SIEBTE RICHTLINIE DER KOMMISSION vom 1. März 1976 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (76/372/EWG)

DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN -

gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft,

gestützt auf die Richtlinie des Rates vom 20. Juli 1970 über die Einführung gemeinschaftlicher Probenahmeverfahren und Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (1), zuletzt geändert durch die Beitrittsakte (2), insbesondere auf Artikel 2,

in Erwägung nachstehender Gründe:

Die obengenannte Richtlinie bestimmt, daß die amtlichen Untersuchungen von Futtermitteln zur Feststellung, ob die auf Grund der Rechts- oder Verwaltungsvorschriften festgelegten Anforderungen hinsichtlich Beschaffenheit und Zusammensetzung der Futtermittel erfuellt sind, nach gemeinschaftlichen Probenahmeverfahren und Analysemethoden durchgeführt werden.

Die Richtlinien 71/250/EWG, 71/393/EWG, 72/199/EWG, 73/46/EWG, 74/203/EWG und 75/84/EWG der Kommission vom 15. Juni 1971 (3), vom 18. November 1971 (4), vom 27. April 1972 (5), vom 5. Dezember 1972 (6), vom 25. März 1974 (7) und vom 20. Dezember 1974 (8) haben bereits eine Reihe von Analysemethoden festgelegt. Der Stand der seitdem durchgeführten Arbeiten ermöglicht es nunmehr, eine siebente Reihe von Analysemethoden festzulegen.

Die in dieser Richtlinie vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des Ständigen Futtermittelausschusses -

HAT FOLGENDE RICHTLINIE ERLASSEN:

Artikel 1

Die Mitgliedstaaten schreiben vor, daß die Analysen für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln auf ihren Gehalt an Aflatoxin B1 nach den in der Anlage zu dieser Richtlinie beschriebenen Methoden durchgeführt werden.

Die allgemeinen Bestimmungen des Teils 1 (Einführung) der Anlage zur Ersten Richtlinie 71/250/EWG der Kommission vom 15. Juni 1971, mit Ausnahme des die Vorbereitung der Analyseprobe betreffenden Teils, finden auf die in der Anlage zu dieser Richtlinie beschriebenen Methoden Anwendung.

Artikel 2

Die Mitgliedstaaten setzen spätestens zum 1. Oktober 1976 die erforderlichen Rechts- oder Verwaltungsvorschriften in Kraft, um den Bestimmungen dieser Richtlinie nachzukommen. Sie setzen die Kommission unverzueglich hiervon in Kenntnis.

Artikel 3

Diese Richtlinie ist an alle Mitgliedstaaten gerichtet.

Brüssel, den 1. März 1976

Für die Kommission

P.J. LARDINOIS

Mitglied der Kommission (1)ABl. Nr. L 170 vom 3.8.1970, S. 2. (2)ABl. Nr. L 73 vom 27.3.1972, S. 14. (3)ABl. Nr. L 155 vom 12.7.1971, S. 13. (4)ABl. Nr. L 279 vom 20.12.1971, S. 7. (5)ABl. Nr. L 123 vom 29.5.1972, S. 6. (6)ABl. Nr. L 83 vom 30.3.1973, S. 21. (7)ABl. Nr. L 108 vom 22.4.1974, S. 7. (8)ABl. Nr. L 32 vom 5.2.1975, S. 26.

ANLAGE BESTIMMUNG VON AFLATOXIN B1

A. METHODE MIT EINDIMENSIONALER DÜNNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE

1. Zweck- und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehaltes an Aflatoxin B1 in folgenden Futtermitteln : Erdnuß-, Kokos-, Lein-, Soja-, Sesam-, Babassu- und Maiskeimkuchen, Getreide und Getreideerzeugnisse, Erbsenmehl, Kartoffelschlempe, getr., und Kartoffelstärke. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 0,01 mg/kg (10 ppb).

Wenn Störsubstanzen vorhanden sind, welche die Auswertung erschweren, muß die Analyse nach der Methode B (zweidimensionale Dünnschichtchromatographie) wiederholt werden.

2. Prinzip

Die Probe wird mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird filtriert und ein aliquoter Teil durch Chromatographie an einer Kieselgelsäule gereinigt. Das Eluat wird eingedampft und der Rückstand in einer definierten Menge Chloroform oder Benzol-Acetonitrilgemisch gelöst. Ein aliquoter Teil dieser Lösung wird dünnschichtchromatographisch untersucht. Die Aflatoxin-B1-Menge wird im UV-Licht visuell oder fluorodensitometrisch im Vergleich zu bekannten Mengen Aflatoxin-B1-Standard ermittelt. Die Identität von Aflatoxin B1 im Futtermittelextrakt muß durch das angegebene Verfahren bestätigt werden.

3. Reagenzien

Anmerkung : Wenn nichts anderes angegeben ist, sind Reagenzien von "p.a."- Qualität zu verwenden. 3.1. Aceton

3.2. Chloroform, mit 0,5 bis 1,0 % Äthanol 96 % ig (V/V) stabilisiert

3.3. n-Hexan

3.4. Methanol

3.5. Diäthyläther, wasserfrei, peroxidfrei

3.6. Benzol-Acetonitril-Gemisch 98 : 2 (V/V)

3.7. Mischung aus Chloroform (3.2) und Methanol (3.4) 97 : 3 (V/V)

3.8. Kieselgel für Säulenchromatographie, 0,05 bis 0,20 mm Teilchengrösse

3.9. Watte, hydrophil und mit Chloroform entfettet, oder Glaswolle

3.10. Natriumsulfat, wasserfrei, gekörnt

3.11. Inertgas, z.B. Stickstoff

3.12. 1 N-Salzsäure

3.13. Schwefelsäure 50 % (V/V)

3.14. Kieselgur (Hyflosupercel), mit Säure gewaschen

3.15. Kieselgel G-HR oder gleichwertiges für Dünnschichtchromatographie

3.16. Standardlösung mit etwa 0,1 ¶g Aflatoxin B1 je ml in Chloroform (3.2) oder in Benzol-Acetonitril-Gemisch (3.6), hergestellt und kontrolliert nach Punkt 7.

3.17. Qualitative Standardlösung mit etwa 0,1 ¶g Aflatoxin B1 und B2 je ml in Chloroform (3.2) oder Benzol-Acetonitril-Gemisch (3.6). Diese Konzentrationen sind als Anhaltspunkte gegeben. Sie sind, entsprechend dem unterschiedlichen Fluoreszenzvermögen, so zu wählen, daß sich für beide Aflatoxine dieselbe Fluoreszenzintensität ergibt.

3.18. Fließmittel: 3.18.1. Mischung aus Chloroform (3.2) und Aceton (3.1) 9 : 1 (V/V). Trennkammer mit nicht gesättigter Atmosphäre

3.18.2. Mischung aus Diäthyläther (3.5), Methanol (3.4) und Wasser 96 : 3 : 1 (V/V/V). Trennkammer mit nicht gesättigter Atmosphäre

3.18.3. Mischung aus Diäthyläther (3.5), Methanol (3.4) und Wasser 94 : 4,5 : 1,5 (V/V/V). Trennkammer mit gesättigter Atmosphäre

3.18.4. Mischung aus Chloroform (3.2) und Methanol (3.4) 94 : 6 (V/V). Trennkammer mit gesättigter Atmosphäre.

3.18.5. Mischung aus Chloroform (3.2) und Methanol (3.4) 97 : 3 (V/V). Trennkammer mit gesättigter Atmosphäre

4. Geräte 4.1. Mahl- und Mischgerät

4.2. Schüttelmaschine oder Magnetrührer

4.3. Faltenfilter, Schleicher & Schüll Nr. 588 oder gleichwertige Filter, Durchmesser 24 cm

4.4. Chromatographierohr aus Glas, (innerer Durchmesser 22 mm, Länge 300 mm), mit Teflonhahn und 250-ml-Vorratsbehälter

4.5. Vacuumrotationsverdampfer mit 500-ml-Rundkolben

4.6. 500-ml-Erlenmeyerkolben mit Schliffstopfen

4.7. Ausrüstung für Dünnschicht-Chromatographie

4.8. Glasplatten für Dünnschicht-Chromatographie, 200 × 200 mm. Sie werden wie folgt vorbereitet (die angegebenen Mengen reichen für fünf Platten) : 30 g Kieselgel G-HR (3.15) werden in einem Erlenmeyerkolben mit 60 ml destilliertem Wasser versetzt, der Kolben wird verschlossen und eine Minute geschüttelt. Die Suspension wird in einer einheitlichen Schichtdicke von 0,25 mm auf die Platten aufgetragen. Man lässt die Platten an der Luft trocknen und bewahrt sie dann im Exsikkator über Kieselgel als Trocknungsmittel auf. Vor Verwendung werden sie eine Stunde im Trockenschrank bei 110º C aktiviert.

Fertigplatten können verwendet werden, sofern sie einen ähnlichen Trenneffekt ergeben wie die in der oben beschriebenen Weise hergestellten.

4.9. Analysenlampe für langwelligen UV-Bereich (360 nm). Die Lichtintensität muß ausreichen, um einen Aflatoxin-B1-Fleck von 1,0 ng auf einer Dünnschichtplatte in 10 cm Entfernung von der Lampe noch deutlich zu erkennen.

4.10. 10-ml-Reagenzgläser, graduiert, mit Schliff und Polyäthylenstopfen

4.11. UV-Spektralphotometer

4.12. Fluorodensitometer (wahlweise)

5. Ausführung 5.1. Vorbereitung der Probe (siehe unter Bemerkungen, Teil C, Punkt 1)

Die Probe wird gemahlen, so daß sie vollständig durch ein 1-mm-Sieb (gem. ISO-Empfehlung R 565) hindurchgeht.

5.2. Extraktion

50,0 g der gemahlenen und homogenisierten Probe werden in einen 500 ml-Erlenmeyerkolben (4.6) eingewogen, man fügt 25 g Kieselgur (3.14), 25 ml Wasser und 250 ml Chloroform (3.2) hinzu. Der Kolben wird verschlossen und 30 Minuten mit dem Gerät (4.2) geschüttelt bzw. gerührt. Anschließend filtriert man durch ein Faltenfilter (4.3), die ersten 10 ml des Filtrats werden verworfen, die nächsten 50 ml aufgefangen.

5.3. Säulenchromatographische Reinigung

Das untere Ende des Chromatographie-Rohrs (4.4) wird mit einem Watte- oder Glaswollepfropfen (3.9) versehen, das Rohr zu etwa zwei Dritteln mit Chloroform (3.2) gefuellt, dann fügt man 5 g Natriumsulfat (3.10) hinzu, wobei darauf zu achten ist, daß die Natriumsulfatschicht eine ebene Fläche bildet. Anschließend gibt man 10 g Kieselgel (3.8) in kleinen Portionen hinzu. Nach jeder Zugabe ist vorsichtig zu rühren, um Luftblasen zu entfernen. Man lässt das Kieselgel 15 Minuten absetzen und fügt dann vorsichtig 15 g Natriumsulfat (3.10) hinzu. Man lässt dann die Flüssigkeit bis unmittelbar an die Oberfläche des Natriumsulfats ablaufen.

50 ml des nach 5.2 erhaltenen Filtrats werden mit 100 ml n-Hexan (3.3) gemischt. Man gibt die Mischung quantitativ auf die Säule und lässt die Flüssigkeit bis zur Oberfläche des Natriumsulfats einsickern. Anschließend fügt man 100 ml Diäthyläther (3.5) hinzu und lässt die Flüssigkeit wieder bis zur Oberfläche des Natriumsulfats einsickern. Die Durchflußgeschwindigkeit soll 8 bis 12 ml/Minute betragen, ein Trockenlaufen der Säule ist zu vermeiden. Der Durchlauf wird verworfen. Man eluiert danach mit 150 ml Chloroform-Methanol-Gemisch (3.7), wobei das gesamte Eluat aufgefangen wird.

Das Eluat wird im Vakuumrotationsverdampfer (4.5) bei einer Temperatur von weniger als 50º C unter einem inerten Gasstrom (3.11) bis fast zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Chloroform (3.2) oder Benzol-Acetonitril-Gemisch (3.6) quantitativ in ein 10-ml-Reagenzglas (4.10) überführt, die Lösung im inerten Gasstrom (3.11) eingeengt und anschließend mit Chloroform (3.2) oder Benzol-Acetonitril-Gemisch (3.6) auf ein Volumen von 2,0 ml aufgefuellt.

5.4. Dünnschicht-Chromatographie

Auf einer Dünnschicht-Platte (4.8) werden 2 cm vom unteren Rand entfernt nebeneinander im Abstand von 2 cm folgende Mengen der Standardlösung und des Extraktes punktförmig aufgetragen: - 10, 15, 20, 30 und 40 ¶l der Aflatoxin-B1-Standardlösung (3.16);

- 10 ¶l des nach 5.3 gewonnenen Extrakts und 20 ¶l der Standardlösung (3.16) übereinander auf denselben Punkt;

- 10 und 20 ¶l des nach 5.3 gewonnenen Extrakts.

Die Platte wird vor Licht geschützt, mit einem der Fließmittel (3.18) entwickelt. Zur Auswahl eines geeigneten Fließmittels trägt man vorher 25 ¶l der qualitativen Standardlösung (3.17) auf eine der Platten auf und prüft, ob bei der Entwicklung eine vollständige Trennung der Aflatoxine B1 und B2 erreicht wird.

Man lässt das Fließmittel im Dunkeln verdampfen und betrachtet dann die Platte im UV-Licht in 10 cm Abstand von der Lampe (4.9). Die Flecke von Aflatoxin B1 weisen eine blaue Fluoreszenz auf.

5.5. Quantitative Bestimmung

Die Bestimmung ist entweder visuell oder durch Fluorodensitometrie, wie nachstehend beschrieben, vorzunehmen. 5.5.1. Visülle Bestimmung

Die im Extrakt enthaltene Menge Aflatoxin B1 wird bestimmt, indem man die Fluoreszenzintensität der Flecke des Extrakts mit denen der Standardlösung vergleicht. Falls erforderlich, ist zu interpolieren. Die durch Übereinanderauftragen von Extrakt und Standardlösung erzielte Fluoreszenzintensität muß stärker sein als die von 10 ¶l des Extrakts und es darf nur ein einziger Fleck erkennbar sein. Ist die Fluoreszenz-Intensität von 10 ¶l Extrakt stärker als die von 40-¶l-Standardlösung, so ist der Extrakt auf das 10- oder 100 fache mit Chloroform (3.2) oder Benzol-Acetonitril-Gemisch (3.6) zu verdünnen und erneut in der beschriebenen Weise auf eine Dünnschichtplatte aufzutragen.

5.5.2. Durch Fluorodensitometrische Messung

Die Fluoreszenzintensität der Aflatoxin-B1-Flecke wird mit Hilfe des Fluorodensitometers (4.12) bei 443 nm gemessen bei einer Anregung mit 365 nm. Durch Vergleich der Fluoreszenzintensitäten von Extrakt- und Standardflecken bestimmt man die in den Extrakt-Flecken enthaltene Menge von Aflatoxin B1.

5.6. Identifizierung von Aflatoxin B1

Die Identifizierung von Aflatoxin B1 im Extrakt erfolgt durch nachstehend beschriehene Verfahren. 5.6.1. Behandlung mit Schwefelsäure

Das nach 5.4 erhaltene Chromatogramm wird mit Schwefelsäure (3.13) besprüht. Die Fluoreszenz der Aflatoxin-B1-Flecke muß im UV-Licht von blau nach gelb umschlagen.

5.6.2. Zweidimensionale Chromatographie mit Bildung von Aflatoxin B1-hemiacetal (Aflatoxin B2a)

Anmerkung : Die nachfolgend beschriebenen Arbeitsgänge müssen genau nach der in Abbildung 3 wiedergegebenen Skizze durchgeführt werden. 5.6.2.1. Auftragen der Lösungen

In eine Platte (4.8) werden, parallel zu zwei angrenzenden Seiten (jeweils 6 cm vom Rand entfernt), zwei gerade Linien als Bregrenzung für die Lösungsmittelfronten geritzt. Auf die Platte trägt man mit Hilfe einer Kapillarpipette oder einer Mikroliterspritze folgende Lösungen auf - bei Punkt A : Ein Volumen des nach 5.3 erhaltenen gereinigten Probenextraktes, das etwa 2,5 Nanogramm Aflatoxin B1 enthält;

- bei Punkt B und C : Jeweils 25 ¶l der Standardlösung (3.16).

5.6.2.2. Entwicklung

Das Chromatogramm wird mit dem Fließmittel (3.18.1) (1-cm-Schicht in einer Trennkammer mit nicht gesättigter Atmosphäre) im Dunkeln in Richtung I entwickelt bis die Lösungsmittelfront die Begrenzungslinie erreicht. Man nimmt danach die Platte aus der Trennkammer und lässt sie im Dunkeln fünf Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Während man den Rest der Platte mit einer Glasscheibe abdeckt, besprüht man einen 2,5 cm breiten Streifen (schraffierte Fläche in der Abbildung 3), der die Punkte A und B überdeckt, mit Salzsäure (3.12), bis eine Dunkelfärbung auftritt. Man lässt 10 Minuten im Dunkeln reagieren und trocknet die Platte dann in einem Luftstrom bei Raumtemperatur.

Anschließend entwickelt man das Chromatogramm mit dem Fließmittel (3.18.1) (1-cm-Schicht in einer Trennkammer mit ungesättigter Atmosphäre) in Richtung II, bis die Lösungsmittelfront die Begrenzungslinie erreicht. Man nimmt die Platte aus der Trennkammer und lässt sie bei Raumtemperatur trocknen.

5.6.2.3. Interpretation des Chromatogramms

Man betrachtet das Chromatogramm unter UV-Licht (4.9) und prüft auf nachfolgende Merkmale: a) Vorhandensein eines blau fluoreszierenden Flecks von Aflatoxin B1, von der bei C aufgetragenen Standardlösung stammend (gewandert in Richtung I).

b) Vorhandensein eines blau fluoreszierenden Flecks von Aflatoxin B1 (nicht mit Salzsäure umgesetzt) und eines intensiven blau fluoreszierenden Flecks von Aflatoxin B1-hemiacetal beide von der bei B aufgetragenen Standardlösung stammend und in Richtung II gewandert.

c) Vorhandensein ähnlicher Flecke, wie unter b) beschrieben, die von dem bei A aufgetragenen Probenextrakt stammen. Die Lage dieser Flecke ergibt sich erstens aus der Laufstrecke des Aflatoxins B1 von Punkt A in Richtung I (dieselbe Strekke, die der bei C aufgetragene Standard zurückgelegt hat) und zweitens aus der Laufstrecke von dort in Richtung II des nicht umgesetzten Aflatoxins B1 und des Aflatoxin B1-hemiacetals (dieselben Strecken, die von dem bei B aufgetragenen Standard zurückgelegt wurden). Die Fluoreszenz-Intensitäten der beiden, von dem Extrakt und der bei B aufgetragenen Standardlösung stammenden Halbacetalflecke sollten dabei einander entsprechen.

6. Berechnung der Ergebnisse 6.1. Visülle Messung

Der Aflatoxin-B1-Gehalt der Probe in Mikrogramm pro kg (ppb) wird nach folgender Formel berechnet: >PIC FILE= "T0009127">

Hierbei sind:

Y und X die Mengen - in Mikroliter - der Aflatoxin-B1-Standardlösung (3.16) bzw. des Extrakts, deren Fluoreszenz-Intensität identisch ist.

S = Konzentration in Mikrogramm Aflatoxin B1 je ml der Standardlösung (3.16);

V = Endvolumen des Extrakts in Mikroliter, unter Berücksichtigung etwaiger Verdünnung;

W= Gewicht der Probe in Gramm, bezogen auf die für die säulenchromatographische Reinigung verwendete Extraktmenge.

6.2. Messungen durch Fluorodensitometrie

Der Gehalt an Aflatoxin B1 der Probe in Mikrogramm pro kg (ppb) wird nach folgender Formel berechnet: >PIC FILE= "T0009128">

Hierbei sind:

Y = Volumen des auf die Platte aufgetragenen Extrakts in Mikroliter (10 oder 20 ¶l);

S = Aflatoxin-B1-Gehalt des Extraktflecks in Nanogramm, den man aus der Messung erhält (bezogen auf das angewendete Volumen Y);

V = Endvolumen des Extrakts in Mikroliter, unter Berücksichtigung etwaiger Verdünnung;

W = Gewicht der Probe in Gramm, bezogen auf die für die säulenchromatographische Reinigung verwendete Extraktmenge.

7. Herstellung und Kontrolle der Standardlösung (3.16) 7.1. Bestimmung der Aflatoxin-B1-Konzentration

Eine Aflatoxin-B1-Standardlösung wird in Chloroform (3.2) oder Benzol-Acetonitril-Gemisch (3.6) mit einer Konzentration von 8 bis 10 ¶g je ml hergestellt. Das Absorptionsspektrum wird zwischen 330 und 370 nm mit einem Spektralphotometer (4.11) gemessen.

Die Extinktion (A) ist im Fall einer Chloroformlösung bei 363 nm, im Fall einer Lösung in Benzol-Acetonitril-Gemisch bei 348 nm zu messen.

Die Aflatoxin-B1-Konzentration in Mikrogramm je ml Lösung wird nach folgenden Formeln berechnet: >PIC FILE= "T0009129">

Die zur Herstellung einer Standardarbeitslösung mit einer Aflatoxin-B1-Konzentration von etwa 0,1 ¶g je ml erforderlichen Verdünnungen werden im Dunkeln vorgenommen. Diese Lösung ist, bei 4º C im Kühlschrank aufbewahrt, zwei Wochen haltbar.

7.2. Kontrolle der chromatographischen Reinheit

Auf einer Dünnschichtplatte (4.8) werden 5 ¶l der Aflatoxin-B1-Standardlösung, die 8-10 ¶g Aflatoxin B1 je ml enthält (siehe 7.1) aufgetragen. Das Chromatogramm wird nach 5.4 entwickelt. Im UV-Licht darf nur ein einziger Fleck erkennbar sein ; ausserdem darf an der Stelle der ursprünglichen Auftragung keine Fluoreszenz wahrnehmbar sein.

8. Wiederholbarkeit

Der Unterschied zwischen den Ergebnissen zweier Parallelbestimmungen eines Analytikers sollte in derselben Probe bei Gehalten von - 10 bis 20 ¶g/kg Aflatoxin B1 25 v.H. des höheren Resultats,

- mehr als 20 bis 50 ¶g/kg Aflatoxin B1 5 ¶g/kg absolut,

- mehr als 50 ¶g/kg Aflatoxin B1 10 v.H. des höheren Resultats

nicht überschreiten.

9. Vergleichbarkeit Siehe unter Bemerkungen, Teil C, Punkt 2.

B. METHODE MIT ZWEIDIMENSIONALER DÜNNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE

1. Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehaltes an Aflatoxin B1 in Futtermitteln, sofern diese nicht unter den Anwendungsbereich der Methode A fallen. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 0,01 mg/kg (10 ppb). Die Methode ist nicht anwendbar bei Futtermitteln, die Citrus-Trester enthalten.

2. Prinzip

Die Probe wird mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird filtriert und ein aliquoter Teil durch Chromatographie an einer Kieselgelsäule gereinigt. Das Eluat wird eingedampft und der Rückstand in einer definierten Menge Chloroform oder Benzol-Acetonitril-Gemisch gelöst. Ein aliquoter Teil dieser Lösung wird der zweidimensionalen Dünnschichtchromatographie unterworfen. Die Aflatoxin-B1-Menge wird im UV-Licht visuell oder fluorodensitometrisch im Vergleich zu bekannten Mengen Aflatoxin-B1-Standard ermittelt. Die Identität von Aflatoxin B1 im Futtermittelextrakt muß durch das angegebene Verfahren bestätigt werden.

3. Reagenzien

Anmerkung : Wenn nichts anderes angegeben ist, sind Reagenzien von "p.a."- Qualität zu verwenden. 3.1. Aceton

3.2. Chloroform, mit 0,5 bis 1,0 % Äthanol 96 % ig (V/V) stabilisiert

3.3. n-Hexan

3.4. Methanol

3.5. Diäthyläther, wasserfrei, peroxidfrei

3.6. Benzol-Acetonitril-Gemisch 98 : 2 (V/V)

3.7. Mischung aus Chloroform (3.2) und Methanol (3.4) 97 : 3 (V/V)

3.8. Kieselgel für Säulenchromatographie, 0,05 bis 0,20 mm Teilchengrösse

3.9. Watte, hydrophil und mit Chloroform entfettet, oder Glaswolle

3.10. Natriumsulfat, wasserfrei, gekörnt

3.11. Inertgas, z.B. Stickstoff

3.12. 1 N-Salzsäure

3.13. Kieselgur (Hyflosupercel), mit Säure gewaschen

3.14. Kieselgel G-HR oder gleichwertiges für Dünnschichtchromatographie

3.15. Fließmittel: 3.15.1 Mischung aus Diäthyläther (3.5), Methanol (3.4) und Wasser 94 : 4, 5 : 1,5 (V/V/V). Trennkammer mit gesättigter Atmosphäre.

3.15.2. Mischung aus Chloroform (3.2) und Aceton (3.1) 9 : 1 (V/V). Trennkammer mit nicht gesättigter Atmosphäre.

3.16. Standardlösung mit etwa 0,1 ¶g Aflatoxin B1 je ml in Chloroform (3.2) oder in Benzol-Acetonitril-Gemisch (3.6), hergestellt und kontrolliert nach Punkt 7 der Methode A.

4. Geräte Siehe unter Punkt 4 der Methode A.

>PIC FILE= "T0009130"> 5.4. Zweidimensionale Dünnschichtchromatographie 5.4.1. Auftragen der Lösungen (siehe Skizze in Abbildung 1)

In eine Platte (4.8) werden parallel zu zwei benachbarten Seiten (in einem Abstand von 5 und 6 cm von der jeweiligen Kante) zwei gerade Linien geritzt als Begrenzung für die Lösungsmittelfronten. Auf die Platte werden mit Hilfe einer Kapillarpipette oder einer Mikroliterspritze folgende Lösungen aufgetragen: - Bei Punkt A : 20 ¶l des nach 5.3 erhaltenen gereinigten Probenextraktes

- bei Punkt B : 20 ¶l der Standardlösung (3.16)

- bei Punkt C : 10 ¶l der Standardlösung (3.16)

- bei Punkt D : 20 ¶l der Standardlösung (3.16)

- bei Punkt E : 40 ¶l der Standardlösung (3.16)

Man trocknet in einem schwachen Strom von Inertgas (3.11). Die erhaltenen Flecke sollten einen Durchmesser von etwa 5 mm aufweisen.

5.4.2. Entwicklung (siehe Skizze in Abbildung 1)

Das Chromatogramm wird mit dem Fließmittel (3.15.1) (1-cm-Schicht in einer Trennkammer mit gesättigter Atmosphäre) im Dunkeln in Richtung I entwickelt, bis die Lösungsmittelfront die Begrenzungslinie erreicht hat. Man nimmt danach die Platte aus der Trennkammer und lässt sie 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln trocknen.

Anschließend entwickelt man das Chromatogramm unter Verwendung des Fließmittels (3.15.2) (1-cm-Schicht in einer Trennkammer mit nicht gesättigter Atmosphäre) im Dunkeln in Richtung II, bis die Lösungsmittelfront die Begrenzungslinie erreicht hat. Man entfernt die Platte aus der Trennkammer und lässt sie bei Raumtemperatur im Dunkeln trocknen.

5.4.3. Auswertung des Chromatogramms (siehe Skizze in Abbildung 2)

Man betrachtet das Chromatogramm unter UV-Licht, wobei die Platte 10 cm von der Lampe (4.9) entfernt sein soll, und bestimmt die Lage der von den Standardlösungen stammenden blau fluoreszierenden Flecke B, C, D und E von Aflatoxin B1. Man zieht senkrecht zur jeweiligen Laufrichtung durch diese Punkte zwei gedachte Geraden. Der Schnittpunkt P dieser Geraden ergibt den Ort, an dem der aus dem bei A (Abbildung 1) aufgetragenen Probenextrakt stammende Aflatoxin-B1-Fleck zu erwarten ist. Tatsächlich findet sich der Aflatoxin-B1-Fleck jedoch meist beim Punkt Q, dem Schnittpunkt zweier gedachter Geraden, die einen Winkel von etwa 100º bilden und durch die Punkte B bzw. C gehen. Man bestimmt die im Probenextrakt enthaltene Menge Aflatoxin B1 wie unter 5.5 beschrieben.

5.4.4. Ergänzende Chromatographie

In eine neue Platte (4.8) ritzt man parallel zu zwei benachbarten Seiten zwei gerade Linien, wie in der Skizze der Abbildung 1 gezeigt wird und trägt auf Punkt A (siehe Abbildung 1) übereinander 20 ¶l des nach 5.3 erhaltenen gereinigten Probenextraktes und 20 ¶l Standardlösung (3.16) auf. Man entwickelt das Chromatogramm wie unter 5.4.2 beschrieben. Man betrachtet das Chromatogramm im UV-Licht (4.9) und prüft, ob - sich die Aflatoxin-B1-Flecke von Extrakt und Standardlösung überlagern und

- die Fluoreszenz dieses Flecks eine höhere Intensität aufweist, als der Aflatoxin-B1-Fleck bei Punkt Q der ersten Platte.

5.5. Quantitative Bestimmung

Die Bestimmung ist entweder visuell oder durch Fluorodensitometrie, wie nachstehend beschrieben, vorzunehmen. 5.5.1. Visülle Bestimmung

Die im Extrakt enthaltene Menge Aflatoxin B1 wird bestimmt durch Vergleich der Fluoreszenzintensität des vom Extrakt stammenden Flecks mit derjenigen der Flecke C, D und E der Standardlösung. Falls erforderlich, ist zu interpolieren. Ist die Fluoreszenzintensität von 20 ¶l Extrakt stärker als die von 40 ¶l Standardlösung, so ist der Extrakt auf das 10- oder 100-fache mit Chloroform (3.2) oder Benzol-Acetonitril-Gemisch (3.6) zu verdünnen und erneut in der beschriebenen Weise auf eine Dünnschichtplatte aufzutragen.

5.5.2. Durch fluorodensitometrische Messung

Die Fluoreszenzintensität der Aflatoxin-B1-Flecke wird mit Hilfe des Fluorodensitometers (4.12) bei 443 nm gemessen bei einer Anregung mit 365 nm. Die Aflatoxinmenge ergibt sich aus dem Vergleich der Fluoreszenzintensität des Probenflecks mit derjenigen der Standardflecke C, D und E.

5.6. Identifizierung von Aflatoxin B1 Siehe unter Punkt 5.6 der Methode A.

6. Berechnung der Ergebnisse

Siehe unter Punkt 6 der Methode A.

7. Wiederholbarkeit

Siehe unter Punkt 8 der Methode A.

8. Vergleichbarkeit

Siehe unter Bemerkungen, Teil C, Punkt 2

C. BEMERKUNGEN BETREFFEND METHODE A UND B

1. Entfettung

Proben mit mehr als 5 v.H. Fett sind nach der unter 5.1 beschriebenen Vorbereitung mit Petroläther (Kp 40-60º C) zu entfetten. In diesem Fall sind die Ergebnisse auf das Gewicht der nicht entfetteten Originalprobe zu beziehen.

2. Vergleichbarkeit der Ergebnisse

Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse, das heisst die Abweichung zwischen den von 2 oder mehr Laboratorien bei derselben Probe erhaltenen Ergebnisse, wurde wie folgt bewertet:

± 50 v.H. des Mittelwertes der Ergebnisse bei Mittelwerten an Aflatoxin B1 von 10 bis 20 ¶g/kg;

± 10 ¶g/kg vom Mittelwert bei Mittelwerten von mehr als 20 bis 50 ¶g/kg;

± 20 v.H. des Mittelwertes bei Mittelwerten von mehr als 50 ¶g/kg.

ANLAGE

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