ANHANG I

Schema der gemäß den Artikeln 3, 4, 5 und 7 durchzuführenden Tests

1. AUFTRETEN DES SPEZIFIZIERTEN SCHÄDLINGS — GRUNDREGELN

1.1. Ein Verdacht auf das Auftreten des spezifizierten Schädlings besteht, wenn der erste Nachweistest an der spezifizierten Pflanze oder an Wasserproben positiv ausfällt.

1.2. Das Auftreten des spezifizierten Schädlings gilt in folgenden Fällen als bestätigt: a) wenn es sich beim ersten oder zweiten Nachweistest um eine selektive Isolierung handelt, aus der Kolonien mit typischer Morphologie hervorgehen, und wenn zwei Identifizierungstests an den Kolonien positiv ausfallen; b) wenn es sich bei dem ersten und dem zweiten Test um andere Tests als eine selektive Isolierung handelt, und wenn zwei Identifizierungstests positiv ausfallen, nachdem die Probe einer selektiven Isolierung unterzogen wurde, aus der Kolonien mit typischer Morphologie hervorgingen. Bei einem dieser beiden Identifizierungstests muss es sich um einen Test gemäß Nummer 2.2 Buchstaben e, f und g handeln.

2. TESTS

2.1. Nachweistests

Die Nachweistests müssen mindestens so beschaffen sein, dass 104 Zellen/ml resuspendiertes Pellet, das aus symptomfreien Proben gewonnen wurde, verlässlich nachgewiesen werden können.

Der zweite Nachweistest muss auf anderen biologischen Grundsätzen oder anderen Nukleotidregionen als der erste Nachweistest beruhen.

Bei den Nachweistests handelt es sich um folgende Tests:

a) Immunofluoreszenztests, wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben;

b) Isolierung des spezifizierten Schädlings auf dem semiselektiven mSMSA-Wachstumsmedium, wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben;

c) konventioneller PCR-Test unter Verwendung der Primer von Pastrik et al. (2002) (1), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben;

d) TaqMan® Real-time-PCR-Tests unter Verwendung von Primern und Sonden von i) Weller et al. (2000) (2), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben; ii) Vreeburg et al. (2016) (3) (unter Verwendung einer TaqMan®-Sonde, modifizierte Original-Sonde nach Weller et al. (2000)), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben; iii) Vreeburg et al. (2018) (4) (sogenannter NYtor-Test), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben; iv) Massart et al. (2014) (5), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben;

e) LAMP-Test (Schleifen-vermittelte isothermale Amplifikation) unter Verwendung der Primer von Lenarčič et al. (2014) (6) (ausschließlich für symptomatisches Pflanzenmaterial), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben.

2.2. Identifizierungstests

Bei den Identifizierungstests handelt es sich um folgende Tests:

a) Immunofluoreszenztests, wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben;

b) konventionelle PCR-Tests unter Verwendung der Primer von Pastrik et al. (2002), wie ausführlich in internationalen Diagnosestandards beschrieben;

c) TaqMan® Real-time-PCR-Tests unter Verwendung von Primern und Sonden von i) Weller et al. (2000), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben; ii) Vreeburg et al. (2016) (unter Verwendung einer TaqMan®-Sonde, modifizierte Original-Sonde nach Weller et al. (2000)), wie ausführlich in internationalen Diagnosestandards beschrieben; iii) Vreeburg et al. (2018) (sogenannter NYtor-Test), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben; iv) Massart et al. (2014), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben;

d) LAMP-Test (Schleifen-vermittelte isothermale Amplifikation) unter Verwendung der Primer von Lenarčič et al. (2014), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben;

e) phylotyp-spezifischer konventioneller Multiplex-PCR-Test (Opina et al. (1997) (7)); Fegan & Prior (2005) (8), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben;

f) DNA-Barcoding (Wicker et al. (2007) (9)), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben;

g) MALDI-TOF MS (van de Bilt et al. (2018) (10)), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben.

3. FLUSSDIAGRAMME DER VERFAHREN

Flussdiagramm Nr. 1: Verfahren zur Diagnose des Auftretens des spezifizierten Schädlings in Proben der spezifizierten Pflanze

a) Die Isolierung kann als erster oder zweiter Nachweistest verwendet werden. Besteht der Verdacht auf das Auftreten des spezifizierten Schädlings auf dem Wachstumsmedium, so werden die Kolonien zur Gewinnung von Reinkulturen gereinigt, an denen zwei Identifizierungstests durchgeführt werden.

b) Bei einem dieser beiden Identifizierungstests muss es sich um einen Test gemäß Nummer 2.2 Buchstaben e, f und g handeln. Zur Bestätigung des Auftretens des Schädlings müssen beide Identifizierungstests positiv ausfallen.

c) Der dritte Nachweistest muss auf anderen biologischen Grundsätzen oder anderen Nukleotidregionen beruhen.

Flussdiagramm Nr. 2: Verfahren zur Diagnose des Auftretens des spezifizierten Schädlings in Wasserproben

a) Bei einem dieser beiden Identifizierungstests muss es sich um einen Test gemäß Nummer 2.2 Buchstaben e, f und g handeln. Zur Bestätigung des Auftretens des Schädlings müssen beide Identifizierungstests positiv ausfallen.

4. PROBENAUFBEREITUNG

4.1. Proben von symptomfreien Knollen

Die Standardprobe muss 200 Knollen je Test umfassen. Das geeignete Laborverfahren zur Verarbeitung der kegelförmigen Nabelendstückchen zur Gewinnung des Extrakts für den Nachweis des spezifizierten Schädlings ist in internationalen Diagnosestandards beschrieben.

4.2. Proben von symptomfreien spezifizierten Pflanzen

Der Nachweis latenter Infektionen erfolgt an Mischproben von Stängelstücken oder Blattstielen. Das Verfahren kann auf bis zu 200 Stängelstücke oder 200 Blattstiele unterschiedlicher Pflanzen in einer Probe angewendet werden. Das geeignete Laborverfahren zur Desinfektion und Verarbeitung der Stängel- oder Blattstielstücke zur Gewinnung des Extrakts für den Nachweis des spezifizierten Schädlings ist in internationalen Diagnosestandards beschrieben.

4.3. Proben von symptomatischem Material der spezifizierten Pflanzen

Schnitte von Gewebe werden aseptisch aus dem Gefäßbündelring einer Kartoffelknolle oder aus den Gefäßsträngen in Stängeln spezifizierter Pflanzen entfernt, die Welkesymptome aufweisen. Das geeignete Laborverfahren zur Verarbeitung dieser Gewebe zur Gewinnung des Extrakts für den Nachweis des spezifizierten Schädlings ist ausführlich in internationalen Diagnosestandards beschrieben.

4.4. Proben von Oberflächen- oder Kreislaufwasser (einschließlich Proben von Kartoffelverarbeitungsabfällen oder Klärschlämmen)

Der Haupttest zum Nachweis des spezifizierten Schädlings in Proben von Oberflächenwasser, Wasser aus Kreislaufsystemen und Abwasserproben (Kartoffelverarbeitungsindustrie) ist die selektive Isolierung. Das geeignete Laborverfahren zur Verarbeitung der Wasserproben ist in internationalen Diagnosestandards beschrieben.

(1) Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G., Pukall, R. (2002). Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, S. 831-842.

(2) Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Boonham, N., Stead, D.E. (2000). Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay. Applied and Environmental Microbiology, 66, 2853–2858. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.66.7.2853-2858.2000.

(3) Vreeburg, R.A.M., Bergsma-Vlami, M., Bollema, R.M., de Haan, E.G., Kooman-Gersmann, M., Smits-Mastebroek, L., Tameling, W.I.L., Tjou-Tam-Sin, N.N.A., van de Vossenberg B.T.L.H, Janse, J.D. (2016). Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in potato tubers in routine testing. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 46, S. 112-121.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, S. 86-96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, S. 29-37.

(6) Lenarčič, R., Morisset, D., Pirc, M., Llop, P., Ravnikar, M., Dreo, T. (2014). Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum. PLoS ONE 9(4), e96027. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096027.

(7) Opina, N., Tavner, F., Holloway, G., Wang, J.F., Li, T.H., Maghirang, R., Fegan, M., Hayward, A.C., Viji Krishnapillai, A., Wai-Foong Hong, Holloway, B.W, Timmis, J.N. (1997). A novel method for development of species and strainspecific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 5, S. 19-30.

(8) Fegan, M., Prior, P. (2005). How complex is the „Ralstonia solanacearum species complex“. In Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex (eds Allen C, Hayward AC & Prior P), S. 449-461. American Phytopathological Society, St Paul, MN (US).

(9) Wicker, E., Grassart, L., Coranson-Beaudu, R., Mian, D., Guilbaud, C., Fegan, M., Prior, P. (2007). Ralstonia solanacearum strains from Martinique French West Indies exhibiting a new pathogenic potential. Applied and Environmental Microbiology 73, S. 6790-6801.

(10) van de Bilt, J.L.J., Wolsink, M.H.L., Gorkink-Smits, P.P.M.A., Landman, N.M., Bergsma-Vlami, M. (2018). Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry for rapid and accurate identification of Ralstonia solanacearum and Ralstonia pseudosolanacearum. European Journal of Plant Pathology, https://doi.org/10.1007/s10658-018-1517-5.