ANHANG X

BESTIMMUNG VON FETTSÄUREMETHYLESTERN DURCH GASCHROMATOGRAFIE

1. ANWENDUNGSBEREICH

Dieser Anhang enthält Anweisungen für die gaschromatografische Bestimmung der freien und der gebundenen Fettsäuren in pflanzlichen Fetten und Ölen nach ihrer Umwandlung in Fettsäuremethylester (FAME).

Die gebundenen Fettsäuren der Triacylglyceride (TAG) und, in Abhängigkeit vom Verfahren der Veresterung, die freien Fettsäuren (FFA) werden zu Fettsäuremethylestern (FAME) umgewandelt, die mit der Kapillar-Gaschromatografie bestimmt werden.

Mit dem in diesem Anhang beschriebenen Verfahren können FAME von C12 bis C24, einschließlich gesättigter Fettsäuremethylester, einfach ungesättigter cis- und trans-Fettsäuremethylester und mehrfach ungesättigter cis- und trans-Fettsäuremethylester bestimmt werden.

2. PRINZIP

Die Gaschromatografie wird für die quantitative Analyse von FAME angewendet. Die FAME werden nach Maßgabe von Teil A hergestellt und dann in den Injektor injiziert und in diesem eingedampft. Die Trennung der FAME wird an Analysesäulen mit spezifischer Polarität und Länge erreicht. Für den Nachweis der FAME wird ein Flammenionisationsdetektor (FID) angewendet. Die Analysebedingungen sind in Teil B beschrieben.

Bei der Gaschromatografie von FAME mit einem Flammenionisationdsdetektor kann Wasserstoff oder Helium als Trägergas (mobile Phase) verwendet werden. Wasserstoff beschleunigt die Trennung und führt zu schärferen Peaks. Die stationäre Phase ist eine mikroskopische Schicht eines dünnen Flüssigfilms an einer inerten festen Oberfläche aus Quarzglas

Die verdampften zu analysierenden Verbindungen interagieren beim Passieren durch die Kapillarsäule mit der stationären Phase, die die Innenseite der Säule auskleidet. Aufgrund dieser unterschiedlichen Interaktion verschiedener Verbindungen eluieren diese zu unterschiedlichen Zeitpunkten; dies wird als die Retentionszeit der Verbindung für einen gegebenen Satz von Analyseparametern bezeichnet. Die einzelnen Verbindungen werden durch den Vergleich der Retentionszeiten ermittelt.

TEIL A.

HERSTELLUNG DER FETTSÄUREMETHYLESTER VON OLIVENÖL UND OLIVENTRESTERÖL

1. GEGENSTAND

In diesem Teil ist die Herstellung der Fettsäuremethylester beschrieben. Er enthält Verfahren für die Herstellung der Fettsäuremethylester von Olivenöl und Oliventresteröl.

2. ANWENDUNGSBEREICH

Die Herstellung der Fettsäuremethylester von Olivenöl und Oliventresteröl erfolgt durch Umesterung mit methanolischer Kaliumhydroxidlösung bei Raumtemperatur. Ob die Probe vor der Umesterung gereinigt werden muss, hängt von ihrem Gehalt an freien Fettsäuren und dem zu bestimmenden Analyseparameter ab; dieser kann nach Maßgabe der folgenden Tabelle gewählt werden:

Ölkategorie Methode Natives Olivenöl mit einer Säure von ≤ 2,0 % 1. Fettsäuren 2. trans-Fettsäuren 3. ΔECN42 (nach Reinigung mit Kieselgel-SPE) Raffiniertes Olivenöl Olivenöl — Gemisch aus raffiniertem und nativem Olivenöl Raffiniertes Oliventresteröl Oliventresteröl Natives Olivenöl mit einer Säure von > 2,0 % Rohes Oliventresteröl 1. Fettsäuren (nach Reinigung mit Kieselgel-SPE) 2. trans-Fettsäuren (nach Reinigung mit Kieselgel-SPE) 3. ΔECN42 (nach der Reinigung mit Kieselgel-SPE)

3. METHODIK

3.1. Umesterung mit methanolischer Kaliumhydroxidlösung bei Raumtemperatur

3.1.1. Prinzip

Methylester werden durch Umesterung mit methanolischer Kaliumhydroxidlösung als Zwischenprodukte vor der Verseifung gebildet.

3.1.2. Reagenzien

3.1.2.1. Methanol mit einem Massenanteil Wasser von nicht mehr als 0,5 % (m/m)

3.1.2.2. Hexan, chromatografische Qualität

3.1.2.3. Heptan, chromatografische Qualität

3.1.2.4. Diethylether, stabilisiert zur Analyse

3.1.2.5. Aceton, chromatografische Qualität

3.1.2.6. Elutionsmittel zur Reinigung des Öls mittels Säulen-/SPE-Chromatografie: Gemisch aus Hexan und Diethylether im Volumenverhältnis 87/13

3.1.2.7. Kaliumhydroxid, etwa 2 N methanolische Lösung: 11,2 g Kaliumhydroxid in 100 ml Methanol lösen

3.1.2.8. Kieselgelkartuschen, 1 g (6 ml), für die Festphasenextraktion

3.1.3. Geräte

3.1.3.1. Probenröhrchen mit Schraubverschluss, 5 ml, Verschluss mit PTFE-Dichtung

3.1.3.2. Messpipetten oder automatische Pipetten, 2 ml und 0,2 ml

3.1.4. Reinigung der Ölproben

Die Ölproben werden bei Bedarf durch Festphasenextraktion an Kieselgelkartuschen gereinigt. In einen Elutionsapparat unter Vakuum eine Kieselgelkartusche (3.1.2.8) geben und mit 6 ml Hexan (3.1.2.2) waschen. Zur Wäsche wird das Vakuum unterbrochen. Dann eine Lösung von etwa 0,12 g Öl in 0,5 ml Hexan (3.1.2.2) auf die Säule laden. Nach Eindringen der Lösung mit 10 ml Hexan/Diethylether (Volumenverhältnis 87:13) (3.1.2.6) eluieren. Das gesamte Eluat homogenisieren und in zwei gleiche Teile teilen. Einen Teil des Eluats an einem Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck bei Raumtemperatur bis zur Trockne abrotieren. Den Rückstand in 1 ml Heptan lösen. Die Lösung ist nun zur gaschromatografischen Analyse der Fettsäuren bereit. Zur Analyse der Triglyceride mit HPLC bei Bedarf den übrigen Teil des Eluats einrotieren und den Rückstand in 1 ml Aceton lösen.

3.1.5. Verfahren

In ein 5-ml-Probenröhrchen mit Schraubverschluss (3.1.3.1) etwa 0,1 g Ölprobe einwiegen. 2 ml Heptan (3.1.2.2) zufügen und schütteln. 0,2 ml der methanolischen Kaliumhydroxidlösung (3.1.2.7) zugeben, fest verschließen und 30 Sekunden kräftig schütteln. Absetzen lassen, bis sich der obere Teil der Lösung geklärt hat. Die obere Phase (mit den Methylestern) abdekantieren. Die Heptan-Lösung ist bereit zur Injektion in den Gaschromatografen. Es wird empfohlen, die Lösung bis zur gaschromatografischen Analyse im Kühlschrank und nicht länger als 12 Stunden aufbewahren.

TEIL B.

GASCHROMATOGRAFISCHE ANALYSE DER FETTSÄUREMETHYLESTER

1. GEGENSTAND

Dieser Teil enthält allgemeine Anweisungen zur Anwendung der Kapillar-Gaschromatografie zur Bestimmung der qualitativen und quantitativen Zusammensetzung eines Gemischs von Fettsäuremethylestern, die nach dem in Teil A beschriebenen Verfahren hergestellt wurden.

Er ist nicht auf polymerisierte Fettsäuren anwendbar.

2. REAGENZIEN

2.1. Trägergas

Inertgas (Helium oder Wasserstoff), vollständig getrocknet und mit einem Sauerstoffgehalt von weniger als 10 mg/kg.

Anmerkung 1: Wasserstoff kann die Analysegeschwindigkeit verdoppeln, das ist jedoch mit Gefahren verbunden. Sicherheitsvorrichtungen sind verfügbar.

2.2. Hilfsgase

2.2.1. Wasserstoff (Reinheit ≥ 99,9 %), frei von organischen Verunreinigungen

2.2.2. Luft oder Sauerstoff, frei von organischen Verunreinigungen

2.2.3. Stickstoff (Reinheit > 99 %)

2.3. Referenzstandard

Ein Gemisch aus reinen Fettsäuremethylestern oder die Methylester eines Fetts mit bekannter Zusammensetzung, die möglichst der Zusammensetzung des zu analysierenden Fetts ähnlich sind. Cis- und trans-Isomere von Ölsäure-, Linolsäure- und Linolensäuremethylesthern sind bei der Bestimmung von trans-Isomeren ungesättigter Säuren hilfreich.

Eine Oxidation der mehrfach ungesättigten Fettsäuren ist zu vermeiden.

3. GERÄTE

Die vorliegenden Instruktionen gelten für die übliche Ausrüstung für die Gaschromatografie mit Kapillarsäule und Flammenionisationsdetektor.

3.1. Gaschromatograf

Der Gaschromatograf muss über folgende Bestandteile verfügen:

3.1.1. Injektionssystem

Bei Kapillarsäulen ist ein Injektor zu verwenden, der speziell für solche Säulen konzipiert ist. Möglich ist ein Split-Injektor oder ein Splitlos-Injektor für die On-Column-Injektion.

3.1.2. Ofen

Der Ofen sollte so ausgelegt sein, dass die Kapillarsäule auf mindestens 260 °C aufgeheizt und die Temperatur auf 0,1 °C genau gehalten werden kann. Letztere Bedingung ist vor allem dann wichtig, wenn eine Quarzsäule verwendet wird.

In jedem Fall, besonders aber bei Fettsäuren mit weniger als 16 Kohlenstoffatomen, wird eine Heizung mit Temperaturprogramm empfohlen.

3.1.3. Kapillarsäule

3.1.3.1. Kapillare aus einem Material, das nicht mit den zu analysierenden Stoffen reagiert (üblicherweise Glas oder Quarzglas (‚Fused Silica‘)). Der Innendurchmesser sollte zwischen 0,20 und 0,32 mm liegen. Die Innenflächen müssen vor dem Auftragen der stationären Phase einer geeigneten Behandlung unterzogen werden (beispielsweise Oberflächenvorbereitung, Desaktivierung). Eine Länge von 60 m ist ausreichend für Fettsäuren und cis- und trans-Isomere von Fettsäuren.

3.1.3.2. Als stationäre Phase sind vernetzte (cross linked) Säulen aus polarem Polysiloxan (Cyanopropylsilicon) geeignet.

Anmerkung 2: Bei Verwendung von polaren Polysiloxanen können bei der Identifizierung und Trennung von Linolensäure und C20-Säuren Schwierigkeiten auftreten.

Die Beschichtung sollte dünn, d. h. nur 0,1 bis 0,2 μm sein.

3.1.3.3. Einbau und Vorbereitung der Säule

Beim Einbau der Kapillarsäule müssen die üblichen Vorsichtsmaßnahmen, wie Anordnung der Säule im Ofen (Träger), Auswahl und Zusammenbau der Verbindungsstücke (Abdichtung), Ausrichten der Säulenenden im Injektor und im Detektor (Verringerung von Totvolumen), getroffen werden. Die Säule wird mit dem Trägergasstrom gespült (z. B. bei einer Säulenlänge von 25 m und einem Innendurchmesser von 0,3 mm mit 0,3 bar (30 kPa)).

Zur Vorbereitung der Säule wird das Temperaturprogramm des Ofens auf 3 °C/min eingestellt und die Säule, ausgehend von der Raumtemperatur, auf eine Temperatur von 10 °C unter der Zersetzungsgrenze der stationären Phase erhitzt. Diese Ofentemperatur wird eine Stunde beibehalten, bis die Basislinie stabilisiert ist. Dann auf 180 °C zurückschalten und unter isothermen Bedingungen weiterarbeiten.

Anmerkung 3: Entsprechend vorbehandelte Fertigsäulen können im Handel bezogen werden.

3.1.4. Flammenionisations-Detektor mit Verstärker

3.2. Spritze

Die Spritze sollte eine maximale Kapazität von 10 μl und eine Graduierung in 0,1 μl haben.

3.3. Datenerfassungssystem

Online mit den Detektoren verbundenes Datenerfassungssystem, das unter einer Software für die Peak-Integration und -Normalisierung läuft.

4. VERFAHREN

Die in 4.1 bis 4.3 beschriebenen Verfahren beziehen sich auf den Gebrauch eines Flammenionisationsdetektors.

4.1. Prüfbedingungen

4.1.1. Ermittlung der optimalen Betriebsbedingungen für Kapillarsäulen

Aufgrund der Leistungsfähigkeit und Durchlässigkeit von Kapillarsäulen hängen die Trennung der Bestandteile und die Analysendauer weitgehend von der Durchflussrate des Trägergases in der Säule ab. Daher ist eine Optimierung der Betriebsbedingungen durch Anpassung dieses Parameters (oder einfach durch Kopfdruckminderung) notwendig, je nachdem, ob eine bessere Trennung oder eine schnellere Analyse gewünscht wird.

Die folgenden Bedingungen haben sich als geeignet für die Trennung von FAME (C4 bis C26) erwiesen. Beispiele für Chromatogramme sind in Anlage B enthalten:

Injektortemperatur: 250 °C Detektortemperatur: 250 °C Ofentemperatur: von 165 °C (8 Min.) auf 210 °C bei 2 °C/Min. Wasserstoff-Trägergas: Säulenkopfdruck: 179 kPa Gesamtdurchflussrate: 154,0 ml/Min. Splitverhältnis: 1:100 Injektionsvolumen: 1 μl

4.1.2. Bestimmung der Auflösung (siehe Anlage A)

Die Auflösung R zweier benachbarter Peaks I und II wird nach folgender Formel berechnet:

R = 2 × ((dr(II) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) oder R = 2 × ((tr(II) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (United States Pharmacopeia)

oder

R = 1,18 × ((tr(II) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB), (JP (Japanese Pharmacopeia), EP (Pharmacopée Européenne), BP (British Pharmacopeia).

Dabei ist

d r(I) die Retentionsstrecke von Peak I; d r(II) die Retentionsstrecke von Peak II; t r(I) die Retentionszeit von Peak I; t r(II) die Retentionszeit von Peak II; ω(I) die Breite von Peak I an der Basis; ω(II) die Breite von Peak II an der Basis; ω0,5 die Peakbreite der spezifizierten Verbindung auf halber Peakhöhe.

Ist ω(I) ≈ ω(II), wird R nach folgender Gleichung berechnet:

R = (dr(II) – d r(I))/ω = (dr(II) – d r(I))/4σ

Dabei ist

σ die Standardabweichung (vgl. Anlage A, Abbildung 1).

Ist der Abstand dr zwischen zwei Peaks d r(II) - d r(I) gleich 4σ, so ist der Auflösungsfaktor R = 1.

Bei zwei nicht vollständig getrennten Peaks schneiden sich die Tangenten zu den Wendepunkten der beiden Peaks am Punkt C. Damit die beiden Peaks vollständig getrennt sind, muss der Abstand zwischen den beiden Peaks Folgendes erfüllen:

d r(II) - d r(I) = 6 σ daraus ergibt sich R = 1,5 (siehe Anlage A, Abbildung 3).

5. DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

5.1. Qualitative Analyse

Die Methylester-Peaks der Probe werden aus dem Chromatogramm in Anlage B Abbildung 1 — wenn nötig durch Interpolation — oder durch Vergleich mit denen der Methylester-Referenzgemische (wie unter 2.3 beschrieben) identifiziert.

5.2. Quantitative Analyse

5.2.1. Bestimmung der Zusammensetzung

Der Massenanteil wi der einzelnen Fettsäuremethylester (ausgedrückt als der prozentuale Anteil der Masse der Methylester) wird wie folgt berechnet:

5.2.2. Berechnungsweise

5.2.2.1. Allgemeiner Fall

Der Gehalt eines Bestandteils i (ausgedrückt als prozentualer Anteil der Masse der Methylester) wird durch Bestimmung des prozentualen Anteils der jeweiligen Peakfläche im Verhältnis zur Summe aller Peakflächen nach folgender Gleichung berechnet:

wi = (Ai/ΣA) × 100

Dabei ist

Ai die Fläche des einzelnen Fettsäuremethylesters i; ΣA die Summe der Flächen aller Peaks von allen Fettsäuremethylestern.

Die Ergebnisse werden mit zwei Dezimalstellen angegeben.

Anmerkung 4: Bei Fetten und Ölen ist der Massenanteil der Fettsäuremethylester gleich dem Massenanteil der Triacylglycerine in Gramm je 100 g. In Fällen, in denen diese Annahme nicht zulässig ist, siehe 5.2.2.2.

5.2.2.2. Anwendung von Korrekturfaktoren

In bestimmten Fällen, z. B. bei Vorhandensein von Fettsäuren mit weniger als acht Kohlenstoffatomen oder von Fettsäuren mit sekundären Gruppen, sind die Flächen mit spezifischen Korrekturfaktoren (Fci) zu korrigieren. Diese Faktoren sind für jedes einzelne Gerät zu bestimmen. Für diesen Zweck werden geeignete Referenzmaterialien mit zertifizierter Zusammensetzung der Fettsäure in dem betreffenden Bereich verwendet.

Anmerkung 5: Diese Korrekturfaktoren sind mit den in Anlage A angegebenen theoretischen FID-Korrekturfaktoren nicht identisch, weil sie auch die Leistung des Injektionssystems usw. umfassen. Jedoch sollte im Fall von größeren Abweichungen das ganze System hinsichtlich der Leistung überprüft werden.

Für dieses Referenzgemisch ist für den FAME i der Massenanteil nach folgender Gleichung zu berechnen:

w i = (mi /Σm) × 100

Dabei ist

mi die Masse des FAME i im Referenzgemisch, Σm die Gesamtheit der Massen der verschiedenen Komponenten als FAME des Referenzgemischs.

Aus dem Chromatogramm des Referenzgemischs ist der prozentuale Flächenanteil für den FAME i nach folgender Gleichung zu berechnen:

wi = (Ai/ΣA) × 100

Dabei ist

Ai die Fläche des FAME i im Referenzgemisch, ΣA die Summe der Flächen sämtlicher FAME des Referenzgemischs.

Der Korrekturfaktor Fc ist dann nach folgender Gleichung zu berechnen:

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

Für die Probe ist für jeden FAME i der Massenamteil nach folgender Gleichung zu berechnen:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Die Ergebnisse werden mit zwei Dezimalstellen angegeben.

Anmerkung 6: Der berechnete Wert entspricht dem Massenanteil der einzelnen Fettsäuren, berechnet als Triacylglycerin je 100 g Fett.

5.2.2.3. Verwendung eines inneren Standards

Für bestimmte Untersuchungen (z. B. wenn nicht alle Fettsäuren quantifiziert werden, wie beispielsweise dann, wenn Säuren mit vier und sechs Kohlenstoffatomen neben Säuren mit 16 und 18 Kohlenstoffatomen vorhanden sind, oder wenn es notwendig ist, die absolute Menge einer Fettsäure in einer Probe zu bestimmen) ist die Verwendung eines internen Standards erforderlich. Fettsäuren mit 5, 15 oder 17 Kohlenstoffatomen werden häufig verwendet. Der Korrekturfaktor (wenn überhaupt) sollte für den internen Standard bestimmt werden.

Der Massenanteil der Komponente i, angegeben als Methylester, ist dann nach folgender Gleichung zu berechnen:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

Dabei ist:

A i die Fläche des FAME i, A IS die Fläche des internen Standards; F i der Korrekturfaktor der Fettsäure i, angegeben als FAME; F IS der Korrekturfaktor des internen Standards; m die Masse der Einwaage in Milligramm; m IS die Masse des internen Standards in Milligramm.

Die Ergebnisse werden mit zwei Dezimalstellen angegeben.

6. UNTERSUCHUNGSBERICHT

Im Untersuchungsbericht sind das angewandte Verfahren zur Herstellung der Methylester und das angewandte gaschromatografische Verfahren genau anzugeben. Darüber hinaus sind alle Arbeitsschritte, die nicht in diesem Standardverfahren aufgeführt wurden oder als fakultativ gelten, sowie alle Vorfälle, die das Untersuchungsergebnis beeinflusst haben können, zu nennen.

Der Untersuchungsbericht hat alle erforderlichen Informationen zur vollständigen Identifizierung der Probe zu enthalten.

7. PRÄSZISION DES VERFAHRENS

7.1. Ergebnisse des Ringversuchs

Einzelheiten eines Ringversuchs zur Präzision des Verfahrens sind in Anhang C der Norm IOC/T.20/Doc. Nr. 33 zusammengefasst. Die in diesem Ringversuch ermittelten Werte könnten auf andere Konzentrationsbereiche und Matrizes als die angegebenen nicht anwendbar sein.

7.2. Wiederholpräzision

Die absolute Differenz zwischen zwei einzelnen, voneinander unabhängigen Prüfergebnissen, die derselbe Bearbeiter mit dem gleichen Verfahren an identischem Untersuchungsmaterial in demselben Laboratorium mit derselben Geräteausstattung innerhalb der kürzest möglichen Zeitspanne erhält, wird nicht häufiger als in 5 % der Fälle den in den Tabellen 1 bis 14 in Anhang C der Norm IOC/T.20/Doc. Nr. 33 angegebenen Wert von r überschreiten.

7.3. Vergleichspräzision

Die absolute Differenz zwischen zwei einzelnen Prüfergebnissen, die verschiedene Bearbeiter mit dem gleichen Verfahren an identischem Untersuchungsmaterial in verschiedenen Laboratorien mit unterschiedlichen Geräteausstattungen erhalten, wird in nicht mehr als 5 % der Fälle den in den Tabellen 1 bis 14 in Anhang C der Norm IOC/T.20/Doc. Nr. 33 angegebenen Wert von R überschreiten.

Anlage A Abbildung 1 Mit Breite ω0,5 auf halber Höhe des Dreiecks (ABC) und Breite b auf halber Höhe des Dreiecks (NPM). Abbildung 2 Abbildung 3