1976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 1
Το έγγραφο αυτό συνιστά βοήθηµα τεκµηρίωσης και δεν δεσµεύει τα κοινοτικά όργανα
►B ΕΒ∆ΟΜΗ Ο∆ΗΓΙΑ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ
της 1ης Μαρτίου 1976
περί καθορισµού των κοινοτικών µεθόδων αναλύσεως για τον επίσηµο έλεγχο των ζωοτροφών
(76/372/ΕΟΚ)
(ΕΕL 102της 15.4.1976, σ. 8)
Τροποποιείται από:
Επίσηµη Εφηµερίδα
αριθ. σελίδα ηµεροµηνία
►M1Οδηγία 81 /680/ΕΟΚ της Επιτροπής της 30ής Ιουλίου 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Οδηγία 92/95/ΕΟΚ της Επιτροπής της 9ης Νοεµβρίου 1992 L 327 54 13.11.1992
▼B
ΕΒ∆ΟΜΗ Ο∆ΗΓΙΑ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ
της 1ης Μαρτίου 1976
περί καθορισµού των κοινοτικών µεθόδων αναλύσεως για τον
επίσηµο έλεγχο των ζωοτροφών
(76/372/ΕΟΚ)
Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,
Έχοντας υπόψη:
τη συνθήκη περί ιδρύσεως της Ευρωπαϊκής Οικονοµικής
Κοινότητος,
την οδηγία του Συµβουλίου της 20ής Ιουλίου 1970 περί
εισαγωγής κοινοτικών τρόπων λήψεως δειγµάτων και µεθόδωναναλύσεως για τον επίσηµο έλεγχο των ζωοτροφών (
1),όπως
τροποποιήθηκε τελευταία µε την πράξη προσχωρήσεως (2),και
ιδίως µε το άρθρο 2,
Εκτιµώντας:ότι η παραπάνω οδηγία προβλέπει ότι οι επίσηµοι έλεγχοι των
ζωοτροφών για τη διαπίστωση του γεγονότος αν τηρούνται οι
όροι που καθορίζονται δυνάµει των νοµοθετικών, κανονιστικώνκαι διοικητικών διατάξεων, οι οποίες αφορούν την ποιότητα καιτη σύνθεση των ζωοτροφών, πραγµατοποιούνται σύµφωνα µε τουςκοινοτικούς τρόπους λήψεως δειγµάτων και τις κοινοτικές µεθό-δους αναλύσεως ·
ότι οι οδηγίες 71 /250/ΕΟΚ, 71 /393/ΕΟΚ, 72 /199/ΕΟΚ, 73 /46/ΕΟΚ,
74/203/ΕΟΚ και 75 /84/ΕΟΚ της Επιτροπής της 15ης Ιουνίου
1971(
3), 18ης Νοεµβρίου 1971 (4), 27ης Απριλίου 1972 (5), 5ης
∆εκεµβρίου 1972 (6), 25ης Μαρτίου 1974 (7)και 20ής ∆εκεµβρίου
1974(8)έχουν ήδη καθορίσει έναν ορισµένο αριθµό κοινοτικών
µεθόδων αναλύσεως ·ότι λαµβανοµένου υπόψη του βαθµού
προόδου των πραγµατοποιηθεισών από τότε εργασιών πρέπει να
θεσπισθεί µια εβδόµη σειρά µεθόδων ·
ότι τα προβλεπόµενα στην παρούσα οδηγία µέτρα είναι σύµφωνα
µε τη γνώµη της Μόνιµης Επιτροπής Ζωοτροφών,
ΕΞΕ∆ΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ Ο∆ΗΓΙΑ:
Άρθρο 1
Τα Κράτη Μέλη ορίζουν ότι οι αναλύσεις για τους επισήµους
ελέγχους των ζωοτροφών, σε ό,τι αφορά την περιεκτικότητάτους σε αφλατοξίνη Β
1,πραγµατοποιούνται σύµφωνα µε τις µεθό-
δους που περιγράφονται στο παράρτηµα της παρούσας οδηγίας.
Άρθρο 2
Τα Κράτη Μέλη θέτουν σε ισχύ το αργότερο την 1η Οκτωβρίου
1976 τις νοµοθετικές, κανονιστικές και διοικητικές διατάξεις που
είναι αναγκαίες για να συµµορφωθούν µε τις διατάξεις της
παρούσας οδηγίας. Ενηµερώνουν αµέσως περί αυτού τηνΕπιτροπή.1976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 2
(1)ΕΕ αριθ. Ν 170 της 3.8.1970, σ. 2 .
(2)ΕΕ αριθ. Ν 73 της 27.3.1972, σ. 14 .
(3)ΕΕ αριθ. Ν 155 της 12.7.1971, σ. 13 .
(4)ΕΕ αριθ. Ν 279 της 20.12.1971, σ. 7 .
(5)ΕΕ αριθ. Ν 123 της 29.5.1972, σ. 6 .
(6)ΕΕ αριθ. Ν 83 της 30.3.1973, σ. 21 .
(7)ΕΕ αριθ. Ν 108 της 22.4.1974, σ. 7 .
(8)ΕΕ αριθ. Ν 32 της 5.2.1975, σ. 26 .▼M1
▼B
▼B
Άρθρο 3
Η παρούσα οδηγία απευθύνεται στα Κράτη Μέλη.1976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 3
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ
ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΑΦΛΑΤΟΞΙΝΗΣ Β1
Α. ΜΕΘΟ∆ΟΣ ΜΕ ΜΟΝΟ∆ΙΑΣΤΑΤΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ
ΣΤΟΙΒΑ∆ΟΣ
1. Σκοπός και αντικείµενο
Η µέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισµό του επιπέδου της
αφλατοξίνης B1σε πρώτες ύλες και απλές ζωοτροφές. Η
µέθοδος αυτή δεν µπορεί να εφαρµοστεί στην παρουσία στεµ-
φύλων εσπεριδοειδών. Το κατώτερο όριο προσδιορισµού
είναι 0,01 mg/kg (10 ppb).
Εφόσον υπάρχουν παρεµβαλλόµενες ουσίες οι οποίες παρεµ-
ποδίζουν τον προσδιορισµό, η ανάλυση επαναλαµβάνεται
χρησιµοποιώντας τη µέθοδο Β (υγρή χρωµατογραφία υψηλής
απόδοσης).
2. Αρχή
Το δείγµα εκχυλίζεται µε χλωροφόρµιο. Το εκχύλισµα
διηθείται, λαµβάνεται κατάλληλη ποσότητα από αυτό και
καθαρίζεται µε χρωµατογραφία σε στήλη silica gel. Το προϊόν
της εκλούσεως εξατµίζεται και το υπόλειµµα λαµβάνεται εκ
νέου µε έναν καθορισµένο όγκο χλωροφορµίου ή µίγµατος
βενζολίου και ακετονιτριλίου. Κατάλληλη ποσότητα του
διαλύµατος αυτού υποβάλλεται σε χρωµατογραφία λεπτής
στοιβάδος. Η ποσότητα της αφλατοξίνης Β1προσδιορίζεται
από την υπεριώδη ακτινοβολία του χρωµατογραφήµατος είτε
οπτικά είτε µε φθοριοπυκνοµετρία δια συγκρίσεως µε
γνωστές ποσότητες προτύπου αφλατοξίνης Β1.Η ταυτότητα
της αφλατοξίνης Β1που εξάγεται από την τροφή πρέπει να
επιβεβαιούται δια των ενδεδειγµένων µεθόδων.
3. Αντιδραστήρια
ΝΒ:Όλα τα αντιδραστήρια είναι ποιότητος «για ανάλυση »
εφ'όσον δεν δίδεται καµία άλλη οδηγία.
3.1. Ακετόνη.
3.2. Χλωροφόρµιο, σταθεροποιηθέν µε 0,5 µέχρι 1,0 %αιθανόλη
96%(όγκος/όγκο).
3.3. η-Εξάνιο.
3.4. Μεθανόλη.
3.5. Άνυδρος διαιθυλικός αιθέρας, απηλλαγµένος υπεροξειδίων.
3.6. Μίγµα βενζολίου και ακετονιτριλίου: 98 /2 (όγκος/όγκο).
3.7. Μίγµα χλωροφορµίου (3.2) και µεθανόλης (3.4): 97 /3 (όγκος/
όγκο).
3.8. Silica gel για χρωµατογραφία σε στήλη κοκκοµετρικής συνθέ-
σεως: 0,05 µέχρι 0,20 mm.
3.9. Υδρόφιλος βάµβαξ που έχει απολιπανθεί προηγουµένως µε
χλωροφόρµιο ή υαλοβάµβαξ.
3.10. Θειικό νάτριο, άνυδρο, σε κόκκους
3.11. Αδρανές αέριο, για παράδειγµα άζωτο.
3.12. Υδροχλωρικό οξύ 1 Ν.
3.13. Θειικό οξύ 50 %(όγκος/όγκο).
3.14. Γη διατόµων ( hyflosupercel), εκπλυθείσα µε οξύ.
3.15. Silica gel G-HR ή ισοδύναµο, για χρωµατογραφία λεπτής στοι-
βάδος.
3.16. Πρότυπο διάλυµα (διάλυµα αναφοράς) 0,1 µ gπερίπου αφλατο-
ξίνης Β1ανά χιλιοστόλιτρο σε χλωροφόρµιο (3.2) ή σε µίγµα1976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 4
▼M2
▼B
▼B
βενζολίου /ακετονιτριλίου (3.6), παρασκευαζόµενο και ελεγ-
χόµενο όπως ορίζεται στο σηµείο 7.
3.17. Πρότυπο ποιοτικό διάλυµα 0,1 µ gπερίπου αφλατοξινών Β1καιB2ανά χιλιοστόλιτρο σε χλωροφόρµιο (3.2) ή σε µίγµα
βενζολίου /ακετονιτριλίου (3.6). Οι πυκνότητες αυτές δίδονται
ενδεικτικά. Πρέπει να ρυθµισθούν ώστε να ληφθεί η αυτή
ένταση φθορισµού για τις δύο αφλατοξίνες.
3.18. ∆ιαλύτες αναπτύξεως:
3.18.1. Χλωροφόρµιο (3.2) /ακετόνη (3.1): 9 /1 (όγκος/όγκο), δοχείο
µετά µη κεκορεσµένης ατµοσφαίρας ·
3.18.2. ∆ιαιθυλικός αιθέρας (3.5) /µεθανόλη (3.4) /ύδωρ: 96 /3/1 (όγκος/
όγκο/όγκο), δοχείο µετά µη κεκορεσµένης ατµοσφαίρας ·
3.18.3. ∆ιαιθυλικός αιθέρας (3.5) /µεθανόλη (3.4) /ύδωρ: 94 /4,5/1,5
(όγκος/όγκο/όγκο), δοχείο µετά κεκορεσµένης ατµοσφαίρας ·
3.18.4. Χλωροφόρµιο (3.2) /µεθανόλη (3.4): 94 /6 (όγκος/όγκο), δοχείο
µε κεκορεσµένη ατµόσφαιρα ·
3.18.5. Χλωροφόρµιο (3.2) /µεθανόλη (3.4): 97 /3 (όγκος/όγκο), δοχείο
µε κεκορεσµένη ατµόσφαιρα.
4. Συσκευές
4.1. Συνθλίπτης —αναµίκτης.
4.2. Συσκευή αναδεύσεως ή µαγνητικός αναδευτήρας.
4.3. Πτυχωτός ηθµός Schleicher καιSchüllαριθ.588ή παρόµοιος,
διαµέτρου: 24 cm.
4.4. Υάλινοι σωλήνες χρωµατογραφίας (εσωτερικής διαµέτρου:
22mmµήκους: 300 mm),µετά κρουνού από πλαστική ύλη
τεφλόν και δεξαµενή 250 ml.
4.5. Περιστροφική συσκευή εξατµίσεως σε κενό µε σφαιρική
φιάλη ζέσεως σφαιρικού πυθµένος 500 ml.
4.6. Κωνικές φιάλες των 500 mlµε εσµυρισµένο πώµα.
4.7. Συσκευές για χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδος.
4.8. Υάλινες πλάκες για χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδος
200× 200 mm, παρασκευαζόµενες ως ακολούθως (οι υποδει-
κνυόµενες ποσότητες αρκούν για την κάλυψη 5 πλακών):
εισάγονται 30 g silica gel G-HR (3.15) σε µια κωνική φιάλη,
προστίθενται 60 mlύδατος, η φιάλη πωµατίζεται και
αναταράσσεται επί ένα λεπτό. Το εναιώρηµα κατανέµεται
στις πλάκες έτσι ώστε να δηµιουργηθεί µια οµοιόµορφη
στοιβάδα πάχους 0,25 mm.Αφήνεται να αποξηρανθεί στον
αέρα και διατηρείται κατόπιν σε ξηραντήρα εφοδιασµένο µε
silica gel. Κατά τη στιγµή της χρήσεως οι πλάκες αναζωογο-
νούνται δια τοποθετήσεως επί 1 ώρα σε κλίβανο και σε
θερµοκρασία 110 ºC.
Οι πλάκες που είναι έτοιµες για χρήση είναι κατάλληλες εφ '
όσον δίνουν αποτελέσµατα παρόµοια µε εκείνα των πλακών
που έχουν παρασκευασθεί όπως αναφέρθηκε παραπάνω.
4.9. Λαµπτήρας υπεριώδης µακρών κυµάτων (360 nm).Η ένταση
της ακτινοβολίας πρέπει να επιτρέπει να διακρίνεται ακόµη
καθαρά µια κηλίδα 1,0 ngαφλατοξίνης Β1σε πλάκα χρωµατο-
γραφίας λεπτής στοιβάδος από µια απόσταση 10 cmαπό τον
λαµπτήρα.
4.10. Σωλήνες των 10 ml,βαθµολογηµένοι, µε πώµα από πολυαιθυ-
λένιο.
4.11. Φασµατοφωτόµετρο UV.
4.12. Φθοριοπυκνόµετρο (ενδεχοµένως).
5. Τρόπος εργασίας
5.1. Παρασκευή του δείγµατος (βλέπε παρατηρήσεις, τµήµα Γ, σηµείο
1).
Το δείγµα κονιοποιείται κατά τρόπο ώστε να διέρχεται
ολόκληρο από κόσκινο, µε άνοιγµα οπών του δικτυωτού 1 mm
(σύµφωνα µε τη σύσταση ISO R 565).1976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 5
▼B
5.2. Εκχύλιση
50,0 gδείγµατος λεπτοαλεσθέντος και οµογενοποιηθέντος
εισάγονται σε µια κωνική φιάλη των 500 ml (4.6).
Προστίθενται 25 gγης διατόµων (3.14), 25 mlύδατος και
250mlχλωροφορµίου (3.2). Η φιάλη πωµατίζεται, αναδεύεται
ή αναταράσσεται επί 30 λεπτά µε τη βοήθεια της συσκευής
(4.2) και διηθείται σε πτυχωτό ηθµό (4.3). Τα πρώτα 10 ml
του διηθήµατος απορρίπτονται και συλλέγονται κατόπιν 50 ml.
5.3. Καθαρισµός σε στήλη
Το κατώτερο άκρο ενός σωλήνα χρωµατογραφίας (4.4)
εφοδιάζεται µε πώµα από βάµβακα ή υαλοβάµβακα (3.9),
πληρούνται τα δύο τρίτα του σωλήνα µε χλωροφόρµιο (3.2)
και προστίθενται 5 gθειικού νατρίου (3.10).
Εξακριβώνεται ότι η επάνω επιφάνεια της στοιβάδος του
θειικού νατρίου είναι επίπεδη και κατόπιν προστίθενται σε
µικρές δόσεις 10 g silica gel (3.8). Ανακινείται µε προσοχή
µετά από κάθε προσθήκη για να αποβληθούν οι φυσαλίδες
του αέρα. Αφήνεται να κατακαθίσει επί 15 λεπτά και
προστίθενται στη συνέχεια µε προσοχή 15 gθειικού νατρίου
(3.10). Αφήνεται να κατέλθει το υγρό στην άµεσο προσέγγιση
της επάνω επιφανείας της στοιβάδος του θειικού νατρίου.
Αναµιγνύονται τα ληφθέντα, στο 5.2, 50 mlεκχυλίσµατος µε
100ml n-εξανίου (3.3) και µεταγγίζεται ποσοτικώς το µίγµα
στη στήλη. Αφήνεται να κατέλθει το υγρό µέχρι την επάνω
επιφάνεια της στοιβάδος του θειικού νατρίου. Απορρίπτεται
το υγρό που έχει χυθεί. Προστίθενται στη συνέχεια 100 ml
διαιθυλικού αιθέρα (3.5) και αφήνεται πάλι να κατέλθει το
υγρό µέχρι την επάνω επιφάνεια της στοιβάδος του θειικού
νατρίου. Κατά τη διάρκεια των εργασιών αυτών λαµβάνεται
µέριµνα ώστε η ταχύτητα της ροής να είναι από 8 µέχρι
12mlανά λεπτό και η στήλη να µην αποξηρανθεί. Απορρί-
πτονται τα υγρά που έχουν χυθεί. Εκλούεται στη συνέχεια
µε 150 mlµίγµατος χλωροφορµίου /µεθανόλης (3.7) και λαµβά-
νεται το σύνολο του προϊόντος εκλούσεως.
Εξατµίζεται αυτό µέχρι ξηρού, περίπου σε ρεύµα αδρανούς
αερίου (3.11) και σε θερµοκρασία που να µην υπερβαίνει
τους 50 ºΚελσίου, µε τη βοήθεια µιας περιστροφικής
συσκευής εξατµίσεως σε κενό (4.5).Το υπόλειµµα φέρεται
ποσοτικώς µε τη βοήθεια χλωροφορµίου (3.2) ή µίγµατος
βενζολίου /ακετονιτριλίου (3.6) σε ένα σωλήνα των 10 ml
(4.10).Συµπυκνώνεται το διάλυµα σε ρεύµα αδρανούς αερίου
(3.11) και κατόπιν φέρεται ο όγκος στα 2 mlµε τη βοήθεια
χλωροφορµίου (3.2) ή µίγµατος βενζολίου /ακετονιτριλίου
(3.6).
5.4. Χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδος
Εναποτίθενται ακριβώς σε µια πλάκα χρωµατογραφίας λεπτής
στοιβάδος (4.8), σε απόσταση 2 cmαπό το κάτω άκρο και σε
διαστήµατα 2 cmοι παρακάτω αναφερόµενοι όγκοι του
προτύπου διαλύµατος και του εκχυλίσµατος:
— 10, 15, 20, 30 και 40 µlπροτύπου διαλύµατος αφλατοξίνης
Β1(3.16)·
—1 0µ l εκ του εκχυλίσµατος που λαµβάνεται στο 5.3 και,
τοποθετούµενα επάνω στα προηγούµενα στο ίδιο σηµείο,
20µlπροτύπου διαλύµατος (3.16) ·
—1 0και 20 µlεκ του εκχυλίσµατος που λαµβάνεται στο 5.3.
Αναπτύσσεται το χρωµατογράφηµα µακριά από το φως µε τη
βοήθεια ενός διαλύτου αναπτύξεως (3.18). Η επιλογή του
διαλύτου πρέπει να γίνεται προηγουµένως µε την εναπόθεση
στην πλάκα 25 µlεκ του ποιοτικού προτύπου διαλύµατος
(3.17) και εξασφαλίζεται ότι κατά την ανάπτυξη οι αφλατο-
ξίνες Β1και Β2είναι εντελώς διαχωρισµένες.
Αφήνονται οι διαλύτες να εξατµισθούν µακριά από το φως και
ακτινοβολούνται κατόπιν µε υπεριώδες φως, αφού τοποθετ-
ηθεί η πλάκα σε απόσταση 10 cmαπό το λαµπτήρα (4.9). Οι
κηλίδες της αφλατοξίνης Β1δίνουν γαλάζιο φθορισµό.
5.5. Ποσοτικοί προσδιορισµοί
Οι ποσοτικοί προσδιορισµοί διενεργούνται είτε οπτικά είτε
µε φθοριοπυκνόµετρο όπως αναφέρεται παρακάτω.1976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 6
▼B
5.5.1. Οπτικές µετρήσεις
Προσδιορίζεται η ποσότητα της αφλατοξίνης B1του εκχυλί-
σµατος δια συγκρίσεως της εντάσεως του φθορισµού της
κηλίδος µε εκείνη των κηλίδων του προτύπου διαλύµατος.
Παρεµβάλλεται αν είναι αναγκαίο. Ο φθορισµός που δηµιουρ-
γείται µε την εναπόθεση του εκχυλίσµατος επάνω στο
πρότυπο διάλυµα πρέπει να είναι περισσότερο ισχυρός από
εκείνον των 10 µlεκχυλίσµατος και δεν πρέπει να γίνεται
αισθητή παρά µόνο µια κηλίδα. Αν η ένταση του φθορισµού
που δηµιουργείται από τα 10 µlεκχυλίσµατος είναι ισχυρό-
τερη από εκείνη των 40 µlτου προτύπου διαλύµατος, το
εκχύλισµα διαλύεται 10 ή 100 φορές µε χλωροφόρµιο (3.2) ή
µε µίγµα βενζολίου /ακετονιτριλίου (3.6) πριν υποβληθεί σε
νέα χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδος.
5.5.2. Μετρήσεις µε φθοριοπυκνόµετρο
Μετράται η ένταση του φθορισµού των κηλίδων της αφλατο-
ξίνης B1στο φθοριοπυκνόµετρο (4.12) χρησιµοποιουµένου
ενός µήκους κύµατος διεγέρσεως της τάξεως των 365 nmκαι
ενός µήκους κύµατος εκποµπής της τάξεως των 443 nm.
Προσδιορίζονται οι ποσότητες της αφλατοξίνης Β1των
αποθεµάτων του εκχυλίσµατος δια συγκρίσεως των εντάσεων
του φθορισµού των κηλίδων του εκχυλίσµατος και του
προτύπου διαλύµατος.
5.6. Επιβεβαίωση της ταυτότητος της αφλατοξίνης B1
Επιβεβαιούται η ταυτότητα της αφλατοξίνης B1του εκχυλί-
σµατος µε τις παρακάτω µεθόδους.
5.6.1. Επεξεργασία µε θειικό οξύ
Ψεκάζεται θειικό οξύ (3.13) στο χρωµατογράφηµα που έχει
ληφθεί στο 5.4. Ο φθορισµός των κηλίδων της αφλατοξίνης
B1πρέπει να µεταβάλλει χρώµα από το γαλάζιο µέχρι το
κίτρινο µε υπεριώδη ακτινοβολία.
5.6.2. Χρωµατογραφία δύο διαστάσεων περιλαµβάνουσα το
σχηµατισµό αφλατοξίνης Β1-ηµιακετάλης ( hemia-
cetal) (αφλατοξίνη Β2α)
ΝΒ:Οι εργασίες οι οποίες περιγράφονται παρακάτω πρέπει
να πραγµατοποιούνται σύµφωνα µε το σχήµα που παρου-
σιάζεται στην εικόνα 3.
5.6.2.1. Εναπόθεση των διαλυµάτων
Χαράσσονται σε µια πλάκα (4.8) δύο ευθείες παράλληλοι σε
δύο γειτονικές πλευρές (σε απόσταση 6 cmαπό τις πλευρές
αυτές) οι οποίες προορίζονται να οριοθετήσουν τη µετατό-
πιση των µετώπων των διαλυτών. Εναποτίθενται σε µια
πλάκα µε τη βοήθεια τριχοειδών σιφωνίων ή µικροσυρίγγων
τα διαλύµατα που αναφέρονται παρακάτω:
—στο σηµείο Α: όγκος καθαρισµένου εκχυλίσµατος του
δείγµατος του παραχθέντος στο 5.3, που περιέχει περίπου
2,5 νανογραµµάρια αφλατοξίνης Β1·
—στα σηµεία Β και Γ: 25 µlτου προτύπου διαλύµατος (3.16).
5.6.2.2. Ανάπτυξη
Αναπτύσσεται το χρωµατογράφηµα προς την κατεύθυνση Ι µε
τη βοήθεια του διαλύτου αναπτύξεως (3.18.1) (στοιβάδα 1 cm
µέσα σε δοχείο µε µη κεκορεσµένη ατµόσφαιρα) µακριά απότο φως µέχρις ότου το µέτωπο του διαλύτου έλθει σε επαφή
µε τη γραµµή οριοθετήσεως.
Αποσύρεται η πλάκα από το δοχείο και αφήνεται να ξηρανθεί
επί πέντε λεπτά µακριά από το φως και στη θερµοκρασία του
περιβάλλοντος. Ψεκάζεται στη συνέχεια µε υδροχλωρικό οξύ
(3.12) σε µια λωρίδα ύψους 2,5 cmη οποία καλύπτει τα
σηµεία Α και Β (παρουσιάζεται µε τις γραµµωτές σκιές στην
εικόνα 3) µέχρις ότου το χρώµα γίνει σκοτεινό, προστατευο-
µένου του υπολοίπου της πλακός µε ένα φύλλο από γυαλί.
Αφήνεται να αντιδράσει για δέκα λεπτά στο σκοτάδι και
ξηραίνεται σε ρεύµα αέρος στη θερµοκρασία του περιβάλ-
λοντος.
Αναπτύσσεται στη συνέχεια το χρωµατογράφηµα προς την
κατεύθυνση IIµε τη βοήθεια του διαλύτου αναπτύξεως
(3.18.1) (στοιβάδα 1 cmµέσα σε δοχείο µε µη κεκορεσµένη1976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 7
▼B
ατµόσφαιρα) µακριά από το φως, µέχρις ότου το µέτωπο του
διαλύτου προσεγγίσει τη γραµµή οριοθετήσεως. Αφαιρείται
η πλάκα από το δοχείο και αφήνεται να ξηρανθεί στη θερµο-
κρασία του περιβάλλοντος.
5.6.2.3. Ερµηνεία του χρωµατογραφήµατος
Εξετάζεται το χρωµατογράφηµα σε υπεριώδες φως (4.9) και
εξακριβώνονται οι παρατηρήσεις που αναφέρονται παρακάτω:
α) Εµφάνιση µιας φθοριζούσης γαλάζιας κηλίδος αφλατο-
ξίνης Β1προερχοµένης από το πρότυπο διάλυµα που έχει
εναποτεθεί στο Γ (µετατόπιση προς την κατεύθυνση Ι).
β) Εµφάνιση µιας φθοριζούσης γαλάζιας κηλίδος αφλατο-
ξίνης Β1(η οποία δεν αντέδρασε µε το υδροχλωρικό οξύ)
και µιας εντονοτέρας φθοριζούσης γαλάζιας κηλίδος αφλα-τοξίνης Β
1-ηµιακετάλης ( hemiacetal), προερχοµένης από το
πρότυπο διάλυµα που έχει εναποτεθεί στο Β (µετατόπιση
προς την κατεύθυνση II).
γ) Εµφάνιση κηλίδων παροµοίων προς εκείνες που αναφέ-
ρονται στην περίπτωση β) οι οποίες προέρχονται από το
εκχύλισµα του δείγµατος που έχει εναποτεθεί στο Α. Η
θέση των κηλίδων αυτών ορίζεται από την απόσταση µετα-
τοπίσεως της αφλατοξίνης Β1από το σηµείο Α προς την
κατεύθυνση Ι (η ίδια απόσταση µε εκείνη που έχει
διανυθεί από το πρότυπο που έχει εναποτεθεί στο Γ)
ακολουθουµένη από τις αποστάσεις µετατοπίσεως που
έχουν διανυθεί στην κατεύθυνση IIαπό τη αφλατοξίνη B1(η οποία δεν αντέδρασε µε το υδροχλωρικό οξύ) και από
την αφλατοξίνη Β1-ηµιακετάλη ( hemiacetal) ( οι αυτές
αποστάσεις µ 'εκείνες που έχουν διανυθεί από το πρότυπο
που έχει εναποτεθεί στο Β). Οι εντάσεις φθορισµού των
κηλίδων της ηµιακετάλης που προέρχονται από το εκχύ-
λισµα και το πρότυπο διάλυµα που έχει εναποτεθεί στο Β
πρέπει να ανταποκρίνονται µεταξύ τους.
6. Υπολογισµός των αποτελεσµάτων
6.1. Από τις οπτικές µετρήσεις
Η περιεκτικότητα σε µικρογραµµάρια της αφλατοξίνης Β1ανά χιλιόγραµµο δείγµατος( ppb)δίδεται από τον τύπο:
S/C1Y/C1V
W/C1X
στον οποίο:
YκαιXείναι αντιστοίχως οι όγκοι σε µικρολίτρα του
προτύπου διαλύµατος αφλατοξίνης Β1(3.16)και του εκχυλί-
σµατος το οποίο έχει µια παροµοία ένταση φθορισµού ·
S=συγκέντρωση σε µικρογραµµάρια αφλατοξίνης Β1ανά
χιλιοστόλιτρο του προτύπου διαλύµατος (3.16) ·
V=τελικός όγκος του εκχυλίσµατος σε µικρολίτρα,
υπολογιζοµένων των ενδεχοµένων διαλύσεων ·
W=βάρος σε γραµµάρια του ληφθέντος δείγµατος που
αντιστοιχεί στον όγκο του εκχυλίσµατος ο οποίος
υποβλήθηκε σε καθαρισµό σε στήλη.
6.2. Από τις µετρήσεις µε φθοριοπυκνόµετρο
Η περιεκτικότητα σε µικρογραµµάρια αφλατοξίνης Β1ανά
χιλιόγραµµο δείγµατος ( ppb)δίδεται από τον τύπο:
S/C1V
W/C1Υ
στον οποίο:
Υ=όγκος σε µικρολίτρα του εκχυλίσµατος που έχει
εναποτεθεί στην πλάκα (10 ή 20 µl)·1976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 8
▼B
S=ποσότητα σε νανογραµµάρια αφλατοξίνης Β1του
αποθέµατος του εκχυλίσµατος (υπολογιζοµένου του
όγκου Υ), υπολογιζοµένη από τους προσδιορισµούς ·
V=τελικός όγκος του εκχυλίσµατος σε µικρολίτρα,
λαµβανοµένων υπόψη των ενδεχοµένων διαλύσεων ·
W=βάρος σε γραµµάρια του ληφθέντος δείγµατος που
αντιστοιχεί στον όγκο του εκχυλίσµατος ο οποίος
υποβλήθηκε σε καθαρισµό σε στήλη.
7. Προετοιµασία και έλεγχος του διαλύµατος (3.16)
7.1. Προσδιορισµός της συγκεντρώσεως της αφλατοξίνης Β1
Παρασκευάζεται ένα πρότυπο διάλυµα αφλατοξίνης Β1σε
χλωροφόρµιο (3.2) ή σε µίγµα βενζολίου /ακετονιτριλίου
(3.6), του οποίου η συγκέντρωση είναι από 8 µέχρι 10 µικρο-
γραµµάρια ανά χιλιοστόλιτρο. Ρυθµίζεται το φάσµα
απορροφήσεως µεταξύ 330 και 370 nmµε τη βοήθεια του
φασµατοφωτοµέτρου (4.11).
Αυξάνεται η οπτική πυκνότητα (Α) σε 363 nmστην
περίπτωση του διαλύµατος του χλωροφορµίου ·σε 348 nm
στην περίπτωση του διαλύµατος σε µίγµα βενζολίου /ακετονι-
τριλίου.
Υπολογίζεται η συγκέντρωση σε µικρογραµµάρια αφλατο-
ξίνης Β1ανά χιλιοστόλιτρο διαλύµατος από τους παρακάτω
τύπους:
312/C1A/C11000
20600για το διάλυµα χλωροφορµίου ·
312/C1A/C11000
19800για το διάλυµα σε µίγµα βενζολίου /ακετονιτρι-
λίου.
∆ιενεργούνται µακράν του φωτός οι απαραίτητες διαλύσεις
για να ληφθεί το πρότυπο διάλυµα εργασίας, του οποίου η
συγκέντρωση σε αφλατοξίνη Β1είναι περίπου 0,1 µικρο-
γραµµάρια ανά χιλιοστόλιτρο. ∆ιατηρούµενο το διάλυµα
αυτό σε θερµοκρασία 4 ºCπαραµένει σταθερό για δύο
εβδοµάδες.
7.2. Έλεγχος χρωµατογραφικής καθαρότητος
Εναποτίθενται σε µια πλάκα (4.8) 5 µlπροτύπου διαλύµατος 8 -
10 µg αφλατοξίνης Β1ανά χιλιοστόλιτρο (βλέπε 7.1).
Αναπτύσσεται το χρωµατογράφηµα όπως αναφέρεται στο 5.4.
Σε υπεριώδες φως ο φθορισµός δεν πρέπει να επιτρέπει να
γίνεται αισθητή παρά µόνο µια κηλίδα και κανένας φθορι-
σµός δεν πρέπει να γίνεται αισθητός στη ζώνη του αρχικού
αποθέµατος.
8. Επαναληπτικότητα
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων των δύο παραλλήλων
προσδιορισµών που πραγµατοποιούνται στο ίδιο δείγµα από
τον ίδιο εργαστηριακό υπάλληλο (υπεύθυνο για την ανάλυση)
δεν πρέπει να υπερβαίνει:
—το 25%εκ του πλέον υψηλού αποτελέσµατος για τις περιε-
κτικότητες σε αφλατοξίνη Β1από 10 µέχρι 20 µg/kg·
—5µ g σε απόλυτη τιµή, για περιεκτικότητες από 20 έως
50µg/kg·
— 10% εκ του πλέον υψηλού αποτελέσµατος για τις περιε-
κτικότητες που είναι ανώτερες των 50 µg/kg.
9. Αναπαραγωγικότητα
Βλέπε «Παρατηρήσεις »,τµήµα Γ, σηµείο 2.1976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 9
▼M2
Β. ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΦΛΑΤΟΞΙΝΗΣ Β1.ΜΕΘΟ∆ΟΣ ΥΓΡΗΣ
ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟ∆ΟΣΗΣ
1. Σκοπός και αντικείµενο
Η µέθοδος αυτή είναι για τον προσδιορισµό αφλατοξίνης Β1σε ζωοτροφές, συµπεριλαµβανοµένων αυτών που περιέχουν
στέµφυλα εσπεριδοειδών. Το κατώτερο όριο προσδιορισµού
είναι 0,001 mg/kg (1 ppb).
2. Αρχή
Το δείγµα εκχυλίζεται µε χλωροφόρµιο. Το εκχύλισµα
διηθείται και µία υποπολλαπλάσια δόση καθαρίζεται µέσα
στο φυσίγγιο Florisil,και ακολούθως µέσα από ένα φυσίγγιο
C18.Ο τελικός διαχωρισµός και προσδιορισµός επιτυγχάνεται
µε υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης ( HPLC)χρησιµο-
ποιώντας µία C18στήλη αντεστραµµένης φάσης,
ακολουθούµενος από δηµιουργία, µετά τη στήλη, παραγώγων
µε ιώδιο σε ύδωρ και ανίχνευση φθορισµού.
Σηµείωση: Οι µυκοτοξίνες είναι εξαιρετικά τοξικές ουσίες.
Οι χειρισµοί πρέπει να εκτελούνται σε ένα καθορισµένο
απαγωγό. Ειδικές προφυλάξεις πρέπει να λαµβάνονται όταν
οι τοξίνες ευρίσκονται σε ξηρή µορφή λόγω της ηλεκτροστα-
τικής τους φύσης και της τάσης τους να διασκορπίζονται
στους χώρους εργασίας.
3. Αντιδραστήρια
3.1. Χλωροφόρµιο, σταθεροποιηµένο µε 0,5 έως 1,0 %κατά µάζα
αιθανόλης. Βλέπε παρατήρηση 10.2.
3.2. Μεθανόλη, βαθµού HPLC,για την παρασκευή του 3.6.
3.3. Ακετόνη.
3.4. Ακετονιτρίλιο, βαθµοί HPLC.
3.5. ∆ιαλύτες έκλουσης: παρασκευάζονται µία ηµέρα πριν τη
χρήση ή αποµακρύνεται ο αέρας από τους διαλύτες µε υπερή-
χους.
3.5.1. Μείγµα ακετόνης (3.3) και ύδατος, 98 + 2 (v + v).
3.5.2. Μείγµα ύδατος και µεθανόλης (3.2), 80 + 20 (v + v).
3.5.3. Μείγµα ύδατος και ακετόνης (3.3), 85 + 15 (v + v).
3.6. Κινητή φάση για HPLC.
Μείγµα ύδατος µεθανόλης (3.2) και ακετονιτριλίου (3.4),
130+ 70 + 40 (v + v + v).
Σηµείωση: Η σύνθεση των διαλυτών της κινητής φάσης ίσως
χρειασθεί ρύθµιση εξαρτώµενη από τα χαρακτηριστικά της
χρησιµοποιούµενης στήλης HPLC.
3.7. Κορεσµένο διάλυµα ιωδίου: Προστίθενται 2 gιωδίου σε
400mlύδατος. Αναµειγνύονται επί τουλάχιστον 90 λεπτά και
διηθούνται µέσα από ηθµό µεµβράνης (4.15). Το κορεσµένο
διάλυµα προφυλάσσεται από το φως για να αποφευχθεί
φωτοαποσύνθεση.
3.8. Celite 545 εκπλυθέν µε οξύ, ή ισοδύναµο.
3.9. Φυσίγγιο Florisil (Waters SEP-PAK), ή ισοδύναµο.
3.10. Φυσίγγιο C18(WatersSEP-PAK), ή ένα ισοδύναµο.
3.11. Αδρανές αέριο παραδείγµατος χάρη άζωτο.
3.12. Πρότυπο διάλυµα αφλατοξίνης B1σε χλωροφόρµιο,
συγκέντρωσης 10 µ g/ml.Η συγκέντρωση του διαλύµατος
ελέγχεται ως εξής: Προσδιορίζεται µε το φασµατοφωτόµετρο
(4.23) το φάσµα απορρόφησης του ανωτέρω διαλύµατος
µεταξύ 330 και 370 nm.Μετράται η απορρόφηση (Α) στο
µέγιστο πλησίον των 363 nm.Η συγκέντρωση αφλατοξίνης
B1σε µικρογραµµάρια ανά χιλιοστόλιτρο διαλύµατος υπολο-
γίζεται από τη σχέση:1976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 10
▼M2
X
υγκ´εντρωση µ g=mlðÞ ¼312/C2A/C21000
22300¼13;991/C2A
3.12.1. Μητρικό πρότυπο διάλυµα αφλατοξίνης B1σε χλωροφόρµιο.
2,5 mlτου προτύπου διαλύµατος αφλατοξίνης B1(3.12)µετα-
φέρονται ποσοτικά σε ογκοµετρική φιάλη των 50 mlκαι ο
όγκος συµπληρώνεται µέχρι τη χαραγή µε χλωροφόρµιο
(3.1). Το διάλυµα αυτό διατηρείται σε δροσερό µέρος (4 ºC)
στο σκοτάδι, καλά σφραγισµένο και τυλιγµένο σε αλουµινό-
χαρτο.
3.13. Βαθµονοµικά διαλύµατα αφλατοξίνης Β1γιαHPLC.
Σηµείωση: Προς παρασκευή αυτών των διαλυµάτων χρησιµο-
ποιούνται γυάλινα σκεύη εκπλυθέντα µε οξύ (βλέπε 4,
όργανα).
3.13.1. ∆ιάλυµα βαθµονόµησης 4 ng/ml.
Η ογκοµετρική φιάλη µε µητρικό διάλυµα (3.12.1), αφήνεται
να ζεσταθεί σε θερµοκρασία δωµατίου µέσα στο αλουµινό-
χαρτο (λίγες ώρες). Μεταφέρονται 400 µ lτου µητρικού
διαλύµατος (200 ngαφλατοξίνης Β1)µέσα σε ογκοµετρική
φιάλη των 50 ml,και το διάλυµα εξατµίζεται µέχρι ξηρού σε
ρεύµα αδρανούς αερίου (3.11).
Το αποκτηθέν ίζηµα διαλύεται σε περίπου 20 mlνερού/
ακετόνης (3.5.3), ο όγκος συµπληρώνεται µέχρι τη χαραγή
µε νερό /ακετόνη (3.5.3) και αναµιγνύεται καλά.
3.13.2. ∆ιάλυµα βαθµονόµησης 3 ng/ml.
Αραιώνονται 7,5 mlτου διαλύµατος βαθµονόµησης των 4 ng/
ml (3.13.1) στα 10 mlµε µείγµα ύδατος ακετόνης (3.5.3), και
αναµιγνύονται καλά.
3.13.3. ∆ιάλυµα βαθµονόµησης 2 ng/ml.
Μεταφέρονται ποσοτικά 25 mlτου διαλύµατος βαθµονόµησης
(3.13.1) σε µια ογκοµετρική φιάλη των 50 ml,συµπληρώνεται
µέχρι τη χαραγή µε µείγµα ύδατος /ακετόνης (3.5.3) και
αναµειγνύονται καλά.
Το διάλυµα αυτό επίσης χρησιµοποιείται για επαναλαµβανό-
µενη έγχυση κατά τη διάρκεια της HPLC,και αναφέρεται
περαιτέρω ως το πρότυπο αναφοράς.
3.13.4. ∆ιάλυµα βαθµονόµησης 1 ng/ml.
Μεταφέρονται ποσοτικά 2,5 mlτου διαλύµατος βαθµο-
νόµησης των 4 ng/ml (3.13.1) σε µια ογκοµετρική φιάλη των
10ml,συµπληρώνεται µέχρι τη χαραγή µε µείγµα ύδατος /
ακετόνης (3.5.3), και αναµειγνύονται καλά.
3.14. Φιαλίδιο περιέχον µείγµα αλφατοξινών Β1,Β2,G1καιG2,
συγκεντρώσεων, κατά προσέγγιση, 1, 0,5, 1 και 0,5 µ g/ml,
αντίστοιχα, σε 1 mlχλωροφόρµιου.
3.14.1. ∆οκιµαστικό διάλυµα χρωµατογραφίας.
Το περιεχόµενο του φιαλιδίου (3.14) µεταφέρονται µέσα σε
δοκιµαστικό σωλήνα µε γυάλινο πώµα ή φιαλίδιο µε βιδωτό
πώµα. Μεταφέρονται 40 µ lτου διαλύµατος αυτού µέσα ή σε
δοκιµαστικό σωλήνα µε γυάλινο πώµα (4.22) (εκπλυθέντα µε
οξύ). Το χλωροφόρµιο εξατµίζεται σε ρεύµα αδρανούς αερίου
(3.11) και ακολουθεί επαναδιάλυση σε 10 mlµείγµατος
ύδατος /ακετόνης (3.5.3).
3.15. Αντιδραστήρια για δοκιµή επιβεβαίωσης (6).
3.15.1. Κορεσµένο διάλυµα NaCl.
3.15.2. Θειικό νάτριο, άνυδρο, κοκκώδες.
4. Όργανα
Προσοχή: Η χρήση γυάλινων σκευών, µη εκπλυθέντων µε
οξύ, για υδατικά διαλύµατα αφλατοξίνης, µπορεί να προκα-
λέσει απώλεια αλφατοξινών. Πρέπει να λαµβάνεται
ιδιαίτερη µέριµνα µε τα καινούργια γυάλινα σκεύη και1976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 11
▼M2
γυάλινα σκεύη µιας χρήσεως, όπως αυτοδειγµατοληπτικά
φιαλίδια και σιφώνια Pasteur. Εποµένως, εργαστηριακός
εξοπλισµός ερχόµενος σε επαφή µε υδατικά διαλύµατα αφλα-
τοξινών πρέπει να βυθίζεται σε αραιό οξύ (π.χ. θειικό οξύ,
2mol/l)επί αρκετές ώρες, µετά να εκπλύεται καλά µε απεστα-
γµένο νερό για να αποµακρυνθούν όλα τα ίχνη οξέος (π.χ.
τρεις φορές, έλεγχος µε πεχαµετρικό χάρτη). Πρακτικά,
αυτή η µεταχείριση απαιτείται για τη φιάλη στρογγυλού
πυθµένα (4.4), τις ογκοµετρικές φιάλες, ογκοµετρικούς κυλίν-
δρους, φιαλίδια ή σωλήνες που χρησιµοποιούνται για
διαλύµατα βαθµονόµησης και τελικά εκχυλίσµατα (κυρίως
φιαλίδια αυτόµατου δειγµατολίπτη) και σιφώνια Pasteurεάν
αυτά χρησιµοποιούνται για µεταφορά διαλυµάτων βαθµο-
νόµησης ή εκχυλισµάτων.
4.1. Μύλος άλεσης —αναµείκτης.
4.2. Κόσκινο µεγέθους ανοίγµατος 1,0 mm (ISO R 565).
4.3. Μηχανικός αναδευτήρας.
4.4. Περιστροφικός εξατµιστής κενού, εξοπλισµένος µε φιάλη
στρογγυλού πυθµένα των 150 έως 250 ml.
4.5. Υγρός χρωµατογράφος υψηλής απόδοσης, εγχυτής µε βρόγχο
κατάλληλο για την έγχυση 250 µ l.Βλέπε οδηγίες κατασκευα-
στού για µερική ή ολική πλήρωση βρόγχου.
4.6. Αναλυτική στήλη HPLC,γέµιση C18των 3 µ mή5µm.
4.7. Αντλία απηλλαγµένη παλµών για τροφοδοσία του αντιδρα-
στήριου ιωδίου µετά τη στήλη.
4.8. Valco µηδενικού όγκου Τ, ανοξείδωτου χάλυβα (1 /16″
×0,75 mm).
4.9. Σπείραµα αντίδρασης τεφλόν ή ανοξείδωτος χάλυβας. Οι
διαστάσεις 3 000 × 0,5 mm έως5 000 × 0,5 mm έχουν βρεθεί
να είναι κατάληλες σε συνδυασµό µε στήλες HPLCτων 5 µ m
ή3µm.
4.10. Θερµοστατικά ελεγχόµενο υδρόλουτρο, ρυθµισµένο στους 60 º
C,ικανό για ρύθµιση της θερµοκρασίας µε ακρίβεια καλύ-
τερη του 0,1 ºC .
4.11. Ανιχνευτής φθορισµού, ικανός να δίνει µήκη κύµατος
διέγερσης στα 365 nmπερίπου και εκποµπής στα 435 nm
(Για όργανο διήθησης: µήκος κύµατος εκποµής > 400 nm).
Πρέπει να είναι δυνατή ανίχνευση τουλάχιστον 0,05 ngαλφα-
τοξίνης Β1.Μπορεί να συσταθεί κάποια οπίσθια πίεση
(παραδείγµατος χάρη περιοριστής ή σπείραµα από τεφλόν ή
ανοξείδωτου χάλυβα, συνδεδεµένο µε την εξαγωγή του ανιχ-
νευτή), προς καταστολή φυσαλίδων αέρα στην κυψελίδα
ροής.
4.12. Καταγραφέας ταινίας χάρτου.
4.13. Ηλεκτρονικός ολοκληρωτής (προαιρετικός).
4.14. Πτυχωτός διηθητικός χάρτης 24 cm, Macherey-Nagel 617 1/4 ή
ισοδύναµος.
4.15. Ηθµός µεµβράνης Millipore µε µέγεθος πόρων 0,45 µ m, Milli-
pore HAWP. 04700 ή ισοδύναµος.
4.16. Κωνική φιάλη των 500 ml,µε γυάλινο πώµα.
4.17. Γυάλινη στήλη (εσωτερική διάµετρος περίπου 1 cm,µήκους
περίπου 30 cm)εξοπλισµένη µε άκρη Luer.
4.18. Στρόφιγγα Luerανθεκτική στο χλωροφόρµιο (παραδείγµατος
χάρηBio-rad 7328017, Analytichem Al 6078, J.T. Baker 4514 ή
ισοδύναµη).
4.19. Χηµικοανθεκτική σύριγγα, Luer 10 ml σύνδεσµος.
4.20. Σύριγγα κατάλληλη για HPLCένεση 250 µ l(βλέπε 4.5).
4.21. Μικροσύριγγα των 100 µ lγια παρασκευή των διαλυµάτων
βαθµονόµησης (ελέγχεται ώστε η ακρίβεια να είναι εντός
του 2%,κατά τη ζύγιση).
4.22. Βαθµονοµηµένοι υάλινοι σωλήνες των 10 ml,µε γυάλινο
πώµα.1976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 12
▼M2
4.23. Φασµατοφωτόµετρο, κατάλληλο για µετρήσεις στην
υπεριώδη περιοχή του φάσµατος.
4.24. Εξοπλισµός για δοκιµή επιβεβαίωσης (6).
4.24.1. Χοάνη διαχωρισµού των 100 ml,εκπλυθείσα µε οξύ, στρό-
φιγγα από τεφλόν.
4.24.2. Συγκρότηµα θέρµανσης στους 40 -50º C.
5. Εκτέλεση
5.1. Προετοιµασία του δείγµατος
Το δείγµα αλέθεται έτσι ώστε να περνά µέσα από το κόσκινο
(4.2).
5.2. Αναλυτική δόση
Ζυγίζονται 50,0 gτου προετοιµασµένου δείγµατος προς
ανάλυση µέσα στην κωνική φιάλη (4.16).
5.3. Εκχύλιση
Προστίθενται 25 g Celite (3.8), 250 ml χλωροφόρµιου (3.1) και
25mlνερού. Η φιάλη πωµατίζεται και ανακινείται επί 30
λεπτά σε µηχανικό αναδευτήρα (4.3). Γίνεται διήθηση µέσα
από πτυχωτό διηθητικό χάρτη (4.14). Συλλέγονται 50 mlτου
διηθήµατος. Εάν είναι απαραίτητο, λαµβάνεται ένα ορισµένο
µέρος του διηθήµατος και αραιώνεται στα 50 mlµε χλωρο-
φόρµιο, ώστε η συγκέντρωση της αφλατοξίνης Β1να µη
είναι µεγαλύτερη από 4 ng/ml.
5.4. Καθαρισµός (η διαδικασία πρέπει να εκτελείται χωρίς σηµαντικές
διακοπές).
Προσοχή:
—Το εργαστήριο, στο οποίο γίνονται οι αναλύσεις, να
προστατεύεται επαρκώς από το φυσικό φως. Αυτό µπορεί
να επιτευχθεί αποτελεσµατικά χρησιµοποιώντας:
1)απορροφητικό φύλλο για το υπεριώδες πάνω στα
παράθυρα σε συνδυασµό µε χαµηλό φωτισµό (όχι
άµεσο ηλιακό φως),
2)κουρτίνες ή στορ σε συνδυασµό µε τεχνητό φως (είναι
αποδεκτοί σωλήνες φθορισµού) ·
—πρέπει να προστατεύονται όσο το δυνατόν περισσότερο
από το φως διαλύµατα περιέχοντα αφλατοξίνη (φύλαξη
στο σκοτάδι, χρήση αλουµινόχαρτου).
5.4.1. Καθαρισµός µέσα από Florisil SEP-PAK
5.4.1.1. Προετοιµασία της διάταξης στήλης -φυσίγγιου
Προσαρµόζεται στρόφιγγα (4.18) στο βραχύτερο στέλεχος
φυσίγγιου Florisil (3.9) ( βλέπε σχήµα 1). Το φυσίγγιο
εκπλύεται και αποµακρύνεται ο αέρας λαµβάνοντας 10 ml
χλωροφόρµιου (3.1) και διοχετεύοντας ταχέως 8 mlχλωρο-
φόρµιου από τη στρόφιγγα µέσα από το φυσίγγιο µε µία
σύριγγα (4.19). Προσαρµόζεται το µακρύτερο στέλεχος του
φυσίγγιου σε γυάλινη στήλη (4.17) και διοχετεύονται τα
εναποµένοντα 2 mlχλωροφόρµιου µέσα από το φυσίγγιο στη
στήλη. Κλείνεται η στρόφιγγα. Αποµακρύνεται η σύριγγα.
5.4.1.2. Καθαρισµός
Το συλλεχθέν στην 5.3 διήθηµα προστίθεται στη διάταξη
στήλης -φυσίγγιου και αποστραγγίζεται µε την επίδραση της
βαρύτητας. Εκπλύεται µε 5 mlχλωροφόρµιου (3.1),
ακολουθούµενα από 20 mlµεθανόλης (3.2). Τα εκπλύµατα
απορρίπτονται. Κατά τη διάρκεια αυτών των ενεργειών, εξασ-
φαλίζεται ότι δεν θα στεγνώσει η διάταξη στήλης -φυσίγγιου.
Η αφλατοξίνη Β1εκλούεται µε 40 mlτου µείγµατος ακετόνης /
ύδατος (3.5.1), και το σύνολο του εκλούσµατος συλλέγεται
στη φιάλη στρογγυλού πυθµένα των 150 mlτου περιστρεφό-
µενου εξατµιστή (4.4). Το έκλουσµα συµπυκνώνεται επί του
περιστρεφόµενου εξατµιστή στους 40 -50 ºC,έως ότου σταµα-
τήσει να αποστάζεται η ακετόνη ( προσοχή: περίπου 0,5 ml
υγρού παραµένουν στη φιάλη στο σηµείο αυτό. Πειράµατα
έχουν δείξει ότι περαιτέρω εξάτµιση δεν βλάπτει και ότι
όταν αποµένουν 0,5 mlυγρού, δεν υπάρχει σηµαντική1976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 13
▼M2
ποσότητα ακετόνης. Υπολείµµατα ακετόνης µπορεί να οδηγή-
σουν σε απώλειες Β1στο φυσίγγιο C18).Προστίθεται 1 ml
µεθανόλης (3.2), η φιάλη στροβιλίζεται για να διαλυθεί η
αφλατοξίνη Β1στα τοιχώµατα της φιάλης, προστίθενται 4 ml
ύδατος και αναµειγνύονται. Αποσυνδέεται και απορρίπτεται η
φύσιγγα. Η γυάλινη στήλη εκπλύεται µε νερό και διατηρείται
για το βήµα καθαρισµού µέσα από C18.
5.4.2. Καθορισµός µέσα από C18SEP-PAK
5.4.2.1. Προετοιµασία της διάταξης στήλης -φυσίγγιου
Προσαρµόζεται στρόφιγγα (4.18) στο βραχύτερο άκρο του
φυσίγγιου C18(3.10) (βλέπε σχήµα 1). Το φυσίγγιο γεµίζεται
και τυχόν αέρας αποµακρύνεται µε ταχεία διοχέτευση 10 ml
µεθανόλης (3.2) από τη στρόφιγγα µέσα από το φυσίγγιο µε
µία σύριγγα (4.19) (φυσαλίδες αέρα µέσα από το φυσίγγιο
φαίνονται σαν ανοικτόχρωµα σηµάδια στο διαφορετικά
φαιόχρωµο υπόβαθρο). Λαµβάνονται 10 mlύδατος, και διοχε-
τεύονται 8 mlµέσα από το φυσίγγιο. (Αποφεύγεται η
εισαγωγή αέρα στο φυσίγγιο κατά την αλλαγή από µεθανόλη
σε νερό). Το µακρύτερο στέλεχος του φυσίγγιου προσαρµό-
ζεται σε γυάλινη στήλη (4.17) και διοχετεύονται τα
εναποµείναντα 2 mlύδατος µέσα από το φυσίγγιο στη στήλη.
Κλείνεται η στρόφιγγα. Αποµακρύνεται η σύριγγα.
5.4.2.2. Καθαρισµός
Το συλλεχθέν στην 5.4.1.2 εκχύλισµα µεταφέρεται ποσοτικά
στη γυάλινη στήλη (4.17), εκπλύοντας τη φιάλη δύο φορές
µε 5mlµείγµατος νερού /µεθανόλης (3.5.2) και αποστραγγί-
ζοντας µε την επίδραση της βαρύτητας. Κατά τη διάρκεια
αυτών των ενεργειών, εξασφαλίζεται ότι δεν θα στεγνώσει η
διάταξη στήλης -φυσίγγιου. (Όταν αναπτύσσονται φυσαλίδες
αέρα στη σύσφιξη κοντά στο φυσίγγιο, διακόπτεται η ροή
και πωµατίζεται η κορυφή της γυάλινης στήλης, για να
αποµακρυνθούν οι φυσαλίδες αέρα. Μετά συνεχίζουµε).
Γίνεται έκλουση µε 25 mlµείγµατος ύδατος /µεθανόλης. Τα
εκλούσµατα απορρίπτονται. Η αφλατοξίνη Β1εκλούεται µε
50mlύδατος /ακετόνης (3.5.3) και το σύνολο του εκλούσµατος
συλλέγεται σε µία ογκοµετρική φιάλη 50 ml.Ο όγκος
συµπληρώνεται στα 50 mlύδατος και αναµειγνύεται: το
προκύπτον αναλυτικό διάλυµα χρησιµοποιείται για χρωµατο-
γραφία (5.5).
Προσοχή: Κανονικά δεν χρειάζεται διήθηση του τελικού
εκχυλίσµατος πριν από HPLC. Εάν κριθεί
απαραίτητο, δεν πρέπει να χρησιµοποιηθούν ηθµοί
από κυτταρίνη, επειδή µπορεί να οδηγήσουν σε
απώλειες αφλατοξίνης Β1.Ηθµοί από téflonείναι
αποδεκτοί.
5.5. Υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης
(Βλέπε σχήµα 2 συναρµολόγηση του οργάνου). Αφήνεται
επαρκής χρόνος για προθέρµανση και σταθεροποίηση των
οργάνων πριν από τη χρήση.
Σηµείωση 1:
Οι ταχύτητες ροής που δίνονται για την κινητή φάση και το
αντιδραστήριο µετά τη στήλη είναι µόνο ενδεικτικές.
Μπορεί να χρειαστεί να προσαρµοστούν ανάλογα µε τα
χαρακτηριστικά της στήλης HPLC.
Σηµείωση 2:
Η απόκριση του ανιχνευτή στην αφλατοξίνη εξαρτάται από
τη θερµοκρασία, εποµένως πρέπει να γίνεται διόρθωση για
µετατόπιση (βλέπε σχήµα 3). Εγχέοντας µία προκαθορισµένη
ποσότητα πρότυπου αναφοράς αφλατοξίνης Β1(3.13.3), σε
τακτικά διαστήµατα (παραδείγµατος χάρη κάθε τρίτη
έγχυση), οι τιµές κορυφής της αφλατοξίνης Β1µεταξύ αυτών
των πρότυπων αναφοράς µπορούν να διορθωθούν χρησιµο-
ποιώντας τη µέση απόκριση, εφόσον η διαφορά µεταξύ τωναποκρίσεων διαδοχικών πρότυπων αναφοράς είναι πολύ
µικρή ( < 10 %). Εποµένως οι εγχύσεις πρέπει να γίνονται
χωρίς διακοπές. Εάν χρειάζεται διακοπή, η τελευταία έγχυση
πριν από τη διακοπή και η πρώτη µετά τη διακοπή πρέπει να
είναι το πρότυπο αναφοράς (3.13.3). Επειδή η καµπύλη βαθµο-
νόµησης είναι γραµµική και διέρχεται µέσα από την αρχή, οι
ποσότητες αφλατοξίνης Β
1στα εκχυλίσµατα του δείγµατος1976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 14
▼M2
προσδιορίζονται άµεσα µε αναφορά στα παρακείµενα
πρότυπα.
5.5.1. Ρυθµίσεις αντλίας HPLC
Η αντλία HPLC (4.5) ρυθµίζεται να δίνει ροή 0,5 ή 0,3 ml/
λεπτό για στήλη HPLCτων 5µ mή των 3 µ m (4.6)αντίστοιχα
χρησιµοποιώντας κινητή φάση (3.6).
5.5.2. Ρυθµίσεις αντλίας µετά τη στήλη
Η αντλία (4.7) ρυθµίζεται να δίνει ροή 0,2 -0,4 ml/λεπτό του
κορεσµένου υδατικού διαλύµατος ιωδίου (3.7). Ως γενικός
κανόνας: ροές περίπου 0,4 ή 0,2 ml/λεπτό συνιστώνται σε
συνδυασµό µε ροές 0,5 και 0,3 ml/λεπτό αντίστοιχα της
κινητής φάσης (3.6).
5.5.3. Ανιχνευτής φθορισµού
Ο ανιχνευτής φθορισµού (4.11) ρυθµίζεται σε διέγερση
= 365 nm και εκποµπή = 435 nm ( όργανο διήθησης: > 400 nm).
Ο µειωτής του ανιχνευτή ρυθµίζεται ώστε να αποκτά περίπου
80%της πλήρους κλίµακας εκτροπής της γραφίδας του κατα-
γραφέα για 1 ngαφλατοξίνης Β1.
5.5.4. Εγχυτής
Για όλα τα διαλύµατα, εγχέονται ποσότητες των 250 µ l,
ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή του εγχυτήρα.
5.5.5. Έλεγχος χρωµατογραφικού διαχωρισµού
Εγχέεται το αρωµατικό δοκιµαστικό διάλυµα (3.14.1). Οι
κοιλότητες πρέπει να είναι λιγότερες από 5 %του συνόλου
των υψών κορυφών των παρακειµένων κορυφών.
5.5.6. Έλεγχος της σταθερότητας του συστήµατος
Πριν από κάθε σειρά αναλύσεων, εγχέεται επανειληµένα το
πρότυπο αναφοράς (3.14.3), έως ότου επιτευχθούν σταθερές
περιοχές κορυφών ( Σηµείωση: αποκρίσεις κορυφών για αφλα-
τοξίνη Β1µεταξύ διαδοχικών εγχύσεων πρέπει να διαφέρουν
λιγότερο από 6 %).Προχωρούµε χωρίς καθυστέρηση στον
έλεγχο της γραµµικότητας (5.5.7).
5.5.7. Έλεγχος γραµµικότητας
Τα διαλύµατα βαθµονόµησης αφλατοξίνης Β1(3.13.1έως
3.13.4) εγχέονται. Σε κάθε τρίτη έγχυση χρησιµοποιείται το
πρότυπο αναφοράς (3.13.3), για διόρθωση της µετατόπισης
της απόκρισης ( Σηµείωση: αποκρίσεις κορυφών για το
πρότυπο αναφοράς πρέπει να διαφέρουν λιγότερο από 10 %
µέσα σε 90 λεπτά ).Γίνεται διόρθωση για µετατόπιση
σύµφωνα µε τη σχέση στην 7. Το διάγραµµα βαθµονόµησης
πρέπει να είναι γραµµικό και να διέρχεται από την αρχή, µε
τυπικό σφάλµα 2Χ ως προς Υ. Οι ευρισκόµενες τιµές πρέπει
να διαφέρουν λιγότερο από 3 %από τις ονοµαστικές τιµές.
Εάν εκπληρώνονται οι προϋποθέσεις, συνεχίζουµε χωρίς
καθυστέρηση. Εάν όχι, πριν συνεχίσουµε αναγνωρίζονται
και διορθώνονται οι πηγές του προβλήµατος.
5.5.8. Έγχυση εκχυλισµάτων δείγµατος
Εγχύονται τα καθαρισµένα εκχυλίσµατα δείγµατος (5.4.2.2).
Μετά από κάθε δύο εκχυλίσµατα δείγµατος, επαναλαµβάνεται
η έγχυση του πρότυπου αναφοράς (3.13.3) σύµφωνα µε την
ακόλουθη σειρά: πρότυπο αναφοράς, εκχύλισµα, εκχύλισµα,
πρότυπο αναφοράς, εκχύλισµα, εκχύλισµα, πρότυπο αναφοράςκ.λπ.
6. ∆οκιµή επιβεβαίωσης
6.1. Περαιτέρω επεξεργασία του εκχυλίσµατος (5.4.2.2)
Προστίθενται 5 mlδιαλύµατος NaCl (3.15.1) στο τελικό εκχύ-
λισµα που αποκτήθηκε στην 5.4.2.2. Γίνεται εκχύλιση τρεις
φορές µε 2 mlχλωροφόρµιου (3.1) επί ένα λεπτό, χρησιµο-
ποιώντας τη χοάνη διαχωρισµού (4.24.1).
Το συλλεχθέν εκχύλισµα χλωροφόρµιου εκχύεται σε περίπου
1gθειικού νατρίου (3.15.2) µέσα σε δοκιµαστικό σωλήνα των
10ml.Μπορεί να χρησιµοποιηθεί µικρή χοάνη διαµέτρου1976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 15
▼M2
4cmµε κοµµάτι ακατέργαστου βάµβακα στη σύσφιξη, καλυµ-
µένο µε περίπου 1 gθειικού νατρίου.
Η στοιβάδα του θειικού νατρίου εκπλύεται µε λίγα mlχλωρο-
φόρµιου και συλλέγεται το έκπλυµα στον ίδιο δοκιµαστικό
σωλήνα. Το εκχύλισµα χλωροφόρµιου εξατµίζεται µέχρι
ξηρού στον ίδιο δοκιµαστικό σωλήνα χρησιµοποιώντας το
συγκρότηµα θέρµανσης (4.24.2) και επαναδιαλύουµε σε 1 ml
χλωροφόρµιου.
6.2. Παρασκευή παραγώγου και χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας
Βλέπε οδηγία 76 /372/ΕΟΚ του Συµβουλίου παράρτηµα,
µέθοδος Α, σηµείο 5.6.2.
7. Υπολογισµός αποτελεσµάτων
Η περιεκτικότητα σε αφλατοξίνη Β1(µg/kg)που υπάρχει στο
δείγµα υπολογίζεται χρησιµοποιώντας τη σχέση:
Περιεκτικ ´οτητα αφλατοξίνης B1σε µg=kg¼m/C2Vext
Vm/C2M/C2Vf
Vc
όπου:
m= ποσότητα αφλατοξίνης B1,σεng,αντιπροσω-
πευόµενη από την κορυφή B1του δείγµατος,
υπολογιζόµενη ως εξής:
m¼PδείγµαðÞ
Pst1ðÞ þ Pst2ðÞ/C22rstðÞ
P(δείγµα) =εµβαδόν κορυφής αφλατοξίνης B1του δείγµατος
P(st1)= εµβαδόν κορυφής αφλατοξίνης B1στο προηγού-
µενο πρότυπο αναφοράς (3.13.3)
P(st2)= εµβαδόν κορυφής αφλατοξίνης B1στο επόµενο
πρότυπο αναφοράς (3.13.3)
r(st) = εγχυθείσα ποσότητα προτύπου αναφοράς
(3.13.3) σε ng
Vm=όγκος του εγχυθέντος εκχυλίσµατος του
δείγµατος, σε ml
Vext=τελικός όγκος εκχυλίσµατος δείγµατος, ml,
λαµβάνοντας υπόψη κάθε αραίωση που έγινε
(5.3)
Μ =µάζα δείγµατος σε g
Vf=όγκος διηθήµατος µεταφερθέντος στο φυσίγγιο
Florisil (5.4.1.2) σεml
Vc=ποσότητα χλωροφόρµιου που χρησιµοποιήθηκε
για την εκχύλιση του δείγµατος, ml
Εάν η µέθοδος ακολουθήθηκε όπως σε αυτή την πρότυπη
περιγραφή, η σχέση µειώνεται στην:
Περιεκτικότητα σε αφλατοξίνη B1,σε µg/kg = 20 × m.
7.1. Οι υπολογισµοί των αποτελεσµάτων µπορεί να γίνουν επίσης
µε µέτρηση ύψους κορυφών.
8. Επαναληπτικότητα
Βλέπε το σηµείο 10.1.
9. Αναπαραγωγικότητα
Βλέπε το σηµείο 10.1.
10. Παρατηρήσεις
10.1. Ακρίβεια ( Précision)
Μία µελέτη συνεργασίας, εκτελεσθείσα σε παγκόσµιο
επίπεδο σε σύνθετες ζωοτροφές, έδωσε τα προαναφερόµενα1976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 16
▼M2
στον πίνακα 1 αποτελέσµατα (1)επαναληπτικότητας και
αναπαραγωγιµότητας. Ο όρος επαναληπτικότητα ( r)χρησιµο-
ποιούµενος εδώ ορίζεται ως ο υψηλότερος λόγος που δεν
είναι σηµαντικός σε επίπεδο πιθανότητας 95 %,για σύγκριση
δύο µετρήσεων στο ίδιο δείγµα στο ίδιο εργαστήριο κάτω
από τις ίδιες συνθήκες. Ο όρος αναπαραγωγιµότητα ( R)
ορίζεται όµοια για σύγκριση δύο διαφορετικών εργαστηρίων.
Σύµφωνα µε την ISO 3534-1977, 2.35(2)και την απόφαση 89 /
610/ΕΟΚ της Επιτροπής (3),οιrκαιRδίνονται επίσης στον
πίνακα 1 σε όρους συντελεστών διακύµανσης.
Πίνακας 1
Επαναληπτικότητα ( r)και αναπαραγωγιµότητα ( R)εκφρα-
σµένες ως λόγοι και αντίστοιχοι συντελεστές διακύµανσης
(15εργαστήρια)
Teneur r R CVr(*) CVR(*)
(µg/kg) (%) (%)
8 & 14 1,4 1,7 11 18
(*) CV = συντελεστής διακύµανσης
10.2. Σταθεροποίηση του χλωροφόρµιου (3.1)
Τα χαρακτηριστικά απορρόφησης του φυσιγγίου Florisil
µπορεί να αλλάζουν εάν χρησιµοποιούνται σταθεροποιητές
εκτός της ανθανόλης. Αυτό µπορεί να επαληθευτεί σύµφωνα
µε το σηµείο 10.3 όπου το περιγραφόµενο χλωροφόρµιο δεν
είναι διαθέσιµο.
10.3. Ακρίβεια ( Exactitude)
Η ορθή εφαρµογή της µεθόδου πρέπει να πιστοποιείται παίρ-
νοντας επαναλαµβανόµενες µετρήσεις σε πιστοποιηµένα
υλικά αναφοράς. Εάν αυτά δεν είναι διαθέσιµα, η απόδοση
της µεθόδου πρέπει να πιστοποιηθεί µε πειράµατα επανα-
πόκτησης σε λευκά δείγµατα ·η απόκλιση από το µέσο της
πραγµατικής τιµής, εκφρασµένη ως ποσοστό επί της πραγµα-τικής τιµής, δεν πρέπει να κείται εκτός των ορίων του −20 %
έως+10 %.1976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 17
(1) Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. and Paulsch, W.E. (1991). Food Additives and
Contaminants 8, 17-29.
(2) ISO 3534-1977.
(3)ΕΕ αριθ. L 351της 2. 12. 1989, σ. 39 .
▼M2
Σχήµα 1: ∆ιάταξη στήλης -φυσιγγίου
Σχήµα 2: ∆ιάγραµµα ροής του συστήµατος LCµε δηµιουργία
παραγώγου µε ιώδιο µετά τη στήλη1976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 18
▼M2
Σχήµα 3: ∆ιόρθωση για µετατόπιση απόκρισης αφλατοξίνης Β1µε
έγχυση πρότυπου αναφοράς (3.13.3) σε τακτικά διαστήµατα
Γ. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ ΠΟΥ ΑΦΟΡΟΥΝ ΤΙΣ ΜΕΘΟ∆ΟΥΣ Α ΚΑΙ Β
1.Αποµάκρυνση λιπών
Τα δείγµατα τα οποία περιέχουν περισσότερο από 5 τοις εκατό
λιπαρές ουσίες πρέπει να απολιπαίνονται µε πετρελαϊκό αιθέρα ( eb.
40-60ºΚελσίου) µετά την παρασκευή που εµφαίνεται στο 5.1.
Στις περιπτώσεις αυτές τα αποτελέσµατα της αναλύσεως πρέπει να
ανάγονται στο βάρος του µη απολιπανθέντος δείγµατος.
2.Αναπαραγωγικότητα των αποτελεσµάτων
Η αναπαραγωγικότητα των αποτελεσµάτων, δηλαδή η διαφορά µεταξύ
των αποτελεσµάτων που έχουν ληφθεί σε δύο ή περισσότερα εργα-
στήρια για το ίδιο δείγµα έχει εκτιµηθεί σε:
±5 0τοις εκατό της µέσης τιµής των αποτελεσµάτων για µέσες τιµές
σε αφλατοξίνη Β1από 10 µέχρι 20 µg/kg·
± 10 µg/kg από τη µέση τιµή για µέσες τιµές από 20 µέχρι 50 µg/kg·
±2 0τοις εκατό της µέσης τιµής για µέσες τιµές που είναι ανώτερες
των 50 µg/kg.1976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 19
▼B
▼B
Προσάρτηµα στο παράρτηµα
Εικόνα 1
Εικόνα 21976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 20
▼B
Εικόνα 31976L0372 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 21