Entscheidung der Kommission

vom 4. Juli 2000

zur Festlegung von Diagnosemethoden, Probenahmeverfahren und Kriterien für die Auswertung der Ergebnisse von Laboruntersuchungen zur Bestätigung und Differentialdiagnose der vesikulären Schweinekrankheit

(Bekanntgegeben unter Aktenzeichen K(2000) 1805)

(Text von Bedeutung für den EWR)

(2000/428/EG)

DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN -

gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Gemeinschaft,

gestützt auf die Richtlinie 92/119/EWG des Rates vom 17. Dezember 1992 mit allgemeinen Gemeinschaftsmaßnahmen zur Bekämpfung bestimmter Tierseuchen sowie besonderen Maßnahmen bezüglich der vesikulären Schweinekrankheit(1), zuletzt geändert durch die Akte über den Beitritt Österreichs, Finnlands und Schwedens, insbesondere auf Anhang II Nummer 3,

in Erwägung nachstehender Gründe:

(1) Es ist angezeigt, gemeinschaftlich einheitliche Diagnosemethoden, Probenahmeverfahren und Kriterien für die Auswertung der Ergebnisse von Laboruntersuchungen festzulegen, die zum Nachweis der vesikulären Schweinekrankheit (VSK) und ihrer Abgrenzung von der Maul- und Klauenseuche durchgeführt werden, damit beide Seuchen gezielter bekämpft werden können.

(2) Gemäß Anhang III der Richtlinie 92/119/EWG des Rates bestehen die Befugnisse und Aufgaben des gemeinschaftlichen Referenzlabors für vesikuläre Schweinekrankheit darin, im Benehmen mit der Kommission die in den Mitgliedstaaten angewandten Methoden zur Diagnose der Seuche zu koordinieren, u. a. durch regelmäßige Durchführung von Tests zum Vergleich der Diagnoseverfahren und Bereitstellung von Standardreagenzien auf Gemeinschaftsebene.

(3) In jüngster Zeit sind Labortests entwickelt worden, die eine schnelle Diagnose der vesikulären Schweinekrankheit und ihre Abgrenzung von der Maul- und Klauenseuche gewährleisten.

(4) Die Ergebnisse der letzten Vergleichstests, die auf Gemeinschaftsebene durchgeführt wurden, lassen insbesondere darauf schließen, daß die entwickelten Testverfahren verläßlich zum Nachweis von VSKV-Antigen oder VSKV-Genom eingesetzt und den bislang zur virologischen Diagnose angewandten Virusisolationstest durchaus ergänzen können.

(5) Anhand der Erfahrungen, die in den vergangenen Jahren bei der Bekämpfung der veskulären Schweinekrankheit erzielt wurden, konnten Probenahmeverfahren und Kriterien für die Auswertung von Laborbefunden herauskristallisiert werden, die für unterschiedliche Situationen eine gezielte Seuchendiagnose gewährleisten.

(6) Stellungnahme und Empfehlungen des Wissenschaftlichen Ausschusses für Tiergesundheit und Tierschutz sind berücksichtigt worden.

(7) Die in dieser Entscheidung vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des Ständigen Veterinärausschusses -

HAT FOLGENDE ENTSCHEIDUNG ERLASSEN:

Artikel 1

(1) Die Mitgliedstaaten tragen dafür Sorge, daß die Bestätigung der vesikulären Schweinekrankheit und ihre Abgrenzung von der Maul- und Klauenseuche nach folgenden Kriterien erfolgt:

a) Feststellung klinischer Krankheitssymptome;

b) Nachweis des Virus, Antigens oder Genoms in Epithelgewebe-, Aphthenfluessigkeits- oder Kotproben;

c) Demonstration einer spezifischen Antikörperreaktion in Serumproben.

Dabei wird den im Leitfaden im Anhang dieser Entscheidung festgelegten Diagnosemethoden, Probenahmeverfahren und Kriterien für die Auswertung der Laborbefunde Rechnung getragen.

(2) Die nationalen Diagnoselaboratorien gemäß Anhang II Nummer 5 der Richtlinie 92/119/EWG können die im Leitfaden im Anhang dieser Entscheidung festgelegten Labortests jedoch ändern oder unterschiedliche Testmethoden anwenden, sofern dieselbe Empfindlichkeit und Spezifität gewährleistet ist.

Die Empfindlichkeit und Spezifität geänderter oder unterschiedlicherer Testmethoden ist im Rahmen der regelmäßigen Vergleichstests des gemeinschaftlichen Referenzlabors für vesikuläre Schweinekrankheit zu überprüfen.

Artikel 2

Diese Entscheidung gilt ab 1. Oktober 2000.

Artikel 3

Diese Entscheidung ist an alle Mitgliedstaaten gerichtet.

Brüssel, den 4. Juli 2000

Für die Kommission

David Byrne

Mitglied der Kommission

(1) ABl. L 62 vom 15.3.1993, S. 69.

ANHANG

LEITFADEN FÜR DIAGNOSEMETHODEN, PROBENAHMEVERFAHREN UND KRITERIEN FÜR DIE AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE VON LABORUNTERSUCHUNGEN ZUR BESTÄTIGUNG UND DIFFERENTIALDIAGNOSE DER VESIKULÄREN SCHWEINEKRANKHEIT

KAPITEL I

Einleitung, Ziele und Definitionen

1. Dieser Leitfaden

a) enthält Leitlinien und Mindestkriterien für Diagnosemethoden und Probenahmeverfahren sowie Kriterien für die Auswertung der Ergebnisse von Laboruntersuchungen zur gezielten Diagnose und Abgrenzung der vesikulären Schweinekrankheit von der Maul- und Klauenseuche;

b) übernimmt die Bestimmungen des Anhangs II der Richtlinie 92/119/EWG und insbesondere der Nummern 4, 7 und 8 des genannten Anhangs;

c) richtet sich im wesentlichen an die für die Bekämpfung der vesikulären Schweinekrankheit zuständigen Behörden und ist daher mehr den Prinzipien und Anwendungsbereichen der Laboruntersuchungen und der Auswertung von Laborbefunden gewidmet als detaillierten Labormethoden.

2. Im Sinne dieses Leitfadens gelten folgende Definitionen:

a) "seropositives Schwein": Schwein, dessen Serum im Virusneutralisationstest des nationalen Diagnoselabors einen Antikörpertiter aufweist, der dem Titer des VSK-Standardserums 4 (vgl. Kapitel X) gleich oder größer ist;

b) "singleton reactor": einzelnes Schwein eines Betriebs mit seropositivem VSK-Befund, von dem jedoch bekannt ist, daß es zu keiner Zeit mit dem VSK-Virus in Berührung gekommen ist und das den Erreger nachweislich nicht auf Kontaktschweine übertragen hat. Ein seropositives Schwein wird als "singleton reactor" bestätigt, wenn die Bedingungen gemäß Kapitel VIII Abschnitt C gegeben sind;

c) "Kontaktschwein": Schwein, das mit einem oder mehreren seropositiven oder VSK-verdächtigen Schweinen in direktem Kontakt ist oder innerhalb der letzten 28 Tage in direktem Kontakt war. Kontaktschweine können Bucht- oder Stallgefährten sein bzw. gewesen sein, soweit ein Kontakt von Tier zu Tier möglich ist bzw. war.

KAPITEL II

Leitlinien für die Untersuchung von Schweinen mit klinischen Anzeichen der vesikulären Schweinekrankheit

1. Die Mitgliedstaaten tragen dafür Sorge, daß bei VSK-Verdacht in einem Betrieb eine statistisch repräsentative Anzahl Schweine so schnell wie möglich vom amtlichen Tierarzt auf die klinischen Krankheitsanzeichen gemäß Kapitel IX untersucht wird.

2. Die Mitgliedstaaten tragen dafür Sorge, daß bei Vorliegen von Anzeichen, die auf vesikuläre Schweinekrankheit oder Maul- und Klauenseuche schließen lassen, durch angemessene Probenahmen und Laboruntersuchungen im Sinne der Kapitel IV, VII und VIII dieses Leitfadens so schnell wie möglich eine Differentialdiagnose gestellt wird.

KAPITEL III

Allgemeine Verfahrensvorschriften für Probenahme und Beförderung des Probenmaterials

1. Alle Personen, die VSK-verdächtige Betriebe betreten oder verlassen, treffen strikte. Hygienevorkehrungen, um das Risiko einer Kontamination oder der Erregerverschleppung zu reduzieren.

2. Jedes einzelne Schwein, von dem eine Probe entnommen wird, ist so zu kennzeichnen, daß es im Hinblick auf eine etwaige Wiederholungsuntersuchung jederzeit identifiziert werden kann. Es wird empfohlen, den Standort aller Schweine des Betriebs, von denen Proben entnommen wurden, und ihre jeweiligen Kennummern aufzuzeichnen, insbesondere, wenn die Probenahme seuchenverdächtige Tiere betrifft.

3. Die entnommenen Proben werden mit entsprechenden Formularen, in denen die Krankheitsgeschichte der betreffenden Schweine sowie etwaige klinische Krankheitsanzeichen vermerkt sind, an das zuständige Untersuchungslabor weitergeleitet.

4. Da bei Anzeichen einer vesikulären Erkrankung Maul- und Klauenseuche nicht ausgeschlossen werden kann, müssen Proben aus seuchenverdächtigem Material besonders sorgfältig verpackt werden. Das Verpackungsmaterial sollte insbesondere so beschaffen sein, daß die Probenbehälter nicht zerbrechen oder auslaufen können und kein Kontaminationsrisiko besteht und daß das Probenmaterial in einwandfreiem Zustand im Labor ankommt. Bei Verwendung von Eis innerhalb der Verpackung ist dafür Sorge zu tragen, daß kein Eiswasser auslaufen kann. Probenbehälter mit VSK-verdächtigem Material dürfen auf keinen Fall geöffnet werden, bevor sie im Labor eintreffen.

5. VSK-verdächtiges Probenmaterial darf nur in einem Diagnoselabor analysiert werden, das nach Maßgabe der geltenden Gemeinschaftsvorschriften zur Bekämpfung der Maul- und Klauenseuche zur Manipulation von MKS-Viren zugelassen ist, es sei denn, der Verdacht auf Maul- und Klauenseuche wurde bereits entkräftet.

6. Proben können bei 4 °C befördert werden, wenn der Transport zum Labor voraussichtlich weniger als 48 Stunden dauert; ansonsten sind sie auf einer Temperatur von nicht über - 20 °C zu halten.

7. Probenmaterial aus anderen Mitgliedstaaten als dem Vereinigten Königreich, das für das gemeinschaftliche Referenzlabor in Pirbright bestimmt ist, dürfen nur als Luftfracht an den Flughafen London-Heathrow oder London-Gatwick befördert werden. Vor dem Versand sind dem Labor per Telefax (+44-1483-232621) oder E-mail Flugnummer, Flugdatum, voraussichtliche Ankunftszeit und Luftfrachtbriefnummer mitzuteilen, damit das Frachtpaket bei seiner Ankunft identifiziert werden kann. Das Paket ist wie folgt zu adressieren: Institute for Animal Health Pirbright Laboratory Community Reference Laboratory for Swine Vesicular Disease Ash Road, Pirbright, Woking Surrey GU24 ONF England , UK

Das Verpackungsetikett muß außerdem folgende Angaben tragen: "Pathologisches Tiermaterial ohne Handelswert. Verderblich. Zerbrechlich. Am Ankunftsflughafen nur an den Empfänger auszuhändigen. Öffnen nur im Labor. (Animal Pathological Material of no commercial value. Perishable. Fragile. To be collected at airport by addressee. Not to be opened outside the laboratory)".

Abholberechtigt am Flughafen ist das Personal des gemeinschaftlichen Referenzlabors vorbehaltlich der Vorlage einer vom britischen Ministerium für Landwirtschaft, Fischerei und Ernährung ausgestellten besonderen Einfuhrgenehmigung. Da es sich hier um eine feste Vereinbarung handelt, ist eine separate Zulassung im Einzelfall nicht erforderlich. VSK-verdächtige Proben dürfen auf keinen Fall im Handgepäck von unbefugtem Personal mitgeführt werden. Auch Kurier-Zustellungen sind nicht zulässig.

8. Die Beförderung von Probenmaterial zu nationalen Laboratorien erfolgt nach Weisung der zuständigen Behörde des betreffenden Mitgliedstaats.

KAPITEL IV

Verfahrensvorschriften für Probenahmen in Betrieben mit klinischen verdächtigen Schweinen

1. Ist ein Betrieb aufgrund klinischer Krankheitsanzeichen VSK-verdächtig, so werden zur Seuchenbestätigung und Abgrenzung von der Maul- und Klauenseuche von repräsentativen Gruppen von Schweinen mit diesen Anzeichen Proben entnommen.

2. Bevorzugtes Probenmaterial sind Epithelgewebe und Flüssigkeit aus nicht aufgebrochenen oder frisch aufgebrochenen Aphthen von Schweinen mit typischen Krankheitssymptomen, die sich zum Nachweis des VSK-Virus, seines Antigens oder Genoms besonders eignen. Es wird empfohlen, von ungefähr fünf bis sechs Schweinen Proben zu entnehmen.

3. Selbst wenn frisches Epithelgewebe und frische Aphthenfluessigkeit in ausreichender Menge (mindestens 1 g) zur Verfügung stehen, müssen zusätzlich noch folgende Proben entnommen werden:

a) Blutproben von seuchenverdächtigen Schweinen und Kontaktschweinen für die serologische Untersuchung und

b) Kotproben von seuchenverdächtigen Schweinen und vom Boden ihrer Bucht oder aus angrenzenden Buchten für die virologische Untersuchung.

4. Die Proben werden wie folgt entnommen und befördert:

a) Epithelgewebe und Aphthenfluessigkeit:

- soweit möglich mindestens 1 g Epithelgewebe aus einer unaufgebrochenen oder frisch aufgebrochenen Aphthe, wobei empfohlen, wird, das Tier aus Tierschutzgründen und zum Schutz des Personals gegen Verletzungen vor der Entnahme medikamentös ruhigzustellen;

- soweit die Proben sofort (d. h. innerhalb von drei Stunden nach der Entnahme) zum nationalen Labor befördert werden, können die Epithelgewebeproben trocken und gekühlt befördert werden. Wird die Dreistundenfrist jedoch voraussichtlich überschritten, so sind die Proben in eine kleine Menge Transportmedium, bestehend zu gleichen Teilen aus Glyzerin und 0,04 M Phosphatpuffer oder einem gleichwertigen Puffer (z. B. Hepes) zu geben, damit der pH-Wert auf dem für das Überleben des MKS-Virus optimalen Niveau (7,2-7,6) gehalten werden kann. Zusätzlich sollte das Transportmedium antimikrobiell wirksame Antibiotika enthalten. Als Antibiotika in folgender Endkonzentration pro ml kommen in Frage:

i) Penizillin 1000 I.E.;

ii) Neomycin-Sulfat 100 I.E.;

iii) Polymyxin B-Sulfat 50 I.E.;

iv) Mycostatin 100 I.E;

- soweit Flüssigkeit aus einer unaufgebrochenen Aphthe entnommen werden kann, ist sie unverdünnt in einem separaten Behältnis zu befördern.

b) Blutproben:

- Blutproben können für serologische oder virologische Untersuchungen entnommen werden. Im allgemeinen werden sie jedoch nur von Schweinen entnommen, bei denen der Verdacht besteht, daß sie von einer klinischen oder subklinischen Infektion genesen sind, und nur zum Antikörpernachweis verwendet, da Epithelgewebe, Aphthenfluessigkeit und Kotproben von Schweinen mit klinischen Symptomen für den Virusnachweis besser geeignet sind als Blutproben. Es wird empfohlen, Vollblut zu entnehmen und ohne Zugabe vori Gerinnungshemmern Vacutainer zu verwenden, die verschlossen befördert werden.

c) Kotproben:

- Kotproben von Buchtenböden aus Betrieben, bei denen der Verdacht besteht, daß sie VSKV-infizierte Schweine halten oder gehalten haben, oder Kotabstriche und Kotproben VSK-verdächtiger lebender Schweine sind in stabile, lecksichere Behältnisse zu geben.

Behältnisse mit VSK-verdächtigen Proben müssen vor ihrer Beförderung zum Labor außen desinfiziert werden. Als Desinfektionsmittel sind geeignet:

- Natriumhydroxid (1:100 verdünnt);

- Formalin (1:9 verdünnte Formalinlösung mit mindestens 34 % Formaldehyd);

- Natriumhypochlorit (2 % verfügbares Chlor).

Beim Umgang mit diesen Desinfektionsmitteln ist Vorsicht geboten.

KAPITEL V

Verfahrensvorschriften für Probenahmen zur serologischen Überwachung der vesikulären Schweinekrankheit

1. Zum Zwecke der

a) Überwachung von Betrieben, bei denen nichts darauf schließen läßt, daß sie verseucht oder seuchenverdächtig sind,

b) Überwachung von Schlachthöfen, Märkten, Sammelstellen o. ä. durch routinemäßige serologische Stichprobeuntersuchungen,

c) nichtdiskriminatorischen Überwachung von Schweinen, die der betreffende Betrieb aus anderen Mitgliedstaaten bezogen hat,

werden Blutproben für die serologische Untersuchung entweder im Rahmen der Überwachungs- und Tilgungsprogramme oder -pläne, die nach Maßgabe der Entscheidung 90/424/EWG des Rates(1) oder der Richtlinie 90/425/EWG(2) genehmigt hat, oder - wenn keine derartigen Programme oder Pläne vorliegen - nach den Verfahren entnommen, die die zuständigen Behörden der Mitgliedstaaten festgelegt haben.

2. Zum Zwecke der

a) Überwachung von Betrieben innerhalb der Schutz- und Überwachungszonen, die nach Bestätigung von Seuchenausbrüchen gemäß Anhang II Nummern 7 und 8 der Richtlinie 92/119/EWG abgegrenzt wurden, oder der

b) Überwachung der Betriebe gemäß Artikel 9 der Richtlinie 92/119/EWG des Rates

werden Blutproben für die serologische Untersuchung nach folgendem Verfahren entnommen:

- im Falle von Zuchtbetrieben: nach einem Zufallsstichprobeverfahren, das gewährleistet, daß mit einer Nachweissicherheit von 95 % eine Befallsrate von 5 % festgestellt werden kann;

- im Falle von reinen Mastbetrieben: nach einem Stichprobeverfahren, das gewährleistet, daß insgesamt aus möglichst vielen Buchten, die nach dem Zufallsprinzip ausgewählt werden, zumindest so viele Proben entnommen werden, wie erforderlich sind, um mit einer Nachweissicherheit von 95 % eine Befallsrate von 5 % festzustellen;

- im Falle gemischter Zucht- und Mastbetriebe: nach einem Verfahren, wonach aus jeder separat untergebrachten Gruppe von Schweinen so viele Proben entnommen werden, wie erforderlich sind, um mit einer Nachweissicherheit von 95 % eine Befallsrate von 5 % festzustellen.

KAPITEL VI

Weitere Maßnahmen und Wiederholungsuntersuchung bei Positivbefunden

1. Wird in einem Betrieb nach der Überwachung gemäß Kapitel V Nummer 1 Buchstabe a) oder Kapitel V Nummer 2 ein einziges seropositives Schwein festgestellt, so veranlaßt die zuständige Behörde folgendes:

a) In dem betreffenden Betrieb werden, soweit dies nicht bereits geschehen ist, die Maßnahmen gemäß Artikel4 der Richtlinie 92/119/EWG durchgeführt;

b) der Betrieb wird gemäß Kapitel II Nummer 1 kontrolliert;

c) für die serologische Untersuchung werden Blutproben entnommen von

- dem VSK-verdächtigen Schwein;

- Kontaktschweinen aus der Bucht des verdächtigen Schweins oder aus. angrenzenden Buchten, wobei so verfahren wird, daß sich in der Bucht mit einer Nachweissicherheit von 95 % eine Befallsrate von 5 % feststellen läßt.

2. Die zuständige Behörde kann jedoch beschließen, die Maßnahmen gemäß Nummer 1 Buchstabe a) aufzuheben, wenn

a) die epidemiologische Untersuchung gemäß Artikel 8 der Richtlinie 92/119/EWG darauf schließen läßt, daß vesikuläre Schweinekrankheit nicht in den Betrieb eingeschleppt wurde;

b) im Betrieb keine klinischen VSK-Symptome festgestellt worden sind, und

c) der Betrieb nicht in einer Überwachungs- oder Sperrzone liegt, die nach Bestätigung eines Seuchenausbruchs abgegrenzt oder die im Zusammenhang mit einem bestätigten Seuchenausbruch anderweitigen Beschränkungen unterliegen,

und sofern

- Schweine nicht zum Zwecke des innergemeinschaftlichen Handels aus dem Betrieb verbracht werden, und

- Schweine aus dem fraglichen Betrieb nur zur unverzüglichen Schlachtung in einen Schlachthof bzw. in einen anderen Betrieb verbracht werden, aus dem keine Schweine in den innergemeinschaftlichen Handel gelangen,

bis die Ergebnisse der weiteren Kontrollen und der serologischen Untersuchungen auf vesikuläre Schweinepest zeigen, daß der Verdacht auf vesikuläre Schweinekrankheit definitiv entkräftet werden kann.

3. Ergeben die Kontrollen oder die serologischen Untersuchungen gemäß Nummer 1 Buchstaben b) und c)

a) Negativbefunde oder bestätigt sich ein Positivbefund nur bei dem bereits zuvor seropositiven Schwein ("singleton reactor"), so kann vesikuläre Schweinekrankheit ausgeschlossen werden. Die Maßnahmen gemäß Nummer 1 Buchstabe a) werden aufgehoben, es sei denn, der Betrieb liegt in einer um einen Seuchenherd abgegrenzten Schutz- oder Überwachungszone, in der die Maßnahmen gemäß Anhang II Nummer 7 bzw. 8 der Richtlinie 92/119/EWG in Kraft bleiben müssen;

b) mehr als ein seropositives Schwein im Betrieb, so muß die vesikuläre Schweinekrankheit entweder bestätigt werden, oder in dem Betrieb müssen - wenn die Bedingungen für die Seuchenbestätigung gemäß Anhang II Nummer 4 der Richtlinie 92/119/EWG nicht gegeben sind - nach dem Verfahren gemäß Nummer 4 dieser Entscheidung weitere Proben entnommen werden.

4. Ergeben die Probenahme und die serologische Untersuchung gemäß Kapitel V Nummer 1 Buchstaben a) und c) oder Kapitel V Nummer 2, daß mehrere Schweine des Betriebs seropositiv sind, obgleich die Bedingungen des Anhangs II Nummer 4 der Richtlinie 92/119/EWG für die Bestätigung der vesikulären Schweinekrankheit nicht erfuellt sind, so veranlaßt die zuständige Behörde folgendes:

a) Die Maßnahmen gemäß Artikel 4 der Richtlinie 92/119/EWG werden angewendet bzw. aufrechterhalten;

b) der Betrieb wird gemäß Kapitel II Nummer 1 kontrolliert;

c) von den seropositiven Schweinen und von Kontaktschweinen werden gemäß Nummer 1 Buchstabe c) weitere Blutproben für serologische Untersuchungen entnommen;

d) nach dem Verfahren des Kapitels V Nummer 2 werden für serologische Untersuchungen Blutproben von Schweinen in anderen Betriebsgebäuden entnommen;

e) für virologische Untersuchungen wird eine ausreichende Anzahl Kotproben entnommen

- von seropositiven Schweinen,

- vom Boden der Buchten seropositiver Schweine und von angrenzenden Buchten,

- aus nach dem Zufallsprinzip ausgewählten Buchten in anderen Betriebsgebäuden.

Kotproben gemäß dem ersten und zweiten Gedankenstrich werden so bald wie möglich untersucht. Fallen diese Untersuchungen negativ aus, obgleich die Ergebnisse der serologischen Untersuchungen darauf schließen lassen, daß die vesikuläre Schweinekrankheit möglicherweise auf andere Gebäude übergegriffen hat; so werden auch die Kotproben gemäß dem dritten Gedankenstrich untersucht.

Sind die Bedingungen des Anhangs II Nummer 4 der Richtlinie 92/119/EWG in bezug auf die Bestätigung der vesikulären Schweinekrankheit auch nach diesen weiteren Kontrollen und Untersuchungen noch nicht gegeben, so werden alle seropositiven Schweine getötet oder gemäß Anhang II Nummer 4 Buchstabe d) der Richtlinie 92/119/EWG geschlachtet. Werden jedoch zusätzlich zu den schon vorliegenden Seropositivbefunden aus der vorangegangenen Untersuchung noch weitere seropositive Schweine festgestellt, so gelten mutatis mutandis weiterhin die Bestimmungen und Verfahren gemäß der Buchstaben a), b), c), d) und e) dieser Nummer.

5. Werden unbeschadet der Maßnahmen gemäß Artikel 9 der Richtlinie 92/119/EWG im Anschluß an die Überwachungsmaßnahmen gemäß Kapitel V Nummer 1 Buchstaben b) oder c) ein oder mehrere seropositive Schweine festgestellt, so veranlaßt die zuständige Behörde folgendes:

a) Soweit erforderlich und durchführbar werden unter Berücksichtigung der Lage vor Ort weitere geeignete Kontrollen, einschließlich Probenahmen, durchgeführt, um an dem Ort, an dem diese Tiere ermittelt wurden, den Verdacht auf vesikuläre Schweinekrankheit zu bestätigen oder zu entkräften;

b) in den Herkunftsbetrieben der betreffenden Schweine werden die Maßnahmen gemäß Artikel 4 der Richtlinie 92/119/EWG des Rates durchgeführt;

c) der Herkunftsbetrieb der betreffenden Schweine wird gemäß Kapitel II Nummer 1 kontrolliert;

d) von den Schweinen im Herkunftsbetrieb der seropositiven Schweine werden für die serologische Untersuchung gemäß Kapitel V Nummer 2 Blutproben entnommen.

6. Die zuständige Behörde kann jedoch beschließen, die Maßnahmen gemäß Nummer 5 Buchstabe b) aufzuheben, wenn

a) die epidemiologische Untersuchung gemäß Artikel 4 und 8 der Richtlinie 92/119/EWG des Rates darauf schließen läßt, daß die vesikuläre Schweinekrankheit nicht in den Betrieb eingeschleppt wurde;

b) wenn im Betrieb keine klinischen VSK-Symptome festgestellt worden sind;

c) der Betrieb nicht in einer Überwachungs- oder Sperrzone liegt, die nach Bestätigung eines Seuchenausbruchs abgegrenzt wurden oder die im Zusammenhang mit einem bestätigten Seuchenausbruch anderweitigen Beschränkungen unterliegen,

und sofern

- Schweine nicht zum Zwecke des innergemeinschaftlichen Handels aus dem Betrieb verbracht werden, und

- Schweine aus dem fraglichen Betrieb nur zur unverzüglichen Schlachtung in einen Schlachthof bzw. in einen anderen Betrieb verbracht werden, aus dem keine Schweine in den innergemeinschaftlichen Handel gelangen,

bis die Ergebnisse der weiteren Kontrollen und serologischen Untersuchungen, die an dem Ort, an dem die seropositiven Tiere ermittelt wurden, und im Herkunftsbetrieb der betreffenden Tiere durchgeführt worden sind, zeigen, daß der Verdacht auf vesikuläre Schweinekrankheit definitiv entkräftet werden kann.

KAPITEL VII

Prinzipien und Anwendungsbereiche virologischer Nachweisverfahren und Auswertung der Befunde

A. Nachweis von Virusantigen

1. Der indirekte ELISA (Sandwich-Methode) hat die Komplementbindungsreaktion (KBR) als bevorzugte Methode zum Nachweis von VSK-Virusantigen ersetzt. Der Test wird auch für die MKS-Diagnose eingesetzt. Die Untersuchungen auf MKS- und VSK-Viren müssen gleichzeitig durchgeführt werden, es sei denn, der MKS-Verdacht ist bereits entkräftet worden. Insbesondere wird empfohlen, Epithelgewebe- oder Aphthenfluessigkeitsproben zu verwenden, in denen bei akut infizierten Schweinen innerhalb weniger Stunden sowohl VSK- als auch MKS-Viren mit hohen Titern präsent und nachweisbar sind(3).

ELISA-Mikrotiterplatten werden doppelreihig mit Kaninchen-Antikörpern gegen VSKV und jeden der sieben MKSV-Serotypen beschichtet. Dieser festen Phase wird in jeder Reihe das Untersuchungsmaterial zugegeben. Kontrollseren sind ebenfalls vorgesehen. Als nächster Reaktionsschritt wird in die betreffenden Reihen homologes Meerschweinchen-Nachweisserum hinzugefügt, gefolgt von enzymmarkiertem (Meerrettich-Peroxidase) Kaninchen-Anti-Meerschweinchen-Serum (Konjugat). Auf jeden Reaktionsschritt folgt ein Waschvorgang zur Entfernung ungebundener Reagenzien. Eine positive Reaktion liegt vor, wenn nach Zugabe von Chromogen und Substrat eine Farbreaktion entsteht. Bei stark positiven Reaktionen ist die Farbbildung mit bloßem Auge erkennbar. Die Ergebnisse lassen sich jedoch auch spektrophotometrisch ablesen; in diesem Falle zeigt eine Lichtabsorption von mehr als 0,1 über dem Hintergrund eine positive Reaktion an.

2. Zum Nachweis von VSK-Antigen in Epithelgewebeproben, Aphthenfluessigkeit oder infizierten Gewebekulturen und zur MKS-Abgrenzung können alternativ auch monospezifische ELISA-Techniken herangezogen werden, bei denen als feste Phase ausgewählte monoklonale Antikörper und als Nachweisantikörper peroxidase-konjugierte monoklonale Antikörper verwendet werden.

3. Zur Untersuchung von Antigenabweichungen zwischen VSK-Virusstämmen kann eine monospezifische ELISA-Methodik angewendet werden. Auf Gewebekulturen angezüchtete Virusantigene werden durch ein an die Festphase geladenes Kaninchen-Hyperimmun-Antiserum gegen VSKV gebunden. Das Untersuchungsmaterial wird nach Vermischung mit geeigneten Gruppen monoklonaler Antikörper in ein Reaktionsgefäß gefuellt, und die Bindung monoklonaler Antikörper an Feldstämme wird mit der Bindung monoklonaler Antikörper an die Elternstämme verglichen. Identische Bindung ist ein Zeichen für das Vorhandensein von Epitopen, die Eltern- und Feldstämmen gemeinsam sind.

B. Isolierung und Anzüchtung von VSK-Virus

1. Empfindliche Zellkulturen werden routinemäßig mit geklärten Suspensionen aus VSK-verdächtigen Epithelgewebe-, Aphthenfluessigkeits- oder Kotproben beimpft. Reicht das zur Untersuchung eingesendete Läsionsmaterial qualitativ und quantitativ für einen sofortigen ELISA nicht aus, so muß zur Vermehrung des viralen Antigens Virusmaterial im Gewebekulturverfahren angezüchtet werden.

2. Zur Virusisolierung und -vermehrung werden Einschichtkulturen aus IB-RS-2-Zellen mit geklärter Epithelgewebesuspension beimpft. Um eine Interferoninduzierte Hemmung der VSK-Virusvermehrung zu vermeiden, sollte die Epithelgewebesuspension einmal stark verdünnt ( 1:500) und einmal schwach verdünnt (1:10) verwendet werden. Für die Virusisolierung werden dem Trägermedium lediglich Antibiotika zugegeben. Zur MKS-Abgrenzung sollten die Kulturen auch mit primären Rinderschilddrüsenzellen oder Babyhamsternierenzellen (BHK-21) beimpft werden.

3. Tritt ein zytopathischer Effekt (CPE) ein, ist der Überstand bei vollständiger Ausbildung des CPE aus den positiven Kulturen abzusaugen und zur Virusidentifizierung im ELISA zu verwenden. Negative Kulturen sind nach 48 oder 72 Stunden auf frische Gewebekulturen zu übertragen, und diese Blindpassage ist maximal 72 Stunden später zu prüfen. Tritt nach einer weiteren Blindpassage kein CPE auf, so kann die Probe als frei von Lebendvirus, also als negativ, bewertet werden.

4. Kotprobensuspensionen können nach dem Verfahren unter Nummer 1 bearbeitet werden. Da in Kot in der Regel weniger Virus vorhanden ist als in Epithelgewebe, ist bei Nichteintreten eines zytopathischen Effekts in den beiden ersten Passagen unbedingt eine dritte Passage erforderlich.

5. Die simultane Beimpfung einer porcinen Zellinie und eines der vorgenannten Gewebekultursysteme (vorzugsweise primäre Rinderschilddrüsenzellen) ist bei der Untersuchung von Aphthenproben auf VSKV- oder MKSV-Haltigkeit hilfreich, da sich VSK-Viren nur in porcinen Zellen vermehren. Es ist jedoch nicht auszuschließen, daß auch MKS-Virusisolate, die mehrmals zwischen Schweinen übertragen wurden, vorzugsweise in porcinen Zellkulturen wachsen.

C. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Genomnachweis

1. Methoden zur Nukleinsäureerkennung eignen sich zum Nachweis von VSKV-Genom in klinischem Untersuchungsmaterial anhand der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und zur Feststellung der Zusammenhänge zwischen VSKV-Isolaten durch Bestimmung der Nukleotidsequenz eines Teils des Genoms. PCR-Techniken sind entwickelt worden, um die Diagnoseempfindlichkeit zu verbessern. Es sind leicht unterschiedliche Umkehrtranskriptase-PCR-Verfahren beschrieben worden, bei denen Reaktionsinitiatoren (primers) verwendet werden, die stark konservierten Regionen in den 1C- und 1D-Genen entsprechen.

2. Die PCR-Technik ist ein schnelles Verfahren (Ergebnisse liegen in der Regel innerhalb von 24 Stunden vor), mit dem sich alle VSKV-Genotypen nachweisen lassen und das empfindlich genug ist, um auch für Proben von klinisch verdächtigen Tieren verwendet werden zu können.

3. Bei Verdacht auf eine subklinische Infektion oder wenn Proben zu einem Zeitpunkt entnommen werden, an dem keine klinischen Symptome mehr vorhanden sind, oder bei der Aufbereitung von Kotproben erweisen sich komplexere RT-PCR-Techniken (wie mehrstufige RT-PCR, Immun-PCR, ELISA-PCR und ausgefeiltere RNA-Extraktionsmethoden) als mindestens ebenso empfindliche, aber wesentlich schnellere Nachweismethoden als multiple Passagen auf Gewebekulturen.

4. Durch Sequenzierung von ungefähr 200 Nukleotiden innerhalb des 1D-Gens, das das Hauptstrukturprotein VP1 kodiert, können VSK-Virusstämme entsprechend ihrer Sequenzhomologie gruppiert und krankheitserregende Stämme, die in unterschiedlichen Regionen oder zu unterschiedlichen Zeiten isoliert wurden, epidemiologisch in Beziehung gesetzt werden.

D. Auswertung der Befunde virologischer Nachweisverfahren

Der VSK-Virusantigen- oder -Virusgenomnachweis mittels ELISA und PCR ist zur Diagnose ebenso geeignet wie die Virusisolierung.

Die Virusisolierung ist jedoch Standardmethode und muß erforderlichenfalls als Bestätigungstest herangezogen werden, insbesondere wenn ein positiver ELISA- oder PCR-Befund nicht assoziiert wird mit

a) klinischen Krankheitssymptomen,

b) seropositiven Schweinen oder

c) einer unmittelbaren epidemiologischen Verbindung zu einem bestätigten Seuchenherd.

KAPITEL VIII

Prinzipien und Anwendungsbereiche serologischer Nachweisverfahren und Auswertung der Befunde

A. Virusneutralisation (VN)

1. Der quantitative Mikroneutralisationstest zum Nachweis von VSKV-Antikörpern wird mit IB-RS-2-Zellen oder einem gleichwertigen Zellsystem in flachgrundigen Mikrotiter-Platten durchgeführt.

2. Das Virus wird in IB-RS-2-Einschichtkulturen vermehrt und entweder nach Zugabe von 50 % Glyzerin bei - 20 °C oder ohne Zugabe von Glyzerin bei - 70 °C aufbewahrt. Die Seren werden vor dem Testen für 30 Minuten bei 56 °C inaktiviert.

B. ELISA-Essays

1. Der zum Antikörpernachweis eingesetzte ELISA ist der monospezifische kompetitive ELISA. Enthält die Serumprobe VSKV-Antikörper, so wird die Bindung eines ausgewählten peroxidase-konjugierten monoklonalen Antikörpers an das Virusantigen gehemmt.

Bei dieser Methode wird das VSKV-Antigen anhand monoklonaler Antikörper an die feste Phase gebunden. Im nächsten Reaktionsschritt werden die Serumproben in geeigneter Verdünnung inkubiert; anschließend werden peroxidase-konjugierte monoklonale Antikörper zugegeben. Die Hemmung der Antikörperbindung wird mittels Substrat und Chromogen gemessen.

2. Anhand eines indirekten "trapping" ELISAs, bei dem porcine IgG oder VSKV-spezifische IgM mit isotypen-spezifischen monoklonalen Antikörpern nachgewiesen werden, läßt sich der Zeitpunkt der Infektion des Schweins oder des Haltungsbetriebs bestimmen.

Beim isotypen-spezifischen ELISA wird das Virusantigen mit antigenfangenden Antikörpern an die feste Phase gebunden. Enthält die Serumprobe VSKV-Antikörper, werden sie mit monoklonalen peroxidase-konjugierten Anti-Schwein-IgG oder Anti-Schwein-IgM Antikörpern nachgewiesen. Diese Bindung wird mittels Substrat und Chromogen gemessen.

Der isotypen-spezifische ELISA kann auch dazu beitragen, "singleton reactors" von echt positiven Tieren (vgl. Teil C) zu differenzieren.

C. Anwendung serologischer Nachweisverfahren und Auswertung der Befunde

1. Für serologische Untersuchungen werden vorzugsweise VN und ELISA empfohlen. In Kapitel X sind die Standardseren aufgelistet, die das gemeinschaftliche Referenzlabor im Interesse gemeinschaftsweit einheitlicher serologischer Analysen bereithält.

Der Neutralisationstest (NT) gilt als Standardmethode, sie hat jedoch den Nachteil, 2-3 Tage in Anspruch zu nehmen, und setzt Gewebekulturen voraus.

Der ELISA ist schneller und läßt sich leichter standardisieren. Der kompetitive monospezifische ELISA ist z. Z. der verläßlichste Test zum Nachweis von VSKV-Antikörpern. Er wird als Vorzugsmethode für die umfangreiche Reihenuntersuchung empfohlen.

Zur Befundbestätigung muß jedoch erforderlichenfalls ein NT durchgeführt werden, insbesondere, wenn in einem Haltungsbetrieb erstmals seropositive Proben nachgewiesen werden. Schweine, die im ELISA positiv, im NT jedoch negativ getestet werden, können unberücksichtigt bleiben.

2. Es besteht Verdacht auf einen "singleton reactor"(4), wenn nur ein seropositives Schwein identifiziert wird und folgende Bedingungen gegeben sind:

a) Es gibt keinerlei klinischen Krankheitsanzeichen im Betrieb;

b) in dem Betrieb sind auch in der Vergangenheit keine klinischen VSK-Fälle aufgetreten;.

c) der Betrieb hatte zu keiner Zeit Kontakte zu bekannten Seuchenherden.

3. Ein Schwein wird als "singleton reactor" bestätigt, wenn folgende Bedingungen gegeben sind:

a) Bei Folgeuntersuchungen werden keine weitere seropositiven Schweine ermittelt;

b) die nach Identifizierung des "singleton reactors" durchgeführte Stichprobeuntersuchung von Kontaktschweinen zeigt keine Serokonversion;

c) bei Wiederholungsuntersuchungen bleibt der Antikörpertiter konstant bzw. er geht zurück.

4. Bei der Bestätigung eines "singleton reactors" sind jedoch auch folgende zusätzliche Kriterien und Grundsätze zu berücksichtigen:

a) "singleton reactors" treten in der Schweinepopulation im Verhältnis 1:1000 auf;

b) Seren von "singleton reactors" haben im allgemeinen folgende Merkmale:

- niedriger VN-Antikörpertiter;

- im kompetitiven monospezifischen ELISA knapp positiv;

- ausschließlich IgM und keine IgG im isotypenspezifischen ELISA(5).

KAPITEL IX

Klinische Symptome und Merkmake der vesikulären Schweinekrankheit

Die vesikuläre Schweinekrankheit (VSK) ist eine ansteckende Viruskrankheit der Schweine, die durch ein Enterovirus der Familie Picornaviridae hervorgerufen wird und die je nach Virusstamm, Übertragungsweg, Ausmaß der Exposition und Haltungsbedingungen einen subklinischen, milden Verlauf nehmen oder sich zu einer schweren Erkrankung ausprägen kann. Zusätzliche Streßfaktoren (Transport, Zusammenführung mit anderen Schweinen, Temperaturextreme) können die Entwicklung klinischer Symptome begünstigen.

Die Seuche äußert sich als fieberhafte Erkrankung mit Aphthenbildungen am Kronsaum, am Hufballen, an der Haut der Gliedmaßen und - weniger häufig - am Rüssel, den Lippen, der Zunge und am Euter. Die Morbidität kann bis zu 100 % betragen, während die Mortalitätsrate in der Regel sehr niedrig oder gleich null ist.

Die Infektion kann in milder, inapparenter Form verlaufen, bei der sich der Gesundheitszustand der Schweine nur vorübergehend verschlechtert, es jedoch innerhalb weniger Tage zur Entwicklung virusneutralisierender Antikörper kommt(6).

Aufgrund des subklinischen oder milden Verlaufs der Seuche entsteht ein Verdacht auf VSK oft erst bei serologischen Untersuchungen, die im Rahmen der Seuchenüberwachung oder für Ausfuhrbescheinigungen durchgeführt werden. Jüngste VSK-Ausbrüche in der Gemeinschaft zeigten eine relativ milde Verlaufsform mit schwachen oder überhaupt keinen klinischen Symptomen. Eine Diagnose hing häufig von serologischen Untersuchungen ab.

Wesentlich ist jedoch, daß das klinische Bild der VSK von dem der Maul- und Klauenseuche (MKS) nicht zu unterscheiden ist. Bei vesikulärer Schweinekrankheit muß zunächst wie bei MKS-Verdacht gehandelt werden, und es sind umgehend differentialdiagnostische Laboruntersuchungen einzuleiten.

Die Inkubationszeit der vesikulären Schweinekrankheit beträgt beim einzelnen Tier in der Regel 2 bis 7 Tage. Danach kann vorübergehend Fieber bis 41 °C auftreten, erste klinische Symptome zeigen sich möglicherweise jedoch erst später. Es entwickeln sich Aphthen am Kronsaum, typischerweise an der Übergangsstelle zum Huf. Sie können den gesamten Kronsaum betreffen und zum Ausschuhen führen. Seltener bilden sich Aphthen an der Rüsselscheibe (dorsal), am Flotzmaul, an der Zunge und am Euter; oberflächliche Erosionen können auch an den Knien auftreten. Die betroffenen Schweine können für eine gewisse Zeit Lahmheiten zeigen und festliegen.

Jungschweine sind stärker betroffen, obgleich die Mortalität - im Vergleich zur Maul- und Klauenseuche bei Jungtieren - sehr niedrig ist.

Störungen des Nervensystems wurden zwar berichtet, kommen jedoch nur selten vor. Aborte sind für die vesikuläre Schweinekrankheit nicht typisch. Herzversagen aufgrund multifokaler Myokarditis kann auf Maul- und Klauenseuche hinweisen, und Ferkel-Enzephalomyokarditis wird nicht mit vesikulärer Schweinekrankheit in Zusammenhang gebracht.

Eine vollständige Genesung erfolgt in der Regel nach 2-3 Wochen, und als einziges Anzeichen der Infektion verbleibt eine dunkle, horizontale Linie an der Klaue, wo das Wachstum vorübergehend gehemmt war.

Die Virusausscheidung erfolgt aus Nase und Maul und über den Kot bis zu 48 Stunden nach Einsetzen der klinischen Symptome. Die meisten Viren werden in den ersten 7 Tagen post infectionem erzeugt, und die Virusexkretion aus Nase und Maul hört in der Regel nach 2 Wochen auf. Das Virus kann bis zu 20 Tagen post infectionem im Kot isoliert werden. Virusisolierungen nach bis zu 3 Monaten wurden beschrieben. Der Erreger kann in nekrotischem Gewebe aus der Umgebung aufgebrochener Aphthen und im Kot für beträchtliche Zeit überleben.

KAPITEL X

VSK-Standardseren

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

(1) ABl. L 224 vom 18.8.1990, S. 19.

(2) ABl. L 224 vom 18.8.1990, S. 29.

(3) Positive ELISA-Befunde werden mit einem Virusgehalt der Probe von mindestens 105 TCID50 (Tissue Culture Infectious Doses) assoziiert.

(4) Ein kleiner Anteil von "singleton reactors" läßt sich nach jedem gängigen VSK-Nachweisverfahren ermitteln. Es ist nicht bekannt, wodurch diese "Einzelreaktion" ausgelöst wird. Eine serologische Kreuzreaktivität mit dem VSK-Virus könnte möglicherweise einer Infektion mit einem anderen, bisher nicht identifizierten Picornavirus oder anderen urspezifischen Faktoren im Serum zuzuschreiben sein.

(5) Spezifische IgG-Antikörper allein oder sowohl IgG- als auch IgM-Antikörper lassen sich in der Regel in Serumproben VSK-infizierter Schweine nachweisen, während Seren von "singleton reactors" im allgemeinen nur IgM-Antikörper enthalten. In Serumproben von Schweinen, die sich erst in den letzten 10-14 Tagen mit VSKV infiziert haben, lassen sich spezifische IgG nicht nachweisen, obgleich sie in einer zweiten Blutprobe feststellbar sein sollten. Kürzlich infizierte Schweine können jedoch erst zuverlässig von "singleton reactors" differenziert werden, wenn ihre Immunreaktion von einer IgM- zur IgH-Antikörperproduktion übergeht. Vgl. Kapitel IX und Fußnote 6.

(6) Spezifische IgM-Antikörper lassen sich in der Regel 2 bis 3 Tage post infectionem im Blut nachweisen: sie verschwinden nach ungefähr 30-50 Tagen. Spezifische IgG-Antikörper lassen sich im allgemeinen 10-14 Tage post infectionem im Blut nachweisen und persistieren über Jahre. Der Ig-Isotyp läßt sich nach der ELISA-Methode gemäß Kapitel VIII Teil B Nummer 2 bestimmen.