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RICHTLINIE DER KOMMISSION

vom 25 . Juli 1980

über die gemeinschaftliche Analysemethode zur Bestimmung des Erukasäuregehalts in Speiseölen und -fetten sowie in Lebensmitteln mit Öl - und Fettzusätzen

( 80/891/EWG )

DIE KOMMISSION DER EUROPAISCHEN GEMEINSCHAFTEN -

gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft ,

gestützt auf die Richtlinie 76/621/EWG des Rates vom 20 . Juli 1976 zur Festsetzung des Hoechstgehalts an Erukasäure in Speiseölen und -fetten sowie in Lebensmitteln mit Öl - und Fettzusätzen ( 1 ) , insbesondere auf Artikel 3 ,

in Erwägung nachstehender Gründe :

Gemäß Artikel 2 der Richtlinie 76/621/EWG darf spätestens ab 1 . Juli 1979 der Erukasäuregehalt der in Artikel 1 dieser Richtlinie genannten Erzeugnisse - bezogen auf den Gesamtgehalt an Fettsäuren in der Fettphase - 5 % nicht übersteigen .

Gemäß Artikel 3 derselben Richtlinie wird der Erukasäuregehalt durch eine gemeinschaftliche Analysenmethode bestimmt .

Die Verordnung ( EWG ) Nr . 1470/68 der Kommission vom 23 . September 1968 über die Entnahme und Verkleinerung von Proben sowie über die Bestimmung des Gehalts der Ölsaaten an Öl , Fremdbestandteilen und Feuchtigkeit ( 2 ) , legt im Anhang VI eine durch die Verordnung ( EWG ) Nr . 72/77 ( 3 ) eingeführte Analysemethode zur Bestimmung des Gehalts an Erukasäure in Raps - und Rübsensamen fest . Es empfiehlt sich , diese Methode als Methode der Vorabunterseheidung anzuwenden .

Unter den üblichen Bedingungen bei der gaschromatographischen Fettsäureanalyse von Ölen und Fetten kann nicht zwischen der Erukasäure und den übrigen Isomeren der Docosensäure - wie der Cetoleinsäure - unterschieden werden .

Es ist erforderlich , den Erukasäuregehalt in Ölen und Fetten sowie in Lebensmitteln mit Öl - und Fettzusatzen , die Cetoleinsäure und trans-Isomere der Docosensäure enthalten können , zu bestimmen .

Es ist nicht erforderlich , den Erukasäuregehalt in Ölen und Fetten sowie in Lebensmitteln mit Öl - und Fettzusätzen zu bestimmen , bei denen eine Voranalyse einen Gesamtgehalt an Docosensäuren oder cis-Docosensäuren von nicht mehr als 5 % ergeben hat .

Bis zur Erarbeitung einer genaueren Analysenmethode zur Bestimmung des Erukasäuregehalts wird diese Analysenmethode als die zur Zeit geeignetste angesehen .

Die in dieser Richtlinie vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des Ständigen Lebensmittelausschusses -

HAT FOLGENDE RICHTLINIE ERLASSEN :

Artikel 1

Die Mitgliedstaaten schreiben vor , daß die Analysen zur Bestimmung des Erukasäuregehalts der i Artikel 1 der Richtlinie 76/621/EWG genannten Erzeugnisse gemäß Artikel 2 durchgeführt werden .

Artikel 2

( 1 ) Zum Zweck der Vorabunterscheidung wird folgendes bestimmt :

a ) entweder der Gesamtgehalt an Docosensäuren der in Artikel 1 genannten Erzeugnisse nach der in Anhang VI der Verordnung ( EWG ) Nr . 1470/68 beschriebenen Methode

b ) oder der Gesamtgehalt an cis-Docosensäuren der in Artikel 1 genannten Erzeugnisse nach der in Anhang VI der Verordnung ( EWG ) Nr . 1470/68 beschriebenen Methode unter Anwendung gaschromatographischer Bedingungen , welche die Trennung der cis - und trans-Isomere der Docosensäure ermöglichen ; als stationäre Phase sind zum Beispiel Cyanopropylpolysiloxane oder Flussigkristalle geeignet .

( 2 ) Sofern

a ) der gemäß Absatz 1 Buchstabe a ) bestimmte Gesamtgehalt an Docosensäuren oder

b ) der gemäß Absatz 1 Buchstabe b ) bestimmte Gesamtgehalt an cis-Docosensäuren

der in Artikel 1 genannten Erzeugnisse - bezogen auf den Gesamtgehalt an Fettsäuren in der Fettphase - 5 % nicht übersteigt , ist eine weitere Bestimmung nicht erforderlich . Andernfalls wird der Gehalt an Erukasäure nach der in der Anlage dieser Richtlinie beschriebenen Methode bestimmt .

Artikel 3

Die Mitgliedstaaten erlassen die erforderlichen Rechts - und Verwaltungsvorschriften , um dieser Richtlinie bis spätestens 1 . Februar 1982 nachzukommen . Sie setzen die Kommission unverzueglich davon in Kenntnis .

Artikel 4

Diese Richtlinie ist an alle Mitgliedstaaten gerichtet .

Brüssel , den 25 . Juli 1980

Für die Kommission

Etienne DAVIGNON

Mitglied der Kommission

( 1 ) ABl . Nr . L 202 vom 28 . 7 . 1976 , S . 35 .

( 2 ) ABl . Nr . L 239 vom 28 . 9 . 1968 , S . 2 .

( 3 ) ABl . Nr . L 12 vom 15 . 1 . 1977 , S . 11 .

ANHANG

BESTIMMUNG DES ERUKASÄUREGEHALTS IN SPEISEÖLEN UND -FETTEN SOWIE IN LEBENSMITTELN MIT ÖL - UND FETTZUSÄTZEN

I . EINLEITUNG

1 . VORBEREITUNG DER PROBE

1.1 . Allgemeines

Die Menge der zu analysierenden Laborprobe beträgt in der Regel 50 g , sofern nicht eine grössere Menge erforderlich ist .

1.2 . Vorbereitung der Probe

Die Probe ist vor der Analyse zu homogenisieren .

1.3 . Lagerung

Die so vorbereitete Probe muß ständig in einem gut verschlossenem Behälter gelagert werden .

2 . REAGENZIEN

2.1 . Wasser

2.1.1 . Ist für Lösungen , Verdünnungen und Waschungen Wasser erforderlich , so handelt es sich stets um destilliertes Wasser oder entmineralisiertes Wasser von mindestens gleichwertiger Reinheit .

2.1.2 . Wird bei einer " Lösung " oder einer " Verdünnung " kein Hinweis auf ein Reagenz gegeben , so handelt es sich stets um eine wäßrige Lösung .

2.2 . Chemikalien

Sofern keine gegenteiligen Angaben vorliegen , müssen alle Chemikalien analysenreine Qualität besitzen .

3 . GERÄTE

3.1 . Geräteliste

Die Geräteliste enthält Ausrüstungen für besondere Zwecke mit besonderen Spezifikationen .

3.2 . Analysenwaagen

Unter Analysenwaage ist eine Waage mit einer Meßgenauigkeit von mindestens 0,1 mg zu verstehen .

4 . DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

4.1 . Ergebnisse

Das im Analysenbericht genannte Ergebnis stellt den Mittelwert von mindestens zwei Bestimmungen mit ausreichender Wiederholbarkeit dar .

4.2 . Berechnung des Prozentsatzes

Ausser bei besonderen Vorschriften werden die Ergebnisse in Prozent ( m/m ) der Gesamtfettsäuren der Probe , die das Laboratorium erhielt , angegeben .

4.3 . Anzahl der Dezimalstellen

Das Ergebnis ist mit nicht mehr Stellen nach dem Komma anzugeben , als die Genauigkeit des Analysenverfahrens zulässt .

II . BESTIMMUNG DER ERUKASÄURE

1 . GEGENSTAND UND ANWENDUNGSBEREICH DER METHODE

Mit dieser Methode kann der Erukasäuregehalt

a ) in Ölen und Fetten , die Cetoleinsäure enthalten ( ein cis-Isomeres der Docosensäure , das in Fischölen vorkommt ) ;

b ) in hydrierten Ölen und Fetten , die cis - und trans-Isomere der Docosensäure enthalten , bestimmt werden .

2 . DEFINITION

Erukasäuregehalt : Erukasäure , bestimmt nach der beschriebenen Methode .

3 . PRINZIP

Die Methylester der Fettsäuren werden auf Silbernitrat enthaltenden Dünnschichtplatten bei tiefer Temperatur getrennt . Die getrennten Ester werden gaschromatographisch quantitativ bestimmt .

4 . REAGENZIEN

4.1 . Frisch destillierter Diäthyläther , frei von Peroxid

4.2 . n-Hexan

4.3 . Kieselgel G für Dünnschichtchromatographie

4.4 . Kieselgel für Säulenchromatographie

4.5 . Silbernitratlösung 200 g/l . 24 g Silbernitrat werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 120 ml aufgefuellt .

4.6 . Lösung des Erukasäuremethylesters , 5 mg/ml . 50 mg Erukasäuremethylester werden in einigen ml n-Hexan gelöst und mit n-Hexan auf 10 ml verdünnt .

4.7 . Lösung des Tetracosansäuremethylesters als innerer Standard , 0,25 mg/ml . 25 mg Tetracosansäuremethylester werden in einigen ml n-Hexan ( wie in 4.6 ) gelöst und auf 100 ml aufgefuellt .

4.8 . Fließmittel . Toluol : n-Hexan 90 : 10 ( v/v )

4.9 . 2,7 Dichlorfluoresceinlösung , 0,5 g/l . 50 mg 2,7-Dichlorfluorescein werden unter Erhitzen und Umrühren in 100 ml 50%igem wasserhaltigem Methanol gelöst .

5 . GERÄTE

5.1 . Geräte für die Dünuschichtchromatographie , insbesondere einschließlich :

5.1.1 . Tiefkühlschrank , der die Trennkammer einschließlich Inhalt auf Temperaturen von minus 20 * C bis minus 25 * C halten kann

5.1.2 . Glasplatten , 200 mm mal 200 mm

5.1.3 . Ultraviolettlampe

5.1.4 . Glassäule 200 mm lang , Innendurchmesser 10 mm , versehen mit Glaswolle oder Glasfilterboden . Alternativ kleine Glasfiltertrichter

5.1.5 . Gerät zum Auftragen von Lösungen in Form eines schmalen Streifens oder einer Linie

5.2 . Gaschromatograph mit elektronischem Integrator wie in Anhang VI Abschnitt III der Verordnung ( EWG ) Nr . 72/77 beschrieben .

6 . ARBEITSVORSCHRIFT

6.1 . Herstellung von Fettsäuremethylestern

Von etwa 400 mg Öl oder Fett der Analysenprobe wird nach der in Anhang VI Abschnitt II Absatz 3 der Verordnung ( EWG ) Nr . 72/77 beschriebenen Methode eine Lösung von etwa 20 bis 50 mg/ml der Fettsäuremethylester in Hexan hergestellt .

6.2 . Dünnschichtchromatographie

6.2.1 . Herstellung der Platten

60 g Kieselgel ( 4.3 ) und 120 ml Silbernitratlösung ( 4.5 ) werden in einen 500-ml-Rundkolben gegeben und eine Minute zur Herstellung einer homogenen Suspension geschüttelt . Die Suspension wird in üblicher Weise in einer Schichtdicke von etwa 0,5 mm auf die Platten aufgebracht . Die Menge reicht zur Beschichtung von fünf Platten von je 200 mal 200 mm . Die Platten werden an der Luft vorgetrocknet ( am besten etwa 30 Minuten im Dunkeln ) ; danach werden sie etwa 2 Stunden und 30 Minuten bei 100 * C im Trockenschrank getrocknet und aktiviert . Nach der Aktivierung sollten die Platten sobald wie möglich verwendet werden , andernfalls sind sie sorgfältig im Dunkeln zu lagern und vor ihrer Verwendung zu aktivieren . ( Anmerkung : Eine einstuendige Aktivierung bei 110 * C kann ausreichen , sofern die Platten dabei nicht dunkel werden ) . Um bei der Entwicklung Randeffekte zu vermeiden , sollten auf jeder Platte im Abstand von 10 mm von den Seiten und vom oberen Rand Striche durch die Schichten gezogen werden , bevor die Platten verwendet werden .

6.2.2 . Auftragen der Methylester

Mit dem Auftraggerät ( 5.1.5 ) werden 50 ml der aus der Probe hergestellten Methylesterlösung ( 6.1 ) in einem schmalen etwa 50 mm langen Streifen und im Abstand von wenigstens 40 mm von der Seite und 10 ml vom unteren Rand der Platte aufgetragen . In gleicher Weise werden 100 ml einer Mischung , die zu gleichen Teilen aus Methylesterlösung ( 6.1 ) und der Lösung des Erukasäuremethylesters ( 4.6 ) besteht , aufgetragen . Wegen der Empfindlichkeit der Schichten ist beim Auftragen der Lösungen besonders vorsichtig vorzugehen . Nach dem Auftragen der Methylester kann der untere Rand der Platte in Diäthyläther getaucht werden , bis der Äther etwa 5 mm über die Startlinie aufgestiegen ist . Dadurch werden die Methylester auf einen schmalen Streifen konzentriert .

Anmerkung : Eventüll können noch 50 ml der Erukasäuremethylesterlösung ( 4.6 ) auf die Platte aufgetragen werden , um nach der Entwicklung die Identifizierung der Erukasäuremethylester enthaltenden Zone zu erleichtern ( vgl . Abbildung ) .

6.2.3 . Entwicklung der Platten

Es wird eine ausreichende Menge Fließmittel ( 4.8 ) bis zu einer Höhe von 5 mm in die Trennkammer gegeben und diese mit Deckel in einen Tiefkühlschrank ( 5.1.1 ) gestellt , dessen Temperatur bei minus 25 * C oder so nahe wie möglich bei dieser Temperatur liegt . ( In einigen Fällen kann es zweckmässig sein , die Trennkammer auszukleiden . ) Nach zwei Stunden wird die Platte vorsichtig in die Trennkammer gestellt und man lässt das Fließmittel bis etwa zur Hälfte oder zwei Dritteln der Plattenhöhe aufsteigen . Nach dem Herausnehmen der Platte wird das Fließmittel im schwachen Stickstoffstrom von der Platte entfernt . Dann wird die Platte erneut in die Trennkammer gestellt und man lässt das Fließmittel bis zum oberen Rand der Platte aufsteigen . Anschließend wird die Platte wieder herausgenommen , wie oben beschrieben im Stickstoffstrom getrocknet und dann mit der 2,7-Dichlorfluoresceinlösung ( 4.9 ) besprüht .

Bei der Betrachtung im UV-Licht kann die Erukasäuremethylester enthaltende Zone der Probe durch Vergleich mit der intensiveren Zone der Probe , der Erukasäuremethylester zugefügt wurde , lokalisiert werden ( vgl . Abbildung ) .

6.2.4 . Trennung der Methylesterfraktionen

Die Erukasäuremethylester enthaltende Zone der Probe wird quantitativ von der Platte abgekratzt und in ein 50-ml-Becherglas gegeben . Das Kieselgel ober - und unterhalb der Erukasäuremethylesterzone , das alle anderen Fettsäuremethylesterfraktionen enthält , wird ebenfalls quantitativ von der Platte geschabt und in ein anderes 50-ml-Becherglas gegeben . In jedes Becherglas werden 1,0 ml der Tetracosansäuremethylester enthaltenden Standardlösung ( 4.7 ) und 10 ml Diäthyläther gegeben ( 4.1 ) . Es wird umgerührt und der Inhalt der beiden Bechergläser jeweils in eine mit etwa 1 g Kieselgel ( 4.4 ) gefuellte Säule bzw . Glasfiltertrichter ( 5.1.4 ) gegeben .

Die Ester werden mit drei oder vier mal 10 ml Diäthyläther extrahiert . Die Eluate werden in kleinen Glaskolben gesammelt . Sie werden im schwachen Stickstoffstrom vorsichtig auf kleine Volumina eingedampft und dann in Spitzgläschen überführt . Das restliche Lösungsmittel wird dann so im Stickstoffstrom verdampft , daß sich die Methylester in der Spitze des Gläschens konzentrieren . Anschließend werden die Methylester in etwa 25 bis 50 ml Hexan ( 4.2 ) gelöst .

6.3 . Gaschromatographie

6.3.1 . Nach der in Anhang VI Abschnitt III der Verordnung ( EWG ) Nr . 72/77 beschriebenen Methode werden 1 bis 2 ml der Methylesterlosungen eingespritzt , die i ) aus der Erukasäuremethylester enthaltenden Fraktion und ii ) aus den Fraktionen , die die restlichen Fettsäuremethylester enthalten , gewonnen wurden .

6.3.2 . Mit Hilfe eines elektronischen Integrators erhält man folgende Peakflächen :

i ) Von dem Chromatogramm der Erukasäuremethylester enthaltenden Fraktion :

a ) des Erukasäuremethylesters ( E ) ,

b ) des inneren Standards ( L1 ) ,

c ) die Peakflächen der Gesamtmethylester ohne inneren Standard ( EF ) ;

ii ) von dem Chromatogramm der in den restlichen Fraktionen enthaltenen Fettsäuremethylester :

a ) die Peakflächen der Gesamtmethylester ohne inneren Standard ( RF ) ,

b ) die Peakflächt des inneren Standards ( L2 ) .

7 . DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

7.1 . Berechnungsmethode und Formeln

7.1.1 . Der Erukasäuregehalt der Probe , berechnet als Prozent Methylester der Gesamtfettsäuremethylester , ergibt sich aus der Formel

E/L1 ( EF/L1 + RF/L2 ) mal 100

hierbei bedeuten :

E , EF , RF , L1 und L2 die Peakflachen entsprechend 6.3.2 , die erforderlichenfalls durch Eichfaktoren korrigiert werden . Der mit vorstehender Formel ermittelte Gehalt an Erukasäuremethylester entspricht dem Gehalt an Erukasäure , bezogen auf die Gesamtfettsäuren .

7.1.2 . Werden die Peakflächen in Prozenten angegeben , so können für EF und RF nachstehende Werte eingesetzt werden :

EF = 100 - L1

RF = 100 - L2 .

7.1.3 . Die Formel unter 7.1.1 setzt voraus , daß der Tetracosansäuregehalt der Probe vernachlässigt werden kann . Wenn jedoch signifikante Mengen an Tetracosansäure vorhanden sind , so muß der Wert für Tetracosansäure ( L2 ) , der aus dem Chromatogramm der restlichen Fraktionen ermittelt wurde , vermindert werden auf :

L2 - T2

Dabei ist :

T2 = T0P2/P0

und

T2 = Peakflache des Tetracosansäuremethylesters , der aus der Probe stammt , und der einen Teil der Peakfläche des inneren Standards in der Fraktion der restlichen Fettsäuremethylester ausmacht ;

P2 = Peakfläche des Palmitinsäuremethylesters in dem Chromatogramm der restlichen Fraktion ;

T0 = Peakfläche des Tetracosansäuremethylesters in dem Chromatogramm der Gesamtfetttsäuremethylester , die bei der in Artikel 2 der Richtlinie beschriebenen Analyse bestimmt wurden ;

P0 = Peakfläche des Palmitinsäuremethylesters in dem Chromatogramm der Gesamtfettsäuremethylester , die bei der in Artikel 2 der Richtlinie beschriebenen Analyse bestimmt wurden .

7.1.4 . Ableitung der Formel

Der in der Erukasäuremethylester-Fraktion enthaltene prozentüle Anteil an Fettsäuren , bezogen auf die Gesamtfettsäuren der Probe , ergibt sich aus

EF/L1 / ( EF/L1 + RF/L2 ) mal 100 oder EF/L1 ( EF/L1 + RF/L2 ) mal 100 .

Der Anteil an Erukasäure in der Erukasäuremethylester enthaltenden Fraktion ist

E/EF

Folglich ist der Erukasäuregehalt der Probe , aus * rückt in Prozent der Gesamtfettsäuren :

EF/L1 ( EF/L1 + RF/L2 ) mal E/EF mal 100 oder E/L1 ( EF/L1 + RF/L2 ) mal 100 .

7.1.5 . Wiederholbarkeit

Der Unterschied zwischen den Ergebnissen zweier unter denselben Bedingungen , durch denselben Analytiker , an derselben Probe gleichzeitig oder in rascher Folge vorgenommenen Bestimmungen darf nicht mehr als 10 % relativ , bezogen auf den ermittelten Wert , oder 0,5 g pro 100 g der Probe betragen , wobei der jeweils grössere Wert gilt .

ABBILDUNG

Beispiel eines Dünnschichtchromatogramms , das die Trennung der Methylester von Erukasäure , Cetoleinsäure und trans-Isomeren der Docosensäure zeigt : siehe ABl .

( 1 ) Die Erukasäuremethylester-Fraktion enthält gewöhnlich noch Methylester anderer Monön-Fettsäuren , sollte aber frei von Cetoleinsäuremethylester sein .