VERORDNUNG (EWG) Nr. 2568/91 DER KOMMISSION

vom 11. Juli 1991

über die Merkmale von Olivenölen und Oliventresterölen sowie die Verfahren zu ihrer Bestimmung

DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN

GEMEINSCHAFTEN -

gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft,

gestützt auf die Verordnung Nr. 136/66/EWG des Rates vom 22. September 1966 über die Errichtung einer gemeinsamen Marktorganisation für Fette (1), zuletzt geändert durch die Verordnung (EWG) Nr. 3577/90 (2), insbesondere auf Artikel 35a,

in Erwägung nachstehender Gründe:

Im Anhang der Verordnung Nr. 136/66/EWG sind die Bezeichnungen und Begriffsbestimmungen für Olivenöle und Oliventresteröle zur Vermarktung im innerstaatlichen und innergemeinschaftlichen Handel sowie im Handel mit Drittländern festgelegt.

Unbeschadet der bereits geltenden einschlägigen Bestimmungen müssen zur Unterscheidung der Olivenölkategorien die entsprechenden chemisch-physikalischen Merkmale sowie die organoleptischen Merkmale nativer Olivenöle festgelegt werden, damit Reinheit und Qualität der betreffenden Erzeugnisse gewährleistet sind.

Die Merkmale der einzelnen Olivenöle müssen gemeinschaftsweit einheitlich bestimmt werden. Daher müssen gemeinschaftliche Verfahren für die chemische Analyse und die organoleptische Prüfung festgelegt werden. Allerdings sollten während einer Übergangszeit auch andere in den Mitgliedstaaten übliche Analyseverfahren zulässig sein, wobei jedoch vorzusehen ist, daß bei abweichenden Ergebnissen die nach dem gemeinschaftlichen Verfahren erzielten Ergebnisse gelten.

Die Festlegung der chemisch-physikalischen Merkmale von Olivenölen und der Analyseverfahren erfordert eine Anpassung der Zusatzvorschriften zu Kapitel 15 der Kombinierten Nomenklatur.

Zur Bewertung der organoleptischen Merkmale nativer Olivenöle müssen Gruppen von ausgewählten und geschulten sensorischen Prüfern gebildet werden; dafür ist eine

ausreichende Zeitspanne vorzusehen. Da einige Mitgliedstaaten solche Prüfergruppen nicht ohne weiteres zusammenstellen können, muß ihnen die Möglichkeit eingeräumt werden, die in anderen Mitgliedstaaten eingesetzten Prüfergruppen zu befassen.

Damit das einwandfreie Funktionieren der für die Einfuhr von Oliventresteröl geltenden Abschöpfungsregelung gewährleistet ist, muß ein einheitliches Verfahren zur Bestimmung des Ölgehalts dieser Erzeugnisse vorgesehen werden.

Um Nachteile für den Handel auszuschließen, sollte Olivenöl, das vor Inkrafttreten dieser Verordnung abgefuellt wurde, während einer bestimmten Zeit noch vermarktet werden dürfen.

Die Verordnung (EWG) Nr. 1058/77 der Kommission (3), zuletzt geändert durch die Verordnung (EWG) Nr. 1858/88 (4), ist aufzuheben.

Der Verwaltungsausschuß für Fette hat nicht innerhalb der ihm von seinem Vorsitzenden gesetzten Frist Stellung genommen -

HAT FOLGENDE VERORDNUNG ERLASSEN:

Artikel 1

(1) Native Olivenöle im Sinne der Nummer 1 Buchstaben a), b) und c) des Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG sind Öle, deren Merkmale mit den in Anhang I Nummern 1, 2 und 3 dieser Verordnung genannten Merkmalen übereinstimmen.

(2) Natives Lampantöl im Sinne der Nummer 1 Buchstabe d) des Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Öl, dessen Merkmale mit den in Anhang I Nummer 4 dieser Verordnung genannten Merkmalen übereinstimmen.

(3) Raffiniertes Olivenöl im Sinne der Nummer 2 des Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Olivenöl, dessen Merkmale mit den in Anhang I Nummer 5 dieser Verordnung genannten Merkmalen übereinstimmen.

(4) Olivenöl im Sinne der Nummer 3 des Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Öl, dessen Merkmale mit den in Anhang I Nummer 6 dieser Verordnung genannten Merkmalen übereinstimmen.

(5) Rohes Oliventresteröl im Sinne der Nummer 4 des Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Olivenöl, dessen Merkmale mit den in Anhang I Nummer 7 dieser Verordnung genannten Merkmalen übereinstimmen.

(6) Raffiniertes Oliventresteröl im Sinne der Nummer 5 des Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Olivenöl, dessen Merkmale mit den in Anhang I Nummer 8 dieser Verordnung genannten Merkmalen übereinstimmen.

(7) Oliventresteröl im Sinne der Nummer 6 des Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Olivenöl, dessen Merkmale mit den in Anhang I Nummer 9 dieser Verordnung genannten Merkmalen übereinstimmen.

Artikel 2

(1) Die Merkmale der Öle gemäß Anhang I dieser Verordnung werden nach folgenden Analysenverfahren bestimmt:

- freie Fettsäuren, berechnet in Prozent Ölsäure, nach dem Verfahren des Anhangs II;

- Peroxidzahl nach dem Verfahren des Anhangs III;

- aliphatische Alkohole nach dem Verfahren des Anhangs IV;

- Sterinfraktion nach dem Verfahren des Anhangs V;

- Erythrodiol nach dem Verfahren des Anhang VI;

- gesättigte Fettsäuren in 2-Stellung der Triglyceride nach dem Verfahren des Anhangs VII;

- Trilinoleingehalt nach dem Verfahren des Anhangs VIII;

- spektrophotometrische Analyse nach dem Verfahren des Anhangs IX;

- Fettsäurezusammensetzung nach dem Verfahren der Anhänge XA und XB;

- fluechtige halogenierte Lösungsmittel nach dem Verfahren des Anhangs XI;

- Bestimmung der organoleptischen Merkmale nativer Olivenöle nach dem gemäß Absatz 2 angewandten Verfahren des Anhangs XII;

- Raffinationsnachweis nach dem Verfahren des Anhangs XIII.

(2) Die organoleptischen Merkmale werden von einem Analytiker - auch unter Hinzuziehung von Sachverständigen - nach dem im Prüfbogen gemäß Anhang XII vorgesehenen Verfahren bewertet. Stellt der Analytiker Abweichungen zwischen den von ihm erfassten und den aufgrund

der Produktbezeichnung zu erwartenden organoleptischen Merkmalen fest, so muß er die Probe von einer Gruppe

von sensorischen Prüfern gemäß den Bestimmungen des

Anhangs XII prüfen lassen.

Die Kontrollanalysen werden von der Gruppe nach denselben Bestimmungen durchgeführt.

Die Prüfergruppe bewertet die organoleptischen Eigenschaften im Zusammenhang mit Interventionsmaßnahmen nach den Vorschriften des Anhangs XII.

Artikel 3

Unbeschadet der Einführung der Analysenverfahren gemäß Artikel 2 dürfen die Mitgliedstaaten bis 31. Oktober 1992 andere erprobte und wissenschaftlich begründete Verfahren verwenden, soweit der freie Verkehr mit den in Anwendung der Gemeinschaftsverfahren als vorschriftsmässig anerkannten Erzeugnissen nicht behindert wird. Die betreffenden Mitgliedstaaten notifizieren der Kommission diese anderen Verfahren vor ihrer Verwendung.

Führt eines dieser anderen Verfahren zu einem anderen Ergebnis als das Gemeinschaftsverfahren, so gilt das nach dem Gemeinschaftsverfahren erzielte Ergebnis.

Artikel 4

(1) Zur Beurteilung der organoleptischen Merkmale bilden die Mitgliedstaaten Gruppen von sensorischen Prüfern, die nach den Regeln des in Anhang XII beschriebenen Verfahrens geschult wurden.

(2) Sollte ein Mitgliedstaat in seinem Hoheitsgebiet nicht ohne weiteres eine Prüfergruppe bilden können, so kann er eine in einem anderen Mitgliedstaat tätige Prüfergruppe befassen.

Artikel 5

Die zusätzlichen Vorschriften 2, 3 und 4 zu Kapitel 15 der Kombinierten Nomenklatur werden durch die des Anhangs XIV ersetzt.

Artikel 6

(1) Der Ölgehalt von Trester und anderen Rückständen der Olivenölextraktion (KN-Codes 2306 90 11 und 2306 90 19) wird nach dem Verfahren des Anhangs XV bestimmt.

(2) Der Ölgehalt gemäß Absatz 1 wird in Massenprozenten, bezogen auf die Trockenmasse, berechnet.

Artikel 7

Für andere als im Anhang XI aufgeführte unerwünschte Stoffe gelten die entsprechenden Gemeinschaftsvorschriften.

Artikel 8

(1) Die Mitgliedstaaten teilen der Kommission die Maßnahmen mit, die sie zur Durchführung dieser Verordnung getroffen haben.

(2) Die Mitgliedstaaten übermitteln der Kommission zu Beginn jedes Halbjahres eine Zusammenstellung der analytischen Daten der im vorangegangenen Halbjahr durchgeführten Bestimmungen.

Diese Ergebnisse werden vom Verwaltungsausschuß für Fette nach dem Verfahren des Artikels 39 der Verordnung Nr. 136/66/EWG geprüft.

Artikel 9

Die Verordnung (EWG) Nr. 1058/77 wird aufgehoben.

Artikel 10

(1) Diese Verordnung tritt am dritten Tag nach ihrer Veröffentlichung im Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften in Kraft.

Das Verfahren des Anhangs XII ist jedoch, ausser wenn es sich um Interventionsmaßnahmen handelt, ab 1. Januar 1992 anwendbar.

(2) Diese Verordnung gilt nicht für Olivenöl und Oliventresteröl, das vor dem Tag des Inkrafttretens dieser Verordnung abgefuellt und bis zum 31. Oktober 1992 vermarktet wurde.

Diese Verordnung ist in allen ihren Teilen verbindlich und gilt unmittelbar in jedem Mitgliedstaat.

Brüssel, den 11. Juli 1991

Für die Kommission

Ray MAC SHARRY

Mitglied der Kommission

(1) ABl. Nr. 172 vom 30. 9. 1966, S. 3025/66.

(2) ABl. Nr. L 353 vom 17. 12. 1990, S. 23.

(3) ABl. Nr. L 128 vom 24. 5. 1977, S. 6.

(4) ABl. Nr. L 166 vom 1. 7. 1988, S. 10.

ANHANG I

MERKMALE VON OLIVENÖLEN

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

ANHANG II

BESTIMMUNG DER FREIEN FETTSÄUREN

1.

ANWENDUNGSBEREICH

Bestimmung der freien Fettsäuren in Olivenölen. Der Gehalt an freien Fettsäuren wird über den Gehalt an freien Säuren in konventioneller Weise berechnet.

1.1.

Prinzip der Methode

Die Probe wird in einem geeigneten Lösungsmittelgemisch gelöst. Dann werden die vorhandenen freien Säuren mit einer ethanolischen Kaliumhydroxidlösung titriert.

1.2.

Reagenzien

Alle Reagenzien müssen anerkannte Anaylsenqualität aufweisen; als Wasser ist destilliertes Wasser oder Wasser gleicher Reinheit zu verwenden.

1.2.1.

Diethylether/Ethanol 95%ig (V/V), Mischung 1:1.

Vorsicht: Diethylether ist leicht brennbar und kann explosive Peroxide bilden. Es muß daher unter besonderen Vorsichtsmaßnahmen verwendet werden.

Das Diethylether/Ethanol-Gemisch muß unmittelbar vor dem Gebrauch mit einer Kaliumhydroxidlösung (1.2.2) unter Zusatz von 0,3 ml Phenolphthaleinlösung (1.2.3) pro 100 ml Lösungsmittelgemisch neutralisiert werden.

Anmerkung: Wenn Diethylether nicht benutzt werden kann, so kann auch eine Mischung aus Ethanol und Toluol verwandt werden. Eventüll kann auch Ethanol durch 2-Propanol ersetzt werden.

1.2.2.

Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung, 0,1 molar oder, falls erforderlich, 0,5 molar.

Die genaue Konzentration der ethanolischen Kaliumhydroxidlösung muß bekannt sein und unmittelbar vor der Verwendung überprüft werden. Die Lösung sollte mindestens 5 Tage vorher hergestellt und in eine braune Flasche, die mit einem Gummistopfen verschlossen wird, dekantiert werden. Sie muß farblos oder nur schwach gefärbt sein.

Anmerkung: Eine stabile farblose Kaliumhydroxidlösung kann wie folgt hergestellt werden: 1 000 ml Ethanol mit

8 g Kaliumhydroxid und 0,5 g Aluminiumspäne eine Stunde am Rückflußkühler kochen. Sofort destillieren. Die erforderliche Menge Kaliumhydroxid in dem destillierten Ethanol lösen und mehrere Tage stehen lassen. Die klare Lösung von dem ausgefallenen Karbonat abdekantieren.

Die Lösung kann auch ohne Destillation wie folgt hergestellt werden: 1 000 ml Ethanol mit 4 ml Aluminiumbutylat mehrere Tage stehen lassen. Die überstehende Flüssigkeit abdekantieren und die erforderliche Menge Kaliumhydroxid darin lösen. Diese Lösung ist gebrauchsfertig.

1.2.3.

Phenolphthalein, Lösung von 10 g/l in 95-96%igem Ethanol oder Alkaliblau (bei sehr stark gefärbten Fetten), Lösung von 20 g/l in 95-96%igem Ethanol.

1.3.

Geräte

Übliche Laborgeräte u. a.:

1.3.1.

Analysenwaage,

1.3.2.

250-ml-Erlenmeyerkolben,

1.3.3.

10-ml-Bürette mit 0,05-ml-Graduierung.

1.4.

Verfahren

1.4.1.

Die Bestimmung erfolgt mit der filtrierten Probe. Beträgt der Gesamtgehalt an Wasser und Verunreinigungen weniger als 1 %, so wird die Bestimmung mit der unfiltrierten Probe durchgeführt.

1.4.2.

Probe

Die Grösse der Einwaage richtet sich nach dem zu erwartenden Gehalt an freien Fettsäuren (Angaben in der nachstehenden Tabelle).

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

Die Probe in den Erlenmeyerkolben (1.3.2) einwiegen.

1.4.3.

Durchführung der Bestimmung

Die Probe (1.4.2) in 50 bis 150 ml der neutralisierten Diethylether/Ethanol-Mischung (1.2.1) lösen. Mit der 0,1 molaren Kaliumhydroxidlösung (1.2.2) (Anmerkung 2) unter Schütteln bis zum Umschlag des Indikators titrieren. (Die Rosafärbung des Phenolphthaleins muß mindestens 10 Sekunden anhalten.)

Anmerkungen:

1. Die ethanolische Kaliumhydroxidlösung (1.2.2) kann durch eine wäßrige Kaliumhydroxid- oder Natriumhydroxidlösung ersetzt werden, wenn die zugeführte Wassermenge keine Phasentrennung bewirkt.

2. Werden zur Titration mehr als 10 ml der 0,1 molaren Kaliumhydroxidlösung benötigt, so ist eine 0,5 molare Lösung zu verwenden.

3. Wird die Lösung während der Titration trübe, so ist eine ausreichende Menge Lösungsmittelmischung (1.2.1) zuzufügen, bis die Lösung wieder klar ist.

1.5.

Berechnung des Gehalts an freien Fettsäuren in % Ölsäure

Der Gehalt an freien Fettsäuren in Gewichtsprozent ist

V × c × 1 000 × 100 = V × c × M

V × c ×

M

1 000

×

100

m

=

V × c × M

10 × m

Dabei sind:

V = Verbrauch an Kaliumhydridlösung in ml,

c

=

genaue Konzentration der Kaliumhydroxidlösung in mol/l,

M

=

Molekulargewicht in g der Säure, die für die Berechnung zugrunde gelegt wird (= 282),

m

=

Probeneinwaage in g.

Als Ergebnis gilt das arithmetische Mittel von zwei Bestimmungen.

ANHANG III

BESTIMMUNG DER PEROXIDZAHL

1.

ZWECK

Diese Norm beschreibt ein Verfahren für die Bestimmung der Peroxidzahl von Ölen und Fetten.

2.

ANWENDUNGSBEREICH

Diese Norm gilt für tierische und pflanzliche Öle und Fette.

3.

DEFINITION

Die Peroxidzahl ist die Gesamtmenge solcher Substanzen in der Probe, ausgedrückt in Milliäquivalenten aktiven Sauerstoffs pro kg, die unter den beschriebenen Arbeitsbedingungen Kaliumiodid oxidieren.

4.

PRINZIP

Behandlung der in Essigsäure und Chloroform gelösten Probe mit einer Kaliumiodidlösung. Titration des freigesetzten Iods durch eine eingestellte Natriumthiosulfatlösung.

5.

GERÄTE

Die Geräte müssen frei von reduzierenden oder oxidierenden Substanzen sein.

Anmerkung: Schliffflächen nicht einfetten.

5.1.

Mikrobechergläschen, 3 ml.

5.2.

250-ml-Schliffkolben mit Stopfen, die zuvor getrocknet und mit einem reinen, trockenen Inertgas (Stickstoff oder vorzugsweise Kohlendioxid) gefuellt wurden.

5.3.

25- oder 50-ml-Bürette, mit 0,1-ml-Graduierung.

6.

REAGENZIEN

6.1.

Chloroform, analytisch rein, durch Einleiten von reinem, trockenem Inertgas von Sauerstoff befreit.

6.2.

Eisessig, analytisch rein, durch Einleiten von reinem, trockenem Inertgas von Sauerstoff befreit.

6.3.

Kaliumiodid, gesättigte wäßrige Lösung, frisch zubereitet, frei von Iod und Iodaten.

6.4.

Natriumthiosulfat, genau 0,01 oder 0,002 N wäßrige Lösung, unmittelbar vor der Verwendung eingestellt.

6.5.

Stärkelösung, wäßrige Dispersion, von 10 g/l, aus natürlicher löslicher Stärke frisch hergestellt.

7.

PROBE

Die Probe ist unter Lichtabschluß zu entnehmen und zu lagern und kühl in vollständig gefuellten Glasgefässen, die mit Glas- oder Korkstopfen verschlossen sind, aufzubewahren.

8.

VERFAHREN

Die Bestimmung soll bei diffusem Tageslicht oder künstlichem Licht durchgeführt werden. In ein Mikrobechergläschen (5.1) oder aber in einen Kolben (5.2) die Probemenge auf 0,001 g genau einwiegen, unter Berücksichtigung der erwarteten Peroxidzahl gemäß nachstehender Tabelle:

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

Den Stopfen von dem Kolben (5.2) abnehmen und den Mikrobecher mit der Probemenge einführen. 10 ml Chloroform (6.1) hinzufügen. Die Probe schnell unter Rühren auflösen, 15 ml Essigsäure (6.2), dann 1 ml Kaliumiodidlösung (6.3) hinzufügen. Den Stopfen rasch einsetzen, eine Minute schütteln und genau fünf Minuten unter Lichtabschluß bei einer Temperatur von 15 bis 25 oC stehenlassen.

Etwa 75 ml destilliertes Wasser zugeben. Das freigesetzte Iod mit Natriumthiosulfatlösung (6.4) unter kräftigem Schütteln titrieren (0,002-N-Lösung für erwartete Werte unter 12 und 0,01-N-Lösung für erwartete Werte über 12). Stärkelösung (6.5) als Indikator verwenden.

Zwei Bestimmungen mit derselben Probe durchführen.

Zur gleichen Zeit einen Blindversuch durchführen. Übersteigt das Ergebnis des Blindversuchs 0,05 ml einer 0,01-N-Natriumthiosulfatlösung (6.4), so sind die unreinen Reagenzien zu ersetzen.

9.

ABFASSUNG DER ERGEBNISSE

Die Peroxidzahl (P.V.), ausgedrückt in Milliäquivalenten aktiven Sauerstoffs pro kg, wird nach folgender Formel errechnet:

P.V. = V × T × 1 000

P.V. =

V × T × 1 000

m

Dabei sind:

V = die Anzahl ml der eingestellten Natriumthiosulfatlösung (6.4), die für die Bestimmung verbraucht werden, korrigiert durch den entsprechenden Wert des Blindversuchs,

T

=

die genaue Normalität der Natriumthiosulfatlösung (6.4),

m

=

das Gewicht der Probe in g.

Als Ergebnis gilt das arithmetische Mittel der beiden so durchgeführten Bestimmungen.

ANHANG IV

BESTIMMUNG DES GEHALTS AN ALIPHATISCHEN ALKOHOLEN MIT DER KAPILLARGASCHROMATOGRAPHIE

1.

ANWENDUNGSBEREICH

Die Methode beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung und des Gehalts an aliphatischen Alkoholen.

2.

KURZBESCHREIBUNG

Das Fett wird mit 1-Eicosanol als internem Standard versetzt, mit ethanolischer Kaliumhydroxidlösung verseift und das Unverseifbare mit Ethylether extrahiert. Die Alkoholfraktion wird dünnschichtchromatographisch über basische Kieselgelplatten vom Unverseifbaren abgetrennt. Die aus dem Kieselgel isolierten Alkohole werden in Trimethylsilylether überführt und mit Hilfe der Kapillar-Gaschromatographie untersucht.

3.

GERÄTE UND HILFSMITTEL

3.1.

- Kolben, 250 ml, mit Rückflußkühler und Schliffstopfen,

3.2.

- Scheidetrichter, 500 ml,

3.3.

- Kolben, 250 ml,

3.4.

- komplette Apparatur für die Dünnschichtchromatographie mit Glasplatten 20 × 20 cm,

3.5.

- UV-Lampe, Wellenlänge 366 oder 254 nm,

3.6.

- Mikroliterspritzen, 100 und 500 ìl,

3.7.

- Glasfiltertiegel mit Porenfilter G 3 (Porosität 15 40 ìm), etwa 2 cm Durchmesser, 5 cm Höhe, geeignetem Anschlußstück für die Vakuumfiltration und Schliffmuffe 12/21,

3.8.

- Vakuumflasche, 50 ml, mit Schliffmuffe 12/21, für Glasfiltertiegel (3.7),

3.9.

- 10-ml-Röhrchen mit konischem Boden und dichtschließendem Stopfen,

3.10.

- Gaschromatograph, geeignet für die Verwendung von Kapillarsäulen mit Splitsystem, bestehend aus:

3.10.1.

- thermostatisierbarem Säulenofen, einstellbar auf die gewünschte Temperatur mit einer Genauigkeit von ± 1oC,

3.10.2.

- temperaturregelbare Verdampfeinrichtung mit Verdampfer aus persilanisiertem Glas,

3.10.3.

- Flammenionisations-Detektor mit Verstärker,

3.10.4.

- Integrator mit Schreiber, mit Verstärker zu koppeln,

3.11.

- Kapillarsäule aus Glas oder fused silica, 20 30 m Länge, 0,25 0,32 mm Innendurchmesser, Innenwand belegt mit SE-52 oder SE-54 oder einer gleichwertigen stationären Phase, Schichtdicke 0,10 0,30 ìm,

3.12.

- Mikroliterspritze für die Gaschromatographie, 10 ìl, mit gehärteter Nadel,

4.

REAGENZIEN

4.1.

- Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung 2 N: 130 g Kaliumhydroxid (Titer mindestens 85 %) in 200 ml destilliertem Wasser unter Kühlen lösen und mit Ethanol auf 1 l auffuellen. Die Lösung sollte in gut verschlossenen braunen Glasflaschen aufbewahrt werden,

4.2.

- Ethylether, analysenrein,

4.3.

- wasserfreies Natriumsulfat, analysenrein,

4.4.

- mit Kieselgel beschichtete Glasplatten ohne Fluoreszenzindikator, Schichtdicke 0,25 mm (gebrauchsfertig im Handel erhältlich),

4.5.

- Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung 0,2 N: 13 g Kaliumhydroxid in 20 ml destilliertem Wasser lösen und mit Ethanol auf 1 l auffuellen,

4.6.

- Benzol für die Chromatographie (siehe 5.2.2),

4.7.

- Aceton für die Chromatographie (siehe 5.2.2),

4.8.

- Hexan für die Chromatographie (siehe 5.2.2),

4.9.

- Ethylether für die Chromatographie (siehe 5.2.2),

4.10.

- Chloroform, analysenrein,

4.11.

- Referenzlösung für die Dünnschichtchromatographie: 5%ige Lösung von C20 bis C28-Alkoholen in Chloroform,

4.12.

- 2', 7'-Dichlorfluorescein, 0,2%ige ethanolische Lösung, leicht alkalisch durch Zusatz einiger Tropfen alkoholischer 2-N-Kaliumhydroxid-Lösung,

4.13.

- wasserfreies Pyridin für die Chromatographie,

4.14.

- Hexamethyldisilazan,

4.15.

- Trimethylchlorsilan,

4.16.

- Standardlösung der Trimethylsilylether der aliphatischen Alkohole von C20 C28, unmittelbar vor Gebrauch ansetzen aus einer Mischung der reinen Alkohole,

4.17.

- 1-Eicosanol, 0,1%ige Lösung (m/V) in Chloroform (interner Standard),

4.18.

- Trägergase: Wasserstoff oder Helium, rein für die Gaschromatographie,

4.19.

- Hilfsgase: Wasserstoff und Luft, rein, für die Gaschromatographie.

5.

VERFAHREN

5.1.

Herstellung des Unverseifbaren

5.1.1.

Mit einer 500FC15>ml-Mikroliterspritze so viel von der 0,1%igen 1-Eicosanollösung in Chloroform (4.17) in einen 250-ml-Kolben geben, daß die Menge an 1-Eicosanol (ebensogut kann 1-Eneicosanol verwendet werden) etwa 10 % des Gehalts an aliphatischen Alkoholen des zur Analyse verwandten aliquoten Teils der Probe entspricht. So werden z. B. für 5 g Olivenöl oder Samenöl 250 ìl der 0,1%igen 1-Eicosanollösung benötigt und für Oliventresteröl 1 500 ìl.

Die Probe im Stickstoffstrom bis zur Trocknung eindampfen. In den gleichen Kolben genau 5 g der trockenen und filtrierten Probe einwiegen.

5.1.2.

Die Probe bei aufgesetztem Rückflußkühler mit 50 ml 2-N-ethanolischer Kaliumhydroxidlösung versetzen, auf dem Wasserbad erhitzen und unter kräftigem Schütteln und schwachem Sieden verseifen (wobei die Lösung klar wird). Die Probe weitere 20 Minuten am Sieden halten und dann durch den Rückflußkühler mit 50 ml destilliertem Wasser versetzen; den Rückflußkühler entfernen und den Kolben auf etwa 30 oC abkühlen.

5.1.3.

Den Kolbeninhalt quantitativ in einen 500-ml-Scheidetrichter überführen, wobei mehrfach mit insgesamt 50 ml destilliertem Wasser nachgespült wird. Die Probe mit etwa 80 ml Ethylether versetzen, 30 Sekunden kräftig schütteln und absetzen lassen (Anmerkung 1).

Die wäßrige Phase in einen anderen Scheidetrichter ablassen und dann noch zweimal nach dem gleichen Verfahren mit 60 70 ml Ethylether extrahieren.

Anmerkung 1: Etwaige Emulsionen können mit Hilfe einer Waschflasche durch Zusatz kleiner Mengen Ethylalkohol oder Methylalkohol zerstört werden.

5.1.4.

Die Etherauszuege in einem Scheidetrichter vereinigen und mehrmals mit jeweils 50 ml destilliertem Wasser waschen, bis das Waschwasser neutral reagiert.

Das Waschwasser ablassen, die Etherphase mit wasserfreiem Natriumsulfat trocknen und über wasserfreiem Natriumsulfat in einen zuvor gewogenen 250-ml-Kolben filtrieren. Scheidetrichter und Filter mit kleinen Mengen Ethylether nachspülen.

5.1.5.

Den Ether bis auf wenige ml abdestillieren, den Rückstand unter leichtem Vakuum oder im Stickstoffstrom trocknen, ¹/4 Stunde im Trockenschrank bei 100 oC nachtrocknen, im Exsikkator abkühlen lassen und wiegen.

5.2.

Abtrennen der Alkoholfraktion

5.2.1.

Herstellung der basischen Platten

Die Kieselgelplatten (4.4) vollständig ca. 10 Sekunden lang in eine ethanolische 0,2-N-Kaliumhydroxidlösung (4.5) eintauchen, dann unter einem Abzug 2 Stunden trocknen lassen, anschließend noch

1 Stunde bei 100 oC im Trockenschrank.

Die Platten aus dem Trockenschrank nehmen und in einem Exsikkator über Calciumchlorid bis zum Gebrauch aufbewahren. (Derart behandelte Platten müssen innerhalb von 14 Tagen gebraucht werden.)

Anmerkung 2: Bei Verwendung von basischen Kieselgelplatten zur Abtrennung der Alkoholfraktion erübrigt sich die Behandlung des Unverseifbaren mit Aluminiumoxid. Auf diese Weise bleiben sämtliche sauren Verbindungen (Fettsäuren und andere) an der Startlinie. So erhält man eine saubere Trennung der Zone der aliphatischen Alkohole und Terpenalkohole von den Sterinen.

5.2.2.

Die Entwicklerkammer bis zu einer Höhe von etwa 1 cm mit einem Benzol/Aceton-Gemisch 95:5 (V/V) beschicken. Statt dessen kann auch ein Hexan/Ethylether-Gemisch 65:35 (V/V) verwandt werden. Die Kammer mit einem geeigneten Deckel verschließen und mindestens eine halbe Stunde stehen lassen, damit sich ein Gleichgewicht zwischen Flüssigkeit und Dampfphase einstellt. An der Innenwand der Kammer können Filterpapierstreifen befestigt werden, die in das Fließmittel eintauchen. Dadurch kann die Laufzeit um ein Drittel verkürzt und eine gleichmässige Elution der Komponenten erzielt werden.

Anmerkung 3: Um gut reproduzierbare Trennungen zu erzielen, ist das Gemisch jedesmal frisch anzusetzen.

5.2.3.

Von einer 5%igen Lösung des Unverseifbaren (5.1.5) in Chloroform mit einer 100FC15>ml-Spritze 0,3 ml als durchgehenden, gleichmässigen Strich 2 cm vom unteren Plattenrand entfernt auf die Dünnschichtplatte (5.2.1) auftragen. In der Verlängerung der Startlinie werden am Rande 2-3 ìl der Standardlösung der aliphatischen Alkohole (4.11) aufgetragen, um die Alkoholzone nach der Entwicklung identifizieren zu können.

5.2.4.

Die Platte in die nach 5.2.2 vorbereitete Entwicklerkammer stellen. Die Temperatur der Umgebung sollte 15 20 oC betragen. Die Kammer mit dem Deckel verschließen und die Platte so lange entwickeln, bis die Fließmittelfront bis 1 cm unter den oberen Plattenrand gestiegen ist. Dann die Platte aus der Entwicklerkammer nehmen und das Lösungsmittel in einem warmen Luftstrom abdampfen oder die Platte eine geraume Zeit unter dem Abzug liegen lassen.

5.2.5.

Die Platte vorsichtig und gleichmässig mit 2', 7'-Dichlorfluoresceinlösung besprühen. Die Lage der Zone der aliphatischen Alkohole mit Hilfe des Flecks der Standardlösung bestimmen. Die Zone der aliphatischen Alkohole und die Zone der unmittelbar darüber liegenden Terpenalkohole werden mit einem schwarzen Stift umrandet.

Anmerkung 4: Da unter den Bedingungen dieses Verfahrens die Terpenalkohole beträchtliche Mengen an aliphatischen Alkoholen enthalten, müssen beide Zonen zusammen erfasst werden.

5.2.6.

Das in der markierten Zone liegende Kieselgel mit einem Metallspatel abkratzen, fein mahlen und in einen Glasfiltertiegel (3.7) überführen. Mit 10 ml warmem Chloroform versetzen, mit Hilfe des Metallspatels gründlich vermischen und unter Vakuum filtrieren. Das Filtrat in der an den Glasfiltertiegel angeschlossenen Vakuumflasche (3.8) auffangen.

Den Rückstand im Glasfiltertiegel dreimal mit je 10 ml Ethylether waschen und das Filtrat wiederum in der Vakuumflasche auffangen. Das Filtrat bis auf ein Volumen von etwa 4-5 ml eindampfen und den Rest der Lösung in das zuvor gewogene 10-ml-Probenglas (3.9) überführen. Durch vorsichtiges Erhitzen unter einem schwachen Stickstoffstrom bis zur Tocknung eindampfen. Mit einigen Tropfen Aceton versetzen, wieder bis zur Trocknung eindampfen, etwa 10 Minuten im Trockenschrank auf 105 oC erhitzen, anschließend im Exsikkator abkühlen lassen und wiegen.

Der Rückstand in dem Probengläschen enthält die Fraktion der aliphatischen Alkohole.

5.3.

Herstellung der Trimethylsilylether (TMSE)

5.3.1.

Dem Probengläschen mit der Fraktion der aliphatischen Alkohole je Milligramm aliphatischem Alkohol 50 ìl Silanisierungsreagenz, bestehend aus einem Gemisch aus Pyridin, Hexamethyldisilazan und Trimethylchlorsilan im Verhältnis 9:3:1 (V/V/V) (Anmerkung 5) zusetzen. Dabei darf es nicht zur Aufnahme von Wasser kommen (Anmerkung 6).

Anmerkung 5: Gebrauchsfertige Lösungen sind im Handel erhältlich; daneben gibt es auch andere Silanisierungsreagenzien, wie beispielsweise N,O- bis -Trimethylsilyltrifluoracetamid + 1 % Trimethylchlorsilan, das mit gleichen Teilen wasserfreiem Pyridin gemischt werden muß.

5.3.2.

Das Probengläschen verschließen und gründlich, nicht zu stark schütteln, bis sich die aliphatischen Alkohole gelöst haben. Die Probe mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen und dann einige Minuten zentrifugieren. Die klare Lösung kann nun gaschromatographisch untersucht werden.

Anmerkung 6: Die Beobachtung einer leichten Opaleszenz ist normal und bedeutet keine Störung. Die Bildung eines weissen Niederschlags oder der Eindruck einer Rosafärbung sind Anzeichen der Anwesenheit von Feuchtigkeit oder der Zersetzung des Reagens. In diesem Fall soll der Test wiederholt werden.

5.4.

Gaschromatographische Analyse

5.4.1.

Vorarbeiten, Einfahren der Säule

5.4.1.1.

Die Säule in den Gaschromatographen einsetzen, wobei das Einlassteil an den mit dem Trennsystem verbundenen Verdampfer und das Auslassteil an den Detektor angeschlossen wird. Überprüfung des Gaschromatographen auf Dichtigkeit der Gasleitungen, Betriebsbereitschaft des Detektors, des Trennsystems, des Schreibers usw.

5.4.1.2.

Wird die Säule zum erstenmal verwendet, ist es ratsam, sie einzufahren. Einen schwachen Gasstrom durch die Säule geben, den Gaschromatographen einschalten und allmählich auf eine Temperatur von mindestens 20 oC über der Arbeitstemperatur (Anmerkung 7) aufheizen. Diese Temperatur ist mindestens 2 Stunden konstant zu halten, und dann sind die Analysenbedingungen einzustellen (Gasstrom, Split, Zuenden der Flamme, Schreiberanschluß, Ofentemperatur, Injektor, Detektor). Dann eine Empfindlichkeit wählen, die mindestens doppelt so groß ist wie bei der Durchführung der Analyse. Die Grundlinie muß linear verlaufen, ohne Peaks oder Drift.

Eine negative Drift ist ein Indiz für einen undichten Anschluß der Säule, eine positive deutet auf ein mangelhaftes Einfahren der Säule hin.

Anmerkung 7: Die Einfahrtemperatur muß in jedem Fall 20 oC unter der für die stationäre Phase angegebenen Maximaltemperatur liegen.

5.4.2.

Wahl der Arbeitsbedingungen

5.4.2.1.

Anhaltspunkte für die Arbeitsbedingungen:

Säulentemperatur: anfangs isotherm 8 Minuten bei 180 oC, dann stufenweise um 5 oC pro Minute bis auf 260 oC ansteigend, anschließend 15 Minuten bei 260 oC;

Verdampfertemperatur: 280 oC;

Detektortemperatur: 290 oC;

Strömungsgeschwindigkeit des Trägergases: Helium 20-35 cm/s, Wasserstoff 30-50 cm/s;

Splitverhältnis: ¹/50 - ¹/100;

Geräteempfindlichkeit: das 4- bis 16fache der Mindestdämpfung;

Detektorempfindlichkeit: 1-2 mV f. s.;

Papiervorschub: 30-60 cm/Std;

Einspritzvolumen: 0,5-1 ìl TMSE-Lösung.

Diese Bedingungen können entsprechend den Kenndaten der Säule und des Gaschromatographen derart geändert werden, daß die damit aufgezeichneten Chromatogramme folgende Bedingungen erfuellen:

- die Retentionszeit des C26-Alkohols muß 18 ± 5 Minuten betragen;

- der Peak des C22-Alkohols muß bei Olivenöl 80 ± 20 % und bei Samenölen 40 ± 20 % der gesamten Skala erreichen.

5.4.2.2.

Zur Überprüfung der vorstehenden Bedingungen werden wiederholt Proben von TMSE-AlkoholGemischen eingespritzt und die Arbeitsbedingungen optimiert.

5.4.2.3.

Die Parameter für die Peak-Integration sind so zu wählen, daß für die in Betracht kommenden Peaks korrekte Werte erzielt werden.

5.4.3.

Durchführung der Analyse

5.4.3.1.

Mit der 10FD15>ml-Mikroliterspritze 1 ìl Hexan entnehmen, 0,5 ìl Luft und anschließend 0,5-1 ìl Probenlösung aufziehen, dabei den Kolben der Spritze so weit einziehen, daß die Nadel leer ist. Die Nadel in die Membran des Injektors einführen, nach 1-2 Sekunden schnell einspritzen, dann nach etwa 5 Sekunden die Nadel langsam herausziehen.

5.4.3.2.

Das Chromatogramm aufzeichnen, bis alle vorhandenen aliphatischen Alkohole eluiert sind.

Die Grundlinie muß stets den vorgeschriebenen Anforderungen (5.4.1.2) genügen.

5.4.4.

Identifizierung der Peaks

Die einzelnen Peaks werden ahand der Retentionszeiten und durch Vergleich mit dem unter denselben Bedingungen analysierten TSME-Gemisch der aliphatischen Alkohole identifiziert.

Abbildung 1 zeigt ein Chromatogramm der Alkoholfraktion eines nativen Ölivenöls.

5.4.5.

Quantitative Bestimmung

5.4.5.1.

Die Peakflächen von 1-Eicosanol und der aliphatischen Alkohole von C22 bis C28 werden mit Hilfe eines Integrators ermittelt.

5.4.5.2.

Der Gehalt an den einzelnen aliphatischen Alkoholen in mg/100 g Fett wird nach folgender Formel berechnet:

Alkohol x = Ax . ms . 100

Alkohol x =

Ax 7 ms 7 100

As 7 m

Darin bedeuten:

Ax = Peakfläche des Alkohols x in mm²,

As

=

Peakfläche von 1-Eicosanol in mm²,

ms

=

zugesetzte Menge 1-Eicosanol in mg,

m

=

Menge der für die Bestimmung entnommenen Probe in g.

6.

ERGEBNISSE

Der Gehalt an den einzelnen aliphatischen Alkoholen wird in mg/100 g Fett angegeben und zum "Gesamtgehalt an aliphatischen Alkoholen" addiert.

ANLAGE

Bestimmung der linearen Strömungsgeschwindigkeit

In den auf Normalbedingungen eingestellten Gaschromatographen werden 1 bis 3 ìl Methan (oder Propan) eingespritzt und die von dem Gas benötigte Durchlaufzeit durch die Säule vom Zeitpunkt des Einspritzens bis zum Peak-Austritt (tM) gemessen.

Die lineare Strömungsgeschwindigkeit in cm/s ist durch die Beziehung L/tM definiert; dabei ist L die Länge der Säule in cm und tM die gemessene Zeit in Sekunden.

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

<?äFN25,6><?äPD7>Abbildung 1: Chromatogramm der Alkoholfraktion eines nativen Olivenöls<?aa2A>

<?Þ><?äBP><?äNP><?äTT1> 1 = Eicosanol (int. Stand.), <?äTT2><?äFA2,><?äTT3> <?äTT4><?äTA5Y0>

<?äTS>1 = Eicosanol (int. Stand.),

<?äFN4>2 = Dicosanol,

<?äFN4>3 = Tricosanol,

<?äFN4>4 = Tetracosanol,

<?äTC><?äTC>5 = Pentacosanol,

<?äFN4>6 = Hexacosanol,

<?äFN4>7 = Heptacosanol,

<?äFN4>8 = Octacosanol.

<?äTE><?aa4L"ENDE EINES SCHAUBILD>

ANHANG V

BESTIMMUNG DER ZUSAMMENSETZUNG UND DES GEHALTS AN STERINEN MIT DER KAPILLAR GASCHROMATOGRAPHIE

1.

UMFANG UND ANWENDUNGSBEREICH

Diese Methode beschreibt das Verfahren zur Bestimmung der Sterinzusammensetzung und des Steringehalts von Fetten.

2.

KURZBESCHREIBUNG

Das Fett wird mit á-Cholestanol als innerem Standard versetzt und mit ethanolischer Kaliumhydroxidlösung verseift. Die Sterinfraktion wird aus dem Unverseifbaren dünnschicht-chromatographisch über basische Kieselgelplatten abgetrennt.

Die aus dem Kieselgel isolierten Sterine werden in Trimethylsilylether überführt und mit Hilfe der Kapillar-Gaschromatographie untersucht.

3.

GERÄTE UND HILFSMITTEL

3.1.

Kolben, 250 ml, mit Rückflußkühler und Schliffstopfen,

3.2.

Scheidetrichter, 500 ml,

3.3.

Kolben, 250 ml,

3.4.

komplette Apparatur für die Dünnschichtchromatographie mit Glasplatten 20 × 20 cm,

3.5.

UV-Lampe, Wellenlänge 366 oder 254 nm,

3.6.

Mikroliterspritzen, 100 und 500 ìl,

3.7.

Glasfiltertiegel mit Porenfilter G 3 (Porosität 15-40 ìm), etwa 2 cm Durchmesser, 5 cm Höhe, mit geeignetem Anschlußstück für die Vakuumfiltration und Schliffmuffe 12/21,

3.8.

Vakuumflasche, 50 ml, mit Schliffmuffe 12/21, für Glasfiltertiegel (3.7),

3.9.

10-ml-Röhrchen mit konischem Boden und dicht schließendem Stopfen,

3.10.

Gaschromatograph, geeignet für die Verwendung von Kapillarsäulen, mit Splitsystem, bestehend aus:

3.10.1.

einem thermostatisierbaren Säulenofen, einstellbar auf die gewünschte Temperatur mit einer Genauigkeit von ± 1 oC,

3.10.2.

einer temperaturregelbaren Verdampfereinrichtung mit Verdampfer aus persilanisiertem Glas,

3.10.3.

einem Flammenionisations-Detektor mit Verstärker,

3.10.4.

einem Integrator mit Schreiber, mit Verstärker zu koppeln,

3.11.

einer Kapillarsäule aus Glas oder fused silica, 20-30 m Länge, 0,25-0,32 mm Innendurchmesser, Innenwand belegt mit SE-52 oder SE-54 oder einer gleichwertigen stationären Phase, Schichtdicke 0,10-0,30 ìm,

3.12.

Mikroliterspritze für die Gaschromatographie, 10 ìl, mit gehärteter Nadel.

4.

REAGENZIEN

4.1.

Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung 2 N: 130 g Kaliumhydroxid (Titer mindestens 85 %) in 200 ml destilliertem Wasser unter Kühlen lösen und mit Ethanol auf 1 Liter auffuellen. Die Lösung ist in gut verschlossenen Braunglasflaschen haltbar (Ethanol 95 % V/V),

4.2.

Ethylether, analysenrein,

4.3.

wasserfreies Natriumsulfat, analysenrein,

4.4.

kieselgelbeschichtete Glasplatten ohne Fluoreszenzindikator, Schichtdicke 0,25 mm (gebrauchsfertig im Handel erhältlich),

4.5.

Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung 0,2 N: 13 g Kaliumhydroxid werden in 20 ml destilliertem Wasser gelöst und mit Ethanol auf 1 Liter aufgefuellt,

4.6.

Benzol für die Chromatographie (siehe 5.2.2),

4.7.

Aceton für die Chromatographie (siehe 5.2.2),

4.8.

Hexan für die Chromatographie (siehe 5.2.2),

4.9.

Ethylether für die Chromatographie (siehe 5.2.2),

4.10.

Chloroform, analysenrein,

4.11.

Referenzlösung für die Dünnschichtchromatographie: Cholesterin oder Phytosterole, 5 %ige Lösung in Chloroform,

4.12.

2', 7'-Dichlorfluorescein, 0,2%ige ethanolische Lösung, leicht alkalisch durch Zusatz einiger Tropfen alkoholischer 2-N-Kaliumhydroxid-Lösung,

4.13.

wasserfreies Pyridin für die Chromatographie,

4.14.

Hexamethyldisilazan,

4.15.

Trimethylchlorsilan,

4.16.

Standardlösung von Sterin-Trimethylsilylethern unmittelbar vor Gebrauch ansetzen mit reinen Sterinen oder Sterinmischungen aus Ölen, in denen sie enthalten sind,

4.17.

á-Cholestanol, 0,2%ige Lösung (m/V) in Chloroform (interner Standard),

4.18.

Trägergas: Wasserstoff oder Helium, rein, für die Gaschromatographie,

4.19.

Hilfsgase: Wasserstoff und Luft, rein, für die Gaschromatographie.

5.

VERFAHREN

5.1.

Herstellung des Unverseifbaren

5.1.1.

Mit einer 500FD15>ml-Mikroliterspritze so viel der 0,2%igen á-Cholestanollösung in Chloroform (4.17) in einen 250-ml-Kolben geben, daß die Menge an Cholestanol etwa 10 % des Steringehalts des zur Analyse verwandten aliquoten Teils der Probe entspricht. So werden z. B. für 5 g Olivenöl 500 ìl der 0,2%igen á-Cholestanollösung benötigt, 1 500 ìl für Samenöle oder Oliventresteröl. Im Stickstoffstrom bis zur Trocknung abdampfen. In den gleichen Kolben genau 5 g der trockenen und filtrierten Probe einwiegen.

Bei tierischen und pflanzlichen Fetten, die grössere Mengen an Cholesterin enthalten, kann ein Peak mit der gleichen Retentionszeit wie Cholestanol auftreten. In diesem Fall ist die Sterinfraktion einmal mit und einmal ohne internen Standard zu analysieren.

5.1.2.

Die Probe bei aufgesetztem Rückflußkühler mit 50 ml 2-N-ethanolischer Kaliumhydroxidlösung versetzen, auf dem Wasserbad erhitzen und unter kräftigem Schütteln und schwachem Sieden verseifen (wobei sich die Lösung klärt). Die Probe weitere 20 Minuten am Sieden halten und dann durch den Rückflußkühler mit 50 ml destilliertem Wasser versetzen, den Rückflußkühler entfernen und den Kolben auf etwa 30 oC abkühlen.

5.1.3.

Den Kolbeninhalt quantitativ in einen 500-ml-Scheidetrichter überführen, wobei mehrfach mit insgesamt 50 ml destilliertem Wasser nachgespült wird. Die Probe mit etwa 80 ml Ethylether versetzen, 30 Sekunden kräftig schütteln und absetzen lassen (vgl. Hinweis 1).

Die wäßrige Phase in einen anderen Scheidetrichter ablassen und dann noch zweimal nach dem gleichen Verfahren mit 60-70 ml Ethylether extrahieren.

Hinweis 1: Etwaige Emulsionen können mit Hilfe einer Waschflasche durch Zusatz kleiner Mengen Ethyl- oder Methylalkohol zerstört werden.

5.1.4.

Die Etherauszuege in einem Scheidetrichter vereinigen und mehrmals mit jeweils 50 ml destilliertem Wasser waschen, bis das Waschwasser neutral reagiert.

Das Waschwasser ablassen, die Etherphase mit wasserfreiem Natriumsulfat trocknen, über wasserfreiem Natriumsulfat in einen zuvor gewogenen 250-ml-Kolben filtrieren. Scheidetrichter und Filter mit kleinen Mengen Ethylether nachspülen.

5.1.5.

Den Ether bis auf wenige ml abdestillieren, den Rückstand unter leichtem Vakuum oder im Stickstoffstrom trocknen, ¹/4 Stunde im Trockenschrank bei 100 oC nachtrocknen, im Exsikkator abkühlen lassen und wiegen.

5.2.

Trennung der Sterinfraktion

5.2.1.

Herstellung der basischen Platten

Die Kieselgelplatten (4.4) vollständig ca. 10 Sekunden lang in eine 0,2-N-ethanolische Alkalihydroxidlösung (4.5) eintauchen, dann unter einem Abzug 2 Stunden trocknen lassen, anschließend noch 1 Stunde bei 100 oC im Trockenschrank.

Die Platten aus dem Trockenschrank nehmen und in einem Exsikkator über Calciumchlorid bis zum Gebrauch aufbewahren. (Derart behandelte Platten müssen innerhalb von 15 Tagen gebraucht werden.)

Hinweis 2: Bei Verwendung von alkalischen Kieselgelplatten zur Trennung der Sterinfraktion erübrigt sich die Behandlung des Unverseifbaren mit Aluminiumoxid. Auf diese Weise bleiben sämtliche sauren Verbindungen (Fettsäuren und andere) an der Startlinie. So erhält man eine saubere Trennung der Sterinzone von denen der aliphatischen Alkohole und Terpenalkohole.

5.2.2.

Die Entwicklerkammer bis zu einer Höhe von etwa 1 cm mit einem Benzol/Aceton-Gemisch 95:5 (V/V) beschicken. Statt dessen kann auch ein Hexan/Ethylether-Gemisch 65:35 (V/V) verwandt werden. Die Kammer mit einem geeigneten Deckel verschließen und mindestens eine halbe Stunde stehen lassen, damit sich ein Gleichgewicht zwischen Flüssigkeit und Dampfphase einstellt. An der Innenwand der Kammer können Filterpapierstreifen befestigt werden, die in das Fließmittel eintauchen. Dadurch kann die Laufzeit um ein Drittel verkürzt und eine gleichmässige Elution der Komponenten erzielt werden.

Hinweis 3: Das Gemisch ist jedesmal frisch anzusetzen, damit die Wiederholbarkeit gewährleistet ist.

5.2.3.

Von einer 5%igen Lösung des Unverseifbaren (5.1.5) in Chloroform mit einer 100FD15>ml-Spritze 0,3 ml als durchgehenden, gleichmässigen Strich 2 cm vom unteren Plattenrand entfernt auf die Dünnschichtplatte (5.2.1) auftragen. In der Verlängerung der Startlinie werden am Rande 2-3 ìl der SterinStandardlösung (4.11) aufgetragen, um die Sterinzone nach der Entwicklung zu identifizieren.

5.2.4.

Die Platte in die nach 5.2.2 vorbereitete Entwicklerkammer stellen. Die Temperatur der Umgebung sollte 15-20 oC betragen. Die Kammer mit dem Deckel verschließen und die Platte so lange entwickeln, bis die Fließmittelfront bis 1 cm unter den oberen Plattenrand gestiegen ist. Dann die Platte aus der Entwicklerkammer nehmen und das Lösungsmittel in einem warmen Luftstrom abdampfen oder die Platte eine geraume Zeit unter dem Abzug liegen lassen.

5.2.5.

Die Platte vorsichtig und gleichmässig mit 2',7'-Dichlorfluoresceinlösung besprühen. Die Lage der Sterinzone mit Hilfe des Flecks der Standardlösung bestimmen und mit einem schwarzen Stift den fluoreszierenden Bereich markieren.

5.2.6.

Das in der markierten Zone liegende Kieselgel mit einem Metallspatel abkratzen, fein mahlen und in einen Glasfiltertiegel (3.7) überführen. Mit 10 ml warmem Chloroform versetzen, mit Hilfe des Metallspatels gründlich vermischen und unter Vakuum filtrieren. Das Filtrat in der an dem Glasfiltertiegel angeschlossenen Vakuumflasche (3.8) auffangen.

Den Rückstand im Glasfiltertiegel dreimal mit je 10 ml Ethylether waschen und das Filtrat wiederum in der Vakuumflasche auffangen. Das Filtrat bis auf ein Volumen von etwa 4-5 ml eindampfen und den Rest der Lösung in das zuvor gewogene 10-ml-Probenglas (3.9) überführen. Durch vorsichtiges Erhitzen unter einem schwachen Stickstoffstrom bis zur Trocknung eindampfen. Mit einigen Tropfen Aceton versetzen, wieder bis zur Trocknung eindampfen, etwa 10 Minuten im Trockenschrank auf 105 oC erhitzen, anschließend im Exsikkator abkühlen lassen und wiegen.

Der Rückstand in dem Probengläschen besteht aus der Sterinfraktion.

5.3.

Herstellung der Trimethylsilylether (TMSE)

5.3.1.

Dem Probengläschen mit der Sterinfraktion werden je Milligramm Sterin 50 ìl Silanisierungsreagenz, bestehend aus einem Gemisch aus Pyridin, Hexamethyldisilazan und Trimethylchlorsilan im Verhältnis 9:3:1 (V/V/V), zugesetzt (Hinweis 4) unter Ausschluß von Feuchtigkeit (Hinweis 5).

Hinweis 4: Gebrauchsfertige Lösungen sind im Handel erhältlich; daneben gibt es auch andere Silanisierungsreagenzien, z. B. N,O-bis-Trimethylsilyltrifluoracetamid + 1 % Trimethylchlorsilan, das mit gleichen Teilen wasserfreiem Pyridin gemischt werden muß.

5.3.2.

Das Probengläschen verschließen und gründlich (nicht zu stark) schütteln, bis sich die Sterine gelöst haben. Die Probe mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen und dann einige Minuten zentrifugieren. Die klare Lösung kann gaschromatographisch untersucht werden.

Hinweis 5: Die Beobachtung einer leichten Opaleszenz ist normal und bedeutet keine Störung. Die Bildung eines weissen Niederschlags oder der Eindruck einer Rosafärbung sind Anzeichen der Anwesenheit von Feuchtigkeit oder der Zersetzung des Reagens. In diesem Fall soll der Test wiederholt werden.

5.4.

Gaschromatographische Analyse

5.4.1.

Vorbereiten, Einfahren der Säule

5.4.1.1.

Die Säule in den Gaschromatographen einsetzen, wobei das Einlassteil an den mit dem Trennsystem verbundenen Verdampfer und das Auslassteil an den Detektor angeschlossen wird.

Überprüfung des Gaschromatographen (Dichtigkeit der Gasleitungen, Betriebsbereitschaft des Detektors, des Trennsystems, des Schreibers usw.).

5.4.1.2.

Wird die Säule zum erstenmal verwendet, ist es ratsam, sie einzufahren. Einen schwachen Gasstrom durch die Säule geben, den Gaschromatographen einschalten und allmählich auf eine Temperatur von mindestens 20 oC über der Arbeitstemperatur (Hinweis 6) aufheizen. Diese Temperatur ist mindestens 2 Stunden konstant zu halten, und dann sind die Analysenbedingungen einzustellen (Gasstrom, Split, Zuenden der Flamme, Schreiberanschluß, Einstellen der Ofentemperatur, Injektor, Detektor). Dann eine Empfindlichkeit wählen, die mindestens doppelt so groß ist wie bei der Durchführung der Analyse. Die Grundlinie muß linear verlaufen, ohne Peaks oder Drift.

Eine negative Drift ist ein Indiz für einen undichten Anschluß der Säule, eine positive deutet auf ein mangelhaftes Einfahren der Säule hin.

Hinweis 6: Die Einfahrtemperatur muß in jedem Fall 20 oC unter der für die stationäre Phase angegebenen Maximaltemperatur liegen.

5.4.2.

Wahl der Arbeitsbedingungen

5.4.2.1.

Anhaltspunkte für die Arbeitsbedingungen:

Säulentemperatur: 260 oC ± 5 oC,

Verdampfertemperatur: 280 oC,

Detektortemperatur: 290 oC,

Strömungsgeschwindigkeit: Helium 20-35 cm/s; Wasserstoff 30-50 cm/s,

Splitverhältnis: 1:50-1:100,

Geräteempfindlichkeit: das 4- bis 16fache der Mindestdämpfung,

Detektorempfindlichkeit: 1-2 mV f. s.,

Papiervorschub: 30-60 cm/Std.,

Einspritzvolumen: 0,5-1 ìl TMSE-Lösung.

Diese Bedingungen können entsprechend den Charakteristiken der Säule und des Gaschromatographen derart geändert werden, daß die damit aufgezeichneten Chromatogramme folgende Bedingungen erfuellen:

- die Retentionszeit von â-Sitosterin muß 20 ± 5 Minuten betragen;

- der Campesterin-Peak muß bei Olivenöl (Durchschnittsgehalt 3 %) 15 ± 5 % des Skalenbereichs und bei Sojaöl (Durchschnittsgehalt 20 %) 80 ± 10 % des Skalenbereichs betragen;

- alle enthaltenen Sterine müssen getrennt werden; die anderen Peaks müssen ebenfalls völlig aufgelöst sein, d. h. der Peakverlauf muß auf die Grundlinie zurückführen, bevor der nächste Peak beginnt; eine unvollständige Auflösung ist nur unter der Bedingung akzeptabel, daß der RRT-1,02-Peak mit Hilfe der Senkrechten quantitativ zu bestimmen ist.

5.4.3.

Durchführung der Analyse

5.4.3.1.

Mit der 10FC15>ml-Mikroliterspritze 1 ìl Hexan entnehmen, 0,5 ìl Luft und anschließend 0,5-1 ìl Probenlösung aufziehen; dabei den Kolben der Spritze so weit einziehen, daß die Nadel leer ist. Die Nadel in die Membran des Injektors einführen, nach 1-2 Sekunden schnell einspritzen, dann nach etwa 5 Sekunden die Nadel langsam herausziehen.

5.4.3.2.

Das Chromatogramm aufzeichnen, bis alle Sterin-TMS-Ether eluiert sind.

Die Grundlinie muß stets den vorgeschriebenen Anforderungen (5.4.1.2) genügen.

5.4.4.

Identifizierung der Peaks

Die einzelnen Peaks werden anhand der Retentionszeiten und durch Vergleich mit dem unter denselben Bedingungen analysierten TSME-Gemisch der Sterine bestimmt.

Die Sterine werden in folgender Reihenfolge eluiert: Cholesterin, Brassicasterin, 24-Methylen-Cholesterin, Campesterin, Campestanol, Stigmasterin, Ä7-Campesterin, Ä5, 23-Stigmastadienol, Chlerosterin, â-Sitosterin, Sitostanol, Ä5-Avenasterin, Ä5, 24-Stigmastadienol, Ä7-Stigmastenol, Ä7-Avenasterin.

In Tabelle I sind die Retentionszeiten relativ zu â-Sitosterin für eine SE-52- und SE-54-Säule aufgeführt.

Die Abbildungen 1 und 2 zeigen die typischen Chromatogramme einiger Öle.

5.4.5.

Quantitative Bestimmung

5.4.5.1.

Mit Hilfe des Integrators werden die Peak-Flächen von á-Cholestanol und der Sterine berechnet. Dabei sind etwa auftretende Peaks von Substanzen, die in Tabelle I nicht aufgeführt sind, nicht zu berücksichtigen. Der Responsefaktor von x-Cholestanol soll gleich 1,00 gesetzt werden.

5.4.5.2.

Der Gehalt an den einzelnen Sterinen in mg/100 g Fett wird nach folgender Formel berechnet:

Sterin x = Ax 7 ms 7 100

Sterin x =

Ax 7 ms 7 100

As 7 m

Darin bedeuten:

Ax = Peakfläche des Sterins x in mm²,

As

=

Peakfläche von á-Cholestanol in mm²,

ms

=

zugesetzte Menge an á-Cholestanol in mg,

m

=

Menge der für die Bestimmung entnommenen Probe in g.

6.

ERGEBNISSE

6.1.

Der Gehalt an den einzelnen Sterinen wird in mg/100 g Öl angegeben, ihre Summe als "Gesamtsterine".

6.2.

Der prozentuale Anteil jedes einzelnen Sterins errechnet sich aus dem Quotienten der Peakfläche des entsprechenden Peaks und der Summe der Peakflächen aller Sterine nach der Formel

Steringehalt in % x = ÓA . 100

Steringehalt in % x =

Ax

ÓA

. 100

Darin bedeuten:

Ax = Peakfläche des Sterins x,

ÓA

=

Summe der Peakfläche aller Sterine.

ANLAGE

Bestimmung der linearen Strömungsgeschwindigkeit

In den auf Normalbedingungen eingestellten Gaschromatographen werden 1 bis 3 ml Methan (oder Propan) eingespritzt und bis zum Peak-Austritt (tM) gemessen.

Die lineare Strömungsgeschwindigkeit in cm/s ist durch die Beziehung L/tMdefiniert; dabei ist L die Länge der Säule in cm und tMdie gemessene Zeit in Sekunden.

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

<?aa8H>Abbildung 1

<?äFN8><?aa8K>Gaschromatogramm der Sterinfraktion von rohem Oivenöl

<?äVS1><?Þ"ENDE EINES SCHAUBILD>

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

<?aa8H>Abbildung 2

<?äFN8><?aa8K>Gaschromatogramm der Sterinfraktion von raffiniertem Olivenöl

<?äVS1><?Þ"ENDE EINES SCHAUBILD>

ANHANG VI

BESTIMMUNG DES ERYTHRODIOLS UND DES UVAOLS

EINLEITUNG

Das (üblicherweise als Summe von Erythrodiol und Uvaol angegebene) Erythrodiol ist ein Bestandteil des Unverseifbaren, das für verschiedene Fette charakteristisch ist. Seine Konzentration ist in extrahierten Olivenölen erheblich höher als in anderen Ölen (Olivenöl aus Pressung, Traubenkernöl), in denen es auch vorkommt. Deshalb kann es zum Nachweis für das Vorhandensein von extrahiertem Olivenöl dienen.

1.

ZWECK UND ANWENDUNGSBEREICH

Die Methode beschreibt ein Verfahren für die Bestimmung des Erythrodiolgehalts in Fetten.

2.

PRINZIP DER METHODE

Das Fett wird mit einer ethanolischen Kaliumhydroxidlösung verseift, dann das Unverseifbare mit Ethylether extrahiert und über eine Aluminiumoxidsäule gereinigt.

Die Fraktionierung des Unverseifbaren wird durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgelplatten durchgeführt, anschließend werden die Zonen der Sterinfraktion und der Erythrodiolfraktion isoliert. Die von der Platte isolierten Sterine und das Erythrodiol werden in Trimethylsilylether überführt, dann wird die Mischung gaschromatographisch untersucht. Das Ergebnis wird angegeben als Prozent Erythrodiol der Gesamtmenge von Erythrodiol plus Sterine.

3.

GERÄTE

3.1.

Die im Anhang V (Bestimmung des Steringehalts) beschriebenen Geräte.

4.

REAGENZIEN

4.1.

Die im Anhang V (Bestimmung des Steringehalts) vorgeschriebenen Reagenzien.

4.2.

Referenzlösung von 0,5 % Erythrodiol in Chloroform.

5.

VERFAHREN

5.1.

Herstellung des Unverseifbaren

Es wird gemäß 5.1.2 des in Anhang V beschriebenen Verfahrens vorgegangen.

5.2.

Abtrennung des Erythrodiols und der Sterine

5.2.1.

Vergleiche 5.2.1 in Anhang V.

5.2.2.

Vergleiche 5.2.2 in Anhang V.

5.2.3.

Eine 5%ige Lösung des Unverseifbaren in Chloroform herstellen. Mit einer 0,1-ml-Mikroliterspritze 0,3 ml dieser Lösung auf eine Dünnschichtplatte 1,5 cm vom unteren Plattenrand entfernt in einem möglichst dünnen und gleichmässigen Strich auftragen. An einem Ende der Platte werden als Referenzsubstanzen einige Mikroliter der Lösungen von Cholesterin und Erythrodiol aufgetragen.

5.2.4.

Die Platte in die nach 5.2.2 vorbereitete Entwicklerkammer geben. Die Raumtemperatur soll etwa 20 oC betragen. Die Kammer sofort mit dem Deckel verschließen und so lange entwickeln, bis die Lösungsmittelfront 1 cm unter dem oberen Plattenrand angekommen ist. Die Platte aus der Entwicklerkammer nehmen und das Lösungsmittel in einem warmen Luftstrom abdampfen.

5.2.5.

Die Platte gleichmässig mit der alkoholischen 2m, 7m-Dichlorfluoresceinlösung besprühen. Unter UV-Licht den Verlauf der Sterin- und Erythrodiolzone an Hand der Referenzsubstanzen identifizieren und etwas ausserhalb der fluoreszierenden Zonen markieren.

5.2.6.

Die markierten Kieselgelzonen mit einem Metallspatel abkratzen. Das von der Platte isolierte Material in ein 50-ml-Becherglas geben, 15 ml warmes Chloroform zugeben, gut schütteln und in einen Glasfiltertiegel fuellen. Dreimal mit je 10 ml warmem Chloroform auswaschen und die Filtrate in einem 100-ml-Rundkolben sammeln. Bis auf ein Volumen von 4-5 ml eindampfen, in ein vorher gewogenes, konisches 10-ml-Zentrifugenröhrchen geben, im warmen Stickstoffstrom trocknen und anschließend wiegen.

5.3.

Herstellung der Trimethylsilylether

Nach dem in Anhang V unter 5.3 beschriebenen Verfahren vorgehen.

5.4.

Gaschromatographische Analyse

Nach der Beschreibung unter 5.4 des vorgenannten Verfahrens vorgehen.

Die Bedingungen der gaschromatographischen Analyse müssen so gewählt werden, daß nicht nur die TMS-Ether der Sterine, sondern auch die TMS-Ether von Erythrodiol und Uvaol getrennt werden.

Nach dem Einspritzen das Schreiberpapier ablaufen lassen, bis alle Sterine, Erythrodiol und Uvaol eluiert sind. Identifizieren der Peaks (Erythrodiol und Uvaol haben im Vergleich zu â-Sitosterin relative Retentionszeiten von etwa 1,45 und 1,55) und Berechnung der Flächenprozente, wie für Sterine beschrieben.

6.

ABFASSUNG DER ERGEBNISSE

% Erythrodiol = A1 + A2 + Ó Asterine × 100

% Erythrodiol =

A1 + A2

A1 + A2 + Ó ASterine

× 100

Hierin bedeuten:

A1 = Fläche des Erythrodiolpeaks in mm²,

A2

= Fläche des Uvaolpeaks in mm²,

Ó ASterine = Summe der vorhandenen Sterinpeaks in mm².

Das Ergebnis wird mit einer Dezimale nach dem Komma angegeben.

ANHANG VII

BESTIMMUNG VON FETTSÄUREN IN 2-STELLUNG DER TRIGLYCERIDE

1.

ZWECK

Diese Methode beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung des Teils der Fettsäuren eines Öles oder Fettes, die in 2-Stellung (â oder innere Stellung) des Glycerins verestert sind.

2.

ANWENDUNGSBEREICH

Diese Methode gilt für Öle und Fette mit einem Schmelzpunkt unter 45 oC, bedingt durch die Besonderheiten der Wirkungsweise der Pankreaslipase.

Sie ist nicht uneingeschränkt anwendbar auf Öle und Fette mit höheren Anteilen an Fettsäuren mit zwölf oder weniger Kohlenstoffatomen (Kokos- und Palmkernöl, Butterfett), hoch ungesättigten Fettsäuren (mit mehr als vier Doppelbindungen), die zwanzig oder mehr Kohlenstoffatome enthalten (Fisch- und Seetieröle), oder Fettsäuren mit sauerstoffhaltigen Gruppen ausser der Säuregruppe.

3.

PRINZIP

Wenn nötig, Neutralisierung von sauren Ölen und Fetten in einem Lösungsmittel. Reinigung über eine Aluminiumoxidsäule. Teilhydrolyse der Triglyceride durch Pankreaslipase in einer vorgegebenen Zeit. Abtrennung der gebildeten Monoglyceride durch Dünnschichtchromatographie und Umesterung dieser Monoglyceride mit Methanol. Die gewonnenen Methylester werden gaschromatographisch analysiert.

4.

GERÄTE

4.1.

100-ml-Rundkolben.

4.2.

25-ml-Rundkolben mit Schliff.

4.3.

1 m langes Steigrohr mit Schliffansatz für den Kolben 4.2.

4.4.

250-ml-Kolben.

4.5.

50-ml-Becherglas.

4.6.

500-ml-Scheidetrichter.

4.7.

Glassäule für die Säulenchromatographie, 13 mm Innendurchmesser, 400 mm Länge, mit Hahn und gläsernem Frittenboden.

4.8.

10-ml-Zentrifugenglas, mit Schliffstopfen.

4.9.

5-ml-Bürette, Graduierung 0,05 ml.

4.10.

1-ml-Injektionsspritze, mit dünner Kanüle.

4.11.

Mikroliterspritze, zur Abgabe von Tropfen von jeweils 3-4 ìl.

4.12.

Beschichtungsgerät für Dünnschichtplatten.

4.13.

Glasplatten für Dünnschichtchromatographie, 20×20 cm.

4.14.

Entwicklerkammer für die Dünnschichtchromatographie, mit Schliffrand, für 20×20 cm Platten.

4.15.

Sprüher für die Dünnschichtchromatographie.

4.16.

Trockenschrank, einstellbar auf 103 ± 2 oC.

4.17.

Thermostat, regulierbar zwischen 30 und 45 oC ± 0,5 oC.

4.18.

Rotationsverdampfer.

4.19.

Elektrisches Schüttel- und Vibriergerät zum kräftigen Schütteln des Zentrifugenglases.

4.20.

Ultraviolettlampe zur Betrachtung der Dünnschichtplatten.

Und für die Kontrolle der Lipasetätigkeit:

4.21.

Ein pH-Meßgerät.

4.22.

Propellerrührer.

4.23.

5-ml-Bürette.

4.24.

Stoppuhr.

Und für die eventuelle Zubereitung der Lipase:

4.25.

Laborrührgerät zum Zerkleinern und Mischen heterogener Materialien.

5.

REAGENZIEN

5.1.

n-Hexan oder, falls nicht verfügbar, Petrolether (Kp. 30-50 oC), für die Chromatographie.

5.2.

2-Propanol oder Ethanol 95 %ig (V/V), analytisch rein.

5.3.

2-Propanol oder Ethanol, 1:1 wäßrige Lösung.

5.4.

Diethylether, peroxidfrei.

5.5.

Aceton.

5.6.

Ameisensäure, mindestens 98 %ig (m/m).

5.7.

Fließmittel: Mischung aus n-Hexan (5.1), Diethylether (5.4) und Ameisensäure (5.6) im Verhältnis von 70:30:1 (V/V/V).

5.8.

Aktiviertes Aluminiumoxid für die Chromatographie, neutral, Aktivitätsstufe Brockmann 1.

5.9.

Kieselgel, mit Bindemittel für die Dünnschichtchromatographie.

5.10.

Pancreaslipase mit ausreichender Aktivität (Anmerkungen 1 und 2).

5.11.

Natriumhydroxid, 120 g/l wäßrige Lösung.

5.12.

Salzsäure, 6 N.

5.13.

Kalziumchlorid (CaCl2), 220 g/l wäßrige Lösung.

5.14.

Natriumcholat (Enzymqualität), 1 g/l wäßrige Lösung.

5.15.

Pufferlösung: 1 M wäßrige Lösung von tris-Hydroxymethylaminomethan durch Zusatz von Salzsäure (5.12) auf pH 8 gebracht (durch Potentiometer überprüfen).

5.16.

Phenolphthalein, Lösung von 10 g/l in 95 %igem (V/V) Ethanol.

5.17.

2m,7m-Dichlorfluorescein, Lösung von 2 g/l in 95 %igem (V/V) Ethanol, schwach alkalisch durch Zusatz eines Tropfens 1-N-Natriumhydroxidlösung pro 100 ml.

Und für die Kontrolle der Lipasetätigkeit:

5.18.

Neutralisiertes Öl.

5.19.

Natriumhydroxid, 0,1 N wäßrigre Lösung.

5.20.

Natriumcholat (Enzymqualität), wäßrige Lösung von 200 g/l.

5.21.

Gummiarabikum, wäßrige Lösung von 100 g/l.

6.

VORBEREITUNG DER PROBE

Liegt der Gehalt an freien Fettsäuren nach einer Bestimmung gemäß Anhang II unter 3 %, so ist direkt über Aluminiumoxid, wie unter 6.2 beschrieben, zu reinigen. Weist die Probe einen Gehalt an freien Fettsäuren von über 3 % gemäß Anhang II auf, so ist sie in Gegenwart eines Lösungsmittels gemäß 6.1 mit Alkali zu neutralisieren und dann über Aluminiumoxid gemäß 6.2 zu geben.

6.1.

Neutralisierung durch Alkali in Gegenwart eines Lösungsmittels

Etwa 10 g rohes Öl in einen Scheidetrichter (4.6) geben und 100 ml Hexan (5.1), 50 ml 2-Propanol (5.2), einige Tropfen Phenolphthaleinlösung (5.16) und so viel Natriumhydroxidlösung (5.11) hinzufügen, wie dem Gehalt des Öls an freien Fettsäuren zuzueglich 0,3 % Überschuß entspricht. Eine Minute lang kräftig schütteln, 50 ml destilliertes Wasser zugeben, erneut schütteln und absetzen lassen.

Nach dem Absetzen die untere, die Seifen enthaltende Schicht sowie etwaige Zwischenschichten (Schleim, unlösliche Stoffe) entfernen. Die Hexanlösung des neutralisierten Öls mehrmals mit

25-30 ml der 2-Propanollösung (5.3) waschen, bis die Rosafärbung des Phenolphthaleins verschwindet.

Den grössten Teil des Hexans unter Vakuum im Rotationsverdampfer (4.18) abdestillieren, das Öl bei 30-40 oC unter Vakuum in einem Stickstoffstrom trocknen, bis das Hexan vollständig entfernt ist.

6.2.

Reinigung über Aluminiumoxid

Eine Suspension von 15 g aktiviertem Aluminiumoxid (5.8) in 50 ml Hexan (5.1) herstellen und unter Rühren in die Chromatographiesäule (4.7) gießen. Das Aluminiumoxid gleichmässig absetzen lassen und warten, bis das Lösungsmittel auf 1-2 mm über dem Absorptionsmittel abgelaufen ist. Auf die Säule vorsichtig eine Lösung von 5 g Öl in 25 ml Hexan (5.1) gießen; die gesamte aus der Säule ablaufende Flüssigkeit in einem Rundkolben (4.1) sammeln.

7.

HERSTELLUNG DER DÜNNSCHICHTPLATTEN

Die Glasplatten (4.13) sorgfältig mit Ethanol, Petrolether und Aceton reinigen, um jeden Fettrest zu beseitigen. In einen Erlenmeyerkolben (4.4) 30 g Kieselgel (5.9) geben, 60 ml destilliertes Wasser hinzufügen, verschließen und eine Minute kräftig schüttteln. Die Suspension sofort in das Beschichtungsgerät (4.12) geben und eine 0,25 mm dicke Schicht auf die Platten auftragen. Die Platten 15 Minuten an der Luft und eine Stunde im Trockenschrank (4.16) bei 103 ± 2 oC trocknen. Die Platten vor Verwendung in einem Exsikkator auf Raumtemperatur abkühlen.

Fertigplatten sind im Handel erhältlich.

8.

VERFAHREN

8.1.

Hydrolyse durch Pancreaslipase

In das Zentrifugenglas (4.8) etwa 0,1 g der vorbereiteten Probe einwiegen; handelt es sich um ein festes Fett, muß es in 0,2 ml Hexan (5.1), evtl. unter schwachem Erwärmen, gelöst werden.

20 mg Lipase (5.10) und 2 ml der Pufferlösung (5.15) hinzufügen. Sorgfältig und vorsichtig schütteln und dann 0,5 ml der Natriumcholatlösung (5.14) und 0,2 ml der Kalziumchloridlösung (5.13) hinzufügen. Das Glas mit dem Schliffstopfen verschließen, vorsichtig schütteln (Befeuchten des Stopfens vermeiden), das Glas sofort bei 40 ± 0,5 oC in den Thermostaten (4.17) stellen und genau eine Minute mit der Hand schütteln.

Das Glas aus dem Thermostaten nehmen und mit Hilfe des Vibriergeräts (4.19) genau 2 Minuten lang kräftig schütteln.

Sofort in fließendem Wasser abkühlen; 1 ml Salzsäure (5.12) und 1 ml Diethylether (5.4) hinzufügen. Verschließen und kräftig mit dem elektrischen Schüttelgerät schütteln. Stehen lassen und die organische Phase mit Hilfe der Spritze (4.10), gegebenenfalls nach Zentrifugieren, abnehmen.

8.2.

Abtrennung der Monoglyceride durch Dünnschichtchromatographie

Den Extrakt mit der Mikroliterspritze (4.11) auf die Dünnschichtplatte auftragen, und zwar 1,5 cm vom unteren Rand entfernt, als dünnen, einheitlichen Strich. Die Platte in die gut gesättigte Entwicklerkammer (4.14) stellen und mit dem Fließmittel (5.7) bei etwa 20 oC bis 1 cm vom oberen Plattenrand entfernt entwickeln.

Die Platte an der Luft bei der gleichen Temperatur wie in der Entwicklerkammer trocknen und mit 2m,7m-Dichlorfluoresceinlösung (5.17) besprühen. Die Zone der Monoglyceride (Rf etwa 0,035) unter UV-Licht (4.20) markieren.

8.3.

Analyse der Monoglyceride durch Gaschromatographie

Die nach 8.2 erhaltene Kieselgelzone mit einem Spatel abkratzen (vermeiden, daß auch die auf der Startlinie verbleibenden Bestandteile mit erfasst werden) und in das Methylierungskölbchen (4.2) überführen.

Das gesammelte Kieselgel, so wie es vorliegt, nach dem Verfahren gemäß Anhang XB behandeln, die Monoglyceride in Methylester überführen, dann die Ester gaschromatographisch nach dem Verfahren gemäß Anhang XA untersuchen.

9.

FORMULIERUNG DER ERGEBNISSE

Die Zusammensetzung der Fettsäuren in 2-Stellung auf eine Dezimalstelle genau angeben (Anmerkung 3).

10.

ANMERKUNGEN

Anmerkung 1: Prüfung der Lipasetätigkeit

Aus einem Gemisch von 165 ml Gummiarabikumlösung (5.21), 15 g gemahlenem Eis und 20 ml neutralisiertem Öl (5.18) mit einem geeigneten Rührgerät eine Ölemulsion herstellen.

10 ml dieser Emulsion in ein Becherglas (4.5) geben, anschließend 0,3 ml Natriumcholatlösung (5.20) und 20 ml destilliertes Wasser hinzufügen.

Das Becherglas bei 37 p0,5 oC (Anmerkung 4) in einen Thermostaten stellen; die Elektroden eines pH-Meters (4.21) und einen Spiralrührer (4.22) einsetzen.

Mit Hilfe einer Bürette (4.23) tropfenweise Natriumhydroxidlösung (5.19) hinzufügen bis zu einem pH-Wert von 8,5.

Eine ausreichende Menge der wäßrigen Lipasesuspension (siehe nachstehend) hinzufügen. Sobald das pH-Meter 8,3 anzeigt, die Stoppuhr anstellen (4.24) und Natriumhydroxidlösung (5.19) so zutropfen lassen, daß der pH-Wert bei 8,3 gehalten wird. Das Volumen der pro Minute verbrauchten Alkalilösung notieren.

Die Werte in ein Koordinatensystem eintragen, und zwar die Zeitablesungen als Abszisse und die Anzahl ml Alkalilösung zur Konstanthaltung des pH-Werts als Ordinate. Dabei muß sich eine Gerade ergeben.

Die vorstehend erwähnte Lipasesuspension ist eine Suspension von eins zu Tausend in Wasser. Für jeden Versuch soviel der Suspension verwenden, daß in 4 bis 5 Minuten etwa 1 ml Alkalilösung verbraucht wird. Normalerweise werden etwa 1-5 mg Lipasepulver gebraucht. Die Lipaseeinheit wird als die Menge Enzym definiert, die 10 Mikroäquivalente Säure pro Minute freisetzt. Damit ergibt sich die Aktivität A des verwendeten Pulvers, ausgedrückt als Lipaseeinheiten in mg, anhand folgender Formel:

Anmerkung 1: A = V × 10

A =

V × 10

m

Dabei entspricht V der Anzahl der pro Minute verbrauchten ml Natriumhydroxidlösung (5.19), berechnet aus der graphischen Darstellung, m ist das Gewicht der Lipaseprobe in mg.

Anmerkung 2: Herstellung der Lipase

Lipasen mit ausreichender Lipasetätigkeit sind im Handel erhältlich. Sie können aber auch im Labor wie folgt hergestellt werden: 5 kg frisches Schweinepankreas auf 0 oC abkühlen; das umhüllende feste Fett und die anhängenden Gewebe entfernen und im Mixer zerkleinern, bis ein fluessiger Brei ensteht. Diesen Brei mit dem Rührgerät (4.25) 4-6 Stunden mit 2,5 l wasserfreiem Aceton rühren, anschließend zentrifugieren. Den Rückstand noch dreimal mit dem gleichen Volumen Aceton, dann zweimal mit einer Mischung von Aceton und Diethylether 1 : 1 (V/V) und zweimal mit Diethylether extrahieren. Den Rückstand im Vakuum 48 Stunden lang trocknen, bis ein stabiles Pulver entsteht, das im Kühlschrank aufbewahrt werden sollte.

Anmerkung 3: In jedem Fall ist es ratsam, die Zusammensetzung der Gesamtfettsäuren der gleichen Probe zu bestimmen, da ein Vergleich mit den Fettsäuren in 2-Stellung bei der Interpretation der Werte von Nutzen ist.

Anmerkung 4: Die Hydrolysentemperatur wird auf 37 oC eingestellt, wenn ein fluessiges Öl verwendet wird. Sie wird jedoch für die Untersuchungsproben auf 40 oC festgelegt, um auch die Untersuchung von Fetten mit Schmelzpunkten bis zu 45 oC zu ermöglichen.

ANHANG VIII

BESTIMMUNG DES TRILINOLEINGEHALTS

1.

ZWECK

Die vorliegende Norm beschreibt ein Verfahren zur Trennung und quantitativen Bestimmung der Zusammensetzung von Triglyceriden in Abhängigkeit von Molekulargewicht und Grad der Ungesättigtheit, ausgedrückt in "äquivalenten Kohlenstoffzahlen" (siehe Anmerkung 1).

2.

ANWENDUNGSBEREICH

Diese Norm gilt für alle pflanzlichen Öle, die Triglyceride langkettiger Fettsäuren enthalten. Das Verfahren eignet sich insbesondere zum Nachweis von kleinen Mengen linolsäurereicher halbtrocknender Öle in den Ölen, die überwiegend Ölsäure als ungesättigte Fettsäure enthalten, wie z. B. Olivenöl.

3.

PRINZIP

Trennung der Triglyceride durch Umkehrphasenchromatographie in Abhängigkeit von ihren äquivalenten Kohlenstoffzahlen und Auswertung der Chromatogramme.

4.

GERÄTE

4.1.

Flüssigchromatograph, der so ausgestattet ist, daß die Temperatur der Säule über einen Thermostaten kontrolliert werden kann.

4.2.

Einspritzsystem mit einer 10FC15>ml-Probenschleife.

4.3.

Detektor: Differentialrefraktometer. Im Bereich der höchsten Empfindlichkeit sollten wenigstens 10 4 Einheiten des Brechungsindexes erreicht werden.

4.4.

Säule: Säule aus rostfreiem Stahl von 250 mm Länge und 4,5 mm Durchmesser, gefuellt mit Kieselgelpartikeln, die mit Oktadecylsilan belegt sind (Durchmesser 5 ìm). Die durchschnittliche Kohlenstoffbelegung sollte bei etwa 22-23 % liegen (siehe Anmerkung 2).

4.5.

Schreiber und/oder Integrator.

5.

REAGENZIEN

Die Reagenzien müssen analytisch rein sein. Die Fließmittel sollten entgast sein. Sie können mehrere Male wiederverwendet werden, ohne daß dadurch die Trennleistungen beeinflusst werden.

5.1.

Chloroform.

5.2.

Aceton.

5.3.

Acetonitril.

5.4.

Fließmittel: Aceton/Acetonitril. Das Mischungsverhältnis ist so einzustellen, daß damit die gewünschte Trennung erzielt wird. Man geht zunächst von einem Mischungsverhältnis von 1:1 aus.

5.5.

Lösungsmittel: Aceton oder eine Mischung von Aceton/Chloroform im Verhältnis 1:1.

5.6.

Triglyceride als Referenzsubstanzen. Entweder mit Hilfe der im Handel verfügbaren Triglyceride (Tripalmitin, Triolein usw.) ein Diagramm aus den Retentionszeiten und den äquivalenten Kohlenstoffzahlen aufzeichnen oder ein Referenzchromatogramm des Sojaöls verwenden (siehe Anmerkungen 3 und 4 sowie Abbildungen 1 und 2).

6.

VORBEREITUNG DER PROBEN

Von der zu analysierenden Probe wird eine 5 %ige Lösung hergestellt, indem genau 0,5 g ± 0,001 g

der Probe in einen 10-ml-Meßkolben eingewogen und mit dem Lösungsmittel (5.5) auf 10 ml aufgefuellt werden.

7.

VERFAHREN

7.1.

Das HPLC-Gerät in Betrieb setzen. Das Fließmittel (5.4) wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,5 ml/min durch die Säule gepumpt, um das gesamte System zu reinigen. Es wird so lange gewartet, bis eine stabile Grundlinie erreicht ist. Anschließend werden 10 ìl der gemäß Ziffer 6 hergestellten Probe eingespritzt.

8.

BERECHNUNG UND ABFASSUNG DER ERGEBNISSE

Es wird die Methode der inneren Standardisierung angewandt, d. h. man geht davon aus, daß die Summe der Peakflächen, die den verschiedenen Triglyceriden entsprechen, 100 % darstellen. Der relative prozentuale Anteil eines jeden Triglycerids wird berechnet nach der Formel

% Triglycerid = Summe der Peakflächen × 100

% Triglycerid =

Peakfläche

Summe der Peakflächen

× 100

Das Ergebnis ist auf eine Stelle nach dem Komma anzugeben.

Anmerkung 1: Die Reihenfolge der Elution kann durch die Berechnung der "äquivalenten Kohlenstoffzahlen" (NCE) ermittelt werden. Diese sind wie folgt definiert:

NCE = NC 2n.

Dabei ist NC die Zahl der Kohlenstoffatome und n die Zahl der Doppelbindungen.

Wenn no, n1 und n1n die Zahlen der Doppelbindungen sind, die von der Öl- bzw. der Linol- und Linolensäure stammen, so kann die äquivalente Kohlenstoffzahl berechnet werden nach der Formel

NCE = NC do no d1 n1 d1n n1n.

Die Koeffizienten do, d1 und d1n können mit Hilfe der Triglyceride, die als Referenzsubstanzen benutzt wurden, berechnet werden. Unter den in dieser Methode beschriebenen Bedingungen gilt etwa folgende Beziehung

NCE = NC 2,60 no 2,35 n1 2,17 n1n.

Anmerkung 2: Beispiele: Lichrosorb RP 18 (Merck) Art 50333,

Lichrospher 100 CH-18 (Merck) Art 50377 oder ähnliches Füllmaterial.

Anmerkung 3: Man kann ebenfalls mit mehreren Triglyceriden als Referenzsubstanzen und mit Hilfe der korrigierten Retentionszeit TRm = TR TRLösungsmittel die Selektivität in bezug auf Triolein wie folgt berechnen:

Anmerkung 3: a = TRmOlein

á =

TRm

TRmOlein

Die graphische Darstellung von log á = f (Zahl der Doppelbindungen) ermöglicht es, die Retention von allen Triglyceriden zu bestimmen, die die Fettsäuren enthalten, die in den als Referenzsubstanzen verwendeten Triglyceriden vorkommen (siehe Abbildung 2).

Anmerkung 4: Die Trennfähigkeit der Säule muß eine klare Trennung des Trilinolein-Peaks (LLL) auch von den Peaks der Triglyceride ermöglichen, die eine nur wenig unterschiedliche Retentionszeit besitzen.

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

Abbildung 1

<?äFN8>Chromatogramm eines Sojaöls

<?äFN46,6><?äPD7>Anmerkung: <?äSL1><?äUL1>P = Palmitinsäure; St = Stearinsäure; O = Ölsäure; L = Linolsäure; Ln = Linolensäure.

<?äIC"ENDE EINES SCHAUBILD>

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

<?äPD8>Abbildung 2

<?äFN8>Graphische Darstellung von log <?aa9A>aals Funktion von f (Zahl der Doppelbindungen)

<?äVS1><?Þ>Anmerkung: <?äSL1><?äUL1>La = Laurinsäure; My = Myristinsäure; P = Palmitinsäure; St = Stearinsäure; O = Ölsäure; <?ß>L = Linolsäure; Ln = Linolensäure.

<?äIC"ENDE EINES SCHAUBILD>

ANHANG IX

UV-SPEKTROPHOTOMETRISCHE ANALYSE

EINLEITUNG

Die spektrophotometrische Untersuchung im Ultraviolettlicht kann Angaben über die Qualität eines Fettes, seine Haltbarkeit und die infolge technologischer Verfahren eingetretenen Veränderungen erbringen.

Die Absorption bei den in dem Verfahren vorgesehenen Wellenlängen ist bedingt durch das Vorkommen konjugierter Dien- und Triensysteme. Die Absorption wird als spezifische Extinktion E1cm 1 % angegeben (Extinktion einer 1%igen Lösung des Fettes in dem vorgeschriebenen Lösungsmittel bei einer Schichtdicke von 1 cm). Sie wird üblicherweise als K bezeichnet (auch Extinktionsköffizient genannt).

1.

ANWENDUNGSBEREICH

Das Verfahren beschreibt die Durchführung der spektrophotometrischen Untersuchung von Fetten im Ultraviolettlicht.

2.

PRINZIP

Das zu untersuchende Fett wird in dem vorgeschriebenen Lösungsmittel gelöst, anschließend wird die Extinktion der Lösung bei der vorgeschriebenen Wellenlänge im Vergleich zum reinen Lösungsmittel bestimmt. Die spezifischen Extinktionen werden mit Hilfe der abgelesenen spektrophotometrischen Werte errechnet.

3.

GERÄTE

3.1.

Spektrophotometer, geeignet zum Messen der Extinktionen im UV-Licht zwischen 220 und 360 nm und mit der Möglichkeit, einzelne nanometrische Einheiten ablesen zu können.

3.2.

Rechteckige Quarzküvetten mit Deckel und einer optischen Länge von 1 cm. Die Extinktionen der mit Wasser oder einem geeigneten Lösungsmittel gefuellten Kuevetten dürfen nicht mehr als 0,01 Einheiten voneinander abweichen.

3.3.

25-ml-Meßkolben.

3.4.

Chromatographische Säule von 450 mm Länge und 35 mm Durchmesser, ausgestattet mit einem Abflußrohr von etwa 10 mm Durchmesser.

4.

REAGENZIEN

4.1.

- Isooktan (2,2,4-Trimethylpentan), spektrophotometrisch rein: es muß im Vergleich zu destilliertem Wasser eine Durchlässigkeit von mindestens 60 % bei 220 nm und mindestens 95 % bei 250 nm haben; oder

- Cyclohexan, spektrophotometrisch rein: es muß im Vergleich zu destilliertem Wasser eine Durchlässigkeit von mindestens 40 % bei 220 nm und mindestens 95 % bei 250 nm haben;

- andere geeignete Lösungsmittel, in denen Fette sich vollständig lösen lassen (Ethylalkohol für Rizinusöl).

4.2.

Basisches Aluminiumoxid zur Säulenchromatographie, das gemäß Anlage 1 vorbereitet und geprüft wurde.

4.3.

n-Hexan, zur Chromatographie.

5.

VERFAHREN

5.1.

Die zu untersuchende Probe muß absolut homogen und frei von suspendierten Verunreinigungen sein. Die bei Raumtemperatur fluessigen Öle werden bei einer Temperatur von etwa 30 oC über Papier filtriert. Die festen Fette werden homogenisiert und bei einer Temperatur von höchstens 10 oC über ihrem Schmelzpunkt filtriert.

5.2.

Etwa 0,25 g der so vorbereiteten Probe in einen 25-ml-Meßkolben einwiegen, mit dem vorgeschriebenen Lösungsmittel auffuellen und homogenisieren. Die so hergestellte Lösung muß absolut klar sein. Wenn die Lösung trüb ist oder Verunreinigungen enthält, muß schnell über Papier filtriert werden.

5.3.

Mit der so hergestellten Lösung wird eine Kuevette gefuellt und die Extinktion bei der entsprechenden Wellenlänge zwischen 232 und 276 nm gemessen, wobei das Lösungsmittel als Referenzlösung verwendet wird.

Die abgelesenen Extinktionen müssen im Bereich von 0,1 bis 0,8 liegen; andernfalls müssen die Messungen unter Verwendung von entsprechend stärker konzentrierten oder verdünnten Lösungen wiederholt werden.

5.4.

Wird eine Bestimmung der spezifischen Extinktion nach Behandlung mit Aluminiumoxid verlangt, so ist wie folgt zu verfahren: 30 g basisches Aluminiumoxid werden in einer Hexansuspension in die Säule gegeben. Nach dem Absetzen des Adsorbens wird überschüssiges Hexan bis auf 1 cm oberhalb der Aluminiumoxidfuellung entfernt.

10 g Fett, das wie unter 5.1 beschrieben homogenisiert und filtriert wurde, wird in 100 ml Hexan gelöst und die Lösung auf die Säule gegeben. Das Eluat wird gesammelt und das Lösungsmittel im Vakuum bei Temperaturen unter 25 oC entfernt.

Mit dem so erhaltenen Fett wird sofort weiter verfahren wie unter 5.2 beschrieben.

6.

ABFASSUNG DER ERGEBNISSE

6.1.

Angegeben werden die bei den verschiedenen Wellenlängen bestimmten spezifischen Extinktionen (Extinktionsköffizienten), die wie folgt zu berechnen sind:

Kl = c 7 s

Kl =

Eë

c 7 s

Dabei bedeuten:

Kë = die spezifische Extinktion (Extinktionsköffizient) bei der Wellenlänge l,

Eë

=

die bei der Wellenlänge ë gemessene Extinktion,

c

=

die Konzentration der Lösung in g/100 ml,

s

=

die Länge der Kuevette in cm.

Die Ergebnisse werden mit zwei Dezimalstellen angegeben.

6.2.

Die spektrophotometrische Untersuchung von Olivenöl nach dem amtlichen Verfahren der EWG-Verordnungen sieht die Bestimmung der spezifischen Extinktion in einer Isooktanlösung bei den Wellenlängen 232 und 270 nm sowie die Bestimmung von DK gemäß folgender Formel vor:

DK = Km Km 4 + Km + 4

DK = Km

Km 4 + Km + 4

2

Dabei ist Km die spezifische Extinktion bei der Wellenlänge m, bei der im Bereich von 270 nm das Maximum der Absorption liegt.

ANLAGE I Vorbereitung des Aluminiumoxids und Prüfung seiner Aktivität

A.1.1.

Vorbereitung des Aluminiumoxids

Das zuvor im Trockenschrank bei 380-400 oC 3 Stunden lang getrocknete Aluminiumoxid in ein gut verschließbares Gefäß geben, je 100 g Aluminiumoxid 5 ml destilliertes Wasser zugeben, das Gefäß rasch verschließen, mehrfach schütteln und vor der Verwendung mindestens 12 Stunden stehen lassen.

A.1.2.

Überprüfung der Aktivität des Aluminiumoxids

Eine chromatographische Säule mit 30 g Aluminiumoxid fuellen und weiter wie unter 5.4 beschrieben verfahren. Über die Säule gibt man eine Mischung bestehend aus

- 95 % nativem Olivenöl mit einer spezifischen Extinktion bei 268 nm von weniger als 0,18 und

- 5 % Erdnussöl, das bei der Raffination mit Bleicherde behandelt wurde und eine spezifische Extinktion bei 268 nm von mindestens 4 aufweist.

Weist die Mischung nach dem Passieren der Säule eine spezifische Extinktion bei 268 nm von mehr als 0,11 auf, so ist das Aluminiumoxid geeignet, anderenfalls ist der Wasserzusatz zu erhöhen.

ANLAGE II Eichung des Spektrophotometers

A.2.

Das Gerät muß regelmässig (mindestens alle 6 Monate) im Hinblick auf die Einstellung der Wellenlänge und die Genauigkeit der Anzeige überprüft werden.

A.2.1.

Die Überprüfung der Einstellung der Wellenlänge kann mit Hilfe einer Quecksilberdampflampe oder geeigneter Filter erfolgen.

A.2.2.

Zur Überprüfung der photölektrischen Zelle und des Photomultipliers wird wie folgt verfahren: 0,2 g reines Kaliumchromat für die Spektrophotometrie einwiegen und in einer 0,05-N-Kaliumhydroxidlösung lösen, dann in einen Meßkolben geben und auf 1 000 ml auffuellen. Anschließend genau 25 ml der so hergestellten Lösung in einen 500-ml-Meßkolben überführen und mit der gleichen Kaliumhydroxidlösung auffuellen. Die Extinktion der so hergestellten Lösung bei 275 nm messen und dabei die Kaliumhydroxidlösung als Referenzlösung verwenden. Die mit einer 1-cm-Kuevette gemessene Extinktion muß 0,2 ± 0,005 betragen.

ANHANG XA

GASCHROMATOGRAPHISCHE ANALYSE DER FETTSÄUREMETHYLESTER

1.

ANWENDUNGSBEREICH

Diese Norm enthält allgemeine Anweisungen zur Anwendung der Gaschromatographie mit gepackten Säulen oder mit Kapillarsäulen zur Bestimmung der qualitativen und quantitativen Zusammensetzung einer Mischung von Fettsäuremethylestern, die nach dem in Anhang XB beschriebenen Verfahren hergestellt wurden.

Das Verfahren eignet sich nicht für polymerisierte Fettsäuren.

2.

REAGENZIEN

2.1.

Trägergas

Inertgas (Stickstoff, Helium, Argon, Wasserstoff usw.), vollständig getrocknet und mit einem Sauerstoffgehalt unter 10 mg/kg.

Anmerkung 1: Der ausschließlich in Kapillarsäulen als Trägergas verwendete Wasserstoff kann die Analysengeschwindigkeit verdoppeln, ist aber gefährlich. Sicherheitsvorrichtungen sind verfügbar.

2.2.

Hilfsgase

2.2.1.

Wasserstoff (Reinheit über 99,9 %), frei von organischen Verunreinigungen.

2.2.2.

Luft oder Sauerstoff, frei von organischen Verunreinigungen.

2.3.

Referenzstandard

Eine Mischung aus reinen Fettsäuremethylestern oder die Methylester eines Fetts mit bekannter Zusammensetzung, die möglichst der Zusammensetzung des zu analysierenden Fetts ähnlich sind.

Eine Oxidation der mehrfach ungesättigten Fettsäuren muß vermieden werden.

3.

GERÄTE

Die vorliegenden Instruktionen gelten für die übliche Ausrüstung für die Gaschromatographie mit gepackter Säule oder Kapillarsäule und Flammenionisationsdetektor. Jedes Gerät, das die in 4.1.2 beschriebene Leistung und Trennung erbringt, ist geeignet.

3.1.

Gaschromatograph

Der Gaschromatograph muß über folgende Bestandteile verfügen:

3.1.1.

Einspritzsystem

Verwendet wird ein Einspritzsystem entweder in Verbindung

a) mit gepackten Säulen und möglichst geringem Totvolumen (es muß in diesem Fall auf Temperaturen erhitzt werden können, die um 20-50 oC über der Säulentemperatur liegen) oder

b) mit Kapillarsäulen. In diesem Fall muß das Einspritzsystem speziell für diese Säulen vorgesehen sein. Es kann das Split-System oder das System der splitlosen "On Column"-Injektion sein.

Anmerkung 2: Sind Fettsäuren mit weniger als 16 Kohlenstoffatomen nicht vorhanden, so kann ein Injektor mit beweglicher Nadel verwendet werden.

3.1.2.

Ofen

Der Ofen sollte so ausgelegt sein, daß die Säule auf mindestens 260 oC aufgeheizt und die Temperatur bei gepackten Säulen auf 1 oC und bei Kapillarsäulen auf 0,1 oC genau konstant gehalten werden kann. Letztere Bedingung ist vor allem dann wichtig, wenn eine "Fused Silica"-Säule verwendet wird.

In jedem Fall, besonders aber bei Fettsäuren mit weniger als 16 Kohlenstoffatomen, wird eine Heizung mit Temperaturprogramm empfohlen.

3.1.3.

Gepackte Säule

3.1.3.1.

Säule aus einem Material, das unempfindlich ist gegenüber den zu analysierenden Substanzen (z. B. Glas oder rostfreier Stahl).

Grösse der Säule:

a) Länge: 1-3 m. Eine relativ kurze Säule sollte verwendet werden, wenn langkettige Fettsäuren (über C20) vorkommen. Bei der Analyse von Säuren mit 4 oder 6 Kohlenstoffatomen wird eine 2 m lange Säule empfohlen;

b) Innendurchmesser: 2-4 mm.

Anmerkung 3: Sind mehrfach ungesättigte Bestandteile mit mehr als drei Doppelbindungen vorhanden, so können sie in einer Säule aus rostfreiem Stahl zersetzt werden.

Anmerkung 4: Es kann ein System mit zwei gepackten Säulen verwendet werden.

3.1.3.2.

Füllung, bestehend aus folgenden Bestandteilen:

a) Trägermaterial: Mit Säure gewaschenes und silanisiertes Kieselgur oder sonstiges geeignetes neutrales Trägermaterial mit einem engen Korngrössenbereich (Schwankungsbereich 25 ìm innerhalb der Grenzwerte von 125 bis 200 ìm), wobei die durchschnittliche Korngrösse auf den Innendurchmesser der Säule abgestimmt wird.

b) Stationäre Phase: Polare Flüssigkeit vom Typ Polyester (z. B. Diehtylenglykolpolysuccinat, Butandiolpolysuccinat, Ethylenglykolpolyadipat usw.), Cyanosilicone oder sonstige Flüssigkeiten, die die erforderliche chromatographische Trennung ermöglichen (siehe Ziffer 4). Die stationäre Phase sollte 5-20 % (m/m) der Füllung ausmachen. Für bestimmte Trennungen kann eine nichtpolare stationäre Phase verwendet werden.

3.1.3.3.

Vorbereitung der Säule

Nachdem die Säule vom Detektor getrennt worden ist, den Ofen allmählich auf 185 oC aufheizen und einen Inertgasstrom von 20-60 ml/min mindestens 16 Stunden bei 185 oC sowie weitere 2 Stunden bei 195 oC durch die frisch hergestellte Säule leiten.

3.1.4.

Kapillarsäule

3.1.4.1.

Kapillare aus einem Material, das nicht mit den zu analysierenden Stoffen reagiert (üblicherweise Glas oder "Fused Silica"). Der Innendurchmesser sollte zwischen 0,2 und 0,8 mm liegen. Die Innenflächen müssen vor dem Auftragen der stationären Phase einer geeigneten Behandlung unterzogen werden (beispielsweise Oberflächenvorbereitung, Desaktivierung). In den meisten Fällen ist eine Länge von 25 m ausreichend.

3.1.4.2.

Die stationäre Phase ist üblicherweise vom Typ Polyglykol (Polyethylenglykol 20 000), Polyester (Butandiolpolysuccinat) oder polarem Polysiloxan (Cyanosilicon). Vernetzte (croß linked) Säulen sind geeignet.

Anmerkung 5: Bei Verwendung von polaren Polysiloxanen können bei der Identifizierung und Trennung von Linolensäure und C20-Säuren Schwierigkeiten auftreten.

Die Beschichtung sollte dünn, beispielsweise nur 0,1 bis 0,2 ìm, sein.

3.1.4.3.

Einbau und Vorbereitung der Säule

Beim Einbau der Kapillarsäule müssen die üblichen Vorsichtsmaßnahmen, wie Anordnung der Säule im Ofen (Träger), Auswahl und Zusammenbau der Verbindungsstücke (Abdichtung), Ausrichten der Säulenenden in dem Einspritzsystem und im Detektor (Verringerung von Totvolumen), getroffen werden. Die Säule wird mit dem Trägergasstrom gespült (z. B. bei einer Säulenlänge von 25 m und einem Innendurchmesser von 0,3 mm mit 0,3 bar (30 kPa)).

Zur Vorbereitung der Säule wird das Temperaturprogramm des Ofens auf 3 oC/min eingestellt und die Säule, ausgehend von der Raumtemperatur, auf eine Temperatur von 10 oC unter der Zersetzungsgrenze der stationären Phase erhitzt. Diese Ofentemperatur wird 1 Stunde beibehalten, bis die Grundlinie stabilisiert ist. Dann auf 180 oC zurückschalten und unter isothermen Bedingungen weiterarbeiten.

Anmerkung 6: Entsprechend vorbehandelte Fertigsäulen können im Handel bezogen werden.

3.1.5.

Der Detektor sollte auf eine höhere Temperatur als die Säulentemperatur erhitzt werden können.

3.2.

Spritze

Die Spritze sollte eine maximale Kapazität von 10 ìl und eine Graduierung in 0,1 ìl haben.

3.3.

Schreiber

Wird die von dem Schreiber aufgezeichnete Kurve zur Berechnung der Zusammensetzung der analysierten Mischung verwendet, so wird ein mit dem verwendeten Gerät kompatibler Schreiber von hoher Präzision benötigt. Der Schreiber sollte folgende Merkmale aufweisen:

a) Ansprechgeschwindigkeit unter 1,5 s, vorzugsweise 1 s (die Ansprechgeschwindigkeit ist die Zeit, die der Schreiber benötigt, um nach plötzlicher Auslösung eines Signals (100 %) von 0 % auf 90 % auszuschlagen);

b) Papierbreite mindestens 20 cm;

c) Vorschubgeschwindigkeit einstellbar zwischen 0,4 und 2,5 cm/min.

3.4.

Integrator oder Rechner (fakultativ)

Eine schnelle und genaue Berechnung ist mit Hilfe eines elektronischen Integrators oder Rechners möglich, der eine lineare Reaktion bei angemessener Empfindlichkeit liefern soll. Dabei muß die Korrektur bei Abweichungen von der Grundlinie zufriedenstellend sein.

4.

VERFAHREN

Die in 4.1 bis 4.3 beschriebenen Verfahren beziehen sich auf den Gebrauch eines Flammenionisationsdetektors.

Alternativ kann auch ein Gaschromatograph mit einem Katharometer-Detektor (der auf dem Prinzip der Änderungen der Wärmeleitfähigkeit beruht) verwendet werden. In diesem Fall müssen die Betriebsbedingungen entsprechend Ziffer 6 geändert werden.

4.1.

Versuchsbedingungen

4.1.1.

Ermittlung der optimalen Betriebsbedingungen

4.1.1.1.

Gepackte Säule

Bei der Ermittlung der Versuchsbedingungen müssen folgende Variablen berücksichtigt werden:

a)

Länge und Durchmesser der Säule;

b)

Art und Menge der stationären Phase;

c)

Säulentemperatur;

d)

Trägergasstrom;

e)

erforderliche Trennleistung;

f)

Grösse der zu untersuchenden Probe, die so ausgewählt sein muß, daß Detektor und Elektrometer eine lineare Anzeige ergeben;

g)

Analysendauer.

Im allgemeinen führen die in den Tabellen 1 und 2 genannten Werte zu dem gewünschten Ergebnis, d. h. mindestens 2 000 theoretische Böden pro Meter Säulenlänge für Methylstearat und dessen Elution innerhalb von 15 Minuten.

Sofern die Geräte es erlauben, sollte das Einspritzsystem etwa 200 oC und der Detektor mindestens genauso heiß wie die Säule sein.

Im allgemeinen liegt das Verhältnis der Strömungsgeschwindigkeit des Wasserstoffs für den Flammenionisationsdetektor und der des Trägergases zwischen 1:2 und 1:1 je nach Säulendurchmesser. Der Sauerstoffstrom beträgt etwa das 5- bis 10-fache des Wasserstoffstroms.

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

4.1.1.2.

Kapillarsäule

Die Eigenschaften der Kapillarsäule, nämlich Leistungsfähigkeit und Durchlässigkeit, bedingen, daß die Trennung der Bestandteile und die Analysendauer weitgehend von der Strömungsgeschwindigkeit des Trägergases in der Säule abhängen. Daher ist eine Optimierung der Betriebsbedingungen durch Einwirkung auf deren Parameter (einfacher ausgedrückt: auf den Druckverlust der Säule) notwendig, je nachdem, ob eine bessere Trennung oder eine schnellere Analyse gewünscht wird.

4.1.2.

Bestimmung der Zahl der theoretischen Böden (Leistungsfähigkeit) und der Auflösung (siehe Abbildung 1)

Die Analyse wird mit einer Mischung aus etwa gleichen Teilen Methylstearat und Methyloleat (beispielsweise Methylestern der Kakaobutter) durchgeführt.

Die Säulentemperatur und der Trägergasstrom sind so zu wählen, daß das Maximum des Methylstearat-Peaks etwa 15 Minuten nach dem Lösungsmittelpeak aufgezeichnet wird. Dabei muß eine ausreichende Menge Methylestermischung verwendet werden, damit der Methylstearat-Peak etwa Dreiviertel des vollen Skalenanschlags erreicht.

Die Zahl der theoretischen Böden n wird nach folgender Formel berechnet:

n = 16 [ ù(I) ]²

n = 16 [

dr(I)

ù(I)

]²

Die Auflösung R wird berechnet nach der Formel:

R = ù(I) + ù(II)

R =

2D

ù(I) + ù(II)

Dabei sind:

dr(I)

= die Retention in Millimetern, vom Start des Chromatogramms bis zum Maximum des Methylstearat-Peaks;

ù(I) + ù(II)

= die Breite des Methylstearat- bzw. Methyloleat-Peaks in Millimeters, gemessen zwischen den Schnittpunkten der Wendetangenten mit der Grundlinie;

D

= die Entfernung zwischen den Maxima des Methylstearat- und des Methyloleat-Peaks in Millimetern.

>ANFANG EINES SCHAUBILD>

<?aa8H>Abbildung 1<?aa7A>

<?Þ>Chromatogramm zur Bestimmung der Zahl der theoretischen Böden (Leistungsfähigkeit) und der Auflösung

<?äFN29,2"ENDE EINES SCHAUBILD>

Die Betriebsbedingungen sind so zu wählen, daß sich für Methylstearat wenigstens 2 000 theoretische Böden pro Meter Säule ergeben und eine Auflösung von wenigstens 1,25 erreicht wird.

4.2.

Zu untersuchende Probe

Mit Hilfe der Spritze (3.2) werden 0,1 bis 2 ìl der nach Anhang XB hergestellten Methylester auf die Säule gespritzt. Sind die Ester nicht gelöst, so sind 100 mg/ml in chromatographisch reinem Heptan zu lösen und davon etwa 0,1 bis 1 ìl einzuspritzen.

Müssen Bestandteile bestimmt werden, die lediglich in Spuren vorkommen, so kann die Probengrösse gesteigert werden (bis zum Zehnfachen).

4.3.

Analyse

Im allgemeinen soll unter den in 4.1.1 beschriebenen Bedingungen gearbeitet werden. Es kann jedoch mit einer niedrigeren Säulentemperatur gearbeitet werden, wenn eine Bestimmung von Fettsäuren mit weniger als 12 Kohlenstoffatomen erforderlich ist. Bei der Bestimmung von Fettsäuren mit mehr als 20 Kohlenstoffatomen kann die Temperatur erhöht werden. In beiden Fällen kann auch mit Temperaturprogramm gearbeitet werden. Beispiel: Enthält die Probe Fettsäuremethylester mit weniger als 12 Kohlenstoffatomen, so wird die Probe bei 100 oC (oder bei 50-60 oC falls Buttersäure vorkommt) eingespritzt und die Temperatur sofort mit einer Anstiegsrate von 4-8 oC/min bis zum Optimum erhöht. In manchen Fällen können die beiden Verfahren kombiniert werden.

Nach dem programmierten Aufheizen wird die Elution bei gleichbleibender Temperatur fortgesetzt, bis alle Bestandteile eluiert sind. Verfügt das Gerät über keine programmierbare Heizung, so ist bei zwei festliegenden Temperaturen zwischen 100 oC und 195 oC zu arbeiten. Gegebenenfalls ist es ratsam, die Analyse mit zwei Phasen von unterschiedlicher Polarität durchzuführen, um die Abwesenheit von verdeckten Peaks beispielsweise bei gleichzeitigem Vorkommen von C 18:3 und

C 20:0 oder C 18:3 und C 18:2 konjugiert, sicherzustellen.

4.4.

Herstellung von Referenzchromatogrammen und Referenzkurven

Die Referenz-Standardmischung (2.3) wird unter den gleichen Arbeitsbedingungen wie die Probe analysiert und die Retentionszeiten oder die Retention der vorkommenden Fettsäuren bestimmt. Für jeden Grad der Ungesättigtheit wird auf halblogarithmischem Papier eine graphische Darstellung angefertigt, die den Logarithmus der Retentionszeit oder der Retention als Funktion der Zahl der Kohlenstoffatome zeigt. Unter isothermen Bedingungen müssten die graphischen Darstellungen der geradzahligen Säuren mit dem gleichen Grad der Ungesättigtheit gerade Linien ergeben. Die Geraden sollten annähernd parallel verlaufen.

Es müssen Bedingungen vermieden werden, unter denen verdeckte Peaks auftreten, d. h. Bedingungen, unter denen die Auflösung zu gering ist, um zwei Bestandteile zu trennen.

5.

DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

5.1.

Qualitative Analyse

Die Methylester-Peaks der Probe werden aus der nach 4.4 erstellten graphischen Darstellung identifiziert, wenn nötig durch Interpolation.

5.2.

Quantitative Analyse

5.2.1.

Bestimmung der Zusammensetzung

Abgesehen von Ausnahmefällen wird die Methode der inneren Normalisierung angewandt, d. h. man geht davon aus, daß alle Bestandteile der Probe auf dem Chromatogramm erscheinen, so daß die Gesamtheit der Peakflächen 100 % der Bestandteile darstellt (vollständige Elution).

Enthält das Gerät einen Integrator, so sind dessen Daten zu verwenden. Andernfalls muß die Fläche unter jedem Peak durch Multiplikation der Peakhöhe mit der Breite auf halber Höhe bestimmt werden. Gegebenenfalls sind auch die verschiedenen während der Aufzeichnung verwendeten Abschwächungen zu berücksichtigen.

5.2.2.

Berechnung

5.2.2.1.

Allgemeiner Fall

Der Gehalt eines Bestandteils i (ausgedrückt in Massenprozent Methylester) wird durch Bestimmung des prozentualen Anteils der jeweiligen Peakfläche im Verhältnis zur Summe aller Peakflächen berechnet. Dazu wird folgende Formel verwendet:

ÓA × 100

Ai

ÓA

× 100

Hierbei sind:

Ai = die Peakfläche, die dem Bestandteil i entspricht,

ÓA

= die Summe aller Peakflächen.

Das Ergebnis ist auf eine Stelle nach dem Komma anzugeben.

Anmerkung 7: In diesem allgemeinen Fall wird davon ausgegangen, daß das auf relative Flächen bezogene Berechnungsergebnis den jeweiligen Massenprozenten entspricht. Für die Fälle, in denen diese Annahme nicht zulässig ist, siehe 5.2.2.2.

5.2.2.2.

Anwendung von Korrekturfaktoren

In bestimmten Fällen, beispielsweise in Gegenwart von Fettsäuren mit weniger als 8 Kohlenstoffatomen oder von Fettsäuren mit sekundären Gruppen, bei Verwendung eines Wärmeleitfähigkeits-Detektors oder wenn eine besonders hohe Genauigkeit erforderlich ist, sollten Korrekturfaktoren angewandt werden, um die prozentualen Peakflächen in Massenprozente der Bestandteile umzurechnen. Die Korrekturfaktoren werden mit Hilfe eines Chromatogramms bestimmt, das durch Analyse einer Referenzmischung von Methylestern bekannter Zusammensetzung unter den gleichen Bedingungen wie bei der Analyse der Probe erstellt wurde.

Für diese Referenzmischung ergibt sich der prozentuale Massenanteil des Bestandteiles i aus der Formel:

Óm × 100

mi

Óm

× 100

Hierin sind:

mi = die Masse des Bestandteils in der Referenzmischung,

Óm

= die Gesamtheit aller Massen der verschiedenen Bestandteile der Referenzmischung.

Aus dem Chromatogramm der Referenzmischung (4.4) wird der prozentuale Anteil (Fläche/Fläche) des Bestandteils i wie folgt berechnet:

Ai

ÓA

× 100

Hierin sind:

Ai

= die Peakfläche des Bestandteiles i,

ÓA

= die Summe aller Peakflächen.

Der Korrekturfaktor ergibt sich aus der Formel

Ki = mi × ÓA

Ki=

mi× ÓA

Ai× Óm

Im allgemeinen werden die Korrekturfaktoren auf KC 1 6bezogen, so daß die relativen Faktoren nach folgender Formel berechnet werden:

Kmi = KC 1 6

Kmi=

Ki

KC 1 6

Der Gehalt der Probe an jedem Bestandteil i, ausgedrückt in Massenprozent Methylester, ist:

Ó (Kmi × Ai) × 100

Kmi× Ai

Ó (Kmi× Ai)

× 100

Die Ergebnisse sind auf eine Stelle nach dem Komma anzugeben.

5.2.2.3.

Verwendung eines inneren Standards

In bestimmten Fällen ist es erforderlich, einen inneren Standard zu verwenden (beispielsweise, wenn nicht alle Fettsäuren quantitativ bestimmt werden sollen, wie beim Vorkommen von Säuren mit 4 und 6 Kohlenstoffatomen neben Säuren mit 16 oder 18 Kohlenstoffatomen, oder wenn die absolute Menge an Fettsäuren in der Probe bestimmt werden soll). Dazu werden häufig Fettsäuren mit 5, 15 oder 17 Kohlenstoffatomen verwendet.

Auch für den inneren Standard sollte der Korrekturfaktor bestimmt werden (sofern einer verwendet wird).

Der Anteil des Bestandteils i in Massenprozent, ausgedrückt als Methylester, ergibt sich dann aus der Formel:

ms × Kmi × Ai × 100

ms× Kmi× Ai

m × Kms× As

× 100

Hierin ist:

Ai = die Peakfläche des Bestandteils i,

As

= die Peakfläche des inneren Standards,

Kmi

= der Korrekturfaktor für den Bestandteil i (bezogen auf KC 1 6),

Kms

= der Korrekturfaktor für den inneren Standard (bezogen auf KC 1 6),

m

= die Masse der zu untersuchenden Probe in Milligramm,

ms

= die Masse des inneren Standards in Milligramm.

Das Ergebnis ist auf eine Stelle nach dem Komma anzugeben.

6.

SONDERFALL - VERWENDUNG EINES KATHAROMETER-DETEKTORS (BASIERT AUF DEM PRINZIP DER ÄNDERUNG DER WÄRMELEITFÄHIGKEIT)

Zur Bestimmung der qualitativen und quantitativen Zusammensetzung eines Gemisches von Fettsäuremethylestern kann auch ein Gaschromatograph mit einem Detektor verwendet werden, der auf der Grundlage von Änderungen der Wärmeleitfähigkeit (Katharometer) arbeitet. In diesem Fall müssen die in den Ziffern 3 und 4 beschriebenen Arbeitsbedingungen gemäß der Tabelle 3 geändert werden.

Für die quantitative Analyse sind die in 5.2.2.2 beschriebenen Korrekturfaktoren anzuwenden.

>PLATZ FÜR EINE TABELLE>

7.

UNTERSUCHUNGSBERICHT

Im Untersuchungsbericht müssen das zur Herstellung der Methylester angewandte Verfahren, das gaschromatograpische Verfahren und die Ergebnisse genau angegeben werden. Darüber hinaus sind alle Arbeitsbedingungen zu nennen, die einen Einfluß auf die Ergebnisse gehabt haben können, auch wenn sie nicht in dieser Internationalen Norm aufgeführt wurden oder als fakultativ gelten.

Der Untersuchungsbericht muß alle zur vollständigen Identifizierung der Probe notwendigen Informationen enthalten.

ANHANG XB

VORBEREITUNG DER FETTSÄUREMETHYLESTER GEMÄSS ANHANG VI ABSCHNITTE I UND II DER VERORDNUNG (EWG) Nr. 72/77 ODER GEMÄSS DEM NACHSTEHEND BESCHRIEBENEN VERFAHREN

EINLEITUNG

Die Wahl der Methode ist abhängig von der Zusammensetzung der Fettsäuren, vom Gehalt an freien Fettsäuren des zu untersuchenden Fettes und von der auszuführenden gaschromatographischen Analyse.

In Frage kommen

- für Fette mit Fettsäuren unter C12 nur Verfahren in geschlossenen Ampullen oder mit Dimethylsulfat,

- für Fette mit einem Gehalt an freien Fettsäuren von über 3 % nur Verfahren mit Methanol-Salzsäure oder Dimethylsulfat,

- für gaschromatographische Bestimmungen von trans-Isomeren nur Verfahren mit Natriummethylat oder Dimethylsulfat,

- das Verfahren mit Methanol-Hexan-Schwefelsäure muß angewandt werden für die Herstellung von Methylestern aus kleinen Fettmengen nach deren dünnschichtchromatographischer Abtrennung.

Das Unverseifbare kann vernachlässigt werden, wenn es einen Gehalt von 3 % nicht überschreitet; anderenfalls müssen die Methylester aus den Fettsäuren hergestellt werden.

1.

METHODEN

Im folgenden werden 5 Methoden für die Herstellung der Methylester aus Fetten beschrieben:

a)

mit Natriummethylat,

b)

mit Natriummethylat in einer verschlossenen Ampulle,

c)

mit Methanol-Salzsäure in einer verschlossenen Ampulle,

d)

mit Dimethylsulfat,

e)

mit Methanol-Hexan-Schwefelsäure.

Methode A

2.

PRINZIP DER METHODE

Das zu untersuchende Fett wird unter Rückfluß mit Methanol und Natriummethylat erhitzt. Die gewonnenen Methylester werden mit Ethylether extrahiert.

3.

GERÄTE

3.1.

100-ml-Kolben mit Rückflußkühler, oben mit einem Calciumchloridrohr verschlossen, mit Schliffanschlüssen.

3.2.

50-ml-Meßzylinder.

3.3.

5-ml-Messpipette, mit 0,1-ml-Graduierung.

3.4.

250-ml-Scheidetrichter.

3.5.

200-ml-Kolben.

4.

REAGENZIEN

4.1.

Wasserfreies Methanol.

4.2.

Natriummethylat, etwa 1%ige Lösung in Methanol; Herstellung durch Auflösen von 0,34 g metallischem Natrium in 100 ml wasserfreiem Methanol.

4.3.

Ethylether.

4.4.

Natriumchlorid, 10%ige Lösung.

4.5.

Petrolether, Kp 40o 60 oC.

5.

VERFAHREN

5.1.

In den 100-ml-Kolben 2 g des über Natriumsulfat getro