„ANHANG XXa

METHODE ZUM NACHWEIS VON FREMDÖLEN IN OLIVENÖLEN

1. ANWENDUNGSBEREICH

Diese Methode dient dem Nachweis fremder Pflanzenöle in Olivenölen. In Olivenöl lassen sich Pflanzenöle mit hohem Linolsäuregehalt (Soja-, Raps-, Sonnenblumenöl usw.) sowie einige Pflanzenöle mit hohem Ölsäuregehalt (wie Haselnussöl, Sonnenblumenöl mit hohem Ölsäuregehalt und Oliventresteröl) nachweisen. Der Nachweisgrad hängt von der Art des Fremdöls und der Olivensorte ab. Bei Haselnussöl ist ein Nachweisgrad von 5–15 % üblich. Die Methode ermöglicht es nicht, die Art des festgestellten Fremdöls zu ermitteln, sondern zeigt nur an, ob es sich um unverfälschtes Olivenöl handelt oder nicht.

2. PRINZIP

Das Öl wird durch Festphasenextraktion (SPE) an Kieselgelkartuschen gereinigt. Die Triacylglycerin- (TAG-) Zusammensetzung wird durch hochauflösende Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung eines Brechungsindexdetektors und von Propionitril als mobiler Phase bestimmt. Aus dem gereinigten Öl werden durch Methylierung mit einer kalten Lösung von KOH in Methanol (Anhang X B) Fettsäuremethylester (FAME) zubereitet, die anschließend mittels Kapillar-Gaschromatographie mit hohen polaren Trennsäulen analysiert werden (Anhang X A). Ein Computerprogramm berechnet die theoretische Triacylglycerinzusammensetzung anhand der Fettsäurezusammensetzung unter der Annahme einer 1,3-Random-2-Random-Verteilung der Fettsäuren im Triacylglycerin, mit Einschränkungen für die gesättigten Fettsäuren in 2-Stellung. Die Berechnungsmethode stellt eine Abwandlung des in Anhang XVIII beschriebenen Verfahrens dar. Anhand der theoretischen und experimentellen Triacylglycerinzusammensetzungen (HPLC) werden mehrere mathematische Algorithmen berechnet, und die so erhaltenen Werte werden mit den in einer Datenbank erfassten Werten unverfälschter Olivenöle verglichen.

3. MATERIALIEN UND REAGENZIEN

3.1. Reinigung des Öls

3.1.1. 25-ml-Erlenmeyerkolben. und Deckel mit PTFE-Dichtung.

3.1.3. Kieselgelkartuschen, 1 g (6 ml), für die Festphasenextraktion (z. B., Waters, Massachusetts, USA).

3.1.4. n -Hexan, Analysequalität.

3.1.5. Lösungsmittelgemisch aus Hexan/Diethylether (87:13, V/V).

3.1.6. n -Heptan, Analysequalität.

3.1.7. Aceton, Analysequalität.

3.2. HPLC-Analyse der Triacylglycerine

3.2.1. Mikroliterspritzen (50 μL) und Nadeln für die HPLC-Injektion.

3.2.2. Propionitril, reinst oder HPLC-Qualität (z. B. ROMIL, Cambridge, Vereinigtes Königreich) zur Verwendung als mobile Phase.

3.2.3. HPLC-Säule (25 cm × 4 mm Innendurchmesser), gepackt mit RP-18-Phase (Korngröße 4 μ).

3.3. Zubereitung von Fettsäuremethylestern

(Siehe Anhang X B)

3.3.1. Methanol mit höchstens 0,5 % Wassergehalt.

3.3.2. Heptan, Analysequalität.

3.3.3. Eine 2N-Lösung von Kaliumhydroxid in Methanol. 1,1 g Kaliumhydroxid werden in 10 ml Methanol gelöst.

3.3.4. 5-ml-Reagenzgläser mit Schraubverschluss und Deckel mit PTFE-Dichtung.

3.4. Gaschromatische Analyse der FAME

(Siehe Methode zur Bestimmung von ungesättigten trans-Fettsäuren mittels Kapillar-Gaschromatographie in Anhang X A).

3.4.1 Mikroliterspritzen (50 μL) und Nadeln für die GC-Injektion.

3.4.2 Wasserstoff oder Helium als Trägergas.

3.4.3 Wasserstoff und Sauerstoff für den Flammenionisationsdetektor.

3.4.4 Stickstoff oder Helium als Hilfsträgergas.

3.4.5. Fused Silica-Kapillarsäule (50-60 m × 0,25 – 0,30 mm Innendurchmesser), beschichtet mit Cyanopropylpolysiloxan- oder Cyanopropylphenylsiloxanphasen (SP-2380 oder ähnlich) mit 0,20-0,25 μm Schichtdicke.

4. GERÄTE

4.1. Vakuumgerät für Festphasenextraktion.

4.2. Rotationsverdampfer.

4.3. HPLC-Apparatur, bestehend aus: 4.3.1. Entgaser für die mobile Phase. 4.3.2. Rheodyn-Injektionsventil mit 10 μL-Schleife. 4.3.3. Hochdruckpumpeneinheit. 4.3.4. Thermostatisch regulierter Trockenschrank für die HPLC-Säule, einstellbar auf Temperaturen unterhalb der Umgebungstemperatur (15-20 °C) (z. B. Typ Peltier). 4.3.5. Brechungsindexdetektor. 4.3.6. Computergestütztes Datenerfassungssystem mit Integrationsprogramm.

4.4 Apparatur für Kapillargaschromatographie gemäß Anhang X A mit folgendem Zubehör: 4.4.1. Split-Injektor. 4.4.2. Flammenionisationsdetektor. 4.4.3. Ofen mit programmierbarer Temperatur. 4.4.4. Computergestütztes Datenerfassungssystem mit Integrationsprogramm.

4.5. Computer mit Microsoft EXCEL.

5. DURCHFÜHRUNG DER ANALYSE

5.1. Reinigung des Öls

Eine SPE-Kieselgelkartusche in einen Vakuum-Eluator geben und unter Vakuum mit 6 ml Hexan waschen. Das Vakuum unterbrechen, damit die Säule nicht austrocknet, und einen Erlenmeyerkolben unter die Kartusche stellen. In die Säule eine Lösung von etwa 0,12 g Öl in 0,5 ml Hexan geben, die Lösung durch das Kieselgel geben und dann mit 10 ml Lösungsgemisch (3.1.5) aus Hexan-Diethylether (87:13 v/v) unter Vakuum eluieren. Das eluierte Lösungsmittel homogenisieren und ungefähr die Hälfte der Menge in einen anderen Erlenmeyerkolben gießen. Beide Lösungen getrennt voneinander in einem Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck bei Zimmertemperatur bis zur Trocknung abrotieren. Zur Triacylglycerin-Analyse einen der Rückstände in 1 ml Aceton lösen (siehe Nummer 5.2 erster Absatz) und in ein 5-ml-Reagenzglas mit Schraubverschluss geben. Zur Zubereitung der Fettsäuremethylester den anderen Rückstand in 1 ml n-Heptan lösen und in ein zweites 5-ml-Reagenzglas mit Schraubdeckel geben.

Anmerkung: Das Öl kann über einer Kieselgelsäule nach der Methode IUPAC 2.507 gereinigt werden.

5.2. HPLC-Analyse der Triacylglycerine

Das HPLC-System einrichten, die Säulentemperatur bei 20 °C halten; als mobile Phase dient Propionitril bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 0,6 ml/min. Wenn die Basislinie stabil ist, eine Lösungsmittelinjektion durchlaufen lassen; wenn die Basislinie im Bereich 12 bis 25 min unruhig erscheint, die Probe mit einer anderen Art von Aceton oder einer Mischung aus Propionitril/Aceton (25:75) lösen.

Anmerkung: Einige Arten von Aceton rufen Störungen der Basislinie in der genannten Region hervor.

Ein 10-μl-Aliquot der Lösung aus gereinigtem Öl in Aceton (5 %) einspritzen. Der Durchlauf dauert ca. 60 min. Ofentemperatur und/oder Durchlaufgeschwindigkeit sind so anzupassen, dass das Chromatogramm dem in Abbildung 1 ähnelt, wo Trilinolein (Peak 1) bei 15,5 min eluiert und die Auflösungen zwischen den Paaren LLL/OLLn (Peaks 1 und 2) und OLL/OOLn (Peaks 4 und 5) gut sind.

Die Höhe von Peak 2 (OLLn+PoLL) muss zumindest 3 % des vollen Skalenendwerts erreichen.

5.3. Zubereitung der Fettsäuremethylester

0,1 ml einer 2N-Lösung aus Kaliumhydroxid in Methanol zu der Lösung aus gereinigtem Öl in 1 ml n-Heptan hinzugeben. Deckel fest auf das Reagenzglas schrauben. Das Glas 15 Sekunden kräftig schütteln und absetzen lassen, bis sich die obere Schicht geklärt hat (5 Minuten). Die n-Heptan-Lösung ist bereit zur Injektion in den Gaschromatographen. Die Lösung kann höchstens 12 Stunden bei Zimmertemperatur aufbewahrt werden.

5.4. GC-Analyse der Fettsäuremethylester

Es ist das Verfahren anzuwenden, das im Rahmen der Methode zur Bestimmung von trans-Fettsäuren beschrieben wurde (siehe Anhang X A).

Das GC-System einrichten und auf eine Ofentemperatur von 165 °C einstellen. Empfohlen wird eine isotherme Ofentemperatur von 165 °C für 10 min, danach Aufheizen um 1,5 °C/min bis auf 200 °C. Für das Einspritzsystem wird eine Temperatur zwischen 220 °C und 250 °C empfohlen, um die Bildung von trans-Fettsäuren möglichst gering zu halten (siehe Anhang X A). Detektortemperatur: 250 °C. Als Trägergas ist Wasserstoff oder Helium bei einem Säulenkopfdruck von ca. 130 kPa zu verwenden. Injektionsvolumen: 1 μL im Split-Injektionsmodus.

Es muss ein ähnliches GC-Profil wie in Abbildung 2 erreicht werden. Besonders ist auf die Auflösung zwischen C18:3 und C20:1 zu achten (der C18:3-Peak muss vor dem C20:1-Peak erscheinen). Um diese Bedingungen zu erfüllen, muss die Anfangstemperatur und/oder die Säulenkopftemperatur optimiert werden. Das Einspritzsystem ist so einzustellen (Temperatur, Splitverhältnis und Volumeninjektion), dass die Unterscheidung von Palmitin- und Palmitoleinsäure weitestgehend vermieden wird.

Die Höhe des C20:0-Peaks muss etwa 20 % des vollen Skalenendwerts betragen, um die Quantifizierung der trans-Isomere zu ermöglichen. Erscheint der C18:0-Peak verzerrt, ist die Probenmenge zu verringern.

6. INTEGRATION CHROMATOGRAPHISCHER PEAKS

6.1. HPLC-Chromatogramm

Abbildung 1 zeigt ein typisches HPLC-Chromatogramm der Triacylglycerine eines gereinigten Olivenöls. Zur Integration der Peaks müssen drei Basislinien gezogen werden: die erste zwischen dem Beginn von Peak 1 und dem Ende von Peak 3; die zweite zwischen dem Beginn von Peak 4 und dem Tal vor Peak 8; die dritte zwischen dem Tal vor Peak 8 und dem Ende von Peak 18.

Die Gesamtfläche ist die Summe der Flächen aller (identifizierten und nicht identifizierten) Peaks von Peak 1 bis Peak 18. Der prozentuale Anteil jedes Peaks ergibt sich aus der Formel

Die prozentualen Anteile sind mit zwei Dezimalstellen anzugeben.

6.2. Gaschromatogramm

Abbildung 2 zeigt ein Gaschromatogramm von Fettsäurealkylestern, die aus einem gereinigten Olivenöl gewonnen wurden. Zu berechnen sind die prozentualen Anteile folgender Fettsäuren:

Palmitinsäure; P (C16:0) = Methylester + Ethylester Stearinsäure; S (C18:0) = Methylester Palmitolsäure; Po (C16:1) = Summe der Methylester der beiden cis-Isomere Ölsäure; O (C18:1) = Summe der Methylester der beiden cis-Isomere + Ethylester + trans-Isomere Linolsäure; L (C18:2) = Methylester+ Ethylester + trans-Isomere Linolensäure; Ln (C18:3) = Methylester + trans-Isomere Arachinsäure; A (C20:0) = Methylester Eicosensäure (Gadoleinsäure); G (C20:1) = Methylester

Ethyl- und trans-Isomer-Ester können im Gaschromatogramm fehlen.

Die Gesamtfläche (AT) ist die Summe aller im Chromatogramm erscheinenden Peaks von C14:0 bis C24:0 mit Ausnahme dessen, der Squalen entspricht. Der prozentuale Anteil jedes einzelnen Peaks wird wie folgt berechnet:

Die Ergebnisse werden mit zwei Dezimalstellen angegeben.

Bei den mittels Computerprogramm vorgenommenen Berechnungen erübrigt sich die Normalisierung auf 100, weil sie automatisch vorgenommen wird.

Abbildung 1

HPLC-Chromatogramm der TAG in einem nativen Olivenöl aus „Chemlali“-Oliven. Hauptkomponenten der Peaks

(1) LLL; (2) OLLn+PoLL; (3) PLLn; (4) OLL; (5) OOLn+PoOL;

(6) PLL+PoPoO; (7) POLn+PPoPo+PPoL; (8) OOL+LnPP; (9) PoOO;

(10) SLL+PLO; (11) PoOP+SPoL+SOLn+SPoPo; (12) PLP;

(13) OOO+PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; (17) SOO;

(18) POS+SLS.

Tabelle 1

Daten zur Wiederholbarkeit der Bestimmung von TAG in nativem Olivenöl mittels HPLC bei einer Säulentemperatur von 20 °C mit Propionitril als mobiler Phase

ECN HPLC-Peaks TAG Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Mittel (%) RSDr (%) Mittel (%) RSDr (%) Mittel (%) RSDr (%) Mittel (%) RSDr (%) Mittel (%) RSDr (%) 42 1 LLL 0,020 7,23 0,066 5,18 0,095 4,10 0,113 0,95 0,34 1,05 2 OLLn+ PoLL 0,085 7,44 0,24 1,78 0,26 2,25 0,35 2,02 0,50 2,83 3 PLLn 0,023 15,74 0,039 5,51 0,057 5,62 0,082 4,35 0,12 6,15 44 4 OLL 0,47 1,52 1,53 0,42 2,62 0,98 3,35 1,05 4,37 1,13 5 OOLn+ PoOL 1,07 2,01 1,54 0,46 1,61 0,71 1,72 1,07 1,77 2,40 6 PLL+ PoPoO 0,11 12,86 0,24 4,37 0,65 1,32 1,35 0,73 2,28 1,24 7 POLn+ PpoPo+ PpoL 0,42 5,11 0,49 2,89 0,55 2,01 0,85 1,83 1,09 1,96 46 8 OOL+ LnPP 6,72 0,63 8,79 0,31 11,21 0,42 13,25 0,33 15,24 0,23 9 PoOO 1,24 2,86 1,49 0,95 1,63 0,85 2,12 0,45 2,52 0,56 10 SLL+ PLO 2,70 0,65 4,05 0,70 6,02 0,65 9,86 0,53 11,53 0,31 11 PoOP+ SpoL+ SOLn+ SpoPo 0,64 4,42 0,69 3,02 0,79 1,23 1,53 0,89 1,70 1,66 48 12+13 OOO+ PLP+ PoPP 49,60 0,07 48,15 0,06 42,93 0,06 33,25 0,10 24,16 0,06 14 SOL 0,82 1,72 0,92 1,56 1,05 1,32 1,25 1,05 1,60 1,77 15 POO 22,75 0,25 21,80 0,20 21,05 0,30 20,36 0,35 20,17 0,14 50 16 POP 3,05 0,46 4,56 0,42 4,98 0,52 5,26 0,41 5,57 0,38 17 SOO 6,87 0,21 5,56 0,33 4,86 0,43 4,12 0,72 3,09 0,69 18 POS+ SLS 1,73 1,23 1,65 1,10 1,54 0,99 1,49 1,10 1,41 1,00 n = 3 Wiederholungen RSDr = Relative Standardabweichung der Wiederholbarkeit

Abbildung 2

G as - Chroma togra m m von Fettsäurealkylestern, die aus einem Oliventresteröl durch Ummesterung mit einer kalten Lösung von KOH in Methanol gewonnen wurden

7. NACHWEIS VON FREMDÖLEN IN OLIVENÖLEN

Die Berechnungsmethode für den Nachweis von Fremdölen in Olivenölen, die auf einem Vergleich mathematischer Algorithmen mit den in einer Datenbank erfassten Werten unverfälschter Olivenöle beruht, wird in Anhang I des Standards IOC/T.20/Dok. Nr. 25 beschrieben.“