DE Amtsblatt der Europäischen Union L 220/1

VERORDNUNG (EG) Nr. 761/2009 DER KOMMISSION

vom 23. Juli 2009

zur Änderung der Verordnung (EG) Nr. 440/2008 zur Festlegung von Prüfmethoden gemäß der Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates zur Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe (REACH) zwecks Anpassung an den technischen Fortschritt

(Text von Bedeutung für den EWR)

DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN —

gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Gemeinschaft,

gestützt auf die Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 18. Dezember 2006 zur Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe (REACH), zur Schaffung einer Europäischen Agentur für chemische Stoffe, zur Änderung der Richtlinie 1999/45/EG und zur Aufhebung der Verordnung (EWG) Nr. 793/93 des Rates, der Verordnung (EG) Nr. 1488/94 der Kommission, der Richtlinie 76/769/EWG des Rates sowie der Richtlinien 91/155/EWG, 93/67/EWG, 93/105/EG und 2000/21/EG der Kommission (1), insbesondere auf Artikel 13 Absatz 3,

in Erwägung nachstehender Gründe:

(1) In der Verordnung (EG) Nr. 440/2008 der Kommission (2) sind die im Sinne der Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 anzuwendenden Prüfmethoden zur Bestimmung der physikalisch-chemischen Eigenschaften, der Toxizität und der Ökotoxizität von Stoffen festgelegt.

(2) Es ist angezeigt, die Verordnung (EG) Nr. 440/2008 zu aktualisieren, um bestimmte Prüfmethoden zu ändern und verschiedene von der OECD angenommene neue Testmethoden hinzuzufügen. Interessenträger wurden zu diesem Vorschlag gehört. Die betreffenden Änderungen dienen der Anpassung der Prüfmethoden an den wissenschaftlichen und technischen Fortschritt.

(3) Die Bestimmungen über den Dampfdruck sollten mit Blick auf die Einbeziehung der neuen Effusionsmethode überprüft werden.

(4) Es ist angezeigt, zur Messung des längengewichteten mittleren geometrischen Durchmessers von Fasern eine neue Methode hinzuzufügen.

(5) Es empfiehlt sich, die Verordnung (EG) Nr. 440/2008 zu aktualisieren und vorrangig eine neue In-vitro-Methode für Hautreizungstests einzubeziehen, um die Zahl der Versuchstiere in Einklang mit der Richtlinie 86/609/EWG des Rates vom 24. November 1986 zur Annäherung der Rechts- und Verwaltungsvorschriften der Mitgliedstaaten zum Schutz der für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere (3) zu verringern. Obgleich der Entwurf einer In-vitro-Methode für Hautreizungstests auf Ebene der OECD noch debattiert wird, ist es in diesem Ausnahmefall angezeigt, Methode B 46 in die Verordnung einzubeziehen. Methode B 46 sollte so schnell wie möglich, d. h. sobald innerhalb der OECD Einigung erzielt wurde oder weitere Informationen, die eine Überprüfung rechtfertigen, verfügbar werden, aktualisiert werden.

(6) Die Bestimmungen über den Algeninhibitionstest müssen mit Blick auf die Einbeziehung zusätzlicher Arten und die Erfüllung der Anforderungen an die Gefahrenbewertung und die Klassifizierung von Chemikalien überprüft werden.

(7) Es ist angezeigt, als neue Methode zur Messung der aeroben Mineralisierung in Oberflächengewässern einen Simulationstest zur Prüfung der biologischen Abbaubarkeit sowie als neue Methode zur Bewertung der Toxizität für die Gattung Lemna einen Wachstumsinhibitionstest hinzuzufügen.

(8) Die Verordnung (EG) Nr. 440/2008 ist daher entsprechend zu ändern.

(9) Die in dieser Verordnung vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des mit Artikel 133 der Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 eingesetzten Ausschusses —

HAT FOLGENDE VERORDNUNG ERLASSEN:

Artikel 1

Der Anhang der Verordnung (EG) Nr. 440/2008 wird wie folgt geändert:

1. Teil A wird wie folgt geändert: a) Kapitel A.4 erhält die Fassung von Kapitel A.4 in Anhang I der vorliegenden Verordnung; b) es wird ein neues Kapitel A.22 (Anhang II der vorliegenden Verordnung) hinzugefügt.

2. Teil B wird wie folgt geändert: Es wird ein neues Kapitel B.46 (Anhang III der vorliegenden Verordnung) hinzugefügt.

3. Teil C wird wie folgt geändert: a) Kapitel C.3 erhält die Fassung von Kapitel C.3 in Anhang IV der vorliegenden Verordnung; b) es werden die neuen Kapitel C.25 und C.26 (Anhänge V und VI der vorliegenden Verordnung) hinzugefügt.

Artikel 2

Diese Verordnung tritt am dritten Tag nach ihrer Veröffentlichung im Amtsblatt der Europäischen Union in Kraft.

Diese Verordnung ist in allen ihren Teilen verbindlich und gilt unmittelbar in jedem Mitgliedstaat. Brüssel, den 23. Juli 2009 Für die Kommission Stavros DIMAS Mitglied der Kommission

(1) ABl. L 396 vom 30.12.2006, S. 1.

(2) ABl. L 142 vom 31.5.2008, S. 1.

(3) ABl. L 358 vom 18.12.1986, S. 1.

ANHANG I A.4. DAMPFDRUCK 1. METHODE Diese Methode entspricht der Prüfrichtlinie OECD TG 104 (2004). 1.1. EINLEITUNG Diese geänderte Fassung von Methode A.4 (1) beinhaltet als zusätzliche Methode die „Effusionsmethode: isotherme Thermogravimetrie“; diese Methode wurde entwickelt für Substanzen mit sehr niedrigen Drücken (bis zu einem Mindestdruck von 10–10 Pa). Angesichts der Verfahrenserfordernisse, insbesondere bei der Ermittlung des Dampfdrucks für Substanzen mit niedrigem Dampfdruck, werden auch andere Verfahren zur Anwendung dieser Methode im Hinblick auf sonstige Einsatzbereiche neu bewertet. Bei thermodynamischem Gleichgewicht hängt der Dampfdruck einer reinen Substanz ausschließlich von der Temperatur ab. Die zugrunde liegenden Prinzipien werden an anderer Stelle erläutert (2)(3). Kein einzelnes Messverfahren ist für sämtliche Dampfdrucke von unter 10–10 Pa bis zu 105 Pa geeignet. Entsprechend umfasst diese Beschreibung acht Methoden zur Messung des Dampfdrucks, die in verschiedenen Dampfdruckbereichen eingesetzt werden können. Die vorgesehenen Einsatzmöglichkeiten und Messbereiche der einzelnen Methoden sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Die Methoden können nur im Zusammenhang mit Verbindungen eingesetzt werden, bei denen unter den Testbedingungen kein Abbau erfolgt. In Fällen, in denen die Versuchsmethoden aus technischen Gründen nicht eingesetzt werden können, kann der Dampfdruck auch geschätzt werden; eine empfohlene Schätzmethode wird in der Anlage beschrieben. 1.2. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN UND EINHEITEN Als Dampfdruck einer Substanz wird der Sättigungsdruck über einer festen oder flüssigen Substanz bezeichnet. In den Messungen sollte die Einheit Pascal (Pa) als SI-Einheit für Druckwerte verwendet werden. Im Folgenden sind weitere, früher verwendete Einheiten jeweils mit den entsprechenden Umrechnungsfaktoren zusammengestellt: 1 Torr = 1 mm Hg = 1,333 × 102 Pa 1 Atmosphäre = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa Die SI-Einheit der Temperatur ist Kelvin (K). Angaben in Grad Celsius werden mit folgender Formel in Kelvin umgerechnet: T = t + 273,15 wobei T = Kelvin oder thermodynamische Temperatur und t = Temperatur in Grad Celsius Tabelle 1 Messmethode Substanzen Geschätzte Wiederholbarkeit Geschätzte Reproduzierbarkeit Empfohlener Bereich Fest Flüssig Dynamische Methode niedriger Schmelzpunkt ja bis zu 25 % 1 bis 5 % bis zu 25 % 1 bis 5 % 103 Pa bis 2 × 103 Pa 2 × 103 Pa bis 105 Pa Statische Methode ja ja 5 bis 10 % 5 bis 10 % 10 Pa bis 105 Pa 10–2 Pa bis 105 Pa (1) Isoteniskopmethode ja ja 5 bis 10 % 5 bis 10 % 102 Pa bis 105 Pa Effusionsmethode: Dampfdruckgleichgewicht ja ja 5 bis 20 % bis zu 50 % 10–3 bis 1 Pa Effusionsmethode: Knudsen-Zelle ja ja 10 bis 30 % — 10–10 bis 1 Pa Effusionsmethode: isotherme Thermogravimetrie ja ja 5 bis 30 % bis zu 50 % 10–10 bis 1 Pa Gassättigungsmethode ja ja 10 bis 30 % bis zu 50 % 10–10 bis 103 Pa Rotationsmethode ja ja 10 bis 20 % — 10–4 bis 0,5 Pa 1.3. PRINZIP DER PRÜFMETHODE Im Allgemeinen wird der Dampfdruck bei verschiedenen Temperaturen gemessen. In einem begrenzten Temperaturbereich ist der Logarithmus des Dampfdrucks einer reinen Substanz eine lineare Umkehrfunktion der thermodynamischen Temperatur gemäß der vereinfachten Clapeyron-Clausius-Gleichung: wobei p = Dampfdruck in Pascal ΔHv = Verdampfungswärme in J mol–1 R = universale Gaskonstante, 8,314 J mol–1 K–1 T = Temperatur in K 1.4. REFERENZSUBSTANZEN Referenzsubstanzen brauchen nicht unbedingt verwendet zu werden. Sie dienen in erster Linie zur gelegentlichen Überprüfung der Leistungsfähigkeit einer Methode und sollen Vergleiche der mit unterschiedlichen Methoden erzielten Ergebnisse ermöglichen. 1.5. BESCHREIBUNG DER METHODE 1.5.1. Dynamische Methode (Cottrell-Verfahren) 1.5.1.1. Prinzip Der Dampfdruck wird durch die Messung der Siedetemperatur einer Substanz bei verschiedenen vorgegebenen Drücken zwischen etwa 103 und 105 Pa gemessen. Diese Methode wird auch für die Bestimmung der Siedetemperatur empfohlen. Für diesen Zweck kann die Methode bei Temperaturen bis zu 600 K eingesetzt werden. Wegen des hydrostatischen Drucks der Flüssigkeitssäule liegen die Siedetemperaturen von Flüssigkeiten bei einer Tiefe von 3 bis 4 cm etwa 0,1 °C höher als an der Oberfläche. Beim Cottrell-Verfahren (4) wird das Thermometer über der Flüssigkeit in den Dampf gebracht und die siedende Flüssigkeit kontinuierlich über die Thermometerkugel gepumpt. Eine dünne Flüssigkeitsschicht, die sich bei Atmosphärendruck im Gleichgewicht mit dem Dampf befindet, bedeckt die Kugel. Das Thermometer gibt dann den echten Siedepunkt an; Fehler durch Überhitzung oder hydrostatischen Druck werden ausgeschlossen. Die ursprünglich von Cottrell verwendete Pumpe ist in Abbildung 1 dargestellt. Rohr A enthält die siedende Flüssigkeit. Ein Platindraht B, der in den Boden eingesiegelt wurde, begünstigt ein gleichmäßiges Siedeverhalten. Das seitliche Rohr C führt zu einem Kondensator, und der Spritzschutz D verhindert, dass das kalte Kondensat in das Thermometer E gelangt. Wenn die Flüssigkeit in A siedet, werden die entstehenden Blasen und die Flüssigkeit mit dem Trichter abgetrennt und über die beiden Arme der Pumpe F über die Thermometerkugel gegossen. Abbildung 1 Abbildung 2 Cottrell-Pumpe (4) A: Thermoelement B: Vakuum-Puffervolumen C: Druckmesser D: Unterdruck E: Messpunkt F: Heizelement ca. 150 W 1.5.1.2. Apparatur In Abbildung 2 ist eine sehr genaue Apparatur dargestellt, die auf dem Cottrell-Prinzip beruht. Die Apparatur besteht aus einem Rohr mit einem Siedebereich im unteren Teil, einem Kühler im mittleren Bereich und einem Auslass und einem Flansch im oberen Bereich. Die Cottrell-Pumpe befindet sich im Siedebereich, der mit einer elektrischen Patrone beheizt wird. Die Temperatur wird mit einem ummantelten Thermoelement oder einem Widerstandsthermomenter gemessen, das über den oben befindlichen Flansch in das Gerät geführt wird. Der Auslass ist mit einem Druckregelsystem verbunden. Letzteres besteht aus einer Vakuumpumpe, einem Puffervolumen, einem Druckwächter zur Druckregulierung unter Stickstoffeinleitung und einem Druckmesser. 1.5.1.3. Verfahren Die Substanz wird in den Siedebereich gebracht. Bei nicht pulverigen Feststoffen können Probleme auftreten, die sich gelegentlich aber durch Beheizung des Kühlmantels beheben lassen. Die Apparatur ist am Flansch versiegelt, und die Prüfsubstanz wird entgast. Schäumende Substanzen können mit dieser Methode nicht gemessen werden. In der Apparatur wird der niedrigste gewünschte Druck eingestellt und die Heizung eingeschaltet. Dann wird der Temperatursensor mit einem Aufzeichnungsgerät verbunden. Das Gleichgewicht ist dann erreicht, wenn eine gleichbleibende Siedetemperatur bei konstantem Druck aufgezeichnet wird. Insbesondere ist darauf zu achten, dass während des Siedevorgangs nicht gegen die Apparatur gestoßen wird. Außerdem muss auf dem Kühler eine vollständige Kondensation erfolgen. Bei der Bestimmung des Dampfdrucks von niedrigschmelzenden Feststoffen ist darauf zu achten, dass der Kondensator nicht verblockt. Nach der Aufzeichnung dieses Gleichgewichtspunkts wird ein höherer Druck eingestellt. Der Prozess wird auf diese Weise fortgesetzt, bis ein Druck von 105 Pa erreicht ist (insgesamt etwa 5 bis 10 Messpunkte). Zur Kontrolle sind die Gleichgewichtspunkte bei abnehmenden Drücken zu reproduzieren. 1.5.2. Statische Methode 1.5.2.1. Prinzip Bei der statischen Methode (5) wird der Dampfdruck bei thermodynamischem Gleichgewicht und einer gegebenen Temperatur bestimmt. Diese Methode eignet sich für Substanzen und für aus mehreren Bestandteilen bestehende Flüssigkeiten und Feststoffe im Druckbereich von 10–1 bis 105 Pa sowie bei entsprechend sorgfältiger Vorgehensweise auch im Bereich von 1 bis 10 Pa. 1.5.2.2. Apparatur Die Apparatur besteht aus einem Bad mit konstanter Temperatur (Genauigkeit ±0,2 K), einem mit einer Unterdruckleitung verbundenen Probenbehälter, einem Druckmesser und einem System zur Druckregelung. Die Probenkammer (Abbildung 3a) ist über ein Ventil und einen Differenzdruckmesser (ein U-Rohr mit einer geeigneten Manometerflüssigkeit) verbunden, das als Nullpunktanzeige dient. Im Differenzdruckmesser können Quecksilber, Silikone und Phthalate verwendet werden; maßgeblich sind der jeweilige Druckbereich und das chemische Verhalten der Prüfsubstanz. Aus Gründen des Umweltschutzes sollte nach Möglichkeit jedoch auf Quecksilber verzichtet werden. Die Prüfsubstanz darf sich nicht merklich in der im U-Rohr enthaltenen Flüssigkeit auflösen oder mit dieser reagieren. Statt eines U-Rohrs kann auch ein Druckmesser verwendet werden (Abbildung 3b). Für den Druckmesser kann Quecksilber im Bereich des Atmosphärendrucks bis zu einem Mindestdruck von 102 Pa eingesetzt werden; Silikon-Flüssigkeiten und Phthalate sind für Drücke unter 102 Pa bis zu 10 Pa geeignet. Unter 102 Pa können sonstige Druckmesser eingesetzt werden; Kapazitätsmanometer mit Heizmembran können sogar bei Drücken unter 10–1 Pa verwendet werden. Die Temperatur wird an der Außenwand des Probenbehälters oder im Behälter selbst gemessen. 1.5.2.3. Verfahren In der in Abbildung 3a beschriebenen Apparatur wird das U-Rohr mit der gewählten Flüssigkeit gefüllt; vor Durchführung der Messungen ist die Flüssigkeit bei höherer Temperatur zu entgasen. Die Prüfsubstanz wird in die Apparatur gebracht und bei niedrigerer Temperatur entgast. Bei aus mehreren Bestandteilen bestehenden Proben sollte die Temperatur so niedrig sein, dass die Zusammensetzung des jeweiligen Materials erhalten bleibt. Durch Rühren kann das erforderliche Gleichgewicht schneller herbeigeführt werden. Die Probe kann dann mit flüssigem Stickstoff oder mit Trockeneis abgekühlt werden. Dabei ist allerdings sicherzustellen, dass die Luft oder die Pumpflüssigkeit nicht kondensieren. Bei geöffnetem Ventil über der Probe wird über mehrere Minuten ein Sog ausgeübt, um die eingeschlossene Luft zu entfernen. Wenn erforderlich, wird die Entgasung mehrmals wiederholt. Abbildung 3a Abbildung 3b Wenn die Probe bei geschlossenem Ventil beheizt wird, erhöht sich der Dampfdruck. Dadurch ändert sich das Gleichgewicht der Flüssigkeit im U-Rohr. Um die Änderung auszugleichen, wird Stickstoff oder Luft in die Apparatur geleitet, bis die Differenzdruckanzeige wieder auf null steht. Der dazu erforderliche Druck kann an einem Druckmesser oder an einem genaueren Messgerät abgelesen werden. Dieser Druck entspricht dem Dampfdruck der Substanz bei der Messtemperatur. Bei der in Abbildung 3b dargestellten Apparatur wird der Dampfdruck direkt abgelesen. Der Dampfdruck wird in geeigneten geringen Temperaturintervallen (insgesamt etwa 5 bis 10 Messpunkte) bis zur gewünschten Höchsttemperatur gemessen. Zur Kontrolle sind Messungen bei niedrigen Temperaturen durchzuführen. Wenn die in den mehrfachen Messungen ermittelten Werte nicht auf der Kurve liegen, die sich bei den höheren Temperaturen ergibt, kann dies auf eine der folgenden Ursachen zurückzuführen sein: i) Die Probe enthält noch Luft (z. B. bei hoch viskosen Materialien) oder Substanzen mit niedrigem Siedepunkt, die während der Erwärmung freigesetzt werden. ii) Die Substanz durchläuft im untersuchten Temperaturbereich eine chemische Reaktion (z. B. eine Zersetzung oder eine Polymerisierung). 1.5.3. Isoteniskopmethode 1.5.3.1. Prinzip Das Isoteniskop (6) beruht auf dem Prinzip der statischen Methode. Bei dieser Methode wird eine Probe in einen Kolben gebracht, in dem eine gleichbleibende Temperatur besteht, und der mit einem Druckmesser und einer Vakuumpumpe verbunden ist. Verunreinigungen mit höherer Flüchtigkeit als die Prüfsubstanz werden durch Entgasen bei reduziertem Druck entfernt. Der Dampfdruck der Probe bei bestimmten Temperaturen wird durch einen mit einem inerten Gas ausgeübten bekannten Druck ausgeglichen. Das Isoteniskop wurde entwickelt, um den Dampfdruck bestimmter flüssiger Kohlenwasserstoffe zu messen, kann aber auch zur Untersuchung von Feststoffen eingesetzt werden. Für Systeme mit mehreren Bestandteilen ist diese Methode im Allgemeinen nicht geeignet. Die Ergebnisse weisen nur leichte Fehler bei Proben mit nicht flüchtigen Verunreinigungen auf. Die Methode wird für den Bereich 102 bis 105 Pa empfohlen. 1.5.3.2. Apparatur In Abbildung 4 wird ein Messsystem dargestellt. Eine vollständige Beschreibung ist ASTM D 2879-86 (6) zu entnehmen. 1.5.3.3. Verfahren Bei Flüssigkeiten dient die Substanz selbst als Flüssigkeit im Differenzdruckmesser. In das Isoteniskop wird so viel Flüssigkeit eingebracht, dass der Kolben und der kurze Fuß des Druckmessers gefüllt sind. Das Isoteniskop wird mit einem Vakuumsystem verbunden und mit Hilfe des Vakuumsystems vollständig entleert. Anschließend wird das Isoteniskop mit Stickstoff gefüllt. Die Absaugung und die Reinigung des Systems wird zweimal wiederholt, um den verbliebenen Sauerstoff zu entfernen. Das befüllte Isoteniskop wird in horizontal ausgerichtet, damit sich die Probe in Kolben und Druckmesser als dünne Schicht ausbreitet. Der Systemdruck wird auf 133 Pa reduziert, und die Probe wird allmählich erwärmt, bis eben der Siedepunkt erreicht ist (Abtrennung gelöster Gase). Danach wird das Isoteniskop so ausgerichtet, dass die Probe wieder in den Kolben zurückfließt und den kurzen Fuß des Druckmessers ausfüllt. Dabei wird ein Druck von 133 Pa aufrechterhalten. Die vorgezogene Spitze des Probenkolbens wird mit kleiner Flamme erwärmt, bis sich der freigesetzte Probendampf hinreichend ausgedehnt hat, um einen Teil der Probe aus dem oberen Bereich des Kolbens und des Druckmesserarms in den Druckmesser hinein zu verdrängen und somit einen stickstofffreien Raum mit Dampf gefüllt hat. Darauf wird das Isoteniskop in ein Bad mit konstanter Temperatur gebracht, und Druck und Stickstoffzufuhr werden so eingestellt, dass sie mit dem Druck und dem Stickstoffanteil der Probe übereinstimmen. Wenn das erwünschte Gleichgewicht erreicht ist, entspricht der Stickstoffdruck dem Dampfdruck der Prüfsubstanz. Abbildung 4 Bei Feststoffen sowie je nach Druck- und Temperaturbereich werden Manometerflüssigkeiten wie z. B. Silikon-Flüssigkeiten oder Phthalate verwendet. Die entgaste Manometerflüssigkeit wird in eine dafür vorgesehene Aufwölbung am langen Arm des Isoteniskops gebracht. Anschließend wird der zu prüfende Feststoff in den Probenkolben gegeben und bei einer höheren Temperatur entgast. Darauf wird das Isoteniskop so geneigt, dass die Manometerflüssigkeit in das U-Rohr fließen kann. 1.5.4. Effusionsmethode: Dampfdruckgleichgewicht (7) 1.5.4.1. Prinzip Eine Probe der Prüfsubstanz wird in einem kleinen Ofen erhitzt und in eine Gasglocke gebracht, in der ein Unterdruck hergestellt wurde. Der Ofen wird mit einem Deckel verschlossen, in dem sich kleine Löcher mit einem bestimmten Durchmesser befinden. Der aus der Substanz erzeugte Dampf entweicht durch eines dieser Löcher und wird unmittelbar auf die Schale einer hoch empfindlichen Waage geleitet, die sich ebenfalls im Vakuum der Glasglocke befindet. Bei manchen Ausführungen ist die Waagschale von einem Kühlgefäß umgeben, über das die Wärme thermisch abgeleitet und unter Abstrahlung der Wärme so gekühlt wird, dass sich der entweichende Dampf darauf niederschlägt. Die Energie des Dampfstrahls wirkt als Kraft auf die Waage. Der Dampfdruck kann auf zweierlei Weise ermittelt werden: entweder direkt aus der auf die Waagschale wirkenden Kraft oder mit Hilfe der Hertz-Knudsen-Gleichung aufgrund der Verdampfungsgeschwindigkeit (2): wobei G = Verdampfungsgeschwindigkeit (kg s–1 m–2) M = Molmasse (g mol–1) T = Temperatur (K) R = Universale Gaskonstante (J mol–1 K–1) P = Dampfdruck (Pa) Der empfohlene Bereich liegt zwischen 10–3 und 1 Pa. 1.5.4.2. Apparatur Abbildung 5 veranschaulicht das Grundprinzip der Apparatur: Abbildung 5 A: Bodenplatte F: Kühlgehäuse und Kühlschiene B: Bewegliches Kühlinstrument G: Verdampfungsofen C: Gasglocke H: Dewargefäß mit flüssigem Stickstoff D: Waage mit Waagschale I: Messung der Probentemperatur E: Vakuummessgerät J: Prüfsubstanz 1.5.5. Effusionsmethode: Knudsen-Zelle 1.5.5.1. Prinzip Die Methode beruht auf der Schätzung der Masse der Prüfsubstanz, die im Ultravakuum pro Zeiteinheit aus einer Knudsen-Zelle (8) als Dampf durch eine Mikrobohrung strömt. Die Masse des ausströmenden Dampfs kann entweder aufgrund des Masseverlustes der Zelle oder durch Kondensation des Dampfs bei niedriger Temperatur und anschließende chromatographische Messung der Menge der verflüchtigten Substanz bestimmt werden. Der Dampfdruck wird mit Hilfe der Hertz-Knudsen-Gleichung (siehe Abschnitt 1.5.4.1) unter Berücksichtigung von Korrekturfaktoren berechnet, die von den Parametern der jeweiligen Apparatur abhängen (9). Empfohlen wird diese Methode für den Bereich 10–10 bis 1 Pa (10)(11)(12)(13)(14). 1.5.5.2. Apparatur Abbildung 6 veranschaulicht das Grundprinzip der Apparatur: Abbildung 6 1: Verbindung zum Vakuum 7: Deckel mit Schraubgewinde 2: Bohrungen des Platinwiderstand-Thermometers oder Temperaturmessung und Kontrolle 8: Flügelmuttern 3: Deckel Vakuumtank 9: Schrauben 4: O-Ring 10: Edelstahl-Effusionszellen 5: Aluminum-Vakuumtank 11: Heizpatrone 6: Vorrichtung zum Einsetzen und Abnehmen der Effusionszellen 1.5.6. Effusionsmethode: isotherme Thermogravimetrie 1.5.6.1. Prinzip Die Methode beruht auf der Bestimmung der Geschwindigkeit einer beschleunigten Verdampfung der Prüfsubstanz bei höheren Temperaturen und bei Umgebungsdruck durch Thermogravimetrie (10)(15)(16)(17)(18)(19)(20). Die Verdampfungsgeschwindigkeiten vT ergeben sich daraus, dass die jeweils ausgewählte Verbindung einer Atmosphäre mit einem langsam strömenden inerten Gas ausgesetzt wird; bei gegebenen isothermen Temperaturen T (ausgedrückt in Kelvin) wird dann über bestimmte Zeitspannen der Gewichtsverlust überwacht. Die Dampfdrücke pT werden aus den Werten für vT aufgrund der linearen Beziehung zwischen dem Logarithmus des Dampfdrucks und dem Logarithmus der Verdampfungsgeschwindigkeit bestimmt. Wenn erforderlich, kann durch eine Regressionsanalyse von log pT bezogen auf 1/T eine Extrapolierung auf Temperaturen von 20 und 25 °C erfolgen. Diese Methode kommt für Substanzen mit Mindestdampfdrücken bis zu 10–10 Pa (10–12 mbar) in Betracht; um Fehlinterpretationen der gemessenen Gewichtsverluste zu vermeiden, sollte die Reinheit annähernd 100 % betragen. 1.5.6.2. Apparatur In Abbildung 7 wird das allgemeine Prinzip der Apparatur dargestellt: Abbildung 7 Die in einer Kammer mit Temperaturüberwachung an einer Mikrowaage aufgehängte Probenträgerplatte wird von trockenem Stickstoffgas umströmt, in dem die verdampften Moleküle der Prüfsubstanz geführt werden. Nach dem Verlassen der Kammer wird der Gasstrom durch eine Sorptionseinheit gereinigt. 1.5.6.3. Verfahren Die Prüfsubstanz wird als homogene Schicht auf eine aufgeraute Glasplatte aufgebracht. Bei Feststoffen wird die Platte gleichförmig mit einer Lösung befeuchtet, in der die Prüfsubstanz in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst wurde; anschließend wird die Lösung in einer inerten Atmosphäre getrocknet. Für die Messung wird die beschichtete Platte in den Thermogravimetrie-Analysator gehängt, dort wird der Gewichtsverlust kontinuierlich als zeitabhängige Funktion bestimmt. Aus dem Gewichtsverlust Δm der Probenplatte wird die Verdampfungsgeschwindigkeit vT bei einer bestimmten Temperatur mit der folgenden Formel berechnet: wobei F = Oberfläche der beschichteten Prüfsubstanzen (im Allgemeinen die Oberfläche der Probenplatte) und t = Dauer des Gewichtsverlusts Δm Der Dampfdruck pT wird ausgehend von der Funktion der Verdampfungsgeschwindigkeit vT wie folgt berechnet: Log pT = C + D log vT wobei C und D spezifische Konstanten für die jeweilige Apparatur sind und vom Durchmesser der Messkammer sowie vom Gasstrom abhängen. Diese Konstanten sind einmal zu bestimmen, indem eine Reihe von Verbindungen mit bekanntem Dampfdruck gemessen und dann durch Regressionsanalyse log pT gegenüber log vT ermittelt wird (11)(21)(22). Die Beziehung zwischen dem Dampfdruck pT und der Temperatur T in Kelvin wird wie folgt ausgedrückt: Log pT = A + B 1/T Dabei sind A und B Konstanten, die sich aus der Regressionsanalyse von log pT gegenüber 1/T ergeben. Mit dieser Formel kann der Dampfdruck für jede beliebige Temperatur extrapoliert werden. 1.5.7. Gassättigungsmethode (23) 1.5.7.1. Prinzip Das inerte Gas wird bei Raumtemperatur und mit einer bekannten Durchflussgeschwindigkeit so langsam durch bzw. über eine Probe der Prüfsubstanz geleitet, dass eine Sättigung eintreten kann. Die Herbeiführung der Sättigung in der Gasphase ist von entscheidender Bedeutung. Die mitgeführte Substanz wird eingeschlossen (im Allgemeinen mit einem Sorptionsmittel); anschließend wird die Menge der abgetrennten Substanz bestimmt. Alternativ zum Dampfeinschluss mit anschließender Analyse kommen in den Gasstrom integrierte Analyseverfahren wie z. B. die Gaschromatographie zur quantitativen Bestimmung des mitgeführten Materials in Betracht. Der Dampfdruck wird ausgehend von der Annahme berechnet, dass sich der Gasstrom entsprechend dem idealen Gasgesetz verhält und dass der Gesamtdruck eines Gasgemischs mit der Summe der Drücke der einzelnen enthaltenen Gase übereinstimmt. Der Teildruck der Prüfsubstanz, d. h. der Dampfdruck, wird aus dem bekannten Volumen des gesamten Gasstroms und aus dem Gewicht des mitgeführten Materials berechnet. Das Gassättigungsverfahren ist für feste und flüssige Substanzen geeignet. Es kann bei Mindestdampfdrücken bis zu 10–10 Pa genutzt werden (10)(11)(12)(13)(14). Bei Dampfdrücken unter 103 Pa ist diese Methode die zuverlässigste Methode. Über 103 Pa werden die Dampfdrücke im Allgemeinen überschätzt; dies ist wahrscheinlich auf die Bildung von Aerosolen zurückzuführen. Da die Dampfdruckmessungen bei Raumtemperatur erfolgen, brauchen keine Extrapolierungen hoher Temperaturen vorgenommen zu werden; entsprechend entfallen die häufig mit der Extrapolierung hoher Temperaturen verbundenen schwerwiegenden Fehler. 1.5.7.2. Apparatur Für das Verfahren wird ein Behälter mit konstanter Temperatur benötigt. In Abbildung 8 ist ein Behälter mit Haltern für jeweils drei feste und flüssige Proben skizziert, in dem jeweils drei wahlweise feste oder flüssige Proben analysiert werden können. Die Temperatur wird mit einer Genauigkeit von mindestens ±0,5 °C überwacht. Abbildung 8 Im Allgemeinen wird Stickstoff als inertes Trägergas verwendet; gelegentlich können aber auch sonstige Gase erforderlich sein (24). Das Trägergas muss trocken sein. Der Gasstrom wird in sechs Teilströme getrennt, die jeweils durch Kegelventile (mit Bohrungen von ca. 0,79 mm) geregelt und über ein Kupferrohr mit einem Innendurchmesser von 3,8 mm in den Behälter geleitet werden. Nach dem Temperaturausgleich strömt das Gas durch die Probe und verlässt den Behälter durch die Adsorptionsfalle. Feste Proben werden in ein mit Glaswollestopfen verschlossenes Glasrohr mit einem Innendurchmesser von 5 mm gegeben (siehe Abbildung 9). In Abbildung 10 sind ein Halter für feste Proben und ein Sorptionssystem dargestellt. Die am besten reproduzierbare Methode zur Messung des Dampfdrucks von Flüssigkeiten besteht darin, die zu prüfende Flüssigkeit auf Glasperlen oder auf ein inertes Sorptionsmittel wie z. B. Kieselerde aufzubringen und den Halter mit diesen Perlen zu packen. Alternativ kann das Trägergas auch über eine grobe Fritte und eine Blase durch die Säule mit der flüssigen Prüfsubstanz geleitet werden. Abbildung 9 Abbildung 10 Das Sorptionssystem enthält einen vorderen und einen hinteren Sorptionsabschnitt. Bei sehr niedrigen Dampfdrücken werden nur geringe Anteile vom Sorptionsmittel abgetrennt; dabei kann die Adsorption auf der Glaswolle und im Glasrohr zwischen der Probe und dem Sorptionsmittel ein ernsthaftes Problem sein. Mit festem CO2 gekühlte Abscheider stellen eine weitere wirksame Möglichkeit zur Aufnahme des verdampften Materials dar. Diese Abscheider verursachen keinerlei Gegendruck auf die Sättigungssäule; außerdem lässt sich das abgetrennte Material leicht quantitativ bestimmen. 1.5.7.3. Verfahren Die Durchflussgeschwindigkeit des ausströmenden Trägergases wird bei Raumtemperatur gemessen. Während der Messung wird die Durchflussgeschwindigkeit häufig geprüft, um sicherzustellen, dass das Gesamtvolumen des Trägergases zuverlässig ermittelt wird. Vorzugsweise erfolgt eine kontinuierliche Überwachung mit einem Mengendurchflussmesser. Die Sättigung der Gasphase kann eine beträchtliche Kontaktzeit und entsprechend verhältnismäßig geringe Gasdurchflüsse erfordern (25). Im Anschluss an die Messungen werden der vordere und der hintere Sorptionsabschnitt getrennt analysiert. Die Verbindungen in den einzelnen Abschnitten werden durch Zugabe eines Lösungsmittels desorbiert. Die entstehenden Lösungen werden einer quantitativen Analyse unterzogen, um die jeweils aus den Abschnitten desorbierten Gewichte zu bestimmen. Die Wahl der Analysemethode (sowie die Wahl des Sorptionsmittels und des desorbierenden Lösungsmittels) hängt von der Beschaffenheit des zu prüfenden Materials ab. Die Desorptionsleistung wird bestimmt, indem eine bekannte Probenmenge auf das Sorptionsmittel gespritzt, die Substanz desorbiert und anschließend die zurückgewonnene Menge analysiert wird. Die Desorptionsleistung muss mit der gleichen oder zumindest annähernd gleichen Probenkonzentration wie in der eigentlichen Prüfung bestimmt werden. Um sicherzustellen, dass das Trägergas mit der Prüfsubstanz gesättigt ist, werden drei verschiedene Durchflussgeschwindigkeiten eingestellt. Wenn sich der berechnete Dampfdruck auch bei unterschiedlichen Durchflüssen nicht ändert, wird angenommen, dass das Gas gesättigt ist. Der Dampfdruck wird mit folgender Gleichung berechnet: wobei p = Dampfdruck (Pa) W = Gewicht der verdampften Prüfsubstanz (g) V = Volumen des gesättigten Gases (m3) R = universale Gaskonstante 8,314 (J mol–1 K–1) T = Temperatur (K) M = Molmasse der Prüfsubstanz (g mol–1) Die gemessenen Volumina sind unter Berücksichtigung von Druck- und Temperaturunterschieden zwischen Durchflussmesser und Sättigungssäule zu korrigieren. 1.5.8. Rotationsmethode 1.5.8.1. Prinzip Bei dieser Methode wird ein Rotationsviskosimeter eingesetzt, bei dem das Messelement aus einer kleinen Stahlkugel besteht, die in einem Magnetfeld aufgehängt durch Drehfelder in Drehungen versetzt wird (26)(27)(28). Aufnehmerspulen ermöglichen eine Messung der Drehzahl. Wenn die Kugel eine bestimmte Drehzahl erreicht hat (in der Regel etwa 400 Umdrehungen pro Sekunde), wird die Erregung unterbrochen, und infolge der Gasreibung erfolgt eine Verzögerung. Der Rückgang der Drehzahl wird zeitabhängig gemessen. Aus der druckabhängigen Verlangsamung der Stahlkugel wird der Dampfdruck abgeleitet. Diese Methode wird für den Bereich von 10–4 bis 0,5 Pa empfohlen. 1.5.8.2. Apparatur In Abbildung 11 ist die Apparatur schematisch dargestellt. Der Messfühler wird in ein Gehäuse mit konstanter Temperatur gebracht, in dem die Temperatur mit einer Genauigkeit von 0,1 °C geregelt wird. Der Probenbehälter wird in ein getrenntes Gehäuse gesetzt, dessen Temperatur ebenfalls mit einer Genauigkeit von 0,1 °C geregelt wird. Alle übrigen Teile der Apparatur werden auf einer höheren Temperatur gehalten, um eine Kondensatbildung auszuschließen. Die gesamte Apparatur ist mit einem Hochvakuumsystem verbunden. Abbildung 11 2. DATEN UND ABSCHLUSSBERICHT 2.1. DATEN Der Dampfdruck sollte mit den genannten Methoden jeweils bei mindestens zwei Temperaturen gemessen werden. Im Bereich 0 bis 50 °C werden Messungen vorzugsweise bei drei Temperaturen durchgeführt, um zu prüfen, ob die Dampfdruckkurve linear verläuft. Bei der Effusionsmethode (Knudsen-Zelle und isotherme Thermogravimetrie) und bei der Gassättigungsmethode wird statt des üblichen Bereichs von 0 bis 50 °C ein Temperaturbereich von 120 bis 150 °C empfohlen. 2.2. PRÜFBERICHT Der Prüfbericht muss folgende Informationen enthalten: — eingesetzte Methode; — genaue Spezifizierung der Substanz (Beschreibung und Verunreinigungen); ggf. ist eine vorläufige Reinigung zu protokollieren; — mindestens zwei Dampfdruck- und Temperaturwerte — vorzugsweise drei oder mehr — im Temperaturbereich 0 bis 50 °C (bzw. 120 bis 150 °C); — mindestens einer der Temperaturwerte sollte 25 °C oder weniger betragen, wenn bei der jeweils gewählten Methode technisch möglich; — alle Originaldaten; — eine Kurve log p vs. 1/T; — eine Schätzung des Dampfdrucks bei 20 oder 25 °C. Wenn ein Übergang (Änderung des Aggregatzustandes oder Zersetzung) beobachtet wird, sollten folgende Informationen vermerkt werden: — Art der Änderung; — Temperatur, bei der die Änderung bei Atmosphärendruck auftritt; — Dampfdruck bei 10 und 20 °C unter der Übergangstemperatur und bei 10 und 20 °C über dieser Temperatur (wenn der Übergang nicht vom festen Zustand in den gasförmigen Zustand erfolgt). Alle für die Auswertung der Ergebnisse maßgeblichen Informationen und Bemerkungen sind zu protokollieren; dies gilt insbesondere für Verunreinigungen und für die physikalische Beschaffenheit der Prüfsubstanz. 3. LITERATUR 1. Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften L 383 A, S. 26-47 (1992). 2. Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, London. 3. Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York. 4. Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., Van Nostrand Company, New York. 5. NF T 20-048 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within a range from 10–1 to 105 Pa — Static method. 6. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure — temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. 7. NF T 20-047 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–3 to 1 Pa — Vapour pressure balance method. 8. Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 593. 9. Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. Thermodynamics 7, S. 1173. 10. Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, S. 521-532. 11. Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition (2000). 12. Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determination of small vapour pressures determination of the vapour pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), S. 22-28. 13. Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), S. 269-278. 14. Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p-dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), S. 117-122. 15. Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973), S. 137-147. 16. Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974), S. 393-400. 17. Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relationship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982), S. 161-168. 18. Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 (1995), S. 27-31. 19. Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermogravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction (SPME); Pesticide Science 53 (1998), S. 300-310. 20. Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low-Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87(12) (1998), S. 1512-20. 21. Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range — 25 °C to 150 °C. 22. Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002). 23. 40 CFR, 796. (1993). S. 148-153, Office of the Federal Register, Washington DC. 24. Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, S. 435. 25. Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, S. 1375. 26. Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987). J. Vac. Sci. Technol. (A), 5(4), S. 2440. 27. Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. Sci. Technol. 17(2), S. 642. 28. Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), S. 1715. (1) In Verbindung mit einem Kapazitätsmanometer. Anlage Schätzmethode EINLEITUNG Geschätzte Dampfdrücke können verwendet werden, — um zu entscheiden, welche Prüfmethode im Einzelfall am besten geeignet ist, und — um in den Fällen einen Schätz- oder Grenzwert angeben zu können, in denen eine Prüfmethode aus technischen Gründen nicht zur Anwendung kommen kann. SCHÄTZMETHODE Der Dampfdruck von Flüssigkeiten und Feststoffen kann aufgrund der modifizierten Watson-Korrelation geschätzt werden (a). In diesem Fall braucht als Prüfwert nur der normale Siedepunkt bestimmt zu werden. Diese Methode kommt im Druckbereich 105 Pa bis 10–5 Pa in Betracht. Detaillierte Informationen zu dieser Methode sind dem „Handbook of Chemical Property Estimation Methods“ zu entnehmen (b). Außerdem wird auf die OECD Environmental Monograph No. 67 verwiesen (c). BERECHNUNGSVERFAHREN Der Dampfdruck wird wie folgt berechnet: wobei T = maßgebliche Temperatur Tb = normaler Siedepunkt PVP = Dampfdruck bei Temperatur T ΔHVb = Verdampfungswärme ΔZb = Kompressibilitätsfaktor (geschätzt 0,97) m = empirischer Faktor, abhängig von der physikalischen Beschaffenheit bei der maßgeblichen Temperatur Außerdem ist folgende Berechnung vorzunehmen: wobei KF ein empirischer Faktor ist, der die Polarität der Substanz berücksichtigt; im Anhang sind die Faktoren KF für verschiedene Verbindungen zusammengestellt. Verhältnismäßig häufig sind Daten verfügbar, bei denen ein Siedepunkt bei reduziertem Druck angegeben wird. In diesen Fällen wird der Dampfdruck wie folgt berechnet: wobei T1 = Siedepunkt bei reduziertem Druck P1. BERICHT Bei der Schätzmethode sollte die vorgenommene Berechnung im Bericht umfassend dokumentiert werden. LITERATUR a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398. b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D. H. (1982). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill. c) OECD Environmental Monograph No. 67. Application of Structure-Activity Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assessment (1993).

ANHANG II A.22. LÄNGENGEWICHTETER MITTLERER GEOMETRISCHER DURCHMESSER VON FASERN 1. METHODE 1.1. EINLEITUNG Mit dieser Testmethode wird ein Verfahren zur Messung des längengewichteten mittleren geometrischen Durchmessers (GWGMD — Length Weighted Geometric Mean Diameter) von künstlichen Mineralfasern (MMMF — Man Made Mineral Fibres) beschrieben. Da der LWGMD der Population mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 % zwischen den 95 %-Vertrauensintervallen (LWGMD ±2 Standardfehler) der Probe liegt, entspricht der im Bericht angegebene Wert (der Testwert) der unteren 95 %-Vertrauensgrenze der Probe (d. h. LWGMD — 2 Standardfehler). Diese Methode basiert auf einer aktualisierten Fassung (Juni 1994) des Entwurfs einer HSE-Industrieverfahrensweisung, die am 26. September 1993 in Chester zwischen ECFIA und HSE vereinbart und für und aus einem zweiten laborinternen Versuch entwickelt wurde (1, 2). Diese Messmethode kann zur Kennzeichnung des Faserdurchmessers von Schüttgutstoffen oder Produkten verwendet werden, die MMMF enthalten, z. B. feuerfeste Keramikfasern (PCF — Refractory Ceramic Fibres), künstliche Glasfasern (MMVF — Man-Made Vitreous Fibres), kristalline und polykristalline Fasern. Die Längengewichtung dient zur Kompensation der Auswirkungen auf die Durchmesserverteilung, zu denen es durch den Bruch langer Fasern bei der Probenahme oder beim Umgang mit dem Material kommt. Die Größenverteilung der Durchmesser der MMMF wird durch geometrische statistische Verfahren (geometrisches Mittel) gemessen, da diese Durchmesser normalerweise Größenverteilungen aufweisen, die näherungsweise dem Lognormal entsprechen. Die Messung der Länge und des Durchmessers ist ein mühsamer, zeitaufwändiger Prozess, werden jedoch nur jene Fasern gemessen, die eine unendlich dünne Linie in einem REM-Sichtfeld berühren, so ist die Wahrscheinlichkeit, eine bestimmte Faser auszuwählen, proportional zu deren Länge. Da damit die Länge in den Berechnungen der Längengewichtung berücksichtigt wird, muss lediglich der Durchmesser gewichtet werden; der LWGMD — 2SF kann dann auf die beschriebene Weise berechnet werden. 1.2. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN Partikel: Ein Objekt mit einem Länge-Breite-Verhältnis von weniger als 3:1. Faser: Ein Objekt mit einem Länge-Breite-Verhältnis (Seitenverhältnis) von mindestens 3:1. 1.3. UMFANG UND EINSCHRÄNKUNGEN Durch diese Methode sollen die Durchmesserverteilungen untersucht werden, deren mittlerer Durchmesser zwischen 0,5 μm und 6 μm liegt. Größere Durchmesser können mithilfe geringerer REM-Vergrößerungsfaktoren gemessen werden, allerdings stößt diese Methode bei feineren Faserverteilungen zunehmend an seine Grenzen; bei mittleren Durchmessern unter 0,5 μm wird die Messung mit Transmissions-Elektronenmikroskopen (TEM) empfohlen. 1.4. PRINZIP DER TESTMETHODE Aus der Fasermatte oder aus losen Fasern wird eine bestimmte Anzahl repräsentativer Kernproben entnommen. Die Länge der losen Fasern wird durch Brechen verringert und es wird eine repräsentative Teilprobe in Wasser dispergiert. Aliquote Teile werden extrahiert und durch ein Polycarbonatfilter mit einer Porengröße von 0,2 μm gefiltert und zur Untersuchung unter einem Rasterelektronenmikroskop (SEM) vorbereitet. Die Faserdurchmesser werden mit einem Rastervergrößerungsfaktor von × 10 000 oder mehr (1) nach einem Line-Intercept-Verfahren gemessen, das eine unverfälschte Schätzung des mittleren Durchmessers ergibt. Das untere 95 %-Vertrauensintervall (auf der Basis eines einseitigen Tests) wird so berechnet, dass ein Schätzwert für den niedrigsten Wert des mittleren geometrischen Faserdurchmessers des Materials entsteht. 1.5. BESCHREIBUNG DER TESTMETHODE 1.5.1. Sicherheits-/Vorsichtsmaßnahmen Die Belastung des menschlichen Organismus durch Schwebfasern ist zu minimieren; daher ist bei der Arbeit mit den trockenen Fasern ein Abzugsschrank oder eine Glove-Box zu verwenden. In periodischen Abständen ist die Belastung des menschlichen Organismus zu überwachen, um die Wirkung der Schutzverfahren zu überprüfen. Bei der Handhabung von MMMF sind Einweghandschuhe zu tragen, um Hautreizungen zu verringern und eine Querkontaminierung zu vermeiden. 1.5.2. Geräte/Apparatur — Press- und Formwerkzeug (für 10 MPa). — Polycarbonat-Kapillarporenfilter mit 0,2 μm Porengröße (Durchmesser 25 mm). — Zelluloseestermembranfilter mit 5 μm Porengröße zur Verwendung als Zusatzfilter. — Glasfiltervorrichtung (oder Einwegfiltersysteme) für die Aufnahme von Filtern mit 25 mm Durchmesser (z. B. Millipore-Glasmikroanalyse-Filtersatz, Typ XX10 025 00). — Frisch destilliertes Wasser, das zur Ausfilterung von Mikroorganismen durch einen Filter mit 0,2 μm Porengröße gefiltert wurde. — Sputter-Beschichtungsvorrichtung mit Gold- oder Gold/Palladium-Target. — Rasterelektronenmikroskop mit einem Auflösevermögen bis 10 nm und Vergrößerungsfaktor bis x 10 000. — Diverses: Spatel, Skalpellmesser Typ 24, Pinzette, REM-Röhrchen, Kohlenstoffkleber oder Kohlenstoffklebeband, Kolloidalsilber („Silver dag“). — Ultraschallsonde oder Tisch-Ultraschallbad. — Kernbohrer oder Korkbohrer für die Entnahme von Kernproben aus MMMF-Fasermatten. 1.5.3. Testverfahren 1.5.3.1. Probenahme Bei Fasermatten und Platten wird ein 25 mm-Kernbohrer oder Korkbohrer zur Entnahme von Proben aus dem Querschnitt verwendet. Diese Proben sind gleichmäßig über die Breite a der Schmalseite der Matte anzuordnen oder, wenn lange Abschnitte der Matte zur Verfügung stehen, aus beliebigen Stellen zu entnehmen. Die gleichen Hilfsmittel können auch für die Entnahme von Zufallsproben aus losen Fasern verwendet werden. Es sind sechs Stichproben möglichst so zu entnehmen, das räumliche Schwankungen im losen Material damit wiedergegeben werden. Die sechs Kernproben sind in einem Stempel mit 50 mm Durchmesser unter 10 MPa zu zerkleinern. Das Material wird mit einem Spachtel durchmischt und bei 10 MPa erneut gepresst. Anschließend wird das Material aus dem Stempel entnommen und in einer verschlossenen Glasflasche gelagert. 1.5.3.2. Vorbereitung der Probe Falls erforderlich, können organische Bindemittel entzogen werden, indem die Faser ca. eine Stunde lang bei 450 °C in einen Ofen eingelegt wird. Die Probe nach dem Cone-and-Quarter-Verfahren in vier gleiche Teile unterteilen (dieser Schritt sollte in einem Staubschrank erfolgen). Mit einem Spatel eine geringe Menge (< 0,5 g) der Probe in 100 ml frisch destilliertes Wasser geben, das durch einen 0,2 μm-Membranfilter gefiltert wurde (andere Beschaffungsquellen von hochreinem Wasser sind ebenfalls zulässig, wenn sie nachgewiesenermaßen von ausreichender Qualität sind). Die Probe mithilfe einer mit 100 W betriebenen Ultraschallsonde, die so eingestellt ist, dass eine Kavitation eintritt, gründlich dispergieren (Steht keine Sonde zur Verfügung, ist wie folgt vorzugehen: 30 Sekunden lang mehrmals schütteln und umkehren; fünfminütige Ultraschallbehandlung in einem Tisch-Ultraschallbad; dann wieder 30 Sekunden lang mehrmals schütteln und umkehren). Sofort nach der Dispersion der Faser mehrere aliquote Teile (z. B. drei aliquote Teile mit 3, 6 und 10 ml) mit einer breiten Pipette (Aufnahmevermögen 2-5 ml) entnehmen. Jeder aliquote Teil wird durch einen 0,2 μm-Polycarbonatfilter mit MEC-Zusatzfilter mit 5 µm-Poren unter Verwendung eines 25-mm-Glasfiltertrichters mit zylindrischem Vorratsbehälter vakuumgefiltert. Rund 5 ml des gefilterten destillierten Wassers wird in den Trichter gegeben und den aliquoten Teil langsam in das Wasser gegeben, wobei die Pipettenspitze unterhalb des Meniskus gehalten wird. Pipette und Vorratsbehälter müssen nach dem Pipettieren gründlich gespült werden, da dünne Fasern dazu neigen, sich eher an der Oberfläche anzusammeln. Filter vorsichtig entnehmen und vom Zusatzfilter trennen, bevor er zum Trocknen in einen Behälter eingelegt wird. Einen Viertel- oder halben Filterquerschnitt der Filterrückstände mit ruckartigen Bewegungen mit einem Skalpell Typ 24 ausschneiden. Den ausgeschnittenen Querschnitt mit Kohlenstoffklebeband oder Kohlenstoffkleber vorsichtig auf dem Träger („Stub“) des REM befestigen. An mindestens drei Stellen ist Kolloidalsilber zur Verbesserung des elektrischen Kontakts der Filterränder und des „Stub“ aufzubringen. Wenn der Klebstoff bzw. das Kolloidalsilber getrocknet ist, durch Sputter-Beschichtung ca. 50 nm Gold oder Gold/Palladium auf die Oberfläche des Filterrückstands aufbringen. 1.5.3.3. Kalibrierung und Betrieb des REM 1.5.3.3.1. Kalibrierung Die Kalibrierung des REM ist mindestens einmal wöchentlich (idealerweise täglich) anhand eines freigegebenen Kalibriergitters zu kontrollieren. Die Kalibrierung ist anhand eines freigegebenen Normals zu kontrollieren; stimmt der Messwert (REM) nicht auf ±2 % mit dem zertifizierten Wert überein, muss die Kalibrierung des REM nachjustiert und erneut kontrolliert werden. Das REM muss bei Verwendung einer Probenmatrix mindestens die Auflösung eines sichtbaren Mindestdurchmessers von 0,2 µm bei einem Vergrößerungsfaktor × 2 000 ermöglichen. 1.5.3.3.2. Betrieb Das REM ist mit einem Vergrößerungsfaktor von 10 000 (2) unter Bedingungen zu betrieben, die eine gute Auflösung und eine akzeptable Bildqualität bei geringer Abtastgeschwindigkeit von beispielsweise 5 Sekunden je Aufnahme ergeben. Da die Betriebsvoraussetzungen unterschiedlicher REM sich voneinander unterscheiden können, sind bei Materialien mit relativ geringer Atommasse Beschleunigungsspannungen von 5-10 keV zu verwenden, um eine möglichst gute Sichtbarkeit und Auflösung zu erreichen; dabei ist eine geringe Punktgröße und ein kurzer Arbeitsabstand einzustellen. Wird ein Linear-Trverse-Verfahren angewandt, ist eine Neigung von 0o zu verwenden, um Refokussierung auf ein Minimum zu beschränken; weist das REM eine euzentrische Stufe auf, ist der euzentrische Arbeitsabstand zu verwenden. Ein geringerer Vergrößerungsfaktor kann verwendet werden, wenn das Material keine kleinen Fasern (mit geringem Durchmesser) enthält und große Faserdurchmesser (> 5 μm) vorliegen. 1.5.3.4. Größenbestimmung 1.5.3.4.1. Bewertung der Probe bei geringer Vergrößerung Zunächst ist die Probe mit einem geringen Vergrößerungsfaktor auf Anzeichen von Klumpenbildung größerer Fasern zu untersuchen und die Faserndichte zu ermitteln. Bei übermäßiger Klumpenbildung wird empfohlen, eine neue Probe herzustellen. Aus Gründen der statistischen Genauigkeit muss eine bestimmte Mindestzahl Fasern gemessen werden, eine hohe Faserndichte ist dabei erstrebenswert, da die Untersuchung leerer Felder zeitaufwändig ist und keinen Beitrag zum Analyseergebnis liefert. Ist der Filter jedoch überladen, ist die Messung aller messbaren Fasern erschwert und es besteht die Gefahr, dass kleinere Fasern durch größere Fasern überdeckt und dadurch übersehen werden. Eine Verfälschung in Richtung einer zu hoch geschätzten LWGMD kann dann eintreten, wenn Faserdichten von mehr als 150 Fasern je Millimeter Linear-Traverse vorliegen. Durch geringe Faserkonzentrationen nimmt andererseits die Dauer der Analyse zu, weshalb es oft kostengünstiger ist, eine Probe herzustellen, deren Faserdichte näher am Optimum liegt, statt ständig die Faserzahlen in Filtern geringer Konzentrationen zu zählen. Die optimale Faserdichte soll durchschnittlich ca. 1 oder 2 zählbare Fasern je Sichtfeld bei einer 5000-fachen Vergrößerung ergeben. Allerdings ist die optimale Dichte von der Größe (Durchmesser) der Fasern abhängig, also muss der Bediener mit entsprechendem Sachverstand entscheiden, ob die Faserdichte dem Optimum nahekommt oder nicht. 1.5.3.4.2. Längengewichtung der Faserdurchmesser Es werden nur diejenigen Fasern gezählt, die eine (unendlich) dünne Linie auf dem Raster des REM berühren (oder kreuzen). Hierzu wird eine waagerechte (oder vertikale) Linie durch die Rastermitte gezogen. Alternativ dazu wird ein einzelner Punkt in der Mitte des Rasters angeordnet und ein kontinuierlicher Abtastvorgang in einer Richtung über den Filter hinweg gestartet. Der Durchmesser jeder Faser mit einem Seitenverhältnis von mehr als 3:1, die diesen Punkt berührt oder kreuzt, wird gemessen und aufgezeichnet. 1.5.3.4.3. Bestimmung der Fasergröße Es wird empfohlen, mindestens 300 Fasern zu messen. Jede Faser wird nur ein einziges Mal am Schnittpunkt mit der auf dem Bild gezeichneten Linie oder Punkt (oder nahe dem Schnittpunkt, wenn die Faserkanten verdeckt sind) gemessen. Werden Fasern mit uneinheitlichen Querschnitten festgestellt, ist eine Messung am durchschnittlichen Faserdurchmesser zugrundezulegen. Bei der Festlegung des Randes und der Messung des geringsten Abstands zwischen den Faserrändern ist vorsichtig vorzugehen. Die Größenbestimmung kann online oder offline an gespeicherten Bildern oder Fotoaufnahmen erfolgen. Die Verwendung von halbautomatischen Bildmesssystemen, bei denen die Daten direkt in eine Tabellenkalkulation geladen werden, ist zu empfehlen, da diese Verfahren Zeit sparen, Abschriftfehler vermeiden und eine automatische Berechnung ermöglichen. Die Enden langer Fasern sind bei geringer Vergrößerung zu prüfen, damit sichergestellt ist, dass sie sich nicht in den Sichtbereich des Messfeldes rollen und nur einmal gemessen werden. 2. DATEN 2.1. BEHANDLUNG DER ERGEBNISSE Die Faserdurchmesser weisen normalerweise keine Normalverteilung auf. Mit Hilfe einer Log-Transformation kann jedoch eine Verteilung ermittelt werden, die näherungsweise der Normalverteilung entspricht. Das arithmetische Mittel (mittlerer lnD) und die Standardabweichung (SDlnD) der lnD-Werte (log to base e) der n Faserdurchmesser (D) wird berechnet. (1) (2) Die Standardabweichung wird durch die Quadratwurzel der Anzahl Messungen (n) dividiert und daraus der Standardfehler (SElnD) ermittelt. (3) Das Zweifache des Standardfehlers wird vom Mittelwert abgezogen und der Exponentialwert dieses Wertes (Mittelwert minus dem Zweifachen des Standardfehlers) berechnet; dies ergibt den geometrischen Mittelwert minus zwei geometrischen Standardfehlern. (4) 3. BERICHTSERSTELLUNG TESTBERICHT Der Testbericht muss mindestens folgende Angaben enthalten: — den Wert für LWGMD-2SE, — etwaige Abweichungen, vor allem jene, die sich auf Präzision oder Genauigkeit der Ergebnisse auswirken (mit entsprechenden Begründungen). 4. LITERATUR 1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 1999. 2. G. Burdett und G. Revell. Development of a standard method to measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory Services Division, 1994. (1) Dieser Vergrößerungsfaktor bezieht sich auf 3 µm-Fasern; bei 6 µm-Fasern ist ein Vergrößerungsfaktor von × 5 000 möglicherweise geeigneter. (2) Siehe vorherige Fußnote zu 3 μm-Fasern.

ANHANG III B.46. IN-VITRO-HAUTREIZUNG: TEST AN REKONSTRUIERTEN MODELLEN MENSCHLICHER EPIDERMIS 1. METHODE 1.1. EINLEITUNG Der Begriff Hautreizung bezeichnet das Auslösen einer reversiblen Hautschädigung nach Applikation einer Prüfsubstanz für die Dauer von bis zu 4 Stunden (Definition des Globalen Harmonisierten Systems (GHS) zur Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien der Vereinten Nationen (UN))(1). Die vorliegende Prüfmethode entspricht einem in vitro-Verfahren, das es je nach Informationsanforderungen gestattet, als vollwertiger Ersatztest (Stand-alone-Test) im Rahmen einer Teststrategie und nach einem evidenzbasierten Bewertungsansatz (Weight-of-Evidence approach) das Hautreizungspotenzial von Substanzen zu bestimmen (2). Hautreizungen wurden bisher meist anhand von Versuchstieren bewertet (siehe Prüfmethode B.4) (3). Um dem Tierschutzaspekt Rechnung zu tragen, sieht Methode B.4 vor, dass Hautverätzungen/-reizungen auch im Wege einer sequenziellen Teststrategie bestimmt werden können, bei der validierte in vitro- und ex vivo-Methoden angewandt werden, die den Tieren Schmerzen und Leiden ersparen. Drei validierte in vitro-Prüfmethoden bzw. Prüfrichtlinien — B.40, B.40bis und TG 435 (4, 5, 6) — sind für den Hautverätzungen betreffenden Teil der sequenziellen Teststrategie der Methode B.4 sinnvoll. Die vorliegende Prüfmethode beruht auf Modellen rekonstruierter menschlicher Epidermis, die in ihrer allgemeinen Ausgestaltung (Verwendung von menschlichen Keratinozyten als zelluläres Ausgangsmaterial, repräsentativem Gewebe und Zytoarchitektur) die biochemischen und physiologischen Eigenschaften der menschlichen Oberhaut, d. h. der Epidermis, weitgehend nachvollziehen. Das im Rahmen dieser Prüfmethode beschriebene Verfahren gestattet die Identifizierung der Gefahren von Reizstoffen gemäß Kategorie 2 des UN-GHS-Systems. Die Prüfmethode umfasst auch eine Reihe von Leistungsnormen für die Bewertung ähnlicher und modifizierter Methoden für Tests auf Basis rekonstruierter menschlicher Epidermis (7). Für zwei in vitro-Prüfmethoden (8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17), die als EpiSkin™ und EpiDerm™ im Handel erhältlich sind und Modelle rekonstruierter menschlicher Epidermis verwenden, wurden Prävalidierungs-, Optimierungs- und Validierungsstudien abgeschlossen. Die angeführten Referenzen beruhten auf R38-Kennzeichnung. Bestimmte Aspekte der Umrechnung zum Zwecke des GHS werden unter Referenz 25 angesprochen. Methoden, die unter Leistungsgesichtspunkten mit der Methode EpiSkin™ (validierte Referenzmethode 1) vergleichbar sind, werden als vollwertige Ersatztests für den in-vivo-Test am Kaninchen zwecks Einstufung von Substanzen mit Hautreizungspotenzial in Kategorie 2 des GHS-Systems empfohlen. Methoden, die unter Leistungsgesichtspunkten mit der Methode EpiDerm™ (validierte Referenzmethode 2) vergleichbar sind, werden lediglich für Reihenuntersuchungen (Screening) oder im Rahmen einer sequenziellen Teststrategie mit evidenzbasiertem Bewertungsansatz zur Einstufung von Substanzen mit Hautreizungspotenzial in Kategorie 2 des GHS-Systems empfohlen. Bevor ein vorgeschlagener Hautreizungstest an Modellen von in vitro rekonstruierter menschlicher Epidermis für regulatorische Zwecke verwendet werden kann, sollten nach den in der vorliegenden Prüfmethode vorgegebenen Leistungsnormen (siehe Anhang) Verlässlichkeit, Relevanz (Genauigkeit) und Grenzen des Tests für den vorgeschlagenen Verwendungszweck bestimmt werden, um sicherzustellen, dass er mit der validierten Referenzmethode 1 vergleichbar ist. Zwei andere Methoden für Tests an in vitro rekonstruierter menschlicher Epidermis — der modifizierte EpiDerm™-Test (modifizierte Referenzmethode 2) und der SkinEthic RHE™-Test (Me-Too-Methode 1) — wurden entsprechend den Anforderungen für die vorliegende Prüfmethode validiert und erbringen ähnliche Ergebnisse wie die validierte Referenzmethode 1 (18). 1.2. DEFINITIONEN Für die vorliegende Prüfmethode gelten die folgenden Definitionen: Genauigkeit: Der Grad an Übereinstimmung zwischen Testergebnissen und akzeptierten Referenzwerten. Die Genauigkeit ist ein Maß der Leistung der Prüfmethode und ein Aspekt der Relevanz. Der Begriff wird oft im Sinne von „Übereinstimmung“ verwendet und bezeichnet den Anteil der korrekten Ergebnisse einer Prüfmethode. Chargenkontrollsubstanz: Die beim Gewebe eine mittlere Zellviabilität hervorrufende Referenzsubstanz. Zellviabilität: Parameter zur Messung der Gesamtaktivität einer Zellpopulation, z. B. Fähigkeit zellulärer mitochondrialer Dehydrogenasen, den Vitalfarbstoff MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid, Thiazolyl-Blau) zu reduzieren, der je nach gemessenem Endpunkt und angewandtem Testkonzept der Gesamtzahl und/oder der Vitalität lebender Zellen entspricht. ET50 : Die Expositionszeit, die erforderlich ist, um die Zellviabilität bei Anwendung der Markersubstanz in vorgegebener fester Konzentration um 50 % zu reduzieren; siehe auch IC50. Falsch-negativ-Rate: Der Anteil aller positiven Substanzen, die von einer Prüfmethode fälschlicherweise als negativ identifiziert werden. Die Falsch-negativ-Rate ist ein Leistungsindikator der Prüfmethode. Falsch-positiv-Rate: Der Anteil aller negativen (nicht wirkenden) Substanzen, die fälschlicherweise als positiv identifiziert werden. Die Falsch-positiv-Rate ist ein Leistungsindikator der Prüfmethode. Unendliche Dosis: Die Menge der auf die Haut aufgetragenen Prüfsubstanz, die über die zur vollständigen und gleichmäßigen Bedeckung der Hautoberfläche erforderliche Menge hinausgeht. GHS (Globales Harmonisiertes System zur Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien): Ein System zur Klassifizierung von Substanzen und Gemischen nach standardisierten Typen und Stufen physikalischer, gesundheitlicher und ökologischer Gefahren und zur entsprechenden Kennzeichnung durch Piktogramme, Signalwörter, Gefahrenhinweise, Sicherheitshinweise und Sicherheitsdatenbögen, um zum Schutz des Menschen (einschließlich Arbeitgeber, Arbeiter, Spediteure, Verbraucher und Notfall-Einsatzkräfte) und der Umwelt Informationen über die schädlichen Wirkungen der betreffenden Chemikalien zu verbreiten (1); in der EU umgesetzt durch die Verordnung (EG) Nr. 1272/2008. IC50 : Die Konzentration, bei der eine Markersubstanz die Viabilität der Gewebe nach einer vorgegebenen Expositionszeit um 50 % (IC50) reduziert; siehe auch ET50. Leistungsnormen: Auf einer validierten Referenzmethode beruhende Normen, auf deren Grundlage die Vergleichbarkeit einer vorgeschlagenen, mechanistisch und funktionell ähnlichen Prüfmethode bewertet werden kann. Sie umfassen i) wesentliche Elemente der Prüfmethode; ii) ein Mindestverzeichnis von Referenzsubstanzen, ausgewählt aus den Substanzen, die zum Nachweis der akzeptablen Leistung der validierten Referenzmethode verwendet werden; und iii) je nach den für die validierte Referenzmethode erzielten Ergebnissen die vergleichbaren Genauigkeits- und Zuverlässigkeitswerte, die die vorgeschlagene Prüfmethode bei der Bewertung anhand des Mindestverzeichnisses von Referenzsubstanzen demonstrieren sollte. Zuverlässigkeit: Maß der Verlässlichkeit der Reproduzierbarkeit einer Prüfmethode innerhalb von und zwischen Laboratorien in einem bestimmten Zeitintervall bei einheitlichem Protokoll. Die Zuverlässigkeit wird durch Berechnung der Intra- und Interlabor-Reproduzierbarkeit bewertet. Empfindlichkeit: Der Anteil aller positiven/wirkenden Stoffe, die durch den Test korrekt eingestuft werden. Die Empfindlichkeit ist ein Maß der Genauigkeit einer Prüfmethode mit kategorialen Ergebnissen und ein wichtiger Aspekt bei der Bewertung ihrer Relevanz. Spezifität: Der Anteil aller negativen/wirkungslosen Stoffe, die durch den Test korrekt eingestuft werden. Die Spezifität ist ein Maß der Genauigkeit einer Prüfmethode mit kategorialen Ergebnissen und ein wichtiger Aspekt bei der Bewertung ihrer Relevanz. Hautreizung: Das Auslösen einer reversiblen Hautschädigung nach Applikation einer Prüfsubstanz für die Dauer von bis zu 4 Stunden. Eine Hautreizung ist eine lokal auftretende, nicht immunogene Reaktion, die kurz nach der Stimulation eintritt (24). Ihr Hauptmerkmal ist ihr umkehrbarer Prozess, der mit Entzündungsreaktionen und den bei Entzündungen gängigsten klinischen Reizsymptomen (Erythema, Ödeme, Juckreiz und Schmerzen) einhergeht. 1.3. ANWENDUNGSBEREICH UND GRENZEN Die unter diese Prüfmethode fallenden Tests an rekonstruierter menschlicher Epidermis sind dadurch begrenzt, dass Stoffe nur als Hautreizstoffe im Sinne von Kategorie 2 des UN-GHS-Systems eingestuft werden können. Da keine Einstufung in die wahlfreie Kategorie 3 des UN-GHS-Systems möglich ist, bleiben alle restlichen Stoffe unklassifiziert (d. h. ohne Kategorieneinstufung). Je nach Regelungsbedarf und bei etwaiger künftiger Einbeziehung neuer Endpunkte, bei Verbesserungen oder bei Entwicklung neuer „Me-Too“-Tests muss die vorliegende Prüfmethode möglicherweise überprüft werden. Die vorliegende Prüfmethode gestattet die Gefahrenidentifizierung bei reizenden Monosubstanzen (19), liefert jedoch keine zweckdienlichen Informationen zur Hautverätzung. Gase und Aerosole können nicht getestet werden, und Gemische waren bisher noch nicht Gegenstand einer Validierungsstudie. 1.4. TESTPRINZIP Die Prüfsubstanz wird topisch aufgetragen auf ein dreidimensionales Modell rekonstituierter menschlicher Epidermis, bestehend aus normalen menschlichen epidermalen Keratinozyten, die zu einem mehrschichtigen, stark differenzierten Modell menschlicher Epidermis kultiviert wurden. Letztere besteht aus angeordneten Basal-, Stachel- und Körnerzellschichten und einer mehrlagigen Hornschicht (stratum corneum), die zwischen den Zellen lamellare Fettschichten aufweist, welche nach in-vivo-ähnlichen Mustern angeordnet sind. Das Prinzip der Testung an Modellen rekonstruierter menschlicher Epidermis beruht auf der Prämisse, dass Reizsubstanzen die Hornschicht diffusionsbedingt durchdringen können und die Zellen in den darunterliegenden Schichten schädigen. Die Zellviabilität wird durch Dehydrogenase-Konversion des Vitalfarbstoffs MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid, Thiazolyl-Blau; EINECS-Nr. 206-069-5, CAS-Nr. 298-93-1)], zu einem blauen Formazan-Salz gemessen, das nach seiner Extaktion aus Geweben quantifiziert wird (20). Reizstoffe werden anhand ihrer Fähigkeit erkannt, die Zellviabilität unter vorgegebene Schwellenwerte zu senken (d. h. ≤ 50 % bei Reizstoffen der UN-GHS-Kategorie 2). Stoffe, die Zellviabilitäten über dem vorgegebenen Schwellenwert generieren, werden nicht klassifiziert (d. h. bei > 50 % keine Kategorieneinstufung). Modelle rekonstruierter menschlicher Epidermis eignen sich zur Untersuchung von Feststoffen, Flüssigkeiten, halbfesten Stoffe und Wachsen. Flüssigkeiten können wässrig oder nichtwässrig, Feststoffe wasserlöslich oder nicht wasserlöslich sein. Feststoffe sollten nach Möglichkeit als Feinpulver getestet werden. Da 58 sorgfältig ausgesuchte Substanzen, die ein breites Spektrum chemischer Klassen repräsentieren, in die Validierung der Tests an Modellen rekonstruierter menschlicher Epidermis einbezogen wurden, wird davon ausgegangen, dass die Methoden allgemeingültig, d. h. für alle chemischen Klassen geeignet sind (16). Die Validierung betrifft 13 Reizsubstanzen der Kategorie 2 des GHS-Systems. Es wird darauf hingewiesen, dass nicht verätzende Säuren, Laugen, Salze und andere anorganische Stoffe nicht validiert wurden und dass einige bekannte Klassen organischer Reizsubstanzen wie Hydroperoxide, Phenole und Tenside nicht oder nur begrenzt inbegriffen waren. 1.5. LEISTUNGSNACHWEIS Bevor eine validierte Methode, die den Anforderungen der vorliegenden Prüfmethode genügt, routinemäßig angewandt werden kann, sollten Laboratorien anhand von zehn der in Tabelle 1 aufgeführten Substanzen die technische Leistungsfähigkeit der Methode demonstrieren. Im Rahmen der vorliegenden Prüfmethode gilt die wahlfreie Kategorie 3 des UN-GHS-Systems nicht als Kategorie. Für im Rahmen der Prüfmethode entwickelte neuartige analoge Prüfmethoden („Me-Too“-Tests), die den validierten Referenzmethoden strukturell und funktionell vergleichbar sind, oder für Änderungen validierter Methoden sollten zum Nachweis der Vergleichbarkeit der Zuverlässigkeit und Genauigkeit der neuen Prüfmethode, bevor diese für Regulierungszwecke eingesetzt wird, die im Anhang zur vorliegenden Prüfmethode beschriebenen Leistungsnormen zugrunde gelegt werden. Tabelle 1 Leistungssubstanzen als Untergruppe der im Anhang aufgelisteten Referenzsubstanzen Substanz CAS-Nummer In-vivo-Punktzahl Physikalischer Zustand GHS-Kategorie Naphthalen-Essigsäure 86-87-3 0 fest keine Kat. Isopropanol 67-63-0 0,3 flüssig keine Kat. Methylstearat 112-61-8 1 fest keine Kat. Heptyl-Butyrat 5870-93-9 1,7 flüssig wahlfrei Kat. 3 Hexyl-Salicylat 6259-76-3 2 flüssig wahlfrei Kat. 3 Cyclamenaldehyd 103-95-7 2,3 flüssig Kat. 2 1-Bromohexan 111-25-1 2,7 flüssig Kat. 2 Butylmethacrylat 97-88-1 3 flüssig Kat. 2 1-Methyl-3-Phenyl-1-Piperazin 5271-27-2 3,3 fest Kat. 2 Heptanal 111-71-7 4 flüssig Kat. 2 1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE Es folgt eine Beschreibung der Elemente und Verfahrensschritte eines Hautreizungstests an Modellen rekonstruierter menschlicher Epidermis. Modelle rekonstruierter menschlicher Epidermis können kultiviert, präpariert oder im Handel erworben werden (z. B. EpiSkin™, EpiDerm™ und SkinEthic RHE™). Standard-Testprotokolle für EpiSkin™, EpiDerm™ und SkinEthic RHE™ sind über http://ecvam.jrc.ec.europa.eu erhältlich (21, 22, 23). Die Testungen sollten wie folgt durchgeführt werden: 1.6.1. Elemente des Modells rekonstruierter menschlicher Epidermis 1.6.1.1. Allgemeine Modellbedingungen Die Epithelschicht sollte aus normalen menschlichen Keratinozyten gebildet werden. Unter der funktionsfähigen Hornschicht (stratum corneum) sollten mehrere Lagen lebensfähiger Epithelzellen (Basalzellschicht, Stachelzellschicht, Körnerzellschicht) vorhanden sein. Die Hornschicht sollte mehrlagig sein und das zur Erzeugung einer funktionsfähigen Barriere, die robust genug ist, um das schnelle Eindringen zytotoxischer Markersubstanzen wie Natriumdodecylsulfat (SDS) oder Triton X-100 zu verhindern, essenzielle Lipidprofil aufweisen. Die Barrierefunktion kann entweder durch Bestimmung der Konzentration, in der eine Markersubstanz die Viabilität der Gewebe nach einer vorgegebenen Expositionsdauer um 50 % verringert (IC50), oder durch Bestimmung der Expositionszeit bewertet werden, die erforderlich ist, um die Zellviabilität bei Anwendung der Markersubstanz in einer vorgegebenen festen Konzentration um 50 % zu reduzieren (ET50). Das Modell muss rückhaltefähig genug sein, um zu verhindern, dass Material rund um die Hornschicht in lebensfähiges Gewebe eindringt, was zu einer mangelhaften Modellierung der Hautexposition führen würde. Das Hautmodell sollte nicht mit Bakterien, Viren, Mycoplasma oder Pilzen kontaminiert sein. 1.6.1.2. Bedingungen für das Funktionsmodell 1.6.1.2.1. Viabilität Die Viabilität wird vorzugsweise anhand des MTT-Tests bestimmt (20). Die optische Dichte (OD) des aus dem mit der Negativkontrolle (NK) behandelten Gewebe extrahierten (solubilisierten) Farbstoffs sollte mindestens dem Zwanzigfachen der OD des Extraktionslösemittels allein entsprechen. Es ist protokollarisch festzuhalten, dass das mit der NK behandelte Gewebe während der Expositionszeit nachweislich in der Kultur stabil ist (d. h. es sollte vergleichbare Viabilitätsmesswerte aufweisen). 1.6.1.2.2. Barrierefunktion Die Hornschicht und ihre Fettzusammensetzung sollten in der Lage sein, das schnelle Eindringen zytotoxischer Markersubstanzen wie SDS oder Triton X-100, wie durch IC50 oder ET50 bestimmt, zu verhindern. 1.6.1.2.3. Morphologie Die histologische Untersuchung der rekonstruierten Haut/Epidermis sollte durch entsprechend qualifiziertes Personal erfolgen, das nachweisen muss, dass das Modell eine der menschlichen Haut/Epidermis ähnliche Struktur (einschließlich mehrlagiger Hornschicht) aufweist. 1.6.1.2.4. Reproduzierbarkeit Die Methode sollte unter gleichen Modellbedingungen, vorzugsweise anhand einer geeigneten Chargenkontroll-(Referenz-)substanz (siehe Anhang), im Zeitverlauf nachweislich reproduzierbar sein. 1.6.1.2.5. Qualitätskontrollen (QK) des Modells Jede Charge des verwendeten Epidermis-Modells sollte bestimmten Freigabekriterien genügen, von denen die Viabilitätskriterien (Absatz 1.6.1.2.1) und die Kriterien für die Barrierefunktion (Absatz 1.6.1.2.2) die wichtigsten sind. Der Hersteller des Hautmodells (oder — bei Verwendung eines hauseigenen Modells — der Prüfer) sollte eine Akzeptanzspanne (oberer und unterer Grenzwert) für IC50 oder ET50 festlegen. Das Labor sollte die Barriereeigenschaften der Gewebe nach deren Bezug überprüfen. Nur mit geeigneten Geweben erzielte Ergebnisse kommen für eine zuverlässige Vorhersage von Reizwirkungen in Frage. Beispiele für Akzeptanzspannen für die validierten Referenzmethoden: Tabelle 2 Beispiele für Chargenfreigabekriterien im Rahmen der Qualitätskontrolle Untere Akzeptanzgrenze Mittelwert Obere Akzeptanzgrenze Validierte Referenzmethode 1 (18-stündige Behandlung mit SDS) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Validierte Referenzmethode 2 (1 % Triton X-100) ET50 = 4,8 Std. ET50 = 6,7 Std. ET50 = 8,7 Std. 1.6.1.3. Applikation der Prüf- und Kontrollsubstanzen Bei jeder Behandlung und für die Kontrollen sollte eine ausreichende Anzahl Gewebereplikate (mindestens drei je Test) verwendet werden. Bei flüssigen und festen Substanzen sollte eine ausreichende Menge Prüfsubstanz gleichmäßig auf die gesamte Hautoberfläche aufgetragen werden; unendliche Dosen (siehe 1.2 — Definitionen) sind zu vermeiden, d. h. es sollten mindestens 25 μL/cm2 bzw. 25 mg/cm2 verwendet werden. Bei festen Stoffen sollte die Epidermis-Oberfläche vor der Applikation mit deionisiertem oder destilliertem Wasser angefeuchtet werden, um guten Hautkontakt zu gewährleisten. Feststoffe sollten nach Möglichkeit als Feinpulver getestet werden. Am Ende der Expositionszeit sollte die Prüfsubstanz mit wässriger Pufferlösung oder 0,9 % NaCl von der Haut abgewaschen werden. Je nachdem, welches Modell rekonstruierter menschlicher Epidermis verwendet wurde, kann die Expositionszeit 15 bis 60 Minuten betragen und die Inkubationstemperatur zwischen 20 und 37 °C liegen. Für Einzelheiten siehe Standardvorgehensweise (Standard Operating Procedures) für die drei Methoden (21, 22, 23). Bei jeder Studie sollten parallel Negativkontrollen (NK) und Positivkontrollen (PK) verwendet werden, um nachweisen zu können, dass die Viabilität (NK), die Barrierefunktion und die resultierende Empfindlichkeit (PK) der Gewebe innerhalb einer vorgegebenen historischen Akzeptanzspanne liegen. Als PK-Substanz wird 5 % wässrige SDS empfohlen. Als NK-Substanzen empfehlen sich Wasser oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). 1.6.1.4. Zellviabilitätsmessungen Wichtigstes Element des Testprotokolls ist es, dass Viabilitätsmessungen nicht unmittelbar nach dem Kontakt mit den Prüfsubstanzen, sondern nach einer ausreichend langen Inkubationszeit der abgespülten Gewebe (nach der Behandlung) in frischem Medium erfolgen. Während dieser Zeit kann sich das Gewebe von milden Reizwirkungen erholen bzw. deutliche zytotoxische Effekte können sich herausbilden. Während der Phase der Testoptimierung (9, 10, 11, 12, 13) hat sich eine Inkubationszeit von 42 Stunden nach der Behandlung als optimal erwiesen und wurde daher bei der Validierung der Referenztestmethoden zugrunde gelegt. Der MTT-Konversionstest ist eine validierte quantitative Methode, die zur Messung der zellulären Aktivität angewandt werden sollte. Sie ist zur Anwendung in einem dreidimensionalen Gewebemodell geeignet. Die Hautprobe wird für drei Stunden in eine MTT-Lösung angemessener Konzentration (z. B. 0,3-1 mg/mL) gegeben. Das präzipitierte blaue Formazan-Produkt wird anschließend mit Hilfe eines Lösemittels (z. B. Isopropanol, Säure-Isopropanol) aus dem Gewebe extrahiert, und die Formazan-Konzentration wird durch Bestimmung der OD bei 570 nm mittels eines Bandpasses von maximal ±30 nm gemessen. Optische Eigenschaften der Prüfsubstanz oder ihre chemische Wirkung auf den MTT können mit dem Test interferieren und (weil die Prüfsubstanz die Farbbildung sowohl verhindern oder umkehren als auch hervorrufen kann) zu einer falschen Viabilitätsschätzung führen. Dies kann der Fall sein, wenn eine bestimmte Prüfsubstanz nicht komplett von der Haut abgewaschen wurde oder wenn sie in die Epidermis eindringt. Wirkt sich die Prüfsubstanz unmittelbar auf den MTT aus, ist sie natürlich gefärbt oder verfärbt sie sich während der Gewebebehandlung, so sollten zum Nachweis und zur Behebung einer etwaigen Interferenz der Prüfsubstanz mit der Viabilitätsmesstechnik zusätzliche Kontrollen verwendet werden. Für eine genaue Beschreibung des Tests der direkten MTT-Reduktion siehe das Testprotokoll für die validierten Referenzmethoden (21, 22, 23). Eine infolge dieser Interferenzen eintretende unspezifische Färbung (non specific colour, NSC) sollte 30 % der NK (bei Behebung) nicht überschreiten. Beträgt die NSC > 30 %, so gilt die Prüfsubstanz als nicht mit dem Test vereinbar. 1.6.1.5. Testakzeptanzkriterien Bei jedem Test an gültigen Chargen (siehe Absatz 1.6.1.2.5) sollten mit der Negativkontrolle behandelte Gewebe OD-Werte aufweisen, die für die Gewebequalität nach abgeschlossenen Beförderungs- und Annahmevorgängen und sämtlichen Schritten des Reizungsprotokolls aussagekräftig sind. Die OD-Werte der Kontrollen sollten nicht unter historisch etablierten niedrigeren Grenzwerten liegen. Gleichermaßen sollten mit der Positivkontrolle, d. h. 5 % wässrige SDS, behandelte Gewebe die verbleibende Empfindlichkeit der Gewebe und ihre Fähigkeit reflektieren, unter den Bedingungen jedes einzelnen Tests (z. B. Viabilität ≤ 40 % bei der validierten Referenzmethode 1 und ≤ 20 % bei der validierten Referenzmethode 2) auf eine Reizsubstanz zu reagieren. Es sollten entsprechende und geeignete Maße der Variabilität zwischen Gewebereplikaten festgelegt werden (Beispiel: soweit Standardabweichungen verwendet werden, sollten sie ≤ 18 % betragen). 2. DATEN 2.1. DATEN Für jede Behandlung sollten Daten aus einzelnen Replikattestproben (z. B. OD-Werte und Daten über die berechnete prozentuale Zellviabilität für jede Prüfsubstanz, einschließlich Einstufung), gegebenenfalls auch Daten aus Wiederholungsversuchen, tabellarisch mitgeteilt werden. Darüber hinaus sollten für jeden Versuch der Mittelwert ± Standardabweichung und für jede geprüfte Substanz festgestellte Interaktionen mit dem MTT-Reagens und Testfarbstoffen übermittelt werden. 2.2. AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE Die für die einzelnen Testproben erzielten OD-Werte können zur Berechnung der prozentualen Viabilität im Vergleich zur Negativkontrolle, die auf 100 % festgesetzt ist, herangezogen werden. Der Schwellenwert der prozentualen Viabilität, der zwischen Reizstoff und nicht klassifizierten Prüfsubstanzen unterscheidet, und das (die) statistische(n) Verfahren zur Auswertung der Ergebnisse und zur Identifizierung von Reizstoffen sollten genau definiert und protokolliert werden und nachweislich geeignet sein. Die Schwellenwerte für die Vorhersage der Reizung im Rahmen der validierten Referenzmethoden sind nachstehend angegeben: Die Prüfsubstanz gilt als hautreizend im Sinne von Kategorie 2 des UN-GHS-Systems, i) wenn die Gewebeviabilität nach der Exposition und der Inkubation nach der Behandlung weniger als oder gleich (≤) 50 % beträgt. Die Prüfsubstanz fällt in keine Kategorie, ii) wenn die Gewebeviabilität nach der Exposition und der Inkubation nach der Behandlung mehr als (>) 50 % beträgt. 3. BERICHTERSTATTUNG 3.1. TESTBERICHT Der Testbericht sollte folgende Informationen enthalten: Prüf- und Kontrollsubstanzen: — chemische Bezeichnung(en) wie IUPAC oder CAS-Bezeichnung und CAS-Nummer, soweit bekannt; — Reinheit und Zusammensetzung der Substanz (in Gewichtsprozent); — physikalisch-chemische Eigenschaften (z. B. physikalischer Zustand, Stabilität und Flüchtigkeit, pH-Wert, Wasserlöslichkeit, soweit bekannt), die für die Durchführung der Studie relevant sind; — Behandlung der Prüf-/Kontrollsubstanzen vor dem Test, sofern relevant (z. B. Erwärmen, Mahlen); — Lagerbedingungen. Gründe für die Verwendung des betreffenden Hautmodells und Protokolls. Testbedingungen: — verwendetes Zellsystem; — Eichdaten für das Messgerät und den Bandpass zur Messung der Zellviabilität (z. B. Spektrofotometer); — umfassende Begleitdokumentation für das betreffende Hautmodell, einschließlich seiner Leistung; die Dokumentation sollte folgende Angaben umfassen, aber nicht darauf begrenzt sein: i) Viabilität, ii) Barrierefunktion, iii) Morphologie, iv) Reproduzierbarkeit und Prädiktivität, v) Qualitätskontrollen (QK) des Modells; — Angaben zum Testprotokoll; — verwendete Testdosen, Dauer der Exposition und der Inkubationszeit nach der Behandlung; — Beschreibung etwaiger Änderungen des Testprotokolls; — Verweis auf historische Modelldaten; diese Information sollten folgende Angaben umfassen, aber nicht darauf begrenzt sein: i) Akzeptanz der QK-Daten mit Verweis auf historische Chargendaten; ii) Akzeptanz der Positiv- und Negativkontrollwerte mit Verweis auf die Mittelwerte und Spannbreiten der Positiv- und Negativkontrollen. — Beschreibung der angewandten Auswertungskriterien, einschließlich Gründe für die Wahl des (der) Schwellenwerte(s) für das Vorhersagemodell. Ergebnisse: — tabellarische Darstellung der Daten aus Einzelproben; — Beschreibung sonstiger beobachteter Wirkungen. Diskussion der Ergebnisse. Schlussfolgerungen. 4. REFERENZEN 1. United Nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), zweite überarbeitete Ausgabe, UN New York und Genf, 2007. Abrufbar über: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html. 2. REACH: Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment. Abrufbar über: http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/information_requirements_en.htm?time=1232447649. 3. Testmethode B.4. AKUTE TOXIZITÄT; HAUTREIZUNG/-VERÄTZUNG. 4. Testmethode B.40. IN VITRO-PRÜFUNG AUF HAUTVERÄTZENDE WIRKUNG: TER-TEST (TRANSCUTANEOUS ELECTRICAL RESISTANCE TEST). 5. Testmethode B.40 BIS. IN VITRO-PRÜFUNG AUF HAUTVERÄTZENDE WIRKUNG: TEST MIT MENSCHLICHEM HAUTMODELL. 6. OECD (2006). Prüfrichtlinie 435. OECD-Guideline for the Testing of Chemicals. In Vitro Membrane Barrier Test Method. Angenommen am 19. Juli 2006. Abrufbar über: http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html. 7. ECVAM (2009) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Abrufbar über Download Study Documents: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 8. Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J.M. & Botham, P. (2001). A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 15, S. 57-93. 9. Portes, P., Grandidier, M.H., Cohen, C. & Roguet, R.(2002). Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study. Toxicology in Vitro 16, S. 765-770. 10. Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. & Spielmann, H. (2004). Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests. ALTEX 21, S. 107-114. 11. Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. & Spielmann H. (2005) The EpiDerm Test Protocol fort the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test. ATLA 33, S. 351-367. 12. Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. & G. Rubinsteen. (2005). The In Vitro Acute Skin Irritation of Chemicals: Optimisation of the EPISKIN Prediction Model within the Framework of the ECVAM Validation Process. ATLA 33, S. 329-249. 13. Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. & Worth, A.(2002). Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. ECVAM Skin Irritation Task Force Report 2. ATLA 30, S. 109-129. 14. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, S. 559-601. 15. Hoffmann, S. (2006). ECVAM Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the Primary Endpoint MTT and the Secondary Endpoint IL1-α. 135 pp. + annexes. Abrufbar Download Study Documents: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 16. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang, V (2007). ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, S. 603-619. 17. J. Cotovio, M.-H. Grandidier, D. Lelièvre, R. Roguet, E. Tinois-Tessonneaud, J. Leclaire (2007). In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy -Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, Special Issue-proceedings from WC6. Vol. 14, S. 351-358. 18. ESAC-Erklärung über aktualisierte EpiDerm- und ähnliche SkinEthic-Tests. 5. November 2008. 19. EG (2006). Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 18. Dezember 2006 zur Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe (REACH), zur Schaffung einer Europäischen Agentur für chemische Stoffe, zur Änderung der Richtlinie 1999/45/EG und zur Aufhebung der Verordnung (EWG) Nr. 793/93 des Rates, der Verordnung (EG) Nr. 1488/94 der Kommission, der Richtlinie 76/769/EWG des Rates sowie der Richtlinien 91/155/EWG, 93/67/EWG, 93/105/EG und 2000/21/EG der Kommission. Amtsblatt der Europäischen Union L 396 vom 30.12.2006, S. 1. 20. Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, S. 55-63. 21. EpiSkin™ SOP, Version 1.6 (January 2005). Validation of the EpiSkin Skin Irritation Test — 42 Hours Assay For The Prediction of Acute Skin Irritation of Chemicals. Abrufbar über Download Study Documents: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 22. EpiDerm™ SOP, Version 5.0 (October 2004). Draft Standard Operating Procedure. In Vitro Skin Irritation Test: Human Skin Model. Model: EpiDerm™- 200. Abrufbar über Download Study Documents: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 23. SkinEthic RHE™ SOP. Demnächst abrufbar über Download Study Documents: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 24. Harvell, J.D., Lamminstausta, K, Maibach H.I. (1995) Irritant contact dermatitis IN: Guin J.D. Practical Contact Dermatitis Mc Graw-Hill New York, S. 7-18. 25. Griesinger C, Barroso J & Zuang V: ECVAM background document on the recent adaptations of the ECVAM performance standards for in vitro skin irritation testing in the context of the drafting process of an EU test method and an OECD draft test guideline. Ispra, 13. November, 2008. Anlage Bewertung der Leistungsmerkmale der für Hautreizungstests vorgeschlagenen Modelle in vitro-rekonstruierter menschlicher Epidermis EINLEITUNG Zur Bewertung der Zuverlässigkeit und Genauigkeit der für die Anwendung im Rahmen der vorliegenden Prüfmethode vorgeschlagenen Verfahren sollten Substanzen verwendet werden, die das gesamte Reizwertspektrum nach Draize repräsentieren. Bei der Bewertung anhand der 20 empfohlenen Referenzsubstanzen (Tabelle 2) sollten die vorgeschlagenen Verfahren Zuverlässigkeits- und Genauigkeitswerte aufzeigen, die denen der validierten Referenzmethode 1 (Tabelle 3) entsprechen (1). Die angestrebten Zuverlässigkeits- und Genauigkeitsnormen sind in den nachstehenden Abschnitten II und III vorgegeben. Nicht eingestufte Substanzen und (in Kategorie 2 des UN-GHS-Systems) eingestufte Substanzen relevanter chemischer Klassen werden einbezogen, um die Zuverlässigkeit und Leistung (Empfindlichkeit, Spezifität, Falsch-negativ-/Falsch-positiv-Raten und Genauigkeit) der vorgeschlagenen Prüfmethode mit denen der validierten Referenzmethode 1 vergleichen zu können. Die Zuverlässigkeit der Prüfmethode sowie ihre Fähigkeit, Reizstoffe der Kategorie 2 des UN-GHS-Systems korrekt zu identifizieren, sollten bestimmt werden, bevor die Methode zur Testung neuer Substanzen eingesetzt wird. LEISTUNGSNORMEN Die Leistungsnormen umfassen die drei folgenden Elemente: i) wesentliche Elemente der Prüfmethode, ii) Referenzsubstanzen und iii) vorgegebene Genauigkeits- und Zuverlässigkeitswerte (2). Diese Normen beruhen auf den im Anschluss an die ECVAM-Hautreizungsvalidierungsstudie aufgestellten Leistungsnormen (3). I) Wesentliche Elemente der Prüfmethode Allgemeine Modellbedingungen Die Epithelschicht sollte aus normalen menschlichen Keratinozyten gebildet werden. Unter der funktionsfähigen Hornschicht (stratum corneum) sollten mehrere Lagen lebensfähiger Epithelzellen (Basalzellschicht, Stachelzellschicht, Körnerzellenschicht) vorhanden sein. Die Hornschicht sollte mehrlagig sein und das zur Erzeugung einer funktionsfähigen Barriere, die robust genug ist, um das schnelle Eindringen zytotoxischer Markersubstanzen wie Natriumdodecylsulfat (SDS) oder Triton X-100 zu verhindern, essenzielle Lipidprofil aufweisen. Die Barrierefunktion kann entweder durch Bestimmung der Konzentration, in der eine Markersubstanz die Viabilität der Gewebe nach einer vorgegebenen Expositionsdauer um 50 % verringert (IC50), oder durch Bestimmung der Expositionszeit bewertet werden, die erforderlich ist, um die Zellviabilität bei Anwendung der Markersubstanz in einer vorgegebenen festen Konzentration um 50 % zu reduzieren (ET50). Das Modell muss rückhaltefähig genug sein, um zu verhindern, dass Material rund um die Hornschicht in lebensfähiges Gewebe eindringt, was zu einer mangelhaften Modellierung der Hautexposition führen würde. Das Hautmodell sollte nicht mit Bakterien, Viren, Mycoplasma oder Pilzen kontaminiert sein. Bedingungen für das Funktionsmodell Viabilität Die Viabilität wird vorzugsweise anhand des MTT-Tests bestimmt (4). Die optische Dichte (OD) des aus dem mit der Negativkontrolle (NK) behandelten Gewebe extrahierten (solubilisierten) Farbstoffs sollte mindestens dem Zwanzigfachen der OD des Extraktionslösemittels allein entsprechen. Es ist protokollarisch festzuhalten, dass das mit der NK behandelte Gewebe während der Expositionszeit nachweislich in der Kultur stabil ist (d. h. es sollte vergleichbare Viabilitätsmesswerte aufweisen). Barrierefunktion Die Hornschicht und ihre Fettzusammensetzung sollten in der Lage sein, das schnelle Eindringen zytotoxischer Markersubstanzen wie SDS oder Triton X-100, wie durch IC50 oder ET50 bestimmt, zu verhindern. Morphologie Die histologische Untersuchung der rekonstruierten Haut/Epidermis sollte durch entsprechend qualifiziertes Personal erfolgen, das nachweisen muss, dass das Modell eine der menschlichen Haut/Epidermis ähnliche Struktur (einschließlich mehrlagiger Hornschicht) aufweist. Reproduzierbarkeit Die Methode sollte unter gleichen Modellbedingungen, vorzugsweise anhand einer geeigneten Chargenkontroll-(Referenz-)substanz (siehe Definitionen in Abschnitt 1.2), im Zeitverlauf nachweislich reproduzierbar sein. Qualitätskontrollen (QK) des Modells Jede Charge des verwendeten Epidermis-Modells sollte bestimmten Freigabekriterien genügen, von denen die Viabilitätskriterien und die Kriterien für die Barrierefunktion die wichtigsten sind. Der Hersteller des Hautmodells (oder — bei Verwendung eines hauseigenen Modells — der Prüfer) sollte eine Akzeptanzspanne (oberer und unterer Grenzwert) für IC50 oder ET50 festlegen. Das Labor sollte die Barriereeigenschaften der Gewebe nach deren Bezug überprüfen. Nur mit geeigneten Geweben erzielte Ergebnisse kommen für eine zuverlässige Vorhersage von Reizwirkungen in Frage. Beispiele für Akzeptanzspannen für die validierten Referenzmethoden: Tabelle 1 Beispiele für Chargenfreigabekriterien im Rahmen der Qualitätskontrolle Untere Akzeptanzgrenze Mittelwert Obere Akzeptanzgrenze Validierte Referenzmethode 1 (18-stündige Behandlung mit SDS) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Validierte Referenzmethode 2 (1 % Triton X-100) ET50 = 4,8 Std. ET50 = 6,7 Std. ET50 = 8,7 Std. II) Referenzsubstanzen Um festzustellen, ob Genauigkeit und Zuverlässigkeit vorgeschlagener neuartiger Prüfmethoden für Testungen an in vitro rekonstruierten Modellen menschlicher Epidermis, die den validierten Referenzmethoden strukturell und funktionell nachweislich ähneln oder die sich nur unwesentlich von einer validierten Referenzmethode unterscheiden, unter Leistungsgesichtspunkten mit der validierten Referenzmethode 1 vergleichbar sind, werden Referenzsubstanzen verwendet (1). Die in Tabelle 2 aufgelisteten 20 Referenzsubstanzen umfassen Substanzen unterschiedlicher chemischer Klassen sowie Substanzen der Kategorie 2 des UN-GHS-Systems. Die Liste umfasst 10 Substanzen der Kategorie 2 des UN-GHS-Systems, 3 Substanzen der Kategorie 3 des UN-GHS-Systems sowie 7 nicht eingestufte Substanzen. Im Rahmen dieser Prüfmethode gilt die wahlfreie Kategorie 3 nicht als Kategorie. Diese Referenzsubstanzen entsprechen der Mindestanzahl Substanzen, die zur Beurteilung der Genauigkeit und Zuverlässigkeit einer vorgeschlagenen Methode für Hautreizungstests an Modellen rekonstruierter menschlicher Epidermis verwendet werden sollten. In Fällen, in denen eine in der Liste geführte Substanz nicht verfügbar ist, könnten andere Substanzen, für die angemessene in-vivo-Referenzdaten vorliegen, verwendet werden. Falls erwünscht, kann die Mindestliste der Referenzsubstanzen um zusätzliche Substanzen anderer chemischer Klassen, für die angemessene in-vivo-Referenzdaten vorliegen, ergänzt werden, um die Genauigkeit der vorgeschlagenen Prüfmethode noch genauer beurteilen zu können. Tabelle 2 Referenzsubstanzen zur Bestimmung der Genauigkeits- und Zuverlässigkeitswerte für Modelle rekonstruierter menschlicher Epidermis Substanz (1) CAS-Nr. EINECS-Nr. Physikalischer Zustand In-vivo-Punktezahl GHS-in-vitro-Kat. GHS-in-vivo-Kat. 1-Bromo-4-Chlorobutan 6940-78-9 230-089-3 L 0 Kat. 2 keine Kat. Diethyl-Phthalat 84-66-2 201-550-6 L 0 keine Kat. keine Kat. Naphthalin-Essigsäure 86-87-3 201-705-8 S 0 Keine Kat. keine Kat. Allyl-Phenoxyacetat 7493-74-5 231-335-2 L 0,3 keine Kat. keine Kat. Isopropanol 67-63-0 200-661-7 L 0,3 keine Kat. keine Kat. 4-Methyl-Thio-Benzaldehyd 3446-89-7 222-365-7 L 1 Kat. 2 keine Kat. Methylstearat 112-61-8 203-990-4 S 1 keine Kat. keine Kat. Hepty-Butyrat 5870-93-9 227-526-5 L 1,7 keine Kat. wahlfrei Kat. 3 Hexyl-Salicylat 6259-76-3 228-408-6 L 2 keine Kat. wahlfrei Kat. 3 Tri-Isobutylphosphat 126-71-6 204-798-3 L 2 Kat. 2 wahlfrei Kat. 3 1-Decanol 112-30-1 203-956-9 L 2,3 Kat. 2 Kat. 2 Cyclamenaldehyd 103-95-7 203-161-7 L 2,3 Kat. 2 Kat. 2 1-Bromhexan 111-25-1 203-850-2 L 2,7 Kat. 2 Kat. 2 2-Chloromethyl-3,5-Dimethyl-4-Methoxypyridin-Hydrochlorid 86604-75-3 434-680-9 S 2,7 Kat. 2 Kat. 2 a-Terpineol 98-55-5 202-680-6 L 2,7 Kat. 2 Kat. 2 Di-n-Propyldisulfid 629-19-6 211-079-8 L 3 keine Kat. Kat. 2 Butylmethacrylat 97-88-1 202-615-1 L 3 Kat. 2 Kat. 2 Benzenethiol, 5-(1,1-Dimethylethyl)-2-Methyl 7340-90-1 438-520-9 L 3,3 Kat. 2 Kat. 2 1-Methyl-3-Phenyl-1-Piperazin 5271-27-2 431-180-2 S 3,3 Kat. 2 Kat. 2 Heptanal 111-71-7 203-898-4 L 4 Kat. 2 Kat. 2 Die in Tabelle 2 aufgelisteten Substanzen entsprechen einer repräsentativen Auswahl aus 58 Substanzen, die in der internationalen ECVAM-Hautreizungsvalidierungsstudie (1) verwendet werden. Die Wahl erfolgte nach folgenden Kriterien: — Die Substanzen sind im Handel erhältlich; — sie sind repräsentativ für das gesamte Spektrum der Draize-Reizungswerte (die von nicht reizend bis stark reizend reichen); — sie haben eine gut definierte chemische Struktur; — sie sind repräsentativ für die Reproduzierbarkeit und Vorhersagefähigkeit der validierten Methode, wie in der ECVAM-Validierungsstudie ermittelt; — sie sind repräsentativ für die im Validierungsprozess verwendete chemische Funktionalität; — sie sind weder mit einem extremen toxischen Profil (z. B. karzinogen oder toxisch für das Fortpflanzungssystem) noch mit untragbaren Entsorgungskosten verbunden. III) Vorgegebene Genauigkeits- und Zuverlässigkeitswerte Die Leistung (Empfindlichkeit, Spezifität, Falsch-negativ-Rate, Falsch-positiv-Rate und Genauigkeit) der vorgeschlagenen Prüfmethode sollten denen der validierten Referenzmethode 1 (Tabelle 3) vergleichbar sein, d. h. die Empfindlichkeit sollte gleich oder höher als (≥) 80 %, die Spezifität gleich oder höher als (≥) 70 % und die Genauigkeit gleich oder höher als (≥) 75 % sein. Die Leistung sollte anhand sämtlicher Klassifizierungen, die in den verschiedenen Teilnehmerlaboratorien für die 20 Substanzen erzielt wurden, berechnet werden. Die Klassifizierung der verschiedenen Substanzen in den einzelnen Laboratorien sollte auf Basis des durchschnittlichen Viabilitätswertes bei den verschiedenen Tests (mindestens drei gültige Tests) erfolgen. Tabelle 3 Leistung der validierten Referenzmethode 1 (2) Prüfmethode Anzahl Substanzen Empfindlichkeit Spezifität Falsch- negativ-Rate Falsch- positiv-Rate Genauigkeit Validierte Referenzmethode 1 (3) 58 87,2 % (4) 71,1 % (5) 12,8 % 29,9 % 74,7 % validierte Referenzmethode 1 (3) 20 90 % 73,3 % 10 % 26,7 % 81,7 % Die Zuverlässigkeit der vorgeschlagenen Prüfmethode sollte mit der Zuverlässigkeit der validierten Referenzmethoden vergleichbar sein. Intra-Labor-Reproduzierbarkeit Eine Bewertung der Intra-Labor-Variabilität sollte eine Übereinstimmung der von einem einzigen Labor bei verschiedenen unabhängigen Tests der 20 Referenzsubstanzen erzielten Klassifizierungen (Kategorie 2/keine Kategorie) von ≥ 90 % ergeben. Inter-Labor-Reproduzierbarkeit Eine Bewertung der Inter-Labor-Reproduzierbarkeit ist nicht wesentlich, wenn die vorgeschlagene Prüfmethode nur in einem Labor angewandt werden soll. Beim Methodentransfer zwischen Laboratorien sollte die Übereinstimmung der bei verschiedenen unabhängigen Tests der 20 Referenzsubstanzen, die vorzugsweise zwischen mindestens drei Laboratorien durchgeführt werden, erzielten Klassifizierungen (Kategorie 2/keine Kategorie) ≥ 80 % betragen. LITERATUR 1. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, S. 559-601. 2. OECD (2005) Guidance Document No. 34 on the validation and international acceptance of new or updated test methods for hazard assessment. OECD, Paris. 3. ECVAM (2007) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Abrufbar unter Download Study Documents: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. Letzter Zugriff am 27.10.2008. 4. Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, S. 55-63. 5. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang. V (2007) ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, S. 603-619. (1) Die 20 Referenzsubstanzen umfassen eine repräsentative Auswahl aus den 58 Substanzen, die ursprünglich zur Validierung der Referenzmethode 1 (EpiSkin™) verwendet wurden. Eine vollständige Liste der Prüfsubstanzen und der Auswahlkriterien liegt vor (5). (2) Tabelle 3 zeigt die Leistung der validierten Referenzmethode 1 in Bezug auf ihre Fähigkeit, für die 58 bzw. 20 Referenzsubstanzen (Tabelle 2) Reizsubstanzen (der Kategorie 2 des UN-GHS-Systems) und nicht klassifizierte Substanzen (keine Kategorie, einschließlich der wahlfreien Kategorie 3) korrekt zu identifizieren. (3) EpiSkin™. (4) Auf Basis von 13 Reizsubstanzen der Kategorie 2 des GHS-Systems. (5) Auf Basis von 45 Reizsubstanzen der Kategorie 3 des GHS-Systems oder nicht GHS-eingestufte Substanzen.

ANHANG IV C.3. SÜSSWASSERALGEN UND CYANOBAKTERIEN: WACHSTUMSINHIBITIONSTEST 1. METHODE Diese Methode entspricht der Prüfrichtlinie OECD TG 201 (2006) (1). 1.1. EINLEITUNG Die Prüfmethoden werden regelmäßig unter Berücksichtigung des wissenschaftlichen Fortschritts überarbeitet und aktualisiert. Prüfmethode C.3 musste unter Einbeziehung weiterer Arten und unter Berücksichtigung der Anforderungen an die Risikobewertung und Klassifizierung chemischer Stoffe überarbeitet werden. Die Überarbeitung wurde auf der Grundlage umfassender praktischer Erfahrungen sowie des wissenschaftlichen Fortschritts im Zusammenhang mit Untersuchungen zur Algentoxizität und der weit reichenden Anwendung entspr