ENTSCHEIDUNG DER KOMMISSION vom 5. Februar 1996 zur Änderung der Entscheidung 92/532/EWG über die Probenahmepläne und Diagnoseverfahren zur Erkennung und zum Nachweis bestimmter Fischseuchen (Text von Bedeutung für den EWR) (96/240/EG)

DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN -

gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Gemeinschaft,

gestützt auf die Richtlinie 91/67/EWG des Rates vom 28. Januar 1991 betreffend die tierseuchenrechtlichen Vorschriften für die Vermarktung von Tieren und anderen Erzeugnissen der Aquakultur (1), zuletzt geändert durch die Richtlinie 95/22/EG (2), insbesondere auf Artikel 15,

in Erwägung nachstehender Gründe:

Die Probenahmepläne und Diagnoseverfahren zur Erkennung und zum Nachweis bestimmter Fischseuchen sind in der Entscheidung 92/532/EWG der Kommission (3) festgelegt.

Diese Probenahmepläne und Diagnoseverfahren sind nunmehr erprobt, und es liegen neue wissenschaftliche Erkenntnisse vor, die ihre Aktualisierung erforderlich machen.

Diese Aktualisierung betrifft den Probenumfang, das Probematerial und seine Beförderung sowie das Verfahren zur Isolierung von im Probematerial etwa vorhandenen Viren.

Der mit Beschluß 81/651/EWG der Kommission (4) eingesetzte Wissenschaftliche Veterinärausschuß wurde in dieser Angelegenheit gehört.

Die in dieser Entscheidung vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des Ständigen Veterinärausschusses -

HAT FOLGENDE ENTSCHEIDUNG ERLASSEN:

Artikel 1

Der Anhang der Entscheidung 92/532/EWG wird durch den Anhang dieser Entscheidung ersetzt.

Artikel 2

Diese Entscheidung ist an alle Mitgliedstaaten gerichtet.

Brüssel, den 5. Februar 1996

Für die Kommission

Franz FISCHLER

Mitglied der Kommission

(1) ABl. Nr. L 46 vom 19. 2. 1991, S. 1.

(2) ABl. Nr. L 243 vom 11. 10. 1995, S. 1.

(3) ABl. Nr. L 337 vom 21. 11. 1992, S. 18.

(4) ABl. Nr. L 233 vom 19. 8. 1981, S. 32.

ANHANG

TEIL I

PROBENAHME- UND ANALYSEVERFAHREN ZUR VHS- UND IHN-ÜBERWACHUNG

I. Probenahme

1. Probenahmezeitplan

In den Zuchtbetrieben werden mindestens zweimal jährlich zwischen Oktober und Juni bzw. immer dann, wenn die Wassertemperatur unter 14 °C liegt, klinische Untersuchungen durchgeführt. Die Abstände zwischen den Untersuchungen müssen mindestens vier Monate betragen. Alle Produktionseinheiten (Teiche, Tanks, Aquarien, Netzkäfige usw.) werden auf verendete, geschwächte oder verhaltensgestörte Fische kontrolliert. Besondere Beachtung ist (nach Möglichkeit) dem Wasserabflußbereich zu widmen, in dem sich geschwächte Fische strömungsbedingt gerne aufhalten.

2. Wahl und Entnahme der Proben

Für die Untersuchungen gemäß Tabelle 1A werden Organ- und/oder Ovarienfluessigkeitsproben von 30 bis 150 Fischen entnommen. Bei Vorhandensein von Regenbogenforellen sollte die gesamte Probe von dieser Fischart entnommen werden. Sind keine Regenbogenforellen präsent, so muß die Probe Fische aller für VHS und/oder IHN empfänglichen Arten des Betriebs umfassen (vgl. dazu Anhang A der Richtlinie 91/67/EWG mit tierseuchenrechtlichen Vorschriften für die Vermarktung von Tieren und anderen Erzeugnissen der Aquakultur). Jede Fischart muß in der Probe proportional vertreten sein. In den beiden ersten Jahren des der Zulassung vorausgehenden vierjährigen Kontrollzeitraums beträgt der Probenumfang 150 Tiere, so daß mit einer Nachweissicherheit von 95 % eine Verseuchung von 2 % erkannt werden kann. Von dieser Regelung ausgenommen sind Salmonidenzuchtbetriebe ohne Brutbestände in Küstengebieten, bei denen der Probenumfang 30 Tiere ausmacht.

In den beiden letzten Jahren des Kontrollzeitraums kann der Probenumfang auf 30 Stück reduziert werden, um mit einer Nachweissicherheit von 95 % eine Verseuchung von 10 % festzustellen. In den folgenden Jahren (Aufrechterhaltung der Zulassung) wird der reduzierte Probenumfang von 30 Tieren beibehalten.

In Betrieben, die (aufgrund regelmäßiger amtlicher Untersuchungen) seit mindestens vier Jahren nachweislich frei von VHS und IHN sind, kann während des gesamten Vierjahreszeitraums mit dem kleinen Probenumfang gearbeitet werden.

Wird mehr als eine Wasserquelle für die Fischproduktion verwendet, so muß die aus 150 bzw. 30 Fischen bestehende Probe alle Wasserquellen berücksichtigen. Die Probe sollte bevorzugt geschwächte, verhaltensgestörte oder soeben verendete Fische (ohne Anzeichen der Zersetzung) umfassen. Fehlen solche Fische, so muß sich die Probe proportional aus normal erscheinenden, gesunden Fischen aller Produktionseinheiten des Betriebs sowie aller Jahresklassen zusammensetzen.

3. Aufbereitung und Einsendung der Fischproben

Vor dem Versenden oder der Überführung zum Untersuchungslabor werden dem Fisch mit einer sterilen Schere und einer sterilen Pinzette die zu untersuchenden Organe entnommen und in Kunststoffröhrchen gefuellt, die ein Transportmedium (Nährmedium aus 10 % Kälberserum und Antibiotika) enthalten. Empfehlenswert ist ein Gemisch aus 200 IE Penicillin, 200 µg Streptomycin und 200 µg Kanamycin je ml; es können auch andere erprobte Antibiotika verwendet werden. Untersucht werden Milz, Vorderniere, sowie entweder Herz oder Gehirn. In manchen Fällen muß auch Ovarienfluessigkeit untersucht werden (Tabelle 1).

Ovarienfluessigkeit oder Organteile von 10 Fischen (Tabelle 1) können als Sammelprobe in je ein 10-ml- Kunststoffröhrchen gefuellt werden, das 4 ml Transportmedium enthält. Jede Gewebeprobe sollte mindestens 0,5 Gramm (g) wiegen.

Die Röhrchen sind in Isolationsbehälter (z. B. dickwandige Styroporkästen) zu packen, die genügend Eis oder Kühlelemente enthalten, um zu gewährleisten, daß die Proben beim Transport zum Labor auf einer Temperatur von 0 bis 5 °C gehalten werden. Ein Anfrieren ist zu vermeiden. Während der Beförderung sollte die Temperatur einer Probe zu keiner Zeit mehr als 10 °C betragen, und bei der Ankunft sollte im Transportbehälter noch Eis vorhanden sein.

Mit der virologischen Untersuchung ist so schnell wie möglich zu beginnen, spätestens jedoch 48 Stunden nach der Entnahme oder - in Ausnahmefällen - nach spätestens 72 Stunden, sofern das Untersuchungsmaterial durch das Transportmedium geschützt war und die Temperaturanforderungen während der Beförderung erfuellt wurden (1. 1. 3, Paragraph 3).

Fische können unzerteilt (ganz) zum Labor gesendet werden, sofern die Temperaturanforderungen während der Beförderung erfuellt werden können. Ganzer Fisch muß, unter Umständen mit Saugpapier umhüllt und wie vorstehend beschrieben gekühlt, in einem Plastikbeutel versendet werden. Fische können auch lebend eingesendet werden.

4. Entnahme von zusätzlichem Probenmaterial

Im Einvernehmen mit dem betreffenden Diagnoselaboratorium kann weiteres Gewebematerial entnommen und für Zusatzuntersuchungen aufbereitet werden.

II. Aufbereitung der Proben für die virologische Untersuchung

1. Homogenisieren der Organe

Im Labor wird die Gewebeprobe (mit einem Stomacher, Mixer oder Mörser) vollständig homogenisiert. Das Homogenat wird anschließend in dem ursprünglichen Transportmedium suspendiert. Besteht die Probe aus ganzem Fisch von weniger als 6 cm Länge, so wird dieser mit Hilfe einer sterilen Schere und nach Entfernen des hinter der Darmöffnung liegenden Körperteils zerlegt, wie vorstehend beschrieben homogenisiert und im Transportmedium suspendiert, wobei zwischen Gewebeprobe und Transportmedium ein Volumenverhältnis von 1: 10 gewährleistet sein muß.

2. Zentrifugieren des Homogenats

Das Homogenat wird in einer auf 2 bis 5 °C gekühlten Zentrifuge bei 2 000 bis 4 000 × g 15 Minuten lang abgeschleudert. Der Überstand wird aufgefangen und entweder für 4 Stunden bei 15 °C oder über Nacht bei 4 °C antibiotisch behandelt (in diesem Stadium empfiehlt sich beispielsweise 1 mg/ml Gentamycin).

Wurde die Probe in einem antibiotikahaltigen Transportmedium versendet, so ist eine antibiotische Behandlung des Überstands nicht nötig.

Da die Antibiotika-Behandlung eine Bakterieninfektion der Proben verhindert, erübrigt sich eine Membranfiltrierung.

Sofern der aufgefangene Überstand innerhalb von 48 Stunden nach der Probenentnahme bei -80 °C gelagert wird, kann er aufgetaut und ein weiteres Mal zur virologischen Untersuchung verwendet werden.

Sollten praktische Schwierigkeiten auftreten (z. B. Inkubatorausfall, Probleme mit Zellkulturen usw.), die eine Beimpfung der Zellen innerhalb von 48 Stunden nach der Entnahme der Gewebeproben unmöglich machen, so können der Überstand bei -80 °C eingefroren und die virologische Untersuchung innerhalb der nächsten 14 Tage vorgenommen werden.

Vor der Zellbeimpfung wird der Überstand zu gleichen Teilen mit einem angemessen verdünnten Pool von Antiseren, die Antikörper gegen die einheimischen IBNV-Serotypen enthalten, gemischt und für mindestens eine Stunde bei 15 °C oder für höchstens 18 Stunden bei 4 °C bebrüht. Bei einem 50 %igen Plaquetest muß der Antiserumtiter mindestens 1: 2 000 betragen.

Die Behandlung aller Inocula mit IPNV-Antiserum (in einigen Teilen Europas sind 50 % der Fischproben mit IPN-Virus kontaminiert) dient der Vorbeugung gegen einen IPNV-induzierten zytopathischen Effekt (CPE) bei beimpften Zellkulturen. Dadurch werden die Dauer der virologischen Untersuchungen und die Zahl der Fälle reduziert, bei denen ein zytopathischer Effekt als Indiz für VHS oder IHN gewertet werden müßte.

Stammen die Proben aus Produktionseinheiten, die als IPN-frei gelten, so kann auf die Beimpfung der Inocula mit IPNV-Antiserum verzichtet werden.

III. Virologische Untersuchung

1. Zellkulturen und Nährmedien

Entweder BF-2 oder RTG-2 und entweder EPC- oder FHM-Zellen werden bei 20 bis 30 °C in einem geeigneten Medium, z. B. Eagle's Minimum Essential Medium oder entsprechende Modifikationen, und mit 10 % Rinderfötenserum und Antibiotika in Standardkonzentrationen versetzt, angezüchtet.

Sofern die Zellen in verschlossenen Phiolen kultiviert werden, wird empfohlen, das Medium mit Bikarbonat zu puffern. Werden die Zellkulturen in offenen Phiolen angesetzt, so kann das Medium mit Tris-HCl (23 mM) und Natriumbikarbonat (6 mM) auf einen pH-Wert von möglichst genau 7,6 gepuffert werden.

Die mit Gewebematerial zu beimpfenden Zellkulturen sollten zum Zeitpunkt der Verimpfung frisch sein (4 bis 48 Stunden alt) und sich aktiv vermehren (also nicht zusammenwachsen).

2. Beimpfen der Zellkulturen

Die mit Antibiotika behandelte Organsuspension wird in zwei Verdünnungsstufen in die Zellkulturen verimpft: die Ausgangsverdünnung und eine 10 %ige Verdünnung davon, wodurch Endverdünnungen des Gewebematerials im Zellkulturmedium von 1: 100 bzw. 1: 1 000 erreicht werden (um homologe Interferenz zu vermeiden). Es sind mindestens zwei Zellinien zu beimpfen (vgl. III.1). Das Volumenverhältnis zwischen Inokulum und Zellkulturmedium sollte ungefähr 1: 10 betragen.

Für jede Verdünnung und jede Zellinie ist eine Zellkulturfläche von mindestens 2 cm² zu verwenden; dies entspricht einer Mulde einer 24-Mulden-Kulturplatte. Die Verwendung von Kulturplatten wird zwar empfohlen, es können jedoch auch andere ähnlich oder größer dimensionierte Geräte verwendet werden.

3. Bebrüten der Zellkulturen

Die beimpften Zellkulturen werden für sieben bis zehn Tage bei 15 °C bebrütet. Bei einem Farbumschlag des Zellkulturnährmediums von Rot nach Gelb als Indiz für eine Übersäuerung ist der pH-Wert mit steriler Bikarbonatlösung so zu ajustieren, daß eine Virusinfektion der Zellen möglich ist.

Alle sechs Monate erfolgt eine Titrierung tiefgefrorener VHSV- und IHNV-Vorratslösung zur Überprüfung der Infektionsanfälligkeit der Zellkulturen.

4. Mikroskopische Untersuchung

Die bebrüteten Zellkulturen werden unter dem Mikroskop mit 40facher Vergrößerung täglich auf das Auftreten eines zytopathischen Effekts (CPE) untersucht. Bei offenkundigem CPE ist sofort ein Virusnachweis gemäß Abschnitt IV durchzuführen.

5. Subkultivierung

Tritt nach der sieben- bis zehntägigen Erstbebrütung kein zytopathischer Effekt auf, so ist die Stammkultur auf frische Zellkulturen abzuimpfen, wobei eine ähnliche Zellfläche zu verwenden ist wie bei der Stammkultur.

Aliquote Mengen Nährmedium (Überstand) von sämtlichen Kulturen/Mulden der Stammkultur werden je nach Zellinie sieben bis zehn Tage nach der Beimpfung zu einer Sammelprobe vereint. Die Sammelproben werden alsdann, wie in Abschnitt I.III.2 beschrieben, unverdünnt und 1: 10 verdünnt (wodurch Endverdünnungen des Überstands von 1: 10 bzw. 1: 1 00 erreicht werden) in homologe Zellkulturen verimpft. Vor dem Abimpfen können die Lösungen mit IPN-Antiserum in einer angemessenen Verdünnungsstufe gemäß Abschnitt I.II.2 bebrütet werden.

Die abgeimpften Kulturen werden dann für sieben bis zehn Tage bei 15 °C bebrütet und gemäß Abschnitt III.4 geprüft.

Wenn ein toxischer, zytopathischer Effekt innerhalb der ersten drei Tage der Bebrütung auftritt, so ist die Stammkultur in diesem Stadium abzuimpfen. Jedoch müssen die Zellen dann für sieben Tage bebrütet und die Stammkultur abgeimpft werden mit einer weiteren Bebrütung von sieben Tagen. Wenn sich der toxisch zytopathische Effekt nach drei Tagen entwickelt, so sollte die Zellkultur nur einmal beimpft und bebrütet werden um eine Gesamtzeit von 14 Tagen ab der Erstbeimpfung zu erreichen. In den letzten sieben Tagen der Bebrütung sollte keine Toxizität auftreten.

IV. Virusnachweis

1. Virusnachweisverfahren

Bei offenkundigem Auftreten eines zytopathischen Effekts in einer Zellkultur wird Nährmedium aufgefangen und nach einem oder mehreren der folgenden Verfahren untersucht: Neutralisation, Immunofluoreszenz (IF), Enzymimmunoassay (ELISA).

Haben diese Tests innerhalb einer Woche keinen eindeutigen Virusnachweis erbracht, so ist das Virusmaterial zwecks sofortigem Nachweis einem nationalen Referenzlaboratorium oder dem Gemeinschaftlichen Referenzlabor zuzusenden.

Die zum Virusnachweis verwendeten Immunoreagenzien müssen von Bezugsqualität und in bezug auf Titer und Spezifität vom nationalen Referenzlabor für Fischkrankheiten zugelassen sein.

2. Neutralisation

Aus dem aufgefangenen Nährmedium werden durch Zentrifugierung (2 000 - 4 000 × g) oder Membranfiltrierung (0,45 µm) die Zellen entnommen, und das Medium wird 1: 1 000 und 1: 10 000 im Zellkulturmedium verdünnt.

Aliquote Mengen der Verdünnungen werden jeweils mit gleichen Teilen der folgenden Reagenzien versetzt und einzeln für 60 Minuten bei 15 °C bebrütet:

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Vor jedem Virus-Serum-Gemisch werden jeweils 50 µl in mindestens zwei Zellkulturen verimpft und bei 15 °C bebrütet. Untersuchung auf CPE wie in Abschnitt III.4 beschrieben.

Alternativ können andere erprobte Neutralisationstests durchgeführt werden.

3. Immunfluoreszenztest (IF)

Für jedes zu bestimmende Virusisolat sind mindestens acht Deckglas-Objektträger o. ä. mit EPC-Zellen zu überschichten, und zwar in einer Dichte, die nach 24stuendiger Kultivierung eine 60 bis 90 %ige Konfluenz gewährleistet. EPC-Zellen eignen sich aufgrund ihres besonders guten Haftungsvermögen auf Glasflächen dazu besonders gut.

Sobald sich auf der Glasfläche ein Zellsediment gebildet hat (etwa eine Stunde nach dem Beschicken) oder nach 24stuendigem Bebrüten der Kulturen wird das zu bestimmende Virus verimpft. Es werden vier Kulturen in einem Volumenverhältnis von 1: 10 und vier weitere Kulturen in einem Volumenverhältnis von 1: 100 verimpft.

20 bis 30 Stunden nach dem Verimpfen werden die Kulturen zweimal mit Eagle's MEM ohne Serum gespült, mit Aceton fixiert und im Wege eines Zweischichten-IFAT angefärbt. Die erste Reagenzschicht besteht aus poly- oder monoklonalen Antikörpern einer Bezugsqualität. Die zweite Reagenzschicht ist ein FITC-konjugiertes Antiserum für das in der ersten Schicht verwendete Immunglobulin, ebenfalls in empfohlener Verdünnung. Für jedes der getesteten Antiseren ist mindestens eine hochdosierte und eine niedrigdosierte Impfkultur anzufärben. Bei der Untersuchung sind auch geeignete Negativ- und Positivkontrollen durchzuführen.

Angefärbte Kulturen werden mit Glycerol-Kochsalzlösung angesetzt und unter UV-Bestrahlung betrachtet. Dazu sind Okulare mit 10- oder 12facher Vergrößerung bzw. Objektivlinsen mit 25- bis 40facher Vergrößerung und numerischen Blenden von > 0,7 bzw. > 1,3 zu verwenden.

Im IFAT reagieren einige Stämme des Egtved-Virus stark mit dem Antiserum gegen F1-Referenzstämme, jedoch nicht im Neutralisationstest.

Die vorstehend beschriebene IF-Technik ist als Beispiel angegeben. Alternativ können (in bezug auf Zellkultur, Fixierung und Bezugsantikörper) andere erprobte IF-Techniken angewandt werden.

4. Enzymimmunoassay (ELISA)

Die einzelnen Mulden der Mikrotiterplatten (z. B. Nunc-Immuntestplatten, Maxisorp, Nunc, Dänemark) werden am Vortag der Untersuchung mit den Protein-A-freien Immunglobulin-Fraktionen der Bezugsantikörper in empfohlener Verdünnung beschichtet.

Die Mulden werden nach dem Spülen mit PBS-Tween-20-Pufferlösung mit dem zu bestimmenden Virus in zwei- oder vierfacher Verdünnung beschickt und für 60 Minuten bei 37 °C einer Antikörperreaktion ausgesetzt. Nach dem Spülen mit PBS-Tween-20-Pufferlösung werden biotinierte Antikörper einer dem Antikörperfilm entsprechenden Spezifität zugegeben und für 60 Minuten einer Reaktion bei 20 °C ausgesetzt. Nach nochmaligem Spülen wie vorstehend beschrieben wird HRP-konjugiertes Streptavidin zugegeben und für eine Stunde einer Reaktion bei 20 °C ausgesetzt. Nach dem letzten Spülen wird das gebundene Enzym anhand geeigneter ELISA-Substrate (OPD oder andere) sichtbar gemacht.

Das vorstehend beschriebene ELISA-Verfahren auf Biotin-Avidin-Basis ist nur ein Beispiel. Statt dessen können auch andere erprobte Varianten des ELISA-Tests verwendet werden.

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TEIL II

DIAGNOSEVERFAHREN ZUR BESTÄTIGUNG VON IHN- UND VHS IM VERDACHTSFALL

Zur IHN- und VHS-Diagnose können folgende Verfahren angewandt werden:

- A. Herkömmliche Virusisolierung mit anschließendem serologischen Virusnachweis,

- B. Virusisolierung mit gleichzeitigem serologischen Virusnachweis,

- C. Andere Diagnoseverfahren (IFAT, ELISA).

Die Erstdiagnose von IHS und VHS in Betrieben in zugelassenen Gebieten darf sich nicht nur auf Verfahren C stützen. Die Verfahren A oder B sind ebenfalls anzuwenden.

Dem zur virologischen Untersuchung bestimmten Gewebematerial ist in einigen Fällen unter Umständen auch zusätzliches Material für die bakteriologische, parasitologische, histologische oder sonstige Untersuchung beizufügen, damit eine Differentialdiagnose durchgeführt werden kann. Solches Material ist nach einem OIE-Verfahren zu entnehmen.

II.A. Herkömmliche Virusisolierung mit anschließendem serologischem Virusnachweis

II.A.I.1. Probenahme

Zur Untersuchung sind mindestens 10 Fische mit typischen IHN- bzw. VHS-Symptomen zu wählen.

II.A.I.2. Aufbereitung und Einsendung der Fischproben

Siehe I.I.3.

II.A.I.3. Entnahme von zusätzlichem Probenmaterial

Siehe I.I.4.

II.A.II. Aufbereitung der Proben für die virologische Untersuchung

Siehe I.II.

II.A.III. Virologische Untersuchung

Siehe I.III, ausgenommen folgende Bestimmung: Es können entweder BF-2 oder RTG-2 und entweder EPC- oder FHM-Zellen für die Beimpfung mit Gewebematerial verwendet werden.

II.A.IV. Virusnachweis

Siehe I.IV.

II.B. Virusisolierung mit gleichzeitigem serologischen Virusnachweis

II.B.I.1. Auswahl der Proben

Siehe II.A.I.1.

II.B.I.2. Aufbereitung und Einsendung der Fischproben

Siehe I.I.3.

II.B.I.3. Entnahme von zusätzlichem Probenmaterial

Siehe I.I.4.

II.B.II.1. Homogenisieren der Organe

Siehe I.II.1.

II.B.II.2. Zentrifugieren des Homogenats

Siehe I.II.2.

II.B.II.3. Behandlung des Überstands mit Diagnoseantiseren

Die mit Antibiotika und Anti-IPN behandelte Organsuspension wird in Zellkulturmedium 1:10 und 1:10 000 verdünnt; aliquote Mengen werden mit gleichen Teilen der in Abschnitt I.IV.2 genannten Reagenzien gemischt und für 60 Minuten bei 15 °C bebrütet.

II.B.III.1. Zellkulturen und Nährböden

Entweder BF-2-oder RTG-2 und entweder EPC- oder FHM-Zellen werden bei 20 bis 30 °C in einem geeigneten Medium, z. B. Eagle's Minimum Essential Medium (oder entsprechende Modifikationen), versetzt mit 10 % Rinderfötenserum und Antibiotika in Standardkonzentrationen, angezüchtet.

Sofern die Zellen in verschlossenen Phiolen kultiviert werden, wird empfohlen, das Medium mit Bikarbonat zu puffern. Werden die Zellkulturen in offenen Phiolen angesetzt, so kann das Medium mit Tris-HCl (23 mM) und Natriumbikarbonat (6 mM) auf einen pH-Wert von möglichst genau 7,6 gepuffert werden.

Die mit Gewebematerial zu beimpfenden Zellkulturen sollten zum Zeitpunkt der Verimpfung frisch sein (4 bis 48 Stunden alt) und sich aktiv vermehren (also nicht zusammenwachsen).

II.B.III.2. Beimpfen der Zellkulturen

Von jeder Virus-Serum-Mischung (aufbereitet gemäß Abschnitt II.B.II.3) werden je Zellinie mindestens zwei Zellkulturen mit jeweils 50 µl beimpft.

II.B.III.3. Bebrüten der Zellkulturen

Siehe I.III.3.

II.B.III.4. Mikroskopische Untersuchung

Die bebrüteten Zellkulturen werden unter dem Mikroskop mit 40facher Vergrößerung täglich auf das Auftreten eines zytopathischen Effekts (CPE) geprüft. Verhindert eines der verwendeten Antiseren das Auftreten eines zytopathischen Effekts, so gilt das Virus als nachgewiesen.

Verhindert keines der verwendeten Antiseren das Auftreten eines zytopathischen Effekts, so ist das Nachweisverfahren gemäß Abschnitt I.IV anzuwenden.

II.B.III.5. Subkultivierung

Tritt nach sieben Tagen kein zytopathischer Effekt auf, so ist die Stammkultur, beimpft mit Überstand plus Medium (vgl. II.B.II.3), gemäß Abschnitt I.III.5 zu subkultivieren.

II.C. Andere Diagnoseverfahren

Gemäß Abschnitt II.A.II.2 aufbereiteter Überstand kann gemäß Abschnitt II.A.IV.3 bzw. II.A.IV.4 einem IFAT- bzw. ELISA-Test unterzogen werden. Diese Schnellverfahren müssen durch eine virologische Untersuchung gemäß Punkt A oder B innerhalb von höchstens 48 Stunden nach der Probenahme ergänzt werden, wenn

a) ein negatives Ergebnis vorliegt,

oder

b) bei Probematerial, das bei einem ersten Ausbruch von IHN oder VHS in zugelassenen Gebieten entnommen wurde, ein positives Ergebnis vorliegt.

Gewebematerial kann nach anderen Diagnoseverfahren (z. B. IF bei Gefrierschnitten oder immunohistochemische Analysen bei formalin-fixiertem Material) untersucht werden. Diese Verfahrenstechniken müssen stets durch Verimpfung von nicht fixiertem Material auf Zellkulturen ergänzt werden.

ABKÜRZUNGEN

BF-2 Bluegill fibroblast (Zellinie)

CPE Zytopathischer Effekt

ELISA Enzymimmunoassay

EPC Epithelioma papulosum cyprini (Zellinie)

FHM fathead minnow (Zellinie)

FITC Fluoreszein-isothiocyanat

HRP Meerrettich-Peroxidase

IF Immunfluoreszenz

IFAT Indirekter Fluoreszenz-Antikörpertest

IHN(V) Infektiöse Hämatopoetische Nekrose (Virus)

IPN(V) Infektiöse Pankreasnekrose (Virus)

MEM Minimum Essential Medium

OPD Ortho-Phenyldiamin

PBS gepufferte Kochsalzlösung

RTG-2 rainbow trout gonad (Zellinie)

Tris-HCl Tris (hydroxymethyl) aminomethan - HCl

VHS(V) Virale hämorrhagische Septikämie (Virus)

(1*) Klinische Untersuchungen