1973L0046 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 1
Το έγγραφο αυτό συνιστά βοήθηµα τεκµηρίωσης και δεν δεσµεύει τα κοινοτικά όργανα
►B ΤΕΤΑΡΤΗ Ο∆ΗΓΙΑ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ
της 5ης ∆εκεµβρίου 1972
περί καθορισµού κοινοτικών µεθόδων αναλύσεως για τον επίσηµο έλεγχο των ζωοτροφών
(73/46/ΕΟΚ)
(ΕΕL8 3της 30.3.1973, σ. 21)
Τροποποιείται από:
Επίσηµη Εφηµερίδα
αριθ. σελίδα ηµεροµηνία
►M1Οδηγία 81 /680/ΕΟΚ της Επιτροπής της 30ής Ιουλίου 1981 L246 32 29.8.1981
►M2Οδηγία92/89/ΕΟΚ της Επιτροπής της 3ης Νοεµβρίου 1992 L344 35 26.11.1992
▼B
ΤΕΤΑΡΤΗ Ο∆ΗΓΙΑ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ
της 5ης ∆εκεµβρίου 1972
περί καθορισµού κοινοτικών µεθόδων αναλύσεως για τον επίσηµο
έλεγχο των ζωοτροφών
(73/46/ΕΟΚ)
Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,
Έχοντας υπόψη:
τη συνθήκη περί ιδρύσεως της Ευρωπαϊκής Οικονοµικής
Κοινότητος,
την οδηγία του Συµβουλίου της 20ής Ιουλίου 1970 περί
εισαγωγής κοινοτικών τρόπων λήψεως δειγµάτων και µεθόδωναναλύσεως για τον επίσηµο έλεγχο των ζωοτροφών (
1),όπως
τροποποιήθηκε µε την οδηγία 72 /275/ΕΟΚ της 20ής Ιουλίου
1972(2),και ιδίως το άρθρο 2,
Εκτιµώντας:ότι η ανωτέρω οδηγία προβλέπει ότι οι επίσηµοι έλεγχοι των
ζωοτροφών για να διαπιστωθεί αν οι όροι, οι οποίοι έχουν καθο-ρισθεί δυνάµει νοµοθετικών, κανονιστικών ή διοικητικώνδιατάξεων, για την ποιότητα και τη σύνθεση των ζωοτροφών
τηρούνται κατά τους κοινοτικούς τρόπους λήψεως δειγµάτων και
τις κοινοτικές µεθόδους αναλύσεως ·
ότι οι οδηγίες της Επιτροπής 71 /250/ΕΟΚ, 71/393/ΕΟΚ και 72 /
199/ΕΟΚ της 15ης Ιουνίου 1971 (
3),της 18ης Νοεµβρίου 1971 (4)
και της 27ης Απριλίου 1972 (5),έχουν/ήδη καθορίσει ορισµένο
αριθµό κοινοτικών µεθόδων αναλύσεως ·ότι η πρόοδος της εργα-
σίας που έχει γίνει από τότε καθιστά αναγκαία την καθιέρωση
τετάρτης σειράς µεθόδων ·
ότι τα προβλεπόµενα στην παρούσα οδηγία µέτρα είναι σύµφωνα
µε τη γνώµη της Μόνιµης Επιτροπής Ζωοτροφών,
ΕΞΕ∆ΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ Ο∆ΗΓΙΑ:
Άρθρο 1
Τα Κράτη Μέλη καθορίζουν ότι οι αναλύσεις για τους επισήµους
ελέγχους των ζωοτροφών σχετικά µε τις περιεκτικότητες σευγρασία των ζωικών και φυτικών λιπών και ελαίων, καθώς καιτις περιεκτικότητες σε µαγνήσιο και σε ινώδεις ουσίες τωνζωοτροφών διενεργούνται κατά τις µεθόδους οι οποίες περιγρά-φονται στο παράρτηµα Iτης παρούσας οδηγίας.
Άρθρο 2
Τα Κράτη Μέλη καθορίζουν ότι οι αναλύσεις για τους επισήµους
ελέγχους των ζωοτροφών σχετικά µε τις περιεκτικότητες αυτώνσε ρητινόλη (βιταµίνη Α), θειαµίνη (ανευρίνη, βιταµίνη Β
1),
ασκορβικό οξύ και δεϋδρο -ασκορβικό οξύ (βιταµίνη C),διενερ-
γούνται κατά τις µεθόδους οι οποίες περιγράφονται στοπαράρτηµα IIτης παρούσας οδηγίας.1973L0046 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 2
(1)ΕΕ αριθ. Ν 170 της 3.8.1970, σ. 2 .
(2)ΕΕ αριθ. Ν 171 της 29.7.1972, σ. 39 .
(3)ΕΕ αριθ. Ν 155 της 12.7.1971, σ. 13 .
(4)ΕΕ αριθ. Ν 279 της 20.12.1971, σ. 7 .
(5)ΕΕ αριθ. Ν 123 της 29.5.1972, σ. 6 .▼M1
▼B
▼M1
Άρθρο 3
Τα Κράτη Μέλη θέτουν σε ισχύ την 1η Ιανουαρίου 1974 το αργό-
τερο τις αναγκαίες νοµοθετικές, κανονιστικές ή διοικητικές
διατάξεις για να συµµορφωθούν µε τις διατάξεις της παρούσαςοδηγίας. Ενηµερώνουν αµέσως περί αυτού την Επιτροπή.
Άρθρο 4
Η παρούσα οδηγία απευθύνεται στα Κράτη Μέλη.1973L0046 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 3
▼B
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι
1.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΟΣ ΣΕ ΥΓΡΑΣΙΑ ΤΩΝ
ΖΩΙΚΩΝ ΚΑΙ ΦΥΤΙΚΩΝ ΛΙΠΩΝ ΚΑΙ ΕΛΑΙΩΝ
1.Αντικείµενο και τοµέας εφαρµογής
Η µέδοθος επιτρέπει τον προσδιορισµό της περιεκτικότητος σε
υγρασία (ύδωρ και άλλες πτητικές ουσίες) των ζωικών και φυτικών
λιπών και ελαίων.
2.Αρχή
Το δείγµα υφίσταται ξήρανση σε 103 ºCµέχρι σταθερού βάρους. Η
απώλεια βάρους προσδιορίζεται δια ζυγίσεως.
3.Συσκευές
3.1.Υποδοχέας (κάψα) επιπέδου πυθµένας από ανθεκτικό σε οξείδωση
υλικό, διαµέτρου 8 έως 9 cmκαι ύψους περίπου 3 cm.
3.2.Υδραργυρικό θερµόµετρο µε ενισχυµένο βολβό και θάλαµο
διαστολής στο άνω άκρο, διαβαθµισµένο µεταξύ 80 ºCπερίπου
έως 110ºCτουλάχιστον, µήκους 10 cmπερίπου.
3.3.Αµµόλουτρο ή θερµαινόµενη ηλεκτρική πλάκα.
3.4.Ξηραντήρας που περιέχει δραστικό αφυδατικό µέσο.
3.5.Αναλυτικός ζυγός.
4.Τρόπος εργασίας
Ζυγίζεται ποσότητα δείγµατος 20 gπερίπου, µε προσέγγιση 1 mg,
οµογενοποιείται εντός του ξηρού υποδοχέα (3.1), του οποίου έχει
ληφθεί το απόβαρο και ο οποίος περιέχει το θερµόµετρο (3.2).
Θερµαίνεται επί του αµµολούτρου ή επί της θερµαινοµένης πλακός
(3.3), ανακινώντας σταθερά µε το θερµόµετρο έτσι ώστε η θερµο-
κρασία να ανέλθει στους 90 ºCεντός 7περίπου λεπτών.
Μειώνεται η ένταση της θερµάνσεως, ανάλογα µε τη συχνότητα
ανόδου των φυσαλλίδων από τον πυθµένα του υποδοχέα. Η θερµο-
κρασία δεν πρέπει να υπερβεί τους 105 ºC.Συνεχίζεται η ανακίνηση
αποξύνοντας τον πυθµένα του υποδοχέα µέχρι να παύσουν να δηµιουρ-
γούνται φυσαλλίδες.
Για να εξασφαλισθεί η πλήρης αποµάκρυνση της υγρασίας, επανα-
λαµβάνεται πολλές φορές η θέρµανση στους 103 ºC ±2 ºC, µε ψύξη
στους 93ºCµεταξύ των διαδοχικών θερµάνσεων. Ακολούθως αφήνεται
να ψυχθεί εντός του ξηραντήρος (3.4) µέχρι θερµοκρασίας δωµατίου
και ζυγίζεται. Επαναλαµβάνεται η εργασία αυτή µέχρις ότου η
απώλεια µάζας µεταξύ δύο διαδοχικών ζυγίσεων να µην υπερβαίνει τα
2mg.
Σηµείωση: Αύξηση της µάζας του δείγµατος κατόπιν επανειληµµένων
θερµάνσεων δείχνει οξείδωση του λίπους. Στην περίπτωση
αυτή το αποτέλεσµα υπολογίζεται από τη ζύγιση η οποία
διενεργείται αµέσως πριν αρχίσει να αυξάνεται η µάζα.
5.Υπολογισµός των αποτελεσµάτων
Η επί τοις εκατό περιεκτικότητα σε υγρασία του δείγµατος δίδεται
από τον τύπο:
M1/C0M2 ðÞ /C1100
Μ0
όπου:
M0=µάζα, σε γραµµάρια, της ποσότητος του δείγµατος.
Μ1=µάζα, σε γραµµάρια, του υποδοχέα και του περιεχοµένου του
πριν από τη θέρµανση.
Μ2=µάζα, σε γραµµάρια, του υποδοχέα και του περιεχοµένου µετά
τη θέρµανση.
Αποτελέσµατα µικρότερα των 0,05 %πρέπει να καταχωρούνται µε την
ένδειξη«µικρότερα των 0,05 %».1973L0046 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 4
▼B
Επαναληπτικότητα
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων δύο παραλλήλων προσδιορι-
σµών που έγιναν στο ίδιο δείγµα δεν πρέπει να υπερβαίνει το 0,05 %,
σε απόλυτη τιµή.
2.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΜΑΓΝΗΣΙΟΥ
—µε φασµατοφωτοµετρία ατοµικής απορροφήσεως —
1.Αντικείµενο και τοµέας εφαρµογής
Η µέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισµό του µαγνησίου στις
ζωοτροφές. Ενδείκνυται ιδιαίτερα για τον προσδιορισµό των περιεκτι-
κοτήτων σε µαγνήσιο που είναι µικρότερες του 5 %.
2.Αρχή
Το δείγµα αποτεφρώνεται και διαλύεται µέσα σε αραιό υδροχλωρικό
οξύ. Εφ'όσον δεν περιέχει οργανικές ουσίες διαλύεται απευθείας
µέσα σε αραιό υδροχλωρικό οξύ. Το διάλυµα αραιώνεται και η περιε-
κτικότητα σε µαγνήσιο προσδιορίζεται µε φασµατοφωτοµετρία
ατοµικής απορροφήσεως στα 285,2 nm,δια συγκρίσεως µε πρότυπα
διαλύµατα.
3.Αντιδραστήρια
3.1.Υδροχλωρικό οξύ p.a. d: 1,16.
3.2.Υδροχλωρικό οξύ p.a. d: 1,19.
3.3.Μαγνήσιο σε ταινία ή σε σύρµα ή θειικό µαγνήσιο MgSO4·7 H2O
a.p.αποξηραµένο σε κενό, σε θερµοκρασία δωµατίου.
3.4.∆ιάλυµα άλατος στροντίου (χλωριούχου ή νιτρικού) 2,5 % (w/v)σε
στρόντιο ( = 76,08g SrCl2·6 H2O p.a.,ή6 0· 38g Sr(N Ο3)2p.a.).
3.5.Πρότυπο διάλυµα µαγνησίου: ζυγίζεται 1 gµαγνησίου (3.3), µε
προσέγγιση 1 mgαφού προηγουµένως απαλλαγεί προσεκτικά από
το επίστρωµα του οξειδίου του, ή αντίστοιχη ποσότητα θειικού
µαγνησίου (3.3). Εισάγεται σε ογκοµετρική φιάλη των 1000 ml,
προστίθενται 80 mgυδροχλωρικού οξέος (3.1), αφήνεται να
διαλυθεί και συµπληρώνεται µέχρι 1000 ml µε ύδωρ. 1 mlτου
διαλύµατος αυτού περιέχει 1000 mg µαγνησίου.
4.Συσκευές
4.1.Χωνευτήρια αποτεφρώσεως από πλατίνα, χαλαζία ή πορσελάνη.
4.2.Ηλεκτρικός κλίβανος µε θερµοστάτη.
4.3.Φασµατοφωτόµετρο ατοµικής απορροφήσεως.
5.Τρόπος εργασίας
5.1.Παρασκευή του διαλύµατος του δείγµατος
5.1.1Ζωοτροφές αποτελούµενες αποκλειστικά από ανόργανες υσίες
Ζυγίζονται 5 gδείγµατος µε προσέγγιση 1 mgκαι
εισάγονται εντός ογκοµετρικής φιάλης των 500 mlµε 250
έως 300mlύδατος. Προστίθενται 40 mlυδροχλωρικού οξέος
(3.1), φέρεται σε βρασµό και διατηρείται το υγρό σε ήπιο
βρασµό επί 30 λεπτά. Αφήνεται να ψυχθεί, συµπληρώνεται
ο όγκος µε ύδωρ, οµογενοποιείται και διηθείται σε ξηρόυάλινο ποτήρι ζέσεως µε ξηρό πτυχωτό ηθµό. Απορρί-
πτονται τα πρώτα 30 mlτου διηθήµατος. Παρουσία
διοξειδίου του πυριτίου κατεργάζονται 5 gτου δείγµατος µε
επαρκή ποσότητα (15 µέχρι 30 ml)υδροχλωρικού οξέος (3.2)
και εξατµίζεται µέχρι ξηρού σε υδρόλουτρο. Συνεχίζεται η
διαδικασία, όπως υποδεικνύεται στην 5.1.2 από την τρίτη
φράση και µετέπειτα.
5.1.2Ζωοτροφές αποτελούµενες κυρίως από ανόργανες ουσίες.
Ζυγίζονται 5 gδείγµατος µε προσέγγιση 1 mgεντός
χωνευτηρίου και αποτεφρώνονται σε 550 ºCστον ηλεκτρικό
κλίβανο, µέχρι να ληφθεί τέφρα απαλλαγµένη ανθρακωδών
σωµατιδίων. Για την αποµάκρυνση του διοξειδίου του πυρι-
τίου προστίθεται στην τέφρα επαρκής ποσότητα (15 µέχρι
30ml)υδροχλωρικού οξέος (3.2) και εξατµίζεται µέχρι1973L0046 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 5
▼B
ξηρού σε υδρόλουτρο. Αποξηραίνεται ακολούθως επί µια
ώρα εντός πυριαντηρίου στους 105 ºC.Επαναλαµβάνεται η
κατεργασία του υπολείµµατος µε 10 mlυδροχλωρικού οξέος
(3.1) και µεταφέρεται µε τη χρήση θερµού ύδατος εντός
ογκοµετρικής φιάλης των 500 ml.Φέρεται σε βρασµό,
αφήνεται να ψυχθεί και συµπληρώνεται ο όγκος µε ύδωρ.
Οµογενοποιείται και διηθείται σε ξηρό υάλινο ποτήρι
ζέσεως, µε ξηρό πτυχωτό ηθµό. Απορρίπτονται τα πρώτα
30mlτου διηθήµατος.
5.1.3Ζωοτροφές αποτελούµενες κυρίως από οργανικές ουσίες
Ζυγίζονται 5 gδείγµατος µε προσέγγιση 1 mgεντός
χωνευτηρίου και αποτεφρώνονται στον κλίβανο, στους
550ºC,µέχρι να ληφθεί τέφρα απαλλαγµένη ανθρακωδών
σωµατιδίων. Επαναλαµβάνεται η κατεργασία της τέφρας µε
5mlυδροχλωρικού οξέος (3.2), εξατµίζεται µέχρι ξηρού σε
υδρόλουτρο και ξηραίνεται ακολούθως επί µια ώρα εντός
πυριαντηρίου στους 105 ºC,προς αδιαλυτοποίηση του διοξει-
δίου του πυριτίου. Επαναλαµβάνεται η κατεργασία του
υπολείµµατος µε 5 mgυδροχλωρικού οξέος (3.1), µεταφέ-
ρεται µε τη χρήση θερµού ύδατος εντός ογκοµετρικής
φιάλης των 250 ml,φέρεται σε βρασµό, αφήνεται να ψυχθεί
και συµπληρούται ο όγκος µε ύδωρ. Οµογενοποιείται και
διηθείται σε ξηρό υάλινο ποτήρι ζέσεως µε ξηρό πτυχωτό
ηθµό. Απορρίπτονται τα πρώτα 30 mlτου διηθήµατος.
5.2Μέτρηση της ατοµικής απορροφήσεως
Παρασκευάζονται, δια αραιώσεως του προτύπου διαλύµατος (3.5)
δι'ύδατος, τουλάχιστον 5 διαλύµατα αναφοράς µε αυξανόµενες
συγκεντρώσεις, που εκλέγονται συναρτήσει της βελτίστης
(optimum) ζώνης µετρήσεων του φασµατοφωτοµέτρου.
Προστίθενται σε κάθε διάλυµα 10 mlδιαλύµατος άλατος στρον-
τίου (3.4) και ακολούθως συµπληρώνεται ο όγκος µέχρις 100 ml
µε ύδωρ. Αραιώνεται µε ύδωρ µέρος της ποσότητος του ληφθέντος
διηθήµατος στην 5.1.1, 5.1.2 ή 5.1.3 κατά τρόπο επιτρέποντα την
επίτευξη συγκεντρώσεως µαγνησίου η οποία να ευρίσκεται µέσα
στα όρια της συγκεντρώσεως των διαλυµάτων αναφοράς. Η
συγκέντρωση του υδροχλωρικού οξέους του διαλύµατος αυτού
δεν πρέπει να υπερβαίνει το 0,4 Ν. Προστίθενται 10 mlδιαλύ-
µατος άλατος στροντίου (3.4) και ακολούθως συµπληρώνεται ο
όγκος µέχρι 100 mlδι'ύδατος. Μετράται η απορρόφηση του προς
προσδιορισµό διαλύµατος και των διαλυµάτων αναφοράς σε µήκος
κύµατος 285,2 nm.
6.Υπολογισµός των αποτελεσµάτων
Η ποσότητα µαγνησίου του δείγµατος υπολογίζεται από τα διαλύµατα
αναφοράς. Το αποτέλεσµα εκφράζεται επί τοις εκατό του δείγµατος.
Επαναληπτικότητα
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων δύο παραλλήλων προσδιορι-
σµών που έγιναν στο ίδιο δείγµα δεν πρέπει να υπερβαίνει το 5 %,σε
σχετική τιµή.
3.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΙΝΩ∆ΩΝ ΟΥΣΙΩΝ
1.Σκοπός και αντικείµενο
Η µέθοδος αυτή καθιστά δυνατό τον προσδιορισµό οργανικών ουσιών
απηλλαγµένων λίπους σε ζωοτροφές, αδιάλυτων σε όξινα και
αλκαλικά µέσα και συµβατικά περιγραφόµενων ως ινώδεις ουσίες.
2.Αρχή
Το δείγµα, απολιπωµένο εφόσον κριθεί απαραίτητο, επεξεργάζεται
διαδοχικά µε ζέοντα διαλύµατα θειικού οξέος και υδροξείδιου του
καλίου καθορισµένων συγκεντρώσεων. Το ίζηµα διαχωρίζεται µε
διήθηση επί ηθµού πεφρυγµένης υάλου, εκπλύεται, ζυγίζεται και
αποτεφρώνεται εντός εύρους 475 έως 500 ºC .Η απώλεια βάρους που
προκύπτει από την αποτέφρωση αντιστοιχεί στις ινώδεις ουσίες που
υπάρχουν στο εξεταζόµενο δείγµα.1973L0046 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 6
▼M2
▼M2
3.Αντιδραστήρια
3.1.Θειικό οξύ, c=0,13 mol/l
3.2.Αντιαφριστικός παράγοντας (π.χ. η -οκτανόλη)
3.3.Βοηθητικό διήθησης ( Celite 545 ή ισοδύναµο), θερµανθέν στους
500ºCεπί τέσσερις ώρες (8.6)
3.4.Ακετόνη
3.5.Πετρελαϊκός αιθέρας —εύρους ζέσεως 40 έως 60 ºC
3.6.Υδροχλωρικό οξύ, c=0,5 mol/l
3.7.∆ιάλυµα υδροξειδίου του καλίου c=0,23 mol/l
4.Όργανα
4.1.Μονάδα θέρµανσης για πέψη µε θειικό οξύ ή διάλυµα υδροξειδίου
του καλίου, εξοπλισµένη µε στήριγµα για το χωνευτήριο
διήθησης (4.2) και εφοδιασµένη µε σωλήνα εξαγωγής µε πώµα
προς την εξαγωγή του υγρού και κενό, πιθανόν µε πιεσµένο
αέρα. Η µονάδα προθερµαίνεται καθηµερινά πριν τη χρήση µε
ζέον ύδωρ επί πέντε λεπτά
4.2.Γυάλινο χωνευτήρι διήθησης (υαλοηθµός), µε πλάκα διήθησης
από συντηχθέν πεφρυγµένο γυαλί µεγέθους πόρων 40 έως 90 µ m.
Πριν από την πρώτη χρήση, θερµαίνεται στους 500 ºCεπί λίγα
λεπτά και ψύχεται (8.6)
4.3.Κύλινδρος τουλάχιστον 270 ml,µε συµπυκνωτή επαναρροής,
κατάλληλος για ζέση
4.4.Πυριατήριο µε θερµοστάτη
4.5.Κλίβανος πυρώσεως µε θερµοστάτη
4.6.Μονάδα ψυχρής εκχύλισης αποτελούµενη από πλάκα στήριξης
για το χωνευτήρι διήθησης (4.2) και µε σωλήνα απόρριψης µε
πώµα προς το κενό και την εξαγωγή του υγρού
4.7.Συνδετικοί δακτύλιοι προς συναρµολόγηση της µονάδας
θέρµανσης (4.1), του χωνευτήριου (4.2) και του κυλίνδρου
θέρµανσης (4.3) και σύνδεσης της µονάδας ψυχρής εκχύλισης
(4.6) και χωνευτηρίου
5.Μεθοδολογία
Ζυγίζεται µε ακρίβεια 1 mg, 1 gτου προετοιµασθέντος δείγµατος, και
µεταφέρεται σε ένα χωνευτήρι (4.2) (βλέπε σηµεία 8.1, 8.2 και 8.3) και
προστίθεται 1 gβοηθητικό διήθησης (3.3).
Η µονάδα θέρµανσης (4.1) και το χωνευτήρι διήθησης (4.2) συναρµο-
λογούνται, µετά προσαρµόζεται ο κύλινδρος ζέσης (4.3) στο
χωνευτήρι. Μεταφέρονται στον κύλινδρο ζέσης 150 mlθειικό οξύ
(3.1) που έχουν ήδη θερµανθεί µέχρι του σηµείου ζέσης και
προστίθενται λίγες σταγόνες αντιαφριστικού παράγοντα (3.2), εφόσον
χρειαστεί. Το υγρό φέρεται σε βρασµό µέσα σε 5 ±2λεπτά και ζέεται
ζωηρά επί ακριβώς 30 λεπτά.
Ανοίγεται το πώµα του σωλήνα απόρριψης (4.1) και, υπό κενό,
διηθείται το θειικό οξύ µέσα από το χωνευτήρι διήθησης και το ίζηµα
εκπλύεται τρεις φορές διαδοχικά, µε 30 mlζέοντος ύδατος κάθε φορά
εξασφαλίζοντας ότι το ίζηµα διηθείται µέχρι στεγνού µετά από κάθε
έκπλυση.
Κλείνεται το πώµα εξαγωγής και µεταφέρονται 150 mlζέοντος διαλύ-
µατος υδροξείδιου του καλίου (3.7) στον συναρµολογηµένο κύλινδρο
ζέσης µε το χωνευτήριο.
Προστίθενται λίγες σταγόνες αντιαφριστικού παράγοντα (3.2). Το υγρό
φέρεται σε βρασµό µέσα σε 5 ±2λεπτά και ζέεται ζωηρά επί ακριβώς
30 λεπτά. Επαναλαµβάνεται η διήθηση και έκπλυση µε τον ίδιο τρόπο
όπως στο στάδιο επεξεργασίας µε το θειικό οξύ.
Μετά την τελική έκπλυση και στέγνωµα αποσυνδέεται το χωνευτήρι
µε τα περιεχόµενά του και επανασυνδέεται µε τη µονάδα ψυχρής εκχύ-
λισης (4.6). Εφαρµόζεται κενό και το ίζηµα στο χωνευτήρι εκπλύεται
τρεις φορές διαδοχικά µε 25 mlακετόνης (3.4) κάθε φορά, εξασφαλί-
ζοντας ότι το ίζηµα διηθείται µέχρι στεγνού µετά από κάθε έκπλυση.
Το χωνευτήρι διήθησης ξηραίνεται µέχρι σταθερού βάρους µέσα στο
πυρατήριο στους 130 ºC .Μετά από κάθε ξήρανση ψύχεται µέσα στον1973L0046 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 7
▼M2
ξηραντήρα και ζυγίζεται γρήγορα. Μετά το χωνευτήρι τοποθετείται
µέσα στον κλίβανο πυρώσεως και τα περιεχόµενα αποτεφρώνονται
στους 475 ºCµε 500ºCεπί τουλάχιστον 30 λεπτά, µέχρι σταθερού
βάρους.
Μετά από κάθε αποτέφρωση, ψύχεται πρώτα µέσα στον κλίβανο πυρώ-
σεως και µετά στον ξηραντήρα πριν από τη ζύγιση.
Εκτελείται µια λευκή δοκιµή χωρίς το δείγµα. Η απώλεια του βάρους
που προκύτπει από την αποτέφρωση δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 4 mg.
6.Υπολογισµός αποτελεσµάτων
Η περιεκτικότητα σε ινώδεις ουσίες ως ποσοστό επί τις εκατό του
δείγµατος δίνεται από την έκφραση:
b/C0c ½/C138 /C2 100
a
όπου
a=µάζα δείγµατος σε g,
b=απώλεια µάζης µετά την αποτέφρωση κατά τον προσδιορισµό, σε
g,
c=απώλεια µάζης µετά την αποτέφρωση κατά τη λευκή δοκιµή, σε
g.
7.Επαναληπτικότητα
Η διαφορά µεταξύ δύο παραλλήλων µετρήσεων που διεξάγονται στο
ίδιο δείγµα δεν πρέπει να υπερβαίνει:
— 0,3σε απόλυτη τιµή για περιεκτικότητα σε ακατέργαστες ινώδεις
ουσίες µικρότερες από 10 %,
—3% σε σχέση µε το υψηλότερο ποσοστό για περιεκτικότητα σε
ακατέργασες ινώδεις ουσίες ίση ή µεγαλύτερη του 10 %.
8.Παρατηρήσεις
8.1.Ζωοτροφές που περιέχουν περισσότερο από 10 %ολικές λιπαρές
ουσίες πρέπει να απολιπωθούν, πριν από την ανάλυση, µε πετρε-
λαϊκό αιθέρα (3.5). Το χωνευτήρι διήθησης (4.2) µε το ζυγισµένο
δείγµα συνδέεται µε τη µονάδα ψυχρής εκχύλισης (4.6) και το
ίζηµα εκπλύεται τρεις φορές υπό κενό µε 30 mlπετρελαϊκό αιθέρα
(3.5) κάθε φορά, εξασφαλίζοντας ότι το ίζηµα διηθείται µέχρι
στεγνού. Το χωνευτήρι (4.2) µε το περιεχόµενό του συνδέεται µε
τη µονάδα θέρµανσης (4.1) και συνεχίζουµε όπως περιγράφηκε
στο σηµείο 5.
8.2.Ζωοτροφές που περιέχουν λίπη που δεν µπορούν να εκχυλιστούν
άµεσα µε πετρελαϊκό αιθέρα πρέπει να απολιπωθούν κατά τα
παρουσιασθέντα στο σηµείο 8.1 και να απολιπωθούν για µία
ακόµη φορά µετά από το βρασµό µε οξύ. Μετά από το βρασµό µε
οξύ και την ακόλουθη έκπλυση, το χωνευτήρι µε τα περιεχόµενα
συνδέεται µε τη µονάδα ψυχρής εκχύλισης (4.6) και εκπλύνεται
τρεις φορές µε 30 mlακετόνης κάθε φορά, και στη συνέχεια
εκπλύνεται τρεις φορές µε 30 mlπετρελαϊκό αιθέρα κάθε φορά.
∆ιηθείται υπό κενό και η ανάλυση συνεχίζεται όπως περιγράφηκε
στο σηµείο 5, αρχίζοντας µε επεξεργασία µε υδροξείδιο του
καλίου.
8.3.Εάν οι ζωοτροφές περιέχουν περισσότερο από 5 %ανθρακικά,
εκφρασµένα ως ανθρακικό ασβέστιο, το χωνευτήρι (4.2) µε το
ζυγισµένο δείγµα συνδέεται µε τη µονάδα θέρµανσης (4.1). Το
δείγµα εκπλύεται τρεις φορές µε 30 mlυδροχλωρικού οξέος (3.6).
Μετά από κάθε προσθήκη το δείγµα αφήνεται ήρεµο επί ένα
λεπτό πριν διηθηθεί. Εκπλύεται µία φορά µε 30 mlύδωρ και µετά
συνεχίζουµε όπως περιγράφηκε στο σηµείο 5.
8.4.Εάν χρησιµοποείται ένα όργανο στη µορφή µιας εξέδρας (πολλά
χωνευτήρια προσαρµοσµένα στην ίδια µονάδα θέρµανσης) δεν
µπορούν να εκτελεστούν δύο ατοµικοί προσδιορισµοί για
ανάλυση στο ίδιο δείγµα µέσα στις ίδιες σειρές.
8.5.Εάν είναι δύσκολο, µετά από βρασµό, να διηθούντα όξινα και
αλκαλικά διαλύµατα, εισάγεται πιεσµένος αέρας µέσα από το
σωλήνα απόρριψης της µονάδας θέρµανσης και µετά συνεχίζεται
η διήθηση.1973L0046 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 8
▼M2
8.6.Η θερµοκρασία αποτέφρωσης δεν πρέπει να είναι υψηλότερη από
500ºCώστε να παραταθεί ο χρόνος ζωής των γυάλινων χωνευτή-
ριων διήθησης. Πρέπει να λαµβάνεται µέριµνα ώστε να
αποφεύγεται υπερβολική θερµική καταπόνηση κατά τη διάρκεια
των κύκλων θέρµανσης της ψύξης.1973L0046 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 9
▼B
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ
1.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΡΗΤΙΝΟΛΗΣ ( RETINOL) ( ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ Α)
1.Αντικείµενο και τοµέας εφαρµογής
Η µέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισµό της ρητινόλης ( Retinol) ( Βιτα-
µίνη Α) εντός των ζωοτροφών, των συµπυκνωµάτων και των
προµιγµάτων. Το κατώτατο όριο του προσδιορισµού είναι 10000 IU/kg
για ζωοτροφές εντόνως κεχρωσµένες και 4000 IU/kg για τα λοιπά
προϊόντα(1).Τα προϊόντα κατατάσσονται σε δύο οµάδες, αναλόγως
της υποτιθέµενης περιεκτικότητος αυτών σε ρητινόλη:
Οµάδα Α: Περιεκτικότητες µικρότερες των 200000 IU/kg·
Οµάδα Β: Περιεκτικότητες ίσες ή υψηλότερες των 200000 IU/kg.
2.Αρχή
Το δείγµα υφίσταται υδρόλυση εν θερµώ µε διάλυµα υδροξειδίου του
καλίου εντός αιθανολικού µέσου και παρουσία αντιοξειδωτικού µέσου
ή σε ατµόσφαιρα αζώτου. Το µίγµα υπόκειται σε εκχύλιση µε 1,2 -
διχλωροαιθάνιο. Το εκχύλισµα εξατµίζεται εν ξηρώ και επαναλαµβά-
νεται η επεξεργασία µε πετρελαϊκό αιθέρα. Το διάλυµα
χρωµατογραφείται επί στήλης οξειδίου του αργιλίου (για τα προϊόντα
της οµάδος Β, η χρωµατογραφία απαιτείται µόνο σε ορισµένες περι-
πτώσεις). Για τα προϊόντα της οµάδος Α, η ρητινόλη προσδιορίζεται
µε φασµατοφωτοµέτρηση σε 610 nmκατόπιν της αναπτύξεως
εγχρώµου συµπλόκου κατά την αντίδραση του Carr-Price. Για τα
προϊόντα της οµάδος Β µε φασµατοφωτοµέτρηση στο UVσε 325nm.
3.Αντιδραστήρια
α)χρησιµοποιούµενα για ανάλυση προϊόντων των οµάδων Α και Β.
3.1.Αιθανόλη 96 %(κ.ό.).
3.2.∆ιάλυµα 10 %(κ.ό) ασκορβικού νατρίου a.p,ή
3.3.Καθαρισµένο άζωτο.
3.4.∆ιάλυµα 50 %(κ.ό.) υδροξειδίου του καλίου a.p.
3.5.∆ιάλυµα υδροξειδίου του καλίου 1 Ν a.p.
3.6.∆ιάλυµα υδροξειδίου του καλίου 0,5 Ν a.p.
3.7. 1,2- διχλωραιθάνιο a.p.
3.8.Πετρελαϊκός αιθέρας, σηµείο ζέσεως: 30 -50 ºC. Εφ'όσον
παρίσταται ανάγκη, καθαρίζεται ως ακολούθως: Ανακινούνται
1000 ml πετρελαϊκού αιθέρα µε δόσεις 20 mlπυκνού θειικού
οξέος µέχρι του σηµείου κατά το οποίο το οξύ παραµένει
άχρουν. Αποµακρύνεται το οξύ και εκπλύνεται ο αιθέρας
διαδοχικά µε 500 mlύδατος, δύο φορές µε 250 mlδιαλύµατος
10%υδροξειδίου του νατρίου και τρεις φορές µε 500 ml
ύδατος. Αποµακρύνεται η υδατική στιβάδα, ξηραίνεται ο
αιθέρας επί µια ώρα επί ενεργού άνθρακος και ανύδρου
θειικού νατρίου, διηθείται και αποστάζεται.
3.9.Οξείδιο του αργιλίου, τυποποιηµένο κατά Brockmann: πυρώ-
νεται επί 8 ώρες σε 750 ºC,ψύχεται σε ξηραντήρα και
διατηρείται σε υάλινη φιάλη φαιού χρώµατος µετά εσµυρι-
σµένου πώµατος. Πριν χρησιµοποιηθεί σε χρωµατογραφία
υγραίνεται ως ακολούθως: Εισάγονται σε υάλινη φιάλη φαιού
χρώµατος 10 gοξειδίου του αργιλίου και 0,7 mlύδατος, η
φιάλη πωµατίζεται ερµητικά, επαναθερµαίνεται επί 5 λεπτά
εντός ζέοντος υδρολούτρου µε ισχυρή ανακίνηση. Αφήνεται
να ψυχθεί ενώ ανακινείται. Ελέγχεται η δραστικότητα του
παρασκευασθέντος κατ 'αυτόν τον τρόπον οξειδίου του αργι-
λίου δια της αναλύσεως κατά 5.3 και 5.4 γνωστής ποσότητος
προτύπου ρητινόλης (3.17).
3.10Βασικό οξείδιο του αργιλίου, βαθµός δραστικότητος 1.
3.11.Καθαρός διαιθυλικός αιθέρας: αποµακρύνονται τα υπερο-
ξείδια και τα ίχνη ύδατος µε χρωµατογραφία επί στήλης1973L0046 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 10
(1) IU = 0,3 µgρητινόλης
▼B
βασικού οξειδίου του αργιλίου (3.10) (25 gοξειδίου του αργι-
λίου σε 250 mlαιθέρα).
3.12.∆ιαλύµατα πετρελαϊκού αιθέρος (3.8) σε 4,8,12,16 και 20 %
(ό.ό.) αιθέρος (3.11).
3.13.∆ιάλυµα θειούχου νατρίου 0,5 moleεντός γλυκερίνης 70 %
(ό.ό.) παρασκευασθέν εκ θειούχου νατρίου a.p.
β)χρησιµοποιούµενα αποκλειστικά για ανάλυση προϊόντων της οµάδος Α
3.14Κρυσταλλώσιµο βενζόλιο a.p.
3.15.Χλωροφόρµιο a.p.:αποµακρύνεται η αιθανόλη, το φωσγένιο
και τα ίχνη ύδατος µε χρωµατογραφία στήλης βασικού οξει-
δίου του αργιλίου (3.10) (50 gοξειδίου του αργιλίου σε 200 ml
χλωροφορµίου). Ενδείκνυται να χρωµατογραφούνται για
δεύτερη φορά τα 50 πρώτα ml.
3.16.Αντιδραστήριο Carr-Price: ανακινούνται 25 gπερίπου τριχλω-
ριούχου αντιµονίου a.p. (διατηρηµένου σε ξηραντήρα) µε
100mlχλωφορµίου (3.15) µέχρι κορεσµού του διαλύµατος.
Ελαφρά απόθεση τριχλωριούχου αντιµονίου δεν ενοχλεί.
Προστίθενται 2 mlοξικού ανυδρίτου a.p.∆ιατηρείται σε
ψυγείο µέσα σε υάλινη φιάλη φαιού χρώµατος µε εσµυρι-
σµένο πώµα. ∆ιάρκεια διατηρήσεως: πολλές εβδοµάδες.
3.17.Πρότυπος ρητινόλη, ελεγχόµενη µε φασµατοφωτοµέτρηση.
γ)χρησιµοποιούµενα αποκλειστικά για ανάλυση προϊόντων της οµάδος Β
3.18.Ισοπροπανόλη χρωµατογραφίας.
4.Συσκευές
4.1.Υδρόλουτρο
4.2.Περιστροφική συσκευή εξατµίσεως σε κενό µε σφαιρικές φιάλες
διαφόρου χωρητικότητος.
4.3.Υάλινοι σωλήνες χρωµατογραφίας (µήκος: 300 mm·εσωτερική
διάµετρος: 13 mmπερίπου).
4.4.Φασµατοφωτόµετρο µε κυψελίδες 10 mmπάχους (από χαλαζία για
µετρήσεις σε UV).
4.5.Λαµπτήρες UV, 365 nm.
5.Τρόπος εργασίας
Σηµείωση: Όλες οι εργασίες πρέπει να διενεργούνται µακριά από το
ελεύθερο φως, ενδεχοµένως σε χώρο εφοδιασµένο µε φαιά
ύαλο.
5.1Ποσότητα δείγµατος
Λαµβάνεται ποσότητα δείγµατος, λεπτοτεµαχισµένη, αναλογική
της υποτιθέµενης περιεκτικότητος σε βιταµίνη Α, ως εξής:
0,1έως 1gγια συµπυκνώµατα ζωοτροφών (περιεκτικότητες
ανώτερες των 20000/g)·
3,0έως 5,0g,για προµίγµατα (περιεκτικότητα κυµαινόµενη µεταξύ
400 και20000 IU/g)·
10έως 20gγια ανόργανα µίγµατα ·
30 gγια προϊόντα της οµάδος Α.
Εισάγεται αµέσως η ποσότητα του δείγµατος σε φιάλη 500 mlµε
εσµυρισµένο πώµα.
5.2Υδρόλυση και εκχύλιση (1)
Προστίθενται διαδοχικά στην ποσότητα του δείγµατος 40 mlαιθα-
νόλης (3.1), 2 mlδιαλύµατος ασκορβικού νατρίου (3.2), (2)1 0m l
διαλύµατος υδροξειδίου του καλίου (3.4) και 2 mlδιαλύµατος
θειούχου νατρίου (3.13).1973L0046 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 11
(1)Για υποκατάστατα γάλακτος και προϊόντα που έχουν τάση να σχηµατίζουν
συσσωµατώµατα ή να διογκώνονται διπλασιάζεται η ποσότητα των αντιδραστη-ρίων των υποδεικνυοµένων στο 5.2 πρώτη και δεύτερη παράγραφος.
(
2)Η προσθήκη ασκορβικού νατρίου δεν είναι απαραίτητη όταν η υδρόλυση
διενεργείται σε ατµόσφαιρα αζώτου.
▼B
Θερµαίνεται επί 30 λεπτά σε 70 -80 ºCσε κάθετο ψυκτήρα και
αφήνεται ακολούθως να ψυχθεί σε ρεύµα ύδατος. Προστίθενται
50mlαιθανόλης (3.1) και 100 ml (λαµβανόµενα µε σιφώνιο) 1,2 -
διχλωραιθανίου (3.7). Ανακινείται ισχυρά και εκχύνεται το
επιπλέον υγρό εντός διαχωριστικής χοάνης. Προστίθενται στη
διαχωριστική χοάνη 150 mlδιαλύµατος υδροξειδίου του καλίου
(3.5), ανακινείται επί 10 δευτερόλεπτα και αφήνεται σε ηρεµία
µέχρι διαχωρισµού των στιβάδων. Συλλέγεται η στιβάς διχλω-
ραιθανίου (κατωτέρα στιβάς) εντός διαχωριστικής χοάνης,
προστίθενται 40 mlδιαλύµατος υδροξειδίου του καλίου (3.6),
ανακινείται επί 10 δευτερόλεπτα και αφήνεται σε ηρεµία µέχρι
διαχωρισµού των στιβάδων. Συλλέγεται η στιβάς διχλωραιθανίου
σε διαχωριστική χοάνη και εκπλύνεται 6 έως 8 φορές µε δόσεις
40mlύδατος, µέχρις εξαφανίσεως του αλκάλεως (δοκιµασία φαινο-
λοφθαλεΐνης). Συλλέγεται η στιβάς διχλωραιθανίου και
αποµακρύνονται τα τελευταία ίχνη ύδατος µε λωρίδες διηθητικού
χάρτου.
Εξατµίζεται εν ξηρώ µέρος της ποσότητος του διαλύµατος σε κενό
και επί υδρολούτρου σε θερµοκρασία 40 ºC.Κατεργάζεται ταχέως
το υπόλειµµα µε 5 mlπετρελαϊκού αιθέρα (3.8).
Για τα προϊόντα της οµάδος Α διενεργείται χρωµατογραφία όπως
υποδεικνύεται στο 5.3.1.
Για τα προϊόντα της οµάδος Β, µεταφέρεται το διάλυµα σε ογκοµε-
τρική φιάλη των 50 ml,συµπληρώνεται ο όγκος µε πετρελαϊκό
αιθέρα (3.8), οµογενοποιείται και µετράται η οπτική πυκνότητα
όπως αναφέρεται στο 5.4.2.
5.3Χρωµατογραφία
5.3.1Προϊόντα της οµάδος Α
Σωλήνας χρωµατογραφίας (4.3) πληρούται µέχρις ύψους
200mmµε οξείδιο του αργιλίου (3.9), προηγουµένως εµποτι-
σµένου µε πετρελαϊκό αιθέρα (3.8). Εισάγεται εντός του
σωλήνα το ληφθέν στο 5.2 διάλυµα και προστίθενται αµέσως
20mlπετρελαϊκού αιθέρα (3.8). Εκλούεται διαδοχικά µε
δόσεις των 10 mlδιαλυµάτων πετρελαϊκού αιθέρα σε 4, 8,
12, 16 και 20 %αιθέρα (3.12) υπό πίεση ή µερικό κενό, ενώ
η ταχύτητα ροής είναι 2 έως 3 σταγόνες ανά δευτερόλεπτο.
Αρχικά εκλούεται το καροτένιο (1).Η ρητινόλη εκλούεται
γενικώς µε διάλυµα πετρελαϊκού αιθέρα σε 20 %αιθέρα
(3.12). Η έκλουση ελέγχεται µε λαπτήρα UV (βραχεία ακτι-
νοβολία της στήλης µε λαµπτήρα υδραργύρου). Η ζώνη
φθορισµού της ρητινόλης διαχωρίζεται ευκρινώς από τις
κίτρινες ζώνες της ξανθοφύλλης οι οποίες την ακολουθούν.
Συλλέγεται το κλάσµα της εκλούσεως το οποίο περιέχει τη
ρητινόλη σε κωνική φιάλη Erlenmeyer.
5.3.2Προϊόντα της οµάδος Β
Χρωµατογραφία πρέπει να διενεργείται µόνον εφ 'όσον οι
µετρήσεις της οπτικής πυκνότητος οι οποίες ελήφθησαν στο
5.4.2 δεν είναι σύµφωνες προς τις προδιαγραφές οι οποίες
υποδεικνύονται στο 5.4.2.
Εάν η χρωµατογραφία αποδειχθεί απαραίτητη, εισάγεται
εντός της χρωµατογραφικής στήλης µέρος της ποσότητος
του διαλύµατος εντός πετρελαϊκού αιθέρα που έχει ληφθεί
στο 5.2, και περιέχει περίπου 500 IUρητινόλης και χρωµατο-
γραφείται όπως υποδεικνύεται στο 5.3.1.
5.4Μέτρηση της οπτικής πυκνότητος
5.4.1Προϊόντα της οµάδος Α
Εξατµίζεται εν ψυχρώ και υπό κενό η διάλυση που περιέχει
τη ρητινόλη, η ληφθείσα στο 5.3.1. Επαναλαµβάνεται η
επεξεργασία του υπολείµµατος µε 2 mlβενζολίου (3.14).
Λαµβάνονται 0,3 mlτου διαλύµατος αυτού και προστίθενται
3mlαντιδραστηρίου Carr-Price (3.16). Αναπτύσσεται κυανούς
χρωµατισµός. Μετράται η οπτική πυκνότητα στο φασµα-
τοφωτόµετρο σε 610 nm, 30δευτερόλεπτα ακριβώς µετά την1973L0046 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 12
(1)Η περιεκτικότητα σε καροτένιο δύναται να προσδιορισθεί µε µέτρηση της
οπτικής πυκνότητος σε 450 nm: E1%
1c m¼2600
▼B
έναρξη της αντιδράσεως. Προσδιορίζεται η περιεκτικότητα
σε ρητινόλη µε την αναφορά σε πρότυπο καµπύλη η οποία
ελήφθη από διαλύµατα βενζολίου αυξανοµένων συγκεντρώ-
σεων σε πρότυπο ρητινόλη κατειργασµένα µε το
αντιδραστήριο Carr-Price (2 έως 16IUπροτύπου βιταµίνης Α
(3.17) µε 0,3 mlβενζολίου (3.14) +3m lαντιδραστηρίου Carr-
Price (3.16). Η πρότυπος καµπύλη πρέπει να ελέγχεται
κανονικά και τακτικά µε τη χρήση του προτύπου και εντός
προσφάτως παρασκευασθέντος διαλύµατος αντιδραστηρίου
Carr-Price.
5.4.2Προϊόντα της οµάδας Β
Λαµβάνεται µέρος της ποσότητος του διαλύµατος σε πετρε-
λαϊκό αιθέρα το οποίο ελήφθη στο 5.2, περιέχον περίπου
200IUρητινόλης. Εξατµίζεται εν ξηρώ και εν κενώ και
επαναλαµβάνεται η κατεργασία του υπολείµµατος µε 25 ml
ισοπροπανόλης (3.18). Μετράται η οπτική πυκνότητα στο
φασµατοφωτόµετρο σε 325, 310 και 334 nm.Το µέγιστο της
απορροφήσεως κείται στα 325 nm.Η περιεκτικότητα του
διαλύµατος σε ρητινόλη Α υπολογίζεται ως ακολούθως:
Ε32518,30 = IU ρητινόλης
Εν τούτοις, οι σχέσεις των οπτικών πυκνοτήτων
Ε310:Ε325και Ε334:Ε325
πρέπει να είναι 6 : 7 = 0,857
Εάν µια των σχέσεων τούτων αποκλίνει ουσιωδώς από την
τιµή αυτή ( < 0.830 ή> 0,880), πρέπει να προηγείται της
µετρήσεως των οπτικών πυκνοτήτων χρωµατογραφία κατά
τη µέθοδο που υποδεικνύεται στο 5.3.2. Εάν η µέτρηση των
οπτικών πυκνοτήτων η οποία διενεργείται µετά από τη
χρωµατογραφία δείχνει ότι οι ανωτέρω αναφερόµενες
σχέσεις αποκλίνουν ακόµη ουσιωδώς από την τιµή 0,857
(< 0,830ή> 0,880), ο προσδιορισµός πρέπει να διενεργηθεί
κατά τη µέθοδο που υποδεικνύεται για τα προϊόντα της
οµάδος Α.
6.Υπολογισµός των αποτελεσµάτων
Η περιεκτικότητα σε ρητινόλη του δείγµατος υπολογίζεται µε βάση το
βάρος της ποσότητος του δείγµατος και των διενεργουµένων αραιώ-
σεων κατά τη διάρκεια της αναλύσεως. Το αποτέλεσµα εκφράζεται σε
IUρητινόλης ανά χιλιόγραµµο.
ΕπαναληπτικότηταΗ διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων δύο παραλλήλων προσδιορι-
σµών που έγιναν στο ίδιο δείγµα δεν πρέπει να υπερβαίνει το:
— 20%σε σχετική τιµή για περιεκτικότητες σε ρητινόλη µικρότερες
των75000 IU/kg·
— 15000 IU για περιεκτικότητες που κυµαίνονται µεταξύ 75000και
150000 IU/kg·
— 10%σε σχετική τιµή για περιεκτικότητες που κυµαίνονται µεταξύ
150000και250000 IU/kg·
— 250000 IU για περιεκτικότητες που κυµαίνονται µεταξύ 25000και
50000 IU/Kg·
—5 %σε σχετική τιµή για περιεκτικότητες ανώτερες των 500000 IU/
kg.
2.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΘΕΙΑΜΙΝΗΣ (ΑΝΕΥΡΙΝΗΣ, ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ
Β
1)
1.Αντικείµενο και τοµέας εφαρµογής.
Η µέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισµό της θειαµίνης (ανευρίνης,
βιταµίνης Β1)εντός των ζωοτροφών, των συµπυκνωµάτων ζωοτροφών
και των προµιγµάτων. Το κατώτερο όριο του προσδιορισµού είναι
5ppm.
2.Αρχή
Το δείγµα κατεργάζεται εν θερµώ µε αραιό θειικό οξύ και ακολούθως
υδρολύεται δια της ενζυµατικής οδού. Το διάλυµα το οποίο λαµβάνεται
υποβάλλεται σε αλκαλική οξείδωση. Το σχηµατιζόµενο θειόχρωµα
εκχυλίζεται µε ισοβουτανόλη και προσδιορίζεται δια φθοριοµετρίας.1973L0046 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 13
▼B
3.Αντιδραστήρια
3.1.Πρότυπο διάλυµα θειαµίνης σε 100 µ g/ml:∆ιαλύονται 112,3 mg
πολύ καθαρής υδροχλωρικής θειαµίνης, ξηρανθείσης προηγου-
µένως εν κενώ µέχρι σταθερού βάρους, εντός 1000 ml θειικού
οξέος 0,2 Ν (3.2). Το διάλυµα τούτο διατηρούµενο σε ψυχρό και
σκοτεινό µέρος, παραµένει σταθερό επί ένα µήνα.
3.2.Θειικό οξύ 0,2 Ν.
3.3.Καθαρό πυροθειώδες νάτριο, Na2S2O5.
3.4.∆ιάλυµα 20 %(κ.ό) σιδηροκυανιούχου καλίου a.p.
3.5.∆ιάλυµα 25 %(κ.ό) υδροξειδίου του καλίου a.p.
3.6.Οξειδωτικό µίγµα: Αναµιγνύονται 2 mlδιαλύµατος σιδηροκυα-
νιούχου καλίου (3.4) µε 48 mlδιαλύµατος υδροξειδίου του
καλίου (3.5). Το µίγµα αυτό δεν διατηρείται πέραν των τεσσάρων
ωρών.
3.7.Ισοβουτανόλη a.p.
3.8.∆ιάλυµα οξικού νατρίου 2,5 Ν.
3.9.Πολυενζυµατικό παρασκεύασµα περιέχον πρωτεάση, φωσφατάση
και αµυλάση (π.χ. clarase).
3.10.Αιθανόλη 96 %(κ.ό.)
4.Συσκευές
4.1.Υδρόλουτρο.
4.2.Φυγόκεντρος ( 3500στροφών ανά λεπτό) µε σωλήνες των 30 έως
50mlεφοδιασµένους µε εσµυρισµένα πώµατα.
4.3.Φθοριόµετρο.
5.Τρόπος εργασίας
5.1.Ενζυµατική υδρόλυση
Εισάγονται εντός δύο ογκοµετρικών φιαλών Α και Β των 250 ml
ίσες ποσότητες λεπτοτεµαχισµένου δείγµατος, περιέχουσες
100 µgπερίπου θειαµίνης και 125 mlθειικού οξέος (3.2).
Προστίθεται επί πλέον, µόνο στη φιάλη Α 1,0 mlπροτύπου διαλύ-
µατος (3.1) (εσωτερικό πρότυπο).
Ανακινούνται ισχυρά, φέρονται οι φιάλες επί ζέοντος υδρολού-
τρου και παραµένουν εκεί επί 15 λεπτά ανακινώντας από καιρού
σε καιρό. Αφήνονται να ψυχθούν µέχρι τους 45 ºCπερίπου.
Προστίθενται σε κάθε φιάλη 20 mlδιαλύµατος οξικού νατρίου
(3.8) και 0,5 gπολυενζυµατικού παρασκευάσµατος (3.9) και
αφήνονται ακολούθως σε ηρεµία επί 20 λεπτά σε θερµοκρασία
δωµατίου. Προστίθενται 20 mlδιαλύµατος οξικού νατρίου (3.8),
συµπληρούται ο όγκος µε ύδωρ, οµογενοποιείται και διηθείται.
Συλλέγονται τα διηθήµατα Α και Β κατόπιν απορρίψεως των 15
αρχικώνml.Παρασκευάζονται τα κάτωθι διαλύµατα:
5.1.1.∆ιάλυµα µάρτυς Τ
Εισάγονται σε σωλήνα φυγοκεντρήσεως (4.2) 5 mlδιηθή-
µατος Α και 10 mgπερίπου πυροθειώδους νατρίου (3.3).
Εµβαπτίζεται ο σωλήνας επί 15 λεπτά εντός ζέοντος υδρο-λούτρου και αφήνεται ακολούθως να ψυχθεί σε
θερµοκρασία δωµατίου.
5.1.2.∆ιάλυµα Α (εσωτερικού προτύπου) και Β (δείγµατος)
Εισάγονται 5 mlτου διηθήµατος Α εντός σωλήνος φυγοκεν-
τρήσεως (4.2) και 5 mlτου διηθήµατος Β εντός ετέρου
σωλήνος φυγοκεντρήσεως (4.2).
5.2.Οξείδωση
Προστίθενται στα διαλύµατα Τ, Α και Β, 5 mlοξειδωτικού
µίγµατος (3.6) και µετά πάροδο ενός λεπτού 10 mlισοβουτανόλης
(3.7). Πωµατίζονται οι σωλήνες και ανακινούνται ισχυρά επί 5
δευτερόλεπτα. Αφήνονται σε ηρεµία επί ένα λεπτό και φυγοκεν-
τρούνται προς διαχωρισµό των στιβάδων. Λαµβάνονται εντός
εκάστου σωλήνος 5 mlεκ της υπερκειµένης στιβάδος ισοβουτα-
νόλης, εισάγονται ακολούθως εντός ογκοµετρικών φιαλών των1973L0046 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 14
▼B
25ml,συµπληρούται ο όγκος µε αιθανόλη (3.10) και οµογενο-
ποιούνται ( =εκχυλίσµατα Τ, Α και Β).
5.3.Μέτρηση του φθορισµού
Οι µετρήσεις διενεργούνται σε µήκος κύµατος στο οποίο το
φθοριόµετρο δίδει µια βέλτιστη απάντηση στο φθορισµό του
θειοχρώµατος. Η ακτινοβολία πραγµατοποιείται σε 365 nm
περίπου.
Ρυθµίζεται το όργανο στο µηδέν µε τη χρήση του εκχυλίσµατος Τ.
Μετράται η ένταση φθορισµού των εκχυλισµάτων Α και Β.
6.Υπολογισµός των αποτελεσµάτων
Η περιεκτικότητα της θειαµίνης σε mgανά χιλιόγραµµο δείγµατος
δίδεται από τον τύπο:
δ/C1β
α/C0β ðÞγ
όπου:
α=ένταση φθορισµού του εκχυλίσµατος Α (εσωτερικού προτύπου) ·
β=ένταση φθορισµού του εκχυλίσµατος Β (δείγµατος) ·
γ=βάρος της ποσότητος του δείγµατος σε γραµµάρια ·
δ=ποσότητα θειαµίνης σε mgη οποία προστίθεται στην ποσότητα
του δείγµατος (εσωτερικού προτύπου) ·
Επαναληπτικότητα
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων δύο παραλλήλων προσδιορι-
σµών που έγιναν ίδιο δείγµα δεν πρέπει να υπερβαίνει το:
10%σε σχετική τιµή, για περιεκτικότητες µικρότερες των 500 ppm,
και
5%σε σχετική τιµή, για περιεκτικότητες ίσες ή µεγαλύτερες των
500ppm.
3.ΠΡΟΣ∆ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΑΣΚΟΡΒΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ΚΑΙ ΤΟΥ
∆ΕΫ∆ΡΟ -ΑΣΚΟΡΒΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ
(BITAMINH C)
1.Αντικείµενο και τοµέας εφαρµογής
Η µέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισµό της συνολικής ποσότητος του
ασκορβικού και του δεϋδρο -ασκορβικού οξέος (βιταµίνη C)εντός των
ζωοτροφών, των συµπυκνωµάτων ζωοτροφών και των προµιγµάτων. Το
κατώτατο όριο του προσδιορισµού είναι 5 ppm.Τα προϊόντα κατατάσ-
σονται σε δύο οµάδες, αναλόγως της υποτιθέµενης περιεκτικότητος
αυτών σε βιταµίνη C:
Οµάδα Α: περιεκτικότητες µικρότερες των 10 g/kg·
Οµάδα Β: περιεκτικότητες ίσες ή υψηλότερες των 10 g/kg.
2.Αρχή
Το δείγµα, αφού τεθεί σε αιώρηση εντός αραιού διαλύµατος µεταφωσ-
φορικού οξέος, υπόκειται σε εκχύλιση µε χλωροφόρµιο. Η υδατική
στιβάδα κατεργάζεται µε διάλυµα 2, 6 -διχλωροφαινόλης -ινδοφαινόλης,
προς µετατροπή του ασκορβικού οξέος σε δεϋδροασκορβικό οξύ και
ακολούθως µε διάλυµα 2, 4 -δινιτροφαινυλυδραζίνης. Η σχηµατιζόµενη
υδραζόνη εκχυλίζεται µε διάλυµα οξικού αιθυλεστέρος, ανύδρου
οξικού οξέος ( glacial)και ακετόνης. Το διάλυµα χρωµατογραφείται σε
στήληsilicagel, η διάλυση εξατµίζεται µέχρι ξηρού και το υπόλειµµα
διαλύεται σε αραιό θειικό οξύ. Η οπτική πυκνότητα του διαλύµατος
µετράται µε φωτόµετρο σε 509 nm.
Για τα προϊόντα της οµάδος Α, η διάλυση, η προερχόµενη από χρωµα-
τογραφία σε στήλη υπόκειται επί πλέον σε χρωµατογραφία λεπτής
στιβάδος για την αποµόνωση της υδραζόνης.
3.Αντιδραστήρια
3.1.Πρότυπο διάλυµα 0,05 %L -ασκορβικού οξέος: διαλύονται 50 mg
L-ασκορβικού οξέος a.p.εντός 20 mlπερίπου διαλύµατος1973L0046 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 15
▼B
µεταφωσφορικού οξέος (3.2) και συµπληρούται έως 100 mlµε
ύδωρ. Παρασκευάζεται αµέσως προ της χρήσεως.
3.2.∆ιάλυµα 10 %(κ.ό.) µεταφωσφορικού οξέος: διαλύονται εντός
ύδατος 200 gµεταφωσφορικού οξέος a.p.,κονιοποιηµένου σε
ιγδίο και συµπληρούται έως 2000 mlµε ύδωρ. ∆ιατηρείται σε
4ºC.Ανανεούται µετά από παρέλευση µιας εβδοµάδος.
3.3.Χλωροφόρµιο a.p.
3.4.∆ιάλυµα 0,5 %(κ.ό.) 2,6-διχλωροφαινόλης -ινδοφαινόλης a.p.
Παρασκευάζεται αµέσως προ της χρήσεως.
3.5.Βοηθητικό διηθήσεως ( SκαιS.αριθ.121ή ισοδύναµο).
3.6.Όξινο διάλυµα 2 %(κ.ό.) 2,4-δινιτροφαινυλυδραζίνης: διαλύονται
2g 2,4-δινιτροφαινυλυδραζίνης εντός 100 mlαραιού θειικού
οξέος (25 mlθειικού οξέος a.p., d: 1,84, αραιωµένο σε 100 mlµε
ύδωρ). Το διάλυµα αυτό, σε ψυχρό µέρος διατηρείται επί µια
εβδοµάδα.
3.7.Άζωτο, ή
3.8.∆ιοξείδιο του άνθρακος.
3.9.Μίγµα οξικού αιθυλεστέρα a.p/ανύδρου οξικού οξέος ( glacial)/
ακετόνης a.p.: 96/2/2 κατ'όγκον.
3.10Μίγµα διχλωροµεθανίου a.p/ανύδρου οξικού οξέος ( glacial): 97/3
κατ'όγκον.
3.11. Silicagel µέγεθος κόκκων: 0,05 έως 0,2 mm.
3.12. Silicagel H, κατάStahl,δια χρωµατογραφία λεπτής στιβάδος.
3.13.Αραιό θειικό οξύ: εισάγονται 105 mlύδατος εντός ογκοµετρικής
φιάλης των 200 ml,συµπληρούται ο όγκος δια θειικού οξέος a.p.,
d: 1,84.
3.14.∆ιαλύτης εκλούσεως για χρωµατογραφία λεπτής στιβάδος: αναµι-
γνύονται 75 mlαιθέραa.p., 25 ml, οξικού αιθυλεστέρα a.p.και
4,0mlοξικού οξέος 96 %(κ.ό.)a.p.Ανανεούται µετά από 2 έως 3
χρωµατογραφίες.
4.Συσκευές
4.1.Υδρόλουτρο ρυθµισµένο στους 20 ºCµε υπερθερµοστάτη.
4.2.Φυγοκεντρική συσκευή ( 3500 t/m) µε σωλήνες των 40 έως 50 ml,
εφοδιασµένους µε εσµυρισµένα πώµατα.
4.3.Περιστροφική συσκευή εξατµίσεως εν κενώ µετά φιαλών των
250ml.
4.4.Υάλινοι σωλήνες χρωµατογραφίας (µήκος: 100 mm,εσωτερική
διάµετρος: 20 mm)µετά πλακός εκ πεφρυγµένης υάλου (π.χ.
σωλήνεςAllihn).
4.5.Φασµατοφωτόµετρο ή χρωµατόµετρο µε φίλτρα και µε κυψελίδες
10mmπάχους.
4.6.Συσκευή για χρωµατογραφία λεπτής στιβάδος, µε πλάκες silicagel
(3.12),πάχος στιβάδος 0,5 έως 0,6 mm (ενδείκνυνται οι έτοιµες
προς χρήση πλάκες). Ξηραίνονται οι πλάκες επί 2 ώρες και 30
λεπτά έως 3 ώρες εντός πυριαντηρίου στους 120 -130 ºC.
Αφήνονται να ψυχθούν και διατηρούνται ακολούθως σε ξηραν-
τήρα τουλάχιστον επί 24 ώρες προ της χρήσεως.
4.7.Πυριαντήριο ρυθµισµένο στους 120 -130 ºC.
5.Τρόπος εργασίας
5.1.Εκχύλιση
Εισάγονται εντός δύο ογκοµετρικών φιαλών Α και Β, των 250 ml
µετά εσµυρισµένων πωµάτων, ίσες ποσότητες λεπτοτεµαχισµένου
δείγµατος, που περιέχουν 200 µ gπερίπου βιταµίνης C.
Προστίθενται µόνον στη φιάλη Α, 0,4 mlπροτύπου διαλύµατος
(3.1) και οµογενοποιούνται ανακινώντας ελαφρώς (εσωτερικό
πρότυπο).
Προστίθενται µέσα σε κάθε φιάλη 30 mlχλωροφορµίου (3.3) και
25mlδιαλύµατος µεταφωσφορικού οξέος (3.2) σε θερµοκρασία
4ºC.Ανακινούνται επ 'ολίγον και αφήνονται ακολούθως σε1973L0046 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 16
▼B
ηρεµία επί 10 έως 15 λεπτά. Προστίθενται 25 mlύδατος, πωµατί-
ζονται οι φιάλες, ανακινούνται ισχυρά επί 10 δευτερόλεπτα και
αφήνονται σε ηρεµία επί 10 έως 15 λεπτά εντός υδρολούτρου
(4.1). Φυγοκεντρούνται για διαχωρισµό της υδατικής στιβάδος
από τη στιβάδα χλωροφορµίου. Οι εργασίες, όπως υποδεικνύονται
ανωτέρω, διενεργούνται συγχρόνως επί των υδατικών εκχυ-
λισµάτων Α (εσωτερικό πρότυπο) και Β.
5.2.Οξείδωση
Λαµβάνονται δια σιφωνίου 40 mlαπό την υπερκείµενη υδατική
στιβάδα (ελαφρώς θολή) που ελήφθη στο 5.1, εισάγονται εντός
σωλήνα αντιδράσεως µε εσµυρισµένο πώµα, προστίθενται 0,5 έως
1mlδιαλύµατος 2,6 -διχλωροφαινόλης -ινδοφαινόλης (3.4) και
οµογενοποιούνται. Σχηµατίζεται ερυθρός χρωµατισµός ο οποίος
πρέπει να διατηρηθεί επί 15 λεπτά τουλάχιστον. Προστίθενται
ακολούθως 300 mgβοηθητικού διηθήσεως (3.5), ανακινείται και
διηθείται δια ξηρού πτυχωτού φίλτρου. Το διήθηµα δεν πρέπει
υποχρεωτικά να είναι διαυγές.
5.3.Αντίδραση µε 2,4 -δινιτροφαινυλυδραζίνη και εκχύλιση της υδραζόνης
Λαµβάνονται δια σιφωνίου 10 mlεκ του διηθήµατος που ελήφθη
στο 5.2, εισάγονται εντός σωλήνα φυγοκεντρήσεως (4.2),
προστίθενται 2 mlδιαλύµατος 2,4 -δινιτριφαινυλυδραζίνης (3.6)
και οµογενοποιούνται. ∆ιοχετεύεται ταχέως εντός του σωλήνα
ρεύµα αζώτου (3.7) ή διοξειδίου του άνθρακος (3.8), πωµατίζεται
ο σωλήνας και εµβαπτίζεται επί 15 ώρες περίπου (µια νύκτα)
εντός υδρολούτρου (4.1).
Προστίθενται ακολούθως 3 mlύδατος, 20 mlµίγµατος οξικού αιθυ-
λεστέρα/ανύδρου οξικού οξέος ( glacial)/ακετόνης (3.9) και 800 mg
περίπου βοηθητικού διηθήσεως (3.5). Πωµατίζεται ο σωλήνας,
ανακινείται ισχυρά επί 30 δευτερόλεπτα και φυγοκεντρείται.
Εισάγονται 15 mlαπό την υπερκείµενη στιβάδα εντός φιάλης
εξατµίσεως και εξατµίζονται υπό µειωµένη πίεση εντός της περι-
στροφικής συσκευής εξατµίσεως (4.3) µέχρι λήψεως ελαιώδους
υπολείµµατος. ∆ιαλύεται το υπόλειµµα εντός 2 mlµίγµατος οξικού
αιθυλεστέρα /ανύδρου οξικού οξέος /ακετόνης (3.9) επαναθερµαί-
νοντας έως 50 ºC,αφήνεται να ψυχθεί, προστίθενται 10 ml
µίγµατος διχλωροµεθανίου /ανύδρου οξικού οξέος (3.10) και οµογε-
νοποιούνται.
5.4.Χρωµατογραφία στήλης
Σωλήνας χρωµατογραφίας (4.4) πληρούται µέχρις ύψους 30 mmµε
µίγµα διχλωροµεθανίου /ανύδρου οξικού οξέος (3.10). Φέρεται σε
αιώρηση (ανακινώντας ισχυρά) 5 g silicagel (3.11) εντός 30 ml
µίγµατος διχλωροµεθανίου /ανύδρου οξικού οξέος (3.10) και
προστίθεται το αιώρηµα εντός του σωλήνα. Αφήνεται να
καθιζάνει και συµπιέζεται ακολούθως υπό ελαφρά πίεση αζώτου
(3.7). Προστίθεται εντός του σωλήνα το ληφθέν διάλυµα στο 5.3,
εκπλύνεται η φιάλη µε µικρή ποσότητα µίγµατος διχλωροµεθα-
νίου/ανύδρου οξικού οξέος (3.10) και µεταφέρεται εντός του
σωλήνα, πληρούται ακολούθως αυτός µε το µίγµα (3.10) και συνε-
χίζεται η έκπλυση της στήλης µε το ίδιο µίγµα (3 έως 4 δόσεις
των 5mlπερίπου) µέχρι λήψεως άχροης διαλύσεως. Απορρίπτεται
το µέρος της διαλύσεως το οποίο είναι χρωµατισµένο κίτρινο.
∆ιαλύεται η ερυθρωπή ζώνη στην κορυφή της στήλης δια
µίγµατος οξικού αιθυλεστέρα /ανύδρου οξικού οξέος /ακετόνης
(3.9), συλλέγεται η διάλυση και εξατµίζεται εν ξηρώ.
5.4.1.Για τα προϊόντα της οµάδος Α (περιεκτικοτήτων σε βιταµίνη C
µικροτέρων των 10 g/kg)διαλύεται το υπόλειµµα εντός 2,0 ml
µίγµατος οξικού αιθυλεστέρα /ανύδρου οξικού οξέος /
ακετόνης (3.9) και διενεργείται αµέσως χρωµατογραφία
λεπτής στιβάδος όπως υποδεικνύεται στο 5.5.
5.4.2.Για τα προϊόντα της οµάδος Β (περιεκτικοτήτων σε βιταµίνη C
ίσων ή υψηλοτέρων των 10 g/kg),επαναλαµβάνεται η κατερ-
γασία του ελαιώδους υπολείµµατος δια 4,0 mlαραιού
θειικού οξέος (3.13), ανακινείται ισχυρώς ώστε να διαλυθεί
πλήρως το υπόλειµµα και µετράται η οπτική πυκνότητα
όπως υποδεικνύεται στο 5.6.
5.5.Χρωµατογραφία λεπτής στιβάδος.
Οι κατωτέρω υποδεικνυόµενες εργασίες πραγµατοποιούνται εις
διπλούν. Εναποτίθενται υπό µορφή γραµµής επί της πλάκας για
χρωµατογραφία λεπτής στιβάδος (4.6) 0,5 mlδιαλύµατος το οποίο1973L0046 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 17
▼B
ελήφθη στο 5.4.1. Εµφανίζεται επί 20 λεπτά τουλάχιστον µε τον
διαλύτη εκλούσεως (3.14), εντός κεκορεσµένης δεξαµενής, µέχρι
πλήρους διαχωρισµού της ροδόχροης ζώνης υδραζόνης. Αφήνεται
να ξηρανθεί η πλάκα στον αέρα. Οριοθετείται η ροδόχροη ζώνη,
αποξέεται µε σπάτουλα και η κονιοποιηµένη µάζα µεταφέρεται
ποσοτικώς εντός σωλήνα χρωµατογραφίας (4.4).
∆ιαλύεται διαδοχικά µια φορά δια 2 mlκαι δύο φορές δια 1,5 ml
µίγµατος οξικού αιθυλεστέρα /ανύδρου οξεικού οξέος /ακετόνης
(3.9). Συλλέγεται η διάλυση εντός µικρής φιάλης (τοτελευταίο
µέρος πρέπει να είναι άχρουν). Εξατµίζεται µέχρι ξηρού, επανα-
λαµβάνεται η κατεργασία του ελαιώδους υπολείµµατος µε 4,0 ml
αραιού θειικού οξέος (3.13), ανακινείται ισχυρά προς πλήρη
διάλυση του υπολείµµατος και µετράται η οπτική πυκνότητα.
5.6.Μέτρηση της οπτικής πυκνότητος.
Μετράται η οπτική πυκνότητα µε φωτόµετρο σε 509 nm, 20έως 30
λεπτά µετά τη διάλυση του υπολείµµατος µε θειικό οξύ. Οι µετρή-
σεις διενεργούνται δια συγκρίσεως µε αραιό θειικό οξύ (3.13).
5.7.Τυφλό πείραµα.
∆ιενεργείται τυφλό πείραµα ακολουθώντας τον ίδιο τρόπο εργα-
σίας απουσία δείγµατος.
6.Υπολογισµός των αποτελεσµάτων
Η περιεκτικότητα σε gβιταµίνης Cανάkgδείγµατος δίδεται από τον
τύπο:
γ/C0α ðÞ /C12
β/C0γ ðÞ /C110δ
όπου:
α=οπτική πυκνότητα του τυφλού διαλύµατος ·
β=οπτική πυκνότητα του προτύπου εσωτερικού διαλύµατος ·
γ=οπτική πυκνότητα του διαλύµατος του δείγµατος ·
δ=βάρος σε γραµµάρια της ποσότητος του δείγµατος.
Επαναληπτικότητα
Η διαφορά µεταξύ των αποτελεσµάτων δύο παραλλήλων προσδιορι-
σµών που έγιναν στο ίδιο δείγµα δεν πρέπει να υπερβαίνει:
το 10%σε σχετική τιµή, για περιεκτικότητες σε βιταµίνη Cµικρό-
τερες των 10 g/kgκαι
5%σε σχετική τιµή, για περιεκτικότητες ίσες ή υψηλότερες των 10 g/
kg.
Σηµείωση: a.p.=«για ανάλυση »ή χηµικώς καθαρό.1973L0046 — EL — 10.11.1992 — 002.001 — 18