VERORDNUNG (EWG) Nr. 72/77 DER KOMMISSION vom 13. Januar 1977 zur Änderung der Verordnung (EWG) Nr. 1470/68 über die Entnahme und Verkleinerung von Proben sowie über die Bestimmung des Gehalts der Ölsaaten an Öl, Fremdbestandteilen und Feuchtigkeit

DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN -

gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft,

gestützt auf die Verordnung Nr. 136/66/EWG des Rates vom 22. September 1966 über die Errichtung einer gemeinsamen Marktorganisation für Fette (1), zuletzt geändert durch die Verordnung (EWG) Nr. 1707/73 (2), insbesondere auf Artikel 26 Absatz 3,

in Erwägung nachstehender Gründe:

Um bei Raps- und Rübsensamen genau den Gehalt an Erucasäure bestimmen zu können, muß eine geeignete Methode vorgesehen werden. Zu diesem Zweck ist die Verordnung (EWG) Nr. 1470/68 der Kommission vom 23. September 1968 über die Entnahme und Verkleinerung von Proben sowie über die Bestimmung des Gehalts der Ölsaaten an Öl, Fremdbestandteilen und Feuchtigkeit (3), zuletzt geändert durch die Verordnung (EWG) Nr. 3025/75 (4), zu ändern.

Die in dieser Verordnung vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des Verwaltungsausschusses für Fette -

HAT FOLGENDE VERORDNUNG ERLASSEN:

Artikel 1

In die Verordnung (EWG) Nr. 1470/68 wird der nachstehende Artikel 2b eingefügt:

"Die Bestimmung des Gehalts an Erucasäure gemäß Artikel 4 der Verordnung Nr. 282/67/EWG erfolgt nach der in Anhang VI zu dieser Verordnung festgelegten Methode.

Als Raps- und Rübsensamen mit dem in Artikel 3 Absatz 2 erster Gedankenstrich der Verordnung Nr. 282/67/EWG genannten Hoechstgehalt an Erucasäure gelten diejenigen Raps- und Rübsensamen, deren Öl, das gemäß der in Anhang VI unter I beschriebenen Methode gewonnen wurde, höchstens 15 % Erucasäure (C22) enthält, berechnet nach der in Anhang VI unter II und III beschriebenen Methode."

Artikel 2

Die Verordnung (EWG) Nr. 1470/68 wird durch Anhang VI ergänzt, der dieser Verordnung als Anlage beigefügt ist.

Artikel 3

Diese Verordnung tritt am dritten Tag nach ihrer Veröffentlichung im Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften in Kraft.

Diese Verordnung ist in allen ihren Teilen verbindlich und gilt unmittelbar in jedem Mitgliedstaat.

Brüssel, den 13. Januar 1977

Für die Kommission

Der Vizepräsident

Finn GUNDELACH (1)ABl. Nr. 172 vom 30.9.1966, S. 3025/66. (2)ABl. Nr. L 175 vom 29.6.1973, S. 5. (3)ABl. Nr. L 239 vom 28.9.1968, S. 2. (4)ABl. Nr. L 300 vom 20.11.1975, S. 5.

ANHANG VI GEMEINSCHAFTLICHE ANALYSENMETHODE ZUR BESTIMMUNG DES ERUCASÄUREGEHALTS VON ÖLSAATEN, DIE DURCH DIE INTERVENTIONSSTELLEN ÜBERNOMMEN WURDEN

I. Vorbereitung der Probe

II. Herstellung von Fettsäuremethylestern

III. Gas-Chromatographie von Fettsäuremethylestern

I. VORBEREITUNG DER PROBE

1. Die Entnahme der Saatproben, die Verkleinerung der Kontraktproben zu Analysenproben und die Bestimmung des Ölgehalts des unveränderten Erzeugnisses werden nach den in den Anhängen I, II und V der Verordnung (EWG) Nr. 1470/68 beschriebenen Methoden durchgeführt.

2. Vorbereitung der Ölprobe, die aus Saaten extrahiert wurde, bei denen Probenahmen durchgeführt wurden. 2.1. Wenn die Probe fluessig und völlig klar ist:

vor Entnahme der zur Untersuchung kommenden Probe vorsichtshalber schütteln;

2.2. wenn die Probe fluessig, jedoch trübe ist oder einen Bodensatz aufweist:

Probe bei 50 ºC in einen Trockenschrank stellen. Hat die Probe diese Temperatur erreicht, kräftig schütteln, dann absetzen lassen.

Im Trockenschrank durch Papier filtrieren und Temperatur auf 30 ºC halten.

Das Filtrat muß klar sein;

2.3. wenn die Probe fest ist:

Probe in einen Trockenschrank stellen, dessen Temperatur 10 ºC über der Temperatur des zu erwartenden Schmelzbereichs liegt. Weiter verfahren nach 2.1 (wenn die geschmolzene Probe klar ist) bzw. nach 2.2 (wenn die geschmolzene Probe trübe ist oder einen Bodensatz enthält).

II. HERSTELLUNG VON FETTSÄUREMETHYLESTERN

1. EINLEITUNG

Die nachstehend beschriebenen Methoden bezwecken die Umwandlung von Fetten tierischen und pflanzlichen Ursprungs sowie von Fettsäuren beliebiger Herkunft in Methylester von Fettsäuren.

Die so gewonnenen Methylester können für verschiedene Verfahren, die eine solche Umwandlung erfordern, verwendet werden, wie z.B. Gas-Chromatographie, Dünnschicht-Chromatographie, Infrarot-Spektrographie usw.

2. ANWENDUNGSBEREICH

Die beschriebenen Methoden gelten für Fette tierischen und pflanzlichen Ursprungs.

Die unter 3 beschriebenen Methoden gelten für die Herstellung von Methylestern von Fettsäuren mit 6 oder mehr Kohlenstoffatomen. In Gegenwart von C6- und C8-Fettsäuren sowie bei der Herstellung von Estern für die Gas-Chromatographie darf das Lösungsmittel nicht aus der Lösung der Methylester entfernt werden.

Die allgemeine Methode nach 3.1 kann in folgenden Fällen zu falschen Ergebnissen führen: - bei Verbindungen mit sekundären sauerstoffhaltigen Gruppen (Hydroxy-, Hydroperoxy-, Keto-, Epoxy-),

- bei Verbindungen mit Cyclopropan- und Cyclopropengruppen,

- bei mehrfach ungesättigten konjugierten Verbindungen sowie bei Acetylenverbindungen,

- bei Wachsen,

so daß bei diesen besser eine der unter 3.2 beschriebenen Methoden angewandt wird. Fette, die solche funktionelle Gruppen nur in sehr geringem Umfang enthalten (z.B. Baumwollsaatöl), können jedoch nach 1 analysiert werden.

Phospholipide können nach Verseifung und Veresterung der Fettsäuren analysiert werden.

Das Unverseifbare wird nicht abgetrennt und kann, wenn es in grösserer Menge vorhanden ist, bei späteren Analysen stören (Anmerkung 1).

3. METHODEN ZUR HERSTELLUNG VON METHYLESTERN VON FETTSÄUREN MIT 6 UND MEHR KOHLENSTOFFATOMEN

Unter 3.1 wird eine allgemeine Methode zur Herstellung von Methylestern unter Verwendung von Bortrifluorid beschrieben, die vorzugsweise angewandt werden sollte. Für die Fälle, in denen diese Methode nicht angewandt werden kann, werden Alternativmethoden unter 3.2 beschrieben. 3.1. Allgemeine Methode unter Verwendung von Bortrifluorid 3.1.1. Prinzip

Verseifung der Glyceride, anschließend Freisetzung und Veresterung der Fettsäuren in Gegenwart von Bortrifluorid.

3.1.2. Geräte - 50- und 100-ml-Kolben mit Schliffansatz,

- Kühler, 20 bis 30 cm lang, mit Schliff, aufsetzbar auf den Kolben,

- Siedesteinchen, fettfrei,

- Rohrstutzen zum Einleiten von Stickstoff,

- graduierte Pipette von mindestens 10 ml Fassungsvermögen mit Aufziehvorrichtung oder automatische Pipette,

- Reagenzgläser mit Schliffstopfen,

- 250-ml-Scheidetrichter.

3.1.3. Reagenzien - Etwa 0,5 N methanolische Natriumhydroxidlösung : 2 g Natriumhydroxid werden in 100 ml Methanol, das nicht mehr als 0,5 Gewichtsprozent Wasser enthält, gelöst. Wenn die Lösung über relativ lange Zeit verwendet wird, bildet sich etwas Natriumkarbonat (weisser Niederschlag) ; dieser hat keinen Einfluß auf die Herstellung der Methylester;

- methanolische Bortrifluoridlösung mit einem Gehalt von 12 bis 15 Gewichtsprozent (Lösungen von 14 und 50 v.H. sind im Handel erhältlich) (Anmerkung 2).

Warnung : Bortrifluorid ist eine toxische Verbindung. Deshalb wird nicht empfohlen, die Lösung aus Bortrifluorid und Methanol selbst herzustellen (Anmerkung 3);

- Heptan, zur Chromatographie (Anmerkungen 2 und 4);

- mehrfach destillierter Petroläther (Siedepunkt 40-60 ºC), Bromzahl niedriger als 1, frei von Rückständen oder Hexan (Anmerkung 2);

- Natriumsulfat, wasserfrei;

- gesättigte wäßrige Natriumchloridlösung;

- Methylrot, in 0,1 prozentiger (Gew./Vol.) Lösung von 60 vol. prozentigem Äthanol;

- Stickstoff mit weniger als 5 mg Sauerstoff je kg.

3.1.4. Arbeitsvorschrift

Wegen der toxischen Eigenschaften des Bortrifluorids werden die nachstehend beschriebenen Arbeiten möglichst unter einem Abzug ausgeführt. Sämtliche Glasgeräte sind sofort nach Gebrauch mit Wasser zu waschen.

Bei Ölen oder Fettsäuren, die Säuren mit mehr als 2 Doppelbindungen enthalten, empfiehlt es sich, die Luft aus dem Methanol und dem Kolben einige Minuten mit Stickstoff auszublasen. Die Probe wird entsprechend der in Teil I gegebenen Vorschrift vorbereitet.

Eine genaue Einwaage ist nicht erforderlich. Die Grösse der Probe muß nur bekannt sein, um Kolbengrösse und Menge der Reagenzien entsprechend nachstehender Tabelle wählen zu können: >PIC FILE= "T0011200">

Wenn die Methylester für die gaschromatographische Analyse bestimmt sind, sollte die Probenmenge bei etwa 350 mg liegen. Ist sie kleiner, so ist darauf zu achten, daß die entnommene Probe auch repräsentativ ist (Anmerkung 5). 3.1.4.1. Für Öle und Fette

Die vorbereitete Probe wird in den Kolben gegeben. Hinzugefügt werden die entsprechende Menge methanolischer Natriumhydroxidlösung sowie Siedesteinchen. Der Kühler wird auf den Kolben aufgesetzt. Unter Rückfluß wird bis zum Sieden erhitzt und bis zum Verschwinden der Fetttröpfchen gekocht (dies kann 5 bis 10 Minuten, in Ausnahmefällen auch länger als 10 Minuten, dauern).

Die angegebene Menge der methanolischen Bortrifluoridlösung wird von oben durch den Kühler in das siedende Gemisch mit Hilfe der graduierten Pipette mit Aufziehvorrichtung oder mit einer automatischen Pipette gegeben. Es wird weitere 2 Minuten gekocht.

In das siedende Gemisch werden von oben durch den Kühler 2 bis 5 ml Heptan (Anmerkung 4) zugegeben (die Heptanmenge ist ohne Bedeutung für die Reaktion) ; anschließend wird 1 Minute weitergekocht.

Es wird zunächst die Heizquelle des Kolbens und dann der Kühler entfernt. Hinzugefügt werden einige ml der gesättigten Natriumchloridlösung, wobei der Kolben einige Male vorsichtig unter kreisenden Bewegungen geschüttelt wird.

Die Zugabe gesättigter Natriumchloridlösung wird fortgesetzt und die Flüssigkeit bis zum Kolbenhals aufgefuellt. Etwa 1 ml der oberen Schicht (Heptanlösung) wird in ein Reagenzglas mit Schliff umgefuellt und es wird so viel wasserfreies Natriumsulfat zugesetzt, wie erforderlich ist, um Spuren von Wasser zu beseitigen. Bei einer Probenmenge von 350 mg enthält die so erhaltene Lösung etwa 5-10 % Methylester und kann direkt auf die gaschromatographische Säule gespritzt werden. In anderen Fällen wird die Heptanlösung verdünnt, um eine Methylester-Konzentration von 5-10 % zu erhalten (Anmerkung 6).

Um die gesamten trockenen Ester zu erhalten, werden die salzhaltige Lösung und die Heptanphase in einen 250-ml-Scheidetrichter umgefuellt, dann dekantiert. Die salzhaltige Lösung wird mit 50 ml Petroläther (Siedepunkt 40-60 ºC) oder Hexan extrahiert. Die Extraktion wird ein zweites Mal wiederholt. Die Heptanphase und die beiden Extrakte werden vereinigt und mit Mengen von jeweils 20 ml Wasser bis zum Verschwinden der Säure (Indikator : Methylrot) gewaschen. Getrocknet wird mit wasserfreiem Natriumsulfat und das Lösungsmittel auf dem Wasserbad im Stickstoffstrom verdampft (Anmerkungen 6 und 7). Bei Probemengen, die kleiner als 500 mg sind, sollten die Lösungsmittel- und Wassermengen entsprechend verringert werden.

3.1.4.2. Für Fettsäuren

Wenn die Probe nur aus Fettsäuren besteht, wird keine Verseifung vorgenommen.

Die gewünschte Menge der vorbereiteten Fettsäuren wird in den Kolben gegeben. Hinzugefügt wird die vorgeschriebene Menge der methanolischen Bortrifluoridlösung. Anschließend wird 2 Minuten unter Sieden erhitzt. Dann wird wie unter 3.1.4.1 beginnend bei : "In das siedende Gemisch werden von oben durch den Kühler..." fortgefahren.

3.2. Ersatzmethoden ohne Verwendung von Bortrifluorid 3.2.1. Für neutrale Fette (Säurezahl 3.2.1.1. Prinzip

Methanolyse der Glyceride im alkalischen Milieu

3.2.1.2. Geräte - Rührgerät zum schnellen Rühren und dazu passendes Heizgerät (z.B. heizbarer Magnetrührer),

- 100-ml-Erlenmeyer- oder -Rundkolben mit Schliffansatz,

- Rohrstutzen zum Einleiten von Stickstoff,

- Kühler, aufsetzbar auf den Erlenmeyer- bzw. den Rundkolben,

- Siedesteinchen, fettfrei,

- 125-ml-Scheidetrichter,

- enghalsiger 50-ml-Erlenmeyerkolben.

3.2.1.3. Reagenzien - Methanol mit nicht mehr als 0,5 Gewichtsprozent Wasser;

- etwa 1 N methanolische Kaliumhydroxidlösung : 5,6 g Kaliumhydroxid werden in 100 ml Methanol, das nicht mehr als 0,5 Gewichtsprozent Wasser enthält, gelöst;

- Heptan, zur Chromatographie (Anmerkungen 2 und 4);

- Natriumsulfat, wasserfrei;

- Stickstoff mit weniger als 5 mg Sauerstoff je kg.

3.2.1.4. Arbeitsvorschrift

Bei Ölen, die Säuren mit mehr als 2 Doppelbindungen enthalten, empfihelt es sich, die Luft aus dem Methanol und dem Kolben einige Minuten mit Stickstoff auszublasen.

Herstellung der Probe:

In einen 100-ml-Erlenmeyer- oder -Rundkolben werden etwa 4 g (Anmerkung 5) des vorbereiteten Fettes gegeben. Dann werden etwa 40 ml Methanol, 0,5 ml der Kaliumhydroxidlösung und Siedesteinchen zugegeben. Es wird der Rückflußkühler aufgesetzt, gerührt und die Mischung zum Sieden gebracht. Die Lösung muß klar werden. Die Reaktion ist im allgemeinen nach 5 bis 10 Minuten beendet. Bei Ölen vom Typ des Rizinusöls ist Klarheit kein Kriterium für eine ausreichende Umsetzung (Anmerkung 8).

Es wird unter fließendem Wasser abgekühlt und dann das Gemisch in einen 125-ml-Scheidetrichter umgefuellt. Der Kolben wird mit 20 ml Heptan (Anmerkung 4) gespült, das dann in den Scheidetrichter gegeben wird.

Es werden etwa 40 ml Wasser zugesetzt, anschließend wird geschüttelt. Die Ester sammeln sich in der oberen Heptanphase. Die wäßrige Phase wird ein zweites Mal mit 20 ml Heptan ausgeschüttelt. Die beiden Extrakte werden vereinigt und zweimal mit 20 ml Wasser gewaschen. Nach dem Dekantieren wird die Esterlösung über Natriumsulfat getrocknet, über Baumwollwatte in einen Erlenmeyerkolben filtriert und das Lösungsmittel gegebenenfalls bis zu 20 ml auf dem siedenden Wasserbad unter Stickstoff verdampft (Anmerkungen 6 und 7).

3.2.2. Für saure Fette (Säurezahl > 2) und Fettsäuren 3.2.2.1. Prinzip

Für saure Fette : Neutralisation der freien Fettsäuren, Methanolyse der Glyceride im alkalischen Milieu, dann Veresterung der Fettsäuren im sauren Milieu.

Für Fettsäuren : Veresterung im sauren Milieu.

3.2.2.2. Geräte - Rührgerät zum schnellen Rühren und dazu passendes Heizgerät (z.B. heizbarer Magnetrührer),

- 250-ml-Erlenmeyer- oder -Rundkolben, mit Schliffansatz,

- Rohrstutzen zum Einleiten von Stickstoff,

- Kühler, aufsetzbar auf den Erlenmeyer- bzw. Rundkolben,

- Siedesteinchen, fettfrei,

- 250-ml-Scheidetrichter,

- enghalsiger 100-ml-Erlenmeyerkolben.

3.2.2.3. Reagenzien - Natriummethylatlösung, hergestellt durch Auflösung von 1 g Natrium in 100 ml Methanol, das nicht mehr als 0,5 Gewichtsprozent Wasser enthält;

- etwa 1 N methanolische Salzsäure, wasserfrei (vgl. 3.2.2.6 Bemerkungen a) und b));

- Heptan, zur Chromatographie (Anmerkungen 2 und 4);

- Natriumsulfat, wasserfrei;

- Stickstoff mit weniger als 5 mg Sauerstoff je kg.

3.2.2.4. Arbeitsvorschrift für saure Fette

Bei Ölen, die Säuren mit mehr als 2 Doppelbindungen enthalten, empfiehlt es sich, die Luft aus dem Methanol und aus dem Kolben einige Minuten mit Stickstoff auszublasen.

Die Probe wird nach der in Teil I gegebenen Vorschrift vorbereitet. In einen 250-ml-Erlenmeyer- oder -Rundkolben werden etwa 4 g (Anmerkung 5) des vorbereiteten Fettes gegeben.

Zugesetzt werden 40 ml der Natriummethylatlösung (vgl. 3.2.2.6 Bemerkung c)). Es wird der Rückflußkühler aufgesetzt, gerührt und die Mischung zum Sieden gebracht. Die Lösung muß klar werden, was im allgemeinen nach etwa 10 Minuten der Fall ist. Nach 15 Minuten ist die Reaktion praktisch beendet.

Dann werden in den Kolben wenigstens 50 ml der Salzsäurelösung gegeben und es wird erneut 10 Minuten unter Sieden erhitzt (vgl. 3.2.2.6 Bemerkung d)). Unter fließendem Wasser wird abgekühlt ; anschließend werden 100 ml Wasser in den Kolben gegeben, das Gemisch in einen 250-ml-Scheidetrichter überführt und 30 ml Heptan zugegeben (Anmerkung 4). Es wird kräftig geschüttelt und man lässt absetzen, bis beide Phasen sich vollständig getrennt haben. Die Heptanphase wird abgetrennt. Die wäßrige Phase wird ein zweites Mal mit 30 ml Heptan ausgeschüttelt. Die beiden Heptanextrakte werden vereinigt, mit Wasser mehrmals gewaschen, bis sie neutral sind, und nach dem Dekantieren über Natriumsulfat getrocknet. Über Baumwollwatte wird in ein 100-ml-Erlenmeyerkölbchen filtriert und das Lösungsmittel gegebenenfalls bis auf 20 ml auf dem siedenden Wasserbad unter Stickstoff verdampft (Anmerkungen 6 und 7).

3.2.2.5. Arbeitsvorschrift für Fettsäuren

Bei Fettsäuren ist nachstehendes vereinfachtes Verfahren anzuwenden:

Bei Fettsäuren, die Säuren mit mehr als 2 Doppelbindungen enthalten, empfiehlt es sich, die Luft aus dem Methanol und aus dem Kolben einige Minuten mit Stickstoff auszublasen.

Die Probe wird nach der in Teil I gegebenen Vorschrift vorbereitet.

In einen 250-ml-Erlenmeyer- oder -Rundkolben werden etwa 4 g (Anmerkung 5) des vorbereiteten Fettes gegeben. Zugesetzt werden 50 ml Salzsäurelösung und Siedesteinchen ; das Gemisch wird 10 Minuten unter Sieden erhitzt. Unter fließendem Wasser wird abgekühlt ; dann werden 100 ml Wasser in den Kolben gegeben, das Gemisch in einen 250-ml-Scheidetrichter überführt und 30 ml Heptan zugesetzt (Anmerkung 4). Es wird kräftig geschüttelt, anschließend lässt man absetzen, bis beide Phasen sich vollständig getrennt haben. Die wäßrige Phase wird abgetrennt und ein zweites Mal mit 30 ml Heptan ausgeschüttelt. Die beiden Heptanextrakte werden vereinigt, mit Wasser mehrmals gewaschen bis sie neutral sind und nach dem Dekantieren über Natriumsulfat getrocknet. Über Baumwollwatte wird filtriert und das Lösungsmittel gegebenenfalls bis auf 20 ml in einem 100-ml-Erlenmeyerkölbchen auf dem siedenden Wasserbad unter Stickstoff verdampft (Anmerkungen 6 und 7).

3.2.2.6. Bemerkungen a) Im Laboratorium lassen sich kleine Mengen wasserfreier gasförmiger Salzsäure leicht herstellen, indem handelsübliche Salzsäure (D = 1,18) durch allmähliche Zugabe von konzentrierter Schwefelsäure (D = 1,84) ausgetauscht wird. Das dabei entstehende Gas wird getrocknet, indem es durch Schwefelsäure geleitet wird. Da Methanol eine hohe Affinität gegenüber gasförmigem Chlorwasserstoff besitzt, sind Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, die sicherstellen, daß es sich auflöst ; so kann das Gas z.B. über einen umgekehrten Trichter zugeführt werden, der genau in Höhe des Methanols endet. Im übrigen können grössere Mengen von in Menthanol gelöstem Chlorwasserstoff im voraus hergestellt und in Schliffflaschen im Dunkeln gut gelagert werden.

b) Statt der methanolischen Salzsäure kann auch etwa 1 N methanolische Schwefelsäure verwendet werden, jedoch muß die Veresterungsdauer wenigstens 20 Minuten betragen. Da der Natriumsulfatniederschlag den Siedevorgang stört, ist eine Filtration oder die Anwendung eines Magnetrührers erforderlich.

c) Vor Einführung der Probe können auch 40 ml Methanol und 0,4 g Natrium zugegeben werden. Auf diese Weise kann bei Bedarf sehr rasch eine Natriummethylatlösung hergestellt werden.

d) Bei sehr sauren Fetten bildet sich wegen der verhältnismässig grossen Menge Natriummethylat ein Natriumchlorid-Niederschlag, der beim nachfolgenden Kochen ein Stossen der Lösung verursachen kann. Der Niederschlag kann abfiltriert werden, doch ist dies im allgemeinen wegen der empfohlenen kurzen Erhitzungsdauer nicht erforderlich.

4. BESONDERE VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON METHYLESTERN VON FETTSÄUREN MIT 4 UND MEHR KOHLENSTOFFATOMEN 4.1. Prinzip

Die Methylester werden durch Umsetzung des Fettes mit einer methanolischen Kaliumhydroxidlösung in einem Zwischenstadium, ehe die Verseifung erfolgt, gewonnen.

4.2. Anwendungsbereich

Die Methode ist in erster Linie zur Herstellung von Methylestern bestimmt, die gaschromatographisch analysiert werden sollen.

Die Methode ist nicht auf saure Fette (Säurezahl > 2) anwendbar.

4.3. Geräte - Reagenzgläser mit Schliffstopfen, etwa 20 ml,

- 50- und 100-ml-Eichkolben,

- graduierte Pipetten, 1 ml (oder mehr),

- 10-ml-Meßzylinder.

4.4. Reagenzien - Etwa 2 N methanolische Kaliumhydroxidlösung : 11,2 g Kaliumhydroxid werden in 100 ml Methanol mit einem Wassergehalt von nicht mehr als 0,5 Gewichtsprozent gelöst;

- Heptan, zur Chromatographie (Anmerkungen 2 und 4);

- Standardlösung I : 1 g Methylpentanoat wird auf 0,1 mg genau in ein 50-ml-Eichkölbchen gewogen ; mit Heptan wird bis zur Marke aufgefuellt;

- Standardlösung II : 200 mg Methylpentanoat werden auf 0,1 mg genau in ein 100-ml-Eichkölbchen gewogen ; mit Heptan wird bis zur Marke aufgefuellt.

4.5. Arbeitsvorschrift

Wird eine spätere gas-chromatographische Bestimmung des Buttersäuregehalts verlangt, so ist eine Standardlösung zu verwenden : Standardlösung I, wenn der Buttersäuregehalt vermutlich mehr als 1 % beträgt ; Standardlösung II, wenn der Gehalt unter 1 % liegt.

Wird eine Bestimmung der Fettsäurezusammensetzung durch Gas-Chromatographie verlangt, so ist die Verwendung einer Standardlösung nicht erforderlich.

Die Probe wird nach der in Teil I gegebenen Vorschrift vorbereitet.

In ein Reagenzglas mit Schliffstopfen von etwa 20 ml wird 1 g der vorbereiteten Probe auf 1 mg genau eingewogen. Mit dem Meßzylinder werden 10 ml Heptan zugegeben. Mit der graduierten Pipette wird 1,0 ml der entsprechenden Standardlösung zugesetzt.

Anmerkung : Wird eine Bestimmung des Buttersäuregehalts nicht verlangt, so braucht die Probe nicht auf 1 mg genau gewogen und auch die Standardlösung nicht zugesetzt zu werden. Anschließend werden 0,5 ml der etwa 2 N methanolischen Kaliumhydroxidlösung zugegeben und der Inhalt des Reagenzglases unter Schütteln vermischt, bis er klar ist. Dafür werden etwa 20 Sekunden benötigt. Fast unmittelbar nach der Klärung wird die Lösung infolge Abscheidung des Glycerins erneut trüb. Das Glycerin setzt sich rasch ab.

Abgegossen wird die obere, die Methylester enthaltende Schicht.

5. ANMERKUNGEN 1. Wenn das Unverseifbare stört, ist die nach der Verseifung erhaltene Lösung mit Wasser zu verdünnen und das Unverseifbare durch Extraktion mit Diäthyläther, Hexan oder Petroläther unter den üblichen Bedingungen zu entfernen. Die wäßrige Seifenlösung wird angesäuert und die Fettsäuren werden abgetrennt. Die Methylester werden nach den unter 3.1.4.2 oder 3.2.2.5 beschriebenen Verfahren hergestellt.

2. Bei der Gas-Chromatographie der Methylester können einige Reagenzien, vor allem Methanollösungen von Bortrifluorid, das Erscheinen von zusätzlichen Peaks verursachen (bei methanolischen Lösungen von Bortrifluorid im Bereich von C20 - C22). Daher ist jede neue Partie von Reagenzien zu prüfen, indem Methylester aus reiner Ölsäure hergestellt und sodann chromatographiert werden. Erscheint ein zusätzlicher Peak, so ist das verwendete Reagenz zu verwerfen.

Die einzelnen Reagenzien dürfen keine Peaks liefern, die sich bei der gas-chromatographischen Analyse mit denen der Fettsäuremethylester überlagern.

3. Ist die Herstellung einer methanolischen Bortrifluoridlösung unumgänglich, so ist wie folgt zu verfahren : Ein 2-Liter-Kolben, der 1 Liter Methanol enthält, wird gewogen und dann im Eisbad gekühlt. Aus einer Druckgasflasche lässt man, wärend der Kolben in dem Bad bleibt, durch ein Glasröhrchen Bortrifluorid in das Methanol perlen bis zur Aufnahme von 125 g. Es wird unter dem Abzug gearbeitet. Man lässt BF3 bereits durch das Glasröhrchen strömen, bevor dieses in das Methanol eingetaucht wird und so lange bis es wieder herausgezogen ist. Dadurch soll verhindert werden, daß Flüssigkeit in das Druckminderungssystem zurücksteigt. Das Gas darf nicht zu schnell aus der Flasche strömen und dabei weisse Dämpfe bilden. Das Reagenz hält sich 2 Jahre.

4. Statt Heptan (Mischung von reinen, gas-chromatographisch überprüften C7-Isomeren) kann Hexan verwendet werden, wenn Fettsäuren mit 20 und mehr Kohlenstoffatomen nicht vorkommen.

5. Falls die vorgeschriebene Probemenge nicht vorhanden ist, kann diese auf 10 mg oder sogar weniger vermindert werden, vorausgesetzt, daß die Volumina der Reagenzien und die Grösse der Apparatur entsprechend verkleinert werden.

6. Die Methylester sollten möglichst rasch analysiert werden. Wenn nötig, kann die die Methylester enthaltende Heptanlösung unter Inertgas im Kühlschrank aufbewahrt werden. Bei längerer Aufbewarung empfiehlt es sich, die Methylester gegen Autoxydation dadurch zu schützen, daß der Lösung ein Antioxydans in einer Konzentration zugesetzt wird, die bei der nachfolgenden Analyse nicht stört, z.B. 0,005 % (Gew./Vol.) B.H.T. (2-6-Di-tert.-butyl-4-methylphenol). Getrocknete Methylester ohne Lösungsmittel können, wenn nötig, 24 Stunden unter Inertgas im Kühlschrank oder sogar länger aufbewahrt werden, wenn sie im Gefrierschrank in Röhrchen gelagert werden, die im Vakuum verschlossen wurden.

7. Es besteht die Gefahr, einen Teil der fluechtigeren Methylester zu verlieren, wenn die Entfernung des Lösungsmittels zu lange ausgedehnt wird oder wenn der Stickstoffstrom zu kräftig ist.

Für die Infrarot-Spektrographie muß das Lösungsmittel so vollständig wie möglich entfernt werden. Für die Gas-Chromatographie sollte das Lösungsmittel möglichst nicht vertrieben werden.

8. Bei Ölen vom Typ des Rizinusöls ist Klarheit kein Kriterium für eine vollständige Umsetzung.

III. GAS-CHROMATOGRAPHIE VON FETTSÄUREMETHYLESTERN

1. EINLEITUNG

Zweck der Methode ist es, allgemeine Richtlinien für die gas-chromatographische Bestimmung der qualitativen und quantitativen Zusammensetzung eines nach Teil II hergestellten Gemisches von Fettsäuremethylestern zu geben. Polymerisierte Fettsäuren können nach dieser Methode nicht analysiert werden.

Die Anweisungen beziehen sich auf die üblichen Gas-Chromatographen mit gepackter Säule und Flammenionisationsdetektor (Anmerkung 1).

2. GERÄTE 2.1. Gas-Chromatograph

Geeignet ist jedes Gerät, das eine solche Trennleistung und Auflösung erbringt, wie sie unter 4.1.2 definiert ist. 2.1.1. Einspritzblock

Der Einspritzblock muß das kleinstmögliche Totvolumen haben. Er sollte, wenn möglich, auf eine Temperatur gebracht werden, die um 25 bis 50 ºC über der der Säulentemperatur liegt.

2.1.2. Ofen

Der Ofen muß in der Lage sein, die Säulen auf mindestens 220 ºC zu erhitzen und mit einer Toleranz von ± 1 ºC auf der gewünschten Temperatur zu halten.

Wenn mit Programmierung gearbeitet wird, empfiehlt sich die Benutzung einer Apparatur mit doppelter Säule.

2.1.3. Säule 2.1.3.1. Säulenrohr

Die Säule sollte aus einem Material bestehen, das sich gegenüber den zu analysierenden Stoffen indifferent verhält : Glas oder, falls nicht vorhanden, rostfreier Stahl (Anmerkung 2).

Länge : 1 bis 3 m. Wenn langkettige Fettsäuren (> C20) vorkommen, empfiehlt sich eine relativ kurze Säule.

Zur Bestimmung von C4- und C6-Säuren wird eine Säule von 2 in Länge empfohlen.

Innerer Durchmesser : 2 bis 4 mm.

2.1.3.2. Füllung

Trägermaterial : säuregewaschenes, silanisiertes Kieselgur oder anderes geeignetes inertes Trägermaterial mit engem Korngrössenbereich (25 ¶m im Bereich von 125 bis 200 ¶m), dessen Durchschnittsgrösse vom inneren Durchmesser und von der Länge der Säule abhängt.

Stationäre Phase : polare Phase, z.B. vom Polyestertyp (Diäthylenglykol-polysuccinat, Butandiol-polysuccinat, Äthylenglykol-polyadipat), Cyanosilicon oder jede andere, den nachstehenden Anforderungen gerecht werdende Phase. Imprägnierungsgrad zwischen 5 und 20 %. Für bestimmte Trennungen können unpolare Phasen verwendet werden.

2.1.3.3. Vorbehandlung

Es wird, falls möglich, die Verbindung von Säule und Detektor getrennt, der Säulenofen auf eine um 10 ºC über der Arbeitstemperatur liegende Temperatur erhitzt und die vorbereitete Säule mindestens 16 Stunden unter einem Inertgasstrom von 20 bis 60 ml/min auf dieser Temperatur gehalten, danach 2 Stunden auf 195 ºC.

2.1.4. Detektor

Der Detektor sollte möglichst auf eine Temperatur, die über der der Säule liegt, eingestellt werden können.

Die nachstehenden Vorschriften beziehen sich auf die Verwendung eines Flammenionisationsdetektors (Anmerkung 1).

2.2. Spritze

Spritze von höchstens 10 ¶l, unterteilt in Zehntel ¶l.

2.3. Schreiber

Soll die aufgezeichnete Kurve zur Berechnung der Zusammensetzung des zu analysierenden Gemisches verwendet werden, so muß der Schreiber ein elektronisches Gerät von hoher Präzision sein.

Die Daten des Schreibers müssen auf die des verwendeten Gerätes abgestimmt sein: - Ansprechgeschwindigkeit unter 1,5 sec (die Ansprechgeschwindigkeit ist die von dem Schreibstift des Schreibers benötigte Zeit, um nach momentaner Eingabe eines Signals von 100 % von 0 auf 90 % zu kommen);

- Papierbreite : mindestens 25 cm;

- Papiervorschub : 25-150 cm/h.

2.4. Integrator oder Rechner (fakultativ)

Ein elektronischer Integrator oder ein Rechner ermöglichen eine schnelle und genaue Berechnung. Er muß linear ansprechen, ausreichend empfindlich sein und über eine ausreichende Grundlinienkorrektur verfügen.

3. REAGENZIEN - Trägergas : Inertgas (Stickstoff, Helium, Argon usw.), sehr gut getrocknet, mit einem Sauerstoffgehalt von weniger als 10 ppm;

- Hilfsgase : Wasserstoff wenigstens 99,9 % rein, frei von organischen Stoffen;

Luft oder Sauerstoff, frei von organischen Stoffen;

- Eichsubstanzen : Gemisch aus Methylestern oder Methylester eines Öles bekannter Zusammensetzung, die der des zu analysierenden Fettes möglichst ähnlich ist.

4. ARBEITSVORSCHRIFT 4.1. Einstellung des Gerätes 4.1.1. Ermittlung der günstigsten Arbeitsbedingungen

Bei der Wahl der Arbeitsbedingungen müssen nachstehende Variablen berücksichtigt werden:

Länge und Durchmesse der Säule,

Art und Menge der stationären Phase,

Säulentemperatur,

Trägergasstrom,

erwünschte Auflösung,

Probenmenge,

Dauer der Analyse.

Die Probenmenge ist so zu wählen, daß Detektor- und Elektrometereinheit linear reagieren.

Im allgemeinen führen nachstehende Werte zu den gewünschten Resultaten, und zwar eine Mindestzahl von 2000 theoretischen Böden für Methylstearat, sowie dessen Elution in etwa 15 Minuten: >PIC FILE= "T0011201">

Wenn das Gerät es zulässt, soll der Einspritzblock eine Temperatur von etwa 200 ºC und der Detektor die gleiche oder eine höhere Temperatur als die Säule haben.

Der Wasserstoffstrom des Flammenionisationsdetektors ist im allgemeinen etwa halb so stark wie der des Trägergases, der Sauerstoffstrom etwa 5 bis 10 mal stärker als der des Wasserstoffs.

4.1.2. Bestimmung von Trennleistung und Auflösung

Es wird ein Gemisch aus Methylstearat und Methyloleat in etwa gleichem Mengenverhältnis (z.B. Methylester der Kakaobutter) analysiert. Probenmenge, Säulentemperatur und Trägergasstrom sind so zu wählen, daß das Maximum des Methylstearat-Peaks etwa 15 Minuten nach dem Peak des Lösungsmittels registriert wird und daß dieser Peak etwa drei Viertel der gesamten Skalenbreite erreicht. >PIC FILE= "T0011202">

4.2. Analyse

Die Probenmenge besteht aus 0,1 bis 2 ¶l der nach Teil II hergestellten Heptanlösung der Methylester. Liegen lösungsmittelfreie Ester vor, so wird aus diesen eine etwa 10 % ige Lösung in Heptan hergestellt und davon 0,1 bis 1 ¶l eingespritzt.

Zur Bestimmung von nur in Spuren vorhandenen Bestandteilen kann die Probenmenge vergrössert werden (bis zum Zehnfachen). Im Normalfall gelten die unter 4.1.1 beschriebenen Arbeitsbedingungen. Es kann allerdings mit einer niedrigeren Säulentemperatur gearbeitet werden, wenn Fettsäuren bestimmt werden müssen, die kürzer als C12 sind und mit einer höheren Temperatur, wenn Fettsäuren zu bestimmen sind, die länger als C20 sind.

Gegebenenfalls kann in den beiden vorgenannten Fällen mit Temperaturprogrammierung gearbeitet werden. Wenn die Probe zum Beispiel Methylester von Fettsäuren mit weniger als 12 Kohlenstoffatomen enthält, wird sie bei 100 ºC (oder bei 50-60 ºC, wenn Buttersäure vorliegt) eingespritzt, und es wird sofort das Temperaturprogramm mit einem Anstieg von 4-8 ºC/min bis zum Erreichen der optimalen Temperatur eingeschaltet.

In bestimmten Fällen können die beiden Verfahren kombiniert werden : nach Ablauf des Temperaturprogramms wird bei konstanter Temperatur weiter eluiert, bis alle Bestandteile eluiert sind. Falls das Gerät nicht mit Temperaturprogrammierung ausgestattet ist, muß bei zwei konstanten Temperaturen zwischen 100 und 195 ºC gearbeitet werden.

Es wird empfohlen, gegebenenfalls eine Analyse auf zwei Phasen unterschiedlicher Polarität durchzuführen, um die Abwesenheit von verdeckten Peaks sicherzustellen, die z.B. im Fischöl oder in den Fällen vorkommen können, in denen gleichzeitig C18 : 3 und C20 oder C18 : 3 und C18 : 2 -konjugiert, vorhanden sind.

5. DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE 5.1. Qualitative Analyse

Das Fettgemisch bekannter Zusammensetzung wird unter den gleichen Bedingungen wie die Probe analysiert ; die Retentionsstrecken (oder Retentionszeiten) werden für die darin enthaltenen Fettsäuren bestimmt. Es werden Kurven gezeichnet, bei denen der Logarithmus der Retentionsstrecke (bzw. der Retentionszeit) gegen die Zahl der Kohlenstoffatome aufgetragen wird. Unter isothermen Bedingungen und für geradkettige Ester mit gleicher Zahl von Doppelbindungen müssen die graphischen Darstellungen auf halblogarithmischem Papier Geraden ergeben, die mehr oder weniger parallel sind. Bei der zu analysierenden Probe werden die Peaks unter Bezug auf diese Geraden gegebenenfalls durch Interpolation identifiziert.

Arbeitsbedingungen, unter denen "verdeckte Peaks" auftreten können, d.h. wenn zwei Bestandteile infolge unzureichender Auflösung nicht unterschieden werden können, sind zu vermeiden.

5.2. Quantitative Analyse 5.2.1. Bestimmung der Zusammensetzung

Anzuwenden ist (von Ausnahmen abgesehen) die Verhältnismethode, d.h. es wird davon ausgegangen, daß alle in der Probe vorhandenen Bestandteile auf dem Chromatogramm erscheinen, daß also die Summe der Peakflächen die Bestandteile zu 100 % repräsentiert (vollständige Elution).

Gehört zu der Apparatur ein Integrator, so sind die von diesem gelieferten Zahlen zu verwenden. Anderenfalls ist die Fläche der einzelnen Peaks durch Triangulation zu bestimmen, indem die Höhe des Peaks mit seiner Breite in halber Höhe multipliziert wird, wobei gegebenenfalls die unterschiedlichen Empfindlichkeitsstufen des Verstärkers berücksicht werden müssen, die während der Aufzeichnung eingeschaltet wurden.

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5.2.2. Ergebnisse

Das Resultat ist anzugeben mit:

3 Ziffern bei Werten über 10 Prozent,

2 Ziffern bei Werten zwischen 1 und 10 Prozent,

1 Ziffer bei Werten unter 1 Prozent,

d.h. in jedem Fall mit einer Ziffer hinter dem Komma.

5.2.3. Wiederholbarkeit

Der Unterschied zwischen den Ergebnissen von zwei Bestimmungen, die am selben Tag mit der gleichen Apparatur von derselben Person mit denselben Estern und für zu mehr als 5 Prozent enthaltene Bestandteile ausgeführt wurden, darf 3 Prozent relativ, bezogen auf den bestimmten Wert, und 1 Prozent absolut nicht überschreiten. Bei Bestandteilen, die zu weniger als 5 Prozent enthalten sind, wird mit abnehmendem Gehalt die Wiederholbarkeit, charakterisiert durch den relativen Wert, rasch schlechter.

5.2.4. Reproduzierbarkeit

Der Unterschied zwischen den Ergebnissen aus zwei verschiedenen Laboratorien bei zu mehr als 5 Prozent enthaltenen Bestandteilen darf 10 Prozent relativ, bezogen auf den bestimmten Wert, und 3 Prozent absolut nicht überschreiten. Bei zu weniger als 5 Prozent enthaltenen Bestandteilen wird mit abnehmendem Gehalt die Reproduzierbarkeit, charakterisiert durch den relativen Wert, rasch schlechter.

6. ANMERKUNGEN 1. Verwendet werden kann auch ein Gas-Chromatograph mit Wärmeleitfähigkeitsdetektor (Catharometer). Die beschriebenen Bedingungen sind dann wie folgt zu ändern: >PIC FILE= "T0011341">

Für die quantitative Analyse müssen die unter 5.2.1.2 beschriebenen Korrekturfaktoren berücksichtigt werden. 2. Wenn mehrfach ungesättigte Bestandteile mit mehr als 3 Doppelbindungen vorkommen, kann eine Säule aus korrosionsbeständigem Stahl deren Zersetzung verursachen.