ENTSCHEIDUNG DER KOMMISSION vom 19. November 1992 über die Probenahmepläne und Diagnoseverfahren zur Erkennung und zum Nachweis bestimmter Fischseuchen (92/532/EWG)

DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN -

gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft,

gestützt auf die Richtlinie 91/67/EWG des Rates vom 28. Januar 1991 betreffend die tierseuchenrechtlichen Vorschriften für die Vermarktung von Tieren und anderen Erzeugnissen der Aquakultur (1), insbesondere auf Artikel 15,

in Erwägung nachstehender Gründe:

Gemäß Artikel 15 der genannten Richtlinie sind Probenahmepläne und Diagnoseverfahren zur Erkennung und zum Nachweis von in Aquakulturanlagen vorkommenden Fischseuchen festzulegen.

Der Wissenschaftliche Veterinärausschuß, der durch die Entscheidung 81/651/EWG der Kommission (2) eingesetzt wurde, ist zu Rate gezogen worden.

Die in dieser Entscheidung vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des Ständigen Veterinärausschusses -

HAT FOLGENDE ENTSCHEIDUNG ERLASSEN:

Artikel 1

Die Probenahmepläne und Diagnoseverfahren zur Erkennung und zum Nachweis der infektiösen hämatopötischen Nekrose (IHN) und der viralen hämorrhagischen Septikämie (VHS) sind im Anhang festgelegt.

Artikel 2

Diese Entscheidung ist an alle Mitgliedstaaten gerichtet. Brüssel, den 19. November 1992 Für die Kommission

Ray MAC SHARRY

Mitglied der Kommission

(1) ABl. Nr. L 46 vom 19. 2. 1991, S. 1. (2) ABl. Nr. L 233 vom 19. 8. 1981, S. 32.

ANHANG

TEIL I

PROBENAHME- UND ANALYSEVERFAHREN ZUR VHS- UND IHN-ÜBERWACHUNG I. Probenahme 1. Probenahmezeitplan

In den Zuchtbetrieben werden mindestens zweimal jährlich zwischen Oktober und Juni bzw. bei einer Wassertemperatur von unter 14 °C klinische Untersuchungen durchgeführt. Die Abstände zwischen den Untersuchungen müssen mindestens vier Monate betragen. Alle Produktionseinheiten (Teiche, Tanks, Aquarien, Netzkäfige usw.) werden auf verendete, geschwächte oder verhaltensgestörte Fische kontrolliert. Besondere Beachtung ist (nach Möglichkeit) dem Wasserabflußbereich zu widmen, in dem sich geschwächte Fische wegen der Strömung gern aufhalten.

2. Auswahl und Entnahme der Proben

Für die Untersuchungen gemäß Tabelle 1A werden Organ- und/oder Ovarliquorproben von 30 bis 150 Fischen entnommen. Bei Anwesenheit von Regenbogenforellen soll die gesamte Probe von dieser Art entnommen werden. Sind keine Regenbogenforellen vorhanden, so muß die Probe Fische aller für VHS und/oder IHN empfänglichen Arten des Betriebs enthalten (vgl. dazu Anhang A der Richtlinie 91/67/EWG mit tierseuchenrechtlichen Vorschriften für die Vermarktung von Tieren und anderen Erzeugnissen der Aquakultur). Jede Art muß in der Probe gleich stark vertreten sein. In dem ersten der Zulassung vorausgehenden Vierjahreszeitraum beträgt der Probenumfang 150 Stück, so daß ein Virusträgernachweis bei einer Sicherheitsschwelle von 95 % und einer Virusträgerprävalenzrate von 2 % gewährleistet ist. In den darauffolgenden Jahren (Aufrechterhaltung der Zulassung) kann der Probenumfang auf 30 Stück gesenkt werden, so daß ein Nachweis bei einer Sicherheitsschwelle von 95 % und einer Prävalenzrate von 10 % gegeben ist (Tabelle 1B).

In Betrieben, die seit längerem nachweislich (aufgrund regelmässiger amtlicher Untersuchungen) frei von VHS und IHN sind, kann bereits im ersten Vierjahreszeitraum anhand des kleinen Probenumfangs gearbeitet werden.

Wird mehr als eine Wasserquelle zur Fischproduktion verwendet, so darf die Probe aus 150 bzw. 30 Fischen alle Wasserquellen berücksichtigen. Bei der Probenahme sind bevorzugt geschwächte, verhaltensgestörte oder gerade verendete Fische (ohne Anzeichen der Zersetzung) zu berücksichtigen. Fehlen solche Fische, so muß sich die Probe aus normal erscheinenden, gesunden Fischen aller Teile des Betriebs sowie aller Jahresklassen zusammensetzen.

3. Vorbereitung und Versand der Fischproben

Vor dem Verschiffen oder dem Versand an das Labor werden dem Fisch Teile der zu untersuchenden Organe mit einer sterilen Schere und einer sterilen Pinzette entnommen und in Probenröhrchen aus Kunststoff übergeführt, die mit Trägerfluessigkeit aus Zellkultur-Nährboden, 10 % Kälberserum und Antibiotika beschickt wurden. Empfehlenswert ist ein Gemisch aus 200 I.E. Penicillin, 200 mg Streptomycin und 200 mg Kanamycin je ml; auch andere erprobte Antibiotika können verwendet werden. Zu untersuchende Organe sind Milz, Vorderniere, Encephalon und in manchen Fällen auch Ovarliquor (Tabellen 1A und 1B).

Organteile von 5 und 10 Fischen (Tabellen 1A und 1B) können in ein einziges Probenröhrchen verbracht und zu einer Sammelprobe vereint werden. Jede Gewebsprobeneinwaage soll mindestens 1 g wiegen, so daß sich eine Endverdünnung von 1: 10 ergibt.

Die Probenröhrchen sind in wärmegedämmte Behälter (z. B. dickwandige Polyesterkisten) zu verpacken, die mit genügend Eis oder Eisblöcken beschickt wurden, damit gewährleistet ist, daß die Proben beim Transport bis zum Labor auf einer Temperatur von 0 bis 5 °C gehalten werden. Ein Anfrieren ist zu vermeiden.

Mit der virologischen Untersuchung ist so schnell wie möglich zu beginnen, spätestens 48 Stunden nach der Probenahme. Ist der zu untersuchende Fisch weniger als 6 cm lang, so ist er unzerteilt in Plastikbeutel zu verpacken und, wie vorstehend beschrieben, gekühlt in das Labor zu verbringen.

4. Entnahme von zusätzlichem Probenmaterial

Entsprechend der Vereinbarung mit dem betreffenden Untersuchungslaboratorium kann weiteres Gewebsmaterial entnommen und für Zusatzuntersuchungen vorbereitet werden.

II. Vorbereitung der Proben für die virologische Untersuchung

1. Homogenisieren der Organe

Im Labor wird die Gewebsprobe (mit einem Mixer oder Mörser) zu einem feinen Brei homogenisiert. Das Homogenat wird dann mit der Originalträgerfluessigkeit aufgeschwemmt. Besteht die Probe aus unzerteiltem Fisch von weniger als 6 cm Länge, wird dieser mit Hilfe einer sterilen Schere und nach Entfernen des hinter der Darmöffnung liegenden Körperteils zerlegt, wie vorstehend beschrieben homogenisiert und mit der Trägerfluessigkeit im Verhältnis 1: 10 aufgeschwemmt.

2. Abschleudern des Homogenats

Das Homogenat wird in einer auf 2 bis 5 °C gekühlten Zentrifuge bei 2 000 bis 4 000 g 15 Minuten lang abgeschleudert und der Überstand zu Untersuchungszwecken abgegossen.

Wurde die Probe in einer Trägerfluessigkeit verschifft (z. B. mit Antibiotika versetzt), muß der Überstand nicht eigens mit Antibiotika versetzt werden.

Wurde die Probe in Form von unzerteiltem Fisch verschifft, muß das abgeschleuderte Homogenat mindestens vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C mit der antibiotikahaltigen Trägerfluessigkeit behandelt werden.

Die Behandlung mit Antibiotika soll die bakterielle Infektion der Proben verhindern, so daß sich ein Filtrieren über Membranfilter erübrigt.

Sofort nach dem Abschleudern wird ein Überstandvolumen mit gleichen Teilen eines bivalenten IPNV-Antiserums (Stämme Sp und Ab) in einer angemessenen Verdünnungsstufe versetzt und das Gemisch mindestens eine Stunde bei 15 °C oder höchstens 18 Stunden bei 4 °C bebrütet. Bei einem 50%igen Plaque-Neutralisationstest muß der Antiserumtiter mindestens 1: 2 000 betragen.

Das Beimpfen aller Testsysteme mit IPNV-Antiserum (Durchseuchungsgrad der Proben bei europäischem Fisch manchmal 50 %) dient der Vorbeugung gegen einen durch das INP-Virus hervorgerufenen zytopathischen Effekt (CPE) bei den beimpften Zellkulturen. Dadurch verringert sich die Dauer der virologischen Untersuchung sowie die Zahl der Fälle, in denen ein zytopathischer Effekt als Indiz für VHS oder IHN gewertet werden kann.

Stammen die Proben von Produktionseinheiten, die als amtlich IPN-frei gelten, so kann auf die Beimpfung der Testsysteme mit IPN-Virus-Antiserum verzichtet werden.

III. Virologische Untersuchung

1. Zellkulturen und Nährböden

Zellen von BF-2 und entweder EPC oder FHM werden mit 10%igem Rinderfötenserum und Antibiotika in Standardkonzentration in einem Zellzuechtungsmedium nach Eagle (Eagle's minimum essential medium) oder einem abgewandelten Medium bei einer Temperatur von 20 bis 25 °C angezogen.

Werden die Zellen in verschlossenen Ampullen angesetzt, so ist der Nährboden mit Bicarbonat abzupuffern. Werden die Zellkulturen in offenen Gefässen angesetzt, so ist mit Tri-HCl (23 mmol) und Natriumbicarbonat (6 mmol) auf einen für die Viruszucht optimalen pH-Wert von möglichst genau 7,6 abzupuffern.

Die mit Gewebsmaterial zu verimpfenden Zellkulturen sind frisch anzusetzen (höchstens 48 Stunden im voraus) und müssen selbsttätig (nicht konfluent) wachsen.

2. Beimpfen der Zellkulturen

Von der mit Antibiotika behandelten Organsuspension werden zwei Verdünnungsstufen in die Zellkulturen verimpft, nämlich die Ausgangsverdünnung sowie die Verdünnungsstufe 1: 100 (damit es nicht zu homologer Interferenz kommt). Es sind mindestens zwei Zellinien zu verimpfen (vgl. III.1). Das Volumenverhältnis zwischen Impfgut und Zellkultur-Nährboden muß 1: 10 betragen.

Mit jeder Verdünnung und jeder Zellinie ist eine Zellkulturfläche von mindestens 2 cm2 zu beimpfen; dies entspricht einer Mulde eines 24-Mulden-Testtabletts. Die Verwendung von Zellkultur-Testtabletts ist ratsam, jedoch können auch andere ähnlich oder grösser dimensionierte Vorrichtungen verwendet werden.

3. Bebrüten der Zellkulturen

Die beimpften Zellkulturen werden sieben Tage bei 15 °C bebrütet. Bei einem Farbumschlag des Zellkulturnährbodens von Rot nach Gelb als Indiz für eine Übersauerung ist der pH-Wert mit steriler Bicarbonatlösung (z. B. 7,5%ige Lösung) so einzustellen, daß eine Virusinfektion der Zellen möglich ist.

Alle sechs Monate erfolgt eine Titration mit tiefgefrorener VHSV- und IHNV-Vorratslösung zur Überprüfung der Infektionsanfälligkeit der Zellkulturen.

4. Mikroskopuntersuchung

Die bebrüteten Zellkulturen werden unter dem Mikroskop mit 40facher Vergrösserung täglich auf das Auftreten eines zytopathischen Effekts (CPE) untersucht. Bei offenkundigem Auftreten eines zytopathischen Effekts ist sofort ein qualitativer Virusnachweis gemäß Abschnitt IV durchzuführen.

Gleichzeitig sind geeignete Maßnahmen für den Entzug der Zulassung der Produktionseinheit, von der die viruspositive Probe stammt, sowie der Zulassung der ihr nachgelagerten Produktionseinheiten zu treffen.

Der Entzug der Zulassung ist so lange aufrechtzuerhalten, bis die Laboruntersuchung erwiesen hat, daß es sich bei dem betreffenden Virus nicht um VHS- oder IHN-Erreger handelt. Für den qualitativen Nachweis des Virus wird eine Frist von vier Wochen eingeräumt, die auch die Zeit für Paralleluntersuchungen in Referenzlaboratorien einschließt.

5. Abimpfen der Stammkultur

Tritt nach siebentägigem Bebrüten kein zytopathischer Effekt auf, so ist die Stammkultur auf frische Zellkulturen abzuimpfen, wobei die gleiche Zellfläche zu verwenden ist wie bei der Stammkultur.

Aliquote Mengen Nährboden von sämtlichen Ansätzen/Mulden der Stammkultur werden nach Zellinien und nach einmaligem Einfrieren und Wiederauftauen zu einer Sammelprobe vereint; 0,5 ml Nährboden werden mit gleichen Teilen IPN-Antiserum gemäß Abschnitt II.2 versetzt und 60 Minuten bei 15 °C bebrütet. Das Gemisch wird dann in Verdünnungsstufen 1: 1 und 1: 100 gemäß Abschnitt III.2 in homologe Zellkulturen übergeimpft. Vor dem Abimpfen können alle Lösungen mit bivalentem IPN-Antiserum einer angemessenen Verdünnungsstufe bebrütet werden.

Die abgeimpften Kulturen werden dann sieben Tage bei 15 °C bebrütet und gemäß Abschnitt III.4 untersucht.

IV. Qualitativer Virusnachweis

1. Neutralisation

Bei offenkundigem Auftreten eines zytopathischen Effekts in einer Zellkultur wird der Nährboden aufgefangen, und die Zellen werden bei niedriger Drehzahl abgeschleudert oder über ein Membranfilter (0,45 mm) separiert; anschließend wird der Nährboden mit Zellnährboden in einer Verdünnungsstufe von 1: 100 und 1: 10 000 verdünnt.

Aliquote Mengen der Verdünnungen werden jeweils mit gleichen Teilen der folgenden Reagenzien versetzt und 60 Minuten bei 15 °C bebrütet:

- spezifische VHS-Virus-Antikörper (Egtved-Virus; virale hämorrhagische Septikämie) 1: 50 * - spezifische IHN-Virus-Antikörper (infektiöse hämatopötische Nekrose) 1: 50 * - bivalentes IPN-Virus-Antiserum (infektiöse pankreatische Nekrose; Stämme Sp und Ab) 1: 50 * - Nährboden 1: 1

* oder wie vom Referenzlabor aufgrund der möglichen Zytotoxizität der Antisera spezifiziert.

Die Reagenzien müssen hinsichtlich Titer und Spezifität von Bezugsqualität sein.

Von jedem Virus-Serum-Gemisch werden jeweils 50 ml in mindestens zwei Zellkulturen übergeimpft und dann bei 15 °C bebrütet. Untersuchung auf CPE wie in Abschnitt III.4 beschrieben.

Ist eine zuverlässige Virusbestimmung mit dieser Untersuchung nicht möglich, so ist binnen einer Woche eine der folgenden Maßnahmen zu treffen:

a) Einsendung des Virus an ein einzelstaatliches oder gemeinschaftliches Fischvirus-Referenzlabor zur sofortigen Untersuchung;

b) Durchführung des IFAT- (Abschnitt IV.2), des ELISA- (Abschnitt IV.3) oder eines anderen Virustest unter Verwendung von Reagenzien einer Bezugsqualität.

2. Immunfluoreszenztest (IFAT)

Für jedes zu bestimmende Virusisolat sind acht Objektträger oder ein Vielfaches davon mit EPC-Zellen zu beschicken, wobei die Impfdichte so zu wählen ist, daß sich nach 24stuendigem Bebrüten eine Konfluenz von 60 bis 90 % einstellt. EPC-Zellen eignen sich aufgrund ihres besonders guten Haftungsvermögens auf Glasflächen dazu besonders gut.

Sobald sich auf der Glasfläche ein Zellsediment gebildet hat (etwa eine Stunde nach dem Verimpfen) oder nach 24stuendigem Bebrüten der Kulturen wird das zu bestimmende Virus verimpft. Es werden vier Kulturen in einem Raumverhältnis von 1: 10 und vier weitere Kulturen in einem Raumverhältnis von 1: 100 verimpft.

20 bis 30 Stunden nach dem Verimpfen werden die Kulturen mit Eagle's Zellzuechtungsmedium ohne Serum gespült, mit Aceton fixiert und mit einem Zweischichten-IFAT-Testmedium angefärbt. Die erste Reagenzschicht besteht aus einem zugelassenen Antiserum (vgl. Abschnitt IV.1) in empfohlener Verdünnung. Die zweite Reagenzschicht besteht aus einem FITC-konjugierten Antiserum für das in der ersten Schicht verwendete Immunglobulin, ebenfalls in empfohlener Verdünnung. Für jedes der getesteten Antisera ist mindestens eine hochdosierte und eine niedrigdosierte Impfkultur anzufärben. Bei der Untersuchung sind auch geeignete Negativ- und Positivkontrollen durchzuführen.

Angefärbte Kulturen werden mit Glycerol-Kochsalzlösung angesetzt und im Ultraviolett analysiert. Dazu sind Okulare mit 10- oder 12facher Vergrösserung und Objektivlinsen mit 25- bis 40facher Vergrösserung und numerischen Blenden von > 0,7 bzw. > 1,3 zu verwenden. Die Verdünnungsstufen des Primärantiserums und des FITC-konjugierten Antikörper-Immunglobulin hängen von dem gewählten bzw. verfügbaren Mikroskop ab.

Im Vergleich zu dem Stamm F1 beim IFAT zeigen einige Stämme des Egtved-Virus eine starke Reaktion auf das Antiserum, jedoch nicht beim Neutralisationstest.

3. Enzymatischer Immunsorptionstest (ELISA)

Die einzelnen Mulden der Mikrotiterplatten (z. B. Nunc-Immuntestplatten, Maxisorp, Nunc, Dänemark) werden am Vortag der Untersuchung mit den Protein-A-freien Immunglobulin-Fraktionen der Antisera in der empfohlenen Verdünnung nach Abschnitt IV.1 beschickt.

Die Mulden werden nach dem Spülen mit PBS-Tween-20-Pufferlösung mit dem zu bestimmenden Virus in zwei- oder vierfacher Verdünnung beschickt und 60 Minuten bei 37 °C einer Antikörperreaktion ausgesetzt. Nach dem Spülen mit PBS-Tween-20-Pufferlösung werden biotinierte Antikörper einer dem Antikörperfilm entsprechenden Spezifität zugesetzt und 60 Minuten einer Reaktion bei 20 °C ausgesetzt. Nach nochmaligem Spülen wie vorstehend beschrieben wird HRP-konjugiertes Streptavidin zugegeben und eine Stunde einer Reaktion bei 20 °C ausgesetzt. Nach dem letzten Spülen wird das gebundene Enzym mit Hilfe von H2O2-OPD oder einem für das ELISA-Standardverfahren geeigneten Substrat entwickelt.

Das vorstehend beschriebene ELISA-Verfahren auf Biotin-Avidin-Basis ist nur ein Beispiel. Statt dessen können auch andere erprobte Varianten des ELISA-Tests verwendet werden.

Tabelle 1A

Erstzulassung

Anzahl klinischer Untersuchungen pro Jahr Anzahl Fische für Organproben Anzahl Fische für Ovarliquor- proben Inlandsgebiete a) Betriebe mit Fischbrutaufzucht 2 120 (1. Serie)

150 (2. Serie) 30 (1. Serie)

0 b) Reine Fischbrutaufzuchtbetriebe 2 0 150 (1. oder 2. Serie) c) Betriebe ohne Fischbrutaufzucht 2 150 (1. und 2. Serie) 0 Küstengebiete a) Betriebe ohne Fischbrutaufzucht 2 30 (1. und 2. Serie) 0 b) Betriebe mit Fischbrutaufzucht 2 120 (1. Serie)

150 (2. Serie) 30 (1. Serie)

0

Maximaler Probenumfang je Becken: 5 Fische.

Tabelle 1B

Beibehaltung der Zulassung

Anzahl klinischer Untersuchungen pro Jahr Anzahl Fische für Organproben Anzahl Fische für Ovarliquor- proben Inlandsgebiete a) Betriebe mit Fischbrutaufzucht 1 15 (1. oder 2. Serie) 15 (1. oder 2. Serie) b) Reine Fischbrutaufzuchtbetriebe 2 0 30 (1. oder 2. Serie) c) Betriebe ohne Fischbrutaufzucht 2 30 (1. oder 2. Serie) 0 Küstengebiete a) Betriebe ohne Fischbrutaufzucht 1 30 (1) (1. oder 2. Serie) 0 b) Betriebe mit Fischbrutaufzucht 2 0 30 (1. oder 2. Serie)

Maximaler Probenumfang je Becken: 10 Fische.

(1) Die Probenahme erfolgt zwei bis sechs Monate nach dem Umsetzen aus Süßwasser in Salzwasser.

TEIL II

IHN- UND VHS-BESTÄTIGUNGSVERFAHREN BEI SEUCHENVERDACHT

Zur IHN- und VHS-Diagnose können folgende Verfahren verwendet werden:

- A. Herkömmliche Virusisolation mit anschließendem serologischen Virusnachweis,

- B. Virusisolation mit gleichzeitigem serologischen Virusnachweis,

- C. Schnellnachweisverfahren (IFAT, ELISA).

Die Erstdiagnose von IHS und VHS in Betrieben in zugelassenen Gebieten darf sich nicht nur auf Verfahren C stützen. Die Verfahren A oder B sind ebenfalls anzuwenden.

Dem zur virologischen Untersuchung bestimmten Gewebsmaterial ist in manchen Fällen auch zusätzliches Material für die bakteriologische, parasitologische, histologische oder sonstige Untersuchung beizufügen, damit eine Differentialdiagnose durchgeführt werden kann. Solches Material ist nach einem OIE-Verfahren zu entnehmen. A. Herkömmliche Virusisolation mit anschließendem serologischem Nachweis

A.I.1. Probenahme Zur Untersuchung sind mindestens 10 Fische mit typischen IHN- bzw. VHS-Symptomen zu entnehmen. A.I.2. Vorbereitung und Verschiffung der Fischproben Vor dem Verschiffen oder dem Versand an das Labor werden dem Fisch Teile der zu untersuchenden Organe mit einer sterilen Schere und einer sterilen Pinzette entnommen und in Probenröhrchen aus Kunststoff übergeführt, die mit Trägerfluessigkeit aus Zellkultur-Nährboden, 10 % Kälberserum und Antibiotika beschickt wurden. Empfehlenswert ist ein Gemisch aus 200 I. E. Penicillin, 200 mg Streptomycin und 200 mg Kanamycin je ml; auch andere erprobte Antibiotika können verwendet werden. Zu untersuchende Organe sind Milz, Vorderniere, Encephalon und in manchen Fällen auch Ovarliquor. Organteile von 5 bis 10 Fischen können in ein einziges Probenröhrchen verbracht und zu einer Sammelprobe vereint werden. Jede Gewebsprobeneinwaage soll mindestens 1 g wiegen, so daß sich eine Endverdünnung von etwa 1: 10 ergibt. Die Probenröhrchen sind in wärmegedämmte Behälter (z. B. dickwandige Polyesterkisten) zu verpacken, die mit genügend Eis oder Eisblöcken beschickt wurden, damit gewährleistet ist, daß die Proben beim Transport bis zum Labor auf einer Temperatur von 0 bis 5 °C gehalten werden. Ein Anfrieren ist zu vermeiden. Mit der virologischen Untersuchung ist so schnell wie möglich zu beginnen, spätestens 48 Stunden nach der Probenahme. Ist der zu untersuchende Fisch weniger als 6 cm lang, so ist er unzerteilt in Plastikbeutel zu verpacken und, wie vorstehend beschrieben, gekühlt in das Labor zu verbringen. A.I.3. Entnahme von zusätzlichem Probenmaterial Entsprechend der Vereinbarung mit dem betreffenden Nachweislaboratorium kann zusätzliches Gewebsmaterial entnommen und für Zusatzuntersuchungen vorbereitet werden. A.II.1. Homogenisieren der Organe Im Labor wird die Gewebsprobe (mit einem Mixer oder Mörser) zu einem feinen Brei homogenisiert. Das Homogenat wird dann mit der Originalträgerfluessigkeit aufgeschwemmt. Besteht die Probe aus unzerteiltem Fisch von weniger als 6 cm Länge, wird dieser mit Hilfe einer sterilen Schere und nach Entfernen des hinter der Darmöffnung liegenden Körperteils zerlegt, wie vorstehend beschrieben homogenisiert und mit der Trägerfluessigkeit im Verhältnis 1: 10 aufgeschwemmt. A.II.2. Abschleudern des Homogenats Das Homogenat wird in einer auf 2 bis 5 °C gekühlten Zentrifuge bei 2 000 bis 4 000 g 15 Minuten lang abgeschleudert und der Überstand zu Untersuchungszwecken abgegossen. Wurde die Probe in einer Trägerfluessigkeit verschifft (z. B. mit Antibiotika versetzt), muß der Überstand nicht eigens mit Antibiotika versetzt werden. Wurde die Probe in Form von unzerteiltem Fisch verschifft, muß das abgeschleuderte Homogenat mindestens vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C mit der antibiotikahaltigen Trägerfluessigkeit behandelt werden. Die Behandlung mit Antibiotika soll die bakterielle Infektion der Proben verhindern, so daß sich ein Filtrieren über Membranfilter erübrigt. Sofort nach dem Abschleudern wird ein Überstandvolumen mit gleichen Teilen eines bivalenten IPNV-Antiserums (Stämme Sp und Ab) in einer angemessenen Verdünnungsstufe versetzt und das Gemisch mindestens eine Stunde bei 15 °C oder höchstens 18 Stunden bei 4 °C bebrütet. Bei einem 50%igen Plaque-Neutralisationstest muß der Antiserumtiter mindestens 1: 2 000 betragen. Das Beimpfen aller Testsysteme mit IPNV-Antiserum (Durchseuchungsgrad der Proben bei europäischem Fisch manchmal 50 %) dient der Vorbeugung gegen einen durch das INP-Virus hervorgerufenen zytopathischen Effekt (CPE) bei den beimpften Zellkulturen. Dadurch verringert sich die Dauer der virologischen Untersuchung sowie die Zahl der Fälle, in denen ein zytopathischer Effekt als Indiz für VHS oder IHN gewertet werden kann. Stammen die Proben von Produktionseinheiten, die als amtlich IPN-frei gelten, so kann auf die Beimpfung der Testsysteme mit IPN-Virus-Antiserum verzichtet werden. A.III.1. Zellkulturen und Nährböden Zellen von BF-2 und entweder EPC oder FHM werden mit 10%igem Rinderfötenserum und Antibiotika in Standardkonzentration in einem Zellzuechtungsmedium nach Eagle (Eagle's minimum essential medium) oder einem abgewandelten Medium bei einer Temperatur von 20 bis 25 °C angezogen. Werden die Zellen in verschlossenen Ampullen angesetzt, so ist der Nährboden mit Bicarbonat abzupuffern. Werden die Zellkulturen in offenen Gefässen angesetzt, so ist mit Tri-HCl (23 mmol) und Natriumbicarbonat (6 mmol) auf einen für die Virusanzucht optimalen pH-Wert von möglichst genau 7,6 abzupuffern. Die mit Gewebsmaterial zu verimpfenden Zellkulturen sind frisch anzusetzen (höchstens 48 Stunden im voraus) und müssen selbsttätig (nicht konfluent) wachsen. A.III.2. Beimpfen der Zellkulturen Von der mit Antibiotika behandelten Organsuspension werden zwei Verdünnungsstufen in die Zellkulturen verimpft, nämlich die Ausgangsverdünnung und die Verdünnungsstufe 1: 100 (damit es nicht zu homologer Interferenz kommt). Es sind mindestens zwei Zellinien zu verimpfen (vgl. A.III.1). Das Volumenverhältnis zwischen Impfgut und Zellkultur-Nährboden muß 1: 10 betragen. Mit jeder Verdünnung und jeder Zellinie ist eine Zellkulturfläche von mindestens 2 cm2 zu beimpfen; dies entspricht einer Mulde eines 24-Mulden-Testtabletts. Die Verwendung von Zellkultur-Testtabletts ist ratsam, jedoch können auch andere ähnlich oder grösser dimensionierte Vorrichtungen verwendet werden.

A.III.3. Bebrüten der Zellkulturen Die beimpften Zellkulturen werden sieben Tage bei 15 °C bebrütet. Bei einem Farbumschlag des Zellkulturnährbodens von Rot nach Gelb als Indiz für eine Übersauerung ist der pH-Wert mit steriler Bicarbonatlösung (z. B. 7,5%ige Lösung) so einzustellen, daß eine Virusinfektion der Zellen möglich ist. Alle sechs Monate erfolgt eine Titration mit tiefgefrorener VHSV- und IHNV-Vorratslösung zur Überprüfung der Infektionsanfälligkeit der Zellkulturen. A.III.4. Mikroskopuntersuchung Die bebrüteten Zellkulturen werden unter dem Mikroskop mit 40facher Vergrösserung täglich auf das Auftreten eines zytopathischen Effekts (CPE) untersucht. Bei offenkundigem Auftreten eines zytopathischen Effekts ist sofort ein qualitativer Virusnachweis gemäß Abschnitt A.IV durchzuführen. Gleichzeitig sind geeignete Maßnahmen für den Entzug der Zulassung der Produktionseinheit, von der die viruspositive Probe stammt, sowie der Zulassung der ihr nachgelagerten Produktionseinheiten zu treffen. Der Entzug der Zulassung ist so lange aufrechtzuerhalten, bis die Laboruntersuchung erwiesen hat, daß es sich bei dem betreffenden Virus nicht um VHS- oder IHN-Erreger handelt. Für den qualitativen Nachweis des Virus wird eine Frist von vier Wochen eingeräumt, die auch die Zeit für Paralleluntersuchungen in Referenzlaboratorien einschließt. A.III.5. Abimpfen der Stammkultur Tritt nach siebentägigem Bebrüten kein zytopathischer Effekt auf, so ist die Stammkultur auf frische Zellkulturen abzuimpfen, wobei die gleiche Zellfläche zu verwenden ist wie bei der Stammkultur. Aliquote Mengen Nährboden von sämtlichen Ansätzen/Mulden der Stammkultur werden nach Zellinien und nach einmaligem Einfrieren und Wiederauftauen zu einer Sammelprobe vereint; 0,5 ml Nährboden werden mit gleichen Teilen IPN-Antiserum gemäß Abschnitt A.II.2 versetzt und 60 Minuten bei 15 °C bebrütet. Das Gemisch wird dann in Verdünnungsstufen 1: 1 und 1: 100 gemäß Abschnitt A.III.2 in Zellkulturen übergeimpft. Vor dem Abimpfen können alle Lösungen mit bivalentem IPN-Antiserum einer angemessenen Verdünnungsstufe bebrütet werden. Die abgeimpften Kulturen werden dann sieben Tage bei 15 °C bebrütet und gemäß Abschnitt A.III.4 untersucht. A.IV.1. Neutralisierung Bei offenkundigem Auftreten eines zytopathischen Effekts in einer Zellkultur wird der Nährboden aufgefangen, und die Zellen werden bei niedriger Drehzahl abgeschleudert oder über ein Membranfilter (0,45 mm) separiert; anschließend wird der Nährboden mit Zellnährboden in einer Verdünnungsstufe von 1: 100 und 1: 10 000 verdünnt. Aliquote Mengen der Verdünnungen werden jeweils mit gleichen Teilen der folgenden Reagenzien versetzt und 60 Minuten bei 15 °C bebrütet: - spezifische VHS-Virus-Antikörper (Egtved-Virus; virale hämorrhagische Septikämie) 1: 50 * - spezifische IHN-Virus-Antikörper (infektiöse hämatopötische Nekrose) 1: 50 * - bivalentes IPN-Virus-Antiserum (infektiöse pankreatische Nekrose; Stämme Sp und Ab) 1: 50 * - Nährboden 1: 1 (*) oder wie vom Referenzlabor aufgrund der möglichen Zytotoxizität der Antisera spezifiziert. Die Reagenzien müssen hinsichtlich Titer und Spezifität von Bezugsqualität sein. Von jedem Virus-Serum-Gemisch werden jeweils 50 ml in mindestens zwei Zellkulturen übergeimpft und dann bei 15 °C bebrütet. Untersuchung auf CPE wie in Abschnitt A.III.4 beschrieben. Ist eine zuverlässige Virusbestimmung mit dieser Untersuchung nicht möglich, so ist binnen einer Woche eine der folgenden Maßnahmen zu treffen: a) Einsendung des Virus an ein einzelstaatliches oder gemeinschaftliches Fischvirus-Referenzlabor zur sofortigen Untersuchung, b) Durchführung des IFAT- (Abschnitt A.IV.2), des ELISA- (Abschnitt A.IV.3) oder eines anderen Virustests unter Verwendung von Reagenzien einer Bezugsqualität. A.IV.2. Immunfluoreszenztest (IFAT) Für jedes zu bestimmende Virusisolat sind acht Objektträger oder ein Vielfaches davon mit EPC-Zellen zu beschicken, wobei die Impfdichte so zu wählen ist, daß sich nach 24stuendigem Bebrüten eine Konfluenz von 60 bis 90 % einstellt. EPC-Zellen eignen sich aufgrund ihres besonders guten Haftungsvermögens auf Glasflächen besonders zu diesem Zweck. Sobald sich auf der Glasfläche ein Zellsediment gebildet hat (etwa eine Stunde nach dem Verimpfen) oder nach 24stuendigem Bebrüten der Kulturen wird das zu bestimmende Virus verimpft. Es werden vier Kulturen in einem Raumverhältnis von 1: 10 und vier weitere Kulturen in einem Raumverhältnis von 1: 100 verimpft. 20 bis 30 Stunden nach dem Verimpfen werden die Kulturen mit Eagle's Zellzuechtungsmedium ohne Serum gespült, mit Aceton fixiert und mit einem Zweischichten-IFAT-Testmedium angefärbt. Die erste Reagenzschicht besteht aus einem zugelassenen Antiserum (vgl. Abschnitt IV.1) in empfohlener Verdünnung. Die zweite Reagenzschicht besteht aus einem FITC-konjugierten Antiserum für das in der ersten Schicht verwendete Immunglobulin, ebenfalls in empfohlener Verdünnung. Für jedes der getesteten Antisera ist mindestens eine hochdosierte und eine niedrigdosierte Impfkultur anzufärben. Bei der Untersuchung sind auch geeignete Negativ- und Positivkontrollen durchzuführen. Angefärbte Kulturen werden mit Glycerol-Kochsalzlösung angesetzt und im Ultraviolett analysiert. Dazu sind Okulare mit 10- oder 12facher Vergrösserung und Objektivlinsen mit 25- bis 40facher Vergrösserung und numerischen Blenden von > 0,7 bzw. > 1,3 zu verwenden. Die Verdünnungsstufen des Primärantiserums und des FITC-konjugierten Antikörper-Immunglobulins hängen von dem gewählten bzw. verfügbaren Mikroskop ab. Im Vergleich zu dem Stamm F 1 beim IFAT zeigen einige Stämme des Egtved-Virus eine starke Reaktion auf das Antiserum, jedoch nicht beim Neutralisationstest. A.IV.3. Enzymatischer Immunsorptionstest (ELISA) Die Mulden der Mikrotiterplatten (z. B. Nunc-Immuntestplatten, Maxisorp, Nunc, Dänemark) werden am Vortag der Untersuchung mit den Protein-A-freien Immunglobulin-Fraktionen der Antisera in der empfohlenen Verdünnung nach Abschnitt A.IV.1 beschickt. Die Mulden werden nach dem Spülen mit PBS-Tween-20-Pufferlösung mit dem zu bestimmenden Virus in zwei- oder vierfacher Verdünnung beschickt und werden 60 Minuten bei 37 °C einer Antikörperreaktion ausgesetzt. Nach dem Spülen mit PBS-Tween-20-Pufferlösung werden biotinierte Antikörper einer dem Antikörperfilm entsprechenden Spezifität zugesetzt und 60 Minuten einer Reaktion bei 20 °C ausgesetzt. Nach nochmaligem Spülen wie vorstehend beschrieben wird HRP-konjugiertes Streptavidin zugegeben und eine Stunde einer Reaktion bei 20 °C ausgesetzt. Nach dem letzten Spülen wird das gebundene Enzym mit für das ELISA-Standardverfahren geeigneten Substraten (OPD, TMB oder andere) entwickelt. Das vorstehend beschriebene ELISA-Verfahren auf Biotin-Avidin-Basis ist nur ein Beispiel. Statt dessen können auch andere erprobte Varianten des ELISA-Tests verwendet werden.

B. Virusisolation mit gleichzeitigem serologischen Virusnachweis

B.I.1. Entnahme der Proben Vgl. A.I.1. B.I.2. Vorbereitung und Versand der Fischproben Vgl. A.I.2. B.II.1. Homogenisieren der Organe Vgl. A.II.1. B.II.2. Abschleudern des Homogenats Vgl. A.II.2. B.II.3. Behandeln des Überstands mit Nachweis-Antisera Die mit Antibiotika und Anti-IPN behandelte Organsuspension wird mit Zellkulturmedium im Verhältnis von 1: 10 und 1: 10 000 verdünnt; aliquote Mengen davon werden mit gleichen Teilen der in Abschnitt A.IV.1 aufgeführten Reagenzien versetzt und 60 Minuten bei 15 °C bebrütet. B.III.1. Zellkulturen und Medien Vgl. A.III.1. B.III.2. Bebrüten der Zellkulturen Jeweils 50 ml von jedem (gemäß B.II.3 angesetztem) Virus-Serum-Gemisch werden in mindestens zwei Zellkulturen pro Zellinie verimpft. B.III.3. Bebrüten der Zellkulturen Vgl. A.III.3. B.III.4. Mikroskopuntersuchung Die bebrüteten Zellkulturen werden unter dem Mikroskop mit etwa 40facher Vergrösserung täglich auf das Auftreten eines zytopathischen Effekts untersucht. Verhindert eines der verwendeten Antisera das Auftreten eines zytopathischen Effekts, so gilt das Virus damit als nachgewiesen. Verhindert keines der verwendeten Antisera den zytopathischen Effekt, so ist der Virusnachweis mit Hilfe der Verfahren gemäß Abschnitt A.IV durchzuführen. B.III.5. Abimpfen der Stammkultur Tritt nach siebentägigem Bebrüten kein zytopathischer Effekt auf, so sind mit Überstand und Medium beimpfte Kulturen (B.II.3) abzuimpfen.

C. Schnellnachweisverfahren (IFAT, ELISA) Gemäß Abschnitt A.II.2 angesetzter Überstand wird gemäß Abschnitt A.IV.2 bzw. A.IV.3 einem IFAT- bzw. ELISA-Test unterzogen. Diese Schnellverfahren müssen durch eine virologische Untersuchung gemäß entweder Punkt A oder B innerhalb von höchstens 48 Stunden nach der Probenahme ergänzt werden, wenn

a) ein negatives Ergebnis erhalten wurde oder

b) ein positives Ergebnis mit Material erhalten wurde, das bei dem ersten Ausbruch von IHN oder VHS in zugelassenen Gebieten entnommen wurde.