1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 1
Το έγγραφο αυτό συνιστά βοήθηµα τεκµηρίωσης και δεν δεσµεύει τα κοινοτικά όργανα
►B ΤΡΙΤΗ Ο∆ΗΓΙΑ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ
της 27ης Απριλίου 1972
περί καθορισµού κοινοτικών µεθόδων αναλύσεως για τον επίσηµο έλεγχο των ζωοτροφών
(72/199/ΕΟΚ)
(ΕΕL 123της 29.5.1972, σ. 6)
Τροποποιείται από:
Επίσηµη Εφηµερίδα
αριθ. σελίδα ηµεροµηνία
►M1Οδηγία 81 /680/ΕΟΚ της Επιτροπής της 30ής Ιουλίου 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Οδηγία 84 /4/ΕΟΚ της Επιτροπής της 20ής ∆εκεµβρίου 1983 L 15 28 18.1.1984
►M3Οδηγία 93/28/ΕΟΚ της Επιτροπής της 4ης Ιουνίου 1993 L 179 8 22.7.1993
►M4Οδηγία 98/54/ΕΚ της Επιτροπής της 16ης Ιουλίου 1998 L 208 49 24.7.1998
►M5Οδηγία 1999 /79/ΕΚ της Επιτροπής της 27ης Ιουλίου 1999 L 209 23 7.8.1999
▼B
ΤΡΙΤΗ Ο∆ΗΓΙΑ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ
της 27ης Απριλίου 1972
περί καθορισµού κοινοτικών µεθόδων αναλύσεως για τον επίσηµο
έλεγχο των ζωοτροφών
(72/199/ΕΟΚ)
Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,
Έχοντας υπόψη:
τη συνθήκη περί ιδρύσεως της Ευρωπαϊκής Οικονοµικής
Κοινότητος,
την οδηγία του Συµβουλίου της 20ής Ιουλίου 1970 περί
εισαγωγής κοινοτικών τρόπων λήψεως δειγµάτων και µεθόδωναναλύσεως για τον επίσηµο έλεγχο των ζωοτροφών (
1),και ιδίως
το άρθρο 2,
Εκτιµώντας:ότι η ανωτέρω οδηγία προβλέπει ότι οι επίσηµοι έλεγχοι των
ζωοτροφών, προς διαπίστωση του αν τηρούνται οι όροι, οι οποίοιέχουν καθορισθεί δυνάµει νοµοθετικών, κανονιστικών ή διοικη-
τικών διατάξεων για την ποιότητα ή τη σύνθεση των
ζωοτροφών, διενεργούνται κατά τους κοινοτικούς τρόπουςλήψεως των δειγµάτων και σύµφωνα µε τις κοινοτικές µεθόδουςαναλύσεως ·
ότι οι οδηγίες 71 /250/ΕΟΚ και 71 /393/ΕΟΚ της Επιτροπής της
15ης Ιουνίου 1971 (
2)και 18ης Νοεµβρίου 1971 (3)έχουν ήδη
καθορίσει ορισµένο αριθµό κοινοτικών µεθόδων αναλύσεως ·ότι
λαµβανοµένης υπόψη της προόδου των εργασιών, η οποία έχειέκτοτε πραγµατοποιηθεί, πρέπει ν 'αποφασίσει τρίτη σειρά
µεθόδων ·
ότι τα προβλεπόµενα στην οδηγία αυτή µέτρα είναι σύµφωνα µε
τη γνώµη της Μόνιµης Επιτροπής Ζωοτροφών,
ΕΞΕ∆ΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ Ο∆ΗΓΙΑ:
Άρθρο1
Τα Κράτη Μέλη καθορίζουν ότι οι αναλύσεις για τον επίσηµο
έλεγχο των ζωοτροφών ως προς τις περιεκτικότητες αυτών σε
άµυλο, ακατέργαστες πρωτεΐνες, ακατέργαστες πρωτεΐνες
διαλυτές υπό της πεψίνης και του υδροχλωρικού οξέος και ειςγκοσσυπόλη ( Gossypol), ελεύθερη και συνολική, καθώς και τη
δραστικότητα της πεψίνης, διενεργούνται κατά τις µεθόδους,που περιγράφονται στο παράρτηµα Ι της οδηγίας αυτής.
Άρθρο2
Τα Κράτη Μέλη καθορίζουν ότι οι αναλύσεις για τον επίσηµο
έλεγχο των ζωοτροφών ►M4 ◄σε ό,τι αφορά τις
περιεκτικότητες των τροφών σε ►M4 ◄τυροζίνη,
νικοτιανοµυκίνη, διενεργούνται κατά τις µεθόδους, οι οποίεςπεριγράφονται στο παράρτηµα IIτης οδηγίας αυτής.1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 2
(1)ΕΕ αριθ. Ν 170 της 3.8.1970, σ. 2 .
(2)ΕΕ αριθ. Ν 155 της 12.7.1971, σ. 13 .
(3)ΕΕ αριθ. Ν 279 της 20.12.1971, σ. 7 .▼M1
▼B
▼M1
Άρθρο3
Τα Κράτη Μέλη θέτουν σε ισχύ την 1η Ιουλίου 1973 το αργό-
τερο τις αναγκαίες νοµοθετικές, κανονιστικές ή διοικητικές
διατάξεις για να συµµορφωθούν προς την παρούσα οδηγία.Ενηµερώνουν αµέσως περί αυτού την Επιτροπή.
Άρθρο4
Η παρούσα οδηγία απευθύνεται στα Κράτη Μέλη.1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 3
▼B
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι
1.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΜΥΛΟΥ
ΠΟΛΩΣΙΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟ∆ΟΣ
1.Αντικείµενο και πεδίο εφαρµογής
Η παρούσα µέθοδος καθιστά δυνατό τον προσδιορισµό της περιεκτι-
κότητας σε άµυλο και σε προϊόντα διασπάσεως των υψηλών µοριακών
βαρών αµύλου των ζωοτροφών µε στόχο τον έλεγχο συµµόρφωσης
προς την οδηγία 86 /174/ΕΟΚ και την οδηγία 96 /25/ΕΚ.
2.Αρχή
Η µέθοδος περιλαµβάνει δύο προσδιορισµούς. Κατά τον πρώτο, το
δείγµα υφίσταται επεξεργασία εν θερµώ µε αραιωµένο υδροχλωρικό
οξύ. Ύστερα από διαύγαση και διήθηση, µετριέται η οπτική στροφική
ικανότητα του διαλύµατος µε πολωσιµετρία.
Κατά τον δεύτερο, το δείγµα εκχυλίζεται µε αιθανόλη 40 %.Κατόπιν
οξύνισης του διηθήµατος µε τη χρήση υδροχλωρικού οξέος, διαύγασης
και διήθησης, µετριέται η οπτική στροφική ικανότητα µε τις αυτές
συνθήκες όπως και στον πρώτο προσδιορισµό.
Η διαφορά µεταξύ των δύο µετρήσεων πολλαπλασιαζόµενη επί ένα
γνωστό συντελεστή δίδει την περιεκτικότητα του δείγµατος σε άµυλο.
3.Αντιδραστήρια
3.1.Υδροχλωρικό οξύ 25 %(κ.β.), d: 1,126.
3.2.Υδροχλωρικό οξύ 1,128 %(κ.ό.).
Η συµπύκνωση πρέπει να ελέγχεται µε ογκοµετρική τιτλοδότηση,
µε τη χρήση διαλύµατος υδροξειδίου του νατρίου 0,1 Ν παρουσία
ερυθρού του µεθυλίου 0,1 %(κ.ό.) σε αιθανόλη 94 %(κ.ό).
10ml = 30,94 ml τουNaOH 0.1 Ν.
3.3.∆ιάλυµα CarrezΙ: διαλύονται εις ύδωρ 21,9 gοξεικού ψευδαργύρου
Zn CH 3CΟΟ ðÞ2/C02H2Oκαι 3 gανύδρου οξεικού οξέος. Συµπλη-
ρούνται δι 'ύδατος έως 100 ml.
3.4.∆ιάλυµα CarrezΙΙ: διαλύονται εις ύδωρ 10,6 gσιδηροκυανιούχου
καλίου K4Fe CNðÞ6/C2/C3
/C03H2O:Συµπληρούνται δι 'ύδατος έως 100 ml.
3.5.Αιθανόλη 40 %(κ.ό.), d: 0,948στους 20 ºC.
4.Συσκευές
4.1.Κωνική φιάλη ( Erlenmeyer) 250 ml µε σύνηθες εσµυρισµένο πώµα
συνδεδεµένη µε κάθετο ψυκτήρα.
4.2.Πολωσίµετρο ή σακχαρόµετρο.
5.Τρόπος εργασίας
5.1.Προετοιµασία του δείγµατος
Κονιοποιείται το δείγµα σε τρόπο ώστε να διέρχεται όλη η
ποσότητα αυτού δια µέσου κοσκίνου στρογγυλών οπών διαµέτρου
0,5mm.
5.2.Προσδιορισµός της συνολικής οπτικής στροφικής ικανότητος (Ρ ή S)
(βλέπε παρατήρηση 7.1.)
Ζυγίζονται 2,5 gκονιοποιηµένου δείγµατος µε προσέγγιση 1 mg
και εισάγονται εντός ογκοµετρικής φιάλης των 100 ml.
Προστίθενται 25 mlυδροχλωρικού οξέος (3.2.), ανακινούνται
προς επίτευξιν καλής κατανοµής της ποσότητας του δείγµατος
και προστίθενται εκ νέου έτερα 25 mlυδροχλωρικού οξέος (3.2.).
Εµβαπτίζεται η φιάλη εντός ζέοντος υδρολούτρου και κατά τη
διάρκεια των πρώτων εποµένων 3 ′ανακινείται ισχυρώς και
σταθερώς προς αποφυγή σχηµατισµού συσσωµατώσεων. Η
ποσότητα του ύδατος στο υδρόλουτρο πρέπει να είναι επαρκής
για να επιτρέπει τη διατήρηση τον λουτρού στο σηµείο βρασµού
κατά το χρονικό διάστηµα της παραµονής της φιάλης εντός αυτού.
Η φιάλη δεν πρέπει να εξέρχεται του λουτρού κατά τη διάρκεια1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 4
▼M5
▼M5
της ανακινήσεως. Μετά πάροδο 15 ′ακριβώς εξάγεται η φιάλη εκ
του λουτρού, προστίθενται 30 mlψυχρού ύδατος και ψύχεται
αµέσως εις 20 ºC.
Προστίθενται 5 mlδιαλύµατος CarrezΙ (3.3.) και ανακινείται επί
1′.Προστίθενται ακολούθως 5 mlδιαλύµατος CarrezΙΙ (3.4.) και
ανακινείται εκ νέου επί 1 ′.Συµπληρούται ο όγκος της φιάλης δι '
ύδατος, οµοιογενοποιείται και διηθείται. Εάν το διήθηµα δεν είναι
πλήρως διαυγές (σπάνια περίπτωση) επαναλαµβάνεται ο προσδιο-
ρισµός µε τη χρησιµοποίηση µεγαλυτέρων ποσοτήτων
διαλυµάτων CarrezΙ και ΙΙ, επί παραδείγµατι 10 ml.
Μετριέται ακολούθως η στροφική ικανότητα του διαλύµατος
εντός σωλήνας 200 mmµε πολωσίµετρο ή σακχαρόµετρο.
5.3.Προσδιορισµός της στροφικής ικανότητος (Ρ ή S)των διαλυτών
προσµίξεων σε αιθανόλη 40 %
Ζυγίζονται 5 gδείγµατος µε προσέγγιση 1 mg,εισάγονται εντός
ογκοµετρικής φιάλης των 100 mlκαι προστίθενται 80 mlπερίπου
αιθανόλης (3.5.) (βλέπε παρατήρηση 7.2.). Αφήνεται η φιάλη σε
ηρεµία επί 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Κατά τη διάρκεια
του χρονικού αυτού διαστήµατος ανακινείται ισχυρώς έξι φορές
κατά τέτοιο τρόπο ώστε η ποσότητα του δείγµατος να αναµιχθεί
καλά µε την αιθανόλη. Συµπληρούται ακολούθως ο όγκος µετά
αιθανόλης (3.5.), οµοιογενοποιείται και διηθείται. Εισάγονται µε
σιφώνιο 50 mlτου διηθήµατος ( = 2,5 g δείγµατος) εντός της
κωνικής φιάλης των 250 ml,προστίθενται 2,1 mlυδροχλωρικού
οξέος (3,1) και ανακινείται ισχυρώς. Προσαρµόζεται κάθετος
ψυκτήρας στην κωνική φιάλη και βυθίζεται αύτη εντός ζέοντος
υδρολούτρου. Μετά 15 ′ακριβώς εξάγεται η κωνική φιάλη από το
υδρόλουτρο, µεταγγίζεται το περιεχόµενο αυτής εντός ογκοµε-
τρικής φιάλης των 100 mlεκπλύνοντας δι 'ελαφρώς ψυχρού
ύδατος και ψύχεται µέχρις 20 ºC.∆ιαυγάζεται ακολούθως µε τη
χρήση των διαλυµάτων CarrezΙ (3.3.) και ΙΙ (3.4.), συµπληρούται
ο όγκος δι 'ύδατος, οµοιογενοποιείται, διηθείται και µετριέται η
στροφική ικανότητα όπως υποδεικνύεται στο σηµείο 5.2, δεύτερη
και τρίτη παράγραφος.
6.Υπολογισµός των αποτελεσµάτων
Η επί τοις εκατό περιεκτικότητα σε άµυλο του δείγµατος υπολογίζεται
ως ακολούθως:
6.1.Μετρήσεις διενεργούµενες µε πολωσίµετρο
περιεκτικ ´οτητα σε ´αµυλο ð%Þ¼2000 P - P0ðÞ
α½/C13820º
D
P= συνολική στροφική ικανότης σε βαθµούς
Ρ′=στροφική ικανότης εις βαθµούς διαλυτών προσµίξεων σε
αιθανόλη 40 %
α½/C13820º
D=η ειδική στροφική ικανότης καθαρού αµύλου. Οι συµβα-
τικώς παραδεδεγµένες τιµές του συντελεστού αυτού είναι
οι κάτωθι:
+ 185,9º: άµυλο ορύζης
+ 185,4º: άµυλο γεωµήλων
+ 184,6º: άµυλο αραβοσίτου
+ 182,7º: άµυλο σίτου
+ 181,5º: άµυλο κριθής
+ 181,3º: άµυλο βρώµης
+ 184,0º: έτεροι τύποι και µίγµατα αµύλου των συνθέτων
τροφών
6.2.Μετρήσεις διενεργούµενες µε σακχαρόµετρο
περιεκτικ ´οτητα σε ´αµυλο ð%Þ¼2000
α½/C13820º
D/C22N/C20;665 ðÞ /C2 S-S0ðÞ
100-26;6N/C2S-S0ðÞ
α½/C13820º
D
S= συνολική στροφική ικανότητα σε σακχαροµετρικούς
βαθµούς.
S′=στροφική ικανότητα σε σακχαροµετρικούς βαθµούς των
διαλυτών προσµίξεων, σε αιθανόλη 40 %.1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 5
▼M5
N= βάρος σε gσακχαρόζης εντός 100 mlύδατος παρέχοντα
στροφική ικανότητα 100 σακχαροµετρικών βαθµών εντός
σωλήνος 200 mm.
16,29 gδια γαλλικά σακχαρόµετρα,
26,00 gδια γερµανικά σακχαρόµετρα,
20,00 gδι'έτερα σακχαρόµετρα.
α½/C13820º
D=ειδική στροφική ικανότης καθαρού αµύλου (βλέπε 6.1.).
6.3.Επαναληπτικότητα
Η διαφορά των αποτελεσµάτων των διενεργουµένων δύο παραλ-
λήλων προσδιορισµών του αυτού δείγµατος δεν πρέπει να
υπερβαίνει το 0,4 σε απόλυτη τιµή για περιεκτικότητα αµύλου
µικρότερη του 40 %και 1,1 %σε σχετική τιµή για περιεκτικότητα
αµύλου ίση ή µεγαλύτερη του 40 %.
7.Παρατηρήσεις
7.1.Εάν το δείγµα περιέχει ανθρακικά άλατα πλέον του 6 %εκφρα-
σµένα σε ανθρακικά άλατα ασβεστίου, πρέπει αυτά να
εξουδετερωθούν δια κατεργασίας µε τη χρήση της απαιτουµένης
ακριβούς ποσότητας αραιωµένου θειικού οξέος, προ του προσδιο-
ρισµού της συνολικής στροφικής ικανότητος.
7.2.Στην περίπτωση προϊόντων µε υψηλή περιεκτικότητα σε λακτόζη,
όπως η σκόνη ορρού γάλακτος ή το αποβουτυρωµένο γάλα,
διενεργούνται τα κάτωθι κατόπιν προσθήκης 80 mlαιθανόλης
(3.5.). Προσαρµόζεται κάθετος ψυκτήρ στη φιάλη, εµβαπτίζεται η
φιάλη σε υδρόλουτρο 50 ºCεπί 30′.Αφήνεται ακολούθως να
ψυχθεί και συνεχίζεται η ανάλυση όπως υποδεικνύεται ανωτέρω
στο σηµείο 5.3.
7.3.Οι ακόλουθες πρώτες ύλες ζωοτροφών, σε περίπτωση παρουσίας
τους σε σηµαντική ποσότητα στις ζωοτροφές, είναι γνωστό ότι
προκαλούν παράσιτα κατά τον προσδιορισµό της περιεκτικότητας
σε άµυλο µε την πολωσιµετρική µέθοδο και ως εκ τούτου ενδέ-
χεται να προκύψουν εσφαλµένα αποτελέσµατα:
—προϊόντα (ζάχαρο)τεύτλων όπως πούλπα (ζάχαρο)τεύτλων,
µελάσα (ζάχαρο)τεύτλων, µελασωµένη πούλπα (ζάχαρο)-
τεύτλων, βινάσα (ζάχαρο)τεύτλων, ζάχαρη (ζάχαρο)τεύτλων,
—πούλπα εσπεριδοειδών,
—λιναρόσπορος ·πλακούντες έκθλιψης λιναρόσπορου ·
πλακούντες εκχυλισµένου λιναρόσπορου,
—σπόροι κράµβης ·πλακούντες έκθλιψης κραµβόσπορων
πλακούντες εκχυλισµένων κραµβόσπορων ·φλοιοί κραµβό-
σπορων,
—ηλιανθόσπορος ·πλακούντες εκχυλισµένου ηλιανθόσπορου ·
πλακούντες εκχυλισµένου µερικώς αποφλοιωµένου ηλιανθό-
σπορου,
—πλακούντες έκθλιψης φοινικοκαρυάς,
—πλακούντες εκχυλισµένης φοινικοκαρυάς,
—πούλπα γεωµήλων,
—αφυδατωµένη µαγιά,
—προϊόντα πλούσια σε ινουλίνη (π.χ. κατάλοιπα επεξεργασίας
και άλευρα κολοκασίου),
—υπολείµµατα ζωικού λίπου.
2.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΟΛΙΚΩΝ ΑΖΩΤΟΥΧΩΝ ΟΥΣΙΩΝ
1.Αντικείµενο και πεδίο εφαρµογής
Η µέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισµό της περιεκτικότητας των
ζωοτροφών σε ολικές αζωτούχες ουσίες βάσει της περιεκτικότητας
σε άζωτο, όπως αυτή προσδιορίζεται µε τη µέθοδο Kjeidahl.
2.Αρχή
Το δείγµα ανοργανοποιείται µε θειικό οξύ παρουσία καταλύτου. Το
όξινο διάλυµα καθίσταται αλκαλικό µε διάλυµα υδροξειδίου του
νατρίου. Η αµµωνία αποστάζεται και συλλέγεται µέσα σε καθορισµένη
ποσότητα θειικού οξέος, η περίσσεια του οποίου ογκοµετρείται µε
διάλυµα υδροξειδίου του νατρίου.1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 6
▼M3
▼M3
3.Αντιδραστήρια
3.1Θειικό κάλιο
3.2Καταλύτης: οξείδιο του (δισθενούς) χαλκού ( CuO)ή θειικός
χαλκός πεντάκις (δισθενής) ένυδρος ( CuSO4·5 H2O)
3.3Ψευδάργυρος υπό µορφή κόκκων
3.4Θειικό οξύ, πυκνότητας ρ20= 1,84 g/ml
3.5Θειικό οξύ συγκεντρώσεως C(½H2SO4) = 0,5 mol/l
3.6Θειικό οξύ συγκεντρώσεως C(½H2SO4) = 0,1 mol/l
3.7∆είκτης Ερυθρό του µεθυλίου ·διαλύονται 300 mgερυθρού του
µεθυλίου σε 100 mlαιθανόλης, σ = 95 — 96 % (V/V)
3.8∆ιάλυµα υδροξειδίου του νατρίου (µπορεί να χρησιµοποιηθεί
διάλυµα του εµπορίου για τεχνικές χρήσεις) β = 40 g/100ml (m/v:
40 %)
3.9∆ιάλυµα υδροξειδίου του νατρίου συγκεντρώσεως C = 0,25 mol/l
3.10∆ιάλυµα υδροξειδίου του νατρίου συγκεντρώσεως C = 0,1 mol/l
3.11Ελαφρόπετρα υπό µορφή κόκκων, η οποία έχει πλυθεί σε
υδροχλωρικό οξύ και υποβληθεί σε ανάφλεξη
3.12Ακετανιλίδιο (σ.τ. = 114º C, άζωτο 10,36 %)
3.13Σακχαρόζη (ελεύθερη αζώτου)
4.Όργανα
Συσκευή κατάλληλη για ανοργανοποίηση, απόσταξη και ογκοµέτρηση
σύµφωνα µε τη µέθοδο Kjeldahl
5.∆ιαδικασία
5.1Ανοργανοποίηση
Ζυγίζουµε 1 gτου δείγµατος µε ακρίβεια 0,001 gκαι το εισάγουµε
στη φιάλη της συσκευής ανοργανοποίησης. Προσθέτουµε 15 g
θειικού καλίου (3.1), την ενδεδειγµένη ποσότητα καταλύτου (3.2)
(0,3 έως 0,4 g CuOή 0,9 έως 1,2 g CuSO4·5 H2O), 25 ml θειικού
οξέος (3.4) και µερικούς κόκκους ελαφρόπετρας και αναµει-
γνύουµε. Θερµαίνουµε τη φιάλη µετρίως στην αρχή, ανακινώντας
από καιρού σε καιρό εάν είνα απαραίτητο µέχρις ότου απανθρακ-
ωθεί η µάζα και εξαφανισθεί ο αφρός ·εν συνεχεία θερµαίνουµε
περισσότερο µέχρις ότου το υγρό αρχίσει να βράζει σταθερά. Η
θέρµανση είναι επαρκής όταν οι ατµοί του ζέοντος οξέος υγρο-
ποιούνται πάνω στα τοιχώµατα της φιάλης. Πρέπει να
αποφεύγεται η υπερθέµανση των πλευρικών τοιχωµάτων καθώς
και η προσκόλληση οργανικών σωµατιδίων επ 'αυτών. Όταν το
διάλυµα καταστεί διαυγές και αποκτήσει ανοικτό πράσινο χρώµα,
αφήνεται να βράσει επί δύο ώρες και εν συνεχεία αφήνεται να
ψυχθεί.
5.2Απόσταξη
Προσθέτουµε µε προσοχή ικανή ποσότητα ύδατος ώστε τα θειικά
άλατα να διαλυθούν πλήρως. Αφήνουµε το διάλυµα να ψυχθεί και
προσθέτουµε εν συνεχεία µερικούς κόκκους ψευδαργύρου (3.3).
Εισάγουµε στη φιάλη συλλογής της αποστακτικής συσκευής 25 ml
(µε ακρίβεια µετρηµένα) θειικού οξέος (3.5) ή (3.6) ανάλογα µε
την κατ 'εκτίµηση αναµενόµενη περιεκτικότητα σε άζωτο.
Προσθέτουµε µερικές σταγόνες ερυθρού του µεθυλίου (3.7).
Συνδέουµε τη φιάλη ανοργανοποίησης µε το συµπυκνωτή της
αποστακτικής συσκευής και βυθίζουµε το άκρο του συµπυκνωτή
στο υγρό της φιάλης συλλογής µέχρι βάθους 1 cmτουλάχιστον
(βλέπε παρατήρηση 8.3). Προσθέτουµε βραδέως 100 mlδιαλύµατος
υδροξειδίου του νατρίου (3.8) στη φιάλη ανοργανοποίησης προσέ-
χοντας ώστε να µη σηµειωθεί απώλεια αµµωνίας (βλέπε
παρατήρηση 8.1). Θερµαίνουµε τη φιάλη µέχρις αποστάξεως όλης
της αµµωνίας.
5.3Ογκοµέτρηση
Ογκοµετρείται η περίσσεια θειικού οξέος στη φιάλη συλλογής µε
διάλυµα υδροξειδίου του νατρίου (3.9) ή (3.10) αναλόγως της1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 7
▼M3
συγκεντρώσεως του χρησιµοποιηθέντος θειικού οξέος µέχρι το
τέλος της αντιδράσεως.
5.4Λευκήδοκιµή
Για να επιβεβαιωθεί ότι τα αντιδραστήρια είναι ελεύθερα αζώτου,
πραγµατοποιούµε µια λευκή δοκιµή (ανοργανοποίηση, απόσταξη
και ογκοµέτρηση) χρησιµοποιώντας 1 gσακχαρόζης (3.13) αντί
του δείγµατος.
6.Υπολογισµός των αποτελεσµάτων
Η περιεκτικότητα σε ολικές αζωτούχες ουσίες υπολογίζεται βάσει του
τύπου:
V0/C0V1 ðÞ /C2 c/C20;014/C2100/C26;25
m
όπου:
V0=ο όγκος (σε ml)τουNaOH (3.9 ή 3.10) που χρησιµοποιήθηκε
κατά τη λευκή δοκιµή
V1=ο όγκος (σε ml)τουNaOH (3.9 ή 3.10) που χρησιµοποιήθηκε
για την ογκοµέτρηση του δείγµατος
C=η συγκέντρωση (σε mol/l)τουNaOH (3.9 ή 3.10)
m=η µάζα του δείγµατος σε g.
7.Επαλήθευση της µεθόδου
7.1Επαναληπτικότητα
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων δύο παράλληλων προσδιο-
ρισµών διεξαχθέντων επί του αυτού δείγµατος δεν πρέπει ναυπερβαίνει:
το 0,2 %σε απόλυτη τιµή, για επίπεδα αζωτούχων ουσιών µικρό-
τερα από 20 %
το 1,0 %σε σχετική τιµή, για επίπεδα από 20 %έως 40 %και
το 0,4 %σε απόλυτη τιµή, για επίπεδα µεγαλύτερα από 40 %.
7.2Ακρίβεια της µεθόδου
Η ανάλυση (ανοργανοποίηση, απόσταξη και ογκοµέτρηση) διεξά-
γεται επί 1,5 έως 2,0 gακετανιλιδίου (3.12) παρουσία 1 g
σακχαρόζης (3.13). Για 1 gακετανιλιδίου απαιτούνται 14,80 ml
θειικού οξέος (3.5). Η επαναπόκτηση πρέπει να είναι τουλάχιστον
99%.
8.Παρατηρήσεις
8.1Η συσκευή µπορεί να είναι χειροκίνητη, ηµιαυτόµατη ή αυτόµατη.
Αν η συσκευή είναι τέτοια ώστε, µεταξύ ανοργανοποίησης και
απόσταξης, να χρειασθεί να γίνει µεταφορά, χρειάζεται προσοχή
ώστε κατά τη µεταφορά αυτή να µη σηµειωθούν απώλειες. Αν η
φιάλη της αποστακτικής συσκευής δεν διαθέτει σταγονοµετρικό
χωνί, προσθέτουµε το υδροξείδιο του νατρίου αµέσως πριν από τη
σύνδεση της φιάλης στο συµπυκνωτή, ρίχνοντας το υγρό σιγά -
σιγά.
8.2Εάν το προκύπτον από την ανοργανοποίηση υγρό πήγνυται,
προβαίνουµε σε νέο προσδιορισµό χρησιµοποιώντας µεγαλύτερη
ποσότητα θειικού οξέος (3.4) από την ανωτέρω οριζόµενη.
8.3Για προϊόντα χαµηλής περιεκτικότητας σε άζωτο, ο όγκος του
θειικού οξέος (3.6) που εισάγεται στη φιάλη συλλογής µπορεί να
µειωθεί, αν χρειασθεί, σε 10 ή 15 mlκαι να συµπληρωθεί µε νερό
µέχρι τα 25 ml.1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 8
▼B
3.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΑΚΑΤΕΡΓΑΣΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΩΝ
∆ΙΑΛΥΤΩΝ ΥΠΟ ΤΗΣ ΠΕΨΙΝΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ Υ∆ΡΟΧΛΩΡΙΚΟΥ
ΟΞΕΟΣ
1.Αντικείµενο και πεδίο εφαρµογής
Η µέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισµό του µέρους των ακατεργάστων
πρωτεϊνών των διαλυτών υπό της πεψίνης και του υδροχλωρικού οξέος
υπό καθορισµένες συνθήκες. Η µέθοδος είναι εφαρµόσιµη για όλες τις
τροφές.
2.Αρχή
Το δείγµα υπόκειται σε κατεργασία επί 48 ώρες εις 40 ºCµετά διαλύ-
µατος υδροχλωρικής πεψίνης. Το αιώρηµα διηθείται και η
περιεκτικότητα σε άζωτο του διηθήµατος προσδιορίζεται κατά την
περιγραφοµένη µέθοδο προσδιορισµού των ακατεργάστων πρωτεϊνών.
3.Αντιδραστήρια
3.1Υδροχλωρικό οξύ, d: 1,125.
3.2Υδροχλωρικό οξύ 0,075 N.
3.3 2.0 U/mg πεψίνης ·η δραστικότητα αυτή καθορίζεται κατά τη
µέθοδο η οποία περιγράφεται στο 4ο µέρος του παρόντος παραρτή-
µατος και πρέπει να ελέγχεται κατά τη µέθοδο αυτή.
3.4Προσφάτως παρασκευασθέν διάλυµα πεψίνης 0,02 %(κ.ό) περίπου
εις υδροχλωρικό οξύ (3.2) ·δραστικότης: 400 U/l.
3.5Αντιαφρώδες γαλάκτωµα (σιλικόνη επί παραδείγµατι).
3.6Όλα τα αντιδραστήρια τα οποία αναφέρονται εις το 3 της µεθόδου
του προσδιορισµού των ακατεργάστων πρωτεϊνών.
4.Συσκευές
4.1Υδρόλουτρο ή επωαστικός κλίβανος, ρυθµιζόµενος σε 40 ºC ± 1 ºC.
4.2Συσκευές µεταλλοποιήσεως και αποστάξεως κατά Kjeldahl.
5.Τρόπος εργασίας
5.1Προετοιµασία του διαλύµατος (ίδε παρατήρηση 7.2)
Ζυγίζονται 2 gδείγµατος µε προσέγγιση 1 mg.Εισάγεται η
ποσότης του δείγµατος εντός ογκοµετρικής φιάλης των 500 mlκαι
προστίθενται 450 mlδιαλύµατος υδροχλωρικής πεψίνης (3.4)
πρότερον θερµανθείσης εις 40 ºC.Ανακινείται κατά τρόπο ώστε ν '
αποφεύγεται η δηµιουργία συσσωµατώσεων. Ελέγχεται αν το pH
του αιωρήµατος είναι µικρότερο του 1,7. Η φιάλη τίθεται εντός
του υδρολούτρου ή του επωαστικού κλιβάνου (4.1) και αφήνεται
εκεί επί 48 ώρες. Ανακινείται κατόπιν 8, 24 και 32 ωρών. Μετά
48 ώρες, προστίθενται 15 mlυδροχλωρικού οξέος (3.1), ψύχεται
µέχρι 20 ºC,συµπληρούται ο όγκος µε ύδωρ και διηθείται.
5.2Μεταλλοποίηση
Λαµβάνονται 250 mlτου διηθήµατος και εισάγονται εντός της
φιάλης της συσκευής αποστάξεως (4.2). Προστίθενται τα
απαραίτητα για τη µεταλλοποίηση αντιδραστήρια, ως δεικνύεται
εις 5.1, δευτέρα φράσις της µεθόδου του προσδιορισµού των
ακατεργάστων πρωτεϊνών.
Οµοιογενοποιείται και θερµαίνεται µέχρι βρασµού. Αν σχηµατι-
σθεί αφρός προστίθενται µερικές σταγόνες αντιαφρώδους
γαλακτώµατος (3.5). ∆ιατηρείται ο βρασµός ισχυρός µέχρι
πλήρους σχεδόν εξατµίσεως του ύδατος. Ελαττούται η ένταση της
θερµάνσεως και εξαλείφεται µετά προσοχής και το τελευταίο
ίχνος ύδατος. Όταν το διάλυµα παρουσιάζεται διαυγές και άχρουν
(ή ανοικτό πράσινο επί παρουσία καταλύτου µε βάση το χαλκό),
συνεχίζεται ο βρασµός επί 1 ώρα ακόµη. Ακολούθως αφήνεται να
ψυχθεί.
5.3Απόσταξη και ογκοµετρικήτιτλοδότηση
∆ιενεργείται όπως υποδεικνύεται εις 5.2 και 5.3 της µεθόδου του
προσδιορισµού των ακατεργάστων πρωτεϊνών.1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 9
▼B
5.4Τυφλό πείραµα
∆ιενεργείται τυφλό πείραµα εφαρµοζοµένου του ανωτέρω τρόπου
εργασίας, απουσία του προς ανάλυση δείγµατος.
6.Υπολογισµός των αποτελεσµάτων
Αφαιρείται ο όγκος του καταναλωθέντος θειικού οξέος δια τυφλού
πειράµατος εκ του ηναλωθέντος υπό της ποσότητος του δείγµατος.
1mlθειικού οξέος 0,1 Nαντιστοιχεί εις 1,4 mgαζώτου.
Πολλαπλασιάζεται η ποσότης του αζώτου επί τον συντελεστή 6,25. Το
αποτέλεσµα εκφράζεται επί τοις εκατό του δείγµατος.
Επαναληπτικότητα
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων των διενεργουµένων δύο
παραλλήλων προσδιορισµών επί του αυτού δείγµατος δεν πρέπει να
υπερβαίνει το:
— 0,4εις απόλυτο τιµή, για περιεκτικότητες µικρότερες του 20 %·
— 2,0% εις σχετική τιµή, για περιεκτικότητες περιλαµβανόµενες
µεταξύ 20 και 40 %·
— 0,8εις απόλυτο τιµή, για περιεκτικότητες ανώτερες του 40 %.
7.Παρατηρήσεις
7.1Οι επιτυγχανόµενες τιµές υπό της παρούσης µεθόδου δεν
συνδέονται αµέσως µετά της πεπτικότητος in vivo .
7.2Τα προϊόντα των οποίων η περιεκτικότητα σε λιπαρές ουσίες
υπερβαίνει το 10 %πρέπει προηγουµένως να υφίστανται απολί-
πανση δι 'εκχυλίσεως δια πετρελαϊκού αιθέρος (σ.ζ. 40 —60 ºC).
4.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ∆ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΟΣ ΤΗΣ ΠΕΨΙΝΗΣ
1.Αντικείµενο και πεδίο εφαρµογής
Η µέθοδος επιτρέπει τον έλεγχο της δραστικότητος της χρησιµο-
ποιουµένης πεψίνης για τον προσδιορισµό των ακατεργάστων
πρωτεϊνών των διαλυτών υπό της πεψίνης και του υδροχλωρικού
οξέος.
2.Αρχή
Η αιµοσφαιρίνη υφίσταται κατεργασία υπό καθορισµένας συνθήκας
δια πεψίνης εις περιβάλλον υδροχλωρικού οξέος. Το µέρος των µη
υδρολυοµένων πρωτεϊνών κατακρηµνίζεται δια τριχλωροξεικού οξέος.
Στο διήθηµα προστίθεται υδροξείδιον του νατρίου και αντιδραστήριο
Folin-Ciocalteu. Η οπτική πυκνότητα του διαλύµατος αυτού µετράται
σε 750 nmκαι η αντιστοιχούσα ποσότητα τυροζίνης αναγιγνώσκεται
επί καµπύλης µετρήσεων.
Ορισµός: Ως µονάδα πεψίνης ορίζεται η ποσότητα εκείνου του ενζύµου
το οποίο, υπό τας συνθήκας της µεθόδου, απελευθερώνει κατά πρώτο
λεπτό ποσότητα οµάδων υδροξυλαρίνης των οποίων ο χρωµατισµός
υπό του αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteu έχει οπτική πυκνότητα αντι-
στοιχούσα προς εκείνη µιας µmoleτυροζίνης κεχρωσµένης µε τις
αυτές συνθήκες.
3.Αντιδραστήρια
3.1Υδροχλωρικό οξύ 0,2 N.
3.2Υδροχλωρικό οξύ 0,06 N.
3.3Υδροχλωρικό οξύ 0,025 N.
3.4∆ιάλυµα 5 %(κ.ό.) τριχλωροξεικού οξέος.
3.5∆ιάλυµα υδροξειδίου του νατρίου 0,5 N.
3.6Αντιδραστήριον Folin-Ciocalteu: Εισάγονται 100 gβολφραµικού
νατρίου ( Na2WO4.2H2O), 25 g µολυβδαινικού νατρίου
(Na2MoO4.2H2O)και 700 mlύδατος εντός φιάλης στρογγυλεµένου
πυθµένος των 2 λίτρων µετά εσµυριδωµένου στοµίου.
Προστίθενται 50 mlφωσφορικού οξέος ( d: 1,71)και 100 mlπυκνού
υδροχλωρικού οξέος ( d: 1,19), προσαρµόζεται στη φιάλη κάθετος
ψυκτήρ, θερµαίνεται µέχρι βρασµού και διατηρείται το διάλυµα
σε ήρεµο βρασµό επί 10 ώρες. Αφήνεται να ψυχθεί, αποσυνδέεται1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 10
▼B
ο κάθετος ψυκτήρ, προστίθενται 175 gθειικού λιθίου
(Li2SO4.2H2O), 50 ml ύδατος και 1 mlβρωµίου. Βράζει επί 15 πρώτα
λεπτά προς αποµάκρυνση της περισσείας βρωµίου.
Αφήνεται να ψυχθεί, µεταγγίζεται το διάλυµα σε ογκοµετρική
φιάλη 1 λίτρου, συµπληρώνεται ο όγκος δι 'ύδατος, οµοιογενο-
ποιείται και διηθείται. ∆εν πρέπει να παραµείνει πρασινωπός
χρωµατισµός. Προ της εργασίας, αραιούται 1 όγκος του αντι-
δραστηρίου µετά 2 όγκων ύδατος.
3.7∆ιάλυµα αιµοσφαιρίνης: Ζυγίζεται ποσότητα αιµοσφαιρίνης,
πρωτεϊνικό υπόστρωµα κατά Anson, (2 γραµµάρια περίπου) τα
οποία αντιστοιχούν εις 354 mgαζώτου (1)και εισάγονται ταύτα
εντός φιάλης 200 mlµετά εσµυριδωµένου στοµίου. Προστίθενται
µερικά mlυδροχλωρικού οξέος (3.2), συνδέεται η φιάλη µετά της
αντλίας κενού και ανακινείται µέχρι πλήρους διαλύσεως της
αιµοσφαιρίνης. ∆ιακόπτεται το κενό και προστίθεται ανακινώντας
υδροχλωρικό οξύ (3.2) µέχρι συµπληρώσεως 100 ml.Παρασκευά-
ζεται αµέσως προ της χρήσεως .
3.8Πρότυπον διάλυµα τυροζίνης: ∆ιαλύονται 181,2 mgτυροζίνης
εντός υδροχλωρικού οξέος (3.1) και συµπληρούται µέχρις ενός (1)
λίτρου δια του ιδίου οξέος (αρχικό διάλυµα). Λαµβάνονται 20,0 ml
και αραιούνται εις 100 mlδι'υδροχλωρικού οξέος (3.1). Εν (1) ml
του διαλύµατος αυτού περιέχει 0,2 µmoleτυροζίνης.
4.Συσκευές
4.1Υδρόλουτρο ρυθµιζόµενο εις 25 ºC ± 0,1 ºC δι'υπερθερµοστάτου.
4.2Φασµατοφωτόµετρο.
4.3Χρονόµετρο, ακρίβεια: 1 δευτερόλεπτο.
4.4 pH-µέτρο.
5.Τρόπος εργασίας
5.1Προετοιµασία του διαλύµατος (ιδέ παρατήρηση 7.1)
∆ιαλύονται 150 mgπεψίνης εντός 100 mlυδροχλωρικού οξέος
(3.2). Λαµβάνονται δια του σιφωνίου 2 mlδιαλύµατος, εισάγονται
ταύτα εντός ογκοµετρικής φιάλης των 50 mlκαι συµπληρούται ο
όγκος δι 'υδροχλωρικού οξέος (3.3). Το pH,ελεγχόµενο δια του
pH-µέτρου, πρέπει να είναι 1,6 ± 0,1.Εµβαπτίζεται η φιάλη εντός
του υδρολούτρου (4.1).
5.2Υδρόλυση
Εισάγονται δια του σιφωνίου εντός του δοκιµαστικού σωλήνος
5,0mlδιαλύµατος αιµοσφαιρίνης (3.7), θερµαίνονται εις 25 ºC
εντός του υδρολούτρου (4.1), προστίθεται 1,0 mlδιαλύµατος
πεψίνης, ως τούτο επιτυγχάνεται εις 5.1 και αναµιγνύεται δια της
χρήσεως υαλίνης ράβδου, πεπλατυσµένης εις εν άκρον δια 10
περίπου κινήσεων εµπρός και πίσω. ∆ιατηρείται ο δοκιµαστικός
σωλήν εντός του υδρολούτρου εις 25 ºCεπί 10 πρώτα λεπτά
ακριβώς, µετρούµενα από της προσθήκης διαλύµατος πεψίνης (η
διάρκεια και η θερµοκρασία πρέπει µετά σχολαστικότητος να
παρακολουθούνται). Προστίθενται ακολούθως 10,0 mlδιαλύµατος
τριχλωροξεικού οξέος (3.4) θερµανθέντων προηγουµένως εις 25 ºC,
οµοιογενοποιείται και διηθείται δια ξηρού φίλτρου.
5.3Ανάπτυξη χρωµατισµού και µέτρηση της οπτικής πυκνότητος
Λαµβάνονται δια του σιφωνίου 5,0 mlδιηθήµατος, εισάγονται
ταύτα εντός κωνικής φιάλης 50 ml,προστίθενται 10,0 mlδιαλύ-
µατος υδροξειδίου του νατρίου (3.5) και, ανακινώντας σταθερά,
3,0mlτου αραιωµένου αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteu (3.6). Μετά
από 5 έως 10 πρώτα λεπτά προσδιορίζεται η οπτική πυκνότητα
του διαλύµατος στο φασµατοφωτόµετρο εις 750 nmεντός κυψε-
λίδων πάχους 1 cm,δια συγκρίσεως µεθ 'ύδατος.1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 11
(1)Προσδιορίζεται η περιεκτικότης αζώτου µε την ηµιµικροµέθοδον Kjeldahl
(θεωρητική περιεκτικότης: 17,7 %αζώτου).
▼B
5.4Τυφλό πείραµα
Για κάθε προσδιορισµό διενεργείται τυφλό πείραµα ως
ακολούθως:
Εισάγεται δια του σιφωνίου δοκιµαστικού σωλήνος ποσότης 5,0 ml
διαλύµατος αιµοσφαιρίνης (3.7), θερµαίνεται σε 25 ºCεντός υδρο-
λούτρου (4.1), προστίθενται 10,0 mlδιαλύµατος τριχλωροξεικού
οξέος (3.4), πρότερον θερµανθέντος εις 25 ºC,οµοιογενοποιείται
και προστίθεται ακολούθως 1,0 mlδιαλύµατος πεψίνης ως αύτη
επιτυγχάνεται εις 5.1. Αναµιγνύεται δια της χρήσεως υαλίνης
ράβδου και διατηρείται ο δοκιµαστικός σωλήν εντός του υδρολού-
τρου εις 25 ºCεπί 10 πρώτα λεπτά ακριβώς (4.1).
Οµοιογενοποιείται και διηθείται σε ξηρό φίλτρο. Ακολουθείται ο
τρόπος εργασίας όπως υποδεικνύεται εις 5.3.
5.5Καµπύλη µετρήσεων
Εισάγονται εντός κωνικών φιαλών των 50 mlόγκοι 1.0, 2.0, 3.0, 4.0
και 5.0 mlτου προτύπου διαλύµατος τυροζίνης (3.8), ανταποκρινό-
µενοι αντιστοίχως σε ποσότητες τυροζίνης 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 και
1.0µmoles.Συµπληρούται η σειρά δια µάρτυρος απηλλαγµένου
τυροζίνης. Συµπληρούνται οι όγκοι µέχρι 5.0 mlδια της χρήσεως
υδροχλωρικού οξέος (3.1). Προστίθενται 10,0 mlδιαλύµατος υδρο-
ξειδίου του νατρίου (3.5) και, ανακινώντας σταθερά, 3,0 ml
αραιωµένου αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteu (3.6). Μετριέται η
οπτική πυκνότητα όπως αποδεικνύεται στο 5.3, τελευταία φράση.
Σύρεται η καµπύλη µετρήσεων δια τοποθετήσεως των οπτικών
πυκνοτήτων έναντι των ποσοτήτων τυροζίνης.
6.Υπολογισµός των αποτελεσµάτων
Αναγιγνώσκεται επί της καµπύλης µετρήσεων η ποσότητα της τυρο-
ζίνης, εις µmole,η αντιστοιχούσα στην οπτική πυκνότητα του
κεχρωσµένου διαλύµατος, διορθωµένου επί τη βάσει τυφλού πειρά-
µατος.
Η δραστικότητα της πεψίνης εις µmoleτυροζίνης ανά mgκαι ανά
πρώτο λεπτό εις 25 ºCδίδεται υπό του τύπου:
Μον´αδες αν´αmg U =mgðÞ ¼0;32α
p
όπου:
α=ποσότης τυροζίνης, εις µmole,αναγιγνωσκοµένης επί της
καµπύλης µετρήσεων ·
p=βάρος εις mgτης ποσότητος πεψίνης προστεθείσης εις 5.2.
7.Παρατηρήσεις
7.1Η ποσότης πεψίνης η οποία πρόκειται να διαλυθεί πρέπει να είναι
τοιαύτη ώστε, κατά την τελική φωτοµετρική µέτρηση, να
επιτυγχάνεται οπτική πυκνότητα 0,35 ± 0,035.
7.2Οι επιτυγχανόµενες δύο µονάδες ανά mgδια της παρούσης
µεθόδου αντιστοιχούν εις: 3,64 χιλιοµονάδες Anson/mg (µmole
τυροζίνης /mgεπί εν (1) πρώτο λεπτό εις 35,5 ºC),ή
36 400εµπορικές µονάδες /g (µmole τυροζίνης /gεπί 10 minεις
35,5ºC).
5.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣΤΗΣΕΛΕΥΘΕΡΑΣΚΑΙΣΥΝΟΛΙΚΗΣΓΚΟΣΣΥ-
ΠΟΛΗΣ
1.Αντικείµενο και πεδίο εφαρµογής
Η µέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισµό της ελευθέρας γκοσσυπόλης
(gossypol), της συνολικής γκοσσυπόλης και των χηµικώς σχετιζοµένων
ουσιών εντός σπόρων, αλεύρων και πλακούντων βάµβακος ως και
εντός συνθέτων τροφών οι οποίες περιέχουν τις ουσίες αυτές. Το
κατώτατο όριο προσδιορισµού είναι 20 ppm.
2.Αρχή
Η γκοσσυπόλη ( gossypol) εκχυλίζεται παρουσία 3 -αµινο-1-προπανόλης,
είτε δια µίγµατος ισοπροπανόλης και εξανίου δια τον προσδιορισµό
της ελευθέρας γκοσσυπόλης, είτε δια διµεθυλοφορµαµίδης δια τον
προσδιορισµό της συνολικής γκοσσυπόλης. Η γκοσσυπόλη µετατρέ-1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 12
▼B
πεται δια της ανιλίνης σε γκοσσυπόλη -διανιλίνη, της οποίας η οπτική
πυκνότητα µετριέται εις 440 nm.
3.Αντιδραστήρια
3.1Μίγµα ισοπροπανόλης -εξανίου: Αναµιγνύονται 60 µέρη κατ 'όγκον
ισοπροπανόλης χ.κ. εις 40 µέρη κατ 'όγκον κανονικού εξανίου.
3.2∆ιαλυτικόν µέσον Α: Τίθενται εντός ογκοµετρικής φιάλης του
ενός λίτρου 500 mlπερίπου του µίγµατος ισοπροπανόλης -εξανίου
(3.1), 2 ml 3-αµινο-1-προπανόλης, 8 mlανύδρου οξεικού οξέος και
50mlύδατος. Συµπληρούται ο όγκος δια µίγµατος ισοπροπανόλης -
εξανίου (3.1). Το αντιδραστήριο αυτό παραµένει σταθερό επί µια
εβδοµάδα.
3.3∆ιαλυτικό µέσο Β: Τίθενται δια σιφωνίου εντός ογκοµετρικής
φιάλης των 100 ml, 2 ml 3- αµινο-1-προπανόλης και 10 mlανύδρου
οξεικού οξέος. Ψύχεται σε θερµοκρασία περιβάλλοντος και
συµπληρούται ο όγκος δια Ν,Ν -διµεθυλοφροµαµίδης. Το αντιδρα-
στήριο τούτο παραµένει σταθερό για µια εβδοµάδα.
3.4Ανιλίνη χ.κ.: Αν η οπτικήπυκνότητα του τυφλού πειράµατος υπερ-
βαίνει το 0,022 ,αποστάζεται η ανιλίνη επί κόνεως ψευδαργύρου δι '
απορρίψεως των πρώτων και των τελευταίων 10 %µερών του
αποστάγµατος. Εντός πωµατισµένης φαιάς φιάλης και εντός
ψυγείου, το αντιδραστήριο αυτό διατηρείται επί πολλούς µήνες.
3.5Πρότυπον διάλυµα γκοσσυπόλης ( gossypol) Α: Τίθενται εντός
ογκοµετρικής φιάλης των 250 ml, 27,9 mg οξεικής γκοσσυπόλης.
∆ιαλύεται και συµπληρούται ο όγκος δια του διαλυτικού µέσου Α
(3.2). Εισάγονται δια σιφωνίου 50 mlτου διαλύµατος τούτου εντός
ογκοµετρικής φιάλης των 250 mlκαι συµπληρούται ο όγκος δια
του διαλυτικού µέσου Α. Η συµπύκνωση της γκοσσυπόλης του
διαλύµατος τούτου είναι 0,02 mg/ml.Αφήνεται εν ηρεµία επί µια
ώρα σε θερµοκρασία περιβάλλοντος προ της χρήσεως.
3.6Πρότυπο διάλυµα γκοσσυπόλης Β: Τίθενται εντός ογκοµετρικής
φιάλης των 50 ml, 27,9 mg οξεικής γκοσσυπόλης. ∆ιαλύεται και
συµπληρούται ο όγκος µε το διαλυτικό µέσο Β (3.3). Η
συµπύκνωση της γκοσσυπόλης του διαλύµατος τούτου είναι
0,5mg/ml.
Τα πρότυπα διαλύµατα γκοσσυπόλης Α και Β παραµένουν σταθερά επί
24 ώρας εφ 'όσον διατηρούνται µακράν του φωτός.
4.Συσκευές
4.1Αναµίκτης (ανατροπεύς): 35 περίπου στροφών ανά πρώτο λεπτό.
4.2Φασµατοφωτόµετρον.
5.Τρόπος εργασίας
5.1Ποσότητα δείγµατος
Η ποσότητα δείγµατος εξαρτάται από την υποτιθέµενη περιεκτι-
κότητα του δείγµατος σε γκοσσυπόλη. Είναι προτιµότερο η
εργασία να εκτελείται επί µικράς ποσότητος δείγµατος και επί
σχετικώς µεγάλου µέρους της ποσότητος του διηθήµατος, ώστε ναεπιτυγχάνεται επαρκής ποσότητα γκοσσυπόλης για τη διενέργεια
επακριβούς φωτοµετρικής µετρήσεως. Για τον προσδιορισµό της
ελεύθερης γκοσσυπόλης εντός των σπόρων βάµβακος, των αλεύρων
βάµβακος και των βαµβακοπλακούντων, η ποσότητα του δείγµατος
δεν πρέπει να υπερβαίνει το ένα γραµµάριο ·για σύνθετες τροφές
είναι δυνατό να ανέρχεται έως 5 γραµµάρια. Μέρος της ποσότητος
του διηθήµατος 10 mlείναι επαρκές για τις περισσότερες των
περιπτώσεων. Αυτό πρέπει να περιέχει 50 έως 100 µgγκοσσυ-
πόλης. Για τον προσδιορισµό της συνολικής γκοσσυπόλης, η
ποσότητα του δείγµατος πρέπει να κυµαίνεται µεταξύ 0,5 έως 5
γραµµάρια, ώστε µέρος της ποσότητος του διηθήµατος 2 µlνα
περιέχει 40 έως 200 µgγκοσσυπόλης.
Η ανάλυση πρέπει να διενεργείται σε θερµοκρασία περιβάλλοντος περί
τους 20 ºC.
5.2Προσδιορισµός ελεύθερης γκοσσυπόλης
Η ποσότητα του δείγµατος εισάγεται εντός φιάλης χαµηλού περι-
λαιµίου των 250 ml,της οποίας ο πυθµήν είναι καλυµµένος δι '
υαλοκόνεως. ∆ια του σιφωνίου προστίθενται 50 mlδιαλυτικού1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 13
▼B
µέσου Α (3.2), πωµατίζεται η φιάλη και αναµιγνύονται επί µια ώρα
εντός του αναµίκτου. ∆ιηθείται δια ξηρού φίλτρου και συλλέγεται
το διήθηµα εντός µικράς φιάλης χαµηλού περιλαιµίου. Κατά τη
διάρκεια της διηθήσεως καλύπτεται το χωνί δι 'υάλου ωρολογίου.
Εισάγονται δια του σιφωνίου εντός δύο ογκοµετρικών φιαλών των
25ml (Α και Β) αντιστοίχως τα αυτά µέρη των ποσοτήτων του
διηθήµατος τα οποία περιέχουν 50 έως 100 µgγκοσσυπόλης.
Συµπληρούται ο όγκος, εφ 'όσον παρίσταται ανάγκη, µέχρι 10 ml
δια της χρήσεως διαλυτικού µέσου Α (3.2). Συµπληρούται
ακολούθως το περιεχόµενο της φιάλης (Α) µέχρι του όγκου αυτής
δια µίγµατος ισοπροπανόλης -εξανίου (3.1). Το διάλυµα αυτό θα
χρησιµοποιηθεί σαν διάλυµα αναφοράς για τη µέτρηση του διαλύ-
µατος του δείγµατος.
Εισάγονται δια σιφωνίου 10 mlτου διαλυτικού µέσου Α (3.2) εντός
των δύο άλλων ογκοµετρικών φιαλών 25 ml (Γ και ∆) αντιστοίχως.
Συµπληρούται ο όγκος του περιεχοµένου της φιάλης (Γ) µε µίγµα
ισοπροπανόλης -εξανίου (3.1). Το διάλυµα αυτό θα χρησιµοποιηθεί
σαν διάλυµα αναφοράς για τη µέτρηση του διαλύµατος του τυφλού
πειράµατος.
Προστίθενται 2 mlανιλίνης (3.4) εντός εκάστης των φιαλών (∆)
και (Β) αντιστοίχως. Θερµαίνονται επί 30 πρώτα λεπτά επί ζέοντος
υδρολούτρου για την ανάπτυξη του χρωµατισµού. Ψύχονται σε
θερµοκρασία δωµατίου, συµπληρούνται οι όγκοι δια µίγµατος
ισοπροπανόλης -εξανίου (3.1), οµοιογενοποιούνται και αφήνονται
σε ηρεµία επί µια ώρα.
Προσδιορίζεται η οπτική πυκνότητα του διαλύµατος του τυφλού
πειράµατος (∆) δια συγκρίσεως µετά του διαλύµατος αναφοράς (Γ)
και η οπτική πυκνότητα του διαλύµατος του δείγµατος (Β) δια
συγκρίσεως µετά του διαλύµατος αναφοράς (Α) στο φασµατοφωτό-
µετρο σε 440 nm,εντός υαλίνων κυψελίδων 1 cm.
Αφαιρείται η οπτική πυκνότητα του διαλύµατος του τυφλού πειρά-
µατος από εκείνης του διαλύµατος του δείγµατος ( =διορθωµένη
οπτική πυκνότητα). Εκ της τιµής αυτής υπολογίζεται η περιεκτι-
κότητα της ελεύθερης γκοσσυπόλης, όπως υποδεικνύεται στο 6.
5.3Προσδιορισµός της συνολικής γκοσσυπόλης
Εισάγεται ποσότητα δείγµατος περιέχουσα 1 έως 5 mgγκοσσυ-
πόλης εντός ογκοµετρικής φιάλης των 50 mlκαι προστίθενται
10mlδιαλυτικού µέσου Β (3.3). Προετοιµάζεται συγχρόνως ένα
τυφλό πείραµα µε την εισαγωγή 10 mlδιαλυτικού µέσου Β (3.3)
εντός ετέρας ογκοµετρικής φιάλης των 50 ml.Θερµαίνονται οι
δύο φιάλες επί 30 πρώτα λεπτά εντός ζέοντος υδρολούτρου.
Ψύχονται σε θερµοκρασία δωµατίου και συµπληρούται το περιεχό-
µενο εκάστης φιάλης µέχρι πληρώσεως του όγκου αυτής δια του
µίγµατος ισοπροπανίου -εξανίου (3.1). Οµοιογενοποιείται και
αφήνεται εν ηρεµία για χρονικό διάστηµα 10 έως 15 πρώτων
λεπτών, ακουλούθως διηθείται και συλλέγεται το διήθηµα εντός
φιάλης χαµηλού περιλαιµίου.
Τίθενται 2 mlτου διηθήµατος του δείγµατος εντός δύο ογκοµε-
τρικών φιαλών των 25 mlαντιστοίχως και 2 mlτου διηθήµατος
του τυφλού πειράµατος εντός δύο ετέρων φιαλών των 25 mlαντι-
στοίχως. Λαµβάνεται µια φιάλη εξ εκάστης σειράς και
συµπληρούνται τα αντίστοιχα περιεχόµενα µέχρις 25 mlδια
µίγµατος ισοπροπανόλης -εξανίου (3.1). Τα διαλύµατα ταύτα θα
χρησιµοποιηθούν σαν διαλύµατα αναφοράς.
Προστίθενται 2 mlανιλίνης (3.4) εντός των δύο ετέρων φιαλών
αντιστοίχως. Θερµαίνονται επί 30 πρώτα λεπτά επί ζέοντος υδρο-
λούτρου για την ανάπτυξη του χρωµατισµού. Ψύχονται σε
θερµοκρασία δωµατίου, συµπληρούνται µέχρι 25 mlµε το µίγµα
ισοπροπανόλης -εξανίου (3.1), οµοιογενοποιούνται και αφήνονται
σε ηρεµία επί 1 ώρα.
Προσδιορίζεται η οπτική πυκνότητα, όπως δεικνύεται στο 5.2 για
την ελεύθερη γκοσσυπόλη. Εκ της τιµής υπολογίζεται η περιεκτι-
κότητα της συνολικής γκοσσυπόλης, όπως δεικνύεται στο 6.
6.Υπολογισµός των αποτελεσµάτων
Ο υπολογισµός των αποτελεσµάτων είναι δυνατό να διενεργηθεί είτε
εκ της ειδικής οπτικής πυκνότητος (6.1), είτε δι 'αναφοράς στην
καµπύλη µετρήσεων (6.2).1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 14
▼B
6.1Με την ειδικήοπτικήπυκνότητα
Υπό τας περιγραφείσας συνθήκας είναι οι ακόλουθοι:
ελεύθερη γκοσσυπόλη: E1%
1c m¼625
συνολική γκοσσυπόλη: E1%
1c m¼600
Η περιεκτικότητα σε ελεύθερη και συνολική γκοσσυπόλη του
δείγµατος δίδεται υπό του κάτωθι τύπου:
γκοσσυπ ´ολη%¼E/C11250
E1%
1c m/C1p/C1a
όπου:
E=διορθωµένη οπτική πυκνότητα, προσδιοριζόµενη όπως δείχ-
νεται στο 5.2,
p=ποσότητα δείγµατος σε γραµµάρια,
α=µέρος ποσότητος του διηθήµατος εις ml.
6.2∆ι'αναφοράς στην καµπύλη µετρήσεων
6.2.1Ελεύθερη γκοσσυπόλη
Προετοιµάζονται 2 σειρές από 5 ογκοµετρικές φιάλες των
25ml.Εισάγονται δια του σιφωνίου εντός των φιαλών
εκάστης σειράς όγκοι 2,0 — 4,0 — 6,0 — 8,0 και 10,0 mlτου
προτύπου διαλύµατος γκοσσυπόλης Α (3,5). Συµπληρούνται
οι όγκοι έως 10 mlδιαδιαλυτικού µέσου Α (3.2). Συµπλη-
ρούται εκάστη σειρά δια µάρτυρος αποτελουµένου εκ µιας
ογκοµετρικής φιάλης των 25 mlπεριέχουσα µόνο 10 ml
διαλυτικού µέσου Α (3.2).
Συµπληρούνται µέχρις 25 mlοι όγκοι των φιαλών της πρώτης
σειράς (συµπεριλαµβανοµένου του µάρτυρος) δια του
µίγµατος ισοπροπανόλης -εξανίου (3.1) (σειρά αναφοράς).
Προστίθενται 2 mlανιλίνης (3.4) εντός εκάστης φιάλης της
δεύτερης σειράς (συµπεριλαµβανοµένου του µάρτυρος).
Θερµαίνονται επί 30 πρώτα λεπτά επί ζέοντος υδρολούτρου
για την ανάπτυξη του χρωµατισµού. Ψύχονται σε θερµο-
κρασία δωµατίου, συµπληρούνται οι όγκοι δια του µίγµατος
ισοπροπανόλης -εξανίου (3.1), οµοιογενοποιούνται και
αφήνονται σε ηρεµία επί µια ώρα (πρότυπος σειρά).
Προσδιορίζεται µε τις υποδεικνυόµενες συνθήκες στο 5.2 η
οπτική πυκνότητα των διαλυµάτων της προτύπου σειράς δια
συγκρίσεως µε τα αντίστοιχα διαλύµατα της σειράς
αναφοράς. Σύρεται η καµπύλη µετρήσεων δια θέσεως των
οπτικών πυκνοτήτων έναντι των ποσοτήτων της γκοσσυ-
πόλης (εις µg).
6.2.2Συνολικήγκοσσυπόλη
Προετοιµάζονται εξ (6) ογκοµετρικές φιάλες των 50 ml.
Εισάγονται εντός της πρώτης φιάλης 10 mlδιαλυτικού µέσου
Β (3.3) και εντός των υπολοίπων 2,0 — 4,0 — 6,0 — 8,0, και
10,0mlπροτύπου διαλύµατος γκοσσυπόλης Β (3.6) αντι-
στοίχως. Συµπληρούται το περιεχόµενο εκάστης φιάλης δια
10mlδιαλυτικού µέσου Β (3.3). Θερµαίνονται επί 30 πρώτα
λεπτά επί ζέοντος υδρολούτρου. Ψύχονται σε θερµοκρασία
δωµατίου, συµπληρούνται οι όγκοι δια µίγµατος ισοπροπα-
νόλης -εξανίου (3.1) και οµοιογενοποιούνται.
Εισάγονται 2,0 mlτων διαλυµάτων τούτων εντός δύο σειρών
εξ 6 ογκοµετρικών φιαλών των 25 mlαντιστοίχως. Συµπλη-
ρούται έως 25 mlτο περιεχόµενο των φιαλών της πρώτης
σειράς δια µίγµατος ισοπροπανόλης -εξανίου (3.1) (σειρά
αναφοράς).
Προστίθενται 2 mlανιλίνης (3.4) εντός εκάστης φιάλης της
δευτέρας σειράς. Θερµαίνονται επί 30 πρώτα λεπτά επί
ζέοντος υδρολούτρου. Ψύχονται σε θερµοκρασία δωµατίου,
συµπληρούνται οι όγκοι δια µίγµατος ισοπροπανόλης -
εξανίου (3.1), οµοιογενοποιούνται και αφήνονται σε ηρεµία
επί µια ώρα (πρότυπος σειρά).1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 15
▼B
Προσδιορίζεται µε τις υποδεικνυόµενες συνθήκες στο 5.2 η
οπτική πυκνότητα των διαλυµάτων της προτύπου σειράς δια
συγκρίσεως µε τα αντίστοιχα διαλύµατα της σειράς
αναφοράς. Σύρεται η καµπύλη µετρήσεων δια θέσεως
οπτικών πυκνοτήτων έναντι των ποσοτήτων της γκοσσυ-
πόλης (εις µg).
6.3Επαναληπτικότητα
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων των διενεργουµένων δύο
παραλλήλων προσδιορισµών επί του αυτού δείγµατος δεν πρέπει
να υπερβαίνει το:
— 15%σε σχετική τιµή, για τις περιεκτικότητες σε γκοσσυπόλη
µικρότερης των 500 ppm,
— 75 ppm σε απόλυτη τιµή, για περιεκτικότητες συµπεριλαµβανό-
µενες µεταξύ 500 και 750 ppm,
— 10% σε σχετική τιµή, για περιεκτικότητες ανώτερες των
750ppm.1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 16
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II
4.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΤΥΡΟΖΙΝΗΣ
—δια διαχύσεως επί άγαρος —
1.Αντικείµενο και πεδίο εφαρµογής
Η µέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισµό της τυροζίνης εντός των
ζωοτροφών, των συµπεπυκνωµένων τροφών και των προµιγµάτων. Το
κατώτατο όριο του ποσοτικού προσδιορισµού είναι 2 ppm.
2.Αρχή
Το δείγµα κατεργάζεται δια φωσφορικού ρυθµιστικού διαλύµατος σε
pH 8,πρότερον θερµανθέντος σε 80 ºCκαι υπόκειται ακολούθως σε
εκχύλιση δια µεθανόλης. Κατόπιν φυγοκεντρήσεως, το εκχύλισµα
αραιούται και η αντιβιοτική αυτού δραστικότητα προσδιορίζεται µε
τη µέτρηση της διαχύσεως της τυροζίνης εντός µέσου άγαρος, το
οποίο έχει σπαρθεί µετά του Sarcina lutea .Η διάχυση υποδεικνύεται
δια του σχηµατισµού ζωνών παρεµποδίσεως παρουσία µικροοργανι-
σµού. Η διάµετρος των ζωνών αυτών είναι ευθέως ανάλογη του
λογαρίθµου της συµπυκνώσεως του αντιβιοτικού.
3.Μικροοργανισµός: Sarcina lutea ATCC No9341
3.1Συντήρηση του µητρικού υλικού
Εµβολιάζεται ο Sarcina lutea επί επικλινούς άγαρος, εντός
σωλήνος, ληφθησοµένου εκ του µέσου καλλιεργείας (4.1), ρυθµι-
σθέντος εις pH 7,0.Επωάζεται επί µια νύκτα σε 35 ºC,περίπου. Η
καλλιέργεια διατηρείται εντός ψυγείου και επανεµβολιάζεται καθ '
έκαστον µήνα επί επικλινούς άγαρος.
3.2Παρασκευήτου αιωρή µατος των βακτηριδίων
Συλλέγονται τα βακτηρίδια εξ ενός σωλήνος επικλινούς άγαρος
(3.1) προσφάτου παρασκευής δια της χρήσεως 2 —3m lφυσιολο-
γικού ορρού (4.4). ∆ια του αιωρήµατος τούτου σπείρεται φιάλη
Rouxπεριέχουσα 250 mlµέσου καλλιεργείας (4.1), ρυθµισθέντος
σεpH 7,0.Επωάζεται επί 24 ώρες σε 35 ºC,συλλέγονται τα βακτη-
ρίδια δια της χρήσεως 25 mlφυσιολογικού ορρού (4.4). Το
αιώρηµα αυτό οµοιογενοποιείται και αραιούται προς επίτευξη
φωτοπερατότητος 75 %περίπου σε 650 nm.
Το αιώρηµα αυτό διατηρούµενο εντός ψυγείου είναι δυνατό να
χρησιµοποιείται επί µια εβδοµάδα.
∆ια προκαταρκτικών δοκιµών επί πλακών µετά του βασικού µέσου
του ποσοτικού προσδιορισµού (4.1), καθορίζεται η ποσότητα του
εµβολίου, η οποία επιτρέπει την επίτευξη για διαφόρους συµπυ-
κνώσεις της χρησιµοποιουµένης τυροζίνης των µεγαλύτερων κατά
το δυνατό ζωνών παρεµποδίσεως οι οποίες παραµένουν ακόµη
καθαρές. Ο εµβολιασµός του µέσου καλλιεργείας λαµβάνει χώρα
σε 48 —5 0º C .
4.Μέσα καλλιεργείας και αντιδραστήρια
4.1Βασικό µέσο προσδιορισµού (1)
Γλυκόζη 1g
Θρυψική πεπτόνη 10 g
Εκχύλισµα κρέατος 1,5 g
Εκχύλισµα µαγιάς µπύρας 3g
Άγαρ, αναλόγως της ποιότητος 1 0—2 0g
Απεσταγµένο ύδωρ 1000 ml1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 17
(1)Οποιοδήποτε µέσο καλλιεργείας του εµπορίου, αναλόγου συνθέσεως και το
οποίο δίδει τα αυτά αποτελέσµατα, είναι δυνατό να χρησιµοποιηθεί.▼M4
▼B
▼B
Ρυθµίζεται κατά τη στιγµή της χρησιµοποιήσεως σε pH 7,0για τη
διατήρηση του µητρικού υλικού και την παρασκευή του αιωρή-
µατος των βακτηρίων, και σε pH 2,0για τον προσδιορισµό.
4.2Φωσφορικό ρυθµιστικό διάλυµα, pH 8
∆ισόξινο φωσφορικό κάλιο KH2PO4χ.κ. 0,523 g
Μονόξινο φωσφορικό νάτριο K2HPO4χ.κ. 16,730 g
Απεσταγµένο ύδωρ σε 1000 ml
4.3Φωσφορικό ρυθµιστικό διάλυµα, pH 7
∆ισόξινο φωσφορικό κάλιο KH2PO4χ.κ. 5,5 g
Μονόξινο φωσφορικό νάτριο K2HPO4χ.κ. 13,6 g
Απεσταγµένο ύδωρ σε 1000 ml
4.4Αποστειρωµένος φυσιολογικός ορρός
4.5Καθαρή µεθανόλη
4.6Μεθανόλη 10 %(κ.ό)
4.7Μίγµα φωσφορικού ρυθµιστικού διαλύµατος (4.2) καθαράς µεθα-
νόλης: 60 /40κατ'όγκον.
4.8Πρότυπος ουσία: τυροζίνη γνωστής δραστικότητος.
5.Πρότυπα διαλύµατα
Ξηραίνεται η πρότυπος ουσία (4.8) επί τρεις ώρες σε 60 ºCεντός
ξηραντηρίου κενού (5 mmυδραργύρου). Ζυγίζονται 10 —5 0m g εντός
ογκοµετρικής φιάλης, διαλύονται εντός 5 mlµεθανόλης (4.5) και
αραιούται το διάλυµα δια του φωσφορικού ρυθµιστικού διαλύµατος,
pH 7 (4.3) προς επίτευξη συµπυκνώσεως σε τυροζίνη βάσεως 1000 µg/
ml.
Επί τη βάσει του αρχικού τούτου διαλύµατος δι 'αραιώσεως µετά του
µίγµατος (4.7) παρασκευάζεται πρότυπο διάλυµα εργασίας S8περιέχον
2µgτυροζίνη βάσεως ανά ml.
Παρασκευάζονται ακολούθως δια διαδοχικών αραιώσεων (1 +1 )δια
της χρήσεως του µίγµατος (4.7), οι κάτωθι συµπυκνώσεις:
S41 µg/ml
S20,5 µg/ml
S10,25 µg/ml
6.Εκχύλιση
Για τις συµπυκνωµένες τροφές, λαµβάνεται ποσότητα δείγµατος 10 g.
Για τα προµίγµατα και τις τροφές, ποσότητα δείγµατος 20 g.
Προστίθενται 60 mlφωσφορικού ρυθµιστικού διαλύµατος, pH 8 (4.2),
πρότερον θερµανθέντος σε 80 ºC,και οµοιογενοποιείται επί 2 πρώτα
λεπτά (οικιακός αναµίκτης, Ultra-turrax κλπ.).
Αφήνεται ακολούθως εν ηρεµία επί 10 πρώτα λεπτά, προστίθενται
40mlµεθανόλης (4.5) και οµοιογενοποιείται επί 5 πρώτα λεπτά. Φυγο-
κεντρείται, λαµβάνεται µέρος της ποσότητος του εκχυλίσµατος και
αραιούται δια του µίγµατος (4.7) προς επίτευξη µιας υποτιθεµένης
συµπυκνώσεως σε τυροζίνη 2 µg/ml (= U8).Παρασκευάζονται
ακολούθως οι συµπυκνώσεις U4,U2καιU1δια διαδοχικών αραιώσεων
(1+1 )δια της χρήσεως του µίγµατος (4.7).
Για περιεκτικότητες µικρότερες των 10 ppm,εξατµίζεται το εκχύλισµα
µέχρι ξηρού εντός περιστρεφοµένου εξατµιστού σε 35 ºCκαι
διαλύεται το υπόλειµµα σε µεθανόλη 40 % (4.6).1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 18
▼B
7.Μεθοδολογία προσδιορισµού
7.1Εµβολιασµός του µέσου καλλιεργείας
Εµβολιάζεται το βασικό µέσον καλλιεργείας (4.1), εις 48 — 50 ºC,
ρυθµισµένο σε pH 8,0,δια του αιωρήµατος των βακτηρίων (3.2).
7.2Προετοιµασία των χώρων
Η διάλυση επί άγαρος πραγµατοποιείται επί δίσκων οι οποίοι
περιέχουν τις 4 συµπυκνώσεις του προτύπου διαλύµατος ( S8,S4,S2,
S1)και τις 4 συµπυκνώσεις του εκχυλίσµατος ( U8,U4,U2,U1).
Έκαστος δίσκος πρέπει να περιέχει απαραιτήτως τις 4 συµπυκνώ-
σεις του προτύπου διαλύµατος και του εκχυλίσµατος.
Για τον σκοπό αυτό εκλέγονται δίσκοι τοιούτων διαστάσεων ώστε
εντός του µέσου άγαρος να δύνανται να σχηµατισθούν τουλάχιστον
8 κοιλότητες διαµέτρου 10 — 13 mm. Υπολογίζεται η ποσότητα
εµβολιασµένου µέσου καλλιεργείας (7.1) η οποία απαιτείται για
την επίτευξη οµοιοµόρφου καλύψεως πάχους 2 mmπερίπου. Είναι
προτιµότερο να χρησιµοποιούνται ως δίσκοι επίπεδες υάλινες
πλάκες οι οποίες είναι εφοδιασµένες µετά τελείως επιπέδου
δακτυλίου εξ αλουµινίου ή εκ πλαστικής ύλης διαµέτρου 200 mm
και ύψους 20 mm.
Εισάγονται δια του σιφωνίου, εντός των κοιλοτήτων, επακριβώς
µετρούµενες ποσότητες διαλύµατος αντιβιοτικού, κυµαινόµενες
µεταξύ 0,10 και 0,15 ml,αναλόγως της διαµέτρου των κοιλοτήτων.
Για κάθε δείγµα διενεργούνται 4 τουλάχιστον επαναλήψεις της
διαχύσεως µεθ 'εκάστης των συµπυκνώσεων, κατά τρόπο ώστε
έκαστος προσδιορισµός να αποτελεί εκτίµηση προερχοµένη εκ 32
ζωνών παρεµποδίσεως.
7.3Επώαση
Οι χώροι επωάζονται επί µια νύκτα σε 35 —3 7º C .
8.Εκτίµηση
Μετριέται η διάµετρος των ζωνών παρεµποδίσεως, κατά προτίµηση
δια προβολής. Οι µετρήσεις σηµειούνται επί ηµιλογαριθµικού χάρτου,ο οποίος δίδει το λογάριθµο των συµπυκνώσεων ως προς τις διαµέ-
τρους των ζωνών παρεµποδίσεως. Σύρονται οι ευθείες του προτύπου
διαλύµατος και του εκχυλίσµατος. Εν απουσία αλληλεπιδράσεως, οι
δύο ευθείες πρέπει να είναι παράλληλες.
Ο λογάριθµος της σχετικής δραστικότητος υπολογίζεται δια του
ακολούθου τύπου:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ :0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Πραγµατική δραστικότητα =υποτιθεµένη δραστικότητα ×σχετική
δραστικότητα.
9.Επαναληπτικότητα
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων των διενεργουµένων δύο
παραλλήλων ποσοτικών προσδιορισµών επί του αυτού δείγµατος δεν
πρέπει να υπερβαίνει το 10 %σε σχετική τιµή.
5.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ VIRGINIAMYCIN
—διά διαχύσεως σε αγαρούχο θρεπτικό υλικό —
1.Αντικείµενο και πεδίο εφαρµογής
Η µέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισµό της virginiamycin στις
ζωοτροφές και τα προµείγµατα. Το κατώτατο όριο προσδιορισµού
είναι 2 mg/kg (2ppm) (1).1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 19
(1) 1 mg virginiamycin ισοδυναµεί µε 1 000µονάδες UK.▼M2
▼M2
2.Αρχή
Το δείγµα εκχυλίζεται µε µεθανολικό διάλυµα Tween 80. Το εκχύλισµα
φέρεται σε διαχωριστική χοάνη ή φυγοκεντρείται και αραιώνεται. Η
αντιβιοτική του δραστικότης προσδιορίζεται µετρώντας τη διάχυση
τηςvirginiamycin σε αγαρούχο θρεπτικό υλικό που έχει ενοφθαλµισθεί
µεMicrococcus luteus. Η διάχυση διαπιστώνεται από το σχηµατισµό
ζωνών αναστολής της µικροβιακής ανάπτυξης. Η διάµετρος των ζωνών
αυτών θεωρείται ευθέως ανάλογη προς το λογάριθµο της συγκεντρώ-
σεως του αντιβιοτικού για τις διάφορες συγκεντρώσεις που
χρησιµοποιήθηκαν.
3.Μικροοργανισµός: MicrococcusluteusATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB
8553)
3.1.∆ιατήρηση του στελέχους
Κεκλιµένοι σωλήνες που περιέχουν το θρεπτικό υλικό (4.1)
ενοφθαλµίζονται µε Micrococcus luteus και επωάζονται επί 24
ώρες στους 30 ºC .Η καλλιέργεια διατηρείται σε ψυγείο στους 4 º
Cκαι ανανεώνεται κάθε δύο εβδοµάδες.
3.2.Προετοιµασία του µικροβιακού εναιωρήµατος (α)
Συλλέγονται τα σπόρια από ένα σωλήνα µε αγαρούχο θρεπτικό
υλικό (3.1) πρόσφατης παρασκευής µε τη βοήθεια 2 έως 3 ml
διαλύµατος χλωριούχου νατρίου (4.3). Το εναιώρηµα αυτό χρησι-
µοποιείται για τον ενοφθαλµισµό 250 mlθρεπτικού υλικού (4.1)
µέσα σε φιάλη Roux.Επωάζεται επί 18 έως 20 ώρες στους 30 ºC .
Τα σπόρια συλλέγονται µε τη βοήθεια 25 mlδιαλύµατος
χλωριούχου νατρίου (4.3). Το εναιώρηµα αναδεύεται και
ακολούθως αραιώνεται στο 1 /10µε διάλυµα χλωριούχου νατρίου
(4.3). Στιβάδα του εναιωρήµατος πάχους 1 cmεξεταζόµενη στα
650nmως προς διάλυµα χλωριούχου νατρίου (4.3) πρέπει να
επιτρέπει τη δίοδο σε 75 %περίπου του προσπίπτοντος φωτός.
Το εναιώρηµα αυτό µπορεί να διατηρηθεί µία εβδοµάδα στους 4 º
Cπερίπου.
4.Θρεπτικά υλικά και αντιδραστήρια
4.1.Θρεπτικό υλικό για τη διατήρηση του στελέχους και για τον προσδιορι-
σµό(β)
Πεπτόνη κρέατος 6,0 g
Τρυπτόνη 4,0 g
Εκχύλισµα µαγιάς 3,0 g
Εκχύλισµα κρέατος 1,5 g
Γλυκόζη 1,0 g
Άγαρ 10,0έως 20,0 g
Νερό 1 000 ml
pH 6,5 ( µετά από
αποστείρωση) ·
4.2.Ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών, pH 6
Όξινο φωσφορικό γάλιο, K2HPO42,0 g
∆ισόξινο φωσφορικό κάλιο, KH2PO48,0 g
Νερό έως 1 000 ml
4.3.∆ιάλυµα χλωριούχου νατρίου 0,8 % (w/v): διαλύονται 8 g
χλωριούχου νατρίου µε νερό και αραιώνονται για να ληφθεί
τελικός όγκος 1 000 ml. Το διάλυµα αποστειρώνεται.
4.4.Μεθανόλη.
4.5.Μείγµα ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικών (4.2) και µεθανόλης
(4.4): 80 /20 (v/v).1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 20
(α)Άλλες µέθοδοι οι οποίες δίνουν, αποδεδειγµένα, ανάλογα µικροβιακά εναιωρή-
µατα µπορούν επίσης να χρησιµοποιηθούν.
(β)Μπορεί να χρησιµοποιηθεί οποιοδήποτε θρεπτικό υλικό του εµπορίου το οποίο
έχει ανάλογη σύσταση και δίνει τα ίδια αποτελέσµατα.
▼M2
4.6.Μεθανολικό διάλυµα Tween 80 0,5 % (w/v): διαλύονται 5 g Tween
80µέσα σε µεθανόλη (4.4) και αραιώνονται µε µεθανόλη ώστε να
ληφθεί τελικός όγκος 1 000 ml.
4.7.Πρότυπη ουσία: Virginiamycin γνωστής δραστικότητος.
5.Πρότυπα διαλύµατα
∆ιαλύεται µια ακριβώς ζυγισµένη ποσότητα πρότυπης ουσίας (4.7)
µέσα σε µεθανόλη (4.4) και αραιώνεται µε µεθανόλη (4.4) ώστε να
προκύψει µητρικό διάλυµα που περιέχει 1 000µg virginiamycin ανάml.
∆ιατηρούµενο σε πωµατισµένη φιάλη στους 4 ºCτο διάλυµα αυτό
παραµένει σταθερό επί πέντε ηµέρες.
Από αυτό το µητρικό διάλυµα παρασκευάζονται µετά από διαδοχικές
αραιώσεις µε το µείγµα (4.5) τα ακόλουθα διαλύµατα:
S81µg/ml
S40,5µg/ml
S20,25µg/ml
S10,125µg/ml
6.Παρασκευή του εκχυλίσµατος και των διαλυµάτων
6.1.Εκχύλιση
6.1.1.Προϊόντα µε περιεκτικότητα σε virginiamycin έως 100 mg/kg
Ζυγίζονται 50,0 gδείγµατος. Προστίθενται 200 mlδιαλύ-
µατος (4.6) και αναδεύονται επί 30 λεπτά. Αφήνεται να
κατακαθίσει ή φυγοκεντρείται. Από το υπερκείµενο διάλυµα
λαµβάνονται 20 mlκαι εξατµίζονται έως ότου αποµείνουν
5mlµέσα σε περιστρεφόµενη αντλία εξατµίσεως και σε
θερµοκρασία όχι µεγαλύτερη από 40 ºC .Το υπόλειµµα
αραιώνεται µε το µείγµα (4.5) έτσι ώστε η αναµενόµενη
περιεκτικότητα σε virginiamycin να είναι 1 µ g/ml (= U8)
6.1.2.Προϊόντα µε περιεκτικότητα σε virginiamycin µεγαλύτερη από
100mg/kg
Ζυγίζονται έως 10,0 gδείγµατος τα οποία περιέχουν από 1,0
έως 50,0 mg virginiamycin. Προστίθενται 100 mlδιαλύµατος
(4.6) και αναδεύονται επί 30 λεπτά. Αφήνεται να κατα-
καθίσει ή φυγοκεντρείται. Το υπερκείµενο διάλυµα
αραιώνεται µε το µείγµα (4.5) έτσι ώστε η αναµενόµενη
περιεκτικότητα σε virginiamycin να είναι 1 µ g/ml (= U8).
6.2.∆ιαλύµατα του εκχυλίσµατος
Από το διάλυµα U8παρασκευάζονται τα διαλύµατα U4(αναµενό-
µενη συγκέντρωση: 0,5 µ g/ml), U2(αναµενόµενη συγκέντρωση:
0,25 µ g/ml)καιU1(αναµενόµενη συγκέντρωση: 0,125 µ g/ml)µετά
από διαδοχικές αραιώσεις (1 +1 )µε το µείγµα (4.5).
7.Τρόπος προσδιορισµού
7.1.Ενοφθαλισµός του θρεπτικού υλικού
Το θρεπτικό υλικό (4.1) ενοφθαλµίζεται µε το µικροβιακό
εναιώρηµα (3.2) στους 50 ºCπερίπου. Από προκαταρκτικές
δοκιµές σε τριβλία µε θρεπτικό υλικό (4.1) προσδιορίζεται η
ποσότητα του µικροβιακού εναιωρήµατος που απαιτείται για να
ληφθούν όσο το δυνατόν ευρύτερες και σαφέστερες ζώνες
αναστολής µε τις διάφορες συγκεντρώσεις της virginiamycin.
7.2.Προετοιµασία των τριβλίων
Η διάχυση πάνω σε αγαρούχο θρεπτικό υλικό πραγµατοποιείται
µέσα σε τριβλία µε τις τέσσερις συγκεντρώσεις του προτύπου
διαλύµατος ( S8,S4,S2,S1)και τις τέσσερις συγκεντρώσεις του
διαλύµατος του εκχυλίσµατος ( U8,U4,U2,U1).Σε κάθε τριβλίο
πρέπει να τοποθετηθούν απαραίτητα οι τέσσερις αυτές συγκεν-
τρώσεις εκχυλίσµατος και προτύπου. Για το λόγο αυτό το
µέγεθος των τριβλίων πρέπει να είναι αρκετά µεγάλο ώστε να
είναι δυνατόν να σχηµατιστούν στο θρεπτικό υλικό τουλάχιστον
οκτώ οπές διαµέτρου 10 έως 13 mmτων οποίων τα κέντρα δεν
απέχουν λιγότερο από 30 mmµεταξύ τους. Αντί των τριβλίων1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 21
▼M2
µπορούν να χρησιµοποιηθούν γυάλινες πλάκες πάνω από τις
οποίες τοποθετούνται δακτύλιοι από αλουµίνιο ή πλαστικό, διαµέ-
τρου 200 mmκαι ύψους 20 mm.
Εισάγεται µέσα στα τριβλία ποσότητα θρεπτικού υλικού (4.1) η
οποία έχει ενοφθαλµιστεί όπως περιγράφεται στο σηµείο 7.1,
έτσι ώστε να ληφθεί στιβάδα πάχους 2 mmπερίπου (60 mlγια
τριβλίο διαµέτρου 200 mm).Αφήνεται να στερεοποιηθεί, ανοί-
γονται οι οπές και τοποθετούνται σ 'αυτές επακριβώς µετρηµένοι
όγκοι διαλυµάτων του προτύπου και του εκχυλίσµατος (0,10 έως
0,15mlανά οπή) ανάλογα µε τη διάµετρο. Γίνονται τουλάχιστον
τέσσερις επαναλήψεις µε κάθε συγκέντρωση έτσι ώστε σε κάθε
προσδιορισµό να υπολογίζονται 32 ζώνες αναστολής.
7.3.Επώαση
Τα τριβλία επωάζονται επί 16 έως 18 ώρες στους 30 ±2ºC .
8.Υπολογισµός
Μετράται η διάµετρος των ζωνών αναστολής µε ακρίβεια 0,1 mm.Για
κάθε συγκέντρωση, οι µέσες τιµές των µετρήσεων καταγράφονται
πάνω σε ηµιλογαριθµικό χάρτη όπου παρίσταται η σχέση του λογα-
ρίθµου των συγκεντρώσεων ως προς τις διαµέτρους των ζωνών
αναστολής. Χαράσσονται οι πιο αντιπροσωπευτικές ευθείες για το
πρότυπο διάλυµα και το εκχύλισµα ακολουθώντας τον τρόπο που
περιγράφεται κατωτέρω:
Προσδιορίζεται το πιο αντιπροσωπευτικό σηµείο για το µικρότερο
διάλυµα του προτύπου ( SL)βάσει του τύπου:
(α)SL¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Προσδιορίζεται το πιο αντιπροσωπευτικό σηµείο για το µεγαλύτερο
διάλυµα του προτύπου ( SH)βάσει του τύπου:
(β)SH¼7s8þ4s4þs2/C02s1
10
Κατά τον ίδιο τρόπο υπολογίζονται τα πιο αντιπροσωπευτικά σηµεία
για το µικρότερο διάλυµα του εκχυλίσµατος ( UL)και το µεγαλύτερο
διάλυµα ( UH),αντικαθιστώντας στους παραπάνω τύπους τα s1,s2,s4και
s8µεu1,u2,u4καιu8αντιστοίχως.
Οι τιµές SLκαιSHκαταγράφονται στο ίδιο διάγραµµα και συνδέοντας
τα δύο σηµεία λαµβάνεται η πιο αντιπροσωπευτική ευθεία για το
πρότυπο διάλυµα. Ακολουθώντας τον ίδιο τρόπο για τις τιµές ULκαι
UHλαµβάνεται η πιο αντιπροσωπευτική ευθεία για το εκχύλισµα.
Αν δεν υπάρχει παρεµβολή, οι ευθείες πρέπει να είναι παράλληλες.
Για πρακτικούς λόγους οι ευθείες µπορούν να θεωρηθούν παράλληλες
αν οι τιµές ( SH — SL) και (UH — UL) δεν αποκλίνουν περισσότερο
από 10 %από το µέσο όρο τους.
Αν οι ευθείες δεν είναι παράλληλες µπορούν να παραλειφθούν είτε τα
u1καιs1είτε τα u8καιs8.Στην περίπτωση αυτή τα SL, SH, UL καιUH
υπολογίζονται από τους ακόλουθους τύπους, προκειµένου να ληφθούν
πιο αντιπροσωπευτικές ευθείες:
(α′)S L=5s1þ2s2/C0s4
6ή5s2þ2s4/C0s8
6
(β′)S H=5s4þ2s2/C0s1
6ή5s8þ2s4/C0s2
6
Κατά τον ίδιο τρόπο υπολογίζονται τα ULκαιUH.Τα ίδια κριτήρια
παραλληλίας πρέπει να ισχύουν και στην εναλλακτική αυτή λύση.
Στην τελική έκθεση θα πρέπει να αναφέρεται ότι για τον υπολογισµό
του αποτελέσµατος χρησιµοποιήθηκαν τρία επίπεδα.
Όταν οι ευθείες θεωρούνται παράλληλες, ο λογάριθµος της σχετικής
δραστικότητας ( log. A)υπολογίζεται από έναν από τους ακόλουθους
τύπους, ανάλογα µε το αν χρησιµοποιήθηκαν τρία ή τέσσερα διαλύ-
µατα για την εκτίµηση της παραλληλίας.1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 22
▼M2
Για τέσσερα διαλύµατα
(γ)Log A ¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
u4þu8þs4þs8/C0u1/C0u2/C0s1/C0s2
Για τρία διαλύµατα
(δ)Log A ¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4þs4/C0u1/C0s1
ή
(δ′) Log A ¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
∆ραστικότητα του εκχυλίσµατος του δείγµατος =δραστικότητα του
αντίστοιχου προτύπου ×Α:
U8=S8×A
Αν η τιµή της σχετικής δραστικότητος βρίσκεται έξω από τη σειρά
των τιµών που περιλαµβάνονται µεταξύ 0,5 και 2,0, ο προσδιορισµός
επαναλαµβάνεται ρυθµίζοντας κατάλληλα τις συγκεντρώσεις του εκχυ-
λίσµατος ή, ενδεχόµενα, τις συγκεντρώσεις των προτύπων διαλυµάτων.
Όταν δεν µπορεί να επιτευχθεί σχετική δραστικότης που να βρίσκεται
µέσα στα όρια των απαιτουµένων τιµών, το λαµβανόµενο αποτέλεσµα
πρέπει να θεωρείται κατά προσέγγιση και αυτό να αναφέρεται στην
τελική έκθεση.
Όταν οι ευθείες δεν θεωρούνται παράλληλες, ο προσδιορισµός επανα-
λαµβάνεται: Αν ποτέ δεν επιτευχθεί παραλληλία ο προσδιορισµός
θεωρείται µη ικανοποιητικός. Τα αποτελέσµατα εκφράζονται σε χιλιο-
στόγραµµα virginiamycin ανά χιλιόγραµµο ζωοτροφής.
9.Επαναληψιµότητα
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων δύο προσδιορισµών που
πραγµατοποιήθηκαν στο ίδιο δείγµα, από τον ίδιο αναλυτή, δεν πρέπει
να υπερβαίνει:
—τα 2mg/kg,σε απόλυτη τιµή, για περιεκτικότητες σε virginiamycin
έως 10 mg/kg,
—το 20 %του υψηλοτέρου αποτελέσµατος για περιεκτικότητες από
10 έως 25 mg/kg,
—τα 5mg/kg,σε απόλυτη τιµή, για περιεκτικότητες από 25 έως 50 mg/
kg,
—το 10 %του υψηλοτέρου αποτελέσµατος για περιεκτικότητες άνω
των 50 mg/kg.1972L0199 — EL — 27.08.1999 — 005.001 — 23