ANHANG II

TESTSCHEMA FÜR DIE DIAGNOSE, DEN NACHWEIS UND DIE IDENTIFIZIERUNG VON RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

ANWENDUNGSBEREICH DES TESTSCHEMAS

Das folgende Testschema beschreibt die verschiedenen Verfahren:

i) zur Diagnose der Schleimkrankheit (Bakteriellen Braunfäule) bei Kartoffelknollen und der Bakteriellen Welke bei Kartoffel- und Tomatenpflanzen und einigen anderen Wirtspflanzen;

ii) zum Nachweis von Ralstonia solanacearum in Proben von Kartoffelknollen, Kartoffel-, Tomaten- und sonstigen Wirtspflanzen, Wasser und Boden;

iii) zur Identifizierung von Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

INHALT

Seite Grundregeln 40 ABSCHNITT I: Anwendung des Testschemas 40 1. Nachweisverfahren zur Diagnose der Bakteriellen Braunfäule und der Bakteriellen Welke (R. solanacearum) in Kartoffelknollen und Kartoffel-, Tomaten- und sonstigen Wirtspflanzen mit Symptomen der Bakteriellen Braunfäule oder der Bakteriellen Welke 40 2. Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von R. solanacearum in Proben symptomfreier Kartoffelknollen 43 3. Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von R. solanacearum in Proben von symptomfreien Kartoffel-, Tomaten- und sonstigen Wirtspflanzen 46 ABSCHNITT II: Detaillierte Beschreibung der Methoden zum Nachweis von R. solanacearum in Kartoffelknollen und Kartoffel-, Tomaten- und sonstigen Wirtspflanzen mit Symptomen der Bakteriellen Braunfäule oder der Bakteriellen Welke 48 1. Symptome 48 2. Schnell-Screeningtests 48 3. Isolierungsverfahren 49 4. Tests zur Identifizierung von R. solanacearum 49 ABSCHNITT III: 1. Detaillierte Beschreibung der Methoden zum Nachweis und zur Identifizierung von R. solanacearum in Proben symptomfreier Kartoffelknollen 49 1.1. Probenaufbereitung 49 1.2. Testung 51 2. Detaillierte Beschreibung der Methoden zum Nachweis und zur Identifizierung von R. solanacearum in Proben von symptomfreien Kartoffel-, Tomaten- und sonstigen Wirtspflanzen 51 2.1. Probenaufbereitung 51 2.2. Testung 52 ABSCHNITT IV: 1. Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von R. solanacearum in Wasser 53 2. Methoden zum Nachweis und zur Identifizierung von R. solanacearum in Wasser 55 2.1. Probenaufbereitung 55 2.2. Testung 55 ABSCHNITT V: 1. Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von R. solanacearum im Boden 56 2. Methoden zum Nachweis und zur Identifizierung von R. solanacearum im Boden 58 2.1. Probenaufbereitung 58 2.2. Testung 58 ABSCHNITT VI: Optimierte Protokolle für den Nachweis und die Identifizierung von R. solanacearum 58 A. Diagnose- und Nachweistests 58 1. Gefäßbündeltest 58 2. Nachweis von Poly-β-hydroxybutyrat-Granula 58 3. Serologische Agglutinationstests 59 4. Selektive Isolierung 60 4.1. Selektivausstrich 60 4.2. Anreicherungsverfahren 60 5. Immunofluoreszenztest (IF-Test) 61 6. Polymerase-Kettenreaktionstest (PCR-Test) 64 6.1. DNA–Reinigungsmethoden 65 a) Methode nach Pastrik (2000) 65 b) Andere Methoden 65 6.2. PCR 66 6.3. Analyse des PCR-Produktes 66 7. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungs-Test (FISH-Test) 67 8. Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) 69 a) Indirekter ELISA 69 b) DASI (Double Antibody Sandwich Indirect) ELISA 70 9. Biotest 71 B. Identifizierungstests 72 1. Nähr- und enzymatische Tests zur Identifizierung 72 2. IF-Test 72 3. ELISA-Test 73 4. PCR-Test 73 5. FISH-Test 73 6. Bestimmung des Fettsäureprofils (FAP) 73 7. Stammcharakterisierungsmethoden 73 7.1. Biovarbestimmung 73 7.2. Genetischer Fingerabdruck 74 7.3. PCR-Methoden 74 C. Bestätigungstest 74 Anlage 1 An der Optimierung und Validierung von Protokollen beteiligte Laboratorien 76 Anlage 2 Medien zur Isolierung und Kultivierung von R. solanacearum 77 Anlage 3 A. Handelsübliches standardisiertes Kontrollmaterial 79 B. Vorbereitung der Kontrollen 80 Anlage 4 Puffer für Testverfahren 82 Anlage 5 Ermittlung des Kontaminationsgrads im IF- und FISH-Test 85 Anlage 6 Validierte PCR-Protokolle und -Reagenzien 86 Anlage 7 Validierte Reagenzien für den FISH-Test 91 Anlage 8 Tomaten- und Auberginenkultivierung 93 Bibliographie 94

GRUNDREGELN

Optimierte Protokolle für die verschiedenen Methoden, validierte Reagenzien und die Einzelheiten für die Vorbereitung der Test- und Kontrollmaterialien sind in den Anlagen festgelegt. Anlage 1 enthält eine Liste der an der Optimierung und Validierung von Protokollen beteiligten Laboratorien.

Da die Protokolle dem Nachweis eines Quarantäneschadorganismus dienen und als Kontrollmaterialen lebensfähige Kulturen von R. solanacearum voraussetzen, müssen die Testverfahren in geeigneten Quarantäneeinrichtungen durchgeführt werden, die über angemessene Abfallentsorgungsanlagen und über eine entsprechende Zulassung durch die für Pflanzenquarantäne zuständige Behörde verfügen.

Die Testparameter müssen den eindeutigen und reproduzierbaren Nachweis von R. solanacearum auf den für die gewählten Methoden vorgegeben Schwellenwerten gewährleisten.

Die präzise Vorbereitung der Positivkontrollen ist unerlässlich.

Das Testen auf der Grundlage vorgegebener Schwellenwerte erfordert auch eine korrekte Einstellung, Wartung und Eichung der Testgeräte, den sorgfältigen Umgang mit und die Aufbewahrung von Reagenzien sowie Vorkehrungen zur Verhütung der Kontamination zwischen Proben, beispielsweise durch Trennung der Positivkontrollen von Testproben. Zur Vermeidung administrativer und sonstiger Fehler, insbesondere bei der Etikettierung und Dokumentierung, sind Qualitätskontrollen durchzuführen.

Ein Verdachtsfall im Sinne von Artikel 4 Absatz 2 der Richtlinie 98/57/EG setzt ein positives Ergebnis der Diagnose- oder Screeningtests an einer Probe nach den Vorgaben der Flussdiagramme voraus. Fällt der erste Screeningtest (IF- oder PCR-/FISH-Test, selektive Isolierung) positiv aus, so ist er durch einen zweiten Screeningtest, der auf unterschiedlichen biologischen Grundsätzen beruht, zu bestätigen.

Fällt der erste Screeningtest positiv aus, so besteht Verdacht auf Kontamination mit R. solanacearum, und es muss ein zweiter Screeningtest durchgeführt werden. Fällt dieser zweite Test ebenfalls positiv aus, so gilt der Verdacht als bestätigt (Befallsverdacht) und die im Flussdiagramm vorgegebenen Tests müssen fortgesetzt werden. Fällt der zweite Screeningtest negativ aus, so gilt die Probe als nicht kontaminiert.

Ein bestätigter Verdacht im Sinne von Artikel 5 Absatz 1 der Richtlinie 98/57/EG erfordert die Isolierung und Identifizierung einer R.-solanacearum-Reinkultur und die Bestätigung der Pathogenität.

ABSCHNITT I

ANWENDUNG DES TESTSCHEMAS

1. Nachweisverfahren zur Diagnose der Bakteriellen Braunfäule und der Bakteriellen Welke (Ralstonia solanacearum) in Kartoffelknollen und Kartoffel-, Tomaten- und sonstigen Wirtspflanzen mit Symptomen der Bakteriellen Braunfäule oder der Bakteriellen Welke

Das Testverfahren ist für Kartoffelknollen und -pflanzen geeignet, die typische oder verdächtige Symptome der Schleimkrankheit oder der Bakteriellen Welke aufweisen. Es umfasst einen Schnell-Screeningtest, die Isolierung des Erregers aus infiziertem Gefäßgewebe auf (selektiven) Medien und — bei positivem Ergebnis — die Identifizierung der Kultur als Ralstonia solanacearum.

2. Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von Ralstonia solanacearum in Proben symptomfreier Kartoffelknollen

Grundsatz

Das Testverfahren dient dem Nachweis latenter Infektionen von Kartoffelknollen. Ein positives Ergebnis bei mindestens zwei Screeningtests (3), die auf unterschiedlichen biologischen Grundsätzen beruhen, ist durch Isolierung des Erregers zu bestätigen. Bei Isolierung typischer Kolonien ist eine Reinkultur als R. solanacearum zu bestätigen. Ein positiver Screeningtest allein reicht nicht aus, um die Probe als verdächtig einzustufen.

Screeningtests und Isolierungstests müssen eine Nachweisgrenze von 103 bis 104 Zellen/ml resuspendiertes Pellet gewährleisten, die als Positivkontrollen in jede Testreihe einzubeziehen sind.

3. Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von Ralstonia solanacearum in Proben von symptomfreien Kartoffel-, Tomaten- und sonstigen Wirtspflanzen

ABSCHNITT II

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER METHODEN ZUM NACHWEIS VON RALSTONIA SOLANACEARUM IN KARTOFFELKNOLLEN UND KARTOFFEL-, TOMATEN- UND SONSTIGEN WIRTSPFLANZEN MIT SYMPTOMEN DER BAKTERIELLEN BRAUNFÄULE ODER DER BAKTERIELLEN WELKE

1. Symptome (siehe Website: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1. Symptome an der Kartoffel

Die Kartoffelpflanze. In der frühen Phase der Infektion welken die Blätter an der Spitze der Pflanze bei hohen Temperaturen während des Tages und regenerieren nachts. Die Blätter bleiben zu Beginn der Welke zunächst grün, verfärben sich jedoch später gelb und nekrotisieren. Auch kommt es zu einer Epinastie. Die Welke eines Triebs oder der gesamten Pflanze wird schnell irreversibel und führt zum Kollabieren und Absterben der Pflanze. Das Gefäßgewebe in quer durchgeschnittenen Stängeln verwelkter Pflanzen kann braun werden, und aus der Schnittfläche tritt ein milchiges bakterielles Exsudat aus oder kann leicht herausgedrückt werden. Wird ein durchgeschnittener Stängel senkrecht ins Wasser gehalten, so treten aus den Gefäßbündeln Schleimfäden aus.

Die Kartoffelknolle. Die Kartoffelknollen sind am Nabelende quer oder längs durch das Nabelende durchzuschneiden. In der frühen Phase der Infektion zeigt sich eine glasig gelbe bis hellbraune Verfärbung des Gefäßbündelringes, aus dem nach einigen Minuten spontan ein blasses, cremefarbiges Exsudat austritt. Später wird die Verfärbung deutlich braun, und die Nekrose kann sich bis ins parenchymatische Gewebe erstrecken. In fortgeschrittenen Stadien breitet sich die Infektion von den Nabelenden und den Augen aus, aus denen Bakterienschleim austreten kann, an dem Bodenpartikel haften bleiben. Durch den Zerfall des Gefäßgewebes im Knolleninneren können auf der Schale rötlich-braune, leicht eingesunkene Läsionen entstehen. Im fortgeschrittenen Stadium der Krankheit ist ein sekundärer Befall mit pilzlicher und bakterieller Weichfäule üblich.

1.2. Symptome an der Tomate

Die Tomatenpflanze. Das erste sichtbare Symptom ist das schwammige Aussehen der jüngsten Blätter. Unter für den Erreger günstigen Bedingungen (Bodentemperatur etwa 25 °C bei gesättigter Luftfeuchtigkeit) wird eine Seite der Pflanze oder die gesamte Pflanze innerhalb weniger Tage von Epinastie und Welke befallen, die zum völligen Absterben der Pflanze führen. Unter weniger günstigen Bedingungen (Bodentemperatur unter 21 °C) ist die Welke geringer, aber es kann sich am Stängel eine große Zahl von Nebentrieben bilden. An der Stängelbasis lassen sich wässrig durchtränkte Streifen beobachten, die ein sichtbares Zeichen der Nekrose des vaskulären Systems sind. Wird der Stängel quer durchgeschnitten, so tritt aus dem braun verfärbten Gefäßgewebe des Stängels ein weißer oder gelblicher Bakterienschleim aus.

1.3. Symptome an anderen Wirtspflanzen

Solanum dulcamara und S. nigrum. Unter natürlichen Bedingungen lassen sich die Welkesymptome an diesen Unkrautwirtspflanzen nur selten beobachten, es sei denn, die Bodentemperatur liegt über 25 °C oder die Inokulumdichte ist äußerst groß (z. B. wenn S. nigrum in der Nähe von kontaminierten Kartoffel- oder Tomatenpflanzen wächst). Tritt die Welke auf, so entsprechen die Symptome denen, die bei der Tomate zu beobachten sind. Bei S.-dulcamara-Pflanzen ohne Welkeerscheinung, die mit Stängel und Wurzeln im Wasser wachsen, kann das Gefäßgewebe an Querschnitten der Stängelbasis oder der unter Wasser befindlichen Stängelteile innen eine hellbraune Verfärbung aufweisen. Wird ein durchgeschnittener Stängel senkrecht ins Wasser gehalten, so können aus dem durchgeschnittenen Gefäßgewebe Bakterien austreten und Schleimfäden bilden, auch wenn keine Welkesymptome an der Pflanze zu beobachten sind.

2. Schnell-Screeningtests

Schnell-Screeningtests können die vorläufige Diagnose erleichtern, sind jedoch nicht unerlässlich. Einen oder mehrere der folgenden validierten Tests verwenden:

2.1. Gefäßbündeltest

(Siehe Abschnitt VI.A.1)

2.2. Nachweis von Poly-β-hydroxybutyrat-Granula (PHB)

Die charakteristischen PHB-Granula in den Zellen von R. solanacearum werden sichtbar gemacht, indem hitzefixierte Ausstriche von Bakterienexsudat aus infiziertem Gewebe auf einem Mikroskop-Objektträger mit Nilblau A oder Sudanschwarz angefärbt werden (siehe Abschnitt VI.A.2).

2.3. Serologische Agglutinationstests

(Siehe Abschnitt VI.A.3)

2.4. Sonstige Tests

Weitere geeignete Schnell-Screeningtests sind u. a. der IF-Test (Abschnitt VI.A.5), der FISH-Test (Abschnitt VI.A.7), die ELISA-Tests (Abschnitt VI.A.8) und die PCR-Tests (Abschnitt VI.A.6).

3. Isolierungsverfahren

a) Das Exsudat oder Bereiche verfärbten Gewebes vom Gefäßbündelring in der Kartoffelknolle oder von den Gefäßsträngen im Stängel von Kartoffel- oder Tomatenpflanzen oder sonstigen welkenden Wirtspflanzen herausschneiden. In einem geringen Volumen sterilen, destillierten Wassers oder 50mM Phosphatpuffer (Anlage 4) suspendieren und 5-10 Minuten stehen lassen.

b) Eine Reihe von Dezimalverdünnungen der Suspension herstellen.

c) 50-100 µl der Suspension und der Verdünnungen auf ein Universalnährmedium (NA, YPGA oder SPA; siehe Anlage 2) und/oder auf das Kelman’s selektive Tetrazolium-Medium (Anlage 2) und/oder ein validiertes selektives Medium (z. B. SMSA; siehe Anlage 2) auftragen. Mit einem geeigneten Verdünnungsausstrichverfahren ausspateln oder ausstreichen. Es kann günstig sein, einen Satz separater Platten mit einer verdünnten Zellsuspension eines Biovar-2-Stamms von R. solanacearum als Positivkontrolle anzulegen.

d) Die Platten 2-6 Tage bei 28 °C inkubieren. — Auf den Universalmedien bilden virulente Isolate von R. solanacearum perlweiße, flache, unregelmäßige und schleimige Kolonien, oft mit charakteristischen Wirbeln in der Mitte. Avirulente Formen von R. solanacearum bilden dagegen kleine, runde, nichtschleimige, butterartige Kolonien, die vollständig cremefarben erscheinen. — Auf Kelman’s Tetrazolium-Medium und SMSA-Medium sind die Wirbel blutrot gefärbt. Avirulente Formen von R. solanacearum bilden dagegen kleine, runde, nichtflüssige, butterartige Kolonien, die vollständig dunkelrot erscheinen.

4. Tests zur Identifizierung von R. solanacearum

Tests zur Bestätigung der Identität R.-solanacearum-verdächtiger Isolate sind in Abschnitt VI. B aufgeführt.

ABSCHNITT III

1. Detaillierte Beschreibung der Methoden zum Nachweis und zur Identifizierung von Ralstonia solanacearum in Proben symptomfreier Kartoffelknollen

1.1. Probenaufbereitung

Hinweis:

— Die Standardprobe umfasst 200 Knollen je Test. Für umfangreichere Tests müssen mehr Proben dieser Größe untersucht werden. Mehr als 200 Knollen in der Probe führen zu Hemmungsreaktionen oder erschweren die Ergebnisauswertung. Das Verfahren ist aber auch für Proben mit weniger als 200 Knollen geeignet, wenn nur wenige Knollen zur Verfügung stehen.

— Die Validierung aller im Folgenden beschriebenen Nachweismethoden beruht auf der Untersuchung von Proben einer Größe von 200 Knollen.

— Der im Folgenden beschriebene Kartoffelextrakt kann auch zum Nachweis des Erregers der bakteriellen Ringfäule der Kartoffel, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, verwendet werden.

Fakultative Vorbehandlung vor Probenaufbereitung:

a) Proben bis zu zwei Wochen vor der Testung bei 25-30 °C inkubieren, um die Vermehrung von R.-solanacearum-Populationen anzuregen.

b) Knollen waschen. Zwischen den einzelnen Proben geeignete Desinfektionsmittel (Chlorverbindungen im Falle des PCR-Tests, um etwa vorhandene pathogene DNA zu entfernen) und Detergenzien verwenden. Knollen an der Luft trocknen. Dieses Waschverfahren ist besonders für Proben mit viel anhaftender Erde und in Fällen hilfreich (jedoch nicht vorgeschrieben), in denen ein PCR-Test oder ein direktes Isolierungsverfahren durchgeführt werden sollte.

1.1.1. Mit einem sauberen, sterilen Skalpell oder Gemüsemesser die Schale am Nabelende der Knolle entfernen, so dass das Gefäßbündelgewebe sichtbar wird. Am Nabelende jeder Knolle sorgfältig ein kleines, kegelförmiges Gewebestück aus dem Gefäßbereich herausschneiden. Dabei darauf achten, dass möglichst wenig nicht vaskuläres Gewebe erfasst wird (siehe Website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Hinweis: Knollen mit Verdachtssymptomen der ‚Schleimkrankheit‘ (sichtbarer Fäulnis) sind auszusondern und separat zu testen.

Werden beim Entfernen des kegelförmigen Gewebestückchens Symptome der Schleimkrankheit festgestellt, so sollte diese Knolle visuell geprüft werden; sie wird zu diesem Zweck am Nabelende durchgeschnitten. Durchgeschnittene Knollen mit verdächtigen Symptomen sollten zur Wundverkorkung mindestens 2 Tage bei Raumtemperatur aufbewahrt und anschließend unter angemessenen Quarantänebedingungen (bei 4-10 °C) gelagert werden. Alle Knollen, einschließlich solcher mit Verdachtssymptomen, sind gemäß Anhang III aufzubewahren.

1.1.2. Die kegelförmigen Nabelendstückchen in unbenutzten verschließbaren und/oder verplombbaren Einwegbehältnissen sammeln (werden Behältnisse wiederverwendet, so sind sie mit Chlorverbindungen gründlich zu reinigen und zu desinfizieren). Die Gewebestückchen sind möglichst sofort zu verarbeiten bzw. können — soweit dies nicht möglich ist — in ihrem Behältnis ohne Zugabe von Puffer für maximal 72 Stunden gekühlt bzw. für maximal 24 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.

Die Gewebestückchen nach einem der folgenden Verfahren verarbeiten:

a) Entweder die Stückchen mit einer ausreichenden Menge (ca. 40 ml) Extraktionspuffer (Anlage 4) bedecken und auf einem Schüttler (50-100 rpm) für 4 Stunden bei einer Temperatur von weniger als 24 °C oder 16-24 Stunden bei Kühlschranktemperatur schütteln; oder

b) die Stückchen mit einer ausreichenden Menge (ca. 40 ml) Extraktionspuffer (Anlage 4) entweder in einem Waring- oder Ultra-Thurax-Mixer oder durch Zerkleinerung in einem robusten verschlossenen Einweg-Mazerationsbeutel (z. B. Stomacher- oder Bioreba-Plastikbeutel, 150 mm × 250 mm; strahlensterilisiert) mit einem Gummihammer oder einem geeigneten Zerkleinerungsgerät (z. B. Homex) homogenisieren.

Hinweis: Das Risiko der Kreuzkontamination von Proben ist groß, wenn letztere mit einem Mixer homogenisiert werden. Es sind Vorkehrungen zu treffen, um jedes Versprühen oder Verschütten während des Extraktionsprozesses zu vermeiden. Ferner ist sicherzustellen, dass für jede Probe frisch sterilisierte Mixerblätter und Gefäße verwendet werden. Beim PCR-Test ist eine DNA-Übertragung auf Behälter oder Zerkleinerungsgeräte zu vermeiden. Die Zerkleinerung sollte in Einwegbeuteln und Einwegröhrchen erfolgen, wenn der PCR-Test angewandt werden soll.

1.1.3. Den Überstand umfüllen. Wenn er sehr trüb ist, entweder durch langsames Zentrifugieren (nicht mehr als 180 g für 10 Minuten zwischen 4-10 °C) oder durch Vakuumfiltration (40-100 µm) klären und den Filter mit zusätzlichem (~10 ml) Extraktionspuffer waschen.

1.1.4. Die Bakterien durch 15-minütiges Zentrifugieren des erhaltenen Überstandes bei 7 000 g (oder für 10 Minuten bei 10 000 g) bei einer Temperatur zwischen 4-10 °C konzentrieren und den Überstand verwerfen, ohne das Pellet aufzurühren.

1.1.5. Das Pellet in 1,5 ml Pelletpuffer (Anlage 4) resuspendieren. 500 µl für das Testen auf R. solanacearum, 500 µl für Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus und 500 µl für Referenzzwecke verwenden. Zum Referenzaliquot von 500 µl und den restlichen Testaliquots steriles Glyzerin zugeben, um eine Endkonzentration von 10-25 % (v/v) zu erreichen, vortexen und bei –16 bis –24 °C (Wochen) oder bei –68 bis –86 °C (Monate) lagern. Die Testaliquots während der Testung bei 4-10 °C aufbewahren.

Von wiederholtem Einfrieren und Auftauen wird abgeraten.

Muss der Extrakt befördert werden, so ist sicherzustellen, dass der Transport innerhalb von 24 bis 48 Stunden erfolgt und eine Kühlbox verwendet wird.

1.1.6. Zur Vermeidung von Kontaminationen müssen alle R.-solanacearum-Positivkontrollen und Proben unbedingt separat behandelt werden. Dies gilt für IF-Objektträger und für sämtliche Tests.

1.2. Testung

Siehe Flussdiagramm und Beschreibung der Tests sowie der optimierten Protokolle in den entsprechenden Anlagen:

Selektive Isolierung (Abschnitt VI.A.4)

IF-Test (Abschnitt VI.A.5)

PCR-Tests (Abschnitt VI.A.6)

FISH-Test (Abschnitt VI.A.7)

ELISA-Tests (Abschnitt VI.A.8)

Biotest (Abschnitt VI.A.9)

2. Detaillierte Beschreibung der Methoden zum Nachweis und zur Identifizierung von R. solanacearum in Proben von symptomfreien Kartoffel-, Tomaten- und sonstigen Wirtspflanzen

2.1. Probenaufbereitung

Hinweis: Zum Nachweis latenter R.-solanacearum-Populationen wird empfohlen, Mischproben zu testen. Das Verfahren ist auch für Mischproben von bis zu 200 Stängelstücken geeignet. Werden Erhebungen durchgeführt, so sollten diese an einer statistisch repräsentativen Probe der zu untersuchenden Pflanzenpopulation ausgerichtet werden.

2.1.1. 1-2 cm lange Stängelstücke in einem verschließbaren, sterilen Behälter sammeln; dabei wie folgt vorgehen:

Tomatenjungpflanzen: Mit einem sauberen, sterilen Messer an der Stängelbasis genau über der Erde ein 1 cm langes Stängelstück herausschneiden.

Freiland- oder Gewächshaustomaten: Mit einem sterilen Messer von jeder Pflanze den untersten Seitentrieb genau an der Ansatzstelle am Haupttrieb abschneiden. Vom unteren Ende eines jeden Seitentriebs ein 1 cm großes Stück abschneiden.

Andere Wirtspflanzen: Mit einem sauberen, sterilen Messer oder einer Gartenschere an der Stängelbasis genau über der Erde ein 1 cm großes Stängelstück herausschneiden. Bei S. dulcamara oder anderen im Wasser wachsenden Wirtspflanzen 1-2 cm große Stücke aus den unter Wasser befindlichen Stängeln oder Stolonen mit Wasserwurzeln herausschneiden.

Soll ein bestimmter Standort beprobt werden, so empfiehlt es sich, die Testung an einer statistisch repräsentativen Probe von mindestens 10 Pflanzen der potenziellen Wirtspflanzen je Entnahmestelle vorzunehmen. Der Erreger lässt sich im Spätfrühling, Sommer und Herbst am verlässlichsten nachweisen, allerdings lassen sich natürliche Infektionen bei der an Wasserläufen wachsenden winterharten Solanum dulcamara das ganze Jahr über nachweisen. Zu den bekannten Wirtspflanzen gehören Durchwuchs-Kartoffeln, Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium und andere Pflanzen aus der Familie der Nachtschattengewächse. Weitere Wirtspflanzen sind Pelargonium spp. und Portulaca oleracea. Zu den europäischen Unkräutern, deren Wurzeln und/oder Rhizosphäre unter bestimmten Umweltbedingungen potenziell mit R.-solanacearum-Populationen (Biovar 2/Rasse 3) infiziert sind, zählen Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra und Urtica dioica.

Hinweis: In diesem Stadium können innere Symptome (Gewebeverfärbungen oder Bakterienschleim) visuell festgestellt werden. Stängelstücke mit Symptomen aussondern und separat testen (siehe Abschnitt II).

2.1.2. Die Stängelstücke kurz mit 70 %igem Ethanol desinfizieren und sofort auf Papiertüchern trocken tupfen. Anschließend die Stängelstücke einer der folgenden Behandlungen unterziehen:

a) Entweder die Stücke mit einer ausreichenden Menge (ungefähr 40 ml) Extraktionspuffer (Anlage 4) bedecken und auf einem Schüttler (bei 50-100 rpm) für 4 Stunden bei einer Temperatur von weniger als 24 °C bzw. für 16-24 Stunden bei Kühlschranktemperatur schütteln; oder

b) die Stücke mit einer ausreichenden Menge (ungefähr 40 ml) Extraktionspuffer (Anlage 4) durch Zerkleinern in einem robusten Mazerationsbeutel (z. B. Stomacher- oder Bioreba-Beutel) mit einem Gummihammer oder einem geeigneten Zerkleinerungsgerät (z. B. Homex) unverzüglich verarbeiten. Ist dies nicht möglich, so können die Stängelstücke gekühlt für höchstens 72 Stunden und bei Raumtemperatur für höchstens 24 Stunden gelagert werden.

2.1.3. Den Überstand umfüllen, nachdem das Mazerat 15 Minuten gestanden hat.

2.1.4. Eine weitere Klärung des Extrakts oder Konzentration der Bakterien ist in der Regel nicht erforderlich, kann jedoch durch Filtrieren und/oder Zentrifugieren (siehe Abschnitte III.1.1.3 bis 1.1.5) erreicht werden.

2.1.5. Den unverdünnten oder konzentrierten Probenextrakt in zwei gleiche Teile teilen. Eine Hälfte während der Testung bei 4-10 °C aufbewahren, die andere Hälfte mit 10-25 % (v/v) sterilem Glyzerin bei –16 bis –24 °C (Wochen) oder bei –68 bis –86 °C (Monate) lagern, für den Fall, dass weitere Tests erforderlich werden.

2.2. Testung

Siehe Flussdiagramm und Beschreibung der Tests sowie der optimierten Protokolle in den entsprechenden Anlagen:

Selektive Isolierung (Abschnitt VI.A.4)

IF-Test (Abschnitt VI.A.5)

PCR-Tests (Abschnitt VI.A.6)

FISH-Test (Abschnitt VI.A.7)

ELISA-Tests (Abschnitt VI.A.8)

Biotest (Abschnitt VI.A.9)

ABSCHNITT IV

1. Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von R. solanacearum in wasser

2. Methoden zum Nachweis und zur Identifizierung von R. solanacearum in Wasser

Grundsatz

Das in diesem Abschnitt beschriebene validierte Verfahren ist zum Nachweis von Erregern in Proben von Oberflächengewässern bestimmt, kann aber auch zur Testung von Proben von Kartoffelverarbeitungsabfällen oder Klärschlämmen verwendet werden. Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass die erwartete Nachweisempfindlichkeit je nach Substrat variiert. Die Sensitivität des Isolierungstests wird durch Populationen konkurrierender saprophytischer Bakterien beeinflusst, die bei der Kartoffelverarbeitung und in Klärschlämmen im Allgemeinen in viel größeren Mengen vorkommen als in Oberflächengewässern. So dürften mit der nachstehend beschriebenen Methode in Oberflächenwasser zwar 103 Zellen je Liter nachgewiesen werden, bei Kartoffelverarbeitungsabfällen oder Klärschlämmen dürfte die Nachweisempfindlichkeit allerdings wesentlich niedriger sein. Daher wird empfohlen, Schlämme nach Reinigungsbehandlungen (z. B. Sedimentation oder Filtration) zu testen, durch die Populationen saprophytischer Bakterien verringert werden. Die begrenzte Empfindlichkeit der Testmethode sollte bei der Bewertung der Zuverlässigkeit etwaiger negativer Testergebnisse berücksichtigt werden. Die Methode hat sich bei Erhebungen zur Feststellung des Vorhandenseins bzw. des Nichtvorhandenseins des Erregers in Oberflächengewässern zwar bewährt, ihre Grenzen sollten jedoch klar sein, wenn ähnliche Erhebungen bei Kartoffelverarbeitungsabfällen oder Klärschlämmen durchgeführt werden.

2.1. Probenaufbereitung

Hinweis:

— R. solanacearum in Oberflächengewässern lässt sich im Spätfrühling, Sommer und Herbst, wenn die Wassertemperaturen über 15 °C betragen, am verlässlichsten nachweisen.

— Wiederholte Probenahmen zu verschiedenen Zeitpunkten innerhalb der oben genannten Zeitspanne an ausgewiesenen Probenahmestellen gewährleisten verlässliche Ergebnisse, da die Auswirkungen wechselnder Witterungsverhältnisse reduziert werden.

— Die Auswirkungen heftiger Niederschläge und die Geografie des Wasserlaufes müssen berücksichtigt werden, um größere Verdünnungseffekte, die das Auftreten des Erregers verschleiern könnten, zu vermeiden.

— Oberflächenwasserproben sollten in Nähe von Wirtspflanzen gezogen werden, sofern letztere vorhanden sind.

2.1.1. An ausgewählten Probenahmestellen, wenn möglich in mindestens 30 cm Tiefe und in 2 m Entfernung zum Ufer, Wasserproben ziehen und in sterile Einwegröhrchen oder -flaschen füllen. Für Verarbeitungs- und Klärschlammabfälle die Proben an der Stelle ziehen, an der die Abfälle in den Wasserlauf eingeleitet werden. Es werden Proben einer Größe von bis zu 500 ml je Entnahmestelle empfohlen. Werden kleinere Proben bevorzugt, so sollten sie mindestens 3x an jeder Entnahmestelle entnommen werden, wobei jede Probe aus 2 Unterproben von jeweils mindestens 30 ml besteht. Für eine umfassendere Erhebung je 3 km Wasserlauf mindestens 3 Entnahmestellen aussuchen und sicherstellen, dass in den Wasserlauf einmündende Flüsse ebenfalls beprobt werden…

2.1.2. Proben gekühlt (4-10 °C) und dunkel transportieren und innerhalb von 24 Stunden testen.

2.1.3. Die Bakterienfraktion kann erforderlichenfalls nach einer der folgenden Methoden konzentriert werden:

a) 30-50 ml Unterproben bei 10 000 g für 10 Minuten (oder 7 000 g für 15 Minuten) vorzugsweise bei 4-10 °C zentrifugieren, Überstand verwerfen und das Pellet in 1 ml Pelletpuffer (siehe Anlage 4) resuspendieren.

b) Membran filtrieren (Mindestporengröße 0,45 µm), anschließend Filter mit 5-10 ml Pelletpuffer waschen und Waschwasser auffangen. Diese Methode ist geeignet für größere Wassermengen mit wenig Saprophyten.

Bei Proben von Kartoffelverarbeitungsabfällen oder Klärschlämmen empfiehlt sich eine Konzentration in der Regel nicht, da ebenfalls angereicherte Populationen konkurrierender saprophytischer Bakterien den Nachweis von R. solanacearum hemmen werden.

2.2. Testung

Siehe Flussdiagramm und Beschreibung der Tests in den entsprechenden Anlagen.

ABSCHNITT V

1. Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von R. solanacearum im Boden

2. Methoden zum Nachweis und zur Identifizierung von R. solanacearum im Boden

Grundsatz

Das in diesem Abschnitt beschriebene validierte Verfahren dient zum Nachweis des Erregers in Bodenproben, kann jedoch auch verwendet werden, um Proben von festen Kartoffelverarbeitungsabfällen oder Klärschlamm zu testen. Allerdings sind diese Methoden nicht sensitiv genug, um den Nachweis von R. solanacearum bei geringen und/oder ungleichmäßig verteilten Populationen, die in natürlich befallenen Proben dieser Substrate auftreten können, zu gewährleisten.

Die begrenzte Sensitivität dieses Testschemas ist daher bei der Beurteilung der Zuverlässigkeit von negativen Testergebnissen sowie bei der Verwendung des Schemas zur Feststellung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins des Erregers im Boden oder in Schlämmen zu berücksichtigen. Der Erreger wird im Feldboden am zuverlässigsten ermittelt, indem eine anfällige Wirtspflanze gepflanzt und auf Befallsanzeichen beobachtet wird. Aber auch mit dieser Methode ist ein Nachweis von schwachen Kontaminationen nicht möglich.

2.1. Probenaufbereitung

2.1.1. Die Entnahme der Feldbodenproben sollte den Standards der Probenahme für die Nematodenuntersuchungen folgen. Je Probe 0,5-1 kg Boden aus 60 Einstichen (Entnahmetiefe 10-20 cm) je 0,3 ha (oder in einem Raster von 7×7 m) entnehmen. Besteht der Verdacht, dass sich der Erreger im Feldboden befindet, so ist die Zahl der Einstichstellen auf 120 je 0,3 ha zu erhöhen. Proben vor der Testung bei 12-15 °C aufbewahren. Proben von Kartoffelverarbeitungsabfällen oder Klärschlämmen sind in einer Gesamtmenge von 1 kg und an Stellen zu entnehmen, die für das gesamte zu testende Schlammvolumen repräsentativ sind. Jede Probe vor der Testung gut mischen.

2.1.2. Teilproben von je 10-25 g Boden oder Schlamm durch Schütteln (250 rpm) in 60-150 ml Extraktionspuffer (Anlage 4) bis zu 2 Stunden dispergieren. Die Dispersion kann ggf. durch Zugabe von 0,02 %igem sterilem Tween-20 und 10-20 g sterilem Kies unterstützt werden.

2.1.3. Die Suspension während der Testung bei 4 °C halten.

2.2. Testung

Siehe Flussdiagramm und Beschreibung der Tests in den entsprechenden Anlagen.

ABSCHNITT VI

OPTIMIERTE PROTOKOLLE FÜR DEN NACHWEIS UND DIE IDENTIFIZIERUNG VON R. SOLANACEARUM

A. DIAGNOSE- UND NACHWEISTESTS

1. Gefäßbündeltest

Ob in welken Stängeln von Kartoffeln, Tomaten oder anderen Wirtspflanzen R. solanacearum vorhanden ist, kann mit folgendem Test leicht festgestellt werden: Stängel kurz über dem Boden abschneiden und die Schnittfläche in ein Röhrchen mit reinem Wasser halten. Nach einigen Minuten ist zu beobachten, wie aus den durchgeschnittenen Gefäßbündeln spontan typische Bakterienschleimfäden austreten.

2. Nachweis von Poly-β-hydroxybutyrat-Granula

1. Auf einem Objektträger einen Ausstrich des Bakterienexsudats aus infiziertem Gewebe oder von einer 48-Stunden-Kultur auf YPGA oder SPA (Anlage 2) herstellen.

2. Für Positivkontrollen Ausstriche eines Biovar-2-Stamms von R. solanacearum und ggf. für eine Negativkontrolle einen Stamm verwenden, der als PHB-negativ bekannt ist.

3. An der Luft trocknen lassen. Die Unterseite eines jeden Objektträgers schnell über eine Flamme führen, um den Ausstrich zu fixieren.

4. Präparat wie nachstehend beschrieben mit Nilblau oder Sudanschwarz färben und unter dem Mikroskop auswerten.

Nilblautest

a) Jeden Objektträger mit 1 %iger wässriger Lösung von Nilblau A vollständig bedecken und 10 Minuten bei 55 °C inkubieren.

b) Färbelösung ablaufen lassen. Kurz unter schwach fließendem Leitungswasser abwaschen. Überschüssiges Wasser mit Papiertüchern aufnehmen.

c) Ausstrich mit 8 %iger wässriger Essigsäure vollständig bedecken und 1 Minute bei Raumtemperatur inkubieren.

d) Kurz unter schwach fließendem Leitungswasser abwaschen. Überschüssiges Wasser mit Papiertüchern aufnehmen.

e) Mit einem Tropfen Wasser wieder befeuchten und Deckglas auflegen.

f) Gefärbten Ausstrich unter einem Epifluoreszenzmikroskop bei 450 nm unter Ölimmersion und bei einer Vergrößerung von 600-1 000 (Öl- oder Wasserimmersionsobjektiv) prüfen.

g) Auf kräftig orangefarbene Fluoreszenz von PHB-Granula achten. Auch bei Normallicht betrachten, um sicherzustellen, dass die Granula intrazellulär sind und die Zellmorphologie typisch für R. solanacearum ist.

Sudanschwarztest

a) Jeden Objektträger mit 0,3 %iger Sudanschwarz-B-Lösung in 70 %igem Ethanol vollständig bedecken und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

b) Färbelösung ablaufen lassen, kurz unter Leitungswasser abwaschen und überschüssiges Wasser mit Papiertüchern aufnehmen.

c) Objektträger kurz in Xylol tauchen und mit Papiertüchern trockentupfen. Achtung: Xylol ist gesundheitsschädlich! Erforderliche Vorsichtsmaßnahmen treffen und unter dem Abzug arbeiten.

d) Objektträger mit 0,5 %igem (w/v) wässrigem Safranin vollständig bedecken und 10 Sekunden bei Raumtemperatur inkubieren. Achtung: Safranin ist gesundheitsschädlich! Erforderliche Vorsichtsmaßnahmen treffen und unter dem Abzug arbeiten.

e) Unter schwach fließendem Leitungswasser abwaschen, überschüssiges Wasser mit Papiertüchern aufnehmen und Deckglas auflegen.

f) Gefärbten Ausstrich im Durchlichtmikroskop unter Ölimmersion bei einer Vergrößerung von 1 000 (Ölimmersionsobjektiv) prüfen.

g) Auf blau-schwarz gefärbte PHB-Granula in R.-solanacearum-Zellen mit rosa gefärbten Zellwänden achten.

3. Serologische Agglutinationstests

Die Agglutination von R.-solanacearum–Zellen in Bakterienschleim oder symptomatischen Gewebeextrakten lässt sich am besten mit validierten Antikörpern (siehe Anlage 3) feststellen, die mit geeigneten Farbmarkierern wie roten Staphylococcus-aureus-Zellen oder gefärbten Latex-Partikeln markiert sind. Wird ein handelsübliches Testkit (siehe Anlage 3) verwendet, so sind die Herstelleranweisungen zu befolgen. Ansonsten wie folgt verfahren:

a) Tropfen einer Suspension aus markiertem Antikörper und Bakterienschleim (jeweils ca. 5 µl) auf Sichtfeldern von Multiwell-Objektträgern mischen.

b) Positiv- und Negativkontrollen aus Suspensionen von R.-solanacearum-Biovar 2 und einem heterologen Stamm zubereiten.

c) 15 Sekunden vorsichtig mischen und danach auf Agglutinationsanzeichen in positiven Proben beobachten.

4. Selektive Isolierung

4.1. Selektivausstrich

Hinweis: Bevor diese Methode zum ersten Mal angewandt wird, sind Voruntersuchungen durchzuführen, um sicherzustellen, dass 103 bis 104 koloniebildende Einheiten von R. solanacearum je ml, die Extrakten aus Proben mit vorhergehendem negativen Testergebnis zugegeben wurden, reproduzierbar nachgewiesen werden können.

Ein geeignetes, validiertes Selektivmedium wie SMSA (modifiziert durch Elphinstone et al., 1996; siehe Anlage 2) verwenden.

Dabei muss R. solanacearum von anderen Bakterien, die auf dem Medium Kolonien bilden können, sorgfältig differenziert werden. Darüber hinaus können R.-solanacearum-Kolonien eine atypische Morphologie aufweisen, wenn die Platten überwuchert oder auch antagonistische Bakterien vorhanden sind. Besteht Verdacht auf Bakterienkonkurrenz oder -antagonismus, so ist die Probe nach einer anderen Methode erneut zu testen.

Die höchste Nachweisempfindlichkeit lässt sich bei dieser Methode mit frisch aufbereiteten Probenextrakten erreichen. Allerdings eignet sich die Methode auch für Extrakte, die bei –68 bis –86 °C unter Zugabe von Glyzerin gelagert wurden.

Als Positivkontrollen Dezimalverdünnungen einer Suspension von 106 cfu je ml eines virulenten Biovar-2-Stammes von R. solanacearum (z. B. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) herstellen. Um jegliches Kontaminationsrisiko zu vermeiden, die Positivkontrollen völlig getrennt von den Testproben vorbereiten.

Für jede neu bereitete Charge eines Selektivmediums ist seine Eignung zum Anzüchten des Erregers zu prüfen, bevor es zur Untersuchung von Routineproben verwendet wird.

Kontrollmaterial wie die Probe(n) testen.

4.1.1. Einen geeigneten Verdünnungsausstrich durchführen, um sicherzustellen, dass saprophytische koloniebildende Hintergrundpopulationen ausverdünnt werden. 50-100 µl je Platte und je Verdünnung ausstreichen.

4.1.2. Die Platten bei 28 °C inkubieren. Die Platten nach 48 Stunden und danach täglich bis zu sechs Tage lang auswerten. Auf dem SMSA-Medium erscheinen für R. solanacearum typische milchig weiße, flache, unregelmäßige und schleimige Kolonien, die nach drei Tagen Inkubation im Zentrum eine rosa bis blutrote Färbung mit Strichen oder Wirbeln aufweisen (siehe Website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Hinweis: Mitunter bilden sich auf diesem Medium atypische R.-solanacearum-Kolonien. Diese können klein, rund, völlig rot und nicht schleimig oder nur teilweise schleimig sein, so dass es schwierig ist, sie von koloniebildenden saprophytischen Bakterien zu unterscheiden.

4.1.3. Die R.-solanacearum-verdächtigen-Kolonien nach Ausspateln oder Verdünnungsausstrich auf einem Universalmedium reinigen, um einzelne Kolonien zu isolieren (siehe Anlage 2).

4.1.4. Kulturen für kurze Zeit in sterilem Wasser (pH 6-8, chlorfrei) bei Raumtemperatur im Dunkeln und für längere Zeit in einem geeigneten Kälteschutzmedium bei –68 bis –86 °C oder lyophilisiert lagern.

4.1.5. Verdächtige Kulturen identifizieren (siehe Abschnitt VI.B.) und einen Pathogenitätstest durchführen (siehe Abschnitt VI. C).

Auswertung der Ergebnisse des Selektivausstrichtests

Der Selektivausstrichtest ist negativ, wenn nach sechs Tagen keine Bakterienkolonien sichtbar sind oder wenn keine verdächtigen R.-solanacearum-typischen Kolonien festgestellt werden, vorausgesetzt, dass keine Hemmung durch konkurrierende oder antagonistische Bakterien anzunehmen ist und dass typische R.-solanacearum-Kolonien bei den Positivkontrollen gefunden wurden.

Der Selektivausstrichtest ist positiv, wenn R.-solanacearum-verdächtige-Kolonien isoliert werden.

4.2. Anreicherungsverfahren

Ein validiertes Anreicherungsmedium wie den modifizierten Wilbrink-Bouillon verwenden (siehe Anlage 2).

Dieses Verfahren kann zur selektiven Vermehrung von R.-solanacearum-Populationen in Probenextrakten und Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit verwendet werden. Mit diesem Verfahren lassen sich auch Inhibitoren der PCR-Reaktion wirksam verdünnen (1:100). Die Anreicherung von R. solanacearum kann allerdings aufgrund konkurrierender oder antagonistischer saprophytischer Organismen scheitern, die häufig gleichzeitig angereichert werden. Aus diesem Grund kann es schwierig sein, aus angereicherten Bouillon-Kulturen R. solanacearum zu isolieren. Da die Populationen von serologisch verwandten Saprophyten zunehmen können, wird empfohlen, für den ELISA-Test spezifische monoklonale statt polyklonale Antikörper zu verwenden.

4.2.1. Für Anreicherungs-PCR 100 µl des Probenextrakts in 10 ml Anreicherungsbouillon (Anlage 2) geben, der zuvor in DNA-freie Röhrchen oder Flaschen aliquotiert wurde. Für Anreicherungs-ELISA kann das Verhältnis zwischen Probenextrakt und Anreicherungsbouillon größer sein (z. B. 100 µl Probenextrakt in 1,0 ml Anreicherungsbouillon).

4.2.2. Für 72 Stunden bei 27-30 °C in Schüttel- oder Standkultur mit zwecks Belüftung lose aufgesetzten Deckeln inkubieren.

4.2.3. Vor Gebrauch für ELISA- oder PCR-Tests gut mischen.

4.2.4. Den Anreicherungsbouillon in gleicher Weise behandeln wie die Probe(n) in den oben aufgeführten Tests.

Hinweis: Wird bei der Anreicherung mit einer Hemmung von R. solanacearum aufgrund hoher Populationen bestimmter konkurrierender saprophytischer Bakterien gerechnet, so kann eine Anreicherung der Probenextrakte vor dem Zentrifugieren oder anderen Konzentrationsschritten zu besseren Ergebnissen führen.

5. IF-Test

Grundsatz

Der IF-Test wird als Hauptscreeningtest empfohlen, weil er nachweislich stabil genug ist, um die vorgeschriebenen Schwellenwerte zu erreichen.

Wird der IF-Test als Hauptscreeningtest angewandt und fällt der IF-Befund positiv aus, so muss als zweiter Screeningtest der Isolierungs-, der PCR- oder der FISH-Test durchgeführt werden. Wird der IF-Test als zweiter Screeningtest angewandt und fällt der IF-Befund positiv aus, so sind zum Abschluss der Analyse weitere Tests (siehe Flussdiagramm) erforderlich.

Hinweis: Validierte Herkunft von Antikörpern gegen R. solanacearum verwenden (siehe Website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Es wird empfohlen, für jede neue Antikörpercharge den Titer zu bestimmen. Der Titer wird definiert als die höchste Verdünnung, bei der eine optimale Reaktion eintritt, wenn eine Suspension aus 105 bis 106 Zellen je ml des homologen Stammes von R. solanacearum mit einem geeigneten Fluorescein-Isothiocyanat-(FITC)-Konjugat nach Herstellervorgaben getestet wird. Alle validierten polyklonalen Antiseren hatten einen IF-Titer von mindestens 1:2 000. Beim Test sollten die Antikörper in Arbeitsverdünnung(en) (AV) auf oder nahe am Titerwert verwendet werden.

Der Test ist an frisch aufbereiteten Probenextrakten durchzuführen. Er kann erforderlichenfalls auch an Extrakten vorgenommen werden, die bei –68 bis –86 °C unter Glyzerinzugabe gelagert haben. Das Glyzerin kann durch Zugabe von 1 ml Pelletpuffer (Anlage 4), 15-minütiges Rezentrifugieren bei 7 000 g und Resuspension in gleicher Menge Pelletpuffer entfernt werden. Dieser Arbeitsschritt ist häufig nicht erforderlich, vor allem, wenn die Proben durch Abflammen am Objektträger fixiert werden.

Separate Objektträger mit Positivkontrollen des homologen Stammes oder eines anderen Referenzstammes von R. solanacearum, gemäß Anlage 3. B. in Kartoffelextrakt und fakultativ in Puffer suspendiert, vorbereiten.

Als ähnliche Kontrolle auf demselben Objektträger sollte nach Möglichkeit natürlich infiziertes Gewebe (durch Lyophilisierung oder Einfrieren bei –16 bis –24 °C gelagert) verwendet werden.

Als Negativkontrollen Aliquots des Probenextrakts verwenden, deren vorheriges Testergebnis negativ war.

Die für diesen Test zur Verfügung stehenden standardisierten Positiv- und Negativ-Kontrollmaterialien sind in Anlage 3 aufgeführt.

Multiwellobjektträger mit vorzugsweise 10 Sichtfeldern von mindestens 6 mm Durchmesser verwenden.

Das Kontrollmaterial nach demselben Verfahren testen wie die Probe(n).

5.1. Die Objektträger nach einem der folgenden Verfahren vorbereiten

i) Pellets mit relativ wenig Stärkesediment: Ein abgemessenes Standardvolumen (15 µl reichen für ein Feld von 6 mm Durchmesser aus — bei größeren Feldern ein entsprechend größeres Volumen verwenden) des 1/100 verdünnten resuspendierten Kartoffelpellets auf das erste Feld pipettieren. Dieselbe Menge unverdünntes Pellet (1/1) auf die restlichen Felder der Reihe pipettieren. Die zweite Reihe kann, wie in Abbildung 1 dargestellt, als Duplikat oder für eine zweite Probe verwendet werden.

ii) Andere Pellets: Dezimalverdünnungen (1/10 und 1/100) des resuspendierten Pellets in Pelletpuffer herstellen. Ein abgemessenes Standardvolumen (15 µl reichen für ein Feld von 6 mm Durchmesser aus — bei größeren Feldern ein entsprechend größeres Volumen verwenden) des resuspendierten Pellets und jeder Verdünnung auf eine Felderreihe pipettieren. Die zweite Reihe kann, wie in Abbildung 2 dargestellt, als Duplikat oder für eine zweite Probe verwendet werden.

5.2. Tropfen bei Umgebungstemperatur oder durch Erwärmen auf 40 bis 45 °C trocknen lassen. Bakterienzellen entweder durch 15-minütiges Erhitzen bei 60 °C, Abflammen, mit 95 %igem Ethanol oder nach genauen Anweisungen des Antikörper-Lieferanten am Objektträger fixieren.

Soweit erforderlich, können fixierte Objektträger vor weiteren Tests eingefroren in einem trockenen Behältnis für kurze Zeit (jedoch höchstens drei Monate) gelagert werden.

5.3. IF-Verfahren

i) Bei Objektträgervorbereitung nach 5.1 Ziffer i: Einen Satz Zweifachverdünnungen des Antikörpers in IF-Puffer herstellen. Im ersten Feld sollte 1/2 des Titers (T/2), in den anderen Feldern 1/4 des Titers (T/4), 1/2 des Titers (T/2), der Titer (T) und das Doppelte des Titers (2T) enthalten sein.

ii) Bei Objektträgervorbereitung nach 5.1 Ziffer ii: Herstellung der Arbeitsverdünnung (AV) des Antikörpers in IF-Puffer. Die Arbeitsverdünnung beeinflusst die Spezifität.

Abb. 1. Vorbereitung des Objektträgers nach 5.1 Ziffer i und 5.3 Ziffer i

Verdünnungen des resuspendierten Pellets 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Verdünnung des resuspendierten Pellets (T = Titer) T/2 T/4 T/2 T 2T  Zweifachverdünnungen des Antiserums/Antikörpers Probe 1 1 2 3 4 5 Duplikat von Probe 1 oder Probe 2 6 7 8 9 10





Abb. 2. Vorbereitung des Objektträges nach 5.1 Ziffer ii und 5.3 Ziffer ii

Arbeitsverdünnung des Antiserums/Antikörpers 1/1 1/10 1/100 leer leer  Dezimalverdünnungen des resuspendierten Pellets Probe 1 1 2 3 4 5 Duplikat von Probe 1 oder Probe 2 6 7 8 9 10

5.3.1. Die Objektträger auf feuchten Papiertüchern auslegen. Alle Testfelder mit Antikörperverdünnung(en) bedecken. Das auf die Felder aufgetragene Antikörpervolumen muss mindestens dem Volumen des aufgetragenen Extraktes entsprechen.

Liegen keine spezifischen Anweisungen des Antikörper-Lieferanten vor, so ist folgendes Verfahren anzuwenden:

5.3.2. Objektträger abgedeckt 30 Minuten bei Raumtemperatur (18-25 °C) auf feuchten Papiertüchern inkubieren.

5.3.3. Tropfen vom Objektträger abschütteln, und die Objektträger sorgfältig mit IF-Puffer spülen. 5 Minuten mit IF-Puffer-Tween (Anlage 4) und anschließend in IF-Puffer waschen. Kreuzkontaminationen durch Sprüh- oder Tropfenbildung vermeiden. Überschüssige Feuchtigkeit durch Abtupfen sorgfältig entfernen.

5.3.4. Objektträger auf feuchten Papiertüchern auslegen. Testfelder mit der zur Titer-Bestimmung verwendeten FITC-Konjugatverdünnung bedecken. Das auf die Felder aufgetragene Konjugatvolumen muss dem Volumen des aufgetragenen Antikörpers entsprechen.

5.3.5. Objektträger abgedeckt 30 Minuten bei Raumtemperatur (18-25 °C) auf feuchten Papiertüchern inkubieren.

5.3.6. Konjugattropfen vom Objektträger abschütteln. Wie unter 5.3.3 angegeben waschen und spülen.

Überschüssige Feuchtigkeit sorgfältig entfernen.

5.3.7. Auf jedes Feld 5-10 µl 0,1 M phosphatgepuffertes Glyzerin (Anlage 4) oder eine handelsübliche Antifading-Deckflüssigkeit auftragen und Deckglas auflegen.

5.4. IF-Test-Befund

5.4.1. Testobjektträger unter einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit Filtern, die für FITC-Anregung geeignet sind, unter Öl- oder Wasserimmersion bei einer Vergrößerung von 500-1 000 untersuchen. Jedes Feld in zwei rechtwinklig zueinander stehenden Durchmessern sowie entlang des Feldrandes mikroskopisch untersuchen. Bei Proben, die keine oder nur wenige Zellen zeigen, mindestens 40 Mikroskopfelder untersuchen.

Zunächst den Objektträger mit der Positivkontrolle prüfen. Die Zellen müssen stark fluoreszieren und bei dem festgelegten Antikörpertiter oder der festgelegten Arbeitsverdünnung vollständig gefärbt sein. Bei abweichender Färbung zum Normalzustand ist der IF-Test (Abschnitt VI.A.5) zu wiederholen.

5.4.2. Auf Anwesenheit hell fluoreszierender Zellen mit charakteristischer R.-solanacearum-Morphologie in den Testfeldern auf den Testobjektträgern prüfen (siehe Website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Die Intensität der Fluoreszenz muss der des positiven Kontrollstammes bei gleicher Antikörperverdünnung entsprechen. Unvollständig gefärbte oder nur schwach fluoreszierende Zellen sind nicht zu berücksichtigen.

Bei jeglichem Verdacht auf eine Kontamination ist der Test zu wiederholen. Dies kann der Fall sein, wenn alle Objektträger in einer Charge wegen Pufferkontamination positive Zellen zeigen oder wenn auf der Objektträgerbeschichtung (außerhalb der Felder) positive Zellen gefunden werden.

5.4.3. Der Immunofluoreszenztest hat in Bezug auf die Spezifität verschiedene Probleme. Es ist damit zu rechnen, dass in Pellets aus Kartoffelnabelenden und Stängelstücken Hintergrundpopulationen mit fluoreszierenden Zellen und atypischer Morphologie sowie kreuzreagierende saprophytische Bakterien mit R.-solanacearum-ähnlicher Größe und Morphologie auftreten.

5.4.4. Nur fluoreszierende Zellen von typischer Größe und Morphologie bei Verwendung des Titers oder der Arbeitsverdünnung der Antikörper (siehe 5.3.) berücksichtigen.

5.4.5. Auswertung des IF-Befundes:

i) Für jede Probe, bei der stark fluoreszierende Zellen mit charakteristischer Morphologie gefunden werden, sind die mittlere Anzahl typischer Zellen je Mikroskopfeld zu schätzen und die Zahl typischer Zellen je ml resuspendiertes Pellet zu berechnen (Anlage 5). Der IF-Befund gilt bei Proben mit mindestens 5 × 103 typischen Zellen je ml resuspendiertes Pellet als positiv. Die Probe gilt in diesem Falle als potenziell kontaminiert, und es sind weitere Tests erforderlich.

ii) Der IF-Befund gilt bei Proben mit weniger als 5 × 103 Zellen je ml resuspendiertes Pellet als negativ. Weitere Tests sind in diesem Falle nicht erforderlich.

6. PCR-Tests

Grundsatz

Wird der PCR-Test als Hauptscreeningtest angewandt und fällt dieser Test positiv aus, so muss obligatorisch als zweiter Screeningtest der Isolierungstest oder der IF-Test durchgeführt werden. Wird der PCR-Test als zweiter Screeningtest durchgeführt und fällt der Test positiv aus, so sind zur Sicherung der Diagnose weitere Tests nach dem Flussdiagramm erforderlich.

Dieses Testverfahren wird als Hauptscreeningtest nur empfohlen, wenn es fachkundig durchgeführt werden kann.

Hinweis: Vorangehende Tests mit diesem Verfahren müssen gewährleisten, mindestens 103 bis 104 Zellen von R. solanacearum je ml, die Probenextrakten mit vorhergehendem negativen Testergebnis zugefügt wurden, reproduzierbar nachzuweisen. Möglicherweise sind Optimierungsversuche erforderlich, um in allen Laboratorien ein höchstmögliches Niveau an Sensitivität und Spezifität zu gewährleisten.

Validierte PCR-Reagenzien und -Protokolle (siehe Anlage 6) verwenden. Vorzugsweise eine Methode mit interner Kontrolle wählen.

Alle erforderlichen Vorkehrungen treffen, um eine Kontamination der Probe mit Ziel-DNA zu vermeiden. Der PCR-Test ist von erfahrenen Technikern und in für molekular-biologische Arbeiten vorgesehenen Laboratorien durchzuführen, um das Risiko einer Kontamination mit Ziel-DNA auf ein Mindestmaß zu begrenzen.

Negativkontrollen (für DNA-Extraktions- und PCR-Verfahren) sind stets als letzte Probe zu behandeln, damit nachvollziehbar bleibt, ob eine DNA-Verschleppung stattgefunden hat.

Die folgenden Negativkontrollen sollten in den PCR-Test einbezogen werden:

— Probenextrakt, der zuvor negativ auf R. solanacearum getestet wurde;

— Pufferkontrollen, die zum Extrahieren des Bakteriums und der DNA aus der Probe verwendet werden;

— PCR-Reaktionsmischung.

Die folgenden Positivkontrollen sollten in den PCR-Test einbezogen werden:

— Aliquots resuspendierter Pellets, denen R. solanacearum zugegeben wurde (Vorbereitung siehe Anlage 3 Abschnitt B);

— eine Suspension aus 106 Zellen je ml R. solanacearum in Wasser aus einem virulenten Isolat (z. B. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; siehe Anlage 3 Abschnitt B);

— soweit möglich während des PCR-Tests auch DNA aus positiven Kontrollproben verwenden.

Um potenzielle Kontaminationen zu vermeiden, sind Positivkontrollen von den Testproben räumlich getrennt vorzubereiten.

Probenextrakte sollten möglichst frei von Erdresten sein. Daher empfiehlt sich in bestimmten Fällen, Extrakte aus gewaschenen Kartoffeln herzustellen, wenn PCR-Protokolle angewandt werden sollen.

Die für diesen Test zur Verfügung stehenden standardisierten Positiv- und Negativ-Kontrollmaterialien sind in Anlage 3 aufgeführt.

6.1. DNA-Reinigungsmethoden

Positive und negative Kontrollproben wie oben beschrieben verwenden (siehe Anlage 3).

Das Kontrollmaterial nach demselben Verfahren testen wie die Probe(n).

Es stehen diverse Methoden zur Reinigung der Ziel-DNA aus komplexen Probensubstraten zur Verfügung, wodurch PCR-Inhibitoren entfernt und andere enzymatische Reaktionen ausgeschlossen werden und die Ziel-DNA im Probenextrakt konzentriert wird. Die folgende Methode wurde zur Verwendung mit der validierten PCR-Methode (Anlage 6) optimiert.

a) Methode nach Pastrik (2000)

1) 220 µl Lysispuffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) in ein 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen pipettieren.

2) 100 µl Probenextrakt zugeben und bei 95 °C für 10 Minuten in einen Thermoblock oder ein Wasserbad stellen.

3) Röhrchen 5 Minuten auf Eis kühlen.

4) 80 µl Lysozym-Stammlösung (50 mg Lysozym je ml in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) zugeben und für 30 Minuten bei 37 °C inkubieren.

5) 220 µl Easy-DNA®-Lösung A (Invitrogen) zugeben, durch Vortexen mischen und für 30 Minuten bei 65 °C inkubieren.

6) 100 µl Easy-DNA®-Lösung B (Invitrogen) zugeben und kräftig vortexen, bis das Präzipitat im Röhrchen frei fließt und die Probe gleichmäßig viskös ist.

7) 500 µl Chloroform zugeben und vortexen, bis die Viskosität nachlässt und die Mischung homogen wird.

8) Zur Phasentrennung und Ausbildung der Interphase bei 15 000 g und 4 °C für 20 Minuten zentrifugieren.

9) Oberphase in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen überführen.

10) 1 ml 100 %iges Ethanol (–20 °C) zugeben, kurz vortexen und für 10 Minuten auf Eis inkubieren.

11) Bei 15 000 g und 4 °C für 20 Minuten zentrifugieren und Ethanol vom Pellet entfernen.

12) 500 µl 80 %iges Ethanol (–20 °C) zugeben und durch Invertieren des Röhrchens mischen.

13) Bei 15 000 g und 4 °C für 10 Minuten zentrifugieren, das Pellet bewahren und das Ethanol entfernen.

14) Pellet an der Luft oder in einer DNA-Speedvac trocknen lassen.

15) Pellet in 100 µl sterilem Reinstwasser (UPW) resuspendieren und bei Raumtemperatur mindestens 20 Minuten stehen lassen.

16) Bei –20 °C lagern, bis es für die PCR benötigt wird.

17) Etwa vorhandenes weißes Präzipitat abzentrifugieren und 5 µl des DNA-haltigen Überstands für die PCR verwenden.

b) Andere Methoden

Andere Methoden der DNA-Extraktion (z. B. Qiagen DNeasy Plant Kit) sind akzeptabel, sofern sie DNA aus Kontrollproben mit 103 bis 104 Zellen des Krankheitserregers je ml nachweislich ebenso wirksam reinigen.

6.2. PCR

6.2.1. Test- und Kontroll-Templates nach dem validierten Protokoll (Abschnitt VI.A.6) für die PCR vorbereiten. Eine Dezimalverdünnung des Proben-DNA-Extrakts (1:10 in UPW) herstellen.

6.2.2. Nach dem vorgegebenen Protokoll (Anlage 6) in einem kontaminationsfreien Umfeld eine geeignete PCR-Reaktionsmischung herstellen. Es wird empfohlen, wenn möglich ein Multiplex-PCR-Protokoll zu verwenden, das auch eine interne PCR-Kontrolle enthält.

6.2.3. Nach den vorgegebenen PCR-Protokollen (Anlage 6) 2 bis 5 µl DNA-Extrakt je 25 µl PCR-Reaktion in sterile PCR-Röhrchen geben.

6.2.4. Eine negative Kontrollprobe mit ausschließlich PCR-Reaktionsmischung einbeziehen und anstelle der Probe UPW zugeben, das zur Herstellung der PCR-Mischung verwendet wurde.

6.2.5. Die Röhrchen in den Thermocycler stellen, der für die vorausgehenden Tests verwendet wurde, und das entsprechend optimierte PCR-Programm (Anlage 6) verwenden.

6.3. Analyse des PCR-Produktes

6.3.1. PCR-Fragmente durch Agarose-Gelelektrophorese auftrennen. Dazu mindestens 12 µl amplifizierte DNA-Reaktionsmischung jeder Probe, mit 3 µl Beladungspuffer (Anlage 6) gemischt, in 2,0 % (w/v) Agarose-Gelen in Tris-Acetat-EDTA-(TAE)-Puffer (Anlage 6) bei 5-8 V je cm laufen lassen. Einen geeigneten DNA-Marker, z. B. ‚100 bp ladder‘, verwenden.

6.3.2. DNA-Banden durch Anfärben in Ethidiumbromid (0,5 mg je l) für 30-60 Minuten sichtbar machen. Dieses Mutagen vorsichtig handhaben.

6.3.3. Das angefärbte Gel unter UV-Transillumination (λ = 302 nm) auf amplifizierte PCR-Produkte der erwarteten Größe (Anlage 6) untersuchen und dokumentieren.

6.3.4. Bei neuen Feststellungen/Fällen ist die Authentizität des PCR-Fragments durch Restriktionsenzymanalyse an einer Probe der verbliebenen amplifizierten DNA zu bestätigen, d. h. die Probe bei optimaler Temperatur und Zeitdauer mit einem geeigneten Enzym und Puffer (Anlage 6) zu inkubieren. Die verdauten Fragmente wie zuvor durch Agarose-Gelelektrophorese auftrennen, nach Anfärben mit Ethidiumbromid charakteristische Restriktionsfragmentmuster unter UV-Transillumination prüfen und mit der unverdauten und verdauten Positivkontrolle vergleichen.

Auswertung des PCR-Testergebnisses:

Der PCR-Test ist negativ, wenn das R.-solanacearum-spezifische PCR-Produkt der erwarteten Größe nicht für die untersuchte Probe, jedoch für alle positiven Kontrollproben nachgewiesen wird (bei Multiplex-PCR mit pflanzenspezifischen internen Kontrollprimern muss ein zweites PCR-Produkt der erwarteten Größe in der untersuchten Probe amplifiziert werden).

Der PCR-Test ist positiv, wenn das R.-solanacearum-spezifische PCR-Produkt der erwarteten Größe und (soweit erforderlich) des erwarteten Restriktionsmusters nachgewiesen wird, vorausgesetzt, es wird nicht in einer der negativen Kontrollproben amplifiziert. Ein positives Ergebnis kann auch durch Wiederholung des Tests mit einem zweiten PCR-Primerset (Anlage 6) verlässlich bestätigt werden.

Hinweis: Es besteht Verdacht auf PCR-Hemmung, wenn das erwartete Fragment aus der positiven Kontrollprobe stammt, die R. solanacearum in Wasser enthält, bei positiven Kontrollproben, die R. solanacearum in Kartoffelextrakt enthalten, jedoch negative Ergebnisse erzielt werden. In Multiplex-PCR-Protokollen mit internen PCR-Kontrollen liegt eine Reaktionshemmung vor, wenn keines der beiden Fragmente erhalten wird.

Es besteht Verdacht auf Kontamination, wenn das erwartete Fragment in einer oder mehrerer der Negativkontrollen erhalten wird.

7. FISH-Test

Grundsatz

Wird der FISH-Test als erster Screeningtest angewandt und fällt dieser Test positiv aus, so muss obligatorisch als zweiter Screeningtest der IF-Test durchführt werden. Wird der FISH-Test als zweiter Screeningtest durchgeführt und fällt der Test positiv aus, so sind zur Sicherung der Diagnose weitere Tests nach dem Flussdiagramm erforderlich.

Hinweis: Validierte R.-solanacearum-spezifische Oligo-Sonden (siehe Anlage 7) verwenden. Vorausgehende Tests mit diesem Verfahren müssen gewährleisten, mindestens 103 bis 104 Zellen von R. solanacearum je ml, die Probenextrakten mit zuvor negativem Testergebnis zugefügt wurden, reproduzierbar nachzuweisen.

Das im Folgenden beschriebene Verfahren ist vorzugsweise an frisch hergestelltem Probenextrakt durchzuführen, kann aber auch bei Probenextrakten angewandt werden, die bei –16 bis –24 °C oder bei –68 bis –86 °C unter Glyzerinzugabe gelagert wurden.

Als Negativkontrollen sind Aliquots von Probenextrakten zu verwenden, die zuvor mit negativem Testergebnis auf R. solanacearum untersucht wurden.

Als Positivkontrollen aus einer 3-5 Tage alten Kultur Suspensionen mit 105 bis 106 Zellen von R. solanacearum Biovar 2 (z. B. Stamm NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, siehe Anlage 3) je ml in 0,01 M Phosphatpuffer (PB) vorberiten. Separate Objektträger mit Positivkontrollen des homologen Stammes oder eines anderen Referenzstammes von R. solanacearum, in Kartoffelextrakt suspendiert, vorbereiten (siehe Anlage 3 B).

Die FITC-marktierte eubakterielle Oligo-Sonde bietet insofern eine Kontrolle für den Hybridisierungsprozess, als sie alle Eubakterien anfärbt, die in der Probe vorhanden sind.

Die für diesen Test zur Verfügung stehenden standardisierten Positiv- und Negativ-Kontrollmaterialien sind in Anlage 3 Abschnitt A aufgeführt.

Das Kontrollmaterial nach demselben Verfahren testen wie die Probe(n).

7.1. Fixierung des Kartoffelextrakts

Das folgende Protokoll basiert auf Wullings et al., (1998):

7.1.1. Fixierlösung herstellen (siehe Anlage 7).

7.1.2. 100 µl von jedem Probenextrakt in ein Eppendorf-Röhrchen pipettieren und für 7 Minuten bei 7 000 g zentrifugieren.

7.1.3. Überstand verwerfen und das Pellet in 200 µl Fixiermittel, das < 24 Stunden zuvor angesetzt wurde, lösen. Vortexen und 1 Stunde lang im Kühlschrank inkubieren.

7.1.4. Für 7 Minuten bei 7 000 g zentrifugieren. Überstand verwerfen und das Pellet in 75 µl 0,01 M PB resuspendieren (siehe Anlage 7).

7.1.5. 16 µl der fixierten Suspensionen auf einen sauberen Multitest-Objektträger (siehe Abbildung 7.1) auftragen. Zwei verschiedene Proben je Objektträger auftragen, unverdünnt und 10 µl zur Herstellung einer 1/100-Verdünnung (in 0,01 M PB) verwenden. Die restliche Probenlösung (49 µl) kann nach Zugabe von 1 Volumen 96 %igem Ethanol bei –20 °C gelagert werden. Für den Fall, dass der FISH-Test wiederholt werden muss, das Ethanol abzentrifugieren und dasselbe Volumen von 0,01 M PB zugeben (durch Vortexen vermischen).

Abb. 7.1. Layout des FISH-Objektträgers

Probe 1 Blank Blank Blank Probe 2 Feld 1 Feld 2 Feld 3 Feld 4 Feld 5 Probe 1 Blank Blank Blank Probe 2 Feld 6 Feld 7 Feld 8 Feld 9 Feld 10 Deckglas 1 Deckglas 2

7.1.6. Objektträger an der Luft (oder bei 37 °C auf einer Wärmebank) trocknen lassen und anschließend durch Abflammen fixieren.

In dieser Phase des Verfahrens kann die Hybridisierung unterbrochen und am nächsten Tag fortgesetzt werden. Objektträger sollten staubfrei und trocken bei Raumtemperatur gelagert werden.

7.2. Hybridisierung

7.2.1. Die Zellen in aufsteigender Ethanolreihe von 50 %, 80 % und 96 % für jeweils 1 Minute dehydratisieren. Objektträger in einem Objektträgerhalter lufttrocknen lassen.

7.2.2. Durch Auslegen des Bodens einer luftdichten Box mit Zellstoff- oder Filterpapier, das in 1x Hybmix (Anlage 7) eingeweicht wurde, eine feuchte Inkubationskammer vorbereiten. Die Box im Hybridisierungsofen bei 45 °C für mindestens 10 Minuten vorinkubieren.

7.2.3. 10 μl Hybridisierungslösung (Anlage 7) auf acht Felder (Felder 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 und 10; siehe Abbildung 7.1) eines jeden Objektträgers geben, dabei die beiden mittleren Felder (3 und 8) leer lassen.

7.2.4. Die ersten und letzten vier Felder ohne Lufteinschluss mit Deckgläsern (24 × 24 mm) abdecken. Objektträger in die vorgewärmte feuchte Kammer geben und für 5 Stunden im Ofen bei 45 °C im Dunkeln hybridisieren.

7.2.5. Drei Becher vorbereiten mit 1 l Reinstwasser (UPW), 1 l 1x Hybmix (334 ml 3x Hybmix und 666 ml UPW) und 1 l 1/8x Hybmix (42 ml 3x Hybmix und 958 ml UPW) und jeweils im Wasserbad bei 45 °C vorinkubieren.

7.2.6. Deckgläser abnehmen und Objektträger in einen Objektträgerhalter stellen.

7.2.7. Auswaschen der überschüssigen Sonde durch 15-minütiges Inkubieren bei 45 °C im Becher mit 1x Hybmix.

7.2.8. Objektträgerhalter in 1/8 Hybmix-Waschlösung stellen und für weitere 15 Minuten inkubieren.

7.2.9. Objektträger kurz in den Becher mit UPW tauchen und auf Filterpapier setzen. Überschüssige Feuchtigkeit durch leichtes Abdecken der Oberfläche mit Filterpapier aufsaugen. 5-10 μl Antifading-Deckflüssigkeit (z. B. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA o.Ä.) auf jedes Feld geben und den gesamten Objektträger mit einem großen Deckglas (24 x 60 mm) abdecken.

7.3. FISH-Test-Befund

7.3.1. Den Objektträger unverzüglich unter einem Epifluoreszenz-Mikroskop bei 630- oder 1 000-facher Vergrößerung unter Ölimmersion untersuchen. Mit einem für die FITC-Markierung (Fluorescein-Isothiocyanat) geeigneten Filter werden eubakterielle Zellen (einschließlich der meisten Gram-negativen Zellen) in der Probe leuchtend grün angefärbt. Mit einem Filter für Tetramethylrhodamin-5-Isothiocyanat leuchten Cy3-angefärbte Zellen von R. solanacearum fluoreszierend rot. Die Zellmorphologie mit der der Positivkontrollen vergleichen. Die Zellen müssen stark fluoreszieren und vollständig gefärbt sein. Der FISH-Test (Abschnitt VI.A.7) ist bei abweichender Färbung zum Normalzustand zu wiederholen. Jedes Sichtfeld in zwei rechtwinklig zueinander stehenden Durchmessern sowie entlang des Feldrandes mikroskopisch untersuchen. Bei Proben, die keine oder nur wenige Zellen zeigen, mindestens 40 Mikroskopfelder untersuchen.

7.3.2. Auf stark fluoreszierende Zellen mit charakteristischer Morphologie von R. solanacearum in den Testfeldern auf den Testobjektträgern untersuchen (siehe Website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Die Intensität der Fluoreszenz muss der des positiven Kontrollstammes entsprechen oder stärker sein. Unvollständig gefärbte oder schwach fluoreszierende Zellen sind nicht zu berücksichtigen.

7.3.3. Bei jeglichem Verdacht auf eine Kontamination ist der Test zu wiederholen. Dies kann der Fall sein, wenn alle Objektträger in einer Charge wegen Pufferkontamination positive Zellen zeigen oder wenn positive Zellen auf der Objektträgerbeschichtung (außerhalb der Felder) gefunden werden.

7.3.4. Der FISH-Test hat in Bezug auf die Spezifität verschiedene Probleme. Es ist damit zu rechnen, dass in Pellets aus Kartoffelnabelenden und Stängelstücken Hintergrundpopulationen fluoreszierender Zellen mit atypischer Morphologie und kreuzreagierende saprophytische Bakterien mit R.-solanacearum-ähnlicher Größe und Morphologie auftreten, wenn auch weniger häufig als beim IF-Test.

7.3.5. Es sind nur fluoreszierende Zellen typischer Größe und Morphologie zu berücksichtigen.

7.3.6. Auswertung des FISH-Test-Befundes:

i) Gültig sind FISH-Test-Ergebnisse, wenn mit Hilfe des FITC-Filters grün fluoreszierende Zellen mit R.-solanacearum-typischer Größe und Morphologie und mit Hilfe des Rhodaminfilters rot fluoreszierende Zellen in allen Positivkontrollen, jedoch in keiner einzigen Negativkontrolle festgestellt werden. Werden hellfluoreszierende Zellen einer R.-solanacearum-typischen Morphologie beobachtet, für jedes mikroskopische Feld die durchschnittliche Anzahl typischer Zellen schätzen und die Zahl der typischen Zellen je ml resuspendiertes Pellet (Anlage 4) berechnen. Proben mit mindestens 5 × 103 typischen Zellen je ml resuspendiertes Pellet gelten als potenziell kontaminiert, und weitere Tests sind erforderlich. Proben mit weniger als 5 × 103 typischen Zellen je ml resuspendiertes Pellet gelten als negativ.

ii) Der FISH-Test ist negativ, wenn mit dem Rhodaminfilter keine rot fluoreszierenden Zellen mit R.-solanacearum-typischer Größe und Morphologie festgestellt werden, vorausgesetzt allerdings, dass sich in den Positivkontrollen bei Verwendung des Rhodaminfilters typische rot fluoreszierende Zellen nachweisen lassen.

8. ELISA-Tests

Grundsatz

Aufgrund seiner relativ geringen Sensitivität kann der ELISA-Test nur als fakultativer Test in Ergänzung zum IF-, PCR- oder FISH-Test durchgeführt werden. Soll DAS-ELISA verwendet werden, so sind Anreicherung und die Verwendung von monoklonalen Antikörpern obligatorisch (siehe Website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Um die Sensitivität des Tests zu erhöhen, kann es sinnvoll sein, die Proben vor der Durchführung des ELISA-Tests anzureichern, aber das kann aufgrund anderer konkurrierender Organismen in der Probe scheitern.

Hinweis: Validierte Herkünfte von Antikörpern gegen R. solanacearum verwenden (siehe Website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Der Titer ist für jede neue Antikörpercharge zu bestimmen. Der Titer wird definiert als die höchste Verdünnung, bei der eine optimale Reaktion eintritt, wenn eine Suspension aus 105 bis 106 Zellen je ml des homologen Stammes von R. solanacearum mit einem geeigneten sekundären Antikörper-Konjugat nach Herstellervorgaben getestet wird. Für den Test sollten die Antikörper in Arbeitsverdünnungen auf oder sehr nah am Titerwert der handelsüblichen Formulierung verwendet werden.

Den Titer der Antikörper auf einer Suspension aus 105 bis 106 Zellen je ml des homologen R.-solanacearum-Stamms bestimmen.

Probenextrakt, der zuvor mit negativem Ergebnis auf R. solanacearum getestet wurde, und die Suspension eines nicht kreuzreagierenden Bakteriums in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Negativkontrollen einbeziehen.

Als Positivkontrolle Aliquots eines Probenextrakts mit vorhergehendem negativen Testergebnis, mit 103 bis 104 Zellen je ml von R. solanacearum Biovar 2 (z. B. Stamm NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, siehe Anlage 2 Abschnitte A und B) gemischt, verwenden. Zum Vergleich der Ergebnisse auf jeder Platte eine Standardsuspension von 105 bis 106 Zellen je ml von R. solanacearum in PBS verwenden. Darauf achten, dass die Positivkontrollen auf der Mikrotiterplatte von den Testproben deutlich getrennt aufgetragen sind.

Die für diesen Test zur Verfügung stehenden standardisierten Positiv- und Negativ-Kontrollmaterialien sind in Anlage 3 Abschnitt A aufgeführt.

Das Kontrollmaterial nach demselben Verfahren testen wie die Probe(n).

Zwei ELISA-Protokolle wurden validiert:

a) Indirekter ELISA (Robinson Smith et al., 1995)

1) 100-200 µl Aliquots des Probenextrakts verwenden (durch Erhitzen für 4 Minuten bei 100 °C im Wasserbad oder im Thermoblock lassen sich unspezifische Ergebnisse in einigen Fällen reduzieren).

2) Gleiches Volumen doppelt konzentrierten Beschichtungspuffer (Anlage 4) zugeben und vortexen.

3) In mindestens zwei Vertiefungen der Mikrotiterplatte (z. B. Nunc-Polysorp oder gleichwertige Platte) Aliquots von jeweils 100 µl geben und eine Stunde bei 37 °C oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.

4) Extrakte aus den Vertiefungen vollständig entfernen. Vertiefungen dreimal mit PBS-Tween (Anlage 4) waschen; die letzte Waschlösung sollte dabei mindestens 5 Minuten in den Vertiefungen bleiben.

5) Die geeignete Verdünnung von R.-solanacearum-Antikörpern in Blockierungs-Puffer (Anlage 4) herstellen. Für validierte handelsübliche Antikörper die empfohlenen Verdünnungen (in der Regel doppelte Konzentration des Titers) verwenden.

6) 100 µl in jede Vertiefung geben und eine Stunde bei 37 °C inkubieren.

7) Antikörperlösung aus den Vertiefungen vollständig entfernen und Vertiefungen wie zuvor beschrieben (Nummer 4) waschen.

8) Die geeignete Verdünnung des sekundären Antikörper-Alkalische-Phosphatase-Konjugats in Blockierungs-Puffer herstellen. 100 µl in jede Vertiefung geben und eine Stunde bei 37 °C inkubieren.

9) Antikörperkonjugat aus den Vertiefungen vollständig entfernen und Vertiefungen wie zuvor beschrieben (Nummer 4) waschen.

10) 100 µl Alkalische-Phosphatasesubstratlösung (Anlage 4) in jede Vertiefung geben. Im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren und in regelmäßigen Abständen innerhalb von 90 Minuten Extinktion bei 405 nm messen.

b) DASI ELISA

1) Die geeignete Verdünnung von polyklonalen Anti-R.-solanacearum-Immunoglobulinen in Beschichtungspuffer pH 9,6 (Anlage 4) herstellen. 200 µl in jede Vertiefung geben. 4 bis 5 Stunden bei 37 °C oder 16 Stunden bei 4 °C inkubieren.

2) Vertiefungen dreimal mit PBS-Tween (Anlage 4) waschen. In mindestens zwei Vertiefungen 190 µl des Probenextrakts geben. In zwei Vertiefungen jeder Platte außerdem Positiv- und Negativkontrollen geben. 16 Stunden bei 4 °C inkubieren.

3) Vertiefungen dreimal mit PBS-Tween (Anlage 4) waschen.

4) Eine geeignete Verdünnung von R.-solanacearum-spezifischen monoklonalen Antikörpern in PBS (Anlage 4) herstellen, die außerdem 0,5 %iges bovines Serumalbumin (BSA) enthält, und 190 µl in jede Vertiefung geben. 2 Stunden bei 37 °C inkubieren.

5) Vertiefungen dreimal mit PBS-Tween (Anlage 4) waschen.

6) Eine geeignete Verdünnung von Anti-Maus-Immunoglobulinen konjugiert mit alkalischer Phosphatase in PBS herstellen. 190 µl in jede Vertiefung geben. 2 Stunden bei 37 °C inkubieren.

7) Vertiefungen dreimal mit PBS-Tween (Anlage 4) waschen.

8) Eine Alkalische-Phosphatase-Substratlösung mit 1 mg p-Nitrophenyl-Phosphat je ml Substratpuffer (Anlage 4) herstellen. 200 µl in jede Vertiefung geben. Im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren und in regelmäßigen Abständen innerhalb von 90 Minuten Extinktion bei 405 nm messen.

Auswertung der ELISA-Testergebnisse

Der ELISA-Test ist negativ, wenn die durchschnittliche optische Dichte (OD) der Vertiefungen der Duplikatprobe < 2x OD der Vertiefung mit dem negativen Probenextrakt beträgt, sofern die OD für die Positivkontrollen alle über 1,0 (nach 90-minütigem Inkubieren mit dem Substrat) betragen und größer als das Doppelte der OD der negativen Probenextrakte sind.

Der ELISA-Test ist positiv, wenn die durchschnittliche optische Dichte (OD) der Vertiefungen der Duplikatprobe > 2x OD der Vertiefung mit dem negativen Probenextrakt beträgt, sofern die abgelesene OD bei allen Vertiefungen mit Negativkontrollen < 2x der Vertiefungen mit den Positivkontrollen beträgt.

Negative ELISA-Ableseergebnisse der Vertiefungen mit den Positivkontrollen weisen darauf hin, dass der Test nicht korrekt durchgeführt wurde oder dass eine Hemmung stattgefunden hat. Positive ELISA-Ableseergebnisse bei Negativkontrollen deuten auf eine Kreuzkontamination oder nichtspezifische Bindung der Antikörper hin.

9. Biotest

Hinweis: Vorausgehende Tests mit diesem Verfahren müssen garantieren, mindestens 103 bis 104 koloniebildende Einheiten von R. solanacearum je ml, die Probenextrakten mit zuvor negativem Testergebnis zugefügt wurden, reproduzierbar nachzuweisen (für die Vorbereitung siehe Anlage 3).

Optimale Nachweisempfindlichkeit ist unter optimalen Wachstumsbedingungen und bei Verwendung von frisch hergestelltem Probenextrakt gegeben. Die Methode ist jedoch auch für Extrakte geeignet, die bei –68 bis –86 °C unter Glyzerinzugabe gelagert wurden.

Protokoll nach Janse (1988):

9.1. Für jede Probe sind 10 Testpflanzen anfälliger Tomatensorten (z. B. Moneymaker oder Sorten mit gleichwertiger Anfälligkeit, die durch das Testlabor bestimmt wurde) im Blattstadium 3 zu verwenden. Für Einzelheiten zur Kultivierung siehe Anlage 8. Als Alternative können Auberginen (z. B. Sorte Black Beauty oder Sorten mit gleichwertiger Anfälligkeit) verwendet werden. Nur Pflanzen im Blattstadium 2-3, d. h. bis zur vollen Ausbildung des dritten Blattes, verwenden. Es hat sich gezeigt, dass die Symptome bei Auberginen weniger ausgeprägt sind und sich langsamer entwickeln, so dass empfohlen wird, möglichst Tomatenjungpflanzen zu verwenden.

100 µl des Probenextrakts auf die Testpflanzen verteilen.

9.2.1. Spritzeninokulation

Die Pflanzenstängel mit einer Spritze, die mit einer hypodermischen Nadel (nicht weniger als 23G) versehen ist, direkt über den Keimblättern beimpfen. Die Probe auf die Testpflanzen verteilen.

9.2.2. Schlitzinokulation

Die Pflanze zwischen zwei Fingern halten, einen Tropfen (etwa 5 bis 10 µl) des suspendierten Pellets zwischen den Keimblättern und dem ersten Blatt auf den Stängel pipettieren.

Mit einem sterilen Skalpell den Stängel vom Pellettropfen aus diagonal ca. 1,0 cm lang und etwa zwei Drittel der Stängeldicke tief einritzen.

Den Schnitt mit steriler Vaseline (Spritze) verschließen.

9.3. Nach derselben Inokulationsmethode jeweils fünf Sämlinge mit einer wässrigen Suspension von 105 bis 106 Zellen je ml aus einer 48-Stunden-Kultur eines virulenten Biovar-2-Stamms von R. solanacearum als Positivkontrolle und mit Pelletpuffer (Anlage 4) als Negativkontrolle beimpfen. Zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen sind die positiven und negativen Kontrollpflanzen von den anderen Pflanzen zu trennen.

9.4. Die Testpflanzen in Quarantäneeinrichtungen bis zu vier Wochen bei 25-30 °C und hoher relativer Luftfeuchtigkeit weiter wachsen lassen und regelmäßig wässern, um Staunässe oder Welken durch Wassermangel zu verhindern. Um Kontaminationen zu vermeiden, positive und negative Kontrollpflanzen auf getrennten Arbeitstischen in einem Gewächshaus oder einer Wachstumskammer inkubieren oder, bei Platzmangel, sicherstellen, dass die Behandlungen streng getrennt erfolgen. Müssen verschiedene Proben eng nebeneinander inkubiert werden, so sind sie durch geeignete Schutzwände zu trennen. Beim Düngen, Wässern, Untersuchen oder anderen Behandlungen sind alle erforderlichen Vorkehrungen zu treffen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Gewächshäuser und Wachstumskammern müssen unbedingt frei von Insekten jeder Art gehalten werden, da diese das Bakterium von Probe zu Probe übertragen können.

Auf Anzeichen von Welke, Epinastie, Chlorosen und/oder Wachstumsstörungen achten.

9.5. Von infizierten Pflanzen isolieren (Abschnitt II.3) und gereinigte Kulturen von R.-solanacearum-verdächtigen Isolaten identifizieren (Abschnitt VI.B.).

9.6. Werden nach drei Wochen keine Symptome festgestellt, den IF-/PCR-/ Isolierungstest an einer Mischprobe von 1 cm langen Stängelstücken jeder Testpflanze, die über der Inokulationsstelle herausgeschnitten werden, durchführen. Bei positivem Testergebnis den Verdünnungsausstrichtest (Abschnitt 4.1) durchführen.

9.7. Reinkulturen von R.-solanacearum-verdächtigen Isolaten identifizieren (Abschnitt VI. B).

Auswertung des Biotest-Ergebnisses

Gültig sind Biotestergebnisse, wenn Pflanzen der Positivkontrolle typische Symptome zeigen, das Bakterium von diesen Pflanzen reisoliert werden kann und bei den Negativkontrollen keine Symptome festgestellt werden.

Das Testergebnis ist negativ, wenn die Testpflanzen nicht mit R. solanacearum infiziert sind und sofern R. solanacearum in Positivkontrollen nachgewiesen wird.

Das Testergebnis ist positiv, wenn die Testpflanzen mit R. solanacearum infiziert sind.

B. IDENTIFIZIERUNGSTESTS

Reinkulturen von R.-solanacearum-verdächtigen Isolaten mit mindestens zwei der folgenden Testmethoden identifizieren, die auf unterschiedlichen biologischen Grundsätzen beruhen.

Für jeden durchgeführten Test ggf. bekannte Referenzstämme einbeziehen (siehe Anlage 3).

1. Nähr- und enzymatische Tests zur Identifizierung

Die folgenden phänotypischen Eigenschaften, die bei R. solanacearum entweder allgemein vorhanden oder nicht vorhanden sind, nach den Methoden von Lelliott and Stead (1987), Klement et al. (1990) und Schaad (2001) bestimmen.

Test Erwartetes Ergebnis Produktion fluoreszierender Pigmente – Poly-β-hydroxybutyrat-Einschlüsse + Oxidations-/Fermentationstest (O/F) O+/F– Katalaseaktivität + Kovac’s Oxidase-Test + Nitratreduktion + Citratverwertung + Wachstum bei 40 °C – Wachstum in 1 % NaCl + Wachstum in 2 % NaCl – Arginin-Dihydrolase-Aktivität – Gelatineverflüssigung – Stärkehydrolyse – Aesculinhydrolyse – Levanproduktion –

2. IF-Test

2.1. Eine Suspension von annähernd 106 Zellen je ml in IF-Puffer herstellen (Anlage 4).

2.2. Eine 2-fache Verdünnungsreihe eines geeigneten Antikörpers herstellen (siehe Website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3. IF-Verfahren anwenden (Abschnitt VI.A.5).

2.4. Der IF-Test ist positiv, wenn der IF-Titer der Kultur dem der Positivkontrolle entspricht.

3. ELISA-Test

Hinweis: Neben dieser Methode keinen weiteren serologischen Test anwenden, wenn nur zwei Identifizierungstests durchgeführt werden.

3.1. Eine Suspension von ca. 108 Zellen je ml in 1x PBS (Anlage 4) herstellen.

3.2. Ein geeignetes ELISA-Verfahren mit einem spezifischen monoklonalen Antikörper gegen R. solanacearum anwenden.

3.3. Der ELISA-Test ist positiv, wenn der ELISA-Wert der Kultur mindestens der Hälfte des Wertes der Positivkontrolle entspricht.

4. PCR-Tests

4.1. Eine Suspension von annähernd 106 Zellen je ml in Reinstwasser (UPW) vorbereiten.

4.2. 100 µl der Zellsuspension in geschlossenen Röhrchen in einem Thermoblock oder Siedewasserbad bei 100 °C für 4 Minuten erhitzen. Die Proben können anschließend bis zu ihrer Verwendung bei –16 bis –24 °C gelagert werden.

4.3. Geeignete PCR-Verfahren anwenden, um R.-solanacearum-spezifische Fragmente zu amplifizieren (z. B. Seal et al. (1993); Pastrik and Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)).

4.4. R. solanacearum gilt als positiv identifiziert, wenn die PCR-Produkte dieselbe Größe und dieselben Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen aufweisen wie der positive Kontrollstamm.

5. FISH-Test

5.1. Eine Suspension von annähernd 106 Zellen je ml in UPW herstellen.

5.2. FISH-Verfahren (Abschnitt VI.A.7) mit mindestens zwei R.-solanacearum-spezifischen Oligo-Sonden (Anlage 7) anwenden.

5.3. Der FISH-Test ist positiv, wenn die Kultur ebenso reagiert wie die Positivkontrolle.

6. Bestimmung des Fettsäureprofils (FAP)

6.1. Die Kultur auf Trypticase-Soja-Agar (Oxoid) für 48 Stunden bei 28 °C anzüchten.

6.2. Ein geeignetes FAP-Verfahren anwenden (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3. Ein FAP-Test ist positiv, wenn das Profil der verdächtigen Kultur mit dem der Positivkontrolle identisch ist. Das Vorliegen charakteristischer Fettsäuren (14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH und 18:1 2OH) und das Fehlen von 16:0 3OH deuten mit hoher Sicherheit auf Ralstonia sp. hin.

7. Stammcharakterisierungsmethoden

Für jeden neuen Fall, in dem R. solanacearum isoliert wurde, wird eine Stammcharakterisierung unter Anwendung einer der folgenden Methoden empfohlen.

Für jeden durchgeführten Test ggf. bekannte Referenzstämme einbeziehen (siehe Anlage 3).

7.1. Biovarbestimmung

R. solanacearum wird nach der Fähigkeit, drei Disaccharide und drei Zuckeralkohole zu verwerten und/oder zu oxidieren, in Biovare unterteilt (Hayward, 1964, und Hayward et al., 1990). Nährmedien für den Biovartest sind in Anlage 2 beschrieben. Der Test kann zuverlässig durch Stichbeimpfung der Medien mit Reinkulturen von R.-solanacearum-Isolaten und Inkubieren bei 28 °C durchgeführt werden. Werden die Nährmedien auf sterile 96er-Zellkulturplatten (200 µl pro Vertiefung) verteilt, so wird nach 72 Stunden ein Farbumschlag von olivgrün nach gelb sichtbar, was ein positives Testergebnis anzeigt.

Biovar 1 2 3 4 5 Verwertung von: Maltose – + + – + Laktose – + + – + D(+)-Cellobiose – + + – + Mannitol – – + + + Sorbitol – – + + – Dulcitol – – + + –

Durch zusätzliche Tests kann Biovar 2 in Subphänotypen unterteilt werden:

Biovar 2A (weltweit verbreitet) Biovar 2A (in Chile und Kolumbien) Biovar 2T (in tropischen Gebieten) Verwertung von Trehalose – + + Verwertung von Meso-Inositol + – + Verwertung von D-Ribose – – + Pektolytische Aktivität (1) gering gering hoch

7.2. Genetischer Fingerabdruck

Die molekulare Unterscheidung von Stämmen des R.-solanacearum-Komplexes kann durch verschiedene Techniken erfolgen, einschließlich

7.2.1. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-Analyse (RFLP) (Cook et al., 1989).

7.2.2. Repetitive Sequenz PCR mit REP-, BOX- und ERIC-Primern (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

7.2.3. AFLP-Analyse (Amplifizierter Fragmentlängenpolymorphismus) (Van der Wolf et al., 1998).

7.3. PCR-Methoden

Spezifische PCR-Primer (Pastrik et al., 2003; siehe Anlage 6) können verwendet werden zur Unterscheidung der Stämme der Gruppe 1 (Biovar 3, 4 und 5) und der Gruppe 2 (Biovar 1, 2A und 2T) von R. solanacearum, wie ursprünglich durch RFLP-Analyse (Cook et al., 1989) und 16S-rDNA-Sequenzierung (Taghavi et al., 1996) festgelegt.

C. BESTÄTIGUNGSTEST

Der Pathogenitätstest dient der endgültigen Bestätigung der Diagnose von R. solanacearum und der Bewertung der Virulenz von als R. solanacearum identifizierten Kulturen.

1) Aus 24-48 Stunden alten zu testenden Kulturen und einem geeigneten positiven Kontrollstamm von R. solanacearum (z. B. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; siehe Anlage 3) ein Inokulum mit einer Zelldichte von etwa 106 Zellen/ml herstellen.

2) 5-10 anfällige Tomaten- bzw. Auberginensämlinge im Blattstadium 3 beimpfen (siehe Abschnitt VI.A.9).

3) Die Pflanzen bis zu zwei Wochen bei 25-28 °C inkubieren. Dabei für hohe relative Luftfeuchtigkeit sorgen und regelmäßig wässern, um Staunässe bzw. Trockenheitsstress zu verhindern. Bei Reinkulturen setzt die typische Welke innerhalb von zwei Wochen ein. Treten nach diesem Zeitraum keine Symptome auf, so kann die Kultur nicht als eine pathogene Form von R. solanacearum bestätigt werden.

4) Auf Anzeichen von Welke und/oder Epinastie, Chlorose und Wachstumsstörungen achten.