VERORDNUNG (EG) Nr. 1081/96 DER KOMMISSION vom 14. Juni 1996 zur Festlegung einer Referenzmethode für den Nachweis von Kuhmilch und Kasein in Käse aus Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch oder Mischungen von Schaf-, Ziegen- und Büffelmilch sowie zur Aufhebung der Verordnung (EWG) Nr. 690/92

DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN -

gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Gemeinschaft,

gestützt auf die Verordnung (EWG) Nr. 804/68 des Rates vom 27. Juni 1968 über die gemeinsame Marktorganisation für Milch und Milcherzeugnisse (1), zuletzt geändert durch die Verordnung (EG) Nr. 2931/95 der Kommission (2), insbesondere auf Artikel 9 Absatz 3, Artikel 16 Absätze 1 und 4 und Artikel 17 Absatz 14,

in Erwägung nachstehender Gründe:

Für die private Lagerhaltung von Schafkäse kann gemäß der Verordnung (EWG) Nr. 508/71 des Rates vom 8. März 1971 zur Festlegung der Grundregeln von Beihilfen für die private Lagerhaltung von lagerfähigen Käsesorten (3) eine Beihilfe gewährt werden. Für diese Erzeugnisse kann gemäß Artikel 17 der Verordnung (EWG) Nr. 804/68 außerdem eine besondere Erstattung gewährt werden. Für die Einfuhr von Käse aus Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch oder aus Gemischen von Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch aus bestimmten Drittländern in die Gemeinschaft gelten Präferenzregelungen.

Aufgrund des Bestehens der vorgenannten Vorschriften für Käse aus Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch oder aus Gemischen von Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch, muß im Wege geeigneter Kontrollen nachgewiesen werden, daß dem betreffenden Erzeugnis keine Kuhmilch zugesetzt wurde. Es empfiehlt sich, eine gemeinschaftliche Referenzmethode für den Kuhmilchnachweis festzulegen, die auch mit Routineverfahren durchgeführt werden kann, sofern sie bestimmte Kriterien erfuellen.

Die Referenzmethode für Käse aus Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch oder aus Gemischen von Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch ersetzt die Referenzmethode gemäß der Verordnung (EWG) Nr. 690/92 der Kommission (4), die daher aufgehoben werden kann.

Die in dieser Verordnung vorgeschlagenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des Verwaltungsausschusses für Milch und Milcherzeugnisse -

HAT FOLGENDE VERORDNUNG ERLASSEN:

Artikel 1

Damit gewährleistet ist, daß ausschließlich aus Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch oder aus Gemischen von Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch herzustellender Käse kein Kuhmilchkasein enthält, ist für die Untersuchung die im Anhang beschriebene Referenzmethode anzuwenden.

Das Vorhandensein von Kuhmilchkasein gilt als nachgewiesen, wenn der festgestellte Kuhmilchkaseingehalt der Analyseprobe gleich dem Gehalt der im Anhang beschriebenen, 1 % Kuhmilch enthaltenden Referenzprobe oder größer ist.

Artikel 2

Zum Nachweis von Kuhmilchkasein in Käse der in Artikel 1 genannten Kategorien dürfen Routineverfahren verwendet werden, wenn sie folgende Bedingungen erfuellen:

- die Nachweisgrenze darf höchstens 0,5 % betragen;

- es dürfen keine falsch-positiven Befunde erzielt werden; ist dies nicht auszuschließen, so muß jede positiv reagierende Probe nochmals mit der Referenzmethode analysiert werden;

- ausreichende Empfindlichkeit zum Nachweis von Kuhmilchkasein auch nach langer Reifezeit entsprechend den Gepflogenheiten des Handels; wird diese Bedingung für eine bestimmte Käseart der in Artikel 1 genannten Kategorien nicht erfuellt, so muß diese Käseart mit Hilfe der Referenzmethode analysiert werden.

Artikel 3

Die Verordnung (EWG) Nr. 690/92 wird aufgehoben. Die Verweise auf die Verordnung (EWG) Nr. 690/92 gelten als Verweise auf diese Verordnung.

Artikel 4

Diese Verordnung tritt am dritten Tag nach ihrer Veröffentlichung im Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften in Kraft.

Sie gilt ab 1. Oktober 1996.

Diese Verordnung ist in allen ihren Teilen verbindlich und gilt unmittelbar in jedem Mitgliedstaat.

Brüssel, den 14. Juni 1996

Für die Kommission

Franz FISCHLER

Mitglied der Kommission

(1) ABl. Nr. L 148 vom 28. 6. 1968, S. 13.

(2) ABl. Nr. L 307 vom 20. 12. 1995, S. 10.

(3) ABl. Nr. L 58 vom 11. 3. 1971, S. 1.

(4) ABl. Nr. L 74 vom 20. 3. 1992, S. 23.

ANHANG

REFERENZMETHODE ZUM NACHWEIS VON KUHMILCHKASEIN IN KÄSE AUS SCHAF-, ZIEGEN- ODER BÜFFELMILCH ODER AUS GEMISCHEN VON SCHAF-, ZIEGEN- ODER BÜFFELMILCH

1. Zweck

Diese Arbeitsvorschrift beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Kuhmilchkasein in Käse aus Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch oder aus Gemischen von Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch mit Hilfe der isoelektrischen Fokussierung der ã-Kaseine nach Plasminolyse.

2. Anwendungsbereich

Dieses Verfahren dient dem empfindlichen und spezifischen Nachweis von Kuhmilchkasein in frischem und gereiftem Käse aus Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch oder aus Gemischen von Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch. Es ist ungeeignet für den Nachweis von Milch- und Käsefälschung durch hitzebehandeltes Rindermolkenkonzentrat.

3. Kurzbeschreibung

3.1. Isolierung des Kaseins aus Käse und Referenzproben.

3.2. Lösen des isolierten Kaseins und Plasminspaltung (EC.3.4.21.7).

3.3. Isoelektrische Fokussierung der plasminbehandelten Kaseine in Anwesenheit von Harnstoff und Anfärben der Proteine.

3.4. Auswertung durch Vergleich der gefärbten ã3- und ã2-Kaseinbanden (Kuhmilchnachweis) zwischen der zu bestimmenden Probe und der im selben Gel laufenden, 0 % und 1 % Kuhmilch enthaltenden Referenzproben.

4. Reagenzien

Soweit nicht anders angegeben, sind analysenreine Reagenzien zu verwenden. Das Wasser muß bidestilliert oder von entsprechender Reinheit sein.

Hinweis: Die folgenden Angaben gelten im Labor hergestellte harnstoffhaltige Polyacrylamidgele im Format 265 × 125 × 0,25 mm. Bei Verwendung anderer Gelrezepturen und -formate müssen die Elektrophoresebedingungen gegebenenfalls angepaßt werden.

Isoelektrische Fokussierung

4.1. Reagenzien zur Herstellung der harnstoffhaltigen Polyacrylamidgele.

4.1.1. Gelstammlösung

4,85 g Acrylamid

0,15 g N, N-Methylen-bis-acrylamid (BIS)

48,05 g Harnstoff

15,00 g Glycerin (87 % w/w)

ad 100 ml H2O lösen, auf 100 ml auffuellen, in Braunglasflaschen überführen und im Kühlschrank aufbewahren.

Hinweis: Statt der angegebenen Festeinwaagen der neurotoxischen Acrylamide kann vorzugsweise eine der handelsüblichen Acrylamid-Fertiglösungen verwendet werden. Bei einer solchen Lösung mit 30 % (w/v) Acrylamid und 0,8 % (w/v) BIS müssen anstelle der Festeinwaagen 16,2 ml für die oben angegebene Rezeptur eingesetzt werden. Die Haltbarkeit der Gelstammlösung beträgt maximal 10 Tage. Beträgt die Leitfähigkeit mehr als 5 mS, wird die Lösung mit 2 g Amberlite MB-3 versetzt, unter Rühren 30 Minuten lang entionisiert und dann membranfiltriert (0,45 mm).

4.1.2. Gellösung

Aus der Gelstammlösung (siehe 4.1.1) wird durch Versetzen mit verschiedenen Ampholyten und Additiven eine Gellösung hergestellt.

9,0 ml Gelstammlösung

24 mg ß-Alanin500 ìl Ampholyt pH 3,5-9,5 (1)

250 ìl Ampholyt pH 5-7 (2)

250 ìl Ampholyt pH 6-8 (3).

Die Gellösung wird durchmischt und 2 bis 3 Minuten im Ultraschallbad oder im Vakuum entgast.

Hinweis: Gellösung erst unmittelbar vor dem Gießen (siehe 6.2) ansetzen.

4.1.3. Katalysatorlösungen

4.1.3.1. TEMED: N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamin

4.1.3.2. 40 % (w/v) PER: Ammoniumpersulfat

800 mg PER werden mit Wasser versetzt und auf 2 ml aufgefuellt.

Hinweis: PER-Lösung stets frisch ansetzen.

4.2. Kontaktfluessigkeit

Kerosin oder n-Decan.

4.3. Anodenfluessigkeit

5,77 g Phosphorsäure (85 % w/w) mit Wasser auf 100 ml auffuellen.

4.4. Kathodenfluessigkeit

2,00 g Natriumhydroxid in Wasser lösen und mit Wasser auf 100 ml auffuellen.

Probenvorbereitung

4.5. Reagenzien zur Proteinisolierung

4.5.1. Verdünnte Essigsäure (25,0 ml Eisessigsäure mit Wasser auf 100 auffuellen)

4.5.2. Dichlormethan

4.5.3. Aceton

4.6. Protein-Lösungspuffer

5,75 g Glycerin (87 % w/w)

24,03 g Harnstoff

250 mg Dithiothreitol

in destilliertem Wasser lösen und auf 50 ml auffuellen.

Hinweis: Im Kühlschrank höchstens 1 Woche haltbar.

4.7. Reagenzien für die Plasminspaltung des Kaseins

4.7.1. Ammoniumcarbonatpuffer

0,2 mol/l NH4HCO3-Lösung (1,58 g/100 ml Wasser), die mit 0,05 mol/l Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA 1,46 g/100 ml) versetzt wurde, wird mit 0,2 mol/l (NH4)2CO3-Lösung (1,92 g/100 ml Wasser), die mit 0,05 mol/l EDTA versetzt wurde, auf pH 8 titriert.

4.7.2. Kälberlab (EC 3.4.21.7), Labstärke mindestens 5 U/ml

4.7.3. å-Aminocapronsäure zur Enzyminaktivierung

2,624 g å-Aminocapronsäure (6-Amino-n-Hexansäure) werden in 100 ml 40%igem Ethanol (v/v) gelöst.

4.8. Standardproben

4.8.1. Zertifizierte Standardproben eines Gemischs von mit Lab versetztem Schaf- und Ziegen-Magermilchpulver, das jeweils 0 % und 1 % Kuhmilch enthält, ist erhältlich beim Kommissionsinstitut für Referenzmaterialien und Meßwesen, B-2440 Geel, Belgien.

4.8.2. Ansetzen der Interim-Standardproben von labversetzter Büffelmilch mit 0 % bzw. 1 % Kuhmilch.

Zur Gewinnung von Magermilch wird eine rohe Büffel- bzw. Kuhsammelmilch bei einer Temperatur von 37 °C und einer Drehzahl von 2 500 g 20 Minuten lang zentrifugiert. Nach raschem Abkühlen des Zentrifugenbechers nebst Inhalt auf 6 bis 8 °C wird die Fettschwimmschicht restlos entfernt. Zum Ansetzen der 1%igen Standardprobe werden 495 ml Büffelmagermilch in einem 1-l-Becherglas mit 5,00 ml Kuhmagermilch versetzt und durch Zusetzen verdünnter Milchsäure (10 % w/v) auf einen pH-Wert von 6,4 eingestellt. Die Probe wird auf 35 °C angewärmt, mit 100 ml Kälberlab versetzt (Labstärke 1:10 000; ca. 3 000 U/ml), eine Minute gerührt und in einem mit Alufolie abgedeckten Becher eine Stunde bei 35 °C bis zum Gerinnen stehen gelassen. Anschließend wird die gesamte dickgelegte Milchprobe ohne vorheriges Homogenisieren oder Abscheiden der Molke gefriergetrocknet. Nach dem Gefriertrocknen wird das Produkt gleichmäßig vermahlen. Zum Ansetzen der 0%igen Standardprobe wird das gleiche Verfahren mit 500 ml reiner Büffelmagermilch durchgeführt. Die Standardproben sind bei - 20 °C aufzubewahren.

Hinweis: Es ist ratsam, die Reinheit der Büffelmilch durch isoelektrische Fokussierung der plasminbehandelten Kaseine vor dem Ansetzen der Standardproben zu prüfen.

Reagenzien zur Proteinfärbung

4.9. Fixierlösung

150 g Trichloressigsäure wird in Wasser gelöst und auf 1 000 ml aufgefuellt.

4.10. Entfärbelösung

500 ml Methanol und 200 ml Eisessig werden mit destilliertem Wasser auf 2 000 ml aufgefuellt.

Hinweis: Die Entfärbelösung ist jeden Tag frisch anzusetzen; sie kann zweckmäßigerweise aus Vorratslösungen 50 % (v/v) Methanol und 20 % (v/v) Eisessig durch Mischen gleicher Volumina zubereitet werden.

4.11. Färbelösungen

4.11.1. Färbelösungen (Vorratslösung 1)

3,0 g Coomassie Brilliant Blau G 250 (C.I. 42655) werden in 1 000 ml 90%igem Methanol unter Verwendung eines Magnetrührers gelöst (ca. 45 Minuten); die Lösung wird durch zwei mittelschnelle Faltenfilter filtriert.

4.11.2. Färbelösung (Vorratslösung 2)

5,0 g Kupfersulfatpentahydrat (CuSO4 75H2O) werden in 1 000 ml 20%iger Essigsäure gelöst.

4.11.3. Färbelösung (gebrauchsfertig)

Unmittelbar vor dem Färben werden jeweils 125 ml der Vorratslösung (4.11.1, 4.11.2) miteinander vermischt.

Hinweis: Die Färbelösung ist am Tag des Ansetzens aufzubrauchen.

5. Geräte und Hilfsmittel

5.1. Glasplatten (265 × 125 × 4 mm); Gummiroller mit Walzenbreite von 15 cm; Nivelliertisch

5.2. Gelträgerfolie (265 × 125 mm)

5.3. Gegenfolie aus Polyester (280 × 125 mm). Beide Längsseiten werden mit je einem Prägebandstreifen (280 × 6 × 0,25 mm) abgeklebt (Abbildung 1).

5.4. Elektrofokussierkammer mit Kühlplatte (z. B. 265 × 125 mm) mit geeignetem Spannungsgeber (≥ 2,5 kV) oder Elektrophoreseautomat

5.5. Umlaufkryostat, thermostatregelbar auf 12 ± 0,5 °C

5.6. Zentrifuge, einstellbar auf 3 000 g

5.7. Elektrodenstreifen (≥ 265 mm lang)

5.8. Tropfflaschen aus Kunststoff, für Anoden- und Kathodenlösung

5.9. Probenapplikatoren 10 × 5 mm (Viskose oder Filterpapier mit geringer Proteinadsorption)

5.10. Scheren, Skalpelle und Pinzetten aus Edelstahl

5.11. Färbe- und Entfärbeschalen aus Edelstahl oder Glas (z. B. Instrumentenschalen 280 × 150 mm)

5.12. Regelbarer Homogenisierstab (Schaftdurchmesser 10 mm), Drehzahlbereich 8 000-20 000 min-15.13. Magnetrührer

5.14. Ultraschallbad

5.15. Folienschweißgerät

5.16. Mikroliterpipetten 5-25 ìl

5.17. Vakuumzentrifuge oder Gefriertrockner

5.18. Thermostatregelbares Wasserbad, einstellbar auf 35 und 40 ± 1 °C, mit Schüttelvorrichtung

5.19. Densitometerausrüstung, Registrierung bei ë=634 nm

6. Verfahren

6.1. Probenvorbereitung

6.1.1. Kaseinisolierung

Die einer Trockenmasse von ca. 5 g entsprechende Menge Käse oder Standardprobe wird in ein 100-ml-Zentrifugenröhrchen eingewogen, mit 60 ml Wasser versetzt und mit einem Stabhomogenisator (8 000-10 000 U/min-1) homogenisiert. Das Homogenisat wird mit verdünnter Essigsäure (4.5.1) auf einen pH-Wert von 4,6 eingestellt und 5 Minuten bei 3 000 g zentrifugiert. Fette und Molke werden dekantiert und der Rückstand in 40 ml destilliertem Wasser, das mit verdünnter Essigsäure (4.5.1) auf einen pH-Wert von 4-5 eingestellt wurde, homogenisiert (20 000 U/min-1), mit 20 ml Dichlormethan (4.5.2) versetzt, nochmals homogenisiert und dann zentrifugiert (5 Minuten bei 3 000 g). Die zwischen wäßriger und organischer Phase schwimmende Kaseinschicht wird mit einem Spatel angehoben, damit beide Phasen dekantiert werden können. Das Kasein wird nochmals in 40 ml destilliertem Wasser (siehe oben) und 20 ml Dichlormethan homogenisiert und zentrifugiert. Dieser Vorgang ist so oft zu wiederholen, bis beide Extraktionsphasen farblos sind (zwei- bis dreimal). Der Proteinrückstand wird mit 50 ml Aceton (4.5.3) homogenisiert und über ein mittelschnelles Faltenpapierfilter abfiltriert. Das Filterretentat wird zweimal mit je 25 ml Aceton gewaschen, an der Luft oder im Stickstoffstrom trocknen gelassen und in einer Reibschale fein zerrieben.

Hinweis: Trockene Kaseinisolate sind bei -20 °C aufzubewahren.

6.1.2. Plasminspaltung derß ß-Kaseine zur Anreicherung der ã-Kasein-Konzentration

25 mg Kaseinisolat (6.1.1) werden in 0,5 ml Ammoniumcarbonatpufferlösung (4.7.1) suspendiert und 20 Minuten z. B. im Ultraschallbad homogenisiert. Das Homogenisat wird auf 40 °C erwärmt, mit 10 ìl Plasmin (4.7.2) versetzt, durchmischt und eine Stunde bei 40 °C unter ständigem Schütteln bebrütet. Zur Enzyminhibierung werden 20 ml å-Aminocapronsäurelösung (4.7.3), danach 200 mg fester Harnstoff und 2 mg Dithiothreitol zugesetzt.

Hinweis: Zur Verbesserung der Symmetrie der fokussierten Kaseinbanden empfiehlt es sich, die Lösung nach Zusatz von å-Aminocapronsäure gefrierzutrocknen und den Probenrückstand in 0,5 ml Harnstoffpufferlösung (4.6) zu lösen.

6.2. Herstellen der harnstoffhaltigen Polyacrylamidgele

Auf eine Glasplatte (5.1) die Gelträgerfolie (5.2) mit Hilfe einiger Tropfen Wasser aufwalzen, ausgetretenes Wasser entfernen. In gleicher Weise die mit Abstandshaltern (0,25 mm) versehene Gegenfolie (5.3) auf eine weitere Glasplatte aufwalzen. Diese dann auf einem Nivelliertisch horizontal ausrichten.

Die frisch angesetzte, entgaste Gellösung (4.1.2) wird mit je 10 ml der Katalysatorlösungen TEMED und PER (4.1.3.1) versetzt, kurz durchmischt und gleichmäßig auf die Mitte der Gegenfolie ausgegossen. Die Gelträgerplatte (Folienseite nach unten zeigend) wird mit einer Kante auf die nivellierte Gegenfolienplatte aufgesetzt und so langsam abgesenkt, daß sich zwischen den Folien ein Gelfilm bilden und sich gleichmäßig und blasenfrei ausbreiten kann (Abbildung 3). Gelträgerfolienplatte mit Hilfe eines dünnen Spatels vollständig aufsetzen lassen und drei weitere Glasplatten als Andruckgewichte auflegen. Nach vollständiger Polymerisierung (ca. 60 Minuten) wird das auf der Gelträgerfolie anpolymerisierte Gel mitsamt Gegenfolie durch Verkanten der Glasplatten herausgelöst. Die Rückseite der Trägerfolie wird sorgfältig von Gelresten und Harnstoff gesäubert. Das "Gelsandwich" wird nun in einen Folienschlauch eingeschweißt und im Kühlschrank (maximal 6 Wochen) aufbewahrt.

Hinweis: Die Gegenfolie mit den Abstandshaltern kann wiederverwendet werden. Das Polyacrylamidgel kann auf kleinere Formate zurechtgeschnitten werden, was bei kleinem Probenumfang oder bei Verwendung eines Elektrophoreseautomaten zu empfehlen ist (2 Gele im Format 4,5 × 5 cm).

6.3. Isoelektrische Fokussierung

Der Kühlthermostat wird auf 12 °C eingestellt. Nach Abwischen der Gelträgerfolienrückseite mit Kerosin (4.2) werden einige Tropfen Kerosin auf die Mitte des Kühlblocks aufgebracht. Das "Gelsandwich" wird mit der Trägerseite nach unten blasenfrei aufgewalzt. Ausgetretenes Kerosin wird abgewischt und die Gegenfolie abgezogen. Die Elektrodenstreifen werden mit den entsprechenden Elektrodenlösungen (4.3, 4.4) getränkt, auf die Gellänge zugeschnitten und auf die dafür vorgesehenen Stellen gelegt (Elektrodenabstand 9,5 cm).

Die Fokussierung ist unter folgenden Bedingungen durchzuführen:

6.3.1. Gelformat 265 × 125 × 0,25 mm

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

Hinweis: Bei Änderung der Dicke oder Breite der Gele sind Strom und Leistung entsprechend anzupassen (z. B. Verdopplung von Stromstärke und Leistung bei Verwendung eines 0,5 mm dicken Gels im Format von 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2. Beispiel eines Spannungsprogramms für einen Elektrophoreseautomaten (2 Gele je 5,0 × 4,5 cm); Elektroden ohne Elektrodenstreifen direkt auf das Gel aufbringen.

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

Probenapplikator aufsetzen bei Schritt 2 bei 0 Vh.

Probenapplikator abnehmen bei Schritt 2 bei 30 Vh.

6.4. Proteinanfärbung

6.4.1. Fixieren der Proteine

Unmittelbar nach Abschalten des Stroms werden die Elektrodenstreifen entfernt. Das Gel wird sofort in eine mit 200 ml Fixierlösung (4.9) gefuellte Färbe- und Entfärbeschale überführt und 15 Minuten geschüttelt.

6.4.2. Waschen und Färben der Gelplatte

Die Fixierlösung wird restlos abgegossen und die Gelplatte zweimal für je 30 Sekunden mit 100 ml Entfärbelösung (4.10) gespült. Spüllösung abgießen, 250 ml Färbelösung (4.11.3) in die Schale fuellen und 45 Minuten unter gelegentlichem Schütteln färben.

6.4.3. Entfärben der Gelplatte

Die Färbelösung wird abgegossen, die Gelplatte zweimal mit je 100 ml Entfärbelösung (4.10) gespült und anschließend mindestens 2 × 15 Minuten in 200 ml Entfärbelösung geschwenkt, bis der Hintergrund klar und farblos ist. Die Gelplatte wird dann mit destilliertem Wasser (2 × 2 Minuten) gespült und an der Luft (2 bis 3 Stunden) oder mit dem Fön (ca. 10 bis 15 Minuten) getrocknet.

Hinweis 1: Fixieren, Waschen, Färben und Entfärben bei 20 °C durchführen. Hohe Temperaturen sind zu vermeiden.

Hinweis 2: Wird einer empfindlicheren Silberfärbelösung (z. B. Silberfärbelösungs-Kit, Protein Pharmacia Biotech, Code Nr. 17-1150-01) der Vorzug gegeben, so sind die plasminbehandelten Kaseinproben auf 5 mg/ml zu verdünnen.

7. Auswertung

Die Auswertung erfolgt durch Vergleich der Proteinbandenmuster der zu beurteilenden Probe mit Referenzproben auf dem gleichen Gel. Der Nachweis von Kuhmilch in Käse aus Schaf-, Ziegen- und Büffelmilch oder aus Gemischen von Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch wird vorzugsweise über die ã2- und ã3-Kaseine geführt, deren isoelektrische Punkte zwischen pH 6,5 und pH 7,5 liegen (Abbildungen 4a, 4b und 5). Die Nachweisgrenze des Verfahrens liegt unter 0,5 %.

7.1. Visuelle Bestimmung

Zur visuellen Bestimmung des Kuhmilchanteils ist es ratsam, die Konzentration der Proben und der Standardproben auf die gleiche Stärke der Schaf-, Ziegen- und/oder Büffel-ã2 und ã3-Kaseine einzustellen (siehe "ã2S, Z, B" und "ã3S, Z, B" in den Abbildungen 4a, 4b und 5). Nur dann kann der Kuhmilchgehalt (kleiner, gleich oder größer als 1 %) in der zu beurteilenden Probe durch direkten Vergleich der Stärken der Rinder-ã2 und ã3-Kaseinzonen (siehe "ã3C" und "ã2C" in den Abbildungen 4a, 4b und 5) mit denen der 0 %- und 1 %-Standardproben (Schaf, Ziege) oder laboreigenen Interims-Standardproben (Büffelmilch) bestimmt werden.

7.2. Densitometrische Messung

Nach Möglichkeit ist mit Hilfe eines Densitometers (5.19) das Peakflächenverhältnis der ã2- und ã3-Kaseine (siehe Abbildung 5) zwischen Rind und Schaf, Ziege und/oder Büffel zu ermitteln. Dieser Wert ist mit dem ã2- und ã3-Kasein-Peakflächenverhältnis der 1%igen Standardprobe (Schaf, Ziege) oder der im selben Gel laufenden laboreigenen Interims-Standardprobe (Büffel) zu vergleichen.

Hinweis: Reagiert die 1 % Kuhmilch enthaltende Standardprobe eindeutig positiv sowohl auf ã2- als auch auf ã3-Kaseine, die 0%ige Standardprobe dagegen nicht, so liefert die Methode zuverlässige Ergebnisse. Andernfalls ist das Verfahren unter genauer Beachtung der Verfahrensvorschrift zu optimieren.

8. Literatur

1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of ã2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

2. Addeo F., Nicolai M. A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

3. Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholyte/immobilized pH gradient - isoelectric focusing of ã2-caseins using plasmin as signal amplifier. In: Electrophoresis-Forum '89 (B. J. Radola, ed.) SS. 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

4. Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

5. Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Z. Lebensm. Unters. Forsch. (in Vorbereitung).

6. Radola B. J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 mm polyacrylamide gels on silanized glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

>VERWEIS AUF EINEN FILM>

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Gegenfolie Abstandshalter (Dymoband) Polyesterfolie

>VERWEIS AUF EINEN FILM>

Abbildung 2: Kaseinschwimmschicht zwischen wäßriger und organischer Phase nach dem Zentrifugieren H2O-Phase Kasein CH2Cl2-Phase

>VERWEIS AUF EINEN FILM>

Abbildung 3: Klapptechnik zur Herstellung ultradünner Polyacrylamidgele

a = Abstandshalter (0,25 mm); b = Gegenplatte (5.3); c, e = Glasplatten (5.1); d = Gellösung (4.1.2); f = Gelträgerplatte (5.2)

>VERWEIS AUF EINEN FILM>

Abbildung 4a: Isoelektrische Fokussierung plasminbehandelter Kaseine von Schaf- und Ziegenmilchkäse mit unterschiedlichem Kuhmilchgehalt.

% CM = Kuhmilchgehalt K = Kuh, S = Schaf, Z = Ziege.

Abgebildet ist die obere Hälfte des IEF-Gels.

>VERWEIS AUF EINEN FILM>

Abbildung 4b: Isoelektrische Fokussierung plasminbehandelter Kaseine von Käse, der aus Gemischen von Schaf-, Ziegen- und Büffelmilch mit unterschiedlichem Kuhmilchgehalt hergestellt wurde.

% CM = Kuhmilchgehalt, 1+ = Probe mit 1 % Kuhmilchgehalt, der in der Mitte des Durchlaufs reines Rinderkasein zugesetzt wurde. K = Kuh, S = Schaf, Z = Ziege, B = Büffel.

Abgebildet ist der gesamte Trennungsabstand des IEF-Gels.

>VERWEIS AUF EINEN FILM>

Abbildung 5: Densitogrammreihe der Standardproben und Käseproben aus Gemischen von Schaf- und Ziegenmilch nach isoelektrischer Fokussierung. Bei a und b handelt es sich um Standardproben mit 0 bzw. 1 % Kuhmilch, bei c und g um Käseproben mit 0, 1, 2, 3 und 7 % Kuhmilch. K = Kuh, S = Schaf, Z = Ziege, B = Büffel.

Die obere Hälfte des IEF-Gels wurde bei ë = 634 nm analysiert.

(1) Derzeit haben sich die Produkte Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) und Resolyte® pH 5-7 bzw. 6-8 (BDH, Merck) zur Erzielung der angestrebten Auflösung der ã-Kaseine besonders bewährt.