(6)

Die folgenden Kapitel C.31 bis C.46 werden angefügt: „ C.31. WACHSTUMSTEST BEI LANDPFLANZEN: UNTERSUCHUNG VON AUFLAUF UND WACHSTUM VON KEIMLINGEN EINLEITUNG 1. Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 208 (2006). Die Prüfmethoden werden regelmäßig unter Berücksichtigung des wissenschaftlichen Fortschritts und der Anwendbarkeit in Rechtsvorschriften überarbeitet und aktualisiert. Diese aktualisierte Prüfmethode dient zur Beurteilung potenzieller Auswirkungen von Chemikalien auf das Auflaufen und das Wachstum von Keimlingen. Insoweit erstreckt sie sich weder auf chronische Wirkungen noch auf Wirkungen auf die Reproduktion (d. h. Samenansatz, Blütenbildung, Reifung der Früchte). Die Expositionsbedingungen und die Eigenschaften der zu prüfenden Chemikalie müssen berücksichtigt werden, um sicherzustellen, dass geeignete Prüfmethoden verwendet werden. (Bei der Prüfung von Metallen/Metallverbindungen sind die Wirkung des pH-Wertes und entsprechender Gegenionen zu berücksichtigen) (1). Diese Prüfmethode ist nicht für Pflanzen vorgesehen, die Chemikaliendämpfen ausgesetzt sind. Sie ist anzuwenden bei allgemeinen Chemikalien, Bioziden und Pflanzenschutzprodukten (auch als Pflanzenschutzmittel oder Pestizide bezeichnet). Die Methode wurde ausgehend von bestehenden Methoden entwickelt (2)(3)(4)(5)(6)(7). Außerdem wurden verschiedene weitere Quellen im Zusammenhang mit Prüfungen an Pflanzen berücksichtigt (8)(9)(10). Definitionen der verwendeten Begriffe sind Anlage 1 zu entnehmen. PRINZIP DER PRÜFMETHODE 2. Mit der Prüfung werden die Wirkungen auf den Saatauflauf und das frühe Wachstum höherer Pflanzen beurteilt, die im Boden (oder in einer sonstigen geeigneten Bodenmatrix) der Prüfchemikalie ausgesetzt waren. Das Saatgut wird mit dem mit der Prüfchemikalie behandelten Boden in Berührung gebracht und gewöhnlich 14 bis 21 Tage nach dem Auflauf von 50 % der Samen in der Kontrollgruppe auf Wirkungen untersucht. Die gemessenen Endpunkte bestehen in der visuellen Beurteilung des Auflaufs, der Ermittlung der Sprosstrockenmasse (alternativ der Sprossfrischmasse) sowie in manchen Fällen der Sprosslänge und in einer Bewertung der sichtbaren schädlichen Wirkungen auf verschiedene Teile der Pflanze. Diese Messungen und Beobachtungen werden mit denen bei unbehandelten Kontrollpflanzen verglichen. 3. Je nach erwartetem Expositionspfad wird die Prüfchemikalie entweder in den Boden (bzw. in eine künstliche Bodenmatrix) eingearbeitet oder auf die Bodenoberfläche aufgebracht, so dass der potenzielle Expositionspfad der Chemikalie angemessen nachgebildet wird. Die Prüfchemikalie wird in die Bodenmasse eingearbeitet. Nach der Einarbeitung wird der Boden in Töpfe gefüllt; anschließend wird das Saatgut der betreffenden Pflanzenarten gesät. Bei der Applikation auf die Oberfläche wird die Chemikalie auf den in die Töpfe eingefüllten Boden ausgebracht, in den bereits die Samen gesät wurden. Danach werden die Versuchseinheiten (Kontrollen und behandelte Böden mit Saatgut) unter Bedingungen gehalten, die die Keimung/das Wachstum der Pflanzen fördern. 4. Je nach Ziel der Untersuchung kann die Prüfung zur Bestimmung der Dosis-Wirkungs-Kurve oder als Limit-Test mit nur einer Konzentration/Dosierung durchgeführt werden. Wenn die Ergebnisse des Limit-Tests ein bestimmtes Toxizitätsniveau überschreiten (z. B. wenn Wirkungen von mehr als x % beobachtet werden), wird ein Vorversuch zur Bestimmung der Ober- und der Untergrenze der Toxizität durchgeführt. Darauf folgt ein Test mit mehreren Konzentrationen/Dosierungen zur Erstellung einer Dosis-Wirkungs-Kurve. Mit einer geeigneten statistischen Analyse werden die wirksame Konzentration ECx oder die wirksame Dosierung ERx (z. B. EC25, ER25, EC50, ER50) für die empfindlichsten relevanten Parameter bestimmt. Außerdem können mit diesem Test die höchste geprüfte Konzentration ohne beobachtete schädliche Wirkung (NOEC) und die niedrigste Konzentration mit beobachteter Wirkung (LOEC) berechnet werden. INFORMATIONEN ZUR PRÜFCHEMIKALIE 5. Die folgenden Informationen sind hilfreich zur Bestimmung des voraussichtlichen Expositionspfads der jeweiligen Chemikalie und zur Konzeption der Prüfung: Strukturformel, Reinheit, Wasserlöslichkeit, Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln, 1-Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizient, Sorptionsverhalten des Bodens, Dampfdruck, chemische Beständigkeit in Wasser und Licht und biologische Abbaubarkeit. VALIDITÄT DES TESTS 6. Damit ein Test als valide gewertet werden kann, müssen die Kontrollen die folgenden Kriterien erfüllen: — Es muss eine Auflaufrate von mindestens 70 % erzielt werden. — Die Keimlinge weisen keine sichtbaren phytotoxischen Wirkungen auf (z. B. Chlorose, Nekrose, Welken, Verformungen von Blättern und Stängeln), und bei den Pflanzen treten hinsichtlich Wachstumsentwicklung und Morphologie nur solche Unterschiede auf, die für die jeweilige Art normal sind. — Die mittlere Überlebensrate der aufgelaufenen Kontrollkeimlinge liegt während der Dauer der Untersuchung bei mindestens 90 %. — Die Umweltbedingungen für alle Pflanzen einer bestimmten Art sind identisch, und die Nährmedien enthalten die gleiche Menge Bodenmatrix, Trägermaterial oder Substrat derselben Herkunft. REFERENZCHEMIKALIE 7. Eine Referenzchemikalie kann regelmäßig getestet werden, um sicherzustellen, dass sich die Leistungsfähigkeit des Tests, die Reaktion der jeweiligen Testpflanzen und die Testbedingungen im Laufe der Zeit nicht erheblich geändert haben. Die Leistungsfähigkeit des Prüfsystems in bestimmten Labors kann auch anhand historischer Messungen der Biomasse und des Wachstums von Kontrollpflanzen beurteilt werden; diese Messungen können auch als laborinterne Qualitätskontrollmaßnahme dienen. BESCHREIBUNG DER METHODE Naturboden — künstliches Substrat 8. Pflanzen können in Töpfen mit sandigem Lehm, lehmigem Sand oder sandiger Lehm-/Tonerde mit einem Anteil von bis zu 1,5 % organischem Kohlenstoff (ca. 3 % organische Bestandteile) gezogen werden. Alternativ können auch handelsübliche Pflanzenerde oder eine künstliche Bodenmischung mit bis zu 1,5 % organischem Kohlenstoff verwendet werden. Tonböden sollten nicht verwendet werden, wenn bekannt ist, dass die Prüfchemikalie eine hohe Tonaffinität besitzt.. Feldboden ist bis auf eine Teilchengröße von 2 mm zu sieben, um eine gleichmäßige Struktur herzustellen und grobe Partikel abzutrennen. Art und Beschaffenheit, der prozentuale Anteil an organischem Kohlenstoff, der pH-Wert und der Salzgehalt (gemessen an der elektrischen Leitfähigkeit des fertig aufbereiteten Bodens) werden erfasst. Der Boden ist nach einer Standard-Klassifizierung einzustufen (11). Um die Wirkung von im Boden befindlichen Erregern zu reduzieren, kann der Boden pasteurisiert oder wärmebehandelt werden. 9. Naturboden kann wegen unterschiedlicher physikalisch-chemischer Eigenschaften und unterschiedlicher Mikrobenpopulationen die Interpretation der Ergebnisse erschweren und zu stärkeren Schwankungen führen. Diese Variablen wirken sich auf die Fähigkeit des Bodens zur Aufnahme von Feuchtigkeit, auf die chemische Bindungsfähigkeit, auf die Belüftung sowie auf den Gehalt an Nährstoffen und Spurenelementen aus. Über diese Unterschiede bei den physikalischen Faktoren hinaus bestehen Unterschiede auch im Hinblick auf chemische Eigenschaften wie z. B. den pH-Wert und das Redoxpotenzial, die die Bioverfügbarkeit der Prüfchemikalie beeinträchtigen können (12)(13)(14). 10. Für die Versuche mit Pflanzenschutzprodukten werden in der Regel keine künstlichen Substrate verwendet; sie können aber bei der Untersuchung allgemeiner Chemikalien hilfreich sein sowie dann, wenn die Unterschiede natürlicher Böden minimiert und eine bessere Vergleichbarkeit der Testergebnisse erzielt werden sollen. Die verwendeten Substrate müssen aus inertem Material bestehen, bei dem es nur zu minimalen Wechselwirkungen mit der Prüfchemikalie und/oder dem Lösungsmittelträger kommt. Mit Säure gereinigter Quarzsand, Mineralwolle und Glasperlen (z. B. mit einem Durchmesser von 0,35 bis 0,85 mm) haben sich als geeignete inerte Materialien erwiesen, die die Prüfchemikalie nur minimal absorbieren (15) und eine maximale Verfügbarkeit der Chemikalie zur Aufnahme durch die Wurzeln des Keimlings gewährleisten. Vermiculit, Perlit oder sonstige stark absorbierende Materialien sind ungeeignet. Um Stress durch Nährstoffmangel zu vermeiden, sind Nährstoffe zur Förderung des Pflanzenwachstums bereitzustellen; hierzu sollten nach Möglichkeit chemische Analysen durchgeführt oder Kontrollpflanzen visuell geprüft werden. Kriterien für die Auswahl von Arten für die Prüfungen 11. Die ausgewählten Arten müssen in Bezug auf ihre taxonomische Diversität im Pflanzenreich, ihre Verbreitung, ihre Abundanz, die artenspezifischen Lebenszyklusmerkmale und ihren natürlichen Lebensraum ein angemessen breites Spektrum abdecken, um eine entsprechende Reihe von Reaktionen zu ermitteln (8)(10)(16)(17)(18)(19)(20). Bei der Auswahl sind folgende Merkmale der möglicherweise im Test zu verwendenden Arten zu berücksichtigen: — die Arten haben einheitliche Samen, die aus zuverlässigen Standardquellen für Saatgut leicht zu beschaffen sind und die regelmäßig, zuverlässig und gleichmäßig keinem; die Keimlinge wachsen einheitlich; — die Pflanzen sind für Labortests geeignet und führen zu verlässlichen und reproduzierbaren Ergebnissen innerhalb von Testanlagen sowie in unterschiedlichen Testanlagen; — die Empfindlichkeit der geprüften Arten muss sich mit den Reaktionen der Pflanzen decken, die in der durch die jeweilige Chemikalie belasteten Umgebung vorkommen; — die Arten wurden in gewissem Umfang bereits in anderen Toxizitätstests verwendet und ihr Verhalten in Herbizid-Bioassays, Schwermetall-Screenings, Tests auf Salz- oder Mineralienbelastung oder in Allelopathie-Untersuchungen deutet auf Empfindlichkeit gegenüber vielfältigen Belastungsfaktoren hin; — sie sind mit den Wachstumsbedingungen der Prüfung kompatibel; — sie erfüllen die Validitätskriterien der Prüfung. Anlage 2 enthält einige in Tests bislang am häufigsten verwendeten Arten, Anlage 3 eine Liste potenzieller Nichtkulturpflanzen. 12. Wie viele Arten zu prüfen sind, hängt von den jeweiligen Regulierungsanforderungen ab; daher enthält diese Prüfmethode hierzu keine Angaben. Applikation der Prüfchemikalie 13. Die Chemikalie wird in einen geeigneten Träger (z. B. Wasser, Aceton, Ethanol, Polyethylenglykol, Gummiarabikum oder Sand) gegeben. Gemische (Fertigprodukte oder Formulierungen) mit Wirkstoffen und mit verschiedenen Hilfsstoffen können ebenfalls geprüft werden. Einarbeitung in den Boden/in künstliches Substrat 14. In Wasser lösliche oder suspendierbare Chemikalien können in Wasser gegeben werden; anschließend wird die Lösung mithilfe einer geeigneten Mischvorrichtung mit dem Boden vermischt. Dieser Prüfungstyp kommt dann in Betracht, wenn eine Belastung durch die Chemikalie über den Boden oder über im Boden enthaltenes Porenwasser gegeben ist und die Gefahr der Aufnahme über die Wurzeln besteht. Die zugegebene Menge der Prüfchemikalie darf die Wasserhaltekapazität des Bodens nicht überschreiten. Bei allen Testkonzentrationen muss das gleiche Volumen Wasser zugegeben werden, jedoch nur so viel, dass das Bodensubstrat nicht verklumpt. 15. Schlecht wasserlösliche Chemikalien sind in einem geeigneten flüchtigen Lösungsmittel (z. B. Aceton oder Ethanol) aufzulösen und mit Sand zu mischen. Das Lösungsmittel kann dann aus dem Sand abgetrennt werden, indem ein Luftstrom auf den kontinuierlich durchmischten Sand geleitet wird. Der so behandelte Sand wird mit dem für den Versuch vorgesehenen Boden gemischt. Eine zweite Kontrolle wird ausschließlich aus Sand und Lösungsmittel hergestellt. Bei allen Dosierungsstufen und bei der zweiten Kontrolle werden gleiche Mengen Sand, dem zunächst Lösungsmittel beigemischt und dann entzogen wurde, hinzugegeben. Für feste, unlösliche Prüfchemikalien wird trockener Boden in einer geeigneten Mischvorrichtung mit der Chemikalie gemischt. Anschließend wird der Boden in Töpfe gefüllt, und das Saatgut wird umgehend eingesät. 16. Wenn anstelle von Naturboden ein künstliches Substrat verwendet wird, können wasserlösliche Chemikalien unmittelbar vor Beginn des Tests in der Nährlösung aufgelöst werden. Chemikalien, die nicht wasserlöslich sind, aber mit einem Lösungsmittelträger in Wasser suspendiert werden können, sind mit dem Träger zur Nährlösung hinzuzugeben. Nicht wasserlösliche Chemikalien, für die es auch keinen nicht toxischen wasserlöslichen Träger gibt, sind in einem geeigneten flüchtigen Lösungsmittel aufzulösen. Die Lösung wird mit Sand oder Glasperlen gemischt und in einem Vakuum-Rotationstrockner verdampft, so dass eine gleichmäßige Schicht der Chemikalie auf dem Sand oder den Perlen verbleibt. Vor der Befüllung der Töpfe ist eine gewogene Menge der Perlen mithilfe des gleichen organischen Lösungsmittels und der Prüfchemikalie zu extrahieren. Ausbringung auf die Oberfläche 17. Im Fall von Pflanzenschutzprodukten wird die Prüfchemikalie häufig ausgebracht, indem die Oberfläche des Bodens mit der Testlösung besprüht wird. Alle bei den Tests verwendeten Geräte einschließlich der Ausrüstung zur Herstellung und Applikation der Prüfchemikalie muss eine solche Konstruktion und Kapazität aufweisen, dass die Tests mit der betreffenden Ausrüstung in der erforderlichen Genauigkeit und mit reproduzierbarer Abdeckung ausgeführt werden können. Die Bodenoberfläche muss gleichmäßig abgedeckt werden. Insbesondere ist darauf zu achten, dass Chemikalien nicht von der Ausrüstung adsorbiert werden und nicht mit der Ausrüstung reagieren können (z. B. Kunststoffschläuche und lipophile Chemikalien oder Stahlbauteile und Komponenten). Die Prüfchemikalie wird in gleicher Weise wie bei einem typischen Sprühbehälter auf die Bodenoberfläche aufgesprüht. Im Allgemeinen bewegen sich die Sprühvolumina im Bereich der normalen landwirtschaftlichen Praxis, und die Volumina (Wassermenge usw.) sind zu protokollieren.) Die Düsen sind so zu wählen, dass der Boden gleichmäßig abgedeckt wird. Wenn Lösungsmittel und Träger verwendet werden, ist eine zweite Gruppe von Kontrollpflanzen ausschließlich mit dem Lösungsmittel/Träger zu behandeln. Bei Pflanzenschutzprodukten, die als Formulierungen geprüft werden, ist dies nicht erforderlich. Verifizierung der Konzentration/Dosierung der Prüfchemikalie 18. Die angewendeten Konzentrationen/Dosierungen sind durch eine geeignete Analyse zu bestätigen. Bei löslichen Chemikalien können sämtliche Testkonzentrationen/-dosierungen bestätigt werden, indem die Testlösung mit der höchsten Konzentration analysiert wird und Aufzeichnungen über anschließende Verdünnungen und über die Verwendung kalibrierter Ausrüstung (z. B. kalibrierter Glasgeräte oder kalibrierte Sprühausrüstung) geführt werden. Bei unlöslichen Chemikalien muss das Gewicht der in den Boden eingebrachten Prüfchemikalie zugrunde gelegt werden. Wenn ein Homogenitätsnachweis erforderlich ist, muss der Boden unter Umständen analysiert werden. VERFAHREN Versuchsaufbau 19. Saatgut derselben Art wird in Töpfe eingesät. Die Anzahl der Samen pro Topf hängt von der Art, der Größe des Topfs und der Testdauer ab. In den Töpfen sollten sich so viele Pflanzen befinden, dass angemessene Wachstumsbedingungen gegeben sind und die Töpfe während der Testdauer nicht zu voll werden. Die maximale Dichte dürfte je nach Samengröße bei drei bis zehn Samen pro 100 cm2 liegen. Zu empfehlen sind beispielsweise ein bis zwei Mais-, Soja-, Tomaten-, Gurken- oder Zuckerrübenpflanzen pro 15-cm-Topf, drei Raps- oder Erbsenpflanzen pro 15-cm-Topf und fünf bis zehn Zwiebeln oder Weizenhalme oder sonstige Pflanzen mit kleinen Samen pro 15-cm-Topf. Die Anzahl der Töpfe mit dem Saatgut und die der Replikate (ein Replikat ist als ein Topf definiert, deshalb stellen Pflanzen in demselben Topf kein Replikat dar) muss für eine optimale statistische Analyse ausreichend sein (21). Wenn im Test Arten mit wenigen großen Samen je Topf (Replikat) verwendet werden, ist eine größere Variabilität zu erwarten als bei Arten, bei denen eine größere Anzahl kleiner Samen pro Topf gesät werden kann. Diese Variabilität kann minimiert werden, indem in alle Töpfe die gleiche Anzahl Samen gesät wird. 20. Mit Kontrollgruppen wird sichergestellt, dass die beobachteten Wirkungen ausschließlich mit der Exposition gegenüber der Prüfchemikalie in Zusammenhang stehen bzw. ausschließlich der Prüfchemikalie zuzurechnen sind. Die Kontrollgruppe muss mit Ausnahme der Exposition gegenüber der Prüfchemikalie in jeder Hinsicht mit der Prüfgruppe identisch sein. In einem Test müssen alle verwendeten Pflanzen einschließlich der Kontrollen aus derselben Quelle stammen. Um Verzerrungen zu vermeiden, sind Test- und Kontrolltöpfe zu randomisieren. 21. Mit einem Insektizid oder einem Fungizid behandeltes Saatgut (d. h. gebeiztes Saatgut) darf nicht verwendet werden. Einige Regulierungsbehörden erlauben jedoch die Verwendung bestimmter nicht systemischer Kontaktfungizide (z. B. Captan, Thiram) (22). Wenn Bedenken hinsichtlich der Eintragung von Erregern über das Saatgut bestehen, kann das Saatgut kurz in eine schwache Hypochloritlösung (5 %) gegeben, gründlich unter fließendem Wasser gewaschen und getrocknet werden. Es dürfen keine Behandlungen mit anderen Pflanzenschutzprodukten vorgenommen werden. Prüfbedingungen 22. Die Prüfbedingungen müssen etwa den Bedingungen entsprechen, die für ein normales Wachstum der geprüften Arten und Sorten erforderlich sind. (Beispiele für Prüfbedingungen sind Anlage 4 zu entnehmen.) Die auflaufenden Pflanzen sind entsprechend guter gärtnerischer Praxis in Klimakammern, Phytotronanlagen oder Gewächshäusern zu halten. In Pflanzenwachstumsanlagen umfasst diese gute Praxis beispielsweise die Regelung sowie die Aufzeichnung von Temperatur, Feuchtigkeit, Kohlendioxid-Konzentration, Lichtverhältnissen (Intensität, Wellenlänge, photosynthetisch aktive Strahlung), Beleuchtungsdauer und Bewässerung in angemessener Häufigkeit (z. B. täglich), um ein gutes Wachstum der Pflanzen (gemessen an der Entwicklung der Kontrollpflanzen der ausgewählten Arten) sicherzustellen. Die Temperaturen in Gewächshäusern müssen durch Belüftungs-, Heiz- und/oder Kühlsysteme geregelt werden. Für Tests in Gewächshäusern werden im Allgemeinen die folgenden Bedingungen empfohlen: — Temperatur: 22 ± 10 °C; — Feuchtigkeit: 70 ± 25 %; — Photoperiode: mindestens 16 Stunden; — Lichtintensität: 350 ± 50 μE/m2/s. Zusätzliche Beleuchtung kann erforderlich sein, wenn die Intensität unter 200 μE/m2/s, Wellenlänge 400-700 nm, absinkt (außer bei bestimmten Arten mit geringerem Lichtbedarf). Im Laufe der Prüfung sind die Umgebungsbedingungen zu überwachen und zu protokollieren. Die Pflanzen müssen in nicht porösen Kunststofftöpfen oder in glasierten Töpfen mit einer Schale oder einem Untersetzer unter dem Topf gezogen werden. Die Töpfe können regelmäßig umgestellt werden, um Wachstumsunterschiede (infolge unterschiedlicher Prüfbedingungen in den Wachstumsanlagen) zu minimieren. Außerdem müssen die Töpfe so groß sein, dass die Pflanzen normal wachsen können. 23. Zur Erhaltung der Wuchskraft können den Böden bei Bedarf Nährstoffe zugeführt werden. Notwendigkeit und Zeitpunkt der Gabe zusätzlicher Nährstoffe lassen sich durch Beobachtung der Kontrollpflanzen ermitteln. Die Testbehältnisse sollten von unten bewässert werden (z. B. mit Glasfaserdochten). Anfänglich kann aber auch von oben bewässert werden, um die Keimung anzuregen und um bei Oberflächenapplikation das Eindringen der Chemikalie in den Boden zu erleichtern. 24. Die spezifischen Wachstumsbedingungen sollten für die zu prüfende Art und die jeweilige Prüfchemikalie angemessen sein. Die Pflanzen der Kontrollgruppe und die behandelten Pflanzen sind unter den gleichen Umgebungsbedingungen zu halten; es sollten jedoch geeignete Maßnahmen getroffen werden, um Kreuzexpositionen (z. B. gegen flüchtige Chemikalien) zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen sowie der Kontrollgruppen gegen die Prüfchemikalie zu vermeiden. Prüfung mit einer einzigen Konzentration/Dosierung 25. Bei der Bestimmung der Konzentration/Dosierung einer Chemikalie zur Durchführung eines Tests mit einer einzigen Konzentration/Dosierung (Challenge- oder Limit-Test) sind eine Reihe von Faktoren zu beachten. Bei allgemeinen Chemikalien gehören dazu die physikalisch-chemischen Eigenschaften der betreffenden Chemikalie. Bei Pflanzenschutzprodukten sind die physikalisch-chemischen Eigenschaften und die Art der Verwendung der Prüfchemikalie, die maximale Konzentration/Dosierung, die Anzahl der Aufbringungen pro Saison und/oder die Persistenz der Prüfchemikalie zu berücksichtigen. Um festzustellen, ob eine allgemeine Chemikalie phytotoxische Eigenschaften besitzt, kann eine Prüfung mit maximal 1 000 mg/kg trockenem Boden angemessen sein. Vorversuch 26. Erforderlichenfalls kann ein Vorversuch durchgeführt werden, um die in der definitiven Dosis-Wirkungs-Studie zu testenden Konzentrationen/Dosierungen zu bestimmen. Im Vorversuch sollten die Testkonzentrationen/-dosierungen weit auseinander liegen (z. B. 0,1, 1,0, 10, 100 and 1 000 mg/kg trockener Boden). Im Fall von Pflanzenschutzprodukten kann von der empfohlenen oder maximalen Konzentration oder Dosierung ausgegangen werden (z. B. 1/100, 1/10, 1/1 der empfohlenen/maximalen Konzentration oder Dosierung). Prüfung mit mehreren Konzentrationen/Dosierungen 27. Ziel der Prüfung mit mehreren Konzentrationen/Dosierungen sind entsprechend den Anforderungen der Regulierungsbehörden die Ermittlung einer Dosis-Wirkungs-Beziehung und die Bestimmung eines ECx- bzw. ERx-Werts für Auflauf, Biomasse und/oder sichtbare Wirkungen im Vergleich zu nicht exponierten Kontrollen. 28. Die Abstände zwischen den Konzentrationen oder Dosierungen und ihre Anzahl sollten hinreichend sein, um eine Dosis-Wirkungs-Beziehung zuverlässig feststellen, eine Regressionsgleichung aufstellen und die Werte für ECx oder ERx bestimmen zu können. Die ausgewählten Konzentrationen/Dosierungen müssen die zu ermittelnden ECx- oder ERx-Werte einschließen. Wenn beispielsweise ein EC50-Wert benötigt wird, sollten die Prüfungen bei Dosierungen durchgeführt werden, bei denen eine Wirkung im Bereich von 20-80 % zu erwarten ist. Hierzu werden mindestens fünf Testkonzentrationen/-dosierungen mit einer geometrischen Reihe sowie eine unbehandelte Kontrolle empfohlen, wobei sich die Konzentrationen/Dosierungen höchstens um den Faktor 3 unterscheiden sollten. Für jede Behandlungsgruppe und für jede Kontrollgruppe sind mindestens vier Replikate vorzusehen, und insgesamt sind mindestens 20 Samen zu verwenden. Bei bestimmten Pflanzen mit schlechter Keimung oder unterschiedlicher Wachstumsentwicklung sind unter Umständen auch mehr Replikate erforderlich, um die statistische Aussagekraft der Prüfung zu erhöhen. Wenn eine größere Anzahl an Testkonzentrationen/-dosierungen verwendet wird, kann die Anzahl der Replikate reduziert werden. Muss die NOEC bestimmt werden, sind unter Umständen mehr Replikate erforderlich, um die erwünschte statistische Aussagekraft zu erzielen (23). Beobachtungen 29. Während der Beobachtungsdauer (d. h. 14 bis 21 Tage nach Auflauf von 50 % der Kontrollpflanzen sowie gegebenenfalls auch der Kontrollen mit Lösungsmitteln) werden die Pflanzen häufig (mindestens wöchentlich, möglichst sogar täglich) auf Auflaufen und sichtbare Anzeichen von Phytotoxizität und Mortalität kontrolliert. Am Ende der Prüfung werden der Prozentanteil der aufgelaufenen Pflanzen und die Biomasse der überlebenden Pflanzen sowie sichtbare Schädigungen an verschiedenen Pflanzenteilen protokolliert. Zu Letzteren zählen Anomalien im Aussehen der aufgelaufenen Keimlinge, Wachstumshemmungen, Chlorose, Entfärbungen, Mortalität und Wirkungen auf die Entwicklung der Pflanzen. Die endgültige Biomasse kann anhand der endgültigen durchschnittlichen Spross-Trockenmasse der überlebenden Pflanzen ermittelt werden, indem die Pflanzen am Boden abgeschnitten und dann bei 60 °C auf ein konstantes Gewicht getrocknet werden. Alternativ kann die endgültige Biomasse auch anhand der Spross-Frischmasse bestimmt werden. Die Länge der Triebe kann ein weiterer Endpunkt sein, wenn von den Regulierungsbehörden gefordert. Es muss ein einheitliches System für die Beurteilung sichtbarer Schäden verwendet werden, um feststellbare toxische Reaktionen bewerten zu können. Beispiele für qualitative und quantitative visuelle Beurteilungen sind den Quellen (23) und (24) zu entnehmen. DATEN UND BERICHTERSTATTUNG Statistische Analyse Prüfung mit einer einzigen Konzentration/Dosierung 30. Für jede Pflanzenart sind die ermittelten Daten mithilfe einer geeigneten statistischen Methode zu analysieren (21). Die Wirkung bei der Testkonzentration/-dosierung ist ebenso zu protokollieren wie gegebenenfalls die Tatsache, dass bei der Testkonzentration/-dosierung eine bestimmte Wirkung nicht eintritt (z. B. festgestellte Wirkung <x % bei Konzentration oder Dosierung y). Prüfung mit mehreren Konzentrationen/Dosierungen 31. Eine Dosis-Wirkungs-Beziehung wird mithilfe einer Regressionsgleichung aufgestellt. Dabei können verschiedene Modelle zur Anwendung kommen. Für die Bestimmung der ECx- oder ERx-Werte (etwa EC25, ER25, EC50 oder ER50) und der entsprechenden Konfidenzintervalle für das Auflaufen als quantale Daten beispielsweise könnten u. a. das Logit-, das Probitmodell, die Weibull-, die Spearman-Karber- oder die Trimmed Spearman-Karber-Methode geeignet sein. Das Wachstum der Keimlinge (Gewicht und Länge) als kontinuierliche Endpunkte ECx oder ERx und die entsprechenden Konfidenzintervalle können mit geeigneten Regressionsanalysen (z. B. durch nicht lineare Regressionsanalyse nach Bruce-Versteeg (25)) bestimmt werden. Nach Möglichkeit sollte R2 bei den empfindlichsten Arten mindestens 0,7 betragen, und die Testkonzentrationen/-dosierungen sollten Wirkungen im Bereich von 20-80 % einschließen. Zur Ermittlung der NOEC sind leistungsfähige statistische Tests zu empfehlen, die auf Basis der Datenverteilung ausgewählt werden sollten (21) (26). Prüfbericht 32. Der Prüfbericht muss die Ergebnisse der Untersuchungen sowie eine detaillierte Beschreibung der Prüfbedingungen, eine eingehende Diskussion der Ergebnisse, eine Datenanalyse und die Schlussfolgerungen der Analyse enthalten. Eine tabellarische Übersicht und eine Zusammenfassung der Ergebnisse ist beizufügen. Der Bericht muss folgende Angaben enthalten: Prüfchemikalie: — chemische Kenndaten, relevante Eigenschaften der geprüften Chemikalie (z. B. log Pow, Wasserlöslichkeit, Dampfdruck und gegebenenfalls Angaben zum Verbleib und zum Verhalten in der Umwelt); — Angaben zur Herstellung der Testlösung und zur Verifizierung von Testkonzentrationen wie unter Nummer 18 beschrieben. Im Test verwendete Art: — Angaben zum Testorganismus; Art/Sorte, Pflanzenfamilien, wissenschaftliche und allgemeine Bezeichnung, möglichst genaue Angaben zu Quelle und Herkunft des Saatguts (d. h. Name des Lieferanten, Keimrate, Größenklasse der Samen, Chargen- oder Losnummer, Saatjahr oder Wachstumssaison, Datum der Bewertung der Keimung), Lebensfähigkeit usw.; — Anzahl der geprüften ein- und zweikeimblättrigen Arten; — Gründe für die Auswahl der Arten; — Beschreibung der Lagerung, der Behandlung und der Erhaltung des Saatguts. Prüfbedingungen: — Prüfanlage (z. B. Wachstumskammer, Phytotron und Gewächshaus); — Beschreibung des Prüfsystems (z. B. Abmessungen der Töpfe, Topfmaterial und Bodenmenge); — Merkmale des Bodens (Textur oder Typ: Partikelverteilung und Klassifizierung, physikalische und chemische Eigenschaften einschließlich Prozentanteil organischer Materie und organischen Kohlenstoffs sowie pH-Wert); — Vorbereitung des Bodens/Substrats vor der Prüfung (natürlicher und künstlicher Boden, Sand usw.); — Beschreibung des Nährmediums, falls verwendet; — Applikation der Prüfchemikalie: Beschreibung der Applikationsmethode, Beschreibung der Ausrüstung, der Exposition (Dosierung und Volumina) einschließlich chemischer Verifizierung, Beschreibung der Kalibrierungsmethode und der Umgebungsbedingungen während der Applikation; — Wachstumsbedingungen: Lichtintensität (z. B. photosynthetisch aktive Strahlung), Photoperiode, Temperaturen (max./min.), Bewässerungsplan und -methode, Düngung; — Anzahl der Samen pro Topf, Anzahl der Pflanzen pro Dosis, Anzahl der Replikate (Töpfe) pro Expositionsrate; — Typ und Anzahl der Kontrollen (negative und/oder positive Kontrollen sowie Lösungsmittelkontrollen, falls verwendet); — Dauer der Prüfung. Ergebnisse: — Tabelle mit allen Endpunkten für alle Replikate, Testkonzentrationen/-dosierungen und Arten; — Anzahl und Prozentsatz aufgelaufener Pflanzen im Vergleich zu den Kontrollen; — Messungen der Biomasse (Spross-Trockenmasse oder -Frischmasse) der Pflanzen ausgedrückt als Prozentsatz der Kontrollen; — Länge der Pflanzentriebe als Prozentsatz der Kontrollen, falls gemessen; — Prozentanteil sichtbarer Schäden sowie qualitative und quantitative Beschreibung der sichtbaren Schäden (Chlorose, Nekrose, Welken, Verformungen von Blättern und Stängeln sowie gegebenenfalls des Ausbleiben von Wirkungen) durch die Prüfchemikalie im Vergleich zu Kontrollpflanzen; — Beschreibung der Skala zur Beurteilung sichtbarer Schäden, wenn eine visuelle Beurteilung vorliegt; — bei Untersuchungen mit einer einzigen Dosierung ist der Prozentanteil der Schäden zu protokollieren; — ECx- oder ERx-Werte (z. B. EC50, ER50, EC25, ER25) und entsprechende Konfidenzintervalle. Wenn Regressionsanalysen vorgenommen werden, sind der Standardfehler für die Regressionsgleichung und der Standardfehler der einzelnen Parameterschätzungen (z. B. Steigung und Schnittpunkt) anzugeben; — NOEC (und LOEC), falls berechnet; — Beschreibung der statistischen Verfahren und der zugrunde gelegten Annahmen; — grafische Darstellung dieser Daten und der Dosis-Wirkungs-Beziehung der im Test verwendeten Art; Abweichungen von den für diese Prüfmethode beschriebenen Verfahren und außergewöhnliche Vorkommnisse während der Prüfung. LITERATUR (1) Schrader, G., Metge, K., und Bahadir, M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189-193. (2) Internationale Organisation für Normung (1993). ISO 11269-1. Bodenbeschaffenheit — Bestimmung der Wirkungen von Schadstoffen auf die Bodenflora — Teil 1: Verfahren zur Messung der Wurzelwachstumshemmmung. (3) Internationale Organisation für Normung (1995). ISO 11269-2. Bodenbeschaffenheit — Bestimmung der Wirkungen von Schadstoffen auf die Bodenflora — Teil 2: Wirkung von verunreinigten Böden auf Saatauflauf und frühes Wachstum höherer Pflanzen. (4) American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. (5) U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1. (6) US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines: — 850.4000: Background — Non-target Plant Testing; — 850.4025: Target Area Phytotoxicity; — 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence); — 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test; — 850.4225: Seedling Emergence, Tier II; — 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. (7) AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. 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B. Bekämpfung von Insekten, Pflanzenkrankheiten oder Unkräutern im jeweils behandelten Bereich); auch als Wirkstoff technischer Qualität bezeichnet. Chemikalie : ein Stoff oder eine Mischung. Pflanzenschutzmittel oder Pestizide : Stoffe mit spezifischer biologischer Wirkung, die gezielt zum Schutz von Pflanzen gegen Schädlinge (z. B. Pilze, Insekten und konkurrierende Pflanzen) eingesetzt werden. ECx, Konzentration mit einer Wirkung von x %, oder ERx, Dosis mit einer Wirkung von x % : die Konzentration oder Dosis, bei der es in einem Test zu einer unerwünschten Änderung des Endpunkts um x % gegenüber der jeweiligen Kontrolle kommt (z. B. Reduzierung des Auflaufs, des Sprossgewichts, der endgültigen Anzahl vorhandener Pflanzen oder Zunahme sichtbarer Schäden um 25 % oder 50 %, entsprechend einer EC25/ER25 bzw. EC50/ER50). Auflauf : Austreten der Koleoptile (Keimscheide) oder der Kotyledone (Keimblatt) aus dem Boden. Formulierung : für den Handel hergestelltes Produkt mit dem Wirkstoff; auch als Endpräparat (8) oder für den typischen Verwendungszweck bestimmtes Endprodukt bezeichnet. LOEC (Lowest Observed Effect Concentration) : niedrigste geprüfte Konzentration der Prüfchemikalie, bei der eine Wirkung beobachtet wurde. Bei dieser Prüfung hat die der LOEC entsprechende Konzentration innerhalb einer bestimmten Expositionsdauer im Vergleich zur Kontrolle eine statistisch signifikante Wirkung (p < 0,05) und ist höher als die NOEC. Nichtzielpflanzen : Pflanzen außerhalb des Zielpflanzenbereichs. Bei Pflanzenschutzmitteln bezieht diese Bezeichnung sich gewöhnlich auf Pflanzen außerhalb des behandelten Bereichs. NOEC (No observed Effect Concentration) : Die höchste Konzentration der Prüfchemikalie, bei der keine Wirkung beobachtet wurde. Bei diesem Test hat die der NOEC entsprechende Konzentration innerhalb einer bestimmten Expositionsdauer im Vergleich zur Kontrolle keine statistisch signifikante Wirkung (p < 0,05). Phytotoxizität : in Messungen und visuellen Prüfungen festgestellte schädliche Abweichungen vom normalen Aussehen und Wachstum der Pflanzen aufgrund der Wirkung einer bestimmten Chemikalie. Replikat : Versuchseinheit, die die Kontrollgruppe und/oder die Behandlungsgruppe repräsentiert. Bei diesen Untersuchungen ist der Topf als Replikat definiert. Visuelle Prüfung : Beurteilung des sichtbaren Schadens anhand von Beobachtungen zur Haltung der Pflanze, zur Wuchskraft, zu Missbildungen, Chlorose, Nekrose sowie zum Gesamteindruck im Vergleich zu einer Kontrolle. Prüfchemikalie : ein Stoff oder eine Mischung, der bzw. die nach dieser Methode geprüft wird. Anlage 2 Liste der Üblicherweise für Pflanzentests verwendeten Arten Familie Art Gewöhnliche Bezeichnung DICOTYLEDONAE Apiaceae (Umbelliferae) Daucus carota Möhre Asteraceae (Compositae) Helianthus annuus Sonnenblume Asteraceae (Compositae) Lactuca sativa Gartensalat Brassicaceae (Cruciferae) Sinapis alba Weißer Senf Brassicaceae (Cruciferae) Brassica campestris var. chinensis Chinakohl Brassicaceae (Cruciferae) Brassica napus Raps Brassicaceae (Cruciferae) Brassica oleracea var. capitata Kohl Brassicaceae (Cruciferae) Brassica rapa Rübsen Brassicaceae (Cruciferae) Lepidium sativum Gartenkresse Brassicaceae (Cruciferae) Raphanus sativus Rettich Chenopodiaceae Beta vulgaris Rübe Cucurbitaceae Cucumis sativus Gurke Fabaceae (Leguminosae) Glycine max (G. soja) Sojabohne Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus aureus Mungobohne Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus vulgaris Gartenbohne Fabaceae (Leguminosae) Pisum sativum Erbse Fabaceae (Leguminosae) Trigonella foenum-graecum Bockshornklee Fabaceae (Leguminosae) Lotus corniculatus Gewöhnlicher Hornklee Fabaceae (Leguminosae) Trifolium pratense Wiesenklee Fabaceae (Leguminosae) Vicia sativa Futterwicke Linaceae Linum usitatissimum Flachs Polygonaceae Fagopyrum esculentum Buchweizen Solanaceae Solanum lycopersicon Tomate MONOCOTYLEDONAE Liliaceae (Amarylladaceae) Allium cepa Zwiebel Poaceae (Gramineae) Avena sativa Hafer Poaceae (Gramineae) Hordeum vulgare Gerste Poaceae (Gramineae) Lolium perenne Deutsches Weidelgras Poaceae (Gramineae) Oryza sativa Reis Poaceae (Gramineae) Secale cereale Roggen Poaceae (Gramineae) Sorghum bicolor Körner-Sorghum, Mohrenhirse Poaceae (Gramineae) Triticum aestivum Weichweizen Poaceae (Gramineae) Zea mays Mais Anlage 3 Liste potenzieller Nichtkulturpflanzen OECD-Liste potenzieller Arten für Toxizitätsprüfungen an Pflanzen Hinweis: Die folgende Tabelle enthält Informationen zu 52 Nichtkulturpflanzen (Literaturangaben sind jeweils in Klammern nachgestellt). Die genannten Auflaufraten stammen aus der veröffentlichten Literatur und dienen nur als Anhaltspunkt. In Abhängigkeit von der Herkunft des Saatguts und anderen Faktoren kann es im Einzelfall zu Abweichungen kommen. FAMILIE Botanischer Name der Art (gemeiner deutscher Name) Lebensdauer (9) und Lebensraum Samengewicht (mg) Photoperiode für Keimung oder Wachstum (10) Saattiefe (mm) (11) Keimzeit (Tage) (12) Spezialbehandlungen (13) Toxizitätstest (14) Saatgut-Anbieter (15) Sonstige Literatur (16) APIACEAE Torilis japónica (Gewöhnlicher Klettenkerbel) А, В gestörte Flächen, Hecken, Weiden (16, 19) 1,7 – 1,9 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19) Stratifikation (Kälte) (7, 14, 18, 19); unter Umständen ist eine Reifung erforderlich (19); Keimung durch Dunkelheit gehemmt (1, 19); keine Spezialbehandlungen (5) NACH (5) ASTERACEAE Bellis perennis (Gänseblümchen) Ρ Grasflächen, Äcker, Rasen (16, 19) 0,09-0,17 (4, 19) L = D (14) 0 (4) 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (18, 19); keine Spezialbehandlungen (4, 14) NACH (4) A, D, F 7 Centaurea cyanus (Kornblume) A Felder, Straßenränder, offene Lebensräume (16) 4,1-4,9 (4, 14) L = D (14) 0-3 (2, 4, 14) 14-21 (100 %) (14) keine Spezialbehandlungen (2, 4) NACH (2,4) A, D, E, F 7 Centaurea nigra (Schwarze Flockenblume) Ρ Felder, Straßenränder, offene Lebensräume (16, 19) 2,4-2,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) Reifung kann erforderlich sein (18, 19); Keimung durch Dunkelheit gehemmt (19); keine Spezialbehandlungen (5, 14, 26) NACH (5, 22, 26) a Inula helenium Alant Ρ feuchte, gestörte Standorte (16) 1 – 1,3 (4, 14, 29) 0 (4, 29) keine Spezialbehandlungen (4) NACH (4) A, F Leontodon hispidus (Steifhaariger Löwenzahn) Ρ Felder, Straßenränder, gestörte Flächen (16, 19) 0,85 -1,2 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) Keimung durch Bestrahlung gehemmt (17, 18, 19); keine Spezialbehandlungen (5, 23) NACH (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (Rudbeckie Β, Ρ gestört (16) 0,3 (4, 14) L = D (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) keine Spezialbehandlungen (4, 14, 33) NACH (4, 33) C, D, E, F Solidago canadensis Kanadische Goldrute Ρ Weiden, offene Flächen (16) 0,06-0,08 (4, 14) L = D (11) 0 (4) 14-21 (11) zu gleichen Teilen mit Sand mischen und 24 h in 500 ppm GA einweichen (11); keine Spezialbehandlungen (4) NACH (4) E, F Xanthium pensylvanicum (Spitzklette) A Felder, offene Lebensräume (16) 25-61 (14, 29) 0(1) 5(29) Keimung kann durch Dunkelheit gehemmt werden (1); 12 h in warmem Wasser einweichen (29) VOR UND NACH (31) a Xanthium spinosum (Dornige Spitzklette) A offene Lebensräume (16) 200 (14) L = D (14) L > D (6) 10 (6) Skarifikation (14); keine Spezialbehandlungen (6) VOR UND NACH (6) a Xanthium strumarium (Gewöhnliche Spitzklette) A Felder, offene Lebensräume (16) 67,4 (14) L = D (14) 10-20 (6, 21) keine Spezialbehandlungen (6, 14, 21) VOR UND NACH (6, 21, 28, 31) a BRASSICACEAE Cardamine pratensis (Wiesenschaumkraut) Ρ Felder, Straßenränder, Rasen (16, 19) 0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) Keimung durch Bestrahlung gehemmt (18, 19); keine Spezialbehandlungen (5, 14, 22) NACH (5, 22) F CARYOPHYLLACEAE Lychnis flos-cuculi (Kuckucks-Lichtnelke) Ρ (16) 0,21 (14) L = D (14) < 14 (100 %) (14, 25) Reifung kann erforderlich sein (18); keine Spezialbehandlungen (5, 14, 15, 22-26) NACH (5, 15, 22-26) F Chenopodiaceae Chenopodium album (Weißer Gänsefuß) a Feldränder, gestörte Flächen (16, 19) 0,7-1,5 (14, 19, 34) L = D (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19) Behandlung je nach Farbe der Samen unterschiedlich (19); trockene Keimruhe (19); Keimung durch Dunkelheit gehemmt (1, 18, 19); Stratifikation (Kälte) (18); keine Spezialbehandlungen (14, 34) VOR UND NACH (28, 31, 34) a 32 CLUSIACEAE Hypericum perforatum (Echtes Johanniskraut) Ρ Felder, Äcker, offene Lebensräume (16, 19) 0,1-0,23 (14, 19) L= D (14) 0 (1, 19) 3 (19) 11 (90 %) (18) Keimung durch Dunkelheit gehemmt (1, 18, 19) keine Spezialbehandlungen (5, 14, 15, 25, 27) NACH (5, 15, 25, 27) A, E, F CONVOLVULACEAE Ipomoea hederacea (Efeu-Prunkwinde) a Straßenränder, offene Lebensräume, Maisfelder (16) 28,2 (14) L > D (6, 10) 10-20 (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (1) keine Spezialbehandlungen (6, 21) VOR UND NACH (6, 12, 21, 28) a CYPERACEAE Cyperus rotundus (Knolliges Zypergras) Ρ Äcker, Weiden, Straßenränder (16, 30) 0,2 (14) L= D (14) 0 (1) 10-20 (6, 10) 12 (91 %) (10) Keimung durch Dunkelheit gehemmt (1) keine Spezialbehandlungen (6, 10, 14) VOR UND NACH (6, 28, 31) B 7 FABACEAE Lotus corniculatus (Gewöhnlicher Hornklee) Ρ Grasflächen, Straßenränder, offene Lebensräume (16, 19) 1-1,67 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) Skarifikation (14, 19) Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (18, 19); keine Spezialbehandlungen (23, 25) NACH (5, 23, 25) A, D, E, F Senna obtusifolia (Senna) A feuchte Wälder (16) 23-28 (9) L = D (14) L > D (9) 10-20 (6,9) Samen 24 h in Wasser einweichen (9) Skarifikation (14); je nach Farbe unterschiedliche Lebensfähigkeit der Samen (1); keine Spezialbehandlungen (6) NACH (6,9) a Sesbania exaltata (Hanf) A Schwemmboden (16) 11-13 (9, 14) L > D (9) 10-20 (9, 21) Samen 24 h in Wasser einweichen (9) Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (1); keine Spezialbehandlungen (21) VOR UND NACH (9, 21, 28, 31) a Trifolium pratense (Wiesenklee) Ρ Felder, Straßenränder, Äcker (16, 19) 1,4-1,7 (14, 19) L= D (14) 1 (50 %) (19) Skarifikation (14, 18) unter Umständen Reifung erforderlich (19); Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (1, 19); keine Spezialbehandlungen (5) NACH (5) A, E, F LAMIACEAE Leonurus cardiaca (Echtes Herzgespann) Ρ offene Flächen (16) 0,75-1,0 (4, 14) L= D (14) 0 (4) keine Spezialbehandlungen (4, 14) NACH (4) F Mentha spicata (Grüne Minze) Ρ feuchte Gebiete (16) 2,21 (4) 0 (4) keine Spezialbehandlungen (4) NACH (4) F Nepeta cataria (Echte Katzenminze) Ρ gestörte Flächen (16) 0,54 (4, 14) L= D (14) 0 (4) keine Spezialbehandlungen (2, 4, 14) NACH (2,4) F Prunella vulgaris (Gewöhnliche Braunelle) Ρ Äcker, Grasflächen, gestörte Standorte (16, 19) 0,58 -1,2 (4, 14, 19) L= D (14) 0 (4, 19) 5 (50 %) (19) 7 (91 %) (18) Keimung durch Dunkelheit gehemmt (18, 19) stärkere Keimung bei größeren Samen (1); keine Spezialbehandlungen (4, 14, 22) NACH (4, 22) A, F Stachys officinalis (Echte Betonie) Ρ Grasflächen, Feldränder (19) 14-18 (14, 19) L= D (14) 7 (50 %) (19) keine Spezialbehandlungen (5, 14, 22) NACH (5, 22) F MALVACEAE Abutilon theophrasti (Europäische Samtpappel) A Felder, offene Lebensräume (16) 8,8 (14) L= D (14) 10-20 (6, 10, 21) 4 (84 %) (10) Skarifikation (14) keine Spezialbehandlungen (5, 10, 21) VOR UND NACH (6, 22, 28, 31) A, F Sida spinosa Sida spinosa a Felder, Straßenränder (16) 3,8 (14) L= D (14) 10-20 (6, 21) Skarifikation (14) Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (1); keine Spezialbehandlungen (6, 21) VOR UND NACH (6, 21, 28, 31) A, F PAPAVERACEAE Papaver rhoeas (Klatschmohn) a Felder, Äcker, gestörte Standorte (16, 19) 0,1 -0,3 (4, 14, 19, 29) L= D (14) 0 (4, 29) 4 (50 %) (19) Stratifikation (Kälte) und Skarifikation (1, 19, 32) keine Spezialbehandlungen (4, 14, 29) NACH (4) A, D, E, F, G POACEAE Agrostis tenuis (Rotes Straußgras) Rasen, Weiden (16) 0,07 (14) L > D (Ю) 20 (10) 10 (62 %) (10) Keimung durch Bestrahlung gehemmt (1, 17-19); keine Spezialbehandlungen (10) NACH (10) A, E Alopecurus myosuroides (Acker-Fuchsschwanzgras) A Felder, offene Lebensräume (16) 0,9-1,6 (29, 34) L = D (14) 2 (29) < 24 (30 %) (34) Skarifikation (14); Behandlung mit 101 mg/l KNO3 (14); Stratifikation (Wärme) (1) Keimung durch Dunkelheit gehemmt (1); keine Spezialbehandlungen (34) VOR UND NACH (28, 34) a 32 Avena fatua (Flughafer) A Anbaugebiete, offene Lebensräume (16) 7-37,5 (14, 30) L = D (14) L > D (6) 10-20 (6, 10) 3 (70 %) (18) Skarifikation (7, 32); Keimung durch Dunkelheit gehemmt (1) Stratifikation (Kälte) (1, 18); keine Spezialbehandlungen (6, 10, 14) VOR UND NACH (6, 10, 28, 31) a Bromus tectorum (Dach-Trespe) A Felder, Straßenränder, Äcker (16) 0,45-2,28 (14, 29) L = D (14) 3 (29) Reifungsperiode (1, 7, 32); Keimung durch Licht gehemmt (1); keine Spezialbehandlungen (14) VOR UND NACH (28, 31) a Cynosurus cristatus (Kammgras) P Felder, Straßenränder, offene Lebensräume (16, 19) 0,5-0,7 (14, 19, 29) L = D (14) 0 (29) 3 (50 %) (19) Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (19); keine Spezialbehandlungen (14, 29) NACH (5) a Digitaria sanguinalis (Blutrote Fingerhirse) A Felder, Rasen, offene Lebensräume (16) 0,52-0,6 (14, 30) L = D (14) 10-20 (21) 7 (75 %) 14 (94 %) (7) Skarifikation, Stratifikation (Kälte) und Reifung (1, 7, 14, 32); Behandlung mit 101 mg/l KNO3 (14); Keimung durch Dunkelheit gehemmt (1); keine Spezialbehandlungen (21) VOR UND NACH (18, 25, 31) a Echinochloa crusgalli (Hühnerhirse) A (16) 1,5 (14) L = D (14) L > D (3) 10-20 (7, 21) Skarifikation (7, 32); Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (1); keine Spezialbehandlungen (3, 14, 21) VOR UND NACH (3, 21, 28, 31) a Elymus canadensis (Kanada-Quecke) P Uferzonen, gestörte Standorte (16) 4-5 (14, 30) L = D (11) 1 (11) 14-28 (11) keine Spezialbehandlungen (2, 11) NACH (2) C, D, E Festuca pratensis (Wiesenschwingel) P Felder, feuchte Gebiete (16, 19) 1,53-2,2 (16, 19) L = D (14) L > D (10) 20 (10) 9 (74 %) (10) 2 (50 %) (19) keine Spezialbehandlungen (10, 19) NACH (10) a 7 Hordeum pusillum (Gerste) A Weiden, Straßenränder, offene Lebensräume (16) 3,28 (14) Stratifikation (Wärme) (1); Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (1) VOR (31) 7 Phieum pratense (Wiesenlieschgras) P Weiden, Äcker, gestörte Standorte (16, 19) 0,45 (14, 19) L > D (10, 14) 0-10 (10, 19) 2 (74 %) (10) 8 (50 %) (19) Keimung durch Dunkelheit gehemmt (19); Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (17); keine Spezialbehandlungen (10, 14, 17, 19) NACH (10) A, E POLYGONACEAE Polygonum convolvulus (Windenknöterich) A offene Lebensräume, Straßenränder (16) 5-8 (4, 14, 29) L = D (20) 0-2 (4, 29) Stratifikation (Kälte) über 4-8 Wochen (1, 2, 4, 20, 29); Keimung durch Bestrahlung nicht gehemmt (1) VOR UND NACH (1, 2, 20, 28, 31) a 32 Polygonum lapathifolium (Ampfer-Knöterich) A feuchter Boden (16) 1,8-2,5 (14) L > D (6) 5 (94 %) (18) Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (1); Keimung durch Dunkelheit gehemmt (18); Stratifikation (Kälte) (1); keine Spezialbehandlungen (5) VOR UND NACH (6) A, E Polygonum pennsylvanicum (Vogelknöterich) A Felder, offene Lebensräume (16) 3,6-7 (14, 29) 2 (29) Stratifikation (Kälte) über 4 Wochen bei 0-5 °C (1, 29); Keimung durch Dunkelheit gehemmt (1) VOR (31) A, E Polygonum periscaria (Floh-Knöterich) A gestörte Flächen, Äcker (16, 19) 2,1 -2,3 (14, 19) L > D (13) 0 (19) < 14 (13) 2 (50 %) (19) Skarifikation, Stratifikation (Kälte), Behandlung mit GA (14); Stratifikation (Kälte), Reifung (17-19); Keimung durch Dunkelheit gehemmt (19); keine Spezialbehandlungen (13) NACH (13) a 32 Rumex crispus (Krauser Ampfer) P Äcker, Straßenränder, offene Flächen (16, 19) 1,3-1,5 (4, 14, 19) L = D (14, 33) 0 (4, 19, 33) 3 (50 %) (19) 6 (100 %) (33) Keimung durch Dunkelheit gehemmt (18, 19); Reifung kann erforderlich sein (18); keine Spezialbehandlungen (4, 14, 33) NACH (4, 33) A, E 32 PRIMULACEAE Anagallis arvensis (Acker-Gauchheil) A Äcker, Grasflächen, gestörte Standorte (16, 19) 0,4-0,5 (4, 14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) Stratifikation (Kälte), Behandlung mit GA (1,14, 18, 19, 32); Licht zur Keimung erforderlich (1); keine Spezialbehandlungen (2, 4) NACH (2,4) A, F RANUNCULACEAE Ranunculus acris (Scharfer Hahnenfuß) Ρ Äcker, Straßenränder, offene Flächen (16, 19) 1,5-2 (14, 19, 29) L = D (14) 1 (29) 41 -56 (19, 29) keine Spezialbehandlungen (5, 14, 22, 24 -26) NACH (5, 22, 24-26) 32 ROSACEAE Geum urbanum (Echte Nelkenwurz) Ρ Hecken, feuchte Gebiete (16, 19) 0,8-1,5 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 16 (79 %) (18) Keimung durch Dunkelheit gehemmt (18, 19); Stratifikation (Wärme) (1); keine Spezialbehandlungen (5, 14, 22, 25, 26) NACH (5, 22, 25, 26) a RUBIACEAE Galium aparine (Kletten-Labkraut) a Äcker, feuchte Gebiete, gestörte Standorte (16, 19) 7-9 (14, 19) L = D (14) 5 (50 %) (19) 6 (100 %) (18) Stratifikation (Kälte) (1, 18, 19); Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (18, 19); Keimung durch Licht gehemmt (1); keine Spezialbehandlungen (6, 14) VOR UND NACH (6, 28) a 32 Galium mollugo (Wiesen-Labkraut) Ρ Wallhecken, offene Flächen (8) 7 (29) L = D (14) 2 (29) keine Spezialbehandlungen (5, 14, 22, 24, 26, 29) NACH (5, 22, 24, 26) a SCROPHULARIACEAE Digitalis purpurea (Roter Fingerhut) Β, Ρ Hecken, offene Flächen (16, 19) 0,1-0,6 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 6 (50 %) (19) 8 (99 %) (18) Keimung durch Dunkelheit gehemmt (1, 17-19); keine Spezialbehandlungen (4, -26, 22) NACH (4, 22-26) D, G, F Veronica persica (Persischer Ehrenpreis) A Äcker, Grasflächen, gestörte Standorte (16, 19) 0,5-0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3(19) 5 (96 %) (18) Keimung durch Dunkelheit gehemmt (18, 19); Stratifikation (Kälte) (18); keine Spezialbehandlungen (14) VOR UND NACH (28) a 32 Genannte Saatgutanbieter Anbieter Anbieterinformationen A Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ, ENGLAND +44 1189 349 464 www.herbiseed.com B Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948, USA +1 727 344 — 4050 www.tropilab.com C Pterophylla — Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0, KANADA +1 519 586 — 3985 D Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002, USA +1 303 431 — 7333 www.applewoodseed.com E Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335, USA +1 800 873 — 3321 www.ernstseed.com F Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB, ENGLAND +44 1229 581137 www.chiltemseeds.co.uk G Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7, KANADA +1 800 274 — 7333 www.thompson-morgan.com LITERATUR (1) Baskin, C.C., und Baskin, J.M. 1998. Seeds. Academic Press, Toronto (2) Blackburn, L.G., und Boutin, C. 2003. Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology, 12:271-285. (3) Boutin, C., Lee, H-B., Peart, T., Batchelor, P.S., und Maguire, R.J. 2000. Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10):2532-2541. (4) Boutin, C., Elmegaard, N., & Kjaer, C. 2004. Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13:349-369. (5) Breeze, V., Thomas, G., und Butler, R. 1992. Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. 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Die Kulturpflanzenarten sind: — Tomate (Solanum lycopersicon); — Gurke (Cucumis sativus); — Salat (Lactuca sativa); — Sojabohne (Glycine max); — Kohl (Brassica oleracea var. capitata); — Möhre (Daucus carota); — Hafer (Avena sativa); — Deutsches Weidelgras (Lolium perenne); — Mais (Zea mays); — Zwiebel (Allium cepa). C.32. ENCHYTRAEEN-REPRODUKTIONSTEST EINLEITUNG 1. Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 220 (2004). Sie soll eingesetzt werden, um die Wirkung von Chemikalien auf die Reproduktionsleistung von Enchytraeen (Enchytraeus albidus, Henle 1873) im Boden zu beurteilen. Die Prüfung beruht im Wesentlichen auf einer vom deutschen Umweltbundesamt entwickelten (1) und in einem Ringtest (2) geprüften Methode. Darüber hinaus wurden noch weitere Methoden zur Untersuchung der Toxizität von Chemikalien für Enchytraeen und Regenwürmer in Betracht gezogen (3)(4)(5)(6)(7)(8). AUSGANGSÜBERLEGUNGEN 2. Bodenbewohnende Anneliden der Gattung Enchytraeus sind ökologisch relevante Arten für Ökotoxizitätsprüfungen. Enchytraeen kommen zwar häufig in Böden vor, in denen auch Regenwürmer leben; bei vielen Böden treten sie aber auch dann in großer Anzahl auf, wenn keine Regenwürmer vorkommen. Enchytraeen können sowohl in Labortests als auch in Halbfreiland- und in Freilandtests verwendet werden. Aus praktischer Sicht ist festzustellen, dass viele Enchytraeus-Arten leicht zu handhaben und zu züchten sind; außerdem ist ihre Regenerationszeit erheblich kürzer als die von Regenwürmern. Ein Reproduktionstest mit Enchytraeen dauert nur 4 bis 6 Wochen (gegenüber 8 Wochen bei Regenwürmern (Eisenia fetida)). 3. Allgemeine Informationen zur Ökologie und zur Ökotoxikologie von Enchytraeen in der terrestrischen Umwelt sind den Quellen (9), (10), (11) und (12) zu entnehmen. PRINZIP DER PRÜFMETHODE 4. Adulte Enchytraeen werden verschiedenen Konzentrationen der in künstlichen Boden eingemischten Prüfchemikalie ausgesetzt. Die Prüfung kann in zwei Schritte unterteilt werden: a) einen Vorversuch zur Feststellung des geeigneten Konzentrationsbereichs (falls keine hinreichenden Informationen verfügbar sind), in dem die Mortalität nach zweiwöchiger Exposition als wesentlicher Endpunkt beurteilt wird, und b) einen definitiven Reproduktionstest, bei dem die Gesamtzahl an juvenilen Tieren eines Elterntiers und das Überleben der Elterntiere bewertet werden. Der definitive Test dauert sechs Wochen. Nach den ersten drei Wochen werden die adulten Würmer herausgenommen und die morphologischen Änderungen protokolliert. Nach weiteren drei Wochen werden die juvenilen Tiere gezählt, die aus den von den adulten Tieren hergestellten Kokons geschlüpft sind. Die Reproduktionsleistung der Tiere, die der Prüfchemikalie ausgesetzt waren, wird mit der Reproduktionsleistung der Kontrollgruppe(n) verglichen, um i) die NOEC (höchste geprüfte Konzentration ohne beobachtete schädliche Wirkung) und/oder ii) mit dem ECx-Wert (z. B. EC10 oder EC50) (mithilfe eines Regressionsmodells) die Konzentration zu ermitteln, bei der die Reproduktionsleistung um x % reduziert wird. Die Testkonzentrationen müssen den ECx-Bereich einschließen (z. B. EC10 und EC50), damit der ECx-Wert durch Interpolation anstelle einer Extrapolation ermittelt werden kann. INFORMATIONEN ZUR PRÜFCHEMIKALIE 5. Die Wasserlöslichkeit, der log-Kow-Wert, der Boden-Wasser-Verteilungskoeffizient (z. B. Kapitel C.18 oder C.19) und der Dampfdruck der Prüfchemikalie sollten bekannt sein. Wünschenswert sind zudem Informationen über den Verbleib der Chemikalie im Boden (z. B. die Photolyse- und die Hydrolyserate). 6. Die Prüfmethode kann sowohl für wasserlösliche als auch für nicht lösliche Chemikalien verwendet werden. Allerdings ist die Prüfchemikalie entsprechend unterschiedlich einzubringen. Für flüchtige Chemikalien ist die Prüfmethode nicht geeignet (d. h. für Chemikalien, bei denen die Henry-Konstante oder der Luft-Wasser-Verteilungskoeffizient größer als eins ist, oder für Chemikalien, bei denen der Dampfdruck bei 25 °C mehr als 0,0133 Pa beträgt. VALIDITÄT DES TESTS 7. Damit ein Test als valide gewertet werden kann, sollten die Kontrollen die folgenden Kriterien erfüllen: — Die Mortalität der adulten Tiere darf am Ende des Vorversuchs und nach den ersten drei Wochen des Reproduktionstests nicht mehr als 20 % betragen; — wenn bei der Vorbereitung des Tests 10 adulte Tiere pro Gefäß verwendet wurden, sollten sich am Ende des Tests durchschnittlich mindestens 25 juvenile Tiere pro Gefäß entwickelt haben; — der Variationskoeffizient um die durchschnittliche Anzahl an juvenilen Tieren sollte am Ende des Reproduktionstests höchstens 50 % betragen. Wenn ein Test die genannten Validitätskriterien nicht erfüllt, ist er zu beenden, sofern keine besonderen Gründe für seine Fortsetzung vorliegen. Die Begründung ist in den Prüfbericht aufzunehmen. REFERENZCHEMIKALIE 8. Eine Referenzchemikalie ist entweder regelmäßig zu prüfen oder in jeden einzelnen Test mit einzubeziehen, um sicherzustellen, dass sich die Reaktion der Testorganismen im Laufe der Zeit nicht signifikant geändert hat. Eine geeignete Referenzchemikalie ist Carbendazim, für das gezeigt wurde, dass es die Lebens- und Reproduktionsfähigkeit von Enchytraeen beeinträchtigt (13)(14); außerdem können Chemikalien mit gut bekannten Toxizitätsdaten verwendet werden. AgrEvo Company (Frankfurt, Deutschland) bietet unter dem Handelsnamen Derosal™ eine Carbendazim-Formulierung mit einem Wirkstoffanteil von 360 g/l (32,18 %) an. Diese Formulierung wurde in einem Ringtest verwendet (2). Der im Ringtest ermittelte EC50-Wert der Reproduktionsleistung lag bei 1,2 ± 0,8 mg Wirkstoff/kg Trockenmasse (2). Wenn ein positiver toxischer Standard in die Testreihe aufgenommen wird, ist eine einzige Konzentration zu verwenden, und die Anzahl der Replikate muss mit der Anzahl der Kontrollen übereinstimmen. Bei Carbendazim wird die Prüfung von 1,2 mg Wirkstoff/kg Trockenmasse (getestet in einer flüssigen Formulierung) empfohlen. BESCHREIBUNG DES TESTS Ausrüstung 9. Die Prüfgefäße müssen aus Glas oder einem sonstigen chemisch inertem Material bestehen. Geeignet sind Glasgefäße (z. B. mit einem Volumen von 0,20 bis 0,25 l und einem Durchmesser von ≈ 6 cm). Die Gefäße müssen transparente Deckel haben (z. B. aus Glas oder Polyethylen), die so ausgeführt sind, dass sie die Wasserverdampfung reduzieren und gleichzeitig den Gasaustausch zwischen dem Bodensubstrat und der Atmosphäre erlauben. Die Deckel müssen transparent sein, damit die erforderliche Lichtdurchlässigkeit gegeben ist. 10. Es wird eine übliche Laborausrüstung insbesondere mit folgenden Bestandteilen benötigt: — Trockenschrank; — Stereomikroskop; — pH-Messgerät und Photometer; — Waagen mit geeigneter Genauigkeit; — geeignete Vorrichtungen zur Temperaturregelung; — geeignete Ausrüstung zur Feuchtigkeitsregelung (bei Expositionsgefäßen mit Deckel nicht wesentlich); — Inkubator oder kleiner Raum mit Klimaanlage; — Pinzette, Haken oder Schlaufen; — Fotoschalen. Herstellung des künstlichen Bodens 11. In diesem Test wird künstlicher Boden (5)(7) mit folgender Zusammensetzung verwendet (bezogen auf Trockenmassen, bei 105 °C bis zur Massekonstanz getrocknet): — 10 % Sphagnum-Torf, luftgetrocknet und fein gemahlen (eine Partikelgröße von 2 ± 1 mm ist akzeptabel); vor der Verwendung in einem Test sollte sichergestellt werden, dass mit einer frischen Torf-Charge hergestellter Boden für die Zucht der Würmer geeignet ist; — 20 % Kaolin-Ton (Kaolinit-Anteil vorzugsweise über 30 %); — ca. 0,3 bis 1,0 % Calciumcarbonat (CaCO3, pulverisiert, Analysequalität), um einen pH-Wert von 6,0 ± 0,5 zu erzielen; wie viel Calciumcarbonat hinzuzugeben ist, kann vor allem von der Qualität/Beschaffenheit des Torfs abhängen; — ca. 70 % luftgetrockneter Quarzsand (je nach erforderlichem CaCO3-Anteil), hauptsächlich Feinsand mit mehr als 50 % Partikeln mit einer Größe von 50 bis 200 μm. Vor der Verwendung eines künstlichen Bodens in einem definitiven Test ist seine Eignung für die Zucht von Würmern und zur Erfüllung der Validitätskriterien des Tests nachzuweisen. Die entsprechende Prüfung wird insbesondere empfohlen, um sicherzustellen, dass die Aussagekraft des Tests bei reduziertem Kohlenstoffgehalt des künstlichen Bodens, z. B. durch Verringerung des Torfanteils auf 4-5 % und entsprechende Erhöhung des Sandanteils, nicht beeinträchtigt wird. Durch eine solche Reduzierung des Gehalts an organischem Kohlenstoff kann die Bindung der Prüfchemikalie an den Boden (d. h. an organischen Kohlenstoff) verringert werden und die Verfügbarkeit der Prüfchemikalie für die Würmer zunehmen. Es wurde nachgewiesen, dass Enchytraeus albidus den Validitätskriterien hinsichtlich der Reproduktion bei Versuchen mit Feldböden mit geringerem Gehalt an organischem Kohlenstoff als oben angegeben (z. B. 2,7 %) (15) genügen, und es gibt (wenngleich in begrenztem Umfang) Hinweise darauf, dass diese Ergebnisse auch mit künstlichem Boden mit 5 %igem Torfanteil erzielt werden können. Hinweis: Wenn in weiteren (z. B. höherstufigen) Tests natürlicher Boden verwendet wird, sind auch die Eignung dieses Bodens und die Erfüllung der Validitätskriterien des Tests nachzuweisen. 12. Die trockenen Bestandteile des Bodens werden gründlich gemischt (z. B. in einem großen Labormischer). Der Mischvorgang wird mindestens eine Woche vor Prüfbeginn durchgeführt. Der gemischte Boden muss zwei Tage ruhen, damit sich der Säurepegel ausgleichen/stabilisieren kann. Zur Bestimmung des pH-Werts wird eine Mischung aus Boden und einer 1 M Kaliumchlorid- (KCl) oder einer 0,01 M Calciumchloridlösung (CaCl2) im Verhältnis 1:5 verwendet (siehe (16) und Anlage 3). Wenn der Säuregrad des Bodens außerhalb des spezifizierten Bereichs liegt (siehe Nummer 11), kann der pH-Wert durch Zugabe einer geeigneten Menge CaCO3 eingestellt werden. Ist der Boden zu alkalisch, kann der pH-Wert durch Zugabe eines größeren Anteils des Gemischs (siehe Nummer 11) ohne CaCO3 eingestellt werden. 13. Die maximale Wasserhaltekapazität des künstlichen Bodens wird mit den in Anlage 2 beschriebenen Verfahren ermittelt. Ein oder zwei Tage vor Beginn des Tests wird der trockene künstliche Boden mit so viel entionisiertem Wasser befeuchtet, dass etwa die Hälfte des endgültigen Wassergehalts erreicht wird (40-60 % der maximalen Wasserhaltekapazität). Zu Beginn des Tests wird der befeuchtete Boden entsprechend der Anzahl der im Test zu verwendenden Testkonzentrationen (sowie gegebenenfalls der Referenzchemikalie) und Kontrollen aufgeteilt. Der Feuchtegehalt wird auf 40-60 % der maximalen Wasserhaltekapazität eingestellt, indem die Lösung mit der Prüfchemikalie und/oder destilliertes oder entionisiertes Wasser hinzugegeben wird (siehe Nummern 19, 20 und 21). Der Feuchtegehalt wird zu Beginn und am Ende des Tests ermittelt (durch Trocknen bei 105 °C bis zur Massekonstanz) und sollte im optimalen Bereich für die Lebensfähigkeit der Würmer liegen. Für eine grobe Prüfung des Feuchtegehalts des Bodens kann der Boden vorsichtig in der Hand gedrückt werden; bei richtigem Feuchtegehalt sollten Wassertröpfchen zwischen den Fingern austreten. Auswahl und Vorbereitung der Versuchstiere 14. Die empfohlene Art für den Test ist Enchytraeus albidus (Henle 1837, weißer Topfwurm), ein Mitglied der Familie Enchytraeidae (Ordnung Oligochaeta, Stamm Annelida). E. albidus ist eine der größten Enchytraeen-Arten; bei einzelnen Exemplaren wurde eine Länge von bis zu 35 mm gemessen (17)(18). E. albidus ist weltweit in marinen, limnischen und terrestrischen Habitaten zu finden, hauptsächlich in faulendem organischem Material (Seetang, Kompost), seltener auch in Wiesen (9). Die breite ökologische Toleranz und gewisse morphologische Variationen deuten darauf hin, dass es unterschiedliche Rassen geben könnte. 15. E. albidus wird im Handel als Fischfutter angeboten. Es ist zu prüfen, ob die Kultur durch andere, normalerweise kleinere Arten kontaminiert ist (1) (19). Ist dies der Fall, sind alle Würmer in einer Petrischale mit Wasser zu waschen. Mithilfe eines Stereomikroskops werden große adulte Exemplare von E. albidus für eine neue Kultur aussortiert, und alle anderen Würmer sind zu verwerfen. E. albidus lässt sich leicht in einer Vielzahl organischer Materialien züchten (siehe Anlage 4). Der Lebenszyklus von E. albidus ist kurz, da die Tiere ihre Geschlechtsreife zwischen dem 33. Lebenstag (bei 18 °C) und dem 74. Lebenstag (bei 12 1 °C) erreichen. Für die Prüfung sollten ausschließlich Wurmkulturen verwendet werden, die mindestens fünf Wochen lang (eine Generation) ohne Probleme im Labor gehalten wurden. 16. Andere Enchytraeus-Arten kommen ebenfalls in Betracht; z. B. E. buchholzi Vejdovsky 1879 oder E. crypticus Westheide und Graefe 1992 (siehe Anlage 5). Werden andere Enchytraeus-Arten verwendet, so sind diese eindeutig zu identifizieren, und die Wahl der Art ist zu begründen. 17. Für die Tests sind adulte Tiere zu verwenden. In der Clitellum-Region sollten Eier (weiße Flecken) erkennbar sein, und die Tiere müssen alle etwa gleich groß sein (ca. 1 cm lang). Die Zuchtkultur braucht nicht synchronisiert zu werden. 18. Wenn die Enchytraeen nicht in demselben Bodentyp und unter denselben Bedingungen (einschließlich Fütterung) gehältert werden wie im endgültigen Test, muss eine Akklimatisierung erfolgen (mindestens 24 Stunden bis drei Tage). Zunächst sollten mehr adulte Tiere als zur Durchführung des Tests benötigt akklimatisiert werden, damit beschädigte oder anderweitig ungeeignete Exemplare verworfen werden können. Am Ende des Akklimatisierungszeitraums werden für den Test ausschließlich Würmer ausgewählt, die Eier enthalten und keine Verhaltensauffälligkeiten zeigen (z. B. Versuche, den Boden zu verlassen). Die Würmer werden mit einer Juwelierpinzette, mit Haken oder Schlaufen vorsichtig herausgenommen und in eine Petrischale mit einer kleinen Menge Süßwasser gesetzt. Für diesen Zweck ist rekonstituiertes Süßwasser zu empfehlen, wie in Kapitel C.20 (Daphnia magna Reproduktionstest) beschrieben, da entionisiertes oder entmineralisiertes Wasser oder Leitungswasser für die Würmer schädlich sein könnte. Die Würmer werden unter einem Stereomikroskop untersucht, und Würmer ohne Eier werden verworfen. Es ist sorgfältig darauf zu achten, dass auch Milben und Springschwänze entfernt und verworfen werden, die in die Kulturen geraten sein könnten. Für den Test nicht benötigte gesunde Würmer werden in die Stammkultur zurückgegeben. Herstellung der Testkonzentrationen Wasserlösliche Prüfchemikalie 19. Eine Lösung der Prüfchemikalie wird in entionisiertem Wasser in ausreichender Menge für alle Replikate einer Testkonzentration hergestellt. Vorzugsweise sollte eine angemessene Menge Wasser verwendet werden, um den erforderlichen Feuchtegehalt (d. h. 40 bis 60 % der maximalen Wasserhaltekapazität (siehe Nummer 13)) zu erzielen. Jede Lösung mit der Prüfchemikalie wird gründlich mit einer Charge des angefeuchteten Bodens gemischt und dann in das Prüfgefäß gegeben. Wasserunlösliche Prüfchemikalien 20. Chemikalien, die in Wasser unlöslich, aber in organischen Lösungsmitteln löslich sind, können in der kleinstmöglichen Menge eines geeigneten Lösungsvermittlers (z. B. Aceton) gelöst werden. Hierzu sind ausschließlich flüchtige Lösungsmittel zu verwenden. Der Trägerstoff wird auf eine kleine Menge (z. B. 2,5 g) Quarzsand gesprüht oder mit dem Sand vermischt. Anschließend wird der Sand mindestens eine Stunde unter einem Abzug gestellt, damit das Lösungsmittel verdunsten kann. Diese Mischung aus Quarzsand und Prüfchemikalie wird zum angefeuchteten Boden hinzugegeben und nach Hinzugabe von entionisiertem Wasser in ausreichender Menge gründlich gemischt, um den erforderlichen Feuchtegehalt zu erzielen. Die endgültige Mischung wird in die Prüfgefäße gegeben. 21. Bei Chemikalien, die sowohl in Wasser als auch in organischen Lösungsmitteln schlecht löslich sind, wird das Äquivalent von 2,5 g fein gemahlenem Quarzsand pro Prüfgefäß mit der Menge der Prüfchemikalie vermischt, die erforderlich ist, um die gewünschte Testkonzentration zu erhalten. Diese Mischung aus Quarzsand und Prüfchemikalie wird zum angefeuchteten Boden hinzugegeben und nach Hinzugabe von entionisiertem Wasser in ausreichender Menge gründlich vermischt, um den erforderlichen Feuchtegehalt zu erzielen. Die endgültige Mischung wird auf die Prüfgefäße verteilt. Dieses Verfahren wird für alle Testkonzentrationen wiederholt, und es wird eine geeignete Kontrolle hergestellt. 22. Die Chemikalien werden im Allgemeinen höchstens bis zu einer Konzentration von 1 000 mg/kg Boden (Trockenmasse) geprüft. Je nach Zielsetzung eines bestimmten Tests können Prüfungen allerdings auch mit höheren Konzentrationen vorgenommen werden. DURCHFÜHRUNG DER TESTS Test- und Kontrollgruppen 23. Für jede Testkonzentration werden 20 g (Trockenmasse) Testboden in das Prüfgefäß gegeben (siehe Nummern 19, 20 und 21). Außerdem werden Kontrollen ohne die Prüfchemikalie hergestellt. In alle Prüfgefäße wird Futter gegeben, wie unter Nummer 29 beschrieben. In jedes Prüfgefäß werden zehn zufällig ausgewählte Würmer gesetzt. Die Würmer werden vorsichtig in die einzelnen Prüfgefäße gegeben und auf dem Boden abgesetzt (z. B. mit einer Juwelierpinzette, mit Haken oder mit Schlaufen. Die Anzahl der Replikate der Testkonzentrationen und der Kontrollen hängt vom jeweiligen Prüfprotokoll ab (siehe Nummer 34). Die Prüfgefäße werden nach dem Zufallsprinzip in den Testinkubator gestellt, und die Positionen werden wöchentlich neu randomisiert. 24. Wenn zur Applikation der Prüfchemikalie ein Lösungsvermittler verwendet wird, ist zusätzlich zu den Testreihen eine Kontrollreihe mit Quarzsand mit aufgesprühtem oder untergemischtem Lösungsmittel zu prüfen. Die Konzentration des Lösungsmittels oder des Dispergiermittels muss mit der Konzentration übereinstimmen, die auch in den Prüfgefäßen mit der Prüfchemikalie verwendet wird. Bei Chemikalien, die gemäß den unter Nummer 21 beschriebenen Verfahren zu applizieren sind, muss eine Kontrollreihe mit zusätzlichem Quarzsand (2,5 g pro Gefäß) geprüft werden. Prüfbedingungen 25. Die Testtemperatur beträgt 20 ± 2 °C. Damit die Würmer den Boden nicht verlassen, wird die Prüfung bei einem geregelten Licht-Dunkel-Zyklus (vorzugsweise 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit) mit einer Lichtstärke von 400 bis 800 lux im Bereich der Prüfgefäße durchgeführt. 26. Um die Feuchte des Bodens zu ermitteln, werden die Gefäße zu Beginn des Tests und danach jeweils einmal pro Woche gewogen. Gewichtsverluste werden durch Zugabe von entionisiertem Wasser in ausreichender Menge aufgefüllt. Wasserverluste können durch Aufrechterhaltung einer hohen Luftfeuchtigkeit (> 80 %) im Testinkubator reduziert werden. 27. Der Feuchtegehalt und der pH-Wert sind jeweils zu Beginn und am Ende sowohl des Vorversuchs als auch des definitiven Tests zu messen. Die Messungen sind an allen Kontrollen und an allen mit der Prüfchemikalie (in allen Konzentrationen) behandelten Bodenproben vorzunehmen, die zwar in der gleichen Weise wie die Testkulturen hergestellt und gehandhabt werden, aber keine Würmer enthalten. Zu diesen Bodenproben ist nur zu Beginn des Tests Futter hinzuzugeben, um die Aktivität der vorhandenen Mikroorganismen anzuregen. Es sollte die gleiche Menge Futter hinzugegeben werden, wie zu den Testkulturen. Während des Tests braucht in diese Gefäße allerdings kein weiteres Futter mehr gegeben zu werden. Fütterung 28. Es wird Futter verwendet, das die Lebensfähigkeit der Enchytraeen-Population gewährleistet. Haferflocken, vorzugsweise vor der Verwendung autoklaviert, um Verunreinigungen durch Mikroorganismen zu verhindern (auch Erwärmung ist möglich), haben sich als geeignetes Futter erwiesen. 29. Bei der ersten Fütterung werden 50 mg gemahlene Haferflocken mit dem Boden in jedem Gefäß vermischt, bevor die Würmer eingesetzt werden. Anschließend wird bis zum 21. Tag Futter einmal wöchentlich hinzugegeben. An Tag 28 wird nicht gefüttert, da die adulten Tiere in diesem Stadium bereits herausgenommen wurden und die juvenilen Würmer ab diesem Zeitpunkt verhältnismäßig wenig zusätzliches Futter brauchen. Die Fütterung während des Tests besteht aus 25 mg gemahlenen Haferflocken pro Gefäß, die wird vorsichtig auf die Bodenoberfläche gelegt werden, damit die Würmer nicht verletzt werden. Um Schimmelpilzbefall zu verhindern, sind die Haferflocken mit einer kleinen Menge Boden zu bedecken. Wenn das Futter nicht aufgezehrt wird, sollte die Futtermenge verringert werden. Protokoll des Vorversuchs zur Konzentrationsbereichs-Bestimmung 30. Wenn erforderlich, wird ein Vorversuch beispielsweise mit fünf Konzentrationen der Prüfchemikalie (0,1, 1,0, 10, 100 und 1 000 mg/kg (Boden Trockenmasse)) durchgeführt. Ein Replikat für jede Behandlung und jede Kontrolle ist ausreichend. 31. Der Vorversuch dauert zwei Wochen. Am Ende des Versuchs wird die Mortalität der Würmer ermittelt. Ein Wurm wird dann als tot erfasst, wenn er am vorderen Ende nicht mehr auf mechanische Reize reagiert. Über die Mortalität hinaus können auch weitere Informationen hilfreich sein, um die im definitiven Test zu verwendenden Konzentrationen festzulegen. Änderungen im Verhalten der adulten Würmer (die Würmer können sich nicht mehr in den Boden eingraben, sie liegen reglos an der Glaswand des Prüfgefäßes usw.) sowie morphologische Änderungen (z. B. offene Wunden) sind daher ebenso zu protokollieren wie das Vorhandensein juveniler Würmer. Letzteres kann mit der in Anlage 6 beschriebenen Färbemethode ermittelt werden. 32. Der ungefähre LC50-Wert kann bestimmt werden, indem der geometrische Mittelwert der Mortalitätsdaten berechnet wird. Bei der Festlegung des Konzentrationsbereichs für den definitiven Test wird davon ausgegangen, dass die Wirkungen auf die Reproduktionsleistungen maximal um den Faktor 10 geringer sind als der LC50-Wert. Dies ist jedoch eine empirische Beziehung; jeder Einzelfall kann anderes aussehen. Weitere Beobachtungen im Vorversuch (z. B. das Vorkommen juveniler Tiere) können helfen, den Konzentrationsbereich der Prüfchemikalie für den definitiven Test noch genauer einzugrenzen. 33. Um den LC50-Wert genau zu bestimmen, wird empfohlen, den Test mit mindestens vier Replikaten für jede Konzentration der Prüfchemikalie und mit einer geeigneten Anzahl Konzentrationen zu wiederholen, damit sich mindestens vier statistisch signifikante mittlere Reaktionen für die jeweiligen Konzentrationen ergeben. Eine ähnliche Anzahl an Konzentrationen und Replikaten ist gegebenenfalls auch für die Kontrollen zu verwenden. Protokoll des definitiven Reproduktionstests 34. Entsprechend den Empfehlungen aufgrund eines Ringtests werden drei Protokolle vorgeschlagen (2): — Zur Bestimmung der NOEC sind mindestens fünf Konzentrationen in einer geometrischen Reihe zu prüfen. Zu empfehlen sind vier Replikate je Testkonzentration und acht Kontrollen. Die Konzentrationen dürfen sich maximal um den Faktor 1,8 unterscheiden. — Zur Ermittlung des ECx-Werts (z. B. EC10 oder EC50) müssen mindestens fünf Konzentrationen geprüft werden; diese Konzentrationen müssen den ECx einschließen, damit der ECx interpoliert werden kann und nicht extrapoliert werden muss. Mindestens vier Replikate je Testkonzentration und vier Kontrollreplikate werden empfohlen. Der Abstandsfaktor kann unterschiedlich sein (d. h. im erwarteten Wirkungsbereich maximal 1,8 und bei den höheren und niedrigeren Konzentrationen mehr als 1,8). — Ein kombinierter Ansatz ermöglicht die Bestimmung sowohl der NOEC als auch des ECx-Werts. Es sind acht Testkonzentrationen in einer geometrischen Reihe zu verwenden. Zu empfehlen sind vier Replikate je Behandlung und acht Kontrollen. Die Konzentrationen dürfen sich maximal um den Faktor 1,8 unterscheiden. 35. Pro Prüfgefäß sind zehn adulte Würmer zu verwenden (siehe Nummer 23). Zu Beginn des Tests und danach einmal wöchentlich bis zum 21. Tag einschließlich wird Futter in die Prüfgefäße gegeben (siehe Nummer 29). An Tag 21 werden die Bodenproben sorgfältig manuell abgesucht, und die lebenden adulten Würmer werden erfasst und gezählt; Verhaltensänderungen (die Würmer graben sich nicht mehr in den Boden; sie liegen reglos an der Glaswand des Prüfgefäßes usw.) und morphologische Veränderungen (z. B. offene Wunden) werden protokolliert. Anschließend werden alle adulten Würmer aus den Prüfgefäßen und aus dem Boden herausgenommen. Der Testboden mit etwa gebildeten Kokons wird nochmals drei Wochen unter den genannten Prüfbedingungen inkubiert, wobei allerdings nur noch einmal an Tag 35 gefüttert wird (25 mg gemahlene Haferflocken pro Gefäß). 36. Nach sechs Wochen werden die neu geschlüpften Würmer gezählt. Hierzu wird die auf der Färbung mit Bengalrot beruhende Methode (siehe Anlage 6) empfohlen, wenngleich sich auch andere Verfahren zur Entnahme und Flotation unter Zufuhr von Flüssigkeit (aber nicht von Wärme) als geeignet erwiesen haben (4)(10)(11)(20). Die Einfärbung mit Bengalrot wird empfohlen, weil die Nassextraktion aus einem Bodensubstrat durch Trübungen aufgrund suspendierter Tonpartikel erschwert sein könnte. Limit-Test 37. Wenn im Vorversuch auch bei der höchsten Konzentration (d. h. bei 1 000 mg/kg) keine Wirkungen festzustellen sind, kann der Reproduktionstest als Limit-Test durchgeführt werden, bei dem mit einer Konzentration von 1 000 mg/kg nachgewiesen wird, dass die NOEC im Hinblick auf die Reproduktionsleistung noch über diesem Wert liegt. Zusammenfassung und Zeitplan des Tests 38. Im Einzelnen umfasst der Test folgende Schritte: Zeitpunkt Vorversuch Definitiver Test Tag – 7 oder früher — Herstellen des künstlichen Bodens (Mischen trockener Bestandteile) — Herstellen des künstlichen Bodens (Mischen trockener Bestandteile) Tag – 5 — Prüfung des pH-Werts des künstlichen Bodens — Messung der maximalen Wasserhaltekapazität des Bodens — Prüfung des pH-Werts des künstlichen Bodens — Messung der maximalen Wasserhaltekapazität des Bodens Tag – 5 bis – 3 — Sortieren der Würmer zur Akklimatisierung — Sortieren der Würmer zur Akklimatisierung Tag – 3 bis 0 — Akklimatisieren der Würmer über mindestens 24 Stunden — Akklimatisieren der Würmer über mindestens 24 Stunden Tag – 1 — Befeuchten des künstlichen Bodens und Aufteilung in Chargen — Befeuchten des künstlichen Bodens und Aufteilung in Chargen Tag 0 — Herstellen der Stammlösungen — Applikation der Prüfchemikalie — Einwiegen des Prüfsubstrats in die Prüfgefäße — Einmischen des Futters — Einsetzen der Würmer — Messung pH-Werts und des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens — Herstellen der Stammlösungen — Applikation der Prüfchemikalie — Einwiegen des Prüfsubstrats in die Prüfgefäße — Einmischen des Futters — Einsetzen der Würmer — Messung des pH-Werts und des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens Tag 7 — Prüfen des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens — Prüfen des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens — Füttern Tag 14 — Bestimmen der Mortalität der adulten Tiere — Schätzung der Anzahl der juvenilen Tiere — Messung des pH-Werts und des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens — Prüfen des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens — Füttern Tag 21 — Beobachten des Verhaltens der adulten Tiere — Entnahme der adulten Tieren — Bestimmung der Mortalität der adulten Tiere — Prüfen des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens — Füttern Tag 28 — Prüfen des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens — Keine Fütterung Tag 35 — Prüfen des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens — Füttern Tag 42 — Zählen der juvenilen Würmer — Messung des pH-Werts und des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens DATEN UND BERICHTERSTATTUNG Auswertung der Ergebnisse 39. Anlage 7 enthält zwar eine Übersicht, doch bei dieser Prüfmethode ist keine statistische Vorgehensweise für die Analyse der Prüfergebnisse vorgeschrieben. 40. Der wesentliche Endpunkt des Vorversuchs ist die Mortalität. Änderungen im Verhalten der adulten Würmer (die Würmer können sich nicht mehr in den Boden eingraben, sie liegen reglos an der Glaswand des Prüfgefäßes usw.) sowie morphologische Änderungen (z. B. offene Wunden) sind jedoch ebenso zu protokollieren wie das Vorhandensein juveniler Würmer. Der LC50-Wert wird normalerweise mit Probit-Analysen (21) oder durch logistische Regressionsanalysen bestimmt. Wenn diese Analysemethode jedoch ungeeignet ist (z. B. weil weniger als drei Konzentrationen verfügbar sind, bei denen ein Teil der Tiere gestorben ist), können auch alternative Methoden verwendet werden. In Betracht kommen etwa gleitende Durchschnitte (22), die Trimmed-Spearman-Karber-Methode (23) oder eine einfache Interpolation (z. B. geometrischer Mittelwert von LC0 und LC100, berechnet als Quadratwurzel von LC0 multipliziert mit LC100). 41. Endpunkt beim definitiven Test ist die Vermehrungsrate (d. h. die Anzahl der entstandenen juvenilen Tiere). Ebenso wie im Vorversuch sind jedoch im Abschlussbericht auch alle Anzeichen für sonstige schädliche Wirkungen zu erfassen. Für die statistische Analyse müssen für jede Textkonzentration und jede Kontrolle im Reproduktionstest das arithmetische Mittel und die Standardabweichung berechnet werden. 42. Wenn eine Varianzanalyse vorgenommen wurde, können die Standardabweichung, s, und die Freiheitsgrade, df, durch die nach der ANOVA geschätzte gepoolte Varianz bzw. durch die entsprechenden Freiheitsgrade ersetzt werden (wenn die Varianz nicht von der Konzentration abhängig ist). In diesem Fall sind die einzelnen Varianzen der Kontrollen und der Gefäße mit den Testkonzentrationen zu verwenden. In der Regel werden die betreffenden Werte mit kommerzieller Statistik-Software berechnet, wobei die Ergebnisse der einzelnen Gefäße als Replikate angenommen werden. Wenn die Zusammenfassung von Daten der negativen Kontrollen und der Lösungsmittelkontrollen sinnvoller erscheint als die Prüfung mit einer einzelnen Kontrolle, werden die Kontrollen getestet, um sicherzustellen, dass sich die Ergebnisse nicht signifikant unterscheiden (entsprechende Tests siehe Nummer 45 und Anlage 7). 43. Ob weitere statistische Tests vorzunehmen und statistische Rückschlüsse zu ziehen sind, hängt davon ab, ob bei den Replikaten eine Normalverteilung und eine homogene Varianz der Werte gegeben ist. Schätzung der NOEC 44. Vorzugsweise sollten leistungsfähige Tests durchgeführt werden. Dabei könnten Informationen (z. B. frühere Erfahrungen mit Ringtests oder sonstige historische Daten) herangezogen werden, um zu beurteilen, ob die Daten in etwa normal verteilt sind. Entscheidender ist die Varianzhomogenität (Homoskedastizität). Erfahrungsgemäß steigt die Varianz häufig mit zunehmendem Mittelwert. In diesem Fall könnte eine Datentransformation eine Homoskedastizität zur Folge haben. Eine entsprechende Transformation sollte aber eher auf Erfahrungen mit historischen Daten als auf den Daten der aktuellen Untersuchung beruhen. Bei homogenen Daten sind multiple t-Tests (z. B. ein Williams-Test (α = 0,05, einseitig) (24)(25) oder in bestimmten Fällen auch ein Dunnett-Test (26)(27)) durchzuführen. Bei uneinheitlichen Replikaten müssen die t-Werte in der Tabelle korrigiert werden, wie von Dunnett und Williams empfohlen. Bei einer starken Variation steigen/sinken die Ergebnisse nicht regelmäßig. Bei derart starken Monotonieabweichungen ist der Dunnett-Test besser geeignet. Bei Abweichungen von der Homoskedastizität kann es angebracht sein, mögliche Wirkungen in Bezug auf Varianzen näher zu untersuchen, um dann zu entscheiden, ob die t-Tests durchgeführt werden können, ohne zu viel an Aussagekraft einzubüßen (28). Alternativ kann ein multipler U-Test (z. B. der Bonferroni-U-Test nach Holm (29)) oder — wenn bei diesen Daten zwar eine Homoskedastizität festzustellen ist, die Daten ansonsten aber mit der zugrunde liegenden monotonen Dosis-Wirkungs-Kurve übereinstimmen — ein weiterer nicht parametrischer Test (z. B. Jonckheere-Terpstra (30)(31) oder Shirley) (32)(33) vorgenommen werden; dies wäre im Allgemeinen sinnvoller als t-Tests für ungleiche Varianzen (siehe auch Flussdiagramm in Anlage 7). 45. Wenn ein Limit-Test durchgeführt wurde und die Voraussetzungen für parametrische Prüfverfahren (Normalität, Homogenität) erfüllt sind, kann der paarige Student-t-Test verwendet werden; ansonsten ist der -U-Test nach Mann und Whitney durchzuführen (29). Schätzung von ECx 46. Zur Berechnung eines ECx-Werts wird eine Regressionsanalyse (linear oder nicht linear) mit den Mittelwerten aus der Vorbehandlung vorgenommen, nachdem eine geeignete Dosis-Wirkungs-Beziehung ermittelt wurde. Für das Wachstum der Würmer als kontinuierliche Reaktion können ECx--Werte mit einer geeigneten Regressionsanalyse geschätzt werden (35). Geeignete Funktionen für quantale Daten (Mortalität/Überleben und Anzahl der Nachkommen) sind die normale sigmoide Funktion, die Logit- oder die Weibull-Funktion mit zwei bis vier Parametern, die teilweise auch hormetische Effekte abbilden können. Wenn eine Dosis-Wirkungs-Funktion mithilfe einer linearen Regressionsanalyse angepasst wurde, müssten in der Regressionsanalyse ein signifikanter r2-Wert (Bestimmungskoeffizient) und/oder eine Steigung festzustellen sein; anschließend wird der ECx-Wert abgeschätzt, indem in die nach der Regressionsanalyse erstellte Gleichung ein Wert entsprechend x % des Mittelwerts der Kontrollgruppe eingesetzt wird. 95- %-Konfidenzintervalle werden nach Fieller (zitiert in Finney (21)) oder mit sonstigen modernen geeigneten Methoden berechnet. 47. Alternativ wird die Reaktion als Anteil oder Prozentanteil eines Modellparameters nachgebildet, der dann als mittlere Reaktion der Kontrollgruppe angenommen wird. In diesen Fällen kann die normale (Logit, Weibull) sigmoide Kurve häufig leicht durch eine Probit-Regression an die Ergebnisse angepasst werden (21). In diesen Fällen ist die Gewichtungsfunktion entsprechend den metrischen Antworten anzupassen, wie bei Christensen (36) beschrieben. Wenn allerdings eine Hormesis festgestellt wurde, ist die Probit-Analyse durch eine 4-Parameter-Funktion (Logit oder Weibull) zu ersetzen, die mit einem nicht linearen Regressionsverfahren angepasst wird (36). Kann keine geeignete Dosis-Wirkungs-Funktion an die Daten angepasst werden, können alternative Methoden zur Abschätzung von ECx und der entsprechenden Konfidenzintervalle verwendet werden (beispielsweise gleitende Durchschnitte nach Thompson (22) und das Trimmed-Spearman-Karber-Verfahren (23)). PRÜFBERICHT 48. Der Prüfbericht muss folgende Informationen enthalten: Prüfchemikalie: — physikalische Beschaffenheit und — wenn relevant — physikalisch-chemische Eigenschaften (z. B. Wasserlöslichkeit oder Dampfdruck); — chemische Bezeichnung der Prüfchemikalie nach der IUPAC-Nomenklatur, CAS-Nummer, Charge, Los, Strukturformel und Reinheit; — Verfallsdatum der Probe; Im Test verwendete Art: — eingesetzte Testtiere: Art, wissenschaftlicher Name, Bezugsquelle der Testorganismen und Zuchtbedingungen. Prüfbedingungen: — Bestandteile und Herstellung des künstlichen Bodens; — Methode der Applikation der Prüfchemikalie; — Beschreibung der Prüfbedingungen (Temperatur, Feuchtegehalt, pH-Wert usw.); — vollständige Beschreibung des Prüfprotokolls und der Verfahren. Prüfergebnisse: — Mortalität adulter Würmer nach zwei Wochen und Anzahl der juvenilen Tiere am Ende des Vorversuchs; — Mortalität adulter Würmer nach dreiwöchiger Exposition und vollständige Anzahl der juvenilen Tiere am Ende des definitiven Tests; — alle beobachteten physischen oder pathologischen Symptome und Verhaltensänderungen der Testorganismen; — der LC50-Wert, die NOEC und/oder der ECx-Wert (z. B. EC50 oder EC10) für die Reproduktionsleistung, gegebenenfalls mit Konfidenzintervallen, und eine Grafik des angepassten Modells der Berechnung sowie sämtliche Informationen und Feststellungen, die für die Interpretation der Ergebnisse hilfreich sein können; Abweichungen von den für diese Prüfmethode beschriebenen Verfahren und außergewöhnliche Vorkommnisse während der Prüfung. LITERATUR (1) Römbke, J. (1989). Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen — Enchytraeen. Abschlussbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt (Berlin), FE-Vorhaben 106 03 051/01. (2) Römbke, J., und Moser, T. (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the Validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, 150 + 223 S. (3) Westheide, W., und Bethge-Beilfuss, D. (1991). The sublethal enchytraeid test system: guidelines and some results, In: Modern Ecology: Basic and Applied Aspects. Hrsg. Esser, G., und Overdieck, D., S. 497-508. Elsevier, Amsterdam. (4) Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R., und Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport Nr. 719102025. 46 S. (5) Kapitel C.8: Toxizität bei Regenwürmern. (6) ISO (Internationale Organisation für Normung) (1993). Bodenbeschaffenheit — Wirkungen von Schadstoffen auf Regenwürmer (Eisenia fetida) — Teil 1: Verfahren zur Bestimmung der akuten Toxizität unter Verwendung von künstlichem Bodensubstrat, Nr. 11268-1. ISO, Genf. (7) ISO (Internationale Organisation für Normung) (1996). Bodenbeschaffenheit — Wirkungen von Schadstoffen auf Regenwürmer — Teil 2: Bestimmung der Wirkung auf die Reproduktionsleistung von Eisenia fetida/Eisenia andrei, Nr. 11268-2. ISO, Genf. (8) Rundgren, S., und A.K. Augustsson (1998). Test on the enchytraeid Cognettia sphagnetorum (Vejdovsky 1877). In: Løkke, H., und C.A.M. 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