ENTSCHEIDUNG DER KOMMISSION vom 29. Juli 1991 über die Tiergesundheitsanforderungen und Veterinärbescheinigung für die Einfuhr von gefrorenem Rindersperma aus den Vereinigten Staaten von Amerika (91/479/EWG)

DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN - gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft,

gestützt auf die Richtlinie 88/407/EWG des Rates vom 14. Juni 1988 zur Festlegung der tierseuchenrechtlichen Anforderungen an den innergemeinschaftlichen Handelsverkehr mit gefrorenem Samen von Rindern und an dessen Einfuhr (1), zuletzt geändert durch die Richtlinie 90/425/EWG (2), insbesondere auf Artikel 10 und 11,

in Erwägung nachstehender Gründe:

Die Vereinigten Staaten von Amerika sind in der Entscheidung 90/14/EWG der Kommission vom 20. Dezember 1989 über die Liste der Drittländer, aus denen die Mitgliedstaaten die Einfuhr von gefrorenem Rindersamen zulassen (3), aufgeführt.

Die Tiergesundheitslage in den Vereinigten Staaten von Amerika ist offensichtlich gut und wird in bezug auf Krankheiten, die durch Sperma übertragbar sind, von einwandfrei strukturierten und organisierten Veterinärdienststellen kontrolliert.

Die zuständigen Veterinärbehörden der Vereinigten Staaten von Amerika haben bestätigt, daß die Vereinigten Staaten mindestens 12 Monate frei waren von Rinderpest, Maulund Klauenseuche und infektiöser Rinderpleuropneumonie und daß in diesem Zeitraum gegen keine dieser Seuchen geimpft wurde.

Die zuständigen Veterinärbehörden der Vereinigten Staaten von Amerika haben sich verpflichtet, die Bestätigung des Auftretens einer der obengenannten Seuchen/Krankheiten oder von Blauzungenkrankheit oder epizootischer hämorrhagischer Krankheit bzw. jede Änderung der jeweiligen Impfmaßnahmen gegen diese Krankheiten fernschriftlich innerhalb von 24 Stunden oder, wenn es sich um einen Vorschlag zur Änderung der Vorschriften handelt, die die Vereinigten Staaten von Amerika auf die Einfuhr von Haustieren, Samen oder Embryonen anwenden, innerhalb eines angemessenen Zeitraums mitzuteilen.

Die zuständigen Veterinärbehörden der Vereinigten Staaten von Amerika schreiben bezueglich der bovinen Tuberkulose und Brucellose Tiergesundheitsgarantien vor, die den innerhalb der Gemeinschaft anwendbaren entsprechen.

Die zuständigen Veterinärbehörden der Vereinigten Staaten von Amerika haben sich verpflichtet, die Ausstellung der in dieser Entscheidung vorgesehenen Bescheinigungen amtlich zu überwachen und dafür Sorge zu tragen, daß alle wesentlichen, der Bescheinigung zugrunde liegenden Atteste, Abweichungen und Laborergebnisse nach dem Versand des entsprechenden Spermas noch mindestens 12 Monate lang amtlich verwahrt werden.

Die zuständigen Veterinärbehörden der Vereinigten Staaten von Amerika haben sich verpflichtet, Besamungsstationen für die Ausfuhr von Rindersperma in die Europäische Wirtschaftsgemeinschaft gemäß Artikel 9 der Richtlinie 88/407/EWG amtlich zuzulassen.

Die zuständigen Veterinärbehörden der Vereinigten Staaten von Amerika haben sich verpflichtet, die Zeitpunkte zu bestimmen und der Kommission der Europäischen Gemeinschaften unverzueglich mitzuteilen, zu denen, bezueglich der einzelnen zugelassenen Besamungsstationen, die für die Übertragung der Blauzungenkrankheit und der epizootischen hämorrhagischen Krankheit der Hirsche (EHD) verantwortlichen Kulikoidenarten ihre Aktivität einstellen bzw. wiederaufnehmen.

Die Tiergesundheitsanforderungen und die entsprechende Veterinärbescheinigung sind der Tiergesundheitslage des erwähnten Drittlandes anzupassen.

Die in dieser Entscheidung vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des Ständigen Veterinärausschusses - HAT FOLGENDE ENTSCHEIDUNG ERLASSEN:

Artikel 1

(1) Bis zum 31. Dezember 1992 können die Mitgliedstaaten die Genehmigung für den Import von Rindersperma aus den Vereinigten Staaten von Amerika erteilen, wenn das Sperma von Bullen gewonnen wurde, bei deren Untersuchung gemäß Anhang I A zu dieser Entscheidung auf Blauzungenkrankheit oder epizootische hämorrhagische Krankheit der Hirsche (EHD) andere als negative Testergebnisse erzielt wurden, sofern die Bedingungen der Anhänge II A und II B eingehalten und ein innergemeinschaftlicher Handel mit diesem Sperma sicher ausgeschlossen wird. Die Kommission wird diese Maßnahmen vor dem oben angegebenen Datum überprüfen.

(2) Die Mitgliedstaaten genehmigen den Import von Rindersperma aus den Vereinigten Staaten von Amerika, das den Anforderungen entspricht, die in den Tiergesundheitsbescheinigungen nach Anhang I A und, wo relevant, nach Anhang I B ausgewiesen sind.

Artikel 2

Diese Entscheidung ist an alle Mitgliedstaaten gerichtet.

Brüssel, den 29. Juli 1991 Für die Kommission Ray Mac SHARRY Mitglied der Kommission

(1) ABl. Nr. L 194 vom 22. 7. 1988, S. 10.

(2) ABl. Nr. L 224 vom 18. 8. 1990, S. 29.

(3) ABl. Nr. L 8 vom 11. 1. 1990, S. 71.

ANHANG I A

TIERGESUNDHEITSBESCHEINIGUNG für die Einfuhr von Rindersperma aus den Vereinigten Staaten von Amerika

Bescheinigung Nr.: .

Land, in dem das Sperma gewonnen wurde: Vereinigte Staaten von Amerika Zuständige Behörde: US Landwirtschaftsministerium - APHIS

I. Identifizierung des Spermas

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II. Herkunft des Spermas

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III. Bestimmungsort des Spermas

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IV. Angaben zum Gesundheitszustand

Ich, der unterzeichnete amtliche Tierarzt ("federal veterinarian"), bescheinige, daß folgende Anforderungen erfuellt sind:

1. Die Vereinigten Staaten von Amerika waren während eines Zeitraums von mindestens 12 Monaten von der ersten bis einschließlich 30 Tage nach der letzten Gewinnung oben bezeichneter Spermaportionen nachweislich frei von Rinderpest.

2. Die zugelassene Besamungsstation, in der das vorgenannte Sperma gewonnen wurde, erfuellt folgende Anforderungen:

a) Die Zulassung für den Export von Rindersperma in die Europäische Gemeinschaft wurde von der Bundesveterinärbehörde der Vereinigten Staaten von Amerika in Übereinstimmung mit allen Anforderungen dieses Punktes erstellt.

b) Sie liegt im Mittelpunkt eines Gebiets mit einem Radius von 50 km, in dem während eines Zeitraums, der mindestens drei Monate vor der ersten Gewinnung des vorgenannten Spermas beginnt und 30 Tage nach der letzten Gewinnung endet, kein Fall von Maul- und Klauenseuche, infektiöser Rinderpleuropneumonie und vesikulärer Stomatitis aufgetreten ist.

c) Sie war während eines Zeitraums, der mindestens drei Monate vor der ersten Gewinnung des vorgenannten Spermas beginnt und 30 Tage nach der letzten Gewinnung endet, nachweislich frei von Maul- und Klauenseuche und Brucellose.

d) Sie war während eines Zeitraums, der mindestens 30 Tage vor der ersten Gewinnung des vorgenannten Spermas beginnt und 30 Tage nach der letzten Gewinnung endet, frei von Tollwut, Milzbrand, Tuberkulose, enzootischer Rinderleukose sowie frei von Symptomen einer Infektion durch Trichomonas fötus, Campylobacter fötus und Leptospiren der Serotypen canicola, grippotyphosa, pomona, hardjo und icterohämorrhagica.

e) Sie wird von einem amtlichen Tierarzt (federal veterinarian) mindestens zweimal jährlich kontrolliert; dabei werden sämtliche Umstände in bezug auf die in dieser Bescheinigung gestellten Anforderungen geprüft und bestätigt.

f) Sie unterliegt der ständigen Überwachung durch einen Stationstierarzt ("Centre veterinarian"), insbesondere bezueglich nachstehender Anforderungen:

i) Die Tiere dürfen nur mit ausdrücklicher Genehmigung des Stationstierarztes in die Station eingestellt werden; sämtliche Ein- und Abgänge sind zu registrieren;

ii) es ist ein Register mit Angaben über die Rasse, das Geburtsdatum, die Identifizierung und den Gesundheitszustand aller in der Station befindlichen Rinder sowie über alle in der Station durchgeführten diagnostischen Untersuchungen und deren Ergebnisse, Behandlungen und Vaccinierungen zu führen;

iii) der Zugang Unbefugter ist zu verhindern; Besucher müssen die vom Stationstierarzt festgelegten Bedingungen einhalten;

iv) es sind technisch qualifizierte Fachkräfte mit entsprechender Ausbildung in den zur Verhütung der Verbreitung von Seuchen unerläßlichen Desinfektionstechniken und hygienischen Arbeitsmethoden beschäftigt.

g) Die Station darf ausser Rindern nur solche Nutztiere aufnehmen, die für den planmässigen Betrieb unbedingt erforderlich sind, keine Infektionsgefahr für die Rinder darstellen und den vom Stationstierarzt festgelegten Anforderungen entsprechen.

h) Die Station genügt folgenden baulichen Anforderungen:

i) Die Stallungen sind von den Spermaaufbereitungs- und -lagerräumen räumlich getrennt, die ihrerseits ebenfalls räumlich voneinander abgegrenzt sind;

ii) es ist eine Isolierstation vorhanden für kranke Tiere;

iii) es sind Räumlichkeiten für die Spermagewinnung, einschließlich eines separaten Raums für das Reinigen und Desinfizieren bzw. Sterilisieren des Arbeitsgeräts, vorhanden;

iv) es sind ein Raum für die Spermaaufbereitung (Spermalabor) und ein Raum für die Spermalagerung (Spermadepot) vorhanden (die sich nicht unbedingt am gleichen Ort befinden müssen);

v) jeglicher Kontakt mit externen Viehbeständen ist ausgeschlossen;

vi) die Besamungsstation ist insgesamt leicht zu reinigen und zu desinfizieren.

Sind die vorgenannten Anforderungen erfuellt, so kann eine zugelassene Besamungsstation ein Betriebsgelände mit einer oder mehreren anderen Besamungsstationen teilen.

3. Die während des Zeitraums der Spermagewinnung und -lagerung in der zugelassenen Besamungsstation eingestellten Bullen erfuellen folgende Anforderungen:

a) Sie befanden sich seit dem 1. Januar 1990 ununterbrochen in der Station und wurden seit ihrer Aufnahme allen Untersuchungen mit dem jeweils vorgeschriebenen Testergebnis gemäß Buchstabe d) unterzogen, oder b) sie wurden aus einer zugelassenen Besamungsstation - in einem zuvor gründlich gereinigten und desinfizierten Transportmittel - transportiert, ohne mit Tieren mit niedrigerem Gesundheitsstatus in Berührung gekommen zu sein, oder c) sie wurden auf Anordnung des Stationstierarztes in die Station aufgenommen und zeigen keine klinischen Krankheitssymptome:

i) Sie stammen aus Beständen, die von der Bundesveterinärbehörde als tuberkulosefrei anerkannt wurden bzw. die sich in anerkannt tuberkulosefreien Gebieten, entsprechend der Definition der Bundesveterinärbehörde abgegrenzt, befanden, und wurden zu keiner Zeit in Beständen mit niedrigerem Gesundheitsstatus gehalten;

ii) sie stammen aus Beständen, die von der Bundesveterinärbehörde als brucellosefrei anerkannt wurden bzw. die sich in brucellosefreien Gebieten "claß free" oder in Gebieten der Klasse A ("claß A"), entsprechend der Definition der Bundesveterinärbehörde abgegrenzt, befanden, und wurden zu keiner Zeit in Beständen mit niedrigerem Gesundheitsstatus gehalten;

iii) - sie stammen aus Beständen, die seit mindestens drei Jahren frei von enzootischer Rinderleukose waren, oder - sie stammen von Mutterkühen, die binnen 30 Tagen vor der Einstellung ihrer Nachkommen in die Isolierstation auf eine serologische Untersuchung gemäß Anhang G der Richtlinie 64/432/EWG auf enzootische Rinderleukose negativ reagiert haben, oder - sie wurden im Alter von unter zwei Jahren in die zugelassene Besamungsstation eingestellt und haben bei einer nach Erreichen des zweiten Lebensjahres, gemäß Anhang G der Richtlinie 64/432/EWG durchgeführten serologischen Untersuchung auf Rinderleukose negativ reagiert;

iv) sie wurden innerhalb von 30 Tagen vor der Einstellung in die zugelassene Isolierstation folgenden Untersuchungen mit jeweils negativem Testergebnis unterzogen:

- USDA (United States Department of Agriculture) - Tuberkulin-Schwanzfaltenprobe,

- USDA-Standardröhrchentest ("standard tube test") auf Brucellose mit negativem Testergebnis bei weniger als 30 IE Agglutination/ml sowie Komplementbindungstest (CFT) mit einem Brucella-Ergebnis von weniger als 20 EG-Einheiten/ml (20 ICFT-Einheiten),

- serologische Untersuchung auf enzootische Rinderleukose nach dem Verfahren des Anhangs G der Richtlinie 64/432/EWG,

- Serumneutralisationstest oder ELISA zum Nachweis von Serumantikörpern gegen das Virus der infektiösen bovinen Rhinotracheitis/infektiösen pustulösen Vulvovaginitis,

- Virusisolationstest auf bovine Virusdiarrhö mittels Blutproben in empfänglichen Zellkulturen mit anschließendem Fluoreszenzantikörpertest bzw. Immunperoxidasetest, wobei der Test bei Bullen, die bei ihrer Einstellung in die Besamungsstation unter sechs Monate alt waren, erst nach Erreichen des sechsten Lebensmonats durchgeführt wurde.

Nachfolgend aufgeführte Untersuchungen wurden mit jeweils negativem Testergebnis durchgeführt:

- Blocking ELISA auf Blauzungenkrankheit unter Verwendung eines gruppenspezifischen monoklonalen Antikörpers gemäß Anhang IV A der Entscheidung 91/479/EWG der Kommission,

- Agargel-Immunodiffusionstest auf alle in den Vereinigten Staaten von Amerika nachweislich vorkommenden Serotypen der epizootischen hämorrhagischen Krankheit der Hirsche (EHD) gemäß Anhang IV B der Entscheidung 91/479/EWG der Kommission.

Ausgenommen davon sind Fälle, in denen sich diese Bescheinigung auf Sperma bezieht, das vor dem 1. Januar 1993 gewonnen und versandt wurde und in der das importierende Mitgliedsland schriftlich bestätigt hat, daß es gemäß Absatz 1 des Artikels 1 der Entscheidung 91/479/EWG der Kommission verfährt, der diese Bescheinigung als Anhang beigefügt ist.

Dabei wird davon ausgegangen, daß die vorgenannten Untersuchungen ganz oder teilweise während des Aufenthaltes des Tieres in der amtlich zugelassenen Isolierstation durchgeführt werden konnten und daß im Fall eines nicht negativen Testergebnisses die Isolationsfrist von 30 Tagen für die anderen Bullen in der Isolierstation erst zu laufen beginnt, nachdem das betroffene Tier die Station verlassen hat, und daß der Status der Tuberkulose- bzw. Brucellosefreiheit der Station gegebenenfalls wiederhergestellt wurde;

v) die Bullen haben nach Beendigung der Gesundheitstests gemäß Ziffer iv) in einer der Isolationsfrist vorgestellten Quarantäne mindestens 30 Tage in einer amtlich zugelassenen Isolierstation verbracht, die sich im Mittelpunkt eines Gebiets mit einem Radius von 10 km befindet, in dem es am Tag ihrer Aufnahme keinen Fall von Maul- und Klauenseuche, Rinderpest, infektiöser Pleuropneumonie der Rinder und vesikulärer Stomatitis gab und die zu diesem Zeitpunkt seit mindestens drei Monaten frei von Maul- und Klauenseuche und Brucellose sowie seit mindestens 30 Tagen frei von Tollwut, Milzbrand, Tuberkulose und enzootischer Rinderleukose war; in der Isolierstation wurden sie den folgenden Untersuchungen mit jeweils negativem Testergebnis unterzogen:

- USDA-serologischer-Standardröhrchentest ("standard tube test") auf Brucellose mit negativem Testergebnis bei weniger als 30 IE Agglutination/ml sowie Komplementbindungstest mit einem Brucella-Ergebnis von weniger als 20 EG-Einheiten/ml (20 ICFT-Einheiten),

- entweder Immunofluoreszenzantikörpertest zum Antigennachweis oder direkter Erregernachweis durch Kultur von Campylobacter fötus aus Präputialspülproben oder aus Spülproben der künstlichen Vagina,

- mikroskopische Untersuchungen und Kulturtest auf Trichomonas-fötus-Infektion aus Präputialspülproben oder aus Spülproben der künstlichen Vagina,

- Serumneutralisationstest oder ELISA zum Nachweis von Antikörpern geben das Virus der infektiösen bovinen Rhinotracheitis/infektiösen pustulösen Vulvovaginitis.

Bei einem nicht negativen Ergebnis beginnt die Isolationsfrist von 30 Tagen erst dann, wenn das fragliche Tier die Station verlassen hat und wenn, gegebenenfalls beeinträchtigt, der Brucellosestatus der Einrichtung wieder hergestellt ist.

Zusätzlich müssen die Tiere in der Station im Abstand von 14 Tagen zweimal durch Injektion von 25 mg je kg Lebendgewicht Streptomyzin oder Dihydrostreptomyzin oder einer Mischung dieser beiden Stoffe gegen Leptospirose behandelt worden sein;

d) Die Bullen wurden mindestens einmal jährlich - mit jeweils negativem Ergebnis - folgenden Untersuchungen unterzogen:

i) USDA-Tuberkulin-Schwanzfaltenprobe,

ii) USDA-Standardröhrchentest ("standard tube test") auf Brucellose mit negativem Testergebnis bei weniger als 30 IE Agglutination/ml sowie Komplementbindungstest mit einem Brucella-Ergebnis von weniger als 20 EG-Einheiten/ml (20 ICFT-Einheiten),

iii) serologische Untersuchung auf enzootische Rinderleukose nach dem Verfahren des Anhangs G der Richtlinie 64/432/EWG,

iv) Serumneutralisationstest oder ELISA zum Ausschluß der infektiösen bovinen Rhinotracheitis/infektiösen pustulösen Vulvovaginitis, sofern die zuständige Behörde des Einfuhrmitgliedstaats schriftlich bestätigt hat, daß vor dem 31. Dezember 1992 gewonnenes Sperma von Bullen, die auf einen dieser Tests positiv reagiert haben, akzeptiert werden kann, wenn es bei einem Virusisolations- und/oder einem Inokulationstest in bezug auf die vorgenannten Krankheiten negativ reagiert hat, in welchem Fall der Test am .......... im .......... Laboratorium durchgeführt wurde,

v) entweder Immunofluoreszenzantikörpertest zum Antigennachweis oder direkter Erregernachweis durch Kultur von Campylobacter fötus aus Präputialspülproben oder aus Spülproben der künstlichen Vagina; davon ausgenommen sind Bullen, die nicht zur Spermagewinnung genutzt werden, sofern der Test vor Aufnahme der Spermagewinnung für diese Tiere nachgeholt wird,

vi) serologische Untersuchung auf Leptospiren der Serotypen canicola, pomona, grippotyphosa, hardjo und icterohämorrhagica und mindestens zweimal jährlich nachfolgende Untersuchungen mit jeweils negativem Testergebnis:

- Blocking ELISA auf Blauzungenkrankheit unter Verwendung eines gruppenspezifischen monoklonalen Antikörpers gemäß Anhang IV A der Entscheidung 91/479/EWG der Kommission,

- Agargel-Immunodiffusionstest auf alle in den USA nachgewiesenen Serotypen des Erregers der epizootischen hämorrhagischen Krankheit der Hirsche (EHD) gemäß Anhang IV B der Entscheidung 91/479/EWG der Kommission.

Davon ausgenommen sind Fälle, in denen sich die Bescheinigung auf Sperma bezieht, das vor dem 1. Januar 1993 gewonnen und versandt wurde und in der das importierende Mitgliedsland schriftlich bestätigt hat, daß es gemäß Absatz 1 Artikel 1 der Entscheidung 91/479/EWG der Kommission verfährt, der diese Bescheinigung als Anhang beigefügt ist.

Diese Untersuchungen (mit Ausnahme der Tuberkulinprobe) werden in einem von der Bundesveterinärbehörde der Vereinigten Staaten von Amerika zu diesem Zweck zugelassenen Laboratorium durchgeführt.

4. Das vorgenannte Sperma - wird als "frei" von Blauzungenkrankheit entsprechend der Definition in Anhang II A zu der Entscheidung 91/479/EWG der Kommission und insbesondere dem Punkt 5 derselben eingestuft (*) oder - wird als "untersucht" auf Blauzungenkrankheit entsprechend der Definition in Anhang II B zu der Entscheidung 91/479/EWG der Kommission und insbesondere dem Punkt 2 eingestuft. Durch die Veterinärbehörde des importierenden Mitgliedstaats wird schriftlich bestätigt, daß die Bedingungen des Absatzes 1 von Artikel 1 dieser Entscheidung in Anspruch genommen werden (*),

(*) Unzutreffendes streichen.

a) wurde ohne Anwendung des Verfahrens der Elektro-Ejakulation bzw. Elektro-Stimulation von in einer zugelassenen Besamungsstation eingestellten Bullen gewonnen,

i) die sich während eines Zeitraums, der mindestens sechs Monate vor der ersten Gewinnung des Spermas beginnt und mit dem Versandtag endet, ununterbrochen im Hoheitsgebiet der Vereinigten Staaten von Amerika befanden;

ii) die ausser dem schriftlich bestätigten Ausnahmefall gemäß Punkt 3 Buchstabe d) Ziffer iv) der Entscheidung 91/479/EWG auf keinen der in dieser Bescheinigung genannten Tests positiv reagiert haben;

iii) die während ihres Aufenthalts in der zugelassenen Besamungsstation nicht zum natürlichen Sprung eingesetzt wurden;

iv) die vor der Spermagewinnung seit mindestens 30 Tagen ununterbrochen in der zugelassenen Besamungsstation gehalten wurden;

v) die während dieser Zeit keine klinischen Krankheitssymptome gezeigt haben;

b) wurde in einer zugelassenen Besamungsstation aufbereitet,

i) in der während des vorgesehenen Zeitraums der Spermagewinnung nur Sperma von Bullen aus zugelassenen Besamungsstationen oder von Bullen mit gleichem Gesundheitsstatus wie Bullen aus zugelassenen Besamungsstationen aufbereitet wurde. Im zweiten Fall sind folgende Anforderungen zu erfuellen: Das Sperma wurde mit anderem Gerät und einer separaten Ausrüstung und zu anderen Zeiten als das Sperma aus zugelassenen Besamungsstationen aufbereitet. Die Aufbereitungsanlage wurde vor ihrer Wiederverwendung zur Aufbereitung von Sperma von Bullen in zugelassenen Besamungsstationen gründlich gereinigt und desinfiziert;

ii) unter hygienisch einwandfreien Bedingungen, wobei alle mit den Spenderbullen oder ihrem Sperma in Berührung gekommenen Gegenstände und Geräte vor ihrer Wiederverwendung sachgemäß desinfiziert bzw. sterilisiert wurden;

iii) unter Verwendung von Zusatzstoffen, Verdünnungsmitteln und Streckmitteln, in denen jegliches Material tierischer Herkunft aus Quellen bezogen wurde, die kein Gesundheitsrisiko für Tiere darstellen oder vor Verwendung so behandelt wurden, daß ein derartiges Risiko ausgeschlossen wurde.

c) ihm wurden folgende Antibiotika in den für die richtige Spermakonzentration erforderlichen Mengen zugefügt:

nicht weniger als:

- 500 IE/ml Streptomyzin,

- 500 IE/ml Penizillin,

- 150 ìg/ml Linkomyzin,

- 300 ìg/ml Spektinomyzin,

wobei es unmittelbar danach für mindestens 45 Minuten auf einer Temperatur von nicht weniger als 5 °C (41° Fahrenheit) gehalten wurde,

oder nicht weniger als:

- 50 ìg/ml Tylosin,

- 250 ìg/ml Gentamyzin,

- 150 ìg/ml Linkomyzin,

- 300 ìg/ml Spektinomyzin,

wobei der Kontakt zwischen dem Antibiotikum und dem unverdünnten Sperma mindestens 3 Minuten auf der Mischtemperatur gehalten und das Sperma und die glycerinfreie Fraktion des Verdünnungsmittels für mindestens zwei Stunden auf nicht weniger als 5 °C (41° Fahrenheit) gehalten wurden;

d) das Sperma wurde in Einzelbehältnissen (Kunststoffröhrchen) gefuellt, auf denen jeweils der Tag der Spermagewinnung, die Rasse und die Identität des Spenderbullen sowie Name und Anschrift der zugelassenen Besamungsstation angegeben sind, wobei diese Informationen ganz oder teilweise in Codeform angegeben werden können, wenn der zuständigen Behörde des Einfuhrmitgliedstaats der Schlüssel zu diesem Code mitgeteilt wurde und die Kennzeichnung der einzelnen Behältnisse mit den entsprechenden Angaben in dieser Bescheinigung eindeutig übereinstimmt;

e) das Sperma wurde unter Verwendung von Kühlmitteln, die zuvor für kein anderes Erzeugnis tierischen Ursprungs benutzt wurden, und unter stationstierärztlicher Überwachung in der zugelassenen Besamungsstation mindestens 30 Tage vor dem Versand in Behältnissen gelagert, die zuvor gründlich gereinigt und desinfiziert bzw. sterilisiert wurden;

f) ist bei einem beliebigen Bullen der Station ein positives Ergebnis bei einer der Untersuchungen, mit Ausnahme der in Artikel 1 Absatz 1 der Entscheidung 91/479/EWG der Kommission aufgeführten Tests auf Blauzungenkrankheit oder epizootische hämorrhagische Krankheit der Hirsche (EHD) oder eines Tests auf infektiöse bovine Rhinotrachitis/infektiöse pustulöse Vulvovaginitis, wofür eine schriftliche Ausnahmegenehmigung gemäß Punkt 3 Buchstabe d) Ziffer iv) vorausgesetzt wird, festgestellt worden, wird das Sperma vom Export ausgeschlossen, solange der Gesundheitszustand der Station nicht wiederhergestellt ist.

g) es wurde unter Verwendung von Kühlmitteln, die zuvor für kein anderes Erzeugnis tierischen Ursprungs benutzt wurden, in zuvor gründlich gereinigten und desinfizierten bzw. sterilisierten Behältnissen versandt, die vor ihrem Versand aus der zugelassenen Besamungsstation unter amtstierärztlicher Überwachung verplombt wurden.

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

ANHANG II A

Verfahren für die Einstufung von Rindersperma zur Ausfuhr aus den Vereinigten Staaten von Amerika in die Europäische Wirtschaftsgemeinschaft als BTV-frei

1. Alle Rinder in der zugelassenen Besamungsstation werden vor ihrer Einstellung und danach alle sechs Monate gemäß den Protokollen in Anhang IV einem Blocking ELISA auf Antikörper gegen das Blauzungenvirus (BTV) sowie einem AGID-Test auf Antikörper gegen sämtliche EHD-Virusstämme unterzogen, die in den Vereinigten Staaten von Amerika nachweislich vorkommen.

2. Ein Bulle, der auf den jüngsten Test gemäß Punkt 1 negativ reagiert hat, gilt im Sinne dieser Entscheidung als serologisch negativ gegen das Blauzungenvirus, ausgenommen wenn bzw. bis das Blut oder das Sperma des Bullen auf einen Test gemäß diesem Anhang oder gemäß Anhang III positiv reagiert.

3. Als vektorfreie Saison in bezug auf eine zugelassene Besamungsstation gilt im Sinne dieser Entscheidung der Zeitraum, der 21 Tage nach dem Termin, der von dem Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten zu bestimmen und der Geschäftsführung der betreffenden zugelassenen Besamungsstation sowie der Kommission der Europäischen Gemeinschaften unverzueglich mitzuteilen ist, beginnt, an dem die für die Übertragung des Blauzungenvirus und des EHD-Virus verantwortlichen Kulikoidenarten ihre Aktivität in der Region, in der die Station ansässig ist, einstellen, und der 21 Tage vor dem gleichermassen bestimmten und mitgeteilten Termin endet, an dem diese Kulikoiden wieder aktiv werden.

4. Als Zeitraum der Spermagewinnung, d. h. Gewinnung von Sperma zur Ausfuhr in die Gemeinschaft, gilt im Sinne dieser Entscheidung ein Zeitraum von nicht länger als drei Wochen, in denen das Sperma gewonnen wird. Werden diese drei Wochen überschritten, so wird der Gesamtzeitraum der Spermagewinnung in zwei oder mehr Gewinnungsphasen unterteilt, die maximal jeweils drei Wochen betragen dürfen und die in bezug auf die Tests und Verfahren zur Ermittlung der in dieser Entscheidung genannten Krankheiten Blauzungenkrankheit und EHD jeweils als ein separater Gewinnungszeitraum angesehen werden.

5. Sperma, das in eine oder mehrere der nachstehenden Kategorien eingereiht werden kann, wird zum Zweck der Ausfuhr in die Europäische Gemeinschaft als BTV-frei eingestuft:

a) Sperma, das in der vektorfreien Saison von einem seronegativen Bullen gewonnen wurde, wenn eine Blutprobe dieses Bullen, die 21 Tage nach Ablauf des Spermagewinnungszeitraums entnommen wurde, auf einen ELISA-Test zur Ermittlung von BTV-Antikörpern und auf einen AGID-Test zur Ermittlung von Antikörpern gegen sämtliche in den USA nachweislich vorkommenden EHD-Serotypen gemäß den Protokollen in Anhang IV negativ reagiert hat;

b) Sperma, das in einer anderen als der vektorfreien Saison von einem seronegativen Bullen gewonnen wurde, wenn eine Blutprobe dieses Bullen, die 21 Tage nach Ablauf des Spermagewinnungszeitraums entnommen wurde, auf einen ELISA-Test zur Ermittlung von BTV-Antikörpern und auf einen AGID-Test zur Ermittlung von Antikörpern gegen sämtliche in den Vereinigten Staaten von Amerika nachweislich vorkommenden EHD-Serotypen gemäß den Protokollen in Anhang IV negativ reagiert hat und wenn Blutproben, die demselben Bullen an den Tagen der Gewinnung des ausfuhrbestimmten Spermas entnommen wurden, im Rahmen der Virusisolierung gemäß Anhang III negativ reagiert haben.

ANHANG III

Virusisolierung zur Ermittlung des Blauzungenvirus im Blut im Hinblick auf die Ausfuhr von Rindersperma aus den Vereinigten Staaten von Amerika in die Europäische Wirtschaftsgemeinschaft

1. An jedem Tag der Gewinnung des zur Ausfuhr bestimmten Spermas (in der Regel zweimal wöchentlich) wird dem betreffenden Bullen Blut entnommen, das binnen 48 Stunden subkutan und intradermal einem Schaf inokuliert wird; zuvor ist im Rahmen eines Blocking ELISA sicherzustellen, daß das Blut seronegativ ist.

2. Über einen Zeitraum von drei Wochen, der am Tag der ersten Beimpfung gemäß Punkt 1 beginnt, wird dem Schaf zweimal wöchentlich Blut für die Virusisolierung entnommen.

3. Mindestens sechs embryonierte elftägige vorbebrütete Hühnereier werden mit Bullen- und Schafblut binnen 48 Stunden nach der jeweiligen Entnahme beimpft.

4. Sterben die Embryonen nicht bzw. binnen zwei Tagen nach der Beimpfung ohne besondere Läsionen ab, so gilt das Testergebnis nach sieben Tagen als negativ.

5. Material eines zwischen zwei und sieben Tagen abgestorbenen Embryos wird auf embryonierte elftägige vorbebrütete Hühnereier übertragen, wobei mindestens sechs Eier je abgestorbenes Embryo verwendet werden.

6. Beträgt die Embryosterblichkeit infolge der Übertragung dieses Materials über 50%, so gilt das Testergebnis als positiv. Im Zellkulturverfahren wird das Virus bzw. die Viren typendifferenziert, um das Vorliegen des Blauzungenvirus zu bestätigen.

7. Über einen Zeitraum von drei Wochen wird dem Bullen zweimal wöchentlich und dem Schaf einmal wöchentlich Serum entnommen, das im Rahmen des Blocking ELISA gemäß Anhang IV A, eines Serumneutralisationstests auf BTV-Antikörper, des AGID-Tests gemäß Anhang IV B sowie eines Serumneutralisationstests auf EHD-Virus-Antikörper untersucht wird.

8. 21 Tage nach der letzten Beimpfung mit dem Bullenblut wird das Schaf erneut einem Blocking ELISA unterzogen.

9. Serokonversion bzw. ein vierfacher (oder grösserer) Anstieg des Antikörpertiters beim Bullen oder beim Schaf lassen auf eine vorliegende oder noch nicht lange zurückliegende Infektion schließen; in diesem Fall gilt das Testergebnis als positiv.

10. Am Ende des Entnahmezeitraums werden alle Proben zusammen serologisch untersucht.

11.Das Sperma wird erst zur Ausfuhr freigegeben, wenn alle Testergebnisse insgesamt negativ sind.

ANHANG IV A

Protokoll für einen Blocking bzw. kompetitiven Enzym-Immuntest (ELISA) unter Verwendung eines gruppenspezifischen monoklonalen Antikörpers zum Nachweis von BTV-Antikörpern

KOMPETITIVER ELISA ZUM BTV-ANTIKÖRPERNACHWEIS UNTER VERWENDUNG DES MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS 3-17-A3 Mit diesem Test können Antikörper aller bekannten Serotypen des Blauzungenvirus (BTV) nachgewiesen werden.

Testprinzip ist die Unterbrechung der Reaktion zwischen BTV-Antigen und einem gruppenspezifischen monoklonalen Antikörper (3-17-A3) durch Zugabe von Testserumverdünnungen. Antikörper gegen im Testserum vorhandenes BTV blockieren die Reaktionsfähigkeit des monoklonalen Antikörpers (Mab) und reduzieren nach Zusatz von Enzymsubstrat die voraussichtliche Farbenentwicklung.

Materialien und Reagenzien 1. Flachgrundige Mikrotiterplatten.

2. Antigen: wie folgt zubereitet.

3. Blocking-Puffer: 5 % (w/v) "Marvel"-Milchpulver, 0,1 % (v/v) Tween-20 (als Polyoxydethylensorbitonmonolauratsirup) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).

4. Monoklonaler Antikörper: 3-17-A3 (als aufschwimmende Hybridom-Gewebekultur), aufbewahrt bei 20 °C oder gefriergetrocknet, vor Verwendung mit Blocking-Puffer 1:50 verdünnt und gegen das gruppenspezifische Polypeptid p7 gerichtet.

5. Konjugat: Kaninchen-Antimaus-Globulin (absorbiert und eluiert), zu Meerrettichperoxidase konjugiert und bei 4 °C im Dunkeln aufbewahrt.

6. Substrat und Chromogen: 0,2 g o-Phenylendiamin (OPD), aufgelöst in einer Pufferlösung aus 2,553 g Zitronensäure und 4,574 g Dinatrium-Hydrogenorthophosphat und mit destilliertem Wasser auf 500 ml aufgefuellt, in 25-ml-Aliquoten aufgeteilt und bei 20 °C im Dunkeln aufbewahrt, unter Zusatz von 12 ìl/25 ml Wasserstoffperoxyd (30 % w/v) unmittelbar vor der Verwendung.

OPD mit Vorsicht handhaben - Gummihandschuhe tragen - mutagenverdächtig.

7. 1 Molar Schwefelsäure: 26,6 ml Säure, zugegeben zu 473,4 ml destilliertem Wasser.

Vorsicht - stets Säure zu Wasser, niemals Wasser zur Säure geben.

8. Orbitalschüttler.

9. ELISA-Plattenleser (das Testergebnis kann visuell abgelesen werden).

Testformat >PLATZ FÜR EINE TABELLE>

Testprotokoll Blindkontrolle Reihe 1 (A - H) ist eine Blindkontrolle, bestehend aus BTV-Antigen und Konjugat. Sie kann zur Nichtanzeige des ELISA-Lesers verwendet werden.

Mab-Kontrolle Reihe 2 (A - H) ist die monoklonale Antikörper-Kontrolle, bestehend aus BTV-Antigen, monoklonalem Antikörper und Konjugat. Sie stellt eine Negativ-Kontrolle dar. Der Mittelwert der optischen Dichte (OD) dieser Kontrollreihe entspricht dem Hemmungswert von 0 %.

Positivkontrolle Reihe 3 (A - H) ist die Positivkontrolle, bestehend aus BTV-Antigen, BTV-positiven Antiserumverdünnungen, Mab und Konjugat. Damit soll angezeigt werden, daß der Test sachgerecht funktioniert, und ähnliche Hemmungsniveaus sollten von Test zu Test erzielt werden.

Testseren Im Testformat (siehe oben) können 18 Seren, verdünnt im Verhältnis 1:2, 1:4, 1:8 und 1:16, getestet werden. So lässt sich der Titer von Antikörpern in den Testseren in etwa ermitteln. Die Verdünnungsreihe könnte bis zu Serumverdünnungsendpunkttitern fortgesetzt werden. Alternativ könnten bei grossangelegten serologischen Untersuchungen Seren einmal (1:4) oder zweimal (1:2 und 1:4) verdünnt im Rapid-screening-Testverfahren getestet werden.

Verfahrensweise 1. BTV-Antigen zu vortitrierter Konzentration in PBS verdünnen, zusammengeballte Viren durch akustisches Abscheiden kurz dispergieren (falls kein akustischer Abscheider vorhanden, kräftig pipettieren) und 50 ìl in alle Mulden der ELISA-Platte geben. Zur Dispergierung des Antigens Platte leicht antippen.

2. Bei 37 °C 60 Minuten auf einem Orbitalschüttler inkubieren. Platten dreimal durch Ausschwemmen der Mulden mit nicht steriler PBS waschen und auf Löschpapier abtropfen lassen.

3. 50 ìl Blocking-Puffer in jede Mulde geben. Testseren und Positivserum in die entsprechenden Mulden geben und über die Platte verteilt mit einer Mehrfach-Pipette verdünnen. Die Seren auf keinen Fall in die Blindkontrolle oder die Mab-Kontrolle geben.

4. Unmittelbar nach Zugabe der Testseren Mab im Blocking-Puffer (zu vortitrierter Verdünnung) verdünnen und 50 ìl in alle Mulden, ausgenommen der Blindkontrolle, geben.

5. Bei 37 °C 60 Minuten auf einem Orbitalschüttler inkubieren. Dreimal mit PBS waschen und abtropfen lassen.

6. Kaninchen-Antimaus-Konzentrat in Blocking-Puffer 1:5 000 verdünnen und 50 ìl in alle Mulden geben.

7. Bei 37 °C 60 Minuten auf einem Orbitalschüttler inkubieren. Dreimal mit PBS waschen und abtropfen lassen.

8. OPD auftauen und unmittelbar vor der Verwendung 12 ìl 30%iges Wasserstoffperoxid zu je 25 ml OPD geben. 50 ìl in alle Mulden geben. Farbe ungefähr 10 Minuten entwickeln lassen und Reaktion mit 1 Molar Schwefelsäure (50 ìl je Mulde) stoppen. Eine Färbung sollte sich in den Mab-Kontrollmulden und in den Mulden mit Seren ohne BTV-Antikörper entwickeln.

9. Plattenergebnisse entweder visuell oder mittels eines spektralphotometrischen Lesers prüfen und registrieren.

Ergebnisanalyse Den OD-Mittelwert, der einem Hemmungswert von 0 % entspricht, anhand der Mab-Kontrollen berechnen. Die OD-Werte der Testseren werden anhand folgender Formel in Hemmungsprozentwerten ausgedrückt:

Hemmungsprozentwert = 100 OD in Anwesenheit des Testserums OD in Abwesenheit des Testserums × 100.

Hemmungswerte von über 40 % bei einer Serumverdünnung von 1:4 gelten als positiv. Visülles Ablesen ist möglich, da eine 40%ige Hemmung der niedrigste Wert ist, der mit blossem Auge problemlos erfaßbar ist.

Zubereitung des BTV-ELISA-Antigens 1. 10 Roux konfluierende BHK-21-Zellen dreimal mit serumfreiem Zellzuechtungsmedium nach Eagle waschen und mit BTV-Serotyp 1 in vorgenanntem Medium infizieren.

2. Bei 37 °C inkubieren und täglich auf zytopathischen Effekt (cpe) prüfen.

3. Wird bei 80 bis 90 % der Zellschicht jedes Roux ein zytopathischer Effekt verzeichnet, das Virus durch Losschütteln noch befestigter Zellen vom Glas ernten.

4. Die Zellen bis zur Pelletierung bei 2 000 bis 3 000 rpm zentrifugieren.

5. Die aufschwimmende Flüssigkeit abnehmen und die Zellen in ungefähr 30 ml PBS mit 1 % "Sarkosyl" und 2 ml Phenolmethylsulphonylfluorid (Lysis-Puffer) erneut suspendieren. Eine eventuelle Gelbildung kann durch Zugabe von mehr Lysis-Puffer reduziert werden.

Anmerkung: Phenylmethylsulphonylfluorid ist schädlich - mit äusserster Vorsicht hantieren.

6. Die Zellen in 60 Sekunden mit einem Ultraschallprüfkopf bei 30 Mikron Amplitude trennen.

7. Bei 10 000 rpm 10 Minuten zentrifugieren.

8. Die aufschwimmende Flüssigkeit bei +4 °C aufbewahren und das verbleibende Zellpellet in 10 bis 20 ml Lysis-Puffer erneut suspendieren.

9. Insgesamt dreimal akustisch abscheiden und klären; dabei die aufschwimmende Flüssigkeit in jeder Phase aufbewahren.

10. Die aufschwimmenden Flüssigkeiten poolen und bei 24 000 rpm 120 Minuten bei 4 °C über einem 5-ml-Kissen aus 40 % Sukrose (w/v in PBS) unter Verwendung von 30-ml-Beckmann-Zentrifugenröhrchen und eines SW-28-Rotors zentrifugieren.

11. Die aufschwimmenden Flüssigkeiten abnehmen, die Röhrchen gründlich leeren und das Pellet durch akustische Abscheidung in PBS erneut suspendieren. Das Antigen in Aliquoten bei 70 °C aufbewahren.

Titrierung des BTV-ELISA-Antigens Das BTV-ELISA-Antigen wird anhand des indirekten ELISA titriert. Zweifache Antigenverdünnungen werden gegenüber einer konstanten Verdünnung (1:50) des monoklonalen Antikörpers 3-17-A3 titriert. Das Protokoll ist wie folgt:

Verfahrensweise:

1. BTV-Antigen in PBS über die Mikrotiterplatte verteilt in Zweifach-Verdünnungsreihen mit einer Mehrfach-Pipette verdünnen (50 ìl/Mulde).

2. Eine Stunde bei 37 °C auf einem Orbitalschüttler inkubieren.

3. Platten dreimal mit PBS waschen.

4. 50 ìl monoklonalen Antikörper 3-17-A3 (verdünnt 1:50) in jede Mulde der Mikroleiterplatte geben.

5. Eine Stunde bei 37 °C auf einem Orbitalschüttler inkubieren.

6. Platten dreimal mit PBS waschen.

7. 50 ìl Kaninchen-Antimaus-Globulin, zu Meerrettichperoxidase konjugiert und zu einer vortitrierten optimalen Konzentration verdünnt, in jede Mulde der Mikrotiterplatte geben.

8. Eine Stunde bei 37 °C auf einem Orbitalschüttler inkubieren.

9. Substrat und Chromogen wie vorstehend beschrieben zugeben. Die Reaktion nach 10 Minuten durch Zugabe von 1 Molar Schwefelsäure (50 ìl/Mulde) stoppen.

Beim kompetitiven ELISA muß der monoklonale Antikörper überschüssig sein. Demnach wird eine Antigenverdünnung gewählt, die auf die Titrationskurve fällt, die nach 10 Minuten ungefähr 0,8 OD ergibt.