Verzeichnis und Beschreibung der Analysemethoden gemäß Artikel 120g Absatz 1 der Verordnung (EG) Nr. 1234/2007 des Rates (1)

(veröffentlicht gemäß Artikel 15 Absatz 2 der Verordnung (EG) Nr. 606/2009 der Kommission vom 10. Juli 2009 (2) )

2010/C 43/01

In der nachstehenden Tabelle sind die Analysemethoden aufgeführt, die anzuwenden sind, um die Einhaltung der Grenzwerte und der Auflagen zu kontrollieren, die im Gemeinschaftsrecht für die Erzeugung von Weinbauerzeugnissen festgelegt sind. In der dritten Spalte sind für jeden Parameter die entsprechenden Analysemethoden angegeben, die im „Recueil des méthodes internationales d'analyse des vins et des moûts“ (Sammelband der internationalen Analysemethoden für Wein) der Internationalen Organisation für Rebe und Wein (OIV) in der zum Zeitpunkt dieser Veröffentlichung neuesten Ausgabe (2009) beschrieben sind. Für jeden Parameter, außer denen, für die es zurzeit keine validierte Methode des Typs I oder II gibt, sind nur die Referenzmethoden („Typ I“ oder „Typ II“ in der OIV-Klassifikation) beschrieben. Der Anhang der Mitteilung enthält die Beschreibung der Methoden.

Hinweis:

In Anhang A Abschnitt I des Sammelbands der OIV sind die verschiedenen Typen der Analysemethoden definiert, namentlich die Methode des Typs I (Standardreferenzmethode), des Typs II (Referenzmethode) und des Typs IV (vorläufige Methode).

Die Analysemethoden für Blei und Cadmium sind nun in der Verordnung (EG) Nr. 333/2007 der Kommission (3) vom 28. März 2007 (Anhang Teil C Nummer 3) beschrieben. Außerdem sind in Anhang II Nummer 4 der Verordnung (EG) Nr. 401/2006 der Kommission (4) vom 23. Februar 2006 die allgemeinen Kriterien für die Analysemethoden für Ochratoxin A festgelegt, so dass es nicht notwendig ist, für diesen Stoff eine besondere Methode für Weinbauerzeugnisse vorzuschreiben.

VERZEICHNIS DER ANALYSEMETHODEN

Die Beschreibung mehrerer Analysemethoden wird zurzeit von den zuständigen Stellen der OIV aktualisiert. Sie werden in einer der nächsten Mitteilungen der Kommission veröffentlicht, sobald die OIV in der Ausgabe 2010 des Sammelbands der internationalen Analysemethoden der OIV einen aktualisierten Text veröffentlicht hat.

(1) ABl. L 299 vom 16.11.2007.

(2) ABl. L 193 vom 24.7.2009, S. 1.

(3) ABl. L 88 vom 29.3.2007, S. 29.

(4) ABl. L 70 vom 9.3.2006, S. 12.

ANHANG

INHALT

1. DICHTE UND RELATIVE DICHTE BEI 20 °C (OIV - AS2 - 01- MASVOL) — Methode des Typs I

2. BESTIMMUNG DES ZUCKERGEHALTES VON MOST, KONZENTRIERTEM MOST UND REKTIFIZIERTEM TRAUBENMOSTKONZENTRAT (RTK) DURCH REFRAKTOMETRIE (OIV - AS2 - 02- SUCREF) — Methode des Typs I

3. GESAMT-TROCKENEXTRAKT (OIV-AS-2-03-EXTSEC) Gesamt-Trockenmasse — Methode des Typs I

4. BESTIMMUNG DES VERHÄLTNISSES DER ISOTOPE 18 O/ 16 O IM WASSER DES WEINS (OIV-AS-2-09-MOUO18) — Methode des Typs II

5. FOLIN-CIOCALTEU-INDEX (OIV-AS-2-10-INDFOL) — Methode des Typs IV

6. GLUCOSE UND FRUCTOSE (OIV-AS-311-02-GLUFRU) — Methode des Typs II

7. BESTIMMUNG DER ZUCKER DURCH HPLC (SACCHAROSE) (OIV-AS-311-03-SUCRES) — Methode des Typs II

8. NACHWEIS DER ANREICHERUNG VON TRAUBENMOST, TRAUBENMOSTKONZENTRAT, REKTIFIZIERTEM TRAUBENMOSTKONZENTRAT UND WEIN MITTELS MAGNETISCHER KERNRESONANZ DES DEUTERIUMS (OIV-AS-311-05-ENRRMN) — Methode des Typs I

9. ALKOHOLGEHALT (OIV-AS-312-01-TALVOL) — Methode des Typs I

10. BESTIMMUNG DES ISOTOPENVERHÄLTNISSES 13 C/ 12 C DURCH ISOTOPENMASSENSPEKTROMETRIE (IRMS) VON WEINETHANOL ODER ETHANOL AUS DER VERGÄRUNG VON TRAUBENMOST, KONZENTRIERTEM TRAUBENMOST ODER REKTIFIZIERTEM TRAUBENMOSTKONZENTRAT (OIV-AS-312-06-ETHANO) — Methode des Typs II

11. GESAMTSÄURE (OIV - AS-313-01-ACITOT) — Methode des Typs I

12. FLÜCHTIGE SÄUREN (OIV - AS-313-02-ACIVOL) — Methode des Typs I

13. CITRONENSÄURE (OIV -AS-313-09-ACIENZ) — Methode des Typs II

14. SÄURE (OIV - AS-313-14-ACISOR) — Methode des Typs IV

15. pH-WERT (OIV - AS-313-15-PH) — Methode des Typs I

16. SIMULTANER NACHWEIS VON L-ASCORBINSÄURE UND D-ISOASCORBINSÄURE DURCH HPLC UND UV-DETEKTION (OIV-AS-313-22-ACASCO) — Methode des Typs II

17. KOHLENDIOXID (OIV - AS-314-01-DIOCAR) — Methode des Typs II

18. MANOMETRISCHE METHODE ZUR BESTIMMUNG VON KOHLENDIOXID IN WEIN (OIV–AS314-04-CO2MAN) — Methode des Typs II

19. MESSUNG DES ÜBERDRUCKS BEI SCHAUM- UND PERLWEINEN (OIV-AS-314-02-SURPRES) — Methode des Typs I

20. BESTIMMUNG VON LYSOZYM IM WEIN DURCH HPLC (OIV-AS-315-14) — Methode des Typs IV

21. SULFATE (OIV- AS-321-05-SULFAT) — Methode des Typs II

22. EISEN (OIV- AS-322-05-FER) — Methode des Typs IV

23. KUPFER (OIV – AS 322-06) — Methode des Typs IV

24. SCHWEFELDIOXID (OIV - AS-323-04-DIOSU) — Methode des Typs II

1 DICHTE UND RELATIVE DICHTE BEI 20 °C (OIV-AS2-01-MASVOL) — METHODE DES TYPS I

1. DEFINITION

Die Dichte ist der Quotient aus der Masse eines bestimmten Volumens Wein oder Most bei 20 °C und seinem Volumen, ausgedrückt in g/ml, Symbol ρ20 °C.

Die relative Dichte bei 20 °C oder Dichte 20 °C/20 °C ist das als Dezimalzahl ausgedrückte Verhältnis der Masse eines bestimmten Volumens Wein oder Most bei 20 °C zur Masse des gleichen Volumens Wasser bei 20 °C. Symbol

2. PRINZIP DER METHODEN

Die Dichte und die relative Dichte bei 20 °C einer Probe werden wie folgt bestimmt:

entweder durch Bestimmung mit dem Pyknometer: Referenzmethode,

oder durch Bestimmung mit der hydrostatischen Waage oder Bestimmung mit dem elektronischen Densimeter.

Bemerkung

Für sehr genaue Bestimmungen muss die Dichte um die Wirkung von Schwefeldioxid korrigiert werden.

ρ20 °C = ρ′20 °C – 0,0006 × S ρ20 °C = korrigierte Dichte ρ′20 °C = gemessene Dichte S = Gesamtschwefeldioxid in g/l

3. VORBEREITUNG DER PROBE

Enthält der Wein oder der Most merkliche Mengen Kohlendioxid, muss dieses zum größten Teil vorher entfernt werden, indem man 250 ml Wein in einem 1 000-ml-Gefäß schüttelt oder unter Unterdruck durch 2 g Watte filtriert.

4. REFERENZMETHODE

4.1. Geräte

Übliches Labormaterial, insbesondere:

4.1.1. Pyknometer (1) aus Pyrexglas von etwa 100 ml Fassungsvermögen mit einem herausnehmbaren Thermometer mit Schliffstopfen und einem Messbereich von 10 bis 30 °C, geteilt in 0,1 °C. Dieses Thermometer muss justiert sein (Abbildung 1).

Das Pyknometer besitzt seitlich ein 25 mm langes Rohr von maximal 1 mm Innendurchmesser, dessen Ende konisch geschliffen ist. Dieses seitliche Rohr kann mit einem „Auffangstöpsel“ verschlossen werden, der aus einem konisch geschliffenen Rohr mit ausgezogener Spitze besteht. Dieser Stöpsel dient als „Ausdehnungsraum“.

Die beiden Stopfen des Pyknometers müssen sehr sorgfältig geschliffen sein.

4.1.2. Als Tara verwendet man ein Gefäß von gleicher äußerer Form (mindestens 1 ml genau) wie das beschriebene Pyknometer und von gleicher Masse wie die Masse des mit einer Flüssigkeit der Dichte 1,01 gefüllten Pyknometers (Natriumchloridlösung, 2 % (m/v)).

Hitzebeständiger Mantel, der sich genau an die Form des Pyknometers anpasst.

4.1.3. Zweischalige Waage mit einer Belastbarkeit von mindestens 300 g, die auf 0,1 mg genau misst,

oder

einschalige Waage mit einer Belastbarkeit von mindestens 200 g, die auf 0,1 mg genau misst.

4.2. Eichung des Pyknometers

Die Eichung des Pyknometers umfasst die Bestimmung folgender Merkmale:

— Leergewicht;

— Volumen bei 20 °C;

— Masse des Wassers bei 20 °C.

4.2.1. Verwendung einer zweischaligen Waage

Das Taragefäß wird auf die linke Schale der Waage und das saubere und trockene Pyknometer mit seinem „Auffangstöpsel“ auf die rechte Schale der Waage gestellt; das Gleichgewicht wird mit Hilfe von Gewichten hergestellt, d. h. p Gramm.

Das Pyknometer wird sorgfältig mit destilliertem Wasser bei Raumtemperatur gefüllt und das Thermometer angebracht. Das Pyknometer wird gut abgetrocknet und in den hitzebeständigen Mantel gegeben. Durch Umdrehen mischen, bis die auf dem Thermometer abgelesene Temperatur konstant bleibt. Bis genau zum oberen Rand des Seitenrohrs auffüllen. Dieses Seitenrohr trocken wischen und den Auffangstöpsel aufsetzen. Die Temperatur t °C sorgfältig ablesen und gegebenenfalls um die Ungenauigkeit der Thermometerskala korrigieren. Das mit Wasser gefüllte Pyknometer wiegen; dabei ist p' die zur Herstellung des Gleichgewichtes erforderliche Masse in Gramm.

Berechnung

Gewicht des leeren Pyknometers: Leergewicht= p + m m= Masse der im Pyknometer enthaltenen Luft m= 0,0012 (p – p′).

Volumen bei 20 °C: V20 °C= (p + m – p′) × Ft Ft= Faktor aus Tabelle I für die Temperatur t °C V20 °C muss auf ± 0,001 ml. genau bekannt sein.

Masse des Wassers bei 20 °C: M20 °C= V20 °C × 0,998203 0,998203= Dichte des Wassers bei 20 °C.

4.2.2. Verwendung einer einschaligen Waage

Zu bestimmen sind:

— die Masse des sauberen, trockenen Pyknometers: P

— die Masse des mit Wasser gefüllten Pyknometers bei t °C: P1 gemäß den Angaben unter Ziffer 4.2.1

— die Masse des Taragefäßes T0.

Berechnung

Gewicht des leeren Pyknometers:

Leergewicht= P – m m= Masse der im Pyknometer enthaltenen Luft m= 0,0012 (P1 – P)

Volumen bei 20 °C: V20 °C= [P1 – (P – m)] × Ft Ft= Faktor aus Tabelle I für die Temperatur t °C

Das Volumen bei 20 °C muss auf ± 0,001 ml genau bekannt sein.

Masse des Wassers bei 20 °C: M20 °C= V20 °C × 0,998203 0,998203= Dichte des Wassers bei 20 °C.

4.3. Durchführung der Bestimmung

4.3.1. Verwendung einer zweischaligen Waage

Das Pyknometer, gefüllt mit der für die Bestimmung vorbereiteten Probe (Ziffer 3), wird wie unter 4.2.1 beschrieben gewogen.

Dabei ist p″ die Masse in Gramm, die zur Herstellung des Gleichgewichtes bei t °C dient.

Masse der im Pyknometer enthaltenen Flüssigkeit = p + m – p″

Scheinbare Dichte bei t °C:

ρt °C = (p + m – p″)/(V20 °C)

Die Dichte bei 20 °C wird mithilfe einer der nachstehenden Korrekturtabellen je nach Art der untersuchten Flüssigkeit berechnet: trockener Wein (Tabelle II), natürlicher oder konzentrierter Most (Tabelle III), Süßweine (Tabelle IV).

Die Dichte 20 °C/20 °C des Weines wird durch Division der Dichte bei 20 °C durch 0,998203 ausgedrückt.

4.3.2. Verwendung einer einschaligen Waage

Das Taragefäß wird gewogen, die Masse ist T1.

Berechnung dT = T1 – T0

Masse des leeren Pyknometers zum Zeitpunkt der Messung = P – m + dT

Das Pyknometer, gefüllt mit der für die Bestimmung vorbereiteten Probe (Ziffer 3), wird wie unter 4.2.1 beschrieben gewogen. P2 ist die Masse bei t °C.2.

Masse der im Pyknometer enthaltenen Flüssigkeit bei t °C = P2 – (P – m + dT)

Scheinbare Dichte bei t °C:

ρt °C = (P2 – (P – m + dT)/(V20 °C)

Die Dichte bei 20 oC der untersuchten Flüssigkeit — trockner Wein, natürlicher Most und konzentrierter Most, Süßwein — wird wie unter Ziffer 4.3.1 beschrieben berechnet.

Die Dichte 20 °C/20 °C wird durch Division der Dichte bei 20 °C durch 0,998203 bestimmt.

4.3.3. Wiederholbarkeit der Bestimmung der Dichte:

für trockene und liebliche Weine: r = 0,00010

für Süßweine: r = 0,00018

4.3.4. Reproduzierbarkeit der Bestimmung der Dichte:

für trockene und liebliche Weine: R = 0,00037

für Süßweine: R = 0,00045

TABELLE I

Faktor F

Mit diesen Faktoren muss die Masse des Wassers, die im Pyknometer aus Pyrexglas bei t °C enthalten ist, multipliziert werden, um das Volumen des Pyknometers bei 20 °C zu erhalten.

[Siehe Tabelle I in Anhang II der Methode AS2 - 01 im Sammelband der internationalen Analysemethoden der OIV]

TABELLE II

Temperaturkorrekturen c zur Umrechnung der mit einem Pyknometer aus Pyrexglas bei t °C gemessenen Dichte von trockenen Weinen und entalkoholisierten trockenen Weinen auf 20 °C

[Siehe Tabelle II in Anhang II der Methode AS2 - 01 im Sammelband der internationalen Analysemethoden der OIV]

ρ20 = ρ t ± (c/1 000) – wenn t °C < 20 °C + wenn t °C > 20 °C

TABELLE III

Temperaturkorrekturen c zur Umrechnung der mit einem Pyknometer aus Pyrexglas bei t oC gemessenen Dichte von natürlichen Mosten und konzentrierten Mosten auf 20 °C

[Siehe Tabelle III in Anhang II der Methode AS2 - 01 im Sammelband der internationalen Analysemethoden der OIV]

ρ20 = ρ t ± (c/1 000) – wenn t °C < 20 °C + wenn t °C > 20 °C

TABELLE IV

Temperaturkorrekturen c zur Umrechnung der mit einem Pyknometer aus Pyrexglas bei t °C gemessenen Dichte von Weinen mit einem Restzuckergehalt bei einem Alkoholgehalt von 13 % Vol. oder mehr auf 20 °C

[Siehe Tabelle IV in Anhang II der Methode AS2 - 01 im Sammelband der internationalen Analysemethoden der OIV]

ρ20 = ρ t ± (c/1 000) – wenn t °C < 20 °C + wenn t °C > 20 °C

2 BESTIMMUNG DES ZUCKERGEHALTES VON MOST, KONZENTRIERTEM MOST UND REKTIFIZIERTEM TRAUBENMOSTKONZENTRAT (RTK) DURCH REFRAKTOMETRIE (OIV-AS2-02-SUCREF) — METHODE DES TYPS I

1. PRINZIP DER METHODE

Der Brechungsindex bei 20 °C, ausgedrückt als absoluter Index oder als Massenanteil Saccharose, wird bestimmt, um in der entsprechenden Tabelle den Zuckergehalt in g/l und in g/kg von Most, konzentriertem Most und rektifiziertem Traubenmostkonzentrat ablesen zu können.

2. GERÄTE

2.1. Abbé-Refraktometer

Das verwendete Refraktometer muss eine Skala haben, die Folgendes angibt:

— den Massenanteil Saccharose auf 0,1 % genau oder

— den Brechungsindex mit 4 Dezimalstellen.

Das Refraktometer muss mit einem Thermometer mit einer Skala von mindestens + 15 °C bis + 25 °C und einer Temperiereinrichtung zur Messung bei 20 °C ± 5 °C ausgestattet sein.

Die Gebrauchsanweisung für das Gerät muss genau befolgt werden, vor allem hinsichtlich der Eichung und der Lichtquelle.

3. VORBEREITUNG DER PROBE

3.1 Most und konzentrierter Most

Der Most wird gegebenenfalls durch eine trockene, vierfach gefaltete Gaze filtriert. Die ersten Tropfen des Filtrats werden verworfen und der Rest wird für die Probe verwendet.

3.2 Rektifiziertes Traubenmostkonzentrat

Je nach Konzentration wird entweder das RTK oder eine Verdünnung verwendet, die durch Auffüllen von 200 g genau eingewogenem RTK mit destilliertem Wasser auf 500 g hergestellt wird.

4. DURCHFÜHRUNG DER BESTIMMUNG

Die Probe wird auf eine Temperatur von etwa 20 °C gebracht. Einen kleinen Teil der Probe auf das untere Prisma des Refraktometers geben, wobei sich die Probe beim Gegeneinanderpressen der beiden Prismen gleichmäßig auf der Oberfläche verteilen soll. Die Messung entsprechend der Bedienungsanleitung für das verwendete Gerät durchführen.

Entweder den Massenanteil Saccharose auf 0,1 % genau oder den Brechungsindex mit 4 Dezimalstellen ablesen.

Es werden mindestens zwei Bestimmungen an derselben Probe durchgeführt. Die Temperatur t °C notieren.

5. BERECHNUNG

5.1. Temperaturkorrektur

5.1.1. Skaleneinteilung in Massenanteil Saccharose (%): Zur Temperaturkorrektur wird Tabelle I verwendet.

5.1.2. Skaleneinteilung in Brechungsindex: Der dem bei t °C abgelesenen Brechungsindex entsprechende Massenanteil Saccharose bei t °C wird Tabelle II (Spalte 1) entnommen. Dieser Wert wird mithilfe der Tabelle I auf 20 °C korrigiert.

5.2. Zuckergehalt von Most und konzentriertem Most

Der dem Massenanteil Saccharose bei 20 °C entsprechende Zuckergehalt in g/l und in g/kg wird Tabelle II entnommen. Der Zuckergehalt wird in Invertzucker mit einer Dezimalstelle ausgedrückt.

5.3. Zuckergehalt von rektifiziertem Traubenmostkonzentrat (RTK)

Der dem Massenanteil Saccharose bei 20 °C entsprechende Zuckergehalt in g/l und in g/kg wird Tabelle III entnommen. Der Zuckergehalt wird in Invertzucker mit einer Dezimalstelle ausgedrückt.

Wurde die Messung mit verdünntem RTK durchgeführt, so ist das Ergebnis mit dem Verdünnungsfaktor zu multiplizieren.

5.4 Brechungsindex von Most, konzentriertem Most und rektifiziertem Traubenmostkonzentrat

Der dem Massenanteil Saccharose bei 20 °C entsprechende Brechungsindex bei 20 °C wird Tabelle II entnommen. Dieser Index wird mit vier Dezimalstellen angegeben.

Hinweis: Der potenzielle Alkoholgehalt von Most, konzentriertem Most und rektifiziertem Traubenmostkonzentrat kann bestimmt werden mithilfe der Umrechnungstabelle in Anhang I der Verordnung (EG) Nr. 1623/2000 der Kommission vom 25. Juli 2000 (ABl. L 194 vom 31. Juli 2000)

TABELLE I

Korrektur für die Bestimmung des Massenanteils Saccharose bei einer anderen Temperatur als 20 °C

[Siehe Tabelle I im Anhang der Methode AS2 - 02 in der internationalen Sammlung der Analysemethoden der OIV]

TABELLE II

Übersicht über den Zuckergehalt von Most und konzentriertem Most in g/l und in g/kg, bestimmt mittels Refraktometer entweder als Massenanteil Saccharose bei 20 °C oder als Brechungsindex bei 20 °C. Die Dichte bei 20 °C ist ebenfalls angegeben.

[Siehe Tabelle II im Anhang der Methode AS2 - 02 in der internationalen Sammlung der Analysemethoden der OIV]

TABELLE III

Übersicht über den Zuckergehalt von rektifiziertem Traubenmostkonzentrat in g/l und in g/kg, bestimmt mittels Refraktometer entweder als Massenanteil Saccharose bei 20 °C oder als Brechungsindex bei 20 °C. Die Dichte bei 20 °C ist ebenfalls angegeben.

[Siehe Tabelle III im Anhang der Methode AS2 - 02 in der internationalen Sammlung der Analysemethoden der OIV]

3 GESAMT-TROCKENEXTRAKT (OIV-AS-2-03-EXTSEC) GESAMT-TROCKENMASSE — METHODE DES TYPS I

1. DEFINITION

Der Gesamt-Trockenextrakt oder die Gesamt-Trockenmasse stellt die Gesamtmenge aller Stoffe dar, die sich unter bestimmten physikalischen Bedingungen nicht verflüchtigen. Diese physikalischen Bedingungen müssen so sein, dass die Stoffe, aus denen der Extrakt besteht, nur möglichst geringe Veränderungen erfahren.

Der nichtreduzierende Extrakt ist der Gesamt-Trockenextrakt abzüglich der Gesamtzucker.

Der reduzierte Extrakt ist der Gesamt-Trockenextrakt, vermindert um den 1 g/l übersteigenden Gesamtzucker, um das 1 g/l übersteigende Kaliumsulfat, um Mannitol (soweit vorhanden) sowie abzüglich aller gegebenenfalls dem Wein zugesetzten chemischen Stoffe.

Der Extraktrest ist der nicht reduzierende Extrakt abzüglich der als Weinsäure ausgedrückten gebundenen Säure.

Der Extrakt wird in g/l ausgedrückt und muss auf 0,5 g genau bestimmt werden.

2. PRINZIP DER METHODE

[Die Beschreibung dieser Analysemethode wird zurzeit von den zuständigen Stellen der OIV aktualisiert. Sie wird in einer der nächsten Mitteilungen der Kommission veröffentlicht, sobald die OIV in der Ausgabe 2010 des Sammelbands der internationalen Analysemethoden der OIV einen aktualisierten Text veröffentlicht hat. Zur Orientierung wird bis zu dieser Veröffentlichung auf Kapitel 4 des Anhangs der Verordnung (EWG) Nr. 2676/90 der Kommission verwiesen.]

4 BESTIMMUNG DES VERHÄLTNISSES DER ISOTOPE 18O/16O IM WASSER DES WEINS (OIV-AS-2-09-MOUO18) — METHODE DES TYPS II

(p m.)

[Die Beschreibung dieser Analysemethode wird zurzeit von den zuständigen Stellen der OIV aktualisiert. Sie wird in einer der nächsten Mitteilungen der Kommission veröffentlicht, sobald die OIV in der Ausgabe 2010 des Sammelbands der internationalen Analysemethoden der OIV einen aktualisierten Text veröffentlicht hat. Zur Orientierung wird bis zu dieser Veröffentlichung auf Kapitel 43 des Anhangs der Verordnung (EWG) Nr. 2676/90 der Kommission verwiesen.]

5 FOLIN-CIOCALTEU-INDEX (OIV-AS-2-10-INDFOL) — METHODE DES TYPS IV

1. DEFINITION

Der Folin-Ciocalteu-Index ist das bei Anwendung nachstehend beschriebener Methode erzielte Ergebnis.

2. PRINZIP

Alle phenolischen Verbindungen im Wein werden durch das Folin-Ciocalteu-Reagenz oxidiert. Dieses Reagenz besteht aus einer Mischung von Phosphorwolframsäure (H3PW12O40), und Phosphormolybdänsäure (H3PMo12O40) die bei der Oxidation der Phenole zu einer Mischung von blaugefärbtem Wolframoxid (W8O23) und Molybdänoxid (Mo8O23) reduziert wird.

Die entstandene Blaufärbung hat ein Absorptionsmaximum von etwa 750 nm. Sie ist proportional zum Gehalt an phenolischen Verbindungen.

3. REAGENZIEN

Die Reagenzien müssen Analysenqualität aufweisen. Es ist destilliertes Wasser oder Wasser gleichwertiger Reinheit zu verwenden.

3.1. Folin-Ciocalteu-Reagenz

Dieses Reagenz wird im Handel gebrauchsfertig angeboten. Es kann wie folgt hergestellt werden: 100 g Natriumwolframat (Na2WO4 · 2H2O) und 25 g Natriummolybdat (Na2MoO4 · 2H2O) in 700 ml destilliertem Wasser lösen; 50 ml 85 %ige Phosphorsäure (ρ20 = 1,71 g/ml) und 100 ml konzentrierte Salzsäure (ρ20 = 1,19 g/ml) hinzugeben. Zum Sieden bringen und unter Rückfluss 10 Stunden lang sieden lassen, dann 150 g Lithiumsulfat (Li2SO4 · H2O) und einige Tropfen Brom hinzugeben; erneut zum Sieden bringen und weitere 15 Minuten lang sieden lassen. Abkühlen lassen und mit destilliertem Wasser auf 1 Liter auffüllen.

3.2. Natriumcarbonat (Na2CO3, wasserfrei) 20 %ig (m/v).

4. GERÄTE

Übliches Labormaterial, insbesondere:

4.1. 100-ml-Messkolben.

4.2. Spektralfotometer für die Messung bei 750 nm.

5. DURCHFÜHRUNG DER BESTIMMUNG

5.1. Rotwein

In einen 100-ml-Meßkolben (Ziffer 4.1) werden in nachstehender Reihenfolge gegeben:

1 ml Wein, 1:5 verdünnt

50 ml destilliertes Wasser

5 ml Folin-Ciocalteu-Reagenz (Ziffer 3.1)

20 ml Natriumcarbonatlösung (Ziffer 3.2).

Mit destilliertem Wasser auf 100 ml auffüllen.

Durch Rühren homogenisieren. 30 Minuten lang stehen lassen, bis sich die Reaktion stabilisiert hat. Die Extinktion wird bei 750 nm und einer Schichtdicke von 1 cm gegen einen Leerwert, der anstelle des Weines destilliertes Wasser enthält, gemessen.

Liegt die gemessene Extinktion nicht bei ungefähr 0,3, so sollte eine geeignetere Verdünnung gewählt werden.

5.2. Weißwein

Die Bestimmung wird unter den gleichen Bedingungen mit 1 ml unverdünntem Wein durchgeführt.

5.3. Rektifiziertes Traubenmostkonzentrat

5.3.1. Vorbereitung der Probe

Eine Lösung mit einem Zuckergehalt von 20 % (m/m) (25 °Brix) verwenden, die nach der Beschreibung im Kapitel „pH-Wert“ Ziffer 4.1.2 hergestellt wurde.

5.3.2. Messung

Die Messung wird, wie (unter Ziffer 5.1) für Rotweine beschrieben, mit 5 ml der nach Ziffer 5.3.1 erhaltenen Probelösung durchgeführt. Die Extinktion wird gegen einen Leerwert gemessen, der mit 5 ml einer 25%igen (m/m) Invertzuckerlösung hergestellt wurde.

6. DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

6.1. Berechnung

Das Ergebnis wird in Form eines Index ausgedrückt, der durch Multiplikation der Extinktion mit 100 bei 1: 5 verdünnten Rotweinen (bzw. mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor) und mit 20 bei Weißweinen bestimmt wird. Bei rektifiziertem Traubenmostkonzentrat wird die Extinktion mit 16 multipliziert.

6.2. Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen von zwei gleichzeitig oder schnell hintereinander von demselben Analytiker durchgeführten Bestimmungen darf nicht größer als 1 sein.

Eine gute Wiederholbarkeit der Ergebnisse hängt von der Verwendung sehr sauberer Geräte (Messkolben und Küvetten) ab.

6 GLUCOSE UND FRUCTOSE (OIV-AS-311-02-GLUFRU) — METHODE DES TYPS II

1. DEFINITION

Glucose und Fructose können ausschließlich zur Bestimmung des Glucose/Fructose-Verhältnisses einzeln enzymatisch bestimmt werden.

2. PRINZIP

Glucose und Fructose werden mit Adenosintriphosphat (ATP) in einer durch das Enzym Hexokinase (HK) katalysierten Reaktion zu Glucose-6-phosphat (G6P) und Fructose-6-phosphat (F6P) phosphoriliert:

Glucose + ATP←→G6P + ADP

Fructose + ATP←→F6P + ADP

Zunächst wird Glucose-6-phosphat durch Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADP) in Gegenwart des Enzyms Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) zu Gluconat-6-phosphat oxidiert. Die Menge des reduzierten Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADPH), die bei der Reaktion gebildet wird, entspricht der Menge Glucose-6-phosphat, somit also der Glucosemenge.

G6P + NADP+←→Gluconat 6-phosphat + NADPH + H+

Das reduzierte Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADPH) wird aufgrund seiner Absorption bei 340 nm bestimmt.

Nach Ablauf dieser Reaktion wird Fructose-6-phosphat durch Phosphoglucose-Isomerase (PGI) in Glucose-6-phosphat umgewandelt.

F6P←→G6P

Glucose-6-phosphat reagiert erneut mit Nicotinamidadenindinucleotidphosphat, wobei Gluconat-6-phosphat und reduziertes Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADPH) entstehen. Dieses wird bestimmt.

3. GERÄTE

— Spektralfotometer zur Durchführung der Messung bei 340 nm, dem Absorptionsmaximum von NADPH. Da es sich um absolute Messungen handelt (keine Eichkurve, sondern Heranziehung des Extinktionskoeffizienten von NADPH), müssen die Skalen der Wellenlänge und der Extinktion geeicht sein. Gegebenenfalls kann auch ein Spektralfotometer verwendet werden, das Messungen bei 334 nm oder 365 nm erlaubt.

— Glas- oder Einmalküvetten, Schichtdicke 1 cm.

— Enzymtestpipetten, 0,02 — 0,05 — 0,1 — 0,2 ml.

4. REAGENZIEN

4.1. Lösung 1: Puffer (Triethanolamin 0,3 M; pH = 7,6; 4×10-3M in Mg 2+): 11,2 g Triethanolaminhydrochlorid (C2H5)3N HCl) und 0,2 g MgSO4 7 H2O in 150 ml bidestilliertem Wasser lösen, rund 4 ml 5 M Natronlauge (NaOH) hinzugeben, um einen pH-Wert von 7,6 zu erreichen, und auf 200 ml auffüllen.

Diese Pufferlösung ist bei + 4 °C vier Wochen lang haltbar.

4.2. Lösung 2: Nicotinamidadenindinucleotidphosphat-Lösung (etwa 11,5x10-3M): 50 mg Dinatrium-Nicotinamidadenindinucleotidphosphat in 5 ml bidestilliertem Wasser lösen.

Diese Lösung ist bei + 4 °C vier Wochen lang haltbar.

4.3. Lösung 3: Adenosin-5’-triphosphat-Lösung (etwa 81 10-3M): 250 mg Dinatrium-Adenosin-5’-triphosphat und 250 mg Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) in 5 ml bidestilliertem Wasser lösen.

Diese Lösung ist bei + 4 °C vier Wochen lang haltbar.

4.4. Lösung 4: Hexokinase/Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase: 0,5 ml Hexokinase (2 mg Protein/ml, d. h. 280 U/ml) und 0,5 ml Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (1 mg Protein/ml) mischen.

Diese Lösung ist bei + 4 °C ein Jahr lang haltbar.

4.5. Lösung 5: Phosphoglucose-Isomerase (2 mg Protein/ml, d. h. 700 U/ml). Die Suspension wird unverdünnt verwendet.

Diese Lösung ist bei + 4 °C ein Jahr lang haltbar.

Hinweis:

Alle für diese Bestimmung nötigen Reagenzien sind im Handel erhältlich.

5. DURCHFÜHRUNG DER BESTIMMUNG

5.1. Vorbereitung der Probe

Nach Maßgabe der geschätzten Glucose- und Fructosemenge je Liter werden folgende Verdünnungen hergestellt:

Messung bei 340 und 334 nm Messung bei 365 nm Verdünnung mit Wasser Verdünnungsfaktor F Bis to 0,4 g/l Bis 0,8 g/l — — Bis to 4,0 g/l Bis 8,0 g/l 1 + 9 10 Bis to 10,0 g/l Bis 20,0 g/l 1 + 24 25 Bis to 20,0 g/l Bis 40,0 /l 1 + 49 50 Bis to 40,0 g/l Bis 80,0 g/l 1 + 99 100 Über 40,0 g/l Über 80,0 g/l 1 + 999 1 000

5.2. Messung

Das Spektralfotometer auf die Wellenlänge 340 nm einstellen und die Messungen gegen Luft (keine Küvette im Strahlengang) oder gegen Wasser durchführen.

Temperatur 20 bis 25 °C.

In zwei Küvetten mit 1 cm Schichtdecke pipettiert man:

Leerwert Messung Lösung 1 (4.1) (auf 20 °C gebracht) 2,50 ml 2,50 ml Lösung 2 (4.2) 0,10 ml 0,10 ml Lösung 3 (4.3) 0,10 ml 0,10 ml Probe 0,20 ml Bidestilliertes Wasser 0,20 ml

Mischen und nach ungefähr drei Minuten die Extinktion der Lösungen (E1) messen. Die Reaktion starten durch Zugabe von

Lösung 4 (4.4) 0,02 ml 0,02 ml

Mischen, 15 Minuten warten, die Extinktion messen und nach weiteren zwei Minuten überprüfen, ob die Reaktion zum Stillstand gekommen ist (E2).

Sofort folgende Lösung zugeben:

Lösung 5 (4.5) 0,02 ml 0,02 ml

Mischen, nach zehn Minuten die Extinktion messen und nach weiteren zwei Minuten überprüfen, ob die Reaktion zum Stillstand gekommen ist (E3).

Die Extinktionsdifferenzen (ΔE) für den Leerwert und die Probe berechnen:

E2 – E1 entspricht Glucose.

E3 – E2 entspricht Fructose.

Die Bestimmung der Differenz der Extinktion des Leerwerts (Δ EL) und der Probe (Δ EP)ergibt:

für Glucose: Δ EG = Δ EL – Δ EP

für Fructose: Δ EF = ΔEDL – Δ EP

Hinweis:

Die für die Enzymwirkung erforderliche Zeit ist hier nur als Beispiel angegeben, da sie von Charge zu Charge variieren kann. Es wird empfohlen, sie für jede Charge zu bestimmen.

5.3. Darstellung der Ergebnisse

5.3.1. Berechnung

Die allgemeine Formel für die Berechnung der Konzentration lautet:

C= ((V × PM)/(ε × d × v × 1 000)) Δ E (g/l)

V= Testvolumen (ml)

v= Probevolumen (ml)

MG= Molekulargewicht des zu bestimmenden Stoffs

d= Schichtdicke der Küvette (cm)

ε= Extinktionskoeffizient von NADPH bei 340 nm = 6,3 (mmol–1 × l × cm–1)

V= 2,92 ml für die Bestimmung von Glucose

V= 2,94 ml für die Bestimmung von Fructose

v= 0,20 ml

PM= 180

d= 1

Man erhält

für Glucose: C (g/l) = 0,417 × ΔEG

für Fructose: C (g/l) = 0,420 × ΔEF

Wurde die Probe bei der Vorbereitung verdünnt, so ist das Ergebnis mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor F zu multiplizieren.

Hinweis:

Wurde die Messung bei den Wellenlängen 334 oder 365 nm durchgeführt, so ergibt sich für die

— Messung bei 334 nm: ε = 6,2 (mmol–1 × l × cm–1) für Glucose: C (g/l) = 0,425 × ΔEG für Fructose: C (g/l) = 0,428 × ΔEF

— Messung bei 365 nm: ε = 3,4 (mmol–1 × l × cm–1) für Glucose: C (g/l) = 0,773 × ΔEG für Fructose: C (g/l) = 0,778 × ΔEF

5.3.2. Wiederholbarkeit (r):

r= 0,056 xi

5.3.3. Reproduzierbarkeit (R)

R= 0,12 + 0,076 xi

xi= Glucose- bzw. Fructosegehalt in g/l.

7 BESTIMMUNG DER ZUCKER DURCH HPLC (SACCHAROSE) (OIV-AS-311-03-SUCRES) — METHODE DES TYPS II

(p. m.)

[Die Beschreibung dieser Analysemethoden wird zurzeit von den zuständigen Stellen der OIV aktualisiert. Sie werden in einer der nächsten Mitteilungen der Kommission veröffentlicht, sobald die OIV in der Ausgabe 2010 des Sammelbands der internationalen Analysemethoden der OIV einen aktualisierten Text veröffentlicht hat. Zur Orientierung wird bis zu dieser Veröffentlichung auf Kapitel 6 Ziffer 3 des Anhangs der Verordnung (EWG) Nr. 2676/90 der Kommission verwiesen.]

8 NACHWEIS DER ANREICHERUNG VON TRAUBENMOST, TRAUBENMOSTKONZENTRAT, REKTIFIZIERTEM TRAUBENMOSTKONZENTRAT UND WEIN MITTELS MAGNETISCHER KERNRESONANZ DES DEUTERIUMS (OIV-AS-311-05-ENRRMN) — METHODE DES TYPS I

(p. m.)

[Die Beschreibung dieser Analysemethode wird zurzeit von den zuständigen Stellen der OIV geprüft. Sie wird in einer Mitteilung der Kommission veröffentlicht, sobald die Generalversammlung der OIV einen endgültigen Text angenommen hat. Zur Orientierung wird bis zu dieser Entscheidung der OIV auf Kapitel 8 des Anhangs der Verordnung (EWG) Nr. 2676/90 der Kommission verwiesen.]

9 ALKOHOLGEHALT (OIV-AS-312-01-TALVOL) — METHODE DES TYPS I

(p. m.)

[Die Beschreibung dieser Analysemethode wird zurzeit von den zuständigen Stellen der OIV aktualisiert. Sie wird in einer der nächsten Mitteilungen der Kommission veröffentlicht, sobald die OIV in der Ausgabe 2010 des Sammelbands der internationalen Analysemethoden der OIV einen aktualisierten Text veröffentlicht hat. Zur Orientierung wird bis zu dieser Veröffentlichung der OVI auf Kapitel 3 des Anhangs der Verordnung (EWG) Nr. 2676/90 der Kommission verwiesen.]

10 BESTIMMUNG DES ISOTOPENVERHÄLTNISSES 13C/12C DURCH ISOTOPENMASSENSPEKTROMETRIE (IRMS) VON WEINETHANOL ODER ETHANOL AUS DER VERGÄRUNG VON TRAUBENMOST, KONZENTRIERTEM TRAUBENMOST ODER REKTIFIZIERTEM TRAUBENMOSTKONZENTRAT (OIV-AS-312-06-ETHANO) — METHODE DES TYPS II

1. ANWENDUNGSGEBIET

Die Methode ermöglicht die Messung des Isotopenverhältnisses 13C/12C von Weinethanol und Ethanol aus der Vergärung von Erzeugnissen der Weinrebe (Traubenmost, konzentrierter Traubenmost, rektifiziertes Traubenmostkonzentrat).

2. BEZUGSNORMEN

ISO: 5725:1994 „Zuverlässigkeit der Versuchsmethoden - Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit einer Versuchsmethode, die durch Ringversuche normalisiert wurde“ V-PDB: Vienna-Pee-Dee Belemnite (RPDB = 0,0112372). OIV-Verfahren AS-311-O5-ENRRMN „Détection de l'enrichissement des moûts, des moûts concentrés, des moûts concentrés rectifiés et des vins par application de la résonance magnétique nucléaire du deutérium (RMN-FINS)“ (Bestimmung der Anreicherung von Mosten, konzentrierten Mosten, rektifizierten Traubenmostkonzentraten und Weinen mittels magnetischer Kernresonanz des Deuteriums (SNIF-NMR))

3. DEFINITIONEN

13C/12C : Verhältnis der Kohlenstoffisotope 13C und 12C in einer Probe δ13C : Gehalt an Kohlenstoff 13 (13C), in Promille (‰) ausgedrückt SNIF-NMR : mit magnetischer Kernresonanz untersuchte, spezifische natürliche Isotopenverteilung V-PDB : Vienna-Pee-Dee Belemnite. Der PDB, die Primärreferenz für die Messung natürlicher Variationen der Kohlenstoff-13-Isotopengehalte, ist ein Calciumcarbonat aus einem Belemnitrostrum der Kreideformation Pee-Dee aus South Carolina (USA). Sein Isotopenverhältnis 13C/12C oder RPDB ist RPDB = 0,0112372. Obgleich die PDB-Lagerstätte seit langem erschöpft ist, dient das Material weiterhin als Primärreferenz, mit der die natürlichen Variationen der Kohlenstoff-13-Isotopengehalte ausgedrückt und Referenzsubstanzen geeicht werden, die bei der Internationalen Atomenergiebehörde (IAEA) in Wien erhältlich sind. Die Häufigkeit des Kohlenstoffs 13 wird vereinbarungsgemäß zum V-PDB ins Verhältnis gesetzt. m/z : Verhältnis Masse/Ladung

4. PRINZIP

Bei der Fotosynthese assimilieren die Pflanzen Kohlendioxid. Hierbei unterscheidet man zwei Haupttypen des Metabolismus: den C3-Metabolismus (Calvin-Zyklus) und den C4-Metabolismus (Hatch-Slack-Zyklus). Diese beiden Mechanismen der Fotosynthese führen zu einer unterschiedlichen Isotopenverteilung. Die Erzeugnisse, die von C4-Pflanzen stammen, wie z. B. Zucker und durch Gärung entstandene Alkohole, weisen höhere 13C-Gehalte auf als die gleichen Stoffe aus C3-Pflanzen. Die meisten Pflanzen wie die Weinrebe und die Zuckerrübe gehören zur C3-Gruppe. Rohrzucker und Mais zählen zur C4-Gruppe. Die Messung des 13C-Gehaltes ermöglicht somit die Erkennung und die Quantifizierung des Zuckers aus der C4-Gruppe (Rohrzucker oder Isoglucose aus Mais), der Traubenerzeugnissen (Traubenmoste, Weine usw.) zugesetzt wurde. Mit den 13C-Gehalten und den SNIF-NMR-Ergebnissen kann auch der Zusatz von Zucker- oder Alkoholmischungen aus C3- und C4-Pflanzen quantifiziert werden.

Der 13C-Gehalt wird mittels des Kohlendioxids bestimmt, das bei der vollständigen Verbrennung der Probe entsteht. Die Häufigkeiten der wichtigsten Isotopomeren der Massen 44 (12C16O2), 45 (13C16O2 und 12C17O16O) sowie 46 (12C16O18O), die aus den verschiedenen möglichen Kombinationen der Isotope 18O, 17O, 16O, 13C und 12C resultieren, werden über Ionenströme von drei verschiedenen Kollektoren eines Isotopenmassenspektrometers gemessen. Die Isotopomere 13C17O16O und 12C17O2 können wegen ihrer sehr geringen Häufigkeit vernachlässigt werden. Der Ionenstrom für m/z = 45 wird um den Beitrag des 12C17O16O korrigiert, der unter Berücksichtigung der relativen Häufigkeiten von 18O und 17O (Craig-Korrektur) in Abhängigkeit der Intensität des Stroms bei m/z = 46 berechnet wird. Der Vergleich mit einer kalibrierten Referenz gegen die internationale Referenz V-PDB erlaubt, den Gehalt an Kohlenstoff 13 auf einer relativen δ13C-Skala zu berechnen.

5. REAGENZIEN

Die Reagenzien und Verbrauchsmaterialien können je nach den im Labor benutzten Geräten (6) variieren. Meistens werden elementaranalytische Systeme verwendet. Bei diesen werden die Proben in verschlossenen Metallbechern oder, bei flüssigen Proben, mittels Injektion mit einer Spritze durch ein Septum eingebracht.

Je nach den benutzten Geräten können folgende Referenzmaterialien, Reagenzien und Verbrauchsmaterialien verwendet werden:

— Bei der IAEA erhältliche Referenzmaterialien: Name Substanz δ13C gegen V-PDB (9) — IAEA-CH-6 Saccharose –10,4 ‰ — IAEA-CH-7 Polyethylen –31,8 ‰ — NBS22 Öl –29,7 ‰ — USGS24 Graphit –16,1 ‰

— beim IRMM in Geel (B) (Institut für Referenzmaterialien und -messungen) erhältlich: Name Substanz δ13C gegen V-PDB (9) — CRM/BCR 656 Weinalkohol –26,93 ‰ — CRM/BCR 657 Glucose –10,75 ‰ — CRM/BCR 660 Wässrige Alkohollösung (Alkoholgehalt 12 % Vol.) –26,72 ‰

— Arbeitsstandard mit einem bekannten, mit internationalen Referenzmaterialien kalibrierten 13C/12C-Verhältnis.

— Die folgende Liste von Verbrauchsmaterialien wird für Systeme mit Durchfluss vorgeschlagen: — Helium für die Analyse (CAS 07440-59-7) — Sauerstoff für die Analyse (CAS 07782-44-7) — Kohlendioxid für die Analyse, als sekundäres Referenzgas für den Kohlenstoff-13-Gehalt (CAS 00124-38-9) — Oxydationsmittel für den Ofen des Verbrennungssystems, z. B. Kupfer(II)-Oxid für die Elementaranalyse (CAS 1317-38-0) — Trockenmittel zur Entfernung des bei der Verbrennung entstandenen Wassers, z. B. Anhydron für die Elementaranalyse (Magnesium-perchlorat) (CAS 10034-81-8). (Nicht notwendig bei Geräten mit Wasserabscheidung durch eine Kühlfalle oder eine selektive durchlässige Kapillarmembran).

6. GERÄTE UND MATERIAL

6.1. Isotopenverhältnis-Massenspektrometer (IRMS)

Isotopenverhältnis-Massenspektrometer (IRMS), mit dem der relative 13C-Gehalt des CO2-Gases in natürlicher Häufigkeit mit einer internen Genauigkeit von mindestens 0,05 ‰ als relativer Wert ausgedrückt gemessen werden kann (9). Die interne Genauigkeit wird hier als Differenz zwischen zwei Messungen an derselben CO2-Probe verstanden. Das Massenspektrometer für die Messung der Isotopenverhältnisse besitzt in der Regel einen dreifachen Kollektor zur simultanen Messung der Intensitäten von m/z = 44, 45 und 46. Das Isotopenverhältnis-Massenspektrometer muss entweder ein doppeltes Probengebersystem aufweisen, um abwechselnd eine unbekannte Probe und eine Referenzprobe messen zu können, oder über ein integriertes System verfügen, das die quantitative Verbrennung der Proben durchführt und das Kohlendioxid von den anderen Verbrennungsprodukten vor der Messung im Massenspektrometer trennt.

6.2. Verbrennungsanlage

Verbrennungsanlage, mit der Ethanol quantitativ in Kohlendioxid umgewandelt und alle anderen Verbrennungsprodukte einschließlich des Wassers ohne Isotopenfraktionierung entfernt werden können. Bei der Anlage kann es sich entweder um ein Durchflusssystem handeln, das in die Massenspektrometrieanlage integriert ist (6.2.1), oder um ein autonomes Verbrennungssystem (6.2.2). Die Anlage muss mindestens die unter (11) angegebene Genauigkeit liefern.

6.2.1. Durchflusssysteme

Sie bestehen entweder aus einem Elementaranalysegerät oder einem Gaschromatographen mit angeschlossenem Verbrennungssystem.

Bei Systemen mit Probeneinbringung mittels Metallbechern wird folgendes Labormaterial benutzt:

— volumetrische Mikrospritze oder Mikropipette mit entsprechenden Spitzen

— Waage mit mindestens 1 μg Genauigkeit

— Zange für die Einkapselung

— Zinnbecher für flüssige Proben

— Zinnbecher für feste Proben

Anmerkung:

Um das Risiko des Verdampfens der Ethanolproben zu begrenzen, kann in die Kapseln ein absorbierendes Material (z. B. Chromosorb W 45-60 mesh) eingebracht werden, wobei vorher durch Messung geprüft werden muss, dass dieses keine signifikante Menge an Kohlenstoff enthält, die die Messung verfälschen könnte.

Wenn ein Elementaranalysegerät mit einem Injektor für Flüssigkeiten oder ein Aufbereitungssystem mit Chromatographie-Verbrennung eingesetzt wird, ist folgendes Labormaterial zu verwenden:

— Spritze für Flüssigkeiten

— Probengefäße mit undurchlässigem Verschluss und inertem Septum.

Die genannten Labormaterialien sind Beispiele und können je nach den eingesetzten Verbrennungsanlagen und Massenspektrometern durch andere geeignete Materialien ersetzt werden.

6.2.2. Autonome Aufbereitungssysteme

Hier werden die aus der Verbrennung der Analyseproben und der Referenzproben stammenden Kohlendioxidproben in Ampullen gefüllt, die dann in das doppelte Probengebersystem des Spektrometers zur Isotopenanalyse gegeben werden. Verschiedene, in der Literatur beschriebene Verbrennungsgeräte können eingesetzt werden:

— geschlossene Verbrennungssysteme, in denen gasförmiger Sauerstoff zirkuliert

— Elementaranalysegeräte mit Helium- und Sauerstoffdurchfluss

— verschlossene Glasampullen, die mit Kupfer(II)oxid als Oxidationsmittel gefüllt sind.

7. AUFBEREITUNG DER ANALYSEPROBEN

Vor der Isotopenbestimmung muss das Ethanol aus dem Wein extrahiert werden. Dies geschieht durch Destillation des Weins wie unter Ziffer 3.1 der SNIF-NMR-Methode beschrieben (OIV-MA-E-AS311-05-ENRRMN).

Im Fall von Traubenmost, Traubenmostkonzentrat oder rektifiziertem Traubenmostkonzentrat müssen die Zucker zunächst wie unter Ziffer 3.2 der SNIF-NMR-Methode beschrieben zu Ethanol vergoren werden (OIV-MA-E-AS311-05-ENRRMN).

8. DURCHFÜHRUNG DER BESTIMMUNG

Signifikante Ethanolverluste durch Verdunstung müssen bei der Aufbereitung vermieden werden, da sich sonst das Isotopenverhältnis in der Probe verändert.

Die folgende Beschreibung basiert auf allgemein gebräuchlichen Verfahren der Ethanolprobenverbrennung mittels automatisierter, handelsüblicher Verbrennungssysteme. Jedes andere Verfahren, bei dem die Ethanolprobe ohne Verdunstungsverlust des Ethanols quantitativ in Kohlendioxid umgesetzt wird, kann für die Aufbereitung des Kohlendioxids für die Isotopenanalyse angewandt werden.

Versuchsverfahren mit einem Elementaranalysegerät:

a) Einkapseln der Proben: — Es sind saubere Becher, Zange und Arbeitsplatte zu verwenden. — Mit der Zange wird ein Becher geeigneter Größe erfasst. — Mit der Mikropipette wird das benötigte flüssige Probenvolumen in den Becher gefüllt. — Anmerkung: 3,84 mg reines Ethanol oder 4,17 mg Destillat mit einem Alkoholgehalt von 92 % (m/m) werden benötigt, um 2 mg Kohlenstoff zu erhalten. Die entsprechende Menge Destillat muss jeweils nach der benötigten Kohlenstoffmenge berechnet werden, die von der Empfindlichkeit des Massenspektrometriegeräts abhängt. — Die Becher werden mit der Zange verschlossen. — Jeder Becher muss absolut undurchlässig verschlossen werden. Ist dies nicht der Fall, muss er verworfen und ein neuer Becher vorbereitet werden. — Pro Probe werden zwei Becher vorbereitet. — Die Becher werden an geeigneten Positionen in den automatischen Probengeber des Elementaranalysegerätes gestellt. Jeder Becher wird mit einer laufenden Nummer gekennzeichnet. — Die Becher mit dem Referenzmaterial werden immer zu Beginn und am Ende der Probenserien gemessen. — Innerhalb der Probenserien werden regelmäßig Kontrollproben gemessen.

b) Überprüfen und Einstellen der Elementaranalyse- und Massenspektrometriegeräte — Die Ofentemperatur des Elementaranalysegerätes und der Durchfluss von Helium- und Sauerstoffgas werden so eingestellt, dass eine optimale Verbrennung der Probe erzielt wird. — Die Dichtigkeit des Elementaranalyse- und Massenspektrometriesystems muss überprüft werden (zum Beispiel durch Kontrolle des Ionenstroms bei m/z = 28, der N2 entspricht). — Das Massenspektrometer wird für die Messung der Ionenstromintensitäten bei m/z = 44, 45 und 46 eingestellt. — Bevor die Probenmessungen durchgeführt werden, wird das System mit bekannten Kontrollproben überprüft.

c) Durchführung einer Messreihe Die Proben im automatischen Probengeber des Elementaranalysegerätes (oder des Chromatographen) werden nacheinander zugeführt. Das jeweils aus der Probenverbrennung entstandene Kohlendioxid wird ins Massenspektrometer überführt, das die Ionenströme misst. Der an die Geräte angeschlossene Computer registriert die Ionenstromintensitäten und berechnet die δ-Werte für jede Probe (9).

9. BERECHNUNG

Das Verfahrensziel ist die Messung des Isotopenverhältnisses 13C/12C des Ethanols, das aus Wein oder Traubenerzeugnissen nach der Gärung extrahiert wurde. Das Isotopenverhältnis 13C/12C kann durch die Abweichung von einem Arbeitsstandard ausgedrückt werden. Die Kohlenstoff-13-Isotopabweichung (δ13C) wird bestimmt auf einer Promille-Delta-Skala (δ/1 000) mittels Vergleich der erhaltenen Ergebnisse von Analyseprobe und Arbeitsstandard, der zuvor mit der internationalen Primärreferenz (V-PDB) kalibriert wurde. Die δ13C-Werte werden gemäß der folgenden Formel auf den Arbeitsstandard bezogen:

δ13CPr/Ref ‰ = 1 000 × (RPr–RRef)/Rref

wo RPr und RRef jeweils das Isotopenverhältnis 13C/12C des Kohlendioxids der Probe bzw. des Arbeitsstandards bezeichnen.

Die δ13C-Werte werden dann gemäß der folgenden Formel auf V-PDB bezogen:

δ13CPr/V-PDB ‰ = δ13CPr/Ref + δ13CRef/V-PDB + (δ13CPr/Ref × δ13Cref/V-PDB)/1 000

wo δ13CRef/V-PDB die zuvor für den Arbeitsstandard gegen das V-PDB bestimmte Isotopenabweichung darstellt.

Während der Online-Messung können kleine, durch die Variation der Gerätebedingungen verursachte Abweichungen auftreten. In diesem Fall müssen die δ13C-Werte der Proben entsprechend der Abweichung des δ13C-Wertes des Arbeitsstandards vom tatsächlichen Wert korrigiert werden. Dieser wurde zuvor mit dem V-PDB durch Abgleich mit einem der internationalen Referenzmaterialien kalibriert. Es kann davon ausgegangen werden, dass zwischen zwei Messungen des Arbeitsstandards die Abweichung und somit die auf die Probenergebnisse anzuwendende Korrektur linear ist. Der Arbeitsstandard muss zu Beginn und am Ende jeder Probenserie gemessen werden. Dann kann mittels einer linearen Interpolation eine Korrektur für jede Probe berechnet werden.

10. QUALITÄTSSICHERUNG UND ÜBERPRÜFUNG

Es wird überprüft, ob der 13C-Wert des Arbeitsstandards nicht um mehr als 0,5 ‰ vom gegebenen Wert abweicht. Andernfalls müssen die Einstellungen der Spektrometrieanlage überprüft und eventuell angepasst werden.

Bei jeder Probe muss überprüft werden, ob die Differenz der Ergebnisse der beiden, nacheinander gemessenen Becher unter 0,3 ‰ liegt. Das Endergebnis einer Probe ist der Mittelwert aus beiden Bechern. Sollte die Abweichung über 0,3 ‰ liegen, muss die Messung wiederholt werden.

Mit Hilfe der Ionenstromintensität bei m/z = 44, die zu der in das Elementaranalysegerät injizierten Kohlenstoffmenge proportional ist, kann überprüft werden, ob der Messvorgang korrekt erfolgt. Unter Standardbedingungen sollte die Ionenstromintensität bei der Analyse der Proben praktisch konstant sein. Eine signifikante Abweichung deutet auf eine Verdunstung des Ethanols (beispielsweise durch einen fehlerhaft verschlossenen Probenbecher) oder auf eine Fehlfunktion des Elementaranalysegeräts oder des Massenspektrometers hin.

11. LEISTUNGSMERKMALE DES VERFAHRENS (GENAUIGKEIT)

Ein erster Ringversuch (11.1) wurde mit Weinalkohol enthaltenden Destillaten und Rohrzucker- und Rübenzucker-Alkoholen sowie verschiedenen Mischungen dieser drei durchgeführt. Da die Studie den Destillationsschritt nicht berücksichtigt, wurden ergänzende Daten aus anderen Ringversuchen zu Weinen (11.2) und insbesondere Eignungstestreihen (11.3) für Isotopenmessungen hinzugezogen. Die Ergebnisse zeigen, dass die verschiedenen, unter geeigneten Bedingungen betriebenen Destillationssysteme und insbesondere diejenigen, die für SNIF-NMR einsetzbar sind, keine signifikante Variabilität für die δ13C-Bestimmungen des Weinethanols aufweisen. Die bei Weinen beobachteten Genauigkeitsparameter sind mit denen des Ringversuchs anhand von Destillaten (11.1) praktisch identisch.

11.1. Ringversuche an den Destillaten

Jahr des Ringversuchs 1996 Anzahl der Labore 20 Probenanzahl 6 Proben in Doppelblindbestimmung Analyt δ13C aus Ethanol





Probencode Weinalkohol Zuckerrübenalkohol Rohrzuckeralkohol A & G 80 % 10 % 10 % B & C 90 % 10 % 0 % D & F 0 % 100 % 0 % E & I 90 % 0 % 10 % H & K 100 % 0 % 0 % J & L 0 % 0 % 100 %





Proben A/G B/C D/F E/I H/K J/L Anzahl der teilnehmenden Labore nach Eliminierung von Ausreißern 19 18 17 19 19 19 Anzahl der auswertbaren Ergebnisse 38 36 34 38 38 38 Mittelwert (δ13C) ‰ –25,32 –26,75 –27,79 –25,26 –26,63 –12,54 Sr 2 0,0064 0,0077 0,0031 0,0127 0,0069 0,0041 Standardabweichung der Wiederholbarkeit (Sr) ‰ 0,08 0,09 0,06 0,11 0,08 0,06 Grenzwert der Wiederholbarkeit r (2,8 × Sr) % 0,22 0,25 0,16 0,32 0,23 0,18 SR 2 0,0389 0,0309 0,0382 0,0459 0,0316 0,0584 Standardabweichung der Reproduzierbarkeit (SR) % 0,20 0,18 0,20 0,21 0,18 0,24 Grenzwert der Reproduzierbarkeit R (2,8 × SR) % 0,55 0,49 0,55 0,60 0,50 0,68

11.2. Ringversuche zu zwei Weinen und einem Alkohol

Jahr des Ringversuchs 1996 Anzahl der Labore 14 für die Weindestillation, davon 7 für die zusätzliche δ13C-Messung des Weinethanols 8 für die δ13C-Messung der Alkoholprobe Anzahl der Proben 3 (Weißwein, Alkoholgehalt 9,3 % Vol., Weißwein, Alkoholgehalt 9,6 % Vol. und Alkohol mit 93 % m/m Alkoholgehalt) Analyt δ13C aus Ethanol





Proben Rotwein Weißwein Alkohol Anzahl der Labore 7 7 8 Anzahl der auswertbaren Ergebnisse 7 7 8 Mittelwert (δ13C) ‰ –26,20 –26,20 –25,08 Varianz der Reproduzierbarkeit SR 2 0,0525 0,0740 0,0962 Standardabweichung der Reproduzierbarkeit (SR) ‰ 0,23 0,27 0,31 Grenzwert der Reproduzierbarkeit R (2,8 × SR) ‰ 0,64 0,76 0,87

Die teilnehmenden Labore benutzten verschiedene Destillationssysteme. Die δ13C- Isotopenbestimmungen, die in einem einzigen Labor für die Gesamtheit der von den Teilnehmern gelieferten Destillate durchgeführt wurden, zeigen weder abweichende Werte noch Werte, die sich signifikant von den Mittelwerten unterscheiden. Die Varianz der Ergebnisse (S2 = 0,0059) ist mit den Varianzen der Wiederholbarkeit Sr 2 des Ringversuchs zu Destillaten (11.1) vergleichbar.

11.3. Ergebnisse der Eignungstestreihen zu Isotopenversuchen

Seit Dezember 1994 finden regelmäßig internationale Eignungsprüfungen für die Isotopenbestimmungen bei Weinen und Alkoholen (Destillate mit Alkoholgehalt 96 % Vol.) statt. Die Ergebnisse ermöglichen es den teilnehmenden Laboren, die Qualität ihrer Analysen zu überprüfen. Die statistische Bearbeitung der Ergebnisse ermöglicht die Einschätzung der Variabilität bei der Bestimmung unter Bedingungen der Reproduzierbarkeit und somit der Varianzparameter und des Reproduzierbarkeitsgrenzwertes. Die Ergebnisse der δ13C-Bestimmungen des Ethanols aus Weinen und Destillaten sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst:

Datum Weine Destillate N S R SR 2 R N S R SR 2 R Dezember 1994 6 0,210 0,044 0,59 6 0,151 0,023 0,42 Juni 1995 8 0,133 0,018 0,37 8 0,147 0,021 0,41 Dezember 1995 7 0,075 0,006 0,21 8 0,115 0,013 0,32 März 1996 9 0,249 0,062 0,70 11 0,278 0,077 0,78 Juni 1996 8 0,127 0,016 0,36 8 0,189 0,036 0,53 September 1996 10 0,147 0,022 0,41 11 0,224 0,050 0,63 Dezember 1996 10 0,330 0,109 0,92 9 0,057 0,003 0,16 März 1997 10 0,069 0,005 0,19 8 0,059 0,003 0,16 Juni 1997 11 0,280 0,079 0,78 11 0,175 0,031 0,49 September 1997 12 0,237 0,056 0,66 11 0,203 0,041 0,57 Dezember 1997 11 0,127 0,016 0,36 12 0,156 0,024 0,44 März 1998 12 0,285 0,081 0,80 13 0,245 0,060 0,69 Juni 1998 12 0,182 0,033 0,51 12 0,263 0,069 0,74 September 1998 11 0,264 0,070 0,74 12 0,327 0,107 0,91 Gewichteter Durchschnitt 0,215 0,046 0,60 0,209 0,044 0,59 N : Anzahl der teilnehmenden Labore

11.4. Grenzwerte der Wiederholbarkeit und der Reproduzierbarkeit

Die in den vorstehenden Tabellen aufgeführten Daten der verschiedenen Labor-Ringversuche ermöglichen so für die vorliegende Methode die Bestimmung der Grenzwerte der Wiederholbarkeit und der Reproduzierbarkeit unter Einbeziehung des Destillationsschrittes:

Grenzwert der Wiederholbarkeit r: 0,24

Grenzwert der Reproduzierbarkeit R: 0,6.

11 GESAMTSÄURE (OIV - AS-313-01-ACITOT) — METHODE DES TYPS I

1. DEFINITION

Die Gesamtsäure stellt die Summe aller titrierbaren Säuren dar, wenn der pH-Wert durch Zugabe einer alkalischen Maßlösung auf 7,0 eingestellt wird.

Kohlensäure ist in der Gesamtsäure nicht enthalten.

2. PRINZIP DER METHODE

Potenziometrische Titration oder Titration in Gegenwart von Bromthymolblau als Indikator des Endpunkts der Reaktion gegen eine Farbvergleichslösung.

3. REAGENZIEN

3.1. Pufferlösung pH 7,0:

Kaliumdihydrogenphosphat KH2PO4: 107,3 g

1 M Natronlauge (NaOH): 500 ml

Wasser zum Auffüllen auf 1 000 ml

Die handelsüblichen Pufferlösungen können ebenfalls verwendet werden.

3.2. 0,1 M Natronlauge (NaOH).

3.3. Bromthymolblaulösung 4 g/l

Bromthymolblau (C27H28Br2O5S) … 4 g Neutraler Alkohol 96 % vol. … 200 ml Nach der Solubilisierung werden hinzugefügt: Kohlendioxidfreies Wasser … 200 ml 1 M Natronlauge bis zum Farbumschlag nach blaugrün (pH 7)… 7,5 ml Wasser zum Auffüllen auf… 1 000 ml

4. GERÄTE

4.1. Wasserstrahlpumpe

4.2. Saugflasche, 500 ml

4.3. Potenziometer mit Skala in pH-Einheiten und Elektroden. Die Glaselektrode muss in destilliertem Wasser, die Kalomel-Elektrode in einer gesättigten Kaliumchloridlösung aufbewahrt werden. Meist wird eine kombinierte Elektrode verwendet, die in destilliertem Wasser aufzubewahren ist.

4.4. Messzylinder mit 50 ml Inhalt (Wein) bzw. 100 ml Inhalt (rektifiziertes Traubenmostkonzentrat).

5. DURCHFÜHRUNG DER BESTIMMUNG

5.1. Vorbereitung der Probe

5.1.1. Wein

Zur Entfernung des Kohlendioxids etwa 50 ml Wein in eine Saugflasche geben und 1 bis 2 Minuten an der Wasserstrahlpumpe schütteln.

5.1.2. Rektifiziertes Traubenmostkonzentrat

Genau 200 g RTK in einen 500 ml-Messkolben einwiegen, mit Wasser zur Marke auffüllen und homogenisieren.

5.2. Potenziometrische Titration

5.2.1. Eichung des pH-Meters

Das pH-Meter wird gemäß seiner Betriebsanleitung mit der Pufferlösung pH 7,0 bei 20 °C geeicht.

5.2.2. Durchführung der Bestimmung

In einen Messzylinder (4.4) die gemäß Ziffer 5.1 vorbereitete Probe geben, d. h. 10 ml Wein bzw. 50 ml RTK-Lösung, etwa 10 ml destilliertes Wasser hinzufügen und mit 0,1 M Natronlauge (3.2) in eine Bürette geben, bis der pH-Wert 7,0 bei 20 °C erreicht ist. Die Natronlauge muss langsam zugegeben und die Lösung ständig gerührt werden. n = ml der zugesetzten 0,1 M Natronlauge.

5.3. Titration mit Indikator (Bromthymolblau)

5.3.1. Vorversuch: Herstellung der Farbvergleichslösung

In einen Messzylinder (4.4) 25 ml ausgekochtes destilliertes Wasser, 1 ml Bromthymolblaulösung (3.3) und ein Volumen der gemäß 5.1 vorbereiteten Probe, d. h. 10 ml Wein bzw. 50 ml RTK-Lösung geben. 0,1 M Natronlauge (3.2) bis zum Farbumschlag nach blaugrün zugeben und anschließend 5 ml der Pufferlösung pH 7,0 (3.1) hinzufügen.

5.3.2. Messung

In einen Messzylinder (4.4) 30 ml ausgekochtes destilliertes Wasser, 1 ml Bromthymolblaulösung (3.3) und ein Volumen der gemäß 5.1 vorbereiteten Probe, d. h. 10 ml Wein bzw. 50 ml RTK-Lösung geben. Man titriert mit 0,1 M Natronlauge (3.2) auf den im Vorversuch (5.3.1) ermittelten Farbton. n = ml verbrauchte 0,1 M Natronlauge.

6. DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

6.1. Berechnung

6.1.1. Wein

Die Gesamtsäure, ausgedrückt als Milliäquivalent (mval) je Liter, beträgt

A = 10 n

Der Wert wird mit einer Dezimalstelle angegeben.

Die Gesamtsäure, ausgedrückt als Gramm Weinsäure je Liter, beträgt

A′ = 0,075 × A

Der Wert wird mit einer Dezimalstelle angegeben.

6.1.2. Rektifiziertes Traubenmostkonzentrat

— Die Gesamtsäure, ausgedrückt als Milliäquivalent (mval) je Kilogramm RTK, beträgt a = 5 × n

— Die Gesamtsäure, ausgedrückt als Milliäquivalent je Kilogramm Gesamtzucker, beträgt — A = (500 × n)/P) — P = % Gesamtzuckergehalt in % (m/m)

Der Wert wird mit einer Dezimalstelle angegeben.

6.2. Wiederholbarkeit (r) der Titration mit Indikator (5.3)

r = 0,9 mval/l r = 0,07 g Weinsäure/l

für Weiß-, Rosé- und Rotweine.

6.3. Reproduzierbarkeit (R) der Titration mit Indikator (5.3)

Für Weiß- und Roséweine: R = 3,6 mval/l R = 0,3 g Weinsäure/l.

Für Rotweine: R = 5,1 mval/l R = 0,4 g Weinsäure/l.

12 FLÜCHTIGE SÄUREN (OIV-AS-313-02-ACIVOL) — METHODE DES TYPS I

1. DEFINITION

Die flüchtigen Säuren setzen sich aus den Homologen der Essigsäure zusammen, die im Wein in freier oder gebundener Form enthalten sind.

2. PRINZIP DER METHODE

Titration der durch Wasserdampfdestillation abgetrennten flüchtigen Säuren.

Aus dem Wein wird zuvor das Kohlendioxid entfernt.

Die unter diesen Bedingungen destillierte freie und gebundene schweflige Säure wird von den flüchtigen Säuren abgezogen.

Eventuell dem Wein zugesetzte Sorbinsäure wird ebenfalls abgezogen.

Hinweis:

Die in einigen Ländern vor der Analyse zur Stabilisierung der Weine verwendete Salicylsäure geht zum Teil in das Destillat über. Sie muss bestimmt und von den flüchtigen Säuren abgezogen werden (Bestimmungsmethode unter Ziffer 7 dieses Kapitels).

3. REAGENZIEN

3.1. Kristallisierte Weinsäure (C4H6O6)

3.2. 0,1 M Natronlauge (NaOH)

3.3. Phenolphtaleinlösung 1 %ig in 96 Vol. %igem neutralen Ethanol

3.4. Salzsäure (ρ20 = 1,18 bis 1,19 g/ml), 1:4 verdünnt (v/v)

3.5. 0,005 M Jodlösung (I2).

3.6. Kristallisiertes Kaliumjodid (KI)

3.7. Stärkelösung, 5 g/l

5 g Stärke in etwa 500 ml Wasser lösen, unter Rühren zum Kochen bringen und 10 Minuten sieden lassen. 200 g Natriumchlorid hinzufügen. Nach dem Abkühlen auf 1 Liter auffüllen.

3.8. Gesättigte Natriumboratlösung (Na2B4O7 10 H2O): etwa 55 g/l bei 20 °C.

4. GERÄTE

4.1. Wasserdampfdestillationsapparatur, bestehend aus

1) einem Wasserdampfentwickler; der erzeugte Wasserdampf muss frei von Kohlendioxid sein;

2) einem Destillierkolben;

3) einer Rektifizierkolonne;

4) einem Kühler.

Diese Apparatur muss folgenden Bedingungen genügen:

a) 20 ml ausgekochtes Wasser in den Destillierkolben geben. 250 ml des Destillats auffangen und 0,1 ml der 0,1 M Natronlauge (3.2) und zwei Tropfen Phenolphtaleinlösung (3.3) zugeben. Die Rosafärbung muss mindestens 10 Sekunden lang bestehen bleiben (Wasserdampf frei von Kohlendioxid).

b) 20 ml 0,1 M Essigsäurelösung in den Destillierkolben geben. 250 ml Destillat auffangen und mit 0,1 M Natronlauge (3.2) titrieren. Es müssen mindestens 19,9 ml titriert werden (überdestillierte Essigsäure ≥ 99,5 %).

c) 20 ml 1 M Milchsäurelösung in den Destillierkolben geben. 250 ml Destillat auffangen und mit 0,1 M Natronlauge (3.2) titrieren.

Es dürfen nicht mehr als 1,0 ml titriert werden (überdestillierte Milchsäure ≤ 0,5 %).

Jede Apparatur und jede Verfahrensweise, die den obengenannten Anforderungen entspricht, gilt als international amtlich.

4.2. Wasserstrahlpumpe

4.3. Saugflasche

5. DURCHFÜHRUNG DER BESTIMMUNG

5.1. Vorbereitung der Probe: Entfernung des Kohlendioxids

Etwa 50 ml Wein in eine Saugflasche geben, 1 bis 2 Minuten schütteln und mithilfe der Wasserstrahlpumpe Unterdruck herstellen.

5.2. Wasserdampfdestillation

20 ml des nach 5.1 entcarbonisierten Weines in den Destillierkolben geben und etwa 0,5 g Weinsäure (3.1) zufügen. Mindestens 250 ml Destillat auffangen.

5.3. Titration

Mit 0,1 M Natronlauge (3.2) in Gegenwart von 2 Tropfen Phenolphtaleinlösung (3.3) titrieren (n = zugegebenes Volumen in ml).

4 Tropfen 1:4 verdünnte Salzsäure (3.4), 2 ml Stärkelösung (3.7) und einige Kaliumjodidkristalle (3.6) hinzufügen. Das freie Schwefeldioxid mit 0,005 M Jodlösung (3.5) titrieren (n′ = zugegebenes Volumen in ml).

Bis zum Farbumschlag nach rosa gesättigte Natriumboratlösung (3.8) zugeben und das gebundene Schwefeldioxid mit 0,005 M Jodlösung (3.5) titrieren (n″ = zugegebenes Volumen in ml).

6. DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

6.1. Berechnung

Der Gehalt an flüchtigen Säuren, ausgedrückt in Milliäquivalent/l (mval/l) mit einer Dezimalstelle, beträgt

A = 5 (n – 0,1 n′ – 0,05 n″)

Der Gehalt an flüchtigen Säuren, ausgedrückt in Gramm Essigsäure je Liter mit zwei Dezimalstellen, beträgt

0,300 (n – 0,1 n′ – 0,05 n″)

6.2. Wiederholbarkeit (r):

r = 0,7 mval/l r = 0,04 g Essigsäure/l

6.3. Reproduzierbarkeit (R)

R = 1,3 mval/l R = 0,08 g Essigsäure/l

6.4. Weine mit Sorbinsäurezusatz

Da die Sorbinsäure bei einem Destillationsvolumen von 250 ml zu etwa 96 % in das Destillat übergeht, muss sie von den flüchtigen Säuren abgezogen werden. 100 mg Sorbinsäure entsprechen 0,89 mval oder 0,053 g Essigsäure. Der Gehalt an Sorbinsäure (mg/l) wird separat bestimmt.

7. BESTIMMUNG DER SALICYLSÄURE IM DESTILLAT DER FLÜCHTIGEN SÄUREN

7.1. Prinzip

Nach der Bestimmung der flüchtigen Säuren und der Korrektur des Schwefeldioxids wird die Salicylsäure nach Ansäuern und Zusatz eines Eisen-III-Salzes durch die entstehende Violettfärbung nachgewiesen.

Die Bestimmung der in das Destillat der flüchtigen Säuren übergegangenen Salicylsäure erfolgt in einem zweiten Destillat von gleichem Volumen. In diesem Destillat wird die Salicylsäure mit einer Farbvergleichsmethode bestimmt. Die so ermittelte Menge an Salicylsäure wird vom Gehalt an flüchtigen Säuren abgezogen.

7.2. Reagenzien

7.2.1. Salzsäure (HCl) (ρ20 = 1,18 to 1,19 g/ml).

7.2.2. Natriumthiosulfat (Na2S2O3 × 5 H2O) 0,1 M

7.2.3. Lösung von Ammoniumeisen-III-Sulfat ([Fe2(SO4)3, (NH4)2SO4 · 24 H2O), 10 %ig (m/v).

7.2.4. Natriumsalicylatlösung, 0,01 M. Die Lösung enthält 1,60 g/l Natriumsalicylat (NaC7H5O3).

7.3. Durchführung der Bestimmung

7.3.1. Nachweis der Salicylsäure im Destillat der flüchtigen Säuren

Unmittelbar nach der Bestimmung der flüchtigen Säuren und der Korrektur des freien und des gebundenen Schwefeldioxids 0,5 ml Salzsäure (7.2.1), 3 ml 0,1 M Natriumthiosulfatlösung (7.2.2) und 1 ml Ammoniumeisen(III)-sulfatlösung (7.2.3) in den Erlenmeyerkolben geben.

Bei Anwesenheit von Salicylsäure entsteht eine violette Färbung.

7.3.2. Bestimmung der Salicylsäure

Das Volumen des Destillats an dem oben genannten Erlenmeyerkolben markieren. Den Kolben entleeren und ausspülen.

Eine neue Probe von 20 ml Wein destillieren und das Destillat in demselben Erlenmeyerkolben bis zur Markierung auffangen. 0,3 ml reine Salzsäure (7.2.1) und 1 ml Ammoniumeisen(III)-sulfatlösung (7.2.3) zugeben. Es entsteht eine violette Färbung.

In einen gleichen Erlenmeyerkolben soviel destilliertes Wasser geben, wie der oben genannten Destillatmenge entspricht. 0,3 ml reine Salzsäure (7.2.1) und 1 ml Ammoniumeisen(III)-sulfatlösung (7.2.3) zugeben. Mit 0,01 M Natriumsalicylatlösung (7.2.4) titrieren, bis die Intensität der entstehenden Violettfärbung derjenigen im Erlenmeyerkolben mit dem Weindestillat entspricht.

n′′′ = zugegebene Menge in ml.

7.4. Korrektur der flüchtigen Säure

Das Volumen 0,1 n′′′ ml von den n ml 0,1 M Natronlauge abziehen, die zur Titration des Destillates der flüchtigen Säuren verbraucht wurden.

13 CITRONENSÄURE (OIV-AS-313-09-ACIENZ) — METHODE DES TYPS II

1. PRINZIP DER METHODE

Citronensäure wird in einer durch Citrat-Lyase (CL) katalysierten Reaktion in Oxalacetat und Acetat umgewandelt:

Citrat ←→ Oxaloacetat + Acetat

Oxalacetat und sein Decarboxilierungsprodukt Pyruvat werden in Gegenwart von Malat-Dehydrogenase (MDH) und Lactat-Dehydrogenase (LDH) durch reduziertes Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) zu L-Malat und L-Lactat reduziert.

Oxalacetat + NADH + H+ ←→ L-Malat + NAD+

Pyruvat + NADH + H+ ←→ L-Lactat + NAD+

Die in diesen Reaktionen zu NAD+ oxidierte NADH-Menge ist proportional dem vorhandenen Citratgehalt. Die Oxidation des NADH wird durch die Abnahme der Extinktion bei der Wellenlänge 340 nm gemessen.

2. REAGENZIEN

2.1. Pufferlösung pH 7,8

(Glycylglycin 0,51 M; pH = 7,8; Zn2+: 0,6 × 10- 3M):

7,13 g Glycylglycin in etwa 70 ml bidestilliertem Wasser lösen.

Den pH-Wert mit etwa 13 ml 5 M Natronlauge auf 7,8 einstellen. 10 ml Zinkchloridlösung (ZnCl2 80 mg/100 ml) zugeben und mit bidestilliertem Wasser auf 100 ml auffüllen.

Die Lösung ist bei + 4 °C mindestens 4 Wochen haltbar.

2.2. Lösung von reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid (NADH), (ca. 6 × 10- 3 M): 30 mg NADH und 60 mg NaHCO3 in 6 ml bidestilliertem Wasser lösen.

2.3. Lösung von Malat-Dehydrogenase/Lactat-Dehydrogenase (MDH/LDH) (0,5 mg MDH/ml); 2,5 mg LDH/ml): Eine Mischung von 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml), 0,4 ml Ammoniumsulfat-Lösung (3,2 M) und 0,5 ml LDH (5 mg/ml) herstellen. Die Suspension ist bei + 4 °C mindestens ein Jahr haltbar.

2.4. Citrat-Lyase CL (5 mg Protein/ml): 168 mg Lyophilisat in 1 ml Eiswasser lösen. Die Lösung ist bei + 4 °C mindestens eine Woche und tiefgefroren mindestens vier Wochen haltbar.

Es wird empfohlen, vor der Bestimmung die Enzymaktivität zu überprüfen.

2.5. Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP)

Hinweis: Alle für diese Bestimmung nötigen Reagenzien sind im Handel erhältlich.

3. GERÄTE

3.1. Spektralfotometer zur Durchführung von Messungen bei 340 nm, dem Absorptionsmaximum von NADH.

Alternativ kann ein Spektrallinienfotometer zur Durchführung der Messungen bei 334 nm oder 365 nm verwendet werden. Da es sich um absolute Messungen der Extinktion handelt (keine Eichkurve, sondern Heranziehung des Extinktionskoeffizienten von NADH), müssen die Skalen der Wellenlänge und der Extinktion geeicht sein.

3.2. Glas- oder Einmalküvetten, Schichtdicke 1 cm.

3.3. Mikropipetten für Volumen von 0,02 bis 2 ml.

4. VORBEREITUNG DER PROBE

Die Citratbestimmung erfolgt im Allgemeinen direkt aus Wein ohne vorherige Entfärbung und ohne Verdünnung, sofern der Citronensäuregehalt unter 400 mg/l liegt. Anderenfalls wird der Wein so verdünnt, dass der Citratgehalt zwischen 20 und 400 mg/l liegt (im Messansatz zwischen 5 μg und 80 μg).

Bei Rotweinen, die viele Phenolverbindungen enthalten, wird zuvor eine Behandlung mit PVPP empfohlen:

Eine Suspension von ca. 0,2 g PVPP in Wasser herstellen, 15 Minuten stehen lassen und über ein Faltenfilter filtrieren.

10 ml Wein in einen 50-ml-Erlenmeyerkolben geben, das mit einem Spatel aus dem Filter entnommene, feuchte PVPP hinzufügen, 2 bis 3 Minuten schütteln und filtrieren.

5. DURCHFÜHRUNG DER BESTIMMUNG

Das Spektralfotometer wird auf 340 nm eingestellt. Die Extinktionsmessungen erfolgen in 1-cm-Küvetten gegen Luft (keine Küvette im Strahlengang). In die 1-cm-Küvetten pipettiert man:

Leerwert Probe Lösung 2.1 1,00 ml 1,00 ml Lösung 2.2 0,10 ml 0,10 ml Probe — 0,20 ml Bidestilliertes Wasser 2,00 ml 1,80 ml Lösung 2.3 0,02 ml 0,02 ml

Mischen und nach etwa 5 Minuten die Extinktion des Leerwertes und der Probe ablesen (E1).

Hinzufügen:

Lösung 2.4 0,02 ml 0,02 ml

Mischen, Ende der Reaktion abwarten (etwa 5 Minuten) und die Extinktion des Leerwertes und der Probe ablesen (E2).

Die Extinktionsdifferenzen (E1 – E2) für Leerwert und Probe bestimmen.

Die Extinktionsdifferenz des Leerwertes wird von der der Probe abgezogen:

ΔE = ΔEP – ΔEL

Hinweis: Die für die Reaktion der Enzyme erforderliche Zeit kann von einer Charge zur anderen schwanken, sie wird hier nur als Beispiel angegeben. Es wird empfohlen, sie für jede Charge zu bestimmen.

6. DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

Der Citronensäuregehalt wird in Milligramm je Liter (mg/l) ohne Dezimalstelle angegeben.

6.1. Berechnung

Die allgemeine Formel für die Berechnung der Konzentration in Milligramm je Liter lautet:

C = ((V × PM)/(ε × d × v)) × ΔE

V = Testvolumen in ml (hier 3,14 ml) v = Volumen der Probe in ml (hier 0,2 ml) M = Molekülmasse des zu bestimmenden Stoffs (hier: Citronensäure, wasserfrei = 192,1) d = Schichtdicke der Küvette in cm (hier 1 cm) ε = Extinktionskoeffizient von NADH bei 340 nm, ε = 6,3 mmol– 1 × l × cm– 1.

Man erhält

C = 479 × ΔE

Wurde die Probe bei der Zubereitung verdünnt, so ist das Ergebnis mit dem Verdünnungsfaktor zu multiplizieren.

Hinweis: bei 334 nm: C = 488 × ΔE (ε = 6,2 mmol– 1 × l × cm– 1)

bei 365 nm: C = 887 × ΔE (ε = 3,4 mmol– 1 × l × cm– 1)

6.2. Wiederholbarkeit (r):

Citronensäuregehalt unter 400 mg/l: r = 14 mg/l

Citronensäuregehalt über 400 mg/l: r = 28 mg/l

6.3. Reproduzierbarkeit (R)

Citronensäuregehalt unter 400 mg/l: R = 39 mg/l

Citronensäuregehalt über 400 mg/l: R = 65 mg/l

14 SÄURE (OIV-AS-313-14-ACISOR) — METHODE DES TYPS IV

1. PRINZIP DER METHODEN

1.1. UV-Spektralfotometrische Messung

Die Sorbinsäure (E,E)-2,4-Hexadiensäure) wird mittels Wasserdampfdestillation abgetrennt und im Destillat durch UV-Spektralfotometrie bestimmt. Zur Entfernung der Stoffe, die die Absorptionsmessung im UV-Bereich stören, wird ein Teil des Destillates mit einer Calciumhydroxidlösung schwach alkalisiert und zur Trockne eingedampft. Gehalte unter 20 mg/l müssen dünnschichtchromatographisch bestätigt werden (Empfindlichkeit: 1 mg/l).

1.2. Gaschromatographische Methode

Die in Diethylether extrahierte Sorbinsäure wird gaschromatographisch in Gegenwart eines internen Standards bestimmt.

1.3. Nachweis von Sorbinsäurespuren durch Dünnschichtchromatographie

Die in Diethylether extrahierte Sorbinsäure wird dünnschichtchromatographisch getrennt, und ihre Konzentration wird semiquantitativ bestimmt.

2. UV-SPEKTRALFOTOMETRISCHE MESSUNG

2.1. Reagenzien

2.1.1. Weinsäure (C4H6O6), kristallisiert

2.1.2. Calciumhydroxidlösung Ca(OH)2, etwa 0,02 M

2.1.3. Sorbinsäure-Standardlösung, 20 mg/l:

20 mg Sorbinsäure C6H8O2 in etwa 2 ml 0,1 M Natronlauge lösen. In einen 1 000-ml-Messkolben geben und mit Wasser zur Marke auffüllen. Man kann auch 26,8 mg Kaliumsorbat (C6H7KO2) in Wasser lösen und mit Wasser auf 1 000 ml auffüllen.

2.2. Geräte

2.2.1. Wasserdampfdestillationsapparatur (siehe ‘Flüchtige Säuren’)

2.2.2. Wasserbad, 100 °C

2.2.3. Spektralphotometer zur Messung bei 256 nm in Quarzküvetten mit 1 cm Schichtdicke

2.3. Durchführung der Bestimmung

2.3.1. Destillation

10 ml Wein in den Destillierkolben der Wasserdampfdestillationsapparatur geben und 1-2 g Weinsäure (2.1.1) hinzufügen. 250 ml Destillat auffangen.

2.3.2. Eichkurve

Aus der Sorbinsäure-Standardlösung (2.1.3) vier verdünnte Standardlösungen mit Wasser herstellen, die 0,5, 1, 2,5 und 5 mg/l Sorbinsäure enthalten. Die Extinktionen dieser Lösungen werden bei 256 nm gegen destilliertes Wasser gemessen. Die gemessenen Extinktionen, gegen die entsprechenden Konzentrationen der Lösungen aufgetragen, ergeben eine Gerade.

2.3.3. Bestimmung

5 ml Destillat in eine Abdampfschale (Durchmesser 55 mm) geben, 1 ml Calciumhydroxidlösung (2.1.2) hinzufügen und auf dem siedenden Wasserbad zur Trockne eindampfen.

Den Rückstand in wenigen Milliliter destilliertem Wasser aufnehmen, quantitativ in einen 20-ml-Messkolben überführen und mit dem Waschwasser zur Marke auffüllen. Mithilfe des Spektralfotometers wird die Extinktion bei 256 nm gegenüber einer Blindlösung messen, die hergestellt wird, indem 1 ml durch Calciumhydroxidlösung (2.1.2) mit Wasser auf 20 ml aufgefüllt wird.

Der der gemessenen Extinktion entsprechende Sorbinsäuregehalt C wird der Eichkurve entnommen.

Hinweis: In der Routineuntersuchung kann das Eindampfen zur Trockne vernachlässigt werden. Die Extinktion kann direkt am 1:4 mit Wasser verdünnten Destillat gemessen werden.

2.4. Darstellung der Ergebnisse

2.4.1. Berechnung

Der Sorbinsäuregehalt des Weines, ausgedrückt in mg/l, beträgt

100 × C

C = Sorbinsäurekonzentration in der spektralfotometrisch analysierten Lösung, ausgedrückt in mg/l.

3. GASCHROMATOGRAPHISCHE BESTIMMUNG

3.1. Reagenzien

3.1.1. Diethylether (C2H5)2O, unmittelbar vor Gebrauch destilliert

3.1.2. Interner Standard: Lösung von Undecansäure (C11H22O2) in Ethanol (95 % Vol.), 1 g/l.

3.1.3. Schwefelsäure (H2SO4) (ρ20 = 1,84 g/ml) mit Wasser 1:3 verdünnt (v/v).

3.2. Geräte

3.2.1. Gaschromatograph mit Flammenionisationsdetektor und Edelstahlsäule (4 M × ″), vorbehandelt mit Dimethyldichlorsilan (DMDCS), belegt mit einer stationären Phase aus einer Mischung von Diethylenglykolsuccinat (5 %) und Phosphorsäure (1 %) (DEGS— H3PO4) oder einer Mischung von Diethylenglykoladipat (7 %) und Phosphorsäure (1 %) (DEGA — H3PO4) auf Gaschrom Q, 80 - 100 mesh.

Behandlung mit Dimethyldichlorsilan (DMDCS): Eine Lösung von 2 - 3 g DMDCS in Toluol durch die Säule fließen lassen und sofort mit Methanol nachwaschen. Anschließend einen Stickstoffstrom durchleiten, dann Hexan und wiederum Stickstoff. Danach wird die Säule gefüllt.

Gaschromatographiebedingungen:

Ofentemperatur: 175 °C

Temperatur des Probengebers und des Detektors: 230 °C

Trägergas: Stickstoff (Strömungsgeschwindigkeit 20 ml/Min.)

3.2.2. Mikroliterspritze, 10 μl mit 0,1 μl-Einteilung

Hinweis: Mit anderen Säulen kann ebenfalls eine gute Trennung erreicht werden, vor allem mit Kapillarsäulen (z. B. FFAP).

Die nachstehend beschriebene Durchführung der Bestimmung ist als Beispiel angegeben.

3.3. Durchführung der Bestimmung

3.3.1. Vorbereitung der Probe

20 ml Wein, 2 ml des internen Standards (3.1.2) und 1 ml verdünnte Schwefelsäurelösung (3.1.3) in ein geeignetes Glasgefäß mit Schliffstopfen (Inhalt etwa 40 ml) geben.

Nach Schütteln durch mehrmaliges Umdrehen 10 ml Diethylether (3.1.1) hinzufügen, die Sorbinsäure durch 5minütiges Schütteln in die organische Phase extrahieren und absetzen lassen.

3.3.2. Zubereitung der Eichlösung

Einem Wein, dessen Etherextrakt im Chromatogramm keinen Peak aufweist, der der Elution von Sorbinsäure entspricht, Sorbinsäure bis zu einer Konzentration von 100 mg/l zusetzen. 20 ml dieser Probe gemäß der Beschreibung unter 3.3.1 behandeln.

3.3.3. Chromatographie

Mithilfe einer Mikrospritze nacheinander 2 μl der nach 3.3.2 zubereiteten Etherphase und 2 μl der gemäß 3.3.1 zubereiteten Etherphase in den Chromatographen einspritzen.

Die jeweiligen Chromatogramme aufzeichnen, die Sorbinsäure und den internen Standard anhand der Retentionszeiten identifizieren und die Höhe (oder Fläche) der aufgezeichneten Peaks messen.

3.4. Darstellung der Ergebnisse

3.4.1. Berechnung

Der Sorbinsäuregehalt des untersuchten Weins, ausgedrückt in mg/l, beträgt

100 × (h/H) × (l/i)

H = Höhe des Sorbinsäurepeaks der Eichlösung

h= Höhe des Sorbinsäurepeaks der zu untersuchenden Probe

l= Höhe des Peaks des internen Standards der Eichlösung

i= Hinweis: Der Sorbinsäuregehalt kann auf die gleiche Weise anhand der Flächen der betreffenden Peaks berechnet werden.

Hinweis: Der Sorbinsäuregehalt kann auf die gleiche Weise anhand der Flächen der betreffenden Peaks berechnet werden.

15 PH-WERT (OIV-AS-313-15-PH) — METHODE DES TYPS I

1. PRINZIP

Die Potenzialdifferenz zwischen zwei Elektroden, die in die zu untersuchende Flüssigkeit getaucht werden, wird gemessen. Eine der Elektroden besitzt ein Potenzial, das in einer bestimmten Abhängigkeit zum pH-Wert der Flüssigkeit steht, die andere Elektrode ist die Referenzelektrode mit einem festen und bekannten Potenzial.

2. GERÄTE

2.1. Geeichtes pH-Meter mit Einheiten in pH (erforderliche Genauigkeit mindestens ± 0,05 pH-Einheiten)

2.2. Elektroden

2.2.1. Glaselektrode, Aufbewahrung in destilliertem Wasser

2.2.2. Referenzelektrode (Kalomel-Elektrode), Aufbewahrung in gesättigter Kaliumchloridlösung

2.2.3. Kombinierte Elektrode, Aufbewahrung in destilliertem Wasser

3. REAGENZIEN

3.1. Pufferlösungen

3.1.1. Gesättigte Lösung von Kaliumhydrogentartrat. Die Lösung enthält mindestens 5,7 g Kaliumhydrogentartrat (C4H5KO6) je Liter bei 20 °C. Diese Lösung ist in Gegenwart von Thymol (0,1 g/200 ml) bis zu zwei Monate haltbar.

pH 3,57 bei 20 °C 3,56 bei 25 °C 3,55 bei 30 °C

3.1.2. 0,05 M Kaliumhydrogenphthalatlösung. Die Lösung enthält mindestens 10,211 g Kaliumhydrogenphthalat (C8H5KO4) je Liter bei 20 °C. (Sie ist maximal zwei Monate haltbar).

pH 3,999 bei 15 °C 4,003 bei 20 °C 4,008 bei 25 °C 4,015 bei 30 °C

3.1.3. Lösung von

Kaliumdihydrogenphosphat, KH2PO4 … 3,402 g Dikaliumhydrogenphosphat, K2HPO4 … 4,354 g Wasser zum Auffüllen auf … 1 l

(Haltbarkeit: max. 2 Monate)

pH 6,90 bei 15 °C 6,88 bei 20 °C 6,86 bei 25 °C 6,85 bei 30 °C

Hinweis: Die handelsüblichen Pufferlösungen können ebenfalls verwendet werden.

4. DURCHFÜHRUNG DER BESTIMMUNG

4.1. Vorbereitung der Probe

4.1.1. Most und Wein

Die Messung wird direkt im Most oder Wein durchgeführt.

4.1.2. Rektifiziertes Traubenmostkonzentrat

Das rektifizierte Traubenmostkonzentrat mit Wasser auf 25 ± 0,5 % (m/m) Gesamtzucker verdünnen (25 oBrix).

Wenn P der Gesamtzuckergehalt des rektifizierten Traubenmostkonzentrats, ausgedrückt in % (m/m), ist, eine Masse von 2 500/P einwiegen

und mit Wasser auf 100 g auffüllen. Das Wasser muss eine Leitfähigkeit unter 2 Mikrosiemens je cm aufweisen.

4.2. Nullpunkteinstellung

Vor jeder Messung ist das Gerät entsprechend der Anleitung auf Null einzustellen.

4.3. Eichung des pH-Meters

Mit den Pufferlösungen pH = 6,88 und pH = 3,57 wird das pH-Meter gemäß der Anleitung für das Gerät bei 20 °C geeicht.

Die Eichung wird mit der Pufferlösung pH = 4,00 bei 20 °C überprüft.

4.4. Messung

Die Elektrode bei einer Temperatur zwischen 20 und 25 °C, die aber möglichst nahe bei 20 °C liegen sollte, in die zu untersuchende Lösung tauchen und den pH-Wert direkt auf der Skala ablesen.

An jeder Probe sind mindestens zwei Bestimmungen durchzuführen.

Als Ergebnis gilt das arithmetische Mittel der Bestimmungen.

5. DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

Der pH-Wert des Mostes, des Weines oder der 25%igen RTK-Lösung (25 o Brix) wird mit zwei Dezimalstellen angegeben.

16 SIMULTANER NACHWEIS VON L-ASCORBINSÄURE UND D-ISOASCORBINSÄURE DURCH HPLC UND UV-DETEKTION (OIV-AS-313-22-ACASCO) — METHODE DES TYPS II

1. EINLEITUNG

Ascorbinsäure ist ein Antioxidans, das in zahlreichen Nahrungsmitteln in natürlicher Form vorkommt. Der natürliche Anteil an Ascorbinsäure in Trauben nimmt beim Mostausbau und bei der Weinherstellung ab. Ascorbinsäure kann Most und Wein in begrenzten Mengen zugegeben werden.

Die beschriebene Methode wurde im Rahmen eines Ringversuchs mittels der Analyse von Weinproben validiert, denen Mengen von 30 mg/l bis 150 mg/l L-Ascorbinsäure bzw. 10 mg/l bis 100 mg/l D-Isoascorbinsäure zugesetzt wurden.

2. GÜLTIGKEITSBEREICH

Diese Methode eignet sich für den simultanen Nachweis von L-Ascorbinsäure und D-Isoascorbinsäure (Erythorbinsäure) im Wein im Konzentrationsbereich von 3 bis 150 mg/l mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit UV-Detektion.

Für Konzentrationen über 150 mg/l ist eine Verdünnung der Probe erforderlich.

3. PRINZIP

Die Proben werden nach Membranfiltration direkt in das HPLC-System eingespritzt. Die Analyten werden mit einer Reverse-Phase-Säule getrennt und mittels UV-Detektion bei 266 nm bestimmt. Die Quantifizierung von L-Ascorbinsäure und D-Isoascorbinsäure wird über einen externen Standard durchgeführt.

Hinweis: Die angegebenen Säulen und Durchführungsbedingungen dienen als Beispiel. Mit anderen Säulen kann ebenfalls eine gute Trennung erzielt werden.

4. REAGENZIEN UND PRODUKTE

4.1 Reagenzien

4.1.1 N-Octylamin, Reinheit ≥ 99,0 %

4.1.2 Natriumacetat x 3 H2O, Reinheit ≥ 99,0 %

4.1.3 Essigsäure, rein, 100 %

4.1.4 Phosphorsäure, etwa 25 %

4.1.5 Oxalsäure, Reinheit ≥ 99,0 %

4.1.6 Ascorbatoxidase

4.1.7 L-Ascorbinsäure, ultra ≥ 99,5 %

4.1.8 D-Isoascorbinsäure, Reinheit ≥ 99,0 %

4.1.9 Bidestilliertes Wasser

4.1.10 Methanol, p. A. 99,8 %

4.2 Herstellung der mobilen Phase

4.2.1 Lösungen für die mobile Phase

Für die mobile Phase folgende Lösungen herstellen:

4.2.1.1 12,93 g N-Octylamin in 100 ml Methanol

4.2.1.2 68,05 g Natriumacetat x 3 H2O in 500 ml bidestilliertem Wasser

4.2.1.3 12,01 g reine Essigsäure in 200 ml bidestilliertem Wasser

4.2.1.4 Pufferlösung (pH 5,4): 430 ml Natriumacetatlösung (4.2.1.2) und 70 ml Essigsäurelösung (4.2.1.3)

4.2.2 Herstellen der mobilen Phase

5 ml N-Octylaminlösung (4.2.1.1) mit etwa 400 ml bidestilliertem Wasser in ein Becherglas geben. Diese Lösung durch tropfenweise Zugabe von Phosphorsäure (25 %) auf einen pH von 5,4 bis 5,6 bringen. 50 ml Pufferlösung (4.2.1.4) zugeben, das Gemisch in einen 1 000-ml-Messkolben umfüllen und mit bidestilliertem Wasser auffüllen. Vor der Verwendung muss die mobile Phase durch eine Membran filtriert (regenerierte Zellulose, 0,2 μm) und, je nach Anforderungen des verwendeten HPLC-Systems, nach Möglichkeit mit Helium entgast werden (etwa 10 Minuten).

4.3 Herstellung der Standardlösungen

Hinweis:

Alle Standardlösungen (Stammlösung 4.3.1 und die Gebrauchslösungen 4.3.2) müssen täglich frisch hergestellt werden und sollten vor der Injektion vorzugsweise gekühlt aufbewahrt werden.

4.3.1 Herstellung der Stammlösung (1 mg/ml)

Eine 2%ige wässrige Oxalsäurelösung herstellen und den gelösten Sauerstoff durch Stickstoffspülung entfernen.

Jeweils genau 100 mg L-Ascorbinsäure und D-Isoascorbinsäure in einen 100-ml-Messkolben geben und mit der 2 %igen wässrigen Oxalsäurelösung zur Marke auffüllen.

4.3.2 Herstellung der Gebrauchslösungen

Zum Herstellen der Gebrauchslösungen die Stammlösung (4.3.1) mit der 2%igen Oxalsäurelösung auf die gewünschten Konzentrationen verdünnen. Empfohlen werden Konzentrationen zwischen 10 mg/l und 120 mg/l, z. B. 100 μl, 200 μl, 400 μl, 800 μl, 1 200 μl bis 10 ml, die 10, 20, 40, 80 bzw. 120 mg/l entsprechen.

5. GERÄTE

Übliche Laborausstattung, insbesondere folgende Geräte:

5.1 HPLC-Pumpe

5.2 Einspritzventil mit 20-μl-Probenschleife

5.3 UV-Detektor

6. PROBENBEHANDLUNG

Die Proben werden vor der Injektion durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,2 μm filtriert.

Bei Gehalten über 150 mg/l ist die Probe zu verdünnen.

7. DURCHFÜHRUNG DER BESTIMMUNG

7.1. Versuchsbedingungen der HPLC-Analyse

20μl der durch den Membranfilter filtrierten Probe in das Chromatographiegerät einspritzen.

Vorsäule : z. B. Nucleosil 120 C18 (4 cm x 4 mm) Porengröße: 7 μm) Säule : z. B. Nucleosil 120 C18 (25 cm x 4 mm) Porengröße: 7 μm) Injektionsvolumen : 20 μl Mobile Phase : siehe 4.2.2, isokratisch Flussrate : 1ml/min UV-Detektion : 266 nm Waschzyklus:mindestens : 30 ml bidestilliertes Wasser, gefolgt von 30 ml Methanol und 30 ml Acetonitril

7.2 Identifikation/Bestätigung

Die Peaks werden durch den Vergleich der Retentionszeiten des Standards und der Proben identifiziert. Mit dem als Beispiel angeführten Chromatographiesystem ergeben sich folgende Retentionszeiten: 7,7 Minuten für L-Ascorbinsäure und 8,3 Minuten für D-Isoascorbinsäure (siehe. Abbildung 1, Chromatogramm A).

Zur weiteren Bestätigung positiver Befunde werden diese Proben mit einem Ascorbatoxidase-Spatel behandelt. Anschließend wird die Messung wiederholt (siehe Abbildung 1, Chromatogramm B).

Als Ergebnis des durch die Ascorbatoxidase verursachten Abbaus der L-Ascorbinsäure und der D-Isoascorbinsäure sollten bei den Retentionszeiten von L-Ascorbinsäure und D-Isoascorbinsäure keine Signale mehr festzustellen sein. Falls Störpeaks vorhanden sind, sollte der Bereich, in dem diese Peaks auftreten, bei der Berechnung der Analytenkonzentration berücksichtigt werden.

Hinweis: Es wird empfohlen, die mit Ascorbatoxidase behandelten Proben am Ende einer Testreihe zu analysieren und anschließend den Waschzyklus durchzuführen, um verbleibende Ascorbatoxidase aus der Säule zu entfernen. Andernfalls könnten die L-Ascorbinsäure und die D-Isoascorbinsäure während der HPLC-Messung von der verbleibenden Ascorbatoxidase umgesetzt werden, und das Ergebnis könnte verfälscht werden.

8. BERECHNUNG

Kalibrierkurve unter Verwendung der Gebrauchslösungen (4.3.2) vorbereiten. Unter Anwendung der Methode des externen Standards erfolgt eine quantitative Bestimmung der L-Ascorbinsäure und der D-Isoascorbinsäure durch Messen der Peakflächen und Ablesen der entsprechenden Konzentrationen aus der Kalibrierkurve.

Darstellung der Ergebnisse

Die Ergebnisse werden in mg/l L-Ascorbinsäure und D-Isoascorbinsäure mit einer Dezimalstelle angegeben (Beispiel: 51,3 mg/l).

Bei Gehalten über 150 mg/l ist die Verdünnung zu berücksichtigen.

9. PRÄZISION

Die Methode wurde in einem Ringversuch getestet, an dem 27 Labors teilnahmen und der 1994 vom früheren Bundesgesundheitsamt (Deutschland) geleitet wurde. Die Auswertung des Ringversuchs entsprach der Amtlichen Sammlung von Analysenmethoden nach § 35 des deutschen Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetzes, das von der OIV bis zur Einführung des neuen Protokolls (OENO 6/2000) akzeptiert wurde.

Die Studie umfasste vier verschiedene Weinproben (zwei Weißweine und zwei Rotweine), für die jeweils fünf Wiederholungen gefordert wurden. Da es nicht möglich war, Proben mit einer ausreichenden Stabilität der Analyten (verschiedene Abbauraten) herzustellen, wurde beschlossen, den Teilnehmern mit den Weinproben definierte Mengen reiner Standardsubstanzen zu senden. Die Labors wurden angewiesen, die Standards den Weinproben quantitativ zuzugeben und sofort im Anschluss die Analyse durchzuführen. L-Ascorbinsäure wurde in Mengen von 30 bis 150 mg/l analysiert, D-Isoascorbinsäure in Mengen von 10 bis 100 mg/l. Im von der OIV veröffentlichten ANHANG werden die Ergebnisse der Studie detailliert dargestellt. Die Auswertung erfolgte gemäß der Norm DIN/ISO 5 725 (Version 1988).

Die Standardabweichungen der Wiederholbarkeit (sr) und der Reproduzierbarkeit (sR) korrelieren mit der L-Ascorbinsäure- und der D-Isoascorbinsäurekonzentration. Der eigentliche Präzisionsparameter kann mittels folgender Gleichungen berechnet werden:

L-Ascorbinsäure sr = 0,011 x + 0,31 sR = 0,064 x + 1,39 x: Konzentration der L-Ascorbinsäure (mg/l)

D-Isoascorbinsäure sr = 0,014 x + 0,31 sR = 0,079 x + 1,29 x: Konzentration der D-Isoascorbinsäure (mg/l)

Beispiel:

50 mg/l D-Isoascorbinsäure sr = 1,0 mg/L

sR = 5,2 mg/L

10. SONSTIGE EIGENSCHAFTEN DER ANALYSE

10.1 Detektionsgrenze

Die Detektionsgrenze dieser Methode wurde sowohl für L-Ascorbinsäure als auch für D-Isoascorbinsäure auf 3 mg/l geschätzt.

10.2 Richtigkeit

Die auf der Grundlage des Ringversuchs mit vier Proben (siehe ANHANG im Sammelband der OIV) berechnete mittlere Wiederfindung betrug

— 100,6 % für L-Ascorbinsäure

— 103,3 % für D-Isoascorbinsäure

17 KOHLENDIOXID (OIV-AS-314-01-DIOCAR) — METHODE DES TYPS II

1. PRINZIP DER METHODE

1.1. Stillweine (Überdruck CO2 ≤ 0,5 × 105 Pa) (2)

Einem aliquoten Teil der auf etwa 0 °C gekühlten Probe wird eine so reichliche Menge einer Natriumlauge-Maßlösung zugegeben, dass ein pH-Wert von 10 bis 11 erreicht wird. Es wird mit einer Säurelösung in Gegenwart von Carboanhydrase titriert. Der Gehalt an Kohlendioxid errechnet sich aus dem zur Titration vom pH-Wert 8,6 (Hydrogencarbonat) zum pH-Wert 4,0 (Kohlensäure) benötigten Volumen an Säure unter Berücksichtigung des Leerwertes (von Kohlendioxid befreiter Wein).

1.2. Perlweine und Schaumweine

Die Probe wird bis etwa zum Gefrierpunkt gekühlt. Nach Entnahme einer bestimmten Menge, die nach der Entcarbonisierung für den Blindwert zu verwenden ist, wird in der übrigen Probe die Kohlensäure durch Alkalisieren in Form von Natriumcarbonat gebunden. Es wird mit einer Säurelösung in Gegenwart von Carboanhydrase titriert. Der Gehalt an Kohlendioxid errechnet sich aus dem zur Titration vom pH-Wert 8,6 (Bicarbonat) zum pH-Wert 4,0 (Kohlensäure) benötigten Volumen an Säure unter Berücksichtigung des Leerwertes (von Kohlendioxid befreiter Wein).

2. BESCHREIBUNG DER METHODE

2.1. Stillweine (Überdruck CO2 ≤ 0,5 × 105 Pa).

2.1.1. Geräte

2.1.1.1. Magnetrührer

2.1.1.2. pH-Meter

2.1.2. Reagenzien

2.1.2.1. Natronlauge (NaOH), 0,1 M

2.1.2.2. Schwefelsäure (H2SO4), 0,05 M

2.1.2.3. Carboanhydraselösung, 1 g/l

2.1.3. Durchführung der Bestimmung

Probe und 10-ml-Pipette auf etwa 0 °C kühlen.

25 ml Natronlauge (2.1.2.1) in ein 100-ml-Becherglas geben und 2 Tropfen Carboanhydraselösung (2.1.2.3) zugeben. Mit der auf 0 °C gekühlten Pipette 10 ml Wein hinzufügen.

Das Becherglas mit einem Magnetstäbchen auf den Magnetrührer stellen, die Elektrode einhängen und mäßig rühren.

Wenn die Flüssigkeit Raumtemperatur erreicht hat, langsam die Schwefelsäure (2.1.2.2) bis zum pH-Wert 8,6 hinzufügen.

Dann weiter Schwefelsäure (2.1.2.2) bis zum pH-Wert 4,0 zugeben. n = zwischen pH 8,6 und 4,0 verbrauchte Menge Schwefelsäure in ml.

Aus etwa 50 ml der Probe das CO2 durch dreiminütiges Schütteln unter Vakuum entfernen und den Kolben im Wasserbad auf etwa 25 °C erwärmen.

Das oben beschriebene Verfahren an 10 ml des entcarbonisierten Weins durchführen. n′ = das verwendete Volumen in ml.

2.1.4. Darstellung der Ergebnisse

1 ml der titrierten 0,05 M Schwefelsäure entspricht 4,4 mg CO2.

Die Menge CO2 in g/l Wein beträgt:

0,44 (n – n′)

Der Wert wird mit 2 Dezimalstellen angegeben.

Hinweis: Beträgt der CO2-Gehalt weniger als 1 g/l, ist die Zugabe von Carboanhydrase zur Katalyse der Hydratation des CO2 nicht erforderlich.

2.2. Perlweine und Schaumweine

2.2.1. Geräte

2.2.1.1. Magnetrührer

2.2.1.2. pH-Meter

2.2.2. Reagenzien

2.2.2.1. Natronlauge (NaOH), 50 % (m/m)

2.2.2.2. Schwefelsäure (H2SO4), 0,05 M

2.2.2.3. Carboanhydraselösung, 1 g/l

2.2.3. Durchführung der Bestimmung

An der Flasche mit dem zu analysierenden Wein wird die Füllhöhe markiert, dann wird die Flasche bis zum Beginn des Gefrierens gekühlt.

Unter Schütteln bis zum Verschwinden der Eiskristalle die Flasche sich langsam erwärmen lassen.

Rasch entkorken und 45 bis 50 ml Wein zur Bestimmung des Leerwerts in einen Messzylinder geben. Das exakte Volumen „v“ ml wird durch Ablesen am Messzylinder festgestellt, nachdem die Probe Raumtemperatur erreicht hat.

Sofort nach der Entnahme für den Leerwert 20 ml Natronlauge (2.2.2.1) zum Flascheninhalt (750 ml) hinzufügen.

Den Wein Raumtemperatur erreichen lassen.

30 ml ausgekochtes, destilliertes Wasser und 2 Tropfen Carboanhydrase-Lösung (2.2.2.3) in ein 100-ml-Becherglas geben und 10 ml des alkalisierten Weins hinzufügen.

Das Becherglas mit einem Magnetstäbchen auf den Magnetrührer stellen, die Elektrode einhängen und mäßig rühren.

Langsam Schwefelsäure (2.2.2.2) bis zum pH-Wert 8,6 zugeben.

Dann weiter Schwefelsäure (2.2.2.2) bis zum pH-Wert 4,0 zugeben. n = zwischen pH 8,6 und 4,0 verbrauchte Menge Schwefelsäure in ml.

Aus den „v“ ml Wein, die zur Bestimmung des Leerwerts entnommen wurden, das CO2 durch dreiminütiges Schütteln unter Vakuum entfernen und den Kolben im Wasserbad auf etwa 25 °C erwärmen. 10 ml des entcarbonisierten Wein in 30 ml ausgekochtes, destilliertes Wasser geben und 2 bis 3 Tropfen Natronlauge (2.2.2.1) hinzufügen, um einen pH-Wert von 10 bis 11 zu erreichen. Dann wie oben beschrieben weiter verfahren. n′ = verbrauchtes Volumen 0,05 M Schwefelsäure in ml.

2.2.4. Darstellung der Ergebnisse

1 ml 0,05 M Schwefelsäure entspricht 4,4 mg CO2.

Den alkalisierten Wein ausgießen und die Flasche bis zur Markierung mit Wasser (V ml) füllen, um das Ausgangsvolumen bis auf 1 ml genau zu bestimmen.

Die Menge CO2 in g/l Wein beträgt:

0,44(n – n′) x ((V – v + 20)/(V – v))

Der Wert wird mit 2 Dezimalstellen angegeben.

2.3. Berechnung des theoretischen Überdrucks

Die Formel für den Überdruck bei 20 °C, Paph20, ausgedrückt in Pascal, lautet:

Paph20 = ((Q)/(1,951 × 10–5(0,86 – 0,01 A)(1 – 0,00144 S))) – Patm

Dabei ist

Q : CO2-Gehalt des Weines in g/l A : Alkoholgehalt des Weines bei 20 °C S : Zuckergehalt des Weines in g/l Patm : Atmosphärendruck, ausgedrückt in Pascal

18 MANOMETRISCHE METHODE ZUR BESTIMMUNG VON KOHLENDIOXID IN WEIN (OIV-AS314-04-CO2MAN) — METHODE DES TYPS II

(p. m.)

[Die Beschreibung dieser Analysemethode wird zurzeit von den zuständigen Stellen der OIV aktualisiert. Sie wird in einer der nächsten Mitteilungen der Kommission veröffentlicht, sobald die OIV in der Ausgabe 2010 des Sammelbands der internationalen Analysemethoden der OIV einen aktualisierten Text veröffentlicht hat.]

19 MESSUNG DES ÜBERDRUCKS BEI SCHAUM- UND PERLWEINEN (OIV-AS-314-02-SURPRES) — METHODE DES TYPS I

1. PRINZIP

Nach thermischer Stabilisierung und Schütteln der Flasche wird der Überdruck mit einem Aphrometer (Druckmesser) gemessen. Er wird in Pascal (Pa) ausgedrückt (Methode des Typs I). Die Methode gilt auch für Schaumwein mit zugesetzter Kohlensäure und Perlwein mit zugesetzter Kohlensäure.

2. GERÄTE

Das Gerät, mit dem bei Perl- und Schaumweinen der Überdruck in der Flasche gemessen wird, bezeichnet man als Aphrometer. Je nach Art des Flaschenverschlusses (Metallkapsel, Kronenkorken, Naturkorken oder Plastikstopfen) werden unterschiedliche Aphrometer verwendet.

2.1. Flaschen mit Metallkapsel oder Kronenkorken

Das Gerät besteht aus drei Teilen (Abbildung 1):

— Der obere Teil (Durchstechvorrichtung) besteht aus dem Manometer, einer Schraub- und Spannvorrichtung, einer Endlosschraube, die in den mittleren Teil greift, und einer Hohlnadel, die die Kapsel durchsticht. Die Hohlnadel hat ein seitliches Loch, das den Druck auf das Manometer überträgt. Eine Dichtung sorgt dafür, dass das Ganze fest auf dem Flaschenverschluss aufliegt.

— Der mittlere Teil (die Mutter) dient dazu, den oberen Teil zu zentrieren. Er wird so auf den unteren Teil geschraubt, dass die Vorrichtung festen Halt auf der Flasche hat.

— Der untere Teil ist eine Klammer, die unter den Rand des Flaschenhalses greift und das Ganze festhält. Es gibt für jeden Flaschentyp angepasste Klammern.

2.2. Flaschen mit Naturkorken oder Plastikstopfen

Das Gerät besteht aus zwei Teilen (Abbildung 2):

— Der obere Teil entspricht demjenigen des vorstehend beschriebenen Geräts, hat jedoch eine längere Hohlnadel, an deren Ende sich eine Spitze befindet, die den Korken durchsticht. Diese Spitze ist lose angebracht und fällt nach Durchstechen des Korkens in den Wein.

— Der untere Teil besteht aus der Mutter und einer Spannvorrichtung, die auf dem Korken aufliegt. Diese ist mit vier Feststellschrauben versehen, die das Ganze auf dem Korken fixieren.

Bemerkungen zu den Manometern, mit denen diese beiden Geräte ausgerüstet sind:

— Es kann sich entweder um mechanische Manometer mit Bourdonfeder oder um digitale Manometer mit piezoelektrischem Sensor handeln. Im ersteren Fall muss die Bourdonfeder aus rostfreiem Stahl sein.

— Sie müssen eine Skala in Pascal (Pa) aufweisen. Bei Schaumwein wird zweckmäßigerweise 105 Pascal (105 Pa) oder Kilopascal (kPa) als Maßeinheit verwendet.

— Es gibt verschiedene Güteklassen. Die Klasse eines Manometers ist abhängig von der prozentualen Abweichung vom Gesamtmessbereich bei der Ablesung (Beispiel: Manometer 1 000 kPa Klasse 1, d. h. Maximaldruck 1 000 kPa, Ablesegenauigkeit ± 10 kPa). Für genaue Messungen wird die Klasse 1 empfohlen.

3. DURCHFÜHRUNG DER BESTIMMUNG

Der Druck muss an Flaschen gemessen werden, deren Temperatur seit mindestens 24 Stunden stabil ist. Nach dem Durchstechen der Kapsel, des Naturkorkens oder des Plastikstopfens muss die Flasche kräftig geschüttelt werden, bis der Druck konstant ist; dann wird der Druck abgelesen.

3.1. Flaschen mit Metallkapsel oder Kronenkorken

Die Klammer unter den Rand des Flaschenhalses schieben. Die Mutter festschrauben, bis die Vorrichtung festen Halt auf der Flasche hat. Dann wird der obere Teil in die Mutter geschraubt. Damit kein Gas entweicht, muss die Kapsel so rasch wie möglich durchstochen werden, um die Dichtung mit der Kapsel in Kontakt zu bringen. Anschließend muss die Flasche kräftig geschüttelt werden, bis der Druck konstant ist und abgelesen werden kann.

3.2. Flaschen mit Naturkorken oder Plastikstopfen

Am Ende der Hohlnadel wird eine Spitze angebracht. Die gesamte Vorrichtung wird auf den Korken gesetzt. Die vier Feststellschrauben anziehen. Den oberen Teil darauf schrauben, so dass die Hohlnadel den Korken durchsticht. Die Spitze muss in die Flasche fallen, damit der Druck auf das Manometer übertragen werden kann. Die Ablesung erfolgt, nachdem die Flasche geschüttelt wurde, bis der Druck konstant ist. Nach der Ablesung wird die Spitze wieder aus der Flasche entfernt.

4. DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

Der Überdruck bei 20 °C (Paph20) wird in Pascal (Pa) oder in Kilopascal (kPa) angegeben. Die Angabe muss in Übereinstimmung mit der Genauigkeit des Manometers erfolgen (z. B. 6,3 x 105 Pa oder 630 kPa, nicht 6,33 x 105 Pa oder 633 kPa für ein Manometer 1 000 kPa, Vollskala, der Güteklasse 1).

Weicht die Messtemperatur von 20 °C ab, so wird der gemessene Druck mit dem in Tabelle 1 angegebenen Koeffizienten multipliziert, um ihn auf 20 °C umzurechnen.

Tabelle 1

Verhältnis des Überdrucks Paph20 eines Perl- oder Schaumweins bei 20 °C zum Überdruck Papht bei einer Temperatur t

°C 0 1,85 1 1,80 2 1,74 3 1,68 4 1,64 5 1,59 6 1,54 7 1,50 8 1,45 9 1,40 10 1,36 11 1,32 12 1,28 13 1,24 14 1,20 15 1,16 16 1,13 17 1,09 18 1,06 19 1,03 20 1,00 21 0,97 22 0,95 23 0,93 24 0,91 25 0,88

5. KONTROLLE DER ERGEBNISSE

Methode zur direkten Bestimmung physikalischer Parameter (Methode des Typs I)

Prüfung der Aphrometer

Die Aphrometer müssen regelmäßig (mindestens einmal pro Jahr) geprüft werden.

Die Prüfung erfolgt mit einem Eichgerät. Damit kann das zu prüfende Manometer mit einem parallel aufgestellten Referenzmanometer einer höheren Klasse verglichen werden, das mit den nationalen Standards verbunden ist. Bei der Kontrolle werden die von beiden Geräten angegebenen Werte bei zunehmendem und dann abnehmendem Druck miteinander verglichen. Gibt es einen Unterschied, so ermöglicht eine Einstellschraube die erforderlichen Berichtigungen.

Alle Laboratorien und zugelassenen Stellen sind mit solchen Eichgeräten ausgerüstet, die auch über die Manometerhersteller erhältlich sind.

20 BESTIMMUNG VON LYSOZYM IM WEIN DURCH HPLC (OIV-AS-315-14) — METHODE DES TYPS IV

1. EINLEITUNG

Für Lysozym ist eine nicht auf der Enzymaktivität beruhende Analysemethode vorzuziehen.

2. ANWENDUNGSGEBIET

Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Lysozym (mg Protein/l) in Weiß- und Rotwein unabhängig von der Enzymaktivität, die durch Denaturierung, Komplexbildung oder Copräzipitation in der Matrix behindert werden könnte.

3. DEFINITION

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist ein analytisches Verfahren, das auf sterischen, polaren oder adsorptiven Wechselwirkungen zwischen der stationären Phase und dem Analyten beruht und daher nicht an die Enzymaktivität des Proteins gebunden ist.

4. PRINZIP

Die Analyse erfolgt mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit spektrofotometrischer und spektrofluorimetrischer Detektion. Der unbekannte Gehalt der Probe wird anhand der Peakfläche des Chromatogramms mithilfe der Methode des externen Standards bestimmt.

5. REAGENZIEN

5.1. Lösungsmittel und Lösungen

Acetonitril (CH3CN), HPLC-Qualität

Trifluoressigsäure (TFA), z. A.

Entionisiertes Wasser, HPLC-Qualität

Standard-Lösung: Weinsäure 1 g/l, Ethylalkohol 10 % v/v, mit neutralem Kaliumtartrat auf pH 3,2 gebracht

5.2. Elutionsmittel

A : CH3CN 1 %, TFA 0,2 %, H2O= 98,8 % B : CH3CN 70 %, TFA 0,2 %, H2O= 29,8 %

5.3. Bezugslösungen

1 bis 250 mg/l in der Standardlösung durch ständiges, mindestens 12 Stunden langes Rühren aufgelöstes Lysozym.

6. GERÄTE

6.1. HPLC-Gerät mit Pumpensystem für die Gradienteneluierung

6.2. Säulenthermostat (Ofen)

6.3. Fotometrischer und fluorimetrischer Detektor

6.4. 20-μl-Probenschleife

6.5. Polymer-Säule mit Umkehrphase und Phenol-Funktionsgruppen (Porendurchmesser = 1 000 Å, Ausschlussgrenze = 1 000 000 Da), z. B. Tosoh Bioscience TSK-Gel Phenyl 5PW RP 7,5 cm x 4,6 mm ID

6.6. Vorsäule aus gleichem Material wie die Säule: z. B. Tosoh Bioscience TSK-Gel Phenyl 5PW RP Guardgel 1,5 cm x 3,2 mm ID

7. VORBEREITUNG DER PROBE

Die Proben werden mit 10 M HCl im Verhältnis 1:10 angesäuert und 5 Minuten nach der Zugabe durch ein 0,22 μm Polyamidfilter filtriert. Die chromatographische Analyse erfolgt unmittelbar nach der Filtration.

8. BETRIEBSBEDINGUNGEN

8.1. Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min

8.2. Säulentemperatur: 30 °C

8.3. Spektrofotometrischer Nachweis: 280 nm

8.4. Spektrofluorimetrischer Nachweis: λ ex = 276 nm; λ em = 345 nm; Verstärkung = 10

8.5. Programm des Elutionsgradienten

Zeit (Min.) Lösung A % Lösung B % Gradient 0 100 0 isokratisch 3 100 0 linear 10 65 35 isokratisch 15 65 35 linear 27 40,5 59,5 linear 29 0 100 isokratisch 34 0 100 linear 36 100 0 isokratisch 40 100 0

8.6. Mittlere Retentionszeit des Lysozyms: 25,50 Minuten.

9. BERECHNUNG

Die Bezugslösungen mit folgenden Lysozymkonzentrationen werden dreifach analysiert: 1, 5, 10, 50, 100, 200, 250 mg/l. Für jedes Chromatogramm werden die dem Lysozym entsprechenden Peakflächen und die jeweiligen Konzentrationen zur Ermittlung einer Regressionsgeraden bestimmt, die durch die Gleichung Y = ax+b dargestellt wird. Der Korrelationskoeffizient r2 muss > 0,999 sein.

10. EIGENSCHAFTEN DER METHODE

Um die Eignung der Methode zu beurteilen, wurde eine Validierungsstudie durchgeführt, wobei die Linearität, die Nachweis- und die Bestimmungsgrenze sowie die Genauigkeit der Methode ermittelt wurden. Der zuletzt genannte Parameter wurde anhand der Präzision und der Richtigkeit der Methode ermittelt.

Linearitätsbereich (mg/l) Steigung der Geraden Regressionskoeffizient (r2) DL (mg/l) QL (mg/l) Wiederholbarkeit (n=5) RSD% Reproduzierbarkeit (n=5) RSD% Std1 RW2 WW3 Std1 UV 5-250 3,786 0,9993 1,86 6,20 4,67 5,54 0,62 1,93 FLD 1-250 52,037 0,9990 0,18 0,59 2,61 2,37 0,68 2,30

Tabelle 1: Daten bezüglich der Methodeneigenschaften: Std1 Standardlösung; RW 2 Rotwein; WW3 Weißwein

10.1. Linearität der Methode

Aus den Analyseergebnissen geht hervor, dass die Methode in den in Tabelle 1 aufgeführten Bereichen linear ist.

10.2. Nachweis- und Bestimmungsgrenze

Die Nachweisgrenze (DL) und die Bestimmungsgrenze (QL) wurden berechnet als das Signal, das jeweils 3 und 10 Mal dem chromatographischen Rauschen unter normalen Arbeitsbedingungen mit reeller Matrix entspricht (Tabelle 1).

10.3. Genauigkeit der Methode

Berücksichtigt wurden die Wiederholbarkeit und die Reproduzierbarkeit. Die Werte dieser Parameter sind in