ANHANG I

Schema der gemäß den Artikeln 3, 4, 5, 7 und 8 durchzuführenden Tests

1. AUFTRETEN DES SPEZIFIZIERTEN SCHÄDLINGS — GRUNDREGELN

1.1. Ein Verdacht auf das Auftreten des spezifizierten Schädlings besteht, wenn der erste Nachweistest an der spezifizierten Pflanze positiv ausfällt. Bei symptomatischem Pflanzenmaterial kann der erste Nachweistest eine selektive Isolierung sein.

1.2. Das Auftreten des spezifizierten Schädlings gilt bei symptomatischen Proben der spezifizierten Pflanzen in folgenden Fällen als bestätigt: a) wenn es sich beim ersten Nachweistest um eine selektive Isolierung handelt, aus der Kolonien mit typischer Morphologie hervorgehen: zwei Identifizierungstests fallen positiv aus; b) wenn es sich beim ersten Nachweistest um einen anderen Test als eine selektive Isolierung handelt: i) zwei Identifizierungstests fallen positiv aus, nachdem die Probe einer selektiven Isolierung unterzogen wurde; ii) ein zweiter Nachweistest, bei dem es sich nicht um eine selektive Isolierung handelt, fällt positiv aus.

1.3. Das Auftreten des spezifizierten Schädlings gilt bei symptomfreien Proben der spezifizierten Pflanzen in folgenden Fällen als bestätigt: a) wenn der zweite Nachweistest positiv ausfällt, sofern es sich beim ersten oder zweiten Nachweistest um einen molekularen (DNA-basierten) Test (TaqMan® Real-time PCR-Test oder konventioneller PCR-Test) handelt; b) für Proben, die in einem Mitgliedstaat oder in einem Gebiet eines Mitgliedstaats entnommen wurden, in dem das Vorkommen des spezifizierten Schädlings nicht bekannt ist, und für Proben, die aus einem anderen Mitgliedstaat stammen: wenn der zweite Nachweistest gemäß Buchstabe a positiv ausfällt und zwei Identifizierungstests, die nach der selektiven Isolierung der Probe durchgeführt wurden, positiv ausfallen.

2. TESTS

2.1. Nachweistests

Die Nachweistests müssen mindestens so beschaffen sein, dass 104 Zellen/ml resuspendiertes Pellet verlässlich nachgewiesen werden können.

Der zweite Nachweistest muss auf anderen biologischen Grundsätzen oder anderen Nukleotidregionen als der erste Nachweistest beruhen.

Bei den Nachweistests handelt es sich um folgende Tests:

a) Immunofluoreszenztests, wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben;

b) FISH-Test (van Beuningen et al. (1995) (1)), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben;

c) Isolierung, wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben. Es ist eine der beiden folgenden Optionen durchzuführen: i) direkte Isolierung auf semiselektiven (oder nicht selektiven) Wachstumsmedien, wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben; ii) Isolierung gemäß internationalen Diagnosestandards nach Anreicherung durch Bioassay;

d) konventioneller PCR-Test unter Verwendung der Primer von Pastrik (2000) (2), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben;

e) TaqMan® Real-time PCR-Tests unter Verwendung von Primern und Sonden von: i) Schaad et al. (1999) (3), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben; ii) Vreeburg et al. (2018) (4) (sogenannter NYtor-Test), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben; iii) Gudmestad et al. (2009), wie angepasst von Vreeburg et al. (2018)4, wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben; iv) Massart et al. (2014) (5), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben.

2.2. Identifizierungstests

Bei den Identifizierungstests handelt es sich um folgende Tests:

a) Immunofluoreszenztest, wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben;

b) konventioneller PCR-Test (Pastrik (2000)), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben;

c) TaqMan® Real-time PCR-Tests unter Verwendung von Primern und Sonden von: i) Schaad et al. (1999), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben; ii) Vreeburg et al. (2018) (sogenannter NYtor-Test), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben; iii) Gudmestad et al. (2009), wie angepasst von Vreeburg et al. (2018), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben; iv) Massart et al. (2014), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben;

d) DNA-Barcoding, wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben;

e) MALDI-TOF MS (Zaluga et al. (2011) (6)), wie in internationalen Diagnosestandards beschrieben.

3. FLUSSDIAGRAMME DER VERFAHREN

Flussdiagramm Nr. 1: Verfahren zur Diagnose des Auftretens des spezifizierten Schädlings in symptomatischen Proben der spezifizierten Pflanze

a Die Isolierung kann als erster oder zweiter Nachweistest verwendet werden. Besteht der Verdacht auf das Auftreten des spezifizierten Schädlings auf dem Wachstumsmedium, so werden die Kolonien zur Gewinnung von Reinkulturen gereinigt, an denen zwei Identifizierungstests durchgeführt werden. Zur Bestätigung des Auftretens des Schädlings müssen beide Identifizierungstests positiv ausfallen.

b Der dritte Nachweistest muss auf anderen biologischen Grundsätzen oder anderen Nukleotidregionen beruhen.

Flussdiagramm Nr. 2: Verfahren zur Diagnose des Auftretens des spezifizierten Schädlings in symptomfreien Proben der spezifizierten Pflanze

a Es darf keine Isolierung zur Anwendung kommen.

b Der dritte Nachweistest muss auf anderen biologischen Grundsätzen oder anderen Nukleotidregionen beruhen. Die Isolierung darf nicht zur Anwendung kommen.

c Für die unter Nummer 1.3 Buchstabe b genannten Proben setzt die Bestätigung des Auftretens des spezifizierten Schädlings nach dem zweiten positiv ausgefallenen Nachweistest voraus, dass der spezifizierte Schädling aus der Probe isoliert wird, gefolgt von zwei positiven Identifizierungstests.

4. PROBENAUFBEREITUNG

4.1. Proben von symptomfreien Knollen

Die Standardprobe muss 200 Knollen je Test umfassen. Das geeignete Laborverfahren zur Verarbeitung der kegelförmigen Nabelendstückchen zur Gewinnung des Extrakts für den Nachweis des spezifizierten Schädlings ist in internationalen Diagnosestandards beschrieben.

4.2. Proben von symptomfreiem Pflanzenmaterial außer Knollen

Der Nachweis latenter Infektionen erfolgt an Mischproben von Stängelstücken. Das Verfahren kann auf bis zu 200 Stängelstücke unterschiedlicher Pflanzen in einer Probe angewendet werden. Das geeignete Laborverfahren zur Desinfektion und Verarbeitung der Stängelstücke zur Gewinnung des Extrakts für den Nachweis des spezifizierten Schädlings ist in internationalen Diagnosestandards beschrieben.

4.3. Proben von symptomatischen spezifizierten Pflanzen

Schnitte von Gewebe werden aseptisch aus dem Gefäßbündelring einer Knolle oder aus den Gefäßsträngen in Stängeln spezifizierter Pflanzen entfernt, die Welkesymptome aufweisen. Das geeignete Laborverfahren zur Verarbeitung dieser Gewebe zur Gewinnung des Extrakts für den Nachweis des spezifizierten Schädlings ist ausführlich in internationalen Diagnosestandards beschrieben.

(1) van Beuningen, A.R., Derks, H., Janse, J.D. (1995). Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in situ hybridization (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungsforschung 1, 266–269.

(2) Pastrik, K.H. (2000). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, 155-165.

(3) Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A., Knorr, D (1999). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIOPCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83, 1095–1100.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, S. 86-96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, S. 29-37.

(6) Zaluga, J., Heylen, K., Van Hoorde, K., Hoste, B., Vaerenbergh, J., Maes, M., De Vos, P. (2011). GyrB sequence analysis and MALDI-TOF MS as identification tools for plant pathogenic Clavibacter. Systematic and applied microbiology 34, 400-7. 10.1016/j.syapm.2011.05.001.