1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 1
Το έγγραφο αυτό συνιστά βοήθηµα τεκµηρίωσης και δεν δεσµεύει τα κοινοτικά όργανα
►B Ο∆ΗΓΙΑ98/57/ΕΚ ΤΟΥ ΣΥΜΒΟΥΛΙΟΥ
της 20ής Ιουλίου 1998
για τον έλεγχο του Ralstonia solanacearum (Smith)Yabuuchi et al
(ΕΕ L235 της 21.8.1998, σ. 1)
∆ιορθώνεται από:
►C1∆ιορθωτικό ΕΕ L218 της 18.8.1999, σ. 30 (98/57)
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 2
▼B
Ο∆ΗΓΙΑ98/57/ΕΚ ΤΟΥ ΣΥΜΒΟΥΛΙΟΥ
της 20ής Ιουλίου 1998
γιατονέλεγχοτου Ralstonia solanacearum (Smith)Yabuuchi et al .
ΤΟ ΣΥΜΒΟΥΛΙΟ ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ,
Έχοντας υπόψη:
τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Κοινότητας, και
ιδίως το άρθρο 43,
την πρόταση της Επιτροπής (1),
τη γνώµη του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου (2),
τη γνώµη της Οικονοµικής και Κοινωνικής Επιτροπής (3),
Εκτιµώντας:ότι ο επιβλαβής οργανισµός Ralstonia solanacearum (Smith)
Yabuuchi et al . ήταν προηγουµένως γνωστός ως Pseudomonas sola -
nacearum (Smith)Smith· ότι, κατά πάσα πιθανότητα, το Ralstonia
solanacearum (Smith)Yabuuchi et al . θα καταστεί το γενικώς αποδε-
κτό όνοµα του οργανισµού· ότι η παρούσα οδηγία θα πρέπει ναλάβει υπόψη την επιστηµονική αυτή εξέλιξη·
ότι η παραγωγή πατάτας και τοµάτας κατέχει σηµαντική θέση
στη γεωργία της Κοινότητας· ότι η απόδοση της παραγωγήςπατάτας και τοµάτας απειλείται διαρκώς από επιβλαβείς οργανι-σµούς·
ότι η προστασία της καλλιέργειας της πατάτας και της τοµάτας
από αυτούς τους επιβλαβείς οργανισµούς είναι αναγκαία όχι µόνογια τη διατήρηση της απόδοσης, αλλά και για την αύξηση τηςπαραγωγικότητας της γεωργίας·
ότι τα µέτρα προστασίας κατά της εισόδου επιβλαβών οργα-
νισµών στο έδαφος κράτους µέλους έχουν περιορισµένα µόνοναποτελέσµατα εάν οι οργανισµοί αυτοί δεν ελέγχονται ταυτόχ-ρονα και µεθοδικά σε ολόκληρη την Κοινότητα και εφόσον δενλαµβάνονται µέτρα για την πρόληψη της µετάδοσής τους·
ότι ένας από τους επιβλαβείς για την πατάτα και την τοµάτα
οργανισµούς είναι το Ralstonia solanacearum (Smith)Yabuuchi et al .,
δηλαδή ο παθογόνος παράγοντας της φαιάς σήψης της πατάταςκαι της βακτηριακής µάρανσης της τοµάτας· ότι η ασθένεια αυτήέχει εκδηλωθεί σε τµήµατα της Κοινότητας και ότι υπάρχουνακόµη ορισµένες εστίες µόλυνσης, περιορισµένης έκτασης·
ότι η καλλιέργεια πατάτας και τοµάτας σε ολόκληρη την Κοι-
νότητα εκτίθεται σε σηµαντικό κίνδυνο εάν δεν ληφθούν αποτε-λεσµατικά µέτρα σχετικά µε τις καλλιέργειες αυτές, για τον εντο-πισµό του οργανισµού αυτού και τον προσδιορισµό του τρόπουεξάπλωσής του, την πρόληψη της εµφάνισης και της µετάδοσηςτου και, σε περίπτωση διαπίστωσής του, για την πρόληψη τηςµετάδοσης και την καταπολέµησή του µε σκοπό την εξάλειψήτου·
ότι, προκειµένου να επιτευχθεί ο σκοπός αυτός, πρέπει να θεσπι-
στούν ορισµένα µέτρα στην Κοινότητα· ότι, επιπλέον, τα κράτηµέλη πρέπει να µπορούν να λαµβάνουν πρόσθετα ή αυστηρότεραµέτρα, εφόσον κρίνονται αναγκαία και εφόσον δεν παρεµποδίζε-ται η διακίνηση της πατάτας ή της τοµάτας στην Κοινότητα,εκτός των περιπτώσεων που καθορίζονται στην οδηγία 77/93/ΕΟΚ του Συµβουλίου, της 21ης ∆εκεµβρίου 1976, περί τωνµέτρων προστασίας κατά της εισαγωγής στα κράτη µέλη επι-
(1)ΕΕC124 της 21.4.1997, σ. 12 και ΕΕ C108 της 7.4.1998, σ. 85.
(2)ΕΕC14 της 19.1.1998, σ. 34.
(3)ΕΕC206 της 7.7.1997, σ. 57.
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 3
▼B
βλαβών οργανισµών για τα φυτά ή τα φυτικά προϊόντα (1)· ότι τα
εν λόγω µέτρα πρέπει να κοινοποιούνται στα άλλα κράτη µέληκαι την Επιτροπή·
ότι στα µέτρα αυτά πρέπει να λαµβάνεται υπόψη ότι είναι ανα-
γκαία η διεξαγωγή επίσηµων συστηµατικών ερευνών για τονεντοπισµό του παθογόνου· ότι οι έρευνες αυτές θα πρέπει ναπεριλαµβάνουν διαδικασίες επιθεώρησης και, κατά περίπτωση,διαδικασίες δειγµατοληψίας και δοκιµών, δεδοµένου ότι, σε ορι-σµένες περιβαλλοντικές συνθήκες, η ασθένεια µπορεί να παραµέ-νει λανθάνουσα και να µην ανιχνεύεται στην πατάτα κατά τοδιάστηµα της βλάστησης ή µέσα στους αποθηκευµένους κονδύ-λους πατάτας· ότι η µετάδοση του παθογόνου στα καλλιεργού-µενα φυτά δεν είναι ο σηµαντικότερος παράγοντας, αλλά ότι τοπαθογόνο µπορεί να µεταδοθεί από τα επιφανειακά ύδατα καιορισµένα άγρια φυτά της οικογένειας των σολανιδών, καισυνεπώς η άρδευση καλλιεργειών πατάτας και τοµάτας µε µολυ-σµένο νερό εµπεριέχει τον κίνδυνο µόλυνσης αυτών των καλ-λιεργειών· ότι επίσης το παθογόνο µπορεί να υπάρχει, κατά τηδιάρκεια του χειµώνα, σε αυτοφυή φυτά πατάτας και τοµάτας ταοποία µπορεί να αποτελούν εστία µόλυνσης από την µία εποχήστην άλλη· ότι το παθογόνο µεταδίδεται επίσης δι’ επαφής τωνπατατών µε προσβεβληµένες πατάτες και µε εργαλεία φύτευσης,συγκοµιδής και επεξεργασίας ή µε περιέκτες µεταφοράς καιαποθήκευσης που έχουν µολυνθεί από προηγούµενη επαφή µεπροσβεβληµένες πατάτες·
ότι η εξάπλωση του παθογόνου µπορεί να µειωθεί ή να αποφευ-
χθεί µε την απολύµανση αυτών των αντικειµένων· ότι η τυχόνµόλυνση του πατατόσπορου αποτελεί σηµαντικό κίνδυνο για τηνεξάπλωση του παθογόνου· παροµοίως, η λανθάνουσα µόλυνσητου πατατόσπορου αποτελεί σηµαντικό κίνδυνο για τηνεξάπλωση του παθογόνου και αυτό µπορεί να αποφευχθεί µε τηχρησιµοποίηση πατατόσπορου που παράγεται στο πλαίσιοεπισήµως εγκεκριµένου προγράµµατος και ο οποίος έχει κριθείαπαλλαγµένος από τον οργανισµό µετά από δοκιµή·
ότι οι υφιστάµενες γνώσεις της βιολογίας και της επιδηµιολογίας
τουRalstonia solanacearum (Smith)Yabuuchi et al . στις ευρωπαϊκές
συνθήκες είναι ανεπαρκείς, και προβλέπεται η επανεξέταση τωνπροτεινόµενων µέτρων στη διάρκεια διαφόρων εποχών· οµοίως,προβλέπεται η βελτίωση της διαδικασίας δοκιµών υπό το φωςπεραιτέρω έρευνας, ιδίως όσον αφορά την ευαισθησία και τηνεξειδίκευση των µεθόδων δοκιµής προκειµένου να επιλεχθούνκαι να τυποποιηθούν οι βέλτιστες διαθέσιµες µέθοδοι δοκιµής·
ότι, προκειµένου να καθοριστούν οι λεπτοµέρειες αυτών των
γενικών µέτρων, καθώς και των αυστηρότερων ή πρόσθετωνµέτρων που λαµβάνουν τα κράτη µέλη για την πρόληψη τηςεισόδου του παθογόνου στο έδαφός τους, είναι επιθυµητό τακράτη µέλη να συνεργάζονται στενά µε την Επιτροπή στο πλαί-σιο της µόνιµης φυτοϋγειονοµικής επιτροπής (που στο εξής ανα-φέρεται ως «επιτροπή»),
ΕΞΕ∆ΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ Ο∆ΗΓΙΑ:
Άρθρο 1
Η παρούσα οδηγία αφορά τα µέτρα που πρέπει να λαµβάνονται
στα κράτη µέλη κατά του Ralstonia solanacearum (Smith)Yabuuchi
et al., παλαιότερον γνωστού ως Pseudomonas solanacearum (Smith)
Smith, (εφεξής καλούµενο «ο οργανισµός») σε σχέση µε τους
ξενιστές του οργανισµού που αναφέρονται στο παράρτηµα I
τµήµα 1 (εφεξής καλούµενοι «καταχωρηµένο φυτικό υλικό»), για:
(1)ΕΕL26 της 31.1.1977, σ. 20· οδηγία όπως τροποποιήθηκε τελευταία
από την οδηγία 98/2/ΕΚ της Επιτροπής (ΕΕ L15 της 21.1.1998, σ.
34).
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 4
▼B
α) τον εντοπισµό του και τον προσδιορισµό της διασποράς του·
β) την πρόληψη της εµφάνισης και της µετάδοσής του·
γ) σε περίπτωση διαπίστωσής του, την πρόληψη της µετάδοσης
και την καταπολέµησή του µε σκοπό την εξάλειψή του.
Άρθρο 2
1. Τα κράτη µέλη πραγµατοποιούν ετήσιες συστηµατικές
επίσηµες µελέτες για τον οργανισµό στο καταχωρηµένο φυτικόυλικό που προέρχεται από το έδαφός τους. Προκειµένου να προ-σδιοριστούν οι άλλες πιθανές εστίες µόλυνσης που απειλούν τηνπαραγωγή του καταχωρηµένου φυτικού υλικού, τα κράτη µέληπραγµατοποιούν αξιολόγηση του κινδύνου και, εκτός από τηνπερίπτωση κατά την οποία ο οργανισµός έχει αναγνωριστεί κατάτην αξιολόγηση, διεξάγουν, στις περιοχές παραγωγής τουκαταχωρηµένου φυτικού υλικού, στοχοθετηµένες επίσηµες µελέ-τες για τον οργανισµό σε φυτά άλλα από το καταχωρηµένοφυτικό υλικό, συµπεριλαµβανοµένων των άγριων ξενιστών τηςοικογένειας των σολανιδών, καθώς και στο επιφανειακό νερό πουχρησιµοποιείται για άρδευση ή ψεκασµό του καταχωρηµένουφυτικού υλικού και στα υγρά απόβλητα που απορρίπτονται απόεγκαταστάσεις βιοµηχανικής µεταποίησης ή συσκευασίας τουκαταχωρηµένου φυτικού υλικού και που χρησιµοποιούνται γιαάδρευση ή ψεκασµό του καταχωρηµένου φυτικού υλικού. Ηέκταση αυτών των στοχοθετηµένων µελετών καθορίζεται ανά-λογα µε τον διαπιστωµένο κίνδυνο. Τα κράτη µέλη µπορούνεπίσης να διεξάγουν επίσηµες µελέτες για τον οργανισµό σεάλλο υλικό, όπως υπόστρωµα βλάστησης, χώµα και στερεάαπόβλητα από εγκαταστάσεις βιοµηχανικής µεταποίησης ήσυσκευασίας.
2. Οι επίσηµες µελέτες που προβλέπονται στην παράγραφο 1
διενεργούνται:
α) για το καταχωρηµένο φυτικό υλικό, σύµφωνα µε τις λεπτοµέ-
ρειες που προβλέπονται στο σηµείο 1 του τµήµατος IIτου
παραρτήµατος I·
β) για ξενιστές άλλους από το καταχωρηµένο φυτικό υλικό, και
για το νερό, συµπεριλαµβανοµένων των υγρών αποβλήτων,σύµφωνα µε τις κατάλληλες µεθόδους και, κατά περίπτωση, ταδείγµατα λαµβάνονται και υποβάλλονται σε επίσηµη ή υπόεπίσηµη εποπτεία εργαστηριακή δοκιµή·
γ) κατά περίπτωση για άλλο υλικό, σύµφωνα µε τις κατάλληλες
µεθόδους.
Για τις µελέτες αυτές, οι περαιτέρω λεπτοµέρειες των διαδικα-
σιών εποπτείας και ο αριθµός, η προέλευση, η διαστρωµάτωσηκαι ο χρόνος λήψης των δειγµάτων, καθορίζονται µε απόφασητων αρµόδιων επίσηµων φορέων κατά την έννοια της οδηγίας77/93/ΕΟΚ βάσει ορθών επιστηµονικών και στατιστικών αρχώνκαι της βιολογίας του οργανισµού, και λαµβανοµένου υπόψη τουσυγκεκριµένου συστήµατος παραγωγής του καταχωρηµένου φυτι-κού υλικού και, κατά περίπτωση, άλλων φυτών ξενιστών σταοικεία κράτη µέλη.
3. Οι λεπτοµέρειες και τα αποτελέσµατα των επίσηµων
µελετών που προβλέπονται στην παράγραφο 1, κοινοποιούνταικάθε χρόνο στα άλλα κράτη µέλη και την Επιτροπή σύµφωνα µετις διατάξεις του σηµείου 2 του τµήµατος IIτου παραρτήµατος I.
Οι κοινοποιήσεις αυτές υποβάλλονται έως την 1η Ιουνίου, εκτόςαπό εκείνες για το πατατόσπορο που διατηρείται στο αγρόκτηµα,οι οποίες υποβάλλονται έως την 1η Σεπτεµβρίου. Οι λεπτοµέ-ρειες και τα αποτελέσµατα όσον αφορά τις καλλιέργειες θα αφο-ρούν την παραγωγή του προηγούµενου έτους. Οι λεπτοµέρειεςτων κοινοποιήσεων αυτών µπορούν να υποβάλλονται στην επι-τροπή.
4. Οι ακόλουθες διατάξεις πρέπει να θεσπίζονται µε τη διαδι-
κασία του άρθρου 16α της οδηγίας 77/93/ΕΟΚ:
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 5
▼B
—οι κατάλληλες µέθοδοι για τις µελέτες και τις εργαστηριακές
δοκιµές που προβλέπονται στην παράγραφο 2, πρώτο εδάφιο,στοιχείο β).
5. Οιακόλουθες διατάξεις µπορούν να θεσπίζονται µε τη διαδι-
κασία του άρθρου 16α της οδηγίας 77/93/ΕΟΚ:
—οι κατάλληλες µέθοδοι για τις µελέτες που προβλέπονται
στην παράγραφο 2, πρώτο εδάφιο, στοιχείο γ),
—περαιτέρω λεπτοµέρειες για τις µελέτες που προβλέπονται
στη παράγραφο 2, δεύτερο εδάφιο, προκειµένου να εξασφαλί-ζεται συγκρίσιµο επίπεδο ασφάλειας µεταξύ των κρατώνµελών.
Άρθρο 3
Τα κράτη µέλη µεριµνούν ώστε κάθε πιθανολογούµενη εµφάνιση
ή διαπιστωµένη παρουσία του οργανισµού στο έδαφος τους, ναανακοινώνεται στους αρµόδιους επίσηµους φορείς τους.
Άρθρο 4
1. Σε κάθε περίπτωση πιθανολογούµενης εµφάνισης, οι αρµό-
διοι επίσηµοι φορείς του οικείου κράτους µέλους εξασφαλίζουντη διεξαγωγή επίσηµης ή υπό επίσηµη εποπτεία εργαστηριακήςδοκιµής, είτε, για το καταχωρηµένο φυτικό υλικό, µε τη σχετικήµέθοδο του παραρτήµατος IIκαι σύµφωνα µε τους όρους του
παραρτήµατος III, σηµείο 1, είτε, στις άλλες περιπτώσεις, µε
οποιαδήποτε άλλη επισήµως εγκεκριµένη µέθοδο, προκειµένουνα επιβεβαιωθεί ή να διαψευσθεί η πιθανολογούµενη εµφάνιση.Σε περίπτωση επιβεβαίωσης, εφαρµόζονται οι απαιτήσεις τουπαραρτήµατος III, σηµείο 2.
2. Μέχρις ότου επιβεβαιωθεί ή διαψευσθεί η πιθανολογούµενη
εµφάνιση σύµφωνα µε την παράγραφο 1, στις περιπτώσεις πιθα-νολογούµενης εµφάνισης κατά τις οποίες, είτε:
i) παρατηρήθηκαν διαγνωστικά συµπτώµατα των ασθενειών που
προκαλούνται από τον οργανισµό και ελήφθη θετικό αποτέλε-σµα από τη δοκιµή ταχείας διαλογής που αναφέρεται στοπαράρτηµα II, τµήµα I, σηµείο 1 και τµήµα II, είτε
ii) ελήφθη θετικό αποτέλεσµα από δοκιµή ή δοκιµές διαλογής,
όπως ορίζεται στο παράρτηµα II, τµήµα I, σηµείο 2 και τµήµα
III,
οι αρµόδιοι επίσηµοι φορείς των κρατών µελών, σχετικά µε τηνπαραγωγή της χώρας τους:
α) απαγορεύουν τη διακίνηση όλων των φυτών και κονδύλων από
όλες τις καλλιέργειες, παρτίδες ή αποστολές από τις οποίεςέχουν ληφθεί τα δείγµατα, εκτός εάν διακινούνται υπό τονέλεγχό τους και µε την προϋπόθεση ότι έχει διαπιστωθεί ότιδεν ενέχουν εµφανή κίνδυνο µετάδοσης του οργανισµού·
β) λαµβάνουν µέτρα προς εξακρίβωση της προέλευσης της πιθα-
νολογούµενης εµφάνισης·
γ) λαµβάνουν κατάλληλα πρόσθετα προληπτικά µέτρα, βάσει του
επιπέδου του εκτιµώµενου κινδύνου, ιδίως σε σχέση µε τηνπαραγωγή του καταχωρηµένου φυτικού υλικού και τη δια-κίνηση παρτίδων πατατόσπορου διαφορετικών από εκείνεςπου αναφέρονται στο στοιχείο α) και που παράγονται στοντόπο παραγωγής από τον οποίο έχουν ληφθεί τα δείγµατα πουαναφέρονται στο στοιχείο α), για την πρόληψη της µετάδοσηςτου οργανισµού.
3. Στις περιπτώσεις πιθανολογούµενης εµφάνισης κατά τις
οποίες υπάρχει κίνδυνος µόλυνσης του καταχωρηµένου φυτικούυλικού ή του επιφανειακού νερού από ή σε άλλο/α κράτος/ηµέλος/η, το κράτος µέλος στο οποίο αναφέρθηκε πιθανολογού-µενη εµφάνιση κοινοποιεί αµέσως, ανάλογα µε την έκταση τουκινδύνου, τις λεπτοµέρειες της πιθανολογούµενης εµφάνισηςστο/α άλλο/α οικείο/α κράτος/η µέλος/η· τα εν λόγω κράτη συνερ-γάζονται κατάλληλα. Το/α κράτος/η µέλος/η το/α οποία/α λαµβά-νει/ουν την κοινοποίηση αυτή λαµβάνει/ουν προληπτικά µέτρα
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 6
▼B
σύµφωνα µε την παράγραφο 2, στοιχείο γ) και, ανάλογα µε τηνπερίπτωση, αναλαµβάνει/ουν κάθε περαιτέρω δράση, σύµφωνα µετις παραγράφους 1 και 2.
4. Η ακόλουθη διάταξη µπορεί να θεσπίζεται µε τη διαδικασία
του άρθρου 16α της οδηγίας 77/93/ΕΟΚ:
—τα µέτρα που αναφέρονται στην παράγραφο 2, στοιχείο γ).
Άρθρο 5
1. Εάν από την επίσηµη ή υπό επίσηµη εποπτεία εργαστη-
ριακή δοκιµή, είτε, για το καταχωρηµένο φυτικό υλικό, µε τησχετική µέθοδο του παραρτήµατος II, είτε, στις άλλες περιπτώ-
σεις, µε άλλη επισήµως εγκεκριµένη µέθοδο, επιβεβαιωθεί ηπαρουσία του οργανισµού σε δείγµα ληφθέν σύµφωνα µε τηνπαρούσα οδηγία, οι αρµόδιοι επίσηµοι φορείς ενός κράτουςµέλους, αφού λάβουν υπόψη τις ορθές επιστηµονικές αρχές, τηβιολογία του οργανισµού και το συγκεκριµένο σύστηµαπαραγωγής, εµπορίας και µεταποίησης των ξενιστών του οργανι-σµού στο κράτος µέλος αυτό:
α) για το καταχωρηµένο φυτικό υλικό:
i) θεσµοθετούν ελέγχους για τον προσδιορισµό της έκτασης
και της ή των πρωτογενών εστιών µόλυνσης σύµφωνα µετις διατάξεις του παραρτήµατος IV, και διενεργούν πρό-
σθετες δοκιµές σύµφωνα µε το άρθρο 4 παράγραφος 1,τουλάχιστον σε όλα τα κλωνικώς σχετιζόµενα αποθέµαταπατατόσµορου και
ii) χαρακτηρίζουν ως µολυσµένο το καταχωρηµένο φυτικό
υλικό, τις αποστολές και/ή τις παρτίδες από τις οποίεςλήφθηκε το δείγµα, καθώς και τα µηχανήµατα, τα οχή-µατα, τους περιέκτες, τις αποθήκες ή τα τµήµατα αυτώνκαι κάθε άλλο αντικείµενο, συµπεριλαµβανοµένων τωνυλικών συσκευασίας που χρησιµοποιήθηκαν για τοκαταχωρηµένο φυτικό υλικό από το οποίο έχει ληφθεί τοδείγµα· επίσης, χαρακτηρίζουν ως µολυσµένους, κατάπερίπτωση, τους αγρούς, τις µονάδες προστατευόµενηςφυτικής παραγωγής και τους τόπους παραγωγής από τουςοποίους συγκοµίστηκε το καταχωρηµένο φυτικό υλικό καιέχει ληφθεί το δείγµα· για τα δείγµατα που λήφθηκαν κατάτη βλαστική περίοδο, πρέπει να χαρακτηρίζονται ως µολυ-σµένοι οι αγροί, οι τόποι παραγωγής και, κατά περίπτωση,οι µονάδες προστατευόµενης φυτικής παραγωγής από τιςοποίες λήφθηκε το δείγµα και
iii) προσδιορίζουν, σύµφωνα µε τις διατάξεις του παραρτήµα-
τος V, σηµείο 1, την έκταση της πιθανής µόλυσης δια
επαφής πριν ή µετά τη συγκοµιδή ή µέσω σχέσης τηςδιαδικασίας παραγωγής, άρδευσης ή ψεκασµού ή µέσωκλωνικής σχέσης µε τη συγκεκριµένη µόλυνση και
iv) οριοθετούν µία ζώνη βάσει του χαρακτηρισµού της
µόλυνσης που αναφέρεται στο σηµείο ii), του προσδιορι-
σµού της έκτασης της πιθανής µόλυνσης που αναφέρεταιστο σηµείο iii), και της πιθανής µετάδοσης του οργανι-
σµού, σύµφωνα µε τις διατάξεις του σηµείου 2, στοιχείο i)
του παραρτήµατος V·
β) για καλλιέργειες ξενιστών άλλων από εκείνους που αναφέρο-
νται στο στοιχείο α) κατά τις οποίες η παραγωγή τουκαταχωρηµένου φυτικού υλικού διατρέχει κίνδυνο:
i) θεσµοθετούν ελέγχους σύµφωνα µε το στοιχείο α), σηµείο
i) και
ii) χαρακτηρίζουν ως µολυσµένους τους ξενιστές του οργανι-
σµού από τους οποίους έχει ληφθεί το δείγµα και
iii) προσδιορίζουν την έκταση της πιθανής µόλυνσης και
οριοθετούν µία ζώνη σύµφωνα µε το εδάφιο α), σηµεία iii)
και iv) αντίστοιχα, σε σχέση µε την παραγωγή του
καταχωρηµένου φυτικού υλικού·
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 7
▼B
γ) για το επιφανειακό νερό (συµπεριλαµβανοµένων των απορρί-
ψεων υγρών αποβλήτων από χώρους βιοµηχανικής µετα-ποίησης ή συσκευασίας του καταχωρηµένου φυτικού υλικού)και για τα άγρια φυτά της οικογενείας των σολανιδών, από ταοποία η παραγωγή του καταχωρηµένου φυτικού υλικού διατρέ-χει κίνδυνο µέσω της άρδευσης ή του ψεκασµού µε τα επιφα-νειακά ύδατα ή λόγω πληµµύρας από το επιφανειακό νερό:
i) θεσµοθετούν ελέγχους, συµπεριλαµβανοµένης της
επίσηµης µελέτης, σε κατάλληλες στιγµές, δειγµάτων απόεπιφανειακό νερό και, εφόσον υπάρχουν, από άγρια φυτάτης οικογένειας των σολανιδών προκειµένου να προσδιο-ριστεί η έκταση της µόλυνσης και
ii) χαρακτηρίζουν ως µολυσµένο το επιφανειακό νερό από το
οποίο έχει ληφθεί το ή τα δείγµατα λαµβάνοντας υόπψητην έκταση της µόλυνσης και τους ελέγχους που διεξάγο-νται σύµφωνα µε το σηµείο i) και
iii) προσδιορίζουν την έκταση της πιθανής µόλυνσης και
οριοθετούν µια ζώνη βάσει του χαρακτηρισµού τηςµόλυνσης που αναφέρεται στο σηµείο ii), και της πιθανής
διάδοσης του οργανισµού, λαµβάνοντας υπόψη τις διατά-ξεις του σηµείου 1 και του σηµείου 2, στοιχείο ii)τ ο υ
παραρτήµατος V.
2. Τα κράτη µέλη κοινοποιούν αµέσως, σύµφωνα µε τις διατά-
ξεις του παραρτήµατος V, σηµείο 3, στα άλλα κράτη µέλη και την
Επιτροπή κάθε µόλυνση που προσδιορίζεται βάσει της παραγρά-φου 1, στοιχείο α), σηµείο ii) και της παραγράφου 1, στοιχείο γ),
σηµείο ii), καθώς και τις λεπτοµέρειες της οριοθέτησης ζώνης
βάσει της παραγράφου 1, στοιχείο α), σηµείο iv) και, κατά
περίπτωση, της παραγράφου 1 στοιχείο γ), σηµείο iii). Οι λεπτο-
µέρειες της κοινοποίησης δυνάµει της παρούσας παραγράφουµπορούν να υποβάλλονται στην επιτροπή.
Ταυτόχρονα, τα κράτη µέλη υποβάλλουν στην Επιτροπή την πρό-
σθετη κοινοποίηση που προβλέπεται στο σηµείο 4 παραρτήµατοςV. Οι λεπτοµέρειες της κοινοποίησης δυνάµει του παρόντος εδα-
φίου υποβάλλονται αµέσως στα µέλη της επιτροπής.
3. Βάσει της κοινοποίησης σύµφωνα µε την παράγραφο 2 και
των κοινοποιούµενων στοιχείων, τα άλλα κράτη µέλη που αναφέ-ρονται στην κοινοποίηση διενεργούν έλεγχο σύµφωνα µε τηνπαράγραφο 1, στοιχείο α), σηµείο i) και, κατά περίπτωση, την
παράγραφο 1, στοιχείο γ), σηµείο i) και αναλαµβάνουν ενδεχο-
µένως περαιτέρω δράση, σύµφωνα µε τις παραγράφους 1 και 2.
Άρθρο 6
1. Τα κράτη µέλη ορίζουν ότι το καταχωρηµένο φυτικό υλικό
που έχει χαρακτηριστεί ως µολυσµένο βάσει του άρθρου 5 παρά-γραφος 1, στοιχείο α), σηµείο ii), δεν µπορεί να φυτεύεται και ότι
πρέπει, υπό τον έλεγχο και την έγκριση των αρµόδιων επίσηµωνφορέων τους, να υπόκειται σε µια από τις διατάξεις του παραρτή-µατος VI, σηµείο 1 κατά τρόπο ώστε να εξασφαλίζεται ότι δεν
υπάρχει εµφανής κίνδυνος µετάδοσης του οργανισµού.
2. Τα κράτη µέλη ορίζουν ότι απαγορεύεται η φύτευση του
καταχωρηµένου φυτικού υλικού που έχει χαρακτηρισθεί ωςπιθανώς µολυσµένο βάσει του άρθρου 5, παράγραφος 1, σηµείοα), στοιχείο iii), και στοιχείο γ), σηµείο iii), συµπεριλαµβανοµέ-
νου του καταχωρηµένου φυτικού υλικού για το οποίο έχει εντοπι-στεί κίνδυνος και το οποίο έχει παραχθεί σε τόπους παραγωγήςπου έχουν χαρακτηριστεί ως πιθανώς µολυσµένοι σύµφωνα µε τοάρθρο 5, παράγραφος 1, στοιχείο α), σηµείο iii), και ότι πρέπει
υπό τον έλεγχο των αρµόδιων επίσηµων φορέων, να χρησιµο-ποιείται ή να διατίθεται καταλλήλως, όπως ορίζεται στοπαράρτηµα VI, σηµείο 2, κατά τρόπο ώστε να διασφαλίζεται ότι
δεν υπάρχει εµφανής κίνδυνος µετάδοσης του οργανισµού.
3. Τα κράτη µέλη ορίζουν ότι τα µηχανήµατα, τα οχήµατα, οι
περιέκτες, οι αποθήκες ή τα τµήµατα αυτών, και κάθε άλλο αντι-κείµενο, συµπεριλαµβανοµένων των υλικών συσκευασίας, που
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 8
▼B
έχουν χαρακτηρισθεί µολυσµένα βάσει του άρθρου 5 παράγραφος1, στοιχείο α), σηµείο ii) ή που έχουν χαρακτηρισθεί ως πιθανώς
µολυσµένα βάσει του άρθρου 5, παράγραφος 1, στοιχεία α),σηµείο iii) και στοιχείο γ), σηµείο iii), πρέπει να καταστρέφονται
ή να απολυµαίνονται µε κατάλληλες µεθόδους όπως ορίζεται στοπαράρτηµα VI, σηµείο 3. Μετά την απολύµανση, τα αντικείµενα
αυτά παύουν να θεωρούνται µολυσµένα.
4. Με την επιφύλαξη των µέτρων που εφαρµόζονται σύµφωνα
µε τις παραγράφους 1, 2 και 3, τα κράτη µέλη ορίζουν ότι, για τηζώνη που οριοθετείται βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1, στοι-χείο α), σηµείο iv) και στοιχείο γ), στοιχείο iii), εφαρµόζονται
ορισµένα µέτρα, όπως καθορίζεται στο παράρτηµα VI, σηµεία 4.1.
και 4.2. Οι λεπτοµέρειες των µέτρων αυτών κοινοποιούνται ετη-σίως στα άλλα κράτη µέλη και την Επιτροπή. Οι λεπτοµέρειεςτης κοινοποίησης αυτής µπορούν να υποβάλλονται στην επι-τροπή.
Άρθρο 7
1. Τα κράτη µέλη ορίζουν ότι ο πατατόσπορος πρέπει να
πληροί τις απαιτήσεις της οδηγίας 77/93/ΕΟΚ και να προέρχεταιαπευθείας από υλικό πατάτας το οποίο παράγεται στο πλαίσιοεπισήµως εγκεκριµένου προγράµµατος και το οποίο έχει κριθείαπαλλαγµένο από τον οργανισµό µετά από επίσηµη ή υπόεπίσηµη εποπτεία δοκιµή µε τη σχετική µέθοδο του παραρτήµα-τος II.
Η προαναφερόµενη δοκιµή πραγµατοποιείται από ένα κράτος
µέλος:
α) στις περιπτώσεις που έχουν επιβεβαιωθεί ευρήµατα του οργα-
νισµού στην παραγωγή πατατοσπόρου του,
i) µε δοκιµή των προηγούµενων γενεών, συµπεριλαµβανο-
µένης της αρχικής κλωνικής επιλογής, και µε συστηµατικήδοκιµή των βασικών κλώνων πατατόσπορου, ή
ii) στις περιπτώσεις κατά τις οποίες έχει αποδειχθεί ότι δεν
υπάρχει κλωνική σχέση, µε δοκιµή όλων των βασικώνκλώνων πατατόσπορου ή προηγούµενων γενεών, συµπερι-λαµβανοµένης της αρχικής κλωνικής επιλογής·
β) στις λοιπές περιπτώσεις, είτε σε κάθε φυτό της αρχικής
κλωνικής επιλογής ή σε αντιπροσωπευτικά δείγµατα του βασι-κού πατατόσπορου ή των προηγουµένων γενεών.
2. Οιακόλουθες διατάξεις µπορούν να θεσπίζονται µε τη διαδι-
κασία του άρθρου 16α της οδηγίας 77/93/ΕΟΚ:
—οι λεπτοµερείς κανόνες εφαρµογής της παραγράφου 1, δεύ-
τερο εδάφιο, στοιχείο α),
—οι κανόνες που αφορούν τα αντιπροσωπευτικά δείγµατα που
προβλέπονται στην παράγραφο 1, δεύτερο εδάφιο, στοιχείοβ).
Άρθρο 8
Τα κράτη µέλη απαγορεύουν την κατοχή και τη διακίνηση του
οργανισµού.
Άρθρο 9
Με την επιφύλαξη των διατάξεων της οδηγίας 77/93/ΕΟΚ, τα
κράτη µέλη µπορούν να επιτρέπουν παρεκκλίσεις από τα µέτραπου αναφέρονται στα άρθρα 6 και 8 της παρούσας οδηγίας,σύµφωνα µε τις διατάξεις της οδηγίας 95/44/ΕΚ για πειραµατι-
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 9
▼B
κούς ή επιστηµονικούς σκοπούς, καθώς και για εργασίες ποικι-
λιακής επιλογής (1).
Άρθρο 10
Τα κράτη µέλη µπορούν να θεσπίζουν, όσον αφορά τη δική τους
παραγωγή, τα πρόσθετα ή αυστηρότερα µέτρα που απαιτούνταιγια την καταπολέµηση του οργανισµού ή για την πρόληψη τηςµετάδοσής του, υπό την προϋπόθεση ότι τα µέτρα αυτά συµ-µορφώνονται µε τις διατάξεις της οδηγίας 77/93/ΕΟΚ.
Ο λεπτοµέρειες των µέτρων αυτών κοινοποιούνται στα άλλα
κράτη µέλη και την Επιτροπή. Ο λεπτοµέρειες της κοινοποίησηςαυτής µπορούν να υποβάλλονται στην επιτροπή.
Άρθρο 11
Οι τροποποιήσεις των παραρτηµάτων της παρούσας οδηγίας, µε
γνώµονα τις εξελίξεις των επιστηµονικών ή τεχνικών γνώσεων,θεσπίζονται µε τη διαδικασία του άρθρου 16α της οδηγίας 77/93/ΕΟΚ. Για τις µεθόδους που ορίζονται στο παράρτηµα IIκαι τα
µέτρα των παραγράφων 4.1 και 4.2 του παραρτήµατος VIτης
παρούσας οδηγίας, η Επιτροπή καταρτίζει έκθεση επανεξέτασηςτων εν λόγω µεθόδων και µέτρων βάσει της κτηθείσας πείρας, καιτην υποβάλει στην επιτροπή πριν από την 1η Ιανουαρίου 2002.
Άρθρο 12
1. Τα κράτη µέλη θέτουν σε ισχύ τις απαιτούµενες νοµοθετι-
κές, κανονιστικές και διοικητικές διατάξεις για να συµµορφ-ωθούν µε την παρούσα οδηγία από τις 21 Αυγούστου 1999. Ενη-µερώνουν αµέσως την Επιτροπή σχετικά.
Οι διατάξεις αυτές, όταν θεσπίζονται από τα κράτη µέλη, αναφέ-
ρονται στην παρούσα οδηγία ή συνοδεύονται από παρόµοια ανα-φορά κατά την επίσηµη δηµοσίευσή τους. Οι λεπτοµερείς διατά-ξεις για την αναφορά αυτή καθορίζονται από τα κράτη µέλη.
2. Τα κράτη µέλη ανακοινώνουν αµέσως στην Επιτροπή τις
βασικές διατάξεις εθνικού δικαίου τις οποίες θεσπίζουν στοντοµέα τον οποίο διέπει η παρούσα οδηγία. Η Επιτροπή ενηµερώ-νει σχετικά τα λοιπά κράτη µέλη.
Άρθρο 13
Η παρούσα οδηγία αρχίζει να ισχύει την ηµέρα της δηµοσίευσής
της στηνΕπίσηµη Εφηµερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων .
Άρθρο 14
Η παρούσα οδηγία απευθύνεται στα κράτη µέλη.
(1)ΕΕL184 της 3.8.1995, σ. 34· οδηγία όπως τροποποιήθηκε τελευταία
από την οδηγία 97/46/ΕΚ της Επιτροπής (ΕΕ L204 της 31.7.1997, σ.
43).
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 10
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I
ΤΜΗΜΑ I
Κατάλογοςξενιστών του Ralstonia solanacearum (Smith)Yabuuchi et al .
όπως ορίζονται στο άρθρο 1
Φυτά ,(συµπεριλαµβανοµένων τωνκονδύλων )άλλα από
τον πραγµατικό σπόρο του Solanum tuberosum L.πατάτα
Φυτά ,άλλα από τα φυτά και τους σπ όρους του Lycopersicon
lycopersicum (L.) Karsten ex Farw.τοµάτα
ΤΜΗΜΑ II
Μελέτες
1. Οι επίσηµες µελέτες που αναφέρονται στο άρθρο 2 παράγραφος 2,
στοιχείο α), διεξάγονται βάσει της βιολογίας του οργανισµού και τωνσυγκεκριµένων συστηµάτων παραγωγής του οικείου κράτους µέλουςκαι πρέπει να περιλαµβάνουν:
i) όσον αφορά την πατάτα,
—σε κατάλληλες στιγµές, µακ ροσκοπική επιθεώρηση των καλ-
λιεργούµενων φυτών, ή/και δειγµοτοληψία από τους σπ όρους
και άλλες πατάτες κατά τη βλαστική περίοδο ή στην αποθήκη.Τα δείγµατα αυτά υποβάλλονται σε επίσηµο ή υπό επίσηµηεποπτεία µακροσκο πικό έλεγχο κοµµένων κονδύλων,
και
—στην περίπτωση του πατατόσπ ορουκαι, κατά περίπτωση, για
άλλες πατάτες, επίσηµες ή υπό επίσηµη εποπτεία εργαστηρια-κές δοκιµές µε τη µέθοδο του παραρτήµατος II,
ii) όσον αφορά την το µάτα,
—µακροσκο πική επιθεώρηση, σε κατάλληλες στιγµές, τουλάχι-
στον τωνκαλλιεργούµενων φυτώνπου π ροορίζονται για µεταφύ-
τευση για επαγγελµατική χρήση.
2. Η κοινοποίηση των επίσηµων µελετών που αναφέρονται στο άρθρο 2,
παράγραφος 3, πρέπει να περιλαµβάνει:
i) στην περίπτωση των µελετών για την πατάτα,
—την εκτιµώµενη συνολική καλλιεργούµενη έκταση, σε εκτάρια,
πατατόσπ ορου και άλλης πατάτας,
—τη διαστρωµάτωση ανά κατηγορία σπ όρου και πατάτες εµπο-
ρίου, και, κατά περίπτωση, ανά περιοχή,
—τον αριθµό και το χρόνο λήψης των δειγµάτων,
—τον αριθµό µακ ροσκοπικών ελέγχων στον αγρό,
—τον αριθµό (και το µέγεθος του δείγµατος) των µακ ροσκοπικών
ελέγχων κονδύλων,
ii) στην περίπτωση τωνµελετών, τουλάχιστον, για τα καλλιεργούµενα
φυτά τοµάτας που π ροορίζονται για µεταφύτευση για επαγγελµα-
τική χρήση,
—τον εκτιµώµενο συνολικό αριθµό φυτών,
—τον αριθµό των µακ ροσκοπικών ελέγχων,
iii) στην περίπτωση των µελετών που αφ ορούν ξενιστές άλλους από
την πατάτα και την τοµάτα, συµπεριλαµβανοµένων των άγριωνφυτών της οικογενείας των σολανιδών,
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 11
▼B
—το είδος,
—τον αριθµό και το χρόνο λήψης των δειγµάτων,
—την περιοχή/ποτάµι δειγµατοληψίας, κατά περίπτωση,
—τη µέθοδο ανάλυσης,
iv) στην περίπτωση των µελετών σχετικά µε το νερό και τις απ ορρί-
ψεις υγρών αποβλήτων από εγκαταστάσεις βιοµηχανικής µετα-ποίησης ή συσκευασίας,
—τον αριθµό και το χρόνο λήψης των δειγµάτων,
—την περιοχή/το ποτάµι/την τοποθεσία των εγκαταστάσεων δειγ-
µατοληψίας, κατά περίπτωση,
—τη µέθοδο ανάλυσης.
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 12
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ
ΣΧΗΜΑ ∆ΟΚΙΜΩΝ ΓΙΑ ΤΗ ∆ΙΑΓΝΩΣΗ, ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ
ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΤΟΥ RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH)
YABUUCHI ET AL .
ΠΕ∆ΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΤΟΥ ΣΧΗΜΑΤΟΣ ∆ΟΚΙΜΩΝ
Στο παρόν σχήµα περιγράφονται οι διάφορες διαδικασίες για:
i) τη διάγνωση της καστανής σήψης σε κονδύλους πατάτας και της
βακτηριακής µάρανσης σε φυτά πατάτας και τοµάτας,
ii) την ανίχνευση της Ralstonia solanacearum σε δείγµατα κονδύλων πατά-
τας,
iii) την αναγνώριση του Ralstonia solanacearum .
Στα προσαρ τήµατα παρέχονται λεπτοµέρειες για την παρασκευή των
χρησιµοποιουµένων για τις δοκιµές υλικών, δηλαδή θρεπτικώνυποστηρωµάτων, ρυθµιστικών διαλυµάτων, διαλυµάτων, αντιδραστηρίων.
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ
ΤΜΗΜΑ I:Εφαρµογήτουσχήµατοςδοκιµών … 9
1.∆ιάγνωση της καστανής σήψης σε κονδύλους πατάτας και της
βακτηριακής µάρανσης σε φυτά πατάτας και τοµάτας …9
2.Ανίχνευση και ταυτοποίηση του Ralstonia solanacearum σε δείγµατα
κονδύλων πατάτας …11
ΤΜΗΜΑ II:∆ιάγνωσητηςκαστανήςσήψηςσεκονδύλουςπατάταςκαιτηςβακτη -
ριακήςµάρανσηςσεφυτάπατάταςκαιτοµάτας …13
1.Συµπτώµατα …1 3
2.∆οκιµή /ές ταχείας διαλογής …1 3
3.∆ιαδικασία αποµόνωσης …1 4
4.∆οκιµή /ές επιβεβαίωσης …1 4
ΤΜΗΜΑ III:Ανίχνευσηκαιταυτοποίησητου Ralstoniasolanacearum σεδείγµατα
κονδύλωνπατάτας …17
1.Προετοιµασία του δείγµατος για τη δοκιµή …1 7
2.∆οκιµή αν οσοφθορισµού (IF) … 18
3.∆οκιµή ενζυµατικής αν οσοαπορρόφησης (ELISA) … 20
4.∆οκιµή αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης n (PCR )… 2 0
5.∆οκιµές επιλεκτικής σπί στερεού υποστρώµατος …2 2
6.Βιοδοκιµή …2 3
7.∆οκιµές εµπλουτισµού …2 3
8.∆οκιµή παθογένειας …2 3
Προσάρτηµα1: Θρεπτικά υλικά για την αποµόνωση και καλλιέργεια της Ralstonia
solanacearum …24
Προσάρτηµα2: Υλικά για την προετοιµασία του δείγµατος δοκιµής …2 5
Προσάρτηµα3: Υλικά για τη δοκιµή IF … 26
Προσάρτηµα4: Προςδιορισµός του βαθµού µόλυνσης στη δικιµή IF … 27
Προσάρτηµα5: Υλικά για τη δοκιµή ELISA … 28
Προσάρτηµα6: Υλικά για τη δοκιµή PCR … 29
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 13
▼B
Προσάρτηµα7: Υλικά για τη δοκιµή επιλεκτικής αποµόνωσης επί στερεού θρεπτι -
κού υποστρώµατος και δοκιµές εµπλουτισµού …29
Βιβλιογραφία
…30
ΤΜΗΜΑ I
ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΟΥ ΣΧΗΜΑΤΟΣ ∆ΟΚΙΜΩΝ
1.∆ιάγνωση της καστανής σήψης σε κονδύλους πατάτας και της
βακτηριακής µάρανσης σε φυτά πατάτας και τοµάτας
Η περιγραφόµενη διαδικασία εξέτασης π ροορίζεται για κο νδύλους
πατάτας που παρουσιάζουν τυπικά συµπτώµατα ή γεννούν υπόνοιεςγια ύπαρξη καστανής σήψης και για φυτά πατάτας και τοµάτας πουπαρουσιάζουν τυπικά συµπτώµατα ή γεννούν υπόνοιες για ύπαρξηβακτηριακής µάρανσης. Η διαδικασία περιλαµβάνει µία δοκιµήταχείας διαλογής, αποµόνωση του παθογόνου αιτίου από µολύ-σµένο αγγειώδη ιστό σε διαγνωστικά υλικά και, σε περίπτωσηθετικού αποτελέσµατος, αναγνώριση της καλλιέργειας ως Ralsto-
nia solanacearum .
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 14
▼B
∆ιάγραµµα ροής της διαδικασίας
Παραποµπές διαγράµµατος:
(1) Περιγραφή των συµπτωµάτων δίδεται στο µέρος II.1.
(2) Οι δοκιµές ταχειάς διαλογής διευκολύνουν την προκαταρκτική
διάγνωση.Κατάλληλες δοκιµές είναι:
—η δοκιµή εκκρίσεων του αγγειώδους ιστού του στελέχους
(µέρος ΙΙ.2),
—η δοκιµή για πολύ-β-υδροξυβουτυρικά κοκκία (µέρος ΙΙ.2),
—η δοκιµή IF(µέρος ΙΙΙ.2),
—η δοκιµή ELISA(µέρος III.3),
—η δοκιµή PCR(µέρος III.4).
(
3) Αν και η αποµόνωση του παθογόνου αιτίου µε τη διαδικασία
διαδοχικών αραιώσεων επί στερεού υποστρώµατος από ιστούςµε τυπικά συµπτώµατα είναι άµεση, η καλλιέργεια µπορεί νααποτύχει αν βρισκόµαστε σε προκεχωρηµένα στάδια µολύν-σεως. Σαπροφυτικά βακτήρια που αναπτύ σσονται σε προ-
σβεβληµένο ιστό µπορεί να επικαλύψουν ή να εµποδίσουν τηνανάπτυξη του παθογόνου στο υλικό αποµόνωσης. Εάν η δοκιµήαποµόνωσης είναι αρνητική, αλλά υπάρχουν τα τυπικά συµπτώ-µατα της ασθένειας, τότε η διαδικασία αποµόνωσης πρέπει ναεπαναληφθεί, κατά προτίµηση µε εκλεκτική αποµόνωση επίστερεού υποστρώµατος.
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 15
▼B
(4) Αξιόπιστη ταυτοποίηση µίας καθαρής καλλιέργειας Ralstonia
solanacearum επιτυγχάνεται µε µία τουλάχιστον από τις δοκιµές
που παρατίθενται στο µέρος ΙΙ.4.1 σε συνδυασµό µε µία δοκιµήπαθογένειας (µέρος ΙΙ.4.3). Ο π ροσδιορισµός του στελέχους
είναι προαιρετικός, συνιστάται όµως να γίνεται σε κάθε νέοπεριστατικό.
2.Ανίχνευση και ταυτοποίηση του Ralstonia solanacearum σε δείγ-
µατα κονδύλων πατάτας
Η διαδικασία αποσκοπεί στην ανίχνευση µολύνσεων σε λανθά-
νουσα µορφή σε κονδύλους πατάτας µε µία ή, κατά προτίµηση,περισσότερες δο κιµές διαλογής οι οποίες, εφ όσον είναι θετικές
επιβεβαιώνονται µε την αποµόνωση του παθογόνου οργανισµού,ακολουθεί δε, στην περίπτωση αποµόνωσης τυπικών αποικιών,ταυτοποίηση µιας καθαρής καλλιέργειας ως καλλιέργειας Ralsto-
nia solanacearum .
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 16
▼B
∆ιάγραµµα ροής της διαδικασίας
Παραποµπές διαγράµµατος:
(1)Μέγεθος δείγµατος
Το κανονικό µέγεθος δείγµατος είναι 200 κόνδυλοι. Η δοκιµα-σία όµως µπορεί να εφαρµοσθεί και για δείγµατα µικρότερα των200 κονδύλων.
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 17
▼B
(2)∆οκιµή(-ές) ανίχνευσης
Για την ανίχνευση της Ralstonia solanacearum µπορεί να µην
αρκεί από πλευράς ευαισθησίας ή αξιοπιστίας η πραγµατο-ποίηση µίας µόνον δοκιµής σε ένα δείγµα. Συνεπώς, συνιστάταινα πραγµατοποιούνται περι σσότερες από µία δο κιµές, οι οποίες
θα πρέπει να βασίζονται κατά προτίµηση σε διαφορετικές βιο-λογικές αρχές.
(
3)∆οκιµή ανοσοφθορισµού ( IF)
Η δοκιµή αν οσοφθορισµού είναι µία καλά καθιερωµένη δοκιµή
διαλογής. Το γεγονός αυτό συνιστά πλεονέκτηµα σε σχέση µεάλλες δοκιµές που δεν έχουν ακόµη αναπτυχθεί πλήρως ή δενέχει ακόµη επιβεβαιωθεί η εγκυρότητά τους. Η δοκιµή αυτήχρησιµοποιείται για πολλά άλλα καθορισµένα βακτήρια, όπωςτηνClavibacter michiganensis subsp .sepedonicus . Βάσει των καθο-
ρισµένων παραµέτρων ανάγνωσης της µεθόδου, αυτή είναι µίαευαίσθητη δοκιµή [όριο ευαισθησίας 103-104 κύτταρα ανά ml
εκχυλίσµατος ιζήµατος πατάτας].Η ποιότητα του αντι ορού αποτελεί κρίσιµο παράγοντα για την
αξιοπιστία των αποτελεσµάτων της δοκιµής. Αποδεκτοί είναιµόνον αντι οροί µε υψηλό τίτλο (κατ’ ελάχιστον 2 000 για τον
αρχικό αντι ορό), όλες δε οι δο κιµές πρέπει να πραγµατοποιού-
νται µε τον τίτλο του αντι ορού ή µία αραίωση κάτω του τίτλου.
Προτιµάται η έµµεση µέθοδος. Η άµεση µέθοδος µπορεί ναεφαρµοστεί εάν το επίπεδο ευαισθησίας και εξειδίκευσης τηςδοκιµής είναι ισοδύναµο µε εκείνο της έµµεσης µεθόδου.Η δοκιµή IFέχει το πλεονέκτηµα της υποκειµενικής ερµηνείας
της µορφολογίας χρώσεως των κυττάρων και της έντασης τουφθορισµού, χαρακτηριστικά που παρέχουν στοιχεία σχετικά µετην εξειδίκευση της αντίδρασης. Αποτελεί σύνηθες φαινόµενοη εµφάνιση µη ειδικής θετικής αντίδρασης ( cross-reaction) ορο-
λογικά σχετιζοµένων βακτηρίων, που προέρχονται από το έδα-φος ή σχετίζονται µε ιστούς πατάτας και έχουν µορφολογίακυττάρων εκείνη του Ralstonia solanacearum . Η δοκιµή IFµπορεί
να χρησιµοποιηθεί ως η αποκλειστική δοκιµή διαλογής, αν καισε περιπτώσεις υποψίας µη εκλεκτικών αντιδράσεων µπορεί ναγίνει µια επιπ ρόσθετη δο κιµή διαλογής που βασίζεται σε δια-
φορετική βιολογική αρχή. Σ’ αυτές τις περιπτώσεις η πιόκατάλληλη δοκιµή είναι η εκλεκτική αποµόνωση επί στερεούθρεπτικού υποστρώµατος.
(
4)Εκλεκτική αποµόνωση επί στερεού υποστρώµατος
Με το τροποποιηµένο υλικό SMSAκαι τη µεθοδολογία εξέ-
τασης που εξιδικεύεται σ’ αυτή τη µέθοδο, αυτή συνιστά µίαευαίσθητη και εκλεκτική δοκιµή για το Ralstonia solanacearum .
Το αποτέλεσµα λαµβάνεται 3-6 ηµέρες µετά την προετοιµασίατου δείγµατος. Το παθογόνο λαµβάνεται απ’ ευθείας στην καλ-λιέργεια και µπορεί να ταυτοποιηθεί εύκολα. Για την πλήρηεκµετάλλευση των δυνατοτήτων της, η δοκιµή απαιτεί να γίνε-ται προσε κτική προετοιµασία των τεµαχίων ιστού λαµβανο-
µένων από το σηµείο πρόσφυσης του στολονίου για την απο-φυγή δευτερογενών βακτηρίων σχετιζοµένων µε τους κονδύ-λους πατάτας που είναι ανταγωνιστές του Ralstonia solanacearum
στο θρεπτικό υπόστρωµα και µπ ορούν να επηρεάζουν την ανά-
πτυξη του παθογόνου µικ ροοργανισµού.
Ορισµένα βακτηριακά στελέχη µπορεί να αναπτυχθούν πολύλίγο καθώς τα συστατικά του υποστρώµατος µπορεί να επηρεά-σουν τον οργανισµό-στόχο. Χρειάζεται επίσης π ροσοχή ώστε
τοRalstonia solanacearum να διαφοροποιείται από τυχόν άλλα
βακτήρια που µπορεί να αναπτυχθούν στο θρεπτικό υπόστρωµα.Η εκλεκτική αποµόνωση µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως απο-κλειστική δοκιµή διαλογής µε την προϋπόθεση ότι σε περιπτώ-σεις που υπάρχει υποψία παρεµπόδισης της ανάπτυξης του Ral-
stonia solanacearum από άλλα βακτήρια επί των τρυβλίων, και
προκύπτει αρνητικό αποτέλεσµα, το δείγµα επανεξετάζεταιχρησιµοποιώντας διαφορετική δοκιµή για την επικύρωση ήαπόρριψη της διάγνωσης. Στις περιπτώσεις αυτές, η δοκιµή IF
είναι η καταλληλότερη.
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 18
▼B
(5)∆οκιµή ELISA
Η δοκιµη ELISAείναι εν γένει λιγότερο ευαίσθητη από τη
δοκιµή IF(όριο ευαισθησίας 104-105κύτταρα ανά mlεκχυλίσµα-
τος ιζήµατος πατάτας). Η δοκιµή είναι φθηνή και γρήγορη,είναι όµως εν γένει πιο επιρρεπής στην εµφάνιση εσφαλµένωνθετικών (µη ειδικών θετικών αντιδράσεων) αποτελεσµάτων καιεσφαλµένων αρνητικών (παρεµπόδιση από φαινολικά µόρια στοεκχύλισµα πατάτας) αποτελεσµάτων. Οι απαιτήσεις από πλευ-ράς εξειδίκευσης του αντι ορού είναι εξαιρετικά µεγάλες. Η
δοκιµή ELISAδεν µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως αποκλειστική
δοκιµή εξέτασης.
(
6)∆οκιµή PCR(αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης)
Η ανίχνευση µε PCRείναι πολύ ευαίσθητη. Αν και σε ένα
δείγµα είναι δυνατόν να ανιχνευθεί ακόµη και ένα µεµονωµένοµόριο DNA, η δοκιµή παρεµποδίζεται εύκολα από διάφορα
συστατικά του εκχυλίσµατος του φυτού ή του κονδύλου πουοδηγούν σε εσφαλµένο αρνητικό αποτέλεσµα. Ορισµένες καλ-λιεργούµενες ποικιλίες πατάτας περιέχουν περι σσότερους
παρεµποδιστές από άλλες. Χρειάζεται εποµένως οι παρεµποδι-στές αυτοί να αποµακρύνονται. Η παρεµπόδιση µπορεί να µει-ωθεί µε αραίωση αλλά έτσι αραιώνονται και οι πληθυσµοί τουRalstonia solanacearum . Ιδιαίτερη π ροσοχή πρέπει να δίνεται σε
όλα τα στάδια ετοιµασίας του δείγµατος και της δοκιµής για νααποκλείεται τυχόν µόλυνση που θα µπ ορούσε να ο δηγήσει σε
εσφαλµένα θετικά αποτελέσµατα. Γι’ αυτό η άµεση PCRδεν
µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως η αποκλειστική δοκιµή εξέ-τασης.
(
7)∆οκιµή εµπλουτισµού
Επωάζοντας δείγµατα εκχυλίσµατος ιζήµατος πατάτας σε έναηµιεκλεκτικό θρεπτικό ζωµό, όπως ο τροποποιηµένος SMSA,
µπορούµε να επιτύχουµε τον πολλαπλασιασµό του Ralstonia
solanacearum . Το σηµαντικότερο ίσως στην περίπτωση αυτή
είναι ότι έτσι αραιώνονται και οι εν δυνάµει παρεµποδιστές τηςδοκιµής ELISAήPCR. Έτσι, η Ralstonia solanacearum σε εµπ-
λουτισµένο ζωµό µπορεί να ανιχνευθεί µε τις µεθόδους IF,
ELISAκαι PCR. Συνιστούµε να µη γίνεται άµεση αποµόνωση
επί στερεού υποστρώµατος από τους εµπλουτισµένους ζωµούς.Οι µέθοδοι αυτές εµπλουτισµού δεν έχουν δοκιµαστεί επιστα-µένως. Περιλαµβάνονται στο παρόν γιατί έχουν καλές π ροοπτι-
κές. Εντούτοις, λόγω της σχετικής έλλειψης εµπειριών, δενµπορούν να χρησιµοπο ιηθούν ως αποκλειστικές µέθοδοι ανιχ-
νεύσεως.
(
8)Βιοδοκιµή
Η βιοδοκιµή χρησιµοποιείται για την αποµόνωση του Ralstonia
solanacearum από ιζήµατα εκχυλισµάτων πατάτας κατόπιν εκλε-
κτικού εµπλουτισµού σε ένα φυτό ξενιστή και µπορεί να γίνεισε φυτά τοµάτας ή µελιτζάνας. Η δοκιµή απαιτεί άριστεςσυνθήκες επωάσεως όπως καθορίζονται στη µέθοδο αυτή, κατάπάσα πιθανότητα, τυχόν βακτήρια που δρουν παρεµποδιστικάέναντι του Ralstonia solanacearum σεSMSAδεν δρουν παρεµβα-
τικά στη δοκιµή αυτή.
(
9)∆οκιµή(-ές) επιβεβαίωσης
Αξιόπιστη ταυτοποίηση καθαρής καλλιέργειας Ralstonia solana -
cearumεπιτυγχάνεται µε µία τουλάχιστον από τις δοκιµές που
παρατίθενται στο µέρος ΙΙ.4.1 σε συνδυασµό µε µία δοκιµήπαθογένειας (µέρος ΙΙ.4.3). Ο χαρακτηρισµός του στελέχουςείναι προαιρετικός, αλλά συστήνεται για κάθε νέα περίπτωση.
ΤΜΗΜΑ ΙΙ
∆ΙΑΓΝΩΣΗ ΤΗΣ ΚΑΣΤΑΝΗΣΣΗΨΗΣ ΣΕ ΚΟΝ∆ΥΛΟΥΣΠΑΤΑΤΑΣ
ΚΑΙ ΤΗΣ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗΣ ΜΑΡΑΝΣΗΣ ΣΕ ΦΥΤΑ ΠΑΤΑΤΑΣ ΚΑΙ
ΤΟΜΑΤΑΣ
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 19
▼B
1.Συµπτώµατα
1.1. Συµπτώµατα στην πατάτα
Στο φυτό της πατάτας στο αρχικό στάδιο της ασθένειας εµφανίζε-
ται µαρασµός των φύλλων προς την κορυφή του φυτού σε υψηλέςθερµοκρασίες κατά τη διάρκεια της ηµέρας µε ανάληψη κατά τηδιάρκεια της νύχτας. Σύντοµα ο µαρασµός καθίσταται µη ανα-στρέψιµος και οδηγεί στο θάνατο του φυτού. Ο αγγειώδης ιστόςσε εγκαρσίως κοµµένα στελέχη από µαραµένα φυτά µπορεί ναγίνει καστανός, από δε την κοµµένη επιφάνεια εκρέει, ή µπορείνα εξέλθει εύκολα συµπιέζοντάς την, ένα γαλακτώδες εξίδρωµα.Όταν ένα κοµµένο στέλεχος τοποθετηθεί κατακόρυφα µέσα σενερό, από τις αγγειώδεις δέσµες εκρέουν κλωστές γλοιώδουςυγρού.
Στον κόνδυλο της πατάτας οι κόνδυλοι πρέπει να κ όβονται
εγκαρσίως κοντά στο σηµείο πρόσφυσης του στολονίου. Στοαρχικό στάδιο της ασθένειας εµφανίζεται ένας υαλώδους όψεως,κίτρινος προς ανοικτό καστανό, µεταχρωµατισµός του αγγειώ-δους δακτυλίου από τον οποίο εκρέει αυθόρµητα µετά λίγα λεπτάή µετά από ελαφρά πίεση µε τους αντίχειρες στο φλοιό κοντάστην κοµµένη επιφάνεια, ένα υπόλευκο εξίδρωµα. Αργότερα, οαγγειακός µεταχρωµατισµός καθίσταται εντονότερα καστανός καιη νέκρωση µπορεί να επεκταθεί στον παρεγχυµατώδη ιστό. Σεπροκεχωρηµένα στάδια της ασθένειας, η µόλυνση εκδηλώνεταιεξωτερικά από το σηµείο πρόσφυσης του στολονίου και τουςοφθαλµούς και εµφανίζονται στην επιδερµίδα ερυθροκάστανες,ελαφρώς βαθουλωµένες κηλίδες από τις οποίες µπορεί να εκρέειβακτηριακό εξίδρωµα προκαλώντας την π ροσκόλληση σωµατι-
δίων του εδάφους.
1.2. Συµπτώµατα στην τοµάτα
Στο φυτό της τοµάτας: Το πρώτο ορατό σύµπτωµα είναι η
έλλειψη σπαργής στα νεαρά φύλλα. Υπό περιβαλλοντικές συνθή-κες που είναι ευνοϊκές για το παθογόνο (θερµοκρασία εδάφους25°C, ατµόσφαιρα κορεσµένη σε υγρασία), µέσα σε λίγες µέρες
εµφανίζεται επιναστία και µαρασµός της µιας πλευράς ή καιολόκληρου του φυτού, στη συνέχεια δε πλήρης κατάρρευση τουφυτού. Υπό λιγότερο ευνοϊκές συνθήκες (θερµοκρασία εδάφουςκάτω των 21 °C), αναπτύσσεται µεγάλος αριθµός τυχαίων ριζών
επί του στελέχους. Ενίοτε, κατά µήκος του στελέχους, εµφανίζε-ται λιπαρό νήµα που αποτελεί ένδειξη της νέκρωσης του αγγεια-κού συστήµατος. Σε εγκάριες τοµές του στελέχους, από τουςκαστανόχρωµα µεταχρωµατισµένους αγγειακούς ιστούς εκρέουνσταγόνες λευκού ή υποκίτρινου βακτηριακού εξιδρώµατος.
2.∆οκιµές ταχείας διαλογής
Οι δοκιµές ταχείας διαλογής διευκολύνουν την προκαταρκτική
διάγνωση. Μπορεί να χρησιµοποιηθεί µία ή περι σσότερες από τις
ακόλουθες δοκιµές:
∆οκιµή εκκρίσεων από το στέλεχος
Η παρουσία Ralstonia solanacearum σε µαραµένα στελέχη πατάτας
µπορεί να εκτιµηθεί µε την ακόλουθη απλή προκαταρκτικήδοκιµή:
Κόβουµε το στέλεχος πάνω ακριβώς από το έδαφος. Τοποθετούµε
την κοµµένη επιφάνεια σε ποτήρι ζέσεως µε νερό. Λίγο µετά, απότις αγγειώδεις δέσµες αρχίζει να τρέχει αυθόρµητα µε µορφήκλωστών ένα βακτηριακό γλοιώδες έκκριµα. Κανένα από ταβακτήρια που προκαλούν αδ ροβακτηρίωση σε φυτά της πατάτας,
δεν εµφανίζει το φαινόµενο αυτό.
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 20
▼B
Ανίχνευση πολυ-β-υδροξυβουτυρικών ( PHB) κοκκίων
Τα κοκκία PHBστα κύτταρα του Ralstonia solanacearum καθίστα-
νται ορατά διά χρώσεως µε Nile Blue A ήµ ε Sudan Black B .
Παρασκευάζουµε επίχρισµα του εξιδρώµατος ή του αιωρήµατος
του ιστού σε αντικειµενοφόρο πλάκα µικ ροσκοπίου ή ε πίχρισµα
48ωρης καλλιέργειας σε YPGAήSPA(προσάρτηµα 1). Παρα-
σκευάζουµε επίσης επιχρίσµατα στελέχους βιοποικιλίας 2, φυλής3, ως θετικούς µάρτυρες, και αν θεωρηθεί χρήσιµο ένα επίχρισµαετερολόγου στελέχους, ως αρνητικό µάρτυρα.
Αφήνουµε να ξηρανθούν. Περνάµε µερικές φορές γρήγορα την
κάτω πλευρά της αντικειµενοφ όρουπλάκας µέσα από φλόγα µέχρι
να προσηλωθεί το επίχρισµα.
∆οκιµή Nile Blue
1. Περιλούζουµε το προσηλωµένο επίχρισµα µε 1 % υδατικό διά-
λυµα Nile Blue A και το αφήνουµε για επώαση επί 10 λεπτά
στους 55 °C.
2. Αποστραγγίζουµε το διάλυµα χρώσεως, πλένουµε την πλάκα
για λίγο π ροσεκτικά µε ρέον νερό της βρύσης και αποµακρύ-
νουµε την περίσσεια του νερού µε απορρο φητικό χαρτί.
3. Περιλούζουµε το επίχρισµα µε 8 % υδατικό διάλυµα οξικού
οξέος και το αφήνουµε για επώαση επί 1 λεπτό σε θερµοκρασίαεργαστηρίου.
4. Ξεπλένουµε ελαφρά µε ρέον νερό της βρύσης και το στεγνώ-
νουµε µε απορρο φητικό χαρτί.
5. Ξεπλένουµε ελαφρά µε ρέον νερό της βρύσης και το στεγνώ-
νουµε µε απορρο φητικό χαρτί.
6. Εξετάζουµε το χρωσµένο επίχρισµα µε µικ ροσκόπιο ε πιφθορι-
σµού στα 450 nmµε ελαιοκαταδυτικό φακό σε µεγέθυνση
1 000 ×.
Εφόσον υπάρχουν κοκκία PHBαυτά φθορίζουν µε λαµπρό πορ-
τοκαλί χρώµα. Τα κοκκία παρατηρούνται επίσης και σε κανο-νικό φως για να ελεγχθεί αν είναι ενδοκυτταρικά και αν ηκυτταρική µορφολογία είναι η τυπική µορφολογία του Ralstonia
solanacearum .
∆οκιµή Sudan Black
1. Περιλούζουµε το προσηλωµένο επίχρισµα µε διάλυµα 0,3 %
Sudan Black B σε 70 % αιθανόλη και το αφήνουµε για επώαση
επί 10 λεπτά σε θερµοκρασία εργαστηρίου.
2. Αποστραγγίζουµε το διάλυµα χρώσεως, ξεπλένουµε για λίγο µε
νερό της βρύσης και αποµακρύνουµε την περίσσεια του νερούµε απορρο φητικό χαρτί.
3. Βυθίζουµε το επίχρισµα για µικρό χρονικό διάστηµα σε ξυλόλη
και το στεγνώνουµε µε απορρο φητικό χαρτί.
Προσοχή! Η ξυλόλη είναι επιβλαβής, γι’ αυτό πρέπει να εργαζό-
µαστε σε απαγωγό εστία.
4. Περιλούζουµε το επίχρισµα µε 0,5 % (β/ο) υδατικό διάλυµα
σαφρανίνης και το αφήνουµε για 10 δευτερόλεπτα σε θερµο-κρασία εργαστηρίου.
Προσοχή! Η σαφρανίνη είναι επιβλαβής, γι’ αυτό πρέπει να
εργαζόµαστε σε απαγωγό εστία.
5. Ξεπλένουµε ήπια µε ρέον νερό της βρύσης, στεγνώνουµε µε
απορροφητικό χαρτί και τοποθετούµε µία καλυπτρίδα.
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 21
▼B
6. Εξετάζουµε το χρωσµένο επίχρισµα σε φωτοµικ ροσκόπιο µε
ελαιοκαταδυτικό φακό και µε κλίµακα µεγέθυνσης 1 000 ×.
Τα κοκκία PHBστα κύτταρα της Ralstonia solanacearum εµφανί-
ζονται χρωσµένα µπλε-µαύρα. Το κυτταρικό τοίχωµα εµφανίζε-ται µε ροζ χρώση.
Άλλες δοκιµές
Άλλες κατάλληλες δοκιµές διαλογής είναι η δοκιµή IF(µέρος
ΙΙΙ.2) η δοκιµή ELISA(µέρος ΙΙΙ.3) και η δοκιµή PCR(µέρος ΙΙΙ.4).
3.∆ιαδικασία αποµόνωσης
3.1. Λαµβάνεται εξίδρωµα ή τµήµατα µεταχρωµατισµένου ιστού από
τον αγγειώδη δακτύλιο του κονδύλου πατάτας ή τις αγγειώδειςδέσµες του στελέχους πατάτας ή τοµάτας. Παρασκευόζεταιαιώρηµα των ανωτέρω σε µικρό όγκο αποστειρωµένου απεσταγµέ-ν ο υν ε ρ ο ύήσ ε5 0 mMφωσφορικού ρυθµιστικού διαλύµατος. Το
αιώρηµα αφήνεται για 5-10 λεπτά πάνω στον πάγκο.
3.2. Παρασκευάζονται σειρές δεκαπλών αραιώσεων του αιωρήµατος
π.χ. 1/10 και 1/100 ή περι σσότερες αν θεωρηθεί απαραίτητο.
3.3. Συγκεκριµένη π οσότητα του αιωρήµατος και τωναραιώσεων µετα-
φέρεται σε γενικής χρήσης θρεπτικό υπόστρωµα ( NA,YPGAκαι
SPA, προσάρτηµα 1) ή/και σε υπόστρωµα του Kelmanµεtetrazolium
(προσάρτηµα 1) ή/και σε εκλεκτικό υπόστρωµα SMSA(προ-
σάρτηµα 7) και απλώνεται ή εξαπλώνεται γραµµωτά µε κατάλληλητεχνική αραιώσεως επί του υποστρώµατος. Αν θεωρηθεί χρήσιµο,προετοιµάζονται ξεχωριστά τρυβλία από κάθε υπόστρωµα µεαραιωµένο αιώρηµα καλλιέργειας παθογόνου στελέχους Ralstonia
solanacearum βιοποικιλίας 2, φυλής 3 που χρησιµοποιείται ως θετι-
κός µάρτυρας.
3.4. Τα τρυβλία επωάζονται 3 ηµέρες στους 28 °C. Η επώαση µπορεί
να παραταθεί στις 6 ηµέρες, αν η ανάπτυξη είναι αργή, αλλά οιαποικίες επί SMSAσυχνά γίνονται µη τυπικές και νεκρώνονται.
Στα γενικής χρήσεως θρεπτικά υποστρώµατα οι παθογόνες απο-
µονώσεις Ralstonia solanacearum αναπτύσσουν µαργαριτώδους
χροιάς λευκές, επίπεδες, ακανόνιστες και ρευστώδεις αποικίεςπου εµφανίζουν συχνά χαρακτηριστικές σπείρες.
Σε υπόστρωµα Kelmanµεtetrazolium , τυπικές αποικίες παθογόνων
αποµονώσεων του Ralstonia solanacearum είναι κρεµώδεις, επίπε-
δες, µε ακανόνιστο περιθώριο και υδαρείς µε αιµατέρυθρες ελικώ-σεις στο κέντρο. Μη παθογόνες αποµονώσεις του Ralstonia solana -
cearumαναπτύσσουν βο υτυρώδεις έντονα ερυθρές αποικίες.
Στο SMSA, τυπικές αποικίες παθογόνων αποµονώσεων του Ralsto-
nia solanacearum αναπτύσσουνγαλακτώδους χροιάς λευκές, επίπε-
δες, ακανόνιστες στο περιθώριο και ρευστώδεις αποικίες µε αιµα-τέρυθρα κέντρα.
Οι µη παθογόνες µορφές Ralstonia solanacearum αναπτύσσουνλιγό-
τερο ρευστώδες αποικίεις, οι οποίες στο SMSAεµφανίζονται
τελείως ροζ προς ερυθρές.
3.5. Οι αποικίες µε χαρακτηριστική µορφολογία καθαρίζονται µε εκ
νέου καλλιέργεια σε γενικής χρήσεως θρεπτικό υπόστρωµα. Πρέ-πει να αποφεύγονται επανειληµµένες εκ νέου καλλιέργειες γιατίαυτό µπορεί να οδηγήσει σε µείωση της παθογένειας.
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 22
▼B
4.∆οκιµη(-ές) επιβεβαίωσης
4.1.Ταυτοποίηση του Ralstonia solanacearum
Η ταυτοποίηση καθαρών καλλιεργειών του Ralstonia solanacearum
γίνεται µε µία από τις ακόλουθες διαδικασίες:
Θρεπτικές και ενζυµατικές δοκιµές
Σηµείωση: Να περιλαµβάνονται κατάλληλα στελέχη ωςµάρτυρες
σε κάθε δοκιµή.
ΗRalstonia solanacearum παρουσιάζει ή όχι εν γένει τις ακό-
λουθες φαινοτυπικές ιδιότες:
Φθορίζουσα χρωστική −
Έγκλειστα PHB +
∆οκιµή οξείδωσης /ζύµωσης (O/F) O +/F −
Καταλάση +
Οξειδάση Kovac’s +
Αναγωγήνιτρικών +
Χρησιµοποίηση κιτρικών +
Ανάπτυξη σε 40°C −
Ανάπτυξη σε 1 % NaCl +
Ανάπτυξη σε 2 % NaCl −
∆ιυδρολάση αργινίνης −
Ρευστοποίηση ζελατίνης −
Υδρόλυση αµύλου −
Υδρόλυση αισκουλίνης −
Παραγωγή levan −
Υλικά και µέθοδοι παρέχονται στην εργασία των Lelliott & Stead
(1987).
∆οκιµή IF
Παρασκευάζουµε αιώρηµα 106κυττάρων ανά mlαπό την καλλιέρ-
γεια και ένα θετικό µάρτυρα. Παρασκευάζουµε επίσης µία σειράαραιώσεων του αντι ορού στο διπλάσιο. Εφαρµόζουµε τη διαδικα-
σίαIF(µέρος ΙΙΙ.2). Ο τίτλος IFτης καλλιέργειας πρέπει να είναι
ισοδύναµος µε εκείνον του θετικού µάρτυρα.
∆οκιµή ELISA
Παρασκευάζουµε αιώρηµα >10
6κυττάρων ανά mlαπό την καλ-
λιέργεια και ένα θετικό µάρτυρα. Εφαρµόζουµε τη διαδικασίαELISA(µέρος III) Ο τίτλος ELISAτης καλλιέργειας πρέπει να
είναι ισοδύναµος µε εκείνον του θετικού µάρτυρα.
∆οκιµή PCR
Παρασκευάζουµε αιώρηµα 10
6κυττάρων ανά mlαπό την καλλιέρ-
γεια και ένα θετικό µάρτυρα. Εφαρµόζουµε τη διαδικασία PCR
(µέρος III.4). Το προϊόν PCRτης καλλιέργειας πρέπει να έχει το
ίδιο µέγεθος και µορφή REAµε εκείνα του θετικού µάρτυρα.
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 23
▼B
Βιοποικιλία
1 2 3 4 5Φθορίζων in situ υβριδισµός ( FISH)
Παρασκευάζουµε αιώρηµα 106κυττάρων mlαπό την καλλιέργεια
και ένα θετικό µάρτυρα. Εφαρµόζουµε τη διαδικασία FISH(van
Beuningen ετ αλ., 1995) χρησιµοποιώντας τον εκκινητή ( primer)
PCR OLI -1 (Seal et al ., 1993). Η καλλιέργεια πρέπει να εµφανίζει
την ίδια αντίδραση µε το θετικό µάρτυρα.
Προφίλ πρωτεϊνών
Οι µετουσιωµένες ολοκυτταρικές πρωτεΐνες διαχωρίζονται µε
ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµίδιου — PAGE (Stead,
1992 a).
Προφίλ σε λιπαρά οξέα ( FAP)
Αναπτύσσουµε την καλλιέργεια και ένα στέλεχος θετικού µάρ-
τυρα για 48 ώρες στους 28 °Cσεtrypticase soy agar και εφαρµό-
ζουµε τη διαδικασία FAP(Janse, 1991, Stead, 1992 a,Stead, 1992 b).
Το προφίλ λιπαρών οξέων της καλλιέργειας πρέπει να είναι ίδιοµε εκείνο του θετικού µάρτυρα. Στις καθορισµένες συνθήκες, ταχαρακτηριστικά λιπαρά οξέα είναι 14:0 3 OH, 16:0 2 OH, 16:1 2 OH
και 18:1 2 OH.
4.2.Χαρακτηρισµός στελέχους
Ο χαρακτηρισµός του στελέχους είναι προαιρετικός αλλά συστή-
νεται για κάθε νέα περίπτωση, χρησιµοποιώντας τουλάχιστον µίααπό τις ακόλουθες διαδικασίες:
Χαρακτηρισµός βιοποικιλίας
ΗRalstonia solanacearum διαχωρίζεται σε βιοποικιλίες βάσει της
ικανότητάς της να παράγει οξύ από τρεις εξοζοαλκοόλες και τρίασάκχαρα ( Hayward, 1964 & 1994).
Χρήση :
—µαλτόζης
− + + − +
—λακτόζης − + + − +
—κελλοβιόζης − + + − +
—µαννιτόλης − − + + +
—σορβιτόλης − − + + −
—δουλκιτόλης − − + + −
Με πρόσθετες δο κιµές, η βιοποικιλία 2 µπορεί να διαφ οροποι-
ηθεί σε υποφαινοτύπους ( Hayward, 1994):
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 24
▼B
Βιοποικιλία 2 Βιοποικιλία 2-Α Βιοποικιλία 2-Τ
Φυλή (*)
1 2 3Χρήση τρεαλόζης − + +
Χρήση ινοσιτόλης + − +
Χρήση D-ριβόζης − − +
Πηκτινολυτική δράση µικρή µικρή µεγάλη
Προσδιορισµός φυλής
Η φυλή ( Buddenhagen et al., 1962) µπορεί να π ροσδιορισθεί µε
βάση µία δοκιµή παθογένειας σε φυτά τοµάτας ή µελιτζάνας καισε φυτά καπνού και µε µία αντίδραση υπερευαισθησίας ( HR)σ ε
φύλλα καπνού ( Lozanoκαι Sequeira, 1970):
Αντίδραση σε :—φυτά τοµάτας /µελιτζά -
νας µαρασµός µη αντί -
δρασηµαρασµός
—φυτά καπνού µαρασµός µη αντί -
δρασηµη αντί -
δραση
—φύλλα καπνού νέκρωση
(48ώρες )
και µαρα -
σµός (7-8
ηµ.)ΗΡ(12-24
ώρες )χλώρωση
(2-8ηµέ-
ρες)
(*)Η φυλή 4(παθογόνος στο gingerκαι µερικούς άλλους ξενιστές )και η φυλή 5(παθογόνος στη
µουριά µόνο )δεν περιλαµβάνονται .
Ο χαρακτηρισµός της φυλής µε τις δοκιµές παθογένειας ή υπε -
ρευαισθησίας σε καπνό ,δεν είναι ίσως πολύ αξιόπιστος και αντ ’
αυτών µπορεί να προκύψει από τη βιοποικιλία και το φυσικόξενιστή προέλευσης .
Το γενωµικό αποτύπωµα
Η µοριακή διαφ οροποίηση των στελεχών στο σ ύµπλοκο Ralstonia
solanacearum µπορεί να γίνει µε :
Ανάλυση RFLP (Cook et al., 1989)
Επαναληπτική αλληλουχία PCR[REP-,ERIC-&BOX-PCR(Louws
et al., 1995· Smithet al., 1995)].
4.3.∆οκιµή παθογένειας
Η δοκιµή αυτή αποσκοπεί στην επιβεβαίωση της διάγνωσης του
Ralstonia solanacearum και την εκτίµηση της παθογένειας τωνκαλ-
λιεργειών που ταυτοποιούνται ως Ralstonia solanacearum .
Παρασκευάζουµε µόλυσµα µε 10
6κύτταρα ανά mlαπό την καλ-
λιέργεια και ένα θετικό στέλεχος µάρτυρα. Μολύνουµε 5-10 φυτάτοµάτας ή µελιτζάνας στο τρίτο κατά προτίµηση πραγµατικό στά-διο φυλλοφορίας (µέρος ΙΙΙ.6). Αφήνουµε για επώαση µέχρι 2εβδοµάδες σε θερµοκρασία 22-28 °Cκαι υψηλή σχετική υγρασία
µε καθηµερινό πότισµα. Παρατηρούµε αν εµφανίζονται συµπτώ-µατα µαρασµού ή/και επιναστία, χλώρωση ή νανισµός.
Αποµονώνουµε από φυτά που παρουσιάζουν συµπτώµατα, ως ακο-
λούθως:
—αφαιρούµε ένα µέρος ιστού από το στέλεχος, 2 cmπάνω από
το σηµείο µόλυνσης,
—τεµαχίζουµε τους ιστούς και παρασκευάζουµε αιώρηµα σε ένα
µικρό όγκο αποστειρωµένου, αποσταγµένου νερού ή σε50mMφωσφορικού ρυθµιστικού διαλύµατος. Ακολούθως γίνε-
ται εξάπλωση επί στερεού θρεπτικού υποστρώµατος, επώαση
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 25
▼B
και έλεγχος παρουσίας τυπικών αποικιών του Ralstonia solana -
cearum.
ΜΕΡΟΣ ΙΙΙ
ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ RALSTONIA SOLANACEARUM
ΣΕ ∆ΕΙΓΜΑΤΑ ΚΟΝ∆ΥΛΩΝΠΑΤΑΤΑΣ
Σηµείωση: Το κανονικό µέγεθος δείγµατος είναι 200 κόνδυλοι. Η δοκιµα-
σία όµως µπορεί να εφαρµοσθεί και για δείγµατα µικρότερατων 200 κονδύλων.
1.Προετοιµασία του δείγµατος για δοκιµή
Σηµείωση: Το εκχυλισµένο ίζηµα πατάτας που λαµβάνεται µε τη
διαδικασία αυτή µπορεί να χρησιµοποιηθεί και για τηνανίχνευση της Clavibacter michiganensis subsp .sepedoni-
cus.
Εφόσον κριθεί σκό πιµο, µπ ορούν να γίνουν και οι εξής προκαταρ-
κτικές εργασίες:
i) το δείγµα επωάζεται στους 25-30 °Cγια διάστηµα µέχρι 2 εβδο-
µάδες για την ενθάρρυνση πολλαπλασιασµού τυχόν χαµηλώνπληθυσµών Ralstonia solanacearum
ii) οι κόνδυλοι πλένονται κάτω από ρέον νερό της βρύσης µε
κατάλληλα απολυµαντικά και απ ορρυπαντικά. Οι κόνδυλοι
στεγνώνουν στον αέρα.
1.1. Με ένα καθαρό και απολυµασµένο νυστέρι ή ειδικό µαχαίρι λαχα-
νικών, αφαιρείται η επιδερµίδα γύρω από το σηµείο π ρόσφυσης
του στολονίου του κονδύλου έτσι ώστε να φανούν πρώτα οιαγγειώδεις ιστοί. Αποκόπτουµε µε π ροσοχή ένα µικρό κώνο (διά-
µετρος 3-5 mm) αγγειώδους ιστού από το σηµείο π ρόσφυσης του
στολονίου κάθε κονδύλου. Π ροσοχή ώστε η αφαιρούµενη
ποσότητα µη αγγειώδους ιστού να είναι η ελάχιστη δυνατή. Συνέ-χιση της διαδικασίας για κάθε κόνδυλο του δείγµατος.
Σηµείωση: Στο στάδιο αυτό οι κόνδυλοι µπ ορούν να εξεταστούν
µακροσκο πικά (µέρος ΙΙ.1). Κάθε κόνδυλος µε συµπτώ-
µατα ή έντονη σήψη αφήνεται παράµερα και εξετάζεταιχωριστά (µέρος ΙΙ).
1.2. Οι κώνοι ιστών συλλέγονται µέσα σε ένα κλειστό δοχείο. Κατά
προτίµηση, οι κώνοι από τα σηµεία π ρόσφυσης του στολονίου
πρέπει να υποβάλλονται σε κατεργασία αµέσως. Εάν αυτό δενείναι δυνατόν, αποθηκεύονται για χρονικό διάστηµα όχι µεγαλύ-τερο από 24 ώρες, ή στους 4 °Cγια χρονικό διάστηµα µεγαλύτερο
από 72 ώρες.
1.3. Οι κώνοι από τα σηµεία π ρόσφυσης του στολονίου υποβάλλονται
σε κατεργασία µε µία από τις ακόλουθες διαδικασίες:
i) Οι κώνοι µεταφέρονται σε κατάλληλο δοχείο.
Προστίθεται ικανή π οσότητα ρυθµιστικού διαλύµατος δια-
βροχής (προσάρ τηµα 2) ώστε να καλυφθούν οι κώνοι.
Οι κώνοι θρυµατίζονται σε ένα Waring-Blender(µίξερ) ή µε
Ultra Thurrax µέχρι πλήρους οµοιογενοποιήσεως. Πρέπει να
αποφεύγεται η υπερβολική οµοιογενοποίηση.
Αφήνουµε το προϊόν να διαβραχεί για 15-30 λεπτά.
ii) Οι κώνοι µεταφέρονται σε κατάλληλο δοχείο.
Προστίθεται ικανή π οσότητα ρυθµιστικού διαλύµατος δια-
βροχής ώστε να καλυφθούν οι κώνοι.
Το δοχείο τοποθετείται σε περιστροφικό αναδευτήρα.Το περιεχόµενο αφήνεται να επωαστεί σε 50-100 rpmγια 4
ώρες στους 20-22 °Cή για 16-24 ώρες στους 4 °C.
iii) Οι κώνοι µεταφέρονται σε ένα ανθεκτικό σάκο δια βροχής µίας
χρήσης (π.χ. σάκκο Stomacher µε διαστάσεις 105 mm ×150mm,
αποστειρωµένο µε ακτιν οβολία).
Οι κώνοι συνθλίβονται π ροσεκτικά µε ένα κατάλληλο εργα-
λείο, π.χ. σφυρί, µέχρι πλήρους οµοιογενοποιήσεως.
Προστίθεται ικανή π οσότητα ρυθµιστικού διαλύµατος δια-
βροχής για την επικάλυψη των συνθλιµµένων κώνων και το
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 26
▼B
υγρό διαβροχής αφήνεται να κατακαθίσει για 15-30 λεπτά της
ώρας.
1.4. Τα βακτήρια εξάγονται από τους κατεργασµένους κώνους µε µία
από τις ακόλουθες διαδικασίες:
i) Το υγρό διαβροχής µεταγγίζεται απαλά µέσα σε σωλήνα φυγο-
κέντρησης αφήνοντας τυχόν υπολείµµατα ιστού µέσα στοδοχείο ή τον σάκο. Εφόσον το µε ταγγιζόµενο υγρό δια βροχής
εµφανίζεται θολό φυγοκεντρείται µε ταχύτητα όχι µεγαλύτερηαπό 180 xgγια 10 λεπτά σε θερµοκρασία κάτω από τους 10 °C.
Το µεταγγισθέν υγρό δια βροχής ή το υπερκείµενο υγρό από το
πρώτο στάδιο φυγοκέντρησης φυγοκεντρείται µε ταχύτητα7000 xgγια 15 λεπτά ή µε ταχύτητα 10 000 xgγια 10 λεπτά σε
θερµοκρασία µικρότερη από τους 10 °C.
Το υπερκείµενο υγρό απορρίπτεται π ροσέχοντας να µη διατα-
ραχθεί το ίζηµα.
ii) Το υγρό διαβροχής διηθείται µέσω φίλτρου µε µέγεθος πόρων
40-100 µ m. Η διήθηση ενισχύεται µε αντλία κενού.
Το διήθηµα συλλέγεται σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης.Το φίλτρο πλένεται µε ρυθµιστικό διάλυµα δια βροχής.
Το διήθηµα φυγοκεντρείται µε ταχύτητα 7000 xgγια 15 λεπτά
ή µε ταχύτητα 10 000 xgγια λεπτά σε θερµοκρασία µικρότερη
από τους 10 °C.
Το υπερκείµενο υγρό απορρίπτεται π ροσέχοντας να µη διατα-
ραχθεί το ίζηµα.
1.5. Το ίζηµα αναδιαλύεται σε 1 mlρυθµιστικού διαλύµατος του ιζήµα-
τος (προσάρ τηµα 2).
Το αιώρηµα διαιρείται σε δύο ίσα µέρη και κάθε µέρος µεταφέρε-
ται σε ένα µικροφιαλίδιο.
Το ένα µικροφιαλίδιο χρησιµοποιείται για τη δοκιµή. Το υπό-
λοιπο από το εκχύλισµα αυτό διατηρείται κατά τη διάρκεια τηςδοκιµής στους 4 °C.
Στο άλλο µικροφιαλίδιο π ροστίθεται αποστειρωµένη γλυκερίνη
σε τελική συγκέντρωση 10-25 % ( V/V). Ανακατεύεται µε στ ροβιλι-
σµό ( vortex). Αποθηκεύεται στους −18°C(εβδοµάδες) ή στους
−70°C(µήνες).
2.∆οκιµή ανοσοφθορισµού ( IF)
Χρησιµοποιείται αντι ορός για Ralstonia solanacearum , κατά προ-
τίµηση για φυλή 3, βιοποικιλία 2. Ο τ íτλος προσδιορίζεται σε
αιώρηµα 10
6κυττάρων ανά mlαπό το οµόλογο στέλεχος Pseudomo -
nas solanacearum µε κατάλληλη αραίωση συµπλόκου ισοθειοκυα-
νικής φθορεϊσίνης ( FITC), σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατα-
σκευαστή. Ο πρωτογενής αντι ορός πρέπει να έχει τίτλο IFτουλά-
χιστον 1: 2 000.
Χρησιµοποιούνται πολυφατνιακές αντικειµενοφ όροιπλάκες
µικροσκοπίου µε 10 κατά προτίµηση φατνία διαµέτρου τουλάχι-
στον 6 mm.
Σε κάθε αντικειµενοφόρο περιλαµβάνεται µάρτυρας συµπλόκου
FITC. Αν τυχόν στο µάρτυρα FITCπαρατηρηθούν θετικά κύτταρα
η δοκιµή θα πρέπει να επαναλαµβάνεται συµπεριλαµβάνοντας καιτο µάρτυρα PBS.
Παρασκευάζονται ξεχωριστά ως θετικοί µάρτυρες αντικειµενοφό-
ροι µε αιώρηµα 10
6κυττάρων ανά mlαπό στέλεχος Pseudomonas
solanacearum κατάλληλης φυλής/βιοποικιλίας (π.χ. φυλής 3, βιο-
ποικιλίας 2). Σε κάθε σειρά δοκιµών χρησιµοποιείται µία αντικει-µενοφόρος.
2.1. Οι προς δοκιµή αντικειµενοφ όροι ετο ιµάζονται µε µία από τις
ακόλουθες διαδικασίες:
i) Σε περίπτωση ιζηµάτων µε µικρή σχετικά π οσότητα αµύλου:
Σε µία σειρά φατνίων, φέρεται µετρηµένος µε σιφώνιο συγκε-
κριµένος όγκος (15 µlείναι αρκετός για φατνία µε διάµετρο
6mm —ο όγκος κλιµακώνεται προς τα άνω για µεγαλύτερα
φατνία) του αιωρήµατος του ιζήµατος. Η άλλη σειρά µπορεί ναχρησιµοποιηθεί ως δείγµα εις διπλούν ή για ένα δεύτεροδείγµα όπως φαίνεται στην εικόνα 1.
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 27
▼B
FITC T/4 T/2 T 2T = >Αραιώ -
σειςαντιορού
FITC Μη αραιωµένο
Καθορισ -
µένη
αραίωση
αντιορούΜη
αραιω -
µένο1/10 1/100 1/1 000 = >∆εκαδική
αραίωσηιζήµατοςii) Σε περίπτωση άλλων ιζηµάτων:
Παρασκευάζονται δεκαπλές αραιώσεις, δηλαδή 1/10, 1/100 και
1/1 000 του αιωρήµατος του ιζήµατος σε ρυθµιστικό διάλυµαιζήµατος. Σε µία σειρά φατνίων, φέρεται µετρηµένος µε σιφώ-νιο συγκεκριµένος όγκος (15 µlείναι αρκετός για φατνία µε
διάµετρο 6 mm —ο όγκος κλιµακώνεται προς τα άνω για µεγα-
λύτερα φατνία) του αιωρήµατος του ιζήµατος από κάθεαραίωση. Η άλλη σειρά µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως δείγµαεις διπλούν ή για ένα δεύτερο δείγµα όπως φαίνεται στηνεικόνα 2.
2.2. Το περιεχόµενο των φατνίων αφήνεται να ξηρανθεί. Τα βακτη-
ριακά κύτταρα στην αντικειµενοφόρο π ροσηλώνονται µε θέρ-
µανση, µε φλόγα ή µε 95 % αιθανόλη.
2.3. ∆ιαδικασία IF
i) Σύµφωνα µε την ετοιµασία της αντικειµενοφ όρου στο σηµείο
2.1.i):
Παρασκευάζεται µία σειρά αραιώσεων του αντι ορού στο διπλά-
σιο σε ρυθµιστικό διάλυµα για IF(προσάρτηµα 3):
του τίτλου (Τ/4 ), του τίτλου (Τ/2 ), ο τίτλος (Τ) και το
διπλάσιο του τίτλου (2Τ).
ii) Σύµφωνα µε την ετοιµασία της αντικειµενοφ όρου στο σηµείο
2.1.ii):
Παρασκευάζεται η αραίωση εργασίας ( WD) του αντι ορού σε
ρυθµιστικό διάλυµα για IF. Αραίωση εργασίας είναι η αραίωση
του αντι ορού που ε µφανίζει την καλύτερη εξειδίκευση και
είναι συνήθως το µισό του τίτλου.
Εικόνα 1
Ετοιµασίατηςαντικειµενοφόρουδοκιµήςσύµφωναµετασηµεία
2.1.i) και 2.3.i)
Καθορισµένη αραίωση αιωρήµατος ιζήµατος
(Τ=τίτλος)
∆είγµα 1 • 1• 2• 3• 4• 5
∆είγµα 1εις διπλούν ή
δείγµα 2•6 •7 •8 •9 •1 0
Εικόνα 2
Ετοιµασίατηςαντικειµενοφόρουδοκιµήςσύµφωναµετασηµεία2.1. ii)και
2.3.ii)
∆είγµα 1 • 1• 2• 3• 4• 5
∆είγµα 1εις διπλούν ή
δείγµα 2•6 •7 •8 •9 •1 0
2.3.1.Οι αντικειµενοφ όροι τοποθετο ύνται πάνω σε ένυγρο απ ορροφη -
τικό χαρτί .
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 28
▼B
Τα φατνία δοκιµής καλύπτονται µε την ή τις αραιώσεις του αντι -
ορού .Στα φατνία FITCφέρεται PBS.Ο όγκος του χρησιµοποιούµε -
νου στα φατνία αντι ορού πρέπει να ε ίναι ισοδύναµος µε τον όγκο
του χρησιµοποιούµενου εκχυλίσµατος .
2.3.2.Οι αντικειµενοφ όροι τοποθετο ύνται κάτω από ένα κάλυµµα και
επωάζονται για 30λεπτά σε θερµοκρασία περιβάλλοντος .
2.3.3.Τα σταγονίδια του αντι ορού απο µακρύνονται µε ένα ελαφρό
τίναγµα από την αντικειµενοφόρο και οι αντικειµενοφ όροι ξεπλέ -
νονται π ροσεκτικά µε ρυθµιστικό διάλυµα IF.Πλύση επί 5λεπτά
σε ρυθµιστικό διάλυµα -Tween IG και ακολούθως επί 5λεπτά σε
ρυθµιστικό διάλυµα IF (προσάρτηµα 3).
Η περίσσεια του υγρού αποµακρύνεται π ροσεκτικά .
2.3.4.Οι αντικειµενοφ όροι τοποθετο ύνται πάνω σε ένυγρο απ ορροφη -
τικό χαρτί .
Τα φατνία δοκιµής και το φατνίο του FITCκαλύπτονται µε την
αραίωση του συµπλόκου FITCπου χρησιµοποιείται για τον προ -
σδιορισµό του τίτλου .Ο όγκος του χρησιµοποιούµενου στα φατνία
συµπλόκου πρέπει να είναι ίδιος µε τον όγκο του χρησιµοποιούµε -
νου αντι ορού .
2.3.5.Οι αντικειµενοφ όροι τοποθετο ύνται κάτω από ένα κάλυµµα και
επωάζονται για 30λεπτά σε θερµοκρασία περιβάλλοντος .
2.3.6.Τα σταγονίδια του συµπλόκου τινάζονται µακρυά από την αντικει -
µενοφόρο και οι αντικειµενοφ όροι ξεπλένο νται και πλένονται
όπως προηγουµένως (2.3.3).Η περίσσεια του νερού αποµακρύνεται
προσεκτικά .
2.3.7.Σε κάθε φατνίο φέρονται µε σιφώνιο 5-10 µlφωσφορικού ρυθµιστι -
κού διαλύµατος γλυκερίνης 0,1Μ(προσάρτηµα 3)ή παροµοίου
ρευστού και τα φατνία καλύπτονται µε µία καλυπτρίδα .
2.4.Ανάγνωση της δοκιµής IF
Οι αντικειµενοφ όροι δοκιµής εξτάζονται σε µικ ροσκόπιο ε πιφθο -
ρισµού µε φίλτρα κατάλληλα για την διέγερση του FITC,µε ελαιο -
καταδυτικό φακό και µε µεγέθυνση 50-1 000 Τα φατνία εξετάζο -
νται κατά µήκος δύο καθέτων διαµέτρων και κατά την περίµετρότους .Πρώτα ελέγχεται η αντικειµενοφ όρος του θε τικού µάρτυρα .
Τα κύτταρα πρέπει να είναι πλήρως χρωσµένα µε λαµπρό φθορι -
σµό.
Σηµείωση :Σε περίπτωση αποτυχίας ,η δοκιµή επαναλαµβάνε -
ται.Τίνεται ανάγνωση αντικειµενοφόρων δοκιµής .
Ελέγχεται κατ ’αρχάς ότι δεν υπάρχουν φθορίζοντα κύτταρα στα
φατνία τωνµαρτύρων FITC.Αν υπάρχουν φθορίζοντα κύτταρα στο
φατνίο FITCαυτό δείχνει µη ειδική σύζευξη του συµπλόκου ,
αυτοφθορισµό ή επιµόλυνση .
Σηµείωση :Στις περιπτώσεις αυτές ,η δοκιµή επαναλαµβάνεται .
Εξετάζεται αν υπάρχουν φθορίζοντα κύτταρα µε τη
χαρακτηριστική µορφολογία της Pseudomonas solana-
cearumστα φατνία δοκιµής .Η ένταση του φθορισµού
πρέπει να είναι ίδια µε εκείνη του θετικού µάρτυραµε ίδια αραίωση αντι ορού .Κύτταρα µε ατελή χρώση
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 29
▼B
ή µε ασθενή φθορισµό δεν πρέπει να λαµβάνονται
υπόψη ,εκτός κι αν υπάρχουν πολλά τέτοια κύτταρα
(βλέπε ερµηνεία αποτελεσµάτων της δοκιµής IF).
Ερµηνεία των αποτελεσµάτων της δοκιµής IF
i) Εφόσον σε ένα δε ίγµα δεν ανευρίσκονται λαµπρώς φθορίζοντα
κύτταρα µε χαρακτηριστική µορφολογία, η δοκιµή IFείναι
αρνητική.
ii) Εφόσον σε ένα δε ίγµα βρίσκονται λαµπρώς φθορίζοντα κύτ-
ταρα µε χαρακτηριστική µορφολογία, π ροσδιορίζεται ο µέσος
αριθµός κυττάρων ανά πεδίο µικ ροσκοπίου και υπολο γίζεται ο
αριθµός των κυττάρων (Ν) ανά mlτου αναδιαλυµένου ιζήµατος
(προσάρτηµα 4).
Ένας πληθυσµός 103περίπου ανά mlαναδιαλυµένο6υ ιξήµα-
τος, θεωρείται το όριο ανίχνευσης της δοκιµής IF:
—σε δείγµατα µε Ν >103κύτταρα ανά mlαναδιαλυµένου
ιζήµατος, η δοκιµή IFθεωρείται θετική,
—σε δείγµατα ►C1µε Ν<103κύτταρα ◄ανά mlανα-
διαλυµένου ιζήµατος, η δοκιµή IFµπορεί να θεωρηθεί
ως θετική.
iii) Αν παρατηρηθούν µεγάλοι αριθµοί (Ν >105κύτταρα ανά ml)
κυττάρων µε ατελή ή ασθενή φθορισµό, µε τον τίτλο τουαντιορού, πρέπει να πρ αγµατοποιείται µία δεύτερη δοκιµή:
—είτε µία δοκιµή βασισµένη σε µία διαφορετική βιολο-
γική αρχή,
—ή επανάληψη της δοκιµής IF, µε ένα δεύτερο αντιορό ή
µε 10 φορές αραιωµένο ίζηµα.
3.∆οκιµήELISA
(βασίζεται στην εργασία των Robinson -Smithet al., 1995)
Χρησιµοποιείται αντι ορός για Ralstonia solanacearum , κατά προ-
τίµηση έναντι φυλής 3, βιοποικιλίας 2. Ο τίτλος π ροσδιορίζεται
σε αιώρηµα 10
6κυττάρων ανά mlαπό το οµόλογο στέλεχος Pseudo-
monas solanacearum .
Συνιστάται η χρήση µικρότιτλων πλακών NUNC Polysorp .
Περιλαµβάνεται ένας αρνητικός µάρτυρας εκχυλίσµατος πατάτας
και ένας µάρτυρας από ρυθµιστικό φωσφορικό διάλυµα αλατιού(PBS).
Ως θετικός µάρτυρας χρησιµοποιείται αιώρηµα >10
6κυττάρων
ανά mlαπό στέλεχος Ralstonia solanacearum κατάλληλης φυλής/
βιοποικιλίας. Η δοκιµή γίνεται µε ταυτόσηµο τρόπο µε εκείνη τουή των δειγµάτων αλλά διαχωρίζεται σαφώς από τα δείγµατα στηπλάκα.
3.1. 100-200 µlτου αιωρήµατος του ιζήµατος φέρονται µε σιφώνιο σε
ένα µικροφιαλίδιο και θερµαίνονται για 4 λεπτά στους 100 °C.
Κατόπιν το µικροφιαλίδιο τοποθετείται σε πάγο.
3.2. Π ροστίθεται ίσος όγκος ανθρακικού ρυθµιστικού διαλύµατος επι-
κάλυψης διπλής ιοντικής ισχύος (π ροσάρτηµα 5) και το περιεχό-
µενο ανακατεύεται σε συσκευή vortex.
3.3. Σε δύο τουλάχιστον φατνία της µικρότιτλης πλάκας φέρονται από
100µlτου ανωτέρω διαλύµατος και επωάζονται για 1 ώρα στους
37°Cή όλη τη νύκτα στους 4 °C.
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 30
▼B
3.4. Η πλάκα τινάζεται ελαφρά για να αποµακρυνθούν τα εκχυλίσµατα
από τα φατνία. Τα φατνία πλένονται τρεις φορές µε PBS-Tween
(προσάρτηµα 5), αφήνοντας το τελευταίο διάλυµα πλυσίµατος στα
φατνία για 5 λεπτά τουλάχιστον.
3.5. Παρασκευάζεται η κατάλληλη αραίωση αντι ορού Ralstonia solana -
cearumσε ρυθµιστικό διάλυµα δεσµεύσεως (π ροσάρτηµα 5). Στα
φατνία φέρονται 100 µlαραίωσης αντι ορού.
Επωάζονται για 1 ώρα στους 37 °C.
3.6. Η πλάκα τινάζεται ελαφρά για να αποµακρυνθεί ο αντι ορός από τα
φατνία και τα φατνία πλένονται όπως και προηγουµένως (σηµείο3.4).
3.7. Παρασκευάζεται η κατάλληλη αραίωση συµπλόκου αλκαλικής
φωσφατάσης σε ρυθµιστικό διάλυµα δεσµεύσεως. Φέρονται σταφατνία 100 µlαπό αυτή και επωάζονται για 1 ώρα στους 37 °C.
3.8. Η πλάκα τινάζεται ελαφρά για να αποµακρυνθούν τα υπολείµµατα
του συµπλόκου από τα φατνία και τα φατνία πλένονται όπως καιπροηγουµένως (σηµεία 3.4 και 3.6).
3.9. Παρασκευάζεται διάλυµα υποστρώµατος αλκαλικής φωσφατάσης
(προσάρτηµα 5). Φέρονται στα φατνία 100 µlαπό αυτό και ακο-
λουθεί επώαση για 30 λεπτά έως 1 ώρα στο σκοτάδι σε θερµοκρα-σία εργαστηρίου.
3.10. ∆ιαβάζεται η απ ορρόφηση στα 409 nm.
Ερµηνεία της δοκιµής ELISA
Η δοκιµή ELISAείναι αρνητική εάν η οπτική πυκνότητα ( O.D)τ ο υ
δείγµατος είναι <2×O.Dτου αρνητικού µάρτυρα.
Η δοκιµή ELISAείναι θετική εάν η οπτική πυκνότητα ( O.D)τ ο υ
δείγµατος είναι >2×O.Dτου αρνητικού µάρτυρα.
4.∆οκιµήPCR
(βασίζεται στην εργασία των Sealet al., 1993)
Σηµείωση: Κατά τη διάρκεια της παρασκευής του δείγµατος καθώς
και των υπόλοιπων εργασιών για τη δοκιµή PCR,π ρ έ -
πει να χρησιµοποιούνται ογκοµετρικά ακ ροστόµια
(pipette tips ) µε φίλτρο.
Παρασκευάζεται αιώρηµα 10
6κυττάρων ανά mlαπό στέλεχος Ral-
stonia solanacearum φυλής 3, βιοποικιλίας 2 ωςθετικός µάρτυρας. Η
δοκιµή γίνεται µε ταυτόσηµο τρόπο µε εκείνη του ή των δειγ-µάτων.
4.1. 100 µlτου αιωρήµατος του ιζήµατος φέρονται µε σιφώνιο σε ένα
µικροφιαλίδιο.
Εναλλακτικώς, 90 µlτου αιωρήµατος µεταφέρονται σε µικροφιαλί-
διο περιέχον 10 µl NaOH 0,5M. Το περιεχόµενο του φιαλιδίου
ανακατεύεται αναποδογυρίζοντας επανειληµµένα πάνω-κάτω τοµικροφιαλίδιο.
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 31
▼B
Συστατικό Π οσότηταΤελική
συγκέντρωση4.2. Το φιαλίδιο θερµαίνεται για 4 λεπτα στους 100 °Cκαι κατόπιν
αποµακρύνεται αµέσως πάνω σε πάγο.
4.3. Παρασκευάζονται δύο τουλάχιστον δεκαδικές αραιώσεις, π.χ. 1/10
και 1/100, ή περι σσότερες αν θεωρηθεί απαραίτητο, σε απο-
στειρωµένο απεσταγµένο ή υπέρ καθαρό νερό ( UPW).
4.4. Παρασκευάζεται το µείγµα αντίδρασης PCR(προσάρτηµα 6) προ-
σθέτοντας σε αποστειρωµένο φιαλίδιο τα παρακάτω συστατικά µετην ακόλουθη σειρά:
Για όγκο αντίδρασης 50 µl
Αποστειρωµένο απε -
σταγµένο ή UPW30,8 µl-33,8 µl
10 ×ρυθµιστικό διά -
λυµα PCR5,0 µl 1 ×
d-ATP 1,0 µl 0,2 mM
d-CTP 1,0 µl 0,2 mMd-GTP 1,0 µl 0,2 mMd-TTP 1,0 µl 0,2 mMΕκκινητής OLI-1
(20 µM)2,5 µl 1 µM
Εκκινητής Y-2
(20 µM)2,5 µl 1 µ Μ
Taqπολυµεράση (5U/
µl)
0,2 µl 1,0 U
Συνολικός όγκος 45 µl—48 µl
Για περισσότερες αντιδράσεις
Υπολογίζεται η π οσότητα κάθε συστατικού για τον απαιτούµενο
αριθµό αντιδράσεων.
Τα συστατικά αναµειγνύονται και 45 µl-48µlτου µείγµατος µετα-
φέρονται σε αποστειρωµένα φιαλίδια PCR.
Τα φιαλίδια µε το µείγµα αντίδρασης PCRδιατηρούνται σε πάγο.
Για όγκο 25 µl
Η ποσότητα των συστατικών µειώνεται αναλογικά.
4.5. Σύνθεση PCR
4.5.1. Προαιρετικό! Τα φιαλίδια µε το βρασµένο δείγµα και τον θετικό
µάρτυρα υποβάλλονται σε παλµική φυγοκέντρηση.
Προστίθενται, µε την καθοριζόµενη σειρά, 2-5 µlτου ή των δειγ-
µάτων, υδατικού µάρτυρα και θετικού µάρτυρα στα φιαλίδια µε το
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 32
▼B
µείγµα αντίδρασης PCR. Τα φιαλίδια τοποθετούνται στο θερµικό
µπλόκ στη µονάδα θέρµανσης του θερµικού κυκλοποιητή DNA.
4.5.2. Ακολουθείται το εξής πρόγραµµα:
1 κύκλος από:
i) 2 λεπτά στους 96 °C:µετουσίωση του αρχικού DNA
50 κύκλοι από:
ii) 20 δευτερόλεπτα στους 94 °C:µετουσίωση
iii) 20 δευτερόλεπτα στους 68 °C:προσκόλληση εκκινητών
iv) 30 δευτερόλεπτα στους 72 °C:επέκταση αντιγράφου1 κύκλος
από:
v) 10 λεπτά στους 72 °C:περαιτέρω επέκταση1 κύκλος συνιστάµε-
νος σε:
vi) διατήρηση στους 4 °C
Σηµείωση: Οι παράµετροι αυτές ισχύουν για θερµικό κυκλοποιητή DNA
Perkin Elmer 9600. Άλλοι θερµικοί κυκλοποιητές µπορεί να
απαιτούν επίστρωση ορυκτελαίου στα φιαλίδια PCRή/και τρο-
ποποίηση της διάρκειας των σταδίων ii),iii) και iv) στο πρό-
γραµµα σύνθεσης.
4.5.3. Τα φιαλίδια αποµακρύνονται από τον θερµικό κυκλοποιητή. Το
προϊόν PCRαναλύεται. Εάν αυτό δεν γίνει αµέσως, τα φιαλίδια
αποθηκεύονται στους 4 °Cγια χρήση την ίδια µέρα ή στους -18 °C
για αργότερα.
4.6. Ανάλυση του προϊόντος PCR
Τα τµήµατα DNA PCR ανιχνεύονται µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή
αναρόζης και χρώση µε βρωµιούχο αιθίδιο.
4.6.1. Παρασκευάζεται κατάλληλη πηκτή αγαρόζης βράζοντας ήπια
ποσότητα αγαρόζης σε tris-οξεικό ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτρο-
φόρησης ( TAE).
4.6.2. Η τηγµένη αγαρόζη ψύχεται στους 50-60 °C, χύνεται στο καλούπι
της µονάδας ηλεκτροφόρησης και εισάγεται η χτένα. Η πηκτήαφήνεται να στερεοποιηθεί.
4.6.3. Αποµακρύνεται η χτένα. Η πηκτή βυθίζεται σε ΤΑΕ έτσι ώστε
ίσα-ίσα να καλύπτεται (2-3 mm) από το ρυθµιστικό διάλυµα.
4.6.4. 3 µlρυθµιστικού διαλύµατος φόρτωσης φέρονται πάνω σε παρα-
φίλµ. Προστίθενται 12 µlτου προϊόντος PCRαπό τα δείγµατα, το
θετικό µάρτυρα ή τον υδατικό µάρτυρα και αναµειγνύονται µεελαφρά ανα ρρόφηση στο ογκοµετρικό ακροστόµιο πριν από την
φόρτωση στην πηκτή. Οι αναφερόµενοι όγκοι µπ ορούν να τροπο-
ποιηθούν προκειµένου να π ροσαρµοστούν στη χωρ ητικότητα των
φατνίων στην πηκτή αγαρόζης.
4.6.5. Η φόρτωση γίνεται µε π ροσοχή στα φατνία της πηκτής. Σε ένα
τουλάχιστον φατνίο φέρεται για λόγους αναφοράς κατάλληλοςιχνηθέτης DNA.
4.6.6. Συνδέονται τα καλώδια στη συσκευή ηλεκτροφόρησης και την
πηγή τροφοδοσίας. Εφαρµόζεται τάση 5-8 V/cmµέχρις ότου το
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 33
▼B
µέτωπο του ιχνηλάτη δείκτη φθάσει στο 1 cmαπό το άκρο της
πηκτής.
4.6.7. ∆ιακόπτεται η τροφοδοσία ρεύµατος. Τα καλώδια αποσυνδέονται
από τη µονάδα ηλεκτροφόρησης, αποµακρύνεται µε π ροσοχή η
πηκτή και εµβαπτίζεται σε βρωµιούχο αιθίδιο για 30-45 λεπτα.
Σηµείωση: Όταν χρησιµοποιούµε βρωµιούχο αιθίδιο, πρέπει να
φορούµε πάντοτε γάντια γιατί είναι ισχυρό µεταλλαξιο-γόνο.
4.6.8. Ακολουθεί αποχρωµατισµός σε απεσταγµένο νερό για 10-15
λεπτά.
4.6.9. Το ή τα συντεθειµένα τµήµατα DNAεµφανίζονται µε υπεριώδη
ακτινοβολία. Το προϊόν PCRτουRalstonia solanacearum µε εκκινη-
τέςOLI-1 και Y-2 έχει µήκος 288 bp. Συγκρίνεται σε σχέση µε τον
ιχνηθέτη DNAκαι τον θετικό µάρτυρα.
Σηµείωση: Ο υδατικός µάρτυρας πρέπει σε κάθε περίπτωση να
είναι αρνητικός. Εάν είναι θετικός, η δοκιµή επαναλαµ-βάνεται.
4.6.10. Η πηκτή, εφ όσον χρε ιάζεται για το αρχείο, φωτογραφίζεται.
4.6.11. Η αυθεντικότητα του συντεθηµένου τµήµατος DNAεπιβεβαιώνε-
ται µε ανάλυση µε ένζυµο περιορισµού ( REA).
4.7. Ανάλυση µε περιοριστικό ένζυµο ( REA)
4.7.1. 8,5 µlαπό το προϊόν PCR(σηµείο 4.5.3) µεταφέρονται σε νέο
µικροφιαλίδιο. Π ροστίθεται 1 µl10×ρυθµιστικού διαλύµατος του
ενζύµου και 0,5 µlένζυµο περιορισµού AvaII.
4.7.2. Αναµειγνύονται µε ήπια ανα ρρόφηση στο ακροστόµιο. Εάν στα
τοιχώµατα του φιαλιδίου παραµείνουν σταγόνες, φυγοκεντρείταισε παλµική µικροφυγόκεντρο. Ακολουθεί επώαση για 1 ώρα στους37°C.
4.7.3. Το τµήµα DNAπου υπέστη πέψη αναλύεται µε ηλεκτροφόρηση σε
πηκτή αγαρόζης όπως προηγουµένως (σηµείο 4.6).
Ερµηνεία των αποτελεσµάτων της δοκιµής PCR
Η δοκιµή PCRείναι αρνητική εφ όσον δεν ανιχνεύεται το
χαρακτηριστικό τµήµα 288 bpκαι το τµήµα ανιχνεύεται στο
θετικό µάρτυρα Ralstonia solanacearum .
Η δοκιµή PCRείναι θετική εάν το τµήµα 288 bpανιχνεύεται και η
ανάλυση REAτου συντεθειµένου τµήµατος είναι ίδια µε εκείνη
του θετικού µάρτυρα Ralstonia solanacearum .
5.Εκλεκτική αποµόνωση επί στερεού υποστρώµατος
(βασίζεται στην εργασία των Elphinstone et al ., 1996)
5.1. Η δοκιµή πραγµατοποιείται µε κατάλληλη τεχνική αραιώσεων επί
στερεού υποστρώµατος, π.χ.:
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 34
▼B
i) Παρασκευάζονται δύο τουλάχιστον δεκαδικές αραιώσεις,
συγκεκριµένα 1/10 και 1/100 ή περι σσότερες αν θεωρηθεί
χρήσιµο, του αιωρήµατος του ιζήµατος σε ρυθµιστικό διάλυµαιζήµατος. Συγκεκριµένος όγκος (50-100 µl) του αιωρήµατος και
κάθε αραίωσης µετρηµένος µε σιφώνιο φέρεται σε τροποποιη-µένο εκλεκτικό υπόστρωµα SMSA(προσάρτηµα 7) και απλώνε-
ται µε µία γυάλινη ράβδο σε όλη την επιφάνεια του υποστρώ-µατος.
Εφόσον κρίνεται σκό πιµο, πραγµατοποιείται γραµµική
εξάπλωση αραίωσης, 10 µlαναδιαλυµένου ιζήµατος περνώντας
κάθε φορά τη βελόνα από φλόγα.
ii) Συγκεκριµένος όγκος (50-100 µl) του αιωρήµατος µετρηµένος
µε σιφώνιο µεταφέρεται σε τροποποιηµένο εκλεκτικόυπόστρωµα SMSAκαι απλώνεται µε µία γυάλινη ράβδο σε όλη
την επιφάνεια του υποστρώµατος. Η ράβδος σύρεται γραµµωτάσε δύο ακόµη τροποποιηµένα τρυβλία SMSAχωρίς να την
περάσουµε από φλόγα.
5.2. Αιώρηµα 10
6κυττάρων ανά mlαπό παθογόνο στέλεχος Ralstonia
solanacearum φυλής 3, βιοποικιλίας 2 που παίζει ρόλο θετικού
µάρτυρα εξαπλούται, µε την ίδια τεχνική, σε µία σειρά ξεχω-ριστών τρυβλίων τροποποιηµένου SMSA.
5.3. Τα τρυβλία επωάζονται στους 28 °C. Μετά 3 ηµέρες ξεκινά η
ανάγνωση των τρυβλίων. Εάν το αποτέλεσµα είναι αρνητικό, αφή-νονται να επωαστούν ακόµη µέχρι 6 ηµέρες. Οι παθογόνες απο-µονώσεις Ralstonia solanacearum αναπτύσσουνγαλακτώδους χροιάς
λευκές, επίπεδες, ακανόνιστες και ρευστώδεις αποικίες µε διά-κριτα ερυθρά προς το πορφυρούν κέντρα που εµφανίζουν εσωτερι-κές ραβδώσεις ή ελικώσεις.
5.4. Οι αποικίες µε χαρακτηριστική µορφολία καθαρίζονται µε εκ νέου
καλλιέργεια σε θρεπτικό υπόστρωµα γενικής χρήσεως (προ-σάρτηµα 1).
5.5. Οι καθαρές καλλιέργειες ταυτοποιούνται (µέρος II.4.1) και οι καλ-
λιέργειες της Ralstonia solanacearum επιβαιώνονται µε µία δοκιµή
παθογένειας (µέρος II.4.3).
Ερµηνεία των αποτελεσµάτων της δοκιµής (εκλεκτικής αποµόνωσης
επί στερεού υποστρώµατος)
Η δοκιµή είναι αρνητική εάν δεν αποµονωθούν αποικίες βακτη-
ρίων µετά 6 ηµέρες ή εάν δεν αποµονωθούν χαρακτηριστικέςαποικίες Pseudomonas solanacearum υπό την προϋπόθεση ότι δεν
υπάρχουν υπόνοιες για παρεµπόδιση από αποικίες άλλων βακτη-ρίων και χαρακτηριστικές αποικίες της Ralstonia solanacearum απο-
µονώνονται από τους θετικούς µάρτυρες.
Η δοκιµή είναι θετική εάν αποµονωθούν χαρακτηριστικές αποι-
κίες Ralstonia solanacearum .
6.Βιοδοκιµή
(βασίζεται στην εργασία του Janse, 1988)
6.1. Χρησιµοποιούνται 10 προς δοκιµή ευαίσθητα σπ ορόφυτα τοµάτας
ή µελιτζάνας ευρισκόµενα στο στάδιο του 3ου πραγµατικού φύλ-λου για κάθε δείγµα. Τα φυτά δεν ποτίζονται για 24 ώρες πριν απότη µόλυνση.
6.2. 100 µlτου αιωρήµατος του ιζήµατος κατανέµονται µεταξύ των πει-
ραµατοφύτων. Τα στελέχη µολύνονται µεταξύ των κοτυληδόνωνκαι σε ένα ή περισσότερα άλλα σηµεία.
6.3. 10 σπ ορόφυτα µολύνονται µε την ίδια τεχνική µε αιώρηµα 10
6
κυττάρων ανά mlαπό παθογόνο στέλεχος Pseudomonas solanacea -
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 35
▼B
rumφυλής 3, βιοποικιλίας 2 για να χρησιµεύσουν ως θετικός
µάρτυρας και µε ρυθµιστικό διάλυµα ιζήµατος για να χρησιµεύ-σουν ως αρνητικός µάρτυρας. Τα φυτά θετικοί µάρτυρες, διαχωρί-ζονται από τα άλλα φυτά προς αποφυγή επιµολύνσεων.
6.4. Τα σπ ορόφυτα αφήνονται να αναπτυχθούν για 4 εβδοµάδες σε
θερµοκρασία 22-28 °Cµε καθηµερινό πότισµα και υψηλή σχετική
υγρασία. Παρατηρούµε αν θα παρουσιαστούν συµπτώµατα µαρα-σµού, επιναστίας, χλώρωσης ή/και νανισµού.
6.5. Από τα π ροσβεβληµένα φυτά γίνεται αποµόνωση (µέρος ΙΙ). Ταυ-
τοποιούνται οι καθαρές καλλιέργειες µε χαρακτηριστική µορφο-λογία (µέρος II.4.1) και οι καλλιέργειες της Ralstonia solanacearum
επιβεβαιώνονται µε δοκιµή παθογένειας (µέρος II.4.3).
6.6. Αν θεωρηθεί χρήσιµο, ελέγχεται η απουσία µόλυνσης σε παρτίδες
πειροµατοφύτων που δεν παρουσιάζουν ένδειξη µόλυνσης. Απόκάθε φυτό αφαιρείται τµήµα του στελέχους µήκους 1 cmαπό
σηµείο ευρισκόµενο σε απόσταση 2 cmπάνω από το σηµείο
µόλυνσης. Οι ιστοί οµοιογενοποιούνται σε ρυθµιστικό διαλυµάδιαβροχής. Εκτελείται δοκιµή αποµόνωσης µε την τεχνική τωναραιώσεων σε στερεό υπόστρωµα (µέρος III.5.1). Εάν η δοκιµή
αποδειχθεί θετική, οι καθαρές καλλιέργειες µε χαρακτηριστικήµορφολογία ταυτοποιούνται (µέρος II.4.1) και οι καλλιέργειες Ral-
stonia solanacearum επιβεβαιώνονται µε δοκιµή παθογένειας (µέρος
II.4.3).
Ερµηνεία των αποτελεσµάτων της βιοδοκιµής
Η βιοδοκιµή είναι αρνητική αν τα φυτά δοκιµής δεν είναι προ-
σβεβληµένα από Ralstonia solanacearum υπό τον όρο ότι η Ralstonia
solanacearum ανιχνεύεται στους θετικούς µάρτυρες.
Η βιοδοκιµή είνα θετική αν τα φυτά δοκιµής είναι π ροσβεβληµένα
από Ralstonia solanacearum .
7.∆οκιµή εµπλουτισµού
(βασίζεται στην εργασία των Elphinstone et al ., 1996)
7.1. 100 µlτου αιωρήµατος του ιζήµατος µεταφέρονται σε 3 mlτροπο-
ποιηµένου ζωµού SMSA(προσάρτηµα 7).
7.2. Επωάζονται για 48 ώρες, εν πάση δε περιπτώσει όχι περι σσότερο
από 72 ώρες, στους 28 °Cδιατηρώντας το καπάκι του σωλήνα
προσαρµοσµένο χαλαρά για να αερίζονται.
7.3. Το καπάκι σφίγγεται και ακολουθεί ανάδευση σε συσκευή vortex.
Λαµβάνεται κατάλληλη π οσότητα για τη δοκιµή IF(µέρος III.2),
τη δοκιµή ELISA(µέρος III.3) ή/και τη δοκιµή PCR(µέρος III.4).
8.∆οκιµή παθογένειας
Αναφέρεται στο µέρος II.4.3.
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 36
▼B
Προσάρτηµα 1
Θρεπτικά υλικάγιατηναποµόνωσηκαικαλλιέργειατης Ralstonia solana -
cearum
Nutrient Agar (NA)
Nutrient Agar (Difco) 23 g
Αποσταγµένο νερό 1λίτρο
Παρασκευάζονται π οσότητες λίτρου από το θρεπτικό υλικό σε φιάλες
1λίτρου .
∆ιαλύονται τα συστατικά .
Το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121°Cεπί 15λεπτά .
Ακολουθεί ψύξη µέχρι τους 50°Cκαι κατανέµεται σε τρυβλία .
Yeast-Peptone -Glucose -Agar(YPGA)
Yeast Extract (Difco) 5 g
Bacto-Pepton (Difco) 5 gD(+)γλυκόζη (µονοϋδρική )1 0 g
Bacto Agar (Difco) 15 gΑποσταγµένο νερό 1λίτρο
Παρασκευάζονται π οσότητες λίτρου από το θρεπτικό υλικό σε φιάλες
1λίτρου .
∆ιαλύονται τα συστατικά .
Το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121°Cεπί 15λεπτά .
Ακολουθεί ψύξη µέχρι τους 50°Cκαι κατανέµεται σε τρυβλία .
Sucrose Peptone Agar (SPA)
Σακχαρόζη 20 g
Πεπτόνη 5g
K
2HPO4 0,5 g
MgSO4·7H2O 0,25 g
Bacto-Agar (Difco) 15 g
Αποσταγµένο νερό 1λίτρο
Παρασκευάζονται π οσότητες λίτρου από το θρεπτικό υλικό σε φιάλες
1λίτρου .
∆ιαλύονται τα συστατικά και ρυθµίζεται το pHσε µία τιµή από 7,2έως
7,4,αν είναι απαραίτητο .
Το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121°Cεπί 15λεπτά .
Ακολουθεί ψύξη µέχρι τους 50°Cκαι κατανέµεται σε τρυβλία .
Θρεπτικό υλικό Kelman ’s tetrazolium
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 37
▼B
Casamino acids (Difco) 1 g
Bacto Peptone (Difco) 10 g∆εξτρόζη 5g
Bacto Agar (Difco) 15 gΑποσταγµένο νερό 1λίτρο
Παρασκευάζονται π οσότητες λίτρου από το θρεπτικό υλικό σε φιάλες
1λίτρου .
∆ιαλύονται τα συστατικά .
Το υλικό αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121°Cεπί 15λεπτά .
Ακολουθεί ψύξη µέχρι τους 50°C.
Προστίθεται υδατικό διάλυµα χλωριούχου τριφαινυλο -τετραζολίου
(Sigma), το οποίο έχει αποστειρωθεί µε διήθηση από φίλτρο ,ώστε να
ληφθεί τελική συγκέντρωση 50 mgανά λίτρο .
Το σύνολο κατανέµεται σε τρυβλία .
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 38
▼B
Προσάρτηµα 2
Υλικά για την προετοιµασία του δείγµατος δοκιµής
Ρυθµιστικό διάλυµα διαβροχής: Ρυθµιστικό διάλυµα φωσφο-
ρικών ιόντων 50 mM,pH7,0
Το εν λόγω ρυθµιστικό διάλυµα χρησιµοποιείται για τη δια βροχή ιστών.
Na2HPO4 4,26 g
KH2PO4 2,72 g
Αποσταγµένο νερό 1λίτρο
∆ιαλύονται τα συστατικά και ελέγχεται η τιµή του pH.Κατανέµονται
κατάλληλες π οσότητες ανάλογα µε τις ανάγκες .
Το διάλυµα αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121°Cεπί15λεπτά .
Κατά τη διεξαγωγή της δοκιµής PCRσυνιστάται η π ροσθήκη διαλύµατος
poly vinyl pyrrolidone-40 000 (PVP-40) 5 % προκειµένου να περιοριστεί η
παρεµόδιση της σύνθεσης DNAλόγω της παρουσίας αρωµατικών µορίων
στο εκχύλισµα .
Για τη διαβροχή των τε µαχίων των ιστών των γεωµήλων ,συνιστάται η
προσθήκη αντικροκιδωτικού ,αντιαφριστικού παράγοντα ή αντιοξειδωτι -
κού µε την εφαρµογή της διαδικασίας οµογενοποίησης Waring Blender ή
Ultra Thurrax.
Lubrol flakes 0,5 g ανά λίτρο
DC silicone antifoam 1,0 ml ανά λίτρο
Πυροφωσφορικό τετρανάτριο 1,0 gανά λίτρο
Το υλικό αυτό αποστειρώνεται ξεχωριστά σε αυτόκαυστο .Ακολουθεί
προσθήκη (στο υλικό δια βροχής ),έως ότου ληφθεί η επιθυµητή
συγκέντρωση .
Ρυθµιστικό διάλυµα ιζήµατος: Ρυθµιστικό διάλυµα φωσφο-
ρικών ιόντων 10 mM,pH7,2
Το εν λόγω ρυθµιστικό διάλυµα χρησιµοποιείται για τον επανασχηµατι-
σµό αιωρήµατος και την αραίωση των ιζηµάτων των κώνων του σηµείουπρόσφυσης του στολονίου των γεωµήλων.
Na
2HPO4·12H2O 2,7 g
NaH2PO4·2H2O 0,4 g
Αποσταγµένο νερό 1λίτρο
∆ιαλύονται τα συστατικά και ελέγχεται η τιµή του pH.Κατανέµονται
κατάλληλες πσότητες ανάλογα µε τις ανάγκες .
Το διάλυµα αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121°Cεπί15λεπτά .
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 39
▼B
Προσάρτηµα 3
Υλικά για τη δοκιµή IF
Ρυθµιστικό διάλυµα IF: φυσιολογικός ορός µε ρυθµιστικό
διάλυµα φωσφορικών ιόντων 10 mM(PBS),pH7,2
Το εν λόγω ρυθµιστικό διάλυµα χρησιµοποιείται για την αραίωση των
αντιορών.
Na2HPO4·12 H2O 2,7 g
NaH2PO4·2H2O 0,4 g
NaCl 8,0 g
Αποσταγµένο νερό 1λίτρο
∆ιαλύονται τα συστατικά και ελέγχεται η τιµή του pH.Κατανέµονται
κατάλληλες π οσότητες ανάλογα µε τις ανάγκες .
Το διάλυµα αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121°Cεπί15λεπτά .
Ρυθµιστικό διάλυµα IF-Tween
Το εν λόγω ρυθµιστικό διάλυµα χρησιµοποιείται για το πλύσιµο των
πλακών. Π ροστίθεται 0,1 % Tween20 στο ρυθµιστικό διάλυµα IF.
0,1 Mφωσφορικό ρυθµιστικό διάλυµα γλυκερίνης, pH7,6
Αυτό το ρυθµιστικό διάλυµα χρησιµοποιείται ωςρευστό π ροσήλωσης στα
φατνία της πλάκας της IFγια την ενίσχυση του φθορισµού.
Na2HPO4·12 H2O 3,2 g
NaH2PO4·2H2O 0,15 g
Γλυκερίνη 50 ml
Αποσταγµένο νερό 100 ml
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 40
▼B
Προσάρτηµα 4
Προσδιορισµός του βαθµού µόλυνσης στη δοκιµή IF
Εµβαδόν (S)του φατνίου µιας πολυφατνιακής αντικειµενοφ όρου :
S=πD2
4
όπου D=διάµετρος του φατνίου(1)
Εµβαδόν (s)του οπτικού πεδίου του αντικειµενικού :
s=πd2
4
όπου d=διάµετρος του οπτικού πεδίου .(2)
Τοdυπολογίζεται είτε µε απευθείας µέτρηση είτε µε τους ακόλουθους τύπους :
s=πi2
G2K2×4
όπου
i=συντελεστής πεδίου (εξαρτάται από τον τύπο του π ροσοφθαλµίου και κυµαίνεται
µεταξύ 8και24),
K=συντελεστής σωλήνα (1ή1,25),
G=µεγεθυντική ισχύς του αντικειµενικού (100 ×, 40 × κ.λπ.)(3)
από τον (2)
d=4s
π√(4)
από τον (3)
d=4×πi2
G2K2×4
π=i
GK√
Μετράται ο αριθµός τωντυπικώνφθοριζόντων κυττάρων ανά πεδίο (c).
Υπολογίζεται ο αριθµός τωντυπικώνφθοριζόντων κυττάρων ανά φατνίο (C).
C=cS
s
Υπολογίζεται ο αριθµός τυπικώνφθοριζόντων κυττάρων ανά mlιζήµατος (N)
N=C×1 000
y×F
όπουy=όγκος ιζήµατος στο φατνίο
F=υντελεστής αραίωσης του ιζήµατος .
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 41
▼B
Προσάρτηµα 5
Υλικά για τη δοκιµή ELISA
Ανθρακικό ρυθµιστικό διάλυµα επικάλυψης, διπλής ισχύος,
pH9,6
Na2CO3 6,36 g
NaHCO3 11,72 g
Αποσταγµένο νερό 1λίτρο
∆ιαλύονται τα συστατικά και ελέγχεται η τιµή του pH.Κατανέµονται
κατάλληλες π οσότητες ανάλογα µε τις ανάγκες .
Το διάλυµα αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121°Cεπί15λεπτά .
Αν το εκχύλισµα περιέχει µεγάλο π οσοστό αρω µατικών µορίων ,µπορεί
να προστεθεί ,ως αντιοξειδωτικό ,θειώδες νάτριο σε τελική συγκέντρωση
0,2 %.
Φυσιολογικός ορός µε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών
ιόντων 10 ×(PBS),pH7,4
NaCl 80 g
KH2PO4 2g
Na2HPO4·12H2O2 9 g
KCl 2 g
Αποσταγµένο νερό 1λίτρο
∆ιαλύονται τα συστατικά και ελέγχεται η τιµή του pH.Κατανέµονται
κατάλληλες π οσότητες ανάλογα µε τις ανάγκες .
Το διάλυµα αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121°Cεπί15λεπτά .
Φυσιολογικός ορός µε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών
ιόντων- Tween (PBS-T)
10 × PBS 100 ml
10 % Tween 20 5 mlΑποσταγµένο νέρο 895 ml
Ρυθµιστικό διάλυµα φραγµού (αντισωµάτων) (πρέπει να έχει
παρασκευαστεί πρόσφατα)
10 × PBS 10 ml
Polyvinylpyrrolidon-MG 44000 (PVP-44) 2 g10 % Tween 20 0,5 gΓάλα σε σκόνη 0,5 g
Αποσταγµένο νερό έως 100 ml
∆ιάλυµα υποστρώµατος αλκαλικής φωσφατάσης, pH9,8
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 42
▼B
∆ιαιθανολαµίνη 97 ml
Αποσταγµένο νερό 800 ml
Αναµειγνύονται και ρυθµίζεται η τιµή του pH 9,8µε πυκνό HCl.
Συµπληρώνεται αποσταγµένο νερό µέχρι τελικού όγκου 1λίτρου .
Προστίθενται 0,2 g MgCl2.
∆ιαλύονται 2δισκία υποστρώµατος φωσφατάσης των 5 mg (Sigma) ανά
15 mlδιαλύµατος .
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 43
▼B
Προσάρτηµα 6
Υλικά για τη δοκιµή PCR
Ακολουθία ολιγονουκλεοτιδίων εκκινητών:
Εκκινητής OLI-1 5 /prime1-GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-3 /prime1
Εκκινητής Y-2 5 /prime1CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3 /prime1
Για τα υλικά βλέπε την εργασία των Seal et al.(1993).
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 44
▼B
Προσάρτηµα 7
Υλικάγιατηνεκλεκτικήαποµόνωσηεπίστερεούθρεπτικούυποστρώµατος
και δοκιµές εµπλουτισµού
Εκλεκτικό θρεπτικό υλικό SMSA (Engelbrecht 1994, όπως
τροποποιήθηκε από τον Elphinstone et al ., 1996)
Βασικό θρεπτικό υλικό
Casamino acids (Difco) 1 gBacto peptone (Difco) 10 gΓλυκερίνη 5m l
Άγαρ (Difco) 15 g
Αποσταγµένο νερό 1λίτρο
Παρασκευάζονται π οσότητες λίτρου από το θρεπτικό υλικό σε φιάλες
1λίτρου .
∆ιαλύονται τα συστατικά και ελέγχεται η τιµή του pH.Πριν από την
αποστείρωση σε αυτόκαυστο ρυθµίζεται το pHστην τιµή 6,5,αν κρίνεται
απαραίτητο .ΗRalstonia solanacearum δεν αναπτύσσεται σωστά στο θρε -
πτικό υλικό ,αν το pHείναι µεγαλύτερο του 7,0.Το υλικό αποστειρώνεται
σε αυτόκαυστο στους 121°Cεπί 15λεπτά .
Ακολουθεί ψύξη µέχρι τους 50°C.
Προστίθενται τα ακόλουθα συστατικά (όλα της Sigma) ώστε αν ληφθούν
οι προδιαγεγραµµένες τελικές συγκεντρώσεις.
Crystal violet 5 mg/l ανά λίτρο
Θει ική πολυµιξίνη Β 100 mgανά
λίτρο(περίπου 600 000µονά -
δες)Sigma P-1004
Βακιτρακίνη (*) 25 mgανά λίτρο (περίπου 1 250µονά -
δες)Sigma P-0125
Χλωραµφενικόλη 5m gανά λίτρο Sigma C-3175
Πενικιλίνη -G 0,5 mg ανά λίτρο (περίπου 825µονάδες ) Sigma P-3032
Άλατα τετραζολίου 50 mgανά λίτρο
(*)Αν χρειάζεται ,είναι δυνατό ,αυξάνοντας τη συγκέντρωση της βακιτρακίνης σε 300 ppm, να περιορισθεί
η επιµόλυνση από σαπροφυτικά βακτηρίδια χωρίς να µειωθεί η ανάκτηση της Ralstonia solonacearum.
Τα συστατικά διαλύονται σε αιθανόλη 70 %µέχρι να ληφθούν οι τελικές
συγκεντρώσεις για τον όγκο του θρεπτικού υλικού που πρόκειται ναπαρασκευασθεί .Ορισµένα συστατικά ,όπως η πολυµιξίνη Β και η
χλωραµφενικόλη απαιτούν ελαφρά θέρµανση και ανάδευση .
Ζωµός SMSA (Elphinstone et al., 1996)
Παρασκευάζεται όπως και το SMSAεκλεκτικό υλικό, αλλά παραλείπεται
το άγαρ. Κατανέµεται σε π οσότητες των 3 mlσε σωλήνες Universal µίας
χρήσης των 30 ml.
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 45
▼B
Βιβλιογραφία
Buddenhagen ,I.W.;Sequeira,L.and Kelman ,A., 1962. Description of races in
Pseudomonas solanacearum .Phytopathology 52, 726.
Cook,D.;Elizabeth B .and Sequeira L ., 1989. Genetic diversity of Pseudomonas
solanacearum :detection of restriction fragment length polymorphism with DNA
probes that specify virulence and hypersensitive respons .Molecular Plant -Mic-
robe Interactions 2, 113-121.
Dinesen I .G.and DeBoer ,S.H., 1995. Extraction of Clavibacter michiganensis
subsp.sepedonicus from composite samples of potato tubers .American Potato
Journal72, 133-142.
Elphinstone ,J.G.;Hennessy ,J.;Wilson,J.and Stead ,D.E., 1996. Sensitivity of
different methods for the detection of Pseudomonas solanacearum (Smith)
Smith in potato tuber extracts .EPPO Bulletin 26.
Engelbrecht ,M.C., 1994. Modification of a semi -selective medium for the
isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum .ACIAR Bacterial
Wilt Newsletter 10, 3-5.
Hayward,A.C., 1964. Characteristics of Pseudomonassolanacearum .Journalof
Applied Bacteriology 27, 265-277.
Hayward,A.C., 1994. Systematic and phylogeny of Pseudomonassolanacearum
and related bacteria .In:Bacterial Wilt :the disease and its causative agent ,
Pseudomonassolanacearum (eds.A.C.HaywardandG .L.Hartman)CABInter-
national Oxford , 127-135.
Janse,J.D., 1988. A detection method for Pseudomonas solanacearum in sym -
ptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity .EPPO
Bulletin18, 343-351.
Janse,J.D., 1991. Infra-and intraspecific classification of Pseudomonas solana -
cearum strains using whole cell fatty acid analysis .Systematic and Applied
Microbiology 14, 335-345.
Kelman,A., 1954. The relationship of pathogenicity in Pseudomonassolanacea -
rum to colony appearance on a tetrazolium medium .Phytopathology 64, 293-
695.
Lelliot,R.A.and Stead ,D.E., 1987. Methods for the diagnosis of bacterial
diseases of plants .(T.F.Preece ed .)Blackwell Scientific Publications ,Oxford.
216 p.
Louws,F.J.;Fulbright,D.W.;Stephens,C.T.and De Bruijn ,F.J., 1995. Differe-
ntiation of genomic structure by rep -PCR fingerprinting to rapidly classify Xant -
homonas campestris pv .vesicatoria .Phytopathology 85, 528-536.
Lozano,J.C.and Sequeira ,L., 1970. Differentiation of races of Pseudomonas
solanacearum by a leaf infiltration technique .Phytopathology 60, 838.
Mirza,M.S.;Rademaker ,J.W.L.;Janse,J.D.and Akkermans ,A.D.L., 1993,
Specific16S ribosomal RNA targeted oligonucleotide probe against Clavibacter
michiganensis subsp .sepedonicus.Canadian Journal of Microbiology 39,1029-
1034.
Robinson -Smith,A.;Jones,P.;Elphinstone ,J.G.and Forde ,S.M.D., 1995.
Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum ,the causative agent of
bacterial wilt .Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.
Seal,S.E.;Jackson,L.A.;Young,J.P.W.and Daniels ,M.J., 1993. Differentia -
tion ofPseudomonassolanacearum ,P.syzygii,P.picketti and the blood disease
bacterium by partial 16S rRNA sequencing :construction of oligonucleotide
primers for sensitive detection by polymerase chain reaction .Journal of General
Microbiology 139, 1587-1594.
Smith,J.J.;Offord,L.C.;Holderness ,M.and Saddler ,G.S., 1995. Genetic
diversity ofBurkholderiasolanacearum (synonymPseudomonassolanacearum )
race3in Kenya.Applied and Environmental Microbiology 61, 4262-4268.
Stead,D.E., 1992 a.Techniques for detecting and identifying plant pathogenic
bacteria.In:Techniques for rapid detection of plant pathogens (eds.J.M.Duncan
and L.Torrance).Blackwell Scientific Publications ,Oxford, 76-111.
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 46
▼B
Stead,D.E., 1992 b.Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas
spp.usingcellularfattyacidprofiles .InternationalJournalofSystematicBacte -
riology42, 281-295.
Van Beuningen ,A.;Derks,H.and Janse J .D., 1995. Detection and identification
ofClavibacter michiganensis subsp .sepedonicus with special attention to fluo -
rescent in-situ hybridisation (FISH)using a16S rRNA targeted oligonucleotide
probe.Züchtungsforschung 2, 266-269.
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 47
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ III
1. Για κάθε πιθανολογούµενη εµφάνιση για την οποία υπάρχει θετικό
αποτέλεσµα από την ή τις µαζικές δοκιµές, για µεν το καταχωρηµένοφυτικό υλικό, µε τη µέθοδο του παραρτήµατος II, για δε όλες τις άλλες
περιπτώσεις, µε οποιαδήποτε άλλη επισήµως εγκεκριµένη µέθοδο, καιγια την οποία αναµένεται επιβεβαίωση ή διάψευση µε την εν λόγωµέθοδο, παρακρατούνται και φυλά σσονται καταλλήλως:
—στο µέτρο του δυνατού, η παρτίδα, ή µέρος της παρτίδας (από την
οποία έχει ληφθεί το δείγµα) στην αρχική της συσκευασία µε τηνετικέτα,
—στο µέτρο του δυνατού, κάθε εναποµένον τµήµα των δειγµάτων,
—κάθε εναποµένον εκχύλισµα και υλικό που χρησιµοποιήθηκε για
την ή τις µαζικές δοκιµές π.χ. αντικειµενοφ όροι ανοσοφθορισµού
και
—όλη η σχετική τεκµηρίωση,
µέχρι την ολοκλήρωση της εν λόγω µεθόδου.
2. Σε περίπτωση επιβεβαίωσης της παρουσίας του οργανισµού, παρακρα-
τείται και φυλάσσεται καταλλήλως:
—το υλικό που αναφέρεται στην παράγραφο 1 και
—ένα δείγµα του µολυσµένου υλικού τοµάτας ή µελιτζάνας το οποίο
έχει εµβολιαστεί µε εκχύλισµα κονδύλου ή φυτού, κατά περίπτωσηκαι
—η αποµενωµένη καλλιέργεια του οργανισµού,
για τουλάχιστον ένα µήνα µετά τη διαδικασία κοινοποίησης βάσει του
άρθρου 5 παράγραφος 2.
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 48
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IV
Τα στοιχεία των ελέγχων που αναφέρονται στο άρθρο 5 παράγραφος 1,
στοιχείο α), σηµείο i), περιλαµβάνουν κατά περίπτωση:
i) τους τόπους παραγωγής,
—όπου καλλιεργούνται ή έχουν καλλιεργηθεί πατάτες που έχουν
κλωνική σχέση µε τις µολυσµένες από τον οργανισµό πατάτες,
—όπου καλλιεργούνται ή έχουν καλλιεργηθεί τοµάτες που έχουν την
ίδια προέλευση µε τις µολυσµένες από τον οργανισµό τοµάτες,
—όπου καλλιεργούνται ή έχουν καλλιεργηθεί πατάτες ή τοµάτες οι
οποίες υπόκεινται σε επίσηµο έλεγχο λόγω της πιθανολογούµενηςεµφάνισης του οργανισµού,
—όπου καλλιεργούνται ή έχουν καλλιεργηθεί πατάτες που έχουν
κλωνική σχέση µε πατάτες που καλλιεργούνται σε µολυσµένουςαπό τον οργανισµό τόπους,
—όπου καλλιεργούνται πατάτες ή τοµάτες οι οποίοι γειτνιάζουν µε
µολυσµένους τόπους παραγωγής, συµπεριλαµβανοµένων εκείνωνπου χρησιµοποιούν τον ίδιο εξοπλισµό και εγκαταστάσειςπαραγωγής απευθείας ή µέσω κοινού αναδόχου,
—που χρησιµοποιούν επιφανειακό νερό για άρδευση ή ψεκασµό από
πηγές για τις οποίες έχει επιβεβαιωθεί ή πιθανολογείται ότι έχουνµολυνθεί από τον οργανισµό,
—που χρησιµοποιούν επιφανειακό νερό για άρδευση ή ψεκασµό από
πηγή που χρησιµοποιείται από κοινού µε τόπους παραγωγής για τιςοποίους έχει επιβεβαιωθεί ή πιθανολογείται ότι έχουν µολυνθείαπό τον οργανισµό,
—που πληµµυρίζουν ή έχουν πληµµυρίσει µε επιφανειακό νερό για
το οποίο έχει επιβεβαιωθεί ή πιθανολογείται ότι έχει µολυνθείαπό τον οργανισµό
και
ii) το επιφανειακό νερό το οποίο χρησιµοποιήθηκε για άρδευση ή ψεκα-
σµό στον ή τους αγρούς ή στον ή τους τόπους παραγωγής για τιςοποίες έχει επιβεβαιωθεί ότι είναι µολυσµένοι από τον οργανισµό ήτο οποίο πληµµύρισε τους εν λόγω αγρούς ή τόπους παραγωγής.
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 49
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ V
1. Το στοιχεία του προσδιορισµού της έκτασης της πιθανής µόλυνσης
βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1, στοιχείο α), σηµείο iii) και του
άρθρου 5 παράγραφος 1, στοιχείο γ), σηµείο iii), περιλαµβάνουν, κατά
περίπτωση:
—το καταχωρηµένο φυτικό υλικό που παράγεται σε τόπο παραγωγής
χαρακτηρισµένο ως µολυσµένο βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1στοιχείο α), σηµείο ii),
—τον ή τους τόπους παραγωγής που συνδέονται µε το καταχωρηµένο
φυτικό υλικό που έχει χαρακτηρισθεί ως µολυσµένο βάσει τουάρθρου 5 παράγραφος 1 στοιχείο α), σηµείο ii), συµπεριλαµβανο-
µένων εκείνων που χρησιµοποιούν τον ίδιο εξοπλισµό και εγκατα-στάσεις παραγωγής απευθείας ή µέσω κοινού αναδόχου,
—το καταχωρηµένο φυτικό υλικό που παράγεται στον ή τους τόπους
παραγωγής που αναφέρονται στην προηγούµενη περίπτωση, ή πουυπήρχε στον ή τους τόπους παραγωγής κατά την ίδια περίοδο κατάτην οποία το καταχωρηµένο φυτικό υλικό που χαρακτηρίστηκε ωςµολυσµένο βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1, στοιχείο α), σηµείοii), υπήρχε στους τόπους παραγωγής που αναφέρονται στην πρώτη
περίπτωση,
—τις αποθήκες που διακινούν το καταχωρηµένο φυτικό υλικό προέ-
λευσης των ανωτέρω τόπων παραγωγής,
—κάθε µηχάνηµα, όχηµα, περιέκτης, αποθήκη ή µονάδα αυτών και
κάθε άλλο αντικείµενο, συµπεριλαµβανοµένων των υλικώνσυσκευασίας, που ενδέχεται να έχουν έλθει σε επαφή µε τοκαταχωρηµένο φυτικό υλικό χαρακτηρισµένο ως µολυσµένο βάσειτου άρθρου 5 παράγραφος 1, στοιχείο α), στοιχείο ii),
—κάθε καταχωρηµένο φυτικό υλικό που έχει αποθηκευτεί ή ήλθε σε
επαφή, µε οποιαδήποτε κατασκευή ή αντικείµενο που απαριθµείταιστην προηγούµενη περίπτωση, πριν από τον καθαρισµό και τηναπολύµανση αυτών των κατασκευών και αντικειµένων,
—βάσει των αποτελεσµάτων των ελέγχων και των δοκιµών που διε-
νεργούνται σύµφωνα µε το άρθρο 5 παράγραφος 1, στοιχείο α),σηµείο i), για τις πατάτες, τους κονδύλους ή φυτά µε αδελφική ή
γονική κλωνική σχέση, και, για τις τοµάτες, τα φυτά της ίδιαςπροέλευσης, µε το καταχωρηµένο φυτικό υλικό που χαρακτη-ρίστηκε ως µολυσµένο βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1, στοιχείοα), σηµείο ii), και τα οποία, µολονότι ενδέχεται να έδωσαν αρνη-
τικά αποτελέσµατα κατά τις δοκιµές ανίχνευσης του οργανισµού,κρίνεται πιθανόν να είναι µολυσµένα λόγω κλωνικής σχέσης,
—τον ή τους τόπους παραγωγής του καταχωρηµένου φυτικού υλικού
που αναφέρεται στην προηγούµενη περίπτωση,
—τον ή τους τόπους παραγωγής καταχωρηµένου φυτικού υλικού που
χρησιµοποιούν νερό για άρδευση ή ψεκασµό το οποίο έχειχαρακτηρισθεί ως µολυσµένο βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1,στοιχείο ii), σηµείο ii),
—το καταχωρηµένο φυτικό υλικό που έχει παραχθεί σε αγρούς οι
οποίοι έχουν πληµµυρίσει µε επιφανειακό νερό για το οποίο έχειεπιβεβαιωθεί ότι έχει µολυνθεί από τον οργανισµό.
2. Ο προσδιορισµός της πιθανής µετάδοσης που αναφέρεται στο άρθρο 5
παράγραφος 1, στοιχείο α), σηµείο iv) και το άρθρο 5, παράγραφος 1,
στοιχείο γ), σηµείο iii), περιλαµβάνει:
i) στις περιπτώσεις βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1, στοιχείο α),
σηµείο iv), τα ακόλουθα στοιχεία που πρέπει να λαµβάνονται
υπόψη:
—τη γειτνίαση άλλων τόπων παραγωγής όπου καλλιεργείται το
καταχωρηµένο φυτικό υλικό,
—τη συνήθη παραγωγή και χρησιµοποίηση του συγκεκριµένου
αποθέµατος πατατόσπ ορου,
—τους τόπους παραγωγής που χρησιµοποιούν επιφανειακό νερό
για άρδευση ή ψεκασµό του καταχωρηµένου φυτικού υλικού σεπεριπτώσεις κατά τις οποίες υπάρχει ή υπήρξε κίνδυνος απορ-ροών επιφανειακού νερού από καλλιεργήσιµα εδάφη που έχουνχαρακτηρισθεί ως µολυσµένα βάσει του άρθρου 5 παράγραφος1, στοιχείο α), σηµείο ii), ή πληµµύρας των εδαφών αυτών από
επιφανειακό νερό,
ii) στις περιπτώσεις κατά τις οποίες το επιφανειακό νερό χαρακτη-
ρίστηκε ως µολυσµένο βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1, στοιχείογ), σηµείο ii):
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 50
▼B
—τον ή τους τόπους παραγωγής του καταχωρηµένου φυτικού υλι-
κού που γειτνιάζουν ή που υπάρχει κίνδυνος να πληµµυρίσουνµε επιφανειακό νερό χαρακτηρισµένο ως µολυσµένο,
—οποιαδήποτε µη συρρέουσα αρδευτική λεκάνη που συνδέεται µε
το επιφανειακό νερό που έχει χαρακτηρισθεί ως µολυσµένο.
3. Οι λεπτοµέρειες της κοινοποίησης που αναφέρεται στο άρθρο 5 παρά-
γραφος 2, πρώτο εδάφιο, περιλαµβάνουν:
—την ηµεροµηνία κοινοποίησης της πιθανολογούµενης εµφάνισης
βάσει του άρθρου 4 και τις ηµεροµηνίες των δειγµατοληψιών καιτης επιβεβαίωσης της παρουσίας του οργανισµού βάσει του άρθρου5, κατά περίπτωση,
—περιγραφή των στοιχείων της προσδιορισθείσας µόλυνσης και της
οριοθέτησης της ζώνης.
4. Οι λεπτοµέρειες της πρόσθετης κοινοποίησης που αναφέρεται στο
άρθρο 5 παράγραφος 2, δεύτερο εδάφιο, περιλαµβάνουν:
—για κάθε αποστολή ή παρτίδα πατάτας που έχει χαρακτηρισθεί ως
µολυσµένη, κατά περίπτωση, τα πιστοποιητικά που ορίζονται σταάρθρα 7 και 8 της οδηγίας 77/93/ΕΟΚ, τον αριθµό διαβατηρίου ήτον αριθµό µητρώου του πατατοπαραγωγού, της συνεταιριστικήςαποθήκης και του κέντρου αποστολής,
—για κάθε αποστολή ή παρτίδα τοµάτας που έχει χαρακτηρισθεί ως
µολυσµένη, τα πιστοποιητικά που ορίζονται στα άρθρα 7ή 8 τηςοδηγίας 77/93/ΕΟΚ και τον αριθµό διαβατηρίου, σύµφωνα µε τονκατάλογο του παραρτήµατος V, µέρος Α, τµήµα Iσηµείο 2.2 της
οδηγίας 77/93/ΕΟΚ,
—την ονοµασία και την κατηγορία της ποικιλίας για τα αποθέµατα
πατατόσπ ορουκαι, όπου είναι δυνατό, για όλες τις άλλες περιπτώ-
σεις,
—οποιαδήποτε άλλη πληροφορία για το επιβεβαιωθέν κρούσµα την
οποία απαιτεί η Επιτροπή.
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 51
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ VI
1. Όσον αφορά το άρθρο 6 παράγραφος 1, οι διατάξεις είναι οι εξής:
—καύση ή
—χρήση ως ζωοτροφή µετά από θερµική επεξεργασία ώστε να µην
υπάρχει κίνδυνος επιβίωσης του οργανισµού ή
—µε εις βάθος ταφή σε τοποθεσία διάθεσης στην οποία δεν υπάρχει
κίνδυνος διήθησης σε γεωργικά εδάφη ή επαφής µε πηγές νερούπου µπορούν να χρησιµοποιο ύνται για άρδευση γεωργικών
εδαφών ή
—βιοµηχανική µεταποίηση µέσω απευθείας και άµεσης παράδοσης
σε µεταποιητική µονάδα µε επισήµως εγκεκριµένες εγκαταστά-σεις διάθεσης αποβλήτων οι οποίες ανταποκρίνονται στις διατά-ξεις του παραρτήµατος VIIτης παρούσας οδηγίας ή
—άλλα µέτρα, µε την προϋπόθεση ότι έχει διαπιστωθεί ότι δεν
υπάρχει εµφανής κίνδυνος µετάδοσης του οργανισµού· τα µέτρααυτά πρέπει να κοινοποιούνται αµέσως στην Επιτροπή και ταάλλα κράτη µέλη.
2. Η κατάλληλη χρήση ή διάθεση του καταχωρηµένου φυτικού υλικού
που αναφέρεται στο άρθρο 6 παράγραφος 2, υπό τον έλεγχο τωναρµόδιων επίσηµων φορέων του ή των οικείων κρατών µελών, µε τηνκατάλληλη συνεργασία µεταξύ τωναρµόδιων επίσηµων φορέων ώστενα εξασφαλίζεται πάντοτε ο έλεγχος αυτός και µε την έγκριση τουαρµόδιου επίσηµου φορέα του κράτους µέλους στο οποίο συσκευάζο-νται ή µεταποιούνται οι πατάτες όσον αφορά τις ε γκαταστάσεις
διάθεσης αποβλήτων που αναφέρονται στην πρώτη και τη δεύτερηπερίπτωση, είναι η ακόλουθη:
i) για τους κονδύλους πατάτας,
—χρήση ως πατάτες εµπορίου για κατανάλωση και συσκευασµέ-
νες σε χώρους µε κατάλληλες εγκαταστάσεις διάθεσηςαποβλήτων, έτοιµες για άµεση παράδοση και χρήση χωρίς νέασυσκευασία, και που προορίζο νται για τέτοιου είδους άµεση
παράδοση και χρήση ή
—χρήση ως πατάτες εµπορίου για βιοµηχανική µεταποίηση, που
προορίζο νται για απευθείας και άµεση παράδοση σε µεταποιη-
τική µονάδα µε κατάλληλες εγκαταστάσεις διάθεσηςαποβλήτων ή
—άλλη χρήση ή διάθεση, µε την προϋπόθεση ότι έχει διαπιστ-
ωθεί ότι δεν υπάρχει εµφανής κίνδυνος µετάδοσης του οργανι-σµού, και εφόσον έχει χορ ηγηθεί έγκριση των προαναφερό-
µενων υπεύθυνων επίσηµων φορέων. Τα µέτρα αυτά κοινο-ποιούνται αµέσως στην Επιτροπή και τα λοιπά κράτη µέλη,
ii) για άλλα µέρη των φυτών, συµπεριλαµβανοµένων των υπολειµ-
µάτων βλαστών και φυλλώµατος,
—καταστροφή ή
—άλλη χρήση ή διάθεση, µε την προϋπόθεση ότι έχει διαπιστ-
ωθεί ότι δεν υπάρχει εµφανής κίνδυνος µετάδοσης του οργανι-σµού· τα µέτρα αυτά πρέπει να κοινοποιούνται στην Επιτροπήκαι τα άλλα κράτη µέλη.
3. Οι κατάλληλες µέθοδοι απολύµανσης των αντικειµένων που αναφέ-
ρονται στο άρθρο 6 παράγραφος 3 πρέπει να είναι ο καθαρισµός και,κατά περίπτωση, η απολύµανση, έτσι ώστε να µην υπάρχει εµφανήςκίνδυνος µετάδοσης του οργανισµού και πρέπει να εφαρµόζονται υπότην εποπτεία των αρµόδιων επίσηµων φορέων των κρατών µελών.
4. Η σειρά µέτρων που εφαρµόζουν τα κράτη µέλη στην ή τις ζώνες που
οριοθετούνται βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1, στοιχείο α), σηµείοiv) και στοιχείο γ), σηµείο iii), και αναφέρονται στο άρθρο 6 παρά-
γραφος 4, περιλαµβάνει:
4.1. Σε τόπους παραγωγής που χαρακτηρίζονται ως µολυσµένοι βάσει του
άρθρου 5 παράγραφος 1, στοιχείο α), σηµείο ii):
α) σε αγρό ή µονάδα µε π ροστατευµένες καλλιέργειες που χαρακτη-
ρίζονται ως µολυσµένες βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1, στοι-χείο α), σηµείο ii), είτε
i) κατά τη διάρκεια τουλάχιστον τεσσάρων καλλιεργητικών ετών
µετά το έτος της προσδιορισθείσας µόλυνσης,
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 52
▼B
—λαµβάνονται µέτρα για την εξάλειψη των αυτοφυών φυτών
πατάτας και τοµάτας και άλλων ξενιστών του οργανισµούσυµπεριλαµβανοµένων των ζιζανίων της οικογένειας τωνσολανιδών και
—δεν φυτέονται:
—κόνδυλοι ή φυτά πατάτας,
—φυτά και σπ όροι τοµάτας,
—ανάλογα µε τη βιολογία του οργανισµού,
—άλλοι ξενιστές,
—φυτά του είδους Brassica, στα οποία υπάρχει
εµφανής κίνδυνος επιβίωσης του οργανισµού,
—καλλιέργειες στις οποίες υπάρχει εµφανής κίνδυνος
εξάπλωσης του οργανισµού,
—κατά την πρώτη καλλιεργητική περίοδο πατάτας ή τοµάτας
µετά την περίοδο που καθορίζεται στην προηγούµενηπερίπτωση, και υπό την προϋπόθεση ότι ο αγρός είναιαπαλλαγµένος από αυτοφυή φυτά τοµάτας και πατάτας καιάλλα φυτά ξενιστές συµπεριλαµβανοµένων των ζιζανίωντης οικογένειας των σολανιδών, πρέπει για δύο τουλάχι-στον συναπτά καλλιεργητικά έτη πριν τη φύτευση,
—στην περίπτωση της πατάτας, να φυτεύεται επισήµως
πιστοποιηµένος πατατόσπ ορος µόνο για παραγωγή
πατάτας εµπορίου και,
—να διεξάγεται επίσηµη έρευνα συµπεριλαµβανοµένων
των δοκιµών, όπως π ροβλέπεται στο άρθρο 2 παράγρα-
φος 1,
—κατά την καλλιεργητική περίοδο πατάτας ή τοµάτας µετά
την περίοδο που καθορίζεται στην προηγούµενηπερίπτωση και σύµφωνα µε ένα κατάλληλο σύστηµα αµει-ψισποράς, φυτεύεται, στην περίπτωση της πατάτας,επισήµως πιστοποιηµένος πατατόσπ ορος για παραγωγή
είτε πατατόσπ ορου είτε πατάτας εµπορίου και, στην
περίπτωση της πατάτας και τοµάτας, πραγµατοποιείταιεπίσηµος έλεγχος όπως καθορίζεται στο άρθρο 2 παράγρα-φος 1 ή
ii) κατά τα πέντε καλλιεργητικά έτη µετά την περίοδο της προ-
σδιορισθείσας µόλυνσης,
—λαµβάνονται µέτρα για την εξάλειψη των αυτοφυών φυτών
πατάτας και τοµάτας και άλλων ξενιστών του οργανισµού,συµπεριλαµβανοµένων των ζιζανίων της οικογένειας τωνσολανιδών και
—ο αγρός διατηρείται, κατά τα πρώτα τρία έτη, είτε χέ ρσος
είτε µε σιτηρά ανάλογα µε τον π ροσδιορισθέντα κίνδυνο,
είτε ως µόνιµος βοσκότοπος στον οποίο η βλάστηση κόβε-
ται συχνά και χαµηλ άήοο π ο ί ο ςχ ρ η σ ι µ ο π ο ι ε ίται για
εντατική βόσκηση ή ως χορτονοµή για παραγωγή σπόρων·
η φύτευση κατά τα ακόλουθα δύο έτη πραγµατοποιείται µεφυτά που δεν είναι ξενιστές του οργανισµού για τα οποίαδεν υπάρχει εµφανής κίνδυνος επιβίωσης ή διάδοσης τουοργανισµού,
—κατά την πρώτη καλλιεργητική περίοδο πατάτας ή τοµάτας
µετά την περίοδο που καθορίζεται στην προηγούµενηπερίπτωση,
—στην περίπτωση της πατάτας, φυτεύεται επισήµως
πιστοποιηµένος πατατόσπ ορος για παραγωγή είτε πατα-
τόσπορου είτε πατάτας εµπορίου,
και διεξάγεται επίσηµη µελέτη, συµπεριλαµβανοµένων
δοκιµών, όπως καθορίζεται στο άρθρο 2 παράγραφος 1·
β) σε άλλους αγρούς:
—κατά το καλλιεργητικό έτος µετά την π ροσδιορισθείσα
µόλυνση:
—είτε δεν φυτεύονται κόνδυλοι ή φυτά πατάτας, ή άλλα φυτά
ξενιστές του οργανισµού, και λαµβάνονται µέτρα για τηνεξάλειψη των αυτοφυών φυτών πατάτας και τοµάτας καιάλλων ξενιστών, συµπεριλαµβανοµένων των ζιζανίων τηςοικογένειας των σολανιδών ή
—στην περίπτωση των κονδύλων πατάτας, φυτεύεται
επισήµως πιστοποιηµένος πατατόσπ ορος για παραγωγή
πατάτας εµπορίου µόνο, υπό την προϋπόθεση ότι οι αρµό-
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 53
▼B
διοι επίσηµοι φορείς κρίνουν ότι έχει εξαλειφθεί ο κίνδυ-
νος µετάδοσης του οργανισµού από αυτοφυή φυτά πατάταςκαι τοµάτας ή άλλους ξενιστές του οργανισµού, συµπερι-λαµβανοµένων των ζιζανίων της οικογένειας των σολα-νιδών. Τα καλλιεργούµενα φυτά επιθεωρούνται τηνκατάλληλη στιγµή, τα δε τυχόν αυτοφυή φυτά πατάτας υπο-βάλλονται σε δοκιµή για την ανίχνευση του οργανισµού·επιπλέον, για τις πατάτες πρέπει να ελέγχονται οι συγκο-µιζόµενοι κόνδυλοι,
—κατά το πρώτο καλλιεργητικό έτος µετά το καθοριζόµενο στην
προηγούµενη περίπτωση,
—στην περίπτωση της πατάτας, φυτεύεται µόνον επισήµως
πιστοποιηµένος πατατόσπ ορος για παραγωγή είτε πατατό-
σπορου είτε πατάτας εµπορίου,
—τουλάχιστον για το δεύτερο καλλιεργητικό έτος µετά το καθο-
ριζόµενο στην πρώτη περίπτωση,
—στην περίπτωση της πατάτας, φυτεύεται µόνον επισήµως
πιστοποιηµένος πατατόσπ ορος ή πατατόσπ ορος που έχει
παραχθεί υπό επίσηµο έλεγχο µε επισήµως πιστοποιηµένοπατατόσπορο για παραγωγή είτε πατατόσπ ορου είτε πατά-
τας εµπορίου,
—για κάθε καλλιεργητικό έτος που αναφέρεται στις προηγούµε-
νες περιπτώσεις, λαµβάνονται µέτρα για την εξάλειψη τωναυτοφυών φυτών πατάτας και τοµάτας και άλλων ξενιστών τουοργανισµού, συµπεριλαµβανοµένων των ζιζανίων της οικογέ-νειας των σολανιδών, και πραγµατοποιείται επίσηµη µελέτηόπως καθορίζεται στο άρθρο 2 παράγραφος 1, και διεξάγεταιέλεγχος των κονδύλων στις περιπτώσεις κατά τις οποίες οπατατόσπ οροςφυτεύεται για την παραγωγή πατατόσπ ορου·
γ) αµέσως µετά το χαρακτηρισµό µολυσµένων αντικειµένων
σύµφωνα µε το άρθρο 5 παράγραφος 1, στοιχείο α), σηµείο ii), και
για κάθε επόµενο καλλιεργητικό έτος, µέχρι και την πρώτη επι-τρεπόµενη καλλιεργητική περίοδο πατάτας ή τοµάτας στον ή τουςαγρούς που έχουν χαρακτηρισθεί µολυσµένοι, όπως περιγράφεταιστο στοιχείο α):
—καθαρίζονται και, κατά περίπτωση, απολυµαίνονται
κατάλληλα όλα τα µηχανήµατα και οι αποθηκευτικοί χώροιτου τόπου παραγωγής που έχουν σχέση µε την παραγωγήπατάτας και τοµάτας, µε τις κατάλληλες µεθόδους, όπως ορίζε-ται στο σηµείο 3,
—εφαρµόζονται κατάλληλοι επίσηµοι έλεγχοι των προγραµ-
µάτων άρδευσης και ψεκασµού, συµπεριλαµβανοµένης τηςαπαγόρευσης αυτών, προκειµένου να αποφευχθεί η διάδοσητου οργανισµού·
δ) στις µονάδες π ροστατευµένης παραγωγής που έχουν χαρακτηρι-
σθεί ως µολυσµένες, βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1, στοιχείοα), σηµείο ii), όπου είναι δυνατή η πλήρης αντικατάσταση του
υποστρώµατος βλάστησης,
—δεν φυτεύονται κόνδυλοι ή φυτά, ή ξενιστές του οργανισµού,
συµπεριλαµβανοµένων των φυτών και σπόρων τοµάτας, παράµόνο εάν στη µονάδα παραγωγής εφαρµόζονται επισήµως επο-πτευόµενα µέτρα για την εξάλειψη του οργανισµού και τηναποµάκρυνση όλων τωνξενιστών, συµπεριλαµβανοµένων, του-λάχιστον, της πλήρους αντικατάστασης του υποστρώµατοςβλάστησης και του καθορισµού και, κατά περίπτωση, της απο-λύµανσης της µονάδας παραγωγής και όλου του εξοπλισµού,και, στη συνέχεια έχει χορηγηθεί άδεια για παραγωγή πατά-τας ή τοµάτας από τους αρµόδους επίσηµους φορείς και
—η παραγωγή πατάτας γίνεται από επισήµως πιστοποιηµένο
πατατόσπορο ή από µικροκονδύλους ή µικροφυτά που προέρ-χονται από ελεγµένες πηγές,
—εφαρµόζονται κατάλληλοι επίσηµοι έλεγχοι των προγραµ-
µάτων άρδευσης και ψεκασµού, συµπεριλαµβανοµένης τηςαπαγόρευσης αυτών, προκειµένου να αποφευχθεί η διάδοσητου οργανισµού.
4.2. Εντός της οριοθετηµένης ζώνης, µε την επιφύλαξη των µέτρων που
περιγράφονται στο σηµείο 4.1, τα κράτη µέλη:
α) αµέσως, και για τρία τουλάχιστον καλλιεργητικά έτη µετά την
προσδιορισθείσα µόλυνση:
αα) στις περιπτώσεις κατά τις οποίες η οριοθετηµένη ζώνη έχει
χαρακτηρισθεί βάσει του άρθρου 5 παράγραφος 1, στοιχείοα), σηµείο iv),
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 54
▼B
—εξασφαλίζουν, µέσω των αρµόδιων επίσηµων φορέων
τους, την εποπτεία των χώρων όπου καλλλιεργούνται,αποθηκεύονται ή διακινούνται κόνδυλοι πατάτας ή τοµά-τες, καθώς και των χώρων στους οποίους λειτουργούν,βάσει σύµβασης, µηχανήµατα για την παραγωγή πατάταςή τοµάτας,
—απαιτούν, κατά περίπτωση, καθαρισµό και απολύµανση
των µηχανηµάτων και των αποθηκών των χώρων αυτών µετις κατάλληλες µεθόδους, όπως ορίζεται στο σηµείο 3,
—απαιτούν τη φύτευση αποκλειστικά πιστοποιηµένου σπό-
ρου ή σπόρου που έχει παρ αχθεί υπό επίσηµο έλεγχο για
όλες τις καλλιέργειες πατάτας της ζώνης αυτής, καιδοκιµή, µετά τη συγκοµιδή, του πατατόσπ ορου που παρά-
γεται σε τόπους παραγωγής που έχουν χαρακτηριστεί ωςπιθανώς µολυσµένοι, σύµφωνα µε το άρθρο 5 παράγραφος1, στοιχείο α), σηµείο iii),
—απαιτούν τη χωριστή διακίνωση των αποθεµάτων συγκο-
µισθέντος πατατόσπ ορου και πατάτας εµπορίου για όλες
τις εγκαταστάσεις της ζώνης,
—διενεργούν επίσηµη µελέτη, όπως περιγράφεται στο
άρθρο 2 παράγραφος 1,
αβ) στις περιπτώσεις κατά τις οποίες το επιφανειακό νερό έχει
χαρακτηρισθεί ως µολυσµένο βάσει του άρθρου 5 παράγρα-φος 1, στοιχείο γ), σηµείο ii), ή περιλαµβάνεται στα στοιχεία
για πιθανή διάδοση του οργανισµού, σύµφωνα µε τοπαράρτηµα V, σηµείο 2,
—διενεργούν ετήσια µελέτη την κατάλληλη στιγµή, συµπε-
ριλαµβανοµένης της δειγµατοληψίας του επιφανειακούνερού και των κατάλληλων ξενιστών της οικογένειας τωνσολανιδών στις σχετικές πηγές επιφανειακού νερού καιδιεξάγουν δοκιµές
—για το καταχωρηµένο φυτικό υλικό, µε τη σχετική
µέθοδο του παραρτήµατος IIή
—στις λοιπές περιπτώσεις, µε άλλη επίσηµα εγκεκρι-
µένη µέθοδο,
—εφαρµόζουν επίσηµους ελέγχους των προγραµµάτων
άρδευσης και ψεκασµού, συµπεριλαµβανοµένης της απα-γόρευσης χρήσης του νερού που έχει χαρακτηρισθεί ωςµολυσµένο για την άρδευση και το ψεκασµό τουκαταχωρηµένου φυτικού υλικού, και, κατά περίπτωση,άλλων ξενιστών προκειµένου να αποφευχθεί η διάδοσητου οργανισµού. Η απαγόρευση αυτή επανεξετάζεταιβάσει των αποτελεσµάτων της προαναφερόµενης ετήσιαςέρευνας,
—στις περιπτώσεις κατά τις οποίες οι απ ορρίψεις υγρών
αποβλήτων είναι µολυσµένες, εφαρµόζουν επίσηµουςελέγχους για τη διάθεση των αποβλήτων από χώρουςβιοµηχανικής µεταποίησης ή συσκευασίας του καταχωρη-µένου φυτικού υλικού·
β) καταρτίζουν, κατά περίπτωση, προγράµµατα αντικατάστασης
όλων των αποθεµάτων πατατόσπ ορου σε εύθετο χρο νικό
διάστηµα.
1998L0057 — EL — 21.08.1998 — 000.001 — 55
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ VII
Οι επισήµως εγκεκριµένες εγκαταστάσεις διάθεσης αποβλήτων που ανα-
φέρονται στο παράρτηµα VI, παράγραφος 1, τέταρτο εδάφιο, συµµορφώ-
νονται µε τις ακόλουθες διατάξεις προκειµένου να αποφευχθεί ο κίνδυνοςδιάδοσης του οργανισµού:
i) απόβλητα από την επεξεργασία πατάτας και τοµάτας (συµπεριλαµβα-
νοµένων των απορρίψεων πατατών, φλοιού πατάτας και τοµατών) καιοποιοδήποτε άλλο στερεό απόβλητο που προέρχεται από πατάτες καιτοµάτες πρέπει να αποµακρύνεται, είτε
—µε εις βάθος ταφή σε τοποθεσία διάθεσης, στην οποία δεν υπάρχει
κίνδυνος διήθησης σε γεωργικά εδάφη ή επαφής µε πηγές νερούπου µπορούν να χρησιµοποιο ύνται για άρδευση γεωργικών
εδαφών. Τα απόβλητα µεταφέρονται απευθείας στην τοποθεσία υπόσυνθήκες περιορισµού, έτσι ώστε να µην υπάρχει κίνδυνος απώ-λειας των αποβλήτων ή
—µε καύση,
ii) υγρά απόβλητα επεξεργασίας: πριν από τη διάθεσή τους, τα υγρά
απόβλητα του περιλαµβάνουν αιωρούµενα στερεά στοιχεία υποβάλλο-νται σε διαδικασίες διήθησης ή καθίζησης για την αποµάκρυνσηαυτών των στερεών στοιχείων. Η διάθεση των στερεών αυτών στοι-χείων γίνεται µε τους τρόπους που π ροβλέπονται στο σηµείο i).
Τα υγρά απόβλητα πρέπει είτε:
—να θερµαίνονται τουλάχιστον σε 70 °Cεπί τουλάχιστον 30 λεπτά
πριν από τη διάθεσή τους ή
—να διατίθενται µε άλλο τρόπο που έχει εγκριθεί επισήµως και υπό
επίσηµο έλεγχο, ώστε να µην υπάρχει κίνδυνος επαφής τωναποβλήτων µε γεωργικά εδάφη ή πηγές νερού που θα µπ ορούσαν
να χρησιµοποιηθούν για άρδευση γεωργικών εδαφών. Οι λεπτοµέ-ρειες αυτές πρέπει να κοινοποιούνται στα άλλα κράτη µέλη καιτην Επιτροπή.