RICHTLINIE 2006/56/EG DER KOMMISSION

vom 12. Juni 2006

zur Änderung der Anhänge der Richtlinie 93/85/EWG des Rates zur Bekämpfung der bakteriellen Ringfäule der Kartoffel

DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN —

gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Gemeinschaft,

gestützt auf die Richtlinie 93/85/EWG des Rates vom 4. Oktober 1993 zur Bekämpfung der bakteriellen Ringfäule der Kartoffel (1), insbesondere auf Artikel 12,

in Erwägung nachstehender Gründe:

Ein für die Kartoffel gefährlicher Schadorganismus ist Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., der Erreger der bakteriellen Ringfäule (im Folgenden „Schadorganismus“ genannt).

HAT FOLGENDE RICHTLINIE ERLASSEN:

Artikel 1

Die Anhänge der Richtlinie 93/85/EWG erhalten die Fassung des Anhangs der vorliegenden Richtlinie.

Artikel 2

(1) Die Mitgliedstaaten erlassen und veröffentlichen bis spätestens 31. März 2007 die erforderlichen Rechts- und Verwaltungsvorschriften, um dieser Richtlinie nachzukommen. Sie teilen der Kommission unverzüglich den Wortlaut dieser Rechtsvorschriften mit und fügen eine Entsprechungstabelle dieser Rechtsvorschriften und der vorliegenden Richtlinie bei.

Sie wenden diese Vorschriften ab 1. April 2007 an.

Bei Erlass dieser Vorschriften nehmen die Mitgliedstaaten in den Vorschriften selbst oder durch einen Hinweis bei der amtlichen Veröffentlichung auf die vorliegende Richtlinie Bezug. Die Mitgliedstaaten regeln die Einzelheiten dieser Bezugnahme.

(2) Die Mitgliedstaaten teilen der Kommission unverzüglich den Wortlaut der wichtigsten innerstaatlichen Vorschriften mit, die sie auf dem unter die vorliegende Richtlinie fallenden Gebiet erlassen.

Artikel 3

Diese Richtlinie tritt am dritten Tag nach ihrer Veröffentlichung im Amtsblatt der Europäischen Union in Kraft.

Artikel 4

Diese Richtlinie ist an die Mitgliedstaaten gerichtet.

(1) ABl. L 259 vom 18.10.1993, S. 2.

ANHANG I

TESTSCHEMA FÜR DIE DIAGNOSE, DEN NACHWEIS UND DIE IDENTIFIZIERUNG DES ERREGERS DER BAKTERIELLEN RINGFÄULE DER KARTOFFEL, CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (Smith) Davis et al. ssp. SEPEDONICUS (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al.

ANWENDUNGSBEREICH DES TESTSCHEMAS

Das folgende Testschema beschreibt die verschiedenen Verfahren

i) zur Diagnose der bakteriellen Ringfäule in Kartoffelknollen und Kartoffelpflanzen,

ii) zum Nachweis von Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus in Proben von Kartoffelknollen und Kartoffelpflanzen,

iii) zur Identifizierung von Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (C. m. subsp. sepedonicus).

GRUNDREGELN

Optimierte Protokolle für die verschiedenen Methoden, validierte Reagenzien sowie die Einzelheiten für die Vorbereitung der Test- und Kontrollmaterialien sind in den Anlagen festgelegt. Anlage 1 enthält eine Liste der an der Optimierung und Validierung von Protokollen beteiligten Laboratorien.

Da die Protokolle dem Nachweis eines Quarantäneschadorganismus dienen und als Kontrollmaterialen lebensfähige Kulturen von C. m. subsp. sepedonicus (Cms) voraussetzen, müssen die Testverfahren in geeigneten Quarantäneeinrichtungen durchgeführt werden, die über angemessene Abfallentsorgungsanlagen und über eine entsprechende Zulassung durch die für Pflanzenquarantäne zuständige Behörde verfügen.

Die Testparameter müssen den eindeutigen und reproduzierbaren Nachweis von C. m. subsp. sepedonicus auf den für die gewählten Methoden vorgegebenen Schwellenwerten gewährleisten.

Die präzise Vorbereitung von Positivkontrollen ist unerlässlich.

Das Testen auf der Grundlage vorgegebener Schwellenwerte erfordert auch eine korrekte Einstellung, Wartung und Eichung der Testgeräte, den sorgfältigen Umgang mit und die Aufbewahrung von Reagenzien sowie Vorkehrungen zur Verhütung der Kontamination zwischen Proben, beispielsweise durch Trennung der Positivkontrollen von Testproben. Zur Vermeidung administrativer und sonstiger Fehler, insbesondere bei der Etikettierung und Dokumentierung, sind Qualitätskontrollen durchzuführen.

Ein Verdachtsfall im Sinne von Artikel 4 Absatz 2 der Richtlinie 93/85/EWG setzt ein positives Ergebnis der Diagnose- oder Screeningtests an einer Probe nach den Vorgaben der Flussdiagramme voraus.

Fällt der erste Screeningtest (IF- oder PCR-/FISH-Test) positiv aus, so besteht Verdacht einer C. m.-subsp.-sepedonicus-Kontamination, und es muss ein zweiter Screeningtest durchgeführt werden. Fällt dieser zweite Test ebenfalls positiv aus, so gilt der Verdacht als bestätigt (Befallsverdacht) und die im Flussdiagramm vorgegebenen Tests müssen fortgesetzt werden. Fällt der zweite Screeningtest negativ aus, so gilt die Probe als nicht kontaminiert.

Ein positiver IF-Test im Sinne von Artikel 4 Absatz 2 wird daher definiert als ein durch einen zweiten Screeningtest (PCR/FISH) bestätigter positiver IF-Befund.

Ein bestätigter Verdacht im Sinne von Artikel 5 Absatz 1 der Richtlinie 93/85/EWG erfordert die Isolierung und Identifizierung einer C. m.-subsp.-sepedonicus-Reinkultur und die Bestätigung der Pathogenität.

1. FLUSSDIAGRAMME

1.1. Nachweisverfahren zur Diagnose der bakteriellen Ringfäule in Kartoffelknollen und Kartoffelpflanzen mit Ringfäulesymptomen

Das Testverfahren ist für Kartoffelknollen und Kartoffelpflanzen mit ringfäuletypischen oder ringfäuleverdächtigen Symptomen geeignet. Es umfasst einen Schnell-Screeningtest, die Isolierung des Erregers aus infiziertem Gefäßgewebe auf Diagnosemedien und — bei positivem Ergebnis — die Identifizierung der Kultur als C. m. subsp. sepedonicus.

1.2. Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von C. m. subsp. sepedonicus in Proben symptomfreier Kartoffelknollen

Grundsatz

Das Testverfahren dient dem Nachweis latenter Infektionen von Kartoffelknollen. Ein positives Ergebnis bei mindestens zwei Screeningtests, die auf unterschiedlichen biologischen Grundsätzen beruhen, ist durch Isolierung des Erregers zu bestätigen. Bei Isolierung typischer Kolonien ist eine Reinkultur als C. m. subsp. sepedonicus zu bestätigen. Ein positiver Screeningtest allein reicht nicht aus, um die Probe als verdächtig einzustufen.

Screeningtests und Isolierungstests müssen eine Nachweisgrenze von 103 bis 104 Zellen/ml resuspendiertes Pellet gewährleisten, die als Positivkontrollen in jede Testreihe einzubeziehen sind.

1.3. Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus in Proben symptomfreier Kartoffelpflanzen

2. VISUELLE PRÜFUNG AUF RINGFÄULESYMPTOME

2.1. Kartoffelpflanzen

Unter europäischen Klimabedingungen zeigen sich Symptome in Feldbeständen nur selten und häufig nur gegen Ende der Saison. Die Symptome sind außerdem oft verschleiert oder werden mit anderen Krankheiten, Alterungsprozessen oder mechanischen Schäden verwechselt. Daher können Ringfäulesymptome bei Feldbesichtigungen leicht übersehen werden. Welkesymptome unterscheiden sich stark von denen der Schleimkrankheit; der Welkeprozess ist gewöhnlich langsam und zunächst auf die Blattränder beschränkt. Infizierte junge Blätter wachsen oft weiter, allerdings in infizierten Zonen weniger. Dadurch entstehen ungewöhnliche Blattformen. An Blättern, deren Gefäßgewebe weiter unten am Stängel blockiert ist, entwickeln sich häufig chlorotische, gelb bis schwach-bräunliche Verfärbungen zwischen den Blattadern. Infizierte Blättchen, Blätter und selbst Stängel können absterben. Oft bleiben Blätter und Knollen auch einfach kleiner. Mitunter bleiben die Pflanzen in ihrem Wachstum gestaucht. Farbabbildungen verschiedener Ringfäulesymptome können über folgende Internet-Website abgerufen werden: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

2.2. Kartoffelknollen

Erste Symptome sind eine leichte Glasigkeit oder Durchsichtigkeit des Gewebes insbesondere nah am Nabelende ohne Aufweichen des Gewebes um das Gefäßsystem. Der Gefäßbündelring am Nabelende kann leicht dunkler gefärbt sein als üblich. Die ersten erkennbaren Symptome sind eine Gelbfärbung des Gefäßbündelrings und, wenn auf die Knolle ein leichter Druck ausgeübt wird, eine aus den Gefäßen austretende käsige Substanz. Diese Absonderung enthält Millionen von Bakterien. In diesem Stadium kann sich eine Braunfärbung des Gefäßgewebes entwickeln, und die Knollensymptome sind mit denen der durch Ralstonia solanacearum verursachten Schleimkrankheit vergleichbar. Die Symptome können zunächst auf einen Teil des Rings, der sich nicht unbedingt in der Nähe des Nabelendes befinden muss, beschränkt sein und sich dann allmählich auf den gesamten Ring ausdehnen. Mit fortschreitender Infektion wird das Gefäßgewebe zerstört, der äußerlich dem Gefäßbündelgefäß angrenzende Gewebebereich kann sich ablösen. In fortgeschrittenen Stadien der Infektion erscheinen auf der Oberfläche der Knolle Risse, die an den Rändern oft eine gelblich-braune Färbung aufweisen. In Europa sind kürzlich verschiedene Fälle aufgetreten, in denen das Knolleninnere zur gleichen Zeit verfault wie der Gefäßbündelring, wodurch eine sekundäre Ausbreitung erfolgt, die dazu führt, dass das Knolleninnere zerfällt und Nekrose eintritt. Sekundärer Pilz- oder Bakterienbefall kann die Symptome verschleiern, und es kann schwierig, wenn nicht sogar unmöglich werden, die Symptome einer fortgeschrittenen Ringfäule von anderen Knollenfäulen zu unterscheiden. Es können auch atypische Symptome auftreten. Farbabbildungen der verschiedenen Symptome können über folgende Internet-Website abgerufen werden: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

3. PROBENAUFBEREITUNG

3.1. Kartoffelknollen

Hinweis:

— Die Standardprobe umfasst 200 Knollen je Test. Für umfangreichere Testreihen müssen mehr Proben dieser Größe untersucht werden. Mehr als 200 Knollen in der Probe führen zu Hemmreaktionen oder erschweren die Ergebnisauswertung. Das Verfahren ist aber auch für Proben mit weniger als 200 Knollen geeignet, wenn nur wenige Knollen zur Verfügung stehen.

— Die Validierung aller im Folgenden beschriebenen Nachweismethoden beruht auf der Untersuchung von Proben einer Größe von 200 Knollen.

— Der im Folgenden beschriebene Kartoffelextrakt kann auch zum Nachweis des Erregers der Schleimkrankheit der Kartoffel, Ralstonia solanacearum, verwendet werden.

Fakultative Vorbehandlung vor der Probenaufbereitung:

Knollen waschen. Zwischen den einzelnen Proben geeignete Desinfektionsmittel (Chlorverbindungen im Falle des PCR-Tests, um etwa vorhandene pathogene DNA zu entfernen) und Detergenzien verwenden. Knollen an der Luft trocknen lassen. Dieses Waschverfahren ist besonders für Proben mit viel überschüssiger Erde und in Fällen hilfreich (jedoch nicht vorgeschrieben), in denen ein PCR-Test oder ein direktes Isolierungsverfahren durchgeführt werden sollte.

3.1.1. Mit einem sauberen, sterilen Skalpell oder Gemüsemesser die Schale am Nabelende der Knolle entfernen, so dass das Gefäßbündelgewebe sichtbar wird. Am Nabelende jeder Knolle sorgfältig ein kleines, kegelförmiges Gewebestück aus dem Gefäßbereich herausschneiden. Dabei darauf achten, dass möglichst wenig nicht vaskuläres Gewebe erfasst wird (siehe Internet-Website: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Hinweis:

Knollen mit ringfäuleverdächtigen Symptomen (sichtbarer Fäulnis) sind auszusondern und separat zu testen.

Werden beim Entfernen des kegelförmigen Gewebestückchens ringfäuleverdächtige Symptome festgestellt, so sollte diese Knolle visuell geprüft werden, nachdem sie am Nabelende durchgeschnitten wurde. Durchschnittene Knollen mit verdächtigen Symptomen sollten zur Wundenverkorkung 2 Tage bei Raumtemperatur aufbewahrt und anschließend unter Quarantänebedingungen (bei 4-10 °C) gelagert werden, bis alle Tests abgeschlossen sind. Alle Knollen der Probe, einschließlich solcher mit Verdachtssymptomen, sind gemäß Anhang II aufzubewahren.

3.1.2. Die kegelförmigen Nabelendstückchen in unbenutzten verschließbaren und/oder verplombbaren Einwegbehältnissen sammeln (werden Behältnisse wieder verwendet, so sind sie mit Chlorverbindungen gründlich zu reinigen und zu desinfizieren). Die Gewebestückchen sind möglichst sofort zu verarbeiten bzw. — soweit dies nicht möglich ist — in ihrem Behältnis ohne Zugabe von Puffer für maximal 72 Stunden gekühlt bzw. für maximal 24 Stunden bei Raumtemperatur aufzubewahren. Ein Austrocknen und Verkorken der Gewebestückchen und Saprophyten-Bewuchs während der Lagerung können den Nachweis des Ringfäulebakteriums verhindern.

3.1.3. Die Gewebestückchen nach einem der folgenden Verfahren verarbeiten: Entweder

a) die Stückchen mit einer ausreichenden Menge (ungefähr 40 ml) Extraktionspuffer (Anlage 3) bedecken und auf einem Schüttler (50-100 rpm) für 4 Stunden bei einer Temperatur von weniger als 24 °C bzw. 16-24 Stunden bei Kühlschranktemperatur schütteln; oder

b) die Stückchen mit einer ausreichenden Menge (ungefähr 40 ml) Extraktionspuffer (Anlage 3) entweder in einem Waring- oder Ultra-Thurax-Mixer oder durch Zerkleinerung in einem robusten verschlossenen Einweg-Mazerationsbeutel (z. B. Stomacher- oder Bioreba-Plastikbeutel, 150 mm × 250 mm; strahlensterilisiert) mit einem Gummihammer oder einem geeigneten Zerkleinerungsgerät (z. B. Homex) homogenisieren.

Hinweis:

Das Risiko der Kreuzkontamination von Proben ist groß, wenn letztere mit einem Mixer homogenisiert werden. Es sind Vorkehrungen zu treffen, um jedes Versprühen oder Verschütten während des Extraktionsprozesses zu vermeiden. Ferner ist sicherzustellen, dass für jede Probe frisch sterilisierte Mixerblätter und Gefäße verwendet werden. Beim PCR-Test ist eine DNA-Übertragung auf Behälter oder Zerkleinerungsgeräte zu vermeiden. Die Zerkleinerung sollte in Einwegbeuteln und Einwegröhrchen erfolgen, wenn der PCR-Test angewendet werden soll.

3.1.4. Den Überstand umfüllen. Wenn er sehr trübe ist, entweder durch langsames Zentrifugieren (bei nicht mehr als 180 g für 10 Minuten zwischen 4-10 °C) oder durch Vakuumfiltration (40-100 µm) klären und den Filter mit zusätzlichem (10 ml) Extraktionspuffer (Anlage 3) waschen.

3.1.5. Die Bakterien durch 15-minütiges Zentrifugieren des erhaltenen Überstandes bei 7 000 g (oder für 10 Minuten bei 10 000 g) bei einer Temperatur zwischen 4-10 °C konzentrieren und den Überstand verwerfen, ohne das Pellet aufzurühren.

3.1.6. Das Pellet in 1,5 ml Pelletpuffer (Anlage 3) resuspendieren. 500 µl für das Testen auf C. m. subsp. sepedonicus, 500 µl für Ralstonia solanacearum und 500 µl für Referenzzwecke verwenden. Zum Referenzaliquot von 500 µl und den restlichen Testaliquots steriles Glyzerin zugeben, um eine Endkonzentration von 10–25 % (v/v) zu erreichen, vortexen und bei –16 bis –24 °C (Wochen) oder bei –68 bis –86 °C (Monate) lagern. Die Testaliquots während der Testung bei 4–10 °C aufbewahren.

Von wiederholtem Einfrieren und Auftauen wird abgeraten.

Muss der Extrakt befördert werden, so ist sicherzustellen, dass der Transport innerhalb von 24 bis 48 Stunden erfolgt und eine Kühlbox verwendet wird.

3.1.7. Zur Vermeidung von Kontaminationen müssen alle C. m. subsp. sepedonicus Positivkontrollen und Proben unbedingt separat behandelt werden. Dies gilt für IF-Objektträger und für sämtliche Tests.

3.2. Kartoffelpflanzen

Hinweis:

Zum Nachweis latenter C. m. subsp. sepedonicus Populationen wird empfohlen, Mischproben zu testen. Das Verfahren ist für Mischproben von bis zu 200 Stängelstücken geeignet. (Werden Erhebungen durchgeführt, so sollten diese an einer statistisch repräsentativen Probe der zu untersuchenden Pflanzenpopulation ausgerichtet werden.)

3.2.1. Mit einem sauberen, sterilen Messer oder einer Gartenschere am Stängelansatz genau über der Erde ein 1-2 cm großes Stängelstück herausschneiden.

Die Stängelstücke kurz mit 70 %igem Ethanol desinfizieren und sofort auf Papiertüchern trocken tupfen.

Die Stängelstücke in einem verschlossenen sterilen Behältnis sammeln und wie folgt verfahren:

3.2.2. Die Stängelstücke einer der folgenden Behandlungen unterziehen: Entweder

a) die Stücke mit einer ausreichenden Menge (ungefähr 40 ml) Extraktionspuffer (Anlage 3) bedecken und auf einem Schüttler (bei 50-100 rpm) für 4 Stunden bei einer Temperatur von weniger als 24 °C bzw. für 16-24 Stunden bei Kühlschranktemperatur schütteln; oder

b) die Stücke mit einer ausreichenden Menge (ungefähr 40 ml) Extraktionspuffer (Anlage 3) durch Zerkleinern in einem robusten Mazerationsbeutel (z. B. Stomacher- oder Bioreba-Beutel) mit einem Gummihammer oder einem geeigneten Zerkleinerungsgerät (z. B. Homex) unverzüglich verarbeiten. Soweit dies nicht möglich ist, die Stängelstücke für maximal 72 Stunden bei Kühlschranktemperatur und höchstens 24 Stunden bei Raumtemperatur lagern.

3.2.3. Den Überstand umfüllen, nachdem das Mazerat 15 Minuten gestanden hat.

3.2.4. Eine weitere Klärung des Extrakts oder Konzentration der Bakterien ist in der Regel nicht erforderlich, kann jedoch durch Filtrieren und/oder Zentrifugieren (siehe Abschnitte 3.1.4-3.1.6) erreicht werden.

3.2.5. Den unverdünnten bzw. konzentrierten Probenextrakt in zwei gleiche Teile teilen. Eine Hälfte während der Testung bei 4-10 °C aufbewahren, die andere Hälfte mit 10-25 %igem (v/v) sterilem Glyzerin bei -16 bis –24 °C (Wochen) oder bei –68 bis –86 °C (Monate) lagern für den Fall, dass weitere Tests erforderlich werden.

4. IF-TEST

Grundsatz

Der IF-Test wird als Hauptscreeningtest empfohlen, weil er nachweislich stabil genug ist, um die vorgeschriebenen Schwellenwerte zu erreichen.

Wird der IF-Test als Hauptscreeningtest angewandt und fällt der IF-Befund positiv aus, so muss als zweiter Screeningtest der PCR- oder der FISH-Test durchgeführt werden. Wird der IF-Test als zweiter Screeningtest angewandt und fällt der IF-Befund positiv aus, so sind zum Abschluss der Analyse weitere Tests (siehe Flussdiagramm) erforderlich.

Hinweis:

Stets einen polyklonalen Antikörper verwenden, wenn der IF-Test als Hauptscreeningtest angewandt wird. Bei positivem IF-Befund mit polyklonalem Antikörper kann ein weiterer Test der Proben mit einem monoklonalen Antikörper unter Umständen spezifischer sein, wenn auch weniger empfindlich.

Antikörper gegen einen Referenzstamm von C. m. subsp. sepedonicus verwenden. Es wird empfohlen, für jede neue Antikörpercharge den Titer zu bestimmen. Der Titer wird definiert als die höchste Verdünnung, bei der eine optimale Reaktion eintritt, wenn eine Suspension aus 105 bis 106 Zellen/ml des homologen Stammes von C. m. subsp. sepedonicus mit einem geeigneten Fluorescein-Isothiocyanat-(FITC)-Konjugat nach Herstellerspezifikationen getestet wird. Das polyklonale oder monoklonale Rohserum sollte einen IF-Titer von mindestens 1:2000 ergeben. Beim Test sollten die Antikörper in Arbeitsverdünnung(en) (AV) sehr nahe am oder auf dem Titerwert verwendet werden. Validierte Antikörper verwenden (siehe Website: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Der Test ist an frisch vorbereitenen Probenextrakten durchzuführen. Er kann erforderlichenfalls auch an Extrakten vorgenommen werden, die bei –68 bis –86 °C unter Glyzerinzugabe gelagert wurden. Das Glyzerin kann durch Zugabe von 1 ml Pelletpuffer (Anlage 4), 15-minütiges Rezentrifugieren bei 7 000 g und Resuspendieren in gleicher Menge Pelletpuffer entfernt werden. Dieser Arbeitsschritt ist häufig nicht erforderlich, vor allem, wenn die Proben durch Abflammen am Objektträger fixiert werden (siehe Abschnitt 2.2).

Separate Objektträger mit Positivkontrollen des homologen Stammes oder eines anderen Referenzstammes von C. m. subsp. sepedonicus, nach Anlage 2 in Kartoffelextrakt und fakultativ in Puffer suspendiert, herstellen.

Als ähnliche Kontrolle auf demselben Objektträger nach Möglichkeit natürlich infiziertes Gewebe (durch Lyophilisierung oder Einfrieren bei –16 bis –24 °C gelagert) verwenden.

Als Negativkontrollen Aliquots des Probenextrakts verwenden, deren vorheriges Testergebnis negativ war.

Multiwell-Objektträger mit vorzugsweise 10 Sichtfeldern von mindestens 6 mm Durchmesser verwenden.

Das Kontrollmaterial nach demselben Verfahren testen wie die Probe(n).

4.1. Die Objektträger nach einem der folgenden Verfahren vorbereiten:

i) Pellets mit relativ wenig Stärkesediment: Ein abgemessenes Standardvolumen (15 µl reichen für ein Feld von 6 mm Durchmesser aus — bei größeren Feldern ein entsprechend größeres Volumen verwenden) des 1/100 verdünnten resuspendierten Kartoffelpellets auf das erste Feld pipettieren. Dieselbe Menge unverdünntes Pellet (1/1) auf die restlichen Felder der Reihe pipettieren. Die zweite Reihe kann, wie in Abbildung 1 dargestellt, als Duplikat oder für eine zweite Probe verwendet werden.

ii) Andere Pellets: Dezimalverdünnungen (1/10 und 1/100) des resuspendierten Pellets in Pelletpuffer herstellen. Ein abgemessenes Standardvolumen (15 µl reichen für ein Feld von 6 mm Durchmesser aus — bei größeren Feldern ein entsprechend größeres Volumen verwenden) des resuspendierten Pellets und jeder Verdünnung auf eine Felderreihe pipettieren. Die zweite Reihe kann, wie in Abbildung 2 dargestellt, als Duplikat oder für eine zweite Probe verwendet werden.

4.2. Tropfen bei Umgebungstemperatur oder durch Erwärmen auf 40 bis 45 °C trocknen lassen. Bakterienzellen entweder durch 15-minütiges Erhitzen bei 60 °C, Abflammen, mit 95 %igem Ethanol oder nach genauen Anweisungen des Antikörper-Lieferanten am Objektträger fixieren.

Soweit erforderlich können fixierte Objektträger vor weiteren Tests eingefroren in einem trockenen Behältnis für kurze Zeit (jedoch höchstens drei Monate) gelagert werden.

IF-Verfahren:

i) Bei Objektträgervorbereitung nach 4.1 i: Einen Satz Zweifachverdünnungen des Antikörpers in IF-Puffer herstellen. Im ersten Feld sollte 1/2 des Titers (T/2), in den anderen Feldern 1/4 des Titers (T/4), 1/2 des Titers (T/2), der Titer (T) und das Doppelte des Titers (2T) enthalten sein.

ii) Bei Objektträgervorbereitung nach 4.1 ii: Herstellung der Arbeitsverdünnung (AV) des Antikörpers in IF-Puffer. Die Arbeitsverdünnung beeinflusst die Spezifität.

Abb. 1: Vorbereitung des Objektträgers nach 4.1 i und 4.3 i

Verdünnungen des resuspendierten Pellets 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Verdünnung des resuspendierten Pellets (T = Titer) T/2 T/4 T/2 T 2T  Zweifachver-dünnungen des Antiserums/Antikörpers Probe 1 1 2 3 4 5 Duplikat von Probe 1 oder Probe 2 6 7 8 9 10





Abb. 2: Vorbereitung des Objektträgers nach 4.1 ii und 4.3 ii

Arbeitsverdünnung des Antiserums/Antikörpers 1/1 1/10 1/100 leer leer  Dezimalver-dünnung des resuspendierten Pellets Probe 1 1 2 3 4 5 Duplikat von Probe 1 oder Probe 2 6 7 8 9 10

4.3.1. Die Objektträger auf feuchten Papiertüchern auslegen. Alle Testfelder mit Antikörperverdünnung(en) bedecken. Das auf die Felder aufgetragene Antikörpervolumen muss mindestens dem Volumen des aufgetragenen Extraktes entsprechen.

Liegen keine spezifischen Anweisungen des Antikörper-Lieferanten vor, so ist folgendes Verfahren anzuwenden:

4.3.2. Objektträger abgedeckt für 30 Minuten bei Raumtemperatur (18-25 °C) auf feuchten Papiertüchern inkubieren.

4.3.3. Antikörpertropfen vom Objektträger abschütteln, und die Objektträger sorgfältig mit IF-Puffer spülen. 5 Minuten mit IF-Puffer-Tween (Anlage 3) und anschließend 5 Minuten in IF-Puffer waschen. Kreuzkontaminationen durch Sprüh- oder Tropfenbildung vermeiden. Überschüssige Feuchtigkeit durch Abtupfen sorgfältig entfernen.

4.3.4. Objektträger auf feuchten Papiertüchern auslegen. Testfelder mit der zur Titer-Bestimmung verwendeten Verdünnung des FITC-Konjugats bedecken. Das auf die Felder aufgetragene Konjugatvolumen muss dem Volumen des aufgetragenen Antikörpers entsprechen.

4.3.5. Objektträger abgedeckt für 30 Minuten bei Raumtemperatur (18-25 °C) auf feuchten Papiertüchern inkubieren.

4.3.6. Tropfen vom Objektträger abschütteln. Wie unter 4.3.3 angegeben waschen und spülen.

Überschüssige Feuchtigkeit sorgfältig entfernen.

4.3.7. Auf jedes Feld 5-10 µl 0,1 M phosphatgepuffertes Glyzerin (Anlage 3) oder eine handelsübliche Antifading-Deckflüssigkeit auftragen und Deckglas auflegen.

IF-Test-Befund:

4.4.1. Test-Objektträger auf einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit Filtern, die für FITC-Anregung geeignet sind, unter Öl- oder Wasserimmersion bei einer Vergrößerung von 500-1 000 untersuchen. Jedes Feld in zwei rechtwinklig zueinander stehenden Durchmessern sowie entlang des Feldrandes mikroskopisch untersuchen. Bei Proben, die keine oder nur wenige Zellen zeigen, mindestens 40 Mikroskopfelder untersuchen.

Zunächst den Objektträger mit der Positivkontrolle prüfen. Die Zellen müssen stark fluoreszieren und bei dem festgelegten Antikörpertiter oder der festgelegten Arbeitsverdünnung vollständig gefärbt sein. Bei abweichender Färbung zum Normalzustand ist der IF-Test (Abschnitt 4) zu wiederholen.

4.4.2. Auf Anwesenheit hell fluoreszierender Zellen mit charakteristischer C. m. subsp. sepedonicus Morphologie in den Testfeldern auf den Testobjektträgern prüfen (siehe Website: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Die Intensität der Fluoreszenz muss der des positiven Kontrollstammes bei gleicher Antikörperverdünnung zumindest entsprechen oder besser sein. Unvollständig gefärbte oder nur schwach fluoreszierende Zellen sind nicht zu berücksichtigen.

Bei jeglichem Verdacht auf eine Kontamination ist der Test zu wiederholen. Dies kann der Fall sein, wenn alle Objektträger in einer Charge wegen Pufferkontamination positive Zellen zeigen oder wenn auf der Objektträgerbeschichtung (außerhalb der Felder) positive Zellen gefunden werden.

4.4.3. Der Immunofluoreszenztest hat in Bezug auf die Spezifität verschiedene Probleme. Es ist damit zu rechnen, dass in Pellets aus Kartoffelnabelenden und Stängelstücken Hintergrundpopulationen mit fluoreszierenden Zellen und atypischer Morphologie sowie kreuzreagierende saprophytische Bakterien mit C. m. sepedonicus ähnlicher Größe und Morphologie auftreten.

4.4.4. Nur fluoreszierende Zellen von typischer Größe und Morphologie bei Verwendung des Titers oder der Arbeitsverdünnung des Antikörpers (siehe 4.3) berücksichtigen.

4.4.5. Auswertung des IF-Befundes:

i) Für jede Probe, bei der stark fluoreszierende Zellen mit charakteristischer Morphologie gefunden werden, sind die mittlere Anzahl typischer Zellen je Mikroskopfeld zu schätzen und die Zahl typischer Zellen je ml resuspendiertes Pellet zu berechnen (Anlage 4). Der IF-Befund gilt bei Proben mit mindestens 5 × 103 typischen Zellen je ml resuspendiertes Pellet als positiv. Die Probe gilt in diesem Falle als potenziell kontaminiert, und es sind weitere Tests erforderlich.

ii) Der IF-Befund gilt bei Proben mit weniger als 5 × 103 Zellen je ml resuspendiertes Pellet als negativ. Weitere Tests sind in diesem Falle nicht erforderlich.

5. FISH-TEST

Grundsatz

Wird der FISH-Test als Hauptscreeningtest angewandt und fällt dieser Test positiv aus, so muss obligatorisch als zweiter Screeningtest der IF-Test durchführt werden. Wird der FISH-Test als zweiter Screeningtest durchgeführt und fällt der Test positiv aus, so sind zur Sicherung der Diagnose weitere Tests nach dem Flussdiagramm erforderlich.

Hinweis:

Validierte C. m. subsp. sepedonicus spezifische Oligo-Sonden (Anlage 7) verwenden. Vorausgehende Tests mit diesem Verfahren müssen gewährleisten, mindestens 103-104 Zellen von C. m. subsp. sepedonicus je ml, die Probenextrakten mit zuvor negativem Testergebnis zugefügt wurden, reproduzierbar nachzuweisen.

Das im Folgenden beschriebene Verfahren ist vorzugsweise an frisch vorbereitetem Probenextrakt durchzuführen, kann aber auch bei Probenextrakten angewendet werden, die bei –16 bis –24 °C oder bei –68 bis –86 °C unter Glyzerinzugabe gelagert wurden.

Als Negativkontrollen sind Aliquots von Probenextrakten zu verwenden, die zuvor mit negativem Testergebnis auf C. m. subsp. sepedonicus untersucht wurden.

Als Positivkontrollen aus einer 3-5 Tage alten Kultur Suspensionen mit 105 bis 106 C. m. subsp. sepedonicus Zellen je ml (z. B. Stamm NCPPB 4053 oder PD 406) in 0,01M Phosphatpuffer (PB) herstellen (siehe Anlage 2). Separate Objektträger mit Positivkontrollen des homologen Stammes oder eines anderen Referenzstammes von C. m. subsp. sepedonicus, in Kartoffelextrakt suspendiert, herstellen (siehe Anlage 2).

Die FITC-markierte eubakterielle Oligo-Sonde bietet insofern eine Kontrolle für den Hybridisierungsprozess, als sie alle Eubakterien anfärbt, die in der Probe vorhanden sind.

Das Kontrollmaterial nach demselben Verfahren testen wie die Probe(n).

5.1. Fixierung des Kartoffelextrakts

Das folgende Protokoll basiert auf Wullings et al., (1998):

5.1.1. Fixierlösung herstellen (siehe Anlage 7).

5.1.2. 100 µl von jedem Probenextrakt in ein Eppendorf-Röhrchen pipettieren und für 8 Minuten bei 7 000 g zentrifugieren.

5.1.3. Überstand verwerfen und das Pellet in 500 µl Fixiermittel, das < 24 Stunden zuvor angesetzt wurde, auflösen. Vortexen und über Nacht bei 4 °C inkubieren.

Als alternatives Fixiermittel kann 96 %iges Ethanol verwendet werden. Dazu das Pellet (Punkt 5.1.2) in 50 µl 0,01M PB und 50 µl 96 %igem Ethanol auflösen. Vortexen und für 30-60 Minuten bei 4 °C inkubieren.

5.1.4. Für 8 Minuten bei 7 000 g zentrifugieren. Überstand verwerfen und das Pellet in 75 µl 0,01M PB resuspendieren (siehe Anlage 3).

5.1.5. 16 µl der fixierten Suspensionen auf einen sauberen Multitest-Objektträger (siehe Abb. 3) auftragen. Zwei verschiedene Proben je Objektträger auftragen, unverdünnt, und 10 µl zur Herstellung einer 1/100 Verdünnung (in 0,01M PB) verwenden. Die restliche Probenlösung (49 µl) kann nach Zugabe von 1 Volumen 96 %igem Ethanol bei –20 °C gelagert werden. Für den Fall, dass der FISH-Test wiederholt werden muss, das Ethanol abzentrifugieren und dasselbe Volumen von 0,01M PB zugeben (durch Vortexen vermischen).

Abb. 3: Layout des FISH-Objektträgers

Probe 1 Blank Blank Blank Probe 2 Feld 1 Feld 2 Feld 3 Feld 4 Feld 5 Probe 1 Blank Blank Blank Probe 2 Feld 6 Feld 7 Feld 8 Feld 9 Feld 10 Deckglas 1 Deckglas 2

5.1.6. Objektträger an der Luft (oder bei 37 °C auf einer Wärmebank) trocknen lassen und anschließend durch Abflammen fixieren.

In dieser Phase des Verfahrens kann die Hybridisierung unterbrochen und am nächsten Tag fortgesetzt werden. Objektträger sind staubfrei und trocken bei Raumtemperatur zu lagern.

5.2. Vorhybridisierung und Hybridisierung

5.2.1. Eine Lysozymlösung mit 10 mg Lysozym (Sigma L-6876) in 10 ml Puffer (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0) herstellen. Diese Lösung kann gelagert, sollte jedoch höchstens einmal aus dem Frost aufgetaut werden. Jede Probe sorgfältig mit ungefähr 50 µl Lysozymlösung bedecken und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Objektträger anschließend nur einmal in entmineralisiertes Wasser tauchen und mit Filterpapier trocknen.

Alternativ können anstelle von Lysozym 50 µl von 40-400 µg ml-1 Proteinase K in Puffer (20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7,4) auf jedes Feld gegeben und bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert werden.

5.2.2. Die Zellen in aufsteigender Ethanolreihe von 50 %, 80 % und 96 % für jeweils 1 Minute dehydratisieren. Objektträger in einem Objektträgerhalter lufttrocknen lassen.

5.2.3. Durch Auslegen des Bodens einer luftdichten Box mit Zellstoff- oder Filterpapier, das in 1x Hybmix (Anlage 7) eingeweicht wurde, eine feuchte Inkubationskammer vorbereiten. Die Box im Hybridisierungsofen bei 55 °C für mindestens 10 Minuten vorinkubieren.

5.2.4. Die Hybridisierungslösung (Anlage 7) herstellen (45 µl je Objektträger) und für 5 Minuten bei 55 °C vorinkubieren.

5.2.5. Objektträger auf eine heiße (45 °C) Platte legen und 10 μl Hybridisierungslösung in jede der 4 Felder auf dem (den) Objektträger(n) geben.

5.2.6. Jeden Objektträger ohne Lufteinschluss mit zwei Deckgläsern (24 × 24 mm) abdecken. Objektträger in die vorgewärmte feuchte Kammer stellen und im Hybridisierungsofen über Nacht bei 55 °C im Dunkeln inkubieren.

5.2.7. Drei Becher vorbereiten mit 1 l Reinstwasser (UPW), 1 l 1x Hybmix (334 ml 3x Hybmix und 666 ml UPW) und 1 l 1/2x Hybmix (167 ml 3x Hybmix und 833 ml UPW) und jeweils im Wasserbad bei 55 °C einzeln vorinkubieren.

5.2.8. Deckgläser abnehmen und Objektträger in einen Objektträgerhalter stellen.

5.2.9. Auswaschen der überschüssigen Sonde durch 15-minütige Inkubation im Becher mit 1x Hybmix bei 55 °C.

5.2.10. Objektträgerhalter in 1/2 Hybmix-Waschlösung stellen und für weitere 15 Minuten inkubieren.

5.2.11. Objektträger kurz in den Becher mit Reinstwasser (UPW) tauchen und auf Filterpapier setzen. Überschüssige Feuchtigkeit durch leichtes Abdecken der Oberfläche mit Filterpapier aufsaugen. 5-10 μl Antifading-Deckflüssigkeit (z. B. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA o. Ä.) auf jedes Feld geben und den gesamten Objektträger mit einem großen Deckglas (24 × 60 mm) abdecken.

5.3. FISH-Test-Befund

5.3.1. Den Objektträger unverzüglich unter einem Epifluoreszenz-Mikroskop bei 630- oder 1 000facher Vergrößerung unter Ölimmersion untersuchen. Mit einem für die Fluorescein-Isothiocyanat-Markierung (FITC) geeigneten Filter werden eubakterielle Zellen (einschließlich der meisten Gram-negativen Zellen) in der Probe leuchtend grün angefärbt. Mit einem Filter für Tetramethylrhodamin-5-Isothiocyanat leuchten Cy3-angefärbte Zellen von C. m. subsp. sepedonicus fluoreszierend rot. Die Zellmorphologie mit der der Positivkontrollen vergleichen. Die Zellen müssen stark fluoreszieren und vollständig gefärbt sein. Der FISH-Test (Abschnitt 9.4) ist bei abweichender Färbung zum Normalzustand zu wiederholen. Jedes Sichtfeld in zwei rechtwinklig zueinander stehenden Durchmessern sowie entlang des Feldrandes mikroskopisch untersuchen. Bei Proben, die keine oder nur wenige Zellen zeigen, mindestens 40 Mikroskopfelder untersuchen.

5.3.2. Auf stark fluoreszierende Zellen mit charakteristischer Morphologie von C. m. subsp. sepedonicus in den Testfeldern auf den Testobjektträgern untersuchen (siehe Website: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Die Intensität der Fluoreszenz muss der des positiven Kontrollstammes entsprechen oder stärker sein. Unvollständig gefärbte oder schwach fluoreszierende Zellen sind nicht zu berücksichtigen.

5.3.3. Bei jeglichem Verdacht auf eine Kontamination ist der Test zu wiederholen. Dies kann der Fall sein, wenn alle Objektträger in einer Charge wegen Pufferkontamination positive Zellen zeigen oder wenn positive Zellen auf der Objektträgerbeschichtung (außerhalb der Felder) gefunden werden.

5.3.4. Der FISH-Test hat in Bezug auf die Spezifität verschiedene Probleme. Es ist damit zu rechnen, dass in Pellets aus Kartoffelnabelenden und Stängelstücken Hintergrundpopulationen fluoreszierender Zellen mit atypischer Morphologie und kreuzreagierende saprophytische Bakterien mit C. m. subsp. sepedonicus ähnlicher Größe und Morphologie auftreten, wenn auch weniger häufig als beim IF-Test.

5.3.5. Es sind nur fluoreszierende Zellen typischer Größe und Morphologie (siehe 5.3.2) zu berücksichtigen.

5.3.6. Auswertung des FISH-Test-Befundes:

i) Gültig sind FISH-Test-Ergebnisse, wenn mit Hilfe des FITC-Filters grün fluoreszierende Zellen mit C. m. subsp. sepedonicus typischer Größe und Morphologie und mit Hilfe des Rhodaminfilters rot fluoreszierende Zellen in allen Positivkontrollen, jedoch in keiner einzigen Negativkontrolle festgestellt werden. Werden hell fluoreszierende Zellen einer charakteristischen Morphologie festgestellt, für jedes mikroskopische Feld die durchschnittliche Anzahl typischer Zellen schätzen und die Zahl der typischen Zellen je ml resuspendiertes Pellet (Anlage 4) berechnen. Proben mit mindestens 5 × 103 typischen Zellen je ml resuspendiertes Pellet gelten als potenziell kontaminiert, und weitere Tests sind erforderlich. Proben mit weniger als 5 × 103 typischen Zellen je ml resuspendiertes Pellet gelten als negativ.

ii) Der FISH-Test ist negativ, wenn mit dem Rhodaminfilter keine rot fluoreszierenden Zellen mit C. m. subsp. sepedonicus typischer Größe und Morphologie festgestellt werden, vorausgesetzt allerdings, dass sich in den Positivkontrollen bei Verwendung des Rhodaminfilters typische rot fluoreszierende Zellen nachweisen lassen.

6. PCR-TEST

Grundsatz

Wird der PCR-Test als Hauptscreeningtest angewandt und fällt dieser Test positiv aus, so muss obligatorisch als zweiter Screeningtest der IF-Test durchgeführt werden. Wird der PCR-Test als zweiter Screeningtest durchgeführt und fällt der Test positiv aus, so sind zur Sicherung der Diagnose weitere Tests nach dem Flussdiagramm erforderlich.

Dieses Testverfahren wird als Hauptscreeningtest nur empfohlen, wenn es fachkundig durchgeführt werden kann.

Hinweis:

Vorausgehende Tests mit diesem Verfahren müssen gewährleisten, mindestens 103 bis 104 Zellen von C. m. subsp. sepedonicus je ml, die Probenextrakten mit zuvor negativem Testergebnis zugefügt wurden, reproduzierbar nachzuweisen. Möglicherweise sind Optimierungsversuche erforderlich, um in allen Laboratorien ein höchstmögliches Niveau an Sensitivität und Spezifität zu gewährleisten.

Validierte PCR-Reagenzien und -Protokolle verwenden. Vorzugsweise eine Methode mit interner Kontrolle wählen.

Alle erforderlichen Vorkehrungen treffen, um eine Kontamination der Probe mit Ziel-DNA zu vermeiden. Der PCR-Test ist von erfahrenen Technikern und in für molekularbiologische Arbeiten vorgesehenen Laboratorien durchzuführen, um das Risiko einer Kontamination mit Ziel-DNA auf ein Mindestmaß zu begrenzen.

Negativkontrollen (für DNA-Extraktions- und PCR-Verfahren) sind stets als letzte Probe zu behandeln, damit nachvollziehbar bleibt, ob eine DNA-Verschleppung stattgefunden hat.

Die folgenden Negativkontrollen sollten in den PCR-Test einbezogen werden:

— Probenextrakt, der zuvor negativ auf C. m. subsp. sepedonicus getestet wurde,

— Pufferkontrollen, die zum Extrahieren des Bakteriums und der DNA aus der Probe verwendet werden,

— PCR-Reaktionsmischung.

Die folgenden Positivkontrollen sollten in den PCR-Test einbezogen werden:

— Aliquots resuspendierter Pellets, denen C. m. subsp. sepedonicus zugegeben wurde (für die Vorbereitung siehe Anlage 2),

— eine Suspension aus 106 Zellen je ml C. m. subsp. sepedonicus in Wasser aus einem virulenten Isolat (z. B. NCPPB 2140 oder NCPPB 4053),

— soweit möglich während des PCR-Tests auch DNA aus positiven Kontrollproben verwenden.

Um potenzielle Kontaminationen zu vermeiden, sind Positivkontrollen von den Testproben räumlich getrennt vorzubereiten.

Probenextrakte sollten möglichst frei von Erdresten sein. Daher empfiehlt sich in bestimmten Fällen, Extrakte aus gewaschenen Kartoffeln herzustellen, wenn PCR-Protokolle angewendet werden sollen.

6.1. DNA-Reinigungsmethoden

Positive und negative Kontrollproben wie oben beschrieben verwenden.

Kontrollmaterial wie die Probe(n) vorbereiten.

Es stehen diverse Methoden zur Reinigung der Ziel-DNA aus komplexen Probensubstraten zur Verfügung, wodurch PCR-Inhibitoren entfernt und andere enzymatische Reaktionen ausgeschlossen werden und die Ziel-DNA im Probenextrakt konzentriert wird.

Die folgende Methode wurde zur Verwendung mit der validierten PCR-Methode (siehe Anlage 6) optimiert.

6.1. a) Methode nach Pastrik (2000):

1. 220 µl Lysispuffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen pipettieren.

2. 100 µl Probenextrakt zugeben und bei 95 °C für 10 Minuten in einen Thermoblock oder ein Wasserbad stellen.

3. Röhrchen 5 Minuten auf Eis kühlen.

4. 80 µl Lysozym-Stammlösung (50 mg Lysozym je ml in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) zugeben und für 30 Minuten bei 37 °C inkubieren.

5. 220 µl Easy DNA® Lösung A (Invitrogen) zugeben, durch Vortexen mischen und bei 65 °C für 30 Minuten inkubieren.

6. 100 µl Easy DNA® Lösung B (Invitrogen) zugeben und kräftig vortexen, bis das Präzipitat im Röhrchen frei fließt und die Probe gleichmäßig viskös ist.

7. 500 µl Chloroform zugeben und vortexen, bis die Viskosität nachlässt und die Mischung homogen wird.

8. Zur Phasentrennung und Ausbildung der Interphase bei 15 000 g und 4 °C für 20 Minuten zentrifugieren.

9. Oberphase in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen überführen.

10. 1 ml 100 % Ethanol (–20 °C) zugeben, kurz vortexen und für 10 Minuten auf Eis inkubieren.

11. Bei 15 000 g und 4 °C für 20 Minuten zentrifugieren und das Ethanol vom Pellet entfernen.

12. 500 µl 80 % Ethanol (–20 °C) zugeben und durch Invertieren des Röhrchens mischen.

13. Bei 15 000 g und 4 °C für 10 Minuten zentrifugieren, das Pellet bewahren und das Ethanol entfernen.

14. Pellet an der Luft oder in einer DNA-Speedvac trocknen lassen.

15. Pellet in 100 µl sterilem Reinstwasser (UPW) resuspendieren und bei Raumtemperatur mindestens 20 Minuten stehen lassen.

16. Bei –20 °C lagern, bis es für die PCR benötigt wird.

17. Etwa vorhandenes weißes Präzipitat abzentrifugieren und 5 µl des DNA-haltigen Überstands für die PCR verwenden.

6.1. b) Andere Methoden

Andere Methoden der DNA-Extraktion (z. B. Qiagen DNeasy Plant Kit) sind akzeptabel, sofern sie DNA aus Kontrollproben mit 103 bis 104 Zellen des Krankheitserregers je ml nachweislich ebenso wirksam reinigen.

6.2. PCR

6.2.1. Test- und Kontroll-Templates nach dem validierten Protokoll (Anlage 6) für die PCR vorbereiten. Eine Dezimalverdünnung des Proben-DNA-Extrakts (1:10 in UPW) herstellen.

6.2.2. Nach dem vorgegebenen Protokoll (Anlage 6) in einem kontaminationsfreien Umfeld eine geeignete PCR-Reaktionsmischung herstellen. Das validierte PCR-Protokoll ist eine multiplexe Reaktion, die auch eine interne PCR-Kontrolle enthält.

6.2.3. 5 µl DNA-Extrakt je 25 µl PCR-Reaktion in sterile PCR-Röhrchen geben.

6.2.4. Eine negative Kontrollprobe mit ausschließlich PCR-Reaktionsmischung einbeziehen und anstelle der Probe UPW zugeben, das zur Herstellung der PCR-Mischung verwendet wird.

6.2.5. Die Röhrchen in den Thermocycler stellen, der für die vorausgehenden Tests verwendet wurde, und das entsprechend optimierte PCR-Programm (Anlage 6) verwenden.

6.3. Analyse des PCR-Produktes

6.3.1. PCR-Fragmente durch Agarose-Gelelektrophorese auftrennen. Dazu mindestens 12 µl amplifizierte DNA-Reaktionsmischung jeder Probe, mit 3 µl Beladungspuffer (Anlage 6) gemischt, in 2,0 %igem (w/v) Agarose-Gelen in Tris-Acetat-EDTA (TAE) Puffer (Anlage 6) bei 5-8 V je cm laufen lassen. Einen geeigneten DNA-Marker, z. B. 100 bp ladder, verwenden.

6.3.2. DNA-Banden durch Anfärben in Ethidiumbromid (0,5 mg je l) für 30-45 Minuten sichtbar machen. Dieses Mutagen vorsichtig handhaben.

6.3.3. Das angefärbte Gel unter UV-Transillumination (z. B. λ = 302 nm) auf amplifizierte PCR-Produkte der erwarteten Größe (Anlage 6) untersuchen und dokumentieren.

6.3.4. Bei neuen Feststellungen/Fällen ist die Authentizität des PCR-Fragments durch Restriktionsenzymanalyse an einer Probe der verbliebenen amplifizierten DNA zu bestätigen, d. h. die Probe bei optimaler Temperatur und Zeitdauer mit einem geeigneten Enzym und Puffer (siehe Anlage 6) zu inkubieren. Die verdauten Fragmente wie zuvor durch Agarose-Gelelektrophorese auftrennen, nach Anfärben mit Ethidiumbromid charakteristische Restriktionsfragmentmuster unter UV-Transillumination prüfen und mit der unverdauten und verdauten Positivkontrolle vergleichen.

Auswertung des PCR-Testergebnisses:

Der PCR-Test ist negativ, wenn das C. m. subsp. sepedonicus spezifische PCR-Produkt der erwarteten Größe nicht für die untersuchte Probe, jedoch für alle positiven Kontrollproben nachgewiesen wird (bei der Multiplex-PCR mit pflanzenspezifischen internen Kontrollprimern muss ein zweites PCR-Produkt in erwarteter Größe in der untersuchten Probe amplifiziert werden).

Der PCR-Test ist positiv, wenn das C. m. subsp. sepedonicus spezifische PCR-Produkt der erwarteten Größe und (soweit erforderlich) des erwarteten Restriktionsmusters nachgewiesen wird, vorausgesetzt, es wird nicht in einer der negativen Kontrollproben amplifiziert. Ein positiver Befund kann auch durch Wiederholung des Tests mit einem zweiten PCR-Primerset (Abschnitt 9.3) verlässlich bestätigt werden.

Hinweis:

Es besteht Verdacht auf PCR-Hemmung, wenn das erwartete Fragment aus der positiven Kontrollprobe stammt, die C. m. subsp. sepedonicus in Wasser enthält, bei positiven Kontrollproben, die C. m. subsp. sepedonicus in Kartoffelextrakt enthalten, jedoch negative Ergebnisse erzielt werden. In Multiplex-PCR-Protokollen mit internen PCR-Kontrollen liegt eine Reaktionshemmung vor, wenn keines der beiden Fragmente erhalten wird.

Es besteht Verdacht auf Kontamination, wenn das erwartete Fragment in einer oder mehrerer der Negativkontrollen erhalten wird.

7. BIOTEST

Hinweis:

Vorausgehende Tests mit diesem Verfahren müssen gewährleisten, mindestens 103 bis 104 koloniebildende Einheiten von C. m. subsp. sepedonicus je ml, die Probenextrakten mit zuvor negativem Testergebnis zugefügt wurden, reproduzierbar nachzuweisen (für die Vorbereitung siehe Anlage 2).

Optimale Nachweisempfindlichkeit ist unter optimalen Wachstumsbedingungen und bei Verwendung von frisch hergestelltem Probenextrakt gegeben. Die Methode ist jedoch auch für Extrakte geeignet, die bei –68 bis –86 °C unter Glyzerinzugabe gelagert wurden.

Einige Auberginensorten sind ein ausgezeichnetes selektives Anreicherungsmedium für das Wachstum von C. m. subsp. sepedonicus, selbst wenn keine Symptome erkennbar sind, und perfekt geeignet für Bestätigungstests an der Wirtpflanze.

Die Wachstumsbedingungen müssen optimal sein, um falsch-negative Testergebnisse zu vermeiden.

Für Einzelheiten zur Kultivierung siehe Anlage 8.

7.1. Das gesamte restliche Testaliquot des resuspendierten Pellets (siehe Abschnitt 3.1.6 bzw. 3.2.5) nach einer der nachstehend beschriebenen Methoden (Abschnitt 7.3 oder 7.4) auf die Auberginenpflanzen verteilen. Nur Pflanzen im Blattstadium 2-3, d. h. bis zur vollen Ausbildung des dritten Blattes, verwenden. Um zu gewährleisten, dass das resuspendierte Pellet vollständig verwendet wird und die Beimpfung wirksam ist, sind für die nachstehend beschriebenen Verfahren 15-25 Auberginen je Probe erforderlich.

7.2. Die Auberginen für 1 bis 2 Tage vor der Beimpfung nicht wässern, um den osmotischen Druck (Turgor) zu verringern.

Schlitzinokulation

7.3.1. Die Auberginenpflanze zwischen zwei Fingern halten, einen Tropfen (etwa 5 bis 10 µl) des suspendierten Pellets zwischen den Keimblättern und dem ersten Blatt auf den Stängel pipettieren.

7.3.2. Mit einem sterilen Skalpell den Stängel vom Pellettropfen aus diagonal 1,0 cm lang und etwa zwei Drittel der Stängeldicke tief einritzen.

7.3.3. Den Schnitt mit steriler Vaseline (Spritze) versiegeln.

7.4. Spritzeninokulation

Die Auberginenstängel mit einer Spritze, die mit einer hypodermischen Nadel (nicht weniger als 23G) versehen ist, direkt über den Keimblättern beimpfen. Die Probe auf die Auberginenpflanze verteilen.

7.5. Als Positivkontrollen 5 Auberginenpflanzen nach derselben Inokulationsmethode (7.3 bzw. 7.4) mit einer wässrigen Suspension von 105 bis 106 Zellen je ml einer bekannten Kultur von C. m. subsp. sepedonicus und, soweit möglich, mit natürlich infiziertem Knollengewebe (siehe Abschnitt 4) beimpfen.

7.6. Als Negativkontrolle 5 Pflanzen nach derselben Inokulationsmethode (7.3 bzw. 7.4) mit sterilem Pelletpuffer beimpfen.

7.7. Die Pflanzen in Quarantäneeinrichtungen bei 18-24 °C für bis zu vier Wochen inkubieren. Dabei für ausreichende Beleuchtung und hohe Feuchtigkeit (70-80 %) sorgen und regelmäßig wässern, um Staunässe oder Welken durch Wassermangel zu verhindern. C. m. subsp. sepedonicus Zellen werden bei Temperaturen von über 30 °C abgetötet; die optimale Temperatur liegt bei 21 °C. Um Kontaminationen zu vermeiden, positive und negative Kontrollpflanzen auf getrennten Arbeitstischen in einem Gewächshaus oder einer Wachstumskammer inkubieren oder, bei Platzmangel, sicherstellen, dass die Behandlungen streng getrennt erfolgen. Müssen verschiedene Proben eng nebeneinander inkubiert werden, so sind sie durch geeignete Schutzwände zu trennen. Beim Düngen, Wässern, Untersuchen oder anderen Behandlungen sind alle erforderlichen Vorkehrungen zu treffen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Gewächshäuser und Wachstumskammern müssen unbedingt frei von Insekten jeder Art gehalten werden, da diese das Bakterium von Probe zu Probe übertragen können.

7.8. Nach einer Woche regelmäßig auf Symptome untersuchen. Pflanzen mit Symptomen zählen. C. m. subsp. sepedonicus verursacht Welken, das mit einer Schlaffheit der Blätter an den Rändern oder zwischen den Blattnerven beginnen kann. Welkes Gewebe kann zunächst dunkelgrün oder gesprenkelt aussehen, erblasst jedoch, bevor es nekrotisch wird. Welke Stellen zwischen den Blattnerven haben häufig ein öliges wässrig durchtränktes Aussehen. Nekrotisches Gewebe hat oft einen hellgelben Rand. Die Auberginen sterben nicht unbedingt ab; je länger es dauert, bis sich Symptome entwickeln, desto größer die Überlebenschancen. Die Pflanzen können aus der Infektion herauswachsen. Junge Auberginen sind gegenüber niedrigen Populationen von C. m. subsp. sepedonicus wesentlich empfindlicher als ältere Pflanzen; deshalb sollten die Pflanzen im oder kurz vor Blattstadium 3 verwendet werden.

Das Welken kann auch durch das Vorhandensein anderer Bakterien oder Pilze hervorgerufen werden, die sich im Knollengewebepellet befinden. Dazu gehören Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora subsp. carotovora und E. carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata sowie große Populationen saprophytischer Bakterien. Insbesondere Erwinia chrysanthemi kann Blattsymptome und eine Welke hervorrufen, die den Welkesymptomen von C. m. subsp. sepedonicus sehr ähnlich ist. Der einzige Unterschied besteht darin, dass die Stängel bei Erwinia-chrysanthemi-Infektionen schwarz werden. Andere Welken lassen sich von der durch C. m. subsp. sepedonicus hervorgerufenen Welke dadurch unterscheiden, dass rasch ganze Blätter oder ganze Pflanzen welken. Zur Differenzierung zwischen C. m. subsp. sepedonicus und Erwinia spp. kann auch eine Gram-Färbung vorgenommen werden.

7.9. Sobald an den Auberginenpflanzen Symptome festgestellt werden, sollte an welken Blattabschnitten oder Stängelteilen der Pflanzen (siehe 3.1.3 für Gewebezerkleinerung) eine Reisolierung vorgenommen werden. Die Oberfläche der Auberginenblätter und -stängel durch Abreiben mit 70 %igem Ethanol desinfizieren. Einen IF- oder PCR-Test am Pflanzensaft durchführen und auf einem geeigneten (selektiven) Medium (siehe Abschnitt 8) isolieren. Es kann auch eine Gram-Färbung (siehe Anlage 9) vorgenommen werden. Reinkulturen von C. m. subsp. sepedonicus verdächtigen Isolaten identifizieren und die Pathogenität bestätigen (siehe Abschnitte 9 und 10).

7.10. Unter bestimmten Umständen, insbesondere dann, wenn die Wachstumsbedingungen nicht optimal sind, kann es vorkommen, dass C. m. subsp. sepedonicus in den Auberginen selbst nach einer Inkubationszeit von bis zu vier Wochen als latente Infektion weiter besteht. Werden nach vier Wochen keine Symptome festgestellt, den IF-/PCR-Test an einer Mischprobe von 1 cm langen Stängelabschnitten jeder Testpflanze, die über der Inokulationsstelle herausgeschnitten werden, durchführen. Fällt der Test positiv aus, so sollte nach dem Verfahren gemäß Abschnitt 8 eine Reisolierung auf geeigneten (selektiven) Medien vorgenommen werden. Reinkulturen von C. m. subsp. sepedonicus verdächtigen Isolaten identifizieren und die Pathogenität bestätigen (siehe Abschnitte 9 und 10).

Auswertung des Biotest-Ergebnisses:

Gültig sind Biotest-Ergebnisse, wenn Pflanzen der Positivkontrolle typische Symptome zeigen, das Bakterium aus diesen Pflanzen reisoliert werden kann und bei den Negativkontrollen keine Symptome festgestellt werden.

Das Testergebnis ist negativ, wenn die Testpflanzen nicht mit C. m. subsp. sepedonicus infiziert sind und sofern C. m. subsp. sepedonicus in Positivkontrollen nachgewiesen wird.

Das Testergebnis ist positiv, wenn die Testpflanzen mit C. m. subsp. sepedonicus infiziert sind.

8. ISOLIERUNG VON C. M. SUBSP. SEPEDONICUS

Hinweis:

Die Diagnose gilt erst als gesichert, wenn C. m. subsp. sepedonicus isoliert und anschließend identifiziert (siehe Abschnitt 9) und durch einen Pathogenitätstest (Abschnitt 10) bestätigt wird. Obgleich C. m. subsp. sepedonicus ein anspruchsvoller Organismus ist, lässt er sich dennoch aus symptomatischem Gewebe isolieren.

Der Erreger kann jedoch von rasch wachsenden saprophytischen Bakterien überwuchert werden; daher ist das Isolieren direkt aus dem Knollen- oder Stängelgewebepellet (Abschnitt 3.1.6 bzw. 3.2.5) schwierig. Mit selektivem Medium und einer geeigneten Verdünnung der resuspendierten Pellets aus Nabelendenstücken der Kartoffel oder Stängeln von Kartoffelpflanzen lässt sich C. m. subsp. sepedonicus möglicherweise direkt isolieren.

Isolierungen sind bei allen Kartoffelknollen oder Stängelstücken mit entsprechenden Symptomen und bei Auberginen vorzunehmen, bei denen zwar keine Symptome festgestellt werden, deren Mischprobe bei der IF-/PCR-Testung jedoch positiv ausgefallen ist (siehe Abschnitt 7.10). Ist eine Zerkleinerung von Auberginenstängeln erforderlich, so sollte sie nach den Vorgaben vom Abschnitt 3.1.3 durchgeführt werden.

Als Positivkontrollen sind Dezimalverdünnungen aus einer Suspension von 106 cfu je ml C. m. subsp. sepedonicus (z. B. NCPPB 4053 oder PD 406) herzustellen. Um jegliches Risiko einer Kontamination zu vermeiden, sind die Positivkontrollen von den Testproben völlig getrennt herzustellen.

Für jede neu hergestellte Charge eines Selektivmediums ist dessen Eignung für das Wachstum des Erregers zu prüfen, bevor es zur Untersuchung von Routineproben verwendet wird.

Das Kontrollmaterial nach demselben Verfahren wie die Probe(n) testen.

8.1. Selektivausstrich

8.1.1. Aus einem 100 µl Aliquot einer resuspendierten Kartoffelpelletprobe oder von Auberginensaft 10fache Verdünnungen in Pelletpuffer (Anlage 3) herstellen.

8.1.2. Die Isolierung aus unverdünntem Kartoffelpellet gelingt aufgrund des problematischen Wachstumsverhaltens des Erregers und der Konkurrenz durch Saprophyten in der Regel nicht. Da das Bakterium gewöhnlich in hohen Populationen in infiziertem Gewebe vorliegt, können die Saprophyten in der Regel ausverdünnt werden, während der Erreger noch vorhanden bleibt. Daher wird empfohlen, 100 µl von jeder Probe, 1/100 bis 1/10 000 verdünnt, mit Ausstrichspateln („hockey sticks“) nach dem Ausstrichverfahren auf MTNA-Medium oder NCP-88-Medium (Anlage 5) auszustreichen (für 90 mm Petrischalen geeignet, die Menge bei Verwendung anderer Schalengröße anpassen).

Hinweis:

Alternativ kann das ursprüngliche 100 µl Kartoffelpelletaliquot (1/100) mit einem Spatel auf einer ersten Agarplatte ausgestrichen werden. Anschließend das noch am Spatel anhaftende Restaliquot auf einer zweiten Agarplatte ausstreichen und den Vorgang schließlich mit einer dritten Platte wiederholen, wodurch mit dem Spatel ein Verdünnungsausstrich erreicht wird.

8.1.3. Die Platten im Dunkeln bei 21-23 °C inkubieren.

8.1.4. Die Platten nach drei Tagen erstmals untersuchen und, im Vergleich zu den Referenzplatten, alle C. m. subsp. sepedonicus ähnlichen Kolonien zählen; weitere Zählungen nach 5, 7 und ggf. 10 Tagen vornehmen.

8.2. Reinigung verdächtiger Kolonien

Hinweis:

Für die Inokulation der Auberginen und/oder anschließende Identifizierung sind C. m. subsp. sepedonicus ähnliche Kolonien zuvor auf YGM-Medium zu kultivieren; dies sollte geschehen, bevor die Platten all zu überwachsen sind, d. h. vorzugsweise nach 3-5 Tagen.

8.2.1. C. m. subsp. sepedonicus ähnliche Kolonien auf einem der folgenden Medien ausstreichen (Zusammensetzung siehe Anlage 5):

Dextrose-Nähragar (nur für die Subkultivierung verwenden),

Hefe-Pepton-Glucose-Agar,

Hefeextrakt-Mineralsalz-Agar.

Maximal 10 Tage bei 21-24 °C inkubieren.

C. m. subsp. sepedonicus wächst langsam und bildet innerhalb von 10 Tagen in der Regel winzige, cremefarbene, kuppelförmige Kolonien (für Fotos typischer Kolonien von C. m. subsp. sepedonicus siehe Internet-Website: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

8.2.2. Zur Herstellung der Reinkultur erneut ausstreichen.

Die Wachstumsgeschwindigkeit verbessert sich mit der Subkultivierung. Typische Kolonien sind cremig-weiß oder elfenbeinfarben, gelegentlich auch gelb, abgerundet, glatt, erhöht, konvex gewölbt, schleimig-flüssig, mit glatten Rändern und einem Durchmesser von in der Regel 1 bis 3 mm.

Eine einfache Gram-Färbung (siehe Anlage 9) kann bei der Auswahl von Kolonien für weitere Testungen hilfreich sein.

8.2.3. Verdächtige Kulturen identifizieren (siehe Abschnitt 9) und einen Pathogenitätstest durchführen (siehe Abschnitt 10).

9. IDENTIFIZIERUNG

Reinkulturen von C. m. subsp. sepedonicus verdächtigen Isolaten mit mindestens zwei der folgenden Testmethoden, die auf unterschiedlichen biologischen Grundsätzen beruhen, identifizieren.

Für jeden durchgeführten Test ggf. bekannte Referenzstämme einbeziehen.

9.1. Nähr- und enzymatische Tests zur Identifizierung

Die folgenden phänotypischen Eigenschaften, die bei C. m. subsp. sepedonicus entweder allgemein vorhanden oder nicht vorhanden sind, nach den Methoden von Lelliott and Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001) und Anonymous (1987) bestimmen.

Alle Medien bei 21 °C inkubieren und nach sechs Tagen untersuchen. Wird kein Wachstum festgestellt, maximal 20 Tage weiter inkubieren.

Alle Tests müssen eine bekannte C. m. subsp. sepedonicus Kontrolle einschließen. Nährtests und physiologische Tests müssen mit Inokula aus Nähragar-Subkulturen durchgeführt werden. Morphologische Vergleiche müssen auf Dextrose-Nähragar-angezogenen Kulturen durchgeführt werden.

Tests Erwartetes Ergebnis Oxidations-/Fermentationstest (O/F) inert oder schwach oxidativ Oxidaseaktivität – Wachstum bei 37 °C – Ureaseaktivität – Aesculinhydrolyse + Stärkehydrolyse – oder schwach Toleranz von 7 % NaCl – Indolproduktion – Katalaseaktivität + H2S-Produktion – Citratverwertung – Gelatineverflüssigung – Säure von Glyzerin – Säure von Laktose – oder schwach Säure von Rhamnose – Säure von Salizin – Gram-Färbung (Anlage 9) +

9.2. IF-Test

a) Eine Suspension von annähernd 106 Zellen je ml in IF-Puffer herstellen (siehe Anlage 3).

b) Eine 2fache Verdünnungsreihe eines geeigneten Antikörpers herstellen.

c) IF-Verfahren anwenden (siehe Abschnitt 4).

d) Der IF-Test ist positiv, wenn der IF-Titer der Kultur dem der Positivkontrolle entspricht.

9.3. PCR-Test

a) Eine Suspension von annähernd 106 Zellen je ml in Reinstwasser (UPW) herstellen.

b) 100 µl der Zellsuspension in geschlossenen Röhrchen in einem Thermoblock oder Siedewasserbad bei 100 °C für 4 Minuten erhitzen. Erforderlichenfalls kann die Zelllysis durch Zugabe frisch zubereiteter NaOH mit einer Endkonzentration von 0,05M unterstützt werden. Die Proben können anschließend bis zu ihrer Verwendung bei –16 bis –24 °C gelagert werden.

c) Geeignete PCR-Verfahren anwenden, um C .m.-subsp.-sepedonicus-spezifische PCR-Produkte (z. B. Pastrik, 2000; siehe Anlage 4; Li and de Boer, 1995; Mills et al., 1997; Pastrik and Rainey, 1999; Schaad et al., 1999) zu amplifizieren.

d) C. m. subsp. sepedonicus gilt als positiv identifiziert, wenn die PCR-Produkte dieselbe Größe und dieselben Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen aufweisen wie der positive Kontrollstamm.

9.4. FISH-Test

a) Eine Suspension von annähernd 106 Zellen je ml in Reinstwasser (UPW) herstellen.

b) FISH-Verfahren anwenden (siehe Abschnitt 5).

c) Der FISH-Test ist positiv, wenn die Kultur ebenso reagiert wie die Positivkontrolle.

9.5. Bestimmung des Fettsäureprofils (FAP)

a) Die Kultur auf Trypticase-Soja-Agar (Oxoid) für 72 Stunden bei 21 °C (+/- 1°) anzüchten.

b) Ein geeignetes FAP-Verfahren anwenden (Janse, 1991; Stead, 1992).

c) Ein FAP-Test ist positiv, wenn das Profil der verdächtigen Kultur mit dem der Positivkontrolle identisch ist. Das Vorliegen charakteristischer Fettsäuren (15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 und 17:0 Anteiso) deutet mit hoher Sicherheit auf C. m. subsp. sepedonicus hin. Andere Gattungen wie Curtobacterium, Arthrobacter und Micrococcus weisen einige dieser Säuren ebenfalls auf, 15:1 Anteiso A ist bei diesen Bakterien jedoch eine Seltenheit, kommt allerdings zwischen 1-5 % in allen Clavibacter spp. vor. In C. m. subsp. sepedonicus liegt der Wert in der Regel bei 5 %.

9.6. BOX-PCR

a) Eine Suspension aus annähernd 106 Zellen je ml in Reinstwasser (UPW) herstellen.

b) Den Test nach dem entsprechenden Verfahren durchführen (Smith et al., 2001).

10. BESTÄTIGUNGSTEST

Der Pathogenitätstest dient der endgültigen Bestätigung der Diagnose von C. m. subsp. sepedonicus und der Bewertung der Virulenz von als C. m. subsp. sepedonicus identifizierten Kulturen.

10.1. Aus drei Tage alten Kulturen des zu testenden Isolats und einem geeigneten positiven Kontrollstamm von C. m. subsp. sepedonicus ein Inokulum mit einer Zelldichte von etwa 106/ml herstellen.

10.2. 5-10 Stängel junger Auberginensämlinge im Blattstadium 3 beimpfen (siehe Abschnitt 7.3 oder 7.4).

10.3. Die Pflanzen bei 18-24 °C inkubieren. Dabei für ausreichende Beleuchtung und hohe relative Feuchtigkeit sorgen und regelmäßig wässern, um Staunässe bzw. Trockenheitsstress zu verhindern (siehe Abschnitt 7.7). Bei Reinkulturen setzt die typische Welke innerhalb von zwei Wochen ein, symptomfreie Pflanzen (siehe Abschnitt 7.8) sollten danach jedoch für bis zu drei Wochen inkubiert werden, und zwar bei Temperaturen, die das Auberginenwachstum fördern, jedoch 25 °C nicht überschreiten (siehe Anlage 8). Treten nach drei Wochen keine Symptome auf, so kann die Kultur nicht als eine pathogene Form von C. m. subsp. sepedonicus bestätigt werden.

10.4. Von Pflanzen mit Symptomen wie folgt isolieren: Ein Stängelstück 2 cm oberhalb der Inokulationsstelle herausschneiden, zerkleinern und in wenig sterilem destilliertem Wasser oder 50 mM Phosphatpuffer (siehe Anlage 3) suspendieren. Aus der Suspension durch Verdünnungsausstrich oder Ausstrich auf MTNA und YPGA (siehe Anlage 5) isolieren, 3-5 Tage bei 21-23 °C inkubieren und auf Bildung typischer C. m. subsp. sepedonicus Kolonien achten.

Anlage 1 An der Optimierung und Validierung von Protokollen beteiligte Laboratorien Labor (1) Ort Land Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Wien und Linz Österreich Departement Gewasbescherming Merelbeke Belgien Plantedirektoratet Lyngby Dänemark Central Science Laboratory York England Scottish Agricultural Science Agency Edinburgh Schottland Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie Angers Frankreich Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre Le Rheu Frankreich Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Deutschland Pflanzenschutzamt Hannover Hannover Deutschland State Laboratory Dublin Irland Plantenziektenkundige Dienst Wageningen Niederlande Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre Aas Norwegen Direcção-Geral de Protecção das Culturas Lissabon Portugal Nacionalni institut za biologijo Ljubljana Slowenien Centro de Diagnóstico de Aldearrubia Salamanca Spanien (1) Kontaktperson: siehe Website: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

Anlage 2 Vorbereitung der Positiv- und Negativkontrollen für die Haupt-Screeningtests (PCR/IF und FISH) Eine 72 Stunden alte Kultur eines virulenten Stammes von C. m. subsp. sepedonicus [NCPPB 4053 oder PD 406] auf MTNA-Basismedium anzüchten und in 10 mM Phosphatpuffer suspendieren, um eine Zelldichte von annähernd 1 bis 2 × 108 cfu je ml zu erhalten. Dieses Ergebnis wird in der Regel erzielt durch eine leicht trübe Suspension mit einer optischen Dichte von 0,20 bei 600 nm. An den Nabelenden von 200 Knollen einer gelbschaligen Kartoffelsortenpartie, die nachweislich frei von C. m. subsp. sepedonicus ist, Stückchen aus dem Gefäßbündelring herausschneiden. Die Nabelenden wie gewöhnlich verarbeiten und das Pellet in 10 ml resuspendieren. 10 sterile 1,5-ml-Mikroröhrchen mit 900 µl des resuspendierten Pellets herstellen. 100 µl der Suspension von C. m. subsp. sepedonicus in das erste Röhrchen geben und vortexen. In den nächsten fünf Röhrchen weitere Dezimalverdünnungen anlegen. Die sechs kontaminierten Röhrchen als Positivkontrollen, die vier nicht kontaminierten Röhrchen als Negativkontrollen verwenden. Die Röhrchen entsprechend beschriften. 100 µl Aliquots in sterilen 1,5-ml-Röhrchen anlegen, um von jeder Kontrollprobe 9 Parallelproben zu erhalten. Bis zur weiteren Verwendung bei –16 bis –24 °C lagern. Das Vorhandensein und die Quantifizierung von C. m. subsp. sepedonicus in den Kontrollproben sollte zunächst durch den IF-Test bestätigt werden. Für den PCR-Test bei jeder Testprobenreihe eine DNA-Extraktion aus positiven und negativen Kontrollproben vornehmen. Für den IF- und FISH-Test bei jeder Testprobenreihe positive und negative Kontrollproben testen. Beim IF-, FISH- und PCR-Test muss C. m. subsp. sepedonicus zumindest in den Positivkontrollen mit 106 und 104 Zellen/ml, darf jedoch in keiner der Negativkontrollen nachgewiesen werden.

Anlage 3 Puffer für Testverfahren ALLGEMEINE ANMERKUNG: Sterile Puffer können ungeöffnet bis zu einem Jahr lang gelagert werden. 1. Puffer für Extraktionsverfahren 1.1. Extraktionspuffer (50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0) Dieser Puffer wird für die Extraktion des Bakteriums aus Pflanzengewebe durch Homogenisierung oder Schütteln verwendet. Na2HPO4 (anhydrid) 4,26 g KH2PO4 2,72 g Destilliertes Wasser 1,00 l Substanzen lösen, pH-Wert messen und durch 15-minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren. Die folgenden zusätzlichen Komponenten können zweckdienlich sein: Zweck Menge (je Liter) Lubrolflocken Verflüssigungs-mittel (1) 0,5 g DC-Silicon-Antischaum Schaumdämpfungs-mittel (1) 1,0 ml Tetranatriumpyrophosphat Antioxidations-mittel 1,0 g Polyvinylpyrrolidon-40 000 (PVP-40) Bindung von PCR-Inhibitoren 50 g 1.2. Pelletpuffer (10 mM Phosphatpuffer, pH 7,2) Dieser Puffer wird für die Resuspendierung und Verdünnung von Extrakten von Gewebestückchen verwendet, die an den Nabelenden von Kartoffelknollen herausgeschnitten wurden, nachdem sie durch Zentrifugieren zu Pellets konzentriert worden waren. Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g Destilliertes Wasser 1,00 l Substanzen auflösen, pH-Wert messen und durch 15-minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren. 2. Puffer für den IF-Test 2.1. IF-Puffer (10 mM phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2) Dieser Puffer wird für die Verdünnung von Antikörpern verwendet. Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g NaCL 8,0 g Destilliertes Wasser 1,0 l Substanzen auflösen, pH-Wert messen und durch 15-minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren. 2.2. IF-Puffer-Tween Dieser Puffer wird zum Waschen von Objektträgern verwendet. 0,1 % Tween 20 zum IF-Puffer geben. 2.3. Phosphatgepuffertes Glyzerin, pH 7,6 Dieser Puffer wird als Einbettungsmittel auf den Feldern der IF-Objektträger zur Verbesserung der Fluoreszenz verwendet. Na2HPO4.12H2O 3,20 g NaH2PO4.2H2O 0,15 g Glyzerin 50 ml Destilliertes Wasser 100 ml Antifading-Eindeckungsmittel sind beispielsweise als Vectashield® (Vector Laboratories) oder Citifluor® (Leica) im Handel erhältlich. (1) Für die Extraktion durch Homogenisierung.

Anlage 4 Ermittlung des Kontaminationsgrads im IF- und FISH-Test 1. Mittlere Anzahl typischer fluoreszierender Zellen je Sichtfeld (c) zählen. 2. Anzahl typischer fluoreszierender Zellen je Mikroskopfeld des Objektträgers (C) berechnen. C = c × S/s wobei S = Fläche eines Feldes eines Multiwell-Objektträgers und s = Fläche des Objektivfelds

s = πi2/4G2K2 wobei i = Feldkoeffizient (variiert zwischen 8 und 24 je nach Okulartyp) K = Tubuskoeffizient (1 oder 1,25) G = Vergrößerung des Objektivs (100fach, 40fach usw.). 3. Anzahl typischer fluoreszierender Zellen je ml resuspendiertes Pellet (N) berechnen. N = C × 1 000/y × F wobei y = Volumen des resuspendierten Pellets auf jedem Objekträgerfeld und F = Verdünnungsfaktor des resuspendierten Pellets.

Anlage 5 Medien zur Isolierung und Kultivierung von C. m. subsp. sepedonicus a) Universalnährmedien Nähragar (NA) Nähragar (Difco) 23,0 g Destilliertes Wasser 1,0 l Substanzen auflösen und durch 15-minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren. Dextrose-Nähragrar (NDA) Difco-Bacto-Nähragrar mit 1 % D(+)-Glucose (Monohydrat). Sterilisieren durch 20-minütiges Autoklavieren bei 115 °C. Hefe-Pepton-Glucose-Agar (YPGA) Hefeextrakt (Difco) 5,0 g Bacto-Pepton (Difco) 5,0 g D(+)-Glucose (Monohydrat) 10,0 g Bacto-Agar (Difco) 15,0 g Destilliertes Wasser 1,0 l Substanzen auflösen und durch 15-minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren. Hefeextrakt-Mineralsalzmedium (YGM) Difco-Bacto-Hefeextrakt 2,00 g D(+)-Glucose (Monohydrat) 2,50 g K2HPO4 0,25 g KH2PO4 0,25 g MgSO4.7H2O 0,10 g MnSO4·H2O 0,015 g NaCl 0,05 g FeSO4.7H2O 0,005 g Difco-Bacto-Agar 18,0 g Destilliertes Wasser 1,0 l Substanzen auflösen und je 1/2 Liter des Mediums durch 20-minütiges Autoklavieren bei 115 °C sterilisieren. b) Validierte Selektivnährmedien MTNA-Medium Soweit nicht anders angegeben, stammen alle Komponenten des Mediums von BDH. Hefeextrakt (Difco) 2,0 g Mannitol 2,5 g K2HPO4 0,25 g KH2PO4 0,25 g NaCl 0,05 g MgSO4.7H2O 0,1 g MnSO4·H2O 0,015 g FeSO4.7H2O 0,005 g Agar (Oxoid Nr. 1) 16,0 g Destilliertes Wasser 1,0 L Substanzen auflösen und pH auf 7,2 einstellen. Nach 15-minütigem Autoklavieren bei 121 °C und Abkühlen auf 50 °C die Antibiotika Trimethoprim 0,06 g, Nalixidinsäure 0,002 g, Amphotericin B 0,01 g zugeben. Antibiotika-Stammlösungen: Trimethoprim (Sigma) und Nalixidinsäure (Sigma) (beide 5 mg/ml) in 96 %igem Methanol, Amphotericin B (Sigma) (1 mg/ml) in Dimethylsulfoxid. Stammlösungen sind filtersterilisiert. Hinweis: Basismedium ist 3 Monate lang haltbar. Nach Zugabe von Antibiotika beträgt die Haltbarkeitsdauer bei Kühlschranklagerung 1 Monat. NCP-88-Medium Nähragar (Difco) 23 g Hefeextrakt (Difco) 2 g D-Mannitol 5 g K2HPO4 2 g KH2PO4 0,5 g MgSO4.7H2O 0,25 g Destilliertes Wasser 1,0 l Substanzen auflösen und pH auf 7,2 einstellen. Nach dem Autoklavieren und Abkühlen auf 50 °C die Antibiotika Polymyxin-B-sulfat (Sigma) 0,003g, Nalixidinsäure (Sigma) 0,008 g und Cycloheximid (Sigma) 0,2 g zugeben. Antibiotika wie folgt in Stammlösungen auflösen: Nalixidinsäure in 0,01 M NaOH, Cycloheximid in 50 %igem Ethanol, Polymyxin-B-sulfat in destilliertem Wasser. Stammlösungen sind filtersterilisiert. Hinweis: Basismedium ist 3 Monate lang haltbar. Nach Zugabe von Antibiotika beträgt die Haltbarkeitsdauer bei Kühlschranklagerung 1 Monat.

Anlage 6 Validiertes PCR-Protokoll und validierte Reagenzien Hinweis: Vorausgehende Tests müssen den reproduzierbaren Nachweis von mindestens 103 bis 104 Zellen von C. m. sepedonicus je ml Probenextrakt garantieren. Vorausgehende Tests dürfen keine falsch-positiven Ergebnisse bei bestimmten ausgewählten Bakterienstämmen zeigen. 1. Multiplex-PCR-Protokoll mit interner PCR-Kontrolle (Pastrik, 2000) 1.1. Oligonucleotid-Primer Primer PSA-1 5′- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3′ Primer PSA -R 5′- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3′ Primer NS-7-F 5′- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3′ Primer NS-8-R 5′- tcc gca ggt tca cct acg ga -3′ Erwartete Fragmentlänge des C.-m.-subsp.-sepedonicus-spezifischen PCR-Produktes = 502 bp (PSA-Primerset). Erwartete Fragmentlänge der 18S-rRNA-internen PCR-Kontrolle = 377 bp (NS-Primerset). 1.2. PCR-Reaktionsmischung Reagenz Menge je Reaktion Endkonzentration Steriles Reinstwasser (UPW) 15,725 µl 10x PCR-Puffer (1) (15 mM MgCl2) 2,5 µl 1x (1,5 mM MgCl2) BSA (Fraktion V) (10 %) 0,25 µl 0,1 % dNTP-Mix (20 mM) 0,125 µl 0,1 mM Primer PSA-1 (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM Primer PSA-R (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM Primer NS-7-F (10 µM) (2) 0,1 µl 0,04 µM Primer NS-8-R (10 µM) (2) 0,1 µl 0,04 µM TaqPolymerase (5 U/µl) (1) 0,2 µl 1,0 U Probenvolumen 5,0 µl Gesamtvolumen 25,0 µl 1.3. PCR-Reaktionsbedingungen Programmablauf: 1 Zyklus: i) 3 Minuten bei 95 °C (Denaturierung der Ziel-DNA) 10 Zyklen: ii) 1 Minute bei 95 °C (Denaturierung der Ziel-DNA) iii) 1 Minute bei 64 °C (Primer-Anlagerung) iv) 1 Minute bei 72 °C (Verlängerung der Kopie) 25 Zyklen v) 30 Sekunden bei 95 °C (Denaturierung der Ziel-DNA) vi) 30 Sekunden bei 62 °C (Primer-Anlagerung) vii) 1 Minute bei 72 °C (Verlängerung der Kopie) 1 Zyklus: viii) 5 Minuten bei 72 °C (Endverlängerung) ix) auf 4 °C abkühlen. Hinweis: Dieses Programm wurde für den MJ-Research-PTC-200-Thermocycler optimiert. Bei anderen Modellen (Geräten) kann eine Änderung der Dauer der Zyklusschritte ii, iii, iv, v, vi und vii erforderlich sein. 1.4. Restriktionsenzymanalyse des Fragments PCR-Produkte, die von C.-m.-subsp.-sepedonicus-DNA amplifiziert werden, zeigen nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 °C mit Enzym Bgl II einen erkennbaren Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus. Die Restriktionsfragmente der C.-m.-subsp.-sepedonicus-spezifischen Fragmente haben eine Größe von 282 bp und 220 bp. 2. Vorbereitung des Beladungspuffers 2.1. Bromphenolblau (10 %-Stammlösung) Bromphenolblau 5 g Destilliertes Wasser (bidest) 50 ml 2.2. Beladungspuffer Glyzerin (86 %) 3,5 ml Bromphenolblau (5,1) 300 µl Destilliertes Wasser (bidest) 6,2 ml 3. 10x Tris-Acetat-EDTA-Puffer (TAE), pH 8,0 Tris-Puffer 48,40 g Eisessig 11,42 ml EDTA (Dinatriumsalz) 3,72 g Destilliertes Wasser 1,00 l Vor Gebrauch auf 1x verdünnen. Auch im Handel erhältlich (z. B. Invitrogen oder gleichwertiges Produkt). (1) Die Methoden wurden validiert mit den Taq-Polymerasen von Perkin Elmer (AmpliTaq oder Gold) und Gibco BRL. (2) Die Konzentrationen der Primer NS-7 F und NS-8-R wurden optimiert für die Extraktion von Gewebestückchen von Kartoffelnabelenden durch Homogenisierung und DNA-Reinigung nach Pastrik (2000) (siehe Abschnitte 6.1.a und 6.2). Eine erneute Optimierung der Reagenzkonzentrationen wird erforderlich, wenn die Extraktion durch Schütteln oder nach anderen DNA-Isolierungsmethoden erfolgt.

Anlage 7 Validierte Reagenzien für den FISH-Test 1. Oligo-Sonden Cms-spezifische Sonde CMS-CY3-01: 5’- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3’ Eubakterielle Universalsonde EUB-338-FITC: 5’ gct gcc tcc cgt agg agt-3’ 2. Fixierlösung [ACHTUNG! FIXATIV ENTHÄLT TOXISCHES PARAFORMALDEHYD. HANDSCHUHE TRAGEN UND NICHT EINATMEN. ES WIRD EMPFOHLEN, UNTER DEM ABZUG ZU ARBEITEN.] i) 9 ml molekular reines Wasser (z. B. Reinstwasser (UPW)) auf ca. 60 °C erhitzen und 0,4 g Paraformaldehyd hinzufügen. Paraformaldehyd mit 5 Tropfen 1N NaOH auflösen und mit einem Magnetrührer rühren. ii) Durch Hinzufügen von 1 ml 0,1M Phosphatpuffer (PB; pH 7,0) und 5 Tropfen 1N HCl auf pH-Wert 7,0 einstellen. pH-Wert mit Indikatorstreifen prüfen und erforderlichenfalls mit HCl oder NaOH justieren. [ACHTUNG! IN PARAFORMALDEHYD-LÖSUNGEN KEIN PH- MESSGERÄT VERWENDEN.] iii) Lösung durch 0,22-µm-Membranfilter filtern und bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung staubfrei lagern. iv) Hinweis: Alternative Fixierlösung: 96 %iges Ethanol. 3. 3x Hybmix NaCl 2,7 M Tris-HCl 60 mM (pH 7,4) EDTA (filtersterilisiert und autoklaviert) 15 mM Verdünnen auf 1x Hybmix vor Gebrauch. 4. Hybridisierungslösung 1x Hybmix Natrium-Dodecylsulfat (SDS) 0,01 % EUB-338-Sonde 5 ng/μl CMSCY301-Sonde 5 ng/μl Zubereitung der Hybridisierungslösung in den nach Tabelle 1 berechneten Mengen. Für jeden Objektträger (mit 2 duplizierten unterschiedlichen Proben) sind 90 μl Hybridisierungslösung erforderlich. Tabelle: Empfohlene Mengen für die Zubereitung der Hybridisierungsmischung 2 Objektträger 8 Objektträger Steriles UPW 50,1 200,4 3x Hybmix 30,0 120,0 1 % SDS 0,9 3,6 EUB-338-Sonde (100 ng/μl) 4,5 18,0 CMSCY301-Sonde (100 ng/μl) 4,5 18,0 Gesamtvolumen (μl) 90,0 360,0 Anmerkung: Alle Lösungen mit den lichtempfindlichen Oligo-Sonden bei -20 °C im Dunkeln lagern. Während des Gebrauchs vor direktem Sonnenlicht und künstlichem Licht schützen. 5. 0,1M Phosphatpuffer, pH 7,0 Na2HPO4 8,52 g KH2PO4 5,44 g Destilliertes Wasser 1,00 l Substanzen auflösen, den pH-Wert prüfen und durch 15-minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren.

Anlage 8 Auberginenkultivierung Auberginensamen (Solanum melongena) in pasteurisierte Anzuchterde säen. Sämlinge mit voll entfalteten Keimblättern (nach 10 bis 14 Tagen) in pasteurisierte Topferde umsetzen. Auberginen in einem Gewächshaus anziehen, das die folgenden Umweltbedingungen erfüllt: Tageslänge: 14 Stunden oder natürliche Tageslänge, wenn länger. Temperatur: tagsüber: 21 bis 24 °C, nachts: 15 °C.

Anfällige Auberginensorten: „Black Beauty“, „Long Tom“, „Rima“, „Balsas“. Lieferant: siehe Website: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.