2.

Kapitel II Teil D Nummer 3 erhält folgende Fassung: „3. Verfahren I. Vollständige Ansätze (gleichzeitige Untersuchung von Proben mit einem Gesamtgewicht von 100 g) a) 16 ± 0,5 ml 25 %ige Salzsäure (0,2 % Endkonzentration) wird in einen 3-l-Behälter mit 2,0 l ± 200 ml Leitungswasser gegeben, auf 46 bis 48 °C vorerhitzt; ein Rührstab wird im Behälter platziert, der Behälter wird auf die vorgeheizte Platte gestellt und der Rührvorgang gestartet. b) 10 ± 1 g Pepsinpulver (oder 30 ± 3 ml flüssiges Pepsin) werden hinzugefügt. c) 100-115 g Proben, die gemäß Nummer 2 zusammengestellt wurden, werden im Mixer mit 150 ml ± 15 ml vorerhitztem Verdauungspuffer zerkleinert. d) Das zerkleinerte Fleisch wird in einen 3-l-Behälter gegeben, der Wasser, Pepsin und Salzsäure enthält. e) Das Schneidewerk des Mixers wird mehrfach in die Verdauungsflüssigkeit des Behälters eingetaucht, und die Mixerschüssel wird mit einer kleinen Menge der Verdauungsflüssigkeit ausgespült, um noch anhängendes Fleisch zu entfernen. f) Der Behälter wird mit Aluminiumfolie abgedeckt. g) Der Magnetrührer ist so einzustellen, dass er während des gesamten Rührvorgangs eine konstante Temperatur von 44 bis 46 °C hält. Während des Rührvorgangs muss die Verdauungsflüssigkeit so schnell drehen, dass ein tiefer zentraler Wirbel entsteht, ohne dass Flüssigkeit herausspritzt. h) Die Verdauungsflüssigkeit wird gerührt, bis die Fleischpartikel verschwinden (etwa 30 min). Danach wird das Rührgerät abgeschaltet und die Verdauungsflüssigkeit durch das Sieb in den Sedimentierungsfilter zur Sedimentation gegossen. Bei der Verarbeitung bestimmter Fleischarten (Zunge, Wildfleisch usw.) können längere Verdauungszeiten erforderlich sein (nicht mehr als 60 Minuten). i) Der Verdauungsvorgang gilt als zufriedenstellend, wenn nicht mehr als 5 % des ursprünglichen Gewichts der Probe auf dem Sieb bleiben. j) Der Nylon-Maschenfilter (20 μm) wird auf dem Filterhalter angebracht. Der konische Filtrationstrichter aus Stahl wird mit Hilfe des Blockiersystems am Filterhalter befestigt und das Stahlsieb (Maschenweite 180 μm) auf dem Trichter angebracht. Die Vakuumpumpe wird an den Filterhalter und den Metall- bzw. Kunststoffbehälter angeschlossen, damit die Verdauungsflüssigkeit aufgefangen werden kann. k) Das Rühren wird gestoppt und die Verdauungsflüssigkeit durch das Sieb in den Filtrationstrichter gegossen. Der Behälter wird mit ca. 250 ml warmem Wasser gespült. Nach der Filtration der Verdauungsflüssigkeit wird die Spülflüssigkeit in die Filtrationsrampe gegossen. l) Die Filtrationsmembran wird mit der Pinzette an einer Seite gehalten. Die Membran wird mindestens 4-fach gefaltet und in die 15 ml fassende konische Phiole eingeführt. Die konische Phiole ist entsprechend dem Pistill zu wählen. m) Die Filtrationsmembran wird in der 15 ml fassenden konischen Phiole mit Hilfe des Pistills nach unten geschoben, anschließend wird durch Vorwärts- und Rückwärtsbewegen des Pistills (ca. 20-mal) starker Druck auf die Membran ausgeübt; dabei sollte sich das Pistill entsprechend den Anweisungen des Herstellers innerhalb der gefalteten Filtrationsmembran befinden. n) 0,5 ml ± 0,01 ml des Probenverdünnungsmittels werden mit einer Pipette in die 15 ml fassende konische Phiole gegeben und die Filtrationsmembran durch leichtes, wiederholtes Vorwärts- und Rückwärtsbewegen des Pistills ca. 30 s lang homogenisiert; hierbei sind entsprechend den Anweisungen des Herstellers abrupte Bewegungen zu vermeiden, um das Verspritzen der Flüssigkeit zu begrenzen. o) Alle Proben, die negative und die positive Kontrolle werden entsprechend den Anweisungen des Herstellers mit Pipetten auf verschiedene Felder der Agglutinationskarte verteilt. p) Die Latexperlen werden entsprechend den Anweisungen des Herstellers mit einer Pipette in jedes Feld der Agglutinationskarte zugegeben, wobei sie nicht mit den Proben und Kontrollen in Kontakt kommen dürfen. Dann werden die Latexperlen in jedem Feld vorsichtig mit Hilfe eines Wegwerfstäbchens vermischt, bis die homogene Flüssigkeit das ganze Feld bedeckt. q) Die Agglutinationskarte wird auf dem 3D-Schüttler positioniert und entsprechend den Anweisungen des Herstellers 10 ± 1 min geschüttelt. r) Nach dem in den Anweisungen angegebenen Zeitraum wird der Schüttelvorgang beendet, die Agglutinationskarte wird auf eine ebene Oberfläche gelegt und die Reaktionsergebnisse werden sofort entsprechend den Anweisungen des Herstellers abgelesen. Im Fall einer positiven Probe müssen sich Perlenaggregate zeigen. Im Fall einer negativen Probe bleibt die Suspension homogen ohne Perlenaggregate. II. Ansätze mit einem Gesamtgewicht von weniger als 100 g gemäß Kapitel I Nummer 3 Abschnitt II Bei Ansätzen mit einem Gesamtgewicht von weniger als 100 g ist das Verfahren gemäß Kapitel I Nummer 3 Abschnitt II anzuwenden. III. Positive oder nicht eindeutige Ergebnisse Ergibt die Untersuchung einer Sammelprobe ein positives oder nicht eindeutiges Ergebnis des Latexagglutinationstests, so wird jedem Schwein eine weitere Probe von 20 g gemäß Kapitel I Nummer 2 Buchstabe a entnommen. Die jeweils 20 g schweren Proben von fünf Schweinen werden zusammengefasst und nach dem Verfahren gemäß Abschnitt I untersucht. Auf diese Weise werden Proben von 20 Gruppen zu je fünf Schweinen untersucht. Im Fall eines positiven Latexagglutinationstests bei einer Gruppenprobe von fünf Schweinen wird von jedem Schwein dieser Gruppe eine weitere Probe von 20 g entnommen und nach einem der in Abschnitt I beschriebenen Verfahren einzeln untersucht. Im Fall eines positiven oder nicht eindeutigen Latexagglutinationstests werden mindestens 20 g Schweinemuskeln zur Bestätigung anhand einer der in Kapitel I beschriebenen Methoden in das nationale Referenzlabor gesendet. Parasitenproben werden zur Konservierung und zur Identifizierung der Erregerart im EU-Referenzlabor oder im nationalen Referenzlabor in 90 %igem Ethylalkohol aufbewahrt. Nach Entnahme der Parasiten werden Flüssigkeiten mit positivem Befund durch Erhitzen auf mindestens 60 °C dekontaminiert. IV. Reinigung und Dekontamination nach positivem oder nicht eindeutigem Befund. Ergibt die Untersuchung einer Sammelprobe oder einer Einzelprobe ein positives oder nicht eindeutiges Ergebnis des Latexagglutinationstests, so wird alles Material, das mit Fleisch in Berührung kommt (Mixerschüssel, Behälter, Rührstab, Temperatursensor, konischer Filtrationstrichter, Sieb und Pinzette) sorgfältig dekontaminiert, indem es einige Sekunden lang in warmes Wasser (65-90 °C) getaucht wird. Fleischreste oder inaktivierte Larven, die sich noch auf den Oberflächen befinden könnten, können mit einem sauberen Schwamm und Leitungswasser entfernt werden. Erforderlichenfalls können einige Tropfen eines Reinigungsmittels zugefügt werden, um die Geräte und Ausrüstungsteile zu entfetten. Es wird empfohlen, danach alle Gegenstände gründlich zu spülen, damit alle Reste des Reinigungsmittels entfernt werden.“