RICHTLINIE 92/95/EWG DER KOMMISSION vom 9. November 1992 zur Änderung des Anhangs der siebten Richtlinie 76/372/EWG zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln

DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN -

gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft,

gestützt auf die Richtlinie 70/373/EWG des Rates vom 20. Juli 1970 über die Einführung gemeinschaftlicher Probenahmeverfahren und Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (1), zuletzt geändert durch die Akte über den Beitritt Spaniens und Portugals, insbesondere auf Artikel 2,

in Erwägung nachstehender Gründe:

Die siebte Richtlinie 76/372/EWG der Kommission vom 1. März 1976 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (2), geändert durch die Richtlinie 81/680/EWG (3), legt die Methoden zur Bestimmung des Gehalts an Aflatoxin B1 fest.

Es empfiehlt sich, diese Methoden den Entwicklungen wissenschaftlicher und technischer Erkenntnisse anzupassen; es ist insbesondere notwendig, über eine Methode zur Kontrolle der sehr niedrigen Grenzwerte von Aflatoxin zu verfügen, wie sie durch die Richtlinie 74/63/EWG des Rates vom 17. Dezember 1973 über die Festlegung von Hoechstgehalten an unerwünschten Stoffen und Erzeugnissen in Futtermitteln (4), zuletzt geändert durch die Richtlinie 91/132/EWG (5), festgelegt wurden.

Es ist ausserdem angebracht, über eine Methode zur Bestimmung von Aflatoxin B1 in Gegenwart von interferierenden Stoffen, die die Bestimmung von Aflatoxin beeinträchtigen, wie z. B. Zitrustrester, zu verfügen.

Die in dieser Richtlinie vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des Ständigen Futtermittelausschusses -

HAT FOLGENDE RICHTLINIE ERLASSEN:

Artikel 1

Der Anhang der Richtlinie 76/372/EWG wird entsprechend dem Anhang der vorliegenden Richtlinie geändert.

Artikel 2

Die Mitgliedstaaten erlassen die erforderlichen Rechts- und Verwaltungsvorschriften, um dieser Richtlinie bis spätestens zum 1. Oktober 1993 nachzukommen. Sie unterrichten die Kommission unverzueglich davon.

Wenn die Mitgliedstaaten diese Vorschriften erlassen, nehmen sie entweder in diesen Vorschriften selbst oder durch einen Hinweis bei der amtlichen Veröffentlichung auf diese Richtlinie Bezug. Die Mitgliedstaaten regeln die Einzelheiten dieser Bezugnahme.

Artikel 3

Diese Richtlinie ist an alle Mitgliedstaaten gerichtet. Brüssel, den 9. November 1992 Für die Kommission

Ray MAC SHARRY

Mitglied der Kommission

(1) ABl. Nr. L 170 vom 3. 8. 1970, S. 2. (2) ABl. Nr. L 102 vom 15. 4. 1976, S. 8. (3) ABl. Nr. L 246 vom 29. 8. 1981, S. 32. (4) ABl. Nr. L 38 vom 11. 2. 1974, S. 31. (5) ABl. Nr. L 66 vom 13. 3. 1991, S. 16.

ANHANG

I. In Teil A "METHODE MIT EINDIMENSIONALER DÜNNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE" wird der Wortlaut von Punkt 1 "Zweck und Anwendungsbereich" durch folgenden Wortlaut ersetzt:

"1. Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an Aflatoxin B1 in Rohstoffen und Einzelfuttermitteln. Diese Methode kann nicht angewendet werden, wenn Citrustrester vorhanden ist. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 0,01 mg/kg (10 ppb).

Wenn Störsubstanzen vorhanden sind, welche die Auswertung erschweren, muß die Analyse nach der Methode B (Hochleistungsfluessigkeitschromatographie) wiederholt werden."

II. In Teil B "METHODE MIT ZWEIDIMENSIONALER DÜNNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE" wird der Wortlaut durch folgenden Wortlaut ersetzt:

"B. BESTIMMUNG VON AFLATOXIN B1 DURCH HOCHLEISTUNGSFLÜSSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE

1. Zweck und Anwendungsbereich Die Methode dient der Bestimmung von Aflatoxin B1 in Futtermitteln, einschließlich solchen, die Citrustrester enthalten. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 0,001 mg/kg (1 ppb). 2. Prinzip Die Probe wird mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird filtriert und ein allquoter Teil über eine Florisil-Kartusche und anschließend über eine C18-Kartusche gereinigt. Die endgültige Trennung und Bestimmung erfolgen mit einer C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule und anschließender Nachsäulenderivatisierung mit Jod in Wasser sowie Fluoreszenzdetektion. Anmerkung: Mykotoxine sind äusserst toxische Substanzen. Alle Arbeiten sollten in einem dafür vorgesehenen Abzug durchgeführt werden. Besondere Vorsichtsmaßnahmen sollten getroffen werden, wenn die Toxine in fester Form vorliegen, wegen ihrer elektrostatischen Eigenschaft und der daraus resultierenden Tendenz, sich auf Arbeitsflächen zu verteilen. 3. Reagenzien 3.1. Chloroform, stabilisiert mit 0,5 bis 1,0 % Ethanol (m/m). Siehe Bemerkung 10.2. 3.2. Methanol, für die HPLC zur Herstellung von 3.6. 3.3. Aceton. 3.4. Acetonitril für die HPLC. 3.5. Elutionsmittel: Sie werden einen Tag vor der Verwendung bereitet, oder die Luft in den Lösemitteln wird mit Hilfe von Ultraschall entfernt. 3.5.1. Mischung aus Aceton (3.3) und Wasser, 98+2 (V+V). 3.5.2. Mischung aus Wasser und Methanol (3.2), 80+20 (V+V). 3.5.3. Mischung aus Wasser und Aceton (3.3), 85+15 (V+V). 3.6. Mobile Phase für die HPLC. Mischung aus Wasser, Methanol (3.2) und Acetonitril (3.4), 130+70+40 (V+V+V). N.B.: Gegebenenfalls muß das Mischungsverhältnis der mobilen Phase der Charakteristik der verwendeten HPLC-Säule angepasst werden. 3.7. Gesättigte Jodlösung: 2 g Jod werden in 400 ml Wasser gegeben, mindestens 90 Minuten gemischt und durch ein Membranfilter (4.15) filtriert. Die gesättigte Lösung ist vor Licht zu schützen, um einen fotochemischen Abbau zu verhindern. 3.8. Celite 545, mit Säure gewaschen, oder gleichwertiges Material. 3.9. Florisil-Kartusche (Waters SEP-PAK) oder gleichwertiges Material. 3.10. C18-Kartusche (Waters SEP-PAK) oder gleichwertiges Material. 3.11. Inertgas, z. B. Stickstoff. 3.12. Aflatoxin-B1-Standardlösung in Chloroform, Konzentration 10 mg/ml. Die Konzentration der Lösung wird folgendermassen überprüft: Bestimmung des Absorptionsspektrums der Lösung zwischen 330 und 370 nm mit Hilfe des Spektralphotometers (4.23). Messung der Extinktion (E) bei 363 nm. Berechnung der Konzentration von Aflatoxin B1 in 1 mg/ml mit der Formel: Konzentration (mg/ml) = 312 × E × 1000

22 300 = 13,991 × E 3.12.1. Aflatoxin-B1-Stammlösung in Chloroform. 2,5 ml der Aflatoxin-B1-Standardlösung (3.12) werden in einen 50-ml-Meßkolben überführt und der Kolben mit Chloroform (3.1) zur Marke aufgefuellt. Diese Stammlösung wird kühl (4 °C), dunkel, dicht verschlossen und mit Alufolie umwickelt aufbewahrt. 3.13. Aflatoxin-B1-Eichlösungen für die HPLC. Anmerkung: Für die Herstellung dieser Lösungen sind säuregewaschene Glasgeräte zu verwenden (siehe 4, Geräte). 3.13.1. Eichlösung, 4 ng/ml. Man lässt den mit Alufolie umwickelten Kolben mit der Stammlösung (3.12.1) auf Raumtemperatur erwärmen (einige Stunden). 400 ml der Stammlösung (200 ng Aflatoxin B1) werden in einen 50-ml-Meßkolben überführt und in einem Strom von Inertgas (3.11) zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in ca. 20 ml Wasser-Aceton-Gemisch (3.5.3) gelöst, bis zur Marke mit Wasser-Aceton-Gemisch (3.5.3) aufgefuellt und gut durchmischt. 3.13.2. Eichlösung, 3 ng/ml. 7,5 ml der Eichlösung (3.13.1) werden quantitativ in einen 10-ml-Meßkolben überführt. Es wird mit Wasser-Aceton-Gemisch (3.5.3) zur Marke aufgefuellt und der Kolbeninhalt gut durchmischt. 3.13.3. Eichlösung, 2 ng/ml. 25 ml der Eichlösung (3.13.1) werden quantitativ in einen 50-ml-Meßkolben überführt. Es wird mit Wasser-Aceton-Gemisch (3.5.3) zur Marke aufgefuellt, und der Kolbeninhalt wird gut durchmischt. Diese Lösung gilt auch als Bezugsstandard, der für die wiederholte Einspritzung während der HPLC-Bestimmung (5.5) verwendet wird. 3.13.4. Eichlösung, 1 ng/ml. 2,5 ml Eichlösung (3.13.1) werden quantitativ in einen 10-ml-Meßkolben überführt. Es wird mit Wasser-Aceton-Gemisch (3.5.3) zur Marke aufgefuellt und der Kolbeninhalt gut durchmischt. 3.14. Ampulle mit einer Mischung der Aflatoxine B1, B2, G1 und G2 in Konzentrationen von ca. 1; 0,5; 1 bzw. 0,5 mg/ml in 1 ml Chloroform. 3.14.1. Testlösung für die HPLC. Der Inhalt der Ampulle (3.14) wird in ein Reagenzglas mit Schliffstopfen oder Schraubverschluß überführt. 40 ml dieser Lösung werden in einen 10-ml-Meßkolben oder in ein Reagenzglas mit Schliffstopfen (mit Säure gewaschen) (4.22) überführt. Nach Abdampfen des Chloroforms im Inertgasstrom (3.11) wird der Rückstand in 10 ml Wasser-Aceton-Gemisch (3.5.3) gelöst. 3.15. Reagenzien für die Identitätsbestätigung (6). 3.15.1. Gesättigte Natriumchloridlösung. 3.15.2. Natriumsulfat, wasserfrei, gekörnt. 4. Geräte Achtung: Die Verwendung von Glasgeräten, die nicht mit Säure gewaschen wurden, kann bei wäßrigen Aflatoxinlösungen zu Verlusten führen. Besondere Sorgfalt ist bei neuen Glasgeräten und Einweg-Glasgeräten wie Ampullen für automatische Probengeber und Pasteurpipetten geboten. Daher müssen Laborgeräte aus Glas, die mit wäßrigen Aflatoxinlösungen in Berührung kommen, mehrere Stunden in verdünnter Säure (z. B. Schwefelsäure, c = 2 mol/l) liegen und dann zur Beseitigung sämtlicher Säurereste sorgfältig mit destilliertem Wasser gespült werden (z. B. dreimal, mit pH-Papier prüfen). In der Praxis ist diese Behandlung erforderlich bei Rundkolben (4.4), Meßkolben, Meßzylindern, Reagenzgläsern oder Gefässen, die für Eichlösungen und Endextrakte verwendet werden (insbesondere bei Ampullen für automatische Probengeber) sowie für Pasteurpipetten, die zur Überführung von Eichlösungen und Extrakten benutzt werden. 4.1. Mahl- und Mischgerät. 4.2. Sieb mit einer Maschenweite von 1,0 mm (ISO R 565). 4.3. Schüttelmaschine. 4.4. Vakuumrotationsverdampfer mit 150- bis 250-ml-Rundkolben. 4.5. Hochleistungs-Flüssigkeitschromatograph, Injektor mit Probenschleife, geeignet für die Injektion von 250 ml. Die Angaben des Herstellers für teilweise oder vollständige Schleifenfuellung sind zu beachten. 4.6. HPLC-Trennsäule: C18-Füllmaterial, Teilchengrösse 3 mm oder 5 mm. 4.7. Pulsationsfreie Pumpe für das Nachsäulen-Jodreagenz. 4.8. Totvolumenfreies T-Stück (Valco) aus Edelstahl, (1/16" × 0,75 mm). 4.9. Spiralreaktionsrohr aus Teflon oder Edelstahl. Abmessungen von 3 000 × 0,5 mm bis 5 000 × 0,5 mm sind in Verbindung mit 5 mm oder 3 mm HPLC-Säulen erwiesenermassen geeignet. 4.10. Thermostatgesteuertes, auf 60 °C eingestelltes Wasserbad, Temperaturregelung genauer als 0,1 °C. 4.11. Fluoreszenzdetektor mit 365 nm Anregungs- und 435 nm Emissionswellenlänge (bei Filtergeräten: Emissionswellenlänge > 400 nm). Ein Nachweis von mindestens 0,05 ng Aflatoxin B1 sollte möglich sein. Unter Umständen kann ein Gegendruck erforderlich sein (z. B. Restriktor bzw. Teflon- oder Edelstahlrohr ausreichender Länge am Detektorauslaß), um Luftblasen in der Durchflußzelle zu vermeiden. 4.12. Schreiber. 4.13. Elektronischer Integrator (wahlweise). 4.14. Faltenfilter, Durchmesser 24 cm, Macherey-Nagel 617 1/4, oder gleichwertiges Filter. 4.15. Membran-Filter mit einer Porengrösse von 0,45 mm, Millipore (H.A.W.P. 04700) oder gleichwertiges Filter. 4.16. 500-ml-Erlenmeyerkolben mit Schliffstopfen. 4.17. Glassäule, Innendurchmesser ca. 1 cm, Länge ca. 30 cm, mit Lür-Endstück. 4.18. Chloroformbeständiger Lür-Absperrhahn aus Nylon (z. B. BIO-RAD 7328017; Analytichem A1 6078; J. T. Baker 4514). 4.19. Chemisch inerte Spritze, 10 ml, mit Lür-Anschluß. 4.20. Spritze geeignet für Injektionen von 250 ml (siehe 4.5). 4.21. 100-ml-Spritze für die Herstellung der Eichlösungen. Durch Wägung ist zu überprüfen, daß die Genauigkeit innerhalb von 2 % liegt. 4.22. 10-ml-Reagenzgläser, graduiert, mit Schliffstopfen. 4.23. UV-Spektralphotometer. 4.24. Geräte für die Identitätsbestätigung (6). 4.24.1. Mit Säure gespülter 100-ml-Scheidetrichter mit Teflon-Absperrhahn. 4.24.2. Heizblock, 40-50 °C. 5. Ausführung 5.1. Vorbereitung der Probe Die Probe wird gemahlen, so daß sie vollständig durch das Sieb (4.2) hindurchgeht. 5.2. Untersuchungsprobe 50 g der vorbereiteten Probe werden in einen Erlenmeyerkolben (4.16) eingewogen. 5.3. Extraktion Zu der Untersuchungsprobe (5.2) werden 25 g Celite (3.8), 250 ml Chloroform (3.1) und 25 ml Wasser gegeben. Der Kolben wird verschlossen, und es wird 30 Minuten mit einer Schüttelmaschine (4.3) gemischt. Anschließend wird durch ein Faltenfilter (4.14) filtriert, und 50 ml des Filtrats werden aufgefangen. Erforderlichenfalls wird ein aliquoter Teil des Filtrats mit Chloroform auf 50 ml verdünnt, so daß die Konzentration von Aflatoxin B1 nicht grösser als 4 ng/ml ist. 5.4. Reinigung Die Reinigung sollte ohne nennenswerte Unterbrechungen durchgeführt werden. Achtung: - Das Labor, in dem die Analysen durchgeführt werden, ist vor Tageslicht zu schützen. Dies kann durch folgende Maßnahmen erreicht werden:

(1) Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. und Paulsch, W.E. (1991). Food Additives and Contaminants 8, S. 17-29.

(2) ISO 3534-1977.

(3) ABl. Nr. L 351 vom 2. 12. 1989, S. 39.

1) UV-absorbierende Folie an den Fenstern in Verbindung mit gedämpftem Licht (keine direkte Sonneneinstrahlung!); 2) Vorhänge oder Jalousien und künstliches Licht (Leuchtstoffröhren können verwendet werden). Aflatoxinhaltige Lösungen müssen so gut wie möglich vor Licht geschützt werden (Aufbewahrung im Dunkeln, Verwendung von Alufolie). 5.4.1. Florisil-SEP-PAK-Reinigung 5.4.1.1. Vorbereitung der Säulen-Kartuschen-Kombination. Am kürzeren Ende der Florisil-Kartusche (3.9) wird ein Absperrhahn (4.18) angebracht (siehe Abbildung 1). Die Kartusche wird gewaschen und die Luft entfernt, indem von 10 ml Chloroform (3.1) 8 ml mit einer Spritze (4.19) über den Absperrhahn schnell durch die Kartusche hineingedrückt werden. Das längere Ende der Kartusche wird mit einer Glassäule (4.17) verbunden und die verbleibenden 2 ml Chloroform durch die Kartusche in die Glassäule gedrückt. Der Absperrhahn wird geschlossen und die Spritze entfernt. 5.4.1.2. Reinigung. Das unter 5.3 gewonnene Filtrat wird in die Säulen-Kartuschen-Kombination gegeben, und man lässt es durch Schwerkraft ablaufen. Es wird mit 5 ml Chloroform (3.1) und anschließend mit 20 ml Methanol (3.2) gespült. Die Eluate werfen verworfen. Dabei ist ein Trockenlaufen der Säulen-Kartuschen-Kombination zu vermeiden. Das Aflatoxin B1 wird mit 40 ml Aceton-Wasser-Gemisch (3.5.1) eluiert und das gesamte Eluat im Rundkolben des Vakuum-Rotationsverdampfers (4.4) aufgefangen. Das Eluat wird am Vakuum-Rotationsverdampfer bei 40-50 °C eingeengt, bis kein Aceton mehr übergeht. (Anmerkung: etwa 0,5 ml der Flüssigkeit verbleiben dabei im Kolben. Versuche haben ergeben, daß ein weiteres Abdampfen sich nicht nachteilig auswirkt und daß die verbleibenden 0,5 ml Flüssigkeit keine nennenwerte Acetonmenge enthalten. Acetonreste können zu Verlusten von Aflatoxin B1 in der C18-Kartusche führen.) Nach Zugabe von 1 ml Methanol (3.2) wird der Kolben geschwenkt, um das Aflatoxin B1 an den Gefäßwänden zu lösen. Anschließend werden 4 ml Wasser zugegeben, und der Kolbeninhalt wird durchmischt. Die Kartusche wird abgenommen und verworfen. Die Glassäule wird mit Wasser gespült und für den Reinigungsschnitt mit C18 bereitgehalten. 5.4.2. C18-SEP-PAK-Reinigung 5.4.2.1. Vorbereitung der Säule-Kartuschen-Kombination. Das kürzere Ende einer C18-Kartusche (3.10) wird mit einem Absperrhahn (4.18) versehen (siehe Abbildung 1). Die Kartusche wird vorbereitet und die Luft entfernt, indem mit einer Spritze (4.19) 10 ml Methanol (3.2) schnell über den Absperrhahn durch die Kartusche gedrückt werden. (Luftblasen in der Kartusche sind als helle Flecken vor dem ansonsten gräulichen Hintergrund erkennbar). Von 10 ml Wasser werden 8 ml durch die Kartusche gedrückt. (Beim Übergang von Methanol auf Wasser ist das Eindringen von Luft in die Kartusche zu vermeiden.) Das längere Ende der Kartusche wird mit einer Glassäule (4.17) verbunden und die restlichen 2 ml durch die Kartusche in die Glassäule gedrückt. Der Absperrhahn wird geschlossen und die Spritze entfernt. 5.4.2.2. Reinigung. Der unter 5.4.1.2 erhaltene Exrakt wird quantitativ in die Glassäule (4.17) überführt. Der Kolben wird zweimal mit 5 ml Wasser-Methanol-Gemisch (3.5.2) gespült, und es wird durch Schwerkraft ablaufen gelassen. Während dieses Arbeitsgangs ist ein Trockenlaufen der Säulen-Kartuschen-Kombination zu vermeiden. (Wenn sich in der Verengung nahe der Kartusche Luftblasen bilden, wird der Fluß unterbrochen, und die Luftblasen werden durch leichtes Klopfen an das obere Ende der Glassäule entfernt.) Anschließend wird mit 25 ml Wasser-Methanol-Gemisch (3.5.2) eluiert, und das Eluat wird verworfen. Das Aflatoxin B1 wird mit 50 ml Wasser-Aceton-Gemisch (3.5.3) eluiert und das gesamte Eluat in einem 50-ml-Meßkolben aufgefangen. Der Kolben wird mit Wasser bis zur Marke aufgefuellt und der Kolbeninhalt gut durchmischt. Die so erhaltene Lösung wird für die HPLC (5.5) verwendet. Achtung: Eine Filtration des Endextrakts vor der HPLC ist normalerweise nicht erforderlich. Wird dies für notwendig gehalten, dürfen keine Cellulosefilter verwendet werden, da diese zu Aflatoxin-B1-Verlusten führen können. Teflonfilter können verwendet werden. 5.5. Hochleistungsfluessigkeitschromatographie (Aufbau der Anlage siehe Abbildung 2.) Es ist genügend Zeit zur Konditionierung und Stabilisierung der Geräte vorzusehen. Anmerkung 1: Die Flußraten für die mobile Phase und das Nachsäulenreagenz sind nur Anhaltspunkte. Sie sind der Art und Dimension der HPLC-Säule entsprechend anzupassen. Anmerkung 2: Der Detektorresponse des Aflatoxins B1 ist temperaturabhängig, daher sollten Korrekturen für die Abweichungen vorgenommen werden (siehe Abbildung 3). Durch Einspritzung einer bestimmten Menge des Aflatoxin-B1-Bezugsstandards (3.13.3) in regelmässigen Abständen (z. B. jede dritte Einspritzung) können die Aflatoxin-B1-Peakwerte zwischen diesen Bezugsstandards mit Hilfe des mittleren Responses korrigiert werden. Voraussetzung ist, daß der Unterschied der Response aufeinanderfolgenden Bezugsstandards sehr klein (10 %) ist. Daher müssen die Einspritzungen ohne Unterbrechung erfolgen. Ist eine Unterbrechung notwendig, muß die letzte Einspritzung vor der Unterbrechung und die erste danach mit dem Bezugsstandard (3.13.3) durchgeführt werden. Da die Eichkurve linear ist und durch den Nullpunkt verläuft, werden die Aflatoxin-B1-Mengen in den Probenextrakten unmittelbar mit Hilfe der benachbarten Standards bestimmt. 5.5.1. Einstellung der HPLC-Pumpe Die HPLC-Pumpe (4.5) wird so eingestellt, daß sich bei Verwendung der mobilen Phase (3.6) eine Flußrate von 0,5 bzw. 0,3 ml/min für die 5-mm- bzw. 3-mm-HPLC-Säule (4.6) ergibt. 5.5.2. Einstellung der Nachsäulenpumpe Die Pumpe (4.7) wird so eingestellt, daß sich eine Flußrate von 0,2 bis 0,4 ml/min der gesättigten Jod-Wasser-Lösung (3.7) ergibt. Als grober Anhaltspunkt können Flußraten von ca. 0,4 bzw. 0,2 ml/min bei Flußraten von 0,5 bzw. 0,3 ml/min der mobilen Phase (3.6) empfohlen werden. 5.5.3. Fluoreszenzdetektor Der Fluoreszenzdetektor (4.11) wird auf eine Anregungswellenlänge von 365 nm und eine Emissionswellenlänge von 435 nm (Filterinstrument: > 400 nm) eingestellt. Die Detektorabschwächung wird so eingestellt, daß 1 ng Aflatoxin B1 ca 80 % Vollausschlag des Schreibers ergibt. 5.5.4. Injektor Von allen Lösungen werden Volumina von 250 ml gemäß den Herstellerangaben eingespritzt. 5.5.5. Überprüfung der chromatographischen Trennung Die Testlösung für die Chromatographie (3.14.1) wird eingespritzt. Der Abstand der Täler sollte weniger als 5 % der Summe der Peakhöhlen der benachbarten Peaks betragen. 5.5.6. Überprüfung der Systemstabilität Vor jeder Analysenreihe wird der Bezugsstandard (3.13.3) wiederholt eingespritzt, bis konstante Peakflächen erhalten werden. Anmerkung: Die Peakflächen von Aflatoxin B1 sollten bei aufeinanderfolgenden Einspritzungen um nicht mehr als 6 % voneinander abweichen. Es ist unverzueglich mit der Überprüfung der Linearität (5.5.7) fortzufahren. 5.5.7. Überprüfung der Linearität Die Aflatoxin-B1-Eichlösungen (3.13.1 bis 3.13.4) werden eingespritzt. Für jede dritte Einspritzung ist der Bezugsstandard 3.13.3 zu verwenden, um Responseabweichungen zu korrigieren (Anmerkung: Die Peak-Response für diesen Bezugsstandard dürfen nicht mehr als 10 % innerhalb von 90 Minuten voneinander abweichen.) Die Abweichungen werden gemäß der Formel in Punkt 7 korrigiert. Die Eichkurve sollte linear sein und innerhalb des zweifachen Standardfehlers des y-Wertes durch den Nullpunkt verlaufen. Die ermittelten Werte dürfen nicht mehr als 3 % von den Nennwerten abweichen. Sind diese Anforderungen erfuellt, ist unverzueglich mit Punkt 5.5.8 fortzufahren; wenn nicht, sind vorher die Fehlerquellen festzustellen und zu beseitigen. 5.5.8. Einspritzung der Probenextrakte Die gereinigten Probenextrakte (5.4.2.2) werden eingespritzt. Nach je zwei Probenextrakten ist die Einspritzung des Bezugsstandards (3.13.3) zu wiederholen, also: Bezugsstandard, Extrakt Extrakt, Bezugsstandard, Ektrakt, Ektrakt, Bezugsstandard usw. 6. Identitätsbestätigung 6.1. Weitere Behandlung des Extraktes (5.4.2.2) Dem nach 5.4.2.2 gewonnen Endextrakt werden 5 ml Natriumchloridlösung (3.15.1) zugesetzt. Man schüttelt in einem Scheidetricher (4.24.1) dreimal mit je 2 ml Chloroform (3.1) jeweils eine Minute. Die vereinigten Chloroformextrakte werden über ca. 1 g Natriumsulfat (3.15.2) in ein 10-ml-Reagenzglas gegossen. Es kann ein kleiner Trichter (Durchmesser 4 cm) verwendet werden, in dessen Auslauf sich ein Wattepfropf, der mit 1 g Natriumsulfat (3.15.2) bedeckt ist, befindet. Die Natriumsulfatschicht wird mit einigen ml Chloroform ausgewaschen und die Waschlösung im gleichen Reagenzglas aufgefangen. Der Chloroformextrakt wird in diesem Reagenzglas in einem Heizblock (4.24.2) zur Trockne eingedampft und erneut in 1 ml Chloroform gelöst. 6.2. Herstellung der Derivate und Dünnschichtchromatographie Vergleiche Richtlinie 76/372/EWG des Rates, Anhang, Methode A unter Punkt 5.6.2. 7. Berechnung der Ergebnisse Der Aflatoxin-B1-Gehalt der Probe (mg/kg) wird mit folgender Formel berechnet: Aflatoxin-B1-Gehalt in mg/kg = m × Ve x t

Vm × M × Vf Vc Hierbei sind: m = die Menge an Aflatoxin B1 in ng, dargestellt durch den B1-Peak der Probe, die folgendermassen berechnet wird: m = P (Probe)

P (st1) + P (st2) × 2 r (st) P (Probe) = Peakfläche des Aflatoxins B1 der Probe P (st1) = Peakfläche des Aflatoxins B1 bei der vorangegangenen Einspritzung des Bezugsstandards (3.13.3) P (st2) = Peakfläche des Aflatoxins B1 bei der nachfolgenden Einspritzung des Bezugsstandards (3.13.3) r (st) = eingespritzte Menge Aflatoxin B1 im Bezugsstandard (3.13.3) in ng Vm = Volumen des eingespritzten Probenextrakts in ml Ve x t = Endvolumen des Probenextrakts in ml, unter Berücksichtigung der Verdünnung (5.3) M = Probeneinwaage in g Vf = Volumen des auf die Florisilkartusche (5.4.1.2) gegebenen Filtrats in ml Vc = Volumen des zur Extraktion der Probe verwendeten Chloroforms in ml Wird dem in diesem Protokoll angegebenen Verfahren gefolgt, kann die Formel folgendermassen verkürzt werden: Aflatoxin-B1-Gehalt in mg/kg = 20 × m 7.1. Die Ergebnisse können auch durch Messung der Peak-Höhen ermittelt werden. 8. Wiederholbarkeit Siehe 10.1 (Bemerkungen). 9. Vergleichbarkeit Siehe 10.1 (Bemerkungen). 10. Bemerkungen 10.1. Reproduzierbarkeit Eine auf internationaler Ebene durchgeführte Ringuntersuchung (1) an Mischfuttermitteln ergab hinsichtlich der Wiederholbarkeit und Vergleichbarkeit die in Tabelle 1 aufgeführten Ergebnisse. Der hier verwendete Begriff Wiederholbarkeit (r) bezeichnet das grösste Verhältnis, das bei 95%iger Wahrscheinlichkeit im Vergleich von 2 Ergebnissen der gleichen Probe und unter gleichen Laborbedingungen nicht signifikant ist. Der Begriff Vergleichbarkeit (R) ist ähnlich definiert für den Vergleich zweier verschiedener Laboratorien. Gemäß ISO 3534 - 1977, Ziffer 2.35 (2) und der Entscheidung 89/610/EWG der Kommission (3) sind in Tabelle 1 r und R auch als Variationsköffizienten angegeben. Tabelle 1 Wiederholbarkeit (r) und Vergleichbarkeit (R), ausgedrückt als Verhältniszahlen und als Variationsköffizienten (15 Laboratorien)

Niveau r R CVr (*) CVR (*) (mg/kg) (%) (%) 8 und 14 1,4 1,7 11 18 (*) CV = Variationsköffizient. 10.2. Stabilisierung des Chloroforms (3.1) Die Absorptionseigenschaften der Florisilkartusche (3.9) können sich verändern, wenn ein anderer Stabilisator als Ethanol verwendet wird. Dieses sollte gemäß Punkt 10.3 überprüft werden für den Fall, daß das beschriebene Chloroform nicht erhältlich ist. 10.3. Richtigkeit Die korrekte Durchführung des Verfahrens ist zu überprüfen, indem wiederholte Bestimmungen an zertifizierten Referenzmaterialien durchgeführt werden. Sind diese nicht verfügbar, sollte die Leistungsfähigkeit des Verfahrens durch Wiederfindungsversuche an dotierten Blindproben überprüft werden. Die Abweichung des Mittelwerts vom Sollwert, ausgedrückt in Prozenten des Sollwerts, soll einen Rahmen von 20 bis +10 % nicht überschreiten. Abbildung 1: Säulen-Kartuschen-Kombination 1. Mobile Phase

2. Pumpe

3. Injektor

4. Vorsäule

5. HPLC-Analysesäule

6. Gesättigte Jodlösung

7. Reagenzienpumpe 8. T-Stück

9. Thermostatgesteuertes Bad

10. Spiralreaktionsrohr

11. Fluoreszenzdetektor

12. Restriktor

13. Auffangbehälter

14. Schreiber bzw. Integrator Abbildung 2: Flußschema des LC-Systems mit Einrichtung zur Nachsäulenderivatisierung mit Jod Respons Mittelwert benachbarter

Bezugsstandards Zeit Bezugs- standard Extrakt (oder Eichlösung) Extrakt (oder Eichlösung) Bezugs- standard Extrakt (oder Eichlösung) Abbildung 3: Korrektur der Abweichung des Aflatoxin-B1-Responses durch Einspritzung des Bezugsstandards (3.13.3) in regelmässigen Abständen"