1991R2568 — EL — 16.10.2015 — 028.001

Το έγγραφο αυτό συνιστά βοήθημα τεκμηρίωσης και δεν δεσμεύει τα κοινοτικά όργανα

Τροποποιείται από:





Διορθώνεται από:









▼B

ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΟΚ) αριθ. 2568/91 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΉΣ

της 11ης Ιουλίου 1991

σχετικά με τον προσδιορισμό των χαρακτηριστικών των ελαιολάδων και των πυρηνελαίων καθώς και με τις μεθόδους προσδιορισμού







Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ, Έχοντας υπόψη: Έχοντας υπόψη: τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Οικονομικής Κοινότητας, τον κανονισμό αριθ. 136/66/ΕΟΚ του Συμβουλίου της 22ας Σεπτεμβρίου 1966 περί δημουργίας κοινής οργανώσεως αγοράς στον τομέα των λιπαρών ουσιών ( 1 ), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 3577/90 ( 2 ), και ιδίως το άρθρο 35α, Εκτιμώντας: Εκτιμώντας: ότι στο παράρτημα του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ προβλέπονται η περιγραφή και ο ορισμός των ελαιολάδων και των πυρηνελαίων που διατίθενται στο εμπόριο στο εσωτερικό κάθε κράτους μέλους, καθώς και όσον αφορά τις ενδοκοινοτικές συναλλαγές και τις συναλλαγές με τις τρίτες χώρες· ότι, για να καταστεί δυνατός ο διαχωρισμός μεταξύ των διαφόρων τύπων ελαίου, θα πρέπει να καθοριστούν τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά κάθε ελαίου, καθώς και τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των παρθένων ελαίων, κατά τρόπο που να διασφολίζεται η γνησιότητα και η ποιότητα των εν λόγω προϊόντων, με την επιφύλαξη των υπολοίπων διατάξεων, οι οποίες αφορούν αυτό το θέμα· ότι θα πρέπει να προσδιοριστούν κατά ενιαίο τρόπο σε ολόκληρη την Κοινότητα τα χαρακτηριστικά των διαφόρων τύπων ελαίου· ότι, προς το σκοπό αυτό, θα πρέπει να καθοριστούν οι μέθοδοι, χημικής ανάλυσης και οργανοληπτικής αξιολόγησης στην Κοινότητα· ότι θα πρέπει, εντούτοις, να επιτραπεί κατά τη διάρκεια μεταβατικής περιόδου η χρησιμοποίηση άλλων μεθόδων ανάλυσης που εφαρμόζονται στα κράτη μέλη, προβλέποντας παράλληλα ότι, σε περίπτωση που τα αποτελέσματα παρουσιάζουν διαφορές, θα είναι καθοριστικά τα αποτελέσματα που έχουν ληφθεί με βάση την ενιαία μέθοδο· ότι ο προσδιορισμός των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών του ελαιολάδου και των μεθόδων ανάλυσης οδηγεί στην προσαρμογή των συμπληρωματικών επεξηγήσεων του κεφαλαίου 15 της συνδυασμένης ονοματολογίας· ότι στην μέθοδο αξιολόγησης των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών των παρθένων ελαίων περιλαμβάνεται η συγκρότηση ομάδος δοκιμαστών που έχουν επιλεγεί και εξασκηθεί ειδικά γι' αυτό· ότι είναι, επομένως, σκόπιμο να προβλεφθεί η προθεσμία η αναγκαία για την δημιουργία μιας τέτοιας υποδομής· ότι, λαμβανομένων υπόψη των δυσκολιών που θα συναντήσουν ορισμένα κράτη μέλη για την συγκρότηση ομάδων δοκιμαστών, είναι σκόπιμο να δοθεί άδεια να καταφεύγουν στις υπάρχουσες ομάδες άλλων κρατών μελλών· ότι, για να εξασφαλιστεί η ορθή λειτουργία του συστήματος των εισφορών που εφαρμόζονται κατά την εισαγωγή των ελαιοπυρήνων είναι σκόπιμο να προβλεφθεί μια ενιαία μέθοδος για τον καθορισμό της περιεκτικότητας σε έλαιο των εν λόγω προϊόντων· ότι, για να μην προκληθεί ζημιά στο εμπόριο, είναι σκόπιμο να προβλεφθεί μια περιορισμένη περίοδος για την διάθεση του τυποποιημένου ελαιολάδου πρό της ενάρξεως του παρόντος κανονισμού· ότι είναι σκόπιμο να καταργηθεί ο κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 1058/77 της Επιτροπής ( 3 ), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 1858/88 ( 4 )· ότι η Επιτροπή Διαχείρισης Λιπαρών Ουσιών δεν διατύπωσε γνώμη εντός της ταχθείσας προδεσμίας, ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΟΝ ΠΑΡΟΝΤΑ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟ:







▼M20

Άρθρο 1

1. Θεωρούνται παρθένα ελαιόλαδα, κατά την έννοια του σημείου 1 α) και β) του παραρτήματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, τα ελαιόλαδα των οποίων τα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα που αναφέρονται στο παράρτημα Ι σημεία 1 και 2 του παρόντος κανονισμού.

2. Θεωρείται ελαιόλαδο λαμπάντε, κατά την έννοια του σημείου 1 γ) του παραρτήματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, το ελαιόλαδο του οποίου τα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα που αναφέρονται στο παράρτημα Ι σημείο 3 του παρόντος κανονισμού.

3. Θεωρείται εξευγενισμένο ελαιόλαδο, κατά την έννοια του σημείου 2 του παραρτήματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, το ελαιόλαδο του οποίου τα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα που αναφέρονται στο παράρτημα Ι σημείο 4 του παρόντος κανονισμού.

4. Θεωρείται ελαιόλαδο αποτελούμενο από εξευγενισμένο ελαιόλαδο και παρθένα ελαιόλαδα, κατά την έννοια του σημείου 3 του παραρτήματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, το ελαιόλαδο του οποίου τα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα που αναφέρονται στο παράρτημα Ι σημείο 5 του παρόντος κανονισμού.

5. Θεωρείται ακατέργαστο πυρηνέλαιο κατά την έννοια του σημείου 4 του παραρτήματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, το έλαιο του οποίου τα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα που αναφέρονται στο παράρτημα Ι σημείο 6 του παρόντος κανονισμού.

6. Θεωρείται εξευγενισμένο πυρηνέλαιο, κατά την έννοια του σημείου 5 του παραρτήματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, το έλαιο του οποίου τα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα που αναφέρονται στο παράρτημα Ι σημείο 7 του παρόντος κανονισμού.

7. Θεωρείται πυρηνέλαιο κατά την έννοια του σημείου 6 του παραρτήματος του κανονισμού αριθ. 136/66/ΕΟΚ, το έλαιο του οποίου τα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με εκείνα που αναφέρονται στο παράρτημα Ι σημείο 8 του παρόντος κανονισμού.

▼M26

Άρθρο 2

1. Τα προβλεπόμενα στο παράρτημα I του παρόντος κανονισμού χαρακτηριστικά των ελαίων προσδιορίζονται σύμφωνα με τις ακόλουθες μεθόδους ανάλυσης:

α) για τον προσδιορισμό των ελευθέρων λιπαρών οξέων, εκφραζόμενων σε εκατοστιαία αναλογία ελαϊκού οξέος, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα II·

β) για τον προσδιορισμό του αριθμού υπεροξειδίων, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα III·

γ) για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε κηρούς, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα IV·

δ) για τον προσδιορισμό της σύστασης και της περιεκτικότητας σε στερόλες και τριτερπενικές διαλκοόλες με αεριοχρωματογραφία τριχοειδούς στήλης, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα V·

ε) για τον προσδιορισμό της εκατοστιαίας αναλογίας μονοπαλμιτικού 2-γλυκερυλίου, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα VII·

στ) για τη φασματοφωτομετρική ανάλυση, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα IX·

▼M28

ζ) για τον προσδιορισμό της συστάσεως σε λιπαρά οξέα, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα X·

▼M26

η) για τον προσδιορισμό των αλογονούχων πτητικών διαλυτών, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα XI·

θ) για την αξιολόγηση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών των παρθένων ελαιολάδων, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα XII·

ι) για τον προσδιορισμό των στιγμασταδιενίων, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα XVII·

ια) για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε τριγλυκερίδια με ECN42, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα XVIII·

▼M28

ιβ) για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε αλειφατικές και τριτερπενικές αλκοόλες, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα XIX·

▼M26

ιγ) για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε κηρούς, καθώς και σε μεθυλεστέρες και αιθυλεστέρες λιπαρών οξέων, εφαρμόζεται η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα ΧΧ.

▼M28 —————

▼M26

2. Ο έλεγχος των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών των παρθένων ελαιολάδων από τις εθνικές αρχές ή τους αντιπροσώπους τους διενεργείται από ομάδες δοκιμαστών αναγνωρισμένες από τα κράτη μέλη.

Τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά ελαιολάδου που αναφέρονται στο πρώτο εδάφιο θεωρούνται σύμφωνα με τη δηλούμενη κατηγορία του ελαιολάδου, εάν η αναγνωρισμένη από το κράτος μέλος ομάδα επιβεβαιώσει τη συγκεκριμένη κατάταξη.

Σε περίπτωση που η αναγνωρισμένη ομάδα δεν επιβεβαιώσει τη δηλούμενη κατηγορία ως προς τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, οι εθνικές αρχές ή οι αντιπρόσωποί τους αναθέτουν χωρίς καθυστέρηση, ύστερα από αίτηση του ενδιαφερομένου, τη διενέργεια δύο κατ’ έφεση εξετάσεων από άλλες αναγνωρισμένες ομάδες, από τις οποίες η μία τουλάχιστον διενεργείται από ομάδα αναγνωρισμένη από το κράτος μέλος παραγωγής του ελαιολάδου. Τα υπόψη χαρακτηριστικά θεωρούνται σύμφωνα με τα δηλωθέντα, εάν οι δύο κατ’ έφεση εξετάσεις επιβεβαιώσουν τη συγκεκριμένη κατάταξη. Σε αντίθετη περίπτωση, τα έξοδα των κατ’ έφεση εξετάσεων βαρύνουν τον ενδιαφερόμενο.

3. Κατά τον έλεγχο των χαρακτηριστικών των ελαίων από τις εθνικές αρχές ή τους αντιπροσώπους τους, όπως προβλέπεται στην παράγραφο 1, η δειγματοληψία διενεργείται σύμφωνα με τα διεθνή πρότυπα EN ISO 661 για την προετοιμασία δείγματος δοκιμής και EN ISO 5555 για τη δειγματοληψία. Ωστόσο, κατά παρέκκλιση από το σημείο 6.8 του προτύπου EN ISO 5555, για τις παρτίδες που αποτελούνται από τα εν λόγω έλαια σε άμεσες συσκευασίες, η δειγματοληψία διενεργείται σύμφωνα με το παράρτημα Ια του παρόντος κανονισμού. Στην περίπτωση των χύδην ελαιολάδων για τα οποία δεν μπορεί να εφαρμοστεί το πρότυπο EN ISO 5555, η δειγματοληψία διενεργείται σύμφωνα με τις υποδείξεις της αρμόδιας αρχής του κράτους μέλους.

Με την επιφύλαξη των διατάξεων του προτύπου EN ISO 5555 και του κεφαλαίου 6 του προτύπου EN ISO 661, τα δείγματα προφυλάσσονται από το φως και από υψηλές θερμοκρασίες το ταχύτερο δυνατό και αποστέλλονται στο εργαστήριο για ανάλυση το αργότερο την πέμπτη εργάσιμη ημέρα από τη λήψη τους. Σε αντίθετη περίπτωση, τα δείγματα φυλάσσονται κατά τρόπο ώστε να μην υποστούν υποβάθμιση ή φθορά κατά τη διάρκεια της μεταφοράς ή της αποθήκευσής τους προτού αποσταλούν στο εργαστήριο.

4. Για τους ελέγχους που προβλέπονται στην παράγραφο 3, οι αναλύσεις που αναφέρονται στα παραρτήματα II, III, IX, XII και XX, καθώς και, κατά περίπτωση, οι κατ’ έφεση αναλύσεις που απαιτούνται βάσει της εθνικής νομοθεσίας, διεξάγονται πριν από την ημερομηνία ελάχιστης διατηρησιμότητας στην περίπτωση των συσκευασμένων προϊόντων. Σε περίπτωση δειγματοληψίας χύδην ελαίων, οι αναλύσεις αυτές διεξάγονται το αργότερο τον έκτο μήνα ύστερα από τον μήνα κατά τον οποίο ελήφθη το δείγμα.

Δεν ισχύει καμία προθεσμία για τις άλλες αναλύσεις που προβλέπονται στον παρόντα κανονισμό.

Εάν τα αποτελέσματα των αναλύσεων δεν αντιστοιχούν στα χαρακτηριστικά της κατηγορίας ελαιολάδου ή πυρηνελαίου που δηλώθηκε, ο ενδιαφερόμενος ενημερώνεται σχετικά, το αργότερο έναν μήνα πριν από τη λήξη της προθεσμίας που ορίζεται στο πρώτο εδάφιο, εκτός εάν η δειγματοληψία διενεργήθηκε λιγότερο από δύο μήνες πριν από την ημερομηνία ελάχιστης διατηρησιμότητας.

5. Για τον προσδιορισμό των χαρακτηριστικών των ελαιολάδων με τις μεθόδους που προβλέπονται στο πρώτο εδάφιο της παραγράφου 1, τα αποτελέσματα των αναλύσεων συγκρίνονται απευθείας με τα όρια που προβλέπονται στον παρόντα κανονισμό.

▼M25

Άρθρο 2a

1. Για τους σκοπούς του παρόντος άρθρου, ως «ελαιόλαδο που διατίθεται στο εμπόριο» νοείται η συνολική ποσότητα ελαιολάδου και πυρηνελαίου ενός δεδομένου κράτους μέλους, η οποία καταναλώνεται στο εν λόγω κράτος μέλος ή εξάγεται από το εν λόγω κράτος μέλος.

2. Τα κράτη μέλη εξασφαλίζουν ότι οι έλεγχοι συμμόρφωσης πραγματοποιούνται επιλεκτικά, βάσει ανάλυσης κινδύνου, με την απαραίτητη συχνότητα, έτσι ώστε να διασφαλίζεται η συμφωνία του ελαιολάδου που διατίθεται στο εμπόριο με τη δηλωθείσα κατηγορία.

3. Τα κριτήρια αξιολόγησης του κινδύνου μπορεί να περιλαμβάνουν:

α) την κατηγορία του ελαίου, την περίοδο παραγωγής, την τιμή των ελαίων σε σχέση με άλλα φυτικά έλαια, τις εργασίες ανάμειξης και συσκευασίας, τις εγκαταστάσεις και τις συνθήκες αποθήκευσης, τη χώρα καταγωγής, τη χώρα προορισμού, τα μέσα μεταφοράς ή την ποσότητα της παρτίδας·

β) τη θέση των επιχειρήσεων στην αλυσίδα εμπορίας, την ποσότητα και/ή την αξία των προϊόντων που διαθέτουν στο εμπόριο, το φάσμα των κατηγοριών ελαίων που διαθέτουν στο εμπόριο, τον τύπο των δραστηριοτήτων που ασκούν, όπως η έκθλιψη, η αποθήκευση, το ραφινάρισμα, η ανάμειξη, η συσκευασία ή η λιανική πώληση·

γ) τα πορίσματα από προηγούμενους ελέγχους, συμπεριλαμβανομένων του αριθμού και του τύπου των ελαττωμάτων που διαπιστώθηκαν, τη συνήθη ποιότητα των ελαίων που διατίθενται στο εμπόριο, τις επιδόσεις του χρησιμοποιούμενου τεχνικού εξοπλισμού·

δ) την αξιοπιστία των συστημάτων διασφάλισης της ποιότητας των επιχειρήσεων ή των συστημάτων αυτοελέγχου σε σχέση με τη συμμόρφωση προς τις προδιαγραφές εμπορίας·

ε) τον τόπο διενέργειας του ελέγχου, ιδίως εάν αυτός είναι το σημείο πρώτης εισόδου στην Ένωση, το σημείο τελευταίας εξόδου από την Ένωση ή ο τόπος παραγωγής, συσκευασίας, φόρτωσης ή πώλησης των ελαίων στον τελικό καταναλωτή·

στ) κάθε άλλη πληροφορία που θα μπορούσε να δηλώνει κίνδυνο μη συμμόρφωσης.

4. Τα κράτη μέλη θεσπίζουν εκ των προτέρων:

α) τα κριτήρια αξιολόγησης του κινδύνου μη συμμόρφωσης παρτίδων·

β) βάσει ανάλυσης κινδύνου για κάθε κατηγορία κινδύνου, τον ελάχιστο αριθμό επιχειρήσεων ή παρτίδων και/ή ποσοτήτων που θα αποτελέσουν αντικείμενο ελέγχου συμμόρφωσης.

Διενεργείται τουλάχιστον ένας ετήσιος έλεγχος συμμόρφωσης ανά χίλιους τόνους ελαιολάδου που διατίθεται στο εμπόριο στο κράτος μέλος.

5. Τα κράτη μέλη επαληθεύουν τη συμμόρφωση:

α) με τη διεξαγωγή των αναλύσεων που προβλέπονται στο παράρτημα I, ανεξαρτήτως σειράς· ή

β) σύμφωνα με τη σειρά που προβλέπεται στο παράρτημα Ιβ σχετικά με το διάγραμμα αποφάσεων, μέχρι να υπάρξει κατάληξη σε μία από τις αποφάσεις που αναφέρονται από το εν λόγω διάγραμμα.

▼M19 —————

▼M25

Άρθρο 3

Στην περίπτωση που διαπιστώνεται ότι ένα ελαιόλαδο διαφέρει από την περιγραφή της κατηγορίας του, το ενδιαφερόμενο κράτος μέλος επιβάλλει, με την επιφύλαξη άλλων ενδεχομένων κυρώσεων, αποτελεσματικές, αναλογικές και αποτρεπτικές κυρώσεις οι οποίες καθορίζονται ανάλογα με τη σοβαρότητα της διαπιστωθείσας παρατυπίας.

Όταν από τους ελέγχους προκύπτουν σημαντικές παρατυπίες, τα κράτη μέλη αυξάνουν τη συχνότητα των ελέγχων σε σχέση με το στάδιο εμπορίας, την κατηγορία ελαιολάδου, την καταγωγή ή άλλα κριτήρια.

▼M5

Άρθρο 4

▼M19

1. Για την εκτίμηση και τον έλεγχο από τις αρμόδιες αρχές ή τον εκπρόσωπό τους των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών, τα κράτη μέλη δύνανται να αναγνωρίζουν ομάδες δοκιμαστών.

Οι όροι αναγνώρισης καθορίζονται από τα κράτη μέλη έτσι, κυρίως, ώστε:

— να ανταποκρίνονται στους όρους του παραρτήματος XII σημείο 4,

— να διασφαλίζεται ότι η κατάρτιση του επικεφαλής της ομάδας πραγματοποιείται από ίδρυμα και υπό προϋποθέσεις αναγνωρισμένες για το σκοπό αυτό από το κράτος μέλος,

— η εγκυρότητα των λαμβανόμενων αποτελεσμάτων των εξετάσεων να υπόκειται σε σύστημα ετήσιου ελέγχου διαμορφωμένο από το κράτος μέλος.

Κάθε κράτος μέλος κοινοποιεί στην Επιτροπή κατάλογο των αναγνωρισμένων ομάδων καθώς και τα μέτρα που ελήφθησαν σύμφωνα με την παρούσα παράγραφο.

▼M5

2. Στην περίπτωση που ένα κράτος αντιμετωπίζει δυσκολίες για να συγκροτήσει επιτροπή δοκιμαστών στην επικράτειά του, μπορεί να προσφύγει σε αναγνωρισμένη επιτροπή δοκιμαστών σε ένα άλλο κράτος μέλος.

3. Κάθε κράτος μέλος καθορίζει τον κατάλογο των επιτροπών δοκιμαστών που συγκροτούνται από τις επαγγελματικές ή διεπαγγελματικές οργανώσεις σύμφωνα με τους όρους που περιγράφονται στην παράγραφο 1 και μεριμνά για την τήρηση των όρων αυτών.

▼M19 —————

▼B

Άρθρο 6

1. Η περιεκτικότητα σε έλαιο των ελαιοπυρήνων και των άλλων υπολειμμάτων εκχύλισης του ελαιολάδου (κωδικός ΣΟ 2306 90 11 και 2306 90 19 ) προσδιορίζεται σύμφωνα με τη μέθοδο που αναφέρεται στο παράρτημα XV.

2. Η περιεκτικότητα σε έλαιο που αναφέρεται στην παράγραφο 1 είναι εκπεφρασμένη επί του 3 % κατά βάρος επί ξηράς ουσίας.

▼M20

Άρθρο 7

Εφαρμόζονται οι κοινοτικές διατάξεις όσον αφορά την παρουσία επιμολυντών.

Όσον αφορά την περιεκτικότητα σε αλογονωμένους διαλύτες τα όρια για όλες τις κατηγορίες ελαιολάδου είναι τα ακόλουθα:

— ανώτατη περιεκτικότητα κάθε αλογονωμένου διαλύτη που έχει ανιχνευθεί 0,1 mg/kg,

— ανώτατη συνολική περιεκτικότητα των αλογονωμένων διαλυτών που έχουν ανιχνευθεί 0,2 mg/kg.

▼M25

Άρθρο 7a

Τα φυσικά ή νομικά πρόσωπα και οι ομάδες προσώπων που έχουν στην κατοχή τους, για την άσκηση του επαγγέλματός τους ή για εμπορικούς σκοπούς, ελαιόλαδο και πυρηνέλαιο από το στάδιο της έκθλιψης στο ελαιοτριβείο μέχρι και την εμφιάλωση, υποχρεούνται να τηρούν μητρώα στα οποία καταγράφονται η είσοδος και η έξοδος κάθε κατηγορίας των ελαίων αυτών.

Τα κράτη μέλη μεριμνούν για την εκπλήρωση της υποχρέωσης που προβλέπεται στο πρώτο εδάφιο.

▼M25

Άρθρο 8

1. Τα κράτη μέλη κοινοποιούν στην Επιτροπή τα μέτρα εφαρμογής του παρόντος κανονισμού. Γνωστοποιούν στην Επιτροπή οποιεσδήποτε μεταγενέστερες τροποποιήσεις.

2. Το αργότερο μέχρι τις 31 Μαΐου κάθε έτους, τα κράτη μέλη διαβιβάζουν στην Επιτροπή έκθεση σχετικά με την εφαρμογή του παρόντος κανονισμού κατά το προηγούμενο ημερολογιακό έτος. Η έκθεση περιλαμβάνει τουλάχιστον τα αποτελέσματα των ελέγχων συμμόρφωσης που διενεργήθηκαν στα ελαιόλαδα σύμφωνα με τα υποδείγματα που παρατίθενται στο παράρτημα XXI.

3. Οι κοινοποιήσεις που αναφέρονται στον παρόντα κανονισμό υποβάλλονται σύμφωνα με τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 792/2009 της Επιτροπής ( 5 ).

▼B

Άρθρο 9

Ο κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 1058/77 καταργείται.

Άρθρο 10

1. Ο παρών κανονισμός αρχίζει να ισχύει την τρίτη ημέρα από τη δημοσίευσή του στην Επίσημη Εφημερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων.

Η εφαρμογή της μεθόδου του παραρτήματος XII αρχίζει από την ►M1 1η Νοεμβρίου 1992 ◄ , εξαιρουμένων των διαδικασιών των σχετικών με την παρέμβαση.

▼M5

Η μέθοδος αυτή δεν εφαρμόζεται στα παρθένα ελαιόλαδα που συσκευάζονται πριν από την 1η Νοεμβρίου 1992.

▼B

2. Ο παρών κανονισμός δεν ισχύει για τα ελαιόλαδα και τα πυρηνέλαια που συσκευάστηκαν έως την ημερομηνία έναρξης ισχύος του παρόντος κανονισμού και τέθηκαν στο εμπόριο έως τις 31 Οκτωβρίου 1992.

Ο παρών κανονισμός είναι δεσμευτικός ως προς όλα τα μέρη του και ισχύει άμεσα σε κάθε κράτος μέλος.









ΠΑΡΑΡΤΗΜΑΤΑ

Σύνοψη







Παράρτημα I: Χαρακτηριστικά του ελαιόλαδου Παράρτημα Ια: Δειγματοληψια ελαιολαδου ή πυρηνελαιου που παραδιδονται σε αμεσεσ συσκευασιεσ Παράρτημα Ιβ: Διαγραμμα αποφασεων για την εξακριβωση τησ συμφωνιασ ενοσ δειγματοσ ελαιολαδου με τη δηλωθεισα κατηγορια Παράρτημα II: ►M21 Προσδιορισμός των ελευθέρων λιπαρών οξέων, εν ψυχρώ μέθοδος ◄ Παράρτημα III: Προσδιορισμός του αριθμού υπεροξειδίων Παράρτημα IV: ►M6 Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε κηρούς διά χρωματογραφίας αερίου φάσεως με τριχοειδή στήλη ◄ Παράρτημα V: Προσδιορισμοσ τησ συνθεσησ και τησ περιεκτικοτητασ σε στερολεσ και τριτερπενικεσ διαλκοολεσ με αεριοχρωματογραφια τριχοειδουσ στηλησ Παράρτημα VII: ►M21 Προσδιορισμός της εκατοστιαίας αναλογίας 2-μονοπαλμιτίνης ◄ ▼M20 ————— ▼B Παράρτημα IX: Φασματοφωτομετρικη εξεταση υπεριωδουσ ▼M28 Παράρτημα Χ: Προσδιορισμός των μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων με αεριοχρωματογραφία ▼B Παράρτημα XI: Προσδιορισμός της περιεκτικότητας του ελαιολάδου σε αλογονούχους πτητικούς διαλύτες Παράρτημα XII: Μεθοδοσ του διεθνουσ συμβουλιου ελαιοκομιασ για την οργανοληπτικη εξεταση παρθενου ελαιολαδου ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Παράρτημα XV: Περιεκτικότητα σε έλαιο των ελαιοπυρήνων Παράρτημα XVI: Προσδιορισμός του αριθμού ιωδίου Παράρτημα XVII: Μέθοδος προσδιορισμού των στιγμασταδιενίων στα φυτικά έλαια Παράρτημα XVIII: Προσδιορισμοσ τησ διαφορασ μεταξυ πραγματικησ και θεωρητικησ περιεκτικοτητασ σε τριακυλογλυκερολεσ με ECN 42 Παράρτημα XIX: ►M28 Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε αλειφατικές και τριτερπενικές αλκοόλες με αεριοχρωματογραφία τριχοειδούς στήλης ◄ ▼M23 Παράρτημα ΧΧ: Μέθοδος προσδιορισμού της περιεκτικότητας σε κηρούς, καθώς και σε μεθυλεστέρες και αιθυλεστέρες λιπαρών οξέων, με αεριοχρωματογραφία τριχοειδούς στήλης ▼M28 ————— ▼M25 Παράρτημα XXI: Αποτελέσματα των αναφερόμενων στο άρθρο 8 παράγραφος 2 ελέγχων συμμόρφωσης για τα ελαιόλαδα

▼M27









ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I

ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΟΥ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ







Κατηγορία Αιθυλεστέρες λιπαρών οξέων (FAEE) (*) Οξύτητα (%) (*) Αριθμός υπεροξειδίων mEq O2/kg (*) Κηροί mg/kg (**) 2-μονοπαλμιτικό γλυκερύλιο (%) Στιγμασταδιένια mg/kg (1) Διαφορά μεταξύ ECN42 (HPLC) και ECN42 (θεωρητικός υπολογισμός) K232 (*) K268 ή K270 (*) ΔΚ (*) Οργανοληπτική εξέταση Διάμεσος του ελαττώματος (Md) (*) Οργανοληπτική εξέταση Διάμεση τιμή του φρουτώδους (Mf) (*) 1. Εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο FAEE ≤ 40 mg/kg (ελαιοκομική περίοδος 2013-2014) (2) FAEE ≤ 35 mg/kg (ελαιοκομική περίοδος 2014-2016) FAEE ≤ 30 mg/kg (ελαιοκομική περίοδος μετά το 2016) ≤ 0,8 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9 εάν ολικό παλμιτικό οξύ % ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 εάν ολικό παλμιτικό οξύ % > 14 % 2. Παρθένο ελαιόλαδο — ≤ 2,0 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9 εάν ολικό παλμιτικό οξύ % ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0 εάν ολικό παλμιτικό οξύ % > 14 % 3. Μειονεκτικό ελαιόλαδο (λαμπάντε) — > 2,0 — C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (3) ≤ 0,9 εάν ολικό παλμιτικό οξύ % ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ |0,3| — — — Md > 3,5 (4) — ≤ 1,1 εάν ολικό παλμιτικό οξύ % > 14 % 4. Εξευγενισμένο ελαιόλαδο — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9 εάν ολικό παλμιτικό οξύ % ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 εάν ολικό παλμιτικό οξύ % > 14 % 5. Σύνθετο ελαιόλαδο αποτελούμενο από εξευγενισμένα και παρθένα ελαιόλαδα — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9 εάν ολικό παλμιτικό οξύ % ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 εάν ολικό παλμιτικό οξύ % > 14 % 6. Ακατέργαστο πυρηνέλαιο — — — C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (5) ≤ 1,4 — ≤ |0,6| — — — — — 7. Εξευγενισμένο πυρηνέλαιο — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,4 — ≤ |0,5| — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Πυρηνέλαιο — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,2 — ≤ |0,5| — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Άθροισμα των ισομερών που θα μπορούσαν να διαχωριστούν (ή όχι) με τριχοειδή στήλη. (2) Το όριο ισχύει για τα ελαιόλαδα που έχουν παραχθεί από την 1η Μαρτίου 2014 και έπειτα. (3) Τα έλαια με περιεκτικότητα σε κηρούς μεταξύ 300 και 350 mg/kg θεωρούνται μειονεκτικά ελαιόλαδα, εάν η περιεκτικότητα σε ολικές αλειφατικές αλκοόλες είναι μικρότερη ή ίση με 350 mg/kg ή εάν η εκατοστιαία αναλογία ερυθροδιόλης και ουβαόλης είναι μικρότερη ή ίση με 3,5 %. (4) Η διάμεση τιμή των ελαττωμάτων μπορεί να είναι μικρότερη ή ίση με 3,5 και η διάμεσος του φρουτώδους να ισούται με 0. (5) Τα έλαια με περιεκτικότητα σε κηρούς μεταξύ 300 και 350 mg/kg θεωρούνται ακατέργαστα πυρηνέλαια, εάν η περιεκτικότητα σε ολικές αλειφατικές αλκοόλες υπερβαίνει τα 350 mg/kg και η εκατοστιαία αναλογία ερυθροδιόλης και ουβαόλης υπερβαίνει το 3,5 %.







Κατηγορία Σύσταση σε λιπαρά οξέα (1) Ολικά ισομερή του transελαϊκού οξέος (%) Ολικά ισομερή του trans-λινελαϊκού + trans- λινολενικού οξέος (%) Σύσταση σε στερόλες Ολικές στερόλες (mg/kg) Ερυθροδιόλη και ουβαόλη (%) (**) Μυριστικό (%) Λινολενικό (%) Αραχιδικό (%) Εικοσενικό (%) Βεχενικό (%) Λιγνοκηρικό (%) Χοληστερόλη (%) Βρασικαστερόλη (%) Καμπεστερόλη (2) (%) Στιγμαστερόλη (%) Φαινόμενη βσιτοστερόλη (3) (%) (**) δ-7 Στιγμαστενόλη (2) (%) 1. Εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Καμπ. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Παρθένο ελαιόλαδο ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Καμπ. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Μειονεκτικό ελαιόλαδο (λαμπάντε) ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (4) 4. Εξευγενισμένο ελαιόλαδο ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Καμπ. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Σύνθετο ελαιόλαδο αποτελούμενο από εξευγενισμένα και παρθένα ελαιόλαδα ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Καμπ. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Ακατέργαστο πυρηνέλαιο ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (5) 7. Εξευγενισμένο πυρηνέλαιο ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Καμπ. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Πυρηνέλαιο ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Καμπ. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 (1) Περιεκτικότητα σε άλλα λιπαρά οξέα (%): παλμιτικό: 7,50-20,00· παλμιτελαϊκό: 0,30-3,50· δεκαεπτανικό: ≤ 0,30· δεκαεπτενικό: ≤ 0,30· στεατικό: 0,50-5,00· ελαϊκό: 55,00-83,00· λινελαϊκό: 2,50-21,00. (2) Βλέπε προσάρτημα του παρόντος παραρτήματος. (3) Φαινόμενη β-σιτοστερόλη: δ-5,23-στιγμασταδιενόλη + κλεροστερόλη + β-σιτοστερόλη + σιτοστανόλη + δ-5-αβεναστερόλη + δ-5,24-στιγμασταδιενόλη. (4) Τα έλαια με περιεκτικότητα σε κηρούς μεταξύ 300 και 350 mg/kg θεωρούνται μειονεκτικά ελαιόλαδα, εάν η περιεκτικότητα σε ολικές αλειφατικές αλκοόλες είναι μικρότερη ή ίση με 350 mg/kg ή εάν η εκατοστιαία αναλογία ερυθροδιόλης και ουβαόλης είναι μικρότερη ή ίση με 3,5 %. (5) Τα έλαια με περιεκτικότητα σε κηρούς μεταξύ 300 και 350 mg/kg θεωρούνται ακατέργαστα πυρηνέλαια, εάν η περιεκτικότητα σε ολικές αλειφατικές αλκοόλες υπερβαίνει τα 350 mg/kg ή εάν η εκατοστιαία αναλογία ερυθροδιόλης και ουβαόλης υπερβαίνει το 3,5 %.

Σημειώσεις:

α) Τα αποτελέσματα των αναλύσεων πρέπει να εκφράζονται με τον αριθμό δεκαδικών ψηφίων που προβλέπεται για κάθε χαρακτηριστικό. Το τελευταίο αριθμητικό ψηφίο πρέπει να αυξάνεται κατά μία μονάδα, εάν το επόμενο ψηφίο είναι μεγαλύτερο από 4.

β) Αρκεί έστω και ένα χαρακτηριστικό να μην ανταποκρίνεται στις αναγραφόμενες τιμές για να καταταχθεί το ελαιόλαδο σε άλλη κατηγορία ή να δηλωθεί ότι δεν είναι καθαρό για τους σκοπούς του παρόντος κανονισμού.

γ) Τα αναφερόμενα στην ποιότητα του ελαιολάδου χαρακτηριστικά που σημειώνονται με αστερίσκο (*) υποδηλώνουν ότι: — προκειμένου για μειονεκτικό ελαιόλαδο, τα δύο σχετικά όρια μπορούν να διαφέρουν συγχρόνως από τις αναγραφόμενες τιμές, — προκειμένου για παρθένο ελαιόλαδο, η διαφορά ενός τουλάχιστον από τα όρια αυτά από τις αναγραφόμενες τιμές συνεπάγεται αλλαγή κατηγορίας, το ελαιόλαδο όμως εξακολουθεί να κατατάσσεται σε μία από τις κατηγορίες παρθένου ελαιολάδου.

δ) Τα χαρακτηριστικά που σημειώνονται με διπλό αστερίσκο (**) υποδηλώνουν ότι, για όλα τα είδη πυρηνελαίων, τα δύο σχετικά όρια μπορούν να διαφέρουν συγχρόνως από τις αναγραφόμενες τιμές.









Προσάρτημα

ΔΕΝΔΡΟΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΑΠΟΦΑΣΕΩΝ

Δενδροδιάγραμμα αποφάσεων σχετικά με την καμπεστερόλη για παρθένα και εξαιρετικά παρθένα ελαιόλαδα:

Οι άλλες παράμετροι συμμορφώνονται με τα όρια του παρόντος κανονισμού.

Δενδροδιάγραμμα αποφάσεων σχετικά με τη δ-7 στιγμαστενόλη για:

— Εξαιρετικά παρθένα και παρθένα ελαιόλαδα —

Οι άλλες παράμετροι συμμορφώνονται με τα όρια του παρόντος κανονισμού.

— Πυρηνέλαια (ακατέργαστα και εξευγενισμένα) —

▼M26









ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ια

ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ Ή ΠΥΡΗΝΕΛΑΙΟΥ ΠΟΥ ΠΑΡΑΔΙΔΟΝΤΑΙ ΣΕ ΑΜΕΣΕΣ ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΕΣ

Η παρούσα μέθοδος δειγματοληψίας εφαρμόζεται σε παρτίδες ελαιολάδου ή πυρηνελαίου σε άμεσες συσκευασίες. Ισχύουν διαφορετικές μέθοδοι δειγματοληψίας ανάλογα με το αν η περιεκτικότητα της άμεσης συσκευασίας υπερβαίνει τα 5 λίτρα ή όχι.

Ως «παρτίδα» νοείται ένα σύνολο μονάδων πώλησης που παράγονται, μεταποιούνται και συσκευάζονται σε τέτοιες συνθήκες ώστε το έλαιο που περιέχει καθεμία από αυτές τις μονάδες πώλησης να θεωρείται ομοιογενές ως προς όλα τα αναλυτικά χαρακτηριστικά. Οι παρτίδες πρέπει να ταυτοποιούνται σύμφωνα με την οδηγία 2011/91/ΕΕ του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου ( 6 ).

Ως «στοιχειώδες δείγμα» νοείται η ποσότητα ελαίου που περιέχεται σε μια άμεση συσκευασία και λαμβάνεται από τυχαίο σημείο της παρτίδας.

1. ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΤΟΥ ΒΑΣΙΚΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ

1.1. Άμεση συσκευασία με χωρητικότητα που δεν υπερβαίνει τα 5 λίτρα

Ως «βασικό δείγμα», προκειμένου για άμεση συσκευασία με χωρητικότητα που δεν υπερβαίνει τα 5 λίτρα, νοείται ο αριθμός των στοιχειωδών δειγμάτων που λαμβάνονται από μια παρτίδα και σύμφωνα με τον πίνακα 1.







Πίνακας 1 Το ελάχιστο μέγεθος βασικού δείγματος πρέπει να είναι το εξής Όταν η χωρητικότητα της άμεσης συσκευασίας είναι Το βασικό δείγμα πρέπει να είναι το έλαιο που περιέχεται α) 1 λίτρο ή μεγαλύτερη α) σε 1 άμεση συσκευασία β) μικρότερη από 1 λίτρο β) στον ελάχιστο αριθμό συσκευασιών με συνολική χωρητικότητα τουλάχιστον 1,0 λίτρου

Κάθε κράτος μέλος δύναται να αυξάνει τον αριθμό των συσκευασιών που αναφέρονται στον πίνακα 1 και συνιστούν ένα βασικό δείγμα, ανάλογα με τις ανάγκες του (για παράδειγμα, οργανοληπτική εξέταση από διαφορετικό εργαστήριο από αυτό που διενήργησε τις χημικές αναλύσεις, κατ’ έφεση ανάλυση κ.λπ.).

1.2. Άμεση συσκευασία με χωρητικότητα που υπερβαίνει τα 5 λίτρα

Ως «βασικό δείγμα», προκειμένου για άμεση συσκευασία με χωρητικότητα που υπερβαίνει τα 5 λίτρα, νοείται ένα αντιπροσωπευτικό μέρος του συνόλου των στοιχειωδών δειγμάτων, λαμβανόμενο με διαδικασία μείωσης και σύμφωνα με τον πίνακα 2. Το βασικό δείγμα πρέπει να αποτελείται από διάφορα αντιπροσωπευτικά δείγματα.

Ως «αντιπροσωπευτικό δείγμα» βασικού δείγματος νοείται καθεμία από τις συσκευασίες που απαρτίζουν το βασικό δείγμα.







Πίνακας 2 Ελάχιστος αριθμός στοιχειωδών δειγμάτων που πρέπει να επιλέγονται Αριθμός συσκευασιών στην παρτίδα Ελάχιστος αριθμός στοιχειωδών δειγμάτων που πρέπει να επιλέγονται Έως 10 1 Από … 11 έως 150 2 Από … 151 έως 500 3 Από … 501 έως 1 500 4 Από … 1 501 έως 2 500 5 > 2 500 ανά 1 000 συσκευασίες 1 επιπλέον στοιχειώδες δείγμα

Προκειμένου να μειωθεί ο όγκος των δειγματιζόμενων άμεσων συσκευασιών, το περιεχόμενο των στοιχειωδών δειγμάτων ομοιογενοποιείται για την παρασκευή του βασικού δείγματος. Τα τμήματα περιεχομένου των διαφορετικών στοιχειωδών δειγμάτων τοποθετούνται σε κοινό δοχείο για ομοιογενοποίηση με ανάδευση, ώστε να προστατεύονται όσο το δυνατόν καλύτερα από τον αέρα.

Το περιεχόμενο του βασικού δείγματος πρέπει να τοποθετείται σε σειρά συσκευασιών με την ελάχιστη χωρητικότητα του 1,0 λίτρου, καθεμία από τις οποίες αποτελεί αντιπροσωπευτικό δείγμα βασικού δείγματος.

Κάθε κράτος μέλος δύναται να αυξάνει τον αριθμό των βασικών δειγμάτων, ανάλογα με τις ανάγκες του (για παράδειγμα, οργανοληπτική εξέταση από διαφορετικό εργαστήριο από αυτό που διενήργησε τις χημικές αναλύσεις, κατ’ έφεση ανάλυση κ.λπ.).

Κάθε συσκευασία πρέπει να πληρούται κατά τρόπο που ελαχιστοποιεί το στρώμα αέρα στο πάνω μέρος της και, στη συνέχεια, να κλείνεται κατάλληλα και να σφραγίζεται ώστε να διασφαλίζεται ο αλύμαντο του προϊόντος.

Αυτά τα αντιπροσωπευτικά δείγματα πρέπει να επισημαίνονται προκειμένου να εξασφαλίζεται η ορθή ταυτοποίησή τους.

2. ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΚΑΙ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

2.1. Κάθε βασικό δείγμα πρέπει να χωρίζεται σε εργαστηριακά δείγματα, σύμφωνα με το σημείο 2.5 του προτύπου EN ISO 5555, και να υποβάλλεται σε ανάλυση με τη σειρά που εμφαίνεται στο δενδροδιάγραμμα αποφάσεων του παραρτήματος Ιβ ή με οποιαδήποτε άλλη τυχαία σειρά.

2.2. Εάν όλα τα αποτελέσματα των αναλύσεων συμφωνούν με τα χαρακτηριστικά της δηλωθείσας κατηγορίας ελαίου, ολόκληρη η παρτίδα θεωρείται σύμφωνη. Εάν έστω και ένα αποτέλεσμα των αναλύσεων δεν συμφωνεί με τα χαρακτηριστικά της δηλωθείσας κατηγορίας ελαίου, ολόκληρη η παρτίδα θεωρείται μη σύμφωνη.

3. ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΤΗΣ ΚΑΤΗΓΟΡΙΑΣ ΤΗΣ ΠΑΡΤΙΔΑΣ

3.1. Προκειμένου να επαληθευθεί η κατηγορία της παρτίδας, η αρμόδια αρχή μπορεί να αυξήσει τον αριθμό των βασικών δειγμάτων που λαμβάνονται από διάφορα σημεία της παρτίδας σύμφωνα με τον επόμενο πίνακα:



Πίνακας 3 Αριθμός βασικών δειγμάτων καθοριζόμενος από το μέγεθος της παρτίδας Μέγεθος της παρτίδας (λίτρα) Αριθμός βασικών δειγμάτων Λιγότερα από 7 500 2 7 500 έως λιγότερα από 25 000 3 25 000 έως λιγότερα από 75 000 4 75 000 έως λιγότερα από 125 000 5 125 000 ή περισσότερα 6 + 1 για κάθε επιπλέον 50 000 λίτρα Κάθε στοιχειώδες δείγμα που αποτελεί μέρος του βασικού δείγματος πρέπει να λαμβάνεται από μη διακριτή θέση της παρτίδας· είναι απαραίτητο να σημειώνεται η θέση κάθε βασικού δείγματος και να ταυτοποιείται με σαφήνεια. Κάθε βασικό δείγμα πρέπει να σχηματίζεται σύμφωνα με τις διαδικασίες που αναφέρονται στα σημεία 1.1 και 1.2. Στη συνέχεια, κάθε βασικό δείγμα υποβάλλεται στις αναλύσεις που αναφέρονται στο άρθρο 2 παράγραφος 1.

3.2. Όταν ένα από τα αποτελέσματα των αναφερόμενων στο άρθρο 2 παράγραφος 1 αναλύσεων ενός τουλάχιστον βασικού δείγματος δεν συμφωνεί με τα χαρακτηριστικά της δηλωθείσας κατηγορίας ελαίου, ολόκληρη η παρτίδα δειγματοληψίας θεωρείται μη σύμφωνη.









ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ιβ

ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΑΠΟΦΑΣΕΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΞΑΚΡΙΒΩΣΗ ΤΗΣ ΣΥΜΦΩΝΙΑΣ ΕΝΟΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ ΜΕ ΤΗ ΔΗΛΩΘΕΙΣΑ ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ

Πίνακας 1

Πίνακας 2

Πίνακας 3









Προσάρτημα 1







Πίνακας αντιστοιχίας μεταξύ των παραρτημάτων του παρόντος κανονισμού και των αναλύσεων που αναφέρονται στο δενδροδιάγραμμα αποφάσεων — Οξύτητα Παράρτημα II Προσδιορισμός των ελεύθερων λιπαρών οξέων, ψυχρή μέθοδος — Αριθμός υπεροξειδίων Παράρτημα III Προσδιορισμός του αριθμού υπεροξειδίων — Φασματομετρία υπεριώδους Παράρτημα IX Φασματοφωτομετρική ανάλυση — Οργανοληπτική εξέταση Παράρτημα XII Οργανοληπτική εξέταση παρθένου ελαιολάδου — Αιθυλεστέρες Παράρτημα ΧΧ Μέθοδος προσδιορισμού της περιεκτικότητας σε κηρούς, καθώς και σε μεθυλεστέρες και αιθυλεστέρες λιπαρών οξέων, με αεριοχρωματογραφία τριχοειδούς στήλης — 3,5-στιγμασταδιένια Παράρτημα XVII Μέθοδος προσδιορισμού των στιγμασταδιενίων στα φυτικά έλαια ▼M28 — Trans ισομερή των λιπαρών οξέων Παράρτημα X Προσδιορισμός των μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων με αεριοχρωματογραφία — Περιεκτικότητα σε λιπαρά οξέα Παράρτημα X Προσδιορισμός των μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων με αεριοχρωματογραφία ▼M26 — ΔΕCN42 Παράρτημα XVIII Προσδιορισμός της σύνθεσης σε τριγλυκερίδια με ECN42 (διαφορά μεταξύ των δεδομένων HPLC και της θεωρητικής περιεκτικότητας) — Σύνθεση σε στερόλες και ολικές στερόλες — Ερυθροδιόλη και ουβαόλη Παράρτημα V Προσδιορισμός της σύστασης και της περιεκτικότητας σε στερόλες και τριτερπενικές διαλκοόλες μέσω αέριας χρωματογραφίας τριχοειδούς στήλης — Κηροί Παράρτημα IV Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε κηρούς με αεριοχρωματογραφία τριχοειδούς στήλης ▼M28 — Αλειφατικές και τριτερπενικές αλκοόλες Παράρτημα XIX Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε αλειφατικές και τριτερπενικές αλκοόλες με αεριοχρωματογραφία τριχοειδούς στήλης ▼M26 — Κορεσμένα λιπαρά οξέα στη θέση 2 Παράρτημα VII Προσδιορισμός της εκατοστιαίας αναλογίας 2-μονοπαλμιτίνης

▼B









ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II

▼M21

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ, ΕΝ ΨΥΧΡΩ ΜΕΘΟΔΟΣ

▼B

1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ

Ο προσδιορισμός ελεύθερων λιπαρών οξέων σε ελαιόλαδα. Η περιεκτικότητα σε ελεύθερα λιπαρά οξέα εκφράζεται ως οξύτητα υπολογισθείσα με συμβατικό τρόπο.

1.1. Αρχή

Διαλύεται το δείγμα σε μείγμα διαλυτών και τα περιεχόμενα ελεύθερα λιπαρά οξέα ογκομετρούνται χρησιμοποιώντας διάλυμα υδροξείδιου του καλίου σε αιθανόλη.

1.2. Αντιδραστήρια

Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αναγνωρισμένης αναλυτικής καθαρότητας και το χρησιμοποιούμενο νερό να είναι απεσταγμένο ή ισοδύναμης καθαρότητας.

1.2.1. Μείγμα διαιθυλαιθέρος αιθανόλης 95 % [με αναλογία 1:1 (V/V)].

Προσοχή:

Ο διαιθυλαιθέρας είναι εξαιρετικά εύφλεκτος και μπορεί να σχηματίσει εκρηκτικά υπεροξείδια. Πρέπει να λαμβάνεται ειδική μέριμνα κατά τη χρήση του.

Εξουδετερώνεται ακριβώς τη στιγμή χρησιμοποίησής του με το διάλυμα υδροξείδιου του καλίου (1.2.2), με την προσθήκη 0,3 ml διαλύματος φαινολοφθαλεϊνης (1.2.3) ανά 100 ml μείγματος.

Σημείωση:

Εάν δεν είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί διαιθυλαιθέρας, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μείγμα διαλυτών που περιέχει αιθανόλη και τολουόλιο. Εάν χρειαστεί, η αιθανόλη μπορεί να αντικατασταθεί από 2-προπανόλη.

1.2.2. Πρότυπο διάλυμα υδροξειδίου του καλίου σε αιθανόλη, κανονικότητας περίπου 0,1 mol/l ή, εάν χρειαστεί, περίπου 0,5 mol/l. Η ακριβής συγκέντρωση του αιθανολικού διαλύματος υδροξείδιου του καλίου πρέπει να είναι γνωστή και να έχει ελεγχθεί ακριβώς πριν χρησιμοποιηθεί. Χρησιμοποιείται διάλυμα παρασκευασμένο τουλάχιστον πέντε ημέρες πριν από τη χρήση και αποθηκευμένο σε σκούρα (καστανή) γυάλινη φιάλη με ελαστικό πώμα. Το διάλυμα πρέπει να είναι άχρωμο ή χρώματος αμυδρώς κίτρινου. Σημείωση: Ένα σταθερό άχρωμο διάλυμα υδροξείδιου του καλίου μπορεί να παρασκευαστεί ως εξής: Φέρονται σε βρασμό 1 000 ml αιθανόλης με 8 g υδροξείδιου του καλίου και 0,5 g ρινισμάτων αργιλίου και συνεχίζεται επί μία ώρα ο βρασμός με κάθετο ψυκτήρα. Εκτελείται αμέσως διήθηση. Διαλύεται μέσα στο διήθημα η απαιτούμενη ποσότητα υδροξείδιου του καλίου. Αφήνονται επί αρκετές ημέρες και το διαυγές υπερκείμενο υγρό διαχωρίζεται με έκχυση από το ίζημα ανθρακικού καλίου. Το διάλυμα μπορεί επίσης να παρασκευαστεί χωρίς διήθηση ως εξής: Σε 1 000 ml αιθανόλης προστίθενται 4 ml βουτυλικού αργιλίου και το μείγμα αφήνεται επί αρκετές ημέρες. Το υπερκείμενο υγρό εκχύεται και διαλύεται η απαιτούμενη ποσότητα υδροξείδιου του καλίου. Το διάλυμα είναι έτοιμο προς χρήση.

1.2.3. Φαινολοφθαλεΐνη, διάλυμα 10 g/l σε αιθανόλη 95-96 (V/V) ή κυανούν της βρωμοφαινόλης (στην περίπτωση λιπών με έντονο χρώμα), διάλυμα 20 g/l σε αιθανόλη 95-96 (V/V).

1.3. Όργανα

Συνηθισμένος εργαστηριακός εξοπλισμός, περιλαμβάνοντας:

1.3.1. Αναλυτικό ζυγό.

1.3.2. Κωνική φιάλη των 250 ml.

1.3.3. Προχοΐδα των 10 ml, βαθμονομημένη ανά 0,05 ml.

1.4. Διαδικασία

1.4.1. Παρασκευή δείγματος προς ανάλυση Ο προσδιορισμός πραγματοποιείπαι επί του διηθημένου δείγματος, εάν η συνολική περιεκτικότητα σε υγρασία και ξένες προσμείξεις είναι μικρότερη από 1 %, ο προσδιορισμός πραγματοποιείται επί που δείγματος όπως έχει.

1.4.2. Ποσότης του δείγματος δοκιμής Η ποσότης του δείγματος δοκιμής είναι ανάλογη με την αναμενόμενη οξύτητα, σύμφωνα με τον ακόλουθο πίνακα.



Αναμενόμενος δείκτης οξύτητας Μάζα δείγματος δοκιμής Ακρίβεια ζύγισης δείγματος δοκιμής < 1 20 0,05 1 μέχρι 4 10 0,02 4 μέχρι 15 2,5 0,01 15 μέχρι 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Το δείγμα δοκιμής ζυγίζεται στην κωνική φιάλη (4.3.2).

1.4.3. Προσδιορισμός Το δείγμα δοκιμής (1.4.2) διαλύεται σε 50 ως 150 ml του προηγούμενα εξουδετερωμένου μείγματος διαιθυλαιθέρος και αιθανόλης (1.2.1). Ογκομετρείται με ταυτόχρονη ανάδευση με το διάλυμα 0,1 mol υδροξείδιου του καλίου (1.2.2) (βλέπε σημείωση 2) έως ότου αλλάξει χρώμα ο δείκτης (το ρόδινο χρώμα της φαινολοφθαλεΐνης επικρατεί επί τουλάχιστον 10 δευτερόλεπτα). Σημειώσεις: 1. Το τιτλοδοτημένο αιθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου (1.2.2) δύναται να αντικατασταθεί από ένα υδατικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου ή του νατρίου, εφόσον ο όγκος του εισαχθέντος ύδατος δεν επιφέρει διαχωρισμό των φάσεων. 2. Εάν η απαραίτητη ποσότητα διαλύματος του υδροξειδίου του καλίου 0,1 mol/l υπερβαίνει τα 10 ml, χρησιμοποιείται ένα διάλυμα 0,5 mol/l. 3. Εάν το διάλυμα θολώνει κατά την ογκομέτρηση, προστίθεται μια ικανοποιητική ποσότητα μείγματος διαλυτών προκειμένου να επιτευχθεί ένα διαυγές διάλυμα.

1.5. Έκφραση της οξύτητας επί τοις % συγκέντρωσης ελαϊκού οξέος

Η οξύτητα, εκφρασμένη σε κατά βάρος εκατοστιαία αναλογία, ισούται με:

όπου:

V είναι ο όγκος σε χιλιοστόλιτρα, του τιτλοδοτημένου διαλύματος υδροξειδίου του καλίου που έχει χρησιμοποιηθεί,

c είναι η ακριβής συγκέντρωση, σε moles ανά λίτρο, του τιτλοδοτημένου διαλύματος υδροξειδίου του καλίου που έχει χρησιμοποιηθεί,

M είναι το γραμμομοριακό βάρος, σε γραμμάρια ανά mole, του οξέος που χρησιμοποιήθηκε για την έκφραση του αποτελέσματος (= 282),

m είναι το βάρος, σε γραμμάρια, του δείγματος δοκιμής.

Ως αποτέλεσμα λαμβάνεται ο αριθμητικός μέσος όρος ►M6 δύο προσδιορισμών ◄ .









ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ III

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΑΡΙΘΜΟΥ ΥΠΕΡΟΞΕΙΔΙΩΝ

1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ

Η προδιαγραφή αυτη περιγράφει μια μέθοδο προσδιορισμού του αριθμού των υπεροξειδίων ελαίων και λιπών.

2. ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ

►C1 Η μέθοδος ◄ αυτή είναι εφαρμόσιμη σε ζωικά και φυτικά έλαια και λίπη.

3. ΟΡΙΣΜΟΣ

Ο αριθμός υπεροξειδίων εκφράζει την ποσότητα αυτών των συστατικών του δείγματος (εκφρασμένη σε χιλιοστοϊσοδύναμα ενεργού οξυγόνου ανά kg) που οξειδώνουν το ιωδιούχο κάλιο κάτω από τις περιγραφόμενες συνθήκες αναλύσεις.

4. ΑΡΧΗ

Το ληφθέν δείγμα διαλύεται σε μείγμα οξεικού οξέος και χλωροφόρμιου και προστίθεται διάλυμα ιωδιούχου καλίου. Ογκομέτρηση του απελευθερούμενου ιωδίου με πρότυπο διάλυμα θειοθειικού νατρίου.

5. ΟΡΓΑΝΑ

Όλος ο χρησιμοποιούμενος εξοπλισμός πρέπει να είναι απαλλαγμένος αναγωγικών ή οξειδωτικών ουσιών.

Σημείωση:

Να μην λιπαίνονται οι εσμυρισμένες επιφάνειες.

5.1. Γυάλινο κουτάλι των 3 ml.

5.2. Εσμυρισμένες φιάλες με πώματα, χωρητικότητας περίπου 250 ml, οι οποίες προηγουμένως έχουν ξηρανθεί και στις οποίες έχει διαβιβάσθει αδρανές αέριο (άζωτο ή, προτιμότερα, διοξείδιο του άνθρακα).

5.3. Προχοΐδα των 25 ή 50 ml, βαθμολογημένη ανά 0,1 ml.

6. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ

6.1. Χλωροφόρμιο, αναλυτικής καθαρότητος, απαλλαγμένο οξυγόνου με διοχέτευση υπό πίεση, μέσα από αυτό, ρεύματος καθαρού, ξηρού αδρανούς αερίου.

6.2. Κρυσταλλικό οξεικό οξύ, αναλυτικής καθαρότητος, απαλλαγμένο οξυγόνου με διοχέτευση, υπό πίεση, μέσα από αυτό, καθαρού, ξηρού αερίου.

6.3. Κεκορεσμένο υδατικό διάλυμα ΚΙ προσφάτως παρασκευασθέν, απαλλαγμένο από ιώδιο και ιωδικά.

6.4. Πρότυπο διάλυμα ►C1 θειθειικού ◄ νατρίου 0,01 ή 0,002 N, τιτλοδοτημένο μόλις πριν χρησιμοποιηθεί.

6.5. Υδατικό διάλυμα αμύλου 10 g/l, πρόσφατα παρασκευασμένο από φυσικό διαλυτό άμυλο.

7. ΔΕΙΓΜΑ

Να ληφθεί μέριμνα για την παραλαβή και διατήρηση του δείγματος μακριά από φώς, θερμότητα και σε εντελώς γεμάτα γυάλινα δοχεία, ερμητικά σφραγισμένα με πώματα, από αδιαφανές γυαλί ή φελλό.

8. ΠΟΡΕΙΑ ΑΝΑΛΥΣΕΩΣ

Η ανάλυση πρέπει να γίνεται με διάχυτο φυσικό ή με τεχνητό φωτισμό. Ζυγίζεται σε γυάλινο κουτάλι (5.1) ή εάν αυτό δεν υπάρχει, σε φιάλη (5.2) με ακρίβεια 0,001 g, ποσότης του δείγματος σύμφωνα με τον ακόλουθο πίνακα, ανάλογα με τον αναμενόμενο αριθμό υπεροξειδίων.







Αναμενόμενος αριθμός υπεροξειδίων (mEq) Βάρος δείγματος σε gr (g) 0-12 5,0-2,0 12-20 2,0-1,2 20-30 1,2-0,8 30-50 0,8-0,5 50-90 0,5-0,3

Αποπωματίζεται μία φιάλη (5.2) και εισάγεται το γυάλινο κουτάλι που περιέχει τη ζυγισθείσα ποσότητα του δείγματος. Προστίθενται 10 ml χλωροφόρμιου (6.1). Διαλύεται το δείγμα γρήγορα με ανάδευση. Προστίθενται 15 ml οξικού οξέος (6.2), κατόπιν 1 ml διαλύματος ιωδιούχου καλίου (6.3). Πωματίζεται γρήγορα, γίνεται ανάδευση επί ένα λεπτό, και αφήνεται για 5 λεπτά ακριβώς, μακριά από το φώς σε θερμοκρασία 15 έως 25 °C.

Προστίθενται περίπου 75 ml απεσταγμένου νερού. Το απελευθερούμενο ιώδιο ογκομετρείται με το διάλυμα του θειοθειικού νατρίου (6.4) (διάλυμα 0,002 N για αναμενόμενες τιμές μικρότερες από 12, και διάλυμα 0,01 N για αναμενόμενες τιμές πάνω από 12) με ζωηρή ανάδευση, χρησιμοποιώντας διάλυμα αμύλου (6.5) σαν δείκτη.

Εκτελούνται δύο ποσδιορισμοί στο ίδιο δοκιμαστικό δείγμα.

Εκτελείται ταυτόχρονα λευκός προσδιορισμός (τυφλός). Εάν το αποτέλεσμα του τυφλού ξεπερνά τα 0,05 ml διαλύματος 0,01 N θειοθειικού νατρίου (6.4), αντικαθίστανται τα αντιδραστήρια.

9. ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

Ο αριθμός υπεροξειδίων (AY), εκπεφρασμένος σε χιλιοστοϊσοδύναμα ενεργού οξυγόνου ανά kg, δίνεται από τη σχέση:







όπου V είναι ο αριθμός των ml του προτύπου διαλύματος θειοθειικού νατρίου (6.4) χρησιμοποιούμενου για την ογκομέτρηση, μετά την αφαίρεση του λευκού, T είναι η ακριβής κανονικότητα του διαλύματος θειοθειικού νατρίου (6.4) που χρησιμοποιείται, m είναι το βάρος του δείγματος σε g.

Σαν αποτέλεσμα λαμβάνεται ο αριθμητικός μέσος των δύο εκτελεσθέντων προσδιορισμών.

▼M21









ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IV

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ ΚΗΡΟΥΣ ΜΕ ΑΕΡΙΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΤΡΙΧΟΕΙΔΟΥΣ ΣΤΗΛΗΣ

1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ

Στην παρούσα μέθοδο περιγράφεται διαδικασία προσδιορισμού της περιεκτικότητας των ελαιολάδων σε κηρούς. Οι κηροί διαχωρίζονται ανάλογα με τον αριθμό των ατόμων άνθρακα. Η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί κυρίως για τη διάκριση μεταξύ του ελαιολάδου που λαμβάνεται με έκθλιψη και εκείνου που λαμβάνεται με εκχύλιση (πυρηνέλαιο).

2. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Προστίθεται στη λιπαρή ουσία κατάλληλο εσωτερικό πρότυπο και ακολουθεί διαχωρισμός με χρωματογραφία σε στήλη ένυδρου διοξειδίου του πυριτίου (silica gel). Παραλαμβάνεται το πρώτο κλάσμα που εκλούεται στις συνθήκες της δοκιμής (με πολικότητα μικρότερη εκείνης των τριγλυκεριδίων) και υποβάλλεται σε άμεση ανάλυση με αέρια χρωματογραφία τριχοειδούς στήλης.

3. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΣΚΕΥΗ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ

3.1. Κωνική φιάλη (Erlenmeyer) των 25 ml.

3.2. Γυάλινη στήλη για αέρια χρωματογραφία, εσωτερικής διαμέτρου 15,0 mm και ύψους 30-40 cm, εφοδιασμένη με στρόφιγγα.

3.3. Αεριοχρωματογράφος δυνάμενος να λειτουργεί με τριχοειδή στήλη, εφοδιασμένος με σύστημα απευθείας εισαγωγής του δείγματος στη στήλη και αποτελούμενος από: 3.3.1. Θερμοστατούμενο θάλαμο στηλών, εξοπλισμένο με προγραμματιστή θερμοκρασίας. 3.3.2. Σύστημα έγχυσης εν ψυχρώ για απευθείας εισαγωγή στη στήλη. 3.3.3. Ανιχνευτή ιονισμού φλόγας και μετατροπέα-ενισχυτή. 3.3.4. Καταγραφέα-ολοκληρωτή δυνάμενο να λειτουργεί με τον μετατροπέα-ενισχυτή (3.3.3), με χρόνο απόκρισης που δεν υπερβαίνει το 1 δευτερόλεπτο και με μεταβλητή ταχύτητα χαρτιού. (Μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν πληροφορικά συστήματα, στα οποία τα αεριοχρωματογραφικά δεδομένα λαμβάνονται με τη βοήθεια υπολογιστή.) 3.3.5. Τριχοειδή στήλη από γυαλί ή τετηγμένο διοξείδιο του πυριτίου, μήκους 8 έως 12 m, εσωτερικής διαμέτρου 0,25 έως 0,32 mm, επικαλυμμένη εσωτερικά με υγρή φάση, ομοιόμορφου πάχους 0,10 έως 0,30 μm (Κατάλληλη υγρή φάση του εμπορίου, τύπου SE 52 ή SE 54.)

3.4. Μικροσύριγγα των 10 μl για την απευθείας εισαγωγή στη στήλη, με συγκολλημένη στο σώμα της βελόνα.

3.5. Ηλεκτρικός δονητής.

3.6. Περιστροφικός εξατμιστήρας.

3.7. Ηλεκτρικός κλίβανος.

3.8. Αναλυτικός ζυγός με ακρίβεια ζύγισης ± 0,1 mg.

3.9. Συνήθη εργαστηριακά γυάλινα σκεύη.

4. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ

4.1. Διοξείδιο του πυριτίου (silica gel) κοκκομετρικού βαθμού 60 έως 200 μm H silica gel πρέπει να τοποθετείται στον κλίβανο σε θερμοκρασία 500 °C επί 4 ώρες τουλάχιστον. Αφού ψυχθεί, προστίθεται νερό σε αναλογία 2 % της ληφθείσας ποσότητας silica gel. Το μείγμα αναδεύεται κατάλληλα, ώστε να ομοιογενοποιηθεί και φυλάσσεται στο σκοτάδι επί 12 τουλάχιστον ώρες πριν χρησιμοποιηθεί.

4.2. n-εξάνιο για χρωματογραφία.

4.3. Αιθυλαιθέρας για χρωματογραφία.

4.4. n-επτάνιο για χρωματογραφία.

4.5. Πρότυπο διάλυμα λαυρικού αραχιδεστέρα 0,1 % (m/V) σε εξάνιο (εσωτερικό πρότυπο) (Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί παλμιτικός παλμιτεστέρας ή μυριστικός στεατεστέρας.) 4.5.1. Χρωστική Soudan 1 (1-φαινυλ-αζω-2-ναφθόλη)

4.6. Φέρον αέριο: καθαρό υδρογόνο ή ήλιο, για αέρια χρωματογραφία

4.7. Βοηθητικά αέρια: — καθαρό υδρογόνο για αέρια χρωματογραφία, — καθαρός αέρας, για αέρια χρωματογραφία.

5. ΤΡΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ

5.1. Ετοιμασία της χρωματογραφικής στήλης

Σχηματίζεται εναιώρημα 15 g silica gel (4.1) σε n-εξάνιο (4.2) και εισάγεται στη στήλη (3.2). Αφήνεται να κατακαθίσει. Η αυτόματη καθίζηση συμπληρώνεται με τη βοήθεια ηλεκτρικού αναδευτήρα (3.5), ώστε η χρωματογραφική στιβάδα να γίνει πιο ομοιογενής. Διηθούνται μέσω της στήλης 30 ml n-εξανίου για να απομακρυνθούν οι ενδεχόμενες ξένες προσμείξεις. Ζυγίζονται με ακρίβεια στον αναλυτικό ζυγό (3.8) 500 mg δείγματος μέσα στη φιάλη Erlenmeyer των 25 ml (3.1) και προστίθεται η κατάλληλη ποσότητα εσωτερικού προτύπου (4.5), ανάλογα με την εκτιμώμενη περιεκτικότητα σε κηρούς. Για παράδειγμα, προστίθεται 0,1 mg λαυρικού αραχιδεστέρα στην περίπτωση του ελαιολάδου και 0,25 έως 0,50 mg στην περίπτωση του πυρηνελαίου. Το παρασκευαζόμενο με τον τρόπο αυτό δείγμα φέρεται στη χρωματογραφική στήλη με τη βοήθεια δύο ποσοτήτων n-εξανίου (4.2) των 2 ml.

Αφήνεται ο διαλύτης να εκρεύσει μέχρι ύψους 1 mm πάνω από το προσροφητικό και, κατόπιν, διηθούνται μέσω της στήλης 70 ml n-εξανίου ακόμη, για να απομακρυνθούν τα φυσιολογικώς ενυπάρχοντα n-αλκάνια. Αρχίζει τότε η χρωματογραφική έκλουση με συλλογή 180 ml μείγματος n-εξανίου και αιθυλαιθέρα 99:1, ενώ η ταχύτητα ροής διατηρείται σε 15 σταγόνες περίπου ανά 10 δευτερόλεπτα. Το δείγμα πρέπει να εκλούεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος 22 ± 4 °C.

Σημειώσεις:

— Το μείγμα n-εξανίου και αιθυλαιθέρα (99:1) πρέπει να παρασκευάζεται καθημερινά.

— Για τον οπτικό έλεγχο της ορθής έκλουσης των κηρών, είναι δυνατόν να προστεθούν στο διάλυμα του δείγματος 100 μl διαλύματος Soudan 1 % σε μείγμα έκλουσης. Επειδή ο χρόνος κατακράτησης της χρωστικής αυτής έχει τιμή μεταξύ εκείνης των κηρών και των τριγλυκεριδίων, όταν το χρώμα φθάσει στον πυθμένα της χρωματογραφικής στήλης, η έκλουση πρέπει να διακοπεί, καθώς έχουν διέλθει όλοι οι κηροί.

Το λαμβανόμενο με τον τρόπο αυτό κλάσμα ξηραίνεται στον περιστροφικό εξατμιστήρα (3.6) μέχρι να απομακρυνθεί σχεδόν τελείως ο διαλύτης. Τα τελευταία 2 ml διαλύτη απομακρύνονται με τη διαβίβαση ελαφρού ρεύματος αζώτου και, στη συνέχεια, προστίθενται 2-4 ml n-επτανίου.

5.2. Ανάλυση με αέρια χρωματογραφία

5.2.1. Προκαταρκτικές εργασίες

Τοποθετείται η στήλη μέσα στον αεριοχρωματογράφο (3.3) με σύνδεση του άκρου εισόδου με το σύστημα απευθείας εισαγωγής (on-column) και του άκρου εξόδου με τον ανιχνευτή. Εκτελούνται οι γενικοί έλεγχοι της συσκευής αέριας χρωματογραφίας (συμπεριφορά των κυκλωμάτων των αερίων, απόδοση του ανιχνευτή και του συστήματος καταγραφής κ.λπ.).

Εάν η στήλη χρησιμοποιείται για πρώτη φορά, συνιστάται η ρύθμιση των συνθηκών της. Διαβιβάζεται ελαφρό ρεύμα αερίου μέσω της στήλης και, στη συνέχεια, τίθεται σε λειτουργία η συσκευή αέριας χρωματογραφίας. Θερμαίνεται σταδιακά μέχρι να επιτευχθεί θερμοκρασία 350 °C εντός 4 ωρών περίπου. Η θερμοκρασία αυτή διατηρείται επί 2 τουλάχιστον ώρες και, κατόπιν, ρυθμίζεται η συσκευή στις συνθήκες λειτουργίας (ρύθμιση της παροχής των αερίων, αφή της φλόγας, σύνδεση με τον ηλεκτρονικό καταγραφέα (3.3.4), ρύθμιση της θερμοκρασίας του θαλάμου στηλών και του ανιχνευτή κ.λπ.) και καταγράφεται το σήμα με ευαισθησία τουλάχιστον διπλάσια της προβλεπόμενης για την εκτέλεση της ανάλυσης. Η βασική γραμμή (baseline) πρέπει να είναι ευθεία, χωρίς κορυφές και απόκλιση.

Ευθύγραμμη αρνητική απόκλιση υποδηλώνει ατελείς συνδέσεις της στήλης, ενώ θετική απόκλιση υποδηλώνει ανεπαρκή ρύθμιση των συνθηκών της στήλης.

5.2.2. Επιλογή των συνθηκών εργασίας

Κατά κανόνα, πρέπει να τηρούνται οι ακόλουθες συνθήκες εργασίας:

— θερμοκρασία της στήλης: —



20 °C/λεπτό 5 °C/λεπτό 20 °C/λεπτό Κατά την έναρξη 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— θερμοκρασία του ανιχνευτή: 350 °C,

— εγχεόμενη ποσότητα υλικού: 1 μl του n-επτανικού διαλύματος (2-4 ml),

— φέρον αέριο: ήλιο ή υδρογόνο με τη βέλτιστη γραμμική ταχύτητα για το επιλεγμένο αέριο (βλέπε προσάρτημα),

— ευαισθησία των οργάνων: κατάλληλη ώστε να πληρούνται οι κατωτέρω όροι.

Οι συνθήκες αυτές μπορούν να τροποποιούνται ανάλογα με τα χαρακτηριστικά της στήλης και του αεριοχρωματογράφου, ώστε να επιτυγχάνονται διαχωρισμός όλων των κηρών, ικανοποιητική διαχωριστική (διακριτική) ικανότητα για όλες τις κορυφές (βλέπε σχήμα) και χρόνος κατακράτησης 18 ± 3 λεπτών για το εσωτερικό πρότυπο με 32 άτομα άνθρακα (C32). Η αντιπροσωπευτικότερη κορυφή των κηρών πρέπει να ισούται τουλάχιστον με το 60 % της κατώτερης τιμής της κλίμακας.

Οι παράμετροι ολοκλήρωσης των κορυφών πρέπει να καθορίζονται κατά τρόπο ώστε να υπολογίζονται σωστά τα εμβαδά των κορυφών που λαμβάνονται υπόψη.

Σημείωση:Λόγω της υψηλής τελικής θερμοκρασίας, γίνεται δεκτή θετική μετατόπιση, η οποία δεν πρέπει να υπερβαίνει το 10 % της κατώτερης τιμής της κλίμακας.

5.3. Εκτέλεση της ανάλυσης

Λαμβάνεται 1 μl διαλύματος με τη μικροσύριγγα των 10 μl και αποσύρεται το έμβολο της σύριγγας, ώστε να αδειάσει η βελόνα. Εισάγεται η βελόνα στο σύστημα έγχυσης και μετά από 1 έως 2 δευτερόλεπτα εγχέεται το διάλυμα γρήγορα. Μετά από 5 δευτερόλεπτα περίπου, η βελόνα εξάγεται αργά.

Καταγράφονται οι ενδείξεις του οργάνου μέχρι την πλήρη έκλουση των κηρών.

Η βασική γραμμή πρέπει πάντοτε να ανταποκρίνεται στους απαιτούμενους όρους.

5.4. Ταυτοποίηση των κορυφών

Οι διάφορες κορυφές πρέπει να ταυτοποιούνται βάσει των χρόνων κατακράτησης και με σύγκριση με μείγματα κηρών γνωστών χρόνων κατακράτησης, που αναλύθηκαν στις ίδιες συνθήκες.

Το κατωτέρω σχήμα απεικονίζει χρωματογράφημα των κηρών παρθένου ελαιολάδου.

5.5. Ποσοτικός προσδιορισμός

Με τη βοήθεια του ολοκληρωτή υπολογίζονται τα εμβαδά των κορυφών που αντιστοιχούν στο εσωτερικό πρότυπο και στους αλειφατικούς εστέρες με 40 έως 46 άτομα άνθρακα (C40 έως C46).

Υπολογίζεται η περιεκτικότητα κάθε εστέρα σε κηρούς, σε mg/kg λιπαρής ουσίας, σύμφωνα με τον τύπο:

όπου:

Ax = το εμβαδόν της κορυφής που αντιστοιχεί σε κάθε εστέρα, σε τετραγωνικά χιλιοστόμετρα,

As = το εμβαδόν της κορυφής που αντιστοιχεί στο εσωτερικό πρότυπο, σε τετραγωνικά χιλιοστόμετρα,

ms = η προστιθέμενη μάζα εσωτερικού προτύπου, σε χιλιοστόγραμμα,

m = η μάζα του λαμβανόμενου για τον προσδιορισμό δείγματος, σε γραμμάρια.

6. ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

Αναφέρεται το άθροισμα των τιμών περιεκτικότητας σε κηρούς C40 έως C46, σε mg/kg λιπαρής ουσίας (ppm).

Σημείωση:Τα συστατικά που πρέπει να προσδιορίζονται ποσοτικά αναφέρονται στις κορυφές που αντιστοιχούν σε εστέρες με άρτιο αριθμό ατόμων άνθρακα μεταξύ C40 και C46, κατά το παράδειγμα του χρωματογραφήματος κηρών ελαιολάδου που εμφαίνεται στο κατωτέρω σχήμα. Σε περίπτωση διπλής εμφάνισης του εστέρα C46, συνιστάται η ταυτοποίησή του με ανάλυση του κλάσματος των κηρών πυρηνελαίου, όπου η κορυφή C46 αναγνωρίζεται εύκολα, καθώς υπερισχύει σαφώς.

Τα αποτελέσματα εκφράζονται με ένα δεκαδικό ψηφίο.

Σχήμα

Χρωματογράφημα κηρών παρθένου ελαιολάδου ( 7 )

Υπόμνημα:

I.S. = λαυρικός αραχιδεστέρας

1 = Διτερπενικοί εστέρες

2 + 2′ = Εστέρες C40

3 + 3′ = Εστέρες C42

4 + 4′ = Εστέρες C44

5 = Εστέρες C46

6 = Τριτερπενικοί εστέρες στερολών και αλκοόλης.









Προσάρτημα

Προσδιορισμός της γραμμικής ταχύτητας του αερίου

Εγχέονται 1 έως 3 μl μεθανίου (ή προπανίου) στον αεριοχρωματογράφο, ο οποίος έχει προηγουμένως ρυθμιστεί στις κανονικές συνθήκες λειτουργίας. Χρονομετρείται η διαδρομή του αερίου μέσω της στήλης από την έγχυσή του μέχρι την εμφάνιση της κορυφής (tM).

Η γραμμική ταχύτητα, σε cm/s, παρέχεται από τον τύπο L/tM, όπου L το μήκος της στήλης, σε εκατοστόμετρα, και tM ο χρόνος, σε δευτερόλεπτα.

▼M26









ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ V

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ ΣΤΕΡΟΛΕΣ ΚΑΙ ΤΡΙΤΕΡΠΕΝΙΚΕΣ ΔΙΑΛΚΟΟΛΕΣ ΜΕ ΑΕΡΙΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΤΡΙΧΟΕΙΔΟΥΣ ΣΤΗΛΗΣ

1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ

Η μέθοδος περιγράφει τη διαδικασία προσδιορισμού της περιεκτικότητας ελαιολάδων και πυρηνελαίων σε στερόλες και σε τριτερπενικές διαλκοόλες, μεμονωμένες και ολικές.

2. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Το έλαιο, στο οποίο έχει προστεθεί α-χολεστανόλη ως εσωτερικό πρότυπο, σαπωνοποιείται με αιθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου· στη συνέχεια, οι ασαπωνοποίητες ύλες εκχυλίζονται με αιθυλαιθέρα.

Το κλάσμα στερολών και τριτερπενικών διαλκοολών διαχωρίζεται από τις ασαπωνοποίητες ύλες με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας σε βασική πλάκα πυριτικής πηκτής (silica gel). Τα ανακτώμενα από την πλάκα κλάσματα μετατρέπονται σε τριμεθυλοσιλυλαιθέρες και, στη συνέχεια, υποβάλλονται σε ανάλυση με αεριοχρωματογραφία τριχοειδούς στήλης.

3. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΣΚΕΥΗ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ

Συνήθης εργαστηριακός εξοπλισμός και, ειδικότερα, τα εξής:

3.1. Σφαιρική φιάλη των 250 ml, εφοδιασμένη με κάθετο ψυκτήρα με εσμυρισμένους κωνικούς συνδέσμους.

3.2. Διαχωριστική χοάνη των 500 ml.

3.3. Σφαιρικές φιάλες των 250 ml.

3.4. Πλήρης εξοπλισμός για ανάλυση με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας, με γυάλινες πλάκες διαστάσεων 20 × 20 cm.

3.5. Λυχνία υπεριώδους φωτός, με μήκος κύματος 254 ή 366 nm.

3.6. Μικροσύριγγες των 100 και 500 μl.

3.7. Κυλινδρική διηθητική χοάνη με πορώδες διάφραγμα G3 (πορώδους 15-40 μm), διαμέτρου 2 cm περίπου και ύψους 5 cm, κατάλληλη για διήθηση υπό κενό, και με εσμυρισμένο κωνικό σύνδεσμο (αρσενικό).

3.8. Κωνική φιάλη κενού των 50 ml, με εσμυρισμένο κωνικό σύνδεσμο (θηλυκό), η οποία μπορεί να συνδεθεί με τη διηθητική χοάνη (σημείο 3.7).

3.9. Δοκιμαστικός σωλήνας με κωνικό πυθμένα, των 10 ml, με γυάλινο πώμα ασφαλείας.

3.10. Αεριοχρωματογράφος, κατάλληλος για λειτουργία με τριχοειδή στήλη, εφοδιασμένος με σύστημα έγχυσης με διαμοιρασμό (split injector), αποτελούμενος από: 3.10.1. θερμοστατούμενο θάλαμο για στήλες, που επιτρέπει να διατηρείται η επιθυμητή θερμοκρασία με ακρίβεια ± 1°C· 3.10.2. μονάδα έγχυσης με ρυθμιζόμενη θερμοκρασία, ψεκαστικό στοιχείο από υπερσιλανιωμένο γυαλί και σύστημα διαμοιρασμού· 3.10.3. ανιχνευτή ιονισμού φλόγας (FID)· 3.10.4. σύστημα απόκτησης δεδομένων κατάλληλο για χρήση με τον ανιχνευτή FID (σημείο 3.10.3.), με δυνατότητα μη αυτόματης ολοκλήρωσης.

3.11. Τριχοειδής στήλη από τετηγμένο διοξείδιο του πυριτίου, μήκους 20 έως 30 m, εσωτερικής διαμέτρου 0,25 έως 0,32 mm, επιστρωμένη με διφαινύλιο 5% - διμεθυλοπολυσιλοξάνιο 95% (στατική φάση SE-52 ή SE-54 ή ανάλογη), ομοιόμορφου πάχους 0,10 έως 0,30 μm.

3.12. Μικροσύριγγα των 10 μl για αέρια χρωματογραφία, με μη αποσπώμενη βελόνα, κατάλληλη για έγχυση με διαμοιρασμό.

3.13 Ξηραντήρας με χλωριούχο ασβέστιο

4. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ

4.1. Υδροξείδιο του καλίου τίτλου τουλάχιστον 85 %.

4.2. Αιθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου, περίπου 2 N. Διαλύονται υπό ψύξη 130 g υδροξειδίου του καλίου (σημείο 4.1) σε 200 ml απεσταγμένου νερού και συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι το ένα λίτρο με αιθανόλη (σημείο 4.10). Το διάλυμα φυλάσσεται σε καλά πωματισμένες σκοτεινόχρωμες γυάλινες φιάλες, για δύο ημέρες κατά μέγιστο όριο.

4.3. Αιθυλαιθέρας, αναλυτικής καθαρότητας.

4.4. Αιθανολικό διάλυμα υδροξείδιου του καλίου, περίπου 0,2 Ν. Διαλύονται 13 g υδροξειδίου του καλίου (σημείο 4.1) σε 20 ml απεσταγμένου νερού και συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι το ένα λίτρο με αιθανόλη (σημείο 4.10).

4.5. Άνυδρο θειικό νάτριο, αναλυτικής καθαρότητας.

4.6. Γυάλινες πλάκες (20x20 cm), επιστρωμένες με πυριτική πηκτή χωρίς δείκτη φθορισμού, πάχους 0,25 mm (διατίθενται στο εμπόριο έτοιμες για χρήση).

4.7. Τολουόλιο, χρωματογραφικής καθαρότητας.

4.8. Ακετόνη, χρωματογραφικής καθαρότητας.

4.9. n-εξάνιο, χρωματογραφικής καθαρότητας.

4.10. Αιθυλαιθέρας, χρωματογραφικής καθαρότητας.

4.11. Αιθανόλη, αναλυτικής καθαρότητας.

4.12. Οξικός αιθυλεστέρας, αναλυτικής καθαρότητας.

4.13. Διάλυμα αναφοράς για χρωματογραφία λεπτής στιβάδας: χοληστερόλη ή φυτοστερόλη, και διάλυμα ερυθροδιόλης 5 % σε οξικό αιθυλεστέρα (σημείο 4.11).

4.14. Αιθανολικό διάλυμα 2-7-διχλωροφλουορεσκεΐνης 0,2 %. Το διάλυμα καθίσταται ελαφρώς αλκαλικό με την προσθήκη μερικών σταγόνων αλκοολικού διαλύματος υδροξειδίου του καλίου 2 N (σημείο 4.2).

4.15. Άνυδρη πυριδίνη, χρωματογραφικής καθαρότητας (βλ. σημείωση 5).

4.16. Εξαμεθυλοδισιλαζάνιο, αναλυτικής καθαρότητας.

4.17. Τριμεθυλοχλωροσιλάνιο, αναλυτικής καθαρότητας.

4.18. Διαλύματα δείγματος τριμεθυλοσιλυλαιθέρων των στερολών. Παρασκευάζονται κατά τον χρόνο της χρήσης από στερόλες και ερυθροδιόλη, προερχόμενες από τα έλαια που τις περιέχουν.

4.19. α-χολεστανόλη, καθαρότητας άνω του 99% (η καθαρότητα πρέπει να ελέγχεται με αεριοχρωματογραφική ανάλυση).

4.20. Διάλυμα εσωτερικού προτύπου α-χολεστανόλης 0,2% (m/V) σε οξικό αιθυλεστέρα (σημείο 4.11).

4.21. Διάλυμα φαινολοφθαλεΐνης 10 g/L σε αιθανόλη (σημείο 4.10).

4.22. Φέρον αέριο: υδρογόνο ή ήλιο, αεριοχρωματογραφικής καθαρότητας.

4.23. Βοηθητικά αέρια: υδρογόνο, ήλιο, άζωτο και αέρας, αεριοχρωματογραφικής καθαρότητας.

4.24. Μείγμα n-εξανίου (σημείο 4.9)/αιθυλαιθέρα (σημείο 4.10) 65:35 (V/V).

4.25. Αντιδραστήριο σιλυλίωσης, το οποίο είναι μείγμα πυριδίνης-εξαμεθυλοδισιλαζανίου-τριμεθυλοχλωροσιλανίου 9:3:1 (V/V/V).

5. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

5.1. Παρασκευή των ασαπωνοποίητων υλών. 5.1.1. Με τη βοήθεια μικροσύριγγας των 500 μl (σημείο 3.6), εισάγεται στη σφαιρική φιάλη των 250 ml (σημείο 3.1) όγκος διαλύματος εσωτερικού προτύπου α-χολεστανόλης (σημείο 4.20) ο οποίος περιέχει ποσότητα χολεστανόλης που αντιστοιχεί σε 10 % περίπου της περιεκτικότητας του δείγματος σε στερόλες. Για παράδειγμα, για 5 g δείγματος ελαιολάδου πρέπει να προστεθούν 500 μl του διαλύματος α-χολεστανόλης (σημείο 4.20), ενώ για 5 g δείγματος πυρηνελαίου πρέπει να προστεθούν 1 500 μl. Το διάλυμα εξατμίζεται σε θερμό υδατόλουτρο, σε ελαφρύ ρεύμα αζώτου, μέχρι ξηρού. Μετά την ψύξη της σφαιρικής φιάλης ζυγίζονται 5±0,01 g ξηρού διηθημένου δείγματος στην ίδια σφαιρική φιάλη. Σημείωση 1: Στην περίπτωση των ζωικών ή φυτικών λιπών και ελαίων τα οποία περιέχουν σημαντικές ποσότητες χοληστερόλης, μπορεί να εμφανιστεί κορυφή η οποία έχει παρόμοιο χρόνο κατακράτησης με αυτόν της χολεστανόλης. Σε αυτές τις περιπτώσεις, πρέπει να αναλύεται το στερολικό κλάσμα εις διπλούν, με και χωρίς εσωτερικό πρότυπο. 5.1.2. Προστίθενται 50 ml αιθανολικού διαλύματος υδροξείδιου του καλίου 2 Ν (σημείο 4.2) και τεμαχίδια ελαφρόπετρας, συνδέεται ο κάθετος ψυκτήρας και το σύνολο θερμαίνεται, διατηρούμενο σε ήπιο βρασμό, μέχρι να πραγματοποιηθεί η σαπωνοποίηση (το διάλυμα γίνεται διαυγές). Συνεχίζεται η θέρμανση για 20 λεπτά, έπειτα προστίθενται 50 ml απεσταγμένου νερού από το επάνω μέρος του ψυκτήρα, αποσυνδέεται ο ψυκτήρας και ψύχεται η σφαιρική φιάλη μέχρι τους 30 °C περίπου. 5.1.3. Μεταγγίζεται ποσοτικώς το περιεχόμενο της σφαιρικής φιάλης σε διαχωριστική χοάνη των 500 ml (σημείο 3.2), με τη βοήθεια διαδοχικών ποσοτήτων απεσταγμένου νερού (50 ml). Προστίθενται περίπου 80 ml αιθυλαιθέρα (σημείο 4.10) και ανακινείται ζωηρά η διαχωριστική χοάνη για περίπου 60 δευτερόλεπτα, ενώ κατά διαστήματα εκτονώνεται η πίεση με αναστροφή της χοάνης και άνοιγμα της στρόφιγγας. Αφήνεται σε ηρεμία μέχρι να ολοκληρωθεί ο διαχωρισμός των δύο φάσεων (σημείωση 2). Στη συνέχεια, αφαιρείται όσο το δυνατόν πληρέστερα το διάλυμα σάπωνα και φέρεται σε δεύτερη διαχωριστική χοάνη. Εκτελούνται δύο ακόμη εκχυλίσεις της υδατικής-αλκοολικής φάσης, με τον ίδιο τρόπο και με 60 έως 70 ml αιθυλαιθέρα (σημείο 4.10). Σημείωση 2: Τα πιθανά γαλακτώματα μπορούν να καταστραφούν με την προσθήκη μικρών ποσοτήτων αιθανόλης (σημείο 4.11). 5.1.4. Ενώνονται τα τρία αιθερικά εκχυλίσματα σε μία διαχωριστική χοάνη η οποία περιέχει 50 ml νερού. Συνεχίζεται η έκπλυση με νερό (50 ml) μέχρις ότου το νερό έκπλυσης δεν χρωματίζεται πλέον ρόδινο με την προσθήκη μιας σταγόνας διαλύματος φαινολοφθαλεΐνης (σημείο 4.21). Μετά την απομάκρυνση του νερού έκπλυσης, ακολουθεί διήθηση σε άνυδρο θειικό νάτριο (σημείο 4.5) σε προζυγισμένη σφαιρική φιάλη των 250 ml, ενώ η χοάνη και ο ηθμός εκπλύνονται με μικρές ποσότητες αιθυλαιθέρα (σημείο 4.10). 5.1.5. Εξατμίζεται ο διαλύτης με απόσταξη σε περιστροφικό εξατμιστήρα στους 30 °C υπό κενό. Προστίθενται 5 ml ακετόνης και απομακρύνεται πλήρως ο πτητικός διαλύτης με ελαφρύ ρεύμα αέρα. Το υπόλειμμα ξηραίνεται σε κλίβανο στους 103 ± 2 °C επί 15 λεπτά. Ψύχεται σε ξηραντήρες και ζυγίζεται με ακρίβεια 0,1 mg.

5.2. Διαχωρισμός του κλάσματος στερολών και τριτερπενικών διαλκοολών (ερυθροδιόλη + ουβαόλη) 5.2.1. Ετοιμασία των βασικών πλακών χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας. Οι πλάκες πυριτικής πηκτής (σημείο 4.6) βυθίζονται σε βάθος περίπου 4 cm στο αιθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου 0,2 N (σημείο 4.5) επί 10 δευτερόλεπτα, στη συνέχεια αφήνονται να στεγνώσουν σε απαγωγό επί δύο ώρες και, τέλος, τοποθετούνται σε κλίβανο στους 100 °C επί μία ώρα. Απομακρύνονται από τον κλίβανο και φυλάσσονται σε ξηραντήρα με χλωριούχο ασβέστιο (σημείο 3.13) μέχρι να χρησιμοποιηθούν (οι πλάκες που έχουν υποστεί αυτή την κατεργασία πρέπει να χρησιμοποιούνται εντός 15 ημερών). Σημείωση 3: Η χρήση βασικών πλακών πυριτικής πηκτής για τον διαχωρισμό του στερολικού κλάσματος εξαλείφει την ανάγκη κατεργασίας του ασαπωνοποίητου κλάσματος με αλουμίνα. Με τον τρόπο αυτό, όλες οι ενώσεις όξινου χαρακτήρα (λιπαρά οξέα και άλλες) συγκρατούνται στη γραμμή τοποθέτησης των κηλίδων δείγματος και η ζώνη των αλειφατικών και τριτερπενικών αλκοολών εμφανίζεται σαφώς διαχωρισμένη από τη ζώνη των στερολών. 5.2.2. Στον θάλαμο ανάπτυξης εισάγεται μείγμα εξανίου-αιθυλαιθέρα (σημείο 4.24) (σημείωση 4) μέχρι ύψους περίπου 1 cm. Ο θάλαμος κλείνεται με κατάλληλο κάλυμμα και αφήνεται σε ηρεμία επί μισή ώρα τουλάχιστον, σε ψυχρό χώρο, ώστε να αποκατασταθεί ισορροπία υγρού-ατμών. Στις εσωτερικές επιφάνειες του θαλάμου είναι δυνατόν να στερεωθούν λωρίδες διηθητικού χαρτιού που βυθίζονται στο υγρό έκλουσης. Με τον τρόπο αυτό μειώνεται κατά το ένα τρίτο περίπου ο χρόνος ανάπτυξης του χρωματογραφήματος και επιτυγχάνεται πιο ομοιόμορφη και ομαλή έκλουση των συστατικών. Σημείωση 4: Για να επιτυγχάνονται απολύτως αναπαραγώγιμες συνθήκες έκλουσης, πρέπει να χρησιμοποιείται νέο μείγμα ανάπτυξης σε κάθε δοκιμή. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως εναλλακτικός διαλύτης μείγμα n-εξανίου–αιθυλεθέρα 50:50 (V/V). 5.2.3. Παρασκευάζεται διάλυμα ασαπωνοποίητων υλών (σημείο 5.1.5) 5 % περίπου σε οξικό αιθυλεστέρα (σημείο 4.12). Με μικροσύριγγες των 100 ml τοποθετούνται στο κάτω χείλος (2 cm) της χρωματογραφικής πλάκας (σημείο 5.2.1) 0,3 ml του προαναφερθέντος διαλύματος σε μια λεπτή και ομοιόμορφη γραμμή. Στην ευθεία της γραμμής τοποθέτησης, φέρονται 2 έως 3 μl του διαλύματος αναφοράς του υλικού (σημείο 4.13), για την ταυτοποίηση της ζώνης των στερολών και τριτερπενικών διαλκοολών μετά την ανάπτυξη. 5.2.4. Η πλάκα τοποθετείται στον θάλαμο ανάπτυξης, ο οποίος έχει προετοιμαστεί όπως περιγράφεται στο σημείο 5.2.2. Η θερμοκρασία του περιβάλλοντος πρέπει να διατηρείται μεταξύ 15 και 20 °C (σημείωση 5). Ο θάλαμος κλείνεται αμέσως με το κάλυμμα και αφήνεται προς έκλουση μέχρι το μέτωπο του διαλύτη να φθάσει σε ύψος περίπου 1 cm από το πάνω χείλος της πλάκας. Απομακρύνεται η πλάκα από τον θάλαμο ανάπτυξης και ο διαλύτης εξατμίζεται σε ρεύμα θερμού αέρα ή αφήνοντας την πλάκα να στεγνώσει σε απαγωγό. Σημείωση 5: Τυχόν υψηλότερη θερμοκρασία θα μπορούσε να δυσχεράνει τον διαχωρισμό. 5.2.5. Η πλάκα ψεκάζεται ελαφρά και ομοιόμορφα με το διάλυμα 2,7-διχλωροφλουορεσκεΐνης (σημείο 4.14) και, στη συνέχεια, αφήνεται να στεγνώσει. Όταν η πλάκα παρατηρείται κάτω από υπεριώδες φως, οι ζώνες των στερολών και τριτερπενικών διαλκοολών μπορούν να αναγνωριστούν από την ευθυγράμμισή τους με τις κηλίδες του διαλύματος αναφοράς (σημείο 4.13). Σημειώνεται με μαύρο μολύβι το περίγραμμα των ζωνών κατά μήκος των άκρων του φθορισμού (βλ. εικόνα πλάκας χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας στο σχήμα 3). 5.2.6. Αφαιρείται η πυριτική πηκτή από τη σημειωμένη επιφάνεια με απόξεση με τη βοήθεια μεταλλικής σπάτουλας. Το αφαιρούμενο θρυμματισμένο υλικό φέρεται σε διηθητική χοάνη (σημείο 3.7). Προστίθενται 10 ml οξικού αιθυλεστέρα (σημείο 4.12) και το σύνολο αναμιγνύεται προσεκτικά με τη μεταλλική σπάτουλα και διηθείται υπό κενό. Το διήθημα συλλέγεται στην κωνική φιάλη (σημείο 3.8) που είναι συνδεδεμένη με τη διηθητική χοάνη. Εκπλύνεται το υπόλειμμα στη χοάνη τρεις φορές με αιθυλαιθέρα (σημείο 4.3) (περίπου 10 ml κάθε φορά) και το διήθημα συλλέγεται ομοίως στη φιάλη που είναι συνδεδεμένη με τη διηθητική χοάνη. Εξατμίζεται το διήθημα μέχρι όγκου περίπου 4-5 ml, μεταγγίζεται το υπολειπόμενο διάλυμα μέσα στον προζυγισμένο σωλήνα των 10 ml (σημείο 3.9) και εξατμίζεται μέχρι ξηρού με ήπια θέρμανση σε ελαφρύ ρεύμα αζώτου. Προστίθενται μερικές σταγόνες ακετόνης (σημείο 4.8) και εξατμίζεται εκ νέου μέχρι ξηρού. Το υπόλειμμα που περιέχει ο δοκιμαστικός σωλήνας αποτελείται από τα κλάσματα των στερολών και των τριτερπενικών διαλκοολών.

5.3. Παρασκευή των τριμεθυλοσιλυλαιθέρων. 5.3.1. Στον δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει το κλάσμα στερολών και τριτερπενικών διαλκοολών προστίθεται το αντιδραστήριο σιλυλίωσης (σημείο 4.25) (σημείωση 6), σε αναλογία 50 μl ανά χιλιοστόγραμμο στερολών και τριτερπενικών διαλκοολών, αποφεύγοντας κάθε απορρόφηση υγρασίας (σημείωση 7). Σημείωση 6: Υπάρχουν στο εμπόριο διαλύματα έτοιμα προς χρήση. Διατίθενται στο εμπόριο και άλλα σιλυλιωτικά αντιδραστήρια, όπως π.χ. το δις(τριμεθυλοσιλυλο)τριφθορακεταμίδιο + 1 % τριμεθυλοχλωροσιλάνιο, το οποίο πρέπει να αραιώνεται με ίσο όγκο άνυδρης πυριδίνης. Η πυριδίνη μπορεί να αντικατασταθεί από την ίδια ποσότητα ακετονιτριλίου. 5.3.2. Ο δοκιμαστικός σωλήνας πωματίζεται, ανακινείται προσεκτικά (χωρίς αναστροφή) έως την πλήρη διαλυτοποίηση των ενώσεων. Αφήνεται σε ηρεμία για 15 τουλάχιστον λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και κατόπιν φυγοκεντρείται για μερικά λεπτά: το διαυγές διάλυμα είναι έτοιμο για αεριοχρωματογραφική ανάλυση. Σημείωση 7: Η ενδεχόμενη εμφάνιση ελαφρού γαλακτώδους ιριδισμού είναι φυσιολογική και δεν προκαλεί κανένα πρόβλημα. Ένδειξη παρουσίας υγρασίας ή αλλοίωσης του αντιδραστηρίου αποτελεί ο σχηματισμός λευκών νιφάδων ή η εμφάνιση ρόδινου χρώματος. Στην περίπτωση αυτή, η δοκιμή πρέπει να επαναληφθεί (μόνο εάν χρησιμοποιείται μείγμα εξαμεθυλοδισιλαζανίου-τριμεθυλοχλωροσιλανίου).

5.4. Ανάλυση με αεριοχρωματογραφία. 5.4.1. Προκαταρκτικές εργασίες, σταθεροποίηση της τριχοειδούς στήλης. 5.4.1.1. Τοποθετείται η στήλη (σημείο 3.11) στον αεριοχρωματογράφο, συνδέοντας το άκρο εισόδου με το σύστημα έγχυσης με διαμοιρασμό και το άκρο εξόδου με τον ανιχνευτή. Διενεργούνται οι συνήθεις έλεγχοι της αεριοχρωματογραφικής μονάδας (διαρροές από τα κυκλώματα των αερίων, απόδοση του ανιχνευτή, του συστήματος διαμοιρασμού και του συστήματος καταγραφής κ.λπ.). 5.4.1.2. Εάν η στήλη χρησιμοποιείται για πρώτη φορά, συνιστάται να προηγείται σταθεροποίηση: Διοχετεύεται ελαφρύ ρεύμα αερίου διαμέσου της στήλης, τίθεται σε λειτουργία η αεριοχρωματογραφική μονάδα και αρχίζει βαθμιαία θέρμανση μέχρις ότου η θερμοκρασία υπερβεί κατά τουλάχιστον 20 °C εκείνη της κανονικής λειτουργίας (σημείωση 8). Η θερμοκρασία αυτή διατηρείται για δύο ώρες τουλάχιστον, κατόπιν ολόκληρη η μονάδα τίθεται σε κατάσταση λειτουργίας (ρύθμιση της ροής των αερίων και του διαμοιρασμού, έναυση της φλόγας, σύνδεση με το υπολογιστικό σύστημα, ρύθμιση της θερμοκρασίας της στήλης, του ανιχνευτή και του συστήματος έγχυσης κ.λπ.) και, στη συνέχεια, καταγράφεται το σήμα με ευαισθησία τουλάχιστον διπλάσια της σκοπούμενης για την ανάλυση. Η γραμμή βάσης πρέπει να είναι ευθεία, χωρίς κανενός είδους κορυφή, και να μην παρουσιάζει ολίσθηση. Τυχόν αρνητική ευθύγραμμη ολίσθηση υποδηλώνει ατελή στεγανότητα των συνδέσεων της στήλης, ενώ η θετική ολίσθηση υποδηλώνει ανεπαρκή σταθεροποίηση της στήλης. Σημείωση 8: Η θερμοκρασία σταθεροποίησης πρέπει να είναι πάντοτε χαμηλότερη κατά 20 °C τουλάχιστον από τη μέγιστη θερμοκρασία που προβλέπεται στις προδιαγραφές της χρησιμοποιούμενης στατικής φάσης. 5.4.2. Επιλογή συνθηκών λειτουργίας 5.4.2.1. Οι συνθήκες λειτουργίας είναι οι ακόλουθες: — θερμοκρασία της στήλης: 260 ± 5 °C· — θερμοκρασία του συστήματος έγχυσης: 280-300 °C· — θερμοκρασία του ανιχνευτή: 280-300 °C· — γραμμική ταχύτητα του φέροντος αερίου: ήλιο 20 έως 35 cm/s, υδρογόνο 30 έως 50 cm/s· — αναλογία διαμοιρασμού: από 1:50 έως 1:100· — ευαισθησία του οργάνου: τετραπλάσια έως 16πλάσια της ελάχιστης εξασθένησης· — ευαισθησία καταγραφής: 1 έως 2 mV στην πλήρη κλίμακα, — ποσότητα εγχεόμενης ουσίας: 0,5 έως 1 μl διαλύματος τριμεθυλοσιλυλαιθέρων (TMSE). Οι συνθήκες αυτές μπορούν να μεταβάλλονται ανάλογα με τα χαρακτηριστικά της στήλης και του αεριοχρωματογράφου, ώστε να λαμβάνονται χρωματογραφήματα που να πληρούν τις ακόλουθες απαιτήσεις: — ο χρόνος κατακράτησης για την κορυφή της β-σιτοστερόλης θα πρέπει να είναι 20 ± 5 min· — η κορυφή της καμπεστερόλης θα πρέπει να είναι: για το ελαιόλαδο (μέση περιεκτικότητα 3%) 20 ± 5 % της πλήρους κλίμακας, για το σογιέλαιο (μέση περιεκτικότητα 20 %) 80 ± 10 % της πλήρους κλίμακας· — πρέπει να διαχωρίζονται όλες οι περιεχόμενες στερόλες. Οι κορυφές, εκτός του διαχωρισμού τους, πρέπει να είναι και τελείως διακριτές, δηλαδή το ίχνος κάθε κορυφής θα πρέπει να επιστρέφει στη γραμμή βάσης, πριν αρχίσει να διαγράφεται η επόμενη κορυφή. Η ανεπαρκής διαχωριστική ικανότητα είναι, παρ’ όλα αυτά, ανεκτή, υπό την προϋπόθεση ότι η κορυφή που αντιστοιχεί στον χρόνο κατακράτησης 1,02 (σιτοστανόλη) είναι ποσοτικά μετρήσιμη με τη χρήση της καθέτου. 5.4.3. Εκτέλεση της ανάλυσης 5.4.3.1. Με τη μικροσύριγγα των 10 μl λαμβάνεται 1 μl εξανίου, αναρροφώνται 0,5 μl αέρα και στη συνέχεια 0,5 έως 1 μl του διαλύματος του δείγματος. Ανυψώνεται λίγο ακόμη το έμβολο της σύριγγας ώστε να κενωθεί η βελόνα. Εισάγεται η βελόνα στη μεμβράνη του συστήματος έγχυσης και μετά από ένα έως δύο δευτερόλεπτα εγχέεται ταχύτατα το περιεχόμενό της. Στη συνέχεια, έπειτα από πέντε δευτερόλεπτα περίπου, η βελόνα αποσύρεται αργά. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί επίσης αυτόματο σύστημα έγχυσης. 5.4.3.2. Εκτελείται καταγραφή μέχρι πλήρους έκλουσης των TMSE των περιεχόμενων τριτερπενικών διαλκοολών. Η γραμμή βάσης πρέπει να εξακολουθεί να πληροί τις απαιτήσεις (σημείο 5.4.1.2). 5.4.4. Ταυτοποίηση των κορυφών Οι κορυφές ταυτοποιούνται βάσει των χρόνων κατακράτησης και μέσω σύγκρισης με το μείγμα TMSE των στερολών και των τριτερπενικών διαλκοολών που έχει υποβληθεί σε ανάλυση υπό τις ίδιες συνθήκες (βλ. προσάρτημα). Οι στερόλες και οι τριτερπενικές διαλκοόλες εκλούονται με την ακόλουθη σειρά: χοληστερόλη, βρασικαστερόλη, εργοστερόλη, 24-μεθυλενο-χοληστερόλη, καμπεστερόλη, καμπεστανόλη, στιγμαστερόλη, δ-7-καμπεστερόλη, δ-5,23-στιγμασταδιενόλη, κλεροστερόλη, β-σιτοστερόλη, σιτοστανόλη, δ-5-αβεναστερόλη, δ-5,24-στιγμασταδιενόλη, δ-7-στιγμαστενόλη, δ-7-αβεναστερόλη, ερυθροδιόλη και ουβαόλη. Στον πίνακα 1 αναφέρονται οι χρόνοι κατακράτησης της β-σιτοστερόλης για τις στήλες SE-52 και SE-54. Στα σχήματα 1 και 2 απεικονίζονται τυπικά χρωματογραφήματα για ορισμένα έλαια. 5.4.5. Ποσοτική αξιολόγηση. 5.4.5.1. Με τη βοήθεια του υπολογιστικού συστήματος υπολογίζονται τα εμβαδά των κορυφών που αντιστοιχούν στην α-χολεστανόλη και στις στερόλες και τριτερπενικές διαλκοόλες. Δεν λαμβάνονται υπόψη οι κορυφές ενώσεων που δεν περιλαμβάνονται στις ενώσεις του πίνακα 1 (δεν πρέπει υπολογίζεται η εργοστερόλη). Ο συντελεστής απόκρισης για την α-χολεστανόλη θα πρέπει να θεωρείται ότι ισούται με 1. 5.4.5.2. Υπολογίζεται η συγκέντρωση κάθε στερόλης χωριστά, σε mg/100 g λιπαρής ουσίας, ως ακολούθως: όπου: Ax = εμβαδόν της κορυφής της στερόλης x, σε μονάδες υπολογιστικού συστήματος· As = εμβαδόν της κορυφής της α-χολεστανόλης, σε μονάδες υπολογιστικού συστήματος· ms = μάζα της α-χολεστανόλης που προστέθηκε, σε χιλιοστόγραμμα· m = μάζα του δείγματος που ελήφθη για τον προσδιορισμό, σε γραμμάρια.

6. ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

6.1. Αναφέρονται οι συγκεντρώσεις των επιμέρους στερολών, σε mg/kg λιπαρής ουσίας, καθώς και το άθροισμά τους ως «ολικές στερόλες». Η σύνθεση σε επιμέρους στερόλες και σε ερυθροδιόλη και ουβαόλη θα πρέπει να εκφράζεται με ένα δεκαδικό ψηφίο. Η σύνθεση σε ολικές στερόλες πρέπει να εκφράζεται χωρίς δεκαδικά ψηφία.

▼M28

6.2. Υπολογίζεται η εκατοστιαία αναλογία κάθε στερόλης από τον λόγο του εμβαδού της αντίστοιχης κορυφής προς το άθροισμα των εμβαδών των κορυφών των στερολών: όπου: Ax = εμβαδόν της κορυφής της στερόλης x· ΣΑ = άθροισμα των εμβαδών όλων των κορυφών.

▼M26

6.3. Φαινόμενη β- σιτοστερόλη: δ-5,23-στιγμασταδιενόλη + χολεστερόλη + β-σιτοστερόλη + σιτοστανόλη + δ-5-αβεναστερόλη + δ-5,24-στιγμασταδιενόλη.

6.4. Υπολογίζεται η εκατοστιαία αναλογία ερυθροδιόλης και ουβαόλης: όπου ΣΑ = αθροιστικό εμβαδόν των κορυφών των στερολών, σε μονάδες υπολογιστικού συστήματος· Er = εμβαδόν της κορυφής της ερυθροδιόλης, σε μονάδες υπολογιστικού συστήματος· Uv = εμβαδόν της κορυφής της ουβαόλης, σε μονάδες υπολογιστικού συστήματος·









Προσαρτημα

Προσδιορισμός της γραμμικής ταχύτητας του αερίου

Εγχέονται 1 έως 3 μl μεθανίου (ή προπανίου) στον αεριοχρωματογράφο, ο οποίος έχει προηγουμένως ρυθμιστεί στις κανονικές συνθήκες λειτουργίας. Χρονομετράται η διαδρομή του αερίου μέσω της στήλης από την έγχυσή του μέχρι την εμφάνιση της κορυφής (tM).

Η γραμμική ταχύτητα, σε cm/s, παρέχεται από τον τύπο L/tM, όπου L το μήκος της στήλης, σε εκατοστόμετρα, και tM ο μετρούμενος χρόνος, σε δευτερόλεπτα.







Πίνακας 1 Σχετικοί χρόνοι κατακράτησης των στερολών Κορυφή Ταυτοποίηση Σχετικός χρόνος κατακράτησης Στήλη SE 54 Στήλη SE 52 1 Χοληστερόλη δ-5-χοληστεν-3β-όλη 0,67 0,63 2 Χολεστανόλη 5α-χολησταν-3β-όλη 0,68 0,64 3 Βρασικαστερόλη [24S]-24-μεθυλο-δ-5,22-χολησταδιεν-3β-όλη 0,73 0,71 * Εργοστερόλη [24S]-24-μεθυλο-Δ-5,7,22-χοληστατριεν-3ß-όλη 0,78 0,76 4 24-μεθυλενο-χοληστερόλη 24-μεθυλενο-Δ-5,24-χολησταδιεν-3ß-όλη 0,82 0,80 5 Καμπεστερόλη (24R)-24-μεθυλο-Δ-5-χοληστεν-3ß-όλη 0,83 0,81 6 Καμπεστανόλη (24 R)- 24-μεθυλο-χολησταν-3ß-όλη 0,85 0,82 7 Στιγμαστερόλη (24S)-24-αιθυλο-Δ-5,22-χολησταδιεν-3ß-όλη 0,88 0,87 8 Δ-7-καμπεστερόλη (24R)-24-μεθυλο-Δ-7-χοληστεν-3ß-όλη 0,93 0,92 9 Δ-Δ5,23-στιγμασταδιενόλη (24R,S)-24-αιθυλο-Δ-5,23-χολησταδιεν-3ß-όλη 0,95 0,95 10 Κλεροστερόλη (24S)-24-αιθυλο-Δ-5,25-χολεσταδιεν-3ß-όλη 0,96 0,96 11 ß-σιτοστερόλη (24R)-24-αιθυλ-Δ5-χοληστεν-3ß-όλη 1,00 1,00 12 Σιτοστανόλη 24-αιθυλο-χολησταν-3ß-όλη 1,02 1,02 13 Δ-5-αβεναστερόλη (24Z)-24-αιθυλιδενο-Δ-5-χοληστεν-3ß-όλη 1,03 1,03 14 Δ-5,24-στιγμασταδιενόλη (24R,S)-24-αιθυλο-Δ-5,24-χολησταδιεν-3ß-όλη 1,08 1,08 15 Δ-7-στιγμαστενόλη (24R,S)-24-αιθυλο-Δ-7-χοληστεν-3ß-όλη 1,12 1,12 16 Δ-7-αβεναστερόλη (24Z)-24-αιθυλιδενο-Δ-7-χοληστεν-3ß-όλη 1,16 1,16 17 Ερυθροδιόλη 5α-ελαιαν-12-εν-3ß,28-διόλη 1,41 1,41 18 Ουβαόλη Δ-12-ουρσεν-3ß,28-διόλη 1,52 1,52

Σχήμα 1

Αεριοχρωματογράφημα του κλάσματος στερολών και τριτερπενικών διαλκοολών ελαιολάδου λαμπάντε (δείγμα εμβολιασμένο με εσωτερικό πρότυπο)

Σχήμα 2

Αεριοχρωματογράφημα του κλάσματος στερολών και τριτερπενικών διαλκοολών εξευγενισμένου ελαιολάδου (δείγμα εμβολιασμένο με εσωτερικό πρότυπο)

Σχήμα 3

Πλάκα χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας ελαιολάδου-πυρηνελαίου με τη ζώνη που πρέπει να αποξεστεί για τον προσδιορισμό των στερολών και τριτερπενικών διαλκοολών

1 – Σκουαλένιο

2 – Τριτερπενικές και αλειφατικές αλκοόλες

3 – Στερόλες και τριτερπενικές διαλκοόλες

4 – Εκκίνηση και ελεύθερα λιπαρά οξέα

▼M26 —————

▼M21









ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ VII

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΕΚΑΤΟΣΤΙΑΙΑΣ ΑΝΑΛΟΓΙΑΣ 2-ΜΟΝΟΠΑΛΜΙΤΙΝΗΣ

1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ ΚΑΙ ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ

Στην παρούσα μέθοδο περιγράφεται η αναλυτική διαδικασία για τον προσδιορισμό της εκατοστιαίας αναλογίας παλμιτικού οξέος στη θέση 2 των τριγλυκεριδίων μέσω της εκτίμησης της 2-μονοπαλμιτίνης.

Η παρούσα μέθοδος έχει εφαρμογή στα φυτικά έλαια που είναι υγρά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (20 °C).

2. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Μετά την παρασκευή του, το δείγμα ελαιολάδου υφίσταται την επίδραση παγκρεατικής λιπάσης: λόγω μερικής και εξειδικευμένης υδρόλυσης στις θέσεις 1 και 3 του μορίου του τριγλυκεριδίου, σχηματίζονται μονογλυκερίδια στη θέση 2. Μετά από σιλυλίωση (σιλανοποίηση), προσδιορίζεται η εκατοστιαία αναλογία 2-μονοπαλμιτίνης στο κλάσμα των μονογλυκεριδίων με αέρια χρωματογραφία τριχοειδούς στήλης.

3. ΣΥΝΗΘΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΣΚΕΥΗ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ

3.1. Κωνική φιάλη (Erlenmeyer) των 25 ml

3.2. Ποτήρια ζέσεως των 100, 250 και 300 ml

3.3. Γυάλινη χρωματογραφική στήλη, εσωτερικής διαμέτρου 21-23 mm και μήκους 400 mm, εφοδιασμένη με πλάκα από συντετηγμένο γυαλί και στρόφιγγα

3.4. Ογκομετρικοί κύλινδροι των 10, 50, 100 και 200 ml

3.5. Σφαιρικές φιάλες των 100 και 250 ml

3.6. Περιστροφικός εξατμιστήρας

3.7. Σωλήνες φυγοκέντρου των 10 ml, με κωνικό πυθμένα και εσμυρισμένο πώμα

3.8. Φυγόκεντρος για σωλήνες των 10 και 100 ml

3.9. Θερμοστάτης ικανός να διατηρεί τη θερμοκρασία στους 40 ± 0,5 °C

3.10. Βαθμολογημένα σιφώνια του 1 και των 2 ml

3.11. Υποδερμική σύριγγα του 1 ml

3.12. Μικροσύριγγα των 100 μl

3.13. Διαχωριστική χοάνη των 1 000 ml

3.14. Αεριοχρωματογράφος για τριχοειδείς στήλες, εφοδιασμένος με σύστημα έγχυσης εν ψυχρώ «on column» για απευθείας εισαγωγή του δείγματος στη στήλη και με κλίβανο ικανό να διατηρεί την επιλεγόμενη θερμοκρασία με ακρίβεια 1 °C

3.15. Σύστημα έγχυσης εν ψυχρώ «on column» για απευθείας εισαγωγή του δείγματος στη στήλη

3.16. Ανιχνευτής ιονισμού φλόγας και ηλεκτρόμετρο

3.17. Καταγραφέας-ολοκληρωτής κατάλληλος για το ηλεκτρόμετρο, με χρόνο απόκρισης που δεν υπερβαίνει το 1 δευτερόλεπτο και με μεταβλητή ταχύτητα χαρτιού

3.18. Τριχοειδής στήλη από γυαλί ή τετηγμένο διοξείδιο του πυριτίου, μήκους 8 έως 12 μέτρων, εσωτερικής διαμέτρου 0,25 έως 0,32 mm, επικαλυμμένη με μεθυλοπολυσιλοξάνιο ή φαινυλοπολυσιλοξάνιο 5 %, πάχους 0,10 έως 0,30 μm, με δυνατότητα χρήσης στους 370 °C

3.19. Μικροσύριγγα των 10 μl για την απευθείας εισαγωγή στη στήλη, μήκους τουλάχιστον 7,5 cm, με συγκολλημένη στο σώμα της βελόνα

4. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ

4.1. Διοξείδιο του πυριτίου (silica gel) κοκκομετρικού βαθμού μεταξύ 0,063 και 0,200 mm (70/280 mesh), που παρασκευάζεται ως εξής: τοποθετείται η silica gel σε κάψα από πορσελάνη, ξηραίνεται στο πυριατήριο στους 160 °C επί 4 ώρες και, κατόπιν, αφήνεται να ψυχθεί σε θερμοκρασία περιβάλλοντος μέσα σε ξηραντήρα. Προστίθεται ποσότητα νερού ίση με 5 % του βάρους του silica gel ως εξής: σε φιάλη Erlenmeyer των 500 ml ζυγίζονται 152 g silica gel και προστίθενται 8 g απεσταγμένου νερού. Η φιάλη πωματίζεται και το σύνολο ανακινείται ήπια, ώστε να επιτευχθεί ομοιογενής κατανομή του νερού, και αφήνεται σε ηρεμία τουλάχιστον επί 12 ώρες πριν χρησιμοποιηθεί.

4.2. n-εξάνιο (χρωματογραφικής καθαρότητας)

4.3. Ισοπροπανόλη

4.4. Υδατικό διάλυμα ισοπροπανόλης 1:1 (κ.ό.)

4.5. Παγκρεατική λιπάση. Η δραστικότητα της χρησιμοποιούμενης λιπάσης πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 2,0 και 10 μονάδων λιπάσης ανά mg. (Στο εμπόριο κυκλοφορούν παγκρεατικές λιπάσες με δραστικότητα 2,0 έως 10 μονάδων ανά mg ενζύμου.)

4.6. Ρυθμιστικό διάλυμα τρις-υδροξυ-μεθυλαμινομεθανίου: υδατικό διάλυμα 1 Μ, του οποίου το pH ρυθμίζεται στην τιμή 8 (ποτενσιομετρικός έλεγχος) με πυκνό HCI (1:1 κ.ό.)

4.7. Χολικό νάτριο ενζυματικής καθαρότητας, υδατικό διάλυμα 0,1 % (το διάλυμα αυτό πρέπει να χρησιμοποιείται εντός 15 ημερών από την παρασκευή του)

4.8. Χλωριούχο ασβέστιο, υδατικό διάλυμα 22 %

4.9. Διαιθυλαιθέρας για χρωματογραφία

4.10. Διαλύτης ανάπτυξης: μείγμα η-εξανίου και διαιθυλαιθέρα 87:13 (κ.ό.)

4.11. Υδροξείδιο του νατρίου, διάλυμα 12 % κ.β.

4.12. Φαινολοφθαλεΐνη, διάλυμα 1 % σε αιθανόλη

4.13. Φέρον αέριο: υδρογόνο ή ήλιο για αέρια χρωματογραφία

4.14. Βοηθητικά αέρια: – υδρογόνο, καθαρότητας τουλάχιστον 99 %, απαλλαγμένο υγρασίας και οργανικών ουσιών – και αέρας της ίδιας καθαρότητας, για αέρια χρωματογραφία

4.15. Αντιδραστήριο σιλυλίωσης: μείγμα πυριδίνης-εξαμεθυλοδισιλαζανίου-τριμεθυλοχλωροσιλανίου 9:3:1 (κ.ό.) (Στο εμπόριο κυκλοφορούν έτοιμα διαλύματα. Είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν και άλλα αντιδραστήρια σιλυλίωσης, όπως π.χ. δις-τριμεθυλοσιλυλοτριφθορακεταμίδιο + 1 % τριμεθυλοχλωροσιλάνιο, αραιωμένα με ίσο όγκο άνυδρης πυριδίνης.)

4.16. Ουσίες αναφοράς: καθαρά μονογλυκερίδια ή μείγματα μονογλυκεριδίων γνωστής εκατοστιαίας σύστασης, ανάλογης με τη σύσταση του δείγματος.

5. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

5.1. Προετοιμασία του δείγματος

5.1.1. Τα έλαια με περιεκτικότητα σε ελεύθερα οξέα κάτω του 3 % δεν χρειάζεται να εξουδετερώνονται πριν από τη χρωματογραφία σε στήλη silica gel. Τα έλαια των οποίων η περιεκτικότητα σε ελεύθερα οξέα υπερβαίνει το 3 % πρέπει να εξουδετερώνονται σύμφωνα με το σημείο 5.1.1.1. 5.1.1.1. Στη διαχωριστική χοάνη των 1 000 ml (3.13) φέρονται 50 g ελαίου και 200 ml n-εξανίου. Προστίθενται 100 ml ισοπροπανόλης και ποσότητα διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου 12 % (4.11) η οποία αντιστοιχεί στην περιεκτικότητα του ελαίου σε ελεύθερα λιπαρά οξέα, προσαυξημένη κατά 5 %. Το σύνολο αναδεύεται ζωηρά επί ένα λεπτό, προστίθενται 100 ml απεσταγμένου νερού, αναδεύεται πάλι και αφήνεται σε ηρεμία. Μετά το διαχωρισμό, απορρίπτεται η κατώτερη στιβάδα που περιέχει τους σάπωνες και απομακρύνονται οι πιθανές ενδιάμεσες στιβάδες (βλέννες και αδιάλυτες ουσίες). Το εξανικό διάλυμα του εξουδετερωμένου ελαίου εκπλύνεται με διαδοχικές δόσεις 50-60 ml διαλύματος ισοπροπανόλης σε νερό 1:1 (κ.ό.) (4.4) μέχρι να εξαφανιστεί το ρόδινο χρώμα της φαινολοφθαλεΐνης. Απομακρύνεται το μεγαλύτερο μέρος του εξανίου με απόσταξη υπό κενό (χρησιμοποιείται π.χ. περιστροφικός εξατμιστήρας) και το έλαιο μεταγγίζεται σε σφαιρική φιάλη των 100 ml (3.5) και ξηραίνεται υπό κενό μέχρι να απομακρυνθεί τελείως ο διαλύτης. Μετά το τέλος της εργασίας αυτής, η οξύτητα του ελαίου πρέπει να είναι μικρότερη από 0,5 %.

5.1.2. Σε φιάλη Erlenmeyer των 25 ml (3.1) φέρεται 1,0 g του ανωτέρω παρασκευάσματος ελαίου και διαλύεται σε 10 ml μείγματος ανάπτυξης (4.10). Το διάλυμα αφήνεται σε ηρεμία τουλάχιστον επί 15 λεπτά πριν από τη χρωματογραφία σε στήλη silica gel. Εάν το διάλυμα είναι θολό, φυγοκεντρείται ώστε να εξασφαλιστούν άριστες συνθήκες για τη χρωματογραφία. (Μπορούν να χρησιμοποιηθούν έτοιμες φύσιγγες silica gel SPE των 500 mg).

5.1.3. Ετοιμασία της χρωματογραφικής στήλης Προστίθενται στη στήλη (3.3) περίπου 30 ml διαλύτη ανάπτυξης (4.10). Με τη βοήθεια γυάλινης ράβδου εισάγεται στο κατώτερο τμήμα της ένα τεμάχιο βάμβακα και πιέζεται για να αφαιρεθεί ο αέρας. Σε ποτήρι ζέσεως παρασκευάζεται εναιώρημα 25 g silica gel (4.1) σε περίπου 80 ml διαλύτη ανάπτυξης και προστίθεται στη στήλη με τη βοήθεια διαχωριστικής χοάνης. Εξακριβώνεται ότι έχει εισέλθει στη στήλη το σύνολο του silica gel. Μετά από έκπλυση με τον διαλύτη ανάπτυξης (4.10), ανοίγεται η στρόφιγγα της στήλης και το υγρό αφήνεται να εκρεύσει έως ότου η στάθμη του να βρίσκεται περίπου 2 mm πάνω από το silica gel.

5.1.4. Χρωματογραφία στήλης Σε φιάλη Erlenmeyer των 25 ml (3.1), ζυγίζεται ακριβώς 1,0 g δείγματος που έχει παρασκευαστεί σύμφωνα με το σημείο 5.1. Το δείγμα διαλύεται σε 10 ml διαλύτη ανάπτυξης (4.10). Το διάλυμα προστίθεται στη χρωματογραφική στήλη που έχει ετοιμαστεί σύμφωνα με το σημείο 5.1.3, ενώ λαμβάνεται μέριμνα ώστε να μην ανακινηθεί η επιφάνεια της στήλης. Ανοίγεται η στρόφιγγα και το διάλυμα του δείγματος αφήνεται να εκρεύσει έως ότου η στάθμη του εξισωθεί με τη στάθμη του silica gel. Ακολουθεί ανάπτυξη με 150 ml διαλύματος ανάπτυξης. Η ταχύτητα ροής ρυθμίζεται σε 2 ml/min (έτσι ώστε τα 150 ml να εκρεύσουν από τη στήλη εντός 60-70 λεπτών περίπου). Το έκλουσμα συλλέγεται σε προζυγισμένη σφαιρική φιάλη των 250 ml. Εξατμίζεται ο διαλύτης υπό κενό και απομακρύνονται τα τελευταία ίχνη του με διαβίβαση ρεύματος αζώτου. Ζυγίζεται η σφαιρική φιάλη και υπολογίζεται το εκχύλισμα που συλλέχθηκε. [Σε περίπτωση χρήσης έτοιμων φυσίγγων silica gel SPE, ακολουθείται η εξής διαδικασία: Μετά την ετοιμασία των φυσίγγων με 3 ml n-εξανίου, προστίθεται σε αυτές 1 ml διαλύματος (5.1.2). Μετά τη διήθηση του διαλύματος, ακολουθεί ανάπτυξη με 4 ml μείγματος η-εξανίου και διαιθυλαιθέρα 9:1 (κ.ό.). Το έκλουσμα συλλέγεται σε σωλήνα των 10 ml και συμπυκνώνεται μέχρι ξηρού με διαβίβαση ρεύματος αζώτου. Το ξηρό υπόλειμμα υφίσταται την επίδραση παγκρεατικής λιπάσης (5.2). Είναι θεμελιώδους σημασίας η εξακρίβωση της σύστασης σε λιπαρά οξέα πριν και μετά τη διέλευση από τη φύσιγγα SPE].

5.2. Υδρόλυση με παγκρεατική λιπάση

5.2.1. Στον σωλήνα φυγοκέντρου ζυγίζεται 0,1 g ελαίου που έχει παρασκευαστεί σύμφωνα με το σημείο 5.1. Προστίθενται 2 ml ρυθμιστικού διαλύματος (4.6), 0,5 ml διαλύματος χολικού νατρίου (4.7) και 0,2 ml διαλύματος χλωριούχου ασβεστίου με καλή ανάδευση μετά από κάθε προσθήκη. Κλείνεται ο σωλήνας με το εσμυρισμένο πώμα και τοποθετείται στον θερμοστάτη στους 40 ± 0,5 °C.

5.2.2. Προστίθενται 20 mg λιπάσης, το σύνολο αναδεύεται επιμελώς (χωρίς να διαβραχεί το πώμα) και τοποθετείται στον θερμοστάτη επί 2 λεπτά ακριβώς. Στη συνέχεια ο σωλήνας αποσύρεται, ανακινείται ζωηρά επί 1 λεπτό ακριβώς και αφήνεται να ψυχθεί.

5.2.3. Προστίθεται 1 ml διαιθυλαιθέρα, ο σωλήνας πωματίζεται και το αιθερικό διάλυμα ανακινείται ζωηρά, φυγοκεντρείται και μεταφέρεται με μικροσύριγγα σε καθαρό και στεγνό σωλήνα.

5.3. Παρασκευή των σιλυλοπαραγώγων και προετοιμασία της αέριας χρωματογραφίας

5.3.1. Σε σωλήνα με κωνικό πυθμένα των 10 ml φέρονται με μικροσύριγγα 100 μl διαλύματος (5.2.3).

5.3.2. Απομακρύνεται ο διαλύτης με τη διαβίβαση ελαφρού ρεύματος, αζώτου, προστίθενται 200 μl αντιδραστηρίου σιλυλίωσης (4.15) και ο σωλήνας πωματίζεται και αφήνεται σε ηρεμία επί 20 λεπτά.

5.3.3. Μετά από 20 λεπτά, προστίθενται 1 έως 5 ml n-εξανίου (ανάλογα με τις συνθήκες χρωματογραφίας): το διάλυμα που προκύπτει είναι έτοιμο για αέρια χρωματογραφία.

5.4. Αέρια χρωματογραφία

Οι συνθήκες εργασίας είναι οι ακόλουθες:

— θερμοκρασία του συστήματος έγχυσης («on column») μικρότερη από το σημείο ζέσεως του διαλύτη (68 °C),

— θερμοκρασία του ανιχνευτή: 350 °C,

— θερμοκρασία της στήλης: προγραμματισμός της θερμοκρασίας του κλιβάνου: 60 °C επί 1 λεπτό, αύξηση 15 °C ανά λεπτό μέχρι τους 180 °C και έπειτα 5 °C ανά λεπτό μέχρι τους 340 °C, κατόπιν 340 °C επί 13 λεπτά,

— φέρον αέριο: υδρογόνο ή ήλιο, ρυθμισμένο στην κατάλληλη γραμμική ταχύτητα, ώστε να επιτευχθεί η διαχωριστική ικανότητα που αποτυπώνεται στο σχήμα 1. Ο χρόνος κατακράτησης του τριγλυκεριδίου C54 πρέπει να είναι 40 ± 5 λεπτά (βλέπε σχήμα 2). (Οι ανωτέρω συνθήκες εργασίας προτείνονται ενδεικτικά. Κάθε τεχνικός οφείλει να τις βελτιστοποιεί για να επιτύχει την επιθυμητή διαχωριστική ικανότητα. Η κορυφή που αντιστοιχεί στην 2-μονοπαλμιτίνη πρέπει να έχει ελάχιστο ύψος 10 % της κλίμακας του καταγραφέα.),

— εγχεόμενη ποσότητα ουσίας: 0,5-1 μl του n-εξανικού διαλύματος (5 ml) (5.3.3).

5.4.1. Ταυτοποίηση των κορυφών

Τα επιμέρους μονογλυκερίδια ταυτοποιούνται βάσει των λαμβανόμενων χρόνων κατακράτησης και με σύγκριση με τους χρόνους κατακράτησης προτύπων μειγμάτων μονογλυκεριδίων, που αναλύθηκαν στις ίδιες συνθήκες.

5.4.2. Ποσοτικός προσδιορισμός

Το εμβαδόν κάθε κορυφής υπολογίζεται με ηλεκτρονικό ολοκληρωτή.

6. ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

Η εκατοστιαία αναλογία 2-μονοπαλμιτίνης υπολογίζεται από τον λόγο του εμβαδού της αντίστοιχης κορυφής προς το άθροισμα των εμβαδών των κορυφών όλων των μονογλυκεριδίων (βλέπε σχήμα 2), σύμφωνα με τον τύπο:

glyceryl monopalmitate (%):

όπου:

Ax = το εμβαδόν της κορυφής που αντιστοιχεί στη 2-μονοπαλμιτίνη,

ΣΑ = το άθροισμα των εμβαδών όλων των κορυφών που αντιστοιχούν σε μονογλυκερίδια.

Το αποτέλεσμα πρέπει να εκφράζεται με ένα δεκαδικό ψηφίο.

7. ΕΚΘΕΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ

Στην έκθεση της ανάλυσης θα πρέπει να αναφέρονται τα εξής:

— παραπομπή στη παρούσα μέθοδο,

— κάθε στοιχείο απαραίτητο για την πλήρη ταυτοποίηση του δείγματος,

— το αποτέλεσμα της ανάλυσης,

— κάθε παρέκκλιση από την παρούσα μέθοδο, ανεξαρτήτως του εάν έχει αποφασιστεί από τα ενδιαφερόμενα μέρη ή οφείλεται σε άλλους λόγους,

— στοιχεία ταυτότητας του εργαστηρίου, ημερομηνία της ανάλυσης και υπογραφή των υπευθύνων γι’ αυτή.

Σχήμα 1

Χρωματογράφημα των προϊόντων της αντίδρασης σιλυλίωσης που προέκυψαν από την επίδραση λιπάσης σε εξευγενισμένο ελαιόλαδο, στο οποίο είχε προστεθεί 20 % εστεροποιημένο έλαιο (100 %)

Key: «acides gras libres» = free fatty acids; «Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée» = refined olive oil + 20 % esterified oil; «1-2 monopalmitoléine» = 1-2 monopalmitolein; «1-2 mono C18 insat.» = unsaturated 1-2 mono C18

Σχήμα 2

Χρωματογράφημα:

A) μη εστεροποιημένου ελαιόλαδου, μετά από την επίδραση λιπάσης και από σιλυλίωση· στις συνθήκες αυτές (τριχοειδής στήλη 8-12 m), το κλάσμα των κηρών εκλούεται ταυτόχρονα με το κλάσμα των διγλυκεριδίων ή λίγο αργότερα. Μετά την επίδραση της λιπάσης, η περιεκτικότητα σε τριγλυκερίδια δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 15 % Υπόμνημα: 1 = Ελεύθερα λιπαρά οξέα 2 = Μονογλυκερίδια 3 = Διγλυκερίδια 4 = Τριγλυκερίδια * = 2-μονοπαλμιτίνη ** = Τριγλυκερίδιο C54

Χρωματογράφημα:

B) εστεροποιημένου ελαίου, μετά από την επίδραση λιπάσης και από σιλυλίωση· στις συνθήκες αυτές (τριχοειδής στήλη 8-12 m), το κλάσμα των κηρών εκλούεται ταυτόχρονα με το κλάσμα των διγλυκεριδίων ή λίγο αργότερα. Μετά την επίδραση της λιπάσης, η περιεκτικότητα σε τριγλυκερίδια δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 15 %. Υπόμνημα: 1 = Ελεύθερα λιπαρά οξέα 2 = Μονογλυκερίδια 3 = Διγλυκερίδια 4 = Τριγλυκερίδια * = 2-μονοπαλμιτίνη ** = Τριγλυκερίδιο C54

8. ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ

ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΤΗΣ ΛΙΠΑΣΗΣ

Στο εμπόριο κυκλοφορούν λιπάσες ικανοποιητικής δραστικότητας. Είναι επίσης δυνατή η εργαστηριακή παρασκευή τους ως εξής:

Ψύχονται 5 kg νωπού παγκρέατος χοίρου στους 0 °C. Το πάγκρεας απαλλάσσεται από το στερεό λίπος και τον συνδετικό ιστό που το περιβάλλουν και αλέθεται σε μικροτεμαχιστή με λεπίδες μέχρι να ληφθεί ρευστός πολτός. Ο πολτός αυτός αναδεύεται επί 4-6 ώρες με 2,5 λίτρα άνυδρης ακετόνης και κατόπιν φυγοκεντρείται. Το υπόλειμμα εκχυλίζεται τρεις φορές ακόμα με τον ίδιο όγκο άνυδρης ακετόνης και, έπειτα, δύο φορές με μείγμα ακετόνης και διαιθυλαιθέρα 1:1 (κ.ό.) και δύο φορές με διαιθυλαιθέρα.

Το υπόλειμμα ξηραίνεται υπό κενό επί 48 ώρες για να ληφθεί σταθερή σκόνη, η οποία διατηρείται για μεγάλο χρονικό διάστημα στο ψυγείο, προφυλαγμένη από την υγρασία.

ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΛΙΠΑΣΗΣ

Παρασκευάζεται γαλάκτωμα ελαιολάδου ως εξής:

Αναδεύεται σε αναμικτήρα επί 10 λεπτά μείγμα 165 ml διαλύματος αραβικού κόμμεως 100 g/l, 15 g θρυμματισμένου πάγου και 20 ml εξουδετερωμένου ελαιολάδου.

Σε ποτήρι ζέσεως των 50 ml εισάγονται διαδοχικά 10 ml του εν λόγω γαλακτώματος, 0,3 ml διαλύματος χολικού νατρίου 0,2 g/ml και 20 ml απεσταγμένου νερού.

Το ποτήρι τοποθετείται σε θερμοστάτη, ρυθμισμένο στους 37 °C, και εισάγονται τα ηλεκτρόδια του πεχάμετρου και ο ελικοειδής αναδευτήρας.

Προστίθεται στάγδην, με προχοΐδα, διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου 0,1 N μέχρι να επιτευχθεί pH 8,3.

Προστίθεται μια ποσότητα αιωρήματος σκόνης λιπάσης σε νερό (0,1 g/ml λιπάσης). Όταν η ένδειξη του πεχάμετρου είναι 8,3, τίθεται σε λειτουργία το χρονόμετρο και προστίθεται στάγδην διάλυμα υδροξειδίου νατρίου με το ρυθμό που απαιτείται για να διατηρηθεί το pH στην τιμή 8,3. Σημειώνεται ανά λεπτό ο όγκος διαλύματος που καταναλώνεται.

Σχεδιάζεται γραφική παράσταση των δεδομένων σε ορθογώνιο σύστημα αξόνων, με τετμημένη τους χρόνους και τεταγμένη τα ml αλκαλικού διαλύματος 0,1 N που καταναλώθηκαν για να διατηρηθεί το pH σταθερό. Πρέπει να προκύπτει γραμμική καμπύλη.

Η δραστικότητα της λιπάσης, μετρούμενη σε μονάδες λιπάσης ανά mg, παρέχεται από τον ακόλουθο τύπο:

όπου:

A = η δραστικότητα σε μονάδες λιπάσης/mg,

V = τα χιλιοστόλιτρα διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου 0,1 N που καταναλώνονται ανά λεπτό (υπολογιζόμενα από την καμπύλη),

N = η κανονικότητα του διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου,

m = η μάζα της ελεγχόμενης λιπάσης, σε mg.

Ως μονάδα λιπάσης ορίζεται η ποσότητα του ενζύμου που ελευθερώνει 10 μικρογραμμοϊσοδύναμα οξέος ανά λεπτό.

▼M20 —————

▼M28









ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IX

ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΥΠΕΡΙΩΔΟΥΣ

ΠΡΟΛΟΓΟΣ

Με τη φασματοφωτομετρική εξέταση υπεριώδους είναι δυνατόν να ληφθούν πληροφορίες σχετικά με την ποιότητα μιας λιπαρής ύλης, την κατάσταση διατήρησής της και τις μεταβολές που προκλήθηκαν με τεχνολογικές διεργασίες. Η απορρόφηση στα μήκη κύματος που καθορίζονται στη μέθοδο οφείλεται στην παρουσία συζυγιακών διενίων και τριενίων που προέρχονται από διαδικασίες οξείδωσης και/ή πρακτικές εξευγενισμού. Η εν λόγω απορρόφηση εκφράζεται ως ειδική απόσβεση

(η απόσβεση διαλύματος 1 % της λιπαρής ύλης στον καθοριζόμενο διαλύτη, με κυψελίδα των 10 mm), η οποία δηλώνεται κατά σύμβαση με το σύμβολο Κ (αναφέρεται επίσης ως «συντελεστής απόσβεσης»).

1. ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ

Στο παρόν παράρτημα περιγράφεται η διαδικασία φασματοφωτομετρικής εξέτασης του ελαιολάδου στο υπεριώδες τμήμα του φάσματος.

2. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Ένα δείγμα διαλύεται στον απαιτούμενο διαλύτη και, στη συνέχεια, μετράται η απορρόφηση του διαλύματος στα καθορισμένα μήκη κύματος έναντι του καθαρού διαλύτη.

Υπολογίζονται οι ειδικές αποσβέσεις σε μήκη κύματος 232 nm και 268 nm σε ισοοκτάνιο ή 232 nm και 270 nm σε κυκλοεξάνιο, για συγκέντρωση 1 % w/v και με κυψελίδα των 10 mm.

3. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΣΚΕΥΗ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ

3.1. Φασματοφωτόμετρο κατάλληλο για μετρήσεις σε μήκη κύματος υπεριώδους (220 nm έως 360 nm), με δυνατότητα ένδειξης ανά νανομετρική μονάδα. Συνιστάται ο τακτικός έλεγχος για την ακρίβεια και την αναπαραγωγιμότητα των κλιμάκων μήκους κύματος και απορρόφησης, καθώς και για παράσιτο φως. 3.1.1. Κλίμακα μήκους κύματος: Η κλίμακα αυτή είναι δυνατόν να ελεγχθεί με τη χρήση υλικού αναφοράς, το οποίο συνίσταται σε γυάλινο οπτικό φίλτρο που περιέχει οξείδιο του ολμίου ή διάλυμα οξειδίου του ολμίου (σφραγισμένο ή όχι) που έχει διακριτές φασματικές ζώνες απορρόφησης. Τα υλικά αναφοράς είναι σχεδιασμένα για τον έλεγχο και τη βαθμονόμηση των κλιμάκων μήκους κύματος των φασματοφωτομέτρων ορατού και υπεριώδους με μέγιστο ονομαστικό εύρος φασματικής ζώνης 5 nm. Οι μετρήσεις πραγματοποιούνται έναντι αέρα ως τυφλού στην περιοχή μηκών κύματος 640 έως 240 nm, σύμφωνα με τις οδηγίες που επισυνάπτονται στα υλικά αναφοράς. Διορθώνεται η γραμμή βάσης με κενή διαδρομή της δέσμης σε κάθε μεταβολή του πλάτους της σχισμής. Τα μήκη κύματος του προτύπου παρατίθενται στο πιστοποιητικό του υλικού αναφοράς. 3.1.2. Κλίμακα απορρόφησης: Η κλίμακα αυτή είναι δυνατόν να ελεγχθεί με τη χρήση υλικών αναφοράς που είναι διαθέσιμα στο εμπόριο, τα οποία συνίστανται σε όξινα διαλύματα διχρωμικού καλίου, σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις και σε πιστοποιημένες τιμές απορρόφησης στο λmax (σε τέσσερα διαλύματα διχρωμικού καλίου σε υπερχλωρικό οξύ, τοποθετημένα σε τέσσερις ερμητικά σφραγισμένες κυψελίδες υπεριώδους από χαλαζία, για τη μέτρηση της γραμμικότητας και της φωτομετρικής ακρίβειας στο υπεριώδες τμήμα του φάσματος). Τα διαλύματα διχρωμικού καλίου μετρώνται έναντι τυφλού του χρησιμοποιούμενου οξέος, μετά από διόρθωση της γραμμής βάσεως, σύμφωνα με τις οδηγίες που επισυνάπτονται στο υλικό αναφοράς. Οι τιμές απορρόφησης παρατίθενται στο πιστοποιητικό του υλικού αναφοράς. Μια άλλη δυνατότητα για να ελεγχθεί η απόκριση του φωτοκυττάρου και του φωτοπολλαπλασιαστή προσφέρει η ακόλουθη διαδικασία: ζυγίζονται 0,2000 g καθαρού χρωμικού καλίου για φασματοφωτομετρία, διαλύονται σε διάλυμα 0,05 N υδροξείδιου του καλίου σε ογκομετρική φιάλη των 1 000 ml και συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι τη χαραγή. Λαμβάνονται ακριβώς 25 ml από το διάλυμα, μεταφέρονται σε ογκομετρική φιάλη των 500 ml και το διάλυμα αραιώνεται μέχρι τη χαραγή, με τη χρήση ίδιου διαλύματος υδροξειδίου του καλίου. Μετράται η απόσβεση του διαλύματος που λαμβάνεται κατ' αυτόν τον τρόπο στα 275 nm, με τη χρήση του διαλύματος υδροξειδίου του καλίου ως αναφοράς. Η απόσβεση που με μετρήθηκε με τη χρήση κυψελίδας 1 cm θα πρέπει να είναι 0,200 ± 0,005.

3.2. Ορθογώνιες κυψελίδες από χαλαζία με καλύμματα, κατάλληλες για μετρήσεις σε μήκη κύματος στην υπεριώδη ακτινοβολία (220 έως 360 nm) οπτικής path-length 10 mm. Όταν πληρούνται με νερό ή άλλον κατάλληλο διαλύτη, οι κυψελίδες δεν πρέπει να εμφανίζουν διαφορά μεταξύ τους μεγαλύτερη από 0,01 μονάδες απόσβεσης.

3.3. Ογκομετρικές φιάλες μιας χαραγής χωρητικότητας 25 ml, κλάσης A.

3.4. Αναλυτικός ζυγός με ακρίβεια ενδείξεων 0,0001 g.

4. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ

Κατά τη διάρκεια της ανάλυσης, εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά, χρησιμοποιούνται μόνον αντιδραστήρια αναγνωρισμένης αναλυτικής καθαρότητας και νερό αποσταγμένο ή απιονισμένο ή ισοδύναμης καθαρότητας.

Διαλύτης: Ισοοκτάνιο (2,2,4 τριμεθυλοπεντάνιο) για τις μετρήσεις στα 232 nm και 268 nm, ή κυκλοεξάνιο για τις μετρήσεις στα 232 nm και 270 nm, με απορρόφηση μικρότερη από 0,12 στα 232 nm και μικρότερη από 0,05 στα 270 nm έναντι αποσταγμένου νερού, μετρούμενη με κυψελίδα των 10 mm.

5. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

5.1. Το δείγμα πρέπει να είναι απόλυτα ομοιογενές και απαλλαγμένο από αιωρούμενες προσμείξεις. Σε αντίθετη περίπτωση, πρέπει να διηθείται με χάρτινο ηθμό σε θερμοκρασία 30 °C περίπου.

5.2. Σε ογκομετρική φιάλη των 25 ml ζυγίζονται επακριβώς (με ακρίβεια 1 mg) περίπου 0,25 g του προετοιμασμένου με τον τρόπο αυτό δείγματος, συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι τη χαραγή με τον καθορισμένο διαλύτη και το μείγμα ομοιογενοποιείται. Το διάλυμα που προκύπτει πρέπει να είναι τελείως διαυγές. Εάν παρατηρηθεί γαλακτώδης ιριδισμός ή θολερότητα, το διάλυμα διηθείται γρήγορα με χάρτινο ηθμό. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Γενικά, μάζα 0,25 έως 0,30 g αρκεί για μετρήσεις απορρόφησης των παρθένων και των εξαιρετικά παρθένων ελαιολάδων στα 268 nm και 270 nm. Για μετρήσεις σε μήκος κύματος 232 nm, απαιτούνται συνήθως 0,05 g δείγματος, και για τον λόγο αυτό παρασκευάζονται κατά κανόνα δύο διαφορετικά διαλύματα. Για μετρήσεις απορρόφησης των πυρηνελαίων, των εξευγενισμένων ελαιολάδων και των νοθευμένων ελαιολάδων, απαιτείται συνήθως μικρότερη ποσότητα δείγματος, π.χ. 0,1 g, λόγω της υψηλότερης απορρόφησής τους.

5.3. Εφόσον χρειάζεται, διορθώνεται η γραμμή βάσεως (220-290 nm) με διαλύτη και στις δύο κυψελίδες από χαλαζία (δείγμα και αναφοράς), κατόπιν πληρούται με το διάλυμα δοκιμής μια κυψελίδα από χαλαζία και μετρώνται οι αποσβέσεις σε 232, 268 και 270 nm έναντι του διαλύτη που χρησιμοποιήθηκε. Οι καταγραφόμενες τιμές απόσβεσης πρέπει να βρίσκονται εντός του εύρους από 0,1 έως 0,8 ή εντός του εύρους γραμμικότητας του φασματοφωτομέτρου που θα πρέπει να επαληθευθεί. Σε αντίθετη περίπτωση, πρέπει να επαναλαμβάνονται οι μετρήσεις με τη χρήση πυκνότερου ή αραιότερου διαλύματος, αναλόγως.

5.4. Μετά τη μέτρηση της απορρόφησης σε 268 ή 270 nm και μετράται η απορρόφηση σε λmax, λmax + 4 and λmax – 4. Οι εν λόγω τιμές απορρόφησης χρησιμοποιούνται για να προσδιοριστεί η μεταβολή της ειδικής απόσβεσης (ΔΚ). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το λmax θεωρείται ότι είναι 268 nm για το ισοοκτάνιο που χρησιμοποιείται ως διαλύτης και 270 nm για το κυκλοεξάνιο.

6. ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

6.1. Καταγράφονται οι τιμές ειδικής απόσβεσης (συντελεστές απόσβεσης) στα διάφορα μήκη κύματος, οι οποίες υπολογίζονται ως εξής: όπου: Κλ = ειδική απόσβεση σε μήκος κύματος λ, Ελ = μετρούμενη απόσβεση σε μήκος κύματος λ, c = συγκέντρωση του διαλύματος, σε g/100 ml, S = μήκος διαδρομής της κυψελίδας από χαλαζία, σε cm, εκφραζόμενο με ακρίβεια δύο δεκαδικών ψηφίων.

6.2. Μεταβλητότητα της ειδικής απόσβεσης (ΔΚ) Η μεταβλητότητα της απόλυτης τιμής