RICHTLINIE DES RATES vom 29. März 1977 über die biologische Überwachung der Bevölkerung auf Gefährdung durch Blei (77/312/EWG)

DER RAT DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN -

gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft, insbesondere auf Artikel 235,

auf Vorschlag der Kommission,

nach Stellungnahme des Europäischen Parlaments (1),

nach Stellungnahme des Wirtschafts- und Sozialausschusses (2),

in Erwägung nachstehender Gründe:

Eine der wesentlichen Aufgaben der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft ist es, eine harmonische Entwicklung des Wirtschaftslebens innerhalb der Gemeinschaft sowie eine beständige und ausgewogene Wirtschaftsausweitung zu fördern ; dies ist ohne Bekämpfung der Umweltverschmutzung und der Umweltbelastung sowie ohne eine Verbesserung der Lebensqualität und des Umweltschutzes nicht denkbar.

Die Verwendung von Blei zu verschiedenen Zwecken führt derzeit zu einer Bleibelastung in vielen Umweltbereichen.

Die vielfältigen in der Umwelt vorhandenen Bleiquellen erschweren die Bestimmung der Gesamtexposition des einzelnen Menschen gegenüber diesem Schadstoff ; daher erfordert der Schutz der menschlichen Gesundheit eine möglichst genaue Überwachung der Gesamtexposition des einzelnen gegenüber Blei.

Es ist angezeigt, eine biologische Überwachung der Bevölkerung auf Gefährdung durch Blei durchzuführen und die Ergebnisse dieser Überwachung gegebenenfalls für die Erarbeitung neuer Vorschläge auszuwerten.

Es gilt, die technischen Einzelheiten und die biologischen Referenzwerte für diese Überwachung festzulegen.

Die Bestimmung des Blutbleispiegels stellt derzeit das beste Mittel zur Bestimmung der Bleidosis dar, die der einzelne kurz zuvor infolge seiner Exposition gegenüber dem in der Umwelt vorhandenen Blei aufgenommen hat ; die Bestimmung der Enzymaktivität der Delta-Aminolävulin-Dehydratase (ALA-D) kann als orientierende oder zusätzliche Untersuchung zur Feststellung der Exposition gegenüber Blei dienen.

Das Aktionsprogramm der Europäischen Gemeinschaften für den Umweltschutz(3) sieht eine Koordinierung der einzelstaatlichen Programme zur Verbesserung der Lebensqualität und eine vorrangige Aktion in bezug auf Blei vor -

HAT FOLGENDE RICHTLINIE ERLASSEN:

Artikel 1

Die Mitgliedstaaten treffen die erforderlichen Maßnahmen zur Anwendung eines gemeinsamen Verfahrens der biologischen Überwachung im Hinblick auf die Beurteilung der Gefährdung der Bevölkerung durch Blei ausserhalb der Arbeitsstätten.

Artikel 2

Dieses gemeinsame Verfahren beruht auf der Messung des Blutbleispiegels ; es ist auf vier Jahre befristet.

Als orientierende oder zusätzliche Untersuchung kann die Bestimmung der ALA-D-Aktivität gemäß den in den Anhängen II und III vorgesehenen Modalitäten herangezogen werden. (1)ABl. Nr. C 28 vom 9.2.1976, S. 31. (2)ABl. Nr. C 50 vom 4.3.1976, S. 9. (3)ABl. Nr. C 112 vom 20.12.1973, S. 3.

Artikel 3

(1) Für diese biologische Überwachung wird folgendes festgelegt: - die Modalitäten der Probenahme und der Analyse,

- die Häufigkeit der Probenahme.

(2) Die Blutentnahme für die Probenahme erfolgt auf freiwilliger Basis.

Artikel 4

Die Probenahme erstreckt sich auf - Gruppen von mindestens 100 Personen in städtischen Gebieten mit mehr als 0,5 Millionen Einwohnern;

- Gruppen von mindestens 100 Personen - sofern diese Zahl erreicht werden kann - aus Bevölkerungsgruppen, die bedeutsamen Bleiemissionsquellen ausgesetzt sind;

- kritische Gruppen, die von den zuständigen Behörden der Mitgliedstaaten bestimmt werden.

In jedem Mitgliedstaat werden je Kampagne mindestens 50 Analysen je 1 Million Einwohner durchgeführt.

Artikel 5

Die Probenahme bei den in Artikel 4 genannten Gruppen wird in jedem in Betracht gezogenen Gebiet während der Laufzeit des Programms im Rahmen von mindestens zwei Kampagnen mit einem Mindestzwischenraum von 24 Monaten durchgeführt. Von der zweiten Kampagne werden nicht unbedingt dieselben Einzelpersonen wie bei der ersten Kampagne erfasst.

Artikel 6

Zur Beurteilung der Ergebnisse der biologischen Überwachung im Hinblick auf die in Artikel 8 vorgesehenen Maßnahmen gelten die folgenden Blutbleispiegelwerte, bei denen die in Anhang I genannten Beziehungen zwischen Dosis und Wirkung berücksichtigt werden, gleichzeitig als Referenzwerte: - höchstens 20 ¶g Pb/100 ml Blut bei 50 % der untersuchten Bevölkerungsgruppe;

- höchstens 30 ¶g Pb/100 ml Blut bei 90 % der untersuchten Bevölkerungsgruppe;

- höchstens 35 ¶g Pb/100 ml Blut bei 98 % der untersuchten Bevölkerungsgruppe.

Artikel 7

Für die Bestimmung des Blutbleispiegels

- teilen die Mitgliedstaaten der Kommission die Namen der Laboratorien, die an dem Programm für die biologische Überwachung teilnehmen, und die angewandten Analysemethoden mit;

- sorgt die Kommission in Verbindung mit den Mitgliedstaaten für die Durchführung von Vergleichsprogrammen, an denen die obengenannten Laboratorien teilnehmen;

- prüft die Kommission in Verbindung mit den Mitgliedstaaten die Ergebnisse dieser Programme im Hinblick auf eine Verbesserung der Vergleichbarkeit der Analysemethoden.

Artikel 8

Geht aus dem Ergebnis der Analysen hervor, daß die Referenzwerte des Artikels 6 in einem oder mehreren Fällen überschritten wurden, so - überprüfen die Mitgliedstaaten die Gültigkeit der Ergebnisse;

- stellen die Mitgliedstaaten die Expositionsquellen fest, auf die diese Überschreitung zurückzuführen ist ; diese Maßnahme betrifft ebenfalls alle Personen, deren Blutbleispiegel höher als 35 ¶g/100 ml ist;

- treffen die Mitgliedstaaten nach dem Ermessen der zuständigen einzelstaatlichen Behörden die entsprechenden Maßnahmen.

Artikel 9

(1) Die Mitgliedstaaten bezeichnen binnen sechs Monaten nach Bekanntgabe dieser Richtlinie die zuständige einzelstaatliche Behörde, die der Kommission folgendes mitteilt: - die Angaben betreffend die biologische Überwachung der in Artikel 4 genannten Bevölkerungsgruppen mit Angaben über die Analysemethoden, die untersuchten Bevölkerungsgruppen und die Zonen, in denen diese Probenahmen erfolgt sind ; bei diesen Angaben muß die Anonymität der untersuchten Personen in vollem Umfang gewährleistet sein ; die Modalitäten und die Form der Übermittlung dieser Angaben werden von der Kommission und den Mitgliedstaaten einvernehmlich festgelegt;

- Auskünfte über die Ursachen oder mutmaßlichen Gründe für die Überschreitung der Referenzwerte des Artikels 6.

(2) Die zuständige einzelstaatliche Behörde teilt der Kommission ferner die gemäß Artikel 8 dritter Gedankenstrich getroffenen Maßnahmen mit.

Artikel 10

Die Kommission beruft mindestens zweimal jährlich die Vertreter der Regierungen der Mitgliedstaaten ein, um insbesondere - die harmonisierte Durchführung der biologischen Überwachung, vor allem der Artikel 4 und 5, sicherzustellen;

- für die Vergleichbarkeit der durchgeführten Analysen zu sorgen;

- die Auskünfte zu untersuchen und den Informationsaustausch zwischen den Mitgliedstaaten über die Ergebnisse der biologischen Überwachung sowie über die gemäß Artikel 8 getroffenen Maßnahmen zu erleichtern.

Artikel 11

An Hand der gemäß Artikel 9 eingeholten Auskünfte erstellt die Kommission in Verbindung mit den zuständigen einzelstaatlichen Behörden - einen zusammenfassenden Jahresbericht über die Durchführung dieses Programms, der den Mitgliedstaaten sowie dem Rat und dem Europäischen Parlament übermittelt wird;

- einen allgemeinen Abschlußbericht über dieses Programm, der bei der etwaigen Ausarbeitung neuer Vorschläge zugrunde gelegt wird ; diese Vorschläge berücksichtigen auch den Fortschritt in den wissenschaftlichen und technischen Erkenntnissen.

Artikel 12

Die Mitgliedstaaten treffen die erforderlichen Maßnahmen, um dieser Richtlinie innerhalb von zwölf Monaten nach ihrer Bekanntgabe nachzukommen, und setzen die Kommission davon unverzueglich in Kenntnis.

Artikel 13

Diese Richtlinie ist an die Mitgliedstaaten gerichtet.

Geschehen zu Brüssel am 29. März 1977.

Im Namen des Rates

Der Präsident

T. BENN

ANHANG I BEZIEHUNGEN ZWISCHEN DOSIS UND WIRKUNG

Die Blutbleispiegelwerte für die Beurteilung der Ergebnisse der biologischen Überwachung ergeben sich aus der Analyse der wissenschaftlichen Daten über die verschiedenen toxischen Wirkungen von Blei. Auf Grund dieser Analyse, die den normalen Schwankungen der biologischen Werte der Bevölkerung Rechnung trägt, können quasi-quantitative Beziehungen zwischen der Dosis und der Wirkung festgestellt werden. Für die Anwendung dieser Richtlinie werden folgende Beziehungen zwischen Dosis und Wirkung vorgesehen:

Eine Verringerung der ALA-D-Aktivität in den roten Blutkörperchen bei der Bevölkerung infolge einer Bleiexposition kann hingenommen werden, solange sie nicht zu einer Störung der Hämatopöse führt. Bei den Blutspiegeln von weniger als 15-20 ¶g/100 ml ruft eine Verringerung der ALA-D-Aktivität nach heutiger Auffassung keine Störungen in der Hämatopöse hervor.

Eine Zunahme des Protoporphyringehalts der Erythrozyten (PPE) im Blut ist ein Anzeichen für eine Beeinträchtigung der Ausnutzung des Eisens, wodurch die Häm-Synthese gehemmt wird. Eine Zunahme der PPE-Werte tritt bei Blutbleispiegeln von mehr als 20-30 ¶g/100 ml in Erscheinung. Eine Zunahme der PPE-Werte kann jedoch andere Ursachen haben.

Eine Beeinträchtigung der Synthese des Glutathions kann nur bei einem kleinen Bruchteil der Bevölkerung geduldet werden, und auch das nur, sofern sie geringfügig ist und keine sonstigen subklinischen Symptome hervorbringt. Eine derartige untragbare Beeinträchtigung der Synthese des Glutathions tritt nicht ein, solange der Blutbleispiegel weniger als 30 ¶g/100 ml beträgt.

Eine signifikante Zunahme der Delta-Aminolävulin-Ausscheidung im Harn (ALA-U) zeigt eine starke Störung des Stoffwechsels der Porphyrine an und ist daher ein Zeichen für eine Gesundheitsschädigung. Eine statistisch gesehen signifikante Zunahme der ALA-U tritt erst bei Blutbleispiegeln von mehr als 35 ¶g/100 ml in Erscheinung.

ANHANG II KORRELATION ZWISCHEN DEN BLUTSPIEGELBLEIWERTEN UND DER ENZYMATISCHEN AKTIVITÄT

Im Sinne von Artikel 2 dieser Richtlinie besteht zwischen den Blutbleispiegelwerten und der nach dem standardisierten europäischen Verfahren bestimmten enzymatischen ALA-D-Aktivität (Anhang III) folgende Korrelation: >PIC FILE= "T0010803">

Sind die gemessenen ALA-D-Werte wesentlich höher als die vorstehend angegebenen Grenzwerte für die einzelnen Bevölkerungsgruppen, so sind Messungen zur Bestätigung der Blutbleispiegelwerte nicht erforderlich.

ANHANG III TECHNISCHE VORSCHRIFTEN FÜR DIE BESTIMMUNG DER ALA-D-AKTIVITÄT

Das standardisierte europäische Verfahren zur Bestimmung der Aktivität der Delta-Aminolävulinsäure-Dehydratase

Das Prinzip der Methode für die Bestimmung der ALA-D-Aktivität ist wohlbekannt. Es beruht auf der Inkubation des Enzyms mit einem Überschuß von Delta-Aminolävulinsäure als Substrat. Das nach einer bestimmten Zeit gebildete Porphobilinogen wird mit modifiziertem Ehrlich-Reagens umgesetzt und die erzielte Farbe mit Hilfe eines Photometers im Vergleich zum Blindversuch gemessen. Die erzeugte Menge an Porphobilinogen gilt als Maß für die ALA-D-Aktivität.

METHODE Wirkung des Lichts

Neuere Erfahrungen haben gezeigt, daß insbesondere Porphobilinogen hoch lichtempfindlich ist. Die gesamte Analyse sollte unter Ausschluß jeglichen direkten Sonnenlichts im Laboratorium (und nicht nur an der Stelle, an der die Analyse vorgenommen wird) durchgeführt werden.

Erste Phase - Blutprobenentnahme und -konservierung vor der Analyse - Entnahme von 2 ml Venenblut mit Hilfe einer (nicht bleistabilisierten) Kunststoffspritze unter Zusatz von getrocknetem Heparin ( - Von der Blutprobe werden sofort 4 aliquote Teile zu 0,2 ml in verschiedene (nicht bleistabilisierte) Kunststoffröhrchen überführt und auf 4º C gekühlt.

- Wird die Analyse innerhalb von 3 Stunden vorgenommen, so ist eine Kühlung der Proben nicht erforderlich.

- Die maximale Konservierungsdauer der Proben bei 4º C beträgt 24 Stunden.

- Unmittelbar vor der Analyse müssen sämtliche Proben 10 Minuten lang in ein Eiswasserbad gestellt werden.

Bemerkung : Als verwendbare Kunststoffe kommen Polyäthylen, Polystyrol und Polypropylen in Frage. Die Konservierungszeit von 24 Stunden ist das Ergebnis einer vorsichtigen Schätzung. Diese Zeitspanne reicht für den Transport der Blutprobe zwecks Analyse vom Ort der Blutprobenahme zu einem Zentrallaboratorium aus. Von den 4 Blutproben sollten 3 für die ALA-D-Bestimmung und eine für den Blindversuch benutzt werden.

Zweite Phase - Bestimmung des Hämatokritwertes

Diese Bestimmung ist auszuführen: - gleichzeitig mit der Blutprobenahme,

- an Hand einer Kapillarmethode unter Verwendung von zwei Proben.

Zentrifugieren nach Verschluß des einen Kapillarenendes bei einer Geschwindigkeit von mindestens 30 000 U/min. (nicht unter 5 Minuten).

Bemerkung : Diese Bestimmung sollte vorzugsweise am Ort der Probenahme vorgenommen werden, aber nicht später als 24 Stunden danach. Nach Möglichkeit ist eine Mikrohämatokrit-Zentrifuge zu benutzen.

Dritte Phase - Hämolyse - Hämolyse von drei, zuvor mit 1,3 ml (auf 37º C erwärmtem) destilliertem Wasser "aufgetauten" Blutproben, 10 Minuten lang bei 37º C ± 0,2º C.

- Zugabe des Wassers vorzugsweise mit Hilfe einer 2-ml-Ausblas-Pipette, anschließend gründlich mischen.

- In diesem Stadium dürfen die Proben nicht mehr bewegt werden

Bemerkung : Es wurde beschlossen, für die Hämolyse Wasser und nicht Triton X 100 zu benutzen. Die Hämolyseversuche mit Triton X 100 führen zu einer beträchtlichen Hemmung der ALA-D-Aktivität, die bisher noch nicht geklärt werden konnte und möglicherweise einem Artefakt entspricht.

Vierte Phase - Zugabe der ALA-Lösung zur Hämolyse - Herstellung der ALA-Lösung.

- Die Lösung darf nicht älter als 5 Stunden sein.

- Diese Lösung ist vor der Zugabe mindestens 10 Minuten lang auf 37º C zu erwärmen.

- Zugabe von 1 ml dieser Lösung zu dem Hämolysat, vorzugsweise mit Hilfe einer 1-ml-Ausblasvollpipette, anschließend mischen.

Bemerkung : Es wurde ein pH-Wert von 6,4 zugrundegelegt, da die Versuche gezeigt hatten, daß sich bei diesem pH-Wert bei normalen Populationen die beste Korrelation zwischen den ALA-D-Aktivitäten und den Blutbleiwerten erzielen lässt. Es geht nicht darum, die maximale Aktivität zu erhalten (realisierbar durch Erhöhung der pH-Werte), da die zu bestimmenden Aktivitäten hoch genug sind.

Fünfte Phase - Herstellung des Blindwertes - 0,2 ml Blut werden wie für die ALA-D-Bestimmung aufbereitet, und zwar bis zum Augenblick der Zugabe der ALA-Lösung ; an Stelle dieser Lösung wird 1 ml HgCl2-TCA-Lösung, sodann 1 ml ALA-Lösung zugegeben ; anschließend wird wie bei der ALA-D-Bestimmung verfahren (vgl. unten).

- Für die vorgenannte Zugabe werden Ausblaspipetten verwendet.

Bemerkung : Nur ein Blindwert wird mit einer Serie von 3 Ansätzen für jede Blutprobe verglichen. Ist die für den Blindwert erzielte optische Dichte sehr groß, so wird der Vorgang zur Kontrolle wiederholt.

Sechste Phase - Inkubation - 60 Minuten im Wasserbad bei 37º C ± 0,2º C.

- Die Inkubationszeit gilt vom Augenblick der Zugabe der ALA-Lösung an.

Bemerkung : Die Inkubationszeit von 60 Minuten wurde gewählt, um die ALA-D-Aktivität auf natürliche Weise zu erhöhen, da keine andere Phase eine künstliche Erhöhung der Aktivität zur Folge hatte. An Hand von Versuchen wurde festgestellt, daß die Relation Inkubationszeit/Aktivität für Zeitspannen von mehr als zwei Stunden linear ist.

Die Inkubationstemperatur wurde aus praktischen Gründen bei 37º C gehalten.

Siebte Phase - Abstoppen der PBG-Reaktion - Zugabe von 1 ml HgCl2-TCA-Lösung zu der Inkubationsmischung, vorzugsweise mit einer 1-ml-Ausblasvollpipette.

Achte Phase - Zentrifugieren und Filtrieren - 30 000 U/min.

- Filtrieren mit Whatman-Papier Nr. 54 oder gleichwertigem Papier (säurebeständig).

Bemerkung : Das Zentrifugieren muß rund 10 Minuten dauern. Der Filtrationsschritt ist eingeführt worden, um das Pipettieren kleiner Partikel, die auf der Flüssigkeitsoberfläche schwimmen können, zu vermeiden. Diese Partikel scheinen eine Farbreaktion mit dem Ehrlich-Reagens auszulösen Mehrere Versuche haben gezeigt, daß die Einführung des Filtrationsschrittes zu einer besseren Reproduzierbarkeit führt. Erforderlichenfalls kann die Filterphase durch ein zweites Zentrifugieren ersetzt werden.

Neunte Phase - Reaktion mit dem Ehrlich-Reagens - 1 ml des filtrierten Überstandes mit 1 ml modifiziertem Ehrlich-Reagens mischen. Zugabe mit Hilfe von Ausblasvollpipetten.

- Mischen mit Hilfe eines Vortex-Mischers, um Homogenität der Probe zu gewährleisten.

- Messung der Extinktion nach 5 Minuten.

Bemerkung : Eine gute Mischung des filtrierten Überstandes mit dem Ehrlich-Reagens ist für die Gewährleistung der Homogenität sehr wichtig.

Zehnte Phase - Messung der Extinktion - Der Spektrophotometer wird mit Hilfe einer Phenolphthalein-Lösung in einem basischen Puffer geeicht.

- Messung der Extinktion der Proben gegen den Blindwert bei 555 nm in einer 1-cm-Kuevette (oder 2-cm-Kuevette, falls die Absorption sehr gering ist).

Elfte Phase - Berechnung der Enzymaktivität - Folgende Gleichung ermöglicht die Berechnung dieser Aktivität: >PIC FILE= "T0010804">

OD = gemessene Extinktion (optische Dichte)

60 = Inkubationszeit

35 = Verdünnungsfaktor

62 = molarer Extinktionsköffizient in cm2/¶mol

K = Korrekturköffizient für das Spektralphotometer

Bemerkung : Die vorgeschlagenen Einheiten entsprechen den Empfehlungen der Union Internationale de Biochimie (Internationale Union für Biochemie) in bezug auf die Nomenklatur der Enzyme.

LÖSUNGEN

1. Herstellung der ALA-Lösung

Lösung A:

1,78 g Na2HPO4 7 2H2O aufgelöst in 100 ml destilliertem Wasser (vorzugsweise Ionenaustauschwasser).

Lösung B:

1,38 g NaH2PO4 7 1H2O aufgelöst in 100 ml destilliertem Wasser.

29 ml Lösung A und 71 ml Lösung B ergeben einen 0,1 Mol/l Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,4.

Diese hohe Ionenkonzentration des Puffers ist notwendig, um jede Veränderung des pH-Wertes in der in Reaktion befindlichen Lösung zu unterbinden.

167,6 mg ALA HCl werden in der Lösung B (stets unter saueren Bedingungen) gelöst ; der pH-Wert wird mit Hilfe der Lösung A auf 6,4 eingestellt. Das Volumen wird sodann mit der 0,1 Mol/l Phosphatpufferlösung (pH-Wert 6,4) auf 100 ml gebracht. Dieser Präparationsansatz ergibt eine Lösung von 0,01 Mol ALA/1.

2. HgCl2-TCA-Lösung

1,35 g HgCl2 werden in 100 ml 10 % iger wässeriger Trichloressigsäure (TCA) aufgelöst.

3. Ehrlich-Reagens-Lösung

Reagenzien:

2,5 g p-Dimethylaminobenzaldehyd (pDMAB),

100 % Essigsäure (Eisessig),

0,25 g HgCl2gelöst in 10 ml Eisessig,

Perchlorsäure S.G. 1,7.

Herstellung:

Das pDMAB wird in 50 ml Eisessig gelöst. 24,5 ml Perchlorsäure und 4 ml der HgCl2-Lösung zugeben ; mischen, kühlen und mit Eisessig im 100 ml Meßkolben auf 100 ml bringen (1). In einer dunkler Flasche aufbewahren.

Eichung:

Durch ein von den Mitgliedstaaten gemeinsam bezeichnetes Laboratorium muß jährlich eine Eichung auf Gemeinschaftsebene durchgeführt werden. (1)Tritt in diesem Stadium eine Braunfärbung ein, so ist das Reagens unbrauchbar.