1978L0633 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 1
Το έγγραφο αυτό συνιστά βοήθηµα τεκµηρίωσης και δεν δεσµεύει τα κοινοτικά όργανα
►B ΟΓ∆ΟΗ Ο∆ΗΓΙΑ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ
της 15ης Ιουνίου 1978
περί καθορισµού των κοινοτικών µεθόδων αναλύσεως για τον επίσηµο έλεγχο των ζωοτροφών
(78/633/ΕΟΚ)
(ΕΕL 206της 29.7.1978, σ. 43)
Τροποποιείται από:
Επίσηµη Εφηµερίδα
αριθ. σελίδα ηµεροµηνία
►M1Οδηγία 81 /680/ΕΟΚ της Επιτροπής της 30ής Ιουλίου 1981 L 246 32 29.8.1981
▼B
ΟΓ∆ΟΗ Ο∆ΗΓΙΑ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ
της 15ης Ιουνίου 1978
περί καθορισµού των κοινοτικών µεθόδων αναλύσεως για τον
επίσηµο έλεγχο των ζωοτροφών
(78/633/ΕΟΚ)
Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,
Έχοντας υπόψη:
τη συνθήκη περί ιδρύσεως της Ευρωπαϊκής Οικονοµικής
Κοινότητος,
την οδηγία του Συµβουλίου 70 /373/ΕΟΚ της 20ής Ιουλίου 1970
περί της εισαγωγής κοινοτικών µεθόδων δειγµατοληψίας καιαναλύσεως για τον επίσηµο έλεγχο των ζωοτροφών (
1),όπως
τελευταία συµπληρώθηκε µε την πράξη προσχωρήσεως καικυρίως το άρθρο 2,
Εκτιµώντας:
ότι η οδηγία απαιτεί όπως ο επίσηµος έλεγχος των ζωοτροφών
εκτελείται µε τη χρήση κοινοτικών µεθόδων δειγµατοληψίας
και αναλύσεως προς το σκοπό ελέγχου για τη συµµόρφωση µετις απαιτήσεις που περιγράφονται από τις νοµοθετικές, κανονι-στικές και διοικητικές διατάξεις σχετικά µε την ποιότητα καιτη σύνθεση των ζωοτροφών ·
ότι οι κοινοτικές οδηγίες 71 /250/ΕΟΚ της 15ης Ιουνίου 1971 (
2),
71/393/ΕΟΚ της 18ης Νοεµβρίου 1971 (3), 72/199/ ΕΟΚ της 27ης
Απριλίου 1972 (4), 73/46/ΕΟΚ της 5ης ∆εκεµβρίου 1972 (5), 74/
203/ΕΟΚ της 25ης Μαρτίου 1974 (6), 75/84/ΕΟΚ της 20ής ∆εκεµ-
βρίου 1974 (7)και 76/372/ΕΟΚ της 1ης Μαρτίου 1976 (8)έχουν
ήδη καθορίσει έναν αριθµό κοινοτικών µεθόδων αναλύσεως ·
ότι λαµβάνοντας υπόψη την πρόοδο των εργασιών που
σηµειώθηκε έκτοτε, συνιστάται η υιοθέτηση µιας όγδοης σειράςµεθόδων ·
ότι τα προβλεπόµενα στην παρούσα οδηγία µέτρα είναι σύµφωνα
µε τη γνώµη της Μόνιµης Επιτροπής για τις Ζωοτροφές,
ΕΞΕ∆ΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ Ο∆ΗΓΙΑ:
Άρθρο 1
1.Τα Κράτη Μέλη ορίζουν όπως οι αναλύσεις για τον
επίσηµο έλεγχο των ζωοτροφών, σχετικά µε το περιεχόµενό
τους σε ψευδαργυρούχο βακιτρακίνη, φλαβοφωσφολιπόλη,
σίδηρο, χαλκό, µαγγάνιο και ψευδάργυρο εκτελούνται σύµφωναµε τις µεθόδους που περιγράφονται στο παράρτηµα της παρούσαςοδηγίας.
Άρθρο 2
Τα Κράτη Μέλη θέτουν σε ισχύ την 1η Ιανουαρίου 1979 τις
νοµοθετικές, κανονιστικές και διοικητικές διατάξεις που είναι1978L0633 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 2
(1)ΕΕ αριθ. Ν 170 της 3.8.1970, σ. 2 .
(2)ΕΕ αριθ. Ν 155 της 12.7.1971, σ. 13 .
(3)ΕΕ αριθ. Ν 279 της 20.12.1971, σ. 7 .
(4)ΕΕ αριθ. Ν 123 της 29.5.1972, σ. 6 .
(5)ΕΕ αριθ. Ν 83 της 30.3.1973, σ. 21 .
(6)ΕΕ αριθ. Ν 108της 22.4.1974, σ. 7 .
(7)ΕΕ αριθ. Ν 32 της 5.2.1975, σ. 26 .
(8)ΕΕ αριθ. Ν 102 της 15.4.1976, σ. 8 .▼M1
▼B
▼B
αναγκαίες για να συµµορφωθούν προς την παρούσα οδηγία.
Ενηµερώνουν αµέσως περί αυτού την Επιτροπή.
Άρθρο 3
Η παρούσα οδηγία απευθύνεται στα Κράτη Μέλη.1978L0633 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 3
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ
1.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΨΕΥ∆ΑΡΓΥΡΙΚΗΣ ΒΑΚΙΤΡΑΚΙΝΗΣ ∆ΙΑ
∆ΙΑΧΥΣΕΩΣ ΣΕ ΜΕΣΟ ΠΕΡΙΕΧΟΝ ΑΓΑΡ
1.ΣΚΟΠΟΣ ΚΑΙ ΠΕ∆ΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ
Η µέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισµό της ψευδαργυρικής βακι-
τρακίνης στις ζωοτροφές, στα συµπυκνώµατα και προµίγµατα. Το
κατώτατο όριο προσδιορισµού είναι 5 mg/kg (5 ppm)(*). Η
µέθοδος δεν ισχύει όταν υπάρχουν παρεµβαλλόµενα υλικά, ιδιαί-
τερα µεγάλες ποσότητες χαλκού και ασκορβικού οξέος.
2.ΑΡΧΗ
Το δείγµα εκχυλίζεται pH 2µε µίγµα µεθανόλης /ύδατος/υδροχλω-
ρικού οξέος. Το εκχύλισµα φέρεται σε pH 6,5, συµπυκνούται
(όπου είναι ανάγκη) και αραιώνεται. Η αντιβιοτική του δράση
προσδιορίζεται µε µέτρηση της διαχύσεως της ψευδαργυρικής
βακιτρακίνης σε µέσο περιέχον άγαρ εµβολιασµένο µε µικρό-
κοκκοLuteus (συνώνυµο M. Flavus). Η διάχυση εµφανίζεται δια
του σχηµατισµού ζωνών ανασχέσεως των µικροοργανισµών. Η
διάµετρος των ζωνών αυτών λαµβάνεται ότι είναι κατ 'ευθείαν
ανάλογη προς το λογάριθµο της αντιβιοτικής συγκεντρώσεως για
το εύρος της χρησιµοποιουµένης αντιβιοτικής συγκεντρώσεως.
3.ΜΙΚΡΟ-ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΣ: ΜΙΚΡΟΚΟΚΚΟΣ LUTEUS ATCC
10240
3.1.Συντήρηση του αποθέµατος καλλιέργειας
Εµβολιάζεται µε µικρόκοκκο Luteus,η καλλιέργεια (4.1) που
περιέχει άγαρ σε κεκλιµένους σωλήνες. Επώαση για 24 ώρες σε
30-37 ºC,διατήρηση σε ψυγείο σε θερµοκρασία περίπου 4 ºCκαι
επανεµβολιασµός της καλλιέργειας που περιέχει άγαρ κάθε δύο
εβδοµάδες.
3.2.Παρασκευή του βακτηριακού εναιωρήµατος (α)
Συλλογή της αναπτύξεως των βακτηριδίων ενός σωλήνος που
περιέχει πρόσφατη καλλιέργεια µε άγαρ (3.1) µε τη βοήθεια 2
έως 3mlδιαλύµατος χλωριούχου νατρίου (4.3). Χρησιµοποίηση
αυτού του εναιωρήµατος για τον εµβολιασµό 250 mlκαλλιέργειας
(4.1) που περιέχεται µέσα σε ένα δοχείο Rouxκαι επώαση για 18
ως 20 ώρες σε 30 ως 37 ºC.Συλλογή της αναπτύξεως των βακτηρι-
δίων µε τη βοήθεια 25 mlδιαλύµατος χλωριούχου νατρίου (4.3)
και ανάµιξη. Αραίωση του εναιωρήµατος στο ένα δέκατο µε
διάλυµα χλωριούχου νατρίου (4.3). Η µετάδοση του φωτός δια
του εναιωρήµατος πρέπει να είναι περίπου 75 %,µετρούµενη στα
650nmµε µια κυψελίδα 1 cmσε σύγκριση µε το διάλυµα
χλωριούχου νατρίου (4.3).
4.ΜΕΣΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ
4.1.Μέσο καλλιέργειας (β)
Πεπτόνη 6,0 g
Τρυπτόνη 4,0 g
Εκχύλισµα ζύµης 3,0 g
Εκχύλισµα κρέατος 1,5 g
Γλυκόζη 1,0 g
Άγαρ 15,0 g
Ύδωρ 1 000 ml
pH 6,5ως 6,6 (µετά την αποστείρωση)
4.2.Μέσο προσδιορισµού (β)
Τρυπτόνη 10,0 g
Εκχύλισµα ζύµης 3,0 g
Εκχύλισµα κρέατος 1,5 g1978L0633 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 4
(*) 1 mg ψευδαργυρική βακιτρακίνη (ποιότητος για ζωοτροφές) είναι ισοδύναµο
µε 42 διεθνείς µονάδες (δ.µ.)
(α)Άλλες µέθοδοι µπορεί να χρησιµοποιηθούν µε την προϋπόθεση ότι έχει καθιερ-
ωθεί ότι δίδουν παρόµοια βακτηριακά εναιωρήµατα.
(β)Οποιοδήποτε µέσο καλλιέργειας του εµπορίου παρόµοιας συνθέσεως και το
οποίο δίδει τα ίδια αποτελέσµατα είναι δυνατό να χρησιµοποιηθεί.
▼B
Γλυκόζη 1,0 g
Άγαρ 20,0 g
Tween 80 1 mlΎδωρ 1 000 ml
pH 6,5 (µετά την αποστείρωση)
4.3.Χλωριούχο νάτριο διάλυµα 0,8 %(β/ο): διάλυση 8 grχλωριούχου
νατρίου α.π. σε νερό και αραίωση δια 1 000 ml και αποστείρωση.
4.4.Μίγµα καθαρής µεθανόλης /ύδατος/υδροχλωρικού οξέος α.π. ( d:
1,18-1,19): 80/17,5/2,5 ( ο/ο/ο).
4.5.Φωσφορικό ρυθµιστικό διάλυµα pH 6,5
Όξινο φωσφορικό κάλιο Κ
2ΗΡΟ4α.π. (22,15 g).
∆ισόξινο φωσφορικό κάλιο ΚΗ2ΡΟ4α.π. (27,85 g).
Νερό µέχρι 1000 ml.
4.6.Υδροχλωρικό οξύ α.π. ( d: 1,18 — 1,19).
4.7.Υδροχλωρικό οξύ α.π. (0,1 Ν).
4.8.Υδροξείδιο του νατρίου α.π. διάλυµα 1 Ν
4.9.∆ιάλυµα πορφυρής βρωµοκρεζόλης 0,04 %(β/ο): διάλυση 0,1 g
πορφυρής βρωµοκρεζόλης σε 18,5 mlδιαλύµατος υδροξειδίου
του νατρίου 0,01 Ν. Συµπλήρωση µέχρι του όγκου των 250 mlµε
νερό και ανάµιξη.
4.10.Πρότυπη ουσία: ψευδαργυρική βακιτρακίνη γνωστής δραστη-
ριότητος (σε δ.µ.).
5.ΠΡΟΤΥΠΑ ∆ΙΑΛΥΜΑΤΑ
Ζύγιση µιας ποσότητος προτύπου ψευδαργυρικής βακιτρακίνης
(4.10) που αντιστοιχεί σε 1050δ.µ. (σύµφωνα µε τη δραστη-
ριότητα). Προστίθενται 5 mlυδροχλωρικού οξέος 0,1 Ν (4,7) και
αφήνεται σε ηρεµία για 15 λεπτά. Προστίθενται 30 mlύδατος,
ρυθµίζεται το pHσε 4,5 µε φωσφορικό ρυθµιστικό διάλυµα pH
6,5 (4.5) ( περίπου 4 ml),συµπληρώνεται µε νερό µέχρι να γίνει ο
όγκος του 50 mlκαι αναµιγνύεται καλώς (1 ml = 21δ.µ.).
Από το διάλυµα αυτό παρασκευάζονται µε διαδοχικές αραιώσεις
µε φωσφορικό ρυθµιστικό διάλυµα pH 6,5 (4.5) τα ακόλουθα
διαλύµατα:
S80,42 δ.µ./ml
S40,21 δ.µ./ml
S20,105 δ.µ./ml
S10,0525 δ.µ./ml
6.ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΤΟΥ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ
6.1.Εκχύλιση
6.1.1. Συµπυκνώµατα,προµίγµατα και µεταλλικά τροφικά άλατα
Ζυγίζεται µια ποσότητα δείγµατος των 2,0 ως 5,0 g,προστίθενται
30mlτου µίγµατος (4.4) και αναταράσσεται για λίγο. Ελέγχεται
ότι το pHείναι περίπου 2. Αναταράσσεται για 10 λεπτά,
προστίθενται 30 mlφωσφορικού ρυθµιστικού διαλύµατος pH 6,5
(4.5)και αναταράσσεται για 15 λεπτά. Αραιώνεται µε φωσφορικό
ρυθµιστικό διάλυµα (4.5) για να ληφθεί ένα αναµενόµενο περιε-
χόµενο σε ψευδαργυρική βακιτρακίνη των 0,42 δ.µ. /ml (= U8).
6.1.2. Πρωτεϊνικά συµπυκνώµατα
Ζυγίζεται µια ποσότητα δείγµατος των 10,0 g,προστίθενται 50 ml
του µίγµατος (4.4) και αναταράσσεται για λίγο. Ελέγχεται ότι το
pHείναι περίπου 2. Αναταράσσεται για 10 λεπτά, προστίθενται
50mlφωσφορικού ρυθµιστικού διαλύµατος pH 6,5 (4.5) και
αναταράσσεται για 15 λεπτά. Αραιώνεται µε φωσφορικό ρυθµι-
στικό διάλυµα (4.5) για να ληφθεί ένα αναµενόµενο περιεχόµενο
σε ψευδαργυρική βακιτρακίνη 0,42 δ.µ. /ml (= U8).
6.1.3. Άλλες τροφές
Ζυγίζεται µια ποσότητα δείγµατος των 10,0 g (20,0 g για ένα
αναµενόµενο περιεχόµενο σε ψευδαργυρική βακιτρακίνη 5 mg/
kg),προστίθενται 25 mlτου µίγµατος (4.4) και οµογενοποιείται
για 10 περίπου λεπτά. Προστίθενται 25 mlφωσφορικού ρυθµι-
στικού διαλύµατος pH 6,5 (4.5), αναταράσσεται για 15 λεπτά και1978L0633 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 5
▼B
φυγοκεντρείται. Λαµβάνονται 20 mlυπερτονικού διαλύµατος και
ρυθµίζεται το pHσε 6,5 µε τη βοήθεια διαλύµατος χλωριούχου
νατρίου 1 Ν (4.8) µε το διάλυµα βρωµοκρεζόλης (4.9) σαν δείκτη.
Εξατµίζεται σε περίπου 4 mlµέσα σε περιστροφικό εξατµιστήρα
σε θερµοκρασία που δεν υπερβαίνει τους 35 ºC.Αραιώνεται το
ίζηµα µε νερό για να ληφθεί ένα αναµενόµενο περιεχόµενο σε
ψευδαργυρική βακιτρακίνη 0,42 δ.µ. /ml (= U8).
6.2.Αναλυτικά διαλύµατα
Από το διάλυµα U8παρασκευάζονται διαλύµατα U4(αναµενόµενο
περιεχόµενο: 0,21 δ.µ. /ml), U2(αναµενόµενο περιεχόµενο
0,105 δ.µ. /ml)καιU1(αναµενόµενο περιεχόµενο: 0,0525 δ.µ. /ml)
δια διαδοχικών αραιώσεων (1 +1 )µε φωσφορικό ρυθµιστικό
διάλυµα (4.5).
7.ΑΝΑΛΥΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟ∆ΟΙ
7.1.Εµβολιασµός του αναλυτικού µέσου
Εµβολιάζεται το αναλυτικό µέσο (4.2) µε το βακτηριακό
εναιώρηµα (3.2) σε θερµοκρασία 50 ºC.Με προκαταρκτικές
δοκιµές σε δίσκους µε αναλυτικό µέσο (4.2) προσδιορίζεται η
ποσότητα του βακτηριακού εναιωρήµατος που απαιτείται για να
δώσει τη µεγαλύτερη και καθαρότερη ζώνη ανασχέσεως µε
διαφορετικές συγκεντρώσεις της ψευδαργυρικής βακιτρακίνης.
7.2.Παρασκευή των πλακών
Η διάλυση µέσα στο άγαρ πραγµατοποιείται σε πλάκες µε τις
τέσσερις συγκεντρώσεις των προτύπων διαλυµάτων ( S8,S4,S2,S1)
και τις τέσσερις συγκεντρώσεις των αναλυτικών διαλυµάτων ( U8,
U4,U2,U1).Οι τέσσερις συγκεντρώσεις των εκχυλισµάτων και των
προτύπων πρέπει οπωσδήποτε να τοποθετηθούν σε κάθε πλάκα.
Για το σκοπό αυτό, οι πλάκες εκλέγονται αρκετά µεγάλες ώστενα επιτρέπουν την κατασκευή στο θρεπτικό µέσο µε άγαρ τουλά-
χιστον οκτώ οπών διαµέτρου 10 έως 13 mm,τα κέντρα των οποίων
απέχουν όχι λιγότερο από 30 mm.Ο έλεγχος µπορεί να πραγµα-
τοποιείται σε πλάκες οι οποίες συνιστώνται από λεπτές υάλινες
πλάκες επάνω στις οποίες τοποθετείται δακτύλιος από αλουµίνιο
ή πλαστικό διαµέτρου 200 mmκαι ύψους 20 mm.
Εισάγεται µέσα στις πλάκες µια ποσότητα του µέσου (4.2) στον
οποίο έχει γίνει εµβολιασµός όπως αναφέρεται στο εδάφιο 7.1,
για να σχηµατισθεί ένα στρώµα 2 mmπάχους (50 mlγια πλάκα
διαµέτρου 200 mm).Αφήνεται να στερεοποιηθεί στην οριζόντια
θέση, ανοίγονται οι οπές και τοποθετούνται σ 'αυτές µε ακρίβεια
µετρηµένοι όγκοι αναλυτικών και προτύπων διαλυµάτων (µεταξύ
0,10 και 0,15 mlανά οπή, ανάλογα µε τη διάµετρό της).
Για κάθε συγκέντρωση γίνονται τέσσερις επαναλήψεις έτσι ώστε
ο προσδιορισµός να εξαρτάται από τον υπολογισµό 32 ζωνών
ανασχέσεως.
7.3.Επώαση
Η επώαση των πλακών γίνεται επί 16 ως 18ώρες σε 28ως 30 ºC.
8.ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ
Μετράται η διάµετρος των ζωνών ανασχέσεως κατά προσέγγιση
0,1mm.Καταγράφονται οι µέσες µετρήσεις για κάθε
συγκέντρωση σε ηµιλογαριθµικό χαρτί που δείχνει το λογάριθµο
των συγκεντρώσεων σε συνάρτηση µε τη διάµετρο των ζωνών
ανασχέσεως. Σύρονται οι γραµµές αρίστης προσαρµογής για το
πρότυπο διάλυµα και το εκχύλισµα, όπως στο κατωτέρω
παράδειγµα.
Προσδιορίζεται το σηµείο αρίστης προσαρµογής για την κατώ-
τατη στάθµη ( SL)του προτύπου διαλύµατος χρησιµοποιώντας τη
σχέση:
α)SL¼7S1þ4S2þS4/C02S8
10
Προσδιορίζεται το σηµείο αρίστης προσαρµογής για την ανώτατη
στάθµη ( SH)του προτύπου διαλύµατος χρησιµοποιώντας τη
σχέση:1978L0633 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 6
▼B
β)SH¼7S8þ4S4þS2/C02S1
10
Παροµοίως υπολογίζονται τα σηµεία αρίστης προσαρµογής για
την κατώτατη στάθµη ( UL)και την ανώτατη στάθµη του εκχυλί-
σµατος ( UH)δι'αντικαταστάσεως στις παραπάνω σχέσεις των S1,
S2,S4S8µε ταU1,U2,U4,U8.
Καταγράφονται οι υπολογισθείσες τιµές των SLκαιSHστο ίδιο
ηµιλογαριθµικό χαρτί και συνδέονται για να σχηµατισουν την
ευθεία αρίστης προσαρµογής για το πρότυπο διάλυµα. Κατά τον
ίδιο τρόπο καταγράφονται τα ULκαιUHκαι συνδέονται για να
ληφθεί η γραµµή αρίστης προσαρµογής για το εκχύλισµα.
Όταν δεν υπάρχει παρεµβολή οι γραµµές πρέπει να είναι
παράλληλες. Για πρακτικούς λόγους οι γραµµές µπορεί να θεωρ-
ηθούν παράλληλες αν οι τιµές ( SH-SL) και (UH-UL) δεν
διαφέρουν περισσότερο από 10 %από τη µέση τιµή τους.
Αν οι γραµµές βρεθεί ότι δεν είναι παράλληλες, είτε το U1και Σ1ήU8καιS8µπορεί να παραληφθούν, και τα SL, SHκαιULκαιUH
υπολογίζονται χρησιµοποιώντας τις εναλλακτικές σχέσεις που
δίδουν εναλλακτικές γραµµές αρίστης προσαρµογής:
α′)S L¼5S1þ2S2/C0S4
6ή5S2þ2S4/C0S8
6
β′)S H ¼5S4þ2S2/C0S1
6ή5S8þ2S4/C0S2
6
και οµοίως για τα ULκαιUH.Οι εναλλακτικές γραµµές αρίστης
προσαρµογής πρέπει να ελέγχονται για την παραλληλότητά τους
όπως και προηγουµένως. Το γεγονός ότι το αποτέλεσµα έχει
υπολογισθεί από τρεις στάθµες πρέπει να αναφερθεί στην τελική
έκθεση.
Όταν οι γραµµές θεωρούνται ότι είναι παράλληλες ,υπολογίζεται ο
λογάριθµος της σχετικής δραστηριότητος ( log. A)µε µια από τις
ακόλουθες σχέσεις.
Για τέσσερις στάθµες
γ)log:A¼U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Για τρεις στάθµες
δ)log:A¼U1þU2þU4/C0S1/C0S2/C0S4 ðÞ /C2 0;401
U4þS4/C0U1/C0S1
ή
δ′) log :A¼U2þU4þU8/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;401
U8þS8/C0U2/C0S2
Πραγµατική δραστηριότητα =υποθετική δραστηριότητα ×
σχετική δραστηριότητα.
Όταν οι γραµµές θεωρούνται ότι δεν είναι παράλληλες ,επαναλαµβά-
νεται ο προσδιορισµός. Αν η παραλληλότης δεν επιτυγχάνεται
πάλι υπολογίζεται ο λογάριθµος της σχετικής δραστηριότητος
(log.Α) χρησιµοποιώντας τη σχέση γ). Το λαµβανόµενο αποτέ-
λεσµα θεωρείται σαν προσεγγιστικό και αυτό πρέπει να
αναφερθεί στην τελική έκθεση.
9.ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΟΤΗΤΑ
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων δύο προσδιορισµών που
πραγµατοποιούνται στο ίδιο δείγµα από τον ίδιο αναλυτή δεν
πρέπει να υπερβαίνει:
20%της µεγίστης τιµής της περιεχόµενης ψευδαργυρικής βακι-
τρακίνης από 5 και µέχρι 25 mg/kg·
5 mg/kg κατ'απόλυτη τιµή, για περιεχόµενα µεγαλύτερα από 25
και µέχρι 50 mg/kg·
10%της µεγίστης τιµής για περιεχόµενα ανώτερα των 50 mg/kg.1978L0633 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 7
▼B
2.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΦΛΑΒΟΦΩΣΦΟΛΙΠΟΛΗΣ ∆ΙΑ ∆ΙΑΧΥ-
ΣΕΩΣ ΣΕ ΘΡΕΠΤΙΚΟ ΜΕΣΟ ΜΕ ΑΓΑΡ
1.ΣΚΟΠΟΣ ΚΑΙ ΠΕ∆ΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ
Η µέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισµό της φλαβοφωσφολιπόλης
στις ζωοτροφές, συµπυκνώµατα και προµίγµατα. Το κατώτερο
όριο προσδιορισµού είναι 1 mg/kg (1 ppm).
2.ΑΡΧΗ
Το δείγµα εκχυλίζεται µε αραιωµένη µεθανόλη δια θερµάνσεως
µε ανακύκλωση. Το εκχύλισµα φυγοκεντρείται και καθαρίζεται
(όπου είναι αναγκαίο) µε ρητίνες ανταλλαγής ιόντων και αραιώ-
νεται. Η αντιβιοτική δραστηριότητα προσδιορίζεται δια
µετρήσεως της διαχύσεως της φλαβοφωσφολιπόλης µέσα σε
θρεπτικό µέσο περιέχον άγαρ εµβολιασµένο µε σταφυλόκοκκο
aureus.Η διάχυση παρουσιάζεται µε το σχηµατισµό ζωνών ανασ-
χέσεως των µικροοργανισµών. Η διάµετρος των ζωνών αυτών
θεωρείται ότι είναι κατ 'ευθείαν ανάλογη προς το λογάριθµο της
αντιβιοτικής συγκεντρώσεως για το εύρος των αντιβιοτικών
συγκεντρώσεων που χρησιµοποιούνται.
3.ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΣ: ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΟΣ AUREUS ATCC
6538 P
3.1.Συντήρηση διατηρηµένης καλλιέργειας
Εµβολιάζεται το µέσο καλλιέργειας µε άγαρ σε κεκλιµένους
σωλήνες (4.1) µε σταφυλόκοκκο aureus.Επωάζεται 24 ώρες σε
37ºCκαι διατηρείται µέσα σε ψυγείο σε θερµοκρασία 4 ºΚελσίου
περίπου και ανανεώνεται ο εµβολιασµός κάθε µήνα.
3.2.Παρασκευή του βακτηριακού εναιωρήµατος (α)
Φυλάσσονται δύο σωλήνες περιέχοντες το απόθεµα καλλιέργειας
(3.1) και ανανεώνεται ο εµβολιασµός τους κάθε εβδοµάδα.
Επωάζονται για 24 ώρες σε 37 ºCκαι διατηρούνται µέσα σε
ψυγείο σε περίπου 4 ºC.
24ώρες πριν από την ανάλυση, µε το ανάπτυγµα αυτό εµβολιά-
ζονται δύο έως τέσσερις σωλήνες περιέχοντες µέσο
καλλιέργειας (4.1). Επωάζονται για 16 έως 18ώρες σε 37 ºC.
Παρασκευάζεται ένα εναιώρηµα του αναπτύγµατος στο διάλυµα
του χλωριούχου νατρίου (4.3). Η µετάδοση του φωτός µε το
εναιώρηµα πρέπει να είναι περίπου 40 %,µετρουµένη στα 578 nm
µε µια κυψελίδα 1 cmως προς το διάλυµα χλωριούχου νατρίου
(4.3).
4.ΜΕΣΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ
4.1.Μέσο καλλιέργειας (β)
Πεπτόνη 6,0 g
Τρυπτόνη 4,0 g
Εκχύλισµα ζύµης 3,0 g
Εκχύλισµα κρέατος 1,5 g
Γλυκόζη 1,0 g
Άγαρ 15,0 g
Ύδωρ 1000 ml
pH 6,5 (µετά την αποστείρωση)
4.2.Αναλυτικό µέσο
4.2.1. Βασική στιβάδα (ψ)
Πεπτόνη 6,0 g
Εκχύλισµα ζύµης 3,0 g
Εκχύλισµα κρέατος 1,5 g
Άγαρ 10,0 g1978L0633 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 8
(α)Άλλοι τρόποι µπορεί να χρησιµοποιηθούν µε την προϋπόθεση ότι έχει καθιερ-
ωθεί ότι δίδουν παρόµοια βακτηριακά εναιωρήµατα.
(β)Κάθε µέσο καλλιέργειας του εµπορίου ανάλογης συνθέσεως και το οποίο
παρέχει ίδια αποτελέσµατα µπορεί να χρησιµοποιηθεί π.χ. oxoidαντιβιοτικό
µέσο 1 (CM 327) µε την προσθήκη oxoidάγαρ αριθ. 3 (L. 13).
(ψ)Κάθε µέσο καλλιέργειας του εµπορίου ανάλογης συνθέσεως και που παρέχει τα
ίδια αποτελέσµατα µπορεί να χρησιµοποιηθεί π.χ. oxoidαντιβιοτικό µέσο 2
(CM 335) µε την προσθήκη oxoidάγαρ, αριθ. 3 (L. 13).
▼B
Ύδωρ 1000 ml
pH 6,5 (µετά την αποστείρωση)
4.2.2. Στιβάδα εµβολιασµού
Όπως και για το εδάφιο 4.1 µε την προσθήκη 2,0 gαντιαφρώδους
γαλακτώµατος σιλικόνης (α).
4.3.∆ιάλυµα χλωριούχου νατρίου 0,4 %(β/ο): διαλύονται 4 g
χλωριούχου νατρίου α.π. σε νερό και αραιώνονται 1 000 ml και
αποστειρώνονται.
4.4.Καθαρή µεθανόλη.
4.5.Μεθανόλη 50 %:αραιώνονται 500 mlµεθανόλης µε 500 mlνερό.
4.6.Μεθανόλη 80 %:αραιώνονται 800 mlµεθανόλης µε 200 mlνερό.
4.7.Τρις (υδροξυµεθύλ) αµινοµεθάνιο α.π.
4.8.Μεθανολικό διάλυµα χλωριούχου καλίου 1,5 %(β/ο): διαλύονται
1,5gχλωριούχου καλίου α.π. και 20 mlνερό και συµπληρούται
µέχρι 100 mlµε µεθανόλη (4.4).
4.9.Ανταλλάκτης κατιόντων: Dowex 50 W×8, 20 ως 50mesh, Na από
(κατ.Servaαριθ.41600)ή ισοδύναµο.
4.10.Ανταλλάκτης ανιόντων: Dowex 1×2, 50 ως 100mesh, Cl από (κατ.
Servaαριθ.41010)ή ισοδύναµο. Πριν από τη χρήση διατηρείται
από 12-14ώρες σε 80 %µεθανόλης (4.6).
4.11.Υαλοβάµβακας.
4.12.Ενδεικτικό χαρτί pH (pH 6,6 ως 8,1).
4.13.Ασκορβικό οξύ.
4.14.Πρότυπο υλικό: φλαβοφωσφολιπόλη γνωστής δραστηριότητος.
5.ΣΥΣΚΕΥΑΙ
5.1.Υάλινοι σωλήνες χρωµατογραφίας, εσωτερικής διαµέτρου: 9 mm,
µήκους: 150 ως 200 mm,µε προσαρµοσµένη στρόφιγγα στο
στενότερο µέρος του κατωτέρου άκρου και µε εσµυρισµένη
υάλινη άρθρωση (για τη σύνδεση µε το σταγονοµετρικό χωνί
(5.2)) στο ανώτερο άκρο.
5.2.Σταγονοµετρικό χωνί 250 mlεφοδιασµένο µε στρόφιγγα και
εσµυρισµένη υάλινη άρθρωση.
5.3. 250 ml κωνική φιάλη µε άρθρωση από εσµυρισµένο γυαλί.
5.4.Συµπυκνωτής µε ανακύκλωση µε άρθρωση από εσµυρισµένο
γυαλί.
6.ΠΡΟΤΥΠΑ ∆ΙΑΛΥΜΑΤΑ
∆ιαλύεται µια ποσότητα του προτύπου υλικού (4.14) µε ακρίβεια
ζυγισµένη σε 50 %µεθανόλη (4.5) και αραιώνεται για να δώσει
ένα απόθεµα διαλύµατος που περιέχει 100 µg/mlφλαβοφωσφολι-
πόλη. ∆ιατηρείται σε πωµατισµένα δοχεία σε 4 ºC.Τα διαλύµατα
αυτά είναι σταθερά µέχρι δύο µήνες.
Εκ του διαλύµατος αποθέµατος παρασκευάζονται δια διαδοχικών
αραιώσεων µε 50 %µεθανόλης (4.5), τα ακόλουθα διαλύµατα:
S80,2 µg/ml
S40,1 µg/ml
S20,05 µg/ml
S10,025µg/ml
7.ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ
7.1.Εκχύλιση
7.1.1. Συµπυκνώµατα,προµίγµατα και µεταλλικά τροφικά άλατα
Ζυγίζεται µια ποσότητα δείγµατος 2,0 ως 5,0 gκαι προστίθενται
περίπου 150 mgασκορβικού οξέος (4.13). Οµογενοποιείται µε
150mlµεθανόλης 50 % (4.5) µέσα σε κωνική φιάλη (5.3) και
ρυθµίζεται το pHστα 8,1 ως 8,2 µε περίπου 400 mgτρις (υδροξυ-1978L0633 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 9
(α)π.χ.SE 2από την Wacker Chemi GmbH, Munich.
▼B
µεθύλ) αµινοµεθάνιο (4.7). Ελέγχεται το pHµε ενδεικτικό χαρτί
(4.12). Αφήνεται να ηρεµήσει για 15 λεπτά και µετά ξαναρυθµί-
ζεται το pHστα 8,1 ως 8,2 µε τρις (υδροξυµεθύλ) αµινοµεθάνιο
(4.7) και βράζει για 10 λεπτά υπό ανακύκλωση (5.4) µε συνεχή
ανάδευση. Αφήνεται να κρυώσει, φυγοκεντρείται το µίγµα και
µεταγγίζεται το εκχύλισµα.
7.1.2. Άλλες τροφές
Ζυγίζεται µια ποσότης δείγµατος 5,0 ως 30,0 gπεριέχουσα τουλά-
χιστον 30 µgφλαβοφωσφολιπόλη. Οµογενοποιείται µε 150 ml
µεθανόλης 50 % (4.5)µέσα σε κωνική φιάλη (5.3) και ρυθµίζεται
τοpHστα 8,1 ως 8,2 µε περίπου 400 mgτρις (υδροξυµεθύλ) αµινο-
µεθάνιο (4.7). Ελέγχεται το pHµε ενδεικτικό χαρτί (4.12),
αφήνεται σε ηρεµία για 15 λεπτά κατόπιν ξαναρυθµίζεται το pH
από 8,1 ως 8,2 µε τρις (υδροξυµεθύλ) αµινοµεθάνιο (4.7) και
βράζει για 10 λεπτά υπό ανακύκλωση (5.4) µε συνεχή ανάδευση.
Αφήνεται να κρυώσει, φυγοκεντρείται το µίγµα και µεταγγίζεται
το εκχύλισµα.
7.2.Καθαρισµός (αυτό το στάδιο µπορεί να παραληφθεί για τα συµπυ-
κνώµατα, προµίγµατα και µεταλλικά τροφικά άλατα)
Αναµιγνύονται 110 mlτου εκχυλίσµατος µε 11 gτου ανταλλάκτου
κατιόντων (4.9), βράζει επί 1 λεπτό υπό ανακύκλωση (5.4) µε
συνεχή ανάδευση. ∆ιαχωρίζεται ο ανταλλάκτης κατιόντων δια
φυγοκεντρήσεως ή διηθήσεως. Αναµιγνύονται εκατό (100 ml)του
εκχυλίσµατος µε 150 mlµεθανόλης (4.4) και αποθηκεύεται το
διάλυµα για 12 ως 15 ώρες σε 4 ºC.∆ιηθείται η ινώδης µάζα ενώ
είναι κρύα.
Τοποθετείται πώµα υαλοβάµβακος (4.11) στον πυθµένα σωλήνος
(5.1), χύνονται στο σωλήνα 5 mlτου ανταλλάκτου ανιόντων
(4.10) και πλένεται η στήλη µε 100 mlµεθανόλης 80 % (4.6).
Χρησιµοποιώντας το χωνί (5.2), µεταφέρεται στη στήλη ένας
όγκος διηθήµατος τουλάχιστον 100 mlο οποίος αναµένεται να
περιέχει 16 µgφλαβοφωσφολιπόλη (200 mlγια δείγµα ζωοτροφής
30gτο 1ppm).Όπου είναι αναγκαίο, πριν από την τοποθέτησή
του στη στήλη, αραιώνεται το διήθηµα µε µεθανόλη 80 % (4.6)
για να ληφθεί ένα αναµενόµενο περιεχόµενο φλαβοφωσφολι-
πόλης 16 µg/100 ml. Ρυθµίζεται ο ρυθµός ροής σε περίπου 2 ml
ανά λεπτό. Αποµακρύνεται το υπόλειµµα. Κατόπιν πλένεται η
στήλη µε 50 mlµεθανόλης 80 % (4.6) και αποµακρύνεται το
υπόλειµµα.
Εκλούεται η φλαβοφωσφολιπόλη µε µεθανολικό διάλυµα
χλωριούχου καλίου (4.5) διατηρώντας το ρυθµό ροής σε περίπου
2mlανά λεπτό. Συλλέγονται 50 mlτης εκλούσεως σε ογκοµε-
τρική φιάλη, προστίθενται 30 mlνερού και αναµιγνύονται. Αυτό
το διάλυµα πρέπει να έχει ένα περιεχόµενο φλαβοφωσφολιπόλης
0,2µg/ml (= U8).
7.3.Ανάλυση των διαλυµάτων
Όπου είναι αναγκαίο (π.χ. όταν παραλείπεται το στάδιο καθαρι-
σµού) αραιώνεται το εκχύλισµα που λαµβάνεται στο 7.1.1 µε
µεθανόλη 50 % (4.5)για να ληφθεί ένα αναµενόµενο περιεχόµενο
φλαβοφωσφολιπόλης 0,2 µg/ml (= U8).
Από το διάλυµα U8παρασκευάζονται διαλύµατα U4(αναµενόµενο
περιεχόµενο 0,1 µg/ml), U2(αναµενόµενο περιεχόµενο 0,05 µg/ml)
καιU1(αναµενόµενο περιεχόµενο 0,025 µg/ml),δια διαδοχικών
αραιώσεων (1 +1 )µε µεθανόλη 50 % (4.5).
8.ΑΝΑΛΥΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟ∆ΟΙ
8.1.Εµβολιασµός του αναλυτικού µέσου
Εµβολιάζεται το αναλυτικό µέσο (4.2.2) µε το βακτηριακό
εναιώρηµα (3.2) σε περίπου 50 ºC.Με προκαταρκτικές προσεγγί-
σεις σε πλάκες µε αναλυτικό µέσο (4.2.2) προσδιορίζεται η
ποσότητα του βακτηριακού εναιωρήµατος που απαιτείται για να
δώσει τις µεγαλύτερες και καθαρότερες ζώνες ανασχέσεως µε
διαφορετικές συγκεντρώσεις φλαβοφωσφολιπόλης (περίπου 30 ml
ανά λίτρο).
8.2.Παρασκευή των πλακών
∆ιάχυση δια µέσου του θρεπτικού µέσου άγαρ πραγµατοποιείται
σε πλάκες µε τις τέσσερις συγκεντρώσεις του προτύπου διαλύ-
µατος (S8,S4,S2,S1)και τις τέσσερις συγκεντρώσεις των1978L0633 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 10
▼B
αναλυτικών διαλυµάτων ( U8,U4,U2,U1).Οι τέσσερις αυτές
συγκεντρώσεις των εκχυλισµάτωνκαι των προτύπων πρέπει αναγ-
καστικά να τοποθετηθούν σε κάθε πλάκα. Για το σκοπό αυτό
εκλέγονται πλάκες αρκετά µεγάλες, ώστε να µπορούν να γίνουν
µέσα στο θρεπτικό µέσο άγαρ τουλάχιστον οκτώ οπές µε διαµέ-
τρους 10 ως 13 mmκαι των οποίων οι αποστάσεις των κέντρων
να µην είναι µικρότερες από 30 mm.Ο έλεγχος µπορεί να
πραγµατοποιείται σε πλάκες οι οποίες συνίστανται από λεπτές
υάλινες πλάκες, επάνω στις οποίες τοποθετείται δακτύλιος από
αλουµίνιο ή πλαστικό διαµέτρου 200 mmκαι ύψους 20 mm.
Εισάγεται µέσα στις πλάκες µια ποσότητα του µέσου (4.2.1) που
θα σχηµατίσει ένα στρώµα πάχους 1,5 mm (45 ml για πλάκα
διαµέτρου 200 mm).Αφήνεται να στερεοποιηθεί στην οριζόντια
θέση και προστίθεται µια ποσότητα του µέσου (4.2.2) εµβολια-
σµένη, όπως αναφέρεται στο 8.1, που θα σχηµατίσει ένα στρώµα
πάχους 1 mm (30 ml για πλάκα διαµέτρου 200 mm).Αφήνεται να
στερεοποιηθεί στην οριζόντια θέση, ανοίγονται οι οπές και
τοποθετούνται µέσα τους µε ακρίβεια µετρηµένοι όγκοι αναλυ-
τικών και προτύπων διαλυµάτων (µεταξύ 0,10 και 0,15 mlανά
οπή ανάλογα µε τη διάµετρό τους). Για κάθε συγκέντρωση γίνο-
νται τέσσερις επαναλήψεις, έτσι ώστε ο προσδιορισµός να
εξαρτάται από τον υπολογισµό 32 ζωνών ανασχέσεως.
8.3.Η επώαση των πλακών γίνεται επί 16 ως 18 ώρες και σε 28 ως
30ºC.
9.ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ
Μετράται η διάµετρος των ζωνών ανασχέσεως κατά προσέγγιση
0,1mm.Καταγράφονται οι µέσες µετρήσεις για κάθε
συγκέντρωση σε ηµιλογαριθµικό χαρτί που δείχνει το λογάριθµο
συγκεντρώσεων σε συνάρτηση µε τις διαµέτρους των ζωνών
ανασχέσεως. Σύρονται οι γραµµές αρίστης προσαρµογής για το
πρότυπο διάλυµα και το εκχύλισµα, π.χ. ως ακολούθως: Προσδιο-
ρίζεται το σηµείο αρίστης προσαρµογής για την κατώτατη
στάθµη του προτύπου διαλύµατος ( SL)χρησιµοποιώντας τη
σχέση:
α)SL¼7S1þ4S2þS4/C02S8
10
Προσδιορίζεται το σηµείο αρίστης προσαρµογής για την ανώτατη
στάθµη ( SH)του προτύπου διαλύµατος χρησιµοποιώντας τη
σχέση:
β)SH¼7S8þ4S4þS2/C02S1
10
Παρόµοια υπολογίζονται τα σηµεία αρίστης προσαρµογής για
την κατώτατη στάθµη του εκχυλίσµατος ( UL)και την ανώτατη
στάθµη του εκχυλίσµατος ( UH)δι'αντικαταστάσεως µε U1,U2,U4καιU8τωνS1,S2,S4καιS8στις παραπάνω σχέσεις.
Καταγράφονται οι υπολογισθείσες τιµές των SLκαιSHστο ίδιο
ηµιλογαριθµικό χαρτί και συνδέονται για να σχηµατίσουν τη
γραµµή αρίστης προσαρµογής για το πρότυπο διάλυµα. Οµοίως
καταγράφονται τα ULκαιUHκαι συνδέονται για να δώσουν τη
γραµµή αρίστης προσαρµογής για το εκχύλισµα.
Όταν δεν υπάρχει παρεµβολή οι γραµµές πρέπει να είναι
παράλληλες. Για πρακτικούς λόγους οι γραµµές θεωρούνται
παράλληλες αν οι τιµές ( SH-SL)και (UH-UL) δεν διαφέρουν
περισσότερο από 10 %από τη µέση τιµή τους.
Αν βρεθεί ότι οι γραµµές δεν είναι παράλληλες, µπορεί να
παραληφθούν είτε τα U1καιS1ήτ αU8καιS8,και ταSL, SH, UL
καιUHυπολογίζονται χρησιµοποιώντας τις εναλλακτικές
σχέσεις που δίδουν εναλλακτικές γραµµές αρίστης προσαρµογής.
α′)S L¼5S1þ2S2/C0S4
6ή5S2þ2S4/C0S8
6
β′)S H ¼5S4þ2S2/C0S1
6ή5S8þ2S4/C0S2
61978L0633 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 11
▼B
και οµοίως για τα ULκαιUH.Οι εναλλακτικές γραµµές αρίστης
προσαρµογής πρέπει να ελέγχονται για την παραλληλότητα όπως
και προηγουµένως. Το γεγονός ότι το αποτέλεσµα έχει υπολογι-
σθεί από τρεις στάθµες πρέπει να αναφερθεί στην τελική έκθεση.
Όταν οι γραµµές θεωρούνται ότι είναι παράλληλες, υπολογίζεται ο
λογάριθµος της σχετικής δραστηριότητος ( log. A)µε µια από τις
ακόλουθες σχέσεις.
Για τέσσερις στάθµες
γ)log:A¼U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Για τρεις στάθµες
δ)log:A¼U1þU2þU4/C0S1/C0S2/C0S4 ðÞ /C2 0;401
U4þS4/C0U1/C0S1
ή
δ′) log :A¼U2þU4þU8/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;401
U8þS8/C0U2/C0S2
Πραγµατική δραστηριότητα =υποθετική δραστηριότητα ×
σχετική δραστηριότητα.
Όταν οι γραµµές θεωρούνται ότι δεν είναι παράλληλες ,επαναλαµβά-
νεται ο προσδιορισµός. Αν η παραλληλότητα δεν επιτυγχάνεται
πάλι, υπολογίζεται ο λογάριθµος της σχετικής δραστηριότητος
(log.Α) µε τη σχέση γ). Το λαµβανόµενο αποτέλεσµα πρέπει να
θεωρείται σαν προσεγγιστικό και αυτό πρέπει να αναφερθεί στην
τελική έκθεση.
10.ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΟΤΗΤΑ
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων δύο προσδιορισµών, που
πραγµατοποιούνται στο ίδιο δείγµα από τον ίδιο αναλυτή δεν
πρέπει να υπερβαίνει:
0,5 mg/kg κατ'απόλυτη τιµή, για περιεχόµενα φλαβοφωσφολι-
πόλης από 1 και µέχρι 2 mg/kg·
25%της µεγίστης τιµής για περιεχόµενα µεγαλύτερα από 2 και
µέχρι 10 mg/kg·
20%της µεγίστης τιµής για περιεχόµενα µεγαλύτερα από 10 και
µέχρι 25 mg/kg·
5 mg/kg κατ'απόλυτη τιµή για περιεχόµενα µεγαλύτερα από 25
και µέχρι 50 mg/kg·
10%της µεγίστης τιµής για περιεχόµενα ανώτερα των 50 mg/kg.
3.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΙΧΝΟΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΣΙ∆ΗΡΟΥ, ΧΑΛΚΟΥ,
ΜΑΓΓΑΝΙΟΥ ΚΑΙ ΨΕΥ∆ΑΡΓΥΡΟΥ
1.ΣΚΟΠΟΣ ΚΑΙ ΠΕ∆ΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ
Η µέθοδος καθιστά δυνατό τον προσδιορισµό των ιχνοστοιχείων
σιδήρου, χαλκού, µαγγανίου και ψευδαργύρου στις ζωοτροφές. Τα
κατώτερα όρια προσδιορισµού είναι:
σίδηρος ( Fe): 20 mg/kg
χαλκός ( Cu): 10 mg/kg
µαγγάνιο (Μ n): 20 mg/kg
ψευδάργυρος ( Zn): 20 mg/kg
2.ΑΡΧΗ
Το δείγµα διαλύεται σε υδροχλωρικό οξύ µετά την καταστροφή
της οργανικής ύλης, αν υπάρχει. Τα στοιχεία σίδηρος, χαλκός,
µαγγάνιο και ψευδάργυρος προσδιορίζονται, µετά από κατάλληλη
αραίωση, µε φασµατοσκοπία ατοµικής απορροφήσεως.1978L0633 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 12
▼B
3.ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ
Εισαγωγικές παρατηρήσειςΓια την παρασκευή των αντιδραστηρίων και των αναλυτικών
διαλυµάτων χρησιµοποιείται νερό απαλλαγµένο από τα κατιόντα
που πρόκειται να προσδιορισθούν, που λαµβάνεται είτε µε διπλή
απόσταξη ύδατος σε αποστακτήρα από βοριοπυριτική ύαλο ή από
χαλαζία είτε µε διπλή επεξεργασία µε ρητίνες ανταλλαγής
ιόντων.
Τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι τουλάχιστον αναλυτικής
ποιότητος (α.π.). Η καθαρότητα από τα στοιχεία που πρόκειται
να προσδιορισθούν πρέπει να ελέγχεται µε λευκό πείραµα. Αν
απαιτείται, τα αντιδραστήρια πρέπει να καθαρίζονται επιπλέον.
Σε αντικατάσταση των προτύπων διαλυµάτων που περιγράφονται
κατωτέρω, πρότυπα διαλύµατα του εµπορίου µπορεί να χρησιµο-
ποιηθούν µε την προϋπόθεση ότι είναι εγγυηµένα και έχουν
ελεγχθεί πριν από τη χρήση.
3.1.Υδροχλωρικό οξύ α.π. ( d: 1,19).
3.2.Υδροχλωρικό οξύ α.π. (6 N).
3.3.Υδροχλωρικό οξύ α.π. (0,5 N).
3.4.Υδροφθορικό οξύ 38µέχρι 40 %(ο/ο) που έχει περιεκτικότητα
σιδήρου λιγότερο από 1 mg Fe/lt και ίζηµα µετά από εξάτµιση,
λιγότερο από 10 mg (ως θειικό άλας) /lit.,
3.5.Θειικό οξύ α.π. ( d: 1,84).
3.6.Υπεροξείδιο του υδρογόνου α.π. (περίπου 100 όγκοι οξυγόνου
30%κατά βάρος).
3.7.Πρότυπο διάλυµα σιδήρου ( 1 000 µg Fe/ml) που παρασκευάζεται
ως εξής: διαλύεται 1 grσύρµατος σιδήρου α.π. σε 200 ml
υδροχλωρικού οξέος 6 Ν (3.2), προστίθενται 16 mlυπεροξειδίου
του υδρογόνου (3.6) και συµπληρώνεται µε νερό µέχρι όγκο ενός
λίτρου.
3.7.1.Πρότυπο διάλυµα εργασίας σιδήρου (100 µg Fe/ml) που παρα-
σκευάζεται δι 'αραιώσεως του προτύπου διαλύµατος (3.7) µε νερό
1+9.
3.8.Πρότυπο διάλυµα χαλκού ( 1000 µg Cu/ml) που παρασκευάζεται ως
εξής: διαλύεται 1 grχαλκού υπό µορφή σκόνης α.π. σε 25 ml
υδροχλωρικού οξέος 6 Ν (3.2), προστίθενται 5 mlυπεροξειδίου
του υδρογόνου (3.6) και συµπληρώνεται µε νερό µέχρι όγκο ενός
λίτρου.
3.8.1.Πρότυπο διάλυµα εργασίας χαλκού (10 µg Cu/ml) που παρασκευά-
ζεται δι'αραιώσεως του προτύπου διαλύµατος (3.8) µε νερό 1 +9
και στη συνέχεια δι 'αραιώσεως του προκύπτοντος διαλύµατος µε
νερό 1+9.
3.9.Πρότυπο διάλυµα µαγγανίου ( 1000 µg Mn/ml) που παρασκευά-
ζεται ως εξής: διαλύεται 1 gµαγγανίου υπό µορφή σκόνης α.π.
σε 25mlυδροχλωρικού οξέος 6 Ν (3.2) και συµπληρώνεται µε
νερό µέχρι όγκο ενός λίτρου.
3.9.1.Πρότυπο διάλυµα εργασίας µαγγανίου (10 µg Mn/ml) που παρα-
σκευάζεται δι 'αραιώσεως του προτύπου διαλύµατος (3.9) µε νερό
1+9και στη συνέχεια δι 'αραιώσεως του προκύπτοντος διαλύ-
µατος µε νερό 1 +9.
3.10.Πρότυπο διάλυµα ψευδαργύρου ( 1000 µg Zn/ml) που παρασκευά-
ζεται ως εξής: διαλύεται 1 gψευδαργύρου υπό µορφή λωρίδος ή
φύλλου α.π. σε 25 mlυδροχλωρικού οξέος 6 Ν (3.2) και συµπλη-
ρώνεται µε νερό µέχρι όγκο ενός λίτρου.
3.10.1.Πρότυπο διάλυµα εργασίας ψευδαργύρου (10 µg Zn/ml) που παρα-
σκευάζεται δι 'αραιώσεως του προτύπου διαλύµατος (3.10) µε νερό
1+9και στη συνέχεια δι 'αραιώσεως του προκύπτοντος διαλύ-
µατος µε νερό 1 +9.
3.11.∆ιάλυµα χλωριούχου λανθανίου που παρασκευάζεται ως εξής:
διαλύονται 12 gοξειδίου του λανθανίου σε 150 mlνερό,
προστίθενται 100 mlυδροχλωρικού οξέος 6 Ν (3.2) και συµπλη-
ρώνεται µε νερό µέχρι όγκο ενός λίτρου.1978L0633 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 13
▼B
4.ΣΥΣΚΕΥΕΣ
4.1.Φούρνος µε διαφράγµατα µε ρυθµιζόµενη θερµοκρασία και κατα-
γραφικό.
4.2.Τα γυάλινα σκεύη πρέπει να είναι από ανθεκτικό πυριτικό βόριο.
Συνιστάται η χρησιµοποίηση συσκευών αποκλειστικά για
προσδιορισµούς ιχνοστοιχείων.
4.3.Χωνευτήρια από πλατίνα και (προαιρετικά) από χαλαζία.
4.4.Φασµατοφωτόµετρο ατοµικής απορρόφησης ανταποκρινόµενο
στις απαιτήσεις της µεθόδου όσον αφορά την ευαισθησία και
την ακρίβεια στο απαιτούµενο εύρος της περιοχής µετρήσεων.
5.ΜΕΘΟ∆ΟΣ
5.1.∆είγµατα που περιέχουν οργανική ύλη
5.1.1. Αποτέφρωση και παρασκευή του διαλύµατος που θα αναλυθεί (*)
ι) Τοποθετούνται 5 ως 10 gτου δείγµατος ζυγισµένα µε προσέγ-
γιση 0,2 mgσε ένα χωνευτήρι από χαλαζία ή πλατίνα (4.3)
(βλέπε σηµείωση β)), ξηραίνονται σε φούρνο σε 105 ºCκαι
τοποθετείται το χωνευτήρι σε κρύο φούρνο µε διαφράγµατα
(4.1). Κλείεται ο φούρνος (βλέπε σηµείωση γ)) και
προοδευτικά αυξάνεται η θερµοκρασία στους 450 µέχρι 475 ºC
µέσα σε 90 λεπτά περίπου. ∆ιατηρείται αυτή η θερµοκρασία
για 4 ως 16 ώρες (π.χ. κατά τη διάρκεια της νύχτας) ώστε να
αποµακρυνθεί η ανθρακώδης ύλη και στη συνέχεια ανοίγεται
ο φούρνος και αφήνεται να κρυώσει (βλέπε σηµείωση δ)).
Υγραίνονται οι στάχτες µε νερό, κατόπιν µεταφέρονται σε
δοχείο των 250 ml.Ξεπλένεται το χωνευτήρι µε περίπου 5 ml
συνολικά υδροχλωρικού οξέος (3.1) και στη συνέχεια
προστίθεται το διάλυµα αυτό σιγά και προσεκτικά στο δοχείο.
(Πιθανόν να υπάρξει µια ισχυρή αντίδραση οφειλόµενη στο
σχηµατισµό CO2).Προστίθεται υδροχλωρικό οξύ (3.1) κατά
σταγόνες ανακατεύοντας ταυτόχρονα το περιεχόµενο του
δοχείου, µέχρι να σταµατήσει τελείως ο αναβρασµός. Εξατµί-
ζεται µέχρι ξηρού, ανακατεύοντας πότε -πότε µε µια γυάλινη
ράβδο.
Στη συνέχεια προστίθενται 15 mlυδροχλωρικού οξέος 6 Ν
(3.2) στο υπόλειµµα και κατόπιν περίπου 120 mlνερό.
Αναδεύεται µε τη βοήθεια της γυάλινης ράβδου, η οποία
πρέπει να µείνει µέσα στο δοχείο και καλύπτεται το δοχείο
µε ύαλο ωρολογίου. Αυξάνεται σιγά -σιγά η θερµοκρασία στο
σηµείο βρασµού και διατηρείται στο σηµείο αυτό µέχρις
ότου δεν φαίνεται να διαλύεται άλλη στάχτη. ∆ιηθείται µε
διηθητικό χαρτί καθαρό από στάχτες και συλλέγεται το
διήθηµα σε µια ογκοµετρική φιάλη των 250 ml.Πλένεται το
δοχείο και το φίλτρο µε 5 mlζεστού υδροχλωρικού οξέος 6 Ν
(3.2) και δυο φορές µε βραστό νερό. Συµπληρώνεται η ογκοµε-
τρική φιάλη µε νερό µέχρι τα 250 ml (συγκέντρωση HCl
περίπου 0,5 Ν).
ιι) Αν το υπόλειµµα στο φίλτρο εµφανίζεται µαύρο (κάρβουνο)
τοποθετείται πάλι στο φούρνο και αποτεφρώνεται στους 450
ως 475ºC.Αυτή η αποτέφρωση, που απαιτεί µόνο λίγες ώρες
(περίπου τρεις ως πέντε ώρες), περατούται όταν η στάχτη
εµφανίζεται άσπρη ή σχεδόν άσπρη. ∆ιαλύεται το υπόλειµµα1978L0633 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 14
(*)Ο πράσινος σανός (φρέσκος ή αποξηραµένος) πιθανό να περιέχει µεγάλες
ποσότητες φυτικού διοξειδίου του πυριτίου, το οποίον µπορεί να συγκρατείιχνοστοιχεία και πρέπει να αποµακρυνθεί. Για δείγµατα προερχόµενα από
τέτοιες ζωοτροφές πρέπει συνεπώς να ακολουθηθεί η επόµενη τροποποιηµένη
µέθοδος. Εκτελείται η εργασία 5.1.1 ι) µέχρι το στάδιο της διηθήσεως.Πλένεται το διηθητικό χαρτί που περιέχει το αδιάλυτο κατακράτηµα, δυοφορές µε βραστό νερό και τοποθετείται σε χωνευτήρι από πλατίνα (4.3).Αποτεφρώνεται µέσα στο φούρνο µε διαφράγµατα (4.1) σε θερµοκρασία χαµη-
λότερη από 550 ºCµέχρις ότου όλη η ανθρακώδης ύλη εξαφανισθεί τελείως.
Αφήνεται να κρυώσει, προστίθενται µερικές σταγόνες νερό, µετά 10 ως 15 ml
υδροφθορικού οξέος (3.4) και εξατµίζεται µέχρι ξηρού στους 150 ºCπερίπου.
Αν παραµείνει καθόλου διοξείδιο του πυριτίου στο υπόλειµµα, ξαναδιαλύεταισε µερικά mlυδροφθορικού οξέος (3.4) και εξατµίζεται µέχρι ξηρού.
Προστίθενται πέντε σταγόνες θειικού οξέος (3.5) και θερµαίνεται µέχρι να
σταµατήσει ή παραγωγή άσπρου καπνού. Μετά την προσθήκη 5 mlυδροχλω-
ρικού οξέος 6 N (3.2) και περίπου 30 mlνερού, θερµαίνεται, διηθείται το
διάλυµα µέσα σε ογκοµετρική φιάλη των 250 mlκαι συµπληρώνεται ο όγκος
των 250 mlµε νερό (η συγκέντρωση του HClείναι περίπου 0,5 Ν). Στη συνέ-
χεια ακολουθείται ή διαδικασία από το σηµείο 5.1.3.
▼B
µε περίπου 2 mlυδροχλωρικού οξέος (3.1), εξατµίζεται µέχρι
του ξηρού και προστίθενται 5 mlυδροχλωρικού οξέος (3.2).
Θερµαίνεται, διηθείται το διάλυµα µέσα στην ογκοµετρική
φιάλη και συµπληρώνεται µε νερό µέχρι τα 250 ml
(συγκέντρωση HClπερίπου 0,5 Ν).
Σηµειώσεις:
α) Στον προσδιορισµό των ιχνοστοιχείων πρέπει να δοθεί ιδιαί-
τερη προσοχή στους κινδύνους µολύνσεως, ιδιαίτερα από τον
ψευδάργυρο, το χαλκό και το σίδηρο. Γι 'αυτό το λόγο ο
εξοπλισµός που χρησιµοποιείται για την παρασκευή των
δειγµάτων πρέπει να είναι καθαρός από αυτά τα µέταλλα.
Για να µειωθεί ο γενικότερος κίνδυνος µολύνσεως, η εργασία
πρέπει να γίνεται σε ατµόσφαιρα ελεύθερη από σκόνη µε
πάρα πολύ καθαρό εξοπλισµό και προσεχτικά πλυµένα
γυάλινα σκεύη. Ο προσδιορισµός του ψευδαργύρου είναι ιδιαί-
τερα ευαίσθητος σε πολλούς τύπους µόλυνσης, π.χ. από
γυάλινα σκεύη, αντιδραστήρια, σκόνη κλπ.
β) Το βάρος του δείγµατος που πρόκειται να αποτεφρωθεί υπολο-
γίζεται από την κατά προσέγγιση περιεκτικότητα του
ιχνοστοιχείου στη ζωοτροφή σε σχέση µε την ευαισθησία
του φασµατοφωτοµέτρου που χρησιµοποιήθηκε. Για µερικές
ζωοτροφές φτωχές σε ιχνοστοιχεία µπορεί να είναι
απαραίτητο να χρησιµοποιηθούν αρχικά 10 ως 20 gδείγµατος
και να περιορίζεται ο όγκος του τελικού διαλύµατος στα
100ml.
γ) Η αποτέφρωση πρέπει να γίνει σε κλειστό φούρνο χωρίς
έγχυση αέρα ή οξυγόνου.
δ) Η θερµοκρασία που δείχνει το πυρόµετρο δεν πρέπει να
υπερβεί τους 475 ºC.
5.1.2. Φασµατοφωτοµετρικός προσδιορισµός
5.1.2.1.Παρασκευή διαλυµάτων βαθµονοµήσεως
Για κάθε ένα από τα στοιχεία που πρόκειται να προσδιορισθούν,
παρασκευάζεται από τα πρότυπα διαλύµατα εργασίας που
δόθηκαν στα σηµεία 3.71, 3.8.1, 3.9.1 και 3.10.1 µια σειρά από
διαλύµατα βαθµονόµησης, έτσι ώστε κάθε διάλυµα βαθµονόµησης
να έχει συγκέντρωση HClπερίπου 0,5 Ν και (στις περιπτώσεις
σιδήρου, µαγγανίου και ψευδαργύρου) συγκέντρωση χλωριούχου
λανθανίου ισοδύναµη µε 0,1 %L a(β/ο). Οι συγκεντρώσεις των
ιχνοστοιχείων που διαλέχτηκαν πρέπει να βρίσκονται µέσα στα
όρια ευαισθησίας του φασµατοφωτόµετρου που χρησιµο-
ποιήθηκε. Οι παρακάτω πίνακες δείχνουν, σαν παράδειγµα, τις
συνθέσεις του τυπικού εύρους των διαλυµάτων βαθµονοµήσεως.
Εν τούτοις, ανάλογα µε τον τύπο και την ευαισθησία του φασµα-
τοφωτόµετρου που χρησιµοποιείται, µπορεί να είναι απαραίτητη
η εκλογή άλλων συγκεντρώσεων.
Σίδηρος
µ g Fe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5
mlπροτύπου
διαλύµατος εργα-
σίας (3.7.1)
(1 ml = 100 µg Fe) 0 0,5 1 2 3 4 5
+m l6ΝHCl
(3.2)7 7 77777
+1 0m l διαλύµατος χλωριούχου λανθανίου (3.11) και συµπληρώ-
νεται µε νερό µέχρι όγκο 100 ml.
Χαλκός
µ g Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 0,1
mlπροτύπου
διαλύµατος εργα-
σίας (3.8.1)
(1 ml = 10 µg Cu) 0 1 2 4 6 8 10
+m l6ΝHCl
(3.2)888888 81978L0633 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 15
▼B
µ g Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 0,1
Συµπληρώνεται µέχρι όγκο 100 mlµε νερό.
Μαγγάνιο
µ g Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
mlπροτύπου
διαλύµατος εργα-
σίας (3.9.1)
(1 ml = 10 µg Mn) 0 1 2 4 6 8 10
+m l6ΝHCl
(3.2)777777 7
+1 0m l διαλύµατος χλωριούχου λανθανίου (3.11) και συµπληρώ-
νεται µε νερό µέχρι όγκο 100 ml.
Ψευδάργυρος
µ g Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8
mlπροτύπου
διαλύµατος εργα-
σίας (3.10.1)
(1 ml = 10 µg Zn) 0 0,5 1 2 4 6 8
+m l6ΝHCl
(3.2)7 7 77777
+1 0m l διαλύµατος χλωριούχου λανθανίου (3.11) και συµπληρώ-
νεται µε νερό µέχρι όγκο 100 ml.
5.1.2.2.Παρασκευή των διαλυµάτων για ανάλυση
Για τον προσδιορισµό του χαλκού, το διάλυµα που παρα-
σκευάστηκε από το σηµείο 5.1.1 µπορεί γενικά να
χρησιµοποιηθεί άµεσα. Αν απαιτείται να προσαρµοσθεί η
συγκέντρωσή του µέσα στα όρια των διαλυµάτων βαθµονόµησης,
µπορεί ένα µέρος του διαλύµατος να µεταφερθεί µε πιπέτα σε µια
ογκοµετρική φιάλη των 100 mlκαι να συµπληρωθεί µε 0,5 Ν
υδροχλωρικό οξύ (3.3) µέχρι ο όγκος να φτάσει τα 100.
Για τον προσδιορισµό του σιδήρου, µαγγανίου και ψευδαργύρου
µεταφέρεται µε πιπέτα ένα µέρος του διαλύµατος που παρα-
σκευάστηκε από το σηµείο 5.1.1 µέσα σε ογκοµετρική φιάλη
των 100 ml,προστίθενται 10 mlδιαλύµατος χλωριούχου λανθα-
νίου (3.11) και συµπληρώνεται µε υδροχλωρικό οξύ 0,5 Ν (3.3)
µέχρι τον όγκο των 100 ml (βλέπε επίσης σηµείο 8 «Παρα-
τήρηση»).
5.1.2.3.Λευκό πείραµα
Το λευκό πείραµα πρέπει να περιλαµβάνει όλα τα προβλεπόµενα
στάδια της διαδικασίας, παραλειποµένου του υλικού του
δείγµατος.
Το διάλυµα βαθµονόµησης «0»δεν πρέπει να χρησιµοποιηθεί
σαν«λευκό».
5.1.2.4.Μέτρηση της ατοµικής απορρόφησης
Μετράται η ατοµική απορρόφηση των διαλυµάτων βαθµονόµησης
και του διαλύµατος πουπρόκειται να αναληθεί χρησιµοποιώντας
µια οξειδωτική φλόγα αέρα -ακετυλενίου στα ακόλουθα µήκη
κύµατος:
Fe: 248, 3 nm
Cu: 324, 8 nmMn: 279,5 nm
Zn: 213, 8 nm
Κάθε µέτρηση γίνεται τέσσερις φορές.1978L0633 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 16
▼B
5.2.Μεταλλικά τροφικά άλατα
Αν το δείγµα δεν περιέχει οργανική ύλη, δεν είναι απαραίτητη
προηγούµενη αποτέφρωση. Ακολουθείται η διαδικασία που
περιγράφεται στο σηµείο 5.1.1.(ι) αρχίζοντας από τη δεύτερη
παράγραφο. Η εξάτµιση µε υδροφθορικό οξύ µπορεί να παραλει-
φθεί.
6.ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
Χρησιµοποιώντας µια καµπύλη βαθµονόµησης, υπολογίζεται η
συγκέντρωση του ιχνοστοιχείου στο δείγµα που αναλύεται και
εκφράζεται το αποτέλεσµα σε mgιχνοστοιχείου ανά kgδείγµατος
(ppm).
7.ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΟΤΗΤΑ
Η διαφορά ανάµεσα στα αποτελέσµατα δύο παραλλήλων προσδιο-
ρισµών, που εκτελέστηκαν στο ίδιο δείγµα από τον ίδιο αναλυτή,
δεν πρέπει να υπερβαίνει:
— 5 mg/kg, κατ'απόλυτη τιµή, για περιεκτικότητες ιχνοστοι-
χείου µέχρι 50 mg/kg·
— 10% του µεγαλύτερου αποτελέσµατος για περιεκτικότητες
ιχνοστοιχείου από 50 και µέχρι 100 mg/kg·
— 10 mg/kg, µε απόλυτη τιµή για περιεκτικότητες ιχνοστοιχείου
από 100 και µέχρι 200 mg/kg·
—5 %του µεγαλύτερου αποτελέσµατος για περιεκτικότητες
ιχνοστοιχείου ανώτερες από 200 mg/kg.
8.ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ
Η παρουσία µεγάλων ποσοτήτων φωσφορικών αλάτων µπορεί να
προκαλέσει παρεµβολές στον προσδιορισµό του σιδήρου, µαγγα-
νίου και ψευδαργύρου. Αυτή η παρεµβολή πρέπει να διορθωθεί
µε την προσθήκη διαλύµατος χλωριούχου λανθανίου (3.11). Αν,
εν τούτοις, στο δείγµα ο λόγος βάρουςCaþMg
P>2;η
προσθήκη του διαλύµατος χλωριούχου λανθανίου (3.11) στο
διάλυµα που θα αναλυθεί και στα διαλύµατα βαθµονόµησης
µπορεί να παραλειφθεί.1978L0633 — EL — 19.08.1981 — 001.001 — 17