6.

Anhang VII erhält folgende Fassung: „ANHANG VII BESTIMMUNG DES PROZENTUALEN GEHALTS AN 2-GLYCERINMONOPALMITAT 1. GEGENSTAND UND ANWENDUNGSBEREICH Diese Arbeitsvorschrift beschreibt das Analyseverfahren für die Bestimmung des prozentualen Gehalts an Palmitinsäure in 2-Stellung der Triglyceride mittels Bestimmung von 2-Glycerinmonopalmitat. Die Methode eignet sich für bei Raumtemperatur (20 °C) flüssige pflanzliche Öle. 2. PRINZIP Die vorbereitete Olivenölprobe wird der Wirkung der Pankreaslipase ausgesetzt. Die hierdurch bewirkte partielle und spezifische Hydrolyse an den Positionen 1 und 3 des Triglyceridmoleküls ergibt ein 2-Monoglycerid. Der prozentuale Gehalt an 2-Glycerinmonopalmitat in der Monoglyceridfraktion wird nach Silylierung durch Kapillargaschromatografie bestimmt. 3. GERÄTE UND LABORAUSSTATTUNG 3.1. Erlenmeyerkolben, 25 ml 3.2. Bechergläser, 100 ml, 250 ml und 300 ml 3.3. Glassäule für Chromatografie, 21—23 mm Innendurchmesser, 400 mm Länge, mit gläsernem Frittenboden und Hahn 3.4. Messkolben, 10, 50, 100 und 200 ml 3.5. Rundkolben, 100 ml und 250 ml 3.6. Rotationsverdampfer 3.7. Zentrifugengläser mit konischem Boden, 10 ml, mit Schliffstopfen 3.8. Zentrifuge für 10- und 100-ml-Gläser 3.9. Thermostat, einstellbar auf 40 °C mit einer Genauigkeit von ± 0,5 °C 3.10. Messpipetten, 1 ml und 2 ml 3.11. Injektionsspritze, 1 ml 3.12. Mikroliterspritze, 100 μl 3.13. Trichter, 1 000 ml 3.14. Kapillargaschromatograf mit ‚Cold-on-column‘-Injektor zur Direkteinspritzung der Probe in die Säule und mit auf 1 °C genau einstellbarem Ofen 3.15. ‚Cold-on-column‘-Injektor zur Direkteinspritzung der Probe in die Säule 3.16. Flammenionisationsdetektor und Elektrometer 3.17. Für das Elektrometer geeigneter Integrator mit Schreiber, Ansprechzeit max. 1 Sekunde, variabler Papiervorschub 3.18. Glaskapillarsäule oder Fused-silica-Säule, Länge 8—12 m, Innendurchmesser 0,25—0,32 mm, beschichtet mit Methylpolysiloxan oder Phenylmethylpolysiloxan 5 %, Schichtdicke 0,10—030 μm, verwendbar bis 370 °C 3.19. Mikroliterspritze, 10 μl, mit gehärteter Nadel, Länge mindestens 7,5 cm, für Direkteinspritzung. 4. REAGENZIEN 4.1. Kieselgel mit einer Korngröße zwischen 0,063 und 0,200 mm (70/280 mesh), hergestellt wie folgt: Kieselgel in eine Porzellanschale geben, im Trockenschrank 4 Stunden bei 160 °C trocknen, anschließend im Exsikkator auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Ein 5 % der Kieselgelmasse entsprechendes Volumen Wasser wie folgt zugeben: 152 g Kieselgel in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben einwiegen, 8 g destilliertes Wasser zugeben, den Kolben verschließen und leicht schütteln, bis eine gleichmäßige Verteilung des Wassers erreicht ist. Vor der Verwendung mindestens 12 Stunden ruhen lassen. 4.2. n-Hexan, zur Chromatografie 4.3. Isopropanol 4.4. Isopropanol, wässrige Lösung 1/1 (V/V) 4.5. Pankreaslipase: Die verwendete Lipase muss eine Aktivität zwischen 2,0 und 10 Lipaseeinheiten je mg haben (Pankreaslipasen mit einer Aktivität zwischen 2 und 10 Einheiten je mg Enzym sind im Handel erhältlich). 4.6. tris-Hydroxymethylaminomethan-Pufferlösung: 1 M wässrige Lösung durch Zusatz von konzentrierter HCl (1/1 V/V) auf pH 8 gebracht (durch Potenziometer überprüfen) 4.7. Natriumcholat, Enzymqualität, 0,1 %ige wässrige Lösung (diese Lösung ist innerhalb von 15 Tagen nach ihrer Herstellung zu verbrauchen) 4.8. Calciumchlorid, 22 %ige wässrige Lösung 4.9. Diethylether, zur Chromatografie 4.10. Elutionsmittel: Gemisch von n-Hexan/Diethylether (87/13) (V/V) 4.11. Natriumhydroxid, 12-Gew. %-Lösung 4.12. Phenolphthalein, 1 %ige Lösung in Ethanol 4.13. Trägergas: Wasserstoff oder Helium, zur Gaschromatografie 4.14. Hilfsgase: Wasserstoff, Reinheit mindestens 99 %, frei von Feuchtigkeit und organischen Stoffen, und Luft, gleicher Reinheitsgrad, zur Gaschromatografie 4.15. Silylierungsreagenz: Gemisch von Pyridin, Hexamethyldisilazan und Trimethylchlorsilan im Verhältnis 9/3/1 (V/V/V). (Gebrauchsfertige Lösungen sind im Handel erhältlich. Daneben gibt es auch andere Silylierungsreagenzien, z. B. bis-Trimethylsilyltrifluoracetamid + 1 % Trimethylchlorsilan, das mit gleichen Teilen wasserfreiem Pyridin gemischt werden muss.) 4.16. Referenzproben: reine Monoglyceride oder Gemische von Monoglyceriden mit bekannter Zusammensetzung, die möglichst der Zusammensetzung der Probe ähnlich ist. 5. VERFAHREN 5.1. Vorbereiten der Probe 5.1.1. Öle mit einem Gehalt an freien Säuren unter 3 % brauchen vor der Säulenchromatografie mit Kieselgel nicht neutralisiert zu werden. Öle mit einem Gehalt an freien Säuren über 3 % sind gemäß Ziffer 5.1.1.1 zu neutralisieren. 5.1.1.1. 50 g Öl und 200 ml n-Hexan in den 1 000-ml-Trichter (3.13) geben. 100 ml Isopropanol und so viel 12 %ige Natriumhydroxidlösung (4.11) hinzufügen, wie dem Gehalt des Öls an freien Fettsäuren, zuzüglich 5 %, entspricht. Eine Minute lang kräftig schütteln, 100 ml destilliertes Wasser zugeben, erneut schütteln und absetzen lassen. Nach dem Dekantieren die untere, die Seifen enthaltende Schicht sowie etwaige Zwischenschichten (Schleim, unlösliche Stoffe) entfernen. Die Hexanlösung des neutralisierten Öls mehrmals mit je 50—60 ml der Isopropanol/Wasserlösung (1/1 V/V) (4.4) waschen, bis die Rosafärbung des Phenolphthaleins verschwindet. Den größten Teil des Hexans unter Vakuum (z. B. im Rotationsverdampfer) abdestillieren. Das Öl in einen 100-ml-Rundkolben (3.5) überführen und bis zur vollständigen Entfernung des Lösungsmittels unter Vakuum trocknen. Nach diesem Verfahren muss der Säuregehalt des Öls unter 0,5 % liegen. 5.1.2. 1,0 g des wie beschrieben vorbereiteten Öls in einen 25-ml-Erlenmeyerkolben (3.1) geben und in 10 ml Elutionsmittel (4.10) lösen. Die Lösung vor der Kieselgelsäulenchromatografie mindestens 15 Minuten ruhen lassen. Wenn die Lösung trüb ist, sollte sie zentrifugiert werden, um optimale Chromatografiebedingungen zu schaffen. (Es können gebrauchsfertige SPE-Kartuschen (500 mg) verwendet werden). 5.1.3. Vorbereiten der Chromatografiesäule Etwa 30 ml Elutionsmittel (4.10) in die Säule (3.3) geben, einen Wattebausch mit Hilfe des Glasstabs bis auf den Grund der Säule schieben; dabei die Luft herausdrücken. In einem 100-ml-Becherglas 25 g Kieselgel (4.1) in etwa 80 ml Elutionsmittel suspendieren, dann mithilfe eines Trichters in die Säule geben. Zur restlosen Überführung des Kieselgels in die Säule ist das Becherglas mit dem Elutionsmittel (4.10) zu spülen. Hahn öffnen und soviel Elutionsmittel ablaufen lassen, bis der Elutionsmittelspiegel etwa 2 mm über dem Kieselgel liegt. 5.1.4. Säulenchromatografie In einen 25-ml-Erlenmeyerkolben (3.1) wird genau 1,0 g der gemäß Ziffer 5.1 vorbereiteten Probe eingewogen. Die Probe in 10 ml Elutionsmittel (4.10) auflösen und die Lösung in die gemäß Ziffer 5.1.3 vorbereitete Chromatografiesäule geben. Nicht umrühren. Hahn öffnen und die Probenlösung bis zur Kieselgelschicht ablaufen lassen. Mit 150 ml Elutionsmittel eluieren. Die Durchlaufgeschwindigkeit auf 2 ml/Min. einstellen (so dass 150 ml die Säule in 60 bis 70 Minuten durchströmen). Eluat in einem zuvor austarierten 250-ml-Rundkolben auffangen. Das Lösungsmittel unter Vakuum eindampfen und letzte Lösungsmittelspuren im Stickstoffstrom entfernen. Den Rundkolben wiegen und den Extrakt berechnen. (Bei Verwendung von gebrauchsfertigen Kieselgel-SPE-Kartuschen ist wie folgt vorzugehen: 1 ml der Lösung (5.1.2) in die mit 3 ml n-Hexan vorbereiteten Kartuschen geben. Nach der Perkolation der Lösung mit 4 ml h-Hexan/Diethylether 9:1 (V/V) eluieren. Das Eluat in einem 10-ml-Glas auffangen und im Stickstoffstrom bis zur Trockne eindampfen. Die Pankreaslipase (5.2) auf den Rückstand einwirken lassen. Es ist wichtig, die Fettsäurezusammensetzung vor und nach dem Durchlaufen der SPE-Kartusche zu überprüfen). 5.2. Hydrolyse durch Pankreaslipase 5.2.1. 0,1 g des gemäß Ziffer 5.1 zubereiteten Öls in ein Zentrifugenglas einwiegen. 2 ml Pufferlösung (4.6), 0,5 ml Natriumcholatlösung (4.7) und 0,2 ml Calciumchloridlösung zugeben und nach jeder Zugabe gut schütteln. Das Glas mit dem Schliffstopfen verschließen und bei 40 + 0,5 °C in den Thermostaten stellen. 5.2.2. 20 mg Lipase zugeben, vorsichtig schütteln (Befeuchten des Stopfens vermeiden) und das Glas genau 2 Minuten in den Thermostaten stellen. Herausnehmen, genau 1 Minute kräftig schütteln und abkühlen lassen. 5.2.3. 1 ml Diethylether zugeben, das Glas verschließen und kräftig schütteln, dann zentrifugieren und die Etherlösung mithilfe einer Mikroliterspritze in ein sauberes und trockenes Glas überführen. 5.3. Zubereitung der silylierten Derivate und Vorbereitung der Gaschromatografie 5.3.1. Mithilfe einer Mikroliterspritze 100 μl der Lösung (5.2.3.) in ein 10-ml-Zentrifugenglas mit konischem Boden geben. 5.3.2. Das Lösungsmittel im schwachen Stickstoffstrom austreiben, 200 μl Silylierungsreagenz (4.15) zugeben, das Glas verschließen und 20 Minuten ruhen lassen. 5.3.3. Nach 20 Minuten 1 bis 5 ml n-Hexan (je nach Chromatografiebedingungen) zugeben; die erhaltene Lösung ist bereit für die Gaschromatografie. 5.4. Gaschromatografie Betriebsbedingungen: — Injektortemperatur (‚On-column-Injektor‘) unter dem Siedepunkt des Lösungsmittels (68 °C), — Detektortemperatur: 350 °C, — Säulentemperatur: Temperaturprogramm des Ofens: 1 Minute 60 °C, dann Erhöhung um 15 °C pro Minute bis auf 180 °C, dann um 5 °C pro Minute bis auf 340 °C, dann 13 Minuten 340 °C, — Trägergas: Wasserstoff oder Helium, mit für die Auflösung gemäß Abbildung 1 geeigneter linearer Strömungsgeschwindigkeit. Die Retentionszeit des Triglycerids C54 muss 40 ± 5 Minuten betragen (siehe Abbildung 2). (Die hier vorgeschlagenen Arbeitsbedingungen sind Anhaltspunkte. Bei der Durchführung der Analyse sind sie so zu optimieren, dass die gewünschte Auflösung erzielt wird. Die Höhe des 2-Glycerinmonopalmitat-Peaks muss mindestens 10 % der Skala des Schreibers entsprechen.) — Einspritzmenge: 0,5—1 μl der (5 ml) n-Hexanlösung (5.3.3). 5.4.1. Identifizierung der Peaks Die einzelnen Monoglyceride werden auf der Grundlage der erhaltenen Retentionszeiten bestimmt, die mit den Retentionszeiten von unter den gleichen Bedingungen analysierten Standardmischungen von Monoglyceriden verglichen werden. 5.4.2. Quantitative Bestimmung Die einzelnen Peakflächen werden mithilfe eines elektronischen Integrators berechnet. 6. DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE Der prozentuale Gehalt an Glycerinmonopalmitat errechnet sich aus dem Quotienten der Peakfläche des entsprechenden Peaks und der Summe der Peakflächen aller Monoglyceride (vgl. Abbildung 2) nach folgender Formel: Glycéryl monopalmitate (%): (Glycéril monopalmitate = Glycerinmonopalmitat) Dabei ist: Ax = Peakfläche von Glycerinmonopalmitat ΣA = Summe der Peakflächen aller Monoglyceride Das Ergebnis wird mit einer Dezimalstelle angegeben. 7. ANALYSEBERICHT Im Analysebericht ist Folgendes anzugeben: — Verweis auf diese Methode, — alle für die vollständige Identifizierung der Probe erforderlichen Angaben, — Analyseergebnis, — jede Abweichung von dieser Methode aufgrund einer Entscheidung der Beteiligten oder aus anderen Gründen, — Angaben zum Labor, Analysedatum und Unterschrift der für die Analyse verantwortlichen Personen. Abbildung 1 Chromatogramm der Produkte der Silylierungsreaktion, die durch Einwirkung der Lipase auf ein raffiniertes Olivenöl mit 20 %igem Zusatz an verestertem Öl (100 %) gewonnen wurden Abbildung 2 Chromatogramm von: A) Olivenöl, nicht verestert; nach Lipase; nach Silylierung; unter diesen Bedingungen (Kapillarsäule 8—12 m) wird die Wachsfraktion gleichzeitig mit der Diglyceridfraktion oder kurze Zeit später eluiert. Nach der Lipase darf der Triglyceridgehalt 15 % nicht übersteigen. Chromatogramm von: B) verestertem Öl nach Lipase; nach Silylierung; unter diesen Bedingungen (Kapillarsäule 8—12 m) wird die Wachsfraktion gleichzeitig mit der Diglyceridfraktion oder kurze Zeit später eluiert. Nach der Lipase darf der Triglyceridgehalt 15 % nicht übersteigen. 8. ANMERKUNGEN Anmerkung 1: HERSTELLUNG DER LIPASE Lipasen mit ausreichender Aktivität sind im Handel erhältlich. Sie können aber auch im Labor wie folgt hergestellt werden: 5 kg frisches Schweinepankreas auf 0 °C abkühlen. Das umhüllende feste Fett und die anhängenden Gewebe entfernen und Pankreas im Mixer zu einem flüssigen Brei zerkleinern. Diesen Brei 4 bis 6 Stunden mit 2,5 l wasserfreiem Aceton rühren, anschließend zentrifugieren. Den Rückstand noch dreimal mit dem gleichen Volumen Aceton, dann zweimal mit einer Mischung von Aceton und Diethylether 1:1 (V/V) und zweimal mit Diethylether extrahieren. Den Rückstand 48 Stunden im Vakuum trocknen, bis ein stabiles Pulver entsteht, das vor Feuchtigkeit geschützt im Kühlschrank aufbewahrt werden sollte. Anmerkung 2: PRÜFUNG DER LIPASEAKTIVITÄT Durch Rühren (10 Min.) eines Gemischs von 165 ml Gummiarabikumlösung (100 g/l), 15 g gemahlenem Eis und 20 ml neutralisiertem Olivenöl mit einem geeigneten Rührgerät eine Ölemulsion herstellen. 10 ml dieser Emulsion in ein 50-ml-Becherglas geben, anschließend 0,3 ml Natriumcholatlösung (0,2 g/ml) und 20 ml destilliertes Wasser hinzufügen. Das Becherglas bei 37 °C in einen Thermostaten stellen; die Elektroden des pH-Meters und den Spiralrührer einsetzen. Mit Hilfe einer Bürette tropfenweise 0,1 N Natriumhydroxidlösung hinzufügen bis zu einem pH-Wert von 8,3. Eine ausreichende Menge der wässrigen Lipasesuspension (0,1 g/ml Lipase) hinzufügen. Sobald das pH-Meter 8,3 anzeigt, die Stoppuhr anstellen und Natriumhydroxidlösung so zutropfen lassen, dass der pH-Wert bei 8,3 gehalten wird. Das Volumen der pro Minute verbrauchten Lösung notieren. Die Werte in ein Koordinatensystem eintragen, und zwar die Zeitablesungen als Abszisse und die Anzahl ml 0,1 N Alkalilösung zur Aufrechterhaltung eines konstanten pH-Werts als Ordinate. Dabei muss sich eine Gerade ergeben. Die Lipaseaktivität, ausgedrückt als Lipaseeinheiten je mg, wird mit folgender Formel angegeben: Dabei ist: A die Aktivität in Lipaseeinheiten/mg V die Anzahl der pro Minute verbrauchten Milliliter 0,1 N Natriumhydroxidlösung (berechnet aus der grafischen Darstellung) N die Normalität der Natriumhydroxidlösung m das Gewicht der Lipaseprobe in mg. Die Lipaseeinheit wird als die Menge Enzym definiert, die 10 Mikroäquivalente Säure pro Minute freisetzt.“