DE Amtsblatt der Europäischen Union L 54/1

VERORDNUNG (EG) Nr. 152/2009 DER KOMMISSION

vom 27. Januar 2009

zur Festlegung der Probenahmeverfahren und Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln

(Text von Bedeutung für den EWR)

DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN —

gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Gemeinschaft,

gestützt auf die Verordnung (EG) Nr. 882/2004 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 29. April 2004 über amtliche Kontrollen zur Überprüfung der Einhaltung des Lebensmittel- und Futtermittelrechts sowie der Bestimmungen über Tiergesundheit und Tierschutz (1), insbesondere auf Artikel 11 Absatz 4 Buchstaben a, b und c,

in Erwägung nachstehender Gründe:

(1) Die nachstehenden Rechtsakte wurden zur Durchführung der Richtlinie 70/373/EWG erlassen und bleiben gemäß Artikel 61 Absatz 2 der Verordnung (EG) Nr. 882/2004 in Kraft: — Erste Richtlinie 71/250/EWG der Kommission vom 15. Juni 1971 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (2), — Zweite Richtlinie 71/393/EWG der Kommission vom 18. November 1971 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (3), — Dritte Richtlinie 72/199/EWG der Kommission vom 27. April 1972 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (4), — Vierte Richtlinie 73/46/EWG der Kommission vom 5. Dezember 1972 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (5), — Erste Richtlinie 76/371/EWG der Kommission vom 1. März 1976 zur Festlegung gemeinschaftlicher Probenahmeverfahren für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (6), — Siebte Richtlinie 76/372/EWG der Kommission vom 1. März 1976 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (7), — Achte Richtlinie 78/633/EWG der Kommission vom 15. Juni 1978 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (8), — Neunte Richtlinie 81/715/EWG der Kommission vom 31. Juli 1981 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (9), — Zehnte Richtlinie 84/425/EWG der Kommission vom 25. Juli 1984 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (10), — Richtlinie 86/174/EWG der Kommission vom 9. April 1986 zur Festlegung der Methode zur Berechnung des Energiegehalts von Mischfuttermitteln für Geflügel (11), — Elfte Richtlinie 93/70/EWG der Kommission vom 28. Juli 1993 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (12), — Zwölfte Richtlinie 93/117/EG der Kommission vom 17. Dezember 1993 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (13), — Richtlinie 98/64/EG der Kommission vom 3. September 1998 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die Bestimmung von Aminosäuren, Rohfetten und Olaquindox in Futtermitteln und zur Änderung der Richtlinie 71/393/EWG (14), — Richtlinie 1999/27/EG der Kommission vom 20. April 1999 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die Bestimmung von Amprolium, Diclazuril und Carbadox in Futtermitteln sowie zur Änderung der Richtlinien 71/250/EWG und 73/46/EWG und zur Aufhebung der Richtlinie 74/203/EWG (15), — Richtlinie 1999/76/EG der Kommission vom 23. Juli 1999 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die Bestimmung von Lasalocid-Natrium in Futtermitteln (16), — Richtlinie 2000/45/EG der Kommission vom 6. Juli 2000 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die Bestimmung von Vitamin A, Vitamin E und Tryptophan in Futtermitteln (17), — Richtlinie 2002/70/EG der Kommission vom 26. Juli 2002 zur Festlegung von Anforderungen an die Bestimmung der Gehalte an Dioxinen und dioxinähnlichen PCB in Futtermitteln (18), — Richtlinie 2003/126/EG der Kommission vom 23. Dezember 2003 über die Analysemethode zur Bestimmung der Bestandteile tierischen Ursprungs bei der amtlichen Untersuchung von Futtermitteln (19).

(2) Da die Richtlinie 70/373/EWG durch die Verordnung (EG) Nr. 882/2004 ersetzt wurde, ist es angezeigt, die Durchführungsrechtsakte zu dieser Richtlinie aufzuheben und in einer einzigen Verordnung zusammenzufassen. Gleichzeitig sollten die Methoden und Verfahren entsprechend den neuesten wissenschaftlichen und technologischen Erkenntnissen angepasst werden. Methoden, die zu ihrem Zweck nicht mehr verwendet werden, sollten gestrichen werden. Es ist geplant, die Probenahmebestimmungen zu gegebener Zeit zu aktualisieren, um den jüngsten Entwicklungen bei der Erzeugung, Lagerung, Beförderung und Vermarktung von Futtermitteln Rechnung zu tragen. Dennoch ist es angezeigt, die bestehenden Probenahmebestimmungen vorläufig beizubehalten.

(3) Die Richtlinien 71/250/EWG, 71/393/EWG, 72/199/EWG, 73/46/EWG, 76/371/EWG, 76/372/EWG, 78/633/EWG, 81/715/EWG, 84/425/EWG, 86/174/EWG, 93/70/EWG, 93/117/EG, 98/64/EG, 1999/27/EG, 1999/76/EG, 2000/45/EG, 2002/70/EG und 2003/126/EG sollten daher aufgehoben werden.

(4) Die in dieser Verordnung vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des Ständigen Ausschusses für die Lebensmittelkette und Tiergesundheit —

HAT FOLGENDE VERORDNUNG ERLASSEN:

Artikel 1

Die Probenahmen für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln auf ihre Bestandteile, Zusatzstoffe und unerwünschte Stoffe, ausgenommen Rückstände von Schädlingsbekämpfungsmitteln und Mikroorganismen, erfolgen nach den in Anhang I aufgeführten Verfahren.

Artikel 2

Die Vorbereitung der Analyseproben und die Formulierung der Ergebnisse erfolgen nach den in Anhang II aufgeführten Methoden.

Artikel 3

Die Analyse für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln erfolgt nach den Methoden, die in Anhang III (Analysemethoden zur Untersuchung der Zusammensetzung von Futtermittel-Ausgangserzeugnissen und Mischfuttermitteln), Anhang IV (Analysemethoden zur Untersuchung von Futtermitteln auf ihren Gehalt an zugelassenen Zusatzstoffen), Anhang V (Analysemethoden zur Untersuchung von Futtermitteln auf unerwünschte Stoffe) und Anhang VI (Analysemethoden zur Bestimmung der Bestandteile tierischen Ursprungs bei der amtlichen Untersuchung von Futtermitteln) aufgeführt sind.

Artikel 4

Der Energiegehalt von Mischfuttermitteln für Geflügel wird in Übereinstimmung mit Anhang VII berechnet.

Artikel 5

Die in Anhang VIII aufgeführten Analysemethoden für die Untersuchung auf rechtswidriges Vorhandensein von nicht mehr zugelassenen Zusatzstoffen in Futtermitteln werden zu Bestätigungszwecken verwendet.

Artikel 6

Die Richtlinien 71/250/EWG, 71/393/EWG, 72/199/EWG, 73/46/EWG, 76/371/EWG, 76/372/EWG, 78/633/EWG, 81/715/EWG, 84/425/EWG, 86/174/EWG, 93/70/EWG, 93/117/EG, 98/64/EG, 1999/27/EG, 1999/76/EG, 2000/45/EG, 2002/70/EG und 2003/126/EG werden aufgehoben.

Verweise auf die aufgehobenen Richtlinien gelten als Verweise auf die vorliegende Verordnung nach den Entsprechungstabellen in Anhang IX.

Artikel 7

Diese Verordnung tritt am zwanzigsten Tag nach ihrer Veröffentlichung im Amtsblatt der Europäischen Union in Kraft.

Sie gilt ab dem 26. August 2009.

Diese Verordnung ist in allen ihren Teilen verbindlich und gilt unmittelbar in jedem Mitgliedstaat. Brüssel, den 27. Januar 2009 Für die Kommission Androulla VASSILIOU Mitglied der Kommission

(1) ABl. L 165 vom 30.4.2004, S. 1. Berichtigte Fassung im ABl. L 191 vom 28.5.2004, S. 1.

(2) ABl. L 155 vom 12.7.1971, S. 13.

(3) ABl. L 279 vom 20.12.1971, S. 7.

(4) ABl. L 123 vom 29.5.1972, S. 6.

(5) ABl. L 83 vom 30.3.1973, S. 21.

(6) ABl. L 102 vom 15.4.1976, S. 1.

(7) ABl. L 102 vom 15.4.1976, S. 8.

(8) ABl. L 206 vom 29.7.1978, S. 43.

(9) ABl. L 257 vom 10.9.1981, S. 38.

(10) ABl. L 238 vom 6.9.1984, S. 34.

(11) ABl. L 130 vom 16.5.1986, S. 53.

(12) ABl. L 234 vom 17.9.1993, S. 17.

(13) ABl. L 329 vom 30.12.1993, S. 54.

(14) ABl. L 257 vom 19.9.1998, S. 14.

(15) ABl. L 118 vom 6.5.1999, S. 36.

(16) ABl. L 207 vom 6.8.1999, S. 13.

(17) ABl. L 174 vom 13.7.2000, S. 32.

(18) ABl. L 209 vom 6.8.2002, S. 15.

(19) ABl. L 339 vom 24.12.2003, S. 78.

ANHANG I PROBENAHMEVERFAHREN 1. ZWECK UND ANWENDUNGSBEREICH Die zur amtlichen Untersuchung bestimmten Futtermittelproben werden gemäß den nachstehenden Verfahren entnommen. Die dabei erhaltenen Proben gelten als repräsentativ für die betreffende Partie. 2. PROBENAHMEPERSONAL Die Probenahme erfolgt durch die von den Mitgliedstaaten zu diesem Zweck bevollmächtigten Personen. 3. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN Partie: Futtermittelmenge, die eine Einheit bildet und von der angenommen wird, dass sie einheitliche Merkmale besitzt. Einzelprobe: Menge, die an einer Stelle der Partie entnommen wird. Sammelprobe: Gesamtmenge von aus einer Partie entnommenen Einzelproben. Reduzierte Sammelprobe: Repräsentative Teilmenge der Sammelprobe, die nach mengenmäßiger Verringerung erhalten wird. Endprobe: Teilmenge der reduzierten Sammelprobe oder der homogenisierten Sammelprobe. 4. GERÄTE 4.1. Die Geräte zur Probenahme müssen aus einem Material bestehen, das die zu beprobenden Erzeugnisse nicht beeinflusst. Diese Geräte können von den Mitgliedstaaten zugelassen werden. 4.2. Empfohlene Geräte für die Probenahme fester Futtermittel 4.2.1. Manuelle Probenahme 4.2.1.1. Schaufel mit ebenem Boden und rechteckig hochgebogenem Rand. 4.2.1.2. Probestecher mit langem Schlitz oder Kammerstecher. Die Größe des Probestechers ist den Merkmalen der Partie (Tiefe des Behälters, Größe des Sacks usw.) und der Größe der Futtermittelteilchen anzupassen. 4.2.2. Mechanische Probenahme Zugelassene mechanische Geräte dürfen zur Probenahme aus in Bewegung befindlichen Futtermitteln verwendet werden. 4.2.3. Probenteiler Zur Zerlegung der Probe in ungefähr gleiche Teile bestimmte Geräte dürfen zur Herstellung der Einzelproben sowie zur Vorbereitung von reduzierten Sammelproben und Endproben verwendet werden. 5. MENGENMÄSSIGE ANFORDERUNGEN 5.A. Bei der Untersuchung auf Stoffe oder Erzeugnisse, die gleichmäßig im Futtermittel verteilt sind 5.A.1. Partie Die Partie darf nur so groß sein, dass von allen Teilen, aus denen die Partie besteht, Proben entnommen werden können. 5.A.2. Einzelproben 5.A.2.1. Lose Futtermittel: Mindestanzahl der Einzelproben: 5.A.2.1.1. Partien bis zu 2,5 t 7 5.A.2.1.2. Partien von mehr als 2,5 t √ 20 Mal die Zahl der Tonnen, aus denen die Partie besteht (1), begrenzt auf höchstens 40 Einzelproben 5.A.2.2. Verpackte Futtermittel: Mindestanzahl der zu beprobenden Packungen (2): 5.A.2.2.1. Packungen von mehr als 1 kg Inhalt 5.A.2.2.1.1. Partien aus 1-4 Packungen Alle Packungen 5.A.2.2.1.2. Partien aus 5-16 Packungen 4 5.A.2.2.1.3. Partien aus mehr als 16 Packungen √ Anzahl der Packungen, aus denen die Partie besteht (1), begrenzt auf höchstens 20 Packungen 5.A.2.2.2. Packungen bis 1 kg Inhalt 4 5.A.2.3. Flüssige oder halbflüssige Futtermittel: Mindestanzahl der zu beprobenden Behälter (2): 5.A.2.3.1. Behälter von mehr als 1 l Inhalt 5.A.2.3.1.1. Partien aus 1-4 Behältern Alle Behälter 5.A.2.3.1.2. Partien aus 5-16 Behältern 4 5.A.2.3.1.3. Partien aus mehr als 16 Behältern √ Anzahl der Behälter, aus denen die Partie besteht (1), begrenzt auf höchstens 20 Behälter 5.A.2.3.2. Behälter bis zu 1 l Inhalt 4 5.A.2.4. Futterblöcke und Lecksteine Mindestanzahl der zu beprobenden Futterblöcke oder Lecksteine (2): 1 Futterblock oder Leckstein je Partie von 25 Einheiten, begrenzt auf höchstens 4 Futterblöcke oder Lecksteine 5.A.3. Sammelproben Je Partie ist eine einzige Sammelprobe erforderlich. Die Gesamtmenge der Einzelproben, aus denen sich die Sammelprobe zusammensetzt, darf nicht unter den nachstehend festgesetzten Mindestmengen liegen: 5.A.3.1. Lose Futtermittel: 4 kg 5.A.3.2. Verpackte Futtermittel: 5.A.3.2.1. Packungen von mehr als 1 kg 4 kg 5.A.3.2.2. Packungen bis zu 1 kg Gewicht des Inhalts von 4 Originalpackungen 5.A.3.3. Flüssige oder halbflüssige Futtermittel: 5.A.3.3.1. Behälter von mehr als 1 l Inhalt 4 l 5.A.3.3.2. Behälter bis zu 1 l Inhalt Volumen des Inhalts von 4 Originalbehältern 5.A.3.4. Futterblöcke oder Lecksteine: 5.A.3.4.1. mit einem Einzelgewicht von mehr als 1 kg 4 kg 5.A.3.4.2. mit einem Einzelgewicht bis zu 1 kg Gewicht von 4 Originalblöcken oder -steinen 5.A.4. Endprobe Die Sammelprobe dient, sofern erforderlich nach Reduzierung, der Herstellung der Endproben. Mindestens eine Endprobe ist zu untersuchen. Die Menge jeder zur Untersuchung bestimmten Endprobe darf nicht unter den nachstehend festgesetzten Mindestmengen liegen: Feste Futtermittel 500 g Flüssige oder halbflüssige Futtermittel 500 ml 5.B. Bei der Untersuchung auf unerwünschte Stoffe oder Erzeugnisse, die ungleichmäßig im Futtermittel verteilt sein können, wie z. B. Aflatoxine, Mutterkorn, Ricinus und Crotalaria in Einzelfuttermitteln (3) 5.B.1. Partie: siehe 5.A.1 5.B.2. Einzelproben 5.B.2.1. Lose Futtermittel: siehe 5.A.2.1 5.B.2.2. Verpackte Futtermittel: Mindestanzahl der zu beprobenden Packungen: 5.B.2.2.1. Partien aus 1-4 Packungen Alle Packungen 5.B.2.2.2. Partien aus 5-16 Packungen: 4 5.B.2.2.3. Partien aus mehr als 16 Packungen √ Anzahl der Packungen, aus der die Partie besteht (1), begrenzt auf höchstens 40 Packungen 5.B.3. Sammelproben Die Anzahl der Sammelproben hängt von der Größe der Partie ab. Die Mindestanzahl der Sammelproben je Partie ist nachstehend angegeben. Die Gesamtmenge der Einzelproben, aus denen sich die Sammelprobe zusammensetzt, darf nicht unter 4 kg liegen. 5.B.3.1. Lose Futtermittel: Gewicht der Partie (t) Mindestanzahl der Sammelproben je Partie: bis zu 1 t 1 mehr als 1 bis 10 t 2 mehr als 10 bis 40 t 3 mehr als 40 t 4 5.B.3.2. Verpackte Futtermittel: Anzahl der Packungen, die die Partie bilden: Mindestanzahl der Sammelproben je Partie: von 1 bis 16 1 17 bis 200 2 201 bis 800 3 mehr als 800 4 5.B.4. Endprobe Jede Sammelprobe ergibt nach Reduzierung die Endproben. Mindestens eine Endprobe je Sammelprobe ist zu untersuchen. Das Gewicht der zur Untersuchung bestimmten Endproben darf nicht unter 500 g liegen. 6. VORSCHRIFTEN FÜR DIE ENTNAHME, VORBEREITUNG UND VERPACKUNG DER PROBEN 6.1. Allgemeines Die Proben sind so schnell wie möglich zu entnehmen und vorzubereiten, wobei mit der angemessenen Sorgfalt vorzugehen ist, damit das Erzeugnis weder verändert noch verunreinigt wird. Die für die Probenahme bestimmten Geräte, Flächen und Behälter müssen sauber und trocken sein. 6.2. Einzelproben 6.2.A. Bei der Untersuchung auf Stoffe oder Erzeugnisse, die gleichmäßig im Futtermittel verteilt sind Die Einzelproben sind nach dem Zufallsprinzip aus der gesamten Partie zu entnehmen. Ihre Größe muss ungefähr gleich sein. 6.2.A.1. Lose Futtermittel Die Partie ist künstlich in ungefähr gleiche Teile aufzuteilen. Nach dem Zufallsprinzip ist entsprechend der Anzahl der unter 5.A.2 vorgesehenen Einzelproben eine Anzahl Teile zu wählen und jedem dieser Teile mindestens eine Probe zu entnehmen. Die Probenahme kann auch bei einer Partie erfolgen, die sich in Bewegung (Aufladen bzw. Abladen) befindet. 6.2.A.2. Verpackte Futtermittel Die erforderliche Anzahl der zu beprobenden Packungen ist nach 5.A.2 festgelegt; aus jeder dieser Packungen ist ein Teil des Inhalts mit einem Probestecher oder einer Schaufel zu entnehmen. Gegebenenfalls sind die Proben zu entnehmen, nachdem die Packungen getrennt entleert worden sind. Wenn erforderlich, sind bei jeder einzelnen Sammelprobe Klumpen zu zerdrücken; dazu werden diese gegebenenfalls von dem übrigen Material abgetrennt und anschließend wieder untergemischt. 6.2.A.3. Flüssige oder halbflüssige homogene oder homogenisierbare Futtermittel Die erforderliche Anzahl der zu beprobenden Behälter ist nach 5.A.2 festgelegt; aus jedem dieser Behälter ist eine Probe zu entnehmen, nachdem sein Inhalt, falls nötig, homogenisiert worden ist. Die Einzelproben können auch beim Ablassen des Erzeugnisses entnommen werden. 6.2.A.4. Flüssige oder halbflüssige nicht homogenisierbare Futtermittel Die erforderliche Anzahl der zu beprobenden Behälter ist nach 5.A.2 festgelegt; die Proben sind verschiedenen Höhen zu entnehmen. Die Proben können ebenfalls während des Ablassens eines Erzeugnisses nach Beseitigung der ersten Bestandteile entnommen werden. In beiden Fällen muss das Gesamtvolumen der entnommenen Proben mindestens 10 l betragen. 6.2.A.5. Futterblöcke und Lecksteine Die erforderliche Anzahl der zu beprobenden Futterblöcke oder Lecksteine ist nach 5.A.2 festgelegt; jedem Block oder Stein ist ein Teil zu entnehmen. 6.2.B. Bei der Untersuchung auf unerwünschte Stoffe oder Erzeugnisse, die ungleichmäßig im Futtermittel verteilt sein können, wie z. B. Aflatoxine, Mutterkorn, Ricinus und Crotalaria in Futtermittel-Ausgangserzeugnissen Die Partie ist entsprechend der Anzahl der unter 5.B.3 vorgesehenen Sammelproben künstlich in eine Anzahl ungefähr gleicher Teile aufzuteilen. Falls diese Anzahl größer als 1 ist, ist die Gesamtanzahl der unter 5.B.2 vorgesehenen Einzelproben ungefähr gleich auf die verschiedenen Teile zu verteilen. Anschließend sind Proben ungefähr gleicher Größe (4) dergestalt zu ziehen, dass das Gesamtgewicht der Proben jedes Teiles nicht unter 4 kg liegt, wie dies für jede Sammelprobe erforderlich ist. Die aus verschiedenen Teilen stammenden Einzelproben dürfen nicht miteinander vereinigt werden. 6.3. Vorbereitung der Sammelproben 6.3.A. Bei der Untersuchung auf Stoffe oder Erzeugnisse, die gleichmäßig im Futtermittel verteilt sind Die Einzelproben sind zu einer einzigen Sammelprobe zusammenzufassen. 6.3.B. Bei der Untersuchung auf unerwünschte Stoffe oder Erzeugnisse, die ungleichmäßig im Futtermittel verteilt sein können, wie z. B. Aflatoxine, Mutterkorn, Ricinus und Crotalaria in Futtermittel-Ausgangserzeugnissen Die Einzelproben aus jedem Teil der Partie sind zu mischen, und daraus ist die in 5.B.3 vorgesehene Anzahl Sammelproben herzustellen. Dabei ist darauf zu achten, dass die Herkunft jeder Sammelprobe angegeben wird. 6.4. Vorbereitung der Endproben Jede Sammelprobe ist sorgfältig zu mischen, bis sie homogen ist (5). Wenn nötig, wird die Sammelprobe zuerst auf bis zu mindestens 2 kg bzw. 2 l entweder mittels eines mechanischen oder automatischen Probenteilers oder durch das Vierteilungsverfahren reduziert (reduzierte Sammelprobe). Dann werden mindestens 3 ungefähr gleich große Endproben entsprechend den mengenmäßigen Anforderungen unter 5.A.4 oder 5.B.4 hergestellt. Jede Probe ist in einen geeigneten Behälter zu füllen. Es sind alle notwendigen Vorkehrungen zu treffen, damit jede Veränderung der Zusammensetzung bzw. jede Verunreinigung oder Verfälschung der Probe während des Transports oder der Lagerung vermieden wird. 6.5. Verschließung und Kennzeichnung der Endproben Die Behälter oder Packungen sind so zu versiegeln/zu plombieren und zu kennzeichnen, dass sie nicht ohne Beschädigung des Siegels/der Plombe geöffnet werden können, wobei die gesamte Kennzeichnung von dem Siegel/der Plombe mit erfasst werden muss. 7. PROBENAHMEPROTOKOLL Für jede Probenahme ist ein Probenahmeprotokoll zu erstellen, aus dem die Identität der beprobten Partie eindeutig hervorgeht. 8. VERWENDUNG DER PROBEN Für jede Sammelprobe wird so schnell wie möglich mindestens eine Endprobe — zusammen mit den Angaben, die für die Untersuchung erforderlich sind — an das zugelassene Laboratorium gesandt. (1) Wenn die Zahl einen Bruch ergibt, ist dieser auf die nächsthöhere ganze Zahl aufzurunden. (2) Für Packungen oder Behälter bis zu 1 kg oder 1 l Inhalt sowie für Futterblöcke oder Lecksteine bis zu 1 kg bildet der Inhalt einer Originalverpackung oder eines Originalbehälters, ein Futterblock oder ein Leckstein eine Einzelprobe. (3) Die unter 5.A vorgesehenen Methoden sind bestimmt für die Untersuchung auf Aflatoxine, Mutterkorn, Ricinus und Crotalaria in Allein- und Ergänzungsfuttermitteln. (4) Bei den verpackten Futtermitteln ist ein Teil des zu beprobenden Inhalts mittels eines Probestechers oder einer Schaufel zu entnehmen, nachdem die Packungen gegebenenfalls getrennt geleert wurden. (5) Wenn erforderlich, sind bei jeder einzelnen Sammelprobe Klumpen zu zerdrücken; dazu werden diese gegebenenfalls von dem übrigen Material abgetrennt und anschließend wieder untergemischt.

ANHANG II ALLGEMEINE BESTIMMUNGEN HINSICHTLICH DER METHODEN ZUR ANALYSE VON FUTTERMITTELN A. VORBEREITUNG DER PROBEN ZUR ANALYSE 1. Zweck Die nachfolgend beschriebenen Verfahren beziehen sich auf die Vorbereitung der zur Analyse bestimmten Endproben, die nach der Probenahme gemäß den Bestimmungen von Anhang I an die Kontrolllaboratorien gesandt wurden. Die Vorbereitung dieser Proben ist so vorzunehmen, dass die in den Analysemethoden vorgesehenen Einwaagen homogen und repräsentativ für die Endproben sind. 2. Vorsichtsmaßnahmen Die Wahl des Verfahrens für die Probenvorbereitung hängt von der Art der angewandten Analysemethode ab. Daher ist es von größter Bedeutung, sicherzustellen, dass das angewandte Probenvorbereitungsverfahren für die jeweilige Analysemethode geeignet ist. Alle notwendigen Schritte sind so durchzuführen, dass eine Verunreinigung der Probe und eine Veränderung ihrer Zusammensetzung so weit wie möglich vermieden werden. Das Zerkleinern, Mischen und Sieben ist möglichst rasch durchzuführen, wobei die Probe möglichst wenig Luft und Licht ausgesetzt wird. Die Verwendung von Mühlen oder Zerkleinerungsgeräten, die zu einer merklichen Erwärmung der Probe führen könnten, ist zu vermeiden. Für besonders hitzeempfindliche Futtermittel wird manuelles Zerkleinern empfohlen. Es ist außerdem darauf zu achten, dass die verwendeten Geräte keine Kontaminationsquelle für Spurenelemente bilden. Kann die Probe nicht ohne eine signifikante Veränderung ihres Feuchtigkeitsgehalts vorbereitet werden, so ist dieser vor und nach der Vorbereitung gemäß dem in Anhang III Teil A festgelegten Verfahren zu bestimmen. 3. Verfahren Die Probe ist für Analyse- bzw. Referenzzwecke mittels angemessener Teilungsmethoden wie alternierendes Schaufeln, Riffel- oder Rotationsteilung in geeignete Teilproben zu teilen. Das Kegeln und das Vierteilungsverfahren werden nicht empfohlen, da mit diesen eine hohe Teilungsfehlerquote bei den Teilproben einhergehen kann. Die Referenzproben sind in einem geeigneten sauberen und trockenen, luftdicht verschließbaren Behälter aufzubewahren. Die für die Analyse bestimmten Teilproben von mindestens 100 g sind wie nachfolgend angegeben vorzubereiten. 3.1. Futtermittel, die direkt gemahlen werden können Sofern keine besonderen Angaben in der Analysemethode gemacht werden, wird die gesamte Probe nach dem Zerkleinern erforderlichenfalls durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 1 mm Seitenlänge (entsprechend der Empfehlung ISO R 565) passiert. Zu starkes Zerkleinern ist zu vermeiden. Die gesiebte Probe wird gemischt und in einen geeigneten sauberen, trockenen, luftdicht verschließbaren Behälter abgefüllt. Unmittelbar vor der Einwaage muss die Probe erneut gemischt werden. 3.2. Futtermittel, die nach Trocknung gemahlen werden können Sofern keine besonderen Angaben in der Analysemethode gemacht werden, wird die Probe bis auf einen Feuchtigkeitsgehalt von 8 bis 12 % unter Anwendung des unter Nummer 4.3 der Methode zur Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts (siehe Anhang III Teil A) vorgesehenen Vortrocknungsverfahrens getrocknet. Die weitere Vorbereitung erfolgt gemäß Nummer 3.1. 3.3. Flüssige oder halbflüssige Futtermittel Die Probe wird in einen geeigneten sauberen, trockenen, luftdicht verschließbaren Behälter abgefüllt und unmittelbar vor der Einwaage gründlich gemischt. 3.4. Andere Futtermittel Proben, die nach keinem der oben genannten Verfahren vorbereitet werden können, sind durch ein anderes Verfahren zu behandeln, das eine homogene und repräsentative Einwaage der Endprobe gestattet. 4. Aufbewahrung der Proben Die Proben müssen bei einer Temperatur gelagert werden, die ihre Zusammensetzung nicht beeinflusst. Für Proben, die zur Analyse von Vitaminen oder besonders lichtempfindlichen Stoffen bestimmt sind, werden braune Glasgefäße verwendet. B. BESTIMMUNGEN ÜBER IN ANALYSEVERFAHREN VERWENDETE REAGENZIEN UND GERÄTE 1. Vorbehaltlich besonderer Angaben in den Analysemethoden müssen alle zur Analyse verwendeten Reagenzien von analysenreiner (p. a.) Qualität sein. Bei der Analyse von Spurenelementen muss die Reinheit der Reagenzien in einem Reagenzienblindversuch überprüft werden. Je nach dem erhaltenen Wert kann eine weitere Reinigung der Reagenzien erforderlich sein. 2. Bei jedem in den Analysemethoden erwähnten Lösungs-, Verdünnungs-, Spül- oder Auswaschvorgang, bei dem keine Angabe über die Art des zu verwendenden Lösungs- oder Verdünnungsmittels gemacht wird, ist Wasser zu verwenden. Im Allgemeinen wird destilliertes oder demineralisiertes Wasser verwendet. In besonderen in den Analysemethoden angegebenen Fällen muss das Wasser speziellen Reinigungsverfahren unterzogen werden. 3. Da die übliche Ausstattung von Kontrolllaboratorien vorausgesetzt wird, werden nur besondere Instrumente und Geräte oder solche, die speziellen Anforderungen entsprechen müssen, in den Analysemethoden aufgeführt. Sie müssen gut gereinigt sein, vor allem bei der Bestimmung von sehr geringen Stoffmengen. C. ANWENDUNG VON ANALYSEMETHODEN UND FORMULIERUNG DER ERGEBNISSE 1. Extraktionsverfahren Einige Methoden geben ein spezifisches Extraktionsverfahren vor. Generell können andere Extraktionsverfahren als das in der Methode genannte angewandt werden unter der Bedingung, dass das verwendete Extraktionsverfahren für die analysierte Matrix eine vergleichbare Extraktionseffizienz aufweist wie das in der Methode genannte Verfahren. 2. Clean-up-Verfahren Einige Methoden geben ein spezifisches Clean-up-Verfahren vor. Generell können andere Clean-up-Verfahren als das in der Methode genannte angewandt werden unter der Bedingung, dass das verwendete Clean-up-Verfahren für die analysierte Matrix zu vergleichbaren Analyseergebnissen führt wie das in der Methode genannte Verfahren. 3. Berichterstattung über die angewandte Analysemethode Im Allgemeinen wird zur Bestimmung eines Stoffes in Futtermitteln eine einzige Analysemethode festgelegt. Werden mehrere Methoden genannt, muss die vom Kontrolllaboratorium angewandte Methode im Analysebericht angegeben werden. 4. Anzahl der Bestimmungen Das im Analysebericht angegebene Ergebnis soll den Mittelwert aus mindestens 2 Bestimmungen von separaten Einwaagen der Probe mit ausreichender Wiederholbarkeit darstellen. Allerdings sind bei der Analyse auf unerwünschte Stoffe — sofern das Ergebnis der ersten Bestimmung deutlich (> 50 %) unter dem zu kontrollierenden Sollwert liegt — keine weiteren Bestimmungen erforderlich unter der Bedingung, dass die geeigneten Qualitätsverfahren angewandt werden. Bei der Kontrolle des angegebenen Gehalts an einem Stoff oder einer Zutat sind — sofern das Ergebnis der ersten Bestimmung den angegebenen Gehalt bestätigt, d. h., wenn das Analyseergebnis innerhalb des akzeptablen Toleranzbereichs für den angegebenen Gehalt liegt — keine weiteren Bestimmungen erforderlich unter der Bedingung, dass die geeigneten Qualitätsverfahren angewandt werden. In einigen Fällen ist dieser Toleranzbereich in Rechtsvorschriften wie beispielsweise in der Richtlinie 79/373/EWG des Rates (1) definiert. 5. Bericht über die Analyseergebnisse Das Ergebnis ist gemäß den Angaben in den Analysemethoden mit einer angemessenen Zahl an signifikanten Ziffern anzugeben und, falls nötig, auf den Feuchtigkeitsgehalt der Endprobe vor deren Vorbereitung umzurechnen. 6. Messunsicherheit und Wiederfindungsrate bei der Analyse auf unerwünschte Stoffe Hinsichtlich unerwünschter Stoffe im Sinne der Richtlinie 2002/32/EG, einschließlich Dioxinen und dioxinähnlichen PCB, erfüllt ein zur Verfütterung bestimmtes Erzeugnis die Bestimmung bezüglich des festgelegten Höchstgehalts nicht, wenn das Analyseergebnis unter Berücksichtigung der erweiterten Messunsicherheit und der Berichtigung um die Wiederfindungsrate den Höchstgehalt überschreitet. Zur Beurteilung, ob die Höchstgehalte eingehalten werden, wird die um die Wiederfindungsrate berichtigte gemessene Konzentration sowie die vom Analyseergebnis subtrahierte erweiterte Messunsicherheit herangezogen. Dieses Verfahren wird nur dann angewandt, wenn die Analysemethode die Schätzung der Messunsicherheit und die Berichtigung um die Wiederfindungsrate ermöglicht (z. B. nicht möglich bei mikroskopischer Analyse). Das Analyseergebnis ist wie folgt anzugeben (soweit die verwendete Analysemethode die Schätzung der Messunsicherheit und der Wiederfindungsrate ermöglicht): a) Berichtigung um die Wiederfindungsrate, wobei diese anzugeben ist. Eine Berichtigung um die Wiederfindungsrate ist nicht erforderlich, wenn Letztere zwischen 90 und 110 % beträgt; b) als „x +/– U“, wobei x das Analyseergebnis und U die erweiterte Messunsicherheit bezeichnen und ein Faktor von 2 verwendet wird, der zu einem Konfidenzniveau von ca. 95 % führt. Liegt jedoch das Analyseergebnis deutlich (> 50 %) unter dem zu kontrollierenden Sollwert — und unter der Bedingung, dass die geeigneten Qualitätsverfahren angewandt werden und die Analyse lediglich dem Zweck der Überprüfung der Einhaltung der Rechtsvorschriften dient —, können die Analyseergebnisse ohne Berichtigung um die Wiederfindungsrate angegeben werden, und die Angabe der Wiederfindungsrate und der Messunsicherheit kann in diesen Fällen entfallen. (1) ABl. L 86 vom 6.4.1979, S. 30.

ANHANG III ANALYSEMETHODEN ZUR UNTERSUCHUNG DER ZUSAMMENSETZUNG VON FUTTERMITTEL-AUSGANGSERZEUGNISSEN UND MISCHFUTTERMITTELN A. BESTIMMUNG DES FEUCHTIGKEITSGEHALTS 1. Zweck und Anwendungsbereich Diese Methode erlaubt die Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts von Futtermitteln. Bei Futtermitteln, die flüchtige Stoffe wie z. B. organische Säuren enthalten, ist zu beachten, dass zusammen mit dem Feuchtigkeitsgehalt auch bedeutende Mengen an flüchtigen Stoffen bestimmt werden. Sie betrifft nicht die Untersuchung von Milcherzeugnissen als Futtermittel-Ausgangserzeugnisse, die Untersuchung von Mineralstoffen und Mischungen, die überwiegend aus Mineralstoffen bestehen, die Untersuchung von tierischen und pflanzlichen Fetten und Ölen oder die Untersuchung von Ölsaaten und Ölfrüchten. 2. Prinzip Die Probe wird unter definierten Bedingungen getrocknet, die von der Art des Futtermittels abhängen. Der Gewichtsverlust wird durch Wiegen bestimmt. Bei festen Futtermitteln mit einem hohen Feuchtigkeitsgehalt ist eine zusätzliche Vortrocknung erforderlich. 3. Geräte 3.1. Zerkleinerungsgerät aus einem Material, das keine Feuchtigkeit absorbiert, leicht zu reinigen ist, eine schnelle und gleichmäßige Zerkleinerung ermöglicht, ohne eine merkliche Erwärmung hervorzurufen, das so weit wie möglich den Kontakt mit der Außenluft verhindert und den unter 4.1.1 und 4.1.2 gestellten Anforderungen entspricht (z. B. Mikroschlagkreuzmühlen, Mikrozerkleinerer mit Wasserkühlung, zerlegbare Kegelmühlen, langsam laufende Kegelmühlen oder Zahnscheibenmühlen). 3.2. Analysenwaage, Genauigkeit 1 mg. 3.3. Trockene Gefäße aus korrosionsbeständigem Metall oder Glas, mit luftdicht schließenden Deckeln; die Nutzfläche muss eine Verteilung der Probe von ca. 0,3 g/cm2 ermöglichen. 3.4. Elektrisch beheizter, temperaturgeregelter Trockenschrank (± 2 oC), der eine schnelle Regelung der Temperatur gewährleistet und eine gute Lüftung besitzt (1). 3.5. Elektrisch beheizter regulierbarer Vakuumtrockenschrank mit einer Ölpumpe, der entweder mit einer Vorrichtung für die Zufuhr warmer und getrockneter Luft oder mit einem Trocknungsmittel (z. B. Calciumoxid) ausgestattet ist. 3.6. Exsikkator mit dicker, perforierter Platte aus Metall oder Porzellan, der ein wirksames Trocknungsmittel enthält. 4. Verfahren Anmerkung : Die Verfahren, die in diesem Abschnitt beschrieben werden, müssen unverzüglich nach dem Öffnen der Packungen, die die Proben enthalten, durchgeführt werden. Die Analysen sind mindestens doppelt auszuführen. 4.1. Vorbereitung 4.1.1. Futtermittel, außer den unter 4.1.2 und 4.1.3 genannten Mindestens 50 g der Probe werden entnommen und erforderlichenfalls unter Vermeidung von Feuchtigkeitsänderungen entsprechend zerkleinert oder geteilt (siehe 6). 4.1.2. Getreide und Grütze Mindestens 50 g der Probe werden entnommen. Diese Menge wird so gemahlen, dass zumindest 50 % der Teilchen durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,5 mm passiert werden können und dass beim Passieren durch ein Rundlochsieb mit einem Lochdurchmesser von 1 mm ein Rückstand von höchstens 10 % verbleibt. 4.1.3. Flüssige oder breiige Futtermittel; Futtermittel, die überwiegend aus Ölen und Fetten bestehen Etwa 25 g der Probe, auf 10 mg genau gewogen, werden entnommen, mit einer entsprechenden, auf 10 mg genau gewogenen Menge wasserfreiem Sand vermischt, bis ein homogenes Produkt entsteht. 4.2. Trocknung 4.2.1. Futtermittel, außer den unter 4.2.2 und 4.2.3 genannten Ein Gefäß (3.3) wird mit seinem Deckel auf 1 mg genau gewogen. Etwa 5 g der Probe werden auf 1 mg genau in das tarierte Gefäß eingewogen und gleichmäßig verteilt. Das Gefäß wird ohne Deckel in den auf 103 oC vorgeheizten Trockenschrank gestellt. Damit die Temperatur des Trockenschranks nicht zu stark abfällt, ist das Gefäß möglichst rasch hineinzustellen. Es wird 4 h lang getrocknet, wobei die Trocknungszeit von dem Zeitpunkt an gerechnet wird, an dem die Temperatur im Trockenschrank erneut 103 oC erreicht hat. Nach Öffnen des Trockenschranks wird das Gefäß sofort mit dem Deckel verschlossen, aus dem Schrank genommen, 30 bis 45 min lang zum Abkühlen in den Exsikkator (3.6) gestellt und anschließend auf 1 mg genau gewogen. Bei Futtermitteln, die überwiegend aus Ölen und Fetten bestehen, wird eine zusätzliche Trocknung von 30 min im Trockenschrank bei 130 oC vorgenommen. Der Unterschied zwischen den beiden Wägeergebnissen darf höchstens 0,1 % Feuchtigkeit betragen. 4.2.2. Getreide, Mehl, Grütze und Grieß Ein Gefäß (3.3) wird mit seinem Deckel auf 0,5 mg genau gewogen. Etwa 5 g der zerkleinerten Probe werden auf 1 mg genau in das tarierte Gefäß eingewogen und gleichmäßig verteilt. Das Gefäß wird ohne Deckel in den auf 130 oC vorgeheizten Trockenschrank gestellt. Damit die Temperatur des Trockenschranks nicht zu stark abfällt, ist das Gefäß möglichst rasch hineinzustellen. Es wird 2 h lang getrocknet, wobei die Trocknungszeit von dem Zeitpunkt an gerechnet wird, an dem die Temperatur im Trockenschrank erneut 130 oC erreicht hat. Nach Öffnen des Trockenschranks wird das Gefäß sofort mit dem Deckel verschlossen, aus dem Schrank genommen, 30 bis 45 min lang zum Abkühlen in den Exsikkator (3.6) gestellt und anschließend auf 1 mg genau gewogen. 4.2.3. Mischfuttermittel mit einem Saccharose- oder Lactosegehalt von mehr als 4 %: Futtermittel-Ausgangserzeugnisse wie z. B. Johannisbrotschrot, hydrolysierte Getreideerzeugnisse, Malzkeime, Zuckerrübenschnitzel, Fisch- und Zuckerpresssäfte; Mischfuttermittel mit einem Gehalt an kristallwasserhaltigen Mineralstoffen von mehr als 25 %. Ein Gefäß (3.3) wird mit seinem Deckel auf 0,5 mg genau gewogen. Etwa 5 g der Probe werden auf 1 mg genau in das tarierte Gefäß eingewogen und gleichmäßig verteilt. Das Gefäß wird ohne Deckel in den auf 80 bis 85 oC vorgeheizten Vakuumtrockenschrank (3.5) gestellt. Damit die Temperatur des Vakuumtrockenschranks nicht zu stark abfällt, ist das Gefäß möglichst rasch hineinzustellen. Der Druck wird auf 100 Torr eingestellt. Die Probe wird 4 h lang bei diesem Druck entweder unter Zufuhr von heißer trockener Luft oder mittels eines Trocknungsmittels (etwa 300 g für 20 Proben) getrocknet. Im letzteren Fall wird beim Erreichen des vorgeschriebenen Drucks die Verbindung zur Vakuumpumpe unterbrochen. Die Trocknungszeit wird von dem Zeitpunkt an gerechnet, an dem die Temperatur im Trockenschrank erneut 80 bis 85 oC erreicht hat. Nach Ablauf der Trocknungszeit wird der Vakuumtrockenschrank vorsichtig wieder auf atmosphärischen Druck gebracht. Nach Öffnen des Vakuumtrockenschranks wird das Gefäß sofort mit dem Deckel verschlossen, aus dem Schrank genommen, zum Abkühlen 30 bis 45 min lang in den Exsikkator (3.6) gestellt und anschließend auf 1 mg genau gewogen. Es wird im Vakuumtrockenschrank weitere 30 min bei 80 bis 85 oC getrocknet und erneut gewogen. Der Unterschied zwischen den beiden Wägeergebnissen darf höchstens 0,1 % Feuchtigkeit betragen. 4.3. Vortrocknung 4.3.1. Futtermittel, außer den unter 4.3.2 genannten Bei festen Futtermitteln mit einem hohen Feuchtigkeitsgehalt, deren Zerkleinerung schwierig ist, ist eine Vortrocknung wie folgt vorzunehmen: Von der nicht zerkleinerten Probe (sofern erforderlich können gepresste oder klumpenhaltige Futtermittel grob zerkleinert werden) werden 50 g auf 10 mg genau in ein geeignetes Gefäß (z. B. eine Aluminiumschale von 20 × 12 cm mit einem Rand von 0,5 cm) eingewogen und in einem Trockenschrank bei einer Temperatur von 60 bis 70 oC getrocknet, bis der Feuchtigkeitsgehalt einen Wert zwischen 8 und 12 % erreicht hat. Anschließend wird das Gefäß aus dem Trockenschrank genommen, im Labor 1 h lang offen abkühlen gelassen und dann auf 10 mg genau gewogen. Im Folgenden wird die Probe unverzüglich, wie unter 4.1.1 angegeben, zerkleinert und je nach Art des Futtermittels entsprechend den Angaben unter 4.2.1 oder 4.2.3 getrocknet. 4.3.2. Getreide Körner, deren Feuchtigkeitsgehalt höher als 17 % ist, müssen wie folgt vorgetrocknet werden: Von den nicht gemahlenen Körnern werden 50 g auf 10 mg genau in ein geeignetes Gefäß (z. B. in eine Aluminiumschale von 20 × 12 cm mit einem Rand von 0,5 cm) eingewogen und in einem Trockenschrank bei einer Temperatur von 130 oC 5 bis 7 min getrocknet. Anschließend wird das Gefäß aus dem Trockenschrank genommen, im Labor 2 h lang offen abkühlen gelassen und dann auf 10 mg genau gewogen. Im Folgenden wird die Probe unverzüglich, wie unter 4.1.2 angegeben, gemahlen und entsprechend den Angaben unter 4.2.2 getrocknet. 5. Berechnung der Ergebnisse Der Feuchtigkeitsgehalt (X) der Probe als Prozentsatz wird nach folgenden Formeln berechnet: 5.1. Trocknung ohne Vortrocknung wobei: m = Anfangsgewicht der Probe in g, m0 = Gewicht der trockenen Probe in g. 5.2. Trocknung mit Vortrocknung wobei: m = Anfangsgewicht der Probe in g, m1 = Gewicht der Probe nach der Vortrocknung in g, m2 = Gewicht der Probe nach der Zerkleinerung oder dem Zermahlen in g, m0 = Gewicht der trockenen Probe in g. 5.3. Wiederholbarkeit Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 0,2 % Feuchtigkeit (absolut) nicht überschreiten. 6. Bemerkung Wenn eine Zerkleinerung sich als notwendig erweist und dabei mit einer Änderung des Feuchtigkeitsgehalts des Materials gerechnet werden muss, so sind die Analyseergebnisse, die die Bestandteile des Futtermittels betreffen, auf den Feuchtigkeitsgehalt der Originalprobe umzurechnen. B. BESTIMMUNG DES FEUCHTIGKEITSGEHALTS IN TIERISCHEN UND PFLANZLICHEN FETTEN UND ÖLEN 1. Zweck und Anwendungsbereich Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an Wasser und flüchtigen Stoffen in tierischen und pflanzlichen Fetten und Ölen. 2. Prinzip Die Probe wird bei 103 oC getrocknet, bis kein Gewichtsverlust mehr eintritt (der Gewichtsverlust zwischen 2 aufeinanderfolgenden Wägungen darf 1 mg nicht überschreiten). Der Gewichtsverlust wird durch Wiegen bestimmt. 3. Geräte 3.1. Schale mit flachem Boden, aus korrosionsbeständigem Material, Durchmesser: 8 bis 9 cm, Höhe ca. 3 cm. 3.2. Thermometer mit verstärkter Kugel und Ausdehnungsraum am oberen Ende, von ca. 80 bis mindestens 110 oC graduiert, Länge ca. 10 cm. 3.3. Sandbad oder elektrische Heizplatte. 3.4. Exsikkator, der ein wirksames Trocknungsmittel enthält. 3.5. Analysenwaage. 4. Verfahren Etwa 20 g der homogenisierten Probe werden auf 1 mg genau in die trockene, gewogene Schale (3.1.) eingewogen, die das Thermometer (3.2) enthält, und auf dem Sandbad oder der elektrischen Heizplatte (3.3) unter ständigem Rühren mit dem Thermometer so erhitzt, dass in ca. 7 min eine Temperatur von 90 oC erreicht wird. Entsprechend der Häufigkeit, mit der Gasblasen vom Boden der Schale aufsteigen, wird die Heizintensität verringert. Die Temperatur darf 105 oC nicht überschreiten. Unter ständigem Abkratzen des Bodens der Schale wird weiter umgerührt, bis sich keine Blasen mehr bilden. Um sicherzustellen, dass keine Feuchtigkeit mehr vorhanden ist, wird mehrmals auf 103 oC ± 2 oC erhitzt und zwischen aufeinanderfolgenden Erhitzungen jeweils auf 93 oC gekühlt. Anschließend wird bis zur Raumtemperatur im Exsikkator (3.4) abkühlen gelassen und gewogen. Dieses Verfahren ist so oft zu wiederholen, bis der Gewichtsverlust zwischen 2 aufeinanderfolgenden Wägungen 2 mg nicht mehr überschreitet. Anmerkung : Eine Gewichtserhöhung der Probe nach wiederholter Erwärmung zeigt eine Oxidation des Fettes an. In diesem Fall wird der Berechnung das Ergebnis der Wägung zugrunde gelegt, die unmittelbar vor dem Auftreten der Gewichtszunahme ausgeführt wurde. 5. Berechnung der Ergebnisse Der Feuchtigkeitsgehalt (X) der Probe als Prozentsatz wird nach folgender Formel berechnet: wobei: m = Probeneinwaage in g, m1 = Gewicht der Schale mit Inhalt in g vor dem Erhitzen, m2 = Gewicht der Schale mit Inhalt in g nach dem Erhitzen. Ergebnisse unter 0,05 % sollten mit der Bezeichnung „weniger als 0,05 %“ angegeben werden. Wiederholbarkeit Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 0,05 % Feuchtigkeit (absolut) nicht überschreiten. C. BESTIMMUNG DES ROHPROTEINGEHALTS 1. Zweck und Anwendungsbereich Die Methode erlaubt die Berechnung des Rohproteingehalts von Futtermitteln anhand des nach Kjeldahl bestimmten Stickstoffgehalts. 2. Prinzip Die Probe wird durch Schwefelsäure in Anwesenheit eines Katalysators aufgeschlossen. Der saure Aufschluss wird durch eine Natriumhydroxidlösung alkalisiert. Das Ammoniak wird durch Destillation abgetrennt und in einer definierten Menge Schwefelsäure aufgefangen, deren Überschuss durch eine Standard-Natriumhydroxidlösung titriert wird. Alternativ wird das freigesetzte Ammoniak in überschüssiger Borsäurelösung destilliert, gefolgt von einer Titration mit Salz- oder Schwefelsäurelösung. 3. Reagenzien 3.1. Kaliumsulfat. 3.2. Katalysator: Kupfer(II)-oxid, CuO, oder Kupfer(II)-sulfatpentahydrat, CuSO4 5H2O. 3.3. Zinkgranulat. 3.4. Schwefelsäure, ρ20 = 1,84 g/ml. 3.5. Schwefelsäure, volumetrische Standardlösung, c(H2SO4) = 0,25 mol/l. 3.6. Schwefelsäure, volumetrische Standardlösung, c(H2SO4) = 0,10 mol/l. 3.7. Schwefelsäure, volumetrische Standardlösung, c(H2SO4) = 0,05 mol/l. 3.8. Methylrot-Indikator; 300 mg Methylrot werden in 100 ml Ethanol (σ = 95 bis 96 %) gelöst. 3.9. Natriumhydroxidlösung (Verwendung technischer Qualität möglich), β = 40 g/100 ml (40 %). 3.10. Natriumhydroxid, volumetrische Standardlösung, c(NaOH) = 0,25 mol/l. 3.11. Natriumhydroxid, volumetrische Standardlösung, c(NaOH) = 0,10 mol/l. 3.12. Bimssteinkörner, mit Salzsäure gewaschen und geglüht. 3.13. Acetanilid (Schmelzpunkt = 114 oC, N-Gehalt = 10,36 %). 3.14. Saccharose (stickstofffrei). 3.15. Borsäure (H3BO3). 3.16. Methylrot-Indikatorlösung: 100 mg Methylrot werden in 100 ml Ethanol oder Methanol gelöst. 3.17. Bromkresolgrünlösung: 100 mg Bromkresolgrün werden in 100 ml Ethanol oder Methanol gelöst. 3.18. Borsäurelösung (10 bis 40 g/l in Abhängigkeit vom eingesetzten Gerät) Bei einer kolorimetrischen Endpunktbestimmung sind der Borsäurelösung Methylrot- und Bromkresolindikatoren zuzufügen. Wird 1 l Borsäurelösung zubereitet, sind vor dem Auffüllen zur Marke 7 ml Methylrot-Indikatorlösung (3.16) und 10 ml Bromkresolgrünlösung (3.17) zuzufügen. In Abhängigkeit von dem verwendeten Wasser kann sich der pH-Wert von einer Borsäurelösung zur anderen unterscheiden. Häufig ist eine Einstellung des pH-Werts mithilfe einer geringen Menge Alkali erforderlich, um eine positive Blindprobe zu erhalten. Anmerkung : Eine Zugabe von rund 3 ml NaOH (3.11) zu 1 l Borsäure von 10 g/l führt in der Regel zu guten Einstellungen. Die Lösung ist bei Raumtemperatur aufzubewahren und während der Aufbewahrung vor Lichteinfall und Ammoniakdämpfen zu schützen. 3.19. Salzsäure, volumetrische Standardlösung, c(HCl) = 0,10 mol/l. Anmerkung : Andere Konzentrationen volumetrischer Lösungen (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 und 3.19) können verwendet werden, sofern die Berechnungen entsprechend berichtigt werden. Die Konzentrationen sind stets auf 4 Dezimalstellen genau anzugeben. 4. Geräte Für Aufschluss, Destillation und Titration nach dem Kjeldahl-Verfahren geeignete Geräte. 5. Verfahren 5.1. Aufschluss Von der Probe wird 1 g auf 0,001 g genau gewogen und in den Kolben des Aufschlussgeräts gegeben. Anschließend werden 15 g Kaliumsulfat (3.1), eine geeignete Katalysatormenge (3.2) (0,3 bis 0,4 g Kupfer(II)-oxid oder 0,9 bis 1,2 g Kupfer(II)-sulfatpentahydrat), 25 ml Schwefelsäure (3.4) und ggf. einige Bimssteinkörnchen (3.12) zugesetzt und vermischt. Der Kolben wird, wenn notwendig, unter regelmäßigem Schwenken zunächst mäßig erhitzt, bis die Substanz verkohlt ist und das Schäumen aufgehört hat. Dann wird die Flüssigkeit stärker erhitzt und gleichmäßig am Sieden gehalten. Bei korrekter Erhitzung kondensiert die siedende Säure auf der Kolbenwand. Ein Überhitzen der Kolbenwände und Ansetzen organischer Partikel ist zu vermeiden. Sobald die Lösung klar ist und sich hellgrün färbt, wird sie noch weitere 2 h am Sieden gehalten und danach abkühlen gelassen. 5.2. Destillation Es wird vorsichtig so viel Wasser zugegeben, dass die Sulfate vollständig gelöst werden. Nach dem Abkühlen werden ggf. einige Körner Zinkgranulat (3.3) zugesetzt. Es wird entweder gemäß 5.2.1 oder 5.2.2 weiterverfahren. 5.2.1. Destillation von Schwefelsäure In den Auffangkolben des Destillationsapparats werden je nach dem zu erwartenden Stickstoffgehalt genau 25 ml Schwefelsäure (3.5 oder 3.7) gebracht und einige Tropfen Methylrot-Indikator (3.8) hinzugefügt. Der Aufschlusskolben wird mit dem Kühler des Destillationsapparats verbunden und das Ende des Kühlers mindestens 1 cm tief in die Flüssigkeit des Auffangkolbens gesenkt (siehe Bemerkung 8.3). Dann werden 100 ml Natriumhydroxidlösung (3.9) langsam in den Aufschlusskolben eingefüllt, wobei kein Ammoniak entweichen darf (siehe Bemerkung 8.1). Der Kolben wird so lange erhitzt, bis alles Ammoniak überdestilliert ist. 5.2.2. Destillation von Borsäure Wird der Ammoniakgehalt des Destillats von Hand titriert, findet das im Folgenden beschriebene Verfahren Anwendung. Bei einem voll automatisierten Destilliergerät, das auch die Titration des Ammoniakgehalts des Destillats vornimmt, ist die Betriebsanleitung des Herstellers zu befolgen. Ein Auffangkolben mit 25 bis 30 ml Borsäurelösung (3.18) wird so unter den Ablauf des Kühlers gestellt, dass sich das Ablaufrohr unter der Oberfläche der überschüssigen Borsäurelösung befindet. Das Destilliergerät wird so eingestellt, dass es 50 ml Natriumhydroxidlösung (3.9) abgibt. Die Bedienung des Destilliergeräts erfolgt entsprechend den Anleitungen des Herstellers. Anschließend wird das durch die Zugabe der Natriumhydroxidlösung freigesetzte Ammoniak abdestilliert. Das Destillat wird in der Borsäure (Auffangsäure) aufgefangen. Die Destillatmenge (Dauer der Dampfdestillation) hängt von der in der Probe enthaltenen Menge Stickstoff ab. Hierbei sind die Anleitungen des Herstellers zu befolgen. Anmerkung : In einem halbautomatischen Destilliergerät erfolgen die Zugabe von überschüssigem Natriumhydroxid und die Dampfdestillation automatisch. 5.3. Titration Es wird entweder gemäß 5.3.1 oder 5.3.2 weiterverfahren. 5.3.1. Schwefelsäure Die überschüssige Schwefelsäure im Auffangkolben wird mit Natriumhydroxidlösung (3.10 oder 3.11) in Abhängigkeit von der Konzentration der verwendeten Schwefelsäure) titriert, bis der Endpunkt erreicht ist. 5.3.2. Borsäure Der Inhalt des Auffangkolbens wird mit der volumetrischen Standardlösung der Salzsäure (3.19) oder mit der volumetrischen Standardlösung der Schwefelsäure (3.6) unter Verwendung einer Bürette titriert und die Menge des eingesetzten Titrationsmittels abgelesen. Bei der kolorimetrischen Endpunktbestimmung ist der Endpunkt erreicht, wenn sich der Inhalt erstmals pink verfärbt. Die Bürette ist auf 0,05 ml genau abzulesen. Eine beleuchtete Magnetrührplatte oder ein fotometrischer Detektor können bei der Visualisierung des Endpunkts hilfreich sein. Dies kann automatisch erfolgen bei Verwendung eines Wasserdampfdestillators mit automatischer Titration. Hinsichtlich des Betriebs des jeweiligen Destillators bzw. des Destillier-/Titriergeräts sind die Anleitungen des Herstellers zu befolgen. Anmerkung : Bei Verwendung eines automatischen Titrationssystems beginnt die Titration unmittelbar mit dem Start der Destillation, und es wird die 1 %ige Borsäurelösung (3.18) eingesetzt. Wird ein vollautomatisches Destilliergerät eingesetzt, kann die automatische Titration des Ammoniaks auch mittels Endpunktbestimmung unter Verwendung eines potenziometrischen pH-Systems durchgeführt werden. In diesem Fall wird eine automatische Titriervorrichtung mit einem pH-Meter verwendet. Das pH-Meter ist nach dem üblichen Labor-pH-Kalibrierverfahren ordnungsgemäß im Bereich pH 4 bis ph 7 zu kalibrieren. Der pH-Endpunkt der Titration ist bei einem pH-Wert von 4,6 erreicht, dem steilsten Punkt der Titrationskurve (Wendepunkt). 5.4. Blindversuch Zur Bestätigung, dass die Reagenzien stickstofffrei sind, wird ein Blindversuch (Aufschluss, Destillation und Titration) mit 1 g Saccharose (3.14) anstelle der Probe durchgeführt. 6. Berechnung der Ergebnisse Die Berechnungen werden gemäß 6.1 oder 6.2 durchgeführt. 6.1. Berechnung für die Titration nach 5.3.1 Der Rohproteingehalt, ausgedrückt als Massenanteil, wird nach folgender Formel berechnet: wobei: V0 = Volumen NaOH (3.10 oder 3.11), das im Blindversuch eingesetzt wurde, in ml, V1 = Volumen NaOH (3.10 oder 3.11), das in der Titration der Probe eingesetzt wurde, in ml, c = Konzentration des Natriumhydroxids (3.10 oder 3.11), in mol/l, m = Probeneinwaage in g. 6.2. Berechnung für die Titration nach 5.3.2 6.2.1. Titration mit Salzsäure Der Rohproteingehalt, ausgedrückt als Massenanteil, wird nach folgender Formel berechnet: wobei: m = Probeneinwaage in g, c = Konzentration der volumetrischen Standardlösung von Salzsäure (3.19), in mol/l, V0 = Volumen der Salzsäure, die im Blindversuch eingesetzt wurde, in ml, V1 = Volumen der Salzsäure, die für die Probenmenge eingesetzt wurde, in ml. 6.2.2. Titration mit Schwefelsäure Der Rohproteingehalt, ausgedrückt als Massenanteil, wird nach folgender Formel berechnet: wobei: m = Probeneinwaage in g, c = Konzentration der volumetrischen Standardlösung von Schwefelsäure (3.6), in mol/l, V0 = Volumen der Schwefelsäure (3.6), die im Blindversuch eingesetzt wurde, in ml, V1 = Volumen der Schwefelsäure (3.6), die für die Probenmenge eingesetzt wurde, in ml. 7. Beurteilung des Verfahrens 7.1. Wiederholbarkeit Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf die folgenden Werte nicht überschreiten: — 0,2 % absolut bei Gehalten von weniger als 20 % Rohprotein, — 1,0 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 20 bis 40 % Rohprotein, — 0,4 % absolut bei Gehalten von mehr als 40 % Rohprotein. 7.2. Genauigkeit Die Analyse (Aufschluss, Destillation und Titration) wird mit 1,5 bis 2,0 g Acetanilid (3.13) in Gegenwart von 1 g Saccharose (3.14) durchgeführt; 1 g Acetanilid verbraucht 14,80 ml Schwefelsäure (3.5). Die Wiederfindung muss mindestens 99 % betragen. 8. Bemerkungen 8.1. Es können manuelle, halbautomatische oder automatische Geräte verwendet werden. Bei Geräten, die ein Umfüllen zwischen Aufschluss und Destillation erfordern, ist darauf zu achten, dass dies verlustlos geschieht. Verfügt der Destillationsapparat nicht über einen Tropftrichter, so erfolgt die Zugabe der Natriumhydroxidlösung unmittelbar vor dem Anschließen des Kolbens an den Kühler; die Flüssigkeit ist in diesem Fall langsam an den Kolbenwänden entlang laufen zu lassen. 8.2. Kommt es während des Aufschlusses zur Verfestigung der Mischung, ist mit der Bestimmung von vorn zu beginnen und eine größere als die oben genannte Menge an Schwefelsäure (3.4) zu verwenden. 8.3. Bei stickstoffarmen Proben kann die in den Auffangkolben einzufüllende Menge Schwefelsäure (3.7) gegebenenfalls auf 10 oder 15 ml verringert und mit Wasser auf 25 ml aufgefüllt werden. 8.4. Für Routineanalysen können auch andere Methoden zur Bestimmung des Rohproteins herangezogen werden; die in diesem Teil C beschriebene Kjeldahl-Methode ist jedoch die Referenzmethode. Die Gleichwertigkeit der Ergebnisse der alternativen Methode (z. B. DUMAS) im Vergleich zur Referenzmethode muss für jede Matrix einzeln nachgewiesen werden. Da die Ergebnisse einer alternativen Methode auch nach Feststellung ihrer Gleichwertigkeit leicht von den Ergebnissen der Referenzmethode abweichen können, muss im Analysebericht angegeben werden, welche Analyse zur Bestimmung des Rohproteins verwendet wurde. D. BESTIMMUNG DES HARNSTOFFGEHALTS 1. Zweck und Anwendungsbereich Die Methode erlaubt die Bestimmung des Harnstoffgehalts von Futtermitteln. 2. Prinzip Die Probe wird unter Zusatz eines Klärungsmittels in Wasser suspendiert. Die Suspension wird filtriert. Nach Zugabe von 4-Dimethylaminobenzaldehyd (4-DMAB) wird der Gehalt an Harnstoff im Filtrat durch Messung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 420 nm bestimmt. 3. Reagenzien 3.1. 4-Dimethylaminobenzaldehydlösung: 1,6 g 4-DMAB werden in 100 ml 96 %igen Ethanols gelöst und 10 ml Salzsäure (ρ20 = 1,19 g/ml) hinzugefügt. Das Reagenz ist höchstens 2 Wochen haltbar. 3.2. Carrez-Lösung I: 21,9 g Zinkazetat, Zn(CH3COO)2·2H2O und 3 g Eisessig werden in Wasser gelöst und auf 100 ml mit Wasser aufgefüllt. 3.3. Carrez-Lösung II: 10,6 g Kaliumhexacyanoferrat (II), K4Fe(CN)6·3H2O, werden in Wasser gelöst und auf 100 ml mit Wasser aufgefüllt. 3.4. Aktivkohle, keinen Harnstoff adsorbierend (zu prüfen). 3.5. Harnstofflösung (Massenkonzentration = 0,1 %). 4. Geräte 4.1. Mechanisches Schüttelgerät, ca. 35 bis 40 min-1. 4.2. Reagenzgläser: 160 × 16 mm, mit Schliffstopfen. 4.3. Spektralfotometer. 5. Verfahren 5.1. Analysengang der Probe Von der Probe werden 2 g auf 1 mg genau eingewogen und mit 1 g Aktivkohle (3.4) in einen 500-ml-Messkolben gebracht. Hierzu werden 400 ml Wasser und 5 ml Carrez-Lösung I (3.2) gegeben, ca. 30 s gemischt und dann 5 ml Carrez-Lösung II (3.3) zugesetzt. Das Ganze wird 30 min lang im Schüttelgerät rotiert. Dann wird mit Wasser zur Marke aufgefüllt, geschüttelt und filtriert. Von den klaren und farblosen Filtraten werden je 5 ml in je ein Reagenzglas mit Schliffstopfen pipettiert, 5 ml 4-DMAB-Lösung (3.1) zugesetzt und gemischt. Die Gläser werden in einem Wasserbad bei 20 oC (+/– 4 oC) temperiert. Nach 15 min wird die Extinktion der Probenlösung im Vergleich mit der Blindprobenlösung der Reagenzien im Spektralfotometer bei 420 nm gemessen. 5.2. Kalibrationskurve Volumen von 1, 2, 4, 5 bzw. 10 ml Harnstofflösung (3.5) werden entnommen, in je 100-ml-Messkolben gebracht und mit Wasser zur Marke aufgefüllt. Von jeder Lösung werden 5 ml mit je 5 ml 4-DMAB-Lösung (3.1) gemischt. Die Extinktion wird, wie oben angegeben, im Vergleich mit einer Lösung, die 5 ml 4-DMAB und 5 ml harnstofffreies Wasser enthält, gemessen. Es wird eine Kalibrationskurve aufgestellt. 6. Berechnung der Ergebnisse Mithilfe der Kalibrationskurve ist die Menge an Harnstoff in der Versuchsprobe zu bestimmen. Das Ergebnis ist als Prozentsatz der Probe auszudrücken. 7. Bemerkungen 7.1. Bei einem Harnstoffgehalt von mehr als 3 % ist die Einwaage auf 1 g zu reduzieren bzw. die Anfangslösung so weit zu verdünnen, dass in 500 ml höchstens 50 mg Harnstoff enthalten sind. 7.2. Bei niedrigen Harnstoffgehalten wird die Einwaage erhöht, soweit das Filtrat klar und farblos bleibt. 7.3. Enthält die Probe einfache Stickstoffverbindungen, insbesondere Aminosäuren, so ist die Extinktion bei 435 nm zu messen. E. BESTIMMUNG DES GEHALTS AN FLÜCHTIGEN STICKSTOFFHALTIGEN BASEN I. DURCH MIKRODIFFUSION 1. Zweck und Anwendungsbereich Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an flüchtigen stickstoffhaltigen Basen, ausgedrückt als Ammoniak, in Futtermitteln. 2. Prinzip Die Probe wird mit Wasser extrahiert, die Lösung geklärt und filtriert. Die flüchtigen stickstoffhaltigen Basen werden nach Zusatz von Kaliumcarbonatlösung durch Mikrodiffusion abgetrennt, in einer Borsäurelösung aufgefangen und mit Schwefelsäure titriert. 3. Reagenzien 3.1. Trichloressigsäurelösung (Massenkonzentration = 20 %). 3.2. Indikator: 33 mg Bromkresolgrün und 65 mg Methylrot werden in 100 ml Ethanol (Volumenkonzentration = 95 bis 96 %) gelöst. 3.3. Borsäurelösung: 10 g Borsäure werden in einem 1-l-Messkolben in 200 ml Ethanol (Volumenkonzentration = 95 bis 96 %) und 700 ml Wasser gelöst. Vom Indikator (3.2) werden 10 ml hinzugefügt. Die Lösung wird gemischt und nötigenfalls unter Zusatz von Natriumhydroxidlösung auf eine hellrote Farbe gebracht. Von dieser Lösung kann 1 ml bis zu 300 μg NH3 binden. 3.4. Gesättigte Kaliumkarbonatlösung: 100 g Kaliumcarbonat werden in 100 ml siedendem Wasser gelöst. Nach dem Abkühlen wird die Lösung filtriert. 3.5. 0,01 mol/l Schwefelsäure. 4. Geräte 4.1. Mechanisches Schüttelgerät, ca. 35 bis 40 min-1. 4.2. Conwayschalen (vgl. Skizze) aus Glas oder Plastik. 4.3. Mikrobüretten mit 0,01-ml-Einteilung. 5. Verfahren Von der Probe werden 10 g auf 1 mg genau gewogen, mit 100 ml Wasser in einen 200-ml-Messkolben gegeben und 30 min lang im Schüttelgerät gemischt oder verrührt. Dann werden 50 ml Trichloressigsäurelösung (3.1) hinzugefügt, mit Wasser zur Marke aufgefüllt, kräftig geschüttelt und durch einen Faltenfilter filtriert. In die Mitte der Conwayschale wird 1 ml Borsäurelösung (3.3) und in den Ring der Schale 1 ml des Probenfiltrats pipettiert. Die Schale wird mit dem angefetteten Deckel teilweise bedeckt; dann wird schnell 1 ml der gesättigten Kaliumcarbonatlösung (3.4) in den Ring gegeben und die Schale luftdicht verschlossen. Um mit Sicherheit eine Mischung der beiden Reagenzien zu erreichen, wird die Schale vorsichtig in waagerechter Stellung gedreht. Darauf lässt man das Ganze mindestens 4 h lang bei Raumtemperatur oder 1 h lang bei 40 oC stehen. Die in der Borsäurelösung enthaltenen flüchtigen Basen werden anschließend mit Schwefelsäure (3.5) unter Verwendung einer Mikrobürette (4.3) titriert. Nach demselben Verfahren ist ein Blindversuch ohne die zu analysierende Probe durchzuführen. 6. Berechnung der Ergebnisse 1 ml H2SO4 (0,01 mol/l) entspricht 0,34 mg Ammoniak. Das Ergebnis ist als Prozentsatz der Probe auszudrücken. Wiederholbarkeit Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf die folgenden Werte nicht überschreiten: — 10 % relativ bei Ammoniakgehalten von weniger als 1,0 %, — 0,1 % absolut bei Ammoniakgehalten von 1,0 % oder mehr. 7. Bemerkung Enthält die Probe mehr als 0,6 % Ammoniak, ist das ursprüngliche Filtrat zu verdünnen. CONWAY CELL Scale 1/1 II. DURCH DESTILLATION 1. Zweck und Anwendungsbereich Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an flüchtigen stickstoffhaltigen Basen, ausgedrückt als Ammoniak, in Fischmehl, das praktisch keinen Harnstoff enthält. Sie ist nur anzuwenden bei Gehalten < 0,25 % Ammoniak. 2. Prinzip Die Probe wird mit Wasser extrahiert, die Lösung geklärt und filtriert. Die flüchtigen stickstoffhaltigen Basen werden nach Zusatz von Magnesiumoxid in der Siedehitze abgetrennt und in einer definierten Menge Schwefelsäure aufgefangen, deren Überschuss durch Natriumhydroxidlösung zurücktitriert wird. 3. Reagenzien 3.1. Trichloressigsäurelösung (Massenkonzentration = 20 %). 3.2. Magnesiumoxid. 3.3. Antischaumemulsion (z. B. Silikon). 3.4. 0,05 mol/l Schwefelsäure. 3.5. 0,1 mol/l Natriumhydroxidlösung. 3.6. Methylrotlösung 0,3 %, in Ethanol (Volumenkonzentration = 95 bis 96 %). 4. Geräte 4.1. Mechanisches Schüttelgerät, ca. 35 bis 40 min-1. 4.2. Destillationsapparatur nach Kjeldahl. 5. Verfahren Von der Probe werden 10 g auf 1 mg genau gewogen, mit 100 ml Wasser in einen 200-ml-Messkolben gegeben und 30 min lang im Schüttelgerät gemischt oder gerührt. Dann werden 50 ml Trichloressigsäurelösung (3.1) hinzugefügt, es wird mit Wasser zur Marke aufgefüllt, kräftig geschüttelt und durch einen Faltenfilter filtriert. Je nach dem vermuteten Gehalt an flüchtigen stickstoffhaltigen Basen wird eine entsprechende Menge (im Allgemeinen 100 ml) des klaren Filtrats auf 200 ml verdünnt und 2 g Magnesiumoxid (3.2) sowie einige Tropfen Antischaumemulsion (3.3) hinzugefügt. Die Lösung muss gegen Lackmuspapier alkalisch reagieren; anderenfalls ist noch Magnesiumoxid (3.2) zuzusetzen. Es ist gemäß 5.2 und 5.3 der Analysenmethode zur Bestimmung des Rohproteingehalts (Teil C dieses Anhangs) weiterzuverfahren. Nach demselben Verfahren ist ein Blindversuch ohne die zu analysierende Probe durchzuführen. 6. Berechnung der Ergebnisse 1 ml H2SO4 (0,05 mol/l) entspricht 1,7 mg Ammoniak. Das Ergebnis ist als Prozentsatz der Probe auszudrücken. Wiederholbarkeit Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 10 % (relativ) Ammoniak nicht überschreiten. F. BESTIMMUNG DES GEHALTS AN AMINOSÄUREN (AUSSER TRYPTOPHAN) 1. Zweck und Anwendungsbereich Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an freien (synthetischen und natürlichen) sowie der gesamten (peptidgebundenen und freien) Aminosäuren in Futtermitteln unter Verwendung eines Aminosäureanalysators. Die Methode ist für folgende Aminosäuren anwendbar: Cyst(e)in, Methionin, Lysin, Threonin, Alanin, Arginin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Tyrosin und Valin. Die Methode unterscheidet nicht zwischen Salzen von Aminosäuren und dient auch nicht zur Unterscheidung der D- und L-Formen der Aminosäuren. Sie ist nicht zur Bestimmung des Gehalts an Tryptophan oder Hydroxyanaloga der Aminosäuren anwendbar. 2. Prinzip 2.1. Freie Aminosäuren Die freien Aminosäuren werden mit verdünnter Salzsäure extrahiert. Mitextrahierte stickstoffhaltige Makromoleküle werden mit Sulfosalicylsäure ausgefällt und durch Filtrieren entfernt. Die filtrierte Lösung wird auf einen pH-Wert von 2,20 eingestellt. Die Aminosäuren werden durch Ionenaustauschchromatografie getrennt und nach Reaktion mit Ninhydrin durch fotometrischen Nachweis bei 570 nm bestimmt. 2.2. Gesamtaminosäuren Die gewählte Methode hängt von den zu untersuchenden Aminosäuren ab. Cyst(e)in und Methionin müssen vor der Hydrolyse zu Cysteinsäure bzw. Methioninsulfon oxidiert werden. Tyrosin muss im Hydrolysat der nicht oxidierten Probe bestimmt werden. Alle übrigen unter 1 genannten Aminosäuren können aus dem Hydrolysat der oxidierten oder der nicht oxidierten Probe bestimmt werden. Die Oxidation wird bei 0 oC mit einer Perameisensäure-Phenol-Mischung durchgeführt. Überschüssiges Oxidationsreagenz wird mit Natriumdisulfit zerstört. Die oxidierte bzw. die nicht oxidierte Probe wird mit Salzsäure (3.20) 23 h lang hydrolysiert. Das Hydrolysat wird auf einen pH-Wert von 2,20 eingestellt. Die Aminosäuren werden durch Ionenaustauschchromatografie getrennt und nach Reaktion mit Ninhydrin fotometrisch bei 570 nm (bei Prolin 440 nm) bestimmt. 3. Reagenzien Es ist bidestilliertes Wasser oder Wasser gleichwertiger Qualität zu verwenden (Leitfähigkeit < 10 μS/cm). 3.1. Wasserstoffperoxid, w (Massenanteil) = 30 %. 3.2. Ameisensäure, w (Massenanteil) = 98 bis 100 %. 3.3. Phenol. 3.4. Natriumdisulfit. 3.5. Natriumhydroxid. 3.6. 5-Sulfosalicylsäure-Dihydrat. 3.7. Salzsäure, Dichte ca. 1,18 g/ml. 3.8. Tri-Natriumcitrat-Dihydrat. 3.9. 2,2′-Thiodiethanol (Thiodiglycol). 3.10. Natriumchlorid. 3.11. Ninhydrin. 3.12. Petrolether, Siedeintervall 40 bis 60 oC. 3.13. Norleucin oder sonstige für die Verwendung als interner Standard geeignete Verbindung. 3.14. Stickstoffgas (< 10 ppm Sauerstoff). 3.15. 1-Octanol. 3.16. Aminosäuren. 3.16.1. Standardstoffe gemäß Auflistung unter 1. Es dürfen nur reine Verbindungen ohne Kristallwasser verwendet werden. Sie sind vor der Verwendung im Vakuum über P2O5 oder H2SO4 1 Woche lang zu trocknen. 3.16.2. Cysteinsäure. 3.16.3. Methioninsulfon. 3.17. Natriumhydroxidlösung, c = 7,5 mol/l: 300 g NaOH (3.5) in Wasser lösen und auf 1 l auffüllen. 3.18. Natriumhydroxidlösung, c = 1 mol/l: 40 g NaOH (3.5) in Wasser lösen und auf 1 l auffüllen. 3.19. Phenolhaltige Ameisensäurelösung: 889 g Ameisensäure (3.2) werden mit 111 g Wasser gemischt; anschließend werden 4,73 g Phenol (3.3) hinzugefügt. 3.20. Hydrolysemischung, c = 6 mol HCl/l unter Zusatz von 1 g Phenol/l: Zu 492 ml HCl (3.7) wird 1 g Phenol (3.3) hinzugefügt und mit Wasser auf 1 l aufgefüllt. 3.21. Extraktionslösung, c = 0,1 mol HCl/l, 2 % Thiodiglycol enthaltend: 8,2 ml HCl (3.7) werden in ca. 900 ml Wasser gegeben, 20 ml Thiodiglycol (3.9) hinzugefügt, und es wird mit Wasser auf 1 l aufgefüllt (3.7 und 3.9 dürfen nicht unmittelbar gemischt werden). 3.22. 5-Sulfosalicylsäurelösung, β = 6 %: 60 g 5-Sulfosalicylsäure (3.6) in Wasser lösen und mit Wasser auf 1 l auffüllen. 3.23. Oxidationsmischung (Perameisensäure-Phenol): 0,5 ml Wasserstoffperoxid (3.1) werden mit 4,5 ml phenolhaltiger Ameisensäurelösung (3.19) in einem kleinen Becherglas gemischt. Es wird bei 20 bis 30 oC 1 h stehen gelassen, um die Bildung von Perameisensäure zu bewirken. Anschließend wird die Lösung 15 min in ein Eisbad gestellt, bevor sie der Probe zugegeben wird. Vorsicht: Hautkontakt vermeiden und Schutzkleidung tragen. 3.24. Citratpufferlösung, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: 19,61 g Natriumcitrat (3.8), 5 ml Thiodiglycol (3.9), 1 g Phenol (3.3) und 16,50 ml HCl (3.7) werden in ca. 800 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert wird auf 2,20 eingestellt. Mit Wasser auf 1 l auffüllen. 3.25. Elutionspuffer entsprechend den Anforderungen des verwendeten Gerätes (4.9). 3.26. Ninhydrinreagenz entsprechend den Bedingungen des verwendeten Gerätes (4.9). 3.27. Aminosäuren-Standardlösungen: Diese Lösungen sind bei < 5 oC aufzubewahren. 3.27.1. Aminosäuren-Standard-Stammlösung (3.16.1): c = 2,5 μmol/ml je Aminosäure in Salzsäure Diese Lösung ist im Handel erhältlich. 3.27.2. Standard-Stammlösung von Cysteinsäure und Methioninsulfon, c = 1,25 μmol/ml: 0,2115 g Cysteinsäure (3.16.2) und 0,2265 g Methioninsulfon (3.16.3) werden in Citratpufferlösung (3.24) in einem 1 000-ml-Messkolben gelöst, und es wird mit Citratpufferlösung zur Marke aufgefüllt. Die Lösung ist bei < 5 oC höchstens 12 Monate haltbar. Sie wird nicht benötigt, falls die Standard-Stammlösung (3.27.1) bereits Cysteinsäure und Methioninsulfon enthält. 3.27.3. Stammlösung des internen Standards, z. B. Norleucin, c = 20 μmol/ml: 0,6560 g Norleucin (3.13) werden in Citratpufferlösung (3.24) in einem Messkolben gelöst, und es wird mit Citratpufferlösung auf 250 ml aufgefüllt. Diese Lösung ist bei < 5 oC höchstens 6 Monate haltbar. 3.27.4. Aminosäurenkalibrierlösung zur Verwendung bei Hydrolysaten, c = 5 nmol/50 μl Cysteinsäure und Methioninsulfon und c = 10 nmol/50 μl der übrigen Aminosäuren: 2,2 g Natriumchlorid (3.10) werden in einem 100-ml-Becherglas in 30 ml Citratpufferlösung (3.24) gelöst. Es werden 4,00 ml Standard-Stammlösung der Aminosäuren (3.27.1), 4,00 ml Standard-Stammlösung von Cysteinsäure und Methinoninsulfon (3.27.2), und, falls verwendet, 0,50 ml Stammlösung des internen Standards (3.27.3) hinzugefügt. Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid (3.18) auf 2,20 eingestellt. Die Lösung wird quantitativ in einen 50-ml-Messkolben überführt, und es wird mit Citratpufferlösung (3.24) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Die Lösung ist bei < 5 oC höchstens 3 Monate haltbar. Siehe auch Bemerkungen unter 9.1. 3.27.5. Aminosäurenkalibrierlösung zur Verwendung bei Hydrolysaten gemäß 5.3.3.1 und bei Extrakten gemäß 5.2. Die Kalibrierlösung wird gemäß 3.27.4 hergestellt, jedoch ohne Zugabe von Natriumchlorid. Die Lösung ist bei < 5 oC höchstens 3 Monate haltbar. 4. Geräte 4.1. 100- oder 250-ml-Rundkolben mit Rückflusskühler. 4.2. 100-ml-Borosilikat-Glasflaschen mit Schraubverschluss mit Gummidichtung/teflonbeschichteter Dichtung (z. B. Duran, Schott). 4.3. Trockenschrank mit forcierter Umluft, auf ± 2 oC regelbar. 4.4. pH-Meter (auf drei Dezimalstellen genau). 4.5. Membranfilter, 0,22 μm Porengröße. 4.6. Zentrifuge. 4.7. Vakuum-Rotationsverdampfer. 4.8. Mechanischer Schüttler oder Magnetrührer. 4.9. Aminosäureanalysator oder HPLC-Einrichtung mit Ionenaustauschersäule, Einrichtung für Ninhydrin-Nachsäulenderivatisierung und Fotometer. Die Säule wird mit sulfoniertem Polystyrolharz gefüllt, das die Trennung der einzelnen Aminosäuren und deren Abtrennung von sonstigen Ninhydrin-positiven Substanzen ermöglicht. Die Pumpen für die Ninhydrin- und für die Pufferlösungen müssen über den Zeitraum des Kalibrationslaufes und des Probenlaufes eine Flussstabilität von ±0,5 % gewährleisten. Bei einigen Aminosäureanalysatoren können auch Hydrolyseverfahren angewandt werden, wenn die Hydrolysate Natriumionenkonzentrationen von c = 0,8 mol/l aufweisen und die restliche Ameisensäure des Oxidationsschrittes enthalten. Andere Analysatoren bieten keine befriedigende Abtrennung bestimmter Aminosäuren, falls das Hydrolysat überschüssige Ameisensäure und/oder hohe Natriumionenkonzentrationen aufweist. In diesem Fall wird das Säurevolumen nach der Hydrolyse und vor der pH-Wert-Einstellung durch Einengen auf ca. 5 ml reduziert. Das Einengen ist unter Vakuum bei höchstens 40 oC vorzunehmen. 5. Verfahren 5.1. Vorbereitung der Probe Die Probe wird so fein vermahlen, dass sie ein Sieb mit 0,5 mm Maschenweite passieren kann. Proben mit hohem Feuchtigkeitsgehalt müssen vor dem Vermahlen entweder bei einer Temperatur von höchstens 50 oC luftgetrocknet oder aber gefriergetrocknet werden. Proben mit hohem Fettgehalt sind vor dem Vermahlen mit Petrolether (3.12) zu extrahieren. 5.2. Bestimmung des Gehalts an freien Aminosäuren in Futtermitteln und Vormischungen Eine geeignete Menge (1 bis 5 g) der vorbereiteten Probe (5.1) auf 0,2 mg genau in einen Erlenmeyerkolben einwiegen und 100,0 ml Extraktionslösung (3.21) hinzufügen. Mit einem mechanischen Schüttler 60 min schütteln bzw. mit einem Magnetrührer (4.8) rühren. Nach dem Absetzen lassen werden mit einer Pipette 10,0 ml der überstehenden Lösung in ein 100-ml-Becherglas gegeben. Es werden 5,0 ml Sulfosalicylsäurelösung (3.22) unter Rühren hinzugefügt, und mithilfe des Magnetrührers wird 5 min weitergerührt. Die überstehende Lösung wird filtriert oder zentrifugiert, um alle Ausfällungen zu entfernen. Von der klaren Lösung werden 10,0 ml in ein 100-ml-Becherglas gegeben, und unter Verwendung von Natriumhydroxidlösung (3.18) wird der pH-Wert auf 2,20 eingestellt. Die Lösung wird mit Citratpufferlösung (3.24) in einen Messkolben geeigneter Größe überführt und mit Citratpufferlösung (3.24) zur Marke aufgefüllt. Bei Verwendung eines internen Standards werden vor dem Auffüllen 1,00 ml der Stammlösung des internen Standards (3.27.3) für jeweils 100 ml Endlösung hinzugefügt und mit Citratpufferlösung (3.24) zur Marke aufgefüllt. Anschließend wird die Chromatografie gemäß 5.4 durchgeführt. Werden die Extrakte nicht am selben Tag chromatografiert, sind sie bei < 5 oC aufzubewahren. 5.3. Bestimmung des Gehalts an Gesamtaminosäuren 5.3.1. Oxidation 0,1 bis 1 g der vorbereiteten Probe (5.1) werden auf 0,2 mg genau eingewogen — in einen 100-ml-Rundkolben (4.1) für die offene Hydrolyse (5.3.2.3) oder — in einen 250-ml-Rundkolben (4.1), falls eine niedrige Natriumionenkonzentration (5.3.3.1) erforderlich ist, oder — in eine 100-ml-Flasche mit Schraubverschluss (4.2) für die geschlossene Hydrolyse (5.3.2.4). Die Einwaage muss einen Stickstoffgehalt von etwa 10 mg und einen Feuchtigkeitsgehalt von höchstens 100 mg haben. Der Kolben/die Flasche wird in ein Eisbad gestellt und auf 0 oC abgekühlt. Dann werden 5 ml der Oxidationsmischung (3.23) hinzugefügt, und es wird mithilfe eines Glasspatels mit gebogener Spitze gemischt. Der Behälter, der den Spatel enthält, wird mit einer luftdichten Folie verschlossen, das Eiswasserbad mit dem verschlossenen Behälter in einen Kühlschrank mit einer Temperatur von 0 oC gestellt und 16 h stehen gelassen. Nach 16 h wird der Behälter aus dem Kühlschrank genommen und das überschüssige Oxidationsreagenz durch Zusatz von 0,84 g Natriumdisulfit (3.4) zersetzt. Es wird gemäß 5.3.2.1 weiterverfahren. 5.3.2. Hydrolyse 5.3.2.1. Hydrolyse der oxidierten Proben Zu der oxidierten Probe (die gemäß 5.3.1 vorbereitet wurde) werden 25 ml Hydrolysemischung (3.20) gegeben. Dabei ist darauf zu achten, dass alle Probenrückstände, die an den Seitenwänden des Gefäßes sowie am Spatel haften, abgewaschen werden. Je nach dem verwendeten Hydrolyseverfahren wird gemäß 5.3.2.3 oder 5.3.2.4 weiterverfahren. 5.3.2.2. Hydrolyse der nicht oxidierten Proben In einen 100-ml- oder 250-ml-Rundkolben (4.1) bzw. in eine 100-ml-Flasche mit Schraubverschluss (4.2) werden 0,1 bis 1 g der vorbereiteten Probe (5.1) auf 0,2 mg genau eingewogen. Die Einwaage muss einen Stickstoffgehalt von ca. 10 mg aufweisen. Vorsichtig 25 ml Hydrolysemischung (3.20) hinzufügen und mit der Probe vermischen. Es wird entweder gemäß 5.3.2.3 oder gemäß 5.3.2.4 weiterverfahren. 5.3.2.3. Offene Hydrolyse (Rückflusshydrolyse) Zu der nach 5.3.2.1 oder 5.3.2.2 hergestellten Mischung werden 3 Glasperlen hinzugegeben. Sie wird zum Sieden erhitzt und unter Rückfluss genau 23 h am Sieden gehalten. Nach Beendigung der Hydrolyse wird der Rückflusskühler mit 5 ml Citratpufferlösung (3.24) gespült und der abgehängte Kolben im Eisbad gekühlt. Es wird gemäß 5.3.3 weiterverfahren. 5.3.2.4. Geschlossene Hydrolyse Die Flasche mit der nach 5.3.2.1 oder 5.3.2.2 vorbereiteten Mischung wird bei 110 oC in den Trockenschrank (4.3) gestellt. Um einen durch Gasentwicklung hervorgerufenen Druckaufbau zu vermeiden und eine Explosion zu verhindern, wird der Schraubverschluss während der ersten Stunde nur lose auf die Flasche gelegt. Die Flasche darf nicht verschlossen werden. Nach 1 h wird die Flasche mit dem Deckel fest verschlossen und 23 h im Trockenschrank (4.3) belassen. Nach Beendigung der Hydrolyse wird die Flasche aus dem Trockenschrank genommen, der Verschluss vorsichtig geöffnet, die Flasche in ein Eisbad gestellt und abkühlen gelassen. Je nach dem Verfahren für die pH-Wert-Einstellung (5.3.3) wird der Inhalt der Flasche quantitativ mit Citratpufferlösung (3.24) in ein 250-ml-Becherglas oder in einen 250-ml-Rundkolben überführt. Es wird gemäß 5.3.3 weiterverfahren. 5.3.3. pH-Wert-Einstellung Je nach der Natriumionentoleranz des Aminosäureanalysators (4.9) wird die pH-Wert-Einstellung gemäß 5.3.3.1 oder 5.3.3.2 vorgenommen. 5.3.3.1. Für Aminosäureanalysatoren oder HPLC-Einrichtungen (4.9), die eine niedrige Natriumionenkonzentration erfordern Werden Aminosäureanalysatoren verwendet, bei denen eine geringe Natriumionenkonzentration erforderlich ist (wenn also das Säurevolumen reduziert werden muss), wird die Verwendung einer Stammlösung eines internen Standards (3.27.3) empfohlen. In diesem Fall sind dem Hydrolysat vor dem Verdampfen 2,00 ml der internen Standardlösung (3.27.3) hinzuzufügen. Zu dem nach 5.3.2.3 oder 5.3.2.4 erhaltenen Hydrolysat werden 2 Tropfen 1-Octanol (3.15) gegeben. Das Volumen wird am Rotationsverdampfer (4.7) unter Vakuum bei 40 oC auf 5 bis 10 ml reduziert. Wurde das Volumen beim Einengen versehentlich auf weniger als 5 ml reduziert, wird das Hydrolysat verworfen und die Analyse wiederholt. Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxidlösung (3.18) auf 2,20 eingestellt, und es wird gemäß 5.3.4 weiterverfahren. 5.3.3.2. Für alle sonstigen Aminosäureanalysatoren (4.9) Die nach 5.3.2.3 oder 5.3.2.4 erhaltenen Hydrolysate werden durch vorsichtige Zugabe unter Rühren von 17 ml Natriumhydroxidlösung (3.17) teilweise neutralisiert, wobei eine Temperatur von unter 40 oC eingehalten werden muss. Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxidlösung (3.17 und anschließend 3.18) bei Raumtemperatur auf 2,20 eingestellt, und es wird gemäß 5.3.4 weiterverfahren. 5.3.4. Probenlösung für die Chromatografie Das auf pH 2,20 eingestellte Hydrolysat (5.3.3.1 oder 5.3.3.2) wird mit Citratpufferlösung (3.24) quantitativ in einen 200-ml-Messkolben überführt und mit Citratpufferlösung (3.24) zur Marke aufgefüllt. Falls bisher noch kein interner Standard hinzugefügt worden ist, werden vor dem Auffüllen 2,00 ml des internen Standards (3.27.3) hinzugegeben und dann mit Citratpufferlösung (3.24) zur Marke aufgefüllt. Es wird sorgfältig gemischt. Anschließend wird die Chromatografie gemäß 5.4 durchgeführt. Falls die Probenlösungen nicht am selben Tag chromatografiert werden, sind sie bei < 5 oC aufzubewahren. 5.4. Chromatografie Falls erforderlich, wird der Extrakt (5.2) oder das Hydrolysat (5.3.4) vor der Chromatografie auf Raumtemperatur gebracht. Die Mischung wird geschüttelt und eine geeignete Menge durch einen 0,22-μm-Membranfilter (4.5) filtriert. Die so erhaltene klare Lösung wird der Ionenaustauschchromatografie unter Verwendung eines Aminosäureanalysators bzw. einer HPLC-Einrichtung (4.9) unterzogen. Die Einspritzung kann von Hand oder automatisch erfolgen. Wesentlich ist, dass jeweils die gleiche Menge ±0,5 % der Standardlösung und der Probenlösung eingespritzt wird, es sei denn, es wird ein interner Standard verwendet. Das Verhältnis der Konzentrationen von Natriumionen und Aminosäuren sollte in der Standard- und der Probenlösung so ähnlich wie möglich sein. Die Häufigkeit von Kalibrationsläufen hängt von der Stabilität des Ninhydrinreagenzes und des Analysatorsystems ab. Die Standardlösung oder die Probenlösung wird mit Citratpufferlösung (3.24) so verdünnt, dass die Peakfläche des Standards etwa 30 bis 200 % der Peakfläche der einzelnen Aminosäuren in der Probenlösung ausmacht. Die Chromatografie der Aminosäuren unterscheidet sich leicht je nach Art des verwendeten Analysators und des eingesetzten Harzes. Das System muss in der Lage sein, die Aminosäuren vollständig voneinander und von den sonstigen Ninhydrin-positiven Substanzen zu trennen. Im Betriebsbereich muss das chromatografische System bei Änderungen der Aminosäuremengen, die der Säule hinzugefügt wird, eine lineare Reaktion aufweisen. Wird eine equimolare Lösung der zu bestimmenden Aminosäuren analysiert, sollten bei der Chromatografie die unten angegebenen Verhältnisse von Tal zu Peakhöhe zwischen den überlappenden Peaks erreicht werden. Diese equimolare Lösung muss mindestens 30 % der maximalen Menge jeder Aminosäure enthalten, die mit dem jeweiligen Aminosäureanalysator (4.9) noch präzise bestimmt werden kann. Für die Trennung von Threonin-Serin darf das Verhältnis von Tal zur Peakhöhe des niedrigeren der 2 sich überlappenden Peaks auf dem Chromatogramm nicht mehr als 2:10 betragen (wenn nur Cyst(e)in, Methionin, Threonin und Lysin bestimmt werden, beeinträchtigt eine unzureichende Trennung von angrenzenden Peaks die Bestimmung). Für alle übrigen Aminosäuren sollte die Trennung besser als 1:10 sein. Das System muss gewährleisten, dass Lysin von „Lysinartefakten“ und Omithin abgetrennt wird. 6. Berechnung der Ergebnisse Die Flächen der Proben- und der Kalibrationsstandardpeaks werden für jede einzelne Aminosäure bestimmt und der Gehalt (X) in g Aminosäure je kg Probe berechnet: Bei Verwendung eines internen Standards ist zu multiplizieren mit A = Peakfläche, Hydrolysat oder Extrakt B = Peakfläche, Kalibrierstandardlösung C = Peakfläche, interner Standard im Hydrolysat oder Extrakt D = Peakfläche, interner Standard, Kalibrierstandardlösung M = Molmasse der zu bestimmenden Aminosäure c = Konzentration des Standards in μmol/ml m = Probeneinwaage (auf Originalgewicht berichtigt, falls getrocknet oder entfettet), in g V = Gesamtvolumen des Hydrolysats (5.3.4) in ml oder errechnetes Gesamtverdünnungsvolumen des Extrakts (6.1) in ml Sowohl Cystin als auch Cystein werden im Hydrolysat der oxidierten Probe als Cysteinsäure bestimmt, jedoch als Cystin (C6H12N2O4S2, M = 240,30 g/mol) unter Verwendung der Molmasse von 120,15 g/mol (0,5 × 240,30 g/mol) berechnet. Methionin wird als Methioninsulfon in Hydrolysaten der oxidierten Probe bestimmt, aber unter Verwendung des M von Methionin (149,21 g/mol) als Methionin berechnet. Zugesetztes freies Methionin wird nach Extraktion als Methionin bestimmt, wobei für die Berechnung das gleiche M verwendet wird. 6.1. Das Gesamtverdünnungsvolumen der Extrakte (F) für die Bestimmung des Gehalts an freien Aminosäuren (5.2) wird wie folgt berechnet: V = Volumen des Endextrakts. 7. Beurteilung des Verfahrens Das Verfahren ist in einem auf internationaler Ebene im Jahr 1990 durchgeführten Vergleichstest an 4 verschiedenen Futtermitteln (Mischfuttermittel für Schweine, Mischfuttermittel für Mastküken, Eiweißkonzentrat und einer Vormischung) erprobt worden. Die nach der Eliminierung von Ausreißern erhaltenen Ergebnisse (Mittelwerte und Standardabweichungen) sind in den Tabellen unter diesem Punkt dargestellt. Mittelwerte in g/kg Referenzmaterial Aminosäure Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin Schweinemischfutter 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Mastkükenmischfutter 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Eiweißkonzentrat 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Vormischung 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = Anzahl der beteiligten Laboratorien. 7.1. Wiederholbarkeit Für die untersuchten Aminosäuren wurde die Wiederholbarkeit ermittelt. Sie ist, ausgedrückt als Standardabweichung der Wiederholbarkeit, für den oben genannten Vergleichstest in der folgenden Tabelle dargestellt. Standardabweichung der Wiederholbarkeit (sr) in g/kg Referenzmaterial Aminosäure Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin Schweinemischfutter 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Mastkükenmischfutter 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Eiweißkonzentrat 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Vormischung 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = Anzahl der beteiligten Laboratorien.

Variationskoeffizient (%) für die Standardabweichung der Wiederholbarkeit (sr) Referenzmaterial Aminosäure Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin Schweinemischfutter 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Mastkükenmischfutter 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Eiweißkonzentrat 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Vormischung 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = Anzahl der beteiligten Laboratorien. 7.2. Vergleichbarkeit Die Ergebnisse hinsichtlich der Standardabweichung der Vergleichbarkeit, die sich aus den oben genannten Untersuchungen ergeben, sind in nachstehender Tabelle dargestellt. Standardabweichung der Vergleichbarkeit (sR) in g/kg Referenzmaterial Aminosäure Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin Schweinemischfutter 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Mastkükenmischfutter 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Eiweißkonzentrat 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Vormischung 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = Anzahl der beteiligten Laboratorien.

Variationskoeffizient (%) für die Standardabweichung der Vergleichbarkeit (sR) Referenzmaterial Aminosäure Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin Schweinemischfutter 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Mastkükenmischfutter 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Eiweißkonzentrat 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Vormischung 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = Anzahl der beteiligten Laboratorien. 8. Verwendung von Referenzmaterialien Die korrekte Anwendung der Methode ist durch Mehrfachbestimmungen an zertifizierten Referenzmaterialien (soweit verfügbar) zu überprüfen. Für die Kalibration wird die Verwendung einer zertifizierten Aminosäurestandardlösung empfohlen. 9. Bemerkungen 9.1. Wegen der Unterschiede zwischen den Aminosäureanalysatoren sind die Endkonzentrationen der Aminosäurenkalibrierlösungen (3.27.4 und 3.27.5) und der Hydrolysate (5.3.4) als Richtwerte anzusehen. Der lineare Reaktionsbereich des Geräts muss für alle Aminosäuren geprüft werden. Die Standardlösung wird mit Citratpufferlösung verdünnt, um Peakflächen in der Mitte des Bereichs zu erhalten. 9.2. Falls Geräte für die Hochleistungsflüssigkeitschromatografie zur Analyse der Hydrolysate eingesetzt werden, sind die Versuchsbedingungen gemäß den Empfehlungen des Herstellers zu optimieren. 9.3. Wird diese Methode für Futtermittel angewandt, die mehr als 1 % Chlorid enthalten (Kraftfuttermittel, Mineralfuttermittel, Ergänzungsfuttermittel), so könnte der Methioningehalt unterschätzt werden, und es ist eine modifizierte Oxidation erforderlich. G. BESTIMMUNG DES TRYPTOPHANGEHALTS 1. Zweck und Anwendungsbereich Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gesamtgehalts an Tryptophan und des Gehalts an freiem Tryptophan in Futtermitteln. Sie dient nicht zur Unterscheidung zwischen D- und L-Formen. 2. Prinzip Zur Bestimmung des Gesamtgehalts an Tryptophan wird die Probe unter alkalischen Bedingungen mit gesättigter Bariumhydroxid-Lösung hydrolysiert, auf 110 oC erhitzt und 20 h auf dieser Temperatur gehalten. Nach der Hydrolyse wird ein interner Standard zugegeben. Zur Bestimmung des Gehalts an freiem Tryptophan wird die Probe unter leicht sauren Bedingungen in Gegenwart eines internen Standards extrahiert. Tryptophan und der interne Standard im Hydrolysat bzw. im Extrakt werden durch HPLC mit Fluoreszenzdetektor bestimmt. 3. Reagenzien 3.1. Es ist bidestilliertes Wasser oder Wasser gleichwertiger Qualität zu verwenden (Leitfähigkeit < 10 μS/cm). 3.2. Standardsubstanz: Tryptophan (Reinheit/Gehalt ≥ 99 %), im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. 3.3. Interner Standard: α-Methyl-Tryptophan (Reinheit/Gehalt ≥ 99 %), im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. 3.4. Bariumhydroxid-Octahydrat (das Ba(OH)2·8H2O darf nicht übermäßig der Luft ausgesetzt werden, um die Bildung von BaCO3 zu vermeiden, das die Bestimmung beeinträchtigen könnte) (siehe Bemerkung 9.3). 3.5. Natriumhydroxid. 3.6. Orthophosphorsäure, w (Massenanteil) = 85 %. 3.7. Salzsäure, ρ20 = 1,19 g/ml. 3.8. Methanol, HPLC-Qualität. 3.9. Petrolether, Siedeintervall 40 bis 60 oC. 3.10. Natriumhydroxidlösung, c = 1 mol/l: 40,0 g NaOH (3.5) in Wasser lösen und mit Wasser (3.1) auf 1 l auffüllen. 3.11. Salzsäure, c = 6 mol/l: 492 ml HCl (3.7) mit Wasser auf 1 l auffüllen. 3.12. Salzsäure, c = 1 mol/l: 82 ml HCl (3.7) mit Wasser auf 1 l auffüllen. 3.13. Salzsäure, c = 0,1 mol/l: 8,2 ml HCl (3.7) mit Wasser auf 1 l auffüllen. 3.14. Orthophosphorsäure, c = 0,5 mol/l: 34 ml Orthophosphorsäure (3.6) mit Wasser (3.1) auf 1 l auffüllen. 3.15. Konzentrierte Tryptophanlösung (3.2), c = 2,50 μmol/ml: 0,2553 g Tryptophan (3.2) in einem 500-ml-Messkolben in Salzsäure (3.13) lösen und mit Salzsäure (3.13) zur Marke auffüllen. Bei — 18 oC höchstens 4 Wochen aufbewahren. 3.16. Konzentrierte interne Standardlösung, c = 2,50 μmol/ml: 0,2728 g α-Methyl-Tryptophan (3.3) in einem 500-ml-Messkolben in Salzsäure (3.13) lösen und mit Salzsäure (3.13) zur Marke auffüllen. Bei — 18 oC höchstens 4 Wochen aufbewahren. 3.17. Kalibrierstandardlösung von Tryptophan und internem Standard: 2,00 ml konzentrierte Tryptophanlösung (3.15) und 2,00 ml konzentrierte interne Standardlösung (α-Methyl-Tryptophan) (3.16) mit Wasser (3.1) und Methanol (3.8) auf etwa dasselbe Volumen und etwa dieselbe Methanolkonzentration (10 bis 30 %) wie das fertige Hydrolysat verdünnen. Diese Lösung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden. Während der Zubereitung vor direktem Sonnenlicht schützen. 3.18. Essigsäure. 3.19. 1,1,1-Trichlor-2-methyl-2-propanol. 3.20. Ethanolamin, w (Massenanteil) > 98 %. 3.21. Lösung von 1 g 1,1,1-Trichlor-2-methyl-2-propanol (3.19) in 100 ml Methanol (3.8). 3.22. Mobile Phase für die HPLC: 3,00 g Essigsäure (3.18) + 900 ml Wasser (3.1) +50,0 ml Lösung (3.21) von 1,1,1-Trichlor-2-methyl-2-propanol (3.19) in Methanol (3.8) (1g/100ml). Der pH-Wert wird mit Ethanolamin (3.20) auf 5,00 eingestellt. Mit Wasser (3.1) auf 1 l auffüllen. 4. Geräte 4.1. HPLC-Einrichtung mit Fluoreszenzdetektor. 4.2. HPLC-Trennsäule, 125 × 4 mm, C18, 3 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule. 4.3. pH-Meter. 4.4. Polypropylen-Kolben, 125 ml, Weithals mit Schraubverschluss. 4.5. Membranfilter, 0,45 μm Porengröße. 4.6. Autoklav, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar. 4.7. Mechanischer Schüttler oder Magnetrührer. 4.8. Vortex-Schüttelgerät. 5. Verfahren 5.1. Vorbereitung der Proben Die Probe wird so fein vermahlen, dass sie ein Sieb mit 0,5 mm Maschenweite passieren kann. Proben mit hohem Feuchtigkeitsgehalt müssen vor dem Vermahlen entweder bei einer Temperatur von höchstens 50 oC luftgetrocknet oder aber gefriergetrocknet werden. Proben mit hohem Fettgehalt sind vor dem Vermahlen mit Petrolether (3.9) zu extrahieren. 5.2. Bestimmung des Gehalts an freiem Tryptophan (Extrakt) Eine geeignete Menge (1 bis 5 g) der vorbereiteten Probe (5.1) auf 1 mg genau in einen Erlenmeyerkolben einwiegen. 100,0 ml Salzsäure (3.13) und 5,00 ml konzentrierte interne Standardlösung (3.16) zugeben. Mit einem mechanischen Schüttler oder einem Magnetrührer (4.7) 60 min schütteln bzw. mischen. Absetzen lassen und 10,0 ml der überstehenden Lösung in ein Becherglas pipettieren. 5 ml Orthophosphorsäure (3.14) zugeben. Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxidlösung (3.10) auf 3 eingestellt. Ausreichend Methanol (3.8) für eine Methanolkonzentration von 10 bis 30 % im Endvolumen zugeben. In einen Messkolben mit ausreichendem Volumen überführen und mit Wasser auf das für die Chromatografie notwendige Volumen verdünnen (entspricht etwa dem Volumen der Kalibrierstandardlösung (3.17)). Einige ml der Lösung werden vor der Einspritzung in die HPLC-Säule durch einen 0,45-μm-Membranfilter (4.5) filtriert. Die Chromatografie gemäß 5.4 durchführen. Standardlösung und Extrakte sind vor direktem Sonnenlicht zu schützen. Falls es nicht möglich ist, die Extrakte am selben Tag zu analysieren, können sie bei 5 oC maximal 3 Tage aufbewahrt werden. 5.3. Bestimmung des Gehalts an Gesamttryptophan (Hydrolysat) 0,1 bis 1 g der vorbereiteten Probe (5.1) werden auf 0,2 mg genau in den Polypropylenkolben (4.4) eingewogen. Die Einwaage muss einen Stickstoffgehalt von ca. 10 mg aufweisen. 8,4 g Bariumhydroxid-Octahydrat (3.4) und 10 ml Wasser zugeben. Mithilfe eines Vortex-Schüttelgeräts (4.8) oder Magnetrührgeräts (4.7) mischen. Den teflonbeschichteten Magneten in der Mischung lassen. Die Gefäßwände mit 4 ml Wasser abspülen. Schraubkappe aufsetzen und Kolben locker verschließen. In einem Autoklaven (4.6) 30 bis 60 min mit kochendem Wasser erhitzen. Den Autoklaven schließen und 20 h bei 110 (+/– 2) oC autoklavieren. Vor dem Öffnen des Autoklaven ist die Temperatur auf knapp unter 100 oC zu senken. Um Kristallisation des Ba(OH)2·8HO2 zu vermeiden, sind der warmen Mischung 30 ml Wasser mit Zimmertemperatur zuzugeben. Leicht schütteln oder rühren. 2,00 ml konzentrierte interne Standardlösung (α-Methyl-Tryptophan) (3.16) zugeben. Die Gefäße im Wasser-/Eisbad 15 min kühlen. Anschließend 5 ml Orthophosphorsäure (3.14) zugeben. Das Gefäß im Kühlbad belassen und unter Rühren mit HCl (3.11) neutralisieren; der pH-Wert wird mit HCl (3.12) auf 3,0 eingestellt. Ausreichend Methanol für eine Methanolkonzentration von 10 bis 30 % im Endvolumen zugeben. In einen Messkolben mit ausreichendem Volumen überführen und mit Wasser auf das für die Chromatografie notwendige Volumen verdünnen (z. B. 100 ml). Die Zugabe von Methanol darf keine Präzipitation verursachen. Einige ml der Lösung werden vor der Einspritzung in die HPLC-Säule durch einen 0,45-μm-Membranfilter (4.5) filtriert. Die Chromatografie gemäß 5.4 durchführen. Standardlösung und Extrakte sind vor direktem Sonnenlicht zu schützen. Falls es nicht möglich ist, die Hydrolysate am selben Tag zu analysieren, können sie bei 5 oC höchstens 3 Tage aufbewahrt werden. 5.4. HPLC-Bestimmung Die folgenden Angaben für eine isokratische Trennung sind Richtwerte; andere Parameter können verwendet werden, sofern sie zu vergleichbaren Ergebnissen führen (siehe auch Bemerkungen 9.1 und 9.2): HPLC-Trennsäule (4.2): 125 × 4 mm, C18, 3 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule Säulentemperatur: Raumtemperatur Mobile Phase (3.22): 3,00 g Essigsäure (3.18) + 900 ml Wasser (3.1) +50,0 ml Lösung (3.21) von 1,1,1-Trichlor-2-methyl-2-propanol (3.19) in Methanol (3.8) (1 g/100 ml). Den pH-Wert mit Ethanolamin (3.20) auf 5,0 einstellen. Mit Wasser (3.1) auf 1 l auffüllen. Durchflussrate: 1 ml/min Gesamtlaufzeit: ca. 34 min Detektionswellenlänge: Anregung: 280 nm, Emission: 356 nm Einspritzvolumen: 20 μl 6. Berechnung der Ergebnisse Die Menge von Tryptophan (X) in g je 100 g Probe wird wie folgt berechnet: A = Peakfläche des internen Standards; Kalibrierstandardlösung (3.17) B = Peakfläche von Tryptophan, Extrakt (5.2) oder Hydrolysat (5.3) V1 = Volumen der konzentrierten Tryptophanlösung (3.15), das der Kalibrierlösung (3.17) zugegeben wurde, in ml (2 ml) c = Konzentration der konzentrierten Tryptophanlösung (3.15), die der Kalibrierlösung (3.17) zugegeben wurde, in μmol/ml (= 2,50) V2 = Volumen der konzentrierten internen Standardlösung (3.16), das bei der Extraktion (5.2) (= 5,00 ml) oder dem Hydrolysat (5.3) (= 2,00 ml) zugegeben wurde, in ml C = Peakfläche des internen Standards, Extrakt (5.2) oder Hydrolysat (5.3) D = Peakfläche von Tryptophan, Kalibrierstandardlösung (3.17) V3 = Volumen der konzentrierten internen Standardlösung (3.16), das der Kalibrierstandardlösung (3.17) zugegeben wurde, in ml (2,00 ml) m = Probeneinwaage (korrigiert auf Originalgewicht, falls getrocknet und/oder entfettet), in g M = Molmasse von Tryptophan (= 204,23 g/mol) 7. Wiederholbarkeit Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 10 % des höheren Werts nicht überschreiten. 8. Ergebnisse eines Ringversuchs Es wurde ein EG-Ringversuch (4. Vergleichstest) durchgeführt, bei dem 3 Proben von bis zu 12 Laboratorien analysiert wurden, um die Hydrolysemethode zu zertifizieren. Jede Probe wurde mehrfach (5-mal) analysiert. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle zusammengefasst: Probe 1 Schweinefutter Probe 2 Schweinefutter mit Zusatz von L-Tryptophan Probe 3 Kraftfutter für Schweine L 12 12 12 n 50 55 50 Mittelwert [g/kg] 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 VKr [ %] 1,9 1,6 1,9 sR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 VKR [ %] 6,3 6,0 2,2 L = Zahl der Laboratorien, die Ergebnisse übermittelt haben n = Zahl der Einzelergebnisse ohne Ausreißer (Ausreißertest von Cochran, Dixon) sr = Standardabweichung der Wiederholbarkeit sR = Standardabweichung der Vergleichbarkeit r = Wiederholbarkeit R = Vergleichbarkeit VKr = Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit, in % VKR = Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit, in % Es wurde ein weiterer EG-Ringversuch (3. Vergleichstest) durchgeführt, bei dem 2 Proben von bis zu 13 Laboratorien analysiert wurden, um die Methode zur Extraktion von freiem Tryptophan zu zertifizieren. Jede Probe wurde mehrfach (5-mal) analysiert. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle zusammengefasst: Probe 4 Mischung aus Weizen und Soja Probe 5 Mischung aus Weizen und Soja (= Probe 4) mit Tryptophan-Zusatz (0,457 g/kg) L 12 12 n 55 60 Mittelwert [g/kg] 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 VKr [ %] 1,34 1,34 sR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 VKR [ %] 4,71 5,11 L = Zahl der Laboratorien, die Ergebnisse übermittelt haben n = Zahl der Einzelergebnisse ohne Ausreißer (Ausreißertest von Cochran, Dixon) sr = Standardabweichung der Wiederholbarkeit sR = Standardabweichung der Vergleichbarkeit r = Wiederholbarkeit R = Vergleichbarkeit VKr = Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit VKR = Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit Es wurde ein weiterer EG-Vergleichstest durchgeführt, bei dem 4 Proben von bis zu 7 Laboratorien analysiert wurden, um die Tryptophan-Hydrolyse zu zertifizieren. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle zusammengefasst. Jede Probe wurde mehrfach (5-mal) analysiert. Probe 1 Schweine mischfuttermittel (CRM 117) Probe 2 Fischmehl mit geringem Fettgehalt (CRM 118) Probe 3 Sojamehl (CRM 119) Probe 4 Magermilch pulver (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Mittelwert [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236 sr [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 VKr [ %] 1,04 1,15 1,30 0,76 sR [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 VKR [ %] 1,48 4,69 4,11 4,22 L = Zahl der Laboratorien, die Ergebnisse übermittelt haben n = Zahl der Einzelergebnisse ohne Ausreißer (Ausreißertest von Cochran, Dixon) sr = Standardabweichung der Wiederholbarkeit sR = Standardabweichung der Vergleichbarkeit r = Wiederholbarkeit R = Vergleichbarkeit VKr = Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit VKR = Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit 9. Bemerkungen 9.1. Mit den folgenden besonderen Chromatografiebedingungen kann eine bessere Trennung von Tryptophan und α-Methyl-Tryptophan erreicht werden. Isokratische Trennung, gefolgt von der Reinigung der Gradientensäule: HPLC-Trennsäule: 125 × 4 mm, C18, 5 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule Säulentemperatur: 32 oC Mobile Phase: A: 0,01 mol/l KH2PO4/Methanol, 95 + 5 (V+V). B: Methanol Gradientenprogramm: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Durchflussrate: 1,2 ml/min Gesamtlaufzeit: ca. 33 min 9.2. Die Durchführung der Chromatografie variiert je nach Art der HPLC und der verwendeten Säulenpackung. Das System muss so gewählt werden, dass eine Grundlinientrennung zwischen Tryptophan und dem internen Standard möglich ist. Die Abbauprodukte müssen deutlich von Tryptophan und dem internen Standard getrennt werden. Zur Untersuchung der Grundlinie unter dem internen Standard auf Verunreinigungen sind Hydrolysate ohne internen Standard zu analysieren. Die Laufzeit muss lang genug sein, dass alle Abbauprodukte eluiert werden, andernfalls können späte Elutionspeaks anschließende Chromatografiedurchgänge beeinträchtigen. Im Betriebsbereich muss das Chromatografiesystem eine lineare Reaktion ergeben. Die lineare Reaktion ist bei einer konstanten (der normalen) Konzentration des internen Standards und unterschiedlichen Tryptophankonzentrationen zu messen. Die Größe des Tryptophan- und des internen Standardpeaks müssen sich innerhalb des linearen Bereichs des HPLC-/Fluoreszenzsystems befinden. Sollten der Tryptophan- und/oder der interne Standardpeak/die internen Standardpeaks zu klein oder zu hoch sein, ist die Analyse mit einer anderen Probengröße und/oder einem anderen Endvolumen zu wiederholen. 9.3. Bariumhydroxid Älteres Bariumhydroxid ist schwerer löslich. Dies kann zur Folge haben, dass die Lösung für die HPLC-Bestimmung nicht klar ist und zu niedrigen Tryptophan-Werten führen kann. H. BESTIMMUNG DES GEHALTS AN ROHÖLEN UND -FETTEN 1. Zweck und Anwendungsbereich Die Methode erlaubt die Bestimmung des Rohöl- und Rohfettgehalts von Futtermitteln. Sie erstreckt sich nicht auf die Analyse von Ölsaaten und Ölfrüchten. Je nach Art und Zusammensetzung des Futtermittels sowie in Abhängigkeit vom Zweck der Untersuchung ist eines der beiden nachstehend beschriebenen Verfahren anzuwenden. 1.1. Verfahren A — Direkt extrahierbare Rohöle und Rohfette Das Verfahren ist anzuwenden bei Futtermittel-Ausgangserzeugnissen pflanzlicher Herkunft mit Ausnahme derjenigen, die in den Anwendungsbereich von Verfahren B fallen. 1.2. Verfahren B — Gesamtgehalt an Rohölen und Rohfetten Das Verfahren ist anzuwenden bei Futtermittel-Ausgangserzeugnissen tierischen Ursprungs und bei allen Mischfuttermitteln. Es ist außerdem bei allen Erzeugnissen anzuwenden, aus denen Öle und Fette ohne vorherige Hydrolyse nicht vollständig extrahiert werden können (z. B. Kleber, Hefen, Kartoffeleiweiß und Erzeugnisse, die Verfahren unterzogen wurden wie Extrudieren,