3.

Die nachstehenden Kapitel werden angefügt: „B.49. IN VITRO-MIKRONUKLEUSTEST AN SÄUGETIERZELLEN EINLEITUNG 1. Der in vitro-Mikronukleustest (MNvit) ist ein Genotoxizitätstest zum Nachweis von Mikronuklei im Zytoplasma von Interphasezellen. Mikronuklei oder Mikrokerne können aus azentrischen Chromosomenfragmenten (d. h. Chromosomen, denen ein Zentromer fehlt) oder aus ganzen Chromosomen entstehen, die während der Anaphase der Zellteilung nicht zu den Polen wandern können. Der Test weist die Aktivität klastogener und aneugener chemischer Substanzen (Stoffe und Gemische) (1) (2) in Zellen nach, die während oder nach Kontakt mit der Prüfsubstanz eine Zellteilung durchlaufen haben. Die vorliegende Prüfmethode gestattet die Verwendung von Protokollen mit und ohne den Aktin-Polymerisationsinhibitor Cytochalasin B (cytoB). Die Hinzufügung von cytoB vor der angestrebten Mitose ermöglicht die Identifizierung und selektive Analyse der Mikrokernfrequenz in Zellen, die eine Mitose durchlaufen haben, da solche Zellen zwei Kerne aufweisen (3) (4). Diese Prüfmethode gestattet auch die Verwendung von Protokollen ohne Zytokinese-Block, vorausgesetzt es gibt Beweise dafür, dass die analysierte Zellpopulation eine Mitose durchlaufen hat. 2. Zusätzlich zum MNvit-Test zur Identifizierung chemischer Substanzen (Stoffe und Gemische), die Mikrokerne erzeugen, können auch ein Zytokinese-Block, die immunchemische Markierung von Kinetochoren oder die Hybridisierung mit Zentromer- bzw. Telomer-Sonden (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)) Informationen über die Mechanismen der Chromosomenschädigung und der Bildung von Mikrokernen liefern (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Die Markierungs- und Hybridisierungsverfahren können angewandt werden, wenn eine verstärkte Mikrokernbildung festgestellt wird und der Prüfer erkennen will, ob diese Zunahme das Ergebnis klastogener und/oder aneugener Ereignisse ist. 3. Mikrokerne stellen auf Tochterzellen übertragene Schäden dar, während in Metaphasezellen festgestellte Chromosomenaberrationen unter Umständen nicht übertragen werden. Da Mikrokerne in Zellen im Stadium der Interphase mit relativer Objektivität bewertet werden können, muss das Laborpersonal nur feststellen, ob die Zellen eine Teilung durchlaufen haben oder nicht, und wie viele Zellen einen Mikrokern enthalten. Infolgedessen können die Zubereitungen relativ schnell bewertet werden und die Analyse lässt sich automatisieren. Dies macht es praktisch möglich, Tausende statt Hunderte von Zellen pro Behandlung zu bewerten und so die Aussagekraft des Tests zu erhöhen. Da schließlich die Mikrokerne von verzögert transportierten Chromosomen herrühren können, besteht die Möglichkeit, Aneuploidie induzierende Agenzien nachzuweisen, deren Untersuchung in konventionellen Chromosomenaberrationstests nur schwer möglich ist, z. B. OECD-Prüfrichtlinie 473 (Kapitel B.10 dieses Anhangs) (17). Allerdings gestattet der MNvit-Test die Differenzierung zwischen Polyploidie induzierenden und Klastogenizität verursachenden Chemikalien nur, wenn besondere Techniken wie die in Absatz 2 beschriebene FISH eingesetzt werden. 4. Der MNvit-Test ist eine in vitro-Methode, bei der in der Regel kultivierte menschliche Zellen oder Nagetierzellen zum Einsatz kommen. Der Test bildet eine breite Basis für die in vitro-Erforschung potenzieller Chromosomenschädigungen, da sowohl Aneugene als auch Klastogene nachgewiesen werden können. 5. Der MNvit-Test ist zuverlässig und wirksam bei einer Vielfalt von Zelltypen und kann mit oder ohne Zusatz von cytoB durchgeführt werden. Umfassende Daten belegen die Validität des MNvit-Tests im Zusammenhang mit unterschiedlichen Nagetier-Zelllinien (CHO, V79, CHL/IU und L5178Y) sowie menschlichen Lymphozyten (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Hierzu zählen insbesondere die internationalen Validierungsstudien, koordiniert durch die Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22), und die Berichte des International Workshop on Genotoxicity Testing (4) (16). Die verfügbaren Daten wurden außerdem vom Europäischen Zentrum zur Validierung von Alternativmethoden (ECVAM) der Europäischen Kommission in einer retrospektiven Validierungsstudie nach dem Weight-of-Evidence-Ansatz neu bewertet, und die Prüfmethode wurde vom Wissenschaftlich Beratenden Ausschuss (ESAC) des ECVM als wissenschaftlich validiert anerkannt (32) (33) (34). Die Verwendung von menschlichen Lymphoblastoidzellen der Zelllinie TK6 (35), von HepG2-Zellen (36) (37) und von primären Embryonalzellen des Syrischen Hamsters (38) wurde beschrieben, obwohl diese Zellen nicht in Validierungsstudien verwendet wurden. DEFINITIONEN 6. Es gelten die Definitionen gemäß Anlage 1. AUSGANGSÜBERLEGUNGEN 7. In vitro durchgeführte Versuche erfordern in der Regel den Zusatz eines exogenen Stoffwechsel-Aktivierungssystems, sofern die Zellen nicht im Hinblick auf die zu prüfenden Substanzen metabolisch kompetent sind. Mit diesem exogenen Stoffwechsel-Aktivierungssystem lassen sich die in vivo-Bedingungen jedoch nicht gänzlich nachvollziehen. Es sind auch Bedingungen zu vermeiden, die zu künstlich positiven Ergebnissen führen, die nicht die intrinsische Mutagenität widerspiegeln und möglicherweise aus Faktoren wie markanten Veränderungen des pH-Wertes bzw. der Osmolalität oder hochgradiger Zytotoxizität herrühren (39) (40) (41). Wenn die Prüfsubstanz zum Zeitpunkt der Hinzufügung eine Änderung im pH-Wert des Mediums auslöst, sollte der pH-Wert entsprechend angepasst werden, vorzugsweise durch Pufferung der Stammlösung, so dass alle Volumina bei allen Prüfkonzentrationen und für sämtliche Kontrollen gleich bleiben. 8. Zur Analyse der Mikrokerninduktion ist es wesentlich, dass sowohl die behandelten als auch die unbehandelten Kulturen eine Mitose durchlaufen haben. Das informativste Stadium für die Auswertung von Mikrokernen liegt in Zellen vor, die eine Mitose während oder nach der Behandlung mit der Prüfsubstanz vollzogen haben. PRINZIP DER PRÜFMETHODE 9. Zellkulturen menschlichen Ursprungs oder von Säugetieren werden sowohl mit als auch ohne Zusatz eines exogenen Fremdstoff-Metabolisierungssystems in Kontakt mit der Prüfsubstanz gebracht, außer wenn Zellen mit eigener adäquater Metabolisierungskapazität verwendet werden. Für alle Tests sind parallellaufende Lösungsmittel-/Vehikelkontrollen (VK) und Positivkontrollen (PK) anzulegen. 10. Während oder nach dem Kontakt mit der Prüfsubstanz werden die Zellen so lange kultiviert, dass Chromosomen- oder Spindelschäden zur Bildung von Mikrokernen in Interphasezellen führen können. Zur Induktion einer Aneuploidie sollte die Prüfsubstanz während der Mitose vorhanden sein. Geerntete und gefärbte Interphasezellen werden auf das Vorhandensein von Mikrokernen untersucht. Im Idealfall sollten Mikrokerne nur in Zellen ausgewertet werden, die während oder ggf. nach Kontakt mit der Prüfsubstanz eine Mitose durchlaufen haben. In Kulturen, die mit einem Zytokinese-Blocker behandelt wurden, werden deshalb nur zweikernige Zellen ausgewertet. Wenn kein Zytokinese-Blocker verwendet wurde, ist es wichtig nachzuweisen, dass die analysierten Zellen mutmaßlich während oder nach dem Kontakt mit der Prüfsubstanz eine Zellteilung durchlaufen haben. Bei allen Protokollen ist es wichtig nachzuweisen, dass sowohl in den Kontrollkulturen als auch in den behandelten Kulturen eine Zellproliferation stattgefunden hat. Das Ausmaß der von der Prüfsubstanz induzierten Zytotoxizität oder Zytostase sollte in den Kulturen (oder Parallelkulturen) bewertet werden, die auf das Vorhandensein von Mikrokernen untersucht werden. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE Vorbereitungen 11. Es können kultivierte primäre Lymphozyten aus dem peripheren Blut von Menschen (5) (19) (42) (43) sowie verschiedene Zelllinien von Nagetieren wie CHO, V79, CHL/IU und L5178Y verwendet werden (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Die Verwendung anderer Zelllinien und -typen sollte anhand ihrer nachgewiesenen Leistung im Test begründet werden, wie im Abschnitt ‚Akzeptanzkriterien‘ beschrieben. Da die Hintergrundfrequenz von Mikrokernen die Empfindlichkeit des Tests beeinflusst, empfiehlt es sich, Zelltypen mit einer niedrigen und stabilen Hintergrundfrequenz der Mikrokernbildung zu verwenden. 12. Lymphozyten aus dem peripheren Blut von Menschen sollten jungen (ca. 18- bis 35-jährigen) gesunden, nicht rauchenden Individuen entnommen werden, die bekanntermaßen in letzter Zeit nicht mit genotoxischen Chemikalien oder Strahlung in Kontakt standen. Wenn Zellen von mehr als einem Spender zur Verwendung gepoolt werden, sollte die Zahl der Spender angegeben werden. Die Mikrokernfrequenz nimmt mit fortschreitendem Alter zu. Dieser Trend ist bei Frauen ausgeprägter als bei Männern (44), was bei der Auswahl von Spenderzellen für die gepoolte Auswertung berücksichtigt werden sollte. Kulturmedien und Inkubationsbedingungen 13. Zur Kultivierung sind geeignete Kulturmedien- und Inkubationsbedingungen (Kulturgefäße, CO2-Konzentration, Temperatur und Feuchtigkeit) zu verwenden. Etablierte Zelllinien und -stämme sind routinemäßig auf Stabilität der modalen Chromosomenzahl und Mykoplasmaverunreinigung zu überprüfen und sollten bei Verunreinigung oder bei Veränderungen der modalen Chromosomenzahl nicht herangezogen werden. Die normale Zellzyklusdauer sollte zur Festlegung der Inkubationsbedingungen im Prüflabor bekannt sein. Bei Anwendung der Zytokinese-Block-Methode sollte die Konzentration des Zytokinese-Hemmers für den betreffenden Zelltyp optimiert werden und nachweislich eine gute Ausbeute an zweikernigen Zellen zur Auswertung ergeben. Vorbereitung der Kulturen 14. Etablierte Zelllinien und -stämme: Die Zellen werden aus Stammkulturen gewonnen und im Kulturmedium in einer solchen Dichte überimpft, dass vor dem Zeitpunkt der Gewinnung Kulturen in Monolagen nicht konfluent werden und Suspensionskulturen keine übermäßige Dichte erreichen. Die Kulturen werden bei 37 °C inkubiert. 15. Lymphozyten: Mit einem Antikoagulans (z. B. Heparin) behandeltes Vollblut oder separierte Lymphozyten werden vor dem Kontakt mit der Prüfsubstanz und cytoB unter Einwirkung eines Mitogens (z. B. Phytohämagglutinin) inkubiert. Stoffwechsel-Aktivierung 16. Bei Zellen mit ungeeigneter endogener Stoffwechselkapazität sollten exogene metabolisierende Systeme eingesetzt werden. Das am häufigsten verwendete System ist eine durch Ko-Faktoren ergänzte post-mitochondriale Fraktion (S9) aus der Leber von Nagetieren, die mit enzyminduzierenden Agenzien wie Aroclor 1254 (45) (46) oder einem Gemisch aus Phenobarbital und β-Naphthoflavon (46) (47) (48) (49) vorbehandelt wurden. Das letztgenannte Gemisch verstößt weder gegen das Stockholmer Übereinkommen über persistente organische Schadstoffe (50) noch gegen die Verordnung (EG) Nr. 850/2004 über persistente organische Schadstoffe (66) und hat sich bei der Induktion von Mischfunktionsoxidasen als ebenso wirksam wie Aroclor 1254 erwiesen (46) (47) (48) (49). Im Endmedium wird die S9-Fraktion in der Regel in Konzentrationen von 1 bis 10 % v/v verwendet. Die Bedingungen des Metabolisierungssystems können von der geprüften chemischen Klasse abhängig sein. In manchen Fällen ist es sinnvoll, mehr als eine S9-Konzentration zu verwenden. 17. Gentechnisch veränderte Zelllinien zur Expression spezifischer Aktivierungsenzyme bei Menschen oder Nagetieren machen möglicherweise den Einsatz exogener Metabolisierungssysteme entbehrlich und könnten als Prüfzellen verwendet werden. In solchen Fällen sollte die Auswahl der verwendeten Zelllinien wissenschaftlich begründet werden, z. B. mit der Relevanz der Mischfunktionsoxidasen für den Stoffwechsel der Prüfsubstanz (51) und mit ihrer Reaktionsfähigkeit auf bekannte Klastogene und Aneugene (siehe besonderer Abschnitt über Akzeptanzkriterien). Es ist zu beachten, dass die geprüfte Substanz unter Umständen nicht von der/den zur Expression gebrachten Mischfunktionsoxidase(n) verstoffwechselt wird; in diesem Fall würden die negativen Ergebnisse nicht anzeigen, dass die Prüfsubstanz keine Mikrokerne induzieren kann. Prüfsubstanzvorbereitung 18. Feste Chemikalien sollten vor der Zellbehandlung in geeigneten Lösungsmitteln oder Vehikeln gelöst und ggf. verdünnt werden. Flüssige Chemikalien können den Versuchssystemen vor der Behandlung direkt beigegeben und/oder verdünnt werden. Gasförmige oder flüchtige Chemikalien sind mit Hilfe geeigneter Änderungen der Standardprotokolle, wie z. B. Behandlung in hermetisch verschlossenen Kulturgefäßen (52) (53), zu prüfen. Es sind frische Zubereitungen der Prüfsubstanz zu verwenden, es sei denn, die Lagerungsstabilität der Substanz wird nachgewiesen. Prüfbedingungen Lösungsmittel/Vehikel 19. Das Lösungsmittel/Vehikel sollte mit der Prüfsubstanz keine chemische Reaktion eingehen, und es sollte mit dem Überleben der Zellen und der S9-Aktivität in der verwendeten Konzentration kompatibel sein. Werden keine allgemein bekannten Lösungsmittel/Vehikel verwendet (z. B. Wasser, ein Zellkulturmedium, Dimethylsulfoxid), so sind Daten über ihre Kompatibilität mit der Prüfsubstanz und über das Nichtvorliegen einer genetischen Toxizität beizubringen. Es ist zu empfehlen, als erste Wahl möglichst die Verwendung eines wässrigen Lösungsmittels/Vehikels in Erwägung zu ziehen. Verwendung von cytoB als Zytokinese-Blocker 20. Eine der wichtigsten Überlegungen bei der Durchführung des MNvit-Tests gilt der Vergewisserung, dass die bewerteten Zellen während der Behandlung oder ggf. während der Inkubationszeit nach der Behandlung eine Mitose durchlaufen haben. CytoB ist das am häufigsten verwendete Agens zur Zytokinese-Blockierung, da es den Aktinaufbau hemmt und somit die Trennung der Tochterzellen nach der Mitose verhindert, was wiederum zur Bildung zweikerniger Zellen führt (5) (54) (55). Die Auswertung von Mikrokernen kann daher auf Zellen beschränkt werden, die während oder nach der Behandlung eine Mitose vollzogen haben. Zugleich kann die Auswirkung der Prüfsubstanz auf die Zellproliferationskinetik gemessen werden. CytoB sollte bei der Verwendung menschlicher Lymphozyten als Zytokinese-Blocker eingesetzt werden, da die Zellzyklendauer innerhalb der Kulturen und zwischen einzelnen Spendern variiert und da nicht alle Lymphozyten auf Phytohämagglutinin reagieren. Andere Methoden wurden für Tests an Zelllinien eingesetzt, um zu bestimmen, ob die bewerteten Zellen eine Teilung durchlaufen haben; diese Methoden werden weiter unten erläutert (siehe Absatz 26). 21. Für jeden Zelltyp sollte das Labor die geeignete cytoB-Konzentration festlegen, um in den Lösungsmittel-/Vehikelkontrollkulturen eine optimale Frequenz der zweikernigen Zellen zu erreichen. Die geeignete cytoB-Konzentration liegt in der Regel zwischen 3 und 6 μg/ml. Messung von Zellproliferation und Zytotoxizität und Auswahl der Expositionskonzentrationen 22. Bei der Festlegung der höchsten zu testenden Konzentration der Prüfsubstanz sind Konzentrationen zu vermeiden, die zu künstlich positiven Reaktionen führen können, wie z. B. zu übermäßiger Zytotoxizität, Ausfällungen im Kulturmedium oder ausgeprägten Änderungen des pH-Werts oder der Osmolalität (39) (40) (41). 23. Es werden Messungen der Zellproliferation durchgeführt, um sicherzustellen, dass die behandelten Zellen während des Tests eine Mitose durchlaufen haben und dass die Behandlungen bei geeigneten Zytotoxizitätsniveaus durchgeführt werden (siehe Absatz 29). Die Zytotoxizität sollte mit und ohne Stoffwechsel-Aktivierung in Zellen bestimmt werden, die eine Stoffwechsel-Aktivierung benötigen. Hierzu wird die relative Erhöhung der Zellzahl (RICC) oder die relative Populationsverdopplung (RPD) verwendet (entsprechende Formeln vgl. Anlage 2), wenn nicht cytoB zum Einsatz kommt. Wenn cytoB verwendet wird, kann die Zytotoxizität mittels des Replikationsindex (RI) bestimmt werden (entsprechende Formel vgl. Anlage 2). 24. Die Behandlung von Kulturen mit cytoB und die Messung der relativen Frequenzen von einkernigen, zweikernigen und mehrkernigen Zellen in der Kultur sind ein genaues Verfahren zur Quantifizierung des Effekts auf die Zellproliferation und die zytotoxische oder zytostatische Wirkung einer Behandlung (5) und stellen sicher, dass nur Zellen bewertet werden, die während oder nach der Behandlung eine Teilung vollzogen haben. 25. In Studien mit cytoB kann die Zytostase/Zytotoxizität mittels des Zytokinese-Block-Proliferationsindex (CBPI) quantifiziert werden (5) (26) (56) oder vom RI bei mindestens 500 Zellen pro Kultur abgeleitet werden (entsprechende Formeln vgl. Anlage 2). Wenn cytoB zur Bewertung der Zellproliferation verwendet wird, sollte von mindestens 500 Zellen pro Kultur ein CBPI oder RI festgelegt werden. Diese Messungen können unter anderen verwendet werden, um die Zytotoxizität durch den Vergleich der Werte in behandelten Kulturen und Kontrollkulturen zu bewerten. Die Bewertung anderer Zytotoxizitäts-Marker (z. B. Konfluenz, Zellzahl, Apoptose, Nekrose, Metaphasezählung) kann ebenfalls nützliche Informationen liefern. 26. In Studien ohne cytoB muss nachgewiesen werden, dass die in der Kultur bewerteten Zellen während oder nach Behandlung mit der Prüfsubstanz eine Teilung durchlaufen haben. Andernfalls kann es zu falsch negativen Reaktionen kommen. Um die Auswertung geteilter Zellen sicherzustellen, werden folgende Methoden eingesetzt: die Hinzufügung und der spätere Nachweis von Bromodeoxyuridin (BrdU) zur Identifikation replizierter Zellen (57), die Bildung von Klonen, wenn Zellen permanenter Zelllinien behandelt und in situ auf einem Mikroskop-Objektträger ausgewertet werden (Proliferationsindex (PI)) (25) (26) (27) (28), oder die Messung der Relativen Populationsverdopplung (RPD) bzw. der Relativen Erhöhung der Zellzahl (RICC) sowie andere bewährte Methoden (16) (56) (58) (59) (entsprechende Formeln vgl. Anlage 2). Die Bewertung anderer Marker für Zytotoxizität oder Zytostase (z. B. Konfluenz, Zellzahl, Apoptose, Nekrose, Metaphasezählung) kann ebenfalls nützliche Informationen liefern. 27. Es sind mindestens drei analysierbare Prüfkonzentrationen zu bewerten. Um dies zu erreichen, kann es notwendig sein, den Versuch mit einer größeren Zahl dicht aufeinander folgender Konzentrationen durchzuführen und die Mikrokernbildung in den Konzentrationen zu analysieren, die die geeignete Bandbreite der Zytotoxizitätswerte ergeben. Eine alternative Strategie wäre ein vorläufiger Zytotoxizitätstest zur Einengung des Spektrums für den definitiven Test. 28. Die Höchstkonzentration sollte darauf abzielen, eine Zytotoxizität von 55 ± 5 % hervorzurufen. Höhere Niveaus könnten Chromosomenschäden als Sekundäreffekt der Zytotoxizität induzieren (60). Wenn Zytotoxizität auftritt, sollten die ausgewählten Prüfkonzentrationen die Bandbreite von der Erzeugung einer Zytotoxizität von 55 ± 5 % bis zu geringer oder nicht vorhandener Zytotoxizität umfassen. 29. Wenn keine Zytotoxizität oder keine Ausfälle festgestellt werden, sollte die Höchstkonzentration bei Versuchen 0,01 M, 5 mg/mL oder 5 μl/ml betragen, je nachdem, welcher Wert am niedrigsten ist. Zwischen den für die Analyse gewählten Konzentrationen sollten im Allgemeinen Abstände von jeweils höchstens 10 liegen. Bei Prüfsubstanzen mit einer steilen Konzentrations-Wirkungs-Kurve kann es notwendig sein, die Konzentrationsabstände der Prüfsubstanz enger zu bemessen, damit auch Kulturen im mäßigen und niedrigen Toxizitätsbereich ausgewertet werden. 30. Falls die Löslichkeit ein begrenzender Faktor ist, sollte die Höchstkonzentration — falls keine Einschränkung durch Zytotoxizität gegeben ist — die geringste Konzentration sein, bei der eine minimale Ausfällung in den Kulturen sichtbar ist, sofern dabei keine Interferenzen mit der Auswertung auftreten. Die Bewertung von Ausfällungen sollte mit Methoden wie der Lichtmikroskopie erfolgen, wobei festzustellen ist, ob Ausfällungen während der Inkubation andauern oder (gegen Ende der Behandlung) auftreten. Kontrollen 31. Für jeden Versuch sind parallel laufende Positiv- und Lösungsmittel-/Vehikelkontrollen mit und ohne Zusatz eines Stoffwechsel-Aktivierungssystems anzulegen. 32. Positivkontrollen werden benötigt, um die Fähigkeit der verwendeten Zellen und des Testprotokolls zur Identifizierung von Klastogenen und Aneugenen nachzuweisen und die Stoffwechselkapazität der S9-Zubereitung zu bestätigen. Zur Positivkontrolle sollten bekannte Induktoren der Mikrokernbildung in Konzentrationen verwendet werden, die voraussichtlich eine geringe, aber reproduzierbare Zunahme gegenüber dem Hintergrund ergeben, womit sich die Empfindlichkeit des Versuchssystems nachweisen lässt. Die PK-Konzentrationen sollten so gewählt werden, dass die Wirkungen eindeutig sind, aber beim Ablesen nicht sofort die Identität der kodierten Objektträger erkennen lassen. 33. Zum Nachweis der Stoffwechselkapazität und der Fähigkeit des Testsystems zur Erkennung von Klastogenen sollte ein Klastogen verwendet werden, das eine Stoffwechsel-Aktivierung benötigt (z. B. Zyklophosphamid; Benzo[a]pyren). Sofern begründet, können weitere Positivkontrollen verwendet werden. Da einige Positivkontrollen, die eine Stoffwechsel-Aktivierung benötigen, unter bestimmten Behandlungsbedingungen oder in bestimmten Zelllinien auch ohne exogene Stoffwechsel-Aktivierung wirken können, sollten die Notwendigkeit der Stoffwechsel-Aktivierung und die Wirkung der S9-Zubereitung in der gewählten Zelllinie und den gewählten Konzentrationen geprüft werden. 34. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind keine Aneugene bekannt, die zu ihrer genotoxischen Wirkung eine Stoffwechsel-Aktivierung benötigen (16). Im Allgemeinen akzeptierte Positivkontrollen für eine aneugene Wirkung sind zum Beispiel Colchicin und Vinblastin. Es können auch andere Chemikalien verwendet werden, sofern sie Mikrokerne nur oder primär durch ihre aneugene Wirkung induzieren. Um zu vermeiden, dass zwei PK (für Klastogenizität und Aneugenizität) ohne Stoffwechsel-Aktivierung benötigt werden, kann die Aneugenizitätskontrolle als PK ohne S9 dienen, und die Klastogenizitätskontrolle kann verwendet werden, um die Eignung des eingesetzten Stoffwechsel-Aktivierungssystems zu prüfen. Positivkontrollen für Klastogenizität und Aneugenizität sollten in Zellen verwendet werden, die kein S9 benötigen. Die vorgeschlagenen Positivkontrollen sind in Anlage 3 aufgeführt. 35. Die Verwendung einer Positivkontrolle derselben chemischen Klasse kann in Erwägung gezogen werden, wenn geeignete Chemikalien zur Verfügung stehen. Alle Positivkontrollen sollten für den Zelltyp und die Aktivierungsbedingungen geeignet sein. 36. Für jeden Erntezeitpunkt sind Lösungsmittel-/Vehikelkontrollen anzulegen. Darüber hinaus sollten auch unbehandelte Negativkontrollen (ohne Lösungsmittel/Vehikel) verwendet werden, soweit nicht veröffentlichte oder laborspezifische historische Kontrolldaten belegen, dass das gewählte Lösungsmittel in den verwendeten Konzentrationen keine genotoxischen oder sonstigen schädlichen Wirkungen hervorruft. TESTVERFAHREN Behandlungsplan 37. Um die Wahrscheinlichkeit zu maximieren, dass ein Aneugen oder Klastogen in einem bestimmten Stadium des Zellzyklus erkannt wird, muss eine ausreichende Anzahl an Zellen während aller Stadien ihrer Zellzyklen mit der Prüfsubstanz behandelt werden. Der Behandlungsplan für Zelllinien und primäre Zellkulturen kann daher in gewisser Weise von dem für Lymphozyten abweichen, die für den Beginn ihres Zellzyklus einer mitogenen Stimulation bedürfen. Hierauf wird in den Absätzen 41-43 genauer eingegangen (16). 38. Theoretische Überlegungen und veröffentlichte Daten (18) legen nahe, dass die meisten Aneugene und Klastogene entdeckt werden, wenn eine kurze Behandlung von 3 bis 6 Stunden mit oder ohne Vorhandensein von S9 erfolgt, worauf die Prüfsubstanz entfernt wird und sich eine Wachstumsperiode von 1,5-2,0 Zellzyklen anschließt (6). Die Zellen werden in einem Zeitraum beprobt, der etwa der 1,5-fachen bis 2-fachen Dauer des normalen (d. h. unbehandelten) Zellzyklus entweder nach Behandlungsbeginn oder nach Ende der Behandlung entspricht (siehe Tabelle 1). Die Zeiträume für die Probenahme oder Regenerierung können ausgedehnt werden, wenn bekannt ist oder der Verdacht besteht, dass die Prüfsubstanz die Dauer des Zellzyklus beeinflusst (z. B. bei der Prüfung von Nucleosidanalogen). 39. Aufgrund der potenziellen zytotoxischen Wirkung von S9-Zubereitungen auf kultivierte Säugetierzellen wird eine verlängerte Expositionsbehandlung der 1,5-fachen bis 2-fachen Dauer des normalen Zellzyklus nur ohne Vorhandensein von S9 vorgenommen. Bei der verlängerten Behandlung werden Optionen angeboten, um eine Behandlung der Zellen mit der Prüfsubstanz mit oder ohne cytoB zu ermöglichen. Diese Optionen gelten für Situationen, in denen Befürchtungen hinsichtlich der möglichen Wechselwirkung zwischen der Prüfsubstanz und cytoB bestehen. 40. Die empfohlenen Zellbehandlungspläne sind in Tabelle 1 aufgeführt. Es handelt sich um allgemeine Behandlungspläne, die je nach der Stabilität oder Reaktivität der Prüfsubstanz oder den besonderen Wachstumseigenschaften der verwendeten Zellen modifiziert werden können. Alle Behandlungen sollten während des exponentiellen Wachstums der Zellen einsetzen und enden. Die genannten Pläne werden ausführlicher in den nachstehenden Absätzen 41-47 vorgestellt. Tabelle 1 Pläne für Zellbehandlung und -gewinnung beim MNvit-Test Lymphozyten, Primärzellen und Zelllinien, die mit cytoB behandelt wurden + S9 3-6 Stunden Behandlung in Anwesenheit von S9; Entfernung von S9 und Behandlungsmedium; Zugabe von neuem Medium und cytoB; Zellgewinnung nach 1,5-2,0 normalen Zellzyklen. – S9 Kurze Exposition 3-6 Stunden Behandlung; Entfernung des Behandlungsmediums; Zugabe von neuem Medium und cytoB; Zellgewinnung nach 1,5-2,0 normalen Zellzyklen. – S9 Verlängerte Exposition Option A: Behandlung über 1,5-2,0 normale Zellzyklen in Anwesenheit von cytoB; Gewinnung am Ende der Expositionsdauer. Option B: Behandlung über 1,5-2,0 normale Zellzyklen; Entfernung der Prüfsubstanz; Zugabe von neuem Medium und cytoB; Zellgewinnung nach 1,5-2,0 normalen Zellzyklen. Zelllinien, die ohne cytoB behandelt wurden (Ebenso wie die oben genannten Behandlungspläne mit der Ausnahme, dass kein cytoB zugegeben wird) Lymphozyten, Primärzellen und Zelllinien mit cytoB 41. Bei Lymphozyten ist es am wirksamsten, die Exposition gegenüber der Prüfsubstanz 44-48 Stunden nach der PHA-Stimulation zu beginnen, wenn die Zyklussynchronisierung nicht mehr vorhanden ist (5). Bei dem anfänglichen Test werden die Zellen über einen Zeitraum von 3-6 Stunden mit und ohne Zusatz von S9 mit der Prüfsubstanz behandelt. Das Behandlungsmedium wird entfernt und durch ein frisches Medium, das cytoB enthält, ersetzt. Die Zellgewinnung erfolgt nach weiteren 1,5-2,0 normalen Zellzyklen. 42. Wenn beide anfänglichen Tests nach der kurzen (3- bis 6-stündigen) Behandlung zu negativen oder nicht eindeutigen Ergebnissen führen, erfolgt eine weitere verlängerte Expositionsbehandlung ohne S9. Zwei weitere Behandlungsoptionen sind verfügbar und gleichermaßen akzeptabel. Möglicherweise ist es jedoch sinnvoller, Option A mit stimulierten Lymphozyten anzuwenden, da das exponentielle Wachstum 96 Stunden nach der Stimulation abnehmen dürfte. Ebenso sollten die Zellkulturen zum Zeitpunkt der abschließenden Probenahme in Option B noch nicht konfluent geworden sein. — Option A: Die Zellen werden über 1,5 bis 2,0 normale Zellzyklen mit der Prüfsubstanz behandelt und die Gewinnung erfolgt am Ende der Behandlungsdauer. — Option B: Die Zellen werden über 1,5 bis 2,0 normale Zellzyklen mit der Prüfsubstanz behandelt. Das Behandlungsmedium wird entfernt und durch ein frisches Medium ersetzt. Die Zellgewinnung erfolgt nach zusätzlichen 1,5-2,0 normalen Zellzyklen. 43. Primärzellen und Zelllinien sollten ähnlich wie Lymphozyten behandelt werden. Es ist allerdings nicht notwendig, sie für 44-48 Stunden mit PHA zu stimulieren. Andere Zellen als Lymphozyten sollten so exponiert werden, dass sich die Zellen bei Abschluss des Versuchs immer noch im Log-Phase-Wachstum befinden. Zelllinien ohne cytoB 44. Die Zellen sollten über einen Zeitraum von 3-6 Stunden mit und ohne Zusatz von S9 behandelt werden. Das Behandlungsmedium wird entfernt und durch ein frisches Medium ersetzt. Die Zellgewinnung erfolgt nach zusätzlichen 1,5-2,0 normalen Zellzyklen. 45. Wenn beide anfänglichen Tests nach der kurzen (3- bis 6-stündigen) Behandlung zu negativen oder nicht eindeutigen Ergebnissen führen, erfolgt eine weitere verlängerte Expositionsbehandlung (ohne S9). Zwei weitere Behandlungsoptionen sind verfügbar und beide gleichermaßen akzeptabel: — Option A: Die Zellen werden über 1,5 bis 2,0 normale Zellzyklen mit der Prüfsubstanz behandelt und die Gewinnung erfolgt am Ende der Behandlungsdauer. — Option B: Die Zellen werden über 1,5 bis 2,0 normale Zellzyklen mit der Prüfsubstanz behandelt. Das Behandlungsmedium wird entfernt und durch ein frisches Medium ersetzt. Die Zellgewinnung erfolgt nach zusätzlichen 1,5-2,0 normalen Zellzyklen. 46. In Monolagern können am Ende der 3- bis 6-stündigen Behandlung mitotische Zellen vorhanden sein (diese sind daran zu erkennen, dass sie rund sind und sich von der Oberfläche lösen). Da diese mitotischen Zellen sich leicht lösen, können sie bei Entfernung des Mediums mit der Prüfsubstanz verloren gehen. Es ist sorgfältig darauf zu achten, diese Zellen beim Spülen der Kulturen aufzufangen und sie in die Kulturen zurückzugeben, damit nicht in Mitose befindliche Zellen, die das Risiko einer Mikrokernbildung aufweisen, zum Zeitpunkt der Gewinnung unberücksichtigt bleiben. Anzahl der Kulturen 47. Für jede Konzentration der Prüfsubstanz sowie für die Vehikel-/Lösungsmittelkulturen und Kontrollkulturen sollten zwei gleichzeitige Kulturen angelegt werden. Lässt sich anhand von historischen Labordaten nachweisen, dass zwischen den Zweifachkulturen nur eine minimale Abweichung besteht, so ist ggf. die Verwendung von Einfachkulturen vertretbar. Wenn Einfachkulturen verwendet werden, wird die Analyse einer erhöhten Anzahl von Konzentrationen empfohlen. Zellgewinnung und Präparation des Objektträgers 48. Jede Kultur wird gesondert gewonnen und aufgearbeitet. Die Zellpräparation kann eine Behandlung mit hypotoner Lösung beinhalten, dieser Schritt ist jedoch nicht notwendig, wenn eine angemessene Ausbreitung der Zellen anderweitig sichergestellt wird. Bei der Präparation der Objektträger können verschiedene Techniken verwendet werden, vorausgesetzt, es werden Zellpräparate hoher Qualität zur Auswertung bereitgestellt. Dabei sollte Zytoplasma zurückgehalten werden, um die Erkennung von Mikrokernen sowie (bei der Zytokinese-Block-Methode) die zuverlässige Identifizierung zweikerniger Zellen zu ermöglichen. 49. Die Objektträger können mit verschiedenen Verfahren gefärbt werden, wie zum Beispiel mit Giemsa oder fluoreszierenden DNA-spezifischen Farbstoffen (59). Durch Verwendung eines DNA-spezifischen Farbstoffs (z. B. Acridin Orange (61) oder Hoechst 33258 Plus Pyronin-Y (62)) lassen sich bestimmte Artefakte vermeiden, die bei Verwendung eines nicht DNA-spezifischen Farbstoffs auftreten. Zur Identifizierung des Inhalts (Chromosomen/Chromosomenfragmente) von Mikrokernen können Anti-Kinetochor-Antikörper, FISH mit panzentromerischen DNA-Sonden oder eine präparierte in situ-Markierung mit panzentromer-spezifischen Primern, zusammen mit der geeigneten DNA-Gegenfärbung, verwendet werden, wenn mechanistische Informationen zu ihrer Bildung benötigt werden (15) (16). Andere Methoden zur Unterscheidung zwischen Klastogenen und Aneugenen können ebenfalls verwendet werden, wenn sie sich als wirksam erwiesen haben. Analyse 50. Alle Objektträger, auch die für die Lösungsmittel-/Vehikelgruppen und die Kontrollen, sind vor der mikroskopischen Untersuchung von unabhängiger Seite zu kodieren. Alternativ dazu können kodierte Proben mittels eines validierten automatisierten Analysesystems (Durchflusszytometrie oder Bildanalyse) untersucht werden. 51. In Kulturen, die mit cytoB behandelt wurden, sollten die Mikrokernfrequenzen von mindestens 2 000 zweikernigen Zellen pro Konzentration (mindestens 1 000 zweikernige Zellen pro Kultur; zwei Kulturen pro Konzentration) analysiert werden. Wenn Einfachkulturen verwendet werden, sollten in einer solchen Kultur mindestens 2 000 zweikernige Zellen pro Konzentration ausgewertet werden. Wenn wesentlich weniger als 1 000 zweikernige Kellen pro Kultur, bzw. 2 000 bei Einfachkulturen, in jeder Konzentration für die Auswertung zur Verfügung stehen, und wenn keine signifikante Zunahme an Mikrokernen festgestellt wird, sollte der Versuch mit einer höheren Anzahl an Zellen oder mit weniger toxischen Konzentrationen durchgeführt werden, je nachdem, was angemessen ist. Es sollte darauf geachtet werden, keine zweikernigen Zellen auszuwerten, die unregelmäßige Formen aufweisen oder deren zwei Kerne in der Größe beträchtlich voneinander abweichen; außerdem sollten zweikernige Zellen nicht mit schlecht auf dem Träger verteilten mehrkernigen Zellen verwechselt werden. Zellen mit mehr als zwei Hauptkernen sollten nicht auf Mikrokerne untersucht werden, da in diesen Zellen die zugrunde liegende Mikrokernfrequenz höher sein könnte (63) (64). Die Auswertung einkerniger Zellen ist akzeptabel, wenn die Prüfsubstanz nachweislich mit der Wirkung von cytoB interferiert. 52. In Zelllinien, die ohne cytoB-Behandlung getestet wurden, sollten die Mikrokerne in mindestens 2 000 Zellen pro Konzentration (mindestens 1 000 Zellen pro Kultur; zwei Kulturen pro Konzentration) ausgewertet werden. Wenn nur eine Kultur pro Konzentration verwendet wird, sollten in dieser Kultur mindestens 2 000 Zellen ausgewertet werden. 53. Wenn cytoB verwendet wird, sollte von mindestens 500 Zellen pro Kultur ein CBPI oder RI zur Bewertung der Zellproliferation (siehe Anlage 2) festgelegt werden. Wenn die Behandlungen in Abwesenheit von cytoB durchgeführt werden, muss unbedingt nachgewiesen werden, dass die ausgewerteten Zellen proliferiert haben, wie in den Absätzen 24-27 erläutert. Akzeptanzkriterien 54. Ein Labor, das die Durchführung des in dieser Prüfmethode beschriebenen MNvit-Tests anbietet, sollte nachweisen, dass es in der Lage ist, mit Hilfe der in Anlage 3 aufgeführten Referenzsubstanzen Chemikalien mit bekannter aneugener und klastogener Wirkung, mit und ohne Stoffwechsel-Aktivierung, sowie auch bekannte negative Chemikalien, zuverlässig und genau festzustellen. Als Nachweis seiner Fähigkeit, diese Prüfmethode ordnungsgemäß anzuwenden, sollte das Labor belegen, dass die auf Mikrokernbildung untersuchten Zellen eine Kernteilung durchlaufen haben, wenn der Test ohne cytoB durchgeführt wird. 55. Die Substanzen in Anlage 3 sind die zur Verwendung empfohlenen Referenzsubstanzen. Ersatzstoffe oder zusätzliche Chemikalien können einbezogen werden, wenn ihre Wirkung bekannt ist, wenn sie Mikrokerne mittels derselben Wirkmechanismen induzieren und wenn sie sich als relevant für die Chemikalien erweisen, die mit dem MNvit-Verfahren geprüft werden. Die Begründung könnte eine Validierungsstudie enthalten, die entweder auf einer breiten Auswahl an Substanzen beruht oder sich auf ein engeres Spektrum auf der Grundlage der chemischen Klasse der Prüfsubstanz oder des untersuchten Schädigungsmechanismus konzentriert. 56. Lösungsmittel-/Vehikelkontrollen und unbehandelte Kulturen sollten reproduzierbar niedrige und gleichbleibende Mikrokernfrequenzen zeigen (in der Regel 5-25 Mikrokerne pro 1 000 Zellen für die in Absatz 11 genannten Zelltypen). Andere Zelltypen können hiervon abweichende Reaktionsbereiche aufweisen, die bei ihrer Validierung zur Verwendung im MNvit-Test bestimmt werden sollten. Daten von Negativ-, Lösungsmittel- und Positivkontrollen sollten herangezogen werden, um historische Kontrollbereiche festzulegen. Diese Werte sollten bei Entscheidungen über die Eignung einer gleichzeitigen Negativkontrolle/Positivkontrolle für einen Versuch zugrunde gelegt werden. 57. Wenn für den Test geringfügige Änderungen des Protokolls vorgeschlagen werden (z. B. Verwendung automatisierter statt manueller Auswertungsverfahren; Verwendung eines neuen Zelltyps), sollte die Wirksamkeit der Änderung nachgewiesen werden, bevor das geänderte Protokoll als einsatztauglich befunden werden kann. Der Wirksamkeitsnachweis beinhaltet den Beweis, dass wesentliche Mechanismen wie Chromosomenbrüche oder Hinzugewinn bzw. Verlust von Chromosomenmaterial festgestellt werden können, und dass die entsprechenden positiven und negativen Ergebnisse für die Klasse der einzelnen Prüfsubstanz oder für die gesamte Bandbreite der zu testenden Substanzen erzielt werden können. DATEN UND BERICHTERSTATTUNG Behandlung der Ergebnisse 58. Bei Verwendung des Zytokinese-Block-Verfahrens werden nur die Frequenzen zweikerniger Zellen mit Mikrokernen (unabhängig von der Anzahl der Mikrokerne pro Zelle) zur Bewertung der Mikrokern-Induktion herangezogen. Die Auswertung der Anzahl an Zellen mit einem, zwei oder mehr Mikrokernen könnte nützliche Informationen liefern, ist jedoch nicht zwingend notwendig. 59. Festzulegen sind auch Maßnahmen, die gleichzeitig zur Bestimmung der Zytotoxizität und/oder Zytostase aller behandelten und Lösungsmittel-/Vehikelkontrollkulturen durchgeführt werden (58). Der CBPI oder der RI sollte für alle behandelten Kulturen und Kontrollkulturen berechnet werden, da sich bei Verwendung des Zytokinese-Block-Verfahrens die Messungen des Zellzyklus verzögern. Kommt cytoB nicht zum Einsatz, sollten die Relative Populationsverdopplung (RPD), die Relative Erhöhung der Zellzahl (RICC) oder der Proliferationsindex (PI) herangezogen werden (siehe Anlage 2). 60. Es sind die Daten für die einzelnen Kulturen zu dokumentieren. Zusätzlich sollten alle Daten in tabellarischer Form zusammengefasst werden. 61. Wenn Chemikalien im MNvit-Test Mikrokerne induzieren, könnte dies darauf zurückzuführen sein, dass sie Chromosomenbrüche, Chromosomenverlust oder eine Kombination aus beidem verursachen. Deshalb können weitere Analysen unter Einsatz von Anti-Kinetochor-Antikörpern, zentromer-spezifischen in situ-Sonden oder mit Hilfe sonstiger Methoden vorgenommen werden, um festzustellen, ob der Mechanismus der Mikrokern-Induktion von einer klastogenen und/oder aneugenen Wirkung herrührt. Bewertung und Interpretation der Ergebnisse 62. Bei einer eindeutigen positiven oder negativen Reaktion ist eine Verifizierung durch zusätzliche Versuche nicht erforderlich. Zur Klärung nicht eindeutiger Ergebnisse empfiehlt sich die Analyse von weiteren 1 000 Zellen aller Kulturen, um die erforderliche Verblindung aufrechtzuerhalten. Sollte diese Methode nicht zur Klärung des Ergebnisses führen, müssen weitere Tests durchgeführt werden. Bei Folgeversuchen sollte die Abänderung der Studienparameter mit Erweiterung oder Verengung des Bedingungsumfangs in Betracht gezogen werden. Zu den Studienparametern, die für eine Abänderung in Frage kommen, gehören die Abstände der Prüfkonzentrationen, der Zeitplan für Behandlung und Zellgewinnung und/oder die Bedingungen für die Stoffwechsel-Aktivierung. 63. Es gibt mehrere Kriterien für die Bestimmung eines positiven Ergebnisses, wie z. B. eine konzentrationsbezogene Zunahme oder eine statistisch signifikante Zunahme der Anzahl der Zellen mit Mikrokernen. Zunächst sollte die biologische Relevanz der Ergebnisse untersucht werden. Die Betrachtung der Frage, ob die festgestellten Werte innerhalb oder außerhalb des historischen Kontrollbereichs liegen, kann Anhaltspunkte für die Bewertung der biologischen Relevanz der Reaktion liefern. Als Hilfsmittel bei der Bewertung der Versuchsergebnisse können geeignete statistische Methoden dienen (65). Allerdings sollten die Ergebnisse statistischer Untersuchungen im Hinblick auf die Dosis-Wirkungs-Beziehung bewertet werden. Dabei ist auch der Reproduzierbarkeit und den historischen Daten Rechnung zu tragen. 64. Auch wenn die meisten Versuche eindeutig positive oder negative Ergebnisse liefern, erlaubt der Datensatz in manchen Fällen keine definitive Aussage über die Aktivität der Prüfsubstanz. Es kommt vor, dass unabhängig davon, wie oft der Versuch wiederholt wird, weiterhin nicht eindeutige oder fragwürdige Ergebnisse auftreten. 65. Positive Befunde beim MNvit-Test deuten darauf hin, dass die Prüfsubstanz in kultivierten Säugetierzellen Chromosomenbrüche oder Chromosomenverlust hervorruft. Negative Befunde sind ein Anzeichen dafür, dass die Prüfsubstanz unter den zugrunde gelegten Versuchsbedingungen keine Chromosomenbrüche und/oder Gewinn bzw. Verlust von Chromosomenmaterial in kultivierten Säugetierzellen hervorruft. Prüfbericht 66. Der Prüfbericht sollte mindestens folgende Informationen enthalten, wenn diese für die Durchführung der Studie relevant sind: Prüfchemikalie — Angaben zur Identifikation und CAS- (Chemical Abstract Services) Nummer sowie EG-Nummer; — physikalische Eigenschaft und Reinheit; — physikalisch-chemische Eigenschaften, die für die Durchführung der Studie relevant sind; — Reaktionsfähigkeit der Substanz mit dem Lösungsmittel/Vehikel oder dem Zellkulturmedium; Lösungsmittel/Vehikel — Begründung für die Wahl des Vehikels/Lösungsmittels; — Löslichkeit und Stabilität der Prüfsubstanz im Lösungsmittel/Vehikel, falls bekannt; Zellen — Typ und Herkunft der verwendeten Zellen; — Eignung des verwendeten Zelltyps; — ggf. Nichtvorhandensein von Mykoplasma; — Informationen zu Zellzyklusdauer, Verdopplungsdauer oder Proliferationsindex; — bei Verwendung von Lymphozyten: Geschlecht, Alter und Anzahl der Blutspender soweit zutreffend; — bei Verwendung von Lymphozyten: Angaben darüber, ob Vollblut oder separierte Lymphozyten in Kontakt mit der Prüfsubstanz gebracht werden; — ggf. Passagenanzahl; — ggf. zum Erhalt der Zellkultur verwendete Verfahren; — Modalwert der Chromosomen; — normale Zellzyklusdauer (Negativkontrolle); Prüfbedingungen — Bezeichnung der Zytokinese-Block-Substanz (z. B. cytoB), falls verwendet, deren Konzentration und Dauer der Zellexposition; — Begründung für die Auswahl der Konzentrationen und die Anzahl der Kulturen, darunter z. B. Angaben zur Zytotoxizität und Löslichkeitsgrenze, falls vorhanden; — Medienzusammensetzung, ggf. CO2-Konzentration; — Konzentrationen der Prüfsubstanz; — Konzentration (und/oder Volumen) des Vehikels und der beigegebenen Prüfsubstanz; — Inkubationstemperatur und -dauer; — Behandlungsdauer; — Zeitpunkt der Gewinnung nach der Behandlung; — ggf. Zelldichte bei der Beimpfung; — Art und Zusammensetzung des Stoffwechsel-Aktivierungssystems einschließlich Akzeptanzkriterien; — Positivkontrollsubstanzen und Negativkontrollen; — Methoden der Objektträger-Präparation und verwendetes Färbeverfahren; — Kriterien für die Identifizierung von Mikrokernen; — Anzahl der analysierten Zellen; — Methoden zur Bestimmung der Zytotoxizität; — alle zusätzliche Angaben zur Zytotoxizität; — Kriterien zur Einstufung der Studien als positiv, negativ oder nicht eindeutig; — verwendete statistische Analysemethode(n); — Methoden, z. B. die Verwendung von Kinetochor-Antikörpern, um ggf. zu beschreiben, ob Mikrokerne ganze oder fragmentierte Chromosomen enthalten; Ergebnisse — Verwendete Messung der Zytotoxizität, z. B. CBPI oder RI bei der Zytokinese-Block-Methode; RICC, RPD oder PI, wenn keine Zytokinese-Block-Verfahren verwendet werden; sonstige Beobachtungen bei Bedarf, z. B. Zell-Konfluenz, Apoptose, Nekrose, Metaphasezählung, Frequenz zweikerniger Zellen; — Ausfällungszeichen; — Angaben zum pH-Wert und zur Osmolalität des Behandlungsmediums, falls ermittelt; — Definition geeigneter Zellen für die Analyse; — Verteilung einkerniger, zweikerniger und mehrkerniger Zellen, falls ein Zytokinese-Block-Verfahren verwendet wird; — Anzahl der Zellen mit Mikrokernen, gesondert für jede behandelte Kultur und Kontrollkultur, und Angabe, ob diese von zweikernigen oder einkernigen Zellen stammen, sofern zutreffend; — nach Möglichkeit Konzentrations-Wirkungs-Verhältnis; — chemische Daten zu gleichzeitigen Negativ-(Lösungsmittel-/Vehikel-) Kontrollen und Positivkontrollen (Konzentrationen und Lösungsmittel); — Daten zu historischen Negativ-(Lösungsmittel-/Vehikel-)Kontrollen und Positivkontrollen mit Bereichen, Mittelwerten, Standardabweichungen sowie Konfidenzniveau (z. 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April 2004 über persistente organische Schadstoffe und zur Änderung der Richtlinie 79/117/EWG, ABl. 229 vom 30.4.2004, S. 5. Anlage 1 Begriffsbestimmungen Aneugen: Substanz oder Prozess, die/der durch Wechselwirkung mit den Komponenten des mitotischen oder meiotischen Zellteilungszyklus zu Aneuploidie in Zellen oder Organismen führt. Aneuploidie: Abweichung von der normalen diploiden (oder haploiden) Chromosomenzahl durch ein einziges Chromosom oder mehr, nicht aber durch einen ganzen (oder mehrere) Chromosomensatz/-sätze (Polyploidie). Apoptose: Programmierter Zelltod, der durch eine Reihe von Schritten charakterisiert ist, an deren Ende eine Desintegration von Zellen in membranumschlossene Partikel steht, die schließlich durch Phagozytose oder Shedding abgebaut werden. Zellproliferation: Zunahme der Anzahl von Zellen als Ergebnis der mitotischen Zellteilung. Zentromer: DNA-Bereich eines Chromosoms, an dem die beiden Chromatiden zusammengehalten werden, und an dem beide Kinetochoren Seite an Seite angeordnet sind. Klastogen: Substanz oder Prozess, die/der strukturelle Chromosomenaberrationen in Zell- oder Organismenpopulationen verursacht. Zytokinese: Prozess der Zellteilung unmittelbar nach der Mitose, in dem zwei Tochterzellen, jeweils mit einem einzigen Kern, gebildet werden. Zytokinese-Block-Proliferationsindex (CBPI): Anteil der Zellen aus zweiter Teilung in der behandelten Population im Verhältnis zur nicht behandelten Kontrollgruppe (entsprechende Formel vgl. Anlage 2). Zytostase: Hemmung des Zellwachstums (entsprechende Formel vgl. Anlage 2). Zytotoxizität: schädliche Auswirkungen auf Zellstruktur und -funktion, die letztlich zum Zelltod führen. Genotoxisch: allgemeiner Begriff, der alle Typen von DNA- oder Chromosomenschädigungen umfasst, einschließlich Brüchen, Addukt-Neubildungen, Mutationen, Chromosomenaberrationen sowie Aneuploidie. Nicht alle genotoxischen Effekte führen zu Mutationen oder stabilen Chromosomenschäden. Interphasezellen: Zellen, die sich nicht im Stadium der Mitose befinden. Kinetochor: proteinhaltige Struktur, die sich am Zentromer eines Chromosoms sammelt, an der während der Zellteilung die Spindelfasern anhaften, wodurch die ordnungsgemäße Beförderung der Tochterchromosomen zu den Polen der Tochterzellen ermöglicht wird. Mikronuklei/Mikrokerne: kleine Kerne zusätzlich zu den Hauptkernen der Zellen und von diesen getrennt, die während der Telophase der Mitose oder Meiose durch zurückgebliebene Chromosomenteile oder ganze Chromosomen gebildet werden. Mitose: Teilung des Zellkerns, die in der Regel in Prophase, Prometaphase, Metaphase, Anaphase und Telophase gegliedert ist. Mitoseindex: Anteil der Zellen einer Zellpopulation, die sich zum Beobachtungszeitpunkt in Metaphase befinden; zugleich Hinweis auf den Grad der Zellproliferation in dieser Population. Mutagen: Auslöser einer Erbgutveränderung der DNA-Basenpaarsequenz(en) in Genen oder in der Chromosomenstruktur (Chromosomenaberrationen). Non-Disjunktion: Unvermögen der paarweise angeordneten Chromatiden, sich zu trennen und sich auf die in Entwicklung begriffenen Tochterzellen aufzuteilen. Dabei entstehen Tochterzellen mit abweichenden Chromosomenzahlen. Polyploidie: Zahlenmäßige Chromosomenaberrationen in Zellen oder Organismen, von denen ein oder mehrere ganze Chromosomensätze betroffen sind, im Gegensatz zur Aneuploidie, bei der nur ein oder mehrere einzelne Chromosomen betroffen sind. Proliferationsindex (PI): Verfahren zur Messung der Zytotoxizität, wenn kein cytoB verwendet wird (entsprechende Formel vgl. Anlage 2). Relative Erhöhung der Zellzahl (RICC): Verfahren zur Messung der Zytotoxizität, wenn kein cytoB verwendet wird (entsprechende Formel vgl. Anlage 2). Relative Populationsverdopplung (RPD): Verfahren zur Messung der Zytotoxizität, wenn kein cytoB verwendet wird (entsprechende Formel vgl. Anlage 2). Replikationsindex (RI): Anteil der abgeschlossenen Zellteilungszyklen in einer behandelten Kultur im Verhältnis zur nicht behandelten Kontrollgruppe während der Expositions- und Regenerationsphase (entsprechende Formel vgl. Anlage 2). Prüfchemikalie (auch Prüfsubstanz): Jeder Stoff oder jedes Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode getestet wird. Anlage 2 Formeln zur Bewertung der Zytotoxizität 1. Wenn cytoB zum Einsatz kommt, sollte die Bewertung der Zytotoxizität auf dem Zytokinese-Block-Proliferationsindex (CBPI) oder dem Replikationsindex (RI) beruhen (16) (58). Der CBPI gibt die mittlere Zahl der Zellzyklen pro Zelle während der Exposition gegenüber cytoB an und kann zur Berechnung der Zellproliferation eingesetzt werden. Der RI gibt die relative Zahl der Zellkerne in behandelten Kulturen im Vergleich zu Kontrollkulturen an und kann zur Berechnung der Zytostase in % verwendet werden: % Zytostase = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)} Und: T = mit der Prüfchemikalie behandelte Kultur C = Vehikel-Kontrollkultur Dabei gilt: Damit entspricht ein CBPI von 1 (alle Zellen sind einkernig) einer Zytostase von 100 %. Zytostase = 100 – RI T = behandelte Kulturen C = Kontrollkulturen 2. Folglich bedeutet ein RI von 53 %: von 100 % der Zellen in der Kontrollkultur, die sich geteilt und anschließend zweikernige und mehrkernige Zellen gebildet haben, haben sich in der behandelten Kultur nur 53 % geteilt, d. h. es ergibt sich für die Zytostase ein prozentualer Wert von 47 %. 3. Wenn kein cytoB zum Einsatz kommt, wird eine Bewertung der Zytotoxizität auf der Basis der Relativen Erhöhung der Zellzahl (RICC) oder der Relativen Populationsverdopplung (RPD) empfohlen (58), da bei beiden der Anteil der Zellpopulation berücksichtigt wird, die eine Teilung vollzogen hat. Dabei gilt: Populationsverdopplung = [log (Zellzahl nach Behandlung ÷ Anfängliche Zellzahl)] ÷ log 2 4. Somit zeigt ein RICC oder eine RPD von 53 % eine Zytotoxizität/Zytostase von 47 % an. 5. Bei Verwendung eines Proliferationsindex (PI) kann die Zytotoxizität durch das Zählen aller Klone bewertet werden, die aus 1 Zelle (cl1), 2 Zellen (cl2), 3 bis 4 Zellen (cl4) sowie 5 bis 8 Zellen (cl8) bestehen. 6. Der PI wurde als aussagefähiger und zuverlässiger Parameter für Zytotoxizität auch bei Zelllinien verwendet, die in situ ohne cytoB kultiviert wurden (25) (26) (27) (28). Anlage 3 Zur Leistungsbewertung empfohlene Referenzsubstanzen (16) Kategorie Substanz CAS-Nr. EG-Nr.: 1. Klastogene, die ohne Stoffwechsel-Aktivierung wirken Zytosin-Arabinosid 147-94-4 205-705-9 Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 2. Klastogene, die eine Stoffwechsel-Aktivierung erfordern Benzo(a)pyren 50-32-8 200-028-5 Zyklophosphamid 50-18-0 200-015-4 3. Aneugene Colchicin 64-86-8 200-598-5 Vinblastin 143-67-9 205-606-0 4. Negative Substanzen Di(2-ethylhexyl)phthalat 117-81-7 204-211-0 Nalidixinsäure 389-08-2 206-864-7 Pyren 129-00-0 204-927-3 Natriumchlorid 7647-14-5 231-598-3 B.50. HAUTSENSIBILISIERUNG: LOKALER LYMPHKNOTENTEST: DA EINLEITUNG 1. Die OECD-Leitlinien für die Prüfung von Chemikalien und die EU-Prüfmethoden werden regelmäßig überarbeitet, um dem wissenschaftlichen Fortschritt, sich ändernden Rechtsvorgaben und Belangen des Tierschutzes gerecht zu werden. Die ursprüngliche Prüfmethode (B.42) zur Bestimmung der Hautsensibilisierung bei der Maus, der Lokale Lymphknotentest (Local Lymph Node Assay bzw. LLNA; OECD-Prüfrichtlinie 429) wurde inzwischen überarbeitet (1). Verschiedene Veröffentlichungen (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) gehen genauer auf die Validierung des LLNA und auf die mit ihm verbundenen wissenschaftlichen Arbeiten ein. Bei dem LLNA wird zur Messung der Lymphozytenproliferation radioisotopisches Thymidin oder Jod verwendet. Der Test hat daher Beschränkungen, wenn der Erwerb, die Verwendung oder die Entsorgung radioaktiver Materialien mit Problemen verbunden sind. Bei dem LLNA: DA (entwickelt von Daicel Chemical Industries, Ltd.) handelt es sich um eine nicht-radioaktive Modifikation des LLNA, die den Gehalt an Adenosintriphosphat (ATP) mittels Biolumineszenz als Indikator für die Lymphozytenproliferation bestimmt. Die Prüfmethode LLNA: DA wurde durch ein internationales Gremium für Sachverständigengutachten (peer review) validiert, geprüft und zur Identifizierung sensibilisierender und nicht sensibilisierender Chemikalien mit einigen Beschränkungen als geeignet befunden (10) (11) (12) (13). Diese Prüfmethode wurde zur Bewertung des Hautsensibilisierungspotenzials von Chemikalien (Stoffen und Gemischen) bei Tieren entwickelt. Kapitel B.6 dieses Anhangs und OECD-Prüfrichtlinie 406 stützen sich auf Meerschweinchen-Tests, insbesondere den Meerschweinchen-Maximierungstest und den Bühler-Test (14). Der LLNA (Kapitel B.42 dieses Anhangs; OECD-Prüfrichtlinie 429) und die beiden nicht-radioaktiven Modifikationen, LLNA: DA (Kapitel B.50 dieses Anhangs; OECD-Prüfrichtlinie 442 A) und LLNA: BrdU-ELISA (Kapitel B.51 dieses Anhangs; OECD-Prüfrichtlinie 442 B) haben insofern Vorteile gegenüber den Meerschweinchen-Tests in B.6 und OECD-Prüfrichtlinie 406 (14), als sie einen verringerten und gezielteren Einsatz von Versuchstieren ermöglichen. 2. Ebenso wie im LLNA wird bei dem LLNA: DA die Induktionsphase der Hautsensibilisierung untersucht. Der Test liefert quantitative Daten für die Bewertung von Dosis-Wirkungs-Beziehungen. Durch den möglichen Nachweis von hautsensibilisierenden Stoffen ohne die Verwendung radioaktiver Markierungen für die DNA können die berufliche Exposition gegenüber Radioaktivität und Entsorgungsprobleme vermieden werden. Dies wiederum ermöglicht eine verstärkte Verwendung von Mäusen zur Bestimmung hautsensibilisierender Stoffe und somit eine geringere Verwendung von Meerschweinchen zur Bewertung des hautsensibilisierenden Potenzials (B.6; OECD-Prüfrichtlinie 406) (14). BEGRIFFSBESTIMMUNGEN 3. Die verwendeten Begriffsbestimmungen sind in Anlage 1 aufgeführt. AUSGANGSÜBERLEGUNGEN UND BEGRENZUNGEN 4. Der LLNA: DA ist eine modifizierte LLNA-Methode zum Nachweis von Chemikalien mit potenziell hautsensibilisierenden Eigenschaften, mit bestimmten Beschränkungen. Dies bedeutet nicht notwendigerweise, dass der LLNA: DA zwingend in jedem Fall anstelle des LLNA oder der Meerschweinchen-Tests (B.6; OECD-Prüfrichtlinie) (14) eingesetzt werden muss. Vielmehr erweist sich der Test als gleichermaßen wertvoll und kann als Alternative gewählt werden, bei der im Allgemeinen keine weitere Bestätigung von positiven oder negativen Ergebnissen erforderlich ist. (10) (11). Das Prüflabor sollte vor der Durchführung der Studie alle verfügbaren Informationen über die Prüfsubstanz auswerten und berücksichtigen. Zu diesen Informationen zählen die Identität und die chemische Struktur der Prüfsubstanz, ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften, die Ergebnisse aller sonstigen in vitro- oder in vivo-Toxizitätsprüfungen der Prüfsubstanz sowie toxikologische Daten zu strukturell verwandten Chemikalien. Diese Informationen sind zu berücksichtigen, um die Eignung des LLNA: DA für die jeweilige Prüfsubstanz festzustellen (bestimmte Arten chemischer Stoffe sind mit dem LLNA: DA nicht kompatibel [siehe Absatz 5]) und die Festlegung der Dosis zu erleichtern. 5. Beim LLNA: DA handelt es sich um eine in vivo-Methode. Das bedeutet, dass die kontaktsensibilisierenden Eigenschaften weiterhin an Tieren bewertet werden. Der Test erlaubt es jedoch, im Vergleich zu den Meerschweinchen-Tests (B.6; OECD-Prüfrichtlinie 406) die Anzahl der für diesen Zweck benötigten Tiere zu reduzieren (14). Zudem ist der LLNA: DA eine wesentlich verfeinerte Methode im Hinblick auf die Verwendung der Tiere (weniger Schmerzen und Leiden) bei den Tests zur Kontraktsensibilisierung, da es beim LLNA: DA, anders als bei B.6 und OECD-Prüfrichtlinie 406, nicht erforderlich ist, provozierte Überempfindlichkeitsreaktionen der Haut auszulösen. Trotz der Vorteile, die der LLNA: DA gegenüber B.6 und OECD-Prüfrichtlinie 406 (14) aufweist, ist er mit gewissen Einschränkungen behaftet, die die Anwendung von B.6 oder von OECD-Prüfrichtlinie 406 erforderlich machen können (z. B. die Prüfung bestimmter Metalle, falsch positive Ergebnisse bei bestimmten hautreizenden Stoffen [wie etwa bei tensidähnlichen Chemikalien] (6) (1 und Kapitel B.42 in diesem Anhang), oder die Löslichkeit der Prüfsubstanz). Zudem können chemische Klassen oder Substanzen mit Funktionsgruppen, die erwiesenermaßen als potenzielle Störfaktoren wirken können (16), den Einsatz von Meerschweinchen-Tests erforderlich machen (B.6; OECD-Prüfrichtlinie 406) (14)). Beschränkungen, die für den LLNA festgestellt wurden (1, und Kapitel B.42 dieses Anhangs), empfehlen sich auch für den LLNA: DA (10). Zudem könnte die Verwendung des LLNA: DA ungeeignet sein für die Prüfung von Substanzen mit Auswirkungen auf das ATP-Niveau (z. B. Substanzen, die als ATP-Hemmer wirken) oder Substanzen, die die genaue Messung der intrazellulären ATP-Messung beeinträchtigen (z. B. Vorhandensein ATP abbauender Enzyme, Vorhandensein extrazellulären ATPs im Lymphknoten). Abgesehen von diesen bekannten Beschränkungen dürfte der LLNA: DA für die Prüfung aller Substanzen geeignet sein, sofern mit diesen Substanzen keine Eigenschaften verbunden sind, die die Genauigkeit des LLNA: DA beeinträchtigen könnten. Außerdem sollte die Möglichkeit positiver Grenzergebnisse in Betracht gezogen werden, wenn für den Stimulationsindex (SI) Werte zwischen 1,8 und 2,5 ermittelt werden (siehe Absätze 31-32). Dies beruht auf der Validierungs-Datenbasis von 44 Substanzen mit einem SI ≥ 1,8 (siehe Absatz 6), bei denen der LLNA: DA alle 32 LLNA-Sensibilisatoren richtig identifizierte, jedoch drei von 12 LLNA-Nichtsensibilisatoren mit SI-Werten zwischen 1,8 und 2,5 (d. h. positive Grenzwerte) (10) nicht korrekt identifizierte. Da allerdings derselbe Datensatz für die Einstellung der SI-Werte und die Berechnung der prädiktiven Eigenschaften des Tests verwendet wurde, könnten die festgestellten Ergebnisse auch eine Überbewertung der tatsächlichen prädiktiven Eigenschaften sein. PRINZIP DER PRÜFMETHODE 6. Der LLNA: DA beruht auf dem Prinzip, dass sensibilisierende Stoffe eine Lymphozytenproliferation in den drainierenden Lymphknoten an der Stelle der Applikation des chemischen Stoffes induzieren. Diese Proliferation verläuft proportional zur Dosis und zur Wirksamkeit des applizierten Allergens und bietet sich als einfache Möglichkeit an, eine quantitative Messung der Sensibilisierung zu erhalten. Die Proliferation wird gemessen, indem man die mittlere Proliferation jeder Prüfgruppe mit der mittleren Proliferation der mit Vehikel behandelten Kontrollgruppe (VK) vergleicht. Das Verhältnis der mittleren Proliferation in jeder Behandlungsgruppe zu dem in der gleichzeitigen Vehikelkontrollgruppe, auch als SI bezeichnet, wird festgelegt und sollte ≥ 1,8 betragen, ehe eine weitere Bewertung einer Prüfsubstanz als potenzieller Hautsensibilisator erfolgt. Die hier beschriebenen Methoden beruhen auf der Messung des ATP-Gehalts durch Biolumineszenz (die bekanntermaßen mit der Anzahl lebender Zellen korreliert) (17), um einen erhöhten Anteil proliferierender Zellen in den drainierenden aurikulären Lymphknoten nachzuweisen (18) (19). Die Biolumineszenz-Methode stützt sich auf das Enzym Luciferase, um die Bildung von Licht aus ATP und Luciferin mittels der folgenden Reaktion zu katalysieren: ATP + Luciferin + O 2 Oxyluciferin + AMP + PPi + CO 2 + Light Die emittierte Lichtintensität steht in linearer Beziehung zur ATP-Konzentration und wird mit einem Luminometer gemessen. Bei dem Luciferin-Luciferase-Test handelt es sich um eine sensible Methode zur ATP-Quantifizierung, die in einer breiten Palette von Anwendungen zum Einsatz kommt (20). BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE Auswahl von Versuchstierarten 7. Für diesen Test ist die Maus die Spezies der Wahl. Validierungsstudien für den LLNA: DA wurden ausschließlich mit dem CBA/J-Stamm durchgeführt, der daher als bevorzugter Stamm gilt (12) (13). Es werden junge erwachsene weibliche Mäuse verwendet, die weder geworfen haben noch trächtig sind. Bei Versuchsbeginn sollten die Tiere 8-12 Wochen alt sein, die Gewichtsunterschiede minimal sein und 20 % des mittleren Gewichts nicht übersteigen. Alternativ können Tests an anderen Stämmen und männlichen Tieren erfolgen, wenn anhand von hinlänglich großen Datenangaben nachgewiesen werden kann, dass keine signifikanten stamm- und/oder geschlechtsspezifischen Unterschiede in der Reaktion auf den LLNA: DA bestehen. Haltungs- und Fütterungsbedingungen 8. Mäuse sollten in Gruppen gehalten werden (21), wenn nicht angemessene wissenschaftliche Begründungen eine Einzelhaltung nahelegen. Die Temperatur im Versuchsraum sollte 22 ± 3 °C betragen. Obwohl die relative Luftfeuchtigkeit mindestens 30 % betragen und zu anderen Zeiten als während der Reinigung vorzugsweise nicht über 70 % liegen soll, ist ein Wert von 50-60 % anzustreben. Die Beleuchtung sollte künstlich sein und die Hell- und Dunkelphasen sollten sich im Abstand von 12 Stunden abwechseln. An die Versuchstiere kann herkömmliches Laborfutter verfüttert werden, und eine unbegrenzte Trinkwasserversorgung ist zu gewährleisten. Vorbereitung der Tiere 9. Die Tiere werden nach Zufallskriterien ausgewählt, zur individuellen Identifizierung markiert (aber nicht am Ohr) und vor Beginn der Dosierung für einen Zeitraum von mindestens 5 Tagen in ihren Käfigen an die Laborbedingungen gewöhnt. Vor Behandlungsbeginn werden alle Tiere untersucht, um sicherzustellen, dass keine sichtbaren Hautverletzungen bestehen. Vorbereitung der Dosierlösungen 10. Feste Chemikalien sollten vor der Applikation in ein Mäuseohr in Lösungsmitteln/Vehikeln gelöst oder suspendiert und ggf. verdünnt werden. Flüssige Chemikalien können direkt appliziert oder zuvor verdünnt werden. Unlösliche Chemikalien, wie sie in der Regel in Medizinprodukten vorliegen, sollten vor der Applikation in ein Mäuseohr in einem geeigneten Lösungsmittel einer übertrieben starken Extraktion unterzogen werden, um alle extrahierbaren Inhaltsstoffe vor der Prüfung sichtbar zu machen. Die Prüfsubstanzen sollten täglich zubereitet werden, es sei denn, die Stabilität der Substanz bei Lagerung wird nachgewiesen. Überprüfung der Zuverlässigkeit: 11. Anhand von positiven Kontrollchemikalien (PC) wird die ordnungsgemäße Leistung des Tests nachgewiesen. Hierzu ist eine angemessene und reproduzierbare Empfindlichkeit der Reaktion auf eine sensibilisierende Prüfsubstanz erforderlich, wobei die Reaktionsstärke gut charakterisiert ist. Es wird die Einbeziehung einer gleichzeitigen Positivkontrolle empfohlen, da diese die Fähigkeit des Labors belegt, jeden Test erfolgreich durchzuführen und eine Bewertung der Wiederholbarkeit und Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Labors ermöglicht. Einige Regulierungsbehörden schreiben eine Positivkontrolle für jede Studie vor. Daher wird Anwendern empfohlen, vor Durchführung des LLNA: DA die zuständigen Behörden zu Rate zu ziehen. Dementsprechend wird die routinemäßige Verwendung einer gleichzeitigen Positivkontrolle angeregt, um die Notwendigkeit zusätzlicher Tierversuche zur Erfüllung von Anforderungen zu vermeiden, die aus der Verwendung einer nur periodischen Positivkontrolle resultieren könnten (siehe Absatz 12). Die Positivkontrolle sollte eine positive Reaktion auf den LLNA: DA bei einem Expositionsniveau hervorrufen, das einen Anstieg des Stimulationsindex (SI ≥ 1,8 im Vergleich zur Negativkontrollgruppe, NK) bewirkt. Die positive Kontrolldosis soll so gewählt werden, dass sie keine übermäßige Hautreizung oder systemische Toxizität verursacht und die Induktion reproduzierbar, aber nicht exzessiv ist (z. B. ein SI > 10 würde als exzessiv gelten). Bevorzugte positive Kontrollstoffe sind 25 % Hexylcinnaminaldehyd (Chemical Abstracts Service [CAS]-Nr. 101-86-0) und 25 % Eugenol (CAS-Nummer 97-53-0) in Aceton: Olivenöl (4:1, v/v). Unter bestimmten Umständen können in ausreichend begründeten Fällen andere Kontrollsubstanzen eingesetzt werden, die den genannten Kriterien entsprechen. 12. Obwohl die Einbeziehung einer gleichzeitigen Positivkontrollgruppe empfohlen wird, können in gewissen Situationen periodische Prüfungen (d. h. in Abständen ≤ 6 Monaten) der Positivkontrolle für Laboratorien ausreichen, die den LLNA: DA regelmäßig (d. h. mindestens einmal pro Monat) durchführen und über eine etablierte historische Kontrolldatenbasis verfügen, die die Fähigkeit des Labors bestätigt, reproduzierbare und genaue Ergebnisse mit Positivkontrollen zu erzielen. Eine angemessene Beherrschung des LLNA: DA kann erfolgreich nachgewiesen werden, indem durchgehend positive Ergebnisse mit den positiven Kontrollchemikalien in mindestens 10 unabhängigen Prüfungen erzielt werden, die innerhalb eines angemessenen Zeitraums (d. h. in weniger als einem Jahr) durchgeführt wurden. 13. Eine gleichzeitige Positivkontrollgruppe sollte immer einbezogen werden, wenn Verfahrensänderungen im LLNA: DA auftreten (z. B. Wechsel des geschulten Personals, Änderung der Materialien bei den Prüfmethoden und/oder der Reagenzien, Änderung der Ausrüstung, Änderung der Herkunft der Versuchstiere). Solche Änderungen sollten in Laborberichten dokumentiert werden. Ferner ist der Einfluss dieser Änderungen auf die Aussagefähigkeit der zuvor eingerichteten historischen Datenbank zu bedenken. Dabei sollte die Notwendigkeit überdacht werden, eine neue historische Datenbank einzurichten, um die gleichbleibende Qualität der positiven Kontrollergebnisse zu dokumentieren. 14. Die Prüfer sollten sich der Tatsache bewusst sein, dass die Entscheidung, eine PC-Studie periodisch statt gleichzeitig durchzuführen, Auswirkungen auf die Aussagefähigkeit und Akzeptanz negativer Studienergebnisse haben kann, die ohne gleichzeitige Positivkontrolle im Zeitraum zwischen den einzelnen periodischen PC-Studien auftreten können. Wenn zum Beispiel ein falsch negatives Ergebnis in der periodischen PC-Studie auftritt, können negative Ergebnisse für die Prüfsubstanz, die in dem Zeitraum zwischen der letzten akzeptablen periodischen PC-Studie und der inakzeptablen periodischen PC-Studie aufgetreten waren, in Frage gestellt werden. Die Auswirkungen solcher Ergebnisse sollten sorgfältig bedacht werden, wenn entschieden wird, ob gleichzeitige oder nur periodische PC-Studien durchgeführt werden sollen. Auch ist die Verwendung einer geringeren Anzahl an Versuchstieren bei der gleichzeitigen Positivkontroll-Gruppe zu bedenken, wenn dies wissenschaftlich zu begründen ist und wenn das Labor auf der Grundlage laborspezifischer historischer Daten nachweist, dass eine geringere Anzahl an Mäusen ausreicht (22). 15. Obwohl eine positive Kontrollchemikalie in einem Vehikel getestet werden sollte, das bekanntermaßen eine gleichbleibende Reaktion auslöst (z. B. Aceton: Olivenöl; 4:1, v/v), können in bestimmten Rechtssituationen außerdem Prüfungen in einem Nichtstandard-Vehikel (klinisch/chemisch relevante Formulierung) erforderlich sein (23). Wenn die gleichzeitige Positivkontrolle in einem anderen Vehikel als der Prüfsubstanz getestet wird, sollte eine gesonderte Vehikelkontrolle für die gleichzeitige PC einbezogen werden. 16. In Fällen, in denen Prüfsubstanzen einer bestimmten chemischen Klasse oder eine Reihe von Reaktionen bewertet werden, können Referenzsubstanzen nützlich sein, um nachzuweisen, dass die Prüfmethode zur Feststellung des Hautsensibilisierungspotenzials dieser Art von Prüfsubstanzen ordnungsgemäß funktioniert. Geeignete Referenzsubstanzen sollten die folgenden Eigenschaften haben: — strukturelle und funktionale Ähnlichkeit mit der Klasse der getesteten Prüfsubstanz; — bekannte physikalische/chemische Eigenschaften; — zugrunde liegende Daten aus dem LLNA: DA; — zugrunde liegende Daten aus anderen Tiermodellen und/oder von Menschen. TESTVERFAHREN Anzahl der Versuchstiere und Dosierungen 17. Mindestens vier Tiere pro Dosisgruppe mit jeweils mindestens drei Konzentrationen der Prüfsubstanz werden benötigt; zusätzlich braucht man eine Negativkontrollgruppe, die nur mit dem Vehikel für die Prüfsubstanz behandelt wird, sowie eine Positivkontrolle (gleichzeitig oder jüngeren Datums, auf der Grundlage der Laborvorschriften in den relevanten Abschnitten 11-15). Tests mit Mehrfachdosen der PC sollten in Erwägung gezogen werden, insbesondere wenn die Positivkontrolle intermittierend getestet wird. Bis auf die Verabreichung der Prüfsubstanz sind die Tiere der Kontrollgruppen ebenso zu behandeln wie die Tiere der Behandlungsgruppen. 18. Die Auswahl der Dosis und des Vehikels soll anhand der Empfehlungen in (2) und (24) erfolgen. Für aufeinanderfolgende Dosierungen werden normalerweise geeignete abgestufte Konzentrationen gewählt, wie z. B. 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % usw. Die Auswahl der Konzentrationsfolge sollte angemessen wissenschaftlich begründet werden. Alle vorhandenen toxikologischen Angaben (z. B. über die akute Toxizität und Hautreizung) sowie strukturelle und physiochemische Angaben zu der jeweiligen Prüfsubstanz (und/oder strukturverwandten Substanzen) sollten bei der Festlegung von drei aufeinander folgenden Konzentrationen berücksichtigt werden, so dass bei der Höchstkonzentration einerseits die Exposition maximiert und andererseits eine systemische Toxizität und/oder eine übermäßige lokale Hautreizung ausgeschlossen werden (24) (25). Mangels solcher Informationen kann ein anfänglicher Dosisfindungstest erforderlich sein (siehe Absätze 21-24). 19. Das Vehikel sollte das Testergebnis nicht beeinflussen oder beeinträchtigen und sollte so gewählt werden, dass die Löslichkeit zur Erzielung einer möglichst hohen Konzentration maximiert und gleichzeitig eine für das Applizieren der Prüfsubstanz geeignete Lösung/Suspension hergestellt werden kann. Empfohlene Vehikel sind Aceton: Olivenöl (4:1, v/v), N,N-Dimethylformamid, Methylethylketon, Propylenglykol und Dimethylsulphoxid (6), wobei mit hinreichender wissenschaftlicher Begründung auch andere Vehikel verwendet werden können. Unter bestimmten Umständen muss ein klinisch relevantes Lösungsmittel oder die handelsübliche Zubereitung, in der die Prüfsubstanz vermarktet wird, als zusätzliche Kontrolle genutzt werden. Besondere Sorgfalt sollte darauf verwendet werden, zu gewährleisten, dass in das Vehikelsystem durch die Verwendung geeigneter Lösungsvermittler (z. B. 1 % Pluronic® L92) hydrophile Stoffe eingearbeitet werden, die die Haut befeuchten und nicht sofort ablaufen. Folglich sind vollständig wässrige Vehikel zu vermeiden. 20. Die Bearbeitung von Lymphknoten einzelner Mäuse ermöglicht die Bewertung der Variabilität von Tieren sowie einen statistischen Vergleich zwischen der Prüfsubstanz und Messungen an der Vehikelkontrollgruppe (siehe Absatz 33). Die Möglichkeit, die Anzahl der Mäuse in der Positivkontrollgruppe zu verringern, ist nur realistisch, wenn Einzeltierdaten erhoben werden (22). Außerdem verlangen einige Regulierungsbehörden die Erhebung von Daten einzelner Tiere. Die regelmäßige Erhebung von Einzeltierdaten stellt im Hinblick auf den Tierschutz einen Vorteil dar, indem Doppeltests vermieden werden. Diese wären notwendig, wenn die ursprünglich gemeinsam gesammelten Ergebnisse für die Prüfsubstanz (z. B. über gepoolte Daten) später von Regulierungsbehörden mit anderen Vorschriften (z. B. Einzeltierdaten) geprüft würden. Dosisfindungstest 21. Wenn über die höchst mögliche Dosierung keine Informationen vorliegen (siehe Absatz 18), sollte ein Dosisfindungstest durchgeführt werden, um die geeignete Dosierung für den LLNA: DA festzulegen. Der Dosisfindungstest soll eine Orientierung bei der Auswahl der höchst möglichen Dosisstufe für die Hauptuntersuchung des LLNA: DA in Fällen liefern, in denen keine Informationen über Konzentrationen vorliegen, die zur systemischen Toxizität (siehe Absatz 24) und/oder zu übermäßiger Hautreizung führen (siehe Absatz 23). Die höchsten geprüften Dosisstufen sollten 100 % der Prüfsubstanz bei Flüssigkeiten bzw. die höchst möglichen Konzentrationen bei Feststoffen oder Suspensionen sein. 22. Der Dosisfindungstest wird unter Bedingungen durchgeführt, die denen der Hauptstudie des LLNA: DA genau entsprechen. Allerdings gibt es hier keine Bewertung der Lymphknotenproliferation und es können weniger Tiere pro Dosisgruppe eingesetzt werden. Es werden ein oder zwei Tiere pro Dosisgruppe empfohlen. Alle Mäuse werden täglich auf klinische Zeichen für systemische Toxizität oder lokale Reizungen an der Applikationsstelle untersucht. Das Körpergewicht wird vor dem Test und vor dem Abschluss (Tag 8) protokolliert. Beide Ohren jeder Maus werden auf Anzeichen für Erytheme untersucht und mit Hilfe von Tabelle 1 bewertet (25). Die Ohrdicke wird mit Hilfe eines Ohrdickenmessgeräts (z. B. digitaler Mikrometer oder Peacock Dickenmessuhr) an Tag 1 vor der Dosierung, Tag 3 (ca. 48 Stunden nach der ersten Dosis), Tag 7 (24 Stunden vor Abschluss) und Tag 8 bestimmt. Zusätzlich kann an Tag 8 die Ohrdicke durch die Gewichtsbestimmung von Ohrstanzproben ermittelt werden. Dies sollte nach der tierschutzgerechten Tötung der Tiere erfolgen. Eine übermäßige lokale Hautreizung wird durch eine Erythem-Punktzahl von ≥ 3 und/oder eine Zunahme der Ohrdicke ≥ 25 % an jedem beliebigen Messtag angezeigt (26) (27). Als höchste Dosis für die Hauptuntersuchung des LLNA: DA wird die nächst niedrigere Dosis in der Konzentrationsreihe des Dosisfindungstests gewählt (siehe Absatz 18), die keine systemische Toxizität und/oder übermäßige lokale Hautreizung verursacht. Tabelle 1 Erythem-Klassifizierung Beobachtung Punktzahl Kein Erythem 0 Sehr leichtes Erythem (kaum wahrnehmbar) 1 Klar abgegrenztes Erythem 2 Mäßiges bis ausgeprägtes Erythem 3 Schweres Erythem (dunkelrot) bis hin zur Schorfbildung, so dass eine Bewertung nicht möglich ist 4 23. Zusätzlich zu einer Zunahme der Ohrdicke um 25 % (26) (27) wurde ein statistisch signifikanter Anstieg der Ohrdicke bei den behandelten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollmäusen zugrunde gelegt, um Reizstoffe in dem LLNA zu identifizieren (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Obwohl ein statistisch signifikanter Anstieg auch bei einer Ohrdicke von weniger als 25 % auftreten kann, konnte kein spezifischer Zusammenhang mit einer übermäßigen Hautreizung festgestellt werden (30) (31) (32) (33) (34). 24. Die folgenden klinischen Beobachtungen können, sofern sie Bestandteil einer Gesamtbewertung sind, auf systemische Toxizität hinweisen (35) und somit die höchst mögliche Dosisstufe für die Hauptuntersuchung des LLNA: DA anzeigen: Änderungen der Funktionen des Nervensystems (z. B. Piloerektion, Ataxie, Tremor und Krämpfe); Verhaltensänderungen (z. B. Aggressivität, Änderungen bei der Fellpflege, auffallende Änderung des Aktivitätsniveaus); Änderungen des Atemmusters (d. h. Änderung der Häufigkeit und Intensität des Atmens wie Dyspnoe, Keuchen, rasselnder Atem) sowie Änderungen der Futter- und Wasseraufnahme. Zusätzlich sollten Anzeichen von Lethargie und/oder Teilnahmslosigkeit sowie alle klinischen Anzeichen für mehr als leichte oder momentane Schmerzen und Qual, eine Gewichtsreduktion > 5 % zwischen Tag 1 und Tag 8 sowie die Sterblichkeit in der Bewertung berücksichtigt werden. Moribunde Tiere oder Tiere, die Anzeichen starker und andauernder Qualen zeigen, sollten tierschutzgerecht getötet werden (36). Versuchsplan der Hauptuntersuchung 25. Der Versuchsplan des Tests ist wie folgt: — Tag 1: Jedes Tier wird einzeln gekennzeichnet und das Gewicht sowie jede klinische Beobachtung protokolliert. Es wird 1 % Natriumlaurylsulfat (NLS) in wässriger Lösung auf die Rückseite jedes Ohrs aufgetragen. Dies erfolgt mit vier bis fünf Strichen einer in die NLS-Lösung getauchten Bürste, so dass die gesamte Rückseite jedes Ohrs bedeckt ist. Eine Stunde nach der NLS-Behandlung werden 25 μL der Prüfsubstanz in der jeweiligen Verdünnung, des Vehikels allein oder der PK (gleichzeitig oder jüngeren Datums) gemäß den Laborvorschriften in den relevanten Abschnitten 11-15) auf die Rückseite jedes Ohrs appliziert. — Tage 2, 3 und 7: Die an Tag 1 erfolgte Vorbehandlung mit 1 % NLS wässriger Lösung und die Applikation der Prüfsubstanz werden wiederholt. — Tage 4, 5 und 6: Keine Behandlung. — Tag 8: Das Gewicht jedes Tiers sowie jede klinische Beobachtung werden protokolliert. Ca. 24 bis 30 Stunden nach Beginn der Applikation an Tag 7 werden die Tiere tierschutzgerecht getötet. Die drainierenden aurikulären Lymphknoten jedes Mäuseohrs werden entfernt und separat (für jedes Tier einzeln) in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) gegeben. Einzelheiten und Diagramme der Lymphknotenidentifikation und -entfernung sind unter Referenz (22) aufgeführt. Zur weiteren Kontrolle der lokalen Hautreaktion in der Hauptuntersuchung können zusätzliche Parameter wie die Auswertung des Ohr-Erythems oder Ohrdickemessungen (mittels eines Dickenmessgeräts oder durch die Gewichtsbestimmung von Ohrstanzproben bei der Nekropsie) in das Untersuchungsprotokoll aufgenommen werden. Vorbereitung der Zellsuspensionen 26. Für jede Maus wird eine Einzelzellsuspension der beidseitig entnommenen Lymphknotenzellen (LNC) erstellt, indem die Lymphknoten zwischen zwei Glasträger geklemmt werden und leichter Druck ausgeübt wird, um die Knoten zu zerquetschen. Nach der Vergewisserung, dass das Gewebe sich dünnflächig verteilt hat, können die beiden Träger voneinander gelöst werden. Das Gewebe auf beiden Trägern wird in PBS gelöst, indem jeder Träger im Winkel über die Petrischale gehalten wird und mit PBS gespült wird, während gleichzeitig das Gewebe mit einem Zellschaber von dem Träger abgeschabt wird. Die Lymphknoten bei Tieren der Negativkontrollgruppe sind klein; daher ist Vorsicht geboten, um eine ungewollte Beeinflussung der SI-Werte zu vermeiden. Für das Spülen beider Träger sollte ein Gesamtvolumen von 1 mL PBS verwendet werden. Die Lymphknoten-Lösung in der Petrischale sollte mit dem Zellschaber leicht homogenisiert werden. Anschließend wird mit einer Mikropipette ein 20 μL Aliquot der Lymphknotenlösung entnommen (Achtung: nicht die für das Auge sichtbare Membran entnehmen) und mit 1,98 mL PBS gemischt, sodass sich eine Probe von 2 mL ergibt. Darauf wird eine zweite Probe von 2 mL mittels desselben Verfahrens zubereitet, sodass für jedes Tier zwei Proben vorliegen. Bestimmung der Zellproliferation (Messung des ATP-Gehalts der Lymphozyten) 27. Erhöhungen des ATP-Gehalts in den Lymphknoten werden mittels der Luciferin-/Luciferase-Methode mit einem ATP-Mess-Kit bestimmt, das die Biolumineszenz in Relativen Lumineszenz-Einheiten (Relative Luminescence Units; RLU) misst. Die Testzeit zwischen dem Zeitpunkt der Tiertötung bis zur Messung des ATP-Gehalts für jedes einzelne Tier sollte gleich bleiben und bei bis zu ca. 30 Minuten liegen, da davon ausgegangen wird, dass der ATP-Gehalt nach der Tiertötung allmählich abnimmt (12). Folglich sollten die verschiedenen Verfahrensschritte ab der Entnahme der aurikulären Lymphknoten bis zur ATP-Messung nach einem vorher festgelegten Zeitplan, der für jedes Tier gleich ist, innerhalb von 20 Minuten abgeschlossen werden. Die ATP-Lumineszenz sollte in jeder Probe von 2 mL gemessen werden, so dass für jedes Tier zwei ATP-Messungen vorliegen. Anschließend wird die mittlere ATP-Lumineszenz bestimmt und in den folgenden Berechnungen verwendet (siehe Absatz 30). BEOBACHTUNGEN Klinische Beobachtungen 28. Jede Maus sollte mindestens einmal täglich sorgfältig auf klinische Zeichen, d. h. lokale Reizung an der Applikationsstelle, oder auf systemische Toxizität untersucht werden. Alle Beobachtungen werden systematisch in Einzelprotokollen dokumentiert, die für jedes Tier geführt werden. Die Überwachungspläne sollten Kriterien beinhalten, anhand derer Mäuse mit systemischer Toxizität, übermäßiger lokaler Hautreizung oder Hautätzung schnell zu Zwecken der schmerzlosen Tötung identifiziert werden können (36). Körpergewicht 29. In Abschnitt 25 wurde bereits ausgeführt, dass das Körpergewicht der einzelnen Tiere zu Versuchsbeginn und zum Zeitpunkt der tierschutzgerechten Tötung der Tiere laut Versuchsplan festgestellt werden soll. BERECHNUNG DER ERGEBNISSE 30. Die Ergebnisse für jede Behandlungsgruppe werden als mittlerer Stimulationsindex (SI) angegeben. Den SI erhält man durch Teilen der mittleren RLU pro Maus innerhalb jeder Prüfgruppe und der Positivkontrollgruppe durch die mittleren RLU pro Maus für die Lösungsmittel-/Vehikelkontrollgruppe. Der durchschnittliche SI beträgt demnach für die mit Vehikel behandelten Kontrollen 1. 31. In dem Entscheidungsprozess gilt ein Ergebnis als positiv, wenn SI ≥ 1,8 ist (10). Die Stärke der Dosis-Wirkung, die statistische Signifikanz und die gleichbleibende Qualität der Lösungsmittel-/Vehikel-Reaktion sowie der Reaktion der Positivkontrolle können aber auch benutzt werden, um festzulegen, ob ein Grenzergebnis (d. h. SI-Wert zwischen 1,8 und 2,5) als positiv bezeichnet werden soll (2) (3) (37). 32. Bei einer positiven Grenzwertreaktion mit einem SI zwischen 1,8 und 2,5 können Anwender zusätzliche Informationen berücksichtigen, wie z. B. die Dosis-Wirkungs-Beziehung, das Vorliegen einer systemischen Toxizität oder übermäßigen Hautreizung, sowie gegebenenfalls die statistische Signifikanz zusammen mit den SI-Werten, um zu bestätigen, dass die Ergebnisse positiv sind (10). Zu beachten sind ferner die verschiedenen Eigenschaften der Prüfsubstanz, wobei es unter anderem zu klären gilt, ob ein struktureller Zusammenhang mit bekannten Hautsensibilisatoren besteht, ob sie eine übermäßige lokale Hautreizung bei der Maus hervorruft und wie die festgestellte Art der Reaktion bezüglich der Dosis ist. Diese und weitere Aspekte werden an anderer Stelle ausführlich erörtert (4). 33. Werden die Daten für jede einzelne Maus erhoben, kann eine statistische Analyse zu Vorhandensein und Grad des Dosis-Wirkungs-Verhältnisses in den Daten durchgeführt werden. Jede statistische Auswertung könnte eine Bewertung der Dosis-Wirkungs-Beziehung sowie geeignete Testgruppen-Vergleiche beinhalten (z. B. Gruppe mit paarweiser Dosierung vs. gleichzeitige Lösungsmittel-/Vehikelkontrollgruppen). Die statistischen Analysen könnten z. B. die lineare Regression, den Williams-Test zur Bewertung von Dosis-Wirkungs-Trends oder den Dunnett-Test für paarweise Vergleiche beinhalten. Bei der Auswahl einer geeigneten Methode für die statistische Analyse sollte sich der Prüfer möglicher ungleicher Varianzen und anderer damit zusammenhängender Probleme stets bewusst sein, denn diese erfordern unter Umständen eine Datentransformation oder ein nicht-parametrisches statistisches Verfahren. Auf jeden Fall muss der Prüfer unter Umständen SI-Berechnungen und statistische Analysen mit und ohne bestimmte Datenpunkte (manchmal als ‚Ausreißer‘ bezeichnet) vornehmen. DATEN UND BERICHTERSTATTUNG Daten 34. Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Sie sollten die RLU-Einzelwerte, die mittleren RLU-Gruppenwerte pro Tier, die damit verbundene Fehlervariable (z. B. SD, SEM) und den mittleren SI für jede Dosisgruppe, verglichen mit der gleichzeitigen Lösungsmittel-/Vehikelkontrollgruppe angeben. Prüfbericht 35. Der Testbericht sollte folgende Angaben enthalten: Prüf- und Kontrollsubstanzen: — Angaben zur Identität (z. B. CAS-Nummer und EG-Nummer, falls vorhanden; Bezugsquelle; Reinheit; bekannte Verunreinigungen; Chargennummer); — physikalische Beschaffenheit und physikalisch-chemische Eigenschaften (z. B. Flüchtigkeit, Stabilität, Löslichkeit); — bei Mischungen Zusammensetzung und relative Anteile der Bestandteile in Prozent; Lösungsmittel/Vehikel: — Angaben zur Identität (Reinheit, Konzentration, gegebenenfalls verwendete Mengen); — Begründung für die Wahl des Vehikels; Versuchstiere: — Herkunft der CBA-Mäuse; — mikrobiologischer Status der Tiere, soweit bekannt; — Anzahl und Alter der Tiere; — Herkunft der Tiere, Haltungsbedingungen, Futter usw.; Prüfbedingungen: — Herkunft, Chargennummer und Daten des Herstellers zur Qualitätssicherung/Qualitätskontrolle für das ATP-Kit; — Angab