ANHANG I

Testmethoden zum Nachweis und zur Identifizierung des spezifizierten Schädlings gemäß Artikel 3 Absatz 2

1. Tests anhand von Sporen

Zum Nachweis und zur Identifizierung werden Sommersporangien und Dauersporen verwendet, die nach Sieben aus der Erde oder direkt aus dem Pflanzenmaterial gewonnen werden.

2. Nachweismethoden

Für die Extraktion von Sporen des spezifizierten Schädlings aus der Erde wird eine der folgenden Methoden angewendet:

a) Aussieben aus der Erde, wie beschrieben von Pratt (1976) (1);

b) Aussieben aus der Erde, wie beschrieben von van Leeuwen et al. (2005) (2);

c) zonale Zentrifugentechnik zur Probenverarbeitung mit hohem Durchsatz, wie beschrieben von Wander et al. (2007) (3).

3. Identifizierungsmethoden

Nach der Extraktion werden die Sporen des spezifizierten Schädlings mithilfe einer der folgenden Methoden identifiziert:

a) morphologische Identifizierung unter einem Lichtmikroskop mit 100-400facher Vergrößerung;

b) konventioneller PCR-Test unter Verwendung der Primer auf der Grundlage von Lévesque et al. (2001) (4) und van den Boogert et al. (2005) (5);

c) Echtzeit-PCR-Test unter Verwendung der Primer und Sonden nach van Gent-Pelzer et al. (2010) (6);

d) Echtzeit-PCR-Test unter Verwendung der Primer und Sonden nach Smith et al. (2014) (7).

4. Lebensfähigkeit von Dauersporen

Die Bestimmung der Lebensfähigkeit von Dauersporen kann durch Mikroskopuntersuchung oder Biotest erfolgen. Die Lebensfähigkeit von Sporangien kann durch Mikroskopuntersuchung von Sporangien, die in Lactophenol oder in Wasser eingedeckt werden, bestimmt werden (Przetakiewicz 2015) (8). Sporangien mit granulärem Inhalt oder mit leicht abgerundetem Protoplasma können als lebensfähig gelten. Diejenigen, die dauerhaft plasmolysiert sind oder augenscheinlich keinen Inhalt haben, gelten als tot.

Alternativ oder im Zweifelsfall kann ein Biotest gemäß Anhang IV Nummer 3 durchgeführt werden.

5. Bestimmung von Pathotypen

Für die Pathotypenbestimmung werden frische Wucherungen benötigt.

Das Inokulum für den Test wird anhand einer der folgenden Methoden hergestellt:

a) SASA-Methode (Science and Advice for Scottish Agriculture), bestehend aus den beiden folgenden Schritten: i) Herstellung des Inokulums Altes (braunes) Krebsgewebe wird in kleinere Stücke aufgebrochen und bei Raumtemperatur luftgetrocknet, bis es hart wird. Das harte Gewebe wird entweder manuell oder mechanisch gemahlen. Das gemahlene Material wird trockengesiebt, wobei die Fraktion zwischen 25 und 75 μm gewonnen wird, und anschließend anhand der Chloroform-Methode nach Pratt (1976)1 extrahiert. ii) Herstellung frischer Wucherungen Rund 10 mg der extrahierten Dauersporen werden auf die Oberfläche von 10 ml sterilem destilliertem Wasser in einer kleinen Petrischale aus Kunststoff gestreut und im Dunkeln bei 20 °C bis zur Keimung inkubiert. Kartoffelknollen mit kleinen Keimen von rund 1-2 mm Länge werden in durchsichtige Kunststoffbehälter gesetzt und mit feuchten Papiertüchern umwickelt, wobei die markierten Keime nach oben zeigen. Um die Keime herum wird mithilfe einer Spritze ein Ring aus geschmolzener Vaseline gezogen. Dieser Ring muss durchgehend und so hoch sein, dass die Sporensuspension darin bleibt, ohne auszulaufen. Die 10 ml keimenden Dauersporen werden mit sterilem Wasser weiter auf 20 ml verdünnt und mithilfe einer Pipette oder einer Quetschflasche in die Ringe gegeben, bis der Keim komplett mit Sporensuspension bedeckt ist. Die Kunststoffbehälter werden mit Deckeln verschlossen und 4 Tage lang bei 10 °C inkubiert, anschließend werden die Behälter geöffnet, das Inokulum und die Vaselineringe entfernt und die Behälter in ein vernebeltes Gewächshaus mit einer Temperatur von 15 bis 18°°C gebracht (16 h Licht);

b) Methode nach Spiekermann & Kothoff (1924) (9);

c) Methode nach Potoček et al. (1991) (10);

d) Methode nach Glynne-Lemmerzahl (Glynne 1925 (11); Lemmerzahl 1930 (12); Noble und Glynne 1970 (13)).

Zur Bestimmung aller Pathotypen, die bekanntermaßen in der Union eine Rolle spielen (1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) und 38(Nevşehir), wird gemäß der Tabelle ein Differentialinfektionstest mit unterschiedlichen Sorten der spezifizierten Pflanze durchgeführt. Der Infektionstest wird anhand des unter Buchstabe d genannten Protokolls (Glynne-Lemmerzahl-Methode) durchgeführt.

Selektive Sensitivität von Kartoffelkultivaren zur Bestimmung von Pathotypen von S. endobioticum

Kultivar Pathotypen von S. endobioticum 1(D1) 2(G1) 6(O1) 18(T1) 38(Nevşehir) Tomensa/Evora/Deodara S S S S S Irga/Producent R S S S S Talent R R* R* S S Saphir R S R R S Ikar/Gawin/Karolin/Belita R R R R R „S“: Susceptible (anfällig) „R“: Resistent *: geringe Anfälligkeit der Sorte für S. endobioticum („Auftreten nichtnekrotischer Sorifelder ohne Bildung von Wucherungen“).

(1) Pratt MA. 1976. A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of Synchytrium endobioticum in soil. Annals of Applied Biology 82: S. 21-29.

(2) van Leeuwen GCM, Wander JGN, Lamers J, Meffert JP, van den Boogert PHJF, Baayen RP. 2005. Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents. EPPO Bulletin 35: S. 25-31.

(3) Wander JGN, van den Berg W, van den Boogert PHJF, Lamers JG, van Leeuwen GCM, Hendrickx G, Bonants P. 2007. A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil. European Journal of Plant Pathology 119: S. 165-174.

(4) Lévesque CA, de Jong SN, Ward LJ & de Boer SH (2001) Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart. Canadian Journal of Plant Pathology 23: S. 200-201.

(5) van den Boogert PHJF, van Gent-Pelzer MPE, Bonants PJM, de Boer SH, Wander JGN, Lévesque CA, van Leeuwen GCM, Baayen RP. 2005. Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease. European Journal of Plant Pathology 113: S. 47-57.

(6) van Gent-Pelzer MPE, Krijger M, Bonants PJM. 2010. Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants. European Journal of Plant Pathology 126: S. 129-133.

(7) Smith DS, Rocheleau H, Chapados JT, Abbott C, Ribero S, Redhead SA, Lévesque CA, De Boer SH. 2014. Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil. Phytopathology 104: S. 422-432.

(8) Przetakiewicz, J. 2015. The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. from Poland. American Journal of Potato Research 92:704-708.

(9) Spieckermann A, Kothoff P. 1924. Testing potatoes for wart resistance. Deutsche Landwirtschaftliche Presse 51: S. 114-115.

(10) Potoček J, Krajíčková K, Klabzubová S, Krejcar Z, Hnízdil M, Novák F, Perlová V. 1991. Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic. Ochrana Rostlin 27: S. 191-205.

(11) Glynne MD. 1925. Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum. Annals of Applied Biology 12: S. 34-60.

(12) Lemmerzahl J. 1930. A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance. Züchter 2: S. 288-297.

(13) Noble M, Glynne MD. 1970. Wart disease of potatoes. FAO Plant Protection Bulletin 18: S. 125-135.