ ΜΕ ΤΡΙΧΟΕΙ∆Η ΣΤΗΛΗ
1. ΠΕ∆ΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ
Η µέθοδος περιγράφει διαδικασία προσδιορισµού της περιεκτι-
κότητας σε κηρούς ορισµένων λιπαρών ουσιών υπό τις συνθήκες
της δοκιµασίας.
Μπορεί να χρησιµοποιηθεί για τη διάκριση µεταξύ του
ελαιολάδου που λαµβάνεται µε έκθλιψη και εκείνου που λαµβά-
νεται µε εκχύλιση (έλαιο εξ ελαιοπυρήνων).
2. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟ∆ΟΥ
Προσθήκη καταλλήλου εσωτερικού προτύπου στη λιπαρή ουσία
και διαχωρισµός µε χρωµατογραφία σε στήλη silica gel. Παρα-
λαβή του πρώτου κλάσµατος που εκλούεται υπό τις συνθήκες
της δοκιµασίας (µε πολικότητα µικρότερη εκείνης των τριγλυκε-
ριδίων) και άµεση ανάλυση µε αέριο χρωµατογραφία τριχοειδούς
στήλης.
3. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ
3.1. ΦιάληErlenmeyer των 25ml.
3.2. Υάλινη στήλη χρωµατογραφίας, εσωτερικής διαµέτρου 15,0 mm
και ύψους 30 έως 40 cm.
3.3. Κατάλληλος χρωµατογράφος αερίου φάσεως µε τριχοειδή στήλη,
εφοδιασµένος µε σύστηµα απευθείας εισαγωγής στη στήλη
αποτελούµενος από:
3.3.1. Θερµοστατικό κλίβανο για τις στήλες ικανό να διατηρεί την
επιθυµητή θερµοκρασία µε ακρίβεια ±1ºC.
3.3.2. Σύστηµα έγχυσης εν ψυχρώ για απευθείας εισαγωγή στη στήλη.
3.3.3. Ανιχνευτή ιονισµού φλόγας και µετατροπέα -ενισχυτή.
3.3.4. Καταγραφέα-ολοκληρωτή δυνάµενο να λειτουργεί µε τον µετα-
τροπέα-ενισχυτή (βλέπε 3.3.3), µε χρόνο απόκρισης που δεν
υπερβαίνει το 1 δευτερόλεπτο και µεταβλητή ταχύτητα χαρτιού.
3.3.5. Τριχοειδή στήλη από γυαλί ή τετηγµένο διοξείδιο του πυριτίου,
►C2µήκους 10 έως 15 m◄,εσωτερικής διαµέτρου 0,25 έως
0,32mm, επικαλυµµένη εσωτερικά µε υγρό SE-54 ή κάτι αντί-
στοιχο, οµοιόµορφου πάχους 0,10 έως 0,30 µ m.
3.4. Μικροσύριγγα των 10 µ lκατάλληλη για έγχυση στη στήλη µε
βελόνα από επιφανειακώς σκληρυµένο χάλυβα ( aiguillecimentée).
4. ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ
4.1. Πυριτιωµένη ζελατίνη ( cilicagel)70 έως 230mesh,7754Merck.
Η πυριτιωµένη ζελατίνη τοποθετείται στον κλίβανο σε θερµο-
κρασία 500ºCεπί τέσσερις ώρες. Μετά από ψύξη, προστίθεται
νερό σε αναλογία 2 %.Το µείγµα αναδεύεται µέχρις ότου οµογε-
νοποιηθεί και διατηρείται στο ·σκοτάδι επί 12 τουλάχιστον ώρες
πριν χρησιµοποιηθεί.
4.2. Κανονικό εξάνιο, για χρωµατογραφία.
4.3. Αιθυλαιθέρας, για χρωµατογραφία.
4.4. Κανονικό επτάνιο, για χρωµατογραφία.
4.5. Πρότυπο διάλυµα λαυρικής αραχιδικής ένωσης 0,1 %κατ'όγκο
µέσα στο εξάνιο (εσωτερικό πρότυπο).
4.6. Φέρον αέριο:υδρογόνο χρωµατογραφικής καθαρότητας, για
χρωµατογραφία αερίου φάσεως.
4.7. Βοηθητικά αέρια:
—υδρογόνο χρωµατογραφικής καθαρότητας, για χρωµατογραφία
αερίου φάσεως,1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—18
▼M6
—αέρας χρωµατογραφικής καθαρότητας, για χρωµατογραφία
αερίου φάσεως.
5. ∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ
5.1. ∆ιαχωρισµός του κλάσµατος των κηρών.
5.1.1. Προετοιµασία της χρωµατογραφικής στήλης.
Φέρονται σε αιώρηση 15 gένυδρουsilicagel σε αναλογία 21 %
µέσα στο άνυδρο κανονικό εξάνιο και το µείγµα εισάγεται στη
στήλη.
Μετά από αυτόµατη καθίζηση, αναδεύεται µε τη βοήθεια ηλεκ-
τρικού αναδευτήρα ώστε το χρωµατογραφικό στρώµα να γίνει
πιο οµογενές. ∆ιηθούνται 30 mlκανονικού εξανίου για αποµά-
κρυνση τυχόν ξένων προσµείξεων.
5.1.2. Εκτέλεση της χρωµατογραφίας επί στήλης.
Ζυγίζονται µε ακρίβεια 500 mgτου δείγµατος εκτός της φιάλης
Ertenmeyer των 25ml,προστίθεται η κατάλληλη ποσότητα εσωτε-
ρικού προτύπου, ανάλογα µε την εκτιµώµενη περιεκτικότητα σε
κηρούς. Για παράδειγµα, προστίθεται 0,1 mgλαυρικής αραχιδικής
ένωσης στην περίπτωση του ελαιολάδου, και 0,25 έως 0,50 mg
στην περίπτωση του πυρηνελαίου.
Το παραπάνω δείγµα µεταφέρεται στη στήλη (στην οποία έχει
γίνει η προετοιµασία που περιγράφεται στο σηµείο 5.1.1) µε τη
βοήθεια δύο ποσοτήτων κανονικού εξανίου των 2 mlη καθεµία.
Ο διαλύτης αφήνεται να ρεύσει µέχρι ύψους 1 mmυπεράνω του
απορροφητικού υλικού, οπότε αρχίζει η χρωµατογραφική
έκλουση. Συλλέγονται 140 mlµείγµατος κανονικού εξανίου -αιθυ-
λαιθέρα 99:1, µε ροή 15 περίπου σταγόνων ανά 10 δευτερόλεπτα
(2,1ml/min).
Το ούτω λαµβανόµενο κλάσµα ξηραίνεται µέσα στον περιστρο-
φικό βραστήρα µέχρι πλήρους σχεδόν εξατµίσεως του διαλύτη.
Τα εναποµένοντα 2 ή 3 mlδιαλύτου αποµακρύνονται διά διαβιβά-
σεως ελαφρού ρεύµατος αζώτου. Εν συνεχεία, προστίθενται 10 ml
κανονικού επτανίου.
5.2. Ανάλυση διά χρωµατογραφίας αερίου φάσεως.
5.2.1. Προκαταρκτικές εργασίες, ρύθµιση της στήλης.
5.2.1.1. Τοποθετείται η στήλη µέσα στον χρωµατογράφο αερίου φάσεως,
διά συνδέσεως του άκρου εισόδου µε το σύστηµα «επί στήλης»
(on-colum) και το άκρο εξόδου µε τον ανιχνευτή.
Πραγµατοποιούνται οι συνήθεις έλεγχοι της συσκευής χρωµατο-
γραφίας αερίου φάσεως (στεγανότητα των κυκλωµάτων των
αερίων, αποτελεσµατικότητα του ανιχνευτή και του συστήµατος
καταγραφής, κ.λπ.).
5.2.1.2. Αν η στήλη χρησιµοποιείται για πρώτη φορά, συνιστάται η
ρύθµισή της. ∆ιαβιβάζεται ελαφρό ρεύµα αερίου µέσω της
στήλης και εν συνεχεία η συσκευή τίθεται σε λειτουργία.
Θερµαίνεται σταδιακά µέχρι θερµοκρασίας κατά 20 ºCτουλάχι-
στον υψηλότερης από τη θερµοκρασία λειτουργίας (βλέπε
σηµείωση). Η θερµοκρασία αυτή διατηρείται επί 2 τουλάχιστον
ώρες και εν συνεχεία γίνεται ρύθµιση της συσκευής στις
συνθήκες λειτουργίας (ρύθµιση της ροής των αερίων, αφή της
φλόγας, σύνδεση µε τον ηλεκτρονικό καταγραφέα, ρύθµιση της
θερµοκρασίας του θαλάµου για τη στήλη, ρύθµιση του ανιχνευτή,
κ.λπ.) και καταγράφεται το σήµα µε ευαισθησία τουλάχιστον δύο
φορές µεγαλύτερη από την προβλεπόµενη για την εκτέλεση της
ανάλυσης. Η βασική καµπύλη πρέπει να είναι γραµµική, χωρίς
κορυφές και παρεκκλίσεις.
Ευθύγραµµη αρνητική παρέκκλιση σηµαίνει κακή επαφή των
συνδέσεων της στήλης ·αρνητική παρέκκλιση σηµαίνει ανεπαρκή
ρύθµιση της στήλης.
Σηµείωση: Η θερµοκρασία ρύθµισης θα πρέπει πάντως να είναι
κατά 20ºCτουλάχιστον χαµηλότερη από τη µέγιστη
θερµοκρασία που προβλέπεται για το χρησιµοποιού-
µενο υγρό έκλουσης.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—19
▼M6
5.2.2. Επιλογή των συνθηκών εργασίας
5.2.2.1. Κατά γενικόν κανόνα, έχουν ως εξής:
—θερµοκρασία της στήλης:80 ºCστην αρχή, αύξηση εν συνε-
χεία κατά 30 ºC/min µέχρι τους 120 ºCκαι κατόπιν
προγραµµατισµένη αύξηση κατά 5 ºC/min µέχρι τους 340ºC,
—θερµοκρασία του ανιχνευτή:350 ºC,
—γραµµική ταχύτητα του φέροντος αερίου:υδρογόνο 20 έως 35
cm/s,
—ευαισθησία των οργάνων:το 4 -πλάσιο έως 16-πλάσιο της
ελάχιστης εξασθένησης,
—ευαισθησία καταγραφής:1 έως 2 mVτης βασικής κλίµακας,
—ταχύτητα εκτύλιξης του χαρτιού:30 cm/h,
—ποσότητα εγχεόµενης ουσίας:0,5 έως 1 µ lδιαλύµατος.
Οι συνθήκες αυτές µπορούν να µεταβάλλονται ανάλογα µε τα
χαρακτηριστικά της στήλης και της συσκευής έτσι ώστε να
λαµβάνονται χρωµατογραφήµατα που να ικανοποιούν τις
ακόλουθες συνθήκες:
—ο χρόνος κατακράτησης C32 πρέπει να είναι 25 ±2min, και
—η αντιπροσωπευτικότερη κορυφή των κηρών πρέπει να
βρίσκεται µεταξύ 60 και 100 %της βασικής κλίµακας.
5.2.2.2. Οι παράµετροι ολοκλήρωσης των κορυφών πρέπει νακθορίζονται
κατά τρόπον ώστε να υπολογίζονται σωστά τα εµβαδά των εξετα-
ζόµενων καµπυλών.
5.2.3. Εκτέλεση της ανάλυσης
5.2.3.1. Λαµβάνεται 1 µlδιαλύµατος µε τη µικροσύριγγα των 10 µ lκαι
αποσύρεται το έµβολο της σύριγγας έτσι ώστε η βελόνα να
αδειάσει. Εισάγεται η βελόνα στη διάταξη έγχυσης και µετά
από 1 έως 2secεγχέεται το διάλυµα γρήγορα. Μετά από 5 sec
περίπου, η βελόνα αφαιρείται αργά.
5.2.3.2. Γίνεται καταγραφή µέχρι πλήρους εκλούσεως των κηρών.
Η βασική καµπύλη πρέπει πάντοτε να ανταποκρίνεται στις απαι-
τούµενες συνθήκες (βλέπε σηµείο 5.2.1.2).
5.2.4. Αναγνώριση των κορυφών
Η αναγνώριση των διαφόρων κορυφών πρέπει να γίνεται βάσει
των χρόνων κατακράτησης και διά συγκρίσεως µε µείγµατα
κηρών γνωστών χρόνων κατακράτησης, που αναλύθηκαν υπό τις
ίδιες συνθήκες.
Το σχήµα 1 εµφαίνει χρωµατογράφηµα κηρών παρθένου
ελαιολάδου.
5.2.5. Ποσοτικός προσδιορισµός
5.2.5.1. Υπολογίζονται τα εµβαδά των καµπυλών του εσωτερικού
προτύπου και των αλειφατικών εστέρων µε άτοµα άνθρακος από
40 έως 46, µε τη βοήθεια του ολοκληρωτή.
5.2.5.2. Υπολογίζεται (σε mg/kg λιπαρής ουσίας) η περιεκτικότητα σε
κηρούς (για καθένα από τους εστέρες) βάσει του τύπου:
εστέρας (mg/kg)=Ax·ms·►M91000◄
As·m
όπου:
Αx=εµβαδόν της καµπύλης κάθε εστέρα
As=εµβαδόν της καµπύλης της λαυρικής αραχιδικής ένωσης
ms=µάζα της προστιθέµενης λαυρικής αραχιδικής ένωσης, σε
mg
m= µάζα του αφαιρούµενου για τον προσδιορισµό δείγµατος,
σεg.
6. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
∆ίδεται η περιεκτικότητα σε καθέναν από τους κηρούς, καθώς και
η συνολική τους περιεκτικότητα, σε mg/kg λιπαρής ουσίας.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—20
▼M6
ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ
Προσδιορισµός της γραµµικής ταχύτητας του αερίου
Εγχέονται 1 έως 3 µ lµεθανίου (ή προπανίου) στον χρωµατογράφο αερίου
φάσεως, µετά τη ρύθµισή του σε κανονικές συνθήκες λειτουργίας.
Χρονοµετρείται η διαδροµή του αερίου µέσω της στήλης από τη στιγµή
της έγχυσης µέχρι τη στιγµή εµφάνισης της κορυφής.
Η γραµµική ταχύτητα (σε cm/sec) δίδεται από το κλάσµα L/tM, όπουLτο
µήκος της στήλης σε cmκαιtMο µετρηθείς χρόνος σε sec.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—21
▼M61991R2568—EL—22.05.2002—019.001—22
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ V
ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟΥ
ΤΩΝ ΣΤΕΡΟΛΩΝ ∆Ι 'ΑΕΡΙΟΥ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΜΕ ΤΡΙΧΟΕΙ∆Η
ΣΤΗΛΗ
1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ
Η µέθοδος περιγράφει τη διαδικασία προσδιορισµού των περιε-
χοµένων στερολών, σε µια λιπαρή ουσία, µεµονωµένων και
ολικών.
2. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟ∆ΟΥ
Η λιπαρή ουσία στην οποία έχει προστεθεί α -χολεστανόλη ως
εσωτερικό πρότυπο, σαπωνοποιείται µε αιθανολικό διάλυµα υδρο-
ξειδίου του καλίου ·έπειτα τα ασαπωνοποίητα συστατικά
εκχυλίζονται µε αιθυλικό αιθέρα. Το στερολικό κλάσµα διαχωρί-
ζεται από τα ασαπωνοποίητα συστατικά δια χρωµατογραφίας επί
βασικής πλάκας silicagel· οι στερόλες που λαµβάνονται στο silica
gelµετατρέπονται σε τριµεθυλοσιλιλαιθέρες και αναλύονται µε
αέριο χρωµατογραφία µε τριχοειδείς στήλες.
3. ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ
3.1. Σφαιρική φιάλη των 250 mlεφοδιασµένη µε κάθετο ψυκτήρα µε
εσµυρισµένα άκρα.
3.2. ∆ιαχωριστική χοάνη των 100 ml.
3.3. Σφαιρικές φιάλες των 250 ml.
3.4. Πλήρης εξοπλισµός για χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδος µε
γυάλινες πλάκες των 20 ×20cm.
3.5. Λυχνία υπεριώδους φωτός, µήκους κύµατος 366 ή 254 nm.
3.6. Μικροσύριγγες των 100 και 500 ml.
3.7. ∆ιηθητική κυλινδρική χοάνη µε πορώδες φίλτρο G3( πορώδους
15 έως 40 µm)διαµέτρου 2cmπερίπου και ύψους 5 cmµε άκρο
κατάλληλο για διήθηση σε κενό αέρος και εσµυρισµένο άκρο
αρσενικό 12/21.
3.8. Φιάλη εν κενώ των 50 mlµε εσµυρισµένο άκρο θηλυκό 12 /21
προσαρµόσιµο στη διηθητική χοάνη (3.7).
3.9. Σωλήνας µε κωνική βάση, των 10 ml,µε πώµα ασφαλείας.
3.10. Αέριος χρωµατογράφος κατάλληλος για λειτουργία µε τριχοειδή
στήλη εφοδιασµένος µε σύστηµα διαχωρισµού, αποτελούµενο
από:
3.10.1. Θερµοστατούµενο θάλαµο, για τη στήλη, ο οποίος επιτρέπει τη
διατήρηση της επιθυµητής θερµοκρασίας µε ακρίβεια ±1ºC.
3.10.2. Σύστηµα εξάτµισης µε ρυθµιζόµενη θερµοκρασία και µε σιλανι-
σµένο γυάλινο χώρο.
3.10.3. Ανιχνευτή ►C1ιονιζούσης φλογός ◄και µεταλλάκτη -ενισ-
χυτή.
3.10.4. Καταγραφέα-ολοκληρωτή κατάλληλο για λειτουργία µε
µεταλλάκτη-ενισχυτή.
3.11. Τριχοειδής στήλη από γυαλί ή τετηγµένο οξείδιο του πυριτίου,
µήκους 20 έως 30 m,εσωτερικής διαµέτρου 0,25 έως 0,32 mm,
καλυµµένη εσωτερικώς µε υγρό SE-52 ήSE-54 ή άλλο ανάλογο,
οµοιόµορφου πάχους µεταξύ 0,10 και 0,30 µ m.
3.12. Μικροσύριγγες για χρωµατογραφία αέριας φάσης των 10 µ lµε
σκληρυµένη βελόνα.
4. ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ
4.1. Αιθανολικό διάλυµα υδροξειδίου του καλίου περίπου 2 N:
διαλύονται, ψύχοντας ταυτόχρονα, 130 gυδροξείδιου του καλίου
(κατώτατου τίτλου 85 %)µέσα σε 200mlαπεσταγµένου ύδατος,
έπειτα συµπληρώνονται µε αιθανόλη µέχρι το ένα λίτρο. Το1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—23
▼B
διάλυµα διατηρείται ►C1µέσα σε σκοτεινά και καλά κλεισµένα
µπουκάλια ◄.
4.2. Αιθυλικός αιθέρας αναλυτικής καθαρότητας.
4.3. Άνυδρο θειικό νάτριο, αναλυτικής καθαρότητας.
4.4. Γυάλινες πλάκες καλυµµένες µε silica gel χωρίς δείκτη φθορι-
σµού, πάχους 0,25 mm( διατίθενται στο εµπόριο έτοιµες ήδη για
χρήση).
4.5. Αιθανολικό διάλυµα υδροξειδίου του καλίου 0,2 N:διαλύονται
13gυδροξείδιου του κάλιου µέσα σε 20 mlαπεσταγµένου ύδατος,
έπειτα συµπληρώνονται µέχρι το ένα λίτρο µε µεθανόλη.
4.6. Βενζόλιο, χρωµατογραφικής καθαρότητας (5.2.2).
4.7. Ακετόνη, χρωµατογραφικής καθαρότητας (5.2.2).
4.8. Εξάνιο, χρωµατογραφικής καθαρότητας (5.2.2).
4.9. Αιθυλικός αιθέρας, χρωµατογραφικής καθαρότητας (5.2.2).
4.10. Χλωροφόρµιο, αναλυτικής καθαρότητας.
4.11. ∆ιάλυµα αναφοράς για χρωµατογραφία επί πλακός:χοληστερόλη
ή φυτοστερόλη, διάλυµα ►M62%◄σε χλωροφόρµιο.
4.12. Αιθανολικό διάλυµα 2 ′-7′διχλωροφλονορεσκεΐνης 0,2 %.Έχει
γίνει ελαφρά αλκαλικό µε την προσθήκη µερικών σταγόνων
αλκοολικού διαλύµατος υδροξειδίου του καλίου, 2 N.
4.13. Άνυδρη πυριδίνη, χρωµατογραφικής καθαρότητας.
4.14. Εξαµεθυλοδισιλαζάνιο ( Hexamethyldisalazane).
4.15. Τριµεθυλοχλωροσιλάνιο.
4.16. ∆ιάλυµα αναφοράς των τριµεθυλοσιλιλαιθέρων των στερολών:
παρασκευάζεται τη στιγµή της χρήσης από τις στερόλες που
λαµβάνονται από τα έλαια που τις περιείχαν.
4.17. α-χολεστανόλη, διάλυµα 0,2 %(m/V) σε χλωροφόρµιο (εσωτερικό
πρότυπο).
4.18. Φέρον αέριον:υδρογόνο ή ήλιο, χρωµατογραφικής καθαρότητας.
4.19. Βοηθητικά αέρια:υδρογόνο ή ήλιον, χρωµατογραφικής καθα-
ρότητας.
5. ΜΕΘΟ∆ΟΣ
5.1. Παρασκευή των ασαπωνοποίητων συστατικών.
5.1.1. Εισάγεται στη σφαιρική φιάλη των 250 ml,δια µικροσύριγγας
των 500 µl,όγκος διαλύµατος α -χολεστανόλης 0,2 %σε χλωρο-
φόρµιο (4.17) που περιέχει ποσότητα ►C1α-χολεστανόλης ◄
που αντιστοιχεί σε 10 %περίπου των στερολών που περιέχονται
στο δείγµα που κρατήθηκε για τον προσδιορισµό. Για
παράδειγµα, για 5 gδείγµατος, πρέπει να προστεθούν 500 µ l
διαλύµατος α-χολεστανόλης 0,2 %,εάν πρόκειται για δείγµα
ελαιολάδου, και 1500 µl, εάν πρόκειται για
►M6 ◄πυρηνέλαιο.
Εξατµίζεται τα χλωροφόρµιο σε ρεύµα αζώτου µέχρι να αποξηρα-
νθεί, έπειτα ζυγίζονται ακριβώς 5 gξηρού διηθηµένου δείγµατος
στην ίδια σφαιρική φιάλη.
Στην περίπτωση των ελαίων ►M6 ◄τα οποία
περιέχουν σηµαντικές ποσότητες χοληστερόλης, µπορεί να εµφα-
νιστεί κορυφή η οποία έχει τον ίδιο χρόνο κατακράτησης µε
αυτόν της χολεστανόλης. Σε αυτές τις περιπτώσεις, πρέπει να
αναλύεται το στερολικό κλάσµα εις διπλούν, µε και χωρίς εσωτε-
ρικό πρότυπο ►M6ή να χρησιµοποιείται βετουλινόλη αντί
χοληστανόλης ◄.
5.1.2. Προστίθενται 50 mlαιθανολικού διαλύµατος υδροξείδιου του
καλίου 2N,τίθεται σε λειτουργία ο κάθετος ψυκτήρας, θερµαί-
νεται σε υδατόλουτρο µέχρι ήπιο βρασµό, ανακινώνταςταυτόχρονα δυνατά µέχρι να πραγµατοποιηθεί η σαπωνοποίηση
(το διάλυµα γίνεται διαυγές). Συνεχίζεται η θέρµανση για 20
λεπτά, έπειτα προστίθενται 50 mlαπεσταγµένου ύδατος τα οποία
ρίχνονται από το επάνω µέρος του ψυκτήρα, αποσυνδέεται ο
ψυκτήρας και ψύχεται η σφαιρική φιάλη στους 30 ºC.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—24
▼B
5.1.3. Μεταγγίζεται ποσοτικώς το περιεχόµενο της σφαιρικής φιάλης
σε διαχωριστική χοάνη των 500 ml,µε τη βοήθεια απεσταγµένου
ύδατος, πολλές φορές, χρησιµοποιώντας συνολικά περίπου 50 ml.
Προστίθενται περίπου 80 mlαιθυλικού αιθέρα, ανακινώντας
δυνατά για περίπου 30 δευτερόλεπτα, και αφήνεται να πραγµατο-
ποιηθεί ο διαχωρισµός (Σηµείωση 1).
∆ιαχωρίζεται η κάτω υδατική φάση συλλέγοντάς τη µέσα σε µια
άλλη φιάλη µετάγγισης. Πραγµατοποιούνται ακόµη δύο εκχυλί-
σεις της υδατικής φάσης, σύµφωνα µε τις ίδιες οδηγίες,
χρησιµοποιώντας κάθε φορά 60 -70ml αιθυλικού αιθέρα.
Σηµείωση 1: Τα πιθανά γαλακτώµατα µπορούν να καταστραφούν
προσθέτοντας µικρές ποσότητες αιθυλικής ή µεθυ-
λικής αλκοόλης δια ψεκασµού.
5.1.4. Συγκεντρώνονται τα αιθερικά εκχυλίσµατα σε µια µόνο διαχωρι-
στική χοάνη και πλένονται µε απεσταγµένο ύδωρ (50 mlκάθε
φορά) µέχρι ουδέτερης αντίδρασης του ύδατος έκπλυσης.
Αφού αποµακρυνθεί το ύδωρ έκπλυσης, ξηραίνονται µε άνυδρο
θειικό νάτριο και διηθούνται, πάνω σε άνυδρο θειικό νάτριο, σε
προζυγισµένη σφαιρική φιάλη των 250 ml,πλένοντας φιάλη και
φίλτρο µε µικρές ποσότητες αιθυλικού αιθέρα.
5.1.5. Αποστάζεται ο αιθέρας µέχρις ότου να αποµείνει µικρή
ποσότητα, έπειτα αποξηραίνεται σε ελαφρό κενό ή σε ρεύµα
αζώτου, ολοκληρώνεται η ξήρανση στον κλίβανο στους 100 ºC
για ένα τέταρτο της ώρας περίπου και ζυγίζεται µετά από ψύξη
σε ξηραντήρα.
5.2. ∆ιαχωρισµός του στερολικού κλάσµατος.
5.2.1. Προετοιµασία των βασικών πλακών:βυθίζονται οι πλάκες από
silicagel(4.4), τελείως, µέσα σε µεθανολικό διάλυµα 0,2 Nυδρο-
ξείδιου του κάλιου (4.5) για 10 δευτερόλεπτα, αφήνονται στη
συνέχεια κλεισµένες σε σκοτεινό θάλαµο για δύο ώρες και
τοποθετούνται τελικά στον κλίβανο σε 100 ºCγια µία ώρα.
Βγαίνουν από τον κλίβανο και διατηρούνται µέσα σε ένα ξηραν-
τήρα µε χλωριούχο ασβέστιο µέχρι τη στιγµή της χρήσης (οι κατ '
αυτόν τον τρόπο επεξεργασµένες πλάκες πρέπει να χρησιµο-
ποιούνται µέσα σε δεκαπέντε µέρες).
Σηµείωση 2: Η χρήση των βασικών πλακών silica gel για το
διαχωρισµό του στερολικού κλάσµατος καταργεί
την ανάγκη επεξεργασίας των ασαπωνοποίητων
συστατικών µε την αλουµίνα. Με αυτόν τον τρόπο,
όλα τα όξινα συστατικά (λιπαρά οξέα και άλλα)
συγκρατούνται στη γραµµή εναπόθεσης. Επιτυγχά-
νεται έτσι η ζώνη των στερολών καθαρά
διαχωρισµένη από την ταινία των αλειφατικών και
τερπενικών αλκοολών.
5.2.2. Εισάγεται στο θάλαµο ανάπτυξης ένα µείγµα βενζόλιου -ακετόνης
95/5(V/V) µέχρι ένα ύψος περίπου 1 cm.Είναι δυνατόν στη θέση
του να χρησιµοποιηθεί ένα µείγµα εξάνιου -αιθυλικού αιθέρα 65 /
35(V/V). Ο θάλαµος κλείνεται µε τη βοήθεια ενός κατάλληλου
σκεπάσµατος και αφήνεται έτσι για µισή ώρα τουλάχιστον, έτσι
ώστε να αποκατασταθεί ισορροπία µεταξύ υγρού και ατµού. Είναι
δυνατόν, να τοποθετηθούν στις εσωτερικές επιφάνειες του
θαλάµου λωρίδες από διηθητικό χαρτί βυθισµένες στο υγρό
ανάπτυξης:µε αυτό τον τρόπο θα µειωθεί στο ένα τρίτο περίπου
ο χρόνος µετακίνησης του µετώπου του υγρού και θα επιτευχθεί
περισσότερο οµοιόµορφη έκλουση.
Σηµείωση 3: Για να υπάρξουν αναπαραγώγιµες συνθήκες
έκλουσης, το µείγµα πρέπει να αλλάζει κάθε φορά.
5.2.3. Παρασκευάζεται ένα διάλυµα 5 %περίπου ασαπωνοποίητων
συστατικών (5.1.5) µέσα σε χλωροφόρµιο και µε τη µικροσύριγγα
των 100 µlτοποθετείται στη χρωµατογραφική πλάκα (5.2.1), στα
2cmπερίπου από το ένα άκρο, 0,3 mlτου ανωτέρω διαλύµατος
σε µια συνεχή γραµµή, όσο το δυνατόν πιο λεπτή και οµοιό-
µορφη. Στην ευθεία της γραµµής εναπόδεσης, τοποθετείται στο
ένα άκρο της πλάκας 2 -3µlτου διαλύµατος αναφοράς των
στερολών (4.11), µε σκοπό να προσδιορισθεί η λωρίδα των
στερολών µετά το πέρας της ανάπτυξης.
5.2.4. Τοποθετείται η πλάκα µέσα στο θάλαµο ανάπτυξης, προετοιµα-
σµένη όπως περιγράφεται στην 5.2.2. Η θερµοκρασία
περιβάλλοντος πρέπει να διατηρείται ανάµεσα στους 15 και1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—25
▼B
20ºC.Κλείνεται αµέσως ο θάλαµος µε το σκέπασµα και αφήνεται
µέχρις ότου το µέτωπο του διαλυτή να ανέλθει σε ύψος 1 cmκάτω
από το άνω άκρο της πλάκας. Βγαίνει στη συνέχεια η πλάκα από
το θάλαµο ανάπτυξης και ο διαλύτης εξατµίζεται µέσα σε ρεύµα
ζεστού αέρα ή ακόµη αφήνοντας την πλάκα σε σκοτεινό θάλαµο
για λίγο.
5.2.5. Η πλάκα ψεκάζεται ελαφρά και µε οµοιόµορφο τρόπο µε το
διάλυµα της 2 ′7′διχλωροφλουοροσκεΐνης. Τοποθετείται η λωρίδα
των στερολών δια ευθυγράµµισης µε την κηλίδα που επιτεύχθηκε
µε το διάλυµα αναφοράς ·η λωρίδα οριοθετείται µε ένα µαύρο
µολύβι κατά µήκος των άκρων φθορισµού.
5.2.6. Τοsilicagel που περιέχεται στην οριοθετηµέη ζώνη ξύνεται µε
µια µεταλική σπάτουλα. Το υλικό που αφαιρείται, λεπτά κονιο-
ποιηµένο, εισάγεται σε µια διηθητική χοάνη (3.7). Προστίθενται
10mlθερµού χλωροφόρµιου, αναµιγνύονται προσεκτικά µε τη
µεταλλική σπάτουλα και διηθούνται εν κενώ ·έπειτα συλλέγεται
το διήθηµα στη φιάλη (3.8) που συνδέεται µε τη διηθητική χοάνη.
Πλένεται το υπόλειµµα στη χοάνη τρεις φορές µε αιθυλικό
αιθέρα (περίπου 10 mlκάθε φορά και συλλέγεται όµοια το
διήθηµα µεσα στη φιάλη την προσαρµοσµένη στη διηθητική
χοάνη Εξατµίζεται το διήθηµα µέχρι να φτάσει σ 'έναν όγκο
περίπου 4-5 ml, µεταγγίζεται το αποµένον διάλυµα µέσα στον
προζυγισµένο σωλήνα των 10 ml(3.9), ξεραίνεται θερµαίνοντας
ελαφρά σε ελαφρύ ρεύµα αζώτου, προστίθενται µερικές σταγόνες
ακετόνης, ξεραίνεται εκ νέου, τοποθετείται 10 λεπτά περίπου
στον κλίβανο στους 105 ºC,έπειτα αφήνεται να κρυώσει σε
ξηραντήρα και ζυγίζεται.
Το περιεχόµενο υπόλειµµα µέσα στο σωλήνα αποτελείται από το
στερολικό κλάσµα.
5.3. Παρασκευή των τριµεθυλοσιλιλαιθέρων.
5.3.1. Στο σωλήνα που περιέχει το στερολικό κλάσµα προστίθεται το
αντιδραστήριο σιλανοποίησης αποτελούµενο από µείγµα πυρι-
δίνης-εξαµεθυλοδισιλαζάνιου -τριµεθυλοχλωρισιλάνιον 9 /3/1 (V/
V/V)( Σηµείωση 4) σε αναλογία 50 µ lανά χιλιστό του γραµµαρίου
των στερολών, αποφεύγοντας κάθε απορρόφηση υγρασίας
(Σηµείωση 5).
Σηµείωση 4: Υπάρχουν στο εµπόριο διαλύµατα έτοιµα προς
χρήση·επιπλέον, άλλα αντιδραστήρια σιλιλαιθερο-
ποίησης όπως, για παράδειγµα, το δις -
τριµεθυλοσιλιλακεταµίδιο +1% τριµεθυλοχλωρι-
σιλάνιο διαλυµένο µε τον ίδιο όγκο ανύδρης
πυριδίνης.
5.3.2. Κλείνεται ο σωλήνας, ανακινείται προσεκτικά (χωρίς να
αναστρέφεται) µέχρι την πλήρη διάλυση των στερολών.
Αφήνεται να ηρεµήσει για τουλάχιστον 15 λεπτά στη θερµο-
κρασία περιβάλλοντος, έπειτα φυγοκεντρείται για µερικά λεπτά:
το διαυγές διάλυµα είναι έτοιµο για την ανάλυση δια χρωµατο-
γραφίας αέριας φάσης.
Σηµείωση 5: Ο σχηµατισµός ελαφρού θολώµατος είναι φυσιολο-
γικός και δεν δηµιουργεί καµία επιπλοκή. Ο
σχηµατισµός άσπρων νιφάδων ή η εµφάνιση ροζ
χρώµατος οφείλονται στην παρουσία υγρασίας ή
στη φθορά του αντιδραστηρίου. Σ 'αυτή την
περίπτωση, η δοκιµή πρέπει να επαναληφθεί.
5.4. Ανάλυση δια χρωµατογραφίας αέριας φάσης.
5.4.1. Προπαρασκευαστικές ενέργειες, ρύθµιση των συνθηκών λειτουρ-
γίας της στήλης.
5.4.1.1. Η στήλη εγκαθίσταται µέσα στο χρωµατογράφο αέριας φάσης,
συνδέοντας το άκρο της εισόδου µε τον εξαερωτή τον ενωµένοµε το σύστηµα κλασµατοποίησης και το άκρο της εξόδου µε τον
ανιχνευτή.
Ελέγχεται γενικά η µονάδα του αερίου χρωµατογράφου (διαρροές
στα κυκλώµατα των αερίων, διαχωριστική ικανοτήτα του ανιχ-
νευτή αποτελεσµατικότητα του συστήµατος κλασµατοποίησης
και του συστήµατος καταγραφής κ.λπ.).
5.4.1.2. Εάν η στήλη χρησιµοποιείται για πρώτη φορά, συνιστάται να
κοντισιοναρισθεί. Περνάται ένα ελαφρό ρεύµα αερίου δια µέσου
αυτής της στήλης, έπειτα ανάβεται το σύνολο της χρωµατογρα-1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—26
▼B
φίας αέριας φάσης και ξεκινά η βαθµιαία θέρµανση µέχρι να
φτάσει σε θερµοκρασία το λιγότερο 20 ºCµεγαλύτερη απ'αυτή
της λειτουργίας (Σηµείωση 6). ∆ιατηρείται αυτή η θερµοκρασία
για τουλάχιστον δύο ώρες, έπειτα η µονάδα τίθεται σε συνθήκες
λειτουργίας (ρύθµιση ροής αερίων και της κλασµατοποίησης,
άναµµα της φλόγας, σύνδεση µε τον ηλεκτρονικό καταγραφέα,
ρύθµιση της θερµοκρασίας του θαλάµου για τη στήλη, του ανιχ-
νευτή και του συστήµατος έγχυσης κ.λπ.) και καταγράφεται το
σήµα σε µια ευαισθησία τουλάχιστον δύο φορές µεγαλύτερη από
αυτή που προβλέπεται για την εκτέλεση της ανάλυσης. Η γραµµή
βάσεως που επιτεύχθηκε πρέπει να είναι ευθύγραµµη, χωρίς
κορυφές οιασδήποτε µορφής και παρεκκλίσεις.
Η αρνητική ευθύγραµµη παρέκκλιση δηλώνει διαρροή της
στήλης, µια θετική παρέκκλιση δηλώνει ανεπαρκή ρύθµιση της
στήλης (κοντισιονάρισµα).
Σηµείωση 6: Η θερµοκρασία κοντισιοναρίσµατος, της στήλης
πρέπει να είναι πάντα µικρότερη, τουλάχιστον 20 ºC,
από τη µέγιστη προβλεπόµενη θερµοκρασία για τη
χρησιµοποιούµενη στατική φάση της στήλης.
5.4.2. Επιλογή των συνθηκών εργασίας
5.4.2.1. Οι προτεινόµενες συνθήκες εργασίας είναι οι ακόλουθες:
—θερµοκρασία της στήλης:260 ºC±5ºC,
—θερµοκρασία του συστήµατος εξαερωσης:280 ºC,
—θερµοκρασία του ανιχνευτή:290 ºC,
—γραµµική ταχύτητα του φέροντος αερίου:ήλιο, 20 έως 35 cm/s,
υδρογόνο, 30 έως 50 cm/s,
—σχέση διαχωρισµού:από 1 /50έως 1/100,
—ευαισθησία του οργάνου:4 έως 16 φορές της ελάχιστης ευαι-
σθησίας,
—ευαισθησία καταγραφής:1 -2mVf.s.,
—ταχύτητα του χαρτιού:30 -60cm/ ώρα,
—ποσότητα εγχεόµενης ουσίας:0,5 -1µlτου διαλύµατος των
TMSE.
Αυτές οι συνθήκες µπορούν να µεταβάλλονται σύµφωνα µε τα
χαρακτηριστικά της στήλης και του χρωµατογράφου αέριας
φάσης, έτσι ώστε να επιτυγχάνονται χρωµατογραφήµατα τα οποία
να ικανοποιούν τις ακόλουθες συνθήκες:
—ο χρόνος κατακράτησης της β -σιτοστερόλης πρέπει να είναι
20±5λεπτά,
—η κορυφή της καµπεστερόλης πρέπει να είναι:για το ελαιό-
λαδο (µέσο περιεχόµενο 3 %) 15 ± 5 % της πλήρους
κλιµακος, για το σογιέλαιο (µέσο περιεχόµενο 20 %)80±10%
της πλήρους κλίµακας,
—πρέπει να γίνεται διαχωρισµός όλων των υπαρχουσών
στερολών. Επιπροσθέτως, για να διαχωρισθούν οι κορυφές
πρέπει να έχουν ξεχωρίσει τελείως, πράγµα το οποίο
σηµαίνει ότι η καµπύλη κάθε κορυφής πρέπει να επιστρέψει
στη γραµµή βάσεως πριν ξεκινήσει για την καµπύλη της
επόµενης κορυφής. Ένας ατελής διαχωρισµός είναι, παρ 'όλα
αυτά, ανεκτός, υπό την προϋπόθεση, όµως, ότι θα είναι µετρή-
σιµος ποσοτικά η κορυφή TRR 1,02 χρησιµοποιώντας την
κάθετο.
5.4.3. Εκτέλεση της ανάλυσης
5.4.3.1. Λαµβάνεται, µε µια µικροσύριγγα των 10 µ l,1µlεξάνιο, αναρρο-
φούνται 0,5 µlαέρα και έπειτα 0,5 -1µlτου διαλύµατος του
δείγµατος·επίσης τραβιέται το έµβολο της σύριγγας έτσι ώστε η
βελόνα να είναι κενή. Εισάγεται η βελόνα µέσω της µεµβράνης
του συστήµατος έγχυσης και, µετά από 1 -2δευτερόλεπτα,
εγχύεται γρήγορα και ύστερα βγαίνει η βελόνα αργά, µετά από 5
δευτερόλεπτα περίπου.
5.4.3.2. Η καταγραφή προχωρά µέχρι την πλήρη έκλουση των TMSE των
παρουσών στερολών.
Η γραµµή βάσεως πρέπει πάντα να πληροί τις απαιτούµενες
προϋποθέσεις (5.4.1.2).
5.4.4. Ταυτοποίηση των κορυφών1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—27
▼B
Η ταυτοποίηση των κορυφών πραγµατοποείται µε βάση το χρόνο
κατακράτησης και σε σύγκριση µε το µείγµα των TMSE των
στερολών, αναλυόµενων υπό τις ίδιες συνθήκες.
Οι στερόλες εκλούονται µε την ακόλουθη σειρά:χοληστερόλη,
βρασικαστερόλη, ►C124-µεθυλενο ◄-χοληστερόλη, καµπε-
στερόλη, καµπεστανόλη, στιγµαστερόλη, ∆7 καµπεστερόλη, ∆5,
23 στιγµασταδιενόλη, ►C1κλεροστερόλη ◄,Β-σιτοστερόλη,
σιτοστανόλη, ∆5 -αβεναστερόλη, 5,24 στιγµασταδιενόλη, ∆7 -
στιγµαστενόλη, ∆7 -αβεναστερόλη.
Στον πίνακαIαναφέρονται οι χρόνοι κατακράτησης οι σχετικοί
µε τη σιτοστερόλη για τις στήλες SE52 καιSE54.
Τα σχήµατα 1 και 2 παρουσιάζουν τα τυπικά χρωµατογραφήµατα
µερικών ελαίων.
5.4.5. Ποσοτική αξιολόγηση
5.4.5.1. Πραγµατοποιείται, µε τον ολοκληρωτή, ο υπολογισµός του
εµβαδού των κορυφών της α -χολεστανόλης και των στερολών.
Να µην λαµβάνονται υπόψη οι πιθανές κορυφές των συστατικών
που δεν περιέχονται σε αυτά που αριθµούνται στον πίνακα I.Ο
ανάλογος συντελεστής για την α -χολεστανόλη πρέπει να είναι
ίσος µε 1.
5.4.5.2. Υπολογίζεται η συγκέντρωση κάθε στερόλης ξεχωριστά σε mg/
100g λιπαρής ουσίας, ως ακολούθως:
στερόληX=Ax·ms·100
As·m
όπου:
Ax=εµβαδόν της κορυφής της στερόλης x
►M6 ◄,
As=εµβαδόν της κορυφής της α -χολεστανόλης
►M6 ◄,
ms=βάρος της α-χολεστανόλης που προσετέθη, σε χιλιοστά
του γραµµαρίου,
µ=βάρος του δείγµατος που λήφθηκε για τον προσδιορισµό,
σε γραµµάρια.
6. ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
6.1. Αναφέρονται οι συγκεντρώσεις για καθεµία από τις στερόλες
ξεχωριστά σεmg/100g λιπαρής ουσίας, και το άθροισµα τους ως
«ολικές στερόλες».
6.2. Υπολογίζεται η εκατοστιαία αναλογία κάθε µεµονωµένης
στερόλης από το λόγο του εµβαδού της αντίστοιχης κορυφής
προς το άθροισµα των εµβαδών των κορυφών των στερολών.
%στερόληςx=Ax
∑A×100
όπου:
Ax=εµβαδόν της κορυφής x,
∑A= άθροισµα των εµβαδών όλων των κορυφών.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—28
▼B
ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ I
Προσδιορισµός της γοαµµικής ταχύτητας του αερίου
Στο χρωµατογράφο αέριας φάσης, ρυθµισµένο στς κανονικές συνθήκες
λειτουργί ας, εγχέονται 1 έως 3 µ lµεθάνιου (ή προπάνιου) και χρονο-
µετράται ο χρόνος που χρειάζεται το αέριο για να διασχίσει τη στήλη,
από τη στιγµή της έγχυσης έως την εµφάνιση της κορυφής ( tM).
Η γραµµική ταχύτητα σε cm/s δίνεται από τη σχέση L/tM, όπουLείναι το
µήκος της στήλης σε εκατοστά και tMο χρονοµετρηµένος χρόνος σε
δευτερόλεπτα.
ΠίνακαςI
Σχετικοί χρόνοι κατακράτησης των στερολών
Κορυ-
φήΤαυτοποίησηΣχετικός χρόνος
κατακράτησης
Στήλη
SE54Στήλη
SE52
1 χοληστερόλη ∆5 -χοληστεν-3β-ολη 0,67 0,63
2 ►C1χολεστανόλη ◄5α-χολησταν-3β-ολη 0,68 0,64
3 βρασσικαστερόλη [24S]-24- µεθυλ-∆5,22-χολεσταδιεν-
3β-ολη0,73 0,71
4 24- µεθυλένιο χοληστε-
ρόλη24-µεθυλένιο,∆5,24-χολεσταδιεν-3β-
ολη0,82 0,80
5 καµπεστερόλη [24R]-24- µεθυλ-∆5χοληστεν-3β-όλη0,83 0,81
6 καµπεστανόλη [24]24- µεθυλ-χολησταν-3β-ολη0,85 0,82
7 στιγµαστερόλη [24S]-24- αιθυλ-∆5,22-χολεσταδιεν-
3β-ολη0,88 0,87
8 ∆7-καµπεστερόλη [24R]-24- µεθυλ-∆7-χοληστεν-3β-ολη0,93 0,92
9 ∆5,23-στιγµασταδιε-
νόλη[24R,S]-24- αιθυλ-∆5,23-χολεσταδιεν-
3β-ολη0,95 0,95
10 ►C1κλεροστερόλη ◄[24S]-24- αιθυλ-∆5,25-χολεσταδιεν-
3β-ολη0,96 0,96
11 β-σιτοστερόλη [24R]-24- αιθυλ-∆5-χολεσταν-3β-ολη1,00 1,00
12 σιτοστανόλη 24-αιθυλ-χολησταν-3β-ολη 1,02 1,02
13 ∆5-αβεναστερόλη [24Z]-24- αιθυλιδεν-∆5-χολησταν-3β-
ολη1,03 1,03
14 ∆5,24 στιγµαστα-
διενόλη[24R,S]-24- αιθυλ-∆5,24-χολεσταδιεν-
3β-ολη1,08 1,08
15 ∆7-στιγµαστενόλη [24R,S]-24- αιθυλ-∆7,24-χολεσταδιεν-
3β-ολη1,12 1,12
16 ►C117-αβεναστε-
ρόλη◄[24Z]-24- αιθυλιδεν-∆7-χολεστεν-3β-
ολη1,16 1,161991R2568—EL—22.05.2002—019.001—29
▼B
Σχήµα 1
Χρωµατογραφία αέριας φάσης του στερολικού κλάσµατος ακατέργαστου
ελαιολάδου
1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—30
▼B
Σχήµα 2
Χρωµατογραφία αέριας φάσης του στερολικού κλάσµατος εξευγενισµένου
ελαιολάδου
1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—31
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ VI
ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΡΥΘΡΟ∆ΙΟΛΗΣ ΚΑΙ ΟΥΒΑΟΛΗΣ
ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Η ερυθροδιόλη (συνήθως γνωστή ως η διόλη ερυθροδιόλη µαζί µε
τη διόλη ουβαόλη) είναι ένα συστατικό του µη σαπωνοποιήσιµου
κλάσµατος, χαρακτηριστικού ορισµένων τύπων λιπαρών ουσιών.
Συναντάται σε σηµαντικά υφηλότερες συγκεντρώσεις σε ελαιόλαδο
εξ εκχυλίσεως από ό,τι σε άλλα έλαια, (όπως ελαιόλαδο εξ εκθλί-ψεως και έλαιο σταφυλόσπορου, τα οποία την περιέχουν επίσης)
και εποµένως η παρουσία της µπορεί να υποδηλώνει τη παρουσία
ελαιόλαδου εξ εκχυλίσεως.
1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ
Η µέθοδος περιγράφει µία διαδικασία ανίχνευσης ερυθροδιόλης σε
λιπαρές ουσίες.
2. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟ∆ΟΥ
Η λιπαρή ουσία σαπωνοποιείται µε υδροξείδιο του καλίου σε αιθα-
νολικό διάλυµα. Το µη σαπωνοποιήσιµο κλάσµα εκχυλίζεται
κατόπιν µε αιθυλικό αιθέρα και καθαρίζεται µε διέλευση µέσα
από στήλη αλουµίνας.
Τα µη σαπωνοποιήσιµα µέρη υπόκεινται σε χρωµατογραφία λεπτής
στοιβάδας σε πλάκα διοξείδιου του πυρίτιου έως ότου διαχωρι-
στούν οι στοιβάδες που αντιστοιχούν στα κλάσµατα στερολών και
ερυθροδιόλης. Οι επανακτούµενες από την πλάκα στερόλες και η
ερυθροδιόλη µετατρέπονται σε τριµεθυλοσιλυλοαιθέρες και το
µείγµα αναλύεται µε αέρια χρωµατογραφία.
Το αποτέλεσµα εκφράζεται ως το ποσοστό ερυθροδιόλης στο
µείγµα ερυθροδιόλης και στερολών.
3. ΟΡΓΑΝΑ
3.1. Τα όργανα περιγράφονται στο παράρτηµα V(προσδιορισµός της
περιεκτικότητας σε στερόλες).
4. ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ
4.1. Τα αντιδραστήρια περιγράφονται στο παράρτηµα V(προσδιορι-
σµός της περιεκτικότητας σε στερόλες).
4.2. ∆ιάλυµα αναφοράς ερυθροδιόλης, διάλυµα 0,5 %σε χλωροφόρµιο.
5. ∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ
5.1. Προπαρασκευή των ασαπωνοποιήτων.
Όπως περιγράφεται στη παράγραφο 5.1.2. του παραρτήµατος V.
5.2. ∆ιαχωρισµός της ερυθροδιόλης και των στερολών.
5.2.1. Βλέπε παράγραφο 5.2.1 της µεθόδου του παραρτήµατος V.
5.2.2. Βλέπε παράγραφο 5.2.2 της ανωτέρω µεθόδου.
5.2.3. Παρασκευάζεται διάλυµα 5 %των ασαπωνοποιήτων σε χλωρο-
φόρµιο. Χρησιµοποιώντας τη µικροσύριγγα του 0,1 ml,στρώνεται
µία χρωµατογραφική πλάκα µε 0,3 mlδιαλύµατος περίπου 1,5 cm
από το κατώτερο άκρο σε µία γραµµή κατά το δυνατό λεπτή και
οµοιόµορφη. Στη µία άκρη της πλάκας τοποθετούνται λίγα µικρο-
λίτρα από τα διαλύµατα χολεστερόλης και ερυθροδιόλης ως
αναφορά.
5.2.4. Η πλάκα τοποθετείται µέσα στο θάλαµο ανάπτυξης που έχει
προετοιµαστεί κατά τα καθοριζόµενα στην 5.2.1. Η θερµοκρασία
του περιβάλλοντος πρέπει να είναι περίπου 20 ºC.Ο θάλαµος κλεί-
νεται αµέσως µε το κάλυµµα και αφήνεται να γίνει έκλουση έως
ότου το µέτωπο του διαλύτη φτάσει σε απόσταση περίπου 1 cm
από το ανώτερο άκρο της πλάκας. Κατόπιν η πλάκα αποµακρύνεται
από το θάλαµο ανάπτυξης και ο διαλύτης εξατµίζεται σε ρεύµα
θερµού αέρα.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—32
▼B
5.2.5. Η πλάκα ψεκάζεται ελαφρά και οµοιόµορφα µε το αλκοολικό
διάλυµα της ►C12-7διχλωροφλουορεσκεΐνης ◄.Όταν η πλάκα
παρατηρείται υπό υπεριώδες φώς, οι στοίβαδες των στερολών και
της ερυθροδιόλης µπορούν να αναγνωρισθούν από την ευθυγράµ-
µισή τους µε τις κηλίδες αναφοράς. Τα όρια της περιοχής
φθορισµού σηµαίνονται µε ένα σηµάδι µόλις έξω από αυτά.
5.2.6. Χρησιµοποιώντας µία µεταλλική σπάτουλα, αποξέεται το πήγµα
διοξείδιου του πυρίτιου εντός των σηµανθέντων περιοχών από τη
πλάκα και µεταφέρεται σε φιάλη των 50 ml.Προστίθενται 15 ml
θερµού χλωροφόρµιου, αναδεύονται καλά και διηθούνται µέσα από
χωνί µε διάτρητο γυάλινο δίσκο, έτσι ώστε το πήγµα του διοξεί-
διου του πυρίτιου να µεταφερθεί στον ηθµό. Εκπλύεται τρείς
φορές µε θερµό χλωροφόρµιο (10 mlκάθε φορά), συλλέγοντας το
διήθηµα σε φιάλη των 100 ml.Το διήθηµα συµπυκνώνεται µέχρις
όγκου 4-5 ml, µεταφέρεται σε βαθµονοµηµένο σωλήνα φυγο-
κέντρησης των 10 ml,µε κωνικό πυθµένα, ξηραίνεται µε ήπια
θέρµανση σε ρεύµα αζώτου και ζυγίζεται.
5.3. Παρασκευή των τριµεθυλοσιλυλοαιθέρων.
Όπως περιγράφεται στη παράγραφο 5.3 της µεδόδου που παραρτή-
µατοςV.
5.4. Αέρια χρωµατογραφική ανάλυση.
Όπως περιγράφεται στη παράγραφο 5.4 της ανωτέρω µεθόδου.Οι συνθήκες εκτέλεσης της αέριας χρωµατογραφικής ανάλυσης
πρέπει να είναι τέτοιες ώστε να εκτελείται η ανάλυση των
στερολών και να διαχωρίζονται οι ΤΜΣΕ από την ερυθροδιόλη
και την ουβαόλη.
Από τη στιγµή που το δείγµα έχει εγχυθεί, η καταγραφή συνεχί-
ζεται έως ότου εκλουσθούν οι υπάρχουσες στερόλες, η
ερυθροδιόλη και η ουβαόλη. Μετά αναγνωρίζονται οι κορυφές (οι
χρόνοι κατακράτησης της ερυθροδιόλης και ουβαόλης αναφορικά
πρός τη β-σιτοστερόλη είναι περίπου 1,4 και 1,55 αντίστοιχα) και
υπολογίζονται τα εµβαδά σχετικά µε τις στερόλες.
6. ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
Ερυθροδιόλη%=A
1+A2
A1+A2+∑Aστερολών×100
όπου:
A1=εµβαδό κορυφής ερυθροδιόλης
►M6 ◄,
A2=εµβαδό κορυφής ουβαόλης
►M6 ◄,
∑Aστερολών=ολικό εµβαδό κορυφών στερολών
►M6 ◄.
Το αποτέλεσµα εκφράζεται µε ένα δεκαδικό ψηφίο.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—33
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ VII
ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ ΣΤΗ 2 -ΘΕΣΗ ΣΤΑ ΤΡΙΓΛΥ-
ΚΕΡΙ∆ΙΑ ΕΛΑΙΩΝ ΚΑΙ ΛΙΠΩΝ
1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ
Το κείµενο αυτό περιγράφει µία ►C1µέθοδο προσδιορισµού της
συνθέσεως ◄αυτού του κλάσµατος των λιπαρών οξέων ενός
ελαίου ή λίπους που εστεροποιείται στη 2 -θέση (β, ή εσωτερική
θέση) της γλυκερίνης.
2. ΠΕ∆ΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ
Η µέθοδος αυτή είναι εφαρµόσιµη σε έλαια και λίπη µε σηµείο
τήξης κάτω από 45 ºC,λόγω►C1εκλεκτικής δράσης ◄της
παγκρεατικής λιπάσης.
∆εν είναι απολύτως εφαρµόσιµη σε έλαια και λίπη περιέχοντα
σηµαντικές ποσότητες λιπαρών οξέων µε δώδεκα ή λιγότερα
άτοµα άνθρακα (έλαια κοκοφοίνικα και φοινικόψυχας, λίπος
βούτυρου), ή πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (µε περισσότερους από
τέσσερις διπλούς δεσµούς) περιέχοντα είκοσι ή περισσότερα
άτοµα άνθρακα (έλαια ψαριών και υδρόβιων ζώων), ή λιπαρά οξέα
περιέχοντα οξυγονωµένες οµάδες, εκτός από την όξινη οµάδα.
3. ΑΡΧΗ
Πιθανή εξουδετέρωση όξινων ελαίων και λιπών σε διαλύτη. Καθα-
ρισµός µε διέλευση από στήλη αλουµίνας. Μερική υδρόλυση τωντριγλυκεριδίων µε παγκρεατική λιπάση επί ένα καθορισµένο
χρονικό διάστηµα. ∆ιαχωρισµός των σχηµατιζόµενων µονογλυκερι-
δίων µε χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας και µεθανόλυση των
µονογλυκεριδίων αυτών. Ανάλυση των µεθυλεστέρων αυτών µε
►
C1αέρια χρωµατογραφία ◄.
4. ΟΡΓΑΝΑ
4.1. Φιάλη των 100mlµε στρογγυλή βάση.
4.2. Φιάλη των 25mlµε στρογγυλή βάση, και εσµήρυσµα.
4.3. Αεροψυκτήρας, µήκους ενός µέτρου, που µπορεί να προσαρµοστεί
στη φιάλη που αναφέρεται στο σηµείο 4.2.
4.4. Κωνική φιάλη των 250 ml.
4.5. Ποτήρι ζέσης των 50 ml.
4.6. ∆ιαχωριστική χοάνη των 500 ml.
4.7. Γυάλινη στήλη χρωµατογραφίας, εσωτερικής διαµέτρου 13 mm,
µήκους 400mm, εξοπλισµένη µε διάτρητο γυάλινο δίσκο και πώµα.
4.8. Σωλήνας φυγοκέντρησης των 10 ml,µε πώµα από αδιαφανές γυαλί.
4.9. Προχοΐδα των 5 ml,βαθµονοµηµένη ανά 0,05 ml.
4.10. Υποδερµική σύριγγα του 1 ml,εξοπλισµένη µε λεπτή βελόνα.
4.11. Μικροσύριγγα για παροχή σταγονών των 3 -4µl.
4.12. Επιστρωτής για χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας.
4.13. Γυάλινες πλάκες για χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας, (20 ×20cm).
4.14. Γυάλινη δεξαµενή ανάπτυξης για χρωµατογραφία λεπτής στοι-
βάδας, µε κάλυµµα από αδιαφανές γυαλί, κατάλληλο για τις πλάκες
των 20×20cm.
4.15. Ψεκαστήρας για χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας.
4.16. Φούρνος ρυθµισµένος στους 103 ±2ºC.
4.17. Θερµοστάτης µε δυνατότητα ρύθµισης µεταξύ 30 και 45 ºC,ανά
0,5ºC.
4.18. Περιστρεφόµενος εκαερωτής.
4.19. ∆ονούµενος ηλεκτρικός αναµείκτης, κατάλληλος για ζωηρή
ανατάραξη του σωλήνα της φυγοκέντρησης.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—34
▼B
4.20. Λυχνία υπεριώδους για την εξέταση των πλακών λεπτής στοιβάδας.
Για τον έλεγχο της ενεργότητας της λιπάσης:
4.21. Πεχάµετρο.
4.22. Σπειροειδής αναδευτήρας.
4.23. Προχοΐδα των 5 ml.
4.24. Χρονόµετρο.
Για την πιθανήπαρασκευήτης λιπάσης:
4.25. Εργαστηριακός αναδευτήρας, κατάλληλος γιά τη διασπορά και
ανάµειξη ετερογενών υλικών.
5. ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ
5.1. η-εξάνιο, ή, αν δεν υπάρχει, πετρελαϊκος αιθέρας (σ.ζ. 30 -50ºC),
χρωµατογραφικού βαθµού.
5.2. 2- προπανόλη (ή αιθανόλη), 95 %(V/V), αναλυτικού βαθµού.
5.3. 2- προπανόλη (ή αιθανόλη), υδατικό διάλυµα 1 /1.
5.4. ∆ιαιθυλικός αιθέρας, απηλλαγµένος, υπεροξειδίων.
5.5. Ακετόνη.
5.6. Μυρµηγκικό οξύ, τουλάχιστον 98 %(m/m).
5.7. ∆ιάλυµα ανάπτυξης:µείγµα η -εξανίου (5.1), διαιθυλικού αιθέρα (5.4)
και µυρµηγκικού οξέος (5.6) σε αναλογία 70 /30/1(V/V/V).
5.8. Ενεργή αλουµίνα για χρωµατογραφία, ουδέτερη, βαθµού Brockmann
1.
5.9. Σκόνη πυριτίου, µε συζευτικό, κατάλληλης ποιότητας για χρωµατο-
γραφία λεπτής στοιβάδας.
5.10. Παγκρεατική λιπάση, κατάλληλης ποιότητας (σηµειώσεις 1 και 2).
5.11. Υδροξείδιο νατρίου σε υδατικό διάλυµα (120 g/l).
5.12. Υδροχλωρικό οξύ σε υδατικό διάλυµα (6 N).
5.13. Χλωριούχο ασβέστιο ( CaCl2)σε υδατικό διάλυµα (220 g/l).
5.14. Χολικό νάτριο (ενζυµατική ποιότητα) σε υδατικό διάλυµα (1 g/l).
5.15. Ρυθµιστικό διάλυµα:υδατικό διάλυµα 1 Mτρί-υδροξυµεθυλαµινο-
µεθανίου φέρεται σε pH8 µε προσθήκη υδροχλωρικού οξέος (5.12)
(έλεγχος µε ποτενσιόµετρο).
5.16. Φαινολοφθαλεΐνη σε διάλυµα (10 g/l)σε 95%(V/V) αιθανόλη.
5.17.2′,7′∆ιχλωροφλουορεσκείνη σε διάλυµα (2 g/l)σε 95%(V/V) αιθα-
νόλη, καθιστάµενη ελαφρά αλκαλική, µε προσθήκη µιας σταγόνας
διαλύµατος 1Nυδροξειδίου νατρίου ανά 100 ml.
Και για τον έλεγχο της ενεργότητας της λιπάσης:
5.18. Εξουδετερωµένο έλαιο.
5.19. Υδροξείδιο νατρίου σε υδατικό διάλυµα (0,1 N).
5.20. Χολικό νάτριο (ενζυµατική ποιότητα) σε υδατικό διάλυµα (200 g/l).
5.21. Αραβικό κόµµι σε υδατικό διάλυµα (100 g/l).
6. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΤΟΥ ∆ΕΙΓΜΑΤΟΣ
Εάν το δείγµα έχει οξύτητα κάτω από 3 %,προσδιοριζόµενη
σύµφωνα µε το παράρτηµα IIκαθαρίζεται αµέσως µέσα από αλου-
µίνα όπως υποδεικνύεται στο σηµείο 6.2. Εάν το δείγµα έχει
οξύτητα πάνω από 3 %,προσδιοριζόµενη σύµφωνα µε το παράρτηµα
IIεξουδετερώνεται µε άλκαλι παρουσία διαλύτη κατά την 6.1,
κατόπιν διέρχεται από αλουµίνα όπως υποδεικνύεται στο σηµείο
6.2.
6.1. Εξουδετέρωση άλκαλι µε παρουσία διαλύτη
Σε διαχωριστική χοάνη (4.6) εισάγονται περίπου 10 gακατέργαστου
ελαίου και προστίθενται 100 mlεξανίου (5.1), 50 ml2- προπανόλης1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—35
▼B
(5.2), λίγες σταγόνες διαλύµατος φαινολοφθαλεΐνης (5.16) και µία
ποσότητα του διαλύµατος υδροξειδίου νατρίου (5.11) αντιστοιχούσα
στην ελεύθερη οξύτητα του ελαίου συν 0,3 %επιπλέον. ∆ονούνται
ζωηρά επί ένα λεπτό, προστίθενται 50 mlαπεσταγµένου νερού,
δονούνται ξανά και αφήνονται να ηρεµήσουν.
Μετά το διαχωρισµό, αποµακρύνεται το στρώµα σάπωνα του
πυθµένα. Επίσης αφαιρείται κάθε ενδιάµεσο στρώµα (γλίστρα,
αδιάλυτη ύλη). Το διάλυµα εξανίου του εξουδετερωµένου ελαίου
εκπλύεταιµε διαδοχικές δόσεις των 25 -30ml διαλύµατος 2-προπα-
νόλης (5.3) έως ότου το ρόδινο χρώµα της φαινολοφθαλεΐνης
εξαφανιστεί.
Το περισσότερο από το εξάνιο αποµακρύνεται µε απόσταξη υπό
κενό στον περιστρεφόµενο εξαερωτή (4.18), το έλαιο ξηραίνεται
στους 30-40ºC υπό κενό µε τη βοήθεια ρεύµατος καθαρού αζώτου
έως ότου το εξάνιο έχει τελείως αποµακρυνθεί.
6.2. Καθαρισµός µέσα από αλουµίνα
Παρασκευάζεται αιώρηµα 15 gενεργής αλουµίνας (5.8) σε 50 ml
εξανίου (5.1) και εισάγεται, µε ανάδευση, στη χρωµατογραφική
στήλη (4.7). Η αλουµίνα αφήνεται να κατακαθίσει οµοιόµορφα, και
το επίπεδο του διαλύτη αφήνεται να πέσει έως 1 -2mm πάνω από το
απορροφητικό. Εισάγεται προσεκτικά στη στήλη διάλυµα 5 g
ελαίου σε 25mlεξανίου (5.1)·συλλέγεται το σύνολο του εκλού-
σµατος από τη στήλη σε φιάλη στρογγυλής βάσης (4.1).
7. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΤΩΝ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΩΝ ΠΛΑΚΩΝ
Οι γυάλινες πλάκες (4.13) καθαρίζονται επιµελώς µε αιθανόλη,
πετρελαϊκο αιθέρα και ακετόνη για να εξαφανιστεί κάθε ίχνος
λιπαρής ουσίας.
Σε κωνική φιάλη (4.4) τοποθετούνται 30 gσκόνης πυριτίου (5.9).
Προστίθενται 60 ml απεσταγµένου νερού. Πωµατίζεται και
αναδεύεται ζωηρά επί ένα λεπτό. Ο πολτός µεταφέρεται αµέσως
στον επιστρωτή (4.12) και οι καθαρές πλάκες επιστρώνονται µε
στρώµα πάχους 0,25 mm. Οι πλάκες στεγνώνονται στον αέρα επί
15 λεπτά και µετά επί µία ώρα στο φούρνο (4.16) στους 103 ±2ºC.
Οι πλάκες ψύχονται σε ►C1ξηραντήρα ◄σε θερµοκρασία δωµα-
τίου πριν τη χρήση.
Παρασκευασµένες πλάκες είναι διαθέσιµες στο εµπόριο.
8. ∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ ΕΚΤΕΛΕΣΗΣ
8.1. Υδρόλυση µε παγκρεατική λιπάση
Μέσα στο σωλήνα της φυγοκέντρησης (4.8) ζυγίζεται περίπου 0,1 g
του παρασκευασµένου δείγµατος ·εάν είναι στερεό λίπος, πρέπει να
διαλυθεί σε 0,2mlεξανίου (5.1) µε ελαφριά θέρµανση, εάν χρεια-
στεί.
Προστίθενται 20 mgλιπάσης (5.10) και 2 mlρυθµιστικού διαλύ-
µατος (5.15). Αναδεύονται καλά, αλλά προσεκτικά, και µετά
προστίθενται 0,5 mlδιαλύµατος χολικού νατρίου (5.14) και 0,2 ml
διαλύµατος χλωριούχου ασβεστίου (5.13). Ο σωλήνας κλείνεται µε
το πώµα, αναδεύεται προσεκτικά (αποφεύγεται η ύγρανση του
πώµατος) και τοποθετείται αµέσως στο θερµοστάτη (4.17), διατη-
ρούµενου στους 40 ±0,5ºC και αναδεύεται µε το χέρι επί ακριβώς
ένα λεπτό.
Ο σωλήνας αποµακρύνεται από το θερµοστάτη, και αναταράσσεται
ζωηρά µε τον ηλεκτρικό αναδευτήρα (4.19) επί ακριβώς δύο λεπτά.
Ψύχεται αµέσως σε τρέχον νερό ·προστίθεται 1mlυδροχλωρικού
οξέος (5.12) και 1 mlδιαιθυλικού αιθέρα (5.4). Πωµατίζεται και
αναµιγνύεται ζωηρά µε τον ηλεκτρικό αναδευτήρα. Αφήνεται να
ηρεµήσει και αποµακρύνεται η αιθερική στοιβάδα µε σύριγγα
(4.10), µετά από φυγοκέντρηση, εάν χρειαστεί.
8.2. ∆ιαχωρισµός των µονογλυκεριδίων µε χρωµατογραφία λεπτής στοι-
βάδας
Το εκχύλισµα τοποδετείται στη χρωµατογραφική πλάκα µε µικρο-
σύριγγα (4.11) περίπου 1,5 cmαπό την κάτω άκρη, σε µία λεπτή,
οµοιόµορφη γραµµή, στενή όσο γίνεται. Η πλάκα τοποθετείται σε
καλά κορεσµένο λουτρό αναπτύξεως (4.14) και αναπτύσσεται µε το
διάλυµα ανάπτυξης (5.7) στους 20 ºCπερίπου, µέχρι περίπου 1 cm
από την επάνω άκρη της πλάκας.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—36
▼B
Οι πλάκες ξηραίνονται στον αέρα, στη θερµοκρασία του λουτρού,
και ψεκάζονται µε διάλυµα 2 ′,7′διχλωροφλουορεσκεΐνης (5.17). Η
στοιβάς των µονογλυκεριδίων ( RFπερίπου 0,035) αναγνωρίζεται
κάτω από υπεριώδες φώς (4.20).
8.3. Ανάλυση των µονογλυκεριδίων µε ►C1αέρια◄χρωµατογραφία
Αποµακρύνεται η στοιβάδα που αποκτήθηκε στην 8.2 µε τη βοήθεια
σπάτουλας (αποφεύγεται η αποµάκρυνση συστατικών που αποµέ-
νουν στη γραµµή της βάσης) και µεταφέρεται στη φιάλη
µεθυλίωσης (4.2).
Το συλλεγµένο πυρίτιο επεξεργάζεται κατευθείαν όπως περιγρά-
φεται στο παράρτηµα X-B, έτσι ώστε να µετατραπούν τα
µονογλυκερίδια σε µεθυλεστέρες, και µετά οι εστέρες εξετάζονται
µε αέριο χρωµατογραφία, όπως περιγράφεται στο παράρτηµα X-A.
9. ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
Υπολογίζεται η ►C1σύνθεση ◄των λιπαρών οξέων στη 2 -θέση
µε ακρίβεια ενός δεκαδικού (Σηµείωση 3).
10. ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ
1.Έλεγχος της ενεργότητας της λιπάσης
Παρασκευάζεται ελαιώδες γαλάκτωµα µε ανάδευση µείγµατος
165mlδιαλύµατος αραβικού κόµµεως (5.21), 15 gκοµµατια-
σµένου πάγου και 20 mlεξουδετερωµένου έλαιου (5.18) σε
κατάλληλο αναδευτήρα.
Σε ένα ποτήρι ζέσης (4.5) τοποθετούνται 10 mlτου γαλακτώµατος
αυτού, ακολουθούµενα διαδοχικά από 0,3 mlδιαλύµατος χολικού
νατρίου (5.20) και 20 mlαπεσταγµένου νερού.
Το ποτήρι τίθεται σε θερµοστάτη διατηρούµενο στους 37 ±0,5ºC
(σηµείωση 4)·εισάγονται τα ηλεκτρόδια ενός πεχάµετρου (4.21)
και ένας σπειροειδής αναδευτήρας (4.22).
Με µία προχοΐδα (4.23) προστίθεται κατά σταγόνες το διάλυµα
υδροξειδίου νατρίου (5.19) έως ότου το pHγίνει 8.5.
Προστίθεται επαρκής ποσότης υδατικού αιωρήµατος λιπάσης
(βλέπε κατωτέρω). Οταν το πεχάµετρο δείξει τιµή pH8,3, τίθεται
σε λειτουργία το χρονόµετρο (4.24) και προστίθεται στάγδην
διάλυµα υδροξειδίου νατρίου (5.19) µε ρυθµό τέτοιο ώστε να
διατηρηθεί η τιµή του pHστο 8,3. Αναγιγνώσκεται ο όγκος του
διαλύµατος αλκάλεως που καταναλίσκεται κάθε λεπτό.
Καταγράφονται οι παρατηρήσεις σε µορφή διαγράµµατος, χρησι-
µοποιώντας τις µετρήσεις χρόνου σαν τετµηµένες και τα mlτου
αλκαλικού διαλύµατος, που απαιτούνται για να διατηρηθεί το rH
σταθερό, σαν τεταγµένες. Πρέπει να προκύψει µία ευθεία
γραµµή.
Το αιώρηµα της λιπάσης που αναφέρθηκε ανωτέρω είναι
αιώρηµα 1% (M/M) σε νερό. Για κάθε δοκιµή θα πρέπει να
χρησιµοποιείται αρκετό από το αιώρηµα αυτό έτσι ώστε περίπου
1mlτου αλκαλικού διαλύµατος να καταναλώνεται σε 4 µε 5
λεπτά. Συνήθως απαιτούνται περίπου 1 -5mg της σκόνης.
Σαν µονάδα λιπάσης ορίζεται η ποσότητα του ενζύµου που θα
ελευθερώσει 10 µ -ισοδύναµα οξέος ανά λεπτό. Μετά η ενερ-
γότητα Α της χρησιµοποιηθείσης σκόνης, εκφρασµένη σε
µονάδες λιπάσης ανά mg,δίνεται από τη σχέση:
A¼V/C210
m
όπουVείναι ο όγκος του διαλύµατος υδροξειδίου νατρίου (5.19)
που καταναλώνεται ανά λεπτό, υπολογιζόµενος από το
διάγραµµα,mείναι η µάζα, σε mg,της δοκιµαστικής δόσης της
σκόνης.
2.Παρασκευή της λιπάσης
Λιπάσες µε ικανοποιητική ενεργότητα λιπάσης διατίθενται στο
εµπόριο. Αλλά είναι επίσης δυνατό να παρασκευαστούν
εργαστηριακά ως εξής:
Ψύχονται 5kgνωπού παγκρέατος χοίρου στους 0 ºC·αποµακρύ-
νεται το περιβάλλον στερεό λίπος και συνδετικός ιστός και1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—37
▼B
ακολουθεί οµογενοποίηση σε οµογενοποιητή ώστε να αποκτηθεί
ένα ιξώδες υγρό (πάστα). Η πάστα αυτή αναδεύεται µε τον
αναδευτήρα (4.25) επί 4 -6ώρες µε 2,5lάνυδρης ακετόνης και
φυγοκεντρείται. Το υπόλειµµα εκχυλίζεται τρείς φορές ακόµα
µε τον (διο όγκο ακετόνης, µετά δύο φορές µε µείγµα I/I(V/V)
ακετόνης και διαιθυλικού αιθέρα, και δύο φορές µε διαιθυλικό
αιθέρα.
Το υπόλειµµα ξηραίνεται υπό κενό επί 48 ώρες έως ότου αποκτ-
ηθεί µία σταθερή σκόνη, που πρέπει να διατηρείται σε ψυγείο.
3.Σε κάθε περίπτωση, συνίσταται να προσδιοριστεί η σύσταση των
ολικών λιπαρών οξέων του ίδιου δείγµατος, αφού η σύγκριση µε
αυτή των οξέων στη 2 -θέση θα βοηθήσει στην ερµηνεία των
λαµβανοµένων στοιχείων.
4.Η θερµοκρασία της υδρόλυσης τίθεται στους 37 ºC,καθώς χρησι-
µοποιείται ένα υγρό έλαιο. Ωστόσο, τίθεται στους 40 ºCγια το
δείγµα προς ανάλυση, ώστε να επιτρέψει την εξέταση λιπών µε
σηµεία ζέσης µέχρι 45 ºC.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—38
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ VIII
ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΡΙΓΛΥΚΕΡΙ∆ΙΩΝ
1.ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ
Προσδιορισµός της συνθέσεως των τριγλυκεριδίων σε υγρά φυτικά
έλαια εκπεφρασµένης σε ισοδύναµο αριθµό ατόµων άνθρακος. Το
παρόν κείµενο περιγράφει µέθοδο ποιοτικού και ποσοτικού προσδιο-
ρισµού της συνθέσεως των τριγλυκεριδίων φυτικών ελαίων
συναρτήσει του µοριακού βάρους και του βαθµού ακορεστότητας
αυτών, εκπεφρασµένου ως ισοδύναµο αριθµό ατόµων άνθρακος.
2.ΠΕ∆ΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ
Η µέδοδος αυτή είναι εφαρµόσιµη σε όλα τα φυτικά έλαια που
περιέχουν τριγλυκερίδια λιπαρών οξέων µακριάς αλύσου. Η µέθοδοςείναι ειδικά εφαρµόσιµη στην ανίχνευση της παρουσίας µικρών
ποσοτήτων ►
C1ηµιξηραινοµένων ◄ελαίων (πλούσιων σε λινε-
λαϊκό οξύ) σε φυτικά έλαια που περιέχουν ελαϊκό οξύ σαν το
κυρίως ακόρεστο λιπαρό οξύ, όπως το ελαιόλαδο.
3.ΑΡΧΗ
∆ιαχωρισµός των τριγλυκεριδίων ανάλογα µε τον ισοδύναµο αριθµό
ατόµων άνθρακα αυτών, µε υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης
(πολικότητας ανάστροφης φάσης) και ερµηνεία των χρωµατο-
γραφηµάτων.
4.ΟΡΓΑΝΑ
4.1.Υγρός χρωµατογράφος υψηλής απόδοσης, µε θερµοστατικό έλεγχο
της θερµοκρασίας της στήλης.
4.2.Σύριγγα των 10ml.
4.3.Ανιχνευτής:διαφορικό διαθλασίµετρο. Η ευαισθησία πλήρους
κλίµακας πρέπει να είναι τουλάχιστον 10−4µονάδες δείκτη
διάθλασης.
4.4.Στήλη:Στήλη από ανοξείδωτο ατσάλι µήκους 250 mm και εσωτε-
ρικής διαµέτρου 4,5 mm, γεµισµένη µε σωµατίδια διοξειδίου του
πυριτίου µε 22-23% άνθρακα σε µορφή οκταδεκυλσιλανίου, διαµέ-
τρου 5mm( σηµείωση 2).
4.5.Καταγραφέας ή/και ολοκληρωτής.
5.ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ
Τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αναλυτικού βαθµού. Οι διαλύτες
έκλουσης πρέπει να είναι ►C1απηλλαγµένοι οξυγόνου ◄,ώστε
να µπορούν να ανακυκλωθούν αρκετές φορές χωρίς επίδραση στους
διαχωρισµούς.
5.1.Χλωροφόρµιο.
5.2.Ακετόνη.
5.3.Ακετονιτρίλιο.
5.4.∆ιαλύτης έκλουσης:ακετονιτρίλιο +ακετόνη (οι αναλογίες προσαρ-
µόζονται προς απόκτηση του επιθυµητού διαχωρισµού ·αρχή µε
µείγµα 50:50).
5.5.∆ιαλύτης διαλυτοποίησης:ακετόνη ή µείγµα (1: 1) ακετόνης -χλωρο-
φόρµιου.
5.6.Τριγλυκερίδια αναφοράς:είτε µπορούν να χρησιµοποιηθούν τριγλυ-
κερίδια του εµπορίου (τριπαλµιτίνη, τριολεΐνη κ.λπ.) και οι χρόνοι
κατακράτησης αυτών να σχεδιαστούν σε διάγραµµα αντιστοιχίας µε
τον ισοδύναµο αριθµό άνθρακα, ή, εναλλακτικά, ένα χρωµα-
τογράφηµα αναφοράς από έλαιο σόγιας (βλέπε σηµειώσεις 3 και 4
και σχήµατα 1 και 2).1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—39
▼C1
▼B
▼B
6.ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΤΩΝ ∆ΕΙΓΜΑΤΩΝ
Ένα διάλυµα 5%των δειγµάτων προς ανάλυση παρασκευάζεται ζυγί-
ζοντας 0,5±0,001g του δείγµατος σε ογκοµετρική φιάλη των 10 ml
και συµπληρώνεται έως τα 10 mlµε το διαλύτη διαλυτοποίησης (5.5).
7.∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ ΕΚΤΕΛΕΣΗΣ
7.1.Τίθεται σε λειτουργία το χρωµατογραφικό σύστηµα. Ο διαλύτης
έκλουσης (5.4) αντλείται µε ρυθµό 1,5 ml/mm για να καθαριστεί
ολόκληρο το σύστηµα. Αναµένουµε µέχρις ότου µία σταθερή γραµµή
βάσης αποκτηθεί.
Ενίονται 10 µlτου δείγµατος παρασκευασµένου κατά την 6.
8.ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
Χρησιµοποιείται η µέθοδος µε εσωτερικό πρότυπο, δηλαδή
υποτίθεται ότι το άθροισµα των εµβαδών των κορυφών που αντιστοι-
χούν στα διάφορα τριγλυκερίδια ισούται µε το 100 %.Η σχετική
ποσοστιαία περιεκτικότητα κάθε τριγλυκεριδίου υπολογίζεται
χρησιµοποιώντας την εξίσωση:
Ποσοστό του%τριγλυκερίδιου=εµβαδόν κορυφής
άθροισµα εµβαδών κορυφών×100,
µε το αποτέλεσµα να δίνεται µε ένα δεκαδικό.
Σηµείωση 1: Η σειρά έκλουσης µπορεί να προσδιοριστεί υπολογί-
ζοντας τους ισοδύναµους αριθµούς άνθρακα, συχνά
καθοριζόµενους από τη σχέση ECN =CN − 2 η, όπου
CNείναι ο αριθµός άνθρακα και η είναι ο αριθµός των
διπλών δεσµών·µπορεί να υπολογιστεί µε πολύ µεγαλύ-
τερη ακρίβεια λαµβάνοντας υπόψη την προέλευση των
διπλών δεσµών. Εάν ηo,η1και η1ηείναι οι αριθµοί των
διπλών δεσµών που αποδίδονται στό ελαϊκό, λινελειϊκό
και λινολενικό οξύ αντίστοιχα, ο ισοδύναµος αριθµός
άνθρακα µπορεί να υπολογιστεί µέσα από µία σχέση
της µορφής:
ECN=CN−doηo−δ1η1−δ1ηη1η,
όπου οι συντελεστές δo,δ1και δ1ηµπορούν να υπολογι-
στούν µε χρήση των τριγλυκεριδίων αναφοράς. Κάτω
από τις συνθήκες που καθορίζονται σε αυτή τη µέθοδο,
η λαµβανόµενη σχέση θα είναι περίπου:
ECN=CN−(2,60 ηo)−(2,35 η1)−(2,17 η1η)
Σηµείωση 2: Παραδείγµατα:Lichrosorb(Merck)RP18Art50333·
Lichrosphere(Merck)100CH18Art50377 η
παρόµοια,
Σηµείωση 3: Με αρκετά τριγλυκερίδια αναφοράς είναι επίσης δυνατό
να υπολογιστεί η διακριτική ικανότητα αναφορικά µε
τη τριελαΐνη,
α=RT′/RT′ολεΐνης
χρησιµοποιώντας τον ανηγµένο χρόνο κατακράτησης
RT′=RT−RTδιαλύτη
Το διάγραµµα των τιµών του logα σε συνάρτηση του f
(αριθµός διπλών δεσµών) επιτρέπει τον προσδιορισµό
των τιµών κατακράτησης για όλα τα τριγλυκερίδια των
λιπαρών οξέων που περιέχονται στα τριγλυκερίδια
αναφοράς (βλέπε σχήµα 2).
Σηµείωση 4: Η αποτελεσµατικότητα της στήλης πρέπει να επιτρέπει
σαφή διαχωρισµό της κορυφής της τριλινολεΐνης από
της κορυφές των τριγλυκεριδίων µε συνεχόµενο RT.
Σηµείωση 5: Σε ότι αφορά τα διαυγή παρθένα έλαια και τα ακατέρ-
γαστα πυρηνέλαια, για να ληφθεί σαφής διαχωρισµός
της κορυφής της τριλινολεΐνης από τις γειτονικές
κορυφές ή από ενδεχόµενες ουσίες που παρεµβάλ-
λονται, είναι απαραίτητο να καθαρίζονται προληπτικά
τα έλαια, σύµφωνα µε την ακόλουθη µεθοδολογία:1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—40
▼M11
▼M11
Αφήνονται να απορροφηθούν 200 mlελαιολάδου, χωρίς
να αραιωθούν, σε λεπτή στήλη διοξειδίου του πυριτίου
για χρωµατογραφία υγρού -στερεού (τύπου SEP PAK
silicacartridge-waters αριθ. 51900).
Τα τριγλυκερίδια εκλούονται µε 20 mlάνυδρου εξανίου
υψηλής αποδόσεως υγρή χρωµατογραφία (ΥΑΥΧ), σε
µέγιστο χρονικό διάστηµα 20 δευτερολέπτων.
Το προϊόν της έκλουσης ξηραίνεται σε ρεύµα αζώτου
και παραλαµβάνει σε ισιπροπανόλη ή ακετόνη (5 ml).
Εκχέονται 10-20ml σε ΥΑΥΧ. Πρέπει να ελέγχεται η
περιεκτικότητα του ελαιολάδου σε λιπαρά οξέα ώστε
να είναι η ίδια πριν και µετά τον καθορισµό, εντός του
περιθωρίου σφάλµατος της µεθόδου που χρησιµο-
ποιήθηκε.
Σχήµα 1
Χρωµατογράφηµα δείγµατος σογιέλαιου
Σχήµα:P=Palmitinsäure;St=Stearinsäure;O=Ölsäure;L=Linolsäure;
Ln=Linolensäure.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—41
▼B
▼B
Σχήµα 2
∆ιάγραµµα τουlogα σε συνάρτηση του f(αριθµός διπλών δεσµών)
Σχήµα:La=Laurinsäure;My=Myristinsäure;P=Palmitinsäure;St=
Stearinsäure;O=Ölsäure;L=Linolsäure;Ln=Linolensäure.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—42
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IX
ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ►C1ΑΝΑΛΥΣΗ ◄ΣΤΟ ΥΠΕΡΙΩ∆ΕΣ
ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Η φασµατοφωτοµετρική εξέταση στο υπεριώδες µπορεί να δώσει
►C1πληροφορίες ◄ως προς την ποιότητα ενός λίπους, την
κατάσταση συντήρησής του και τις µεταβολές που έχουν επέλθει
►C1τις οφειλόµενες σε τεχνολογικές διαδικασίες ◄.
Η απορρόφηση στα µήκη κύµατος που καθορίζονται στη µέθοδο
οφείλεται στη παρουσία ►C1συζυγιακών συστηµάτων ◄διένιων
και τριένιων. Οι απορροφήσεις αυτές εκφράζονται ως ειδικές
αποσβέσειςE1cm1%( η απόσβεση διαλύµατος 1 %του λίπους στον
ορισµένο διαλύτη, σε πάχος 1 cm) συµβατικά παριστώµενες µε K
(που ονοµάζεται επίσης συντελεστής αποσβέσεως).
1.ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ
Η µέθοδος περιγράφει τη διαδικασία εκτέλεσης φασµατοφωτοµε-
τρικής εξέτασης λιπών στο υπεριώδες.
2.ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟ∆ΟΥ
Το υπό εξέταση λίπος διαλύεται στον απαιτούµενο διαλύτη και µετά
προσδιορίζεται η απόσβεση του διαλύµατος στα καθοριζόµενα µήκη
κύµατος αναφορικά προς καθαρό διαλύτη. Οι ειδικές αποσβέσεις
υπολογίζονται από τις φασµατοφωτοµετρικές αναγνώσεις.
3.ΟΡΓΑΝΑ
3.1.Φασµατοφωτόµετρο πρός µέτρηση αποσβέσεων στο υπεριώδες
µεταξύ 220 και 360 nm,µε δυνατότητα ανάγνωσης αυτόνοµων νανο-
µετρικών µονάδων.
3.2.Ορθογώνιες κυψελίδες από χαλαζία, µε καλύµµατα, οπτικού µήκους
1cm.Όταν είναι γεµάτες µε νερό ή άλλο κατάλληλο διαλύτη, οι
κυψελίδες δεν πρέπει να εµφανίζουν διαφορά µεταξύ τους µεγαλύ-
τερη από 0,01 µονάδες απόσβεσης.
3.3.Ογκοµετρικές φιάλες των 25 ml.
3.4.Χρωµατογραφική στήλη της οποίας το επάνω µέρος έχει µήκος 270
mm και διάµετρο 35 mm και το κάτω µέρος µήκος 270 mm και
διάµετρο 10mm.
4.ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ
4.1. — Φασµατοφωτοµετρικά καθαρό ισοοκτάνιο (2,2,4 -τριµεθυλο-
πεντάνιο). Αναφορικά προς απεσταγµένο νερό, αυτό δεν πρέπει
να έχει διαπερατότητα µικρότερη από 60 %στα 220nmκαι
µικρότερη από 95 %στα 250nm,
ή
—φασµατοφωτοµετρικά καθαρό κυκλοεξάνιο:αναφορικά προς
απεσταγµένο νερό, αυτό δεν πρέπει να έχει διαπερατότητα µικρό-
τερη από 40%στα 220nmκαι µικρότερη από 95 %στα 250nm.
4.2.Βασική αλουµίνα για χρωµατογραφία στήλης, προετοιµασµένη και
ελεγµένη όπως περιγράφεται στο παράρτηµα I.
4.3.η-εξάνιο, για χρωµατογραφία.
5.∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ
5.1.Το υπό εξέταση δείγµα πρέπει να είναι εντελώς οµοιογενές και
χωρίς υποψία ακαθαρσιών. Έλαια τα οποία είναι υγρά σε θερµο-
κρασία περιβάλλοντος πρέπει να διηθηθούν ►C1µέσω διηθητικού
χάρτη◄σε θερµοκρασία περίπου 30 ºC,σκληρά λίπη πρέπει να1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—43
▼M6
▼B
▼M6
▼B
▼B
οµοιογενοποιηθούν και να διηθηθούν σε θερµοκρασία όχι µεγαλύ-
τερη από 10ºCπάνω από το σηµείο τήξης.
5.2.Ζυγίζονται µε σχετική ακρίβεια 0,25 gτου δείγµατος που
προετοιµάστηκε µε τον τρόπο αυτό σε ογκοµετρική φιάλη των 25 ml,
ο όγκος συµπληρώνεται έως τη χαραγή µε το καθοριζόµενο διαλύτη
και οµοιογενοποιείται. Το διάλυµα που προκύπτει πρέπει να είναι
εντελώς διαυγές. Αν υπάρχει αδιαφάνεια ή θολότητα διηθείται
γρήγορα ►C1µέσω διηθητικού χάρτη ◄.
5.3.Γεµίζεται µία κυψελίδα µε το αποκτηθέν διάλυµα και µετρώνται οι
απορροφήσεις σε κατάλληλο µήκος κύµατος µεταξύ 232 και 276 nm,
λαµβάνοντας το χρησιµοποιούµενο διαλύτη ως αναφορά.
Οι καταγραφόµενες τιµές απόσβεσης πρέπει να βρίσκονται µέσα στη
περιοχή 0,1-0,8. Εάν όχι, οι µετρήσεις πρέπει να επαναληφθούν,
χρησιµοποιώντας, κατά περίπτωση, πυκνότερα ή αραιότερα διαλύ-
µατα.
5.4.Όταν απαιτείται ένας προσδιορισµός ειδικής απόσβεσης µετά από
►C1διέλευση από αλουµίνα ◄,εκτελείται ως εξής:Τοποθετούνται
30gβασικής αλουµίνας σε αιώρηµα, σε εξάνιο, µέσα στη χρωµατο-
γραφική στήλη. Αφού το απορροφητικό κατακαθίσει, αποµακρύνεται
το πλεονάζον εξάνιο έως 1 cmπερίπου πάνω από την κορυφή της
αλουµίνας.
∆ιαλύονται 10gτου λίπους, οµοιογενοποιηµένου και διηθέντος όπως
περιγράφηκε στην 5.1, σε 100 mlεξάνιου και το διάλυµα εκχύεται
µέσα στη στήλη. Το έκλουσµα συλλέγεται και αποµακρύνεται όλος
ο διαλύτης υπό κενό σε θερµοκρασία κάτω από 25 ºC.
Χρησιµοποιώντας το λίπος που αποκτήθηκε µε το τρόπο αυτό,
προχωρούµε αµέσως όπως καθορίστηκε στην 5.2.
6.ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
6.1.Καταγράφονται οι ειδικές αποσβέσεις (συντελεστές αποσβέσεως)
στα διάφορα µήκη κύµατος, υπολογιζόµενες ως εξής:
Kλ¼Eλ
c/C1s
όπου:
Kλ=ειδική απόσβεση σε µήκος κύµατος λ,
Eλ=απόσβεση µετρηθείσα σε µήκος κύµατος λ,
c= συγκέντρωση του διαλύµατος σε g/100ml,
σ=πάχος της κυψελίδας σε cm.
Τα αποτελέσµατα εκφράζονται µε δύο δεκαδικά ψηφία.
6.2.Η φασµατοφωτοµετρική ανάλυση ελαιόλαδου σύµφωνα µε την
επίσηµη µέθοδο των κανονισµών της ΕΟΚ καθορίζει τον προσδιο-
ρισµό της ειδικής απόσβεσης σε διάλυµα ισοοκτάνιου σε µήκη
κύµατος 232 και 270 nmκαι τον προσδιορισµό ∆ K,ο οποίος αποδί-
δεται ως:
∆K¼Km/C0Km/C04þKmþ4
2
όπουKmείναι η ειδική απόσβεση σε µήκος κύµατος m,το µήκος
κύµατος µέγιστης απορρόφησης γύρω από τα 270 nm.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—44
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I
Προετοιµασία της αλουµίνας και έλεγχος της ενεργότητάς της
Α1.1. Προετοιµασία της αλουµίνας
Αλουµίνα, ►C1αλουµίνα προξηρανθείσα ◄σε φούρνο στους
380-400ºC επί 3 ώρες, τοποθετείται σε ερµητικά κλεισµένο δοχείο,
προστίθεται απεσταγµένο νερό σε αναλογία 5 mlανά 100gαλου-
µίνας, το δοχείο κλείνεται αµέσως, ανακινείται επανειληµµένα
και µετά αφήνεται όπως έχει επί τουλάχιστον 12 ώρες πριν από
τη χρήση.
Α1.2. Έλεγχος της ενεργότητας της αλουµίνας
Προετοιµάζεται χρωµατογραφική στήλη µε 30 gαλουµίνας. Ενερ-
γώντας όπως περιγράφεται στον παράγραφο 5.4, διοχετεύεται
µείγµα αποτελούµενο από:
—9 5% παρθένο ελαιόλαδο µε ειδική απόσβεση µικρότερη από
0,18 στα 268nm,
—5 % αραχιδέλαιο επεξεργασµένο σε αποχρωστικές γαίες, κατά
τον εξευγενισµό του και να έχει ειδική απόσβεση στα 268 nm
ανωτέρα ή ίση του 4.
Εάν µετά από διέλευση µέσα από τη στήλη το µείγµα έχει ειδική
απόσβεση µεγαλύτερη από 0,11 στα 268 nm, η αλουµίνα είναι
αποδεκτή, εάν όχι, πρέπει να αυξηθεί το επίπεδο
►C1ενυδατώσεως ◄.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—45
▼C1
▼B
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II
Ρύθµιση του φασµατοφωτόµετρου
Α2. Ο εξοπλισµός πρέπει να ελέγχεται κατά διαστήµατα (τουλάχιστον
κάθε 6 µήνες) για την ανταπόκριση στα µήκη κύµατος και για την
ακρίβεια της ανταπόκρισης.
Α2.1. Το µήκος κύµατος µπορεί να ελεγχθεί χρησιµοποιώντας λυχνία
ατµών υδραργύρου ή µε κατάλληλα φίλτρα.
Α2.2. Για να ελεγχθεί η ανταπόκριση του φωτοκύτταρου και του φωτο-
πολλαπλασιαστή, εκτελούνται τα ακόλουθα:ζυγίζονται 0,2 g
καθαρού χρωµικού καλίου για φασµατοφωτοµετρία, διαλύονται σε
διάλυµα 0,05Nυδροξείδιου του καλίου σε ογκοµετρική φιάλη των
1000ml και ο όγκος συµπληρώνεται έως τη χαραγή. Λαµβάνονται
ακριβώς 25mlαπό το αποκτηθέν διάλυµα, µεταφέρονται σε ογκο-
µετρική φιάλη των 500 mlκαι αραιώνονται, µε συµπλήρωση του
όγκου έως τη χαραγή, χρησιµοποιώντας το ίδιο διάλυµα υδροξεί-
διου του καλίου.
Μετράται η απόσβεση του διαλύµατος που αποκτήθηκε µε τον
τρόπο αυτό στα 275 nm,χρησιµοποιώντας το διάλυµα υδροξείδιου
του καλίου ως αναφορά. Η µετρηθείσα απόσβεση χρησιµοποιώντας
κυψελίδα του 1cmπρέπει να είναι 0,2 ±0,005.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—46
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ X«Α»
ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΕΘΥΛΕΣΤΕΡΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ ∆Ι 'ΑΕΡΙΟΥ
ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ
1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ ΚΑΙ ΠΕ∆ΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ
Το παρόν διεθνές πρότυπο παρέχει γενικές οδηγίες για την εφαρ-
µογή της αέριας χρωµατογραφίας, µε κοινές ►C1(packed) ◄ή
τριχοειδείς στήλες, στον προσδιορισµό της ποιοτικής και ποσο-
τικής σύστασης µείγµατος µεθυλεστέρων, οι οποίοι λαµβάνονται
από λιπαρά οξέα µε τη µέθοδο που καθορίζεται στο παράρτηµα
XB.
Η παρούσα µέθοδος δεν έχει εφαρµογή στα πολυµερισµένα
λιπαρά οξέα.
2. ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ
2.1.Φέρον αέριο
Αδρανές αέριο (άζωτο, ήλιο, αργό, υδρογόνο, κ.λπ.) που έχει
πλήρως ξηρανθεί και περιέχει λιγότερο από 10 mg/kg οξυγόνου.
Σηµείωση 1: Το υδρογόνο που χρησιµοποιείται ως φέρον αέριο
µόνο µε τριχοειδείς στήλες, µπορεί να έχει ως
αποτέλεσµα διπλάσια ταχύτητα ανάλυσης, αλλά
είναι επικίνδυνο. ∆ιατίθενται συστήµατα ασφαλείας.
2.2.Βοηθητικά αέρια
2.2.1. Υδρογόνο (καθαρότητας 99,9 %), απαλλαγµένο από οργανικές
προσµείξεις.
2.2.2. Αέρας ή οξυγόνο χωρίς ►C1οργανικές ◄προσµείξεις.
2.3.Πρότυπο αναφοράς
Μείγµα µεθυλεστέρων ►C1καθαρών ◄λιπαρών οξέων ή µεθυ-
λεστέρες λιπών γνωστής σύστασης, κατά προτίµηση ανάλογης µε
τη σύσταση της προς ανάλυση λιπαρής ύλης.
Λαµβάνεται πρόνοια ώστε να παρεµποδιστεί η οξείδωση των
πολυακόρεστων λιπαρών οξέων.
3. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΣΚΕΥΗ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ
Οι παρεχόµενες υποδείξεις αφορούν το συνήθη εργαστηριακό
εξοπλισµό αέριας χρωµατογραφίας, µε χρήση κοινών ή /και
τριχοειδών στηλών και ανιχνευτή ►C1ιονιζούσης φλογός ◄.
Οποιοσδήποτε εξοπλισµός, µε τον οποίο επιτυγχάνονται η
αποδοτικότητα και η διακριτική ικανότητα που καθορίζονται στο
σηµείο 4.1.2, είναι κατάλληλος.
3.1.Αέριος χρωµατογράφος
Ο αέριος χρωµατογράφος αποτελείται από τα παρακάτω
►C1τµήµατα ◄:
3.1.1. Σύστηµα έγχυσης του δείγµατος
Χρησιµοποιείται σύστηµα έγχυσης του δείγµατοςα) είτε µε κοινές στήλες, µε το λιγότερο δυνατό µη
►
C1ωφέλιµο ◄χώρο (στην περίπτωση αυτή, το σύστηµα
έγχυσης πρέπει να µπορεί να θερµαίνεται σε θερµοκρασία
20ºCέως 50ºCυψηλότερη από τη θερµοκρασία της στήλης)
β) είτε µε τριχοειδείς στήλες, οπότε το σύστηµα έγχυσης πρέπει
να είναι ειδικά σχεδιασµένο για χρήση µε στήλες του είδους
αυτού. Μπορεί να είναι σύστηµα µε οπή ( split) ή σύστηµα
έγχυσης πάνω στη στήλη χωρίς οπή ( splitless).
Σηµείωση 2: Εφόσον δεν υπάρχουν στο δείγµα λιπαρά οξέα µε
λιγότερα από 16 άτοµα άνθρακα, µπορεί να χρησιµο-
ποιηθεί σύστηµα έγχυσης κινούµενης βελόνης.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—47
▼B
3.1.2. Κλίβανος
Ο κλίβανος πρέπει να θερµαίνει τη στήλη σε θερµοκρασία
τουλάχιστον 268 ºCκαι να διατηρεί την επιθυµητή θερµοκρασία
µε ακρίβεια±1ºC, προκειµένου για κοινές στήλες, ή ±0,1ºC
προκειµένου για τριχοειδείς. Η δεύτερη απαίτηση έχει ιδιαίτερη
σηµασία, όταν χρησιµοποιείται στήλη από συντετηγµένο
διοξείδιο του ►C1πυριτίου ◄.
Η χρήση προγραµµατισµού θερµοκρασίας για τη θέρµανση
συνιστάται σε όλες τις περιπτώσεις, αλλά ιδίως προκειµένου για
λιπαρά οξέα µε λιγότερα από 16 άτοµα άνθρακα.
3.1.3. Κοινή στήλη ►C1(packedcolumn) ◄
3.1.3.1. Στήλη κατασκευασµένη από υλικό υδρανές σε σχέση µε τις προς
ανάλυση ουσίες (δηλαδή από γυαλί ή ανοξείδωτο χάλυβα) µε τις
ακόλουθες διαστάσεις:
α) µήκος:1 έως 3 µέτρα. Παρουσία λιπαρών οξέων µε µακρά
άλυσο (άνω του C20),θα πρέπει να χρησιµοποιείται σχετικά
κοντή στήλη. Για την ανάλυση οξέων µε 4 ή 6 άτοµα άνθρακα,
συνιστάται η χρήση στήλης µήκους 2 µέτρων ·
β) εσωτερική διάµετρος:2 έως 4 mm.
Σηµείωση 3: Με τις στήλες από ανοξείδωτο χάλυβα είναι δυνατόν
να επέλθει αποσύνθεση των πολυακόρεστων συστα-
τικών µε περισσότερους από τρεις διπλούς δεσµούς.
Σηµείωση 4: Μπορεί να χρησιµοποιηθεί σύστηµα διπλών
στηλών.
3.1.3.2. Υλικό πληρώσεως της στήλης, που αποτελείται από τα ακόλουθα
στοιχεία:
α)υπόστρωµα: Γη διατόµων, που έχει υποβληθεί σε έκπλυση µε
οξύ και σιλανοποίηση ή άλλο κατάλληλο αδρανές υπόστρωµα,
µε στενό εύρος µεγέθους κόκκων (εύρος 25 µ mµεταξύ των
οριακών τιµών 125 µ mκαι 200 µm)·το µέσο µέγεθος κόκκων
εξαρτάται από την εσωτερική διάµετρο και το µήκος της
στήλης·
β)Στατικήφάση: Πολική φάση πολυεστερικού τύπου (παραδεί-
γµατος χάρη πολυηλεκτρική διαιθυλενογλυκόλη,
πολυηλεκτρική βουτανοδιόλη, ►C1πολυαδιπική ◄αιθυλε-
νογλυκόλη κ.λπ.), κυανοσιλικόνες ή οποιαδήποτε άλλη φάση
επιτρέπει τον απαιτούµενο διαχωρισµό (βλέπει διάταξη 5). Η
►C1στατική ◄θα πρέπει να καταλαµβάνει ποσοστό 5 %
(m/m) έως 20%(m/m) του υλικού πληρώσεως. Για ορισµένους
διαχωρισµούς µπορεί να χρησιµοποιηθεί µη πολική στατική
φάση.
3.1.3.3. Προετοιµασία (κοντισιονάρισµα)
Με τη στήλη αποσυνδεδεµένη, αν είναι δυνατόν, από τον ανιχ-
νευτή, η θερµοκρασία του κλιβάνου φέρεται σταδιακά στους
185ºCκαι, κατόπιν, διοχετεύεται ρεύµα αδρανούς αερίου µέσω
της πρόσφατα παρασκευασµένης στήλης, µε ταχύτητα ροής
20ml/min έως 60ml/min, για 16 ώρες τουλάχιστον στην παραπάνω
θερµοκρασία και για ακόµη 2 ώρες στους 195 ºC.
3.1.4. Τριχοειδής στήλη
3.1.4.1. Στήλη κατασκευασµένη από υλικό υδρανές σε σχέση µε τις προς
ανάλυση ουσίες (συνήθως γυαλί ή συντετηγµένο διοξείδιο του
πυριτίου). Η εσωτερική διάµετρος κυµαίνεται µεταξύ 0,2 mmκαι
0,8mm. Η εσωτερική επιφάνεια υποβάλλεται σε κατάλληλη
κατεργασία (επιφανειακή προετοιµασία, αδρανοποίηση), πριν
επιστρωθεί µε την στατική φάση. Στις περισσότερες περιπτώσεις
αρκεί µήκος 25 µέτρων.
3.1.4.2. Στατική φάση, συνήθως τύπου πολυγλυκόλης
►C1(πολυαιθυλενογλυκόλη) 20000◄,πολυεστέρα (πολυηλεκ-
τρική βουτανοδιόλη) ή πολικού πολυσιλοξανίου
(κυανοσιλικόνες). Κατάλληλες είναι οι στήλες µε σταυροδε-
σµούς.
Σηµείωση 4: Τα πολικά πολυσιλοξάνια υπάρχει κίνδυνος να
προκαλέσουν δυσχέρειες στην ταυτοποίηση και τον
διαχωρισµό του λινολενικού οξέος και των οξέων
C20.Οι επιστρώσεις πρέπει να είναι λεπτές, δηλαδή
πάχους 0,1 µmέως►C10,2µm◄.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—48
▼B
3.1.4.3. Συναρµολόγηση και προετοιµασία (κοντισιονάρισµα) της στήλης.
Κατά τη συναρµολόγηση των τριχοειδών στηλών τηρούνται οι
συνήθεις προφυλάξεις, δηλαδή διάταξη της στήλης στον κλίβανο
(στήριγµα), επιλογή και συναρµολόγηση των συνδέσµων (στεγα-
νότητα), σύνδεση των άκρων της στήλης µέ το σύστηµα έγχυσης
και τον ανιχνευτή (µείωση των µη ωφελίµων χώρων). Η στήλη
τοποθετείται κάτω από ρεύµα φέροντος αερίου [παραδείγµατος
χάρη 0,3bar (30 kPa), προκειµένου για στήλη µήκους
►C125m◄και εσωτερικής διαµέτρου 0,3 mm].
Το κοντισιονάρισµα της στήλης γίνεται µε προγραµµατισµό της
θερµοκρασίας του κλιβάνου ώστε να ανέρχεται 3 ºC/min από τη
θερµοκρασία περιβάλλοντος µέχρι µια θερµοκρασία 10 ºCχαµη-
λότερη από το σηµείο αντοχής της στατικής φάσης. Η
θερµοκρασία του κλιβάνου διατηρείται στην τιµή αυτή για µία
ώρα, µέχρι να σταθεροποιηθεί η γραµµή βάσεως, έπειτα επανα-
φέρεται στους 180 ºCγια εργασία σε ισόθερµες συνθήκες.
Σηµείωση 5: Στο εµπόριο κυκλοφορούν κατάλληλα προετοιµα-
σµένες στήλες.
3.1.5. Ανιχνευτής, κατά προτίµηση επιδεχόµενος θέρµανση σε θερµο-
κρασία υψηλότερη από της στήλης.
3.2.Σύριγγα
Η σύριγγα πρέπει να έχει ανώτατη χωρητικότητα 10 µ lκαι να
είναι αριθµηµένη ανά 0,1 µ l.
3.3.Καταγραφέας
Αν για τον υπολογισµό της σύστασης του προς ανάλυση
µείγµατος πρόκειται να χρησιµοποιηθεί καµπύλη καταγραφέα,
απαιτείται ηλεκτρονικός καταγραφέας µεγάλης ακρίβειας,
συµβατός µε τις χρησιµοποιούµενες συσκευές. Ο καταγραφέας
πρέπει να έχει τα ακόλουθα χαρακτηριστικά:
α) ταχύτητα απόκρισης µικρότερη από 1,5 s,κατά προτίµηση 1 s
(ταχύτητα απόκρισης είναι ο χρόνος που χρειάζεται η γραφίδα
του καταγραφέα για να καλύψει το διάστηµα 8 %έως 90%
µετά την ακαριαία είσοδο σήµατος 100 %)·
β) πλάτος χαρτιού 20 cmκατ'ελάχιστο όριο·
γ) ταχύτητα χαρτιού ρυθµιζόµενη σε διάφορες τιµές µεταξύ
►C10,4cm/min ◄και 2,5cm/min.
3.4.Ολοκληρωτής ή υπολογιστής (προαιρετικά)
Ταχείς και ακριβείς υπολογισµοί µπορούν να επιτευχθούν µε τη
βοήθεια ηλεκτρονικού ολοκληρωτή ή ηλεκτρονικού υπολογιστή ·
το όργανο αυτό πρέπει να παρέχει γραµµική απόκριση µε επαρκή
ευαισθησία, καθώς και ικανοποιητική διόρθωση, όσον αφορά την
απόκλιση της γραµµής βάσεως.
4. ΕΚΤΕΛΕΣΗ
Οι εργασίες που περιγράφονται στα σηµεία 4.1 έως 4.3 αφορούν
τη χρήση ανιχνευτή φλογός ιονισµού. Είναι δυνατόν να χρησιµο-
ποιηθεί, εναλλακτικά, αέριος χρωµατογράφος µε ανιχνευτή
θερµικής αγωγιµότητος (καθαρόµετρο). Στην περίπτωση αυτή, οι
συνθήκες της εργασίας τροποποιούνται όπως περιγράφεται στη
διάταξη 6.
4.1.Συνθήκες δοκιµής
4.1.1. Εκλογή των άριστων συνθηκών εργασίας
4.1.1.1. Κοινή στήλη
Για την εκλογή των συνθηκών δοκιµής, θα πρέπει να λαµβά-
νονται υπόψη οι ακόλουθες µεταβλητές:
α) το µήκος και η διάµετρος της στήλης ·
β) το είδος και η ποσότητα της στατικής φάσης ·
γ) η θερµοκρασία της στήλης ·
δ) η ταχύτητα ροής του φέροντος αερίου ·
ε) η απαιτούµενη διακριτική ικανότητα ·1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—49
▼B
ζ) η ποσότητα του δείγµατος δοκιµής, η οποία επιλέγεται µε
τρόπο ώστε η συνδεσµολογία ανιχνευτή και ηλεκτροµέτρου
να παρέχει γραµµική απόκριση ·
η) η διάρκεια της ανάλυσης.
Οι τιµές που παρατίθενται στους πίνακες 1 και 2 γενικά, οδηγούν
στα επιθυµητά αποτελέσµατα, δηλαδή αποτελεσµατικότητα
τουλάχιστον2000 θεωρητικών πλακών ανά µέτρο µήκους της
στήλης, για το στεατικό µεθυλεστέρα και έκλουσή του σε 15 min
περίπου.
Εφόσον το επιτρέπει ο χρησιµοποιούµενος εξοπλισµός, η θερµο-
κρασία του συστήµατος έγχυσης θα πρέπει να είναι περίπου
200ºCκαι του ανιχνευτή ίση ή υψηλότερη από τη θερµοκρασία
της στήλης.
Κατά κανόνα, ο λόγος της ταχύτητας ροής του υδρογόνου, που
διοχετεύεται στον ανιχνευτή φλογός ιονισµού προς την ταχύτητα
ροής του φέροντος αερίου κυµαίνεται από 1:2 έως 1:1, ανάλογα µε
τη διάµετρο της στήλης. Η ταχύτητα ροής του οξυγόνου είναι
περίπου πενταπλάσια έως δεκαπλάσια από του υδρογόνου.
Πίνακας 1
Εσωτερική διάµετρος στήλης
mmΤαχύτητα ροής φέροντος αερίου
ml/min
21 5 έως 25
32 0 έως 40
44 0 έως 60
Πίνακας 2
►C1Συγκέντρωση στατικής
φάσης ◄
%(m/m)Θερµοκρασία στήλης
ºC
5 175
10 180
15 185
20 185
4.1.1.2. Τριχοειδής στήλη
Τα χαρακτηριστικά αποδοτικότητας και δυνατότητας των
τριχοειδών στηλών σηµαίνουν ότι ο διαχωρισµός των συστατικών
και η διάρκεια της ανάλυσης εξαρτώνται σε µεγάλο βαθµό από
την ταχύτητα ροής του φέροντος αερίου στη στήλη. Κατά συνέ-
πεια, για την επίτευξη άριστων συνθηκών εργασίας, είναι
απαραίτητο να ρυθµιστεί αυτή η παράµετρος (ή, πιο απλά, το
ύψος απωλειών της στήλης), ανάλογα µε το αν επιδιώκεται καλύ-
τερος διαχωρισµός ή ταχύτερη ανάλυση.
4.1.2. Προσδιορισµός του αριθµού θεωρητικών πλακών (αποδοτικότητα)
και της διακριτικής ικανότητας (βλέπε σχήµα 1).
Εκτελείται ανάλυση µείγµατος στεατικού µεθυλεστέρα και
ελαϊκού µεθυλεστέρα σε ίσες περίπου αναλογίες (παραδείγµατος
χάρη µεθυλεστέρες από βούτυρο κακάου).
Η θερµοκρασία της στήλης και η ταχύτητα ροής του φέροντος
αερίου επιλέγονται µε τρόπο ώστε το µέγιστο της κορυφής που
αντιστοιχεί στο στεατικό µευθλεστέρα να καταγράφεται 15 min
περίπου µετά την κορυφή που αντιστοιχεί στο διαλύτη. Χρησιµο-
ποιείται αρκετή ποσότητα από το µείγµα των µεθυλεστέρων, έστε
η κορυφή που αντιστοιχεί στο στεατικό µεθυλεστέρα να κατα-
λαµβάνει περίπου τα 3 /4της πλήρους κλίµακας.
Ο αριθµός των θεωρητικών πλακών, n(αποδοτικότητα), υπολογί-
ζεται µε τον τύπο:1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—50
▼B
n¼16drðIÞ
ωðIÞ/C18/C192
ενώ η διακριτική ικανότητα, Rµε τον τύπο:
R¼2∆
ωðIÞþωðIIÞ
όπου:
dr(I)=είναι η απόσταση κατακράτησης, σε χιλιοστό-
µετρα, από την αρχή του χρωµατογραφήµατος
µέχρι το µέγιστο της κορυφής που αντιστοιχεί
στο στεατικό µεθυλεστέρα,
ω(I)και ω(II)=είναι τα πλάτη, σε χιλιοστόµετρα, των κορυφών
που αντιπροσωπεύουν το στεατικό µεθυλεστέρα
και τον ελαϊκό µεθυλεστέρα, αντίστοιχα, τα
οποία µετρώνται µεταξύ των σηµείων τοµής των
εφαπτοµένων στα σηµεία καµπής των καµπυλών
και της γραµµής βάσεως,
∆=είναι η απόσταση, σε χιλιοστόµετρα, µεταξύ
των µεγίστων των κορυφών που αντιστοιχούν
στο στεατικό µεθυλεστέρα και στον ελαϊκόµεθυλεστέρα,
και ο δείκτης διακριτικής ικανότητας µε τον τύπο
Ir¼a
b
όπου:
a= είναι το ύψος της χαµηλότερης κορυφής, µετρούµενο ως
προς τη γραµµή βάσεως και
b= είναι το ύψος του χαµηλότερου σηµείου της κοιλάδας της
περιλαµβανόµενης µεταξύ των δύο προσκείµενων κορυφών,
µετρούµενο ως προς τη γραµµή βάσεως.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—51
▼M2
▼B
Σχήµα 1
Χρωµατογράφηµα για τον προσδιορισµό του αριθµού θεωσητικών πλακών
(αποδοτικότητα) και της διαχωριστικής ικανότητας
Οι συνθήκες εργασίας που πρέπει να επιλέγονται είναι εκείνεςµε τις οποίες επιτυγχάνονται αποδοτικότητα τουλάχιστον 2000
θεωρητικών πλακών ανά µέτρο µήκους της στήλης, για το στεα-
τικό µεθυλεστέρα, και διακριτική ικανότητα τουλάχιστον 1,25.
4.2.∆είγµα δοκιµής
Με τη βοήθεια της σύριγγας (3.2), λαµβάνονται 0,1 µ lέως 2 µl
από το διάλυµα µεθυλεστέρων που έχει παρασκευαστεί σύµφωνα
µε το παράρτηµα XBκαι►
C1εγχύονται ◄στη στήλη.
Σε περίπτωση που οι εστέρες δεν είναι διαλυµένοι, παρασκευά-
ζεται διάλυµα συγκεντρώσεως περίπου 100 mg/ml σε επτάνιο
χρωµατογραφικής καθαρότητας, από το οποίο
►C1εγχύονται ◄0,1µlέως 1 µl.
Αν πρόκειται για ανάλυση συστατικών που περιέχονται µόνο σε
ίχνη, η ποσότητα του δείγµατος δοκιµής µπορεί να αυξηθεί (έως
10 φορές).
4.3.Ανάλυση
Οι συνθήκες εργασίας είναι γενικά εκείνες που καθορίζονται στο
σηµείο 4.1.1.
Η εργασία, ωστόσο, µπορεί να εκτελεστεί σε χαµηλότερη θερµο-
κρασία στήλης, όταν απαιτείται ο προσδιορισµός λιπαρών οξέωνµε λιγότερα από 12 άτοµα άνθρακα, ή σε υψηλότερη, προκει-
µένου για τον προσδιορισµό λιπαρών οξέων µε περισσότερα από
20 άτοµα άνθρακα. Όταν το επιτρέπουν οι περιστάσεις, είναι
δυνατόν να εφαρµοστεί προγραµµατισµός θερµοκρασίας και στις
δύο παραπάνω περιπτώσεις. Παράδειγµα:αν το δείγµα περιέχει
τους µεθυλεστέρες λιπαρών οξέων µε λιγότερα από 12 άτοµα
άνθρακα, το δείγµα εγχέεται στους 100 ºC (ή στους 50-60ºC
παρουσία βουτυρικού οξέος) και αµέσως η θερµοκρασία φέρεται
στην►
C1µέγιστη τιµή ◄µε ταχύτητα 4ºC/min έως 8ºC/min.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—52
▼B
Σε ορισµένες περιπτώσεις, µπορεί να γίνει συνδυασµός των δύο
τεχνικών.
Μετά τη θέρµανση µε προγραµµατισµό θερµοκρασίας, συνεχί-
ζεται η έκλουση σε σταθερή θερµοκρασία, µέχρι να εκλουσθούν
όλα τα συστατικά. Εάν το όργανο δεν επιτρέπει θέρµανση µε
προγραµµατισµό θερµοκρασίας, η εργασία εκτελείται σε δύο
καθορισµένες θερµοκρασίες µεταξύ 180 ºCκαι 195ºC.
Συνιστάται, εφόσον είναι απαραίτητο, η διεξαγωγή δύο αναλύ-
σεων µε στατικές φάσεις διαφορετικής πολικότητας, ώστε να
επιβεβαιωθεί η απουσία συγκαλυµµένων κορυφών, παραδείγµατος
χάρη στην περίπτωση της ταυτόχρονης παρουσίας συζυγών C18:3και►C1C20:0◄ήC18:3καιC18:2.
4.4.Καταγραφή του χρωµατογραφήµατος και των γραφικών παραστά-
σεων αναφοράς
Εκτελείται ανάλυση του πρότυπου µείγµατος αναφοράς (2.3), µε
τις ίδιες συνθήκες εργασίας όπως για το δείγµα, και µετρώνται
οι χρόνοι ή οι αποστάσεις κατακράτησης για τα λιπαρά οξέα
που το αποτελούν. Για κάθε βαθµό ακορέστου, σχεδιάζονται σε
ηµιλογαριθµικό χαρτί οι γραφικές παραστάσεις που απεικονίζουν
το λογάριθµο του χρόνου ή της απόστασης κατακράτησης συναρ-
τήσει του αριθµού ατόµων άνθρακα. Σε ισόθερµες συνθήκες, οι
καµπύλες για οξέα µε ευθεία άλυσο και τον ίδιο βαθµό ακορέ-
στου θα πρέπει να είναι ευθείες γραµµές, σχεδόν παράλληλες.
Είναι απαραίτητο να αποφεύγονται οι συνθήκες εκείνες, που
επιτρέπουν«συγκαλυµµένες κορυφές »,δηλαδή µε τις οποίες η
διακριτική ικανότητα είναι ανεπαρκής για το διαχωρισµό δύο
συστατικών.
5. ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
5.1.Ποιοτική ανάλυση
Οι κορυφές που αντιστοιχούν στους µεθυλεστέρες του δείγµατος
ταυτοποιούνται από τις καµπύλες του σηµείου 4.4, αν είναι
απαραίτητο µε παρεµβολή.
5.2.Ποσοτική ανάλυση
5.2.1. Προσδιορισµός της σύστασης
Εκτός από εξαιρετικές περιπτώσεις, εφαρµόζεται η µέθοδος
εσωτερικής κανονικοποίησης, δηλαδή λαµβάνεται ως δεδοµένο
ότι στο χρωµατογράφηµα εµφανίζεται το σύνολο των συστατικών
του δείγµατος, µε τρόπο ώστε το συνολικό εµβαδόν που περι-
κλείεται από τις κορυφές να αντιπροσωπεύει το 100 %των
συστατικών (πλήρης έκλουση).
Εάν ο χρησιµοποιούµενος εξοπλισµός περιλαµβάνει
ολοκληρωτή, χρησιµοποιούνται οι αριθµοί που λαµβάνονται από
αυτόν. Σε αντίθετη περίπτωση, το εµβαδόν που περικλείεται από
κάθε κορυφή προσδιορίζεται πολλαπλασιάζοντας το ύψος της επί
το πλάτος της στο µέσον του ύψους, ενώ λαµβάνονται υπόψη,
κατά περίπτωση, οι διάφορες εξασθενήσεις του σήµατος κατά
την καταγραφή.
5.2.2. Τρόπος υπολογισµού
5.2.2.1. Γενική περίπτωση
Η περιεκτικότητα σε δεοµένο συστατικό i,εκφραζόµενη σε κατά
µάζα εκατοστιαία αναλογία µεθυλεστέρων, υπολογίζεται µε τον
προσδιορισµό του επί τοις εκατό ποσοστού που αντιπροσωπεύει
το εµβαδόν της αντίστοιχης κορυφής ως προς το άθροισµα των
εµβαδών όλων των κορυφών, εφαρµόζοντας τον τύπο:
AIPA/C2100
όπου:
AI = είναι το εµβαδόν που περικλείεται από την κορυφή η
οποία αντιστοιχεί στο συστατικό i,1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—53
▼C1
▼B
▼B
►C1ΣΑ◄=είναι το άθροισµα των εµβαδών που περι-
κλείονται από όλες τις κορυφές.
Το αποτέλεσµα δίδεται µε ένα δεκαδικό φηφίο.
Σηµείωση 6: Στη γενική αυτή περίπτωση, θεωρείται ότι το αποτέ-
λεσµα του υπολογισµού βάσει των σχετικών
εµβαδών αντιπροσωπεύει εκατοστιαία αναλογία
κατά µάζα. Για τις περιπτώσεις όπου η υπόθεση
αυτή δεν ευσταθεί, βλέιπε σηµείο 5.2.2.2.
5.2.2.2. Χρήση συντελεστών διορθώσεως
Σε ορισµένες περιπτώσεις, παραδείγµατος χάρη παρουσία
λιπαρών οξέων µε λιγότερα από 8 άτοµα άνθρακα ή οξέων µε
δευτερεύουσες οµάδες, όταν χρησιµοποιούνται ανιχνευτές
θερµικής αγωγιµότητας ή όταν απαιτείται οπωσδήποτε η µεγαλύ-
τερη δυνατή ακρίβεια, θα πρέπει να χρησιµοποιούνται
συντελεστές διορθώσεως για τη µετατροπή του επί τοις εκατό
ποσοστού των εµβαδών των κορυφών σε κατά µάζα εκατοστιαίες
αναλογίες συστατικών.
Οι συντελεστές διορθώσεως καθορίζονται µε τη βοήθεια χρωµα-
τογραφήµατος που προκύπτει από την ανάλυση µείγµατος
µεθυλεστέρων γνωστής σύστασης η οποία εκτελείται µε πανο-
µοιότυπες συνθήκες εργασίας όπως η ανάλυση του δείγµατος.
Για το εν λόγω µείγµα αναφοράς, η κατά µάζα εκατοστιαία
αναλογία του συστατικού iπαρέχεται από τον τύπο:
miX
m/C2100
όπου
mi=είναι η µάζα του συστατικού iστο µείγµα αναφοράς,
∑m=είναι η συνολική µάζα των διαφόρων συστατικών του
µείγµατος αναφοράς.
Από το χρωµατογράφηµα του µείγµατος αναφοράς (4.4), υπολογί-
ζεται το επί τοις εκατό ποσοστό (εµβαδόν /εµβαδόν) για το
συστατικόiως εξής:
AiX
A/C2100
όπου
Ai=είναι το εµβαδόν που περικλείεται από την κορυφή η
οποία αντιστοιχεί στο συστατικό i,
∑A=είναι το άθροισµα των εµβαδών που περικλείονται από
όλες τις κορυφές.
Ο συντελεστής διορθώσεων υπολογίζεται τότε ος λόγος
Ki¼mi/C2X
A
Ai/C2X
m
Στην κοινή πρακτική, οι συντελεστές διορθώσεως εκφράζονται
σε σχέση µε το συντελεστή KC16οπότε προκύπτουν οι σχετικοί
συντελεστές
K0
i¼Ki
KC16
Όσον αφορά το δείγµα, η περιεκτικότητα σε κάθε συστατικό i
εκφραζόµενη ως κατά µάζα εκατοστιαία αναλογία µεθυλεστέρων,
είναι
K0
i/C2AiX
K0
i/C2Ai/C0/C1 /C2100
Τα αποτελέσµατα δίδονται µε ένα δεκαδικό ψηφίο.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—54
▼B
5.2.2.3. Χρήση εσωτερικού προτύπου
Σε ορισµένες αναλύσεις (παραδείγµατος χάρη όταν ο ποσοτικός
προσδιορισµός δεν αφορά όλα τα λιπαρά οξέα, όπως στην
περίπτωση ταυτόχρονης παρουσίας οξέων µε 4 και 6 ατοµα
άνθρακα και οξέων µε 16 και 18 άτοµα άνθρακα, ή όταν είναι
απαραίτητο να προσδιοριστεί η απόλυτη ποσότητα ενός λιπαρού
οξέος σε ένα δείγµα) απαιτείται η χρήση εσωτερικού προτύπου.
Χρησιµοποιούνται συνήθως λιπαρά οξέα µε 5, 15 ή 17 άτοµα
άνθρακα. Ο συντελεστής διορθώσεως (αν έχει εφαρµογή) θα
πρέπει να προσδιορίζεται και για το εσωτερικό πρότυπο.
Η κατά µάζα εκατοστιαία αναλογία του συστατικού i,εκφραζό-
µενη σε µεθυλεστέρες, παρέχεται από τον τύπο:
ms/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
s/C2As/C2100
όπου
Ai=είναι το εµβαδόν που περικλείεται από την κορυφή η
οποία αντιστοιχεί στο συστατικό i,
As=είναι το εµβαδόν που περικλείεται από την κορυφή η
οποία αντιστοιχεί στο εσωτερικό πρότυπο,
K′i=είναι ο συντελεστής διορθώσευς για το συσταρικό i
(σχετικός, ως προς τον KC16),
K′s=είναι ο συντελεστής διορθώσεως για το εσωτερικό
πρότυπο (σχετικός, ως προς τον KC16),
m= είναι η µάζα του δείγµατος δοκιµής, σε χιλιοστόγραµµα,
ms=είναι η µάζα του εσωτερικού προτύπου, σε χιλιοστό-
γραµµα.
Τα αποτελέσµατα δίδονται µε ένα δεκαδικό ψηφίο.
6. ΕΙ∆ΙΚΗ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ TRANS
ΙΣΟΜΕΡΩΝ
Είναι δυνατό να προσδιορισθεί η περιεκτικότητα σε trans
ισοµερή των λιπαρών οξέων µε αριθµό ατόµων άνθρακος µεταξύ
10 και 24, µε διαχωρισµό των µεθυλεστέρων και µε χρήση
τροχοειδών στηλών χρωµατογραφίας οι οποίες έχουν συγκεκρι-
µένη πολικότητα.
6.1. Τριχοειδής στήλη από οξείδιο του πυριτίου, εσωτερικής διαµέ-
τρου από 0,25 έως 0,32 mm και µήκους 50 m,µε επίχρισµα
κυανοπροπυλσιλικόνης πάχους µεταξύ 0,1 και 0,3 µm( τύπουSP
2340, τύπουSP2380,C.P.sil88,Silor10 και άλλων παροµοίων).
6.2. Οι µεθυλεστέρες παρασκευάζονται σύµφωνα µε τη µέθοδο Β του
άλλου παραρτήµατος (Χ /Β). Οι λιπαρές ουσίες των οποίων η
περιεκτικότητα σε ελεύθερα οξέα υπερβαίνει το 3 %πρέπει να
εξουδετερώνονται προληπτικά σύµφωνα µε το σηµείο 6.1. του
παραρτήµατος 7.
6.3. Οι συνθήκες εργασίας για τη χρωµατογραφία αέρος φάσεως είναι
συνολικά οι ακόλουθες:
—η θερµοκρασία της στήλης ρυθµίζεται στους 150 ºCέως 230ºC
(π.χ. 165ºCεπί 15 λεπτά και εν συνεχεία αυξάνεται κατά 5 ºC
ανά λεπτό µέχρι τη θερµοκρασία των 200 ºC),
—θερµοκρασία της διάταξης εγχύσεως:250 ºC όταν χρησιµο-
ποιείται το σύστηµα split ή η αρχική θερµοκρασία της
στήλης όταν χρησιµοποιείται το σύστηµα εγχύσεως πάνω
στη στήλη (oncolumn),
—θερµοκρασία του ανιχνευτή:260 ºC,
—παροχή του φέροντος αερίου (ήλιο και υδρογόνο):1,2 mlανά
λεπτό.
Η εισαγόµενη ποσότητα πρέπει να είναι τέτοια ώστε στις χρησι-
µοποιούµενες συνθήκες ευαισθησίας το ύψος της κορυφής που
αντιστοιχεί στο µεθυλεστέρα του αραχιδικού οξέος να είναι ίσο
ή να υπερβαίνει το 20 %του κάτω µέρος της κλίµακας.
6.4. Η αναγνώριση των διαφόρων µεθυλεστέρων γίνεται επί τη βάσει
των χρόνων συγκρατήσεως οι οποίοι συγκρίνονται προς εκείνους
των µειγµάτων αναφοράς. (Όπως αναφέρεται στο σηµείο 2.3).1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—55
▼M2
▼M2
Οι εστέρες των λιπαρών οξέων trans εκλύονται πριν από τα αντί-
στοιχα ισοµερή cis. Το σχήµα 2 εµφαίνει σχετικό
χρωµατογράφηµα.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—56
▼M2
Σχήµα 2
Χρωµατογράφηµα για τον προσδιορισµό των ισοµερών trans των λιπαρών
οξέων µε τριχοειδή στήλη
6.5. Η αποδοτικότητα της στήλης, η προσδιοριζόµενη σύµφωνα µε το
σηµείο 4.1.2, πρέπει να επιτρέπει διαχωρισµό ορισµένων
κρίσιµων ζευγών, για παράδειγµα το ζεύγος που σχηµατίζεται
από τη ζώνη των trans ισοµερών του ισοελαϊκού οξέος και την
κορυφή του ελαϊκού οξέος, transC18:1/cisC18:1, µε δείκτη
διακριτικής ικανότητας ανώτερο του 2,
6.6. Το ποσοστό των διαφόρων οξέων trans υπολογίζεται µε τη
βοήθεια της σχέσεως ανάµεσα στο εµβαδόν της αντίστοιχης
κορυφής και το άθροισµα των εµβαδών όλων των κορυφών.
Λαµβάνονται υπόψη τα ποσοστά των οξέων:
—trans δεκαοκτανικών (T18:1) που αναφέρονται στο παράρτηµα
του παρόντος κανονισµού ως σύνολο των trans ισοµερών
ελαϊκού οξέος,
—cis-trans καιtrans-cis δεκαοκταδιενικών [( CT/TC) 8:2] που
αναφέρονται στο παράρτηµα του παρόντος κανονισµού ως
σύνολο τωνtrans ισοµερών λινελαϊκού οξέος,
—trans-cis-trans, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis, δεκαοκτα-
τριενικών [(TCT+CCT+CTC+TCC)18:3], που αναφέρονται
στο παράρτηµα του παρόντος κανονισµού ως σύνολο των trans
ισοµερών λινολενικού οξέος.
Σηµείωση 8: Λαµβανοµένων υπόψη των ιδιαιτέρων χαρακτηρι-
στικών αυτής της µεθόδου, τα αποτελέσµατα να
δίδονται µε δύο δεκαδικούς.
►M27.◄ΕΙ∆ΙΚΗ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ —ΧΡΗΣΗ ΚΑΘΑΡΟΜΕΤΡΟΥ ΩΣ
ΑΝΙΧΝΕΥΤΗ (ΠΟΥ ΛΕΙΤΟΥΡΓΕΙ ΒΑΣΕΙ ΤΗΣ ΑΡΧΗΣ ΤΩΝ
ΜΕΤΑΒΟΛΩΝ ΤΗΣ ΘΕΡΜΙΚΗΣ ΑΓΩΓΙΜΟΤΗΤΑΣ)
Για τον προσδιορισµό της ποιοτικής και ποσοτικής σύστασης
µείγµατος µεθυλεστέρων λιπαρών οξέων, µπορεί επίσης να
χρησιµοποιηθεί αέριος χρωµατογράφος µε ανιχνευτή που
λειτουργεί βάσει της αρχής των µεταβολών της θερµικής αγωγι-
µότητας (καθαρόµετρο). Στην περίπτωση αυτή, οι συνθήκες που
καθορίζονται στις διατάξεις 3 και 4 θα πρέπει να τροποποιούνται
όπως φαίνεται στον πίνακα 3.
Για την ποσοτική ανάλυση χρησιµοποιούνται οι συντελεστές
διορθώσεως που ορίζονται στο σηµείο 5.2.2.2.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—57
▼B
▼B
Πίνακας 3
Μεταβλητή Τιµή /συνθήκη
Στήλη Μήκος:2 έως 4 µέτρα
Εσωτερική διάµετρος:4 mm
Υπόστρωµα Μέγεθος κόκκων από 160 µ m
έως 200 µm
Συγκέντρωση ακίνητης φάσης 15%(m/m) έως 25%(m/m)
Φέρον αέριο Ήλιο ή, ελλείψει αυτού, υδρο-
γόνο, µε τη χαµηλότερη
δυνατή περιεκτικότητα σε
οξυγόνο
Βοηθητικά Κανένα
Θερµοκρασία συστήµατος
έγχυσης40—60ºC υψηλότερη από της
στήλης
Θερµοκρασία στήλης Μεταξύ 180 ºCκαι 200ºC
Ταχύτητα ροής φέροντος
αερίουΣυνήθως µεταξύ 60 ml/min και
80ml/min
Με ποσότητα του εγχεόµενου
δείγµατος δοκιµήςΣυνήθως µεταξύ 0,5 µ lκαι 2 µl
►M28.◄►C1ΕΚΘΕΣΗ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ◄
►C1Στην έκθεση ανάλυσης περιγράφονται ◄οι µέθοδοι που
χρησιµοποιήθηκαν για παρασκευή των µεθυλεστέρων και για
την αεριοχρωµατογραφική ανάλυσή τους, καθώς και τα αποτελέ-
σµατα που προέκυψαν. Αναφέρονται επίσης όλες οι λεπτοµέρειες
των εργασιών, που δεν καθορίζονται στο παρόν διεθνές πρότυπο
ή θεωρούνται προαιρετικές, καθώς και των τυχόν συµβάντων,
που ενδέεται να έχουν επηρεάσει τα αποτελέσµατα.
Η έκθεση δοκιµής πρέπει να περιλαµβάνει όλα τα απαραίτητα
στοιχεία για την πλήρη ταυτοποίηση του δείγµατος.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—58
▼M19
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ X «B»
ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΜΕΘΥΛΕΣΤΕΡΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ ΕΛΑΙΟΛΑ∆ΟΥ
ΚΑΙ ΠΥΡΗΝΕΛΑΙΟΥ
Για την παρασκευή των µεθυλεστέρων λιπαρών οξέων ελαιολάδου και
πυρηνελαίων συνιστώνται οι ακόλουθες δύο µέθοδοι:
ΜέθοδοςA:Μετεστεροποίηση εν ψυχρώ µέσω µεθανολικού διαλύµατος
υδροξειδίου του καλίου
ΜέθοδοςB:Μεθυλίωση εν θερµώ µέσω µεθανολικού διαλύµατος µεθυ-
λικού νατρίου ακολουθούµενη από εστεροποίηση σε όξινο
περιβάλλον.
Η επιλογή της µίας ή της άλλης µεθόδου εξαρτάται από την προς
προσδιορισµό αναλυτική παράµετρο και από την κατηγορία του ελαίου,
όπως υποδεικνύεται παρακάτω:
α) προσδιορισµός της διαφοράς µεταξύ πραγµατικής και θεωρητικής
περιεκτικότητας σε τριγλυκερίδια µε την ECN42( ∆ECN42):
—η µέθοδοςAεφαρµόζεται σε δείγµατα ελαίων όλων των κατηγο-
ριών ύστερα από καθαρισµό του ελαίου µέσω διέλευσής του από
στήλη διοξειδίου του πυριτίου:
β) προσδιορισµός της συστάσεως σε λιπαρά οξέα:
—η µέθοδοςAεφαρµόζεται απευθείας σε δείγµατα ελαίων των κατω-
τέρω κατηγοριών:
—παρθένο ελαιόλαδο µε ελεύθερη οξύτητα κάτω του 3,3 %,
—εξευγενισµένο παρθένο ελαιόλαδο,
—ελαιόλαδο (µείγµα παρθένου ελαιολάδου και εξευγενισµένου
παρθένου ελαιολάδου),
—εξευγενισµένο πυρηνέλαιο,
—πυρηνέλαιο (µείγµα παρθένου ελαιολάδου και εξευγενισµένου
πυρηνελαίου),
—η µέθοδος Β εφαρµόζεται απευθείας σε δείγµατα ελαίων των κατω-
τέρω κατηγοριών:
—παρθένο ελαιόλαδο µε ελεύθερη οξύτητα άνω του 3,3 %,
—ακατέργαστο πυρηνέλαιο,
γ) προσδιορισµός των trans ισοµερών λιπαρών οξέων:
—η µέθοδοςAεφαρµόζεται απευθείας σε δείγµατα ελαίων των κατω-
τέρω κατηγοριών:
—παρθένο ελαιόλαδο µε ελεύθερη οξύτητα κάτω του 3,3 %,
—εξευγενισµένο παρθένο ελαιόλαδο,
—ελαιόλαδο (µείγµα παρθένου ελαιολάδου και εξευγενισµένου
παρθένου ελαιολάδου),
—εξευγενισµένο πυρηνέλαιο,
—πυρηνέλαιο (µείγµα παρθένου ελαιολάδου και εξευγενισµένου
πυρηνελαίου),
—η µέθοδοςAεφαρµόζεται απευθείας σε δείγµατα ελαίων των κατω-
τέρω κατηγοριών ύστερα από καθαρισµό του ελαίου µέσω
διέλευσής του από στήλη διοξειδίου του πυριτίου:
—παρθένο ελαιόλαδο µε ελεύθερη οξύτητα άνω του 3,3 %,
—ακατέργαστο πυρηνέλαιο.
ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ∆ΕΙΓΜΑΤΩΝ ΕΛΑΙΟΥ
Εφόσον είναι αναγκαίο, τα δείγµατα καθαρίζονται διοχετεύοντας το
έλαιο από στήλη διοξειδίου του πυριτίου, χρησιµοποιώντας ως διαλύτη
έκλουσης εξάνιο /διαιθυλαιθέρα (87:13, v/v), όπως περιγράφεται στη
µέθοδοIUPAC2.507.
Ως εναλλακτική µέθοδος, είναι δυνατή η προσφυγή σε εκχύλιση σε
στερεά φάση χρησιµοποιώντας φύσιγγες διοξειδίου του πυριτίου.
Φύσιγγα διοξειδίου του πυριτίου (1 g, 6 ml) τοποθετείται σε συσκευή
εκλούσεως υπό κενό και πλένεται µε 6 mlεξανίου. Η εφαρµογή κενού
διακόπτεται για να αποφευχθεί ξήρανση της στήλης. Στη συνέχεια,
εισάγεται στη στήλη διάλυµα ελαίου (περίπου 0,12 g)σε 0,5mlεξανίου
και εφαρµόζεται κενό για εισαγωγή του διαλύµατος στο διοξείδιο του
πυριτίου και στη συνέχει γίνεται έκλουση µε 10 mlεξανίου/διαιθυ-
λαιθέρα (87:13 v/v) υπό κενό. Το σύνολο των εκλουσµάτων
οµοιογενοποιείται και χωρίζεται σε δύο ίσα µέρη. Το ένα εκ των δύο1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—59
▼M19
µερών εξατµίζεται µέχρι ξηράνσεως σε περιστροφικό εξατµιστήρα υπό
ελαττωµένη πίεση και σε θερµοκρασία περιβάλλοντος. Το υπόλειµµα
διαλύεται σε 1mlεπτανίου. Το λαµβανόµενο διάλυµα είναι έτοιµο για
την ανάλυση των λιπαρών οξέων µε CPG. Το δεύτερο µέρος εξατµίζεται
και το υπόλειµµα διαλύεται σε 1 mlακετόνης για ανάλυση των τριγλυκε-
ριδίων, µεHPCL εφόσον χρειάζεται.
ΜΕΘΟ∆ΟΙ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ ΜΕΘΥΛΕΣΤΕΡΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ
1. Μέθοδος A:Μετεστεροποίηση εν ψυχρώ µε µεθανολικό διάλυµα
υδροξειδίου του καλίου
1.1.Εφαρµογή
Η ταχεία αυτή µέθοδος εφαρµόζεται σε ελαιόλαδα και πυρηνέ-
λαια µε περιεκτικότητα σε ελεύθερα λιπαρά οξέα κάτω του
3,3%.Τα ελεύθερα λιπαρά οξέα δεν εστεροποιούνται µε υδρο-
ξείδιο του καλίου. Οι αιθυλεστέρες των λιπαρών οξέων
µετεστεροποιούνται βραδύτερα από τους γλυκεριδικούς εστέρες,
ενώ είναι δυνατόν να µετεστεροποιηθούν µόνον µερικώς.
1.2.Αρχή
Οι µεθυλεστέρες σχηµατίζονται µε µετεστεροποίηση σε µεθανο-
λικό διάλυµα υδροξειδίου του καλίου ως ενδιάµεση φάση πριν
από τη σαπωνοποίηση (σηµείο 5 της µεθόδου ISO 5509:2000,
σηµείο 5 της µεθόδου IUPAC2.301).
1.3.Αντιδραστήρια
Μεθανόλη µε περιεκτικότητα σε νερό όχι άνω του 0,5 %(m/m).
Επτάνιο χρωµατογραφικής καθαρότητας.
Υδροξείδιο του καλίου, µεθανολικό διάλυµα περίπου 2 N:
διαλύουµε 11,2gυδροξειδίου του καλίου σε 100 mlµεθανόλης.
1.4.Εξοπλισµός
∆οκιµαστικοί σωλήνες µε βιδωτό πώµα (χωρητικότητας 5 ml)
εφοδιασµένο µε παρέµβυσµα από PTFE.
Βαθµονοµηµένα ή αυτόµατα σιφώνια των 2 και 0,2 ml.
1.5.Τρόπος εργασίας
Σε δοκιµαστικό σωλήνα µε βιδωτό πώµα των 5 ml,ζυγίζονται
περίπου 0,1gδείγµατος ελαίου. Προστίθενται 2 mlεπτανίου και
αναδεύονται. Προστίθενται 0,2 mlµεθανολικού διαλύµατος 2 N
υδροξειδίου του καλίου, ο σωλήνας πωµατίζεται µε το εφοδια-
σµένο µε παρέµβυσµα από PTFE πώµα και το όλον αναδεύεται
ισχυρά επί 30 δευτερόλεπτα. Ο σωλήνας αφήνεται σε ηρεµία
µέχρις ότου το πάνω µέρος του διαλύµατος να καταστεί διαυγές.
Η άνω στιβάδα, η οποία και περιέχει τους µεθυλεστέρες, µεταγγί-
ζεται. Το διάλυµα επτανίου είναι έτοιµο για έγχυση στο
χρωµατογράφο. Συνιστάται το διάλυµα να διατηρείται σε ψυγείο
µέχρι τη στιγµή της χρωµατογραφικής ανάλυσης και να αποφεύ-
γεται η αποθήκευσή του επί χρονικό διάστηµα άνω των δώδεκα
ωρών.
2. Μέθοδος B:Μεθυλίωση εν θερµώ µε µεθανολικό διάλυµα µεθυλικού
νατρίου ακολουθούµενη από εστεροποίηση σε όξινο περιβάλλον
2.1.Εφαρµογή
Η µέθοδος αυτή εφαρµόζεται σε ελαιόλαδα και πυρηνέλαια µε
περιεκτικότητα σε ελεύθερα λιπαρά οξέα άνω του 3,3 %.
2.2.Αρχή
Εξουδετέρωση των ελεύθερων λιπαρών οξέων και επίδραση
αλκαλικού µεθανολικού διαλύµατος στα γλυκερίδια, ακολουθού-
µενη από εστεροποίηση των λιπαρών οξέων σε όξινο
περιβάλλον (σηµείο 4.2 της µεθόδου IUPAC2.301).1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—60
▼M19
2.3.Αντιδραστήρια
—επτάνιο χρωµατογραφικής καθαρότητας,
—µεθανόλη µε περιεκτικότητα σε νερό όχι άνω του 0,5 %(m/m),
—µεθυλικό νάτριο, µεθανολικό διάλυµα 0,2 N: 5 g νατρίου
διαλύονται σε1000ml µεθανόλης (µπορεί να παρασκευαστεί
από διαλύµατα του εµπορίου),
—φαινολοφθαλεΐνη, 0,2 %µεθανολικό διάλυµα,
—θειικό οξύ, σε µεθανολικό διάλυµα 1 N:3ml θειικού οξέος
96%προστίθενται σε 100 mlµεθανόλης,
—κορεσµένο διάλυµα χλωριούχου νατρίου σε νερό.
2.4.Εξοπλισµός
—ογκοµετρική φιάλη χωρητικότητας 50 ml,µε επίπεδο πυθµένα
και µακρύ και στενό εσµυρισµένο λαιµό,
—κάθετος ψυκτήρας:αεροψυκτήρας (µήκους 1 m)µε εσµυρι-
σµένη άρθρωση,
—ρυθµιστής βρασµού,
—γυάλινο χωνί.
2.5.Τρόπος εργασίας
0,25g δείγµατος ελαίου προστίθενται σε ογκοµετρική φιάλη µε
εσµυρισµένο λαιµό των 50 ml.Με τη βοήθεια του χωνιού,
προστίθενται 10 mlτου µεθανολικού διαλύµατος 0,2 Nµεθυλικού
νατρίου και ο ρυθµιστής βρασµού. Το διάλυµα, έπειτα από δέκα
λεπτά, πρέπει να γίνει διαυγές. Η αντίδραση τερµατίζεται
πρακτικά µετά δεκαπέντε λεπτά. Η φιάλη αποσύρεται από την
πηγή θερµότητας, αναµένεται να σταµατήσει η αναρροή, ο
ψυκτήρας αποσύρεται και προστίθενται δύο σταγόνες διαλύµατος
φαινολοφθαλεΐνης. Στο µεθανολικό διάλυµα προστίθενται µερικά
mlθειικού οξέος 1Nµέχρις ότου να καταστεί άχρουν και κατόπιν
προστίθεται επιπλέον 1 mlακόµη. Προσαρµόζεται ο ψυκτήρας
και το διάλυµα φέρεται εκ νέου σε βρασµό επί είκοσι λεπτά
περίπου. Η φιάλη αποσύρεται από την πηγή θερµότητας και
επαναψύχεται σε ρεύµα ύδατος. Ο ψυκτήρας αποµακρύνεται,
προστίθενται 20 mlτου κορεσµένου διαλύµατος χλωριούχου
νατρίου και το διάλυµα αναδεύεται. Προστίθενται 5 mlεπτανίου,
η φιάλη πωµατίζεται και ανακινείται ζωηρά επί δεκαπέντε δευτε-
ρόλεπτα.
Αφήνεται να κατακαθίσει µέχρι πλήρους διαχωρισµού των δύο
φάσεων. Προστίθεται εκ νέου µέρος του κορεσµένου διαλύµατος
χλωριούχου νατρίου µέχρις ότου η υδατική φάση φθάσει το κάτω
µέρος του λαιµού της φιάλης. Τους µεθυλεστέρες περιέχει η
πάνω στιβάδα που βρίσκεται στο λαιµό της φιάλης. Το λαµβανό-
µενο διάλυµα είναι έτοιµο για έγχυση στον αεριοχρωµατογράφο.
Προσοχή:Η µεθυλίωση µε τη µέθοδο Β πρέπει να γίνεται σε
απαγωγό.
2.6.Εναλλακτικοί αντί της µεθυλίωσης τρόποι σύµφωνα µε τη µέθοδο
Β
2.6.1.Μέθοδος Γ
2.6.1.1. Αρχή
Η προς ανάλυση λιπαρή ύλη υποβάλλεται σε κατεργασία µε
µεθανολικό διάλυµα υδροχλωρικού οξέος σε κλειστό φιαλίδιο,
στους 100ºC.
2.6.1.2. Εξοπλισµός
—Γυάλινο παχύτοιχο φιαλίδιο χωρητικότητας περίπου 5 ml
(ύψος 40 έως 45mm, διάµετρος 14 έως 16 mm).
—Βαθµονοµηµένα σιφώνια του 1 και 2 ml.
2.6.1.3. Αντιδραστήρια
∆ιάλυµα υδροχλωρικού οξέος σε 2 %µεθανόλη, παρασκευαζό-
µενο από αέριο υδροχλώριο και άνυδρη µεθανόλη (σηµείωση 1).
Εξάνιο χρωµατογραφικής καθαρότητας.
Σηµείωση 1: Είναι δυνατόν να χρησιµοποιηθούν διαλύµατα
υδροχλωρίου σε µεθανόλη του εµπορίου. Στο εργα-
στήριο, είναι εύκολο να παρασκευαστούν µικρές1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—61
▼M19
ποσότητες αερίου υδροχλωρίου τροποποιώντας το
διάλυµα του εµπορίου ( P = 1,18), µε προσθήκη
µερικών σταγονών πυκνού θειικού οξέος. Επειδή η
µεθανόλη απορροφά ισχυρώς το αέριο υδροχλώριο,
σκόπιµο είναι να λαµβάνονται όλες οι δυνατές
προφυλάξεις χρήσεως κατά τη διάλυση (π.χ.
εισαγωγή του αερίου µε τη βοήθεια µικρού
ανεστραµµένου χωνιού που µόλις εγγίζει την
επιφάνεια της µεθανόλης). Είναι δυνατόν να παρα-
σκευαστούν εκ των προτέρων σηµαντικές
ποσότητες µεθανολικών διαλυµάτων υδροχλωρικού
οξέος που διατηρούνται απόλυτα στο σκότος µέσα
σε φιάλες εφοδιασµένες µε γυάλινο πώµα. Το αντι-
δραστήριο αυτό µπορεί επίσης να παρασκευαστεί
διαλύοντας ακετυλοχλωρίδιο σε άνυδρη µεθανόλη.
2.6.1.4. Τρόπος λειτουργίας
—Στο γυάλινο φιαλίδιο προστίθενται 0,2 gλιπαρής ύλης που
έχει προηγουµένως ξηρανθεί µε θειικό νάτριο και διηθηθεί,
και κατόπιν προστίθενται 2 mlτου µεθανολικού διαλύµατος
υδροχλωρικού οξέος. Το φιαλίδιο κλείνεται.
—Το φιαλίδιο βυθίζεται σε λουτρό στους 100 ºCεπί 40 λεπτά.
—Το φιαλίδιο ψύχεται σε ρεύµα ύδατος, το ανοίγουµε και
προστίθενται 2mlαπεσταγµένου νερού και 1 mlεξανίου.
—Φυγοκεντρούµε και η εξανική φάση αποµακρύνεται, έτοιµη
προς χρήση.
2.6.2.Μέθοδος ∆
2.6.2.1. Αρχή
Η προς ανάλυση λιπαρή ύλη θερµαίνεται υπό αναρροή µε µεθα-
νόλη, εξάνιο και θειικό οξύ. Οι λαµβανόµενοι ούτως
µεθυλεστέρες εκχυλίζονται µε πετρελαϊκό αιθέρα.
2.6.2.2. Εξοπλισµός
—∆οκιµαστικός σωλήνας χωρητικότητας περίπου 20 mlµε
κάθετο αεροψυκτήρα µήκους περίπου 1 m,εφοδιασµένο µε
εσµυρισµένη άρθρωση.
—Βαθµονοµηµένο σιφώνιο 5 ml.
—∆ιαχωριστική χοάνη 50 ml.
—Ογκοµετρικοί κύλινδροι των 10 και 25 ml.
—∆οκιµαστικός σωλήνας µε κωνικό πυθµένα των 15 ml.
2.6.2.3. Αντιδραστήρια
—Αντιδραστήριο µεθυλίωσης:άνυδρη µεθανόλη, εξάνιο και
πυκνό θειικό οξύ ( p=1,84 στην ακόλουθη αναλογία: 75:25:1
(V/V/V).
—Πετρελαϊκός αιθέρας 40 έως 60 ºC.
—Άνυδρο θειικό νάτριο.
2.6.2.4. Τρόπος εργασίας
Στο σωλήνα των 20 mlεισάγονται 0,1gελαίου και προστίθενται
5mlαπό το αντιδραστήριο µεθυλίωσης.
Συνδέεται ο ψυκτήρας και θερµαίνουµε σε υδρόλουτρο µέχρι
βρασµού επί 30 λεπτά (σηµείωση 2).
Το µείγµα µεταφέρεται ποσοτικά σε διαχωριστική χοάνη 50 ml
µε 10mlαπεσταγµένου ύδατος και 10 mlπετρελαϊκού αιθέρα.
Ανακινούµε ισχυρά και αναµένουµε µέχρις ότου να επέλθει
διαχωρισµός φάσεων. Η υδατική φάση αποµακρύνεται και η αιθε-
ρική στιβάδα πλένεται δύο φορές µε 20 mlαπεσταγµένου ύδατος.
Στη διαχωριστική χοάνη προστίθεται µικρή ποσότητα άνυδρου
θειικού νατρίου, αναδεύουµε, αφήνουµε σε ηρεµία επί µερικά
λεπτά και διηθούµε, συλλέγοντας το διήθηµα σε σωλήνα κωνικού
πυθµένα 15ml.
Ο διαλύτης εξατµίζεται σε υδρόλουτρο σε ρεύµα αζώτου.
Σηµείωση 2: Για τον έλεγχο του βρασµού, στο σωλήνα εισάγεται
µικρή γυάλινη ράβδος και η θερµοκρασία του υδρό-
λουτρου περιορίζεται στους 90 ºC.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—62
▼M19
3. Παράµετροι ακριβείας
Η στατιστική αξιολόγηση της ακρίβειας των µεθόδων Α και Β
δηµοσιεύτηκε από το διεθνές συµβούλιο ελαιολάδου στον κανο-
νισµό τουCOI/T.20/CO. αριθ. 24.
ΣΥΣΤΑΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΕ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΑΕΡΙΑΣ
ΦΑΣΗΣ ΤΩΝ ΕΣΤΕΡΩΝ ΤΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ ΤΟΥ ΕΛΑΙΟΛΑ∆ΟΥ
ΚΑΙ ΤΟΥ ΠΥΡΗΝΕΛΑΙΟΥ
1. Τρόπος εργασίας
Η ανάλυση µε χρωµατογραφία αέριας φάσης διαλυµάτων λιπαρών
εστέρων σε εξάνιο πραγµατοποιείται σύµφωνα µε το πρότυπο ISO
5508, µέσω τριχοειδούς στήλης (50 mµήκος×0,25 ή 0,32mm
εσωτερική διάµετρος) καλυµµένης µε κυανοπροπυλοσιλικόνη,
όπως υποδεικνύεται για τον προσδιορισµό των trans ισοµερών
λιπαρών οξέων (COI/T.20/Doc. αριθ. 17).
Στην εικόνα 1 παρουσιάζεται το τυπικό χρωµατογραφικό προφίλ
πυρηνελαίου περιέχοντος µεθυλικούς και αιθυλικούς εστέρες
λιπαρών οξέων και trans ισοµερή µεθυλικών εστέρων.
2. Υπολογισµοί
2.1. Για να υπολογιστεί η σύσταση σε λιπαρά οξέα και το ∆ ECN42,
πρέπει να λαµβάνονται υπόψη τα ακόλουθα λιπαρά οξέα:
Μυριστικό (C14:0).
Παλµιτικό (C16:0). Άθροισµα των εµβαδών των κορυφών που
αντιστοιχούν στους µεθυλικούς και αιθυλικούς εστέρες.
Παλµιτελαϊκό (C16:1). Άθροισµα των εµβαδών των κορυφών που
αντιστοιχούν στα ισοµερή ω9 και ω7 του µεθυλικού εστέρα.
∆εκαεπτανοϊκό (C17:0).
∆εκαεπτενοϊκό (C17:1).
Στεατικό (C18:0).
Ελαϊκό (C18:1). Άθροισµα των εµβαδών των κορυφών που αντι-
στοιχούν στα ισοµερή ω9 και ω7 του µεθυλικού εστέρα, του
αιθυλικού εστέρα και των trans ισοµερών του µεθυλικού εστέρα.
Λινελαϊκό (C18:2). Άθροισµα των εµβαδών των κορυφών που
αντιστοιχούν στους µεθυλικούς και αιθυλικούς εστέρες και στα
trans ισοµερή του µεθυλικού εστέρα.
Αραχιδικό (C20:0).
Λινολενικό (C18:3). Άθροισµα των εµβαδών του µεθυλικού
εστέρα και τωνtrans ισοµερών του µεθυλικού εστέρα.
Εικοσενοϊκό (C20:1).
Βεχενικό (C22:0).
Λιγνοκηρικό (C24:0).
Το σκουαλένιο δεν λαµβάνεται υπόψη στον υπολογισµό του
συνολικού εµβαδού.
2.2. Για τον υπολογισµό του ποσοστού του trans-C18:1, χρησιµο-
ποιείται η κορυφή που αντιστοιχεί στους µεθυλικούς εστέρες
του λιπαρού αυτού οξέος. Για το άθροισµα [ trans-C18:2 +trans-
C18:3], προστίθενται όλες οι κορυφές που αντιστοιχούν στα trans
ισοµερή των δύο αυτών λιπαρών οξέων. Για να υπολογιστεί το
συνολικό εµβαδόν, λαµβάνονται υπόψη όλες οι αναφερόµενες
στο 2.1 κορυφές (βλέπε COI/T.20/Doc. αριθ. 17).
Ο υπολογισµός του ποσοστού κάθε λιπαρού οξέος πραγµατο-
ποιείται µε τον ακόλουθο τύπο:
%X=( ΕµβαδόνX×100)/( συνολικό εµβαδόν)1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—63
▼M19
Εικόνα 1:Χρωµατογραφικό προφίλ πυρηνελαίου, ληφθέν µε τη µέθοδο της µεθυ-
λίωσης εν ψυχρώ. Οι χρωµατογραφικές κορυφές αντιστοιχούν στους µεθυλεστέρες,
εκτός αν υποδεικνύεται διαφορετικά1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—64
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XI
ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ►C1ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ◄ΤΟΥ ΕΛΑΙΟ-
ΛΑ∆ΟΥ ΣΕ ΑΛΟΓΟΝΟΥΧΟΥΣ ΠΤΗΤΙΚΟΥΣ ∆ΙΑΛΥΤΕΣ
1.ΑΡΧΗ
Αεριοχρωµατογραφική ανάλυση σύµφωνα µε την τεχνική «head
space».
2.ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ
2.1.Συσκευή αερίου χρωµατογραφίας, µε ανιχνευτή σύλληψης ηλεκτρο-
νίων (ECD).
2.2.Συσκευή«headspace».
2.3.Στήλη αερίου χρωµατογραφίας από γυαλί µήκους 2 µέτρων και
διαµέτρου 2mm,►C1µε στατική φάση ◄.OV101 ως 10%ή ισοδύ-
ναµο, που εµποτίζει γη διατόµων, η οποία έχει αποτεφρωθεί,
εκπλυθεί µε οξέα και µετατραπεί σε σιλάνιο, κοκκοµετρικού βαθµού
80 ως 100Mesh.
2.4.Φέρον αέριο και βοηθητικό αέριο:άζωτο για αέριο χρωµατογραφία,
►C1κατάλληλο για ανιχνευτή σύλληψης ηλεκτρονίων ◄.
2.5.Γυάλινα φιαλίδια 10 ώς 15 ml,µε επένδυση από τεφλόν και ένα πώµα
από αλουµίνιο εφοδιασµένο µε στόµιο, για δειγµατοληψία µε
σύριγγα.
2.6.Λαβίδες ερµητικού κλεισίµατος.
2.7.Σύριγγα για αέριο 0,5 ως 2 ml.
3.ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ
3.1.Πρότυπα:αλογονούχοι πτητικοί διαλύτες ►C1χρωµατογραφικής
καθαρότητας ◄.
4.∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ
4.1.Ζυγίζουµε ακριβώς 3 gελαιολάδου περίπου σε ένα γυάλινο φιαλίδιο
(µιας χρήσεως), κλείνουµε το φιαλίδιο ερµητικά. Εισάγουµε το
φιαλίδιο σε θερµοστάτη σε 70 ºCγια µία ώρα. Λαµβάνουµε µε ακρί-
βεια, µε τη βοήθεια σύριγγας, όγκο 0,2 ώς 0,5 mlαπό το«head
space». Το εγχέουµε στη στήλη της συσκευής αερίου χρωµατογρα-
φίας που ρυθµίζεται ως εξής:
—θερµοκρασία έγχυσης:150 ºC,
—θερµοκρασία στήλης:70 ώς 80 ºC,
—θερµοκρασία ανίχνευσης:200 ως 250 ºC.
Είναι δυνατό να χρησιµοποιηθούν άλλες θερµοκρασίες στο βαθµό
που τα αποτελέσµατα είναι ισοδύναµα.
4.2.∆ιαλύµατα αναφοράς. Προετοιµάζουµε πρότυπα διαλύµατα, χρησιµο-
ποιώντας εξευγενισµένο ελαιόλαδο χωρίς ίχνη διαλυτών, σε
συγκεντρώσεις που κυµαίνονται µεταξύ 0,05 και 1 mg/kg και
ανάλογες µε την υπολογιζόµενη περιεκτικότητα του δείγµατος. Η
ενδεχόµενη διάλυση πρέπει να γίνεται µε πεντάνιο.
4.3.►C1Ποσοτικός προσδιορισµός ◄.Συγκρίνουµε τα εµβαδά ή τα
ύψη των κορυφών του φάσµατος που αντιστοιχούν στο δείγµα και
στο πρότυπο διάλυµα µε την υπολογιζόµενη πλησιέστερη
συγκέντρωση. Αν η σχετική απόκλιση είναι µεγαλύτερη από 10 %,
η ανάλυση πρέπει να επαναληφθεί, συγκρίνοντας µε ένα νέο
πρότυπο διάλυµα, µέχρι η σχετική συγκέντρωση να ανταποκρίνεται
στη σχετική απόκλιση που προαναφέρεται. Η περιεκτικότητα υπολο-
γίζεται µε βάση ένα µέσο όρο των στοιχειωδών εγχύσεων.
4.4.∆ιατύπωση αποτελεσµάτων. Τα αποτελέσµατα ►C1εκφράζονται ◄
σεmg/kg(ppm). Το όριο ανίχνευσης της µεθόδου είναι 0,01 mg/kg.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—65
▼M19
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XII
ΟΡΓΑΝΟΛΗΠΤΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΩΝ ΠΑΡΘΕΝΩΝ ΕΛΑΙΟ-
ΛΑ∆ΩΝ
1.ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ ΚΑΙ ΠΕ∆ΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ
Η παρούσα µέθοδος έχει σκοπό τη θέσπιση των αναγκαίων κριτη-
ρίων για την αξιολόγηση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών
των παρθένων ελαιολάδων κατά την έννοια του σηµείου 1 του παραρ-
τήµατος του κανονισµού 136 /66/ΕΟΚ και την περιγραφή της
σχετικής µεθόδου ταξινόµησής τους.
Η παρούσα µέθοδος εφαρµόζεται µόνο για την ταξινόµηση των
παρθένων ελαιολάδων, βάσει της ύπαρξης του φρουτώδους γεύσεως
και της έντασης των ελαττωµάτων τους, κατά την κρίση οµάδας
επιλεγµένων και εκπαιδευµένων δοκιµαστών, συγκροτηµένων σε
οµάδα, σύµφωνα µε το σηµείο 4.
2.ΓΕΝΙΚΑ
Για το γενικό βασικό λεξιλόγιο, η αίθουσα δοκιµών, η γενική µεθο-
δολογία καθώς και το ποτήρι δοκιµής των ελαίων συνιστάται να
είναι σύµφωνα µε τις προδιαγραφές που προβλέπονται από το
διεθνές συµβούλιο ελαιολάδου.
3.ΕΙ∆ΙΚΟ ΛΕΞΙΛΟΓΙΟ
3.1.Θετικές ιδιότητες
Φρουτώδες:σύνολο οσφραντικών αισθήσεων, οι οποίες εξαρτώνται
από την ποικιλία των ελαιών και είναι χαρακτηριστικές του ελαίου
που προέρχεται από υγιείς και φρέσκιες ελιές, πράσινες ή ώριµες,
το οποίο γίνεται αισθητό απευθείας από τη µύτη ή από την οπισθο-
ρινική οδό.
Πικρό:χαρακτηριστική γεύση ελαιολάδου που έχει ληφθεί από
πράσινες ελιές ή από ελιές που αρχίζει να αλλάζει το χρώµα τους.
Πικάντικο:έντονη κιναισθητική αίσθηση, χαρακτηριστική ελαίων
που παράγονται στην αρχή της ελαιοκοµικής περιόδου, κυρίως από
πράσινες ακόµη ελιές.
3.2.Αρνητικά χαρακτηριστικά
Ατροχάδο:χαρακτηριστική οσµή -γεύση ελαιολάδου που έχει
παραληφθεί από ελιές αποθηκευµένες σε σωρούς και που βρίσκονται
σε προχωρηµένο στάδιο αναερόβιας ζύµωσης.
Μουχλιασµένο —νοτισµένο:χαρακτηριστική οσµή -γεύση ελαιολάδων
που έχουν παραληφθεί από ελιές προσβεβληµένες από µύκητες και
ζυµοµύκητες λόγω αποθήκευσης των καρπών για πολλές ηµέρες σε
περιβάλλον µε υγρασία.
Μούργα:χαρακτηριστική οσµή -γεύση ελαιολάδου που έχει παρα-
µείνει σε επαφή µε το ίζηµα που καθιζάνει σε βαρέλια και
δεξαµενές φύλαξης.
Κρασώδες —οξώδες:χαρακτηριστική οσµή -γεύση ελαιολάδων που
θυµίζουν κρασί ή ξύδι. Οφείλεται, βασικά, σε διαδικασία ζύµωσης
στις ελιές που οδηγεί στο σχηµατισµό οξικού οξέος, οξικού αιθυλε-
στέρα και αιθανόλης.
Μεταλλική:χαρακτηριστική οσµή -γεύση ελαιολάδου που θυµίζει
µέταλλο. Είναι χαρακτηριστική ελαίου που έχει παραµείνει επί
µακρόν σε επαφή µε µεταλλικές επιφάνειες, κατά τη διάρκεια της
θραύσης του ελαιοκάρπου, µάλαξης, πίεσης ή αποθήκευσης.
Ταγγό:χαρακτηριστική οσµή -γεύση ελαιολάδων που έχουν υποστεί
διαδικασία οξείδωσης.
Ψηµένο ήκαµένο :χαρακτηριστική οσµή -γεύση ελαιολάδου που
προήλθε από υπερβολική ή /και παρατεταµένη θέρµανση κατά την
παραλαβή του και, ιδιαίτερα, κατά τη θερµοµάλαξη της ελαιόπαστας,
όταν αυτή πραγµατοποιηθεί σε ακατάλληλες θερµικές συνθήκες.
Άχυρο —ξύλο:χαρακτηριστική οσµή -γεύση ορισµένων ελαιολάδων
που προέρχονται από ελιές που έχουν αφυδατωθεί.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—66
▼M19
Τραχύ:χαρακτηριστική πηχτή και ζυµώδης αίσθηση που παράγεται
στο στόµα από ορισµένα έλαια.
Λιπαντικά:οσµή-γεύση ελαιολάδου που θυµίζει πετρέλαιο, γράσο ή
ορυκτέλαιο.
Απόνερα:οσµή-γεύση ελαιολάδου που αποκτάται από το ελαιόλαδο
ύστερα από παρατεταµένη επαφή τους µε απόνερα του ελαιοτρι-
βείου.
Άλµη:οσµή-γεύση ελαιολάδου που προέρχεται από ελιές διατηρη-
µένες σε άλµη.
Σπάρτο:χαρακτηριστική οσµή -γεύση ελαιολάδου που προέρχεται
από ελιές που έχουν υποστεί έκθλιψη σε καινούργιους σάκους από
σπάρτο. Μπορεί να διαφέρει ανάλογα µε το αν πρόκειται για σάκους
κατασκευασµένους από πράσινο ή από ξηρό σπάρτο.
Χωµατίλα:οσµή-γεύση ελαιολάδου προερχόµενο από ελιές που
έχουν συλλεγεί µαζί µε χώµα ή λάσπες και δεν έχουν πλυθεί.
Σκουλήκι:οσµή-γεύση ελαιολάδου που παραλαµβάνεται από ελιές
που έχουν υποστεί σοβαρή προσβολή από νύµφες δάκου της ελαίας
(Bactroceraoleae).
Αγγούρι:Οσµή-γεύση ελαιολάδου που παράγεται όταν το ελαιόλαδο
είναι συσκευασµένο σε ερµητικά κλειστά δοχεία για υπερβολικό
χρονικό διάστηµα και ειδικά σε λευκοσιδηρά δοχεία, και η οποία
αποδίδεται στο σχηµατισµό 2,6 -εννεανοδιενάλης.
4.ΟΜΑ∆Α ΟΡΓΑΝΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ
Η οµάδα ορίζεται από το κράτος µέλος και αποτελείται από τον
επικεφαλής της οµάδας και από οκτώ έως δώδεκα δοκιµαστές.
Ωστόσο, για την περίοδο 2001 -2002 οι δοκιµαστές µπορεί να είναι
λιγότεροι από οκτώ.
Ο επικεφαλής της οµάδας πρέπει να είναι εξαιρετικά καταρτισµένος,
γνώστης και µε ιδιαίτερη εµπειρία στους διάφορους τύπους ελαίων.
Είναι υπεύθυνος για την οµάδα, την οργάνωση και τη λειτουργία
της, την προετοιµασία, την κωδικοποίηση και την παρουσίαση των
δειγµάτων στους δοκιµαστές, καθώς και για τη συλλογή των δεδο-
µένων και τη στατιστική τους επεξεργασία.
Ο επικεφαλής της οµάδας επιλέγει τους δοκιµαστές και επιβλέπει
για την εκπαίδευσή τους και τον έλεγχο των επιδόσεών τους, ώστε
οι ικανότητές τους να διατηρούνται πάντοτε σε ικανό επίπεδο.
Οι δοκιµαστές για τους οργανοληπτικούς ελέγχους του ελαιολάδου
πρέπει να επιλέγονται και να εκπαιδεύονται ανάλογα µε την
ικανότητά τους στη διάκριση µεταξύ παροµοίων δειγµάτων, σύµφωνα
µε τον οδηγό του διεθνούς συµβουλίου ελαιολάδου για την επιλογή,
την εκπαίδευση και τον έλεγχο των χαρακτηρισµένων ως δοκιµα-
στών παρθένου ελαιολάδου.
Οι οµάδες οργανοληπτικής εξέτασης πρέπει να συµµετέχουν στις
οργανοληπτικές αξιολογήσεις που προβλέπονται σε εθνικό, κοινο-
τικό ή διεθνές επίπεδο για τον περιοδικό έλεγχο και την
εναρµόνιση των κριτηρίων αντίληψης. Εξάλλου, πρέπει να παρέχουν
κάθε χρόνο στο συγκεκριµένο κράτος µέλος κάθε πληροφορία
σχετικά µε τη σύνθεση και τον αριθµό των αξιολογήσεων που
πραγµατοποίησαν ως αναγνωρισµένη οµάδα.
5.∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΟΡΓΑΝΟΛΗΠΤΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ
ΚΑΤΑΤΑΞΗ
5.1.Χρησιµοποίηση του φύλλου χαρακτηριστικών από τον δοκιµαστή
Το φύλλο χαρακτηριστικών που χρησιµοποιείται από τον δοκιµαστή
εµφαίνεται στο προσάρτηµα Aτης παρούσας µεθόδου.
Κάθε δοκιµαστής που αποτελεί µέλος της οµάδας πρέπει να οσφραί-
νεται και στη συνέχεια να γεύεται (1)το υπό εξέταση έλαιο, το οποίο
περιέχεται στο ποτήρι δοκιµής, προκειµένου να αναλύσει τις αντιλή-
ψεις του από πλευράς όσφρησης, γεύσης, αφής και κιναισθησίας.
Στη συνέχεια, πρέπει να καταγράφει στο φύλλο χαρακτηριστικών1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—67
(1)Όταν παρατηρήσει ορισµένες εξαιρετικά αρνητικές ιδιότητες, µπορεί να
απόσχει της πρόγευσης και να σηµειώσει στο φύλλο χαρακτηρισµού την εξαι-
ρετική αυτή κατάσταση.
▼M19
που έχει στη διάθεσή του, την ένταση µε την οποία αντιλαµβάνεται
καθεµία από τις αρνητικές και θετικές ιδιότητες.
Στην περίπτωση όπου γίνουν αντιληπτές αρνητικές ιδιότητες που δεν
αναφέρονται στο φύλλο χαρακτηριστικών, αυτές πρέπει να καταγρά-
φονται στο χώρο µε το χαρακτηρισµό «άλλες»,χρησιµοποιώντας τον
ή τους όρους που τις περιγράφουν µε τη µεγαλύτερη δυνατή ακρίβεια
µεταξύ εκείνων που ορίζονται στο σηµείο 3.2 της παρούσας µεθόδου.
5.2.Χρήση των δεδοµένων από τον επικεφαλής της οµάδας
Ο επικεφαλής της οµάδας πρέπει να µαζεύει τα φύλλα χαρακτηρι-
στικών που έχουν συµπληρωθεί από τους δοκιµαστές και να ελέγχει
τις αποδοθείσες εντάσεις των ιδιοτήτων. Σε περίπτωση εντοπισµού
κάποιας ανωµαλίας, ζητά από τον δοκιµαστή να αναθεωρήσει το
φύλλο χαρακτηριστικών και, αν κρίνει αναγκαίο, να επαναλάβει τη
δοκιµή.
Ο επικεφαλής της οµάδας µπορεί θα εισαγάγει τα δεδοµένα κάθε
δοκιµαστή σε πρόγραµµα πληροφορικής σύµφωνο µε τη µέθοδο του
στατιστικού υπολογισµού της διάµεσης τιµής που εµφαίνεται στο
προσάρτηµαB.Η εισαγωγή των δεδοµένων για ένα δείγµα πρέπει
να γίνεται µε τη βοήθεια πίνακα αποτελούµενου από δέκα στήλες
αντιστοιχούσες στις δέκα αισθητηριακές ιδιότητες και nγραµµές
αντιστοιχούσες στους nδοκιµαστές της οµάδας.
Όταν κάποια αρνητική ιδιότητα έχει καταγραφεί στη στήλη «άλλες»
από το 50%τουλάχιστον της οµάδας, ο επικεφαλής πρέπει να
προβαίνει στον υπολογισµό της διάµεσης τιµής της ιδιότητας αυτής
και στην αντίστοιχη κατάταξη.
Σε περίπτωση αναλύσεων που πραγµατοποιούνται στο πλαίσιο
ελέγχων συµφωνίας µε το πρότυπο ή κατ 'έφεση εξετάσεων, ο επικε-
φαλής της οµάδας πρέπει να προβαίνει σε τριπλή οργανοληπτική
αξιολόγηση του ελαίου, µε µία τουλάχιστον ηµέρα διάλειµµα. Η
διάµεση τιµή των ιδιοτήτων υπολογίζεται από το σύνολο των δεδο-
µένων των φύλλων χαρακτηριστικών των τριών δοκιµών.
5.3.Κατάταξη των ελαίων
Το έλαιο κατατάσσεται στις ακόλουθες κατηγορίες, ανάλογα µε τη
διάµεση τιµή των ελαττωµάτων και τη διάµεση τιµή της φρουτώδους
ιδιότητας. Με τον όρο διάµεση τιµή των ελαττωµάτων νοείται η
διάµεση τιµή της αρνητικής ιδιότητας που γίνεται αντιληπτή µε τη
µεγαλύτερη ένταση. Η τιµή του ανθεκτικού συντελεστή διακύµανσης
για αυτή την αρνητική ιδιότητα πρέπει να είναι µικρότερη ή ίση µε
20%.
α)Εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο :η διάµεση τιµή των ελαττωµάτων
είναι ίση µε 0 και η διάµεση τιµή για το φρουτώδες είναι µεγαλύ-
τερη του 0.
β)Παρθένο ελαιόλαδο :η διάµεση τιµή των ελαττωµάτων είναι µεγα-
λύτερη του 0 και µικρότερη ή ίση µε 2,5 και η διάµεση τιµή για
το φρουτώδες είναι µεγαλύτερη του 0.
γ)Κοινό παρθένο ελαιόλαδο :η διάµεση τιµή των ελαττωµάτων είναι
µεγαλύτερη του 2,5 και µικρότερη ή ίση του 6,0 ·ή η διάµεση
τιµή των ελαττωµάτων είναι µικρότερη ή ίση µε το 2,5 και η
διάµεση τιµή για το φρουτώδες είναι ίση µε 0.
δ)Λαµπάντε παρθένο ελαιόλαδο :η διάµεση τιµή των ελαττωµάτων
είναι µεγαλύτερη του 6,0.
Ωστόσο, από την 1η Νοεµβρίου 2003, οι κατηγορίες γ) και δ)
αντικαθίστανται από την κατηγορία:
γ)Λαµπάντε ελαιόλαδο :η διάµεση τιµή των ελαττωµάτων είναι µεγα-
λύτερη του 2,5·ή η διάµεση τιµή των ελαττωµάτων είναι
µικρότερη ή ίση µε 2,5 και η διάµεση τιµή για το φρουτώδες είναι
ίση µε 0.
5.4.Ιδιαίτερες περιπτώσεις
Όταν η διάµεση τιµή θετικής ιδιότητας εκτός του φρουτώδους είναι
µεγαλύτερη του 5,0, ο επικεφαλής της οµάδας το σηµειώνει στο
πιστοποιητικό ανάλυσης του ελαίου.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—68
▼M19
ΠΡΟΣΑΡΤΗΜΑ A
1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—69
▼M19
ΠΡΟΣΑΡΤΗΜΑ B
ΜΕΘΟ∆ΟΣ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ∆ΙΑΜΕΣΗΣ ΤΙΜΗΣ ΚΑΙ ΤΩΝ
ΟΡΙΩΝ ΕΜΠΙΣΤΟΣΥΝΗΣ
∆ιάµεση τιµή
∆ιάµεση τιµή είναι ο πραγµατικός αριθµός Xmπου χαρακτηρίζεται από
το γεγονός ότι η πιθανότητα ( P)οι τιµές της κατανοµής ( X)να είναι
µικρότερες από τον αριθµό αυτό ( Xm), είναι µικρότερη ή ίση µε 0,5 και
ότι, ταυτόχρονα, η πιθανότητα ( P)οι τιµές της κατανοµής ( X)να είναι
µικρότερες ή ίσες µε Xm, είναι µεγαλύτερη ή ίση µε 0,5. Ένας άλλος
ορισµός ορίζει τη διάµεση τιµή ως το 50ό εκατοστηµόριο διαµερισµού
µιας κατανοµής αριθµών διατεταγµένων κατ 'αύξουσα τάξη. Με άλλα
λόγια, η διάµεση τιµή αντιπροσωπεύει την κεντρική τιµή µιας διατετα-
γµένης σειράς περιττού πλήθους ή το µέσο όρο των δύο κεντρικών
τιµών µιας διατεταγµένης σειράς άρτιου πλήθους.
Ανθεκτική τυπική απόκλιση
Για να υπάρχει µια αξιόπιστη εκτίµηση της διακύµανσης που παράγεται
γύρω από τη διάµεση τιµή, πρέπει να αναφερθούµε στην εκτίµηση της
ανθεκτικής τυπικής απόκλισης κατά Stuart et Kendall. Ο τύπος της
ασυµπτωτικής τυπικής απόκλισης Sεξαρτάται από το Nκαι τοIQR.N
είναι ο αριθµός των παρατηρήσεων και IQR το διατεταρτηµοριακό
διάστηµα, δηλαδή η σταθερή εκτίµηση της διακύµανσης των εξεταζό-
µενων δεδοµένων (το διατεταρτηµοριακό διάστηµα περικλείει ακριβώς
το 50%των περιπτώσεων µιας οποιασδήποτε κατανοµής πιθανότητας).
Ο υπολογισµός του διατεταρτηµοριακού διαστήµατος πραγµατοποιείται
υπολογίζοντας το µέγεθος της απόκλισης µεταξύ του 75ου και του 25ου
εκατοστηµορίου.
IQR=75 ο-25ο εκατοστηµόριο
Εκατοστηµόριο είναι η τιµή Xpcπου χαρακτηρίζεται από το γεγονός ότι
η πιθανότητα (P)οι τιµές της κατανοµής να είναι µικρότερες της Xpc
είναι µικρότερη ή ίση µε ένα καθορισµένο εκατοστό και ότι, ταυτόχ-
ρονα, η πιθανότητα ( P)οι τιµές της κατανοµής να είναι µικρότερες ή
ίσες µε τηXpc είναι µεγαλύτερη ή ίση µε το εν λόγω εκατοστό.
Εκατοστό είναι το κλάσµα της λαµβανόµενης κατανοµής. Στην
περίπτωση της διάµεσης τιµής, αυτή είναι ίση µε το 50 /100.
Με άλλα λόγια, εκατοστηµόριο είναι η τιµή κατανοµής που αντιστοιχεί
σε καθορισµένο εµβαδόν χαρασσόµενο από την καµπύλη κατανοµής ή
πυκνότητας. Για παράδειγµα, το 25ο εκατοστηµόριο αντιπροσωπεύει την
τιµή κατανοµής που αντιστοιχεί σε εµβαδόν ίσο µε 0,25 ή 25 /100.
Ανθεκτικός συντελεστής διακύµανσης %
1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—70
▼M19
ΟCVR είναι καθαρός αριθµός, δηλαδή χωρίς διαστάσεις, που δείχνει το
ποσοστό διακύµανσης της αναλυόµενης σειράς αριθµών σε σχέση µε την
τιµήMeτης διάµεσης τιµής. Για το λόγο αυτό, ο συντελεστής αυτός είναι
πολύ χρήσιµος για την επαλήθευση της αξιοπιστίας των µελών της
οµάδας.
Όρια εµπιστοσύνης 95 %στη διάµεση τιµή
Τα όρια εµπιστοσύνης ( I.C.) µε πιθανότητα 95 %(τιµή σφάλµατος πρώτου
είδους ίση µε 0,05 ή 5 %)αντιπροσωπεύουν τα όρια όπου η διάµεση τιµή
θα µπορούσε να κυµαίνεται αν υποτεθεί ότι είναι δυνατή η επανάληψη
του πειράµατος άπειρες φορές. Στην πράξη, το εύρος αυτό δείχνει την
περιοχή διακύµανσης της δοκιµής υπό τις κρατούσες λειτουργικές
συνθήκες, µε την υπόθεση ότι η δοκιµή θα µπορεί να επαναληφθεί
πολλές φορές. Το εύρος βοηθά στην εκτίµηση, όπως και στην περίπτωση
τουCVR%, της αξιοπιστίας της δοκιµής.
I.C.ανώτατο=Me+(c.S)
I.C.S κατώτατο=Me-(c.S)
όπουc,στην περίπτωση των ορίων εµπιστοσύνης 0,95, είναι 1,96.
Η κατάταξη γίνεται συγκρίνοντας τις διάµεσες τιµές µε τα διαστήµατα
αναφοράς που καθορίζονται στο σηµείο 5.3 της µεθόδου. Το λογισµικό
επιτρέπει την οπτική απεικόνιση της κατάταξης σε πίνακα στατιστικών
δεδοµένων ή σε γράφηµα.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—71
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XIII
ΕΞΟΥ∆ΕΤΕΡΩΣΗ ΚΑΙ ΑΠΟΧΡΩΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΕΛΑΙΟΛΑ∆ΟΥ
ΣΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ
1. ΕΞΟΥ∆ΕΤΕΡΩΣΗ ΚΑΙ ΑΠΟΧΡΩΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΕΛΑΙΟ-
ΛΑ∆ΟΥ ΣΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ
1.1.Α. Εξουδετέρωση του ελαίου
1.1.1. Εξοπλισµός
—γυάλινο ποτήρι 300 mlυψηλού σχήµατος,
—εργαστηριακή φυγόκεντρος µε σωλήνες των 100 ml.
—γυάλινο ποτήρι των 250 ml.
—σφαιρικές φιάλες των 100 ml.
—διαχωριστική χοάνη ενός λίτρου.
1.1.2. Αντιδραστήρια
—υδατικό διάλυµα 12 %υδρυξειδίου του νατρίου,
—αιθανολικό διάλυµα 1 %φαινολοφθαλεΐνης,
—εξάνιο καθαρό,p.a.,
—ισοπροπυλική αλκοόλη p.a.
1.1.3. Τρόπος εργασίας
α) Έλαια οξύτητος ►C1εκπεφρασµένης ◄σε ελαϊκό οξύ µέχρι
30%.
Τοποθετούµε 50gακατεργάστου ελαίου µέσα σε υψηλό ποτήριο
ζέσεως των 300 mlκαι θερµαίνουµε σε υδρόλουτρο µέχρι τους
65ºC.Αναδεύοντας αργά, προσθέτουµε ποσότητα διαλύµατος
υδροξειδίου του νατρίου 12 %αντιστοιχούσα στην ελεύθερη
οξύτητα του ελαίου, µε περίσσεια 5 %.Συνεχίζουµε την
ανάδευση για πέντε λεπτά διατηρώντας τη θερµοκρασία στους
65ºC.
Μεταφέρουµε το µείγµα στους δοκιµαστικούς σωλήνες της
φυγοκέντρου των 100 ml,και διαχωρίζουµε το σαπούνι µε φυγο-
κέντριση. Αποχύνουµε και µεταγγίζουµε το έλαιο σε ποτήρι
ζέσεως των 250 ml,το ξεπλένουµε µε 50 έως 60 mlζέοντος
απεσταγµένου υδάτος, αποµακρύνοντας συγχρόνως τη στοιβάδα
του ύδατος µε σιφώνιο. Επαναλαµβάνουµε τις εκπλύσεις µέχριςότου εξαφανισθούν τα ίχνη υπολειµµάτων σάπωνος (εξαφάνιση
της ροδαλής χροιάς της φαινολοφθαλεΐνης).
Φυγοκεντρούµε το έλαιο προκειµένου να αποµακρύνουµε τις
αποµένουσες µικρές ποσότητες νερού.
β) Έλαια οξύτητος εκπεφρασµένης σε ελαϊκό οξύ άνω του 30 %
Εντός διαχωριστικής χοάνης του ενός λίτρου διαβιβάζουµε 50 g
ακατεργάστου ελαίου, 200 mlεξανίου, 100mlισοπροπυλικής
αλκοόλης και ποσότητα διαλύµατος υδροξειδίου του νατρίου
12%αντιστοιχούσα στην ελεύθερη οξύτητα του ελαίου µε
περίσσεια 0,3%.
Αναδεύουµε ισχυρά για ένα λεπτό. Προσθέτουµε 100 ml
απεσταγµένου ύδατος, αναταράσσουµε εκ νέου και αφήνουµε
να ηρεµήσει.
Μετά τον διαχωρισµό των στοιβάδων, αφήνουµε να εκχυθεί η
κατώτερη στοιβάδα, που περιέχει τους σάπωνες. Μεταξύ των
δύο στοιβάδων (ελαιώδης προς τα άνω και υδατίνη προς τα
κάτω) δηµιουργείται συχνά µια ενδιάµεση στοιβάδα από µυκη-
λίωµα και αδιάλυτα συστατικά η οποία πρέπει επίσης να
αποµακρυνθεί.
1.2.Β. Αποχρωµατισµός του εξουδετερωµένου ελαίου
1.2.1. Εξοπλισµός
—σφαιρική φιάλη των 250 mlµε τρεις λαιµούς εσµυρισµένους για
την τοποθέτηση:
α) θερµοµέτρου βαθµολογηµένου σε βαθµούς και επιτρέποντος
τη λήψη ενδείξεων µέχρι τους 90 ºC.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—72
▼M6
▼B
▼B
β) µηχανικού αναδευτήρα πραγµατοποιούντος 250 έως 300
στροφές το λεπτό, καταλλήλου για εργασία εν κενώ ·
γ) συνδέσεως µε αντλία κενού.
—αντλία κενού εφοδιασµένη µε µανόµετρο, δυναµένη να δώσει
πιέσεις 15 έως 30 millibars.
1.2.2. Τρόπος εργασίας
Ζυγίζουµε περίπου 100 gεξουδετερωθέντος ελαίου έντος της
τριλαίµου σφαιρικής φιάλης. Εισάγουµε το θερµόµετρο και τον
αναδευτήρα, συνδέουµε την αντλία κενού και θερµαίνουµε στοις
90ºCαναδεύοντας συνεχώς. ∆ιατηρούµε τη θερµοκρασία αυτή,
πάντα υπο ανάδευση, µέχρις ότου το προς ανάλυση έλαιο απαλ-
λαγεί πλήρως, από την υγρασία, (περίπου για 30 λεπτά). Τότε
διακόπτουµε το κενό και προσθετουµε 2 έως 3 gενεργού γης.
Αποκαθιστούµε το κενό έως ότου η παραµένουσα πίεση φθάσει τα
15 έως 30millibars και, διατηρώντας τη θερµοκρασία στους 90 ºC
αναδεύουµε επί τριάντα λεπτά µε 250 στροφές ανά λεπτό περίπου.
Εν συνεχεία διηθούµε εν θερµώ εντός κλιβάνου ρυθµιζοµένης
θερµοκρασία (50 έως 60 ºC).1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—73
▼M19
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XV
1.ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΣΕ ΕΛΑΙΟ ΤΩΝ ΕΛΑΙΟΠΥΡΗΝΩΝ
1.1.Εξοπλισµός
—κατάλληλη συσκευή εκχυλίσεως εφοδιασµένη µε σφαιρική φιάλη
των 200 έως 250 ml,
—λουτρό ηλεκτρικής θερµάνσεως (αµµόλουτρο, υδρόλουτρο κ.λπ.)
θερµαινόµενη πλάκα,
—αναλυτικός ζυγός,
—φούρνος ρυθµισµένος στους 80 ºCτο µέγιστο,
—φούρνος ηλεκτρικής θερµάνσεως εφοδιασµένος µε θερµοστατικό
µηχάνηµα, ρυθµισµένος στους 103 ±2ºC µε µηχανισµό εµφυσή-
σεως αέρος η µειώσεως της πιέσεως,
—µηχανικός µύλος εύκολα καθαριζόµενος, που να επιτρέπει τη
σύνθλιψη, χωρίς να επιφέρει ανύψωση της θερµοκρασίας ή
αισθητή µεταβολή της περιεκτικότητος σε υγρασία και έλαιο,
—►C1φύσιγγα εκχυλίσεως και υδρόφιλος βάµβαξ ◄ή διηθη-
τικός χάρτης, απαλλαγµένα συστατικών εκχυλιζοµένων µε το
εξάνιο,
—ξηραντήρας,
—κόσκινο διαµέτρου οπών 1 mm,
—µικρά τεµαχίδια ξηρανθείσης ελαφρόπετρας.
1.2.Αντιδραστήρια
Κανονικό εξάνιο ( technicalgrade), το οποίο µετά από πλήρη εξάτµιση
να αφήνει υπόλειµµα το πολύ 0,002 gανά 100ml.
2.ΤΡΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ
2.1.Παρασκευή του δείγµατος δοκιµής
Αλέθουµε το εργαστηριακό δείγµα εάν παρίσταται ανάγκη, µε µηχα-
νικό µύλο, καλά καθαρισµένο, ώστε νά λάβουµε τεµάχια που να
δύνανται να διέλθουν από το κόσκινο.
Χρησιµοποιούµε το εικοστό περίπου του δείγµατος για τον πλήρη
καθαρισµό του µύλου, απορρίπτουµε το άλεσµα αυτό, αλέθουµε την
υπόλοιπη ποσότητα, τη συλλέγουµε, την αναµειγνύουµε προσεκτικά
και την αναλύουµε αµέσως.
2.2.Ποσότης δοκιµής
Μόλις ολοκληρωθεί η εργασία λειοτριβήσεως, ζυγίζουµε 10 gτου
δείγµατος δοκιµής µε ακρίβεια 0,01 g.
2.3.Προετοιµασία των εκχυλιστικών δακτυλίων ( cartouche)
Τοποθετούµε το δείγµα δοκιµής εντός του δακτύλιου και πωµατί-
ζουµε µε ►C1υδρόφιλο βάµβακα ◄.Αν χρησιµοποιείται
διηθητικός χάρτης, το άλεσµα τυλίγεται µέσα σ 'αυτόν.
2.4.Προκαταρκτική ξήρανση
Αν ο ελαιοπυρήνας είναι πολύ υγρός (παραδείγµατος χάρη περιεκτι-
κότητα σε υγρασία και πτητικές ύλες άνω του 10 %),ξηραίνουµε
αυτόν προκαταρκτικώς διά τοποθετήσεως του ετοίµου δακτυλίου (ή
του διηθητικού χάρτου) επί τι χρονικό διάστηµα µέσα σε φούρνο
θερµανθέντα σε θερµοκρασία όχι ανώτερη των 80 ºCγιά να ελαττώ-
σουµε την περιεκτικότητα σε υγρασία και πτητικές ύλες κάτω του
10%.
2.5.Προετοιµασία της σφαιρικής φιάλης
Ζυγίζουµε, µε ακρίβεια 1 mg,φιάλη περιέχουσα ένα ή δύο τεµαχίδια
ελαφρόπετρας, προηγουµένως ξηρανθείσα µέσα σε φούρνο στούς
103±2º C και εν συνεχεία ψυχθείσα µέσα σε ξηραντήρα γιά
διάστηµα τουλάχιστον µίας ώρας.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—74
▼B
2.6.Πρώτη εκχύλιση
Μέσα στη συσκευή εκχυλίσεως εισάγουµε ►C1τη φύσιγγα ◄(ή
το διηθητικό χάρτη) που περιέχει την ποσότητα δοκιµής. Χύνουµε
εντός της σφαιρικής φιάλης την απαραίτητη ποσότητα εξανίου.
Συνδέουµε τη φιάλη µε τή συσκευή εκχυλίσεως και το σύνολο
τοποθετείται στο ηλεκτρικά θερµαινόµενο λουτρό. Ρυθµίζουµε τη
θέρµανση κατά τέτοιο τρόπο ώστε η ταχύτης επαναρροής να είναι
τουλάχιστον 3 σταγόνες το δευτερόλεπτο (βρασµός µέτριος, όχι
ισχυρός).
Μετά τέσσερις ώρες εκχυλίσεως ψύχουµε. Αποµακρύνουµε ►C1τη
φύσιγγα ◄από τη συσκευή εκχυλίσεως και το θέτουµε σε ρεύµα
αέρος για να αποµακρύνουµε τον εµποτισθέντα διαλύτη.
2.7.∆εύτερη εκχύλιση
Αδειάζουµε ►C1τη φύσιγγα ◄ εντός µικρο-αλεστήρος και
αλέθουµε σε όσο το δυνατό λεπτότερα τεµάχια Επαναφέρουµε το
µείγµα πάλι µέσα ►C1στη φύσιγγα ◄ποσοτικά και τοποθετούµέ
το δακτύλιο µέσα στη συσκευή εκχυλίσεως.
Συνεχίζουµε την εκχύλιση για δύο επιπλέον ώρες, χρησιµοποιώντας
την ίδια σφαιρικη φιάλη που περιέχει το πρώτο εκχύλισµα.
Το λαµβανόµενο στη φιάλη εκχυλίσεως διάλυµα πρέπει να είναι
διαυγές. Αν δεν είναι, το διηθούµε µε διηθητικό χάρτη και ξεπλέ-
νουµε την αρχική φιάλη και το διηθητικό χάρτη αρκετές φορές µε
εξάνιο. Συλλέγουµε το διήθηµα και το διαλύτη της πλύσεως εντός
δευτέρας σφαιρικής φιάλης, η οποία έχει προηγουµένως ξηρανθεί
και ζυγισθεί µε ακρίβεια 1 mg.
2.8.Αποµάκρυνση του διαλύτου και ζύγιση του εκχυλίσµατος
Αποµακρύνουµε το µεγαλύτερο µέρος του διαλύτου δι 'αποστάξεως
επί ηλεκτρικώς θερµαινοµένου λουτρού. Αποµακρύνουµε τα τελευ-
ταία ίχνη του διαλύτου θερµαίνοντας τη φιάλη µέσα σε φούρνο
στους 103º±2ºC για 20 λεπτά. ∆ιευκολύνουµε την αποµάκρυνση
αυτή είτε δι'εµφυσήσεως, κατά διαλείµµατα αέρος, ή προτιµότερο
αδρανούς αερίου, είτε διά µειώσεως της πιέσεως.
Αφήνουµε τη φιάλη να ψυχθεί µέσα σε ξηραντήρα επί µια τουλάχι-
στον ώρα και ζυγίζουµε µε ακρίβεια 1 mg.
Θερµαίνουµε εκ νέου για 10 λεπτά µε τις ίδιες συνθήκες, ψύχουµε
µέσα στον ξηραντήρα και ζυγίζουµε.
Η διαφορά µεταξύ των δύο ζυγίσεων δεν πρέπει να υπερβαίνει τα
10mg. Αν όχι, θερµαίνουµε εκ νέου για διάστηµα 10 λεπτών,
ψύχουµε και ζυγίζουµε, επαναλαµβάνοντας την εργασία µέχρις ότου
η διαφορά βάρους µεταξύ δύο ζυγίσεων να µην είναι µεγαλύτερη από
10mg.Λαµβάνουµε υπόψη την τελευταία ζύγιση της φιάλης.
Εκτελούµε δύο προσδιορισµούς επί του αυτού δείγµατος δοκιµής.
3.ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
3.1.Τρόπος υπολογισµού και τύπος
α) Το εκχύλισµα εκπεφρασµένο επί τοις εκατό κατά µάζα του
προϊόντος ως έχει, ισούται µε:
S=m1×100
m0
όπου:
S= είναι το ποσοστό επί τοις %κατά µάζα του εκχυλίσµατος
του προϊόντος ως έχει,
m0=είναι η µάζα, σε γραµµάρια, της ποσότητος δοκιµής,
m1=είναι η µάζα, σε γραµµάρια, του εκχυλίσµατος µετά την
ξήρανση.
Λαµβάνουµε ως αποτέλεσµα τον αριθµητικό µέσο όρο των δύο
προσδιορισµών εφόσον πληρούνται οι προϋποθέσεις επαναληπτι-
κότητος.
Εκφράζουµε το αποτέλεσµα µε ένα δεκαδικό ψηφίο.
β) Το εκχύλισµα ανάγεται επί ξηράς ουσίας µε τον ακόλουθο τύπο:1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—75
▼B
S/C2100
100/C0U=εκχύλισµα επί τοις εκατό λιπαρό ξηρό.
όπου:
S= είναι το ποσοστό κατά µάζα του εκχυλίσµατος του
προϊόντος ως έχει [βλέπε στοιχείο α)],
U= είναι η περιεκτικότης σε υγρασία και πτητικές ύλες.
3.2.Επαναληπτικότης
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων των δύο προσδιορισµών, οι
οποίοι πραγµατοποιούνται συγχρόνως ή ταχέως ο ένας µετά τον
άλλο από τον ίδιο αναλύτη, δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 0,2 gεκχυ-
λίσµατος εξανίου ανά 100 gδείγµατος.
Σε αντίθετη περίπτωση, επαναλαµβάνουµε την ανάλυση µε δύο
άλλες ποσότητες δοκιµής. Αν και πάλι η διαφορά υπερβαίνει τα
0,2g,λαµβάνουµε ως αποτέλεσµα τον αριθµητικό µέσο όρο των
τεσσάρων πραγµατοποιηθέντων προσδιορισµών.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—76
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XVI
ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΑΡΙΘΜΟΥ ΙΩ∆ΙΟΥ
1.ΠΕ∆ΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ
►C1Η διεθνής αυτή προδιαγραφή περιγράφει ◄µέθοδο προσδιο-
ρισµού του αριθµού ιωδίου στα ζωικά και φυτικά λίπη και έλαια το
οποία αναφέρονται στο εξής ως λιπαρές ουσίες.
2.ΟΡΙΣΜΟΣ
►C1Για τους σκοπούς της παρούσης διεθνούς προδιαγραφής ◄
εφαρµόζεται ο ακόλουθος ορισµός:
2.1.Αριθµός ιωδίου·η µάζα του ιωδίου που απορροφάται από το δείγµα
υπό τις συνθήκες εργασίας που καθορίζονται στο παρόν διεθνές
πρότυπο.
Ο αριθµός ιωδίου εκφράζεται σε γραµµάρια ιωδίου ανά 100 g
δείγµατος.
3.ΑΡΧΗ
∆ιάλυση του δείγµατος στο διαλύτη και προσθήκη αντιδραστήριου
Wijs. Προσθήκη µετά την πάροδο καθορισµένου χρόνου διαλύµατος
ιωδιούχου καλίου και νερού και τιτλοδότηση του ιωδίου που ελευθε-
ρώθηκε µε διάλυµα θειοθειικού νατρίου.
4.ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ
Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι ανεγνωρισµένης αναλυτική
καθαρότητας.
4.1.Ιωδιούχο κάλιο, διάλυµα 100 g/l,απαλλαγµένο ιωδικών ιόντων ή
ελευθέρου ιωδίου.
4.2.∆ιάλυµα αµύλου
Αναµειγνύονται 5 gδιαλυτού αµύλου µε 30 mlύδατος, το µείγµα
διαλύεται µε1000 ml ζέοντος ύδατος, ζέεται επί 3 λεπτά και
αφήνεται να ψυχθεί.
4.3.Θειοθειικό νάτριο, πρότυπο διάλυµα C(Na2S2O3·5H2O)=0,1mol/l, το
οποίο έχει τιτλοδοτηθεί το πολύ 7 ηµέρες πριν από τη χρήση.
4.4.∆ιαλύτης, για την παρασκευή του οποίου αναµείχθηκαν ίσοι όγκοι
κυκλοεξανίου και οξικού οξέος.
4.5.ΑντιδραστήριοWijs, ήτοι διάλυµα µονοχλωριούχου ιωδίου σε οξικό
οξύ. Χρησιµοποιείται αντιδραστήριο Wijs του εµπορίου.
Σηµείωση: Το αντιδραστήριο περιέχει 9 gICL3+9gI σε οξικό οξύ.
5.ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΟΡΓΑΝΑ ΚΑΙ ΣΚΕΥΗ
Συνήθη εργαστηριακά όργανα και σκεύη και ιδίως τα κατωτέρω:
5.1.Γυάλινα κοχλιάρια ζυγίσεως κατάλληλα για την ελεγχόµενη
ποσότητα και για την εισαγωγή της στις φιάλες (5.2).
5.2.Κωνικές φιάλες χωριτικότητας 500 mlµε εσµυρισµένα πώµατα και
τελείως ξηρές.
6.ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ∆ΕΙΓΜΑΤΟΣ ΠΡΟΣ ΑΝΑΛΥΣΗ
Το οµογενοποιηµένο δείγµα ξηραίνεται µε θειικό νάτριο και
διηθείται.
7.ΤΡΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ
7.1.Βάρος δείγµατος
Το βάρος του δείγµατος ποικίλλει ανάλογα µε τον αναµενόµενο
αριθµό ιωδίου όπως προκύπτει από τον πίνακα 1.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—77
▼B
Πίνακας Ι
Αναµενόµενος αριθµός ιωδίου Βάρος δείγµατος ( g)
µικρότερος από 5 3,00
5έως 20 1,00
21έως 50 0,40
51έως 100 0,20
101έως 150 0,13
151έως 200 0,10
Το δείγµα ζυγίζεται µε προσέγγιση 0,1 mgστο γυάλινο κοχλιάριο
ζυγίσεως (5.1).
7.2.Ποσοτικός προσδιορισµός
Το ζυγισθέν δείγµα φέρεται σε κωνική φιάλη των 500 ml (5.2).
Προστίθενται 20 mlδιαλύτη (4.4) για τη διάλυση της λιπαράς ουσίας.
Ακολούθως προστίθενται επακριβώς 25 mlαντιδραστηρίουWijs(4.5),
τοποθετείται το πώµα, η φιάλη ανακινείται και τοποθετείται σε
σκοτεινό µέρος. Για τη λήψη του αντιδραστηρίου Wijs δεν πρέπει
να χρησιµοποιηθεί σιφώνιο που απαιτεί αναρρόφηση µε το στόµα.
Κατά τον ίδιο τρόπο παρασκευάζεται το τυφλό διάλυµα µε διαλύτη
και αντιδραστήριο αλλά χωρίς δείγµα.
Για τα δείγµατα των οποίων η τιµή ιωδίου είναι µικρότερη από 150,
οι φιάλες αφήνονται σε σκοτεινό µέρος επί 1 ώρα. Όταν πρόκειται
για δείγµατα µε αριθµό ιωδίου µεγαλύτερο από 150 και για πολυµερι-
σµένα προϊόντα ή προϊόντα µε σηµαντικό βαθµό οξείδωσης, οι
φιάλες αφήνονται σε σκοτεινό µέρος επί 2 ώρες.
Μετά την πάροδο του απαιτούµενου χρόνου προστίθενται σε καθεµία
από τις φιάλες 20 mlδιαλύµατος ιωδιούχου καλίου (4.1) και 150 ml
νερού.
Ακολουθεί ογκοµέτρηση µε το πρότυπο διάλυµα θειοθειικού νατρίου
(4.3) έως ότου εξαφανισθεί σχεδόν τελείως το κίτρινο χρώµα που
οφείλεται στο ιώδιο. Προστίθενται λίγες σταγόνες διαλύµατος
αµύλου (4.2) και η ογκοµέτρηση συνεχίζεται µέχρι την πρώτη
εξαφάνιση του κυανού χρώµατος µετά από ισχυρή ανάδευση.
Σηµείωση: Ο ποτενσιοµετρικός προσδιορισµός του τέλους της
αντιδράσεως επιτρέπεται.
7.3.Αριθµός προσδιορισµών
Για κάθε δείγµα πραγµατοποιούνται δύο ποσοτικοί προσδιορισµοί.
8.ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
Ο αριθµός ιωδίου δίδεται από τον ακόλουθο τύπο:
12;69c V1/C0V2 ðÞ
m
όπου:
c= η αριθµητική τιµή της ακριβούς συγκεντρώσεως, σε molανά
λίτρο, του προτύπου διαλύµατος θειοθειικού νατρίου (4.3) που
χρησιµοποιήθηκε,
V1=η αριθµητική τιµή του όγκου, σε ml,του προτύπου διαλύ-
µατος θειοθειικού νατρίου (4.3) που χρησιµοποιήθηκε για
την τυφλή δοκιµασία,
V2=η αριθµητική τιµή του όγκου, σε ml,του προτύπου διαλύ-
µατος θειοθειικού νατρίου (4.3) που χρησιµοποιήθηκε για
τον ποσοτικό προσδιορισµό,
m= η αριθµητική τιµή της µάζας, σε g,του δείγµατος (7.1).
Λαµβάνεται ως αποτέλεσµα ο αριθµητικός µέσος όρος των δύο
προσδιορισµών, υπό την προϋπόθεση ότι τηρούνται οι απαιτήσεις
όσον αφορά την επαναληψιµότητα.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—78
▼M11
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XVII
ΜΕΘΟ∆ΟΣ ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΣΤΙΓΜΑΣΤΑ∆ΙΕΝΙΩΝ ΣΕ
ΦΥΤΙΚΑ ΕΛΑΙΑ
1. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ∆ΟΥ
Προσδιορισµός των στιγµαταδιενίων σε φυτικά έλαια χαµηλής
περιεκτικότητας στους εν λόγω υδρογονάνθρακες, κυρίως σε
παρθένα ελαιόλαδα και σε ακατέργαστα πυρηνέλαια.
2. ΠΕ∆ΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ
Η µέθοδος είναι εφαρµόσιµη για όλα τα φυτικά έλαια, οι µετρήσεις
όµως είναι αξιόπιστες µόνον όταν η περιεκτικότητα του ελαίου
στους εν λόγω υδρογονάνθρακες περιλαµβάνεται µεταξύ των τιµών
0,01 και 4,0mg/kg. Η µέθοδος προσφέρεται κυρίως για την ανίχ-
νευση της παρουσίας εξευγενισµένων (ραφιναρισµένων) φυτικών
ελαίων (ελαιολάδων, πυρηνελαίων, ηλιανθελαίων, φοινικελαίων,
κ.λπ.) στο παρθένο ελαιόλαδο, αφού τα εξευγενισµένα έλαια περιέ-
χουν στιγµασταδιένια ενώ τα παρθένα όχι.
3. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟ∆ΟΥ
Αποµόνωση των ασαπωνοποίητων υλών, διαχωρισµός του
κλάσµατος στεροειδών υδρογονανθράκων µε χρωµατογραφία
στήλης επί πηκτής διοξειδίου του πυριτίου ( silicagel) και ανάλυση
µε αέριο χρωµατογραφία τριχοειδούς στήλης.
4. ΣΥΣΚΕΥΕΣ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ
4.1. Φιάλες των 250mlµε επίπεδο πυθµένα κατάλληλες για χρήση µε
ψυκτήρα αναρροής.
4.2. ∆ιαχωριστικές χοάνες των 500 ml.
4.3. Σφαιρικές φιάλες των 100 ml.
4.4. Περιστροφικός εξατµιστήρας.
4.5. Υάλινη στήλη χρωµατογραφίας εσωτερικής διαµέτρου 1,5 -2,0cm
και µήκους 50cm,µε στρόφιγγαTeflon και βύσµα από υαλοβάµ-
βακα ή δίσκο από συντετηγµένο γυαλί στον πυθµένα. Για να
ετοιµαστεί η στήλη silicagel, εισάγεται µέσα στην υάλινη στήλη
εξάνιο µέχρι ύψους 5 cmπερίπου και εν συνεχεία η στήλη
πληρούται µε υδαρές µείγµα silicagel και εξανίου (15gσε 40ml)
το οποίο προστίθεται τµηµατικά. Το περιεχόµενο της στήλης
αφήνεται σε ηρεµία και η καθίζηση ολοκληρώνεται µε ελαφρά
ανατάραξη. Προστίθεται άνυδρο θειικό νάτριο µέχρι ύψους 0,5 cm
περίπου και τέλος εκλούεται η περίσσεια εξανίου.
4.6. Χρωµατογράφος αερίου µε ανιχνευτή ιονισµού δια φλογός, split ή
διάταξη έγχυσης εν ψυχρώ, ενσωµατωµένη στη στήλη και
κλίβανος προγραµµατιζόµενης θερµοκρασίας µε ακρίβεια ±1ºC.
4.7. Τριχοειδής στήλη από τετηγµένο διοξείδιο του πυριτίου για αέριο
χρωµατογραφία (εσωτερικής διαµέτρου 0,25 ή 0,30 mmκαι µήκους
25m),µε επίστρωση από 5 %- φαινυλοµεθυλοσιλικόνη πάχους
0,25mm.
Σηµείωση 1.
Μπορούν να χρησιµοποιηθούν και άλλες στήλες ανάλογης ή
µικρότερης πολικότητας.
4.8. Καταγραφέας-ολοκληρωτής µε δυνατότητα ολοκλήρωσης κοιλάδα
προς κοιλάδα.
4.9. Μικροσύριγγα των 5 -10ml για αέριο χρωµατογραφία µε σκληρυµ-
µένη βελόνη.
4.10. Ηλεκτρικό θερµαντήρα ή εστία.
5. ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ
Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αναλυτικής καθαρότητος,
εκτός εάν διευκρινίζεται διαφορετικά. Το χρησιµοποιούµενο νερό
πρέπει να είναι απεσταγµένο ή τουλάχιστον ισοδύναµης καθα-
ρότητας.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—79
▼M11
5.1. Εξάνιο ή µείγµα αλκανίων σηµείου ζέσεως 65 -70ºC, αποσταζόµενο
σε αποστακτική ύλη.
Σηµείωση 2.
Ο διαλύτης πρέπει να αποστάζεται ώστε να αποµακρύνονται οι
ξένες προσµείξεις.
5.2. Αιθανόλη 96 κ.ό.
5.3. Άνυδρο θειικό νάτριο.
5.4. Αλκοολικό διάλυµα υδροξειδίου του καλίου 10 %.Προστίθενται
10mlύδατος σε 50gυδροξειδίου του καλίου, το διάλυµα
αναδεύεται και εν συνεχεία αραιώνεται µε αιθανόλη µέχρις όγκου
500ml.
Σηµείωση 3.
Το αλκοολικό διάλυµα ποτάσας γίνεται φαιόχρουν όσο παραµένει ·
γι'αυτό πρέπει να παρασκευάζεται σε ηµερήσια βάση και να
φυλάσσεται σε καλώς πωµατισµένες σκούρες υάλινες φιάλες.
5.5. Silicagel60 για χρωµατογραφία στήλης, άνοιγµα βροχίδων 70 -230
(αριθ. αναφ.Merck7734 ή ανάλογος).
Σηµείωση 4.
Ηsilicagel µπορεί συνήθως να χρησιµοποιείται απευθείας από το
δοχείο χωρίς προηγούµενη επεξεργασία. Ωστόσο, µερικές
παρτίδες ενδέχεται να παρουσιάσουν χαµηλού βαθµού δραστη-
ριότητα µε αποτέλεσµα κακής ποιότητας χρωµατογραφικό
διαχωρισµό. Σε τέτοιες περιπτώσεις, η επεξεργασία της silicagel
πρέπει να γίνεται µε τον ακόλουθο τρόπο:αποενεργοποιείται η
silicagel µε θέρµανση επί τέσσερις τουλάχιστον ώρες σε θερµο-
κρασία 550ºC.Μετά τη θέρµανση, τοποθετείται σε ξηραντήρα
ενόσω ψύχεται, και εν συνεχεία µεταφέρεται σε πωµατισµένη
φιάλη. Προστίθεται 2 %ύδατος και η φιάλη αναταράσσεται µέχρις
ότου δεν υπάρχουν πλέον σβώλοι, αλλά σκόνη που αιωρείται
ελεύθερα.
Εάν από διάφορες παρτίδες silicagel ληφθούν χρωµατογραφήµατα
µε αλληλεπικαλυπτόµενες κορυφές, η επεξεργασία της πρέπει να
γίνει κατά τον ανωτέρω περιγραφόµενο τρόπο. Μια άλλη λύση θα
ήταν να χρησιµοποιηθεί silica gel 60 εξαιρετικής καθαρότητας
(αριθ. αναφ.Merck7754).
5.6. Μητρικό διάλυµα (200 ppm) χολησταδιενί-3,5-ου (Sigma, καθα-
ρότητας 99%)σε εξάνιο (10mgσε 50ml).
5.7. Πρότυπο διάλυµα (συγκεντρώσεως 20 ppm) χολησταδιενί-3,5-ου σε
εξάνιο, λαµβανόµενο µε αραίωση του ανωτέρω διαλύµατος.
Σηµείωση 5.
∆ιατηρούµενα σε θερµοκρασία κατώτερη των 4 ºC,τα διαλύµατα
των σηµείων 5.6 και 5.7 µπορούν να παραµείνουν αναλλοίωτα επί
τέσσερις τουλάχιστον µήνες.
5.8. ∆ιάλυµαn-εικοσιεννεανενίου σε εξάνιο συγκεντρώσεως περίπου
100ppm.
5.9. Φέρον αέριο για χρωµατογραφία:ήλιο ή υδρογόνο καθαρότητας
99,9990%.
5.10. Βοηθητικά αέρια για ανιχνευτή ιονισµού διά φλογός:υδρογόνο
καθαρότητα 99,9990 %και καθαρισµένος αέρας.
6. ∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ
6.1.Προετοιµασία των ασαπωνοποίητων υλών:
6.1.1. Ζυγίζονται 20±0,1g ελαίου µέσα σε φιάλη των 250 ml(σηµείο
4.1), προστίθεται 1 mlπρότυπου διαλύµατος χολησταδιενί -3,5-ου
(20mg)και 75mlαλκοολικού διαλύµατος ποτάσας 10 %,συναρµο-
λογείται ο ψυκτήρας αναρροής και ακολουθεί θέρµανση µέχρι
ελαφρού βρασµού επί 30 λεπτά. Αποµακρύνεται η φιάλη που
περιέχει το δείγµα από τη θερµότητα και το διάλυµα αφήνεται να
ψυχθεί ελαφρά (το διάλυµα δεν αφήνεται να ψυχθεί εντελώς γιατί
τότε το δείγµα θα στερεοποιηθεί). Προστίθενται 100 mlύδατος και
το διάλυµα µεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη (σηµείο 4.2) µε τη
βοήθεια 100mlεξανίου. Το µείγµα ανακινείται ζωηρώς επί 30
δευτερόλεπτα και αφήνεται να ηρεµήσει µέχρι να σχηµατισθούν
οι στιβάδες.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—80
▼M11
Σηµείωση 6.
Εάν σχηµατισθεί γαλάκτωµα το οποίο διατηρείται, προστίθενται
µικρές ποσότητες αιθανόλης.
6.1.2. Η υποκείµενη υδατική φάση µεταφέρεται σε δεύτερη διαχωριστική
χοάνη και εκχυλίζεται εκ νέου µε 100 mlεξανίου. Αφήνεται να
εκρεύσει για µια ακόµη φορά η κατώτερη φάση και εκπλύνονται
τα εκχυλίσµατα εξανίου (συνδυαζόµενα σε µια άλλη διαχωριστική
χοάνη) τρεις φορές µε 100 mlµείγµατος αιθανόλης -ύδατος (1:1)
κάθε φορά, µέχρις ότου επιτευχθεί ουδέτερο pH.
6.1.3. Το διάλυµα εξανίου διαβιβάζεται µέσω άνυδρου θειικού νατρίου
(50g),εκπλύνεται µε 20 mlεξανίου και εξατµίζεται µέχρι
ξηράνσεως µέσα σε περιστροφικό εξατµιστήρα σε θερµοκρασία
30ºCκαι υπό χαµηλή πίεση.
6.2.∆ιαχωρισµός του κλάσµατος στεροειδών υδρογονανθράκων:
6.2.1. Το υπόλειµµα φέρεται στην κλασµατική στήλη µε τη βοήθεια δύο
δόσεων εξανίου του 1 mlη καθεµία, αφήνεται το δείγµα να
εκρεύσει επί της στήλης µε ταπείνωση της στάθµης του διαλύ-
µατος µέχρι της ανωτάτης στάθµης του θειικού νατρίου και
αρχίζει η χρωµατογραφική έκλουση µε εξάνιο µε ταχύτητα ροής
ίση προς 1ml/min περίπου. Απορρίπτονται τα πρώτα 25 -30ml του
εκλούσµατος και συλλέγονται τα επόµενα 40 ml.Το κλάσµα αυτό
µεταγγίζεται σε σφαιρική φιάλη των 100 ml.
Σηµείωση 7.
Το πρώτο κλάσµα περιέχει κορεσµένους υδρογονάνθρακες (σχήµα
1α) και το δεύτερο κλάσµα περιέχει τους στεροειδείς. Με περαι-
τέρω έκλουση λαµβάνεται ο υδρογονάνθρακας squalene και
συνεχείς ενώσεις. Για να επιτευχθεί ικανοποιητικός διαχωρισµός
µεταξύ κορεσµένων και στεροειδών υδρογονανθράκων, οι όγκοι
των κλασµάτων πρέπει να είναι οι καταλληλότεροι δυνατοί. Προς
τούτο, ο όγκος του πρώτου κλάσµατος πρέπει να προσαρµόζεται
κατά τρόπον ώστε, κατά την ανάλυση του δεύτερου κλάσµατος, οι
κορυφές που αντιστοιχούν στους κορεσµένους υδρογονάνθρακες να
είναι χαµηλές (βλέπε σχήµα 1γ) ·αν δεν εµφανισθούν, αλλά η
ένταση της κορυφής του πρότυπου διαλύµατος είναι χαµηλή, τότε
ο όγκος πρέπει να ελαττώνεται. Πάντως, δεν χρειάζεται να γίνεται
πλήρης διαχωρισµός µεταξύ των συστατικών του πρώτου και του
δεύτερου κλάσµατος, αφού κατά την ανάλυση µε αέριο χρωµατο-
γραφία δεν γίνεται αλληλεπικάλυψη κορυφών, εφόσον έχουν
τηρηθεί οι συνθήκες αερίου χρωµατογραφίας που αναφέρονται
στο σηµείο 6.3.1. Ούτε χρειάζεται κατά κανόνα να επιτυγχάνεται
ο κατλληλότερος όγκος του δεύτερου κλάσµατος, αφού µε τα
περαιτέρω συστατικά γίνεται ικανοποιητικός διαχωρισµός. Παρ '
όλα αυτά, µια υψηλή κορυφή που σηµειώνεται σε χρόνο
κατακράτησης χαµηλότερο κατά 1,5 min περίπου από τον αντί-
στοιχο του πρότυπου διαλύµατος οφείλεται στον υδρογονάνθρακα
squalene και είναι ενδεικτική µη ικανοποιητικού διαχωρισµού.
6.2.2. Το δεύτερο κλάσµα εξατµίζεται µέχρι ξηράνσεως µέσα σε εξατµι-
στήρα σε θερµοκρασία 30 ºCκαι υπό χαµηλή πίεση, και αµέσως,
µετά διαλύεται το υπόλειµµα σε 0,2 mlεξανίου. Το διάλυµα φυλάσ-
σεται στο ψυγείο µέχρις ότου αναλυθεί.
Σηµείωση 8.
Τα υπολείµµατα των σηµείων 6.1.3 και 6.2.2 δεν πρέπει να παραµέ-
νουν ξηρά και σε θερµοκρασία περιβάλλοντος. Μόλις ληφθούν,
πρέπει να προστίθεται ο διαλύτης και εν συνεχεία να φυλάσσονται
στο ψυγείο.
6.3.Αέριος χρωµατογραφία:
6.3.1. Συνθήκες εργασίας για διάταξη έγχυσης split:
—Θερµοκρασία στη διάταξη έγχυσης:300 ºC.
—Θερµοκρασία ανιχνευτή:320 ºC.
—Καταγραφέας-ολοκληρωτής:οι παράµετροι ολοκλήρωσης
πρέπει να καθορίζονται κατά τρόπον ώστε ο υπολογισµός των
εµβαδών να είναι ακριβής. Συνιστάται η ολοκλήρωση κοιλάδα
προς κοιλάδα.
—Ευαισθησία:το δεκαεξαπλάσιο περίπου της ελάχιστης
εξασθένησης.
—όγκος εγχεόµενου διαλύµατος:1 ml.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—81
▼M11
—Θερµοκρασίες προγραµµατισµού του κλιβάνου:αρχικά 235 ºC
επί 6minκαι εν συνεχεία αύξηση κατά 2 ºC/min µέχρι θερµο-
κρασίας 285ºC.
—Έγχυση µε µερισµό ροής:1:15.
—Φέρον αέριο:ήλιο ή υδρογόνο υπό πίεση 120 kPaπερίπου.
Οι συνθήκες αυτές µπορούν να προσαρµόζονται ανάλογα µε τα
χαρακτηριστικά του χρωµατογράφου και της στήλης, κατά τρόπον
ώστε τα λαµβανόµενα χρωµατογραφήµατα να πληρούν τους
ακόλουθους όρους:ο χρόνος κατακράτησης του διαλύµατος εσωτε-
ρικού προτύπου θα αντιστοιχεί προς τους χρόνους που εµφαίνονται
στο σηµείο 6.3.2 µε ακρίβεια ±5min· η κορυφή του διαλύµατος
εσωτερικού προτύπου θα αντιστοιχεί προς το 80 %τουλάχιστον
της πλήρους κλίµακας.
Το σύστηµα αέριας χρωµατογραφίας πρέπει να ελέγχεται µε
έγχυση µείγµατος από το µητρικό διάλυµα χολησταδιενίου (σηµείο
5.6) και το διάλυµα n-εικοσιεννεανίου (σηµείο 5.8). Η κορυφή που
αντιστοιχεί στο χολησταδιέν -3,5-ιο πρέπει να εµφανίζεται πριν από
την κορυφή που αντιστοιχεί στο n-εικοσιεννεάνιο (σχήµα 1γ) ·εάν
αυτό δεν συµβεί, υπάρχουν δύο λύσεις:να µειωθεί η αρχική θερµο-
κρασία του κλιβάνου ή /και να χρησιµοποιηθεί στήλη αερίου
χρωµατογραφίας µικρότερης πολικότητας.
6.3.2. Ταυτοποίηση των κορυφών του φάσµατος.
Η κορυφή του διαλύµατος εσωτερικού προτύπου εµφανίζεται στα
19min περίπου και το στιγµασταδιέν -3,5-ιο σε σχετικό χρόνο
κατακράτησης ίσο προς 1,29 (βλέπε σχήµα 1β). Το στιγµασταδιέν -
3,5-ιο συνοδεύεται από µικρές ποσότητες ισοµερούς και, συνήθως,
εµφανίζονται και τα δύο ως µία κορυφή χρωµατογραφήµατος.
Παρόλα αυτά, εάν η στήλη είναι πολύ πολική ή έχει µεγάλη
διαχωριστική ικανότητα, το ισοµερές µπορεί να εµφανίζεται ως
µικρή κορυφή πριν και πολύ κοντά στην κορυφή του στιγµαστα-
διεν-3,5-ίου (σχήµα 2). Για να εξασφαλιστεί η έκλουση των
στιγµασταδιενίων σε µία κορυφή συνιστάται η αντικατάσταση της
στήλης µε άλλη µικρότερης πολικότητας ή µεγαλύτερης εσωτε-
ρικής διαµέτρου.
Σηµείωση 9.
Στιγµασταδιένια αναφοράς µπορούν να ληφθούν από την ανάλυση
ενός εξευγενισµένου φυτικού ελαίου µε τη χρησιµοποίηση µικρό-
τερης ποσότητας δείγµατος (1 -2 g). Τα στιγµασταδιένια
εµφανίζονται ως ευµεγέθης κορυφή που ταυτοποιείται εύκολα.
6.3.3. Ποσοτικός προσδιορισµός
Η περιεκτιότητα σε στιγµασταδένιο προσδιορίζεται βάσει του
τύπου:
στιγµασταδένια ( mg/kg):As/C2Mc;
Ac/C2Mo
όπου:Ab=εµβαδόν της κορυφής που αντιστοιχεί στο στιγµα-
σταδένιο (εάν η κορυφή αυτή χωρίζεται σε δύο,
άθροισµα των εµβαδών που αντιστοιχούν στα δύο
ισοµερή)
Ac=εµβαδόν της κορυφής του εσωτερικού προτύπου
(χολησταδένιο)
Mc=µάζα (σεmg)του προστιθέµενου προτύπου
Mo=µάζα (σεg)του δείγµατος ελαίου.
Το όριο ανίχνευσης κυµαίνεται γύρω από την τιµή 0,01 mg/kg.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—82
▼M11
Σχήµα 1
Χρωµατογραφήµατα αερίου ληφθέντα από δείγµατα ελαιολάδου
που αναλύθηκαν σε τριχοειδή στήλη (εσωτερικής διαµέτρου
0,25mmκαι µήκους 25m)από τετηγµένο διοξείδιο του πυριτίου,
επιχρισµένη µε 5 %-φαινυλοµεθυλοσιλικόνη πάχους 0,25 mm.
α) Πρώτο κλάσµα (30 ml)από παρθένο ελαιόλαδο, ενισχυµένο µε
το πρότυπο διάλυµα.
β) ∆εύτερο κλάσµα (40 ml)από ελαιόλαδο που περιέχει στιγµαστα-
διένια σε αναλογία 0,10 mg/kg.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—83
▼M11
γ) ∆εύτερο κλάσµα (40 ml) που περιέχει µικρό ποσοστό του
πρώτου κλάσµατος.
Σχήµα 2
Χρωµατογράφηµα αερίου από δείγµα εξευγενισµένου ελαιολάδου
που αναλύεται στη στήλη DB-5, το οποίο δείχνει το ισοµερές του
στιγµασταδιεν-3,5-ίου.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—84
▼M13
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XVIII
ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΤΡΙΓΛΥΚΕΡΙ∆ΙΩΝ ΜΕ ECN42 (∆ΙΑΦΟΡΑ
ΜΕΤΑΞΥ ∆Ε∆ΟΜΕΝΩΝ HPLCΚΑΙ ΘΕΩΡΗΤΙΚΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙ-
ΚΟΤΗΤΑΣ)
1.Αντικείµενο
Ο προσδιορισµός της περιεκτικότητας των τριγλυκεριδίων ( TAG)
στα ελαιόλαδα µε τη βοήθεια του ισοδύναµου αριθµού άνθρακα
από τις διαφορές µεταξύ των αναλυτικών αποτελεσµάτων που
λαµβάνονται µε υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης ( HPLC)
και της θεωρητικής τιµής περιεκτικότητας, που υπολογίζεται
αρχίζοντας από τη σύνθεση των λιπαρών ουσιών.
2.Πεδίο εφαρµογής
Το πρότυπο αυτό εφαρµόζεται στα ελαιόλαδα. Η µέθοδος ισχύει
για την ανίχνευση της παρουσίας µικρών ποσοτήτων σπορέλαιων
(πλούσιων σε λινελαϊκό οξύ) σε κάθε κατηγορία ελαιόλαδων.
3.Αρχή
Στο αυθεντικό ελαιόλαδο, η θεωρητική τιµή της περιεκτικότητας
των τριγλυκεριδίων µε ECN42 [ υπολογιζόµενη µε βάση τον
προσδιορισµό της σύνθεσης των λιπαρών οξέων µε αέρια χρωµα-
τογραφία (GLC)] αντιστοιχεί, εντός ορισµένων ορίων µε την
περιεκτικότητα των τριγλυκεριδίων που προσδιορίζεται µε
ανάλυση µεECN42. ∆ιαφορές µεγαλύτερες των τιµών που
ορίζονται στον κανονισµό για κάθε τύπο ελαιολάδου καταδει-
κνύουν ότι το λάδι περιέχει σπορέλαια.
4.Μέθοδος
Η µέθοδος για τον υπολογισµό της θεωρητικής τιµής της περιε-
κτικότητας των τριγλυκεριδίων µε ECN42 καθώς και η διαφορά
της από την τιµή που λαµβάνεται από την ανάλυση HPLC υπολο-
γίζονται µέσω άλλων µεθόδων. ∆ιακρίνονται τρεις φάσεις:
προσδιορισµός της σύνθεσης των λιπαρών οξέων µε αέρια
χρωµατογραφία τριχοειδούς στήλης, υπολογισµός θεωρητικής
σύνθεσης τριγλυκεριδίων µε ECN42, προσδιορισµός τριγλυκερι-
δίων µεECN42 µεHPLC.
4.1.Όργανα
4.1.1. Σφαιρικές φιάλες των 250 και 500 ml.
4.1.2. Ποτήρια ζέσεως των 100 ml.
4.1.3. Γυάλινη στήλη χρωµατογραφίας, εσωτερικής διαµέτρου 21 mm,
µήκους 450mm, εφοδιασµένη µε στρόφιγγα και µε εσµυρισµένη
κωνική υποδοχή στην κορυφή της.
4.1.4. ∆ιαχωριστική χοάνη των 250 mlµε αρσενικό κωνικό εσµύρισµα
κατάλληλο για να προσαρµοστεί στην κορυφή της στήλης.
4.1.5. Γυάλινη ράβδος µήκους 600 mm.
4.1.6. Γυάλινη χοάνη διαµέτρου 80 mm.
4.1.7. Ογκοµετρικές φιάλες των 50 ml.
4.1.8. Ογκοµετρικές φιάλες των 20 ml.
4.1.9. Περιστροφικός εξατµιστής.
4.1.10. Υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης που επιτρέπει τον
θερµοστατικό έλεγχο της θερµοκρασίας της στήλης.
4.1.11. Βρόγχος εισόδου των 10 µ l.
4.1.12. Ανιχνευτής:διαφορετικό διαθλασίµετρο. Η ευαισθησία πλήρους
κλίµακας πρέπει να είναι τουλάχιστον 10−4µονάδες δείκτη
διάθλασης.
4.1.13. Στήλη:σωλήνας από ανοξείδωτο χάλυβα µήκους 250 mm και
εσωτερικής διαµέτρου 4,5 mm· πληρωµένη µε σωµατίδια διοξει-
δίου του πυριτίου µε 22 -23 % άνθρακα σε µορφή
δεκαοκτυλοσιλανίου, διαµέτρου 5 µ m(σηµείωση 2).1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—85
▼M13
4.1.14. Καταγραφέας ή/και ολοκληρωτής.
4.2.Αντιδραστήρια
Τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αναλυτικής καθαρότητας. Οι
διαλύτες έκλουσης πρέπει να είναι απαερωµένοι, και να µπορούν
να ανακυκλωθούν αρκετές φορές χωρίς επίδραση στους διαχωρι-
σµούς.
4.2.1. Πετρελαϊκός αιθέρας, σ.ζ. 40 -60ºC, για χρωµατογραφία ·
4.2.2. Αποσταγµένος αιθυλαιθέρας, απαλλαγµένος υπεροξειδίων.
4.2.3. ∆ιαλύτης έκλουσης για χρωµατογραφία στήλης:µείγµα πετε-
λαϊκού αιθέρα/αιθυλαιθέρα 87/13(v/v).
4.2.4. Πηκτή διοξειδίου του πυριτίου ( Silica gel), 70-230 mesh, 7734
Merck, σταθερής περιεκτικότητας σε νερό 5 %(w/w).
4.2.5. Υαλοβάµβακας.
4.2.6. Ακετόνη.
4.2.7. Ακετονιτρίλιο.
4.2.8. ∆ιαλύτης έκλουσης HPLC: ακετονιτρίλιο+ακετόνη (οι αναλογίες
ρυθµίζονται ώστε να επιτευχθεί ο επιθυµητός διαχωρισµός ·
αναλογία εκκίνησης 50:50).
4.2.9. ∆ιαλύτης διαλυτοποίησης:ακετόνη ή µείγµα ακετόνης -χλωρο-
φόρµιου σε αναλογία 1:1.
4.2.10. Τριγλυκερίδια αναφοράς:µπορούν αν χρησιµοποιηθούν είτε
τριγλυκερίδια του εµπορίου (τριπλαµιτίνη, τριελαΐνη κ.λπ.) και
να σχεδιαστεί καµπύλη των χρόνων κατακράτησης συναρτήσει
του ισοδύναµου αριθµού άνθρακα ή εναλλακτικά, χρωµατογραφή-
µατα αναφοράς από µείγµα σογιέλαιου -αυθεντικού ελαιόλαδου σε
αναλογία 30:70 (βλέπε σηµειώσεις 3 και 4 και σχήµατα 1, 2, 3 και
4).
4.3.Προετοιµασία δείγµατος
∆εδοµένου ότι η παρεµβολή ορισµένων ουσιών µπορεί να
οδηγήσει σε λανθασµένο θετικό αποτέλεσµα, το δείγµα πρέπει
πάντα να καθαρίζεται σύµφωνα µε τη µέθοδο IUPAC2.507, που
χρησιµοποιείται για τον προσδιορισµό των πολικών συστατικών
σε οξειδωµένα έλαια.
4.3.1. Παρασκευή της χρωµατογραφικής στήλης
Η στήλη (4.1.3) πληρούνται µε 30 mlπερίπου διαλύτη έκλουσης
(4.2.3)·εισάγεται βύσµα υαλοµβάµβακα (4.2.5), που σπρώχνεται
µε τη γυάλινη ράβδο (4.1.5) µέχρι το άκρο της στήλης.
Μέσα σε ποτήρι ζέσεως των 100 ml,παρασκευάζεται αιώρηµα
25gπηκτής διοξειδίου (4.2.4) µέσα σε 80 mlµείγµατος έκλουσης
(4.2.3) και µεταγγίζεται στη στήλη µε τη βοήθεια χωνίου (4.1.6).
Για να διασφαλιστεί ότι έχει µεταφερθεί όλο το πυριτικό οξύ στη
στήλη, το ποτήρι ζέσεως εκπλένεται µε το µείγµα έκλουσης και
το υγρό της πλύσης µεταφέρεται και αυτό εντός της στήλης.
Η στρόφιγγα της στήλης ανοίγεται και το διάλυµα εκρέει έως
ότου η στάθµη του διαλύτη έκλουσης βρίσκεται 1 cmπάνω από
τοsilicagel.
4.3.2. Χρωµατογραφία στήλης
Σε ογκοµετρική φιάλη των 50 ml(4.1.7) ζυγίζονται 2,5±0,1g µε
ακρίβεια 0,001 γ. διαθηµένου, οµογενοποιηµένου και, αν κρίνεται
αναγκαίο, αφυδατοµένου λαδιού, και διαλύονται σε 20 mlπερίπου
διαλύτη έκλουσης (4.2.3). Αν θεωρείται απαραίτητο, το σύνολο
θερµαίνεται ελαφρά για να διευκολυνθεί η διάλυση, στη συνέχεια
το διάλυµα ψύχεται σε θερµοκρασία περιβάλλοντος και, τέλος,
συµπληρώνεται ο όγκος του µε διαλύτη έκλουσης.
Με τη βοήθεια βαθµολογηµένου σιφονιού, προστίθενται στη
στήλη 20mlδιαλύµατος, όπως παρασκευάστηκε στο σηµείο
(4.3.1). Η στρόφιγγα ανοίγεται και ο διαλύτης εκρέει, έως ότου
η στάθµη του εξισωθεί µε τη στάθµη του silicagel.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—86
▼M13
Εν συνεχεία, εκλούονται 150 mlδιαλύτη έκλουσης (4.2.3), η δε
παροχή ρυθµίζεται σε 2 ml/min( κατά τρόπο ώστε τα 150 mlνα
εκρεύσουν από τη στήλη σε 60 -70λεπτά).
Το έκλουσµα συλλέγεται σε σφαιρική φιάλη (4.1.1) των 250 ml,
που έχει προηγουµένως ξηρανθεί µέχρι σταθερού βάρους και
ζυγιστεί µε ακρίβεια. Ο διαλύτης αποµακρύνεται υπό ελαττωµένη
πίεση (Rotavapor) και ζυγίζεται το υπόλειµµα το οποίο θα χρησι-
µοποιηθεί για την παρασκευή του διαλύµατος για την ανάλυση
HPLC και την παρασκευή των µεθυλεστέρων.
Η ανάκτηση του δείγµατος από τη στήλη πρέπει να είναι κατά
90%τουλάχιστον για τις κατηγορίες εξαιρετικό παρθένο,
παρθένο, κοινό εξευγενισµένο και ελαιόλαδο και τουλάχιστον
80%για το µειονεκτικό παρθένο ελαιόλαδο και τα πυρηνέλαια.
4.4.Ανάλυση HPLC
4.4.1. Προετοιµασία των δειγµάτων για χρωµατογραφική
ανάλυση
Σε ογκοµετρική φιάλη των 10 ml,παρασκευάζεται διάλυµα 5 %
του δείγµατος προς ανάλυση δια ζυγίσεως 0,5 ± 0,001 g του
δείγµατος και συµπλήρωση του όγκου µε το διαλύτη διαλυτο-
ποίησης µέχρι τα 10 ml(4.2.9).
4.4.2. Τρόπος εργασίας
Το χρωµατογραφικό σύστηµα τίθεται σε λειτουργία. Ο διαλύτης
έκλουσης (4.2.8) αντλείται µε παροχή 1,5 ml/min για να καθαρι-
στεί ολόκληρο το σύστηµα. Αφήνεται έως ότου ληφθεί µία
σταθερή γραµµή βάσης.
Εγχέονται 10 µlτου δείγµατος, όπως αυτό παρασκευάστηκε στο
4.3.
4.4.3. Υπολογισµός και έκφραση των αποτελεσµάτων
Χρησιµοποιείται η µέθοδος κανονικοποίησης, δηλαδή υποτίθεται
ότι το άθροισµα των εµβαδών των κορυφών που αντιστοιχούν στα
τριγλυκερίδια από ECN 42 έωςECN 52 ισούται µε 100 %.Η
σχετική εκατοστιαία αναλογία κάθε τριγλυκεριδίου υπολογίζεται
χρησιµοποιώντας τον τύπο:
ποσοστό επί%τριγλυκερίδιου=εµβαδόν κορυφής × 100 /
άθροισµα εµβαδών κορυφών,
Τα αποτελέσµατα πρέπει να περιέχουν τουλάχιστον δύο δεκαδικά
ψηφία.
Σηµείωση 1: Η σειρά έκλουσης µπορεί να προσδιοριστεί υπολογί-
ζονταςς τους ισοδύναµους αριθµούς άνθρακα, συχνά
καθοριζόµενους από τη σχέση ECN=CN−2n, όπουCNείναι ο
αριθµός άνθρακα και nο αριθµός των διπλών δεσµών. Μπορεί,
όµως, να υπολογιστεί µε µεγαλύτερη ακρίβεια λαµβάνοντας
υπόψη την προέλευση των διπλών δεσµών. Εάν no,nlκαιnlnείναι
οι αριθµοί των διπλών δεσµών που αποδίδονται στό ελαϊκό, λινε-
λαϊκό και λινολενικό οξύ αντίστοιχα, ο ισοδύναµος αριθµός
άνθρακα µπορεί να υπολογιστεί από µία σχέση της µορφής::
ECN=CN−dono−dlnl−dlnnln,
όπου οι συντελεστές do,dlκαιdlnµπορούν να υπολογιστούν µε
χρήση των τριγλυκεριδίων αναφοράς. Στις συνθήκες που καθορί-
ζονται σε αυτή τη µέθοδο, η σχέση που λαµβάνεται είναι
περίπου:
ECN=CN−(2,60no)−(2,35nl)−(2,17nln)
Σηµείωση 2: Παραδείγµατα:Lichrosorb(Merck)RP18Art50333
Lichrosphere ή αντίστοιχο (Merck)100CH18Art50377.
Σηµείωση 3: Με αρκετά τριγλυκερίδια αναφοράς είναι επίσης
δυνατό να υπολογιστεί η διακριτική ικανότητα αναφορικά µε
την τριελαΐνη,1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—87
▼M13
α=RT′=RT′τριελαΐνης
χρησιµοποιώντας τον ανηγµένο χρόνο κατακράτησης RT′=RT′−
RTδιαλύτη
Η καµπύλη τιµών του logα συναρτήσει του f(αριθµός διπλών
δεσµών) επιτρέπει τον προσδιορισµό των τιµών του χρόνου
κατακράτησης για όλα τα τριγλυκερίδια των λιπαρών οξέων που
περιέχονται στα τριγλυκερίδια αναφοράς (βλέπε σχήµα 2).
Σηµείωση 4: Η αποτελεσµατικότητα της στήλης πρέπει να
επιτρέπει σαφή διαχωρισµό της κορυφής της τριλινελαΐνης από
τις κορυφές των τριγλυκεριδίων µε παραπλήσιο RT.Η έκλουση
πραγµατοποιείται µέχρι την κορυφή ECN52.
Σηµείωση 5: Για να διασφαλιστεί η ορθή µέτρηση των εµβαδών
όλων των κορυφών, πρέπει η δεύτερη κορυφή που αντιστοιχεί
στοECN50 να είναι το 50%της πλήρους κλίµακος του κατα-
γραφέα.
4.5.Υπολογισµός της σύστασης των τριγλυκεριδίων
4.5.1. Προσδιορισµός της σύστασης λιπαρών οξέων
Η σύσταση των λιπαρών οξέων προσδιορίζεται µε βάση τη
µέθοδο αέριας χρωµατογραφίας (ΕΟΚ), η οποία αναφέρεται στο
παράρτηµα Χ κεφάλαιο Α του κανονισµού (ΕΟΚ) αριθ. 2568 /91,
και κατά την οποία χρησιµοποιείται τριχοειδής στήλη. Η παρα-
σκευή των µεθυλεστέρων πραγµατοποιείται σύµφωνα µε τη
µέθοδο που αναφέρεται στο παράρτηµα Χ κεφάλαιο Β (αντίδραση
µε µεθυλικό νάτριο σε διάλυµα ακλοόλης) του ίδιου κανονισµού.
4.5.2. Λιπαρά οξέα που λαµβάνονται υπόψη κατά τους υπολο-
γισµούς
Τα γλυκερίδια κατατάσσονται σε κατηγορίες ανάλογα µε τους
ισοδύναµους αριθµούς άνθρακα ( ECN), λαµβάνοντας υπόψη τους
ακόλουθες ισοδυναµίες µεταξύ του ECN και των λιπαρών οξέων.
Λήφθηκαν υπόψη µόνο τα λιπαρά οξέα µε 16 ή 18 άτοµα άνθρακα
διότι µόνο αυτά έχουν σηµασία στην περίπτωση του ελαιόλαδου.
Λιπαρό οξύ (ΛΟ)Συντοµο-
γραφίαΜοριακό
βάρος (ΜΒ)ECN
Παλµιτικό οξύ P 256,4 16
Παλµιτελαϊκό οξύ Po 254,4 14
Στεατικό οξύ S 284,5 18
Ελαϊκό οξύ O 282,5 16
Λινελαϊκό οξύ L 280,4 14
Λινολενικό οξύ Ln 278,4 12
4.5.3. Μετατροπή του ποσοστού %του εµβαδού σε moles για
όλα τα λιπαρά οξέα
molesP ¼%εµβαδ :P
PMPmolesS ¼%εµβαδ :S
PMSmolesPo ¼%εµβαδ :Po
PMPo
(1)
molesO ¼%εµβαδ :O
PMOmolesL ¼%εµβαδ :L
PMLmolesLn ¼%εµβαδ :Ln
PMLn1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—88
▼M13
4.5.4. Κανονικοποίηση των moles λιπαρών οξέων σε 100 %
%molesP 1 ;2;3 ðÞ ¼molesP /C3100
moles P þSþPoþOþLþLn ðÞ
(2)%molesS 1 ;2;3 ðÞ ¼molesS /C3100
moles P þSþPoþOþLþLn ðÞ
%molesPo 1 ;2;3 ðÞ ¼molesPo /C3100
moles P þSþPoþOþLþLn ðÞ
%molesO 1 ;2;3 ðÞ ¼molesO /C3100
moles P þSþPoþOþLþLn ðÞ
%molesL 1 ;2;3 ðÞ ¼molesL /C3100
moles P þSþPoþOþLþLn ðÞ
%molesLn 1 ;2;3 ðÞ ¼molesLn /C3100
moles P þSþPoþOþLþLn ðÞ
Το αποτέλεσµα δίνει την εκατοστιαία αναλογία κάθε λιπαρού
οξέως σε%moles στο σύνολο των θέσεων 1,2,3 -τωνTAG.
Στη συνέχεια, υπολογίζεται το άθροισµα των κεκορεσµένων
λιπαρών οξέωνPκαιS(SFA) καθώς και των ακόρεστων λιπαρών
οξέωνPo,O,L καιLn(UFA):
%molesSFA=%molesP+%molesS
(3)%molesUFA=100-%molesAGS.
4.5.5. Υπολογισµός της σύνθεσης των TAG σε λιπαρά οξέα
στις θέσεις 2-και 1,3-
Τα λιπαρά οξέα κατανέµονται σε τρία σύνολα κατά τον ακόλουθο
τρόπο:δύο πανοµοιότυπα για τις θέσεις 1 -και 3-και ένα για τη
θέση 2-,µε διαφορετικούς συντελεστές για τα κεκορεσµένα
οξέα (PκαιS)και για τα ακόρεστα ( Po,O,L καιLn).
4.5.5.1. Κεκορεσµένα λιπαρά οξέα στη θέση 2 -[P(2) καιS(2)]
%molesP(2)=%molesP(1,2,3)*0,06
(4)%molesS(2)=%molesS(1,2,3)*0,06
4.5.5.2. Ακόρεστα λιπαρά οξέα στη θέση 2 -[Po(2),O(2),L(2) καιLn(2)]:
%molesPo2 ðÞ ¼%molesPo1 ;2;3 ðÞ
%molesAGI/C3100/C0%molesP2 ðÞ /C0%molesS2 ðÞ ½/C138
(5)%molesO2 ðÞ ¼%molesO1 ;2;3 ðÞ
%molesAGI/C3100/C0%molesP2 ðÞ /C0%molesS2 ðÞ ½/C138
%molesL2 ðÞ ¼%molesL1 ;2;3 ðÞ
%molesAGI/C3100/C0%molesP2 ðÞ /C0%molesS2 ðÞ ½/C138
%molesLn2 ðÞ ¼%molesLn1 ;2;3 ðÞ
%molesAGI/C3100/C0%molesP2 ðÞ /C0%molesS2 ðÞ ½/C1381991R2568—EL—22.05.2002—019.001—89
▼M13
4.5.5.3. Λιπαρά οξέα στις θέσεις 1,3 -[P(1,3),S(1,3),Po(1,3)O(1,3),L(1,3)
καιLn(1,3)]
%molesP1 ;3ðÞ ¼%molesP1 ;2;3 ðÞ /C0%molesP2 ðÞ
2þ%molesP1 ;2;3 ðÞ
(6)%molesS1 ;3ðÞ ¼%molesS1 ;2;3 ðÞ /C0%molesS2 ðÞ
2þ%molesS1 ;2;3 ðÞ
%molesPo1 ;3ðÞ ¼%molesPo1 ;2;3 ðÞ /C0%molesPo2 ðÞ
2þ%molesPo1 ;2;3 ðÞ
%molesO1 ;3ðÞ ¼%molesO1 ;2;3 ðÞ /C0%molesO2 ðÞ
2þ%molesO1 ;2;3 ðÞ
%molesL1 ;3ðÞ ¼%molesL1 ;2;3 ðÞ /C0%molesL2 ðÞ
2þ%molesL1 ;2;3 ðÞ
%molesLn1 ;3ðÞ ¼%molesLn1 ;2;3 ðÞ /C0%molesLn2 ðÞ
2þ%molesLn1 ;2;3 ðÞ
4.5.6. Υπολογισµός των τριγλυκεριδίων
4.5.6.1. TAG µε ένα µόνο λιπαρό οξύ ( AAA· εν προκειµένωLLL,PoPoPo)
%molesAAA ¼%molesA1 ;3ðÞ /C3%molesA2 ðÞ/C3%molesA1 ;3ðÞ
10000(7)
4.5.6.2. TAG µε δύο λιπαρά οξέα ( AAB· εν προκειµένωPoPoL,PoLL)
%molesAAB ¼%molesA1 ;3ðÞ /C3%molesA2 ðÞ/C3%molesB1 ;3ðÞ /C32
10000
(8)
%molesABA ¼%molesA1 ;3ðÞ /C3%molesB2 ðÞ/C3%molesA1 ;3ðÞ
10000
4.5.6.3. TAG µε τρία διαφορετικά λιπαρά οξέα ( ABC· εν προκειµένω
OLLn,PLLn,PoOLn,PPoLn)
%molesABC ¼%molesA1 ;3ðÞ /C3%molesB2 ðÞ/C3%molesC1 ;3ðÞ /C32
10000
(9) %molesBCA ¼%molesB1 ;3ðÞ /C3%molesC2 ðÞ/C3%molesA1 ;3ðÞ /C32
10000
%molesCAB ¼%molesC1 ;3ðÞ /C3%molesA2 ðÞ/C3%molesB1 ;3ðÞ /C32
10000
4.5.6.4. Τριγλυκερίδια µε ECN42
Τα ακόλουθα τριγλυκερίδια µε ECN42 υπολογίζονται βάσει των
εξισώσεων 7, 8 και 9, ανάλογα µε τη σειρά της αναµενόµενης
έκλουσης στηνHPLC( κανονικά µόνο τρεις κορυφές).
LLL
PoLL και το ισοµερές θέσης LPoL
OLLn και τα ισοµερή θέσης OLnL καιLnOL
PoPoL και το ισοµερές θέσης PoLPo
PoOLn και τα ισοµερή θέσης OPoLn καιOLnPo
PLLn και τα ισοµερή θέσης LLnP καιLnPL
PoPoPo1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—90
▼M13
SLnLn και το ισοµερές θέσης LnSLn
PPoLn και τα ισοµερή θέσης PLnPo καιPoPLn
Τα τριγλυκερίδια µε ECN42 προκύπτουν από το άρθροισµα των
εννέα τριακυλογλυκερολών, συµπεριλαµβανοµένων των ισοµερών
θέσης τους. Τα αποτελέσµατα πρέπει να περιέχουν τουλάχιστον
δύο δεκαδικά ψηφία.
5.Αξιολόγηση των αποτελεσµάτων
Συγκρίνεται η υπολογιζόµενη θεωρητικώς τιµή περιεκτικότητας
µε αυτή που προσδιορίστηκε από την ανάλυση HPLC. Εάν η
διαφορά των θεωρητικών δεδοµένων από τα δεδοµένα της HPLC
είναι µεγαλύτερη από τις τιµές που ορίζονται για την ανάλογη
κατηγορία στον κανονισµό, αυτό σηµαίνει ότι το δείγµα περιέχει
σπορέλαιο.
Σηµείωση: τα αποτελέσµατα εκφράζονται µε ακρίβεια ενός δεκα-
δικού ψηφίου.
6.Παράδειγµα (oi ariumoí anaférontai sta tmñmata toy keiménoy thß
meuódoy)
4.5.1. Υπολογισµός των %m o l e s των λιπαρών οξέων από
δεδοµέναGLC(% του εµβαδού)
Τα ακόλουθα δεδοµένα για τη σύνθεση των λιπαρών οξέων
λαµβάνονται µε αέρια χρωµατογραφία:
ΛΟ
ΜΒP
256,4S
284,5Po
254,4O
282,5L
280,4Ln
278,4
%του εµβ. 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0
4.5.3. Μετατροπή του ποσοστού %του εµβαδού σε moles για
όλα τα λιπαρά οξέα
molesP ¼10
256 ;4¼0;03900molesP Βλέπε τύπο (1)
molesS ¼3
284 ;5¼0;01054molesS Βλέπε τύπο (1)
molesPo ¼1
254 ;4¼0;00393molesPo Βλέπε τύπο (1)
molesO ¼75
282 ;5¼0;26549molesO Βλέπε τύπο (1)
molesL ¼10
280 ;4¼0;03566molesL Βλέπε τύπο (1)
molesLn ¼1
278 ;4¼0;003594molesLn Βλέπε τύπο (1)
Άθροισµα =0,35822molesTG
4.5.4. Κανονικοποίηση των moles λιπαρών οξέων σε 100 %
%molesP1 ;2;3 ðÞ ¼0;03900molesP /C3100
0;35822moles¼10;888% Βλέπε τύπο (2)
%molesS1 ;2;3 ðÞ ¼0;01054molesS /C3100
0;35822moles¼2;944% Βλέπε τύπο (2)
%molesPo1 ;2;3 ðÞ ¼0;00393molesPo /C3100
0;35822moles¼1;097% Βλέπε τύπο (2)
%molesO1 ;2;3 ðÞ ¼0;26549molesO /C3100
0;35822moles¼74;113% Βλέπε τύπο (2)1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—91
▼M13
%molesL1 ;2;3 ðÞ ¼0;03566molesL /C3100
0;35822moles¼9;956% Βλέπε τύπο (2)
%molesLn1 ;2;3 ðÞ ¼0;00359molesLn /C3100
0;35822moles¼1;003% Βλέπε τύπο (2)
Συνολικά%moles =100,0%
Άθροισµα των κεκορεσµένων και των ακόρεστων λιπαρών οξέων
στις θέσεις 1,2,3-τωνTAG:
%molesAGS=10,888%+2,944%=13,831% Βλέπε τύπο (3)
%molesAGI=100,000%−13,831%=86,169% Βλέπε τύπο (3)
4.5.5. Υπολογισµός της σύνθεσης των TAG σε λιπαρά οξέα
στις θέσεις 2-και 1,3-
4.5.5.1. Κεκορεσµένα οξέα στη θέση 2 -[P(2) καιS(2)]
%molesP(2)=10,888%*0,06=0,653% Βλέπε τύπο (4)
%molesS(2)=2,944%*0,06=0,177% Βλέπε τύπο (4)
4.5.5.2. Ακόρεστα λιπαρά οξέα στις θέσεις 1,3 [ Po(1,3),O(1,3),L(1,3) και
Ln(1,3)]
%molesPo2 ðÞ ¼1;097%
86;169%/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 1;263%moles Βλέπε τύπο
(5)
%molesO2 ðÞ ¼74;113%
86;169%/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 85;295%moles Βλέπε τύπο
(5)
%molesL2 ðÞ ¼9;956%
86;169%/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 11;458%moles Βλέπε τύπο
(5)
%molesLn2 ðÞ¼1;003%
86;169%/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼1;154%moles Βλέπε τύπο
(5)
4.5.5.3. Λιπαρά οξέα στις θέσεις 1,3 [ P(1,3),S(1,3),Po(1,3),O(1,3),L(1,3)
καιLn(1,3)]
%molesP1 ;3ðÞ ¼10;888/C00;659
210;888¼16;005%moles Βλέπε τύπο (6)
%molesS1 ;3ðÞ ¼2;944/C00;177
22;944¼4;327%moles Βλέπε τύπο (6)
%molesPo1 ;3ðÞ ¼1;097/C01;263
21;097¼1;015%moles Βλέπε τύπο (6)
%molesO1 ;3ðÞ ¼74;113/C085;295
274;113¼68;522%moles Βλέπε τύπο (6)
%molesL1 ;3ðÞ ¼9;956/C011;458
29;956¼9;205%moles Βλέπε τύπο (6)
%molesLn1 ;3ðÞ ¼1;003/C01;154
21;003¼0;927%moles Βλέπε τύπο (6)
4.5.6. Υπολογισµός των τριακυλογλυκερολών
Από την υπολογιζόµενη περιεκτικότητα σε λιπαρά οξέα στη
θέση 2-και στις θέσεις 1,3 -(βλέπε παραπάνω):
ΛΟ σε Θέσεις 1,3 - Θέση 2-
P 16,005% 0,653%1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—92
▼M13
ΛΟ σε Θέσεις 1,3 - Θέση 2-
S 4,327% 0,177%
Po 1,015% 1,263%
O 68,522% 85,295%
L 9,205% 11,458%Ln 0,927% 1,154%Σύνολο 100,0% 100,0%
υπολογίζονται οι ακόλουθες τριακυλογλυκερόλες:
LLL
PoPoPoPoLL µε 1 ισοµερές θέσης
SLnLn µε 1 ισοµερές θέσης
PoPoL µε 1 ισοµερές θέσης
PPoLn µε 2 ισοµερή θέσης
OLLn µε 2 ισοµερή θέσης
PLLn µε 2 ισοµερή θέσης
PoOLn µε 2 ισοµερή θέσης
4.5.6.1. TAG µε ένα λιπαρό οξύ ( LLL,PoPoPo) Βλέπε τύπο (7)
%molesLLL ¼
9;205% /C311;458% /C39;205%
10000=0,09708molLLL
%molesPoPoPo ¼1;015% /C31;263% /C31;015%
10000=0,00013molPoPoPo
4.5.6.2. TAG µε δύο λιπαρά οξέα ( PoLL,SLnLn,PoPoL) Βλέπε τύπο (8)
%molesPoLL þLLPo ¼1;015% /C311;458% /C39;205% /C32
10000=0,02141
%molesLPoL ¼9;205% /C31;263% /C39;205%
10000=0,01070
0,03211molPoLL
%molesSLnLn þLnLnS ¼4;327% /C31;154% /C30;927% /C32
10000=0,00093
%molesLnSLn ¼0;927% /C30;177% /C30;927%
10000=0,00002
0,00095molSLnLn
%molesPoPoL þLPoPo ¼1;015% /C31;263% /C39;205% /C32
10000=0,00236
%molesPoLPo ¼1;015% /C311;458% /C31;015%
10000=0,00118
0,00354molPoPoL
4.5.6.3. TAG µε τρία διαφορετικά λιπαρά οξέα ( PoPLn, OLLn, PLLn,
PoOLn) Βλέπε τύπο (9)
%molesPPoLn ¼16;005% /C31;263% /C30;927% /C32
10000=0,00375
%molesLnPPo ¼0;927% /C30;653% /C31;015% /C32
10000=0,000121991R2568—EL—22.05.2002—019.001—93
▼M13
%molesPoLnP ¼1;015% /C31;154% /C316;005% /C32
10000 =0,00375
0,00762molPPoLn
%molesOLLn ¼68;522% /C311;458% /C30;927% /C32
10000=0,14577
%molesLnOL ¼0;927% /C385;295% /C39;205% /C32
10000=0,14577
%molesLLnO ¼9;205% /C31;154% /C368;522% /C32
10000=0,14577
0,43671molOLLn
%molesPLLn ¼16;005% /C311;458% /C30;927% /C32
10000=0,03400
%molesLnPL ¼0;927% /C30;653% /C39;205% /C32
10000=0,00111
%molesLLnP ¼9;205% /C31;154% /C316;005% /C32
10000=0,03400
0,06911molPLLn
%molesPoOLn ¼1;015% /C385;295% /C30;927% /C32
10000=0,01605
%molesLnPoO ¼0;927% /C31;263% /C368;522% /C32
10000=0,01605
%molesOLnPo ¼68;522% /C31;154% /C31;015% /C32
10000=0,01605
0,04815molPoOLn
ECN42=0,69540molTAG1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—94
▼M14
Σχήµα 1: ∆ιάγραµµα του logασε συνάρτηση του f(αριθµός διπλών
δεσµών)
Σχήµα:La=Laurinsäure;My=Myristinsäure;P=Palmitinsäure;St=
Stearinsäure;O=Ölsäure;L=Linolsäure;Ln=Linolensäure.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—95
▼M14
Σχήµα 2: Έλαιο σόγιας
Σχήµα 3: Έλαιο σόγιας /Ελαιόλαδο 30 /70
1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—96
▼M14
Σχήµα 4: Ελαιόλαδο
1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—97
▼M19
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XIX
ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ ΑΛΕΙΦΑΤΙΚΕΣ
ΑΛΚΟΟΛΕΣ ΜΕΣΩ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΑΕΡΙΑΣ ΦΑΣΗΣ ΜΕ
ΤΡΙΧΟΕΙ∆Η ΣΤΗΛΗ
1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ
Η µέθοδος περιγράφει διαδικασία προσδιορισµού της περιεκτι-
κότητας λιπαρών υλών σε αλειφατικές αλκοόλες, απλές και
ολικές.
2. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟ∆ΟΥ
Η λιπαρή ύλη, µετά από προσθήκη 1 -εικοσανόλης ως εσωτερικό
πρότυπο, σαπωνοποιείται µε αιθανολικό διάλυµα υδροξειδίου του
καλίου και στη συνέχεια τα ασαπωνοποίητα συστατικά εκχυλί-
ζονται µε αιθυλαιθέρα. Το κλάσµα των αλκοολών διαχωρίζεται
από το εκχύλισµα των ασαπωνοποιήτων µε χρωµατογραφία σε
βασική πλάκα βασικού διοξειδίου του πυριτίου ·οι ανακτώµενες
από το διοξείδιο του πυριτίου αλκοόλες µετατρέπονται σε
τριµεθυλοσιλυλαιθέρες και αναλύονται µε χρωµατογραφία αέριας
φάσης τριχοειδούς στήλης.
3. ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ
3.1. Σφαιρική φιάλη 250 mlπου φέρει κάθετο ψυκτήρα µε εσµυρι-
σµένα άκρα.
3.2. ∆ιαχωριστική χοάνη 500 ml.
3.3. Σφαιρικές φιάλες 250 ml.
3.4. Πλήρης εξοπλισµός για χρωµατογραφία λεπτής στιβάδας, µε
γυάλινες πλάκες 20 ×20cm.
3.5. Λυχνία υπεριώδους, µήκους κύµατος 366 ή 254 nm.
3.6. Μικροσύριγγες 100 και 500 µ l.
3.7. Κυλινδρική διηθητική χοάνη µε πορώδη ηθµό G3( πορώδες 15
έως 40 µm)διαµέτρου περίπου 2 cmκαι ύψους 5cm, µε
κατάλληλο άκρο για διήθηση υπό κενό και αρσενικό εσµυρι-
σµένο άκρο 12/21.
3.8. Φιάλη κενού των 50 mlµε θηλυκό εσµυρισµένο άκρο 12 /21
κατάλληλο για τη διηθητική χοάνη (3.7).
3.9. Σωλήνας µε κωνικό πυθµένα, των 10 ml,µε πώµα ασφαλείας.
3.10. Χρωµατογράφος αέριας φάσης κατάλληλος για λειτουργία µε
τριχοειδή στήλη, εφοδιασµένος µε σύστηµα κλασµάτωσης,
αποτελούµενος από:
3.10.1. Θερµοστατούµενο θάλαµο για τη στήλη, που επιτρέπει τη
διατήρηση της επιθυµητής θερµοκρασίας µε ακρίβεια περίπου
1ºC.
3.10.2. Σύστηµα έγχυσης µε ρυθµιζόµενη θερµοκρασία και είσοδο από
υπερσιλανισµένο γυαλί.
3.10.3. Ανιχνευτής ιονισµού φλόγας και µετατροπέας -ενισχυτής.
3.10.4. Καταγραφέας-ολοκληρωτής κατάλληλος για λειτουργία µε µετα-
τροπέα-ενισχυτή µε χρόνο απόκρισης το πολύ ένα δευτερόλεπτο
και µε µεταβλητή ταχύτητα χαρτιού.
3.11. Τριχοειδής στήλη από γυαλί ή από τετηγµένο διοξείδιο του πυρι-
τίου, µήκους 20 έως 30 µέτρων, εσωτερικής διαµέτρου 0,25 έως
0,32mm, καλυµµένη εσωτερικά από υγρό SE-52 ήSE-54 ή ισοδύ-
ναµο, µε πάχος µεταξύ 0,10 και 0,30 µ m.
3.12. Μικροσύριγγα για χρωµατογραφία αέριας φάσης των 10 µ lµε
εσκληρυµένη βελόνη.
3.13. Ζυγός ακριβείας µε ευαισθησία 1 mg(µε ένδειξη 0,1mg).
4. ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ
4.1. Υδροξείδιο του καλίου, αιθανολικό διάλυµα περίπου 2 Ν:130 g
υδροξειδίου του καλίου (ελάχιστου τίτλου 85 %)διαλύονται υπό1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—98
▼M19
ψύξη σε 200mlαπεσταγµένου νερού και κατόπιν το διάλυµα
συµπληρώνεται µέχρις όγκου ενός λίτρου µε αιθανόλη. Το
διάλυµα φυλάσσεται σε γυάλινες καλά πωµατισµένες αδιαφανείς
φιάλες.
4.2. Αιθυλαιθέρας, αναλυτικής καθαρότητας.
4.3. Άνυδρο θειικό νάτριο, αναλυτικής καθαρότητας.
4.4. Γυάλινες πλάκες καλυµµένες µε διοξείδιο του πυριτίου χωρίς
δείκτη φθορισµού, πάχους 0,25 mm ( διατίθενται στο εµπόριο
έτοιµες για χρήση).
4.5. Υδροξείδιο του καλίου, αιθανολικό διάλυµα 0,2 N:13g υδροξει-
δίου του καλίου διαλύονται σε 20 mlαπεσταγµένο νερό και το
διάλυµα συµπληρώνεται µέχρις όγκου ενός λίτρου µε αιθανόλη.
4.6. Βενζόλιο, χρωµατογραφικής καθαρότητας (5.2.2).
4.7. Ακετόνη, χρωµατογραφικής καθαρότητας (5.2.2).
4.8. Εξάνιο χρωµατογραφικής καθαρότητας (5.2.2).
4.9. Αιθυλαιθέρας, χρωµατογραφικής καθαρότητας (5.2.2).
4.10. Χλωροφόρµιο, αναλυτικής καθαρότητας.
4.11. ∆ιάλυµα αναφοράς για τη χρωµατογραφία σε πλάκα:χοληστε-
ρόλη ή φυτοστερόλη, διάλυµα 0,5 %σε χλωροφόρµιο.
4.12. ∆ιχλωρο-2′-7′-φλουορεσκεΐνη, αιθανολικό διάλυµα 0,2 %.Καθί-
σταται ελαφρώς βασικό µε προσθήκη µερικών σταγονών
αλκοολικού διαλύµατος υδροξειδίου του καλίου 2 N.
4.13. Άνυδρη πυριδίνη, χρωµατογραφικής καθαρότητας.
4.14. Εξαµεθυλοδισιλαζάνιο.
4.15. Τριµεθυλοχλωροσιλάνιο.
4.16. Πρότυπα διαλύµατα τριµεθυλοσιλυλαιθέρων των αλειφατικών
αλκοολών απόC20έωςC28.Πρέπει να παρασκευάζονται τη στιγµή
της χρήσης από µείγµατα καθαρών αλκοολών.
4.17. 1- εικοσανόλη, διάλυµα 0,1 %(m/v) σε χλωροφόρµιο (εσωτερικό
πρότυπο).
4.18. Φέρον αέριο:καθαρό υδρογόνο ή ήλιο, χρωµατογραφικής καθα-
ρότητας.
4.19. Βοηθητικό αέριο:καθαρό άζωτο, για αέρια χρωµατογραφία.
5. ∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ
5.1.Παρασκευή των ασαπωνοποιήτων
5.1.1. Με τη βοήθεια της µικροσύριγγας 500 µ l,εισάγεται στη σφαιρική
φιάλη 250mlδιάλυµα 1-εικοσανόλης 0,1 %σε χλωροφόρµιο
(4.17) που περιέχει ποσότητα 1 -εικοσανόλης που αντιστοιχεί στο
10%περίπου του περιεχοµένου σε αλειφατικές αλκοόλες στην
ποσότητα του προς δοκιµή δείγµατος. Για παράδειγµα, για 5 g
δείγµατος, πρέπει να προστίθενται 250 µ lτου διαλύµατος 1 -εικο-
σανόλης 0,1%εάν πρόκειται για δείγµα ελαιολάδου ή
σπορελαίου και1500 µlεάν πρόκειται για πυρηνέλαιο.
Ακολουθεί εξάτµιση σε ρεύµα αζώτου µέχρι ξηράνσεως και
κατόπιν ζυγίζονται 5 gακριβώς ξηρού δείγµατος και προστίθενται
υπό διήθηση στην ίδια σφαιρική φιάλη.
5.1.2. Προστίθενται 50 mlαιθανολικού διαλύµατος υδροξειδίου του
καλίου 2N,τοποθετείται ο κάθετος ψυκτήρας και θερµαίνουµε
σε ατµόλουτρο µέχρις ελαφρού βρασµού υπό ταυτόχρονη ζωηρή
ανάδευση µέχρις ότου πραγµατοποιηθεί σαπωνοποίηση (το
διάλυµα γίνεται διαυγές). Η θέρµανση συνεχίζεται επί είκοσι
λεπτά και κατόπιν προστίθενται 50 mlαπεσταγµένο νερό από
την κορυφή του ψυκτήρα, ο ψυκτήρας αποσυνδέεται και η σφαι-
ρική φιάλη ψύχεται στους 30 ºCπερίπου.
5.1.3. Το περιεχόµενο της σφαιρικής φιάλης µεταγγίζεται ποσοτικώς
σε διαχωριστική χοάνη 500 ml,υποβοηθώντας τη µετάγγιση µε
την προσθήκη ποσοτήτων απεσταγµένου ύδατος, χρησιµο-
ποιώντας συνολικά 50 ml. Προστίθενται περίπου 80 ml
αιθυλαιθέρα, η χοάνη ανακινείται ζωηρά για 30 περίπου δευτερό-1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—99
▼M19
λεπτα και αφήνεται σε ηρεµία µέχρι να επέλθει διαχωρισµός
(σηµείωση 1).
Η υποκείµενη υδατική φάση διαχωρίζεται συλλέγοντάς την σε
άλλη διαχωριστική χοάνη. Πραγµατοποιούνται ακόµη δύο εκχυ-
λίσεις της υδατικής φάσεως, µε τον ίδιο τρόπο,
χρησιµοποιώντας κάθε φορά 60 έως 70 mlαιθυλαιθέρα.
Σηµείωση 1: Τυχόν γαλακτώµατα µπορούν να εξαλειφθούν
προσθέτοντας µε υδροβολέα µικρή ποσότητα αιθυ-
λικής ή µεθυλικής αλκοόλης.
5.1.4. Τα αιθερικά εκχυλίσµατα συγκεντρώνονται σε µία µόνη διαχωρι-
στική χοάνη και πλένονται µε απεσταγµένο νερό (50 mlκάθε
φορά) µέχρις ουδετέρας αντιδράσεως του νερού πλύσεως.
Το νερό πλύσεως αποµακρύνεται, το διάλυµα ξηραίνεται µε
άνυδρο θειικό νάτριο και διηθείται µέσω ανύδρου θειικού νατρίου
σε προζυγισµένη σφαιρική φιάλη 250 ml,εκπλένοντας τη χοάνη
και το φίλτρο µε µικρές ποσότητες αιθυλαιθέρα.
5.1.5. Ο αιθέρας αποστάζεται µέχρις ότου να παραµείνει µόνον µια
µικρή ποσότητα και κατόπιν ξηραίνεται υπό ελαφρό κενό ή σε
ρεύµα αζώτου, η ξήρανση ολοκληρώνεται σε ξηραντήριο στους
100ºCεπί ένα τέταρτο της ώρας περίπου, ακολουθεί ζύγιση και
έπειτα ψύξη σε ξηραντήρα.
5.2.∆ιαχωρισµός του αλκοολικού κλάσµατος
5.2.1. Ετοιµασία των βασικών πλακών:οι πλάκες διοξειδίου του πυρι-
τίου (4.4) βυθίζονται πλήρως στο αιθανολικό διάλυµα 0,2 N
υδροξειδίου του καλίου (4.5) επί δέκα δευτερόλεπτα και
αφήνονται στη συνέχεια να στεγνώσουν καλά σε απαγωγό επί
δύο ώρες και τοποθετούνται τελικά σε κλίβανο στους 100 ºCεπί
µία ώρα.
Αποµακρύνονται από τον κλίβανο και φυλάσσονται σε ξηραντήρα
µε χλωριούχο ασβέστιο µέχρι να χρησιµοποιηθούν (οι πλάκες
που έχουν προετοιµαστεί µε αυτό τον τρόπο πρέπει να χρησιµο-
ποιούνται µέσα σε δεκαπέντε ηµέρες).
Σηµείωση 2: Η χρήση των βασικών πλακών διοξειδίου του πυρι-
τίου για το διαχωρισµό του αλκοολικού κλάσµατος
εξαλείφει την ανάγκη κατεργασίας των ασαπωνο-
ποιήτων µε αλουµίνα. Με τον τρόπο αυτό, όλες οι
ενώσεις όξινου χαρακτήρα (λιπαρά οξέα και άλλες)
συγκρατούνται στη γραµµή εναπόθεσης. Έτσι, η
λωρίδα των αλειφατικών και τερπενικών αλκοολών
λαµβάνεται σαφώς διαχωρισµένη από την ταινία
των στερολών.
5.2.2. Στο θάλαµο ανάπτυξης εισάγεται µείγµα εξανίου -αιθυλαιθέρα 65/
35(V/V) µέχρις ύψους περίπου 1 cm(*).
Ο θάλαµος κλείνεται µε κατάλληλο καπάκι και αφήνεται έτσι επί
µισή ώρα τουλάχιστον έτσι ώστε να αποκατασταθεί ισορροπία
υγρού/ατµού. Στις εσωτερικές επιφάνειες του θαλάµου είναι
δυνατόν να στερεωθούν λωρίδες διηθητικού χαρτιού που βυθί-
ζονται στο υγρό έκλουσης:µε τον τρόπο αυτό µπορεί να µειωθεί
κατά το ένα τρίτο περίπου ο χρόνος µετατόπισης του µετώπου του
υγρού και να επιτευχθεί πλέον οµοιόµορφη έκλουση των συστα-
τικών.
Σηµείωση 3: Για να έχουµε απολύτως αναπαραγώγιµες συνθήκες
έκλουσης, το µείγµα πρέπει να αλλάζει σε κάθε
δοκιµή.
5.2.3. Παρασκευάζεται διάλυµα 5 %περίπου ασαπωνοποιήτων (5.1.5) σε
χλωροφόρµιο και, µε τη µικροσύριγγα των 100 µ l,αποτίθενται
στη χρωµατογραφική πλάκα (5.2.1) σε απόσταση 2 cmπερίπου
από το ένα χείλος, 0,3 mlτου προαναφερθέντος διαλύµατος σε
µια συνεχή γραµµή, όσο το δυνατό λεπτότερη και πιο οµοιό-
µορφη. Στην ευθεία της γραµµής απόθεσης, σε µια από τις άκρες
της πλάκας, φέρονται 2 έως 3 µ lτου διαλύµατος αναφοράς των
αλειφατικών αλκοολών (4.11), για την ταυτοποίηση της λωρίδας
των αλειφατικών αλκοολών κατά την τελευταία ανάπτυξη.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—100
(*) Σε ιδαίτερες περιπτώσεις, για να επιτευχθεί καλός διαχωρισµός των λωρίδων
πρέπει να χρησιµοποιηθεί ως µείγµα έκλουσης βενζόλιο -ακετόνη 95/5(V/V).
▼M19
5.2.4. Η πλάκα τοποθετείται στο θάλαµο ανάπτυξης, ο οποίος έχει
προετοιµαστεί όπως περιγράφεται στο σηµείο 5.2.2. Η θερµο-
κρασία του περιβάλλοντος πρέπει να διατηρείται µεταξύ 15 και
20ºC.Ο θάλαµος κλείνεται αµέσως µε το καπάκι και αφήνεται
να επέλθει έκλουση µέχρις ότου το µέτωπο του διαλύτη να
φθάσει περίπου 1 cmαπό το πάνω χείλος της πλάκας.
Η πλάκα στη συνέχεια αποµακρύνεται από το θάλαµο ανάπτυξης
και ο διαλύτης εξατµίζεται σε ρεύµα θερµού αέρα ή καλύτερα
αφήνοντας την πλάκα να στεγνώσει σε απαγωγό.
5.2.5. Η πλάκα ψεκάζεται ελαφρά και οµοιόµορφα µε το διάλυµα της
διχλωρο-2′-7′-φλουορεσκεΐνης. Ως λωρίδα των αλειφατικών
αλκοολών αναγνωρίζεται εκείνη που είναι στην ίδια ευθεία µε
την κηλίδα που λαµβάνεται µε το διάλυµα αναφοράς. Με ένα
µαύρο µολύβι σηµειώνεται το σύνολο της λωρίδας των αλειφα-
τικών αλκοολών και της αµέσως παραπάνω λωρίδας που
αντιστοιχεί στις τερπενικές αλκοόλες.
Σηµείωση 4: Η υπόδειξη για συλλογή του συνόλου της λωρίδας
των αλειφατικών αλκοολών και της λωρίδας των
τερπενικών αλκοολών οφείλεται στο ότι σε αυτή,
υπό τις συνθήκες της µεθόδου, εγκλωβίζονται
σηµαντικές ποσότητες αλειφατικών αλκοολών.
5.2.6. Με µια µεταλλική σπάτουλα ξύνεται το διοξείδιο του πυριτίου
που περιλαµβάνεται στην οριοθετηµένη ζώνη. Το ξύσµα
εισάγεται στη χοάνη διηθήσεως (3.7), προστίθενται 10 mlθερµού
χλωροφορµίου, αναµειγνύουµε επισταµένως µε τη µεταλλική
σπάτουλα και διηθούµε µε τη βοήθεια κενού. Στη συνέχεια το
διήθηµα συλλέγεται στη φιάλη (3.8), η οποία είναι συνδεδεµένη
µε τη χοάνη διηθήσεως.
Το υπόλειµµα στη χοάνη πλένεται τρεις φορές µε αιθυλαιθέρα
(περίπου 10mlκάθε φορά) και συλλέγεται όπως και το διήθηµα
στη συνδεδεµένη µε τη χοάνη διηθήσεως φιάλη (3.8). Το διήθηµα
εξατµίζεται µέχρις όγκου περίπου 4 έως 5 ml,το υπολειπόµενο
διάλυµα µεταγγίζεται σε προζυγισµένο σωλήνα 10 ml(3.9), ξηραί-
νεται θερµαίνοντάς το σε ελαφρύ ρεύµα αζώτου, προστίθενται
µερικές σταγόνες ακετόνης, ξηραίνεται εκ νέου, τοποθετείται
για δέκα λεπτά περίπου στον κλίβανο στους 105 ºC,αφήνεται να
ψυχθεί σε ξηραντήρα και ζυγίζεται.
Το υπόλειµµα στο σωλήνα αποτελείται από το κλάσµα των αλει-
φατικών αλκοολών.
5.3.Παρασκευή των τριµεθυλοσιλυλαιθέρων
5.3.1. Στο σωλήνα που περιέχει το κλάσµα των αλειφατικών αλκοολών,
προστίθεται το αντιδραστήριο σιλυλιώσεως, το οποίο είναι
µείγµα πυριδίνης -εξαµεθυλοδισιλαζάνιου -τριµεθυλοχλωροσιλα-
νίου 9/3/1 (V/V/V) ( σηµείωση 5) σε αναλογία 50 µ lανά
χιλιοστόγραµµο αλειφατικών αλκοολών, αποφεύγοντας κάθε
απορρόφηση υγρασίας (σηµείωση 6).
Σηµείωση 5: Στο εµπόριο υπάρχουν έτοιµα προς χρήση διαλύ-
µατα. Υπάρχουν και άλλα σιλυλιωτικά
αντιδραστήρια όπως π.χ. το δις -τριµεθυλοσιλυλοτρι-
φθορακεταµίδιο +1% τριµεθυλοχλωροσιλάνιο που
αραιώνεται µε ίσο όγκο άνυδρης πυριδίνης.
Σηµείωση 6: Η ενδεχόµενη εµφάνιση µιας ελαφράς θολότητας
είναι φυσιολογική και δεν εµπνέει καµία ανησυχία.
Ένδειξη παρουσίας υγρασίας ή αλλοίωσης του αντι-
δραστηρίου αποτελεί ο σχηµατισµός λευκών
νιφάδων ή η εµφάνιση ροζ χρωµατισµού. Στην
περίπτωση αυτή, η δοκιµή πρέπει να επαναληφθεί.
5.3.2. Ο σωλήνας πωµατίζεται, ανακινείται προσεκτικά (χωρίς να
αναποδογυριστεί) έως την πλήρη διαλυτοποίηση των αλειφα-
τικών αλκοολών. Αφήνεται σε ηρεµία για δεκαπέντε
τουλάχιστον λεπτά σε θερµοκρασία περιβάλλοντος και κατόπιν
φυγοκεντρείται για µερικά λεπτά:το διαυγές διάλυµα είναι
έτοιµο για ανάλυση µε αεριοχρωµατογραφική ανάλυση.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—101
▼M19
5.4.Ανάλυση µε χρωµατογραφία αέριας φάσης
5.4.1. Προκαταρκτικές εργασίες, σταθεροποίηση της στήλης
5.4.1.1. Τοποθετείται η στήλη στο χρωµατογράφο αέριας φάσης,
συνδέοντας το άκρο εισόδου µε τον εισαγωγέα που είναι συνδε-
δεµένος µε το σύστηµα κλασµάτωσης και το άκρο εξόδου µε τον
ανιχνευτή. Πραγµατοποιούνται οι εν γένει έλεγχοι που απαι-
τούνται για µια διάταξη χρωµατογραφίας αέριας φάσης
(στεγανότητα του κυκλώµατος των αερίων, αποτελεσµατικότητα
του ανιχνευτή, αποτελεσµατικότητα του συστήµατος
κλασµάτωσης και του συστήµατος καταγραφής κ.λπ.).
5.4.1.2. Εάν η στήλη χρησιµοποιείται για πρώτη φορά, συνιστάται να
προηγείται σταθεροποίηση. ∆ιοχετεύεται ένα ελαφρό ρεύµα
φέροντος αερίου διαµέσου της στήλης αυτής, τίθεται σε
λειτουργία ο αέριος χρωµατογράφος και αρχίζει µια βαθµιαία
θέρµανση µέχρις ότου να φθάσουµε σε µια θερµοκρασία τουλάχι-
στον 20ºCπάνω από εκείνη της συνήθους λειτουργίας (σηµείωση
7). Η θερµοκρασία αυτή διατηρείται για δύο ώρες τουλάχιστον
και κατόπιν η διάταξη φέρεται σε συνθήκες λειτουργίας (ρύθµισητης ροής του αερίου και του διαχωρισµού, άναµµα της φλόγας,
σύνδεση µε τον ηλεκτρονικό καταγραφέα, ρύθµιση της θερµο-
κρασίας του θαλάµου για τη στήλη, του ανιχνευτή και του
εκκινητήρα κ.λπ.) και καταγράφεται το σήµα µε ευαισθησία
τουλάχιστον δύο φορές πάνω από εκείνη που προβλέπεται για
την εκτέλεση της ανάλυσης. Το ίχνος της λαµβανόµενης γραµµής
βάσεως πρέπει να είναι γραµµικό, χωρίς οποιαδήποτε φύσεως
κορυφή και δεν πρέπει να παρουσιάζει µετατόπιση. Τυχόν αρνη-
τική ευθύγραµµη µετατόπιση δείχνει ατελή στεγανότητα των
συνδέσεων της στήλης, τυχόν θετική µετατόπιση δείχνει
ανεπαρκή σταθεροποίηση της στήλης.
Σηµείωση 7: Η θερµοκρασία σταθεροποίησης πρέπει να είναι
πάντοτε κατώτερη κατά 20 ºCτουλάχιστον από τη
µέγιστη θερµοκρασία που προβλέπεται για το χρησι-
µοποιούµενο υγρό κατανοµής.
5.4.2. Επιλογή συνθηκών εργασίας
5.4.2.1. Οι ενδεικτικές συνθήκες εργασίας είναι οι ακόλουθες:
—θερµοκρασία της στήλης:ισοθερµική έναρξη οκτώ λεπτών
στους 180ºC,κατόπιν πρόγραµµα 5 ºCανά λεπτό µέχρι τους
260ºCκαι κατόπιν ακόµη δεκαπέντε λεπτά στους 260 ºC,
—θερµοκρασία του εξατµιστή:280 ºC,
—θερµοκρασία του ανιχνευτή:290 ºC,
—γραµµική ταχύτητα του φέροντος αερίου:ήλιο, 20 έως 35 cm
ανά δευτερόλεπτο, υδρογόνο, 30 έως 50 cmανά δευτερόλεπτο,
—λόγος της διαίρεσης διαχωρισµού:από 1 /50έως 1/100,
—ευαισθησία οργάνου:τετραπλάσια έως 16πλάσια της
ελάχιστης εξασθένησης,
—ευαισθησία καταγραφής:1 έως 2 millivolts στη βασική
κλίµακα,
—ταχύτητα του χαρτιού:30 έως 60 cmανά ώρα,
—ποσότητα εγχυόµενης ουσίας:0,5 έως 1 µ lδιαλύµατοςTMSE.
Οι συνθήκες αυτές µπορούν να τροποποιούνται ανάλογα µε τα
χαρακτηριστικά της στήλης και του χρωµατογράφου έτσι ώστε
να λαµβάνονται χρωµατογραφήµατα που να ικανοποιούν τις
ακόλουθες συνθήκες:
—ο χρόνος κατακράτησης της αλκοόλης C
26πρέπει να είναι
18±πέντε λεπτά,
—η κορυφή της αλκοόλης C22πρέπει να είναι 80 ±20% της
βασικής κλίµακας για το ελαιόλαδο και για τα σπορέλαια
40±20% της βασικής κλίµακας.
5.4.2.2. Για τον έλεγχο των απαιτούµενων ανωτέρω συνθηκών, πραγµατο-
ποιούνται επανειληµµένες εγχύσεις µε τα δείγµατα µειγµάτων
τωνTMSE των αλκοολών και οι λειτουργικές συνθήκες προσαρ-
µόζονται µέχρις ότου ληφθούν τα καλύτερα αποτελέσµατα.
5.4.2.3. Οι παράµετροι ολοκλήρωσης των κορυφών πρέπει να τίθενται
κατά τρόπον ώστε να λαµβάνονται σωστές τιµές για τις εξεταζό-
µενες κορυφές.1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—102
▼M19
5.4.3. Εκτέλεση της ανάλυσης
5.4.3.1. Λαµβάνεται µε τη µικροσύριγγα των 10 µ l,1µlεξανίου, αναρρο-
φώνται 0,5 µlαέρα και διαδοχικώς 0,5 έως 1 µ lτου διαλύµατος
του δείγµατος. Τραβάµε λίγο ακόµη το έµβολο της σύριγγας
έτσι ώστε η βελόνα να κενωθεί. Εισάγουµε τη βελόνα στη
µεµβράνη της διάταξης εγχύσεως και µετά ένα έως δύο δευτερό-
λεπτα εγχύουµε ταχύτατα, εξάγοντας στη συνέχεια αργά τη
βελόνα, µετά πέντε δευτερόλεπτα περίπου.
5.4.3.2. Εκτελείται καταγραφή µέχρι πλήρους εκλούσεως των TMSE των
υπαρχουσών αλειφατικών αλκοολών. Η γραµµή βάσης πρέπει να
πληροί πάντοτε τις απαιτούµενες συνθήκες (5.4.1.2).
5.4.4. Ταυτοποίηση των κορυφών
Η ταυτοποίηση των µεµονωµένων κορυφών πραγµατοποιείται
βάσει των χρόνων κατακράτησης και διά συγκρίσεως µε το
µείγµα τωνTMSE των αλειφατικών αλκοολών, µε ανάλυση υπό
τις ίδιες συνθήκες.
Η εικόνα 1 δείχνει χρωµατογράφηµα του αλκοολικού κλάσµατος
ενός παρθένου ελαιολάδου.
5.4.5. Ποσοτικός προσδιορισµός
5.4.5.1. Προβαίνουµε µε τον ολοκληρωτή στον υπολογισµό του εµβαδού
των κορυφών της 1 -εικοσανόλης και των αλειφατικών αλκοολών
C22,C24,C26καιC28.
5.4.5.2. Η περιεκτικότητα σε κάθε µεµονωµένη αλειφατική αλκοόλη
υπολογίζεται σε χιλιοστόγραµµα για 1000 γραµµάρια λιπαρής
ύλης, ως εξής:
όπου:
Ax=εµβαδόν της κορυφής της αλκοόλης x
As=εµβαδόν της κορυφής της 1 -εικοσανόλης
ms=βάρος προστιθέµενης 1 -εικοσανόλης, σε χιλιοστόγραµµα
m= βάρος ληφθέντος δείγµατος για τον προσδιορισµό, σε
γραµµάρια.
6. ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
Οι περιεκτικότητες των µεµονωµένων αλειφατικών αλκοολών
αναφέρονται σε χιλιοστόγραµµα για 1000 γραµµάρια λιπαρής
ύλης και το άθροισµά τους ως «συνολικές αλειφατικές
αλκοόλες».1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—103
▼M19
ΠΡΟΣΑΡΤΗΜΑ
Προσδιορισµός της γραµµικής ταχύτητας του αερίου
Στο χρωµατογράφο αέριας φάσης, ρυθµισµένο σε φυσιολογικές συνθήκες
λειτουργίας, εγχύονται 1 έως 3 µ lµεθανίου (ή προπανίου) και µετράται ο
χρόνος που χρειάζεται το αέριο να διασχίσει τη στήλη, µεταξύ της
στιγµής εγχύσεως και εκείνης της εξόδου της κορυφής ( tM).
Η γραµµική ταχύτητα σε εκατοστόµετρα ανά δευτερόλεπτο δίδεται από
τον τύποL/tM, όπουLείναι το µήκος της στήλης σε εκατοστόµετρα και
tMο µετρούµενος χρόνος σε δευτερόλεπτα.
Εικόνα 1—Χρωµατογράφηµα του αλκοολικού κλάσµατος ενός παρθένου
ελαιολάδου
1= Εικοσανόλη
2= Εικοσιδυανόλη
3= Εικοσιτριανόλη
4= Εικοσιτετρανόλη
5= Εικοσιπεντανόλη
6= Εικοσιεξανόλη
7= Εικοσιεπτανόλη
8= Εικοσιοκτανόλη1991R2568—EL—22.05.2002—019.001—104