BERICHTIGUNG FÜR :

Verordnung (EWG) Nr. 2435/86 der Kommission vom 29. Juli 1986 zur Änderung der Verordnung (EWG) Nr. 1470/68 über die Entnahme und Verkleinerung von Proben sowie über die Bestimmung des Gehalts der Ölsaaten an Ölfremdbestandteilen und Feuchtigkeit

Berichtigung der Verordnung (EWG) Nr. 2435/86 der Kommission vom 29. Juli 1986 zur Änderung der Verordnung (EWG) Nr. 1470/68 über die Entnahme und Verkleinerung von Proben sowie über die Bestimmung des Gehalts der Ölsaaten an Ölfremdbestandteilen und Feuchtigkeit

(Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften Nr. L 210 vom 1. August 1986, Seite 55)

Der Anhang VIII der Verordnung (EWG) Nr. 2435/86 wird durch den nachstehenden Anhang VIII ersetzt:

»ANHANG VIII

RAPS- UND RÜBSENSAMEN

Bestimmung des Glukosinolategehalts

1. GEGENSTAND

Dieses Verfahren dient der Bestimmung der Zusammensetzung der wichtigsten Glukosinolate und ihres Gehaltes in Raps- und Rübsensamen.

2. PRINZIP

2.1. Bestimmung von Trimethylsilylabkömmlingen enzymatisch desulfatierter Glukosinolate durch temperaturgesteuerte Gaschromatografie unter Verwendung von Sinigrin als innerem Standard.

2.2. Mit Hilfe dieses Verfahrens können sechs wichtige in Raps- und Rübsensamen enthaltene Glukosinolate sowie zwei in Senfsaat enthaltene Glukosinolate, die als Verunreinigungen vorkommen können, quantitativ - in Mikromol pro Gramm lufttrockene Saat - bestimmt werden.

3. HAUPTREAGENZIEN

3.1. DEÄ-Sephadex A-25

3.2. SP-Sephadex C-25

3.3. Sulfatase Typ H-1

3.4. Allylglukosinolat (Sinigrin)

3.5. Bariumazetat

3.6. Bleiazetat

3.7. Pyridin (zur Silylierung)

3.8. N-Methyl-N-Trimethylsilyl- Heptafluorbutyramid (MSHFBA)

3.9. Trimethylchlorosilan (TMCS)

3.10. 1-Methylimidazol

4. HAUPTAUSRÜSTUNG

4.1. Schwedischer Extraktionszylinder, 70 ml, rostfreier Stahl, am Hals 18 mm innerer Durchmesser, 17 mm Kugellager-Kugeln, Nr. 3 Stopfen aus fluoriertem Silicongummi und horizontale Schüttelvorrichtung (Tröng 1955) oder gleichwertige Schüttelvorrichtung mit Stahlkugeln.

4.2. Hochtourige Kaffeemühle.

4.3. Trockenschrank mit Luftumwälzung.

4.4. Gaschromatograph mit Temperaturprogrammierung und Flammen-Ionisations-Detektor.

4.5. Säule für den Gaschromatographen aus Glas, Länge etwa 2 m, innerer Durchmesser 2 mm, gefuellt mit 2 % OV-07 auf Diatomit CLQ 80-100 mesh.

5. VORBEREITUNG

5.1. Herstellung von DEÄ-Sephadex A-25 in Azetatform und »Pyridin- Azetat"-Form

10 Gramm DEÄ-Sephadex A-25 in ein 250-ml-Becherglas einwiegen, 150 ml Wasser hinzufügen, dann Sephadex über Nacht quellen lassen.

Sephadex in eine 20 × 400 mm-Säule einschlämmen.

500 ml 0,5-N-Natriumhydroxid (10 Gramm in Wasser auflösen und auf 500 ml auffuellen) durch die Säule laufen lassen.

Die Säule mit 250 ml Wasser waschen, um überschüssiges Natriumhydroxid zu entfernen, und auf neutralen pH-Wert prüfen.

Ein Zehntel des Sephadex zur Überführung in die Azetatform entnehmen. In Wasser aufschlämmen und in eine rund 15 × 200 mm-Säule gießen. 100 ml einer 0,5 Mol-Essigsäure (2,9 ml Eisessig auf 100 ml auffuellen) durch die Säule geben. Mit 250 ml Wasser waschen. Zur Aufbewahrung in einen 250-ml-Kolben mit Wasser einschlämmen.

Die verbleibenden 9/10 des Sephadex in der Säule mit Wasser zum Absetzen bringen. 400 ml 0,5 Mol Pyridinazetat (19,8 ml Pyridin plus 15 ml Eisessig mit Wasser auf 500 ml auffuellen) durch die Säule laufen lassen. Mit 250 ml Wasser waschen. Zur Aufbewahrung mit Wasser in einen 250-ml-Kolben einschlämmen. 5.2. Herstellung der Natrium-Form des SP-Sephadex C-25

1 Gramm SP-Sephadex C-25 in einen 100-ml- Becher einwiegen, 75 ml Wasser hinzufügen und das Sephadex über Nacht quellen lassen. Das Sephadex in eine 15 × 200 mm Säule einschlämmen und mit 250 ml Wasser waschen. Zur Aufbewahrung mit Wasser in einen 250-ml-Kolben einschlämmen.

5.3. Reinigung der Sulfatase

70 mg Sulfatase vom Typ H-1 in ein 16 × 150-mm-Reagenzglas einwiegen. 3 ml Wasser zur Auflösung der Sulfatase hinzufügen und mit dem gleichen Volumen Äthanol verdünnen.

Zehn Minuten mit rund 2 000 × g zentrifugieren. Die überstehende Lösung in ein zweites Reagenzglas dekantieren und den Niederschlag verwerfen. 9 ml Äthanol zu der abgegossenen Lösung geben und erneut 10 Minuten lang bei rund 2 000 × g zentrifugieren. Die überstehende Lösung verwerfen und den Niederschlag in 2 ml Wasser auflösen.

In die Spitzen von zwei Pipetten jeweils einen kleinen Stopfen aus Glaswolle stecken.

In die eine Pipette 100 Mikroliter der wäßrigen Lösung geben, die über dem DEÄ-Sephadex A-25 in Azetatform stand. Dann so viel DEÄ-Sephadex A-25 in Azetatform geben, daß eine 15 mm hohe Säule entsteht, die 20 mg trockenem Sephadex entspricht.

In die andere Pipette rund 100 Mikroliter der wäßrigen Lösung geben, die über dem SP-Sephadex C-25 in Natriumform stand. Dazu so viel SP-Sephadex C-25 in Natriumform zufügen, um eine ähnliche Säule zu bilden. Die wäßrige Enzymlösung zuerst über eine Säule, gefuellt mit DEÄ-Sephadex A-25 in Azetatform, und dann über eine Säule, gefuellt mit der SP-Sephadex C-25 in Natriumform, laufen lassen.

Die Sulfatase-Lösung wird später unverdünnt auf die Säulen aus Pipettenspitzen gegeben. Das Eluat bei 20 C aufbewahren und unmittelbar vor Gebrauch auftauen.

5.4. Herstellung des inneren Standards

Allyl- Glukosinolat (Monohydrat, Kaliumsalz)

SC6H 1 1 O5

CH2 = CHCH2 C

NOSO3 K + H2O

Molekulargewicht:

1.2.3 // C // 10 × 12,011 = // 120,110 // H // 18 × 1,008 = // 18,144 // N // 1 × 14,008 = // 14,008 // S // 2 × 32,006 = // 64,132 // O // 10 × 16,000 = // 160,000 // K // 1 × 39,100 = // 39,100 415,494

Zur Herstellung einer Lösung von 1 Mikromol pro ml 41,5 mg einwiegen und auf 100 ml auffuellen.

5.5. Herstellung einer OV-7 Säule für Gaschromatographie

Zuerst die Innenfläche einer Glassäule (4' × 0,25" äusserer Durchmesser, 2 mm innerer Durchmesser) waschen, wobei das eine Ende der Säule mit Hilfe eines Gummischlauchs an eine Wasserstrahlpumpe angeschlossen und schwach gesaugt wird. Durch die Säule 100 ml Chloroform, 100 ml Aceton und 100 ml Petroläther (Siedepunkt 30 - 60 C) saugen. Zum Trocknen Luft durch die Säule saugen und dann im Trockenschrank mit Luftumwälzung trocknen. Das eine Ende mit Glaswolle verstopfen. An dieses Ende der Säule Vakuum anlegen. Durch einen kleinen Trichter, der an das andere Ende der Säule mit Hilfe eines kurzen Tygon-Schlauchs angeschlossen ist, Säulenfuellung 2 % OV-7 auf Diatomit CLQ 80 - 100 mesh, einfuellen. Die Säule vorsichtig klopfen, um das Nachrutschen des Füllmaterials durch die Spiralen zu erleichtern, bis sie gefuellt und gleichmässig gepackt ist. Trichter und Tygon-Schlauch entfernen. Mit Hilfe einer Pasteur-Pipette und eines Gummiballs genügend Füllmaterial ausblasen, um das Ende mit Glaswolle verstopfen zu können.

Die Säule wird mit Hilfe einer Überwurfmutter aus rostfreiem Stahl, einer Graphitdichtung und einer dahinterliegenden Dichtung an den Einspritzblock angeschlossen. Als Trägergas Helium durch die Säule strömen lassen, das Temperaturprogramm von 100 auf 290 C mit einer Anstiegsrate von 1 C pro Minute einstellen und bei 290 C über Nacht in Betrieb lassen. Den Ofen abkühlen lassen und die Säule an den Detektor mit Hilfe einer Überwurfmutter aus rostfreiem Stahl, einer vorne liegenden Graphitdichtung und einer dahinter liegenden Dichtung anschließen.

Eingestellt werden die Temperatur des Einspritzblocks auf 250 C, die Detektortemperatur auf 300 C, die Säulentemperatur auf 200 C, der Helium-Trägergasstrom auf 40 ml pro Minute, der Wasserstoff- und Luftstrom auf 50 bzw. 500 ml pro Minute, um so eine optimale Detektoreinstellung zu erhalten, die Bereichsabschwächung (range) auf 1 und die Ausgangsabschwächung (attenuation) auf 64. 6. VERFAHREN

6.1. Vorbereitung der Proben

Die Entnahme der Ölsaatenproben und die Verkleinerung der Laborproben zu Analyseproben ist gemäß den jeweils in den Anhängen I und II der Verordnung (EWG) Nr. 1470/68 beschriebenen Verfahren durchzuführen.

Mit jeder Probenserie sollte wenigstens einmal eine Standard-Probe der Saat untersucht werden. Die von der Standard-Probe erhaltenen Analysenergebnisse sind zur Kontrolle der Präzision und der Genauigkeit der Methode sehr nützlich.

Ist die Probe feucht, so sind 20 Gramm in einem Trockenschrank mit Luftumwälzung über Nacht bei 45 C zu trocknen, um eine Feuchtigkeit von 7 % zu erreichen.

20 Gramm der getrockneten Saat in einer Kaffeemühle mahlen. Das Öl aus 3 Gramm der gemahlenen Saat mit 40 ml Petroläther (Siedepunkt 30 - 60 C) oder n- Hexan extrahieren unter Verwendung eines »Schwedischen Extraktionszylinders", der 3 Stahlkugeln enthält und mit einem Stopfen aus fluoriertem Silicon verschlossen ist. 45 Minuten in einer horizontalen Schüttelvorrichtung schütteln. Unter Absaugen und Verwendung eines konischen Trichters durch Whatman No. 1 Papier filtrieren und zweimal mit frischem Lösungsmittel waschen. Die Mehlprobe in einem Abzug über Nacht an der Luft trocknen. Klumpen in der trockenen Probe durch Sieben durch ein 280 mm Sieb beseitigen. Mehr als 90 % der Probe müssen das Sieb passieren.

6.2. Inaktivierung der Myrosinase und Extraktion der Glukosinolate

In ein Reagenzglas 100 mg Mehl einwiegen. Das Reagenzglas mit der Probe in einem siedenden Wasserbad (95 C) erhitzen. Nach 2 Minuten 1 ml siedendes Wasser zugeben. Nach weiteren 2 Minuten 1 ml inneren Standard (Allylglukosinolat) zugeben. Die Konzentration des inneren Standards hängt, wie in der nachstehenden Tabelle angegeben, von der Höhe des zu erwartenden Glukosinolatgehalts der Probe ab. Weitere 15 Minuten bei über 95 C erhitzen.

Um den Allylglukosinolatgehalt der Originalprobe zu bestimmen, wird in einer zweiten Bestimmung kein innerer Standard zugegeben.

Die Lösung abkühlen und 100 ml einer Lösung zugeben, die 0,5 mol Bariumacetat und 0,5 mol Bleiacetat pro Liter Wasser enthält und mischen. Mit 2 000 × g zentrifugieren. Die überstehende Lösung aufbewahren.

1.2.3 // // // // Glukosinolatgehalt (mmol/g Saat) // Konzentration des inneren Standards (mmol/ml) // Extraktmenge, die auf das Sephadex gegeben wird (ml) // // // // < 15 // 1 // 1,0 // 15 - 40 // 2 // 0,5 // > 40 // 3 // 0,2 // // //

6.3. Herstellung der DEÄ-Sephadex A-25 Mikrosäulen

Geeignete Säulen können aus 1 ml Pipettenspitzen aus Kunststoff oder aus verkürzten Pasteur-Pipetten hergestellt werden. In das untere Ende der »Minisäule" einen kleinen Stopfen aus Glaswolle stecken und mit Wasser waschen (1 ml). Eine Suspension des DEÄ-Sephadex A-25 (Pyridinacetat-Form), die 20 mg trockenem Sephadex entspricht, zugeben. Das wird in einfacher Weise erreicht, indem man das vorher bestimmte Volumen einer (gut durchmischten) Suspension zugibt. Das Gel absetzen lassen und mit Wasser waschen.

Auf die Säule die überstehende Lösung von der Barium/Blei-Behandlung geben. Ablaufen lassen und die Säule mit 1 ml Wasser, danach mit 1 ml Pyridinacetat (0,02 M) waschen. Ablaufen lassen, dann auf die Säule 50 Mikroliter gereinigte Sulfatase- Lösung geben und über Nacht bei Raumtemperatur stehen lassen. Die Desulfoglukosinolate mit Wasser eluieren (3 × 0,5 ml).

6.4. Derivatisierung der Desulfoglukosinolate

Das Silylierungsreagenz durch Mischen von MSHFBA (100 ml), TMCS (10 ml) und verdünntem 1-Methylimidazol (50 ml) herstellen. Das verdünnte 1-Methylimidazol wird hergestellt aus 1-Methylimidazol (50 ml) und Aceton (950 ml).

Eine Probe des Eluats der Desulfoglukosinolate in einem Spitzgläschen, das gut verschlossen werden kann, trocknen. Kleine Mengen (5 - 10 ml) können durch 10minütiges Erhitzen bei 120 C getrocknet werden. Andernfalls im Vakuumexsikkator über P2O5 trocknen. Zu der getrockneten Probe das gleiche Volumen Silylierungsreagenz geben und das Spitzgläschen verschließen. Um die Derivatisierung zu Ende zu führen, das Spitzgläschen 5 Minuten bei 120 C erhitzen.

6.5. Gaschromatographische Trennung der derivatisierten Desulfoglukosinolate

2 ml auf die OV-7 Säule geben, die Temperatur 5 Minuten bei 200 C halten und dann das Temperaturprogramm von 200 auf 280 C mit einer Anstiegsrate von 5 C pro Minute einstellen. 15 Minuten bei der Endtemperatur halten.

Peakflächen ermitteln für:

3-Butenylglukosinolat, 4-Pentenylglukosinolat, 2-Hydroxy-3-butenylglukosinolat, 2-Hydroxy-4-pentenylglukosinolat, Indolyl-3-methylglukosinolat, 4- Hydroxyindolyl-3-methylglukosinolat und soweit vorhanden Allylglukosinolat, 4-Hydroxybenzylglukosinolat. Wenn Proben mit einer breiten Glukosinolatzusammensetzung analysiert werden sollen oder wenn die Untersuchungen nach einer Pause von einigen Stunden aufgenommen werden, sind wiederholte Einspritzungen erforderlich, um zu konstanten Ergebnissen zu gelangen.

Temperaturprogrammierte gaschromatographische Trennung von derivatisierten Desulfoglukosinolaten

(1) Allyl-,

(2) 3-Butenyl-,

(3) 4-Pentenyl-,

(4) 2- Hydroxy-3-Butenyl-,

(5) 2-Hydroxy-4-Pentenyl-,

(6) Saccharose,

(7) Benzyl-,

(8) 4-Hydroxybenzyl,

(9) 4-Hydroxyindolyl-3-Methyl-.

6.6. Quantitative Bestimmung

Die erste Aufgabe ist die Bestimmung der Peakfläche des Allylglukosinolats, das, soweit vorhanden, auf eine Verunreinigung zurückzuführen ist.

Die Peakfläche des Allylglukosinolats aus der Analyse ohne inneren Standard wird normalisiert unter Verwendung der Peakflächen des 2-Hydroxy-3-butenylglukosinolats aus den beiden Analysen mit und ohne inneren Standard:

1.2.3.4.5 // Fläche des Allylglukosinolat TMS (ohne inneren Standard) // × // Fläche des 2-Hydroxy-3-butenyl- glukosinolat TMS (mit innerem Standard) Fläche des 2-Hydroxy-3-butenyl- glukosinolat TMS (ohne inneren Standard) // = // Fläche des Allylglukosinolat TMS aus der Verunreinigung

Die zweite Aufgabe besteht darin, die Peakfläche des Allylglukosinolats, die dem inneren Standard zuzuordnen ist, zu bestimmen. Das vorstehende Ergebnis wird von der Gesamtfläche des Allylglukosinolats aus der Analyse mit innerem Standard subtrahiert:

1.2.3.4.5 // Fläche des Allylglukosinolat TMS (mit innerem Standard) // - // Fläche des Allylglukosinolat TMS aus der Verunreinigung // = // Fläche des Allylglukosinolat TMS vom zugesetzten inneren Standard

Die Peakflächen der einzelnen Glukosinolat TMS-Derivate, die bei der Analyse mit zugesetztem inneren Standard erhalten wurden, werden jeweils durch die dem Allylglukosinolat als innerem Standard zuzuordnende Fläche dividiert. Sie werden dann multipliziert mit den Mikromolen Allylglukosinolat, die pro Gramm ölfreies, lufttrockenes Mehl zugesetzt wurden, um die Mikromole Glukosinolat pro Gramm ölfreies lufttrockenes Mehl zu erhalten:

1.2.3.4.5 // Fläche des Glukosinolat TMS Fläche des Allylglukosinolat TMS vom zugesetzten inneren Standard // × // mmol Allylglukosinolat g ölfreies, lufttrockenes Mehl // = // mmol Glukosinolat g ölfreies, lufttrockenes Mehl

Für die Angabe der Ergebnisse auf der Basis lufttrockene Saat gilt:

1.2.3.4.5 // mmol Glukosinolat g ölfreies lufttrockenes Mehl // × // 100 - % Öl 100 // = // mmol Glukosinolat g lufttrockene Saat

7. DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

Die Gehalte an 3-Butenylglukosinolat, 4-Pentenylglukosinolat, 2- Hydroxy-3-Butenylglukosinolat, 2-Hydroxy-4-Pentenylglukosinolat, Indolyl-3-Methylglukosinolat und 4- Hydroxyindolyl-3-Methylglukosinolat werden addiert und als Summe angegeben. Sofern Allylglukosinolat und 4-Hydroxybenzyl-Glukosinolat vorkommen, werden sie getrennt aufgeführt als Hinweis auf eine Verunreinigung mit Senfsaat oder anderen Unkrautsamen aus der Gruppe der Cruciferen.

Die Ergebnisse werden in mmol pro Gramm lufttrockene Saat als Mittelwert von Doppelbestimmungen und unter Angabe des Bereiches R angegeben (R = höherer Wert minus niedrigerer Wert der Doppelbestimmung)."