FÜNFTE RICHTLINIE DER KOMMISSION vom 25. März 1974 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (74/203/EWG)

DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN -

gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft,

gestützt auf die Richtlinie des Rates vom 20. Juli 1970 über die Einführung gemeinschaftlicher Probenahmeverfahren und Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (1), zuletzt geändert durch die dem Vertrag über den Beitritt von neuen Mitgliedstaaten zur Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft und zur Europäischen Atomgemeinschaft (2), der am 22. Januar 1972 in Brüssel unterzeichnet worden ist, beigefügte Akte (3), und insbesondere auf Artikel 2,

in Erwägung nachstehender Gründe:

Die obengenannte Richtlinie bestimmt, daß die amtlichen Untersuchungen von Futtermitteln zur Feststellung, ob die auf Grund der Rechts- oder Verwaltungsvorschriften festgelegten Anforderungen hinsichtlich Beschaffenheit und Zusammensetzung der Futtermittel erfuellt sind, nach gemeinschaftlichen Probenahmeverfahren und Analysemethoden durchgeführt werden.

Die Richtlinien Nr. 71/250/EWG, Nr. 71/393/EWG, Nr. 72/199/EWG und Nr. 73/46/EWG der Kommission vom 15. Juni 1971 (4), vom 18. November 1971 (5), vom 27. April 1972 (6) und vom 5. Dezember 1972 (7) haben bereits eine Reihe von Analysemethoden festgelegt. Der Stand der seitdem durchgeführten Arbeiten ermöglicht es nunmehr, eine fünfte Serie von Analysemethoden festzulegen.

Die in dieser Richtlinie vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des Ständigen Futtermittelausschusses -

HAT FOLGENDE RICHTLINIE ERLASSEN:

Artikel 1

Die Mitgliedstaaten schreiben vor, daß die Analysen für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln auf den Gehalt an Stärke und ihrer Abbauprodukte mit hohem Molekulargewicht in Futtermitteln, die Schnitzel und Diffusionsschnitzel von Rüben, getrocknete Rübenblätter und Rübenköpfe, Kartoffelpülpe, Trokkenhefe, inulinhaltige Erzeugnisse oder Grieben enthalten, nach der in Anlage I zu dieser Richtlinie beschriebenen Methode durchgeführt werden.

Die allgemeinen Bestimmungen des Teils 1 (Einführung) der Anlage zur Ersten Richtlinie Nr. 71/250/EWG der Kommission vom 15. Juni 1971 finden für die in Anlage I zu dieser Richtlinie beschriebenen Methode Anwendung.

Artikel 2

Die Mitgliedstaaten schreiben, vor, daß die Analysen für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln auf ihren Gehalt an Amprolium, Ethopabat, Dinitolmid (DOT), Nicarbazin und Menadion (Vitamin K3) nach den in Anlage II zu dieser Richtlinie beschriebenen Methoden durchgeführt werden.

Die allgemeinen Bestimmungen des Teils 1 (Einführung) der Anlage zur Ersten Richtlinie Nr. 71/250/EWG der Kommission vom 15. Juni 1971, mit Ausnahme des die Vorbereitung der Analyseprobe betreffenden Teils, finden für die in Anlage II zu dieser Richtlinie beschriebenen Methoden Anwendung.

Artikel 3

Die Mitgliedstaaten setzen spätestens zum 1. November 1974 die erforderlichen Rechts- und Verwaltungsvorschriften in Kraft, um den Bestimmungen dieser Richtlinie nachzukommen. Sie setzen die Kommission unverzueglich hiervon in Kenntnis.

Artikel 4

Diese Richtlinie ist an alle Mitgliedstaaten gerichtet.

Brüssel, den 25. März 1974

Für die Kommission

Der Präsident

François-Xavier ORTOLI (1)ABl. Nr. L 170 vom 3.8.1970, S. 2. (2)ABl. Nr. L 73 vom 27.3.1972, S. 5. (3)ABl Nr. L 73 vom 27.3.1972, S. 14. (4)ABl. Nr. L 155 vom 12.7.1971, S. 13. (5)ABl. Nr. L 279 vom 20.12.1971, S. 7. (6)ABl. Nr. L 123 vom 29.5.1972, S. 6. (7)ABl. Nr. L 83 vom 30.3.1973, S. 21.

ANLAGE I BESTIMMUNG VON STÄRKE (Pankreatin-Methode)

1. Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an Stärke und ihrer Abbauprodukte mit hohem Molekulargewicht in Futtermitteln, die Schnitzel und Diffusionsschnitzel von Rüben, getrocknete Rübenblätter und Rübenköpfe, Kartoffelpülpe, Trockenhefe, inulinhaltige Erzeugnisse (z.B. Topinamburschnitzel und -mehl) oder Grieben enthalten. Die Bestimmung ist nur vorzunehmen, wenn die mikroskopische Untersuchung das Vorhandensein nicht unbeträchtlicher Stärkemengen in der Probe ergeben hat.

2. Prinzip

Die in der Probe vorhandenen Zucker werden durch Extraktion mittels Äthanol entfernt. In dem Extraktionsrückstand wird die Stärke mit Pankreatin verzuckert. Die entstandenen Zucker werden mit Salzsäure hydrolysiert und die gebildete Glukose nach der Methode von Luff-Schoorl bestimmt. Aus dem so ermittelten Glukosegehalt wird durch Multiplikation mit einem konstanten Faktor der Stärkegehalt der Probe errechnet.

3. Reagenzien 3.1.Äthanol, 90 v.H. (V/V), neutral gegen Phenolphthalein

3.2.n-Amylalkohol p.a.

3.3. Toluol p.a.

3.4. Pufferlösung : 9,078 g Kaliumdihydrogenphosphat KH2PO4 und 11,876 g Dinatriumhydrogenphosphat Na2HPO4 72H2O werden in Wasser gelöst und auf 1 l mit Wasser aufgefuellt.

3.5. Natriumchloridlösung 0,2 N

3.6. Carrez-Lösung I : 21,9 g Zinkazetat (CH3COO)2 Zn 7 2H2O und 3 g Eisessig werden in Wasser gelöst und auf 100 ml mit Wasser aufgefuellt.

3.7. Carrez-Lösung II : 10,6 g Kaliumhexacyanoferrat (II), K4 [Fe (CN6)] 7 3H2O werden in Wasser gelöst und auf 100 ml mit Wasser aufgefuellt.

3.8. N-Salzsäure

3.9. Salzsäure p.a., etwa 8 N, D = 1,125

3.10. Natriumhydroxidlösung p.a., etwa 10 N, D = 1,33

3.11. Indikator : Methylorange-Lösung 0,1 v.H. (G/V)

3.12. Pankreatin, pulverförmig, den Vorschriften in Punkt 8 entsprechend. Licht- und feuchtigkeitsgeschützt in verschlossener Flasche aufzubewahren

3.13. Reagenz nach Luff-Schoorl : Unter vorsichtigem Umschwenken wird die Zitronensäurelösung (3.13.2) in die Natriumcarbonatlösung (3.13.3) gegossen ; dann wird die Kupfersulfatlösung (3.13.1) hinzugefügt und zu 1 l mit Wasser aufgefuellt. Man lässt über Nacht stehen und filtriert. Die Normalität des so erhaltenen Reagenzes muß nachgeprüft werden (0,1 N Cu ; 2 N Na2CO3). Der pH-Wert beträgt etwa 9,4. 3.13.1. Kupfersulfatlösung : 25 g Kupfersulfat p.a., CUSO4 7 5H2O, werden in 100 ml Wasser gelöst

3.13.2. Zitronensäurelösung : 50 g Zitronensäure p.a., C6H8O7 7 H2O, werden in 50 ml Wasser gelöst

3.13.3. Natriumcarbonatlösung : 143,8 g Natriumcarbonat p.a., wasserfrei, werden in ungefähr 300 ml warmem Wasser gelöst. Die Lösung wird abgekühlt

3.14. Bimssteinkörner mit Salzsäure ausgekocht, mit Wasser gewaschen und getrocknet

3.15. Kaliumjodidlösung 30 v.H. p.a. (G/V)

3.16. Schwefelsäure, ca. 6 N, D = 1,18

3.17. 0,1 N Natriumthiosulfatlösung

3.18. Stärkelösung : Eine Aufschlämmung von 5 g löslicher Stärke in 30 ml Wasser wird zu 1 l siedendem Wasser hinzugefügt und 3 Min. lang im Sieden gehalten ; dann wird abgekühlt. Vor Gebrauch frisch zubereiten.

4. Geräte 4.1. Extraktionsapparat (siehe Skizze S. 12), bestehend aus: 4.1.1. Erlenmeyerkolben, weithalsig, 500 ml

4.1.2. Rückflußkühler mit Stopfen, passend auf den Erlenmeyerkolben 4.1.1

4.1.3. im Zentralrohr des Rückflußkühlers gleitender Stab mit Haken am unteren Ende. Klammer zum Fixieren des Stabes

4.1.4. Metallkorb zum Aufhängen an den Haken des Stabes 4.1.3, um den Glasfiltertiegel (4.1.5) zu halten

4.1.5. Glasfiltertiegel für Schnellfiltrierung, max. Porenweite 90 - 150 ¶m (z.B. G 1), ca. 30 ml.

4.1.6. Filterpapier, im Format zum Filtertiegel 4.1.5 passend

4.2. Brutschrank, auf 38 ºC eingestellt

4.3. 200-ml-Meßkolben mit Normschliff und aufsetzbarem Rückflußkühler

4.4. 100-ml-Meßkolben mit Normschliff und aufsetzbarem Rückflußkühler

5. Ausführung 5.1. Vorbereitung der Probe

Die Probe wird so zerkleinert, daß sie vollständig durch ein Sieb mit 0,5 mm Maschenweite hindurchgeht.

5.2. Extraktion

2 g der Probe werden auf 1 mg genau abgewogen und in den Filtertiegel (4.1.5) gegeben, dessen Boden vorher mit einem mit Äthanol (3.1) angefeuchteten Filterpapier (4.1.6) bedeckt wurde. In den Erlenmeyerkolben (4.1.1) werden 55 ml Äthanol (3.1) und einige Bimssteinkörner (3.14) gegeben. Der Filtertiegel wird in den Metallkorb (4.1.4) gesetzt und dieser an den Haken des Stabes (4.1.3) aufgehängt. Der Rückflußkühler wird auf den Erlenmeyerkolben gesetzt und der Stab so tief geschoben, daß der Boden des Filtertiegels die Oberfläche des Äthanols leicht berührt. Mit einer Klammer wird der Stab in dieser Höhe festgehalten. Das Äthanol wird zum Sieden gebracht und 3 Std. lang so gehalten, danach lässt man abkühlen und zieht den Stab (4.1.3) mit dem Filtertiegel in dem Erlenmeyerkolben so hoch wie möglich. Der Erlenmeyerkolben wird vorsichtig geöffnet, und es werden 45 ml Wasser zugesetzt, die man an den Innenwänden des Gefässes entlanglaufen lässt. Dann wird der Kühler mit Stopfen erneut auf den Erlenmeyerkolben gesetzt. Der Filtertiegel wird bis auf 10 cm über das Flüssigkeitsniveau gesenkt. Die Flüssigkeit wird zum Sieden gebracht und 3 Std. lang so gehalten, danach lässt man abkühlen. Der Erlenmeyerkolben wird geöffnet und der Filtertiegel aus dem Korb genommen.

5.3. Verzuckerung und Hydrolyse

Der Filtertiegel wird auf eine Saugflasche gesetzt und unter Absaugen getrocknet. Der Extraktionsrückstand kommt in einen Mörser und wird fein zerkleinert. Das Pulver wird quantitativ mit etwa 60 ml Wasser in einen 200-ml-Meßkolben mit Normschliff umgefuellt ; dann werden ein paar Tropfen Amylalkohol (3.2) hinzugefügt. Der Rückflußkühler wird auf den Meßkolben aufgesetzt. Es wird zum Sieden erhitzt und eine Std. lang so gehalten, dann lässt man abkühlen und nimmt den Kühler ab.

Es werden 25 ml Pufferlösung (3.4), 250 mg Pankreatin (3.12), 2,5 ml Natriumchloridlösung (3.5) und 10 Tropfen Toluol (3.3) hinzugefügt und 2 Min. lang geschüttelt. Danach wird der Meßkolben in den auf 38 ºC angeheizten Brutschrank gestellt und 21 St., unter gelegentlichem Schütteln, darin belassen. Anschließend wird der Inhalt des Meßkolbens auf Raumtemperatur abgekühlt. Es werden 5 ml Carrez-Lösung I (3.6) hinzugefügt und eine Min. lang geschüttelt ; dann werden 5 ml Carrez-Lösung II (3.7) hinzugefügt, und es wird nochmals eine Min. lang geschüttelt. Hierauf wird mit Wasser zur Marke aufgefuellt, gemischt und filtriert. 50 ml des Filtrats werden mit der Pipette in einen 100-ml-Meßkolben (4.4) gegeben (es kann auch mit 100 ml Filtrat in einem Meßkolben von 200 ml gearbeitet werden). Sodann werden einige Tropfen des Indikators (3.11) hinzugegeben, und es wird mit 8-N-Salzsäure (3.9) bis zum Umschlag nach rot angesäuert. Danach werden zusätzlich 6,25 ml 8-N-Salzsäure (3.9) (bei der Menge von 100 ml des Filtrats 12,50 ml) hinzugegeben, der Rückflußkühler wird auf den Meßkolben aufgesetzt, die Lösung zum Sieden gebracht und 1 Std. lang so gehalten. Dann lässt man abkühlen und neutralisiert mit 10-N-Natrium-hydroxidlösung (3.10) bis zum Umschlag des Indikators auf gelb. Hierauf wird durch Zusatz von wenig N-Salzsäure (3.8) leicht angesäuert, mit Wasser zur Marke aufgefuellt und gemischt. Der Glukosegehalt wird nach der Methode von Luff-Schoorl wie unter 5.4 angegeben bestimmt.

5.4. Titration nach Luff-Schoorl

25 ml des Reagenzes nach Luff-Schoorl (3.13) werden in einen 300-ml-Erlenmeyerkolben pipettiert und dann genau 25 ml der nach 5.3 gewonnenen Lösung hinzugefügt, die höchstens 60 mg Glukose enthalten dürfen. Nach Zugabe von 2 Körnchen Bimsstein (3.14) wird unter Schütteln mit der Hand über freier Flamme von mittlerer Höhe erhitzt, so daß die Flüssigkeit in etwa 2 Min. zum Sieden kommt. Anschließend wird der Erlenmeyerkolben sofort auf ein Drahtnetz mit einer Asbestscheibe, in die ein Loch von etwa 6 cm Durchmesser gestanzt wurde, gestellt. Vorher wird unter dem Drahtnetz eine Flamme entzuendet und so eingestellt, daß der Kolben nur am Boden erhitzt wird. Dann wird der Kolben mit einem Rückflußkühler verbunden. Von diesem Augenblick an lässt man genau 10 Min. sieden, kühlt dann sofort in kaltem Wasser ab und titriert nach etwa 5 Min. wie folgt:

Zu der Flüssigkeit werden 10 ml Kaliumjodid-Lösung (3.15) und anschließend sofort, aber vorsichtig (wegen Gefahr übermässigen Schäumens), 25 ml 6-N-Schwefelsäure (3.16) hinzugegeben. Dann wird mit 0,1 N Natriumthiosulfatlösung (3.17) zunächst bis zum Auftreten einer mattgelben Färbung titriert und nach Zugabe der Stärkelösung (3.18) als Indikator die Titration zu Ende geführt.

Die gleiche Titration wird in einer Mischung aus genau 25 ml Reagenz nach Luff-Schoorl (3.13) und 25 ml Wasser, nach Zugabe von 10 ml Kaliumjodidlösung (3.15) und 25 ml 6 N Schwefelsäure (3.16), aber ohne vorheriges Erhitzen durchgeführt.

5.5. Blindversuch

Nach dem unter 5.3 und 5.4 beschriebenen Verfahren ist ein Blindversuch, d.h. ohne die Probe, durchzuführen.

6. Berechnung der Ergebnisse

Mit Hilfe der Tabelle am Ende dieser Anlage ist die Glukosemenge in mg zu ermitteln, die dem Unterschied zwischen den Ergebnissen der beiden Titrationen (ausgedrückt in ml 0,1-N-Natriumthiosulfat) entspricht, und zwar einmal für die Probe, zum anderen für den Blindversuch.

Der Stärkegehalt in Hundertteilen der Probe wird durch folgende Formel berechnet:

0,72 (a - b),

wobei

a = mg Glukose bei der Probe,

b = mg Glukose beim Blindversuch (siehe Bemerkung 7.2).

7. Bemerkungen 7.1. Gleichzeitiges Vorhandensein von teilweise oder gänzlich dextrinisierter Stärke und von Laktose in einer Probe kann um 0,5 bis 3 % zu hohe Stärkeergebnisse verursachen. In diesem Fall lässt sich der wirkliche Stärkegehalt folgendermassen ermitteln: a) Es wird der Gehalt an reduzierenden Zuckern des nach 5.2 gewonnenen Äthanolextrakts festgestellt und das Ergebnis in Hundertteilen Glukose ausgedrückt;

b) es wird der Gehalt der Probe an wasserlöslichen reduzierenden Zuckern festgestellt und das Ergebnis in Hundertteilen Glukose ausgedrückt;

c) das gemäß a) erhaltene Ergebnis wird von dem nach b) erhaltenen abgezogen und der Unterschied mit 0,9 multipliziert;

d) der nach c) gewonnene Wert wird von dem Stärkegehalt abgezogen, der durch Anwendung der Methode gemäß 6 ermittelt und berechnet wurde.

7.2. Die beim Blindversuch ermittelte Glukosemenge beträgt normalerweise 0,25 mg. Sie darf nicht grösser als 0,50 mg sein.

8. Vorschriften betreffend Pankreatin

Aussehen : weiß-gelbliches Pulver, amorph.

Glukosegehalt : Die Glukosemenge des Blindversuchs (siehe 5.5) beträgt normalerweise 0,25 mg. Ergebnisse über 0,50 mg bedeuten, daß das Pankreatin nicht mehr verwendbar ist.

Prüfung des Jodverbrauchs : 62,5 mg Pankreatin werden in etwa 50 ml Wasser bei einer Temperatur zwischen 25 bis 30 ºC suspendiert. Es wird 1 ml Jodlösung 0,1 N hinzugefügt und 2 Min. lang geschwenkt. Dann titriert man mit 0,1 N Natriumthiosulfatlösung nach Zusatz des Stärkeindikators zurück. Der Verbrauch an 0,1 N Jodlösung durch das Pankreatin darf 0,5 ml nicht übersteigen.

Prüfung der amylolytischen Wirkung : 100 ml Stärkelösung (3.18), 5 ml Pufferlösung (3.4), 0,5 ml Natriumchloridlösung (3.5) und 62,5 mg Pankreatin werden gemischt, die Mischung wird auf 25 - 30 ºC erwärmt und 2 Min. lang geschwenkt. Dann wird 1 ml 0,1 N Jodlösung hinzugefügt. Die blaue Färbung muß spätestens 15 Min. nach Zusatz der Jodlösung verschwunden sein.

Tabelle für 25 ml des Reagenzes nach Luff-Schoorl ml 0,1 N Na2S2O3 bei 2 Min. Anheizen, 10 Min. Sieden

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ANLAGE II

1. BESTIMMUNG VON AMPROLIUM [1-(4-Amino-2-Propyl-5-Pyrimidylmethyl)-2-Picoliniumchlorid-Hydrochlorid]

1. Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung von Amprolium in Futtermitteln, Konzentraten und Vormischungen. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 40 mg/kg.

2. Prinzip

Die Probe wird mit verdünntem Methanol extrahiert. Der Extrakt wird über einer Aluminiumoxidsäule gereinigt und mit einer methanolischen Lösung von Naphthalindiol (2,7), Kaliumhexacyanoferrat (III), Kaliumcyanid und Natriumhydroxid behandelt. Es entwickelt sich eine Purpurfärbung, deren Extinktion spektrophotometrisch bei 530 nm gemessen wird.

3. Reagenzien 3.1. Methanol p.a.

3.2. Verdünntes Methanol : Mischung von 2 Volumteilen Methanol (3.1) und 1 Volumteil Wasser

3.3. Kaliumhexacyanoferrat (III)-Lösung K3Fe(CN)6 p.a. 0,2 v.H. (G/V). Diese Lösung ist zwei Wochen haltbar

3.4. Kaliumcyanidlösung p.a. 1 v.H. (G/V). Diese Lösung ist zwei Wochen haltbar

3.5. Natriumhydroxidlösung p.a. 1,125 v.H. (G/V)

3.6. Methanolische Natriumhydroxidlösung : 15 ml der Lösung (3.5) werden entnommen und mit Methanol (3.1) auf 200 ml aufgefuellt.

3.7. Naphthalindiol (2,7)-Lösung 0,0025 v.H. : 25 mg Naphthalindiol (2,7) p.a. werden in Methanol (3.1) gelöst und mit Methanol (3.1) auf 1000 ml aufgefuellt.

3.8. Farbreagenz : 90 ml Naphthalindiol (2,7)-Lösung (3.7) werden in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben (4.1) mit 5 ml Kaliumhexacyanoferrat (III)-Lösung (3.3) gemischt. Nach Zusatz von 5 ml Kaliumcyanidlösung (3.4) wird der Erlenmeyerkolben verschlossen und geschüttelt. Danach lässt man 30 bis 35 Min. stehen und gibt anschließend 100 ml methanolische Natrium-hydroxidlösung (3.6) hinzu. Die Lösung wird gemischt und durch eine Filternutsche (4.3) abfiltriert. Dieses Reagenz ist binnen 75 Min. nach der Filtration zu verwenden.

3.9. Aluminiumoxid zur Säulen-Chromatographie. Vor Verwendung werden 100 g Aluminiumoxid mit 500 ml Wasser 30 Min. geschüttelt, die Suspension wird filtriert. Der Rückstand auf dem Filter wird dreimal mit je 50 ml Methanol (3.1) gewaschen, durch Absaugen getrocknet, über Nacht stehen gelassen und anschließend 2 Std. bei 100 ºC im Vakuumtrokkenschrank getrocknet, danach lässt man im Exsikkator abkühlen. Die Aktivität wird überprüft, indem eine bestimmte Menge Standardlösung (3.11) nach dem vorliegenden Verfahren, von Punkt 5.2 ab, untersucht wird. Die Wiederfindungsrate des Amproliums muß 100 % ± 4 % betragen.

3.10. Standardsubstanz : Amprolium entsprechend folgenden Reinheitskriterien : Schmelzpunkt (Zersetzung) : 248 ºC. >PIC FILE= "T0005529">

3.11. Standardlösung : 50 mg des Stadards (3.10) werden auf 0,1 mg genau abgewogen und mit Methanol (3.2) in einem 500-ml-Meßkolben gelöst. Es wird mit demselben Lösungsmittel zur Marke aufgefuellt und gemischt. 10,0 ml dieser Lösung werden abpipettiert, auf 50 ml mit Methanol (3.2) in einem Meßkolben aufgefuellt und gemischt. 1 ml dieser Lösung enthält 20 ¶g Amprolium.

4. Geräte 4.1. Erlenmeyerkolben mit eingeschliffenem Stopfen, 50, 250 und 500 ml Inhalt

4.2. Schüttelmaschine

4.3. Filternutsche, Porosität G 3, Durchmesser : 60 mm

4.4. Chromatographierohr aus Glas (innerer Durchmesser : 9 mm, Länge : 400 - 500 mm)

4.5. Zentrifuge, dazu Gläser mit eingeschliffenem Stopfen und 25 ml Inhalt

4.6. Spektralphotometer mit 10 mm Kuevetten.

5. Ausführung 5.1. Extraktion und Reinigung 5.1.1. Futtermittel und Vormischungen

10 g der fein zerkleinerten und homogenisierten Probe werden auf 1 mg genau abgewogen (von Vormischungen werden 3 bis 6 g auf 1 mg genau abgewogen) und in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben (4.1) gegeben. Nach Zusatz von genau 100 ml verdünntem Methanol (3.2) wird 60 Min. geschüttelt und filtriert. Wenn erforderlich, wird mit Methanol (3.2) verdünnt, um einen Amproliumgehalt von 5 bis 15 ¶g pro ml zu erhalten.

Ein zuvor mit einem Wattepfropfen versehenes Chromatographierohr (4.4) wird mit 5 g Aluminiumoxid (3.9) beschickt, dann werden 25,0 ml des Extrakts auf die Säule gegeben. Von der durchlaufenden Flüssigkeit werden die ersten 5 ml verworfen, die folgenden 12 ml in einem Meßzylinder aufgefangen.

5.1.2. Konzentrate 0,5 g der fein zerkleinerten und homogenisierten Probe werden auf 1 mg genau abgewogen und in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben (4.1) gegeben. Nach Zusatz von genau 250 ml Methanol (3.2) wird 60 Min. geschüttelt und filtriert. Von dem Filtrat werden 5,0 ml abpipettiert und mit Methanol (3.2) in einem Meßkolben auf 200 ml aufgefuellt.

5.2. Entwicklung der Färbung und Messung der Extinktion

5,0 ml der nach 5.1.1 bzw. 5.1.2 erhaltenen Lösung werden in ein Zentrifugenglas A (4.5) und 5,0 ml verdünntes Methanol (3.2) in ein Zentrifugenglas B (4.5) pipettiert. In beide Gläser werden je 10,0 ml des Farbreagenzes (3.8) gegeben ; die Gläser werden verschlossen, man mischt und lässt 18 Min. stehen. Man zentrifugiert 3 Min., um klare Lösungen zu erhalten, anschließend werden die Lösungen A und B in 50-ml-Erlenmeyerkolben (4.1) dekantiert.

Anschließend wird sofort die Extinktion der Lösung A bei 530 nm photometrisch gemessen, wobei die Lösung B als Blindlösung dient. Die Amprolium-Menge wird mit Hilfe einer Eichkurve (5.3) bestimmt.

5.3. Eichkurve In Zentrifugengläser (4.5) werden 1,0 - 2,0 - 3,0 - 4,0 und 5,0 ml der Standardlösung (3.11) gegeben. Das Volumen in den ersten vier Gläsern wird mit Methanol (3.2) auf 5,0 ml ergänzt. Zu allen fünf Gläsern werden je 10,0 ml des Farbreagenzes (3.8) zugesetzt. Die Gläser werden verschlossen, man mischt und lässt 18 Min. stehen. Nach 3 Min. Zentrifugieren werden die Lösungen jeweils in 50-ml-Erlenmeyerkolben (4.1) dekantiert.

Anschließend wird sofort die Extinktion dieser Lösungen bei 530 nm photometrisch gemessen, wobei als Blindlösung eine Mischung von 5 ml verdünntem Methanol (3.2) und 10 ml des Farbreagenzes (3.8) dient. Zum Zeichnen der Eichkurve werden die Extinktionswerte auf der Ordinate und die entsprechenden Amprolium-Mengen in mg auf der Abszisse aufgetragen.

6. Berechnung der Ergebnisse 6.1. Futtermittel und Vormischungen

Der Gehalt an Amprolium der Probe in mg/kg wird nach folgender Formel berechnet: >PIC FILE= "T0005507">

wobei :

A = durch photometrische Messung bestimmte Menge Amprolium in mg,

P = Einwaage in g,

F = Verdünnungsköffizient (wie eventuell unter 5.1.1 angewandt).

6.2. Konzentrate

Der Gehalt an Amprolium der Probe in v.H. wird nach folgender Formel berechnet: >PIC FILE= "T0005508">

wobei:

A = durch photometrische Messung bestimmte Menge Amprolium in mg,

P = Einwaage in g.

7. Wiederholbarkeit

Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und derselben Probe bei Gehalten von

weniger als 100 mg/kg Amprolium 10 mg/kg absolut,

100 bis 5 000 mg/kg Amprolium 10 v.H. relativ,

mehr als 5 000 bis 10 000 mg/kg Amprolium 500 mg/kg absolut,

mehr als 10 000 mg/kg 5 v.H. relativ,

nicht überschreiten.

2. BESTIMMUNG VON ETHOPABAT (4-Acetamido-2-Äthoxy-Methylbenzoat)

1. Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung von Ethopabat in Futtermitteln, Konzentraten und Vormischungen. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 2 mg/kg.

2. Prinzip

Die Probe wird mit verdünntem Methanol extrahiert. Die Lösung wird angesäuert und mit Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wird zuerst mit einer alkalischen Lösung, anschließend mit Wasser gewaschen. Der gereinigte Extrakt wird eingeengt, das Ethopabat mit verdünnter Salzsäure hydrolysiert. Das gebildete Aminoderivat wird diazotiert und mit N-[Naphthyl-(1)]-Äthylendiamin gekuppelt. Der Farbstoff wird mit Butanol extrahiert und die Extinktion der Lösung bei 555 nm gemessen.

3. Reagenzien 3.1. Methanol p.a.

3.2. Methanol 50 v.H. (V/V) : Mischung aus gleichen Volumenteilen Methanol (3.1) und Wasser

3.3. Salzsäure p.a. ; D : 1,19

3.4. Verdünnte Salzsäure : 10,0 ml Salzsäure (3.3) werden mit Wasser auf 100 ml aufgefuellt

3.5. Salzsäure ca. 0,3 N : 25,0 ml Salzsäure (3.3) werden auf 1 000 ml mit Wasser aufgefuellt

3.6. Chloroform p.a.

3.7. Natriumcarbonatlösung 4. v.H. (G/V) : 40,0 g wasserfreies Natriumcarbonat p.a. werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 1 000 ml aufgefuellt

3.8. Natriumnitritlösung 0,2 v.H. (G/V) : 100 mg Natriumnitrit p.a. werden in Wasser gelöst und mit Wasser in einem Meßkolben auf 50 ml aufgefuellt. Die Lösung ist unmittelbar vor Gebrauch herzustellen.

3.9. Ammoniumamidosulfonatlösung 1,0 v.H. (G/V) : 500 mg Ammoniumamidosulfonat p.a. werden in Wasser gelöst und mit Wasser in einem Meßkolben auf 50 ml aufgefuellt. Die Lösung ist unmittelbar vor Gebrauch herzustellen.

3.10. N-[Naphthyl-(1)]-Äthylendiammoniumdichlorid-Lösung 0,2 v.H. (G/V) : 100 mg N-[Naphthyl-(1)]-Äthylendiammoniumdichlorid p.a. werden in Wasser gelöst und mit Wasser in einem Meßkolben auf 50 ml aufgefuellt. Die Lösung ist unmittelbar vor Gebrauch herzustellen.

3.11. Natriumchlorid p.a., wasserfrei

3.12. n-Butanol p.a.

3.13. Standard : reines Ethopabat

3.14. Standardlösungen: 3.14.1. Ethopabatlösung 0,040 mg/ml : 40 mg des Standards (3.13) werden auf 0,1 mg genau abgewogen, mit verdünntem Methanol (3.2) in einem 100-ml-Meßkolben gelöst, mit demselben Lösungsmittel aufgefuellt und gemischt. Von dieser Lösung werden 10,0 ml entnommen, mit Methanol (3.2) in einem Meßkolben auf 100 ml aufgefuellt und gemischt. Diese Lösung ist einen Monat haltbar.

3.14.2. Ethopabatlösung 0,016 mg/20 ml : 5,0 ml der Lösung (3.14.1) werden in einem Meßkolben mit verdünntem Methanol (3.2) auf 250 ml aufgefuellt und gemischt. Die Lösung ist vor Gebrauch frisch herzustellen.

4. Geräte 4.1. Erlenmeyerkolben mit eingeschliffenem Stopfen, 250 ml Inhalt

4.2. Scheidetrichter mit eingeschliffenem Stopfen, 100 ml Inhalt

4.3. Schüttelmaschine

4.4. Vakuum-Rotations-Verdampfer mit Rundkolben von 250 ml Inhalt

4.5. Wasserbad

4.6. Zentrifuge, dazu Gläser mit eingeschliffenem Stopfen, 50 und 15 ml Inhalt

4.7. Steigrohr mit Schliff

4.8. Spektralphotometer mit 10 mm Kuevetten.

5. Ausführung 5.1. Extraktion

Eine Menge der fein zerkleinerten und homogenisierten Probe, die etwa 80 ¶g Ethopabat enhtält, wird auf 1 mg genau abgewogen und und in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben (4.1) gegeben, nach Zugabe von 100,0 ml verdünntem Methanol (3.2) wird gemischt. Der Kolben wird verschlossen und 1 Std. unter Verwendung einer Schüttelmaschine (4.3) geschüttelt. Dann lässt man absetzen und filtriert ; die ersten ml des Filtrats werden verworfen.

5.2. Reinigung

NB : Die unter diesem Punkt beschriebenen Arbeitsgänge sind rasch durchzuführen.

20,0 ml des klaren Extrakts werden in einen 100-ml-Scheidetrichter (4.2) gegeben, nach Zusatz von 5,0 ml verdünnter Salzsäure (3.4) und 20,0 ml Chloroform (3.6) wird erst vorsichtig, dann 3 Min. kräftig geschüttelt. Man lässt stehen, nach Trennung der Phasen wird die Chloroformphase in einem zweiten 100-ml-Scheidetrichter (4.2) aufgefangen.

Die saure Phase wird zweimal nacheinander mit je 20,0 ml Chloroform (3.6) extrahiert. Die Chloroformextrakte werden im zweiten Scheidetrichter vereinigt und die saure Phase verworfen. Der Chloroformlösung werden 10 ml der Natriumcarbonatlösung (3.7) zugesetzt, man schüttelt 3 Min. und lässt dann stehen bis zur Trennung der Phasen. Die Chloroformphase wird in einem dritten 100-ml-Scheidetrichter (4.2) aufgefangen, die wäßrige Phase verworfen. Der Chloroformlösung werden 10 ml der Natriumcarbonatlösung (3.7) zugesetzt, man schüttelt 3 Min. und lässt dann bis zur Trennung der Phase stehen.

Die Chloroformphase wird in einem vierten 100-ml-Scheidetrichter (4.2) aufgefangen, zweimal nacheinander mit je 25 ml Wasser gewaschen ; die wäßrigen Phasen werden jeweils abgetrennt und der Chloroformextrat quantitativ in einem 250-ml-Kolben (4.4) aufgefangen. Die wäßrigen Phasen werden vereinigt, die beiden Scheidetrichter mit einigen ml Chloroform (3.6) ausgespült und anschließend die wäßrige Phase mit diesem Chloroform gewaschen. Nach Trennung wird die Chloroformphase zu dem im Kolben aufgefangenen Extrakt hinzugefügt.

5.3. Hydrolyse

Der Chloroformextrakt wird im Vakuum-Rotations-Verdampfer (4.4) bei 50 ºC Badtemperatur eingedampft. Der Rückstand wird mit 2 bis 3 ml Methanol (3.1) aufgenommen und die Lösung quantitativ mit zweimal 10 ml und einmal 5 ml ca. 0,3 N Salzsäure (3.5) in ein 50-ml-Zentrifugenglas (4.6) übergeführt. Der Inhalt des Glases wird gemischt, nach Zugabe von einigen Bimssteinkörnern wird das Glas mit einem Steigrohr versehen und 45 Min. in ein kochendes Wasserbad getaucht. Anschließend wird unter fließendem Wasser abgekühlt.

5.4. Entwicklung der Färbung und Messung der Extinktion

Man fügt 1,0 ml Natriumnitritlösung (3.8) hinzu, schüttelt und lässt 2 Min. stehen ; dann gibt man 1,0 ml Ammoniumamidosulfonatlösung (3.9) hinzu, schüttelt und lässt 2 Min. stehen ; anschließend gibt man noch 1,0 ml N-[Naphthyl-(1)]-Äthylendiammoniumdichloridlösung (3.10) hinzu, schüttelt und lässt 10 Min. stehen. Nach Zusatz von 5,0 g Natriumchlorid (3.11) und 10,0 ml n-Butanol (3.12) wird kräftig geschüttelt bis zur vollständigen Lösung des Natriumchlorids.

Die oben schwimmende Butanolphase wird abpipettiert, in ein 15-ml-Zentrifugenglas (4.6) gegeben und zentrifugiert. Dann wird die Extinktion EA photometrisch bei 555 nm im Vergleich mit n-Butanol (3.12) gemessen.

5.5. Blindversuch

Ein Blindversuch wird mit 20,0 ml verdünntem Methanol (3.2) nach dem gleichen Verfahren ab Punkt 5.2 durchgeführt. Die Extinktion EB wird bei 555 nm im Vergleich mit n-Butanol (3.12) gemessen.

5.6. Standardversuch

Ein Standardversuch wird mit 20,0 ml Standardlösung (3.14.2) nach dem gleichen Verfahren ab Punkt 5.2 durchgeführt. Die Extinktion EC wird bei 555 nm im Vergleich mit n-Butanol (3.12) gemessen.

6. Berechnung der Ergebnisse

Der Gehalt an Ethopabat der Probe in mg/kg wird nach folgender Formel berechnet: >PIC FILE= "T0005509">

wobei:

EA = Extinktion der Probenlösung,

EB = Extinktion der Lösung aus dem Blindversuch,

EC = Extinktion der Lösung aus dem Standardversuch,

P = Einwaage in g.

7. Wiederholbarkeit

Der Unterschied zwischen zwei Parellelbestimmungen darf bei ein und derselben Probe bei Gehalten von

weniger als 7,5 mg/kg Ethopabat 20 v.H. relativ,

7,5 bis 10 mg/kg Ethopabat 1,5 mg/kg absolut,

mehr als 10 mg/kg Ethopabat 15 v.H. relativ,

nicht überschreiten.

3. BESTIMMUNG VON DINITOLMID (DOT) (3,5-Dinitro-o-Toluamid)

1. Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung von Dinitolmid (DOT) in Futtermitteln, Konzentraten und Vormischungen. Nitrofuranderivate stören. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 40 mg/kg.

2. Prinzip

Die Probe wird mit Acetonitril extrahiert. Der Extrakt wird über Aluminiumoxid gereinigt und filtriert. Ein aliquoter Teil des Filtrats wird zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Dimethylformamid aufgenommen und mit Äthylendiamin behandelt. Es entwickelt sich eine Purpurfärbung, deren Extinktion bei 560 nm spektrophotometrisch gemessen wird.

3. Reagenzien 3.1. Acetonitril 85 v.H. (V/V) : 850 ml reines Acetonitril werden mit 150 ml Wasser gemischt. Vor Verwendung ist die Mischung zu destillieren und die Fraktion, die bei 75-77 ºC übergeht, zu sammeln.

3.2. Aluminiumoxid zur Säulenchromatographie ; es wird mindestens 2 Std. bei 750 ºC erhitzt, im Exsikkator abgekühlt und in braunen Schliffflaschen aufbewahrt. Vor Verwendung wird wie folgt angefeuchtet : 10 g Aluminiumoxid und 0,7 ml Wasser werden in eine braune Flasche gegeben, die Flasche wird hermetisch verschlossen, 5 Min. im siedenden Wasserbad kräftig geschüttelt, dann lässt man unter Schütteln abkühlen. Die Aktivität des vorbereiteten Aluminiumoxids wird durch Analyse einer bestimmten Menge Standardlösung (3.6) nach dem Verfahren ab Punkt 5.1 überprüft. Die Wiederfindungsrate von Dinitolmid muß 100 % ± 2 % betragen.

3.3. N,N-Dimethylformamid 95 v.H. (V/V) : 95,0 ml N,N-Dimethylformamid p.a. und 5,0 ml Wasser werden gemischt

3.4. Äthylendiamin p.a., Hoechstgehalt an Wasser : 2,0 v.H.

3.5. Standardsubstanz : 3,5-Dinitro-o-Toluamid, rein, entsprechend folgenden Reinheitskriterien: >PIC FILE= "T0005530">

3.6. Standardlösung : 40 mg der Standardsubstanz (3.5) werden auf 0,1 mg genau eingewogen und in einem 200-ml-Meßkolben mit Acetonitril (3.1) gelöst. Der Kolben wird mit demselben Lösungsmittel aufgefuellt und umgeschüttelt. Von dieser Lösung werden 20,0 ml entnommen, mit Acetonitril (3.1) in einem Meßkolben auf 100 ml aufgefuellt und gemischt. 1 ml dieser Lösung enthält 40 ¶g Dinitolmid.

4. Geräte 4.1. Erlenmeyerkolben mit Schliff, 250 ml Inhalt

4.2. Rückflußkühler mit Schliff,

4.3. Filternutsche, Porosität G 3, Durchmesser : 60 mm

4.4. Vakuum-Filtrationseinrichtung (z.B. Witt'scher Topf)

4.5. Wasserbad, auf 50 ºC eingestellt

4.6. Spektralphotometer mit Kuevetten von 10 mm Schichtdicke.

5. Ausführung 5.1. Extraktion und Reinigung

10 g der fein zerkleinerten und homogenisierten Probe werden auf 1 mg genau eingewogen. Bei Konzentraten und Vormischungen wird 1 g auf 1 mg genau abgewogen. Die Einwaage wird in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben (4.1) mit 65 ml Acetonitril (3.1) versetzt und gemischt. Der Kolben wird an den Rückflußkühler (4.2) angeschlossen und unter ständigem Schütteln 30 Min. im Wasserbad (4.5) erhitzt, dann lässt man unter kaltem Wasser abkühlen.

Nach Zusatz von 20 g Aluminiumoxid (3.2) wird 3 Min. geschüttelt, dann lässt man absetzen.

In das Filtriergerät (4.4) wird ein 100-ml-Meßkolben eingesetzt und die Filternutsche (4.3) darüber angebracht. Die Flüssigkeit wird durch die aufgesetzte Filternutsche in den 100-ml-Meßkolben abgesaugt. Der Rückstand wird mit einigen ml Acetonitril (3.1) in die Filternutsche verbracht und abgesaugt. Das Vakuum wird unterbrochen, der Rückstand in einigen ml Acetonitril (3.1) suspendiert und erneut abgesaugt. Das Verfahren ist so lange zu wiederholen, bis das Filtrat ein Volumen von etwa 95 ml aufweist. Der Meßkolben wird mit Acetonitril (3.1) auf 100 ml aufgefuellt und umgeschüttelt.

Wenn erforderlich, wird ein aliquoter Teil dieser Lösung mit Acetonitril (3.1) verdünnt, so daß man eine Lösung mit einem Gehalt von 5 bis 15 ¶g Dinitolmid pro ml erhält.

5.2. Entwicklung der Färbung und Messung der Extinktion

In drei 50-ml-Bechergläser A, B und C werden je 4,0 ml der nach 5.1 erhaltenen Lösung pipettiert. Ferner wird nur in das Becherglas C 1,0 ml der Standardlösung (3.6) hinzugefügt. Die drei Bechergläser werden im Wasserbad (4.5) unter einen gut ventilierten Abzug gestellt und ihr Inhalt unter einem Luftstrom zur Trockne eingedampft. Man lässt die Bechergläser auf Zimmertemperatur abkühlen. In das Becherglas A werden 10,0 ml N,N-Dimethylformamid (3.3), in die Gläser B und C je 2,0 ml dieses Lösungsmittels gegeben. Man lässt das Lösungsmittel einige Min. unter leichtem Schütteln einwirken, bis sich der Rückstand vollständig gelöst hat. Danach werden den Bechergläsern B und C je 8 ml Äthylendiamin (3.4) zugesetzt. Es wird gemischt und genau 5 Min. nach Zusatz des Äthylendiamins die Extinktion der 3 Lösungen im Spektralphotometer (4.6) bei 560 nm, unter Verwendung von N,N-Dimethylformamid (3.3) als Blindlösung, gemessen.

6. Berechnung der Ergebnisse

Der Gehalt an Dinitolmid der Probe in mg/kg wird nach folgender Formel berechnet: >PIC FILE= "T0005510">

Es bedeutet:

EA = Extinktion der Lösung A (Vergleichslösung),

EB = Extinktion der Lösung B (Probe),

EC = Extinktion der Lösung C (interner Standard),

P = Einwaage in g,

F = (der eventuell bei 5.1 angewandte) Verdünnungsköffizient.

7. Wiederholbarkeit

Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und derselben Probe bei Gehalten von

weniger als 100 mg/kg Dinitolmid 10 mg/kg absolut,

100 bis 5 000 mg/kg 10 v.H. relativ,

mehr als 5 000 bis 10 000 mg/kg 500 mg/kg absolut,

mehr als 10 000 mg/kg 5 v.H. relativ,

nicht überschreiten.

4. BESTIMMUNG VON NICARBAZIN (Äquimolekulares Gemisch von 4,4'-Dinitrocarbanilid und 2-Hydroxy-4,6-Dimethylpyrimidin)

1. Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung von Nicarbazin in Futtermitteln, Konzentraten und Vormischungen, die nicht mehr als 5 v.H. Grünmehl enthalten. Nitrofuranderivate, Acetylenheptin und Carbadox stören. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 20 mg/kg.

2. Prinzip

Die Probe wird mit N,N-Dimethylformamid extrahiert. Der Extrakt wird durch Chromatographie über einer Aluminiumoxidsäule gereinigt und das Nicarbazin mit Äthanol eluiert. Das Eluat wird mit äthanolischer Natriumhydroxidlösung behandelt ; es entwickelt sich eine Gelbfärbung, deren Extinktion bei 430 nm spektrophotometrisch gemessen wird.

3. Reagenzien 3.1. N,N-Dimethylformamid p.a.

3.2. Aluminiumoxid zur Säulenchromatographie. Es wird mindestens 2 Std. bei 750 ºC erhitzt, im Exsikkator abgekühlt und in braunen Schliffflaschen aufbewahrt. Die Aktivität des Aluminiumoxids wird durch Analyse einer bestimmten Menge Standardlösung (3.8.3) nach dem Verfahren ab Punkt 5.2 überprüft. Die Wiederfindungsrate von Nicarbazin muß 100 % ± 2 % betragen.

3.3. Äthanol 95 v.H. (V/V)

3.4. Äthanol 80 v.H. (V/V)

3.5. Natriumhydroxidlösung p.a. 50 v.H. (G/V)

3.6. Äthanolische Natriumhydroxidlösung 1 v.H. (G/V) : 1 ml Natriumhydroxidlösung (3.5) wird in einem 50-ml-Meßkolben mit Äthanol 80 v.H. (3.4) zur Marke aufgefuellt. Die Lösung ist unmittelbar vor Gebrauch herzustellen.

>PIC FILE= "T0005531"> 3.8. Standardlösungen: 3.8.1. Nicarbazinlösung 1,25 mg/ml : 125 mg der Standardsubstanz (3.7) werden auf 0,1 mg genau eingewogen und in einem 100-ml-Meßkolben mit 75 ml N,N-Dimethylformamid (3.1) unter leichtem Erwärmen gelöst. Man lässt abkühlen, fuellt mit demselben Lösungsmittel zur Marke auf und schüttelt um. Die Lösung ist vor Lichteinwirkung geschützt aufzubewahren.

3.8.2. Nicarbazinlösung 0,125 mg/ml : Von der Lösung (3.8.1) werden 10,0 ml abpipettiert, mit N,N-Dimethylformamid (3.1) in einem Meßkolben auf 100 ml aufgefuellt und gemischt.

3.8.3. Nicarbazinlösung 0,025 mg/ml : Von der Lösung (3.8.2) werden 20,0 ml abpipettiert, mit N,N-Dimethylformamid (3.1) in einem Meßkolben auf 100 ml aufgefuellt und gemischt.

4. Geräte 4.1. Erlenmeyerkolben mit Schliffstopfen, 250 ml Inhalt

4.2. Rückflußkühler mit Schliff

4.3. Wasserbad

4.4. Zentrifuge, dazu Gläser mit 120 ml Inhalt

4.5. Chromatographierohr aus Glas (innerer Durchmesser : 25 mm, Länge : 300 mm)

4.6. Spektralphotometer mit Kuevetten von 10 mm Schichtdicke

4.7. Bürette, 1/10 ml-Einteilung.

5. Ausführung 5.1. Extraktion

10 g der fein zerkleinerten und homogenisierten Probe werden auf 1 mg genau eingewogen. Bei Konzentraten und Vormischungen wird 1 g auf 1 mg genau eingewogen. Die Einwaage wird in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben (4.1) mit genau 100 ml N,N-Dimethylformamid.

(3.1) versetzt und gemischt. Der Kolben wird mit einem Rückflußkühler (4.2) verbunden und 15 Min. unter gelegentlichem Schütteln im siedenden Wasserbad (4.3) erhitzt. Danach kühlt man unter kaltem Wasser ab.

Die oben schwimmende Flüssigkeit wird sodann in ein Zentrifugenglas (4.4) umgefuellt und etwa 3 Min. zentrifugiert. Wenn erforderlich, werden 25,0 ml der oben schwimmenden Flüssigkeit entnommen und mit N,N-Dimethylformamid (3.1) verdünnt, so daß man eine Lösung mit einem Gehalt von 2,0 bis 10,0 ¶g Nicarbazin pro ml erhält.

5.2. Chromatographie

In ein Chromatographierohr (4.5) wird eine Suspension von 30 g Aluminiumoxid (3.2) in N,N-Dimethylformamid (3.1) gegeben. Wenn die Flüssigkeit bis auf 1 cm über der Aluminiumoxidsäule abgeflossen ist, werden 25,0 ml des nach 5.1 erhaltenen Extrakts auf die Säule gegeben. Man lässt die Flüssigkeit ablaufen, wobei die Säule nicht trocken werden darf. Danach wird diese dreimal mit je 10 ml N,N-Dimethylformamid (3.1) gewaschen und mit 70 ml Äthanol 95 v.H (3.3) eluiert. Die ersten 10 ml des Eluats werden verworfen ; der Rest wird in folgenden Fraktionen aufgefangen:

eine Fraktion (a) von 5 ml,

eine Fraktion (b) von 50 ml in einem Meßkolben,

eine Fraktion (c) von 5 ml.

Zu prüfen ist, ob die Fraktionen (a) und (c) bei Zusatz von äthanolischer Natriumhydroxidlösung (3.6) keine Gelbfärbung ergeben. Teil (b) wird nach dem unter 5.3 beschriebenen Verfahren weiterbehandelt.

5.3. Entwicklung der Färbung und Messung der Extinktion

In zwei 25-ml-Meßkolben A und B werden je 20,0 ml der Fraktion (b) des Eluats gegeben. Dem Kolben A werden 5,0 ml äthanolische Natriumhydroxidlösung (3.6), dem Kolben B 5,0 ml Äthanol 95 v.H. (3.3) zugesetzt, dann wird gemischt.

In den folgenden 5 Min. wird die Extinktion beider Lösungen bei 430 nm gemessen, wobei ein Gemisch von 20,0 ml Äthanol 95 v.H. (3.3) und 5,0 ml äthanolische Natriumhydroxidlösung (3.6) als Blindlösung verwendet wird.

Der Extinktionswert der Lösung B ist von dem der Lösung A abzuziehen. Dieser Wert dient zur Ermittlung der Nicarbazinmenge aus der Eichkurve (5.4).

5.4. Eichkurve

25,0 ml der Standardlösung (3.8.3) werden, wie unter 5.2 angegeben, chromatographiert. Von der Fraktion (b) des Eluats werden mit Hilfe einer Bürette (4.7) 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 und 10,0 ml (entsprechend 0,025 - 0,050 - 0,075 - 0,100 und 0,125 mg Nicarbazin) in 25-ml-Meßkolben abgelassen. Nach Zusatz von 5,0 ml äthanolischer Natriumhydroxidlösung (3.6) werden die Kolben mit Äthanol 95 v.H. (3.3) aufgefuellt und umgeschüttelt.

In den folgenden 5 Min. wird die Extinktion der Lösungen bei 430 nm unter Verwendung eines Gemischs von 20,0 ml Äthanol 95 v.H. (3.3) und 5,0 ml äthanolischer Natriumhydroxidlösung (3.6) als Blindlösung gemessen.

Zum Zeichnen der Eichkurve werden die Extinktionswerte auf der Ordinate, die entsprechenden Nicarbazinmengen in mg auf der Abszisse aufgetragen.

6. Berechnung der Ergebnisse

Der Gehalt an Nicarbazin der Probe in mg/kg wird nach folgender Formel berechnet: >PIC FILE= "T0005511">

Es bedeutet:

A = durch photometrische Messung ermittelte Menge Nicarbazin in mg,

P = Einwaage in g,

F = (der eventuell bei 5.1 angewandte) Verdünnungsfaktor.

7. Wiederholbarkeit

Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und derselben Probe bei Gehalten von

weniger als 100 mg/kg Nicabazin 10 mg/kg absolut,

100 bis 5 000 mg/kg 10 v.H. relativ,

mehr als 5 000 bis 10 000 mg/kg 500 mg/kg absolut,

mehr als 10 000 mg/kg 5 v.H. relativ

nicht überschreiten.

5. BESTIMMUNG VON MENADION (VITAMIN K3)

1. Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung von Menadion (Vitamin K3) in Futtermitteln, Konzentraten und Vormischungen. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 1 mg/kg.

2. Prinzip

Die Probe wird mit verdünntem Äthanol extrahiert, mit Tanninlösung geklärt und zentrifugiert. Der Extrakt wird mit einer Natriumcarbonatlösung behandelt und das freigesetzte Menadion mit 1,2-Dichloräthan extrahiert. Der Dichloräthanextrakt wird - je nach dem Gehalt an Menadion - entweder direkt verwendet oder eingeengt und mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin in salzsäurehaltigem Äthanol versetzt. Aus dem gebildeten Hydrazon entsteht, nach Zusatz eines Überschusses an Ammoniak, ein blaugrüner Farbkomplex, dessen Extinktion bei 635 nm gemessen wird.

3. Reagenzien 3.1. Äthanol 96 v.H. (V/V)

3.2. Äthanol (3.1) 40 v.H. (V/V) mit Wasser verdünnt

3.3. Tanninlösung, 10 v.H. (G/V) aus gepulvertem, reinen Tannin

3.4. 1,2-Dichloräthan p.a.

3.5. Natriumcarbonatlösung 10 v.H. (G/V), aus wasserfreiem Natriumcarbonat p.a.

3.6. Salzsäure 37 v.H. (G/G), D = 1,19

3.7. Äthanol absolut p.a.

3.8. 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Reagenz : 40 mg 2,4-Dinitropehnylhydrazin p.a. werden in ca. 40 ml siedendem absolutem Äthanol (3.7) gelöst und nach dem Abkühlen in einen 50-ml-Meßkolben übergeführt. Man fügt 1 ml Salzsäure (3.6) hinzu und fuellt mit absolutem Äthanol (3.7) bis zur Marke auf. Das Reagenz ist vor dem Gebrauch frisch zuzubereiten.

3.9. Ammoniaklösung 25 v.H. (G/G), D = 0,91

3.10. Äthanol-Ammoniaklösung : Ein Volumenteil Äthanol (3.7) wird mit einem Volumenteil Ammoniak (3.9) gemischt.

3.11. Menadion-Standardlösungen : 20 mg Menadion (Vitamin K3) werden in einem 200-ml-Meßkolben in 1,2-Dichloräthan (3.4) gelöst und mit diesem auf 200 ml aufgefuellt. Von dieser Lösung werden aliquote Teile abgenommen und so verdünnt, daß man eine Reihe von Standardlösungen, deren Konzentrationen an Menadion zwischen 2 und 10 ¶g pro ml liegen, erhält. Die Lösung ist vor dem Gebrauch frisch herzustellen.

4. Geräte 4.1. Mechanischer Schüttelapparat

4.2. Zentrifuge (3 000 bis 5 000 U/Min.)

4.3. Scheidetrichter, 100 und 250 ml Inhalt, mit Schliffstopfen

4.4. Vakuum-Rotations-Verdampfer mit 250-ml-Rundkolben

4.5. Wasserbad

4.6. Spektralphotometer mit Kuevetten von 10 mm Schichtdicke

5. Ausführung

NB : Alle Arbeiten werden bei gedämpftem Tageslicht, gegebenenfalls unter Verwendung von braunen Glasgefässen, durchgeführt. 5.1. Einwaage

Je nach dem vermuteten Gehalt an Menadion wird eine Menge der fein zerkleinerten Probe wie folgt eingewogen:

bei Konzentraten und Vormischungen 0,1 bis 5,0 g;

bei Futtermitteln 20 bis 30 g.

Die Einwaage wird sofort in einen 250-ml-Schliffkolben umgefuellt.

5.2. Extraktion

Die eingewogenen Probe wird mit exakt 96 ml verdünntem Äthanol (3.2) 15 Min. mechanisch bei Zimmertemperatur geschüttelt. Anschließend werden 4,0 ml Tanninlösung (3.3) hinzugegeben und geschüttelt. Der Extrakt wird in ein Zentrifugenglas umgefuellt, scharf zentrifugiert (3 000 - 5 000 U/Min.) und dekantiert.

Zu einer genau abgemessenen Menge von 20 bis 40 ml des Extrakts werden in einen 250-ml-Scheidetrichter mit einer Pipette 50 ml 1,2-Dichloräthan (3.4) gegeben und geschüttelt ; in diese Mischung pipettiert man 20 ml Natriumcarbonatlösung (3.5). Man schüttelt 30 Sek. kräftig durch und lässt die Dichloräthanphase in einen 100-ml-Scheidetrichter ab ; der Dichloräthanextrakt wird 15 Sek. mit 20 ml Wasser geschüttelt, die Dichloräthanphase aufgefangen und Wasserspuren mit Filterpapierschnitzeln entfernt.

Bei Konzentraten und Vormischungen wird ein aliquoter Anteil dieses Extrakts mit 1,2-Dichloräthan (3.4) so verdünnt, daß er 2 bis 10 ¶g Menadion pro ml enthält ; bei Futtermitteln wird ein aliquoter Teil bei 40 ºC Wassertemperatur bei vermindertem Druck unter Stickstoff-Atmosphäre zur Trockne eingeengt und der Rückstand schnell in soviel 1,2-Dichloräthan (3.4) aufgenommen, daß in der Dichloräthan-Lösung 2 bis 10 ¶g Menadion pro ml enthalten sind.

5.3. Hydrazonbildung

2,0 ml des nach 5.2 gewonnen Dichloräthanextrakts werden in einem 10-ml-Meßkolben mit 3,0 ml 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Reagenz (3.8) versetzt ; man verschließt das Kölbchen mit einem Kork- oder Teflonstopfen, um Verdampfung zu vermeiden, und erhitzt für 2 Std. bei 70 ºC im Wasserbad. Nach dem Abkühlen fügt man 3,0 ml Äthanol-Ammoniaklösung (3.10) hinzu, schüttelt um, ergänzt das Volumen mit absolutem Äthanol (3.7) bis zur Marke und schüttelt nochmals.

5.4. Messung der Extinktion

Die Extinktion des blaugrünen Farbkomplexes wird bei 635 nm im Spektralphotometer gegen einen Reagenzblindwert, wobei 2,0 ml 1,2-Dichloräthan (3.4) nach dem unter 5.3 beschriebenen Verfahren behandelt werden, gemessen. Die Bestimmung des Gehalts an Menadion erfolt über eine Eichkurve, die für jede Analysenreihe aufgestellt wird.

5.5. Eichkurve

2,0 ml der Menadion-Standardlösungen (3.11) werden wie unter 5.3 angegeben behandelt. Die Extinktion wird wie unter 5.4 angegeben gemessen und die Eichkurve wird durch Eintragung der Extinktionswerte in die Ordinate und der entsprechenden Menadion-Mengen in ¶g in die Abszisse gezeichnet.

6. Berechnung der Ergebnisse

Der Gehalt an Menadion der Probe wird unter Berücksichtigung des Gewichts der Einwaage und der Verdünnungverhältnisse im Analysengang berechnet. Die Ergebnisse werden in mg Menadion pro kg ausgedrückt.

7. Wiederholbarkeit

Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und derselben Probe bei Gehalten von

weniger als 10 mg/kg 20 v.H. relativ,

10 bis 14 mg/kg 2 mg/kg absolut,

mehr als 14 bis 100 mg/kg 15 v.H. relativ,

mehr als 100 bis 150 mg/kg 15 mg/kg absolut,

mehr als 150 mg/kg 10 v.H. relativ

nicht überschreiten.