VERORDNUNG (EWG) Nr. 690/92 DER KOMMISSION vom 19. März 1992 zur Festlegung einer Referenzmethode zum Nachweis von Kuhmilchkasein in Schafmilch

DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN -

gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft,

gestützt auf den Vertrag über den Beitritt Spaniens und Portugals, insbesondere auf Artikel 67 Absätze 1 und 2, Artikel 98, Artikel 234 Absatz 2 sowie Artikel 310,

gestützt auf die Verordnung (EWG) Nr. 1677/85 vom 11. Juni 1985 über die Währungsausgleichsbeträge im Agrarsektor (1), zuletzt geändert durch die Verordnung (EWG) Nr. 2205/90 (2), insbesondere auf Artikel 1 Absatz 1,

gestützt auf die Verordnung (EWG) Nr. 804/68 vom 27. Juni 1968 über die gemeinsame Marktorganisation für Milch und Milcherzeugnisse (3), zuletzt geändert durch die Verordnung (EWG) Nr. 374/92 der Kommission (4), insbesondere auf Artikel 9 Absatz 3,

Artikel 14

Absatz 7 und Artikel 17 Absatz 4,

gestützt auf die Verordnung (EWG) Nr. 876/68 des Rates vom 28. Juni 1968 über die Grundregeln für die Gewährung von Erstattungen bei der Ausfuhr von Milch und Milcherzeugnissen und die Kriterien für die Festsetzung der Erstattung (5), zuletzt geändert durch die Verordnung (EWG) Nr. 1344/86 (6), insbesondere auf Artikel 6 Absatz 3,

in Erwägung nachstehender Gründe:

Für reinen Schafkäse gelten spezifische Vorschriften der gemeinschaftlichen Verordnungen für den Agrarsektor. Damit diese Vorschriften angewendet werden können, muß sichergestellt werden, daß das betreffende Erzeugnis keine Kuhmilch enthält.

Für die private Lagerhaltung von Schafkäse kann gemäß der Verordnung (EWG) Nr. 508/71 vom 8. März 1971 zur Festlegung der Grundregeln von Beihilfen für die private Lagerhaltung von lagerfähigen Käsesorten (7) eine Beihilfe gewährt werden. Diese Erzeugnisse kommen gemäß der Verordnung (EWG) Nr. 876/86 ausserdem für eine besondere Erstattung in Frage. Dagegen werden im Handel mit Schafmilcherzeugnissen gemäß der Verordnung (EWG) Nr. 1677/85 keine Währungsausgleichsbeträge erhoben bzw. gewährt. Auch werden im Handel mit Schafmilcherzeugnissen gemäß der Verordnung (EWG) Nr. 466/86 des Rates vom 25. Februar 1986 zur Festlegung der Grundregeln für das System der Beitrittsausgleichsbeträge im Sektor Milch und Milcherzeugnisse aufgrund des Beitritts Spaniens (8), sowie der Verordnung (EWG) Nr. 3640/90 des Rates vom 11. Dezember 1990 zur Festlegung der Grundregeln für das System der Beitrittsausgleichsbeträge im Sektor Milch und Milcherzeugnisse während der zweiten Stufe des Beitritts Portugals (9), keine Beitrittsausgleichsbeträge gewährt.

Da die Kommission die vorgenannten Vorschriften für Schafkäse mittlerweile hat, muß mit einem geeigneten Untersuchungsverfahren nachgewiesen werden können, daß zur Herstellung des Erzeugnisses keine Kuhmilch verwendet wurde. Es empfiehlt sich, eine gemeinschaftliche Referenzmethode für diese Untersuchung festzulegen, die auch mit Routineverfahren durchgeführt werden kann, sofern sie bestimmte Kriterien erfuellen.

Der Verwaltungsausschuß für Milch und Milcherzeugnisse hat nicht innerhalb der ihm von seinem Vorsitzenden gesetzten Frist Stellung genommen -

HAT FOLGENDE VERORDNUNG ERLASSEN:

Artikel 1

Damit gewährleistet ist, daß ausschließlich aus Schafmilch herzustellender Käse kein Kuhmilchkasein enthält, ist für die Untersuchung die im Anhang beschriebene Referenzmethode anzuwenden.

Das Vorhandensein von Kuhmilchkasein gilt als nachgewiesen, wenn der festgestellte Gehalt der Analyseprobe an Kuhmilchkasein gleich dem Gehalt der im Anhang beschriebenen Referenzprobe oder grösser ist.

Artikel 2

Zum Nachweis von Kuhmilchkasein in Schafkäse dürfen Routineverfahren verwendet werden, wenn sie folgende Bedingungen erfuellen:

- die Nachweisgrenze darf höchstens 0,5 % betragen;

- es dürfen keine falsch-positiven Ergebnisse erzielt werden; ist dies nicht auszuschließen, so muß jede positiv reagierende Probe nochmals mit der Referenzmethode analysiert werden;

- ausreichende Empfindlichkeit zum Nachweis von Kuhmilchkasein auch nach langer Reifezeit entsprechend den Gepflogenheiten des Handels; wird diese Bedingung für einen bestimmten Schafkäse nicht erfuellt, so muß dieser Käse mit Hilfe der Referenzmethode analysiert werden.

Artikel 3

Diese Verordnung tritt am dritten Tag nach ihrer Veröffentlichung im Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften in Kraft.

Sie gilt ab 16. September 1992. Diese Verordnung ist in allen ihren Teilen verbindlich und gilt unmittelbar in jedem Mitgliedstaat.

Brüssel, den 19. März 1992 Für die Kommission

Ray MAC SHARRY

Mitglied der Kommission

(1) ABl. Nr. L 164 vom 24. 6. 1985, S. 6. (2) ABl. Nr. L 201 vom 31. 7. 1990, S. 9. (3) ABl. Nr. L 148 vom 28. 6. 1968, S. 13. (4) ABl. Nr. L 41 vom 18. 2. 1992, S. 9. (5) ABl. Nr. L 155 vom 3. 7. 1968, S. 1. (6) ABl. Nr. L 119 vom 8. 5. 1986, S. 36. (7) ABl. Nr. L 58 vom 11. 3. 1971, S. 1. (8) ABl. Nr. L 53 vom 1. 3. 1986, S. 23. (9) ABl. Nr. L 362 vom 27. 12. 1990, S. 3.

g ANHANG

REFERENZMETHODE ZUM NACHWEIS VON KUHMILCHKASEIN IN SCHAFKÄSE

1. Zweck Diese Arbeitsvorschrift beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Kuhmilchkasein in Schafkäse mit Hilfe der isölektrischen Fokussierung der g-Kaseine nach Plasminolyse. 2. Anwendungsbereich Dieses Verfahren dient dem empfindlichen und spezifischen Nachweis von Kuhmilchkasein in frischem und gereiftem Schafkäse. 3. Kurzbeschreibung 3.1. Isolierung des Kaseins aus Käse. 3.2. Lösen des isolierten Kaseins und Plasminspaltung (EC.3.4.21.7). 3.3. Isoelektrische Fokussierung der plasminbehandelten Kaseine in Anwesenheit von Harnstoff und Anfärben der Proteine mit Coomassie Brilliant Blau G 250. 3.4. Auswertung durch Vergleich der gefärbten g2-Banden (Kuhmilchnachweis) zwischen der zu bestimmenden Probe und der im selben Gel laufenden Referenzproben mit 0 % und 1 % Kuhmilch. 4. Reagenzien Soweit nicht anders angegeben, sind analysenreine Reagenzien zu verwenden. Das Wasser muß bidestilliert oder von entsprechender Reinheit sein. Hinweis: Die folgenden Angaben gelten für 0,25 mm dünne, im Labor hergestellte harnstoffhaltige Polyacrylamidgele im Format 265 × 125 × 0,25 mm. Bei Verwendung anderer Gelrezepturen und -formate müssen die Elektrophoresebedingungen gegebenenfalls angepasst werden. Isoelektrische Fokussierung 4.1. Reagenzien zur Herstellung der harnstoffhaltigen Polyacrylamidgele 4.1.1. Gelstammlösung 4,85 g Acrylamid 0,15 g N,Nthylen-bis-acrylamid (BIS) 48,05 g Harnstoff 12,22 g Glycerin (87 % w/w) in 100 ml H2O lösen, auf 100 ml auffuellen, in Braunglasflaschen überführen und im Kühlschrank aufbewahren. Hinweis: Statt der angegebenen Festeinwaagen der neurotoxischen Acrylamide kann vorzugsweise eine der handelsüblichen Acrylamid-Fertiglösungen verwendet werden. Bei einer solchen Lösung mit 30 % (w/v) Acrylamid und 0,8 % (w/v) BIS müssen anstelle der Festeinwaagen 16,2 ml für die oben angegebene Rezeptur eingesetzt werden. Die Haltbarkeit der Gelstammlösung beträgt maximal 10 Tage. Beträgt die Leitfähigkeit mehr als 5 mS, wird die Lösung mit 2 g Amberlite MB-3 versetzt, unter Rühren 30 Minuten lang entionisiert und dann membranfiltriert (0,45 mm). 4.1.2. Gellösung Aus der Gelstammlösung (siehe 4.1.1) wird durch Versetzen mit verschiedenen Ampholyten und Additiven eine Gellösung hergestellt. 9,0 ml Gelstammlösung 24 mg ß-Alanin 500 ml Ampholyt pH 3,5-9,5 (1) 500 ml Ampholyt pH 6-7 (1). Die Gellösung wird durchmischt und 2 bis 3 Minuten im Ultraschallbad oder im Vakuum entgast. Hinweis: Gellösung erst unmittelbar vor dem Gießen (siehe 6.2) ansetzen. 4.1.3. Katalysatorlösungen 40 % (w/v) Ammoniumpersulfat (PER): Abstand 800 mg PER werden mit Wasser versetzt und auf 2 ml aufgefuellt. TEMED: N,N,NN-Tetramethylethylendiamin. Hinweis: PER-Lösung stets frisch ansetzen. 4.2. Kontaktfluessigkeit Kerosin oder n-Decan. 4.3. Anodenfluessigkeit 5,77 g Phosphorsäure (85 % w/w) mit Wasser auf 100 ml auffuellen. 4.4. Kathodenfluessigkeit 2,00 g Natriumhydroxid in Wasser lösen und mit Wasser auf 100 ml auffuellen. Probenvorbereitung 4.5. Reagenzien zur Proteinisolierung Dichlormethan, verdünnte Essigsäure (25,0 ml Eisessig mit Wasser auf 100 ml auffuellen); Aceton. 4.6. Protein-Lösungspuffer 5,75 g Glycerin (87 % w/w) 24,03 g Harnstoff 250 mg Dithiothreitol in destilliertem Wasser lösen und auf 50 ml auffuellen. Hinweis: Im Kühlschrank höchstens 1 Woche haltbar. 4.7. Reagenzien für die Plasminspaltung des Kaseins 4.7.1. Ammoniumcarbonatpuffer 0,2 mol/l NH4HCO3-Lösung (1,58 g/100 ml Wasser) werden mit 0,2 mol/l (NH4)2CO3-Lösung (1,92 g/100 ml Wasser) auf einen pH-Wert von 8 titriert. 4.7.2. Kälberlab (EC 3.4.21.7); Labstärke mindestens 5 U/ml. 4.7.3. Enzyminaktivierungslösung 2,624 g e-Aminocapronsäure (6-Amino-n-Hexansäure) werden in 100 ml 40 %igem Ethanol (v/v) gelöst. 4.8. Herstellung der mit Lab versetzten Schafmagermilch-Standardproben mit 0 % und 1 % Kuhmilch. Zur Gewinnung von Magermilch wird eine rohe Schaf- bzw. Rindersammelmilch bei einer Temperatur von 37 °C und einer Drehzahl von 2 500 g 20 Minuten lang zentrifugiert. Nach raschem Abkühlen des Zentrifugenbechers nebst Inhalt auf 6 bis 8 °C wird die obere Fettschicht restlos entfernt. Zum Ansetzen der 1 %igen Standardprobe werden 495 ml Schafmagermilch in einem Becherglas mit 5,00 ml Kuhmagermilch vermischt und durch Zusatz verdünnter Milchsäure (10 % v/v) auf einen pH-Wert von 6,4 eingestellt. Die Probe wird auf 35 °C angewärmt, mit 100 ml Kälberlab versetzt (Labstärke 1: 10 000; ca. 3 000 U/ml), eine Minute gerührt und in einem mit Alufolie abgedeckten Becher eine Stunde bei 35 °C bis zum Gerinnen stehen gelassen. Anschließend wird die gesamte labbehandelte Probe - ohne vorher zu homogenisieren oder Molke zu entfernen - gefriergetrocknet. Nach dem Gefriertrocknen wird das Produkt gleichmässig vermahlen. Zum Ansetzen der 0 %igen Standardprobe wird das gleiche Verfahren mit 500 ml reiner Kuhmagermilch durchgeführt. Hinweis: Es ist ratsam, die Reinheit der Schafmilch durch isölektrische Fokussierung der plasminbehandelten Kaseine vor dem Ansetzen der Standardproben zu prüfen. Reagenzien zur Proteinfärbung 4.9. Fixierlösung 150 g Trichloressigsäure wird in Wasser gelöst und auf 1 000 ml aufgefuellt. 4.10. Entfärbelösung 500 ml Methanol und 200 ml Eisessig werden mit destilliertem Wasser auf 2 000 ml aufgefuellt. Hinweis: Die Entfärbelösung ist jeden Tag frisch anzusetzen; sie kann zweckmässigerweise aus Vorratslösungen (50 % (v/v) Methanol und 20 % (v/v) Eisessig durch Mischen gleicher Volumina zubereitet werden. 4.11. Färbelösung 4.11.1. Färbelösung (Vorratslösung 1) 3,0 g Coomassie Brilliant Blau G 250 (C.I. 42655) werden in 1 000 ml 90 %igem Methanol unter Verwendung eines Magnetrührers gelöst (ca. 45 Minuten); die Lösung wird durch zwei mittelschnelle Faltenfilter filtriert. 4.11.2. Färbelösung (Vorratslösung 2) 5,0 g Kupfersulfatpentahydrat (CuSO4.5 H2O) werden in 1 00 ml 20 %iger Essigsäure gelöst. 4.11.3. Färbelösung (gebrauchsfertig) Unmittelbar vor dem Färben werden jeweils 125 ml der Vorratslösung (4.11.1, 4.11.2) miteinander vermischt. Hinweis: Die Färbelösung ist am Tag des Ansetzens aufzubrauchen. 5. Geräte und Hilfsmittel 5.1. Glasplatten (265 × 125 × 4 mm); Gummiroller mit Walzenbreite von 15 cm; Nivelliertisch 5.2. Gelträgerfolie (265 × 125 mm) 5.3. Gegenfolie aus Polyster (280 × 125 mm). Beide Längsseiten werden mit je einem Prägebandstreifen (260 × 6 × 0,25 mm) abgeklebt (Abbildung 1) 5.4. Elektrofokussierkammer mit Kühlplatte (z. B. 260 × 125 mm) mit geeignetem Spannungsheber (' 2,5 kV) oder Elektrophoreseautomat 5.5. Umlaufkryostat, thermostatregelbar auf 12 ± 0,5 °C 5.6. Zentrifuge, einstellbar auf 3 000 g 5.7. Elektrodenstreifen (' 265 mm lang) 5.8. Tropfflaschen aus Kunststoff, für Anoden- und Kathodenlösung 5.9. Probenapplikatoren 10 × 5 mm (Viskose oder Filterpapier mit geringer Proteinadsorption). 5.10. Scheren, Skalpelle und Pinzetten aus Edelstahl 5.11. Färbe- und Entfärbeschalen aus Edelstahl oder Glas (z. B. Instrumentenschalen 260 × 150 mm) 5.12. Regelbarer Homogenisierstab (Schaftdurchmesser 10 mm), Drehzahlbereich 8 000 - 20 000 min-1 5.13. Magnetrührer 5.14. Ultraschallbad 5.15. Folienschweißgerät 5.16. Mikroliterpipetten 5-25 ml 5.17. Vakuumzentrifuge oder Gefriertrockner 5.18. Thermostatregelbares Wasserbad, einstellbar auf 35 und 40 ± 1 °C, mit Schüttelvorrichtung 5.19. Densitometerausrüstung, Registrierung bei l = 634 nm 6. Verfahren 6.1. Probenvorbereitung 6.1.1. Kaseinisolierung Die einer Trockenmasse von ca. 5 g entsprechende Menge Käse oder Referenzprobe - bei Weißschimmelkäse möglichst aus dem unreifen Mittelteil entnommen - wird in ein 10 ml Zentrifugenröhrchen eingewogen, mit 60 ml Wasser versetzt und mit einem Stabhomogenisator (8 000-10 000 U/min-1) homogenisiert. Das Homogenisat wird mit verdünnter Essigsäure (4.5) auf einen pH-Wert von 4,6 eingestellt und 5 Minuten bei 3 000 g zentrifugiert. Fette und Molke werden dekantiert und der Rückstand in 40 ml destilliertem Wasser, das mit verdünnter Essigsäure (4.5) auf einen pH-Wert von 4-5 eingestellt wurde, homogenisiert (20 000 min-1), mit 20 ml Dichlormethan (4.5) versetzt, nochmals homogenisiert und dann zentrifugiert (5 Minuten bei 3 000 g). Die zwischen wäßriger und organischer Phase schwimmende Kaseinschicht wird mit einem Spatel angehoben, damit beide Phasen dekantiert werden können. Das Kasein wird nochmals in 40 ml destilliertem Wasser (siehe oben) und 20 ml Dichlormethan homogenisiert und zentrifugiert. Dieser Vorgang ist so oft zu wiederholen, bis beide Extraktionsphasen farblos sind (zwei- bis dreimal). Der Proteinrückstand wird mit 50 ml trockenem Aceton (4.5) homogenisiert und über ein mittelschnelles Faltenpapierfilter abfiltriert. Das Filterretentat wird zweimal mit je 25 ml Aceton gewaschen, an der Luft oder im Stickstoffstrom trocknen gelassen und in einer Reibschale fein zerrieben.

Hinweis: Trockene Proteinisolate sind bei Raumtemperatur unbegrenzt haltbar. Zur schnellen Proteinisolierung wird die einer Trockenmasse von ca. 5 g entsprechende Menge zweimal mit je 50 ml Aceton (4.5) homogenisiert (20 000 U/min), 5 Minuten ruhen gelassen und dann durch ein Faltenfilter abfiltriert. Das Retentat wird wie oben beschrieben mit Aceton getrocknet und zerrieben. Das Schnellverfahren eignet sich nicht für Käse des Typs Roquefort. 6.1.2. Plasminspaltung der v-Kaseine zur Anreicherung der g-Kasein-Konzentration 25 mg Proteinisolat (Referenzmethode) bzw. 50 mg unbehandeltes Acetontrockenpulver (Schnellmethode) werden in 0,5 ml Ammoniumcarbonatpuffer (4.7.1) suspendiert und 20 Minuten z. B. unter Ultraschalleinwirkung homogenisiert. Das Homogenisat wird auf 40 °C erwärmt, mit 10 ml Plasmin (4.7.2) versetzt, durchmischt und eine Stunde bei 40 °C unter ständigem Schütteln inkubiert. Zur Enzyminhibierung werden 20 ml e-Aminocapronsäure (4.7.3), danach 200 mg fester Harnstoff und 2 mg Dithiothreitol zugesetzt. Hinweis: Zur Verbesserung der Symmetrie der fokussierten Kaseinbanden empfiehlt es sich, die Lösung nach Zusatz von e-Aminocapronsäure gefrierzutrocknen und den Probenrückstand in 0,5 ml Harnstoffpufferlösung (4.6) zu lösen. 6.2. Herstellen der harnstoffhaltigen Polyacrylamidgele Auf eine Glasplatte (5.1) die Gelträgerfolie (5.2) mit Hilfe einiger Tropfen Wasser aufwalzen, ausgetretenes Wasser entfernen. In gleicher Weise die mit Abstandshaltern (0,25 mm) versehene Gegenfolie (5.3) auf eine weitere Glasplatte aufwalzen. Diese dann auf einem Nivelliertisch horizontal ausrichten. Die frisch angesetzte, entgaste Gellösung (4.1.2) wird mit je 10 ml der Katalysatorlösungen TEMED und PER (4.1.3) versetzt, kurz durchmischt und gleichmässig auf die Mitte der Gegenfolie ausgegossen. Die Gelträgerplatte (Folienseite nach unten zeigend) wird mit einer Kante auf die nivellierte Gegenfolienplatte aufgesetzt und so langsam abgesenkt, daß sich zwischen den Folien ein Gelfilm bilden und sich gleichmässig und blasenfrei ausbreiten kann (Abbildung 3). Gelträgerfolienplatte mit Hilfe eines dünnen Spatels vollständig aufsetzen lassen und drei weitere Glasplatten als Andruckgewichte auflegen. Nach vollständiger Polymerisierung (ca. 60 Minuten) wird das auf der Gelträgerfolie anpolymerisierte Gel mitsamt Gegenfolie durch Verkanten der Glasplatten herausgelöst. Die Rückseite der Trägerfolie wird sorgfältig von Gelresten und Harnstoff gesäubert. Das "Gelsandwich" wird nun in einen Folienschlauch eingeschweisst und im Kühlschrank (maximal 6 Wochen) aufbewahrt. Hinweis: Die Gegenfolie mit den Abstandshaltern kann wiederverwendet werden. Das Polyacrylamidgel kann auf kleinere Formate zurechtgeschnitten werden, was bei kleinem Probenumfang oder bei Verwendung eines Elektrophoreseautomaten zu empfehlen ist (2 Gele im Format 4,5 × 5 cm). 6.3. Isoelektrische Fokussierung Der Kühlthermostat wird auf 12 °C eingestellt. Nach Abwischen der Gelträgerfolienrückseite mit Kerosin (4.2) werden einige Tropfen Kerosin auf die Mitte des Kühlblocks aufgebracht. Das "Gelsandwich" wird mit der Trägerseite nach unten blasenfrei aufgewalzt. Ausgetretenes Kerosin wird abgewischt und die Gegenfolie abgezogen. Die Elektrodenstreifen (5.7) werden mit den entsprechenden Elektrodenlösungen (4.3, 4.4) getränkt, auf die Gellänge zugeschnitten und auf die dafür vorgesehenen Stellen gelegt (Elektrodenabstand 9,5 cm). Die Fokussierung ist unter folgenden Bedingungen durchzuführen: 6.3.1. Gelformat 265 × 125 × 0,25 mm Schritt Zeit (Min) Spannung (V) Strom (mA) Leistung (W) Voltstunden (Vh) 1. Vorfokussierung 30 max. 2 500 max. 15 konst. 4 ca. 300 2. Probenfokussierung (*) 60 max. 2 500 max. 15 konst. 4 ca. 1 000 3. Endfokussierung 60 max. 2 500 max. 5 max. 20 ca. 3 000 40 max. 2 500 max. 6 max. 20 ca. 3 000 30 max. 2 500 max. 7 max. 25 ca. 2 500 (*) Probenauftrag: Nach der Vorfokussierung werden die Probenapplikatoren (10 × 5 mm) mittels einer Pipette mit je 18 ml der Probenlösungen beschickt, im Abstand von 1 mm zueinander 5 mm von der Anode entfernt auf das Gel aufgesetzt und leicht angedrückt. Die Fokussierung wird bei vorgenannten Bedingungen durchgeführt; die Probenapplikatoren nach 40 Minuten vorsichtig entfernen. Hinweis: Bei Änderung der Dicke oder Breite der Gele sind Strom und Leistung entsprechend anzupassen (z. B. Verdopplung von Stromstärke und Leistung bei Verwendung eines 0,5 mm dicken Gels im Format von 265 ×125 × 0,5 mm). 6.3.2. Beispiel eines Spannungsprogramms für einen Elektrophoreseautomaten (2 Gele je 5,0 × 4,5 cm); Elektroden ohne Elektrodenstreifen direkt auf das Gel aufbringen. Schritt Spannung (V) Strom (mA) Leistung (W) Temperatur (°C) Voltstunden (Vh) 1. Vorfokussierung 1 000 10,0 3,5 8 85 2. Probenfokussierung 250 5,0 2,5 8 30 3. Fokussierung 1 200 10,0 3,5 8 80 4. Fokussierung 1 500 5,0 7,0 8 570 Probenapplikator aufsetzen bei Schritt 2 bei 0000 Vh. Probenapplikator abnehmen bei Schritt 2 bei 0030 Vh. 6.4. Proteinanfärbung 6.4.1. Fixieren der Proteine Unmittelbar nach Abschalten des Stroms werden die Elektrodenstreifen entfernt. Das Gel wird sofort in eine mit 200 ml Fixierlösung (4.8) gefuellte Färbe- und Entfärbeschale überführt und 15 Minuten geschüttelt. 6.4.2. Waschen und Färben der Gelplatte Die Fixierlösung wird restlos abgegossen und die Gelplatte zweimal für je 30 Sekunden mit 100 ml Entfärbelösung (4.10) gespült. Spüllösung abgießen, 250 ml Färbelösung (4.10) in die Schale fuellen und 45 Minuten unter gelegentlichem Schütteln färben. 6.4.3. Entfärben der Gelplatte Die Färbelösung wird abgegossen, die Gelplatte zweimal mit je 100 ml Entfärbelösung (4.9) gespült und anschließend mindestens 2 × 15 Minuten in 200 ml Entfärbelösung geschwenkt, bis der Hintergrund klar und farblos ist. Die Gelplatte wird dann mit destilliertem Wasser (2 × 2 Minuten) gespült und an der Luft (2 bis 3 Stunden) oder mit dem Fön (ca. 10 bis 15 Minuten) getrocknet. Hinweis: Fixieren, Waschen, Färben und Entfärben bei 20 °C durchführen. 7. Auswertung Die Auswertung erfolgt durch Vergleich der Proteinbandenmuster der zu beurteilenden Probe mit Referenzproben auf dem gleichen Gel. Der Nachweis von Kuhmilch in Schafmilch oder daraus hergestellten Produkten wird vorzugsweise über die durch Plasminbehandlung (siehe 6.1.2) verstärkten g2- und g3-Kaseine geführt, deren isölektrische Punkte zwischen pH 6.5 und pH 7.5 liegen (Abbildungen 4 und 5). Die Nachweisgrenze des Verfahrens liegt unter 0,5 % Kuhmilch in Schafkäse. Zur visuellen Bestimmung des Kuhmilchanteils ist es ratsam, die Konzentration der Probem und der Standards auf die gleiche Intensität der Schaf-g2-Kaseine einzustellen (siehe "g2S" in den Abbildungen 4 und 5). Nur dann kann der Kuhmilchgehalt (kleiner, gleich oder grösser 1 %) in der zu beurteilenden Probe durch direkten Vergleich der Intensitäten der Kuh-g2-Kaseinzonen bestimmt werden (siehe "g2C" in den Abbildungen 4 und 5). Mit Hilfe eines Densitometers (5.19) kann das Peakflächenverhältnis der g2-Kaseine von Kuh und Schaf ermittelt werden (siehe Abbildung 5). Zur Beurteilung einer Probe ist dieser Wert mit den Peakflächenverhältnissen der auf dem selben Gel analysierten Standards mit 0 % bzw. 1 % Kuhmilch (4.8) zu vergleichen. Hinweis: Diese Methode ist zuverlässig, sofern im Standard mit 1 % Kuhmilch ein deutlich positives Signal für Kuh-g2-Kasein erhalten wird, im Standard mit 0 % Kuhmilch dagegen nicht. Anderenfalls ist das Verfahren unter genauer Beachtung der Methodenvorschrift zu optimieren. 8. Bibliographie Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine cheese by gel isölectric focusing of g2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990). Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholyte/immobilized pH gradient - isölectric focusing of g2-caseins using plasmin as signal amplifier. In: Electrophoresis-Forum '89 (B.J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, München (1989). Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -käse durch isölektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982). Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Z. Lebensm. Unters. Forsch. (in Vorbereitung). Radola B.J.: Ultrathin-layer isölectric focusing in 50-100 mm polyacrylamide gels on silanized glaß plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

Abb. 1. Schematische Darstellung der Gegenfolie

Abstandshalter

Polyesterfolie

Abb. 2. Kaseinschicht zwischen wäßriger und organischer Phase nach dem Zentrifugieren

H2O-Phase

Kasein

CH2Cl2-Phase

Abb. 3. Klapptechnik zur Herstellung ultradünner Polyacrylamidgele

a = Abstandshalter (0,25 mm); b = Gegenplatte (5.3); c, e = Glasplatten (5.1); d = Gellösung (4.1.2); f = Gelträgerplatte (5.2)

Abb. 4. Isoelektrische Fokussierung plasminbehandelter Kaseine von Käse des Typs Pecorino mit unterschiedlichem Kuhmilchgehalt. % CM = Kuhmilchgehalt C = Kuh, S = Schaf.

Käse des Typs Pecorino mit:

Abb. 5. Densitogrammreihe von Käseproben des Typs Pecorino mit 0, 1, 2, 3 und 7 % Kuhmilch nach isölektrischer Fokussierung. Die obere Hälfte des IEF-Gels wurde bei l = 634 nm analysiert. STD = Standardproben mit 0 bzw. 1 % Kuhmilch

(1) Zur Erzielung der angestrebten Trennung der -Kaseine haben sich die Produkte Ampholine pH 3,5-9,5 (Pharmacia-LKB) und Servalyt pH 6-7 (Serva) besonders bewährt.