ANHANG I

KAPITEL 1

LEISTUNGSKRITERIEN UND SONSTIGE ANFORDERUNGEN FÜR ANALYSEMETHODEN

1.1. Anforderungen an Screeningmethoden

1.1.1. Kategorien geeigneter Screeningmethoden

Qualitative, semi-quantitative oder quantitative Methoden sind als Screeningmethoden geeignet.

1.1.2. Anforderungen an biologische, biochemische oder physikalisch-chemische Screeningmethoden

Bei verbotenen oder nicht zugelassenen Stoffen muss das CCβ so niedrig wie möglich (ALARA-Prinzip) sein, in jedem Fall aber unter dem RPA liegen, sofern für den betreffenden Stoff mit der Verordnung (EU) 2019/1871 ein solcher Wert festgelegt wurde.

Bei zugelassenen pharmakologisch wirksamen Stoffen muss das CCβ unter dem MRL oder dem ML liegen.

Nur solche Analysemethoden, für die nachvollziehbar dokumentiert werden kann, dass sie validiert sind und eine nicht konforme („falsch negative“) Rate von 5 % oder darunter (β-Fehler) aufweisen, dürfen für Screeningzwecke eingesetzt werden. Bei Verdacht auf ein nicht konformes Ergebnis muss dieses Ergebnis durch eine Bestätigungsmethode abgesichert werden.

Quantitative Screeningmethoden, die sowohl für Screening- als auch für Bestätigungszwecke eingesetzt werden, müssen denselben Anforderungen an Genauigkeit, Bereich und Präzision genügen, wie unter 1.2.2.1 und 1.2.2.2 beschrieben.

1.2. Anforderungen an Bestätigungsmethoden

1.2.1. Allgemeine Anforderungen an Bestätigungsmethoden

Bei verbotenen oder nicht zugelassenen Stoffen muss die CCα so niedrig wie nach vernünftigem Ermessen erreichbar sein. Bei verbotenen oder nicht zugelassenen Stoffen, für die mit der Verordnung (EU) 2019/1871 ein RPA festgelegt wurde, muss die CCα kleiner oder gleich diesem Referenzwert für Maßnahmen sein.

Bei zugelassenen Stoffen muss die CCα über dem MRL oder dem ML liegen, diesem jedoch so nahe wie möglich sein.

Für Bestätigungszwecke dürfen nur solche Analysemethoden eingesetzt werden, für die nachvollziehbar dokumentiert werden kann, dass sie validiert sind und eine falsch nicht konforme („falsch positive“) Rate von 1 % oder darunter (α-Fehler) bei verbotenen oder nicht zugelassenen Stoffen bzw. von 5 % oder darunter bei zugelassenen Stoffen aufweisen.

Bestätigungsmethoden müssen Informationen über die chemische Struktur des Analyten liefern. Folglich sind Bestätigungsmethoden, die sich auf chromatografische Techniken ohne massenspektrometrische Detektion stützen, für sich allein genommen als Bestätigungsmethoden für verbotene oder nicht zugelassene pharmakologisch wirksame Stoffe nicht geeignet. Sollte für zugelassene Stoffe die Massenspektrometrie nicht geeignet sein, so können auch andere Methoden wie zum Beispiel HPLC-DAD und HPLC-FLD oder eine Kombination aus beiden angewandt werden.

Wenn es die Bestätigungsmethode vorschreibt, muss zu Beginn des Extraktionsverfahrens der Analysenprobe ein geeigneter interner Standard zugesetzt werden. Je nach Verfügbarkeit werden entweder stabile isotopenmarkierte Formen des Analyten, die besonders für die massenspektrometrische Detektion geeignet sind, oder analoge Verbindungen, die mit dem Analyten strukturell eng verwandt sind, verwendet. Wenn kein geeigneter interner Standard verwendet werden kann, muss die Identifizierung des Analyten vorzugsweise durch Co-Chromatografie (1) bestätigt werden. In diesem Fall darf nur ein Peak erhalten werden, wobei dann die Zunahme der Peakhöhe (oder -fläche) der Menge des zugesetzten Analyten entspricht. Ist dies nicht praktikabel, so sind matrix-angepasste Standards oder Matrixstandards zu verwenden.

1.2.2. Allgemeine Leistungskriterien für Bestätigungsmethoden

1.2.2.1. Richtigkeit durch Wiederfindung

Bei wiederholten Analysen eines zertifizierten Referenzmaterials muss die Abweichung des experimentell bestimmten wiederfindungskorrigierten mittleren Masseanteils vom zertifizierten Wert den in Tabelle 1 aufgeführten Mindestwerten der Richtigkeit entsprechen.

Tabelle 1

Mindestwerte der Richtigkeit quantitativer Methoden

Massenanteil Bereich ≤ 1 μg/kg –50 % bis +20 % > 1 μg/kg bis 10 μg/kg –30 % bis +20 % ≥ 10 μg/kg –20 % bis +20 %

Wenn keine zertifizierten Referenzmaterialien zur Verfügung stehen, ist die Bestimmung der Richtigkeit der Messungen auf anderem Wege akzeptabel, zum Beispiel durch die Verwendung von Materialien mit zugewiesenen Werten (Referenzwerten) aus Laborvergleichsstudien oder durch den Zusatz bekannter Mengen des/der Analyten zu einer Leerwertmatrix.

1.2.2.2. Präzision

Bei wiederholter Analyse eines Referenzmaterials oder dotierten Materials darf der Variationskoeffizient (CV) unter laborinternen Reproduzierbarkeitsbedingungen den anhand der Horwitz-Gleichung berechneten Wert nicht überschreiten. Diese Gleichung lautet:

CV = 2(1-0.5 log C)

Dabei ist C der Massenanteil, ausgedrückt als Zehnerpotenz (Exponent) (z. B. 1 mg/g = 10-3). Für Massenanteile unter 120 μg/kg liefert die Horwitz-Gleichung unangemessen hohe Werte. Deshalb darf der zulässige maximale Variationskoeffizient nicht über den in Tabelle 2 aufgeführten Werten liegen.

Tabelle 2

Akzeptabler Variationskoeffizient

Massenanteil Reproduzierbarkeits-CV (%) > 1 000 μg/kg 16 (gemäß der Horwitz-Gleichung) > 120 μg/kg — 1 000 μg/kg 22 (gemäß der Horwitz-Gleichung) 10-120 μg/kg 25 (*) < 10 μg/kg 30 (*)

Bei Analysen unter Wiederholbedingungen soll der Variationskoeffizient unter Wiederholbedingungen zwei Drittel der in Tabelle 2 aufgeführten Werte oder weniger betragen.

1.2.3. Anforderungen an die chromatografische Trennung

Bei der Flüssigchromatografie (LC) oder der Gaschromatografie (GC) muss die Mindestretentionszeit für den/die untersuchten Analyten das Doppelte der Retentionszeit für das Totvolumen der Säule betragen. Die Retentionszeit des Analyten im Extrakt muss mit einer Toleranz von ± 0,1 Minute derjenigen des Kalibrierstandards, eines matrix-angepassten Standards oder eines Matrixstandards entsprechen. Bei schneller Chromatografie, bei der die Retentionszeit unter 2 Minuten beträgt, ist eine Abweichung von weniger als 5 % der Retentionszeit akzeptabel. Für alle Methoden, die ab Inkrafttreten dieser Verordnung validiert werden, muss bei Verwendung eines internen Standards das Verhältnis der chromatografischen Retentionszeit des Analyten zu derjenigen des internen Standards, d. h. die relative Retentionszeit des Analyten, derjenigen des Kalibrierstandards, des matrix-angepassten Standards oder des Matrixstandards mit einer maximalen Abweichung von 0,5 % im Fall von Gaschromatografie und 1 % im Fall von Flüssigchromatografie entsprechen.

1.2.4. Spezifische Leistungskriterien für die Massenspektrometrie

1.2.4.1. Massenspektrometrische Detektion

Zur Durchführung massenspektrometrischer Detektionen stehen unter anderem folgende Datenaufnahmearten zur Verfügung:

1. Aufzeichnung vollständiger Massenspektren (Full Scan);

2. Selected Ion Monitoring (SIM);

3. sequentielle massenspektrometrische Verfahren (MSn), zum Beispiel Selected Reaction Monitoring (SRM);

4. Kombination aus massenspektrometrischen Verfahren (MS) oder sequentiellen massenspektrometrischen Verfahren (MSn) mit entsprechenden Ionisierungsarten.

Sowohl die niedrig auflösende Massenspektrometrie (LRMS, mit Nominalmassenauflösung) als auch die hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS), inklusive zum Beispiel doppelfokussierende Sektorfeld-, Flugzeit- und Orbitrap-Instrumente, sind hierfür geeignete Techniken.

Zur Bestätigung der Identität eines Analyten bei der hochauflösenden Massenspektrometrie (HRMS) muss die Massenabweichung aller diagnostischen Ionen weniger als 5 ppm (oder im Fall von m/z < 200 weniger als 1 mDa) betragen. Basierend hierauf sollte die effektive Massenauflösung zweckbezogen gewählt werden. Sie muss für den gesamten Massenbereich typischerweise höher als 10 000 (bei der 10 % Tal Definition) oder höher 20 000 (bei voller Halbwertsbreite, FWHM) sein.

Wenn die massenspektrometrische Bestimmung im Full Scan (Aufzeichnung vollständiger Spektren, sowohl LRMS als auch HRMS) durchgeführt wird, sind als diagnostische Ionen nur Ionen mit einer relativen Intensität von mehr als 10 % im Referenzspektrum des Kalibrierstandards, des matrix-angepassten Standards oder des Matrixstandards geeignet. Zu den diagnostischen Ionen gehören das Molekül-Ion (falls es mit einer Intensität von ≥ 10 % des Basispeaks detektiert wird) und die weiteren charakteristischen Fragment- oder Produkt-Ionen.

Auswahl der Vorläufer-Ionen: Wenn die massenspektrometrische Bestimmung durch Fragmentierung von Vorläufer-Ionen erfolgt, wird die Vorläufer-Ionenauswahl mit mindestens Nominalmassenauflösung vorgenommen. Bei dem ausgewählten Vorläufer-Ion muss es sich um das Molekül-Ion, charakteristische Addukte des Molekül-Ions, charakteristische Produkt-Ionen oder eines ihrer Isotopen-Ionen handeln. Ist der Massenauswahlbereich bei der Vorläufer-Ionenauswahl größer als ein Dalton (z. B. im Fall der „Data Independent Acquisition“-Methode), so gilt die Methode als Full-Scan-Bestätigungsanalyse.

Auswahl der Fragment- und Produkt-Ionen: Als Fragment- oder Produkt-Ionen sind für den gemessenen Analyten/das gemessene Produkt diagnostische Fragmente auszuwählen. Nichtselektive Übergänge (z. B. das Tropylium-Kation oder Wasserverlust) sind dabei weitestmöglich zu vermeiden. Die Signalintensität der einzelnen diagnostischen Ionen ist anhand der Peakfläche oder -höhe integrierter extrahierter Ionen-Chromatogramme zu bestimmen. Dies gilt auch, wenn Full-Scan-Messungen zur Identifizierung vorgenommen werden. Das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) aller diagnostischen Ionen muss größer oder gleich drei zu eins (3:1) sein.

Relative Intensitäten: Die relativen Intensitäten der diagnostischen Ionen (Ionenverhältnis) werden in Prozent der Intensität des häufigsten Ions oder Übergangs ausgedrückt. Das Ionenverhältnis ist durch Vergleich von Spektren oder durch Integration der Signale der extrahierten Einzelmassen zu ermitteln. Das Ionenverhältnis des zu bestätigenden Analyten muss den Ionenverhältnissen der matrix-angepassten Standards, der Matrixstandards oder von Standardlösungen mit vergleichbaren Konzentrationen, die unter denselben Bedingungen gemessen wurden, mit einer relativen Abweichung von maximal ± 40 % entsprechen.

Für alle massenspektrometrischen Analysen ist mindestens ein Ionenverhältnis zu bestimmen. Dabei handelt es sich vorzugsweise um mittels eines einzelnen Scans gewonnene Ionen, doch sie können auch aus verschiedenen Scans derselben Injektion stammen (d. h. Full Scan und Fragmentierungsscan).

1.2.4.2. Identifizierung

Für die Auswahl geeigneter Datenaufnahmearten und Auswertungskriterien ist ein System von Identifizierungspunkten zu verwenden. Zur Bestätigung der Identität von Stoffen in einer Matrix, für die ein MRL festgelegt ist (zulässige Verwendung), sind mindestens 4 Identifizierungspunkte erforderlich. Für nicht zugelassene oder verbotene Stoffe sind 5 Identifizierungspunkte nötig. Einer dieser Punkte kann aus der chromatografischen Trennung stammen. Tabelle 3 zeigt die Anzahl der Identifizierungspunkte, die die einzelnen Verfahren liefern. Die zur Bestätigung benötigten Identifizierungspunkte können durch Einsatz verschiedener Techniken erhalten worden sein.

1. Alle massenspektrometrischen Analysen sind mit einem Trennverfahren zu kombinieren, das ein ausreichendes Trennvermögen und eine ausreichende Selektivität für die spezielle Anwendung aufweist. Geeignete Trennverfahren sind unter anderem die Flüssig- und Gaschromatografie, die Kapillarelektrophorese (CE) und die überkritische Flüssigchromatographie (SFC). Falls zu dem Analyten isobare oder isomere Verbindungen existieren, müssen die Akzeptanzkriterien für Retentionszeitabweichungen (d. h. ± 0,5 % bei GC und ± 1 % bei LC und SFC) für die Bestätigung der Identität des Analyten erfüllt sein.

2. Maximal drei separate Verfahren können kombiniert werden, um die Mindestanzahl an Identifizierungspunkten zu erreichen.

3. Verschiedene Ionisierungsarten (z. B. Elektronenstoßionisation und chemische Ionisierung) gelten als verschiedene Verfahren. Tabelle 3 Identifizierungspunkte pro Verfahren Verfahren Identifizierungspunkte Trennverfahren (GC, LC, SFC, CE) 1 LR-MS Ion 1 Vorläufer-Ionenauswahl mit einem Massenbereich < ± 0,5 Da 1 (indirekt) LR-MSn Produkt-Ion 1,5 HR-MS Ion 1,5 HR-MSn Produkt-Ion 2,5 Tabelle 4 Beispiele für die Anzahl an Identifizierungspunkten für spezifische Verfahren und Kombinationen aus Verfahren (n = ganze Zahl) Verfahren Trennung Anzahl von Ionen Identifizierungspunkte GC-MS (EI oder CI) GC n 1 + n GC-MS (EI und CI) GC 2 (EI) + 2 (CI) 1 + 4 = 5 GC-MS (EI oder CI) 2 Derivate GC 2 (Derivat A) + 2 (Derivat B) 1 + 4 = 5 LC-MS LC n (MS) 1 + n GC- oder LC-MS/MS GC oder LC 1 Vorläufer + 2 Produkte 1 + 1 + 2 × 1,5 = 5 GC- oder LC-MS/MS GC oder LC 2 Vorläufer + 2 Produkte 1 + 2 + 2 × 1,5 = 6 GC- oder LC-MS3 GC oder LC 1 Vorläufer + 1 MS2 Produkt + 1 MS3 Produkt 1 + 1 + 1,5 + 1,5 = 5 GC- oder LC-HRMS GC oder LC n 1 + n × 1,5 GC- oder LC-HRMS/MS GC oder LC 1 Vorläufer (< ± 0,5 Da Massenbereich) + 1 Produkt 1 + 1 + 2,5 = 4,5 GC- oder LC-HRMS und HRMS/MS GC oder LC 1 Full-Scan-Ion + 1 HRMS Produkt-Ion (a) 1 + 1,5 + 2,5 = 5 GC- und LC-MS GC und LC 2 Ionen (GCMS) + 1 Ion (LCMS) 1 + 1 + 2 + 1 + 1 = 6

1.2.5. Spezifische Leistungskriterien für die Bestimmung eines Analyten mittels Flüssigchromatografie mit Detektion, ausgenommen Massenspektrometrie

Folgende Verfahren dürfen ausschließlich für zugelassene Stoffe alternativ zu massenspektrometrischen Methoden angewandt werden, sofern die für diese Verfahren relevanten Kriterien erfüllt sind:

1. Full-Scan-Diodenarray-Spektralfotometrie (DAD) gekoppelt mit HPLC;

2. Fluoreszenzdetektion (FLD) gekoppelt mit HPLC.

Flüssigchromatografie mit UV/VIS-Detektion (eine Wellenlänge) ist für sich allein nicht als Bestätigungsmethode geeignet.

1.2.5.1. Leistungskriterien für die Full-Scan-Diodenarray-Spektralfotometrie

Die Leistungskriterien für die chromatografische Trennung gemäß Kapitel 1.2.3 müssen erfüllt sein.

Die Absorptionsmaxima im UV-Spektrum des Analyten müssen mit einer maximalen Toleranz, die durch das Auflösungsvermögen des Detektionssystems bestimmt wird, bei denselben Wellenlängen wie denjenigen des Kalibrierstandards in der Matrix liegen. Bei der Dioden-Array-Detektion beträgt diese maximale Toleranz typischerweise ± 2 nm. Das Analytspektrum oberhalb von 220 nm darf sich für diese Teile der beiden Spektren mit einem relativen Absorptionsvermögen größer oder gleich 10 % optisch nicht vom Spektrum des Kalibrierstandards unterscheiden. Dieses Kriterium ist erfüllt, wenn zum einen die gleichen Maxima vorliegen und zum anderen der Unterschied zwischen den beiden Spektren an keinem Punkt mehr als 10 % des Absorptionsvermögens des Kalibrierstandards beträgt. Wenn mittels computergestützter Bibliothekssuche ein Spektrenvergleich durchgeführt wird, muss das Ergebnis des Spektrenvergleichs zwischen amtlichen Proben und Kalibrierlösung einen kritischen Übereinstimmungsgrad überschreiten. Dieser Übereinstimmungsgrad wird bei der Validierung für jeden Analyten auf der Basis von Spektren bestimmt, für welche die oben beschriebenen Kriterien erfüllt sind. Schwankungen in den Spektren, die durch die Probenmatrix und die Leistungsfähigkeit des Detektors verursacht werden, müssen überprüft werden.

1.2.5.2. Leistungskriterien für die Fluoreszenzdetektion

Die Leistungskriterien für die chromatografische Trennung gemäß Kapitel 1.2.3 müssen erfüllt sein.

Die Anregungs- und Emissionswellenlängen müssen in Verbindung mit den chromatografischen Bedingungen so gewählt werden, dass die Wirkungen störender Bestandteile in Leerwertprobenextrakten auf ein Mindestmaß reduziert werden. Zwischen den Anregungs- und Emissionswellenlängen sollten mindestens 50 Nanometer liegen.

Der jeweilige Analytpeak muss von dem nächstgelegenen Peakmaximum im Chromatogramm durch mindestens eine volle Peakbreite bei 10 % der maximalen Höhe des Analytpeaks getrennt sein.

Dies betrifft Moleküle, die eine natürliche Fluoreszenz aufweisen, und Moleküle, die nach Transformation oder Derivatisierung eine Fluoreszenz zeigen.

KAPITEL 2

VALIDIERUNG

2.1. Für die Analysemethoden zu bestimmende Leistungsmerkmale

Durch die Validierung der Methode ist nachzuweisen, dass die relevanten Leistungsmerkmale der Analysemethode die jeweils dafür gültigen Kriterien erfüllen. Unterschiedliche Kontrollzwecke erfordern unterschiedliche Arten von Methoden. Aus Tabelle 5 geht hervor, welche Leistungsmerkmale für welchen Methodentyp bestimmt werden müssen; nähere Erläuterungen zu jedem Parameter finden sich in diesem Kapitel.

Tabelle 5

Klassifikation von Analysenmethoden nach den zu bestimmenden Leistungsmerkmalen

Methode Bestätigung Screening qualitativ quantitativ qualitativ semi-quantitativ quantitativ Stoffe A A, B A, B A, B A, B Identifizierung gemäß 1.2 x x CCα x x CCβ - x x x Richtigkeit x x Präzision x (x) x Relativer Matrixeffekt/absolute Wiederfindungsrate (*) x x Selektivität/Spezifität x x x x Stabilität (#) x x x x Robustheit x x x x x: Durch die Validierung muss nachgewiesen werden, dass die Anforderungen bezüglich der Leistungsmerkmale erfüllt sind. (x) Die Anforderungen bezüglich der Präzision gemäß Kapitel 1.2.2.2 brauchen bei semi-quantitativen Screeningmethoden nicht erfüllt zu sein. Die Präzision ist jedoch zu bestimmen, um nachzuweisen, dass sich die Methode zur Vermeidung nicht konformer Analyseergebnisse eignet. A: verbotene oder nicht zugelassene Stoffe B: zugelassene Stoffe

2.2. Richtigkeit, Wiederholpräzision und laborinterne Reproduzierbarkeit

Dieses Kapitel enthält Beispiele für bzw. Verweise auf Validierungsverfahren. Andere Ansätze zum Nachweis, dass die Methode die Leistungskriterien erfüllt, sind zulässig, sofern sie Informationen im selben Umfang und in derselben Qualität liefern.

2.2.1. Klassische Validierung

Zur Berechnung der Parameter nach den klassischen Validierungsmethoden müssen mehrere Einzeluntersuchungen durchgeführt werden. Jedes Leistungsmerkmal muss für jede größere Änderung bestimmt werden (siehe Abschnitt 2.4). Bei Multianalytmethoden können mehrere Analyten gleichzeitig analysiert werden, sofern möglicherweise relevante Störungen ausgeschlossen wurden. Mehrere Leistungsmerkmale können auf ähnliche Weise bestimmt werden. Daher empfiehlt es sich zur Reduzierung des Aufwands, die Untersuchungen soweit wie möglich zu kombinieren (z. B. Wiederholpräzision und laborinterne Reproduzierbarkeit mit der Spezifität, die Analyse von Leerwertproben zur Bestimmung der Entscheidungsgrenze zur Bestätigung und Prüfung auf Spezifität).

2.2.1.1. Richtigkeit auf der Grundlage eines zertifizierten Referenzmaterials

Die Richtigkeit einer Analysemethode ist vorzugsweise anhand eines zertifizierten Referenzmaterials zu bestimmen. Das Verfahren hierfür ist in ISO 5725-4:1994 (2) beschrieben.

Ein Beispiel findet sich nachstehend:

1. Analyse von sechs Replikaten des zertifizierten Referenzmaterials gemäß der Prüfvorschrift für die Methode;

2. Ermittlung der Konzentration des Analyten in jedem Replikat;

3. Berechnung des Mittelwerts, der Standardabweichung und des Variationskoeffizienten (%) für diese sechs Replikate;

4. Berechnung der Richtigkeit, indem die gemessene mittlere Konzentration durch den zertifizierten Wert (gemessen als Konzentration) dividiert, mit 100 multipliziert und das Ergebnis als Prozentwert angegeben wird.

Richtigkeit (%) = (mittlere wiederfindungskorrigierte gemessene Konzentration) x 100/zertifizierter Wert

2.2.1.2. Richtigkeit auf der Grundlage dotierter Proben

Ist kein zertifiziertes Referenzmaterial verfügbar, so muss die Richtigkeit der Methode durch Untersuchungen mit dotierter Leerwertmatrix bestimmt werden, und zwar mindestens wie folgt:

1. Bei Methoden, die ab Inkrafttreten dieser Verordnung validiert werden, ist Leerwertmatrix auszuwählen und auf folgenden Konzentrationsniveaus zu dotieren: a) dem 0,5fachen (3), 1,0fachen und 1,5fachen des RPA oder b) dem 0,1fachen (4), 1,0fachen und 1,5fachen des MRL oder ML bei zugelassenen Stoffen oder c) dem 1,0fachen, 2,0fachen und 3,0fachen des niedrigsten Dotierniveaus bei nicht zugelassenen Stoffen (für die kein RPA festgelegt ist).

2. Für jedes Konzentrationsniveau ist die Analyse mit mindestens sechs Replikaten durchzuführen.

3. Analyse der Proben.

4. Berechnung der in jeder Probe festgestellten Konzentration.

5. Berechnung der Richtigkeit für jede Probe anhand der nachstehenden Gleichung und anschließend Berechnung der mittleren Richtigkeit und des Variationskoeffizienten für die sechs Ergebnisse bei jeder Konzentration.

Richtigkeit (%) = (mittlere wiederfindungskorrigierte gemessene Konzentration) x 100/Dotierungsniveau

Bei Methoden für zugelassene Stoffe, die vor dem Geltungsbeginn dieser Verordnung validiert wurden, ist eine Bestimmung der Richtigkeit der Methode anhand von 6 dotierten Aliquoten beim 0,5fachen, 1,0fachen und 1,5fachen des MRL oder des ML ausreichend.

2.2.1.3. Wiederholpräzision

1. Bei Methoden, die ab Inkrafttreten dieser Verordnung validiert werden, ist ein Satz identischer Proben (identische Leerwertmatrix, identische Tierart) vorzubereiten. Diese sind mit dem Analyten zu folgenden Konzentrationsniveaus zu dotieren: a) dem 0,5fachen (5), 1,0fachen und 1,5fachen des RPA oder b) dem 0,1fachen (6), 1,0fachen und 1,5fachen des MRL oder ML bei zugelassenen Stoffen oder c) dem 1,0fachen, 2,0fachen und 3,0fachen des niedrigsten Dotierniveaus bei nicht zugelassenen oder verbotenen Stoffen, falls kein RPA festgelegt ist.

2. Für jedes Konzentrationsniveau ist die Analyse mit mindestens sechs Replikaten durchzuführen.

3. Analyse der Proben.

4. Berechnung der in jeder Probe festgestellten Konzentration.

5. Berechnung der mittleren Konzentration, der Standardabweichung und des Variationskoeffizienten (%) der dotierten Proben.

6. Mindestens zweimalige Wiederholung dieser Schritte.

7. Berechnung der mittleren Konzentrationen, der Standardabweichungen (durch Berechnung des Durchschnitts der quadrierten Standardabweichung und Ziehung der Quadratwurzel hieraus) und der Variationskoeffizienten der dotierten Proben insgesamt. Bei Methoden für zugelassene Stoffe, die vor Inkrafttreten dieser Verordnung validiert wurden, ist eine Bestimmung der Wiederholpräzision auf Konzentrationsniveaus des 0,5fachen, 1,0fachen und 1,5fachen des MRL oder des ML ausreichend (dotierte Leerwertmatrices). Alternativ kann die Berechnung der Wiederholpräzision gemäß ISO 5725-2:2019 (7) erfolgen.

2.2.1.4. Laborinterne Reproduzierbarkeit

1. Bei Validierungen, die nach Inkrafttreten dieser Verordnung durchgeführt werden, ist ein Satz Proben mit definiertem Prüfmaterial (identische oder verschiedene Matrices) vorzubereiten, die mit dem/den Analyten zu folgenden Konzentrationsniveaus dotiert werden: a) dem 0,5fachen(5), 1,0fachen und 1,5fachen des RPA oder b) dem 0,1fachen(6), 1,0fachen und 1,5fachen des MRL oder ML bei zugelassenen Stoffen oder c) dem 1,0fachen, 2,0fachen und 3,0fachen des niedrigsten Dotierniveaus bei nicht zugelassenen oder verbotenen Stoffen, falls kein Referenzwert für Maßnahmen gilt.

2. In jeder Konzentration ist die Analyse mit mindestens sechs Replikaten von Leerwertmaterial durchzuführen.

3. Analyse der Proben.

4. Berechnung der in jeder Probe festgestellten Konzentration.

5. Mindestens zweimalige Wiederholung dieser Schritte mit verschiedenen Chargen Leerwertmaterials, anderen Bearbeitenden und möglichst vielen unterschiedlichen Umgebungsbedingungen, beispielsweise anderen Chargen von Reagenzien, anderen Lösungsmitteln, anderen Raumtemperaturen, anderen Geräten oder anderen Parametern.

6. Bestimmung der mittleren Konzentration, der Standardabweichung und des Variationskoeffizienten (%) der dotierten Proben. Bei Methoden für zugelassene Stoffe, die vor Inkrafttreten dieser Verordnung validiert wurden, ist eine Bestimmung der laborinternen Reproduzierbarkeit anhand dotierter Matrices in Konzentrationen des 0,5fachen, 1,0fachen und 1,5fachen des MRL oder des ML ausreichend. Alternativ kann die Berechnung der laborinternen Reproduzierbarkeit/der Laborpräzision auch gemäß ISO 5725-2:2019, ISO 11843-1:1997 (8), Codex CAC/GL 59-2006 (9) erfolgen.

2.2.2. Validierung nach alternativen Modellen

Zur Berechnung der Parameter nach alternativen Modellen muss ein Versuchsplan erstellt werden. Dieser Versuchsplan muss in Abhängigkeit von der Anzahl der verschiedenen Tierarten und der verschiedenen zu untersuchenden Faktoren angelegt sein. Deshalb muss als erster Schritt des Validierungsvorhabens ermittelt werden, welche Probenarten künftig im Labor analysiert werden sollen, um die wichtigsten Tierarten und Faktoren auszuwählen, welche die Messergebnisse beeinflussen können. Der faktorielle Ansatz erlaubt die Einschätzung der Messunsicherheit der Testergebnisse, die unter verschiedenen Bedingungen, wie zum Beispiel verschiedene Bearbeitende, verschiedene Geräte, verschiedene Chargen von Reagenzien, verschiedene Matrices, verschiedene Bearbeitungsdauern und Umgebungsbedingungen in einem bestimmten Labor erzielt wurden. Anschließend muss der Konzentrationsbereich anwendungsbezogen entsprechend dem MRL bzw. dem ML bei zugelassenen Stoffen oder dem RPA bzw. dem niedrigsten Dotierniveau bei verbotenen oder nicht zugelassenen Stoffen gewählt werden.

Ziel des faktoriellen Ansatzes ist die Ermittlung verlässlicher Präzisionsdaten und Messergebnisse durch die gleichzeitig stattfindende kontrollierte Variation der ausgewählten Faktoren. Er ermöglicht die Auswertung der kombinierten Wirkung faktorieller und zufälliger Effekte. Der Versuchsplan erlaubt außerdem die Untersuchung der Robustheit (10) der Analysemethode und die Bestimmung der laborinternen Reproduzierbarkeit unter Einbeziehung verschiedener Matrices.

Nachstehend folgt ein Beispiel für einen alternativen Validierungsansatz unter Verwendung eines orthogonalen Versuchsplans.

Es können bis zu sieben Faktoren („Rauschfaktoren“) untersucht werden. Die Untersuchung ist so konzipiert, dass Präzision, Richtigkeit (auf Basis dotierter Proben), Sensitivität, Messunsicherheit und kritische Konzentrationen durch die Verwendung des Versuchsplans gleichzeitig bestimmt werden können.

Tabelle 6

Beispiel für einen orthogonalen Versuchsplan mit 7 Faktoren (I — VII), jeweils auf zwei Faktorstufen (A/B) variiert, in einer Validierungsstudie mit acht Läufen (Faktor-Stufen-Kombinationen)

Faktor I II III IV V VI VII Lauf 01 A A A A A A A Lauf 02 A A B A B B B Lauf 03 A B A B A B B Lauf 04 A B B B B A A Lauf 05 B A A B B A B Lauf 06 B A B B A B A Lauf 07 B B A A B B A Lauf 08 B B B A A A B

Die Berechnung der Methodeneigenschaften ist gemäß der Beschreibung von Jülicher et al. (11) vorzunehmen.

2.2.3. Andere Validierungsansätze

Andere Ansätze zum Nachweis, dass die Methode die Leistungskriterien für die Leistungsmerkmale erfüllt, sind zulässig, sofern sie Informationen im selben Umfang und in derselben Qualität liefern. Die Validierung kann auch erfolgen, indem eine Laborvergleichsstudie zum Beispiel gemäß Codex Alimentarius, ISO oder IUPAC (12) durchgeführt wird, oder mittels alternativer Methoden, zum Beispiel laborinterner Validierungsstudien (13). Wenn andere Validierungsverfahren angewandt werden, sind das zugrunde liegende Modell und die Strategie sowie die jeweiligen Voraussetzungen, Annahmen und Formeln im Validierungsprotokoll darzulegen oder es ist zumindest auf die entsprechenden Quellen zu verweisen.

2.3. Selektivität/Spezifität

Das Unterscheidungsvermögen zwischen dem Analyten und eng verwandten Stoffen ist im bestmöglichen Umfang zu bestimmen. Störungen durch Homologe, Isomere, Abbauprodukte, endogene Stoffe, Analoga, Metabolite des interessierenden Rückstands, Matrixbestandteile oder sonstige möglicherweise störende Stoffe sind zu ermitteln. Falls nötig ist die Methode dahingehend zu ändern, dass die ermittelten Störungen vermieden werden. Die Spezifität der Methode muss anhand des folgenden Ansatzes bestimmt werden:

1. Es ist eine Reihe chemisch verwandter Verbindungen oder anderer Stoffe auszuwählen, die wahrscheinlich zusammen mit der interessierenden Verbindung, die in den Proben vorhanden sein kann, vorkommen, und zu prüfen, ob sie die Analyse des/der Zielanalyten beeinträchtigen könnten.

2. Eine geeignete Anzahl an repräsentativen Leerwertproben, z. B. verschiedene Chargen einer Tierart oder verschiedene Chargen verschiedener Tierarten (n ≥ 20), ist zu analysieren und in dem interessierenden Bereich, in dem die Elution des Zielanalyten zu erwarten ist, auf Störungen (Signale, Peaks oder Ionenspuren) zu untersuchen.

3. Repräsentative Leerwertproben sind in einer relevanten Konzentration mit Stoffen zu dotieren, welche die Identifizierung und/oder Quantifizierung des Analyten beeinträchtigen könnten, und zu untersuchen, ob der zugesetzte Stoff a) zu einer falschen Identifizierung führen kann; b) die Identifizierung des Zielanalyten beeinträchtigt; c) die Quantifizierung nennenswert beeinflusst.

2.4. Robustheit

Die Gültigkeit der Methodenkenngrößen ist unter verschiedenen Versuchsbedingungen zu prüfen, wozu beispielsweise unterschiedliche Probenahmebedingungen und geringfügige Änderungen gehören, die sich bei Routineanalysen ergeben können. Bei dieser Prüfung der Robustheit der Methode sollten die Versuchsbedingungen nur geringfügig geändert werden. Der Einfluss dieser Änderungen auf die Leistungsfähigkeit der Methode ist zu bewerten. Für alle geringfügigen Änderungen, die nachweislich einen wesentlichen Einfluss auf die Leistungsfähigkeit des Tests haben, muss jedes Leistungsmerkmal bestimmt werden.

2.5. Stabilität

Die Stabilität des Kalibrierstandards, des matrix-angepassten Standards und/oder des Matrixstandards sowie des Analyten oder der Matrixbestandteile in der Probe während der Lagerung oder der Analyse ist zu bestimmen, da Instabilitäten die Testergebnisse beeinflussen könnten.

Normalerweise ist die Analytstabilität unter verschiedenen Lagerungsbedingungen gut charakterisiert. Die zur Überwachung der Lagerungsbedingungen von Standards und Proben durchgeführten Untersuchungen, die im Rahmen der normalen Laborakkreditierung und des Qualitätskontrollsystems erfolgen, können die erforderlichen Informationen liefern. Stehen für die Analyten in der Matrix Stabilitätsdaten zur Verfügung (z. B. auf Grundlage von Informationen aus den EU-Referenzlaboratorien oder von veröffentlichten Daten), so brauchen diese Daten nicht von jedem Labor ermittelt zu werden. Ein Verweis auf verfügbare Stabilitätsdaten für Analyten in Lösung und in Matrix ist jedoch nur akzeptabel, wenn identische Bedingungen angewandt werden.

Falls die erforderlichen Stabilitätsdaten nicht verfügbar sind, sollten die nachstehenden Ansätze verfolgt werden.

2.5.1. Bestimmung der Stabilität des Analyten in Lösung

1. Herstellung frischer Stammlösungen des/der Analyten und Verdünnung gemäß den Angaben in der Prüfvorschrift, um ausreichend Aliquote (z. B. 40) jeder gewählten Konzentration zu erhalten. Die Proben sind herzustellen aus a) Lösungen des Analyten, die für die Dotierung verwendet werden; b) Analytlösungen, die für die abschließende Analyse verwendet werden; c) sonstigen interessierenden Lösungen (z. B. derivatisierten Standards).

2. Messung des Analytgehalts in der frisch hergestellten Lösung gemäß der Prüfvorschrift.

3. Abfüllung entsprechender Volumina in geeignete Behältnisse, Etikettierung und Lagerung gemäß den Licht- und Temperaturbedingungen in Tabelle 7. Die Lagerungszeit ist unter Berücksichtigung der angewandten analytischen Praxis zu wählen, idealerweise bis die ersten Abbauerscheinungen bei der Identifizierung und/oder Quantifizierung festzustellen sind. Ist während der Stabilitätsprüfung kein Abbau festzustellen, so gilt die Lagerungsdauer der Stabilitätsprüfung als identisch mit der maximalen Lagerungsdauer der Lösung.

4. Berechnung der Konzentration des/der Analyten in jedem Aliquot im Vergleich zur Konzentration des Analyten in der frisch hergestellten Lösung anhand folgender Formel: Restanalyt (%) = Ci × 100/Cfrisch Ci = Konzentration zum Zeitpunkt i Cfrisch = Konzentration der frischen Lösung Der Mittelwert von fünf gelagerten Replikaten darf maximal um 15 % vom Mittelwert von fünf frisch hergestellten Replikaten abweichen. Der Mittelwert der fünf frisch hergestellten Lösungen ist als Grundlage für die Berechnung der prozentualen Differenz heranzuziehen. Tabelle 7 Schema für die Bestimmung der Analytstabilität in Lösung –20 °C +4 °C +20 °C Dunkel 10 Aliquote 10 Aliquote 10 Aliquote Hell 10 Aliquote

2.5.2. Bestimmung der Stabilität des/der Analyten in Matrix

1. Nach Möglichkeit ist gewachsenes Probenmaterial zu verwenden. Wenn kein solches Material zur Verfügung steht, ist eine mit dem Analyten dotierte Leerwertmatrix zu verwenden.

2. Wenn gewachsenes Probenmaterial zur Verfügung steht, ist die Konzentration in der Matrix zu bestimmen, solange diese noch frisch ist. Weitere Aliquote des homogenisierten gewachsenen Probenmaterials sind bei -20 °C oder erforderlichenfalls darunter zu lagern, und die Konzentrationen des Analyten sind zu bestimmen, solange die Probe im Labor gelagert wird.

3. Wenn kein gewachsenes Probenmaterial zur Verfügung steht, ist eine ausreichende Menge Leerwertmatrix zu homogenisieren und in 5 Aliquote aufzuteilen. Jedes Aliquot ist mit dem Analyten zu dotieren, der vorzugsweise in einer geringen Menge wässriger Lösung gelöst werden sollte. Ein Aliquot der so dotierten Leerwertmatrix ist sofort zu analysieren. Die verbleibenden Aliquote sind bei mindestens -20 °C oder erforderlichenfalls darunter zu lagern und nach kurzfristiger, mittelfristiger und langfristiger Lagerung mit geeigneten Analysenmethoden zu analysieren.

4. Die maximal akzeptable Lagerungszeit und die optimalen Lagerungsbedingungen sind zu dokumentieren. Der Mittelwert von fünf gelagerten Replikaten darf maximal um die laborinterne Reproduzierbarkeit der Methode vom Mittelwert von fünf frisch hergestellten Replikaten abweichen. Der Mittelwert der fünf frisch hergestellten Replikate ist als Grundlage für die Berechnung der prozentualen Differenz heranzuziehen.

2.6. Entscheidungsgrenze für die Bestätigung (CCα)

Die CCα ist für Bestätigungsmethoden zu bestimmen. Die CCα muss unter Bedingungen bestimmt werden, die den Anforderungen für die Identifizierung oder die Identifizierung plus Quantifizierung entsprechen, wie in Kapitel 1 („Leistungskriterien und sonstige Anforderungen für Analysemethoden“) dargelegt.

Zur Kontrolle der Konformität der Proben wird die kombinierte Standardmessunsicherheit beim CCα-Wert (Entscheidungsgrenze für die Bestätigung) bereits berücksichtigt.

1. Für nicht zugelassene oder verbotene pharmakologisch wirksame Stoffe ist die CCα wie folgt zu berechnen: a) Methode 1: durch das Kalibrierkurvenverfahren gemäß ISO 11843-1:1997 (14) (hier als kritischer Wert der Nettokonzentration des Analyten bezeichnet). In diesem Fall muss Leerwertmaterial verwendet werden, das in gleichmäßigen Schritten an und über dem RPA oder des niedrigsten Dotierniveaus dotiert ist. Die Proben sind zu analysieren. Nach der Identifizierung ist, soweit möglich, das Signal oder die berechnete Konzentration gegen die dotierte Konzentration aufzutragen. Die entsprechende Konzentration am y-Abschnitt plus das 2,33fache der Standardabweichung der laborinternen Reproduzierbarkeit am Achsenabschnitt ist gleich der Entscheidungsgrenze. Dieses Verfahren ist nur auf quantitative Bestimmungen anwendbar. Durch diesen Ansatz ermittelte Entscheidungsgrenzen sind durch die Analyse von Leerwertmatrix, dotiert in der Konzentration der berechneten Entscheidungsgrenze, zu verifizieren. b) Methode 2: durch Analyse von mindestens 20 repräsentativen Leerwertmaterialien pro Matrix, um das Signal-Rausch-Verhältnis im Zeitfenster, in dem der Analyt zu erwarten ist, zu berechnen. Das Dreifache des Signal-Rausch-Verhältnisses kann als Entscheidungsgrenze herangezogen werden. Dieses Verfahren ist auf quantitative und qualitative Bestimmungen anwendbar. Durch diesen Ansatz ermittelte Entscheidungsgrenzen sind durch die Analyse von Leerwertmatrix, dotiert in der Konzentration der berechneten Entscheidungsgrenze, zu verifizieren. c) Methode 3: CCα = niedrigstes Dotierniveau + k (einseitig, 99 %) × (kombinierte) Standardmessunsicherheit am niedrigsten Dotierniveau. Bei nicht zugelassenen oder verbotenen pharmakologisch wirksamen Stoffen könnte — abhängig von der Validierungsstudie (und den entsprechenden Freiheitsgraden) — die t-Verteilung nach vernünftigem Ermessen angewandt werden, oder — falls die Gausssche Verteilung (einseitig, n=∞) als Grundlage herangezogen wird — ist ein k-Faktor von 2,33 zu verwenden. Die laborinterne Reproduzierbarkeit und die Richtigkeit sind geeignet, um die (kombinierte) Standardmessunsicherheit abzuleiten, wenn dies unter Berücksichtigung aller relevanten Einflussfaktoren geschieht. Im Fall von Methoden, die vor Inkrafttreten dieser Verordnung validiert wurden, darf Methode 2 zur Berechnung der CCα nur bis zum 1. Januar 2026 angewandt werden. Im Fall von Methoden, die nach Inkrafttreten dieser Verordnung validiert werden, dürfen nur die Methoden 1 und 3 angewandt werden.

2. Bei zugelassenen Stoffen ist die CCα wie folgt zu berechnen: a) Bei zugelassenen Stoffen in Matrix-Spezies-Kombinationen, für die ein MRL oder ein ML festgelegt wurde: i) Methode 1: durch das Kalibrierkurvenverfahren gemäß ISO 11843-1:1997 (hier als kritischer Wert der Nettokonzentration des Analyten bezeichnet). In diesem Fall muss Leerwertmaterial verwendet werden, das in gleichmäßigen Schritten am und über dem Konzentrationsniveau des MRL oder des ML dotiert ist. Die Proben sind zu analysieren. Nach der Identifizierung ist, soweit möglich, das Signal oder die berechnete Konzentration gegen die dotierte Konzentration aufzutragen. Die entsprechende Konzentration des MRL oder des ML plus das 1,64fache der Standardabweichung der laborinternen Reproduzierbarkeit an dem Grenzwert ist gleich der Entscheidungsgrenze (α = 5 %). ii) Methode 2: CCα = MRL (oder ML) + k (einseitig, 95 %) × (kombinierte) Standardmessunsicherheit beim MRL oder ML. Bei zugelassenen Stoffen könnte — abhängig von der Validierungsstudie (und den entsprechenden Freiheitsgraden) — die t-Verteilung nach vernünftigem Ermessen angewandt werden, oder — falls die Gausssche Verteilung (einseitig, n=∞) als Grundlage herangezogen wird — ist ein k-Faktor von 1,64 zu verwenden. Die laborinterne Reproduzierbarkeit und die Richtigkeit sind geeignet, um die (kombinierte) Standardmessunsicherheit abzuleiten, wenn dies unter Berücksichtigung aller relevanten Einflussfaktoren geschieht. Bei pharmakologisch wirksamen Stoffen, bei denen der MRL für die Summe verschiedener Stoffe festgelegt ist, muss die CCα des Stoffs mit der höchsten Konzentration in der Probe als CCα für die Bewertung der Summe der Stoffe in der gemessenen Probe verwendet werden. b) Bei zugelassenen Stoffen in Matrix-Tierart-Kombinationen, für die kein MRL festgelegt wurde, dürfen keine Rückstände vorhanden sein, es sei denn, dass eine zugelassene Behandlung gemäß Artikel 11 der Richtlinie 2001/82/EG stattgefunden hat. Bei zugelassenen Stoffen, für die kein MRL festgelegt wurde, ist der gemäß der Durchführungsverordnung (EU) 2018/470 der Kommission (15) bestimmte Kaskaden-MRL zur Berechnung der CCα zu verwenden. Die Methoden 1 oder 2 des obigen Absatzes sind anzuwenden. Dabei wird jedoch als „MRL“ das 0,5fache des Kaskaden-MRL eingesetzt, oder — sofern mit angemessenem Aufwand erreichbar — das 0,1fache des Kaskaden-MRL.

2.7. Nachweisvermögen von Screeningverfahren (CCβ)

Das CCβ ist für Screeningmethoden zu bestimmen. Das CCβ ist wie in Kapitel 1 („Leistungskriterien und sonstige Anforderungen für Analysemethoden“) dieses Anhangs beschrieben und gemäß den Anforderungen in Tabelle 5 zu bestimmen. Bei Screeningmethoden brauchen jedoch die Anforderungen bezüglich der Identifizierung (siehe 1.2.3, 1.2.4 und 1.2.5) nicht vollständig erfüllt zu werden.

1. Bei nicht zugelassenen oder verbotenen pharmakologisch wirksamen Stoffen ist ein maximaler β-Fehler von 5 % sicherzustellen. Das CCβ ist wie folgt zu berechnen: a) Methode 1: durch das Kalibrierkurvenverfahren gemäß ISO 11843-1:1997 (hier als kleinster nachweisbarer Wert der Nettokonzentration des Analyten bezeichnet). In diesem Fall muss repräsentatives Leerwertmaterial verwendet werden, das in gleichmäßigen Schritten am und unter dem Konzentrationsniveau des RPA, oder falls kein RPA festgelegt wurde, um die STC dotiert ist. Die Proben sind zu analysieren. Das Signal ist gegen die dotierte Konzentration aufzutragen. Die entsprechende Konzentration bei der STC plus das 1,64fache der Standardabweichung der laborinternen Reproduzierbarkeit des mittleren gemessenen Gehalts bei der STC ist gleich dem Nachweisvermögen. Die Extrapolation weit unter das niedrigste Dotierniveau (< 50 % der niedrigsten Dotierung) ist durch Untersuchungsdaten, die im Rahmen der Validierungsstudie zu erheben sind, zu bestätigen. b) Methode 2: Untersuchung von dotiertem Leerwertmaterial, dotiert auf dem Konzentrationsniveau der STC und darüber. Für jedes Konzentrationsniveau sind 20 dotierte Leerwertproben zu analysieren, damit eine zuverlässige Basis für diese Bestimmung gewährleistet wird. Die Konzentration, bei der nur ≤ 5 % nicht konforme („falsch negative“) Ergebnisse verbleiben, ist gleich dem Nachweisvermögen der Methode. c) Methode 3: CCβ = STC + k (einseitig, 95 %) × (kombinierte) Standardmessunsicherheit bei oder über der STC. Bei nicht zugelassenen oder verbotenen pharmakologisch wirksamen Stoffen könnte — abhängig von der Validierungsstudie (und den entsprechenden Freiheitsgraden) — die t-Verteilung nach vernünftigem Ermessen angewandt werden, oder — falls die Gausssche Verteilung (einseitig, n=∞) als Grundlage herangezogen wird — ist ein k-Faktor von 1,64 zu verwenden. Die laborinterne Reproduzierbarkeit und die Richtigkeit sind geeignet, um die (kombinierte) Standardmessunsicherheit abzuleiten, wenn dies unter Berücksichtigung aller relevanten Einflussfaktoren geschieht.

2. Bei zugelassenen Stoffen ist ein maximaler β-Fehler von 5 % sicherzustellen. Das CCβ ist wie folgt zu berechnen: a) Methode 1: durch das Kalibrierkurvenverfahren gemäß ISO 11843-1:1997 (hier als kleinster nachweisbarer Wert der Nettokonzentration des Analyten bezeichnet). In diesem Fall muss repräsentatives Leerwertmaterial verwendet werden, das in gleichmäßigen Schritten auf dem Konzentrationsniveau des zulässigen Grenzwerts und darunter, beginnend mit der STC, dotiert ist. Die Proben sind zu analysieren und die Analyten zu quantifizieren, die Standardabweichung des mittleren gemessenen Gehalts bei der STC ist zu berechnen. Die entsprechende Konzentration bei der STC plus das 1,64fache der Standardabweichung der laborinternen Reproduzierbarkeit des mittleren gemessenen Gehalts bei der STC ist gleich dem Nachweisvermögen. b) Methode 2: durch Untersuchung von dotiertem Leerwertmaterial auf Konzentrationsniveau unterhalb des zulässigen Grenzwerts. Für jede Konzentration sind 20 dotierte Leerwertproben zu analysieren, damit eine zuverlässige Basis für diese Bestimmung gewährleistet wird. Die Konzentration, bei der nur ≤ 5 % nicht konforme Ergebnisse verbleiben, ist gleich dem Nachweisvermögen der Methode. c) Methode 3: CCβ = STC + k (einseitig, 95 %) × (kombinierte) Standardmessunsicherheit bei oder über der STC. Bei zugelassenen Stoffen könnte — abhängig von der Validierungsstudie (und den entsprechenden Freiheitsgraden) — die t-Verteilung nach vernünftigem Ermessen angewandt werden, oder — falls die Gausssche Verteilung (einseitig, n=∞) als Grundlage herangezogen wird — ist ein k-Faktor von 1,64 zu verwenden (sowohl bei der Anwendung von Kaskaden-RHG als auch bei der normalen Anwendung von RHG). Die laborinterne Reproduzierbarkeit und die Richtigkeit sind geeignet, um die (kombinierte) Standardmessunsicherheit abzuleiten, wenn dies unter Berücksichtigung aller relevanten Einflussfaktoren geschieht. Bei pharmakologisch wirksamen Stoffen, bei denen der MRL für die Summe verschiedener Stoffe festgelegt ist, muss das CCβ des Stoffs mit der höchsten Konzentration in der Probe als CCβ für die Bewertung der Summe der Stoffe in der gemessenen Probe verwendet werden.

2.8. Kalibrierkurven

Wenn Kalibrierkurven zur Quantifizierung verwendet werden, gilt Folgendes:

(1) Mindestens fünf — vorzugsweise in gleichmäßigen Schritten festgelegte — Konzentrationsstufen (einschließlich null) sollten zur Erstellung der Kurve verwendet werden;

(2) der Arbeitsbereich der Kurve ist zu beschreiben;

(3) die mathematische Formel der Kurve und die Anpassungsgüte der Daten (Bestimmtheitsmaß R2) an die Kurve sind zu beschreiben;

(4) Akzeptanzbereiche für die Parameter der Kurve sind zu beschreiben.

Für Kalibrierkurven auf der Grundlage von Standardlösungen, matrix-angepasster Standards oder Matrixstandards sind Akzeptanzbereiche für die Parameter der Kalibrierkurve anzugeben, die von Serie zu Serie variieren können.

2.9. Absolute Wiederfindungsrate

Die absolute Wiederfindungsrate der Methode ist zu bestimmen, wenn kein interner Standard oder kein Matrixstandard verwendet wird.

Wenn die Anforderungen bezüglich der Richtigkeit, wie in Tabelle 1 angegeben, erfüllt sind, kann ein fester Korrekturfaktor verwendet werden. Ansonsten ist der für die betreffende Probenserie ermittelte Wiederfindungsfaktor zu verwenden. Alternativ muss anstatt eines Wiederfindungskorrekturfaktors das Standardadditionsverfahren (16) oder ein interner Standard verwendet werden.

Die absolute Wiederfindungsrate muss für mindestens sechs repräsentative Matrixchargen berechnet werden.

Ein Aliquot eines Leerwertmaterials ist vor der Extraktion mit dem Analyten zu dotieren, ein zweites Aliquot eines Leerwertmaterials ist nach der Probenvorbereitung in einer relevanten Konzentration zu dotieren, und die Konzentration des Analyten ist zu bestimmen.

Die Wiederfindungsrate ist wie folgt zu berechnen:

Rec (Analyt) = (Signalfäche Matrixstandard)/(Signalfläche matrix-angepasster Standard) × 100

2.10. Relative Matrixeffekte

Der relative Matrixeffekt muss in allen Fällen bestimmt werden. Dies kann entweder im Rahmen der Validierung oder in getrennten Untersuchungen erfolgen. Die Berechnung des relativen Matrixeffekts muss für mindestens 20 verschiedene Leerwertproben (Matrix/Tierart-Kombinationen) durchgeführt werden, entsprechend des Anwendungsbereichs der Methode (z. B. Erfassung verschiedener Tierarten).

Die Leerwertmatrix sollte nach der Extraktion mit dem Analyten in der Konzentration des RPA, des MRL oder des ML dotiert und zusammen mit einer reinen Lösung des Analyten analysiert werden.

Der relative Matrixeffekt oder Matrixfaktor (MF) wird wie folgt berechnet:

IS: interner Standard

MMS: matrix-angepasster Standard

Der Variationskoeffizient für den MF (für den IS normalisierter Standard) darf nicht mehr als 20 % betragen.

KAPITEL 3

QUALITÄTSKONTROLLE IN DER ROUTINEANALYTIK — LAUFENDE ÜBERPRÜFUNG DER LEISTUNGSFÄHIGKEIT DER METHODE

Die Anforderungen bezüglich der Qualitätssicherung von Analyseergebnissen gemäß Kapitel 7.7 von ISO/IEC 17025:2017 (17) müssen erfüllt sein.

Bei der Routineanalyse ist die Analyse zertifizierter Referenzmaterialien die bevorzugte Option zum Nachweis der Leistungsfähigkeit der Methode. Da zertifizierte Referenzmaterialien, welche die relevanten Analyten in den erforderlichen Konzentrationen enthalten, nur selten verfügbar sind, können alternativ auch Referenzmaterialien verwendet werden, die von den EU-Referenzlaboratorien oder von Laboratorien mit einer Akkreditierung gemäß ISO/IEC 17043:2010 (18) bereitgestellt und charakterisiert wurden. Eine weitere Alternative ist die Verwendung interner Referenzmaterialien, die aber regelmäßig überprüft werden müssen.

Die laufende Überwachung der Leistungsfähigkeit der Methode in der Routineanalytik sollte während des Probenscreenings und der Probenbestätigung erfolgen.

1. In der Screeningphase: Für jede Serie durchgeführter Analysen ist ein Satz folgender Qualitätskontrollproben gleichzeitig zu analysieren: a) Systemkontrollprobe, im Idealfall methodenspezifisch; b) Qualitätskontrollproben, die bei zugelassenen sowie verbotenen oder nicht zugelassenen pharmakologisch wirksamen Stoffen in einer Konzentration nahe der STC und idealerweise in der Konzentration des CCβ dotiert sind; c) konforme Kontrollprobe (Leerwertproben) und, falls relevant, Reagenzienleerwerte.

2. In der Bestätigungsphase: Für jede Serie durchgeführter Analysen ist ein Satz folgender Qualitätskontrollproben gleichzeitig zu analysieren: a) Systemkontrollprobe, im Idealfall methodenspezifisch; b) Qualitätskontrollproben, die bei zugelassenen pharmakologisch wirksamen Stoffen in einer Konzentration nahe dem MRL oder dem ML und bei verbotenen oder nicht zugelassenen Stoffen in einer Konzentration nahe dem RPA oder dem niedrigsten Dotierniveau dotiert sind (nicht konforme Kontrollproben); c) konforme Kontrollprobe (Leerwertproben) und, falls relevant, Reagenzienleerwerte.

Für die Qualitätskontrollproben wird folgende Reihenfolge empfohlen: Systemkontrollprobe, konforme Kontrollprobe, zu bestätigende Probe(n), konforme Kontrollprobe und dotierte Qualitätskontrollprobe (nicht konforme Kontrollproben).

Bei quantitativen Methoden ist für jede Serie amtlicher Proben vor oder nach den oben aufgeführten Proben eine Kalibrierkurve zu analysieren und zu messen.

Soweit praktikabel, ist die Richtigkeit (auf der Grundlage dotierter Proben) aller Zielanalyten in den nicht konformen Kontrollproben anhand von Qualitätskontrollkarten gemäß Kapitel 7.7 von ISO/IEC 17025:2017 zu bewerten. Falls dies eine unverhältnismäßig hohe Anzahl an Bestimmungen der Richtigkeit erfordert, kann die Zahl der Analyten auf eine Anzahl repräsentativer Analyten reduziert werden.

KAPITEL 4

ERWEITERUNG DES VALIDIERTEN ANWENDUNGSBEREICHS EINER BEREITS ZUVOR VALIDIERTEN METHODE

Bisweilen ist es erforderlich, den Anwendungsbereich einer bereits zuvor umfassend validierten Methode zu erweitern. In diesen Fällen sollte eine Erweiterung des Anwendungsbereichs auf effiziente und analytisch fundierte Weise erfolgen. Erreicht werden kann dies durch die Validierung einer im Vergleich zu einer vollständigen Validierung reduzierten Anzahl von Proben (z. B. der halben Probenzahl).

Allerdings müssen Art und Anzahl der zu validierenden Änderungen in einem einzelnen reduzierten Validierungsplan stets auf Expertenwissen und Erfahrung basieren; so würde beispielsweise eine Änderung im Detektionsverfahren in jedem Fall eine vollständige Validierung erfordern.

Generell muss zur Gewährleistung der Validität der Methode deren Leistungsfähigkeit laufend überwacht und mit den ursprünglich erzielten Validierungsparametern verglichen werden. Idealerweise ist diese laufende Kontrolle der Leistungsfähigkeit der Methode so angelegt, dass die für eine vollständige Validierung fehlenden Daten im Lauf der Zeit erhoben werden können (z. B. mit einigen Datenpunkten aus Qualitätskontrollproben in jeder Analysenserie).

4.1. Erweiterungen von Methoden in Bezug auf den Konzentrationsbereich

Aufgrund von Änderungen des MRL, des ML oder des RPA kann sich die Notwendigkeit ergeben, den Konzentrationsbereich, für den eine Methode validiert ist, anzupassen. In solchen Fällen ist die Anwendung eines reduzierten Validierungsplans akzeptabel.

Kalibrierkurven für den geänderten Bereich sollten gemäß dem validierten Verfahren erstellt werden. Es sollten verschiedene Chargen Leerwertmatrix, die in unterschiedlichen Konzentrationen (siehe 2.2.1 und 2.2.2) dotiert sind, analysiert werden. Die Richtigkeit, die Wiederholpräzision und die laborinterne Reproduzierbarkeit/die Laborpräzision sollten verglichen mit den entsprechenden Werten der ursprünglich validierten Methode innerhalb eines akzeptablen Bereichs liegen. Falls relevant, sollte eine Neuberechnung des CCβ (Screeningmethoden) und der CCα (Bestätigungsmethoden) vorgenommen werden.

4.2. Erweiterungen von Methoden in Bezug auf zusätzliche Stoffe

Generell ist die Erweiterung einer Methode auf zusätzliche Verbindungen nur bei Analyten möglich, die eine ähnliche Struktur und ähnliche Eigenschaften wie die bereits in der Analysemethode erfassten Analyten aufweisen. In solchen Fällen ist die Anwendung eines reduzierten Validierungsplans akzeptabel. Eine Abweichung von der Methodenbeschreibung ist nicht erlaubt.

Kalibrierkurven für die zusätzlichen Stoffe sollten gemäß dem validierten Verfahren erstellt werden. Es sollten verschiedene Chargen mit Leerwertmatrix, die in unterschiedlichen Konzentrationen (siehe 2.2.1 und 2.2.2) dotiert sind, analysiert werden. Die Richtigkeit, die Wiederholpräzision und die laborinterne Reproduzierbarkeit/die Laborpräzision sollten innerhalb eines Bereichs liegen, der mit den entsprechenden Werten der in der ursprünglich validierten Methode erfassten anderen Analyten vergleichbar ist und den Anforderungen gemäß 1.2.2 entspricht. Für die neuen Analyten muss eine Berechnung des CCβ (Screeningmethoden) und der CCα (Bestätigungsmethoden) vorgenommen werden.

4.3. Erweiterungen von Methoden in Bezug auf Matrices/Tierarten

Über die Aufnahme neuer Matrices oder Tierarten in eine bereits validierte Analysemethode ist stets im Einzelfall zu entscheiden, basierend auf dem Wissen über die Methode, den bisherigen Erfahrungen sowie Vorversuchen zur Bewertung potenzieller Matrixeffekte und Interferenzen. Generell wird dies nur bei Matrices mit ähnlichen Eigenschaften und bei nicht-kritischen Analyten (Stabilität, Nachweisbarkeit) möglich sein.

Kalibrierkurven (Standard oder Matrix) sollten gemäß dem validierten Verfahren erstellt werden. Es sollten verschiedene Chargen mit Leerwertmatrix, die in unterschiedlichen Konzentrationen (siehe 2.2.1 und 2.2.2) dotiert sind, analysiert werden. Die Richtigkeit, die Wiederholpräzision und die laborinterne Reproduzierbarkeit/die Laborpräzision sollten innerhalb eines Bereichs liegen, der verglichen mit den entsprechenden Werten der ursprünglich validierten Methode akzeptabel ist und den Anforderungen gemäß 1.2.2 entspricht. Abhängig vom Validierungsansatz könnte eine Neuberechnung des CCβ (Screeningmethoden) oder der CCα (Bestätigungsmethoden) erforderlich sein.

Wenn die Ergebnisse verglichen mit den Werten für die ursprüngliche Matrix nicht innerhalb eines akzeptablen Bereichs liegen, ist eine zusätzliche vollständige Validierung erforderlich, um die für die Matrix/Tierart spezifischen Leistungsparameter zu bestimmen.

Wenn MRL für einen spezifischen Stoff bei bestimmten Matrices abweichen, wird es wahrscheinlich schwierig sein, den Anwendungsbereich der Methode an die zusätzliche Matrix/Tierart und Konzentration anzupassen, da in diesem Fall zwei Änderungen berücksichtigt werden müssen. In solchen Fällen wird eine vollständige Validierung empfohlen.

(1) Co-Chromatografie ist eine Technik, bei der der Probenextrakt vor dem (den) chromatografischen Schritt(en) in zwei Teile aufgeteilt wird. Der eine Teil wird normal chromatografiert. Der zweite Teil wird mit der zu messenden Standardsubstanz gemischt. Dieses Gemisch wird dann ebenfalls chromatografiert. Die Menge an zugesetzter Standardsubstanz muss etwa gleich groß wie die geschätzte Menge des Analyten im Extrakt sein. Co-Chromatografie soll die Identifizierung eines Analyten verbessern, wenn chromatografische Methoden eingesetzt werden, besonders wenn kein geeigneter interner Standard verwendet werden kann.

(*) Der angegebene Reproduzierbarkeits-CV (in %) stellt einen Richtwert dar und sollte so niedrig wie möglich sein (ALARA-Prinzip).

(a) Für die Vorläufer-Ionenauswahl gibt es keinen zusätzlichen Identifizierungspunkt, wenn dieses Vorläufer-Ion dasselbe Ion (oder ein Addukt oder Isotop) ist wie das bereits beim Full Scan berücksichtigte HRMS-Ion.

(#) Stehen für die Analyten in einer Matrix aus der wissenschaftlichen Literatur oder von einem anderen Labor Stabilitätsdaten zur Verfügung, so brauchen diese Daten von dem betreffenden Labor nicht nochmals ermittelt zu werden. Dagegen ist ein Verweis auf verfügbare Stabilitätsdaten für Analyten in Lösung nur akzeptabel, wenn identische Bedingungen vorliegen.

(*) Relevant für MS-Methoden, um durch die Validierung nachzuweisen, dass die Anforderungen bezüglich der Leistungsmerkmale erfüllt sind. Der relative Matrixeffekt der Methode ist zu bestimmen, wenn dieser nicht im Rahmen des Validierungsverfahrens bestimmt wurde. Die absolute Wiederfindungsrate der Methode ist zu bestimmen, wenn kein interner Standard oder kein Matrixstandard verwendet wird.

(2) ISO 5725-4:2020 Genauigkeit (Richtigkeit und Präzision) von Messverfahren und Messergebnissen — Teil 4: Grundlegende Methoden für die Ermittlung der Richtigkeit eines vereinheitlichten Messverfahrens (Satz 3).

(3) Ist für die Validierung eines nicht zugelassenen pharmakologisch wirksamen Stoffes eine Konzentration des 0,5fachen des RPA nicht mit angemessenem Aufwand erreichbar, so kann die Konzentration des 0,5fachen RPA ersetzt werden durch die niedrigste Konzentration zwischen dem 0,5fachen und dem 1,0fachen des RPA, die sinnvoll erreichbar ist.

(4) Ist für die Validierung eines spezifischen pharmakologisch wirksamen Stoffes eine Konzentration des 0,1fachen des MRL nicht mit angemessenem Aufwand erreichbar, so kann die Konzentration des 0,1fachen des MRL ersetzt werden durch die niedrigste Konzentration zwischen dem 0,1fachen und dem 0,5fachen des RHG, die sinnvoll erreichbar ist.

(5) Ist für die Validierung eines nicht zugelassenen pharmakologisch wirksamen Stoffes eine Konzentration des 0,5fachen des RPA nicht mit angemessenem Aufwand erreichbar, so kann die Konzentration des 0,5fachen des RPA ersetzt werden durch die niedrigste Konzentration zwischen dem 0,5fachen und dem 1,0fachen des Referenzwerts für Maßnahmen, die sinnvoll erreichbar ist.

(6) Ist für die Validierung eines spezifischen pharmakologisch wirksamen Stoffes eine Konzentration des 0,1fachen des MRL nicht mit angemessenem Aufwand erreichbar, so kann die Konzentration des 0,1fachen des MRL ersetzt werden durch die niedrigste Konzentration zwischen dem 0,1fachen und dem 0,5fachen des MRL, die sinnvoll erreichbar ist.

(7) ISO 5725-2:2019 Genauigkeit (Richtigkeit und Präzision) von Messverfahren und Messergebnissen — Teil 2: Grundlegende Methode für die Ermittlung der Wiederhol- und Vergleichpräzision eines vereinheitlichten Messverfahrens (Satz 3).

(8) ISO 11843-1:1997 Erkennungsfähigkeit — Teil 1: Begriffe.

(9) Codex-Alimentarius-Kommission, Ernährungs- und Landwirtschaftsorganisation der Vereinten Nationen/Weltgesundheitsorganisation, Guidelines on estimation of uncertainty of results (CAC/GL 59-2006).

(10) Die einschlägigen Änderungen in den Versuchsbedingungen können das Probenmaterial, die Analyten, die Lagerbedingungen sowie Umgebung- und/oder Probenvorbereitungsbedingungen betreffen. Für alle Versuchsbedingungen, die in der Praxis möglicherweise schwanken können (beispielsweise Stabilität der Reagenzien, Zusammensetzung der Probe, pH-Werte, Temperatur), ist anzugeben, welche Schwankungen das Analysenergebnis beeinflussen könnten.

(11) Jülicher, B., Gowik, P. and Uhlig, S. (1998) Assessment of detection methods in trace analysis by means of a statistically based in-house validation concept. Analyst, 120, 173.

(12) IUPAC (1995), Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies, Pure & Applied Chem, 67, 331.

(13) Gowik, P., Jülicher, B. and Uhlig, S. (1998) Multi-residue method for non-steroidal anti-inflammatory drugs in plasma using high performance liquid chromatography-photodiode-array detection. Method description and comprehensive in-house validation. J. Chromatogr., 716, 221.

(14) ISO 11843-1:1997 Erkennungsfähigkeit — Teil 1: Begriffe.

(15) Durchführungsverordnung (EU) 2018/470 der Kommission vom 21. März 2018 mit ausführlichen Vorschriften zu den Rückstandshöchstmengen, die bei Kontrollen von Lebensmitteln zu berücksichtigen sind, die von in der EU gemäß Artikel 11 der Richtlinie 2001/82/EG behandelten Tieren stammen (ABl. L 79 vom 22.3.2018, S. 16).

(16) Die Menge des zugesetzten Standardanalyten kann beispielsweise zwischen dem Zweifachen und dem Fünffachen der geschätzten Menge des Analyten in der Probe betragen. Dieses Verfahren dient dazu, den Gehalt eines Analyten in einer Probe unter Berücksichtigung der Wiederfindung des Analyseverfahrens zu bestimmen.

(17) ISO/IEC 17025:2017 Allgemeine Anforderungen an die Kompetenz von Prüf- und Kalibrierlaboratorien (Kapitel 7.7).

(18) ISO/IEC 17043:2010 Konformitätsbewertung — Allgemeine Anforderungen an Eignungsprüfungen.